合成大片段基因的瓶颈是什么？我们离人工制造一个生物还有多远？
现在最常用的DNA合成方法是固相亚磷酰胺三酯法，从3‘到5'合成， 1、脱保护基 (Deblocking) 用三氯乙酸 (Trichloroacetic Acid，TCA) 脱去连结在CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保护基团DMT (二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5'-羟基端，以供下一步缩合反应。 2、活化 (Activation) 将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体 (其3'-端已被活化，但5'-端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。 3、连接 (Coupling) 亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5'-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。 4、封闭 (Capping) 缩合反应后，为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。 5、氧化 (Oxidation) 缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。 因此每增加一个碱基需要5步反应，即使假设每一步效率是99%，那么总的效率也是0.99^(5*碱基长度)，用科学计算器很容易算出来100bp的最终目标产品的占总量的比例。 因为DNA合成是在固相上进行的，每一个碱基的合成包含了脱保护基(DMT)、碱基的加成、盖帽(Capping)、氧化等步骤。如果说某一个碱基由于种种原因(如瓶中溶液没有了，或管道堵塞)，未加入到正在延伸的Oligo上，那么下一个反应Capping将会把Oligo封死，使整个oligo合成立即中止。在纯化过程中，这种合成不完全的短片段是可以被去除的，因此化学合成的精确性是没有问题的； 但是Hecker,KH使用两条长123和126的化学合成的DNA，用DNA聚合酶进行primer,extension并且酶切连接转化后检查in vivo的复制发现： 好像不知道为什么合成的DNA复制错误率还是挺高的，这篇太老了下不到我就懒得再找全文了…… 现在也全基因合成，乃是把基因组分别设计成很多短片段然后一步步PCR得到的(Hoover, D. M., & Lubkowski, J. 2002)，要合成一个10kb的全基因，想想就真是一件天怒人怨的事情啊……