균주 를 MAM 배지 ( 50 mg / L 아프 라 마이신 으로 보충 됨 ) 에 패치 하 고 , 4 일 동안 28 ℃ 에서 성장 시켰 다 . 250 ml 원추형 플라스크 에 30 mL 의 ISP 2 ( 0 . 4 % 효모 추출물 , 1 % 맥아 추출물 , 0 . 4 % 덱 스트로즈 , 항생제 로 보충 되 지 않 음 ) 를 접종 하 기 위해 2 개 의 6 mm 원형 플러그 를 사용 하 였 다 . 배 양물 을 2 - 3 일 동안 기른 뒤 250 ml 원추형 플라스크 에서 30 mL 의 ISP 2 내로 서브 배양 하 였 다 ( 5 % 접종물 ) . 4 내지 5 회 의 서브 배양 후 , 배 양물 을 실시 예 3 . 6 에서 기술 된 바 와 같이 원형질체 화 하 고 , 상기 원형질체 를 일련 의 희석 을 통해 준비 한 후 , 재생 배지 ( 실시 예 3 . 6 참조 ) 에 도말 하 고 , 4 일 동안 28 ℃ 에서 인 큐 베이 션 하 였 다 . 이어서 , 단일 클 로니 를 아프 라 마이신 을 포함 하 는 MAM 배지 및 항생제 를 포함 하 지 않 는 MAM 배지 로 이중 으로 패치 하 고 , 플레이트 를 4 일 동안 28 ℃ 에서 인 큐 베이 션 하 였 다 . 항생제 비 함유 플레이트 에서 는 성장 하나 아프 라 마이신 플레이트 에서 는 성장 하 지 못한 클론 1 로부터 유도 되 는 7 개 의 패치 ( 32 번 내지 37 번 ) 및 클론 3 으로부터 유도 되 는 4 개 의 패치 ( 38 번 내지 41 번 ) 를 +/- 아프 라 마이신 플레이트 에 다시 패치 하 여 항생제 마커 를 상실 하 였 다는 것 을 확인 하 였 다 .