96 웰 면역 검정 플레이트 를 4 ℃ 에서 증류수 중 의 웰 당 0 . 5 ㎍ 의 스 트 렙 타비 딘 100 ㎕ ( Sigma ) 을 사용 하 여 밤새 코팅 시켰 다 . 플레이트 를 3 회 세척 하 고 ( PBS / 0 . 01 % Tween 20 ) , 웰 을 실온 에서 1 시간 동안 PBS 중 의 웰 당 3 % BSA 250 ㎕ 를 사용 하 여 차단 하 였 다 . 플레이트 를 3 회 세척 하 고 , 100 ul 의 펩티드 용액 ( PBS 중 의 1 % BSA 0 . 1 % Tween 20 중 의 0 . 5 ug / 웰 ) 을 실온 에서 3 시간 동안 3 중 ( triplicate ) 웰 에 첨가 하 였 다 . DMSO 단독 대조 웰 을 또한 준비 하 였 다 . 플레이트 를 3 회 세척 하 고 , 100 ㎕ 의 29 개 의 하이브리도마 상층 액 ( 1 % BSA / 0 . 1 % Tween 20 중 에서 1 / 20 으로 희석 됨 ) 을 모든 웰 에 첨가 하 고 , 4 ℃ 에서 밤새 인 큐 베이 션 하 였 다 . 플레이트 를 3 회 세척 하 고 , 항 - 마우스 IgG 항체 - 호오 스 래디 쉬 퍼 옥시다아제 컨 쥬 게이트 ( Amersham , PBS 중 의 1 % BSA , 0 . 1 % Tween 20 중 에서 1 : 2000 으로 희석 됨 ) 를 웰 당 100 ㎕ 로 첨가 하 였 다 . 플레이트 를 실온 에서 1 시간 동안 인 큐 베이 션 하 고 , 3 회 세척 하 고 , 실온 에서 약 5 분 간 웰 당 100 ul 의 테트라메틸 벤지딘 ( Sigma ) 기질 을 사용 하 여 검출 항체 의 결합 을 발색 시켜서 청색 발색 을 모니터링 하 였 다 . 반응 을 정지 시키 고 , 450 nm 에서 각각 의 웰 에 대해 광학 밀도 를 판독 하 였 다 .