2020 年诺贝尔化学奖授予 CRISPR 基因编辑，这项技术将如何影响我们的未来？
CRISPR基因编辑技术大火大热，今年获得诺贝尔奖名至实归。 但也许很多人并不了解CRISPR的本来面目，CRISPR/Cas9系统其实是细菌面对病毒入侵时的免疫系统。 病毒是如何入侵细菌的呢？ 病毒入侵细菌时，通常会将自己的基因组DNA或RNA注入到细菌的细胞内。而病毒注入的这段基因会整合到细菌的基因组中。 图中我们可以看到，噬菌体吸附到细菌表面以后，通过外壳上的蛋白，打开一个通道，将内部的基因释放出来。这段基因透过细菌的细胞膜，就能够进入细菌内部。  病毒的基因进入细菌细胞后，会插入到细菌的基因组内部。对细菌来说，这将是致命的。 可以想象，如果细菌的基因组中含有病毒的基因，那么，病毒可以利用细菌的营养物质，合成自己所需要的蛋白，并且进行复制，包装成更多的病毒颗粒，最终病毒将占领整个细菌的细胞。 因此，细菌绝对不能让病毒的阴谋得逞。在病毒注入基因时，细菌就要想方设法地阻止这段病毒基因，不能让病毒的基因发挥功能。 细菌如何阻止病毒基因呢？ 研究发现，细菌会启动自身的适应性免疫系统，这个系统就是我们前面提到的CRISPR/Cas9系统。 病毒基因进入细菌后，细菌会迅速获取病毒基因的序列。随后，细菌会将获取的病毒序列整合到自己基因组内的一个特定位点——CRISPR位点，从而获取对病毒的抗性。 什么意思呢？ 病毒想要把基因整合到细菌的基因组，而此时，细菌先发制人，先获取这段病毒基因序列，将其整合到自己想要整合的位点，掌握主动权。之后再来想办法来对付这段病毒基因。 目前已经发现了三种不同的CRISPR机制，研究最广泛的是第二类CRISPR系统。这个系统主要通过三步反应来应对外来入侵者，分别是获取（Acquisition）、表达（Expression）和干扰（Interference），如下图所示。   细菌的具体防御过程是怎样的呢？ 1. 获取（Adaptation） 首先，细菌要获取入侵者的DNA序列（Adaptation）。 病毒的DNA进入细菌体内后，除了病毒本身会去将自己的基因整合到细菌基因组中以外，细菌会将病毒DNA切成多个短序列，这些序列称为空格（spacer）。细菌会将这些空格序列整合进基因组的cas酶后的基因序列中，并用短重复序列将这些空格间隔开来。 短重复位点和病毒的空格序列共同构成CRISPR阵列（CRISPR Array）。   CRISPR，即Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，翻译过来就是规律间隔的成簇短回文序列。而Cas，即CRISPR相关（associated）蛋白；Cas9就是CRISPR相关蛋白9。Cas9是一个核酶，能够切割核酸。 2. 表达（Expression） 然后，细菌要合成多条短重复序列的RNA（crNA biogenesis）。 CRISPR阵列的DNA被转录出前体RNA（Precursor），并切割成为成熟的CRISPR RNA（crRNA）。Cas9基因也被转录出来并合成蛋白质。 3. 干扰（Interference） 最后，细菌需要干扰病毒基因的合成（Targeting）。 crRNA会指导Cas9到达基因组上与其同源的位置，即病毒基因的位置。Cas执行切割基因的功能，从而破坏病毒基因，达到细菌抗病毒的目的。  由于细菌具有这种防御机制，即使病毒的基因插入到基因组内，也会被Cas9破坏掉功能。因此，细菌就能够抵制病毒，保护自己。 在上面这个系统中，最后一步发挥效应阶段的机制是具有重大意义的。这种意义甚至可以帮助人们破解上帝造物的密码，成为对密码进行改造、加工甚至创造新密码的基础。 最后一步短小的crRNA可以像向导一样，带领效应酶Cas到达基因组的特定位点，进行DNA切割。 它不仅能够切割病毒的基因，还能够被设计成编辑哺乳动物基因组的工具。 我们知道，哺乳动物包括人类的基因组从受精卵开始就是确定的了。尽管染色体基因组是父母赐予我们的，但这更像是上帝造人时随意编造的密码，人类一直处于接受这个密码的状态，没有方法去改变。 而就是这样一个最简单的细菌防御机制——CRISPR/Cas9系统，就打开了编辑基因的大门，让人类能够有方法去像上帝一样编造密码。 当然，使用基因编辑工具对人类基因组进行改造仍有伦理问题，人类不能随意去充当上帝的角色。 实际上，CRISPR/Cas系统的效应酶并不止Cas9一个，而是有很多类型的Cas酶。 根据最后切割基因的效应酶是多个Cas还是单个Cas，CRISPR/Cas系统可以分为两个大类。多个Cas发挥作用的是第一大类，单个Cas发挥作用的是第二大类。 两个大类中包括目前已知的CRISPR/Cas共包括6个类型：I型到VI型。其中第一大类包括I型、III型和IV型；第二类包括II型、V型和VI型。  目前应用最广泛的Cas9就属于第二大类中的II型CRISPR系统。 由于第二类CRISPR/Cas系统仅使用单个效应酶，因此应用简单，科学家对其研究也最多。这一类系统中的三个类型，对应的效应酶分别为II型对应Cas9；V型对应Cas12；VI型对应Cas13。   与传统的基因编辑工具相比，CRISPR/Cas9系统作为基因编辑工具，更加简单，也更具可操作性。 这个工具的开发来源于对细菌中防御机制的发现。科学家们对CRISPR/Cas系统的改造使得哺乳动物的基因编辑成为可能。 目前仍有很多新的Cas酶被持续发现，越来越多的工具开发使得人类对于基因编辑更加熟练。基因编辑工具的前景广阔，有望能够应用到肿瘤、神经退行性病变等各种疾病的治疗中，为人类的健康贡献力量。 我们来看一看实验室里的科学家是如何利用CRISPR/cas9系统实现基因的敲入和敲除的。 CRISPR，即Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，翻译过来就是规律间隔的成簇短回文序列。而Cas，即CRISPR相关（associated）蛋白；Cas9就是CRISPR相关蛋白9。Cas9是一个核酶，能够切割核酸。CRISPR/Cas9技术也被称为基因的“魔剪”。   作为一个切割DNA的酶，Cas9是如何确定去切割DNA上的哪个基因呢？ 这就需要向导RNA（guide RNA），也叫gRNA。gRNA是一段单链的RNA序列，可以指导Cas9到达切割的位点。 首先，gRNA是一段和基因上特定序列互补的一段单链RNA序列，大小约20bp。Ca9能够和gRNA结合在一起，而gRNA能够锚定到特定的基因序列上。因此，gRNA带领Cas9这个酶来到特定的切割位点，切开基因。Cas9像一把剪刀，能够使DNA双链断裂。    当基因发生双链断裂时，细胞需要对断裂的基因进行及时修复，否则，基因双链断裂对细胞来说通常是致命的，会引起细胞凋亡。 细胞如何修复断开的基因呢？通常有两种主要的方式：非同源末端连接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）和同源重组修复（Homologous Directed Repair，HDR）。通过DNA修复，断裂的基因能够重新连接起来。   NHEJ是一种快速非精确的DNA修复方式。当基因组发生断裂时，细胞可以通过在断裂位点增加或减少几个碱基，快速将断裂的基因连接起来。由于在修复过程中，基因的碱基发生了变化，减少一个或多个碱基，因此基因的序列就发生了变化。产生突变的基因无法正常表达出蛋白质，就失去了功能。   同源重组修复方式需要一段同源序列作为模板。例如，当一条染色体发生断裂时，同源染色体上相应的片段可以作为同源序列，使断裂的基因重新合成。这种修复方式是精确的，一般不会改变基因的序列。 当两条染色体同时发生断裂时，细胞没有内源的同源染色体作为模板，就无法进行同源重组修复。此时，非精确的NHEJ是主要的修复方式。如果细胞内没有这种快速的修复方式，那么基因组断裂对于细胞来说就是致命的，修复不好细胞就会走向凋亡。 NHEJ修复方式会产生突变，产生的突变对物种的进化有一定的贡献。 通常情况下，NHEJ的修复方式效率更高，更快，但是不精确，会引起基因序列的变化，影响基因功能。相反，HDR的修复方式效率较低，速度较慢，并且需要另一条染色体上的同源序列，但是非常精确，不造成基因序列的变化，基因功能不变。   当gRNA像向导一样带领Cas9来到特定的基因上以后，Cas9切割DNA造成双链断裂，随后，细胞通过内部的修复方式，将断裂的DNA重新连接起来。 从细胞群体来看，有的细胞会发生NHEJ修复，有的细胞会发生同源重组修复。这时，科学家就需要挑选那些发生了NHEJ修复，基因发生突变的细胞。 那些使用同源重组修复方式修复DNA断裂口的细胞，基因没有突变，也就没被敲除，这种细胞就不能要。 当科学家们通过筛选得到那些失去特定基因的细胞时，就完成了一个基因敲除的过程。 然而，想要敲入基因时，HDR修复方式的细胞则会成为科学家们想要的细胞。 当科学家需要基因敲入时，就必须提供一个外源片段，充当同源重组修复的同源系列。待敲入的目标基因便藏于这一外源片段中。 Cas9酶在gRNA的引导下，切割目标DNA。随后，DNA修复发生。 当细胞利用同源重组修复方式，以此片段为模板，在断裂处合成与同源序列互补的基因序列，这样就实现了基因敲入的目的。   同样，细胞群体里仍然会有一部分利用NHEJ修复断裂的DNA链，这些细胞没有实现基因敲入，需要筛选掉。  CRISPR/Cas9介导的基因敲除和敲入，高效、精确、价格低廉，是最热门的基因编辑技术。除了在DNA上编辑，CRISPR/Cas系统还可以在mRNA上操作，实现基因的敲减，即不影响DNA，只降解mRNA，从而实现功能蛋白的表达量降低。