결합 검정 을 위해 , 96 웰 플레이트 ( 높 은 결합 마이크 로 플레이트 ) 를 RT 에서 2 시간 동안 ( 또는 4 ℃ 에서 밤새 ) DPBS 중 1 μ g / ml α Syn WT PFF 100 μ L 로 코팅 하 였 다 . 플레이트 를 ~ 300 μ L 의 세 척 완충제 ( DPBS 중 0 . 05 % 트윈 ) 로 3 회 세척 하 였 다 . 플레이트 를 150 μ l 의 3 % BSA / DPBS 로 RT 에서 2 시간 동안 ( 또는 4 ℃ 에서 밤새 ) 차단 하 였 다 . PFF ( 2 μ g / ml 로부터 출발 함 ) 및 α - syn WT 단량체 ( 20 μ g / ml 로부터 출발 함 ) 의 3 - 배 연속 희석 물 을 샘플 완충제 ( 0 . 1 % BSA / 0 . 05 % 트윈 / DPBS , 50 ml 완충제 중 프로테아제 억제제 ( 로슈 컴 플리트 , 시그마 - 알드리치 , 미주리주 세인트 루이스 ) 의 2 개 의 펠릿 ) 중 에서 제조 하 였 다 . 항체 인 큐 베이 션 의 경우 , 동등 부피 의 2 - 배 검정 농도 의 α Syn PFF 또는 단량체 를 BD 팔 콘 낮 은 결합 플레이트 에서 2 - 배 검정 농도 의 항체 와 혼합 하 고 , RT 에서 ~ 2 시간 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 항체 및 PFF 또는 단량체 의 혼합물 100 μ L 를 PFF 코팅 된 플레이트 에 첨가 하 고 , RT 에서 10 분 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 플레이트 를 3 회 세척 하 였 다 . PBSTB ( 1 % BSA / 0 . 2 % 트윈 / dPBS ) 중 에 1 : 1000 으로 희석 된 당나귀 항 - 인간 IgG ( 잭슨 이 뮤 노리 서 치 , 펜 실베 니 아주 웨스트 그로브 , 50 % 글리세롤 함유 ) 100 μ L 를 첨가 하 고 , 플레이트 를 RT 에서 1 시간 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 플레이트 를 세 척당 5 ~ 10 분 동안 3 회 세척 하 였 다 . 100 μ L 의 AP 기질 ( 트 로 픽스 CDP 스타 레디 - 투 - 유즈 위드 사파이어 II , 써 모 피셔 사이언 티 픽 , 매사추세츠주 월섬 ) 을 첨가 하 고 , RT 에서 30 분 동안 발색 시켰 다 . 발광 계수 를 퍼킨 엘머 엔 비전 ( 2102 멀티 라벨 리더 , 퍼킨 엘머 , 매사추세츠주 월섬 ) 으로 판독 하 였 다 . PFF 를 항체 에 의한 코팅 또는 항체 와 의 혼합 전 1 초 펄스 로 15 회 초음파 처리 하 였 다 . 플레이트 를 검정 동안 일정 한 진탕 ( 적정 플레이트 진탕기 ) 하 에 유지 시켰 다 .