카페인 산 처리 를 통한 자외선 B 에 의해 유도 된 세포 손상 의 보호 효과 분석 
 DOI : https : / / doi . org / 10 . 20402 / ajbc . 2016 . 0122 
 DOI : https : / / doi . org / 10 . 20402 / ajbc . 2016 . 0122 
 건국대 학교 의학 전문 대학원 피부 과학 교실 , 서울 , 한국 
 咖啡 酸 对 紫 外 线 B 诱 导 细 胞 损 伤 的 保 护 作用 
 安 圭 重 
 建 国 大學 医 科 专 门 大 學院 皮 肤 科 ， 首 尔 ， 韩 国 
 Corresponding author : Kyu Joong Ahn , Department of Dermatology , Konkuk University School of Medicine , 120 Neungdong - ro , Gwangjin - gu , Seoul 05029 , Korea Tel . : + 82 2 2030 5181 Fax : + 82 2 3030 5179 Email : kjahn @ kuh . ac . kr 
 Received January 31 , 2017 Revised February 6 , 2017 Accepted February 13 , 2017 
 카페인 산 은 식물 및 조류 에 많이 발견 되 는 항산 화 페놀산 중 하나 이 다 . 여러 논문 들 을 통해 카페인 산 은 자외선 에 의한 matrix metalloproteinase 1 발현 및 피부 발암 기전 을 억제 한다고 보 고 되 고 있 지만 , 인간 진피 모유 두 세포 에 대한 광보 호 효과 에 대해서 는 연구 되 지 않 고 있 다 . 
 카페인 산 이 자외선 에 의한 진피 모유 두 세포 손상 에 어떠 한 영향 을 미치 는지 에 대해서 cell viability , ultraviolet ( UV ) , intracellular reactive oxygen species ( ROS ) 및 cellular senescence detection assays 를 통하 여 분석 하 였 다 . 
 카페인 산 은 진피 모유 두 세포 에 세포독성 을 유발 하 지 않 았 으며 , 자외선 B 에 의한 세포독성 을 현저 하 게 감소 시켰 다 . 또한 , 카페인 산 의 처리 는 자외선 B 에 의해 유도 되 는 세포 내 ROS 생성 을 농도 의존 적 으로 감소 시켰 다 . 뿐 만 아니 라 , 진피 모유 두 세포 에 자외선 B 를 처리 하 기 전 카페인 산 의 전처리 는 자외선 B 에 의해 유도 되 는 세포 노화 를 현저 하 게 억제 하 였 다 . 
 본 연구 결과 를 통해 카페인 산 은 진피 모유 두 세포 에 있 어 , 자외선 B 에 의한 세포 손상 을 보호 하 는 효능 을 가짐 을 증명 하 였 다 . 
 핵심 용어 : 카페인 산 , 인간 진피 모유 두 세포 , 자외선 , 보호 , 노화 
 Caffeic acid is one of anti - oxidant phenolic acids and is abundant in plants and algae . Various reports have shown that caffeic acid inhibits ultraviolet ( UV ) - induced matrix metalloproteinase 1 upregulation and skin carcinogenesis , however , the photoprotective effects on human follicle dermal papilla cells ( HFDPCs ) have not been elucidated yet . 
 We investigated if caffeic acid inhibits UV - induced cellular damages in HFDPCs by conducting cell viability , UV protection , intracellular reactive oxygen species ( ROS ) , and cellular senescence detection assays . 
 We found that caffeic acid had a low cytotoxicity and significantly inhibited UVB - induced cytotoxicity on HFDPCs . In addition , treatment with caffeic acid decreased UVB - mediated intracellular ROS production in a dose - dependent manner . Furthermore , UVB - induced cellular senescence , which was detected by a senescence - associated β - galactosidase ( SA - β - galactosidase ) assay , markedly reduced in caffeic acid treatment before UVB irradiation on HFDPCs . 
 Our data indicated that caffeic acid has protective effects against UVB - induced cellular damages on HFDPCs . 
 Keywords : Caffeic acid , Human follicle dermal papilla cell , Ultraviolet , Protection , Senescence 
 咖啡 酸 是 抗 氧 化 酚 酸 之 一 ， 在 植物 和 藻 类 中 丰 富 。 各 种 报 告 已 经 表明 咖啡 酸 抑制 紫 外 线 诱 导 的 基 质 金 属 蛋白 酶 1 表 达 和 皮 肤 致 癌 作用 。 然 而 ， 对 人毛 囊 真 皮 乳 头 细 胞 （ human follicle dermal papilla cells , HFDPCs ） 的 光 保 护 作用 尚 未 阐 明 。 
 通 过 分析 cell viability ， ultraviolet ( UV ) ， intracellular reactive oxygen species ( ROS ) 以 及 cellular senescence detection assays 调 查 咖啡 酸 对 紫 外 线 照射 损 伤 的 人毛 囊 真 皮 乳 头 细 胞 的 影 响 。 
 发 现 咖啡 酸 对 真 皮 乳 头 细 胞 没 有 产 生 细 胞 毒性 ， 并 减 少 了 UVB 诱 导 产 生 的 HFDPCs 细 胞 的 毒性 。 此外 ， 用 咖啡 酸 处 理 时 ， 以 剂 量 依 赖 性 方式 降 低 UVB 诱 导 产 生 的 细 胞 内 ROS 。 还 有 在 UVB 照射 之 前 ， 提 前 用 咖啡 酸 处 理 时 ， 明 显 抑制 UVB 诱 导 的 细 胞 衰老 。 
 通 过 研 究 证 明 ， 咖啡 酸 对 于 UVB 诱 导 人毛 囊 真 皮 乳 头 细 胞 损 伤 具有 保 护 作用 。 
 关 键 词 : 咖啡 酸 , 人毛 囊 真 皮 乳 头 细 胞 , 紫 外 线 , 保 护 , 衰老 
 2 . Analysis of cell viability 
 3 . UVB protection assay 
 진피 모유 두 세포 를 60 mm dish 에 2 × 106 cells / well 의 농도 로 접종 한 후 , 10 , 20 , 50 , 100 µ M 농도 의 카페인 산 을 3 , 6 , 12 h 동안 처리 하 였 다 . 이후 phosphate buffered saline ( PBS ) 를 이용 하 여 배양액 을 수세 한 후 , 배 양접시 의 뚜껑 이 없 는 상태 에서 15 mJ / cm 2 UVB 를 조사 하 였 다 . 이후 새로운 배양액 으로 바꾸 어 24 h 배양 시킨 후 , WST - 1 assay 를 이용 하 여 세포 생존 율 을 측정 하 였 다 . 
 4 . Analysis of intracellular levels of ROS 
 5 . Analysis of cellular senescence 
 1 . 인간 진피 모유 두 세포 에서 카페인 산 의 세포독성 확인 
 먼저 , 카페인 산 이 인간 진피 모유 두 세포 에 미치 는 영향 을 분석 하 고자 , WST - 1 assay 를 이용 하 여 0 – 100 µ M 농도 대 의 카페인 산 을 24 h 동안 처리 하 여 모유 두 세포 의 세포 생존 율 을 측정 하 였 다 . 그 결과 100 µ M 이하 의 카페인 산 농도 대 에서 는 세포 생존 율 의 감소 가 나타나 지 않 았 으며 , 특히 20 µ M 와 50 µ M 농도 에서 는 대 조군 대비 통계학 적 으로 유의 하 게 세포 생존 율 을 증가 시켰 다 ( Figure 1 ) . 상기 결과 를 바탕 으로 이후 실험 은 100 µ M 이하 의 카페인 산 농도 대 를 사용 하 여 진행 하 였 다 . 
 2 . 인간 진피 모유 두 세포 에서 카페인 산 의 UVB 에 의한 세포독성 보호 효과 
 카페인 산 은 인간 각질 세포 주인 HaCaT 세포 에서 UVA 에 의한 세포독성 을 현저 하 게 억제 한다고 보 고 되 었 다 ( Pluemsamran et al . , 2012 ) . 또한 , 카페인 산 은 마우스 실험 을 통해 UVB 에 의한 carcinogenesis 억제 효능 을 보였 다 ( Balupillai et al . , 2015 ) . 이 를 바탕 으로 , 본 연구 에서 는 추가 적 으로 인간 진피 모유 두 세포 에서 UVB 에 의한 세포 손상 유발 에 있 어 카페인 산 의 효능 을 분석 하 고자 하 였 다 . 먼저 , 모유 두 세포 에 UVB 를 조사 하 기 전 에 3 h 동안 카페인 산 을 전처리 한 결과 , 50 µ M 이하 농도 대 에서 농도 의존 적 으로 UVB 에 의한 세포 생존 율 감소 를 억제 하 는 효과 가 나타났 다 ( Figure 2 ) . 또한 , 카페인 산 을 UVB 조사 전 에 6 h 전처리 한 결과 , 동일 농도 대의 3 h 전처리 실험 군 에서 나타나 는 결과 값 보다 증가 됨 을 보였 다 . 뿐 만 아니 라 , 카페인 산 을 UVB 조사 전 에 12 h 전처리 한 결과 , 앞선 3 h 및 6 h 전처리 의 실험 군 값 에 비해 자외선 에 의한 세포독성 보호 효능 이 더 높 아 짐 을 보였 다 . 따라서 , 본 결과 를 통해 카페인 산 은 UVB 의존 적 모유 두 세포독성 에 보호 효능 이 있 음 을 나타낸다 . 
 3 . 인간 진피 모유 두 세포 에서 카페인 산 의 UVB 에 의한 산화 적 스트레스 보호 효과 
 UVB 는 여러 세포 내 에서 ROS 생산 에 관여 하 는 주요 한 유도자 중 하나 이 다 . 따라서 , 본 연구 에서 는 카페인 산 의 UVB 에 의한 세포독성 보호 효능 이 ROS 생성 억제 와 관련 있 는지 파악 하 고자 하 였 다 . 먼저 카페인 산 을 UVB 조사 전 에 12 h 전처리 해 주 었 다 . UVB 조사 이후 24 h 배양 시키 고 , 세포 내 존재 하 는 ROS level 를 DCFDA fluorescent dye 를 이용 하 여 분석 하 였 다 . 그 결과 , UVB 조사 는 모유 두 세포 내 ROS level 을 39 . 48 ± 5 . 14 % 증가 시켰으나 , 10 , 20 , 50 µ M 카페인 산 을 전처리 한 실험 군 에서 는 UVB 조사 이후 세포 내 ROS level 이 32 . 14 ± 3 . 17 %, 14 . 14 ± 3 . 96 %, 11 . 10 ± 4 . 31 % 로 현저 하 게 감소 하 였 다 ( Figure 3 ) . 이러 한 결과 를 토대 로 , 진피 모유 두 세포 에 있 어 카페인 산 에 의한 UVB 의존 적 세포 손상 보호 효능 은 ROS 생성 억제 효능 과 연관 되 어 있 음 을 나타낸다 . 
 4 . 인간 진피 모유 두 세포 에서 카페인 산 의 UVB 에 의한 세포 노화 보호 효과 
 높 은 수준 의 ROS 는 세포 노화 의 주요 한 원인 중 하나 로 알려져 있 다 . 기존 보고 에서 , 초기 탈모 에서 나타나 는 모유 두 세포 의 조기 노화 ( premature senescence ) 는 세포 내 SA - β - galactosidase 의 발현 변화 와 연관 되 어 있 으며 , 이러 한 모유 두 세포 의 조기 노화 에 는 산화 적 스트레스 가 관여 되 어 있 을 것 으로 보 고 있 다 . 따라서 , 본 논문 에서 는 추가 적 으로 자외선 에 의한 모유 두 세포 의 세포 노화 유발 에 있 어 카페인 산 의 효능 을 분석 하 고자 하 였 다 . 모유 두 세포 를 앞선 실험 ( Figure 3 ) 과 동일 하 게 카페인 산 을 전처리 한 후 UVB 를 조사 하 여 나타나 는 세포 노화 를 SA - β - galactosidase detection assay 를 이용 하 여 분석 하 였 다 . UVB 조사 는 대 조군 대비 31 . 50 ± 1 . 90 % 세포 노화 가 증가 됨 을 확인 하 였 다 ( Figure 4 ) . 흥미 롭 게 도 , 자외선 을 조사 하 기 전 에 카페인 산 을 10 , 20 , 50 µ M 농도 로 전처리 한 실험 군 에서 는 세포 노화 의 비율 이 각각 26 . 50 ± 2 . 03 %, 16 . 41 ± 1 . 93 %, 13 . 94 ± 2 . 31 % 로 나타났 다 . 이 를 통해 , 카페인 산 은 UVB 에 의한 모유 두 세포 의 세포 노화 를 현저 하 게 억제 하 는 효능 이 있 음 을 밝혔 다 . 
 본 논문 에서 는 , UVB 의존 적 모유 두 세포 손상 에 대한 카페인 산 의 보호 효능 을 생화학 적 분석 법 을 통해 증명 하 였 다 . 특히 , 카페인 산 의 전처리 는 UVB 조사 에 의한 세포독성 , 세포 내 ROS 생산 , 세포 노화 를 현저 하 게 억제 하 였 다 . 비록 이러 한 카페인 산 의 보호 효능 관련 특이 적 세포 신호 전달 체계 를 증명 하 지 못하 였으나 , 본 연구 논문 은 탈모 를 예방 및 억제 할 수 있 는 가능 성 높 은 물질 로서 카페인 산 발견 에 그 중요 성 이 있 다 . 
 최근 의 연구 논문 들 은 탈모 에 있 어 산화 적 스트레스 에 대한 영향 을 제시 하 고 있 으며 , 이 는 산화 적 스트레스 의 억제 는 탈모 및 백모 화 를 조절 하 는 데 중요 한 신규 전략 으로 제시 될 수 있 음 을 나타낸다 ( Trüeb , 2009 ) . 과거 사례 연구 에 따르 면 , 탈모 가 없 는 정상인 과 비교 하 여 원형 탈모 ( alopecia areata ) 를 가진 환자 에서 산화 적 스트레스 가 상대 적 으로 높 다는 것 을 증명 하 였 다 ( Bakry et al . , 2014 ) . 게다가 , 마우스 를 이용 한 실험 을 통해 염색약 에 의해 유도 되 는 탈모 는 대부분 hydrogen peroxide 에 의해 유도 되 는 산화 적 스트레스 가 원인 이 라고 보 고 되 었 다 ( Seo et al . , 2012 ) . 
 따라서 , 산화 적 스트레스 를 억제 하 는 것 은 스트레스 및 안드로겐 의존 적 탈모 를 극복 하 는 데 중요 한 전략 으로 사료 될 수 있 다 . 본 연구 에서 는 카페인 산 은 모유 두 세포 에서 산화 적 스트레스 에 의한 세포 손상 을 억제 할 뿐 만 아니 라 모유 두 세포 에 세포독성 을 거의 유발 하 지 않 음 을 확인 하 였 다 . 따라서 , 추후 임상학 적 인 연구 를 통해 카페인 산 의 두피 도포 에 따른 영향 을 분석 함 으로써 , 카페인 산 을 탈모 예방 및 탈모 억제 의 기능 성 물질 로 개발 하 는 데 기초 자료 로서 활용 될 수 있 을 것 으로 사료 된다 . 
 Analysis of cell viability in caffeic acid - treated HFDPCs . 
 Human follicle dermal papilla cells ( HFDPCs ) were treated with the indicated doses of caffeic acid for 24 h . And then cell viability was detected by using a water soluble tetrazolium - 1 ( WST - 1 ) assay . The results are presented as mean ± standard deviation ( M ± S . D . ) of three independent experiments . * p < 0 . 05 compared with control sample ( untreated group of caffeic acid ) . 
 Caffeic acid protects HFDPCs against the UVBmediated reduction in viability . 
 HFDPCs were pretreated with the indicated doses of caffeic acid for the indicated time followed by ultraviolet B ( UVB ) irradiation . And then cell viability was detected by using a WST - 1 assay . The results are presented as M ± S . D . of three independent experiments . * p < 0 . 05 compared with control sample ( untreated group of caffeic acid ) . 
 Caffeic acid downregulates the level of intracellular ROS in HFDPCs . 
 HFDPCs were treated with the indicated doses of caffeic acid for 12 h followed by irradiation to UVB . And then intracellular reactive oxygen species ( ROS ) levels were measured by using a flow cytometric analysis . The results are presented as M ± S . D . of three independent experiments . * p < 0 . 05 compared with control sample ( untreated group of caffeic acid and UVB ) . 
 Caffeic acid inhibits cellular senescence induced by UVB irradiation in HFDPCs . 
 HFDPCs were treated with the indicated doses of caffeic acid for 12 h followed by irradiation to UVB . And then cellular senescence level was measured by using a senescenceassociated β - galactosidase assay . The results are presented as M ± S . D . of three independent experiments . * p < 0 . 05 compared with control sample ( untreated group of caffeic acid and UVB ) . 
 Bakry OA , Elshazly RM , Shoeib MA , Gooda A . Oxidative stress in alopecia areata : a case - control study . American Journal of Clinical Dermatology 15 : 57 - 64 . 2014 . 
 Balupillai A , Prasad RN , Ramasamy K , Muthusamy G , Shanmugham M , Govindasamy K , Gunaseelan S . Caffeic acid inhibits UVB - induced inflammation and photocarcinogenesis through activation of peroxisome proliferator - activated receptor - γ in mouse skin . Photochemistry and Photobiology 91 : 1458 - 1468 . 2015 . 
 Camacho F , Moreno JC , García - Hernández MJ . Telogen alopecia from UV rays . Archives of Dermatology 132 : 1398 - 1399 . 1996 . 
 Chan WS , Wen PC , Chiang HC . Structure - activity relationship of caffeic acid analogues on xanthine oxidase inhibition . Anticancer Research 15 : 703 - 707 . 1995 . 
 Fernández MA , Sáenz MT , García MD . Anti - inflammatory activity in rats and mice of phenolic acids isolated from Scrophularia frutescens . Journal of Pharmacy and Pharmacology 50 : 1183 - 1186 . 1998 . 
 Johnsson A , Kjeldstad B , Melø TB . Fluorescence from pilosebaceous follicles . Archives of Dermatological Research 279 : 190 - 193 . 1987 . 
 Kang KA , Lee KH , Zhang R , Piao M , Chae S , Kim KN , Jeon YJ , Park DB , You HJ , Kim JS , et al . Caffeic acid protects hydrogen peroxide induced cell damage in WI - 38 human lung fibroblast cells . Biological and Pharmaceutical Bulletin 29 : 1820 - 1824 . 2006 . 
 Kashiwada Y , Nishizawa M , Yamagishi T , Tanaka T , Nonaka G , Cosentino LM , Snider JV , Lee K . Anti - AIDS agents , 18 . sodium and potassium salts of caffeic acid tetramers from Arnebia euchroma as anti - HIV agents . Journal of Natural Products 58 : 392 - 400 . 1995 . 
 Kim B , Kim JE , Kim HS . Caffeic acid induces keratinocyte differentiation by activation of PPAR - α . Journal of Pharmacy and Pharmacology 66 : 84 - 92 . 2014 . 
 Kim KS , Han SH , An IS , Ahn KJ . Protective effects of ellagic acid against UVA - induced oxidative stress in human dermal papilla . Asian Journal of Beauty and Cosmetology 14 : 191 - 200 . 2016 . 
 Lu Z , Fischer TW , Hasse S , Sugawara K , Kamenisch Y , Krengel S , Funk W , Berneburg M , Paus R . Profiling the response of human hair follicles to ultraviolet radiation . Journal of Investigative Dermatology 129 : 1790 - 1804 . 2009 . 
 Müller - Röver S , Handjiski B , van der Veen C , Eichmüller S , Foitzik K , McKay IA , Stenn KS , Paus R . A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages . Journal of Investigative Dermatology 117 : 3 - 15 . 2001 . 
 Nogueira AC , Nakano AK , Joekes I . Impairment of hair mechanical properties by sun exposure and bleaching treatments . Journal of Cosmetic Science 55 : 533 - 537 . 2004 . 
 Ploemen JH , van Ommen B , de Haan A , Schefferlie JG , van Bladeren PJ . In vitro and in vivo reversible and irreversible inhibition of rat glutathione S - transferase isoenzymes by caffeic acid and its 2 - S - glutathionyl conjugate . Food and Chemical Toxicology 31 : 475 - 482 . 1993 . 
 Pluemsamran T , Onkoksoong T , Panich U . Caffeic acid and ferulic acid inhibit UVA - induced matrix metalloproteinase - 1 through regulation of antioxidant defense system in keratinocyte HaCaT cells . Photochemistry and Photobiology 88 : 961 - 968 . 2012 . 
 Seo JA , Bae IH , Jang WH , Kim JH , Bak SY , Han SH , Park YH , Lim KM . Hydrogen peroxide and monoethanolamine are the key causative ingredients for hair dye - induced dermatitis and hair loss . Journal of Dermatological Science 66 : 12 - 19 . 2012 . 
 Shin H , Yoo HG , Inui S , Itami S , Kim IG , Cho AR , Lee DH , Park WS , Kwon O , Cho KH , et al . Induction of transforming growth factor - beta 1 by androgen is mediated by reactive oxygen species in hair follicle dermal papilla cells . BMB Reports 46 : 460 - 464 . 2013 . 
 Tanaka T , Kojima T , Kawamori T , Wang A , Suzui M , Okamoto K , Mori H . Inhibition of 4 - nitroquinoline - 1 - oxide - induced rat tongue carcinogenesis by the naturally occurring plant phenolics caffeic , ellagic , chlorogenic and ferulic acids . Carcinogenesis 14 : 1321 - 1325 . 1993 . 
 Trüeb RM . Is androgenetic alopecia a photoaggravated dermatosis ? Dermatology 207 : 343 - 348 . 2003 . 
 Trüeb RM . Oxidative stress in ageing of hair . International Journal of Trichology 1 : 6 - 14 . 2009 . 
 Vieira O , Laranjinha J , Madeira V , Almeida L . Cholesteryl ester hydroperoxide formation in myoglobin - catalyzed low density lipoprotein oxidation : concerted antioxidant activity of caffeic and p - coumaric acids with ascorbate . Biochemical Pharmacology 55 : 333 - 340 . 1998 . 
 Yang G , Fu Y , Malakhova M , Kurinov I , Zhu F , Yao K , Li H , Chen H , Li W , Lim DY , et al . Caffeic acid directly targets ERK 1 / 2 to attenuate solar UV - induced skin carcinogenesis . Cancer Prevention Research 7 : 1056 - 1066 . 2014 .