인산 완충 식염수 ( phosphate bufffered saline : PBS ) 를 사용 하 여 1 : 4 의 비율 로 희석 된 대 조군 과 인터넷 또는 게임 중 독군 환자 의 혈청 시료 와 , 1000 pg / ㎖, 333 . 33 pg / ㎖, 111 . 11 pg / ㎖, 37 . 04 pg / ㎖, 12 . 35 pg / ㎖, 0 pg / ㎖ 의 농도 로 준비 된 콜레 시스토 키닌 스탠다드 ( Wuhan USCN Business Co . , Ltd ) , 및 1 : 100 의 비율 로 희석 된 50 ㎕ 의 검출 시약 A 를 준비 하 였 다 . 준비 된 용액 들 을 96 웰 ELISA 플레이트 ( Cloud - Clone Co . , USA ) 에 로딩 하 고 , ELISA 플레이트 를 37 ℃ 에서 약 1 시간 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 반응 후 남 아 있 는 시료 , 스탠다드 , 및 검출 시약 A 를 제거 하 였 다 . 30 X 로 농축 된 세척 완충액 을 1 X 로 희석 시켜 각 웰 당 300 ㎕ 씩 가하 고 , 3 회 세척 하 였 다 . 그 후 , 1 : 100 의 비율 로 희석 된 100 ㎕ 의 검출 시약 B ( Cloud - Clone Co . , USA ) 용액 을 각 웰 에 가하 고 37 ℃ 에서 약 30 분 간 인 큐 베이 션 하 였 다 . 반응 후 남 아 있 는 시료 와 스탠다드 를 제거 하 고 , 세 척 완충액 으로 5 회 세척 하 였 다 . 90 ㎕ 의 기질 용액 ( Cloud - Clone Co . , USA ) 을 각 웰 에 가하 고 , ELISA 플레이트 를 37 ℃ 에서 약 10 분 내지 20 분 간 빛 을 차단 한 상태 에서 인 큐 베이 션 하 였 다 . 시료 와 스탠다드 의 색 이 파란색 으로 바뀌 면 , 50 ㎕ 의 종결 용액 ( Cloud - Clone Co . , USA ) 을 ELISA 플레이트 에 가하 고 450 nm 에서 흡광도 를 측정 하 였 다 .