HBG 1 및 HBG 2 프로모터 에서 표적 화 부위 사이 의 대형 결 디지털 방울 PCR ( ddPCR ) 에 의해 제조 업체 의 권고 사항 에 따라 복사 수 결정 을 위한 비 - 경쟁 적 검정 법 포맷 에서 정량 화 하 였 다 . 간략 하 게 는 , gDNA 를 프로브 용 ddPCR SuperMix ( dUTP 없 음 ) ( BioRad Cat # 1863024 ) , HindIII - HF 제한 효소 ( NEB Cat # R 3104 S ) 및 각각 의 프라이머 프로브 믹스 와 조합 하 고 , 프로브 용 방울 발생 오일 ( BioRad Cat # 1863005 ) 과 함께 DG 8 카트리지 로 옮기 고 , QX 200 방울 발생기 ( BioRad ) 를 이용 하 여 방울 을 발생 시켰 다 . 방울 을 96 - 딥 웰 반응 모듈 이 있 는 C 1000 Touch Thermal Cylcer ( BioRad ) 상 에서 PCR 을 받 게 하 고 , 뒤 이 어 QX 200 방울 리더 ( BioRad ) 를 이용 하 여 검출 하 였 다 . 1 ul 당 복사 물 를 QuantaSoft 소프트웨어 ( BioRad ) 를 이용 한 분석 에 의해 결정 하 였 다 . 커스텀 프라이머 프로브 세트 ( Life Technologies Cat # APZW 76 R , PN 4331348 , 포워드 프라이머 : A CGGATAAGTAGATATTGAGGTAAGC ( SEQ ID NO : 285 ) , 리버스 프라이머 : GTCTCTTTCAGTTAGCAGTGG ( SEQ ID NO : 286 ) , FAM TaqMan 프로브 : A CTGCGCTGAAACTGTGGCTTTATAG ( SEQ ID NO : 287 ) ) 를 사용 하 여 , HBG 1 - HBG 2 유전자 간 영역 내 에서 gDNA 를 증폭 시켰 다 . TaqMan 복사 수 참조 검정 법 , 인간 , RNase P ( Thermo Fisher cat # 4403326 ) 를 참조 앰 플리 콘 으로서 사용 하 였 다 . HBG 1 - HBG 2 및 RNase P 앰 플리 콘 에 대한 1 ul 당 복사 물 은 제조 업체 의 보고 된 선형 범위 내 에 있 었 다 . 퍼센트 결실 을 100 % x ( 1 - HBG 1 - HBG 2 및 RNase P 앰 플리 콘 에 대한 1 ul 당 복사 물 의 비 ) 로서 보고 하 였 다 . 비편 집 된 대 조군 시료 는 2 % 이하 의 계산 된 퍼센트 결실 을 가졌으며 , 이 는 검정 법 에서 백그라운드 를 반영 할 수 있 다 .