단일 - 쇄 단백질 분해 도메인 ( NS 4 A 21 - 32 - GSGS - NS 33 - 631 ) 을 pET - 14 b ( 제조원 ; Novagen , Madison , WI ) 로 클로닝 하 고 DH 1 OB 세포 ( 제조원 ; Invitrogen ) 로 형질 전환 시켰 다 . 생성 된 플라스미드 를 앞서 기재 된 바 와 같이 ( 1 , 2 ) 단백질 발현 및 정제 를 위해 에스 케 리키아 콜라 이 ( Escherichia coli ) BL 21 ( 제조원 ; Novagen ) 에 이식 하 였 다 . 간단히 , 배양액 을 37 ℃ 에서 암피실린 100 ㎍/ mL 를 함유 하 는 LB 배지 에서 600 nm 에서 의 광학 밀도 ( OD 600 ) 가 1 . 0 에 도달 할 때 까지 성장 시키 고 , 이소프로필 - β - D - 티 오갈 락 토피 라 노 사이드 ( IPTG ) 를 1 mM 로 첨가 하 여 유도 시켰 다 . 18 ℃ 에서 20 시간 동안 추가 로 항온 처리 한 후 , 6 , 000 xg 에서 10 분 동안 원심 분리 하 여 세균 을 수거 하 고 , 50 mM Na 3 PO 4 , pH 8 . 0 , 300 mM NaCl , 5 mM 2 - 머 캅 토 에탄올 , 10 % 글리세롤 , 0 . 5 % Igepal CA 630 , 및 1 mM 페닐 메틸 설포닐 플 루오 라이드 , 0 . 5 ㎍/ mL 류 펩 틴 , 펩 스타 틴 A 및 2 mM 벤즈 아미딘 으로 이루어진 프로테아제 억제제 칵테일 을 함유 하 는 용리 완충액 ( lysis buffer ) 에 재현 탁 시켰 다 . 세포 를 동결 및 해동 에 의해 용리 시킨 다음 초음파 처리 하 였 다 . 12 , 000 xg 에서 30 분 동안 원심 분리 하 여 세포 파쇄 물 ( cell debris ) 을 제거 하 였 다 . 상청 액 을 0 . 45 -㎛ 필터 ( 제조원 ; Corning ) 를 통해 통과 시켜 추가 로 정화 한 다음 NiSO 4 로 충전 된 HiTrap 킬 레이팅 컬럼 ( 제조원 ; Amersham Pharmacia Biotech ) 상 에 부하 시켰 다 . 결합 된 단백질 을 100 - 내지 - 500 mM 선형 구배 로 이미다졸 용액 으로 용출 시켰 다 . 선택 된 분획 을 Ni 2 + 컬럼 크로마토그래피 를 통해 흘려 보내 고 , 10 % 나트륨 도데 실 설 페이트 ( SDS ) - 폴리 아크릴아미드 겔 상 에서 분석 하 였 다 . 정제 된 단백질 을 12 % SDS - PAGE 겔 에서 전기영동 에 의해 분해 한 다음 니트 로 셀 룰 로즈 막 으로 옮겼 다 . 단백질 을 NS 3 에 대한 모노클 로 날 항체 를 사용 하 여 웨스턴 블롯 분석 ( Western blot analysis ) 에 의해 분석 하 였 다 . 단백질 을 제 2 항체 로서 호스 라디쉬 퍼 옥시 다제 - 접합 된 염소 항 - 마우스 항체 ( horseradish peroxidase - conjugated goat anti - mouse antibody , 제조원 ; Pierce ) 를 갖 는 화학 발광 키트 ( 제조원 ; Roche ) 를 사용 하 여 시각 화 하 였 다 . 단백질 을 분 취량 으로 취하 여 - 80 ℃ 에서 저장 하 였 다 .