CRISPR 到底是一种怎样的技术？
之前同学发我的一份儿有关这个东东的文章，贴上来： 在表观遗传学、干细胞、癌症研究如火如荼的今天，大家似乎都把目光投入了更加“高等”的生物。然而原核CRISPR系统的发现和应用却再次证明了“低等”生物的存在感——谁说这些“小东西”不能有精妙复杂的体系？ CRISPR系统不但丰富了我们对于细菌、古细菌生理机制的认知，更重要的是这种体系的改造利用能带来席卷整个分子生物学领域，更新现有操作模式的一场技术革命。同时，它也为我们打开了一扇窗，从CRISPR的角度重新认识整个微生物世界自我和相互间的调控网络、调控机制，原核及真核细胞间的异同和联系，甚至协同进化的证据。 没人能否认，这次，“小东西”的确搞出了“大名堂”。 一、初露锋芒，刮目相看 ——细菌也有“高级”的获得性免疫系统 到底什么是CRISPR？ ——它的中文名很长很拗口，和英文一样不知道怎么念，却能顾名思义，了解其基因序列上的特点，那就是——成簇的、规律间隔的、短回文、重复序列（clustered
regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。 既然是讲故事就把关子卖到最后，讲到那里再告诉大家这些定语的含义。 是个啥？ 任何伟大事物的开端（原谅我下此断言，不过看溢美之词甚盛【21】【22】，也不算过分），任何风云人物的发家，任何跌宕故事的开始，总是不起眼“其貌不扬”的，我们的主角CRISPR系统也不例外。 很多综述【3】里都把CRISPR的起源说在了1987年，还是从我们最熟悉的E.coli,最经典的K-12株系中发现的，但是本着挖祖坟的心态费劲找出这篇26年前的文章【7】来考据，却发现似乎其中只有这一点是与我们的CRISPR沾边的，就是这个回文序列。 “叫”个啥？ 这个发现纯属偶然，也没有引起包括发现者本身太大的重视，甚至这种特征序列都没有一个名字，直到2002年，在通过计算机操作发现很多原核生物（真细菌和古细菌），都有类似被21-37bp的回文重复序列间隔开的非重复序列后，他才正式有了这个顾名思义的名字CRISPR，成簇的、规律间隔的、短回文、重复序列（clustered
regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）【8】。并且除了这样的特征序列外，在他们的附近还有一写CRISPR-associated基因。也就是我们后来说的发挥大刀剪切作用和整合外源片段作用的一系列Cas蛋白。于是我们基本可以得到这样一张漂亮的模式图，并清楚了CRISPR系统中最重要的3大元件—spacer（白色方块），回文repeats（双三角），cas等基因。 “干“个啥？ 一开始，由于spacer序列种内保守，种间差异的特点，一度甚至现在【30】也在被用来鉴定菌株，回头看来虽然大材小用，但好歹也是广泛应用性的体现。 还是和大多数科学发现一样，CRISPR系统的发现经历了一个搞清：是个啥？——“叫”个啥？—— “干”个啥的过程。 现在我们已经知道他长得什么样子什么特点，可是关于这一奇怪序列是干什么的，在很长一段时间里众说纷纭。 功能显然和spacer的序列特异性有关，那么是chromosomal
rearrangement？ modulation of
expression of neighboring genes,target for DNA binding proteins,？replicon partitioning,还是DNA
repair？ 都有道理不过只是猜测，直到2005年，3个课题组独立的数据分析表明——这些spacer是外源DNA来源的，病毒或者质粒。【3】于是才让大家想，外源DNA，这会不会参与了防御外来DNA呢？ 2007年Streptococcus
thermophilus的实验证实了这一猜想，于是经过不断完善，有了我们下面这张华丽丽的示意图，一个只能用elegant形容的漂亮的免疫过程。 漂亮的获得性免疫系统——谁说这是“高等”生物的专长？ 如何解说这个漂亮的系统，我想参照我们学过的抗原抗体免疫很容易理解，这里用一个通俗的比喻（如下图3）简单讲讲。 外源DNA就是坏蛋，而抓住坏蛋特征这一最核心的步骤之一则是——靠的Cas复合体将片段特征proto-spacer制作成spacer，整合进CRISPR序列中，形成记忆。于是接下来的2次免疫中，spacer便可以快速bingding到proto-spacer上。完成这一target的精确打击过程。干掉入侵者。 估计大家也都注意到了一个特别的“帽子“ PAM（下文中也会提到）这里作为一个防止自身免疫的机理出现，不难想到当然也同时也制约了proto-spacer的选择。 图4原核生物CRISPR获得性系统工作原理图【3】 怎么样？是不是有够震撼？不夸张的说，这个流程图真的很冲击我的旧思想，谁也别“小”看原核生物啊！这么精妙的，不亚于真核的获得性免疫，不得不：1、让我们惊叹于这个奇妙的世界——造物主和原核小东西们的聪明才智。2、扪心自问——对于自然和生物，我们真的还知道的太少了。 当然，CRISPR也不是原核生物唯一的防御系统，近期的一篇NAR【15】也横向总结比较了真细菌与古细菌的各种免疫机制。但是毫无疑问的是，CRISPR的发现极大的扩充了我们对于原核生物生理机制的认知。 跟据最新的官方说法【31】目前，已经在48%的真细菌和95%的古细菌中发现了CRISPR系统。可以算得上是普遍存在了。2007年就有法国的课题组开发了一个CRISPRFinder【12】，让大家上传序列，来鉴定该基因组中是否包含CRISPR。从而统计CRISPR的在原核生物中存在的普遍性。（这里的统计数据和刚才说的有出入，尚未能证实其关系） 图5 网络工具CRISPRFinder（2013年6月5日截图） 图6 各种Type的CRISPR【16】 CRISPR系统也是有很多Type的，不同细菌中含有的CRISPR的type也不一样。上图是2013年的一篇非常棒的review当中对几种type作用机制的整理。（是不是几年之后绝对入主教科书呢？不入也没道理啊。）在这里，也要提醒大家特别注意type-II，因为后面的故事，Cas9将会扮演绝对主角。 似曾相识，本是同根生？ 看了上面的流程图，我想大家都会觉得“面熟”，没错，看了下面的一张比较图，更会觉得原核真核之间机制的相通性。也许，我们的差距没有想象中那么大。 图7和真核RNAi比较Parallels and distinctions between CRISPR RNA-guided silencing systems and
RNAi.【11】 二、 深入了解，为“我”所用，指哪打哪 ——Cas9等机理研究和工具改造 故事如果就到这里，那虽然有趣，充其量也只算是认识自然。其实，真正的好戏才刚刚开始。 随着CRISPR重要性的逐渐显现，对它的作用机理研究也一步步深入。【10】【14】【16】各个方面，各种类型的蛋白作用渐渐清楚。比如如何将spacer整合如基因组？【14】中，Csn2作用的模型建立。 图8 Csn2参与整合spacer模型 移花接木，给细菌打“疫苗”！ 于是就有人在想，既然这看起来是个不错的免疫体系，既然大肠杆菌中这个体系看似不够强悍，能不能移植啊？ 答案是肯定的。2011年，NAR杂志上，法国的一个课题组【4】正是做了这样的一件事情——将Streptococcus
thermophilus嗜热链球菌中的Type-II CRISPR系统利用质粒系统移植到了大肠杆菌当中，发挥了作用！于是他们很愉悦的得出了结论——CRISPR是可以用来给细菌打疫苗的，我们了解他的天敌，就可以主动防御，先发制人。 同时，几乎是“顺带”，他们还发现了2件事情， 1、Cas9“一粒起效”——作为唯一需要的，足以起作用的剪切蛋白（强悍性充分性）。 2、Cas9“左膀右臂“ ——起作用依赖McrA/HNH- 和RuvC/RNaseH这两个motif. 。从此Cas9也从那么多Type【16】的CRISPR的蛋白中，款款走入了我们的视线。 图9 利用质粒实现Cas9-嗜热链球菌CRISPR系统往大肠杆菌的移植 所以说第一次，他们证明了CRISPR不但可以免疫自己，还可以异源表达，免疫他人，这就是“疫苗”啊，很有意思。 然而从故事的后续发展来看（如果我梳理的逻辑中没有落掉太多东西），他们实在浪费了一块宝藏，大材小用了。而这篇文章结果的重要性也被研究者本身严重低估了。不能说他们愉悦的结论和细菌的疫苗不重要，只能说他们只看透了一层，没有看到更深的一层，没有看得更远。 为什么这么说，因为虽然他们没看到，但是有人看到了。并且真正成功的奥秘就在于那两件顺带的发现。 “一粒起效”，果断改造——从此剑锋直指！ 如果要在CRISPR系统的研究中树一块里程碑，我想【2】他是。如果要在这个故事里有个转折，我想他【2】也是。从这里开始，CRISPR的传奇将开始上演，新一代分子生物学革命的帷幕即将拉开！ 2012年8月17，一篇看似低调的Science，看那些胶图和data也没什么意思，这里用我的语言简单总结一下他们主要做了些什么： 是的，流水账一样，到这里这文章看起来没啥难度，也没啥亮点。但是，细心地你发现了吗，到这里，他们已经一步一步的把Cas9作为定向内切酶的每一步机制，方方面面都搞清楚了。 插一句，又有一个被忽略（至少在这篇文章里没大动作）的意外惊喜——2个“左膀右臂“domain是各切一条链，HNH domain 切 complementary DNA
strand， RuvC-like domain 切 noncomplementary DNA strand 。 接着说，他们把方方面面都搞清楚了，但这仅仅是一个机理研究吗？错！他们有非常明确地目的——剑锋直指！可以人为定制的特异性内切酶！为我所用，指哪打哪。 他们紧接着就利用这些发现，设计，做了体外切割GFP基因的实验，果然获得成功。并且都是按照预想的设计的切口切开，这难道不是“想切哪里切哪里，妈妈再也不用担心我的课题”？。 同时，推断由于限制性的PAM的序列NGG很常见，基本上利用的限制很少——有望可以实现见人杀人，见鬼杀鬼！并且2个必须的RNA已经可以“双剑合璧”，这样可以使构建的RNA更方便也更稳定。一个新型“大杀器“呼之欲出。 图10  crRNA 和
tra crRNA的“双剑合璧”【2】 （对了，这里要特别提到的是【13】，和【2】内容非常相似，同年9月4号的PNAS，如果没什么意外，应该是晚了一步。看来做科研，不但找准方向，下手稳准狠，动作还要快啊！） 好了，现在已经是“司马昭之心，路人皆知”了，再笨我们也猜到他们的目的了——构建一个可以按需定制的DNA定点剪切工具。然而又一次，我们要说，技术和发现放在那，决定高度的是你能看多远。（也有可能他们想到了但还没做到） “万事俱备，只欠东风”。基础已打好，序幕已拉开，热场已完成，真正的好戏就要开演了。 三、 “洲”际导弹，秒杀众生 ——多种真核、原核细胞中的基因编辑、合成生物学利器 刚才的序幕估计只是让关注该领域的人激动兴奋了一下（而且好多人也正是从关注这篇文章开始进入领域，开始抢滩），然而真正让CRISPR系统走进所有人的视野，发出不容忽视的声音，引发了震动的是接下来的两篇文章。虽然我们这个故事从头讲下来你觉得仿佛有此文章顺理成章，但是乍一看，两篇文章的成果实在太诱人，太漂亮了。也的确，短短5个月，向前迈进了一大步，重要的一大步。 虽然说是2篇文章，意义却是一个，他俩很有意思，背靠背，连着印在同期的Science上，一前一后。第1篇【1】就是丛乐学长的文章了，而第2篇【17】来头也不小，是George M. Church课题组的作品。 （应该说，可以看出第二篇文章几乎是被第一篇的文章“逼”出来的，有种赶着发没有well-organized的感觉，但其实做了很多东西，具体后面再说。其实还有杯具的同样的第3篇【18】，来晚一步，只好nature子刊了。） 这2篇文章的突破就是——在人类细胞中，成功实现了由Cas9介导的基因组定向编辑。 （注意是编辑，而非简单地剪切。嗯，Genome
Editing，是不是听起来就高端大气上档次。） “洲”际导弹，深入敌镜，精确制导，圆满完成 图11   组装导弹，直入腹地---入核导弹系统【1】 先来看看第1篇，第2篇的异同稍后再表。想在真核内实现基因组的编辑，第一步就是要进核。NLS就是潜入目标的伪装，戴了 2个帽子，一头直入腹地。当然导弹必备的爆破装置Cas9和定位装置crRNA等也必在导弹组成中。 调试导弹，精简装备 顺利完成第一波实验，继续调试导弹，居然有惊喜——装备是可以精简的，RNaseIII不是必须的，因为估计“不明真相的群众”也就是人类细胞内的同样蛋白是可以帮忙的！ 同时也发现“制导”位置不同，在一个loci中target的序列不同，效率也不同。他们也尝试了双剑合璧，但是发现组合制导效率略低。 图12 变“战后重建”为“和平殖民”，减少毒性———用HR插入新东西【1】 这是很赞的一步，这里就充分利用了我们说的一个domain切一条链的发现，变双链切断为切开单链的一个口，再导入外源片段，从而介导HR，通过重组的方式实现片段替换——从而插入，删除，等等，都成为了可能。 图13  “万箭齐发”同时一块儿切【1】 另一幅让人激动不已的途径就是可以万箭齐发，而这也充分利用了CRISPR系统本身的特性——人家本来就是个array嘛。 当然，还有比较容易想到的就是下面这种删除方式： 图14 切两头，直接删除一段【1】 总之一句话——导弹在你手，想怎么玩，就怎么玩！ 讲完了丛乐的文章，下面就说说第2篇文章与丛乐文章的不同之处—— 1、用且只用“双剑合璧装”guide RNA
(gRNA)  图15【17】 2、鉴定体系用的是  GFP rescue，更漂亮图16【17】 3、做且只做 human cells 更多关注在人细胞中（包括iPS
cell）的实际应用。 4、做了庞大规模的生信设计，目标针对整个基因组水平设计全几组靶标，覆盖近一半基因。（野心很大啊，名家风范） 5、与ZFNs ，TALEN 比较的实验更多。 6、工作量更大，数据量更大。 所以看来，动手快是多么重要，差点到手的鸭子被别人抢了总是不好的，然追求完美也是有价值的。 此剑一出，谁与争锋 最后简单总结一下，这目前为止，故事的高潮部分是这个样子—— 1、
实现真核细胞体内的基因组编辑，而且一下子打通关了，直接搞定了终极目标——“大boss”human cells 2、利用单链切除介导HR（同源重组），变单纯的切为定向编辑：想插入，改写，删除，全部满足你 3、实现“万箭齐发” ，别再打一枪装一次子弹了，咱已然进入机关枪时代了。 4、证实了与TALEN比的优越性（大家都懂得，其实即使在效率差不多的情况下，无需新编码蛋白而是换短序列即可的Cas9，比TALEN有着不可逆转的便捷性优势） 总之，我们获得了一种想打哪里只需要换“定位弹芯”-gRNA  就行的基因导弹，定点、准确、体内体外、原核真核都可以。更重要的是方便、便宜（“几个质粒就OK”）。 如此利器，预示前景一片大好，自然各家不吝溢美之词【20】【21】【22】【23】【29】。 有人欢喜有人忧，你方唱罢我登场——更高、更快、更强 如果说Cas9开启了一个基因分子生物学的新时代，大家都开心还来不及，只有一个人哭的话，那就一定是TALEN相关公司了。 正所谓“长江后浪推前浪，前浪死在沙滩上”，科学也有更新换代，算是自然规律使然。Cas9无论是从理论分析，可行性便捷性，还是实际结果，效率上都轻松的“秒杀”了前任明星——TALEN。【1】【17】【19】【21】. 没办法，在秉承了“更高、更快、更强”精神的Cas9同学面前，曾经风光无限的TALEN同学只能默默垂泪离去，剩下一堆公司做好准备血本无归了。 百花齐放，四海皆准 Human这个大boss都搞掂了，剩下的估计问题不大。也的确是这样，一时间，各种物种体内的Cas9运用文章哗啦啦的冒出来——斑马鱼【24】酵母【25】小鼠（多基因同时，还是丛乐老板课题组的作品）【26】细菌（仍然是丛乐老板课题组作品）【27】，Cas9大热正式出现。 眼看，一个Cas9的时代就这样到来了。 精确定位，潜力无穷 其实，Cas9的成功给了我们一个运用CRISPR系统方便快捷定位基因序列的可能，但仅仅局限于编辑基因吗？其实可以做的远不止于此。 图17 利用Cas9定位控制转录【28】 比如可以利用这种特异性，做有针对性的表达调控【28】，比如利用双切致死性“自动”筛选突变株【27】。未来，也许还有更多应用，开动脑筋改造他，还有很大潜力。 四、惊喜连连，奇妙继续 ——CRISPR系统在各个层次的广泛性与给我们的认知拓展 主观来讲，一个好故事的结尾总是留有悬念的开放式，为了讲个好故事，我们的CRISPR也不负重望，更多发现，让我再多写一节。 客观来讲，能够开启一个分子生物学的新局面已经够牛气了，可是偏偏人家还有更大的使命——让我们继续思考原核的种种，调控网络的种种。 道高一尺魔高一丈——病毒抗CRISPR系统机制 有个问题不知道大家有没有想过，如果CRISPR在原核生物中真的那么所向披靡，那噬菌体、病毒对于细菌早就没任何威胁能力了，早就给干掉了。“这不科学啊”~ 俗话说“道高一尺魔高一丈”，你细菌能有CRISPR对付我病毒，我病毒也必然有一套甚至几套机理来对付你。【6】【31】 “别拿豆包不当干粮”，别拿病毒不当生命，人家不但能“借尸还魂”繁殖自己，连特异性的免疫系统，都是可以有的！ 奥特曼与小怪兽共同成长———军备竞赛，协同进化 正如这个有趣的题目CRISPR-mediated phage
resistance and the ghost of coevolution past【33】，让我们感兴趣的是CRISPR系统中那些细菌病毒协同进化的证据。【31】中噬菌体对抗CRISPR基因来源等表明，细菌和噬菌体简直“你中有我”“我中有你”，不断竞争，共同成长。 想一想，大自然的法则多么有哲学意义啊！ 苦肉计——自身抗逆，作用比我们想的更多 更玄妙的机制是这个“苦肉计”——细菌通过CRISPR调节自身基因，帮助自己躲避哺乳动物的免疫系统。 2013年4月的一篇文章【5】表明细菌Francisella novicida的传染力依赖自身的CRISPR系统。 在哺乳动物细胞内生长时，细菌会通过CRISPR系统关闭自身脂蛋白的合成基因，以避免被宿主免疫系统发现并摧毁。 “如果将宿主的免疫细胞比作大海中的鲨鱼，那么对于它们来说，细菌脂蛋白就如同海水里的血一般充满着吸引力。因此，为了不被免疫系统发现，细菌就必须关闭脂蛋白的生产。” 太神奇了！ “除了切割噬菌体基因以外，Cas9还能够调节细菌基因，这是一项新发现，” 看来CRISPR系统是一种原核生物间、原核和真核之间综合性的调控网络的中心，是原核生物抵御外界不良环境的手段方法，并非切切外源基因那么简单。也给了我们一个机会，让我们从CRISPR的角度重新认识一下奇妙的“微生物界”。 当然，还有更多关于CRISPR的报道【32】引导我们继续去关注。 “小东西”搞出“大名堂”故事的“启示” 好啦，故事讲到这里也差不多了，是时候总结一下啦，故事梗概如图所示，多说一遍也没啥意思。 “不幸的各有各的不幸，幸运的都差不多一个样子。”其实想想，也许这就是一个nice的科学故事该有的pattern——从最初一片草莽中被慧眼识英雄，到研究不断深化，打开一片认知新天地，甚至改写固有“教科书”，改变固有观念。而后派上用场，为更多研究服务。并且同时开启一个新领域，新视野。 然而这个故事的意义还在于提醒我们怎么做好的研究，回顾整个故事，其实无论在哪里及时进入有所建树都是很好的研究。关键在于如何敏锐的发现这自然宝藏的价值所在，看得比别人远，下手比别人早，而且动作比别人快。 自然界有很多宝藏，怪不得venter要下海去找。我们可以不去找，就盯着那些出土的，嗅觉灵敏，慧眼识珠，有了make a difference的机遇，果断抓住！ 希望再有这样的好“戏”，我们不但在台上，唱的还是高潮部分~