리포 칼린 뮤 테인 은 HT - 스크리닝 ELISA 에서 선별 하 였 다 . 여기 서 , Strep - tag II 친화성 태그 ( IBA ) 뿐 만 아니 라 T 7 검출 태그 ( Novagen ) 가 구비 된 NGAL 변이체 는 phNGAL 101 를 포함 하 는 E . coli strain TG 1 / F - 를 이용 하 여 96 웰 마이크 로타 이터 플레이트 에서 가용성 으로 발현 되 었 다 . 이 벡터 는 11 개 의 아미노산 ( MASMTGGQQMG ) ( SEQ ID NO : 34 , 도 4 b 참조 ) 을 포함 하 는 N - 말단 에 T 7 태그 를 갖 는 phNGAL 98 ( SEQ ID NO : 31 ) 에 상응 한다 . 리포 칼린 뮤 테인 발현 은 OD 550 이 0 . 6 일 때 안 하이드로 테트라사이클린 ( 0 . 2 ㎍/ mL ) 을 첨가 하 여 22 ℃, 700 rpm 조건 에서 오버 나이트 동안 유도 되 었 다 . 이 후 , 세포 를 교반 하 면서 1 시간 동안 용해 시켰 다 ( 100 mM Na - 보레 이트 , pH 8 . 0 , 80 mM NaCl , 1 mM EDTA , 0 . 025 % w / v 라이소자임 ) . 이후 ELISA 스크리닝 에서 비 특이 적 결합 을 최소 화 하 기 위해 , 미 정제 세포 용해 물 에 2 % w / v BSA 및 0 . 1 % v / v Tween 20 를 부가 하 고 , 사람 헵시딘 - 25 에 결합 시키 기 위해 ELISA 에서 시험 하 였 다 . 그러므로 , 가용성 의 C - 말단 에 바이오틴 이 결합 된 사람 헵시딘 - 25 는 뉴트 라비딘 ( Neutravidin ( 5 ㎍/ mL , Thermo Scientific ) 에 의한 포획 에 의해 1 ㎍/ mL 으로 black Fluotrac 600 ELISA 플레이트 ( Greiner ; 384 웰 ) 상 에 고정 되 었 다 . 뉴트 라비딘 , 스 트 렙 타비 딘 5 ㎍/ mL 각각 및 3 % 의 밀크 를 음성 대 조군 으로 사용 하 였 다 . 플레이트 는 2 % w / v BSA 를 포함 하 는 PBST / 0 . 1 로 블록 킹 되 었 고 , 차후 세균성 세포 추출물 과 실온 에서 1 시간 동안 인 큐 베이 션 되 었 다 . 플레이트 는 5 회 세척 하 였 고 결합 된 리포 칼린 뮤 테인 은 PBST / 0 . 1 에서 1 : 10 , 000 으로 희석 된 항 - T 7 단 클론 성 항체 - HRP 컨 쥬 게이트 ( Novagen ) 에 의해 검출 되 었 다 . 그러므로 , QuantaBlu ™( Pierce ; PBS / T 0 . 1 % 에서 1 : 2 로 희석 ) 는 형광 HRP 기질 로 사용 되 었 다 . 실온 에서 시그널 디 벨 럽 의 45 분 후 , GENiosPlus plate reader ( Tecan ) 에서 형광 은 320 nm ( ± 2 . 5 nm ) 의 파장 에서 여기 되 고 , 430 nm ( ± 7 . 5 nm ) 에서 측정 되 었 다 .