384 웰 플레이트 ( Corning 사 ) 에 , 어 세이 버퍼 ( assay buffer ) ( 50 mM HEPES , 150 mM NaCl , 5 mM MgCl 2 , 0 . 05 % Tween 20 , pH 7 . 4 ) 에 용해 한 비오틴 화 AviTag - KRAS G 12 C ( 아미노산 영역 1 - 185 , GDP ) ( 2 . 5 μ L ; 400 nM ) 과 피 험 화합물 을 4 , 000 nM 에서 4 nM 까지 2 . 5 μ L 의 액량 으로 첨가 했 다 . 이것 에 선 오브 세븐 리스 ( Son of Sevenless , SOS ) ( 아미노산 영역 564 - 1049 , 2 . 5 μ L ; 1 . 3 μ M ) , GTP ( Sigma - Aldrich 사 ) 를 포함 하 는 c - Raf ( 아미노산 영역 51 - 131 ) GST ( 2 . 5 μ L ; 각각 4 μ M 및 130 nM ) 을 가하 여 1 시간 실온 에서 정치 했 다 . 그 후 LANCE Ulight - anti - GST ( 120 nM , PerkinElmer 사 ) 및 LANCE Eu - W 1024 라벨 링 된 스 트 렙 토아 비딘 ( labeled Streptoavidin ) ( 100 ng / mL , PerkinElmer 사 ) 의 혼합액 ( 10 μ L ) 을 가하 여 , EnVision 2103 멀리 라벨 리더 ( Multilabel Reader ) ( PerkinElmer 사 ) 를 이용 하 여 여기 파장 337 nm 의 조건 으로 620 nm 및 665 nm 에 있 어서 의 형광 강도 를 측정 했 다 . 참조 파장 620 nm 에 의한 형광 강도 로 값 을 표준 화 한 후 , 용매 처리 에서 의 시그널 치를 0 % 저해 , GTP 무 첨가 에서 의 시그널 치를 100 % 저해 로 하 여 , 50 % 저해 농도 ( IC 50 ) 를 Sigmoid - Emax 모델 비선형 회귀 분석 으로 산출 했 다 . 몇 개 의 식 ( I ) 의 피 험 화합물 의 결과 를 표 1 에 나타낸다 . 또한 , 표 중 , Ex 는 후기 의 실시 예 번호 를 나타낸다 . 또한 , 표 중 , 화합물 C 는 국제 공개 제 WO 2016 / 164675 호 에 기재 된 실시 예 I - 59 의 피 험 화합물 을 나타내 고 , 참고 예 1 및 참고 예 2 의 구조 는 후기 의 표 168 에 나타낸다 ( 이하 마찬가지 ) .