1 차 인간 피부 섬유 아 세포 를 글루타민 없이 EMEM ( Earle ' s Minimum Essential Medium ; 얼 최소 필수 배지 ) 에서 배양 하 고 37 ℃/ 5 % CO 2 에서 항생제 / 항사 상 균제 ( AB / AM ) , 2 mM L - 글루타민 및 7 . 5 % 송아지 태아 혈청 ( FCS ) 으로 보충 시키 고 100 % 합류 되 도록 성장 시켰 다 . 방사 ( irradiation ) 하 기 48 시간 전 , 세포 를 EMEM ( AB / AM , L - 글루타민 및 2 % FCS 함유 ) 에서 목적 물질 과 함께 예비 배양 하 였 다 . 24 시간 후 , 배지 를 물질 을 함유 한 새로운 배지 ( 새롭 게 제조 된 ) 로 대체 시켰 다 . 방사 하 기 위해 , 배지 를 제거 하 고 인산염 완충 된 염수 ( PBS ) 에 의한 6 개 의 세 척 단계 후 PBS 로 대체 시켰 다 . 이어서 , 플레이트 를 30 J / cm 2 UVA 1 에 노출 시켰 다 . UVA 1 출력 은 약 150 mW / cm 2 이 었 다 . 방사 후 , 세포 마이크 로 플레이트 중 PBS 를 배지 ( + 7 . 5 % FCS ) 에 대해 물질 ( 새롭 게 제조 된 ) 로 교환 하 고 , 세포 를 CO 2 - 배양기 에서 추가 의 24 시간 동안 배양 하 였 다 ( MMP - 1 측정 ) . 배지 를 제거 하 였 다 . 세포 를 PBS 로 헹구 고 전체 플레이트 를 액체 질소 중 에 냉동 하 였 다 . 총 RNA 를 알 엔 이 지 토탈 알 엔 에이 키츠 ( RNeasy Total RNA Kits ; 독일 힐 든 소재 의 퀴아젠 ( Qiagen ) ) 를 사용 하 여 단리 하 였 다 . RNA 농도 를 260 / 280 에서 광도 측정 을 통해 측정 하 였 다 . 75 ng 인 총 RNA 의 분취 량 을 RT - PCR 용 수퍼 스크립트 ( Superscript , 상표 ) III 제 1 가닥 ( First - Strand ) 합성 시스템 을 사용 하 여 cDNA - 합성 에 적용 하 였 다 . 각 화합물 에 대해 두 샘플 을 분석 하 였 다 . PCR 반응 을 에스 와 이 비알 그린 피 씨알 마스터 믹스 ( SYBR Green ( 등록 상표 ) PCR Master Mix ; 독일 다름 스타트 소재 의 어 플 라이드 바이오 시스템즈 ( Applied Biosystems ) ) 를 사용 하 여 옵 티 콘 ( Opticon ) 1 ( 미국 매사추세츠주 왈 탐 소재 의 엠제이 리서치 ( MJ Research ) ) 상 에서 수행 하 였 다 . 실제 시간 PCR 대조 세포 및 처리 된 세포 에서 상대 발현 을 비교 하 기 위해 2 ( - 델타 델타 C ( T ) ) 방법 을 사용 하 였 다 . 결과 를 하 기 표 3 에 요약 하 였 다 . UVA 처리 는 비 - 방사 된 세포 ( 도시 되 지 않 음 ) 에서 검출 된 수준 에 비해 MMP - 1 RNA 의 약 10 배 증가 를 유도 하 였 다 . EGCG 및 바이오틴 은 각각 13 % 및 66 % 만큼 이 발현 을 감소 시켰 다 . 대조 적 으로 , 물질 을 조합 하 였을 때 , UVA 유도 된 MMP - 1 발현 은 완전히 폐지 되 었 다 . 이 는 , 관찰 된 억제 율 과 예상 된 억제 율 ( 각각 의 단일 화합물 의 값 들 의 합 ) 사이 의 차이 가 양 의 값 ( 즉 , 21 %) 으로 수득 되 었 으므로 , EGCG 및 바이오틴 이 MMP - 1 의 조절 에 상승 효과 를 나타냄 을 의미 한다 .