산화 된 폴리 사카 라이드 용액 을 혈청형 에 따라 1 . 5 M 인산칼륨 , pH 6 . 0 또는 pH 7 . 0 및 물 과 혼합 하 였 다 . 선택 된 완충제 pH 는 접합 반응 동안 활성 화 된 폴리 사카 라이드 의 안정 성 을 개선 시키 기 위한 것 이 었 다 . 이전 에 기재 된 바 와 같이 ( WO 2012 / 173876 A 1 ) 슈도모나스 플 루 오 레 센스 에서 의 발현 을 통해 수득 된 정제 된 CRM 197 을 0 . 2 - 마이크로미터 여과 하 고 , 완충 폴리 사카 라이드 용액 과 , 혈청형 에 따라 0 . 4 내지 1 . 0 w / w 범위 의 CRM 197 에 대한 폴리 사카 라이드 질량 비 로 합하 였 다 . 질량 비 는 생성 된 접합체 에서 CRM 197 에 대한 폴리 사카 라이드 비 를 제어 하 도록 선택 하 였 다 . 폴리 사카 라이드 및 포스 페이트 농도 는 혈청형 에 따라 각각 3 . 6 내지 10 . 0 g / L 및 100 내지 150 mM 범위 로 , 혈청형 - 특이 적 이 었 다 . 혈청형 - 특이 적 폴리 사카 라이드 농도 는 생성 된 접합체 의 크기 를 제어 하 도록 선택 하 였 다 . 이어서 , 용액 을 0 . 2 - 마이크로미터 여과 하 였 다 . 100 mM 염화니켈 용액 을 사용 하 여 염화니켈 을 대략 2 mM 로 첨가 하 였 다 . 소듐 시아노 보로 히드라 이드 ( 폴리 사카 라이드 반복 단위 몰 당 2 몰 ) 를 첨가 하 였 다 . 폴리 사카 라이드 및 단백질 의 소비 를 최대 화 하 기 위해 혈청형 - 특이 적 지속 기간 ( 72 내지 120 시간 ) 동안 접합 을 진행 시켰 다 .