北海道医療大学学術リポジトリ
牛白血病ウイルスによる白血病発症機構の解明－Taxの変異と腫瘍原性に関する研究－
学位名博士（薬学）
学位授与機関北海道医療大学
学位授与年度令和元年度
学位授与番号30110甲第316号
URLht t p: //i d. ni i . ac. j p/1145/00064757/
博 士 学 位 論 文 
牛白血病ウイルスによる白血病発症機構の解明 
-Tax の変異と腫瘍原性に関する研究- 
令和元年度 
L233P mutation of bovine leukemia virus (BLV) Tax protein 
 correlated with leukemogenicity. 
SUMMARY 
Bovine leukemia virus (BLV) can be divided into two categories based on the 
amino acid at position 233 in the Tax protein, which probably plays a crucial 
role in leukemogenesis. We show here that a rat fibroblast cell line stably 
expressing L233-Tax formed significantly larger tumors than P233-Tax-
expressing cells in a murine xenograft study. Although the microvessel 
density was comparable in both tumors, visible blood vessel invasion was 
observed only on tumors from L233-Tax-expressing cells. Endothelial cell 
tube formation assays using human umbilical vein endothelial cells showed 
no significant difference in angiogenic activity between conditioned medium 
from L233- and P233-Tax-expressing cells, whereas in vitro chemotaxis 
assays revealed that only L233-Tax-expressing cells produced a 
chemoattractant for endothelial cells. Since pathological neovascularization 
can occur from the recruitment of endothelial progenitor cells, these results 
suggest that L233-Tax-expressing cells recruit murine endothelial progenitor 
cells and promote neovascularization to support tumor growth. BLV-infected 
lymphoma cells may also recruit bovine endothelial progenitor cells to 
promote neovascularization. The findings of this study are consistent with 
our previous observation that BLV carrying P233-Tax has a significantly 
longer incubation period for developing tumors than the virus carrying L233-
Tax and provide insight into the function of Tax in leukemogenesis by BLV. 
略語表 本論文中において, 以下の略語を使用した.   
ATL   Adult T-cell leukemia  
BLV  Bovine leukemia virus  
CM    Conditioned medium  
CT    Threshold cycle  
DMEM  Dulbecco’s modified Eagle’s medium  
EBL  Enzootic bovine leucosis  
EDTA  Ethylenediamine-N,N,N‛,N‛-tetraacetic acid 
FCS  Fetal calf serum 
GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 
HBZ  HTLV-1 basic leucine zipper factor 
H-DME Ham’s F12 medium:DMEM (1:1) 
HTLV  Human T-lymphotropic virus  
HUVEC   Human umbilical vein endothelial cell 
HIF  Hypoxia-inducible factor 
LTR   Long terminal repeat  
miRNA  Micro-RNA 
MVD    Microvessel density  
NHEJ  Non-homologous end joining 
PBS  Phosphatase-buffered saline 
PCR  Polymerase chain reaction 
RFU   Relative firefly luciferase unit  
TAE  Tris-acetate-EDTA 
TEC  Tumor endothelial cell 
Tris  2-amino-2-(hydroxymethyl1)-1,3,-propanediol 
WHO  World Health Organization 
序論 .................................................................................................................... 1 
 本論 .................................................................................................................... 7 
第 1 章 Tax の in vitro における腫瘍原性 ...................................................... 7 
1 ) 緒言 ...................................................................................................... 7 
2 ) 材料および方法 .................................................................................. 10 
3 ) 結果 .................................................................................................... 19 
（ 1 ）Tax のアミノ酸配列の確認 .................................................... 19 
（ 2 ）L233-Tax および P233-Tax 持続発現細胞の樹立.................. 19 
（ 3 ）L233-Tax および P233-Tax の BLV-LTR に対するトランス 
アクチベーション活性 ........................................................... 22 
（ 4 ）Tax 発現細胞におけるゲノムの損傷...................................... 24 
（ 5 ）Tax 発現細胞の足場非依存性増殖 ......................................... 27 
4 ) 考察 .................................................................................................... 30 
第 2 章 Tax の in vivo における腫瘍原性と液性因子の生物活性 ................. 32 
1 ) 緒言 .................................................................................................... 32 
2 ) 材料および方法 .................................................................................. 33 
3 ) 結果 .................................................................................................... 36 
（ 1 ）ヌードマウス皮下移植実験 .................................................... 36 
（ 2 ）免疫組織染色 ......................................................................... 39 
（ 3 ）チューブ形成試験 .................................................................. 41 
（ 4 ）走化性試験 ............................................................................. 44 
4 ) 考察 .................................................................................................... 47 
総括 .................................................................................................................. 49 謝辞 .................................................................................................................. 50 引用文献 ........................................................................................................... 51 
 牛白血病ウイルス (bovine leukemia virus: BLV) は, 地方病性牛白血病 
(Enzootic bovine leucosis: EBL ) の病因であり, レトロウイルス科 (Family 
Retroviridae) , オルトレトロウイルス亜科 (Subfamily Orthoretrovirinae) , 
デルタレトロウイルス属 (Genus Deltaretrovirus) に分類され, ヒト T リ
ンパ球向性ウイルス (human T-lymphotropic virus: HTLV ) に極めて近縁
なウイルスである. オルトレトロウイルス亜科には, デルタレトロウイルス
の他にニワトリの白血病ウイルスや肉腫ウイルスを含むアルファレトロウイ
ルス属 (Genus Alpharetrovirus) , マウス乳がんウイルスを含むベータレト
ロウイルス属 (Genus Betaretrovirus) , サルを含むほ乳類に白血病や肉腫
を引き起こすガンマレトロウイルス属 (Genus Gammaretrovirus) , 魚の肉
腫ウイルスを含むイプシロンレトロウイルス属 (Genus Epsilonretrovirus) 
な ら び に ヒ ト 免 疫 不 全 ウ イ ル ス を 含 む レ ン チ ウ イ ル ス 属  (Genus 
Lentivirus) が分類される. 一方, スプーマレトロウイルス亜科 (Subfamily 
Spumavirinae) , スプーマウイルス属 (Genus Spumavirus) に分類される
ウイルスは種々の動物から分離されるが, それらの宿主に対する病原性は不
明である (Fig. 1 ) . 1, 2 )  
レトロウイルスは (+) 鎖 RNA 2 分子をゲノムとして有し, 宿主細胞に感
染後, 自身の逆転写酵素によってその RNA を鋳型に DNA (プロウイルス) 
を合成する. その際, プロウイルスゲノムの両端には long terminal repeat  
(LTR)  と呼ばれる繰り返し配列が形成される. 次いで, インテグラーゼに
よってプロウイルス DNA を宿主細胞ゲノム上に挿入した後, 宿主の RNA ポ
リメラーゼによってウイルスゲノ厶 RNA および mRNA が転写されて子孫
ウイルスの複製が行われる. 一方, 宿主ゲノム上のプロウイルスも細胞分裂
によってコピー数を増やす.  
Fig. 1. Phylogenetic reconstruction of retroviruses using 
reverse transcriptase sequences. 3) 
Orthoretrovirinae 
Spumaretrovirina
典型的なレトロウイルスのプロウイルスゲノムは 5'LTR – gag – pro – pol 
– env – 3'LTR の形で配列する. 両端の LTR はプロウイルス DNA の宿主細
胞ゲノムへの挿入時に重要な役割を果たし, 5’LTR はウイルス遺伝子の転写
プロモーターとして機能する. gag 遺伝子はウイルス粒子の内部構造タンパ
ク質, pro 遺伝子はプロテアーゼ, pol 遺伝子は逆転写酵素およびインテグラ
ーゼ, env 遺伝子はエンベロープ糖タンパク質をコードする. アルファおよ
びガンマレトロウイルスの一部は宿主細胞のがん原  (c-onc)  遺伝子に由
来する v-onc 遺伝子を有し, これらのウイルスが宿主動物に感染すると, 本
遺伝子産物の作用によって短い潜伏期で肉腫を形成する. 一方, v-onc 遺伝子
を有しないウイルスは, 複製を繰り返し, プロウイルスが宿主細胞の c-onc
遺伝子上流に挿入された場合にのみ, すなわち, 比較的長い潜伏期の後に
3'LTR の作用によってその転写が活性化され, 細胞の悪性増殖を引き起こす 
(Fig. 2).  
BLV および成人 T 細胞白血病  (adult T-cell leukemia: ATL)  の病因で
ある HTLV-1 を含むデルタレトロウイルスのプロウイルスゲノム上には, env
遺伝子と 3'LTR の間に pX と呼ばれる領域が存在する(Fig. 3). 本領域におい
て最大のオープンリーディングフレームがコードする Tax タンパク質は, 
5’LTR からのウイルス遺伝子転写のトランスアクチベーターとして機能す
る.4-8) さらに, 本タンパク質は細胞増殖因子を含む様々な細胞遺伝子の転写
を調節することが知られている (Fig. 3) . 9-11)  また, BLV および HTLV-1 の
Tax は Ha-Ras タンパク質との共発現によってラット胎児線維芽細胞を腫瘍
化する 12, 13) とともに, 単独で各々ヒツジ B 細胞およびヒト T 細胞を不死化
することが報告されている. 14)  
 HTLV-1 の Tax は細胞傷害性 T 細胞  (CTL) の主要な標的であるため, 
Tax 発現細胞は宿主の免疫機構によって速やかに排除される. 15)  そのため, 
実際の ATL 患者の腫瘍細胞や ATL 細胞株では tax 遺伝子の変異や 5’LTR
の欠失あるいはメチル化によって Tax の発現は認められない場合が多い. 一
方, 3’LTR の欠損やメチル化の例は報告されていない. 16-19)  以前から, 
HTLV-1 の (－) 鎖から 3’LTR の逆向きプロモーター活性によって転写され
る RNA の存在が報告されており, 20)  2002 年に Tax のトランスアクチベー
ショ ン 活 性 を抑 制 する 分子 と して HTLV-1 basic leucine zipper factor  
Fig. 3. Genome structure of BLV provirus. 
Fig. 2. Mechanism of canceration by retrovirus. 
(HBZ)  が同定された. 21)  Tax とは異なり, HBZ は ATL 細胞株および新鮮
腫瘍細胞を含む HTLV-1 感染のすべてのステージにおいて発現が認められ
る.22)  
 HTLV-1 は感染のごく初期にウイルス粒子の産生が認められるが, 大部分
は感染細胞が非感染細胞に接着することによってウイルスを伝達する.23) そ
の後, Tax および HBZ の作用によってウイルス感染 T 細胞がポリクローナ
ルに増殖し, 体内でのウイルスコピー数を増やす. この過程でウイルス感染
細胞に Tax によるゲノム損傷や DNA のメチル化などが蓄積し, アポトーシ
ス抵抗性や不死化が付与される. 次いで, Tax および HBZ によるウイルス感
染細胞の増殖促進と宿主の免疫機構による Tax 発現細胞の排除との間で平衡
状態が成立する. そのような状況で, 不死化したウイルス感染細胞の中に
Tax に依存しない増殖能を獲得した T 細胞クローンが出現すると, 免疫によ
る排除を回避して異常な増殖を起こすようになる. このように, ATL の発症
においては, ウイルス感染初期には Tax が, Tax の発現が認められなくなる
中期以降では HBZ が中心的役割を担うものと考えられている.24)  
 BLV は HTLV-1 に極めて近縁なウイルスであるが, ATL の潜伏期が 50-60
年であることに対し, BLV による白血病の好発年齢は 5-8 才とその潜伏期は
短い. また, ATL 腫瘍細胞内では HTLV-1 の Tax は多くが欠損・不活化され
ているのに対し, BLV 感染白血病細胞では欠損はほとんど認められない. さ
らに, BLV では HBZ 様タンパク質の報告はなく, 3’LTR の逆向きプロモータ
ー活性によるマイナス鎖からの miRNA の転写が報告されているのみであ
る.25) したがって, BLV Tax の機能を解析することはデルタレトロウイルス
の白血病発症機構における Tax の役割を理解するうえの重要なモデルとなる.  
 腫瘍はイニシエーション (ゲノムの不安定化, 細胞死への抵抗性) , プロモ
ーション (増殖を伴う不死化・増殖シグナルの維持) , プログレッション (血
管新生・浸潤と転移) の 3 段階を経て進展する.26) 本研究の第一章では, BLV 
Tax を持続的に発現するラット株化線維芽細胞を樹立して本タンパク質が宿
主細胞ゲノムに与える影響並びに足場非依存性増殖能に与える影響を調べ, 
Tax のイニシエーションおよびプロモーションにおける役割を検討した. 次
いで第二章では, Tax 発現細胞をヌードマウス皮下に移植して腫瘍形成能を
調べて Tax が腫瘍のプログレッションにおいて果たす役割を推測するととも
に, Tax 発現細胞が分泌する液性因子の活性について検討した.  
第 1 章  Tax の in vitro における腫瘍原性 
1 ) 緒言 
デルタレトロウイルスのプロウイルスゲノム上には, env 遺伝子と 3’LTR
の間に数種の調節タンパク質をコードする pX と呼ばれる領域が存在する. 27) 
それらのうち, 最大のタンパク質 Tax はプロウイルスの 5’LTR に作用してウ
イルス遺伝子の転写を活性化する.4-8) さらに, c-fos などの宿主細胞がん原遺
伝子やアポトーシス関連遺伝子の転写に影響を及ぼす.9-11)  また, HTLV-1 お
よび BLV の Tax は単独で宿主細胞 DNA ポリメラーゼによるゲノム DNA の
損傷修復機能を阻害すること,28) Ha-Ras との共発現によってラット胎児線維
芽細胞を悪性転換すること,12,13) さらに, in vitro でそれぞれヒト T 細胞およ
びヒツジ B 細胞を不死化することが報告されている.14)  
当研究室では, BLV による白血病発症の機構を明らかにするため, 全国の
食肉衛生検査所の協力を得て EBL の疫学調査を実施してきた.29) その結果, 
①BLV は Tax の 233 位アミノ酸によって Leu233 (L233) -Tax 型と Pro233 
(P233) -Tax 型に 2 分され (Fig. 4), ②L233-Tax ウイルス感染牛の EBL 発症
月 齢 の 分 布 と P233-Tax ウイルスのそれは各々対数正規分布すること    
(Fig. 5), ③P233-Tax ウイルス感染牛の EBL 平均発症月齢は L233-Tax のそ
れに比べ有意に高いことを報告した.30)  これらの成績は, P233-Tax ウイル
スによる EBL の潜伏期は L233-Tax ウイルスに比べ有意に長いことを示唆
している. すなわち, P233-Tax ウイルスは L233-Tax ウイルスに比べ腫瘍原
性が低い可能性を示している.  
本章では, Tax の L233P 変異と BLV の腫瘍原性が関連するメカニズムを
明らかにするため, L233-Tax および P233-Tax を持続的に発現するラット株
化線維芽細胞を樹立した. これらを単一細胞ゲル電気泳動法に供し, 両 Tax
による宿主ゲノムに対する損傷能を比較し, Tax が BLV による白血病発症の
イニシエーションに果たす役割を調べた. さらに, 軟寒天内コロニー形成試
験により両 Tax 発現細胞の足場非依存性増殖能を調べ, Tax が腫瘍のプロモ
ーションに果たす役割について検討した.  
Fig. 4. Phylogenetic tree of the tax gene of BLV.30） 
Fig. 5. Frequency distribution of age at diagnosis of EBL.30) 
Cattle number 
Age (months)    
L233-Tax 
P233-Tax 
2 ) 材料および方法 
 ( 1 ) リンパ肉腫検体 
 2008 年 6 月茨城県および 2009 年 8 月群馬県の食肉衛生検査所において, 
全身性腫瘍のため廃棄されたウシの胃表面および腸間膜リンパ節に形成され
た腫瘍を用いた. 腫瘍組織は世界保健機構 (WHO) の感染性物質の輸送規制
に従い, 1 次および 2 次容器に梱包した. 凍結後, 北海道医療大学薬学部分子
生命科学講座免疫微生物学教室に送付し, 使用まで－80℃で保存した.  
 ( 2 ) 腫瘍細胞総 DNA の抽出 
ウシ腫瘍組織からの総 DNA 抽出には Kapa Express Extract Kit (Kapa 
Biosystems) を用いた. すなわち, 腫瘍片約 10mg を切り出し, PCR-grade 
water 44µl, 10×KAPA Express Extract Buffer 5µl, 1U/µl KAPA Express 
Extract 1µl に 懸 濁 し た . 懸 濁 液 を Heat block fastgeneTM (NIPPON 
Genetics) 中で 75℃, 10 分間加熱した. 次いで, 95℃で 5 分間加熱し, 数秒
間遠心した後, 上清を得た. これに, TE [10mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM 
EDTA (pH 8.0) ] 200µl を加え, 使用時まで－20℃で保存した.  
 ( 3 ) プライマー 
  BLV tax 遺伝子第 2 エクソンの 5’末端 15 塩基に相補的な配列に開始コド
ン ATG および制限酵素 BamHⅠ認識配列を付加した rTax Fw および 3’末端
30 塩基に相補的な配列に XhoⅠ認識配列を付加した rTax Rv を設計し, 合
成をファスマックに委託した (Table 1).  
Primer Nucleotide sequence 
rTax Fw 5'-GGATCCGCCACCATGGCAAGTGTTGTTGGT-3' 
      
rTax Rv 5'-CTCGAGTCAAAAAAGGCGGGAGAGCCATTCATTTTC-3' 
            
 ( 4 ) tax 遺伝子の増幅 
PCR 溶液は 10×AccuPrimeTM reaction mix (Invitrogen) 5µl, 10µM rTax 
Fw および rTax Rv 各 1.5µl, AccuPrimeTM Pfx DNA polymerase (Invitrogen) 
1.25U (0.5µl), リンパ肉腫総 DNA 5µl を混合し, 滅菌精製水で全量を 50µl
とした. iCycler (Bio-Rad) で 94℃ 1 分間加熱後, 94℃ 15 秒, 60℃ 30 秒, 
68℃ 30 秒の反応を 35 回繰り返した. その後, 72℃ 5 分で伸長反応を行い, 
L233-Tax または P233-Tax をコードする遺伝子を増幅した.  
 ( 5 ) アガロースゲル電気泳動 
泳動用緩衝液には 0.1µg/ml 臭化エチジウム (和光純薬) を含む 1×TAE 緩
衝液 [40mM Tris-HCl (pH 8.0) , 20mM 酢酸, 1 mM EDTA]を用いた. 泳動
用緩衝液に NE-AG01 (FastGene) を 1% (w/v) になるように溶解してアガロ
ースゲルを作製した. PCR 産物 5µl に 6×loading buffer (TaKaRa)  [30mM 
EDTA, 36%グリセリン, 0.05%ブロモフェノールブルー, 0.05%キシレンシア
ノール]を 1µl 加え, 泳動用試料とした. 泳動用緩衝液に浸したアガロースゲ
ルの試料溝に調製試料を添加し, Mupid-2x 泳動装置 (ADVANCE) を用いて
100V 定電圧で 30 分間泳動した. トランスイルミネーター上にゲルを置き, 
LAS-1000 UV mini® (FUJIFILM) を用いて蛍光を検出した.  
 ( 6 ) DNA 断片の精製 
アガロースゲル電気泳動で分画した BLV tax 遺伝子断片を Wizard® SV 
Table 1. Primers used in this chapter 
BamHⅠ 
and PCR clean-up system (Promega) を用いて精製した. すなわち, アガロ
ースゲルをスーパーLED ビューアー (BioSpeed) 上に置き, 約 0.9kb のバン
ドをメスで切り出した. 切り出したゲルを秤量し, 10 mg に対して 10µl の割
合で membrane binding solution を加え, 60℃でゲルが融解するまで撹拌し
た. SV minicolumn assembly にゲル融解液を添加後, 室温で 1 分間静置し
た. これを 15,000×g で 1 分間遠心し, DNA をカラムに吸着させた. 
membrane wash solution 700µl で 1 回, 500µl で 1 回洗浄後, nuclease-free 
water を 50µl 加えた. 1 分間室温に静置した後, 15,000×g, 1 分間遠心して
精製 DNA 溶液を溶出した. 
 ( 7 ) Tax 発現プラスミドの構築 
 (6) で得られた DNA 溶液 1µl に, 10×K buffer (TaKaRa) 1µl, BamHⅠ 
(15U/µl) 0.4µl, XhoⅠ (10 U/µl) 0.4µl および滅菌精製水を加えて全量を 10µl
とし, 30℃で 1 時間保温後, 37℃で一晩消化した. 産物を本章 (5) および (6) 
に準じ, アガロース電気泳動に供して約 0.9kb の DNA を精製した. これら
を L233-Tax および P233-Tax DNA とした. BamHⅠ/XhoⅠ消化発現プラス
ミド pcDNA3.1 (+)  (Invitrogen) 84ng に各 Tax DNA を加え, 精製水で全
量を 10µl に調製した, これに DNA Ligation Kit＜Mighty Mix＞ (TaKaRa) 
を等量加え, 16℃で 30 分間連結反応を行い, pcA95/L233 および pcA95/P233
 ( 8 ) 大腸菌の形質転換 
大腸菌 JM109 株コンピテント細胞 (TOYOBO) 100µl に Tax 発現プラス
ミド 5µl を加え氷中に 1 時間, 42℃で 30 秒間,さらに氷中で 10 分間放置後, 
S.O.C. Medium [2% tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM 
KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glucose] (Thermo Fisher) 100µl
を加え, 37℃で 1 時間振盪した. 50µg/ml アンピシリン含有 LB 寒天培地[1.5% 
(w/v) Bacto agar (Difco), 1% (w/v) NaCl, 1% (w/v) tryptone (Difco), 0.5% 
(w/v) yeast extract (和光純薬) ]に塗布し, 37℃で 16 時間培養して形質転換
株を選択した. 
 ( 9 ) プラスミドの精製 
アンピシリン添加 LB 寒天培地上のコロニーを釣菌し, 50µg/ml アンピシ
リン添加 LB 培地[1% (w/v) NaCl, 1% (w/v) tryptone (Difco), 0.5% (w/v) 
yeast extract (和光純薬) ] 2ml に懸濁した後, 37℃16 時間振盪した. 2,500×
g で 4℃, 10 分間遠心し, 沈渣を Resuspension buffer [50 mM Tris-HCl (pH 
8.0), 10mM EDTA, 100µg/µl RNase A] 100µl に懸濁した. これに Lysis 
buffer [200mM NaOH, 1% (w/v) SDS]を 100µl 添加し,転倒混和後,室温で 5
分間静置した. 3M 酢酸カルシウム (pH5.5) を 100µl 添加して転倒混和後, 
20,000×g で 4℃, 10 分間遠心した.上清に TE 緩衝液飽和フェノールを 300µl
加えて撹拌後, 20,000×g で 4℃ , 10 分間遠心した.新しい 1.5 ml マイクロチ
ューブに水層を移し,イソプロパノールおよび 3M 酢酸ナトリウム (pH5.2) 
をそれぞれ 210µl および 30µl 加えて転倒混和後, -80℃に 30 分間放置した. 
20,000×g で 4℃, 30 分間遠心して得た沈査に 70%エタノールを 50µl 加え, 
20,000×g, 4℃, 5 分間遠心した. 沈査を真空乾燥後, TE 10µl を加えて室温
で 1 時間静置し, 完全に溶解させた. これらを制限酵素 BamHⅠおよび
XhoⅠで消化した後, 本節 (5) に準じてアガロース電気泳動に供し, 制限消
化による約 0.9kb の tax 遺伝子の存在を確認した.  
 ( 10 ) 塩基配列の決定 
 BigDye Terminators v1.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems) お
よび ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) を用いて塩
基配列を決定した. 精製プラスミド DNA (150～300 ng), rTax Fw あるいは
rTax Rv (最終濃度 3.2µg), 5×sequencing buffer 2µl, premix solution 4µl
に滅菌精製水を加え, 全量を 20µl に調製した. iCycler を用いて 96℃ で 5 分
間熱変性させた後, 96℃ 30 秒, 50℃ 5 秒, 60℃ 4 分の反応を 25 回繰り返し
反応液に 125 mM EDTA および 99.5%エタノールをそれぞれ 5µl および
60µl 加えて転倒混和後,室温で 15 分間静置した. 15,000×g, 30 分間遠心して
得た沈殿を 70%エタノールで洗浄し, 真空乾燥した後, Hi-DiTM formamide 
(Applied Biosystems) を 20µl 加えて 95℃で 2 分間加熱した. 氷中で冷却後, 
ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer を用いたキャピラリー電気泳動に供し
た. DNA の塩基配列は ABI PRlSM310 の付属ソフトを用いて決定した.  
 ( 11 ) 細胞 
 ラット株化線維芽  (Rat-1) 細胞は理化学研究所バイオリソースセンター
か ら 購 入 し た . 細 胞 の 培 養 に は 10%ウ シ 胎 児 血 清  (FCS) を 添 加 し た
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)  (日水) を使用した. 細胞の
培養は 37℃, 5%CO2 下で行った. 
 ( 12 ) Tax 持続発現細胞の樹立 
pL233-Tax, pP233-Tax および対照として pcDNA3.1 (+) を Rat-1 細胞に
トラ ン スフ ェク ト した . すな わ ち , Lipofectamine® 3000  (Invitrogen)  
1.5µl および Opti-MEM® Medium (Gibco™) 51.5µl を混合したチューブを
用意し, もう一方のチューブには Opti-MEM® Medium 50µl に プラスミド
溶液 1µg/µl および P3000 Reagent 2µl を混合した DNA 溶液を用意した. こ
れらを混合し, 室温に 5 分間放置した. 混合溶液 100µl を 12-well culture 
plate (Nunc) に前日播種し, 70-90%コンフルエントとなった Rat-1 細胞に滴
下した. 24 時間培養後, 10%FCS, 500µg/ml G418 含有 DMEM に置換して 
5～6 週間培養した. これらを L233-Tax 発現細胞, P233-Tax 発現細胞およ
び対照細胞とした. 位置効果による発現量の偏りを避けるため, トランスフ
ェクタントの各プールを以下の実験に供した. 
 ( 13 ) リアルタイム PCR 
 Trizol Reagent  (Invitrogen) を用いて Tax 持続発現細胞から総 RNA を
抽出し, Recombinant RNase Inhibitor  (TaKaRa)  1µl  (40U/µl)  の存在
下で DNaseI  (TaKaRa)  2µl  (5U/µl)  処理を行った. 内部標準として
Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase  (GAPDH)  遺伝子を用いた. 
細胞総 RNA 20µl を GAPDH-Rv  (5’-GAAGACGCCAGTAGACTCCA-3’)  
お よ びtax7808R  (5’-GGACCATACGTGTAACCGGTC-3’)  と 共 に
SuperScriptⅢ RT  (Invitrogen)  1µl  (200units/µl ) を用いた逆転写反
応に供した (50℃, 1hr) . リアルタイム PCR は, CFX Connect Real-
TimeSystem  (Bio-Rad) を 用 い て マ ニ ュ ア ル に 従 い 実 施 し た . Sso 
Advanced Universal SYBR Green Supermix  (Bio-Rad) を 用 い て Tax 
cDNA の増幅は両 tax 遺伝子に共通する塩基配列に相補的なプライマー対
taxFw3  (5’-GCCCAGCTACTTGTATTCTACCC-3’) および tax7808R を用
いて実施した. GAPDH cDNA 増幅用のプライマーには GAPDH-Rv  (5’-
CAACGACCCCTTCATTGACC-3’) および GAPDH-Rv を用いた. 各増幅反
応の特異性を確かめるため, PCR 産物は融解曲線分析にかけた. 測定は 3 回
行い, サイクル閾値比較  (CT)  法 31) を用いて Tax 発現細胞間の転写レベ
ルを比較した. 
 ( 14 ) レポーターアッセイ 
L233-Tax 発現細胞, P233-Tax 発現細胞および対照細胞を各々5×10⁴ 
cell/well となるように 24-well culture plate  (Nunc) に播種した. BLV LTR 
の下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子を挿入したレポーターベクターpGL-
LTRluc33) 0.45µg, 内部標準としてウミシイタケルシフェラーゼ (Rluc) を
発現する pRL-TK (Promega) 0.05µg および FugeneHD® (Promega) 1.25µl
を加え, DMEM で 25µl とした. 混和後, 室温に 15 分間放置し, 80%コンフ
ルエントとなった Tax 発現細胞および対照細胞に滴下した. プレートシェー
カーで 1 分間混合後, 37℃で 48 時間培養した. 培養上清を除き, リン酸緩衝
生理食塩水 (PBS; 137mM NaCl, 10mM Na2HPO4, 2.7mM KCl, 1.8 mM 
KH2PO4, pH 7.4) で 2 回洗浄した. Dual-Glo® Luciferase Assay System 
(Promega) に添付されている Passive Lysis Buffer を 5 倍に希釈し, 1 穴あ
たり 100µl ずつ加えた. プレートシェーカーで 15 分間混和し, 細胞膜を溶解
した. 上清を白色の 96-well assay plate (Nunc) に 75µl ずつ分注し, キット
に付属の Luciferase Assay ReagentⅡを 75µl ずつ加え, Tecan Infinite 
M1000 (TECAN) を用いて発光量を測定した. その後, 100 倍希釈した
Stop&Glo 試薬を 75µl 加えて 10 分間インキュベートし, 内部標準としてウ
ミシイタケルシフェラーゼによる発光量を測定した. なお, レポーターの陰
性対照としてホタルルシフェラーゼ遺伝子のみでプロモーターを欠く pGL3 
(Promega) を用いた. 実験は 3 穴ずつ行った. 各細胞で認められたルシフェ
ラーゼによる発光量をウミシイタケルシフェラーゼによる発光量で除してト
ランスフェクション効率を補正し, ルシフェラーゼ活性を比較した. 
 ( 15 ) ゲノム損傷の検出 
Tax 発現細胞における二本鎖ゲノム損傷は Trevigen 社の Comet assay kit 
(#4250-050-K) を用いた中性単一細胞ゲル電気泳動法 (コメットアッセイ) 
により評価した. すなわち, 各 Tax 発現細胞を 0.25％トリプシン-0.02％ 
EDTA で分散し, 10% FCS 加 DMEM で洗浄した後, 3.0×103 個を 37℃に保
持したキットの LMAgarose150µl に懸濁した. これを高撥水性フッ素樹脂ベ
ースインクでコートした 10 穴スライドグラス (6 ㎜φ)  (Matsunami Glass 
Ind.,Ltd.) に載せた. アガロースを固化した後, スライドグラスをキットの
Lysis Solution に浸し, 暗所で 4℃ 1 時間放置した. これを 4℃で TAE 緩衝
液に 15 分浸漬後, 21V で 30 分間電気泳動を行った. 次いで, 2 回の滅菌精製
水浸漬 (5 分間) した後, 70％エタノールで 30 分間脱水した. アガロースが
十分に脱水されたことを確認した後, SYBR™ Gold Nucleic Acid Gel Stain 
(ThermoFisher) で染色し, 蛍光顕微鏡下で撮影した. Image J を用いてオー
プンソースソフトウェア (OpenComet: http://cometbio.org/index.html) に取
り込み, 各蛍光像のピクセル数を計測した.１スライドにつき 150 回程度撮
影し, コメット尾部のピクセル数を総ピクセル数で除し, 核から漏出した
tail DNA %を求めた (Fig. 6).  
Fig. 6. Typical damaged DNA in comet. The DNA damage is quantified by 
measuring the displacement between the genetic material of the nucleus 
('comet head') and the resulting 'tail'.  Tail Moment and Tail DNA% are 
the two most common parameters to analyze Comet assay results. At least 
50-100 cells should be analyzed per sample. In this experiment, Tail 
DNA % was used. Tail DNA%= (No. of tail pixel/no. of total pixel) ×100. 
 ( 16 ) 軟寒天コロニー形成試験 
 Tax 発現細胞の足場非依存性増殖能を調べるため, 軟寒天内コロニー形成
試験を行った. Tax 発現細胞および対照細胞 3×105 個を 0.3% agarose, 15% 
FCS, 500µg/ml G418 を含む 1ml の DMEM に懸濁し, 予め 0.5% agarose, 
15% FCS, 500µg/ml G418 添加 DMEM を固化させた 6cm シャーレに播種し
た. 6 週間培養後, 暗視野で低倍率の顕微鏡下撮影し, 形成されたコロニーの
断面積を ImageJ により測定した.  
 ( 17 ) 統計解析 
レポーターアッセイおよびコメットアッセイのデータは, 平均値±標準偏
差で示した. 各データの比較は one-way ANOVA により行い, p＜0.05 を有
意とみなした. 軟寒天コロニー形成試験の成績は順位和検定により比較した.  
3 ) 結果 
 ( 1 ) Tax のアミノ酸配列の確認 
L233-Tax および P233-Tax を発現するベクターpL233-Tax および
pP233-Tax の塩基配列を調べた結果, 両者は Tax の 233 位アミノ酸を除き
全て同一の配列をコードすることが確認された.  
 ( 2 ) L233-Tax および P233-Tax 持続発現細胞の樹立 
 Tax233 位アミノ酸の Leu→Pro  (L233P) 変異がその機能に及ぼす影響
を調べるため, ラット株化線維芽細胞に L233-Tax または P233-Tax を発現
するプラスミドをトランスフェクト後, G418 で選択し, 薬剤耐性細胞株を
得た. 両 tax 遺伝子に共通なプライマーを用いたリアルタイム PCR により
それぞれの転写量を調べた. その結果, pL233-Tax 形質転換細胞における
GAPDH mRNA および tax mRNA の CT 値はそれぞれ 14.19±0.119 およ
び 30.79±0.069 であった. 同様に, pP233-Tax トランスフォーマントにお
けるそれらは, それぞれ 15.48±0.639 および 32.18±0.255 であった (Fig. 
7) . 両形質転換細胞における内部標準遺伝子の転写量と tax 遺伝子の転写量
の差ΔCT は, 16.60 および 16.70 であった. したがって, 両形質転換細胞で
はほぼ等量の tax mRNA が転写されていることが確認された. tax 遺伝子を
含まないベクターでのトランスフェクションにより G418 耐性となった対照
細胞では, GAPDH 遺伝子および tax 遺伝子に対応するプライマーで増幅
された産物の CT 値はそれぞれ 17.38±0.394 および 30.41±0.111 であっ
しかしながら, tax 遺伝子プライマーによる産物の解離曲線は, 明らかに異
なるメルトピークを示したことから非特異産物であることが確認された 
(Fig. 8).  
Fig. 7. Quantitation of Tax mRNA transcription in the transformant cells. 
In the present study, we carried out real time RT-PCR to estimate Tax 
expression in the cells. ΔCt value, which indicates difference of threshold 
cycle number between internal control gene and Tax gene, in L233 -Tax-
expressing cells was 16.7 and that of P233-Tax was 16.6. Since there was 
little difference between the cells, these cells seemed to produce 
comparable amount of Tax.   
Control 
Control 
A B A:GAPDH 
B:Tax 
Fig. 8. Melt peak of PCR products in the transformant cells. Although 
some amplicons were observed in control cells using Tax gene specific 
primers, their melting curves were different from those from Tax mRNA, 
indicating non specific amplification. 
Control 
GAPDH 
( 3 ) L233-Tax および P233-Tax の BLV-LTR に対するトランスアクチベー
ション活性 
Tax の機能的発現を確認し, L233-Tax および P233-Tax の LTR に対する
トランスアクチベーション活性を比較するため, ルシフェラーゼ遺伝子を用
いたレポーターアッセイを行った. 結果を Fig. 9 に示す. pL233-Tax および
pP233-Tax により形質転換した細胞で検出された発光量は, それぞれ
712.984±313.172 および 1665.017±425.161 であった. 一方,pcDNA3.1(+) 
による形質転換細胞のそれは 123.340±69.603 であった. 両 Tax 形質転換
細胞は対照に比べ有意に高い活性を示したことから, これらは機能的な Tax
を持続的に発現していることが確認された. 一方, P233-Tax 発現細胞は, 
L233-Tax 発現細胞に比べ有意に高いルシフェラーゼ活性を示した. mRNA
の転写量がほぼ同等であったにもかかわらず, LTR に対するトランスアクチ
ベーション活性は P233-Tax の方が有意に高かったことから, L233P 変異に
より Tax のウイルス遺伝子に対するトランスアクチベーション活性は増大
することが分かった.  
Fig. 9. Transactivation of transcription from LTR. A luciferase reporter 
gene assay was carried out to assess the transactivation activity of the Tax 
protein directed to the BLV LTR. Rat fibroblast cell lines transformed by 
pcA95/L233, pcA95/P233, or pcDNA3.1(+) were transfected with the 
reporter plasmid pGL-LTRluc and the reference plasmid phRL-TK. Cells 
were harvested 48 h later, and firefly luciferase activity was measured and 
normalized to Renilla luciferase activity. Data are presented as the 
average and standard deviation from three independent transfections.  
Control 
 ( 4 ) Tax 発現細胞におけるゲノムの損傷 
DNA の損傷には塩基の変化, 同一鎖上あるいは相補鎖間の架橋, 鎖の切断
があり, これらは細胞内における生理的条件下でも恒常的に生じている. 本
章で実施した中性条件下でのコメットアッセイでは, DNA の二本鎖切断が検
出される. Fig. 10 に Tax 発現細胞および対照細胞をコメットアッセイに供し
た泳動像を示す. 両 Tax 発現細胞, 対照細胞ともに DNA が核外へ漏出して
いたことから, プラスミドの挿入によりゲノム DNA の二本鎖切断が誘導さ
れている可能性が示された. OpenComet による定量の結果, 両 Tax 発現細胞
とも対照細胞に比べ Tail DNA%が有意に大きな値を示していた (Table 2). 
したがって, Tax はプラスミド挿入による宿主細胞ゲノム DNA の二本鎖切
断を促進することが確認された. さらに, L233-Tax 発現細胞および P233-
Tax 発現細胞の平均 Tail DNA%に有意差が認められたことから, L233-Tax
の方が宿主細胞のゲノム DNA に二本鎖切断を誘発しやすいものと考えられ
Fig. 10. Tax-induced DNA damage was measured by a comet assay. The 
experiments were repeated three times. To obtain enough cell counts for 
statistical analysis, at least 600 cells in each sample were counted. The 
bar indicates 100µm. 
Control 
Tax Tail DNA % 
 P233 58.96±6.25 (n=639)  
 L233 59.74±6.09 (n=687)  
 Control 57.96±6.19 (n=646)  
Table 2. DNA damage in Tax-expressing cells 
p<0.05 
p<0.01 
 ( 5 ) Tax 発現細胞の足場非依存性増殖 
 血球系細胞を除くすべての正常細胞は, 細胞外マトリックスを足場にして
増殖する.33) しかし, がん化に伴い細胞は足場なしに増殖する能力を獲得し, 
転移が可能となる. 本章では Tax 発現細胞の悪性度を評価するために軟寒天
内でのコロニー形成能を調べた. その結果, いずれの Tax 発現細胞および対
照細胞も軟寒天内でコロニーを形成した (Fig. 11) . 両 Tax 発現細胞間では
コロニー出現頻度に大きな差は認められなかった. 一方, 対照細胞では直径
20µm (1200µm2) を超えるコロニーの数は明らかに少なかった. 次いで, コ
ロニーの断面積を測定したところ, P233-Tax 発現細胞の最頻値は 4,000-
8,000µm2 であったのに対し, L233-Tax 発現細胞では 2,000-4,000 平方 µm2
が最頻値であった. 一方, 対照細胞では 1,000-2,000µm2 が最頻値であった 
(Fig. 12). 順位和検定の結果, L233-Tax 発現細胞と P233-Tax 発現細胞の間
で有意差が認められた. したがって, P233-Tax 発現細胞は L233-Tax 発現細
胞に比べて足場非依存性増殖能が高いことがわかった.  
Fig. 11. Anchorage independent growth of Tax expressing cells. Tax-
expressing cells or control cells were seeded in soft agar to evaluate 
anchorage-independent growth ability. Five weeks after seeding, the cross-
section areas of colonies were analyzed using ImageJ. The assay was 
carried out in quadruplicate, and the data presented are total numbers of 
well-defined colonies in the four individual plates. The bar indicates 
100µm. 
pcDNA 
Fig. 12. Frequency distribution of colony cross-sectional area in Tax-
expressing cells. The results show that P233-Tax-expressing cells formed 
larger colonies (peak between 4,000 and 8,000 μm2 in cross-section areas) 
compared with L233-Tax-expressing cells (peak between 2,000 and 4,000 
μm2), although both formed colonies at a similar frequency. 
Cross section area (µm2)  
No. of colony 
 ( 4 ) 考察 
本章では, BLV による白血病の発症機構を明らかにするため, L233-Tax お
よび P233-Tax を持続的に発現するラット線維芽細胞を樹立した. また, 対
照細胞として空の発現ベクターで G418 耐性となった細胞を用いた. これら
をコメットアッセイおよび軟寒天コロニー形成試験に供し, 宿主細胞ゲノム
への損傷活性および発現細胞の足場非依存性増殖能を比較評価した.  
Tax の機能的発現を確認するため, BLV LTR の下流にルシフェラーゼ遺伝
子を挿入したレポーターベクターを各細胞に導入した. その結果, 両 Tax 発
現ベクターで形質転換した細胞は対照細胞に比べ有意に高い活性が認められ
た. したがって, これらの細胞では Tax が機能的に発現していることが確認
された. また, P233-Tax 発現細胞は, L233-Tax 発現細胞に比べ有意に高いル
シフェラーゼ活性を示した. 一方, リアルタイム PCR では, 両 Tax 発現細胞
間で mRNA の転写量にほとんど差は認められなかった. したがって, P233-
Tax は L233-Tax に比べウイルス遺伝子に対するトランスアクチベーション
能が高いものと考えられる. 今後, トランスアクチベーション活性を正確に
比較するため, 適切な抗 Tax 抗体を作成して分子当たりの活性を調べる必要
がある.  
コメットアッセイでは, 対照細胞においてもゲノムの損傷が検出された. 
プラスミド DNA の挿入によって宿主細胞のゲノムが不安定になり, 二本鎖
切断が生じたものと考えられる. Tax 発現プラスミドを挿入された細胞では
より多くの DNA の漏出が認められた. HTLV-1 の Tax は宿主細胞の分裂時
にゲノム二本鎖切断を誘発することが報告されている.34)  BLV の Tax も同
様に宿主ゲノムに二本鎖切断を生じさせているものと考えられる. また, 
L233-Tax 発現細胞は P233-Tax 発現細胞に比べ有意にゲノムの損傷が大き
かった. したがって, L233-Tax はトランスアクチベーション活性が低い一方, 
P233-Tax より宿主細胞ゲノムに対する損傷能が大きいことが示唆された. 
二本鎖切断の修復は相同組換あるいは非相同末端結合 (non-homologous 
end joining: NHEJ) によって行われる. しかしながら, NHEJ ではしばしば
塩基の欠損を伴うため, 修復が変異の原因となることがある. DNA 損傷の修
復に失敗した細胞ではアポトーシスが誘導されるが, 一部は染色体異常など
重大な損傷に進展すると考えられている. 35)  したがって, L233-Tax は腫瘍
化のイニシエーションにおいて P233-Tax に比べ大きな役割を果たすことが
示唆された.  
軟寒天コロニー形成試験は細胞の足場非依存性増殖能を評価する試験法で
あり, in vivo における腫瘍形成能とよく相関する in vitro の実験系として認
められている. 36)  本研究では, 両 Tax 発現細胞および対照細胞のいずれも
足場非依存性増殖能を獲得したことが示された. しかしながら, 対照細胞で
は直径 20µm を超えるようなコロニーの発現頻度は両 Tax 発現細胞に比べて
明らかに低かった. 対照細胞では, ゲノムへのプラスミドの挿入による c-
onc 遺伝子の活性化, あるいはがん抑制遺伝子の不活化により足場非依存性
増殖能を獲得したのかもしれない. 一方, Tax 発現プラスミドによる形質転
換細胞ではプラスミド挿入による影響に加え, Tax の機能的発現によってコ
ロニー出現頻度が増加したものと考えられる. さらに, P233-Tax 発現細胞は
L233-Tax 発現細胞に比べ有意に大きなコロニーを形成した. したがって, 
P233-Tax 発現細胞は in vitro では L233-Tax 発現細胞に比べ悪性度が高い
ものと考えられる. P233-Tax は, 腫瘍のプロモーションでは L233-Tax より
大きな役割を果たす可能性がある.  
本章では, BLV の Tax が宿主細胞ゲノムの不安定化および足場非依存性増
殖能の付与に働くことを示した. L233-Tax と P233-Tax を比較したところ, 
ゲノムの不安定化では L233-Tax が, 足場非依存性増殖能付与では P233-Tax
がより大きな役割を果たすことが示唆された.  
第 2 章  Tax の in vivo における腫瘍原性と Tax 発現細胞が産生する液性因
子の生物活性 
1 ) 緒言 
 腫瘍はイニシエーション, プロモーション, プログレッションの 3 段階を
経て進展する. 前章では BLV のウイルス転写活性因子である Tax が宿主細
胞のゲノム損傷および足場非依存性増殖能の付与において重要な役割を果た
すことを示した. さらに, ゲノムの損傷では L233-Tax が, 足場非依存性増殖
能付与では P233-Tax がより大きな活性を有することが示唆された. すなわ
ち, 腫瘍化のイニシエーションにおいては L233-Tax が, プロモーションに
おいては P233-Tax がより大きな役割を果たすものと考えられた. Inoue ら
は, L233-Tax をコードする BLV は P233-Tax をコードするウイルスに比べ
EBL の潜伏期が短い可能性を示した. 30) BLV 感染牛の多くは不顕性に経過
するが, 約 1/3 では B 細胞がポリクローナルに増殖してリンパ球増多症を呈
し, 数％がモノクローナルな B 細胞性リンパ腫を発症する. EBL の大部分で
は, モノクローナルな B リンパ腫細胞による多発性肉腫として認識される.  
 悪性新生物は, 正常組織と同様, 栄養素および酸素の供給, あるいは老廃
物および二酸化炭素の排出を必要とする. そのため, これらを支持する新た
な血管系を構築する必要がある. また, このような血管は腫瘍の転移におい
ても重要な役割を果たす. 26) 血管系の発達は既存の血管から新たな血管の形
成（angiogenesis:血管新生）に加えて, 内皮細胞の分化による新たな血管の
形成（vasculogenesis:脈管形成）を含む.36) しかしながら, これらは創傷治癒
過程や生理的状態では発生等の限られた時期においてのみ認められる. 一方, 
腫瘍形成時には血管新生は常に活性化され, 新生血管の増殖を持続するため
の新たな血管内皮細胞を持続的に発芽させる.26) 本章では, BLV 感染リンパ
腫細胞の生体内における増殖および腫瘍形成と Tax の機能の関連を明らかに
するため, 両 Tax 発現細胞をヌードマウス皮下に移植し, その L233P 変異が
及ぼす影響を調べた.   
2 ) 方法 
( 1 ) 細胞 
第 1 章 2)-(6)で樹立した L233-Tax および P233-Tax 発現 Rat-1 細胞なら
びに対照細胞を 10％FCS および 500µg/mL G418 添加 DMEM で培養した. 
ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）は PromoCell から購入し, Endothelial Cell 
Growth Medium 2（PromoCell）で培養した. 実験には 5-6 代継代したもの
を用いた.  
( 2 ) ヌードマウス皮下移植実験 
 4 週齢雌の BALB / C（nu / nu）マウスを CLEA JAPAN から購入し, 1 週
間の馴致後, 実験に供した. 全ての動物実験は, 北海道医療大学動物実験委
員会のガイドラインのもとで行った (承認番号:平成 27 年度 第 083 号). 80％
コンフルエントの L233-Tax および P233-Tax 発現細胞ならびに対照細胞を
0.25％トリプシン-0.02％EDTA で分散し, 10％FCS 加 DMEM で洗浄した. 
DMEM に懸濁した後, 5×106 を各々10 匹のマウスの背側部皮下に接種した. 
6 週間後, 400µg/body weight g 以上のペントバルビタールナトリウム溶液を
腹腔内に投与してマウスを安楽殺した. 腫瘍を摘出後, その重量を測定した. 
一部は以下の免疫組織化学染色に供した.  
( 3 ) 免疫組織化学染色 
 腫瘍内の微小血管構造を調べるため, 血管内皮細胞マーカーである CD31
に対する抗体を用いた免疫組織化学染色を行った. すなわち, 腫瘍組織を
10％ホルマリンで 1 週間固定し, パラフィン包埋後, 3µm に薄切して組織切
片とした. 脱パラフィン後, 切片を 0.01M クエン酸緩衝液（pH6.0）中で
121℃10 分間加熱した. 3％H2O2 を含むメタノールに 30 分間浸漬して内因性
ペルオキシダーゼを不活性化した後, 3％ウシ血清アルブミンを含む PBS で
30 分間ブロックした. ウサギ抗マウス CD31 抗体(希釈, 1:50; Abcam）を作
用させ, 室温に 1 時間放置した. 洗浄後, ホースラディッシュ・ペルオキシダ
ーゼ標識抗ウサギ IgG 抗体（Dako）を 30 分間作用させた. 次いで, DAB + 
Substrate Chromogen System（Dako）を用いて発色を行い, CD31 抗体を検
出した. 切片をマイヤー・ヘマトキシリン溶液で対比染色した. 免疫組織化
学染色は札幌総合病理研究所に委託した. 光学顕微鏡下で撮影し, 単一また
は CD31 陽性細胞のクラスターを血管とみなした. 40 倍で血管の密集する部
位を 3 ヶ所選定し, 400 倍下で血管数を計測して, 微小血管密度（微小血管/ 
mm2, MVD）を決定した. 
( 4 ) 血管内皮細胞チューブ形成試験 
HUVEC を用いた本実験は血管新生誘導因子の in vitro 評価系として賞用
される. 37) 80％コンフルエントの L233-Tax または P233-Tax 発現細胞およ
び対照細胞を PBS で 3 回洗浄し, Ham’s F12（Gibco™）と DMEM を等量混
合 し た 培 地 （ H-DME）に置換し た . 48 時間 培養後 , 上清 (Conditioned 
medium:CM) を 回 収 し , 使 用 す る ま で -80 ℃ で 保 存 し た . µ-Slide 
Angiogenesis（ibidi）の各ウェルを 10µl の Matrigel（カタログ番号 356231; 
BD Biosciences）で満たし, 37℃で 60 分間放置してゲル化した. これに, 50µl
の各 CM に懸濁した 2×104 個の HUVEC を添加した. 20 時間培養後, 光学
顕微鏡下で撮影し, Image J を用いて HUVEC により形成されたチューブの
長さを測定した. 
( 5 ) 走化性試験 
 Endothelial cell Growth Medium 2 で HUVEC を 8×105 cells/ml に調製
し, µ-Slide Chemotaxis 3D（ibidi）の観察領域に付着させた. H-DME で 2
回洗浄した後, 第 1 リザーバーを H-DME で満たした. 次いで, 第 2 リザー
バーは CM で満たし, 37℃に保持した(Fig. 13). 細胞の付着した視察領域を
光学顕微鏡下で 60 分毎に 10 時間まで撮影し, 各細胞の位置をトレースした. 
走化性指数は, 10 時間の総移動距離に対する第 2 リザーバー側への移動距離
の比として算出した.  
( 6 ) 統計 
 マウス皮下移植実験および免疫組織化学染色, 血管内皮細胞チューブ形成
試験のデータは, 平均値±標準偏差で示した. 各データの比較は one-way 
ANOVA を用いて行い, p<0.05 を有意とみなした. 走化性試験のデータはフ
ィッシャーの正確確率検定を用いて比較した.  
Fig. 13. Chemotaxis chamber used in this chapter. 
3 ) 結果 
( 1 ) ヌードマウス皮下移植実験 
 L233-Tax または P233-Tax 発現ラット株化繊維芽細胞および対照細胞 5×
106 個を, ヌードマウスの背側皮下に接種した. 6 週間後, 両 Tax 発現細胞お
よび対照細胞を移植したすべてのマウスで腫瘍が形成された(Fig. 14). L233-
Tax 発現細胞を移植されたマウスの多くでは, 表面に血管を伴った不規則で
大きな腫瘍が形成された. 一方, P233-Tax 発現細胞および対照細胞により形
成された腫瘍の表面に血管は認められなかった. また, P233-Tax 発現細胞由
来の腫瘍は不規則な形のものが多かったが, 対照細胞のそれは卵円形に近い
ものが多かった. 腫瘍重量を比較したところ, L233-Tax 発現細胞由来腫瘍の
平均重量は 3.83±0.77g（n=10）であったのに対し, P233-Tax 発現細胞およ
び対照細胞はそれぞれ 0.84±0.20g （n=10）および 0.33±0.13g （n=10）
であった（P<0.01）. また, P233-Tax 発現細胞由来腫瘍と対照細胞由来腫瘍
のそれの間では P<0.05 で有意差を示した (Fig. 15).  
Fig. 14. Appearance of tumor derived from BLV-Tax expressing cells. Five-
week-old athymic nude mice were inoculated subcutaneously with either 
of the Tax-expressing cells or control cells. Images of animals at six weeks 
after inoculation. The arrow indicates invasion of blood vessels. Six weeks 
later the mice were euthanized and the tumor extraction. 
L233 P233 Control 
Fig. 15. Comparison of weight of the tumors. Tumors were excised and 
weighed, and the data presented are the average and standard deviation 
of 10 tumors.  
( 2 ) 免疫組織染色 
 ヌードマウス皮下に形成された腫瘍内の微小血管を検出するため, 血管内
皮細胞のマーカーである CD31 に対する抗体を用いた免疫組織化学染色を行
った. 腫瘍表面に伸びる血管の有無にかかわらず, 両 Tax 発現細胞および対
照細胞では多数の微小血管がすべての腫瘍において観察された(Fig. 16.). 
L233-Tax 発現細胞由来腫瘍内の微小血管数の平均値は 1100±190.8 (n=10), 
P233-Tax 発現細胞および対照細胞はそれぞれ 1300±81.6 (n=10)および
1113.4±63.4 (n=10)であった. したがって, L233-Tax 発現細胞, P233-Tax 発
現細胞および対照細胞由来腫瘍の間に MVD の有意な差は認められなかった 
（Fig. 17）.  
Fig. 16. CD31-positive cells in the tumors. Immunohistochemistry using 
anti-CD31 antibodies was performed in tumors derived from Tax-
expressing cells or control cells. Representative images of three individual 
sections are shown. The bar indicates 50 μm. 
L233 P233 Control 
Fig. 17. Comparison of microvessel density in the tumors. Single cells or 
clusters of cells positive for CD31 were considered a vessel. MVD 
(microvessels/ mm2) was determined from three hot spots, and the data 
presented are the average and standard deviation 
Control 
Control 
( 3 ) チューブ形成試験 
 ヌードマウス皮下に腫瘍を形成した細胞が血管新生誘導因子を分泌してい
るか否かを調べるため, これらの細胞を 48 時間培養して得た CM を HUVEC
によるチューブ形成試験に供した. その結果, 両 Tax 発現細胞あるいは対照
細胞から得た CM 中では HUVEC は Matrigel 上によく分枝したチューブを
形成し, 網目状の構造を呈した. 一方, 新鮮な H-DME 中の HUVEC はほと
んどチューブ形成しなかった (Fig. 18). 総チューブ長の平均値は L233-Tax
発現細胞群, P233-Tax 発現細胞群, 対照細胞群, H-DME 群でそれぞれ 158.5
±15.32mm (n=6), 143.83±28.89mm (n=6), 94.33±16.79mm (n=6), 24.83
±4.8mm (n=6)であった. H-DME 中で形成されたチューブ長は, いずれの
CM 中で形成されたチューブ長より有意に短かった. 両 Tax 発現細胞間およ
び P233-Tax 発現細胞群と対照細胞群から得た CM の間ではチューブ長に有
意差は認められなかった. 一方, L233-Tax 発現細胞群と対照細胞群との間で
は有意差が認められた（Fig. 19）. 
Fig. 18. Vascular endothelial cell tube formation assay. Endothelial cell 
tube formation assays were performed using HUVEC and CM from Tax-
expressing cells or control cells. The cells were suspended in CM and 
placed onto Matrigel in a well of a μ-Slide Angiogenesis chamber slide, and 
cell morphology was examined under a light microscope 20 h later. The 
bar indicates 1 mm. 
L233 P233 
pcDNA Control 
Fig. 19. Comparison of total length of tube derived from HUVEC. The total 
tube length in each well was measured, and the data presented are the 
average and standard deviation of four individual wells.  
pcDNA 
H-DME 
 ( 4 ) 走化性試験 
両 Tax 発現細胞および対照細胞ともにヌードマウス皮下に腫瘍を形成し, 
その内部の微小血管環境に大きな差は認められなかった. 一方, L233-Tax 発
現細胞由来腫瘍のみで目視可能な血管の挿入が認められた. そのため, 各細
胞の CM を HUVEC に対する走化性試験に供し, 血管内皮細胞誘引物質の有
無を調べた. 1 時間毎に記録した HUVEC の軌跡を Fig. 20 に示す. L233-Tax
発現細胞由来 CM に対しては 32 個の HUVEC 中 21 個 (65.6％) が正の走化
性を示したのに対し, P233-Tax 発現細胞のそれに対しては 35 個中 14 個 
(42％) のみであり, 有意な差が認められた. さらに, L223-Tax 発現細胞の
CM 側への HUVEC の移動度の平均値は 51.05±17.64 µm であったのに対
し, P233-Tax 発現細胞の CM に対しては－8.16±13.85 µm であった 
(p<0.01). 走化性指数の比較では, L233-Tax 発現細胞 CM では HUVEC のほ
とんどが正方向に移動しているのに対し, P233-Tax 発現細胞および対照細胞
の CM では多くの HUVEC が原点付近にとどまっていた (Fig. 21).  
Specific migration (m) 
Control 
H-DME 
H-DME 
H-DME 
Fig. 20. Chemotaxis assays using HUVEC. HUVEC were attached to the 
observation area in a μ-Slide Chemotaxis 3D chamber slide, and the direction of 
cell migration was examined at 60-min intervals for 10 h. Trajectory plots of the 
cells that migrated in response to the CM are indicated. The black lines show the 
trajectory that has moved to the CM side, and the red lines that have moved to 
the H-DME side. Note that concentration gradients decrease from top to bottom.  
Fig. 21. Comparison of specific mobility of HUVEC. Chemotaxis assays 
were performed using HUVEC and CM from Tax-expressing cells or 
control cells. Box plots showing the distribution of the chemotactic index 
of the cells. Upper horizontal line of the box, 75th percentile; lower 
horizontal line of the box, 25th percentile; horizontal bar within the box, 
median; notch, 95% confidence interval for the actual mean; upper 
horizontal bar outside the box, the highest datum still within the 
interquartile range (IQR) × 1.5 of the upper quartile; lower horizontal bar 
outside the box, the lowest datum still within 1.5 IQR of the lower quartile. 
Triangles represent outliers not included between the whiskers. 
Control 
3 ) 考察 
BLV の Tax は白血病発症に重要な役割を果たすと考えられているが, その
詳細はいまだ解明されていない. 当研究室では以前, Tax の L233P 変異が
BLV の病原性と強く関連していることを報告した.30）前章では Tax の腫瘍原
性を宿主細胞ゲノム損傷能および軟寒天コロニー形成能により評価し, イニ
シエーションにおいては L233-Tax が, プロモーションにおいては P233-Tax
がより強い活性を示す可能性を示した. 本章では腫瘍のプログレッションに
おける Tax の役割を明らかにするため, 両 Tax 発現細胞および対照細胞をヌ
ードマウス皮下に移植した. さらに, HUVEC を用いたチューブ形成試験お
よび走化性試験によって各細胞が産生する液性因子の活性を評価した. その
結果, L233-Tax 発現細胞は P233-Tax 発現細胞より著しく大きな腫瘍を形成
することが分かった. 対照細胞もごく小さな腫瘍を形成したが, いずれの細
胞に由来する腫瘍内部においても微小血管環境の差は認められなかった. 一
般に, 腫瘍組織内では低酸素誘導因子(HIF)を含む非特異的な反応による腫
瘍血管内皮細胞(TEC)の血管新生が誘導される.38) また, HUVEC を用いたチ
ューブ形成試験においては, 両 Tax 発現細胞および対照細胞の CM で網目状
の構造を呈し, 総チューブ長の有意差は L233-Tax 発現細胞と対照細胞との
間で認められたのみであった. したがって, ヌードマウス皮下に形成された
腫瘍組織内の微小血管環境の構築には Tax の寄与は少ないものと考えられた. 
また, L233-Tax と P233-Tax 間では差が認められなかった. したがって, こ
れらの腫瘍で認められた血管新生は HIF などの非特異的因子が作用した結
果と考えられる.   
血管新生誘導能では差が認められなかったにもかかわらず, L233-Tax 発現
細胞由来腫瘍では著明な新規の脈管形成が認められた. 病的な脈管新生では
既存の血管からのみならず末梢あるいは骨髄の血管内皮前駆細胞を誘引する
ことによっても生じる.39) HUVEC を用いた走化性試験の結果, L233-Tax 発
現細胞のみが明らかに誘引物質を分泌していることが示された. したがって, 
ヌードマウスに移植された L233-Tax 発現細胞は, マウスの血管内皮前駆細
胞を初期の微細な腫瘍に誘引することによって新規の脈管を形成させ, 大量
の栄養素および酸素の運搬路を確保し, 腫瘍を成長させたものと考えられる.  
BLV の Tax は, がん原遺伝子 c-fos の活性化およびアポトーシス促進遺伝
子 bcl-2 の抑制 9-11) を含む多数の細胞遺伝子の発現を調節し, ヒツジ B 細胞
を IL-4 非依存性に不死化する.40) Tax はまた, DNA 二本鎖切断の修復を阻害
し, それによって細胞 DNA に変異を蓄積させることが示されている.28) し
かしながら, Tax の mRNA はリンパ球増多症を呈する BLV 感染牛では極め
て少数 (1/20,000 程度) の B 細胞で検出されるのみであり,41) 腫瘍において
も転写レベルは低い.42-44) そのため, BLV 感染リンパ腫細胞による腫瘍形成, 
すなわち, プログレッションにおける Tax の役割は不明であった. 本研究で
明らかになった血管内皮細胞誘引因子はごく少数の細胞が分泌するだけで十
分であり, Tax の発現量が少ないという報告と矛盾しない.  
ヌードマウス皮下移植実験の成績と EBL の潜伏期から推定された BLV の
病原性はよく一致していた. したがって, L233-Tax ウイルス感染ウシ B リン
パ腫細胞もまた血管内皮細胞誘引物質を分泌し, ウシの血管内皮前駆細胞を
誘引することによって脈管形成を誘導して腫瘍の成長を促進している可能性
が強い. P233-Tax 発現ラット繊維芽細胞と同様, P233-Tax ウイルス感染リ
ンパ腫細胞は, ほとんど血管内皮細胞誘引物質を分泌しないことが推測され
る. そのため, 脈管形成は制限されて腫瘍の成長は遅れ, EBL の潜伏期間が
2 年以上長くなるものと考えられる. さらに, 腫瘍組織への血管の侵入は腫
瘍細胞の遠隔組織への転移を容易にする. EBL の特徴は, モノクローナルな
細胞による多発性リンパ肉腫である. L233-Tax 発現細胞が分泌する血管内皮
誘引物質は腫瘍の転移, すなわちプログレッションに大きな役割を果たすこ
とが示唆される.  
本研究では, 疫学的に BLV の病原性との関連が示唆されていた Tax の
L233P 変異が Tax 発現細胞の腫瘍原性に及ぼす影響を in vitro および in vivo
において解析した. その結果, 以下の知見を得た.  
1. Tax 発現細胞は対照細胞に比べゲノムの損傷が大きかった. また, L233-
Tax は P233-Tax に比べ宿主ゲノム損傷能が高かった. したがって, BLV
による白血病発症のイニシエーションでは L233-Tax がより大きな役割
を果たすものと考えられた.  
2. P233-Tax 発現細胞は, 軟寒天中において L233-Tax 発現細胞より大きな
コロニーを形成した. したがって, 腫瘍のプロモーションにおいては
P233-Tax の方が大きな役割を果たすことが示唆された. 
3. L233-Tax 発現細胞は, ヌードマウス皮下に大きな血管を伴った腫瘍を形
成した. P233-Tax 発現細胞由来腫瘍は有意に小さく, 血管を伴わなかっ
た. L233-Tax 発現細胞は HUVEC に対する誘引物質を分泌していたこと
から, L233-Tax は腫瘍組織への脈管形成において大きな役割を果たすも
のと考えられた. すなわち, L233-Tax は腫瘍のプログレッションにおい
て重要な役割を果たすことが示唆された.  
BLV の Tax はウシ B 細胞腫のイニシエーション, プロモーションに大き
な役割を果たし, リンパ肉腫のプログレッションにも重要な役割を担うこと
が示唆された. これらの知見はデルタレトロウイルスによる白血病発症機構
を理解するうえで極めて有益と考えられ, ATL の治療法開発への応用も期待
 本研究に際して, 研究全般にわたる多大なご指導,ご鞭撻を賜りました北海
道医療大学大学院薬学研究科 岡崎克則教授に心より深く感謝致します. 
本論文を審査頂き, 数々のご助言とご指導を賜りました北海道医療大学大学
院薬学研究科 泉剛教授, 小島弘幸教授, 小林大祐准教授に感謝申し上げます. 
 本研究を遂行するにあたり, 有益なご教授を賜りました北海道医療大学薬学
部 大澤宜明准教授ならびにご退職された渡邊恵美博士に深く感謝致します.  
 本研究の実験材料をご提供いただきました茨城県県西食肉衛生検査所, (株)
群馬県食肉卸売市場の皆様に厚くお礼申し上げます.  
本論文の基礎となる報文の執筆にあたり共著者としてご協力を賜り, 基礎と
なる報文の提出に快諾していただきました富安貴史君, 西山加那子さんならび
に松本舞子さんに深く感謝致します.  
本論文を提出するにあたり, ご支援とご協力を頂きました全ての方々に心よ
り御礼申し上げます.  
令和元年 7 月 
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