가교 ELISA 로부터 의 데이터 를 보다 확증 하 기 위해 , VEGF 및 ANGPT 2 에 대한 동시 결합 이 확인 되 도록 하 기 의 프로토콜 에 따라 Biacore T 100 기구 상 에서 표면 플라스몬 공명 기술 을 사용 하 는 추가 적 인 검정 을 확립 하 였 다 . T 100 소프트웨어 패키지 를 사용 하 여 데이터 를 분석 하 였 고 : 아민 커플링 ( 무 - BSA ) 을 통해 CM 5 칩 상 에 고정 된 펜 타 히스 항체 ( PentaHisAntibody ) ( PentaHis - Ab BSA - free , Qiagen 번호 34660 ) 를 통해 2000 ~ 1700 RU 의 포획 수준 으로 ANGPT 2 를 포획 하 였 다 . HBS - N 완충액 은 영동 완충액 으로서 역할 하 였 고 , EDC / NHS 의 혼합물 에 의해 활성 화 가 수행 되 었 다 . PentaHis - Ab BSA - free 포획 항체 를 커플링 완충액 NaAc ( pH 4 . 5 , c = 30 ㎍/ mL ) 에서 희석 하 여 , 최종 적 으로 1 M 에탄올아민 의 주입 으로 여전히 활성 화 된 카르복실기 를 블로킹 하 였 고 , 5000 및 17000 RU 의 리간드 밀도 를 시험 하 였 다 . 500 nM 의 농도 를 갖 는 ANGPT 2 를 , 5 ㎕/ 분 의 흐름 에서 , 영동 완충액 + 1 mg / mL BSA 로 희석 된 펜 타 히스 - 항체 로 포획 하 였 다 . 이후 , rhVEGF 로 인 큐 베이 션 하 여 ANGPT 2 및 VEGF 에 결합 하 는 이중 특이 적 항체 를 입증 하 였 다 . 이 를 위해 이중 특이 적 항체 를 50 ㎕/ 분 의 흐름 , 및 100 ~ 500 nM 의 농도 에서 , 영동 완충액 + 1 mg / mL BSA 로 희석 된 ANGPT 2 에 결합 시키 고 , 50 ㎕/ 분 의 흐름 및 100 ~ 150 nM 의 VEGF 농도 에서 PBS + 0 . 005 % ( 부피 / 부피 ) 트윈 20 영동 완충액 + 1 mg / ml BSA 에서 VEGF ( rhVEGF , R & D - Systems 카탈로그 번호 293 - VE ) 로 인 큐 베이 션 하 여 동시 적 결합 을 검출 하 였 다 . 결합 시간 은 120 초 , 해리 시간 은 1200 초 였 다 . 2 x 10 mM 글리신 pH 2 . 0 및 접촉 시간 60 초 로 , " 50 ㎕/ 분 의 흐름 에서 재생 을 수행 하 였 다 . 통상 적 이중 참조 ( 대 조군 참조 : 펜 타 히스 항체 분자 를 포획 하 기 위한 이중 특이 적 항체 및 rhVEGF 의 결합 ) 를 사용 하 여 센서 그램 을 보정 하 였 다 . 각각 의 항체 에 대한 블랭크 ( Blank ) 를 rhVEGF 농도 "" 0 "" 으로 측정 하 였 다 . Biacore 검정 의 도식 을 도 21 에 나타내 었 다 . 통상 적 이중 참조 ( 대 조군 참조 : 펜 타 히스 항체 분자 를 포획 하 기 위한 이중 특이 적 항체 및 rhVEGF 의 결합 ) 를 사용 하 여 센서 그램 을 보정 하 였 다 . "