ELISA 프로토콜 은 아래 와 같 았 다 . 96 - 웰 NUNC MAXISORB ® ELISA 플레이트 는 5 μ g / ml , 100 μ l / 웰 로 NeutrAvidin ® 바이오틴 결합 단백질 ( Thermo Scientific Catalog No . 31000 , 스톡 10 mg / ml ) 로 밤새 코팅 되 었 다 . 웰 들 은 세정 완충액 ( 0 . 05 % TWEEN ®- 20 을 가진 PBS ) 로 3 회 세정 되 었 고 건조 블랏팅 되 었 다 . 웰 들 은 그 다음 200 μ l / 웰 의 차단 완충액 ( 0 . 5 % 소 혈청 알부민 ( BSA ) 및 0 . 05 % TWEEN ®- 20 을 가진 PBS ) 로 차단 되 었 고 실온 에서 30 분 이상 동안 인 큐 베이 션 되 었 다 . ( 0 . 5 % BSA , 0 . 05 % TWEEN ®- 20 , 및 0 . 1 mg / ml 헤파린 을 가진 PBS ; 검정 완충액 에서 희석 된 ) 바 이오티 닐 화 된 인간 트립 타제 베타 1 단백질 은 웰 들 에 1 μ g / ml 로 첨가 되 었 고 실온 에서 1 시간 ± 10 분 동안 인 큐 베이 션 되 었 다 . 헤파린 은 트립 타제 가 사량 체 로서 잔류 하 였 다는 것 을 보장 하 기 위해 포함 되 었 다 . 웰 들 은 세정 완충액 ( 200 μ l / 웰 ) 로 3 회 세정 되 었 고 건조 블랏팅 되 었 다 . 하이브리도마 상청 액 ( 샘플 ) 또는 대 조군 ( 예 를 들 어 , 양성 대 조군 토끼 정제 된 다 클론 성 항체 YZ 4209 ( 스톡 0 . 25 mg / ml ) 는 웰 들 ( 검정 완충액 에서 희석 됨 , 100 μ l / 웰 ) 에 첨가 되 었 고 실온 에서 1 시간 동안 인 큐 베이 션 되 었 다 . 다음 으로 , 웰 들 은 세정 완충액 ( 200 μ l / 웰 ) 로 3 회 세정 되 었 고 건조 블랏팅 되 었 다 . 홀스 래 디쉬 페록시다아제 ( HRP ) 접합체 ( 염소 항 - 토끼 IgG ( H + L ) HRP ; Thermo Scientific Catalog No . 31460 ) 은 첨가 되 었 고 ( 검정 완충액 에서 1 : 10 , 000 희석 됨 , 100 μ l / 웰 ) 실온 에서 30 분 동안 인 큐 베이 션 되 었 다 . 웰 들 은 재차 세정 완충액 ( 200 μ l / 웰 ) 로 3 회 세정 되 었 고 건조 블랏팅 되 었 다 . 기질 ( BioFX TMB Substrate , 제품 번호 : TMBW - 1000 - 01 ) 은 첨가 되 었 고 ( 100 μ l / 웰 ) 5 분 동안 실온 에서 인 큐 베이 션 되 었 다 . 반응 은 하 기 의 첨가 로 중단 되 었 고 : 100 μ l / 웰 의 BioFX 중단 용액 ( 제품 번호 : BSTP - 0100 - 01 ) , 및 플레이트 는 A 650 에서 판독 되 었 다 .