흥 주 육 , 건민 노 , 정숙 최 , 오 경 권 , 수영 홍 , 상수 강 , 계 만 조 , 동식 박 
 Korean Journal of Environmental Agriculture . 2015 . Mar , 34 ( 1 ) : 57 - 63 
 DOI : http : / / dx . doi . org / 10 . 5338 / KJEA . 2015 . 34 . 1 . 09 
 흥 주 육 
 건민 노 
 정숙 최 
 오 경 권 
 상수 강 
 동식 박 
 dpark @ korea . kr 
 따라서 본 연구 는 국내 에서 재배 된 여주 에 들 어 있 는 여주 씨 추출물 의 α - glucosidase 저해 효과 를 측정 하 고 함유 된 기능 성 물질 과 의 상관 관계 를 알아보 고자 하 였 다 . 또한 효소 저해제 의 함량 을 HPLC 를 통한 정량 분석 을 수행 함 으로써 여주 씨 에 함유 된 기능 성 성분 의 혈당 개선 식 의 약 소재 로 의 응용 가능 성 을 연구 하 였 다 . 
 실험 에 사용 한 α - glucosidase ( EC 3 . 2 . 1 . 20 , from Baker ’ s Yeast ) 와 기질 ( p - nitrophenyl - α - D - glucopyranoside ) 은 Sigma ( St . Louis , MO , USA ) 에서 구입 하 였으며 , 실험 에 이용 한 모든 시약 은 특급 시약 을 사용 하 였 다 . 물질 분리 를 위해 Column chromatography ( CC ) 용 silica gel 및 octadecyl silica gel ( ODS ) 은 Merck ( Darmstadt , Germany ) 을 , Sephadex LH - 20 ( Amersham Biosciences , Uppsala , Sweden ) 을 사용 하 였 고 , 분석 을 위해 nuclear magnetic resonance ( NMR ) spectrum 은 Bruker AM 500 instrument ( Billerica , MA , USA ) 으로 측정 하 였 고 , electronic ionization mass spectrometer ( EI / MS ) spectrum 은 JEOL JMS 505 - WA ( JEOL , Tokyo , Japan ) 로 측정 하 였 다 . 정성 및 정량 분석 을 위해 2998 photodiode array detector ( PDA ) 가 장착 된 Alliance e 2695 HPLC system ( Waters Co . , Milford , MA , USA ) 및 Micromass ZQ MS ( Waters Co . , Milford , MA , USA ) 를 사용 하 였 다 . 
 - 추출 및 분리 
 Chemical structures of vicine ( 1 ) and α - eleostearic acid ( 2 ) from the seeds of Momordica charantia . 
 - HPLC - ESI / MS 에 의한 정량 / 정성 분석 
 분석 시료 조제 를 위한 추출 은 건조 분말 시료 1 g 을 cornical tube 에 칭량 하 여 30 mL 의 에탄올 ( 30 %, 50 % 70 %, 95 %) 및 증류수 를 추출 용매 로 하 여 50 ℃ 에서 1 시간 동안 초음파 추출 ( sonication ) 하 였 다 . 추출 된 각 시료 를 원심 분리 ( 3000 rpm , 15 min ) 를 한 후 상층 액 을 취하 여 0 . 2 μ m PTFE syringe filter 로 여과 하 여 이 를 HPLC - MS 분석 시료 로 사용 하 였 다 . 분석 컬럼 은 Phenomenex hydro - RP C 18 , 80 A ( 250 × 4 . 60 mm , 4 micron , Phenomenex , Torrance , CA , USA ) 를 사용 하 였 고 시료 주 입량 은 10 μ L , 검출 파장 은 270 nm 에서 측정 하 였 다 . 이동상 으로 는 A 용매 ( 0 . 5 % formic acid in water ) 와 B 용매 ( 0 . 5 % formic acid in acetonitrile ) 를 사용 하 였 고 , 유속 은 0 . 8 mL / min 로 하 였 다 . 이동상 의 농도 구배 조건 은 B 용매 를 10 분 까지 4 % 로 일정 하 게 유지 하 였 고 , 32 분 까지 90 % 로 일정 하 게 증가 시킨 후 37 분 까지 컬럼 세척 ( B , 100 %) 과 40 분 까지 B 용매 0 % 로 급격 하 게 감소 시켰 다 . 정량 분석 을 위한 표준 용액 의 제조 는 0 . 01 , 0 . 05 , 0 . 1 , 0 . 5 , 1 mg / mL 로 각각 조제 하 여 검량 선 을 작성 한 후 계산 된 함량 으로 나타내 었 다 . 여주 씨 의 생리 활성 물질 의 정성 분석 을 위한 MS 의 분석 조건 은 cone voltage 30 V , source temperature 120 ℃, desovation temperature 350 ℃, 고순 도 N 2 가스 L / h 이 었 으며 , 분자량 측정 범위 는 m / z 100 - 1000 으로 설정 하 였 다 . 
 α - glucosidase 저해 활성 은 합성 기질 인 1 mM p - nitrophenyl - α - D - glucopyranoside ( p NPG ) 를 phosphate buffer ( pH 6 . 8 ) 에 첨가 한 후 시료 를 넣 고 그 혼합액 에 효소 액 첨가 후 37 ℃ 에서 15 분 간 반응 시키 고 0 . 1 M NaOH 를 첨가 하 여 반응 을 종결 시켜 기질 인 p NPG 로부터 유리 되 어 나오 는 반응 생성물 인 p - nitrophenol 을 405 nm 에서 측정 하 여 α - glucosidase 활성 의 억제 정도 를 측정 하 였 다 ( Yuk . , 2011 ) . 샘플 무 첨 가구 는 negative control 로 사용 하 였으며 , 기질 무 첨 가구 는 blank 로 사용 하 였 다 . 계 산식 은 다음 과 같 다 . 
 실험 에서 얻 어 진 결과 의 통계 적 유의 성 은 SPSS ( statistical package for social sciences , Version 10 . 0 , Chicago , USA ) 를 이용 하 여 모든 값 은 mean ± SD 값 으로 나타내 었 고 , 각 농도 의 평균치 의 통계 적 유의 성 을 p < 0 . 05 수준 에서 Duncan ’ s multiple range test 에 의해 검정 하 였 다 . 
 - 생리 활성 물질 의 분리 및 동정 
 여주 씨 분말 500 g 을 에탄올 로 침지 하 여 얻 어 진 추출물 에 대하 여 용매 의 극성 에 따라 클로로포름 ( chloroform ) 과 물 층 으로 분획 하 고 각각 농축 하 여 2 개 의 분획 물 을 얻 었 다 . 각각 의 분획 물 에 대해 순상 , 역상 및 sephadex LH - 20 CC 를 반복 실시 하 여 2 종 의 화합물 을 분리 하 였 다 . 
 화합물 1 은 백색 의 분말 형태 로서 ESI / MS 에서 m / z 305 [ M + H ] + 의 분자 이온 peak 가 관측 되 어 분자량 을 304 로 결정 하 였 다 . 특히 쪼개짐 이온 ( fragment ion ) 인 m / z 143 을 갖 고 있 어 6 탄 당 한 분자 가 결합 된 배당체 화합물 임 을 추측 하 였 다 . 13 C - NMR spectrum 에서 10 개 의 carbon 이 관측 되 었 고 , 화학 적 이동의 δ 159 . 65 ( C - 1 ) 에서 1 개 의 hydroxylated aromatic carbon 시 그날 이 , δ 158 . 87 ( C - 5 ) , δ 152 . 45 ( C - 3 ) 에서 2 개 의 아미노기 가 치환 된 carbon 시 그날 이 관찰 되 었 다 . δ 108 . 43 ( C - 1 ´) 에서 1 개 의 아노 머 탄소 시 그날 이 관찰 되 어 한 분자 의 당 이 결합 되 어 있 음 을 알 수 있 었 고 전형 적 인 단당 ( glucose ) 의 carbon 시 그날 인 δ 77 . 94 ( C - 5 ´), δ 76 . 50 ( C - 2 ´), δ 73 . 49 ( C - 3 ´), δ 70 . 17 ( C - 4 ´) 를 확인 하 였으며 , 1 개 의 methylene carbon δ 61 . 60 ( C - 6 ´) 이 관측 되 었 다 . 이러 한 결과 를 토대 로 화합물 1 은 문헌 치 와 비교 하 여 알칼로이드 ( alkaloid ) 계 화합물 인 vicine 으로 동정 하 였 다 ( Delfini . , 1990 ) . 
 - HPLC 에 의한 정량 분석 
 Positive ion mass spectrum acquired by HPLC - ESI / MS analysis of vicine ( A ) and α - eleostearic acid ( B ) . 
 에탄올 의 농도 를 달리 하 여 여주 씨 의 추출물 을 제조 한 후 각 추출물 의 지표 성분 함량 을 분석 한 결과 는 Table 1 과 같 았 다 . 추출 수율 이 가장 높 았 던 70 % 에탄올 추출물 중 vicine , α - ESA 함량 은 각각 3 . 34 ± 0 . 3 , 21 . 7 ± 2 . 1 mg / g 이 었 다 . vicine ( 1 ) 의 경우 물 , 30 %, 50 %, 70 %, 95 % 에탄올 추출물 까지 각각 7 . 10 ± 0 . 4 , 4 . 60 ± 0 . 3 , 3 . 98 ± 0 . 4 , 3 . 34 ± 0 . 4 , 0 . 52 ± 0 . 1 의 함량 을 나타내 었 으며 , 극 성도 가 증가 할수록 다량 추출 되 었 고 95 % 에탄올 추출물 에서 는 그 함량 이 현저히 줄어들 었 다 . 반면 α - eleostearic acid ( 2 ) 의 경우 에탄올 농도 별 추출물 은 각각 ND ( 검출 안 됨 ) , 0 . 59 ± 0 . 1 , 10 . 9 ± 0 . 9 , 21 . 7 ± 2 . 1 , 23 . 5 ± 1 . 7 의 함량 을 나타내 었 고 특히 , 50 % 에탄올 이상 의 지용성 물질 의 추출 조건 에서 그 함량 이 지속 적 으로 증가 하 였 다 . 이러 한 경향 은 vicine 성분 의 추출 은 95 % 에탄올 보다 는 극성 이 훨씬 높 은 물 추출 혹은 70 % 에탄올 이하 의 폴라 ( polar ) 한 조건 에서 추출 하 는 것 이 성분 용출 에 더 용이 함 을 시사 하 고 있 으며 , 동일 한 추출 조건 에서 α - eleostearic acid 는 95 % 에탄올 추출물 의 함량 이 23 . 5 ± 1 . 7 으로 가장 높 은 것 으로 보 아 50 % 에탄올 이상 의 non - polar 한 조건 에서 추출 하 는 것 이 성분 용출 에 더 용이 함 을 확인 할 수 있 었 다 ( Fig . 3 ) . 이상 의 결과 를 토대 로 추출 수율 과 지표 성분 의 함량 을 고려 할 때 , α - glucosidase 에 저해 활성 을 나타내 는 여주 씨 분말 시료 에 대한 최적 의 추출 조건 은 α - eleostearic acid 성분 이 다량 추출 되 는 조건 인 95 % 에탄올 의 조건 인 것 으로 판단 된다 . 
 The contents of vicine ( 1 ) and α - eleostearic acid ( 2 ) in various extracts from the seeds ofMomordica charantia 
 HPLC - PDA profiles ( at 270 nm ) of vicine ( 1 ) and α - eleostearic acid ( 2 ) in seeds extracts from the five different polarity solvents . 
 에탄올 농도 별 에 따른 다양 한 여주 씨 추출물 및 주요 성분 의 α - glucosidase 저해 활성 은 Table 2 에 나타내 었 다 . p NPG 를 기질 로 사용 한 in vitro yeast α - glucosidase 저해 활성 결과 , 물 추출물 및 30 % 에탄올 추출물 에서 는 1000 μ g / mL 의 측정 농도 에서 저해 율 이 10 % 미만 으로 나타났 고 , 50 %, 70 %, 95 % 에탄올 추출물 의 저해 율 은 각각 62 %, 72 %, 80 % 이상 으로 높 게 나타났 다 . 가장 저해 활성 이 높 은 95 % 에탄올 추출물 은 농도 의존 적 으로 목표 효소 를 저해 하 였으며 , 단계 별 로 희석 한 검체 들 의 효소 저해 율 을 근간 으로 산출 된 50 % 효소 활성 저해 농도 ( IC 50 ) 는 88 . 7 μ g / mL 로 나타났 다 . 따라서 여주 씨 추출물 에 함유 된 α - glucosidase 효소 활성 저해 성분 들 은 주로 non - polar 한 추출물 에 분포 하 는 것 으로 예측 되 어 분리 한 단일 성분 들 의 저해 활성 을 검증 하 였 다 . 
 Inhibitory effects of the seed extract ofMomordica charantiausing different solvents and vicine ( 1 ) and α - eleostearic acid ( 2 ) on α - glucosidase inhibitory activities 
 This study was funded by a Research Program for Agricultural Science & Technology Development ( PJ 01000304 ) and Postdoctoral Fellowship Program of Rural Development Administration , Korea . 
 Asano N . 2003 Glycosidase inhibitors : update and perspectives on practical use Glycobiology 13 ( 10 ) 93 R - 104 R DOI : 10 . 1093 / glycob / cwg 090 
 Delfini M . , Nola A . D . , Carnovale E . , Lepri A . , Gaggelli E . , Russo N . 1990 13 C NMR Study of the Natural Glycosides Vicine and Convicine Spectroscopy letters 23 ( 5 ) 657 - 667 DOI : 10 . 1080 / 00387019008054447 
 Girón L . M . , Freire V . , Alonzo A . , Cáceres A . 1991 Ethnobotanical survey of the medicinal flora used by the Caribs of Guatemala Journal of Ethnopharmacology 34 ( 2 ) 173 - 187 DOI : 10 . 1016 / 0378 - 8741 ( 91 ) 90035 - C 
 Hu X . J . , Wang X . B . , Kong L . Y . 2013 α - Glucosidase inhibitors via green pathway : biotransformation for bicoumarins catalyzed by Momordica charantia Peroxidase Journal of Agricultural and Food Chemistry 61 ( 7 ) 1501 - 1508 DOI : 10 . 1021 / jf 304384 b 
 Kai H . , Akamatsu E . , Torii E . , Kodama H . , Yukizaki C . , Akagi I . , Ino H . , Sakakibara Y . , Suiko M . , Yamamoto I . , Okayama A . , Morishita K . , Kataka H . , Matsuno K . 2014 Identification of a bioactive compound against adult T - cell Leukaemia from bitter gourd seeds Plants 3 ( 1 ) 18 - 26 
 Khanna P . , Jain S . C . , Panagariya A . , Dixit V . P . 1981 Hypoglycemic activity of polypeptide - p from a plant source Journal of Natural Products 44 ( 6 ) 648 - 655 DOI : 10 . 1021 / np 50018 a 002 
 Kenny O . , Smyth T . J . , Hewage C . M . , Brunton N . P . 2013 Antioxidant properties and quantitative UPLC - MS analysis of phenolic compounds from extracts of fenugreek ( Trigonella foenum - graecum ) seeds and bitter melon ( Momordica charantia ) fruit Food chemistry 141 ( 4 ) 4295 - 4302 DOI : 10 . 1016 / j . foodchem . 2013 . 07 . 016 
 Kim H . Y . , Kwon S . H . , Cho E . J . 2013 Phytochemical Constituents of Bitter Melon ( Momordica charantia ) Natural Product Sciences 19 ( 4 ) 286 - 289 
 Liu J . Q . , Chen J . C . , Wang C . F . , Qiu M . H . 2009 New cucurbitane triterpenoids and steroidal glycoside from Momordica charantia Molecules 14 ( 12 ) 4804 - 4813 DOI : 10 . 3390 / molecules 14124804 
 Maki K . C . , Carson M . L . , Miller M . P . , Turowski M . , Bell M . , Wilder D . M . , Reeves M . S . 2007 High - viscosity h y d roxypropylmethylcellulose blunts postprandial glucose and insulin responses Diabetes Care 30 ( 5 ) 1039 - 1043 DOI : 10 . 2337 / dc 06 - 2344 
 Parkash A . , Ng T . B . , Tso W . W . 2002 Purification and characterization of charantin , a napin - like ribosome - inactivating peptide from bitter gourd ( Momordica charantia ) seeds The Journal of peptide research 59 ( 5 ) 197 - 202 DOI : 10 . 1034 / j . 1399 - 3011 . 2002 . 00978 . x 
 Rathi S . S . , Grover J . K . , Vats V . 2002 The effect of Momordica charantia and Mucuna pruriens in experimental diabetes and their effect on key metabolic enzymes involved in carbohydrate metabolism Phytotherapy Research 16 ( 3 ) 236 - 243 
 Schmourlo G . , Mendonca - Filho R . R . , Alviano C . S . , Costa S . S . 2005 Screening of antifungal agents using ethanol precipitation and bioautography of medicinal and food plants Journal of Ethnopharmacology 96 ( 3 ) 563 - 568 
 Singh R . , Kumar A . , Giri D . D . , Bhuvaneshwari K . , Pandey K . D . 2012 Gas chromatography - mass spectrometry analysis and phytochemical screening of methanolic fruit extract of Momordica charantia Journal of Recent Advances in Agriculture 1 ( 4 ) 122 - 127 
 Virdi J . , Sivakami S . , Shahani S . , Suthar A . C . , Banavalikar M . M . , Biyani M . K . 2003 Antihyperglycemic effects of three extracts from Momordica charantia Journal of Ethnopharmacology 88 ( 1 ) 107 - 111 
 Yuk H . J . , Lee J . H . , Curtis - Long M . J . , Lee J . W . , Kim Y . S . , Ryu H . W . , Park C . G . , Jeong T . S . , Park K . H . 2011 The most abundant polyphenol of soy leaves , coumestrol , displays potent α - glucosidase inhibitory activity Food chemistry 126 ( 3 ) 1057 - 1063 
 Zong R . J . , Morris L . , Cantwell M . 1995 Postharvest physiology and quality of bitter melon ( Momordica charantia L . ) Postharvest Biology and Technology 6 ( 1 ) 65 - 72 
 Citing ' α - Glucosidase Inhibitory Effect of Vicine and α - Eleostearic Acid from the Seeds of Momordica charantia ' 
 AU - 육 , 흥 주 
 AU - 노 , 건민 
 AU - 최 , 정숙 
 AU - 권 , 오경 
 AU - 강 , 상수 
 AU - 박 , 동식 
 TI - α - Glucosidase Inhibitory Effect of Vicine and α - Eleostearic Acid from the Seeds of Momordica charantia 
 DO - 10 . 5338 / KJEA . 2015 . 34 . 1 . 09 
 UR - http : / / dx . doi . org / 10 . 5338 / KJEA . 2015 . 34 . 1 . 09 
 육 , 흥 . , 노 , 건 . , 최 , 정 . , 권 , 오 . , 홍 , 수 . , 강 , 상 . , 조 , 계 . , & 박 , 동 . ( 2015 ) . α - Glucosidase Inhibitory Effect of Vicine and α - Eleostearic Acid from the Seeds of Momordica charantia . Korean Journal of Environmental Agriculture , 34 ( 1 ) The Korean Society of Environmental Agriculture . doi : 10 . 5338 / KJEA . 2015 . 34 . 1 . 09 
 육 , 흥 et al . 2015 , α - Glucosidase Inhibitory Effect of Vicine and α - Eleostearic Acid from the Seeds of Momordica charantia , Korean Journal of Environmental Agriculture , vol . 1 , no . 1 , Retrieved from http : / / dx . doi . org / 10 . 5338 / KJEA . 2015 . 34 . 1 . 09 
 [ 1 ] 흥 육 , 건 노 , 정 최 , 오 권 , 수 홍 , 상 강 , 계 조 , and 동 박 , “ α - Glucosidase Inhibitory Effect of Vicine and α - Eleostearic Acid from the Seeds of Momordica charantia ” , Korean Journal of Environmental Agriculture , vol . 1 , no . 1 , Mar 2015 . 
 육 , 흥 주 노 , 건민 최 , 정숙 et al . “ α - Glucosidase Inhibitory Effect of Vicine and α - Eleostearic Acid from the Seeds of Momordica charantia ” Korean Journal of Environmental Agriculture , 1 . 1 2015 : 
 육 , 흥 주 , 노 , 건민 , 최 , 정숙 , 권 , 오경 , 홍 , 수영 , 강 , 상수 , 조 , 계 만 , and 박 , 동식 , “ α - Glucosidase Inhibitory Effect of Vicine and α - Eleostearic Acid from the Seeds of Momordica charantia . ” Korean Journal of Environmental Agriculture 1 no . 1 ( ) Mar , 2015 ) : http : / / dx . doi . org / 10 . 5338 / KJEA . 2015 . 34 . 1 . 09