Datsenko 및 Wanner ( 2000 ) ( Datsenko 등 , Proc Natl . Acad . Sci USA 97 : 6640 - 6645 , 2000 ) 에 의해 기재 된 바 와 같이 플라스미드 pCP 20 을 사용 하 여 클로람페니콜 마커 를 균주 EWL 201 의 외부 로 루프 화 시켰 다 . 에스 케 리키아 콜리 K - 12 에서 의 염색체 유전자 의 1 - 단계 불활성 은 PCR 생성물 을 사용 하 였 다 ( Datsenko 등 , PNAS , 97 : 6640 - 6645 , 2000 ) . EWL 201 세포 를 L 브로 쓰 에서 중간 로그 상 까지 성장 시킨 후 얼음 냉각 된 멸 균수 로 3 회 세척 하 였 다 . 50 ㎕ 의 세포 현탁액 분취 액 을 1 ㎕ 의 pCP 20 과 혼합 하 고 , 세포 현탁액 혼합물 을 Gene Pulser Electroporator ( Bio - Rad Inc . ) 를 사용 하 여 2 . 5 볼트 및 25 uFd 에서 2 mm 큐벳 ( Invitrogen Corp . ) 내 에서 전기 천공 하 였 다 . 1 ㎖ 의 LB 를 세포 에 즉시 첨가 한 후 , 금속 마개 를 갖 는 14 ㎖ 폴리프로필렌 튜브 ( Sarstedt ) 에 옮겼 다 . 30 ℃ 에서 1 시간 동안 성장 시켜 세포 가 회수 되게 하 였 다 . 형질전환 체 를 L 한 천 및 20 ㎍/㎕ 클로람페니콜 및 50 ㎍/㎕ 카르 베 니 실린 상 에서 선별 하 고 30 ℃ 에서 하룻밤 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 다음 날 , 단일 콜로니 를 초기 로그 상 이 될 때 까지 10 ㎖ L 브 로 쓰 및 50 ㎍/㎕ 카르 베니 실린 에서 30 ℃ 에서 성장 시켰 다 . 이후 성장 배 양물 의 온도 를 2 시간 동안 42 ℃ 로 변경 하 였 다 . 여러 희 석물 을 제조 하 고 , 세포 를 이후 LA 플레이트 ( 항생제 선택 성 이 없 는 ) 상 에 스프 레딩 하고 , 30 ℃ 에서 하룻밤 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . 다음 날 , 20 개 의 콜로니 를 고르 고 L 한천 ( 항생제 없 음 ) 및 LA 및 20 ㎍/㎕ 클로람페니콜 플레이트 상 에 적용 시켰 다 . 이후 플레이트 를 3 O ℃ 에서 하룻밤 동안 인 큐 베이 션 하 였 다 . LA 플레이트 에서 성장 할 수 있 으나 , LA 및 20 ㎍/㎕ 클로람페니콜 플레이트 에서 는 성장 하 지 못하 는 세포 는 외부 에 루프 화 된 클로람페니콜 마커 를 갖 는 것 으로 간주 되 었 다 ( 하나 를 고르 고 균주 EWL 204 로 지정 하 였 음 ) .