특정 IgG 에 대해 대략 적 으로 평가 된 KD 로 비오틴 화 된 인간 IL - 4 R α HIS FLAG 를 부가 시 에 유의 한 신호 를 부여 하 는 농도 로 PBS 중 96 - 웰 Maxisorp 마이크 로 타 이터 플레이트 ( Nunc ) 에 정제 된 IgG 를 흡착 시켰 다 . 과량 의 IgG 는 PBS - Tween ( 0 . 1 % v / v ) 로 세척 해 내 고 , 웰 을 PBS - Marvel ( 3 % w / v ) 로 1 시간 동안 블로킹 하 였 다 . 하 기 경쟁 인자 각각 의 희석 시리즈 물 을 PBS 에 제조 하 였 는데 , 비오틴 화 된 인간 IL - 4 R α 및 각각 의 IgG ; 인간 IL - 4 R α Fc ( R & D Systems , 604 - 4 R - 050 ) , 인간 IL - 4 R α I 75 V Fc ( AstraZeneca ) , 사이 노 몰 거스 IL - 4 R α HIS Fc ( 인하 우스 ) , 쥣과 동물 IL 4 R α Fc ( R & D Systems 530 - MR - 100 ) , 인간 공통 감마 쇄 ( sIL - 2 Rg ) ( R & D Systems 384 - RG - 050 - CF ) , 인간 IL - 13 Ra 1 Fc ( R & D Systems , 146 - IR - 100 ) , 인간 IL - 13 Ra 2 Fc ( R & D Systems , 614 - IR - 100 ) 간 상호 작용 의 KD 값 의 대략 400 배 의 농도 에서 출발 하 였 다 . 비오틴 화 되 지 않 은 인간 IL - 4 R α HIS FLAG 를 양성 대 조군 으로서 사용 하 였 다 . 이 시리즈 물 에 , KD 의 대략 2 배 농도 로 동일 부피 의 비오틴 화 된 재조합 인간 IL - 4 R α 를 부가 하 였 다 ( 그 결과 대략 200 : 1 의 경쟁 인자 항원 : 비오틴 화 된 인간 IL - R α 의 비율 에서 시리즈 물 이 출발 함 ) . 다음 으로 이 들 혼합물 을 블로킹 된 IgG 상 으로 전달 하 고 1 . 5 시간 동안 평형 화 되 도록 하 였 다 . 미 결합 된 항원 은 PBS - Tween ( 0 . 1 % v / v ) 로 세척 하 여 제거 하 는 한편 , 남 아 있 는 비오틴 화 된 인간 IL - 4 R α 는 스 트 렙 타비 딘 - 유로 피움 3 + 접합체 ( DELFIA ® 검출 , PerkinElmer ) 를 통해 검출 하 였 다 . 시차 형광 발광 은 EnVision 플레이트 판독기 ( PerkinElmer ) 상 에서 620 nm 에서 측정 하 였 다 . 형광 발광 데이 타 는 특이 적 결합 율 ( %) 로 전환 시켰 다 ( 비오틴 화 된 인간 IL - 4 R α 는 함유 하 지만 경쟁 인 자 는 없 는 대 조군 웰 에서 100 % 가 측정 되 었 고 , 0 % 는 비오틴 화 된 인간 IL - 4 R α 및 1000 배 과량 의 비오틴 화 되 지 않 은 인간 IL - 4 R α 함유 웰 에서 얻 음 ) . 최종 데이 타 는 Prism curve fitting 소프트웨어 ( Graphpad ) 를 사용 하 여 분석 해서 IC 50 값 을 확인 하 였 다 .