GFP 가 삽입 된 CJ 1 OX 2 G Vector 를 주형 으로 하 여 CJ 1 F 와 CJ 1 GuaA B 1 를 이용 하 여 1 차 PCR 을 수행 하 였 다 . PCR 의 수행 조건 은 다음 과 같 다 . 각각 0 . 4 mM 의 상기 의 프라이머 , 주형 , 10 mM 트리스 완충액 ( Tris - HCl , pH 8 . 3 ) , 50 mM KCl , 2 mM MgCl 2 , 0 . 2 mM dATP , 0 . 2 mM dGTP , 0 . 2 mM dCTP , 0 . 2 mM dTTP 및 Pfu 중합효소 5 효소 단위 ( unit ) 를 포함 하 도록 50 mL 를 조제 하 였 다 . 이어 반응 액 을 94 ℃ 1 분 , 50 ℃ 1 분 30 초 , 68 ℃ 에서 1 분 의 조건 으로 25 회 수행 후 68 ℃ 에서 7 분 간 PCR 을 수행 하 였 다 . 또한 , CJGuaA F 2 와 CJ 1 GuaA B 2 를 사용 하 여 , 이전 에 재조합 된 pGem - GuaA 벡터 를 주형 으로 해서 2 차 PCR 을 수행 하 였 다 . 2 차 PCR 의 과정 은 1 차 의 과정 과 동일 하 였 다 . PCR 과정 을 통해 얻 은 1 차 PCR 산물 과 2 차 PCR 산물 을 주형 으로 하 여 CJ 1 F 와 CJ 1 GuaA B 2 를 이용 하 여 최종 적 으로 3 차 PCR 을 수행 하 였 다 ( 도 19 ) . 최종 적 으로 얻 은 PCR product 를 T / A 클로닝 벡터 에 삽입 한 후 , 이전 실험 을 통해 재조합 된 pGem - GuaA 를 각각 제한 효소 인 Msc I 과 Nde I 을 이용 하 여 소화 를 해서 다시 리 게이 션 ( ligation ) 을 수행 하 였 다 . 이렇게 완전히 재조합 된 pGem - CJ 1 OX 2 - GuaA 를 Apa I , Spe I site 를 이용 하 여 pCES - CJ 1 SC 1 벡터 에 삽입 을 한 다음 . dem -, dcm - 균주 인 대장균 GM 2929 를 형질 전환 한 후 , 얻 은 재조합 DNA 를 최종 적 으로 , 코리 네 박 테리 움 암모니아 게 네스 에 형질전환 하 였으며 ( 도 20 ) 한국 종균 협회 에 2005 년 12 월 5 일자 로 기탁 하 였 다 ( 수탁 번호 : KCCM - 10723 P ) .