HFYD 처리 한 세포 를 수집 하 여 차가운 PBS 로 두 번 세 척 한 후 , 세포 용해 완충액 ( lysis buffer ) 〔 50 mM Tris - HCl ( pH 7 . 5 ) 150 mM NaCl , 1 % Nonidet P - 40 , 2 mM EDTA , 1 mM EGTA , 1 mM NaVO 3 , 10 mM NaF , 1 mM dithiothreitol , 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride , 25 ㎍/ ml aprotinin , 25 ㎍/ ml leupeptin 〕 에 용해 시키 고 30 분 동안 냉각 상태 로 두 었 다 . 이후 , 세포 용해 물 을 20 분 동안 4 ℃ 에서 12 , 000 RPM 으로 원심 분리 하 고 , 상층 액 의 세포 용해 물 ( 단백질 30 - 50 ㎍) 의 분 핵 을 8 - 12 % SDS - 폴리아 클 릴 아미드 겔 ( polyacrylamide gel ) 에서 전기영동 시킨 후 , 겔 상 의 단백질 을 PVDF ( polyvinylidene fluoride ) 멤 브레인 ( BIO - RAD , HC , USA ) 으로 트랜스퍼 시켰 다 . 5 % 탈지 건조유 제 ( nonfat dried milk ) 를 이용 하 여 비 특이 적 부위 를 차단 한 후 에 , 상기 멤 브레인 을 일차 항체 인 카스 파제 3 ( primary antihuman caspase 3 ) 항체 , 폴리 ADP 리 보 실 폴리머 라 제 ( PARP : Poly ADP Ribosyl Polymerase ) 항체 , Bcl - 2 항체 및 Bax 항체 ( Cell signaling , MA , USA ) 를 이용 하 여 반응 시키 고 , 퍼 옥시 다제 가 접합 된 이 차 항체 ( 1 : 5000 , Vector , CA , USA ) 로 추가 로 반응 시켰 다 . 상기 PVDF 멤 브레인 을 X 선 필름 에 노출 시키 고 , 상기 단백질 밴드 를 관찰 하 였 다 .