バイオカスケード装置を用いた内皮由来および神経由来血管弛緩物質の測定
その他（別言語等）の研究課題名
Measurement  of  vasorel axant  subst ance deri vedf rom endot hel i um and i nnervat i ng nerve bybi ocascade syst em
研究代表者安屋敷 和秀,  岡村 富夫
発行年2000- 03
URLht t p: //hdl . handl e. net /10422/6573
バイオカスケード装置を用いた内皮由来および神経由来血管弛緩物質の測定
( 課題番号1  0 6  7  0 0 8  3)  
平成10年度~ 平成11年度科学研究費補助金基盤研究 (C)(2) 研究成果報告書
平成 12 年 3月
研 究 代 表 者 安 屋 敷和秀
( 滋賀医科大学医学部助教雄)
111111111111111111111111111111111111111111111111 は じ め に
血管平滑筋の緊張性は、外膜側から支配神経によって、内膜側か
らは血流中に存在する血管作動物質および内皮細胞由来の化学物質
によって、調節されている。血管内皮細胞はプロスタノイド、エン
ドセリン類および一酸化窒素( NO) などを産生・遊離する。特に、 N O
はプロスタサイクリンとともに血管を拡張性に調節している。われ
われは、内因性 N Oが E DR F ( 内皮由来弛緩因子) として働くとと
もに血管支配神経の拡張性神経伝達物質としても働いていることを
N O合成酵素阻害薬を用いて示し、また、陰茎勃起機能を調節する海
綿体支配神経の伝達物質も N Oであることを報告してきた。しかし、
摘出した血管や海綿体を支配する拡張性神経を電気的に刺激して観
察される弛緩が、 N Oによることを薬理学的に証明できても、遊離さ
れた N Oを直接的に測定することは現在のところ困難である。また近
年、血管抵抗を調節する細動脈において、血管内皮細胞はプロスタ
サイクリンや N O以外に、血管弛緩物質を産生・遊離していることが
明らかとなった。同弛緩物質は、血管平滑筋細胞からのカリウム流
出をひき起こし、細胞膜を過分極して血管を弛緩させると考えられ、
内皮由来過分極因子( EDHF) と命名されている。しかし、この E DHF
の本体は現在不明であり、循環薬理学、生理学の分野で国際的に高
い注目を集めている。
そこで本研究は、血管や海綿体支配神経から遊離される微量の神
経伝達物質を、高感度のバイオカスケード装置を用いて測定を試み
るとともに、現在、世界的に注目を集めている本体不明の E DHF の
解析を同装置を用いて行った。さらに、このカスケード装置とは別
に、内皮を除去した動脈標本を用いて、産生された E DHF 様物質の
バイオアッセイを行い、その薬理学的解析から E DHF の本体を明ら
かにすることを試みた。
研 究 組 織
研究代表者安屋敷和秀( 滋賀医科大学医学部助教救)
研究分担者岡村富夫( 滋賀医科大学医学部教授)
研 究 経 費
平成 1 0年度1， 8  0  0千円
平成 1 1 年度上 4 0 0 千円
合 計3 ， 2  0  0 千円
研究成果の要約
血管内皮細胞はー酸化窒素 ( NO)およびプロスタサイクリン
( PGI 2) を産生・遊離し、血管の緊張性を調節している。われわれは、
内因性 N Oが E DR F として作用するだけでなく、血管および陰茎海綿
体支配神経の拡張性伝達物質としても作用していることを報告して
いる( 論文 1 ) 。内皮細胞は N O以外にも内皮由来過分極因子 ( EDHF)
を遊離し血管を拡張するが、同物質の本体は現在も同定されていな
い。そこで、イヌないしサルを用い、種々の臓器から動脈および海
綿体標本を摘出し、内皮に依存した弛緩および支配神経を介する弛
緩反応を検討した。今回は、これまでに報告されていない内皮依存
性弛緩に注目して薬理学的解析を行った。さらに、バイオカスケー
ド装置を用いて、神経由来の弛緩物質の測定と N Oおよび PGI 2 以外
の内皮由来弛緩物質の測定を試みた。
下垂体後葉ホルモンであるバゾフ。レッシンは、その名のとおり昇
圧をひき起こし、多くの血管を収縮するが、ヒトおよびイヌ脳動脈
およびイヌおよびラット腎動脈ではバゾプレッシンにより弛緩する
ことが知られている。これまで、霊長類の冠状動脈におけるバゾプ
レッシンの作用は報告されていなかった。そこで、日本ザルから摘
出した冠状動脈を用いて、バゾプレッシンの作用を特に血管内皮の
役割に注目して解析した。バゾプレッシンは、内皮正常なサル冠状
動脈標本を用量依存性に弛緩した。内皮を除去した標本の張力を変
化しなかった。この内皮依存性弛緩は、 N O合成酵素阻害薬である L-
ニトロアルギニン( L- NA) 処置により消失し、 N O の基質であるしア
ルギニン添加により回復した。光学異性体の 0- アルギニン添加によ
る影響は無かった。同弛緩はバゾフ。レッシン V( 受容体に選択的な措
抗薬処置により著しく抑制された。パゾプレッシン V 2受容体刺激薬
であるデスモプレッシンは、内皮正常な標本をわずかにしか弛緩し
なかった。同弛緩もバゾプレッシン V 1受容体措抗薬処置により消失
した。以上の結果から、摘出日本ザル冠状動脈におけるバゾプレツ
シンの作用は、内皮に存在するバゾフ。レッシン V 1受容体を刺激して、
N O合成酵素を活性化し、これにより合成・遊離された N Oが動脈を
拡張すると考えられた。したがって、局所ないし全身性にパゾプレ
ッシン濃度が高まった場合、正常なサル冠状動脈の内皮細胞は、 N O
遊離を介して心筋虚血を保護する可能性を明らかにした( 論文 2)。
N O以外の内皮由来の血管弛緩物質が、特に抵抗血管の緊張性調節
に重要な働きがあると考えられ、注目されている。現在、同物質は
血管平滑筋細胞膜の K+ チャネルを関口して過分極を生じ、血管弛緩
をひき起こすと考えられているが、同物質の本体は不明で、ある。わ
れわれは、非 PGI 2 非 N O性の弛緩に注目し、各種サル摘出動脈で検
討したところ、舌動脈が最大の内皮依存性弛緩を示すことを予備実
験で明らかにし、 N O および PGI 2 以外の内皮由来弛緩物質の検討に
使用した。アセチルコリンは、摘出サル舌動脈標本を内皮依存性に
弛緩し、同弛緩はインドメタシン処置に影響されず、N O 合成酵素
阻害薬の L - NA処置により部分的に抑制された。 L - NA抵抗性のアセ
チルコリン弛緩は、 Ca2+依存性 K+チャネル阻害薬のチャリブドトキ
シン ( CHTX)とアパミンの併用処置で消失した。同弛緩は、非選択
的チトクローム P450 ( CYP)阻害薬ならびに CY P3A選択的阻害薬、
ケトコナゾールで抑制された。内皮正常なサル舌リング標本をドナ
ー標本としてバイオカスケード装置の上流に装着し、標本の張力変
化を測定するとともに、ドナー標本の直下に装着した内皮を除去し
たアッセイ標本の張力変化を記録した。? - 産流液に適用したアセチル
コリンは、ドナー標本を弛緩し、この潅流液はアッセイ標本をわず
かに弛緩した。この弛緩はドナー標本の L - NA処置により消失した。
このため、L - NA 抵抗性の弛緩を同装置で測定することは困難と判
断し、以下の実験を行った。 CY P3 A の豊富なヒト肝ミクロゾームと
アラキドン酸の反応生成物は、内皮を除去した舌動脈標本を弛緩し、
同弛緩は CHfX とアパミンの併用処置で消失した。ケトコナゾール
存在下の反応生成物は標本を弛緩しなかった。したがって、サル舌
動脈におけるアセチルコリンによる内皮依存性弛緩は、 PGI 2 の関与
はほとんどなく、N O と Ca2+ 依存性 K+ チャネルを開口させる
CY P3 A 由来のアラキドン酸代謝物によると考えられた( 論文 3 )。
陰茎勃起は、陰茎海綿体の拡張に基づくことが知られている。わ
れわれはイヌを用いた実験から、陰茎海綿体に分布する N O作動性神
経から遊離された N Oが海綿体平滑筋を拡張し、勃起をひき起こすこ
とを生体位および摘出標本を用いて明らかにしてきた。しかし、海
綿体組織における内皮細胞の機能は十分に解析されていなかった。
そこで摘出イヌ陰茎海綿体標本を用いて、界面活性物質であるサポ
ニンを処置し、その組織学的および機能的影響を検討した。無処置
の標本の内皮細胞を電子顕微鏡で観察すると、ゴルジ装置、粗面小
胞体およびミトコンドリアなどの細胞内小器官が観察される。サポ
ニン処置により、内皮細胞は変性・萎縮し、正常細胞で観察された
小器官を観察することが困難となった。ただし、内皮細胞の脱落は
認められなかった。機能的実験として標本の張力変化を測定した。
内皮正常な海綿体標本では、アセチルコリン、 A T P および Ca2+ イオ
ノフォア A23187 により弛緩した。他方、サポニンを処置した標本で
は、アセチルコリンおよび Ca2+ イオノフォア A23187 による弛緩は消
失したが、 A T P による弛緩は影響されなかった。アセチルコリンに
よる弛緩は N O 合成酵素阻害薬の L - NA 処置により部分的に抑制さ
れ、 L アルギニン添加によりに回復した。L - NA 処置下に残った弛
緩は、高濃度の K+ ならびに非選択的な K+ チャネル阻害薬であるテ
トラブチルアンモニウム処置により消失した。A T P による弛緩はア
ミノフィリン処置により抑制された。経壁電気刺激を海綿体標本に
適用すると、標本は頻度依存性に弛緩した。同弛緩は、 L - NA処置に
より消失し、 L- アルギニン添加によりに回復した。サポニンを処置
した標本においても電気刺激による弛緩は無処置の標本と同程度に
観察された。経壁電気刺激により支配神経から遊離される弛緩物質
を、アセチルコリン刺激およびシェアストレス( ずり応力) 刺激に
よってウサギ腸骨動脈から遊離される N O を十分に測定できる
( Ay司iki ，et al. Circ. Res. ， 78: 750-8， 1996) バイオカスケード装置を
用いて測定したところ、アッセイ標本での弛緩は観察されなかった。
以上の結果から、アセチルコリンは海綿体内皮から N Oおよび K+ チ
ャネル開口物質を遊離し、平滑筋を弛緩する。A T P による弛緩は、
内皮非依存性で、 P t プリン受容体刺激を介する。支配神経の刺激に
よる弛緩も内因性 N Oによるが、内皮機能が消失しでも影響されない
ことを明らかにした( 論文 4)。
さらに、インポテンス治療薬のバイアグラ (Sildenafil)について、
陰茎海綿体を支配する N O 作動性神経機能に及ぼす影響とニトログ
リセリンなどの N O 供与体とバイアグラ併用による危険性について
まとめた( 論文 5)。すなわち、バイアグラを代表とするホスホジ
エステラーゼ 5 型 ( PDE- V)阻害薬の投与が、勃起神経刺激の効果を
増強するのは、 N Oが海綿体平滑筋のグアニル酸シクラーゼを活性化
して産生するサイクリック G MP の分解を抑制するためである。他方、
バイアグラはニトログリセリンなどの N O 供与体の効果も増強する
ので、循環系に重大な副作用をひき起こす危険性があり、使用には
十分な注意が必要であると考える。
本研究に使用したバイオカスケード装置は、血管内皮に由来する
N Oの測定には十分有用であるが、神経由来の N Oを測定できなかっ
たことから、神経伝達物質としての N Oの多くは、隣接した平滑筋細
胞に利用され、その作用効率は、内皮由来の N Oよりもはるかに高い
と考えられた。したがって、今後、神経由来の N Oの測定を行うには、
より大量の N Oを遊離する標本をドナー標本として使用し、本装置を
活用する予定である。他方、 N O以外の内皮由来血管弛緩物質は、 N O
と比較して極めて不安定で容易に失活すると考えられた。そこで、
血管内皮細胞で産生・遊離される Ca2+ 依存性 K+ チャネル関口物質
の解明には、バイオカスケード装置は使用せず、酵素標品を使用し
た再構成実験を行つことにより、研究を継続している。
研 究 発 表
，さ-!...6、雪士告企-r- AQI~ 写デ
1 .岡 村 富 夫 、 安 屋 敷 和 秀 、 戸 田 昇N O作動性神経による血管系の機能調節実験医学1 7 :  9 3 5 - 9 4 0 ，1 9 9 9  
2. Okamur a， T. ， Ayaj i ki ， K. ， Fuj i oka， H.  and Toda， N.  Mechani sms underl yi ng argi ni ne vasopressi n-i nduced relaxation in monkey isolated coronary arteries. J ournal  of Hypertensi on 17: 673- 678， 1999 
3. Ayaj i ki ， K. ， Okamura， T. ， Fuj i oka， H. ， l maoka， S. ， Funae， Y.  and Toda， N  l nvol vement of CYP3A- deri ved arachi doni c acid metabolite(s) in responses to endothel i um-deri ved K+ channel  openi ng substance in monkey lingual artery. British J ournal  of Pharmacol ogy 128: 802- 808， 1999 
4. Okamur a， T. ， Ay吋iki ，K. ， Fuj i oka， H， Toda， M. ， Fuj i mi ya， M.  and Toda， N.  Effects of endothelial i mpai rment by saponi n on the responses to vasodilators and nitergic nerve sti mul ati on in isolated cani ne corpus cavernosum.  British J ournal  of Pharmacol ogy 127: 802- 808， 1999 
5.岡 村 富 夫 、 安 屋 敷 和 秀 、 戸 田 昇N O とノてイアグラ血管と内皮特別:5 0 - 5 6 ， 1 9 9 9  