GUIDE - seq 실험 및 데이터 분석 . GUIDE - seq 을 약간 의 변형 으로 이전 에 기재 된 바 와 같이 수행 하 였 다 ( Bolukbasi MF et al . , Nat Methods . 2015 , 12 ( 12 ) : 1150 - 6 ) . 간략 하 게 , 2 x 105 개 의 293 T 세포 를 리포 펙 타민 ( Lipofectamine ) 3000 형질 감염 시약 ( 인 비트 로 젠 ) 을 사용 하 여 250 ng 의 sgRNA - 코딩 플라스미드 또는 비 어 있 는 pUC 19 플라스미드 및 양쪽 단부 에 포스 포로 티오 에이트 결합 을 함유 하 는 10 pmol 의 미끼 dsODN ( 원래 GUIDE - seq 프로토콜 에 따라 설계 됨 ) 과 함께 750 ng 의 Cas 9 발현 플라스미드 로 형질 감염 시켰 다 . 형질 감염 후 3 일 에 게놈 DNA 를 DNeasy 혈액 및 조직 키트 ( 퀴아젠 ( Qiagen ) ) 를 제조자 의 지침서 에 따라 사용 하 여 추출 하 고 , 바이오 럽 터 피코 ( Bioruptor Pico ) 초음파 처리 장치 ( 디 아 게 노드 ( Diagenode ) ) 로 500 bp 의 평균 길이 로 전단 하 였 다 . 라이브러리 제조 를 이전 의 연구 ( Tsai SQ et al . , Nat Biotechnol . 2015 , 33 ( 2 ) : 187 - 97 ) 에 따라 원래 어댑터 및 프라이머 로 수행 하 였 다 . 라이브러리 를 큐빗 dsDNA 고 민감 도 검정 키트 ( 인 비트 로 젠 ) 로 정량 화 하 고 , 일루 미나 MiSeq 리 에이전트 키트 V 2 - 300 사이클 ( 2 x 150 bp 쌍 형성 된 - 말단 ) 을 사용 하 여 MiSeq 시퀀싱 시스템 ( 일 루미나 ) 으로 시퀀싱 하 였 다 .