Datasets:

panosgriz

/

COVID-QA-el-small

like 0

{ "paragraphs": [ { "context": "Οι λειτουργικές γενετικές παραλλαγές στο DC-SIGNR συσχετίζονται με τη μετάδοση του HIV-1 από μητέρα σε παιδίhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2752805/Boily-Larouche, Geneviève; Iscache, Anne-Laure; Zijenah, Lynn S.; Humphrey, Jean H.; Mouland, Andrew J.; Ward, Brian J.; Roger, Michel2009-10-07DOI:10.1371/journal.pone.0007211License:cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Η μετάδοση από μητέρα σε παιδί (MTCT) είναι η κύρια αιτία μόλυνσης από τον ιό HIV-1 στα παιδιά παγκοσμίως. Δεδομένου ότι ο υποδοχέας λεκτίνης τύπου C, μη σχετιζόμενη με την ιντεγκρίνη ICAM που αρπάζει ειδικά δενδριτικά κύτταρα (DC-SIGNR, επίσης γνωστό ως CD209L ή μη ιντεγκρίνη που αρπάζει ειδική για ήπαρ/λεμφαδένα ICAM (L-SIGN)), μπορεί να αλληλεπιδράσει με παθογόνα συμπεριλαμβανομένου του HIV-1 και εκφράζεται στη διεπαφή μητέρας-εμβρυϊκού, υποθέσαμε ότι θα μπορούσε να επηρεάσει το MTCT του HIV-1. ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΕΥΡΗΜΑΤΑ: Για να διερευνήσουμε τον πιθανό ρόλο του DC-SIGNR στην MTCT του HIV-1, πραγματοποιήσαμε μια μελέτη γενετικής συσχέτισης του DC-SIGNR σε μια καλά χαρακτηρισμένη κοόρτη 197 μητέρων που είχαν μολυνθεί με HIV και των βρεφών τους που στρατολογήθηκαν στο Χαράρε. Ζιμπάμπουε. Βρέφη που έφεραν δύο αντίγραφα απλοτύπων DC-SIGNR H1 και/ή H3 (H1-H1, H1-H3, H3-H3) είχαν 3,6 φορές αυξημένο κίνδυνο in utero (IU) (P = 0,013) μόλυνσης από HIV-1 και 5,7 φορές αυξημένο κίνδυνο ενδογεννητικής (IP) (P = 0,025) λοίμωξης HIV-1 μετά από προσαρμογή για έναν αριθμό μητρικών παραγόντων. Οι ενεχόμενοι απλότυποι Η1 και Η3 μοιράζονται δύο μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς (SNPs) στην περιοχή προαγωγέα (p-198A) και το εσώνιο 2 (int2-180A) που σχετίστηκαν με αυξημένο κίνδυνο και των δύο IU (P = 0,045 και P = 0,003, αντίστοιχα) και IP (P = 0,025, για int2-180A) μόλυνση HIV-1. Η παραλλαγή του προαγωγέα μείωσε τη μεταγραφική δραστηριότητα in vitro. Σε ομόζυγα βρέφη Η1 που φέρουν τόσο τις μεταλλάξεις p-198A όσο και int2-180A, παρατηρήσαμε μια 4-πλάσια μείωση στο επίπεδο των μεταγραφών DC-SIGNR του πλακούντα, επηρεάζοντας δυσανάλογα την έκφραση των ισομορφών που συνδέονται με τη μεμβράνη σε σύγκριση με βρέφη μη φορείς.011 011 ). ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το DC-SIGNR παίζει κρίσιμο ρόλο στην MTCT του HIV-1 και ότι η μειωμένη έκφραση του DC-SIGNR του πλακούντα αυξάνει τον κίνδυνο μετάδοσης. Κείμενο: Χωρίς ειδικές παρεμβάσεις, το ποσοστό μετάδοσης του HIV-1 από μητέρα-παιδί (MTCT ) είναι περίπου 15-45% [1] . Το UNAIDS υπολογίζει ότι μόνο πέρυσι, περισσότερα από 400.000 παιδιά μολύνθηκαν παγκοσμίως, κυρίως μέσω MTCT και το 90% από αυτά ζούσε στην υποσαχάρια Αφρική. Στις χώρες που έχουν πληγεί περισσότερο, όπως η Ζιμπάμπουε, ο HIV-1 είναι υπεύθυνος για το ένα τρίτο όλων των θανάτων μεταξύ παιδιών κάτω των πέντε ετών. Η MTCT του HIV-1 μπορεί να συμβεί κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης (in utero, IU), του τοκετού (ενδοτοκετού, IP) ή του θηλασμού (μετά τον τοκετό, PP). Το υψηλό μητρικό ιικό φορτίο, ο χαμηλός αριθμός κυττάρων CD4, ο κολπικός τοκετός, η χαμηλή ηλικία κύησης έχουν αναγνωριστεί ως ανεξάρτητοι παράγοντες που σχετίζονται με την MTCT του HIV-1 [1] . Αν και τα αντιρετροϊκά μπορούν να μειώσουν το MTCT στο 2%, η περιορισμένη πρόσβαση σε έγκαιρα διαγνωστικά και φάρμακα σε πολλές χώρες του αναπτυσσόμενου κόσμου περιορίζει τον πιθανό αντίκτυπο αυτής της στρατηγικής. Η καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών που δρουν στη διεπαφή μητέρας-εμβρυϊκού είναι ζωτικής σημασίας για το σχεδιασμό εναλλακτικών παρεμβάσεων έναντι της αντιρετροϊκής θεραπείας για την πρόληψη της μετάδοσης. Μη σχετιζόμενη με την ιντεγκρίνη ICAM-αρπαγή ειδικών δενδριτικών κυττάρων (DC-SIGNR, επίσης γνωστή ως CD209L ή Η μη ιντεγκρίνη που αρπάζει το ήπαρ/λεμφαδένα (L-SIGN)) μπορεί να αλληλεπιδράσει με μια πληθώρα παθογόνων παραγόντων συμπεριλαμβανομένου του HIV-1 και εκφράζεται σε τριχοειδικά ενδοθηλιακά κύτταρα πλακούντα [2] . Το DC-SIGNR είναι οργανωμένο σε τρεις διακριτές περιοχές, μια Ν-τελική κυτταροπλασματική ουρά, μια επαναλαμβανόμενη περιοχή που περιέχει επτά επαναλήψεις 23 αμινοξέων και μια Ο-τερματική περιοχή που εμπλέκεται στη σύνδεση του παθογόνου. Το εναλλακτικό μάτισμα του γονιδίου DC-SIGNR οδηγεί στην παραγωγή ενός ρεπερτορίου ισομορφών υψηλής διαφοροποίησης που περιλαμβάνει συνδεδεμένες με μεμβράνη και διαλυτές ισομορφές [3] . Έχει προταθεί ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ DC-SIGNR και HIV-1 μπορεί να ενισχύσει τη μεταφορά του ιού σε άλλους ευαίσθητους τύπους κυττάρων [2] αλλά το DC-SIGNR μπορεί επίσης να εσωτερικεύσει και να μεσολαβήσει στην εξαρτώμενη από το πρωτεάσωμα αποικοδόμηση των ιών [4] που μπορεί να επηρεάσει διαφορετικά το αποτέλεσμα Δεδομένης της παρουσίας του DC-SIGNR στη διεπαφή μητέρας-εμβρυϊκού και της αλληλεπίδρασής του με τον HIV-1, υποθέσαμε ότι θα μπορούσε να επηρεάσει το MTCT του HIV-1. Για να διερευνήσουμε τον πιθανό ρόλο του DC-SIGNR στο MTCT του HIV-1, πραγματοποιήσαμε μια μελέτη γενετικής συσχέτισης του DC-SIGNR σε μια καλά χαρακτηρισμένη κοόρτη μητέρων μολυσμένων με HIV και των βρεφών τους που στρατολογήθηκαν στη Ζιμπάμπουε και προσδιορίσαμε συγκεκριμένα DC- Παραλλαγές SIGNR που σχετίζονται με αυξημένους κινδύνους μετάδοσης του HIV. Χαρακτηρίσαμε περαιτέρω τη λειτουργική επίδραση αυτών των γενετικών παραλλαγών στην έκφραση του DC-SIGNR και δείξαμε ότι επηρεάζουν τόσο το επίπεδο όσο και τον τύπο των μεταγραφών DC-SIGNR που παράγονται στον πλακούντα. Τα δείγματα αποτελούνταν από αποθηκευμένα εκχυλίσματα DNA που ελήφθησαν από 197 ζεύγη μητέρας-παιδιού. εγγράφηκε αμέσως μετά τον τοκετό στη δοκιμή συμπληρωμάτων βιταμίνης Α ZVITAMBO (Χαράρε, Ζιμπάμπουε) και ακολούθησε σε 6 εβδομάδες και 3μηνιαία διαστήματα έως και 24 μήνες. Το έργο ZVITAMBO ήταν μια τυχαιοποιημένη ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο κλινική δοκιμή στην οποία συμμετείχαν 14.110 ζευγάρια μητέρας-παιδιού, από τον Νοέμβριο του 1997 έως τον Ιανουάριο του 2000, με κύριο στόχο τη διερεύνηση της επίδρασης της άμεσης μετά τον τοκετό συμπληρώματος βιταμίνης Α στο MTCT του HIV-1. Τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη προέρχονταν από ζευγάρια μητέρας-παιδιού που κατανεμήθηκαν τυχαία στην ομάδα εικονικού φαρμάκου του έργου ZVITAMBO. Η αντιρετροϊκή προφύλαξη για HIV-1 προγεννητικές γυναίκες δεν ήταν διαθέσιμη στον δημόσιο τομέα της Χαράρε κατά τη διάρκεια της στρατολόγησης ασθενών με ZVITAMBO. Τα δείγματα λήφθηκαν διαδοχικά από δύο ομάδες: 97 ζευγάρια HIV-1-θετική μητέρα/HIV-1-θετικό παιδί και 100 HIV-1-θετική μητέρα/HIV-αρνητικό παιδί ζευγάρια. Η ορολογική κατάσταση της μητέρας προσδιορίστηκε με ELISA και επιβεβαιώθηκε με Western Blot. Τα βρέφη θεωρήθηκαν ότι είχαν μολυνθεί εάν ήταν οροθετικά στον HIV-1 σε ηλικία 18 μηνών ή μεγαλύτερα και είχαν δύο ή περισσότερα θετικά αποτελέσματα αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) HIV-1-DNA σε μικρότερες ηλικίες. 100 βρέφη θεωρήθηκαν μη μολυσμένα καθώς ήταν αρνητικά ELISA σε ηλικία 18 μηνών ή μεγαλύτερα και είχαν δύο αρνητικά αποτελέσματα DNA PCR από δείγματα που συλλέχθηκαν σε μικρότερη ηλικία. Από τα 97 μολυσμένα με HIV-1 βρέφη, 57 μολύνθηκαν IU, 11 είχαν μολυνθεί με PP και 17 μολύνθηκαν με PP όπως προσδιορίστηκε με αναλύσεις PCR δειγμάτων αίματος που συλλέχθηκαν κατά τη γέννηση, ηλικίας 6 εβδομάδων, 3 και 6 μηνών και σύμφωνα με ακολουθώντας τους ορισμούς που προσαρμόστηκαν από τον Bryson και τους συνεργάτες του [5] . Εν συντομία, τα βρέφη που ήταν θετικά στο DNA PCR κατά τη γέννηση μολύνθηκαν με IU. Βρέφη με αρνητικά αποτελέσματα PCR από δείγμα που ελήφθη κατά τη γέννηση αλλά που γίνονται θετικά στην ηλικία των 6 εβδομάδων μολύνθηκαν με IP. Βρέφη με αρνητικά αποτελέσματα PCR κατά τη γέννηση και την ηλικία των 6 εβδομάδων αλλά που στη συνέχεια έγιναν θετικά σε DNA PCR θεωρήθηκαν ότι είχαν μολυνθεί κατά τη διάρκεια της περιόδου PP. Στην ανάλυση που συγκρίνει τους 3 διαφορετικούς τρόπους MTCT, 12 μολυσμένα με HIV-1 βρέφη αποκλείστηκαν επειδή τα αποτελέσματα PCR δεν ήταν διαθέσιμα στην ηλικία των 6 εβδομάδων. Πλήρεις μέθοδοι στρατολόγησης, συλλογή βασικών χαρακτηριστικών, εργαστηριακές διαδικασίες έχουν περιγραφεί αλλού. ] . Η ανακατασκευή απλότυπου πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Bayesian στατιστικής μεθόδου που εφαρμόστηκε στη ΦΑΣΗ [8] , έκδοση 2.1.1, χρησιμοποιώντας πολυμορφισμό απλού νουκλεοτιδίου (SNP) με ελάχιστη συχνότητα αλληλόμορφων (MAF) 2%. Εφαρμόσαμε τον αλγόριθμο πέντε φορές, χρησιμοποιώντας διαφορετικούς τυχαία δημιουργημένους σπόρους, και λήφθηκαν σταθερά αποτελέσματα σε όλες τις δοκιμές (Εικόνα 1). Δεκαπέντε SNP με ετικέτα απλότυπου (htSNPs) αναγνωρίστηκαν από το λογισμικό HaploBlockFinder [9] με MAF $5%. Αυτά τα htSNP προσδιορίστηκαν γονότυπος στα 197 βρέφη με άμεση ανάλυση αλληλουχίας PCR, όπως έχουμε περιγράψει προηγουμένως [7]. Ο γονότυπος της περιοχής επανάληψης του εξονίου 4 DC-SIGNR προσδιορίστηκε με ενίσχυση PCR ακολουθούμενη από μετανάστευση σε πηκτώματα αγαρόζης 1,5% [10] . Οι αλληλουχίες DNA στην περιοχή του προαγωγέα αναλύθηκαν με τη διεπαφή TESS (http//:www.cbil.upenn.edu/tess) για υποτιθέμενες θέσεις δέσμευσης παραγόντων μεταγραφής χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων TRANSFAC. Οι δοκιμασίες αναφοράς λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας τον φορέα pGL2-Basic πραγματοποιήθηκαν με τη σειρά για τη διερεύνηση της λειτουργικής επίδρασης των μεταλλάξεων στη δραστηριότητα του προαγωγέα DC-SIGNR. Γονιδιωματικό DNA από υποκείμενα ομόζυγα για τις παραλλαγές προαγωγέα και WT ενισχύθηκε από τη θέση νουκλεοτιδίου 2715 έως 21 και κλωνοποιήθηκε μεταξύ των πολλαπλών θέσεων κλωνοποίησης BglII και HindIII στον φορέα pGL2-Basic που φιλοξενεί ένα γονίδιο λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας αναφοράς (Invitrogenling Canada, Invitrogenling Canada, Invitrogen, Canada, Καναδάς). Όλοι οι ανασυνδυασμένοι κλώνοι επαληθεύτηκαν με προσδιορισμό αλληλουχίας DNA. Ο φορέας αναφοράς δοκιμής λουσιφεράσης πυγολαμπίδας συν-μορφομετατράπηκε σε αναλογία 10:1 με τον συστατικό εκφραστή της λουσιφεράσης Renilla, phRL-CMV (Promega, Madison, WI, USA). Καλλιεργήσαμε κύτταρα HeLa σε πλάκες 6 φρεατίων (2610 5 κύτταρα) και τα επιμολύναμε την επόμενη μέρα χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη (Invitrogen) σύμφωνα με τον κατασκευαστή. Τα κύτταρα λύθηκαν και πραγματοποιήθηκαν δοκιμές λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας 20 mg εκχυλίσματος πρωτεΐνης σύμφωνα με τον κατασκευαστή (Promega) στις 44 ώρες μετά τη διαμόλυνση. Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας κανονικοποιήθηκε σε δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla. 0 mg, 0,5 mg ή 1 mg φορέας CMV-Tat επιμολύνθηκε με LTR-Luc ως θετικό μάρτυρα σε αυτά τα πειράματα. Πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς λουσιεράσης εις τριπλούν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσο6 τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (S.E.M). Οι ιστοί του πλακούντα πρώτου χρόνου ελήφθησαν από αμβλώσεις μετά από εκούσια διακοπή της εγκυμοσύνης στο CHUM Hopital Saint-Luc (Μόντρεαλ, Καναδάς). Χρησιμοποιήθηκαν ιστοί από 3 Η1 (σχετιζόμενοι με MTCT του HIV-1) και 3 Η15 (άγριου τύπου) ομόζυγοι απλότυποι για την ανάλυση πιθανών διαφορών στην έκφραση ισομορφής. Τα συνολικά RNA του πλακούντα εξήχθησαν με MasterPure DNA και RNA Extraction Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) σύμφωνα με τον κατασκευαστή. Θραύσματα που αντιστοιχούν στην κωδικοποιητική περιοχή DC-SIGNR μεταγράφηκαν αντίστροφα (RT) και στη συνέχεια ενισχύθηκαν με ένθετη PCR με τους ακόλουθους εκκινητές. RT εκκινητές RR, πρώτοι PCR RF και RR και δεύτεροι PCR RcF και RcR σύμφωνα με τον Liu και τους συνεργάτες του [11] . 1 mg ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με Expand RT (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) σύμφωνα με τον κατασκευαστή και ενισχύθηκαν με PCR με DNA Platinum Taq Polymerase (Invitrogen). Τα κύρια προϊόντα PCR από τη δεύτερη αντίδραση PCR εκχυλίστηκαν με πήκτωμα με το κιτ εξαγωγής γέλης Qiagen (Qiagen Canada inc, Mississauga, ON, Canada) και κλωνοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ κλωνοποίησης TOPO TA για προσδιορισμό αλληλουχίας (Invitrogen). Για κάθε πλακούντα, επιλέχθηκαν τυχαία 15 διαφορετικοί κλώνοι και ενισχύθηκαν με εκκινητές Μ13 και αλληλουχήθηκαν με ABI PRISM 3100 αυτοματοποιημένο τριχοειδές sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Οι αλληλουχίες αναλύθηκαν και ευθυγραμμίστηκαν με την αλληλουχία αναφοράς GeneBank NM_014257 χρησιμοποιώντας λογισμικό Lasergene (DNA Stars, Madison, WI, USA). Ποσοτική έκφραση ισομορφών DC-SIGNR 1,5 mg πλακούντα RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας 2,5 mM Oligo RT σε όγκο 20 ml σύμφωνα με τον κατασκευαστή (Roche Applied Science). 15 ng ολικού cDNA σε τελικό όγκο 20 ml χρησιμοποιήθηκαν για την εκτέλεση ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας Universal Express SYBR GreenER qPCR Supermix (Invitrogen) σε Rotor Gene Realtime Rotary Analyzer (Corbett Life Science, Sydney, Αυστραλία). Χρησιμοποιήθηκαν δείγματα από 2 άτομα σε κάθε ομάδα επειδή η ποιότητα RNA άλλων δεν ήταν κατάλληλη για ανάλυση qRT-PCR. Η ενίσχυση όλων των ισομορφών DC-SIGNR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ειδικό ζεύγος εκκινητών εξονίου 5 (Πίνακας S1). Ισόμορφες συνδεδεμένες με μεμβράνη ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για το εξόνιο 3, που αντιστοιχούν στην κοινή διαμεμβρανική περιοχή του DC-SIGNR. Οι εκκινητές στοχεύθηκαν στη σύνδεση εξωνίου-εξονίου και τα εκχυλίσματα RNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DNase (Fermantas International inc, Burlington, ΟΝ, Καναδάς) για να αποφευχθεί η ενίσχυση του μολυντικού DNA. Δημιουργήθηκαν τυπικές καμπύλες (50-500.000 αντίγραφα ανά αντίδραση) χρησιμοποιώντας σειριακή αραίωση ενός πλήρους μήκους DC-SIGNR ή πλασμιδικού DNA του εμπορίου GAPDH (Invitrogen). Όλες οι αντιδράσεις qPCR είχαν αποτελεσματικότητες που κυμαίνονταν από 99% έως 100%, ακόμη και παρουσία 20 ng μη ειδικών νουκλεϊκών οξέων, και επομένως μπορούσαν να συγκριθούν. Ο αριθμός αντιγράφων των άγνωστων δειγμάτων υπολογίστηκε τοποθετώντας τον μετρούμενο αριθμό κύκλου PCR (διασταυρούμενο κατώφλι) στην τυπική καμπύλη. Για τη διόρθωση των διαφορών τόσο στην ποιότητα όσο και στην ποσότητα RNA μεταξύ των δειγμάτων, τα επίπεδα έκφρασης των μεταγραφών κανονικοποιήθηκαν στις μεταγραφές γονιδίου αναφοράς GAPDH. Οι αλληλουχίες εκκινητών GAPDH παρασχέθηκαν ευγενικά από τον A. Mes-Masson στο CHUM. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως αριθμός αντιγράφων γονιδίου στόχου ανά 10 5 αντίγραφα GAPDH. Η αναλογία των ισομορφών που συνδέονται με τη μεμβράνη υπολογίστηκε ως Ε3/Ε5. Οι διαλυτές ισομορφές υπολογίστηκαν αφαιρώντας τις δεσμευμένες στη μεμβράνη από τις συνολικές ισομορφές. Πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς qPCR εις τριπλούν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος6S.E.M. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το GraphPad PRISM 5.0 για Windows (GraphPad Software inc, San Diego, CA, USA). Οι διαφορές στα βασικά χαρακτηριστικά και στις γονοτυπικές συχνότητες απλοτύπων ή htSNP συγκρίθηκαν μεταξύ των ομάδων χρησιμοποιώντας την ανάλυση x 2 ή την ακριβή δοκιμή Fisher. Η ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση των αναλογιών πιθανοτήτων (OR) για κάθε γονότυπο και βασικούς παράγοντες κινδύνου. Χρησιμοποιήθηκε πολλαπλή λογιστική παλινδρόμηση για να οριστούν ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες που προσδιορίστηκαν ως σημαντικοί στην ακατέργαστη ανάλυση. Τα OR και το διάστημα εμπιστοσύνης 95% υπολογίστηκαν με την ακριβή μέθοδο. Οι συγκρίσεις των συνεχών μεταβλητών μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκαν με το μη ζευγαρωμένο τεστ t Student με δύο ουρές όταν οι μεταβλητές ήταν κανονικά κατανεμημένες και με το τεστ Mann-Whitney U όταν διαφορετικά. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές στο P,0,05. Ελήφθη γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση από όλες τις μητέρες που συμμετείχαν στη μελέτη και τη δοκιμή ZVITAMBO και η έρευνα που αναφέρθηκε σε αυτό το έγγραφο εγκρίθηκε από το The We πραγματοποιήσαμε μια μελέτη συσχέτισης του πολυμορφισμού DC-SIGNR το 197 βρέφη που γεννήθηκαν από μητέρες που είχαν προσβληθεί από τον ιό HIV-1 που δεν είχαν λάβει θεραπεία, που στρατολογήθηκαν στο Χαράρε της Ζιμπάμπουε. Μεταξύ αυτών, 97 βρέφη ήταν μολυσμένα με HIV-1 και 100 βρέφη παρέμειναν μη μολυσμένα. Από τα 97 μολυσμένα με HIV-1 βρέφη, τα 57 είχαν μολυνθεί από IU, τα 11 ήταν μολυσμένα με ΙΡ και τα 17 είχαν μολυνθεί με ΡΡ. Ο χρόνος μόλυνσης δεν καθορίστηκε για 12 μολυσμένα με HIV-1 βρέφη. Τα βασικά χαρακτηριστικά των μητέρων και των βρεφών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Η ηλικία της μητέρας και ο αριθμός των κυττάρων CD4, το φύλο του παιδιού, ο τρόπος τοκετού, η διάρκεια της ρήξης της μεμβράνης και η ηλικία κύησης ήταν παρόμοια σε όλες τις ομάδες. Ωστόσο, το μητρικό ιικό φορτίο 0,29 000 αντίγραφα/ml συσχετίστηκε με αυξημένο κίνδυνο τόσο σε IU όσο και σε PP με αναλογίες πιθανοτήτων (OR) 3,64 (95% CI = 1,82-7,31, P = 0,0002) και 4,45 (95% CI = 1,50 -13,2, P = 0,0045) για μετάδοση του HIV-1, αντίστοιχα. Δεκαπέντε SNP με ετικέτα απλότυπου (htSNPs) που αντιστοιχούν στους 15 κύριους απλότυπους DC-SIGNR (Εικόνα 1) που περιγράφονται μεταξύ των κατοίκων της Ζιμπάμπουε [7] γονότυποι προσδιορίστηκαν στα δείγματα της μελέτης μας S2 και S3). Οι Η1 (31%) και Η3 (11%) ήταν οι πιο συχνοί απλότυποι που παρατηρήθηκαν (Εικόνα 1). Το ότι είναι ομόζυγο για τον απλότυπο Η1 συσχετίστηκε με αυξημένο κίνδυνο μετάδοσης HIV-1 τόσο IU (OR: 4,42, P = 0,022) όσο και PP (OR: 7,31, P = 0,016) (Πίνακας 2). Βρέφη που έφεραν δύο συνδυασμούς αντιγράφων απλοτύπων Η1 και/ή Η3 (H1-H1, H1-H3 ή H3-H3) είχαν αυξημένο κίνδυνο IU (OR: 3,42, P = 0,007) και IP (OR: 5,71, P = 0,025) αλλά όχι PP (P = 0,098) μόλυνση HIV-1 σε σύγκριση με βρέφη μη φορείς (Πίνακας 2). Οι τελευταίες συσχετίσεις παρέμειναν σημαντικές αφού έγινε προσαρμογή για το μητρικό ιικό φορτίο τόσο για IU (OR: 3,57, 95% CI = 1,30-9,82, P = 0,013) όσο και για IP (OR: 5,71, 95% CI = 1,40-23,3, P = 0,025) Μετάδοση HIV-1. Οι απλότυποι Η1 και Η3 μοιράζονται ένα σύμπλεγμα μεταλλάξεων (ρ-198Α, int2-391C, int2-180A, ex4RPT, int5+7C) (Εικόνα 1). Από αυτές, οι παραλλαγές p-198A και int2-180A συσχετίστηκαν σημαντικά με MTCT του HIV-1 (Πίνακας S2). Στην ανάλυση μη προσαρμοσμένης παλινδρόμησης, τα ομόζυγα βρέφη για τις παραλλαγές p-198A και int2-180A είχαν αυξημένο κίνδυνο IU (OR: 2,07 P = 0,045, OR: 3,78, P = 0,003, αντίστοιχα) και IP (OR: 2,47, P = 0,17, O.R: 5,71, P = 0,025, αντίστοιχα) μόλυνση HIV-1 σε σύγκριση με ετερόζυγα βρέφη ή μη φορείς (Πίνακας 3). Όταν έγινε προσαρμογή για μητρικούς παράγοντες, μόνο η συσχέτιση με την παραλλαγή int2-180A παρέμεινε σημαντική για IU (OR: 3,83, 95% CI = 1,42-10,4, P = 0,008) και IP (O.R: 5,71, 95% CI = 1,40 -23,3, P = 0,025) Μετάδοση HIV-1. Έτσι, βρέφη ομόζυγα για την παραλλαγή DC-SIGNR int2-180A που περιέχεται στους απλότυπους Η1 και Η3 είχαν 4 φορές έως 6 φορές περισσότερες πιθανότητες να μολυνθούν από τον HIV-1 κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης ή κατά τον τοκετό, αντίστοιχα. Εναλλακτικό μάτισμα του DC-SIGNR γονίδιο στον πλακούντα παράγει ρεπερτόρια ισομορφών που συνδέονται τόσο με τη μεμβράνη όσο και διαλυτά [3] . Η σχετική αναλογία του δεσμευμένου στη μεμβράνη και του διαλυτού DC-SIGNR θα μπορούσε εύλογα να επηρεάσει την ευαισθησία στη μόλυνση από τον HIV-1 [11] . Υποθέσαμε λοιπόν ότι οι μεταλλάξεις DC-SIGNR που σχετίζονται με το MTCT του HIV-1 θα είχαν αντίκτυπο τόσο στο επίπεδο έκφρασης του DC-SIGNR όσο και στο ρεπερτόριο ισομορφής που παράγεται. Ερευνήσαμε την έκφραση μεταγραφής DC-SIGNR σε πλακούντες πρώτου χρόνου που λήφθηκαν μετά από εκλεκτική άμβλωση. Κλωνοποιήσαμε το DC-SIGNR από ιστούς πλακούντα με RT-PCR από 3 ομόζυγα δείγματα Η1 που περιείχαν και τις παραλλαγές DC-SIGNR p-198AA και int2-180AA που σχετίζονται με Μετάδοση HIV-1 και 3 δείγματα ομόζυγου άγριου τύπου (WT) (p-198CC, int2-180GG). Δεκαπέντε κλώνοι ανά δείγμα επιλέχθηκαν τυχαία για αλληλούχιση. Όπως ήταν αναμενόμενο, βρήκαμε ένα εκτεταμένο ρεπερτόριο μεταγραφών DC-SIGNR σε όλα τα δείγματα με 9 έως 16 διαφορετικές ισομορφές ανά άτομο. Ταυτοποιήθηκαν συνολικά 65 διακριτές μεταγραφές (Εικόνα S1), εκ των οποίων οι 3 ήταν μεταγραφές πλήρους μήκους. 64 από τους κλώνους της αλληλουχίας περιείχαν συνολικά 69 υποκαταστάσεις αμινοξέων με 3 νέα C άκρα και 2 πρόωρα κωδικόνια λήξης. Ωστόσο, η ποικιλομορφία αποδόθηκε κυρίως σε ολόκληρη τη διαγραφή του εξονίου 2 ή του εξονίου 3 ή σε παραλλαγές στο μήκος της περιοχής του λαιμού (εξόνιο 4) του DC-SIGNR. Η διαγραφή του εξονίου 3 εξαλείφει τη διαμεμβρανική περιοχή της πρωτεΐνης και οδηγεί στην έκφραση των διαλυτών ισομορφών DC-SIGNR [3] . Είναι ενδιαφέρον ότι η αφθονία των ισομορφών που συνδέονται με τη μεμβράνη στους ιστούς του πλακούντα των ομοζυγώτων Η1 φαίνεται να είναι χαμηλότερη από αυτή που παρατηρείται σε δείγματα από άτομα WT (Εικόνα S1). Η διαγραφή του εξονίου 3 επιβεβαιώθηκε με αλληλούχιση και υποθέτουμε ότι η παράλειψη του εξονίου 3, θα μπορούσε να οφείλεται στην παρουσία της μετάλλαξης int2-180A που παρατηρήθηκε σε βρέφη με απλότυπο Η1. Στην πραγματικότητα, αυτή η μετάλλαξη ιντρονίου βρίσκεται 180 bp προς τα κάτω από το εξόνιο 3 και δυνητικά τροποποιεί τα συμβάντα ματίσματος (Εικόνα 2Α). Επιβεβαιώσαμε ότι η διακύμανση στις αναλογίες μεταγραφής που παρατηρήθηκε μεταξύ των δύο ομάδων αντικατοπτρίστηκε επίσης στο επίπεδο της έκφρασης mRNA στον πλακούντα. Για να ποσοτικοποιήσουμε τις δεσμευμένες στη μεμβράνη έναντι των διαλυτών ισομορφών σε δείγματα πλακούντα από ομόζυγα βρέφη Η1 και WT, ενισχύσαμε την αλληλουχία του εξονίου 5 (Ε5) που υπάρχει σε όλες τις ισομορφές DC-SIGNR (συνολικές μεταγραφές). Στη συνέχεια ενισχύσαμε το εξόνιο 3 (Ε3) το οποίο διαγράφεται στις διαλυτές μορφές και στη συνέχεια υπολογίσαμε την αναλογία Ε3:Ε5. Βρήκαμε ότι οι ιστοί του πλακούντα από ομόζυγα βρέφη Η1 εκφράζουν σημαντικά χαμηλότερο ποσοστό δεσμευμένου στη μεμβράνη DC-SIGNR (18%) σε σύγκριση με αυτό στα άτομα WT (36%) (P = 0,004) (Εικόνα 2Β) που υποδηλώνει ότι συμβαίνει παράλειψη εξονίου 3 πιο συχνά παρουσία της παραλλαγής DC-SIGNR int2-180A που σχετίζεται με MTCT του HIV-1. Η παραλλαγή DC-SIGNR int2-180A μεταδίδεται πάντα με τη μετάλλαξη προαγωγέα p-198A (Εικόνα 1). Στην ανάλυση μη προσαρμοσμένης παλινδρόμησης, η παραλλαγή p-198A συσχετίστηκε σημαντικά με IU αλλά όχι με IP και PP μετάδοση HIV-1 (Πίνακας 3). Η ανάλυση θέσης δέσμευσης υπολογιστικού παράγοντα μεταγραφής προβλέπει τον Πίνακα 1. Βασικά χαρακτηριστικά των παραγόντων κινδύνου μητέρας και βρέφους για ενδομήτρια (IU), ενδογεννητική (IP) και μετά τον τοκετό (PP) μετάδοση HIV-1 από μητέρα σε παιδί. Σχήμα 3Α). Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης του κατασκευάσματος παραλλαγής p-198A ήταν σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη του κατασκευάσματος προαγωγέα WT p-198C (αναλογία p-198C/A = 2, P = 0,006) (Εικόνα 3Β) υποδηλώνοντας ότι το DC-SIGNR p-198A επηρεάζει δραστηριότητα προαγωγέα. Οι άλλες μεταλλάξεις προαγωγέα (ρ-577C και ρ-323Α) που παρατηρήθηκαν στον πληθυσμό της Ζιμπάμπουε δεν επηρέασαν τη μεταγραφή DC-SIGNR σε αυτή τη δοκιμασία (Σχήμα S2). Για να προσδιορίσουμε τον καθαρό αντίκτυπο της μετάλλαξης DC-SIGNR p-198A στην έκφραση DC-SIGNR στον πλακούντα, ποσοτικοποιήσαμε τον απόλυτο αριθμό των ολικών και δεσμευμένων στη μεμβράνη μεταγραφών DC-SIGNR στα δείγματα Η1 ομοζυγώτη και άγριου τύπου πλακούντα όπως περιγράφεται νωρίτερα. Ο συνολικός αριθμός μεταγραφών DC-SIGNR προσδιορίστηκε ότι είναι 6856213 (αντίγραφα DC-SIGNR6S.E.M ανά 105 αντίγραφα GAPDH) στα δείγματα πλακούντα από ομόζυγα βρέφη Η1 και ήταν 4 φορές χαμηλότερος σε σύγκριση με αυτόν που βρέθηκε στους πλακούντες από άτομα WT ( 27816638, P = 0,011) (Εικόνα 3C). Όπως προτάθηκε προηγουμένως, η μετάλλαξη int2-180A μπορεί να προκαλέσει παράκαμψη του εξονίου 3 που οδηγεί σε χαμηλότερη παραγωγή δεσμευμένου στη μεμβράνη DC-SIGNR. Αν και η μείωση του συνολικού αριθμού μεταγραφών DC-SIGNR σε δείγματα ομόζυγου πλακούντα Η1 που περιείχαν και τις παραλλαγές p-198AA και int2-180AA επηρέασε την αναλογία των δεσμευμένων στη μεμβράνη και των διαλυτών ισομορφών, η επίδραση αυτών των μεταλλάξεων ήταν πιο έντονη στην Ισόμορφες δεσμευμένες στη μεμβράνη με 8 φορές μείωση (H1 = 117636,2 vs WT = 9906220,6, P = 0,003) σε σύγκριση με 3 φορές μείωση στις συνολικές διαλυτές ισομορφές (H1 = 5686181,9 έναντι WT = 302C = 302C (Σχήμα 35 = 302C) ). Ως εκ τούτου, οι μεταλλάξεις DC-SIGNR p-198A και int2-180A που σχετίζονται με MTCT του HIV-1 μείωσαν σημαντικά το επίπεδο των ολικών μεταγραφών DC-SIGNR του πλακούντα, επηρεάζοντας δυσανάλογα την παραγωγή ισομορφών που συνδέεται με τη μεμβράνη. Πίνακας 3 . Συσχετίσεις μεταξύ του βρεφικού υποκινητή DC-SIGNR p-198 και των παραλλαγών του ιντρονίου 2 (int2)-180 και της ενδομήτριας (IU), ενδογεννητικής (IP) και μετά τον τοκετό (PP) μετάδοσης HIV-1 από μητέρα σε παιδί. Τα γενετικά μας αποτελέσματα, που υποστηρίζονται από δοκιμασία έκφρασης στον πλακούντα, υποδηλώνουν τη συμμετοχή του DC-SIGNR στο MTCT του HIV-1. Η ομοζυγωτία για τον απλότυπο Η1 συσχετίστηκε με μετάδοση IU στην ανάλυση μη προσαρμοσμένης παλινδρόμησης. Ωστόσο, η συσχέτιση εξαφανίστηκε μετά την προσαρμογή για τους μητρικούς παράγοντες πιθανώς λόγω του μικρού αριθμού των βρεφών Η1 ομοζυγώτων που αναλύθηκαν σε κάθε ομάδα. Οι Η1 και Η3 ήταν οι πιο συχνοί απλότυποι που παρατηρήθηκαν στον πληθυσμό της μελέτης και μοιράζονται ένα σύμπλεγμα μεταλλάξεων (Εικόνα 1). Η ομαδοποίηση των απλοτύπων Η1 και Η3 αύξησε την ισχύ της μελέτης και επέτρεψε τον εντοπισμό συγκεκριμένων μεταλλάξεων DC-SIGNR που σχετίζονται με το MTCT του HIV-1. Πράγματι, δύο μεταλλάξεις που μοιράζονται οι απλότυποι Η1 και Η3 συσχετίστηκαν με κάθετη μετάδοση του HIV-1. Το int2-180A συσχετίστηκε με 4 φορές αυξημένο κίνδυνο IU και 6 φορές αυξημένο κίνδυνο IP μετά από προσαρμογή για τους μητρικούς παράγοντες. Αν και η παραλλαγή p-198A συσχετίστηκε με μετάδοση IU, η συσχέτιση εξαφανίστηκε μετά την προσαρμογή για το μητρικό ιικό φορτίο. Ωστόσο, δείξαμε ότι αυτή η μετάλλαξη μειώνει τη μεταγραφική δραστηριότητα DC-SIGNR in vitro και παράγει χαμηλότερα επίπεδα μεταγραφών DC-SIGNR στους ιστούς του πλακούντα σε συνδυασμό με την παραλλαγή int2-180A. Δεδομένου ότι το int2-180A μεταδίδεται πάντα με το p-198A στους συνδυασμένους απλότυπους H1/H3 που σχετίζονται με MTCT, ενώ το p-198A μεταφέρεται σε άλλους μη συσχετισμένους απλότυπους (Εικόνα 1), μπορούμε να υποθέσουμε ότι η μετάλλαξη p-198A από μόνη της μπορεί να έχει δευτερεύουσα αποτέλεσμα in vivo ενώ σε συνδυασμό με την παραλλαγή int2-180A, και τα δύο δρουν για να μειώσουν το επίπεδο έκφρασης του DC-SIGNR του πλακούντα με αποτέλεσμα αυξημένο κίνδυνο MTCT του HIV-1. Η πλειοψηφία της μετάδοσης IU συμβαίνει κατά το τελευταίο τρίμηνο της εγκυμοσύνης (ανασκόπηση στο [12] ). Δείγματα πλακούντα πλήρους διάρκειας δεν ήταν διαθέσιμα για την τρέχουσα μελέτη και οι δοκιμασίες έκφρασης πραγματοποιήθηκαν σε ιστούς πλακούντα πρώτου χρόνου. Μια προηγούμενη μελέτη που εξέταζε το ρεπερτόριο των ισομορφών του πλακούντα DC-SIGNR σε δείγματα πλακούντα πλήρους διάρκειας έδειξε παρόμοια ποικιλομορφία μεταγραφών DC-SIGNR όπως και στους πρώτους ιστούς πλακούντα που μελετήθηκαν εδώ [3] . Ωστόσο, δεδομένου ότι τα επίπεδα έκφρασης του DC-SIGNR δεν συγκρίθηκαν ποτέ μεταξύ των διαφορετικών όρων εγκυμοσύνης, δεν είναι γνωστό εάν η έκφραση του DC-SIGNR ποικίλλει κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης. Ωστόσο, είναι λογικό να υποθέσουμε ότι οι διαφορές μεταξύ των ατόμων τόσο στο ρεπερτόριο ισομορφής DC-SIGNR όσο και στα επίπεδα μεταγραφής που παρατηρήθηκαν μεταξύ των ομόζυγων βρεφών H1 και WT θα αντανακλώνται σε όλη τη διάρκεια της εγκυμοσύνης. Μέχρι σήμερα, οι περισσότερες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στον πιθανό ρόλο του DC-SIGNR στην trans μόλυνση του HIV-1 in vitro [2, 10]. Ωστόσο, οι πολλαπλοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην trans μόλυνση και τον πλεονασμό μεταξύ των λειτουργιών λεκτίνης τύπου C καθιστούν δύσκολο τον προσδιορισμό της πραγματικής συμμετοχής του DC-SIGNR σε αυτόν τον τρόπο μόλυνσης in vivo [13, 14]. Η ισχυρή συσχέτιση που παρατηρήσαμε μεταξύ MTCT γενετικών παραλλαγών HIV-1 και DC-SIGNR που παράγουν χαμηλά επίπεδα DC-SIGNR στον πλακούντα υποδηλώνει ότι μηχανισμοί διαφορετικοί από τη διαμεσολαβούμενη από το DC-SIGNR τρανς λοίμωξη μπορεί να λειτουργούν κατά την κάθετη μετάδοση του HIV-1. Για παράδειγμα, το DC-SIGNR έχει επίσης αποδειχθεί ότι λειτουργεί ως υποδοχέας σύλληψης αντιγόνου HIV-1 [15] . Ο Chan και οι συνεργάτες του απέδειξαν πρόσφατα ότι τα διαμολυσμένα με DC-SIGNR κύτταρα CHO μειώνουν τους τίτλους του SARS-CoV με ενισχυμένη σύλληψη και αποικοδόμηση του ιού με τρόπο που εξαρτάται από το πρωτεάσωμα [4] . Δεδομένου ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα εκφράζουν MHC-I και II, αποικοδομημένα ιικά αντιγόνα θα μπορούσαν στη συνέχεια να παρουσιαστούν στα κύτταρα του ανοσοποιητικού για να προκαλέσουν μια προσαρμοστική ανοσοαπόκριση [16, 17]. Ο υποδοχέας HIV-1 CCR5, αλλά όχι το CD4, συνεκφράζεται με το DC-SIGNR στα ενδοθηλιακά κύτταρα του πλακούντα και του αιματοεγκεφαλικού φραγμού (BBB) ​​[18, 19]. Η δέσμευση του HIV-1 gp120 στον υποδοχέα CCR5 στα ενδοθηλιακά κύτταρα θέτει σε κίνδυνο την ακεραιότητα του BBB και ενισχύει την προσκόλληση και τη μετανάστευση των μονοκυττάρων μέσω του BBB [20, 21]. Είναι επομένως πιθανό ότι η μειωμένη έκφραση του DC-SIGNR, ιδιαίτερα των ισόμορφων που συνδέονται με τη μεμβράνη, στα τριχοειδικά ενδοθηλιακά κύτταρα του πλακούντα μπορεί να ευνοήσει τη δέσμευση HIV-1 στον υποδοχέα CCR5, αντί για τον υποδοχέα DC-SIGNR, διευκολύνοντας τη μετανάστευση μητρικών κυττάρων μολυσμένων με HIV-1 κατά μήκος του φραγμού του πλακούντα με αποτέλεσμα τη μετάδοση IU του HIV-1. Η παραλλαγή int2-180A που περιέχεται στους απλότυπους Η1 και Η3 συσχετίστηκε με τη μετάδοση IP υποδηλώνοντας ότι το DC-SIGNR επηρεάζει επίσης τη μετάδοση του HIV-1 κατά την παράδοση. Λίγα είναι γνωστά για τους μηχανισμούς μετάδοσης του HIV-1 κατά την παράδοση. Η διέλευση μέσω του καναλιού γέννησης θα μπορούσε δυνητικά να εκθέσει τα βρέφη μέσω μιας πύλης του βλεννογόνου (πιθανώς οφθαλμική, δερματική ή γαστρεντερική), ενώ η προσβολή του πλακούντα κατά τη διάρκεια του τοκετού (σωματική ή φλεγμονώδης) μπορεί να ενισχύσει τη διαπλακουντιακή διέλευση των μητρικών μολυσμένων με HIV-1 κυττάρων στην εμβρυϊκή κυκλοφορία. 22, 23]. Μια τέτοια διαδικασία που ονομάζεται μικρομετάγγιση έχει προταθεί σε σχέση με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται σε μια κοόρτη του Μαλάουι. Ο Kweik και οι συνεργάτες του βρήκαν μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του μητρικού DNA στο αίμα του ομφάλιου λώρου και της IP μετάδοσης του HIV-1, υποδηλώνοντας ότι η διέλευση των μητρικών μολυσμένων κυττάρων μέσω του πλακούντα είναι πιθανό να συμβεί κατά τη διάρκεια του τοκετού [22]. Έτσι, με παρόμοιο τρόπο όπως προτάθηκε προηγουμένως για μετάδοση IU, το σχετικά χαμηλότερο επίπεδο DC-SIGNR στον πλακούντα ομόζυγων βρεφών που φιλοξενούν την παραλλαγή int2-180A θα μπορούσε να προάγει τη δέσμευση του HIV-1 με τον υποδοχέα CCR5 στα ενδοθηλιακά κύτταρα που επηρεάζει την ακεραιότητα του φραγμού του πλακούντα και διευκολύνοντας τη διέλευση των μητρικών μολυσμένων κυττάρων στην εμβρυϊκή κυκλοφορία κατά τη διάρκεια του τοκετού. Εκτός από το DC-SIGNR, άλλοι υποδοχείς HIV-1 είναι γνωστό ότι επηρεάζουν το MTCT του HIV-1 (ανασκόπηση στο [24] ). Γενετικές παραλλαγές στο CCR5 έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν την κάθετη μετάδοση του HIV-1. Οι παραλλαγές του προαγωγέα CCR5 που είχαν ως αποτέλεσμα υψηλότερη έκφραση του υποδοχέα συσχετίστηκαν με αυξημένο κίνδυνο MTCT του HIV-1 στους Αφρικανούς της υποσαχάριας Αφρικής [25, 26]. Ο πολυμορφισμός διαγραφής 32-pb στο CCR5 έχει αποδειχθεί ότι προστατεύει από την κάθετη μετάδοση του HIV-1 [27] , αλλά αυτή η παραλλαγή ουσιαστικά απουσιάζει στους αφρικανικούς πληθυσμούς [28] . Οι υψηλοί αριθμοί αντιγράφων του CCL3L1, ενός ισχυρού κατασταλτικού προσδέματος HIV-1 για το CCR5, σχετίζονται με υψηλότερη παραγωγή χημειοκίνης και χαμηλότερο κίνδυνο MTCT του HIV-1 στα βρέφη της Νότιας Αφρικής [29, 30]. Η λεκτίνη που δεσμεύει τη μαννόζη (MBL) είναι ένας έμφυτος ανοσολογικός υποδοχέας που συντίθεται στο ήπαρ και εκκρίνεται στην κυκλοφορία του αίματος ως απόκριση στο σήμα φλεγμονής. Το MBL προάγει την εξάλειψη του παθογόνου με οψωνισμό και φαγοκυττάρωση, και η μειωμένη έκφραση του MBL που προκύπτει από τον πολυμορφισμό σε κωδικοποιητικές και μη κωδικοποιητικές περιοχές έχει συσχετιστεί με αυξημένο κίνδυνο MTCT του HIV-1 [31, 32]. Σε αυτή τη μελέτη, καταδεικνύουμε για την πρώτη φορά, η πιθανή λειτουργική επίδραση των μεταλλάξεων του DC-SIGNR στην έκφρασή του στον πλακούντα και στην κατακόρυφη μετάδοση του HIV-1. Πιστεύουμε ότι η παρουσία του DC-SIGNR στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων του πλακούντα μπορεί να προστατεύσει τα βρέφη από τη μόλυνση HIV-1 συλλαμβάνοντας τον ιό και προάγοντας την αποικοδόμηση/παρουσίασή του. Ωστόσο, σε πλακούντα που περιέχει χαμηλά επίπεδα DC-SIGNR, ο HIV-1 δεσμεύει κατά προτίμηση το CCR5 στα ενδοθηλιακά κύτταρα με αποτέλεσμα την απώλεια της ακεραιότητας του φραγμού του πλακούντα και την ενίσχυση της διέλευσης των μητρικών κυττάρων που έχουν μολυνθεί με HIV-1 στην εμβρυϊκή κυκλοφορία που οδηγεί σε MTCT του HIV- 1. Αυτός ο μηχανισμός μπορεί επίσης να εφαρμοστεί σε άλλα κάθετα μεταδιδόμενα παθογόνα που είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρούν με το DC-SIGNR όπως οι ιοί HIV-2, ηπατίτιδας C και δάγκειος πυρετός και δικαιολογεί περαιτέρω διερεύνηση. Συσχετίσεις μεταξύ γονοτύπων επαναλαμβανόμενης περιοχής του εξονίου 4 του παιδιού DC-SIGNR και της μετάδοσης HIV-1 από μητέρα σε παιδί. CI, Διάστημα εμπιστοσύνης. Ν, αριθμός; NA; Δεν εφαρμόζεται; Ή, λόγος πιθανοτήτων μια τιμή P όπως προσδιορίζεται από τη δοκιμή Τετράγωνου Χ. β Σύγκριση μεταξύ γονότυπου και όλων των άλλων. Βρέθηκε στη διεύθυνση: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s003 (0,05 MB DOC) Εικόνα S1 Ρεπερτόριο μεταγραφών DC-SIGNR στον πλακούντα. Τα κύρια προϊόντα RT-PCR από εκχύλισμα RNA από 3 ομόζυγα δείγματα πλακούντα Η1 και 3 ομόζυγα WT πλακούντα καθαρίστηκαν, κλωνοποιήθηκαν και αλληλουχήθηκαν. Η αλληλουχία αναλύθηκε σύμφωνα με την αλληλουχία αναφοράς NCBI NM_014257. CT; κυτταροπλασματική ουρά, ΤΜ; διαμεμβρανικός τομέας; WT; άγριου τύπου Βρέθηκε στη διεύθυνση: doi:10.1371/journal.pone.0007211.s004 (0,11 MB DOC) Εικόνα S2 Επίδραση της παραλλαγής προαγωγέα DC-SIGNR στη μεταγραφική δραστηριότητα σε δοκιμασία αναφοράς λουσιφεράσης in vitro σε επιμολυσμένα κύτταρα HeLa. Σχετική έκφραση λουσιφεράσης από pGL2-Basic, γονικός φορέας χωρίς προαγωγέα. Έκφραση κατασκευάσματα προαγωγέα DC-SIGNR, που καλύπτουν την παραλλαγή p-577C ή την παραλλαγή p-323A, υπολογίστηκαν σχετικά με αυτήν την τιμή. Τα δεδομένα παρουσιάζονται σε μέσες τιμές 6S.E.M τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η δοκιμή ANOVA μονής κατεύθυνσης ακολουθούμενη από τη δοκιμή Dunnett για πολλαπλή σύγκριση χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση της σχετικής έκφρασης λουσιφεράσης των ανταποκριτών παραλλαγής p-557C και p-323A έναντι του κατασκευάσματος άγριου τύπου (WT) (μη σημαντικό). 0 mg, 0,5 mg ή 1 mg φορέας CMV-Tat επιμολύνθηκε με LTR-Luc ως θετικό μάρτυρα σε αυτά τα πειράματα.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 370, "text": "Η μετάδοση από μητέρα σε παιδί (MTCT) είναι η κύρια αιτία μόλυνσης από τον ιό HIV-1 στα παιδιά παγκοσμίως" } ], "id": 262, "question": "Ποια είναι η κύρια αιτία μόλυνσης από τον ιό HIV-1 στα παιδιά;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2156, "text": "το DC-SIGNR παίζει κρίσιμο ρόλο στην MTCT του HIV-1 και ότι η μειωμένη έκφραση του DC-SIGNR του πλακούντα αυξάνει τον κίνδυνο μετάδοσης." } ], "id": 276, "question": "Τι παίζει τον κρίσιμο ρόλο στη μετάδοση του HIV-1 από τη μητέρα στο παιδί και τι αυξάνει τον κίνδυνο" }, { "answers": [ { "answer_start": 2450, "text": "περισσότερα από 400.000 παιδιά μολύνθηκαν παγκοσμίως, κυρίως μέσω MTCT και το 90% από αυτά ζούσε στην υποσαχάρια Αφρική" } ], "id": 278, "question": "Πόσα παιδιά μολύνθηκαν από τον ιό HIV-1 το 2008-2009, παγκοσμίως;" }, { "answers": [ { "answer_start": 30965, "text": "Οι υψηλοί αριθμοί αντιγράφων του CCL3L1, ενός ισχυρού κατασταλτικού προσδέματος HIV-1 για το CCR5, σχετίζονται με υψηλότερη παραγωγή χημειοκίνης και χαμηλότερο κίνδυνο MTCT του HIV-1 στα βρέφη της Νότιας Αφρικής" } ], "id": 316, "question": "Ποιος είναι ο ρόλος του C-C Motif Chemokine Ligand 3 Like 1 (CCL3L1) στη μετάδοση του HIV-1 από μητέρα σε παιδί;" }, { "answers": [ { "answer_start": 30490, "text": "Γενετικές παραλλαγές στο CCR5 έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν την κάθετη μετάδοση του HIV-1. Οι παραλλαγές του προαγωγέα CCR5 που είχαν ως αποτέλεσμα υψηλότερη έκφραση του υποδοχέα συσχετίστηκαν με αυξημένο κίνδυνο MTCT του HIV-1 στους Αφρικανούς της υποσαχάριας Αφρικής" } ], "id": 312, "question": "Επηρεάζει ο υποδοχέας χημειοκίνης C-C τύπου 5 (CCR5) τη μετάδοση του HIV-1;" }, { "answers": [ { "answer_start": 31187, "text": "Η λεκτίνη που δεσμεύει τη μαννόζη (MBL) είναι ένας έμφυτος ανοσολογικός υποδοχέας που συντίθεται στο ήπαρ και εκκρίνεται στην κυκλοφορία του αίματος ως απόκριση στο σήμα φλεγμονής. Το MBL προάγει την εξάλειψη του παθογόνου με οψωνισμό και φαγοκυττάρωση," } ], "id": 318, "question": "Πώς επηρεάζει η λεκτίνη που δεσμεύει τη μαννανόζη (MBL) την εξάλειψη του παθογόνου HIV-1;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Ο ρόλος της S-Palmitoylation στο IFITM5 για την αλληλεπίδραση με το FKBP11 σε κύτταρα οστεοβλαστώνhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3776769/Tsukamoto, Takashi; Li, Xianglan; Morita, Hiromi; Minowa, Takashi; Aizawa, Tomoyasu; Hanagata, Nobutaka; Demura, Makoto2013-09-18DOI:10.1371/journal.pone.0075831License:cc-byAbstract: Πρόσφατα, μία από τις διαμεμβρανικές πρωτεΐνες της οικογένειας που προκαλούνται από ιντερφερόνη (IFITM), η IFITM3, έχει γίνει σημαντικός στόχος για τη δράση κατά της γρίπης A (H1N1 ) μόλυνση από ιό. Σε αυτή την πρωτεΐνη, μια μετα-μεταφραστική τροποποίηση από λιπαρά οξέα ομοιοπολικά συνδεδεμένα με την κυστεΐνη, που ονομάζεται S-palmitoylation, παίζει κρίσιμο ρόλο για την αντιική δράση. Το IFITM3 διαθέτει τρία υπολείμματα κυστεΐνης για την S-παλμιτουλίωση στην πρώτη διαμεμβρανική περιοχή (ΤΜ1) και στον κυτταροπλασματικό (CP) βρόχο. Επειδή αυτές οι κυστεΐνες είναι καλά διατηρημένες στις πρωτεΐνες της οικογένειας IFITM των θηλαστικών, η S-παλμιτουλίωση σε αυτές τις κυστεΐνες είναι σημαντική για τις λειτουργίες τους. Το IFITM5 είναι μια άλλη πρωτεΐνη της οικογένειας IFITM και αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη 11 που δεσμεύει το FK506 (FKBP11) για να σχηματίσει ένα σύμπλοκο υψηλότερης τάξης σε κύτταρα οστεοβλαστών, το οποίο επάγει την έκφραση ανοσολογικά σχετικών γονιδίων. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τον ρόλο που παίζει η S-παλμιτοϋλίωση του IFITM5 στην αλληλεπίδρασή του με το FKBP11 στα κύτταρα, επειδή αυτή η αλληλεπίδραση είναι μια βασική διαδικασία για τη γονιδιακή έκφραση. Οι έρευνές μας χρησιμοποιώντας έναν καθιερωμένο ανταποκριτή, το 17-οκταδεκυνοϊκό οξύ (17-ODYA) και έναν αναστολέα για την S-παλμιτουλίωση, το 2-βρωμοπαλμιτικό οξύ (2BP), αποκάλυψαν ότι το IFITM5 ήταν S-παλμιτοϋλιωμένο επιπλέον του IFITM3. Συγκεκριμένα, βρήκαμε ότι τα υπολείμματα κυστεΐνης στην περιοχή ΤΜ1 και στον βρόχο CP ήταν S-παλμιτοϋλιωμένα στο IFITM5. Στη συνέχεια, αποκαλύψαμε με ανοσοκαταβύθιση και αναλύσεις στυπώματος western ότι η αλληλεπίδραση του IFITM5 με το FKBP11 ανεστάλη παρουσία 2ΒΡ. Το μετάλλαγμα που δεν είχε τη θέση S-παλμιτοϋλίωσης στον τομέα ΤΜ1 έχασε την αλληλεπίδραση με το FKBP11. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η S-παλμιτοϋλίωση στο IFITM5 προάγει την αλληλεπίδραση με το FKBP11. Τέλος, διερευνήσαμε τον σχηματισμό οστικού οζιδίου σε κύτταρα οστεοβλαστών παρουσία 2BP, επειδή το IFITM5 αρχικά αναγνωρίστηκε ως παράγοντας σχηματισμού οστού. Το πείραμα οδήγησε σε μορφολογική εκτροπή του οστικού οζιδίου. Αυτό έδειξε επίσης ότι η S-παλμιτοϋλίωση συμβάλλει στον σχηματισμό οστού. Κείμενο: Η οικογένεια πρωτεϊνών διαμεμβρανικής πρωτεΐνης που προκαλείται από ιντερφερόνη (IFITM) (γνωστή και ως οικογένεια Fragilis σε ποντίκια) είναι μέρος της οικογένειας dispanin [1] και αποτελείται από διπλά -διαμεμβρανικές α-έλικες συνδεδεμένες με έναν κυτταροπλασματικό (CP) βρόχο και εξωκυτταρικές (EC) αμινο-και καρβοξυτελικές πολυπεπτιδικές αλληλουχίες (Εικόνα 1-Α). Οι πρωτεΐνες IFITM διατηρούνται εξελικτικά στα σπονδυλωτά [2] . Πρόσφατη γονιδιωματική έρευνα αποκάλυψε ότι υπάρχουν 5 μέλη IFITM στους ανθρώπους (IFITM1, 2, 3, 5 και 10) και 7 μέλη σε ποντίκια (IFITM1, 2, 3, 5, 6, 7 και 10). Αυτές οι πρωτεΐνες παίζουν ρόλο σε διάφορες βιολογικές διεργασίες, όπως η ωρίμανση των γεννητικών κυττάρων κατά τη γαστρίωση (IFITM1-3) [3] [4] [5] , η προσκόλληση κυττάρου σε κύτταρο (IFITM1) [6] [7] [8] , αντιική δράση (IFITM1-3) [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] , και σχηματισμός οστού (IFITM5) [18] [19] [20] [21] [22] , αν και οι λεπτομερείς λειτουργίες των IFITM6, 7 και 10 είναι άγνωστες προς το παρόν. Συγκεκριμένα, το IFITM3 έχει αποτελέσει στόχο εντατικών μελετών σχετικά με τη δραστηριότητά του κατά της μόλυνσης και της εσωτερίκευσης του ιού της γρίπης Α (H1N1) [9] [10] [11] [12] [13] [14] .Το 2010, ο Δρ. Yount και οι συνάδελφοι ανέφεραν ότι η αντιική δράση του IFITM3 εξαρτάται από την S-παλμιτοϋλίωση στην πρωτεΐνη [10] . Η S-παλμιτοϋλίωση [23] είναι μια μετα-μεταφραστική τροποποίηση πρωτεϊνών από κορεσμένα λιπαρά οξέα C 16 (παλμιτικά οξέα) ομοιοπολικά συνδεδεμένα με ορισμένα υπολείμματα κυστεΐνης μέσω μιας θειοεστερικής σύνδεσης (Εικόνα 1-Β). Η τροποποίηση καταλύεται αναστρέψιμα από πρωτεϊνικές ακυλοτρανσφεράσες και ακυλοπρωτεϊνικές θειοεστεράσες και προσδίδει μοναδικές ιδιότητες στην πρωτεΐνη, όπως σύνδεση και στόχευση μεμβράνης, ανοσοαντιδραστικότητα, ευθυγράμμιση αλληλουχίας αμινοξέων των IFITM5, IFITM1, IFITM2 και IFITM3 που προέρχονται από ποντίκια. Τα διατηρημένα υπολείμματα επισημαίνονται με μαύρο χρώμα. Οι τρεις διατηρημένες κυστεΐνες επισημαίνονται με κόκκινο και αριθμούνται με βάση την αλληλουχία των IFITM5 (πάνω) και IFITM3 (κάτω). Τα υπολείμματα μοναδικά στο IFITM5 επισημαίνονται με γκρι χρώμα. Η πρώτη και η δεύτερη διαμεμβρανική περιοχή, οι εξωκυτταρικές αλληλουχίες και ο κυτταροπλασματικός βρόχος υποδεικνύονται με βέλη και συμβολίζονται ως ΤΜ1 και ΤΜ2, EC και κρίκος CP, αντίστοιχα. Οι τομείς TM προβλέφθηκαν από το SOSUI. Τα ασπαρτικά στην C-τερματική περιοχή στο IFITM5 εμφανίζονται με μπλε χρώμα. Β) Η σχηματική απεικόνιση της πρωτεΐνης S-παλμιτοϋλίωσης. Το C16-παλμιτικό οξύ συνδέεται με την κυστεΐνη μέσω ενός δεσμού θειοεστέρα. Η παλμιτοϋλίωση και η αποπαλμιτουλίωση καταλύονται από πρωτεϊνικές ακυλοτρανσφεράσες και ακυλοπρωτεϊνικές θειοεστεράσες, αντίστοιχα. Σε αυτή τη μελέτη, η υδροξυλαμίνη, NH 2 OH, χρησιμοποιήθηκε για τη μείωση της σύνδεσης θειοεστέρα. Γ) Συνοψίζεται η ταυτότητα (ομοιότητα) της αλληλουχίας αμινοξέων μεταξύ των IFITM5, IFITM1, IFITM2 και IFITM3. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g001 και αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Οι συγγραφείς αποκάλυψαν ότι το IFITM3 είναι S-παλμιτοϋλιωμένο σε τρεις εγγύς κυστεΐνες μεμβράνης, Cys71 και Cys72 στην πρώτη διαμεμβρανική περιοχή (TM1) και Cys105 στον βρόχο CP (Εικόνα 1-Α) [10] . Επιπλέον, το IFITM3 που δεν έχει την S-παλμιτοϋλίωση δεν συγκεντρώνεται στην κυτταρική μεμβράνη και μειώνει σημαντικά την αντιική δράση. Επιπλέον, οι κυστεΐνες στα IFITM2, Cys70, Cys71 και Cys104 επίσης παλμιτοϋλιώνονται με τον ίδιο τρόπο, γεγονός που επηρεάζει τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό [24] . Μια πρόσφατη μελέτη αποκάλυψε ότι το IFITM1 ποντικού έχει τέσσερα υπολείμματα κυστεΐνης (Cys49, Cys50, Cys83 και Cys103) για την S-παλμιτουλίωση, η οποία απαιτείται για την αντιική δράση και τη σταθερότητα της πρωτεΐνης [25] . Τα άλλα μέλη της οικογένειας IFITM διαθέτουν επίσης αυτές τις κυστεΐνες (Εικόνα 1-Α) , και επομένως ο ρόλος της σπαλμιτοϋλίωσης στις κυστεΐνες θα πρέπει να είναι σημαντικός για τις λειτουργίες των πρωτεϊνών IFITM. Εδώ, επικεντρωθήκαμε στο IFITM5, το οποίο είναι επίσης γνωστό ως περιορισμένο IFITM πρωτεΐνη τύπου (BRIL) [18] . Μεταξύ των πρωτεϊνών της οικογένειας IFITM, το IFITM5 είναι μοναδικό. (i) Έκφραση του IFITM5: Σε αντίθεση με τις άλλες πρωτεΐνες της οικογένειας IFITM, η έκφραση του IFITM5 δεν προκαλείται από ιντερφερόνες επειδή η περιοχή ανάντη του γονιδίου ifitm5 στερείται των ρυθμιστικών στοιχείων της ιντερφερόνης [26] . Επιπλέον, η έκφραση του IFITM5 περιορίζεται κυρίως στα κύτταρα οστεοβλαστών [18, 19, 27], ενώ οι άλλες πρωτεΐνες IFITM εκφράζονται παντού (ii). Ομοιότητα αλληλουχίας αμινοξέων: Η αλληλουχία αμινοξέων του IFITM5 είναι σχετικά ανόμοια με τις πρωτεΐνες IFITM1-3 (~ 65% ομοιότητα), ενώ οι πρωτεΐνες IFITM1-3 μοιράζονται ~ 85% ομοιότητα μεταξύ τους (Εικόνα 1 -C). Επιπλέον, το IFITM5 έχει μια περιοχή πλούσια σε ασπαρτικό στην C-τερματική περιοχή, η οποία θα μπορούσε να εμπλέκεται στη δέσμευση ασβεστίου (Εικόνα 1 -Α) [26] . (iii) Ο ρόλος του IFITM5 στον σχηματισμό οστών: Η έκφραση του IFITM5 σχετίζεται με την ανοργανοποίηση κατά τη διαδικασία σχηματισμού οστού σε κύτταρα οστεοβλαστών [18] [19] [20] [21] . Προηγούμενες μελέτες έχουν επιβεβαιώσει την έκφραση του IFITM5 σε οστικούς ιστούς σε ποντίκια, αρουραίους, ανθρώπους και ταμάρια wallabies [2] . Τα ποντίκια νοκ-άουτ του γονιδίου ifitm5 έχουν μικρότερα οστά [19] . Επιπλέον, η καταστροφή του γονιδίου ifitm5 από το μικρό RNA της φουρκέτας προκαλεί μείωση στο σχηματισμό οζιδίων οστού, ενώ η υπερέκφραση του γονιδίου στα κύτταρα UMR106 έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει την πρόσληψη ασβεστίου και τον σχηματισμό οστικών οστών [18] . (iv) Ο ρόλος του IFITM5 για την ανοσολογική δραστηριότητα: Πρόσφατες μελέτες αποκάλυψαν ότι το IFITM5 αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη 11 που δεσμεύει το FK506 (FKBP11) για να σχηματίσει το σύμπλεγμα IFITM5-FKBP11-CD81-το σύμπλεγμα αρνητικού ρυθμιστή του υποδοχέα F2 προσταγλανδίνης (FPRP) [28]. Όταν σχηματίζεται το σύμπλεγμα, επάγονται οι εκφράσεις 5 γονιδίων που προκαλούνται από ιντερφερόνη, συμπεριλαμβανομένου του αντιγόνου 2 στρωματικών κυττάρων μυελού των οστών (Bst2), της επαγόμενης από ιντερφερόνη πρωτεΐνης 1 (Irgm), της πρωτεΐνης που προκαλείται από ιντερφερόνη με επαναλήψεις τετρατρικοπεπτιδίου 3 (Ifit3), b(2) μικροσφαιρίνη (B2m) και γονίδιο αντιγόνου MHC τάξης Ι. Συνεπώς, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το IFITM5 εμπλέκεται όχι μόνο στον σχηματισμό οστών αλλά και στη δραστηριότητα του ανοσοποιητικού συστήματος. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την S-παλμιτουλίωση του IFITM5 και τον ρόλο του στην αλληλεπίδραση με το FKBP11 σε κύτταρα οστεοβλαστών ποντικού. Κύτταρα που επιμολύνθηκαν από ένα πλασμιδικό DNA που κωδικοποιεί IFITM5 ποντικού αναπτύχθηκαν παρουσία ενός καθιερωμένου χημικού ανταποκριτή, του 17-οκταδεκυνοϊκού οξέος (17-ODYA) [29, 30] ή ενός αναστολέα για την S-παλμιτουλίωση, 2-βρωμοπαλμιτικού οξέος (2BP ) [31] . Οι βιοχημικές δοκιμασίες που χρησιμοποιούν αυτές τις ενώσεις αποκάλυψαν ότι το άγριου τύπου IFITM5 είναι S-παλμιτοϋλιωμένο. Για να ταυτοποιήσουμε τη θέση σπαλμιτοϋλίωσης στο IFITM5, παρασκευάσαμε μεταλλάγματα υποκατεστημένα με κυστεΐνη, IFITM5-C86A, -C52A/C53A και -C52A/53A/86A (Cys-less). Η ανάλυση χημικού ανταποκριτή πρότεινε ότι τουλάχιστον δύο στις τρεις κυστεΐνες στο IFITM5 είναι S-παλμιτοϋλιωμένες. Η αλληλεπίδραση του IFITM5 με το FKBP11 εξετάστηκε με δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης, με αποτέλεσμα την απώλεια της αλληλεπίδρασης παρουσία 2ΒΡ. Το ίδιο αποτέλεσμα λήφθηκε στους δύο μεταλλάκτες, C52A/C53A και Cys-less. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η S-παλμιτοϋλίωση σε Cys52 και/ή Cys53 στον τομέα ΤΜ1 του IFITM5 είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδραση με το FKBP11. Από την άλλη πλευρά, το Cys86 στον βρόχο CP του IFITM5 ήταν S-παλμιτοϋλιωμένο αλλά δεν συμμετείχε στην αλληλεπίδραση. Επειδή αυτή η αλληλεπίδραση είναι σημαντική για την ανοσολογικά σχετική έκφραση γονιδίου, υποδείχθηκε ότι ο ρόλος της S-παλμιτοϋλίωσης είναι να προάγει την αλληλεπίδραση του IFITM5 με το FKBP11 και να ρυθμίζει την ανοσολογική δραστηριότητα στα κύτταρα οστεοβλαστών. Ο πιθανός μηχανισμός αλληλεπίδρασης και η επίδραση της S-παλμιτοϋλίωσης στον σχηματισμό όζων οστού θα συζητηθούν. Για την έκφραση των κυττάρων θηλαστικών, κατασκευάστηκαν πλασμιδικοί φορείς άγριου τύπου IFITM5 (IFITM5-WT) και συντηγμένου με FLAG FKBP11 (FKBP11-FLAG). με εισαγωγή των κλωνοποιημένων γονιδίων σε φορέα έκφρασης pBApo-CMV Neo (Takara Bio, Shiga, Japan). Οι λεπτομέρειες των κατασκευών ανασυνδυασμένου DNA ήταν οι ίδιες με αυτές που περιγράφηκαν προηγουμένως [19] . Τα γονίδια των μεταλλαγμάτων IFITM5 (IFITM5-C86A, -C52A/53A, και -C52A/C53A/C86A (Cys-less)) παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ μεταλλαξογένεσης κατευθυνόμενης θέσης QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA). Οι φορείς πλασμιδίου των συντηγμένων με FLAG IFITM5-WT, -C52A/53A και Cys-less κατασκευάστηκαν με εισαγωγή των κλωνοποιημένων γονιδίων στον φορέα έκφρασης pBApo-CMV Neo. Για έκφραση κυττάρων Ε. coli, ο πλασμιδιακός φορέας του IFITM5-WT κατασκευάστηκε με εισαγωγή του κλωνοποιημένου γονιδίου σε φορέα έκφρασης pET22b (Novagen, Madison, WI). Ο εμπρόσθιος εκκινητής 5'-GGAATTCCATATGGACACTTCATATCCCCGTG-3' και ο αντίστροφος εκκινητής 5'-CCGCTCGAGGTTATAGTCCTCCTCATCAAACTTGG-3' χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση του γονιδίου που κωδικοποιεί ολόκληρο το IFITM5 από τον φορέα πλασμιδίου για έκφραση κυττάρου θηλαστικού. Τα υπογραμμισμένα γράμματα δηλώνουν μια θέση διάσπασης NdeI και XhoI, αντίστοιχα. Τα πλασμίδια των μεταλλαγμάτων IFITM5 παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ μεταλλαξογένεσης κατευθυνόμενης θέσης QuikChange. Οι εκκινητές με νόημα και αντί-νοηματοδότηση που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 5'-GGCAGTATGGCTCCAAAGCCAAGGCGTACAACATCCTGG CTGC-3' και 5'-GCAGCCAGGATGTTGTACGCCTTGGCTTTGGAGCATACT GCC-3' για IFITM5-C86A. και 5'-GCACGATGTACCTGAATCTGGCGGCGCTTTGGATTCCTGG CGC-3' και 5'-GCGCCAGGAATCCAAGCGCCGCCAGATTCAGGTACATCG TGC-3' για τα IFITM5-C52A/C53A, αντίστοιχα, παρέχονταν από τα κύτταρα που μοιάζουν με τα Cee-ΙΙΙΜΟΑ, τα Louise-3Richtllma. Τράπεζα (RCB 1126). Οι διαδικασίες για κυτταρική καλλιέργεια, επιμόλυνση και έκφραση πρωτεΐνης ήταν οι ίδιες με αυτές που αναφέρθηκαν προηγουμένως. Όταν είναι απαραίτητο, 2-βρωμοπαλμιτικό οξύ (2BP; Wako, Osaka, Ιαπωνία) και 17-οκταδεκυνοϊκό οξύ (17-ODYA; Sigma-Aldrich) διαλύθηκαν σε 99,5% διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO; Wako) και προστέθηκαν στο μέσο διαφοροποίησης σε συγκεντρώσεις 100 μΜ και 50 μΜ σε λιγότερο από 0,1% DMSO, αντίστοιχα [30, 31] . Οι πρωτεΐνες άγριου τύπου και μεταλλαγμένες IFITM5 παρήχθησαν επίσης χρησιμοποιώντας ένα ανασυνδυασμένο σύστημα έκφρασης E. coli. Κύτταρα E. coli BL21(DE3) που μετασχηματίστηκαν από το πλασμίδιο έκφρασης αναπτύχθηκαν στους 37°C σε μέσο LB που περιείχε 50 μg/mL αμπικιλλίνη. Μετά από τετράωρη επαγωγή από 1 mM ισοπροπυλ β-Δθειογαλακτοπυρανοσίδη (IPTG), τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (6.400 χ g για 10 λεπτά στους 4°C). Τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris-HCl 50 mM (ρΗ 8) και διασπάστηκαν με γαλλική πρέσα (Ohtake, Τόκιο, Ιαπωνία) (100 MPa χ 4 φορές). Το ακατέργαστο κλάσμα μεμβράνης συλλέχθηκε με υπερφυγοκέντρηση (178.000 χ g για 90 λεπτά στους 4°C). Το συλλεχθέν κλάσμα διαλυτοποιήθηκε με 1,5% η-δωδεκυλ-β-Δμαλτοπυρανοσίδη (DDM) (Dojindo Lab, Kumamoto, Ιαπωνία) σε 50 mM Tris-HCl, ρΗ 8, που περιέχει 0,3 Μ NaCl και 5 mM ιμιδαζόλη. Μετά την υπερφυγοκέντρηση, το υπερκείμενο επωάστηκε με ρητίνη αγαρόζης Ni 2+ -NTA (Qiagen, Hilden, Γερμανία). Η ρητίνη εφαρμόστηκε σε στήλη χρωματογραφίας και πλύθηκε με 50 mM ιμιδαζόλης που περιέχει 50 mM Tris-HCl (ρΗ 8), 0,3 Μ NaCI και 0,1% DDM. Το διαλυτοποιημένο με DDM IFITM5 συλλέχθηκε με έκλουση με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 0,3 Μ ιμιδαζόλη. Τα μέσα δείγματος αντικαταστάθηκαν από το κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα με δύο διελεύσεις πάνω από μια στήλη PD-10 (GE Healthcare UK, Ltd., Amersham Place, Αγγλία). Οι πειραματικές λεπτομέρειες περιγράφονται σε προηγούμενες αναφορές [19, 28]. Εν συντομία, ολικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από τα κύτταρα οστεοβλαστών που συνέκφρασαν IFITM5 και FKBP11-FLAG χρησιμοποιώντας ένα κιτ εξαγωγής ολικής πρωτεΐνης (BioChain Institute Inc., Newark, CA). Στη συνέχεια, το κυτταρόλυμα επωάστηκε με αντι-FLAG M2 πήκτωμα αγαρόζης (Sigma-Aldrich) στους 4°C για 2 ώρες. Για την ανάκτηση του FKBP11-FLAG, 500 ng/μL 3 × FLAG πεπτίδιο (Sigma-Aldrich) διαλυμένο σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με Tris προστέθηκαν στο συλλεγμένο πήκτωμα στους 4°C για 1 ώρα. Οι ανακτημένες πρωτεΐνες και το κυτταρόλυμα που περιέχει ολικές πρωτεΐνες αναλύθηκαν με SDS-PAGE (15% ePAGEL; ATTO, Τόκιο, Ιαπωνία) και western blot. Το πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-IFITM5, το οποίο παρασκευάστηκε από την αμινοτελική πεπτιδική αλληλουχία (TSYPREDPRAPSSRC), και το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-FLAG (Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκαν ως πρωτεύοντα αντισώματα. Τα συζευγμένα με HRP αντισώματα κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (H+L) (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) και αντισώματα κατσίκας αντι-ποντικού IgG (H+L) (Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκαν ως δευτερεύοντα αντισώματα για το αντι-IFITM5 και αντι-FLAG πρωτογενή αντισώματα, αντίστοιχα. Οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με αντίδραση χημειοφωταύγειας (MercK-Millipore, Billerica, ΜΑ). Το κυτταρόλυμα που εκχυλίστηκε από τα κύτταρα οστεοβλαστών που ήταν μεταβολικά σημασμένα από 17-ODYA επωάστηκε με γέλη αγαρόζης anti-FLAG M2 για να ληφθούν καθαρισμένες πρωτεΐνες IFITM5 συντηγμένες με FLAG. Οι σημασμένες με 17-ΟΔΥΑ πρωτεΐνες επισημάνθηκαν χημικά με αζίδιο-PEG3-5(6)-καρβοξυτετραμεθυλροδαμίνη (ΤΑΜΡΑ-αζίδιο; Κάντε κλικ στο Chemistry Tools, Scottsdale, AZ) με αναφορά σε προηγούμενες μελέτες [10, 29, 30, 32] και στον οδηγό του κατασκευαστή. Οι πρωτεΐνες που διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας λέιζερ 532 nm για διέγερση και ο φθορισμός με TAMRA (565 nm) ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας φίλτρο μακράς διαδρομής 575 nm (Typhoon FLA 9000; GE Healthcare). Τα υποκαλλιεργημένα κύτταρα οστεοβλαστών MC3T3 σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5.000 κυττάρων/cm2 σε δίσκους 40 mm και καλλιεργήθηκαν σε α-Τροποποιημένο Μέσο Eagle (α-ΜΕΜ; Sigma-Aldrich) που περιέχει 10% (v/v) εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS; Nichirei Biosciences Inc., Τόκιο, Ιαπωνία). Την επόμενη μέρα, αυτό αντικαταστάθηκε με μέσο διαφοροποίησης, που περιείχε 2 mM γλυκεροφωσφορικό και 50 μg/mL ασκορβικό νάτριο σε τελικές συγκεντρώσεις, για να προκληθεί διαφοροποίηση των οστεοβλαστών. Όταν ήταν απαραίτητο, 100 μM 2BP σε λιγότερο από 0,1% DMSO ή 0,1% DMSO μόνο προστέθηκαν στο μέσο διαφοροποίησης σε τελικές συγκεντρώσεις. Όλες οι καλλιέργειες επωάστηκαν στους 37°C σε υγρή ατμόσφαιρα που περιείχε 5% CO2 για 27 ημέρες. Τα μεταλλαγμένα οζίδια χρωματίστηκαν με Alizarin Red S (Sigma-Aldrich). Χρησιμοποιήθηκε η τυπική διαδικασία χρώσης. Οι ανοργανοποιημένοι όζοι ελέγχονταν κάθε τρεις ημέρες. Για την αναγνώριση της S-παλμιτουλίωσης στο IFITM5, τα κύτταρα οστεοβλαστών που έφεραν το πλασμιδικό DNA που κωδικοποιεί το IFITM5-WT καλλιεργήθηκαν απουσία και παρουσία 2BP, η οποία αναστέλλει την S-παλμιτουλίωση (Εικόνα 2-Α ) [31] . Στη συνέχεια, το κυτταρόλυμα που περιείχε ολική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε για χρήση στις αναλύσεις SDS-PAGE και western blot. Για λόγους σύγκρισης, τα κύτταρα Ε. coli καλλιεργήθηκαν επίσης απουσία 2ΒΡ και το κυτταρόλυμα εκχυλίστηκε. Το Σχήμα 2 -Β δείχνει τα αποτελέσματα της δοκιμασίας κηλίδος western για το IFITM5-WT που εκφράζεται στον οστεοβλάστη και στα κύτταρα Ε. coli. Στα κύτταρα οστεοβλαστών, το IFITM5-WT εμφάνισε μια μονή ζώνη κοντά στον δείκτη μοριακής μάζας 17,4 kDa (βλ. λωρίδα 1) απουσία 2BP. Ωστόσο, παρουσία 2BP (βλ. λωρίδα 4), η ζώνη εμφανίστηκε σε χαμηλότερη θέση από αυτήν απουσία 2BP (λωρίδα 1). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το IFITM5-WT έχει μορφές υψηλής και χαμηλής μοριακής μάζας απουσία και παρουσία 2BP, αντίστοιχα. Η S-παλμιτοϋλίωση είναι μια αναστρέψιμη αντίδραση και επομένως αποπαλμιτοϋλιώνεται από ένα ισχυρό αναγωγικό όπως η υδροξυλαμίνη [10] . Μετά την επεξεργασία με υδροξυλαμίνη (βλ. λωρίδα 2), η ταινία εμφανίστηκε στην ίδια θέση όπως παρουσία 2ΒΡ (λωρίδα 4). Σε προκαρυωτικά κύτταρα E. coli, η μετα-μεταφραστική τροποποίηση S-Palmitoylation στο IFITM5 PLOS ONE | Το www.plosone.org δεν εμφανίζεται. Ως εκ τούτου, η ζώνη παρατηρήθηκε επίσης στην ίδια χαμηλότερη θέση (βλ. λωρίδα 3). Στην περίπτωση του IFITM3, η παλμιτοϋλίωση αναφέρθηκε επίσης ότι επάγει μια αλλαγή στην κινητικότητα κατά την ηλεκτροφόρηση, όπως και στα σημερινά μας αποτελέσματα [10] . Για άμεση παρατήρηση της S-παλμιτοϋλίωσης, ένας καθιερωμένος χημικός ανταποκριτής, 17-ODYA (Εικόνα 2 -Γ) , χρησιμοποιήθηκε. Τα κύτταρα οστεοβλαστών που φέρουν το πλασμίδιο που κωδικοποιεί IFITM5-WT καλλιεργήθηκαν παρουσία 17-ODYA για να επισημανθεί η πρωτεΐνη μεταβολικά. Μετά την εκχύλιση και τον καθαρισμό του κυτταρολύματος, το σημασμένο IFITM5-WT συνδέθηκε με αζίδιο TAMRA σύμφωνα με τη μέθοδο κυκλοπροσθήκης [3+2] αζιδαλκινίου που καταλύθηκε με Cu(I) [10, 29, 30, 32]. Μια εικόνα φθορισμού σε πήκτωμα του σημασμένου με 17-ODYA-TAMRA IFITM5-WT (βλ. λωρίδα 2 στο Σχήμα 2-D) έδειξε ότι το IFITM5 ήταν Σπαλμιτοϋλιωμένο στα κύτταρα οστεοβλαστών. Η ετικέτα FLAG που είναι προσαρτημένη στο IFITM5 δεν επηρεάζει την τροποποίηση και τη χημική επισήμανση (λωρίδες 1 και 5). Επιπλέον, μετά την επεξεργασία με υδροξυλαμίνη (βλ. λωρίδα 6), ο φθορισμός έγινε αδύναμος λόγω της διάστασης της 17-ODYA από το IFITM5, που ήταν ο ίδιος μηχανισμός με τη διάσταση του παλμιτικού οξέος από το IFITM5 με αναγωγή όπως περιγράφεται παραπάνω (λωρίδα 2 του Σχήματος 2-Β). Συνεπώς, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το IFITM5 που εκφράζεται στα φυσικά κύτταρα οστεοβλαστών είναι S-παλμιτοϋλιωμένο. Επιπλέον, οι ζώνες που αντιστοιχούν στις μορφές υψηλής και χαμηλής μοριακής μάζας που φαίνονται στην ανάλυση western blot αποδίδονται δοκιμαστικά στις S-παλμιτοϋλιωμένες και στις αποπαλμιτοϋλιωμένες μορφές, αντίστοιχα. Όπως περιγράφεται παραπάνω στην Εισαγωγή, τα υπολείμματα κυστεΐνης είναι το υπόστρωμα για το S -παλμιτοϋλίωση. Το IFITM5 διαθέτει τρεις κυστεΐνες, Cys52 και Cys53 στον τομέα ΤΜ1 και Cys86 στον βρόχο CP (Εικόνα 1-Α). Όλες αυτές οι κυστεΐνες είναι εξαιρετικά συντηρημένες μεταξύ των πρωτεϊνών της οικογένειας IFITM θηλαστικών (Εικόνα 3-Α). Για να ταυτοποιήσουμε τη θέση τροποποίησης στο IFITM5, παρασκευάσαμε μεταλλάγματα υποκατεστημένα με κυστεΐνη, IFITM5-C52A/C53A, -C86A και -C52A/C53A/C86A (Cys-less). Τα κύτταρα οστεοβλαστών που φιλοξενούν κάθε πλασμίδιο καλλιεργήθηκαν απουσία 2ΒΡ, και στη συνέχεια το κυτταρόλυμα εκχυλίστηκε. Το Σχήμα 3-Β δείχνει τα αποτελέσματα του στυπώματος western που ανιχνεύει την έκφραση όλων των μεταλλάξεων στα κύτταρα οστεοβλαστών. Στα μεταλλαγμένα C52A/C53A και Cys-less (βλέπε λωρίδες 2 και 4), ανιχνεύθηκε η μορφή χαμηλής μοριακής μάζας. Αυτό το αποτέλεσμα υποδεικνύει ότι είτε το Cys52 είτε το Cys53 εμπλέκεται στη S-παλμιτοϋλίωση. Επιπλέον, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2 -Δ, ισχυρός και ασθενής φθορισμός ανιχνεύθηκαν στο μετάλλαγμα C52A/C53A απουσία και παρουσία υδροξυλαμίνης (λωρίδες 3 και 7), αντίστοιχα, αλλά όχι στο μετάλλαγμα Cys-less (λωρίδες 4 και 8). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η υπόλοιπη κυστεΐνη στο μετάλλαγμα C52A/C53A, Cys86, είναι S-παλμιτοϋλιωμένη και η μετάλλαξη χωρίς Cys έχασε εντελώς τη S-παλμιτουλίωση επειδή όλες οι κυστεΐνες υποκαταστάθηκαν. Επομένως, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το Cys86, συν ένα ή δύο άλλα υπολείμματα κυστεΐνης στο IFITM5, δηλ. Cys52 και/ή Cys53, είναι S-παλμιτοϋλιωμένα. Επιπλέον, βρέθηκε ότι η S-παλμιτοϋλίωση στην περιοχή ΤΜ1 έχει σημαντική επίδραση στην κινητικότητα στο πήκτωμα (κάτω πλαίσιο του Σχήματος 2-D και του Σχήματος 3-Β). Ως εκ τούτου, στο εξής αναφερόμαστε στις μορφές υψηλής και χαμηλής μοριακής μάζας ως ΤΜ1-παλμιτοϋλιωμένη και ΤΜ1-απαλμιτοϋλιωμένη μορφή, αντίστοιχα. Τέλος, επαναπροσδιορίσαμε τις ζώνες που εμφανίζονται στην ανάλυση western blot ως εξής: το IFITM5-WT είναι πλήρως παλμιτοϋλιωμένο, το μετάλλαγμα C86A είναι μερικώς παλμιτοϋλιωμένο σε Cys52 και/ή Cys53, το μετάλλαγμα C52A/C53A είναι μερικώς παλμιτοϋλιωμένο στο Cys8 λιγότερο μεταλλαγμένο είναι πλήρως αποπαλμιτοϋλιωμένο. Προηγούμενες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι το IFITM5 αλληλεπιδρά με το FKBP11 [19] . Η FKBP11 ανήκει στην οικογένεια πρωτεϊνών που δεσμεύουν FK506 και έχει διαμεμβρανική περιοχή. Η αλληλεπίδραση μεταξύ IFITM5 και FKBP11 είναι σημαντική για την ανοσολογική δραστηριότητα επειδή ο σχηματισμός του συμπλέγματος IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP επάγει την έκφραση των επαγόμενων από ιντερφερόνη γονιδίων και συγκεκριμένα του γονιδίου αντιγόνου Bst2, Irgm, Ifit3, B2m και MHC [28. ] . Για να διερευνήσουμε την επίδραση της S-παλμιτοϋλίωσης στην αλληλεπίδραση του IFITM5 με το FKBP11, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης. Τα κύτταρα οστεοβλαστών που συνεπιμολύνθηκαν από τα πλασμίδια που κωδικοποιούν IFITM5-WT και FKBP11-FLAG καλλιεργήθηκαν απουσία και παρουσία 2ΒΡ. Στη συνέχεια, το εκχυλισμένο κυτταρόλυμα επωάστηκε με αντι-FLAG γέλη αγαρόζης. Το πήκτωμα πλύθηκε πολλές φορές. Τέλος, οι πρωτεΐνες εκλούστηκαν ανταγωνιστικά με την προσθήκη πεπτιδίου FLAG. Εάν το IFITM5 αλληλεπιδρούσε με το FKBP11, αναμενόταν ότι το IFITM5 Οι διατηρημένες κυστεΐνες επισημαίνονται με πορτοκαλί χρώμα και αριθμούνται. Στο κάτω πλαίσιο, οι αριθμοί που δίνονται σε παρένθεση αντιστοιχούν στον υπολειπόμενο αριθμό για το IFITM2. Για τον υπολογισμό της πιθανότητας χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 23 αλληλουχίες IFITM2, 23 IFITM3 και 17 IFITM5 που προέρχονται από είδη θηλαστικών στη βάση δεδομένων Εγκυκλοπαίδεια Γονιδίων και Γονιδιωμάτων του Κιότο (KEGG). Η ευθυγράμμιση της αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας CLUSTALW. Τα λογότυπα ακολουθιών δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το WEBLOGO 3. Β) Κηλίδα Western για τα μεταλλάγματα άγριου τύπου και υποκατεστημένα με κυστεΐνη του IFITM5 που εκφράζονται στα κύτταρα οστεοβλαστών. Για ανίχνευση, το αντίσωμα αντι-IFITM5 χρησιμοποιήθηκε ως πρωτεύον αντίσωμα. Το επάνω βέλος υποδεικνύει ότι το C52 και/ή το C53 στην περιοχή ΤΜ1 είναι Σπαλμιτοϋλιωμένο (λωρίδες 1 και 3). Τα μεταλλάγματα C52A/C53A (λωρίδα 2) και Cys-less (λωρίδα 4) είναι μερικώς και πλήρως αποπαλμιτοϋλιωμένα. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε 2 φορές. doi: 10.1371/journal.pone.0075831.g003 θα ληφθεί κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου και θα ανιχνευθεί με ανοσοστύπωση. Το Σχήμα 4 -Α δείχνει τα αποτελέσματα του στυπώματος western για την συν-ανοσοκαθίζηση του IFITM5-WT με FKBP-FLAG. Η ζώνη που αντιστοιχεί στο FKBP11 εμφανίστηκε σε όλες τις λωρίδες (άνω πίνακα). Οι λωρίδες 1 και 2 είναι έλεγχοι για να διασφαλιστεί ότι τα IFITM5 και FKBP11 περιέχονται και τα δύο στο κυτταρόλυμα πριν από την ανοσοκατακρήμνιση. Οι έλεγχοι εξασφάλισαν επίσης ότι το IFITM5 ήταν S-παλμιτοϋλιωμένο απουσία 2ΒΡ (βλ. λωρίδα 1), ενώ το IFITM5 δεν ήταν S-παλμιτοϋλιωμένο παρουσία 2ΒΡ (βλ. λωρίδα 2). Μετά την ανοσοκατακρήμνιση, εμφανίστηκε μια μονή ζώνη που αντιστοιχεί στο S-παλμιτοϋλιωμένο IFITM5 απουσία 2ΒΡ (βλ. λωρίδα 3), υποδεικνύοντας την αλληλεπίδραση του σπαλμιτοϋλιωμένου IFITM5 με το FKBP11. Ωστόσο, παρουσία 2BP, δεν εμφανίστηκε ζώνη που να αντιστοιχεί στο IFITM5 (βλ. λωρίδα 4), υποδεικνύοντας ότι τα δύο μόρια δεν αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η S-παλμιτοϋλίωση στο IFITM5 συμβάλλει στην αλληλεπίδραση με το FKBP11. Στη συνέχεια, διερευνήσαμε περαιτέρω τη σχέση μεταξύ της σπαλμιτοϋλίωσης και της αλληλεπίδρασης με το FKBP11 χρησιμοποιώντας τα μεταλλάγματα IFITM5 που περιγράφονται παραπάνω. Τα οστεοβλαστικά κύτταρα που συνεπιμολύνθηκαν από τα πλασμίδια που κωδικοποιούν μεταλλάκτες IFITM5 (C52A/C53A, C86A και Cys-less) και FKBP11-FLAG καλλιεργήθηκαν. Η δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης διεξήχθη με τον ίδιο τρόπο όπως περιγράφηκε παραπάνω. Το Σχήμα 4-Β δείχνει τα αποτελέσματα του στυπώματος western για την συν-ανοσοκαθίζηση των μεταλλαγμάτων άγριου τύπου και IFITM5 με FKBP11. Το Σχήμα 4 -Γ δείχνει τα αποτελέσματα του πειράματος ελέγχου χρησιμοποιώντας το κυτταρόλυμα πριν από την ανοσοκαταβύθιση. Όπως περιγράφηκε στην προηγούμενη ενότητα 3-3, η ζώνη που αντιστοιχεί στο FKBP11 εμφανίστηκε σε όλες τις λωρίδες (άνω πάνελ) επειδή η ανοσοκατακρήμνιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας το πήκτωμα αγαρόζης αντι-FLAG. Στο κάτω πλαίσιο του Σχήματος 4-Β, παρατηρήθηκαν μονές ζώνες για το μετάλλαγμα IFITM5-WT και -C86A (λωρίδες 1 και 3) αλλά όχι για τα μεταλλάγματα -C52A/C53A και Cys-less (λωρίδες 2 και 4). Αυτό το αποτέλεσμα υποδεικνύει ότι η άγριου τύπου μετάλλαξη και η μετάλλαξη C86A αλληλεπιδρούν με το FKBP11, ενώ οι άλλοι δύο μεταλλάκτες όχι. Είναι ενδιαφέρον ότι αυτή η τάση αντικατοπτρίζει την τάση για τα προφίλ S-παλμιτοϋλίωσης, πράγμα που σημαίνει ότι τα Cys52 και/ή Cys53 στον τομέα TM1 των μεταλλαγμάτων IFITM5-WT και -C86A είναι S-παλμιτοϋλιωμένα, ενώ αυτά τα υπολείμματα δεν είναι S-παλμιτοϋλιωμένα στο C52A/C53A και μεταλλαγμένα χωρίς Cys (βλ. Σχήματα 2-D, 3-B και το κάτω πλαίσιο του Σχήματος 4 -C). Επειδή η S-παλμιτοϋλίωση συμβάλλει στην αλληλεπίδραση IFITM5-FKBP11, όπως περιγράφεται στην προηγούμενη ενότητα 3-3 (επίσης στο Σχήμα 4-Α), τα αποτελέσματα του Σχήματος 4-Β υποδηλώνουν ότι τα μεταλλάγματα που έχασαν τη θέση S-παλμιτοϋλίωσης ( s), Cys52 και/ή Cys53, δεν μπορούν να αλληλεπιδράσουν με το FKBP11. Με άλλα λόγια, η S-παλμιτοϋλίωση σε αυτές τις κυστεΐνες είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδραση του IFITM5 με το FKBP11. Όπως περιγράφεται παραπάνω στην Εισαγωγή, προηγούμενες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι το IFITM5 συμβάλλει επίσης στον σχηματισμό οστού [18] [19] [20] [21] ] . Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε την επίδραση της σπαλμιτοϋλίωσης στον σχηματισμό οζιδίων οστού σε κύτταρα οστεοβλαστών, στα οποία εκφράζεται το φυσικό IFITM5. Το Σχήμα 5 δείχνει τον εξαρτώμενο από το χρόνο σχηματισμό οζιδίων απουσία και παρουσία 2ΒΡ (Εικόνα 5-Α και -Β). Το Σχήμα 5 -Γ δείχνει τα αποτελέσματα της δοκιμής ελέγχου για την επαλήθευση της επίδρασης του DMSO, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως διαλύτης για το 2BP, στον σχηματισμό όζων. Το ανοργανοποιημένο οζίδιο χρωματίστηκε με Alizarin Red, το οποίο αντιδρά με το εναποτιθέμενο ασβέστιο. Στο Σχήμα 5 -Δ, η περιοχή του ανοργανοποιημένου οζιδίου σχεδιάστηκε σε συνάρτηση με τον πειραματικό χρόνο. Απουσία 2ΒΡ (Σχήμα 5-Α, -Γ και -Δ), η ανοργανοποίηση ξεκίνησε 15 ημέρες μετά την έναρξη της κυτταρικής διαφοροποίησης (Ημέρα 0). Από την άλλη πλευρά, παρουσία 2ΒΡ (Εικόνα 5-Β και -Δ), το οζίδιο σχηματίστηκε την Ημέρα 12. Το ημίχρονο για τη μέγιστη ανοργανοποίηση παρουσία 2BP εκτιμήθηκε ότι ήταν 7 ημέρες νωρίτερα από αυτό απουσία 2BP (Εικόνα 5-D). Επιπλέον, παρατηρήθηκαν διαφορές στη μορφή των μεταλλοποιημένων οζιδίων. Το Σχήμα 5 -Ε δείχνει μια μεγεθυμένη όψη κάθε όζου την Ημέρα 21. Τα χρωματισμένα οζίδια διαχέθηκαν παρουσία 2ΒΡ (πάνελ b), ενώ απουσία 2ΒΡ τα οζίδια σχημάτισαν ένα μεγάλο σύμπλεγμα (πάνελ α και γ). Ως εκ τούτου, οι παρατηρήσεις μας σε αυτή τη μελέτη πρότειναν ότι η S-παλμιτοϋλίωση επηρεάζει τον σχηματισμό οστικού οζιδίου στα κύτταρα οστεοβλαστών.Σε αυτή τη μελέτη, επιβεβαιώσαμε την S-παλμιτοϋλίωση στο IFITM5 στα κύτταρα οστεοβλαστών, η οποία ήταν η ίδια με αυτή που αναφέρθηκε προηγουμένως για το IFITM3 και IFITM2. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, στα IFITM3 και IFITM2, τα οποία μοιράζονται 85% ομοιότητα αλληλουχίας (Εικόνα 1-C), δύο κυστεΐνες στον τομέα TM1 (Cys71 και Cys72 για IFITM3, Cys70 και Cys71 για IFITM2) και μία κυστεΐνη στον βρόχο CP (Cys10 για το IFITM3, το Cys104 για το IFITM2) είναι όλα S-παλμιτοϋλιωμένα σε κύτταρα [10, 24]. Από την άλλη πλευρά, αν και το IFITM5 μοιράζεται 68% και 66% ομοιότητα αλληλουχίας με τα IFITM3 και IFITM2, αντίστοιχα, περισσότερες από μία κυστεΐνες στον τομέα ΤΜ1 (Cys52 ή Cys53) και μία κυστεΐνη στον βρόχο CP (Cys86) είναι S-παλμιτοϋλιωμένες. Λαμβάνοντας υπόψη την υψηλή διατήρηση τριών κυστεϊνών στις πρωτεΐνες IFITM (Εικόνες 1-Α και 3-Α), όλες οι κυστεΐνες στο IFITM5 μπορεί να εμπλέκονται στην S-παλμιτοϋλίωση όπως ακριβώς στην περίπτωση των IFITM3 και IFITM2 [10, 24 ] .Οι ρόλοι της S-palmitoylation στο IFITM3 έχουν μελετηθεί εντατικά και η S-palmitoylation έχει αποδειχθεί ότι είναι κρίσιμος για τη σωστή τοποθέτηση στη μεμβράνη και την αντίσταση σε ιογενείς λοιμώξεις και εσωτερίκευση [10] (οι ρόλοι συνοψίζονται στο Σχήμα 6 -Α και συζητείται λεπτομερώς παρακάτω). Μια πρόσφατη μελέτη αποκάλυψε ότι η S-παλμιτοϋλίωση στο IFITM2 είναι επίσης σημαντική για τη συσσώρευση πρωτεϊνών στη μεμβράνη [24]. Ωστόσο, δεν γνωρίζουμε τον ρόλο της σπαλμιτοϋλίωσης του IFITM5 για τη συσσώρευση στη μεμβράνη προς το παρόν, επειδή δεν έχουμε καταφέρει ακόμη να αποκτήσουμε ένα κατάλληλο αντίσωμα για την ανοσοϊστοχημεία, παρά το γεγονός ότι αφιερώσαμε πολύ χρόνο στην αναζήτηση και λαμβάνοντας υπόψη έναν σημαντικό αριθμό αντισωμάτων .Δρ. Ο Hanagata και οι συνεργάτες του ανέφεραν προηγουμένως ότι το IFITM5 δεν είχε τον τομέα TM1 και τον βρόχο CP, ο οποίος και το IFITM5 (κάτω πάνελ), τα αντισώματα anti-FLAG και τα αντι-IFITM5 αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν ως κύρια αντισώματα, αντίστοιχα. Τα βέλη υποδεικνύουν την ύπαρξη κάθε πρωτεΐνης και την S-παλμιτουλίωση στο IFITM5. Α) Κηλίδα Western για την ταυτόχρονη ανοσοκατακρήμνιση του IFITM5 άγριου τύπου με το συντηγμένο με FLAG FKBP11 (FKBP11-FLAG) στα κύτταρα οστεοβλαστών απουσία και παρουσία 2ΒΡ (σημειώνεται ως \"-\" και \"+\", αντίστοιχα ). Οι λωρίδες 1 και 2 είναι τα αποτελέσματα για τις δοκιμές ελέγχου που χρησιμοποιούνται για την επαλήθευση της ύπαρξης IFITM5 και FKBP11 πριν από την ανοσοκατακρήμνιση και οι λωρίδες 3 και 4 δείχνουν τα αποτελέσματα μετά την ανοσοκατακρήμνιση. Το πείραμα επαναλήφθηκε 3 φορές. Β) Κηλίδα Western για την συν-ανοσοκαθίζηση των μεταλλαγμάτων άγριου τύπου και των υποκατεστημένα με κυστεΐνη μεταλλάξεων του IFITM5 με FKBP11-FLAG στα κύτταρα οστεοβλαστών. Η ζώνη που αντιστοιχεί στο πεπτίδιο FLAG δεν φαίνεται λόγω της μικρότερης μοριακής μάζας του πεπτιδίου FLAG σε σχέση με το FKBP11-FLAG. Γ) Το πείραμα ελέγχου του Σχήματος 4-Β χρησιμοποιήθηκε για την επαλήθευση ότι τα IFITM5 και FKBP11 ήταν αμφότερα παρόντα στο κυτταρόλυμα πριν από την ανοσοκατακρήμνιση. Το πείραμα επαναλήφθηκε 2 φορές. Α) Ο λειτουργικός μηχανισμός του IFITM3 συνοψίζεται από προηγούμενες μελέτες. (i) Το IFITM3 είναι S-παλμιτοϋλιωμένο στα Cys71, Cys72 και Cys105, (ii) το οποίο προκαλεί ομαδοποίηση και σωστή τοποθέτηση στη μεμβράνη, (iii) με αποτέλεσμα την αντιική δράση έναντι του ιού της γρίπης. Β) Ο λειτουργικός μηχανισμός του IFITM5 συνοψίζεται με το συνδυασμό των αποτελεσμάτων από την παρούσα και τις προηγούμενες μελέτες. (i) Το Cys86, συν ένα ή δύο άλλα υπολείμματα κυστεΐνης στο IFITM5, δηλ., Cys52 και/ή Cys53, είναι S-παλμιτοϋλιωμένα (ii). Η S-παλμιτοϋλίωση επιτρέπει στο IFITM5 να αλληλεπιδρά με το FKBP11 στα κύτταρα οστεοβλαστών (iii). Η διάσταση του CD9 από το σύμπλοκο FKBP11-CD81-FPRP/CD9 επάγεται από το σχηματισμό του συμπλόκου IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP και οδηγεί στην ανοσολογικά σχετική γονιδιακή έκφραση. Το IFITM5 συμβάλλει επίσης στον σχηματισμό οστού, αλλά είναι άγνωστο ποιες καταστάσεις όπως περιγράφονται στο (i)-(iii) είναι σημαντικές για τον σχηματισμό οστών επί του παρόντος. Προς το παρόν, δεν έχει εντοπιστεί αλληλεπιδραστική πρωτεΐνη στο IFITM3 και το IFITM2. Από την άλλη πλευρά, το IFITM5 αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη συνεργάτη, FKBP11, και η S-παλμιτοϋλίωση συμβάλλει σαφώς στην αλληλεπίδραση. Επομένως, το IFITM5 σχηματίζει ένα ετερο-ολιγομερές στην κυτταρική μεμβράνη για τη φυσιολογική του λειτουργία. περιέχει τις σχετικές θέσεις τροποποίησης, έχασε την ικανότητα αλληλεπίδρασης με το FKBP11 [19] . Στην παρούσα μελέτη, προσδιορίσαμε ότι η S-παλμιτοϋλίωση σε Cys52 και/ή Cys53 στον τομέα ΤΜ1 είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδραση. Από αυτά τα αποτελέσματα, υποθέτουμε ότι τα Cys52 και Cys53 βλέπουν προς την επιφάνεια αλληλεπίδρασης με το FKBP11 και επομένως τα IFITM5 και FKBP11 αλληλεπιδρούν μεταξύ τους μέσω του παλμιτικού οξέος που είναι συνδεδεμένο με την κυστεΐνη (συνοψίζεται στο Σχήμα 6 -Β, που συζητείται αναλυτικά αργότερα). Η έρευνά μας αποκάλυψε ότι το Cys86 εμπλέκεται στη σπαλμιτοϋλίωση αλλά δεν συμβάλλει στην αλληλεπίδραση με το FKBP11. Υποθέτουμε ότι ορισμένα άλλα υπολείμματα στον βρόχο CP που βρίσκεται κοντά στην περιοχή TM1 συμβάλλουν στην αλληλεπίδραση. Προηγούμενες έρευνες αποκάλυψαν επίσης ότι το IFITM5 που εκφράζεται στα κύτταρα ετερόλογων ινοβλαστών NIH3T3 εμφάνισε άμεσες αλληλεπιδράσεις με το CD81, την πρωτεΐνη 31 που σχετίζεται με τον υποδοχέα των Β κυττάρων ( BCAP31), και το υδροξυστεροειδές (17-βήτα) αφυδρογονάση 7 (HSD17b7). Αυτές οι τρεις πρωτεΐνες συνδέονται με το IFITM5 χωρίς την S-παλμιτοϋλίωση (μορφή χαμηλής μοριακής μάζας. βλέπε Εικόνα 3 -b στην αναφορά [19] . και Εικόνα 1 -Β στην αναφορά [28] . Στα κύτταρα ινοβλαστών, η S-παλμιτοϋλίωση στο IFITM5 είναι ανεπαρκής [19] . Αυτές οι αλληλεπιδράσεις δεν παρατηρούνται στα εγγενή κύτταρα οστεοβλαστών και επομένως είναι μη ειδικές. Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα γεγονότα, υποθέτουμε ότι η S-παλμιτοϋλίωση στο IFITM5 προάγει την ειδική αλληλεπίδραση με το FKBP11 στα κύτταρα οστεοβλαστών. Ο ρόλος που διαδραματίζει η S-παλμιτουλίωση του IFITM5 στην ανοσολογική δραστηριότητα των οστεοβλαστικών κυττάρων θα συζητηθεί με το συνδυασμό των αποτελεσμάτων από τις παρούσες και τις προηγούμενες μελέτες. Μια συγκεκριμένη αλληλεπίδραση μεταξύ IFITM5 και FKBP11 θα πρέπει να είναι απαραίτητη για να σχηματιστεί το σύμπλεγμα IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Το CD81, γνωστό και ως TAPA-1, είναι μέλος της οικογένειας πρωτεϊνικών μεμβρανών τετρασπανίνης και συστατικό του συμπλέγματος συνυποδοχέων Β-κυττάρων που μεσολαβεί στη σηματοδότηση των Β-κυττάρων για ανοσοαποκρίσεις. Όταν σχηματίζεται αυτό το σύμπλεγμα, η CD9, μια πρωτεΐνη συνεργάτης με το CD81, διαχωρίζεται από το σύμπλεγμα FKBP11-CD81-FPRP/CD9 και κατά συνέπεια επάγει την ειδική έκφραση των οστεοβλαστών των επαγόμενων από ιντερφερόνη γονιδίων, Bst2, Irgm, Ifit3, B2m και MHC κατηγορίας I. γονίδιο αντιγόνου [28] . Εάν η προκαλούμενη από σπαλμιτοϋλίωση ειδική αλληλεπίδραση του IFITM5 με το FKBP11 χανόταν, το σύμπλεγμα IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP δεν θα σχηματιζόταν και κατά συνέπεια η επαγόμενη από ιντερφερόνη έκφραση γονιδίου θα ανασταλεί επειδή το CD9 θα παρέμενε συνδεδεμένο με το FKBP11-CD81 Σύμπλεγμα FPRP/CD9. Από αυτή την άποψη, υποθέτουμε ότι το IFITM5 εμπλέκεται στη δραστηριότητα του ανοσοποιητικού συστήματος στα κύτταρα οστεοβλαστών και η αλληλεπίδραση του S-παλμιτοϋλιωμένου IFITM5 με το FKBP11 ρυθμίζει την ανοσολογική δραστηριότητα. Επιπλέον, προτάθηκε ότι η S-παλμιτοϋλίωση στο IFITM5 συμβάλλει στην ο σχηματισμός οστικού οστού, συμπεριλαμβανομένης της μορφολογίας και του χρόνου για ανοργανοποίηση, στα κύτταρα οστεοβλαστών (Εικόνα 5). Είναι δύσκολο να συμπεράνουμε επί του παρόντος ότι η έλλειψη της S-παλμιτουλίωσης στο IFITM5 προκαλεί τη διάχυση των οστικών οστών (πίνακας b του Σχήματος 5 -Ε). μπορούμε να πούμε, ωστόσο, ότι το IFITM5 πιθανότατα δεν θα είναι S-παλμιτοϋλιωμένο στα κύτταρα παρουσία 2BP. Ενώ το 2BP χρησιμοποιείται συνήθως ως αναστολέας της παλμιτουλίωσης, στοχεύει επίσης πολλά μεταβολικά ένζυμα [33, 34]. Έτσι, είναι επίσης δύσκολο να ερμηνευτούν τα αποτελέσματα της μακροχρόνιας επώασης των οστεοβλαστικών κυττάρων παρουσία 2ΒΡ. Σε κάθε περίπτωση, πρόκειται για ενδιαφέρουσες και βασικές παρατηρήσεις όσον αφορά την αποσαφήνιση του ρόλου που διαδραματίζει η S-παλμιτοϋλίωση του IFITM5 στον σχηματισμό οστών και απαιτούνται περαιτέρω μελέτες. Το Σχήμα 6 περιγράφει έναν πιθανό μηχανισμό της αλληλεπίδρασης του IFITM5 με το FKBP11 και τον ρόλο του IFITM5 στη λειτουργία των οστεοβλαστικών κυττάρων μέσω σύγκρισης με το IFITM3. Στην περίπτωση του IFITM3, όπως φαίνεται στο Σχήμα 6 -Α, παρατηρούνται τα ακόλουθα. (i) Οι τρεις κυστεΐνες είναι όλες S-παλμιτοϋλιωμένες (ii). Η S-παλμιτοϋλίωση οδηγεί στη ομαδοποίηση και τη σωστή τοποθέτηση των μορίων IFITM3 στη μεμβράνη (iii). Η σπαλμιτοϋλίωση και η ακόλουθη ομαδοποίηση είναι ζωτικής σημασίας για την αντοχή στον ιό της γρίπης. Όταν το IFITM3 δεν έχει τη σπαλμιτοϋλίωση, τα μόρια IFITM3 δεν συγκεντρώνονται, γεγονός που οδηγεί σε σημαντική μείωση της αντιϊκής δραστηριότητας. Από την άλλη πλευρά, το σχήμα 6 -Β δείχνει ότι οι ακόλουθες παρατηρήσεις γίνονται στην περίπτωση του IFITM5. (i) Το Cys86, συν ένα ή δύο άλλα υπολείμματα κυστεΐνης στο IFITM5, δηλ., Cys52 και/ή Cys53, είναι S-παλμιτοϋλιωμένα (ii). Το S-παλμιτοϋλιωμένο IFITM5 είναι σε θέση να αλληλεπιδρά ειδικά με το FKBP11. Η αλληλεπίδραση θεωρείται ότι διαμεσολαβείται από το παλμιτικό οξύ(α) που είναι συνδεδεμένο με την κυστεΐνη(ες) που βλέπει προς την επιφάνεια αλληλεπίδρασης στο FKBP11. Το Cys86 εμπλέκεται στην S-παλμιτοϋλίωση αλλά όχι στην αλληλεπίδραση του IFITM5 με το FKBP11. Προς το παρόν, ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τον ρόλο της S-παλμιτουλίωσης του IFITM5 για τον εντοπισμό στη μεμβράνη. Όταν η S-παλμιτοϋλίωση επηρεάζει τον εντοπισμό του IFITM5 όπως στην περίπτωση του IFITM3 [10] , τα S-παλμιτοϋλιωμένα μόρια IFITM5 θα πρέπει να εντοπίζονται στη μεμβράνη ή τα αποπαλμιτοϋλιωμένα μόρια θα πρέπει να αποεντοπίζονται. Η απώλεια της αλληλεπίδρασης μεταξύ IFITM5 και FKBP11 θα μπορούσε να οφείλεται σε επανατοπισμό του αποπαλμιτοϋλιωμένου IFITM5 που αποτρέπει τη συσχέτισή του με το FKBP11 (iii). Το σπαλμιτοϋλιωμένο IFITM5 αλληλεπιδρά με το σύμπλοκο FKBP11-CD81-FPRP/CD9 μέσω του FKBP11, το οποίο επάγει τη διάσταση του CD9 από το σύμπλοκο και την έκφραση 5 ανοσολογικά σχετικών γονιδίων. Τέλος, το IFITM5 σχηματίζει το σύμπλεγμα IFITM5-FKBP11-CD81-FPRP. Είναι άγνωστο προς το παρόν ποια από τις τρεις καταστάσεις (i)~(iii) που απεικονίζονται στο Σχήμα 6 -Β είναι σημαντική για την ανοργανοποίηση των οστών των οστεοβλαστικών κυττάρων. Η έλλειψη της S-παλμιτοϋλίωσης επηρεάζει την αλληλεπίδραση με το FKBP11, το οποίο θα μπορούσε να ευθύνεται για τον ακόλουθο σχηματισμό συμπλόκου και έκφραση γονιδίου. Επιπλέον, επηρεάζεται και ο σχηματισμός οστικού οστού. Σημειώστε ότι ο ρόλος της σπαλμιτοϋλίωσης έχει εμπλακεί στον σχηματισμό οστών [35] . Υποδεικνύεται ότι η S-παλμιτοϋλίωση στο IFITM5 παίζει ρόλο όχι μόνο για τη ρύθμιση της ανοσολογικής δραστηριότητας αλλά και για τον σχηματισμό οστού. Συμπερασματικά, αποκαλύψαμε την S-παλμιτοϋλίωση στο IFITM5 και το ρόλο της στην αλληλεπίδραση με το FKBP11. Όχι μόνο η ανοσολογική δραστηριότητα αλλά και η ανοργανοποίηση των οστών στα κύτταρα των οστεοβλαστών επηρεάζεται από την S-παλμιτοϋλίωση. Γενικά, ο λειτουργικός ρόλος της S-παλμιτουλίωσης είναι διαφορετικός για κάθε πρωτεΐνη [36]. Για πολλές πρωτεΐνες, ο κύκλος παλμιτουλίωσης και αποπαλμιτουλίωσης είναι συστατικός και ρυθμίζεται από ένζυμα. Με βάση τα παρόντα αποτελέσματα, είναι δύσκολο να εξεταστεί (i) εάν η S-παλμιτοϋλίωση στο IFITM5 είναι συστατική ή ρυθμιζόμενη, ή (ii) πότε και πού το IFITM5 είναι S-παλμιτοϋλιωμένο στα κύτταρα οστεοβλαστών. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες και βρίσκονται σε εξέλιξη.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 742, "text": "τρία" } ], "id": 569, "question": "Πόσα υπολείμματα κυστεΐνης περιέχονται στην πρώτη διαμεμβρανική περιοχή του IFITM3;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1665, "text": "2-βρωμοπαλμιτικό οξύ (2BP)" } ], "id": 570, "question": "Τι αναστέλλει την S-παλμιτοϋλίωση;" }, { "answers": [ { "answer_start": 26028, "text": "IFITM5 με FKBP11" } ], "id": 571, "question": "Ποια αλληλεπίδραση αναστέλλεται από την παρουσία του 2-βρωμοπαλμιτικού οξέος (2BP);" }, { "answers": [ { "answer_start": 3851, "text": "S-παλμιτοϋλίωση στην πρωτεΐνη" } ], "id": 573, "question": "Τι ρυθμίζει την αντιική δράση του IFITM3;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6817, "text": "η περιοχή ανάντη του γονιδίου ifitm5 στερείται των ρυθμιστικών στοιχείων της ιντερφερόνης" } ], "id": 575, "question": "Γιατί η έκφραση του IFITM5 δεν προωθείται από τις ιντερφερόνες;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7174, "text": "~ 65% ομοιότητα" } ], "id": 576, "question": "Ποια είναι η ομοιότητα αμινοξέων μεταξύ του IFITM5 και των άλλων πρωτεϊνών IFITM;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7230, "text": "~ 85% ομοιότητα" } ], "id": 577, "question": "Ποια είναι η ομοιότητα αμινοξέων μεταξύ των IFITM 1, IFITM 2 και IFITM 3;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7321, "text": "ασπαρτικό" } ], "id": 580, "question": "Ποιο αμινοξύ μπορεί να εμπλέκεται στη δέσμευση ασβεστίου στην C-τερματική περιοχή μιας πρωτεΐνης;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Πρώτη πλήρης ακολουθία γονιδιώματος ενός γαλλικού στελέχους κορωνοϊού βοοειδώνhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5477389/SHA: eef0ecf5b8e7b179dadaef967e65f2ab68f021e1Συγγραφείς: Kin, Nathalie; Guerard, Pauline; Diancourt, Laure; Caro, Valérie; Vabret, Astrid; Ar Gouilh, MeriadegΗμερομηνία: 2017-05-25DOI: 10.1128/genomea.00319-17 Άδεια χρήσης: cc-byAbstract: Αναλύσαμε την αλληλουχία της πρώτης πλήρους αλληλουχίας γονιδιώματος Bovine coronavirus (BCoV) από τη Γαλλία. Αυτός ο BCoV αναλύθηκε απευθείας από ένα δείγμα κοπράνων που συλλέχθηκε από ένα μόσχο στη Νορμανδία το 2014. Κείμενο: Ο κορωνοϊός Β προβάτου (BCoV) ανήκει στην τάξη Nidovirales, στην οικογένεια Coronavirinae, στην υποοικογένεια Coronavirinae και στον Betacoronavirus (https://talk. ictvonline.org/ ICTV/proposals/2008.085-122V.v4.Coronaviridae.pdf). Το γονιδίωμά του είναι ένα μονόκλωνο, γραμμικό και μη τμηματοποιημένο RNA περίπου 31 kb. Το BCoV είναι υπεύθυνο για αναπνευστικές και εντερικές ασθένειες στα βοοειδή, ιδιαίτερα κατά τη διάρκεια του χειμώνα (1, 2) . Μέχρι σήμερα, οι 19 πλήρεις αλληλουχίες γονιδιώματος BCoV που είναι διαθέσιμες στις βάσεις δεδομένων της GenBank (διαβούλευση στις 17 Ιανουαρίου 2017) προέρχονται από τις Ηνωμένες Πολιτείες ή την Ασία. Εδώ, αναφέρουμε την πρώτη πλήρη αλληλουχία γονιδιώματος ενός BCoV που ανιχνεύθηκε στη Γαλλία. Το στέλεχος BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 ελήφθη από δείγμα κοπράνων που συλλέχθηκε από μόσχο 1 εβδομάδας στη Νορμανδία το 2014. Η παρουσία του BCoV στο δείγμα κοπράνων αξιολογήθηκε με χρήση εσωτερικής αντίστροφης μεταγραφής-PCR (RT-PCR) που στοχεύει το γονίδιο Μ (3). Μια βιβλιοθήκη cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας SuperScript III (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και εξαμερή. Ο πλήρης προσδιορισμός αλληλουχίας γονιδιώματος των επικαλυπτόμενων προϊόντων PCR πραγματοποιήθηκε και προς τις δύο κατευθύνσεις, χρησιμοποιώντας αρχικούς εκκινητές και διδεοξυ αλληλουχία Sanger. Οι αντιδράσεις προσδιορισμού αλληλουχίας πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (3). Οι ακολουθίες συναρμολογήθηκαν και σχολιάστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Geneious (έκδοση 5.1.6). Λάβαμε μια αλληλουχία που μετράει 30.847 νουκλεοτίδια. Τα γονίδια orf1ab, HE, S, ns5, E, M και N του ληφθέντος BCoV υποβλήθηκαν σε ανάλυση Blastn. Σύμφωνα με αυτές τις αναλύσεις, το γονίδιο orf1ab (νουκλεοτίδια 20 kb, που βρίσκονται στην 5= πλευρά του γονιδιώματος) σχετίζεται στενά με το στέλεχος HKU23-23-362F του κορωνοϊού καμήλας Dromedary (DcCoV) από τα Ηνωμένα Αραβικά Εμιράτα (αρ. KF906251), με ταυτότητα νουκλεοτιδίου 99,19%. Αντίθετα, τα γονίδια NS2, HE, S, ns5 και M σχετίζονται στενά με το στέλεχος BCoV Bubalus/Italy/179/07-11 (αριθμός προσχώρησης. EU019216), με ταυτότητες νουκλεοτιδίων 99,88%, 99,45%, 99,02%, 98,79% και 99,28%, αντίστοιχα. Το γονίδιο Ε σχετίζεται στενά με το στέλεχος του κινεζικού κορωνοϊού βοοειδών BCV-AKS-01 (accession no. KU886219), με νουκλεοτιδική ταυτότητα 100%. Τέλος, η υψηλότερη βαθμολογία Blastn για το γονίδιο N βρέθηκε με το αμερικανικό εντερικό BCoV-ENT (accession no. AF391541), που σχετίζεται με ταυτότητα νουκλεοτιδίου 100%. Ευθυγράμμιση πολλαπλών αλληλουχιών, συμπεριλαμβανομένων 20 BCoV και 10 βήτα κορωνοϊών κλάδου Α που σχετίζονται στενά με τον BCoV από τη Βόρεια Αμερική, δύο DcCoV από τα Ηνωμένα Αραβικά Εμιράτα και δύο ανθρώπινους κορονοϊούς OC43 (HCoV-OC4 ) στελέχη από τη Γαλλία, πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο Muscle που υλοποιήθηκε στο MEGA7 (4, 5) . Η φυλογενετική ανάλυση στο orf1ab επιβεβαιώνει ότι το BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 σχετίζεται στενά με τον κοροναϊό καμήλας Dromedary (DcCoV) HKU23-23-362F. Το γονίδιο orf1ab αυτών των δύο ιών μαζί συγκεντρώθηκε χωριστά από αυτό των ιών BCoV και παρόμοιων με BCoV ιών από τη Βόρεια Αμερική και την Ασία. Αυτό το εύρημα επιβεβαιώνει επίσης τα αποτελέσματα από την προηγούμενη ανάλυσή μας για μερικά γονιδιώματα στα οποία τα γονίδια nsp12, S και N των αμερικανικών και ασιατικών BCoVs ομαδοποιούνται σε ένα σύμπλεγμα που ονομάζεται προσωρινά C 1 . Οι περιοχές κωδικοποίησης nsp12 και N των BCoV από τη Γαλλία και DcCoV από τα Ηνωμένα Αραβικά Εμιράτα συγκεντρώθηκαν μαζί στο C 2. Το γονίδιο DcCoV S εξατομικεύεται και από τα γονίδια HCoV-OC43 και BCoV S. Πιθανά συμβάντα ανασυνδυασμού θα μπορούσαν να προέρχονται από τους αριθμούς DcCoV.Accession. Η πλήρης αλληλουχία γονιδιώματος της απομόνωσης BCoV/FRA-EPI/CAEN/2014/13 έχει κατατεθεί στη GenBank με τον αριθμό πρόσβασης KX982264.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 912, "text": "31 kb" } ], "id": 917, "question": "Ποιο είναι το μέγεθος του κορωνοϊού των βοοειδών;" }, { "answers": [ { "answer_start": 857, "text": "μονόκλωνο, γραμμικό και μη τμηματοποιημένο RNA" } ], "id": 918, "question": "Ποια είναι η μοριακή δομή του κοροναϊού των βοοειδών;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2139, "text": "30.847 νουκλεοτίδια" } ], "id": 919, "question": "Πόσα νουκλεοτίδια περιέχει ο κορωνοϊός των βοοειδών;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2316, "text": "20 kb" } ], "id": 920, "question": "Ποιο είναι το μέγεθος του γονιδίου orf1ab στον κοροναϊό των βοοειδών;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Ειδικά κατά είδος κλινικά χαρακτηριστικά της ανθρώπινης μόλυνσης από κορωνοϊό μεταξύ κατά τα άλλα υγιών εφήβων και ενηλίκων https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5820427/SHA: edfe02a438fa9b667313da8f03614303fc2a4sa14A; Chen, Wei-Ju; Arnold, John C.; Fairchok, Mary P.; Danaher, Patrick J.; Lalani, Tahaniyat; Malone, Leslie; Mor, Deepika; Ridoré, Michelande; Burgess, Timothy H.; Millar, Eugene V.Ημερομηνία: 2018-02-02DOI: 10.1111/irv.12538Άδεια: cc-byAbstract: Ο ανθρώπινος κορωνοϊός (HCoV) είναι μια γνωστή αιτία ασθένειας που μοιάζει με γρίπη (ILI). Σε μια πολυτοπική, παρατήρηση, διαχρονική μελέτη του ILI μεταξύ κατά τα άλλα υγιών εφήβων και ενηλίκων, το 12% των ατόμων ήταν PCR-θετικά για HCoV. Η κατανομή των ειδών ήταν η εξής: HCoV‐OC43 (34%), HCoV‐229E (28%), HCoV‐NL63 (22%) και HCoV‐HKU1 (16%). Δεν παρατηρήσαμε ειδικές για το είδος διαφορές στα κλινικά χαρακτηριστικά της λοίμωξης HCoV, με εξαίρεση τη λοίμωξη από HCoV-HKU1, για την οποία η σοβαρότητα των γαστρεντερικών συμπτωμάτων κινήθηκε υψηλότερα την τέταρτη ημέρα της νόσου. Κείμενο: Κλινικές εκδηλώσεις του ανθρώπινου κοροναϊού (HCoV) Η λοίμωξη ποικίλλει από μια ήπια, αυτοπεριοριζόμενη ασθένεια της ανώτερης αναπνευστικής οδού έως ένα σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας με υψηλό ποσοστό θνησιμότητας. Τα εξαιρετικά λοιμώδη είδη του HCoV ήταν υπεύθυνα για τα κρούσματα του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου (SARS) και του αναπνευστικού συνδρόμου της Μέσης Ανατολής. MERS); Τα ποσοστά θνησιμότητας κυμαίνονταν από 14% έως 45%. [1] [2] [3] Αντίθετα, άλλα είδη HCoV (HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 και HCoV-229E) είναι πολύ πιο διαδεδομένα, πολύ λιγότερο σοβαρά και κοινά αίτια ασθένειας που μοιάζει με γρίπη (ILI). [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] Πέντε προηγούμενες μελέτες έχουν περιγράψει τα ειδικά για το είδος κλινικά χαρακτηριστικά της λοίμωξης από τον HCoV μεταξύ των ενηλίκων. 6, 7, [10] [11] [12] Σε δύο από αυτές τις μελέτες, ένα σημαντικό ποσοστό του πληθυσμού της μελέτης είχε υποκείμενες ιατρικές παθήσεις. 6, 7 Στο παρόν, περιγράφουμε, μεταξύ μιας κοόρτης κατά τα άλλα υγιών εφήβων και ενηλίκων με ασθένεια παρόμοια με τη γρίπη (ILI), τον επιπολασμό και τη σοβαρότητα των συμπτωμάτων που σχετίζονται με τη μόλυνση από HCoV. 13 Ασθενείς ηλικίας 0-65 ετών που παρουσιάζονται για περίθαλψη <72 ώρες μετά την έναρξη των συμπτωμάτων ILI επιλέχθηκαν για συμμετοχή στη μελέτη. Ο ILI ορίστηκε ως θερμοκρασία ≥100,4°F και πονόλαιμος ή ένα από τα ακόλουθα αναπνευστικά συμπτώματα: βήχας, παραγωγή πτυέλων, δύσπνοια ή πόνος στο στήθος. Δικαίωμα συμμετοχής είχαν τόσο νοσηλευόμενοι όσο και εξωτερικοί ασθενείς. Ασθενείς με υποκείμενες ιατρικές παθήσεις (π.χ. διαβήτης, χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια, σοβαρό άσθμα), γυναίκες με εγκυμοσύνη υψηλού κινδύνου ή περίπλοκη και ασθενείς με κακώς ελεγχόμενη ψυχιατρική διαταραχή αποκλείστηκαν. Οι πληροφορίες σχετικά με τα δημογραφικά στοιχεία των ασθενών και την παρουσία/σοβαρότητα των συμπτωμάτων κατά τη στιγμή της εγγραφής συλλέχθηκαν με προσωπική συνέντευξη. Στη συνέχεια, οι συμμετέχοντες έλαβαν οδηγίες σχετικά με τη χρήση ενός καθημερινού ημερολογίου για την καταγραφή της παρουσίας/σοβαρότητας των συμπτωμάτων για 7 ημέρες μετά την αρχική έναρξη των συμπτωμάτων. Η σοβαρότητα των συμπτωμάτων βαθμολογήθηκε σε μια τακτική κλίμακα από 0 (καμία) έως 3 (σοβαρή). Οι βαθμολογίες σοβαρότητας των συμπτωμάτων ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες πέντε μετρήσεις: (i) ατομική βαθμολογία συμπτωμάτων για 20 συμπτώματα, (ii) η βαθμολογία των συμπτωμάτων του ανώτερου αναπνευστικού, που υπολογίστηκε ως το άθροισμα των βαθμολογιών σοβαρότητας για πόνο στο αυτί, καταρροή, πονόλαιμο και φτάρνισμα, iii) η βαθμολογία των κατώτερων αναπνευστικών συμπτωμάτων, που υπολογίζεται ως το άθροισμα των βαθμολογιών σοβαρότητας για βήχα, δυσκολία στην αναπνοή, βραχνάδα και δυσφορία στο στήθος, (iv) τη βαθμολογία γαστρεντερικών συμπτωμάτων, που υπολογίζεται ως το άθροισμα των βαθμολογιών σοβαρότητας για διάρροια, έμετο, ανορεξία, ναυτία , και (Πίνακας 1). Υπήρχε διακύμανση από εποχή σε εποχή στις κύριες αιτίες Τα ευρήματα της μελέτης μας, που διεξήχθησαν σε μια περίοδο 5 ετών σε πέντε γεωγραφικά διασκορπισμένες τοποθεσίες στις ΗΠΑ, καταδεικνύουν ότι ο ανθρώπινος κοροναϊός (HCoV) είναι μια σημαντική αιτία της ασθένειας που μοιάζει με γρίπη (ILI) κυμαινόταν από 4% έως 22%. [8] [9] [10] [11] 14 Επιπλέον, βρήκαμε ότι το HCoV-OC43 είναι το πιο κοινό είδος μεταξύ των ενηλίκων, όπως έχει αναφερθεί αλλού. 8, 9, 11, 12, 14 HCoV-OC43 και HCoV-229E ήταν τα πιο κοινά στελέχη σε εναλλακτικές εποχές, αντανακλώντας μια μεταβλητότητα της κυκλοφορίας του στελέχους HCoV από εποχή σε εποχή που έχει αναφερθεί σε άλλες πολυετείς μελέτες. 4 8 Οι μηχανισμοί με τους οποίους αυτό το συγκεκριμένο είδος προκαλεί αυτά τα συμπτώματα δεν είναι γνωστοί. Τα πλεονεκτήματα αυτής της μελέτης του HCoV σε κατά τα άλλα υγιείς εφήβους και ενήλικες περιλαμβάνουν τον πολυετή και πολυετή σχεδιασμό του, τη χρήση ενός πολυπλεξικού διαγνωστικού πίνακα, την προοπτική συλλογή δεδομένων συμπτωμάτων και τη χρήση μιας κλίμακας σοβαρότητας συμπτωμάτων παρόμοια με αυτή που χρησιμοποιήθηκε προηγουμένως. 15 Ένας σημαντικός περιορισμός αυτής της μελέτης ήταν η επιλεκτική μας στρατολόγηση ατόμων που είχαν παρουσιαστεί σε μια μονάδα υγειονομικής περίθαλψης για φροντίδα ενός ILI. Ως εκ τούτου, οι περιπτώσεις μας δεν είναι αντιπροσωπευτικές της λοίμωξης από HCoV στην κοινότητα, όπου άτομα με ήπια, αυτοπεριοριζόμενη ασθένεια λόγω HCoV επιλέγουν να μην αναζητήσουν ιατρική φροντίδα για τη διαχείριση του ILI τους. Συνοπτικά, δείξαμε ότι ο HCoV είναι σημαντικός αιτία της ILI μεταξύ κατά τα άλλα υγιών εφήβων και ενηλίκων που παρουσιάζονται για ιατρική αξιολόγηση. Αν και υπήρχαν διαφορές στην κατανομή των ειδών ανά ηλικιακή ομάδα, δεν εντοπίσαμε διαφορές μεταξύ των ειδών σε σχέση με το κλινικό φάσμα της νόσου.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 494, "text": "HCoV" } ], "id": 1658, "question": "Ποια είναι η σημαντική αιτία εμφάνισης ασθένειας τύπου γρίπης μεταξύ υγιών εφήβων και ενηλίκων που παρουσιάζονται για ιατρική αξιολόγηση;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4459, "text": "HCoV-OC43" } ], "id": 1659, "question": "Ποιο είναι το πιο κοινό είδος του ανθρώπινου κορωνοϊού μεταξύ των ενηλίκων;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1551, "text": "HCoV-HKU1" } ], "id": 1660, "question": "Ποιος ανθρώπινος κορωνοϊός έδειξε συγκεκριμένα κλινικά χαρακτηριστικά του είδους της μόλυνσης του;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4459, "text": "HCoV-OC43 και HCoV-229E" } ], "id": 1719, "question": "Ποια ήταν τα κοινά στελέχη HCOV στην 5ετή μελέτη στις ΗΠΑ;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1551, "text": "HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63 και HCoV-229E" } ], "id": 1720, "question": "Ποια είδη είναι πιο διαδεδομένα αλλά λιγότερο σοβαρά;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Ανάπτυξη συστοιχίας ELISA για ταυτόχρονη ανίχνευση πέντε ιών εγκεφαλίτιδαςhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3305475/SHA: ef2b8f83d5a3ab8ae35e4b51fea6d3ed9Authoria; Li, Yuchang; Fan, Li; Lin, Fang; Wei, Jingjing; Zhu, Xiaolei; Hu, Yi; Li, Jing; Chang, Guohui; Zhu, Qingyu; Liu, Χονγκ; Yang, Yinhui Ημερομηνία: 2012-02-27DOI: 10.1186/1743-422x-9-56 Άδεια χρήσης: cc-byAbstract: Ιός Ιαπωνικής εγκεφαλίτιδας (JEV), ιός εγκεφαλίτιδας που μεταδίδεται από κρότωνες (TBEV) και ιός ανατολικής ιπποειδούς μπορεί να προκαλέσει (EEphalence) συμπτώματα εγκεφαλίτιδας. Η καθιέρωση ακριβών και εύκολων μεθόδων με τις οποίες ανιχνεύονται αυτοί οι ιοί είναι απαραίτητη για την πρόληψη και τη θεραπεία σχετικών μολυσματικών ασθενειών. Επί του παρόντος, δεν υπάρχουν ακόμη διαθέσιμες κλινικά μέθοδοι ανίχνευσης πολλαπλών αντιγόνων. Μια συστοιχία ELISA, η οποία ανιχνεύει πολλαπλά αντιγόνα, είναι εύκολη στον χειρισμό και φθηνή, έχει τεράστιες δυνατότητες στην ανίχνευση παθογόνων. Σε αυτή τη μελέτη αναπτύχθηκε μια μέθοδος συστοιχίας ELISA για την ταυτόχρονη ανίχνευση πέντε ιών εγκεφαλίτιδας. Επτά μονοκλωνικά αντισώματα κατά πέντε ιών που σχετίζονται με εγκεφαλίτιδα παρασκευάστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη της συστοιχίας ELISA. Η ανάλυση συστοιχίας ELISA βασίζεται σε μια μορφή ELISA \"σάντουιτς\" και αποτελείται από ιικά αντισώματα που εκτυπώνονται απευθείας σε πλάκες μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων, επιτρέποντας την άμεση ανίχνευση 5 ιών. Η ανεπτυγμένη συστοιχία ELISA αποδείχθηκε ότι έχει παρόμοια ειδικότητα και υψηλότερη ευαισθησία σε σύγκριση με τις συμβατικές ELISA. Αυτή η μέθοδος επικυρώθηκε με διαφορετικές καλλιέργειες ιών και τρία αυγά κοτόπουλου εμβολιασμένα με μολυσμένο ορό ασθενών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ανεπτυγμένη συστοιχία ELISA είναι ευαίσθητη και εύκολη στη χρήση, η οποία θα μπορούσε να έχει δυνατότητα κλινικής χρήσης. Ο ιός sindbis (SV) και ο ιός του δάγκειου πυρετού (DV) είναι αρβοϊοί και προκαλούν συμπτώματα εγκεφαλίτιδας, με μεγάλο εύρος βαρύτητας και ποσοστών θνησιμότητας [1] . Η καθιέρωση μιας ακριβούς και εύκολης μεθόδου για την ανίχνευση αυτών των ιών είναι απαραίτητη για την πρόληψη και τη θεραπεία σχετικών μολυσματικών ασθενειών. Επί του παρόντος, η ELISA και η IFA είναι οι κλινικά διαθέσιμες μέθοδοι για την ανίχνευση των ιικών αντιγόνων της εγκεφαλίτιδας, αλλά θα μπορούσαν να ανιχνεύσουν μόνο ένα παθογόνο σε μία ανάλυση [2, 3]. Υπάρχει μια ποικιλία διαφορετικών μεθόδων για την ταυτοποίηση πολλαπλών αντιγόνων σε ένα δείγμα ταυτόχρονα, όπως δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση γέλης, τσιπ πρωτεΐνης, φασματομετρία μάζας και τεχνολογία διάταξης εναιωρήματος [4] [5] [6] . Ωστόσο, η εφαρμογή αυτών των τεχνικών στην ανίχνευση παθογόνων βρίσκεται ακόμα σε πρώιμο στάδιο, ίσως λόγω της περίπλοκης χρήσης και του υψηλού κόστους. Οι συστοιχίες αντισωμάτων για ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό πολλαπλών αντιγόνων θεωρούνται οι πιο ακριβείς μέθοδοι [7] [8] [9] [ 10] . Το Liew [11] επικύρωσε μία πολυπλεξία ELISA για την ανίχνευση 9 αντιγόνων. Ο Anderson [12] χρησιμοποίησε ELISA μικροσυστοιχίας για πολλαπλή ανίχνευση αντισωμάτων σε αντιγόνα όγκου στον καρκίνο του μαστού και έδειξε ότι οι δοκιμασίες συστοιχίας που βασίζονται σε ELISA είχαν το ευρύτερο δυναμικό εύρος και τις χαμηλότερες απαιτήσεις όγκου δείγματος σε σύγκριση με τις άλλες δοκιμασίες. Ωστόσο, η εφαρμογή της ELISA- Οι βασισμένες συστοιχίες περιορίζονται επί του παρόντος στην ανίχνευση καρκινικών δεικτών ή ιντερλευκινών. δεν έχει αναφερθεί ανίχνευση παθογόνων. Σε αυτή τη μελέτη, αναπτύξαμε μια συστοιχία βασισμένη σε ELISA για την ταυτόχρονη ανίχνευση πέντε ιών εγκεφαλίτιδας. Παρασκευάστηκαν επτά ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα έναντι πέντε ιών εγκεφαλίτιδας και χρησιμοποιήθηκαν για την καθιέρωση μιας δοκιμασίας σειράς ELISA. Η δοκιμασία επικυρώθηκε χρησιμοποιώντας καλλιεργημένους ιούς και εμβολιασμένα αυγά κοτόπουλου με ορούς ασθενών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αυτή η μέθοδος συνδύαζε το πλεονέκτημα της ELISA και της συστοιχίας πρωτεϊνών (πολλαπλή και ευκολία χρήσης) και έχει δυνατότητες για την ταυτοποίηση του ιού της κλινικής εγκεφαλίτιδας. Τα μονοκλωνικά αντισώματα παρασκευάστηκαν από κυτταρικές σειρές υβριδώματος που κατασκευάστηκαν από τους Prof. Zhu et al. Ο καθαρισμός διεξήχθη με χρωματογραφία ανοσοσυγγένειας σε σεφαρόζη συγγένειας πρωτεΐνης G [13] . Επιλέχθηκαν ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα (4D5 κατά JEV, 2B5 έναντι TBEV, 1F1 έναντι SV, 2B8 κατά του ορότυπου 2 DV, 4F9 κατά του ορότυπου 4 DV, 4E11 κατά του EEEV και 2A10 έναντι του Flavivirus). Όλα τα αντισώματα αναπτύχθηκαν σύμφωνα με τυπικές διαδικασίες. Χρησιμοποιώντας τα 4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 και 4E11 ως αντισώματα σύλληψης, τα αντισώματα ανίχνευσης (2A10, 1 F1 και 4E11) συζεύχθηκαν με εστέρα βιοτίνης-NHS Γερμανίας (Pierce, ) στους 4°C για 3 ώρες σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η μη ενσωματωμένη βιοτίνη αφαιρέθηκε με στήλη Desalt spin (Pierce). Ανοσολογικές αντιδράσεις αναφέρθηκαν από Streptavidin-HRP (CWBIO, Beijing, China) και Super Signal ELISA Femto Maximum ευαίσθητο υπόστρωμα. Καθαρισμένο αντίσωμα κατσίκας-αντι ποντικού χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. JEV και DV καλλιεργήθηκαν σε κύτταρα C6/36. Τα SV, TBEV και EEEV καλλιεργήθηκαν σε κύτταρα ΒΗΚ-21. Η καλλιέργεια των TBEV και EEEV διεξήχθη σε εγκαταστάσεις βιοασφάλειας επιπέδου 3, ωστόσο, JEV, DV και SV διεξήχθησαν σε εγκαταστάσεις βιοασφάλειας επιπέδου 2. Οι τίτλοι του ιού προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο μολυσματικής δόσης ιστοκαλλιέργειας 50% (TCID50). Όλες οι καλλιέργειες απενεργοποιήθηκαν με 0,025% β-προπιονολακτόνη στους 4°C όλη τη νύχτα, στη συνέχεια στους 37°C για 1 ώρα για να αποσυντεθεί η β-προπιονολακτόνη. Τα αντισώματα εντοπίστηκαν με χρήση μηχανής BIODOT (BD6000; Καλιφόρνια, ΗΠΑ) σε πλάκες ELISA (30 /τελεία). Οι πλάκες μπλοκαρίστηκαν με 3% BSA-PBS σε 37°C για 1 ώρα, ακολουθούμενο από πλύση 3 φορές με PBS που περιέχει 0,1% Tween-20 για 2 λεπτά η κάθε μία. Στη συνέχεια, οι πλάκες ξηράνθηκαν, σφραγίστηκαν και αποθηκεύτηκαν στους 4°C πριν από τη χρήση [11]. Κατά την κηλίδωση, αξιολογήθηκαν διαφορετικά ρυθμιστικά διαλύματα κηλίδωσης και συγκεντρώσεις μονοκλωνικών αντισωμάτων σύλληψης για να βελτιστοποιηθεί η ανάλυση της σειράς ELISA. Η βελτιστοποίηση αξιολογήθηκε με μορφολογία κουκκίδων και ένταση σήματος. Τα εξετασθέντα ρυθμιστικά κηλίδωσης περιελάμβαναν 1 x φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS), PBS +20% γλυκερόλη και 1 x PBS + 20% γλυκερίνη + 0,004% Triton-X100. Συγκρίθηκε ένα εύρος συγκεντρώσεων μονοκλωνικών αντισωμάτων (0,0125, 0,025, 0,05, 0,1 και 0,2 mg/ml). Μετά από μια διπλή μορφή σάντουιτς αντισώματος, οι τυπωμένες πλάκες επωάστηκαν διαδοχικά με απενεργοποιημένες ιικές καλλιέργειες, επισημασμένο με βιοτίνη ανιχνευτικό αντίσωμα-bella, HPR αβιδίνη και υπόστρωμα, ακολουθούμενη από αξιολόγηση σήματος. Η δέσμευση αντιγόνου πραγματοποιήθηκε σε PBS (που περιέχει 0,1% Tween-20 και 5% FCS) στους 37°C για 2 ώρες, ακολουθούμενη από πλύση 3 φορές (1 × PBS που περιέχει 0,1% Tween- 20). Η επώαση των πλακών ELISA με κοκτέιλ βιοτινυλιωμένων αντισωμάτων ανίχνευσης πραγματοποιήθηκε σε PBS (που περιέχει 0,1% Tween-20 και 5% FCS) στους 37°C για 2 ώρες. Μετά το πλύσιμο, αναφέρθηκε ειδική δέσμευση των αντισωμάτων ανίχνευσης με στρεπταβιδίνη-HRP και χρωματίστηκε με ευαίσθητο υπόστρωμα Super Signal ELISA Femto Maximum (Thermo Scientific, Rockford, ΗΠΑ) [11, 14, 15] . Η οπτικοποίηση της πλάκας πραγματοποιήθηκε σε αναλυτή εικόνας ψυχρού CCD AE 1000 (Beijing BGI GBI Biotech Company., LTD, Κίνα). Η ένταση του σήματος και το φόντο κάθε σημείου διαβάστηκε και καταγράφηκε με το λογισμικό \"Monster\". Τα θετικά σήματα ορίστηκαν ως τιμή σήματος > 400 και τιμή σήματος (δείγμα)/τιμή σήματος (αρνητική) > 2. Τα πανομοιότυπα αντισώματα που χρησιμοποιούνται στη μορφή συστοιχίας ELISA δοκιμάστηκαν επίσης σε μια συμβατική μορφή ELISA για να προσδιοριστεί η διαφορά ευαισθησία και ειδικότητα των δύο μεθόδων. Οι συμβατικές ELISA διεξήχθησαν ταυτόχρονα με τις δοκιμασίες συστοιχίας ELISA για να εξασφαλιστούν παρόμοιες συνθήκες αντίδρασης. Οι συμβατικές ELISA πραγματοποιήθηκαν με τον ίδιο τρόπο με τη συστοιχία ELISA, με τη διαφορά ότι τα αντισώματα επικαλύφθηκαν σε συγκέντρωση 2 μg/mL σε PBS (pH 7,4) και το υπόστρωμα TMB χρησιμοποιήθηκε αντί του Super Signal ELISA Femto Maximum ευαίσθητο υπόστρωμα [ 16, 17] .Τρία δείγματα ορού συλλέχθηκαν από ασθενείς με συμπτώματα από το νευρικό σύστημα και ιστορικό τσιμπήματος κροτώνων. Τα δείγματα ορού υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη και στη συνέχεια εμβολιάστηκαν στις αλλαντοϊκές κοιλότητες των αυγών κοτόπουλου. 3 ημέρες αργότερα, το υγρό συλλέχθηκε και χωρίστηκε σε δύο μέρη (ένα για αδρανοποίηση και ένα για εκχύλιση RNA). Το RNA και τα αδρανοποιημένα δείγματα αποθηκεύτηκαν στους -70°C πριν από τη χρήση. Το RNA εκχυλίστηκε από τα εμβολιασμένα αυγά κοτόπουλου χρησιμοποιώντας ένα μίνι κιτ RNeasy (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλες οι διαδικασίες εκχύλισης RNA διεξήχθησαν σε εγκαταστάσεις BSL-3. Οι εκκινητές και οι ανιχνευτές χρησιμοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18] . Η RT-PCR πραγματικού χρόνου διεξήχθη με κιτ Quti-teck q-RT-PCR (Qiagen Inc,). Η αντίδραση αποτελούνταν από 10 μL ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης 2 × (0,2 μL ενζύμου αντίστροφης μεταγραφής και 250 nmol/l εκκινητές και ανιχνευτές). RNA και απιονισμένο νερό προστέθηκαν σε τελικό όγκο 20 μl. Η PCR πραγματοποιήθηκε με LightCycler 2.0 (Roche, Ελβετία) [19] . Βελτιστοποίηση της ανάλυσης συστοιχίας ELISA Η διάταξη της διάταξης με κηλίδες απεικονίζεται στο Σχήμα 1 και διερευνήθηκε η αποτελεσματικότητα τριών διαφορετικών ρυθμιστικών κηλίδων στην ποιότητα των εκτυπωμένων συστοιχιών ELISA με παρατήρηση μορφολογίας κηλίδων και σύγκριση έντασης σήματος. Η συγκέντρωση κηλίδων των αντισωμάτων σύλληψης κυμαινόταν από 0,2 έως 0,0125 mg/ml (το καθένα αραιώθηκε σειριακά 2 φορές). Η αποτελεσματικότητα της συγκέντρωσης κηλίδωσης των αντισωμάτων σύλληψης αξιολογήθηκε με ανίχνευση καλλιέργειας ιού, η κατάλληλη συγκέντρωση κηλίδωσης προσδιορίστηκε με έναν συνδυασμό ελαχιστοποιημένης διασταυρούμενης αντίδρασης και υψηλότερης έντασης σήματος. Το Σχήμα 1 απεικονίζει τη διάταξη της διάταξης και το Σχήμα 2 δείχνει το αποτέλεσμα των τριών ρυθμιστικών διαλυμάτων κηλίδωσης και της συγκέντρωσης κηλίδων του αντισώματος 2Β5 με ανίχνευση καλλιέργειας ιού ΤΒΕ. Διεξήχθη επίσης ανίχνευση διασταυρούμενης αντίδρασης εφαρμόζοντας καλλιέργειες JEV, YF και DV. Παρατήρηση μορφολογίας κηλίδων (Εικόνες 2a, b και 2c) έδειξε ότι το ρυθμιστικό κηλίδων που περιέχει PBS με 20% γλυκερόλη παρήγαγε μορφολογία ουράς κηλίδας. ρυθμιστικά διαλύματα που περιέχουν μόνο PBS και PBS με 20% γλυκερίνη +0,004% Triton-X100 έδωσαν καλή μορφολογία κηλίδων (στρογγυλή και πλήρη). Ρυθμιστικά διαλύματα που περιέχουν PBS με 20% γλυκερίνη και PBS με 20% γλυκερίνη+0,004% Triton-X100 παρήγαγαν υψηλότερες εντάσεις σήματος από το PBS μόνο. Έτσι, PBS με 20% γλυκερόλη + 0,004% Triton-X100 υιοθετήθηκε ως το βελτιστοποιημένο ρυθμιστικό κηλίδωσης για τα επόμενα πειράματα. Ταυτόχρονα, η αξιολόγηση της συγκέντρωσης κηλίδων πρότεινε ότι τα 0,05 mg/ml ήταν η βέλτιστη. Σε αυτή τη συγκέντρωση, η ένταση του σήματος ήταν υψηλότερη και η διασταυρούμενη αντίδραση δεν εμφανίστηκε (Εικόνα 2δ). Συνεπώς, η βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης κηλίδωσης άλλων αντισωμάτων σύλληψης (4D5, 1F1, 4E11 και 2B8) έδειξε ότι τα 0,05 mg/ml ήταν επίσης κατάλληλα (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Η βελτιστοποιημένη διάταξη της διάταξης ELISA φαίνεται στο Σχήμα 3, η οποία εφαρμόστηκε στο μετά από πειράματα. Η επιτυχής ανίχνευση ιικών παθογόνων απαιτεί μια δοκιμή με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα. Για να αξιολογηθεί η απόδοση των σχεδιασμένων συστοιχιών αντισωμάτων, εξετάστηκε η ειδικότητα και η ευαισθησία των μεμονωμένων αναλυτών. Δοκιμάζοντας σειριακά αραιωμένες ιικές καλλιέργειες, συμπεριλαμβανομένων των DV-2, DV-4, JEV, TBE, SV και EEEV, συγκρίθηκαν η ευαισθησία της σειράς ELISA και της πανομοιότυπης συμβατικής ELISA (Πίνακας 1). Το όριο ανίχνευσης των δύο μεθόδων συγκρίθηκε και αποδείχθηκε. Η δοκιμή διασταυρούμενης αντιδραστικότητας διεξήχθη χρησιμοποιώντας καλλιέργειες BHK-21 και κυτταρόλυμα vero, ιού κίτρινου πυρετού (YFV) (5 × 10 5 TCID 50 /ml, καλλιέργειες ιού Δυτικού Νείλου (WNV) (2 × 10 6 TCID 50 /ml) και τον ιό της δυτικής εγκεφαλίτιδας των ίππων (1 × 10 7 TCID 50 /ml). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ούτε η συστοιχία ELISA ούτε η παραδοσιακή ELISA παρουσίασαν διασταυρούμενη αντιδραστικότητα. Ίσοι όγκοι καλλιεργημένων TBEV, JEV, DV-2, DV-4, SV και EEEV παρασκευάστηκαν για ανίχνευση ενός δείγματος. δύο ή τρεις από τις καλλιέργειες αναμίχθηκαν για ανίχνευση πολυπλεξίας. Σε όλες τις δοκιμές χρησιμοποιήθηκε ένα κοκτέιλ συζευγμένου αντισώματος βιοτίνης (2A10, 4E11 και 1F1). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι για όλους τους συνδυασμούς ιών, κάθε ιός ανιχνεύτηκε ειδικά, χωρίς ψευδώς θετικά ή αρνητικά αποτελέσματα (Εικόνες 4 και 5). Αυγά κοτόπουλου εμβολιασμένα με μολυσμένο ανθρώπινο ορό χρησιμοποιήθηκαν για την επικύρωση της ανάλυσης συστοιχίας ELISA. Όλα τα δείγματα έδειξαν υψηλά σήματα αντίδρασης με το αντίσωμα σύλληψης 2Β5, το οποίο ήταν ειδικό για το TBEV (Εικόνα 6b). Η δοκιμασία συστοιχίας ELISA πρότεινε ότι και οι τρεις ασθενείς είχαν μολυνθεί όλοι με TBEV. Για να επαληθευτούν τα αποτελέσματα που δοκιμάστηκαν με συστοιχία ELISA, το RNA που εκχυλίστηκε από αυγά κοτόπουλου εφαρμόστηκε σε μια δοκιμασία RT-PCR πραγματικού χρόνου χρησιμοποιώντας εκκινητές και ανιχνευτές που στοχεύουν το TBEV. Τα αποτελέσματα ήταν επίσης θετικά (Εικόνα 6α). Τα συναινετικά αποτελέσματα ανίχνευσης επιβεβαίωσαν ότι η ανάλυση ELISAarray ήταν αξιόπιστη. Για να χρησιμοποιηθεί ευρέως στο κλινικό περιβάλλον, το σύστημα ανίχνευσης θα πρέπει να είναι εύκολο στη χρήση και να μπορεί να εκτελεστεί από μη εκπαιδευμένο προσωπικό με μικρή εργαστηριακή και πειραματική εμπειρία. Επιπλέον, όταν ο όγκος των κλινικών δειγμάτων είναι περιορισμένος και ένας αυξανόμενος αριθμός παθογόνων ανά δείγμα πρέπει να ελεγχθεί, το σύστημα ανίχνευσης θα πρέπει να είναι υψηλής απόδοσης ώστε να επιτρέπει την ταυτόχρονη ανίχνευση πολλαπλών παθογόνων [6, 20, 21]. Η πολλαπλή ανίχνευση, η εύκολη χρήση και η προσιτή τιμή είναι απαιτήσεις για μεθόδους ανίχνευσης στο κλινικό περιβάλλον. Έτσι, μια συστοιχία ELISA, η οποία συνδυάζει τα πλεονεκτήματα της σειράς ELISA και πρωτεϊνών, πληροί τις παραπάνω απαιτήσεις. Έχει αναφερθεί ότι μια συστοιχία ELISA έχει χρησιμοποιηθεί στη διάγνωση του καρκίνου και της αυτοαλλεργικής νόσου [7, 12]. Ωστόσο, καμία μελέτη δεν έχει αναφέρει την ανίχνευση ιικών παθογόνων. Σε αυτή τη μελέτη, αναπτύξαμε μια μέθοδο πολλαπλής ELISA σε μορφή σάντουιτς διπλού αντισώματος για την ταυτόχρονη ανίχνευση πέντε ιικών παθογόνων που σχετίζονται με την εγκεφαλίτιδα. Η παραγωγή ενός αξιόπιστου τσιπ αντισωμάτων για την αναγνώριση μικροοργανισμών απαιτεί προσεκτικό έλεγχο σύλληψης αντισωμάτων 14] . Η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα πρέπει να ελαχιστοποιηθεί και η συγγένεια του αντισώματος είναι εξίσου σημαντική με την ειδικότητα. Αρχικά, ετοιμάσαμε και εξετάσαμε 23 μονοκλωνικά αντισώματα έναντι οκτώ ιών και επαληθεύσαμε την ειδικότητα και τη συγγένεια με τους ιούς στόχους με μια δοκιμασία ανοσοφθορισμού. Στη συνέχεια, τα αντισώματα υποβλήθηκαν σε διαλογή με μια συστοιχία ELISA με μια μορφή σάντουιτς ELISA διπλού αντισώματος. Τα αντισώματα που παρήγαγαν διασταυρούμενη αντιδραστικότητα και χαμηλά θετικά σήματα αποκλείστηκαν. Τέλος, έξι αντισώματα επιλέχθηκαν ως αντισώματα σύλληψης. Ένα άλλο μονοκλωνικό αντίσωμα, το 2A10, το οποίο μπορούσε να αντιδράσει ειδικά με όλους τους ιούς του γένους Flavivirus χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι των DV, JEV και TBEV. Για την ανίχνευση των EEEV και SV, αν και τα αντισώματα ανίχνευσης και παγίδευσης ήταν τα ίδια (1F1 και 4E11, αντίστοιχα), τα αντισώματα παρήγαγαν εξαιρετικά θετικά σήματα. Ο επίτοπος δεν ορίστηκε. Ωστόσο, υποπτευόμαστε ότι και τα δύο αντισώματα στοχεύουν στην επιφάνεια των ιοσωμάτων. Καθώς ένα ιοσωμάτιο εξέρχεται καθώς εμφανίζονται πολλά με τον ίδιο επίτοπο, επομένως δεν παρουσιάστηκε καμία παρέμβαση χρησιμοποιώντας το ίδιο αντίσωμα στη δοκιμασία τύπου σάντουιτς διπλού αντισώματος. Επί του παρόντος, η διαθεσιμότητα αντισωμάτων κατάλληλων για μια διαγνωστική ανάλυση με μορφή συστοιχίας είναι ένα σημαντικό πρόβλημα. Στην ανάλυση συστοιχίας ELISA, υπάρχει επίσης αυτό το πρόβλημα. Λόγω του περιορισμού των διαθέσιμων αντισωμάτων, αυτή η ανάλυση μπορούσε να ανιχνεύσει μόνο 5 παθογόνα. Στο μέλλον, με αυξανόμενους αριθμούς κατάλληλων αντισωμάτων, ειδικά ειδικών αντισωμάτων κατά του Flavivirus, αυτή η συστοιχία ELISA ενδέχεται να είναι σε θέση να δοκιμάσει περισσότερα παθογόνα και να έχει μεγαλύτερη πιθανή χρήση. Για να γίνει η ανάλυση πιο επιδεκτική στην ανίχνευση πολλαπλών ιών, το πρωτόκολλο ανάλυσης βελτιστοποιήθηκε. Εκτός από το ρυθμιστικό διάλυμα σημείων, συγκρίθηκαν και αξιολογήθηκαν επίσης η συγκέντρωση αντισώματος σύλληψης και οι διαφορετικές μέθοδοι απενεργοποίησης του ιού (θέρμανση και β-προπιολακτόνη). Η θερμική απενεργοποίηση πραγματοποιήθηκε με θέρμανση των ιικών καλλιεργειών στους 56°C για 1 ώρα, και η αδρανοποίηση της β-προπιολακτόνης πραγματοποιήθηκε με την προσθήκη β-προπιολακτόνης στο προϊόν διατηρεί καλύτερη αντιγονικότητα από τη μέθοδο απενεργοποίησης θερμότητας. Έτσι, η θεραπεία με β-προπιολακτόνη επιλέχθηκε ως μέθοδος απενεργοποίησης του ιού. Η συμβατική ELISA είναι μια τυπική μέθοδος σε πολλά διαγνωστικά εργαστήρια. Συγκρίναμε τη συστοιχία ELISA με μια συμβατική ELISA και επιβεβαιώσαμε ότι το πλεονέκτημα της συστοιχίας ELISA ήταν εμφανές με συγκρίσιμη ειδικότητα και υψηλότερη ευαισθησία από την ELISA. Ο χρόνος που απαιτείται για τη συστοιχία ELISA είναι σημαντικά μικρότερος από ό,τι για τη συμβατική ELISA (4 ώρες έναντι τουλάχιστον 6 ωρών, αντίστοιχα). Επιπλέον, απαιτείται λιγότερη IgG για την εκτύπωση από ό,τι για την επίστρωση πλακών ELISA. Η επικάλυψη ενός μόνο φρεατίου σε πλάκα μικροτιτλοδότησης απαιτεί 100 μl διαλύματος αντισώματος 1 μg/ml, που ισοδυναμεί με 100 ng IgG. Για τη συστοιχία ELISA, απαιτούνται μόνο 30 nl διαλύματος αντισωμάτων 50 μg/ml για κάθε κηλίδα, που ισοδυναμεί με 1,5 ng IgG. Με τα χαρακτηριστικά της ευκολίας χρήσης, της ευαισθησίας, της ειδικότητας και της ακρίβειας, η ανάλυση της σειράς ELISA θα ήταν ευρέως αποδεκτή για κλινική χρήση.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 4405, "text": "9" } ], "id": 3006, "question": "Πόσα αντιγόνα θα μπορούσαν να ανιχνευθούν με το τεστ ELISA multiplex του Liew;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3766, "text": "χρησιμοποιώντας καλλιεργημένους ιούς και εμβολιασμένα αυγά κοτόπουλου με ορούς ασθενών" } ], "id": 3008, "question": "Πώς επικυρώθηκε η ανάλυση ELISA;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4565, "text": "4D5, 2B5, 1F1, 2B8, 4F9 και 4E11" } ], "id": 3009, "question": "Ποια αντισώματα σύλληψης χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 9711, "text": "από 0,2 έως 0,0125 mg/ml" } ], "id": 3010, "question": "Ποιο ήταν το εύρος συγκέντρωσης κηλίδων για τα αντισώματα σύλληψης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 10301, "text": "εφαρμόζοντας καλλιέργειες JEV, YF και DV" } ], "id": 3012, "question": "Πώς προσδιορίστηκε η ανίχνευση διασταυρούμενης αντίδρασης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3766, "text": "χρησιμοποιώντας καλλιεργημένους ιούς και εμβολιασμένα αυγά κοτόπουλου με ορούς ασθενών" } ], "id": 3013, "question": "Πώς επικυρώθηκε η ανάλυση συστοιχίας ELISA;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Αλλαγές στον επιπολασμό της πνευμονικής φυματίωσης: στοιχεία από την έρευνα πληθυσμού του 2010 σε μια πυκνοκατοικημένη επαρχία της Κίναςhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890533/SHA: eef61bdfa49b8652fd660b54b8f0597; Zhang, Xiulei; Γιν, Τζια; Walley, John; Beanland, Rachel; Zou, Guanyang; Zhang, Hongmei; Li, Fang; Liu, Zhimin; Zee, Benny CY; Griffiths, Sian MDate: 2014-01-11DOI: 10.1186/1471-2334-14-21Άδεια: cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Αυτή η εργασία αναφέρει ευρήματα από την έρευνα επικράτησης που διεξήχθη στην Shandong Κίνα το 2010 με πληθυσμό 4 εκατομμυρίων, μια επαρχία 4. . Αυτή η μελέτη είχε στόχο να εκτιμήσει τον επιπολασμό της φυματίωσης στην επαρχία το 2010 σε σύγκριση με την έρευνα του 2000. και να συγκρίνουν τις αποδόσεις των περιπτώσεων φυματίωσης από διαφορετικές προσεγγίσεις εύρεσης περιστατικών. ΜΕΘΟΔΟΙ: Πραγματοποιήθηκε συγχρονική έρευνα με βάση τον πληθυσμό χρησιμοποιώντας τυχαία δειγματοληψία πολλαπλών σταδίων. Στην έρευνα συμμετείχαν 54.279 ενήλικες με ποσοστό ανταπόκρισης 96%. Οι γιατροί πήραν συνέντευξη και κατέταξαν τους συμμετέχοντες ως ύποπτες περιπτώσεις φυματίωσης εάν παρουσίαζαν επίμονο βήχα, μη φυσιολογική ακτινογραφία θώρακος (CXRAY) ή και τα δύο. Τρία δείγματα πτυέλων από όλα τα ύποπτα περιστατικά συλλέχθηκαν και στάλθηκαν για μικροσκόπιο επιχρίσματος και καλλιέργεια. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Το προσαρμοσμένο ποσοστό επικράτησης των βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων περιπτώσεων ήταν 34 ανά 100.000 για ενήλικες στο Shandong το 2010. Σε σύγκριση με την έρευνα του 2000, ο επιπολασμός της φυματίωσης έχει μειωθεί κατά 80%. Το 53% των βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων περιπτώσεων δεν παρουσίαζε επίμονο βήχα. Η απόδοση των βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων περιπτώσεων ήταν 47% με έλεγχο συμπτωμάτων και 95% με CXRAY. Πάνω από το 50% των περιπτώσεων φυματίωσης ήταν μεταξύ άνω των 65 ετών. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Το ποσοστό επικράτησης των βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων περιπτώσεων μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με το 2000. Η έρευνα έθεσε προκλήσεις για τον εντοπισμό περιπτώσεων φυματίωσης χωρίς σαφή συμπτώματα. Κείμενο: Η Κίνα, με εκτιμώμενο επιπολασμό όλων των περιπτώσεων φυματίωσης 108 ανά 100.000 το 2010, έχει τη δεύτερη υψηλότερη επιβάρυνση φυματίωσης στον κόσμο, αντιπροσωπεύοντας το 13% όλων των περιπτώσεων παγκοσμίως [ 1] . Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (ΠΟΥ) υπολόγισε ότι η Κίνα είχε επιτύχει τους στόχους της επιτυχίας της θεραπείας 85% έως το 1993 και 70% του ποσοστού ανίχνευσης περιπτώσεων έως το 2005 [2] . Εθνικές έρευνες για τον επιπολασμό της φυματίωσης πραγματοποιήθηκαν στην Κίνα το 1979 στην Κίνα, το 1990 στην Κίνα, το 2000 και το 2010 [4]. Τα αποτελέσματα της έρευνας παρέχουν ακριβέστερες εκτιμήσεις για τα ποσοστά επιπολασμού της φυματίωσης από ό,τι εκτιμά ο ΠΟΥ και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αξιολόγηση της πιθανότητας η Κίνα να επιτύχει παγκόσμιους στόχους για τον επιπολασμό της φυματίωσης. Η επαρχία Σαντόνγκ έχει πληθυσμό 94 εκατομμυρίων. Είναι μια σχετικά ανεπτυγμένη επαρχία με κατά κεφαλήν ΑΕΠ 1,6 φορές τον εθνικό μέσο όρο το 2010 [5] . Το ποσοστό επικράτησης της φυματίωσης στο Shandong ήταν χαμηλότερο σε σύγκριση με το μέσο ποσοστό της Κίνας το 2000 [3] . Αντιπροσωπευτικά δείγματα πληθυσμού λήφθηκαν στο Shandong στις έρευνες του 2000 και του 2010 χρησιμοποιώντας παρόμοιες μεθόδους. Η μελέτη είχε στόχο να εκτιμήσει τον επιπολασμό της φυματίωσης στο Shandong με βάση την έρευνα του 2010 και να συγκρίνει τα αποτελέσματα των δύο συγχρονικών ερευνών. Ο πληθυσμός-στόχος της έρευνας για τον επιπολασμό της φυματίωσης ήταν κάτοικοι ηλικίας 15 ετών και άνω που είχαν ζήσει στις επιλεγμένες ομάδες για περισσότερο από 6 μήνες. Διεξήχθη μια συγχρονική έρευνα με βάση τον πληθυσμό χρησιμοποιώντας τη μέθοδο τυχαίας ομαδικής δειγματοληψίας πολλαπλών σταδίων. Η έρευνα χρησιμοποίησε τις ίδιες μεθόδους δειγματοληψίας με την εθνική έρευνα της Κίνας το 2010, η οποία ήταν παρόμοια με τις μεθόδους δειγματοληψίας που χρησιμοποιήθηκαν το 2000 [6] . Ο σχεδιασμός των ερευνών ήταν σύμφωνος με τις συστάσεις του ΠΟΥ [7] . Ο παράγοντας επίδρασης σχεδιασμού λόγω της δειγματοληψίας σε ομάδες υπολογίστηκε σε 1,28 [8] . Ένα μέγεθος δείγματος 52500 ενηλίκων (≧15 ετών), σε 35 ομάδες, υπολογίστηκε με βάση την ανίχνευση μιας αλλαγής 20% στο ποσοστό επιπολασμού θετικών περιπτώσεων επίχρισμα φυματίωσης σε σύγκριση με το ποσοστό της έρευνας του 2000 (95 ανά 100.000), με μια πιθανότητα μεγαλύτερη από ισχύς 95% και 95%, που αντιστοιχεί στο ποσοστό απόκρισης 90% των συμμετεχόντων [9] . Χρησιμοποιήθηκε μια στρωματοποιημένη τυχαία δειγματοληψία πολλαπλών σταδίων για την επιλογή των 35 ομάδων σε 17 νομούς στην επαρχία Shandong. Ο αριθμός των ομάδων κατανεμήθηκε τυχαία σε αναλογία με τον πληθυσμό της επαρχίας σε επίπεδο νομού, νομού/επαρχίας και δήμου. Ως σύμπλεγμα ορίστηκε μια κοινότητα (ένα χωριό στην αγροτική περιοχή ή μια κοινότητα κατοίκων σε μια αστική περιοχή) με πληθυσμό από 1250 έως 1750 ενήλικες (δηλαδή, άτομα ηλικίας 15 ετών και άνω). Εάν η κοινότητα περιείχε λιγότερους από 1250 ενήλικες κατοίκους, η γειτονική κοινότητα στα βόρεια προσαρτήθηκε. Εάν η κοινότητα ή οι συνδυασμένες κοινότητες που περιείχαν περισσότερους από 1750 ενήλικες, επιλέξαμε τυχαία νοικοκυριά και στη συνέχεια συμπεριλάβαμε όλους τους ενήλικες του νοικοκυριού για την έρευνα έως ότου ο συνολικός αριθμός των επιλεγμένων ενηλίκων φτάσει τους 1750. Οι στρατιωτικοί στρατώνες και οι φυλακές που βρίσκονται στο σύμπλεγμα εξαιρέθηκαν [7] . Η έρευνα διεξήχθη από τον Μάρτιο έως τον Ιούνιο του 2010 από ομάδες έρευνας που αποτελούνταν από κλινικούς ιατρούς, γιατρούς δημόσιας υγείας, ακτινολόγους, τεχνικούς εργαστηρίου και νοσηλευτές. Τα τοπικά μέσα ενημέρωσης χρησιμοποιήθηκαν για την προώθηση της ευαισθητοποίησης σχετικά με την έρευνα. Οι κοινοτικοί εργαζόμενοι διεξήγαγαν απογραφή από σπίτι σε σπίτι για να ενημερώσουν τη βάση δεδομένων των κατοίκων, να ενημερώσουν τους συμμετέχοντες στην έρευνα και να λάβουν ενημερωμένη συγκατάθεση. Στη μελέτη δεν συμμετείχαν παιδιά κάτω των 15 ετών. Ελήφθη γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση από όλους τους συμμετέχοντες ηλικίας 16 ετών και άνω. Ενώ από τα άτομα ηλικίας 15 ετών, λήφθηκαν γραπτές συναινέσεις κατόπιν ενημέρωσης από τους γονείς ή τους κηδεμόνες τους. Όλα τα έγγραφα αποθηκεύτηκαν σωστά στο Shandong Chest Hospital. Οι δεοντολογικές εγκρίσεις για τη μελέτη και οι διαδικασίες συναίνεσης λήφθηκαν από το Ιδρυματικό Συμβούλιο Αναθεώρησης (IRB) του Shandong Chest Hospital (Αριθμός μητρώου NIH IRB00006010). Όσοι συμφώνησαν να συμμετάσχουν στην έρευνα προσκλήθηκαν στο ιατρείο φυματίωσης της κομητείας, όπου ολοκλήρωσαν μια διαβούλευση με έναν εκπαιδευμένο κλινικό γιατρό φυματίωσης σχετικά με τυχόν συμπτώματα που υποδηλώνουν φυματίωση, όπως επίμονος βήχας (που διαρκεί δύο εβδομάδες ή περισσότερο), αιμόπτυση, απώλεια βάρους και πυρετός. Όλοι οι συμμετέχοντες υποβλήθηκαν σε ακτινογραφία θώρακος (CXRAY) που στη συνέχεια εξετάστηκαν από μια ομάδα ακτινολόγων. Εκείνα με συμπτώματα ή φιλμ CXRAY που υποδηλώνουν φυματίωση ταξινομήθηκαν ως ύποπτα περιστατικά φυματίωσης. Ζητήθηκε από όλα τα ύποπτα περιστατικά να παράγουν τρία δείγματα πτυέλων, ένα τη στιγμή της διαβούλευσης, ένα άλλο τη νύχτα και το τρίτο νωρίς το πρωί της επόμενης ημέρας. Οι ταυτοποιημένοι ύποπτοι συμπλήρωσαν ένα επιπλέον ερωτηματολόγιο σχετικά με την κοινωνικοοικονομική τους κατάσταση, το κάπνισμα και την παρουσία συμπτωμάτων που σχετίζονται με τη φυματίωση τους προηγούμενους έξι μήνες (βήχας, πυρετός, απώλεια βάρους, πόνος στο στήθος και αιμόπτυση). . Όλα τα δείγματα πτυέλων καλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας το μέσο Löwenstein-Jensen στο επαρχιακό εργαστήριο εντός 24 ωρών με μεταφορά ψυχρής αλυσίδας. Τα δείγματα αποκλείστηκαν από τη φυματίωση όταν εντοπίστηκαν από την καλλιέργεια βάκιλλοι μη φυματίωσης. Όλα τα επιχρίσματα και οι καλλιέργειες πτυέλων διεξήχθησαν αυστηρά σύμφωνα με το μέτρο εξωτερικού ποιοτικού ελέγχου του εθνικού εργαστηρίου φυματίωσης, το οποίο είναι σύμφωνο με την οδηγία της ΠΟΥ για την έρευνα επιπολασμού της φυματίωσης [7] . Η ταξινόμηση της φυματίωσης έγινε σύμφωνα με την εθνική οδηγία για τη φυματίωση της Κίνας [10] . Σε ένα θετικό επίχρισμα εντοπίστηκε τουλάχιστον ένας οξέως γρήγορος βάκιλος κατά την εξέταση τουλάχιστον 100 πεδίων. Οι συμμετέχοντες με θετικά δείγματα επιχρίσματος πτυέλων ταξινομήθηκαν ως θετικές περιπτώσεις πτυέλων. Όσοι είχαν θετικό επίχρισμα ή δείγματα πτυέλων καλλιέργειας ταξινομήθηκαν ως βακτηριολογικά επιβεβαιωμένα περιστατικά πτυέλων. Όσες ήταν αρνητικές σε καλλιέργεια με μη φυσιολογικό CXRAY που υποδηλώνει φυματίωση και είχαν αποκλειστεί από άλλες ασθένειες από κλινικούς ιατρούς και ακτινολόγους ταξινομήθηκαν ως υποδηλωτικές βακτηριολογικά αρνητικές περιπτώσεις CXRAY. Λόγω περιορισμών πόρων, η σύσταση αντιμικροβιακών παραγόντων ευρέος φάσματος για την επιβεβαίωση της διάγνωσης αρνητικών περιπτώσεων φυματίωσης δεν εφαρμόστηκε σε αυτήν την έρευνα [11] . Οι νεοδιαγνωσθείσες περιπτώσεις διακρίθηκαν από τις περιπτώσεις που είχαν διαγνωστεί προηγουμένως μέσω ελέγχων κατά τη διάρκεια των συνεντεύξεων και έναντι του συστήματος καταγραφής της φυματίωσης. Η αρχική διάγνωση έγινε από ομάδα τοπικών κλινικών και ακτινολόγων. Στη συνέχεια, δείγματα και φιλμ CXRAY όλων των ύποπτων και επιβεβαιωμένων περιπτώσεων επαναξιολογήθηκαν από μια ομάδα ανώτερων κλινικών ιατρών και ακτινολόγων σε επαρχιακό και εθνικό επίπεδο. Τα φιλμ CXRAY του 100% αυτών που βαθμολογήθηκαν ως μη φυσιολογικά και του 10% τυχαία δειγματοληψία αυτών που βαθμολογήθηκαν ως κανονικά μεταφέρθηκαν για ανεξάρτητη ανάγνωση. Η ομάδα του επαρχιακού εργαστηρίου εξέτασε τυχαία μία διαφάνεια από τα τρία δείγματα περιπτώσεων θετικών πτυέλων, και τα τρία δείγματα υποδηλωτικών περιπτώσεων φυματίωσης CXRAY και επέλεξε τυχαία το 10% των περιπτώσεων μη φυματίωσης. Εκτιμήσεις επιπολασμού θετικών πτυέλων, βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων και όλων των περιπτώσεων φυματίωσης υπολογίστηκαν. Σε όλες τις αναλύσεις, χρησιμοποιήθηκαν σταθμίσεις πληθυσμού για την προσαρμογή του φαινομένου σχεδιασμού της στρωματοποιημένης δειγματοληψίας πολλαπλών σταδίων [8] . Τα αποτελέσματα της έρευνας το 2010 και το 2000 τυποποιήθηκαν σε σχέση με τις ηλικιακές δομές του πληθυσμού της απογραφής της Κίνας το 2010. Η έρευνα για τον επιπολασμό της φυματίωσης του 2000 περιελάμβανε όλες τις ηλικιακές ομάδες [12] . Η συνιστώμενη μέθοδος του ΠΟΥ χρησιμοποιήθηκε για να καταστεί δυνατή η σύγκριση μεταξύ των δύο ερευνών ότι τα ποσοστά επιπολασμού της παιδικής φυματίωσης υποτίθεται ότι μειώνονταν στον ίδιο βαθμό με τη φυματίωση των ενηλίκων από το 2000 έως το 2010 [13]. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση υποομάδας σε φύλο, ηλικιακές ομάδες και αστική/αγροτική κατοικία. Το ποσοστό αναγνώρισης κρουσμάτων υπολογίστηκε ως ο αριθμός των περιπτώσεων που εντοπίστηκαν με μια μέθοδο προσυμπτωματικού ελέγχου σε όλες τις ύποπτες περιπτώσεις που εντοπίστηκαν με τη μέθοδο. Οι αποδόσεις των συμπτωμάτων και του CXRAY υπολογίστηκαν ως αναλογία του συνολικού αριθμού βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων περιπτώσεων. Η έρευνα επέλεξε 17 αστικές ομάδες και 18 αγροτικές ομάδες. Κάλυψε συνολικό πληθυσμό 89.093, εκ των οποίων 56.671 ήταν επιλέξιμοι για την έρευνα (Εικόνα 1 ). Το ποσοστό απόκρισης κυμαινόταν από 95% έως 97% σε διαφορετικές ομάδες. 54.279 συμμετέχοντες παρακολούθησαν την κλινική διαβούλευση και εξετάστηκαν από το CXRAY. Μεταξύ αυτών, το 47% ήταν άνδρες. Ο μέσος όρος ηλικίας ήταν τα 46 έτη με το 14% των 65 ετών και άνω. Συνολικά βρέθηκαν 572 ύποπτα κρούσματα φυματίωσης. Από αυτά, 264 (46%) εντοπίστηκαν με βάση τις ανωμαλίες CXRAY, 228 (40%) βασίστηκαν στον επίμονο βήχα, 80 (14%) βασίστηκαν και στα δύο. Η έρευνα διέγνωσε 172 νέα περιστατικά, συμπεριλαμβανομένων 19 νέων βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων περιπτώσεων (συμπεριλαμβανομένων 11 περιπτώσεων θετικών για πτύελα και καλλιέργειας και 8 αρνητικών πτυέλων αλλά θετικών περιπτώσεων καλλιέργειας) και 153 υποδηλωτικών βακτηριολογικά αρνητικών περιπτώσεων CXRAY. Η έρευνα εντόπισε επίσης 11 υπάρχοντα κρούσματα που καταγράφηκαν στο εθνικό πρόγραμμα για τη φυματίωση. Επιπλέον, η έρευνα βρήκε τέσσερις περιπτώσεις με θετικούς σε καλλιέργεια βάκιλλους μη φυματίωσης και τους απέκλεισε από ασθενείς με φυματίωση. Όλοι οι συμμετέχοντες στην έρευνα εξετάστηκαν πρώτα με βάση τα συμπτώματα και CXRAY. Όσοι είχαν συμπτώματα συνεχούς βήχα ή αιμόπτυσης, ή ανωμαλίες CXRAY στη συνέχεια εξετάστηκαν με επίχρισμα και καλλιέργεια. Τα ποσοστά αναγνώρισης περιστατικών νέων βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων περιπτώσεων από τα ύποπτα περιστατικά ήταν σημαντικά υψηλότερα με το CXRAY ως κύριο εργαλείο (Εικόνα 1, 3,8%, P = 0,012) και αυξήθηκαν περαιτέρω τόσο από την εξέταση συμπτωμάτων του επίμονου βήχα όσο και από την CXRAY (10%, P < 0,001) σε σύγκριση μόνο με την εξέταση συμπτωμάτων (0,4%). Το ίδιο μοτίβο ποσοστού αναγνώρισης κρουσμάτων παρατηρήθηκε στις περιπτώσεις θετικών πτυέλων (7,5%, 1,9% και 0% αντίστοιχα). Το ποσοστό που ανέφερε επίμονο βήχα δεν ήταν σημαντικά υψηλότερο μεταξύ των βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων περιπτώσεων σε σύγκριση με άλλους ύποπτους (P = 0,565). Μόνο η συμπτωματολογία εντόπισε 308 ύποπτους, συμπεριλαμβανομένων 6 (1,9%) θετική φυματίωση σε επίχρισμα πτυέλων και 9 (2,9%) βακτηριολογικά επιβεβαιωμένη φυματίωση. Μεταξύ των 344 υπόπτων με ανωμαλίες CXRAY, 11 (3,2%) είχαν θετική φυματίωση στα πτύελα και 18 (5,2%) είχαν βακτηριολογικά επιβεβαιωμένη φυματίωση. Η απόδοση των βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων περιπτώσεων ήταν 47,4% με διαβούλευση προσυμπτωματικού ελέγχου και 94,7% με CXRAY. Στον πληθυσμό άνω των 65 ετών, η συμπτωματολογία και το CXRAY εντόπισαν 174 και 182 ύποπτα κρούσματα αντίστοιχα, αποδίδοντας 5 (2,9%) και 9 (4,9%) βακτηριολογικά επιβεβαιωμένες περιπτώσεις. Οι αποδόσεις των βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων περιπτώσεων ήταν 55,6% με συμπτωματολογία και 100% με CXRAY μεταξύ άνω των 65. Από τις 512 ύποπτες περιπτώσεις που συμπλήρωσαν το πρόσθετο ερωτηματολόγιο, το 42% ήταν αγρότες και το 31% ήταν σημερινοί καπνιστές (Πίνακας 1) . Το κατά κεφαλήν οικογενειακό εισόδημα των βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων κρουσμάτων ήταν μικρότερο από το 50% του εισοδήματος των μη φυματίωσης (P <0,05). Αν και το ποσοστό καπνίσματος ήταν υψηλότερο μεταξύ των περιπτώσεων φυματίωσης σε σύγκριση με τις περιπτώσεις μη φυματίωσης, δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές (P > 0,05). Από τις δέκα βακτηριολογικά επιβεβαιωμένες περιπτώσεις που δεν παρουσίαζαν επίμονο βήχα στην έρευνα επιπολασμού, η μία έβηχε για δύο ημέρες, η μία είχε πόνο στο στήθος και οι άλλες οκτώ δεν είχαν συμπτώματα φυματίωσης τους τελευταίους έξι μήνες. Το ακατέργαστο ποσοστό επιπολασμού στο Shandong το 2010 των περιπτώσεων θετικών πτυέλων ήταν 22,1 (95% CI: 9,6-34,6), βακτηριολογικά επιβεβαιωμένες περιπτώσεις ήταν 36,8 (95% CI: 17,8-55,8) και όλες οι περιπτώσεις ήταν 337,1 (95% CI: 254,1-420,0) ανά 10 ενήλικες (Πίνακας 2). Τα προσαρμοσμένα ποσοστά επικράτησης ολόκληρου του πληθυσμού στο Shandong ήταν 17,8 (95% CI: 8,3-17,5), 27,8 (95% CI: 14,8-28,0) και 239,4 (95% CI: 179,9-298,9) ανά 100.000. Μια αξιοσημείωτη μείωση κατά 82,0%, 80,2% και 31,4% παρατηρήθηκε στα ποσοστά επικράτησης της φυματίωσης των θετικών πτυέλων, βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων και όλων των περιπτώσεων, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα προσαρμοσμένα ποσοστά το 2000 [12] . Παρατηρήθηκαν μεγάλες μειώσεις σε άνδρες μεταξύ 40 και 65 ετών και σε γυναίκες άνω των 60 ετών (Εικόνα 2). Τα προσαρμοσμένα ποσοστά επιπολασμού στον ενήλικο πληθυσμό ήταν 21,4 (95% CI: 10,0-32,8), 33,5 (95% CI : 17,8-49,2) και 285,8 (95% CI: 254,2-356,4) για περιπτώσεις θετικών πτυέλων, βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων περιπτώσεων και όλων των περιστατικών, αντίστοιχα. Σημαντικές διαφορές σχετικά με τα προσαρμοσμένα ποσοστά επιπολασμού της φυματίωσης παρατηρήθηκαν μεταξύ ανδρών και γυναικών, ηλικίας άνω των 65 ετών και 15 έως 64 ετών, σε αγροτικές και αστικές περιοχές (Πίνακας 2, P <0,001). Οι αναλογίες ανδρών προς γυναίκες ήταν 5,5 σε περιπτώσεις θετικών πτυέλων και 2,8 σε βακτηριολογικά επιβεβαιωμένες περιπτώσεις, ενώ οι αναλογίες ανέβηκαν στο 6,0 και στο 4,1, αντίστοιχα, σε άτομα άνω των 65 ετών. Η πλειονότητα των ασθενών με φυματίωση, το 54,5% των περιπτώσεων θετικών στα πτύελα και το 47,3% των βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων περιπτώσεων, ήταν από άτομα 65 ετών και άνω. Η αναλογία μεταξύ άνω των 65 και 15 έως 64 ετών ήταν 8,4 σε περιπτώσεις θετικών πτυέλων και 5,9 σε βακτηριολογικά επιβεβαιωμένες περιπτώσεις. Η αναλογία μεταξύ αγροτικών και αστικών περιοχών ήταν 2,7 σε περιπτώσεις θετικών πτυέλων και 4,8 σε βακτηριολογικά επιβεβαιωμένες περιπτώσεις. Το πιο εντυπωσιακό εύρημα ήταν ότι ένα μεγάλο ποσοστό ασθενών με φυματίωση δεν παρουσίαζε σταθερό βήχα. Η παθητική εύρεση κρουσμάτων είναι η πρακτική ρουτίνας στις αναπτυσσόμενες χώρες όπου γίνεται μικροσκόπηση πτυέλων για τον εντοπισμό περιπτώσεων φυματίωσης σε άτομα με επίμονο βήχα. Ένα μεγάλο ποσοστό περιπτώσεων φυματίωσης μπορεί να παραλειφθεί χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, καθώς το 53% των βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων περιπτώσεων και το 45% των θετικών για πτύελα περιπτώσεων σε αυτή τη μελέτη δεν είχαν επίμονο βήχα, αλλά εντοπίστηκαν μέσω μη φυσιολογικής CXRAY. Σχεδόν οι μισές από τις βακτηριολογικά επιβεβαιωμένες περιπτώσεις δεν ανέφεραν συμπτώματα τους τελευταίους έξι μήνες. Αυτό το εύρημα, αν και αρχικά ήταν εκπληκτικό, είναι συνεπές με αναφορές από το Βιετνάμ (47% των βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων περιπτώσεων που δεν παρουσίαζαν επίμονο βήχα) [14] , τη Μιανμάρ (38%) και την Αιθιοπία (48%) [13] . Το CXRAY ήταν ευαίσθητο στην ανίχνευση περιπτώσεων φυματίωσης, καθώς οι αποδόσεις των βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων περιπτώσεων ήταν πολύ υψηλότερες από το CXRAY σε σύγκριση με τον έλεγχο συμπτωμάτων, όπως αναφέρθηκε στο Βιετνάμ [15] και σε ορισμένες ρυθμίσεις υψηλού επιπολασμού του HIV [16, 17] . Το CXRAY, αν και ακριβό στην αρχική δόση, μπορεί να βελτιώσει την ανεύρεση κρουσμάτων φυματίωσης λόγω του μικρού χρόνου κύκλου εργασιών και της υψηλής απόδοσης [18] . Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η στρατηγική εύρεσης περιστατικών με χρήση CXRAY ακολουθούμενη από πτύελα ή καλλιέργεια ως πρωτεύον και δευτερεύον τεστ προσυμπτωματικού ελέγχου θα μπορούσε να είναι πιο αποτελεσματική, ειδικά στον πληθυσμό άνω των 65 ετών, καθώς οι αποδόσεις ήταν υψηλότερες σε ηλικία άνω των 65 ετών σε σύγκριση με το γενικό Πίνακας 2 Ποσοστά επιπολασμού θετικών κρουσμάτων φυματίωσης στα πτύελα, βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων κρουσμάτων φυματίωσης και όλων των περιπτώσεων στο Shandong, Κίνα, 2010 Χωρίς πληθυσμό. Αν και η χρήση CXRAY για την εξέταση όλων δεν είναι εφικτή, μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνήθεις φυσικές εξετάσεις ηλικιωμένων. Το πακέτο δημόσιας υγείας της Κίνας καλύπτει πλέον δωρεάν CXRAY για ηλικιωμένους, καθώς και ετήσιες εξετάσεις σώματος εργαζομένων που παρέχονται δωρεάν CXRAY. Σε αυτήν την έρευνα, μόνο ένας ασθενής θετικός στα πτύελα είχε εντοπιστεί και αντιμετωπιστεί από το εθνικό πρόγραμμα, αν και διεξήχθη ειδική κλινική διαβούλευση για τον εντοπισμό τυχόν ασθενείς που έχουν διαγνωστεί και υποβληθεί σε θεραπεία για φυματίωση στο παρελθόν. Αυτό μπορεί να αντανακλά τη διαφορά μεταξύ της προσέγγισης ενεργητικής εύρεσης περιπτώσεων στην έρευνα και της προσέγγισης παθητικής εύρεσης περιπτώσεων στην πράξη. Ωστόσο, ανέφερε ότι ένα μεγάλο ποσοστό βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων περιπτώσεων φυματίωσης χάνονται από το εθνικό πρόγραμμα για τη φυματίωση. Μια άλλη αξιοσημείωτη αλλαγή είναι η απότομη μείωση του ποσοστού των περιπτώσεων θετικών πτυέλων, που αντιπροσώπευε το 30,5% όλων των περιπτώσεων στην έρευνα του 2000 αλλά ήταν μειώθηκε στο 6,6% στην έρευνα του 2010. Το ποσοστό των κοινοποιημένων περιπτώσεων πτυέλων από όλα τα κρούσματα φυματίωσης στο Shandong μειώθηκε επίσης από 80,9% το 2005 σε 64,6% το 2010 [19] . Το ποσοστό επικράτησης των βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων περιπτώσεων μειώθηκε κατά 80% την τελευταία δεκαετία στο Shandong, σε σύγκριση με εθνική μείωση 45% (από 216/100.000 το 2000 σε 119/100.000 το 2010) [4] . Η ταχεία μείωση του ποσοστού επικράτησης της φυματίωσης των βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων περιπτώσεων την τελευταία δεκαετία μπορεί να αποδοθεί στο ενισχυμένο σύστημα δημόσιας υγείας της Κίνας μετά το ξέσπασμα του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου το 2003 [2] . Ένας άλλος λόγος μπορεί να οφείλεται στη βελτιωμένη αναφορά περιπτώσεων φυματίωσης στο διαδικτυακό σύστημα αναφοράς μεταδοτικών ασθενειών και στη βελτιωμένη συνεργασία μεταξύ των δημόσιων νοσοκομείων και των ιατρείων φυματίωσης [20] . Άλλοι παράγοντες όπως η κοινωνική οικονομική ανάπτυξη μπορεί επίσης να έπαιξαν σημαντικό ρόλο στη μείωση του επιπολασμού της φυματίωσης, όπως διαπιστώθηκε σε μια μελέτη των τάσεων των ποσοστών γνωστοποίησης φυματίωσης σε 134 χώρες [21] .Το προσαρμοσμένο ποσοστό επιπολασμού των βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων περιπτώσεων στο Shandong ήταν χαμηλότερο από ό,τι εκτιμά ο ΠΟΥ για την Κίνα το 2010 [1] . Όμως τα εθνικά ποσοστά επικράτησης βακτηριολογικά επιβεβαιωμένων περιπτώσεων, 119/100.000 το 2010 [4], ήταν υψηλότερα από την εκτίμηση του ΠΟΥ, 108/100.000, ακόμη και η έρευνα δεν συγκέντρωσε αρνητικά και εξωπνευμονικά κρούσματα φυματίωσης. Το Βιετνάμ ανέφερε παρόμοια ευρήματα στην έρευνά του το 2006 [14] . Ένας λόγος είναι ότι τα αποτελέσματα των ερευνών επιπολασμού βασίζονται σε ενεργή εύρεση κρουσμάτων, ενώ οι εκτιμήσεις του ΠΟΥ βασίζονται σε ποσοστά ειδοποίησης από παθητική εύρεση κρουσμάτων. Απαιτείται επανεκτίμηση του αναφερόμενου επιπολασμού της φυματίωσης στην Κίνα με βάση την πρόσφατη έρευνα. Οι υποδηλωτικές βακτηριολογικά αρνητικές περιπτώσεις CXRAY μπορεί να είναι επιχρίσματα ή αρνητικές περιπτώσεις φυματίωσης σε καλλιέργεια, εάν είχαν συμπτώματα φυματίωσης, ενώ ορισμένες μπορεί να προκαλούνται από επιχρίσματα ή καλλιέργεια κάτω από το βέλτιστο. Όπως αναφέρθηκε σε προηγούμενες έρευνες της Κίνας [3, 22], συμπεριλαμβανομένων αυτών των περιπτώσεων καθώς οι περιπτώσεις φυματίωσης μπορεί να οδηγήσουν σε υπερεκτίμηση όλων των πνευμονικών περιπτώσεων [23] . Η έρευνα αποκάλυψε ότι περισσότεροι από τους μισούς ασθενείς με φυματίωση ήταν 65 ετών και άνω στο Shandong , ενώ οι άνω των 65 ετών ήταν πιο πιθανό να παρουσιάσουν μη φυσιολογική CXRAY και επίμονο βήχα. Παρόμοιες τάσεις έχουν τεκμηριωθεί και σε άλλες ανεπτυγμένες πόλεις όπως το Χονγκ Κονγκ και η Σιγκαπούρη [24] . Αυτά τα υψηλά ποσοστά μπορεί να αντικατοπτρίζουν τα υψηλότερα ποσοστά φυματίωσης στο παρελθόν και τη μείωση της ανοσίας στους άνω των 65 ετών. Ο τρόπος αντιμετώπισης των ηλικιωμένων με φυματίωση και άλλες επιπλοκές όπως ο διαβήτης παραμένει μια διαρκής πρόκληση στην Κίνα και σε παρόμοια περιβάλλοντα. Τα αποτελέσματα της έρευνας μπορούν να γενικευθούν στον πληθυσμό των 94 εκατομμυρίων Shandong ή σε παρόμοια διεθνή περιβάλλοντα με μεσαίο εισόδημα και μεσαία επίπεδα επιπολασμού της φυματίωσης. Τα πρότυπα της επιδημίας της φυματίωσης που βρέθηκαν στο Shandong, δηλαδή το ποσοστό των ασθενών με συμπτώματα, οι αναλογίες μεταξύ αστικών και αγροτικών περιοχών, ανδρών και γυναικών, ήταν παρόμοια με αυτά που βρέθηκαν στην εθνική έρευνα [4] . Ωστόσο, τα ποσοστά επικράτησης δεν μπορούν να επεκταθούν στις δυτικές επαρχίες της Κίνας με υψηλότερο επιπολασμό φυματίωσης. Για υλικοτεχνικούς λόγους, ο επιλέξιμος πληθυσμός δεν περιλάμβανε ενήλικες που διαμένουν στις ομάδες του δείγματος για λιγότερο από 6 μήνες, κάτι που ήταν η ίδια πρακτική στην έρευνα του 2000. Ωστόσο, οι βραχυπρόθεσμοι μετανάστες μπορεί να έχουν δυνητικά υψηλότερο επιπολασμό της φυματίωσης από τον γενικό πληθυσμό [25] . Αυτό μπορεί να οδηγήσει σε χαμηλότερη εκτίμηση του πραγματικού ποσοστού επιπολασμού. Η έρευνα δεν συγκέντρωσε κοινωνικοοικονομικούς δείκτες, το κάπνισμα και την κατάσταση του HIV όλων των συμμετεχόντων, επομένως δεν υπάρχουν διαθέσιμες συγκρίσεις μεταξύ των περιπτώσεων φυματίωσης και όλων των μη φυματίωσης ασθενών. Ωστόσο, ο επιπολασμός του HIV στη Σαντόνγκ της Κίνας είναι κάτω του 0,01% και δεν θα άλλαζε σημαντικά το ποσοστό επικράτησης της φυματίωσης. Επιπλέον, η έρευνα δεν αξιολόγησε την παιδική φυματίωση και την εξωπνευμονική φυματίωση. Οι συζητήσεις για τη χρήση του CXRAY ως εργαλείου ελέγχου αφορούσαν την τεχνική πτυχή, αλλά όχι την πλευρά του κόστους, καθώς δεν πραγματοποιήσαμε ανάλυση κόστους-αποτελεσματικότητας ή την κοινωνική προθυμία να πληρώσουμε για μια τέτοια στρατηγική σε παρόμοια περιβάλλοντα. Αυτή η μελέτη έδειξε ότι ο επιπολασμός Η βακτηριολογικά επιβεβαιωμένη φυματίωση στο Shandong έχει μειωθεί σημαντικά την τελευταία δεκαετία. Είναι σημαντικό ότι η πλειονότητα αυτών των περιπτώσεων δεν εμφανίστηκε με επίμονο βήχα και το ποσοστό των περιπτώσεων θετικών στα πτύελα έχει μειωθεί απότομα. Συνιστώνται περαιτέρω μελέτες για την αξιολόγηση της σκοπιμότητας της υιοθέτησης του CXRAY στις υπάρχουσες υπηρεσίες υγειονομικής περίθαλψης για την ανίχνευση περιπτώσεων φυματίωσης και της οικονομικής αποδοτικότητας μιας τέτοιας παρέμβασης. Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν έχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 2114, "text": "108 ανά 100.000" } ], "id": 3014, "question": "Το 2010, πόσα κρούσματα φυματίωσης υπολογίστηκαν στην Κίνα;" }, { "answers": [ { "answer_start": 22340, "text": "94 εκατ" } ], "id": 3015, "question": "Ποιος είναι ο πληθυσμός της επαρχίας Shandong;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3286, "text": "εκτιμήσει τον επιπολασμό της φυματίωσης στο Shandong" } ], "id": 3016, "question": "Ποιος ήταν ο σκοπός αυτής της μελέτης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4890, "text": "15 ετών και άνω" } ], "id": 3017, "question": "Ποιο ήταν το ηλικιακό εύρος για τα άτομα που ερωτήθηκαν;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4102, "text": "52500" } ], "id": 3019, "question": "Ήταν το μέγεθος του δείγματος;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4459, "text": "μια στρωματοποιημένη τυχαία δειγματοληψία πολλαπλών σταδίων" } ], "id": 3020, "question": "Πώς επιλέχθηκαν τα clusters;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4844, "text": "1250 έως 1750" } ], "id": 3021, "question": "Πόσα άτομα ήταν σε μια ομάδα κοινότητας;" }, { "answers": [ { "answer_start": 11051, "text": "95% έως 97%" } ], "id": 3026, "question": "Ποιο ήταν το ποσοστό ανταπόκρισης για τη μελέτη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 16347, "text": "ένα μεγάλο ποσοστό ασθενών με φυματίωση δεν παρουσίαζε σταθερό βήχα" } ], "id": 3029, "question": "Ποιο ήταν το πιο εντυπωσιακό εύρημα της μελέτης σχετικά με τους ασθενείς με φυματίωση;" }, { "answers": [ { "answer_start": 19617, "text": "45%" } ], "id": 3030, "question": "Πόσες περιπτώσεις ασθενών με φυματίωση θετικών στα πτύελα δεν είχαν επίμονο βήχα;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Σχεδιασμός, Σύνθεση, Αξιολόγηση και Θερμοδυναμική Παραγώγων 1-Υποκατεστημένης Πυριδυλιμιδαζο[1,5-α]Πυριδίνης ως Αναστολείς Πρωτεάσης Κυστεΐνης Mohd Sajid; Baig, Mohd Hassan; Ahmad, Saheem; Siddiqui, Shapi Ahmad; Srivastava, Ashwini Kumar; Srinivasan, Kumar Venkatraman; Ansari, Irfan A.Ημερομηνία: 2013-08-05DOI: 10.1371/journal.pone.0069982Άδεια: cc-byAbstract: Η στόχευση πρωτεασών κυστεΐνης της οικογένειας παπαΐνης είναι μια από τις νέες στρατηγικές στην ανάπτυξη χημειοθεραπείας ασθενειών. Νέοι αναστολείς πρωτεάσης κυστεΐνης που προέρχονται από 1-πυριδυλιμιδαζο[1,5-a]πυριδίνη που αντιπροσωπεύει φαρμακολογικά σημαντική κατηγορία ενώσεων αναφέρονται εδώ για πρώτη φορά. Τα παράγωγα αρχικά σχεδιάστηκαν και εξετάστηκαν σε πυρίτιο με μελέτες μοριακής προσάρτησης έναντι της παπαΐνης για να διερευνηθεί ο πιθανός τρόπος δράσης. Η μοριακή αλληλεπίδραση μεταξύ των ενώσεων και της πρωτεάσης κυστεΐνης (παπαΐνη) βρέθηκε να είναι πολύ παρόμοια με τις αλληλεπιδράσεις που παρατηρήθηκαν με τον αντίστοιχο αναστολέα εποξειδίου (E-64c) της παπαΐνης. Στη συνέχεια, συντέθηκαν ενώσεις για να επικυρωθεί η αποτελεσματικότητά τους σε πειράματα υγρού εργαστηρίου. Όταν χαρακτηρίζονται κινητικά, αυτές οι ενώσεις εμφανίζουν τις τιμές τους Κ(ί) και IC(50) στην περιοχή από 13,75 έως 99,30 μΜ και 13,40 έως 96,50 μΜ, αντίστοιχα. Οι θερμοδυναμικές μελέτες υποδηλώνουν τη σύνδεσή τους με την παπαΐνη υδροφοβικά και εντροπικά. Αυτοί οι αναστολείς αναστέλλουν επίσης την ανάπτυξη κλινικά σημαντικών διαφορετικών τύπων Gram θετικών και Gram αρνητικών βακτηρίων με τιμές MIC(50) στην περιοχή από 0,6–1,4 μg/ml. Με βάση τον κανόνα των πέντε του Lipinski, προτείνουμε επίσης αυτές τις ενώσεις ως ισχυρά αντιβακτηριακά προφάρμακα. Η πιο δραστική αντιβακτηριακή ένωση βρέθηκε να είναι η 1-(2-πυριδυλ)-3-(2-υδροξυφαινυλ)ιμιδαζο[1,5-a]πυριδίνη (3a). Κείμενο: Οι αναστολείς κυστεΐνης-πρωτεάσης (CPI) έχουν κερδίσει μεγάλη προσοχή τις τελευταίες δύο δεκαετίες και πολλές κατηγορίες ενώσεων βρίσκονται επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές σε ανθρώπους για μια σειρά από ασθένειες. Το ενδιαφέρον για τις πρωτεάσες κυστεΐνης της οικογένειας παπαΐνης ως χημειοθεραπευτικούς στόχους προέρχεται από την αναγνώριση ότι είναι κρίσιμες για τον κύκλο ζωής ή την παθογένεια πολλών μικροοργανισμών. Οι πρωτεάσες κυστεΐνης από Streptococcus sp. (στρεπτόπαινη) [1] , Staphylococcus sp. (σταφοπαΐνη) [2] , το Plasmodium falciparum (falcipain-1, -2, και -3) και το Trypanosoma cruzi (cruzipain) [3] είναι μερικά από τα πιο ευρέως μελετημένα μέλη της οικογένειας παπαΐνης που έχουν αναφερθεί ότι συνδέονται με τη σοβαρότητα λοίμωξης και διαφόρων παθολογικών καταστάσεων που προκαλούνται από αυτούς τους μικροοργανισμούς. Η ενεργοποίηση της οδού καλλικρεΐνης-κινίνης, η οποία θα μπορούσε να ενεργοποιηθεί από περισσότερες από δεκαέξι βακτηριακές πρωτεάσες, είναι ένας μηχανισμός που εκμεταλλεύονται ορισμένα παθογόνα για να εξασφαλίσουν ότι υπάρχει παροχή θρεπτικών ουσιών στην περιοχή λοίμωξης με αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας. Αυτό έχει αποδειχθεί ότι συμβαίνει σε λοιμώξεις από διάφορα μικροβιακά είδη, συμπεριλαμβανομένων των Pseudomonas, Serratia, Clostridium, Candida, Bacteroides, Porphyromonas και Staphylococcus sp. [4] . Πολλά βακτήρια εκκρίνουν αρκετές μη ειδικές πρωτεάσες π.χ. Pseudomonas, Serratia, Streptococcus, Staphylococcus και Bacteroides sp. έχουν ισχυρές πρωτεάσες μεταλλο-, κυστεΐνης και σερίνης με ευρύ φάσμα δράσεων [5] . Ο κρίσιμος ρόλος των βακτηριακών πρωτεασών στη λοιμογόνο δράση αποδείχθηκε επιτυχώς με την εξάλειψη του γονιδίου που κωδικοποιεί την πρωτεάση στο P. gingivalis [6] . Η πρόσφατα περιγραφείσα υπεροικογένεια πρωτεϊνών κυστατίνης περιλαμβάνει τόσο ευκαρυωτικούς όσο και προκαρυωτικούς αναστολείς πρωτεάσης κυστεΐνης [7]. Οι ανθρώπινες κυστατίνες C, D και S, οι κυστατίνες A και S αρουραίου, η κυστατίνη κοτόπουλου και η κυστατίνη oryza έχουν αναφερθεί ότι αναστέλλουν την αναπαραγωγή ορισμένων ιών και βακτηρίων [8] αν και δεν έχει ακόμη αποδειχθεί άμεσα ότι αυτές οι επιδράσεις οφείλονται στην πρωτεάση ανασταλτική ικανότητα των κυστατινών [9] . Ο βασικός ρόλος των πρωτεασών κυστεΐνης σε μικροβιακές λοιμώξεις, σε συνδυασμό με τη σχετική έλλειψη πλεονασμού σε σύγκριση με συστήματα θηλαστικών, έχει κάνει τις μικροβιακές πρωτεάσες ελκυστικούς στόχους για την ανάπτυξη νέων χημειοθεραπευτικών προσεγγίσεων [10, 11]. Τα συστήματα δακτυλίου ιμιδαζοπυριδίνης αντιπροσωπεύουν μια σημαντική κατηγορία ενώσεων που δεν μόνο για το θεωρητικό τους ενδιαφέρον αλλά και από φαρμακολογική άποψη. Έχει αποδειχθεί ότι διαθέτουν ένα ευρύ φάσμα χρήσιμων φαρμακολογικών δράσεων [12] συμπεριλαμβανομένων αντιγαστρικών, αντιεκκριτικών, τοπικών αναισθητικών, αντιιικών, αντιαγχολυτικών, αντιβακτηριακών, αντιμυκητιασικών, αντιελμινθικών, αντιπρωτοζωικών, αντισπασμωδικών, γαστρεντερικών, κατά του έλκους (Zolmidine), anxio, anxio, anxio, υπνωτικό (Zolpidem) και ανοσοτροποποιητικό [13] . Η φύση και η θέση των υποκαταστατών στο πυριδινικό τμήμα επηρεάζουν αυτές τις φαρμακολογικές δραστηριότητες. Αυτές οι ετεροκυκλικές δομές ιμιδαζοπυριδίνης αποτελούν μέρος του σκελετού των φυσικών αλκαλοειδών, παραγόντων νευρομυϊκού αποκλεισμού [14] , αναστρέψιμων αναστολέων των ενζύμων H +, K + -ATPase με ισχυρή αντιεκκριτική δράση και είναι γνωστό ότι είναι ηρεμιστικά υπνωτικά του νευρικού συστήματος. 15] . Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε προτείνει κινητικά και θερμοδυναμικά χαρακτηρισμένα παράγωγα 1-υποκατεστημένης πυριδυλιμιδαζο[1,5-a]πυριδίνης ως ισχυρούς και νέους αναστολείς πρωτεάσης κυστεΐνης που δρα επίσης ως αντιβακτηριδιακοί παράγοντες. Η κρυσταλλική δομή της παπαΐνης εξήχθη από την Τράπεζα Δεδομένων Πρωτεϊνών (κωδικός PDB: 1PE6) [16] . Όλα τα μόρια νερού και τα ετεροάτομα αφαιρέθηκαν και άτομα υδρογόνου προστέθηκαν στην πρωτεΐνη. Εφαρμόστηκε το πεδίο δύναμης CharMm [17] και η δομή υποβλήθηκε σε ελαχιστοποίηση ενέργειας για 1000 βήματα χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της πιο απότομης καθόδου. Οι χημικές δομές όλων των συνθετικών ενώσεων δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας chemdraw και στη συνέχεια μετατράπηκαν σε τρισδιάστατη μορφή χρησιμοποιώντας CORINA. Διεξήχθη μια σειρά πειραμάτων σύνδεσης με όλα τα σχεδιασμένα παράγωγα 1 υποκατεστημένης πυριδυλιμιδαζο[1,5-a]πυριδίνης έναντι της παπαΐνης χρησιμοποιώντας το AutoDock Tools 4.0 [18] για πιθανές ανασταλτικές δραστηριότητες κυστεΐνης-πρωτεάσης. Οι ενώσεις επιλέχθηκαν με βάση τις ενέργειες δέσμευσής τους και αυτές που αντικατοπτρίζουν καλή συγγένεια δέσμευσης αναλύθηκαν περαιτέρω σε πλατφόρμα πυριτίου. Ως παράμετρος για τη μοριακή σύνδεση, χρησιμοποιήθηκε ο γενετικός αλγόριθμος Λαμάρκ, ένας συνδυασμός μεταξύ του γενετικού αλγορίθμου και του αλγόριθμου τοπικής αναζήτησης Pseudo-Solis και Wets. Ένα κουτί πλέγματος 60660660 Å δημιουργήθηκε γύρω από την ενεργό θέση της παπαΐνης, διασφαλίζοντας ότι αυτοί οι αναστολείς μπορούν να περιστρέφονται ελεύθερα μέσα στο πλέγμα. Ο αριθμός των διαδρομών σύνδεσης ορίστηκε σε 10. Κάθε docking επαναλαμβανόταν πέντε φορές, έχοντας στο τέλος συνολικά 50 docking runs, για να ελεγχθεί η ακρίβεια των αποτελεσμάτων. Τα τελικά ληφθέντα συνδεδεμένα σύμπλοκα οπτικοποιήθηκαν στη συνέχεια χρησιμοποιώντας PyMol [19]. Το έργο πιστοποιήθηκε περαιτέρω στο υγρό εργαστήριο μετά τη λεπτομερή ανάλυσή του σε πλατφόρμα πυριτίου. Τα σχεδιασμένα παράγωγα φιλτραρίστηκαν από τον «Κανόνα των πέντε» του Lipinski που θέτει τα κριτήρια για ιδιότητες που μοιάζουν με φάρμακα. Η ομοιότητα του φαρμάκου είναι μια ιδιότητα που χρησιμοποιείται συχνότερα για τον χαρακτηρισμό νέων ενώσεων μολύβδου [20] . Σύμφωνα με αυτόν τον κανόνα, αναμένεται κακή απορρόφηση εάν MW 0,500, log P.5, δότες δεσμών υδρογόνου 0,5 και δέκτες δεσμών υδρογόνου 0,10 [21] . Στις ιδιότητες απορρόφησης, κατανομής, μεταβολισμού και απέκκρισης του πυριτίου (ADME) αυτών των παραγώγων προβλέφθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα διαδικτυακά εργαλεία βιοπληροφορικής.N http://www.organic-chemistry.org. N http://mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr/cgi-bin/portal. py; Μορφή = admetox N https://secure.chemsilico.com/pages/submit.phpΗ παραπάνω μελέτη μας έδωσε μια ιδέα για την ύπαρξη πιθανών μεταλλαξιογόνων και ογκογονικών ιδιοτήτων σε συντιθέμενες ενώσεις. Το αποτέλεσμα που προέκυψε μας βοήθησε να εξετάσουμε τις συντιθέμενες ενώσεις για την περαιτέρω χρήση τους ως ισχυρούς απαγωγείς. Με βάση τα αποτελέσματα των μελετών σύνδεσης, δέκα παράγωγα της 1πυριδυλιμιδαζο[1,5-a]πυριδίνης συντέθηκαν σύμφωνα με τους Siddiqui et al., 2006 [ 22] τα οποία ονομάζονται ως εξής: 1- Η ικανότητα των παραγώγων 1-πυριδυλιμιδαζο[1,5-a]πυριδίνης να αναστέλλουν πρωτεάσες κυστεΐνης δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας παπαΐνη ως μοντέλο ενζύμου. Η πρωτεολυτική δράση των μιγμάτων αντίδρασης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Bz-DL-Arg-pNA ως χρωμογόνο υπόστρωμα [23]. Σε διαλύματα δραστικής παπαΐνης (τελική συγκέντρωση: 0,05 mM) προστέθηκαν συμπυκνωμένα διαλύματα των διαφορετικών παραγώγων σε τελικές συγκεντρώσεις 0,2 mM. Μετά από επώαση για 30 λεπτά στους 37 uC, προστέθηκε το διάλυμα υποστρώματος και μετά από περαιτέρω επώαση για 20 λεπτά η αντίδραση σταμάτησε με την προσθήκη 5% τριχλωρικού οξέος (TCA) οξινισμένο με 2,25% HCI και προσδιορίστηκε η απορρόφηση του μίγματος της αντίδρασης σε μήκος κύματος 410 nm από το Microplate Manager 4.0 (εργαστήρια Bio-Rad). Η ίδια διαδικασία χρησιμοποιήθηκε στους 32uC και στους 42uC για θερμοδυναμικές μελέτες. Οι κινητικές παράμετροι για την υδρόλυση του υποστρώματος προσδιορίστηκαν με μέτρηση του αρχικού ρυθμού ενζυματικής δραστηριότητας. Η σταθερά αναστολής K i προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Dixon [24] και επίσης με την εξίσωση Lineweaver-Burk. Η τιμή Km υπολογίστηκε από τη διπλή αμοιβαία εξίσωση προσαρμόζοντας τα δεδομένα στο λογισμικό υπολογιστή Origin 6.1. Η γραφική παράσταση Lineweaver-Burk χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των τύπων αναστολής. Για την κινητική ανάλυση και τους προσδιορισμούς της σταθεράς ταχύτητας, οι προσδιορισμοί πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και η μέση τιμή λήφθηκε υπόψη σε όλη αυτή την εργασία. Η εξάρτηση από τη θερμοκρασία των σταθερών αναστολής χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των θερμοδυναμικών παραμέτρων. Οι αλλαγές στην ενθαλπία (DH) προσδιορίστηκαν από τα διαγράμματα Van't Hoff χρησιμοποιώντας την εξίσωση, όπου DH είναι μεταβολή ενθαλπίας, R είναι σταθερά αερίου, DS είναι μεταβολή εντροπίας και T είναι η απόλυτη θερμοκρασία. Η μεταβολή της εντροπίας λήφθηκε από την εξίσωση, Η ανάλυση έγινε σε διαφορετικές θερμοκρασίες (32uC, 37uC, 42uC) υπολογίζοντας διάφορα K i παραγώγων 1-πυριδυλιμιδαζο[1,5-a]πυριδίνης με παπαΐνη ως πρότυπο ένζυμο. Η μέθοδος διάχυσης δίσκου [25] χρησιμοποιήθηκε για την προκαταρκτική αντιβακτηριακή αξιολόγηση των παραγώγων 1-πυριδυλιμιδαζο[1,5-a]πυριδίνης. Το MIC 50 αυτών των παραγώγων, που έδειξε αναστολή στις προκαταρκτικές δοκιμές, προσδιορίστηκε περαιτέρω με την τεχνική της πλάκας μικροτιτλοδότησης χρησιμοποιώντας τη μέθοδο μικροαραίωσης [26] . Εν συντομία, τα βακτηριακά στελέχη (S. aureus, P. vulgaris, Streptococci της ομάδας D, Bacillus sp., E. coli, P. aeruginosa και S. morganii)) αναπτύχθηκαν και αραιώθηκαν σε 2610 5 μονάδες σχηματισμού αποικιών (CFU) /ml σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου (SPB) που περιέχει 0,03% ζωμό Luria-Bertani (LB). Τα συντιθέμενα παράγωγα διαλύθηκαν σε DMSO και η σειριακή τους αραίωση πραγματοποιήθηκε σε 50 mL μέσου LB σε πλάκα μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων για να επιτευχθούν οι απαιτούμενες συγκεντρώσεις (0,1-10 mg/ml) με βακτηριακά εμβόλια (5610 4 CFU ανά φρεάτιο). Το DMSO λήφθηκε ως αρνητικός έλεγχος και η κεφτριαξόνη και η κλοτριμαζόλη λήφθηκαν ως θετικοί μάρτυρες. Μετά από επώαση στους 37 οC όλη τη νύχτα, τα MIC λήφθηκαν ως η χαμηλότερη συγκέντρωση αναστολέα στην οποία ανεστάλη η βακτηριακή ανάπτυξη. Υπολογίστηκε ο μέσος όρος τριών τιμών και αυτός ήταν το MIC για το υλικό δοκιμής και το βακτηριακό στέλεχος. Για τη μέθοδο μέτρησης πλακών άγαρ [27] , επωάστηκαν κλάσματα 25 mL βακτηρίων σε 1610 5 CFU/ml σε SPB που περιείχε 0,03% ζωμό LB με 25 mL αραιωμένων ενώσεων για 2 ώρες στους 37uC. Τα μίγματα βακτηρίων και ενώσεων αραιώθηκαν σειριακά 10 φορές με SPB και απλώθηκαν σε πλακίδια LB που επωάστηκαν στους 37 uC όλη τη νύχτα. Οι βακτηριακές αποικίες απαριθμήθηκαν την επόμενη μέρα. Μετά τον προσδιορισμό των MICs, βακτηριακά στελέχη από τα φρεάτια της πλάκας μικροτιτλοδότησης χωρίς ορατή βακτηριακή ανάπτυξη αφαιρέθηκαν για σειριακή υποκαλλιέργεια 2 ml σε άλλη νέα πλάκα μικροτιτλοδότησης που περιείχε 100 ml ζωμού ανά φρεάτιο και επωάστηκε περαιτέρω για 24 ώρες. Η χαμηλότερη συγκέντρωση χωρίς ορατή ανάπτυξη ορίστηκε ως MBC [28], υποδεικνύοντας 99,5% θανάτωση του αρχικού εμβολίου. Η απορρόφηση κάθε φρεατίου μετρήθηκε σε μήκος κύματος 620 nm από το Microplate Manager 4.0 (εργαστήρια Bio-Rad) και συγκρίθηκε με ένα τυφλό. Ως αρνητικός έλεγχος χρησιμοποιήθηκε διαλύτης (DMSO). Έγιναν τρεις επαναλήψεις για κάθε ένωση και το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές. Τα βακτήρια χρησιμοποιούν τις πρωτεάσες κυστεΐνης τους για παθογένεια, όπως θα μπορούσε να απεικονιστεί από τη δομή του ομολόγου Cif στο Burkholderia pseudomallei (CHBP) που αποκαλύπτει μια πτυχή που μοιάζει με παπαΐνη και ένα διατηρημένο Cys-His -Gln καταλυτική τριάδα [29] . Έχει αποδειχθεί ότι τα βακτηριακά παθογόνα έχουν μια μοναδική υδρολυτική δράση παρόμοια με την παπαΐνη για να εμποδίζουν την πρόοδο του φυσιολογικού κυτταρικού κύκλου ξενιστή καθώς ο πυρήνας μιας πρωτεΐνης μη τοξικότητας (Avr) (AvrPphB) από το φυτικό παθογόνο Pseudomonas syringae, μοιάζει με τις πρωτεάσες κυστεΐνης που μοιάζουν με παπαΐνη. . Η ομοιότητα αυτής της πρωτεΐνης AvrPphB με την παπαΐνη περιλαμβάνει την καταλυτική τριάδα των Cys-98, His-212 και Asp-227 στην ενεργό θέση AvrPphB [30] .Turk et al. έχουν προτείνει, βάσει κινητικών και δομικών μελετών, ότι η παπαΐνη έχει επτά υποθέσεις στο ενεργό κέντρο, αλλά μόνο πέντε υποθέσεις είναι σημαντικές που μπορούν να συνδεθούν με ένα υπόλειμμα αμινοξέος του υποστρώματος [31] . Μια ποικιλία ενδιάμεσων παράγονται όταν η παπαΐνη αντιδρά με υπόστρωμα ή έναν αναστολέα [2] . Όπως οι πρωτεάσες σερίνης, οι πρωτεάσες κυστεΐνης τείνουν να έχουν σχετικά ρηχές, εκτεθειμένες σε διαλύτη ενεργές θέσεις που μπορούν να φιλοξενήσουν μικρά τμήματα υποστρώματος/αναστολέα πρωτεϊνικών βρόχων (π.χ. από ενδογενείς αναστολείς όπως κυστατίνες) ή κλώνους. Ο αναστολέας Πίνακας 3. Ονομασία, Δομή, IC50 & Ki παραγώγων 1-υποκατεστημένης πυριδυλιμιδαζο[1,5-a]πυριδίνης έναντι παπαΐνης πρωτεάσης κυστεΐνης. Τύπος αναστολής Ki (mM) IC 50 (mM) Μη ανταγωνιστική 13,7 13,4 προτεάση ένωσης με μια ένωση προτεάσης 13,7 13,4. συνδυασμός δεσμών υδρογόνου και υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Ως μέρος της έρευνάς μας για την ανάπτυξη νέων και αποτελεσματικών αναστολέων πρωτεάσης κυστεΐνης, δέκα 1-υποκατεστημένα παράγωγα πυριδυλιμιδαζο [1,5a] πυριδίνης (3a-j) σχεδιάστηκαν κυρίως και εξετάστηκαν με βάση τις ενέργειες πρόσδεσής τους έναντι της παπαϊνης για να διαλευκανθούν οι πιθανές τους τρόπος δράσης. Διαπιστώθηκε ότι αυτές οι ενώσεις ήταν ειδικοί αναστολείς της πρωτεάσης της κυστεΐνης, της παπαϊνης και δεν έδειξαν αναστολή έναντι άλλων τύπων πρωτεασών όπως η σερίνη, το ασπαρτικό ή οι μεταλλοπρωτεάσες. Είναι ειδικά για την CA φυλή πρωτεάσης κυστεΐνης και δεν έδειξαν καμία σημαντική αναστολή έναντι άλλων φυλών πρωτεασών κυστεΐνης. Αυτές οι νέες ενώσεις επινοήθηκαν με βάση τη γνώση της ικανότητας μιας πρωτεΐνης να μεταβάλλει τη διαμόρφωσή της για να φιλοξενήσει έναν συνδετικό συνδέτη και μας επέτρεψαν για να συγκρίνετε απευθείας τις σχετικές θέσεις του υπολείμματος στον θύλακα δεσίματος. Η μελέτη μοριακής σύνδεσης παρείχε τη δομική εικόνα για τη δέσμευση αυτών των ενώσεων (3a-j) (Εικόνα 1) εντός της ενεργού θέσης της παπαΐνης η οποία αποτελείται κυρίως από μια καταλυτική τριάδα των Cys 25, His 159 και Asp 175 [32] . Επιπλέον, έχει αποκαλυφθεί και ο ρόλος άλλων υπολειμμάτων που υπάρχουν στη δραστική θέση της παπαΐνης, που παίζουν σημαντικό ρόλο στην προσαρμογή των ενώσεων. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε σύνδεση με όλες τις σχεδιασμένες ενώσεις (3a-j) ενάντια στην παπαΐνη, ένα γνωστό ένζυμο πρωτεάσης της κυστεΐνης και σε αυτό το πλαίσιο, παρατηρήσαμε πολύ ενδιαφέροντα αποτελέσματα όπου οι προτεινόμενοι αναστολείς μας (3a-j) εκμεταλλεύονται τα αρωματικά και υδρόφιλα κατάλοιπα. κάνοντας μια ποικιλία αλληλεπιδράσεων με το ένζυμο στόχο. Αν και, οι ενώσεις 3e-j έδωσαν σημαντικά αποτελέσματα όταν συνδέθηκαν με παπαΐνη, αλλά κατά την αξιολόγηση των αντιβακτηριακών ιδιοτήτων σε πειράματα υγρού εργαστηρίου, έδωσαν ασήμαντα αποτελέσματα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, μόνο τέσσερις ενώσεις εξετάστηκαν για συζήτηση και πραγματοποιήθηκαν περαιτέρω πειράματα όπως κινητικές και θερμοδυναμικές μελέτες για να χαρακτηριστούν αυτές οι ενώσεις ως ισχυροί προ-αναστολείς (3a-d). Τα ευρήματα της παραπάνω μελέτης έδειξαν ότι οι μοριακές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ενώσεων Το 3a-d και η παπαΐνη ήταν πολύ παρόμοιες με τις αλληλεπιδράσεις που παρατηρήθηκαν για το E-64c, ένα παράγωγο του φυσικώς απαντώμενου αναστολέα εποξειδίου (E-64c) (Εικόνα 1) των πρωτεασών κυστεΐνης [31, 32], με την παπαϊνη. ειδικά όσον αφορά τους δεσμούς υδρογόνου και τις υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις των προσδεμάτων με διατηρημένα υπολείμματα στη θέση καταλυτικής δέσμευσης (Εικόνα 2 Α-Δ). Αρκετά υπολείμματα παπαΐνης συμμετείχαν σε υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις με τις ενώσεις 3a-d, συμπεριλαμβανομένων των Gln19, Cys25, Gly66 και Asp158. Τα τμήματα πυριδίνης των ενώσεων 3a-d αλληλεπιδρούν με τη θέση S2 της παπαΐνης που περιλαμβάνει (Tyr61, Asn64, Gly65 & Tyr67) αμινοξέα (Εικόνα 2 A-D). Τα υπολείμματα της ενεργού θέσης που βρέθηκαν να παίζουν βασικό ρόλο στην αλληλεπίδραση των ενώσεων εντός της δραστικής θέσης (κυρίως μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων) ήταν τα Cys25, Tyr61, His159 και Trp177, ενώ τα Trp177, Gln19 βρέθηκαν σε εμένα να κάνω δεσμούς υδρογόνου μόνο με την ένωση 3a . Εκτός από αυτό, πολλά άλλα υπολείμματα βρέθηκαν επίσης να εμπλέκονται ενεργά (Πίνακας 1). Επιπλέον, οι ενέργειες δέσμευσης για την ένωση 3a, 3b, 3c και 3d με την παπαΐνη βρέθηκαν να είναι 26,12, 25,76, 26,84 και 25,62 Kcal/mol αντίστοιχα, οι οποίες ήταν σε μεγάλη συμφωνία με τα πειράματά μας σε υγρό εργαστήριο. θα συζητηθεί αργότερα (Πίνακας 1). Αυτό επιβεβαίωσε την ακρίβεια του πρωτοκόλλου σύνδεσης. Δεδομένου ότι, η ενέργεια δέσμευσης είναι ένα άμεσο μέτρο της ισχύος της αλληλεπίδρασης και οι ενώσεις μας 3a-d έδειξαν ισχυρότερη δέσμευση εντός της ενεργού θέσης της παπαΐνης σε σύγκριση με τον αναστολέα E-64c (DG: 24,04 Kcal/mol), επομένως, τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι αυτά τα 1-υποκατεστημένα παράγωγα πυριδυλιμιδαζο[1,5-a]πυριδίνης (3ad) θα μπορούσαν να είναι ισχυροί αναστολείς της παπαΐνης όπως οι πρωτεάσες κυστεΐνης. wet lab Πίνακας 5 . Πρόβλεψη αντιβακτηριακών ενώσεων ως φάρμακα (http://www.organic-chemistry.org). Πίνακας 2). Είναι ενδιαφέρον ότι οι ενέργειες δέσμευσης πυριτίου που παρατηρήθηκαν για τις ενώσεις 3a-d έναντι της παπαΐνης βρέθηκαν να συμφωνούν σε μεγάλο βαθμό (τυπικό σφάλμα 62 Kcal/mol) με την τιμή της ελεύθερης ενέργειας δέσμευσης (DG) που παρατηρήθηκε κατά τη διάρκεια θερμοδυναμικών μελετών (Πίνακας 1 και 2) . Παρομοίως, η αλλαγή ενθαλπίας (DH) της δέσμευσης ήταν αρνητική ενώ η αλλαγή εντροπίας (DS) της δέσμευσης ήταν θετική, γεγονός που έδειξε την εξώθερμη και εντροπικά καθοδηγούμενη φύση της δέσμευσης. Αυτό το πρότυπο εξάρτησης από τη θερμοκρασία είναι χαρακτηριστικό της υδρόφοβης αλληλεπίδρασης [33] . Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως ότι όλες οι ενώσεις (3a-d) βρέθηκαν να αλληλεπιδρούν με τα υπολείμματα της ενεργού θέσης της παπαΐνης μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων στις περισσότερες περιπτώσεις κατά τη διάρκεια μελετών πυριτίου, το ίδιο παρατηρήθηκε από την ανάλυση των γραφικών παραστάσεων Van't Hoff για όλα τα προτεινόμενοι αναστολείς σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες (32uC, 37uC και 42uC) σε πειράματα υγρού εργαστηρίου (Εικόνα 3). Αυτό αποδεικνύει τη σημασία αυτών των τύπων αλληλεπιδράσεων στην τοποθέτηση των ενώσεων εντός της δραστικής θέσης. Ως εκ τούτου, η θερμοδυναμική καθώς και η μελέτη πυριτίου αποκαλύπτει ότι οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις ευνοούν τη σύνδεση αυτών των προτεινόμενων αναστολέων με πρωτεάσες κυστεΐνης όπως η παπαΐνη. Περαιτέρω αποτελέσματα υγρού εργαστηρίου πρότειναν τη μη ανταγωνιστική αλληλεπίδραση των ενώσεων (3a, 3c & 3d) με την παπαΐνη εκτός από την ένωση 3b που έδειξε ανταγωνιστική αλληλεπίδραση. Συνοψίζοντας, τα παραπάνω αποτελέσματα μελετών μοριακής σύνδεσης και θερμοδυναμικής ανάλυσης των ενώσεων 3a-d με παπαΐνη έδειξαν ότι αυτές οι ενώσεις έχουν τη δυνατότητα να είναι νέοι και μοναδικοί αναστολείς πρωτεάσης κυστεΐνης. Στην τρέχουσα μελέτη, η ανασταλτική δραστηριότητα πρωτεάσης κυστεΐνης των συντιθέμενων παραγώγων της 1-υποκατεστημένης πυριδυλιμιδαζο[1,5-a] πυριδίνης (3a-d)) πραγματοποιήθηκε επίσης έναντι της παπαΐνης και οι σταθερές αναστολής (Ki) για το παραπάνω εν λόγω ένζυμο παρατηρήθηκαν ότι ήταν 13,70, 23,20, 90,00 και 99,30 mM για ενώσεις 3a, 3b, 3c και 3d αντίστοιχα (Πίνακας 3). Επιπλέον, οι υπολογισμένες τιμές IC50 βρέθηκαν επίσης να είναι 13,40, 21,17, 94,50 και 96,50 mM για τις ενώσεις 3a, 3b, 3c και 3d αντίστοιχα (Πίνακας 3). Εκτός από την ένωση 3b, οι υπόλοιπες ενώσεις εμφάνισαν μη ανταγωνιστικές, αναστρέψιμες αναστολές, αλλά όλες οι ενώσεις, ανεξάρτητα από τους τύπους δέσμευσης, έδειξαν υδρόφοβη και εντροπικά καθοδηγούμενη αλληλεπίδραση. Αυτά τα παράγωγα (3a-j) αξιολογήθηκαν τελικά για τις αντιβακτηριακές τους δράσεις έναντι επτά κλινικά σημαντικών μικροβίων (S. aureus, P. vulgaris, Streptococci Ομάδας D, Bacillus sp., E. coli, P. aeruginosa και S. morganii). Εδώ, δείχνουμε τα δεδομένα μόνο τεσσάρων ενώσεων (3a-d) λόγω των σημαντικών αποτελεσμάτων τους (Πίνακας 4). Όλες οι ενώσεις ακολούθησαν αυστηρά το πρότυπο της δράσης αντιπρωτεάσης προς την ανάπτυξη βακτηριδίων εκτός από το P. vulgaris και το E. coli σε μία περίπτωση το καθένα (Πίνακας 4). Δεδομένου ότι η ένωση 3c και 3d δεν έχουν μεγάλη διαφορά στις τιμές IC50 τους (3c-94,5 mM και 3d-96,5 mM) έναντι της πρωτεάσης της κυστεΐνης, της παπαϊνης και επομένως στην αντιβακτηριακή δράση σε όλες τις περιπτώσεις εκτός από μία. Μπορεί να είναι τυχαίο λόγω τόσο κοντά στις τιμές IC50. Οι ενώσεις 3c & 3d έχουν μεγάλη διαφορά στις τιμές IC50 τους (3b-21,17 mM και 3c-94,5 mM) και έδειξαν ακριβές πρότυπο για την αντιβακτηριακή τους δράση για όλα τα μικρόβια εκτός από το E. coli σε μία περίπτωση. Αν και, το E. coli περιέχει όντως έξι κύριες πρωτεάσες κυστεΐνης, αλλά καμία δεν ανήκει στη φυλή CA της παπαΐνης. Υποστηρίζεται ότι αυτές οι ενώσεις ανέστειλαν επίσης τις πρωτεάσες κυστεΐνης άλλης φυλής εκτός της παπαΐνης, αλλά με χαμηλή αποτελεσματικότητα. Δεδομένου ότι, τα παράγωγα πυριδυλιμιδαζο[1,5-a]πυριδίνης είναι απολύτως νέο ικρίωμα προς αντιβακτηριακούς παράγοντες και επομένως, όχι οποιαδήποτε τυπική ένωση(εις) του ίδιου ικριώματος είναι διαθέσιμο για αναφορά. Έτσι, η κλοτριμαζόλη (1-[(2-χλωροφαινυλ)(διφαινυλ)μεθυλ]-1Η-ιμιδαζόλη), ένα παράγωγο ιμιδαζόλης και η Κεφτριαξόνη (τρίτης γενιάς αντιβιοτικό κεφαλοσπορίνης με ευρέως φάσματος δράση έναντι Gram-θετικών και Gram-αρνητικών βακτηρίων) έχουν χρησιμοποιείται ως θετικός έλεγχος ενώ το DMSO έχει χρησιμοποιηθεί ως αρνητικός έλεγχος. Όλα τα προαναφερθέντα βακτηριακά είδη έχει αποδειχθεί ότι εκκρίνουν ορισμένες πρωτεάσες κυστεΐνης που παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στην παθογένεια διαφορετικών ασθενειών που προκαλούνται από αυτούς τους μικροοργανισμούς. Η ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση (MICs) των ενώσεων (3a-d) (Πίνακας 4) έναντι όλων των ελεγχόμενων βακτηρίων εκτός από το E. coli και το P. vulgaris, παρατηρήθηκε ότι συμφωνεί σε μεγάλο βαθμό με την αντίστοιχη σταθερά αναστολής τους (Ki)/IC 50 τιμές έναντι της παπαΐνης (Πίνακας 3) που δείχνει ξεκάθαρα ότι αυτές οι ενώσεις έχουν τη δυνατότητα να αναστέλλουν τις πρωτεάσες κυστεΐνης τύπου παπαΐνης αυτών των παθογόνων. Ο συντελεστής κατανομής (logP) είναι ένα καλά τεκμηριωμένο μέτρο της λιποφιλικότητας της ένωσης. Η κατανομή των υπολογισμένων τιμών logP (cLogP) της πλειονότητας των φαρμάκων στην αγορά κυμαίνεται από μηδέν έως πέντε. Όλες οι ενώσεις που μελετήθηκαν εκτός από το 3d, έδειξαν καλή συμφωνία με τα κριτήρια που ορίζονται για την πρόβλεψη μιας ένωσης ως δυνητικού φαρμάκου (Πίνακας 5). Όλες οι ενώσεις δεν παρουσιάζουν καμία απειλή κατά της αξιολόγησης κινδύνου τοξικότητας εκτός από την ένωση 3d που έδειξε απειλή ως ογκογονική δράση λόγω της παρουσίας της ομάδας ισοβουτυλίου. Μεταξύ όλων των εξεταζόμενων ενώσεων, η ένωση 3a ήταν η πιο ισχυρή της οποίας το MIC ήταν το χαμηλότερο μεταξύ όλων των ελεγχόμενων ενώσεων και έδειξε μέγιστη βαθμολογία φαρμάκου και θετικές τιμές για ομοιότητα φαρμάκου. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης έχουν αποδείξει ότι το 1-υποκατεστημένο πυριδυλιμιδαζό Τα παράγωγα [1,5-a]πυριδίνης θα μπορούσαν να είναι υποψήφια για νέους και ισχυρούς αναστολείς της παπαΐνης, όπως οι πρωτεάσες κυστεΐνης, που παίζουν επιβλαβή ρόλο στην εξέλιξη διαφορετικών ασθενειών που προκαλούνται από διάφορους μικροοργανισμούς. Επομένως, αυτή η ομάδα ενώσεων θα μπορούσε να αποτελέσει αντικείμενο μελλοντικής έρευνας για την αντιμετώπιση των προκλήσεων με ανθεκτικούς μικροοργανισμούς που αποτελούν σημαντική απειλή παγκοσμίως. Αρχείο S1 Τύποι αναστολών με Ki (Ενώσεις 3a-3d). (DOC)", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 8475, "text": "πρωτεάσες κυστεΐνης" } ], "id": 3041, "question": "Ποια ένζυμα έχουν αναφερθεί ότι συνδέονται με τη σοβαρότητα της μόλυνσης και τις διάφορες παθολογικές καταστάσεις που προκαλούνται από μικροοργανισμούς;" }, { "answers": [ { "answer_start": 10328, "text": "32uC, 37uC, 42uC" } ], "id": 3042, "question": "Σε ποιες θερμοκρασίες ολοκληρώθηκε η ανάλυση;" }, { "answers": [ { "answer_start": 18316, "text": "1-υποκατεστημένα παράγωγα πυριδυλιμιδαζο[1,5-a]πυριδίνης" } ], "id": 3044, "question": "Ποιοι θα μπορούσαν να είναι νέοι υποψήφιοι ως ισχυροί αναστολείς της παπαΐνης όπως οι πρωτεάσες κυστεΐνης σε ανθεκτικούς μικροοργανισμούς;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "RNAi Θεραπευτικές Πλατφόρμες για Πνευμονοπάθειεςhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3816685/Fujita, Yu; Τακεσίτα, Φουμιτάκα; Kuwano, Kazuyoshi; Ochiya, Takahiro2013-02-06DOI:10.3390/ph6020223License:cc-byAbstract: Η παρεμβολή RNA (RNAi) γίνεται γρήγορα μια σημαντική μέθοδος για την ανάλυση των λειτουργιών των γονιδίων σε πολλούς ευκαρυώτες και υπόσχεται την ανάπτυξη θεραπευτικού γονιδίου. Η επαγωγή του RNAi βασίζεται σε μικρά RNA σιγής, τα οποία επηρεάζουν την αποικοδόμηση του συγκεκριμένου αγγελιοφόρου RNA (mRNA). Δύο τύποι μικρών μορίων RNA, δηλ. Τα μικρά παρεμβαλλόμενα RNA (siRNA) και τα microRNA (miRNAs), είναι κεντρικά στο RNAi. Οι μελέτες ανακάλυψης φαρμάκων και οι νέες θεραπείες των siRNAs στοχεύουν επί του παρόντος ένα ευρύ φάσμα ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων διαφόρων ιογενών λοιμώξεων και καρκίνων. Οι πνευμονικές παθήσεις γενικά αποτελούν ελκυστικούς στόχους για τα θεραπευτικά siRNA λόγω της θνησιμότητας και του επιπολασμού τους. Επιπλέον, ο πνεύμονας είναι ανατομικά προσβάσιμος σε θεραπευτικούς παράγοντες μέσω της ενδοπνευμονικής οδού. Πρόσφατα, αυξανόμενα στοιχεία δείχνουν ότι τα miRNA παίζουν σημαντικό ρόλο σε ανωμαλίες των πνευμόνων, όπως η φλεγμονή και η ογκογένεση. Ως εκ τούτου, τα miRNAs στοχεύονται για θεραπευτικούς σκοπούς. Σε αυτήν την ανασκόπηση, παρουσιάζουμε στρατηγικές για την παροχή RNAi και συζητάμε τις τρέχουσες θεραπείες που βασίζονται σε RNAi τελευταίας τεχνολογίας για διάφορες πνευμονικές παθήσεις. Κείμενο: παραδοσιακή χειρουργική, Bivas-Benita et al. ανέφερε ότι δεν σημειώθηκε θνησιμότητα ως αποτέλεσμα της χρήσης της ενδοτραχειακής τεχνικής. Οι ενδοτραχειακές εφαρμογές χρησιμοποιούνται επί του παρόντος από πολλούς επαγγελματίες στον πνευμονικό τομέα [22, 34]. Αυτό είναι χρήσιμο για τη μελέτη της πνευμονικής χορήγησης φαρμάκου σε ποντίκια. Ωστόσο, η προσέγγιση είναι πιο περίπλοκη στους ανθρώπους επειδή χρησιμοποιείται μια τεχνητή οδός για τη χορήγηση φαρμάκων στους πνεύμονες. Ως εκ τούτου, η μέθοδος χρησιμοποιείται σε ζωικά μοντέλα για τη δοκιμή και αξιολόγηση της αξιοπιστίας της για πιθανές κλινικές εφαρμογές. Ενδοτραχειακή οδός: υπό αναισθησία, η τραχεία εκτίθεται χειρουργικά και ένας σωλήνας ή βελόνα εισάγεται μέσω μιας τομής που γίνεται μεταξύ των τραχειακών δακτυλίων. Επιπλοκές, όπως αγγειακός τραυματισμός και διαρροή αέρα, είναι πιθανές λόγω της τραχειοτομής. (β) Ενδοτραχειακή οδός: τα siRNA ψεκάζονται απευθείας από το στόμα στους πνεύμονες χρησιμοποιώντας έναν αερόστατο MicroSprayer® (Penn-Century, Philadelphia, PA, ΗΠΑ) και ένα λαρυγγοσκόπιο. Είναι σημαντικό να διατηρείται μια σαφής εικόνα της τραχείας κατά τη διάρκεια της διαδικασίας. Η ενδορρινική χορήγηση είναι μια άλλη κοινή μέθοδος πνευμονικής εφαρμογής φαρμάκου σε μελέτες σε ζώα. Σε πολλές μελέτες, η in vivo επιτυχία έχει αποδειχθεί στην παροχή siRNA στους πνεύμονες ενδορινικά [22, 35, 36]. Μια πειραματική ρύθμιση ενδορινικής χορήγησης με ψεκασμό ή σταγονίδιο είναι απλή και ανώδυνη για το ζώο. Αν και η επιτυχία στην ενδορρινική παροχή siRNA σε τρωκτικά δεν μπορεί να επεκταθεί πλήρως στην ανθρώπινη χρήση λόγω των σημαντικών διαφορών στην ανατομία των πνευμόνων [37] , αυτή η προσέγγιση έχει δυνατότητες για την κλινική εφαρμογή των siRNA. Ξεκίνησαν κλινικές δοκιμές Φάσης ΙΙ για τη θεραπεία της λοίμωξης από αναπνευστικό συγκυτιακό ιό (RSV), με χρήση ενδορινικής εφαρμογής γυμνών χημικά τροποποιημένων μορίων siRNA που στοχεύουν προϊόντα ιικού γονιδίου [17, 38] (βλ. Ενότητα 3.1.1. για λεπτομέρειες). .Η ενδορινική είσοδος έχει χρησιμοποιηθεί από καιρό για τη χορήγηση μικρών μορίων, όπως πρωτεϊνών, για συστηματική χορήγηση. Επειδή ο ρινικός βλεννογόνος είναι εξαιρετικά αγγειωμένος, η χορήγηση ενός λεπτού επιθηλίου φαρμάκου σε όλη την επιφάνεια μπορεί να οδηγήσει σε ταχεία απορρόφηση του φαρμάκου στο αίμα. Επομένως, τα siRNA που χορηγούνται ενδορρινικά μπορεί να εναποτίθενται στη μύτη και μερικά από αυτά μπορεί να μην μπορούν να φτάσουν στην κατώτερη αναπνευστική οδό. Στην πραγματικότητα, έχει αναφερθεί ότι η ενδορρινική εφαρμογή μη τυποποιημένων siRNAs είχε ως αποτέλεσμα χαμηλότερη αποτελεσματικότητα χορήγησης και ομοιογενή πνευμονική κατανομή από αυτή που επιτεύχθηκε με την ενδοτραχειακή εφαρμογή [31] . Η ενδορρινική μέθοδος είναι κατάλληλη για ορισμένες ασθένειες των πνευμόνων, όπως η λοίμωξη του ανώτερου αναπνευστικού από RSV, και έχει επίσης δυνατότητα συστηματικής χορήγησης και όχι πνευμονικής παροχής των siRNAs. Επομένως, είναι σημαντικό να λαμβάνεται υπόψη η οδός χορήγησης σε μελέτες σε ζώα κατά την αξιολόγηση της χορήγησης και της θεραπευτικής αποτελεσματικότητας ενός σκευάσματος για πνευμονική χορήγηση. Είναι απαραίτητη η προσεκτική επιλογή της αποτελεσματικής χορήγησης ως απάντηση στην κατάσταση των πνευμονικών παθήσεων. Η χρήση αερολυμάτων για τη χορήγηση φαρμάκων στους πνεύμονες έχει μακρά ιστορία. Η χορήγηση με εισπνοή είναι μια δημοφιλής και μη επεμβατική μέθοδος χορήγησης παραγόντων στους πνεύμονες. Υπάρχουν αρκετές συσκευές εισπνοής διαθέσιμες για τη χορήγηση φαρμάκων στους πνεύμονες. Οι συσκευές εισπνοής μετρημένης δόσης (MDI) και οι συσκευές εισπνοής ξηρής σκόνης (DPI) είναι οι πιο συνηθισμένοι τρόποι εισπνοής. Οι MDI είναι οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες συσκευές εισπνοής για πολλές ασθένειες των πνευμόνων, όπως το άσθμα, η βρογχίτιδα και η χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (ΧΑΠ), και ο διαχωριστής είναι μια εξωτερική συσκευή που συνδέεται με ένα MDI για να επιτρέπει την καλύτερη παροχή φαρμάκου με ενισχυμένη ενεργοποίηση και συντονισμός εισπνοής. Για τους περισσότερους ΕΚΔ, το προωθητικό είναι ένα ή περισσότερα αέρια που ονομάζονται χλωροφθοράνθρακες (CFCs). Αν και οι CFC στα φάρμακα είναι ασφαλείς για εισπνοή από τους ασθενείς, είναι επιβλαβείς για το περιβάλλον. Επομένως, η περαιτέρω ανάπτυξη εισπνεόμενων siRNA μπορεί να μην είναι ο καλύτερος τρόπος για να προχωρήσουμε. Οι DPI είναι συσκευές που παρέχουν φάρμακα στους πνεύμονες με τη μορφή ξηρής σκόνης. Η χρήση των DPIs έχει ήδη αποδειχθεί πολλά υποσχόμενη για την in vivo παροχή θεραπευτικών μακρομορίων όπως η ινσουλίνη [39] και η χαμηλού μοριακού βάρους ηπαρίνη [40]. Έτσι, θα μπορούσε να είναι μια καλύτερη συσκευή για την παροχή siRNA στους πνεύμονες. Τα πλεονεκτήματα των DPIs είναι η βελτιωμένη σταθερότητα και η στειρότητα των βιομορίων έναντι των υγρών αερολυμάτων και ο σχηματισμός χωρίς προωθητικό. Αν και τα φάρμακα χορηγούνται συνήθως στους πνεύμονες μέσω εισπνοής, οι περισσότερες in vivo μελέτες που χρησιμοποιούν siRNA βασίζονται στην ενδοτραχειακή ή ενδορινική παροχή. Ο λόγος θα μπορούσε να είναι η δυσκολία στη διαμόρφωση εισπνεόμενων siRNA και τη διατήρηση της σταθερότητας κατά τη διαδικασία παράδοσης. Χρειάζεται επίσης ένας κατάλληλος φορέας για την προστασία των νουκλεϊκών οξέων από την αποικοδόμηση λόγω της δύναμης διάτμησης και της αυξημένης θερμοκρασίας κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ξήρανσης. Η χρήση της ξήρανσης με ψεκασμό ως τεχνική για την κατασκευή σκευασμάτων ξηρής σκόνης νανοσωματιδίων siRNA, τα οποία θα μπορούσαν να επιτρέψουν την τοπική παράδοση βιολογικά ενεργού siRNA απευθείας στον πνευμονικό ιστό, έχει αποδειχθεί [24, 25]. Στο μέλλον, η τεχνική είναι επιθυμητή για την εκτίμηση της in vivo μελέτης για τη θεραπεία με siRNA για εισπνοή. Μακροπρόθεσμα, αναμένουμε ότι θα υπάρχουν πιο εξελιγμένες συσκευές για κλινική χρήση και ότι αυτές που αναπτύσσονται επί του παρόντος θα είναι πιο κατάλληλες. Υπάρχουν δύο βασικά εμπόδια για την αποτελεσματική πνευμονική παροχή siRNA στα κύτταρα του πνεύμονα. Το πρώτο είναι η σύνθετη, διακλαδισμένη ανατομία των πνευμόνων και τα εμβιομηχανικά εμπόδια, όπως το στρώμα βλέννας που καλύπτει τα κύτταρα των αεραγωγών [41, 42] (Εικόνα 2) . Ένα αξιοσημείωτο χαρακτηριστικό της αναπνευστικής οδού είναι ο υψηλός βαθμός διακλάδωσης. Ο αεραγωγός αποτελείται από αναπνευστικά βρογχιόλια, κυψελιδικούς πόρους και κυψελιδικούς σάκους. Όλες αυτές οι δομές φέρουν κυψελίδες, τους μικροσκοπικούς αερόσακους στους οποίους λαμβάνει χώρα η ανταλλαγή αερίων. Είναι γενικά αποδεκτό ότι ο κρίσιμος παράγοντας για την αποτελεσματική παροχή siRNA εξαρτάται από τις ιδιότητες των σωματιδίων φαρμάκου RNAi όσον αφορά το μέγεθος, το φορτίο, το σχήμα, την ταχύτητα και την πυκνότητα. Για αποτελεσματική πνευμονική παροχή siRNA, τα σωματίδια πρέπει να εναποτίθενται στην κατώτερη αναπνευστική οδό. Η εναπόθεση στον αεραγωγό επηρεάζεται από το μέγεθος των σωματιδίων και την πνευμονική λειτουργία του ασθενούς. Ένα μέγεθος σωματιδίων μεταξύ 1-5 μm βρέθηκε ότι είναι το καταλληλότερο για εναπόθεση στην κατώτερη αναπνευστική οδό [23] . Επιπλέον, η παρουσία βλέννας και επιφανειοδραστικών πρωτεϊνών, οι δράσεις κάθαρσης του βλεννογόνου και η φαγοκυττάρωση από τα μακροφάγα αποτελούν σημαντικούς φραγμούς στη στοχευμένη πνευμονική παροχή. Ως εκ τούτου, τα συστήματα χορήγησης συνήθως απαιτούν φορείς παροχής και αυτοί οι φορείς πρέπει να σχεδιαστούν προκειμένου να μεγιστοποιηθεί η εναπόθεση του siRNA στην πάσχουσα περιοχή της αναπνευστικής οδού. Επιπλέον, οι εξωκυτταρικοί φραγμοί στην παροχή siRNA εξαρτώνται επίσης από τα φυσιολογικά χαρακτηριστικά της αναπνευστικής οδού, τα οποία μπορεί να αλλάζουν ανάλογα με το στάδιο της νόσου και τα χαρακτηριστικά του ασθενούς. Στο ενεργό στάδιο της πνευμονικής νόσου, οι φυσιολογικές συνθήκες των αεραγωγών μπορεί να αλλάξουν και να έχουν σημαντικό αντίκτυπο στην αποτελεσματικότητα του συστήματος πνευμονικής παροχής. Κατά τη διάρκεια της μόλυνσης, της φλεγμονής και της αλλεργικής αντίδρασης, παρατηρείται αύξηση της έκκρισης βλέννας μαζί με μειωμένη κάθαρση του βλεννογόνου [43] . Επιπλέον, το άσθμα και η ΧΑΠ είναι και οι δύο χρόνιες φλεγμονώδεις καταστάσεις του πνεύμονα που σχετίζονται με δομική «αναδιαμόρφωση» που είναι ακατάλληλη για τη διατήρηση της φυσιολογικής πνευμονικής λειτουργίας [44] . Το πάχος του τοιχώματος των αεραγωγών, το υψηλό ιξώδες και η σύνθεση της στιβάδας της βλέννας μπορεί να μεταβληθούν σε ασθενείς που έχουν φλεγμονώδεις πνευμονικές παθήσεις. Σχήμα 2 . Εξωκυτταρικοί φραγμοί στην πνευμονική παροχή siRNA. Το ανατομικό χαρακτηριστικό της αναπνευστικής οδού είναι ο υψηλός βαθμός διακλάδωσής της. Η βλέννα ευθυγραμμίζει το αναπνευστικό επιθήλιο από τη ρινική κοιλότητα μέχρι τα τερματικά βρογχιόλια. Τα εναποτιθέμενα σωματίδια στα βλεφαροειδή επιθηλιακά κύτταρα καθαρίζονται γρήγορα με τις δράσεις κάθαρσης του βλεννογόνου. Η βλέννα και η βλεννογόνος κάθαρση των παγιδευμένων με βλέννα σωματιδίων είναι ένας πνευμονικός αμυντικός μηχανισμός ως φυσιολογικός φραγμός. Στο κυψελιδικό, τα κύτταρα clara και τα κυψελιδικά κύτταρα τύπου ΙΙ εκκρίνονται στην επιφάνεια του κυψελιδικού επιθηλίου, σχηματίζοντας ένα λεπτό στρώμα πνευμονικών επιφανειοδραστικών ουσιών. Τα επιφανειοδραστικά δρουν ως το κύριο εμπόδιο για την παροχή siRNA επειδή μειώνουν την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης. Επιπλέον, τα μακροφάγα που βρίσκονται στις κυψελίδες καταπίνουν γρήγορα τα ξένα σωματίδια με φαγοκυττάρωση. Τα σωματίδια που λαμβάνονται στα μακροφάγα στη συνέχεια αποικοδομούνται μέσα στα κύτταρα. Αυτοί οι παράγοντες παρουσιάζουν σημαντικούς φραγμούς στη στοχευμένη πνευμονική παροχή. Ο δεύτερος είναι η κυτταρική μεμβράνη των αεραγωγών και οι ενδοκυτταρικοί φραγμοί της (Εικόνα 3). Για αποτελεσματική σίγαση γονιδίου στους πνεύμονες, τα siRNAs πρέπει να παραδίδονται στη θέση δράσης τους, να είναι σταθερά, να εισέρχονται στα κύτταρα στόχους και να υπάρχουν στο κυτταρόπλασμα σε επαρκή συγκέντρωση. Μόλις τα siRNA φτάσουν στα κύτταρα-στόχους, πρέπει να διακινηθούν στο κυτταρόπλασμα και να ληφθούν από το σύμπλοκο σιγής που προκαλείται από Argonaute (Ago)2/RNA (RISC), το οποίο αποικοδομεί τα mRNA και, στη συνέχεια, καταστέλλει την ειδική για την αλληλουχία έκφραση γονιδίου. Για να συμβεί αποτελεσματική ενδοκυττάρωση, τα σωματίδια θα πρέπει να έχουν μέγεθος μικρότερο από 150 nm. Τα σωματίδια εντός αυτού του εύρους μεγέθους θα μπορούσαν επίσης να αποφύγουν την πρόσληψη μακροφάγων και την καθυστερημένη κάθαρση των πνευμόνων [45]. Οι φυσικοχημικές ιδιότητες των siRNA παίζουν επίσης σημαντικό ρόλο στη διέλευση της βιολογικής μεμβράνης. Παρά το μικρό τους μέγεθος, το αρνητικό φορτίο και η χημική αποικοδόμηση των μορίων siRNA τα εμποδίζουν να διασχίζουν εύκολα τις βιολογικές μεμβράνες. Ως εκ τούτου, οι αποτελεσματικές προσεγγίσεις παροχής siRNA πρέπει να ξεπεράσουν αυτόν τον περιορισμό διευκολύνοντας την κυτταρική πρόσληψη. Μία από τις κύριες λειτουργίες ενός φορέα παροχής είναι να διευκολύνει την κυτταρική πρόσληψη των siRNAs [46] . Η ηλεκτροστατική συμπλοκοποίηση των μορίων siRNA με κατιονικά λιπίδια και πολυμερή βοηθά στην κάλυψη του καθαρού αρνητικού φορτίου τους. Το θετικά φορτισμένο σύμπλεγμα φορέα siRNA αλληλεπιδρά με ανιονικές πρωτεογλυκάνες στην κυτταρική μεμβράνη, σχηματίζει ένα ενδοκυτταρικό κυστίδιο και εισέρχεται στα κύτταρα με ενδοκύττωση [47] . Μετά την κυτταρική εσωτερίκευση, το σύμπλεγμα φορέα siRNA σε ενδοκυτταρικά κυστίδια μεταφέρεται κατά μήκος μικροσωληνίσκων σε λυσοσώματα που συνεντοπίζονται με το κέντρο οργάνωσης μικροσωληνίσκων. Για να αποφευχθεί η λυσοσωμική αποικοδόμηση, τα siRNAs πρέπει να διαφύγουν από το ενδοσώμα στο κυτταρόπλασμα, όπου μπορούν να συσχετιστούν με τον μηχανισμό RNAi. Η ενδοσωματική διαφυγή είναι ένα σημαντικό εμπόδιο για την αποτελεσματική παροχή siRNA [48, 49]. Η ενδοσωμική παγίδευση και η λυσοσωμική αποικοδόμηση του siRNA και των φορέων συμβάλλουν στη χαμηλή αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης και είναι μια σημαντική δυσκολία για τους φορείς παροχής. Ένας ιδανικός παράγοντας διανομής θα πρέπει να προστατεύει τα siRNA από την ενζυματική αποικοδόμηση, να διευκολύνει την κυτταρική πρόσληψη και να προάγει την ενδοσωμική διαφυγή μέσα στα κύτταρα με αμελητέα τοξικότητα. Έχουν αναφερθεί πολλαπλές προσεγγίσεις για τη χορήγηση των siRNAs, που κυμαίνονται από τη σχετικά απλή άμεση χορήγηση siRNA που έχουν διαμορφωθεί με αλατούχο διάλυμα έως Προσεγγίσεις νανοσωματιδίων με βάση τα λιπίδια και πολυμερή και προσεγγίσεις σύζευξης και συμπλοκοποίησης siRNA [50] . Το αρνητικό φορτίο και η χημική αποικοδόμηση των siRNAs υπό φυσιολογικά σχετικές συνθήκες καθιστούν την απελευθέρωσή τους μια σημαντική πρόκληση. Αντίστοιχα, η παράδοση των siRNA συνήθως απαιτεί έναν φορέα ή φορείς για τη διαμόλυνσή τους στα κύτταρα-στόχους. Γενικά, τόσο οι ιικοί όσο και οι μη ιικοί φορείς αξιολογούνται για παράδοση siRNA σε κύτταρα πνεύμονα. Ορισμένοι ιικοί φορείς, όπως οι ρετροϊοί και οι αδενοϊοί, έχει αποδειχθεί ότι μεσολαβούν στη γονιδιακή σίγηση σε ένα in vitro πνευμονικό μοντέλο [51] και ότι επάγουν RNAi σε μια σειρά ζωικών ιστών [52] . Πρόσφατα, οι Guo et al. έδειξε ότι το siRNA με τη μεσολάβηση του φακοϊού χρησιμοποιήθηκε για την ειδική μείωση της έκφρασης της πυρηνικής πρωτεΐνης 1 (NUPR1) in vivo, η οποία είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου [53] . Ωστόσο, η παράδοση που βασίζεται σε ιούς έχει αρκετά μειονεκτήματα. Η ανοσολογική απόκριση στους ιούς όχι μόνο εμποδίζει την παράδοση γονιδίων αλλά έχει επίσης τη δυνατότητα να προκαλέσει σοβαρές επιπλοκές [54] . Πρόσφατες καλά τεκμηριωμένες περιπτώσεις, όπως ο θάνατος του Jesse Gelsinger λόγω επιπλοκών που σχετίζονται με έναν αδενοϊικό φορέα παροχής, τονίζουν αυτό το πρόβλημα [55] . Επιπλέον , ορισμένοι ιικοί φορείς μπορεί να εισάγουν το γονιδίωμά τους σε τυχαίες θέσεις στο χρωμόσωμα του ξενιστή , κάτι που τελικά περιορίζει τη γονιδιακή λειτουργία [ 56 ] . Ενδοκυτταρικοί φραγμοί στην πνευμονική παροχή siRNA. Τα εμπόδια στην κυτταρική εσωτερίκευση εξαρτώνται από τις επιφανειακές ιδιότητες του siRNA και των φορέων (π.χ. φορτίο και μέγεθος). Μετά την επιτυχή λήψη των siRNA στα κύτταρα-στόχους μέσω ενδοκυττάρωσης, τα κύρια εμπόδια για την παράδοση των siRNA στη θέση δράσης του είναι η ενδοσωμική παγίδευση και η λυσοσωμική αποικοδόμηση του siRNA και των φορέων. Για να κατευθύνουν τη σίγαση του γονιδίου στόχου, τα siRNA πρέπει να διαφύγουν από το ενδοσώμα στο κυτταρόπλασμα, όπου συνδέονται με το σύμπλοκο σιγής που προκαλείται από Ago2/RNA (RISC) για να κατευθύνουν τη διάσπαση των mRNA που φέρουν συμπληρωματικές θέσεις δέσμευσης. Ως εναλλακτική των ιικών φορείς, μη ιικοί φορείς, συμπεριλαμβανομένων των φορέων που βασίζονται σε λιπίδια και πολυμερή, έχουν γενικά χρησιμοποιηθεί για την παροχή siRNA στους πνεύμονες λόγω της μειωμένης τοξικότητάς τους [57] . Η συνεχιζόμενη έρευνα για τη διαμόλυνση πρωτογενών κυττάρων και ολόκληρων οργανισμών με siRNA με τη χρήση μη ιικών παραγόντων επιμόλυνσης έχει δώσει πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα. Οι φορείς παροχής με βάση τα λιπίδια χρησιμοποιούνται με επιτυχία για την παροχή siRNA in vitro και in vivo [58]. Τα κατιονικά λιπίδια αποτελούνται από θετικά φορτισμένη κεφαλή, συνδετικό και υδρόφοβο. Γενικά, τα σύμπλοκα με βάση τα λιπίδια είναι εύκολο να σχηματιστούν και επιτυγχάνεται καλή αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης λόγω της αλληλεπίδρασης με αρνητικά φορτισμένη κυτταρική μεμβράνη. Πολλοί εμπορικοί παράγοντες επιμόλυνσης siRNA είναι σύστημα χορήγησης με βάση τα λιπίδια, μερικά από τα οποία χρησιμοποιούνται επίσης για πνευμονική χορήγηση-DharmFECT [30] , Oligofectamine [59] , Lipofectamine [60] και TransIT-TKO [35] . Παρομοίως, κατιονικά πολυμερή έχουν επίσης αξιολογηθεί για παροχή siRNA σε κύτταρα πνεύμονα. Η κατιονική πολυμερής πολυαιθυλενιμίνη (PEI) χρησιμοποιείται ευρέως για την παροχή siRNA [13, 61]. Το PEI θεωρείται ως το χρυσό πρότυπο για την in vitro γονιδιακή παράδοση και η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσής του εξαρτάται από το μοριακό βάρος και τον βαθμό διακλάδωσης. Από την άλλη πλευρά, οι φορείς που βασίζονται σε λιπίδια μπορούν επίσης να προκαλέσουν τοξικότητα και μη ειδική ενεργοποίηση φλεγμονωδών αποκρίσεων κυτοκίνης και ιντερφερόνης [62, 63]. Αν και οι φορείς που βασίζονται σε πολυμερή προκαλούν μια σχετικά λιγότερο ισχυρή ανοσολογική απόκριση από τους φορείς που βασίζονται σε λιπίδια, η αποτελεσματική παράδοση siRNA σε μια τοπική περιοχή σε πνευμονικές παθήσεις απαιτεί περισσότερη προσοχή στην ανάπτυξη μη τοξικών φορέων παροχής. Ένα σημαντικό σημείο για την αναστολή της γονιδιακής έκφρασης με τη μεσολάβηση του siRNA είναι εάν τα παρατηρούμενα αποτελέσματα είναι ειδικά και όχι λόγω επιδράσεων εκτός στόχου και απαλλαγμένα από πιθανές αποκρίσεις ιντερφερόνης [64, 65]. Είναι ενδιαφέρον ότι ορισμένες μελέτες έχουν δείξει ότι ήταν δυνατό να χορηγηθούν \"γυμνά siRNA\" σε ποντίκια και να μειωθεί η ρύθμιση ενός ενδογενούς ή εξωγενούς στόχου χωρίς να προκληθεί απόκριση ιντερφερόνης [66] . Ο όρος \"γυμνά siRNA\" αναφέρεται στην παροχή siRNA χωρίς κανένα φορείς παράδοσης. Τα γυμνά siRNA αποικοδομούνται από τις ενδονουκλεάσες του ορού και συνήθως απομακρύνονται με σπειραματική διήθηση, με αποτέλεσμα μια σύντομη ημιζωή στο πλάσμα < 10 λεπτά. Έτσι, ορισμένες μελέτες συστηματικής παροχής γυμνών siRNA απέτυχαν να επιτύχουν την καθοδική ρύθμιση του στοχευόμενου γονιδίου [67, 68]. Αντίθετα, υπήρξαν επίσης κάποιες επιτυχίες τοπικής παροχής γυμνών siRNA στους πνεύμονες [15, 16, 20, 31]. Μερικοί από αυτούς ανέφεραν ότι η χρήση φορέων παροχής δεν έδειξε σημαντική διαφορά στην αποτελεσματικότητα σίγησης γονιδίου σε σύγκριση με αυτή των γυμνών siRNA [16, 35]. Πράγματι, σε μια κλινική δοκιμή, έχει χρησιμοποιηθεί η παροχή γυμνών siRNAs για τη θεραπεία του RSV [17, 38]. Αυτή η επιτυχής απόδειξη μπορεί να οφείλεται στο ότι τα γυμνά siRNAs για κλινικές εφαρμογές είναι εξαιρετικά χημικά τροποποιημένα για να αποτρέπουν την επαγόμενη από νουκλεάση αποικοδόμηση και πιθανώς να ελαχιστοποιούν τα ανοσοδιεγερτικά αποτελέσματα. Αν και δεν είναι σαφές πώς τα γυμνά siRNA διασχίζουν την κυτταρική μεμβράνη, αποκτούν πρόσβαση στο κυτταρόπλασμα και παραμένουν άθικτα για να εκτελέσουν τη βιολογική τους δράση, δοκιμές τόσο σε ζώα όσο και σε ανθρώπους έχουν διεξαχθεί με επιτυχία, δείχνοντας την αποτελεσματικότητα των γυμνών siRNAs (ALN-RSV01). χορηγήθηκαν ενδορινικά. Αυτή η εξήγηση δεν έχει επιβεβαιωθεί, αλλά η φυσιολογική βλάβη των αναπνευστικών επιθηλιακών κυττάρων που προκαλείται από ιογενή λοίμωξη μπορεί να έχει επηρεάσει πιθανώς το μυστήριο. Η ενεργή αλλαγή στη μεμβράνη των επιθηλιακών κυττάρων των αεραγωγών που προκαλείται από λοιμώδη νόσο μπορεί να επηρεάσει την κυτταρική εσωτερίκευση. Η γυμνή παροχή siRNA έχει ορισμένα πλεονεκτήματα, όπως ο απλός σχηματισμός και η απουσία τοξικότητας ή φλεγμονωδών αποκρίσεων που συνήθως συνδέονται με φορείς παροχής. Ωστόσο, το πλεονέκτημα των γυμνών siRNAs έναντι των φορέων παροχής στη θεραπεία πνευμονικών παθήσεων είναι αμφιλεγόμενο [69, 70]. Απαιτούνται περαιτέρω in vivo έρευνες τόσο για γυμνά siRNA όσο και για μη ιικούς φορείς. Η πνευμονική νόσος είναι κύρια αιτία θανάτου και η μειωμένη ποιότητα ζωής είναι υπεύθυνη για την ταλαιπωρία πολλών ασθενών. Διάφορες πνευμονικές ασθένειες κάνουν τη ζωή εξαιρετικά δύσκολη για τους ασθενείς και οι σοβαρές περιπτώσεις αυτών των πνευμονοπαθειών μπορεί να οδηγήσουν σε θάνατο. Τα υψηλά ποσοστά θνησιμότητας που σχετίζονται με τον καρκίνο του πνεύμονα οφείλονται εν μέρει στο γεγονός ότι δυστυχώς είναι δύσκολο να θεραπευθεί. Πάνω απ 'όλα, η ΧΑΠ είναι η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου στις περισσότερες βιομηχανικές χώρες και προβλέπεται ότι θα γίνει τρίτη έως το 2020 [71] . Ως εκ τούτου, απαιτείται αποφασιστική δράση για να αναχαιτιστεί η αυξανόμενη επιβάρυνση για την υγεία και την οικονομία που αυτό αντιπροσωπεύει. Οι χρόνιες πνευμονικές παθήσεις, όπως η ΧΑΠ και το άσθμα, είναι διαταραχές των αεραγωγών που σχετίζονται σε μεγάλο βαθμό με την παρουσία επίμονης φλεγμονής. Η έγκριση των εισπνεόμενων κορτικοστεροειδών πρωτοστάτησε σε μια νέα γενιά θεραπείας στη θεραπεία χρόνιων φλεγμονωδών ασθενειών. Αυτή ήταν η πρώτη φορά που ένα αντιφλεγμονώδες προϊόν ήταν διαθέσιμο για τη μείωση της χαρακτηριστικής φλεγμονής των πνευμόνων στους αεραγωγούς και της σχετικής απόφραξης. Τα κορτικοστεροειδή εξακολουθούν να αποτελούν σημαντική θεραπευτική παρέμβαση. Ωστόσο, χρησιμοποιούνται με περιορισμούς στη ΧΑΠ και στο μέτριο έως σοβαρό άσθμα. Ομοίως, η θεραπεία διαφόρων ανθεκτικών πνευμονοπαθειών εξαρτάται επίσης από τη συστηματική θεραπεία με κορτικοστεροειδή. Πολλοί από αυτούς τους ασθενείς υπέστησαν επίσης διάφορες παρενέργειες από τη συστηματική χρήση κορτικοστεροειδών, όπως αύξηση βάρους και ανεξέλεγκτη υπεργλυκαιμία. Η θεραπεία της πνευμονικής νόσου με τη χρήση κυτταροειδικής στόχευσης καθώς και τεχνικών RNAi αντιπροσωπεύει μια νέα στρατηγική και θα μπορούσε ενδεχομένως να προσφέρει νέες ευκαιρίες στη νανοϊατρική. Οι πνευμονικές εφαρμογές του siRNA σε συνθήκες in vivo μελετώνται συχνά και συχνά καταλήγουν σε κλινικές δοκιμές [57, 72]. Τα ευρήματα πρόσφατων κλινικών μελετών των πνευμονικών θεραπευτικών RNAi συζητούνται. Από την ανακάλυψη του RNAi, το θεραπευτικό δυναμικό των siRNAs έχει αναγνωριστεί γρήγορα. Το 2004, ξεκίνησε η πρώτη ανθρώπινη κλινική δοκιμή θεραπείας με βάση το RNAi για τη θεραπεία της σχετιζόμενης με την ηλικία εκφύλισης της ωχράς κηλίδας με ένα siRNA που στοχεύει τον υποδοχέα VEGF 1 που χορηγείται ενδοϋαλοειδώς [73] . Πολλές μελέτες έχουν διεξαχθεί τα τελευταία χρόνια που περιλαμβάνουν την παροχή siRNA στους πνεύμονες για τη θεραπεία διαφόρων πνευμονικών παθήσεων. Η παράδοση στους πνεύμονες θα είναι πολύ σημαντική για τη μεταφορά της τεχνολογίας siRNA στην κλινική. Ένας αριθμός θεραπειών που βασίζονται σε siRNA αξιολογούνται σε κλινικές δοκιμές για τη θεραπεία διαφορετικών καταστάσεων, συμπεριλαμβανομένων των πνευμονικών ασθενειών όπως το άσθμα και η μόλυνση από RSV. Ο Πίνακας 1 είναι μια περίληψη κλινικών δοκιμών θεραπευτικών σκευασμάτων που βασίζονται σε siRNA [74] . Το SiRNA δείχνει δυνατότητες για τη θεραπεία διαφόρων πνευμονικών ιογενών λοιμώξεων και έχει αναφερθεί ότι θεραπευτικές ουσίες που βασίζονται σε siRNA μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν στη θεραπεία της γρίπης [13] , του ιού της παραγρίπης [35] , του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου (SARS) [14 ] και RSV [35] . Πάνω απ 'όλα, ο RSV είναι ο πιο πολλά υποσχόμενος θεραπευτικός στόχος των siRNAs. Το RSV είναι μια κοινή αιτία σοβαρών αναπνευστικών λοιμώξεων σε βρέφη και παιδιά. Επίσης προκαλεί σημαντική νοσηρότητα και θνησιμότητα σε ενήλικες ανοσοκατεσταλμένους ή ηλικιωμένους πληθυσμούς [75] . Δεν υπάρχει διαθέσιμο εμβόλιο για τον RSV και η μόνη εγκεκριμένη αντιική θεραπεία για τον RSV είναι ανεπιθύμητη για παιδιατρικούς ασθενείς λόγω της πιθανής τερατογένεσης και της περιορισμένης αποτελεσματικότητάς του. Έτσι, μια ασφαλής και αποτελεσματική θεραπεία με RSV αναμένεται από καιρό τόσο για παιδιατρικούς όσο και για ενήλικες ασθενείς. Η θεραπεία που βασίζεται σε RNAi έχει δείξει πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα σε μοντέλα ποντικών λοίμωξης από RSV [35]. Το siRNA, ALN-RSV01, στρέφεται ενάντια στο mRNA που κωδικοποιεί τη Ν-πρωτεΐνη του RSV που εμφανίζει ειδική in vitro και in vivo αντι-RSV δράση. Χορηγείται χωρίς φορέα χορήγησης ως ρινικό σπρέι και στοχεύει στην ανώτερη αναπνευστική οδό αντί στην κάτω περιοχή των πνευμόνων. Το ALN-RSV01 έχει υποβληθεί σε πλήρεις μελέτες φάσης Ι ενδορρινικές και εισπνοές σε υγιείς ενήλικες και έχει βρεθεί ότι είναι γενικά καλά ανεκτή [38]. Επιπλέον, το ALN-RSV01 έχει αξιολογηθεί σε μια τυχαιοποιημένη, διπλά τυφλή, ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο δοκιμή φάσης ΙΙ σε ασθενείς με μεταμόσχευση πνεύμονα με λοίμωξη της αναπνευστικής οδού RSV [76] . Η χορήγηση του ALN-RSV01 σε ασθενείς με μεταμόσχευση πνεύμονα με μόλυνση με RSV ήταν ασφαλής και καλά ανεκτή και συσχετίστηκε με στατιστικά σημαντική βελτίωση των συμπτωμάτων. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, έχει ξεκινήσει μια μεγαλύτερη πολυεθνική, τυχαιοποιημένη, διπλά τυφλή δοκιμή Φάσης IIb του ALN-RSV01 σε ασθενείς με μεταμόσχευση πνεύμονα για να επιβεβαιωθούν και να επεκταθούν αυτά τα ευρήματα. Ο καρκίνος είναι κύριος στόχος της θεραπείας που βασίζεται στο RNAi, καθώς τα ογκογονίδια, μεταλλάσσονται Τα ογκοκατασταλτικά γονίδια και αρκετά άλλα γονίδια που συμβάλλουν στην εξέλιξη του όγκου είναι δυνητικά σημαντικοί στόχοι για τη σίγαση γονιδίων από το RNAi. Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι ένας από τους πιο συχνούς όγκους παγκοσμίως όσον αφορά τα ποσοστά επίπτωσης και τη θνησιμότητα. Οι ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα συνήθως διαγιγνώσκονται σε προχωρημένο στάδιο της νόσου και έχουν περιορισμένες θεραπευτικές επιλογές. Αν και η γνώση σχετικά με τη γενετική και μοριακή βάση του καρκίνου του πνεύμονα έχει αυξηθεί τακτικά, τα μέσα ποσοστά επιβίωσης των ατόμων με προχωρημένο καρκίνο του πνεύμονα εξακολουθούν να είναι φτωχά. Η θεραπεία με βάση το RNAi είναι μια ελκυστική στρατηγική για την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών αντικαρκινικών θεραπειών με μειωμένη θεραπεία σχετική τοξικότητα. Το κύριο πλεονέκτημα των θεραπευτικών RNAi στον καρκίνο μπορεί να είναι η ταυτόχρονη στόχευση πολλαπλών γονιδίων που ανήκουν σε διαφορετικές κυτταρικές οδούς που εμπλέκονται στην εξέλιξη του όγκου. Η ταυτόχρονη αναστολή πολλών γονιδίων θα ελαχιστοποιούσε επίσης τον κίνδυνο ανθεκτικότητας στα φάρμακα που συνήθως αντιμετωπίζεται με θεραπείες με μικρά μόρια, που περιλαμβάνουν siRNA και miRNA. Έχουν ήδη σημειωθεί σημαντικές βελτιώσεις στα siRNA για την πρωτογενή ή μεταστατική θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα στοχεύοντας ογκογονίδια όπως Akt1 [9] , όγκος 1 Wilms (WT1) [12] , υπερεκφρασμένα γονίδια όπως ο υποδοχέας 1 του αυξητικού παράγοντα που μοιάζει με ινσουλίνη (IGF- 1R) [77], NUPR1 [53] και EZH2 [78]. Μερικές από αυτές τις μελέτες έχουν δείξει επιτυχώς την αποτελεσματικότητα της θεραπείας που βασίζεται σε RNAi μέσω της ενδοπνευμονικής χορήγησης siRNA με μη ιικούς φορείς. Αν και πρέπει να επινοηθούν στρατηγικές για την ελαχιστοποίηση των εκτός στόχου και μη ειδικών ανοσοδιεγερτικών επιδράσεων, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η σίγαση του γονιδίου στόχου με siRNAs είναι μια ελκυστική στρατηγική για την πρόληψη και τη θεραπεία του πρωτογενούς και μεταστατικού καρκίνου του πνεύμονα. Υπάρχουν επί του παρόντος ορισμένες κλινικές δοκιμές σε εξέλιξη που εκτιμούν την ασφάλεια και την αποτελεσματικότητα των φαρμάκων που βασίζονται σε siRNA για τη θεραπεία του καρκίνου. Το Atu027, ένα siRNA-lipoplex που στοχεύει κατά της πρωτεϊνικής κινάσης N3 (PKN3), απέτρεψε τη μετάσταση στους πνεύμονες σε μια δοκιμή φάσης Ι διαφόρων μοντέλων καρκίνου [79] . Το PKN3 είναι ένας μεταγενέστερος τελεστής της οδού σηματοδότησης της φωσφοϊνοσιτιδικής 3-κινάσης (PI3K) [80] , η οποία ρυθμίζει διάφορες κυτταρικές αποκρίσεις, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης, της ανάπτυξης και της επιβίωσης [81] . Πρόσφατα, η PKN3 έχει επίσης θεωρηθεί ως κατάλληλος θεραπευτικός στόχος για τη ρύθμιση της αγγειογένεσης του όγκου, επειδή η ανάλυση απώλειας λειτουργίας με Atu027 σε καλλιεργημένα πρωτεύοντα ενδοθηλιακά κύτταρα έδειξε έναν ουσιαστικό ρόλο της PKN3 για το σχηματισμό και τη μετανάστευση ενδοθηλιακού σωλήνα [79]. Το Atu027 μπορεί να θεωρηθεί ως ένα πιθανό siRNA για την πρόληψη της μετάστασης στους πνεύμονες και μπορεί να είναι κατάλληλο για την πρόληψη της αιματογενούς μετάστασης σε συνδυασμό με τη συμβατική θεραπεία του καρκίνου. Η φλεγμονώδης πνευμονοπάθεια, που ονομάζεται επίσης ΧΑΠ, περιλαμβάνει ένα ευρύ φάσμα πνευμονικών παθήσεων. Αυτές οι σχετικές ασθένειες περιλαμβάνουν το άσθμα, την πνευμονική ίνωση και τη χρόνια βρογχίτιδα. Επηρεάζονται από έναν συνδυασμό περιβαλλοντικών, γενετικών και επιγενετικών συστατικών [82] . Η ΧΑΠ είναι μια χρόνια φλεγμονώδης νόσος των αεραγωγών. Αυτή η ασθένεια χαρακτηρίζεται από ροή αέρα που δεν είναι πλήρως αναστρέψιμη. Η συστηματική και τοπική φλεγμονή των αεραγωγών έχει εμπλακεί στην παθογένεση της ΧΑΠ [83] . Η ΧΑΠ σχετίζεται κυρίως με το κάπνισμα και πρόσφατες μελέτες που διερευνούν την παθοφυσιολογία του εμφυσήματος έχουν δείξει ότι ο καπνός του τσιγάρου μπορεί να προκαλέσει την είσοδο των κυττάρων στην κυτταρική γήρανση. βράχυνση τελομερών [84] . Τελευταία, πολλές μελέτες έχουν διερευνήσει το ρόλο της κυτταρικής γήρανσης στην ανάπτυξη και εξέλιξη της ΧΑΠ [85] . Αν και πολλές κατηγορίες φαρμάκων, συμπεριλαμβανομένων των εισπνεόμενων κορτικοστεροειδών, χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία της ΧΑΠ, κανένα από αυτά τα φάρμακα δεν έχει αποδειχθεί ότι βελτιώνει σημαντικά τη μακροπρόθεσμη λειτουργία των πνευμόνων κατά την εξέλιξη της νόσου. Οι τρέχουσες παρεμβάσεις που έχουν αποδειχθεί ότι βελτιώνουν τη θνησιμότητα στη ΧΑΠ είναι η διακοπή του καπνίσματος και η παροχή συμπληρωματικού οξυγόνου όταν υπάρχει υποξαιμία. Πολλοί άνθρωποι αναπτύσσουν ΧΑΠ και η αιτία αυτής της κατάστασης είναι περίπλοκη και δεν είναι πλήρως κατανοητή. Ένας βασικός παράγοντας είναι η γενετική ευαισθησία. Ορισμένες μελέτες έχουν δείξει μεγάλη γενετική συμβολή στη μεταβλητότητα της πνευμονικής λειτουργίας και της ΧΑΠ [86, 87]. Πολυμορφισμοί σε πολλαπλά γονίδια έχουν αναφερθεί ότι σχετίζονται με τη ΧΑΠ [87] , όπως ο παράγοντας μεταγραφής [π.χ. πυρηνικός παράγοντας-κάπα Β (NFκB)] [88], εξωκυτταρική μήτρα (π.χ. μεταλλοπρωτεϊνάση μήτρας-12 (MMP-12)) [89, 90], κυτοκίνες [π.χ. παράγοντας νέκρωσης όγκου (TNF)-α] [91], χημειοκίνες [π.χ. ιντερλευκίνες (IL)-8, υποδοχέας IL-8 και υποδοχέας χημειοκίνης (CCR)1] [92, 93] και απόπτωση (π.χ. κασπάση-3 και αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF)) [94, 95]. Πολλά από αυτά έχουν αναγνωριστεί ως πιθανοί στόχοι για θεραπευτική παρέμβαση με χρήση μορίων αναστολέων ή ανταγωνιστών. Αν και αρκετές νέες θεραπείες που στοχεύουν τη φλεγμονώδη διαδικασία βρίσκονται τώρα σε κλινική ανάπτυξη, όπως οι αναστολείς TNF-α και οι αναστολείς του συμπλέγματος κινάσης I-kappaB 2 (IKK2) [96, 97], κλινικές δοκιμές με siRNAs δεν έχουν πραγματοποιηθεί ποτέ στη ΧΑΠ. Η καθυστέρηση της ανάπτυξης φαρμάκων για τη ΧΑΠ μπορεί να οφείλεται στη σχετικά πρόσφατη εμφάνιση έρευνας που ασχολείται με τη μοριακή βάση της ΧΑΠ. Επιπλέον, απαιτείται περισσότερη έρευνα για την κατανόηση των βασικών μοριακών μηχανισμών σχετικά με την παθογένεση της ΧΑΠ και για την ανάπτυξη τεχνικών παρακολούθησης για την υποστήριξη της ανάπτυξης θεραπειών RNAi. Επί του παρόντος, καμία διαθέσιμη θεραπεία δεν μειώνει την εξέλιξη της ΧΑΠ ή καταστέλλει τη φλεγμονή σε μικρούς αεραγωγούς και πνευμονικό παρέγχυμα. Η προσέγγιση που βασίζεται στο RNAi για τα βασικά μόρια έχει επίσης πιθανές επιπτώσεις για τη θεραπεία της ΧΑΠ. Το άσθμα είναι επίσης μια χρόνια φλεγμονώδης νόσος των αεραγωγών που χαρακτηρίζεται από μεταβλητά και επαναλαμβανόμενα συμπτώματα και αναστρέψιμη απόφραξη της ροής του αέρα. Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας υπολογίζει ότι 300 εκατομμύρια άνθρωποι προσβάλλονται επί του παρόντος και ότι, μέχρι το έτος 2025, άλλα 100 εκατομμύρια θα έχουν προσβληθεί από τη νόσο [98] . Τα εισπνεόμενα κορτικοστεροειδή είναι πολύ αποτελεσματικά στο ήπιο άσθμα επειδή βελτιώνουν τα συμπτώματα και μειώνουν τις παροξύνσεις. Ωστόσο, στο μέτριο και σοβαρό άσθμα, τα εισπνεόμενα κορτικοστεροειδή έχουν σημαντικούς θεραπευτικούς περιορισμούς. Αν και τα κορτικοστεροειδή παραμένουν μια σημαντική θεραπευτική παρέμβαση για φλεγμονώδεις πνευμονικές παθήσεις, η χρήση τους δεν είναι πάντα απόλυτα αποτελεσματική και σχετίζεται με παρενέργειες. Λόγω τέτοιων περιορισμών, είναι σαφές ότι υπάρχει ανάγκη για νέους τύπους φαρμάκων που μπορούν να θεραπεύσουν και να βελτιώσουν την πρόγνωση του μέτριου έως σοβαρού άσθματος. Έχουν εντοπιστεί πολλά γονίδια στόχοι που συμμετέχουν στην παθογένεση του άσθματος. Οι πιο πολλά υποσχόμενοι στόχοι περιλαμβάνουν γονίδια που κωδικοποιούν κυτοκίνες (IL-4, IL5 και IL-13), υποδοχείς κυτοκίνης και χημειοκίνης (υποδοχέας IL-4 και CCR3) και κινάσες τυροσίνης [κινάση τυροσίνης σπλήνας (Syk) και LCK/YES- σχετική νέα κινάση τυροσίνης (Lyn)], καθώς και για μεταγραφικούς παράγοντες [μετατροπείς σήματος και ενεργοποιητές της μεταγραφής 1 (STAT1), STAT6, GATA3 και NFκB] που εμπλέκονται στο άσθμα [19, 99, 100]. Τα γονίδια που έχουν αξιολογηθεί ως στόχοι siRNA για τη θεραπεία του άσθματος σε προκλινικά μοντέλα αναφέρονται [101] . Επί του παρόντος, σε μια κλινική δοκιμή για το άσθμα, χρησιμοποιείται το Excellair TM (ZaBeCor, Bala Cynwyd, PA, ΗΠΑ), ένα siRNA που στοχεύει το Syk. Η κινάση εμπλέκεται στη σηματοδότηση από έναν υποδοχέα Β-λεμφοκυττάρων και είναι ένας βασικός ρυθμιστής των κατάντη καταρράξεων σηματοδότησης που τελικά οδηγούν στην ενεργοποίηση αρκετών προφλεγμονωδών παραγόντων μεταγραφής. Έχει αναφερθεί ότι τα αντιπληροφοριακά ολιγονουκλεοτίδια που χορηγούνται με αεροζόλ ήταν ισχυρά για να μειώσουν την έκφραση του Syk, την απελευθέρωση μεσολαβητή από κυψελιδικά μακροφάγα και την εξαρτώμενη από το Syk πνευμονική φλεγμονή [102] . Επιπλέον, η αναστολή των φλεγμονωδών μεσολαβητών φάνηκε σε μια μελέτη που χρησιμοποιεί το siRNA που στοχεύει το Syk σε επιθηλιακά κύτταρα των αεραγωγών [103] . Μετά τα επιτυχή αποτελέσματα της κλινικής δοκιμής Φάσης Ι της εταιρείας, έχει ήδη ξεκινήσει μια δοκιμή Φάσης ΙΙ για το υποψήφιο φάρμακο για το άσθμα Excellair TM. Ορισμένες από τις τρέχουσες θεραπείες για το άσθμα και άλλες φλεγμονώδεις καταστάσεις, όπως οι αναστολείς TNF-α ή οι αναστολείς λευκοτριενίων, αναστέλλουν μόνο έναν από τους μεσολαβητές της φλεγμονής. Αντίθετα, το Syk που στοχεύει το siRNA επιδιώκει να αναστείλει ένα αρχικό στάδιο σηματοδότησης της φλεγμονής και, ως εκ τούτου, να αποτρέψει την απελευθέρωση πολλαπλών φλεγμονωδών μεσολαβητών. Συνολικά, η πρόσφατη πρόοδος των siRNA στους πνεύμονες έχει επίσης βελτιώσει τη θεραπευτική σκοπιμότητα του RNAi για φλεγμονώδεις πνευμονικές ασθένειες. Η ταχεία πρόοδος θα θέσει τις θεραπείες που βασίζονται σε siRNA σε γρήγορο δρόμο για την κλινική. Τα MiRNA είναι μικρά ενδογενή μη κωδικοποιητικά RNA που ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων καταστέλλοντας τη μετάφραση ή προάγοντας την αποικοδόμηση του mRNA-στόχου τους. Τα MiRNA ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση δεσμεύοντας την 3' αμετάφραστη περιοχή (UTR) των mRNA-στόχων τους και μεσολαβώντας στην αποικοδόμηση του mRNA ή στην αναστολή της μετάφρασης. Στο ανθρώπινο γονιδίωμα, τα μεταγραφήματα του 60% περίπου όλων των mRNAs εκτιμάται ότι στοχεύονται από miRNAs [104]. Σύμφωνα με τη λειτουργία τους, τα miRNA παίζουν σημαντικό ρόλο στις κυτταρικές διεργασίες όπως η ανάπτυξη, ο πολλαπλασιασμός και η απόπτωση των πνευμονικών παθολογιών [105] . Ένας αυξανόμενος αριθμός miRNAs έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκεται σε διαφορετικές πνευμονικές παθήσεις. Αυτά τα στοιχεία καθιστούν τα miRNA μια πολλά υποσχόμενη τεχνολογία για την τρέχουσα και μελλοντική θεραπευτική ανάπτυξη. Συζητάμε τον ρόλο ορισμένων miRNA σε διάφορες πνευμονικές παθήσεις καθώς και το πιθανό μέλλον αυτών των ανακαλύψεων σε κλινικές εφαρμογές. Ο Πίνακας 2 δείχνει την περίληψη των miRNAs στη θεραπευτική ανάπτυξη. Σε αυτό το σημείο, μια θεραπεία που βασίζεται σε miRNA έχει ήδη εισέλθει σε κλινική δοκιμή φάσης ΙΙ. Υπάρχουν ενδείξεις ότι η ανοδική ρύθμιση ή η μείωση των miRNAs είναι κρίσιμη για την ομοιόσταση των πνευμόνων και, ως εκ τούτου, μπορεί να συμβάλει στην ανάπτυξη παθολογικών πνευμονικών καταστάσεων. Πολλές μελέτες έχουν επικεντρωθεί στον ρόλο των miRNAs σε φλεγμονώδεις πνευμονικές ασθένειες, όπως η ΧΑΠ [116, 117] , η πνευμονική ίνωση [118] [119] [120] [121] , και το άσθμα [122] [123] [124] [ 125] (Πίνακας 3) . [130] [117, 129] Η παθογένεση της ΧΑΠ αποδίδεται όχι μόνο στη χρόνια φλεγμονή στους αεραγωγούς αλλά και στη συστηματική φλεγμονή [131] . Το κάπνισμα είναι ο κύριος παράγοντας κινδύνου για την ανάπτυξη της ΧΑΠ. Το κάπνισμα έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί βιολογικές αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση των πνευμόνων [132] και υπάρχουν ορισμένες αναφορές σχετικά με τα miRNAs που σχετίζονται με το κάπνισμα [117, 129, 130]. Ωστόσο, υπάρχουν λίγες αναφορές που εστιάζουν στα miRNA που σχετίζονται με την παθογένεση αυτής της νόσου με συστηματικά φλεγμονώδη συστατικά. Πρόσφατη μελέτη σε πνευμονικούς ινοβλάστες ασθενών με ΧΑΠ παρουσιάζει λιγότερη έκφραση του miR-146a μετά από διέγερση με προφλεγμονώδεις κυτοκίνες σε σύγκριση με άτομα χωρίς ΧΑΠ με ​​παρόμοια ιστορικά καπνίσματος [127]. Η καθοδική ρύθμιση του miR-146a είχε ως αποτέλεσμα παρατεταμένο χρόνο ημιζωής mRNA της κυκλοοξυγενάσης-2, αυξάνοντας έτσι την προσταγλανδίνη Ε2 σε ινοβλάστες από άτομα με ΧΑΠ. Επιπλέον, Ezzie et al. ερεύνησε τη διαφορά των προφίλ miRNA που εκφράζεται στους πνεύμονες των καπνιστών με και χωρίς ΧΑΠ. Κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι τα miR-223 και miR-1274a ήταν τα πιο επηρεασμένα miRNA σε άτομα με ΧΑΠ [126] . Ωστόσο, η ΧΑΠ είναι μια σύνθετη, πολυσυστατική και ετερογενής διαταραχή με μια σειρά από διαφορετικές παθολογικές διεργασίες και υποομάδες με τα δικά τους χαρακτηριστικά και τη φυσική τους ιστορία [133] . Απαιτείται καλύτερη κατανόηση της πολυπλοκότητας της νόσου και της πιθανής κλινικής συνάφειας των αναγνωρισμένων miRNAs. Η πνευμονική ίνωση μπορεί να προκληθεί από έναν αναγνωρίσιμο ερεθισμό στους πνεύμονες, αλλά, σε πολλές περιπτώσεις, η αιτία είναι άγνωστη και οι θεραπευτικές δυνατότητες είναι περιορισμένες . Το κάπνισμα είναι ένας από τους πιο αναγνωρισμένους παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη πνευμονικής ίνωσης. Αυτή η διαταραχή συνοδεύεται κυρίως από αυξημένη έκφραση του βασικού αυξητικού παράγοντα β μετασχηματισμού του ινωτικού μεσολαβητή (TGF-β) και άλλων κυτοκινών που παράγονται στη βλάβη της ενεργού ίνωσης [128]. Πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι τα miRNA μπορεί να παίζουν σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο στην πνευμονική ινωτική αλλαγή στους πνεύμονες. Η καθοδική ρύθμιση του let-7d στην ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση (IPF) είχε ως αποτέλεσμα αυξημένη εναπόθεση κολλαγόνου και πάχυνση του κυψελιδικού διαφράγματος [119] . Επιπλέον, οι Liu et al. ανέφερε ότι το ογκογόνο miR-21 βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε ασθενείς με IPF και στους πνεύμονες ποντικού με ίνωση που προκαλείται από τη βλεομυκίνη [118] . Αν και αυτά τα miRNA μπορεί να είναι πιθανοί θεραπευτικοί στόχοι επειδή η έκφρασή τους σχετίζεται με τη ρύθμιση του TGF-β, ο παράγοντας είναι απαραίτητος αλλά όχι επαρκής για την παθολογική ίνωση των πνευμόνων. Η πνευμονική ίνωση είναι επίσης μια περίπλοκη ασθένεια που μπορεί να έχει πολλές διαφορετικές αιτίες. Η εστίαση στον ρόλο των miRNAs στο άσθμα έχει πρόσφατα αυξηθεί. Το άσθμα είναι μια φλεγμονώδης νόσος των αεραγωγών που χαρακτηρίζεται από μια ανώμαλη απόκριση των λεμφοκυττάρων CD4+T τύπου T helper-2 (Th2) έναντι εισπνεόμενων αλλεργιογόνων [134] . Σε ένα διαφορετικό μοντέλο ασθματικού ποντικού, παρατηρήθηκε αύξηση στην έκφραση του miR-21 στους πνεύμονες [123] . Αυτή η αναφορά μπορεί να συμβάλει στην κατανόηση του φλεγμονώδους μηχανισμού στον αεραγωγό μέσω της αναστολής της IL-12, ευνοώντας την απόκριση των λεμφοκυττάρων Th2. Ένα λεμφοκύτταρο Th2 που επάγεται από τον υποδοχέα 4 (TLR4) επάγει υψηλή έκφραση του miR-126 και ο εκλεκτικός αποκλεισμός του miR-126 κατέστειλε τον ασθματικό φαινότυπο [124]. Επιπλέον, η αναδιαμόρφωση των αεραγωγών είναι χαρακτηριστικό γνώρισμα του άσθματος και έχει σημαντικές λειτουργικές επιπτώσεις. Οι Rodriguez et al. έχουν δείξει ότι το miR-155 σχετίζεται με την ανάπτυξη φλεγμονώδους διήθησης στον πνεύμονα και την αναδιαμόρφωση των αεραγωγών [122]. Έτσι, ορισμένες μελέτες παρουσιάζουν μια λειτουργική σύνδεση μεταξύ της έκφρασης miRNA και της παθογένεσης του άσθματος και προτείνουν ότι η στόχευση των miRNAs στους αεραγωγούς μπορεί να οδηγήσει σε αντιφλεγμονώδεις θεραπείες για το αλλεργικό άσθμα. Παρά τα στοιχεία από πειραματικά μοντέλα, το προφίλ έκφρασης των miRNAs σε βιοψίες αεραγωγών από ασθενείς με ήπιο άσθμα πριν και μετά τη θεραπεία με εισπνεόμενα κορτικοστεροειδή και σε υγιείς εθελοντές δεν αποκάλυψε διαφορές στην έκφραση του miRNA [135]. Απαιτούνται περαιτέρω έρευνες σχετικά με το ρόλο των miRNAs που σχετίζονται με την παθογένεση του άσθματος. Αν και τα βασικά στοιχεία της βιολογίας του miRNA εξακολουθούν να παρέχουν νέες ιδέες, οι εφαρμογές θεραπείας με βάση το miRNA για φλεγμονώδεις πνευμονικές ασθένειες είναι λιγότερο προηγμένες από εκείνες για τον καρκίνο του πνεύμονα [136]. Ένας λόγος για αυτό θα μπορούσε να είναι ότι η ετερογένεια της νόσου προκαλείται από τις επιπτώσεις πολλών περιβαλλοντικών ατμοσφαιρικών ρύπων, συμπεριλαμβανομένου του καπνού και των πτητικών οργανικών ενώσεων. Η παρουσία αρκετών παραγόντων κινδύνου καθιστά την κατανόηση της παθογένειας των φλεγμονωδών πνευμονοπαθειών περίπλοκη. Η κατανόηση του ρόλου που διαδραματίζουν τα miRNA στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, που οδηγεί στη διατήρηση της παθογένεσης των πνευμονικών παθήσεων, είναι σημαντική για την ανάπτυξη νέων θεραπειών που εστιάζουν στην πρόληψη της εξέλιξης της νόσου και στην ανακούφιση των συμπτωμάτων. Δεδομένων των σημαντικών ρόλων που διαδραματίζουν τα miRNA πολλαπλές οδούς καρκινογένεσης του πνεύμονα, αυξανόμενες προσπάθειες αφιερώνονται στην έρευνα και ανάπτυξη θεραπειών που βασίζονται σε miRNA, συμπεριλαμβανομένης της αποκατάστασης λειτουργιών των κατασταλτικών όγκων miRNAs ή της αναστολής των ογκογόνων miRNAs. Η ανάπτυξη θεραπειών που βασίζονται σε miRNA για τον καρκίνο του πνεύμονα αναπτύσσεται ευημερούσα με τη βοήθεια των νέων τεχνολογιών RNAi. Σε σύγκριση με τις θεραπείες που βασίζονται σε siRNA, οι οποίες βρίσκονται ήδη σε κλινικές δοκιμές, τα miRNA είναι λιγότερο τοξικά και έχουν τη δυνατότητα να στοχεύουν πολλαπλά γονίδια. Η δυσκολία που σχετίζεται με την παράδοση miRNA είναι κυρίως ίση με αυτή των siRNA. Τα κρίσιμα προβλήματα για την ανάπτυξη αυτής της θεραπείας είναι η αποτελεσματική χορήγηση σε θέσεις-στόχους, η ισχύς της θεραπείας και η εξάλειψη των επιπτώσεων εκτός στόχου [137] . Υπάρχουν δύο στρατηγικές ως θεραπευτικές εφαρμογές των miRNAs για τον καρκίνο του πνεύμονα [138] . Μια στρατηγική είναι η θεραπεία υποκατάστασης miRNA, η οποία περιλαμβάνει την επανεισαγωγή ενός μιμητικού ογκοκατασταλτικού miRNA για την αποκατάσταση της απώλειας της λειτουργίας. Τα μιμητικά MiRNA είναι συνθετικά διπλά RNA που έχουν σχεδιαστεί για να μιμούνται τις ενδογενείς λειτουργίες των miRNA με χημικές τροποποιήσεις για σταθερότητα και κυτταρική πρόσληψη. Η έννοια της θεραπείας αντικατάστασης miRNA αποτυπώνεται περισσότερο από το let-7 miRNA. Το let-7 είναι ένα ογκοκατασταλτικό miRNA σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα που συσχετίζεται αντιστρόφως με την έκφραση της ογκοπρωτεΐνης RAS, ενός βασικού καρκινικού γονιδίου [139] . Η ενδορινική χορήγηση let-7 mimic σε μοντέλα ποντικού καρκίνου του πνεύμονα μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου, υποδηλώνοντας ότι η θεραπεία υποκατάστασης miRNA είναι πράγματι πολλά υποσχόμενη [106, 140, 141]. Ένα άλλο miRNA που δείχνει την αξία της αντικατάστασης του miRNA παρέχεται από το miR-34a [107, 142]. Τοπική ή/και συστηματική παροχή ενός συνθετικού μιμητικού miR-34a οδήγησε στη συσσώρευση του miR-34a στον ιστό του όγκου και στην αναστολή της ανάπτυξης του όγκου του πνεύμονα. Τον τελευταίο καιρό, οι Ling et al. έδειξε επίσης ότι το ογκοκατασταλτικό miR-22 παρουσίασε αντικαρκινική δράση του πνεύμονα μέσω της μετα-μεταγραφικής ρύθμισης του ErbB3 [143]. Έτσι, οι θεραπευτικοί μιμητές miRNA έχουν ισχυρό δυναμικό επιτιθέμενοι σε πολλαπλά γονίδια που σχετίζονται με διάφορες ασθένειες. Ωστόσο, είναι απαραίτητο να δοθεί προσοχή στην πιθανή τοξικότητα σε φυσιολογικούς ιστούς υπό συνθήκες στις οποίες η θεραπευτική παροχή μιμήσεων miRNA θα οδηγήσει σε συσσώρευση εξωγενών miRNAs σε φυσιολογικά κύτταρα [138] . Αν και οι υποθέσεις είναι καλά θεμελιωμένες, εξακολουθούν να υπάρχουν ανεπαρκή στοιχεία για την τοξικότητα που προκαλείται από μιμήσεις miRNA. Πράγματι, αρκετές in vivo μελέτες απέτυχαν να αποκαλύψουν παρενέργειες που προκαλούνται από τις μιμήσεις miRNA και πρότειναν ότι η παράδοση μιμητών miRNA σε φυσιολογικούς ιστούς ήταν καλά ανεκτή [107, 141]. Θα είναι σημαντικό να ερευνηθούν τα αποτελέσματα που προκαλούνται από μίμηση miRNA σε φυσιολογικά κύτταρα και να αξιολογηθεί προσεκτικά η τοξικότητα πριν από τη χρήση τους στην κλινική πράξη. Η δεύτερη στρατηγική στοχεύει στην αύξηση της λειτουργίας και στοχεύει στην αναστολή των oncomiRs με τη χρήση αντι-miRNAs. Χημικές τροποποιήσεις, όπως η 2'-Ο-μεθυλο-ομάδα και το κλειδωμένο νουκλεϊκό οξύ (LNA), θα αύξαναν τη σταθερότητα του ολιγο έναντι των νουκλεασών [144] . Τα αντιπληροφοριακά ολιγονουκλεοτίδια που περιέχονται σε αυτές τις τροποποιήσεις ονομάζονται ανταγομίρια ή \"LNA-antimiRs\" [144, 145]. Είναι ολιγονουκλεοτίδια με αλληλουχίες συμπληρωματικές του ενδογενούς miRNA και αναστέλλουν τη συγκεκριμένη λειτουργία miRNA. Ένα LNA-antimiR έναντι του miR-122 έχει αποδειχθεί ότι αποσιωπά αποτελεσματικά το miR-122 σε πρωτεύοντα πλην του ανθρώπου [145] και τα ευρήματα υποστηρίζουν τη δυνατότητα αυτών των ενώσεων ως νέας κατηγορίας θεραπευτικών. Επιπλέον, έχει επίσης αναφερθεί ότι το anti-miR-150 που χορηγήθηκε σε ξενομοσχεύματα όγκου πνεύμονα σε ποντίκια οδήγησε σε αναστολή της ανάπτυξης όγκου [146] . Σε σχέση με μελέτες για μιμήσεις miRNA, μελέτες με αντιπληροφοριακά ολιγονουκλεοτίδια έχουν δείξει αποτελεσματικά στοιχεία με γυμνά ολιγονουκλεοτίδια. Αυτό απεικονίζει τη δυνατότητα των χημικών τροποποιήσεων των ολιγονουκλεοτιδίων για τη βελτίωση της σταθερότητας, της αντοχής στην RNase και των φαρμακολογικών ιδιοτήτων τους. Ως εκ τούτου, η αναστολή της λειτουργίας miRNA από χημικά τροποποιημένα ολιγονουκλεοτίδια antitimiR έχει γίνει μια σημαντική και ευρέως χρησιμοποιούμενη προσέγγιση. Πρόσφατα δεδομένα από την πρώτη μελέτη φάσης ΙΙ σε ασθενείς με χρόνια λοίμωξη HCV που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το τροποποιημένο με LNA antitimiR-122 έδειξαν ότι αυτή η ένωση ήταν καλά ανεκτή και παρείχε συνεχή καταστολή του ιού. Ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών εξέτασε τις θεραπευτικές δυνατότητες των miRNAs. Πρόσφατα, προέκυψαν τα στοιχεία για τους ρόλους των miRNA στον προσδιορισμό της αντοχής στα φάρμακα [147] . Τα κυτταροτοξικά φάρμακα και τα φάρμακα μοριακού στόχου έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως στη θεραπεία του προχωρημένου καρκίνου του πνεύμονα. Δυστυχώς, πολλές περιπτώσεις εξακολουθούν να είναι ανθεκτικές στη χημειοθεραπεία. Σε αυτήν την περίπτωση, ο συνδυασμός μιμήσεων miRNA ή antimiR με χημειοθεραπεία μπορεί να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα της θεραπείας του καρκίνου στο μέλλον. Επιπλέον, τα miRNAs που σχετίζονται με τα καρκινικά βλαστοκύτταρα μπορεί να διευρύνουν σημαντικά το πεδίο της θεραπείας που βασίζεται σε miRNA και υποδηλώνουν ότι τα miRNAs μπορούν να είναι πιθανά εργαλεία για τη θανάτωση καρκινικών κυττάρων που σχετίζονται με αντίσταση στη θεραπεία, υποτροπή και μετάσταση [108, 148]. Ως εκ τούτου, η κύρια πρόκληση είναι η επιτυχής παράδοση και οι χημικές τροποποιήσεις των θεραπευτικών miRNAs στον ιστό-στόχο χωρίς να βλάπτουν τους φυσιολογικούς ιστούς. Οι προσεγγίσεις που βασίζονται στο RNAi παρέχουν μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική μέθοδο για τη θεραπεία διαφόρων πνευμονικών παθήσεων. Μία από τις μεγαλύτερες προκλήσεις στη θεραπεία με βάση το RNAi συνεχίζει να είναι η μέθοδος χορήγησης των θεραπευτικών siRNA και miRNA στα κύτταρα-στόχους. Οι εφαρμογές πνευμονικής χορήγησης είναι πολύ ελκυστικές, καθώς τείνουν να είναι μη επεμβατικές, είναι τοπικά περιορισμένες και μπορούν να χορηγηθούν από τον ασθενή. Μια ρεαλιστική θεραπευτική παρέμβαση, όπως η αεροζόλ, μπορεί να ενισχύσει τη χορήγηση του φαρμάκου στο σημείο δράσης και να μειώσει τη συστηματική έκθεση του ασθενούς στη θεραπεία, μειώνοντας έτσι τα αποτελέσματα εκτός στόχου. Η πρόοδος της πνευμονικής παροχής siRNA στην κλινική δείχνει ότι η θεραπεία με βάση το RNAi κατέχει κεντρική θέση στη μελλοντική θεραπεία πνευμονικών παθήσεων. Από την άλλη πλευρά, τα miRNAs έχουν την ευκαιρία να στοχεύουν πολλαπλά γονίδια με λεπτομέρεια και η θεραπεία που βασίζεται σε miRNA θα παρέχει μια ελκυστική αντικαρκινική και αντιφλεγμονώδη προσέγγιση για διάφορες πνευμονικές παθήσεις. Συγκεκριμένα, η θεραπεία με αντι-miRNA με χημικά τροποποιημένα ολιγονουκλεοτίδια antitimiR έχει γίνει μια πιθανή θεραπεία για πνευμονικές παθήσεις, επειδή τα ολιγονουκλεοτίδια μπορούν να χορηγηθούν με επιτυχία χωρίς φορείς παροχής. Αυξημένες ενδείξεις έχουν δείξει ότι τα miRNAs εκπληρώνουν αιτιολογικούς ρόλους σε μια ποικιλία πνευμονικών παθήσεων και έχουν προκαλέσει έρευνες για τις δυνατότητές τους ως θεραπευτικοί στόχοι. Απαιτείται περαιτέρω κατανόηση των λεπτομερών μηχανισμών της θεραπείας με βάση το RNAi και έρευνες για πιο αποτελεσματικές μεθόδους χορήγησης για μελλοντική ανάπτυξη. Αυτές οι νέες προσεγγίσεις θα μπορούσαν να ανοίξουν νέους δρόμους για διάφορες πνευμονικές παθήσεις και να βελτιώσουν την κλινική έκβαση των ασθενών.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 6442, "text": "ενδορινική" } ], "id": 1612, "question": "Ποια μέθοδος είναι χρήσιμη για τη χορήγηση μικρών μορίων για συστηματική παροχή στο σώμα;" }, { "answers": [ { "answer_start": 8373, "text": "1-5 μm" } ], "id": 1620, "question": "Ποιο μέγεθος σωματιδίου έχει αποδειχθεί ότι είναι πιο αποτελεσματικό στην παροχή στον κατώτερο αεραγωγό;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Πλήρης αλληλουχία γονιδιώματος ενός στελέχους ιού νεφροπαθογόνου λοιμώδους βρογχίτιδας που απομονώθηκε στην Κίναhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3795213/SHA: f2df4fc3c60338755fd23da3d4455A201c Ma, Bing-cunDate: 2013-10-10DOI: 10.1128/genomea.00815-13License: cc-byAbstract: Infectious bronchitis virus (IBV) προκαλεί τεράστιες οικονομικές απώλειες στη βιομηχανία πουλερικών. Εδώ, αναφέρουμε τα πλήρη αποτελέσματα ανάλυσης γονιδιώματος για ένα νέο φυσικό ανασυνδυασμό νεφροπαθογόνου στελέχους IBV που ονομάζεται SAIBK, το οποίο απομονώθηκε στην επαρχία Σιτσουάν της Κίνας το 2005. Κείμενο: χαρακτηριστική και οξεία νόσος σε κατοικίδια κοτόπουλα, ανήκει στην ομάδα III του γένους Coronavirus στην οικογένεια Coronaviridae (1) . Είναι ένας ιός μονόκλωνος RNA (ssRNA) με περίβλημα, μη τμηματοποιημένος, θετικής αίσθησης και έχει γονιδίωμα περίπου 27,6 kb (2) . Πρόσφατα, πολλές εκθέσεις επιδημιολογικής ανάλυσης έχουν προτείνει ότι οι νεφροπαθογόνοι IBV έχουν γίνει ολοένα και πιο διαδεδομένοι (3) (4) (5) (6) στην Κίνα. Σε αυτή την εργασία, αναλύθηκε η πλήρης αλληλουχία γονιδιώματος μιας απομόνωσης που ονομάζεται SAIBK και ανιχνεύθηκε ανασυνδυασμός μεταξύ SAIBK και ορισμένων προηγουμένως αναφερθέντων IBV. Χρησιμοποιήθηκε κιτ ταχείας ενίσχυσης των άκρων cDNA (RACE) (TaKaRa, Ιαπωνία) για τη λήψη του 5= και 3= άκρα του γονιδιώματος. Άλλα μέρη ενισχύθηκαν με 19 εκκινητές με επικάλυψη μεταξύ κάθε θραύσματος και κλωνοποιήθηκαν στον φορέα pMD19-T (TaKaRa, Ιαπωνία). Όλα τα θραύσματα αλληλουχήθηκαν τρεις φορές από τη Sangon Biotech (Σαγκάη, Κίνα). Τα θραύσματα αλληλουχίας συναρμολογήθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα λογισμικού SeqMan (DNAStar, Inc.). Διεξήχθη ευθυγράμμιση αλληλουχιών και κατασκευάστηκε ένα φυλογενετικό δέντρο χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα λογισμικού MEGA5 (7). Η ανάλυση ανασυνδυασμού πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τα προγράμματα λογισμικού RDP 4.14 (8) και SimPlot 3.5.1 (9). Το πλήρες γονιδίωμα του στελέχους SAIBK έχει μήκος 27.534 νουκλεοτίδια (nt), συμπεριλαμβανομένης της ουράς πολυ(Α). Έχει μια κλασική οργάνωση γονιδιώματος IBV με 10 ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (ORFs): Η αλληλουχία γονιδιώματος του SAIBK δείχνει την υψηλότερη ταυτότητα (94,3%) με το κινεζικό στέλεχος IBV SC021202 (GenBank accession no. EU714029) και τη χαμηλότερη ταυτότητα (85,8%) σε δύο κινεζικά στελέχη IBV, BJ (GenBank accession no. AY319651) και DY07 (αρ. προσχώρησης GenBank. HM245923). Έχει χαμηλότερες ταυτότητες νουκλεοτιδίων 88,1%, 87,9% και 87,7% στα πιο δημοφιλή στελέχη εμβολίων IBV, H120, H52 και M41, αντίστοιχα. Η φυλογενετική ανάλυση των αποτελεσμάτων πλήρους γονιδιώματος έδειξε ότι το στέλεχος SAIBK συγκεντρώνεται στον ίδιο κλάδο ως το στέλεχος IBV YN (GenBank accession αρ. JF893452) και το στέλεχος SC021202 (GenBank accession αρ. EU714029). Η υπομονάδα S1 του γονιδιώματος IBV είναι ο κύριος καθοριστικός παράγοντας του ορότυπου (10) (11) (12) (13) και η ανάλυση S1 έδειξε ότι το στέλεχος SAIBK έχει ορότυπο που μοιάζει με 4/91. Οι χρησιμοποιούμενες μέθοδοι ανίχνευσης ανασυνδυασμού αποκάλυψαν ότι Ο SAIBK είναι ένας χιμαιρικός ιός, με ανασυνδυασμό από το στέλεχος SC021202 ως κύριο γονέα και το στέλεχος εμβολίου Η120 ως δευτερεύον γονέα. Η πρώτη και η δεύτερη περιοχή ανασυνδυασμού εντοπίστηκαν στις θέσεις 7231 έως 9126 και 13437 έως 14473 στα γονίδια 1a και 1b, αντίστοιχα. Υπήρχαν δύο άλλες περιοχές ανασυνδυασμού που ανιχνεύθηκαν στις θέσεις 951 έως 1067 και 5393 έως 5605 του SAIBK, οι οποίες ανασυνδυάστηκαν με το στέλεχος SC021202 ως κύριο γονέα και το στέλεχος εμβολίου Η52 ως δευτερεύον γονέα. Τα αποτελέσματα ανίχνευσης ανασυνδυασμού υποδηλώνουν ότι ο SAIBK είναι πιθανώς ένας ιός χίμαιρας που προέρχεται από τα ευρέως χρησιμοποιούμενα στελέχη εμβολίου H120 και H52 και το στέλεχος πεδίου SC021202 και το στέλεχος SC021202 απομονώθηκε από κοτόπουλα εμβολιασμένα με H120 στην επαρχία Σιτσουάν (στην επαρχία Σιτσουάν) . Αυτό το αποτέλεσμα αποκάλυψε ότι τα IBV πεδίου στην επαρχία Σιτσουάν έχουν υποστεί γενετικό ανασυνδυασμό και πιθανώς αναδύονται ως νέα μεταλλαγμένα στελέχη, όπως ο αριθμός εισαγωγής αλληλουχίας SAIBK.Nucleotide. Η πλήρης αλληλουχία γονιδιώματος της απομόνωσης SAIBK υποβλήθηκε στην GenBank και της δόθηκε ο αρ. DQ288927.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 1962, "text": "27.534 νουκλεοτίδια" } ], "id": 1622, "question": "Πόσο καιρό είναι το γονίδιο SAIBK;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2863, "text": "10" } ], "id": 1623, "question": "Πόσα ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης υπάρχουν στο γονίδιο SAIBK;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2192, "text": "κινεζικό στέλεχος IBV SC021202" } ], "id": 1624, "question": "Ποιος ιός έχει την πλησιέστερη γενετική ταυτότητα με το γονίδιο SAIBK;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Προετοιμασία για πιθανή διαρκή μετάδοση του νέου κορωνοϊού 2019 Μαθήματα από προηγούμενες επιδημίεςhttps://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2761285 11 Φεβρουαρίου 2020 David L. Swerdlow, MD1; Lyn Finelli, DrPH, MS2Author Affiliations Article InformationJAMA. 2020; 323 (12): 1129-1130. doi:10.1001/jama.2020.1960COVID-19 Resource Centerrelated articles icon Σχετικά άρθρα Εικονίδιο συνέντευξης συγγραφέα ΣυνεντεύξειςΗχητική συνέντευξη (25:53)Ενημέρωση COVID-19 από την Κίνα Η μεταδοτικότητα και η σοβαρότητα είναι οι 2 πιο κρίσιμοι παράγοντες που καθορίζουν την επιδημία. Ούτε η πανδημία του ιού A(H1N1) της πανδημίας γρίπης ([H1N1]pdm09) του 2009 ούτε ο κορωνοϊός με σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο (SARS-CoV) ή οι επιδημίες του κορωνοϊού του αναπνευστικού συνδρόμου της Μέσης Ανατολής (MERS-CoV) είχαν τον συνδυασμό υψηλής μεταδοτικότητας και αυστηρότητα. Οι στρατηγικές ελέγχου οδηγούνται από αυτόν τον συνδυασμό. Το R0, ο βασικός αριθμός αναπαραγωγής, είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο μέτρο μεταδοτικότητας και ορίζεται ως ο αριθμός των επιπλέον ατόμων που μολύνει ένα κρούσμα κατά τη διάρκεια της ασθένειάς τους. Ένα R0 μικρότερο από 1 υποδηλώνει ότι η μόλυνση θα εξαφανιστεί \"τελικά\". Ένα R0 μεγαλύτερο από 1 υποδηλώνει ότι η μόλυνση έχει τη δυνατότητα για συνεχή μετάδοση. Για παράδειγμα, η γρίπη A(H1N1)pdm09, που εντοπίστηκε για πρώτη φορά στη νότια Καλιφόρνια στις 15 Απριλίου 2009, ήταν εξαιρετικά μεταδοτική. Μέχρι τις 5 Μαΐου 2009, η γρίπη A(H1N1)pdm09 είχε εξαπλωθεί σε 41 πολιτείες των ΗΠΑ και 21 χώρες.1 Ενώ η γρίπη A(H1N1)pdm09 ήταν εξαιρετικά μεταδοτική, δεν ήταν σοβαρή. Οι αρχικές εκτιμήσεις του R0 της γρίπης A(H1N1)pdm09 ήταν 1,7.2 Αν και εκτιμάται ότι το 201200 αναπνευστικοί θάνατοι λόγω της γρίπης A(H1N1)pdm09 σημειώθηκαν κατά το πρώτο έτος της πανδημίας, ο αριθμός των θανάτων ανά πληθυσμό ήταν 30 λιγότεροι από αυτό που παρατηρήθηκε κατά την πανδημία γρίπης του 1968, 1000 φορές λιγότερο από την πανδημία του 1918 και ακόμη λιγότερο από τις τυπικές επιδημίες εποχικής γρίπης (υπολογίζεται από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας [ΠΟΥ] σε 250000 έως 500000 ετησίως, αν και οι μέθοδοι εκτίμησης διαφέρουν) .3 Η γρίπη A(H1N1)pdm09 ήταν εξαιρετικά μεταδοτική αλλά όχι σοβαρή. SARS-CoV (2003) και MERS-CoV (2012-σήμερα) προκαλούν σοβαρή νόσο, αλλά παρά τις αρχικές εκτιμήσεις R0 άνω του 2,0 για SARS-CoV (υποδεικνύει θα μπορούσε να συμβεί διαρκής, ακόμη και παγκόσμια μετάδοση), και ορισμένα μεγάλα κρούσματα, κανένα από τα δύο δεν ήταν τόσο μεταδοτικά όσο υποδεικνύονταν οι αρχικές ανησυχίες. Ο SARS-CoV προκάλεσε 8098 αναφερόμενα κρούσματα και 774 θανάτους (ποσοστό κρουσμάτων-θνησιμότητας, 9,6%) σε 37 χώρες πριν τεθεί υπό έλεγχο η επιδημία. Θεωρήθηκε ότι ο έλεγχος ήταν δυνατός επειδή ένα μεγάλο ποσοστό περιπτώσεων ήταν σοβαρές, γεγονός που καθιστούσε ευκολότερο τον γρήγορο εντοπισμό και την απομόνωση των μολυσμένων ατόμων. Επιπλέον, ο ιός ήταν παρών σε χαμηλότερα επίπεδα στις εκκρίσεις των ανώτερων αεραγωγών. Δεν υπήρξε δευτερογενής μετάδοση στις Ηνωμένες Πολιτείες από τα 8 εισαγόμενα κρούσματα, αν και στο Τορόντο του Καναδά, μία μόνο εισαγωγή θεωρείται ότι οδήγησε σε περίπου 400 κρούσματα και 44 θανάτους. Οι μεταγενέστερες εκτιμήσεις του R0 ήταν μικρότερες από 1, υποδεικνύοντας ότι ο SARS-CoV μπορεί να μην ήταν ικανός για συνεχή μετάδοση, ειδικά στον καθορισμό των μέτρων ελέγχου.4 Ομοίως, ο MERS-CoV φαίνεται να έχει υψηλή σοβαρότητα και χαμηλή μεταδοτικότητα. Από το 2012, ο MERS-CoV έχει προκαλέσει 2494 αναφερόμενα κρούσματα και 858 θανάτους (ποσοστό κρουσμάτων-θνησιμότητας, 34%) σε 27 χώρες. Ο MERS-CoV έχει επίσης προκαλέσει κάποια γρήγορα κρούσματα, κυρίως σε νοσοκομεία στη Σαουδική Αραβία, την Ιορδανία και τη Νότια Κορέα, αλλά οι εκτιμήσεις για τον MERS-CoV R0 είναι λιγότερο από 1 και μέχρι στιγμής έχει περιοριστεί.5 Μπορεί ένας αναπνευστικός ιός που είναι και τα δύο μεταδοτικό και σοβαρό να περιέχονται; Στο πλαίσιο της προετοιμασίας για μια πανδημία γρίπης, το σχέδιο πανδημίας γρίπης του Υπουργείου Υγείας και Ανθρωπίνων Υπηρεσιών των ΗΠΑ περιλάμβανε έναν συνδυασμό μη φαρμακευτικών (κλείσιμο συνόρων και σχολείων, μέτρα ελέγχου λοιμώξεων) και φαρμακευτικών (αντιϊκή προφύλαξη, εμβόλια) παρεμβάσεων που προορίζονταν να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό διακοπή ή επιβράδυνση της μετάδοσης της γρίπης. Παρά την εφαρμογή ορισμένων από αυτές τις παρεμβάσεις, η γρίπη A(H1N1)pdm09 εξαπλώθηκε σε 120 χώρες σε 3 μήνες. Με την εμφάνιση του MERS-CoV στη Μέση Ανατολή, αναπτύχθηκε ένα σχέδιο ετοιμότητας που περιλάμβανε ένα σχέδιο επιτήρησης, εργαστηριακές δοκιμές και επαφή ιχνηλατική καθοδήγηση. Οι οδηγίες ελέγχου λοιμώξεων αναπτύχθηκαν για χρήση σε περιβάλλοντα υγειονομικής περίθαλψης και οι ταξιδιωτικές οδηγίες αναπτύχθηκαν για το κοινό.6 Τα Κέντρα Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων των ΗΠΑ (CDC) διένειμαν κιτ δοκιμών αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης MERS-CoV στις κρατικές υπηρεσίες υγείας. Δύο θήκες εισήχθησαν στις Ηνωμένες Πολιτείες. Εντοπίστηκαν επαφές, συμπεριλαμβανομένων των επαφών του νοικοκυριού, του νοσοκομείου και των αεροπορικών εταιρειών. Δεν εντοπίστηκαν δευτερεύουσες περιπτώσεις στις Ηνωμένες Πολιτείες. Ο MERS-CoV θεωρήθηκε σοβαρός και τα μέτρα ελέγχου βασίστηκαν στην αναγνώριση ύποπτων περιπτώσεων. Ωστόσο, κατά τη διάρκεια μιας επιδημίας σε νοσοκομείο στη Τζέντα της Σαουδικής Αραβίας, μεταξύ των νοσηλευόμενων ασθενών μόνο 5 από τις 53 (9%) περιπτώσεις που σχετίζονται με την υγειονομική περίθαλψη είχαν τεκμηριωμένη παρουσία στο ίδιο δωμάτιο με έναν ασθενή με MERS.5 Παρά το υψηλό ποσοστό θνησιμότητας ( σημαντικό μέτρο σοβαρότητας), τα κρούσματα MERS μπορεί να είναι ασυμπτωματικά και ήπια (25% σε μία εστία). Αν και δεν είναι γνωστό πόσο συχνά οι ασυμπτωματικοί ή ήπια συμπτωματικοί ασθενείς μεταδίδουν MERS, η έναρξη ολοκληρωμένων μέτρων, όπως η απομόνωση ασθενών για τους οποίους υπάρχει υποψία ότι έχουν ή έχουν εκτεθεί στον ιό και η χρήση ατομικού προστατευτικού εξοπλισμού κατά τη φροντίδα τους μπορεί να είναι εξαιρετικά δύσκολη, επειδή πολλοί ασθενείς έχουν ήπια και μη ειδικά συμπτώματα. Είναι ο κόσμος έτοιμος για έναν αναπνευστικό ιό με υψηλή μεταδοτικότητα και σοβαρότητα; Μετά τον εντοπισμό ενός νέου ιού γρίπης (H7N9) στην Κίνα το 2013, μια σειρά άρθρων μοντελοποίησης περιέγραψε την επίδραση και το επίπεδο ετοιμότητας για μια σοβαρή πανδημία ενός κύματος στις Ηνωμένες Πολιτείες.7 Σε σενάρια που χρησιμοποιούσαν κλινική επίθεση ποσοστά (το ποσοστό των ατόμων που νοσούν ή πεθαίνουν από ασθένεια σε πληθυσμό αρχικά μη μολυσμένο) από 20% έως 30% (για σύγκριση το ποσοστό κλινικής προσβολής ήταν 20% το πρώτο έτος της πανδημίας H1N1 του 2009), ανάλογα με βαρύτητα θα υπήρχαν περίπου 669.000 έως 4,3 εκατομμύρια νοσηλείες και εκτιμάται ότι 54.000 έως 538.000 θάνατοι χωρίς καμία παρέμβαση στις Ηνωμένες Πολιτείες. Τα μοντέλα πρότειναν ότι χωρίς εμβόλιο, το κλείσιμο των σχολείων θα ήταν απίθανο να επηρεάσει την πανδημία, εκτιμάται ότι θα χρειάζονταν 35000 έως 60000 αναπνευστήρες, εκτιμάται ότι θα απαιτούνταν έως και 7,3 δισεκατομμύρια χειρουργικές μάσκες ή αναπνευστήρες, και ίσως το πιο σημαντικό, εάν Η ανάπτυξη του εμβολίου δεν ξεκίνησε πριν από την εισαγωγή του ιού, ήταν απίθανο να αποφευχθεί σημαντικός αριθμός νοσηλειών και θανάτων λόγω του χρόνου που απαιτείται για την ανάπτυξη, τη δοκιμή, την κατασκευή και τη διανομή ενός εμβολίου. Είναι αδύνατο να γνωρίζουμε τι θα συμβεί τόσο νωρίς σε αυτή τη νέα επιδημία του κορωνοϊού 2019 (2019-nCoV). Το εύρος, η νοσηρότητα και η θνησιμότητα θα εξαρτηθούν από το συνδυασμό σοβαρότητας και μεταδοτικότητας. Πολλοί ειδικοί έχουν «αναφέρει τώρα» πόσες περιπτώσεις έχουν συμβεί και προέβλεψαν πόσες πιθανές περιπτώσεις θα εμφανιστούν. Μια πρόσφατη μελέτη δείχνει ότι μπορεί να συμβεί ταχεία μετάδοση από άτομο σε άτομο.8 Οι μοντελιστές ασθενειών υπολόγισαν ότι το R0 είναι 2.2.9 Το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ εκτιμά ότι η επιδημία θα μπορούσε να μολύνει περισσότερα από 150.000 άτομα την ημέρα στην Κίνα στο αποκορύφωμά της. Is 2019-nCoV σοβαρή μόλυνση; Μέχρι σήμερα, περίπου το 14% των περιπτώσεων του 2019-nCoV έχουν περιγραφεί ως σοβαρές από τον ΠΟΥ, με ποσοστό θνησιμότητας 2,1%.10 Οι εκτιμήσεις της σοβαρότητας είναι συνήθως υψηλότερες στην αρχή μιας επιδημίας λόγω του εντοπισμού της πιο σοβαρής επηρεάζονται και μειώνονται καθώς εξελίσσεται η επιδημία. Ωστόσο, επειδή πολλά μολυσμένα άτομα δεν έχουν αναρρώσει ακόμη και μπορεί να πεθάνουν, το ποσοστό θνησιμότητας και η σοβαρότητα των κρουσμάτων θα μπορούσαν να υποτιμηθούν. Στις 30 Ιανουαρίου 2020, ο ΠΟΥ κήρυξε επίσημα την επιδημία 2019-nCoV ως Έκτακτης Ανάγκης για τη Δημόσια Υγεία διεθνούς ανησυχίας, υποδεικνύοντας την ανησυχία του ότι χώρες εκτός από την Κίνα θα μπορούσαν να επηρεαστούν από το 2019-nCoV. Κατά την προετοιμασία για πιθανή παρατεταμένη μετάδοση του 2019-nCoV. Κίνα, θα πρέπει να εξεταστούν προσεκτικά τα ισχύοντα διδάγματα από προηγούμενες εμπειρίες με επιδημίες/πανδημίες αναπνευστικών ιών για καλύτερο έλεγχο και μετριασμό των πιθανών συνεπειών. Έχουν αναπτυχθεί σχέδια ετοιμότητας για τη γρίπη που στοχεύουν να σταματήσουν, να επιβραδύνουν ή να περιορίσουν την εξάπλωση μιας πανδημίας γρίπης στις Ηνωμένες Πολιτείες. Αυτά τα σχέδια αφορούν τον περιορισμό της εγχώριας εξάπλωσης και τον μετριασμό των ασθενειών, αλλά και τη διατήρηση των υποδομών και τη μείωση των αρνητικών επιπτώσεων της πανδημίας στην οικονομία και την κοινωνία. Αυτά τα σχέδια θα ήταν χρήσιμα να εφαρμοστούν κατά τη διάρκεια της επιδημίας 2019-nCoV, εάν οι Ηνωμένες Πολιτείες βιώσουν συνεχή μετάδοση. Οι χώρες ήταν επιτυχημένες στο παρελθόν και δεν υπάρχει τίποτα ακόμα να προβλέψει ότι αυτή τη φορά είναι πιθανό να είναι χειρότερο. Η αποτελεσματική πρόληψη και έλεγχος δεν θα είναι εύκολος εάν υπάρχει συνεχής μετάδοση και θα απαιτήσει την πλήρη προσοχή της δημόσιας υγείας, των ομοσπονδιακών και τοπικών κυβερνήσεων, του ιδιωτικού τομέα και κάθε πολίτη. Epidemiology Lead, Medical Development and Scientific/Clinical Affairs, Pfizer Vaccines, 500 Arcola Rd, Collegeville, PA 19426 ([email protected]). Δημοσιεύτηκε στο Διαδίκτυο: 11 Φεβρουαρίου 2020. doi:10.1001/jamaflict ofC2020 Γνωστοποιήσεις: Ο Δρ Swerdlow αναφέρει ότι κατέχει μετοχές και δικαιώματα προαίρεσης μετοχών στην Pfizer Inc. Ο Δρ Swerdlow αναφέρει επίσης ότι παρέχει μια εφάπαξ διαβούλευση που αποτελείται από μια επισκόπηση της επιδημιολογίας του SARS και του MERS στην GLG Consulting και λαμβάνει αμοιβή. Ο Δρ Finelli αναφέρει ότι κατέχει μετοχές στη Merck and Co. Χρηματοδότηση/Υποστήριξη: Η Pfizer Inc παρείχε μισθολογική υποστήριξη στον Dr Swerdlow. Ρόλος του Χρηματοδότη/Χορηγού: Η Pfizer Inc εξέτασε το χειρόγραφο και ενέκρινε την απόφαση να υποβάλει το χειρόγραφο για δημοσίευση. Αναφορές1.Swerdlow DL , Finelli L, Bridges CB. 2009 Πανδημία γρίπης H1N1: επιτόπιες και επιδημιολογικές έρευνες στις Ηνωμένες Πολιτείες στην αρχή της πρώτης πανδημίας του 21ου αιώνα. Clin Infect Dis. 2011; 52 (suppl 1): S1-S3. doi:10.1093/cid/ciq005PubMedGoogle ScholarCrossref2.Balcan D, Hu H, Goncalves B, et al. Εποχιακές δυνατότητες μετάδοσης και κορυφές δραστηριότητας της νέας γρίπης A(H1N1): ανάλυση πιθανότητας του Μόντε Κάρλο με βάση την ανθρώπινη κινητικότητα. BMC Medicine. 2009; 7 (45). doi:10.1186/1741-7015-7-453.Dawood FS, Iuliano AD, Reed C, et al. Εκτιμώμενη παγκόσμια θνησιμότητα που σχετίζεται με τους πρώτους 12 μήνες της κυκλοφορίας του ιού της πανδημίας γρίπης A H1N1 του 2009: μια μελέτη μοντελοποίησης. Lancet Infect Dis. 2012, 12(9):687-695. doi:10.1016/S1473-3099(12)70121-4PubMedGoogle ScholarCrossref4.Chowell G, Castillo-Chavez C, Fenimore PW, Kribs-Zaleta CM, Arriola L, Hyman JM. Παράμετροι μοντέλου και έλεγχος εστίας για SARS. Emerg Infect Dis. 2004, 10(7):1258-1263. doi:10.3201/eid1007.030647PubMedGoogle ScholarCrossref5.Killerby ME, Biggs HM, Midgley CM, Gerber SI, Watson JT. Μετάδοση του κορωνοϊού με το αναπνευστικό σύνδρομο της Μέσης Ανατολής. Emerg Infect Dis. 2020; 26 (2): 191-198. doi:10.3201/eid2602.190697PubMedGoogle ScholarCrossref6.Rasmussen SA, Watson AK, Swerdlow DL. Αναπνευστικό σύνδρομο Μέσης Ανατολής (MERS). Microbiol Spectr. 2016; 4 (3). doi:10.1128/microbiolspec.EI10-0020-2016PubMedGoogle Scholar7.Swerdlow DL, Pillai SK, Meltzer MI, eds. Προσπάθειες μοντελοποίησης CDC ως απάντηση σε μια πιθανή έκτακτη ανάγκη για τη δημόσια υγεία: η γρίπη A(H7N9) ως παράδειγμα. Clin Infect Dis. 2015; 60 (suppl): S1-S63. https://academic.oup.com/cid/issue/60/suppl_1.Google Scholar8.Wang D, Hu B, Hu C, et al. Κλινικά χαρακτηριστικά 138 νοσηλευόμενων ασθενών με νέα πνευμονία 2019 μολυσμένη από κορωνοϊό στη Γουχάν της Κίνας. ΤΖΑΜΑ. Δημοσιεύθηκε στο διαδίκτυο στις 7 Φεβρουαρίου 2020. doi:10.1001/jama.2020.1585ArticlePubMedGoogle Scholar9.Li Q, Guan X, Wu P, et al. Δυναμική πρώιμης μετάδοσης στη Γουχάν της Κίνας της νέας πνευμονίας που έχει προσβληθεί από κορωνοϊό. N Engl J Med. Δημοσιεύθηκε ηλεκτρονικά στις 29 Ιανουαρίου 2020. doi:10.1056/NEJMoa2001316PubMedGoogle Scholar10.Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας. Αναφορές κατάστασης για τον νέο κορωνοϊό (2019-nCoV). https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports/. Πρόσβαση στις 4 Φεβρουαρίου 2020. Σχόλιο2 Σχόλια για αυτό το άρθρο ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΟΛΗ 12 Φεβρουαρίου 2020 Κατανόηση του R και του ελέγχου ασθενειώνOz Mansoor | Ιατρός Δημόσιας Υγείας, Wellington Το μήνυμα ότι πρέπει να προετοιμαστούμε για μια πανδημία είναι ζωτικής σημασίας. Αλλά το άρθρο αναφέρει εσφαλμένα ορισμένες βασικές ιδέες. Πρώτον, το SARS δεν ελεγχόταν «επειδή ένα μεγάλο ποσοστό περιπτώσεων ήταν σοβαρό». Αν και αυτό βοήθησε, ήταν επειδή οι περιπτώσεις δεν ήταν μολυσματικές πριν από μερικές ημέρες μετά την έναρξη των συμπτωμάτων (συνήθως τη δεύτερη εβδομάδα της ασθένειας). Αυτό έδωσε περισσότερο χρόνο για τον εντοπισμό και την απομόνωση της υπόθεσης. Και οι περισσότερες περιπτώσεις δεν μετέφεραν μόλυνση σε κανέναν, αλλά μερικές εξαπλώθηκαν σε πολλούς. Όταν όλα αυτά τα άτομα εντοπίστηκαν και απομονώθηκαν, η εξάπλωση σταμάτησε. Δυστυχώς, ο νέος ιός φαίνεται να εξαπλώνεται από ανθρώπους πολύ νωρίτερα κατά τη διάρκεια της ασθένειας, ακόμη και με ήπια συμπτώματα - κάτι που δεν τεκμηριώθηκε ποτέ για το SARS. Ωστόσο, δεν είναι σαφές ότι είναι διαφορετικό ή καλύτερο στην εξάπλωση μεταξύ των ανθρώπων και ίσως με το ίδιο μοτίβο στις περισσότερες περιπτώσεις να μην προκαλεί περαιτέρω εξάπλωση. Δεύτερον, ο R0, ο βασικός αριθμός αναπαραγωγής, περιγράφεται σωστά ως ο μέσος αριθμός λοιμώξεις που προκαλεί κάθε περίπτωση. Λείπουν όμως δύο βασικές ιδέες: 1) το 0 μετά το R υποδηλώνει την εγγενή κατάσταση, η οποία είναι ένας πλήρως ευαίσθητος πληθυσμός και χωρίς κανένα μέτρο ελέγχου. Το R είναι ο αποτελεσματικός αριθμός και μπορεί να περιλαμβάνει τον αντίκτυπο των μέτρων ελέγχου. Ο ισχυρισμός ότι ήταν η έλλειψη μεταδοτικότητας και όχι τα μέτρα ελέγχου που τερμάτισαν το SARS, δεν βασίζεται σε κανένα στοιχείο. Και αγνοεί τις ηρωικές προσπάθειες των πληγεισών χωρών. Η εξάλειψη του SARS απέδειξε τις δυνατότητες της παγκόσμιας συντονισμένης συλλογικής δράσης, καθώς και τη ζημιά που προκαλείται από την άγνοια και την προκατάληψη. Οι περισσότεροι φαίνεται να έχουν ήδη ξεχάσει τα μαθήματα του SARS. ΣΥΓΚΡΟΥΣΗ ΣΥΜΦΕΡΟΝΤΩΝ: Εργάστηκε για τον WHO/WPRO στο SARS απάντησηΔΙΑΒΑΣΤΕ ΠΕΡΙΣΣΟΤΕΡΑ 24 Φεβρουαρίου 2020COVID 19: μια παγκόσμια παρουσία και όχι μόνο ένα νέο παθογόνο; Giuliano Ramadori, Καθηγητής Ιατρικής | Πανεπιστημιακή κλινική, Γκέτινγκεν, Γερμανία Κατά τη χειμερινή περίοδο έρχεται η ώρα των λοιμώξεων του ανώτερου και κατώτερου αναπνευστικού συστήματος που χαρακτηρίζονται από βήχα, δύσπνοια και τελικά πυρετό (ασθένεια που μοιάζει με γρίπη). μπορεί να χρειαστεί νοσηλεία και τελικά εντατική θεραπεία. Σε πολλές από τις περιπτώσεις που νοσηλεύονται, το ρινικό ή/και το τραχειακό υγρό εξετάζονται για ιικούς ή βακτηριακούς παράγοντες. Μόνο σε λιγότερο από το 50% των περιπτώσεων οι ιοί της γρίπης θεωρείται ότι είναι η αιτία της νόσου. Στις υπόλοιπες περιπτώσεις η διαγνωστική διαδικασία για τους ανθρώπινους κοροναϊούς δεν εκτελείται τακτικά. Ένας από τους τέσσερις διαφορετικούς ανθρώπινους κοροναϊούς (HuCoV: 229E, NL 63,0C43 και HKU1) μπορεί ωστόσο να βρεθεί σε έως και 30% των ασθενών αρνητικών για ιούς γρίπης (1). Κινέζοι επιστήμονες στη Γουχάν, οι οποίοι έπρεπε να αντιμετωπίσουν έναν αυξανόμενο αριθμό οξειών αναπνευστικών ασθενειών που μοιάζουν με ιογενή πνευμονία, πραγματοποίησαν ανάλυση σε βάθος από δείγματα που ελήφθησαν από την κατώτερη αναπνευστική οδό και βρήκαν έναν «νέο» κοροναϊό. Η αλληλουχία του πλήρους γονιδιώματος δημοσιοποιήθηκε. Ταυτόχρονα, ωστόσο, η ειδοποίηση από τη Γουχάν έφερε στο μυαλό τις επιδημίες SARS και MERS. Τα μέτρα που έλαβαν οι κινεζικές αρχές και οι αρχές του ΠΟΥ είναι πλέον γνωστά. Πρόσφατα, περίπου 150 νέα κρούσματα εντοπίστηκαν στη βόρεια Ιταλία και οι υγειονομικές αρχές εξακολουθούν να αναζητούν την περίπτωση 0 (η πηγή). Είναι δυνατόν ο COVID-19 να υπήρχε ήδη στην Ιταλία -- και όχι μόνο στην Ιταλία αλλά πιθανώς παντού στον κόσμο -- και ότι η πρόσφατα διαθέσιμη αλληλουχία νουκλεοτιδίων επιτρέπει τώρα να βρεθεί η αιτία μιας απροσδιόριστης προηγουμένως ασθένειας που μοιάζει με γρίπη; ΑΝΑΦΟΡΑ1. Benezit F et al. :Αναπνευστικοί ιοί μη γρίπης σε ενήλικες ασθενείς που εισήχθησαν με γριππώδη νόσο: προοπτική πολυκεντρική μελέτη 3 ετών. Λοίμωξη, 13 Φεβρουαρίου 2020, https://doi.org/10.1007/s15010-019-01388LICT-1). ΕΝΔΙΑΦΕΡΟΝΤΟΣ: Κανένας δεν έχει αναφερθεί ΔΙΑΒΑΣΤΕ ΠΕΡΙΣΣΟΤΕΡΑΔείτε περισσότερα για την Παγκόσμια Υγεία Δημόσια Υγεία Πνευμονική Ιατρική Λοιμώδη Νοσήματα ΓρίπηΛήψη PDFΑναφέρετε αυτές τις άδειεςΣχόλιοCME & MOC Coronavirus Resource CenterTrendingOpinion is learning έχει πολυμέσαUS Emergency Legal Responses to Novel Coronavirusion20 Σημαντικές πληροφορίες για τους κλινικούς ιατρούς 17, 2020research είναι η μάθηση έχει πολυεακυκλινικά χαρακτηριστικά ασθενών με νέα κορώνα Coronavirus (2019-NCOV) που νοσηλεύεται στο Πεκίνο, Chinamarch 17, 2020Select Οι καταχωρίσεις ενδιαφέροντός σας στο JAMA Career Center®Academic Cardiologist: Heartistforistphoenix, Arizoninoninvisialwestestwestwove, Pennsylvaniacardiologistphoenixville, Pennsylvaniacardiac Intensivist Σχολή Ανάγνωσης, Pennsylvaniaclinical Σχολή: Καρδιολογία / Electrophysiologistphoenix, Arizonasee περισσότερο στο Jama Career Centerothers Untcoronavirus excelplyserizations Ofroceutistics Ofcoves-Coveutics Ofcoves-Covery υπολογιστικές μέθοδοιCanrong Wu, Acta Pharmaceutica Sinica B, 2020 Commercial Labs ενισχύουν τις προσπάθειες δοκιμής Coronavirus After FDA Guidance360Dx, 2020 Powered byTrendingUS Emergency Legal Responses to Novel Coronavirus—Balancing Public Health and Civil Liberties2020 Epidemicjama otolaryngology -head & neck Χειρουργική γνώμη 20 Μαρτίου 20202019 Νέες Coronavirus - Σημειώσεις Πληροφορίες για τις Κλινικές Ιάνες Ιάνες 17 Μαρτίου, 2020JamacontEnthome Νέες Διαδικτυακές Τρέχουσες Πληροφοριακές Πληροφοριακές Γνωστές Συντάκτες & Εκδότες RSS Open JAMA Cardiology JAMA Dermatology JAMA Facial Plastic Surgery JAMA Health Forum JAMA Internal Medicine JAMA Neurology JAMA Oncology JAMA Ophthalmology JAMA Ωτορινολαρυγγολογία–Χειρουργική Κεφαλής & Τραχήλου JAMA Pediatrics JAMA Psychiatry JAMA-Psychiatry of Neurology191919 Images in Psychiatry Οδηγίες προσυμπτωματικού ελέγχου καρκίνου του μαστού Κατευθυντήριες οδηγίες για τον προσυμπτωματικό έλεγχο του παχέος εντέρου Διακήρυξη των κατευθυντήριων γραμμών για τον προσυμπτωματικό έλεγχο κατάθλιψης του Ελσίνκι Ιατρική βασισμένη σε αποδεικτικά στοιχεία: An Oral History Fishbein Fellowship Γονιδιωματική και Ακριβής Υγεία Ανισότητες Δίκτυο Υγείας Υπέρταση Οδηγίες Δικτύου Διαχείρισης Υπερτασικής Δίκτυο JAMA Menoid Οδηγίες Ανασκόπηση Ερευνητική Δεοντολογία Σήψη και σηπτικό σοκ Στατίνες και δυσλιπιδαιμία Θέματα και συλλογές ΕΠΙΧΕΙΡΗΜΑΤΙΚΕΣ ΑΡΘΡΕΣ Οδηγίες προσυμπτωματικού ελέγχου για τον καρκίνο του μαστού Κατευθυντήριες γραμμές CDC για συνταγογράφηση οπιοειδών Οδηγίες CDC για την πρόληψη των λοιμώξεων χειρουργικής τοποθεσίας Consensus Definitions of Sep. Νόσος στα παιδιά, 1990-2013 Παγκόσμιο βάρος υπέρτασης, 1990-2015 Παγκόσμια θνησιμότητα από πυροβόλα όπλα, 1990-2016 Δαπάνες υγειονομικής περίθαλψης στις ΗΠΑ και σε άλλες χώρες υψηλού εισοδήματος Εισόδημα και προσδόκιμο ζωής στις ΗΠΑ JNC 8 Κατευθυντήρια γραμμή για τη διαχείριση του υψηλού αίματος Ο Πρόεδρος Ομπάμα για τη μεταρρύθμιση της υγειονομικής περίθαλψης των ΗΠΑ για τον προσυμπτωματικό έλεγχο για τον καρκίνο του παχέος εντέρου Έλεγχος για την κατάθλιψη σε ενήλικες Έλεγχος για τον καρκίνο του προστάτη Στατίνες για την πρωτογενή πρόληψη των καρδιαγγειακών παθήσεων Η κατάσταση της υγείας των ΗΠΑ, 1990-2016 Επιβάρυνση των Καρδιαγγειακών Νόσων των ΗΠΑ, 1996MA-20 7ο RevisionBlogsjama Health Forum ama στυλ Insiderininformation forauthors ίδρυμα & βιβλιοθηκονόμοι διαφημιστές διαφημιζόμενοι πράκτορες Εργοδότες και αναζητούν εργασία mediajama δικτύους προϊόντα jamavidence jn jun review review resevice resporehome resporehome cme quizes Μάθημα προσυμπτωματικού ελέγχου για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας CME / MOC Προτιμήσεις αναφοράς Σχετικά με το CME & MOCHelpΣυνδρομές & ανανεώσεις Συνδρομές email Ενημέρωση της διεύθυνσής σας Επικοινωνήστε μαζί μας Συχνές ερωτήσεις ΚΕΝΤΡΟ ΚΑΡΙΕΡΑJAMA Καταχωρίσεις θέσεων εργασίας ιατρού Λάβετε τα νεότερα από JAMAEmail Διεύθυνση Εγγραφή | Όροι χρήσης Λογότυπο δικτύουJama© 2020 American Medical Association. Με την επιφύλαξη παντός δικαιώματος.Όροι Χρήσης| Πολιτική Απορρήτου| Δήλωση προσβασιμότητας Λογότυπο Silverchair", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 6034, "text": "μεταδοτικότητα και σοβαρότητα" } ], "id": 249, "question": "Ποιοι είναι οι κρίσιμοι παράγοντες που καθορίζουν την επίδραση μιας επιδημίας;" }, { "answers": [ { "answer_start": 8380, "text": "30 Ιανουαρίου 2020" } ], "id": 250, "question": "Πότε ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (ΠΟΥ) κήρυξε επίσημα την επιδημία 2019-nCoV ως Έκτακτης Ανάγκης Δημόσιας Υγείας διεθνούς ενδιαφέροντος;" }, { "answers": [ { "answer_start": 12162, "text": "H7N9" } ], "id": 251, "question": "Ποιος ιός γρίπης εντοπίστηκε στην Κίνα το 2013;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6065, "text": "Μετά τον εντοπισμό ενός νέου ιού γρίπης (H7N9) στην Κίνα το 2013, μια σειρά άρθρων μοντελοποίησης περιέγραψε την επίδραση και το επίπεδο ετοιμότητας για μια σοβαρή πανδημία ενός κύματος στις Ηνωμένες Πολιτείες." } ], "id": 252, "question": "Ποια προηγούμενη έρευνα έχει γίνει για σοβαρές πανδημίες ενός κύματος;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6428, "text": "20%" } ], "id": 254, "question": "Ποιο ήταν το ποσοστό κλινικής προσβολής στην πανδημία H1N1 του 2009;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7714, "text": "2.2" } ], "id": 255, "question": "Ποιο είναι το εκτιμώμενο R0 του COVID-19;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6843, "text": "35000 έως 60000" } ], "id": 1657, "question": "Πόσοι αναπνευστήρες έχουν προβλεφθεί προηγούμενες μελέτες ότι θα απαιτηθούν για μια πανδημία στις Ηνωμένες Πολιτείες;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Η δειγματοληψία συμπυκνώματος εκπνεόμενης αναπνοής δεν είναι μια νέα μέθοδος για την ανίχνευση αναπνευστικών ιώνhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3059288/SHA: f3b46e7e8f58799207cc44515f859c1dafesepi5; De Coster, Sarah; Keyaerts, Els; Narongsack, Phouthalack; De Roy, Rikka; Talboom, Ive; Sisk, Maura; Maes, Piet; Verbeeck, Jannick; Van Ranst, MarcΗμερομηνία: 2011-03-04DOI: 10.1186/1743-422x-8-98 Άδεια χρήσης: cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Η δειγματοληψία εκπνεόμενου συμπυκνώματος αναπνοής (EBC) έχει θεωρηθεί ως μια εφευρετική και νέα μέθοδος για την αναπνευστική ιού. ΜΕΘΟΔΟΙ: Στη μελέτη μας, 102 εθελοντές που εμφάνισαν λοίμωξη του ανώτερου αεραγωγού επιστρατεύτηκαν τον χειμώνα και τις αρχές της άνοιξης του 2008/2009 και το πρώτο εξάμηνο του χειμώνα του 2009/2010. Ελήφθησαν με επιτυχία ενενήντα εννέα EBC και εξετάστηκαν για 14 κοινώς κυκλοφορούντες αναπνευστικούς ιούς. Για τη διερεύνηση της αποτελεσματικότητας της απομόνωσης του ιού από EBC, λήφθηκε ένα ρινικό επίχρισμα παράλληλα από ένα υποσύνολο εθελοντών. Η συνδυασμένη χρήση της συσκευής ECoVent με το RTube™ επέτρεψε την καταγραφή του εκπνεόμενου όγκου και της συχνότητας αναπνοής κατά τη συλλογή. Με αυτόν τον τρόπο, ο αριθμός των εκπνεόμενων ιικών σωματιδίων ανά λίτρο αέρα ή ανά λεπτό μπορεί θεωρητικά να εκτιμηθεί. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Ο έλεγχος ιών οδήγησε στην ανίχνευση 4 διαφορετικών ιών σε EBC και/ή ρινικά επιχρίσματα: ρινοϊό, ανθρώπινο αναπνευστικό συγκυτιακό ιό Β, γρίπη Α και γρίπη Β. Ο ρινοϊός ανιχνεύθηκε σε 6 EBC και 1 EBC ήταν θετικός στη γρίπη Β. Αναφέρουμε ποσοστό ανίχνευσης ιού 7% για τα EBC, το οποίο είναι πολύ χαμηλότερο από το ποσοστό ανίχνευσης 46,8% που παρατηρήθηκε με τη χρήση ρινικών επιχρισμάτων. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Αν και πολλά υποσχόμενη, η συλλογή EBC με χρήση του RTube™ δεν είναι αξιόπιστη για τη διάγνωση λοιμώξεων του αναπνευστικού. Κείμενο: Οι λοιμώξεις της ανθρώπινης αναπνευστικής οδού αντιπροσωπεύουν τις πιο συχνά εμφανιζόμενες λοιμώξεις παγκοσμίως. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων, η αιτιολογία αυτών των λοιμώξεων παραμένει απροσδιόριστη λόγω της ταχείας ανάρρωσης μετά τη μόλυνση. Οι λοιμώξεις της αναπνευστικής οδού σε υγιείς ενήλικες μπορεί να προκληθούν από μια ποικιλία παθογόνων και η ανίχνευση αυτών των παραγόντων βασίζεται επί του παρόντος στην απομόνωσή τους από ρινικά επιχρίσματα (NS), βρογχοκυψελιδικές πλύσεις (BAL), ρινοφαρυγγικές αναρροφήσεις και δείγματα πτυέλων. Η απόκτηση αυτών των δειγμάτων με ημι-επεμβατικές και επεμβατικές τεχνικές είναι συχνά δυσάρεστη για τον ασθενή. Ως εκ τούτου, η ανάλυση εκπνεόμενου συμπυκνώματος (EBC) έχει διερευνηθεί πρόσφατα ως μια νέα και μη επεμβατική μέθοδος για την παρακολούθηση της φλεγμονής των πνευμόνων και της πνευμονικής νόσου όπως η χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (ΧΑΠ), το άσθμα, η κυστική ίνωση, ο καρκίνος του πνεύμονα κ.λπ. Τα EBC αποτελούνται κυρίως από υδρατμούς, αλλά ένα μικρό κλάσμα περιέχει αναπνευστικά σταγονίδια που προέρχονται από το υγρό της επένδυσης των αεραγωγών [1, 2]. Αυτή η παρατήρηση έχει δημιουργήσει ένα αυξανόμενο ενδιαφέρον για τη χρήση του EBC ως νέας μεθόδου δειγματοληψίας για τον έλεγχο των αναπνευστικών ιών που μολύνουν τους ανώτερους αεραγωγούς. Αρχικά, οι ερευνητές υποψιάστηκαν ότι οι αναταράξεις του εισπνεόμενου αέρα ήταν υπεύθυνοι για την αεροζόλ του αναπνευστικού υγρού. Ωστόσο, η επίδραση της τυρβώδους ροής αέρα περιορίζεται στους ανώτερους αεραγωγούς αφού η τυρβώδης ροή αέρα γίνεται στρωτή καθώς φτάνει στους μικρότερους βρογχικούς αεραγωγούς και τις κυψελίδες. Πρόσφατα, έχει περιγραφεί το μοντέλο έκρηξης μεμβράνης υγρού βρογχιολίου [3] . Αυτό το μοντέλο προτείνει ότι τα αερολύματα παράγονται κατά την εισπνοή από το σκάσιμο των φυσαλίδων υγρού που υπάρχουν στα βρογχιόλια. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να διερευνήσει εάν η μέθοδος συλλογής EBC ήταν κατάλληλη για την αποτελεσματική συμπύκνωση σωματιδίων ιού που έχουν υποστεί αερολύσεις κατά την κανονική αναπνοή και να διερευνήσει το απομόνωση των αναπνευστικών ιών στο συμπύκνωμα. Ως εκ τούτου, εξετάσαμε τα δείγματα EBC με προσδιορισμούς PCR ειδικών για τον ιό που στοχεύουν 14 Σε αυτή τη μελέτη, συλλέχθηκαν 102 EBC από κατά τα άλλα υγιείς εθελοντές που εμφάνιζαν αναπνευστικά ή παρόμοια συμπτώματα γρίπης (που ορίζονται στον Πίνακα 1), χρησιμοποιώντας έναν εμπορικά διαθέσιμο συμπυκνωτή (RTube™, Respiratory Research Inc., Charlottesville, Βιρτζίνια, ΗΠΑ). Ο ασθενής έλαβε οδηγίες να αναπνέει από το στόμα σε παλιρροϊκούς όγκους σε ένα επιστόμιο συνδεδεμένο σε έναν συμπυκνωτή για 10 λεπτά. Δεν χρησιμοποιήθηκαν κλιπ μύτης κατά τη συλλογή και η μόλυνση από το σάλιο αποφεύχθηκε με την παρουσία μιας μονόδρομης βαλβίδας και του τμήματος σχήματος Τ του επιστόμιου. Συλλέχθηκαν 70 δείγματα EBC από ασθενείς που παρουσιάστηκαν εθελοντικά στο εργαστήριό μας. Η πλειοψηφία αυτών των εθελοντών ήταν φοιτητές που ανταποκρίθηκαν στο ενημερωτικό φυλλάδιο, που διανεμήθηκε στα πανεπιστημιακά κτίρια του Καθολικού Πανεπιστημίου του Leuven. Τα δείγματα συλλέχθηκαν με το χιτώνιο ψυγείου αλουμινίου ψυγμένο στους -80°C. Το φθινόπωρο και το πρώτο μισό του χειμώνα 2009/2010, συλλέχθηκαν 32 συμπυκνώματα από ασθενείς που παρουσιάστηκαν στον γενικό ιατρό τους. Λόγω των πρακτικών συνθηκών, τα συμπυκνώματα συλλέχθηκαν με το ψυγείο ψυγμένο στους -20°C. Για 13 από τις 32 συλλογές, το RTube™ συνδέθηκε με ένα προσαρμοσμένο συνδετικό κομμάτι στο ECoVent (Jaeger, Γερμανία). Αυτή η συσκευή καταγράφει παραμέτρους αερισμού όπως ο εκπνεόμενος όγκος, η συχνότητα αναπνοής και ο αναπνεόμενος όγκος. Επιπρόσθετα, λήφθηκε ένα NS παράλληλα με τη συλλογή συμπυκνώματος από κάθε ασθενή. Όλα τα EBC αποθηκεύτηκαν αμέσως στους -20°C. Τα ρινικά επιχρίσματα (NS) τοποθετήθηκαν στο ψυγείο. Μετά την εξαγωγή ιικού DNA και RNA, τα δείγματα EBC και τα ρινικά επιχρίσματα αποθηκεύτηκαν στους -80°C. Τρία δείγματα αποκλείστηκαν από τη μελέτη λόγω λανθασμένης συλλογής συμπυκνωμάτων. Χρησιμοποιήθηκε ένα σύντομο ερωτηματολόγιο για την τεκμηρίωση της ημερομηνίας γέννησης, της σοβαρότητας των αναπνευστικών προβλημάτων και για την καταγραφή των ημερών συμπτωματικής ασθένειας από όλους τους εθελοντές. Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ιατρικής Δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου του Leuven και ελήφθησαν ενημερωμένες συναινέσεις από όλους τους συμμετέχοντες. Το DNA και το RNA του ιού απομονώθηκαν με το κιτ QIAamp MinElute Virus (Qiagen, Westburg, Ολλανδία) σύμφωνα με το εγχειρίδιο οδηγιών. Τα εκχυλίσματα EBC εκλούστηκαν σε 60 μl ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης και τα εκχυλίσματα NS σε ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης 110 μl. Τα συμπυκνώματα αναπνοής εξετάστηκαν για 11 ιούς αναπνευστικού RNA (CoV NL63, E229 και OC43, RV, HMPV, InfA&B και PIV1-4) [4] 5] [6] [7] χρησιμοποιώντας κιτ OneStep RT-PCR (Qiagen, Westburg, Ολλανδία) σε αντίδραση 50 μl που περιέχει 10 μl του εξαγόμενου RNA, 0,6 μΜ εμπρόσθιων και αντίστροφων εκκινητών (Πίνακας 2), 1,5 μl Μίγμα ενζύμου ενός σταδίου, 10 μl 5 × ρυθμιστικού διαλύματος RT-PCR ενός σταδίου και 400 μΜ από κάθε dNTP. Για τον έλεγχο αδενοϊού, διεξήχθη DNA PCR για την οποία το μείγμα αντίδρασης ενίσχυσης περιείχε 0,5 μΜ εμπρός εκκινητή (AdFW) και ανάστροφο εκκινητή (AdRV), 0,4 mM dNTPs, 10 μl ρυθμιστικό διάλυμα C και 1 U Taq πολυμεράση σε τελικό όγκο 50 μl. Οι εκκινητές PCR που χρησιμοποιήθηκαν εντοπίστηκαν σε διατηρημένες περιοχές των γονιδιωμάτων των αναπνευστικών παθογόνων (Πίνακας 2). Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν σε T3000 Thermocycler 48 (Westburg, Leusden, The Netherlands) με ένα αρχικό βήμα αντίστροφης μεταγραφής για ιούς RNA στους 50°C για 30 λεπτά, ακολουθούμενη από ενεργοποίηση PCR στους 95°C για 30 δευτερόλεπτα, 45 κύκλους ενίσχυση ακολουθούμενη από ένα τελικό στάδιο επέκτασης για 10 λεπτά στους 72°C. Το πρόγραμμα ενίσχυσης DNA ξεκίνησε με ένα στάδιο μετουσίωσης στους 94°C για 3 λεπτά, ακολουθούμενο από 45 κύκλους 94°C για 30 δευτερόλεπτα, 55°C για 30 δευτερόλεπτα και ένα τελικό στάδιο επέκτασης στους 72°C για 1 λεπτό. Τα αμπλικόνια υποβλήθηκαν σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 6% και έγιναν ορατά κάτω από υπεριώδες φως με χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο. Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ Invitek MSB Spin PCRapace και η αλληλουχία του κύκλου έγινε προς τα εμπρός και προς την αντίστροφη κατεύθυνση χρησιμοποιώντας το κιτ ABI PRISM Big-Dye Termination Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Πραγματοποιήθηκε ανάλυση αλληλουχίας με τον ABI3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Οι συναινετικές αλληλουχίες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό SeqMan II (DNASTAR, Madison, Wis.). Για τα δείγματα από το HRSV ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία RT-PCR όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8, 9]. Εν συντομία, παρασκευάστηκε ένα μείγμα πολυπλεξίας σε τελικό όγκο 25 μl χρησιμοποιώντας 5 μl εκχυλισμένο RNA, 12,5 μl Eurogentec One-Step Reverse Transcriptase qPCR Master Mix που περιέχει ROX ως παθητική αναφορά, 0,125 μl Euroscript + RT & αναστολέας RNase (Eurogentec , Seraing, Βέλγιο) 200 nM HRSV-A και -B ειδικών εμπρόσθιων και ανάστροφων εκκινητών και 100 nM HRSV-A και -B MGB ανιχνευτών. Τα πρότυπα cRNA κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ MEGAshortscript T7 (Ambion, Austin, TX, USA) και ποσοτικοποιήθηκαν φασματοφωτομετρικά. Το ιικό φορτίο των θετικών δειγμάτων RV ποσοτικοποιήθηκε με qRT-PCR όπως περιγράφεται στο χειρόγραφο που δημοσιεύτηκε από τον Lu και τους συνεργάτες του [10]. Το κιτ Eurogentec Ένα Βήμα Αντίστροφης Μεταγραφάσης qPCR χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή του κύριου μείγματος όπως περιγράφεται παραπάνω. Το σετ εκκινητών HRSV-AF F 669-695 ctgtgatagarttccaacaaaaagaaca [8, 9] HRSV-AF F 718-745 agttacacctgcattaacactaaattcc [8, 9] HRSV-BN N 435-45gatagattCaaacaaaagaaca [8, 9] HRSV-AF F 718-745 8, 9] Οι ανιχνευτές MGB και ο ανιχνευτής, που βρίσκονται στο 5'UTR, προστέθηκαν σε τελική συγκέντρωση 1 μΜ και 0,1 μΜ, αντίστοιχα. Τα πρότυπα cRNA κατασκευάστηκαν με βάση το προϊόν PCR του δείγματος 1 χρησιμοποιώντας το κιτ MegaScript (Ambion, Austin, ΤΧ, ΗΠΑ). Η ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε με φασματοφωτόμετρο στα 260 nm και μετατράπηκε στον αριθμό μορίου [11] . Χρησιμοποιήθηκαν δεκαπλάσιες σειριακές αραιώσεις, επιτρέποντας την ανίχνευση σε μια περιοχή από 8,6 × 10 6 έως 8,6 × 10 2 αντίγραφα RNA. Οι δοκιμές RT-PCR διεξήχθησαν σε σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Ένα αρχικό στάδιο αντίστροφης μεταγραφής πραγματοποιήθηκε στους 48°C για 30 λεπτά, ακολουθούμενο από ένα στάδιο μετουσίωσης στους 95°C για 10 λεπτά. Τέλος, ολοκληρώθηκε ένα στάδιο ενίσχυσης 45 κυκλικών στους 95°C για 15 δευτερόλεπτα και 1 λεπτό στους 60°C. (37,5%) άνδρες, με διάμεση ηλικία τα 29 (εύρος 9 -46 έτη). Η ηλικία και το φύλο έλειπαν για 2 συμμετέχοντες της δεύτερης ομάδας. Συνολικά, το 52% των συμμετεχόντων ήταν μεταξύ 20-30 ετών. Μόνο το 6% ήταν κάτω των 20 ετών και το 3% ήταν άνω των 70 ετών. Συνολικά, 80 ασθενείς (78,4%) ένιωθαν ήδη άρρωστοι για 1 έως 7 ημέρες την ημέρα που ελήφθη το δείγμα. Επτά εθελοντές (6,8%) ήταν συμπτωματικοί για 8 έως 14 ημέρες και 9 συμμετέχοντες (8,8%) ήταν ήδη άρρωστοι για περισσότερες από 14 ημέρες την ημέρα της συλλογής του δείγματος. Τα στοιχεία για τη διάρκεια των συμπτωμάτων έλειπαν για 6 ασθενείς. Σχεδόν όλοι οι εθελοντές παρουσίασαν τουλάχιστον 2 συμπτώματα εκτός από δύο ασθενείς (Πίνακας 1) . Σαράντα επτά (46,1%) εθελοντές παραπονέθηκαν για συνεχή καταρροή ή βουλωμένη μύτη, 43 (42,2%) είχαν συχνά φταρνίσματα και 38 (37,3%) συμμετέχοντες είχαν σοβαρό πονόλαιμο (Πίνακας 1). Σε ένα πρώτο μέρος της μελέτης , συγκεντρώσαμε 70 EBC. Ο έλεγχος των EBC για 14 αναπνευστικούς ιούς (Πίνακας 2), έδειξε 5 θετικά δείγματα RV (7,1%) (Πίνακας 3). Σε ένα δεύτερο μέρος, συλλέξαμε 32 EBC από ασθενείς που παρουσιάστηκαν στον γενικό ιατρό τους. Δύο από αυτά τα EBC ήταν θετικά για έναν από τους 14 αναπνευστικούς ιούς που ερευνήθηκαν, 1 για RV και 1 για InfB. Για να επιθεωρηθεί ο ρυθμός ανίχνευσης των αναπνευστικών ιών στο συμπύκνωμα, λήφθηκε ένα NS από αυτή τη δεύτερη ομάδα εθελοντών για σύγκριση. Σε 15 από τα 32 NS (46,8%), απομονώθηκαν ένα ή περισσότερα ιικά παθογόνα. Ο ιικός έλεγχος του NS είχε ως αποτέλεσμα την ανίχνευση RV, InfA (υποτύπος H1N1) και HRSV-B. Ποσοτικοποίηση του ιικού φορτίου HRSV-B που αποδείχθηκε για δείγματα 72 και 101 ιικούς τίτλους 8,0 × 10 4 αντιγράφων RNA/ml και 6,8 × 10 7 αντιγράφων RNA/ml αντίστοιχα. Η δοκιμασία RV RT-PCR δεν επέτρεψε τον ποσοτικό προσδιορισμό όλων των δειγμάτων που βρέθηκαν θετικά για RV με PCR (Πίνακας 3). Η παρουσία του ίδιου παθογόνου τόσο στο EBC όσο και στο NS επιβεβαιώθηκε μόνο για 1 δείγμα: το δείγμα 71, το οποίο ήταν θετικό για RV τόσο στο EBC όσο και στο NS. Για το δείγμα 81, ανιχνεύθηκε RV στο NS και η ανάλυση του EBC έδειξε μόλυνση InfB. Για δείγματα EBC που συλλέχθηκαν το φθινόπωρο και τον χειμώνα του 2009/2010, οι μετρήσεις με το ECoVent στο (Πίνακας 3, δείγμα 81) ήταν θετικές για InfB όταν χρησιμοποιείτε το RTube™ σε συνδυασμό με το EcoVent. Θεωρητικά, ο ρυθμός δημιουργίας ιού (αριθμός αντιγράφων ιικού RNA που εκπνέονται ανά λεπτό) μπορεί να προβλεφθεί με ποσοτικοποίηση του εκπνεόμενου ιικού φορτίου. Στη συνέχεια, μπορεί να υπολογιστεί μια εκτίμηση των αντιγράφων RNA ανά λίτρο εκπνεόμενου αέρα ή ανά λεπτό. Η ποσοτικοποίηση του εκπνεόμενου InfB θα μας επέτρεπε να προβλέψουμε τον ρυθμό παραγωγής για αυτόν τον ιό. Λόγω ανεπαρκούς όγκου δείγματος, δεν μπορέσαμε να προσδιορίσουμε τον αριθμό των αντιγράφων RNA στο δείγμα. Η συλλογή συμπυκνωμάτων εκπνεόμενης αναπνοής είναι μια νέα και μη επεμβατική μέθοδος για τη λήψη δειγμάτων της ανώτερης αναπνευστικής οδού. Η συλλογή EBC είναι εύκολη στην εκτέλεση και μπορεί να πραγματοποιηθεί σε οικιακό περιβάλλον. Αυτή η μέθοδος είναι πολύ πιο ευχάριστη για τον ασθενή σε σύγκριση με τη δυσάρεστη και επεμβατική συλλογή ρινικών επιχρισμάτων, BAL, αναρροφήσεων κ.λπ. Αυτή η πτυχή καθιστά τη μέθοδο πολύ ελκυστική για τη συνήθη εργαστηριακή διάγνωση ιογενών λοιμώξεων. Οι περισσότερες μελέτες που εκτελούν αναλύσεις αναπνοής για ανίχνευση ιού χρησιμοποιούν τροποποιημένες μάσκες προσώπου, με αφαιρούμενη κεντρική περιοχή στο ηλεκτρέτ ή αφαιρούμενο φίλτρο τεφλόν στο οποίο προσκρούουν τα εκπνεόμενα σωματίδια [12] [13] [14] . Με τη συσκευή συλλογής RTube™, τα αερολυμένα σωματίδια του υγρού της επένδυσης των αεραγωγών κατακρημνίζονται σε συμπύκνωμα όταν ψύχεται η αναπνοή, το οποίο χρησιμεύει ως άμεσο σημείο εκκίνησης για μοριακές δοκιμές. Μέχρι τώρα, αυτή είναι η μελέτη με το μεγαλύτερο υποσύνολο εθελοντών που διερεύνησε Το EBC ως δείγμα για την ανίχνευση αναπνευστικών ιών. Προηγούμενες μελέτες ανέφεραν τη συμπερίληψη ενός περιορισμένου υποσυνόλου συμμετεχόντων και διερεύνησαν την παρουσία περιορισμένου αριθμού ιών στα δείγματα αναπνοής. Η μελέτη που διεξήχθη από τον Fabian και τους συνεργάτες του περιελάμβανε 12 εθελοντές [12] . Ο Huynh και οι συνεργάτες του στρατολόγησαν 9 εθελοντές για δειγματοληψία εκπνεόμενης αναπνοής [13] . Στη μελέτη των Stelzer-Braid et al., αναλύθηκαν 50 EBC [14] και οι St-George et al. αναφέρουν τη συμμετοχή 12 ενηλίκων [15] . Αυτές οι μελέτες έχουν επικεντρωθεί στην ανίχνευση των InfA και -B, PIV1-3, HRSV και HMPV, ενώ έχουμε εξετάσει τα δείγματα για μια ομάδα 14 κοινώς κυκλοφορούντων αναπνευστικών ιών. Με βάση την ανάλυση 99 EBC (3 EBC εξαιρέθηκαν), τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν την εκπνοή RV και InfB στο 7% των δειγμάτων μας. Δεδομένου ότι πολλοί από τους εθελοντές είχαν ήδη συμπτώματα για 1 έως 7 ημέρες, αρχικά υποθέσαμε ότι ήδη ανέρρωσαν από τη μόλυνση και δεν εξέπνεαν πλέον τον ιό. Για λοιμώξεις από κοινό κρυολόγημα, προτείνεται ότι ένα άτομο μπορεί να είναι ήδη μολυσματικό για 1 ή 2 ημέρες πριν εμφανίσει οποιαδήποτε συμπτώματα. Ωστόσο, σε ένα δεύτερο μέρος της μελέτης μας ξεκινήσαμε τη συλλογή EBC παράλληλα με ρινικά επιχρίσματα από ασθενείς που παρουσιάστηκαν στον γιατρό τους, 1 έως 3 ημέρες μετά την έναρξη των συμπτωμάτων. Μόνο για 1 συμπύκνωμα ανιχνεύθηκε το ίδιο παθογόνο τόσο στο EBC όσο και στο NS. Το ποσοστό ανίχνευσης για τα αναπνευστικά ιικά παθογόνα στο NS ήταν 46,8% που είναι πολύ υψηλότερο από το ποσοστό ανίχνευσης 7% στα EBC. Η χαμηλή ανίχνευση συμπυκνωμάτων θετικών ιών δεν μπορεί επομένως να αποδοθεί στο γεγονός ότι οι εθελοντές δεν ήταν πλέον μολυσματικοί. Ο ασύμβατος ρυθμός ανίχνευσης μεταξύ των δειγμάτων μπορεί επίσης να εξηγηθεί από τη διαφορετική σοβαρότητα της αναπνευστικής λοίμωξης, καθώς τα συγκριτικά δείγματα προέρχονταν από διαφορετικά μέρη της αναπνευστικής οδού. Οι ασθενείς που απέδωσαν θετικό NS μπορεί να υπέφεραν πιθανώς από λοίμωξη των ανώτερων αεραγωγών, ενώ οι θετικοί εθελοντές EBC μπορεί να είχαν παρουσιάσει μια πιο προχωρημένη, λοίμωξη του κατώτερου αναπνευστικού. Ωστόσο, η επίδραση της ρινικής εισπνοής στη συλλογή EBC, η οποία οδηγεί τα σχηματισμένα σωματίδια στην ανώτερη αναπνευστική οδό στα κάτω διαμερίσματα, αντί της στοματικής εισπνοής δεν διερευνήθηκε. Οι ασθενείς με θετικά δείγματα EBC παρουσίαζαν συμπτώματα για δύο ημέρες το πολύ τη στιγμή της συλλογής. Ωστόσο, αυτό δεν ήταν διαφορετικό για 7 ασθενείς με θετικό NS. Έξι ασθενείς που έδωσαν θετικό NS εμφάνιζαν συμπτώματα για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα κατά τη στιγμή της συλλογής (Πίνακας 3). Στην ομάδα των εθελοντών που έδωσε ένα αρνητικό EBC ή αρνητικό EBC και NS δείγμα, η εκδήλωση συμπτωμάτων αναφέρθηκε που κυμαίνονταν από 1 ημέρα έως περισσότερες από δύο εβδομάδες. Όταν τα αναφερθέντα συμπτώματα συγκρίθηκαν μεταξύ ασθενών θετικών για EBC (7) και θετικών ασθενών με NS (15), 27% και 33% στη θετική ομάδα NS παρουσίασαν ρίγος και μυϊκό πόνο, ενώ αυτό το σύμπτωμα δεν υποδείχθηκε από κανέναν ασθενή της θετικής ομάδας EBC. Σε όλες τις ομάδες αναφέρθηκε πυρετός, πονοκέφαλος, δακρύρροια, βουλωμένη μύτη, συχνό φτάρνισμα, πονόλαιμος και βήχας. Οι εθελοντές δεν είχαν διαγνωστεί με άλλα παθογόνα πριν από τη συμμετοχή τους στη μελέτη. Εφόσον δεν δοκιμάσαμε αυτά τα δείγματα για άλλα παθογόνα εκτός από ιούς, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα ορισμένα από τα αρνητικά NS να είναι θετικά για βακτήρια ή άλλα παθογόνα που προκαλούν αναπνευστική νόσο. Πρόσφατα, μια μελέτη ανέφερε ποσοστό ανίχνευσης 5% για τη γρίπη σε EBC [15] . Αυτό είναι στο ίδιο εύρος του ποσοστού ανίχνευσης που αναφέρουμε για τους ιούς του αναπνευστικού γενικά. Άλλες μελέτες με περιορισμένο αριθμό ασθενών, περιγράφουν μια αξιοσημείωτα υψηλότερη ευαισθησία από 33 έως 36% [12] [13] [14] αλλά το υψηλότερο ποσοστό μπορεί να οφείλεται στον χαμηλό αριθμό συμμετεχόντων που συμπεριλήφθηκαν [12] . Είναι αξιοσημείωτο ότι οι μελέτες που ανέφεραν αυτό το υψηλότερο ποσοστό ανίχνευσης χρησιμοποίησαν μάσκες συλλογής, ενώ η μελέτη που χρησιμοποιούσε το RTube™ ανέφερε συγκρίσιμα ευρήματα. Οι μάσκες προσώπου αποτελούνται από ηλεκτρόδιο που παγιδεύει ιούς που βασίζονται σε μόνιμα φορτισμένες ίνες [13] . Επιπλέον, το φίλτρο Teflon έχει πόρους 2 μm που θα συγκρατούν όλα τα μεγαλύτερα σωματίδια. Πιθανώς, ο χαμηλότερος ρυθμός ανίχνευσης μπορεί εν μέρει να εξηγηθεί από το γεγονός ότι το RTube™ κατασκευάζεται από πολυπροπυλένιο και δεν διαθέτει δυνατότητα έλξης και φιλτραρίσματος ιών όπως τα προαναφερθέντα υλικά. Η qRT-PCR που αναπτύχθηκε από τον Lu και τους συνεργάτες του για την ανίχνευση RV , δεν επέτρεψε την αξιολόγηση του ιικού φορτίου που υπάρχει στα δείγματα EBC [10] . Επίσης για 4 NS, ο τίτλος του ιού παρέμεινε απροσδιόριστος, πιθανώς λόγω της περιορισμένης ευαισθησίας της ανάλυσης. Για τη διάγνωση, ενδέχεται να απαιτούνται πιο ευαίσθητες μέθοδοι για την ανίχνευση αναπνευστικών ιών που υπάρχουν στο EBC, καθώς είναι απρόβλεπτο πόσο αραιωμένα είναι τα ιικά σωματίδια στο δείγμα. Πρόσφατα, αναπτύχθηκαν ένθετες δοκιμές qRT-PCR για να επιτρέπουν μια πιο ευαίσθητη ανίχνευση ιών σε αερολύματα [16]. Επίσης, παράγοντες που εξαρτώνται από το άτομο, όπως ο αριθμός των σωματιδίων που παράγονται, ο όγκος εκπνοής και η ηλικία του ασθενούς, έχουν γίνει προτείνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην εκπνοή των ιικών σωματιδίων. Οι συμμετέχοντες που στρατολογήθηκαν στη μελέτη του Fabian και των συναδέλφων τους ήταν 12 ετών και άνω [12] . Για τα νοσηλευόμενα παιδιά αναφέρεται πολύ υψηλότερο ποσοστό θετικών δειγμάτων για ιούς [14] . Στη μελέτη μας, η πλειοψηφία των εθελοντών ήταν μεταξύ 20 και 30 ετών. Συμπεριλήφθηκαν μόνο δύο παιδιά κάτω των 10 ετών και 3 ηλικιωμένοι (> 70 ετών). Ένα από τα παιδιά βρέθηκε θετικό για InfA στο NS, αλλά η λοίμωξη δεν επιβεβαιώθηκε στο EBC. Για τη γρίπη, προβλέφθηκε ρυθμός παραγωγής εκπνεόμενου RNA <3,2 έως 20 αντιγράφων RNA γρίπης ανά λεπτό, ποσοτικοποιώντας τα αερολύματα του ιού που επηρέασαν αφαιρούμενο φίλτρο τεφλόν μάσκας συλλογής [12] . Χρησιμοποιήσαμε το RTube™ σε συνδυασμό με το ECoVent, που επέτρεψε την καταγραφή πρόσθετων παραμέτρων αερισμού, όπως η συχνότητα αναπνοής και ο εκπνεόμενος όγκος. Με αυτόν τον τρόπο, όταν ποσοτικοποιείται ο αριθμός των αντιγράφων RNA στο EBC, μπορεί να εκτιμηθεί η ποσότητα των σωματιδίων του ιού που εκπνέονται ανά λίτρο ή ανά λεπτό. Δυστυχώς, δεν μπορέσαμε να προβλέψουμε το ποσοστό δημιουργίας ιών για το InfB, καθώς το ιικό φορτίο παρέμεινε απροσδιόριστο. Αν και μια εφευρετική, νέα και πολλά υποσχόμενη μέθοδος, το EBC που συλλέγεται από το RTube™ δεν φαίνεται να είναι κατάλληλο για τη διάγνωση λοιμώξεων του αναπνευστικού. Ωστόσο, αυτή η μέθοδος μπορεί να προσφέρει μια εναλλακτική λύση για την τρέχουσα προμήθεια δειγμάτων για επιδημιολογικές μελέτες των κυκλοφορούντων ιών. Αυτή η τεχνική επιβεβαιώνει επίσης την παρατήρηση ότι οι ιοί είναι σε θέση να διαδοθούν μέσω της κανονικής αναπνοής, ιδιαίτερα του RV. Επιπλέον, η συλλογή EBC από ασθενείς κατά τη διάρκεια λοιμώξεων του αναπνευστικού μπορεί να διερευνηθεί περαιτέρω για μοτίβα βιοδεικτών. Σε μόσχους που μολύνθηκαν πειραματικά με βόειο RSV, παρατηρήθηκε αύξηση του λευκοτριενίου Β4, που υποδηλώνει οξειδωτικό στρες. Αυτό το αυξημένο επίπεδο συσχετίστηκε επίσης με την ανάπτυξη βρογχικής υπερανταπόκρισης [17] . Στους ανθρώπους, ένα παροδικά αυξημένο επίπεδο H 2 O 2 παρατηρήθηκε κατά τη διάρκεια της λοίμωξης από κοινό κρυολόγημα. Αυτός ο δείκτης επέστρεψε στις βασικές τιμές όταν οι εθελοντές ανάρρωσαν από μόλυνση. Το H 2 O 2 έχει επίσης αναγνωριστεί ως ένας ενδιαφέρον δείκτης στο άσθμα, όπου σχετίζεται με χρόνια φλεγμονή των κατώτερων αεραγωγών [18] . Σε εθελοντές που είχαν μολυνθεί με InfA, παρατηρήθηκε αυξημένο επίπεδο CO κατά τη διάρκεια λοίμωξης του ανώτερου αναπνευστικού. Αυτή η παρατήρηση μπορεί να υπονοεί ότι το CO είναι δείκτης φλεγμονής των αεραγωγών ή αντιπροσωπεύει έναν από τους αμυντικούς μηχανισμούς του ξενιστή έναντι της ιογενούς λοίμωξης [19] . Επομένως, μια καλύτερη αναγνώριση της υπογραφής του βιοδείκτη σε συμπυκνώματα ατόμων που παρουσιάζουν ιογενή λοίμωξη μπορεί να συνεπάγεται ενδιαφέροντα ευρήματα για την αναγνώριση δεικτών που αντανακλούν φλεγμονή ή αντιική προστασία. Αυτό μπορεί να συμβάλει στα προφίλ βιοδεικτών που έχουν δημιουργηθεί για ασθένειες όπως το άσθμα και η ΧΑΠ, για τις οποίες οι ιογενείς λοιμώξεις προτείνεται να προκαλούν ή να επιδεινώνουν τα συμπτώματα [20] .", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 4084, "text": "102" } ], "id": 5194, "question": "Πόσοι ασθενείς ήμουν σε αυτή τη μελέτη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1731, "text": "η συλλογή EBC με χρήση του RTube™ δεν είναι αξιόπιστη για τη διάγνωση λοιμώξεων του αναπνευστικού" } ], "id": 5195, "question": "Ποιο ήταν το συμπέρασμα αυτής της μελέτης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7592, "text": "10 λεπτά" } ], "id": 5196, "question": "Πόσο καιρό εισέπνευσε ο ασθενής στο RTube;" }, { "answers": [ { "answer_start": 10638, "text": "52%" } ], "id": 5199, "question": "Τι ποσοστό των ασθενών ήταν μεταξύ 20 και 30 ετών σε αυτή τη μελέτη;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Πνευμονία της κοινότητας στα παιδιά — ένα μεταβαλλόμενο φάσμα της νόσουhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5608782/SHA: eecb946b106a94f26a79a964f0160e8e16f79f42A; Zar, Heather J.Date: 2017-09-21DOI: 10.1007/s00247-017-3827-8Άδεια: cc-byAbstract: Η πνευμονία παραμένει η κύρια αιτία θανάτου σε παιδιά εκτός της νεογνικής περιόδου, παρά τις προόδους στην πρόληψη και τη διαχείριση. Τα τελευταία 20 χρόνια, υπήρξε σημαντική μείωση της συχνότητας της παιδικής πνευμονίας και της θνησιμότητας που σχετίζεται με την πνευμονία. Τα νέα συζευγμένα εμβόλια κατά του Haemophilus influenzae τύπου b και του Streptococcus pneumoniae συνέβαλαν στη μείωση των ακτινολογικών, κλινικών και επιπλεγμένων περιπτώσεων πνευμονίας και έχουν μειώσει τη νοσηλεία και τη θνησιμότητα. Αναδεικνύεται η σημασία των συν-λοιμώξεων με πολλαπλά παθογόνα και η επικράτηση της νόσου που σχετίζεται με τον ιό. Απαιτείται καλύτερη πρόσβαση σε αποτελεσματικές στρατηγικές πρόληψης και διαχείρισης σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος, ενώ απαιτούνται νέες στρατηγικές για την αντιμετώπιση του υπολειπόμενου βάρους της νόσου μόλις εφαρμοστούν. Κείμενο: Η πνευμονία ήταν η κύρια αιτία θανάτου σε παιδιά μικρότερης ηλικίας από 5 χρόνια για δεκαετίες. Αν και υπήρξαν σημαντικές μειώσεις στη συνολική παιδική θνησιμότητα και στη θνησιμότητα λόγω πνευμονίας, η πνευμονία παραμένει η κύρια αιτία θανάτου στα παιδιά εκτός της νεογνικής περιόδου, προκαλώντας περίπου 900.000 από τους εκτιμώμενους 6,3 εκατομμύρια παιδικούς θανάτους το 2013 [1] . Σημαντική πρόοδος έχει σημειωθεί στην κατανόηση των παραγόντων κινδύνου και της αιτιολογίας της πνευμονίας, στην ανάπτυξη τυποποιημένων ορισμών περιπτώσεων και στην πρόληψη με την παραγωγή βελτιωμένων εμβολίων και στη θεραπεία. Τέτοιες εξελίξεις έχουν οδηγήσει σε αλλαγές στην επιδημιολογία, την αιτιολογία και τη θνησιμότητα από την παιδική πνευμονία. Ωστόσο, σε πολλούς τομείς η πρόσβαση σε αυτές τις παρεμβάσεις παραμένει μη βέλτιστη, με μεγάλες ανισότητες μεταξύ και εντός χωρών και περιφερειών. Σε αυτό το άρθρο εξετάζουμε τον αντίκτυπο των πρόσφατων προόδων πρόληψης και διαχείρισης στην επιδημιολογία, την αιτιολογία, την ακτινολογική παρουσίαση και την έκβαση της πνευμονίας στα παιδιά. Το συνολικό βάρος της παιδικής πνευμονίας έχει μειωθεί σημαντικά την τελευταία δεκαετία, παρά την αύξηση του παγκόσμιου παιδικού πληθυσμού από 605 εκατομμύρια το 2000 σε 664 εκατομμύρια το 2015 [2] . Πρόσφατα δεδομένα υποδηλώνουν ότι υπήρξε μείωση κατά 25% στη συχνότητα της πνευμονίας, από 0,29 επεισόδια ανά παιδί το έτος σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος το 2000, σε 0,22 επεισόδια ανά παιδικό έτος το 2010 [3] . Αυτό τεκμηριώνεται από μια μείωση 58% των ετών ζωής προσαρμοσμένης στην αναπηρία που σχετίζεται με την πνευμονία μεταξύ 1990 και 2013, από 186 εκατομμύρια σε 78 εκατομμύρια όπως εκτιμάται στη μελέτη Παγκόσμιας Επιβάρυνσης Νόσων [1] . Οι θάνατοι από πνευμονία μειώθηκαν από 1,8 εκατομμύρια το 2000 σε 900.000 το 2013 [1] . Αυτά τα δεδομένα δεν αντικατοπτρίζουν τον πλήρη αντίκτυπο της ολοένα και πιο διαδεδομένης χρήσης του συζευγμένου εμβολίου κατά του πνευμονιόκοκκου σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος, επειδή η συχνότητα της πνευμονίας και ο αριθμός των θανάτων είναι πιθανό να μειωθούν περαιτέρω ως αποτέλεσμα αυτής της ευρείας παρέμβασης [4] . Παρά την πρόοδο αυτή, εξακολουθεί να υπάρχει δυσανάλογη επιβάρυνση ασθενειών σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος, όπου σημειώνεται πάνω από το 90% των περιπτώσεων πνευμονίας και των θανάτων. Η συχνότητα εμφάνισης στις χώρες υψηλού εισοδήματος υπολογίζεται σε 0,015 επεισόδια ανά παιδικό έτος, σε σύγκριση με 0,22 επεισόδια ανά παιδικό έτος στις χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος [3]. Κατά μέσο όρο, 1 στα 66 παιδιά σε χώρες υψηλού εισοδήματος προσβάλλεται από πνευμονία ανά έτος, σε σύγκριση με 1 στα 5 παιδιά σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος. Ακόμη και στις χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος υπάρχουν περιφερειακές ανισότητες και προκλήσεις όσον αφορά την πρόσβαση σε υπηρεσίες υγειονομικής περίθαλψης: έως και το 81% των θανάτων από σοβαρή πνευμονία συμβαίνουν εκτός νοσοκομείου [5] . Εκτός από την υψηλότερη επίπτωση πνευμονίας, το ποσοστό θνησιμότητας εκτιμάται ότι είναι σχεδόν 10 φορές υψηλότερο σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος σε σύγκριση με χώρες υψηλού εισοδήματος [3, 5] . Η παιδική πνευμονία μπορεί επίσης να οδηγήσει σε σημαντική νοσηρότητας και χρόνιας νόσου. Η πνευμονία πρώιμης ζωής μπορεί να βλάψει την υγεία των πνευμόνων μακροπρόθεσμα μειώνοντας τη λειτουργία των πνευμόνων [6] . Η σοβαρή ή υποτροπιάζουσα πνευμονία μπορεί να έχει χειρότερη επίδραση στην πνευμονική λειτουργία. Τα αυξανόμενα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια μπορεί να σχετίζεται με την πρώιμη παιδική πνευμονία [7, 8]. Μια μετα-ανάλυση του κινδύνου μακροπρόθεσμων εκβάσεων μετά από παιδική πνευμονία κατηγοριοποίησε τα χρόνια αναπνευστικά επακόλουθα σε μεγάλες ομάδες (περιοριστική πνευμονική νόσο, αποφρακτική πνευμονοπάθεια, βρογχεκτασίες) και δευτερεύουσες (χρόνια βρογχίτιδα, άσθμα, μη φυσιολογική πνευμονική λειτουργία) [9]. Ο κίνδυνος ανάπτυξης τουλάχιστον ενός από τα κύρια επακόλουθα υπολογίστηκε σε 6% μετά από περιπατητικό περιστατικό πνευμονίας και 14% μετά από επεισόδιο πνευμονίας στο νοσοκομείο. Επειδή οι αναπνευστικές ασθένειες επηρεάζουν σχεδόν 1 δισεκατομμύριο ανθρώπους παγκοσμίως και αποτελούν κύρια αιτία θνησιμότητας και νοσηρότητας [10] , η παιδική πνευμονία μπορεί να συμβάλει σε σημαντική νοσηρότητα καθ 'όλη τη διάρκεια της ζωής. Οι ακτινολογικές αλλαγές θώρακα έχουν θεωρηθεί το χρυσό πρότυπο για τον ορισμό ενός περιστατικού πνευμονίας [11 ] επειδή τα κλινικά ευρήματα μπορεί να είναι υποκειμενικά και οι κλινικοί ορισμοί της πνευμονίας μπορεί να είναι μη ειδικοί. Το 2005, για να βοηθήσει στον καθορισμό των αποτελεσμάτων των μελετών πνευμονιοκοκκικού εμβολίου, η τυποποιημένη περιγραφή ακτινογραφίας θώρακος του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (ΠΟΥ) όρισε μια ομάδα παιδιών που θεωρούνταν πιο πιθανό να έχουν πνευμονιοκοκκική πνευμονία [12] . Ο όρος \"ενοποίηση τελικού σημείου\" περιγράφηκε ως μια πυκνή ή χνουδωτή αδιαφάνεια που καταλαμβάνει ένα τμήμα ή ολόκληρο έναν λοβό ή ολόκληρο τον πνεύμονα. Το \"άλλο διήθημα\" περιελάμβανε γραμμικές και αποσπασματικές πυκνότητες, περιβρογχική πάχυνση, δευτερεύουσες αποσπασματικές διηθήσεις που δεν είναι επαρκούς μεγέθους για να αποτελέσουν πρωτεύον τελικό σημείο παγίωσης και μικρές περιοχές ατελεκτασίας που στα παιδιά μπορεί να είναι δύσκολο να διακριθούν από την ενοποίηση. Η \"πρωτοπαθής πνευμονία τελικού σημείου\" περιελάμβανε είτε παγίωση τελικού σημείου είτε υπεζωκοτική συλλογή που σχετίζεται με πνευμονικό παρεγχυματικό διήθημα (συμπεριλαμβανομένου του \"άλλου\" διηθήματος). Η ευρεία χρήση του συζυγούς εμβολιασμού για πνευμονιόκοκκο και η αιμόφιλη ινφλουέντζα του συζυγούς τύπου Β έχει μειώσει το ραδιολογικό σύζευγμα πνευμονία. Σε μια ανασκόπηση τεσσάρων τυχαιοποιημένων ελεγχόμενων δοκιμών και δύο μελετών περιπτώσεων ελέγχου συζευγμένου εμβολιασμού Haemophilus influenzae τύπου Β σε κοινότητες υψηλής επιβάρυνσης, ο εμβολιασμός συσχετίστηκε με 18% μείωση της ακτινολογικής πνευμονίας [13] . Η εισαγωγή του συζευγμένου εμβολιασμού κατά του πνευμονιόκοκκου συσχετίστηκε με μείωση 26% της ακτινολογικής πνευμονίας στην Καλιφόρνια μεταξύ 1995 και 1998 [14] . Σε δοκιμές αποτελεσματικότητας εμβολίων σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος, ο συζευγμένος εμβολιασμός με πνευμονιόκοκκο μείωσε την ακτινολογική πνευμονία κατά 37% στη Γκάμπια [15] , 25% στη Νότια Αφρική [16] και 26% στις Φιλιππίνες [17] . Η ακτινολογική του ΠΟΥ Ο ορισμός του περιστατικού δεν είχε σκοπό να διακρίνει τη βακτηριακή από την ιογενή αιτιολογία, αλλά μάλλον να ορίσει ένα υποσύνολο περιπτώσεων πνευμονίας στις οποίες η πνευμονιοκοκκική λοίμωξη θεωρήθηκε πιο πιθανή και να παράσχει ένα σύνολο τυποποιημένων ορισμών μέσω των οποίων οι ερευνητές θα μπορούσαν να επιτύχουν ευρεία συμφωνία στην αναφορά ακτινογραφιών θώρακα. Ωστόσο, παρά την ευρεία χρήση πεδίου, υπάρχουν ανησυχίες σχετικά με την επαναληψιμότητα μεταξύ των παρατηρητών. Υπήρξε καλή συναίνεση για την περιγραφή της λοβιακής ενοποίησης, αλλά σημαντική διαφωνία σχετικά με την περιγραφή των αποσπασματικών και περιχιλιακών διηθήσεων [18, 19]. Επιπλέον, πολλά παιδιά με κλινικά σοβαρή πνευμονική νόσο δεν έχουν πρωτοπαθή τελικού σημείου πνευμονία: σε μια μελέτη προ-πνευμονιοκοκκικού συζευγμένου εμβολιασμού, μόνο το 34% των παιδιών που νοσηλεύτηκαν με πνευμονία είχαν πρωτοπαθή τελικού σημείου πνευμονία [20] . Έχει εισαχθεί ένας αναθεωρημένος ορισμός περιστατικών της \"υποτιθέμενης βακτηριακής πνευμονίας\" και αυτός ο ορισμός περιλαμβάνει περιπτώσεις πνευμονίας με κυψελιδική ενοποίηση που ορίζεται από τον ΠΟΥ, καθώς και εκείνες με άλλες μη φυσιολογικές διηθήσεις ακτινογραφίας θώρακα και C-αντιδρώσα πρωτεΐνη ορού τουλάχιστον 40 mg/ L [21, 22]. Αυτός ο ορισμός έχει αποδειχθεί ότι έχει μεγαλύτερη ευαισθησία από τον αρχικό ακτινολογικό ορισμό του ΠΟΥ για την πρωτοπαθή πνευμονία τελικού σημείου για την ανίχνευση της επιβάρυνσης της πνευμονίας που αποτρέπεται από τον συζευγμένο πνευμονιόκοκκο εμβολιασμό [23] . Χρησιμοποιώντας τον αναθεωρημένο ορισμό, το 10-δύναμο συζευγμένο εμβόλιο πνευμονιόκοκκου (πνευμονιόκοκκος συζευγμένος εμβολιασμός-10), είχε αποτελεσματικότητα εμβολίου 22% στην πρόληψη της υποτιθέμενης βακτηριακής πνευμονίας σε μικρά παιδιά στη Νότια Αμερική [22] και ο πνευμονιόκοκκος συζευγμένος εμβολιασμός-13 αποτελεσματικότητα του εμβολίου 39% στην πρόληψη της εικαζόμενης βακτηριακής πνευμονίας σε παιδιά ηλικίας άνω των 16 εβδομάδων που δεν είχαν μολυνθεί από τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV) στη Νότια Αφρική [21] . Επομένως, υπάρχουν πειστικές ενδείξεις ότι ο συζευγμένος εμβολιασμός με πνευμονιόκοκκο μειώνει τη συχνότητα εμφάνισης ακτινολογικής πνευμονίας. Ωστόσο, δεν υπάρχουν στοιχεία που να υποδηλώνουν ότι ο συζευγμένος εμβολιασμός για τον πνευμονιόκοκκο τροποποιεί την ακτινολογική εμφάνιση της πνευμονιοκοκκικής πνευμονίας. Το εμπύημα είναι μια σπάνια επιπλοκή της πνευμονίας. Αυξημένη επίπτωση εμπυήματος σε παιδιά σημειώθηκε σε ορισμένες χώρες υψηλού εισοδήματος μετά την εισαγωγή του συζευγμένου εμβολίου πνευμονιόκοκκου-7, και αυτό αποδόθηκε σε ορότυπους πνευμονιόκοκκου που δεν περιλαμβάνονται στον συζευγμένο πνευμονιόκοκκο εμβολιασμό-7, ειδικά 3 και 19Α [24]. Στις Ηνωμένες Πολιτείες, στοιχεία από μια εθνική βάση δεδομένων νοσοκομείων υποδηλώνουν ότι η επίπτωση του εμπυήματος αυξήθηκε 1,9 φορές μεταξύ 1996 και 2008 [25] . Στην Αυστραλία, η αναλογία ποσοστού επίπτωσης αυξήθηκε κατά 1,4 φορές όταν συγκρίθηκε η περίοδος προ-πνευμονιοκοκκικού συζευγμένου εμβολιασμού-7 (1998 έως 2004) με την περίοδο μετά τον συζευγμένο εμβολιασμό-7 μετά τον πνευμονιόκοκκο (2005 έως 2010) [26] . Στη Σκωτία, η συχνότητα εμφάνισης εμπυήματος στα παιδιά αυξήθηκε από 6,5 ανά εκατομμύριο μεταξύ 1981 και 1998, σε 66 ανά εκατομμύριο το 2005 [27] . Αυτές οι τάσεις έχουν αντιστραφεί από την εισαγωγή του συζευγμένου εμβολιασμού για τον πνευμονιόκοκκο-13. Δεδομένα από τις Ηνωμένες Πολιτείες υποδηλώνουν ότι το εμπύημα μειώθηκε κατά 50% σε παιδιά μικρότερα των 5 ετών [28]. Παρομοίως, δεδομένα από το Ηνωμένο Βασίλειο και τη Σκωτία έδειξαν σημαντική μείωση στο παιδιατρικό εμπύημα μετά την εισαγωγή του συζευγμένου εμβολιασμού για τον πνευμονιόκοκκο-13 [29, 30]. συνιστούν ότι η ακτινογραφία θώρακος δεν πρέπει να γίνεται τακτικά σε παιδιά με περιπατητική πνευμονία [31] [32] [33] . Οι ενδείξεις για ακτινογραφία θώρακος περιλαμβάνουν νοσηλεία, σοβαρή υποξαιμία ή αναπνευστική δυσχέρεια, αποτυχημένη αρχική αντιβιοτική θεραπεία ή υποψία για άλλες ασθένειες (φυματίωση, εισπνεόμενο ξένο σώμα) ή επιπλοκές. Ωστόσο, το υπερηχογράφημα του πνεύμονα σημείου φροντίδας αναδεικνύεται ως μια πολλά υποσχόμενη μέθοδος για τη διάγνωση της παιδικής πνευμονίας [34] . Εκτός από την επίδραση στην ακτινολογική πνευμονία, ο συζευγμένος πνευμονιόκοκκος εμβολιασμός μειώνει τον κίνδυνο νοσηλείας από πνευμονία που σχετίζεται με ιούς, πιθανώς μειώνοντας τη βακτηριακή -ιογενείς συν-λοιμώξεις που οδηγούν σε σοβαρή νόσο και νοσηλεία [35] . Μια ανάλυση οικολογικών μελετών και μελετών παρατήρησης της συχνότητας της πνευμονίας σε διαφορετικές ηλικιακές ομάδες αμέσως μετά την εισαγωγή του συζευγμένου εμβολιασμού για πνευμονιόκοκκο-7 στον Καναδά, την Ιταλία, την Αυστραλία, την Πολωνία και τις Ηνωμένες Πολιτείες έδειξε μειώσεις των νοσηλειών από πνευμονία κάθε αιτίας που κυμαίνονται από 15% έως 65% [36] . Στις Ηνωμένες Πολιτείες αφού ο συζευγμένος εμβολιασμός με πνευμονιόκοκκο-13 αντικατέστησε τον συζευγμένο πνευμονιόκοκκο εμβολιασμό-7, σημειώθηκε περαιτέρω μείωση κατά 17% στις νοσηλείες για πνευμονία μεταξύ των παιδιών που ήταν επιλέξιμα για εμβολιασμό και μια περαιτέρω μείωση κατά 12% μεταξύ των μη εμβολιασμένων ενηλίκων [28] . ανασκόπηση των μελετών αιτιολογίας πριν από τη διαθεσιμότητα νέων συζευγμένων εμβολίων επιβεβαίωσε το S. pneumoniae και το H. influenzae τύπου Β ως τα πιο σημαντικά βακτηριακά αίτια πνευμονίας, με Staphylococcus aureus και Klebsiella pneumoniae να σχετίζονται με ορισμένες σοβαρές περιπτώσεις. Ο αναπνευστικός συγκυτιακός ιός ήταν η κύρια ιογενής αιτία, που εντοπίστηκε στο 15-40% των περιπτώσεων πνευμονίας, ακολουθούμενη από τη γρίπη Α και Β, την παραγρίππη, τον ανθρώπινο μεταπνευμοϊό και τον αδενοϊό [37]. με αυξανόμενη αναγνώριση ότι η κλινική πνευμονία προκαλείται από τη διαδοχική ή ταυτόχρονη αλληλεπίδραση περισσότερων του ενός οργανισμών. Ιδιαίτερα η σοβαρή ασθένεια προκαλείται συχνά από πολλαπλά παθογόνα. Με υψηλή κάλυψη του συζευγμένου εμβολιασμού κατά του πνευμονιόκοκκου και του συζευγμένου εμβολιασμού κατά του Haemophilus influenzae τύπου Β, τα ιικά παθογόνα κυριαρχούν όλο και περισσότερο [38] . Σε πρόσφατες μελέτες περιπτώσεων ελέγχου, τουλάχιστον ένας ιός ανιχνεύθηκε στο 87% των περιπτώσεων κλινικής πνευμονίας στη Νότια Αφρική [39] , ενώ ιοί ανιχνεύθηκαν στο 81% των περιπτώσεων ακτινολογικής πνευμονίας στη Σουηδία [40] . Σε μια μεγάλη πολυκεντρική μελέτη στις Ηνωμένες Πολιτείες, ιικά παθογόνα ανιχνεύθηκαν στο 73% των παιδιών που νοσηλεύονταν με ακτινολογική πνευμονία, ενώ βακτήρια εντοπίστηκαν μόνο στο 15% των περιπτώσεων [41] . Μια μετα-ανάλυση 23 μελετών περιπτώσεων ελέγχου ιικής αιτιολογίας σε ακτινολογικά επιβεβαιωμένη πνευμονία σε παιδιά, που ολοκληρώθηκε έως το 2014, ανέφερε καλές ενδείξεις αιτιολογικής απόδοσης για τον αναπνευστικό συγκυτιακό ιό, τη γρίπη, τον μεταπνευμοϊό και τον ιό της παραγρίπης [42]. Ωστόσο, δεν υπήρχαν σταθερές ενδείξεις ότι πολλοί άλλοι ιοί που περιγράφονται συνήθως, συμπεριλαμβανομένων των ρινοϊών, αδενοϊών, βοκαϊών και κοροναϊού, απομονώθηκαν συχνότερα από κρούσματα παρά από μάρτυρες. Περαιτέρω απόδοση βακτηριακής αιτιολογίας είναι δύσκολη επειδή συχνά δεν είναι δυνατόν να γίνει διάκριση του αποικισμού από τα παθογόνα βακτήρια όταν αυτά απομονώνονται από ρινικά δείγματα [43] . Μια άλλη αιτιολογία είναι ο κοκκύτης. Την τελευταία δεκαετία υπήρξε επίσης αναζωπύρωση των κρουσμάτων κοκκύτη, ιδιαίτερα σε χώρες υψηλού εισοδήματος [44] . Επειδή η ανοσία κατά του κοκκύτη μετά τον ακυτταρικό εμβολιασμό κατά του κοκκύτη είναι λιγότερο μακροχρόνια από την ανοσία μετά από λοίμωξη άγριου τύπου ή ολοκυτταρικό εμβολιασμό, πολλές γυναίκες σε αναπαραγωγική ηλικία έχουν μειωμένα επίπεδα αντισωμάτων για τον κοκκύτη. Τα βρέφη τους μπορεί επομένως να γεννηθούν με χαμηλά επίπεδα διαπλακουντιακής ανοσοσφαιρίνης G κατά του κοκκύτη, καθιστώντας τα ευαίσθητα στη μόλυνση από κοκκύτη πριν από την ολοκλήρωση της σειράς αρχικών εμβολιασμών [45] . Το 2014, περισσότερα από 40.000 περιστατικά κοκκύτη αναφέρθηκαν στα Κέντρα Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων στις Ηνωμένες Πολιτείες. Σε ορισμένες πολιτείες, τα ποσοστά επίπτωσης με βάση τον πληθυσμό είναι υψηλότερα από οποιαδήποτε άλλη στιγμή τα τελευταία 70 χρόνια [44] . Αντίθετα, οι περισσότερες χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος χρησιμοποιούν ολοκυτταρικά εμβόλια για τον κοκκύτη και ο αριθμός των περιπτώσεων κοκκύτη σε αυτές τις χώρες ήταν σταθερός ή μειώνονταν μέχρι το 2015 [46] . Ωστόσο, πρόσφατα στοιχεία από τη Νότια Αφρική (όπου χρησιμοποιείται το ακυτταρικό εμβόλιο) δείχνουν μια σημαντική συχνότητα εμφάνισης κοκκύτη σε βρέφη που παρουσιάζουν οξεία πνευμονία: 2% των περιπτώσεων κλινικής πνευμονίας μεταξύ βρεφών που εγγράφηκαν σε μια κοόρτη γέννησης προκλήθηκαν από κοκκύτη [39] και 3,7 % των βρεφών και των μικρών παιδιών που προσήλθαν σε τριτοβάθμιο ακαδημαϊκό νοσοκομείο είχαν ενδείξεις μόλυνσης από κοκκύτη [47] . Ομοίως, η παιδική φυματίωση είναι κύρια αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας σε πολλές χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος και το Mycobacterium tuberculosis αναγνωρίζεται όλο και περισσότερο ως παθογόνο στην οξεία πνευμονία σε παιδιά που ζουν σε περιβάλλοντα υψηλού επιπολασμού της φυματίωσης. Μεταθανάτιες μελέτες παιδιών που πεθαίνουν από οξεία αναπνευστική νόσο έχουν κοινώς αναφερθεί M. tuberculosis [48, 49] . Μια πρόσφατη συστηματική ανασκόπηση της φυματίωσης ως συννοσηρότητας της παιδικής πνευμονίας ανέφερε νόσο επιβεβαιωμένη από καλλιέργεια σε περίπου 8% των περιπτώσεων [50] . Επειδή η νόσος της ενδοθωρακικής φυματίωσης επιβεβαιώνεται με καλλιέργεια μόνο σε μια μειοψηφία περιπτώσεων, η πραγματική επιβάρυνση θα μπορούσε να είναι ακόμη μεγαλύτερη. Η φυματίωση θα μπορούσε επομένως να συμβάλλει σημαντικά στην επίπτωση και τη θνησιμότητα της παιδικής πνευμονίας σε περιοχές υψηλού επιπολασμού. Η παιδική πνευμονία και η κλινικά σοβαρή νόσος προκύπτουν από μια πολύπλοκη αλληλεπίδραση παραγόντων κινδύνου ξενιστή και περιβάλλοντος [37] . Λόγω της αποτελεσματικότητας του συζυγούς εμβολιασμού κατά του πνευμονιόκοκκου και του συζευγμένου εμβολιασμού κατά του Haemophilus influenzae τύπου Β για την πρόληψη της ακτινολογικής και κλινικής πνευμονίας, ο ατελής ή ανεπαρκής εμβολιασμός πρέπει να θεωρείται ως κύριος παράγοντας κινδύνου για την παιδική πνευμονία που μπορεί να προληφθεί. Άλλοι παράγοντες κινδύνου περιλαμβάνουν το χαμηλό βάρος γέννησης, το οποίο σχετίζεται με 3,2 φορές αυξημένες πιθανότητες σοβαρής πνευμονίας σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος και 1,8 φορές αυξημένες πιθανότητες σε χώρες υψηλού εισοδήματος [51] . Ομοίως, η έλλειψη αποκλειστικού θηλασμού για τους πρώτους 4 μήνες της ζωής αυξάνει τις πιθανότητες σοβαρής πνευμονίας κατά 2,7 φορές στις χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος και 1,3 φορές στις χώρες υψηλού εισοδήματος. Οι δείκτες υποσιτισμού είναι ισχυροί παράγοντες κινδύνου για πνευμονία μόνο σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος, με εξαιρετικά σημαντικές αναλογίες πιθανοτήτων για λιποβαρή για την ηλικία (4,5), την καθυστέρηση (2,6) και την απώλεια βάρους (2,8). Ο συνωστισμός των νοικοκυριών έχει ομοιόμορφο κίνδυνο, με αναλογίες πιθανοτήτων μεταξύ 1,9 και 2,3 τόσο σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος όσο και σε χώρες υψηλού εισοδήματος. Η ατμοσφαιρική ρύπανση των εσωτερικών χώρων από τη χρήση στερεών καυσίμων ή καυσίμων από βιομάζα αυξάνει τις πιθανότητες πνευμονίας κατά 1,6 φορές. Η έλλειψη εμβολιασμού κατά της ιλαράς μέχρι το τέλος του πρώτου έτους της ηλικίας αυξάνει τις πιθανότητες πνευμονίας κατά 1,8 φορές [51] . Εκτιμάται ότι ο επιπολασμός αυτών των κρίσιμων παραγόντων κινδύνου σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος μειώθηκε κατά 25% μεταξύ 2000 και 2010, συμβάλλοντας στη μείωση της συχνότητας εμφάνισης πνευμονίας και της θνησιμότητας σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος, ακόμη και σε χώρες όπου εμβόλια δεν είναι διαθέσιμα [3] .Ο μοναδικός ισχυρότερος παράγοντας κινδύνου για πνευμονία είναι η μόλυνση από τον ιό HIV, η οποία είναι ιδιαίτερα διαδεδομένη στα παιδιά στην υποσαχάρια Αφρική. Τα παιδιά που έχουν μολυνθεί από τον ιό HIV έχουν 6 φορές αυξημένες πιθανότητες να αναπτύξουν σοβαρή πνευμονία ή θάνατο σε σύγκριση με τα μη μολυσμένα με HIV παιδιά [52] . Δεδομένου ότι η αποτελεσματική πρόληψη της μετάδοσης του HIV από τη μητέρα στο παιδί, υπάρχει ένας αυξανόμενος πληθυσμός παιδιών που εκτίθενται στον ιό HIV που δεν έχουν μολυνθεί. Ο υπερβολικός κίνδυνος πνευμονίας τους, σε σύγκριση με τα παιδιά που δεν έχουν εκτεθεί στον HIV, έχει περιγραφεί ως 1,3 έως 3,4 φορές υψηλότερος [53] [54] [55] [56] [57] . Ο συζευγμένος εμβολιασμός πνευμονιόκοκκου και συζευγμένος εμβολιασμός κατά του Haemophilus influenzae τύπου Β υπήρξαν αποτελεσματικά εργαλεία για τη μείωση της επίπτωσης, της σοβαρότητας και της θνησιμότητας της πνευμονίας [58, 59]. Ωστόσο, η δίκαιη κάλυψη και η πρόσβαση σε εμβόλια παραμένει κατώτερη των βέλτιστων. Μέχρι το τέλος του 2015, ο συζευγμένος εμβολιασμός κατά του Haemophilus influenzae τύπου Β είχε εισαχθεί σε 73 χώρες, με παγκόσμια κάλυψη να υπολογίζεται στο 68%. Ωστόσο, οι ανισότητες εξακολουθούν να είναι εμφανείς μεταξύ των περιοχών: στην Αμερική η κάλυψη υπολογίζεται σε 90%, ενώ στον Δυτικό Ειρηνικό είναι μόνο 25%. Μέχρι το 2015, ο συζευγμένος εμβολιασμός κατά του πνευμονιόκοκκου είχε εισαχθεί σε 54 χώρες, με παγκόσμια κάλυψη 35% για τρεις δόσεις συζευγμένου εμβολιασμού πνευμονιόκοκκου για βρεφικούς πληθυσμούς [60] . Για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος, ξεκίνησε η πρωτοβουλία του Παγκόσμιου Σχεδίου Πρόσβασης Εμβολίων του ΠΟΥ για να καταστήσει πιο δίκαια διαθέσιμα τα εμβόλια που σώζουν ζωές. Εκτός από την εξασφάλιση εγγυήσεων για τη χρηματοδότηση των εμβολίων, οι στόχοι του προγράμματος περιλαμβάνουν την οικοδόμηση πολιτικής βούλησης σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος για δέσμευση στον εμβολιασμό ως προτεραιότητα, το κοινωνικό μάρκετινγκ σε άτομα και κοινότητες, την ενίσχυση των συστημάτων υγείας και την προώθηση της σχετικής τοπικής έρευνας και ανάπτυξης καινοτομίες [61] .Ο μητρικός εμβολιασμός για την πρόληψη ασθενειών στα μικρότερα βρέφη έχει αποδειχθεί αποτελεσματικός για τον τέτανο, τη γρίπη και τον κοκκύτη [62] . Ο αντιγριπικός εμβολιασμός κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης είναι ασφαλής, παρέχει εύλογη προστασία της μητέρας από τη γρίπη και επίσης προστατεύει τα βρέφη για περιορισμένο χρονικό διάστημα από επιβεβαιωμένη μόλυνση γρίπης (αποτελεσματικότητα του εμβολίου 63% στο Μπαγκλαντές [63] και 50,4% στη Νότια Αφρική [64] ). Ωστόσο, καθώς τα επίπεδα αντισωμάτων πέφτουν απότομα μετά τη γέννηση, η προστασία του βρέφους δεν διαρκεί πολύ περισσότερο από τις 8 εβδομάδες [65]. Πρόσφατα, ο εμβολιασμός κατά του αναπνευστικού συγκυτιακού ιού στην εγκυμοσύνη έχει αποδειχθεί ασφαλής και ανοσογονικός και μια κλινική δοκιμή φάσης 3 για την αποτελεσματικότητα στην πρόληψη της νόσου του αναπνευστικού συγκυτιακού ιού στα βρέφη βρίσκεται σε εξέλιξη [66] . Μέσα σε μια δεκαετία, ο αναπνευστικός συγκυτιακός ιός στη βρεφική ηλικία μπορεί να προληφθεί με εμβόλια, με περαιτέρω μειώσεις στην επίπτωση της πνευμονίας, τη νοσηρότητα και τη θνησιμότητα [67] . Η βελτιωμένη πρόσβαση στην υγειονομική περίθαλψη, η καλύτερη διατροφή και οι βελτιωμένες συνθήκες διαβίωσης μπορεί να συμβάλουν σε περαιτέρω μείωση της επιβάρυνσης της παιδικής πνευμονίας . Το Ολοκληρωμένο Παγκόσμιο Σχέδιο Δράσης του ΠΟΥ για τη διάρροια και την πνευμονία υπογραμμίζει πολλές ευκαιρίες για την προστασία, την πρόληψη και τη θεραπεία των παιδιών [68] . Τα ποσοστά μητρικού θηλασμού μπορούν να βελτιωθούν με προγράμματα που συνδυάζουν εκπαιδευτικές και συμβουλευτικές παρεμβάσεις σε σπίτια, κοινότητες και εγκαταστάσεις υγείας και με την προώθηση νοσοκομείων φιλικών προς τα μωρά [69] . Ο βελτιωμένος αερισμός του σπιτιού, τα καθαρότερα καύσιμα μαγειρέματος και η μείωση της έκθεσης στον καπνό του τσιγάρου είναι απαραίτητες παρεμβάσεις για τη μείωση της συχνότητας και της σοβαρότητας της πνευμονίας [70, 71]. Η πρόληψη του παιδικού HIV είναι δυνατή με την παροχή παρεμβάσεων για την πρόληψη της μετάδοσης από τη μητέρα στο παιδί [72] . Η πρώιμη βρεφική εξέταση για HIV και η πρώιμη έναρξη της αντιρετροϊκής θεραπείας και της προφύλαξης με κοτριμοξαζόλη μπορούν να μειώσουν σημαντικά τη συχνότητα της πνευμονίας της κοινότητας μεταξύ των παιδιών που έχουν μολυνθεί από τον ιό HIV [73] . Οι παρεμβάσεις που βασίζονται στην κοινότητα μειώνουν τη θνησιμότητα από πνευμονία και έχουν το έμμεσο αποτέλεσμα της βελτιωμένης συμπεριφοράς φροντίδας [58] . Εάν αυτές οι οικονομικά αποδοτικές παρεμβάσεις κλιμακωθούν, υπολογίζεται ότι το 67% των θανάτων από πνευμονία σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος θα μπορούσαν να αποφευχθούν έως το 2025 [58] .Η διαχείριση περιπτώσεων πνευμονίας είναι μια στρατηγική με την οποία η σοβαρότητα της νόσου ταξινομείται ως σοβαρή ή μη σοβαρή. Όλα τα παιδιά λαμβάνουν έγκαιρα, κατάλληλα από του στόματος αντιβιοτικά και οι σοβαρές περιπτώσεις παραπέμπονται για παρεντερικά αντιβιοτικά. Όταν εφαρμόστηκε σε περιοχές με υψηλό φορτίο πριν από τη διαθεσιμότητα των συζευγμένων εμβολίων, η διαχείριση περιστατικών ως μέρος της Ολοκληρωμένης Διαχείρισης Παιδικής Ασθένειας συσχετίστηκε με μείωση 27% στη συνολική παιδική θνησιμότητα και 42% μείωση στη θνησιμότητα που σχετίζεται με την πνευμονία [74] . Ωστόσο, η κυριαρχία των ιογενών αιτιών της πνευμονίας και του χαμηλού περιστατικού θανάτου έχουν προκαλέσει ανησυχίες για την υπερβολική χρήση αντιβιοτικών. Έχουν διεξαχθεί αρκετές τυχαιοποιημένες ελεγχόμενες δοκιμές που συνέκριναν αντιβιοτικά από του στόματος με εικονικό φάρμακο για μη σοβαρή πνευμονία [75] [76] [77] και άλλες βρίσκονται σε εξέλιξη [78] . Σε δύο μελέτες, που πραγματοποιήθηκαν στη Δανία και στην Ινδία, τα αποτελέσματα των θεραπειών με αντιβιοτικά και εικονικό φάρμακο ήταν ισοδύναμα [76, 77]. Στην τρίτη μελέτη, στο Πακιστάν, υπήρχε ένα μη σημαντικό ποσοστό αποτυχίας 24% έναντι 20% στην ομάδα του εικονικού φαρμάκου, το οποίο θεωρήθηκε ότι δεν ήταν ισοδύναμο με την ομάδα των αντιβιοτικών [75] . Επιπλέον, επειδή η μη σοβαρή πνευμονία και η βρογχιολίτιδα που ταξινομείται από τον ΠΟΥ μπορεί να θεωρηθεί εντός ενός φάσματος παθήσεων του κατώτερου αναπνευστικού, πολλά παιδιά με κλινική πνευμονία θα μπορούσαν στην πραγματικότητα να έχουν ιογενή βρογχιολίτιδα, για την οποία τα αντιβιοτικά δεν είναι ωφέλιμα [79] . Αυτό αντικατοπτρίζεται στις εθνικές κατευθυντήριες οδηγίες για την πνευμονία της Βρετανίας [33] και της Ισπανίας [31], οι οποίες δεν συνιστούν αντιβιοτική θεραπεία ρουτίνας για παιδιά κάτω των 2 ετών με στοιχεία συζευγμένου εμβολιασμού κατά του πνευμονιόκοκκου που παρουσιάζουν μη σοβαρή πνευμονία. Οι εθνικές κατευθυντήριες γραμμές των Ηνωμένων Πολιτειών συνιστούν την απαγόρευση λήψης αντιβιοτικών σε παιδιά ηλικίας έως 5 ετών που παρουσιάζουν μη σοβαρή πνευμονία [32] . Ωστόσο, δεδομένης της υψηλής θνησιμότητας από πνευμονία σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος, της έλλειψης εύκολης πρόσβασης στη φροντίδα και του υψηλού επιπολασμού παραγόντων κινδύνου για σοβαρή νόσο, οι αναθεωρημένες κατευθυντήριες γραμμές για την πνευμονία του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας εξακολουθούν να συνιστούν αντιβιοτική θεραπεία για όλα τα παιδιά που πληροί τους ορισμούς των περιπτώσεων πνευμονίας του ΠΟΥ [80] .Η χρήση συμπληρωματικού οξυγόνου σώζει ζωές, αλλά αυτό δεν είναι παγκοσμίως διαθέσιμο σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος. Εκτιμάται ότι η χρήση συμπληρωματικών συστημάτων οξυγόνου θα μπορούσε να μειώσει τη θνησιμότητα των παιδιών με υποξική πνευμονία κατά 20% [81] . Ο εντοπισμός της ικανότητας των συστημάτων για την αύξηση της διαθεσιμότητας οξυγόνου στις εγκαταστάσεις υγείας και ο εντοπισμός των εμποδίων για περαιτέρω εφαρμογή είναι μεταξύ των 15 κορυφαίων προτεραιοτήτων για τη μελλοντική έρευνα για την παιδική πνευμονία [82] . Ωστόσο, έως και το 81% των θανάτων από πνευμονία το 2010 σημειώθηκαν εκτός υγειονομικών εγκαταστάσεων [5] , επομένως υπάρχουν μεγάλες προκλήσεις με την πρόσβαση σε υπηρεσίες υγείας και τη συμπεριφορά αναζήτησης υγείας των ευάλωτων πληθυσμών. Ο εντοπισμός και η αλλαγή των εμποδίων στην πρόσβαση στην υγειονομική περίθαλψη είναι ένας σημαντικός τομέας με τη δυνατότητα να επηρεάσει την επιβίωση και την υγεία των πιο ευάλωτων παιδιών [82] . Έχει σημειωθεί μεγάλη πρόοδος στη μείωση των θανάτων που προκαλούνται από παιδική πνευμονία. Η βελτιωμένη κοινωνικοοικονομική κατάσταση και οι εμβολιασμοί, κυρίως τα συζευγμένα εμβόλια (κατά του Haemophilus influenzae και του πνευμονιόκοκκου), έχουν οδηγήσει σε σημαντικές μειώσεις της συχνότητας και της σοβαρότητας της παιδικής πνευμονίας. Ισχυρότερες στρατηγικές για την πρόληψη και τη διαχείριση του HIV έχουν μειώσει τους θανάτους από πνευμονία που σχετίζονται με τον HIV. Ωστόσο, παρά τις ουσιαστικές αλλαγές στη συχνότητα εμφάνισης, την αιτιολογία και την ακτινολογία παγκοσμίως, εξακολουθούν να υπάρχουν ανισότητες στην πρόσβαση στην περίθαλψη και στη διαθεσιμότητα αποτελεσματικών παρεμβάσεων, ειδικά σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος. Οι αποτελεσματικές παρεμβάσεις πρέπει να είναι ευρύτερα διαθέσιμες και να αναπτυχθούν νέες παρεμβάσεις για την υπολειπόμενη επιβάρυνση της παιδικής πνευμονίας.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 1329, "text": "η πνευμονία παραμένει η κύρια αιτία θανάτου στα παιδιά εκτός της νεογνικής περιόδου," } ], "id": 502, "question": "Ποια είναι η κύρια αιτία θανάτου στα παιδιά μετά την ηλικία του 1 μήνα;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2408, "text": "Πρόσφατα δεδομένα υποδηλώνουν ότι υπήρξε μείωση κατά 25% στη συχνότητα της πνευμονίας, από 0,29 επεισόδια ανά παιδί το έτος σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος το 2000, σε 0,22 επεισόδια ανά παιδικό έτος το 2010 [3] . Αυτό τεκμηριώνεται από μια μείωση 58% των ετών ζωής προσαρμοσμένης στην αναπηρία που σχετίζεται με την πνευμονία μεταξύ 1990 και 2013, από 186 εκατομμύρια σε 78 εκατομμύρια" } ], "id": 511, "question": "Ποια είναι η μείωση των περιπτώσεων παιδικής πνευμονίας;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2865, "text": "Οι θάνατοι από πνευμονία μειώθηκαν από 1,8 εκατομμύρια το 2000 σε 900.000 το 2013" } ], "id": 512, "question": "Πόσο είναι η μείωση των θανάτων από παιδική πνευμονία;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3482, "text": "Η συχνότητα εμφάνισης στις χώρες υψηλού εισοδήματος υπολογίζεται σε 0,015 επεισόδια ανά παιδικό έτος, σε σύγκριση με 0,22 επεισόδια ανά παιδικό έτος στις χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος [3]. Κατά μέσο όρο, 1 στα 66 παιδιά σε χώρες υψηλού εισοδήματος προσβάλλεται από πνευμονία ανά έτος, σε σύγκριση με 1 στα 5 παιδιά σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος." } ], "id": 513, "question": "Ποσοστό παιδικής πνευμονίας για χώρες υψηλού εισοδήματος έναντι χωρών χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος." }, { "answers": [ { "answer_start": 4011, "text": "έως και το 81% των θανάτων από σοβαρή πνευμονία συμβαίνουν εκτός νοσοκομείου" } ], "id": 514, "question": "Τι ποσοστό των θανάτων από παιδική πνευμονία συμβαίνουν εκτός νοσοκομείου σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4139, "text": "το ποσοστό θνησιμότητας εκτιμάται ότι είναι σχεδόν 10 φορές υψηλότερο σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος σε σύγκριση με χώρες υψηλού εισοδήματος" } ], "id": 515, "question": "Ποσοστά θνησιμότητας για παιδική πνευμονία σε χώρες υψηλού εισοδήματος έναντι χωρών χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος." }, { "answers": [ { "answer_start": 4389, "text": "Η πνευμονία πρώιμης ζωής μπορεί να βλάψει την υγεία των πνευμόνων μακροπρόθεσμα μειώνοντας τη λειτουργία των πνευμόνων [6] . Η σοβαρή ή υποτροπιάζουσα πνευμονία μπορεί να έχει χειρότερη επίδραση στην πνευμονική λειτουργία. Τα αυξανόμενα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια μπορεί να σχετίζεται με την πρώιμη παιδική πνευμονία" } ], "id": 516, "question": "Πώς μπορεί η παιδική πνευμονία να επηρεάσει τη μετέπειτα υγεία ενός ατόμου;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5059, "text": "Ο κίνδυνος ανάπτυξης τουλάχιστον ενός από τα κύρια επακόλουθα υπολογίστηκε σε 6% μετά από περιπατητικό περιστατικό πνευμονίας και 14% μετά από επεισόδιο πνευμονίας στο νοσοκομείο." } ], "id": 517, "question": "Ποια είναι η αύξηση του κινδύνου αναπνευστικής νόσου μετά από παιδική πνευμονία." }, { "answers": [ { "answer_start": 11248, "text": "η ακτινογραφία θώρακος δεν πρέπει να γίνεται τακτικά σε παιδιά με περιπατητική πνευμονία [31] [32] [33] . Οι ενδείξεις για ακτινογραφία θώρακος περιλαμβάνουν νοσηλεία, σοβαρή υποξαιμία ή αναπνευστική δυσχέρεια, αποτυχημένη αρχική αντιβιοτική θεραπεία ή υποψία για άλλες ασθένειες (φυματίωση, εισπνεόμενο ξένο σώμα) ή επιπλοκές" } ], "id": 533, "question": "Ποιες παθήσεις που σχετίζονται με την πνευμονία ή παθήσεις θώρακα υποδεικνύουν την ανάγκη για παιδική ακτινογραφία;" }, { "answers": [ { "answer_start": 14898, "text": "Επειδή η ανοσία κατά του κοκκύτη μετά τον ακυτταρικό εμβολιασμό κατά του κοκκύτη είναι λιγότερο μακροχρόνια από την ανοσία μετά από λοίμωξη άγριου τύπου ή ολοκυτταρικό εμβολιασμό, πολλές γυναίκες σε αναπαραγωγική ηλικία έχουν μειωμένα επίπεδα αντισωμάτων για τον κοκκύτη" } ], "id": 535, "question": "Γιατί η ανοσία του κοκκύτη στα βρέφη έχει μειωθεί στα βρέφη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 18628, "text": "Η ατμοσφαιρική ρύπανση των εσωτερικών χώρων από τη χρήση στερεών καυσίμων ή καυσίμων από βιομάζα αυξάνει τις πιθανότητες πνευμονίας κατά 1,6 φορές. Η έλλειψη εμβολιασμού κατά της ιλαράς μέχρι το τέλος του πρώτου έτους της ηλικίας αυξάνει τις πιθανότητες πνευμονίας κατά 1,8 φορές" } ], "id": 538, "question": "Πώς επηρεάζει η ατμοσφαιρική ρύπανση τη συχνότητα εμφάνισης της παιδικής πνευμονίας;" }, { "answers": [ { "answer_start": 9926, "text": "μια σπάνια επιπλοκή της πνευμονίας" } ], "id": 923, "question": "Τι είναι το εμφύσημα;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Ανοσοτροποποιητική δράση και προστατευτικές επιδράσεις του πολυσακχαρίτη από το εκχύλισμα φύλλων Eupatorium adenophorum σε υψηλής παθογονικότητας λοίμωξη από τη γρίπη H5N1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3789439/SHA: efba1ccfuta2000: efba1ccf20000 Zhang, Yuewei; Wan, Chunyan; Wang, Hongjun; Hou, Lingyu; Chang, Jianyu; Fan, Kai; Xie, Xiangming Ημερομηνία: 2013-09-18DOI: 10.1155/2013/194976 Άδεια χρήσης: cc-byAbstract: Απαιτείται επειγόντως η ανάπτυξη νέων αντιικών παραγόντων ευρέως φάσματος κατά της λοίμωξης H5N1. Σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήσαμε τις ανοσοτροποποιητικές δραστηριότητες και την προστατευτική δράση του πολυσακχαρίτη Eupatorium adenophorum (EAP) έναντι του εξαιρετικά παθογόνου ιού της γρίπης του υποτύπου H5N1. Η θεραπεία με ΕΑΡ αύξησε σημαντικά την παραγωγή IL-6, TNF-α και IFN-γ τόσο in vivo όσο και in vitro όπως μετρήθηκε με qPCR και ELISA. Σε ένα μοντέλο λοίμωξης ποντικού, η ενδορινική χορήγηση EAP σε δόση 25 mg/kg σωματικού βάρους πριν από την ιική πρόκληση H5N1 ανέστειλε αποτελεσματικά την αντιγραφή του ιού, μείωσε τις βλάβες στους πνεύμονες και αύξησε το ποσοστό επιβίωσης. Αξιολογήσαμε περαιτέρω την έμφυτη ανοσολογική αναγνώριση του EAP, καθώς αυτή η διαδικασία ρυθμίζεται κυρίως από τον υποδοχέα δεκτίνης-1 και μαννόζης (MR). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το EAP μπορεί να έχει ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες και πιθανή προφυλακτική δράση έναντι της λοίμωξης από τη γρίπη H5N1. Η έρευνά μας προτείνει μια εναλλακτική στρατηγική για την ανάπτυξη νέων αντιγριπικών παραγόντων και των πλεονεκτημάτων των προϊόντων E. adenophorum. Κείμενο: Ο υψηλά παθογόνος ιός της γρίπης του υποτύπου H5N1 μπορεί να μεταδοθεί απευθείας από τα πουλερικά στον άνθρωπο και να προκαλέσει οξείες αναπνευστικές λοιμώξεις. Ο πανδημικός ιός γρίπης H5N1 αποτελούσε παγκόσμια απειλή για τη δημόσια υγεία λόγω της ταχείας εξάπλωσης και της υψηλής παθογονικότητας [1, 2] . Τα συμπτώματα σε ζώα ή ανθρώπους που έχουν μολυνθεί με H5N1 περιλαμβάνουν πυρετό, εγκεφαλίτιδα, πνευμονία και σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο (SARS) [3, 4] . Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας ανέφερε 622 ανθρώπινες περιπτώσεις μόλυνσης από τον ιό της γρίπης H5N1 υψηλής παθογονικότητας, συμπεριλαμβανομένων 371 θανάτων (ποσοστό θνησιμότητας >50%), από το 2003 έως το 2013 (http://www.who.int/influenza/human animal interface/H5N1 αθροιστικά αρχεία πινάκων/en/index.html). Επί του παρόντος, το πιο αποτελεσματικό προληπτικό μέτρο κατά του ιού της γρίπης είναι ο εμβολιασμός. Αρκετά αντιγριπικά φάρμακα έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως, συμπεριλαμβανομένης της ζαναμιβίρης (Relenza) και του oseltamivir (Tamiflu). Δυστυχώς, τα οφέλη τους έχουν περιοριστεί σημαντικά από την αντοχή στα φάρμακα και τη συχνή αντιγονική μετάλλαξη [5, 6]. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη νέων αντιγριπικών παραγόντων κατά του υποτύπου H5N1 είναι πολύ σημαντική. Το χωροκατακτητικό φυτό Eupatorium adenophorum, εγγενές στην Κεντρική Αμερική, έχει ισχυρή ικανότητα να προσαρμόζεται σε διαφορετικά περιβάλλοντα σε όλο τον κόσμο. Αυτό το φυτό εισέβαλε για πρώτη φορά στη νότια επαρχία Γιουνάν (Κίνα) τη δεκαετία του 1940 από τη Βιρμανία και το Βιετνάμ και γρήγορα εξαπλώθηκε στη νοτιοδυτική Κίνα κατά τη διάρκεια της δεκαετίας του 1950 [7, 8] . Τα τελευταία 50 χρόνια, το E. adenophorum έχει επηρεάσει σοβαρά το οικολογικό περιβάλλον στις μεσαίες υποτροπικές ζώνες της Κίνας, συμπεριλαμβανομένων των επαρχιών Yunnan, Guizhou, Sichuan και Guangxi, καταπατώντας γεωργικές εκτάσεις, λιβάδια και δάση [7] . Ο χειρωνακτικός, χημικός ή βιολογικός έλεγχος του E. adenophorum έχει εμποδίσει την ολοκληρωμένη ανάπτυξη και χρήση του για οικονομικό όφελος. Πολλά βιοενεργά συστατικά που απομονώθηκαν από το E. adenophorum έχουν δείξει αντιμικροβιακή δράση και ανοσοτροποποιητικές 2 ιδιότητες Συμπληρωματικής και Εναλλακτικής Ιατρικής Βασιζόμενης σε Αποδείξεις [9] . Σε μια πρόσφατη μελέτη, αξιολογήθηκαν οι αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες του αιθανολικού εκχυλίσματος φύλλων [10] . Ωστόσο, έχουν υπάρξει λίγες αναφορές που ασχολούνται με τη βιοδραστικότητα του πολυσακχαρίτη E. adenophorum (EAP). Οι ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες και το θεραπευτικό δυναμικό μεγάλου αριθμού βοτανικών πολυσακχαριτών έχουν αναφερθεί [11] . Αρκετοί πολυσακχαρίτες από Cordyceps militaris, Portulaca oleracea, Gracilaria lemaneiformis, Gyrodinium impudium και Panax ginseng έχουν περιγραφεί ως αποτελεσματικοί παράγοντες κατά της γρίπης κατά των στελεχών H1N1 και H3N2 [12] [13] 5 [14]. Σε πρόσφατες αναφορές, τα ανοσοενισχυτικά με βάση πολυσακχαρίτες ενίσχυσαν την ανοσογονικότητα και βελτίωσαν την προστατευτική αποτελεσματικότητα των εμβολίων H5N1 σε μοντέλα ζωικής λοίμωξης [16, 17]. Ωστόσο, από όσο γνωρίζουμε δεν έχουν υπάρξει αναφορές σχετικά με τη θεραπεία με EAP έναντι της υψηλής παθογονικότητας γρίπης H5N1. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήσαμε την πιθανή επίδραση του EAP έναντι της λοίμωξης από τη γρίπη H5N1 σε μοντέλο ποντικού. Αξιολογήθηκαν επίσης τα αποτελέσματα ενίσχυσης του ανοσοποιητικού και η έμφυτη ανοσολογική αναγνώριση του EAP. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι τα αποτελέσματα κατά του H5N1 του EAP προσφέρουν μια εναλλακτική στρατηγική για την ανάπτυξη αντιγριπικών παραγόντων και τη χρήση προϊόντων E. adenophorum. Ιός. Ο ιός της γρίπης H5N1 (A/bar-headed goose/ Qinghai/1/2010) που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη απομονώθηκε από τη λίμνη Qinghai τον Μάιο του 2010. Αυτό το προϊόν απομόνωσης είναι εξαιρετικά παθογόνο σε κύτταρα νεφρού σκύλου (MDCK) πουλερικών, ποντικών και Madin-Darby. Ο ιός πολλαπλασιάστηκε σε κύτταρα MDCK στους 37 ∘ C για 48 ώρες και το ιικό υπερκείμενο συλλέχτηκε, κλασματοποιήθηκε και αποθηκεύτηκε στους -80 ∘ C. Οι τίτλοι του ιού προσδιορίστηκαν με ανάλυση πλάκας όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18] . Ζώα και κύτταρα. Θηλυκά ποντίκια BALB/c ηλικίας 8-10 εβδομάδων ελήφθησαν από Vital River Laboratories (Πεκίνο, Κίνα) και τα αρχικά ζεύγη αναπαραγωγής αγοράστηκαν από τον Charles River (Πεκίνο, Κίνα). Τα ποντίκια ανατράφηκαν σε ανεξάρτητα αεριζόμενα κλουβιά (IVC) και έλαβαν τροφή και νερό χωρίς παθογόνα. Οι θεραπείες σε ζώα διέπονταν από τους Κανονισμούς Πειραματικών Ζώων της Αρχής του Πεκίνου και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Ζώων του Γεωπονικού Πανεπιστημίου της Κίνας. Η κυτταρική σειρά μακροφάγων λευχαιμικών μονοκυττάρων ποντικού Raw 264.7, κυτταρική σειρά επιθηλίου αδενοκαρκινώματος ανθρώπινου πνεύμονα A549-D και Madin-D Οι κυτταρικές σειρές νεφρών (MDCK) παρασχέθηκαν από το Κέντρο Κυτταρικών Πόρων του Peking Union Medical College. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν και διατηρήθηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις του προμηθευτή. Επαρχία Γιουνάν, Κίνα. Τα φύλλα κόπηκαν σε φέτες και στέγνωσαν στη σκιά. 100 g ξηρών υλικών κονιοποιήθηκαν σε ένα μίξερ και κατόπιν διηθήθηκαν με 40 mesh. Η σκόνη φύλλων εκχυλίστηκε με επεξεργασία υπερήχων με 1000 mL απεσταγμένου νερού για 45 λεπτά. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 1000 mL απεσταγμένου νερού και εκχυλίστηκε ξανά με επεξεργασία με υπερήχους για 30 λεπτά. Το προκύπτον υπερκείμενο συνδυάστηκε με αυτό που ελήφθη από την πρώτη επεξεργασία με υπερήχους. Το τελικό υδατικό κλάσμα εξατμίστηκε μέχρι ξηρού σε περιστροφικό εξατμιστήρα. Το υπόλειμμα που λήφθηκε διαλύθηκε σε απεσταγμένο νερό και διατηρήθηκε παγωμένο στους 4 °C. Το εκχύλισμα φυγοκεντρήθηκε στα 3000 g/min για 25 λεπτά και συμπυκνώθηκε στους 80 °C για 8 ώρες για να παρασκευαστεί πολυσακχαρίτης. Το υπερκείμενο στη συνέχεια αποπρωτεϊνώθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Sevag και υποβλήθηκε σε διαπίδυση έναντι νερού για 48 ώρες. Το τελικό υγρό αναμίχθηκε με τριπλάσιο όγκο αιθανόλης 95% (ο/ο) και φυγοκεντρήθηκε στα 3000 g/min για 10 λεπτά. Τα ιζήματα πλύθηκαν διαδοχικά με απόλυτη αιθανόλη, αιθέρα και ξηράνθηκαν υπό κενό στους 40 ∘ C για να ληφθεί ο ακατέργαστος πολυσακχαρίτης (απόδοση = 1,2%). Η περιεκτικότητα σε EAP προσδιορίστηκε με τη μέθοδο phenol-H2SO4 [19].Vitro. 2,5 mL A549 και Raw 264,7 κύτταρα (4 x 105/mL) ανά φρεάτιο επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν στους 37 ∘ C υπό 5% CO2 για 24 ώρες. Το μέσο απομακρύνθηκε και 2,5 mL μέσο καλλιέργειας που περιείχε διαφορετικές συγκεντρώσεις ΕΑΡ (50, 100, 200 g/mL) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Οι έλεγχοι υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 36 ώρες μετά την επεξεργασία για εκχύλιση RNA και ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR). Δοκιμασία. Σε ποντίκια χορηγήθηκε ΕΑΡ σε δόση 5, 10, 25 ή 50 mg/kg σωματικού βάρους, ενδορινικά μία φορά την ημέρα για 5 ημέρες πριν από την πρόκληση. Σε ποντίκια ελέγχου χορηγήθηκε PBS χρησιμοποιώντας το ίδιο πρόγραμμα. Τα αποθέματα του ιού της γρίπης αραιώθηκαν σε PBS. Τα ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν με Zotile (Virbac, Γαλλία) ενδομυϊκά στα 15 mg/kg (σωματικό βάρος) και στη συνέχεια μολύνθηκαν ενδορινικά με 120 μονάδες σχηματισμού πλάκας (PFU) του ιού της γρίπης H5N1 σε 50 L. Ο πνευμονικός ιστός πέντε ποντικών ανά ομάδα συλλέχθηκε σε ημέρα 0 πριν από την πρόκληση για qPCR και ELISA. Πνευμονικός ιστός από άλλα πέντε ποντίκια την ημέρα 3 μετά τη μόλυνση συλλέχθηκε για ανάλυση πλάκας και qPCR. Δέκα ποντίκια ανά ομάδα παρατηρήθηκαν για επιβίωση για 14 ημέρες και καταγράφηκαν σωματικά βάρη.2.6. Δοκιμασία πλάκας. Κύτταρα MDCK καλλιεργήθηκαν σε DMEM (Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA) που περιείχε 10% FBS (Hyclone Laboratories), 100 U/mL πενικιλλίνη και 100 g/mL στρεπτομυκίνη (Invitrogen, San Diego, CA, USA). Το υπερκείμενο πνευμονικού ιστού αραιώθηκε 10 φορές και προστέθηκε σε μια κυτταρική μονοστιβάδα καλυμμένη με ημιστερεό άγαρ που περιείχε 0,5 g/mL τρυψίνης TPCK (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ). Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ∘ C, 5% CO 2 για 60-72 ώρες και χρωματίστηκαν με 1% κρυσταλλική βιολέτα. Συνολικό RNA από 1 × 10 6 κύτταρα ή 10 mg πνευμονικού ιστού παρασκευάστηκε από την Trizol (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή . Το RNA που έχει υποστεί επεξεργασία με DNase (0,2 g) μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας τυχαίους εκκινητές. Η έκφραση του γονιδίου της αιμοσυγκολλητίνης (HA) του ιού της γρίπης H5N1 ανιχνεύθηκε με qPCR χρησιμοποιώντας το κιτ Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Ήταν χρησιμοποιήθηκε: μπροστινό αστάρι, 5 -CGC AGT ATT CAG AAG AAG CAAGAC-3; και ανάστροφο αστάρι, 5 -TCC ATA AGG ATA GAC CAG CTA CCA-3. Η αντίδραση διεξήχθη σε θερμικό κυκλοποιητή ABI 7500 με ένα αρχικό στάδιο μετουσίωσης στους 95 ∘ C για 10 λεπτά, ακολουθούμενο από 40 κύκλους των 95 ∘ C για 15 δευτερόλεπτα, 56 ∘ C για 30 δευτερόλεπτα και 72 ∘ C για 40 δευτερόλεπτα. Ο αριθμός αντιγράφων του γονιδίου ΗΑ υπολογίστηκε με λογισμικό 7500 v2.0 (Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας ένα πλασμίδιο που περιέχει ΗΑ γνωστής συγκέντρωσης ως πρότυπο. Η σχετική qPCR πραγματοποιήθηκε για άλλα οκτώ γονίδια: χακτίνη, h IL-6, h IFN - και hTNF-για κύτταρα Α549. μακτίνη, mTLR-2, mTLR-4, mDectin-1, mMR, mIL-6, mIFN- και mTNF-για Raw264.7 κύτταρα. Οι αλληλουχίες των εκκινητών δείχνονται στον Πίνακα 1. Η αντίδραση διεξήχθη με 95 ∘ C για 10 λεπτά, ακολουθούμενο από 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ∘ C για 15 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 52 ∘ C για 30 δευτερόλεπτα και επέκταση στους 72 ∘ C για 40 δευτερόλεπτα. Η πολλαπλάσια αλλαγή στη γονιδιακή έκφραση κανονικοποιήθηκε σε μάρτυρες (αγενή ποντίκια) με 2 -ΔΔCT χρησιμοποιώντας -ακτίνη ως εσωτερικό πρότυπο [20] .2.8. ELISA. Τα επίπεδα IL-6, TNF- και IFN στον πνεύμονα δοκιμάστηκαν με κιτ ELISA (Boster, Wuhan, Κίνα) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ένα γραμμάριο πνευμονικού ιστού από κάθε ποντικό αλέστηκε σε 1 mL PBS και φυγοκεντρήθηκε για 20 λεπτά στις 5000 rpm. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και αραιώθηκαν 10 φορές για ELISA. 2.10. Στατιστική ανάλυση. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μονόδρομες ANOVA με SPSS 12.0 (SPSS Taiwan Corp., Taiwan) και < 0.05 θεωρήθηκε σημαντική. Πολλοί βοτανικοί πολυσακχαρίτες παρουσιάζουν ανοσοτροποποιητική δράση [11] . Για να προσδιορίσουμε τις ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες του EAP, διερευνήσαμε την πιθανή επίδραση των πολυσακχαριτών στα κύτταρα A549 και Raw264.7. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις ΕΑΡ (50, 100, 200 g/mL) για 36 ώρες. Τα επίπεδα mRNA των IL-6, TNF- και IFN-ανιχνεύθηκαν με qPCR. Το Σχήμα 1 δείχνει τις ανοσοτροποποιητικές δραστηριότητες του ΕΑΡ in vitro. Διάφορες συγκεντρώσεις EAP προκάλεσαν ισχυρή έκκριση IL-6, TNF- και IFN- με δοσοεξαρτώμενο τρόπο τόσο στα κύτταρα A549 (Εικόνες 1(a)-1(c)) όσο και στα κύτταρα Raw264.7 (Εικόνες 1(d) -1(f)) σε σύγκριση με την ομάδα θεραπείας με PBS. Για να ελεγχθεί εάν το EAP θα μπορούσε να προστατεύσει ποντίκια με H5N1, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με EAP σε δόση 5, 10, 25 ή 50 mg/kg σωματικού βάρους ενδορινικά μία φορά την ημέρα για 5 ημέρες πριν από την πρόκληση ιού με 120 PFU. Δέκα ποντίκια ανά ομάδα παρακολουθήθηκαν για 14 ημέρες για το ποσοστό επιβίωσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2 (α), όλα τα ποντίκια που έλαβαν PBS πέθαναν την ημέρα 11. Τα ποντίκια στα οποία χορηγήθηκε 25 mg/kg EAP είχαν ποσοστό επιβίωσης 50% την ημέρα 14, το οποίο ήταν σημαντικά υψηλότερο από εκείνους που έλαβαν PBS (με ανάλυση λογαριθμικής κατάταξης). Η θεραπεία με EAP 10 mg/kg και 50 mg/kg φάνηκε επίσης να έχει πλεονέκτημα επιβίωσης, αλλά όχι στατιστικά σημαντικό. Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι η προστατευτική δράση του EAP έναντι της μόλυνσης από H5N1 απαιτεί μέτρια δόση. Η θεραπεία με ΕΑΡ ανακούφισε επίσης την απώλεια βάρους σε μολυσμένους ποντικούς (Εικόνα 2(β)). Για να προσδιοριστεί το ιικό φορτίο στον πνεύμονα των μολυσμένων ποντικών, πραγματοποιήθηκαν δοκιμές πλάκας και qPCR. Οι τίτλοι του πνευμονικού ιού στην ομάδα ΕΑΡ (25 mg/kg) ήταν σημαντικά χαμηλότεροι από τους τίτλους στα ποντίκια που έλαβαν PBS την ημέρα 3 μετά τη μόλυνση (Εικόνες 2(c) και 2(d)). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ξεκάθαρα ότι η ενδορινική χορήγηση του EAP ελέγχει την αναπαραγωγή του ιού H5N1 και βελτιώνει τα ποσοστά επιβίωσης σε ένα μοντέλο ποντικού. Η προστατευτική δράση του EAP έναντι του ιού H5N1 είναι πιθανό να οφείλεται στις ανοσοτροποποιητικές του ιδιότητες. Για την ανίχνευση της έκφρασης IL-6, TNF- και IFN, συλλέχθηκαν πνεύμονες πέντε ποντικών ανά ομάδα την ημέρα 0 πριν από τη μόλυνση και δοκιμάστηκαν με qPCR και ELISA. Τα επίπεδα mRNA στην ομάδα ΕΑΡ (25 mg/kg) ήταν σημαντικά υψηλότερα από εκείνα στον μάρτυρα PBS (αυθεντικά ποντίκια) (Εικόνες 3(α)-3(γ)). Τα επίπεδα διαλυτών κυτοκινών την ημέρα 0 μετρήθηκαν με ELISA και τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με τα αποτελέσματα qPCR, παρόλο που η παραγωγή IFN στην ομάδα EAP δεν ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη της ομάδας PBS (= 0,0599) (Εικόνες 3(g)- 3(i) ). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το EAP αυξάνει την παραγωγή IL-6, TNF- και IFN. Η έκφραση IL-6, TNF- και IFN την ημέρα 3 μετά τη μόλυνση προσδιορίστηκε με qPCR. Αντίθετα, τα επίπεδα TNF-mRNA μετά από θεραπεία με EAP (25 mg/kg) ήταν σημαντικά χαμηλότερα από αυτά στην ομάδα PBS (Εικόνα 3(ε)), ενώ η έκφραση της IL-6 και της IFN ήταν μόνο ελαφρώς χαμηλότερη (μη σημαντική) ( Σχήματα 3(δ) και 3(στ) ). Αυτά τα αποτελέσματα μπορεί να εξηγηθούν από το υψηλότερο ιικό φορτίο και την πιο σοβαρή φλεγμονώδη απόκριση σε ποντίκια που έλαβαν PBS. Η υπερβολική φλεγμονή μπορεί να προκαλέσει σοβαρές βλάβες στους πνεύμονες κατά τη διάρκεια της λοίμωξης από τη γρίπη H5N1. Για να αξιολογηθούν οι ιστοπαθολογικές αλλαγές στους πνεύμονες των μολυσμένων ποντικών, εξετάστηκαν ιστοί κάθε ομάδας την 3η ημέρα μετά τη μόλυνση. Οι πνεύμονες των ποντικών που έλαβαν PBS εμφάνισαν σοβαρή απόκριση φλεγμονής, που χαρακτηρίζεται από διάμεσο οίδημα, φλεγμονώδη κυτταρική διήθηση γύρω από μικρά αιμοφόρα αγγεία, κυψελιδικό αυλό πλημμυρισμένο με υγρό οιδήματος αναμεμειγμένο με απολεπισμένα κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα και πάχυνση των κυψελιδικών τοιχωμάτων (Εικόνες 4(c) και 4(δ) ). Οι πνεύμονες των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με EAP (25 mg/kg) εμφάνισαν ηπιότερες βλάβες από εκείνες που έλαβαν PBS, που χαρακτηρίζονται από σημεία βρογχοπνευμονίας με διάμεσο οίδημα και διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων γύρω από μικρά αιμοφόρα αγγεία (Εικόνες 4(α) και 4(β)). Τα ιικά φορτία και η φλεγμονώδης παραγωγή κυτοκίνης στον πνεύμονα συσχετίστηκαν. υποδηλώνοντας ότι η θεραπεία με EAP μειώνει τις βλάβες των πνευμόνων σε μολυσμένα με H5N1 ποντίκια. Οι πολυσακχαρίτες που προέρχονται από πολλά φυτά ενισχύουν την έκκριση κυτοκινών και χημειοκινών, όπως TNF-, IL-6, IL-8 και IL-12 [11] . Αυτή η ανοσοτροποποιητική δράση προκαλείται κυρίως μέσω της αναγνώρισης πολυμερών πολυσακχαριτών από αρκετούς υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων (PRRs). Για να προσδιοριστεί ποιος υποδοχέας συμβάλλει άμεσα στην έμφυτη ανοσολογική αναγνώριση του ΕΑΡ, ο υποδοχέας τύπου Toll 2 (TLR2), ο TLR4, η δεκτίνη-1 και ο υποδοχέας μαννόζης (MR) εξετάστηκαν με qPCR τόσο in vivo όσο και in vitro. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ΕΑΡ σε δόση 25 mg/kg σωματικού βάρους ενδορινικά μία φορά ημερησίως για 5 ημέρες, με τα ποντίκια ελέγχου να λαμβάνουν PBS. Ολικό RNA πνεύμονα παρασκευάστηκε για qPCR. Η έκφραση της δεκτίνης-1 και του MR σε ποντίκια που έλαβαν EAP ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με τους ελέγχους, ενώ η έκφραση των TLR2 και TLR4 ήταν ελαφρώς υψηλότερη, αλλά όχι στατιστικά σημαντική (Εικόνα 5(α)). Η in vitro δοκιμασία έδειξε παρόμοιες τάσεις. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5 (β), τα κύτταρα Raw264.7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 200 g/mL EPA για 36 ώρες πριν από την qPCR. Τα επίπεδα δεκτίνης-1 και MR ήταν σημαντικά υψηλότερα, ενώ η έκφραση των TLR2 και TLR4 δεν άλλαξε. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η αναγνώριση EAP έλαβε χώρα κυρίως μέσω της οδού Dectin-1 και MR. Σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήσαμε τις ανοσοτροποποιητικές δραστηριότητες και την προστατευτική επίδραση του EAP έναντι της λοίμωξης από τη γρίπη H5N1 σε μοντέλο ποντικού. Από όσο γνωρίζουμε, αυτά τα ευρήματα είναι τα πρώτα που δείχνουν την αντι-Η5Ν1 επίδραση του EAP. Η ενδορινική χορήγηση του EAP πριν από την πρόκληση του ιού H5N1 βελτίωσε τα ποσοστά επιβίωσης των μολυσμένων ποντικών με αντίστοιχη μείωση του πνευμονικού ιικού φορτίου. Το αποτέλεσμα κατά του H5N1 ήταν πολύ πιθανό λόγω της έμφυτης ανοσολογικής αναγνώρισης του EAP και της έκκρισης έμφυτων ανοσομεσολαβητών (IL-6, TNF και IFN-) πριν από τη μόλυνση. Επιπλέον, η επίδραση του EAP στην έκφραση PRR (συμπεριλαμβανομένων των TLR2, TLR4, Dectin-1 και MR) προσδιορίστηκε τόσο in vivo όσο και in vitro. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η έμφυτη ανοσολογική αναγνώριση του EAP εξαρτιόταν από την ενεργοποίηση των μονοπατιών της Δεκτίνης-1 και της MR. Τα δεδομένα μας καταδεικνύουν τη σκοπιμότητα χρήσης του EAP ως νέου ανοσοτροποποιητικού παράγοντα κατά της λοίμωξης από γρίπη. Δυστυχώς, η σύνθεση σακχάρου του EAP δεν έχει χαρακτηριστεί. Η εμφάνιση νέων ανθεκτικών στα φάρμακα στελεχών που προκύπτουν από την αντιγονική μετατόπιση περιορίζει τα θεραπευτικά οφέλη του εμβολιασμού και των αντιικών παραγόντων στον έλεγχο της γρίπης [6, 21, 22]. Επομένως, απαιτείται επειγόντως η ανάπτυξη νέων στρατηγικών ευρέως φάσματος κατά της γρίπης. Οι περισσότεροι βοτανικοί πολυσακχαρίτες είναι ιδανικοί υποψήφιοι για νέους ανοσοτροποποιητικούς παράγοντες λόγω των μη τοξικών ιδιοτήτων τους και των λιγότερων παρενεργειών σε σύγκριση με τους πολυσακχαρίτες που προέρχονται από βακτήρια. Ένας αριθμός πολυσακχαριτών που απομονώθηκαν από φυτά και μύκητες εμφανίζουν αποτελεσματικά αντιικά οφέλη έναντι του ιού της γρίπης Α (συμπεριλαμβανομένων των υποτύπων H1N1 και H3N2) [12] [13] [14] [15] . Η χρήση πολυσακχαριτών ως ανοσοτροποποιητικού παράγοντα σε μελέτες αντι-Η5Ν1 είναι σπάνια. Σε αυτό το έγγραφο, τα δεδομένα μας δείχνουν τις ανοσοτροποποιητικές δραστηριότητες του EAP τόσο in vivo όσο και in vitro. Η θεραπεία με EAP αύξησε την παραγωγή IL-6, TNF- και IFN και παρέχει πλεονέκτημα επιβίωσης σε μολυσμένα με H5N1 ποντίκια. Το ποσοστό επιβίωσης μετά την προκαταρκτική θεραπεία με EAP (25 mg/kg σωματικού βάρους) ήταν σημαντικά υψηλότερο από ό,τι σε ποντικούς που έλαβαν PBS (50% έως 0%). Σε προηγούμενες αναφορές, υψηλά επίπεδα προφλεγμονωδών κυτοκινών και χημειοκινών (συμπεριλαμβανομένων των TNF-, IL-6 και IFN-) ανιχνεύθηκαν κατά τη διάρκεια μόλυνσης από H5N1 [23, 24]. Αυτή η «καταιγίδα κυτοκινών» οδηγεί σε σοβαρά αναπνευστικά συμπτώματα και τραυματισμό του ανοσοποιητικού του ξενιστή. Έτσι, οι καταιγίδες κυτοκινών που προκαλούνται από το H5N1 υποτίθεται ότι είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας και η χρήση αντιφλεγμονωδών παραγόντων μπορεί επομένως να προσφέρει θεραπευτικό αποτέλεσμα [25, 26] . Ωστόσο, δεν είναι σαφές εάν η έλλειψη προφλεγμονωδών κυτοκινών (όπως το TNFand IL-6) διευκολύνει την κάθαρση του ιού. Είναι ενδιαφέρον ότι τα ποντίκια συμπληρωματικής και εναλλακτικής ιατρικής που βασίζονται σε νοκ-άουτ 8 ποντίκια με έλλειψη TNF-, TNF-υποδοχέα, IL-6, MIP-1 και IL-1R ή ποντίκια άγριου τύπου που έλαβαν θεραπεία με στεροειδή δεν είχαν πλεονέκτημα επιβίωσης σε σύγκριση με τα άγρια ποντίκια τύπου μετά από λοίμωξη από τη γρίπη H5N1 [27, 28]. Είναι ενδιαφέρον ότι η προφυλακτική θεραπεία του αγωνιστή TLR3 PolyICLC, η οποία ρυθμίζει έντονα την παραγωγή κυτοκίνης, παρέχει προστασία έναντι των λοιμώξεων H1N1 και H5N1 [29, 30]. Αυτές οι αντικρουόμενες μελέτες μπορούν να εξηγηθούν στο ότι η φλεγμονώδης απόκριση βοηθά στην απομάκρυνση του ιού, ενώ επιδεινώνει την παθολογική βλάβη του ξενιστή. Η αυξημένη παραγωγή κυτοκινών, όπως IL-6, TNF- και IFN είναι πολύ σημαντική για την κάθαρση του ιού στο πρώιμο στάδιο της μόλυνσης, ενεργοποιώντας το έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα. Μόλις η ιογενής λοίμωξη πυροδοτήσει μια καταιγίδα κυτοκινών λόγω του υψηλού ιικού φορτίου, η φλεγμονώδης απόκριση προκαλεί σοβαρό παθολογικό τραυματισμό ή ακόμα και θάνατο. Σε αυτή την περίπτωση, η λήψη ενός ανοσοτροποποιητή από μόνη της δεν μπορεί να βοηθήσει το ζώο να επιβιώσει [25] . Αυτό πιθανώς εξηγεί γιατί η θεραπεία με ανοσοτροποποιητή πριν από την ιογενή λοίμωξη οδηγεί σε καλύτερο ποσοστό επιβίωσης [26, 30]. Στη μελέτη μας, η θεραπεία του EAP λίγο μετά τη μόλυνση ή 24 ώρες μετά τη μόλυνση δεν παρείχε πλεονέκτημα επιβίωσης (τα δεδομένα δεν δείχνουν). Οι αντιγριπικές ιδιότητες των IL-6, TNF- και IFN έχουν συζητηθεί σε πολλές μελέτες, παρά τη συμμετοχή τους στην κυτοκίνη καταιγίδες που προκαλούνται από λοίμωξη από γρίπη. Η IL-6 παίζει σημαντικό ρόλο στην προστασία από τον ιό της γρίπης Α, καθώς απαιτείται για την κάθαρση του ιού και απαραίτητη για την επιβίωση των ζώων [31] . Ο TNF-έχει αναφερθεί ότι ασκεί αμυντική δράση έναντι της λοίμωξης από γρίπη in vitro [32]. Η θεραπεία με IFN στα αρχικά στάδια της λοίμωξης από γρίπη βελτιώνει το ποσοστό επιβίωσης σε μοντέλα ποντικών [33]. Επιπλέον, τα υψηλά επίπεδα έκκρισης IFN που διεγείρονται από πολυσακχαρίτες ginseng παρέχουν αντιγριπική δράση in vivo [12] . Σε αυτήν την αναφορά, η ενδορινική χορήγηση του EAP πριν από την πρόκληση H5N1 αυξάνει την έκφραση της IL-6, TNF- και IFN σε σύγκριση με ποντίκια που λαμβάνουν PBS. Τα υψηλά επίπεδα αυτών των μεσολαβητών συμβάλλουν στην ιική κάθαρση και στην αντιική απόκριση. Οι τίτλοι του πνευμονικού ιού μετά τη θεραπεία με ΕΑΡ ήταν χαμηλότεροι την 3η ημέρα μετά τη μόλυνση. Αντίθετα, τα επίπεδα IL-6 και IFN-mRNA ήταν ελαφρώς χαμηλότερα, ενώ η παραγωγή TNF ήταν σημαντικά χαμηλότερη από αυτή της ομάδας PBS. Όσον αφορά την υπερβολική φλεγμονή που προκαλείται από τον ιό H5N1, η μαζική έκκριση μεσολαβητών συμβάλλει στον τραυματισμό των πνευμόνων παρά σε μια αντιική απόκριση. Επομένως, ο χρόνος της θεραπείας με EAP ως προφυλακτικός παράγοντας είναι πολύ σημαντικός. Οι ανοσοτροποποιητικές δραστηριότητες των βοτανικών πολυσακχαριτών πιστεύεται ότι διαμεσολαβούνται από πολλά PRR [11] . Σε αυτή τη μελέτη, εξετάσαμε τα επίπεδα mRNA των TLR2, TLR4, Dectin-1 και MR μετά τη θεραπεία με EAP. Βρέθηκε ότι το EAP ρυθμίζει προς τα πάνω τις εκφράσεις mRNA της δεκτίνης-1 και του MR τόσο in vivo όσο και in vitro. Η υπόθεσή μας είναι ότι η έμφυτη ανοσολογική αναγνώριση του EAP καθοδηγείται κυρίως μέσω ενός μονοπατιού που εξαρτάται από τη δεκτίνη-1 και την MR. Συνδέοντας με αυτούς τους υποδοχείς, το EAP μπορεί να ενεργοποιήσει πολύπλοκες ενδοκυτταρικές οδούς σηματοδότησης και να αυξήσει την παραγωγή κυτοκίνης, οδηγώντας σε μια αντιική απόκριση. Έτσι, η προστασία έναντι του H5N1 με τη θεραπεία με EAP είναι λιγότερο πιθανό να προκαλέσει αντίσταση στο φάρμακο και μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα ευρέως φάσματος αντιγριπικό αποτέλεσμα. Συμπερασματικά, η μελέτη μας δείχνει ότι το εκχύλισμα φύλλων EAP είναι προφυλακτικός και ανοσοποιητικός παράγοντας έναντι της λοίμωξης από τον ιό της γρίπης H5N1. Η θεραπεία με EAP αναστέλλει αποτελεσματικά την αναπαραγωγή του ιού H5N1 και βελτιώνει την επιβίωση των ζώων. Αυτή η προσέγγιση προσφέρει μια εναλλακτική στρατηγική για την ανάπτυξη ανοσοτροποποιητικού παράγοντα κατά της γρίπης και ωφελεί τη χρήση προϊόντων E. adenophorum.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 17494, "text": "επίδραση του EAP έναντι της λοίμωξης από τη γρίπη H5N1" } ], "id": 5221, "question": "Ποιο είναι το επίκεντρο της τρέχουσας μελέτης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5006, "text": "τα αποτελέσματα κατά του H5N1 του EAP προσφέρουν μια εναλλακτική στρατηγική για την ανάπτυξη αντιγριπικών παραγόντων" } ], "id": 5222, "question": "Ποιο είναι το αποτέλεσμα της τρέχουσας μελέτης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 16140, "text": "ενισχύουν την έκκριση κυτοκινών και χημειοκινών, όπως TNF-, IL-6, IL-8 και IL-12" } ], "id": 5223, "question": "Πώς οι πολυσακχαρίτες στα φυτά επηρεάζουν την ανοσολογική απόκριση;" }, { "answers": [ { "answer_start": 21745, "text": "δεν παρείχε πλεονέκτημα επιβίωσης" } ], "id": 5225, "question": "Σε αυτή τη μελέτη, πώς επηρέασε την επιβίωση η θεραπεία του EAP μετά τη μόλυνση;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Μια 3ετής προοπτική μελέτη της επιδημιολογίας των οξειών αναπνευστικών ιογενών λοιμώξεων σε νοσηλευόμενα παιδιά στο Shenzhen της Κίνας Lin, Guang-Yu; Wang, Qiong; Cai, Xiao-Ying; Zhang, Yin-Hui; Lin, Chuang-Xing; Lu, Chang-Dong; Lu, Xue-DongDate: 2014-05-14DOI: 10.1111/irv.12257Άδεια: cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Η επιδημιολογία των τοπικών ιικών αιτιολογιών είναι απαραίτητη για τη διαχείριση ιογενών λοιμώξεων του αναπνευστικού συστήματος. Περιορισμένα δεδομένα είναι διαθέσιμα στην Κίνα για να περιγράψουν την επιδημιολογία των ιογενών λοιμώξεων του αναπνευστικού, ειδικά σε μικρές και μεσαίες πόλεις και αγροτικές περιοχές. ΣΤΟΧΟΙ: Για να προσδιοριστεί η ιογενής αιτιολογία και η εποχικότητα των οξειών αναπνευστικών λοιμώξεων σε νοσηλευόμενα παιδιά, πραγματοποιήθηκε μια 3ετής μελέτη στο Shenzhen της Κίνας. ΜΕΘΟΔΟΙ: Συλλέχθηκαν ρινοφαρυγγικές αναρροφήσεις από επιλέξιμα παιδιά. Η γρίπη και άλλοι αναπνευστικοί ιοί δοκιμάστηκαν με μοριακές αναλύσεις ταυτόχρονα. Τα δεδομένα αναλύθηκαν για να περιγράψουν τη συχνότητα και την εποχικότητα. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Από τα 2025 παιδιά που εντάχθηκαν στη μελέτη, 971 (48,0%) ήταν θετικά σε τουλάχιστον ένα ιικό παθογόνο, από τα οποία τα 890 (91,7%) ήταν <4 ετών. Οι τρεις πιο διαδεδομένοι ιοί ήταν η γρίπη Α (IAV; 35,8%), αναπνευστικό συγκυτιακό ιό (RSV; 30,5%) και του ανθρώπινου ρινοϊού (HRV; 21,5%). Συν-λοιμώξεις βρέθηκαν σε 302 περιπτώσεις (31,1%) και η διπλή ιογενής λοίμωξη ήταν κυρίαρχη. Ο RSV, ο HRV και ο IAV ήταν οι πιο συχνοί ιικοί παράγοντες που εμπλέκονται στη συνλοίμωξη. Συνολικά, οι εμφανείς εποχιακές αιχμές, κυρίως από τον Μάρτιο έως τον Μάιο, παρατηρήθηκαν με την ένταση αιχμής να ποικίλλει από έτος σε έτος. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Αυτή η μελέτη παρέχει ένα βασικό προφίλ της επιδημιολογίας της οξείας αναπνευστικής ιογενούς λοίμωξης σε παιδιά που νοσηλεύονται στο Shenzhen. Το φάσμα των ιών στην περιοχή μελέτης είναι παρόμοιο με αυτό σε άλλα μέρη, αλλά η εποχικότητα σχετίζεται στενά με τη γεωγραφική θέση, διαφορετική από αυτή στις μεγάλες πόλεις της βόρειας Κίνας και του γειτονικού Χονγκ Κονγκ. Κείμενο: Οι οξείες λοιμώξεις του αναπνευστικού συστήματος (ARTIs) είναι ένα επίμονο και διάχυτο πρόβλημα δημόσιας υγείας τόσο στις ανεπτυγμένες όσο και στις αναπτυσσόμενες χώρες. Προκαλούν μεγάλο βάρος ασθενειών παγκοσμίως. Ειδικά στις αναπτυσσόμενες χώρες, συμπεριλαμβανομένης της Κίνας, οι ART, κυρίως η πνευμονία, είναι η κύρια αιτία θανάτου σε παιδιά ηλικίας κάτω των 5 ετών. 1,2 Μια μεγάλη ποικιλία παθογόνων μικροοργανισμών μπορεί να προκαλέσει ARTIS και οι ιοί έχουν θεωρηθεί ως τα κυρίαρχα παθογόνα σε αυτόν τον παιδικό πληθυσμό. 3, 4 Οι πιο συχνά αναφερόμενοι ιοί περιλαμβάνουν τον αναπνευστικό συγκυτιακό ιό (RSV), τους ιούς της γρίπης Α και Β (IAV, IBV), τους ιούς παραγρίπης (PIVs), τον ανθρώπινο ρινοϊό (HRV) και τον αδενοϊό (ADV), οι οποίοι είναι υπεύθυνοι για τα περισσότερα επεισόδια των ARTIS στα παιδιά. 1 Την περασμένη δεκαετία, αρκετοί νέοι ιοί που σχετίζονται με ARTIS, όπως ο ανθρώπινος μεταπνευμοϊός (HMPV), νέα στελέχη κορωνοϊών (SARS-CoV, HCoV-NL63 και HKUI), ο ανθρώπινος ιός μποκαΐας (BOV), ο ιός πολυομάτου WU (WUPoyV) και ο ιός πολυωματικών KI (KIPoyV) έχουν ανακαλυφθεί σε δείγματα ανθρώπινης αναπνευστικής οδού. Μεταξύ αυτών, ορισμένα έχουν εντοπιστεί ως αιτιολογικά παθογόνα των ARTIS. 1, 4, 5 Επί του παρόντος, δεν υπάρχουν εγκεκριμένα εμβόλια ή φάρμακα διαθέσιμα για τους περισσότερους από τους αναπνευστικούς ιούς. 1 Η καλύτερη κατανόηση της επιδημιολογίας των ιογενών λοιμώξεων του αναπνευστικού συστήματος στα παιδιά διαδραματίζει βασικό ρόλο για την πρόληψη, τον έλεγχο και τη θεραπεία των ARTIs. Μελέτες έδειξαν ότι πολλές ιογενείς λοιμώξεις του αναπνευστικού εμφάνισαν προβλέψιμες εποχιακές διακυμάνσεις. Ωστόσο, τα επιδημιολογικά προφίλ των ιογενών αναπνευστικών λοιμώξεων από διαφορετικές κλιματικές ζώνες ή διαφορετικές χώρες στην ίδια κλιματική ζώνη μπορεί να ποικίλλουν. [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] Η Κίνα είναι μια μεγάλη χώρα που διασχίζει τρεις κλιματικές ζώνες και υπάρχουν μεγάλες διαφορές στο κλίμα από περιοχή σε περιοχή. Η καλύτερη κατανόηση της επιδημιολογίας των ARTIS σε διαφορετικές περιοχές θα μπορούσε να είναι χρήσιμη για την ανάπτυξη αποτελεσματικών στρατηγικών επιτήρησης, πρόληψης και θεραπείας. Παρόλο που έχουν πρόσφατα αναφερθεί ορισμένες μελέτες σχετικά με την επιδημιολογία των ARTIS σε μεγάλες πόλεις όπως το Πεκίνο, η Σαγκάη και το Χονγκ Κονγκ, [13] [14] [15] [16] τα επιδημικά χαρακτηριστικά των ιών στα ARTIs δεν είναι ακόμα καλά εδραιωμένα παντού. Κίνα, ειδικά σε άλλες πόλεις και αγροτικές περιοχές. Το Shenzhen είναι η μεγαλύτερη μεταναστευτική πόλη της Κίνας με υψηλή πυκνότητα πληθυσμού και κινητικότητα πληθυσμού. Βρίσκεται στη νότια Κίνα στις 22°27 0 -22°52 0 B και 113°46 0 -114°37 0 E, αμέσως βόρεια του Χονγκ Κονγκ, με τυπικό υποτροπικό κλίμα των μουσώνων. Η μέση ετήσια θερμοκρασία και η σχετική υγρασία του Shenzhen είναι περίπου 23°C (12-33°C) και 77%, αντίστοιχα. Σκοπός αυτής της μελέτης είναι η διερεύνηση του επιπολασμού, της εποχικότητας και των κλινικών χαρακτηριστικών των οξειών ιογενών αναπνευστικών λοιμώξεων σε νοσηλευόμενα παιδιά στο Shenzhen και η παροχή πληροφοριών σχετικά με τις αιτιολογίες των ARTIs σε τοπικά βρέφη και παιδιά. Μια διαδοχική προοπτική μελέτη 3 ετών από τον Ιούλιο του 2007 έως Τον Ιούνιο του 2010 διεξήχθη στο Shenzhen, μια παραθαλάσσια πόλη γειτονική του Χονγκ Κονγκ. Τέσσερα νοσοκομεία συμπεριλαμβανομένου ενός νοσοκομείου παίδων επιλέχθηκαν για τη μελέτη. Εγγράφηκαν επιλεγμένοι ασθενείς με ARTI που εισήχθησαν στους παιδιατρικούς θαλάμους. Τα κριτήρια συμπερίληψης ήταν τα εξής: ηλικίας κάτω των 14 ετών, οξύς πυρετός (T ≥ 38°C), με οποιοδήποτε από τα αναπνευστικά συμπτώματα (όπως πονόλαιμος, βήχας, συριγμός και δύσπνοια/ταχύπνοια), φυσιολογικός ή χαμηλός αριθμός λευκοκυττάρων, την έναρξη της νόσου εντός 3 ημερών πριν από τη νοσηλεία. Η διάγνωση της πνευμονίας βασίστηκε στις κατευθυντήριες γραμμές της διαχείρισης της παιδικής πνευμονίας από την κοινότητα (CAP) που εκδόθηκε από τον Κινεζικό Ιατρικό Σύλλογο το 2006. 17 Στην οδηγία, τα κλινικά συμπτώματα και σημεία για τη διάγνωση της παιδικής ΚΑΠ περιλαμβάνουν πυρετό, βήχα, ταχύπνοια (που ορίζεται ανάλογα με την ηλικία), δυσκολία στην αναπνοή και/ή έλξη του κάτω θωρακικού τοιχώματος. Η αξιολόγηση με ακτίνες Χ έχει πραγματοποιηθεί όταν είναι απαραίτητο. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από τις επιτροπές ιατρικής δεοντολογίας των νοσοκομείων. Λήφθηκε γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση από τους γονείς ή τους νόμιμους κηδεμόνες των παιδιών. Οι ρινοφαρυγγικές αναρρόφηση (NPA) λήφθηκαν από εκπαιδευμένο προσωπικό ακολουθώντας τις τυπικές χειρουργικές διαδικασίες εντός 24 ωρών μετά την εισαγωγή. Τα δείγματα μεταφέρθηκαν αμέσως στο εργαστήριο με αποστειρωμένα μέσα μεταφοράς ιού, στη συνέχεια χωρίστηκαν σε δείγματα και καταψύχθηκαν αμέσως στους À80°C μέχρι περαιτέρω επεξεργασία. Τα συνολικά ιικά νουκλεϊκά οξέα (DNA και RNA) εκχυλίστηκαν από 200 ll δείγματος NPA χρησιμοποιώντας το AxyPrep Body Υγρό DNA/RNA Miniprep Kit (Axygen, Union City, CA, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Καθαρισμένο DNA και RNA αποθηκεύτηκαν στους À80°C σε κλάσματα για περαιτέρω ανάλυση PCR. Για κάθε δείγμα, πραγματοποιήθηκαν δοκιμές για δέκα κοινούς και πρόσφατα ταυτοποιημένους ιούς. Εν συντομία, τα WUPoyV και BOV δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας μονοπλεξικές PCR που περιγράφηκαν προηγουμένως. 18, 19 Άλλοι ιοί δοκιμάστηκαν με τη χρήση της πλατφόρμας Luminex και της ανάλυσης αναπνευστικού πάνελ πολλαπλών ιών xTAG TM (RVP Assay) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 20 Όλα τα πολλαπλά δείγματα μόλυνσης εξετάστηκαν ξανά. Εάν υπήρχε ασυμφωνία μεταξύ δύο δοκιμών, το δείγμα επιβεβαιώθηκε με monoplex PCR. Χρησιμοποιήθηκε το Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) για Windows έκδοση 11.0 (SPSS Inc. Chicago, IL, USA). Για τη σύγκριση των κατηγορικών δεδομένων χρησιμοποιήθηκε το chi-square ή το ακριβές τεστ Fisher. Όλες οι δοκιμές ήταν δύο ουρών και μια τιμή P κάτω από 0Α05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Συνολικά ελήφθησαν 2025 δείγματα από 2025 επιλέξιμους ασθενείς ηλικίας από 15 ημερών έως 14 ετών με διάμεση ηλικία 12 μηνών, στους οποίους το 89-6% των οι ασθενείς ήταν < 4 ετών. Συμπεριλαμβάνονταν 964 (47Á6%) γυναίκες και 1061 (52Á4%) άνδρες. Από όλα τα νοσηλευόμενα παιδιά που εγγράφηκαν σε αυτή τη μελέτη, το 84-0% εμφάνιζε λοίμωξη του κατώτερου αναπνευστικού και το 16-0% είχε λοίμωξη της ανώτερης αναπνευστικής οδού (Πίνακας 1). Μεταξύ 971 θετικών περιπτώσεων, 572 (58Á9%) διαγνώστηκαν ως πνευμονία. Περίπου 971 από τις 2025 περιπτώσεις (48Á0%) ήταν θετικές σε τουλάχιστον ένα ιικό παθογόνο. Μεταξύ αυτών, IAV, RSV, HRV και PIV ανιχνεύθηκαν σε 348 (35Á8%), 296 (30Á5%), 209 (21Á5%) και 169 (17Á4%) περιπτώσεις, αντίστοιχα. Μία λοίμωξη παρατηρήθηκε σε 669 (68-9%) περιπτώσεις και πολλαπλή λοίμωξη βρέθηκε σε 302 (31-1%). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν επίσης ότι οι RSV, IAV και HRV ήταν τα κύρια παθογόνα σε περιπτώσεις μεμονωμένης ιογενούς λοίμωξης (Πίνακας 1). Τα μηνιαία θετικά ποσοστά κυμαίνονταν από 32Á5% έως 75Á0% με μέσο όρο 45Á1% (Εικόνα 1). Το έτος 2009, όταν η γρίπη Α (Η1Ν1) ήταν πανδημία παγκοσμίως, το θετικό ποσοστό άρχισε να αυξάνεται τον Μάρτιο και το υψηλότερο θετικό ποσοστό 75-0% παρατηρήθηκε τον Μάιο. Μεταξύ των 971 θετικών κρουσμάτων, ανιχνεύθηκαν συνολικά 1335 ιικά παθογόνα. Το πιο συχνά ανιχνευόμενο παθογόνο ήταν το IAV (26Á1%, 348/1335), ακολουθούμενο από το RSV (22Á2%, 296/1335), το HRV (15Á7%, 209/1335), το PIV1 και το PIV3 (12Á7%, 169/1335) Εντοπίστηκαν περίπου 302 περιπτώσεις συνλοίμωξης, που αντιπροσωπεύουν το 14-9% του συνόλου των 2025 νοσηλευόμενων παιδιών. Κατά τη διάρκεια της επιδημίας H1N1 από τον Μάρτιο έως τον Αύγουστο του 2009, τα κρούσματα και το ποσοστό συνλοίμωξης αυξήθηκαν σημαντικά (Εικόνα 2). 143 από τις 302 (47-4%) περιπτώσεις συνλοίμωξης εντοπίστηκαν κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου. Μεταξύ αυτών, 121 περιπτώσεις εμπλέκονταν σε λοίμωξη από IAV, συμπεριλαμβανομένων 90 περιπτώσεων διπλής μόλυνσης. Από όλες τις περιπτώσεις συνλοίμωξης, 247 (81-8%), 49 (16-2%) και 5 (1-7%) μολύνθηκαν με δύο, τρία και τέσσερα πιθανά ιικά παθογόνα, αντίστοιχα. Μία πολλαπλή λοίμωξη με πέντε ιούς ανιχνεύθηκε σε ένα RSV IAV HRV BOV PIV3 ADV HMPV WUPoyV PIV1 IBV Σύνολο A Σύνολο κρουσμάτων 163 172 85 55 51 49 37 26 24 7 669 βρογχίτιδα 12 19 7 29 26 35 20 7 13 9 8 2 5 0 128 Πνευμονία 93 97 55 28 24 28 25 18 14 5 387 URTI 13 37 3 13 9 10 2 3 0 2 *Αριθμός περιπτώσεων και ποσοστό παιδιών συνολικά. **Το ποσοστό επίπτωσης σε αυτή την ηλικιακή ομάδα είναι σημαντικά υψηλότερο από τις άλλες ηλικιακές ομάδες. ***Καμία σημαντική διαφορά μεταξύ αυτών των τριών ηλικιακών ομάδων. †Δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές μεταξύ αυτών των δύο ηλικιακών ομάδων, αλλά σημαντικά χαμηλότερες από τις άλλες ηλικιακές ομάδες. βρέφος 6 μηνών. Ο IAV, ο RSV και ο HRV ήταν οι τρεις πιο συχνά εντοπισμένοι ιοί σε συνλοίμωξη και ανιχνεύθηκαν σε 176, 133 και 124 περιπτώσεις με ποσοστά συνλοίμωξης 50Α6%, 44Α9% και 59Α3%, αντίστοιχα (Πίνακας 2). Στη μελέτη παρατηρήθηκαν διάφορα πρότυπα πολλαπλών λοιμώξεων. Συνολικά 152 (50-3%) περιπτώσεις συνλοίμωξης αφορούσαν τουλάχιστον δύο ιούς RSV, HRV και IAV. Το ποσοστό ταυτόχρονης μόλυνσης για κάθε μεμονωμένο ιό που ανιχνεύθηκε διέφερε σημαντικά. Τα χαμηλότερα και υψηλότερα ποσοστά συνλοίμωξης παρατηρήθηκαν σε WUPoyV (33-3%) και IBV (66-7%), αντίστοιχα. Το 91-4% (276/302) των περιπτώσεων συνλοίμωξης δοκιμάστηκαν στην ηλικιακή ομάδα των 4 ετών ή μικρότερης (Πίνακας 2), αλλά μεταξύ όλων των ηλικιακών ομάδων, δεν βρέθηκε στατιστική διαφορά στο ποσοστό συνλοίμωξης (v 2 = 1Á83 , Ρ = 0Α8721). Δεν παρατηρήθηκε διαφορά ανάλογα με το φύλο στο ποσοστό συν-λοίμωξης (v 2 = 2Á17, P = 0Á1404). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στα ποσοστά συν-λοίμωξης μεταξύ των περιπτώσεων PICU και μη PICU. Ομοίως, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στα κλινικά συμπτώματα μεταξύ της συνλοίμωξης και των μεμονωμένων περιπτώσεων (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Γενικά, οι ιοί του αναπνευστικού ανιχνεύθηκαν συχνότερα την περίοδο Μαρτίου έως Μαΐου από ό,τι σε άλλους μήνες (55-4% και 40-6%, αντίστοιχα, v 2 = 28Á06, P = 0Á0000) και εμφανείς εποχιακές κορυφές παρατηρήθηκαν κατά τη διάρκεια αυτών των μηνών με την ισχύ αιχμής να ποικίλλει από 1 έτος σε έτος. Μια ασθενέστερη εποχιακή αιχμή μπορούσε επίσης να διακριθεί σε ορισμένους χειμερινούς μήνες σε διαφορετικά έτη (Εικόνα 1). Το προφίλ εποχικότητας κάθε μεμονωμένου ιού που ανιχνεύθηκε ήταν διαφοροποιημένο. Μια εποχιακή κατανομή του IAV μπορεί να παρατηρηθεί από τα τέλη της άνοιξης έως το καλοκαίρι (κυρίως Μάρτιο έως Μάιο) και μερικές φορές το φθινόπωρο (Οκτώβριο, Νοέμβριο ή Δεκέμβριο). Μια ευρεία εποχική αιχμή της μόλυνσης από IAV εντοπίστηκε από τον Μάρτιο έως τον Αύγουστο του 2009 (Εικόνα 3Α). Αν και το RSV δοκιμάστηκε σχεδόν ένα ολόκληρο έτος, εντοπίστηκαν δύο ετήσιες κορυφές. Το ένα βρέθηκε τον Νοέμβριο ή/και τον Δεκέμβριο και το άλλο ισχυρότερο τον Μάρτιο έως τον Μάιο του έτους. Η διάρκεια αιχμής το 2009 ήταν μεγαλύτερη από εκείνη των άλλων ετών. Οι εποχιακές τάσεις των HRV και PIV ήταν παρόμοιες με αυτές του RSV, αλλά οι κορυφές αυτών των τριών ιών κυμάνθηκαν και μετατοπίστηκαν ήπια (Εικόνα 3Β). Παρόλο που ο IBV και ο ADV είχαν χαμηλό ποσοστό ανίχνευσης στη μελέτη, παρατηρήθηκε παρόμοια εποχικότητα και οι κορυφές μόλυνσης τους ήταν κυρίως στα μέσα του χειμώνα. Αιχμές την άνοιξη και το καλοκαίρι παρατηρήθηκαν επίσης σε μερικά χρόνια (Εικόνα 3C). Η έρευνά μας δεν βρήκε τακτική εποχικότητα στις λοιμώξεις από BOV. Μια ξαφνική αύξηση της μόλυνσης από BOV καταγράφηκε τον Απρίλιο και τον Μάιο του 2010. Αν και το θετικό ποσοστό μόλυνσης από HMPV ήταν μόνο 4-8%, παρατηρήθηκε τακτική εποχικότητα από τον Μάρτιο έως τον Μάιο κάθε έτους. Από τους 39 ασθενείς με λοίμωξη WUPoyV, οι 36 εντοπίστηκαν μετά τον Ιούλιο του 2008. Τα δεδομένα μας υποδήλωναν ότι οι μήνες αιχμής της μόλυνσης από WUPoyV ήταν από τον Μάρτιο έως τον Μάιο (Εικόνα 3D). Τα θετικά ποσοστά ιογενών λοιμώξεων σε άνδρες και γυναίκες ήταν 52Α5% και 47Α5%, αντίστοιχα. Δεν αποκαλύφθηκε σημαντική διαφορά φύλου (v 2 = 0Á012, P = 0Á9118). Η κατανομή των ιικών παραγόντων και τα πρότυπα μόλυνσης σε διαφορετικές ηλικιακές ομάδες παρουσιάζονται στον Πίνακα 2. Από τα 971 θετικά παιδιά, τα 890 (91-7%) ήταν ηλικίας 4 ετών ή μικρότερα. Το θετικό ποσοστό σε αυτή την ηλικιακή ομάδα ήταν σημαντικά υψηλότερο από αυτό σε παιδιά άνω των 4 ετών (v 2 = 8Á26, P = 0Á0041). Παιδιά κάτω των 6 μηνών ήταν τα πιο ευαίσθητα σε αναπνευστικά ιικά παθογόνα με θετικό ποσοστό 14-8% (Πίνακας 2). Πολύ λίγες μακροπρόθεσμες προοπτικές μελέτες διεξήχθησαν για ιογενείς αιτιολογίες ARTI στα νοσηλευόμενα παιδιά. Σε αυτήν την παρούσα μελέτη, η συχνότητα των λοιμώξεων, η εποχικότητα, το πρότυπο συν-λοίμωξης και τα κλινικά χαρακτηριστικά των ιογενών αναπνευστικών λοιμώξεων διερευνήθηκαν με βάση την προοπτική ανάλυση δεδομένων τριών διαδοχικών ετών από νοσηλευόμενα παιδιά με ARTIs. Τα αποτελέσματά μας παρείχαν ένα διακριτικό επιδημιολογικό προφίλ ιογενών αναπνευστικών λοιμώξεων σε νοσηλευόμενα παιδιά με ARTI στις περιοχές της μελέτης, το οποίο ήταν διαφορετικό από εκείνα στις μεγάλες πόλεις της βόρειας Κίνας όπως το Πεκίνο και η Σαγκάη και επίσης διαφορετικό από αυτό στο γειτονικό Χονγκ Κονγκ. Το 48-0% των περιπτώσεων μας ήταν θετικές σε λοιμώξεις από ιούς του αναπνευστικού, κάτι που έμοιαζε με την τελευταία μελέτη στην ίδια πόλη. 21 Παρόμοιο ποσοστό επίπτωσης έχει ληφθεί σε γειτονικές περιοχές 13, 22 και άλλες πόλεις όπως η Ρώμη 23 και το Μιλάνο, 24, αλλά ήταν διαφορετικό από άλλες μελέτες. [10] [11] [12] Στην Κίνα, το συνολικό θετικό ποσοστό που αναφέρθηκε κυμάνθηκε από 27Α3 έως 74Α8% ανάλογα με τις διαφορετικές περιοχές και τις μεθόδους ανίχνευσης. 15, 16, [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] Το ποσοστό των αναπνευστικών ιογενών λοιμώξεων διέφερε παγκοσμίως και πολλοί παράγοντες όπως η γεωγραφική κατανομή, ο σχεδιασμός της μελέτης και τα πρωτόκολλα ανίχνευσης θα μπορούσαν οδηγούν σε αυτές τις παραλλαγές. 1, 7, 8, 32 Στη μελέτη μας, ο αριθμός των λευκοκυττάρων χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης κριτηρίων ένταξης και πιθανότατα επηρέασε το θετικό ποσοστό. Οι ιοί που δεν λαμβάνονται υπόψη στη μελέτη, για παράδειγμα οι κοροναϊοί, θα υποτιμούσαν το θετικό ποσοστό. Οι περισσότερες μελέτες έδειξαν ότι ο RSV ή ο HRV ήταν οι πιο διαδεδομένοι ιοί σε παιδιά με ιογενή λοίμωξη του αναπνευστικού συστήματος. 1 Σε αυτή τη μελέτη, ο IAV ήταν ο πιο συχνά ανιχνευμένος αναπνευστικός ιός, ακολουθούμενος από τον RSV και τον HRV. Η επιδημία IAV (H1N1) το 2009 θα μπορούσε να εξηγήσει αυτή τη μετατόπιση. Τα δεδομένα έδειξαν ότι περίπου το 60% των λοιμώξεων από IAV ανιχνεύθηκαν κατά την περίοδο της επιδημίας. Μελέτες έδειξαν ότι η επιδημία H1N1 θα μπορούσε να αλλάξει τα πρότυπα κατανομής του ιού. 24, 29, 33 Ανεξάρτητα από το ξέσπασμα του IAV (H1N1), ο RSV και ο HRV ήταν τα δύο πιο κοινά ιικά παθογόνα στα ARTIS, κάτι που ήταν σύμφωνο με τις περισσότερες προηγούμενες μελέτες. 1, 10, 15, 16, 22, [25] [26] [27] [28] [29] Η μελέτη μας επιβεβαίωσε περαιτέρω τη σημασία του RSV και του HRV σε παιδιά με ARTIs, ειδικά σε παιδιά < 4 ετών. 10, 14, 23 Τα αποτελέσματά μας έδειξαν επίσης ότι το 12-7% των ιικών παθογόνων που ανιχνεύθηκαν ήταν PIV1 και PIV3, γεγονός που υπονοούσε ότι τα PIV έπαιζαν σημαντικό ρόλο σε παιδιά με ARTIS. Παρόμοια ευρήματα προέκυψαν στις μελέτες που διεξήχθησαν στη Σαγκάη, 14, 34 Changsha, 26 Harbin, 30 Χονγκ Κονγκ 13 και Ρώμη. 23 Ο επιπολασμός του PIV3 ήταν διπλάσιος από αυτόν του PIV1, ιδιαίτερα στα βρέφη, κάτι που ήταν παρόμοιο με άλλες αναφορές, 25, 26, 30, 35 υπονοώντας ότι τα βρέφη θα μπορούσαν να είναι πιο ευάλωτα στη μόλυνση με PIV3 από το PIV1. Το HMPV έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα από τα κύρια ιικά παθογόνα που ευθύνονται για τις ARTI στα παιδιά. 5 Το θετικό ποσοστό που βρέθηκε στη μελέτη ήταν συνεπές με προηγούμενα δημοσιευμένα αποτελέσματα. 10, 36, 37 Στην Κίνα, το ποσοστό μόλυνσης του HMPV κυμαινόταν από 3Α2 έως 10Α6%. 22, 26, 28, 29, 31 Η εποχικότητα του HMPV σε αυτή τη μελέτη ήταν κυρίως από τον Μάρτιο έως τον Μάιο, παρόμοια με αυτή στο Χονγκ Κονγκ, 36 αλλά διαφορετική από άλλα μέρη. 5, 37 Στη μελέτη μας, το 4-9% των περιπτώσεων ήταν θετικές για BOV, το οποίο συνέπεσε με 5-0% στο Χονγκ Κονγκ 38 και υψηλότερο από το Guangzhou 39 και το ανατολικό Guangdong. 22 Τα αποτελέσματά μας πρότειναν ότι το BOV μπορεί να είναι παρόν καθ' όλη τη διάρκεια του έτους χωρίς εποχιακή κατανομή. Ωστόσο, η εποχιακή διανομή σημειώθηκε από τον Σεπτέμβριο έως τον Φεβρουάριο στο Χονγκ Κονγκ 38 και τον Μάιο και τον Ιούνιο στο Guangzhou. 39 Η χρήση πολλαπλής PCR κατέστησε δυνατή την ταυτόχρονη ανίχνευση ενός ευρέος φάσματος ιών με εξαιρετική ευαισθησία, ταυτόχρονα με αυξημένο ποσοστό ανίχνευσης ιών και ποσοστό συν-μόλυνσης για ARTIs. 12,40 Μεταξύ των θετικών μας περιπτώσεων, το ποσοστό συνλοίμωξης ήταν 31-1%, το οποίο ήταν παρόμοιο με το 27-9% που αναφέρθηκε από τους Do et al. 10 Το ποσοστό συνλοίμωξης που αναφέρθηκε αλλού κυμαινόταν ευρέως από 25Α4 έως 47Α9%. 40 Τα σχετικά χαμηλότερα ποσοστά συνλοίμωξης που κυμαίνονται από 0Α24 έως 26Α9% αναφέρθηκαν στις μελέτες που διεξήχθησαν σε διάφορες πόλεις της Κίνας. 22, [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] Στις περισσότερες από αυτές τις μελέτες, τα κιτ ανοσοφθορισμού χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο μικρότερου αριθμού αναπνευστικών ιών. Αξίζει να σημειωθεί ότι στη μελέτη των Peng et al. 32 στο Wuhan της Κίνας, αναφέρθηκε το 69-5% του ποσοστού συνλοίμωξης με κιτ ανοσοφθορισμού. Αυτές οι παραλλαγές μπορεί να αποδοθούν σε γεωγραφικές διαφορές, διαγνωστικές μεθόδους για ιικούς παράγοντες και σχεδιασμό μελέτης. 12, 32, 34, 41, 42 Τα παθογόνα σε αυτούς τους αρνητικούς ασθενείς πρέπει να διερευνηθούν περαιτέρω, καθώς στη μελέτη μας συμπεριλήφθηκαν μόνο δέκα κοινοί και πρόσφατα ταυτοποιημένοι ιοί, οι οποίοι ενδέχεται να υποτιμούν το θετικό ποσοστό ή το ποσοστό συνλοίμωξης. Ήταν αξιοσημείωτο ότι δεν παρατηρήθηκε η συσχέτιση μεταξύ του ποσοστού συνλοίμωξης και του θετικού ποσοστού. Στις πολλαπλές λοιμώξεις, η διπλή λοίμωξη ήταν κυρίαρχη σε αυτή τη μελέτη, είτε λαμβανομένης υπόψη της επιδημίας IAV (H1N1) το 2009, η οποία ήταν σύμφωνη με προηγούμενες μελέτες. 28, 32, 42, 43 Παρόμοια με τις μελέτες που πραγματοποιήθηκαν στις πόλεις Guangzhou και Wuhan, Κίνα, 28, 29, η μελέτη μας έδειξε ότι ο IAV, ο RSV και ο HRV ήταν οι κύριοι ιοί που εμπλέκονται σε πολλαπλές λοιμώξεις. Το υψηλό ποσοστό συν-μόλυνσης μεταξύ αυτών των τριών ιών θα μπορούσε να εξηγηθεί από την επικάλυψη των εποχιακών κατανομών τους. Μια ποικιλία από κυρίαρχα πρότυπα πολλαπλών λοιμώξεων μεταξύ των αναπνευστικών ιών παρατηρήθηκε σε διαφορετικές μελέτες. 12, 32, 42, 43 Για παράδειγμα, παρουσιάστηκε στους Martin et al. Η μελέτη 43 ότι ο ADV και οι κοροναϊοί ήταν το πιο κοινό μοτίβο συν-λοίμωξης. Η μελέτη μας έδειξε ότι ο RSV και ο HRV ήταν οι δύο ιοί που εμπλέκονται περισσότερο σε πολλαπλές λοιμώξεις, ακολουθούμενοι από IAV και PIV, ανεξάρτητα από τη μόλυνση από IAV στην περίοδο έξαρσης του H1N1. Ήταν δύσκολο να εξηγηθούν οι παραλλαγές των μοτίβων ταυτόχρονης μόλυνσης με βάση μόνο την εποχιακή κατανομή. Μια πρόσφατη μελέτη πρότεινε ότι τα πρότυπα συν-λοίμωξης δεν ήταν τυχαία και ορισμένα παθογόνα είχαν υψηλότερη συχνότητα ταυτόχρονης μόλυνσης. Καθώς οι μοριακές αναλύσεις ανιχνεύουν μόνο νουκλεϊκό οξύ και το θετικό αποτέλεσμα δεν σημαίνει την παρουσία του παθογόνου, κατά τη μελέτη των μοτίβων συν-μόλυνσης των αναπνευστικών ιών, πρέπει πρώτα να επιλυθεί η ικανότητα διαφοροποίησης των πραγματικών αιτιολογικών παθογόνων. Η ανίχνευση ιικού φορτίου θα μπορούσε να παρέχει ορισμένες ενδείξεις για την επίλυση αυτού του ζητήματος. 43, 44 Αν και έχουν αναφερθεί υψηλά ποσοστά συν-λοίμωξης σε διάφορες μελέτες, οι συσχετίσεις μεταξύ πολλαπλών λοιμώξεων, ποσοστού νοσηλείας και σοβαρότητας των ARTIS δεν ήταν ακόμη σαφείς με ασυνεπή αποτελέσματα σε διαφορετικές μελέτες. 42, 43, 45 Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η πολλαπλή μόλυνση είχε μικρότερη σχέση με τη σοβαρότητα της νόσου, σύμφωνα με τους Peng et al. η μελέτη του. 32 Η σχέση μεταξύ των ποσοστών συνλοίμωξης και της ηλικιακής ομάδας διερευνήθηκε επίσης στη μελέτη μας και παρατηρήθηκε μικρή συσχέτιση. Αρκετές προηγούμενες μελέτες παρατήρησαν ότι τα ποσοστά συν-λοίμωξης ήταν πιο συχνά σε μια συγκεκριμένη ηλικιακή ομάδα, αλλά τα αποτελέσματα διέφεραν. 32, 43 Σε αντίθεση με την εύκρατη περιοχή, όπου οι περισσότεροι ιοί είχαν εποχικότητα χειμώνα-άνοιξη, οι ιογενείς λοιμώξεις του αναπνευστικού σε τροπικές και υποτροπικές περιοχές φαινόταν κυρίως να είναι εποχικότητα άνοιξη-καλοκαίρι. 9 Σε αυτή τη μελέτη, λόγω του υψηλού ποσοστού ανίχνευσης και της παρόμοιας εποχικότητας των RSV, HRV, IAV, PIV και HMPV, κατέληξε στο συμπέρασμα μια συνολική εποχικότητα άνοιξη-καλοκαίρι ιογενών αναπνευστικών λοιμώξεων στα παιδιά. Μελέτες που διεξήχθησαν στο Χονγκ Κονγκ έδειξαν ότι μια καθαρή εποχική αιχμή ήταν από τον Απρίλιο έως τον Σεπτέμβριο, 36, 46 με μεγαλύτερη διάρκεια από τη μελέτη μας. Η συνολική εποχικότητα σε αυτή τη μελέτη ήταν επίσης διαφορετική από τις μελέτες που διεξήχθησαν σε βόρειες ή κεντρικές πόλεις της Κίνας, στις οποίες η εποχικότητα των περισσότερων ιών παρουσιάστηκε το φθινόπωρο-χειμώνα ή/και χειμώνα-άνοιξη. 15, [25] [26] [27] 30 Η εποχικότητα χειμώνα-άνοιξη παρατηρήθηκε επίσης στο Guangzhou, μια πόλη περίπου 150 χιλιόμετρα βόρεια του Shenzhen. 28 Διαφορετική εποχιακή έναρξη και διάρκεια παρατηρήθηκαν σε διάφορες μελέτες που διεξήχθησαν σε (υπο) τροπικές περιοχές. Σε αυτές τις μελέτες, η θερμοκρασία περιβάλλοντος, η υγρασία και η βροχόπτωση χρησιμοποιήθηκαν ευρέως για να εξηγήσουν αυτές τις διαφορές στην εποχικότητα, αλλά παρατηρήθηκαν ασυνεπή αποτελέσματα. 9, 46, 47 Αν και οι περισσότερες μελέτες έδειξαν ότι η εποχικότητα των ιογενών αναπνευστικών λοιμώξεων συσχετίστηκε με αυξημένες βροχοπτώσεις, οι επιπτώσεις κλιματικών παραγόντων όπως η υγρασία και η θερμοκρασία στην εποχικότητα ήταν πολύπλοκες και αλληλεπιδράσεις. 9, 46, 48 Οι περιοχές μελέτης έχουν τέσσερις ασαφείς εποχές και ο πιο κρύος μήνας εμφανίζεται συνήθως τον Ιανουάριο (μέσος όρος 12°C). Κατά την περίοδο από τον Μάρτιο έως τον Μάιο, ο καιρός παρουσίασε ζεστή θερμοκρασία περιβάλλοντος (μέσος όρος 18-25°C), υψηλή σχετική υγρασία (μέση τιμή 85%-90%) και αυξανόμενες βροχοπτώσεις. Αυτές οι μετεωρολογικές συνθήκες ήταν ίσως ευνοϊκές για την επιβίωση του ιού. 9, 48 Επιπλέον, οι έντονες διακυμάνσεις της θερμοκρασίας κατά την εποχιακή εναλλαγή θα μπορούσαν να αυξήσουν την ευαισθησία σε λοιμώξεις. 49 Όπως αναφέρθηκε σε άλλες μελέτες σε εύκρατες, τροπικές και υποτροπικές περιοχές, τα ποσοστά ιογενών λοιμώξεων στον παιδικό πληθυσμό έδειξαν αντίστροφη συσχέτιση με την ηλικία, με τα νεότερα άτομα να παρουσιάζουν υψηλότερα ποσοστά ιογενούς μόλυνσης. 3, 4, 6, 9, 24 Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα παιδιά ηλικίας μικρότερης των 4 ετών, ιδιαίτερα <6 μηνών, διέτρεχαν υψηλότερο κίνδυνο νοσηλείας για ARTIS, σε σύγκριση με τα μεγαλύτερα παιδιά. Αυτό τεκμηριώθηκε ιδιαίτερα στη μόλυνση από RSV. Το τεκμήριό μας υποστηρίχθηκε από άλλες μελέτες. 14,25-28 Φυσικά, αυτή η εικασία έπρεπε να επικυρωθεί από τη μελέτη με βάση τον πληθυσμό. Τα ευρήματα που αναφέρθηκαν αλλού υποδεικνύουν ότι περισσότεροι άνδρες από τις γυναίκες επηρεάστηκαν από ARTIS, οι οποίες δεν παρατηρήθηκαν στη μελέτη μας. Σημειωτέον, η μελέτη μας διεξήχθη σε διάστημα 3 ετών, το οποίο περιελάμβανε το ξέσπασμα IAV (H1N1) το 2009. Θα πρέπει να ληφθεί υπόψη ο αντίκτυπος της επιδημίας στα αποτελέσματα. Τα δεδομένα έδειξαν ότι το ποσοστό ανίχνευσης του IAV αυξήθηκε σημαντικά και το ποσοστό συν-λοίμωξης κατά τους μήνες εκδήλωσης της επιδημίας ήταν πολύ υψηλότερο από το μέσο ποσοστό συνλοίμωξης. Δυστυχώς, δεν πληκτρολογήσαμε αυτά τα στελέχη γρίπης με βάση τον αρχικό σχεδιασμό της μελέτης. Ήταν πολύ πιθανό ότι αυτά τα στελέχη συνέβαλαν στο σχετικά υψηλό ποσοστό IAV. Σχετικά υψηλότερες μεμονωμένες και πολλαπλές λοιμώξεις RSV, HRV και PIV παρατηρήθηκαν επίσης κατά την έξαρση του IAV. Η αύξηση του ευπαθούς πληθυσμού και της ευαισθητοποίησης, οι εντατικές δοκιμές και η αλλαγή της συμπεριφοράς ασθενών και ιατρών θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε αυτές τις αυξήσεις. Αυτοί οι παράγοντες θα μπορούσαν εν μέρει να εξηγήσουν το σχετικά υψηλό ποσοστό περιπτώσεων πνευμονίας στη μελέτη. Επιπλέον, μελέτες έδειξαν ότι το ξέσπασμα του IAV (H1N1) θα μπορούσε να αυξήσει τον κίνδυνο άλλων ιογενών λοιμώξεων όπως ο RSV και ο HRV. 24, 33 Υπήρχαν και άλλοι περιορισμοί σε αυτή τη μελέτη. Πρώτον, οι μοριακές μέθοδοι επέτρεψαν την ανίχνευση μόνο ιικού νουκλεϊκού οξέος ακόμη και χωρίς αντιγραφή ιού, γεγονός που περιπλέκει την ερμηνεία των θετικών αποτελεσμάτων ανίχνευσης. Δεύτερον, η αναγνώριση υποτύπου ορισμένων κοινών αναπνευστικών ιών όπως ο IAV και ο HRV δεν πραγματοποιήθηκε στη μελέτη μας, ιδιαίτερα κατά τη διάρκεια της επιδημίας IAV (H1N1) το 2009. Συνοπτικά, παρά τους προαναφερθέντες περιορισμούς, αυτή η τριετής συνεχόμενη επιτήρηση θα παρείχε βασικό προφίλ του φάσματος, εποχικότητα, κατανομή ηλικίας και φύλου, μοτίβα συν-λοίμωξης καθώς και κλινική συσχέτιση ιογενών αναπνευστικών λοιμώξεων σε νοσηλευόμενα παιδιά στις τοποθεσίες μελέτης. Θα μπορούσε να βοηθήσει στην πρόβλεψη, την πρόληψη και τον έλεγχο των ARTI στα παιδιά.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 3275, "text": "Επί του παρόντος, δεν υπάρχουν εγκεκριμένα εμβόλια ή φάρμακα διαθέσιμα για τους περισσότερους από τους αναπνευστικούς ιούς" } ], "id": 553, "question": "Υπάρχουν εμβόλια για την προστασία από ιογενείς λοιμώξεις του αναπνευστικού;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Εξάπλωση από τον νεροχύτη στον ασθενή: Μελέτη επί τόπου με χρήση πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) που εκφράζει Escherichia coli για να μοντελοποιήσει τη βακτηριακή διασπορά από τις δεξαμενές παγίδων νεροχύτη πλυσίματος χεριώνhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles /PMC5377511/SHA: 615071c8c959f24857b1bad521cc432b59719bfbΣυγγραφείς: Kotay, Shireen; Chai, Weidong; Guilford, William; Barry, Katie; Mathers, Amy J.Date: 2017-03-31DOI: 10.1128/aem.03327-16License: cc-byAbstract: Υπήρξε ένας αυξανόμενος αριθμός αναφορών που εμπλέκουν γαμπρωτεοβακτήρια ως συχνά φέροντα γονίδια ανθεκτικότητας σε φάρμακα από αποικισμένες παγίδες σε νοσοκομειακές παγίδες . Ωστόσο, ο μηχανισμός μετάδοσης από τα λύματα του νεροχύτη P-trap στους ασθενείς παραμένει ελάχιστα κατανοητός. Εδώ αναφέρουμε τη χρήση μιας καθορισμένης συλλογής εργαστηρίου νεροχύτη για πλύσιμο χεριών για τη μοντελοποίηση της διασποράς της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) Escherichia coli από τα λύματα του νεροχύτη στο περιβάλλον. Δεν βρήκαμε διασπορά του E. coli που εκφράζει GFP απευθείας από την παγίδα P στη λεκάνη του νεροχύτη ή τον περιβάλλοντα πάγκο με συμπίπτουσα ροή νερού από μια βρύση. Ωστόσο, όταν τα κύτταρα E. coli που εκφράζουν GFP αφέθηκαν να ωριμάσουν στην παγίδα P υπό συνθήκες παρόμοιες με εκείνες σε νοσοκομειακό περιβάλλον, μια υποθετική βιομεμβράνη που περιέχει E. coli που εκφράζει GFP επεκτάθηκε προς τα πάνω σε 7 ημέρες για να φτάσει στο φίλτρο . Αυτό στη συνέχεια είχε ως αποτέλεσμα τη διασπορά των σταγονιδίων στις γύρω περιοχές (<30 in.) κατά τη λειτουργία της βρύσης. Δείξαμε επίσης ότι ο αποικισμός της παγίδας P θα μπορούσε να συμβεί με ανάδρομη μετάδοση κατά μήκος ενός κοινού σωλήνα. Υποθέτουμε ότι οι οργανισμοί κινητοποιούνται μέχρι το φίλτρο από την P-παγίδα, με αποτέλεσμα τη διασπορά σταγονιδίων παρά τη διασπορά απευθείας από την παγίδα P. Αυτή η εργασία βοηθά στον περαιτέρω καθορισμό του τρόπου μετάδοσης των βακτηρίων από μια δεξαμενή P-trap σε έναν ευάλωτο νοσηλευόμενο ασθενή. ΣΗΜΑΣΙΑ Πολλές πρόσφατες αναφορές καταδεικνύουν ότι οι σωλήνες αποχέτευσης του νεροχύτη αποικίζονται με εξαιρετικά συνεπακόλουθα πολυανθεκτικά βακτήρια, τα οποία στη συνέχεια καταλήγουν σε νοσοκομειακές λοιμώξεις. Ωστόσο, ο μηχανισμός διασποράς των βακτηρίων από το νεροχύτη στους ασθενείς δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως. Μέσω της δημιουργίας μιας μοναδικής γκαλερί νεροχύτη, αυτή η εργασία διαπίστωσε ότι εμφανίζεται ένας σταδιακός τρόπος μετάδοσης που περιλαμβάνει ανάπτυξη βιοφίλμ από τον κάτω σωλήνα στο φίλτρο του νεροχύτη και επακόλουθο πιτσίλισμα στο μπολ και στη γύρω περιοχή, αντί να πιτσιλιστεί απευθείας από το νερό στον κάτω σωλήνα. Έχουμε επίσης αποδείξει ότι η μετάδοση βακτηρίων μπορεί να συμβεί μέσω συνδέσεων σε υδραυλικές εγκαταστάσεις λυμάτων σε γειτονικούς νεροχύτες. Αυτή η εργασία βοηθά στον σαφέστερο προσδιορισμό του μηχανισμού και του κινδύνου μετάδοσης από μια πηγή λυμάτων σε νοσηλευόμενους ασθενείς σε έναν κόσμο με βακτήρια ολοένα και πιο ανθεκτικά στα αντιβιοτικά που μπορούν να ευδοκιμήσουν σε περιβάλλοντα λυμάτων και να προκαλέσουν λοιμώξεις σε ευάλωτους ασθενείς. Κείμενο: Παρά τις πρώτες αναφορές (1 ) (2) (3) (4) (5) , η υπόθεση ότι οι παγίδες νεροχύτη πλυσίματος στο χέρι μπορούν να λειτουργήσουν ως δεξαμενές βακτηρίων που προκαλούν νοσοκομειακές λοιμώξεις έχει συχνά παραβλέπεται. Πρόσφατα υπήρξε μια ανησυχητική αύξηση των κρουσμάτων που σχετίζονται με το νεροχύτη παγκοσμίως, με πολλές αναφορές να δημιουργούν μια παρατήρηση (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) . Ένας νεροχύτης λειτουργεί συχνά ως ανοιχτός αγωγός για τα λύματα σε έναν χώρο περίθαλψης ασθενών που συχνά βρίσκεται στον ίδιο χώρο με τον ασθενή. Τα ιδρύματα υγειονομικής περίθαλψης συχνά επενδύουν σε απεγνωσμένες παρεμβάσεις για την αντιμετώπιση νοσοκομειακών εστιών. Η προτιμώμενη μέθοδος για την αντιμετώπιση του μεγαλύτερου μέρους της μετάδοσης που σχετίζεται με το περιβάλλον είναι η χρήση ενισχυμένου καθαρισμού με χρήση χημικών και φυσικών παραγόντων (14, 15) . Δυστυχώς, οι συνήθεις προσεγγίσεις είναι αναποτελεσματικές για την πλήρη εξάλειψη των ανθεκτικών στα φάρμακα γαμπρωτεοβακτηρίων σε μια απρόσιτη μικροβιολογικά ενεργή περιοχή όπως μια παγίδα νιπτήρα (6, (16) (17) (18) (19) (20) . Το υγρό, υγρό και σχετικά προστατευμένο περιβάλλον σε μια παγίδα νεροχύτη ευνοεί το σχηματισμό πλούσιων σταθερών μικροβιακών κοινοτήτων (16, 21, 22). Αυτές οι κοινότητες θα εκτεθούν σε υγρά και απόβλητα που απορρίπτονται σε νεροχύτη και μπορεί να περιλαμβάνουν αντιμικροβιακά, απορριπτόμενα ποτά, σαπούνι, πιθανώς παθογόνα βακτήρια από τα χέρια των εργαζομένων στον τομέα της υγείας και άλλα αντικείμενα. Εν ολίγοις, οι παγίδες νεροχύτη θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως πρόσφορο έδαφος για ευκαιριακά και εξαιρετικά ανθεκτικά στα αντιμικροβιακά βακτήρια που δεν μπορούν εύκολα να καθαριστούν ή να αφαιρεθούν (23) (24) (25) (26) (27) (28) . Υπάρχουν πολλές αναφορές για μια γενετική συσχέτιση μεταξύ παθογόνων που βρίσκονται στις παγίδες του νεροχύτη και εκείνων που βρίσκονται σε ασθενείς (29, 30) . Ωστόσο, εκπληκτικά λίγη δουλειά έχει γίνει για την κατανόηση της δυναμικής μετάδοσης σε μικροκλίμακα. Είχε αποδειχθεί προηγουμένως χρησιμοποιώντας ένα εναιώρημα φθοριζόντων σωματιδίων (Glo Germ; Glo Germ Co., Moab, UT) ότι το υλικό που εγχέεται στην παγίδα P διασκορπίζεται γύρω από έναν νεροχύτη για το πλύσιμο των χεριών (6) . Ωστόσο, αυτό το αποτέλεσμα δεν έχει επαναληφθεί μέχρι στιγμής στις μελέτες παρακολούθησης. Η διασπορά δεν έχει διερευνηθεί ποτέ με ζωντανούς οργανισμούς. Τελικά, πολλές λεπτομέρειες παραμένουν αδιευκρίνιστες σχετικά με την εξάπλωση των Enterobacteriaceae σε συστήματα λυμάτων: (i) μπορούν οι οργανισμοί να αναπτυχθούν ανάδρομα από το νερό P-trap στο φίλτρο του νεροχύτη, (ii) μπορούν οι οργανισμοί να εξαπλωθούν από τη μια καταβόθρα στην άλλη κατά μήκος του εσωτερικού επιφάνειες σωλήνων με κοινόχρηστα συστήματα αποστράγγισης και (iii) ποιο τμήμα ενός αποικισμένου σωλήνα αποχέτευσης οδηγεί σε διασπορά στο μπολ νεροχύτη κατά τη διάρκεια μιας εκδήλωσης πλυσίματος χεριών; Στόχος μας είναι να κατανοήσουμε καλύτερα τη δυναμική διασποράς των γαμμαπρωτεοβακτηρίων που ζουν στα λύματα ενός φίλτρου και P-trap σε μια περιοχή όπου θα μπορούσαν να εκτεθούν ασθενείς και εργαζόμενοι στον τομέα της υγείας. Για να μελετήσουμε αυτή τη δυναμική, χρησιμοποιήσαμε έναν υποκατάστατο οργανισμό που θα μπορούσε εύκολα να εντοπιστεί ενώ παρέμενε στην οικογένεια των Εντεροβακτηριδίων, όπου αναπτύσσονται μερικές από τις πιο ανησυχητικές απειλές στη μικροβιακή αντοχή (30). Π-παγίδα. Τις πρώτες 14 ημέρες μετά την εγκατάσταση της παγίδας P με καθιερωμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) που εκφράζει Escherichia coli και μόνο νερό που έτρεχε από τη βρύση, το GFPexpressing E. coli δεν ανιχνεύθηκε στην εξάτμιση πέρα ​​από 1,5 in. πάνω από το επίπεδο του υγρού στην παγίδα P. Το E. coli που εκφράζει GFP, ωστόσο, βρέθηκε ότι είναι βιώσιμο στην παγίδα P χωρίς προσθήκη θρεπτικών συστατικών. Στη συνέχεια καθιερώθηκε ένα διατροφικό σχήμα για την κατανόηση της επίδρασης των θρεπτικών ουσιών στην κινητικότητα και την ανοδική ανάπτυξη. Η προσθήκη ζωμού τρυπτικής σόγιας (TSB) προώθησε την ανάπτυξη E. coli που εκφράζει GFP ήδη από την 1η ημέρα, με ανάπτυξη που παρατηρείται στην εξάτμιση 2 in. πάνω από την επιφάνεια του υγρού στην παγίδα P (Πίνακας 1) . Την 7η ημέρα, το φίλτρο (ϳ8 in. πάνω από το υγρό στην παγίδα Ρ) βρέθηκε να αποικίζεται με Ε. coli που εκφράζει GFP. Αυτό μεταφράζεται σε μέσο ρυθμό ανάπτυξης 1 ίντσας/ημέρα σε όλο το μήκος του σωλήνα εξάτμισης με την προσθήκη θρεπτικών ουσιών και χωρίς λειτουργία βρύσης. Το E. coli που εκφράζει GFP δεν ανιχνεύτηκε στο νερό της βρύσης. Μετάδοση βακτηριδίων από βυθό σε νεροχύτη. Σε αυτά τα πειράματα, ένας πλευρικός νεροχύτης (νεροχύτης 5) ήταν η μόνη παγίδα P που εμβολιάστηκε με E. coli που εκφράζει GFP και επομένως ήταν η μοναδική πηγή μετάδοσης στις συνδεδεμένες καταβόθρες. Ξεκινώντας με χαμηλότερη συγκέντρωση εμβολίου (103 CFU/ml) στο νεροχύτη 5, την ημέρα 7, ανιχνεύθηκε E. coli που εκφράζει GFP στο νεροχύτη 2 και στο νεροχύτη 3 Ρ-παγίδες (Εικ. 1α). Με συγκεντρώσεις εμβολίου 10 6 CFU/ml και Ͼ10 10 CFU/ml στο νεροχύτη 5, όλες οι παγίδες P στη συλλογή του νεροχύτη με εξαίρεση τον νεροχύτη 1 βρέθηκαν να αποικίζονται με E. coli που εκφράζει GFP μετά από 7 ημέρες (Εικ. 1β και γ) . Το νερό της βρύσης και οι αεριστές βρέθηκαν αρνητικά για E. coli που εκφράζει GFP. Ανεξάρτητα από την αρχική συγκέντρωση εμβολίου, την ημέρα 7 το υψηλότερο επίπεδο αποικισμού καταγράφηκε στην παγίδα νεροχύτη 3 Ρ. Μετά την 7η ημέρα, όταν το σχήμα θρεπτικών συστατικών (που περιγράφηκε προηγουμένως) ακολουθήθηκε για επιπλέον 7 ημέρες σε καθένα από τους νεροχύτες στη γκαλερί νεροχύτη με συγκέντρωση εμβολίου Ͼ10 10 CFU/ml, ανιχνεύθηκε E. coli που εκφράζει GFP στα φίλτρα των νεροχυτών 2 και 3 την ημέρα 14. Αυτό το εύρημα επικύρωσε τον ανοδικό ρυθμό ανάπτυξης και ανάπτυξης στην εξάτμιση όταν προστέθηκαν θρεπτικά συστατικά. Περιστασιακά παρατηρήθηκαν μη φθορίζουσες αποικίες στα δείγματα νερού P-trap που συλλέχθηκαν από τις καταβόθρες, οι οποίες στη συνέχεια αναγνωρίστηκαν ως Pseudomonas sp. ή Stenotrophomonas maltophilia, και οι φθορίζουσες αποικίες επιβεβαιώθηκαν ότι είναι E. coli. Διασπορά μικροσφαιρών από καταβόθρες. Στο πρώτο πείραμα διασποράς, όταν ενοφθαλμίστηκαν φθορίζουσες μικροσφαίρες στην ουρά αποστράγγισης μετατόπισης μόνο 4 in. κάτω από το φίλτρο, δεν ανιχνεύθηκαν μικροσφαίρες στα πολυεστερικά φύλλα που τοποθετήθηκαν στον χώρο του πάγκου. Ωστόσο, όταν το μπολ νεροχύτη επικαλύφθηκε με τις μικροσφαίρες, τα φύλλα πολυεστέρα που επιστρώθηκαν στον χώρο του πάγκου κατέλαβαν τις διασκορπισμένες μικροσφαίρες που προκλήθηκαν από τη λειτουργία της βρύσης. Παρατηρήθηκε διασπορά σχεδόν σε όλες τις ζώνες του χώρου του πάγκου του νεροχύτη (Εικ. 2) . Σχετικά υψηλότερα επίπεδα διασποράς παρατηρήθηκαν κατά μήκος του κύριου και του δευτερεύοντος άξονα του ελλειπτικού μπολ νεροχύτη (ζώνες 2, 5, 6, 9, 11 και 12). Οι πρόσθιες γωνίες του χώρου του πάγκου του νεροχύτη (ζώνες 4 και 7), οι οποίες ήταν πιο απομακρυσμένες από την πρόσκρουση του νερού στο μπολ νεροχύτη, έλαβαν τη χαμηλότερη διασπορά. Διασπορά E. coli που εκφράζει GFP από νεροχύτες. Αρχικά η παγίδα Ρ μόνη της εμβολιάστηκε με E. coli που εκφράζει GFP και εγκαταστάθηκε προσεκτικά, διατηρώντας το σωλήνα εξάτμισης και το φίλτρο απαλλαγμένο από E. coli που εκφράζει GFP πριν λειτουργήσουν οι βρύσες. Δεν παρατηρήθηκε CFU φθορισμού στις πλάκες που τοποθετήθηκαν στον πάγκο ή προσαρτήθηκαν στην επιφάνεια του μπολ μετά τη λειτουργία της βρύσης. Ομοίως, δεν ανιχνεύθηκε καμία φθορίζουσα CFU όταν εμβολιάστηκε το GFPexpressing E. coli στην ουρά αποστράγγισης offset μόνο 4 in. κάτω από το σουρωτήρι. Είναι ενδιαφέρον ότι όταν υπήρχε εμφανές εφεδρικό νερό πάνω από το φίλτρο ως αποτέλεσμα υψηλότερου ρυθμού ροής νερού από τη βρύση από το ρυθμό αποστράγγισης από την παγίδα P, ανιχνεύτηκε διασπορά στις πλάκες που ήταν προσαρτημένες στην επιφάνεια του μπολ. ​​Το σχέδιο διασποράς καταγράφηκε όταν το μπολ νεροχύτη επικαλύφθηκε με GFPexpressing E. coli ήταν συγκρίσιμο με το μοτίβο που καταγράφηκε όταν το μπολ νεροχύτη ήταν επικαλυμμένο με φθορίζουσες μικροσφαίρες (Εικ. 2) . Η διασπορά ήταν σημαντικά υψηλότερη κατά μήκος των αξόνων (ζώνες 6, 9, 11 και 12) και χαμηλότερη στις γωνίες του χώρου του πάγκου του νεροχύτη (ζώνες 4, 7 και 10). Αντίθετα, η διασπορά του E. coli που εκφράζει GFP προκάλεσε Η λειτουργία της βρύσης ήταν πολύ πιο εκτεταμένη όταν το φίλτρο αφέθηκε να αποικιστεί με GFPexpressing E. coli πριν από το πείραμα διασποράς. Εκτός από το χώρο του πάγκου του νεροχύτη, μετρήσαμε τη διασπορά στο μπολ νεροχύτη, τη βρύση, τις λαβές της βρύσης, τις ασπίδες για πιτσιλίσματα και την εκτεταμένη επιφάνεια του πάγκου. Η διασπορά του E. coli που εκφράζει GFP ήταν υψηλότερη στις πλάκες που ήταν προσαρτημένες στο μπολ νεροχύτη (Εικ. 3β). Επιπλέον, η διασπορά ήταν μεγαλύτερη κατά μήκος του Ϫ\" και το \"ϩ\" υποδηλώνουν την απουσία και την παρουσία του E. coli που εκφράζει GFP, αντίστοιχα. ελάσσονος άξονας του μπολ νεροχύτη (Εικ. 3b , ζώνες Β3, Β4 και Β10) παρά κατά μήκος του κύριου άξονα του μπολ νεροχύτη, που σχετίζεται με μικρότερη απόσταση από το σημείο πρόσκρουσης του νερού της βρύσης μέχρι το μπολ κατά μήκος αυτού του άξονα. Ο επόμενος υψηλότερος αριθμός CFU από τη διασπορά καταγράφηκε στην περιοχή του πάγκου κοντά στις βρύσες (Εικ. 3a, ζώνες 12 και 11). Παρόμοιο μοτίβο υψηλότερης διασποράς κοντά στις βρύσες και χαμηλότερης διασποράς στις γωνίες του χώρου του πάγκου (Εικ. 3a, ζώνες 4, 7 και 10) παρατηρήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας μικροσφαιρίδια. Η διασπορά καταγράφηκε επίσης σε άλλες ζώνες του χώρου του πάγκου, στις ασπίδες πιτσιλίσματος από Plexiglas, στις βρύσες, στις λαβές της βρύσης και στην εκτεταμένη επιφάνεια (Εικ. 3γ). Δεν καταγράφηκαν CFU που να εκφράζουν GFP E. coli σε πλάκες τοποθετημένες πέραν των 30 in. από το φίλτρο, οριοθετώντας το εύρος διασποράς κάτω από αυτές τις πειραματικές συνθήκες. Ο Πίνακας 2 δίνει μια περίληψη των συνολικών φορτίων κατανομής που καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας φθορίζουσες μικροσφαίρες και E. coli που εκφράζουν GFP σε κάθε πείραμα. Τα φορτία διασποράς στον μετρητή νεροχύτη ήταν συγκρίσιμα όταν το μπολ νεροχύτη ήταν επικαλυμμένο με μικροσφαίρες ή E. coli που εκφράζει GFP πριν από τη λειτουργία της βρύσης. Αν και το φορτίο διασποράς στον μετρητή νεροχύτη ήταν χαμηλότερο όταν αποικίστηκε το φίλτρο νεροχύτη, είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι το μπολ του νεροχύτη έλαβε την υψηλότερη διασπορά. Για να μιμηθούμε τη διασπορά σε νοσοκομειακό περιβάλλον, πρώτα ερευνήσαμε εάν η έκφραση GFPE. αποικισμός σε παγίδα καταβόθρα όπως έχουν κάνει πολλά άλλα γαμμαπρωτεοβακτήρια που εμπλέκονται σε νοσοκομειακές επιδημίες (6, 28) . Πολλές πρόσφατες αναφορές καταδεικνύουν ότι οι παγίδες Ρ αποικίζονται με εξαιρετικά συνεπακόλουθα γαμπρωτεοβακτήρια, τα οποία στη συνέχεια καταλήγουν σε νοσοκομειακή μετάδοση (29, 31, 32). Το συγκρατημένο νερό σε μια παγίδα P-παγίδας νεροχύτη υπάρχει για να παρέχει ένα φράγμα νερού για να αποτρέψει την απαέρωση της μυρωδιάς του υπονόμου, αλλά μπορεί κατά λάθος να παρέχει ευνοϊκές συνθήκες για παθογόνους και ευκαιριακούς ανθεκτικούς στα αντιβιοτικά μικροοργανισμούς να επιβιώσουν και να αναπτύξουν ανθεκτικά βιοφίλμ (3, 33 ) . Ωστόσο, ο μηχανισμός διασποράς των βακτηρίων στην παγίδα P στους ασθενείς ή στην γύρω περιοχή υγειονομικής περίθαλψης δεν είχε αποσαφηνιστεί πλήρως. Ξεκινήσαμε με την υπόθεση ότι τα βακτήρια προέρχονται από την παγίδα P μέσω δημιουργίας σταγονιδίων όταν το νερό από τη βρύση χτυπά το νερό της παγίδας P, μολύνοντας έτσι το μπολ του νεροχύτη και τη γύρω περιοχή. Το εύρημα που υποστηρίζει αυτή τη θεωρία είχε προηγουμένως αναφερθεί χρησιμοποιώντας σωματίδια Glo Germ (6) . Ωστόσο, στην παρούσα μελέτη, με ιδιαίτερη προσοχή για την αποφυγή μόλυνσης από το σουρωτήρι και το τεμάχιο ουράς, η διασπορά απευθείας από την παγίδα P νεροχύτη είτε με μικροσφαίρες είτε με E. coli που εκφράζει GFP δεν μπορούσε να αναπαραχθεί όπως αναφέρθηκε προηγουμένως (6) . Μάλλον αυτή η εργασία δείχνει έναν διαφορετικό, πιο σταδιακό τρόπο μετάδοσης από μια δεξαμενή P-trap στο νεροχύτη και το περιβάλλον περιβάλλον. Το E. coli που εκφράζει GFP μόνο στην παγίδα P διατηρήθηκε για 14 ημέρες αλλά δεν αναπτύχθηκε ούτε κινητοποίησε την σωλήνωση της εξάτμισης προς το φίλτρο μόνο με διακοπτόμενη έκθεση σε νερό. Ωστόσο, όταν στη συνέχεια προστέθηκαν θρεπτικά συστατικά στο σύστημα, οι οργανισμοί ανέπτυξαν γρήγορα την απόληξη της εξάτμισης στο φίλτρο σε περίπου μία ίντσα την ημέρα. Σε ένα πραγματικό περιβάλλον, η κινητικότητα των βακτηρίων στο εσωτερικό της εξάτμισης περιορίζεται σε σχετικά σποραδικά και σύντομα γεγονότα διαβροχής στα οποία η κολύμβηση είναι μια ευκαιρία για αποικισμό νέων επιφανειών. Θεωρείται ότι μόλις δημιουργηθεί, το βιοφίλμ προάγει την ανοδική ανάπτυξη του E. coli που εκφράζει GFP στην εξάτμιση με επιταχυνόμενο ρυθμό. Το σχήμα θρεπτικών ουσιών που προώθησε τον αποικισμό στο μοντέλο μας αντανακλά τις παρατηρήσεις μας και άλλων για αντικείμενα που συνήθως απορρίπτονται στους νεροχύτες νοσοκομείων (ενδοφλέβια υγρά, συμπληρώματα διατροφής και υπολείμματα ποτών) (5, 32). ένα βασικό εύρημα σε αυτή τη μελέτη, καθώς αυτό υπογραμμίζει την ιδέα ότι οι υδραυλικές εγκαταστάσεις μπορεί να είναι ένα πιο συνεχές σύστημα με κοινή μικροβιολογία από έναν μεμονωμένο νεροχύτη. Η γκαλερί νεροχύτη που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη παρείχε ένα μοναδικό in situ πλεονέκτημα για τη διερεύνηση της μετάδοσης βακτηριδίων από νεροχύτη σε νεροχύτη μέσω κοινών αποχετεύσεων. Οι δύο πιθανοί μηχανισμοί για τον αποικισμό των φίλτρων P-trap είναι η σπορά οργανισμών από πάνω και η ανάδρομη εξάπλωση των οργανισμών κατά μήκος κοινών σωλήνων σε μια υποδομή λυμάτων νοσοκομείων. Εδώ αποδεικνύουμε ότι είναι δυνατό για το E. coli που εκφράζει GFP να μολύνει παρακείμενες παγίδες P με μόνο χρόνο και νερό, δεδομένης της τυπικής ανύψωσης των σωληνώσεων του κώδικα των ΗΠΑ κατά 0,25 πόδια/ft. Η μετάδοση από το νεροχύτη σε νεροχύτη ή η ανάδρομη μετάδοση μπορεί να εξηγεί την επανεμφάνιση του αποικισμού παθογόνων μετά από στρατηγικές παρέμβασης όπως η απολύμανση ή η αντικατάσταση υδραυλικών εγκαταστάσεων (23) . Ο νεροχύτης 3 ήταν χαμηλότερος στην κλίση στη γραμμή αποστράγγισης (βλ. 4) με αναμφισβήτητα την μεγαλύτερη ευκαιρία για παλινδρόμηση και ανάδρομη διαβροχή. Ο νεροχύτης 1, από την άλλη πλευρά, βρισκόταν πιο μακριά από την πηγή (νεροχύτης 5) και η παγίδα P είχε τη μεγαλύτερη κλίση στη γραμμή αποστράγγισης που συνδέει τους νεροχύτες, κάτι που θα μπορούσε ίσως να συμβάλει στους λόγους που δεν υπήρχε E που εκφράζει GFP ανιχνεύθηκε αποικισμός coli σε αυτό μετά από 7 ημέρες. Έχει γίνει περισσότερη έρευνα σχετικά με τη μικροβιολογική δυναμική των μολυσματικών ιικών σωματιδίων, όπως αυτά του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου (SARS) και των ιών Έμπολα μέσω των εγκαταστάσεων υδραυλικών συστημάτων (34) (35) (36) . Ωστόσο, η μικροβιολογία, η βιωσιμότητα και η δυναμική μπορεί να είναι πολύ διαφορετικές, αν και τα ζητήματα αντίστροφης ροής και ενοφθαλμισμού θα μπορούσαν να έχουν κάποιους παραλληλισμούς κατά τη σύγκριση των ιών με τα βακτήρια. Καθώς τα Enterobacteriaceae μπορούν είτε να πολλαπλασιαστούν είτε να παραμείνουν βιώσιμα για μεγάλες χρονικές περιόδους σε βιομεμβράνες που επικαλύπτουν το εσωτερικό των παγίδων P και των συνδεδεμένων υδραυλικών εγκαταστάσεων, μπορεί να μην είναι βιώσιμο να στοχεύσουμε οποιαδήποτε παρέμβαση περιορισμένη σε ένα μεμονωμένο νεροχύτη ως πηγή συγκεκριμένου παθογόνου. Δεδομένα από διαφορετικά πειράματα διασποράς υποδηλώνουν ότι παρόλο που οι παγίδες Ρ μπορούν να λειτουργήσουν ως πηγή ή δεξαμενή παθογόνων, η φυσική παρουσία του οργανισμού στο μπολ νεροχύτη ή ο αποικισμός του φίλτρου είναι απαραίτητη για να συμβεί η διασπορά. Ο αποικισμός στραγγιστών ή αποχετεύσεων που αναφέρθηκε σε προηγούμενες μελέτες (7, 10, 13, 24, 37) ήταν ίσως αποτέλεσμα της ανιούσας ανάπτυξης βιοφίλμ από την παγίδα P στο φίλτρο ή της εισαγωγής μέσω μολυσμένων υγρών. Πολλές από τις μελέτες χρησιμοποίησαν δείγματα επιχρίσματος, τα οποία πιθανότατα έλαβαν δείγμα από το φίλτρο και όχι από το νερό P-trap (17, 20) . Μόλις αποικίστηκε το φίλτρο, το νερό από τη βρύση οδήγησε σε διασπορά E. coli που εκφράζει GFP στο μπολ και στις γύρω επιφάνειες έως και 30 in. Το εύρος διασποράς (6) . Η μεγαλύτερη διασπορά κοντά στη βρύση μπορεί να αποδοθεί στα συγκεκριμένα σχέδια του μπολ νεροχύτη και της βρύσης σε αυτή τη μελέτη, τα οποία καθορίζουν τη γωνία επαφής της πρόσκρουσης του νερού. Αυτό είναι ένα σημαντικό εύρημα, καθώς πολλοί νεροχύτες στα νοσοκομεία έχουν παρόμοιο σχεδιασμό, με τις λαβές βρύσης να αντιπροσωπεύουν μια επιφάνεια υψηλής αφής για τους χρήστες νεροχύτη (38) . Μπορεί επίσης να συναχθεί το συμπέρασμα από τα πειράματα διασποράς ότι οι δευτερεύουσες και διαδοχικές διασπορές πιθανότατα θα αύξαναν τον βαθμό και το εύρος της διασποράς. Υπάρχουν αρκετοί περιορισμοί σε αυτό το έργο. Πρώτα, η χρήση παρόμοιων μπολ νεροχύτη σε αυτούς τους νεροχύτες εξετάζει μόνο το σχέδιο διασποράς αυτού του συγκεκριμένου σχεδίου νεροχύτη. Ομοίως, η μετάδοση από νεροχύτη σε νεροχύτη μπορεί να μην είναι εφαρμόσιμη σε όλα τα υδραυλικά συστήματα αποχέτευσης, καθώς τα εξαρτήματα στο σωλήνα είναι πολύ κοντά μεταξύ τους, σε αντίθεση με τις περισσότερες διατάξεις σε εγκαταστάσεις υγειονομικής περίθαλψης. Ωστόσο, εικάζουμε ότι η μετάδοση θα μπορούσε να συμβεί σε μεγαλύτερα συστήματα σε μεγαλύτερες χρονικές κλίμακες, ειδικά εάν περιλαμβάνονταν επίσης βαριά φορτία θρεπτικών συστατικών και μόλυνσης. Το E. coli που εκφράζει GFP είναι ένα εργαστηριακό υποκατάστατο και τα υποτιθέμενα βιοφίλμ που δημιουργήθηκαν στο σύντομο χρονικό πλαίσιο των πειραμάτων μας είναι απίθανο να είναι τόσο περίπλοκα ή σταθερά όσο τα βιοφίλμ που αναπτύχθηκαν σε ένα σύστημα νοσοκομειακών λυμάτων για πολλά χρόνια. Ωστόσο, για να αντιμετωπίσουμε τη μονομικροβιακή κυριαρχία του E. coli που εκφράζει GFP που προστέθηκε στο σύστημα, κρατήσαμε το σύστημα ανοιχτό και άλλοι περιβαλλοντικοί οργανισμοί μπόρεσαν να αποικίσουν σε μια προσπάθεια να μιμηθούν το νοσοκομειακό σύστημα. Ένας άλλος περιορισμός ήταν η ανάγκη προσθήκης θρεπτικών ουσιών στην αποχέτευση για να εξασφαλιστεί ο γρήγορος και ισχυρός αποικισμός. Δεν είμαστε ξεκάθαροι πόσο διαδεδομένη είναι η πρακτική της απόρριψης ενδοφλεβίων υγρών που περιέχουν δεξτρόζη ή υπολειμμάτων ποτών στους νεροχύτες για το πλύσιμο των χεριών. Ωστόσο, έχουμε παρατηρήσει αυτή την πρακτική, και ανέκδοτα φαίνεται να είναι σχετικά κοινή στις Ηνωμένες Πολιτείες. Επίσης, δεν χαρακτηρίσαμε πλήρως τα μεγέθη των σταγονιδίων, ούτε επιδεικνύουμε δειγματοληψία αέρα για να καταλάβουμε εάν η διασπορά είναι μόνο σταγονίδια ή αν υπάρχουν επίσης αερολύματα που περιέχουν E. coli που εκφράζει GFP. Αυτό θα απαιτούσε πρόσθετες δοκιμές και σχεδιάζεται ως μελλοντική εργασία. Συνοπτικά, αυτή η εργασία μοντελοποιεί για πρώτη φορά καλύτερα τους μηχανισμούς εξάπλωσης των πολυανθεκτικών παθογόνων παραγόντων που προκύπτουν από την αποχέτευση του νεροχύτη και μολύνουν ασθενείς. Η διασπορά σταγονιδίων από την παγίδα P δεν συμβαίνει άμεσα. Είναι μάλλον μια διαδικασία πολλαπλών σταδίων: η διασπορά προέρχεται από το φίλτρο και/ή το μπολ μετά την ανάπτυξη του βιοφίλμ από τη μικροβιακή δεξαμενή της παγίδας P. Επιδεικνύουμε επίσης μετάδοση από νεροχύτη σε νεροχύτη μέσω ενός κοινού σωλήνα υγιεινής. Αυτή η εργασία θα μπορούσε να έχει συνέπειες για την ασφάλεια των ασθενών, τον έλεγχο των λοιμώξεων και τις παρεμβάσεις, καθώς και το σχεδιασμό μελλοντικών συστημάτων υδραυλικών νοσοκομείων για την εξάλειψη αυτού του τρόπου μετάδοσης σε ευάλωτους νοσηλευόμενους ασθενείς. Σχεδιασμός γκαλερί νεροχύτη. Μια ειδική γκαλερί νεροχύτη δημιουργήθηκε για να προσομοιώσει νοσοκομειακούς νεροχύτες πλυσίματος χεριών. Η γκαλερί αποτελούνταν από πέντε μονάδες νεροχύτη συναρμολογημένες η μία δίπλα στην άλλη (Εικ. 4) . Οι πέντε σταθμοί νεροχύτη πλυσίματος χεριών ήταν πανομοιότυποι σε σχέδια και διαστάσεις μπολ και διαμορφώθηκαν από τον πιο κοινό τύπο νεροχύτη πλυσίματος χεριών στη μονάδα εντατικής θεραπείας στο νοσοκομείο οξείας φροντίδας στο Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου της Βιρτζίνια. Μεταξύ των νεροχυτών τοποθετήθηκαν χωρίσματα από φύλλο πλεξιγκλάς ύψους 24 ιντσών για την αποφυγή πιτσιλίσματος και διασταυρούμενης μόλυνσης. Κάθε μονάδα νεροχύτη κατασκευάστηκε με ενσωματωμένο νεροχύτη/πάγκους Corian χωρίς υπερχείλιση και εφοδιάστηκε με 8 ιντσών. κεντρικό σετ βρύση με λαιμό χήνας 2 λαβών (Elkay, Oak Brook, IL). Η γραμμή αποχέτευσης (Dearborn Brass-Oatey, Cleveland, OH). Όλα τα φωτιστικά κατασκευάστηκαν από ορείχαλκο με επιχρωμίωση. Κάθε ένα από τα νεροχύτη P-παγίδες συνδέθηκε με ένα 3-in. κοινός σωλήνας από χυτοσίδηρο με κλίση σε έναν σύνδεσμο Τ που οδηγεί στη γραμμή υγιεινής του κτιρίου που βρίσκεται πίσω από τον νεροχύτη 3 (Εικ. 4) .Εμβολιασμός, ανάπτυξη και εγκατάσταση του E. coli που εκφράζει GFP σε παγίδες P νεροχύτη. Για το στέλεχος E. coli που εκφράζει GFP (ATCC 25922GFP), το γονίδιο της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) περιέχεται σε ένα πλασμίδιο που περιέχει επίσης ένα γονίδιο αντίστασης στην αμπικιλλίνη. Μία μοναδική απομονωμένη αποικία E. coli που εκφράζει GFP που αναπτύχθηκε από απόθεμα Ϫ80°C εμβολιάστηκε σε 5 ml ζωμό τρυπτικής σόγιας (TSB) (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD) που περιείχε 100 g/ml αμπικιλλίνη (ATCC μέσο 2855 ). Η συγκέντρωση του εμβολίου και η μέθοδος διέφεραν για κάθε πείραμα. Για την εγκατάσταση του E. coli που εκφράζει GFP σε παγίδες P νεροχύτη, νέες παγίδες Ρ σε αυτόκλειστο γεμίστηκαν με 100 ml 0,1 TSB και εμβολιάστηκαν με ε10 3 CFU/ml GFPexpressing E. coli. Μετά τον εμβολιασμό, και τα δύο άκρα των παγίδων Ρ καλύφθηκαν με διάτρητο Parafilm (Bemis, Inc., Oshkosh, WI) και αφέθηκαν να επωαστούν σε θερμοκρασία δωματίου (22 Ϯ 2°C) για 14 ημέρες για να διευκολυνθεί η προσκολλημένη βακτηριακή ανάπτυξη. Το μέσο στην παγίδα P αποχύθηκε και αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​0,1 TSB κάθε 48 ώρες. Ένα κλάσμα αποχυθέντος μέσου και ένα δείγμα μπατονέτας από την εσωτερική επιφάνεια της παγίδας P επιστρώθηκαν σε πλάκες τρυπτικού άγαρ σόγιας (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD) που περιείχαν 100 g/ml αμπικιλλίνη (TSA) για την παρακολούθηση της ανάπτυξης του Ε. coli που εκφράζει GFP στις παγίδες Ρ. Οι πλάκες TSA επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 37°C και απαριθμήθηκαν οι CFU που φθορίζουν υπό υπεριώδες φως. Όλες οι προπαρασκευαστικές καλλιέργειες του E. coli που εκφράζει GFP έλαβαν χώρα σε ξεχωριστό δωμάτιο από τη στοά του νεροχύτη για να αποφευχθεί η ακούσια μόλυνση. Εγκατάσταση παγίδων P που αποικίστηκαν με E.coli που εκφράζει GFP. Μετά την επώαση 14 ημερών, οι παγίδες P στερεώθηκαν στα υδραυλικά των νεροχυτών (Εικ. 5α). Το υπόλοιπο της γραμμής αποστράγγισης είτε αποστειρώθηκε σε αυτόκλειστο (φίλτρο, σωλήνας εξάτμισης και βραχίονες παγίδας) πριν από την εγκατάσταση ή απολυμάνθηκε η επιφάνεια (κύπελλο νεροχύτη, πάγκος και βρύσες) με Caviwipes-1 (Meterx Research, Romulus, MI), διατηρώντας τουλάχιστον 1 λεπτά χρόνου επαφής. Μετά την εγκατάσταση της παγίδας P, ακολουθήθηκε ένα ημερήσιο σχήμα στο οποίο προστέθηκαν 25 ml TSB ακολουθούμενα από 25 ml διαλύματος NaCl 0,9% (αλατόνερο) σε αναλογία 1:3 μέσω του φίλτρου (Εικ. 5β) για μίμηση της πιθανής έκθεσης σε θρεπτικά συστατικά στο νοσοκομείο. Δειγματοληψία και απαρίθμηση του E. coli που εκφράζει GFP. Για την παρακολούθηση της ανάπτυξης του E. coli που εκφράζει GFP στις υδραυλικές εγκαταστάσεις, τρυπήθηκαν θυρίδες δειγματοληψίας κατά μήκος της ουράς (μεταξύ της παγίδας P και του φίλτρου) και του βραχίονα παγίδας (μεταξύ της παγίδας P και της κοινής γραμμής) . Αυτές οι τρύπες ήταν εφοδιασμένες με πώματα σιλικόνης μεγέθους 00 (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) (Εικ. 5α). Μέσα από αυτές τις θυρίδες δειγματοληψίας εισήχθησαν αποστειρωμένες μπατονέτες (Covidien, Mansfield, ΜΑ) προεμποτισμένες σε αλατούχο διάλυμα και συλλέχθηκαν δείγματα περιστρέφοντας τη μπατονέτα με κυκλική κίνηση στην εσωτερική επιφάνεια (ϳ20 cm 2) των σωλήνων εξάτμισης. Τα επιχρίσματα δείγματος στροβιλίστηκαν με παλμό σε 3 ml αλατούχου ορού και οι σειριακές αραιώσεις επιστρώθηκαν σε TSA. Το φίλτρο, ο αεριστής βρύσης και η επιφάνεια του μπολ δειγματολήφθηκαν με προ-εμποτισμένα μάκτρα και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Μετάδοση βακτηρίων από νεροχύτη σε νεροχύτη. Για τη διερεύνηση της μετάδοσης βακτηρίων από νεροχύτη σε νεροχύτη, ένας απομακρυσμένος νεροχύτης (νεροχύτης 5) (Εικ. 4) τοποθετήθηκε με μια παγίδα Ρ εμβολιασμένη με Ε. coli που εκφράζει GFP. Διερευνήθηκαν οι επιδράσεις των διαφορετικών συγκεντρώσεων εμβολίου του E. coli-10 3, 10 6 και Ͼ10 10 CFU/ml (αποικισμός για 14 ημέρες) που εκφράζει GFP. Ο προσδιορισμός του επιπέδου είδους των φθοριζουσών και μη φθοριζουσών αποικιών που ταυτοποιήθηκαν από μικτές καλλιέργειες σωλήνων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας φασματόμετρο μάζας εκρόφησης-ιονισμού με λέιζερ (MALDI)-χρόνου πτήσης (MALDI-TOF) (Vitek-MS; bioMérieux, Durham, NC). Οι διαδρομές λυμάτων των νεροχυτών 1 έως 4 είτε αποστειρώθηκαν σε αυτόκλειστο (φίλτρο, σωλήνας εξάτμισης, P-παγίδες και βραχίονες παγίδας) πριν από την εγκατάσταση ή απολυμάνθηκαν οι επιφάνειες (κύπελλο νεροχύτη, πάγκος και βρύσες) με Caviwipes-1 (Meterx Research, Romulus, MI ). Οι βρύσες σε κάθε έναν από τους πέντε νεροχύτες άνοιξαν ταυτόχρονα για 1 λεπτό, παρέχοντας νερό με ταχύτητα ροής 8 λίτρα/λεπτό, μία φορά κάθε 24 ώρες για 7 ημέρες. Δεν προστέθηκε επιπλέον τροφοδοσία σε κανέναν νεροχύτη κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου των 7 ημερών. Τις ημέρες 0 και 7, οι παγίδες Ρ σε καθεμία από τις πέντε νεροχύτες αποσυνδέθηκαν και δείγματα επιχρίσματος από την παγίδα Ρ συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Η διασπορά μετρήθηκε χρησιμοποιώντας φθορίζουσες μικροσφαίρες. Καρβοξυλικές μικροσφαίρες Fluoresbrite YO (Polysciences, Inc.) που είχαν διάμετρο 1 m και μέγιστη διέγερση και εκπομπή 529 nm και 546 nm, αντίστοιχα, χρησιμοποιήθηκαν ως ανιχνευτής στα προκαταρκτικά πειράματα για την κατανόηση της διασποράς σταγονιδίων από τους νεροχύτες πλύσης χεριών .Για να ελεγχθεί εάν οι μικροσφαίρες μπορούσαν να διασκορπιστούν κάτω από το φίλτρο νεροχύτη, ένα εναιώρημα μικροσφαιρών 1 ml (τε10 10 σωματίδια) εγχύθηκε μέσω ενός φίλτρου συνδεδεμένου σε ένα Hert 4,5-in. μετατόπιση ουράς αποστράγγισης που χρησιμοποιείται συνήθως για νεροχύτες προσβάσιμους από αναπηρικά αμαξίδια (American Standard, μοντέλο 7723018.002) (Εικ. 5γ). Η κατακόρυφη απόσταση μεταξύ του φίλτρου και του εναιωρήματος μικροσφαιρών που εγχύθηκε στον σωλήνα εξάτμισης ήταν 4 in. Ο χώρος του πάγκου γύρω από το μπολ του νεροχύτη σκουπίστηκε επιμελώς με μαντηλάκια με οινόπνευμα (Covidien Webcol 6818; Kendall), και φύλλα πολυεστέρα προκομμένα σε κατάλληλα σχήματα τοποθετήθηκαν στον πάγκο για να καλύπτουν ολόκληρο τον πάγκο του νεροχύτη και επισημάνθηκαν ανάλογα με τη θέση (Εικ. 6α). Η βρύση άνοιξε για 5 λεπτά με ρυθμό ροής νερού 1,8 έως 3,0 λίτρα/λεπτό. Τα φύλλα πολυεστέρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν αμέσως χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ChemiDoc MP (Bio-Rad Laboratories, Inc.) με χρόνο έκθεσης 5 δευτερόλεπτα. Οι φθορίζουσες μικροσφαίρες απαριθμήθηκαν από τις ψηφιακές μικρογραφίες χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image Lab (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Για να ελεγχθεί εάν οι μικροσφαίρες μπορούσαν να διασκορπιστούν από την επιφάνεια του μπολ νεροχύτη, το μπολ νεροχύτη επικαλύφθηκε ομοιόμορφα με μια μικροσφαίρα 20 ml εναιώρημα (ε10 10 σωματίδια/ml) χρησιμοποιώντας ένα μάκτρο μιας χρήσης (Sage Products, Inc., Cary, IL) και το πείραμα διασποράς επαναλήφθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφηκε παραπάνω. Για να εξακριβωθεί ότι δεν υπήρχε μη ειδικός φθορισμός υποβάθρου στο νεροχύτη και/ή στο νερό από τη βρύση, πριν από κάθε πείραμα διεξήχθη ένας έλεγχος χρησιμοποιώντας το ίδιο πρωτόκολλο αλλά χωρίς τις φθορίζουσες μικροσφαίρες. Η διασπορά μετρήθηκε χρησιμοποιώντας E.coli που εκφράζει GFP. Η διασπορά χρησιμοποιώντας Ε. coli που εκφράζει GFP διερευνήθηκε σε τρία πειράματα. Για να ελεγχθεί εάν ζωντανοί οργανισμοί στην παγίδα P μπορούσαν να διασκορπιστούν με τρεχούμενο νερό, ϳ10 10 CFU/ml E. coli που εκφράζει GFP σε αλατούχο διάλυμα προστέθηκαν σε μια παγίδα P σε αυτόκλειστο και τοποθετήθηκαν στη γραμμή αποχέτευσης που είχε προαυτοκλείστει (διηθητή, εξάτμιση και βραχίονες παγίδας). Ομοίως, για να ελεγχθεί εάν ζωντανοί οργανισμοί θα μπορούσαν να διασκορπιστούν από τις ουρές των νεροχυτών προσβάσιμων σε αναπηρικά αμαξίδια, προστέθηκε ένα εναιώρημα ϳ10 10 CFU/ml E. coli που εκφράζει GFP με μια σύριγγα μέσω του φίλτρου στο τεμάχιο αποστράγγισης 4,5 ft. (Σύκο. 5γ). Ακριβώς όπως στο πείραμα διασποράς μικροσφαιρών, η κατακόρυφη απόσταση μεταξύ του φίλτρου και του εναιωρήματος E. coli που εκφράζει GFP που εγχύθηκε στο σωλήνα εξάτμισης ήταν ϳ4 in. Στη συνέχεια δοκιμάσαμε εάν ζωντανοί οργανισμοί από την επιφάνεια του μπολ νεροχύτη θα μπορούσαν να διασκορπιστούν με τρεχούμενο νερό. Η επιφάνεια του μπολ νεροχύτη επικαλύφθηκε ομοιόμορφα με ένα εναιώρημα περίπου 20 ml 10 10 CFU/ml E. coli που εκφράζει GFP. Τέλος, για να μιμηθεί όλες αυτές τις συνθήκες, μια παγίδα P αποικίστηκε με E. coli που εκφράζει GFP (για 14 ημέρες) εγκαταστάθηκε και ένα πρόγραμμα διατροφής (Εικ. 5β) παρακολουθήθηκε για 14 ημέρες για να προωθηθεί σκόπιμα ο αποικισμός του E. coli που εκφράζει GFP στον προσαρτημένο σωλήνα εξάτμισης και στο φίλτρο. Την ημέρα 15, διεξήχθη το πείραμα διασποράς. Πριν από κάθε ένα από τα πειράματα διασποράς E. coli που εκφράζουν GFP, ο χώρος του πάγκου απολυμάνθηκε επιμελώς με Caviwipes-1. Έπειτα, οι πλάκες TSA τοποθετήθηκαν στον πάγκο του νεροχύτη που περιβάλλει το μπολ και μια πλατφόρμα επέκτασης (Εικ. 6β). Πρόσθετες πλάκες προσαρτήθηκαν στο μπολ νεροχύτη, στις βρύσες, στα χωρίσματα από πλεξιγκλάς και στις λαβές της βρύσης χρησιμοποιώντας κολλητική ταινία. Οι πλάκες TSA τοποθετήθηκαν επίσης 3 μέτρα μακριά από το νεροχύτη ως αρνητικοί έλεγχοι. Η βρύση άνοιξε για 5 λεπτά με ρυθμό ροής νερού 1,8 έως 3,0 λίτρα/λεπτό. Τα καπάκια των πλακών TSA αφαιρέθηκαν μόνο κατά τη λειτουργία της βρύσης. Δείγματα επιχρίσματος από τους αεραγωγούς της βρύσης πριν και μετά τη λειτουργία συλλέχθηκαν και επιστρώθηκαν σε TSA. Πριν από κάθε πείραμα διασποράς, συλλέχθηκαν επίσης 50 ml νερού από τη βρύση και τοποθετήθηκαν δείγματα για να εκτιμηθεί η παρουσία E. coli που εκφράζει GFP στο νερό πηγής και να διασφαλιστεί ότι δεν είχε συμβεί διασταυρούμενη μόλυνση του E. coli που εκφράζει GFP. Ένα πείραμα διασποράς ελέγχου διεξήχθη επίσης χρησιμοποιώντας το ίδιο πρωτόκολλο πριν από τον εμβολιασμό με E. coli που εκφράζει GFP σε κάθε περίπτωση. Η διασπορά ανά καθορισμένη περιοχή (CFU ανά τετραγωνικό εκατοστό) συνάγεται με διαίρεση των μετρήσεων CFU στην πλάκα TSA με την επιφάνεια της πλάκας TSA.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 13701, "text": "γαμπρωτεοβακτήρια" } ], "id": 544, "question": "Ποιοι τύποι βακτηρίων εμπλέκονται στη μεταφορά γονιδίων ανθεκτικότητας στα φάρμακα;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Τεχνικές για τη μελέτη των ειδικών αντιγόνων αντιδράσεων των Β κυττάρωνhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6667631/SHA: ee632fa425607e8ff91fc3730bc0782d43ce9c0cAutkorana; Taylor, Justin J.Date: 2019-07-24DOI: 10.3389/fimmu.2019.01694License: cc-byAbstract: Τα αντισώματα κατά ξένων αντιγόνων είναι ένα κρίσιμο συστατικό της συνολικής ανοσολογικής απόκρισης και μπορούν να διευκολύνουν την κάθαρση του παθογόνου κατά τη διάρκεια μιας πρωτογενούς μόλυνσης και επίσης επακόλουθες λοιμώξεις. Η απορρύθμιση της απόκρισης των αντισωμάτων μπορεί να οδηγήσει σε αυτοάνοση νόσο, κακοήθεια ή ενισχυμένη μόλυνση. Από την πειραματική οριοθέτηση μιας ξεχωριστής γενεαλογίας Β-λεμφοκυττάρων το 1965, έχουν αναπτυχθεί διάφορες μέθοδοι για την κατανόηση των ειδικών για αντιγόνο αποκρίσεων Β κυττάρων στο πλαίσιο αυτοάνοσων ασθενειών, πρωτογενών ανοσοανεπάρκειων, μόλυνσης και εμβολιασμού. Σε αυτήν την ανασκόπηση, συνοψίζουμε τις καθιερωμένες τεχνικές και συζητάμε νέες και αναδυόμενες τεχνολογίες για την ανίχνευση της απόκρισης Β κυττάρων in vitro και in vivo, εκμεταλλευόμενοι την ειδικότητα των αντισωμάτων που σχετίζονται με τον υποδοχέα Β κυττάρων (BCR) και τα εκκρινόμενα. Αυτά περιλαμβάνουν ELISPOT, κυτταρομετρία ροής, κυτταρομετρία μάζας και μικροσκοπία φθορισμού για τον εντοπισμό και/ή την απομόνωση πρωτογενών Β-λεμφοκυττάρων ειδικών για αντιγόνο. Παρουσιάζουμε επίσης την προσέγγισή μας για τον εντοπισμό σπάνιων αντιγονοειδικών Β κυττάρων χρησιμοποιώντας μαγνητικό εμπλουτισμό που ακολουθείται από κυτταρομετρία ροής. Μόλις απομονωθούν αυτά τα κύτταρα, μπορούν να χρησιμοποιηθούν δοκιμασίες πολλαπλασιασμού in vitro και πειράματα μεταφοράς υιοθέτησης σε ποντίκια για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό της ενεργοποίησης, της λειτουργίας και της μοίρας των ειδικών για αντιγόνο Β κυττάρων. Διαγονιδιακά μοντέλα ποντικιών Β-λεμφοκυττάρων που στοχεύουν μοντέλα αντιγόνων και σηματοδότησης Β-λεμφοκυττάρων έχουν επίσης βελτιώσει σημαντικά την κατανόησή μας για τις ειδικές για το αντιγόνο αποκρίσεις Β κυττάρων in vivo. Κείμενο: Στη διάλεξή του για το Νόμπελ το 1908, ο Paul Ehrlich παρομοίασε την αλληλεπίδραση αντισώματος-αντιγόνου με κλειδαριά και κλειδί. Σκέφτηκε ότι οι αντιτοξίνες (αντισώματα) που περιέχονται σε ένα διάλυμα στον ορό των ανοσοποιημένων ζώων πρέπει να είναι πανομοιότυπες με έναν κυτταρικό υποδοχέα «γιατί ένα πραγματικά καλά κατασκευασμένο κλειδί δεν θα ανοίγει διαφορετικές κλειδαριές ταυτόχρονα» (1) . Χρειάστηκαν σχεδόν πέντε δεκαετίες για να χρησιμοποιηθεί η μικροσκοπία ανοσοφθορισμού για να επιβεβαιωθεί η κυτταρική προέλευση των αντισωμάτων (2) . Ακολούθησαν σημαντικά βήματα στον τομέα των Β κυττάρων και αντισωμάτων στη δεκαετία του 1970 με την ανάπτυξη της τεχνολογίας υβριδώματος για την παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων και την ανακάλυψη ότι η σωματική αναδιάταξη κατά τη διαφοροποίηση των Β κυττάρων ήταν υπεύθυνη για τη διαφοροποίηση των αντισωμάτων (3, 4). Η επακόλουθη έκρηξη των διαθέσιμων μονοκλωνικών αντισωμάτων οδήγησε σε επαναστατικά διαγνωστικά, θεραπευτικά και ερευνητικά αντιδραστήρια για τη διάκριση διαφορετικών τύπων ανοσοκυττάρων (5) . Μαζί, αυτές οι ανακαλύψεις μας επέτρεψαν να ανιχνεύσουμε τη χυμική ανοσία στο επίπεδο του ειδικού για αντιγόνο Β κυττάρου. Οι μέθοδοι για την ανίχνευση της ειδικής για το αντιγόνο απόκρισης Β κυττάρων έχουν βελτιώσει την κατανόησή μας για το πώς να αξιοποιήσουμε το αξιοσημείωτο εύρος του ρεπερτορίου Β κυττάρων και εξαιρετική ειδικότητα του μεμονωμένου Β κυττάρου στην ανάπτυξη (1) υποψηφίων εμβολίων που προκαλούν προστατευτικά αντισώματα. (2) αντισώματα που αποτρέπουν την ασθένεια όταν χορηγούνται προφυλακτικά. και (3) αντισώματα που μπορούν να χορηγηθούν ως θεραπεία μετά την έναρξη της νόσου. Πολλά από τα εμβόλια που είναι διαθέσιμα σήμερα αναπτύχθηκαν αρχικά εμπειρικά είτε με αδρανοποίηση, εξασθένιση ή χορήγηση μιας υπομονάδας του παθογόνου. Ωστόσο, η ανάπτυξη εμβολίου κατά των παθογόνων που παραδοσιακά είναι δύσκολο να εμβολιαστούν μπορεί να βασίζεται σε μια βαθύτερη έρευνα της απόκρισης των Β κυττάρων στα αντιγόνα που εκτίθενται στην επιφάνεια αυτών των παθογόνων. Η προστασία από τη μόλυνση σε διάφορα απομονωμένα στελέχη ιών έχει εντείνει τις προσπάθειες για την κατανόηση της αναπτυξιακής οδού των σπάνιων Β κυττάρων που παράγουν αυτά τα αντισώματα (6) (7) (8) (9) . Οι γνώσεις σχετικά με την οντογένεση αυτών των σπάνιων Β κυττάρων θα μπορούσαν να επιτρέψουν το σχεδιασμό ενός σταδιακά σχήματος εμβολίου που διεγείρει τον πρόδρομο της βλαστικής σειράς να επεκταθεί και να ωριμάσει για να παράγει κυκλοφορούντα bnAbs που θα μπορούσαν να προστατεύσουν από την απόκτηση HIV (10, 11) . Για τον RSV, οι σταθεροποιημένες εκδόσεις της πρωτεΐνης σύντηξης (F) στη διαμόρφωση πριν από τη σύντηξη έχουν οδηγήσει σε γνώσεις σχετικά με την απόκριση των Β κυττάρων στη μόλυνση και έχουν δημιουργήσει δυνητικά ασφαλέστερα και πιο αποτελεσματικά υποψήφια εμβόλια (12, 13) . Η γρίπη εκτελεί επίσης σύντηξη μέσω της περιοχής του στελέχους της πρωτεΐνης αιμοσυγκολλητίνης και η αναγνώριση των Β κυττάρων που στοχεύουν αυτή τη σχετικά διατηρημένη θέση έχει ωθήσει την έρευνα για την ανάπτυξη ενός καθολικού εμβολίου κατά της γρίπης (14) (15) (16) . Όπως ο RSV, ο HIV και η γρίπη, οι πρωτεΐνες σύντηξης του EBV και του CMV υπάρχουν σε μια διαμόρφωση πριν από τη σύντηξη και η σταθεροποίηση στις καταστάσεις πριν από τη σύντηξη θα μπορούσε να επιταχύνει σημαντικά την ανάπτυξη εμβολίου εναντίον αυτών των παθογόνων (17-19). Έχουν απομονωθεί σπάνια Β κύτταρα μνήμης που παράγουν αντισώματα ειδικά για τον μηχανισμό σύντηξης EBV. Αυτά μπορούν να εξουδετερώσουν τη μόλυνση τόσο των Β κυττάρων όσο και των επιθηλιακών κυττάρων (20). Ένα νέο παράδειγμα στην ανάπτυξη εμβολίου κατά της ελονοσίας αναδύεται επίσης με την ανακάλυψη των Β κυττάρων μνήμης IgM+ και IgD+ που στοχεύουν την πρωτεΐνη Merozoite Surface 1, που ανταποκρίνεται γρήγορα στην επαναμόλυνση της ελονοσίας (21). Περαιτέρω, πολύ ισχυρά εξουδετερωτικά αντισώματα που στοχεύουν μια νέα και διατηρημένη θέση στην πρωτεΐνη Circumsporozoite έχουν απομονωθεί από Β κύτταρα (22). Μαζί, αυτά τα παραδείγματα καταδεικνύουν τη σημασία της μελέτης των ειδικών για το αντιγόνο χυμικών αποκρίσεων σε μολυσματικές ασθένειες. Οι λύσεις στις κρυσταλλικές δομές των επιφανειακών πρωτεϊνών για μια ποικιλία παθογόνων, η διαμορφωτική σταθεροποίηση αυτών των αντιγόνων και η εφαρμογή των μεθόδων που συνοψίζονται σε αυτή την ανασκόπηση, για την ανίχνευση ειδικών για αντιγόνο αποκρίσεις Β κυττάρων, έχουν δημιουργήσει νέες ευκαιρίες για συστηματική και ορθολογική σχεδιασμός εμβολίου για τον HIV, τον RSV, τον EBV, την ελονοσία και πολλά άλλα παθογόνα. Η μελέτη των αποκρίσεων των Β κυττάρων δεν ενημέρωσε μόνο τον σχεδιασμό του εμβολίου αλλά έχει επίσης βελτιώσει την κατανόησή μας για τις αυτοάνοσες ασθένειες που προκαλούνται από αντισώματα, όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα και ο συστηματικός ερυθηματώδης λύκος (23, 24). Έως και το 20% των ώριμων, προγενέστερων Β κυττάρων έχουν υποδοχείς με την ικανότητα να δεσμεύουν αυτοαντιγόνα (25). Αν και αυτά τα κύτταρα είναι δυνητικά παθογόνα, η εξάλειψη των Β κυττάρων με υψηλή συγγένεια με αυτό-αντιγόνο μέσω απόπτωσης, η ανεργία των Β κυττάρων με χαμηλή συγγένεια με το αυτο-αντιγόνο και η απουσία Τ-κυττάρων συνδυάζονται για την προστασία από αυτοάνοση νόσο σε ποντίκια (26). Η μελέτη των ειδικών για αυτοαντιγόνο Β-λεμφοκύτταρα και η λεπτομερής ανάλυση των υποομάδων Β-λεμφοκυττάρων με παθογόνο δυναμικό στον άνθρωπο θα μπορούσε να οδηγήσει σε καλύτερη κατανόηση του τρόπου πρόληψης και θεραπείας αυτοάνοσων ασθενειών. Αν και ο όρος ειδικό για αντιγόνο Β κύτταρο χρησιμοποιείται σε αυτό το μίνι ανασκόπηση για να υποδηλώσει την ανάλυση των Β κυττάρων με βάση τη δέσμευση μεταξύ του υποδοχέα Β κυττάρων (BCR) και ενός συγκεκριμένου αντιγόνου που χρησιμοποιείται ως δόλωμα, είναι σημαντικό να έχουμε κατά νου ότι οι BCR εντός του ρεπερτορίου πολυκλωνικών Β κυττάρων παρουσιάζουν ένα φάσμα πολυαντιδραστικότητας. Στο ένα άκρο του φάσματος, ένα εξαιρετικά πολυδραστικό BCR είναι ικανό να δεσμεύει πολλαπλά δομικά άσχετα αντιγόνα με φυσιολογικά σχετικές συγγένειες. Η συχνότητα της πολυαντιδραστικότητας στο ρεπερτόριο των φυσιολογικών ενήλικων ανθρώπινων Β κυττάρων έχει υπολογιστεί ότι είναι 4% των αρχέγονων Β κυττάρων, 23% των Β κυττάρων μνήμης IgG+ και 26% των εντερικών πλασμαβλαστών IgA+ και IgG+ (27-29). Στο άλλο άκρο του φάσματος, ένα μονο-αντιδραστικό BCR ενεργοποιείται μόνο όταν συναντήσει ένα μοναδικό συγγενές αντιγόνο. Αν και υπάρχουν εξαιρέσεις, η συσσώρευση σωματικών υπερμεταλλαγών εντός των μεταβλητών περιοχών του BCR κατά τη διαδικασία ωρίμανσης της συγγένειας θεωρείται γενικά ότι οδηγεί σε αυξημένη συγγένεια και ειδικότητα για το συγγενές αντιγόνο (30, 31). Πολλές γενικές τεχνικές χρησιμοποιούνται συνήθως για ταυτοποιούν τα ειδικά για αντιγόνο Β κύτταρα (Πίνακας 1). Η τεχνική ELISPOT με ένζυμο συνδεδεμένο με το ανοσοποιητικό σήμα βασίζεται στην αρχή της σύλληψης του εκκρινόμενου αντισώματος κοντά σε κάθε κύτταρο. Στο ELISPOT των Β κυττάρων, Β κύτταρα που εκκρίνουν αντισώματα (ASC) που υπάρχουν σε ένα δείγμα ή διαφοροποιούνται in vitro προστίθενται σε πλάκες επικαλυμμένες με το αντιγόνο ενδιαφέροντος. Τα ειδικά για το αντιγόνο αντισώματα θα συνδεθούν σε κοντινή απόσταση με τη θέση των μεμονωμένων Β κυττάρων που παράγουν αυτά τα αντισώματα. Στη συνέχεια χρησιμοποιούνται δευτερογενή αντισώματα επισημασμένα με ένζυμο ή φθορισμό για την οπτικοποίηση σημείων έκκρισης αντισωμάτων και σύνδεσης με δεσμευμένο σε πλάκα αντιγόνο στη θέση των ASCs. Κάθε κηλίδα αντιστοιχεί σε αντίσωμα που παράγεται από ένα μοναδικό αντιγόνο ειδικό κύτταρο Β και επομένως η τεχνική είναι εξαιρετικά ευαίσθητη. Δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με συνδυαστικά έγχρωμα σφαιρίδια μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση των αντισωμάτων που εκκρίνονται από μεμονωμένα Β κύτταρα με το πλεονέκτημα της πολυπλεξίας της δοκιμασίας (32). Ένας περιορισμός της δοκιμασίας είναι η απαίτησή της για έκκριση αντισωμάτων από Β κύτταρα, περιορίζοντας έτσι την ανάλυση μόνο σε ένα υποσύνολο Β κυττάρων στο ρεπερτόριο, συγκεκριμένα ASC (33). Τα κύτταρα Β μνήμης μπορούν να διεγερθούν in vitro για να διαφοροποιηθούν σε ASC πριν από την προσθήκη στην επικαλυμμένη με αντιγόνο πλάκα (34) . Περαιτέρω, τα αντιγονοειδικά Β κύτταρα που προσδιορίζονται από το ELISPOT γενικά δεν είναι διαθέσιμα για ανάλυση κατάντη. Η περιοριστική αραίωση είναι μια άλλη τεχνική που έχει χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση των ειδικών για αντιγόνο Β κυττάρων. Σε αυτή την προσέγγιση, τα πρωτεύοντα κύτταρα μπορούν να αραιωθούν σειριακά έως ότου διαχωριστούν μεμονωμένα Β κύτταρα σε πλάκες μικροβυθισμάτων (36). Τα Β κύτταρα μπορούν στη συνέχεια να καλλιεργηθούν και να επεκταθούν ex vivo και/ή να απαθανατιστούν χρησιμοποιώντας EBV έτσι ώστε κάθε φρεάτιο να περιέχει ένα μονοκλωνικό αντίσωμα (3, 37, 38). Τα ειδικά για αντιγόνο Β κύτταρα μπορούν να επιλεγούν με διαλογή των υπερκειμένων καλλιέργειας για μονοκλωνικά αντισώματα που δεσμεύουν ένα αντιγόνο ενδιαφέροντος. Αν και τα αντισώματα μπορούν να αναλυθούν και να κλωνοποιηθούν, η απαίτηση για καλλιέργεια ex vivo πριν από την επιλογή αποκλείει τον προσδιορισμό του μεταγραφικού προφίλ του αρχικού Β κυττάρου σε αυτή την προσέγγιση. Αυτή η τεχνική μπορεί δυνητικά να είναι χρονοβόρα και επίπονη, αλλά η χρήση μικρορευστών και ρομποτικής έχει βελτιώσει σημαντικά την απόδοση για την επιλογή των ειδικών για αντιγόνο Β κυττάρων (39) . Οι πρόοδοι στην τεχνολογία προσδιορισμού αλληλουχίας επόμενης γενιάς μονοκυττάρου επέτρεψαν το μεταγραφικό προφίλ υψηλής απόδοσης και τον προσδιορισμό αλληλουχίας ζευγαρωμένων βαριών και ελαφρών αλυσίδων ανοσοσφαιρίνης (40) . Σε αυτή την προσέγγιση, η εξειδίκευση του αντιγόνου μπορεί να ελεγχθεί αφού κλωνοποιηθούν και παραχθούν μονοκλωνικά αντισώματα χρησιμοποιώντας τα δεδομένα προσδιορισμού αλληλουχίας. Αυτή η μέθοδος μπορεί να είναι χρήσιμη για την αναγνώριση αντιγονοειδικών Β κυττάρων που έχουν υποστεί κλωνική επέκταση μετά από εμβολιασμό ή οξεία μόλυνση (41) . Η κυτταρομετρία ροής είναι η πιο κοινή μέθοδος που χρησιμοποιείται για ανάλυση και απομόνωση μεμονωμένων κυττάρων (39) . Η ανάλυση που βασίζεται στην κυτταρομετρία ροής των ειδικών για αντιγόνο Β-λεμφοκυττάρων εξαρτάται από την επισήμανση του αντιγόνου με μια φθορίζουσα ετικέτα για να επιτρέπεται η ανίχνευση. Τα φθοριόχρωμα μπορούν είτε να προσκολληθούν ομοιοπολικά μέσω χημικής σύζευξης στο αντιγόνο, εκφραζόμενη ως ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη σύντηξης, είτε να προσκολληθούν μη ομοιοπολικά με βιοτινυλίωση του αντιγόνου. Μετά τη βιοτινυλίωση, προστίθεται στρεπταβιδίνη συζευγμένη με φθορόχρωμα για να δημιουργηθεί ένα σημασμένο τετραμερές του αντιγόνου. Η βιοτινυλίωση του αντιγόνου σε αναλογία ≤1 βιοτίνη προς 1 αντιγόνο είναι σημαντική, καθώς κάθε στρεπταβιδίνη έχει τη δυνατότητα να δεσμεύει τέσσερις βιοτίνες. Εάν η αναλογία βιοτίνης προς αντιγόνο είναι >1:1, τότε η συσσώρευση και η καθίζηση του αντιγόνου εκτός διαλύματος μπορεί να συμβεί αμέσως μόλις προστεθεί στρεπταβιδίνη. Εναλλακτικά, η κατευθυνόμενη από τη θέση βιοτινυλίωση μπορεί να επιτευχθεί με την προσθήκη είτε μιας ετικέτας AviTag είτε BioEase στο ανασυνδυασμένο αντιγόνο πριν από την έκφραση (77, 78). Όταν χρησιμοποιείται βιοτινυλίωση ειδικής θέσης, οι ερευνητές πρέπει να έχουν κατά νου ότι η ετικέτα μπορεί να αποφράξει έναν επίτοπο από την αναγνώριση από Β κύτταρα, κάτι που μπορεί να είναι προβληματικό για τα αντιγόνα του εμβολίου. Περαιτέρω, για πρωτεΐνες που ολιγομερίζονται, μπορεί να ενσωματωθούν πολλαπλές ετικέτες, που πιθανώς έχουν ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση. Ένα άλλο σημαντικό στοιχείο είναι η πιθανότητα σύγχυσης από Β κύτταρα στο ρεπερτόριο που συνδέονται με το φθορόχρωμα, τη στρεπταβιδίνη ή οποιονδήποτε συνδέτη αντί για το αντιγόνο ενδιαφέροντος . Η δέσμευση μεταξύ φθοροχρωμάτων, συνδετήρων ή στρεπταβιδίνης και BCR από ανθρώπους και ποντίκια που δεν εκτέθηκαν ποτέ σε αυτά τα αντιγόνα είναι γενικά χαμηλής συγγένειας και αυτά τα BCR γενικά εκφράζονται από ασυνήθιστα και δυνητικά πολυδραστικά Β κύτταρα (62, 79, 80). Η διπλή επισήμανση, στην οποία το ίδιο αντιγόνο επισημαίνεται χωριστά με δύο διαφορετικά φθοριόχρωμα, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό διπλών θετικών Β κυττάρων και την αφαίρεση της σύγχυσης από τα Β κύτταρα που δεσμεύουν το φθόριο (12, 42) . Ωστόσο, ακόμη και όταν χρησιμοποιούνται τετραμερή για διπλή επισήμανση, τα ειδικά για τη στρεπταβιδίνη Β κύτταρα θα μολύνουν τον διπλά θετικό πληθυσμό. Για την πλήρη απομάκρυνση της σύγχυσης από το φθόριο, τη στρεπταβιδίνη και τους συνδέτες, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένα τετραμερές «δόλωμα» για την αναγνώριση αυτών των μολυσματικών Β κυττάρων (21, 26). Σε αυτή την προσέγγιση, το ίδιο φθορόχρωμα που χρησιμοποιείται για την αναγνώριση των ειδικών για αντιγόνο Β-λεμφοκυττάρων συζευγνύεται με ένα διαφορετικό φθορόχρωμο έτσι ώστε το φάσμα εκπομπής να μεταβάλλεται από τη μεταφορά ενέργειας συντονισμού φθορισμού (FRET) (26). Τα Β-κύτταρα που δεσμεύουν δόλωμα μπορούν επομένως να αποκλειστούν από τα πραγματικά ειδικά αντιγονο-κύτταρα Β. Συγκεκριμένα, είναι σημαντικό να χρησιμοποιείται η ίδια πηγή συζευγμένης με φθόριο στρεπταβιδίνης στο τετραμερές και στο αντιδραστήριο δόλωμα, επειδή οι μέθοδοι σύζευξης, η ανασυνδυασμένη στρεπταβιδίνη και τα πρωτεϊνικά φθοριόχρωμα όπως η R-φυκοερυθρίνη διαφέρουν αρκετά από εταιρεία σε εταιρεία ώστε να αλλάξουν ορισμένους από τους επίτοπους που είναι διαθέσιμοι για το Β. Μια αδυναμία της προσέγγισης κυτταρομετρίας ροής είναι η εξάρτηση από αντιγόνα που μπορούν εύκολα να συζευχθούν με ένα φθοροχρωματικό ή βιοτινυλιωμένο. Εκτός από τις ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες και τα συντιθέμενα πεπτίδια, επισημασμένοι πολυσακχαρίτες, λιπίδια, απτένια, σωματίδια που μοιάζουν με ιούς και ψευδοϊοί έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί για την αναγνώριση αντιγονοειδικών κυττάρων με κυτταρομετρία ροής (33, [43] [44] [45] [ 46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] . Περαιτέρω, επιτόπιο-ειδικά Β-κύτταρα έχουν ταυτοποιηθεί με διαλογή βακτηριοφάγων-οθονών ή βιβλιοθηκών πεπτιδίων μικροσυστοιχιών με πολυκλωνικά αντισώματα που στοχεύουν το φυσικό αντιγόνο για να επιλέξουν διαμορφωτικούς επιτόπους που μπορούν να συγχωνευτούν με φθορίζουσες πρωτεΐνες για χρήση στην κυτταρομετρία ροής (47, 60) τεχνολογικά W. προόδους που αυξάνουν τον αριθμό των ταυτόχρονα μετρήσιμων παραμέτρων, τα ειδικά για αντιγόνο Β κύτταρα μπορούν περαιτέρω να χαρακτηριστούν από δείκτες κυτταρικής επιφάνειας και ενδοκυτταρική χρώση. Επιπλέον, η δοκιμασία δέσμευσης ανοσοσφαιρίνης είναι μια προσαρμογή της ανάλυσης ELISPOT που βασίζεται σε κυτταρομετρία ροής στην οποία χρησιμοποιείται ένα συζευγμένο με στρεπταβιδίνη αντίσωμα αντι-CD45 που φέρει τέσσερα βιοτινυλιωμένα αντισώματα αντι-IgG για την ταυτόχρονη δέσμευση πλασμαβλαστών και σύλληψη εκκρινόμενων αντισωμάτων από πλασμαβλάστες. για την ανίχνευση αντιγονοειδικών πλασμοβλαστών (61) . Η μέση ένταση φθορισμού που μετράται με κυτταρομετρία ροής και κανονικοποιείται στο επίπεδο έκφρασης BCR παρέχει επίσης ένα μέτρο της σχετικής ποσότητας αντιγόνου που δεσμεύεται σε ένα κύτταρο Β και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως πρόχειρο υποκατάστατο για τη συγγένεια σύνδεσης (79, 81, 82). Η προεπώαση των Β κυττάρων με αυξανόμενες συγκεντρώσεις ενός μονομερούς αντιγόνου πριν από την επισήμανση με τετραμερές αντιγόνο μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την περαιτέρω ποσοτικοποίηση της συγγένειας δέσμευσης. Κύτταρα που εκφράζουν BCR υψηλής συγγένειας θα δεσμεύουν μονομερές αντιγόνο σε χαμηλές συγκεντρώσεις, ενώ τα χαμηλής συγγένειας BCR θα απαιτούν υψηλότερες συγκεντρώσεις μονομερούς αντιγόνου για να ανταγωνιστούν και να αναστέλλουν τη δέσμευση τετραμερούς (26). Μεμονωμένα κύτταρα μπορούν επίσης να απομονωθούν με διαλογή κυττάρων ενεργοποιημένων με φθορισμό (FACS) για κατάντη ανάλυση, συμπεριλαμβανομένης της αλληλουχίας και της κλωνοποίησης BCR, της μέτρησης συγγένειας BCR, του πολλαπλασιασμού in vitro και του μεταγραφικού προφίλ. Πρόσφατα αναπτύχθηκαν μέθοδοι για την περαιτέρω βελτίωση της ευαισθησίας για την ανίχνευση σπάνιων αντιγονοειδικών Β κυττάρων. Τα μαγνητικά νανοσωματίδια συζευγμένα με αντισώματα που στοχεύουν το φθορόχρωμα στο αντιγόνο ενδιαφέροντος, επιτρέπουν τον εμπλουτισμό των ειδικών για το αντιγόνο Β κυττάρων πριν από την κυτταρομετρία ροής (20, 26, 80, 83). Αυτή η προσέγγιση είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για την ανίχνευση σπάνιων αντιγονοειδικών παρελθοντικών Β κυττάρων, αυτοαντιδραστικών Β κυττάρων, Β κυττάρων μνήμης και πλασμαβλαστών (21, 26, 47, 50). Η στρατηγική μαγνητικού εμπλουτισμού επιτρέπει την ανάλυση σημαντικά περισσότερων κυττάρων σε συντομότερο χρονικό διάστημα με τη συγκέντρωση των κυττάρων που μας ενδιαφέρουν πριν από την κυτταρομετρία ροής (Εικόνα 1) . Συγκεκριμένα, όπως με κάθε μέθοδο που επιδιώκει να αναγνωρίσει έναν πληθυσμό κυττάρων σε πολύ χαμηλή συχνότητα, το φόντο και ο θόρυβος που είναι εγγενείς στο σύστημα ανίχνευσης μεγεθύνονται σε σχέση με το σήμα ενδιαφέροντος, ειδικά όταν αυτό το σήμα είναι ασθενές. Επομένως, για την ανίχνευση του ειδικού για αντιγόνο πληθυσμού ενδιαφέροντος, είναι κρίσιμες οι ακόλουθες εκτιμήσεις: (1) Χρήση δολωμάτων για τον αποκλεισμό κυττάρων Β ανεπιθύμητων ειδικοτήτων· (2) προσεκτικός σχεδιασμός πλαισίων κυτταρομετρίας ροής για να αποφευχθεί η διάχυση εκπομπής στο κανάλι για το αντιγόνο ενδιαφέροντος; και (3) η επιλογή των φωτεινότερων φθοριοχρωμάτων, όπως η R-φυκοερυθρίνη ή η αλλοφυκοκυανίνη. Οι μέθοδοι in vivo για την ανίχνευση αντιγονοειδικών αποκρίσεων Β κυττάρων παρουσία άλλων αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων και βοηθών Τ κυττάρων, έχουν αυξήσει τη μηχανιστική μας κατανόηση του χυμικού ανοσοποιητικού ανταπόκριση κατά τον εμβολιασμό, μόλυνση και αυτοάνοση. Τα επιδεκτικά μεταφερθέντα Β κύτταρα μπορούν να διακριθούν από τα λεμφοκύτταρα δέκτη εκμεταλλευόμενοι στελέχη ποντικών με αλληλικές παραλλαγές σε CD45 ή ποντίκια χωρίς Β κύτταρα. Τα θετικά μεταφερόμενα Β κύτταρα μπορούν να προέρχονται από ποντίκια άγριου τύπου ή από ποντίκια που εκφράζουν διαγονιδιακά BCRs (Πίνακας 2) και τα ειδικά για αντιγόνο Β κύτταρα μπορούν να αναλυθούν χρησιμοποιώντας τις τεχνικές που περιγράφονται παραπάνω. Η μικροσκόπηση είναι μια άλλη γενική τεχνική που έχει χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό ειδικών για αντιγόνο κύτταρα in vivo και προσφέρει το πλεονέκτημα της άμεσης απεικόνισης. Στην πρώτη αναφερόμενη εφαρμογή αυτής της τεχνικής για την επίδειξη της κυτταρικής προέλευσης των αντισωμάτων το 1955, χρησιμοποιήθηκαν συζευγμένα με φλουορεσκεΐνη αντισώματα κατά της ωολευκωματίνης και της ανθρώπινης ανοσοσφαιρίνης για τη χρώση τμημάτων ιστού της σπλήνας από υπεράνοσα κουνέλια (2) . Έκτοτε, άλλες ομάδες έχουν επισημάνει με φθορισμό αντιγόνα για να εντοπίσουν τα ειδικά για αντιγόνο Β κύτταρα με μικροσκοπία (62, 65). Η πρόοδος στη μικροσκοπία ανατομής σύλληψης με λέιζερ, που χρησιμοποιείται ήδη στο πεδίο των Τ κυττάρων, παρέχει επίσης μια ευκαιρία για την απομόνωση μεμονωμένων αντιγονοειδικών Β κυττάρων για κατάντη ανάλυση, συμπεριλαμβανομένης της αλληλουχίας και της κλωνοποίησης του BCR ή του μεταγραφικού προφίλ (66) . Ωστόσο, η χρώση με αντιγόνο των BCRs in situ μπορεί να είναι προκλητική ανάλογα με τη δέσμευση αντιγόνων από παθογόνα σε άλλους κυτταρικούς υποδοχείς ή μια αλλαγή της ειδικότητας BCR κατά τη διάρκεια της στερέωσης ή της επεξεργασίας του ιστού. Η μικροσκοπία δύο φωτονίων ή πολυφωτονίων έχει την ικανότητα να αναλύει εικόνες σε μεγαλύτερα βάθη και με λιγότερη φωτολεύκανση από την ομοεστιακή μικροσκοπία (67, 68) . Ως αποτέλεσμα, αυτή η τεχνολογία επέτρεψε την απεικόνιση σε πραγματικό χρόνο σε ζωντανούς, ανέπαφους λεμφικούς ιστούς ποντικών, επιτρέποντας την άμεση in vivo παρατήρηση των αλληλεπιδράσεων των ανοσοκυττάρων. Οι δυναμικές κινήσεις και οι αλληλεπιδράσεις των ειδικών για αντιγόνο Β-λεμφοκυττάρων μπορούν να μελετηθούν in vivo συνδυάζοντας μια θετική μεταφορά μεμονωμένων Β κυττάρων (που απομονώνονται με περιοριστική αραίωση ή FACS) με μικροσκόπιο δύο φωτονίων (63, 69, 70). Εξανθρωπισμένα μοντέλα ποντικιών είναι ισχυρά εργαλεία για τη μετάφραση πειραμάτων σε ποντίκια σε εφαρμογές σε ανθρώπους. Τα διαγονιδιακά ποντίκια που παράγουν ανθρωποποιημένες κυτοκίνες με αντικατάσταση knock-in μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την υποστήριξη ανθρώπινων αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων (104) . Τα διαγονιδιακά ποντίκια με πλήρη εξανθρωπισμό των τόπων ανοσοσφαιρίνης ποντικού παρέχουν μια ευκαιρία για την ανακεφαλαίωση του εύρους του ρεπερτορίου των ανθρώπινων Β κυττάρων και χρησιμεύουν ως πολύτιμο εργαλείο για την ανακάλυψη θεραπευτικών αντισωμάτων (71) . Ωστόσο, μια προειδοποίηση είναι ότι οι συχνότητες αλληλόμορφων που βρίσκονται στα ρεπερτόρια Β-λεμφοκυττάρων αυτών των μοντέλων ποντικιών μπορεί να μην ανακεφαλαιώνουν απαραίτητα αυτές που βρίσκονται στους ανθρώπους (72) . Η κυτταρομετρία μάζας έχει τη δυνατότητα να παρέχει περαιτέρω ανάλυση υψηλών διαστάσεων των ειδικών για αντιγόνο Β κυττάρων. Σε αυτή τη μέθοδο, ετικέτες ιόντων βαρέων μετάλλων αντί για φθοριόχρωμα χρησιμοποιούνται για την επισήμανση των κυττάρων. Δεδομένου ότι τα δεδομένα συλλέγονται ως φασματομετρία μάζας χρονικής διακοπής, έως και 42 μοναδικές παράμετροι μπορούν να μετρηθούν ταυτόχρονα από ένα μόνο δείγμα χωρίς σημαντική διάχυση μεταξύ των καναλιών ή την ανάγκη για αντιστάθμιση. Η κυτταρομετρία μάζας με τετραμερή σημασμένα με βαρέα μέταλλα μπορεί να κατασκευαστεί χρησιμοποιώντας στρεπταβιδίνη (73) . Η κυτταρομετρία μάζας με τετραμερή πεπτιδίου MHC με σήμανση μετάλλου έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για τον εντοπισμό και τον χαρακτηρισμό των ειδικών για αντιγόνο Τ-λεμφοκυττάρων, αλλά από όσο γνωρίζουμε δεν έχει ακόμη εφαρμοστεί σε ειδικά για αντιγόνο Β κύτταρα (73, 74). Ένας περιορισμός αυτής της προσέγγισης είναι ότι τα κύτταρα δεν είναι διαθέσιμα για κατάντη ανάλυση αφού εξατμίζονται από έναν πυρσό πλάσματος για να ψεκάσουν τις ετικέτες ιόντων. Ωστόσο, με την ταυτόχρονη ανίχνευση πολλών περισσότερων επιφανειακών δεικτών και ενδοκυτταρικών κυτοκινών, παραγόντων μεταγραφής και ανίχνευσης περισσότερων σηματοδοτικών μορίων από μεμονωμένα κύτταρα από ό,τι ήταν δυνατόν προηγουμένως με τις παραδοσιακές φθορίζουσες ετικέτες, η εφαρμογή κυτταρομετρίας μάζας με αλγόριθμους μείωσης διαστάσεων θα μπορούσε να βοηθήσει στην ανατομή της πολυπλοκότητας του κυττάρου Β. διαμέρισμα, παρέχουν μια άποψη υψηλότερης ανάλυσης της ανάπτυξης των Β κυττάρων και αποκαλύπτουν νέα υποσύνολα αντιγονοειδικών Β κυττάρων που εμπλέκονται στη μεσολάβηση αυτοάνοσων ασθενειών ή στην προστασία από λοιμώξεις. Στον ορίζοντα, οι τεχνολογίες προσδιορισμού αλληλουχίας RNA μονοκυττάρου (RNA-seq) έχουν τη δυνατότητα να φέρει επανάσταση στη μελέτη των αντιγονοειδικών ανοσοκυττάρων (75, 76) . Η ικανότητα δημιουργίας μιας βιβλιοθήκης τετραμερών με μοναδικούς γραμμωτούς κώδικες θα μπορούσε να επιτρέψει την ταυτόχρονη εξέταση προφίλ γονιδιακής έκφρασης από μεγάλο αριθμό κυττάρων με διαφορετικές ειδικότητες αντιγόνου σε ένα μόνο πείραμα. Ο συνδυασμός τετραμερών με γραμμωτό κώδικα με συζευγμένα με ολιγονουκλεοτίδια αντισώματα και RNA-seq για την ταυτόχρονη μέτρηση της πρωτεΐνης και της γονιδιακής έκφρασης των αντιγονοειδικών κυττάρων θα μπορούσε να αυξήσει περαιτέρω την ποσότητα αμερόληπτων πολλαπλών ομικών πληροφοριών για μεμονωμένα αντιγονοειδικά κύτταρα σε φυσιολογικές καταστάσεις και να βοηθήσει την ορθολογικός σχεδιασμός εμβολίων και θεραπευτικών (105) (106) (107) . Η συνεχιζόμενη ανάλυση των ειδικών για αντιγόνο αποκρίσεων Β κυττάρων έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων διαγνωστικών, θεραπευτικών και ερευνητικών αντιδραστηρίων. Μέθοδοι για τη μελέτη των ειδικών αντιγόνων αποκρίσεων Β-λεμφοκυττάρων εφαρμόζονται όλο και περισσότερο για την αντιμετώπιση ασθενειών όπως ο HIV, ο RSV και τα αυτοάνοσα νοσήματα, στα οποία η ανοσολογική απόκριση είτε αποτυγχάνει να προστατεύσει ή να καθαρίσει την ασθένεια, είτε όπου ενισχύει τη νόσο ή ευθύνεται για την ίδια τη νόσο . Υπάρχουν σημαντικές ευκαιρίες στον ορίζοντα για την εφαρμογή αυτών των μεθόδων σε μυριάδες ασθένειες στις οποίες τα Β κύτταρα παίζουν ενεργό ρόλο. Οι JB και JT εξέτασαν τη βιβλιογραφία, δημιούργησαν σχήματα και πίνακες και έγραψαν το χειρόγραφο.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 497, "text": "Η απορρύθμιση της απόκρισης των αντισωμάτων μπορεί να οδηγήσει σε αυτοάνοση νόσο, κακοήθεια ή ενισχυμένη μόλυνση" } ], "id": 467, "question": "Πώς μπορούν επίσης τα αντισώματα να δημιουργήσουν προβλήματα υγείας;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2646, "text": "τη δεκαετία του 1970 με την ανάπτυξη της τεχνολογίας υβριδώματος για την παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων" } ], "id": 474, "question": "Ποια τεχνολογική εφεύρεση παρήγαγε αντισώματα που είναι κλώνοι ενός μοναδικού γονικού κυττάρου;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4589, "text": "Για τον RSV, οι σταθεροποιημένες εκδόσεις της πρωτεΐνης σύντηξης (F) στη διαμόρφωση πριν από τη σύντηξη έχουν οδηγήσει σε γνώσεις σχετικά με την απόκριση των Β κυττάρων στη μόλυνση και έχουν δημιουργήσει δυνητικά ασφαλέστερα και πιο αποτελεσματικά υποψήφια εμβόλια" } ], "id": 489, "question": "Πώς βοήθησε η μελέτη των Β-κυττάρων στη θεραπεία του αναπνευστικού συγκυτιακού ιού (RSV);" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Demographic Variations of MERS-CoV Infection among Suspected and Confirmed Cases: An Epidemiological Analysis of Laboratory-Based Data from Riyadh Regional Laboratoryhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7049846/SHA: edee452881f826fb72c58ee68a982789b12aa99dAuthors: Altamimi, Asmaa; Abu-Saris, Raghib; El-Metwally, Ashraf; Alaifan, Taghreed; Alamri, ArefΗμερομηνία: 2020-02-19DOI: 10.1155/2020/9629747Άδεια: cc-byAbstract: Εισαγωγή. Ο κορωνοϊός του αναπνευστικού συνδρόμου της Μέσης Ανατολής αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά τον Σεπτέμβριο του 2012 στη Σαουδική Αραβία. Οι κλινικές εκδηλώσεις του MERS και του μη MERS SARI είναι συχνά παρόμοιες. Ως εκ τούτου, ο εντοπισμός ύποπτων περιπτώσεων που μπορεί να έχουν μεγαλύτερες πιθανότητες να διαγνωστούν ως κρούσματα MERS-CoV είναι απαραίτητος. Ωστόσο, η πραγματική πρόκληση είναι να επισημανθούν αυτοί οι ασθενείς μέσω ορισμένων δημογραφικών δεικτών. Η φύση αυτών των δεικτών δεν έχει διερευνηθεί προηγουμένως στη Σαουδική Αραβία και ως εκ τούτου, αυτή η μελέτη στοχεύει να τους αναγνωρίσει. ΜΕΘΟΔΟΙ: Ήταν μια μελέτη βασισμένη σε σύστημα επιτήρησης, για την οποία αναλύθηκαν δεδομένα από συνολικά 23.646 ύποπτους ασθενείς στις περιοχές του Ριάντ και του Αλ Κασίμ από τον Ιανουάριο του 2017 έως τον Δεκέμβριο του 2017 για να εκτιμηθεί ο επιπολασμός του MERS-CoV μεταξύ ύποπτων περιπτώσεων και να προσδιοριστεί το ενδεχόμενο δημογραφικοί παράγοντες κινδύνου που σχετίζονται με την επιβεβαίωση της διάγνωσης. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Από 23.646 ύποπτα κρούσματα, τα 119 (0,5%) επιβεβαιώθηκαν με εργαστηριακά αποτελέσματα. Αυτές οι επιβεβαιωμένες περιπτώσεις (το 67,2% των οποίων ήταν άνδρες) είχαν μέση ηλικία 43,23 έτη (SD ± 22,8). Περίπου το 42,2% των επιβεβαιωμένων περιπτώσεων ήταν ηλικίας μεταξύ 41 και 60 ετών και περίπου στο 47% των επιβεβαιωμένων περιπτώσεων εξετάστηκε το ύποπτο δείγμα τους το καλοκαίρι. Η μελέτη εντόπισε τρεις σημαντικούς και ανεξάρτητους προγνωστικούς παράγοντες για την επιβεβαίωση της νόσου: ηλικία μεταξύ 41 και 60 ετών, αρσενικό φύλο και εισαγωγή στη θερινή περίοδο. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Η μελέτη παρέχει στοιχεία ότι η επιδημία MERS-CoV στις εν λόγω περιοχές έχει συγκεκριμένα χαρακτηριστικά που θα μπορούσαν να βοηθήσουν τα μελλοντικά σχέδια για την πρόληψη και τη διαχείριση μιας τέτοιας μεταδοτικής νόσου. Οι μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να στοχεύουν στην επιβεβαίωση τέτοιων ευρημάτων και σε άλλες περιοχές της Σαουδικής Αραβίας και στη διερεύνηση πιθανών παραγόντων κινδύνου που μπορούν να προληφθούν. 60χρονος άνδρας που πέθανε στη Τζέντα της KSA λόγω σοβαρής οξείας πνευμονίας και πολλαπλής ανεπάρκειας οργάνων [1] . Έκτοτε, 27 χώρες έχουν αναφέρει την παρουσία αυτού του ιού, συμπεριλαμβανομένων των 12 χωρών της περιοχής της Ανατολικής Μεσογείου. Αρκετά κρούσματα έχουν εμφανιστεί σε πολλές χώρες, όπως η Σαουδική Αραβία, τα Ηνωμένα Αραβικά Εμιράτα και η Δημοκρατία της Κορέας [2] . Ποσοστό πρόσφατης θνησιμότητας (CFR) 21% [5, 6] . Υπάρχουν πολύ περιορισμένα στοιχεία για τη διερεύνηση της επιδημιολογίας αυτού του ιού στον παιδιατρικό πληθυσμό [7]. Η βιβλιογραφία δείχνει ότι ο MERS-CoV μολύνει τους άνδρες περισσότερο από τις γυναίκες [8, 9]. Το ποσοστό θνησιμότητας των ανδρών (52%) είναι υψηλότερο από αυτό των γυναικών (23%) [10] . Τα αρσενικά με ιστορικό σοβαρών ιατρικών καταστάσεων είναι πολύ ευαίσθητα σε αυτή τη μόλυνση. Επιπλέον, η μέση ηλικία μόλυνσης στους ενήλικες είναι τα 60 έτη [10] . Ο τρόπος μετάδοσης δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητός [2]. Ωστόσο, οι πηγές μετάδοσης από άνθρωπο σε άνθρωπο [11] και ζωονοσογόνους [12] έχουν τεκμηριωθεί σε πολλές μελέτες. Οι καμήλες dromedary είναι η κύρια ζωική πηγή μετάδοσης του MERS-CoV στον άνθρωπο. Η μετάδοση του ιού από τον άνθρωπο δεν συνέβη εύκολα, αλλά παρατηρείται κυρίως στις οικογένειες των ασθενών και στις εγκαταστάσεις υγειονομικής περίθαλψης [2] . Οι κλινικές εικόνες αυτής της λοίμωξης διέφεραν από ασυμπτωματικά έως ήπια αναπνευστικά συμπτώματα έως σοβαρή αναπνευστική δυσχέρεια και θάνατο [2] . Η σοβαρή πάθηση μπορεί συχνά να προκαλέσει αναπνευστικές καταστροφές που χρειάζονται μηχανικό αερισμό και υποστήριξη σε ΜΕΘ σε διαφορετικά περιβάλλοντα υγειονομικής περίθαλψης [4] . Οι μελέτες έχουν προτείνει περίοδο επώασης 16 ημερών με μέσο όρο 5-6 ημέρες [12, 13] , ενώ ο διάμεσος χρόνος μέχρι το θάνατο είναι 11-13 ημέρες (εύρος 5-27 ημέρες) μεταξύ των βαρέως πασχόντων ασθενών [13] . Το τεστ χρυσού προτύπου για την ανίχνευση αυτού του ιού είναι οι δοκιμές αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής σε πραγματικό χρόνο (rRT-PCR) [14] .δεν υπάρχει ειδική θεραπεία για τον MERS-CoV. Όπως οι περισσότερες ιογενείς λοιμώξεις, οι θεραπευτικές επιλογές είναι υποστηρικτικές και συμπτωματικές [2] . Προς το παρόν, δεν υπάρχει εμβόλιο για την πρόληψη των λοιμώξεων του MERS-CoV. Το CDC έδειξε ότι πρέπει να λαμβάνονται προληπτικά μέτρα για κάθε τύπο αναπνευστικής νόσου [4] . Τέτοιες ενέργειες περιλαμβάνουν το πλύσιμο των χεριών με νερό και σαπούνι για περίπου 20 δευτερόλεπτα ή τη χρήση απολυμαντικών χεριών με οινόπνευμα εάν δεν υπάρχει διαθέσιμο νερό. Κάποιος πρέπει να καλύπτει τη μύτη και το στόμα του σε περιπτώσεις φτερνίσματος και βήχα με χαρτομάντιλο και να αποφεύγει να αγγίζει το στόμα, τη μύτη ή τα μάτια με τα χέρια του μέχρι να πλυθεί σωστά. Οι επιφάνειες που αγγίζονται επανειλημμένα, όπως τα πόμολα της πόρτας, πρέπει να απολυμαίνονται και να καθαρίζονται τακτικά. Πρέπει επίσης να αποφεύγεται η στενή προσωπική επαφή, π.χ. φιλιά και κοινή χρήση φλιτζανιών ή σκευών φαγητού [15] .Πολλές μελέτες έχουν διεξαχθεί τα τελευταία χρόνια στη Σαουδική Αραβία για την καταπολέμηση αυτής της θανατηφόρας ασθένειας. Μια μεγάλη πολυκεντρική μελέτη έδειξε ότι είναι σχεδόν αδύνατο να γίνει διάκριση μεταξύ ασθενών με MERS-CoV και μη MERS-CoV μόνο με βάση την κλινική εικόνα [16] . Μια άλλη μελέτη κοόρτης, η οποία βασίστηκε σε νοσοκομείο (17 περιπτώσεις έναντι 82 ελέγχων), διαπίστωσε ότι υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές ως προς το φύλο, τις κλινικές και τις ακτινογραφικές εκδηλώσεις [17] . Ομοίως, δύο ακόμη μελέτες περιπτώσεων ελέγχου ενός μόνο κέντρου ανέφεραν ότι τα συμπτώματα της λοίμωξης MERS-CoV δεν ήταν συγκεκριμένα [18, 19] . Οι γιατροί και οι επαγγελματίες της δημόσιας υγείας πρέπει να εντοπίσουν ύποπτες περιπτώσεις που έχουν υψηλότερες πιθανότητες διάγνωσης ως επιβεβαιωμένες περιπτώσεις πριν εργαστηριακός έλεγχος (που συνήθως διαρκεί από 12 έως 24 ώρες). Ο εντοπισμός ενός επιβεβαιωμένου κρούσματος είναι απαραίτητος για την εφαρμογή προληπτικών στρατηγικών για την καταπολέμηση της εξάπλωσης της νόσου στα μέλη της οικογένειας και στους εργαζόμενους στον τομέα της υγείας του νοσοκομείου [20] . Ήπιες συμπτωματικές περιπτώσεις, που καταλήγουν σε θετική PCR, μπορεί να απομονωθούν στο σπίτι. Οι σοβαρές έως μέτριες περιπτώσεις θα πρέπει να εισάγονται και να απομονώνονται σε νοσοκομείο μέχρι να βελτιωθούν και στη συνέχεια να λάβουν εξιτήριο για απομόνωση στο σπίτι για μεγάλο χρονικό διάστημα. Τόσο οι ήπιες όσο και οι σοβαρές περιπτώσεις επανεξετάζονται μετά από 7 ημέρες και η εξέταση επαναλαμβάνεται στη συνέχεια μετά από κάθε 3 ημέρες έως ότου ληφθεί αρνητικό αποτέλεσμα [20] .Εντοπισμός ύποπτων περιπτώσεων που μπορεί να έχουν υψηλότερες πιθανότητες να διαγνωστούν ως επιβεβαιωμένο κρούσμα και εφαρμογή αυστηρών διαδικασιών σε αυτά μπορεί να προσφέρει την καλύτερη λύση. Η πρόκληση είναι να επισημανθούν αυτοί οι ασθενείς με ορισμένους δημογραφικούς δείκτες, καθώς η κλινική παρουσίαση των ασθενών με μόλυνση με MERS-CoV ήταν μη ειδική. Ως εκ τούτου, στοχεύαμε να προσδιορίσουμε ορισμένους δημογραφικούς δείκτες ειδικά για επιβεβαιωμένα κρούσματα MERS-CoV. Η φύση αυτών των δεικτών δεν έχει διερευνηθεί στη Σαουδική Αραβία και, ως εκ τούτου, αυτή η μελέτη στοχεύει στην ταυτοποίησή τους. Διεξήχθη συγχρονική μελέτη στο περιφερειακό εργαστήριο και τράπεζα αίματος, που βρίσκεται στο νοσοκομείο Shumaisi στο Ριάντ, KSA. Το εργαστήριο e έχει λάβει το Πρόγραμμα Διαπίστευσης Κεντρικών Τραπεζών Αίματος και Εργαστηρίων Αναφοράς της Σαουδικής Αραβίας Central Board for Accreditation of Healthcare Institution (CBAHI) 2018 [21] .Τεχνική. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν κατά την περίοδο Ιανουαρίου 2017 έως Δεκεμβρίου 2017. Όλοι οι ασθενείς στις περιοχές του Ριάντ και του Αλ-Κασίμ που υποβλήθηκαν σε έλεγχο των δειγμάτων τους στο περιφερειακό εργαστήριο του Ριάντ κατά την περίοδο της μελέτης θεωρήθηκαν ως ύποπτες περιπτώσεις. Η μελέτη είχε δύο στόχους: περιγραφικό και αναλυτικό. Για τον περιγραφικό σκοπό, υπολογίσαμε τον επιπολασμό του MERS-CoV. Για τον αναλυτικό σκοπό, αναπτύχθηκε ένα μοντέλο δυαδικής λογιστικής παλινδρόμησης. Σε αυτό το μοντέλο, συμπεριλάβαμε τους παράγοντες κινδύνου φύλου, ηλικίας, εποχών, εθνικότητας, κατάστασης υγειονομικής περίθαλψης (ναι/όχι), νοσοκομεία και περιοχή διαμονής. Τα δεδομένα διασταυρώθηκαν με μια εργαστηριακή ηλεκτρονική βάση δεδομένων. Συλλέχθηκαν περαιτέρω δεδομένα σχετικά με τα δημογραφικά χαρακτηριστικά (ηλικία και φύλο), την υποκείμενη εθνικότητα και την κατάσταση της υγειονομικής περίθαλψης. Συλλέξαμε δεδομένα από 25.400 περιπτώσεις, εκ των οποίων 23.646 ύποπτες περιπτώσεις MERS-CoV συμπεριλήφθηκαν στην τελική ανάλυση. Τα δεδομένα καθαρίστηκαν, καταχωρήθηκαν, αποθηκεύτηκαν και διαχειρίστηκαν με βάση δεδομένων excel και IBM SPSS Έκδοση 25. Οι στατιστικές αναλύσεις αποτελούνταν από περιγραφικές μετρήσεις και ποσοστά. Για αυτά τα συνεχώς κλιμακούμενα στοιχεία, χρησιμοποιήθηκαν μη παραμετρικές στατιστικές (διάμεσοι, διατεταρτημόριο, ελάχιστο και μέγιστο) για την περιγραφή της κατανομής. Μια ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των προγνωστικών παραγόντων επιβεβαίωσης της μόλυνσης στις ομάδες ύποπτων περιπτώσεων. Αρχικά, διενεργήθηκαν μονομεταβλητές αναλύσεις για την εκτίμηση της μη προσαρμοσμένης συμβολής και για τον προσδιορισμό των σημαντικών παραγόντων κινδύνου. ακολουθήθηκε από πολυπαραγοντική ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης για την εκτίμηση της ανεξάρτητης συνεισφοράς κάθε συμμεταβλητής. Για τον προσδιορισμό σημαντικών παραγόντων, ελήφθησαν υπόψη μια τιμή p κάτω από 0,05 και ένα διάστημα εμπιστοσύνης 95%. Ένα επιβεβαιωμένο κρούσμα ορίζεται ως ένα ύποπτο κρούσμα με εργαστηριακή επιβεβαίωση λοίμωξης από MERS-CoV [20] . Συνολικά 23.646 ύποπτα κρούσματα MERS-CoV συμπεριλήφθηκαν σε αυτή τη μελέτη, εκ των οποίων το 52,3% ήταν άνδρες (n 12376) και το 47,7% ήταν γυναίκες (n 11270). Η ηλικία των ατόμων με ύποπτα κρούσματα κυμαινόταν μεταξύ 0 και 92 ετών με μέση ηλικία τα 43. 23 e προσαρμοσμένες πιθανότητες MERS-CoV παρέμειναν σημαντικές μεταξύ των διαφορετικών ηλικιακών ομάδων. οι πιθανότητες ασθενών ηλικίας μεταξύ 20-40 ετών αυξήθηκαν τρεις φορές (A.OR: 3,11, 95% CI: 1,104-8,76, τιμή P 0,032), ενώ στην ηλικιακή ομάδα 41-60 ετών, αυξήθηκε περαιτέρω σε κίνδυνο που ήταν έξι φορές υψηλότερη είναι συγχρονική μελέτη σχετικά με την επιδημιολογική ανάλυση των εργαστηριακών δεδομένων μόλυνσης MERS-CoV που διεξήχθη στο Ριάντ σε περίοδο ενός έτους (2017). Συνολικά 23.646 ύποπτες περιπτώσεις συμπεριλήφθηκαν στα αποτελέσματα. Από τα συνολικά ύποπτα κρούσματα, 119 κρούσματα είχαν επιβεβαιωθεί μέσω εργαστηριακών αποτελεσμάτων. Όλα τα επιβεβαιωμένα κρούσματα αναφέρονται στο MOH μέσω του HESN (δίκτυα ηλεκτρονικής παρακολούθησης της υγείας) και στον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (ΠΟΥ) μέσω των Διεθνών Κανονισμών Υγείας (IHR), Εθνικού Εστιακού Σημείου της Σαουδικής Αραβίας. Διαπιστώσαμε ότι η λοίμωξη MERS-CoV βρέθηκε σημαντικά σε άτομα ηλικίας μεταξύ 41 και 60 ετών και αναφέρθηκε συχνότερα κατά τη θερινή περίοδο. Οι πιθανότητες μόλυνσης μεταξύ των ανδρών βρέθηκαν να είναι διπλάσιες από αυτές των γυναικών με ύποπτα κρούσματα. Κατά την περίοδο της μελέτης, δηλαδή το έτος 2017, αναφέρθηκαν μόνο 119 επιβεβαιωμένα κρούσματα, πράγμα που σημαίνει ότι ο αριθμός των κρουσμάτων μόλυνσης από MERS-CoV έχει μειωθεί στις περιοχές του Ριάντ και του Αλ-Κασίμ σε σύγκριση με εκείνη των τελευταίων τριών ετών. Από το 2015 έως το 2016 σημειώθηκε μείωση 25,4%, ενώ από το 2016 έως το 2017 μειώθηκε κατά 48,7%, που μεταφράζεται σε μείωση 50% μεταξύ των δύο περιόδων. Συμπληρώνει επίσης τα ευρήματα που αναφέρουν οι Da'ar και Ahmed στην εργασία τους [23] . Η επικράτηση της λοίμωξης στους άνδρες παρατηρήθηκε επίσης σε μια άλλη μελέτη που έγινε στο KSA (2015), η οποία ανέφερε το ποσοστό των επιβεβαιωμένων κρουσμάτων στους άνδρες σε 66%, σε σύγκριση με 34% στις γυναίκες [24] . Αξίζει να αναφερθεί ότι η Σαουδική Αραβία ορίζει τις ηλικιακές κατηγορίες διαφορετικά από τον ΠΟΥ (παιδιά: 0-14, ενήλικες: διαφορετικά) [20] . Ωστόσο, σε αντίθεση με την ταξινόμηση που χρησιμοποιείται στη Σαουδική Αραβία, ακολουθήσαμε την κατηγοριοποίηση της ΠΟΥ για την ηλικία για να διαφοροποιήσουμε μεταξύ παιδιών/εφήβων (0 έως 19 ετών) και ενηλίκων (20 ετών και άνω), όπως υποδεικνύεται στις εκθέσεις του ΠΟΥ για τυποποιημένο κατά ηλικία πληθυσμό και σε μολυσματικές ασθένειες [25] . Η κατηγοριοποίηση ακολούθησε επίσης ο Aly και οι συνεργάτες του στην πρόσφατη εργασία τους που δημοσιεύθηκε το 2017 [14] . Οι ενήλικες υποκατηγοριοποιήθηκαν περαιτέρω σε τρεις ομάδες ανάλογα με την ηλικιακή κατανομή του πληθυσμού της μελέτης χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα δύο σημεία αποκοπής (ηλικία 41 ετών και ηλικία 60 ετών) [14] .τα δεδομένα αυτά συμφωνούσαν με μια προηγούμενη μελέτη επιτήρησης, η οποία ανέφερε ότι η πλειοψηφία των επιβεβαιωμένα κρούσματα MERS-CoV αναφέρθηκαν σε άτομα ηλικίας 40 ετών και άνω [24] . Το 2016, μόνο 9 από τις 552 περιπτώσεις (1,6%) λοίμωξης MERS-CoV βρέθηκαν σε παιδιατρικούς ασθενείς. Επιπλέον, η μελέτη που διεξήχθη στο King Fahad Medical City στο Ριάντ (KFMC) μεταξύ Ιανουαρίου 2012 και Δεκεμβρίου 2013 δεν ανέφερε κρούσματα MERS-CoV σε παιδιά [26] . Μελέτη που διεξήχθη σε όλες τις χώρες του Κόλπου για τέσσερα χρόνια από τους Mahmoud Aly et al. μεταξύ 2012 και 2016 υποδηλώνει ότι ο επιπολασμός και η κατανομή του MERS-CoV ήταν ο υψηλότερος κίνδυνος σε ηλικιωμένους ηλικίας 60 ετών και άνω [14] . Παρόμοια με τα αποτελέσματά μας, αυτή η μελέτη ανέφερε επίσης τον υψηλότερο αριθμό επιβεβαιωμένων κρουσμάτων κατά τη θερινή περίοδο [14]. Μεταξύ των επιβεβαιωμένων κρουσμάτων, μόνο το 25,2% ήταν εργαζόμενοι στον τομέα της υγείας, ενώ περίπου το 75% ήταν μη εργαζόμενοι στον τομέα της υγείας. μελέτη που έγινε από τον Ahmad για την εκτίμηση του ποσοστού επιβίωσης στον MERS-CoV παγκοσμίως πριν από τις 26 Ιανουαρίου 2017· Το 86,9% δεν ήταν εργαζόμενοι στον τομέα της υγειονομικής περίθαλψης σε σύγκριση με το 13,1% επιβεβαιωμένες περιπτώσεις εργαζομένων στον τομέα της υγείας [27] . Ομοίως, άλλες μελέτες ανέφεραν επίσης χαμηλότερο επιπολασμό στους εργαζόμενους στον τομέα της υγειονομικής περίθαλψης [28] [29] [30] . Τα δεδομένα μας ανέφεραν υψηλότερο επιπολασμό μόλυνσης μεταξύ των υπηκόων της Σαουδικής Αραβίας σε σύγκριση με τους μη Σαουδάραβες. Μια άλλη μελέτη έδειξε επίσης παρόμοια αποτελέσματα αλλά με πολύ υψηλότερο ποσοστό μεταξύ των Σαουδάραβων, το οποίο μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι περιελάμβανε Σαουδάραβες από όλες τις περιοχές [29] . Δεν υπάρχει καμία βάση εύρεσης για σύγκριση αυτή καθαυτή, επειδή η μελέτη μας επικεντρώθηκε μόνο στις περιοχές του Ριάντ και του Αλ Κασίμ. Στη μελέτη μας, εντοπίσαμε χαμηλό επιπολασμό (0,5%). Η χαμηλή θετική προγνωστική αξία των αποτελεσμάτων του εργαστηρίου μας δεν σχετίζεται με τη χαμηλή ευαισθησία και ειδικότητα της εργαστηριακής ανάλυσης. Η εκτιμώμενη αναλυτική ευαισθησία και ειδικότητα του κιτ Real Star από την Altona αναφέρθηκε ότι είναι 100% χωρίς διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με άλλα παθογόνα του αναπνευστικού [31] . Επιπλέον, αυτή η χαμηλή προγνωστική αξία στα αποτελέσματα του εργαστηρίου σχετίζεται με την υψηλή επιβάρυνση των ψευδώς θετικών περιπτώσεων που παραπέμπονται στο εργαστήριο. Στην πραγματικότητα, αυτή η έρευνα είναι μόνο το σημείο εκκίνησης για να ρίξει φως σε περισσότερους παράγοντες που θα μπορούσαν να βοηθήσουν στη θέσπιση περισσότερων περιγραφικών κριτηρίων για τη μείωση του φόρτου οικονομικών και ανθρώπινων πόρων. Από όσο γνωρίζουμε, κανείς δεν έχει αναπτύξει μια υλικοτεχνική παλινδρόμηση που να εστιάζει σχετικά με δημογραφικούς παράγοντες κινδύνου όπως το φύλο, την ηλικία και τις εποχές πριν από τη μελέτη μας. Ωστόσο, αξίζει να αναφέρουμε ότι ο Ahmed et al. ανέπτυξε ένα μοντέλο πρόβλεψης κινδύνου που περιλαμβάνει παράγοντες κινδύνου όπως πόνο στο στήθος, λευκοπενία και αυξημένη ασπαρτική αμινοτρανσφεράση (AST) [21] . Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω έρευνες για να επιβεβαιωθούν τα ευρήματά μας. Ένα από τα κύρια πλεονεκτήματα της μελέτης μας είναι ότι πρόκειται για μια ολοκληρωμένη περιφερειακή μελέτη που περιελάμβανε όλες τις ύποπτες περιπτώσεις MERS-CoV στις περιοχές του Ριάντ και του Αλ-Κασίμ. Δεύτερον, η εξωτερική εγκυρότητα της μελέτης μας αναμένεται επίσης να είναι υψηλή, καθώς καλύπτει πλήρως τις δύο περιοχές, πράγμα που σημαίνει ότι συμπεριλήφθηκαν τα αρχεία όλων των ύποπτων κρουσμάτων σε αυτές τις δύο κύριες περιοχές της Σαουδικής Αραβίας. Τρίτον, η ποιότητα των δεδομένων θεωρείται υψηλή, δεδομένου ότι η μεταδοτική και απειλητική για τη ζωή φύση αυτής της νόσου έχει οδηγήσει σε αυστηρή υπακοή σε κανόνες που επιβάλλονται έγκαιρα, διασφαλίζοντας έτσι την ακριβή αναφορά των ύποπτων περιπτώσεων. Επιπλέον, στο HESN εφαρμόζονται πολιτικές διασφάλισης ποιότητας προκειμένου να διατηρηθεί το υψηλότερο επίπεδο εγκυρότητας και αξιοπιστίας της διαδικασίας συλλογής δεδομένων. Οι διαθέσιμες μεταβλητές για ύποπτες περιπτώσεις περιορίζονταν στα δημογραφικά στοιχεία, γεγονός που περιόριζε το εύρος της έρευνάς μας, αλλά παρείχαν πολύτιμες πληροφορίες για να αποτελέσουν βάση για μελλοντικές μελέτες ευρύτερου βεληνεκούς. Μεταβλητές όπως οι πρωτογενείς/δευτερογενείς λοιμώξεις είναι ζωτικής σημασίας πληροφορίες, αλλά λόγω του περιορισμού των διαθέσιμων δεδομένων, δεν μπορέσαμε να προσδιορίσουμε τις επιπτώσεις τους. Σύμφωνα με τις γνώσεις μας, αυτή είναι μια από τις λίγες μελέτες που έχουν ερευνήσει ειδικά τους παράγοντες κινδύνου MERS-CoV στις περιοχές του Ριάντ και του Αλ-Κασίμ (δύο μεγάλες περιοχές στην KSA). Δεδομένου ότι όλες οι ύποπτες και επιβεβαιωμένες περιπτώσεις συμπεριλήφθηκαν σε αυτή τη μελέτη, υποθέτουμε ότι τα αποτελέσματά μας είναι γενικεύσιμα και για τις δύο περιοχές με σιγουριά. Πρέπει να σημειωθεί ότι η συγκριτική ομάδα αυτής της μελέτης είναι διαφορετική από αυτή των προηγούμενων, καθώς συγκρίναμε αυτούς με επιβεβαιωμένο MERS-CoV με αυτούς με ύποπτο MERS-CoV που έχουν περάσει όλα τα στάδια προσυμπτωματικού ελέγχου στο νοσοκομείο, ενώ άλλες μελέτες ήταν νοσοκομειακές αλλά όχι εργαστηριακές με στόχο τον εντοπισμό παραγόντων που βοηθούν στην υποψία και όχι στην επιβεβαίωση κρουσμάτων. μπορεί να είναι ο λόγος για τον οποίο βρήκαμε κάποιους σημαντικούς δημογραφικούς παράγοντες σε αντίθεση με άλλες αναφορές. Συμπερασματικά, αυτή η έρευνα αφορά προγνωστικούς παράγοντες για την επιβεβαίωση της διάγνωσης μόνο μεταξύ ύποπτων περιπτώσεων, πράγμα που σημαίνει ότι οι παράγοντες που βρήκαμε μπορούν να βοηθήσουν στον εντοπισμό ύποπτων περιπτώσεων που μπορεί να έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα να βγει θετικός έλεγχος. θα βοηθήσει τους επαγγελματίες πρωτοβάθμιας περίθαλψης να αναπτύξουν ένα καλύτερο εργαλείο προσυμπτωματικού ελέγχου για ύποπτα περιστατικά, καθώς επί του παρόντος μόνο μια μικρή μειοψηφία ύποπτων περιπτώσεων επιβεβαιώνεται θετικά μέσω εργαστηριακών αποτελεσμάτων, με αποτέλεσμα να δαπανώνται πολλοί πόροι για τη δοκιμή χιλιάδων δειγμάτων, μόνο για εντοπισμός μερικών περιπτώσεων. Τρεις παράγοντες που εντοπίσαμε είναι σημαντικοί επειδή, για παράδειγμα, μια γυναίκα, ηλικίας 18 ετών, που εμφανίζεται το χειμώνα θα είναι λιγότερο πιθανό να διαγνωστεί από έναν άνδρα, ηλικίας 45 ετών, που παρουσιάζεται το καλοκαίρι ή, για να δώσουμε ένα άλλο παράδειγμα, ένα 60- άνδρας ετών που παρουσιάζει σημεία MERS-CoV με αρνητικό εργαστηριακό αποτέλεσμα μπορεί να χρειαστεί επανέλεγχο. Η μελέτη μας κάλυψε δύο κύριες περιοχές στη Σαουδική Αραβία και παρέχει στοιχεία ότι η επιδημία MERS-CoV σε αυτές τις δύο περιοχές έχει συγκεκριμένα χαρακτηριστικά που μπορεί να βοηθήσουν τα μελλοντικά σχέδια για την πρόληψη και τη διαχείριση τέτοιων μεταδοτικών ασθενειών. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι μόνο μια μειοψηφία ύποπτων περιπτώσεων διαγιγνώσκεται πραγματικά με τη νόσο, πράγμα που σημαίνει ότι οι διαδικασίες που εφαρμόζονταν φαινόταν να είναι ιδιαίτερα ευαίσθητες αλλά όχι ιδιαίτερα συγκεκριμένες. Η πλειονότητα των επιβεβαιωμένων κρουσμάτων ήταν άνδρες, ηλικίας 41 έως 60 ετών, και παρουσιάστηκαν σε μονάδες υγειονομικής περίθαλψης το καλοκαίρι. Οι μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να στοχεύουν στην επιβεβαίωση τέτοιων ευρημάτων σε άλλες περιοχές της Σαουδικής Αραβίας, στη διερεύνηση πιθανών παραγόντων κινδύνου που μπορούν να αποφευχθούν και στη διερεύνηση των υποκείμενων παραγόντων που κάνουν τους άνδρες ηλικίας 41-60 ετών πιο ευαίσθητους από άλλες. αυτή η μελέτη παρασχέθηκε από το Περιφερειακό Εργαστήριο του Ριάντ κατόπιν άδειας και δεν διατίθεται ελεύθερα. Ωστόσο, η πρόσβαση στα δεδομένα θα ληφθεί υπόψη από τον αντίστοιχο συντάκτη εφόσον το request.e δημιουργοί δηλώσουν ότι δεν έχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 2856, "text": "Ποσοστό πρόσφατης θνησιμότητας (CFR) 21%" } ], "id": 558, "question": "Ποιο είναι το ποσοστό θνησιμότητας από τον κορονοϊό MERS;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3051, "text": "ο MERS-CoV μολύνει τους άνδρες περισσότερο από τις γυναίκες" } ], "id": 559, "question": "Πώς το φύλο επηρεάζει τη μόλυνση MERS-COV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3549, "text": "Οι καμήλες dromedary είναι η κύρια ζωική πηγή μετάδοσης του MERS-CoV στον άνθρωπο." } ], "id": 560, "question": "Ποιο είναι το ζώο πηγής για τον MERS-COV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4498, "text": "δεν υπάρχει ειδική θεραπεία για τον MERS-CoV. Όπως οι περισσότερες ιογενείς λοιμώξεις, οι θεραπευτικές επιλογές είναι υποστηρικτικές και συμπτωματικές" } ], "id": 564, "question": "Ποια είναι η θεραπεία για το MERS-COV;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Οι αναστολείς της σύνθεσης της γεμσιταβίνης και της νουκλεο(t)ίδης είναι ευρέως φάσματος αντιιικά φάρμακα που ενεργοποιούν την έμφυτη ανοσία Kim, Chonsaeng; Cho, Sungchan Ημερομηνία: 2018-04-20DOI: 10.3390/v10040211 Άδεια χρήσης: cc-byAbstract: Τα ανάλογα νουκλεοσιδίων έχουν συχνά αναγνωριστεί ως αντιιικοί παράγοντες. Τα τελευταία χρόνια, η γεμσιταβίνη, ένα ανάλογο κυτιδίνης σε κλινική χρήση για τη θεραπεία πολλών συμπαγών όγκων, αποδείχθηκε επίσης ότι έχει αντιική δράση ενάντια σε ένα ευρύ φάσμα ιών. Τα ανάλογα νουκλεοσιδίων γενικά παρεμβαίνουν στις οδούς σύνθεσης κυτταρικών πυρηνικών (t)ide, με αποτέλεσμα την εξάντληση ή την ανισορροπία των δεξαμενών (d)NTP. Περιέργως, μερικές πρόσφατες αναφορές έχουν δείξει ότι ορισμένα ανάλογα νουκλεοσιδίων, συμπεριλαμβανομένης της γεμσιταβίνης, ενεργοποίησαν την έμφυτη ανοσία, προκαλώντας την έκφραση γονιδίων που διεγείρονται από ιντερφερόνη, μέσω της αναστολής της σύνθεσης νουκλεο(t)ide. Η ακριβής διασταύρωση μεταξύ αυτών των δύο ανεξάρτητων διαδικασιών μένει να καθοριστεί. Παρόλα αυτά, συνοψίζουμε την τρέχουσα γνώση της έμφυτης ανοσίας που σχετίζεται με την αναστολή της σύνθεσης των πυρηνικών (t)ide και την προτείνουμε ως έναν πρόσφατα αναδυόμενο αντιιικό μηχανισμό αναλόγων νουκλεοσιδών. Κείμενο: Τα ανάλογα νουκλεοσιδών έχουν χρησιμοποιηθεί ιστορικά για αντικαρκινική χημειοθεραπεία επειδή αναστέλλουν το κυτταρικό DNA /RNA πολυμεράσες [1] . Πιο πρόσφατα, τα ανάλογα νουκλεοσιδίων έχουν επεκτείνει τις θεραπευτικές τους εφαρμογές και χρησιμοποιούνται για την ανάπτυξη αντιιικών φαρμάκων ενάντια σε ένα ευρύ φάσμα σοβαρών και απειλητικών για τη ζωή ιών. Μερικά ανάλογα νουκλεοσιδικών φαρμάκων που στοχεύουν συγκεκριμένες ιικές πολυμεράσες (ακυκλοβίρη για ιούς έρπητα, ζιδοβουδίνη για τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV) και σοφοσμπουβίρη για τον ιό της ηπατίτιδας C (HCV)) ήταν επιτυχείς σε κλινικές δοκιμές [2] [3] [4] [5] και χρησιμοποιούνται επί του παρόντος για τη θεραπεία ασθενών που έχουν μολυνθεί από τον ιό. Μια άλλη κατηγορία φαρμάκων αναλόγων νουκλεοσιδίων όπως η ριμπαβιρίνη, που δρουν ευρύτερα σε διάφορους ιούς, έχει χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με την IFN-α [6] . Είναι σημαντικό ότι εκτενείς μελέτες σχετικά με την αντιική δράση της ριμπαβιρίνης έχουν δημιουργήσει το υποκείμενο μοριακό πλαίσιο των αναλόγων νουκλεοσιδών. Ο κύριος μηχανισμός για την εξήγηση της αντιϊκής δράσης των αναλόγων νουκλεοσιδών βασίζεται στην άμεση δράση τους στον ιικό πολυμερισμό. Τα ανάλογα νουκλεοσιδίων μεταφέρονται στα κύτταρα και φωσφορυλιώνονται με τη διαδοχική δράση ιικών ή κυτταρικών κινασών, δημιουργώντας τελικά τριφωσφορικά νουκλεοτίδια. Τα ώριμα ανάλογα νουκλεοτιδίων, τα οποία είναι παρόμοια με τα φυσιολογικά νουκλεοτίδια, μπορούν να ενσωματωθούν απευθείας στο αναπτυσσόμενο ιικό γονιδίωμα κατά τον πολυμερισμό, με αποτέλεσμα τον τερματισμό της αλυσιδωτής αντίδρασης ή τη συσσώρευση μεταλλάξεων (Εικόνα 1). Εναλλακτικά, τα ανάλογα νουκλεοτιδίων μπορούν να συνδεθούν στην περιοχή δέσμευσης νουκλεοτιδίων στις ιικές πολυμεράσες και να εμποδίσουν την είσοδο των εισερχόμενων φυσικών νουκλεοτιδίων. Ο άλλος μηχανισμός βασίζεται στη διαμόρφωση της σύνθεσης του κυτταρικού πυρήνα(t)ide. Έχουν συσσωρευτεί αναφορές ότι τα ανάλογα νουκλεοσιδών δρουν ως αντιιικοί παράγοντες παρεμβαίνοντας στις οδούς σύνθεσης του πυρήνα(t)ide του ξενιστή [7] [8] [9] [10] . Με τη στόχευση μεταβολικών ενζύμων, τα ανάλογα νουκλεοσιδών εμποδίζουν τη φυσική ροή της σύνθεσης νουκλεο(t)ide και κατά συνέπεια προκαλούν την εξάντληση ή την ανισορροπία των δεξαμενών (d)NTP. Καθώς ο ιικός αναδιπλασιασμός εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη διαθεσιμότητα των νουκλεοτιδίων του ξενιστή, μια κατάσταση ελαττωματικού νουκλεοτιδίου μειώνει την αποτελεσματικότητα της ιικής αντιγραφής. Ένας πιο πρόσφατα προτεινόμενος μηχανισμός βασίστηκε στις παρατηρήσεις ότι μερικά ανάλογα νουκλεοσιδών ενεργοποιούν την έμφυτη ανοσία, ειδικά που περιλαμβάνει την ανοδική ρύθμιση των διεγερμένων από ιντερφερόνη γονιδίων (ISGs). Είναι σημαντικό ότι αυτό το φαινόμενο συνήθως μεσολαβείται από την αναστολή της σύνθεσης νουκλεοτιδίων, υποδηλώνοντας μια πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ της βιοσύνθεσης νουκλεοτιδίων και της έμφυτης ανοσίας. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός αυτής της διασταυρούμενης συζήτησης μένει να διευκρινιστεί. Υπάρχει τώρα ένας αυξανόμενος αριθμός αναλόγων νουκλεοσιδίων με αντιική δράση σε ένα ευρύ φάσμα ιών. Έχουν συνοψιστεί καλά σε προηγούμενη έκθεση [1] . Στην παρούσα ανασκόπηση, εστιάζουμε περισσότερο στη γεμσιταβίνη ως ανάλογο νουκλεοσιδίου, το οποίο είναι κλινικά σχετικό και του οποίου η αντιική δράση ευρέος φάσματος έχει πρόσφατα αναφερθεί από πολλές ομάδες, συμπεριλαμβανομένης της ομάδας μας. Το πιο σημαντικό, συνοψίζουμε τους αναστολείς των οδών βιοσύνθεσης πουρίνης/πυριμιδίνης που επάγουν έμφυτη ανοσία και προτείνουμε πιθανούς μηχανισμούς δράσης για αυτούς τους αναστολείς. μπορεί να ενσωματωθεί απευθείας στο αναπτυσσόμενο ιικό γονιδίωμα κατά τη διάρκεια του πολυμερισμού, με αποτέλεσμα τον τερματισμό της αλυσιδωτής αντίδρασης ή τη συσσώρευση μεταλλάξεων (Εικόνα 1). Εναλλακτικά, τα ανάλογα νουκλεοτιδίων μπορούν να συνδεθούν στην περιοχή δέσμευσης νουκλεοτιδίων στις ιικές πολυμεράσες και να εμποδίσουν την είσοδο των εισερχόμενων φυσικών νουκλεοτιδίων. Ο άλλος μηχανισμός βασίζεται στη διαμόρφωση της σύνθεσης του κυτταρικού πυρήνα(t)ide. Έχουν συσσωρευτεί αναφορές ότι τα ανάλογα νουκλεοσιδών δρουν ως αντιιικοί παράγοντες παρεμβαίνοντας στις οδούς σύνθεσης του πυρήνα(t)ide του ξενιστή [7] [8] [9] [10] . Με τη στόχευση μεταβολικών ενζύμων, τα ανάλογα νουκλεοσιδών εμποδίζουν τη φυσική ροή της σύνθεσης νουκλεο(t)ide και κατά συνέπεια προκαλούν την εξάντληση ή την ανισορροπία των δεξαμενών (d)NTP. Καθώς ο ιικός αναδιπλασιασμός εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη διαθεσιμότητα των νουκλεοτιδίων του ξενιστή, μια κατάσταση ελαττωματικού νουκλεοτιδίου μειώνει την αποτελεσματικότητα της ιικής αντιγραφής. Ένας πιο πρόσφατα προτεινόμενος μηχανισμός βασίστηκε στις παρατηρήσεις ότι μερικά ανάλογα νουκλεοσιδών ενεργοποιούν την έμφυτη ανοσία, ειδικά που περιλαμβάνει την ανοδική ρύθμιση των γονιδίων που διεγείρονται με ιντερφερόνη (ISGs). Είναι σημαντικό ότι αυτό το φαινόμενο συνήθως μεσολαβείται από την αναστολή της σύνθεσης νουκλεοτιδίων, υποδηλώνοντας μια πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ της βιοσύνθεσης νουκλεοτιδίων και της έμφυτης ανοσίας. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός αυτής της διασταυρούμενης συζήτησης μένει να διευκρινιστεί. Υπάρχει τώρα ένας αυξανόμενος αριθμός αναλόγων νουκλεοσιδίων με αντιική δράση σε ένα ευρύ φάσμα ιών. Έχουν συνοψιστεί καλά σε προηγούμενη έκθεση [1] . Στην παρούσα ανασκόπηση, εστιάζουμε περισσότερο στη γεμσιταβίνη ως ανάλογο νουκλεοσιδίου, το οποίο είναι κλινικά σχετικό και του οποίου η αντιική δράση ευρέος φάσματος έχει πρόσφατα αναφερθεί από πολλές ομάδες, συμπεριλαμβανομένης της ομάδας μας. Το πιο σημαντικό, συνοψίζουμε τους αναστολείς των οδών βιοσύνθεσης πουρίνης/πυριμιδίνης που επάγουν έμφυτη ανοσία και προτείνουμε πιθανούς μηχανισμούς δράσης για αυτούς τους αναστολείς. Φιγούρα 1 . Ο μηχανισμός της αντιϊκής δράσης των αναλόγων του πυρηνικού(t)ide. Η έμφυτη ανοσία που σχετίζεται με την αναστολή της σύνθεσης νουκλεο(t)ide, ένας πρόσφατα αναδυόμενος αντιιικός μηχανισμός αναλόγων νουκλεοσιδών, τονίστηκε με κίτρινα πλαίσια. Η γεμσιταβίνη είναι ένα ανάλογο κυτιδίνης που έχει χρησιμοποιηθεί κλινικά για τη θεραπεία διαφόρων καρκίνων [11, 12]. Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια, η αντιική δράση της γεμσιταβίνης έχει επίσης αναφερθεί έναντι ενός ευρέος φάσματος ιών RNA, συμπεριλαμβανομένου του κορωνοϊού του αναπνευστικού συνδρόμου της Μέσης Ανατολής (MERS-CoV), του κορωνοϊού με σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο (SARS-CoV), του ιού Ζίκα (ZIKV). ), HCV, ιός πολιομυελίτιδας (PV), ιός γρίπης Α (IAV), HIV και εντεροϊοί (EV) [13] [14] [15] [16] [17] [18] .Οι αντιικές δράσεις της γεμσιταβίνης έναντι των προαναφερθέντων Οι ιοί συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Το MERS-CoV και το SARS-CoV ανήκουν στην οικογένεια των Coronaviridae και είναι αιτιολογικοί παράγοντες σοβαρής ιογενούς αναπνευστικής νόσου στον άνθρωπο. Για να επιλέξετε αποτελεσματικά το κατάλληλο αντιικό φάρμακο Εικόνα 1 . Ο μηχανισμός της αντιϊκής δράσης των αναλόγων του πυρηνικού(t)ide. Η έμφυτη ανοσία που σχετίζεται με την αναστολή της σύνθεσης νουκλεο(t)ide, ένας πρόσφατα αναδυόμενος αντιιικός μηχανισμός αναλόγων νουκλεοσιδών, τονίστηκε με κίτρινα πλαίσια. Η γεμσιταβίνη είναι ένα ανάλογο κυτιδίνης που έχει χρησιμοποιηθεί κλινικά για τη θεραπεία διαφόρων καρκίνων [11, 12]. Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια, η αντιική δράση της γεμσιταβίνης έχει επίσης αναφερθεί έναντι ενός ευρέος φάσματος ιών RNA, συμπεριλαμβανομένου του κορωνοϊού του αναπνευστικού συνδρόμου της Μέσης Ανατολής (MERS-CoV), του κορωνοϊού με σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο (SARS-CoV), του ιού Ζίκα (ZIKV). ), HCV, ιός πολιομυελίτιδας (PV), ιός γρίπης Α (IAV), HIV και εντεροϊοί (EV) [13] [14] [15] [16] [17] [18] .Οι αντιικές δράσεις της γεμσιταβίνης έναντι των προαναφερθέντων Οι ιοί συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Το MERS-CoV και το SARS-CoV ανήκουν στην οικογένεια των Coronaviridae και είναι αιτιολογικοί παράγοντες σοβαρής ιογενούς αναπνευστικής νόσου στον άνθρωπο. Για την αποτελεσματική επιλογή των κατάλληλων υποψηφίων αντιιικών φαρμάκων, οι Dyall et al. εξέτασε 290 εγκεκριμένα από τον FDA φάρμακα σε κύτταρα Vero E6 μολυσμένα με ιό και αναγνώρισε τη γεμσιταβίνη ως ένα από τα φάρμακα με αντιική δράση τόσο κατά του MERS-CoV όσο και του SARS-CoV (EC 50 1,2 μΜ και 4,9 μΜ, αντίστοιχα) [13] . Πιο πρόσφατα, η γεμσιταβίνη αποδείχθηκε ότι καταστέλλει αποτελεσματικά τη μόλυνση και τον πολλαπλασιασμό του ZIKV σε κύτταρα ανθρώπινου επιθηλίου με χρωστική αμφιβληστροειδούς (RPE), ιδιαίτερα σε μη κυτταροτοξικές συγκεντρώσεις (EC 50 0,01 μΜ έναντι CC 50 > 10 μΜ) [14] . Το ZIKV, μέλος της οικογένειας Flaviviridae, μπορεί να μολύνει έγκυες γυναίκες και να προκαλέσει συγγενείς ανωμαλίες όπως η μικροκεφαλία σε βρέφη, η οποία έχει προσελκύσει την αυξανόμενη προσοχή του κοινού καθώς και εκτεταμένη έρευνα και ανάπτυξη πιθανών θεραπειών. Αποτελεσματικές αντιικές δράσεις της γεμσιταβίνης βρέθηκαν επίσης για την αντιγραφή του HCV σε κύτταρα Huh-7 και τη μόλυνση του HIV σε κύτταρα U373-MAGI-CXCR4 CEM, με εκτιμώμενη EC 50 s 12 nM και 16,3 nM, αντίστοιχα [17, 19] , οι οποίες ήταν χαμηλότερες συγκεντρώσεις από αυτές που χρησιμοποιήθηκαν στη θεραπεία του καρκίνου [20] . Στην περίπτωση του HIV, ο συνδυασμός γεμσιταβίνης με ντεσιταβίνη, ένα άλλο νουκλεοσιδικό ανάλογο σε κλινική χρήση για τη θεραπεία του καρκίνου, μείωσε συνεργικά τη μολυσματικότητα του HIV αυξάνοντας τη συχνότητα ιικών μεταλλάξεων [21] . Σε μια μελέτη παρακολούθησης, οι Clouser et al. ανέφερε περαιτέρω την αντιική επίδραση της γεμσιταβίνης έναντι του ρετροϊού που σχετίζεται με τον HIV, του ιού της λευχαιμίας των ποντικών (MuLV), in vitro (EC 50 του 1,6 nM) και ακόμη και σε μοντέλο AIDS ποντικού [17] . Σημαντική αντιική επίδραση της γεμσιταβίνης στα IAVs αναφέρθηκε επίσης για τα κύτταρα RPE από τους Denisova et al. (EC 50 από 0,068 μΜ) [16] . Έλεγξαν επίσης εάν η γεμσιταβίνη είχε αντιική δράση σε πολλούς άλλους ιούς διαφορετικών οικογενειών και βρήκαν την ισχυρή ανασταλτική της δράση στον ιό Sindbis και στον ιό του απλού έρπητα-1 (HSV-1) (>2 log μείωση στον τίτλο του ιού) αλλά σχετικά ασθενή Ιός του δάσους Semliki και ανθρώπινος ηχοϊός 6, και ελάχιστες επιδράσεις στον ιό Bunyamwera, τον ιό της ιλαράς (MeV) και τον ιό της δαμαλίτιδας [16] . Η αντιική επίδραση της γεμσιταβίνης στα EVs, που πραγματοποιήθηκε αρχικά στον ιό Coxsackie B3 (CVB3), βρέθηκε από τον έλεγχο εγκεκριμένων από την FDA φαρμάκων σε κύτταρα Vero που φέρουν αντιγραφικό CVB3 από την ομάδα μας (EC 50 από 0,4 μΜ) [18] . Η ευρέως φάσματος αντιική δράση του στα EVs αναγνωρίστηκε περαιτέρω παρατηρώντας μια παρόμοια ανασταλτική επίδραση στους εντεροϊούς 71 (EV71) και στους ανθρώπινους ρινοϊούς (HRVs) (EC 50 s 1 και 1-5 μΜ, αντίστοιχα). Στην περίπτωση του HRV, η αντιϊκή δράση της γεμσιταβίνης επιβεβαιώθηκε περαιτέρω σε μοντέλο ποντικού που είχε μολυνθεί από ιό [22] . Σε αυτή τη μελέτη, η ενδορινική χορήγηση γεμσιταβίνης μείωσε σημαντικά το πνευμονικό ιικό φορτίο και τη φλεγμονή μειώνοντας τις προφλεγμονώδεις κυτοκίνες, συμπεριλαμβανομένων των TNF-α και IL-1β, και τον αριθμό των λεμφοκυττάρων που διηθούν τους πνεύμονες. Πιο πρόσφατα, οι Zhang et al. προσδιόρισε επίσης τη γεμσιταβίνη ως τον καλύτερο αναστολέα αντι-PV από μια διαλογή εγκεκριμένων από την FDA φαρμάκων σε κύτταρα HeLa που φέρουν PV replicon (EC 50 του 0,3 μM) [15] . Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, η συσσώρευση στοιχείων έχει δείξει οριστικά ότι η γεμσιταβίνη είναι ένας αποτελεσματικός αναστολέας ευρέος φάσματος των ιών RNA και έχει θεραπευτικό δυναμικό για τη θεραπεία διαφόρων ασθενειών που σχετίζονται με τον ιό. Επιπλέον, είναι πιθανό η γεμσιταβίνη να είναι αποτελεσματική για άλλους μη ελεγμένους ιούς RNA. Επειδή η γεμσιταβίνη είναι ένα ανάλογο δεοξυκυτιδίνης που παρεμβαίνει στη σύνθεση του DNA καθώς και στη σύνθεση του RNA, οι ιοί DNA μπορεί να μην αποτελούν εξαίρεση. Σύμφωνα με αυτή την πιθανότητα, έχει υπάρξει μια αναφορά ότι η μόλυνση του HSV-1, που είναι ένας αντιπροσωπευτικός ιός DNA που ταξινομείται στην οικογένεια των Herpesviridae, επηρεάστηκε έντονα από τη γεμσιταβίνη [16] . Οι περισσότεροι από τους προαναφερθέντες ιούς έχουν, στην καλύτερη περίπτωση, περιορισμένα προφυλακτικά ή θεραπευτικά φάρμακα ως πιθανές θεραπείες. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα για τους νεοεμφανιζόμενους ή επανεμφανιζόμενους ιούς που περιλαμβάνουν σοβαρές ασθένειες, όπως ο MERS-CoV, ο SARS-CoV και ο ZIKV, που αποτελούν σημαντικές απειλές για τη δημόσια υγεία και οι οποίοι χρειάζονται επειγόντως αποτελεσματική θεραπεία κατά τα αρχικά στάδια μόλυνσης. Από αυτή την άποψη, η επαναχρησιμοποίηση της γεμσιταβίνης για τη θεραπεία ασθενών που έχουν μολυνθεί από αυτούς τους θανατηφόρους ιούς είναι μια ρεαλιστική προσέγγιση. Είναι σημαντικό, αξιοσημείωτο ότι το ZIKV επηρεάστηκε περισσότερο από τη γεμσιταβίνη, με χαμηλό νανομοριακό EC 50, το οποίο ήταν χαμηλότερο από αυτό που χρησιμοποιήθηκε στη θεραπεία του καρκίνου [14, 20]. Ακόμη και για άλλους ιούς με σχετικά υψηλό EC 50, υπάρχει η επιλογή θεραπείας ασθενών με συνδυασμό γεμσιταβίνης με άλλους αντιιικούς παράγοντες. Με αυτόν τον τρόπο, μια αποτελεσματική αντιική θεραπεία μπορεί να επιτευχθεί με τη συνεργική δράση δύο αντιικών με πολύ χαμηλότερες δόσεις για κάθε φάρμακο, η οποία ελαχιστοποιεί τις επιβλαβείς παρενέργειες όταν χρησιμοποιείται κλινικά. Για παράδειγμα, η συνεργική αντιική δράση της γεμσιταβίνης σε συνδυασμό με τη ριμπαβιρίνη, ένα αντιικό φάρμακο που χρησιμοποιείται επί του παρόντος κατά μερικών ιών RNA, αναφέρθηκε έναντι των EVs όπως οι CVB3 και EV71 [18] . Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, ο συνδυασμός γεμσιταβίνης με ντεσιταβίνη κατέστειλε συνεργικά τη μολυσματικότητα του HIV τόσο in vitro όσο και in vivo [17, 21]. Ωστόσο, η πραγματική χρήση της γεμσιταβίνης σε ασθενείς που έχουν μολυνθεί από ιό απαιτεί προηγούμενες in vivo μελέτες σε ζώα και κλινικές δοκιμές. Παρόλο που τα περισσότερα αντιιικά δεδομένα προέρχονται από μελέτες in vitro, δύο πρόσφατες μελέτες ανέφεραν τις αντιικές επιδράσεις της γεμσιταβίνης σε μοντέλα ποντικών [17, 22]. Εκτενέστερες αναλύσεις της γεμσιταβίνης σε ζωικά μοντέλα στο εγγύς μέλλον θα επιταχύνουν τις θεραπευτικές της εφαρμογές σε κλινικές δοκιμές. Οι περισσότερες μελέτες σχετικά με την αντιική δράση της γεμσιταβίνης δεν έχουν πειραματικά στοιχεία για τον τρόπο δράσης. Ωστόσο, η ομάδα μας ανέφερε πρόσφατα ότι η γεμσιταβίνη είχε μια αντι-EV επίδραση στοχεύοντας την οδό διάσωσης της βιοσύνθεσης πυριμιδίνης [23] . Επιπλέον, η γεμσιταβίνη προκάλεσε έντονα την έκφραση αρκετών ISG, συμπεριλαμβανομένων των CXCL10, IRF7, IRF9, IFIT1 και DDX58, που ήταν οι κύριοι τελεστές στην έμφυτη ανοσία που υπερασπίστηκε τον ξενιστή έναντι της μόλυνσης από τον ιό. Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με μια προηγούμενη αναφορά ότι η γεμσιταβίνη διεγείρει την παραγωγή IFN-β και IFN-γ σε κύτταρα RPE μολυσμένα με IAV [16] . Είναι σημαντικό ότι η ενεργοποίηση των ISG συσχετίστηκε καλά με την αναστολή της βιοσύνθεσης πυριμιδίνης, υποδηλώνοντας μια σύνδεση μεταξύ της βιοσύνθεσης πυριμιδίνης και της έμφυτης ανοσίας. Παρόμοια φαινόμενα όσον αφορά την ενεργοποίηση ISG έχουν προηγουμένως αναφερθεί με μερικές ενώσεις από αρκετούς αναστολείς βιοσύνθεσης πουρίνης ή πυριμιδίνης που είχαν αντιική δράση, όπως συνοψίζεται στον Πίνακα 2 [6, 10, [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] . Όσον αφορά τους αναστολείς βιοσύνθεσης πουρίνης, η ριμπαβιρίνη και το μυκοφαινολικό οξύ (MPA) είναι αναστολείς της αφυδρογονάσης της 5-μονοφωσφορικής ινοσίνης (IMP) (IMPDH), η οποία είναι ένα βασικό ένζυμο της οδού βιοσύνθεσης πουρίνης. Αυτοί οι αναστολείς έχουν χρησιμοποιηθεί επιτυχώς ως κλινικοί αντιιικοί ή ανοσοκατασταλτικοί παράγοντες εδώ και δεκαετίες. Και οι δύο έχουν αντιιικές δράσεις έναντι ιών όπως ο ιός HCV, ο ιός της ηπατίτιδας Ε (HEV), ο ιός του δάγκειου πυρετού, ο κίτρινος πυρετός, ο ιός της ηπατίτιδας Β, ο ιός του Δυτικού Νείλου (WNV), ο ιός Chikungunya (CHIKV) και ο IAV [24] [24] 25] [26] [27] [28] [29] [30] , κυρίως μέσω της αναστολής της οδού βιοσύνθεσης πουρινών, με την αντιική δράση έναντι του HCV και του HEV που φαίνεται ότι περιλαμβάνει τη διέγερση των ISG [10, 30] . Για την αντιική δράση της ριμπαβιρίνης έναντι του HCV, η ριμπαβιρίνη προκάλεσε ειδικά την έκφραση των mRNAs IRF7, IRF9 και ISG15, τα οποία είναι γνωστό ότι είναι σημαντικά για τις ανοσοαποκρίσεις κατά του HCV [6] . Η ενεργοποίηση ISG έλαβε χώρα μέσω ενός απροσδιόριστου μηχανισμού που ήταν διαφορετικός από την κλασική οδό σηματοδότησης IFN, την ενδοκυτταρική οδό ανίχνευσης dsRNA, τον υποδοχέα τύπου Toll και τα μονοπάτια του πυρηνικού παράγοντα Β. Το πιο σημαντικό, η επαγόμενη από τη ριμπαβιρίνη ενεργοποίηση ISG και η αντιϊκή δραστηριότητα κατεστάλησαν χρησιμοποιώντας συμπληρωματική γουανοσίνη, ένα φυσικό ανάλογο της ριμπαβιρίνης, υποδηλώνοντας την ενεργοποίηση ISG που προκαλείται από την αναστολή IMPDH ως εναλλακτική οδό έμφυτης ανοσίας. Όπως η ριμπαβιρίνη, το MPA προκάλεσε αξιοσημείωτα την έκφραση αρκετών ISGs, συμπεριλαμβανομένων των IRF1, IRF9, ISG15, IFI6, IRF7, CXCL10, IFIT2 και IFITM3 mRNAs σε προγενέστερα ή μολυσμένα με HEV κύτταρα Huh-7, και η επαγωγή ISG ήταν τουλάχιστον εν μέρει καταργήθηκε με τη χρήση συμπληρωματικής γουανοσίνης [10] . Μηχανιστικά, η επαγωγή των ISG από το MPA ήταν ανεξάρτητη από το κλασικό σύστημα JAK/STAT, το οποίο είναι παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε με τη ριμπαβιρίνη [30] . Παρόμοια αποτελέσματα λήφθηκαν με αρκετούς αναστολείς IMPDH1 ή IMPDH2, με διάφορες συγγένειες, που σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν κατά παραγγελία [10] .Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, οι περισσότεροι αναστολείς βιοσύνθεσης πυριμιδίνης στοχεύουν τη διυδροοροτική αφυδρογονάση (DHODH), ένα μη ουσιαστικό ένζυμο της αφυδροπυριμιδίνης σύνθεση. Lucas-Hourani et al. αναγνώρισε το DD264 ως μια ένωση που διεγείρει το στοιχείο ιντερφερόνης (ISRE) από τον έλεγχο υψηλής απόδοσης και περαιτέρω αναλύσεις πρότειναν ότι ήταν αναστολέας DHODH με ισχυρή αντιική δράση έναντι διαφόρων ιών, συμπεριλαμβανομένων των MeV, CHIKV και WNV [37]. Το DD264 ενίσχυσε την έκφραση αρκετών ISG, τα οποία κατεστάλησαν σχεδόν πλήρως με την προσθήκη συμπληρωματικής ουριδίνης, υποδεικνύοντας την ενεργοποίηση ISG που προκαλείται από την αναστολή DHODH. Επιπλέον, η αντιϊκή δράση και η ενεργοποίηση του ISG από το DD264 απαιτούσαν τον μεταγραφικό παράγοντα ρυθμιστικού παράγοντα 1 (IRF1) ιντερφερόνης, έναν κύριο ρυθμιστή της έκφρασης αντιιικών γονιδίων [37] , ο οποίος ήταν σύμφωνος με την παρατήρηση ότι η αντι-HCV δράση του MPA ήταν εν μέρει με τη μεσολάβηση IRF1 [30] . Σε αυτή τη μελέτη, παρόμοια αποτελέσματα παρουσιάστηκαν με το brequinar, έναν άλλο πολύ γνωστό αναστολέα DHODH. Το FA-613 είναι επίσης μια αντιική ένωση, η οποία αναστέλλει την οδό βιοσύνθεσης της πυριμιδίνης, πιθανώς μέσω της στόχευσης του DHODH και της πρόκλησης της έκφρασης ISGs όπως IFNB1, CXCL10, ISG15 και CCL5 [38]. Ωστόσο, εάν η ενεργοποίηση ISG μεσολαβείται από αναστολή βιοσύνθεσης πυριμιδίνης παραμένει να προσδιοριστεί. Ο μηχανισμός της επαγόμενης από αναστολέα σύνθεσης νουκλεοτιδίων ενεργοποίησης ISG είναι ακόμη επί του παρόντος ασαφής. Ωστόσο, έχουν συσσωρευτεί στοιχεία που δείχνουν ότι η επαγόμενη από αναστολέα σύνθεσης νουκλεοτιδίων ενεργοποίηση ISG είναι ανεξάρτητη από το κλασικό σήμα IFN με τη μεσολάβηση JAK/STAT [6, 10, 23]. Πρώτον, οι Wang et al. έδειξε ξεκάθαρα ότι η ενεργοποίηση ISG και η αντι-ΗΕV δραστηριότητα που προκαλείται από MPA ή brequinar δεν μεσολαβούνταν από το JAK [10] . Δεύτερον, η επαγωγή του IRF7 από τη ριμπαβιρίνη δεν επηρεάστηκε από την πτώση της STAT1, ενώ αυτή της IFN-α επηρεάστηκε έντονα υπό τις ίδιες συνθήκες [6] . Τρίτον, η πρόσφατη μελέτη μας με τη γεμσιταβίνη επιβεβαίωσε περαιτέρω την ανεξάρτητη από το σήμα ενεργοποίηση ISG της IFN με παράλληλες μελέτες που συγκρίνουν τις επιδράσεις της γεμσιταβίνης και της IFN-α. Στη μελέτη μας, η φωσφορυλίωση του STAT1 στο Tyr701, η οποία προκλήθηκε δραματικά από την IFN-α, δεν συνέβη όταν έλαβε θεραπεία με γεμσιταβίνη [23] . Επιπλέον, η ανοδική ρύθμιση των mRNA DDX58 που προκαλείται από τη γεμσιταβίνη δεν επηρεάστηκε από την καταστροφή του IRF9, κάτι που ήταν αντίθετο με το αποτέλεσμα ότι η επαγόμενη από την IFN-α ρύθμιση προς τα πάνω των DDX58 mRNAs καταστέλλεται σημαντικά υπό τις ίδιες συνθήκες. Σε συμφωνία με τις παραπάνω παρατηρήσεις, υπήρξαν ορισμένες αναφορές ότι τα ISG προκλήθηκαν απουσία ενεργοποίησης JAK1 ή STAT1 [43, 44] . Παρά τα περιορισμένα δεδομένα, εικάζουμε το σενάριο ενεργοποίησης ISG που είναι ανεξάρτητο από το σήμα IFN με τη μεσολάβηση JAK/STAT . Οι αναστολείς βιοσύνθεσης πουρίνης ή πυριμιδίνης θα μπορούσαν να επηρεάσουν τη μεταβολική οδό στοχεύοντας ορισμένα βασικά ένζυμα όπως το IMPDH και το DHODH, οδηγώντας σε εξάντληση ή ανισορροπία της δεξαμενής (d)NTP. Η αδρανοποίηση των ίδιων των μεταβολικών ενζύμων ή κατά συνέπεια οι αλλοιωμένες δεξαμενές πυρηνικών (t)ide μπορεί να πυροδοτήσει ένα σήμα, το οποίο τελικά παραδίδεται σε ορισμένα στοιχεία που δρουν cis στον προαγωγέα μιας υποομάδας ISG, πιθανώς μέσω της αναμετάδοσης κινασών και παραγόντων μεταγραφής . Με βάση τις προαναφερθείσες αναφορές, αυτό το σήμα είναι λιγότερο πιθανό να εξαρτάται από το STAT1/2-IRF9 (γονιδιακός παράγοντας 3 που διεγείρεται από την IFN. ISGF3), τουλάχιστον για τη γεμσιταβίνη, η οποία είναι το κύριο μεταγραφικό σύμπλεγμα στην οδό JAK/STAT που προκαλείται από IFN. Θα πρέπει επίσης να ληφθεί υπόψη ότι οι Thomas et al. απέκλεισε τη συμμετοχή μιας ενδοκυτταρικής οδού ανίχνευσης δίκλωνου RNA, μονοπατιών υποδοχέα τύπου Toll και πυρηνικού παράγοντα κΒ, καθώς και ενός κλασικού σήματος IFN στην ενεργοποίηση των ISG που επάγεται από τη ριμπαβιρίνη [6] . Παρά τη συναίνεση για την ενεργοποίηση ISG, κάθε αναστολέας βιοσύνθεσης πουρίνης/πυριμιδίνης φαίνεται να προκαλεί ξεχωριστά σύνολα ISG, τουλάχιστον με διαφορετικά πρότυπα [10] . Η στόχευση ενός ενζύμου στο οποίο μονοπάτια (σύνθεση πουρίνης ή πυριμιδίνης) ή στάδια (πρώιμα/όψιμα και de novo/διάσωσης) παράγουν διαφορετικά επίπεδα ενδιάμεσων ενώσεων και νουκλεο(τ)ιδών θα έχει συνεπώς ως αποτέλεσμα ποικίλα αποτελέσματα των ενεργοποιήσεων ISG. Μπορεί να εμπλέκονται περισσότερα από ένα μονοπάτια σηματοδότησης. Η συνεργική αντιική δράση της γεμσιταβίνης και της ριμπαβιρίνης που παρατηρήθηκε στη μελέτη μας μπορεί να εξηγηθεί από την πιθανή ύπαρξη δύο ξεχωριστών μονοπατιών σηματοδότησης που μεσολαβούν σε κάθε αναστολή της σύνθεσης νουκλεοτιδίων προς την ενεργοποίηση ISG. Οι συστηματικές αναλύσεις κινασών σηματοδότησης, IRFs και STAT χρησιμοποιώντας siRNA knockdown ή/και φαρμακολογική αναστολή και μεταβολικές αναλύσεις των αντίστοιχων ενδιάμεσων και νουκλεο(τ)ιδών θα πρέπει επομένως να αποσαφηνίσουν τους υποκείμενους μοριακούς μηχανισμούς ενεργοποίησης ISG από τη σύνθεση νέων βιομερών πουρίνης/πυριμιδίνης. ή ιοί που επανεμφανίστηκαν όπως οι SARS-CoV, MERS-CoV και ZIKV έχουν γίνει μια σημαντική απειλή για τη δημόσια υγεία, η ανάγκη για ευρέως φάσματος αντιιικά φάρμακα έχει αυξηθεί. Από αυτή την άποψη, τα ανάλογα νουκλεοσιδίων που στοχεύουν άμεσα την ιική εξαρτώμενη από RNA πολυμεράση και παρουσιάζουν υψηλό εμπόδιο στην ανάπτυξη ανθεκτικών ιών έχουν θεωρηθεί πλεονεκτήματα. Επιπλέον, η πρόσφατη ανακάλυψη ενός νέου αντιιικού τρόπου νουκλεοσιδικών αναλόγων που δρα μέσω της έμφυτης ανοσίας ενισχύει τη μοριακή βάση για τη θεραπευτική τους εφαρμογή ως ευρέως φάσματος αντιιικά φάρμακα. Τα ανάλογα νουκλεοσιδών πιθανώς προκαλούν διαφορετικά υποσύνολα ISG, τουλάχιστον με διαφορετικό πρότυπο, οδηγώντας σε διάφορα συνδυασμοί ISG και προκύπτοντα αντιιικά αποτελέσματα. Επιπλέον, σύμφωνα με τους Schoggins et al., διαφορετικοί ιοί επηρεάζονται από διαφορετικά υποσύνολα ISG και ορισμένα ISG όπως τα IRF1, MB21D1, HPSE, DDX58, MDA και IFITM3 δρουν ευρέως σε διάφορους ιούς [45] . Έτσι, απαιτούνται πιο συστηματικές αναλύσεις στα υποσύνολα των ISG που προκαλούνται από ανάλογα νουκλεοσιδών κατά των ιών για τον εντοπισμό καλύτερων αντιιικών φαρμάκων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ευρέως ή ειδικά. Δεδομένων των κλινικών παρενεργειών της θεραπείας με IFN, τα ανάλογα νουκλεοτιδίων που διαφέρουν από την IFN στην ενεργοποίηση υποομάδων ISG πρέπει να θεωρούνται εναλλακτικά. Παρόλα αυτά, τα ανάλογα νουκλεοσιδίων που παρεμβαίνουν στην οδό σύνθεσης νουκλεοτιδίων του ξενιστή υποδηλώνουν πιθανές παρενέργειες στις κλινικές τους εφαρμογές. Απαιτείται προσεκτική αξιολόγηση της κλινικής ασφάλειας και η εφαρμογή τους για το επείγον μέτρο των ασθενών που έχουν μολυνθεί από θανατηφόρους ιούς θα πρέπει να εξεταστεί πρωτίστως.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 7229, "text": "γεμσιταβίνη" } ], "id": 5233, "question": "Ποιο ανάλογο νουκλεοσιδίου είναι το επίκεντρο της τρέχουσας μελέτης;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Ταυτοποίηση και χαρακτηρισμός του συνδέτη CD40 του Sigmodon hispidushttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6063397/SHA: edf2997357501734a93c1b7e16d44e886a3sA7d Muralidharan, Abenaya; Larocque, Louise; Cao, Jingxin; Deschambault, Yvon; Varga, Jessie; Thulasi Raman, Sathya N.; Li, XuguangDate: 2018-07-27DOI: 10.1371/journal.pone.0199067Άδεια: cc-byAbstract: Οι αρουραίοι από βαμβάκι είναι ένα σημαντικό ζωικό μοντέλο για τη μελέτη μολυσματικών ασθενειών. Έχουν επιδείξει υψηλότερη ευαισθησία σε μια ευρύτερη ποικιλία ανθρώπινων παθογόνων από άλλα τρωκτικά και είναι επίσης το ζωικό μοντέλο επιλογής για προκλινικές αξιολογήσεις ορισμένων υποψηφίων εμβολίων. Ωστόσο, το γονιδίωμα των βαμβακερών αρουραίων παραμένει προς πλήρη αλληλουχία, με πολύ λιγότερα γονίδια να κλωνοποιούνται και να χαρακτηρίζονται σε σύγκριση με άλλα είδη τρωκτικών. Εδώ αναφέρουμε την κλωνοποίηση και τον χαρακτηρισμό του συνδέτη CD40, του οποίου οι αντίστοιχοι άνθρωποι και ποντικοί είναι γνωστό ότι εκφράζονται σε μια σειρά κυτταρικών τύπων, συμπεριλαμβανομένων ενεργοποιημένων Τ-λεμφοκυττάρων και Β κυττάρων, δενδριτικών κυττάρων, κοκκιοκυττάρων, μακροφάγων και αιμοπεταλίων και ασκεί ευρεία γκάμα ανοσοποιητικών απαντήσεις. Το cDNA για CD40L αρουραίου βαμβακιού που απομονώσαμε αποτελείται από 1104 νουκλεοτίδια με ένα ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) 783 bp που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 260 αμινοξέων. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη CD40L αρουραίου βαμβακιού αναγνωρίστηκε από ένα αντίσωμα κατά του CD40L ποντικού. Επιπλέον, έδειξε λειτουργικές δραστηριότητες σε ανώριμα δενδριτικά κύτταρα μυελού των οστών ρυθμίζοντας προς τα πάνω τους δείκτες ωρίμανσης της επιφάνειας (CD40, CD54, CD80 και CD86) και αυξάνοντας την έκφραση γονιδίου και πρωτεΐνης IL-6. Η διαθεσιμότητα της ταυτότητας του γονιδίου CD40L θα μπορούσε να διευκολύνει σημαντικά τη μηχανιστική έρευνα για την επαγόμενη από παθογόνο ανοσοπαθογένεση και τις προκαλούμενες από εμβόλια ανοσοαποκρίσεις. Κείμενο: Ο αρουραίος βαμβακιού (Sigmodon hispidus) χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά στην έρευνα της πολιομυελίτιδας τη δεκαετία του 1930 [1] και σε όλη την τελευταία αιώνα, έχει αποδειχθεί ένα εξαιρετικό μοντέλο για βιοϊατρική έρευνα [2, 3, 4] . Ιστορικά στη βιοϊατρική έρευνα, το ποντίκι έχει χρησιμοποιηθεί ως το προεπιλεγμένο ζωικό μοντέλο. Αυτό οφείλεται εν μέρει στις καλά καθορισμένες ανοσολογικές και γενετικές πληροφορίες, την οικονομική αποδοτικότητα και τα άφθονα συγγενή στελέχη και τα ερευνητικά αντιδραστήρια. Ωστόσο, η χρήση ποντικών ως μοντέλων για τη μελέτη μολυσματικών ασθενειών έχει τον περιορισμό της, καθώς τα ποντίκια δεν μολύνονται φυσικά από τα περισσότερα ανθρώπινα παθογόνα. Από την άλλη πλευρά, ο βαμβακερός αρουραίος είναι ευαίσθητος σε πολλά ανθρώπινα παθογόνα και είναι το ιδανικό μοντέλο επιλογής για ιλαρά (paramyxovirus) [5], γέιλη (orthomyxovirus) 7, 8] , HIV-1 [9] , RSV (αναπνευστικός συγκυτιακός ιός) [10] , αδενοϊός [11, 12] , ανθρώπινη παραγρίππη [13] και ανθρώπινος μεταπνευμοϊός [14] . Αυτό το μοντέλο ήταν πολύτιμο για την έρευνα θεραπείας γονιδιακής υποκατάστασης με βάση τον αδενοϊό [15, 16] και αποδείχθηκε επίσης απαραίτητο στην προκλινική αξιολόγηση των προφυλακτικών αντισωμάτων (RespiGam 1 [17] και Synagis 1 [18] . Πράγματι, το μοντέλο βαμβακερού αρουραίου βρέθηκε ότι είναι πολύτιμο όσον αφορά τη βιολογική και ανοσολογική του συνάφεια, κρίθηκε περιττό να δοκιμαστεί η γονιδιακή θεραπεία που βασίζεται σε αδενοϊό και η προφυλακτική θεραπεία Synagis 1 κατά της νόσου RSV σε πρωτεύοντα πλην του ανθρώπου πριν από τον άνθρωπο. δοκιμές [19, 20] .Έχουν αναπτυχθεί ένας αριθμός μεθόδων και αντιδραστηρίων για την ανάλυση των ανοσολογικών αποκρίσεων σε αρουραίους από βαμβάκι την τελευταία δεκαετία. Μέχρι σήμερα, περισσότερα από 200 γονίδια που κωδικοποιούν κυτοκίνες, χημειοκίνες, δείκτες κυτταρικής επιφάνειας και ρυθμιστικά μόρια έχουν κλωνοποιηθεί, με διάφορα σχετικά ερευνητικά αντιδραστήρια να είναι διαθέσιμα στο εμπόριο. Ως αποτέλεσμα, η χρήση βαμβακερών αρουραίων σε μελέτες παθογένεσης που αντιμετωπίζουν μηχανιστικά ερωτήματα έχει αυξηθεί σημαντικά. Παρ' όλα αυτά, το γονίδιο που κωδικοποιεί τον συνδέτη CD154 και CD40 (CD40L), παραμένει άγνωστο. Το CD40L παίζει κρίσιμο ρόλο στην ενορχήστρωση των ανοσολογικών αποκρίσεων έναντι των παθογόνων. Ανάλογα με την μετα-μεταφραστική τροποποίηση, το CD40L ποντικού είναι μια γλυκοπρωτεΐνη μεμβράνης τύπου II 32-39 kDa που αρχικά αναγνωρίστηκε ως επιφανειακός δείκτης αποκλειστικά για ενεργοποιημένα CD4 + Τ κύτταρα [21, 22]. Είναι μέλος της υπεροικογένειας TNF που αποτελείται από μια σάντουιτς εξωκυτταρική δομή που αποτελείται από ένα β-φύλλο, έναν βρόχο α-έλικα και ένα β-φύλλο, επιτρέποντας τον τριμερισμό του CD40L, ένα πρόσθετο χαρακτηριστικό της οικογένειας των προσδεμάτων TNF [23. ] . Από την αρχική του ανακάλυψη, το CD40L έχει αποδειχθεί ότι δεν εκφράζεται μόνο σε CD4+ Τ κύτταρα, αλλά σε δενδριτικά κύτταρα (DCs) [24] , Β κύτταρα [25] και αιμοπετάλια [26] . Έχει αποδειχθεί ότι κατά την αλληλεπίδραση με Ο υποδοχέας του, CD40, CD40L επάγει βαθιές επιδράσεις στα Τ κύτταρα, τα DC, τα Β κύτταρα, τα ενδοθηλιακά κύτταρα, καθώς και πολλά κύτταρα του αιμοποιητικού και μη αιμοποιητικού συστήματος. Επιπλέον, όταν το CD40L εμπλέκει το CD40 στην επιφάνεια των DCs, προάγει την παραγωγή κυτοκίνης, την επαγωγή συνδιεγερτικών μορίων κυτταρικής επιφάνειας και διευκολύνει τη διασταυρούμενη παρουσίαση του αντιγόνου από αυτά τα κύτταρα [27], επιτρέποντας στα DC να ωριμάσουν και να επάγουν αποτελεσματικά την ενεργοποίηση και διαφοροποίηση των Τ κυττάρων. Όταν το CD40L εμπλέκει το CD40 στην επιφάνεια των Β κυττάρων, προάγει το σχηματισμό βλαστικού κέντρου, την αλλαγή ισοτύπου ανοσοσφαιρίνης (Ig), τη σωματική υπερμετάλλαξη για την ενίσχυση της συγγένειας του αντιγόνου και, τέλος, το σχηματισμό μακρόβιων πλασματοκυττάρων και Β κυττάρων μνήμης [28] . Έχουν διεξαχθεί διάφορες μελέτες για τη χρήση της γονιδιακής παράδοσης του CD40L σε DCs και καρκινικά κύτταρα για ανοσοθεραπεία όγκου. Βρέθηκε ότι η έκφραση του CD40L σε ένα μικρό ποσοστό καρκινικών κυττάρων ήταν αρκετή για να δημιουργήσει μια μακροχρόνια συστηματική αντικαρκινική ανοσολογική απόκριση σε ποντικούς που αποδείχθηκε ότι εξαρτάται από κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα [29, 30]. Εδώ αναφέρουμε επιτυχής κλωνοποίηση του γονιδίου που κωδικοποιεί CD40L αρουραίου βαμβακιού (crCD40L). Επίσης εκφράσαμε και καθαρίσαμε το CD40L που παράγεται σε κύτταρα θηλαστικών. Περαιτέρω χαρακτηρισμός του CD40L του ανασυνδυασμένου αρουραίου βαμβακιού αποκάλυψε τις λειτουργικές του δραστηριότητες στην προώθηση της ωρίμανσης DC και της παραγωγής κυτοκίνης. [6] [7] αρουραίοι βαμβακιού ηλικίας 7 εβδομάδων ελήφθησαν από μια συγγενή αποικία που διατηρήθηκε στο Envigo (ΗΠΑ). Όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης (IACUC) της Επιτροπής Υγείας Καναδά Οττάβα Animal Care που ενέκρινε αυτή τη μελέτη. Οι αρουραίοι στεγάστηκαν 3 ζώα ανά κλουβί σε ατομικά αεριζόμενους κλωβούς Allentown NexGen με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. Αυτά τα κλουβιά παρείχαν χώρο δαπέδου 142 σε 2 / 916 cm 2 . Το σωματικό βάρος και κάθε σημάδι αγωνίας παρακολουθούνταν καθημερινά. Εάν παρατηρηθεί οτιδήποτε σχετίζεται με την υγεία των ζώων, θα διενεργείται πλήρης εξέταση. Καθώς σε αυτή τη μελέτη απομονώθηκαν σπληνικά κύτταρα από φυσιολογικά, υγιή ζώα, δεν παρατηρήσαμε καμία ανεπιθύμητη ενέργεια. Για την απομόνωση σπληνοκυττάρων από τα ζώα, χρησιμοποιήθηκε ισοφλουράνιο για να κοιμηθούν τα ζώα μέσω εισπνοής με οξυγόνο για ευθανασία. Οι σπλήνες από τρεις παρθένους βαμβακερούς αρουραίους αφαιρέθηκαν ασηπτικά και καταψύχθηκαν απότομα σε υγρό άζωτο. Οι σπλήνες ομογενοποιήθηκαν ξεχωριστά με TissueLyser II (Qiagen) και εκχυλίστηκε ολικό RNA χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy Mini (Qiagen) με πέψη DNase επί στήλης σύμφωνα με το εγχειρίδιο χρήστη. Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε το σύστημα 3' RACE (Life Technologies) για την ενίσχυση του τμήματος 3' του CD40L του αρουραίου βαμβακιού από το συνολικό RNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μια σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας 3' RACE που χρησιμοποιείται παρέχεται στο S1 Σχήμα. Ένας ειδικός για το γονίδιο εκκινητής (5'-GGACTCTATTATGTCTACACCCAAGTCACCTTCTTG -3') προήλθε από μια συναινετική αλληλουχία που ευθυγραμμίζει τον αρουραίο (Rattus norvegicus UniProt: Q9Z2V2), τον ποντικό (Mus musculus UniProt: P27540M: P27548: P27548 Reference: P27548 Reference: 27548M100548M10058M10100100010000006M10000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000) και .3) Αλληλουχίες CD40L που ελήφθησαν από το Εθνικό Κέντρο Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας (NCBI). Μετά τη σύνθεση του πρώτου κλώνου cDNA, το 3' τμήμα του mRNA CD40L αρουραίου βαμβακιού ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας τον ειδικό γονιδιακό εκκινητή που προέρχεται από τη συναινετική αλληλουχία και τον συντομευμένο εκκινητή γενικής ενίσχυσης με θερμοκρασία ανόπτησης στους 56°C. Η αντίστροφη συμπληρωματική αλληλουχία αυτού του εκκινητή στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε ως αντίστροφος εκκινητής με τον εμπρόσθιο εκκινητή (5'-GATAGAAACATACAGCCAACCTTCTCCCAGATC -3') για να ενισχύσει το τμήμα 5' του mRNA CD40L αρουραίου βαμβακιού με θερμοκρασία ανόπτησης 57˚C. Όλα ενισχύθηκαν Τα θραύσματα αλληλουχήθηκαν με κιτ BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing (ThermoFisher cat # 4336917). Εν συντομία, τα δείγματα ενισχύθηκαν σε θερμικό κύκλο PTC-200 (MJ Research) με το ακόλουθο πρόγραμμα: 26 κύκλοι από 1˚C/S έως 96˚C, 96˚C για 10 δευτερόλεπτα, 1˚C/S έως 50˚C , 50˚C για 5 δευτερόλεπτα, 1˚C/S έως 60˚C, 60˚C για 4 λεπτά. Τα δείγματα καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ DyeEx 2.0 Spin (Qiagen cat # 63204) και φορτώθηκαν σε Genetic Analyzer 3130xl (Applied Biosystems). Τα ακατέργαστα δεδομένα αλληλουχίας επεξεργάστηκαν από το λογισμικό του οργάνου (ThermoFisher 3130xl Genetic Analyzer Data Collection Software v3.0) και στη συνέχεια εισήχθησαν στο λογισμικό ανάλυσης αλληλουχίας GeneCodes Sequencher v4.6.1 για περαιτέρω επεξεργασία. Οι τελικές αλληλουχίες contigs εισάγονται στη συνέχεια στο NCBI BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi) για την επιβεβαίωση της ταυτότητας. Οι υποτιθέμενες διατηρημένες περιοχές, η διεπαφή τριμερούς και οι θέσεις δέσμευσης υποδοχέα προσδιορίστηκαν με την εκτέλεση ενός τυπικού BLAST πρωτεΐνης (αλγόριθμος blastp. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Οι αλληλουχίες που παράγουν σημαντικές ευθυγραμμίσεις εισήχθησαν στο λογισμικό Geneosis, (Auckland, Νέα Ζηλανδία). Διεξήχθη πολλαπλή ευθυγράμμιση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31], με φυλογενετική ανάλυση χρησιμοποιώντας Geneosis Pro 5.6.7. Μόλις επιβεβαιώθηκε η αλληλουχία mRNA, σχεδιάστηκε ένα κατασκεύασμα που αρχίζει με μια αλληλουχία kozak (5'-CACCGCCGCCACC-3'), ακολουθούμενη από μια σήμα έκκρισης που αποτελείται από 23 αμινοξέα (aa) (MLLAVLYCLLWSFQTSAGHFPRA) από το πεπτίδιο σήματος ανθρώπινης τυροσινάσης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32] . Αυτό ακολουθείται από έξι υπολείμματα ιστιδίνης για να διευκολυνθεί ο καθαρισμός της πρωτεΐνης. Μετά από αυτή την αλληλουχία, ένα θραύσμα 27-aa από το μοτίβο τριμερισμού ινωδίνης Τ4 βακτηριοφάγου προστέθηκε [33] και τελικά συνδέθηκε με το πλήρους μήκους ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης 783 bp (ORF) της ακολουθίας CD40L αρουραίου βαμβακιού στο C άκρο. Αυτό το κατασκεύασμα συντέθηκε και κλωνοποιήθηκε σε pUC57 (Biobasic, Markham, ON). Η δημιουργία ενός ανασυνδυασμένου ιού δαμαλίτιδας που εκφράζει το κατασκεύασμα πρωτεΐνης CD40L αρουραίου βαμβακιού επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας έναν ιό δαμαλίτιδας E3L και K3L μεταλλαγμένου ιού διπλής διαγραφής ως τον γονικό ιό και τον ιό taterapoxvirus K3L δείκτης θετικής επιλογής (Jingxin Cao, αδημοσίευτες πληροφορίες). Εν συντομία, ο φορέας πλασμιδίου ανασυνδυασμού για έκφραση του γονιδίου κατασκευάσματος CD40L αποτελείται από τις ομόλογες πλευρικές αλληλουχίες DNA δαμαλίτιδας που στοχεύουν το γονίδιο A45R της δαμαλίτιδας (ομόλογο SOD). το γονίδιο κατασκευής CD40L που οδηγείται από έναν τροποποιημένο προαγωγέα δαμαλίτιδας Η5 (Vaccine 1996, 14:1451) και το γονίδιο 037 του ιού taterapox που οδηγείται από τον προαγωγέα δαμαλίτιδας K3L ως δείκτη θετικής επιλογής. Ο φορέας ανασυνδυασμού επιμολύνθηκε σε κύτταρα νοκ-άουτ HeLa PKR μολυσμένα με έναν ιό δαμαλίτιδας με τα γονίδια E3L και K3L να έχουν διαγραφεί. Η επιλογή και ο καθαρισμός του ανασυνδυασμένου ιού δαμαλίτιδας που εκφράζει το CD40L έγινε σε κύτταρα BHK21. Η έκφραση της πρωτεΐνης CD40L επιβεβαιώθηκε με στύπωμα Western χρησιμοποιώντας His-tag Ab. Οι μονοστοιβάδες κυττάρων λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος και ομογενοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας στήλες QIAshredder (Qiagen). Η κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 4 έως 15% γέλη TGX και ρυθμιστικό τρεξίματος Tris/Glycine/SDS (Bio-Rad Laboratories Inc.), και τα δείγματα πρωτεΐνης μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες Immobilon-FL PVDF (Millipore). Η πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε με Tetra-HIS Ab (Qiagen) και κατσίκα αντι-ποντικού IRDye-800CW (LiCor). Οι μεμβράνες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα Odyssey (LiCor). Ο ιός δαμαλίτιδας που φέρει το γονίδιο crCD40L πολλαπλασιάστηκε σε κύτταρα BHK21. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με PBS μία φορά και στη συνέχεια λύθηκαν με ένα ρυθμιστικό μετουσίωσης (10 mM Tris-HCl, 100 mM φωσφορικό νάτριο, 6 Μ υδροχλωρική γουανιδίνη, 10 mM ανηγμένη γλουταθειόνη, ρΗ 8,0) και διασπάστηκαν με υπερήχους σε πάγο χρησιμοποιώντας Branson sonifier 150 (ThermoFisher, Waltham, MA) στο επίπεδο 1 για δύο εκρήξεις 10 δευτερολέπτων με ανάπαυση 1 λεπτό σε πάγο μεταξύ. Μετά τον διαχωρισμό των κυτταρικών υπολειμμάτων, το υπερκείμενο προστέθηκε σε ένα εναιώρημα ρητίνης Ni-NTA (Qiagen, Mississauga, ΟΝ, Καναδάς) (10 mL κλίνης ρητίνης) και αναδεύτηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά πριν φορτωθεί σε μια στήλη. Η στήλη καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας έναν καθαριστή ΑΚΤΑ (Amersham Biosciences) με λογισμικό Unicorn 5.3 (Amersham Biosciences). Η αναδίπλωση πραγματοποιήθηκε υπό οξειδωτικές συνθήκες με μια βαθμίδα μετουσιωτικού ρυθμιστικού διαλύματος προς το ρυθμιστικό διάλυμα Β (ρυθμιστικό διάλυμα Β: 10 mM Tris-HCl, 100 mM φωσφορικό νάτριο, ρΗ 7,8) σε 10 όγκους στήλης (CVs). Η στήλη στη συνέχεια πλύθηκε με τρία CV ρυθμιστικού διαλύματος Β + 60 mM ιμιδαζόλης (ρΗ 7,8) για να αφαιρεθεί η μη ειδική δέσμευση. Η πρωτεΐνη εκλούστηκε από τη στήλη με ρυθμιστικό διάλυμα Β + 250 mM ιμιδαζόλη (ρΗ 7,8). Η πρωτεΐνη που προέκυψε υποβλήθηκε σε διαπίδυση έναντι PBS pH 7,5 και στη συνέχεια επιβεβαιώθηκε με στύπωμα western. Οι πλάκες 96 φρεατίων επικαλύφθηκαν είτε με ανασυνδυασμένο CD40L ποντικού (R&D Systems) είτε με την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη crCD40L 2ug/ml σε 100μl PBS. Οι πλάκες πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (PBS-0,1% tween-20) και στη συνέχεια μπλοκαρίστηκαν με ρυθμιστικό αποκλεισμού 200 μl/φρεάτιο (PBS που περιέχει 0,1% Tween 20 και 3% IgG Free BSA) για 1 ώρα στους 37°C. Οι πλάκες πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης και επωάστηκαν στους 37°C για 1 ώρα με 100 μl/πηγάδι κατσίκας αντι-ποντικού CD40L (R&D Systems) 2 ug/ml σε ρυθμιστικό αποκλεισμού. Οι πλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν στους 37°C για 1 ώρα με 100 μl/φρεάτιο με σύζευγμα κουνελιού αντι-κατσίκας IgG HRP (Zymed). Οι πλάκες πλύθηκαν ξανά και επωάστηκαν για 10 λεπτά στο σκοτάδι με 100μl/φρεάτιο υπόστρωμα 3,3'5,5'-τετραμεθυλοβενζιδίνης (New England Bio Labs). Η αντίδραση διακόπηκε με διάλυμα Stop (New England Bio Labs) και η απορρόφηση διαβάστηκε στα 450 nm σε συσκευή ανάγνωσης πλακών BioTek Synergy 2. Πρωτογενή κύτταρα μυελού των οστών από ποντικούς Balb/c (Chicago, IL) αποψύχθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε μέσο δενδριτικών κυττάρων από κατασκευή (Cell Biologics M7711) συμπληρωμένο με GMCSF (Cell Biologics) χωρίς IL-4 σε 4x10 5 κύτταρα/πηγάδι σε όγκο 200μl. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0,5μg/ml ανασυνδυασμένο CD40L ποντικού (Preprotech, Montreal, QC) ή με την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη crCD40L στα 0,5μg/ml, 5μg/ml ή 50μg/ml. Σαράντα ώρες αργότερα, πραγματοποιήθηκε κυτταρομετρία ροής σε αναλυτή κυττάρων BD LSRFortessa αφού χρωματίστηκαν 2 x 10 5 κύτταρα/σωλήνα χρησιμοποιώντας αντισώματα CD11c-PE-CF594, CD54-FITC, CD40-BV786, CD80-BV421 και CD86-BV711. Όλα τα αντισώματα αγοράστηκαν από την BD Biosciences. Τα φάσματα που προέκυψαν αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FACS-Diva έκδοση 8.0.1. Για να εκτιμηθεί η παραγωγή mRNA IL-6 ανώριμων DC μυελού των οστών σε απόκριση στη στόχευση με ανασυνδυασμένο crCD40L, διεξήχθη ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο σε μια Ταχεία Αλληλουχία ABI Prism 7500 σύστημα ανίχνευσης (Applied Biosystems). Χρησιμοποιήθηκαν κιτ αντιδραστηρίων προσδιορισμού TaqMan (Applied Biosystems) που περιέχουν προτυποποιημένους εκκινητές και ανιχνευτές TaqMan MGB για IL-6 και 18S που χρησιμοποιήθηκαν για την κανονικοποίηση των δεδομένων. Το συνολικό RNA απομονώθηκε από 8x10 5 διεγερμένα DCs μυελού των οστών χρησιμοποιώντας το RNeasy Mini Kit (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το απομονωμένο RNA χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή cDNA χρησιμοποιώντας το Superscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το cDNA στη συνέχεια υποβλήθηκε σε ποσοτική PCR χρησιμοποιώντας το TaqMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα εκτελέστηκαν εις διπλούν και ελήφθησαν τιμές Ct. Η αλλαγή των πτυχών σε σχέση με τα μη διεγερμένα DCs υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο σχετικής ποσοτικοποίησης 2 -ΔΔCT [34] , χρησιμοποιώντας το 18S ως το γονίδιο αναφοράς οικιακής φροντίδας. Για τη διερεύνηση της έκκρισης IL-6 από DCs μυελού των οστών ποντικού, το υπερκείμενο από καλλιέργειες διεγερμένες σαράντα ώρες συλλέχθηκε και αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ ELISA IL-6 DuoSet ποντικιού (R & D Systems) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Λήφθηκε η πλήρης αλληλουχία mRNA του CD40L σε δύο βήματα (Εικ. 1) . Μια αλληλουχία που αντιστοιχεί στα νουκλεοτίδια 535 έως την ουρά πολυ-Α λήφθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ 3' RACE και mRNA ως υλικό έναρξης, το οποίο απομονώθηκε από σπληνοκύτταρα αρουραίου βαμβακιού και μια συναινετική αλληλουχία τρωκτικών ως εκκινητή. Αυτό το τμήμα της αλληλουχίας έχει την 3' μη μεταφρασμένη περιοχή του mRNA καθώς και το κωδικόνιο λήξης. Το 5' άκρο της πρωτεΐνης λήφθηκε στο επόμενο βήμα με ενίσχυση PCR του cDNA που λήφθηκε στο πρώτο βήμα με το κιτ 3' RACE και το αντίστροφο συμπλήρωμα του εναρκτήρα της συναινετικής αλληλουχίας και ενός δεύτερου εναρκτήρα συναινετικής αλληλουχίας σχεδιασμένου να δεσμεύεται στο αρχή του CD40L mRNA. Το 783bp ORF κωδικοποιεί το 260aa ακολουθούμενο από ένα κωδικόνιο λήξης. Η σύγκριση του γονιδίου CD40L με αλληλουχία αποκάλυψε ότι η κωδικοποιητική αλληλουχία crCD40L μοιράζεται 93%, 89% και 83%, ταυτότητα με χρυσό χάμστερ, αρουραίο και ποντίκι, αντίστοιχα. Σε επίπεδο αμινοξέων (aa), οι αντίστοιχες ταυτότητες είναι 91%, 82% και 82%, Σχήμα 2α. Και στα επίπεδα mRNA και aa, το crCD40L μοιράστηκε την πλησιέστερη ομοιότητα με το Peromyscus maniculatus bairdii (ή ποντίκι ελάφι) σε 93% και 92% αντίστοιχα. Όταν εκτελείται ανάλυση ομολογίας αλληλουχίας, το crCD40L συγκεντρώνεται με άλλα μέλη της οικογένειας Cricetidae Εικ. 2β. Στη συνέχεια εξετάσαμε τις λειτουργικές περιοχές στο crCD40L σε σύγκριση με άλλα γνωστά CD40L. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3α, το crCD40L έχει μια υπεροικογένεια υποτιθέμενου παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF) Χρησιμοποιώντας το λογισμικό EZmol [35] , προβλέψαμε την αναδίπλωση της πρωτεΐνης όπως φαίνεται στο Σχήμα 3β. Το cDNA CD40L αρουραίου βαμβακιού που απομονώσαμε ήταν μια αλληλουχία νουκλεοτιδίων 1104 με ουρά πολυ-Α που περιείχε ένα ORF 783 bp που κωδικοποιούσε μια πρωτεΐνη 260 aa. Η ομολογία του CD40L αρουραίου βαμβακιού, τόσο σε επίπεδο αμινοξέων όσο και σε επίπεδο νουκλεϊκού οξέος, είναι πιο κοντά στα μέλη της οικογένειας Cricetidae (ποντίκι χάμστερ και ελάφι) παρά σε εκείνα της οικογένειας Muridae (αρουραίος και ποντικός) όπως φαίνεται στο Σχήμα 2β. Όπως και με άλλες γνωστές πρωτεΐνες CD40L, υπάρχει μια υποτιθέμενη περιοχή υπεροικογένειας TNF, μια διαμεμβρανική περιοχή, θέσεις τριμερισμού και θέσεις δέσμευσης υποδοχέα [36]. Τα μέλη της υπεροικογένειας TNF περιλαμβάνουν TNF (TNF-άλφα), LT (λεμφοτοξίνη-άλφα, TNF-βήτα ), συνδέτης CD40, Apo2L (TRAIL), συνδέτης Fas και συνδέτης οστεοπρωτεγερίνης (OPG), μεταξύ άλλων [37] . Η υπεροικογένεια TNF αποτελείται από 19 συνδέτες και 29 υποδοχείς, στους οποίους ο καθένας έχει πολύ διαφοροποιημένους ρόλους στο σώμα και εμφανίζει προφλεγμονώδη δράση, εν μέρει μέσω της ενεργοποίησης του NF-kB [37] . Τα μέλη αυτής της οικογένειας έχουν γενικά μια ενδοκυτταρική Ν-τερματική περιοχή, ένα βραχύ διαμεμβρανικό τμήμα, έναν εξωκυτταρικό μίσχο και μια σφαιρική εξωκυτταρική περιοχή που μοιάζει με TNF με περίπου 150 υπολείμματα [23] . Ξεκινούν την απόπτωση δεσμεύοντας σε σχετικούς υποδοχείς, ορισμένοι από τους οποίους έχουν περιοχές ενδοκυτταρικού θανάτου [38]. Αυτές οι πρωτεΐνες τυπικά σχηματίζουν ομο- ή ετερο-τριμερή σύμπλοκα και δεσμεύουν ένα επιμήκη μόριο υποδοχέα κατά μήκος καθεμιάς από τις τρεις σχισμές που σχηματίζονται από γειτονικά μονομερή του τριμερούς και ο τριμερισμός του προσδέματος είναι για δέσμευση υποδοχέα [23, 39]. Και τα επτά γνωστά διατηρημένα υπολείμματα που αποτελούν τη διεπαφή τριμερούς στη συντηρημένη περιοχή TNF [23, 40], χαρτογραφήθηκαν στην πιθανή αλληλουχία πρωτεΐνης crCD40L. Επιπλέον, και οι έξι γνωστές θέσεις δέσμευσης διατηρημένων υποδοχέων στη συντηρημένη περιοχή TNF [23, 40], χαρτογραφήθηκαν στην αλληλουχία πρωτεΐνης crCD40L. Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η συναγόμενη αλληλουχία του crCD40L, το πλήρες ORF των 783 bp του crCD40L κλωνοποιήθηκε σε κενό φορέας ιού. Το κατασκεύασμα crCD40L σχεδιάστηκε για να φέρει ένα σήμα έκκρισης, ετικέτα ιστιδίνης και ένα μοτίβο τριμερισμού (Σχήμα 4α). Η επιλογή και ο καθαρισμός του ανασυνδυασμένου ιού δαμαλίτιδας που εκφράζει το κατασκεύασμα CD40L διεξήχθη σε κύτταρα ΒΗΚ21. Στύπωμα Western με αντίσωμα αντι-ιστιδίνης (Ab) χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει την έκφραση του κατασκευάσματος πρωτεΐνης CD40L Σχήμα 4b και S2 Σχήμα. Το προκύπτον προϊόν πρωτεΐνης 36 kDa βρέθηκε τόσο στο κυτταρόλυμα όσο και στο υπερκείμενο (ασθενής ζώνη-48 ώρες μόνο). Δεδομένου ότι η υψηλότερη έκφραση βρέθηκε στο κυτταρόλυμα, χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω καθαρισμό της πρωτεΐνης. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η πρωτεΐνη ήταν δυνατό να ανιχνευθεί μόνο υπό αναγωγικές συνθήκες. Υπό μη αναγωγικές συνθήκες, η πρωτεΐνη δεν ήταν δυνατό να ανιχνευθεί από το αντι-ιστιδίνη Ab, ακόμη και στο κυτταρόλυμα (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Αυτό υποδεικνύει ότι η ετικέτα ιστιδίνης είναι διπλωμένη εντός του τριμερούς και δεν είναι διαθέσιμη στην φυσική μορφή για καθαρισμό. Αυτός είναι ένας επιπλέον λόγος για την ανάγκη καθαρισμού της πρωτεΐνης από το κυτταρόλυμα υπό σκληρές συνθήκες μετουσίωσης που ακολουθούνται από αναδίπλωση πρωτεΐνης. Ο λόγος που χρησιμοποιήσαμε ένα σύστημα έκφρασης θηλαστικών για την παραγωγή της πρωτεΐνης αντί για ένα βακτηριακό σύστημα είναι για να διευκολύνουμε τη σωστή αναδίπλωση της στη φυσική της δομή, τον τριμερισμό και τη γλυκοζυλίωση. Η ραχοκοκαλιά του aa προβλέπει μια πρωτεΐνη 29 kDa, ωστόσο οι αρχικές μελέτες της πρωτεΐνης CD40L πρότειναν μοριακή μάζα 39 kDa και στους περισσότερους τύπους κυττάρων η μοριακή μάζα του CD40L είναι 32-33 kDa, σύμφωνα με εκτεταμένη τροποποίηση μετά τη μετάφραση [36] Τα κύτταρα BHK21 που εκφράζουν το κατασκεύασμα crCD40L συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε λύση με 6 Μ υδροχλωρική γουανιδίνη με ανηγμένη γλουταθειόνη και επεξεργασία με υπερήχους. Το προϊόν λύσης φορτώθηκε στη στήλη νικελίου και πλύθηκε με μετουσιωτικό ρυθμιστικό όπως περιγράφεται στα υλικά και τις μεθόδους. Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες αναδιπλώθηκαν στη στήλη με ανταλλαγή ρυθμιστικού διαλύματος κλίσης, για να επιτραπεί η αργή αναδίπλωση της πρωτεΐνης, δεδομένου ότι η βιολογική δραστηριότητα του CD40L εξαρτάται από τη διαμόρφωση ομο-τριμερούς [23] . Η προκύπτουσα δεσμευμένη πρωτεΐνη στη συνέχεια εκλούστηκε με ιμιδαζόλη. Τα προκύπτοντα κλάσματα που έδειξαν μια κορυφή συνενώθηκαν και υποβλήθηκαν σε διαπίδυση έναντι PBS. Η καθαρισμένη πρωτεΐνη επιβεβαιώθηκε με ELISA. Εφόσον η αλληλουχία πρωτεΐνης CD40L αρουραίου βαμβακιού μοιράστηκε 82% ταυτότητα με την αλληλουχία πρωτεΐνης CD40L ποντικού, χρησιμοποιήθηκε ένα Ab γνωστό ότι ανιχνεύει το CD40L ποντικού για την αναγνώριση της καθαρισμένης πρωτεΐνης crCD40L. Το καθαρισμένο ανασυνδυασμένο crCD40L χρησιμοποιήθηκε ως αντιγόνο επικάλυψης με τρόπο βαθμίδωσης συγκέντρωσης και ανιχνεύθηκε με ένα Ab που δημιουργήθηκε έναντι του CD40L ποντικού σε όλες τις συγκεντρώσεις (Σχήμα 5). Οι μη επικαλυμμένοι έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν παράλληλα και ήταν αρνητικοί για CD40L σε ELISA. Μετρήσαμε τη συνολική ισχύ του συμπλέγματος αντιγόνου-αντισώματος παρουσία 6Μ ουρίας [41] . Η απληστία του CD40L αρουραίου βαμβακιού για το αντίσωμα CD40L κατά ποντικού μειώθηκε παρουσία 6Μ ουρίας σε όλες τις συγκεντρώσεις. Σαφώς, καθώς το αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε αναπτύχθηκε κατά του CD40L ποντικού, το crCD40L ανιχνεύεται από το CD40L ποντικού. Το crCD40L εκφράστηκε σε ιό δαμαλίτιδας και καθαρίστηκε από μολυσμένο κυτταρόλυμα ΒΗΚ21 σε στήλη νικελίου. Η καθαρισμένη πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε με ELISA χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα ποντικού έναντι του CD40L με τρόπο εξαρτώμενο από τη βαθμίδα συγκέντρωσης. Η απληστία του αντισώματος CD40L ποντικού στην πρωτεΐνη CD40L αρουραίου βαμβακιού αξιολογήθηκε παρουσία 6Μ ουρίας. Η διαφορά μεταξύ της μη επεξεργασμένης ουρίας και της ουρίας 6Μ που υποβλήθηκε σε αγωγή για κάθε ομάδα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμή t Student ÃÃÃ p<0,001, ÃÃÃÃ p<0,0001 (n = 2). Τα δεδομένα που εμφανίζονται είναι ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα τριών χωριστών πειραμάτων όπου διεξάγονται δύο (n = 2) τεχνικές επαναλήψεις σε κάθε πείραμα. Οι αρνητικοί μάρτυρες χωρίς επίστρωση και χωρίς πρωτεύον αντίσωμα έδωσαν μέσες τιμές OD 0,56 και 0,107 αντίστοιχα. Δεδομένου ότι η αλληλουχία πρωτεΐνης CD40L αρουραίου βαμβακιού μοιράστηκε 82% ταυτότητα με την αλληλουχία πρωτεΐνης CD40L ποντικού με παρόμοιες λειτουργικές περιοχές, αξιολογήσαμε τη βιολογική δραστηριότητα του ανασυνδυασμένου crCD40L σε ανώριμα DCs μυελού των οστών ποντικού. Πραγματοποιήσαμε πειράματα βασισμένα σε γνωστές λειτουργικές δραστηριότητες του CD40L σε άλλα ζωικά είδη. Συγκεκριμένα, η ωρίμανση των ανώριμων DC μετά την έκθεση σε αντιγόνο είναι γνωστό ότι παίζει κρίσιμο ρόλο στη λειτουργία διέγερσης της ανοσίας [36] , ενώ το τριμερές ανασυνδυασμένο CD40L έχει αποδειχθεί ότι διεγείρει τις ανοσοτροποποιητικές λειτουργίες του DC [42] . Όταν το CD40L εμπλέκει το CD40 στην επιφάνεια των DCs, προάγει την παραγωγή κυτοκίνης, την επαγωγή συν-διεγερτικών μορίων κυτταρικής επιφάνειας και διευκολύνει τη διασταυρούμενη παρουσίαση του αντιγόνου από αυτά τα κύτταρα [27] . Επιπλέον, το CD11c είναι δείκτης ιντεγκρίνης DC και κατά τη διέγερση ρυθμίζεται προς τα κάτω [43]. Ο δείκτης ενδοκυτταρικής προσκόλλησης CD54, μαζί με τους συνδιεγερτικούς δείκτες CD40, CD80 και CD86 ρυθμίζονται προς τα πάνω κατά τη διέγερση με CD40L [44, 45]. Επιπλέον, το κύριο σύμπλεγμα ιστοσυμβατότητας I-A d ποντικού ρυθμίζεται επίσης προς τα πάνω κατά τη διέγερση με CD40L [45] . Όταν το ανασυνδυασμένο crCD40L χρησιμοποιήθηκε για τη διέγερση ανώριμων DC μυελού των οστών ποντικού, παρατηρήσαμε παρόμοια αποτελέσματα με αυτά όταν χρησιμοποιείται CD40L ποντικού (Πίνακες 1 και 2). Το CD11c ρυθμίστηκε προς τα κάτω τόσο στη μέση ένταση φθορισμού (Πίνακας 1) όσο και στο ποσοστό των θετικών κυττάρων (Πίνακας 2). Τα συν-διεγερτικά μόρια CD54, CD40, CD80 και CD86 ρυθμίστηκαν όλα προς τα πάνω τόσο στη μέση ένταση φθορισμού (Πίνακας 1) όσο και στο ποσοστό των θετικών κυττάρων (Πίνακας 2). Το κύριο σύμπλεγμα ιστοσυμβατότητας ποντικού I-A d ρυθμίστηκε προς τα πάνω στη μέση ένταση φθορισμού (Πίνακας 1) αλλά δεν ρυθμίστηκε προς τα πάνω ως προς το συνολικό ποσοστό των θετικών κυττάρων (Πίνακας 2). Υποθέτουμε ότι αυτό οφείλεται στην ασυμβατότητα του είδους, καθώς διεγείρουμε κύτταρα μυελού των οστών ποντικού με CD40L αρουραίου βαμβακιού. Ωστόσο, το crCD40L μπόρεσε να προωθήσει τη ρύθμιση προς τα πάνω των βασικών συνδιεγερτικών δεικτών σε ανώριμα DC που προάγουν την ωρίμανση DC. Η στρατηγική πύλης που χρησιμοποιείται για την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής παρέχεται στο Σχήμα S3 μαζί με επικαλυπτόμενα ιστογράμματα του δείκτη ενδοκυτταρικής προσκόλλησης και συνδιεγερτικούς δείκτες. Η επαγόμενη από το CD40 ενεργοποίηση της έκφρασης του γονιδίου της κυτοκίνης σε DCs από το CD40L είναι μια σημαντική διαδικασία στην έναρξη των πρωτογενών ανοσολογικών αποκρίσεων και είναι κρίσιμη για την ωρίμανση DC και τη δημιουργία αντιγονοειδικών αποκρίσεων Τ κυττάρων [46] . Η IL-6 είναι μια υψηλά πλειοτροπική κυτοκίνη στο ότι διεγείρει την ενεργοποίηση, τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των Τ κυττάρων και επιπλέον τροποποιεί τη λειτουργία και την επιβίωση του DC [47] [48] [49] [50] . Δοκιμάσαμε εάν το ανασυνδυασμένο crCD40L θα μπορούσε να προκαλέσει έκφραση γονιδίου IL-6 (Εικ. 6a) και παραγωγή της κυτοκίνης (Εικ. 6b) από ανώριμα DCs μυελού των οστών ποντικού. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι μια σημαντική αύξηση τόσο στην έκφραση του γονιδίου IL-6 όσο και στην παραγωγή κυτοκίνης σε ανώριμα DC μυελού των οστών ποντικού παρατηρήθηκε σαράντα ώρες μετά τη διέγερση με το crCD40L. Συλλογικά, η παρατήρηση ότι τόσο η ρύθμιση προς τα πάνω των ανώριμων δεικτών ωρίμανσης της επιφάνειας των κυττάρων DC όσο και η αυξημένη έκφραση του γονιδίου IL-6 και η παραγωγή κυτοκίνης παρέχουν ισχυρές ενδείξεις για τη βιολογική δραστηριότητα του crCD40L. Συνοπτικά, το cDNA CD40L αρουραίου βαμβακιού που απομονώσαμε ήταν ένα νουκλεοτίδιο 1104 αλληλουχία με μια ουρά πολυ-Α που περιέχει ένα ORF 783 bp που κωδικοποιούσε μια πρωτεΐνη 260 aa. Το CD40L του ανασυνδυασμένου αρουραίου βαμβακιού αναγνωρίστηκε από ένα Ab έναντι του CD40L ποντικού σε απευθείας ELISA και έδειξε βιολογική δραστηριότητα με αυξημένη ρύθμιση των δεικτών ωρίμανσης (CD40, CD54, CD80 και CD86) καθώς και I-A d σε ανώριμα DCs μυελού των οστών και επιπλέον, επαγωγή Ρύθμιση προς τα πάνω του γονιδίου IL-6 και της έκφρασης κυτοκίνης σε αυτά τα κύτταρα. Η απομόνωση της ακολουθίας CD40L αρουραίου βαμβακιού και η διαθεσιμότητα του CD40L έχει τη δυνατότητα να επηρεάσει θετικά τη βασική ανοσολογική έρευνα και την ανάπτυξη εμβολίων, δεδομένης της κρίσιμης σημασίας αυτής της πρωτεΐνης στην ενορχήστρωση των ανοσολογικών αποκρίσεων. 51, 52].", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 4517, "text": "μια σάντουιτς εξωκυτταρική δομή που αποτελείται από ένα β-φύλλο, έναν βρόχο α-έλικα και ένα β-φύλλο" } ], "id": 1632, "question": "Ποια είναι η δομή του CD40 Ligand;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5206, "text": "προάγει την παραγωγή κυτοκίνης, την επαγωγή συνδιεγερτικών μορίων κυτταρικής επιφάνειας και διευκολύνει τη διασταυρούμενη παρουσίαση του αντιγόνου από αυτά τα κύτταρα" } ], "id": 1633, "question": "Ποια είναι η επίδραση του CD40L στα δενδριτικά κύτταρα;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Βιοπληροφορική ανάλυση του γονιδιώματος του ιού της αιμορραγικής νόσου κουνελιούhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3377956/SHA: eff26d8739498efca2d32fe2e66cdbebf0569c50Authorias Li, Bao-yu; Zhang, Liang; Jiao, Wen-qiang; Liu, Ji-xingΗμερομηνία: 2011-11-01DOI: 10.1186/1743-422x-8-494Άδεια: cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Ο ιός της αιμορραγικής νόσου του κουνελιού (RHDV), ως η παθογένεια του Rabbit, η οποία προκαλεί υψηλή λοιμώδη αιμορραγία συχνά θανατηφόρα ασθένεια που προσβάλλει μόνο άγρια ​​και οικόσιτα κουνέλια. Πρόσφατες έρευνες αποκάλυψαν ότι, ως ένας αριθμός των Caliciviridae, έχει κάποιες ειδικότητες στο γονιδίωμά του, στην αναπαραγωγή του και ούτω καθεξής. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Σε αυτήν την έκθεση, αναλύσαμε αρχικά το γονιδίωμά του και δύο ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (ORF) από αυτήν την πτυχή της μεροληψίας χρήσης κωδικονίων. Οι έρευνές μας έδειξαν ότι η πίεση μετάλλαξης και όχι η φυσική είναι ο πιο σημαντικός καθοριστικός παράγοντας στον RHDV με υψηλή μεροληψία κωδικονίου και η μεροληψία χρήσης κωδικονίου είναι σχεδόν αντίθετη μεταξύ των ORF1 και ORF2, που είναι ίσως ένας από τους παράγοντες που ρυθμίζουν την έκφραση του VP60 (κωδικοποιείται από ORF1). και VP10 (κωδικοποίηση από ORF2). Επιπλέον, οι αρνητικοί εκλεκτικοί περιορισμοί στο συνολικό γονιδίωμα του RHDV υποδήλωναν ότι το VP10 έπαιξε σημαντικό ρόλο στον κύκλο ζωής του RHDV. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Υποθέσαμε ότι το VP10 μπορεί να είναι ωφέλιμο για την αντιγραφή, την απελευθέρωση ή και τα δύο του ιού προκαλώντας την έναρξη της απόπτωσης μολυσμένων κυττάρων με RHDV. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ανάλυσης κύριου συστατικού για το ORF2 του RSCU, πρώτα διαχωρίσαμε 30 RHDV σε δύο γονότυπους και οι τιμές ENC που υποδεικνύουν ότι το ORF1 και το ORF2 ήταν ανεξάρτητες μεταξύ της εξέλιξης του RHDV. Κείμενο: Τα συνώνυμα κωδικόνια δεν χρησιμοποιούνται τυχαία [1] . Η διακύμανση της χρήσης κωδικονίων μεταξύ των ORF σε διαφορετικούς οργανισμούς υπολογίζεται από την πίεση μετάλλαξης και την επιλογή μετάφρασης ως δύο κύριους παράγοντες [2, 3]. Τα επίπεδα και οι αιτίες της μεροληψίας χρήσης κωδικονίων είναι διαθέσιμα για την κατανόηση της εξέλιξης του ιού και της αλληλεπίδρασης μεταξύ των ιών και της ανοσολογικής απόκρισης [4] . Έτσι, πολλοί οργανισμοί όπως βακτήρια, ζυμομύκητες, Drosophila και θηλαστικά, έχουν μελετηθεί με μεγάλη λεπτομέρεια σχετικά με την προκατάληψη χρήσης κωδικονίων και τη σύνθεση νουκλεοτιδίων [5] . Ωστόσο, οι ίδιες έρευνες σε ιούς, ειδικά σε ζωικούς ιούς, έχουν μελετηθεί λιγότερο. Έχει παρατηρηθεί ότι η μεροληψία χρήσης κωδικονίων σε ιούς ανθρώπινου RNA σχετίζεται με την πίεση μετάλλαξης, το περιεχόμενο G +C, την τμηματοποιημένη φύση του γονιδιώματος και την οδό μετάδοσης του ιού [6] . Για ορισμένους ιούς DNA σπονδυλωτών, η πίεση μετάλλαξης σε ολόκληρο το γονιδίωμα θεωρείται ως ο κύριος καθοριστικός παράγοντας της χρήσης κωδικονίων και όχι η φυσική επιλογή για συγκεκριμένες τρίδυμες κωδικοποίησης [4] . Η ανάλυση των όψιμων γονιδίων του ιού θηλώματος βοοειδών τύπου 1 (BPV1) αποκάλυψε μια σχέση μεταξύ της χρήσης κωδικονίων και της διαθεσιμότητας tRNA [7] . Στους ιούς των θηλαστικών θηλαστικών, έχει προταθεί ότι οι διαφορές από τις μέσες συχνότητες χρήσης κωδικονίων στο γονιδίωμα του ξενιστή επηρεάζουν έντονα τόσο την ιική αντιγραφή όσο και την έκφραση γονιδίων [8] . Η χρήση κωδικονίων μπορεί να διαδραματίσει βασικό ρόλο στη ρύθμιση της λανθάνουσας έναντι της παραγωγικής μόλυνσης στον ιό Epstein-Barr [9] . Πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι η χρήση κωδικονίων είναι μια σημαντική κινητήρια δύναμη στην εξέλιξη των αστροϊών και των μικρών ιών DNA [10, 11] . Σαφώς, οι μελέτες της χρήσης συνώνυμων κωδικονίων σε ιούς μπορούν να αποκαλύψουν πολλά για τη μοριακή εξέλιξη των ιών ή των μεμονωμένων γονιδίων. Τέτοιες πληροφορίες θα ήταν χρήσιμες για την κατανόηση της ρύθμισης της έκφρασης των ιικών γονιδίων. Μέχρι τώρα, έχει πραγματοποιηθεί μικρή ανάλυση χρήσης κωδικονίων στον ιό της αιμορραγικής νόσου των κουνελιών (RHDV), ο οποίος είναι το παθογόνο που προκαλεί την αιμορραγική νόσο του κουνελιού (RHD), επίσης γνωστή ως κουνέλι νόσος καλυκοϊού (RCD) ή ιογενής αιμορραγική νόσος (VHD), μια εξαιρετικά μολυσματική και συχνά θανατηφόρα ασθένεια που προσβάλλει άγρια ​​και οικόσιτα κουνέλια. Αν και ο ιός μολύνει μόνο τα κουνέλια, η RHD συνεχίζει να προκαλεί σοβαρά προβλήματα σε διάφορα μέρη του κόσμου. Ο RHDV είναι ένας μονόκλωνος θετικός ιός RNA χωρίς φάκελο, ο οποίος περιέχει δύο ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (ORFs) που κωδικοποιούν ξεχωριστά μια προβλεπόμενη πολυπρωτεΐνη και μια δευτερεύουσα δομική πρωτεΐνη που ονομάζεται VP10 [12] . Μετά την υδρόλυση της αυτοκωδικοποιούμενης κυστεϊνάσης τύπου 3C, η πολυπρωτεΐνη τελικά υδρολύθηκε σε 8 προϊόντα διάσπασης συμπεριλαμβανομένων 7 μη δομικών πρωτεϊνών και 1 δομικής πρωτεΐνης που ονομάζεται VP60 [13, 14]. Μελέτες σχετικά με τη φυλογενετική σχέση των RHDV έδειξαν ότι είχε απομονωθεί μόνο ένας ορότυπος και δεν αναφέρθηκε γονότυπος για RHDV. Ανέφερε ότι το VP10 μεταφράστηκε με απόδοση 20% του προηγούμενου ORF1 [15] . Προκειμένου να κατανοήσουμε καλύτερα τα χαρακτηριστικά του γονιδιώματος RHDV και να αποκαλύψουμε περισσότερες πληροφορίες σχετικά με το γονιδίωμα του ιού, αναλύσαμε τη χρήση κωδικονίων και τη σύνθεση δινουκλεοτιδίων. Σε αυτήν την έκθεση, επιδιώξαμε να αντιμετωπίσουμε τα ακόλουθα ζητήματα σχετικά με τη χρήση κωδικονίων σε RHDV: (i) την έκταση και τις αιτίες της μεροληψίας κωδικονίων σε RHDV. (ii) Ένας πιθανός προσδιορισμός γονότυπου του RHDV. (iii) Προκατάληψη χρήσης κωδικονίου ως παράγοντας που μειώνει την έκφραση του VP10 και (iii) την εξέλιξη των ORF. Οι 30 διαθέσιμες πλήρεις αλληλουχίες RNA του RHDV ελήφθησαν από την GenBank τυχαία τον Ιανουάριο του 2011. Ο σειριακός αριθμός (SN), οι ημερομηνίες συλλογής, οι απομονωμένες περιοχές και οι αριθμοί προσχώρησης GenBank παρατίθενται στον Πίνακα 1. Για τη διερεύνηση των χαρακτηριστικών της χρήσης συνωνύμων κωδικονίων χωρίς την επίδραση της σύνθεσης αμινοξέων, υπολογίστηκαν οι τιμές RSCU κάθε κωδικονίου σε ένα ORF του RHDV σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές (2 Sharp, Tuohy et al. 1986) ως ο ακόλουθος τύπος: Όπου g ij είναι ο παρατηρούμενος αριθμός του ιου κωδικονίου για το jο αμινοξύ που έχει τύπο n i συνώνυμων κωδικονίων. Τα κωδικόνια με τιμή RSCU υψηλότερη από 1,0 έχουν θετική μεροληψία χρήσης κωδικονίων, ενώ τα κωδικόνια με τιμή μικρότερη από 1,0 έχουν σχετική αρνητική προκατάληψη χρήσης κωδικονίων. Καθώς οι τιμές RSCU ορισμένων κωδικονίων είναι σχεδόν ίσες με 1,0, σημαίνει ότι αυτά τα κωδικόνια επιλέγονται εξίσου και τυχαία. Ο δείκτης GC3s σημαίνει το κλάσμα των νουκλεοτιδίων G+C στη συνώνυμη τρίτη θέση κωδικονίου, εξαιρουμένων των Met, Trp και του τερματισμού κωδικόνια. Ο ENC, ως ο καλύτερος εκτιμητής της απόλυτης μεροληψίας χρήσης κωδικονίου [16] , υπολογίστηκε για την ποσοτικοποίηση της μεροληψίας χρήσης κωδικονίου κάθε ORF [17] . Οι προβλεπόμενες τιμές του ENC υπολογίστηκαν ως ENC = 2 + s + 29 όπου το s αντιπροσωπεύει τη δεδομένη τιμή (G+C) 3 %. Οι τιμές του ENC μπορούν επίσης να ληφθούν με το πρόγραμμα EMBOSS CHIPS [18] . Διεξήχθησαν αναλύσεις με το μοντέλο Nei-Gojobori [19] , που περιελάμβανε 30 αλληλουχίες νουκλεοτιδίων. Όλες οι θέσεις που περιείχαν κενά και λείπουν δεδομένα εξαλείφθηκαν. Οι τιμές των dn, ds και ω (dn/ds) υπολογίστηκαν σε MEGA4.0 [20] .Πολυμεταβλητή στατιστική ανάλυση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διερεύνηση των σχέσεων μεταξύ μεταβλητών και δειγμάτων. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήθηκε ανάλυση αντιστοιχίας για τη διερεύνηση της κύριας τάσης στη διακύμανση της χρήσης κωδικονίων μεταξύ των ORF. Σε αυτή τη μελέτη, η πλήρης περιοχή κωδικοποίησης κάθε ORF αναπαρίσταται ως ένα διάνυσμα 59 διαστάσεων και κάθε διάσταση αντιστοιχεί στην τιμή RSCU ενός κωδικονίου αίσθησης (εξαιρουμένων των κωδικονίων Met, Trp και τερματισμού) [21] .Χρησιμοποιήθηκε ανάλυση συσχέτισης για τον προσδιορισμό της σχέσης μεταξύ της σύνθεσης νουκλεοτιδίων και του προτύπου χρήσης συνωνύμων κωδικονίων [22] . Αυτή η ανάλυση εφαρμόστηκε με βάση τον τρόπο ανάλυσης συσχέτισης κατάταξης του Spearman. Όλες οι στατιστικές διεργασίες πραγματοποιήθηκαν με στατιστικό λογισμικό SPSS 17.0 για windows. Οι τιμές των περιεχομένων νουκλεοτιδίων στην πλήρη κωδικοποιητική περιοχή και των 30 γονιδιωμάτων RHDV αναλύθηκαν και καταγράφηκαν στον Πίνακα 2 και στον Πίνακα 3. Προφανώς, η περιεκτικότητα σε (C+G)% του ORF1 κυμάνθηκε από 50,889 έως 51,557 με μέση τιμή 51,14557, και η περιεκτικότητα σε (C+G)% του ORF2 κυμαινόταν από 35,593 έως 40,113 με μέση τιμή 324,6 που ήταν 37,6. υποδεικνύοντας ότι τα νουκλεοτίδια Α και U ήταν τα κύρια στοιχεία του ORF2 έναντι του ORF1. Συγκρίνοντας τις τιμές του A 3 %, U 3 %, C 3 % και G 3 %, είναι σαφές ότι το C 3 % ήταν σαφώς υψηλό και το A 3 % ήταν το χαμηλότερο όλων στο ORF1 του RHDV, ενώ το U 3 % ήταν σαφώς υψηλό και το C 3 % ήταν το χαμηλότερο από όλα στο ORF2 του Πίνακα 2 Προσδιορίστηκαν περιεχόμενα νουκλεοτιδίων σε πλήρη κωδικοποιητική περιοχή (μήκος > 250 bps) στο γονιδίωμα ORF1 του RHDV (30 απομονώσεις) Πίνακας 4 . Τα περισσότερα κατά προτίμηση χρησιμοποιούμενα κωδικόνια στο ORF1 ήταν κωδικόνια με άκρο C ή G εκτός από τα Ala, Pro και Ser, ωστόσο, τα κωδικόνια με άκρο Α ή G προτιμήθηκαν ως το περιεχόμενο του ORF2. Επιπλέον, οι τιμές dn, ds και ω(dN/dS) του ORF1 ήταν ξεχωριστά 0,014, 0,338 και 0,041, και οι τιμές του ORF2 ήταν 0,034, 0,103 και 0,034, αντίστοιχα. Οι τιμές ω δύο ORF στο γονιδίωμα RHDV είναι γενικά χαμηλές, υποδεικνύοντας ότι ολόκληρο το γονιδίωμα RHDV υπόκειται σε σχετικά ισχυρούς εκλεκτικούς περιορισμούς. Χρησιμοποιήθηκε COA για τη διερεύνηση της κύριας τάσης στη διακύμανση της χρήσης κωδικονίων μεταξύ δύο ORF και των 30 RHDV που επιλέχθηκαν για αυτήν τη μελέτη . Μετά το COA για το γονιδίωμα RHDV, μια σημαντική τάση στον πρώτο άξονα (f' 1 ) που αντιπροσώπευε το 42,967% της συνολικής διακύμανσης και μια άλλη σημαντική τάση στον δεύτερο άξονα (f' 2 ) που αντιπροσώπευε το 3,632% της συνολικής διακύμανσης . Η συντεταγμένη της πλήρους περιοχής κωδικοποίησης κάθε ORF σχεδιάστηκε στο Σχήμα 1 που ορίζεται από τον πρώτο και τον δεύτερο κύριο άξονα. Είναι σαφές ότι η συντεταγμένη κάθε ORF είναι σχετικά απομονωμένη. Είναι ενδιαφέρον ότι διαπιστώσαμε ότι σχετικά μεμονωμένες κηλίδες από το ORF2 τείνουν να συγκεντρώνονται σε δύο ομάδες: η τεταγμένη τιμή μιας ομάδας (που σημειώνεται ως Ομάδα 1) είναι να εκτιμηθεί εάν η εξέλιξη του γονιδιώματος RHDV στη χρήση κωδικονίων ρυθμίστηκε από την πίεση μετάλλαξης ή τη φυσική επιλογή. το A%, U%, C%, G% και (C+G)% συγκρίθηκαν με A 3 %, U 3 %, C 3 %, G 3 % και (C 3 +G 3 )%, αντίστοιχα (Πίνακας 5). Υπάρχει μια πολύπλοκη συσχέτιση μεταξύ των συνθέσεων νουκλεοτιδίων. Αναλυτικά, το A 3 %, U 3 %, C 3 % και G 3 % έχουν σημαντική αρνητική συσχέτιση με G%, C%, U% και A% και θετική συσχέτιση με A%, U%, C% και G% , αντίστοιχα. Υποδηλώνει ότι ο περιορισμός των νουκλεοτιδίων μπορεί να επηρεάσει τα πρότυπα χρήσης συνώνυμων κωδικονίων. Ωστόσο, το A 3% έχει μη συσχέτιση με το U% και το C%, και το U 3% έχει μη συσχέτιση με το A% και το G%, αντίστοιχα, τα οποία δεν έχουν υποδείξει καμία ιδιαιτερότητα σχετικά με τη χρήση συνωνύμων κωδικονίων. Επιπλέον, το C 3 % και το G 3 % δεν έχουν συσχετισμό με το A%, G% και U%, C%, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι αυτά τα δεδομένα δεν αντικατοπτρίζουν επίσης το πραγματικό χαρακτηριστικό της χρήσης συνώνυμων κωδικονίων. Ως εκ τούτου, εφαρμόστηκε ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης για την ανάλυση της συσχέτισης μεταξύ της μεροληψίας χρήσης συνώνυμων κωδικονίων και των συνθέσεων νουκλεοτιδίων. Λεπτομέρειες της ανάλυσης συσχέτισης μεταξύ των δύο πρώτων βασικών αξόνων (f' 1 και f' 2) κάθε γονιδιώματος RHDV σε COA και περιεχόμενα νουκλεοτιδίων παρατίθενται στον Πίνακα 6. Με έκπληξη, μόνο οι τιμές f2 σχετίζονται στενά με το περιεχόμενο των βασικών νουκλεοτιδίων Α και G μόνο στην τρίτη θέση κωδικονίου, υποδηλώνοντας ότι τα νουκλεοτίδια Α και G είναι ένας παράγοντας που επηρεάζει το συνώνυμο μοτίβο χρήσης κωδικονίων του γονιδιώματος RHDV. Ωστόσο, η τιμή f' 1 δεν έχει συσχετισμό με τα περιεχόμενα νουκλεοτιδίων βάσης στην τρίτη θέση κωδικονίου. παρατηρείται ότι τα πρότυπα χρήσης κωδικονίων στον RHDV πιθανότατα επηρεάστηκαν από άλλους παράγοντες, όπως η δεύτερη δομή του ιικού γονιδιώματος και τα όρια του ξενιστή. Παρόλα αυτά, ο περιορισμός σύνθεσης είναι ένας παράγοντας που διαμορφώνει το πρότυπο της χρήσης συνώνυμων κωδικονίων στο γονιδίωμα RHDV. Σχήμα 1 Ένα διάγραμμα τιμής του πρώτου και του δεύτερου άξονα του γονιδιώματος RHDV σε COA. Ο πρώτος άξονας (στ' 1 ) αντιπροσωπεύει το 42,967% της συνολικής διακύμανσης και ο δεύτερος άξονας (στ' 2 ) αντιστοιχεί στο 3,632% της συνολικής διακύμανσης. Πίνακας 5 Σύνοψη της ανάλυσης συσχέτισης μεταξύ των περιεχομένων A, U, C, G και των περιεχομένων A 3 , U 3 , C 3 , G 3 σε όλα τα επιλεγμένα δείγματα Υπήρχαν όλο και περισσότερα χαρακτηριστικά που είναι μοναδικά για το RHDV στην οικογένεια Caliciviridae, συμπεριλαμβανομένου του τροπισμού του μεμονωμένου ξενιστή, του γονιδιώματός του και του VP10 του ως δομικής πρωτεΐνης με άγνωστη λειτουργία. Αφού αναλύσαμε τη χρήση συνωνύμων κωδικονίων στο RHDV (Πίνακας 2), καταλήξαμε στη συνέχεια αρκετά συμπεράσματα και εικασίες. 4.1 Μεταλλακτική προκατάληψη ως κύριος παράγοντας που οδηγεί σε παραλλαγή χρήσης συνωνύμων κωδικονίων Το ENC-plot, ως γενική στρατηγική, χρησιμοποιήθηκε για τη διερεύνηση προτύπων συνώνυμη χρήση κωδικονίων. Τα γραφικά ENC των ORF που περιορίζονται μόνο από μια σύνθεση C 3 + G 3 θα βρίσκονται πάνω ή ακριβώς κάτω από την καμπύλη των προβλεπόμενων τιμών [18] . Οι τιμές ENC των γονιδιωμάτων RHDV σχεδιάστηκαν έναντι του αντίστοιχου (C3+G3) %. Όλες οι κηλίδες βρίσκονται κάτω από την καμπύλη των προβλεπόμενων τιμών, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, υποδηλώνοντας ότι η μεροληψία χρήσης κωδικονίου σε όλα αυτά τα 30 γονιδιώματα RHDV επηρεάζεται κυρίως από τη μεταλλακτική προκατάληψη. Όπως γνωρίζουμε, η αποτελεσματικότητα της γονιδιακής έκφρασης επηρεάζεται από ακολουθίες ή στοιχεία ρυθμιστή και μεροληψία χρήσης κωδικονίων. Ανέφερε ότι η αλληλουχία RNA των 3 τερματικών 84 νουκλεοτιδίων του ORF1 βρέθηκε ότι είναι κρίσιμη για την έκφραση VP10 αντί του κωδικοποιημένου πεπτιδίου. Το VP10 που κωδικοποιεί το ORF2 έχει αναφερθεί ως χαμηλή εκφραστική δομική πρωτεΐνη έναντι του VP60 που κωδικοποιεί το ORF1 [5]. Και η αποτελεσματικότητά του στη μετάφραση είναι μόνο 20% του VP60. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που φαίνονται από τον Πίνακα 4, αποκάλυψε τις διαφορές στα πρότυπα χρήσης κωδικονίων δύο ORF, που είναι ένας πιθανός παράγοντας που μειώνει την έκφραση του VP10. Αν και το VP10 που κωδικοποιείται από το ORF2, ως δευτερεύουσα δομική πρωτεΐνη με άγνωστες λειτουργίες, έχει περιγραφεί από Η LIU ως ​​μη απαραίτητη πρωτεΐνη για τη μολυσματικότητα του ιού, ο ω Σχήμα 2 Ο αποτελεσματικός αριθμός κωδικονίων που χρησιμοποιούνται σε κάθε ORF σχεδιάστηκε έναντι των GC3. Η συνεχής καμπύλη απεικονίζει τη σχέση μεταξύ GC3 και ENC απουσία επιλογής. Όλες οι κηλίδες βρίσκονται κάτω από την αναμενόμενη καμπύλη. Η τιμή του ORF2 υποδηλώνει ότι το VP10 παίζει σημαντικό ρόλο στο συγκεκριμένο στάδιο ολόκληρου του κύκλου ζωής του RHDV. Μετά από συνδυασμό με χαμηλή έκφραση και τιμή ω του VP10, υποθέσαμε ότι το VP10 μπορεί να είναι ωφέλιμο για την αντιγραφή, την απελευθέρωση ή και τα δύο του ιού προκαλώντας έναρξη απόπτωσης μολυσμένων κυττάρων από RHDV. Αυτός ο μηχανισμός έχει επιβεβαιωθεί σε διάφορους ιούς RNA θετικής αλυσίδας, συμπεριλαμβανομένου του ιού coxsackie, του ιού του δάγγειου πυρετού, του αρτηριοϊού των ιπποειδών, του ιού του αφθώδους πυρετού, του ιού της ηπατίτιδας C, του ιού της πολιομυελίτιδας, του ρινοϊού και του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] , αν και οι λεπτομέρειες παραμένουν ασαφείς. Όπως και στην προηγούμενη περιγραφή, το ENC αντικατοπτρίζει την εξέλιξη της παραλλαγής χρήσης κωδικονίων και της σύνθεσης νουκλεοτιδίων σε κάποιο βαθμό. Μετά την ανάλυση συσχέτισης των τιμών ENC μεταξύ ORF1 και ORF2 (Πίνακας 7), ο σχετικός συντελεστής των τιμών ENC δύο ORF είναι 0,230 και η τιμή p είναι 0,222 μεγαλύτερη από 0,05. Αυτά τα δεδομένα αποκάλυψαν ότι δεν υπήρχε συσχέτιση στις τιμές ENC δύο ORF, υποδεικνύοντας ότι τα πρότυπα χρήσης κωδικονίων και η εξέλιξη δύο ORF διαχωρίζονται μεταξύ τους. Επιπλέον, αυτές οι πληροφορίες ίσως μας βοηθήσουν να καταλάβουμε γιατί το RSCU και το ENC μεταξύ δύο ORF είναι αρκετά διαφορετικά. Είναι ενδιαφέρον ότι διαπιστώσαμε ότι σχετικά μεμονωμένα σημεία από το ORF2 τείνουν να συγκεντρώνονται σε δύο ομάδες: η τεταγμένη τιμή μιας ομάδας (που σημειώνεται ως Ομάδα 1) είναι θετική τιμή και η άλλη (επισημασμένη ως Ομάδα 2) είναι αρνητική τιμή. Και όλα αυτά τα στελέχη που απομονώθηκαν πριν από το 2000 ανήκαν στην Ομάδα 2, συμπεριλαμβανομένων των Italy-90, RHDV-V351, RHDV-FRG, BS89, RHDV-SD και M67473.1. Αν και ο RHDV έχει αναφερθεί ως μόνο ένας τύπος, αυτό μπορεί να είναι μια αναφορά για τη διαίρεση σε δύο γονότυπους. Σε αυτήν την αναφορά, αναλύσαμε αρχικά το γονιδίωμά του και δύο ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (ORF) από αυτήν την πτυχή της μεροληψίας χρήσης κωδικονίων. Οι έρευνές μας έδειξαν ότι η πίεση μετάλλαξης και όχι η φυσική είναι ο πιο σημαντικός καθοριστικός παράγοντας στον RHDV με υψηλή μεροληψία κωδικονίου και η μεροληψία χρήσης κωδικονίου είναι σχεδόν αντίθετη μεταξύ των ORF1 και ORF2, που είναι ίσως ένας από τους παράγοντες που ρυθμίζουν την έκφραση του VP60 (κωδικοποιείται από ORF1). και VP10 (κωδικοποίηση από ORF2). Επιπλέον, οι αρνητικοί εκλεκτικοί περιορισμοί στο συνολικό γονιδίωμα του RHDV υποδήλωναν ότι το VP10 έπαιξε σημαντικό ρόλο στον κύκλο ζωής του RHDV. Υποθέσαμε ότι το VP10 μπορεί να είναι ωφέλιμο για την αντιγραφή, την απελευθέρωση ή και τα δύο του ιού προκαλώντας απόπτωση μολυσμένων κυττάρων που ξεκινά από RHDV. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ανάλυσης του κύριου συστατικού για το ORF2 του RSCU, πρώτα διαχωρίσαμε 30 RHDV σε δύο γονότυπους και οι τιμές ENC έδειξαν ότι το ORF1 και το ORF2 ήταν ανεξάρτητες μεταξύ της εξέλιξης του RHDV. Όλα τα αποτελέσματα θα καθοδηγήσουν τις επόμενες έρευνες για το RHDV ως αναφορά.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 3135, "text": "τις μέσες συχνότητες χρήσης κωδικονίων στο γονιδίωμα του ξενιστή" } ], "id": 567, "question": "Ποιος παράγοντας μπορεί να επηρεάσει την αντιγραφή του ιού και τη γονιδιακή έκφραση;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Παχυσαρκία και κίνδυνος λοιμώξεων της αναπνευστικής οδού: αποτελέσματα μιας μελέτης κοόρτης που βασίζεται σε ημερολόγιο λοιμώξεωνhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5819164/SHA: ee0c318d282c0089cca94f0b2ea4d9fcioniscioniaut2; Weber, Susanne; Elgizouli, Magdeldin; Stoehlker, Anne-Sophie; Geist, Ilona; Peter, Hans-Hartmut; Vach, Werner; Nieters, Alexandra Ημερομηνία: 2018-02-20DOI: 10.1186/s12889-018-5172-8Άδεια: cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Οι λοιμώξεις της αναπνευστικής οδού (RTIs) είναι ένας σημαντικός παράγοντας νοσηρότητας που συμβάλλει σε μεγάλο βαθμό στο κόστος της ατομικής φροντίδας υγείας. Ο στόχος της μελέτης ήταν να ελεγχθεί εάν η παχυσαρκία (ΔΜΣ ≥ 30 kg/m(2)) είναι ένας από τους παράγοντες κινδύνου που υποκρύπτουν συχνές RTI στον γερμανικό ενήλικο πληθυσμό. ΜΕΘΟΔΟΙ: Επιστρατεύσαμε 1455 άτομα ηλικίας μεταξύ 18 και 70 ετών από μια συγχρονική έρευνα για τις λοιμώξεις των αεραγωγών στη Γερμανία και τα προσκαλέσαμε να αναφέρουν μόνοι τους τα περιστατικά RTIs ημερολογίων που αντιμετώπισαν κατά τη διάρκεια τριών διαδοχικών περιόδων χειμώνα/άνοιξη. Οι RTI που αναφέρθηκαν σε αυτούς τους 18 μήνες και τα συνοπτικά μέτρα που αθροίζουν μεμονωμένες RTI ήταν τα αποτελέσματα ενδιαφέροντος. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Σε σύγκριση με άτομα με κανονικό βάρος, τα παχύσαρκα άτομα ανέφεραν σταθερά υψηλότερη συχνότητα ανώτερων και κατώτερων RTIs και κατά κύριο λόγο έπεσαν στην ανώτερη ομάδα 10% ενός ημερολογίου αθροίζοντας 10 διαφορετικά συμπτώματα RTI με την πάροδο του χρόνου. Η παχυσαρκία συσχετίστηκε τόσο με χαμηλότερο RTIs ((προσαρμοσμένο)OR = 2,02, 95%CI = 1,36-3,00) όσο και με ανώτερο RTIs ((προσαρμοσμένο)OR = 1,55, 95%CI = 1,22-1,96). Η προσαρμογή για δημογραφικές μεταβλητές και μεταβλητές του τρόπου ζωής επηρέασε οριακά μόνο τις OR. Οι στρωματοποιημένες αναλύσεις πρότειναν μια ισχυρότερη συσχέτιση για τις γυναίκες και επηρεάζουν τροποποιήσεις από την αθλητική δραστηριότητα και τις διατροφικές συνήθειες. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Επιβεβαιώνουμε τη συσχέτιση της παχυσαρκίας με το φορτίο μόλυνσης και παρουσιάζουμε στοιχεία για πιθανή αλληλεπίδραση με την αθλητική δραστηριότητα και τα διατροφικά πρότυπα. ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ: Η ηλεκτρονική έκδοση αυτού του άρθρου (10.1186/s12889-018-5172-8) περιέχει συμπληρωματικό υλικό, το οποίο είναι διαθέσιμο σε εξουσιοδοτημένους χρήστες. Κείμενο: Συχνές και σοβαρές λοιμώξεις του αναπνευστικού συστήματος (RTIs) αποτελούν σημαντικό παράγοντα νοσηρότητάς μας κοινωνία και σημαντική επιβάρυνση κόστους όσον αφορά την ιατρική περίθαλψη και τον χρόνο απώλειας εργασίας [1, 2] . Οι RTIs χωρίζονται σε ανώτερες RTIs (URTIs) που περιλαμβάνουν κοινό κρυολόγημα, φαρυγγίτιδα, ωτίτιδα, ιγμορίτιδα, λαρυγγοτραχειίτιδα, επιγλωττίτιδα και κατώτερο RTIs (LRTIs) συμπεριλαμβανομένης της βρογχίτιδας, της πνευμονίας και της βρογχιολίτιδας [3] . Η ατομική έκθεση σε μολυσματικούς παράγοντες και παράγοντες ξενιστή όπως το κάπνισμα [4, 5] και η κατάσταση της βιταμίνης D [6, 7] πιστεύεται ότι συμβάλλει στις παρατηρούμενες διαφορές στον κίνδυνο RTI. Επιπλέον, ο ρόλος του υπερβολικού βάρους (Δείκτης Μάζας Σώματος (ΔΜΣ) = 25,0-29,9 kg/m 2 ) και ειδικότερα της παχυσαρκίας (ΔΜΣ ≥ 30 kg/m 2 ) στην προδιάθεση για RTIs συζητείται όλο και περισσότερο [8] [9] [ 10] [11] [12] [13] . Αυτό το αυξανόμενο ενδιαφέρον καθοδηγείται από τον αυξανόμενο αριθμό υπέρβαρων και παχύσαρκων ατόμων παγκοσμίως [14] και την αναδυόμενη γνώση για αξιοσημείωτες ανοσολογικές ανισορροπίες σε σχέση με την παχυσαρκία [15] . Οι περισσότερες από τις μελέτες που στοχεύουν σε ενήλικες διερεύνησαν τη συσχέτιση της παχυσαρκίας με συγκεκριμένες RTIs και τα αποτελέσματά τους. Έτσι, η παχυσαρκία συσχετίστηκε με μη αλλεργική ρινίτιδα [8] και παρόμοια ασθένεια της γρίπης [9] . Επιπλέον, δύο πληθυσμιακές μελέτες που διερεύνησαν τον ρόλο της παχυσαρκίας ως παράγοντα κινδύνου για την επίκτητη πνευμονία στην κοινότητα (CAP) στο γενικό πληθυσμό κατέληξαν σε αμφιλεγόμενα ευρήματα [10, 11]. Δύο πρόσφατες μελέτες με βάση τον πληθυσμό της Δανίας ανέφεραν περίσσεια μεγάλου φάσματος RTIs συμπεριλαμβανομένης της πνευμονίας μεταξύ παχύσαρκων ατόμων [12, 13]. Ο γενικός στόχος της μελέτης μας που στοχεύει τον ενήλικο πληθυσμό στο South Baden της Γερμανίας είναι να εντοπίσει τους παράγοντες κινδύνου για την ευαισθησία σε RTIs. Εδώ παρουσιάζουμε δεδομένα σχετικά με τον ρόλο της παχυσαρκίας ως παράγοντα που συμβάλλει σε υψηλή επιβάρυνση RTI στη γερμανική κοινωνία και διερευνούμε την τροποποίηση της επίδρασης ανά φύλο, αθλητική δραστηριότητα και διατροφικά πρότυπα. Οι συμμετέχοντες στη μελέτη (n = 1455) στρατολογήθηκαν από την ευαισθησία στη μόλυνση των αεραγωγών (AWIS ) συγχρονική μελέτη που διερευνά το φορτίο RTI σε ενήλικο πληθυσμό στο South-Baden, Γερμανία [16] . Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από κοινοτικούς αξιωματούχους και την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Φράιμπουργκ (Αρ. Οχι. 258/11_120365). Με βάση τη βαθμολογία ιστορικού RTI άτομα υποτιθέμενου χαμηλού, μεσαίου και υψηλού κινδύνου μελλοντικών RTI προσκλήθηκαν στην πραγματική υποκοόρτη. Η βαθμολογία ιστορικού RTI συνοψίζει πληροφορίες σχετικά με τη συχνότητα και τη σοβαρότητα των RTI και τη χρήση αντιβιοτικών τα τελευταία δύο χρόνια, την αυτοεκτιμημένη ευαισθησία σε RTI και την εμφάνιση επιλεγμένων σοβαρών λοιμώξεων [16] . Ζητήθηκε από τους συμμετέχοντες στη μελέτη να συμπληρώσουν ένα επιπλέον ερωτηματολόγιο (βασικό ερωτηματολόγιο) σχετικά με παράγοντες τρόπου ζωής και συννοσηρότητες και να συμπληρώσουν μηνιαία ημερολόγια που καταγράφουν τη μηνιαία εμφάνιση και τη διάρκεια (< 2 εβδομάδες, > 2 εβδομάδες) των RTIs, δηλαδή ιγμορίτιδα, ρινίτιδα , μέση ωτίτιδα, φαρυγγίτιδα/λαρυγγίτιδα, αμυγδαλίτιδα, γριππώδης νόσος, βρογχίτιδα, πνευμονία, πλευρίτιδα και άλλες οξείες RTI, από τις αρχές Νοεμβρίου έως τα τέλη Απριλίου τριών εποχών: 2012/13, 2013/14 και 2014/15 . Επιπλέον, διερευνήθηκαν η λήψη αντιβιοτικών, οι επισκέψεις σε γιατρό, η νοσηλεία για RTI και η επίδραση των συμπτωμάτων της RTI στις καθημερινές τους δραστηριότητες. Περαιτέρω λεπτομέρειες πρόσληψης στη μελέτη AWIS και στην παρούσα υποκοόρτη παρουσιάζονται στα Πρόσθετα αρχεία 1 και 2. Ελήφθη ενημερωμένη συγκατάθεση από όλους τους μεμονωμένους συμμετέχοντες που συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. Για να περιγραφεί η συσχέτιση μεταξύ παχυσαρκίας και RTI, ελήφθησαν υπόψη διαφορετικοί δείκτες έκβασης: αποτελέσματα σε επίπεδο κάθε μήνα [\"οποιαδήποτε RTI\", \"οποιαδήποτε URTI\" (ιγμορίτιδα, ρινίτιδα, μέση ωτίτιδα, φαρυγγίτιδα/λαρυγγίτιδα και αμυγδαλίτιδα), \"οποιαδήποτε LRTI\" (βρογχίτιδα, πνευμονία και πλευρίτιδα), \"≥3 RTIs\", \"οποιαδήποτε μακροχρόνια λοίμωξη\" (> 2 εβδομάδες)]. σε επίπεδο κάθε χειμερινής περιόδου (\"≥4 μήνες με λοιμώξεις\", \"≥3 μακροχρόνιες λοιμώξεις\")· και σε ατομικό επίπεδο (δηλ. ορίζονται μία φορά ανά άτομο και καλύπτουν τη συνολική περίοδο σπουδών). Οι δέκα συγκεκριμένες κατηγορίες συμπτωμάτων RTI λήφθηκαν υπόψη με τους δυαδικούς δείκτες συμπτωμάτων \"λοίμωξη αναφέρθηκε\" ή \"δεν αναφέρθηκε μόλυνση\" για κάθε μήνα. Κατά την καταμέτρηση των επεισοδίων για τον δείκτη έκβασης \"≥3 μακροχρόνιες λοιμώξεις\", διαφορετικά συμπτώματα μόλυνσης μετρήθηκαν ως ξεχωριστά επεισόδια, ακόμα κι αν επικαλύπτονταν χρονικά. Ωστόσο, μέσα σε μία κατηγορία συμπτωμάτων, τουλάχιστον ένας μήνας χωρίς αυτή τη συγκεκριμένη λοίμωξη χρειάστηκε να χαρακτηριστεί νέο επεισόδιο. Υπολογίσαμε επίσης μια μηνιαία βαθμολογία RTI ημερολογίου, υπολογίζοντας κατά μέσο όρο τις δέκα κατηγορίες συμπτωμάτων RTI με κωδικοποίηση \"0\" για \"δεν αναφέρθηκε μόλυνση\", \"1\" για \"αναφερθείσα λοίμωξη με διάρκεια < 2 εβδομάδες\" και \"2\" για \"αναφερθείσα μόλυνση παρουσιάζεται με διάρκεια >2 εβδομάδες». Οι τιμές που λείπουν για μεμονωμένα στοιχεία μόλυνσης αντιμετωπίστηκαν ως μηδέν. Εάν αναφέρθηκε ένα μεμονωμένο σύμπτωμα RTI, αλλά έλειπαν πληροφορίες σχετικά με τη διάρκεια, μετρήθηκε ως \"αναφερθείσα λοίμωξη με διάρκεια < 2 εβδομάδες\". Εάν έλειπαν όλα τα στοιχεία, δεν υπολογίστηκε βαθμολογία ημερολογίου. Η βαθμολογία RTI του ημερολογίου σε μηνιαίο επίπεδο επεκτάθηκε σε μια βαθμολογία σε εποχικό επίπεδο με τον μέσο όρο των έξι μηνών (Νοέμβριος-Απρίλιος) κάθε σεζόν και σε μια συνολική βαθμολογία σε ατομικό επίπεδο, λαμβάνοντας μέσο όρο για όλους τους διαθέσιμους μήνες. Το αντίστοιχο ανώτερο 10% αυτών των βαθμολογιών ημερολογίου μέσα σε κάθε μήνα, εποχή και συνολικά χρησίμευσε ως πρόσθετοι δείκτες έκβασης. Άλλες μεταβλητές που εξετάστηκαν στη μελέτη ήταν η ηλικία, το φύλο, το αυτοαναφερόμενο βάρος και το ύψος για τον υπολογισμό του ΔΜΣ (ΔΜΣ κατηγοριοποιήθηκε ως < 30 ( μη παχύσαρκοι), 25 ≤ ΔΜΣ < 30 (υπέρβαρος) και ≥30 (παχύσαρκος)), μορφωτικό επίπεδο, επαφή με παιδιά, συννοσηρότητες, αφαίρεση ανοσολογικών οργάνων, κατάσταση καπνίσματος, αθλητική δραστηριότητα και διατροφικά πρότυπα πρόσληψης. Λεπτομέρειες σχετικά με αυτές τις μεταβλητές περιγράφονται στο Πρόσθετο αρχείο 1 και συμπληρωματικές πληροφορίες σχετικά με τα πρότυπα διατροφικής πρόσληψης παρουσιάζονται στο Πρόσθετο αρχείο 3. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Stata (έκδοση 14 STATSCorp, ΗΠΑ). Περιγραφικά στατιστικά στοιχεία: Οι μηνιαίοι επιπολασμοί μεμονωμένων συμπτωμάτων RTI υπολογίστηκαν λαμβάνοντας τον μέσο όρο όλων των υποκειμένων που είναι διαθέσιμα κάθε μήνα και στη συνέχεια υπολογίζοντας τον μέσο όρο για όλους τους 18 μήνες που καλύπτονται. Οι επιπολασμοί σε εποχικό επίπεδο υπολογίστηκαν αναλόγως με μέσο όρο και για τις τρεις καλυπτόμενες εποχές. Τα αντίστοιχα διαστήματα εμπιστοσύνης (CIs) και οι τιμές p βασίζονται σε ένα γενικευμένο γραμμικό μοντέλο με σύνδεση ταυτότητας και διακύμανση διωνυμικού τύπου μαζί με ισχυρές εκτιμήσεις διακύμανσης. Η συχνότητα των μακροχρόνιων λοιμώξεων μεταξύ όλων των μηνών με λοιμώξεις αναλύθηκε ανάλογα. Ωστόσο, λόγω του περιορισμένου αριθμού περιπτώσεων αμυγδαλίτιδας και μέσης ωτίτιδας, προσδιορίσαμε τη μηνιαία συχνότητα των μακροχρόνιων λοιμώξεων συγκεντρώνοντας τα δεδομένα για όλες τις εποχές και για την πνευμονία συγκεντρώνοντας όλους τους υποδεικνυόμενους μήνες. μοντέλο παλινδρόμησης με μια τυχαία τομή που εφαρμόζεται στα μεμονωμένα δεδομένα για κάθε μήνα λαμβάνοντας υπόψη τους 18 μήνες ως κατηγορική συμμεταβλητή επιπλέον του δείκτη κατάστασης παχυσαρκίας. Λόγω του μικρού επιπολασμού της, η πλευρίτιδα δεν θεωρήθηκε ως μεμονωμένη έκβαση σε αυτές τις αναλύσεις. Τα αποτελέσματα σε εποχικό επίπεδο αναλύθηκαν ανάλογα με τα επιμέρους δεδομένα για κάθε χειμερινή περίοδο και λαμβάνοντας υπόψη τις τρεις εποχές ως κατηγορική συμμεταβλητή. Τα αποτελέσματα σε ατομικό επίπεδο αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης. Τα αποτελέσματα είναι OR και 95% CI. Οι προσαρμοσμένες ΕΑΠ βασίζονται στη συμπερίληψη ηλικιακών ομάδων και εκπαίδευσης ως ταυτόχρονων κατηγορικών συμμεταβλητών. Επιπλέον, προκειμένου να μελετηθεί η σταθερότητα της συσχέτισης παχυσαρκίας-RTI σε σχέση με πιθανούς συγχυτές, τα OR προσαρμόστηκαν με αντίστοιχες μεταβλητές. Υποκείμενα με ελλιπή δεδομένα συμμεταβλητών εξαιρέθηκαν από πολυμεταβλητές αναλύσεις. Η τροποποίηση του αποτελέσματος από μια δυαδική μεταβλητή αξιολογήθηκε με την προσαρμογή ενός συνολικού μοντέλου με τις αντίστοιχες αλληλεπιδράσεις παραμετροποιημένες έτσι ώστε να μπορούμε να διαβάσουμε απευθείας τις δύο ειδικές OR για υποομάδες. Η τροποποίηση της επίδρασης από την αθλητική δραστηριότητα και τα πρότυπα διατροφής διερευνήθηκε μεταξύ αυτών που αντιπροσώπευαν το χαμηλότερο και το ανώτερο τρίτο των αντίστοιχων βαθμολογιών. Ο πληθυσμός της μελέτης περιελάμβανε 1455 άτομα (931 γυναίκες και 524 άνδρες) με διάμεση ηλικία τα 51,08 έτη. Με βάση τον ΔΜΣ που υπολογίστηκε από το βάρος και το ύψος που αναφέρθηκαν από τους ίδιους, το 2,1% του πληθυσμού ήταν λιποβαρές (ΔΜΣ < 18,5 kg/m 2), το 54% είχε φυσιολογικό βάρος (18,5 kg/m 2 ≤ ΔΜΣ < 25 kg/m 2 ) , το 31,1% ήταν υπέρβαρο και το 12,8% θεωρήθηκε παχύσαρκο (Πίνακας 1). Στις γυναίκες, η κατανομή ήταν 2,8%, 60,21%, 25,0% και 12,1% και στους άνδρες 0,76%, 43,1%, 41,8% και 14,3% αντίστοιχα. Οι συμμετέχοντες στη μελέτη ήταν κυρίως μεσαίου και υψηλού μορφωτικού επιπέδου, μη ή πρώην καπνιστές, μετρίως επηρεασμένοι από επιλεγμένες συννοσηρότητες και ανέφεραν μάλλον σπάνια επαφή με μικρά παιδιά. Περισσότερες πληροφορίες για τον πληθυσμό της μελέτης και τα συμπληρωμένα ημερολόγια αναφέρονται στον Πίνακα 1 και στο Πρόσθετο αρχείο 4. Τα ποσοστά που λείπουν μεμονωμένα στοιχεία στα επιστρεφόμενα ημερολόγια ήταν περιορισμένα και κυμαίνονταν από 1,2% για τη ρινίτιδα και τη φαρυγγίτιδα/λαρυγγίτιδα έως 2,6% για άλλες οξείες αναπνευστικές λοιμώξεις. Οι συμμετέχοντες στη μελέτη ανέφεραν συχνότερα ρινίτιδα (26,6%), ακολουθούμενη από γριππώδη νόσο (11,4%) και φαρυγγίτιδα/λαρυγγίτιδα (10,5%), ενώ σπάνια εμφανίστηκε πλευρίτιδα (0,10%). Οποιοδήποτε URTI (31,5%) ήταν συχνότερο από οποιοδήποτε LRTI (7,9%). Εκτός από τους LRTIs βρογχίτιδα, πνευμονία και πλευρίτιδα, που ανέφεραν περισσότεροι άνδρες από γυναίκες, όλες οι άλλες RTI ήταν πιο διαδεδομένες στις γυναίκες (Πίνακας 2). Τα εποχικά μοτίβα των αναφερόμενων λοιμώξεων δείχνουν μια κορύφωση τον Φεβρουάριο για δύο από τις τρεις περιόδους μόλυνσης που αξιολογήθηκαν (2012/13 και 2014/15, βλ. Πρόσθετο αρχείο 5). Οι λοιμώξεις του αναπνευστικού με υψηλό κλάσμα μακράς διάρκειας ήταν σχεδόν αποκλειστικά LRTIs, δηλαδή πνευμονία (59%), ακολουθούμενη από βρογχίτιδα (48,2%). Οι άνδρες υπερεκπροσωπούνταν μεταξύ εκείνων με μακροχρόνιες RTIs (Πίνακας 2). Σε σύγκριση με άτομα φυσιολογικού βάρους, τα υπέρβαρα και παχύσαρκα άτομα είχαν σταθερά υψηλότερο επιπολασμό (Πίνακας 3) για τα μεμονωμένα RTIs, URTIs, LRTIs, καθώς και τις άλλες παραμέτρους έκβασης εξετάσαμε με άλλες οξείες λοιμώξεις και πνευμονία ως εξαιρέσεις. Για την πνευμονία, μόνο τα παχύσαρκα άτομα είχαν υψηλότερο επιπολασμό. Η υπέρβαρη ομάδα συνήθως έπεφτε ανάμεσα στις ομάδες με φυσιολογικό βάρος και παχυσαρκία (Πίνακας 3). Η ισχυρότερη συσχέτιση παρατηρήθηκε για την πνευμονία και τη βρογχίτιδα, και κατά συνέπεια, κάθε LRTI συσχετίστηκε ισχυρότερα με την παχυσαρκία από οποιοδήποτε URTI. Οι μακροχρόνιες RTIs, οι συχνές RTIs και οι υψηλές βαθμολογίες στο ημερολόγιο συσχετίστηκαν επίσης πιο έντονα με την παχυσαρκία από τα μεμονωμένα συμπτώματα. Οι προσαρμογές ανά ηλικία και εκπαίδευση άλλαξαν οριακά μόνο αυτές τις εκτιμήσεις. Μεταξύ των ατόμων με λοίμωξη, οι μακροχρόνιες λοιμώξεις συσχετίστηκαν και πάλι με την παχυσαρκία, φθάνοντας σε σημασία για οποιαδήποτε RTI, ρινίτιδα, φαρυγγίτιδα/λαρυγγίτιδα, ασθένεια παρόμοια με γρίπη και βρογχίτιδα (Πίνακας 3). Για καλύτερη κατανόηση της ευρωστίας της σχέσης μεταξύ Επιβάρυνση RTI και παχυσαρκία, διερευνήθηκε η επίδραση της προσαρμογής για πιθανούς συγχυτές (Επιπλέον αρχείο 6). Οι δημογραφικές μεταβλητές και οι μεταβλητές του τρόπου ζωής που μελετήθηκαν (ηλικία, φύλο, μορφωτικό επίπεδο, κατάσταση καπνίσματος, επαφή με παιδιά, άσθμα, αθλητική δραστηριότητα, διατροφικά πρότυπα και προηγούμενη αφαίρεση των οργάνων του ανοσοποιητικού) επηρέασαν οριακά μόνο τις ΕΑΠ. Ωστόσο, η προσαρμογή για το άσθμα, τη χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (ΧΑΠ) ή μια συνοπτική βαθμολογία που καλύπτει όλες τις ερωτούμενες συννοσηρότητες αποδυνάμωσε σημαντικά τη σχέση μεταξύ της παχυσαρκίας και όλων των εκβάσεων. Η προσαρμογή για τα επίπεδα βιταμίνης D μεταξύ εκείνων για τα οποία ήταν διαθέσιμος ορός (n = 508), είχε μόνο μια μικρή επίδραση στο μέγεθος της συσχέτισης μεταξύ της παχυσαρκίας και των αποτελεσμάτων RTI. Η συσχέτιση μεταξύ της παχυσαρκίας και των αποτελεσμάτων RTI ήταν πιο εμφανής για τις γυναίκες παρά για τους άνδρες και έφτασε σε στατιστική σημασία μόνο για το πρώτο (Πίνακας 4). Για τα περισσότερα αποτελέσματα αυτή η αλληλεπίδραση δεν ήταν σημαντική, με εξαίρεση τη βαθμολογία ημερολογίου σε ατομικό επίπεδο. Κατά την εξέταση της αθλητικής δραστηριότητας, για τα περισσότερα αποτελέσματα η συσχέτιση με την παχυσαρκία περιοριζόταν σε εκείνους που είναι σωματικά πιο δραστήριοι και δεν παρατηρήθηκε για εκείνους που ανέφεραν μικρή αθλητική δραστηριότητα (Πίνακας 5). Για όλα τα αποτελέσματα, η συσχέτιση ήταν λιγότερο έντονη στην τελευταία ομάδα (συγκρίνετε τις αναλογίες των OR στον Πίνακα 5), μια διαφορά που ήταν σημαντική για όλα τα αποτελέσματα εκτός από εκείνα με χαμηλό επιπολασμό. Τυπικά, ο επιπολασμός ενός αποτελέσματος ήταν αυξημένος μόνο στη μικρή ομάδα των ατόμων με παχυσαρκία και υψηλότερη αθλητική δραστηριότητα, ενώ όλες οι άλλες ομάδες παρουσίαζαν μάλλον παρόμοια πρότυπα. Ομοίως, ο επιπολασμός των αποτελεσμάτων ήταν αυξημένος μεταξύ των ατόμων με παχυσαρκία και ένα πιο ευνοϊκό διατροφικό πρότυπο, αλλά συγκρίσιμο μεταξύ των άλλων ομάδων (Πίνακας 6). Η αλληλεπίδραση αποκτά σημασία για την πλειονότητα των αποτελεσμάτων. Οι RTI αποτελούν σημαντικό παράγοντα νοσηρότητας λαμβάνοντας υπόψη το υψηλό κόστος υγειονομικής περίθαλψης, τον χρόνο που χάνεται από την εργασία και τη μειωμένη ποιότητα ζωής μεταξύ εκείνων που επηρεάζονται επανειλημμένα [1, 2, 17] . Η παχυσαρκία ανήκει σε έναν από τους παράγοντες κινδύνου ξενιστή για RTI και έχει πιθανώς έναν αναδυόμενο ρόλο λόγω του δραματικά αυξανόμενου επιπολασμού της παχυσαρκίας παγκοσμίως. Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε τη συσχέτιση της παχυσαρκίας με μεμονωμένες RTIs καθώς και με μια βαθμολογία ημερολογίου που συνοψίζει τα διάφορα περιστατικά RTI συμπτώματα σε μια περίοδο 18 μηνών. Η έρευνά μας θα μπορούσε να καταδείξει μια συσχέτιση μεταξύ της παχυσαρκίας και των RTI που επιβεβαιώνουν προηγούμενα ευρήματα για ασθένειες που μοιάζουν με γρίπη [9] , βρογχίτιδα [18] και πνευμονία [10, 12] . Είδαμε επίσης μια συσχέτιση μεταξύ της παχυσαρκίας και της ρινίτιδας, της ιγμορίτιδας και της φαρυγγίτιδας/λαρυγγίτιδας. Ένας αυξημένος κίνδυνος για ιγμορίτιδα μεταξύ των παχύσαρκων αναφέρθηκε επίσης σε μια πληθυσμιακή ομάδα Δανών γυναικών [13]. Καμία από τις δύο μελέτες με βάση τον πληθυσμό της Δανίας [12, 13] δεν χρησιμοποίησε OR μηνιαίας επικράτησης, αλλά αναλογίες κινδύνου (HRs), καθώς μπορούσαν να προσδιορίσουν γεγονότα σε καθημερινή βάση. Το HR 1,6 [12] για τη συσχέτιση με RTIs και το HR του 1,48 [13] για τη συσχέτιση με URTIs είναι, ωστόσο, παρόμοιου μεγέθους με τις εκτιμήσεις κινδύνου που παρατηρήσαμε. Μηχανιστικά, η υπερβολική παχυσαρκία μπορεί να επιβαρύνει την άμυνα του ξενιστή, όπως έχουν προτείνει αρκετές μελέτες σε ποντίκια και ανθρώπους [19, 20]. Οι συσχετίσεις που παρατηρήθηκαν εδώ ήταν πιο εμφανείς για τους LRTI σε σύγκριση με τις URTI, αλλά εμφανείς και για τις δύο, και πιο έντονες όταν εξετάζονται μακροχρόνιες ή συχνές RTIs σε σύγκριση με μεμονωμένα συμπτώματα. Με βάση τα δεδομένα του ημερολογίου μόλυνσης, δημιουργήσαμε μια βαθμολογία ημερολογίου RTI που συνοψίζει και τα δέκα συμπτώματα και επιτρέπει τον μέσο όρο ανά μήνα, ανά ολόκληρη σεζόν ή για ολόκληρη την περίοδο των τριών ετών. Λαμβάνοντας υπόψη το ανώτερο δέκατο εκατοστημόριο της κατανομής τέτοιων βαθμολογιών ως αποτέλεσμα, οι συσχετίσεις ήταν συνήθως ισχυρότερες από ό,τι όταν εξετάζονταν μεμονωμένα συμπτώματα και οι αλληλεπιδράσεις ήταν πιο έντονες. Επιπλέον, τα αποτελέσματα της εποχικής βαθμολογίας ήταν πολύ παρόμοια ή και ισχυρότερα από εκείνα της βαθμολογίας των τριών ετών, υποστηρίζοντας την επάρκεια να διερευνηθούν μολυσματικά συμβάντα έξι μηνών σε μελλοντικές μελέτες για τον εντοπισμό της επιρρεπούς σε μόλυνση υποομάδα του πληθυσμού. Οι συνήθειες του τρόπου ζωής φαίνεται να συμβάλλουν στον κίνδυνο ενός ατόμου για RTI. Μεταξύ αυτών, το κάπνισμα έχει αναφερθεί ως κύριος περιβαλλοντικός παράγοντας κινδύνου για υποτροπιάζουσες και σοβαρές RTI [4, 5] . Η συχνή επαφή με μικρά παιδιά [21, 22], η ανεπάρκεια βιταμίνης D [23, 24] και η έλλειψη σωματικής δραστηριότητας [25, 26] αποτελούν άλλες εκθέσεις που σχετίζονται με αυξημένους κινδύνους RTI. Επιπλέον, τα υψηλότερα επίπεδα εκπαίδευσης συσχετίστηκαν με χαμηλότερο κίνδυνο ΚΑΠ [27] . Με βάση αυτά τα προηγούμενα ευρήματα, διερευνήσαμε τον ρόλο τους ως πιθανοί συγχυτικοί παράγοντες. Η συσχέτιση μεταξύ παχυσαρκίας και RTI παρέμεινε σχεδόν αμετάβλητη μετά την προσαρμογή για την ηλικία, το φύλο, την εκπαιδευτική κατάσταση, την επαφή με τα παιδιά, την κατάσταση καπνίσματος, την αθλητική δραστηριότητα και τις βαθμολογίες διατροφής, υποδηλώνοντας ότι η συσχέτιση δεν συγχέεται σημαντικά από τις επιδράσεις αυτών των παραγόντων τόσο στο ΔΜΣ όσο και τον κίνδυνο λοιμώξεων. Επίσης, η πρόσθετη προσαρμογή με τη μετρούμενη βιταμίνη D ορού σε μια υποομάδα για την οποία υπήρχαν διαθέσιμες μετρήσεις δεν άλλαξε σημαντικά τις εκτιμήσεις κινδύνου. Αυτό υποστηρίζει τα επιχειρήματα ότι οι παρατηρούμενες συσχετίσεις μεταξύ παχυσαρκίας και επιβάρυνσης RTI οφείλονται σε φυσιολογικές διαφορές στην ανοσολογική ανταπόκριση μεταξύ παχύσαρκων και μη παχύσαρκων ατόμων παρά σε διαφορές στον τρόπο ζωής. Επιπλέον, ορισμένες χρόνιες ασθένειες, κυρίως το άσθμα και η ΧΑΠ, σχετίζονται τόσο με αυξημένο κίνδυνο RTIs όσο και με παχυσαρκία [28] [29] [30] [31] [32] . Λαμβάνοντας υπόψη αυτές τις συσχετίσεις, διερευνήσαμε την επίδραση του άσθματος, της ΧΑΠ και της βαθμολογίας συννοσηρότητας που συνοψίζει τις άλλες χρόνιες παθήσεις στη σχέση μεταξύ της παχυσαρκίας και των μεμονωμένων RTIs και της βαθμολογίας του ημερολογίου RTI. Η προσαρμογή αυτών των συνθηκών μεμονωμένα και ακόμη περισσότερο με συνδυασμένο τρόπο είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική εξασθένηση της συσχέτισης μεταξύ της παχυσαρκίας και των θεωρούμενων αποτελεσμάτων RTI. Ως εκ τούτου, μέρος της συσχέτισης μεταξύ λοιμώξεων και παχυσαρκίας μπορεί να εξηγηθεί από συσχετίσεις συννοσηροτήτων και με τα δύο. Βλέπουμε διαφορά φύλου στις παρατηρούμενες συσχετίσεις με πιο αισθητά ευρήματα για τις γυναίκες. Ένας σημαντικά αυξημένος κίνδυνος για συνδυασμένες RTIs περιοριζόταν επίσης σε γυναίκες σε μια ομάδα δανών αιμοδοτών [12] . Αρκετές γραμμές έρευνας υποστηρίζουν αυτήν την ιδέα: Szabova et al. και Ilavska et al. ανέφεραν εξαρτώμενες από το φύλο επιδράσεις της παχυσαρκίας στο ανοσοποιητικό σύστημα [33, 34]. Η επίδραση του ΔΜΣ σε μια ποικιλία παραμέτρων του ανοσοποιητικού, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που σχετίζονται με την ανοσολογική άμυνα ήταν πολύ πιο εμφανής στις γυναίκες παρά στους άνδρες [34]. Τα κύτταρα ΝΚ (CD3-/CD16+/CD56+), αντιπροσωπεύουν κύτταρα πρώτης γραμμής για την εκκαθάριση κυττάρων μολυσμένων από ιό. Τα μειωμένα επίπεδα αυτών των κυττάρων που αναφέρθηκαν για τις παχύσαρκες γυναίκες, αλλά όχι για τους αντίστοιχους άνδρες, μπορεί να αποτελούν τη βάση της επίδρασης του φύλου που παρατηρήθηκε στη μελέτη μας. Ερευνήσαμε επίσης μια πιθανή τροποποίηση επίδρασης από την αθλητική δραστηριότητα και τη διατροφή. Είναι ενδιαφέρον ότι η συσχέτιση μεταξύ παχυσαρκίας και RTI ήταν εμφανής μόνο για τα παχύσαρκα άτομα που ανέφεραν υψηλότερο επίπεδο αθλητικής δραστηριότητας. Έτσι, μόνο η ομάδα των παχύσαρκων ατόμων που ασχολούνταν με πιο εντατική αθλητική δραστηριότητα ανέφερε συχνότερα RTI ενώ τα παχύσαρκα άτομα με χαμηλή αθλητική δραστηριότητα και τα μη παχύσαρκα με χαμηλή ή υψηλή αθλητική δραστηριότητα παρουσίασαν συγκρίσιμο χαμηλότερο επιπολασμό για τα περισσότερα αποτελέσματα. Υποθέτουμε ότι το οξειδωτικό στρες που προκαλείται από έντονη αερόβια καθώς και αναερόβια αθλητική δραστηριότητα επιδεινώνεται σε άτομα με παχυσαρκία, αλλά όχι σε άτομα φυσιολογικού βάρους. Στοιχεία που το υποστηρίζουν έχουν δημοσιευτεί στο παρελθόν [35] . Μια μη ισορροπημένη κατάσταση οξειδωτικού στρες μπορεί να έχει αρνητικές συνέπειες στην ανάπτυξη μιας κατάλληλης ανοσολογικής απόκρισης έναντι των παθογόνων του αναπνευστικού. Τα υπερβολικά δραστικά είδη οξυγόνου (ROS) αποδείχθηκαν ότι εμποδίζουν τις αποκρίσεις των Τ κυττάρων στην ιογενή λοίμωξη [36] και η συσσώρευση ROS ανιχνεύθηκε σε τελεστικά Τ κύτταρα με έλλειψη αυτοφαγίας, καθιστώντας τα ανίκανα να ελέγξουν τις ιογενείς λοιμώξεις [37] . Ένα παρόμοιο εκπληκτικό αποτέλεσμα βρέθηκε όταν μελέτη της τροποποίησης του αποτελέσματος από διατροφικά πρότυπα. Εδώ ρωτήσαμε τις διατροφικές συνήθειες των συμμετεχόντων και τις ταξινομήσαμε ως τηρώντας ένα πιο ευνοϊκό ή πιο δυσμενές διατροφικό πρότυπο σύμφωνα με τους Winkler et al. [38] . Έχοντας επίγνωση των περιορισμών μιας εφάπαξ αξιολόγησης μιας συνήθους διατροφής, βρήκαμε μια πιο έντονη σχέση μεταξύ παχυσαρκίας και λοιμώξεων μεταξύ παχύσαρκων ατόμων που ανέφεραν μια φαινομενικά πιο υγιεινή διατροφή. Έτσι, και πάλι μόνο η ομάδα των παχύσαρκων ατόμων που υποτίθεται ότι τρώνε πιο υγιεινή διατροφή εμφάνισε αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης RTI. Τίθεται το ερώτημα εάν η εσφαλμένη αναφορά διατροφικών συνηθειών μεταξύ αυτών των ατόμων με και χωρίς RTI μπορεί να εξηγήσει το παζλ. Κάποιος μπορεί να φανταστεί ότι τα παχύσαρκα άτομα μπορεί να έχουν αυξημένη αντίληψη για τα συμπτώματα που σχετίζονται με RTI που αντιμετωπίζουν την αντίφαση μεταξύ ενός υγιεινού τρόπου ζωής και του ότι επηρεάζονται από το υπερβολικό βάρος και τις συχνές λοιμώξεις. Από την άλλη πλευρά, τα δυσδιάκριτα αποτελέσματα από τον μη παχύσαρκο πληθυσμό σε σχέση με το ευνοϊκό και δυσμενές πρότυπο διατροφής θα μπορούσαν κάπως να αντιταχθούν σε αυτήν την εξήγηση. Εναλλακτικά, μεταξύ της ομάδας των ατόμων με παχυσαρκία μπορεί να υπάρχει μια γενετικά καθορισμένη υποομάδα που προδιαθέτει τόσο για το υπερβολικό σωματικό βάρος όσο και για την τάση για λοιμώξεις. Ως δυνατά σημεία της μελέτης μας μετράμε 1) το μέγεθος του δείγματός της, επιτρέποντας την ανάλυση της τροποποίησης της επίδρασης, 2) ο μελλοντικός σχεδιασμός του που περιλαμβάνει ημερολόγια μόλυνσης 18 μηνών για τη διερεύνηση της σχέσης μεταξύ του ΔΜΣ και της επακόλουθης συχνότητας και σοβαρότητας RTI, 3) τις περιεκτικές πληροφορίες για τον τρόπο ζωής και τις συννοσηρότητες που επιτρέπουν τη μελέτη της αλληλεπίδρασης τέτοιων παραγόντων στην επίδρασή τους στις λοιμώξεις και 4 ) το ευρύ φάσμα δεικτών αποτελέσματος που εξετάζονται. Η ομοιομορφία των αποτελεσμάτων σε σχέση με αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνει επίσης ότι στον τομέα της νοσηρότητας των λοιμώξεων των αεραγωγών, οι μελέτες μπορεί να είναι συγκρίσιμες παρά το γεγονός ότι συχνά επικεντρώνονται σε διαφορετικά αποτελέσματα RTI. Σύμφωνα με την πλειονότητα των επιδημιολογικών μελετών σε αυτόν τον τομέα έρευνας, η μελέτη μας υποφέρει από ορισμένους περιορισμούς, συμπεριλαμβανομένης της εξάρτησης από τα αυτοαναφερόμενα αποτελέσματα και τα δεδομένα έκθεσης με τον κίνδυνο εσφαλμένης ταξινόμησης. Ωστόσο, βρήκαμε -για παράδειγμα- μια καλή συμφωνία μεταξύ του ΔΜΣ που προέρχεται από δεδομένα βάρους και ύψους που αναφέρθηκαν μόνοι σας και του ΔΜΣ που υπολογίστηκε από τις μετρημένες τιμές που είναι διαθέσιμες για μια υποκοόρτη (n = 508). Επιπλέον, η διαφορική εσφαλμένη ταξινόμηση που θα μεροληπτούσε ουσιαστικά τη σχέση μεταξύ παχυσαρκίας και RTI είναι μάλλον απροσδόκητη σε αυτό το πλαίσιο. Η δυσανάλογη επιλογή των γυναικών στη μελέτη μπορεί να επηρεάσει αρνητικά τη γενίκευση ορισμένων από τα αποτελέσματά μας.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 2596, "text": "κοινό κρυολόγημα, φαρυγγίτιδα, ωτίτιδα, ιγμορίτιδα, λαρυγγοτραχειίτιδα, επιγλωττίτιδα" } ], "id": 328, "question": "Ποιες καταστάσεις θεωρούνται λοιμώξεις του ανώτερου αναπνευστικού συστήματος;" }, { "answers": [ { "answer_start": 21736, "text": "κύτταρα ΝΚ (CD3-/CD16+/CD56+)" } ], "id": 330, "question": "Ποια κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος συμμετέχουν κυρίως στην εξάλειψη των μολυσμένων από τον ιό κυττάρων;" }, { "answers": [ { "answer_start": 23067, "text": "υπερβολικά δραστικά είδη οξυγόνου (ROS)" } ], "id": 331, "question": "Ποια μόρια έχει αποδειχθεί ότι εμποδίζουν τις αποκρίσεις των Τ κυττάρων σε ιογενείς λοιμώξεις;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "A Global Champion for Health—WHO's Next?https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4924837/SHA: f2f9088055600d4160e36db5cb6ea000916390a3Authors: nanDate: 2016-06-28DOI: 10.1371/journal.pmed.1002059License: cc -byAbstract: Στο editorial αυτού του μήνα, οι PLOS Medicine Editors προτείνουν ιδανικές ιδιότητες για τον επόμενο Γενικό Διευθυντή του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας, για τον οποίο η διαδικασία επιλογής βρίσκεται τώρα σε εξέλιξη. Κείμενο: απάντηση στην επιδημία Έμπολα [1] . Η μεταρρύθμιση του ΠΟΥ για να τον προετοιμάσει για να ηγηθεί της ανταπόκρισης σε μελλοντικές καταστάσεις έκτακτης ανάγκης για την υγεία είναι ένας τομέας ενεργού συζήτησης. Ο Τσαν θα αποχωρήσει από τον ΠΟΥ στις 30 Ιουνίου 2017 μετά από πάνω από μια δεκαετία στη θέση του. Η διαδικασία για την επιλογή του επόμενου ηγέτη του ΠΟΥ έχει ξεκινήσει, υποσχόμενη να είναι παρατεταμένη και αυστηρή όπως αρμόζει στη σημασία του ρόλου. Λαμβάνοντας υπόψη τα πολλά ενδιαφερόμενα μέρη με επιρροή στη διαδικασία διορισμού του διαδόχου του Τσαν, ωστόσο, η διαφάνεια της διαδικασίας επιλογής μπορεί να είναι ένας τομέας που είναι απίθανο να προσελκύσει επαίνους. Αν και είναι πολύ νωρίς για να κάνουμε εικασίες σχετικά με την ταυτότητα του επόμενου Γενικού Διευθυντή του ΠΟΥ, αξίζει να αναλογιστούμε ποιες ιδιότητες θα πρέπει να φέρει στον ΠΟΥ ένας εισερχόμενος ηγέτης και πώς αυτό το άτομο μπορεί να χρειαστεί να συλλάβει αλλαγές στη δομή και τη συμπεριφορά του οργανισμού σε ένα τοπίο σημαντικές και εξελισσόμενες απειλές για την υγεία του ταχέως αναπτυσσόμενου παγκόσμιου πληθυσμού. Αντί να εκλέξει νέο Γενικό Διευθυντή, ο Lorenz Von Seidlein του Πανεπιστημίου Mahidol της Ταϊλάνδης, υποστήριξε ότι «τα προβλήματα… είναι τώρα τόσο βαθιά ριζωμένα που αντικαθιστώντας τον ΠΟΥ με νέα , οι καταλληλότεροι οργανισμοί είναι η λογική λύση...με ένα κλάσμα του τρέχοντος κόστους, χωρίς δυσκίνητες, αρχαϊκές υποχρεώσεις και δικαιώματα και [με] την ικανότητα να ανταποκρίνονται σε νέα προβλήματα». Αυτή η άποψη είναι ενδεικτική της δύναμης της αίσθησης ότι οι ελλείψεις του ΠΟΥ έχουν αρχίσει να προκαλούν σε ορισμένους από αυτούς που έχουν δεσμευτεί για την αιτία της βελτίωσης της υγείας των ανθρώπων σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος. Αλλά αυτή η αντίληψη αναγνωρίζει ότι θα χρειάζεται πάντα ένας υπεύθυνος παγκόσμιος οργανισμός για την προώθηση, τη θέσπιση προτύπων και την αξιολόγηση της προόδου προς καλύτερη υγεία για τους ανθρώπους σε όλες τις χώρες. Ο επόμενος Γενικός Διευθυντής θα πρέπει να ακούσει τους επικριτές του οργανισμού και να δημιουργήσει μια διαδικασία εξορθολογισμού και αναδιάρθρωσης για να δημιουργήσει έναν νέο ΠΟΥ που είναι αποδεδειγμένα αποτελεσματικός στην αντιμετώπιση απειλών για την υγεία και αποτελεσματικός ως προς αυτό. Όπως σχολίασε ο Gostin στην PLOS Medicine, «Ο ΠΟΥ χρειάζεται επειγόντως μια τολμηρή ατζέντα μεταρρυθμίσεων για να διορθώσει μακροχρόνια προβλήματα που αναγνωρίζονται από κάθε ανεξάρτητη ομάδα που έχει αξιολογήσει τον Οργανισμό». Οι πολιτικές μηχανορραφίες και ο εσωτερικός εχθρός, η γραφειοκρατία, είναι πιθανό να εμποδίσουν τη μεταρρύθμιση. Για παράδειγμα, τα περιφερειακά γραφεία και τα γραφεία της ΠΟΥ θεωρούνται από ορισμένους ως ακαταλόγιστα, ωστόσο ο οργανισμός του μέλλοντος θα πρέπει να συνδεθεί και να ανταποκρίνεται στους πόρους και τις ανάγκες όλων των συστατικών χωρών. Όπως σημείωσε επίσης ο Gostin, «[Ο ΠΟΥ] απέτυχε να συμπεριλάβει την κοινωνία των πολιτών στη διακυβέρνησή του, σε αντίθεση με... νεότερες οργανώσεις. «Ο επόμενος Γενικός Διευθυντής του ΠΟΥ θα πρέπει να είναι αποδεδειγμένα ηγέτης και υποστηρικτής, ίσως από χώρα χαμηλού ή μεσαίου εισοδήματος. Ο νέος νεοσύλλεκτος θα καλωσοριστεί από ένα πλήρες in-tray, και σε περίοπτη θέση είναι πιθανό να είναι οι περιορισμοί που επιβάλλονται από τους τρέχοντες μηχανισμούς χρηματοδότησης του ΠΟΥ. Ένα σημαντικό μέρος του υφιστάμενου προϋπολογισμού του ΠΟΥ προορίζεται για συγκεκριμένα έργα, αφήνοντας τον οργανισμό με μικρή οικονομική ευελιξία για να ανταποκριθεί σε απρόβλεπτες απαιτήσεις. Ωστόσο, οποιοσδήποτε βελτιωμένος μηχανισμός χρηματοδότησης είναι πιθανό να ακολουθήσει και να εξαρτηθεί από την οργανωτική μεταρρύθμιση. Σύμφωνα με τον Kruk, «ο ΠΟΥ είναι τόσο ουσιαστικό όσο και εμπόδιο. . . . η εκλογή του Γενικού Διευθυντή θα πρέπει να είναι μια στιγμή για τα κράτη μέλη και άλλους χρηματοδότες να σκεφτούν εάν θέλουν μια υπηρεσία υλοποίησης για την ευνοούμενη ατζέντα για την υγεία τους ή ένα ανεξάρτητο ίδρυμα με την ευφυΐα, την ευελιξία και την επιχειρησιακή ικανότητα για την αντιμετώπιση των επερχόμενων παγκόσμιων προκλήσεων υγείας». Πάνω απ 'όλα, ο εισερχόμενος ηγέτης του ΠΟΥ θα πρέπει να είναι ανοιχτόμυαλος και δημιουργικός. Περισσότεροι από ένας από τους ειδικούς με τους οποίους επικοινωνήσαμε υπογράμμισαν τη ρευστή φύση των απειλών για την ανθρώπινη υγεία στις οποίες ο ΠΟΥ θα πρέπει να διαμορφώσει την απάντηση του κόσμου. Ο ΠΟΥ πρέπει να είναι σε θέση να ηγηθεί των απαντήσεων σε ορισμένους τομείς της παγκόσμιας υγείας, αλλά, σε άλλους τομείς, η συνεργασία με πιο ευκίνητους και εστιασμένους οργανισμούς θα είναι ρεαλιστική. Οι εστίες μολυσματικών ασθενειών μεγάλης κλίμακας συνεχίζονται και οι μη μεταδοτικές ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου, της άνοιας και των ψυχικών ασθενειών, αυξάνονται σε επικράτηση και αυξάνουν τη ζήτηση για θεραπεία και φροντίδα. Οι πόροι και η εφευρετικότητα των ερευνητών και των κλινικών γιατρών θα πρέπει να αξιοποιηθούν και οι παρεμβάσεις να προσαρμοστούν σε νέα περιβάλλοντα, με πολύ μεγαλύτερο δυναμισμό. Τα κοσμικά ζητήματα της γήρανσης του πληθυσμού, των συγκρούσεων, της κλιματικής αλλαγής, της μετανάστευσης και άλλων θα δημιουργήσουν προβλήματα υγείας που μόνο ένας οργανισμός με παγκόσμια εμβέλεια, υπεύθυνος για όλους, μπορεί να ελπίζει να αντιμετωπίσει. Ανυπομονούμε να καλωσορίσουμε έναν νέο ηγέτη για τον ΠΟΥ με την ενέργεια και το όραμα να αναμορφώσει τον οργανισμό για να καλύψει τις ανάγκες υγείας των ανθρώπων και των κοινωνιών του κόσμου για τον 21ο αιώνα.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 695, "text": "30 Ιουνίου 2017" } ], "id": 1592, "question": "Πότε παραιτήθηκε ο τελευταίος Γενικός Διευθυντής του ΠΟΥ;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2297, "text": "για την προώθηση, τη θέσπιση προτύπων και την αξιολόγηση της προόδου προς καλύτερη υγεία για τους ανθρώπους σε όλες τις χώρες" } ], "id": 1593, "question": "Γιατί μπορεί να είναι απαραίτητος ένας οργανισμός όπως ο ΠΟΥ;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3558, "text": "χώρα χαμηλού ή μεσαίου εισοδήματος" } ], "id": 1595, "question": "Από πού πρέπει να προέρχεται ο επόμενος Γενικός Διευθυντής του ΠΟΥ;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4599, "text": "ανοιχτόμυαλος και δημιουργικός" } ], "id": 1596, "question": "Ποια χαρακτηριστικά πρέπει να έχει ο νέος Γενικός Διευθυντής του ΠΟΥ;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Μια δοκιμασία εξουδετέρωσης μείωσης εστίασης για αντισώματα εξουδετέρωσης του ιού ηπατίτιδας Chttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1852297/SHA: ee8dca216514deeed4c9415bc2ad8a78dc3d9670urnierole; Duverlie, Gilles; François, Catherine; Schnuriger, Aurelie; Dedeurwaerder, Sarah; Brochot, Etienne; Capron, Dominique; Wychowski, Czeslaw; Thibault, Vincent; Castelain, SandrineΗμερομηνία: 2007-03-30DOI: 10.1186/1743-422x-4-35Άδεια: cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ/ΣΚΟΠΟΣ: Ο ρόλος της χυμικής ανοσίας στη μόλυνση από τον ιό της ηπατίτιδας C (HCV) είναι ελάχιστα κατανοητός. Παρόλα αυτά, υπάρχει αυξανόμενο ενδιαφέρον για τον χαρακτηρισμό των εξουδετερωτικών αντισωμάτων στον ορό ασθενών με λοίμωξη από HCV. Οι δοκιμασίες μείωσης εστίασης έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για την αξιολόγηση των αποκρίσεων εξουδετέρωσης αντισωμάτων έναντι μιας σειράς μη κυτταροπαθητικών ιών. Με βάση την πρόσφατη ανάπτυξη ενός συστήματος κυτταροκαλλιέργειας HCV χρησιμοποιώντας το στέλεχος JFH-1 του γονότυπου 2, αναπτύξαμε έναν προσδιορισμό μείωσης εστίασης για αντισώματα εξουδετέρωσης του HCV. ΜΕΘΟΔΟΙ: Η δοκιμασία μείωσης εστίασης βασίστηκε σε μια τυπική δοκιμασία μικροεξουδετέρωσης στην οποία μετρώνται οι ανοσοχρωματισμένες εστίες σε πλάκες καλλιέργειας ιστού. Οι τίτλοι εξουδετερωτικών αντισωμάτων αντι-HCV των καθαρισμένων δειγμάτων ανοσοσφαιρίνης ορού από εβδομήντα επτά άτομα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία εξουδετέρωσης μείωσης εστίασης 50%. Κάθε τίτλος προσδιορίστηκε ως η λογαριθμική τιμή της αμοιβαίας αραίωσης αντισώματος που μείωσε τον αριθμό των ιικών εστιών κατά 50%. Τα αντισώματα IgG καθαρίστηκαν πρώτα από κάθε ορό προκειμένου να αποφευχθεί η διευκολυντική επίδραση της HDL στην είσοδο του HCV. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Η αποκοπή της δοκιμασίας με τη χρήση δειγμάτων ELISA και RNA αρνητικών για HCV βρέθηκε να είναι 1,25 log, που αντιστοιχεί σε αραίωση 1:18. Η δοκιμασία συγκρίθηκε με εμπορική HCV ELISA και έδειξε τιμές ειδικότητας και ευαισθησίας 100% και 96,5%, αντίστοιχα, και καλή αναπαραγωγιμότητα (με συντελεστές διακύμανσης εντός και μεταξύ της ανάλυσης 6,7% και 12,6%, αντίστοιχα). Η ανάλυση δεν έδειξε καμία διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με δείγματα αντι-HIV, αντι-ΗΒ ή ετερόφιλα αντισώματα. Οι τίτλοι των εξουδετερωτικών αντισωμάτων ήταν 2,13 log (1:134) για ομόλογα δείγματα από ασθενείς μολυσμένους με γονότυπο 2 HCV που έφεραν τον ίδιο γονότυπο με το JFH-1 και 1,93 log (1:85) για ετερόλογα δείγματα από ασθενείς που είχαν μολυνθεί από γονότυπους άλλους από τον τύπο 2. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν την παρουσία αντισωμάτων ευρέως διασταυρούμενης εξουδετέρωσης που έχουν ήδη αναφερθεί χρησιμοποιώντας το σύστημα ψευδοσωματιδίων HCV. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Αυτή η μελέτη παρουσιάζει μια απλή, ειδική και αναπαραγώγιμη ανάλυση βασισμένη σε κυτταρική καλλιέργεια για τον προσδιορισμό των αντισωμάτων εξουδετέρωσης του HCV σε ανθρώπινους ορούς. Η ανάλυση θα πρέπει να είναι ένα σημαντικό εργαλείο για τη μέτρηση της σχέσης μεταξύ της απόκρισης των εξουδετερωτικών αντισωμάτων και της κινητικής του ιικού φορτίου σε ασθενείς με οξεία ή χρόνια μόλυνση και για τη διερεύνηση της πιθανής εκρίζωσης ή πρόληψης της λοίμωξης από HCV με εξουδετέρωση αντισωμάτων. Κείμενο: Ιός ηπατίτιδας C (HCV, a μέλος της οικογένειας Flaviviridae) είναι ένας ιός RNA με περίβλημα, θετικής έλικος που αναπαράγεται κατά προτίμηση στα ηπατοκύτταρα. Τουλάχιστον 170 εκατομμύρια άνθρωποι σε όλο τον κόσμο μολύνονται επίμονα από τον ιό της ηπατίτιδας C. Η χρόνια λοίμωξη από HCV σχετίζεται με σημαντικό κίνδυνο εξέλιξης σε κίρρωση και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [1] . Η αντιική θεραπεία με πεγκυλιωμένη άλφα-ιντερφερόνη και ριμπαβιρίνη (το τρέχον καλύτερο θεραπευτικό σχήμα) είναι επιτυχής μόνο στο 50% περίπου όλων των ασθενών που λαμβάνουν θεραπεία. Απαιτείται καλύτερη γνώση των παραγόντων του ιού και του ξενιστή που καθορίζουν την κάθαρση ή την επιμονή του HCV κατά το οξύ στάδιο της λοίμωξης προκειμένου να βελτιωθεί η αντιική θεραπεία και να αναπτυχθούν αποτελεσματικά εμβόλια. Μελέτες που επικεντρώνονται σε έμφυτες και κυτταρικές ανοσοαποκρίσεις έχουν δείξει ότι ένα αρκετά μεγάλο εμβόλιο HCV είναι σε θέση να αποφύγει, να ανατρέψει ή να παρακάμψει την άμυνα του ξενιστή. Προς το παρόν, ο χιμπατζής είναι το μόνο αξιόπιστο μοντέλο πειραματόζωων στο οποίο μπορούν να αξιολογηθούν τα αρχικά συμβάντα μετά τη μόλυνση με HCV και η αποτελεσματικότητα των υποψηφίων εμβολίων [2] . Έχει αποδειχθεί ότι η ειδική για τον HCV ανοσία των Τ-κυττάρων είναι σημαντική για τον έλεγχο της λοίμωξης από HCV [3, 4]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει έναν ρόλο για τη χυμική ανοσία στο οξύ στάδιο της λοίμωξης από HCV, αλλά αυτή η πτυχή παραμένει ανεπαρκώς χαρακτηρισμένη. Οι γλυκοπρωτεΐνες Ε1 και Ε2 πιστεύεται ότι είναι οι πρωτεΐνες προσκόλλησης του ιού και επομένως οι κύριοι στόχοι για τα αντισώματα εξουδετέρωσης του HCV. Η ταυτοποίηση προστατευτικών επιτόπων που διατηρούνται σε διαφορετικά στελέχη HCV είναι επομένως μια σημαντική πρόκληση στο σχεδιασμό του εμβολίου. Έχει περιγραφεί ένας αριθμός αντισωμάτων ικανών να μπλοκάρουν τη δέσμευση της Ε2 σε κύτταρα ή κυτταρικούς υποδοχείς, [5] [6] [7] [8] μερικά από τα οποία εξουδετερώνουν την είσοδο του HCV σε ζωικά ή κυτταρικά μοντέλα [9, 10] . Η κυτταρική είσοδος έχει αποδειχθεί ότι περιλαμβάνει πολλά επιφανειακά μόρια (κυρίως συμπεριλαμβανομένης της τετρασπανίνης CD81 και του υποδοχέα SR-BI [11, 12] ), αν και απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να κατανοηθεί καλύτερα πώς συμβαίνει η είσοδος του ιού και πώς μπορεί να εξουδετερωθεί. Η ανίχνευση εξουδετερωτικών αντισωμάτων στο ανθρώπινο αίμα ήταν προβληματική έως ότου κατέστη διαθέσιμο ένα αποτελεσματικό και αξιόπιστο σύστημα κυτταροκαλλιέργειας για τον HCV. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη μιας in vitro δοκιμασίας εξουδετέρωσης για τον HCV θα μπορούσε να είναι εξαιρετικά πολύτιμη για τον χαρακτηρισμό της χυμικής ανοσολογικής απόκρισης στον HCV και για την αξιολόγηση της δυνατότητας παθητικής και ενεργητικής ανοσοποίησης κατά της ηπατίτιδας C. Πρόσφατες μελέτες που χρησιμοποιούν ένα σύστημα δοκιμασίας εξουδετέρωσης in vitro (με βάση μολυσματικά ψευδοσωματίδια ρετροϊού (HCVpp) που φέρουν γλυκοπρωτεΐνες φακέλου HCV) έχουν επιβεβαιώσει ότι οι μολυσμένοι με HCV οροί ασθενών μπορούν πράγματι να εξουδετερώσουν τη μόλυνση [13, 14] . Ωστόσο, έχει επίσης αποδειχθεί ότι η εξουδετερωτική δραστηριότητα των αντισωμάτων από ασθενείς με HCV μολυσμένο μειώνεται από έναν παράγοντα που υπάρχει στον ανθρώπινο ορό, που προσδιορίζεται ως το κλάσμα λιποπρωτεϊνών υψηλής πυκνότητας (HDL) [11, 13, 15]. Η διευκόλυνση της HDL εισόδου του HCVpp είναι ένα γεγονός μετά τη δέσμευση [16], υποδηλώνοντας ότι οι HDL ευνοούν την εσωτερίκευση των ιοσωμάτων και επομένως τη διαφυγή των τελευταίων από τα εξουδετερωτικά αντισώματα. Πρόσφατα, ένα μοντέλο κυτταροκαλλιέργειας HCV (HCVcc) [17] [17] 18] [19] , επιτρέποντας την παραγωγή σωματιδίων ιού που μπορούν να πολλαπλασιαστούν αποτελεσματικά σε κυτταρική καλλιέργεια. Ορισμένες προκαταρκτικές δοκιμασίες εξουδετέρωσης έχουν πραγματοποιηθεί από αυτούς τους συγγραφείς. Σε αυτή τη μελέτη, περιγράφουμε πώς δημιουργήσαμε μια τυποποιημένη δοκιμασία εξουδετέρωσης μείωσης εστίασης βασισμένη σε HCVcc. Οι δοκιμασίες μείωσης εστίασης έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για την αξιολόγηση των αποκρίσεων εξουδετερωτικών αντισωμάτων σε ιούς που μπορούν να σχηματίσουν εστίες σε μολυσμένα κύτταρα. Μετά την πρόσφατη ανάπτυξη του μοντέλου HCVcc, η αρχή της ανάλυσης μείωσης εστίασης εφαρμόστηκε στην ανίχνευση αντισωμάτων εξουδετέρωσης του HCV. Το ιικό στέλεχος JFH-1 HCV 2a αναπτύχθηκε σε κυτταρική σειρά ανθρώπινου ηπατώματος Huh-7. Μετά από τρεις ημέρες μόλυνσης και κυτταρικής διαπερατότητας, η ανίχνευση των εστιών του HCV διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα αδρανοποιημένο πρωτεύον αντίσωμα ορού ασθενούς με θετικό HCV και ένα συζευγμένο με υπεροξειδάση, ειδικό για Fc αντι-ανθρώπινο IgG αντίσωμα. Η αντίδραση αποκαλύφθηκε με υπόστρωμα υπεροξειδάσης DAB. Οι ιογενείς εστίες χρωματίστηκαν έτσι καφέ, καθιστώντας τους εύκολο να μετρηθούν (βλ. 1α). Έχει αποδειχθεί πρόσφατα ότι η εξουδετερωτική δραστηριότητα των αντισωμάτων HCV εξασθενεί από έναν παράγοντα ορού που σχετίζεται με το κλάσμα HDL. Ως εκ τούτου, οι HDL μπόρεσαν να διευκολύνουν την είσοδο των HCVpp και HCVcc μέσω ενός μηχανισμού που εξαρτιόταν από την έκφραση του υποδοχέα καθαρισμού BI (SR-BI) και τη λειτουργία επιλεκτικής πρόσληψης λιπιδίων [11, 15, 16, 20]. Λόγω του ρόλου της HDL στην είσοδο του HCV, οι ανοσοσφαιρίνες καθαρίστηκαν από κάθε δείγμα ορού πριν από τον προσδιορισμό του τίτλου του εξουδετερωτικού αντισώματος (βλ. 1b). Η ειδικότητα της δοκιμασίας εξουδετέρωσης του HCV αξιολογήθηκε με δοκιμή 20 δειγμάτων αρνητικών έναντι του HCV-ELISA, συμπεριλαμβανομένων πέντε θετικών για επιφανειακά αντισώματα ιού ηπατίτιδας Β (anti-HBs) και πέντε θετικών για ετερόφιλα αντισώματα. Όλα τα δείγματα ήταν αρνητικά με δύο εμπορικές δοκιμασίες ανίχνευσης αντισωμάτων αντι-HCV (Axsym ® HCV Έκδοση 3.0, Abbott, Wiesbaden, Γερμανία. Συσκευασία αντιδραστηρίων Vitros ® Anti-HCV, Ortho-Clinical Diagnostic, High Wycombe, Ηνωμένο Βασίλειο) και HCV-RNA-αρνητικό με ποιοτική, εμπορική ανάλυση (Cobas Amplicor HCV test Version 2.0, Roche Diagnostics, Meylan, Γαλλία). Τα HCV-αρνητικά δείγματα συγκρίθηκαν με 11 δείγματα ασθενών με χρόνια μόλυνση με γονότυπο 2 του HCV. Οι τίτλοι εξουδετέρωσης των αντι-HCV-αρνητικών δειγμάτων ορού φαίνονται στο Σχ. 2., με μέση τιμή 1,083 ± 0,083 (που αντιστοιχεί σε αραίωση 1:12). Η αποκοπή της δοκιμασίας (που προσδιορίστηκε ως η μέση τιμή για αρνητικά δείγματα συν δύο τυπικές αποκλίσεις) αντιστοιχούσε σε αραίωση 1:18. Η ανάλυση έδειξε τιμές ειδικότητας και ευαισθησίας 100% και 96,5%, αντίστοιχα. Η ανάλυση δεν έδειξε καμία διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με δείγματα αντι-HIV, αντι-ΗΒ ή ετερόφιλα αντισώματα (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Αντίθετα, τα χρόνια θετικά δείγματα γονότυπου 2 για HCV εμφάνισαν έντονες αντιδράσεις, με μέση τιμή 2,128 ± 0,365 (που αντιστοιχεί σε αραίωση 1:134) (p < 0,001). Η μεταβλητότητα μεταξύ της ανάλυσης προσδιορίστηκε με δοκιμή ενός γονότυπου HCV 2 δείγμα σε 10 διαδοχικά πειράματα (n = 10), ενώ η μεταβλητότητα εντός της δοκιμασίας αξιολογήθηκε με δοκιμή του ίδιου δείγματος 10 φορές (n = 10) στο ίδιο πείραμα, ενώ εκτελείται η σειρά αραίωσης. Οι συντελεστές διακύμανσης εντός και μεταξύ των προσδιορισμών (CV) των τίτλων εξουδετέρωσης log ήταν 6,7% και 12,6%, αντίστοιχα. Πενήντα επτά δείγματα HCV-θετικών αντισωμάτων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία εξουδετέρωσης μείωσης εστίασης HCV. Οι γονότυποι κατανεμήθηκαν ως εξής. για τους τύπους 1a, 1b, 2, 3, 4 και 5, μελετήσαμε 11, 11, 11, 12, 10 και 2 δείγματα, αντίστοιχα. Οι μέσες τιμές των διαφορετικών γονότυπων φαίνονται στο Σχήμα. 3 . και Πίνακας 1 . Οι μέσοι τίτλοι λογαριθμικής εξουδετέρωσης για τους γονότυπους 1a, 2 και 3 είναι πολύ παρόμοιοι (2,046 ± 0,671 για τον γονότυπο 1a, 2,128 ± 0,365 για τον γονότυπο 2 και 2,148 ± 0,478 για τον γονότυπο 3). Οι μέσες μέσες τιμές είναι χαμηλότερες για τον γονότυπο 1b (1,747 ± 0,462) και τον γονότυπο 4 (1,786 ± 0,236). Εντυπωσιακά, πολύ υψηλοί ετερόλογοι τίτλοι παρατηρήθηκαν για πέντε ασθενείς -τρεις μολύνθηκαν με γονότυπο 1a HCV και δύο μολυσμένοι με γονότυπο 3 HCV (βλ. 3α). Υπήρχαν πολύ λίγα δείγματα γονότυπου 5 για να συγκριθούν με τους άλλους γονότυπους, αλλά τα αντίστοιχα αποτελέσματα δείχνουν ωστόσο ότι η δοκιμασία εξουδετέρωσης είναι κατάλληλη για αυτόν τον γονότυπο. Οι δύο Η κατανομή των τίτλων εξουδετέρωσης log σε όλα τα δείγματα HCV ELISA και RNA θετικά ως συνάρτηση του γονότυπου HCV φαίνεται στο Σχήμα. 3β . Περισσότερο από το 60% των τίτλων των αντισωμάτων εξουδετέρωσης έπεσαν στην περιοχή από 1,7 έως 2,69 log τίτλους, που αντιστοιχούν σε αραιώσεις 1:50 και 1:500, αντίστοιχα. Συνολικά, το 3,5% των δειγμάτων εμφάνισε τίτλο μεγαλύτερο από το log 3,0 (1:1000) και, αντιστρόφως, το 3,5% εμφάνισε τίτλο κάτω από την τιμή αποκοπής, δηλ. log 1,25 (1:10). Έτσι, από 57 ασθενείς μολυσμένους με HCV, μόνο δύο δεν βρέθηκαν θετικοί για εξουδετερωτικά αντισώματα σε αυτή τη δοκιμασία (οι τίτλοι ήταν 0,960 και 0,932, αντίστοιχα). Ο ρόλος των εξουδετερωτικών αντισωμάτων κατά την οξεία και χρόνια ιογενή λοίμωξη παραμένει ένα σημαντικό ερώτημα αμφιλεγόμενα αποτελέσματα. Αρχικά, η παρουσία εξουδετερωτικών αντισωμάτων αποδείχθηκε ότι ελέγχει το φορτίο του HCV και ότι συμβάλλει στην εκρίζωση του ιού σε ασθενείς ικανούς να καθαρίσουν τη λοίμωξη [13] . Σε άλλες μελέτες, η εμφάνιση εξουδετερωτικών αντισωμάτων καθυστέρησε και περιορίστηκε στα αντισώματα IgG1 σε ασθενείς που αναπτύσσουν χρόνια λοίμωξη [2, 21]. Το μοντέλο του χιμπατζή ήταν κρίσιμο για τη μελέτη της μετάδοσης του HCV και των ανοσοαποκρίσεων του ξενιστή. Ωστόσο, δεν ανιχνεύθηκαν εξουδετερωτικά αντισώματα σε ορισμένα ζώα που επέλυσαν τη μόλυνση τους - υποδηλώνοντας έναν ελάχιστο ρόλο στην κάθαρση του ιού, όπως επίσης παρατηρήθηκε σε ανθρώπινες μελέτες [14, 15]. Οι πειραματικά μολυσμένοι χιμπατζήδες και οι φυσικά μολυσμένοι άνθρωποι μπορούν να μολυνθούν εκ νέου με ομόλογα και ετερόλογα στελέχη HCV, υποδηλώνοντας ότι η χυμική ανοσία που αναπτύσσεται μετά την αυθόρμητη υποχώρηση της οξείας ηπατίτιδας C δεν είναι στείρωση [22] [23] [24] . Κατά τη διάρκεια χρόνιας μόλυνσης στον άνθρωπο, η παρουσία ή/και η παραγωγή εξουδετερωτικών αντισωμάτων δεν αρκεί για τη θεραπεία της λοίμωξης, αλλά θα μπορούσε να ρυθμίσει την εξάπλωση του ιού. Έτσι, μπορεί να υποτεθεί ότι κατά τη διάρκεια της χρόνιας μόλυνσης, τα μεταλλαγμένα ιού μπορούν να διαφεύγουν συνεχώς από την ανανεωμένη παραγωγή εξουδετερωτικών αντισωμάτων. Τα ψευδοσωματίδια ρετροϊού έχουν χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη ενός πολύ ενδιαφέροντος εργαλείου για τη μέτρηση των εξουδετερωτικών αντισωμάτων in vitro [14] . Η δοκιμασία έδειξε την παρουσία αντισωμάτων εξουδετέρωσης του HCV σε ανθρώπινους ορούς με σχετικά υψηλούς τίτλους (>1:320) και ευρέως εξουδετερωτική δράση έναντι διαφορετικών γονότυπου HCV. Ωστόσο, αυτό το μοντέλο δεν αντιπροσωπεύει γνήσια ιοσωμάτια HCV. Συγκεκριμένα, η εκβλάστηση των ρετροϊικών σωματιδίων πιστεύεται ότι είναι πολύ διαφορετική και μπορεί να περιλαμβάνει μια ποικιλία κυτταρικών οδών. Ο χαρακτηρισμός μολυσματικών σωματιδίων ψευδοτύπου ρετροϊού που φέρουν γλυκοπρωτεΐνες HCV έχει αποδειχθεί ότι είναι πολύ ετερογενής και επομένως είναι πιθανό αυτά τα ψευδοσωματίδια να μην είναι τόσο σχετικά όσο τα εγγενή ιοσωμάτια HCV [25] . Η πρόσφατη ανάπτυξη ενός μοντέλου κυτταροκαλλιέργειας για τον HCV επιτρέπει την παραγωγή φυσικών ιοσωμάτων HCV που μπορούν να πολλαπλασιαστούν αποτελεσματικά σε κυτταρική καλλιέργεια [17] [18] [19] . Αυτό το σύστημα κυτταροκαλλιέργειας μας επέτρεψε να αναπτύξουμε μια δοκιμασία εξουδετέρωσης για την αξιολόγηση του επιπέδου και της αναλογίας των αντισωμάτων εξουδετέρωσης του HCV σε ασθενείς με χρόνια μόλυνση με HCV. Αναλύσαμε έναν αριθμό παραμέτρων (όπως πρακτικότητα, αναπαραγωγιμότητα και ειδικότητα) και δοκιμάσαμε την επίδραση μιας σειράς μεταβλητών (μέγεθος ιικού εμβολίου, χρόνος επώασης, μέθοδοι στερέωσης και διαπερατότητας, αντιδραστήρια αποκλεισμού και αποκάλυψης) σε αυτές τις παραμέτρους (δεδομένα δεν εμφανίζονται) . Συνολικά, η ανάλυση εξουδετέρωσης που περιγράφεται σε αυτή τη μελέτη λειτουργεί παρόμοια με τις τυποποιημένες δοκιμασίες εξουδετέρωσης για πολλούς άλλους ιούς [26] [27] [28] . μια κυτταρική σειρά ανθρώπινου ηπατώματος Huh-7 σε μοντέλο κυτταροκαλλιέργειας, που επιτρέπει την ταχεία ανίχνευση ιικών εστιών μετά από 72 ώρες μόλυνσης. Επιπλέον, δεν ήταν ανιχνεύσιμες δευτερεύουσες εστίες σε αυτό το χρονικό σημείο. Η στερέωση με παραφορμαλδεΰδη και η διαπερατότητα με Triton X-100 επιλέχθηκαν προκειμένου να διατηρηθεί η αντιγονικότητα και να αποτραπεί η αποκόλληση της κυτταρικής μονοστιβάδας κατά τις πλύσεις. Η ανάπτυξη με υπόστρωμα υπεροξειδίου DAB διευκόλυνε την καταμέτρηση των ειδικά έγχρωμων ιικών εστιών. Το μέγεθος του ιικού εμβολίου είναι μια σημαντική παράμετρος. πρέπει να είναι αρκετά χαμηλό για να επιτρέψει την καλή ευαισθησία της ανάλυσης αλλά αρκετά υψηλό για να παράγει έναν στατιστικά σημαντικό αριθμό εστιών, δηλ. επιτρέποντας την παρακολούθηση της μείωσης του αριθμού των εστιών (και συνεπώς της επίδρασης της εξουδετέρωσης). Έτσι, χρησιμοποιήθηκαν 100 FFUs ως εμβόλιο σε αυτήν την ανάλυση εξουδετέρωσης. Για να δοκιμάσουμε διαφορετικά ανθρώπινα δείγματα, έπρεπε να λάβουμε υπόψη την ικανότητα της HDL να διευκολύνει την είσοδο του HCVcc μέσω ενός μηχανισμού που εξαρτάται από την έκφραση του υποδοχέα σαρωτής BI [11 , 15, 16, 20]. Δεδομένου του ρόλου της HDL στην είσοδο του HCV, οι ανοσοσφαιρίνες καθαρίστηκαν από κάθε δείγμα ορού πριν από τον προσδιορισμό του τίτλου των αντισωμάτων εξουδετέρωσης. Αυτό απελευθερώνει τον προσδιορισμό του κινδύνου μη ειδικής δραστηριότητας εξουδετέρωσης του ορού μέσω των επιδράσεων της HDL, του συστήματος συμπληρώματος ή/και της πρωτεΐνης αμυλοειδούς Α ορού (SAA) [29] . Η ανάλυση εξουδετέρωσης του HCV επέδειξε καλή αναπαραγωγιμότητα και για τα δύο διπλά αναλύσεις και ανεξάρτητες δοκιμές. Όπως ήταν αναμενόμενο, ο συντελεστής διακύμανσης εντός της δοκιμασίας (CV) ήταν χαμηλότερος από το CV μεταξύ της ανάλυσης. Το τεστ έδειξε επίσης καλή ειδικότητα, καθώς δεν υπήρχε αλληλεπίδραση με αντι-HIV, anti-HBV ή ετερόφιλα αντισώματα. Βρέθηκαν πολύ χαμηλοί τίτλοι με δείγματα HCV ELISA και RNA αρνητικά και η αποκοπή της ανάλυσης προσδιορίστηκε ως ο μέσος τίτλος για αρνητικά δείγματα συν δύο τυπικές αποκλίσεις (1,25 log, που αντιστοιχεί σε αραίωση 1:18). Δεδομένου ότι μόνο το στέλεχος JFH-1 του γονότυπου 2a του HCV ήταν διαθέσιμο για τη δοκιμασία, αξιολογήσαμε τον τίτλο εξουδετέρωσης των ορών από ασθενείς που είχαν χρόνια μολυνθεί με άλλους γονότυπους HCV, π.χ. 1, 2, 3, 4 και 5. Οι περισσότεροι από αυτούς τους ορούς ανιχνεύθηκαν ως θετικοί με τη δοκιμασία εξουδετέρωσης, εκτός από δύο ορούς από ασθενείς μολυσμένους με γονότυπο 1 HCV. Αυτά τα δύο δείγματα παρουσίασαν υψηλή αναλογία ειδικών αντισωμάτων σύμφωνα με την ELISA αλλά μόνο πολύ χαμηλή αναστολή με δοκιμασία εξουδετέρωσης (πολύ κάτω από το όριο, στην πραγματικότητα). Συμπεραίνουμε ότι είτε τα δείγματα δεν είχαν εξουδετερωτικά αντισώματα είτε ότι τυχόν τέτοια αντισώματα που υπήρχαν δεν εξουδετερώθηκαν με τον γονότυπο 2a του HCV. Η ευαισθησία ήταν 100% -όχι μόνο για τον γονότυπο 2 (τον γονότυπο του στελέχους που χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό) αλλά επίσης για άλλους γονότυπους HCV (εκτός από τον γονότυπο 1). Μετρήθηκαν επίσης αντισώματα γονότυπου 5 του HCV, αλλά υπήρχαν πολύ λίγα δείγματα για ακριβή έλεγχο. Επιπλέον, οι θετικοί οροί (96,5%) είχαν συγκρίσιμους και σημαντικά υψηλούς τίτλους (1,99 ± 0,63), ανεξάρτητα από τον γονότυπο. Αυτό το εύρημα υποδηλώνει ότι τα περισσότερα εξουδετερωτικά αντισώματα είναι διασταυρούμενα αντιδραστικά. Μια άλλη πιθανότητα είναι ότι οι περισσότεροι ασθενείς είχαν προηγουμένως μολυνθεί από ένα στέλεχος γονότυπου 2. Ωστόσο, αυτό είναι απίθανο επειδή λίγα στελέχη του γονότυπου 2 κυκλοφορούν στη Γαλλία [30] . Όπως αναμενόταν για μια δοκιμή εξουδετέρωσης, η ανάλυση που παρουσιάστηκε στην παρούσα μελέτη φάνηκε να είναι πολύ συγκεκριμένη (ανεξάρτητα από τον γονότυπο) και να μπορεί να χρησιμοποιηθεί στις περισσότερες περιπτώσεις. Για τις περισσότερες ιογενείς λοιμώξεις, δοκιμές εξουδετέρωσης όπως αυτές που περιγράφονται σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιούνται ως αναλύσεις αναφοράς. Έτσι, είμαστε βέβαιοι ότι καθώς άλλοι γονότυποι HCVcc γίνονται διαθέσιμοι, αυτές οι δοκιμασίες θα αντικαταστήσουν τη δοκιμασία ψευδοσωματιδίων στο εγγύς μέλλον, επειδή είναι πιθανώς πιο σχετικές. Η δοκιμασία μας είναι κάπως χρονοβόρα και θα μπορούσε να απλοποιηθεί χρησιμοποιώντας μία αραίωση για την καταμέτρηση των εστιών. Ωστόσο, αυτός ο τύπος \"σύντομης κοπής\" θα καθιστούσε δύσκολη την προέκταση στην αραίωση που εξουδετερώνει το 50% του εμβολίου. Μια άλλη προσέγγιση θα συνίστατο στη χρήση ανασυνδυασμένου HCV ικανού να εκφράζει γονίδια αναφοράς (όπως η λουσιφεράση) προκειμένου να χρησιμοποιηθεί μία μόνο αραίωση και να ληφθεί ένα ποσοτικό αποτέλεσμα [31] . Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες εξουδετέρωσης χρησιμοποιώντας άλλους γονότυπους προκειμένου να ολοκληρωθούν οι παρατηρήσεις μας και να χαρ- Αναπτύχθηκε μια απλή, ειδική και αναπαραγώγιμη δοκιμασία εξουδετέρωσης με βάση την κυτταροκαλλιέργεια για τον προσδιορισμό των εξουδετερωτικών αντισωμάτων αντι-HCV σε ανθρώπινους ορούς. Αυτή η δοκιμή θα πρέπει να είναι ένα σημαντικό εργαλείο για τη μέτρηση της σχέσης μεταξύ της απόκρισης εξουδετέρωσης και της κινητικής του ιικού φορτίου σε ασθενείς με οξεία και χρόνια μόλυνση. Τα κύτταρα ανθρώπινου ηπατώματος Huh-7 [32] αναπτύχθηκαν στο ελάχιστο απαραίτητο υλικό Dulbecco (Invitrogen) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκός βόειος ορός. Όλες οι κυτταροκαλλιέργειες διατηρήθηκαν σε 5% CO 2 στους 37°C. Το πλασμίδιο pJFH-1 που περιέχει το πλήρους μήκους cDNA του απομονώματος JFH-1 (το οποίο ανήκει στον υποτύπο 2a (GenBank πρόσβαση αρ. AB047639)), ήταν δώρο από τον Δρ Wakita (Τμήμα Μικροβιολογίας, Μητροπολιτικό Ινστιτούτο Νευροεπιστήμης του Τόκιο, Τόκιο, Ιαπωνία) και έχει περιγραφεί προηγουμένως [17] . Για τη δημιουργία γονιδιωματικού HCV RNA, το πλασμίδιο pJFH-1 γραμμικοποιήθηκε στο 3' άκρο του cDNA του HCV και χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για in vitro μεταγραφή, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33] . Αποθέματα ιών ελήφθησαν με συλλογή υπερκειμένων κυτταροκαλλιέργειας και κατάψυξή τους στους -80°C. Η τιτλοποίηση του ιού πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα Huh-7 με πλάκες μικροτιτλοδότησης 6 φρεατίων (Corning, NY) 72 ώρες μετά την επώαση, με ανοσοχρώση των κυττάρων με αντισώματα από ορό ασθενούς θετικού για HCV που είχε προηγουμένως αδρανοποιηθεί στους 56°C (βλ. ενότητα για τη δοκιμασία εξουδετέρωσης του ιού). Ο τίτλος του ιού προσδιορίστηκε εις τριπλούν από τον μέσο αριθμό εστιών και εκφράστηκε ως μονάδες σχηματισμού εστίασης/mL (FFU/mL). Εβδομήντα επτά δείγματα ανθρώπινου ορού δοκιμάστηκαν. Η συλλογή των ορών εγκρίθηκε από την τοπική Επιτροπή Δεοντολογίας και είχε ληφθεί ενημερωμένη συγκατάθεση από τους δότες. Πενήντα επτά από αυτά τα δείγματα ελήφθησαν από χρόνια μολυσμένους ασθενείς με HCV. Η παρουσία αντισωμάτων HCV προσδιορίστηκε και επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας δύο δοκιμές HCV EIA τρίτης γενιάς (Axsym ® HCV Έκδοση 3.0, Abbott, Wiesbaden, Γερμανία και πακέτο αντιδραστηρίων Vitros ® Anti-HCV, Ortho-Clinical Diagnostic, High Wycombe, Ηνωμένο Βασίλειο). Το RNA του HCV προσδιορίστηκε με μια ποιοτική εμπορική δοκιμασία (Cobas Amplicor HCV test Version 2.0, Roche Diagnostics, Meylan, Γαλλία) και ο γονότυπος του HCV πραγματοποιήθηκε με άμεση αλληλούχιση, όπως περιγράφεται αλλού [34] . Οι γονότυποι κατανεμήθηκαν ως εξής: 11, 11, 11, 12, 10 και 2 δείγματα των τύπων 1a, 1b, 2, 3, 4 και 5, αντίστοιχα. Ένα σύνολο 20 δειγμάτων ορού αρνητικού αντι-HCV χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της ειδικότητας της ανάλυσης, συμπεριλαμβανομένων πέντε δειγμάτων ορού με θετική κατάσταση επιφανειακών αντισωμάτων ιού ηπατίτιδας Β (anti-HBs) και πέντε ορούς από ασθενείς μολυσμένους από τον ιό Epstein-Barr που είχε βρεθεί θετικός σε ετερόφιλα αντισώματα. Όλα τα δείγματα ορού είχαν αποθηκευτεί στους -80°C κατά τη συλλογή και δεν είχαν αποψυχθεί μέχρι τη στιγμή της ανάλυσης. Το κλάσμα των ανοσοσφαιρινών G (IgG) ορού καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας πρωτεΐνη G-Sepharose (GE Healthcare, Orsay, Γαλλία Η εξουδετέρωση μείωσης εστίασης HCV ο προσδιορισμός πραγματοποιήθηκε σε πλάκες μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων. Καθιερώθηκαν σειριακές αραιώσεις καθαρισμένου IgG (10 μg) που κυμαίνονται από 1:10 έως 1:1.280. Κάθε αραίωση δοκιμάστηκε δύο φορές. 25 μL από κάθε δείγμα αναμίχθηκαν με 25 μL ιού (100 FFU) σε πλάκες μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων και επωάστηκαν για 1 ώρα στους 37°C, 5% CO 2 . Προστέθηκε όγκος 100 μL εναιωρήματος κυττάρων Huh-7 (10.000 κύτταρα/φρεάτιο) σε μέσο καλλιέργειας και επωάστηκε για 5 ώρες στους 37°C, 5% CO2. Μετά από 5 ώρες, τα υπερκείμενα αφαιρέθηκαν και 100 μL μέσου καλλιέργειας προστέθηκαν στις μονοστιβάδες. Μετά από 72 ώρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με παραφορμαλδεΰδη και διαπερατήθηκαν με 0,5% Triton Χ-100. Το πρωτογενές αντίσωμα (ορός ασθενούς με θετικό HCV απενεργοποιημένος στους 56°C) αραιώθηκε σε 1:500 πριν από τη χρήση και στη συνέχεια επωάστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Ένα συζευγμένο με υπεροξειδάση, ειδικό για Fc αντι-ανθρώπινο IgG αντίσωμα (Sigma, Saint Quentin Fallavier, Γαλλία) αραιωμένο σε 1:200 διανεμήθηκε στη μονοστιβάδα κυττάρων και επωάστηκε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η αντίδραση αναπτύχθηκε με υπόστρωμα υπεροξειδάσης DAB (Sigma, Saint Quentin Fallavier, Γαλλία) και σταμάτησε μετά από 10 λεπτά επώασης με απεσταγμένο νερό. Προσδιορίστηκε ο αριθμός των εστιών HCV σε κάθε αραίωση. Οι μάρτυρες συμπεριλήφθηκαν σε κάθε δοκιμασία (μη εξουδετερωμένος ιός, καθαρισμένη IgG από κάθε ασθενή σε αραίωση 1:10). Η αραίωση που εξουδετέρωσε το 50% του ιού υπολογίστηκε με ανάλυση καμπυλόγραμμης παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας το λογισμικό XLSTAT 2006 (Addinsoft SARL, Παρίσι, Γαλλία) [35] . Κάθε τίτλος προσδιορίστηκε ως η λογαριθμική τιμή της αμοιβαίας αραίωσης αντισώματος που μείωσε τον αριθμό των ιικών εστιών κατά 50%. Οι τίτλοι εκφράστηκαν ως λογαριθμικές τιμές και υπολογίστηκαν οι μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση. Το Student's t-test χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση δεδομένων μεταξύ των ομάδων. Οι τιμές p κάτω του 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 3341, "text": "170 εκατομμύρια άνθρωποι σε όλο τον κόσμο" } ], "id": 1626, "question": "Πόσα άτομα έχουν επίμονο ιό της ηπατίτιδας C;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3500, "text": "κίρρωση και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα" } ], "id": 1627, "question": "Ποιος είναι ο μακροπρόθεσμος κίνδυνος χρόνιας λοίμωξης από ηπατίτιδα C;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3565, "text": "πεγκυλιωμένη άλφα-ιντερφερόνη και ριμπαβιρίνη" } ], "id": 1628, "question": "Ποιες αντιικές θεραπείες χρησιμοποιούνται για τη μόλυνση από ηπατίτιδα C;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Σχέση μεταξύ ηπσιδίνης και οξειδωτικής/αντιοξειδωτικής κατάστασης σε μόσχους με υποψία νεογνικής σηψαιμίαςhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5146304/SHA: efcd7d171bb51acf2ef0a631907950 Erdogan, H. M.; Ogun, Μ.; Kirmizigul, Α. Η.; Gokce, Ε.; Kuru, Μ.; Kukurt, A.Date: 2016-11-14DOI: 10.14202/vetworld.2016.1238-1241License: cc-byAbstract: ΣΚΟΠΟΣ: Αυτή η μελέτη διεξήχθη με σκοπό τον προσδιορισμό της επσιδίνης ορού, της ολικής αντιοξειδωτικής κατάστασης (TA TOS) και επίπεδα Fe σε μόσχους με υποψία νεογνικής σηψαιμίας πριν και μετά τη θεραπεία και η κλινική σημασία της εψιδίνης σε μόσχους με υποψία νεογνικής σηψαιμίας. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Το υλικό της μελέτης αποτελούνταν από 15 μόσχους διαφορετικών ηλικιών και φύλων που μεταφέρθηκαν στο Κέντρο Εκπαίδευσης, Έρευνας και Εφαρμογών της Κτηνιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου του Κάυκα με ύποπτη νεογνική σηψαιμία. 8,5 mL αίματος λήφθηκαν από τη σφαγίτιδα φλέβα κάθε ζώου σε πηκτικούς σωλήνες πριν και μετά τη θεραπεία για εφάπαξ βιοχημικές αναλύσεις και φυγοκεντρήθηκαν. Μετά από αυτό, ο ορός διαχωρίστηκε. Μετρήθηκαν τα επίπεδα εψιδίνης, TAS, TOS και Fe στον ορό. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Ενώ τα επίπεδα ηψιδίνης πριν από τη θεραπεία ήταν 58,42±3,46 ng/mL, τα επίπεδα μετά τη θεραπεία ήταν 46,87±2,98 ng/mL (ρ<0,05). Τα επίπεδα Fe πριν από τη θεραπεία ήταν 60,13±7,27 μg/dl, ενώ τα επίπεδα μετά τη θεραπεία ήταν 83,1±8,09 μg/dl (ρ<0,05). Οι αλλαγές στα επίπεδα TAS και TOS βρέθηκαν επίσης στατιστικά σημαντικές. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Υπό το πρίσμα του γεγονότος ότι η εψιδίνη παίζει ρόλο στη ρύθμιση του Fe καθώς και του γεγονότος ότι ο Fe είναι μια σημαντική διατροφική πηγή για πολλούς μικροοργανισμούς, συνήχθη το συμπέρασμα ότι η εψιδίνη μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στη διατροφική ανοσία και στην παθογένεια. των ασθενειών.Κείμενο: Η νεογνική σηψαιμία μόσχου προκαλεί υψηλή νοσηρότητα και θνησιμότητα και αποτελεί μια από τις κύριες και σημαντικότερες δυσκολίες στην εκτροφή βοοειδών. Η σηψαιμία των μοσχαριών είναι η κύρια αιτία θανάτου στη νεογνική περίοδο [1] . Η αιτιολογία της περιλαμβάνει βακτήρια (κοινώς Escherichia coli), ιούς (rota και κοροναϊός), παράσιτα και άλλους παράγοντες. Καθώς η ασθένεια εξελίσσεται γρήγορα και είναι θανατηφόρα, η διάγνωση και η θεραπεία θα πρέπει να ξεκινήσει όσο το δυνατόν γρηγορότερα [2] . Η εψιδίνη είναι μια χαμηλού μοριακού βάρους, αντιμικροβιακή πεπτιδική ορμόνη και ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά στα ανθρώπινα ούρα [3] . Παράγεται από το ήπαρ ως απόκριση πρώτης γραμμής σε φλεγμονώδεις αντιδράσεις και υψηλές συγκεντρώσεις Fe [4, 5] . Η εψιδίνη παίζει θεμελιώδη ρόλο στη ρύθμιση του μεταβολισμού του Fe [6] , ο οποίος αποτελεί μέρος των θεμελιωδών κυτταρικών λειτουργιών και επομένως ζωτικής σημασίας. Από την άλλη πλευρά, ο Fe, συμμετέχοντας σε αντιδράσεις οξειδοαναγωγής που οδηγούν στην παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου (ROSs), προκαλεί επίσης οξειδωτικό στρες. Ως εκ τούτου, ο Fe έχει θεωρηθεί ως δυνητικά τοξικό στοιχείο για τα κύτταρα [7] . Ο Fe παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην παθογένεση των βακτηριακών λοιμώξεων καθώς τα βακτήρια χρησιμοποιούν τον Fe για επιβίωση, ανάπτυξη και πολλαπλασιασμό. Ως εκ τούτου, είναι υψίστης σημασίας ο έλεγχος του μεταβολισμού του Fe [6] . Είναι ευρέως γνωστό ότι η αφθονία του Fe καταστέλλει το αμυντικό σύστημα που οδηγεί τον ξενιστή ευάλωτο σε λοιμώξεις. Υπάρχει σημαντική σχέση μεταξύ της Hepcidin, του μεταβολισμού του Fe, της φλεγμονής και του ανοσοποιητικού συστήματος. Το γεγονός ότι η εψιδίνη παίζει ενεργό ρόλο στη ρύθμιση της απελευθέρωσης Fe από τα μακροφάγα και στον έλεγχο της υπερβολικής απορρόφησης Fe από το δωδεκαδάκτυλο είναι καλά τεκμηριωμένο [6] . Η εψιδίνη αποτελεί μέρος του φυσικού αμυντικού μηχανισμού, επομένως περιορίζει την ποσότητα Fe που μπορεί να χρησιμοποιηθεί από παθογόνα [8] . Σε φλεγμονώδεις καταστάσεις, η υποφερραιμία είναι ένας σημαντικός προστατευτικός μηχανισμός πρώτης γραμμής ως απάντηση σε λοιμώξεις [9] . Ο Fe συμμετέχει επίσης σε αντιδράσεις οξειδοαναγωγής, προκαλώντας την παραγωγή ROS, οδηγώντας έτσι σε οξειδωτικό στρες [7] . Οι ελεύθερες ρίζες παίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεση πολλών ασθενειών [10] . Τα νεογνά υπόκεινται σε οξειδωτικό στρες κατά τη γέννηση. Αναφέρεται επίσης ότι σε ασθένειες των ζώων, ιδιαίτερα εντερίτιδα και πνευμονία, η αντιοξειδωτική ικανότητα είναι αποτελεσματική [11] . Αυτή η μελέτη σχεδιάστηκε για να προσδιορίσει την κλινική σημασία της εψιδίνης σε μόσχους με υποψία νεογνικής σηψαιμίας, αξιολογώντας την εψιδίνη ορού, την ολική αντιοξειδωτική κατάσταση (TAS) , ολική οξειδωτική κατάσταση (TOS) και επίπεδα Fe σε μόσχους με υποψία νεογνικής σηψαιμίας πριν και μετά τη θεραπεία. Αυτή η μελέτη διεξήχθη μετά από έγκριση από την Τοπική Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Mehmet Akif Ersoy Animal Experiments (MAKU-HADYEK-Υποβολή: 2014/77 Η μελέτη περιελάμβανε 15 μόσχους με υποψία νεογνικής σηψαιμίας ηλικίας μεταξύ 1 και 10 ημερών που εισήχθησαν στο Teaching Hospital of Veterinary Medicine. Η ύποπτη σηψαιμία διαγνώστηκε με βάση την κλινική (διάρροια, αδυναμία ή απουσία αντανακλαστικού πιπιλίσματος, η γάμπα να βρίσκεται σε ύπτια θέση στο έδαφος ή να μην μπορεί να σταθεί, σοβαρή αφυδάτωση, μη φυσιολογική θερμοκρασία του ορθού [υπο-ή υπερθερμία], υπεραιμία του βλεννογόνου, και πλήρους σκληρού χιτώνα) και αιματολογικές (αύξηση του αριθμού των λευκών αιμοσφαιρίων [WBC]) εξετάσεις. Τα ζώα ήταν ύποπτα για σηψαιμία [12, 13] . Στα ζώα χορηγήθηκε τυπική θεραπεία (αντιβιοτικό, μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα, βιταμίνη C, θεραπεία με υγρά και στυπτικό εντέρου). Για τον προσδιορισμό των επιπέδων εψιδίνης ορού, TAS, TOS, Fe και αιματολογικών παραμέτρων. λήφθηκαν δείγματα αίματος πριν και μετά τη θεραπεία σε όλες τις περιπτώσεις. 8,5 mL αίματος λήφθηκαν από τη σφαγίτιδα φλέβα κάθε ζώου σε πηκτικούς σωλήνες για βιοχημική ανάλυση και 3 mL αίματος ελήφθησαν σε σωλήνες ETDA για αιματολογική ανάλυση. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις 3000 rpm για 10 λεπτά και ο ορός συλλέχθηκε και διατηρήθηκε στους -20°C μέχρι την ανάλυση. Η εψιδίνη ορού (Mybiosource®), το TAS (Rel Assay Diagnostics®) και το TOS (Rel Assay Diagnostics®) προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικά κιτ ELISA και η τιμή Fe μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά. Αιματολογική ανάλυση (WBC, λεμφοκύτταρα [LYM], ερυθρά αιμοσφαίρια [RBC], μέσος σωματιδιακός όγκος (MCV) και αιματοκρίτης [HCT]) πραγματοποιήθηκε σε μετρητή αίματος (VG-MS4e ®, Melet Schloesıng, Γαλλία). Τα αποτελέσματα ήταν αξιολογήθηκε με τη χρήση του t-test στο στατιστικό πακέτο SPSS ® (SPSS 20, ΗΠΑ) για τον προσδιορισμό των διαφορών μεταξύ των τιμών πριν και μετά τη θεραπεία. απουσία αντανακλαστικού πιπιλίσματος, ψυχρά άκρα, αδυναμία ορθοστασίας, διάρροια, βύθιση των ματιών στις κόγχες τους και υπεραιμία στον επιπεφυκότα. Η μέση θερμοκρασία σώματος, ο καρδιακός ρυθμός και οι αναπνευστικοί ρυθμοί των ζώων ήταν 37,18±0,13°C, 104±4,33/λεπτό και 28,86±0,75/λεπτό πριν από τη θεραπεία. και 38,54±0,1°C, 107,53±2,20/min και 26,40±0,36/λεπτό μετά τη θεραπεία, αντίστοιχα. Οι αλλαγές στα επίπεδα εψιδίνης, TAS, TOS και Fe στους μόσχους με υποψία σηψαιμία πριν και μετά τη θεραπεία δίνονται στον Πίνακα- 1. Μετά τη θεραπεία, τα επίπεδα εψιδίνης ορού και TOS ήταν σημαντικά χαμηλότερα από ό,τι πριν από τη θεραπεία σε μόσχους. Αντίθετα, τα επίπεδα TAS και Fe στον ορό ήταν σημαντικά υψηλότερα από ό,τι πριν από τη θεραπεία (Πίνακας-1). Η θεραπεία των μοσχαριών οδήγησε σε σημαντικές αλλαγές στις αιματολογικές παραμέτρους που εξετάστηκαν εκτός από τα RBC. Ο αριθμός WBC, ο αριθμός LYM, MCV και HCT άλλαξαν σημαντικά μετά τη θεραπεία σε σύγκριση με τις τιμές που ελήφθησαν πριν από τη θεραπεία (Πίνακας-2). Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να προσδιορίσει την κλινική σημασία ή τη χρήση της hepcidin συγκρίνοντας τις τιμές της hepcidin ορού, TAS, TOS και τα επίπεδα Fe σε μόσχους με υποψία νεογνικής σηψαιμίας πριν και μετά τη θεραπεία. Οι κλινικοί γιατροί βασίζονται σε κλινικές και εργαστηριακές εξετάσεις ασθενών για να σχηματίσουν μια λειτουργική διάγνωση, επομένως αιματολογικές και βιοχημικές παράμετροι ορού χρησιμοποιούνται συνήθως για το σκοπό αυτό [14] . Οι αιματολογικές παράμετροι (WBC, HCT, LYM και MCV) που αξιολογήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν συγκρίσιμες με αυτές που αναφέρθηκαν από άλλους σε νεογνά μοσχάρια με διάρροια και υποψία σηψαιμία [15] [16] [17] . Η θεραπεία διόρθωσε σημαντικά σε φυσιολογικές τιμές τις αιματολογικές παραμέτρους που εξετάστηκαν με εξαίρεση τα RBC. Ο αριθμός λευκοκυττάρων πριν από τη θεραπεία ήταν υψηλός λόγω της φλεγμονής που εμφανίστηκε στον οργανισμό και ότι τα επίπεδα HCT ήταν υψηλά λόγω της αφυδάτωσης που προέκυψε λόγω της διάρροιας. Η εψιδίνη ελέγχεται από την παρουσία φλεγμονής στο σώμα, την αποθήκευση Fe και την ερυθροποιητική δραστηριότητα στο μυελό των οστών και παίζει πρωταρχικό ρόλο στην ομοιόσταση του Fe [4] . Η αύξηση των επιπέδων Fe στους ιστούς και στο πλάσμα διεγείρει τη σύνθεση της εψιδίνης και μειώνει την απελευθέρωση του Fe και την εντερική απορρόφηση του Fe από τα μακροφάγα και τα ηπατοκύτταρα [18] . Οι αυξημένες συγκεντρώσεις εψιδίνης κατά τη διάρκεια της φλεγμονής και της λοίμωξης μειώνουν τα επίπεδα Fe στον ορό μειώνοντας την απελευθέρωση Fe από τα μακροφάγα και τα ηπατοκύτταρα, και έτσι ο Fe που απαιτείται για τους μικροοργανισμούς και τα κύτταρα όγκου περιορίζεται [19] . Τα επίπεδα εψιδίνης στον ορό σε μόσχους με υποψία σηψαιμία ήταν σημαντικά υψηλά πριν από τη θεραπεία σε σύγκριση έως μετά τη θεραπεία? Επίσης, τα επίπεδα Fe ήταν χαμηλότερα πριν από τη θεραπεία σε σύγκριση με μετά τη θεραπεία σε αυτή τη μελέτη. Αυτή η κατάσταση θα μπορούσε να σχετίζεται με την αλληλεπίδραση μεταξύ της εψιδίνης και του Fe και επίσης δίνει αξιοπιστία στο ρόλο της εψιδίνης στην αιμόσταση του Fe κατά τη διάρκεια της φλεγμονής και της μόλυνσης. Όπως και στη μελέτη μας, τα επίπεδα Fe είναι γνωστό ότι μειώνονται σε μόσχους με διάρροια σε σύγκριση με υγιείς μόσχους [20, 21]. Αν και δεν υπάρχει καμία μελέτη που να αναφέρει τη συγκέντρωση της εψιδίνης σε άρρωστα μοσχάρια, μελέτες σε ανθρώπους δείχνουν ότι τα επίπεδα εψιδίνης στο αίμα του ομφάλιου λώρου μπορεί να είναι ένας σημαντικός δείκτης για τη διάγνωση της πρώιμης έναρξης της νεογνικής σήψης. Τα επίπεδα ηψιδίνης στο αίμα του ομφάλιου λώρου των νεογνών με σήψη κυμαίνονταν μεταξύ 118,1 και 8400 ng/mL και ήταν σημαντικά υψηλότερα από τα υγιή βρέφη [22] . Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα αναφέρθηκε ότι οι συγκεντρώσεις της εψιδίνης σε νεογνά με σήψη ήταν σημαντικά υψηλότερες από ότι σε υγιή βρέφη [23]. Αυτά τα ευρήματα μαζί με τα αποτελέσματά μας προσθέτουν αξιοπιστία στην ιδέα ότι η αλληλεπίδραση hepcidin-Fe μπορεί να παίξει ρόλο στην παθογένεση της σηψαιμίας. Η παραγωγή ελεύθερων ειδών οξυγόνου προκαλεί αλλοιώσεις στις πρωτεΐνες, τα λιπίδια και το DNA κατά τη διάρκεια του οξειδωτικού στρες και οδηγεί στην ανάπτυξη βλάβες στα όργανα [24] . Ο ελεύθερος σίδηρος έχει τοξικά χαρακτηριστικά καθώς καταλύει την παραγωγή ROSs [25] και έτσι προκαλεί οξειδωτικό στρες [26] . Ο ρόλος του Fe στην ανάπτυξη του οξειδωτικού στρες μπορεί για άλλη μια φορά να δείξει τη σημασία της εψιδίνης, ως σημαντικού ρυθμιστή Fe, όσον αφορά την ενίσχυση της αντιοξειδωτικής ικανότητας μέσω της αναστολής της χρήσης του Fe από τον οργανισμό καθώς και από τα κύτταρα ξενιστή. Το αντιοξειδωτικό και οξειδωτικό σύστημα βρίσκονται σε σταθερή κατάσταση ισορροπίας στον οργανισμό. Οποιοδήποτε γεγονός διασπάσει αυτή την ισορροπία προς όφελος των μορίων του οξειδωτικού στρες θα προκαλέσει κυτταρική βλάβη [27, 28] . Τα κύτταρα-ξενιστές εκκινούν το αντιοξειδωτικό σύστημα σε περίπτωση έκθεσης σε οξειδωτικό στρες [27] . Οι Kabu et al. [16] ανέφεραν τιμές TOS και TAS σε νεογνούς μόσχους με διάρροια ως 13,47±0,81 μmol H 2 O 2 /L και 0,51±0,02 mmol ισοδύναμο Trolox/L, αντίστοιχα, και η θεραπεία αυτών των μόσχων προκάλεσε αλλαγές σε αυτές τις τιμές 11,21± 0,26 μmol H 2 O 2 /L και 0,55±0,02 mmol Troloxequivalent/L, αντίστοιχα. Μελέτες ανέφεραν επίσης ότι οι παράμετροι που χρησιμοποιήθηκαν για το οξειδωτικό στρες (μηλονοδιαλδεΰδη) ήταν υψηλότερες [29] και οι αντιοξειδωτικές παράμετροι (δισμουτάση υπεροξειδίου [21], TAS) ήταν χαμηλότερες σε διαρροϊκούς μόσχους [29] . Ομοίως, στη μελέτη μας, το επίπεδο TAS ήταν σημαντικά χαμηλότερο και το επίπεδο TOS ήταν σημαντικά υψηλότερο σε διαρροϊκούς μόσχους πριν από τη θεραπεία και η θεραπεία προκάλεσε διορθώσεις σε αυτές τις παραμέτρους. Η μείωση του TAS και η αύξηση των επιπέδων TOS κατέδειξαν ότι το οξειδωτικό στρες ήταν εμφανές στα άρρωστα μοσχάρια στη μελέτη μας. Τα αυξημένα επίπεδα TOS και εψιδίνης πριν από τη θεραπεία πιστεύεται ότι σχετίζονται με φλεγμονή. Μετά τη θεραπεία, η αυξημένη TAS και τα μειωμένα επίπεδα εψιδίνης υποστηρίζουν αυτή τη γνώμη. Η εψιδίνη μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στη μη ειδική ανοσία και είναι ένα βασικό μόριο που παίζει ρόλο στην παθογένεση ασθενειών ενισχύοντας την ανάπτυξη αντιοξειδωτικού συστήματος. Ωστόσο, απαιτούνται πιο λεπτομερείς μελέτες για τον ρόλο της εψιδίνης στην παθογένεση της σηψαιμίας. Αυτή η εργασία πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία μεταξύ όλων των συγγραφέων. EEE, HME και AHK: Σχεδίασε τις πειραματικές διαδικασίες. EEE, EG and MK: Διεξήγαγε την ερευνητική εργασία. EEE, AHK, MO και AK: Βοήθησε στην εργαστηριακή ανάλυση. Όλοι οι συγγραφείς διάβασαν και ενέκριναν το τελικό χειρόγραφο.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 2392, "text": "ανθρώπινα ούρα" } ], "id": 2131, "question": "Πού ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά η εψιδίνη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2299, "text": "χαμηλού μοριακού βάρους, αντιμικροβιακή πεπτιδική ορμόνη" } ], "id": 2130, "question": "Τι είναι η εψιδίνη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2465, "text": "φλεγμονώδεις αντιδράσεις και υψηλές συγκεντρώσεις Fe" } ], "id": 2133, "question": "Τι διεγείρει την απελευθέρωση της εψιδίνης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2717, "text": "Fe" } ], "id": 2134, "question": "Ποιο στοιχείο παίζει ρόλο η εψιδίνη στη ρύθμιση κατά τη διάρκεια του μεταβολισμού;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2894, "text": "δυνητικά τοξικό" } ], "id": 2135, "question": "Είναι η εψιδίνη τοξική;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3022, "text": "τα βακτήρια χρησιμοποιούν τον Fe για επιβίωση, ανάπτυξη και πολλαπλασιασμό" } ], "id": 2136, "question": "Γιατί ο σίδηρος είναι κρίσιμος για τα βακτήρια;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3460, "text": "ρύθμιση της απελευθέρωσης Fe" } ], "id": 2138, "question": "Πώς η εψιδίνη επηρεάζει τα μακροφάγα;" }, { "answers": [ { "answer_start": 10777, "text": "παραγωγή ROS" } ], "id": 2139, "question": "Τι οδηγεί στο οξειδωτικό στρες στον οργανισμό;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Οξεία αιμορραγική εγκεφαλίτιδα που ανταποκρίνεται σε συνδυασμένη αποσυμπιεστική κρανιεκτομή, ενδοφλέβια ανοσοσφαιρίνη και θεραπείες κορτικοστεροειδών: Συσχέτιση με νέα παραλλαγή RANBP2 Saint-Martin, Christine; Bhanji, Farhan; Srour, Myriam; Atkinson, Jeffrey; Sébire, GuillaumeΗμερομηνία: 2018-03-12DOI: 10.3389/fneur.2018.00130Άδεια χρήσης: cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Η οξεία αιμορραγική εγκεφαλομυελίτιδα (AHEM) θεωρείται ως μια σπάνια λιπώδης ελαττωματώδης αιμοφθαλμίτιδα αποτέλεσμα. ΣΚΟΠΟΣ: Να αναφερθεί η συσχέτιση με την παραλλαγή του γονιδίου Ran Binding Protein (RANBP2) και η ανταπόκριση στην αποσυμπιεστική κρανιεκτομή και σε υψηλής δόσης ενδοφλέβια μεθυλπρεδνιζολόνη (IVMP) σε απειλητική για τη ζωή AHEM. ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ: Ενιαία μελέτη περίπτωσης. ΑΝΑΦΟΡΑ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗΣ: Ένα 6χρονο κορίτσι γνωστό ότι πάσχει από δρεπανοκυτταρική αναιμία (SCD) παρουσίασε επίκτητο απομυελινωτικό σύνδρομο (ADS) με διπλωπία λόγω ξαφνικής μονόπλευρης παράλυσης του τέταρτου νεύρου. Έλαβε πέντε παλμούς IVMP (30 mg/kg/ημέρα). Δύο εβδομάδες μετά τον απογαλακτισμό με στεροειδή, εμφάνισε δεξιά ημιπληγία και κώμα. Η μαγνητική τομογραφία εγκεφάλου έδειξε μια αριστερή μετωπιαία νεκρωτική-αιμορραγική βλάβη και νέες πολυεστιακές περιοχές απομυελίνωσης. Υποβλήθηκε σε αποσυμπιεστική κρανιοτομή και εκκένωση μιας συνεχιζόμενης αριστερής μετωποβρεγματικής αιμορραγίας. Οι εκτενείς έρευνες απέκλεισαν αγγειακή και μολυσματική διαδικασία. Η νευρολογική επιδείνωση σταμάτησε ταυτόχρονα με συνδυασμένη νευροχειρουργική παροχέτευση του αιματώματος, αποσυμπιεστική κρανιοτομή, IVMP και ενδοφλέβιες ανοσοσφαιρίνες (IVIG). Εμφάνισε κατά τους επόμενους μήνες νόσο του Crohn και σκληρυντική χολαγγειίτιδα. Μετά από παρακολούθηση 2 ετών, δεν υπήρξε νέα νευρολογική εκδήλωση. Ο ασθενής έπασχε από δεξιά ημιπληγία και αφασία, αλλά μπορούσε να περπατήσει. Οι γνωστικές/συμπεριφορικές ικανότητες ανακτήθηκαν σημαντικά. Μια ετερόζυγη νέα σπάνια παραλλαγή με νόημα (c.4993A>G, p.Lys1665Glu) ταυτοποιήθηκε στο RANBP2, ένα γονίδιο που σχετίζεται με οξεία νεκρωτική εγκεφαλοπάθεια. Η RANBP2 είναι μια πρωτεΐνη που παίζει σημαντικό ρόλο στην ενεργειακή ομοιόσταση των νευρωνικών κυττάρων. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Σε οποιαδήποτε ADS που εμφανίζεται στο πλαίσιο SCD και/ή αυτοάνοσης κατάστασης, συνιστούμε να απογαλακτιστεί αργά τα στεροειδή και να παρακολουθείται στενά ο ασθενής μετά τον απογαλακτισμό για γρήγορη αντιμετώπιση τυχόν υποτροπής νευρολογικών συμπτωμάτων με IVMP. Αυτή η αναφορά περιπτώσεων, εκτός από άλλες, τονίζει την πιθανή αποτελεσματικότητα των συνδυασμένων θεραπειών κρανιοτομής, IVIG και IVMP στο AHEM. Οι μεταλλάξεις RANBP2 μπορεί να ευαισθητοποιήσουν τον εγκέφαλο στη φλεγμονή και να προδιαθέτουν σε AHEM. Κείμενο: Η οξεία αιμορραγική εγκεφαλομυελίτιδα (AHEM) ή η οξεία αιμορραγική λευκοεγκεφαλίτιδα θεωρείται μια σπάνια και εξαιρετικά σοβαρή μορφή οξείας διάχυτης εγκεφαλομυελίτιδας (ADEM). Το AHEM χαρακτηρίζεται από μια οξεία και ταχέως προοδευτική εγκεφαλοπάθεια που περιλαμβάνει αιμορραγική νέκρωση του παρεγχύματος του κεντρικού νευρικού συστήματος. Είναι συνήθως θανατηφόρο (1) (2) (3) . Έχουν χρησιμοποιηθεί πολλές θεραπευτικές επιλογές, συμπεριλαμβανομένων της ενδοφλέβιας (IV) στεροειδών, της ενδοφλέβιας ανοσοσφαιρίνης (IVIG) και της πλασμαφαίρεσης (4) . Έχουν υπάρξει λίγες αναφορές επιβίωσης μετά από πρώιμη παρέμβαση με θεραπεία υψηλής δόσης κορτικοστεροειδών και/ή αποσυμπιεστική κρανιοτομή (5) (6) (7) (8) (9) Η RANBP2, μια πρωτεΐνη πυρηνικών πόρων, έχει πολλούς ρόλους στο κύτταρο κύκλος. Το RANBP2 σχετίζεται με μικροσωληνίσκους και μιτοχόνδρια υποδηλώνοντας ρόλους στην ενδοκυτταρική διακίνηση πρωτεϊνών ή στη διατήρηση της ενέργειας και στην ομοιόσταση των νευρωνικών κυττάρων. Μεταλλάξεις RANBP2 έχουν αναφερθεί στην οξεία νεκρωτική εγκεφαλοπάθεια (ANE) που θα μπορούσε να εμφανιστεί με κώμα, σπασμούς και εγκεφαλοπάθεια. Το χαρακτηριστικό της ΑΝΕ είναι οι πολλαπλές, συμμετρικές βλάβες του εγκεφάλου που εντοπίζονται στον θάλαμο αμφοτερόπλευρα, η πουταμίνα, η εν τω βάθει περικοιλιακή λευκή ουσία, η παρεγκεφαλίδα και το εγκεφαλικό στέλεχος. Θα μπορούσε να προκληθεί από μια ιογενή λοίμωξη σε προηγουμένως υγιή παιδιά (10). Αναφέρουμε μια νέα περίπτωση AHEM που σχετίζεται με μια παραλλαγή Ran Binding Protein (RANBP)-2 και ανταποκρίνεται σε συνδυασμένη κρανιεκτομή, ενδοφλέβια μεθυλπρεδνιζολόνη (IVMP) και IVIG ως εναρκτήρια εκδήλωση πολυσυστημικής αυτοανοσίας σε κορίτσι με δρεπανοκυτταρική αναιμία (SCD). Ένα 6χρονο κορίτσι γνωστό για SCD που υποβλήθηκε σε θεραπεία με φολικό οξύ και υδροξυουρία εισήχθη για διπλωπία νέας έναρξης [ημέρα 0 (D0): αναφέρεται στην αρχή της διπλωπίας] 6 εβδομάδες μετά τη λοίμωξη της αναπνευστικής οδού λόγω ρινοϊού. Διαγνώστηκε με παράλυση τέταρτου νεύρου λόγω επίκτητου απομυελινωτικού συνδρόμου. Η αρχική μαγνητική τομογραφία εγκεφάλου (MRI) που διεξήχθη στο D5 μετά την έναρξη του νευρολογικού συμπτώματος έδειξε οίδημα αριστερού μεσεγκεφάλου και γείσου με επέκταση του εγκεφαλικού στελέχους, του δεξιού κερκοφόρου πυρήνα και διάσπαρτες εστίες λευκής ουσίας υψηλού T2/FLAIR (Εικόνα 1). Η MR αγγειογραφία εγκεφάλου (MRA) έδειξε έναν φυσιολογικό κύκλο του Willis. Το εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ) που λήφθηκε με παρακέντηση ξυλείας ήταν φυσιολογικό (WBC 1 κύτταρα/μl, RBC 0 κύτταρα/μl, γλυκόζη 2,9 mmol/L, πρωτεΐνη 0,18 g/L και απούσες ολιγοκλωνικές ζώνες). Η λοιμώδης εξέταση περιλαμβάνει βακτηριακή καλλιέργεια αίματος, βακτηριακές και ιικές καλλιέργειες ΕΝΥ, ρινοφαρυγγική αναρρόφηση (δοκιμασμένο για γρίπη A, influenza B, Parainfluenza 1-2-3, αναπνευστικό συγκυτιακό ιό, αδενοϊό, κοροναϊό 229E, κορωνοϊό OC43, μεταπνευμονιό ιό R. ), και οι ορολογίες για τον ιό Epstein-Barr, Mycoplasma pneumoniae, HTLV I, HTLV II, HIV1 και νόσο Lyme ήταν αρνητικές. Το Bartonella Henselae IgG ήταν θετικό (1:1.280) αντανακλώντας μια προηγουμένως αποκτηθείσα κοινή και αυτοπεριοριζόμενη λοίμωξη στην περιοχή μας. Τα αντιπυρηνικά αντισώματα (ANA) ήταν θετικά (1:160). Τα επίπεδα Β12 και φυλλικού οξέος ήταν φυσιολογικά. Τα αντισώματα των λείων μυών ήταν αρνητικά. Τα αντι-μιτοχονδριακά αντισώματα ήταν θετικά. Ο ρυθμός καθίζησης ήταν 65 mm/h. Έλαβε θεραπεία με πέντε δόσεις IVMP (30 mg/kg/ημέρα) και ακολούθησαν 9 ημέρες από του στόματος πρεδνιζόνης (1 mg/kg/ημέρα). Κατά το εξιτήριο, η νευρολογική της εξέταση ήταν σημαντική μόνο για κάθετη διπλωπία. Παρουσιάστηκε 1 μήνα αργότερα με συμπτώματα λοίμωξης του ανώτερου αναπνευστικού συστήματος 5 ημέρες, πυρετό, κεφαλαλγία και ταχέως προοδευτική αδυναμία του δεξιού χεριού (D30) με φυσιολογική εγρήγορση. Είχε φυσιολογική αρτηριακή πίεση (120/81 mmHg). Ξεκίνησε με κεφοταξίμη, βανκομυκίνη και ακυκλοβίρη. Ο αριθμός των λευκών αιμοσφαιρίων ήταν 13,4 × 10 9 /L, η αιμοσφαιρίνη ήταν 7,8 g/L και τα αιμοπετάλια ήταν 239 × 10 9 /L. Ενώ βρισκόταν στο μηχάνημα μαγνητικής τομογραφίας (D30) επιδεινώθηκε με εμετό και μειωμένο επίπεδο συνείδησης (η κλίμακα κώματος της Γλασκώβης έπεσε από 15 σε 8 σε 30 λεπτά). Η μαγνητική τομογραφία εγκεφάλου έδειξε ταχεία εξέλιξη σε μερικές αλληλουχίες ενεργού αιμορραγίας που αφορούσε τόσο την επιφανειακή όσο και τη βαθιά φαιά ουσία καθώς και την υποφλοιώδη λευκή ουσία του πρόσθιου τεταρτημορίου του αριστερού ημισφαιρίου. Η MRA του εγκεφάλου ήταν φυσιολογική (Εικόνες 2A-F). Η ασθενής βγήκε αμέσως από τον μαγνήτη και η φυσική της εξέταση έδειξε άνιση διεσταλμένες κόρες. Έλαβε ενδοφλέβια μαννιτόλη και υπερτονικό ορό για τη διαχείριση της οξείας ενδοκρανιακής υπέρτασης/κήλης και οδηγήθηκε για χειρουργική επέμβαση. Υποβλήθηκε σε αποσυμπιεστική κρανιοτομή αριστερής μετωπο-κροφοβρεγματικής, εκκένωσης της αριστερής μετωπιοβρεγματικής ενδοεγκεφαλικής αιμορραγίας και εισαγωγή εξωτερικής κοιλιακής παροχέτευσης (EVD). Κατά το άνοιγμα του κρανίου, υπήρξε σημαντική ένταση της σκληράς μήνιγγας και κατά το άνοιγμα της σκληρής μήνιγγας, υπήρχε μεγάλη αιμορραγία, εκτός από οίδημα του εγκεφάλου και νέκρωση. Η εκτιμώμενη απώλεια αίματος ήταν 3,5 L. Έλαβε 8 μονάδες συσκευασμένων ερυθρών αιμοσφαιρίων, 3 μονάδες κρυοϊζήματος, 6 μονάδες φρέσκου κατεψυγμένου πλάσματος και 3 μονάδες αιμοπεταλίων. Το προφίλ πήξης έδειξε διεθνή αναλογία ομαλοποίησης = 3,38, χρόνο προθρομβίνης = 51,2 s και χρόνο μερικής θρομβοπλαστίνης = 122 s. Τοποθετήθηκε ένα μόνιτορ ενδοκοιλιακής πίεσης. Επέστρεψε με σταθερά ζωτικά στοιχεία στη PICU. Στο D31, η αξονική τομογραφία έδειξε εκτεταμένη πολυδιαμερισματική αιμορραγία που αφορούσε τους αριστερούς μετωπιοβρεγματικούς λοβούς, τη μεσοημισφαιρική σχισμή και τους αραχνοειδείς χώρους του αριστερού ημισφαιρίου. Ανιχνεύθηκαν νέες βλάβες λευκής ουσίας στον αριστερό οπίσθιο βρεγματικό και ινιακό λοβό και στην αριστερή κεραία κεφαλή. Η μαγνητική τομογραφία στο D33 έδειξε επιδείνωση μεσοδιαστήματος με διάχυτες μη αιμορραγικές βλάβες της φαιάς και λευκής ουσίας στο δεξί εγκεφαλικό και αμφότερα τα παρεγκεφαλιδικά ημισφαίρια, αμφοτερόπλευρους βαθύ γκρίζους πυρήνες, καθώς και νέες νεκρωτικές μη αιμορραγικές βλάβες στο αριστερό ημισφαίριο (Εικόνες 2G-I). Ξεκίνησε με IVMP (30 mg/kg/ημέρα για 5 ημέρες) και IVIG (1 g/kg/ημέρα για 2 ημέρες). Η επαναλαμβανόμενη μαγνητική τομογραφία στο D9 δεν έδειξε νέα παρεγχυματική αιμορραγία και μερική υποχώρηση των μη αιμορραγικών βλαβών (Εικόνα 3). Η πρεδνιζολόνη μειώθηκε σε 6 εβδομάδες. Στο εξιτήριο (D71), ήταν σε θέση να πει μερικές λέξεις και είχε καλύτερη δύναμη στη δεξιά πλευρά της. Η μαγνητική τομογραφία εγκεφάλου που πραγματοποιήθηκε 3 μήνες αργότερα έδειξε πλήρη επίλυση των μη αιμορραγικών μη νεκρωτικών βλαβών, που παρατηρούνται κυρίως στο δεξί εγκεφαλικό ημισφαίριο και την παρεγκεφαλίδα. Η βιοψία εγκεφάλου του αιματώματος, ορισμένων μικρών αγγείων, του φλοιού και της λευκής ουσίας έδειξε νεκρωτική περιοχή, αντιδραστική και μη ειδικά ευρήματα που θα μπορούσαν να εξηγηθούν εξ ολοκλήρου από συμπιεστικές αλλαγές δίπλα σε ένα αιμάτωμα. Υπήρχε διάχυτη μικρογλοιακή ενεργοποίηση και σημεία πρώιμων μικροεμφραγμάτων. Η καλλιέργεια αίματος, ΕΝΥ και ούρων και PCR (HSV1/2) ήταν αρνητικά για βακτήρια και ιούς. Το ΕΝΥ που λήφθηκε μέσω κρανιοτομής και EVD που διενεργήθηκε στο D32 έδειξε αυξημένες πρωτεΐνες 2,56 g/L, γλυκόζη 3,6 mmol/L, λευκά αιμοσφαίρια 9 κύτταρα/μL και ερυθρά αιμοσφαίρια 1.341 κύτταρα/μL. Τα αντισώματα ANA και αντι-DNA ήταν αρνητικά. Τα αντι-εκχυλίσιμα πυρηνικά αντιγόνα (SSA-RO, SSB-LA, smith, RNP) ήταν αρνητικά. Το πάνελ αυτοάνοσων αντισωμάτων ορού (NMO, NMDAR, AMPA I/II, GAB, MAG, VGCC, MOG, YO, HU, RI) ήταν αρνητικό αλλά το αντίσωμα GAD ήταν ελαφρώς θετικό, πιθανώς λόγω της έγχυσης IVIG. Το EBV δεν έδειξε σημάδια πρόσφατης λοίμωξης. Μετά την έξοδο, ο ασθενής ξεκίνησε τακτική ανταλλαγή μετάγγισης. Έξι μήνες αργότερα, ο ασθενής διαγνώστηκε με νόσο του Crohn και πρωτοπαθή σκληρυντική χολαγγειίτιδα. Δύο χρόνια αργότερα, ο ασθενής εξακολουθεί να υποφέρει από δεξιά ημιπάρεση αλλά μπορεί να περπατήσει χωρίς υποστήριξη. Παρουσιάζει μια εκφραστική αφασία. Οι διανοητικές της ικανότητες είναι μέσες ή κάτω από το μέσο όρο, αλλά στο φυσιολογικό εύρος, εκτός από την ταχύτητα επεξεργασίας πληροφοριών, τη λεκτική μνήμη εργασίας και ορισμένες περίπλοκες εκτελεστικές λειτουργίες. Ένα γονιδιακό πάνελ ( Πίνακας 1 ) που στοχεύει σε φλεγμονώδεις διαταραχές και μεταμολυσματικές νεκρωτικές εγκεφαλοπάθειες βρήκε μια ετερόζυγη RANBP2 missense μετάλλαξη (NM_006267.4, c.4993A>G, p.Lys1665Glu). Αυτή η μετάλλαξη δεν έχει αναφερθεί προηγουμένως στη βάση δεδομένων HGMD. Αυτή η παραλλαγή έχει παρατηρηθεί σε συχνότητα <0,01% σε ολόκληρο το σύνολο δεδομένων ExAC των ατόμων χωρίς σοβαρή παιδική έναρξη νόσου (6/117.118 αλληλόμορφα). Η ανάλυση διατήρησης αμινοξέων δείχνει ότι το άγριου τύπου αμινοξύ Lys1665 διατηρείται σε 59 από τα 60 θηλαστικά που εξετάστηκαν, συμπεριλαμβανομένων 12 από τα 12 πρωτεύοντα, και σε 25 από τα 34 μη θηλαστικά σπονδυλωτά αυξάνοντας την πιθανότητα να μην γίνει ανεκτή μια αλλαγή σε αυτή τη θέση. Τα εργαλεία in silico προβλέπουν ότι αυτή η παραλλαγή είναι επιβλαβής (SIFT και Align GVGD). Μπορούν να ληφθούν υπόψη αρκετές διαφορικές διαγνώσεις οξείας εγκεφαλοπάθειας σε ασθενή με δρεπανοκυτταρική αναιμία. Μια λοιμώδης εγκεφαλίτιδα, συμπεριλαμβανομένης της ερπητικής εγκεφαλίτιδας, αποκλείστηκε με καλλιέργειες αίματος και ΕΝΥ βακτηριδίων και ιών και αρνητική HSV I/II PCR. Η ρινοφαρυγγική αναρρόφηση ήταν αρνητική για ιούς. Ορισμένες λοιμώξεις είχαν προηγουμένως συσχετιστεί με νεκρωτική εγκεφαλίτιδα όπως η γρίπη Α (11) . Οι ασθενείς με SCD είναι επιρρεπείς σε ισχαιμικά ή αιμορραγικά εγκεφαλικά επεισόδια (12) . Το πρωτοπαθές αιμορραγικό εγκεφαλικό είναι ασυνήθιστο στην παιδιατρική SCD. Οι περισσότερες περιπτώσεις ήταν από ενήλικες και έχουν περιγραφεί στο πλαίσιο προηγούμενων ισχαιμικών εγκεφαλικών επεισοδίων, ανευρυσμάτων, χαμηλής αιμοσφαιρίνης, οξέος θωρακικού συνδρόμου και υπερμεταγγίσεων. Επιπλέον, αν και το αιμορραγικό εγκεφαλικό επεισόδιο έχει περιγραφεί σε ασθενείς με SCD που λαμβάνουν μετάγγιση ή κορτικοστεροειδή, ήταν στο πλαίσιο της αυξημένης αρτηριακής πίεσης που δεν υπήρχε στην περίπτωσή μας (13) . Αυτό αποκλείστηκε καθώς τα ευρήματα της μαγνητικής τομογραφίας δεν ήταν συνεπή με μια συγκεκριμένη αγγειακή περιοχή και φάνηκαν φυσιολογικές αρτηριακές και φλεβικές ροές στην αγγειακή απεικόνιση. Μια άλλη διαφορά είναι το σύνδρομο οπίσθιας αναστρέψιμης εγκεφαλοπάθειας που έχει αναφερθεί σε ασθενείς με SCD (13) (14) (15) (16) . Ωστόσο, είναι απίθανο στην περίπτωσή μας λόγω της σοβαρότητας της εγκεφαλικής βλάβης και της απουσίας κλασικών παραγόντων καθίζησης του συνδρόμου οπίσθιας αναστρέψιμης εγκεφαλοπάθειας όπως η υψηλή αρτηριακή πίεση. Το σύνδρομο ενεργοποίησης μακροφάγων θα μπορούσε επίσης να οδηγήσει σε οξεία νεκρωτική εγκεφαλική βλάβη. Ωστόσο, σχετίζεται με υψηλή φερριτίνη και χαμηλά τριγλυκερίδια κατά τη στιγμή της εγκεφαλοπάθειας, άλλους πολυσυστημικούς τραυματισμούς, τυπικά νευροπαθολογικά ευρήματα και υποτροπές με την πάροδο του χρόνου, που δεν σημειώθηκαν στον ασθενή μας (17) . Ο παρβοϊός Β19 έχει περιγραφεί ότι προκαλεί εγκεφαλοπάθεια σε δρεπανοκυτταρικούς ασθενείς. Σχετίζεται με απλαστική αναιμία. Προκάλεσε στίγματα αιμορραγιών στα βασικά γάγγλια, στην περικοιλιακή λευκή ουσία και κυρίως κατά μήκος του οπίσθιου βρεγματικού φλοιού. Αυτό αποδόθηκε στην επαγόμενη από τον παρβοϊό Β19 αγγειίτιδα (18) . Στον ασθενή μας, δεν υπήρχε κανένα σημάδι απλασίας ή κάποιο νευροακτινολογικό εύρημα μόλυνσης από παρβοϊό Β19. Τέλος, οξεία εγκεφαλίτιδα έχει παρατηρηθεί σε ασθενείς με SCD στο πλαίσιο αρτηριακής υποξαιμίας από λιπώδη εμβολή, πνευμονική εμβολή, αιφνίδια αναιμία ή οξύ θωρακικό σύνδρομο λόγω πνευμονίας (19) . Αυτό αποκλείστηκε καθώς ο ασθενής δεν είχε κλινικά ή ακτινολογικά σημεία οξέος θωρακικού συνδρόμου ή εμβολής και δεν υπήρχε αρτηριακή υποξαιμία. Η οξεία αιμορραγική εγκεφαλομυελίτιδα έχει περιγραφεί σε παιδιατρικούς ασθενείς μετά από επεισόδια ADEM ή παρόμοια με ADEM (20, 21) . Το AHEM είναι η πιο εύλογη διάγνωση στους ασθενείς μας με βάση την κλινική και ακτινολογική εικόνα, το προηγούμενο επεισόδιο τύπου ADEM και τον αποκλεισμό άλλων αιτιολογιών οξείας εγκεφαλοπάθειας. Άλλοι ασθενείς με AHEM έχουν περιγραφεί στο πλαίσιο SCD (7, 19) . Πολλές επιλογές θεραπείας έχουν χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία του AHEM. από αυτά, τα IV στεροειδή έχουν συσχετιστεί με την επιβίωση μετά από επιθετική θεραπεία υψηλής δόσης κορτικοστεροειδών (5) (6) (7) (8) (9) (22) (23) (24) (25) .Αυτοσωματικές κυρίαρχες μεταλλάξεις ( με ατελή διείσδυση) στο RANBP2 έχουν συσχετιστεί με ευαισθησία σε νεκρωτική εγκεφαλοπάθεια που προκαλείται από μόλυνση (26, 27) . Προηγουμένως υγιείς ασθενείς με παθογόνες μεταλλάξεις στο RANBP2 μπορεί να παρουσιάσουν οξεία εγκεφαλοπάθεια και σπασμούς στο πλαίσιο μιας λοίμωξης, με την απεικόνιση του εγκεφάλου να αποκαλύπτει συμμετοχή του εγκεφαλικού στελέχους, του θαλάμου, της πουταμίνας, της παρεγκεφαλίδας και των εξωτερικών καψουλών και της κλειστής κοιλότητας (10) . Ο ασθενής μας έχει παρόμοια παρουσίαση και απεικονιστικά χαρακτηριστικά με τη νεκρωτική εγκεφαλοπάθεια που προκαλείται από λοίμωξη, συμπεριλαμβανομένης της αμφοτερόπλευρης θαλαμικής προσβολής. Η σπάνια ετερόζυγη παραλλαγή που δεν είχε αναφερθεί προηγουμένως που εντοπίσαμε στο RANBP2 επηρεάζει ένα πολύ διατηρημένο αμινοξύ και προβλέπεται επιβλαβής χρησιμοποιώντας εργαλεία silico (ένα εργαλείο πρόβλεψης που εκτελεί μια γρήγορη βιοπληροφορική ανάλυση που μπορεί να προβλέψει την παθογένεια μιας παραλλαγής με βάση την αλλαγή σε ένα αμινοξύ). Είναι πιθανό αυτή η παραλλαγή να είναι παθογόνος και υπεύθυνη για τον κλινικό φαινότυπο. Υπάρχει μια επικάλυψη μεταξύ των διαγνωστικών κριτηρίων του AHEM και εκείνων της οξείας αιμορραγικής εγκεφαλοπάθειας (25, 26) που καθιστά δυνατό και τις δύο οντότητες να αποτελούν μέρος του ίδιου παθοφυσιολογικού συνεχούς. Η RANBP2 είναι μια πρωτεΐνη που παίζει σημαντικό ρόλο στην ενεργειακή ομοιόσταση των νευρωνικών κυττάρων (28) . Ως εκ τούτου, η δυσλειτουργία του RANBP2 μπορεί να κάνει τα νευρωνικά κύτταρα πολύ ευάλωτα σε ενεργειακή ανεπάρκεια και νέκρωση όταν εκτίθενται σε φλεγμονώδη ή άλλα στρες, όπως αυτά που εμπλέκονται στο AHEM. Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις συστάσεις της θεσμικής μας επιτροπής δεοντολογίας. Ελήφθη γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση από όλους τους συμμετέχοντες για τη δημοσίευση. Όλοι οι συγγραφείς συμμετείχαν στη συλλογή των δεδομένων, στο σχεδιασμό του άρθρου και στη συζήτηση και την επεξεργασία του χειρογράφου. ΑΠΟΔΕΙΞΕΙΣ Ευχαριστούμε τον Δρ. C. Guiraut για τη βοήθειά τους. Είμαστε ευγνώμονες στο Hoppenheim Fund από το Montreal Children Hospital Foundation. Ο πρώτος συγγραφέας αυτού του άρθρου έλαβε υποτροφία από το Hoppenheim Fund, Montreal Children Hospital Foundation (2016). Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Heart and Stroke Foundation του Καναδά (αριθμός επιχορήγησης: G-14-0005756) και το Foundation of Stars.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 3403, "text": "πρωτεΐνη πυρηνικών πόρων" } ], "id": 3034, "question": "Τι είναι το RANBP2;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Νέα ισοξαζολιδίνη-συζεύγματα κιναζολινονών—σύνθεση, αντιική και κυτταροστατική δράσηhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6273226/SHA: eefddcf51f8426ecaa9e3aceb. Andrei, Graciela; Schols, Dominique; Snoeck, Robert; Grabkowska-Drużyc, Magdalena Ημερομηνία: 2016-07-22DOI: 10.3390/molecules21070959Άδεια χρήσης: cc-byAbstract: Μια νέα σειρά (3-διαιθοξυφωσφορυλ)ισοξαζολιδινών έχουν υποκατασταθεί από την κουζοκυκλοδινοποίηση διαφόρων, με τη συνένωση των 1,339, με διάφορα μεθυλ-C-(διαιθοξυφωσφορυλ)νιτρόνη με Ν3-υποκατεστημένες 2-βινυλ-3Η-κιναζολιν-4-όνες. Όλες οι ισοξαζολιδίνες αξιολογήθηκαν για αντιική δράση έναντι ενός ευρέος φάσματος ιών DNA και RNA. Οι ισοξαζολιδίνες trans-11f/cis-11f (90:10), trans-11h και trans-11i/cis-11i (97:3) έδειξαν ασθενή δραστηριότητα (EC(50) = 6,84, 15,29 και 9,44 μΜ) προς το VZV (TK (+) στέλεχος) το οποίο ήταν μόνο μία τάξη μεγέθους χαμηλότερο από αυτό της ακυκλοβίρης που χρησιμοποιήθηκε ως φάρμακο αναφοράς. Τα φωσφονικά trans-11b/cis-11b (90:10), trans-11c, trans-11e/cis-11e (90:10) και trans-11g εμφανίστηκαν ελαφρώς ενεργά έναντι του κυτταρομεγαλοϊού (EC(50) = 27–45 μM) . Οι ενώσεις που περιέχουν υποκαταστάτες βενζυλίου στο Ν3 στον σκελετό της κιναζολινόνης εμφάνισαν ελαφρά αντιπολλαπλασιαστική δράση προς τα δοκιμασμένα απαθανατισμένα κύτταρα με IC(50) στην περιοχή 21–102 μM. Κείμενο: Οι ετερόκυκλοι που περιέχουν άζωτο αποτελούν τον πυρήνα των φυσικών προϊόντων (π.χ. αλκαλοειδών). υπάρχουν επίσης σε πολλά φαρμακοφόρα καθώς και σε πολυάριθμα φάρμακα που κυκλοφορούν στο εμπόριο. Μεταξύ αυτών, οι κιναζολίνες και οι κιναζολινόνες έχουν τραβήξει ιδιαίτερη προσοχή λόγω του ευρέος φάσματος βιολογικών δράσεων των παραγώγων τους, συμπεριλαμβανομένων των ηρεμιστικών [1] [2] [3] , των αντικαρκινικών [4] [5] [6] [7] , των αντιικών [7] 8] [9] [10] [11] [12] , αντιβακτηριδιακό [13] [14] [15] , αντιμυκητιακό [15, 16] , αντιφλεγμονώδες [15, [17] [18] [19] και αντιινωτικό [20, 21] δραστηριότητες. Έχουν δημοσιευτεί αρκετές ανασκοπήσεις που επικεντρώνονται στις συνθετικές στρατηγικές και τις βιολογικές δραστηριότητες αυτών των ενώσεων [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] . Ο σημαντικός αντίκτυπος των διαφόρων λειτουργικών ομάδων που είναι εγκατεστημένες σε πλαίσια κιναζολίνης/κιναζολινόνης στις φαρμακολογικές ιδιότητες έχει αποδειχθεί. Τις τελευταίες δεκαετίες έχουν ληφθεί αρκετές ενώσεις που περιέχουν το πλαίσιο κιναζολίνης-4-όνης, οι οποίες εμφάνιζαν πολλά υποσχόμενες αντικαρκινικές καθώς και αντιικές ιδιότητες (Εικόνα 1). Περαιτέρω, μερικές βιολογικά ενεργές υποκατεστημένες κιναζολιν-4(3Η)-όνες απομονώθηκαν από διάφορα είδη μυκήτων και βακτηρίων. Για παράδειγμα, η 2-(4-υδροξυβενζυλ)κιναζολιν-4(3Η)-όνη (1) βρέθηκε σε έναν εντομοπαθογόνο μύκητα Isaria farinosa και αναγνωρίστηκαν οι ισχυρές ανασταλτικές ιδιότητές του στην αντιγραφή του ιού του μωσαϊκού του καπνού (TMV) [30]. ενώ το 2-(4-υδροξυβενζοϋλ) ανάλογό του 2 που υπήρχε σε μύκητες από το γένος Penicillium φάνηκε ελαφρώς μόνο ενεργό έναντι του TMV [30] . Επιπλέον, η ένωση 1 εμφάνισε σημαντική κυτταροτοξικότητα προς διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές [31, 32]. Κιναζολινόνη 3 που απομονώθηκε από Streptomyces sp. εμφανίστηκε κυτταροτοξικό έναντι των κυττάρων Vero [33] . Πολύ πρόσφατα ελήφθη το συνθετικό ανάλογο 4 που περιέχει πυριδίνη και τα 3-υποκατεστημένα παράγωγά του 5 και 6 και αποκαλύφθηκε η ελαφρά δράση τους έναντι του ιού της γρίπης Α [34] . Από την άλλη πλευρά, διάφορες 2,3-διυποκατεστημένες κιναζολιν-4(3Η)-όνες, συμπεριλαμβανομένων των ενώσεων 7-10, έχει βρεθεί ότι διαθέτουν αντικαρκινική δράση [35] . αποκαλύφθηκε ελαφρά δράση κατά του ιού της γρίπης Α [34] . Από την άλλη πλευρά, διάφορες 2,3-διυποκατεστημένες κιναζολιν-4(3Η)-όνες, συμπεριλαμβανομένων των ενώσεων 7-10, έχει βρεθεί ότι διαθέτουν αντικαρκινική δράση [35] . Σε συνέχιση των μελετών μας σχετικά με την αντιική και κυτταροστατική δράση των αναλόγων ισοξαζολιδίνης των αναλόγων C-νουκλεοζίτη, σχεδιάσαμε μια νέα σειρά ενώσεων του γενικού τύπου 11 που περιέχει ένα υποκατεστημένο τμήμα κιναζολινόνης ως ψευδή νουκλεοβάση στο C5 στον δακτύλιο ισοξαζολιδίνης και τη διαιτοξική συνάρτηση επισυνάπτεται στο C3. Η συνθετική μας στρατηγική για τις ενώσεις trans-11/cis-11 βασίζεται στην 1,3-διπολική κυκλοπροσθήκη Ν-μεθυλ-C-(διαιθοξυφωσφορυλ)νιτρόνης 12 [36] με 2-βινυλ-3Η-κιναζολιν-4-όνες 13 υποκατεστημένες στη Ν3 (Σχήμα 1). Σχέδιο 1. Ρετροσύνθεση φωσφονικών (ισοξαζολιδινυλ) Οι trans-11/cis-11.2-βινυλ-3Η-κιναζολιν-4-όνες 13 τροποποιημένες σε Ν3 με υποκατεστημένες βενζυλικές ομάδες συντέθηκαν από το εμπορικά διαθέσιμο 2-αμινοβενζαμίδιο (14) με ακυλίωση με ακυλορροπιονυλοχλ. με κυκλοποίηση και αφυδροαλογόνωση για να παρασκευαστεί η 2-βινυλ-3Ηκιναζολιν-4-όνη (13a) ως βασικό ενδιάμεσο [37] και μια επακόλουθη αντίδραση με υποκατεστημένα βενζυλοβρωμίδια 13b-i [38] (Σχήμα 2). Επιπλέον, οι ενώσεις 13j (R = Me) και 13k (R = Et) ελήφθησαν επίσης με σκοπό να προσδιοριστεί η επίδραση του βενζυλικού υποκαταστάτη στη βιολογική δραστηριότητα των σχεδιασμένων ισοξαζολιδινών trans-11/cis-11. Στα φάσματα 1H-NMR των ενώσεων, παρατηρήθηκαν χαρακτηριστικά σήματα 13a-k για πρωτόνια βινυλίου στα 6,94-5,59 ppm (τρεις διπλές διπλές). Σε συνέχιση των μελετών μας σχετικά με την αντιική και κυτταροστατική δράση των αναλόγων ισοξαζολιδίνης των αναλόγων C-νουκλεοζίτη, σχεδιάσαμε μια νέα σειρά ενώσεων του γενικού τύπου 11 που περιέχει ένα υποκατεστημένο τμήμα κιναζολινόνης ως ψευδή νουκλεοβάση στο C5 στον δακτύλιο ισοξαζολιδίνης και τη διαιτοξική συνάρτηση επισυνάπτεται στο C3. Η συνθετική μας στρατηγική για τις ενώσεις trans-11/cis-11 βασίζεται στην 1,3-διπολική κυκλοπροσθήκη Ν-μεθυλ-C-(διαιθοξυφωσφορυλ)νιτρόνης 12 [36] με 2-βινυλ-3Η-κιναζολιν-4-όνες 13 υποκατεστημένες στη Ν3 (Σχήμα 1). αποκαλύφθηκε ελαφρά δράση κατά του ιού της γρίπης Α [34] . Από την άλλη πλευρά, διάφορες 2,3-διυποκατεστημένες κιναζολιν-4(3Η)-όνες, συμπεριλαμβανομένων των ενώσεων 7-10, έχει βρεθεί ότι διαθέτουν αντικαρκινική δράση [35] . Σε συνέχιση των μελετών μας σχετικά με την αντιική και κυτταροστατική δράση των αναλόγων ισοξαζολιδίνης των αναλόγων C-νουκλεοζίτη, σχεδιάσαμε μια νέα σειρά ενώσεων του γενικού τύπου 11 που περιέχει ένα υποκατεστημένο τμήμα κιναζολινόνης ως ψευδή νουκλεοβάση στο C5 στον δακτύλιο ισοξαζολιδίνης και τη διαιτοξική συνάρτηση επισυνάπτεται στο C3. Η συνθετική μας στρατηγική για τις ενώσεις trans-11/cis-11 βασίζεται στην 1,3-διπολική κυκλοπροσθήκη Ν-μεθυλ-C-(διαιθοξυφωσφορυλ)νιτρόνης 12 [36] με 2-βινυλ-3Η-κιναζολιν-4-όνες 13 υποκατεστημένες στη Ν3 (Σχήμα 1). Σχέδιο 1. Ρετροσύνθεση φωσφονικών (ισοξαζολιδινυλ) Οι trans-11/cis-11.2-βινυλ-3Η-κιναζολιν-4-όνες 13 τροποποιημένες σε Ν3 με υποκατεστημένες βενζυλικές ομάδες συντέθηκαν από το εμπορικά διαθέσιμο 2-αμινοβενζαμίδιο (14) με ακυλίωση με ακυλορροπιονυλοχλ. με κυκλοποίηση και αφυδροαλογόνωση για να παρασκευαστεί η 2-βινυλ-3Ηκιναζολιν-4-όνη (13a) ως βασικό ενδιάμεσο [37] και μια επακόλουθη αντίδραση με υποκατεστημένα βενζυλοβρωμίδια 13b-i [38] (Σχήμα 2). Επιπλέον, οι ενώσεις 13j (R = Me) και 13k (R = Et) ελήφθησαν επίσης με σκοπό να προσδιοριστεί η επίδραση του βενζυλικού υποκαταστάτη στη βιολογική δραστηριότητα των σχεδιασμένων ισοξαζολιδινών trans-11/cis-11. Στα φάσματα 1H-NMR των ενώσεων, παρατηρήθηκαν χαρακτηριστικά σήματα 13a-k για πρωτόνια βινυλίου στα 6,94-5,59 ppm (τρεις διπλές διπλές). Σχέδιο 1. Ρετροσύνθεση φωσφονικών (ισοξαζολιδινυλ) Οι trans-11/cis-11.2-βινυλ-3Η-κιναζολιν-4-όνες 13 τροποποιημένες σε Ν3 με υποκατεστημένες βενζυλικές ομάδες συντέθηκαν από το εμπορικά διαθέσιμο 2-αμινοβενζαμίδιο (14) με ακυλίωση με 3-προπυλο-ιονικό χλωρίδιο που ακολουθείται από κυκλοποίηση και αφυδροαλογόνωση για να παρασκευαστεί η 2-βινυλ-3Η-κιναζολιν-4-όνη (13a) ως βασικό ενδιάμεσο [37] και μια επακόλουθη αντίδραση με υποκατεστημένα βενζυλοβρωμίδια 13b-i [38] (Σχήμα 2). Επιπλέον, οι ενώσεις 13j (R = Me) και 13k (R = Et) ελήφθησαν επίσης με σκοπό να προσδιοριστεί η επίδραση του βενζυλικού υποκαταστάτη στη βιολογική δραστηριότητα των σχεδιασμένων ισοξαζολιδινών trans-11/cis-11. Στα φάσματα 1H-NMR των ενώσεων, παρατηρήθηκαν χαρακτηριστικά σήματα 13a-k για πρωτόνια βινυλίου στα 6,94-5,59 ppm (τρεις διπλές διπλές). Η 1,3-διπολική κυκλοπροσθήκη μιας νιτρόνης 12 με 2-βινυλοκιναζολίνες 13a-k οδήγησε στον σχηματισμό διαστερεοϊσομερών μιγμάτων 5-υποκατεστημένης (3-διαιθοξυφωσφορυλ)ισοξαζολιδινών trans-11 και cis-0%-18% με καλή ) διαστερεοεκλεκτικότητες (Σχήμα 3, Πίνακας 1). Οι αναλογίες διαστερεοϊσομερών cis/trans υπολογίστηκαν από φάσματα 31 P-NMR ακατέργαστων μιγμάτων αντίδρασης και επιβεβαιώθηκαν με την ανάλυση φασματικών δεδομένων 1H-NMR. Ακατέργαστα μίγματα κυκλοπροσαγωγών ισοξαζολιδίνης υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε καθαρισμό σε στήλες πυριτικής πηκτής. Ωστόσο, οι προσπάθειες απομόνωσης καθαρών διαστερεοϊσομερών ήταν καρποφόρες για το trans-11a. Οι σχετικές διαμορφώσεις των ισοξαζολιδινών trans-11a και cis-11a καθορίστηκαν με βάση τις προηγούμενες μελέτες μας στη στερεοχημεία της κυκλοπροσθήκης της Ν-μεθυλ-C-(διαιθοξυφωσφορυλ)νιτρόνης (11) με διάφορα βινυλαρύλια [39, 40] αφού παρατηρήθηκαν παρόμοια φασματικά μοτίβα 1H-NMR για τις αντίστοιχες σειρές trans-και cis-ισοξαζολιδινών. Εφόσον για την ένωση trans-11a εξήχθησαν επιτυχώς όλες οι απαραίτητες σταθερές σύζευξης από τα φάσματα 1H-και 13C-NMR, διεξήχθη λεπτομερής ανάλυση διαμόρφωσης με βάση αυτά τα δεδομένα {J(H3-H4α) = 9,3 Hz [41], J( Η3-Η4β) = 8. 3 Hz, J(H4α-P) = 9,9 Hz Η 1,3-διπολική κυκλοπροσθήκη μιας νιτρόνης 12 με 2-βινυλοκιναζολινόνες 13a-k οδήγησε στον σχηματισμό διαστερεοϊσομερών μιγμάτων 5-υποκατεστημένης (3-διαιθοξυξυφωσφορινυλ) και cis-11 με καλές (80%-88%) διαστερεοεκλεκτικότητες (Σχήμα 3, Πίνακας 1). Οι αναλογίες διαστερεοϊσομερών cis/trans υπολογίστηκαν από φάσματα 31 P-NMR ακατέργαστων μιγμάτων αντίδρασης και επιβεβαιώθηκαν με την ανάλυση φασματικών δεδομένων 1H-NMR. Ακατέργαστα μίγματα κυκλοπροσαγωγών ισοξαζολιδίνης υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε καθαρισμό σε στήλες πυριτικής πηκτής. Ωστόσο, οι προσπάθειες για απομόνωση καθαρών διαστερεοϊσομερών ήταν καρποφόρες για trans-11a (R = H), trans-11c (R = 2-NO 2 -C 6 H 4 -CH 2 ), trans-11 g (R = 3-F-C 6 H 4-CH2), trans-11h (R = 4-F-C6H4-CH2) και trans-11j (R = Me) μόνο. Τραπέζι 1 ). Οι αναλογίες διαστερεοϊσομερών cis/trans υπολογίστηκαν από φάσματα 31 P-NMR ακατέργαστων μιγμάτων αντίδρασης και επιβεβαιώθηκαν με την ανάλυση φασματικών δεδομένων 1H-NMR. Ακατέργαστα μίγματα κυκλοπροσαγωγών ισοξαζολιδίνης υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε καθαρισμό σε στήλες πυριτικής πηκτής. Ωστόσο, οι προσπάθειες απομόνωσης καθαρών διαστερεοϊσομερών ήταν καρποφόρες για trans-11a (R = H), trans-11c (R = 2-NO2-C6H4-CH2), trans-11g (R = 3-F-C6H4-CH2), trans -11h (R = 4-F-C6H4-CH2) και trans-11j (R = Me) μόνο. Οι σχετικές διαμορφώσεις των ισοξαζολιδινών trans-11a και cis-11a καθορίστηκαν με βάση προηγούμενες μελέτες μας σχετικά με τη στερεοχημεία της κυκλοπροσθήκης της Ν-μεθυλ-C-(διαιθοξυφωσφορυλ)νιτρόνης (12) με διάφορα βινυλαρύλια [39, 40] αφού παρόμοια 1 Η -Παρατηρήθηκαν φασματικά μοτίβα NMR για τις αντίστοιχες σειρές trans-και cis-ισοξαζολιδινών. Εφόσον για την ένωση trans-11a εξήχθησαν επιτυχώς όλες οι απαραίτητες σταθερές σύζευξης από τα φάσματα 1H-και 13C-NMR, διεξήχθη λεπτομερής ανάλυση διαμόρφωσης με βάση αυτά τα δεδομένα {J(H3-H4α) = 9,3 Hz [41], J( Η3-Η4β) = 8. 3 Hz, J(H4α-P) = 9,9 Hz Σχήμα 3. Σύνθεση ισοξαζολιδινών cis-11a-k και trans-11a-k. Αντίδραση και συνθήκες: α. τολουόλιο, 70˝C, 24 h. Οι σχετικές διαμορφώσεις των ισοξαζολιδινών trans-11a και cis-11a καθορίστηκαν με βάση προηγούμενες μελέτες μας σχετικά με τη στερεοχημεία της κυκλοπροσθήκης της Ν-μεθυλ-C-(διαιθοξυφωσφορυλ)νιτρόνης (12) με διάφορα βινυλαρύλια [39, 40] αφού παρόμοια 1 Η -Παρατηρήθηκαν φασματικά μοτίβα NMR για τις αντίστοιχες σειρές transand cis-ισοξαζολιδινών. Εφόσον για την ένωση trans-11a εξήχθησαν επιτυχώς όλες οι απαραίτητες σταθερές σύζευξης από τα φάσματα 1H-και 13C-NMR, διεξήχθη λεπτομερής ανάλυση διαμόρφωσης με βάση αυτά τα δεδομένα {J (H3-H4α) = 9,3 Hz [41] , J ( Η3-Η4β) = 8. 3 Hz, J (H4α-P) = 9,9 Hz [42, 43], J (H4β-P) = 16,9 Hz, J (H4α-H5) = 6,2 Hz, J (H4β-H5) = 8. 3 Hz, J (CCCP) = 8,5 Hz [44, 45] } και αποκάλυψε ότι ο δακτύλιος ισοξαζολιδίνης στο trans-11a υιοθετεί μια διαμόρφωση 3 Ε στην οποία η ομάδα διαιθοξυφωσφορυλίου βρίσκεται στην ισημερινή θέση του δακτυλίου ισοξαζολιδίνης ενώ ένας υποκαταστάτης κιναζολινόνης βρίσκεται ψευδοισημερινά (Εικόνα 2). Από την άλλη πλευρά, η cis διαμόρφωση του δευτερεύοντος ισομερούς καθορίστηκε από τις αντίστοιχες ζεύξεις [J (H3-H4α) = 9,0 Hz, J (H3-H4β) = 6,5 Hz, J (H4α-P) = 11,2 Hz, J ( H4β-P) = 20,0 Hz, J (H4α-H5) = 9,1 Hz, J (H4β-H5) = 3,9 Hz, J (CCCP) = 7. 3 Hz] που δείχνει τη διαμόρφωση 2 Ε του δακτυλίου ισοξαζολιδίνης (Εικόνα 2). Τα πρόσθετα επιχειρήματα για την υποστήριξη των εκχωρήσεών μας προκύπτουν από τη θωράκιση των πρωτονίων CH 3 CH 2 OP που παρατηρήθηκαν για το cis ισομερές (Δδ περίπου. 0,1 ppm) σε σύγκριση με το trans-11a. Επιπλέον, βρέθηκε ότι σε ένα φάσμα 1 H-NMR που λήφθηκε στο μίγμα 83:17 cisand trans-11a, το πρωτόνιο H-N στον δακτύλιο κιναζολινόνης του cis-11a αποκαλύφθηκε σημαντικά (Δδ = 0,7 ppm) σε σύγκριση με το trans ισομερές, πολύ πιθανό, ως αποτέλεσμα του σχηματισμού δεσμού υδρογόνου με το φωσφορυλοοξυγοναμίδιο, ένα φαινόμενο χωρικά επιτεύξιμο μόνο στο cis ισομερές. Δεδομένου ότι η εισαγωγή διαφόρων υποκαταστατών στο N3 του τμήματος κιναζολινόνης δεν έχει καμία επίδραση στο στερεοχημικό αποτέλεσμα του κυκλοπροσθήκη επομένως η διαμόρφωση όλων των κύριων ισοξαζολιδινών 11 εκχωρήθηκαν ως trans, και ως εκ τούτου δευτερεύουσες ως cis. Σχήμα 2 ). Τα πρόσθετα επιχειρήματα για την υποστήριξη των εκχωρήσεών μας προκύπτουν από τη θωράκιση των πρωτονίων CH3CH2OP που παρατηρήθηκαν για το ισομερές cis (Δδ περίπου. 0,1 ppm) σε σύγκριση με το trans-11a. Επιπλέον, βρέθηκε ότι σε ένα φάσμα 1H-NMR που λήφθηκε στο μείγμα 83:17 cis-και trans-11a, το πρωτόνιο Η-Ν στον δακτύλιο κιναζολινόνης του cis-11a αποκαλύφθηκε σημαντικά (Δδ = 0,7 ppm) όταν συγκρίθηκε με το trans ισομερές, πολύ πιθανό, ως αποτέλεσμα του σχηματισμού δεσμού υδρογόνου με το φωσφορυλο-οξυγοναμίδιο, ένα φαινόμενο χωρικά επιτεύξιμο μόνο στο cis ισομερές. Δεδομένου ότι η εισαγωγή διάφορων υποκαταστατών στο N3 του τμήματος κιναζολινόνης δεν έχει καμία επίδραση στο στερεοχημικό αποτέλεσμα του Συνεπώς, η διαμόρφωση κυκλοπροσθήκης όλων των κύριων ισοξαζολιδινών 11 εκχωρήθηκαν ως trans και ως εκ τούτου δευτερεύουσες ως cis. Ganciclovir, cidofovir, acyclovir, brivudin, zalcitabine, zanamivir, alovudine, amantadine, rimantadine, ριμπαβιρίνη, θειική δεξτράνη (μοριακό βάρος 10.000, DS-10000), mycophenolic acid, Hippeastrum hybrid. ως ενώσεις αναφοράς. Η αντιϊκή δράση εκφράστηκε ως EC50: η συγκέντρωση της ένωσης που απαιτείται για τη μείωση του σχηματισμού πλάκας του ιού (VZV) κατά 50% ή για τη μείωση της επαγόμενης από τον ιό κυτταροπαθογονικότητα κατά 50% (άλλοι ιοί). Αρκετές ισοξαζολιδίνες trans-11/cis-11 ήταν σε θέση να αναστέλλει ασθενώς την αντιγραφή των στελεχών TK + και TK − VZV με τιμές EC50 στην περιοχή 6,84-100 μM (Πίνακας 2). Μεταξύ αυτών, φωσφονικά Ganciclovir, cidofovir, acyclovir, brivudin, zalcitabine, zanamivir, alovudine, amantadine, rimantadine, ριμπαβιρίνη, θειική δεξτράνη (μοριακό βάρος 10.000, DS-10000), μυκοφαινολική οξύ UDA) χρησιμοποιήθηκαν ως ενώσεις αναφοράς. Η αντιική δράση εκφράστηκε ως EC50: η συγκέντρωση της ένωσης που απαιτείται για τη μείωση του σχηματισμού πλάκας του ιού (VZV) κατά 50% ή για τη μείωση της επαγόμενης από τον ιό κυτταροπαθογένεση κατά 50% (άλλοι ιοί). Οι ισοξαζολιδίνες trans-11/cis-11 ήταν ικανές να αναστείλουν ασθενώς την αντιγραφή των στελεχών TK+ και TKV ZV με τιμές EC50 στην περιοχή 6,84-100 μΜ (Πίνακας 2). Μεταξύ αυτών, φωσφονικά trans-11f/cis-11f (90:10) (R = 2-F-C 6 H 4 -CH 2 ) (EC 50 = 6,84 μΜ), trans-11h (R = 4-F-C 6 H 4 - CH2) (EC 50 = 15,29 μΜ), trans-11i/cis-11i (97:3) (R = 2,4-diF-C6H3-CH2) (EC 50 = 9,44 μΜ) ήταν τα περισσότερα ενεργό προς το στέλεχος TK + VZV Oka, ενώ δεν παρουσιάζει δραστηριότητα προς το στέλεχος TK´VZV. Η δραστικότητα αυτών των ισοξαζολιδινών trans-11/cis-11 έναντι του στελέχους TK + VZV Oka ήταν 8 έως 22 φορές χαμηλότερη από εκείνη του φαρμάκου αναφοράς acyclovir. Από την άλλη πλευρά, οι τιμές EC 50 για το στέλεχος TK´VZV 07-1 (το οποίο είναι ένα ανθεκτικό στέλεχος στην ακυκλοβίρη) των φωσφονικών trans-11e/cis-11e (90:10) (R = 4-NO 2 -C 6H4-CH2) (EC 50 = 42,87 μΜ) και trans-11k/cis-11k (97:3) (R = Et) (EC 50 = 41,57 μΜ) ήταν συγκρίσιμα με αυτό της ακυκλοβίρης (EC 50 = 39,69 μΜ). Αυτά τα παράγωγα έδειξαν παρόμοια EC 50 για τα στελέχη TK + και TK´VZV και επομένως η ισχύς τους έναντι του TK + VZV ήταν περίπου 50 φορές χαμηλότερη σε σύγκριση με την ακυκλοβίρη. Επιπλέον, οι ενώσεις trans-11b/cis-11b (90:10) ( R = C 6 H 5 - CH 2 ), trans-11c (R = 2-NO 2 - C 6 H 4 - CH 2 ), trans-11e/cis-11e (90:10) (R = 4-NO 2 -C 6 H 4 -CH 2 ) και trans-11g (R = 3-F-C 6 H 4 -CH 2 ) έδειξαν κάποια δράση έναντι του ανθρώπινου κυτταρομεγαλοϊού (EC 50 = 27-45 μΜ), αν και ήταν λιγότερο δραστικά από τη γκανσικλοβίρη και Το cidofovir χρησιμοποιείται ως ενώσεις αναφοράς (Πίνακας 3). Κανένα από τα φωσφονικά παράγωγα που περιγράφονται εδώ δεν έδειξε δραστικότητα έναντι των άλλων δοκιμασμένων ιών DNA και RNA. Η 50% κυτταροστατική ανασταλτική συγκέντρωση (IC50) που προκαλεί 50% μείωση στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό προσδιορίστηκε έναντι της λευχαιμίας ποντικού L1210, του CEM ανθρώπινου λεμφοκυττάρου, του ανθρώπινου καρκινώματος του τραχήλου της μήτρας HeLa και των απαθανατισμένων ανθρώπινων μικροαγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων του δέρματος (HMEC-1). Οι ισοξαζολιδίνες trans-11a (R = H) και trans-11j (R = Me) δεν ανέστειλαν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό στην υψηλότερη δοκιμασμένη συγκέντρωση (δηλ. 250 μΜ), ενώ η trans-11k/cis-11k (97:3) (R = Et) εμφανίστηκε ελαφρώς κυτταροστατική προς τις δοκιμασμένες κυτταρικές σειρές (IC50 = 85-101 μΜ). Από την άλλη πλευρά (Πίνακας 4, καταχωρήσεις b έως i), ενώσεις που έχουν υποκαταστάτες βενζυλίου στο Ν3 στο τμήμα κιναζολινόνης έδειξαν χαμηλότερες τιμές IC50 (IC 50 = 21-102 μΜ) υποδεικνύοντας έτσι ότι η εγκατάσταση λειτουργικών ομάδων βενζυλίου ήταν κερδοφόρα για ανασταλτική ιδιότητες. Πίνακας 4 . Ανασταλτική δράση των δοκιμασμένων ενώσεων κατά του πολλαπλασιασμού της λευχαιμίας ποντικού (L1210), των ανθρώπινων Τ-λεμφοκυττάρων (CEM), του ανθρώπινου καρκινώματος του τραχήλου της μήτρας (HeLa) και των απαθανατισμένων ανθρώπινων μικροαγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων του δέρματος (HMEC-1). Στο διάλυμα της 2-βινυλ-3Η-κιναζολιν-4-όνης (13a, 1,00 mmol) σε ακετονιτρίλιο (15 mL) προστέθηκε ανθρακικό κάλιο (3,00 mmol). Μετά από 15 λεπτά προστέθηκε το αντίστοιχο βενζυλοβρωμίδιο (1,10 mmol) και το μίγμα της αντίδρασης αναδεύτηκε υπό κάθετο ψυκτήρα για 4 ώρες. Ένας διαλύτης απομακρύνθηκε και το υπόλειμμα εκχυλίστηκε με νερό (3ˆ10 mL). Μια οργανική στιβάδα ξηράνθηκε (MgS04), συμπυκνώθηκε και το ακατέργαστο προϊόν καθαρίστηκε σε στήλη πυριτικής πηκτής με μίγμα μεθυλενοχλωριδίου: εξανίου (7:3, ν/ν) ακολουθούμενη από κρυστάλλωση (χλωροφόρμιο-πετρελαϊκός αιθέρας) για να δώσει καθαρό κιναζολινόνες 13b-e και 13g-i. 133,57, 128,60, 128,28, 128,25, 127,67, 126,60, 123,81, 123,61, 115,59, 68,32 (s, N-CH2). Πρωκτικός. Υπολογ. για C17 Στο διάλυμα της 2-βινυλ-3Η-κιναζολιν-4-όνης (13a, 1,00 mmol) σε ακετονιτρίλιο (15 mL) προστέθηκε ανθρακικό κάλιο (3,00 mmol). Μετά από 15 λεπτά. Προστέθηκε ιωδομεθάνιο (2,00 mmol) ή ιωδοαιθάνιο (1,10 mmol) και το μίγμα της αντίδρασης αναδεύτηκε στους 60°C για 5 ώρες. Ο διαλύτης απομακρύνθηκε και ένα υπόλειμμα εκχυλίστηκε με νερό (3ˆ10 mL). Η οργανική στιβάδα ξηράνθηκε (MgS04), συμπυκνώθηκε και το ακατέργαστο προϊόν καθαρίστηκε σε στήλη πυριτικής πηκτής με μίγμα μεθυλενοχλωριδίου:εξανίου (7:3, ν/ν) ακολουθούμενη από κρυστάλλωση (χλωροφόρμιο: πετρελαϊκός αιθέρας) για να δώσει καθαρές κιναζολινόνες 13j [35] ή 13k.3-Μεθυλ-2-βινυλκιναζολιν-4(3Η)-όνη (13j). Άμορφο στερεό, σ.τ. = 122˝C-124˝C (αναφορά [35] m.p. = 123˝C-125˝C). Ένα διάλυμα της νιτρόνης 12 (1,0 mmol) και της αντίστοιχης βινυλοκιναζολινόνης (1,0 mmol) σε τολουόλιο (2 mL) αναδεύτηκε στους 70°C μέχρι την εξαφάνιση (TLC) της αρχικής νιτρόνης. Όλα τα πτητικά απομακρύνθηκαν υπό κενό και τα ακατέργαστα προϊόντα υποβλήθηκαν σε χρωματογραφία σε στήλες πυριτικής πηκτής με μίγματα χλωροφορμίου/μεθανόλης (100:1, 50:1, 20:1, ν/ν) ως διαλύτες έκλουσης. Διαιθυλ trans-(2-μεθυλ) -5-(4-οξο-3,4-διυδροκιναζολιν-2-υλ)ισοξαζολιδιν-3-υλ)φωσφονικό (trans-11a). Κιτρινωπό λάδι; IR (φιλμ, cm'1) ν μέγ.: 3085, 2980, 2929, 2782, 1687, 1610, 1469, 1331, 1132, 1098, 1052, 13 Διαιθυλ trans-(2-μεθυλ-5- Νιτροβενζυλ)-4-οξο-3,4-διυδροκιναζολιν-2-υλ)ισοξαζολιδιν-3-υλ)-φωσφονικό (trans-11d). Τα δεδομένα που σημειώνονται παρακάτω αντιστοιχούν σε ένα μίγμα 92:8 trans-11d και cis-11d. Ένα κιτρινωπό λάδι. IR (φιλμ, cm´1) ν μέγιστο : 3070, 2982, 2930, 2910, 1620, 1574, 1531, 1497, 1415, 1298, 1103, 1025, 774", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 4653, "text": "κιναζολιν-4-όνη" } ], "id": 3039, "question": "Οι ενώσεις από ποιο πλαίσιο έχουν δείξει πολλά υποσχόμενες αντικαρκινικές και αντιικές ιδιότητες;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Επιδημιολογία της λοίμωξης HBoV1 και σχέση με μετεωρολογικές συνθήκες σε νοσηλευόμενους παιδιατρικούς ασθενείς με οξεία αναπνευστική νόσο: μια 7ετής μελέτη σε μια υποτροπική περιοχή Liu, Wen-Kuan; Liu, Qian; Chen, De-Hui; Tan, Wei-Ping; Cai, Yong; Qiu, Shu-Yan; Xu, Duo; Li, Chi; Li, Xiao; Lin, Zheng-Shi; Zhou, RongDate: 2018-07-16DOI: 10.1186/s12879-018-3225-3Άδεια χρήσης: cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Ο ανθρώπινος ιός βοκαΐας 1 (HBoV1) είναι μια σημαντική αιτία της οξείας αναπνευστικής νόσου και της επιδημίας οι μετεωρολογικές συνθήκες σχετικά με τη μόλυνση δεν είναι πλήρως κατανοητές. Για να διερευνηθεί η κατανομή του HBoV1 και να προσδιοριστεί η επίδραση των μετεωρολογικών συνθηκών, μελετήθηκαν νοσηλευόμενοι παιδιατρικοί ασθενείς σε μια υποτροπική περιοχή της Κίνας. ΜΕΘΟΔΟΙ: Δείγματα από 11.399 νοσηλευόμενους παιδιατρικούς ασθενείς (≤14 ετών), με ARI δοκιμάστηκαν για HBoV1 και άλλα κοινά παθογόνα του αναπνευστικού με τη χρήση PCR σε πραγματικό χρόνο, μεταξύ Ιουλίου 2009 και Ιουνίου 2016. Επιπλέον, συλλέχθηκαν τοπικά μετεωρολογικά δεδομένα. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Από τους 11.399 ασθενείς που εξετάστηκαν, οι 5606 (49,2%) ήταν θετικοί σε τουλάχιστον ένα παθογόνο του αναπνευστικού. Διακόσια σαράντα οκτώ από τα 11.399 (2,2%) ήταν θετικά για μόλυνση από HBoV1. Η συνλοίμωξη ήταν συχνή σε ασθενείς με θετικούς HBoV1 (45,2%, 112/248). Σημαντική διαφορά στον επιπολασμό του HBoV1 βρέθηκε σε ασθενείς διαφορετικών ηλικιακών ομάδων (p < 0,001) και ο μέγιστος επιπολασμός βρέθηκε σε ασθενείς ηλικίας 7-12 μηνών (4,7%, 56/1203). Δύο κορυφές επικράτησης του HBoV1 βρέθηκαν το καλοκαίρι (μεταξύ Ιουνίου και Σεπτεμβρίου) και χειμώνα (μεταξύ Νοεμβρίου και Δεκεμβρίου). Ο επιπολασμός του HBoV1 συσχετίστηκε σημαντικά θετικά με τη μέση θερμοκρασία και αρνητικά με τη μέση σχετική υγρασία και η μέση θερμοκρασία τον προηγούμενο μήνα είχε καλύτερη ερμηνευτική ισχύ από την τρέχουσα μηνιαία θερμοκρασία. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Αυτή η μελέτη παρέχει μια καλύτερη κατανόηση των χαρακτηριστικών της λοίμωξης HBoV1 σε παιδιά σε υποτροπικές περιοχές. Τα δεδομένα από αυτή τη μελέτη παρέχουν χρήσιμες πληροφορίες για τον μελλοντικό έλεγχο και την πρόληψη των λοιμώξεων από HBoV1. Κείμενο: Ο ανθρώπινος ιός μποκαΐας 1 (HBoV1), που ανήκει στην οικογένεια Parvoviridae, εντοπίστηκε για πρώτη φορά σε αναπνευστικές εκκρίσεις παιδιών με νόσο του αναπνευστικού συστήματος το 2005 [1, 2 ] . Ο HBoV1 έχει επιβεβαιωθεί ως σημαντικό αναπνευστικό παθογόνο και εντοπίζεται σε λοιμώξεις του αναπνευστικού σε παιδιά και ενήλικες παγκοσμίως. Ο επιπολασμός της ανίχνευσης νουκλεϊκού οξέος HBoV1 κυμαίνεται από 1,5 έως 33% σε ασθενείς με οξεία αναπνευστική νόσο (ARI), σύμφωνα με διαφορετικές μελέτες [3] [4] [5] [6] [7] . Τα αποτελέσματα των ορολογικών εξετάσεων και των δοκιμών νουκλεϊκού οξέος είναι γενικά συνεπή [8] ​​[9] [10] [11] , δείχνοντας ότι η μόλυνση από τον HBoV1 είναι πολύ συχνή. Ο HBoV1 μπορεί να προκαλέσει τόσο νόσο του ανώτερου αναπνευστικού (URI) όσο και νόσο του κατώτερου αναπνευστικού (LRI) [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] . Η μόλυνση με HBoV1 μπορεί να οδηγήσει σε ανάπτυξη βήχα, ρινίτιδας, πυρετού και άλλων κοινών κλινικών συμπτωμάτων [15, 19]. Σε ορισμένες περιπτώσεις, μπορεί να προκαλέσει αναπνευστική δυσχέρεια, υποξία, συριγμό και άλλα σοβαρά αναπνευστικά συμπτώματα [18, 20]. Η κλινική διάγνωση είναι κυρίως πνευμονία, βρογχίτιδα, πνευμοθώρακας, μεσοθωρακικό εμφύσημα και μέση ωτίτιδα και άλλες επιπλοκές [18] [19] [20] [21] [22] . Σε ορισμένες περιπτώσεις, οι ασθενείς αναπτύσσουν σοβαρά συμπτώματα αναπνευστικής βλάβης, τα οποία μπορεί να είναι θανατηφόρα [21, 23]. Ο HBoV1 μπορεί να ανιχνευθεί σε δείγματα κοπράνων [24] , δείγματα αίματος [25, 26] , ούρα [27, 28] , εγκεφαλονωτιαίο υγρό [29] [30] [31] , νερό ποταμού [32] και λύματα [33, 34] , υποδεικνύοντας ότι ο HBoV1 μπορεί να σχετίζεται με μια ποικιλία ασθενειών. Τρέχουσες in vitro μελέτες που μοντελοποιούν καλλιέργειες επιθηλιακών κυττάρων αεραγωγού τύπου ιστού δείχνουν ότι η λοίμωξη από HBoV1 μπορεί να οδηγήσει σε διάσπαση του φραγμού της σφιχτής σύνδεσης, απώλεια βλεφαρίδων και υπερτροφία επιθηλιακών κυττάρων [35] [36] [37] , παρόμοια με τις αλλαγές στον ιστό τραυματισμού του πνεύμονα σε vivo. Επί του παρόντος δεν υπάρχει εμβόλιο ή ειδική θεραπεία για αυτόν τον ιό. Η πρόληψη και η θεραπεία ασθενειών που σχετίζονται με τον HBoV1 απαιτούν ακόμη περαιτέρω έρευνα. Ο επιπολασμός των αναπνευστικών ιών σχετίζεται με πολλούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένου του τοπικού κλίματος, που μπορεί να επηρεάσει την επιβίωση και την εξάπλωση των ιών [38] . Η μελέτη της επιδημιολογίας του HBoV1 και της σχέσης του με τις μετεωρολογικές συνθήκες θα βελτιώσει τη διάγνωση, τη θεραπεία, τον έλεγχο και την πρόληψη αυτού του ιού. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την επιδημιολογία της λοίμωξης HBoV1 σε παιδιά (≤14 ετών) που νοσηλεύονται με ARI σε υποτροπική περιοχή στην Κίνα για μια περίοδο 7 ετών. Επιπλέον, συλλέξαμε δεδομένα για το κλίμα για να προσδιορίσουμε εάν υπήρχε σχέση μεταξύ του επιπολασμού του HBoV1 και των μετεωρολογικών συνθηκών. Αυτή η μελέτη θα προσθέσει στα υπάρχοντα επιδημιολογικά δεδομένα για τον HBoV1 και τη σχέση του με τις κλιματικές συνθήκες σε υποτροπικές περιοχές και θα παίξει θετικό ρόλο στον έλεγχο και την πρόληψη του HBoV1. Οι τοποθεσίες μελέτης ήταν τρία τριτοβάθμια νοσοκομεία στο Guangzhou, στη νότια Κίνα (Γεωγραφικό μήκος: E112°57′ έως E114 03′; Γεωγραφικό πλάτος N22°26′ έως N23°56′). Κριτήρια συμπερίληψης ήταν οι παιδιατρικοί ασθενείς (≤14 ετών) που παρουσίασαν τουλάχιστον δύο από τα ακόλουθα συμπτώματα: βήχα, φαρυγγική δυσφορία, ρινική απόφραξη, ρινίτιδα, δύσπνοια ή που διαγνώστηκαν με πνευμονία με ακτινογραφία θώρακα την προηγούμενη εβδομάδα. Η ακτινογραφία θώρακος έγινε σύμφωνα με την κλινική κατάσταση του ασθενούς. Συλλέχθηκαν δείγματα επιχρίσματος λαιμού από τους εγγεγραμμένους ασθενείς μεταξύ Ιουλίου 2009 και Ιουνίου 2016 για έλεγχο ρουτίνας για ιούς του αναπνευστικού, Mycoplasma pneumoniae (MP) και Chlamydophila pneumoniae (CP). Τα δείγματα καταψύχθηκαν στους 2-8°C σε μέσο μεταφοράς ιού, μεταφέρθηκαν σε πάγο και αναλύθηκαν αμέσως ή αποθηκεύτηκαν στους -80°C πριν από την ανάλυση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15, 39] .Μετεωρολογικά δεδομένα για το Guangzhou, συλλέχθηκαν από τον Ιούλιο του 2009 έως τον Ιούνιο του 2016, από τη Μετεωρολογική Υπηρεσία της Κίνας, συμπεριλαμβανομένης της μηνιαίας μέσης θερμοκρασίας (°C), της μέσης σχετικής υγρασίας (%), των βροχοπτώσεων (mm), της μέσης ταχύτητας ανέμου (m/s), της μέσης ατμοσφαιρικής πίεσης (hPa), των μέσων ατμών πίεση (hPa), διάρκεια ηλιοφάνειας (h). PCR σε πραγματικό χρόνο για τον HBoV1 και την ανίχνευση κοινού αναπνευστικού παθογόνου DNA και RNA εξήχθησαν από τα αναπνευστικά δείγματα χρησιμοποιώντας το QIAamp DNA Mini Kit και QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Shanghai, Κίνα) , αντίστοιχα, σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Το Taqman PCR σε πραγματικό χρόνο για τον HBoV1 σχεδιάστηκε με βάση τη διατηρημένη περιοχή του γονιδίου NP1, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15] . Κοινά παθογόνα του αναπνευστικού, συμπεριλαμβανομένου του αναπνευστικού συγκυτιακού ιού (RSV), του ιού της γρίπης Α (InfA), του ιού της γρίπης Β (InfB), των τεσσάρων τύπων παραγρίπης (PIV1-4), του αδενοϊού (ADV), του εντεροϊού (EV), του ανθρώπινου μεταπνευμοϊού (HMPV). ), τέσσερα στελέχη ανθρώπινου κορωνοϊού (HCoV-229E, OC43, NL63 και HKU1), ανθρώπινου ρινοϊού (HRV), MP και CP ανιχνεύθηκαν ταυτόχρονα όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [40] . Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τεστ Chi-squared και ακριβή δοκιμή Fisher στο SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Η συσχέτιση με τα κλιματικά δεδομένα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση πολλαπλής γραμμικής παλινδρόμησης. Όλες οι δοκιμές ήταν δύο ουρών και μια τιμή p < 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Έντεκα χιλιάδες τριακόσιοι ενενήντα εννέα παιδιατρικοί ασθενείς (≤14 ετών) που νοσηλεύτηκαν με ARI εντάχθηκαν στη μελέτη μεταξύ Ιουλίου 2009 και Ιουνίου 2016. Η αναλογία ανδρών προς γυναίκες ήταν 1,82:1 (7361:4038) και η διάμεση ηλικία ήταν 1,75 έτη (διατεταρτημόριο εύρος 0,75-3,83). Συνολικά, το 86,5% (9857/11399) των ασθενών ήταν ηλικίας κάτω των 5 ετών. Και οι 11.399 ασθενείς εξετάστηκαν και για τα 18 παθογόνα που αναφέρθηκαν και 5606 (49,2%) ήταν θετικοί για ένα ή περισσότερα από αυτά τα παθογόνα (Πίνακας 1) και είχαν μέση ηλικία 1,50 έτη (διατεταρτημόριο εύρος 0,67-3,00). Οι αναλογίες ανδρών προς γυναίκες ήταν 1,94: 1 (3698:1908) σε ασθενείς θετικούς σε παθογόνο και 1,72: 1 (3663:2130) σε ασθενείς αρνητικούς σε παθογόνο (p = 0,002). Διακόσιοι σαράντα οκτώ από 11.399 ασθενείς ( Το 2,2%) βρέθηκε θετικό για λοίμωξη από HBoV1. Από τους θετικούς σε HBoV1 ασθενείς, 112 (45,2%) μολύνθηκαν ταυτόχρονα με άλλα παθογόνα, πιο συχνά με RSV (11,7%, 29/248) (Πίνακας 1). Η διάμεση ηλικία ήταν 1 έτος (διατεταρτημόριο εύρος 0,75-1,83). Η αναλογία ανδρών προς γυναίκες ήταν 2,54:1 (178:70) στους HBoV1-θετικούς ασθενείς και 1,81:1 (7183:3968) στους HBoV1-αρνητικούς ασθενείς (p = 0,019). Για να διευκρινιστεί η ηλικιακή κατανομή του HBoV1, οι ασθενείς χωρίστηκαν σε επτά ηλικιακές ομάδες. 0-3 μηνών, 4-6 μηνών, 7-12 μηνών, 1-2 ετών, 3-5 ετών, 6-10 ετών και 11-14 ετών. Υπήρξε σημαντική διαφορά στον επιπολασμό του HBoV1 σε ασθενείς σε διαφορετικές ηλικιακές ομάδες (p < 0,001) και ο μέγιστος επιπολασμός βρέθηκε σε ασθενείς ηλικίας 7-12 μηνών (4,7%, 56/1203) (Εικ. 1) Σε αυτή τη μελέτη, παρακολουθήσαμε τον επιπολασμό του HBoV1 σε ασθενείς (≤14 ετών) που νοσηλεύτηκαν με ARI από τον Ιούλιο. Συλλέξαμε μετεωρολογικά δεδομένα για το Guangzhou, συμπεριλαμβανομένης της μέσης μηνιαίας θερμοκρασίας, της μέσης σχετικής υγρασίας, των βροχοπτώσεων, της μέσης ταχύτητας ανέμου, του μέσου αέρα πίεση, μέση τάση ατμών και διάρκεια ηλιοφάνειας για μια περίοδο 7 ετών, για να διερευνηθεί η συσχέτιση μεταξύ μετεωρολογικών συνθηκών και επικράτησης του HBoV1. Το Guangzhou, το οποίο βρίσκεται στη νότια Κίνα (γεωγραφικό μήκος 112°57′ έως 114°3′, γεωγραφικό πλάτος 22°26′ έως 23°56′), έχει θαλάσσιο υποτροπικό κλίμα των μουσώνων. Μεταξύ Ιουλίου 2009 και Ιουνίου 2016, η μέση θερμοκρασία ήταν 21,8 ± 5,8°C (μέση ± τυπική απόκλιση), η υγρασία ήταν 77,2 ± 7,3%, η διάρκεια της ηλιοφάνειας ήταν 132,7 ± 59,5 ώρες, η ταχύτητα του ανέμου ήταν 2,2 m/s ± 0. 175,2 ± 165,9 mm, η πίεση αέρα ήταν 1005,6 ± 6,0 hPa και η τάση ατμών ήταν 21,3 h ± 7,4 hPa. Μεταξύ 2009 και 2016, η μέση θερμοκρασία από τον Μάιο έως τον Σεπτέμβριο ήταν μεγαλύτερη από 25°C (Εικ. 3) Για ανάλυση πολλαπλής γραμμικής παλινδρόμησης του επιπολασμού του HBoV1 και της συσχέτισης των μετεωρολογικών συνθηκών, ανεξάρτητες μεταβλητές της μέσης ατμοσφαιρικής πίεσης (προσαρμοσμένη R 2 = 0,793, p < 0,001) και της μέσης τάσης ατμών (προσαρμοσμένη R 2 = 0,929, p < 0,001), η οποία γραμμικά που σχετίζονται με τη μέση θερμοκρασία και η βροχόπτωση (προσαρμοσμένη R 2 = 0,278, p < 0,001), η οποία συσχετίστηκε ισχυρά με τη μέση σχετική υγρασία, αποκλείστηκαν. Οι ανεξάρτητες μεταβλητές για την τελική ανάλυση πολλαπλής γραμμικής παλινδρόμησης περιελάμβαναν τη μέση θερμοκρασία, τη μέση σχετική υγρασία, τη μέση ταχύτητα ανέμου και τις ώρες ηλιοφάνειας. Η επίδραση της θερμοκρασίας είχε καθυστέρηση, επομένως η μέση θερμοκρασία τον προηγούμενο μήνα (μέση θερμοκρασία 1 μήνα πριν) συμπεριλήφθηκε επίσης ως ανεξάρτητη μεταβλητή στην ανάλυση (Πίνακας 2). Καθιερώθηκαν και τα δύο μοντέλα παλινδρόμησης (p < 0,001) και οι προσαρμοσμένες τιμές R 2 ήταν 0,373 και 0,231 στη μέση θερμοκρασία στο μοντέλο του προηγούμενου μήνα και στο τρέχον μοντέλο μηνιαίας θερμοκρασίας, αντίστοιχα. Ο επιπολασμός του HBoV1 συσχετίστηκε θετικά με τη θερμοκρασία (συντελεστής = 0,259 στο τρέχον μοντέλο θερμοκρασίας (p = 0,002), συντελεστής = 0,328 στη μέση θερμοκρασία στο μοντέλο του προηγούμενου μήνα (p < 0,001)). Αντίθετα, ο επιπολασμός του HBoV1 συσχετίστηκε αρνητικά με τη σχετική υγρασία (συντελεστής = - 0,126 στο τρέχον μοντέλο θερμοκρασίας (p = 0,024), συντελεστής = - 0,083 στο μοντέλο καθυστέρησης θερμοκρασίας (p = 0,039)) (Πίνακας 2). Το ARI είναι ένα από τις πιο κοινές ανθρώπινες ασθένειες, που προκαλούνται κυρίως από διαφορετικούς αναπνευστικούς ιούς [41, 42] . Ένας από αυτούς τους ιούς, η λοίμωξη HBoV1, προκαλεί παγκόσμιες επιδημίες, έχει υψηλή επιβάρυνση για τη δημόσια υγεία και κυκλοφορεί με διαφορετικά πρότυπα σε διαφορετικές περιοχές [3] [4] [5] [6] [7] 43] . Γενικά, ο επιπολασμός των ιών ποικίλλει λόγω παραγόντων όπως η ανάλυση πολλαπλής γραμμικής παλινδρόμησης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον μηνιαίο επιπολασμό HBoV1 ως εξαρτημένη μεταβλητή, μέση μηνιαία θερμοκρασία (ή μέση θερμοκρασία τον προηγούμενο μήνα), μέση σχετική υγρασία, μέση ταχύτητα ανέμου και ηλιοφάνεια διάρκεια ως ανεξάρτητες μεταβλητές Τα δεδομένα που καταγράφονται με έντονους χαρακτήρες είναι εξαιρετικά σημαντική γεωγραφική θέση, κλιματικές συνθήκες, πληθυσμός και κοινωνική δραστηριότητα [38] . Η επιδημιολογία του HBoV1 σε εύκρατες περιοχές έχει περιγραφεί με περισσότερες λεπτομέρειες και έχει παρατηρηθεί υψηλή συχνότητα μόλυνσης σε παιδιά ηλικίας κάτω των 2 ετών τον χειμώνα και την άνοιξη [15, 16, 39, 44] . Για να περιγράψουμε την επιδημιολογία του HBoV1 σε Guangzhou, συλλέξαμε επιχρίσματα λαιμού από 11.399 παιδιά (≤14 ετών), που νοσηλεύτηκαν με ARI και παρακολουθήσαμε τον HBoV1 και άλλα κοινά παθογόνα του αναπνευστικού για μια περίοδο 7 ετών (Πίνακας 1). Στην τρέχουσα μελέτη, το 86,5% (9857/11399) των ασθενών ήταν ηλικίας κάτω των 5 ετών, με διάμεση ηλικία τα 1,75 έτη, υποδεικνύοντας ότι τα βρέφη και τα μικρά παιδιά κινδύνευαν περισσότερο από ARI, σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές [45, 46]. Συνολικά, το 49,2% (5606/11399) των ασθενών βρέθηκαν θετικοί για ένα ή περισσότερα παθογόνα του αναπνευστικού, το 2,2% (248/11399) των ασθενών εξετάστηκαν με λοίμωξη HBoV1 (Πίνακας 1). Ανιχνεύθηκε υψηλότερος επιπολασμός του HBoV1 σε άνδρες ασθενείς σε σύγκριση με γυναίκες ασθενείς (p = 0,019), σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [15, 16, 39, 44] . Η ταυτόχρονη μόλυνση με HBoV1 και άλλα παθογόνα είναι συχνή [14, 15]. Στη μελέτη μας, το 45,2% (112/248) των HBoV1 θετικών ασθενών ήταν επίσης θετικοί για άλλα παθογόνα (Πίνακας 1). Αυτό μπορεί να οφείλεται εν μέρει σε συμπίπτουσες επιδημίες του HBoV1 και άλλων παθογόνων παραγόντων. Στη μελέτη μας, η εποχιακή κατανομή του HBoV1 και η συνολική θετική κατανομή του παθογόνου ήταν συνεπείς, επιβεβαιώνοντας αυτό το συμπέρασμα (Εικ. 2) . Η τρέχουσα έρευνα δείχνει ότι η μόλυνση από τον HBoV1 μπορεί να οδηγήσει στην κατάρρευση της πρώτης γραμμής άμυνας του επιθηλίου των αεραγωγών [35] [36] [37] , γεγονός που μπορεί να οδηγήσει σε υψηλότερη ευαισθησία σε άλλα παθογόνα, εξηγώντας το υψηλό ποσοστό συν-μόλυνσης. Το εάν η ταυτόχρονη μόλυνση οδηγεί σε πιο σοβαρή ασθένεια είναι επί του παρόντος άγνωστο και απαιτείται περισσότερη έρευνα για να προσδιοριστεί αυτό. Τα χαρακτηριστικά της λοίμωξης HBoV1 είναι πιθανό να είναι ένα καλό μοντέλο για τη μελέτη των επιπτώσεων των συν-λοιμώξεων. Σε αυτή τη μελέτη, υπήρξε σημαντική διαφορά στον επιπολασμό του HBoV1 σε ασθενείς διαφορετικών ηλικιών (p < 0,001). Η πλειονότητα των λοιμώξεων από HBoV1 εμφανίστηκε σε ασθενείς ηλικίας κάτω των 2 ετών και η μέγιστη συχνότητα της λοίμωξης από HBoV1 εμφανίστηκε σε ασθενείς ηλικίας 7-12 μηνών (Εικ. 1) , σύμφωνα με προηγούμενες ορολογικές και επιδημιολογικές αναφορές για τον ιό [8-11, 15, 16, 39, 44]. Αυτό μπορεί να οφείλεται στο ότι το ανοσοποιητικό σύστημα των παιδιών είναι ακόμη υπό ανάπτυξη και τα μητρικά αντισώματα σταδιακά εξαφανίζονται σε αυτήν την ηλικιακή ομάδα. Η κατανομή του HBoV1 σε ασθενείς διαφορετικών ηλικιών θα αποτελέσει σημαντική αναφορά για μελλοντικά εμβόλια και έρευνα και ανάπτυξη νέων φαρμάκων, καθώς και για την παροχή σημαντικών δεδομένων για την πρόληψη και τον έλεγχο της νόσου. Πολλοί παράγοντες επηρεάζουν την επιδημιολογία των παθογόνων, όπως η γεωγραφική θέση και το τοπικό κλίμα . Το Guangzhou, μια κεντρική πόλη και κύριος κόμβος μεταφορών στη νότια Κίνα, βρίσκεται σε μια υποτροπική περιοχή. Το Guangzhou είναι ζεστό και έχει υψηλές ετήσιες βροχοπτώσεις, μακρά καλοκαίρια, σύντομους χειμώνες και η ετήσια βροχόπτωση και η υψηλή θερμοκρασία είναι σχεδόν στην ίδια περίοδο (Εικ. 3) . Σε αυτή τη μελέτη, παρατηρήθηκαν δύο κορυφές HBoV1 (Εικ. 2) . Οι μεγάλες κορυφές επικράτησης της μόλυνσης από τον HBoV1 σημειώθηκαν μεταξύ Ιουνίου και Σεπτεμβρίου κάθε έτους, που είναι οι καλοκαιρινοί μήνες στο Guangzhou, με μέσες θερμοκρασίες υψηλότερες από 25°C (Εικ. 3) . Μικρές κορυφές μόλυνσης από τον HBoV1 σημειώθηκαν το χειμώνα, μεταξύ Νοεμβρίου και Δεκεμβρίου κάθε έτους. Αυτή η εποχιακή κατανομή είναι παρόμοια με τον επιπολασμό σε υποτροπικές περιοχές που αναφέρθηκε προηγουμένως [47], αλλά διαφέρει από τις επιδημίες HBoV1 σε εύκρατες περιοχές, οι οποίες εμφανίζονται κυρίως το χειμώνα και την άνοιξη [15, 16, 39, 44], καθώς και από τροπικές περιοχές , όπως η Ινδία, όπου δεν έχει βρεθεί εμφανής εποχή επιδημίας [48] . Για την ανάλυση της συσχέτισης μεταξύ του επιπολασμού του HBoV1 και των μετεωρολογικών συνθηκών, πραγματοποιήθηκε ανάλυση πολλαπλής γραμμικής παλινδρόμησης, με τον μηνιαίο επιπολασμό HBoV1 ως εξαρτημένη μεταβλητή και μέση θερμοκρασία (ή μέση θερμοκρασία τον προηγούμενο μήνα), η μέση σχετική υγρασία, η μέση ταχύτητα ανέμου και η διάρκεια της ηλιοφάνειας ως ανεξάρτητες μεταβλητές (Πίνακας 2) . Καθιερώθηκαν και τα δύο μοντέλα παλινδρόμησης (p < 0,001) και η προσαρμοσμένη τιμή R 2 (0,373) του μοντέλου θερμοκρασίας dorp 1 μήνα ήταν μεγαλύτερη από την προσαρμοσμένη τιμή R 2 (0,231) του τρέχοντος μηνιαίου μοντέλου θερμοκρασίας, υποδεικνύοντας ότι η θερμοκρασία dorp 1 Το μοντέλο μήνα είχε καλύτερη επεξηγηματική ισχύ από το τρέχον μοντέλο μηνιαίας θερμοκρασίας. Και τα δύο μοντέλα έδειξαν ότι ο επιπολασμός του HBoV1 συσχετίστηκε σημαντικά με τη θερμοκρασία και τη σχετική υγρασία (Πίνακας 2). Αναλυτικά, ο επιπολασμός του HBoV1 συσχετίστηκε θετικά με τη θερμοκρασία, κάτι που είναι σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές [47, 49]. Αντίθετα, ο επιπολασμός του HBoV1 συσχετίστηκε αρνητικά με τη σχετική υγρασία, αυτό ήταν διαφορετικό από μια προηγούμενη αναφορά στο Suzhou [47] , η οποία μπορεί να σχετίζεται με την υψηλή υγρασία του Guangzhou (η μέση μηνιαία σχετική υγρασία ήταν 77,2 ± 7,3%) (Εικ. 3) . Είναι σύνηθες φαινόμενο ο επιπολασμός των παθογόνων να κυμαίνεται με την πάροδο του χρόνου λόγω ποικίλων παραγόντων. Σε αυτή τη μελέτη, ο επιπολασμός του HBoV1 ήταν σχετικά χαμηλός το 2013 έως το 2014. Μπορεί να σχετίζεται εν μέρει με τη σχετικά υψηλότερη μέση σχετική υγρασία κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου (Εικ. 3) . Οι κλιματικές συνθήκες μπορεί να επηρεάσουν την επιβίωση και την εξάπλωση των αναπνευστικών ιών, ωστόσο δεν βρέθηκε σημαντική γραμμική σχέση μεταξύ της μόλυνσης από HBoV1 και της ταχύτητας του ανέμου ή της διάρκειας της ηλιοφάνειας σε αυτή τη μελέτη (p > 0,05) (Πίνακας 2). Θα πρέπει να σημειωθούν ορισμένοι περιορισμοί αυτής της μελέτης. Πρώτον, επειδή η μελέτη μας επικεντρώθηκε κυρίως στην κυκλοφορία του HBoV1 σε νοσηλευόμενους ασθενείς με ARI, ο HBoV1 σε εξωτερικούς ασθενείς και στον ασυμπτωματικό πληθυσμό δεν συμπεριλήφθηκαν. Δεύτερον, πολλοί παράγοντες μπορούν να επηρεάσουν τις επιδημίες των ιών, η ανάλυση μετεωρολογικών δεδομένων από μόνη της μπορεί να μην χρησιμεύσει ως τελική οριστική ερμηνεία. Τρίτον, η μελέτη διεξήχθη μόνο σε τρία νοσοκομεία και μπορεί να μην είναι αντιπροσωπευτική του συνολικού πληθυσμού. Η μελέτη μας παρείχε μια καλύτερη κατανόηση της επιδημιολογίας του HBoV1 σε υποτροπικές περιοχές, συγκεκριμένα τις συσχετίσεις με τα κλιματικά δεδομένα. Αυτά τα δεδομένα θα είναι χρήσιμα για μελλοντικό έλεγχο και πρόληψη λοιμώξεων από τον HBoV1.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 1077, "text": "11.399" } ], "id": 3267, "question": "Πόσα δείγματα ελήφθησαν;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1119, "text": "49,2%" } ], "id": 3268, "question": "Ποιο ποσοστό ασθενών ήταν θετικοί σε τουλάχιστον ένα παθογόνο του αναπνευστικού;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1223, "text": "2,2%" } ], "id": 3269, "question": "Ποιο ποσοστό ασθενών βρέθηκαν θετικοί στον HBoV1;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2341, "text": "2005" } ], "id": 3270, "question": "Πότε εντοπίστηκε για πρώτη φορά ο HBoV1;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5422, "text": "≤14 ετών" } ], "id": 3272, "question": "Ποιες είναι οι ηλικίες των ασθενών σε αυτή τη μελέτη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7897, "text": "1,82:1" } ], "id": 3273, "question": "Ποια ήταν η αναλογία ανδρών προς γυναίκες για αυτήν τη μελέτη;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Αλληλουχία πλήρους γονιδιώματος και φυλογενετική ανάλυση στελεχών ανθρώπινου μεταπνευμοϊού από την Κένυα και τη Ζάμπιαhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6941262/SHA: f5ae3f66face323615df39d838000; Oketch, John W.; de Laurent, Zaydah R.; Phan, My V. T.; Agoti, Charles N.; Nokes, D. James; Cotten, Matthew Ημερομηνία: 2020-01-02DOI: 10.1186/s12864-019-6400-zΆδεια: cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Ο ανθρώπινος μεταπνευμοϊός (HMPV) είναι μια σημαντική αιτία οξείας αναπνευστικής νόσου των παιδιών. Η αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος επιτρέπει την καλύτερη αναγνώριση των γεγονότων μετάδοσης και των εστιών, κάτι που δεν είναι πάντα δυνατό με τις υπογονιδιωματικές αλληλουχίες. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Αναφέρουμε μια μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας επόμενης γενιάς με βάση το αμπλικόνιο 2 αντιδράσεων για τον προσδιορισμό των πλήρεις αλληλουχίες γονιδιώματος πέντε στελεχών HMPV, που αντιπροσωπεύουν τρεις υποομάδες (Α2, Β1 και Β2), απευθείας από κλινικά δείγματα. Εκτός από την αναφορά πέντε νέων γονιδιωμάτων HMPV από την Αφρική, εξετάσαμε τη γενετική ποικιλότητα και τα μοτίβα αλληλουχίας των δημοσίως διαθέσιμων γονιδιωμάτων HMPV. Βρήκαμε ότι η συνολική ταυτότητα της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων ήταν 71,3 και 80% για τις ομάδες HMPV Α και Β, αντίστοιχα, η ποικιλομορφία μεταξύ των ομάδων HMPV ήταν μεγαλύτερη σε επίπεδο αμινοξέων για τα γονίδια επιφανειακής πρωτεΐνης SH και G και πολλαπλές υποομάδες συνκυκλοφορούσαν σε διάφορες χώρες . Η σύγκριση των αλληλουχιών μεταξύ των ομάδων HMPV αποκάλυψε μεταβλητότητα στο μήκος της πρωτεΐνης G (219 έως 241 αμινοξέα) λόγω αλλαγών στη θέση του κωδικονίου λήξης. Η φυλογενετική ανάλυση σε όλο το γονιδίωμα έδειξε συμφωνία με τα μεμονωμένα σύνολα αλληλουχιών γονιδίων εκτός από τα γονίδια F και M2. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Αυτός είναι ο πρώτος γονιδιωματικός χαρακτηρισμός γονιδιωμάτων HMPV από Αφρικανούς ασθενείς. Κείμενο: Ο ανθρώπινος μεταπνευμοϊός (HMPV) είναι ένας μονόκλωνος ιός RNA της οικογένειας των Paramyxoviridae και σχετίζεται στενά με τον ανθρώπινο αναπνευστικό συγκυτιακό ιό (RSV) [1] . Ο HMPV προκαλεί αναπνευστική νόσο παρόμοια με τον RSV, που κυμαίνεται από ήπια λοίμωξη του ανώτερου αναπνευστικού έως βρογχιολίτιδα και πνευμονία [2] . Οι λοιμώξεις από HMPV είναι εποχιακές και η ταυτόχρονη μόλυνση με άλλα παθογόνα του αναπνευστικού είναι συχνή [1] . Το γονιδίωμα HMPV είναι περίπου 13 kb και περιλαμβάνει οκτώ ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (ORFs) που κωδικοποιούν νουκλεοπρωτεΐνη (N), φωσφοπρωτεΐνη (P), πρωτεΐνη μήτρας (M), γλυκοπρωτεΐνη σύντηξης (F), πρωτεΐνη ενισχυτή μεταγραφής (M2), μικρή υδρόφοβη πρωτεΐνη ( SH), γλυκοπρωτεΐνη προσκόλλησης (G) και μεγάλη πρωτεΐνη πολυμεράσης (L) [3] . Οι αλληλουχίες των μεμβρανικών γλυκοπρωτεϊνών F και G χρησιμοποιούνται για να ορίσουν δύο κύριους γονότυπους ή ομάδες, τους Α και Β, οι οποίοι ταξινομούνται περαιτέρω σε τέσσερις υποομάδες (Α1, Α2, Β1 και Β2). Ο HMPV A2, η πιο συχνά παρατηρούμενη υποομάδα, χωρίζεται περαιτέρω σε δύο προτεινόμενες υποκατηγορίες (A2a και A2b) [3]. Ο HMPV αναφέρεται ότι έχει σημαντική συμβολή στις οξείες αναπνευστικές λοιμώξεις (ARI) στην Αφρική. Για παράδειγμα, η νοσηλεία που σχετίζεται με τον HMPV υπολογίστηκε σε 6,5 ανά 1000 ανθρωποέτη σε βρέφη στο Soweto της Νότιας Αφρικής [4]. στο 4% σε νοσηλευόμενα παιδιά με σοβαρή ARI κατά τη διάρκεια μιας περιόδου 2 ετών στο Καμερούν [5]. και στην αγροτική δυτική Κένυα, η συχνότητα εμφάνισης HMPV που σχετίζεται με περιπτώσεις ARI σε επισκέψεις σε εξωτερικά ιατρεία υπολογίστηκε σε 0,43 ανά 100 άτομα-έτη μεταξύ των εξωτερικών ασθενών [6] . Στην παράκτια Κένυα Kilifi, από τον Ιανουάριο του 2007 έως τον Δεκέμβριο του 2011, τα παιδιά ηλικίας κάτω των 6 μηνών αντιπροσώπευαν το 44% των θετικών περιπτώσεων HMPV, ενώ το 74% ήταν παιδιά κάτω του 1 έτους και το 1,3% (2/160) ήταν παιδιά > 36 μηνών. 7] . Στους προσφυγικούς καταυλισμούς Dadaab και Kakuma στην Κένυα, ο HMPV εντοπίστηκε στο 5,7% των νοσηλειών και το ακατέργαστο ποσοστό νοσηλείας με θετικό ιό (ανά 1000 παιδιά < 5 ετών) ήταν 4 για το HMPV [8] . Στο Μάλι, η συμβολή του HMPV στην πνευμονία είχε ένα αποδιδόμενο από τον πληθυσμό κλάσμα 9% (95% CI: 7-11%) [9]. ενώ στο Μαρόκο [10] , το 8,9% των παιδιών < 5 ετών που εισήχθησαν με σοβαρή πνευμονία είχαν μολυνθεί με HMPV. Ο επιπολασμός και η συχνότητα εμφάνισης του HMPV αλλού παγκοσμίως, υποδεικνύεται στο Πρόσθετο αρχείο 4: Πίνακας S1 . Αξίζει να σημειωθεί ότι οι διακυμάνσεις στα ποσοστά επίπτωσης θα μπορούσαν να αποδοθούν στον πληθυσμό της μελέτης, την εποχικότητα και ακόμη και τις μεθόδους ανίχνευσης. Ωστόσο, η γονιδιωματική επιδημιολογία του HMPV στην Αφρική δεν έχει αναφερθεί επαρκώς και η σύγκριση της γενετικής ομοιότητας και διαφορών μεταξύ αφρικανικών και παγκόσμιων στελεχών δεν έχει τεκμηριωθεί. Οι αλληλουχίες γονιδιώματος παρέχουν πολύτιμους πόρους για τον χαρακτηρισμό της εξέλιξης του ιού και της επιδημιολογίας ασθενειών και για τον εντοπισμό συμβάντων μετάδοσης και εστιών, που δεν είναι πάντα δυνατό με υπογονιδιωματικά θραύσματα [11] [12] [13] . Ο αυξημένος αριθμός φυλογενετικά ενημερωτικών θέσεων παραλλαγής που λαμβάνονται από πλήρη γονιδιώματα μπορεί να επιτρέψει την καλύτερη σύνδεση των περιπτώσεων και να βοηθήσει τις παρεμβάσεις στη δημόσια υγεία σε πραγματικό χρόνο κατά τη διάρκεια επιδημιών [14, 15]. Οι προσεγγίσεις PCR για στοχευμένη αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος, σε αντίθεση με την τυχαία ενίσχυση, μπορούν κατά προτίμηση να ενισχύσουν τον ιό στόχο έναντι των νουκλεϊνικών οξέων του ξενιστή ή του περιβάλλοντος [16, 17] εστιάζοντας πιθανώς την αλληλουχία στον ιό που μας ενδιαφέρει. Μέχρι σήμερα, το μεγαλύτερο σύνολο δεδομένων ολόκληρων γονιδιωμάτων HMPV (n = 61) που έχει προσδιοριστεί η αλληλουχία από οποιαδήποτε τροπική χώρα προέρχεται από τρεις περουβιανές πόλεις, τη Λίμα, την Πιούρα και τον Ικίτος [18] . Στην Αφρική, εκτός από ένα γονιδίωμα μεταπνευμοϊού που εντοπίστηκε από έναν άγριο γορίλα του βουνού στη Ρουάντα (αριθμός πρόσβασης GenBank HM197719), δεν έχουν αναφερθεί γονιδιώματα HMPV σύμφωνα με τη Βάση Δεδομένων και Πηγή Ανάλυσης Παθογόνων Ιού NIAID (ViPR, http://www.viprbrc). org/, πρόσβαση στις 30 Απριλίου 2019). Αυτό οδήγησε σε περιορισμένη κατανόηση της γενετικής και γονιδιωματικής ποικιλομορφίας του HMPV στην ήπειρο. Αυτή η εργασία περιγράφει μια προσέγγιση αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος (WGS) για τον HMPV από έναν μικρό αριθμό θετικών για HMPV κλινικά δείγματα που συλλέχθηκαν στο νοσοκομείο της κομητείας Kilifi στο Kilifi, Κένυα και Πανεπιστημιακό Διδακτικό Νοσοκομείο στη Λουσάκα της Ζάμπια. Τα γονιδιώματα δημιουργήθηκαν με αλληλουχία επικαλυπτόμενων αμπλικονίων PCR που καλύπτουν ολόκληρο το γονιδίωμα. Αυτές είναι οι πρώτες αναφερόμενες πλήρεις αλληλουχίες γονιδιώματος τοπικά κυκλοφορούντων στελεχών HMPV που λαμβάνονται απευθείας από κλινικά δείγματα στην Αφρική. Συνδυάσαμε επίσης τα νέα γονιδιώματα με διαθέσιμες στο κοινό αλληλουχίες για να εξετάσουμε μοτίβα στην παγκόσμια γενετική ποικιλότητα του HMPV. Η αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος ήταν επιτυχής και για τα 5 κλινικά δείγματα που επιχειρήθηκαν. Από κάθε δείγμα ελήφθη μια μοναδική γονιδιωματική αλληλουχία και το μήκος των 5 νέων γονιδιωμάτων HMPV κυμαινόταν από 13.097 έως 13.134 nt (> 95% κάλυψη μήκους). Οι παράμετροι αλληλουχίας και συναρμολόγησης δεδομένων, συμπεριλαμβανομένου του βάθους κάλυψης φαίνονται στον Πίνακα 1. Ο σχολιασμός ακολουθίας των γονιδιωμάτων πλήρους μήκους χρησιμοποιώντας το Geneious R8.1.5 (https://www.geneious.com) προσδιόρισε τα αναμενόμενα οκτώ κωδικοποιητικά ORF και τα μη κωδικοποιητικά γονιδιωματικά περιφέρειες. Η συνολική ταυτότητα νουκλεοτιδίων (δηλαδή, πανομοιότυπες θέσεις με μέσο όρο σε όλα τα ζεύγη αλληλουχιών και εξαιρώντας τις θέσεις που περιέχουν κενά) μεταξύ και των 143 αλληλουχιών γονιδιώματος που αναλύθηκαν (5 νέα γονιδιώματα συν 138 από το ViPR) ήταν 58,2%. Η ταυτότητα της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων ήταν 71,3% εντός του HMPV-A και 80% εντός του HMPV-B. Τα γονιδιώματα ενδουποομάδας, Α1, Α2, Β1 και Β2 μοιράστηκαν 92,1% (10 αλληλουχίες), 76,8% (88 αλληλουχίες), 91% (24 αλληλουχίες) και 89,6% (21 αλληλουχίες) ταυτότητα αμινοξέων. Για τα 143 γονιδιώματα HMPV ελέγχεται η διατήρηση της αλληλουχίας στις περιοχές μεταγραφικού ελέγχου, στα άκρα κάθε γονιδίου, καθώς και τα μήκη των διαγονιδιακών αλληλουχιών μεταξύ των ορίων των γονιδίων. Το μήκος της διαγονιδιακής περιοχής F-M2 ήταν διαφορετικό μεταξύ των ιών της ομάδας Α και Β, δηλαδή 13 nt και 2 nt, αντίστοιχα. Οι διαγονιδιακές περιοχές SH-G και G-L ήταν οι μεγαλύτερες, έως 125 nt και 190 nt, αντίστοιχα. Τα συναινετικά νουκλεοτίδια (μήκους 9 έως 19) στις πιθανές περιοχές έναρξης και τέλους που πλευρίζουν το ORF των ιικών γονιδίων φαίνονται στο Σχήμα. 1 . Οι περιοχές έναρξης και τέλους γονιδίου των Ν και Ρ διατηρήθηκαν (> 90% μέση ταυτότητα ανά ζεύγη) και στις δύο ομάδες HMPV, και η έναρξη και το τέλος των γονιδίων Μ2 και Μ διατηρήθηκαν επίσης στην ομάδα Α και Β του HMPV, αντίστοιχα. Το υποτιθέμενο κωδικόνιο έναρξης ATG βρισκόταν σταθερά στις θέσεις 14-16 ανάντη ενός μοτίβου έναρξης γονιδίου (συναίνεση: GG/AGAC/TAAA/GTnnnnATG), εκτός από το εσωτερικό Μ2-2. Ένα επιπλέον κωδικόνιο έναρξης ATG προς τα πάνω του μοτίβου έναρξης γονιδίου παρατηρήθηκε στο γονίδιο SH για τα στελέχη Β1 και Β2. Σε πέντε από τα οκτώ σχολιασμένα γονίδια (N, P, F, M2 και G (μόνο στελέχη B1 και B2)), οι διαγονιδιακές περιοχές ήταν σύντομες και τα ORF για αυτά τα 5 γονίδια κατέληγαν στα προτεινόμενα μοτίβα άκρου γονιδίου. Συνδυάσαμε οι πέντε αλληλουχίες γονιδιώματος από την Κένυα και τη Ζάμπια με διαθέσιμες παγκόσμιες αλληλουχίες, ευθυγράμμισαν μεμονωμένα γονίδια και υπολόγισαν το ποσοστό ταυτότητας νουκλεοτιδίου (nt) και αμινοξέος (aa) (Πίνακας 2). Οι κωδικοποιητικές αλληλουχίες των N, M, F, M2-1, Τα γονίδια M2-2 και L διατηρήθηκαν σε επίπεδα νουκλεοτιδίων και αμινοξέων, με κοινή χρήση > 85% ταυτότητας νουκλεοτιδίων μεταξύ υποομάδων και 90% ταυτότητας πρωτεΐνης (Πίνακας 3). Το γονίδιο της νουκλεοπρωτεΐνης ήταν το πιο διατηρημένο μεταξύ όλων των υποομάδων στα επίπεδα nt και aa. Τα γονίδια της γλυκοπρωτεΐνης SH και G ήταν πιο αποκλίνοντα μεταξύ των υποομάδων HMPV σε επίπεδο νουκλεοτιδίων με 76 και 63% ταυτότητα, αντίστοιχα. Το μήκος της πρωτεΐνης SH ήταν μεταβλητό μεταξύ των στελεχών της ομάδας Α και Β λόγω υποκατάστασης νουκλεοτιδίου (CAA ➔ ΤΑΑ) στη γονιδιακή θέση 532 στην ομάδα Β, με αποτέλεσμα μήκη πρωτεΐνης 178 και 180 αα, αντίστοιχα. Το προβλεπόμενο μήκος πρωτεΐνης G διέφερε επίσης μεταξύ των διαφορετικών υποομάδων HMPV, μεταξύ 219 και 241 aa, λόγω διαφορετικών θέσεων του κωδικονίου Stop. Η ποικιλομορφία της αλληλουχίας αμινοξέων για τις γλυκοπρωτεΐνες G και SH απεικονίζεται στο Σχήμα. 2 και Πρόσθετο αρχείο 2: Εικόνα S2 , αντίστοιχα. Η ποικιλομορφία των πλήρων νουκλεοτιδικών αλληλουχιών των γονιδίων SH και G απεικονίζεται σε φυλογενετικά δέντρα στο Σχήμα. 3. Αξιολογήσαμε τη φυλογενετική ταξινόμηση και τη σχέση μεταξύ των 5 νέων γονιδιωμάτων που ελήφθησαν σε αυτή τη μελέτη και των γονιδιωμάτων που είχαν δημοσιευθεί προηγουμένως (Εικ. 3) . Πλήρες γονιδίωμα Εικόνα S3. Υπήρχε φυλογενετική συμφωνία με τα μεμονωμένα σύνολα αλληλουχιών γονιδίων όπως και με το πλήρες σύνολο δεδομένων γονιδιώματος, εκτός από τα γονίδια F και M2 (Επιπρόσθετο αρχείο 3: Εικόνα S3 ). Τα παραλλαγμένα ή παρασυρόμενα ιικά στελέχη μπορεί να μειώσουν την ευαισθησία της ανίχνευσης με αποτέλεσμα τη μειωμένη ποσοτικοποίηση του ιικό φορτίο και υποεκτίμηση της επίπτωσης της νόσου [19] . Ελέγξαμε τα νέα γονιδιώματα HMPV για διαφορές νουκλεοτιδίων στις γονιδιωματικές περιοχές που στοχεύουν οι διαγνωστικοί μας εκκινητές rRT-PCR και οι ανιχνευτές (Επιπλέον αρχείο 7: Πίνακας S4 ) που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση HMPV. Εντοπίστηκαν έως και οκτώ αναντιστοιχίες εκκινητή και προτύπου (Εικ. 4) : μία αναντιστοιχία στην περιοχή του μπροστινού εκκινητή στην ομάδα Α HMPV (προσδιορισμός rRT-PCR με βάση το γονίδιο F, Εικ. 4a); μία αναντιστοιχία σε καθεμία από τις προς τα εμπρός και τις περιοχές στόχου ανιχνευτή στην ομάδα Β (προσδιορισμός rRT-PCR με βάση το γονίδιο F, Εικ. 4β); και 5 διαφορετικές αναντιστοιχίες με τον προσδιορισμό rRT-PCR με βάση το Ν-γονίδιο (Εικ. 4γ). Σημείωση, οι αναλύσεις rRT-PCR που βασίζονται στο γονίδιο F είναι διαφορετικές ή ειδικές για τις δύο ομάδες HMPV. Το HMPV προκαλεί αναπνευστική νόσο που παρουσιάζεται ως ήπια λοίμωξη του ανώτερου αναπνευστικού ή απειλητική για τη ζωή σοβαρή βρογχιολίτιδα και πνευμονία κυρίως σε παιδιά, μερικές φορές ενήλικες καθώς και σε ανοσοκατεσταλμένους άτομα [2] . Ωστόσο, τα δεδομένα της αλληλουχίας του γονιδιώματος του HMPV από την Αφρική είναι αραιά και οι πληροφορίες σχετικά με την ποικιλία του γονιδιώματος είναι περιορισμένες. Στην παρούσα μελέτη, προσδιορίστηκαν όλες οι αλληλουχίες γονιδιώματος πέντε στελεχών HMPV από την Κένυα και τη Ζάμπια και συγκρίθηκαν με τα γονιδιώματα που είχαν δημοσιευτεί προηγουμένως από όλο τον κόσμο. Η συγκριτική ανάλυση αλληλουχίας έδειξε αρκετά διατηρημένη τοποθέτηση των περιοχών έναρξης και τερματισμού γονιδίου καθώς και των κωδικονίων έναρξης και τέλους μετάφρασης. Η παραλλαγή στις αλληλουχίες έναρξης και λήξης μπορεί να έχει σημαντικό αντίκτυπο στην αποτελεσματικότητα έναρξης και τερματισμού της μεταγραφής, έτσι ώστε να υπάρχει πιο επιλεκτική πίεση που εμποδίζει τις αλλαγές σε αυτές τις περιοχές [20], και αυτό εξηγεί πιθανώς την παρατήρησή μας. Το πρόσθετο κωδικόνιο έναρξης ATG που βρέθηκε ανάντη του μοτίβου έναρξης γονιδίου του γονιδίου SH ήταν σύμφωνο με μια προηγούμενη αναφορά [21] , αν και ο ρόλος του στη γονιδιακή έκφραση δεν έχει ακόμη προσδιοριστεί. Τα γονίδια M2-1, M2-2 και L δεν είναι ασυνήθιστα και υποδηλώνουν λειτουργικούς και δομικούς περιορισμούς στην ποικιλομορφία, αλλά λιγότερο αναμενόμενο για το γονίδιο F λόγω της κατάστασής του ως εξουδετερωτικού και προστατευτικού αντιγόνου, παρόμοιο με το στενό «συγγενή» του RSV [22] . Έχει επίσης προταθεί ότι η χαμηλή ποικιλομορφία στο γονίδιο F μπορεί να συμβάλει ουσιαστικά στη διασταυρούμενη εξουδετέρωση και διασταυρούμενη προστασία μεταξύ των υποομάδων HMPV [21] . Η σχετικά υψηλή συχνότητα ποικιλότητας αμινοξέων στο G (και σε μικρότερο βαθμό στο SH) θα μπορούσε να αποδοθεί στην επιλεκτική πίεση για αλλαγή αμινοξέων που προέρχεται από την ανοσία του ξενιστή. και την ικανότητα της πρωτεΐνης να ανέχεται τις υποκαταστάσεις, η οποία μπορεί να οφείλεται στην προτεινόμενη εκτεταμένη, ξεδιπλωμένη φύση της [22] . Η φυλογενετική ασυμφωνία που παρατηρήθηκε μεταξύ ολόκληρου του δέντρου γονιδιώματος και των δέντρων γονιδίων F και G, είναι όπως αναφέρθηκε προηγουμένως για το HMPV [23] και θα μπορούσε να αποδοθεί σε διαφορετικούς ρυθμούς εξέλιξης, πίεση επιλογής ή προηγούμενα γεγονότα ανασυνδυασμού [24] . Ο επιπολασμός του HMPV σε νοσηλευόμενο παιδιατρικό πληθυσμό στην κομητεία Kilifi στην παράκτια Κένυα έχει αναφερθεί [7, 25]. Ωστόσο, είναι αξιοσημείωτο ότι τα τελευταία χρόνια, ο HMPV έχει ανιχνευθεί σε χαμηλό επιπολασμό στο Κιλίφι (μη δημοσιευμένες παρατηρήσεις από την παρακολούθηση της πνευμονίας σε νοσοκομείο). Το εάν αυτός ο χαμηλός επιπολασμός οφείλεται στη μειωμένη μετάδοση του ιού ή στη μειωμένη ευαισθησία της μοριακής μας διαγνωστικής δοκιμασίας HMPV λόγω προοδευτικών αναντιστοιχιών εκκινητών/ανιχνευτών, δεν έχει ακόμη καθοριστεί. Παρουσιάζουμε τις πρώτες πλήρεις αλληλουχίες γονιδιώματος κυκλοφορούντων στελεχών HMPV από την υποσαχάρια Αφρική . Ένας περιορισμός της μεθόδου αλληλουχίας μας, όπως συνηθίζεται με τα πρωτόκολλα αλληλουχίας αμπλικονίου [26, 27], ήταν η απουσία κάλυψης στις περιοχές 3' οδηγού και 5' ρυμουλκούμενου που δεν καταγράφηκαν από αυτούς τους εκκινητές. Τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν την εφαρμογή της αλληλουχίας του αμπλικονίου για τη δημιουργία γονιδιωμάτων HMPV πλήρους μήκους απευθείας από κλινικά δείγματα. Η παρατηρούμενη ποικιλομορφία των μεμονωμένων γονιδίων είναι συγκρίσιμη με αυτή που περιγράφηκε προηγουμένως [20] [21] [22] . Αυτή η μέθοδος και τα δεδομένα παρέχουν μια χρήσιμη αναφορά για το σχεδιασμό τοπικών μοριακών διαγνωστικών και για μελέτες που στοχεύουν στην κατανόηση της επιδημιολογίας και της εξέλιξης του HMPV στην Αφρική. Δείγματα ρινοφαρυγγικού και στοματοφαρυγγικού επιχρίσματος (NP-OP) συλλέχθηκαν από παιδιά (1-59 μηνών) που νοσηλεύτηκαν με πνευμονία , τέσσερις από τους οποίους εγγράφηκαν στη μελέτη PERCH [18] το 2012. Το πέμπτο δείγμα συλλέχθηκε από ένα παιδί που εγγράφηκε στη μελέτη ρουτίνας παρακολούθησης της πνευμονίας στο νοσοκομείο της κομητείας Kilifi, στην Κένυα, το 2015. Τα δείγματα δοκιμάστηκαν για HMPV με πολυπλές ημι-ποσοτικές δοκιμές PCR αντίστροφης μεταγραφής σε πραγματικό χρόνο (rRT-PCR). Οι εκκινητές και οι ανιχνευτές rRT-PCR που χρησιμοποιούνται, οι συνθήκες κύκλου και η ρύθμιση της δοκιμασίας έχουν περιγραφεί αλλού [28, 29]. Τα γονίδια που κωδικοποιούν σύντηξη (F) και γλυκοπρωτεΐνη (G) των θετικών δειγμάτων για HMPV ενισχύθηκαν σε μια δοκιμασία RT-PCR ενός σταδίου (κιτ OneStep RT-PCR, QIAGEN), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7] . Μερικές αλληλουχίες νουκλεοτιδίων G ή F αναλύθηκαν με φυλογενετικά δέντρα μέγιστης πιθανότητας (ML) χρησιμοποιώντας IQ-TREE [30] , μαζί με στελέχη αναφοράς υποομάδων HMPV (αριθμοί πρόσβασης AF371337.2, FJ168779, AY297749, AY297749, AY45701, AY294, AY471, AY294, AY501 και AY29701). Πέντε θετικά HMPV δείγματα από τις τοποθεσίες μελέτης της Κένυας και της Ζάμπια, που ανήκουν στις γενετικές υποομάδες A2a (n = 1), A2b (n = 2), B1 (n = 1) και B2 (n = 1) με βάση τους G και F γονιδιακές αλληλουχίες, επιλέχθηκαν για αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος. Τα δεδομένα σχετικά με την ηλικία, το φύλο και τις πληροφορίες κλινικής αξιολόγησης που συλλέχθηκαν τη στιγμή της συλλογής του δείγματος, για τα πέντε επιλεγμένα δείγματα, φαίνονται στον Πίνακα 3. Το πρωτόκολλο προσδιορισμού αλληλουχίας αποτελούνταν από τέσσερα βήματα ως εξής: (i) σχεδιασμός εκκινητών, (ii) προετοιμασία μείγματα εκκινητών, (iii) cDNA και PCR (iv) Αλληλουχία Illumina και ανάλυση δεδομένων. Όλες οι πλήρεις αλληλουχίες γονιδιώματος ανθρώπινου μεταπνευμοϊού (HMPV) ανακτήθηκαν από την GenBank (Ιανουάριος 2018) χρησιμοποιώντας το ερώτημα (txid162145 (Οργανισμός) AND 000SL (SLEN) ΟΧΙ ευρεσιτεχνία). Οι καταχωρίσεις αλληλουχίας με κενά μεγαλύτερα από 6 nt αποκλείστηκαν για να δημιουργηθεί ένα σύνολο από 178 γονιδιώματα. Όλες οι πιθανές αλληλουχίες 23 nt δημιουργήθηκαν από το σύνολο δεδομένων γονιδιωμάτων και κόπηκαν σε μια τελική υπολογισμένη θερμοκρασία τήξης (Tm) 47,9-49,5°C. Αλληλουχίες με ομολογία με αλληλουχίες rRNA, με περιεχόμενο GC εκτός < 0,3 ή > 0,75 ή με κλασματική περιεκτικότητα σε νουκλεοτίδιο > 0,6 απορρίφθηκαν. Το σετ εκκινητών στη συνέχεια έγινε μη περιττό αποδίδοντας 60.746 πιθανούς εκκινητές. Όλοι οι πιθανοί εκκινητές χαρτογραφήθηκαν έναντι των 178 πλήρων γονιδιωμάτων HMPV και ο αριθμός των τέλειων αντιστοιχίσεων (βαθμολογία συχνότητας) προσδιορίστηκε ως μέτρο διατήρησης της αλληλουχίας εκκινητών. Για την επιλογή εκκινητών, οι αλληλουχίες γονιδιώματος HMPV χωρίστηκαν σε αμπλικόνια με επικάλυψη 222 nt που εκτείνεται στο γονιδίωμα του ιού. Εντοπίστηκαν πιθανοί εκκινητές που χαρτογράφησαν εντός του τερματικού 5' και 3' 222 nt κάθε αμπλικόνιου και επιλέχθηκε η αλληλουχία με την υψηλότερη βαθμολογία συχνότητας και συμπληρώθηκαν αντίστροφα οι εκκινητές που χαρτογραφήθηκαν στους αντίστροφους κάδους. Με αυτόν τον τρόπο, επιλέχθηκαν 24 εκκινητές για καθένα από τα 4 αντιπροσωπευτικά γονιδιώματα του γονότυπου HMPV (Αριθμός πρόσβασης GenBank HMPV A1: AF371337, HMPV A2: FJ168779; HMPV B1: AY525843 και HMPV B2: FJ168778). Λόγω της διατήρησης μεταξύ των γονοτύπων, υπήρξε πλεονασμός εκκινητών που αφαιρέθηκε. Το τελικό σύνολο 65 αλληλουχιών εκκινητών, τα μήκη τους, η υπολογισμένη Tm, το κλασματικό περιεχόμενο GC και η θέση χαρτογράφησης στο γονιδίωμα του HMPV παρουσιάζονται στο Πρόσθετο αρχείο 5: Πίνακας S2. Οι εκκινητές δοκιμάστηκαν υπολογιστικά έναντι καθεμίας από τις 4 υποομάδες HMPV. Μια γραφική αναπαράσταση των θέσεων στόχου εκκινητών παρουσιάζεται στο Πρόσθετο αρχείο 1: Σχήμα S1. Η ενίσχυση πραγματοποιήθηκε σε δύο αντιδράσεις. Για να αποφευχθεί η δημιουργία μικρών προϊόντων από παρακείμενους εκκινητές προς τα εμπρός και ανάστροφα, τα amplicons αντιστοιχίστηκαν στον εναλλακτικό Πίνακα 3 . Οι τιμές υποστήριξης του Bootstrap (αξιολογημένες κατά 1000 επαναλήψεις) υποδεικνύονται κατά μήκος των διακλαδώσεων. Υποδεικνύονται οι γενετικές υποομάδες A1, A2a, A2b, B1 και B2. Η ευθυγράμμιση πολλαπλών αλληλουχιών έγινε χρησιμοποιώντας MAFFT και η φυλογένεση ML συνήχθη χρησιμοποιώντας μοντέλο υποκατάστασης νουκλεοτιδίων GTR + Γ και υπερταχεία προσέγγιση bootstrap στο IQ-TREE. Η αλληλουχία στελεχών του γονότυπου Β2 Sabana (αριθμός πρόσβασης GenBank HM197719) που αναφέρθηκε από έναν άγριο γορίλα βουνών στη Ρουάντα σημειώνεται με μπλε χρώμα. Η κλιμακούμενη γραμμή υποδεικνύει νουκλεοτιδικές υποκαταστάσεις ανά θέση αντιδράσεις, με την αντίδραση 1 να περιέχει εκκινητές για αμπλικόνια 1,3,5,7,9,11. αντίδραση 2 που περιέχει εκκινητές για αμπλικόνια 2,4,6,8,10,12. Κάθε αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποίησε Μείγματα εκκινητών μπροστινών εκκινητών (FPMs) με 3,0 μl από κάθε αντίστροφο εκκινητή (100 pmol/μl) συν νερό σε 200 μl για τη δημιουργία συγκέντρωσης εκκινητών 24 pmol/μl. Στη συνέχεια χρησιμοποιούνται δύο μικρολίτρα FPM σε μια αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής 20 μl (τελική συγκέντρωση 2,4 pmol/μl στην αντίδραση ή 2,4 μΜ/εκκινητήρα). Για την ενίσχυση PCR, κάθε αντίδραση αμπλικόνιου χρησιμοποιούσε ξεχωριστό μίγμα εκκινητών PCR (PPM) που περιείχε 1,5 μl από κάθε 100 pmol/μl εμπρός εκκινητή και 1,5 μl από κάθε αντίστροφο εκκινητή (5,3-5,5 pmol/μl ολικό εκκινητή στο PPM). Χρησιμοποιήθηκαν 2 μl PPM ανά 25 μl αντίδρασης PCR = 0,5 pmol/μl στην αντίδραση (= 500 nM). Τα ιικά νουκλεϊκά οξέα εκχυλίστηκαν από τα αρχικά δείγματα χρησιμοποιώντας κιτ QIAamp Viral RNA Mini (QIAGEN). Το RNA (5 μl) μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας SuperScript III (200 U, Invitrogen), ρυθμιστικό διάλυμα RT (1Χ τελική συγκέντρωση, Invitrogen) και 2 μl FPM σε αντιδράσεις 20 μl. Ένα κλάσμα cDNA (5 μl) ενισχύθηκε σε 35 κύκλους χρησιμοποιώντας κιτ PCR Highfidelity Phusion (New England Biolabs) και 2 μl PPM σε μια αντίδραση 25 μl. Το μίγμα PCR επωάστηκε στους 98°C για 30 δευτερόλεπτα, ακολουθούμενο από 35 κύκλους των 98°C για 10 δευτερόλεπτα, 43°C για 30 δευτερόλεπτα και 72°C για 90 δευτερόλεπτα και μια τελική επέκταση 72°C για 10 λεπτά. Τα αναμενόμενα προϊόντα PCR για κάθε αμπλικόνιο ήταν περίπου 1500 bp. Τα προϊόντα PCR από τις δύο αντιδράσεις για κάθε δείγμα συγκεντρώθηκαν για την προετοιμασία της βιβλιοθήκης Illumina. Σύκο. 4 Αναντιστοιχίες μεταξύ των διαγνωστικών εκκινητών και ανιχνευτών rRT-PCR και των αναμενόμενων θέσεων δέσμευσής τους στα πέντε γονιδιώματα από την Κένυα και τη Ζάμπια. 'Fwd primer' = Forward primer και 'Rev primer' = Reverse primer. Δύο δοκιμές rRT-PCR χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση HMPV. Οι έγχρωμες ράβδοι στο σχήμα υποδεικνύουν διαφορές νουκλεοτιδίων (αναντιστοιχίες) μεταξύ (α) τριών γονιδιωμάτων HMPV-A και ειδικών εκκινητών HMPV-A και ανιχνευτών που στοχεύουν το γονίδιο σύντηξης, (β) δύο γονιδιωμάτων HMPV-B και ειδικών εκκινητών και ανιχνευτών HMPV-B επίσης στοχευόμενο γονίδιο σύντηξης και (γ) και τα πέντε γονιδιώματα που αναφέρονται εδώ και ειδικοί εκκινητές και ανιχνευτές που στοχεύουν το γονίδιο νουκλεοπρωτεΐνης. Οι αλληλουχίες των εκκινητών rRT-PCR και των ανιχνευτών που ελέγχθηκαν έναντι των αφρικανικών γονιδιωμάτων HMPV παρατίθενται στο Πρόσθετο αρχείο 7: Πίνακας S4 Αλληλουχία και ανάλυση δεδομένων Illumina Οι βιβλιοθήκες προετοιμάστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ Nextera XT (Illumina) και αλληλουχία άκρου ζεύγους (2 × 300 βάσης ζεύγη) με το κιτ MiSeq Reagent V3 (Illumina), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το μίγμα ενζύμων Nextera χρησιμοποιήθηκε για τον ταυτόχρονο τεμαχισμό του DNA εισόδου και της επισήμανσης με γενικούς προσαρμογείς σε μια αντίδραση ενός σωλήνα, ακολουθούμενη από αντίδραση PCR 12 κύκλων για διπλή ευρετηρίαση. Τα σφαιρίδια AMPure XP της Agencourt (Beckman Coulter) χρησιμοποιήθηκαν για όλα τα στάδια καθαρισμού και οι βιβλιοθήκες ποσοτικοποιήθηκαν και ελέγχθηκαν ποιοτικά με χρήση του Qubit (Thermo Fisher) και του Bioanalyzer (Agilent). Περικοπή προσαρμογέα, ποιοτικό φιλτράρισμα, κανονικοποίηση kmer των αναγνώσεων αλληλουχίας, de novo συναρμολόγηση, υπολογισμός της μέσης κάλυψης γονιδιώματος ήταν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31] . Ένα σύνολο δεδομένων αλληλουχιών γονιδιώματος HMPV ανακτήθηκε από το ViPR προκειμένου να συναχθεί η σχέση μεταξύ των ιών HMPV από την Κένυα και Η Ζάμπια και οι πληθυσμοί των ιών δειγματολήφθηκαν παγκοσμίως. Το σύνολο δεδομένων περιελάμβανε 138 καταχωρήσεις ακολουθίας (> 13.000 nt) που περιελάμβαναν ημερομηνία (έτος) και τοποθεσία του δείγματος Πίνακας S3 . Η στοίχιση της αλληλουχίας έγινε χρησιμοποιώντας MAFFT v.7.221 [32] χρησιμοποιώντας τις παραμέτρους «τοπικό ζεύγος -maxiterate 1000». Το IQ-TREE χρησιμοποιήθηκε για να συμπεράνει τα δέντρα μέγιστης πιθανότητας (ML) του πλήρους γονιδιώματος και των μεμονωμένων γονιδίων κάτω από το γενικό μοντέλο υποκατάστασης αναστρέψιμης χρόνου (GTR) με ετερογένεια ρυθμού γάμα κατανεμημένης μεταξύ των θέσεων. Μια περίληψη της μεθοδολογίας που περιγράφεται εδώ απεικονίζεται στο Σχ. 5 .", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 1855, "text": "ανθρώπινος μεταπνευμοϊός (HMPV)" } ], "id": 4059, "question": "Τι προκαλεί την οξεία αναπνευστική νόσο στα μικρά παιδιά;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1898, "text": "μονόκλωνος ιός RNA" } ], "id": 4060, "question": "Ποια είναι η μοριακή δομή του ανθρώπινου μεταπνευμοϊού (HMPV);" }, { "answers": [ { "answer_start": 401, "text": "ανθρώπινος μεταπνευμοϊός (HMPV)" } ], "id": 4061, "question": "Ποιος ιός σχετίζεται στενά με τον ανθρώπινο αναπνευστικό συγκυτιακό ιό (RSV);" }, { "answers": [ { "answer_start": 2330, "text": "13 kb" } ], "id": 4063, "question": "Πόσο μεγάλο είναι το γονιδίωμα του HMPV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7405, "text": "οκτώ" } ], "id": 4064, "question": "Πόσα ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης υπάρχουν στο γονιδίωμα HMPV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 8305, "text": "Α και Β" } ], "id": 4065, "question": "Ποιοι είναι οι δύο κύριοι γονότυποι του HMPV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 19210, "text": "HMPV A2" } ], "id": 4066, "question": "Ποια είναι η πιο κοινή υποομάδα του HMPV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6191, "text": "μια προσέγγιση αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος (WGS) για τον HMPV" } ], "id": 4068, "question": "Τι περιγράφει αυτή η μελέτη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 8221, "text": "Το μήκος της διαγονιδιακής περιοχής F-M2" } ], "id": 4069, "question": "Ποια ήταν η διαφορά στα γονιδιώματα της ομάδας Α και Β;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Ιογενείς λοιμώξεις της αναπνευστικής οδού σε ενήλικες ασθενείς που παρακολουθούν τμήματα εξωτερικών ασθενών και επειγόντων περιστατικών, Ταϊβάν, 2012–2013: Μελέτη Φασματομετρίας Μάζας Ιονισμού PCR/Ηλεκτροψεκασμούhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC146700000000000000000666665575666669357575700000006665657657660000676565757567068686565757567000000686865757 Shih, Hsin-I; Wang, Hsuan-Chen; Su, Ih-Jen; Hsu, Hsiang-Chin; Wang, Jen-Ren; Sun, Hsiao Fang Sunny; Chou, Chien-Hsuan; Ko, Wen-Chien; Hsieh, Ming-I; Wu, Chi-JungDate: 2015-09-25DOI: 10.1097/md.0000000000001545Άδεια: cc-byAbstract: Ιογενείς αιτιολογίες λοιμώξεων της αναπνευστικής οδού (RTIs) έχουν μελετηθεί λιγότερο σε ενήλικες από ό,τι σε παιδιατρικούς πληθυσμούς. Επιπλέον, η ικανότητα της φασματομετρίας μάζας ιονισμού PCR/ηλεκτροψεκασμού (PCR/ESI-MS) να ανιχνεύει εντεροϊούς και ρινοϊούς σε αναπνευστικά δείγματα δεν έχει αξιολογηθεί καλά. Επιδιώξαμε να χρησιμοποιήσουμε PCR/ESI-MS για να διερευνήσουμε διεξοδικά την ιική επιδημιολογία των RTI ενηλίκων, συμπεριλαμβανομένων των δοκιμών για ρινοϊούς και εντεροϊούς. Ρινοφαρυγγικά επιχρίσματα ή επιχρίσματα λαιμού από 267 ενήλικες με οξεία RTIs (212 άνω RTIs και 55 low RTIs) που επισκέφτηκαν τοπική κλινική ή εξωτερικά ιατρεία ή τμήματα επειγόντων περιστατικών ενός ιατρικού κέντρου στην Ταϊβάν μεταξύ Οκτωβρίου 2012 και Ιουνίου 2013 εξετάστηκαν για αναπνευστικούς ιούς και από τους δύο ιούς απομόνωση και PCR/ESI-MS. Ως δείγματα ελέγχου συμπεριλήφθηκαν επιχρίσματα λαιμού από 15 ασθενείς με βακτηριακές λοιμώξεις και 27 άτομα χωρίς ενεργές λοιμώξεις. Αναπνευστικοί ιοί βρέθηκαν στο 23,6%, 47,2% και 47,9% από τις 267 περιπτώσεις με απομόνωση ιού, PCR/ESI-MS και με τις δύο μεθόδους, αντίστοιχα. Όταν χρησιμοποιήθηκαν και οι δύο μέθοδοι, ο ιός της γρίπης Α (24,3%) και οι ρινοϊοί (9,4%) ήταν οι πιο συχνά ταυτοποιημένοι ιοί, ενώ οι ανθρώπινοι κοροναϊοί, ο ανθρώπινος μεταπνευμοϊός (hMPV), οι εντεροϊοί, οι αδενοϊοί, ο αναπνευστικός συγκυτιακός ιός και οι ιοί παραγρίπης ταυτοποιήθηκαν σε μικρές αναλογίες περιπτώσεων (<5% των περιπτώσεων για κάθε τύπο ιού). Μολύνσεις παρατηρήθηκαν στο 4,1% των περιπτώσεων. Στην ομάδα ελέγχου, μόνο 1 (2,4%) δείγμα βρέθηκε θετικό για αναπνευστικό ιό με PCR/ESI-MS. Οι ασθενείς που υποβάλλονταν σε θεραπεία με στεροειδή, είχαν ενεργό κακοήθεια ή έπασχαν από χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (ΧΑΠ) διέτρεχαν κίνδυνο για λοιμώξεις από ρινοϊό, hMPV ή παραγρίπη, αντίστοιχα. Συνολικά, οι ανοσοκατεσταλμένοι ασθενείς, οι ασθενείς με ΧΑΠ και οι ασθενείς που υποβάλλονταν σε αιμοκάθαρση διέτρεχαν κίνδυνο για λοίμωξη από τον αναπνευστικό ιό εκτός της γρίπης. Οι ρινοϊοί (12,7%), ο ιός της γρίπης Α (10,9%) και οι ιοί της παραγρίπης (7,3%) ήταν οι πιο συνηθισμένοι ιοί που εμπλέκονται στις 55 περιπτώσεις κατώτερων RTIs. Οι παράγοντες της λοίμωξης από παραγρίπη, της μεγάλης ηλικίας και της ανοσοκαταστολής συσχετίστηκαν ανεξάρτητα με χαμηλότερες RTI. Συμπερασματικά, η PCR/ESI-MS βελτίωσε τη διαγνωστική απόδοση για ιικούς RTI. Οι λοιμώξεις από τον αναπνευστικό ιό χωρίς τη γρίπη συσχετίστηκαν με ασθενείς με συννοσηρότητες και με χαμηλότερο RTI. Επιπρόσθετες μελέτες που οριοθετούν την κλινική ανάγκη για συμπερίληψη αναπνευστικών ιών μη γρίπης στη διαγνωστική εργασία σε αυτούς τους πληθυσμούς είναι δικαιολογημένες. Κείμενο: Οι λοιμώξεις του αναπνευστικού συστήματος από V ιούς (RTIs) στον άνθρωπο συμβαίνουν καθ' όλη τη διάρκεια του έτους και αποτελούν κύρια αιτία κλινικών επισκέψεων Παγκόσμιος. Στο παρελθόν, τα ιογενή αίτια των RTI ήταν σε μεγάλο βαθμό άγνωστα, κυρίως λόγω της μη ευαισθησίας των μεθόδων που βασίζονται σε καλλιέργεια για την ανίχνευση ιών ή στο στενό φάσμα ανίχνευσης ιών με τη χρήση δοκιμών νουκλεϊκού οξέος singleplex (NATs). Πρόσφατα, η ανάπτυξη πολλαπλών αναπνευστικών ΝΑΤ επέτρεψε την ταυτόχρονη, ταχεία και ευαίσθητη ανίχνευση πολλαπλών ιών, γεγονός που διευκολύνει εκτενείς μελέτες σχετικά με την επιδημιολογία των ιικών RTIs. Επί του παρόντος, η ιική επιδημιολογία των RTIs έχει μελετηθεί εκτενέστερα μεταξύ των παιδιατρικών πληθυσμών σε σύγκριση με τους ενήλικους πληθυσμούς σε όλο τον κόσμο. 1 Ομοίως, οι περισσότερες μελέτες που περιγράφουν την ιογενή αιτιολογία της αναπνευστικής νόσου στην Ταϊβάν, μια υποτροπική χώρα στην Ανατολική Ασία, περιορίστηκαν σε παιδιατρικούς πληθυσμούς. [2] [3] [4] Έτσι, ελλείπουν μελέτες μεταξύ ενηλίκων ασθενών, ιδιαίτερα όσον αφορά τις λοιμώξεις που οφείλονται σε επιθετικούς ή πρόσφατα εντοπισμένους ιούς, όπως ο ανθρώπινος μεταπνευμοϊός (hMPV) και ο ανθρώπινος κοροναϊός (hCoV). Οι επικαλυπτόμενες κλινικές παρουσιάσεις που μοιράζονται διαφορετικοί ιοί του αναπνευστικού καθιστούν δύσκολη τη διενέργεια διαφορικών διαγνώσεων με βάση μόνο τις κλινικές παραμέτρους. 5 Επιπλέον, οι αποτελεσματικοί αντιιικοί παράγοντες περιορίζονται επί του παρόντος σε λοιμώξεις από τον ιό της γρίπης. Ως εκ τούτου, μια καλύτερη κατανόηση της επιδημιολογίας των ιικών RTI ενηλίκων θα βοηθούσε τον μελλοντικό σχεδιασμό των διαγνωστικών στρατηγικών, του ελέγχου των λοιμώξεων και της διαχείρισης ασθενών. Μεταξύ των διαφόρων ΝΑΤ πολυπλεξίας, η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πολλαπλών θέσεων σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (PCR/ESI-MS ) μπορεί ταυτόχρονα να αναγνωρίσει και να υποτυπώσει πολλαπλούς αναπνευστικούς ιούς. [6] [7] [8] [9] Παρά τη διαγνωστική δυνατότητα, η ικανότητα της PCR/ESI-MS να ανιχνεύει ανθρώπινο εντεροϊό και ρινοϊό σε αναπνευστικά δείγματα από ασθενείς με RTIs δεν έχει αξιολογηθεί καλά. Προηγούμενες μελέτες PCR/ESI-MS σε ασθενείς με RTIs δεν συμπεριέλαβαν αυτούς τους 2 ιούς στα διαγνωστικά πάνελ. [6] [7] [8] [9] Εδώ, επεκταθήκαμε σε αυτές τις προηγούμενες μελέτες που χρησιμοποιούν PCR/ESI-MS για την ανίχνευση του αναπνευστικού ιού. Στόχος μας ήταν να διερευνήσουμε διεξοδικά την επιδημιολογία των ιικών RTI ενηλίκων χρησιμοποιώντας PCR/ESI-MS και να συγκρίνουμε τη διαγνωστική απόδοση μεταξύ PCR/ESI-MS και συμβατικών μεθόδων καλλιέργειας για τον εντοπισμό πολλαπλών, κλινικά σχετικών, αναπνευστικών ιών, συμπεριλαμβανομένων εντεροϊών και ρινοϊών. ολοκληρωμένη επιδημιολογική μελέτη που περιελάμβανε ασθενείς με και χωρίς συννοσηρότητα, εγγράψαμε ενήλικες (ηλικίας τουλάχιστον 18 ετών) με οξείες RTIs εντός 7 ημερών από την έναρξη που υποβλήθηκαν σε θεραπεία σε τοπική κλινική εξωτερικών ασθενών του νοσοκομείου YC ή στα εξωτερικά ιατρεία ή στα τμήματα επειγόντων περιστατικών του Εθνικού Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Cheng-Kung (NCKUH), ένα πανεπιστημιακό ιατρικό κέντρο στη νότια Ταϊβάν, μεταξύ Οκτωβρίου 2012 και Ιουνίου 2013. Η οξεία RTI ορίστηκε ως η ταυτόχρονη εμφάνιση τουλάχιστον 1 αναπνευστικού συμπτώματος ή σημείου (νέος ή επιδεινούμενος βήχας, παραγωγή πτυέλων, πονόλαιμος, ρινική συμφόρηση, ρινόρροια, δύσπνοια, συριγμός ή αμυγδαλές με ένεση) και τουλάχιστον 1 από τα ακόλουθα συμπτώματα: πυρετός, ρίγη και βήχας. Ο κατώτερος RTI (LRTI) ορίστηκε ως η παρουσία οξείας RTI και ενός νέου διηθήματος στην ακτινογραφία θώρακος. Για ασθενείς που εμφάνισαν περισσότερα από 1 επεισόδια RTI, το πιο πρόσφατο επεισόδιο μετρήθηκε ως ξεχωριστό μόνο εάν ο ασθενής ανάρρωσε πλήρως από το προηγούμενο επεισόδιο και υπήρχε ένα διάστημα τουλάχιστον 3 εβδομάδων μεταξύ της έναρξης των 2 επεισοδίων. Ανακτήθηκαν κλινικά, εργαστηριακά και ακτινολογικά δεδομένα και το ιστορικό επαφής κάθε ασθενή. Οι συννοσηρότητες αξιολογήθηκαν σε όλους τους ασθενείς με βάση τον δείκτη συννοσηρότητας Charlson (CCI). 10 Η χρήση στεροειδών ορίστηκε ως η λήψη θεραπείας με κορτικοστεροειδή (10 mg πρεδνιζολόνης ή ισοδύναμη ημερήσια δόση) για περισσότερες από 2 εβδομάδες. Μια ανοσοκατεσταλμένη κατάσταση διαγνώστηκε εάν οι ασθενείς πληρούσαν μία από τις ακόλουθες προϋποθέσεις: θεραπεία με κορτικοστεροειδή, στερεό όργανο ή λήπτης αιμοποιητικών βλαστοκυττάρων ή χημειοθεραπεία για υποκείμενη κακοήθεια κατά τους τελευταίους 6 μήνες. Ελήφθησαν από όλους τους ασθενείς και συλλέχθηκαν επιχρίσματα από ρινοφαρυγγικό ή λαιμό μέσο μεταφοράς, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. 11 για ανίχνευση και ταυτοποίηση ιού τόσο με απομόνωση ιού όσο και με PCR/ESI-MS. Τα κλινικά δείγματα αποθηκεύτηκαν στους 48 C και μεταφέρθηκαν στις θέσεις μελέτης εντός 24 ωρών από τη συλλογή. Επιχρίσματα λαιμού από 42 περιπτώσεις χωρίς λοιμώξεις του αναπνευστικού κατά τον μήνα πριν από την εγγραφή συμπεριλήφθηκαν ως δείγματα ελέγχου για ανάλυση PCR/ESI-MS, συμπεριλαμβανομένων 15 ασθενών με αποκλειστικά βακτηριακές λοιμώξεις (τεκμηριωμένες περιπτώσεις βακτηριαιμίας ή ουρολοίμωξης) που εισήχθησαν στο NCKUH και 27 άτομα χωρίς ενεργές λοιμώξεις. Αυτά τα άτομα χωρίς ενεργές λοιμώξεις περιελάμβαναν 10 ασθενείς με σταθερές χρόνιες ασθένειες που παρακολουθήθηκαν σε κλινικές NCKUH και 17 υγιή άτομα των οποίων οι ιατρικές πληροφορίες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κλινικό ερωτηματολόγιο. Η μελέτη εγκρίθηκε από το Institutional Review Board (B-ER-101-031) του το νοσοκομείο της μελέτης και όλοι οι ασθενείς παρείχαν ενημερωμένη συγκατάθεση. Αναπνευστικά δείγματα εμβολιάστηκαν σε κατάλληλες καλλιέργειες ιστού (νεφρός σκύλου Madin-Darby, MRC-5, A549 και ραβδομυοσάρκωμα) για την απομόνωση του ιού της ανθρώπινης γρίπης, του ιού της παραγρίπης, του γένους Enterovirus, του κυτταρομεγαλοϊού (C ), αδενοϊός, αναπνευστικό συγκυτιακό ιό (RSV), ιοί απλού έρπητα 1 και 2 (HSV-1 και -2) και ιός ανεμευλογιάς ζωστήρα (VZV). Η απομόνωση και η ταυτοποίηση των ιών διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας μια προηγουμένως περιγραφείσα μέθοδο 11 και οι εντεροϊοί ταυτοποιήθηκαν με μια δοκιμασία ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας ένα μίγμα Chemicon Pan EV που αντιδρά διασταυρούμενα με ρινοϊό (Light Diagnostics, Chemicon [Millipore], ΜΑ). 11, 12 Ανίχνευση και ταυτοποίηση ιών με PCR/ESI-MS Ολικά νουκλεϊκά οξέα εκχυλίστηκαν από 700 mL δειγμάτων επιχρίσματος χρησιμοποιώντας αυτοεξαγωγέα νουκλεϊκού οξέος (MagNA Pure Compact Instrument, Mannheim, Γερμανία) και το έκλουσμα αποθηκεύτηκε στους À808C μέχρι την ανάλυση. Κατά τη διάρκεια των αναλύσεων, τα εκχυλισμένα νουκλεϊκά οξέα προστέθηκαν τόσο σε μια πλάκα ανάλυσης PLEX-ID Respiratory Virus όσο και σε μια πλάκα ανάλυσης Broad Viral I PLEX-ID (PLEX-ID, Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois). Η ανάλυση αναπνευστικού ιού PLEX-ID ανιχνεύει ανθρώπινο αδενοϊό, hCoV, hMPV, γρίπη Α και Β, παραγρίπη τύπους 1 έως 3 και RSV, 6, ενώ η ανάλυση PLEX-ID Broad Viral I ανιχνεύει ανθρώπινο αδενοϊό, εντεροϊό, ρινοϊό, BK και JC πολυομαϊκός, παρβοϊός Β19, HSV-1 και -2, VZV, ιός Epstein-Barr (EBV), CMV και ανθρώπινος ιός έρπητα (HHV)-8. 13, 14 Σε αυτή τη μελέτη, οι αναπνευστικοί ιοί αναφέρονται σε αδενοϊό, hCoV, hMPV, γρίπη, παραγρίπη, RSV, εντεροϊό και ρινοϊό. Η ενίσχυση νουκλεϊκού οξέος και οι αναλύσεις των προϊόντων PCR διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα PCR/ESI-MS (PLEX-ID, Abbott Laboratories) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή, με χρόνο επαναφοράς της δοκιμής από το δείγμα στο αποτέλεσμα εντός 6 έως 8 ωρών. 8, 13 Οι αναλύσεις PCR/ESI-MS περιελάμβαναν αυτοματοποιημένη αφαλάτωση PCR, λήψη σήματος ESI-MS, φασματική ανάλυση και αναφορά δεδομένων. Η ταυτοποίηση του οργανισμού βασίστηκε στη συνολική μάζα και τις συνθέσεις βάσης των αμπλικονίων PCR σε σύγκριση με εκείνες στη βάση δεδομένων μοριακών υπογραφών που δημιουργήθηκε από τον κατασκευαστή PLEX-ID. 6, 8, 13, 14 Δείγματα στα οποία τα αποτελέσματα PCR/ESI-MS διαφωνούσαν με τα αποτελέσματα καλλιέργειας σε επίπεδο είδους επανεξετάστηκαν με μια δεύτερη μοριακή μέθοδο. Για εντεροϊούς, ο ρινοϊός διαφοροποιήθηκε από τον εντεροϊό χρησιμοποιώντας μια συμβατική ανάλυση αλληλουχίας PCR με τους προηγουμένως περιγραφέντες εκκινητές (Ρινοϊός s1 και ως) και μια αναζήτηση BLAST. 15 Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το Statistical Package for the Social Sciences έκδοση 17.0 (SPSS Inc, Chicago, IL). Οι συνεχείς μεταβλητές εκφράστηκαν ως μέσες τιμές τυπικές αποκλίσεις AE και συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμή ανάλυσης διασποράς. Οι κατηγορικές μεταβλητές συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας την ακριβή δοκιμή Fisher ή τη δοκιμή x 2. Όλες οι βιολογικά εύλογες μεταβλητές με τιμή P 0,10 στη μονομεταβλητή ανάλυση ελήφθησαν υπόψη για συμπερίληψη στο μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης για την πολυμεταβλητή ανάλυση. Μια τιμή P μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική και όλες οι δοκιμές ήταν 2-ουράς. Κατά τη διάρκεια της περιόδου μελέτης 9 μηνών, καταγράφηκαν συνολικά 267 επεισόδια οξείας RTIs από 263 ασθενείς, συμπεριλαμβανομένων 96 επεισοδίων σε τοπική κλινική και 171 επεισοδίων στο NCKUH (19 εξωτερικά ιατρεία και 152 στα τμήματα επειγόντων περιστατικών). Για ευκολία, κάθε επεισόδιο μετρήθηκε ως 1 περίπτωση. Συνολικά, 123 (46,1%) περιπτώσεις ήταν άνδρες ασθενείς και 152 (56,9%), 60 (22,5%) και 55 (20,6%) ασθενείς ήταν 18 έως 39, 40 έως 59 και !60 ετών, αντίστοιχα. Διακόσιοι δώδεκα (79,4%) ασθενείς παρουσίασαν ανώτερες RTIs (URTIs) και 55 (20,6%) περιπτώσεις παρουσίασαν LRTIs. Σε σύγκριση με τους ασθενείς που παρακολουθούσαν την τοπική κλινική, οι ασθενείς που παρακολουθούσαν το κέντρο ιατρικής περίθαλψης ήταν μεγαλύτερης ηλικίας και είχαν περισσότερες συννοσηρότητες (Πίνακας 1). Τα λεπτομερή δημογραφικά δεδομένα των 267 περιπτώσεων RTI και 42 περιπτώσεων ελέγχου παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Και τα 267 αναπνευστικά δείγματα από κάθε περίπτωση RTI εξετάστηκαν για ιούς τόσο με απομόνωση ιού όσο και με PCR/ESI-MS, και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον Πίνακα 2 . Για την απομόνωση του ιού, ιοί του αναπνευστικού ανιχνεύθηκαν σε 63 (23,6%) περιπτώσεις, συμπεριλαμβανομένης της γρίπης Α (48 περιπτώσεις, 18,0%), του εντεροϊού (13, 4,9%) και του ιού της παραγρίπης (2, 0,7%), και δεν ανιχνεύθηκε συνλοίμωξη . Η απομόνωση του ιού εντόπισε επιπλέον λοιμώξεις από παραγρίππη τύπου 3 και εντεροϊούς που δεν βρέθηκαν με PCR/ESI-MS σε 2 δείγματα. Με PCR/ESI-MS, ανιχνεύθηκαν ιοί του αναπνευστικού συστήματος σε 126 περιπτώσεις (47,2%). Ο ιός γρίπης Α (65 περιπτώσεις, 24,3%) ήταν ο πιο συχνά εντοπισμένος ιός, μεταξύ των οποίων 36 (13,5%) κρούσματα χαρακτηρίστηκαν ως πανδημικός ιός H1N1/09, 28 (10,5%) κρούσματα ως εποχικός ιός H3N2 και 1 κρούσμα ως η γρίπη Α. ταιριάζουν τόσο με την πανδημία H1N1 όσο και με τον εποχικό H3N2. Το γένος Εντεροϊός (34, 12,7%) ήταν ο δεύτερος πιο συχνά ανιχνευμένος ιός, συμπεριλαμβανομένου του ρινοϊού (25, 9,4%), του εντεροϊού (8, 3,0%) και 1 κρούσματος αρνητικής καλλιέργειας που αντιστοιχούσε τόσο για τον ρινοϊό όσο και για τον εντεροϊό. Σε μικρές αναλογίες ανιχνεύθηκαν hCoV (13, 4,9%), hMPV (10, 3,7%), αδενοϊός (6, 2,2%), RSV (6, 2,2%) και παραγρίπη (4, 1,5%). Ταυτόχρονη ανίχνευση περισσότερων από 1 αναπνευστικών ιών παρατηρήθηκε σε 11 (4,1%) ασθενείς και ο ρινοϊός (5 περιπτώσεις) ήταν πιο πιθανό να κωδικοποιηθεί με άλλον αναπνευστικό ιό (Πίνακας 2). Αξίζει να σημειωθεί ότι 4 καλλιεργημένοι ιοί που ταυτοποιήθηκαν ως εντεροϊοί λόγω της αντιδραστικότητας με το μίγμα Chemicon Pan EV χαρακτηρίστηκαν ως ρινοϊοί με PCR/ESI-MS. Περαιτέρω ανάλυση αλληλουχίας PCR των 4 κλινικών δειγμάτων επιβεβαίωσε την ύπαρξη ρινοϊών αλλά όχι εντεροϊών. Η PCR/ESI-MS εντόπισε επιπρόσθετους αναπνευστικούς ιούς σε 65 αρνητικά σε καλλιέργεια δείγματα, κυρίως ρινοϊό (21 δείγματα) και έναν δεύτερο αναπνευστικό ιό σε 3 δείγματα γρίπης Α θετικά σε καλλιέργεια. Συνολικά, τα ποσοστά θετικής ανίχνευσης για οποιονδήποτε αναπνευστικό ιό με καλλιέργεια, PCR/ESI-MS και με τις δύο μεθόδους ήταν 23,6%, 47,2% και 47,9% (128/267), αντίστοιχα. Από 61 δείγματα θετικά και με τις δύο μεθόδους, οι μέθοδοι PCR/ESI-MS και καλλιέργειας έφτασαν σε επίπεδα συμφωνίας 100% σε επίπεδο είδους για τη γρίπη και την παραγρίππη και 100% σε επίπεδο γένους για το γένος Εντεροϊό. Στην ομάδα ελέγχου, μόνο 1 (2,4%) υγιές άτομο βρέθηκε θετικό σε αναπνευστικό ιό (ρινοϊό) με PCR/ESI-MS. Όσον αφορά τους ιούς έρπητα, η PCR/ESI-MS ταυτοποίησε EBV, HSV-1, CMV και VZV σε 128 (47,9%), 25 (9,4%), 7 (2,6%) και 2 (0,7%) δείγματα από περιπτώσεις RTI, με παρόμοια ποσοστά ανίχνευσης που παρατηρήθηκαν στην ομάδα ελέγχου. Δεν υπήρξε ανίχνευση ιού πολυομάτου, παρβοϊού B19, HSV-2 ή ιού HHV-8 σε δείγματα από περιπτώσεις με RTIs ή την ομάδα ελέγχου. Οι περιπτώσεις που βρέθηκαν θετικές για οποιονδήποτε αναπνευστικό ιό είτε με καλλιέργεια είτε με PCR/ESI-MS αναλύθηκαν . Τα θετικά ποσοστά ανίχνευσης μειώθηκαν με την ηλικία: 55,3%, 41,7% και 34,5% στις ομάδες ηλικίας 18-39, 40-59 και !60 ετών, αντίστοιχα (P ¼ 0,02) (Εικόνα 1Α). Ένα υψηλότερο ποσοστό θετικότητας παρατηρήθηκε σε ασθενείς με URTIs από αυτό σε ασθενείς με LRTIs (50,5% έναντι 38,2%, P ¼ 0,10) (Πίνακας 3 και Εικόνα 1Β). Παρόμοιες κατανομές των αναπνευστικών ιών υπήρχαν σε περιπτώσεις από το τοπικό κλινικό και ιατρικό κέντρο (Πίνακας 2) και μεταξύ ασθενών από τις 3 ηλικιακές ομάδες (Εικόνα 1Α). Από 128 περιπτώσεις με αναγνωρίσιμους αναπνευστικούς ιούς, η λοίμωξη από τον ιό της γρίπης ήταν πιο συχνή σε ασθενείς με LRTIs από αυτούς με URTIs (81,0% [17/21] έναντι 48,6% [52/107], P 0,007 ¼). Ο ρινοϊός (12,7%), η γρίπη Α (10,9%) και η παραγρίππη (7,3%) ήταν οι 3 κύριοι αναπνευστικοί ιοί που εμπλέκονταν σε 55 περιπτώσεις LRTI και η παραγρίπη παρατηρήθηκε συχνότερα στην ομάδα LRTI από ό,τι στην ομάδα URTI (Πίνακας 3 και Εικόνα 1Β). Δεν υπήρχε εποχιακή διακύμανση σε κανένα μεμονωμένο αναπνευστικό ιό κατά τη διάρκεια της περιόδου των 9 μηνών. Από 128 ασθενείς με αναγνωρίσιμους αναπνευστικούς ιούς, η μονοπαραγοντική ανάλυση αποκάλυψε ότι οι ασθενείς με 1 από τις ακόλουθες καταστάσεις ήταν πιο πιθανό να έχουν λοιμώξεις από τον αναπνευστικό ιό χωρίς γρίπη: ανοσοκατεσταλμένη κατάσταση , χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (ΧΑΠ) και χρόνια νεφρική ανεπάρκεια που υποβάλλονται σε αιμοκάθαρση (OR 5,4, 95% CI 1,2-25,5, P ¼ 0,02). Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι η χρήση στεροειδών ήταν ένας ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για μόλυνση από ρινοϊό (OR 15,3, 95% CI 1,5-154,7, P ¼ 0,02), η ενεργός κακοήθεια ήταν ένας ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για μόλυνση από hMPV (OR 29,3, 95% CI 2,4-358. , P ¼ 0,008), και η ΧΑΠ ήταν ένας ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για λοίμωξη από παραγρίπη (OR 229,2, 95% CI 10,5-5020,8, Κατά τη σύγκριση των ομάδων URTI και LRTI, οι παράγοντες που βρέθηκαν να σχετίζονται με το LRTI από μονοπαραγοντική ανάλυση περιελάμβαναν το γήρας (! 60 ετών), υψηλός δείκτης συννοσηρότητας, συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια, ΧΑΠ, κακοήθεια, ανοσοκατεσταλμένη κατάσταση και ανίχνευση παραγρίπης ή EBV, ενώ η ανίχνευση της γρίπης Α συσχετίστηκε λιγότερο συχνά με LRTI. Η συν-ανίχνευση του αναπνευστικού ιού δεν συσχετίστηκε με την ανάπτυξη LRTI. Με πολυπαραγοντική ανάλυση, μόνο το γήρας, η ανοσοκατεσταλμένη κατάσταση και η ανίχνευση της παραγρίπης παρέμειναν 3 ανεξάρτητοι παράγοντες που σχετίζονται με το LRTI (Πίνακας 3). Μεταξύ των 117 επεισοδίων λοιμώξεων από μεμονωμένο αναπνευστικό ιό, η αρθραλγία παρατηρήθηκε συχνότερα σε λοιμώξεις από γρίπη Α παρά σε μη λοιμώξεις από γρίπη (66,1% [39/59] έναντι 46,6% [27/58], P ¼ 0,033); για αυτούς τους 2 τύπους λοιμώξεων, τα άλλα συμπτώματα που εξετάστηκαν, όπως πονόλαιμος, ρινόρροια, βήχας, πυώδη πτύελα, συριγμός, δύσπνοια και πονοκέφαλος, εντοπίστηκαν σε παρόμοιες συχνότητες. Από 55 περιπτώσεις LRTIs, συνλοίμωξη με βακτηριακά παθογόνα με καλλιέργεια πτυέλων ή Η καλλιέργεια αίματος βρέθηκε σε 3 (8,8%) από τους 34 ασθενείς που βρέθηκαν θετικοί για ιούς του αναπνευστικού και σε 2 (9,5%) από τους 21 ασθενείς που βρέθηκαν αρνητικοί για ιούς του αναπνευστικού. Τέσσερα από τα 6 κρούσματα γρίπης A LRTI είχαν λάβει oseltamivir. Δύο ασθενείς πέθαναν από πνευμονία και επιδείνωση μιας υποκείμενης κακοήθειας. 1 από αυτούς τους ασθενείς βρέθηκε θετικός για hMPV και ο άλλος ασθενής ήταν αρνητικός για αναπνευστικό ιό. Τέσσερα Η μελέτη μας για την ιογενή επιδημιολογία της οξείας RTI ενηλίκων με χρήση τεχνολογίας PCR/ESI-MS έχει 3 σημαντικά πλεονεκτήματα. Αρχικά, επεκταθήκαμε σε προηγούμενες μελέτες που χρησιμοποιούν PCR/ESI-MS για την ανίχνευση αναπνευστικού ιού. Η ανάλυση PLEX-ID Broad Viral I, η οποία στοχεύει εντεροϊούς, ρινοϊούς, ιούς έρπητα, JC και BK πολυοϊούς και παρβοϊό B19, και οι δοκιμές ανάλυσης αναπνευστικού ιού PLEX-ID υιοθετήθηκαν και οι δύο για την ανίχνευση πολλαπλών κλινικά σχετικών αναπνευστικών ιών. Δεύτερον, 2 ομάδες ελέγχου (ασθενείς με αποκλειστικά βακτηριακές λοιμώξεις και άτομα χωρίς ενεργές λοιμώξεις) εγγράφηκαν για την εξάλειψη των ψευδώς θετικών τεχνουργημάτων των ΝΑΤ και την εκτίμηση του επιπολασμού των ανιχνεύσιμων ασυμπτωματικών φορέων των αναπνευστικών ιών. Τρίτον, αυτή η μελέτη ενέγραψε ανοσοεπαρκείς και ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς που επισκέφθηκαν μια τοπική κλινική ή ιατρικό κέντρο που παρουσίασαν URTI ή LRTI, που αντικατοπτρίζει την πραγματική ιογενή επιδημιολογία των RTI ενηλίκων. Με τη συμπλήρωση της συμβατικής μεθόδου καλλιέργειας με PCR/ESI-MS, 2 -Επιτεύχθηκε διπλάσια αύξηση στο ποσοστό ανίχνευσης του αναπνευστικού ιού, από 23,6% μόνο με καλλιέργεια σε 47,9% με συνδυασμό και των δύο μεθόδων. Διαγνωστικό κέρδος παρατηρήθηκε τόσο για τους καλλιεργήσιμους ιούς, ιδιαίτερα για τους ρινοϊούς, όσο και για τους επιθετικούς ιούς. Αν και δεν συγκρίναμε ένα εναλλακτικό NAT λόγω περιορισμών όγκου δείγματος, έχει αναφερθεί ότι η PCR/ESI-MS έχει υψηλή ευαισθησία (92,9-100%) και ειδικότητα (99-100%) για την ανίχνευση μεταβλητού αναπνευστικού ιού σε σχέση με την ανοσολογική και μεθόδους που βασίζονται σε PCR ως δοκιμασίες χρυσού προτύπου, με εξαίρεση την παραγρίπη (ευαισθησία 63,4%). 6 Συμπτωματικά, διαπιστώσαμε ότι η παραγρίππη τύπου 3 ήταν 1 από τους 2 μόνο ιούς που δεν ανιχνεύθηκαν με PCR/ESI-MS. Οι πιθανές αιτίες που συμβάλλουν στο χαμηλότερο ποσοστό ανίχνευσης για την παραγρίπη πρέπει να διερευνηθούν. Το θετικό ποσοστό ανίχνευσης (47,2%) για τους αναπνευστικούς ιούς με PCR/ESI-MS στην παρούσα μελέτη ήταν παρόμοιο με εκείνο των παράλληλων προγραμμάτων επιτήρησης ενηλίκων με χρήση ΝΑΤ (43,2 -57%). 5,16-18 αλλά σημαντικά υψηλότερο από μια προηγούμενη μελέτη που χρησιμοποιούσε το σύστημα βιοαισθητήρα Ibis T5000 (το πρωτότυπο του PCR-ESI/MS) χρησιμοποιώντας το κιτ επιτήρησης αναπνευστικού ιού II (35,9%), πιθανότατα επειδή το κιτ δεν σχεδιάστηκε για την ανίχνευση του εντεροϊού και του ρινοϊού. 8 Ο εντεροϊός και ο ρινοϊός, αμφότεροι μέλη του γένους Enterovirus, συνέβαλαν στο 13,1% των περιπτώσεων RTI στη μελέτη μας και στο 9,8-17,8% των περιπτώσεων ενηλίκων σε άλλες μελέτες. 5, 16, 17 Λαμβάνοντας υπόψη τον επιπολασμό τους, ο εντεροϊός και ο ρινοϊός θα πρέπει να περιλαμβάνονται στα διαγνωστικά πάνελ των αναπνευστικών ιών, εάν ενδείκνυται πλήρης ανίχνευση ιών. Το ποσοστό κωδικοποίησης (4,1%) ήταν εντός του εύρους 2,0-7,2% που έχει αναφερθεί αλλού . 5, 16, 17 και ο ρινοϊός ήταν ο ιός που εμπλέκεται συχνότερα στις συνλοιμώξεις, πιθανώς λόγω του υψηλού επιπολασμού του καθ' όλη τη διάρκεια του έτους. 18 Ο ιός της γρίπης Α και ο ρινοϊός ήταν οι 2 πιο συχνά ανιχνευόμενοι αναπνευστικοί ιοί, ενώ ο hCoV, ο hMPV, ο εντεροϊός, ο αδενοϊός, ο RSV και η παραγρίππη εντοπίστηκαν σε μικρές αναλογίες. Αυτό το εύρημα είναι παρόμοιο με την ιογενή επιδημιολογία των RTI ενηλίκων που παρατηρήθηκε από άλλες ομάδες μελέτης. 5, 16, 17 Οι παρόμοιες κατανομές ιών μεταξύ περιπτώσεων από τοπική κλινική και ιατρικό κέντρο και μεταξύ ασθενών των 3 ηλικιακών ομάδων υποδηλώνουν ότι άτομα όλων των ηλικιακών ομάδων είναι ευαίσθητα σε πολλαπλούς αναπνευστικούς ιούς που κυκλοφορούν ταυτόχρονα στην κοινότητα. Ένα χαμηλότερο ποσοστό θετικής ανίχνευσης παρατηρήθηκε στον ηλικιωμένο πληθυσμό, πιθανώς επειδή οι ηλικιωμένοι ενήλικες ασθενείς απέκοψαν χαμηλότερους τίτλους ιών. 19 Ωστόσο, οι ρόλοι του EBV, του HSV-1 και του CMV σε ενήλικες RTIs παραμένουν ατελώς 20 Επιπλέον, η μονομεταβλητή συσχέτιση μεταξύ EBV και LRTIs που παρατηρήθηκε σε αυτή τη μελέτη μπορεί να προκλήθηκε από τον συγχυτικό παράγοντα της ηλικίας, ιδιαίτερα δεδομένου ότι η μεγάλη ηλικία ήταν αναγνωρίστηκε ως ανεξάρτητος παράγοντας για την ανίχνευση EBV (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Η έλλειψη ανίχνευσης του πολυωμαϊκού ιού BK και JC ή του παρβοϊού Β19 υποδηλώνει ότι αυτοί οι ιοί διαδραματίζουν μικρό ρόλο σε ενήλικες RTIs και ότι τα στοματοφαρυγγικά κύτταρα δεν εμπλέκονται στην επιμονή του πολυωμαϊκού ιού BK και JC. 21 Επιπλέον, ο χαμηλός θετικός ρυθμός ανίχνευσης για τους αναπνευστικούς ιούς στην ομάδα ελέγχου υποδηλώνει χαμηλή πιθανότητα ψευδώς θετικών τεχνουργημάτων στην PCR/ESI-MS ή χαμηλότερο ποσοστό ασυμπτωματικού αποικισμού των αναπνευστικών ιών. Εκτός από το πλεονέκτημα της ευαίσθητης ανίχνευσης, η PCR/ESI-MS διαθέτει την ικανότητα ταυτόχρονης αναγνώρισης υποτύπων των αναπνευστικών ιών. 22 Σε αυτή τη μελέτη, οι ιοί της γρίπης Α υποτυπώθηκαν ως πανδημική γρίπη Α H1N1 και εποχιακή γρίπη H3N2. Στην Ευρώπη, και οι δύο ιοί συνκυκλοφόρησαν στην κοινότητα την περίοδο της γρίπης 2012-2013. 23 Στο γένος Enterovirus, ο ασταθής σε οξύ ρινοϊός μπορεί να διαφοροποιηθεί από τον εντεροϊό χρησιμοποιώντας μια δοκιμή αστάθειας σε οξύ. 24 ενώ η PCR/ESI-MS μπορεί να διαφοροποιήσει γρήγορα τα 2 είδη σε μία μόνο δοκιμή, όπως αποδείχθηκε στη μελέτη μας. Οι 13 hCoV υποτυπώθηκαν ως hCoV-OC43, -229E και -HKU1, το οποίο επικυρώθηκε περαιτέρω με συμβατικές αναλύσεις αλληλουχίας PCR (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ο πρόσφατα ταυτοποιημένος HCoV-NL63 δεν ανιχνεύθηκε κατά την περίοδο της μελέτης και αναφέρθηκε χαμηλό ποσοστό ανίχνευσης (<1%) στην Κίνα. 16 Η κατανόησή μας για τους ρόλους των αναπνευστικών ιών που δεν είναι γρίπη σε ασθενείς με συννοσηρότητες ή LRTI έχει ενισχυθεί στη μελέτη μας. Οι ασθενείς που υποβάλλονταν σε θεραπεία με στεροειδή, είχαν ενεργό κακοήθεια ή έπασχαν από ΧΑΠ διέτρεχαν κίνδυνο για λοιμώξεις από ρινοϊό, hMPV ή παραγρίπη, αντίστοιχα. Συνολικά, οι ανοσοκατεσταλμένοι ασθενείς, οι ασθενείς με ΧΑΠ και οι ασθενείς που υποβάλλονταν σε αιμοκάθαρση διέτρεχαν κίνδυνο λοίμωξης από τον αναπνευστικό ιό που δεν ήταν γρίπη. Οι λοιμώξεις από τον ιό της γρίπης εμπλέκονταν επίσης συχνότερα σε LRTIs παρά σε URTIs. Μεταξύ των LRTI, ο ρινοϊός και η παραγρίππη κατατάχθηκαν ως το πρώτο και το τρίτο πιο κοινό παθογόνο, αντίστοιχα, και η παραγρίππη ήταν ένας ανεξάρτητος παράγοντας που σχετίζεται με τους LRTIs, εύρημα που συνάδει με προηγούμενες αναφορές ότι και οι δύο ιοί είναι σημαντικές αιτίες των LRTIs. 18, [25] [26] [27] Από την άλλη πλευρά, παρά τον αυξανόμενο ρόλο των αναπνευστικών ιών που δεν είναι γρίπη, οι επί του παρόντος διαθέσιμοι αντιιικοί παράγοντες και εμβόλια στοχεύουν κυρίως τη μόλυνση από τη γρίπη. Αν και η ιογενής RTI είναι μια αυτοπεριοριζόμενη ασθένεια, όπως παρατηρείται στην πλειονότητα των ασθενών μας με LRTI που ανέρρωσαν από ασθένεια χωρίς τη βοήθεια αντιιικών παραγόντων, μια σίγουρη αιτιολογική διάγνωση μπορεί να βοηθήσει στη μείωση της αδικαιολόγητης χρήσης αντιγριπικών παραγόντων ή αντιμικροβιακών και /ή περιττές νοσηλείες και παρέχουν χρήσιμες πληροφορίες για τον έλεγχο των RTI. Ωστόσο, παρατηρήσαμε ότι η κλινική διαφοροποίηση της λοίμωξης από γρίπη από άλλες λοιμώξεις από ιούς του αναπνευστικού είναι δύσκολη λόγω αλληλοεπικαλυπτόμενων συμπτωμάτων, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. 5 Συλλογικά, η συσχέτιση της λοίμωξης από τον ιό της γρίπης με ασθενείς με συννοσηρότητες ή LRTIs που αναφέρονται εδώ υποδηλώνει ότι ένα πλήρες αναπνευστικό ιικό πάνελ θα ήταν κατάλληλο για τη διαγνωστική εργασία για RTI σε αυτούς τους πληθυσμούς. Το πρόσθετο κόστος που προκύπτει από τη χρήση μιας πλήρους ομάδας αξιολογήσεων βάσει PCR/ESI-MS ή άλλων μοριακών δοκιμών θα αντισταθμιστεί πιθανώς από τις συνοδευτικές μειώσεις της περιττής αντιμικροβιακής θεραπείας ή/και νοσηλείας. 18 Η μελέτη μας έχει ορισμένους περιορισμούς. Πρώτον, οι νέοι αναπνευστικοί ιοί της παραγρίππης τύπου 4 και 3, ο ανθρώπινος ιός μποκαϊού, ο ανθρώπινος ιός πολυομαϊκού ιού KI και ο πολυομαϊκός ιός WU δεν συμπεριλήφθηκαν στα πάνελ. [28] [29] [30] [31] και ο ρόλος τους σε RTI ενηλίκων στην Ταϊβάν είναι ασαφής. Δεύτερον, αν και έχουν εντοπιστεί ορισμένοι παράγοντες κινδύνου για συγκεκριμένες λοιμώξεις από ιούς, όπως οι λοιμώξεις από hMPV ή παραγρίππη, αυτές οι συσχετίσεις θα πρέπει να επανεξεταστούν σε πρόσθετες κλινικές μελέτες μεγάλης κλίμακας και θα πρέπει να διερευνηθούν οι κλινικές επιπτώσεις και οι υποκείμενοι μηχανισμοί αυτών των συσχετίσεων. Ομοίως, μπορεί να χρειαστούν περισσότερες περιπτώσεις ελέγχου για την καλύτερη εκτίμηση του επιπολασμού των ασυμπτωματικών φορέων των αναπνευστικών ιών. Τρίτον, καλύφθηκαν μόνο 3 εποχές και η εποχικότητα των ιογενών αναπνευστικών λοιμώξεων δεν μπόρεσε να αποδειχθεί. Συμπερασματικά, σε σύγκριση με την απομόνωση του ιού, η PCR/ESI-MS παρήγαγε μεγαλύτερη διαγνωστική απόδοση για ιογενείς RTIs, με χαμηλή πιθανότητα ψευδώς θετικών τεχνουργήματα. Η λοίμωξη από τον αναπνευστικό ιό χωρίς γρίπη συσχετίστηκε σημαντικά με ασθενείς με συννοσηρότητες και με LRTIs. Δικαιολογούνται πρόσθετες μελέτες για την οριοθέτηση της κλινικής ανάγκης και των οικονομικών οφελών της συμπερίληψης των αναπνευστικών ιών που δεν είναι γρίπη στη διαγνωστική εργασία σε αυτούς τους πληθυσμούς.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 1538, "text": "27" } ], "id": 4078, "question": "Πόσα δείγματα ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2106, "text": "4,1% των περιπτώσεων" } ], "id": 4079, "question": "Ποιος ήταν ο επιπολασμός της συνλοίμωξης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5042, "text": "αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πολλαπλών θέσεων σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας ιονισμού ηλεκτροψεκασμού" } ], "id": 4081, "question": "Ποιες εξετάσεις μπορούν να ταυτοποιήσουν και να υποτυπώσουν ταυτόχρονα πολλαπλούς ιούς του αναπνευστικού συστήματος;" }, { "answers": [ { "answer_start": 17002, "text": "9 μηνών" } ], "id": 4083, "question": "Ποια ήταν η διάρκεια της μελέτης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 12201, "text": "263" } ], "id": 4084, "question": "Πόσοι ασθενείς είχαν οξείες RTI;" }, { "answers": [ { "answer_start": 24404, "text": "ρινοϊός" } ], "id": 4085, "question": "Ποια ήταν η πιο συχνή συνλοίμωξη;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Μια υπερ-εξαπλωμένη προβατίνα μολύνει εκατοντάδες με πυρετό Q σε μια αγορά αγροτών στη Γερμανία https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1618839/SHA: ee1b5a9618dcc4080ed100486cedd0969e80fa4; Rissland, Jürgen; Tigges, Almira; Broll, Susanne; Hopp, Wilfried; Lunemann, Mechthild; van Treeck, Ulrich; Kimig, Peter; Brockmann, Stefan O; Wagner-Wiening, Christiane; Hellenbrand, Wiebke; Buchholz, UdoDate: 2006-10-06DOI: 10.1186/1471-2334-6-147Άδεια: cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Τον Μάιο του 2003 το Τμήμα Υγείας της κομητείας Soest ενημερώθηκε για έναν ασυνήθιστα μεγάλο αριθμό ασθενών που νοσηλεύτηκαν με pneaonia. ΜΕΘΟΔΟΙ: Σε διερευνητικές συνεντεύξεις οι ασθενείς ανέφεραν ότι είχαν επισκεφθεί μια αγορά αγροτών όπου ένα πρόβατο είχε αρνηθεί. Ο ορολογικός έλεγχος επιβεβαίωσε τη διάγνωση του πυρετού Q. Ζητήσαμε από τα τοπικά τμήματα υγείας στη Γερμανία να εντοπίσουν ειδοποιημένους ασθενείς με πυρετό Q που είχαν επισκεφτεί την αγορά των αγροτών. Για να διερευνήσουμε τους παράγοντες κινδύνου για λοίμωξη, πραγματοποιήσαμε μια μελέτη ελέγχου περίπτωσης (τα περιστατικά ήταν ασθενείς με πυρετό Q, οι έλεγχοι επιλέχθηκαν τυχαία πολίτες Soest) και μια μελέτη κοόρτης μεταξύ των πωλητών στην αγορά. Τα πρόβατα που εκτέθηκαν στην αγορά, το κοπάδι από το οποίο προήλθε καθώς και πρόβατα από κοπάδια που διατηρούνται στην περιοχή του Soest δοκιμάστηκαν για Coxiella burnetii (C. burnetii). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Συνολικά 299 αναφερθέντα κρούσματα πυρετού Q συνδέθηκαν με αυτό το ξέσπασμα. Η μέση περίοδος επώασης ήταν 21 ημέρες, με ένα διατεταρτημόριο 16-24 ημέρες. Η μελέτη περίπτωσης ελέγχου προσδιόρισε την κοντινή απόσταση και το σταμάτημα για τουλάχιστον μερικά δευτερόλεπτα στη μάντρα των προβάτων ως σημαντικούς παράγοντες κινδύνου. Οι πωλητές σε απόσταση περίπου 6 μέτρων από την μάντρα των προβάτων διέτρεχαν αυξημένο κίνδυνο για ασθένειες σε σύγκριση με εκείνους που βρίσκονταν πιο μακριά. Ο άνεμος δεν έπαιξε σημαντικό ρόλο. Το ποσοστό κλινικής προσβολής ενηλίκων και παιδιών υπολογίστηκε σε 20% και 3%, αντίστοιχα, το 25% των περιπτώσεων νοσηλεύονταν. Η προβατίνα που είχε γεννήσει αρνί καθώς και το 25% του κοπαδιού της βρέθηκαν θετικά σε αντισώματα C. burnetii. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Λόγω του μεγέθους και της φύσης της σημειακής πηγής, αυτή η εστία επέτρεψε την αξιολόγηση θεμελιωδών, αλλά σπάνια μελετημένων επιδημιολογικών παραμέτρων. Ως συνέπεια αυτής της επιδημίας, προτάθηκε να μην εκτίθενται τα έγκυα πρόβατα στο κοινό κατά τη διάρκεια του 3ου τριμήνου και να ελέγχονται τακτικά ζώα σε ζωολογικούς κήπους για το C. burnetii. Κείμενο: Ο πυρετός Q είναι μια παγκόσμια ζωονόσος που προκαλείται από την Coxiella burnetii (C. burnetii), ένα μικρό, gram-αρνητικό υποχρεωτικό ενδοκυτταρικό βακτήριο. Το C. burnetii εμφανίζει αντιγονική παραλλαγή με μολυσματική φάση Ι και λιγότερο μολυσματική φάση II. Η κύρια δεξαμενή από την οποία εμφανίζεται η ανθρώπινη μόλυνση αποτελείται από πρόβατα, κατσίκες και βοοειδή. Αν και οι λοιμώξεις από C. burnetii στα ζώα είναι συνήθως ασυμπτωματικές, μπορεί να προκαλέσουν αμβλώσεις σε αιγοπρόβατα [1] . Υψηλές συγκεντρώσεις C. burnetii μπορούν να βρεθούν σε προϊόντα γέννησης μολυσμένων θηλαστικών [2] . Οι άνθρωποι συχνά αποκτούν μόλυνση μέσω εισπνοής μολυσμένων αερολυμάτων από υγρά τοκετού, πλακούντα ή μαλλί [1] . Επειδή η μολυσματική δόση είναι πολύ χαμηλή [3] και το C. burnetii είναι σε θέση να επιβιώσει σε κατάσταση που μοιάζει με σπόρους για μήνες έως χρόνια, εστίες μεταξύ των ανθρώπων έχουν επίσης εμφανιστεί μέσω μολυσμένης σκόνης που μεταφέρεται από τον άνεμο σε μεγάλες αποστάσεις [4] [5] [6] .Γ. Η μόλυνση με burnetii στους ανθρώπους είναι ασυμπτωματική στο 50% περίπου των περιπτώσεων. Περίπου το 5% των περιπτώσεων νοσηλεύονται και οι θανατηφόρες περιπτώσεις είναι σπάνιες [1] . Η κλινική εικόνα του οξέος πυρετού Q είναι μεταβλητή και μπορεί να μοιάζει με πολλές άλλες μολυσματικές ασθένειες [2] . Ωστόσο, η πιο συχνή κλινική εκδήλωση του οξέος πυρετού Q είναι μια αυτοπεριοριζόμενη εμπύρετη ασθένεια που σχετίζεται με σοβαρή κεφαλαλγία. Η άτυπη πνευμονία και η ηπατίτιδα είναι οι κύριες κλινικές εκδηλώσεις πιο σοβαρής νόσου. Ο οξύς πυρετός Q μπορεί να επιπλέκεται από μηνιγγοεγκεφαλίτιδα ή μυοκαρδίτιδα. Σπάνια μια χρόνια μορφή πυρετού Q αναπτύσσεται μήνες μετά την οξεία ασθένεια, πιο συχνά με τη μορφή ενδοκαρδίτιδας [1] . Τα παιδιά αναπτύσσουν κλινική νόσο λιγότερο συχνά [7, 8]. Λόγω της μη ειδικής εμφάνισής του, ο πυρετός Q μπορεί να υποψιαστεί μόνο για κλινικούς λόγους και απαιτεί ορολογική επιβεβαίωση. Ενώ η έμμεση δοκιμασία ανοσοφθορισμού (IFA) θεωρείται η μέθοδος αναφοράς, μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί η σταθεροποίηση συμπληρώματος (CF), η ELISA και η μικροσυγκόλληση (MA) [9] . Οι οξείες λοιμώξεις διαγιγνώσκονται με αυξημένα αντισώματα IgG και/ή IgM κατά της φάσης ΙΙ, ενώ τα αυξημένα αντισώματα IgG κατά της φάσης Ι είναι χαρακτηριστικά για χρόνιες λοιμώξεις [1] . Στη Γερμανία, ο οξύς πυρετός Q είναι μια ασθένεια που μπορεί να δηλωθεί. Μεταξύ 1991 και 2000, ο ετήσιος αριθμός των υποθέσεων κυμαινόταν από 46 έως 273 περιπτώσεις ετησίως [10] . Το 2001 και το 2002, ειδοποιήθηκαν 293 και 191 περιπτώσεις, αντίστοιχα [11, 12] . Στις 26 Μαΐου 2003 το τμήμα υγείας του Soest ενημερώθηκε από ένα τοπικό νοσοκομείο για έναν ασυνήθιστα μεγάλο αριθμό ασθενών με άτυπη πνευμονία. Μερικοί ασθενείς ανέφεραν ότι επισκέφτηκαν μια αγορά αγροτών που πραγματοποιήθηκε στις 3 και 4 Μαΐου 2003 σε μια λουτρόπολη κοντά στο Soest. Δεδομένου ότι η αιτιολογία ήταν ασαφής, ελήφθησαν υπόψη παθογόνα όπως ο κορωνοϊός SARS και εφαρμόστηκαν αυστηρά μέτρα ελέγχου της λοίμωξης μέχρι να επιβεβαιωθεί η διάγνωση του πυρετού Q. Συγκροτήθηκε μια ομάδα έρευνας επιδημίας που περιλάμβανε επαγγελματίες δημόσιας υγείας από το τοπικό τμήμα υγείας, το τοπικό τμήμα κτηνιατρικής υγείας , το κρατικό τμήμα υγείας, το Εθνικό Εργαστήριο Συμβούλων (NCL) για την Coxiellae και το Robert Koch-Institute (RKI), το ομοσπονδιακό ινστιτούτο δημόσιας υγείας. Λόγω του μεγέθους και της εμφάνισης σημειακής πηγής της εστίας, στόχος της έρευνας ήταν ο εντοπισμός αιτιολογικών παραγόντων που σχετίζονται με την πρόληψη και τον έλεγχο του πυρετού Q καθώς και η αξιολόγηση επιδημιολογικών παραμέτρων που σπάνια μπορούν να μελετηθούν διαφορετικά. Στις 26 και 27 Μαΐου, Το 2003 πραγματοποιήσαμε διερευνητικές συνεντεύξεις με ασθενείς στο Soest που νοσηλεύτηκαν λόγω άτυπης πνευμονίας. Ζητήθηκε από τους θεράποντες ιατρούς να εξετάσουν τον ορό ασθενών με άτυπη πνευμονία για Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila,, Coxiella3influenzai, και Coxiella3influenzai Αδενοϊός και Εντεροϊός. Τα επιχρίσματα λαιμού δοκιμάστηκαν για τον ιό της γρίπης, τον αδενοϊό και τον SARS-Coronavirus. Η εργαστηριακή επιβεβαίωση μιας οξείας λοίμωξης από πυρετό Q ορίστηκε ως η παρουσία αντισωμάτων IgM έναντι αντιγόνων C. burnetii φάσης II (ELISA ή IFA), 4 φορές αύξηση στον τίτλο αντισωμάτων IgG κατά φάσης II (ELISA ή IFA) ή σε αντι Τίτλος αντισωμάτων φάσης ΙΙ από ΚΙ μεταξύ οξέων και αναρρωθέντων ορών. Μια χρόνια λοίμωξη επιβεβαιώθηκε όταν αυξήθηκαν οι τίτλοι αντισωμάτων αντισωμάτων IgG και IgG φάσης ΙΙ. Επειδή οι ασθενείς με βαλβιδικές καρδιακές ανωμαλίες και οι έγκυες γυναίκες διατρέχουν υψηλό κίνδυνο να αναπτύξουν χρόνια λοίμωξη [13, 14] ειδοποιήσαμε τους παθολόγους και τους γυναικολόγους μέσω του περιοδικού του Γερμανικού Ιατρικού Συλλόγου και τους ζήτησε να στείλουν δείγματα ορού στο NCL εάν εντόπιζαν ασθενείς από αυτές τις ομάδες κινδύνου που βρίσκονταν στην αγορά των αγροτών κατά τη διάρκεια της επιδημίας. Ο στόχος της πρώτης μελέτης περιστατικού ελέγχου ήταν να διαπιστωθεί εάν υπήρξε σύνδεση μεταξύ της αγοράς των αγροτών και της επιδημίας και για τον εντοπισμό άλλων πιθανών παραγόντων κινδύνου. Πραγματοποιήσαμε τηλεφωνικές συνεντεύξεις χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο ερωτηματολόγιο που ρωτούσε για τη συμμετοχή στην αγορά των αγροτών, αφού βρισκόταν σε απόσταση 1 χιλιομέτρου από ένα από τα 6 κοπάδια προβάτων της περιοχής, τα τσιμπήματα από τσιμπούρια και την κατανάλωση μη παστεριωμένου γάλακτος, πρόβειου ή κατσικίσιου τυριού. Για τους σκοπούς του CCS1, ορίσαμε μια περίπτωση (υπόθεση CCS1) ως ενήλικα κάτοικο της πόλης Soest που ειδοποιήθηκε στο νόμιμο σύστημα επιτήρησης με πυρετό Q, με έναρξη των συμπτωμάτων μεταξύ 4 Μαΐου και 3 Ιουνίου 2003. Κριτήριο αποκλεισμού ήταν αρνητικός τίτλος IgM έναντι αντιγόνων φάσης II. Επιλέχθηκαν δύο έλεγχοι ανά περίπτωση από κατοίκους Soest με τυχαία ψηφιακή κλήση. Υπολογίσαμε το αποδιδόμενο κλάσμα των περιπτώσεων που εκτέθηκαν στην αγορά των αγροτών στις 4 Μαΐου (AFE) ως (OR-1)/OR και το αποδιδόμενο κλάσμα για όλες τις περιπτώσεις λόγω αυτή η έκθεση ως: Η αγορά των αγροτών πραγματοποιήθηκε σε μια λουτρόπολη κοντά στο Soest με πολλούς επισκέπτες από άλλες περιοχές της πολιτείας και ακόμη και από ολόκληρη τη χώρα. Για να προσδιορίσουμε το μέγεθος της επιδημίας, ζητήσαμε επομένως από τα τοπικά τμήματα δημόσιας υγείας στη Γερμανία να εξακριβώσουν μια πιθανή σύνδεση με την αγορά των αγροτών στο Soest για όλους τους ασθενείς που έχουν ειδοποιηθεί με πυρετό Q. Ένα κρούσμα σε αυτό το πλαίσιο («κοινοποιημένο κρούσμα») ορίστηκε ως κάθε άτομο με κλινική διάγνωση συμβατή με πυρετό Q με ή χωρίς εργαστηριακή επιβεβαίωση και ιστορικό έκθεσης στην αγορά των αγροτών. Τα τοπικά τμήματα υγείας ανέφεραν επίσης εάν ένα κοινοποιημένο κρούσμα νοσηλεύτηκε . Για να λάβουμε μια ανεξάρτητη, δεύτερη εκτίμηση του ποσοστού νοσηλειών μεταξύ συμπτωματικών ασθενών πέρα ​​από αυτό που αναφέρθηκε μέσω του νόμιμου συστήματος επιτήρησης, υπολογίσαμε το ποσοστό των νοσηλευόμενων ασθενών μεταξύ εκείνων των ατόμων που πληρούν τον ορισμό της κλινικής περίπτωσης (όπως χρησιμοποιείται στη μελέτη προμηθευτών (s.b.)). που προσδιορίστηκε μέσω τυχαίας δειγματοληψίας του πληθυσμού Soest (εντός του CCS2 (s.b.)) καθώς και σε δύο ομάδες (μελέτη πωλητών και 9 φίλοι ναυτικοί (βλ. παρακάτω)). Ο στόχος του CCS2 ήταν να εντοπίσει τους παράγοντες κινδύνου που σχετίζονται με την παρουσία στην αγορά των αγροτών τη δεύτερη ημέρα. Χρησιμοποιήσαμε τον ίδιο ορισμό περίπτωσης όπως στο CCS1, αλλά συμπεριλάβαμε μόνο άτομα που είχαν επισκεφτεί την αγορά των αγροτών στις 4 Μαΐου, τη δεύτερη ημέρα της αγοράς. Επιλέξαμε ξανά τυχαία ελέγχους από το τηλεφωνικό μητρώο του Soest και συμπεριλάβαμε μόνο τα άτομα που είχαν επισκεφθεί την αγορά των αγροτών στις 4 Μαΐου και δεν είχαν αρρωστήσει με πυρετό στη συνέχεια. Οι πιθανοί μάρτυρες που αρρώστησαν αποκλείστηκαν για ανάλυση στο CCS2, αλλά παρόλα αυτά ερωτήθηκαν πλήρως. Αυτό επέτρεψε τον υπολογισμό του ποσοστού επίθεσης μεταξύ των επισκεπτών στην αγορά (βλ. παρακάτω \"Εκτίμηση του συνολικού ποσοστού προσβολής\") και έδωσε μια εκτίμηση του ποσοστού των κλινικά ασθενών περιπτώσεων που νοσηλεύτηκαν (σ.α.). Στη μελέτη των πωλητών ερευνήσαμε εάν Η απόσταση των κερκίδων του πωλητή από την μάντρα ή η διασπορά του C. burnetii από τον άνεμο ήταν σχετικοί παράγοντες κινδύνου για την απόκτηση πυρετού Q. Λάβαμε μια λίστα με όλους τους πωλητές, συμπεριλαμβανομένης της κατά προσέγγιση τοποθεσίας των περιπτέρων από τον διοργανωτή. Επιπλέον, ζητήσαμε από τον τοπικό μετεωρολογικό σταθμό την κυρίαρχη κατεύθυνση του ανέμου στις 4 Μαΐου 2003. Οι τηλεφωνικές συνεντεύξεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση τυποποιημένων ερωτηματολογίων. Ως περίπτωση ορίστηκε ένα άτομο με έναρξη πυρετού μεταξύ 4 Μαΐου και 3 Ιουνίου 2003 και τουλάχιστον τρία από τα ακόλουθα συμπτώματα: πονοκέφαλος, βήχας, δύσπνοια, πόνος στις αρθρώσεις, μυϊκός πόνος, απώλεια βάρους άνω των 2 κιλών, κόπωση, ναυτία ή έμετος. Η σχετική απόσταση των κερκίδων από το μαντρί υπολογίστηκε με την καταμέτρηση των κερκίδων μεταξύ της στάμπας και της εν λόγω στάμπας. Κάθε βάση θεωρήθηκε ότι είναι μία μονάδα βάσης (περίπου 3 μέτρα). Μεγαλύτερες κερκίδες μετρήθηκαν ως 2 μονάδες. Η κατεύθυνση του ανέμου σε σχέση με το μαντρί ορίστηκε διαιρώντας το τριαντάφυλλο του ανέμου (360°) σε 4 ίσα μέρη των 90°. Η κυρίαρχη κατεύθυνση ανέμου κατά τη διάρκεια της αγοράς ήταν νότιος-νοτιοανατολικός (Εικόνα 1). Για τους σκοπούς της ανάλυσης χωρίσαμε την περιοχή της αγοράς σε 4 τμήματα με το μαντρί στο κέντρο της. Στην ενότητα 1 ο άνεμος φυσούσε προς την μάντρα των προβάτων (συν μείον 45°). Το τμήμα 4 ήταν στην αντίθετη πλευρά, δηλ. όπου ο άνεμος φυσούσε από την μάντρα προς τις κερκίδες, και τα τμήματα 2 και 3 ήταν ανατολικά και δυτικά ως προς την κατεύθυνση του ανέμου, αντίστοιχα. Η θέση των κερκίδων σε σχέση με την μάντρα ορίστηκε επομένως με δύο τρόπους: ως η απόλυτη απόσταση από την μάντρα (σε μονάδες βάσης ή μέτρα) και σε σχέση με την κατεύθυνση του ανέμου. Εντοπίσαμε μια μικρή ομάδα 9 φίλων ναυτικών που επισκέφθηκε την αγορά των αγροτών στις 4 Μαΐου 2003. Όλα αυτά εξετάστηκαν ορολογικά ανεξάρτητα από τα συμπτώματα. Θα μπορούσαμε επομένως να υπολογίσουμε την αναλογία των εργαστηριακά επιβεβαιωμένων ατόμων που πληρούσαν τον ορισμό της κλινικής περίπτωσης (όπως ορίζεται στη μελέτη κοόρτης για προμηθευτές). Το συνολικό ποσοστό επίθεσης μεταξύ των ενηλίκων υπολογίστηκε με βάση τις ακόλουθες πηγές: (1) Συνεντεύξεις που πραγματοποιήθηκαν για τη στρατολόγηση ελέγχων για το CCS2 επέτρεψε το ποσοστό των ενηλίκων που απέκτησαν συμπτωματικό πυρετό Q μεταξύ εκείνων που επισκέφθηκαν την αγορά των αγροτών τη δεύτερη ημέρα. Αποδιδόμενο κλάσμα AFE Αριθμός περιπτώσεων που εκτέθηκαν Όλες οι περιπτώσεις = *(2) Οι συνεντεύξεις των περιπτώσεων και οι έλεγχοι στο CCS2 έδωσαν πληροφορίες σχετικά με τα συνοδευτικά ενήλικες και πόσοι από αυτούς αργότερα «αρρώστησαν με πυρετό»· (3) Αποτελέσματα της μικρής κοόρτης των 9 φίλων ναυτικών (σ.α.)· (4) Αποτελέσματα από τη μελέτη κοόρτης σε πωλητές. Τοπικά τμήματα υγείας που εντόπισαν κρούσματα επιδημίας Q πυρετός (σ.α. «προσδιορισμός μεγέθους εστίας και περιγραφική επιδημιολογία») πήρε συνεντεύξεις με ασθενείς σχετικά με τον αριθμό των ατόμων που τους συνόδευαν στην αγορά των αγροτών και εάν κάποιο από αυτά είχε αρρωστήσει με πυρετό στη συνέχεια. Ωστόσο, καθώς δεν υπήρχε διαφοροποίηση μεταξύ ενηλίκων και παιδιών, οι υπολογισμοί για την εκτίμηση του ποσοστού προσβολής μεταξύ των ενηλίκων πραγματοποιήθηκαν τόσο με όσο και χωρίς αυτήν την πηγή. Για να μετρήσουμε τις περιπτώσεις στα (1), (3) και (4) χρησιμοποιήσαμε τον ορισμό της κλινικής περίπτωσης όπως ορίζεται στη μελέτη κοόρτης για τους προμηθευτές. Για τον υπολογισμό του ποσοστού επίθεσης μεταξύ των παιδιών που προκλήθηκε στο CCS2 ήταν ο ίδιος για όλους τους επισκέπτες. Ο αριθμός των παιδιών που επισκέφτηκαν την αγορά θα μπορούσε στη συνέχεια να εκτιμηθεί από τον συνολικό αριθμό των επισκεπτών όπως εκτιμήθηκε από τους διοργανωτές. Στη συνέχεια υπολογίσαμε τον αριθμό των συμπτωματικών παιδιών (αριθμητής). Για αυτό υποθέσαμε ότι το ποσοστό των παιδιών με πυρετό Q που επισκέφθηκαν οι γιατροί και κατά συνέπεια ειδοποιήθηκαν ήταν το ίδιο με αυτό των ενηλίκων. Υπολογίστηκε ως εξής: Επομένως, ο πραγματικός αριθμός παιδιών με πυρετό Q υπολογίστηκε με τον αριθμό των αναφερόμενων παιδιών διαιρεμένος με την εκτιμώμενη αναλογία που αναφέρθηκε. Στη συνέχεια, το ποσοστό προσβολής μεταξύ των παιδιών θα μπορούσε να υπολογιστεί ως εξής: Επειδή αυτός ο υπολογισμός βασίστηκε σε πολλές υποθέσεις (αριθμός επισκεπτών, αναλογία ενηλίκων επισκεπτών και ποσοστό κλινικής επίθεσης μεταξύ ενηλίκων), πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση ευαισθησίας όπου οι τιμές αυτών των μεταβλητών διέφεραν. Ορός συλλέχτηκε από όλα τα πρόβατα και τις αγελάδες που εκτίθενται στην κτηνοτροφική αγορά καθώς και από όλα τα πρόβατα των αντίστοιχων κοπαδιών (70 ζώα). Δείγματα 25 προβάτων από πέντε άλλα κοπάδια στην περιοχή Soest δοκιμάστηκαν επίσης για C. burnetii. Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές με ELISA με μίγμα αντιγόνου φάσης Ι και φάσης II. Πραγματοποιήσαμε στατιστική ανάλυση με το Epi Info, έκδοση 6.04 (CDC, Ατλάντα, ΗΠΑ). Οι διχοτομικές μεταβλητές στις μελέτες περιπτώσεων ελέγχου και κοόρτης συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Chi-Square και αριθμητικές μεταβλητές χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Kruskal-Wallis. Τιμές P μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Η διερεύνηση της εστίας διεξήχθη στο πλαίσιο του νόμου περί μεταδοτικών ασθενειών της Γερμανίας για τη μεταρρύθμιση του νόμου. Τηρήθηκαν υποχρεωτικοί κανονισμοί. Ασθενείς στο τοπικό νοσοκομείο στο Soest ανέφεραν ότι μια αγορά αγροτών είχε πραγματοποιηθεί στις 3 και 4 Μαΐου 2003 σε μια λουτρόπολη κοντά στην πόλη Soest. Βρισκόταν σε ένα πάρκο κατά μήκος του κεντρικού πεζόδρομου, σε απόσταση περίπου 500 μέτρων. Η αγορά προσέλκυσε κυρίως τρεις ομάδες ανθρώπων: ντόπιους, κατοίκους της ευρύτερης περιοχής Soest, ασθενείς από το σανατόριο spa και την οικογένεια ή τους φίλους τους που επισκέπτονταν. Οι αρχικοί συνεντευξιαζόμενοι ανέφεραν επίσης ότι είχαν περάσει χρόνο στη μάντρα των προβάτων βλέποντας νεογέννητα αρνιά που είχαν γεννηθεί τις πρώτες πρωινές ώρες της 4ης Μαΐου 2003. Η προβατίνα είχε φάει τον πλακούντα αλλά το τοκετό υγρό στο έδαφος είχε απλώς καλυφθεί με φρέσκο ​​άχυρο. Συνολικά 171 (65%) από 263 δείγματα ορού που υποβλήθηκαν στο NCL ήταν θετικά για αντισώματα IgM κατά της φάσης ΙΙ με ELISA. Τα αποτελέσματα των επιχρισμάτων λαιμού και του ορού ήταν αρνητικά για άλλους λοιμογόνους παράγοντες. (Σχήμα 2 ). Αν υποθέσουμε ότι η έναρξη των συμπτωμάτων στις περιπτώσεις κατανεμήθηκε κανονικά με μέσο όρο 21 ημερών, το 95% των περιπτώσεων (μέσες +/-2 τυπικές αποκλίσεις) είχαν την έναρξή τους μεταξύ 10ης και 31ης ημέρας. Τα δύο κοινοποιηθέντα κρούσματα με πρώιμη έναρξη στις 6 και 8 Μαΐου, αντίστοιχα, επιβεβαιώθηκαν εργαστηριακά και οι πρόσθετες συνεντεύξεις δεν αποκάλυψαν πρόσθετους παράγοντες κινδύνου. Από τις 298 περιπτώσεις με γνωστό φύλο, οι 158 (53%) ήταν άνδρες και οι 140 (47%) ήταν γυναίκες. Από τα κοινοποιημένα κρούσματα, 189 (63%) ήταν από την κομητεία του Soest, 104 (35%) ήταν Ποσοστό αναφερόμενος αριθμός ειδοποιημένων ενηλίκων αριθμός vis = i iting ενήλικες ποσοστό επίθεσης μεταξύ ενηλίκων * Ποσοστό επίθεσης μεταξύ παιδιών εκτιμώμενος πραγματικός αριθμός παιδιών = e en με πυρετό Q εκτιμώμενος αριθμός παιδιών στην αγορά από άλλες κομητείες στην ίδια ομοσπονδιακή πολιτεία (Βόρεια Βεστφαλία) και 6 (2%) ήταν από πέντε άλλα ομοσπονδιακά κρατίδια στη Γερμανία (Εικόνα 3). Μόνο οκτώ (3%) περιπτώσεις ήταν κάτω των 18 ετών, η μέση και η διάμεση ηλικία ήταν 54 και 56 έτη, αντίστοιχα (Εικόνα 4). 75 (25%) από τα 297 που κοινοποιήθηκαν νοσηλεύτηκαν, κανένα δεν πέθανε. Ο υπολογισμός του ποσοστού των περιπτώσεων που νοσηλεύτηκαν μέσω άλλων πηγών πληροφοριών αποκάλυψε ότι 4 από τα 19 (21%; 95% CI = 6-46%;(1/5 (CCS2), 2/11 (μελέτη πωλητών) και 1/3 (φίλοι ναυτικοί)) νοσηλεύτηκαν κλινικά άρρωστα περιστατικά. Εργαστηριακή επιβεβαίωση αναφέρθηκε σε 167 (56%) κρούσματα περιπτώσεις? 66 (22%) επιβεβαιώθηκαν από αύξηση στον τίτλο αντισωμάτων αντισωμάτων φάσης ΙΙ (CF), 89 (30%) είχαν αντισώματα IgM έναντι αντιγόνων φάσης II, 11 (4%) ήταν θετικά και στις δύο δοκιμές και ένα επιβεβαιώθηκε με καλλιέργεια . Δεν υπήρχαν διαθέσιμες πληροφορίες για το εάν οι 132 (44%) περιπτώσεις χωρίς εργαστηριακή επιβεβαίωση εξετάστηκαν εργαστηριακά. Εξετάστηκαν 18 ασθενείς με βαλβιδικές καρδιακές ανωμαλίες και έντεκα έγκυες γυναίκες. Κανένας από αυτούς δεν είχε κλινικά σημεία πυρετού Q. Δύο (11%) από 18 καρδιολογικούς ασθενείς και τέσσερις (36%) από 11 έγκυες γυναίκες είχαν οξεία λοίμωξη με πυρετό Q. Κατά τον τοκετό εφαρμόζονταν αυστηρά μέτρα υγιεινής. Οι λόχιες και το πρωτόγαλα όλων των μολυσμένων γυναικών εξετάστηκαν με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης και ήταν θετικά μόνο σε μία γυναίκα (περίπτωση 3, Τραπέζι 1 ). Η ορολογική παρακολούθηση των μητέρων ανίχνευσε χρόνια λοίμωξη στην ίδια γυναίκα (περίπτωση 3) 12 εβδομάδες μετά τον τοκετό. Η παρακολούθηση ενός έτους σε δύο νεογέννητα παιδιά (των περιπτώσεων 1 και 3) δεν εντόπισε ούτε οξείες ούτε χρόνιες λοιμώξεις με πυρετό Q. Επιστρατεύσαμε 20 περιπτώσεις και 36 ελέγχους που επισκέφθηκαν την αγορά των αγροτών στις 4 Μαΐου για τη δεύτερη μελέτη περίπτωσης ελέγχου. Δεν διέφεραν σημαντικά ως προς την ηλικία και το φύλο (Ή για το αρσενικό φύλο = 1,7; 95%CI = 0,5-5,3; p = 0,26; p-τιμή για την ηλικία = 0,23). Δεκαεπτά (85%) από τα 20 κρούσματα δήλωσαν ότι είχαν δει την αγελάδα (που επίσης εκτέθηκε στην αγορά δίπλα στο πρόβατο) σε σύγκριση με 7 (32%) της γεωγραφικής θέσης κρουσμάτων εστίας πυρετού Q που κοινοποιήθηκαν στο νόμιμο σύστημα επιτήρησης Σχήμα 3 Γεωγραφική θέση κρουσμάτων εστίας πυρετού Q που κοινοποιήθηκαν στο νόμιμο σύστημα επιτήρησης. ή απευθείας στην πύλη της μάντρας σε σύγκριση με 8 (32%) από 25 ελέγχους (OR = 5,0; 95%CI = 1,2-22,3; p = 0,03). Το άγγιγμα του προβάτου ήταν επίσης σημαντικά πιο συχνό μεταξύ των περιπτώσεων (5/20 (25%) περιπτώσεις CCS2 έναντι 0/22 (0%) μαρτύρων. Ή απροσδιόριστο? χαμηλότερο 95% CI = 1,1; p = 0,02). 17 (85%) από 20 περιπτώσεις CCS2, αλλά μόνο 6 (25%) από 24 μάρτυρες σταμάτησαν για τουλάχιστον μερικά δευτερόλεπτα στη μάντρα προβάτων ή μέσα, η αναφορά για αυτήν τη μεταβλητή ήταν \"πέρασαν από το μαντρί χωρίς σταματημό\" ( Ή = 17,0; 95%CI = 3,0-112,5; p < 0,01). Μεταξύ των περιπτώσεων CCS2, η εγγύτητα ή ο χρόνος που αφιερώθηκε με/κοντά στο πρόβατο δεν συσχετίστηκε με μικρότερη περίοδο επώασης. Μπορέσαμε να επικοινωνήσουμε και να συνεντεύξουμε 75 (86%) από 87 πωλητές και λάβαμε πληροφορίες από δεύτερο χέρι για 7 περισσότερα (συνολικό ποσοστό απόκρισης: 94%). Σαράντα πέντε (56%) ήταν άνδρες και 35 (44%) ήταν γυναίκες. 13 (16%) πληρούσαν τον ορισμό της κλινικής περίπτωσης. Από τους 11 πωλητές που δούλευαν σε δύο μονάδες βάσης της μάντρας, οι 6 (55%) έγιναν κρούσματα σε σύγκριση με μόνο 7 (10%) από τα 70 άτομα που εργάζονταν σε ένα περίπτερο σε μεγαλύτερη απόσταση (σχετικός κίνδυνος (RR) = 5,5 (95%CI = 2,3-13,2; p = 0,002); Φιγούρα 1 ). Από αυτούς τους 7 πωλητές, 4 είχαν περάσει χρόνο σε απόσταση 5 μέτρων από το στυλό στις 4 Μαΐου, ένας ήταν κοντά στο στυλό, αλλά σε απόσταση μεγαλύτερη από 5 μέτρα, και δεν υπήρχαν διαθέσιμες πληροφορίες για αυτή τη μεταβλητή για τους υπόλοιπους 2. Στο τμήμα της αγοράς που αντιμετωπίζει τον άνεμο που προέρχεται από το στυλό (ενότητα 4, Εικόνα 1 ), 4 (9%) από 44 πωλητές έγιναν κρούσματα, σε σύγκριση με 2 (13%) από τα 15 άτομα που εργάζονταν στην ενότητα 1 (p = 0,6). Από τα 22 άτομα που εργάζονταν σε κερκίδες που ήταν κάθετες προς την κατεύθυνση του ανέμου, 7 (32%) έγιναν κρούσματα. (Πίνακας 3). Σε όλα τα σενάρια το AR μεταξύ των ενηλίκων ήταν σημαντικά υψηλότερο από αυτό μεταξύ των παιδιών (Εικόνα 5). Συνολικά, 5 αρνιά και 5 προβατίνες εμφανίστηκαν στην αγορά, ένα από αυτά ήταν έγκυο και γέννησε δίδυμα αρνιά στις 6:30 π.μ. 4 Μαΐου 2003 . Από αυτές, 3 προβατίνες, συμπεριλαμβανομένης αυτής που είχε γεννήσει αρνί, βρέθηκαν θετικές στο C. burnetii. Τα ζώα προέρχονταν από ένα κοπάδι 67 προβατίνων, εκ των οποίων οι 66 είχαν γεννήσει μεταξύ Φεβρουαρίου και Ιουνίου. Η πλειονότητα των γεννήσεων (57 (86%)) είχαν συμβεί τον Φεβρουάριο και τον Μάρτιο, συνήθως μέσα σε στάβλο ή σε λιβάδι που βρίσκεται μακριά από την πόλη. Έξι προβατίνες έκαναν αποβολή, είχαν γεννήσει νεκρά ή ασυνήθιστα αδύναμα αρνιά. Μεταξύ όλων των προβατίνων, 17/67 (25%) βρέθηκαν θετικές για C. burnetii. Το ποσοστό των προβάτων που βρέθηκαν θετικά στα άλλα 5 κοπάδια προβάτων στην περιοχή κυμαινόταν από 8% έως 24% (8%; 12%; 12%; 16%; 24%). Περιγράψαμε ένα από τα μεγαλύτερα κρούσματα πυρετού Q στη Γερμανία, η οποία, λόγω της σημειακής φύσης του, έδωσε την ευκαιρία να αξιολογηθούν πολλά επιδημιολογικά χαρακτηριστικά της νόσου που σπάνια μπορούν να μελετηθούν διαφορετικά. Το 1954, περισσότεροι από 500 περιπτώσεις πυρετού Q συνδέθηκαν, παρόμοια με αυτήν την εστία, με την άμβλωση μιας μολυσμένης αγελάδας σε μια αγορά αγροτών [15] . Πιο πρόσφατα, ένα μεγάλο ξέσπασμα εμφανίστηκε στην Ιένα (Θουριγγία) το 2005 με 322 αναφερόμενες περιπτώσεις [16] που σχετίζονται με έκθεση σε κοπάδι προβάτων που κρατούνταν σε λιβάδι κοντά στην περιοχή στέγασης στην οποία εμφανίστηκαν τα κρούσματα. Η πρώτη μελέτη ελέγχου περίπτωσης χρησίμευσε για επιβεβαιώνουν την υπόθεση της συσχέτισης μεταξύ της εστίας και της αγοράς των αγροτών. Το γεγονός ότι μόνο η προσέλευση τη δεύτερη, αλλά όχι την πρώτη ημέρα συνδέθηκε έντονα με την ασθένεια, έδειξε τον ρόλο της προβατίνας που είχε γεννήσει. .τις πρώτες πρωινές ώρες της 4ης Μαΐου 2005 . Αυτή η ισχυρή συσχέτιση και το πολύ υψηλό αποδιδόμενο κλάσμα μεταξύ όλων των περιπτώσεων πρότειναν μια σημειακή πηγή και δικαιολογούσαν τον ορισμό των κρουσμάτων που κοινοποιήθηκαν μέσω του συστήματος αναφοράς ως κρουσμάτων επιδημίας εάν ήταν κλινικά συμβατά με τον πυρετό Q και έδωσαν ιστορικό επίσκεψης στην αγορά των αγροτών. Η σημειακή φύση της εστίας επέτρεπε τον υπολογισμό της περιόδου επώασης των κρουσμάτων που ήταν κατά μέσο όρο 21 ημέρες και κυμαίνονταν από 2 έως 48 ημέρες με ένα διατεταρτημόριο εύρος από 16 έως 24 ημέρες. Αυτό είναι συμβατό με τη βιβλιογραφία [1] . Μια πρόσθετη συνέντευξη με τις δύο περιπτώσεις με πρώιμη έναρξη (2 και 4 ημέρες μετά την παρουσία στην αγορά στις 4 Μαΐου, Ποσοστά επιθέσεων μεταξύ ενηλίκων και παιδιών σε ένα πιο πιθανό σενάριο και 8 άλλα σενάρια Σχήμα 5 Ποσοστά επιθέσεων μεταξύ ενηλίκων και παιδιών σε ένα πιο πιθανό σενάριο σενάριο και 8 άλλα σενάρια. Πιθανότερο σενάριο: 3000 επισκέπτες, 83% ενήλικες επισκέπτες και 20% ποσοστό κλινικής επίθεσης μεταξύ ενηλίκων. Τα σενάρια 1-8 διέφεραν ως προς τις υποθέσεις που έγιναν για τον \"αριθμό επισκεπτών\", \"αναλογία ενηλίκων επισκεπτών\" και \"ποσοστό επίθεσης μεταξύ ενηλίκων\" (βλ. Πίνακα 3). Εμφανίζονται τα ποσοστά επίθεσης και τα διαστήματα εμπιστοσύνης 95%. αντίστοιχα) δεν μπόρεσε να εντοπίσει καμία άλλη πηγή μόλυνσης. Μια σύντομη περίοδος επώασης παρατηρήθηκε πρόσφατα σε μια άλλη εστία πυρετού Q στην οποία η μολυσματική δόση ήταν πιθανότατα πολύ υψηλή [17] . Η δεύτερη μελέτη ελέγχου περίπτωσης μεταξύ ατόμων που επισκέφθηκαν την αγορά στις 4 Μαΐου έδειξε ότι τόσο η εγγύτητα με την προβατίνα όσο και η διάρκεια η έκθεση ήταν σημαντικοί παράγοντες κινδύνου. Αυτό το εύρημα επιβεβαιώθηκε από τη μελέτη κοόρτης σε πωλητές, η οποία έδειξε ότι όσοι εργάζονταν σε ένα περίπτερο κοντά (σε απόσταση 6 μέτρων) στο μαντρί διέτρεχαν σημαντικά υψηλότερο κίνδυνο να αποκτήσουν πυρετό Q. Η μελέτη απέτυχε να δείξει σημαντικό ρόλο της θέσης του σταντ σε σχέση με την κατεύθυνση του ανέμου, αν και πρέπει να λάβουμε υπόψη ότι ο άνεμος πιθανότατα δεν ήταν πάντα και ακριβώς όπως αναφέρει ο μετεωρολογικός σταθμός. Ωστόσο, αν ο άνεμος ήταν σημαντικός, θα μπορούσαν να αναμένονταν περισσότερες περιπτώσεις μεταξύ των πωλητών που βρίσκονται σε μεγαλύτερη απόσταση από τα πρόβατα. Σύμφωνα με τα δεδομένα του νομοθετικού συστήματος επιτήρησης, το ποσοστό των κλινικών περιπτώσεων που νοσηλεύτηκαν ήταν 25%, παρόμοιο με το ποσοστό 21% που βρέθηκε σε άτομα που συγκεντρώθηκαν από τις άλλες μελέτες που πραγματοποιήθηκαν. Αρκετές δημοσιεύσεις αναφέρουν χαμηλότερες αναλογίες από αυτές που βρέθηκαν σε αυτήν την έρευνα: 4% (8/ 191) [7] , 5% [1] και 10% (4/39) [5] ), και υπήρξε τουλάχιστον μία μελέτη με πολύ υψηλότερο ποσοστό (63% (10/ 16)) [18] . Είναι απίθανο τα νοσοκομεία να ανέφεραν κρούσματα με πυρετό Q πιο συχνά από ό,τι οι ιδιώτες γιατροί, επειδή η αναλογία νοσηλευόμενων ασθενών με πυρετό Q που εντοπίστηκαν μέσω τυχαίων τηλεφωνικών κλήσεων στον πληθυσμό Soest ή σε αυτούς στις δύο κοόρτες ήταν παρόμοια με αυτή των κοινοποιημένων περιπτώσεων. Επομένως, η αναφορά μεροληψίας είναι μια απίθανη εξήγηση για το σχετικά υψηλό ποσοστό των περιπτώσεων που νοσηλεύονται. Οι εναλλακτικές εξηγήσεις περιλαμβάνουν υπερβολικά προσεκτικές πρακτικές παραπομπής από την πλευρά των θεράπων ιατρών ή την πιθανώς υψηλή μολυσματική δόση του οργανισμού σε αυτό το ξέσπασμα, π.χ. σε εκείνες τις περιπτώσεις που πέρασαν χρόνο στη μάντρα προβάτων. Το εκτιμώμενο ποσοστό επίθεσης μεταξύ των ενηλίκων στις τέσσερις μελέτες κυμαινόταν μεταξύ 16% και 33%. Η εκτίμηση του 23% με βάση το τυχαίο δείγμα των ατόμων που επισκέφθηκαν την αγορά τη δεύτερη ημέρα θα φαινόταν πιο ανοσία στην ανάκληση μεροληψίας, ακόμη κι αν αυτό δεν μπορεί να αποκλειστεί εντελώς. Η εκτίμηση που βασίζεται σε πληροφορίες σχετικά με τα άτομα που συνοδεύουν τις περιπτώσεις μπορεί να υπόκειται σε υπερεκτίμηση, επειδή τα άτομα αυτά είχαν πιθανώς μεγαλύτερη πιθανότητα να βρεθούν κοντά στο μαντρί, παρόμοια με τις περιπτώσεις. Από την άλλη πλευρά, η εκτίμηση από τη μελέτη κοόρτης για τους προμηθευτές μπορεί να είναι υποεκτιμημένη, καθώς οι πωλητές είχαν προφανώς διαφορετικό σκοπό για την παρουσία τους στην αγορά και μπορεί να ενδιαφέρθηκαν λιγότερο να ρίξουν μια ματιά στα πρόβατα. Ωστόσο, όλες οι εκτιμήσεις ήταν ανεξάρτητες μεταξύ τους και λαμβάνοντας υπόψη τις διάφορες πιθανές προκαταλήψεις, ήταν εντυπωσιακά παρόμοιες. Συγκριτικά, σε ένα διαφορετικό ξέσπασμα στη Γερμανία, κατά το οποίο οι κάτοικοι ενός χωριού εκτέθηκαν σε ένα μεγάλο κοπάδι προβάτων (n = 1000-2000) [5, 7] το ποσοστό προσβολής υπολογίστηκε σε 16%. Σε ένα παρόμοιο ξέσπασμα στην Ελβετία, αρκετά χωριά εκτέθηκαν σε περίπου 900 πρόβατα [19] . Στο χωριό που έχει πληγεί περισσότερο, το ποσοστό κλινικής προσβολής ήταν 16% (εκτιμάται από τα δεδομένα που παρέχονται) [19] . Είναι αξιοσημείωτο ότι στο ξέσπασμα που περιγράφεται εδώ, το μολυσματικό δυναμικό μιας εγκύου προβατίνας -κατά τον τοκετό- ήταν συγκρίσιμο με αυτό ολόκληρων κοπαδιών, αν και σε διαφορετικά περιβάλλοντα. Η εκτίμησή μας για το ποσοστό των ορολογικά επιβεβαιωμένων περιπτώσεων που έγιναν συμπτωματικές (50% ( 3/6)) βασίζεται σε ένα πολύ μικρό δείγμα, αλλά συνεπές με τη διεθνή βιβλιογραφία. Στην προαναφερθείσα ελβετική εστία, το 46% των ορολογικά θετικών ασθενών ανέπτυξαν κλινική νόσο [7] . Μόνο περίπου οι μισές από όλες τις συμπτωματικές περιπτώσεις αναφέρθηκαν στο νόμιμο σύστημα επιτήρησης. Οι ασθενείς που δεν αναζήτησαν υγειονομική περίθαλψη λόγω ήπιας νόσου, καθώς και λόγω υποδιάγνωσης ή ανεπαρκούς αναφοράς μπορεί να συνέβαλαν στο να λείπει το άλλο μισό. Το εκτιμώμενο ποσοστό προσβολής 3% μεταξύ των παιδιών βασίζεται σε έναν αριθμό διαδοχικών υποθέσεων και επομένως πρέπει να ερμηνεύεται με προσοχή. Ωστόσο, η ανάλυση ευαισθησίας επιβεβαίωσε ότι οι ενήλικες είχαν σημαντικά αυξημένο ποσοστό προσβολής σε σύγκριση με τα παιδιά. Ενώ έχει προταθεί ότι τα παιδιά διατρέχουν χαμηλότερο κίνδυνο από τους ενήλικες να αναπτύξουν συμπτωματική ασθένεια [7, 8] λίγα δεδομένα έχουν δημοσιευθεί σχετικά με τα ποσοστά προσβολής των παιδιών σε σύγκριση με τους ενήλικες. Ο εκτιμώμενος οροθετικός επιπολασμός του C. burnetii στα κοπάδια προβάτων της περιοχής κυμαινόταν από 8% έως 24%. Ο οροθετικός επιπολασμός 25% στο κοπάδι των εκτεθειμένων ζώων μαζί με μια θετική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε μετά τον τοκετό τον Ιούνιο του 2003 υποδηλώνουν μια πρόσφατη μόλυνση του σμήνους [20] . Ο οροθετικός επιπολασμός μεταξύ κοπαδιών προβάτων που σχετίζεται με ανθρώπινες επιδημίες τείνει να είναι σημαντικά υψηλότερος από εκείνους σε κοπάδια που δεν σχετίζονται με ανθρώπινες εστίες. Η διάμεση οροεπιπολασμός σε μια σειρά σχετικών μελετών που πραγματοποιήθηκαν στο πλαίσιο ανθρώπινων εστιών [7, 20, 21], ήταν 40% σε σύγκριση με 1% στα κοπάδια προβάτων που δεν συνδέονται με ανθρώπινες επιδημίες [20] . Αυτή η εστία δείχνει τις δραματικές συνέπειες της θέτοντας έναν μεγάλο αριθμό ευπαθών ατόμων σε στενή επαφή με μια μολυσμένη προβατίνα που (σε μια τέτοια ρύθμιση) μπορεί να μετατραπεί σε υπερ-διασκορπιστή κατά το τοκετό. Υπάρχει πάντα μια πολιτιστική συνιστώσα στην αλληλεπίδραση μεταξύ ανθρώπων και ζώων, και αυτά μπορεί να συμβάλλουν σε ξεσπάσματα ή μεταβαλλόμενα πρότυπα επίπτωσης. Τις τελευταίες δεκαετίες έχει σημειωθεί αστικοποίηση των αγροτικών περιοχών και αλλαγές στην κτηνοτροφία [20] , με πιο πρόσφατες προσπάθειες να τεθεί ένας «στερημένος» αστικός πληθυσμός «σε επαφή» με τα ζώα φάρμας. Το χάιδεμα ζωολογικών κήπων, οι οικογενειακές διακοπές σε αγροκτήματα ή η έκθεση ζώων (αγρόκτημα) σε μια αγορά όπως αυτή μπορεί να οδηγήσει σε νέους δρόμους για τη μετάδοση ζωονοσογόνων μολυσματικών παραγόντων [20, [22] [23] [24] . Αν και δεν μπορούν να προβλεφθούν όλα τα ενδεχόμενα, είναι σημαντικό να αυξηθεί η ευαισθητοποίηση των ιδιοκτητών κατοικίδιων ζώων και ζώων καθώς και να ενισχυθούν οι συστάσεις όπου χρειάζεται. Αυτό το ξέσπασμα οδήγησε στην τροποποίηση και επέκταση των υφιστάμενων συστάσεων [25] οι οποίες πλέον απαγορεύουν την έκθεση προβάτων στο τελευταίο τρίτο της εγκυμοσύνης τους και απαιτούν τακτικές δοκιμές ζώων για C. burnetii σε ζωολογικούς κήπους, όπου υπάρχει στενή επαφή μεταξύ ανθρώπων και Λόγω του μεγέθους και της φύσης της σημειακής πηγής, αυτή η εστία επέτρεψε την επαναξιολόγηση των θεμελιωδών, αλλά σπάνια μελετημένων επιδημιολογικών παραμέτρων του πυρετού Q. Χρησιμοποίησε επίσης για την αναθεώρηση των συστάσεων δημόσιας υγείας για να ληφθεί υπόψη ο μεταβαλλόμενος τύπος και η συχνότητα επαφής των ευπαθών ανθρώπων με δυνητικά μολυσματικά ζώα. Συντομογραφίες AFE = αποδιδόμενο κλάσμα των περιπτώσεων που εκτέθηκαν Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν έχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 18217, "text": "1%" } ], "id": 5202, "question": "Ποια ήταν η διάμεση οροπαρουσία του C. burnetti σε κοπάδια προβάτων που δεν συνδέθηκε με ανθρώπινες εστίες;" }, { "answers": [ { "answer_start": 24391, "text": "16 έως 24 ημέρες" } ], "id": 5204, "question": "Ποιο ήταν το διατεταρτημόριο της περιόδου επώασης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 11725, "text": "36" } ], "id": 5205, "question": "Πόσοι έλεγχοι χρησιμοποιήθηκαν στη δεύτερη μελέτη περίπτωσης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1351, "text": "Coxiella burnetii (C. burnetii)" } ], "id": 5207, "question": "Τι προκαλεί τον πυρετό Q;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2633, "text": "μικρό, gram-αρνητικό υποχρεωτικό ενδοκυτταρικό βακτήριο" } ], "id": 5208, "question": "Τι είναι το Coxiella burnetii;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Πρόβλεψη αλληλεπιδράσεων lncRNA-πρωτεΐνης με τη χρήση βαθμολογιών HeteSim με βάση ετερογενή δίκτυαhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5473862/SHA: f4f9ea9e0aeb74d3601ee316b338009; Zhang, Jingpu; Deng, LeiDate: 2017-06-16DOI: 10.1038/s41598-017-03986-1Άδεια: cc-byAbstract: Ογκώδεις μελέτες έχουν δείξει ότι τα μακρά μη κωδικοποιητικά RNA (lncRNAs) είναι κρίσιμα για τη ρύθμιση των κυτταρικών βιολογικών διεργασιών με RNA -σχετικές πρωτεΐνες. Ωστόσο, έχουν αναφερθεί μόνο μερικές πειραματικά υποστηριζόμενες συσχετίσεις lncRNA-πρωτεΐνης. Οι υπάρχουσες μέθοδοι που βασίζονται σε δίκτυο εστιάζονται συνήθως σε εγγενή χαρακτηριστικά του lncRNA και της πρωτεΐνης, αλλά αγνοούν τις πληροφορίες που υπονοούνται στις τοπολογίες των βιολογικών δικτύων που σχετίζονται με τα lncRNA. Λαμβάνοντας υπόψη τους περιορισμούς σε προηγούμενες μεθόδους, προτείνουμε το PLPIHS, μια αποτελεσματική υπολογιστική μέθοδο για την Πρόβλεψη των αλληλεπιδράσεων lncRNA-πρωτεΐνης με τη χρήση βαθμολογιών HeteSim. Το PLPIHS χρησιμοποιεί το μέτρο HeteSim για να υπολογίσει τη βαθμολογία συγγένειας για κάθε ζεύγος lncRNA-πρωτεΐνης στο ετερογενές δίκτυο, το οποίο αποτελείται από δίκτυο ομοιότητας lncRNA-lncRNA, δίκτυο συσχέτισης lncRNA-πρωτεΐνης και δίκτυο αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Ένας ταξινομητής SVM για την πρόβλεψη αλληλεπιδράσεων lncRNA-πρωτεΐνης δημιουργείται με τις βαθμολογίες HeteSim. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το PLPIHS αποδίδει σημαντικά καλύτερα από τις υπάρχουσες προσεγγίσεις τελευταίας τεχνολογίας και επιτυγχάνει βαθμολογία AUC 0,97 στη δοκιμή επικύρωσης άδειας-ένα-έξω. Συγκρίνουμε επίσης τις επιδόσεις δικτύων με διαφορετική πυκνότητα συνδεσιμότητας και διαπιστώνουμε ότι το PLPIHS αποδίδει καλά σε όλα τα δίκτυα. Επιπλέον, χρησιμοποιούμε την προτεινόμενη μέθοδο για να αναγνωρίσουμε τις σχετικές πρωτεΐνες για το lncRNA MALAT1. Οι πρωτεΐνες υψηλής κατάταξης επαληθεύονται από τις βιολογικές μελέτες και καταδεικνύουν την αποτελεσματικότητα της μεθόδου μας. Κείμενο: η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη προσέγγιση είναι η ενοχή-από-σύνδεση (GBA) 19 , η οποία παρέχει την κεντρική αρχή από πάνω προς τα κάτω για την ανάλυση των γονιδιακών δικτύων με λειτουργικούς όρους ή την αξιολόγηση της ποιότητάς τους στην κωδικοποίηση λειτουργικών πληροφοριών. Νέες προέκυψαν μέθοδοι, συμπεριλαμβανομένης της μεθόδου Katz 20 , Συνδυάζοντας δεδομένα σε είδη με χρήση θετικών-μη επισημασμένων τεχνικών μάθησης (CATAPULT) 19 , Τυχαία βάδιση με επανεκκίνηση (RWR) 21 και πρόβλεψη αλληλεπίδρασης LncRNA-πρωτεΐνης με βάση το μοντέλο HeterLPINe έχουν επεκτείνει τη συσχέτιση από απλώς άμεσες αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών σε πιο απομακρυσμένες συνδέσεις με διάφορους τρόπους. Το μέτρο KATZ 20 είναι ένα σταθμισμένο άθροισμα του αριθμού των μονοπατιών στο δίκτυο που μετρά την ομοιότητα δύο κόμβων. Το CATAPULT 19 είναι μια εποπτευόμενη μέθοδος μηχανικής μάθησης που χρησιμοποιεί μια προκατειλημμένη μηχανή διανύσματος υποστήριξης όπου τα χαρακτηριστικά προέρχονται από περιπάτους σε ένα ετερογενές δίκτυο γονιδιακών χαρακτηριστικών. Το RWR 21 είναι μια μέθοδος για τον καθορισμό προτεραιοτήτων των υποψηφίων γονιδίων με τη χρήση μιας συνολικής μέτρησης απόστασης δικτύου, ανάλυση τυχαίας βάδισης, για τον ορισμό ομοιοτήτων σε δίκτυα αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και προσθέτει βάρος στην υπόθεση ότι φαινοτυπικά παρόμοιες ασθένειες σχετίζονται με διαταραχές των υποδικτύων εντός της μεγαλύτερης αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης που εκτείνεται πέρα ​​από τις ίδιες τις πρωτεΐνες της νόσου. Το LPIHN 22 είναι μια μέθοδος που βασίζεται σε δίκτυο με την εφαρμογή ενός τυχαίου περιπάτου σε ένα ετερογενές δίκτυο. Το PRINCE είναι μια παγκόσμια μέθοδος που βασίζεται στη διατύπωση περιορισμών στη λειτουργία ιεράρχησης προτεραιοτήτων που σχετίζονται με την ομαλότητά της στο δίκτυο και τη χρήση προηγούμενων πληροφοριών. Σε σύγκριση με το LPIHN και το RWR, το PRINCE διαδίδει πληροφορίες σε ένα μικρότερο δίκτυο, αλλά περιέχει πιο υπονοητικό νόημα κατά τη δημιουργία των αρχικών τιμών πιθανότητας και έχει εξαιρετική απόδοση στην ιεράρχηση γονιδίων 23 και στον προσδιορισμό ασθενειών 24 . Ωστόσο, πολλές υπάρχουσες μέθοδοι που βασίζονται σε δίκτυο απλώς προβάλλουν αντικείμενα σε ετερογενή δίκτυα ως ίδιου τύπου και δεν λαμβάνουν υπόψη τις λεπτές σημασιολογικές έννοιες διαφορετικών μονοπατιών. Σε αυτό το άρθρο, υιοθετούμε μια μέθοδο που ονομάζεται HeteSim, η οποία είναι ένα μέτρο που βασίζεται σε μονοπάτια για τον υπολογισμό της συνάφειας μεταξύ αντικειμένων σε ετερογενές δίκτυο 25 . Η βασική ιδέα είναι ότι παρόμοια αντικείμενα είναι πιο πιθανό να σχετίζονται με κάποια άλλα αντικείμενα. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η συνάφεια των ετερογενών αντικειμένων είναι περιορισμένη σε μονοπάτια, το HeteSim δίνει ένα ομοιόμορφο και συμμετρικό μέτρο για αυθαίρετα μονοπάτια για την αξιολόγηση της συνάφειας ετερογενών ζευγών αντικειμένων (ίδιοι ή διαφορετικοί τύποι) με μία μόνο βαθμολογία. Λόγω του ότι η διαδρομή συνάφειας όχι μόνο καταγράφει τις σημασιολογικές πληροφορίες, αλλά περιορίζει επίσης τη διαδρομή πεζοπορίας, η βαθμολογία είναι επίσης ένα μέτρο ομοιότητας που βασίζεται στη διαδρομή. Ένα παράδειγμα της βαθμολογίας HeteSim απεικονίζεται στο (Εικ. 1). Ο αριθμός των μονοπατιών από το A στο C και το B στο C είναι 3 και 2, αντίστοιχα. Το πλήθος βαδίσματος μεταξύ Α και Γ είναι μεγαλύτερο από το Β και το Γ, κάτι που μπορεί να υποδηλώνει ότι το Α είναι πιο κοντά στο Γ από το Β. Αλλά η συνδεσιμότητα μεταξύ B και C είναι πιο έντονη από το A και το C κατά την άποψη της βαθμολογίας HeteSim, καθώς οι περισσότερες ακμές που ξεκινούν από το B συνδέονται με το C, όταν το A έχει μόνο ένα μικρό μέρος ακμών συνδεδεμένο με το C. Εδώ, προτείνουμε ένα μέθοδος με το όνομα PLPIHS (Εικ. 2) να προβλέψει τις αλληλεπιδράσεις lncRNA-Πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας βαθμολογίες HeteSim. Κατασκευάζουμε αρχικά ένα ετερογενές δίκτυο που αποτελείται από ένα δίκτυο ομοιότητας lncRNA-lncRNA, ένα δίκτυο συσχέτισης lncRNA-πρωτεΐνης και ένα δίκτυο αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Στη συνέχεια, χρησιμοποιούμε το μέτρο HeteSim για να υπολογίσουμε τη βαθμολογία για κάθε ζεύγος lncRNA-πρωτεΐνης στο δίκτυο. Ένας ταξινομητής SVM δημιουργείται με βάση τις βαθμολογίες διαφορετικών μονοπατιών. Συγκρίνουμε τα PLPIHS μας με τα PRINCE, RWR και LPIHN και διαπιστώνουμε ότι το PLPIHS υπερτερεί των άλλων μεθόδων σε πολλά μέτρα απόδοσης. Μέτρα επικύρωσης. Το LOOCV (Leave-One-Out Cross Validation) 26 εφαρμόζεται στις επαληθευμένες συσχετίσεις πρωτεΐνης lncR-NA για την αξιολόγηση της απόδοσης του LPIHN 22 . Αφήνουμε ένα γνωστό ζεύγος lncRNA-πρωτεΐνης με τη σειρά του ως δείγμα δοκιμής και όλα τα άλλα γνωστά ζεύγη lncRNA-πρωτεΐνης θεωρούνται ως δείγματα εκπαίδευσης. Για να βελτιώσουμε την ακρίβεια του PLPIHS, αφαιρούμε όλα τα συνδεδεμένα lncRNA και πρωτεΐνες κατά τη διάρκεια κάθε γύρου επικύρωσης. Η καμπύλη Λειτουργικού Χαρακτηριστικού Δέκτη (ROC) 27 χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση της απόδοσης πρόβλεψης, η οποία απεικονίζει τον ρυθμό αληθινού θετικού (TPR, ευαισθησία ή ανάκληση) έναντι του ψευδώς θετικού ρυθμού (FPR, 1-ειδικότητα) σε διαφορετικές αποκοπές κατάταξης. Όταν μεταβάλλουμε τα όρια κατάταξης της επιτυχημένης πρόβλεψης, μπορούμε να λάβουμε τα αντίστοιχα TPR και FPR. Με αυτόν τον τρόπο σχεδιάζεται η καμπύλη ROC και υπολογίζεται επίσης η περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC). Για ένα κατώφλι κατάταξης, ευαισθησία (SEN) 28 και ειδικότητα (SPE) 29 Αυτές οι μετρήσεις χρησιμοποιούνται επίσης για την αξιολόγηση της ικανότητας του PLPIHS κατά τη διαδικασία προεπεξεργασίας. Επίδραση των χαρακτηριστικών προεπεξεργασίας δικτύου. Σε αυτό το άρθρο, έχουμε μόνο δύο είδη αντικειμένων, το lncRNA και την πρωτεΐνη. Έτσι, οι διαδρομές από ένα lncRNA σε μια πρωτεΐνη στο ετερογενές μας δίκτυο με μήκος μικρότερο από έξι παρατίθενται στον Πίνακα 1. Για να διαλέξουμε τα πιο αποτελεσματικά μονοπάτια, συγκρίναμε τις επιδόσεις αυτών των 14 μονοπατιών κάτω από διαφορετικούς συνδυασμούς (Εικ. 3) . Μπορούμε να δούμε ότι όλα τα μονοπάτια επιτυγχάνουν ευνοϊκή κατάσταση εκτός από τη διαδρομή 1′~2′. Η διαδρομή 1′~14′ αποκτά την καλύτερη απόδοση σε όλα τα μέτρα, πράγμα που σημαίνει ότι η διαδρομή με μήκος μεγαλύτερο από τρία περιέχει πιο σημαντικές έννοιες. Ο σταθερός παράγοντας β χρησιμοποιείται για τον έλεγχο της επιρροής μεγαλύτερων διαδρομών. Όσο μεγαλύτερο είναι το μήκος της διαδρομής, τόσο μικρότερος είναι ο ανασταλτικός παράγοντας. Το μήκος διαδρομής ισούται με 3 αντιστοιχίσεις με σταθερά β, το μήκος διαδρομής ισούται με 4 αγώνες με σταθερά β*β και το μήκος διαδρομής ισούται με 5 αγώνες με σταθερά β*β*β. Ο Πίνακας 2 δείχνει ότι το β έχει μικροσκοπικό αντίκτυπο στα τελικά αποτελέσματα και το β = 0,2, 0,4 και 0,7 πέτυχε την καλύτερη βαθμολογία AUC και τα άλλα δεν είναι πολύ πίσω ακόμα. Για να επαληθεύσουμε περαιτέρω την αξιοπιστία της μεθόδου μας, συγκρίνουμε τα τρία δίκτυα διαφορετικών πυκνότητα συνδεσιμότητας κάτω από διαφορετικές τιμές αποκοπής 0,3, 0,5 και 0,9 (βλ. συσχετίσεις lncRNA-Πρωτεΐνη). Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχ. 4 . Υπάρχουν μικροσκοπικές διαφορές απόδοσης μεταξύ διαφορετικών αραιών δικτύων. Η βαθμολογία AUC του δικτύου 0,5 είναι υψηλότερη από αυτή άλλων, ενώ το δίκτυο 0,9 υπερτερεί των άλλων σε ACC, SEN, MCC και F1-Score. Αυτό υποδηλώνει ότι το PLPIHS αποδίδει καλά σε δίκτυα με διαφορετικές πυκνότητες. Τραπέζι 1 . Τα μονοπάτια από ένα lncRNA σε μια πρωτεΐνη στο ετερογενές δίκτυό μας με μήκος μικρότερο από έξι. Η μέθοδος RWR, υπάρχει μόνο μία πιθανότητα επανεκκίνησης r και οι επιπτώσεις της είναι πολύ μικρές, κάτι που αποδεικνύεται από πειράματα. Η παράμετρος r ορίζεται ως 0,5 σε αυτή τη σύγκριση. Προκειμένου να υπολογίσουμε την απόδοση των διαφορετικών μεθόδων, χρησιμοποιούμε μια διαδικασία διασταυρούμενης επικύρωσης άδειας. Εξάγουμε 2000 συσχετίσεις lncRNA-πρωτεΐνης από το δίκτυο 0,9 ως θετικά δείγματα, ο ίδιος αριθμός αρνητικών δειγμάτων επιλέγονται τυχαία και από το δίκτυο 0,3, αποφεύγοντας το σφάλμα που προκαλείται από το σύνολο δεδομένων ανισορροπίας. Το χρυσό σετ που περιέχει 185 αλληλεπιδράσεις lncRNA-πρωτεΐνης που έχουν ληφθεί από τη βάση δεδομένων NPinter έχει συμπεριληφθεί επίσης σε θετικά ζεύγη. Στην ιεράρχηση πρωτεϊνών lncRNA, κάθε αλληλεπίδραση lncRNA-πρωτεΐνης χρησιμοποιείται ως σύνολο δοκιμών με τη σειρά του και οι υπόλοιπες συσχετίσεις χρησιμοποιούνται ως δεδομένα εκπαίδευσης. Το όλο πείραμα θα επαναληφθεί 4000 φορές για να δοκιμαστεί κάθε ζεύγη lncRNA-πρωτεΐνης στο σύνολο δεδομένων. Η καμπύλη ROC σχεδιάζεται με βάση τον πραγματικό θετικό ρυθμό (TPR) και τον ψευδώς θετικό ρυθμό (FPR) σε διαφορετικά κατώφλια. Η βαθμολογία AUC χρησιμοποιείται για τη μέτρηση της απόδοσης. Το AUC = 1 δείχνει την τέλεια απόδοση και το AUC = 0,5 δείχνει την τυχαία απόδοση. Η καμπύλη ROC των PLPIHS, LPIHS, PRINCE και RWR απεικονίζεται στο Σχήμα. 5 . Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η βαθμολογία AUC του PLPIHS στο δίκτυο 0,3 είναι 96,8%, που είναι υψηλότερη από αυτή των PRINCE, LPIHN και RWR, επιτυγχάνοντας τιμή AUC 81,3%, 88,4% και 79,2% αντίστοιχα. Ομοίως, το PLPIHS ξεπερνά άλλες μεθόδους σε δίκτυο 0,5 και δίκτυο 0,9 επίσης. Αξιολόγηση απόδοσης με ανεξάρτητη δοκιμή. Για περαιτέρω επικύρωση, επιλέξαμε επίσης τυχαία 2000 συσχετίσεις lncRNA-πρωτεΐνης από τα υπόλοιπα θετικά δείγματα σε δίκτυο 0,9 και επιλέγαμε τον ίδιο αριθμό αρνητικών αλληλεπιδράσεων από τα υπόλοιπα αρνητικά δείγματα του δικτύου 0,3 για να δημιουργήσουμε το ανεξάρτητο σύνολο δεδομένων δοκιμής. Δεδομένου ότι οι υπάρχουσες μέθοδοι που βασίζονται στο δίκτυο δεν είναι κατάλληλες για ανεξάρτητη δοκιμή, αξιολογούμε μόνο την απόδοση για το προτεινόμενο PLPIHS. Τα αποτελέσματα ανεξάρτητων δοκιμών φαίνονται στο Σχ. 6, μια βαθμολογία AUC 0,879 επιτυγχάνεται από το PLPIHS, απεικονίζοντας την αποτελεσματικότητα και το πλεονέκτημα της προτεινόμενης προσέγγισης. Οι περιπτωσιολογικές μελέτες. Με την εφαρμογή της προτεινόμενης μεθόδου PLPIHS, οι νέες υποψήφιες πρωτεΐνες που σχετίζονται με lncRNA προβλέπονται χρησιμοποιώντας LOOCV. Εφαρμόσαμε το PLPIHS στις 2000 γνωστές συσχετίσεις lncRNA-πρωτεΐνης, οι οποίες περιλαμβάνουν 1511 lncRNA και 344 πρωτεΐνες για να συμπεράνουμε νέες αλληλεπιδράσεις lncRNA-πρωτεΐνης. Ως αποτέλεσμα, μια περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC των 0,9669, 0,9705 και 0,9703 (Εικ. 5) επιτυγχάνεται χρησιμοποιώντας τα τρία δίκτυα διαφορετικής πυκνότητας συνδεσιμότητας, τα οποία αποδεικνύουν ότι η προτεινόμενη μέθοδος είναι αποτελεσματική στην ανάκτηση γνωστών πρωτεϊνών που σχετίζονται με lncRNA. Για να επεξηγηθεί περαιτέρω η εφαρμογή της προσέγγισής μας, μια μελέτη περίπτωσης του lncRNA MALAT1 (αναγνωριστικό συνόλου: ENSG00000251562) εξετάζεται. Το MALAT1 είναι ένα μακρύ μη κωδικοποιητικό RNA το οποίο υπερεκφράζεται σε πολλούς ανθρώπινους ογκογόνους ιστούς και ρυθμίζει τον κυτταρικό κύκλο και την επιβίωση 31 . Το MALAT1 έχει εντοπιστεί σε πολλαπλούς τύπους φυσιολογικών διεργασιών, όπως εναλλακτικό μάτισμα, πυρηνική οργάνωση, επιγενετική τροποποίηση της γονιδιακής έκφρασης. Πολλά στοιχεία δείχνουν ότι το MALAT1 σχετίζεται επίσης στενά με διάφορες παθολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένων των επιπλοκών του διαβήτη, των καρκίνων και ούτω καθεξής 32, 33 . Το MALAT1 σχετίζεται με 68 πρωτεΐνες στο NPInter 3.0 34 . Κατασκευάζουμε τα δίκτυα αλληλεπίδρασης του lncRNA MALAT1 χρησιμοποιώντας τα αποτελέσματα πρόβλεψης αυτών των τεσσάρων μεθόδων (Εικ. 7) . Μεταξύ των 68 γνωστών αλληλεπιδράσεων lncRNA-πρωτεΐνης, το PLPIHS προβλέπει λανθασμένα 6 αλληλεπιδράσεις, ενώ 13 συσχετίσεις προβλέπονται λανθασμένα με τη μέθοδο PRINCE και RWR και 15 ζεύγη lncRNA-πρωτεΐνη προβλέπονται λανθασμένα με τη μέθοδο LPIHN. Ελέγχουμε χειροκίνητα την πρωτεΐνη στην κορυφή. λίστα κάτω από το δίκτυο 0,5 (Πίνακας 3). Τρεις από τις 10 κορυφαίες προβλεπόμενες πρωτεΐνες έχουν αλληλεπιδράσεις με το MALAT1 και οι περισσότερες από αυτές είχαν υψηλές θέσεις στις προβλεπόμενες λίστες πρωτεϊνών. Για παράδειγμα, στη διερεύνηση του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC), το MALAT1 θα μπορούσε να συνδεθεί με το SFPQ, απελευθερώνοντας έτσι την PTBP2 από το σύμπλεγμα SFPQ/PTBP2 και η αλληλεπίδραση μεταξύ MALAT1 και SFPQ θα μπορούσε να είναι ένας νέος θεραπευτικός στόχος για το CRC 35 . Το MALAT1 αλληλεπιδρά με τις πρωτεΐνες SR (SRSF1, SRSF2, SRSF3 και SRSF5) και ρυθμίζει τα κυτταρικά επίπεδα φωσφορυλιωμένων μορφών πρωτεϊνών SR 36 . Και είναι επίσης ως στόχος του TARDBP να παίξει τη βιολογική απόδοση και διαπιστώθηκε ότι το TDP-43 δεσμεύεται σε μακρά ncRNAs με τρόπο εξαιρετικά ειδικό για την αλληλουχία στον ιστό από άτομα με ή χωρίς FTLD-TDP, το MALAT1 ncRNA στρατολογεί παράγοντες ματίσματος στα πυρηνικά στίγματα και επηρεάζει τη φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών του παράγοντα ματίσματος πλούσιων σε σερίνη/αργινίνη 37, 38. Όλα αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η προτεινόμενη μέθοδος είναι αποτελεσματική και αξιόπιστη στον εντοπισμό νέων πρωτεϊνών που σχετίζονται με lncRNA. Τα LncRNA εμπλέκονται σε ένα ευρύ φάσμα βιολογικών λειτουργιών μέσω ποικίλων μοριακών μηχανισμών που συχνά περιλαμβάνουν την αλληλεπίδραση με έναν ή περισσότερους πρωτεϊνικούς εταίρους 12, 13 . Μόνο ένας μικρός αριθμός αλληλεπιδράσεων lncRNA-πρωτεΐνης έχει χαρακτηριστεί καλά. Οι υπολογιστικές μέθοδοι μπορούν να βοηθήσουν στην πρόταση πιθανών αλληλεπιδράσεων για πιθανούς πειραματισμούς 25 . Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιούμε το μέτρο HeteSim για να υπολογίσουμε τη συνάφεια μεταξύ lncRNA και πρωτεΐνης σε ένα ετερογενές δίκτυο. Η σημασία της εξαγωγής νέων αλληλεπιδράσεων lncRNA-πρωτεΐνης λαμβάνοντας υπόψη τις λεπτές σημασιολογικές έννοιες των διαφορετικών μονοπατιών στο ετερογενές δίκτυο έχει επαληθευτεί 39 . Κατασκευάζουμε αρχικά ένα ετερογενές δίκτυο που αποτελείται από ένα δίκτυο ομοιότητας lncRNA-lncRNA, ένα δίκτυο συσχέτισης lncRNA-πρωτεΐνης και ένα δίκτυο αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Στη συνέχεια, χρησιμοποιούμε το μέτρο HeteSim για να υπολογίσουμε μια βαθμολογία για κάθε ζεύγη lncRNA-πρωτεΐνης σε κάθε διαδρομή. Τέλος, ένας ταξινομητής SVM χρησιμοποιείται για να συνδυάσει τις βαθμολογίες διαφορετικών μονοπατιών και να κάνει προβλέψεις. Συγκρίνουμε τα προτεινόμενα PLPIHS με τα PRINCE, RWR και LPIHN και διαπιστώνουμε ότι τα PLPIHS λαμβάνουν βαθμολογία AUC 0,9679 στο δίκτυο 0,3, που είναι σημαντικά υψηλότερο από τα PRINCE, RWR και LPIHN (0,813, 0,884 και 0,7918, αντίστοιχα). Συγκρίνουμε επίσης την απόδοση αυτών των τεσσάρων μεθόδων σε δίκτυα διαφορετικής πυκνότητας συνδεσιμότητας. Ως αποτέλεσμα, το PLPIHS έχει καλύτερη απόδοση από την άλλη μέθοδο σε όλα τα δίκτυα. Επιπλέον, κατά την ανάλυση των προβλεπόμενων πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με το lncRNA MALAT1, το PLPIHS προβλέπει επιτυχώς 63 από τις 68 συσχετίσεις, ενώ τα PRINCE, RWR και LPIHN ανακτούν πολύ χαμηλότερες αλληλεπιδράσεις 57, 57 και 53, αντίστοιχα. Και οι κορυφαίες αλληλεπιδράσεις lncRNA-πρωτεΐνης που προβλέπονται από τη μέθοδό μας υποστηρίζονται από υπάρχουσες βιβλιογραφία. Τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν τα πλεονεκτήματα της προτεινόμενης μεθόδου μας στην πρόβλεψη πιθανών αλληλεπιδράσεων lncRNA-πρωτεΐνης. Μέθοδοι συσχετίσεις lncRNA-πρωτεΐνης. Όλα τα ανθρώπινα γονίδια lncRNA και τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες λαμβάνονται από την Έκδοση GENCODE 24 9 . Εξάγονται συνολικά 15941 γονίδια lncRNA και 20284 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Για να λάβουμε lncRNA σε ολόκληρο το γονιδίωμα και συσχετίσεις γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, συνδυάζουμε τρεις πηγές δεδομένων:• Δεδομένα συνέκφρασης από το COXPRESdb 40 . Τρία προεπεξεργασμένα σύνολα δεδομένων συν-έκφρασης (Hsa.c4-1, Hsa2.c2-0 και Hsa3.c1-0) συμπεριλαμβανομένων των προ-υπολογισμένων κατά ζεύγη συντελεστών συσχέτισης Pearson για τον άνθρωπο συλλέχθηκαν από το COXPRESdb. Οι συσχετίσεις υπολογίζονται ως εξής: όπου C(l, p) είναι η συνολική συσχέτιση μεταξύ του γονιδίου l (lncRNA) και του γονιδίου που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη p, το Cd (l, p) είναι η βαθμολογία συσχέτισης μεταξύ l και p στο σύνολο δεδομένων d, D είναι ο αριθμός των ζευγών γονιδίων (l και p) με θετικές βαθμολογίες συσχέτισης. Τα ζεύγη γονιδίων με αρνητικές βαθμολογίες συσχέτισης αφαιρούνται.• Δεδομένα συνέκφρασης από το ArrayExpress 41 και το GEO 42 . Λάβαμε τα δεδομένα συν-έκφρασης από την εργασία των Jiang et al. 43 . Τα ακατέργαστα δεδομένα RNA-Seq 19 ανθρώπινων φυσιολογικών ιστών λαμβάνονται από το ArrayExpress (E-MTAB-513) και το GEO (GSE30554). Το TopHat και τα μανικετόκουμπα με τις προεπιλεγμένες παραμέτρους χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό των τιμών έκφρασης. Οι συντελεστές συσχέτισης Pearson χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση της συνέκφρασης των ζευγών lncRNA-πρωτεΐνης. • Δεδομένα αλληλεπίδρασης lncRNA-πρωτεΐνης. Κατεβάζουμε το γνωστό σύνολο δεδομένων αλληλεπίδρασης lncRNA-πρωτεΐνης από τις αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Λαμβάνουμε τα δεδομένα αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (PPI) από τη βάση δεδομένων STRING V10.0 45 , η οποία περιέχει σταθμισμένες αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης που προέρχονται από μεθόδους υπολογιστικής πρόβλεψης, πειράματα υψηλής απόδοσης και εξόρυξη κειμένου. Οι βαθμολογίες εμπιστοσύνης υπολογίζονται συνδυάζοντας τις πιθανότητες από τα διαφορετικά κανάλια αποδεικτικών στοιχείων, διορθώνοντας την πιθανότητα τυχαίας παρατήρησης μιας αλληλεπίδρασης. Το μέτρο HeteSim. Το μέτρο HeteSim είναι ένα ομοιόμορφο και συμμετρικό μέτρο συνάφειας. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον υπολογισμό της συσχέτισης αντικειμένων με τους ίδιους ή διαφορετικούς τύπους σε ένα ομοιόμορφο πλαίσιο και είναι επίσης ένα μέτρο περιορισμένης διαδρομής για την εκτίμηση της συσχέτισης των ζευγών αντικειμένων με βάση τη διαδρομή αναζήτησης που συνδέει δύο αντικείμενα μέσω μιας ακολουθίας τύποι κόμβων 39 . Επιπλέον, η βαθμολογία HeteSim έχει κάποιες καλές ιδιότητες (δηλαδή, αυτομέγιστη και συμμετρική), οι οποίες έχουν επιτύχει θετική απόδοση σε πολλές μελέτες 25 . Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιούμε βαθμολογίες HeteSim για να μετρήσουμε τις ομοιότητες μεταξύ lncRNA και πρωτεϊνών. Ορισμός 1 Ο πίνακας πιθανότητας μετάβασης 39 L και P είναι δύο είδη αντικειμένων στο ετερογενές δίκτυο, (I LP ) n*m είναι ένας γειτονικός πίνακας μεταξύ L και P, τότε ο κανονικοποιημένος πίνακας του I LP κατά μήκος του διανύσματος σειράς ορίζεται ως LP LP k m LP 1 Ορισμός 2 Πίνακας προσιτής πιθανότητας 39 Σε ένα ετερογενές δίκτυο, ο προσβάσιμος πίνακας πιθανοτήτων R  για διαδρομή = +  PP P ( ) n 1 2 1  μήκους n, όπου το P i ανήκει σε οποιοδήποτε αντικείμενο στο ετερογενές δίκτυο, μπορεί να εκφραστεί ως P P P P P P n n 1 2 2 3 1  Με βάση τους παραπάνω ορισμούς, τα βήματα υπολογισμού των βαθμολογιών HeteSim μεταξύ δύο ειδών αντικειμένων (lncRNA και πρωτεΐνη ) μπορεί να παρουσιαστεί ως εξής:• Χωρίστε τη διαδρομή σε δύο μέρη. Όταν το μήκος n της διαδρομής  είναι άρτιο, μπορούμε να το χωρίσουμε σε  =  P P ( ) Διαφορετικά, αν το n είναι περιττό, το μονοπάτι δεν μπορεί να διαιρεθεί σε δύο μονοπάτια ίσου μήκους. Για να αντιμετωπίσουμε ένα τέτοιο πρόβλημα, πρέπει να χωρίσουμε τη διαδρομή δύο φορές ορίζοντας αντίστοιχα. Στη συνέχεια, μπορούμε να λάβουμε μια βαθμολογία HeteSim για κάθε μεσαία τιμή, η τελική βαθμολογία θα είναι ο μέσος όρος των δύο βαθμολογιών.• Επιτύχετε τον πίνακα πιθανοτήτων μετάβασης και τον πίνακα πιθανοτήτων προσβάσιμων κάτω από τη διαδρομή L  και R  . • Υπολογίστε τη βαθμολογία HeteSim: όπου  − R 1 είναι η αντίστροφη διαδρομή του R  . Ένα παράδειγμα υπολογισμού της βαθμολογίας HeteSim φαίνεται στο Σχ. 8 . Μπορούμε να δούμε ότι υπάρχουν τρία είδη αντικειμένων L, T και P στο δίκτυο. Τα απλοποιημένα βήματα υπολογισμού της βαθμολογίας HeteSim μεταξύ l3 και p2 κάτω από τη διαδρομή  = (LTP) είναι τα εξής:• Διαχωρίστε τη διαδρομή  σε δύο συνιστώσες  = LT ( )• Δίνοντας τον παρακείμενο πίνακα I LT και I TP παρακάτω, που σημαίνει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ lncRNA και πρωτεϊνών, μπορούμε να λάβουμε τον πίνακα πιθανοτήτων μετάβασης T LT και T TP κανονικοποιώντας τα δύο μήτρα κατά μήκος του διανύσματος σειράς. Η μέθοδος PLPIHS. Μεταξύ ενός ετερογενούς δικτύου, διαφορετικά μονοπάτια μπορούν να εκφράσουν διαφορετικές σημασιολογικές έννοιες. Για παράδειγμα, ένα lncRNA και μια πρωτεΐνη συνδέονται μέσω διαδρομής «lncRNA-lncRNA-πρωτεΐνη» ή διαδρομής «lncRNA-πρωτεΐνη-πρωτεΐνη» που αντιπροσωπεύει εντελώς διαφορετικές έννοιες. Το πρώτο σημαίνει ότι εάν ένα lncRNA συσχετίζεται με μια πρωτεΐνη, τότε ένα άλλο lncRNA παρόμοιο με το lncRNA θα συνδέεται δυνητικά με την πρωτεΐνη. Το τελευταίο δείχνει ότι εάν μια πρωτεΐνη συσχετίζεται με ένα lncRNA, τότε μια άλλη πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη θα σχετίζεται πιθανώς με το lncRNA. Επομένως, οι πιθανές πληροφορίες που κρύβονται σε κάθε διαδρομή είναι εξαιρετικά απαραίτητες για να ληφθούν υπόψη κατά την πρόβλεψη. Το πλαίσιο PLPIHS απεικονίζεται στην Εικ. 2 . Πρώτον, κατασκευάζουμε ένα ετερογενές δίκτυο που αποτελείται από ένα δίκτυο ομοιότητας lncRNA-lncRNA, ένα δίκτυο συσχέτισης lncRNA-πρωτεΐνης και ένα δίκτυο αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Τρία είδη αραιών δικτύων λαμβάνονται από το ετερογενές δίκτυο με διαφορετική τιμή αποκοπής 0,3, 0,5 και 0,9 (βλ. συσχετίσεις lncRNA-Πρωτεΐνης). Όσο μεγαλύτερη είναι η αποκοπή, το δίκτυο είναι πιο αραιό. Ένα σύνολο 15941 γονιδίων lncRNAs και 20284 γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες εξάγονται όπως παρουσιάζεται στην Ενότητα 2.3. Λαμβάνουμε τυχαία 1511 lncRNAs και 344 πρωτεΐνες για να κατασκευάσουμε ένα μικρότερο δίκτυο για τα ακόλουθα πειράματα λαμβάνοντας υπόψη το κόστος υπολογισμού. Η κατασκευή των μικρότερων ετερογενών δικτύων κάτω από διαφορετικές τιμές αποκοπής φαίνεται στον Πίνακα 4, όπου το 'lnc2lnc' υποδηλώνει το δίκτυο lncRNA-lncRNA, το 'lnc2code' το δίκτυο lncRNA-πρωτεΐνη και το 'code2code' το δίκτυο πρωτεΐνης-lncRNA. Τραπέζι 1 . Χρησιμοποιούμε το id για να υποδείξουμε τον συνδυασμό διαδρομής, δηλαδή, το 1′~2′ αντιπροσωπεύει τη διαδρομή 'LLP' και τη διαδρομή 'LPP' . Στη συνέχεια, υπολογίζουμε τη βαθμολογία heteSim για κάθε ζεύγος lncRNA-πρωτεΐνης κάτω από κάθε διαδρομή. Τα αποτελέσματα διαφορετικών μονοπατιών χρησιμοποιούνται ως διαφορετικά χαρακτηριστικά. Και συνδυάζουμε έναν σταθερό παράγοντα β για να αναστέλλουμε την επίδραση μεγαλύτερων μονοπατιών. Όσο μεγαλύτερο είναι το μήκος της διαδρομής, τόσο μικρότερος είναι ο ανασταλτικός παράγοντας. Τέλος, κατασκευάζεται ένας ταξινομητής SVM με αυτές τις βαθμολογίες για την πρόβλεψη πιθανών συσχετισμών lncRNA-πρωτεΐνης. Λόγω του ότι το μέτρο HeteSim βασίζεται στο πλαίσιο συνάφειας που βασίζεται σε μονοπάτια 39 , μπορεί αποτελεσματικά να ανακαλύψει τη λεπτή σημασιολογία κάθε διαδρομής.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 319, "text": "μακρά μη κωδικοποιητικά RNA" } ], "id": 3687, "question": "Τι είναι κρίσιμο για τη ρύθμιση των κυτταρικών βιολογικών διεργασιών;" }, { "answers": [ { "answer_start": 12574, "text": "ρυθμίζει τον κυτταρικό κύκλο και την επιβίωση" } ], "id": 3690, "question": "Ποια είναι η λειτουργία του MALAT1;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Δοκιμή ελεγχόμενης αποτελεσματικότητας που επιβεβαιώνει την αντοχή στην τολτραζουρίλη σε απομόνωση αγρού προβατίνας Eimeria spp. Enemark, Heidi L.; Ruiz, Antonio; Robertson, Lucy J.; Ersdal, Cecilie; Nes, Silje K.; Tømmerberg, Vibeke; Stuen, SnorreΗμερομηνία: 2018-07-05DOI: 10.1186/s13071-018-2976-4Άδεια χρήσης: cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Κοκκιδίωση λόγω Eimeria spp. Οι λοιμώξεις στα αρνιά προκαλούν αυξημένη θνησιμότητα και σημαντικές απώλειες παραγωγής και τα αντικοκκιδιακά είναι σημαντικά για τον έλεγχο της μόλυνσης. Έχει αναφερθεί αντίσταση στα πουλερικά και στους χοίρους στην αντικοκκιδιακή δράση και πρόσφατα περιγράψαμε τη μειωμένη αποτελεσματικότητα της τολτραζουρίλης σε προβατοειδή Eimeria spp. σε ορισμένες νορβηγικές εκμεταλλεύσεις προβάτων χρησιμοποιώντας μια νέα δοκιμασία μείωσης του αριθμού ωοκύστης στα κόπρανα (FOCRT). Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να χρησιμοποιήσει μια δοκιμή ελεγχόμενης αποτελεσματικότητας για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της τολτραζουρίλης έναντι ενός απομονώματος αγρού για το οποίο υπάρχει υποψία ότι είναι ανθεκτικό. ΜΕΘΟΔΟΙ: Είκοσι αρνιά, ηλικίας 17–22 ημερών και εκτράφηκαν προστατευμένα από την έκθεση σε κοκκίδια, μολύνθηκαν με απομόνωση αγρού 100.000 Eimeria spp. ωοκύστεις. Αυτό το προϊόν απομόνωσης ελήφθη από μια φάρμα με προηγουμένως υπολογισμένη αποτελεσματικότητα φαρμάκου 56% (95% διάστημα εμπιστοσύνης: -433,9 έως 96,6%). Την 7η ημέρα μετά τη μόλυνση, 10 από τα αρνιά έλαβαν από του στόματος θεραπεία με 20 mg/kg τολτραζουρίλης (Baycox Sheep vet., Bayer Animal Health), ενώ στα άλλα 10 αρνιά (μάρτυρες) δόθηκε φυσιολογικός ορός. Πραγματοποιήθηκαν κλινικές εξετάσεις και καταγράφηκαν αυξήσεις βάρους. Ημερήσια δείγματα κοπράνων βαθμολογήθηκαν για διάρροια σε κλίμακα από 1 έως 5 και προσδιορίστηκε η απέκκριση ωοκύστης χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη τεχνική McMaster. Οι ωοκύστες ταυτοποιήθηκαν μορφολογικά σε επίπεδο είδους. Στις 17-24 ημέρες μετά τη μόλυνση, τα αρνιά υποβλήθηκαν σε ευθανασία και νεκροψία. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Το ελεγμένο προϊόν απομόνωσης Eimeria ήταν ανθεκτικό στην τολτραζουρίλη και παρατηρήθηκε αντοχή τόσο σε παθογόνα όσο και σε μη παθογόνα είδη. Επιπλέον, δεν εντοπίστηκαν σημαντικές διαφορές στη βαθμολογία των κοπράνων, στην ανάπτυξη, στη συνολική παθολογία ή στις ιστολογικές αλλαγές μεταξύ των δύο ομάδων. Το παθογόνο E. ovinoidalis ήταν το κυρίαρχο είδος και δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά στον ατομικό επιπολασμό του E. ovinoidalis μετά τη θεραπεία μεταξύ των αμνών που έλαβαν θεραπεία (66,9%) και των αρνιών ελέγχου (61,9%). Άλλα είδη που ταυτοποιήθηκαν περιελάμβαναν τα E. crandallis/weybridgensis, E. parva, E. marsica, E. faurei, E. pallida, E. ahsata και E. bakuensis. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Αυτή η μελέτη επιβεβαιώνει την ανθεκτικότητα στην τολτραζουρίλη σε πρόβειο Eimeria spp. Επιπλέον, τα δεδομένα υποστηρίζουν τη χρήση του FOCRT ως κατάλληλο εργαλείο για την επιτόπια αξιολόγηση της αντικοκκιδιακής αποτελεσματικότητας. Λόγω των περιορισμένων εναλλακτικών αντικοκκιδιακών θεραπειών, αυτά τα ευρήματα μπορεί να έχουν σημαντικές επιπτώσεις για τη βιομηχανία προβάτων, ιδιαίτερα στη Βόρεια Ευρώπη. ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ: Η ηλεκτρονική έκδοση αυτού του άρθρου (10.1186/s13071-018-2976-4) περιέχει συμπληρωματικό υλικό, το οποίο είναι διαθέσιμο σε εξουσιοδοτημένους χρήστες. η χρήση αντικοκκιδιακών φαρμάκων εμφανίζεται ευρέως στην παραγωγή πουλερικών και έχει επίσης εντοπιστεί στο Cystoisospora suis σε χοιρίδια [1] [2] [3] [4] [5] . Επιπλέον, πρόσφατα αναπτύχθηκε μια μέθοδος πεδίου για την αξιολόγηση της μειωμένης αντικοκκιδιακής αποτελεσματικότητας (ACE) σε προβατοειδή Eimeria spp., η δοκιμή μείωσης του αριθμού ωοκύστης στα κόπρανα (FOCRT), η οποία έδειξε ότι η αποτελεσματικότητα της τολτραζουρίλης είναι μειωμένη σε ορισμένα κοπάδια προβάτων της Νορβηγίας. [6] .Λοιμώξεις με Eimeria spp. μπορεί να επηρεάσει τόσο την καλή διαβίωση των ζώων όσο και την παραγωγικότητα στη βιομηχανία προβάτων και ο έλεγχος της μόλυνσης είναι σημαντικός για την ελαχιστοποίηση της θνησιμότητας και της νοσηρότητας και για τη διασφάλιση ότι δεν διακυβεύεται η ανάπτυξη του αρνιού [7] [8] [9] . Οι προτεινόμενες στρατηγικές για τον έλεγχο της κοκκιδίωσης των μηρυκαστικών περιλαμβάνουν τη διαχείριση των βοσκοτόπων, την επαρκή διατροφή και τα μέτρα υγιεινής [10, 11] . Ωστόσο, αυτά τα μέτρα είναι συχνά δύσκολο να εφαρμοστούν στην πράξη και η κύρια προσέγγιση ελέγχου είναι συχνά η μεταφυλαξία με αντικοκκιδιακά [12] [13] [14] [15] . Η μεταφυλακτική χορήγηση μίας από του στόματος δόσης τολτραζουρίλης κατά την περίοδο πριν από το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας έχει αποδειχθεί αποτελεσματική στη μείωση των κλινικών συμπτωμάτων και στη διατήρηση επαρκών ρυθμών ανάπτυξης αρνιού σε διαφορετικά συστήματα παραγωγής [13, [15] [16] [17] [18] [19] ] . Αντίθετα, η θεραπεία της κλινικής κοκκιδίωσης θεωρείται αναποτελεσματική λόγω της εκτεταμένης εντερικής βλάβης που έχει ήδη προκληθεί από τη μόλυνση [20, 21]. Ως εκ τούτου, η απώλεια ευαισθησίας στην τολτραζουρίλη, το μόνο αντικοκκιδιακό που έχει καταχωρηθεί για χρήση σε πρόβατα στις σκανδιναβικές χώρες [22] [23] [24] , θα πρέπει να αποτελέσει θέμα σοβαρής ανησυχίας για την παραγωγή αρνιού. Κατευθυντήριες οδηγίες της Παγκόσμιας Ένωσης για την Προώθηση της Κτηνιατρικής Παρασιτολογίας για την αξιολόγηση του ΜΕΑ σε θηλαστικά [25] , δηλώνει ότι υπάρχει ανάγκη για επαληθευμένες μεθόδους αξιολόγησης του ΜΕΑ. Οι μέθοδοι πεδίου για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας του φαρμάκου, όπως το FOCRT [6] και το τεστ μείωσης του αριθμού των ωαρίων στα κόπρανα που χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση της ανθελμινθικής αποτελεσματικότητας [26] , δίνουν μόνο ένδειξη μειωμένης αποτελεσματικότητας και χρειάζονται επαλήθευση μέσω ελεγχόμενων δοκιμών αποτελεσματικότητας (CET) [ 27, 28]. Επιπλέον, λόγω της διακύμανσης της παθογένειας μεταξύ προβάτων Eimeria spp., η διαφοροποίηση των ειδών θα πρέπει να εξεταστεί χωριστά [25] . Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να πραγματοποιηθεί ένα CET προκειμένου να προσδιοριστεί εάν διαφορετικά είδη σε ένα απομονωμένο αγρό προβατίνα Eimeria spp. με υποψία ACR, με βάση το FOCRT [6] , στην πραγματικότητα έδειξε αντοχή στην τολτραζουρίλη. Συνολικά 20 αρνιά από 8 προβατίνες της νορβηγικής φυλής λευκών προβάτων (\"Norsk kvit sau\") συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη, η οποία εγκρίθηκε από το Νορβηγική Αρχή Έρευνας Ζώων (ID: 11657). Οι προβατίνες συγχρονίστηκαν χρησιμοποιώντας Chronogest® CR και PMSG® (MSD Animal Health, Buckinghamshire, UK) και εξυπηρετήθηκαν με φυσικό ζευγάρωμα. Τα αρνιά είτε άρπαξαν κατά τη γέννηση (n = 16) είτε γεννήθηκαν με καισαρική τομή (n = 4) σε διάστημα 6 ημερών και στη συνέχεια εκτράφηκαν τεχνητά. Για την αναγνώριση χρησιμοποιήθηκαν μεμονωμένα ακουστικά. Αμέσως μετά τη γέννηση, όλα τα αρνιά πλύθηκαν με σαπούνι Optima pH 4 (Optima Produkter AS, Norheimsund, Νορβηγία) και στέγνωσαν πριν τοποθετηθούν σε κουτιά με διογκωμένο μεταλλικό δάπεδο, σε ομάδες των τεσσάρων. Σε όλη τη διάρκεια της δοκιμής χρησιμοποιήθηκαν θερμαντήρες υπερύθρων. Μια επισκόπηση των ομάδων μελέτης, συμπεριλαμβανομένης της ηλικίας αρνιού, του βάρους γέννησης και του φύλου μπορεί να βρεθεί στο Πρόσθετο αρχείο 1: Πίνακας S1. Τα αρνιά έλαβαν πρωτόγαλα προβάτου από προβατίνες εμβολιασμένες κατά του Clostridium spp. (Covexin-8, Zoetis) κατά τα πρώτα 30 λεπτά της ζωής, ακολουθούμενο από πρωτόγαλα από εμβολιασμένες αγελάδες (Covexin-8, Zoetis) κατά τις επόμενες 24 ώρες. Για να αποφευχθούν περιπτώσεις αιμολυτικής αναιμίας, το πρωτόγαλα αγελάδας είχε δοκιμαστεί προηγουμένως σε αρνιά φυσικά εκτρεφόμενα. Στη συνέχεια, τα αρνιά τρέφονταν κατά βούληση με ένα εμπορικό υποκατάστατο γάλακτος (Denkamilk, Denkavit, Fiskå, Mølle, Stavanger), χρησιμοποιώντας ένα αυτόματο σύστημα σίτισης (Holm & Laue, Godkalven, Figgjo, Νορβηγία). Τα αρνιά είχαν κατά βούληση πρόσβαση σε νερό, σανό και εμπορικό συμπύκνωμα εκκίνησης αρνιών (FORMEL lam vår, Felleskjøpet, Νορβηγία). Για να διασφαλιστεί ότι η μετάδοση της Eimeria στα αρνιά μέσω μολυσμένου πρωτόγαλα και σανού δεν θα μπορούσε να συμβεί, και τα δύο καταψύχθηκαν στους -75°C για τουλάχιστον 24 ώρες, πριν από την παροχή στα αρνιά. Η απομόνωση αγρού του Eimeria spp. ελήφθη από ένα από τα σμήνη (ID 35) που συμμετείχαν στην πρόσφατη μελέτη FOCRT [6] . Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της FOCRT, η τολτραζουρίλη είχε μειωμένη αποτελεσματικότητα έναντι της Eimeria σε δύο σμήνη. Ωστόσο, κανένα από αυτά τα σμήνη δεν ήταν διαθέσιμα για την CET, για γεωγραφικούς και πρακτικούς λόγους. Έτσι, η θεραπεία με τολτραζουρίλη στο επιλεγμένο σμήνος είχε βρεθεί ότι είχε αποτελεσματικότητα 56,0%, αλλά τα αποτελέσματα ταξινομήθηκαν ως ασαφή, λόγω του μεγάλου διαστήματος εμπιστοσύνης 95% (CI) των -433,9 και 96,6% [6] . αποκτήστε επαρκείς ωοκύστεις Eimeria αυτού του απομονώματος μικτού πεδίου (με το όνομα \"NMBU ID 35\") για την παρούσα μελέτη, ελήφθησαν δείγματα κοπράνων από 35 αρνιά σε αυτό το κοπάδι 9 ημέρες μετά τη θεραπεία με τολτραζουρίλη (Baycox® Sheep vet., Bayer Animal Health, Oslo, Noray). Οι ωοκύστες απομονώθηκαν σύμφωνα με τον Jackson [29] με ορισμένες τροποποιήσεις. Εν συντομία, τα κόπρανα αναμίχθηκαν 1:1 με νερό και διηθήθηκαν. Το διήθημα μίγματος κοπράνων στη συνέχεια αναμίχθηκε 1:1 με κορεσμένο διάλυμα ζάχαρης (πυκνότητα: 1,5 g/l) σε πλαστικό δοχείο και αφέθηκε να επιπλεύσει σε γυάλινη πλάκα. Η αντικειμενοφόρος πλάκα πλύθηκε κάθε δεύτερη ώρα με απιονισμένο νερό για τρεις διαδοχικές ημέρες και συλλέχθηκαν οι πλύσεις. Οι εκπλύσεις φυγοκεντρήθηκαν στα 2300 χ g για 20 λεπτά, το υπερκείμενο απορρίφθηκε και το ίζημα αναμείχθηκε 1:1 με απιονισμένο νερό σε μια γυάλινη φιάλη με σταθερό αερισμό. Οι ωοκύστεις στη φιάλη αφέθηκαν να σποριωθούν για 7 ημέρες σε θερμοκρασία δωματίου. Οι σποριωμένες ωοκύστεις αποθηκεύτηκαν για 18 ημέρες στους 4°C. Με βάση τη μορφολογία [30] , όπως φαίνεται με μικροσκόπιο φωτός σε μεγέθυνση 400 × (βλ. επίσης ενότητα δειγμάτων κοπράνων) και ταξινόμηση 300 ωοκύστεων, η απομόνωση πεδίου αποτελούνταν από E. parva (32%), E. crandallis/ weybridgensis (25 %), E. ovinoidalis (24%), E. faurei (9%), E. marsica (8%), E. pallida (1%), E. ahsata (< 1%) και E. bakuensis (< 1 %).Όλα τα αρνιά μολύνθηκαν (ημέρα 0) σε ηλικία 17-22 ημερών, χρησιμοποιώντας οισοφαγικό σωλήνα. Μια δόση περίπου 100.000 σποριωμένων ωοκυστών, αραιωμένων σε νερό σε συνολικό όγκο 5 ml, δόθηκε σε καθένα από τα 20 αρνιά. Στη συνέχεια, δύο τυχαία επιλεγμένα αρνιά (ρίψη νομισμάτων) από κάθε ομάδα των τεσσάρων υπέστησαν από του στόματος θεραπεία (ημέρα 7) με 0,4 ml/kg τολτραζουρίλης (Baycox® Sheep vet. 50 mg/ml, Bayer Animal Health) και στα υπόλοιπα αρνιά (μάρτυρες) έλαβαν 0,4 ml/kg 0,9% NaCl (B. Braun Medical AS, Vestskogen, Νορβηγία). Κλινικές εξετάσεις πραγματοποιήθηκαν καθημερινά καθ' όλη τη διάρκεια της δοκιμής. Η θερμοκρασία του ορθού μετρήθηκε τις ημέρες 0, 1, 2 και 7 και καθημερινά από την 14η ημέρα και οι θερμοκρασίες > 40,5°C θεωρήθηκαν πυρετός. Τα αρνιά ζυγίζονταν μία φορά την εβδομάδα χρησιμοποιώντας ένα βαθμονομημένο βάρος (Kruuse, Drøbak Norway) με ευαισθησία 0,1 kg, μέχρι 14 ημέρες μετά τη μόλυνση, και στη συνέχεια τρεις φορές την εβδομάδα. Δύο αρνιά (μάρτυρες) υποβλήθηκαν σε θεραπεία από το στόμα με τριμεθοπρίμη/σουλφαμεθοξαζόλη (Bactrim , Roche, Etterstad, Νορβηγία) κατά τις τρεις πρώτες ημέρες της ζωής λόγω ύποπτης μόλυνσης από Escherichia coli, από την οποία και οι δύο ανέρρωσαν εντός 48 ωρών. Έξι αρνιά, δύο μάρτυρες και τέσσερα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τολτραζουρίλη, εμφάνισαν χωλότητα λόγω μεσοδακτυλικού αποστήματος και ανιχνεύθηκε χρυσίζων στρεπτόκοκκος σε δύο αρνιά. Τέσσερα αρνιά ανάρρωσαν χωρίς θεραπεία και δύο από τα αρνιά ανάρρωσαν μετά από θεραπεία με βενζυλοπενικιλλινοπροκαΐνη (Penovet vet., Boehringer Ingelheim Vetmedica, Κοπεγχάγη, Δανία) που χορηγήθηκε ενδομυϊκά για τρεις ημέρες. Κατά την κλινική εξέταση, δόθηκε ιδιαίτερη προσοχή στα κλινικά σημεία που σχετίζονται με το Eimeria spp . λοιμώξεις, δηλ. αφυδάτωση, πυρεξία, αδυναμία, ανορεξία και, ειδικότερα, παρουσία διάρροιας. Η σοβαρή αιμορραγική διάρροια και η αφυδάτωση σε ένα αρνί την ημέρα 17, οδήγησαν σε ευθανασία ολόκληρης της ομάδας των τεσσάρων αρνιών. Την ημέρα 18, ένα άλλο αρνί εμφάνισε σημάδια αιμορραγικής διάρροιας και όλα τα αρνιά αυτής της ομάδας υποβλήθηκαν επίσης σε ευθανασία. Οι υπόλοιπες τρεις ομάδες υποβλήθηκαν σε ευθανασία τις ημέρες 21, 23 και 24. Δείγματα αίματος λήφθηκαν από v. jugularis χρησιμοποιώντας σωλήνες vacuette (απλό και επεξεργασμένο με EDTA. BD, Franklin Lakes, ΗΠΑ) στις 48 ± 2 ώρες μετά τη γέννηση και τις ημέρες 0, 7 και κατά την ευθανασία. Η αιματολογία πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του συστήματος αιματολογίας ADVIA 120 (Bayer Diagnostics, Leverkusen, Γερμανία). Η αφυδάτωση εξετάστηκε με αιματοκρίτη (hct) > 45,0% [31] . Σωληνάρια ολικού αίματος φυγοκεντρήθηκαν και ο ορός αφαιρέθηκε και αποθηκεύτηκε στους -20°C μέχρι περαιτέρω ανάλυση. Η βιοχημική ανάλυση πραγματοποιήθηκε από το ABX Pentra 400 (Horiba, Les Ulis, Γαλλία) και περιελάμβανε ανάλυση σιδήρου, ολικής πρωτεΐνης, λευκωματίνης, ουρίας, κρεατινίνης, γ-γλουταμυλοτρανσφεράσης, γλουταμικής αφυδρογονάσης και βήτα υδροξυβουτυρικού οξέος. Μεμονωμένα δείγματα κοπράνων από καθένα από τα αρνιά λαμβάνονταν καθημερινά από τη 10η ημέρα της ζωής μέχρι το τέλος του πειράματος. Η οπτική βαθμολόγηση της συνοχής των κοπράνων πραγματοποιήθηκε σε κλίμακα από το ένα έως το πέντε (1: κανονικό, σφαιροποιημένο. 2: μαλακό; 3: υγρό; 4: υδαρής? 5: υδαρής με αίμα και/ή εντερικό ιστό) [32] . Μια βαθμολογία ≥ 3 θεωρήθηκε ως διάρροια. Τα δείγματα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα εσωτερικό \"κουτάλι κοπράνων\" [6] και τα δείγματα κοπράνων τοποθετήθηκαν σε σακούλες με φερμουάρ, οι οποίες συσκευάστηκαν σε κενό (Fresh'n'easy, OBH Nordica, Sundbyberg, Σουηδία), αποθηκεύτηκε στους 4°C και αναλύθηκε εντός 37 ημερών. Ο ρυθμός απέκκρισης ωοκύστης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη τεχνική McMaster με θεωρητική ευαισθησία 5 ωοκύστεων ανά γραμμάριο (OPG) [6] . Εκατό ωοκύστεις Eimeria από όλα τα δείγματα ≥ 1000 OPG εξετάστηκαν με μικροσκόπιο φωτός σε μεγέθυνση 400× και ταυτοποιήθηκαν σε επίπεδο είδους, χρησιμοποιώντας μορφολογικά κριτήρια [30] . Ωστόσο, λόγω της μορφολογικής τους ομοιότητας, οι ωοκύστεις των E. crandallis και E. weybridgensis δεν διαφοροποιήθηκαν. Ο αριθμός των ωοκυστών αναλύθηκε με το FOCRT [6] , το οποίο αποτελείται από μια διαδικασία δύο σταδίων. Αρχικά, αξιολογήθηκε ο χρόνος της θεραπείας και της δειγματοληψίας, ακολουθούμενη από αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας, συγκρίνοντας τα δείγματα κοπράνων μετά τη θεραπεία από αρνιά που είχαν υποστεί αγωγή με ισοδύναμα δείγματα από μάρτυρες χωρίς θεραπεία. Δείγματα προ-κατεργασίας (δείγμα 1) ελήφθησαν την ημέρα 7 (ημέρα θεραπείας) και δείγματα μετά την επεξεργασία (δείγμα 2) ελήφθησαν τις ημέρες 14-18. Το FOCRT στη συνέχεια εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας τις μετρήσεις ωοκύστεων μετά τη θεραπεία και για τα πέντε πιθανά χρονικά διαστήματα (7-11 ημέρες) μεταξύ των δειγμάτων 1 και 2. Τα δείγματα κοπράνων που ελήφθησαν κατά την ευθανασία αναλύθηκαν για ροταϊό, κορωνοϊό, Cryptosporidium spp. και γενική βακτηριολογία. Πρόσθετες δοκιμές για Cryptosporidium spp. διενεργήθηκε σε διαρροϊκά αρνιά τη στιγμή της μόλυνσης (ημέρα 0, n = 10). Τα επιχρίσματα κοπράνων αναλύθηκαν στο Νορβηγικό Κτηνιατρικό Ινστιτούτο στο Όσλο για Cryptosporidium με άμεση ανάλυση ανοσοφθορισμού (Crypt-a-Glo™, Waterborne Inc., Νέα Ορλεάνη, ΗΠΑ), ενώ η παρουσία ροταϊού και κοροναϊού δοκιμάστηκε με τυπικές διαγνωστικές μεθόδους. Λήφθηκαν δείγματα για βακτηριολογικές αναλύσεις από τη μέση της νήστιδας και τη σπείρα του παχέος εντέρου, απλώθηκαν σε πλάκες άγαρ αίματος προβάτου και επωάστηκαν υπό αναερόβιες και αερόβιες συνθήκες για 24-48 ώρες στους 37°C και 5% CO2. Σε περιπτώσεις αιμορραγικής διάρροιας, επιπρόσθετα δείγματα αναπτύχθηκαν σε άγαρ κυστεΐνης μπλε λακτόζης βρωμοθυμόλης (άγαρ βρολακτίνης/CLED) για πιθανή ταυτοποίηση της σαλμονέλας [33]. Τα αρνιά υποβλήθηκαν σε ευθανασία στις ημέρες 17-24, με ενδοφλέβια ένεση με βετοβαρβιτάλη (E pentobarbital. , Virbac, Sollihøgda, Νορβηγία) στα 140 mg/kg. Η τυπική νεκροψία πραγματοποιήθηκε αμέσως μετά, με έμφαση στα έντερα. Λήφθηκαν ιστολογικά δείγματα από τη μέση νήστιδα, τον εγγύς και άπω ειλεό, τη μέση και τη βάση του τυφλού, το σπειροειδές κόλον και το περιφερικό κόλον, εκτός από καρδιά, πνεύμονα, ήπαρ και νεφρό . Τα δείγματα σταθεροποιήθηκαν με εμβάπτιση σε φορμαλδεΰδη 4%, ενσωματώθηκαν σε παραφίνη και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ). Πραγματοποιήθηκε ιστολογική αξιολόγηση με μικροσκόπιο φωτός και πραγματοποιήθηκε τυφλή ημιποσοτική αξιολόγηση (μονός αξιολογητής) για την εκτίμηση της παθολογίας του εντέρου. Οι παράμετροι αξιολόγησης περιελάμβαναν αλλαγές σε: (i) λάχνες, (ii) επιφανειακό επιθήλιο (ατροφία/εξασθένηση), (iii) βαθμό μόλυνσης από Eimeria, (iv) υπεραιμία, (v) οίδημα, (vi) διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων και ( vii) αποστήματα κρύπτης και βαθμολογήθηκαν ως εξής: 0 = ελάχιστο. 1 = λίγο; 2 = μέτρια; 3 = σοβαρή, συμπεριλαμβανομένης της βαθμολόγησης μισού βήματος. Επιπλέον, η παρουσία επιθηλιακής νέκρωσης βαθμολογήθηκε ως παρούσα (1) ή απουσία (0). Μια συνολική ιστολογική βαθμολογία υπολογίστηκε για κάθε ιστό με άθροιση όλων των παραμέτρων που αξιολογήθηκαν (i-vii). Η διαχείριση των δεδομένων έγινε στο Excel 2013 (Microsoft Inc., Redmond, USA) και στη συνέχεια αναλύθηκαν σε R [34] και Stata 14 (Stata Στατιστικό λογισμικό: Έκδοση 14. Stata-Corp LP, College Station, TX, ΗΠΑ). Η αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το FOCRT [6] . Για τους υπολογισμούς της σημασίας με βάση τους μέσους όρους, χρησιμοποιήθηκε ένα τεστ t. P < 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Οι μέσοι ρυθμοί ανάπτυξης ήταν πάνω από 300 g/ημέρα μέχρι τις ημέρες 14-16, οπότε ο μέσος ρυθμός ανάπτυξης μειώθηκε σε περίπου 0 g/ημέρα (Εικ. 1) . Οι ρυθμοί ανάπτυξης αυξήθηκαν ξανά από την 21η ημέρα και μετά. Το ίδιο μοτίβο παρατηρήθηκε και στους αμνούς που έλαβαν θεραπεία και στους αμνούς ελέγχου. Από την ημέρα 15, τόσο τα αμνοερίφια όσο και τα αρνιά ελέγχου είχαν μέση βαθμολογία κοπράνων ≥ 3, υποδηλώνοντας διάρροια. Η μέγιστη μέση βαθμολογία στα κόπρανα παρατηρήθηκε την ημέρα 17 (3,9 ± 0,2) και την ημέρα 18 (4,4 ± 0,3) στις ομάδες που έλαβαν θεραπεία και στην ομάδα ελέγχου, αντίστοιχα. Αιμορραγική διάρροια παρατηρήθηκε από την ημέρα 14, σε δύο αμνούς που έλαβαν θεραπεία και σε πέντε αρνιά ελέγχου, και τενέσμος παρατηρήθηκε σε δύο αρνιά ελέγχου (ημέρα 17). Μια αύξηση στη θερμοκρασία του ορθού παρατηρήθηκε από την ημέρα 14, με τις μέγιστες θερμοκρασίες να μετρώνται την ημέρα 18 (40,4 ± 0,4°C) και 16 (40,9 ± 0,4°C) στην ομάδα που υποβλήθηκε σε αγωγή και στην ομάδα ελέγχου, αντίστοιχα. Η μέση διάρκεια του πυρετού (> 40,5°C) ήταν 2,3 ± 0,5 ημέρες και 1,9 ± 0,4 ημέρες για την ομάδα που έλαβαν θεραπεία και την ομάδα ελέγχου, αντίστοιχα. Για αυτές τις παραμέτρους, δεν παρατηρήθηκε καμία σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων ανά πάσα στιγμή. Στην ευθανασία, η μέση hct ήταν 39,2 ± 1,7% και 41,4 ± 1,9% στις ομάδες που έλαβαν θεραπεία και στην ομάδα ελέγχου, αντίστοιχα. Ωστόσο, αφυδάτωση (hct > 45,0%) παρατηρήθηκε μόνο σε 3 αρνιά, ένα εκ των οποίων είχε λάβει θεραπεία με τολτραζουρίλη. Η μέση ολική πρωτεΐνη ορού μειώθηκε και στις δύο ομάδες από τη μόλυνση έως την ευθανασία, αλλά δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων. Άλλες βιοχημικές παράμετροι ήταν εντός φυσιολογικών ορίων (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Η απέκκριση ωοκύστης καταγράφηκε για πρώτη φορά σε ένα αρνί που υποβλήθηκε σε αγωγή την ημέρα 10 (10 OPG), ακολουθούμενη από απέκκριση ωοκύστης σε όλα τα αρνιά και στις δύο ομάδες από την ημέρα 14 και μετά. Η μέγιστη έκκριση ωοκύστης παρατηρήθηκε στην ομάδα που έλαβε θεραπεία την ημέρα 20 (μέση OPG: 5.438.500) και στην ομάδα ελέγχου την ημέρα 21 μετά τη μόλυνση (μέση OPG: 3.630.850) (Εικ. 2) . Στη συνέχεια, η απέκκριση ωοκύστης μειώθηκε. Δεν υπήρξε καμία σημαντική διαφορά στην απέκκριση ωοκύστης και στην κατανομή των ειδών μεταξύ των ομάδων ανά πάσα στιγμή. Όλα τα είδη που υπήρχαν στην απομόνωση αγρού απομονώθηκαν από τα δείγματα κοπράνων και των 20 μολυσμένων αρνιών. Το E. ovinoidalis ήταν το πιο διαδεδομένο είδος τόσο στους αμνούς που έλαβαν θεραπεία όσο και στα αρνιά ελέγχου (Πίνακας 1). Η αποτελεσματικότητα, σύμφωνα με το FOCRT, αξιολογήθηκε με σιγουριά εάν η κλίση ήταν ≥ 0,75 και με προσοχή εάν η κλίση ήταν ≥ 0,5 και < 0,75 [6 ] . Η κλίση κυμαινόταν από 1,24 έως 1,69 για τη συνολική απέκκριση ωοκύστης στους αμνούς ελέγχου. Κλίση, εκτιμήσεις μέγιστης πιθανότητας και 95% CI για τη γεωμετρική μέση αποτελεσματικότητα όλων των ωοκύστεων, E. ovinoidalis, E. crandallis/weybridgensis, και the παθογόνο Eimeria spp. παρουσιάζονται στον Πίνακα 2. μειωμένη αποτελεσματικότητα της τολτραζουρίλης είναι εμφανής τόσο έναντι των παθογόνων όσο και των μη παθογόνων ειδών. Η κλίση ήταν ≥ 0,75 για όλα τα χρονικά διαστήματα και τα είδη, εκτός από τα τέσσερα από τα πέντε χρονικά διαστήματα του E. crandallis/weybridgensis. Τα δείγματα που αναλύθηκαν για Cryptosporidium spp., Salmonella, κοροναϊό και ροταϊό ήταν όλα αρνητικά. Οι βακτηριολογικές αναλύσεις έδειξαν μικτή χλωρίδα, κυριαρχούμενη από κολοβακτηρίδια και Enterococcus spp. Τα ακαθάριστα παθολογικά ευρήματα περιελάμβαναν διάχυτο παχύρρευστο και διπλωμένο βλεννογόνο του ειλεού (7 που υποβλήθηκαν σε αγωγή και 7 μάρτυρες) και περιεκτικότητα σε ινώδη ειλεό σε δύο αρνιά (ένα υπό θεραπεία και ένα μάρτυρα). Οζώδεις ή πλάκες εστίες στον βλεννογόνο του ειλεού παρατηρήθηκαν σε 4 αρνιά που έλαβαν θεραπεία και 6 αρνιά ελέγχου (Εικ. 3α). Οι περιφερειακοί περιφερικοί λεμφαδένες της νήστιδας ήταν μετρίως αυξημένοι σε μέγεθος και οιδηματώδεις σε 5 αρνιά που έλαβαν θεραπεία και 6 αρνιά ελέγχου. Τέλος, παρατηρήθηκε περιεκτικότητα σε υδαρή αφαίρεση σε > 50% των ζώων και στις δύο ομάδες. Η μικροσκοπική αξιολόγηση έδειξε βλάβες, κυρίως στον ειλεό, το τυφλό έντερο και το κόλον, με μικρές βλάβες στη νήστιδα (Εικ. 3b-f). Ωστόσο, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές σε σχέση με τις ιστολογικές βαθμολογίες μεταξύ της ομάδας που έλαβαν θεραπεία και της ομάδας ελέγχου σε οποιοδήποτε από τα τμήματα του εντέρου. Η υψηλότερη υπολογιζόμενη ιστολογική βαθμολογία βρέθηκε στον εγγύς ειλεό και στη βάση του τυφλού εντέρου (Εικ. 4) . Η μέση βαθμολογία για κάθε παράμετρο βρίσκεται στο Πρόσθετο αρχείο 2: Πίνακας S2 . Παρατηρήθηκαν ποικίλες ποσότητες ενδοκυτταρικών σταδίων Eimeria σε όλα τα εντερικά τμήματα, εκτός από τη νήστιδα, και εντοπίζονταν ως επί το πλείστον στο επιθήλιο της λάχνης, με λιγότερα παράσιτα στο επιθήλιο της κρύπτης και στο lamina propria και λίγα στον υποβλεννογόνο και τα λεμφικά αγγεία. Τόσο στα αρνιά που έλαβαν θεραπεία όσο και στα αρνιά ελέγχου, οι αλλαγές στις εντερικές επιφάνειες διέφεραν από ελαφριά ατροφία του επιθηλίου της νήστιδας και αμβλύνσεις των προσβεβλημένων λαχνών του ειλεού (Εικ. 3β), σε περιοχές ολικής ισοπέδωσης, εξασθένησης του επιφανειακού επιθηλίου (Εικ. 3ε) και νέκρωση (Εικ. 3δ). Σε όλα τα αρνιά βρέθηκαν επιθηλιακή νέκρωση. Η διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων περιελάμβανε κυρίως μονοκύτταρα και ηωσινόφιλα, αλλά και ουδετερόφιλα και μακροφάγα, και βρέθηκε τόσο στο lamina propria όσο και στον υποβλεννογόνιο χιτώνα. Διαφορετικοί βαθμοί οιδήματος, υπεραιμία και αιμορραγία παρατηρήθηκαν σε όλες τις τομές ιστού που εξετάστηκαν, και σε αμνούς που υποβλήθηκαν σε θεραπεία και σε αμνούς ελέγχου. Αποστήματα κρυπτών (Εικ. 3β) βρέθηκαν σε διαφορετικό βαθμό σε όλα τα αρνιά και περιείχαν φλεγμονώδη κύτταρα, υπολείμματα και διαφορετικά στάδια του Eimeria spp. Από όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη αναφορά πειραματικά επιβεβαιωμένης αντοχής στην τολτραζουρίλη σε απομόνωση αγρού προβάτου Eimeria spp. Τα αποτελέσματα υποστηρίζουν επίσης τη χρήση του FOCRT ως εργαλείου για την αξιολόγηση του ΜΕΑ στο πεδίο. Αν και δέκα από τα 20 αρνιά που μολύνθηκαν πειραματικά με Eimeria υποβλήθηκαν σε μεταφυλακτική αγωγή με τη συνιστώμενη δόση των 20 mg/kg τολτραζουρίλης (Baycox® Sheep vet., Bayer Animal Health), αυτή η θεραπεία δεν οδήγησε σε σημαντική μείωση της απέκκρισης ωοκύστης στους υπό θεραπεία ζώα, σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Επιπρόσθετα, δεν σημειώθηκαν σημαντικές διαφορές στην κλινική εικόνα, τη χονδρική παθολογία και τα ιστοπαθολογικά ευρήματα. Τα δεδομένα ειδογένεσης έδειξαν ότι τόσο τα παθογόνα όσο και τα μη παθογόνα είδη της Eimeria σε αυτό το στέλεχος ήταν ανθεκτικά στην τολτραζουρίλη. Τα αρνιά απέκκρισαν μεγάλους αριθμούς ωοκύστεων, όπως έχει καταγραφεί προηγουμένως σε πειραματικές λοιμώξεις με πολλαπλά Eimeria spp. [35] . Αν και η απέκκριση ωοκύστης μειώθηκε περίπου από την 20ή ημέρα μετά τη μόλυνση, η συνολική διάρκεια της απέκκρισης δεν ήταν δυνατό να προσδιοριστεί, καθώς τα αρνιά υποβλήθηκαν σε ευθανασία. Το μοτίβο απέκκρισης που σημειώνεται εδώ, με εκθετική αύξηση, φάση οροπεδίου και πτώση, έχει προηγουμένως σημειωθεί σε πειραματικές λοιμώξεις [35] [36] [37] . Ωστόσο, λόγω της συνεχούς επαναμόλυνσης υπό συνθήκες φυσικού πεδίου, η διάρκεια της απέκκρισης ωοκύστης μπορεί να είναι μεγαλύτερη [38, 39] από ό,τι παρατηρήθηκε στην παρούσα μελέτη. Αυτό μπορεί επίσης να εξηγήσει γιατί η υπολογισμένη κλίση που παρατηρήθηκε για όλα τα είδη σε αυτήν την πειραματική μελέτη είναι υψηλότερη από τις κλίσεις που αναφέρθηκαν από την προηγούμενη δοκιμή πεδίου [6] . Η αντοχή σε πολλά είδη, όπως παρατηρείται εδώ, έχει επίσης σημειωθεί σε απομονώσεις αγρού πτηνών Eimeria spp. [3, 40]. Σημειώσεις: Οι εκτιμήσεις βασίστηκαν σε αριθμούς ωοκύστεων μετά τη θεραπεία για πέντε χρονικά διαστήματα μεταξύ του δείγματος 1 (ημέρα 7 μετά τη μόλυνση) και του δείγματος 2, και υπολογίστηκαν σύμφωνα με το FOCRT [6] . Μια κλίση ≥ 0,5 και < 0,75 αξιολογήθηκε με προσοχή, ενώ μια κλίση < 0,5 ερμηνεύτηκε ως μη έγκυρη. E. c/w, E. crandallis/weybridgensis; Μη παθογόνο, όλα τα είδη εκτός από τα E. ovinoidalis και E. crandallis/weybridgensis Ιδιαίτερη σημασία σε αυτή τη μελέτη είναι ότι το E. ovinoidalis ήταν το κυρίαρχο είδος που απεκκρίθηκε από μολυσμένα αρνιά. Καθώς αυτό το είδος είναι ένα από τα πιο παθογόνα Eimeria spp. στα πρόβατα [41, 42], η αντοχή στο πιο συχνά χρησιμοποιούμενο αντικοκκιδιακό φάρμακο υποδεικνύει ότι μπορεί να αναμένεται να εμφανιστεί σοβαρή κλινική κοκκιδίωση σε ανθεκτικά κοπάδια. Αν και το E. ovinoidalis ήταν το κυρίαρχο είδος που απεκκρίθηκε, το πιο διαδεδομένο είδος στο αρχικό εμβόλιο απομονωμένου αγρού ήταν το E. parva. Αυτό θα μπορούσε να αντανακλά ομοιότητες μεταξύ του E. ovinoidalis και του E. ninakholyakimovae στις κατσίκες, η τελευταία εκ των οποίων αναπτύσσει μακροσχιζόντες στα ενδοθηλιακά κύτταρα, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση χιλιάδων μεροζωιτών [42, 43]. Έτσι, η έκταση του ενδοκυτταρικού πολλαπλασιασμού/αντιγραφής, η οποία πιθανώς σχετίζεται επίσης με την έκταση της παθογένειας που σχετίζεται με αυτό το είδος, είναι υψηλότερη για το E. ovinoidalis από ό,τι για τα άλλα είδη Eimeria. Για το E. crandallis/weybridgensis, οι υπολογισμοί FOCRT έδειξαν άκυρους αποτελέσματα από τρία από τα πέντε χρονικά σημεία δειγματοληψίας, πιθανώς λόγω των δοκιμών που έγιναν πολύ νωρίς στη μόλυνση. Η απέκκριση του E. crandallis/weybridgensis αυξήθηκε κυρίως από την ημέρα 16 και μετά, και η ευθανασία πραγματοποιήθηκε στις ημέρες 17-24. Έτσι, οι μεγαλύτερες περίοδοι πριν από το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας για αυτά τα είδη σε σύγκριση με το E. ovinoidalis [44] πιθανώς εξηγούν αυτά τα αποτελέσματα. Αυτό είναι ένα σημαντικό εύρημα, καθώς ο αριθμός των μη έγκυρων εκμεταλλεύσεων που δοκιμάστηκαν στο FOCRT [6] μπορεί να ήταν μικρότερος εάν το δείγμα 2 είχε συλλεχθεί 10-11 ημέρες μετά το δείγμα 1. Αυτά τα ευρήματα υπογραμμίζουν επίσης το γεγονός ότι αν και το Eimeria spp. θεωρούνται συχνά ως μια σχετικά ομοιόμορφη ομάδα, στην πραγματικότητα είναι ξεχωριστά είδη με δυνητικά σημαντικές διαφορές στη βιολογία και το παθογόνο δυναμικό. Δύο από τα αρνιά υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τριμεθοπρίμη/σούλφα κατά τις πρώτες ημέρες της ζωής τους, σκευάσματα που έχουν αποδειχθεί αποτελεσματικά στη θεραπεία της κοκκιδίωσης των προβάτων [45, 46]. Ωστόσο, οι περίοδοι αναμονής για συγκρίσιμα φάρμακα που έχουν λάβει άδεια στα βοοειδή είναι 10-15 ημέρες για το κρέας [47] , και αυτά τα αρνιά υποβλήθηκαν σε θεραπεία > 17 ημέρες πριν από την πειραματική μόλυνση. Επιπλέον, αυτά τα αρνιά που υποβλήθηκαν σε θεραπεία ήταν στην ομάδα ελέγχου και επομένως αυτή η θεραπεία δεν θα έπρεπε να είχε επηρεάσει τα αποτελέσματα της μελέτης. Παρόμοια κλινικά σημεία όπως παρατηρήθηκαν εδώ μπορεί να προκληθούν από Cryptosporidium spp., κοροναϊό, ροταϊό και Salmonella spp., αλλά κανένα από αυτά τα παθογόνα δεν ανιχνεύθηκε. Επιπλέον, τα ευρήματα των κολοβακτηριδίων και του Enterococcus spp. μπορεί να θεωρηθεί ως φυσιολογική εντερική χλωρίδα αρνιών [48] . Επομένως, τα παρατηρούμενα κλινικά σημεία προκλήθηκαν σχεδόν σίγουρα από το Eimeria spp., ιδιαίτερα τα δύο κύρια παθογόνα είδη, το E. ovinoidalis και το E. crandallis [35, 36]. Πυκνωμένος βλεννογόνος ειλεού παρατηρείται συχνά σε αρνιά μολυσμένα με E. ovinoidalis [49] . Επιπλέον, οι ιστολογικές αλλαγές, όπως αμβλύνσεις λαχνών και νέκρωση επιφάνειας, καθώς και η παρουσία κοκκιδίων, υπεραιμία, οιδήματος, διήθησης φλεγμονωδών κυττάρων και αποστημάτων κρύπτης, είναι επίσης σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές [42, 50, 51] . Για να βελτιώσουμε τη μελέτη μας, μια επιπλέον ομάδα μη μολυσμένων αρνιών μπορεί να ήταν επωφελής, καθώς αυτό θα επέτρεπε καλύτερες συγκρίσεις μεταξύ της αύξησης βάρους και των ιστοπαθολογικών αλλαγών. Ωστόσο, αυτό δεν ήταν εφικτό τη στιγμή της μελέτης. Επιπλέον, λόγω της έλλειψης καθορισμένων τιμών αποκοπής για το ΜΕΑ, θα μπορούσε να ήταν πλεονεκτικό να συμπεριληφθεί απομόνωση ωοκύστης από μη ύποπτη φάρμα (δηλ. ένα ευαίσθητο στέλεχος) [25] . Αυτό θα επέτρεπε συγκρίσεις διαφορετικών παραμέτρων, όπως η απέκκριση ωοκύστης, μεταξύ αμνών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία και μάρτυρες που έχουν μολυνθεί με ευαίσθητα ή ανθεκτικά Eimeria spp. Ωστόσο, λόγω έλλειψης εργαλείων για την επιλογή τέτοιων ευαίσθητων απομονώσεων προβάτων Eimeria, επιλέξαμε να περιορίσουμε το CET μας σε αμνούς που έχουν υποστεί αγωγή και ελέγχουν μολυσμένα με το προϊόν απομόνωσης \"NMBU ID 35\" ως πρώτο βήμα στον χαρακτηρισμό της αντικοκκιδιακής αντοχής σε προβατοειδή Eimeria spp .Αν και οι αρχικές τιμές αποτελεσματικότητας δεν έχουν παρασχεθεί για την τολτραζουρίλη από τον κατασκευαστή, αρκετές μελέτες έχουν διερευνήσει την επίδρασή της στην απέκκριση ωοκύστης. Για παράδειγμα, η αποτελεσματικότητά του βρέθηκε να είναι 96,9-99,9% στην περίοδο από 7 έως 98 ημέρες μετά την πρώτη θεραπεία, σε μια μελέτη στην οποία τα αρνιά υποβλήθηκαν σε θεραπεία κάθε 14 ημέρες [52] . Άλλες μελέτες έχουν δείξει αποτελεσματικότητες τολτραζουρίλης [είτε παρέχονται στη δημοσίευση είτε υπολογίζονται ως 1-(μέση ομάδα που έλαβε θεραπεία με OPG)/(μέση ομάδα ελέγχου OPG) από τα δεδομένα στη δημοσίευση] που κυμαίνονται από 90,0 έως 100,0% στην περίοδο από δύο έως τρεις εβδομάδες μετά τη θεραπεία [13, 18, 19, [53] [54] [55] [56] . Αυτές οι αποτελεσματικότητες είναι πολύ υψηλότερες από αυτές που υπολογίστηκαν στην παρούσα μελέτη, και ως εκ τούτου τα συγκριτικά δεδομένα παρέχουν μια περαιτέρω σαφή ένδειξη αντοχής στην απομόνωση \"NMBU ID 35\". Το Toltrazuril κυκλοφορεί στην αγορά για αντικοκκιδιακή θεραπεία σε πρόβατα από τη δεκαετία του 1980 και η χρήση του έχει αυξηθεί τα τελευταία χρόνια, τόσο στη Νορβηγία [57] όσο και στο Ηνωμένο Βασίλειο (Dr Gillian Diesel, προσωπική επικοινωνία). Η εκτεταμένη χρήση ενός φαρμάκου με την πάροδο του χρόνου μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη αποτελεσματικότητα, πιθανώς λόγω των απλοειδών σταδίων της Eimeria, τα οποία επιλέγουν αμέσως την αντίσταση [1, 5] . Δεδομένου ότι η τολτραζουρίλη είναι το μόνο καταγεγραμμένο αντικοκκιδιακό για τα πρόβατα σε πολλές χώρες, η ανάπτυξη ανθεκτικότητας στα προβατοειδή είδη Eimeria μπορεί να οδηγήσει στο να υπάρχουν λίγες διαθέσιμες θεραπευτικές επιλογές για τους εκτροφείς προβάτων, ειδικά στη βόρεια Ευρώπη [22] [23] [24] . Το Diclazuril είναι ένα αντικοκκιδιακό που έχει εγγραφεί για τη θεραπεία προβάτων σε πολλές χώρες, αλλά καθώς μπορεί να μοιράζεται έναν κοινό τρόπο δράσης με αυτόν της τολτραζουρίλης [58] , η διασταυρούμενη αντοχή μεταξύ αυτών των δύο παραγώγων τριαζίνης σε προβατοειδή Eimeria spp. φαίνεται πολύ πιθανό και πρέπει να διερευνηθεί. Πράγματι, αναφέρθηκε διασταυρούμενη αντοχή μεταξύ δικλαζουρίλης και τολτραζουρίλης για απομόνωση πτηνού Eimeria spp. πριν από περισσότερα από 20 χρόνια [3] .Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι υπάρχει σαφής ανάγκη για εργαλεία για την αξιολόγηση του ΜΕΑ, έτσι ώστε να μπορούν να αποφευχθούν οι αναποτελεσματικές θεραπείες και, επομένως, η πιθανότητα μειωμένης καλής διαβίωσης και παραγωγικότητας των ζώων. Τέτοια εργαλεία είναι διαθέσιμα για τα πουλερικά, χρησιμοποιώντας διαφορετικές μετρήσεις, όπως ο δείκτης ωοκύστης, η αύξηση του σωματικού βάρους, η σχετική αύξηση βάρους, οι βαθμολογίες των βλαβών και ο αντικοκκιδιακός δείκτης [59] . Ωστόσο, τέτοιες μέθοδοι δεν έχουν ακόμη καθιερωθεί για χρήση σε μηρυκαστικά [25] , με την Εικ. 4 Διαγράμματα Box-and-Whisker με ακραία σημεία που απεικονίζουν την ιστολογική βαθμολογία. Η βαθμολογία ήταν ένα άθροισμα όλων των ιστολογικών παραμέτρων που αξιολογήθηκαν (βλέπε κείμενο) στα 20 Eimeria spp. μολυσμένα αρνιά, κόκκινο: με τολτραζουρίλη και μπλε: ελέγχει την εξαίρεση του πρόσφατα δημοσιευμένου FOCRT [6] . Αν και το FOCRT μπορεί να χρησιμεύσει ως εργαλείο για την επιτόπια αξιολόγηση του ΜΕΑ, υπάρχει σαφής απαίτηση για περαιτέρω δοκιμές της χρήσης του σε διαφορετικά περιβάλλοντα. Η επιβεβαίωση του φάσματος της αντοχής στα προβατοειδή είδη Eimeria αυξάνει την επείγουσα ανάγκη εντοπισμού εναλλακτικών θεραπειών και βελτιστοποίησης άλλων στρατηγικών ελέγχου . Οι αντικοκκιδιακές επιδράσεις διαφορετικών φυτών και φυσικών εκχυλισμάτων, όπως το σκαρίφημα (Onobrychis viciifolia), οι λοβοί χαρουπιών (Ceratonia siliqua), το εκχύλισμα φλούδας ροδιού (Punica granatum), τα εκχυλίσματα προανθοκυανιδίνης από κουκούτσι σταφυλιού και διάφορα φυσικά αντιοξειδωτικά, έχουν διερευνηθεί in vivo και σε vitro σε διαφορετικούς ξενιστές [60] [61] [62] [63] [64] . Ωστόσο, καμία από αυτές τις βιοδραστικές ουσίες δεν έχει κυκλοφορήσει ακόμη στην αγορά για την πρόληψη της κλινικής κοκκιδίωσης. Επιπλέον, υπάρχουν διαθέσιμα εμβόλια για τα πτηνά Eimeria spp. [65, 66] και επιτυχής ανοσοποίηση κατσικιών με εξασθενημένο Eimeria spp. ωοκύστεις έχουν πραγματοποιηθεί [67] .Μελλοντικές μελέτες είναι απαραίτητες για την ανάπτυξη ενός εμπορικού εμβολίου κατά του προβάτου Eimeria spp. Επομένως, οι τρέχουσες προσπάθειες θα πρέπει να επικεντρωθούν στον εντοπισμό του ΜΕΑ και στη διατήρηση της αποτελεσματικότητας της τολτραζουρίλης σε ευαίσθητα σμήνη. Οι στρατηγικές διαχείρισης που μειώνουν την ανάγκη για αντικοκκιδιακά μειώνοντας την πίεση της μόλυνσης, που πιθανώς επιτυγχάνονται με την εφαρμογή αυστηρών μέτρων υγιεινής και τη βελτιωμένη διαχείριση του κοπαδιού και των βοσκοτόπων θα πρέπει να ενθαρρύνονται ενεργά από τους κτηνιάτρους και τα κίνητρα γεωργικής πολιτικής [11] . Επιπρόσθετα, οι αγρότες θα πρέπει να ενημερώνονται για τη σημασία των σωστών τεχνικών καταβροχής, συμπεριλαμβανομένης της εκτίμησης της δόσης και της βαθμονόμησης του πιστολιού ποτίσματος, καθώς αυτές έχουν αποδειχθεί ανεπαρκείς σε αρκετές φάρμες [12] . Από όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη αναφορά της ACR κατά της τολτραζουρίλης σε προβατοειδή απομόνωση αγρού Eimeria, που περιελάμβανε το εξαιρετικά παθογόνο είδος, E. ovinoidalis. Τα αποτελέσματα υποστηρίζουν επίσης τη χρήση του FOCRT για την επιτόπια αξιολόγηση του ΜΕΑ. Ωστόσο, η κατανομή και ο επιπολασμός της ACR είναι άγνωστη και απαιτούνται περαιτέρω μελέτες. Στο μέλλον, οι δυσκολίες στη διαχείριση της κοκκιδίωσης χωρίς χημειοθεραπεία, λόγω των λίγων διαθέσιμων θεραπευτικών επιλογών, ενδέχεται να επηρεάσουν σοβαρά τόσο την καλή διαβίωση των ζώων όσο και την οικονομία της προβατοβιομηχανίας. Πρόσθετο αρχείο 1: Πίνακας S1 . Πληροφορίες για τα 20 αρνιά που μολύνθηκαν με Eimeria spp. την ημέρα 0. (PDF 22 kb) Πρόσθετο αρχείο 2: Πίνακας S2 . Τα ιστοπαθολογικά ευρήματα από αρνιά που έλαβαν τολτραζουρίλη και μάρτυρες υποβλήθηκαν σε ευθανασία 17-24 ημέρες μετά τη μόλυνση με 100.000 ωοκύστεις Eimeria. (PDF 118 kb) Συντομογραφίες ACE: anticoccidial efficacy; ACR: αντικοκκιδιακή αντίσταση. CET: δοκιμή ελεγχόμενης αποτελεσματικότητας. FOCRT: δοκιμή μείωσης του αριθμού των ωοκύστεων κοπράνων. hct: αιματοκρίτης; OPG: ωοκύστεις ανά γραμμάριο", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 4959, "text": "αντικοκκιδιακό" } ], "id": 595, "question": "Τι χρησιμοποιείται για τη θεραπεία το toltrazuril;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Πολυτροπική απεικόνιση σε ένα ασυνήθιστο σύμπλεγμα συνδρόμου πολλαπλών παροδικών λευκών κουκκίδωνhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5444036/SHA: ee3cc22161595e877450737882a517950f; Priel, Ethan; Rosenblatt, Irit; Shulman, Shiri; Kramer, MichalΗμερομηνία: 2017-05-11DOI: 10.1155/2017/7535320Άδεια χρήσης: cc-byAbstract: ΣΚΟΠΟΣ: Να περιγράψει ένα ασυνήθιστο σύμπλεγμα συνδρόμου πολλαπλών παροδικών λευκών κουκκίδων (MEWDS) που συναντήθηκε μέσα σε μια περίοδο 3. ΜΕΘΟΔΟΙ: Αυτή η αναδρομική μελέτη παρατήρησης αποτελείται από επτά ασθενείς που παρουσίασαν MEWDS σε μια περίοδο 3 μηνών στο κεντρικό Ισραήλ. Συλλέχθηκαν δεδομένα από τα ιατρικά αρχεία ασθενών σχετικά με κλινικά, πολυτροπική απεικόνιση και ορολογικά ευρήματα ιών. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Έξι γυναίκες και ένας άνδρας μέσης ηλικίας 31,5 ± 7,2 ετών. Τρεις ανέφεραν προηγούμενη ιογενή λοίμωξη. Όλοι είχαν μονόπλευρη μειωμένη όραση. Η βυθοσκόπηση αποκάλυψε την κοκκοποίηση του βοθρίου. ΚΥΡΙΑ ΕΥΡΗΜΑΤΑ ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗΣ: Υπερφθορίζουσες κηλίδες σε μπλε αυτοφθορισμό (BAF), υποφθορίζουσες κηλίδες στην αγγειογραφία πράσινου ινδοκυανίνης, σκούρες βλάβες σε υπέρυθρες φωτογραφίες και ανωμαλίες ελλειψοειδούς ζώνης στην τομογραφία οπτικής συνοχής φασματικής περιοχής (SD-OCT). Η ανάλυση των κηλίδων στο BAF συσχετίστηκε με την ανατομική (SD-OCT) και την οπτική αποκατάσταση. Η αγγειογραφία OCT που πραγματοποιήθηκε μετά το στάδιο της ανάρρωσης έδειξε άθικτη ροή αμφιβληστροειδούς και χοριοειδούς. Τα ορολογικά ευρήματα ήταν ασαφή. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Αναφέρουμε μια μοναδική ομάδα ασθενών με MEWDS που παρουσιάστηκε σε σύντομο χρονικό διάστημα. Τα ευρήματα SD-OCT της διαταραχής της ελλειψοειδούς ζώνης σε συνδυασμό με άλλες πολυτροπικές μεθόδους απεικόνισης περιγράφονται σχολαστικά. Η αναγνώριση αυτών των απεικονιστικών χαρακτηριστικών μαζί με τον υψηλό δείκτη κλινικής υποψίας είναι σημαντική για τη διάγνωση του MEWDS. Ο ορολογικός έλεγχος μπορεί να εξεταστεί σε μελλοντικούς ασθενείς. Κείμενο: Το σύνδρομο πολλαπλών παροδικών λευκών κουκίδων (MEWDS) περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1984 ως μια σπάνια, ξαφνική έναρξη μονόπλευρης χοριοαμφιβληστροειδοπάθειας, με κυρίαρχο σημείο να είναι οι πολυεστιακές κίτρινες-λευκές κηλίδες σε όλο τον αμφιβληστροειδή [1. 2] . Το κλινικό φάσμα του MEWDS έχει επεκταθεί με την πάροδο των ετών για να περιλαμβάνει αμφοτερόπλευρες και υποτροπές [3] ή μια άτυπη εμφάνιση που περιλαμβάνει το βοθρίο χωρίς τις λευκές κηλίδες [4] . Τα συμπτώματα περιλαμβάνουν οξεία έναρξη μειωμένης οπτικής οξύτητας μονόπλευρα συνοδευόμενη στις περισσότερες περιπτώσεις από φωτοψία και σκοτώματα. Μια πρόδρομη ασθένεια που μοιάζει με γρίπη έχει αναφερθεί σε έως και 50% των περιπτώσεων [1] . Μια αναφορά περιέγραψε έναν ασθενή με αυξημένα επίπεδα ολικής IgG ορού κατά τη διάρκεια της πορείας της νόσου και αρνητικά ευρήματα για IgM στον έρπητα ζωστήρα, τον απλό έρπητα, την παρωτίτιδα και την ιλαρά [5]. μόλυνση σε γενετικά ευαίσθητα άτομα, η ακριβής παθογένειά της παραμένει άγνωστη. Η ανάρρωση είναι σταδιακή, σε εβδομάδες έως μήνες, και η οπτική πρόγνωση είναι πολύ ευνοϊκή [2] . Συνήθως δεν απαιτείται θεραπεία. Η συχνότητα εμφάνισης MEWDS είναι άγνωστη. Μόνο μικρές σειρές περιπτώσεων αναφέρονται στη βιβλιογραφία [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] . Ένας από τους μεγαλύτερους περιγραφόμενους 34 προσβεβλημένους ασθενείς που εξετάστηκαν σε περίοδο πολλών ετών [1, 13, 14] . Ο στόχος της παρούσας έκθεσης ήταν να περιγράψει μια ασυνήθιστη ομάδα επτά περιπτώσεων MEWDS που αντιμετωπίστηκαν μέσα σε μια περίοδο 3 μηνών, με έμφαση στην κλινική παρουσίαση και ευρήματα πολυτροπικής απεικόνισης. Το σύμπλεγμα μας ώθησε να αναζητήσουμε μια κοινή μολυσματική συσχέτιση. Διεξήχθη μια αναδρομική μελέτη παρατήρησης σε επτά ασθενείς που παρουσίασαν MEWDS μεταξύ Ιουλίου και Σεπτεμβρίου 2013 σε δύο τριτοβάθμια ιατρικά κέντρα στο κεντρικό Ισραήλ. Από τους ιατρικούς φακέλους συλλέχθηκαν δεδομένα σχετικά με το ιστορικό, τις κλινικές και τις εργαστηριακές παραμέτρους. Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή αναθεώρησης δεοντολογίας του ιδρύματος. Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε ολοκληρωμένη οφθαλμική εξέταση και πολυτροπικές εξετάσεις απεικόνισης, συμπεριλαμβανομένων μπλε αυτοφθορισμού (BAF), αγγειογραφία φλουορεσκεΐνης (FA) και/ή αγγειογραφία πράσινης ινδοκυανίνης (ICGA), υπέρυθρη (IR) φωτογραφία , και τομογραφία οπτικής συνοχής φασματικής περιοχής (SD-OCT). Λήφθηκαν εικόνες με τις συσκευές HRA-2 και Spectralis HRA + OCT (Heidelberg Engineering, Heidelberg, Γερμανία) στα ακόλουθα μήκη κύματος: Διέγερση BAF 488 nm, αποκοπή φραγμού 496 nm. IR-820 nm; Διέγερση ICGA 790 nm, εκπομπή 800 nm. και πηγή φωτός με δίοδο υπερφωταύγειας SD-OCT 870 nm. Η επιλογή σάρωσης όγκου χρησιμοποιήθηκε για την λήψη των πολλαπλών σαρώσεων SD-OCT (25-49 οριζόντιες σαρώσεις σε μια περιοχή 6 mm που καλύπτει την περιοχή της παθολογίας). Η ακριβής καταγραφή μεταξύ των ευρημάτων που παρατηρήθηκαν σε IR ή BAF και SD-OCT ενεργοποιήθηκε από το σύστημα παρακολούθησης ματιών με λέιζερ διπλής δέσμης, όπου το ένα λέιζερ χρησιμοποιείται για την απεικόνιση του αμφιβληστροειδούς και το άλλο λέιζερ για την εκτέλεση των σαρώσεων OCT. Η ακριβής εκ νέου σάρωση σε περιοχές ενδιαφέροντος εξασφαλίστηκε από τη λειτουργία παρακολούθησης Spectralis, η οποία τοποθετεί αυτόματα τις επόμενες σαρώσεις στην ίδια θέση με τις προηγούμενες. Οι εικόνες αγγειογραφίας OCT αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας το RTVue XR Avanti με AngioVue (Optovue Inc., Fremont, California, ΗΠΑ), με ρυθμό σάρωσης Α 70 000 σαρώσεις ανά δευτερόλεπτο, πηγή φωτός 840 nm και εύρος ζώνης 45 nm. Αποκτήθηκαν κύβοι ωχράς κηλίδας (3 × 3 mm), κάθε κύβος αποτελούμενος από 304 ομάδες 2 επαναλαμβανόμενων σαρώσεων Β που περιείχαν 304 σαρώσεις Α η καθεμία. Η τεχνολογία αποσυσχέτισης πλάτους διαχωρισμού φάσματος χρησιμοποιήθηκε για τη βελτίωση της αναλογίας σήματος προς θόρυβο με διαχωρισμό του φάσματος για τη δημιουργία πολλαπλών επαναλαμβανόμενων καρέ OCT από 2 πρωτότυπα επαναλαμβανόμενα καρέ OCT [15] . Η διόρθωση κίνησης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την καταχώριση 2 όγκων απεικόνισης που καταγράφηκαν ορθογώνια. Πραγματοποιήθηκε αυτόματη κατάτμηση των στιβάδων του αμφιβληστροειδούς από το λογισμικό προβολής και χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία εικόνων προβολής προσώπου μετά την προσαρμογή του επιπέδου του τμηματοποιημένου στρώματος στις σαρώσεις Β. Πραγματοποιήθηκε ορολογικός έλεγχος για ιούς που ήταν συνήθως παρόντες τη στιγμή των ασθενών παρουσίαση, συγκεκριμένα, ανοσοσφαιρίνη IgG και IgM για τον ιό του απλού έρπητα (HSV) I-II, τον ιό της ανεμευλογιάς ζωστήρα (VZV), τον ιό του Δυτικού Νείλου, τον ιό coxsackie, τον ηχοϊό (υποομάδα εντεροϊού) και τον κοροναϊό. Υπήρχαν ένας άνδρας και έξι γυναίκες ασθενείς μέσης ηλικίας 31,5 ± 7,2 ετών (εύρος 22-41 ετών). Ο Πίνακας 1 συνοψίζει τα δημογραφικά δεδομένα. Τρεις ασθενείς ανέφεραν λοίμωξη από πρόδρομο ιό. Όλοι οι ασθενείς παρουσίασαν οξεία έναρξη μονόπλευρης μειωμένης όρασης. Η καλύτερα διορθωμένη οπτική οξύτητα κατά την παρουσίαση κυμαινόταν από 6/9 έως 6/30 στο προσβεβλημένο μάτι. Κανένας από τους ασθενείς δεν είχε σημάδια πρόσθιας ή υαλοειδούς φλεγμονής στο προσβεβλημένο μάτι. Τα βυθοσκοπικά ευρήματα κατά την παρουσίαση περιελάμβαναν κοκκοποίηση βοθρίου σε έξι ασθενείς. Σε τέσσερις ασθενείς (ασθενείς 1, 4, 5 και 6), ήταν το μοναδικό παθολογικό εύρημα του αμφιβληστροειδούς (Εικόνα 1). και σε τρεις ασθενείς (ασθενείς 2, 3 και 7), η κοκκοποίηση του βοθρίου συσχετίστηκε με αμυδρές λευκές βλάβες του αμφιβληστροειδούς (Εικόνα 2), που εντοπίζονται κυρίως στον μεσοπεριφερικό αμφιβληστροειδή που εκτείνεται στην περιφέρεια. Ο ασθενής 6 είχε πρησμένο δίσκο και ήπια σημάδια οπτικής νευροπάθειας (ήπιος κόκκινος αποκορεσμός, διευρυμένο τυφλό σημείο στο οπτικό πεδίο). Ο ασθενής 6 υποβλήθηκε σε νευρολογική αξιολόγηση λόγω της αρχικής εμφάνισης που μιμείται την οπτική νευρίτιδα. Η νευρολογική αξιολόγηση, συμπεριλαμβανομένης της πλήρους νευρολογικής εξέτασης και της νευροαπεικόνισης, απέκλεισε πρόσθετο νευρολογικό έλλειμμα, πριν από τη διάγνωση του MEWDS. Τα κλινικά ευρήματα συνοψίζονται στον Πίνακα 2. 3.2. Ευρήματα Πολυτροπικής Απεικόνισης. Οι ασθενείς που υποβλήθηκαν σε απεικόνιση σε λιγότερο από 2 εβδομάδες από την έναρξη των συμπτωμάτων είχαν τα πιο τυπικά ευρήματα. Το BAF αποκάλυψε υπεραυτοφθορίζουσες βλάβες στην ωχρά κηλίδα μεταξύ και κατά μήκος των στοών σε τέσσερις ασθενείς (ασθενείς 1, 3, 6 και 7). Οι φωτογραφίες IR έδειξαν σκούρες βλάβες σε παρόμοιες, αν και όχι πανομοιότυπες, θέσεις (Εικόνα 3). Οι ασθενείς 1 και 6, οι οποίοι υποβλήθηκαν σε ICGA, είχαν υποφθορίζουσες βλάβες σε αριθμούς που τυπικά υπερέβαιναν εκείνους που ανιχνεύθηκαν τόσο από κλινικές όσο και από άλλες απεικονιστικές μεθόδους. Η Β-σάρωση SD-OCT μέσω του βοθρίου έδειξε μια διαταραγμένη ζώνη ελλειψοειδούς ζώνης εσωτερικού τμήματος ποικίλης σοβαρότητας και στα 7 προσβεβλημένα μάτια. Η υπερανακλαστική ζώνη ελλειψοειδούς ζώνης στο SD-OCT ανατομικά συσχετίζεται με το εσωτερικό τμήμα των φωτοϋποδοχέων, το ελλειψοειδές τμήμα πυκνά γεμάτο με μιτοχόνδρια [16] . Η παροδική διαταραχή της ελλειψοειδούς ζώνης του βοθρίου στο SD-OCT αντιστοιχούσε στην κλινικά εμφανή κοκκοποίηση του βοθρίου. Στον ασθενή 5, ο οποίος παρουσίασε μοναδικό εύρημα αμφιβληστροειδούς κοκκοποίησης βοθρίου και ήπιας διαρροής οπτικού δίσκου στο FA, το εύρημα SD-OCT διαταραχής της ελλειψοειδούς ζώνης ήταν το κύριο σημάδι για τη διάγνωση MEWDS (Εικόνα 1). Η υπερανακλαστικότητα του οπίσθιου πόρου που βρέθηκε σε 3 ασθενείς (ασθενείς 1, 4 και 7) σημειώθηκε ότι εκτείνεται στις εσωτερικές στιβάδες του αμφιβληστροειδούς (Εικόνα 4). Οι βλάβες που εντοπίστηκαν στις εικόνες BAF, IR και ICGA αντιστοιχούσαν στις περιοχές διάρρηξης της ελλειψοειδούς ζώνης, στις σαρώσεις SD-OCT (Εικόνα 3). Το FA έδειξε μη ειδικές πρώιμες στίγματα υπερφθορισμού αλλοιώσεις, με ελαφρά χρώση κατά την πρώιμη φάση, σε τέσσερις ασθενείς (ασθενείς 2, 3, 6 και 7). Αυτές οι βλάβες δεν αντιστοιχούσαν στα ευρήματα ούτε από την κλινική ούτε από άλλες απεικονιστικές μεθόδους. Δεν παρατηρήθηκε παθολογία στην περιοχή του βοθρίου παρά την παρουσία τυπικής κοκκοποίησης του βοθρίου. Ήπια διαρροή οπτικού δίσκου ήταν εμφανής σε τέσσερις ασθενείς (ασθενείς 1, 4, 5 και 6). Κατά τη διάρκεια της νόσου, οι υπεραυτοφθορίζουσες περιοχές μειώθηκαν σε αριθμό και ξεθώριασαν χωρίς να αφήσουν υποαυτοφθορίζουσες ανωμαλίες. Η επίλυση των βλαβών BAF αντιστοιχούσε στην ανατομική ανάκαμψη που παρατηρήθηκε στο SD-OCT. Η υπερανακλαστικότητα του βοθρίου εξαφανίστηκε επίσης (Εικόνα 5). Εικόνα 6. Τέσσερις ασθενείς (ασθενείς 1, 4, 6 και 7) υποβλήθηκαν σε ορολογικό έλεγχο με αρνητικά αποτελέσματα εκτός από ένα κοινό αποτέλεσμα αυξημένου τίτλου IgG σε VZV. Μετά από 6 μήνες παρακολούθησης, η καλύτερη διορθωμένη οπτική οξύτητα κυμαινόταν από 6/6 έως 6/6.6 (Πίνακας 2). Αν και το MEDWS θεωρείται παραδοσιακά ως ένα σπάνιο σύνδρομο [2], αναφέρουμε μια ασυνήθιστη ομάδα επτά ασθενών που παρουσιάστηκαν μέσα σε μια περίοδο τριών μηνών. Όλοι οι ασθενείς ήταν κατά τα άλλα υγιείς και όλοι παρουσίαζαν μειωμένη όραση στο ένα μάτι. Αυτή η ομάδα περιπτώσεων θα μπορούσε να σπάσει σε κάποιο βαθμό τη στατιστική απιθανότητα της σπανιότητας της νόσου. Η άτυπη παρουσίαση στους περισσότερους από τους ασθενείς μας θα μπορούσε να υποδηλώνει ότι το MEWDS είναι υποδιαγνωσμένο. Ωστόσο, μπορεί να είναι σύμφωνο με την εικασία ότι μερικές φορές τα άτυπα ευρήματα μπορεί απλώς να αντικατοπτρίζουν τη χρονική στιγμή κατά την οποία εξετάστηκαν οι ασθενείς και δεν αποτελούν αληθινή άτυπη παρουσίαση [4] . Στην αρχική του περιγραφή από τους Jampol et al. [2] , οι περιπτώσεις MEWDS ήταν μονόπλευρες με παρουσίαση βυθού συμπεριλαμβανομένων πολυάριθμων λευκών κουκκίδων διάσπαρτες στον οπίσθιο πόλο και πέρα ​​από τις στοές. Κατά την πορεία της νόσου, η κοκκώδης εμφάνιση της ωχράς κηλίδας αναπτύσσεται στις περισσότερες περιπτώσεις και, όταν φαίνεται, καθορίζει τη διάγνωση. Ο αριθμός των λευκών κηλίδων είναι πολύ μεταβλητός, και στην πραγματικότητα, μπορεί να απουσιάζουν. Δεδομένου ότι οι χαρακτηριστικές λευκές κουκκίδες δεν υπήρχαν σε τέσσερις ασθενείς (ασθενείς 1, 4, 5 και 6), καθοδηγηθήκαμε από άλλα χαρακτηριστικά του βυθού, ιδιαίτερα την κοκκοποίηση του βοθρίου, τα συμπτώματα, την πολυτροπική απεικόνιση και την κλινική πορεία. Ενώ η εικαζόμενη παθογένεση του MEWDS περιλαμβάνει μια ιογενή λοίμωξη, μόνο λίγες αναφορές μέχρι σήμερα έχουν περιγράψει μια έρευνα για το παθογόνο [5, [17] [18] [19] . Η παρούσα συστάδα περιπτώσεων μας έδωσε μια μοναδική ευκαιρία να αναζητήσουμε έναν κοινό παρονομαστή του ιού. Ο ορολογικός έλεγχος απέδωσε μόνο έναν αυξημένο τίτλο IgG σε VZV, πιο συχνά ενδεικτικό προηγούμενης μόλυνσης ή εμβολιασμού με VZV. Επομένως, δεν μπορούσαμε να κάνουμε καμία γενίκευση σχετικά με αυτά τα ευρήματα. Η πολυτροπική απεικόνιση (BAF, SD-OCT, IR, FA και ICGA) έχει αποδειχθεί ότι έχει υψηλή αξία στην προκλητική διάγνωση του MEWDS. Τα περισσότερα από τα ευρήματα που σημειώνονται εδώ έχουν περιγραφεί χωριστά σε προηγούμενες αναφορές [7-9, 11, 12]. Ωστόσο, η παρούσα μελέτη προσέφερε δύο σημαντικά πλεονεκτήματα. Μπορέσαμε να εξετάσουμε όλους τους ασθενείς με ταυτόχρονη επίκτητη απεικόνιση και ήταν δυνατές πολλαπλές συσχετίσεις μεταξύ των απεικονιστικών ευρημάτων και της κλινικής αξιολόγησης. Επιπλέον, το σχετικά μεγάλο μέγεθος της κοόρτης και οι επαναλαμβανόμενες σαρώσεις μας επέτρεψαν να επαληθεύσουμε τα απεικονιστικά ευρήματα σε αυτή τη σπάνια ασθένεια. Παρατηρήσαμε αντίστοιχες θέσεις των σκοτεινών κηλίδων στις εικόνες IR, τις υπεραυτοφθορισμού κηλίδες στις εικόνες BAF και τις εστίες του εξωτερικού παθολογία αμφιβληστροειδούς σε εικόνες SD-OCT. Μικρά υπερανακλαστικά σημεία, που βρίσκονται στο στρώμα των γαγγλιακών κυττάρων, στην ελλειψοειδή ζώνη και στη χοριοτριχοειδή, έχουν σημειωθεί και περιγραφεί στο \"en face\" EDI SD-OCT [20] . Ωστόσο, σημειώσαμε ένα μοναδικό εύρημα της υπερανακλαστικότητας του βοθρίου που εκτείνεται στα εσωτερικά στρώματα του αμφιβληστροειδούς. Το εύρημα μας ενισχύει ένα πρόσφατα περιγραφόμενο εύρημα στη βιβλιογραφία [14] που πιστεύεται ότι είναι παθογνωμονικό για το MEWDS. Κατά τη διάρκεια της πορείας της νόσου, τόσο τα ευρήματα IR όσο και τα ευρήματα BAF εξασθενούσαν ταυτόχρονα με την ανατομική επίλυση της διαταραχής στην ελλειψοειδή ζώνη και την υπερανακλαστική βλάβη του βοθρίου στο SD-OCT. Έτσι, οι εικόνες IR μπορεί να παρέχουν μια εύκολη, ευρέως διαθέσιμη μέθοδο απεικόνισης για την παρακολούθηση ασθενών με MEWDS. Παρόλο που περιγράφηκαν πρόσφατα αλλαγές αυτοφθορισμού υπερύθρου σε ασθενείς με MEWDS [21, 22], αυτή η μέθοδος δεν είναι ευρέως διαθέσιμη, ενώ η απεικόνιση IR εκτελείται τακτικά. Επιπλέον, με βάση τα ευρήματά μας με την πολυτροπική απεικόνιση, προτείνουμε ότι η διάγνωση του MEWDS μπορεί να εδραιωθεί με την ταυτόχρονη χρήση τέτοιων μη επεμβατικών τεχνικών όπως το BAF, το IR και το SD-OCT. Το ICGA και το FA ενδέχεται να δεσμεύονται για δευτερεύουσα χρήση, όταν τα ευρήματα είναι διφορούμενα. Το OCTA είναι σχετικά νέα μη επεμβατική μέθοδος απεικόνισης που δείχνει χαρακτηριστικά ροής του αγγειακού δικτύου εντός της περιφερειακής κυκλοφορίας για την κατασκευή μη επεμβατικών εικόνων του αγγειακού δικτύου. Οι εικόνες προσώπου που δημιουργούνται από το OCTA μας επιτρέπουν επίσης να μελετήσουμε τις χωρικές σχέσεις μεταξύ αγγείωσης και γειτονικών στρωμάτων αμφιβληστροειδούς/χοριοειδούς με μεγαλύτερη ακρίβεια από την αγγειογραφία βαφής και τα ευρήματα OCTA δεν έδειξαν διαταραχή της ροής στην αγγείωση του αμφιβληστροειδούς και του χοριοειδούς των ασθενών που σαρώθηκαν μετά το στάδιο της ανάρρωσης. Δεν μπορούμε να υπερεκτιμήσουμε το ρόλο της πολυτροπικής απεικόνισης σε αυτούς τους ασθενείς, καθώς όχι πολύ συχνά, η διάγνωση λανθασμένα γίνεται με οπτική νευρίτιδα και τα κλινικά ευρήματα είναι πολύ λεπτά. Οι περιορισμοί της μελέτης ήταν η χρονική μεταβλητότητα από την έναρξη της νόσου έως τον ορολογικό έλεγχο. Τα αποτελέσματα IgM είναι δύσκολο να ερμηνευτούν. Ως εκ τούτου, θεωρούμε ότι αυτές οι δοκιμές είναι ασαφείς. Δεύτερον, δεν είχαν όλοι οι ασθενείς απεικόνιση με όλες τις μεθόδους. Επιπλέον, απαιτείται μελλοντική έρευνα με τη χρήση αγγειογραφίας OCT για τη μελέτη της φύσης των κουκκίδων σε ασθενείς με MEWDS και τη συσχέτισή της με άλλες πολυτροπικές απεικονιστικές μεθόδους στο οξύ και στο στάδιο της ανάρρωσης. Συμπερασματικά, παρουσιάζουμε μια μεγάλη μοναδική ομάδα ασθενών που παρουσίασαν MEWDS σε μια σύντομη περίοδο Εικόνα 6: Εικόνες OCTA μετά το στάδιο της ανάρρωσης του δεξιού οφθαλμού του ασθενή 7 (a-b) και του αριστερού οφθαλμού του 6 (c-d). Οι πράσινες και κόκκινες γραμμές αντιπροσωπεύουν τους άξονες x και y. Ασθενής 7 μετά από επαναλαμβανόμενα επεισόδια. Αγγειογραφία 3 × 3 mm OCT της χοριοτριχοειδής (a1), της επιφανειακής στιβάδας (a2) και της βαθιάς στιβάδας (a3) ​​με κέντρο την ωχρά κηλίδα χωρίς κανένα συμβιβασμό της ροής. Αντίστοιχη δομική σάρωση OCT άξονα Χ (b1) που λήφθηκε ταυτόχρονα κατά την ίδια σάρωση με το αγγειογράφημα OCT με επικάλυψη ροής στη διατομή που φαίνεται από την πράσινη γραμμή στο (a1). SD-OCT (b2) που δείχνει φυσιολογική ανατομία του έξω αμφιβληστροειδούς 6 μήνες μετά το πρώτο οξύ επεισόδιο. Ασθενής 6, αγγειογραφία OCT 3× 3 mm της χοριοτριχοειδής (c1), της επιφανειακής στιβάδας (c2) και της εν τω βάθει στιβάδας (c3) με κέντρο την ωχρά κηλίδα χωρίς κανένα συμβιβασμό της ροής. 3 × 3 mm στο πρόσωπο δομική OCT (d1) της χοριοτριχοειδούς με κέντρο την ωχρά κηλίδα όπως στο c1. Αυτή η εικόνα λήφθηκε ταυτόχρονα κατά την ίδια σάρωση με το αγγειόγραμμα OCT στο (c). Εν όψει δομική OCT του εν τω βάθει (d2) και του εξωτερικού αμφιβληστροειδούς (d3). χρονικός. Από όσο γνωρίζουμε, ένα τέτοιο σύμπλεγμα δεν είχε αναφερθεί προηγουμένως στη βιβλιογραφία ούτε συναντήθηκε από εμάς σε διαφορετικές εποχές. Η διάγνωση υποστηρίχθηκε από την παρουσία βασικών χαρακτηριστικών κοκκοποίησης βοθρίου και διάρρηξης της ελλειψοειδούς ζώνης στην OCT και τη συσχέτισή τους με τις υπεραυτοφθορίζουσες βλάβες που εντοπίστηκαν στο BAF. Θα πρέπει επίσης να δοθεί προσοχή στα σκοτεινά σημεία που εμφανίζονται στις εικόνες IR, τα οποία μπορεί να χρησιμεύσουν ως πρόσθετη διαγνωστική ένδειξη που παρέχεται από μια μη επεμβατική μέθοδο απεικόνισης. Η πορεία της νόσου στους ασθενείς μας ήταν χαρακτηριστική για MEWDS, με σχεδόν πλήρη αποκατάσταση της οπτικής οξύτητας. Η συγκεκριμένη παθογένεση του MEWDS είναι άγνωστη αλλά πιστεύεται ότι είναι μια φλεγμονώδης κατάσταση μετά από ιογενή λοίμωξη. Προτείνουμε συνεχή ορολογικό έλεγχο σε ασθενείς που πληρούν τα κλινικά κριτήρια. Τα κλινικά σημεία του MEWDS είναι διακριτικά, έτσι ώστε η διάγνωση να βασίζεται σε υψηλό δείκτη υποψίας. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία σύγκρουση συμφερόντων να δηλώσουν.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 2031, "text": "μια σπάνια, ξαφνική έναρξη μονόπλευρης χοριοαμφιβληστροειδοπάθειας" } ], "id": 581, "question": "Τι είναι το σύνδρομο πολλαπλών παροδικών λευκών κουκίδων;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2563, "text": "ασθένεια που μοιάζει με γρίπη" } ], "id": 582, "question": "Τι προηγείται περίπου των μισών από τα αναφερόμενα κρούσματα MEWDS;" }, { "answers": [ { "answer_start": 0, "text": "Πολυτροπική απεικόνιση" } ], "id": 584, "question": "Ποιος τύπος κλινικής εξέτασης μπορεί να διαφοροποιήσει το σύνδρομο πολλαπλής παροδικής λευκής κουκκίδας (MEWDS) από την οπτική νευρίτιδα;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Αιτιολογία λοιμώξεων της αναπνευστικής οδού στην κοινότητα και την κλινική στο Ilorin, Νιγηρίαhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5719735/SHA: f2e835d2cde5f42054dbd0c20d406050721; Oguntoye, Michael; Νταμ, Τίνα; Chunara, RumiDate: 2017-12-07DOI: 10.1186/s13104-017-3063-1License: cc-byAbstract: ΣΚΟΠΟΣ: Αναγνωρίζοντας το αυξανόμενο ενδιαφέρον για την κοινοτική επιτήρηση ασθενειών παγκοσμίως, ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να διερευνήσει εάν η αναπνευστική κοινότητα των ιών μπορεί να αντιπροσωπεύεται μέσω της κλινικής (νοσοκομειακής) επιτήρησης στη Νιγηρία. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Τα παιδιά επιλέχθηκαν μέσω δειγματοληψίας ευκολίας από κοινότητες και κέντρο τριτοβάθμιας φροντίδας (n = 91) την άνοιξη του 2017 στο Ilorin της Νιγηρίας. Συλλέχθηκαν ρινικά επιχρίσματα και δοκιμάστηκαν χρησιμοποιώντας αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Η πλειοψηφία (79,1%) των ατόμων ήταν κάτω των 6 ετών, εκ των οποίων τα 46 ήταν μολυσμένα (63,9%). Συνολικά 33 από τα 91 άτομα είχαν έναν ή περισσότερους ιούς της αναπνευστικής οδού. υπήρξαν 10 περιπτώσεις τριπλής μόλυνσης και 5 τετραπλής. Ο ιός παραγρίππης 4, ο αναπνευστικός συγκυτιακός ιός Β και ο εντεροϊός ήταν οι πιο συνηθισμένοι ιοί στο κλινικό δείγμα. υπάρχει στο 93,8% (15/16) των κλινικών ατόμων και στο 6,7% (5/75) των ατόμων της κοινότητας (σημαντική διαφορά, p < 0,001). Ο κορωνοϊός OC43 ήταν ο πιο κοινός ιός που ανιχνεύθηκε στα μέλη της κοινότητας (13,3%, 10/75). Ένα διαφορετικό στέλεχος, ο Coronavirus OC 229 E/NL63 ανιχνεύτηκε μεταξύ των ατόμων από την κλινική (2/16) και δεν εντοπίστηκε στην κοινότητα. Αυτή η πιλοτική μελέτη παρέχει ενδείξεις ότι τα δεδομένα από την κοινότητα μπορούν δυνητικά να αντιπροσωπεύουν διαφορετικές πληροφορίες από αυτές που προέρχονται από κλινικά, υποδηλώνοντας την ανάγκη κοινοτικής επιτήρησης για την ενίσχυση των προσπαθειών δημόσιας υγείας και την επιστημονική κατανόηση των αναπνευστικών λοιμώξεων. Κείμενο: Οξείες αναπνευστικές λοιμώξεις (ARIs) (η αιτία Τόσο οι λοιμώξεις του ανώτερου αναπνευστικού συστήματος (URIs) όσο και οι λοιμώξεις του κατώτερου αναπνευστικού συστήματος (LRIs)) αποτελούν κύρια αιτία θανάτου στα παιδιά κάτω των 5 ετών, ιδιαίτερα στις αναπτυσσόμενες χώρες όπου το βάρος της νόσου είναι 2-5 φορές υψηλότερο από ό,τι στις ανεπτυγμένες χώρες [1. ] . Ενώ αυτοί οι ιοί συνήθως προκαλούν ήπια συμπτώματα που μοιάζουν με κρυολόγημα και μπορεί να είναι αυτοπεριοριζόμενα, τα τελευταία χρόνια νέοι κοροναϊοί όπως το σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο (SARS) και το αναπνευστικό σύνδρομο της Μέσης Ανατολής (MERS) έχουν εξελιχθεί και έχουν μολύνει ανθρώπους, προκαλώντας σοβαρές ασθένειες, επιδημίες και πανδημίες [2] . Επί του παρόντος, η πλειονότητα όλων των κρουσμάτων μολυσματικών ασθενειών όπως καταγράφονται από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (ΠΟΥ) συμβαίνουν στην ήπειρο της Αφρικής όπου υπάρχει υψηλός κίνδυνος μετάδοσης [3, 4] . Περαιτέρω, στις αναπτυσσόμενες περιοχές (τόσο σε αγροτικές όσο και σε αστικές περιοχές), υπάρχουν αυξανόμενοι παράγοντες κινδύνου, όπως οι διεπαφές ανθρώπου-ζώου (λόγω της γειτνίασης με τα ζώα). Αυτά τα μεταβαλλόμενα επιδημιολογικά μοτίβα έχουν οδηγήσει σε εκκλήσεις για βελτιωμένη επιτήρηση ARI, ειδικά σε μέρη υψηλού κινδύνου μετάδοσης [5] . Η Νιγηρία είναι ένα τέτοιο μέρος με υψηλή επικράτηση πολλών από τους παράγοντες κινδύνου που εμπλέκονται στην ARI μεταξύ των παιδιών. ηλικία, φύλο, υπερπληθυσμός, διατροφική κατάσταση, κοινωνικοοικονομική κατάσταση και όπου η μελέτη των ARI είναι επί του παρόντος περιορισμένη [6] . Αυτοί οι γενικοί παράγοντες κινδύνου μαζί με τους περιορισμένους πόρους έχουν δείξει την ανάγκη για πρωτοβουλίες με βάση την κοινότητα για επιτήρηση και παρεμβάσεις [6, 7] . Ειδικά για την επιτήρηση ARI, οι λοιμώξεις στην κοινότητα είναι αυτές που δεν αναφέρονται κλινικά. Τα κλινικά δεδομένα αντιπροσωπεύουν γενικά τις πιο σοβαρές περιπτώσεις και εκείνες από τοποθεσίες με πρόσβαση σε ιδρύματα υγειονομικής περίθαλψης. Στη Νιγηρία, τα νοσοκομεία επισκέπτονται μόνο όταν τα συμπτώματα είναι πολύ σοβαρά. Έτσι, υποτίθεται ότι οι ιογενείς πληροφορίες από την κλινική δειγματοληψία είναι ανεπαρκείς είτε για την καταγραφή της επίπτωσης της νόσου σε γενικούς πληθυσμούς είτε για την προβλεψιμότητά της από τα συμπτώματα [8] . Οι προσπάθειες παγκοσμίως, συμπεριλαμβανομένης της Ανατολικής και Νότιας Αφρικής, έχουν επικεντρωθεί στην ανάπτυξη μεθόδων συμμετοχικής επιτήρησης ασθενειών με βάση την κοινότητα [9] [10] [11] [12] [13] . Οι προσεγγίσεις που βασίζονται στην κοινότητα έχουν αποδειχθεί χρήσιμες για την εκμάθηση περισσότερων αναδυόμενων αναπνευστικών λοιμώξεων, όπως η αξιολόγηση της ελλιπούς αναφοράς [14], των τύπων ιών που επικρατούν στις κοινότητες [10] και της πρόβλεψης επιδημιών [15]. Ταυτόχρονα, οι εξελίξεις στις μεθόδους μοριακής ταυτοποίησης έχουν επιτρέψει μελέτες σχετικά με την εμφάνιση και την επιδημιολογία των ιών ARI σε πολλές τοποθεσίες (π. νέοι πολυομαϊκοί ιοί στην Αυστραλία [16, 17] , ανθρώπινος κορονοϊός Erasmus Medical Center (HCoV-EMC) στη Μέση Ανατολή και στο Ηνωμένο Βασίλειο [18, 19] , SARS στον Καναδά και την Κίνα [20] [21] [22] ), ακόμη Η έρευνα σχετικά με τη μοριακή επιδημιολογία των ιών ARI στη Νιγηρία είναι περιορισμένη. Οι διαθέσιμες διαγνωστικές μέθοδοι και άλλοι περιορισμοί έχουν περιορισμένες μελέτες εκεί σε ορολογικές έρευνες μόνο μερικών από αυτούς τους ιούς και μόνο σε κλινικούς πληθυσμούς [23, 24]. Έτσι, η χρησιμότητα της επίβλεψης με βάση την κοινότητα μπορεί να είναι κατάλληλη σε περιβάλλοντα όπως στη Νιγηρία, και ο σκοπός αυτής της πιλοτικής μελέτης ήταν να διερευνήσει εάν οι κλινικές περιπτώσεις μπορούν να περιγράψουν ολόκληρη την εικόνα του ARI μεταξύ των παιδιών στη Νιγηρία. Πραγματοποιήσαμε μια συγχρονική μελέτησε τρία κοινοτικά κέντρα και ένα κλινικό στο Ilorin της Νιγηρίας. Το Ilorin βρίσκεται στην πολιτεία Kwara και είναι η 6η μεγαλύτερη πόλη της Νιγηρίας σε πληθυσμό [25] . Τρεις Περιοχές Τοπικής Αυτοδιοίκησης (Ilorin East, Ilorin South και Ilorin West LGAs) ήταν οι κοινοτικοί χώροι και το Ειδικό Νοσοκομείο Παίδων, Ilorin ο κλινικός χώρος. Για τους σκοπούς αυτής της πιλοτικής μελέτης χρησιμοποιήθηκε βολική δειγματοληψία και τα δείγματα ελήφθησαν από τις 28 Μαρτίου έως τις 5 Απριλίου 2017. Τα κριτήρια συμπερίληψης ήταν: παιδιά κάτω των 14 ετών που είχαν ορατά συμπτώματα ARI εντός των κοινοτήτων ή εκείνα που επιβεβαιώθηκαν στο νοσοκομείο με ARI. Κριτήρια αποκλεισμού ήταν: παιδιά 14 ετών και άνω, που δεν εμφάνιζαν σημάδια ARI και άτομα των οποίων οι γονείς δεν έδωσαν τη συγκατάθεσή τους. Επιλέχθηκαν είκοσι πέντε παιδιά με συμπτώματα το καθένα από τις τρεις τοποθεσίες της κοινότητας, ενώ 16 συμπτωματικά παιδιά ελήφθησαν ως δείγμα από το νοσοκομείο. Το συνολικό μέγεθος του δείγματος (n = 91) προέκυψε με βάση τους περιορισμούς υλικών και κόστους επεξεργασίας, καθώς και για την παροχή αρκετών δειγμάτων για να καταστεί δυνατή η περιγραφική κατανόηση των μοτίβων κυκλοφορίας του ιού που εκτιμήθηκαν από άλλες μελέτες που βασίζονται στην κοινότητα [10] .Παρακολούθηση ασθενειών και ειδοποίηση Αξιωματικοί, οι οποίοι απασχολούνται στο Υπουργείο Υγείας της Πολιτείας και είναι εξοικειωμένοι με τις κοινότητες σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποίησαν συλλογή δειγμάτων και δεδομένων. Τα συμπτώματα που εξετάστηκαν προέκυψαν σύμφωνα με άλλες προσπάθειες επιτήρησης του ARI: πονόλαιμος, πυρετός, καναπές, μύτη που τρέχει, έμετος, πόνος στο σώμα, πόνος στα πόδια, ναυτία, ρίγη, δύσπνοια [10, 26]. Το φύλο και η ηλικία, ο τύπος της περιοχής κατοικίας (αγροτική/αστική), το μορφωτικό επίπεδο, η εγγύτητα της κατοικίας με τα ζώα, η εγγύτητα σε μη στρωμένο δρόμο και ο αριθμός των ατόμων που κοιμούνται στο ίδιο δωμάτιο, καταγράφηκαν όλα. Η γενική διαφορά μεταξύ των δύο πλαισίων ήταν ότι εκείνοι από το νοσοκομείο είχαν σοβαρές ασθένειες, ενώ εκείνοι από την κοινότητα ήταν γενικά \"υγιείς\" αλλά παρουσίαζαν συμπτώματα ARI (δηλ. ήπια ασθένεια). Ρινικά επιχρίσματα συλλέχθηκαν από τα άτομα και αποθηκεύτηκαν σε ασπίδα DNA/RNA (Zymo Research, Irvine, Καλιφόρνια). Τα δείγματα που συλλέχθηκαν περιστράφηκαν και το στυλεό αφαιρέθηκε. Τα υπολείμματα που περιείχαν τα ρινικά δείγματα αποθηκεύτηκαν στους -20 °C πριν από τη μοριακή ανάλυση. Το RNA του ιού απομονώθηκε χρησιμοποιώντας κιτ ZR Viral RNA™ (Zymo Research, Irvine, California) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (http://www.zymoresearch.com/downloads /dl/file/ id/147/r1034i.pdf ). Η PCR πραγματικού χρόνου (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης), που χρησιμοποιείται συνήθως σε μελέτες ARI [10, 19, 27], πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης ACE RV15 One Step, αριθμούς καταλόγου RV0716K01008007 και RV0717B01008001 (Seegeneo, South Korea, Seegeneo) από 15 ανθρώπινους ιούς: ιός παραγρίπης 1, 2, 3 και 4 (PIV1-4), αναπνευστικό συγκυτιακό ιό (RSV) Α και Β, γρίπη Α και Β (FLUA, FLUB), ρινοϊός τύπου A-C, αδενοϊός (ADV), κορωνοϊός (OC 229 E/NL63, OC43), εντεροϊός (HEV), μεταπνευμοϊός (hMPV) και bocavirus (BoV). Τα αντιδραστήρια επικυρώθηκαν στην πειραματική τοποθεσία χρησιμοποιώντας ένα ενσωματωμένο πρωτόκολλο επικύρωσης για την επιβεβαίωση ζητημάτων ψευδώς αρνητικών και ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων ανησυχία. Η αντίδραση ενίσχυσης πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή: αντίστροφη μεταγραφή 50 °C-30′, αρχική ενεργοποίηση 94°-15′, 45 κύκλοι: μετουσίωση 94°-30″, ανόπτηση 60°-1′ 30″, επέκταση 72° -1, τελική επέκταση 72°-10′, κρατήστε 4°. Η οπτικοποίηση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 2% σε TBE 1X με EtBr, παρουσία δεικτών RV15 OneStep A/B/C. δείκτης μοριακού βάρους. Η επεξεργασία του δείγματος δεν ήταν τυφλή καθώς δεν υπήρχε κίνδυνος πειραματικής μεροληψίας. Χρησιμοποιήθηκαν τυποποιημένες διαδικασίες για δειγματοληψία κοινότητας και κλινικής. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την έκδοση R 3.2.4. Περιγράφονται μονομεταβλητές στατιστικές [μέσος όρος και 95% διάστημα εμπιστοσύνης (CI)]. Στατιστικά διμεταβλητών (διαφορά στις αναλογίες) αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα z-test δύο αναλογιών. Μια τιμή p < 0,001 θεωρήθηκε σημαντική. Καμία παρατήρηση που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη δεν είχε στοιχεία που έλειπαν για αναλύσεις σε αυτήν τη μελέτη. Τα βασικά δημογραφικά στοιχεία των συμμετεχόντων συνοψίζονται στα αποτελέσματα PCR έδειξαν ότι δέκα διαφορετικοί ιοί (γρίππη A, κορωνοϊός OC 229 E/NL63, RSVA, RSV B, parainfluenza 1-4) εντοπίστηκαν. Το Σχήμα 1 δείχνει πώς αυτές οι λοιμώξεις κατανεμήθηκαν μεταξύ των τύπων ιών καθώς και στην κοινότητα έναντι των δειγμάτων κλινικής. Συνολικά, συνολικά 33 από τα 91 άτομα που ερωτήθηκαν είχαν έναν ή περισσότερους ιούς της αναπνευστικής οδού (36,3%, 95% CI 26,6-47,0%, Εικ. 1). Επιπλέον, 10 από αυτές τις περιπτώσεις ήταν τριπλές λοιμώξεις και 5 ήταν τετραπλοί λοιμώξεις (που απεικονίζεται με το χρώμα των ράβδων στην Εικ. 1). Το Σχήμα 2 δείχνει πόσο συχνά κάθε ζεύγος ιών βρέθηκε στον ίδιο συμμετέχοντα. Οι συν-λοιμώξεις ήταν πιο συχνές μεταξύ του εντεροϊού και του ιού της παραγρίπης 4 (Εικ. 2) Συγκρίναμε επίσης και συγκρίναμε τα κλινικά και κοινοτικά αποτελέσματα. Ο ιός παραγρίππης 4, ο αναπνευστικός συγκυτιακός ιός Β και ο εντεροϊός ήταν οι πιο συνηθισμένοι ιοί που βρέθηκαν στο κλινικό δείγμα. Αυτές οι τρεις λοιμώξεις είχαν ως αποτέλεσμα 41 ιούς που εντοπίστηκαν σε 15 άτομα κλινικά και οκτώ λοιμώξεις εντοπίστηκαν σε πέντε άτομα στην κοινότητα. Μαζί μόλυναν το 94% (15/16, 95% CI 67,7-99,7%) των κλινικών ατόμων και το 7% (5/75, 95% CI 2,5-15,5%) στην κοινότητα (σημαντική διαφορά, p < 0,001). Ο πιο κοινός ιός που εντοπίστηκε σε δείγματα της κοινότητας ήταν ο Coronavirus OC43. αυτός ο ιός ανιχνεύθηκε σε 13,3% (95% CI 6,9-23,6%) άτομα στην κοινότητα και όχι σε κανένα από τα κλινικά δείγματα. Ωστόσο, ένα διαφορετικό στέλεχος, ο κοροναϊός OC 229 E/NL63 ανιχνεύθηκε στο 12,5% των κλινικών ατόμων (2/16, 95% CI 2,2-39,6%) και δεν ανιχνεύθηκε στην κοινότητα. Οι διπλές, οι τριπλές και οι τετραπλές λοιμώξεις ήταν ένα άλλο κοινό χαρακτηριστικό της σημείωσης. Εντοπίσαμε δέκα διαφορετικούς ιούς της αναπνευστικής οδού μεταξύ των υποκειμένων, όπως φαίνεται στο Σχήμα. 1 . Τα δείγματα που συλλέχθηκαν από το εξειδικευμένο νοσοκομείο Παίδων έδειξαν ποσοστό επιπολασμού 100% μόλυνσης από έναν ή περισσότερους ιούς. Αυτό μπορεί να μην προκαλεί έκπληξη, καθώς η βασική διαφορά μεταξύ των δειγμάτων της κοινότητας και της κλινικής ήταν η αυξημένη σοβαρότητα της νόσου στο κλινικό δείγμα. Αυτό μπορεί επίσης να εξηγήσει το υψηλό επίπεδο συν-λοίμωξης που βρέθηκε μεταξύ των κλινικών υποκειμένων. Ο πιο διαδεδομένος ιός στο κλινικό δείγμα (coronavirus OC43) δεν ανιχνεύτηκε στο κοινοτικό δείγμα. Επιπλέον, υπήρξε σημαντική διαφορά μεταξύ του επιπολασμού των πιο κοινών ιών στο κλινικό δείγμα (ιός παραγρίππης 4, αναπνευστικός συγκυτιακός ιός Β και εντεροϊός) και του επιπολασμού τους στην κοινότητα. Τέλος, ορισμένοι από τους ιούς που ανιχνεύθηκαν σε αυτή τη μελέτη δεν έχουν ανιχνευθεί και εμπλέκονται με ARI στη Νιγηρία. Δεν υπάρχει καμία αναφορά, από όσο γνωρίζουμε, που να εμπλέκει τον κορωνοϊό σε ARI στη Νιγηρία και εντοπίστηκε σε 12 άτομα σε αυτήν τη μελέτη. Αν και περιπτώσεις διπλών και τριπλών λοιμώξεων παρατηρήθηκαν σε μια μελέτη στη Νιγηρία το 2011 [28] , από όσο γνωρίζουμε, οι αναφορές τετραπλών λοιμώξεων είναι σπάνιες και δεν έχουν αναφερθεί στη Νιγηρία στο παρελθόν. Λόγω της μοναδικής φύσης των δεδομένων που δημιουργείται σε αυτήν τη μελέτη και η καινοτομία της εργασίας στο πλαίσιο, δεν είναι δυνατή η ακριβής σύγκριση των αποτελεσμάτων με άλλες μελέτες. Για παράδειγμα, αν και βρήκαμε μια παρόμοια μελέτη σχετικά με τους ARIs σε κλινικά άτομα στη Μπουρκίνα Φάσο [27] , λόγω του μικρού μεγέθους δείγματος από αυτήν τη μελέτη δεν θα ήταν εφικτό να συναχθούν ή να συγκριθούν τα ποσοστά επικράτησης. Οι μελέτες της αιτιολογίας του ARI έχουν ως επί το πλείστον επικεντρωθεί σε περιοχές του κόσμου που είναι πιο ανεπτυγμένες [29] και είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η διαθεσιμότητα των μοριακών διαγνωστικών μεθόδων όπως χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη βελτιώνει σημαντικά την ικανότητα ανίχνευσης ιών που μέχρι τώρα είχαν δεν εντοπίστηκε στη Νιγηρία. Επιπλέον, τα ευρήματα από αυτήν την εργασία προσθέτουν επίσης στον αυξανόμενο όγκο έρευνας που δείχνει την αξία των κοινοτικών δεδομένων στην επιτήρηση μολυσματικών ασθενειών [8] . Καθώς το μεγαλύτερο μέρος της εργασίας μέχρι σήμερα έχει γίνει σε περιοχές με υψηλότερους πόρους του κόσμου, αυτή η μελέτη προσθέτει προοπτική από έναν τομέα όπου οι πόροι υγειονομικής περίθαλψης είναι χαμηλότεροι. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης παρέχουν στοιχεία για την ενεργό κοινοτική επιτήρηση για την ενίσχυση της επιτήρησης της δημόσιας υγείας και της επιστημονικής κατανόηση των ARI. Αυτό δεν συμβαίνει μόνο επειδή μια μειοψηφία παιδιών με σοβαρή λοίμωξη εισάγεται στο νοσοκομείο σε περιοχές όπως αυτή στη Νιγηρία, αλλά και τα ευρήματα αυτής της πιλοτικής μελέτης που δείχνουν ότι η κυκλοφορία του ιού στην κοινότητα μπορεί να μην ανιχνευθεί κλινικά [29] . Αυτή η πιλοτική μελέτη δείχνει ότι σε περιοχές της Νιγηρίας, η αιτιολογία των ARI που προσδιορίζεται από κλινικά δείγματα μπορεί να μην αντιπροσωπεύει όλα τα ARI που κυκλοφορούν στην κοινότητα. Ο κύριος περιορισμός της μελέτης είναι το μέγεθος του δείγματος. Ειδικότερα, το δείγμα δεν είναι εξίσου αντιπροσωπευτικό για όλες τις ηλικίες. Ωστόσο, το μέγεθος του δείγματος ήταν αρκετά μεγάλο για να διαπιστωθούν σημαντικές διαφορές στους ιούς που προέρχονται από την κοινότητα και την κλινική και παρέχει μια ποιοτική κατανόηση της ιικής αιτιολογίας σε δείγματα από την κοινότητα και την κλινική. Επιπλέον, το δείγμα επικεντρώθηκε σε μεγάλο βαθμό σε άτομα κάτω των 6 ετών, τα οποία συγκαταλέγονται στις ομάδες με τον υψηλότερο κίνδυνο εμφάνισης ARI. Παρά το μικρό μέγεθος του δείγματος, τα δείγματα εδώ υποδεικνύουν ότι τα πρότυπα κυκλοφορίας στην κοινότητα μπορεί να διαφέρουν από αυτά στην κλινική. Επιπλέον, αυτή η μελέτη οδήγησε σε μοναδικά ευρήματα Δεδομένου ότι οι πόροι είναι περιορισμένοι για έρευνα και πρακτική, ελπίζουμε ότι αυτά τα πιλοτικά αποτελέσματα μπορεί να παρακινήσουν περαιτέρω συστηματικές έρευνες σχετικά με το πώς τα δεδομένα που παράγονται από την κοινότητα μπορούν να χρησιμοποιηθούν καλύτερα στην επιτήρηση ARI. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης μπορούν να πληροφορήσουν μια μεγαλύτερη μελέτη, αντιπροσωπευτική σε δημογραφικές και τοποθεσίες για να αξιολογήσει συστηματικά την αιτιολογία της μόλυνσης και τις διαφορές στις κλινικές και κοινοτικές κοόρτες. Μια ευρύτερη μελέτη θα επιτρέψει επίσης να ληφθούν υπόψη οι πιθανοί συγχυτικοί παράγοντες, όπως οι περιβαλλοντικοί παράγοντες κινδύνου. Τέλος, αν και μπορεί να είναι διαισθητικό, τα ευρήματα αυτής της πιλοτικής μελέτης ρίχνουν φως στο εύρος των διαφορών στα πρότυπα ARI, συμπεριλαμβανομένων διαφορετικών τύπων και στελεχών κυκλοφορούντων ιών. Επίσης, επειδή χρησιμοποιήθηκε PCR για την ανίχνευση ιών, η μελέτη περιορίστηκε στην ανίχνευση ιών στα σετ εκκινητών. Δεδομένου ότι αυτοί είναι οι πιο ενημερωμένοι και κοινοί ιοί, αυτή η προσέγγιση κρίθηκε επαρκής για αυτήν την αρχική έρευνα. Η μελέτη σχεδιάστηκε από τους RC και OK. Οι RC και OK, MO και TD συμμετείχαν στο σχεδιασμό της μελέτης, η οποία διεξήχθη από τους MO και TD. Οι RC και OK ανέλυσαν τα δεδομένα. Οι RC και OK έγραψαν και αναθεώρησαν το χειρόγραφο. Όλοι οι συγγραφείς διάβασαν και ενέκριναν το τελικό χειρόγραφο.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 1320, "text": "κορωνοϊός OC43" } ], "id": 1598, "question": "Ποιος ήταν ο πιο κοινός ιός που εντοπίστηκε σε μέλη της κοινότητας σε αυτό το δείγμα;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2198, "text": "2-5 φορές υψηλότερο από ό,τι στις ανεπτυγμένες χώρες" } ], "id": 1599, "question": "Πόσο κακό είναι το βάρος των ασθενειών στις αναπτυσσόμενες χώρες;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4260, "text": "Αφρική" } ], "id": 1600, "question": "Πού συμβαίνουν τα περισσότερα κρούσματα μολυσματικών ασθενειών;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3316, "text": "ηλικία, φύλο, υπερπληθυσμός, διατροφική κατάσταση, κοινωνικοοικονομική κατάσταση και όπου η μελέτη των ARI είναι επί του παρόντος περιορισμένη" } ], "id": 1601, "question": "Ποιοι είναι ορισμένοι παράγοντες κινδύνου για τις χώρες να εμφανίσουν υψηλό επιπολασμό Οξειών Αναπνευστικών Λοιμώξεων;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7210, "text": "πονόλαιμος, πυρετός, καναπές, μύτη που τρέχει, έμετος, πόνος στο σώμα, πόνος στα πόδια, ναυτία, ρίγη, δύσπνοια" } ], "id": 1602, "question": "Ποια συμπτώματα σχετίζονται με οξείες λοιμώξεις του αναπνευστικού;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1320, "text": "κορωνοϊός OC43" } ], "id": 1603, "question": "Ποιος ήταν ο πιο κοινός ιός που εντοπίστηκε σε δείγματα κοινότητας στο Ilorin της Νιγηρίας;" }, { "answers": [ { "answer_start": 11468, "text": "13,3% (95% CI 6,9-23,6%)" } ], "id": 1604, "question": "Ποιος ήταν ο επιπολασμός του Coronavirus OC43 σε κοινοτικά δείγματα στο Ilorin της Νιγηρίας;" }, { "answers": [ { "answer_start": 11633, "text": "12,5%" } ], "id": 1605, "question": "Ποιος ήταν ο επιπολασμός του Coronavirus OC 229 E/NL63 σε κλινικά άτομα στο Ilorin της Νιγηρίας;" }, { "answers": [ { "answer_start": 12190, "text": "αυξημένη σοβαρότητα της νόσου στο κλινικό δείγμα" } ], "id": 1606, "question": "Ποια ήταν η διαφορά μεταξύ των περιπτώσεων οξέων αναπνευστικών λοιμώξεων στην κοινότητα και την κλινική;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Αιτιολογία Οξειών Λοιμώξεων του Αναπνευστικού σε Νοσηλευόμενα Παιδιά στην Κύπροhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4720120/SHA: efd27ff0ac04dd60838266386aaebb5df80f4fa9A; Παναγιώτου, Χριστάκης; Τρύφωνος, Χριστίνα; Κοπτίδης, Dana; Κολιού, Μαρία; Καλογήρου, Νικόλας; Γεωργίου, Ελένη; Χριστοδούλου, Χριστίνα Ημερομηνία: 2016-01-13DOI: 10.1371/journal.pone.0147041 Άδεια: cc-byAbstract: Προκειμένου να βελτιωθεί η κλινική διαχείριση και η πρόληψη των ιογενών λοιμώξεων σε νοσηλευόμενα παιδιά απαιτείται βελτιωμένη αιτιολογική εικόνα. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η αξιολόγηση του φάσματος των ιικών παθογόνων του αναπνευστικού σε παιδιά που εισάγονται σε νοσοκομείο με οξείες λοιμώξεις του αναπνευστικού συστήματος στην Κύπρο. Για το σκοπό αυτό συλλέχθηκαν δείγματα ρινοφαρυγγικού επιχρίσματος από 424 παιδιά κάτω των 12 ετών με οξείες λοιμώξεις του αναπνευστικού συστήματος σε τρεις επιδημικές περιόδους και αναλύθηκαν για την παρουσία των πιο κοινών 15 αναπνευστικών ιών. Ένα ιικό παθογόνο εντοπίστηκε στο 86% των δειγμάτων, με πολλαπλές λοιμώξεις να παρατηρούνται σχεδόν στο 20% των δειγμάτων. Οι πιο συχνά ανιχνευθέντες ιοί ήταν ο RSV (30,4%) και ο ρινοϊός (27,4%). Ο RSV παρουσίασε σαφή εποχικότητα με αξιοσημείωτες κορυφές τον Ιανουάριο/Φεβρουάριο, ενώ οι λοιμώξεις από ρινοϊό δεν εμφάνισαν έντονη εποχικότητα που ανιχνεύθηκε σχεδόν καθ' όλη τη διάρκεια του έτους. Ενώ η επίπτωση των RSV και PIV3 μειώθηκε σημαντικά με την ηλικία, το αντίθετο παρατηρήθηκε για τη γρίπη Α και Β καθώς και για τις λοιμώξεις από αδενοϊό. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται διευρύνουν την κατανόησή μας για την επιδημιολογία των ιογενών λοιμώξεων του αναπνευστικού συστήματος σε παιδιά της Κύπρου και θα βοηθήσουν τους κλινικούς ιατρούς και τους ερευνητές που ενδιαφέρονται για τη θεραπεία και τον έλεγχο των ιογενών λοιμώξεων του αναπνευστικού συστήματος. πρόβλημα δημόσιας υγείας λόγω της παγκόσμιας εμφάνισής τους, της ευκολίας μετάδοσης και της σημαντικής νοσηρότητας και θνησιμότητας που επηρεάζουν άτομα όλων των ηλικιών. Τα παιδιά μολύνονται κατά μέσο όρο δύο έως τρεις φορές πιο συχνά από τους ενήλικες, με τις οξείες RTI να είναι η πιο κοινή λοίμωξη στην παιδική ηλικία [1, 2]. Οι ασθένειες που προκαλούνται από ιούς του αναπνευστικού περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, το κοινό κρυολόγημα, τη φαρυγγίτιδα, τη βρογχιολίτιδα, την ιογενή πνευμονία και τη μέση ωτίτιδα. Η ταχεία διάγνωση είναι σημαντική όχι μόνο για την έγκαιρη θεραπευτική παρέμβαση αλλά και για τον εντοπισμό μιας αρχικής επιδημίας γρίπης και την αποφυγή άσκοπης αντιβιοτικής θεραπείας [3, 4] . Οι RTI αποτελούν κύρια αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας παγκοσμίως. Η οξεία RTI είναι πιο συχνή σε παιδιά κάτω των πέντε ετών και αντιπροσωπεύει το 30-50% των παιδιατρικών ιατρικών εισαγωγών, καθώς και το 20-40% των νοσηλειών σε παιδιά. Οι αναπνευστικές λοιμώξεις συγκεντρώνονται κατά τους χειμερινούς και τους πρώιμους μήνες της άνοιξης. Οι κορυφαίοι ιικοί παράγοντες περιλαμβάνουν τον αναπνευστικό συγκυτιακό ιό (RSV), τους ιούς της γρίπης Α και Β (INF-A, INF-B), τους ιούς της παραγρίππης (PIVs) και τους ανθρώπινους αδενοϊούς (HAdVs). Επιπλέον, υπάρχει ένας συνεχώς αυξανόμενος κατάλογος νέων αναπνευστικών ιών που συμβάλλουν σημαντικά στην επιβάρυνση των οξειών αναπνευστικών λοιμώξεων, όπως ο πρόσφατα ταυτοποιημένος ανθρώπινος μεταπνευμοϊός (HMPV) και ο ανθρώπινος ιός Bocavirus (HBoV) [5] .Οι οξείες RTI ταξινομούνται ως ανώτερες (UTRIs) και χαμηλότερο RTI (LRTIs), σύμφωνα με τον εμπλεκόμενο ανατομικό εντοπισμό. Τα URTI προκαλούν μη σοβαρές αλλά εκτεταμένες επιδημίες που ευθύνονται για τη συνεχή κυκλοφορία των παθογόνων στην κοινότητα. Οι LRTIs έχουν ταξινομηθεί ως φανερή πνευμονία και βρογχιολίτιδα με κλινικά, ακτινολογικά και αιτιολογικά χαρακτηριστικά που συνήθως επικαλύπτονται [6, 7]. Οι ιοί είναι και πάλι οι κύριοι παράγοντες των LRTI που συχνά διαγιγνώσκονται λανθασμένα ως βακτηριακής προέλευσης και ως εκ τούτου αντιμετωπίζονται με αντιβιοτικά χωρίς λόγο [8] . Ο κύριος στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιοριστεί η αιτιολογία των οξέων λοιμώξεων του αναπνευστικού συστήματος σε παιδιά της Κύπρου και να αξιολογηθεί η επιδημιολογία των εντοπισμένων ιικά παθογόνα σε τρεις περιόδους επιδημίας. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Εθνική Επιτροπή Βιοηθικής Κύπρου. Κατά συνέπεια, ελήφθη γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση από τους γονείς πριν από τη λήψη του δείγματος. Μεταξύ Νοεμβρίου 2010 και Οκτωβρίου 2013, συλλέχθηκαν 485 δείγματα ρινοφαρυγγικού επιχρίσματος από παιδιά ηλικίας έως 12 ετών, τα οποία νοσηλεύονταν με οξεία λοίμωξη του αναπνευστικού στο νοσοκομείο Αρχιεπίσκοπος Μακάριος ΙΙΙ Λευκωσίας. Καταγράφηκαν κλινικές και δημογραφικές πληροφορίες συμπεριλαμβανομένων των συμπτωμάτων, της διάρκειας νοσηλείας, της διάγνωσης και της θεραπείας. Δείγματα ρινικού επιχρίσματος συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ συλλογής ιικών μεταφορών Universal BD. Το ιικό RNA/DNA εξήχθη από δείγμα 400 μl χρησιμοποιώντας το κιτ ιού iPrep PureLink σε ένα όργανο καθαρισμού iPrep (Invitrogen). Δημιουργήθηκε και επικυρώθηκε ένα σύνολο τεσσάρων πολυπλών αναλύσεων RT-PCR σε πραγματικό χρόνο για την ανίχνευση των 15 πιο κοινών αναπνευστικών ιοί ως εξής: δοκιμασία 1: ιοί γρίπης Α και Β, RSV, δοκιμασία 2: ιοί παραγρίπης 1-4, δοκιμασία 3: HAdV, εντεροϊοί, HMPV και HBoV και δοκιμασία 4: ρινοϊοί και οι ανθρώπινοι κοροναϊοί OC43, NL63 και 2 με δυνατότητα 2) Τα δημοσιευμένα σύνολα εκκινητών και ανιχνευτών χρησιμοποιήθηκαν ως βάση για το σχεδιασμό των δοκιμασιών, ωστόσο, όλες οι αλληλουχίες εκκινητών/ανιχνευτών ελέγχθηκαν έναντι ευθυγραμμίσεων αλληλουχίας πρόσφατα κατασκευασμένων όλων των ιών που δοκιμάστηκαν και τροποποιήθηκαν, εάν ήταν απαραίτητο, για να ληφθούν υπόψη πιθανές παραλλαγές αλληλουχίας. Για το σκοπό αυτό, όλες οι διαθέσιμες πλήρεις αλληλουχίες γονιδιώματος ελήφθησαν για κάθε ιό από την GenBank, εισήχθησαν στο BioEdit Sequence Alignment Editor v7.1.7 και ευθυγραμμίστηκαν χρησιμοποιώντας ClustalX. Σε περίπτωση αναντιστοιχιών μεταξύ δημοσιευμένων εκκινητών/ανιχνευτών και αλληλουχιών στόχου, εφαρμόστηκαν τροποποιήσεις, όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα 1. Οι ευθυγραμμίσεις για τους ιούς, οι οποίοι απαιτούσαν αλλαγές στους εκκινητές/ανιχνευτή είναι διαθέσιμες σε Fasta-Format ως συμπλήρωμα S1-S4 Files. Οι συγκεντρώσεις του εκκινητή και οι συνθήκες αντίδρασης για τις τέσσερις δοκιμασίες βελτιστοποιήθηκαν στη συνέχεια για πολυπλεξία. Προκειμένου να αξιολογηθεί η ευαισθησία και η ειδικότητα των δοκιμών, το εργαστήριο εγγράφηκε για δύο συνεχή έτη σε σχήματα ποιοτικού ελέγχου ποιότητας για μοριακή διάγνωση (QCMD) για όλους τους ιούς, εκτός από τον Bocavirus, ο οποίος δεν ήταν διαθέσιμος. Συνοπτικά, οι καθιερωμένες δοκιμασίες μπόρεσαν να αναγνωρίσουν σωστά όλους τους ιούς που δοκιμάστηκαν, αποδεικνύοντας την καταλληλότητά τους για διαγνωστική εφαρμογή. Αξιολογήθηκε μια πιθανή συσχέτιση του επιπολασμού του ιού και της ηλικίας μόλυνσης χρησιμοποιώντας μονομεταβλητές αναλύσεις. Το ακριβές τεστ του Fisher χρησιμοποιήθηκε όπου βρέθηκαν μετρήσεις κυττάρων κάτω από 5. Διαφορετικά, διεξήχθη το τεστ χ-τετράγωνο. Οι ίδιες στατιστικές δοκιμές χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση της συχνότητας των ατόμων με μεμονωμένες ή πολλαπλές λοιμώξεις μεταξύ των ηλικιακών ομάδων. Επιπλέον, η συσχέτιση Pearson χρησιμοποιήθηκε για την εξέταση συν-λοιμώξεων διαφορετικών ιών. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας StataSE 12 (StatCorp. 2007. College Station, TX, ΗΠΑ). Η παρούσα μελέτη ήταν μια προοπτική διερεύνηση παιδιών που νοσηλεύτηκαν με οξείες λοιμώξεις του αναπνευστικού συστήματος μεταξύ Νοεμβρίου 2010 και Οκτωβρίου 2013 στην Κύπρο. Η διάμεση ηλικία των παιδιών ήταν 15 μήνες (εύρος: 0-140 μήνες) με 243 να είναι άνδρες και 181 γυναίκες (αναλογία ανδρών/θηλέων 1,34). Η κατανομή ηλικίας φαίνεται στο σχήμα 1. Από τα 424 δείγματα που αναλύθηκαν, τα 364 (85,8%) ήταν θετικά για έναν ή περισσότερους ιούς. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Οι πιο συχνά ανιχνευόμενοι ιοί ήταν ο RSV, ο οποίος βρέθηκε σε 129 (30,4%) ασθενείς και οι ρινοϊοί σε 116 (27,4%) αντιπροσωπεύουν μαζί σχεδόν το 60% όλων των ανιχνεύσεων. Με μέτρια συχνότητα έχουν ανιχνευθεί HAdV σε 31 (7,3%) ασθενείς, γρίπη Α σε 28 (6,6%), HBoV σε 24 (5,7%), εντεροϊοί και PIV 3 σε 23 (5,4%) των ασθενών αντίστοιχα, και Γρίπη Β σε 21 (5,0%). Χαμηλή συχνότητα παρουσίασαν τα HMPV με 16 (3,8%) θετικά δείγματα, ο ανθρώπινος κορωνοϊός OC43 με 13 (3,1%), PIV 1 με 12 (2,8%), PIV 4 με 9 (2,1%), PIV 2 με 7 (1,7%) %) και HCoV NL63 με 6 (1,4%). Ο κορωνοϊός 229Ε μπορούσε να ανιχνευθεί μόνο σε ένα μόνο δείγμα. Συν-λοιμώξεις με δύο ή περισσότερους ιούς παρατηρήθηκαν σε 84 από τα 364 θετικά δείγματα (βλ. Πίνακα 2). Οι διπλές λοιμώξεις αντιπροσώπευαν το 17% όλων των θετικών δειγμάτων και τρεις ιοί ανιχνεύθηκαν στο 2,7% των δειγμάτων). Ένα δείγμα ασθενή εμφάνισε τετραπλή λοίμωξη που ήταν ταυτόχρονα θετική για RSV, ρινοϊό, HBoV και γρίπη Β. Ο Πίνακας 3 συνοψίζει τη συχνότητα κάθε ιού σε μεμονωμένες έναντι πολλαπλών λοιμώξεων καθώς και τον αριθμό των συν-εμφανίσεων ιών για κάθε πιθανό συνδυασμό ιών. Σε απόλυτες τιμές, ο πιο κοινός συνδυασμός που παρατηρήθηκε ήταν ο RSV/ρινοϊός. Ως ποσοστό, ωστόσο, ο ιός που εμφανιζόταν συχνότερα στις συν-λοιμώξεις ήταν ο HBoV, ο οποίος βρέθηκε σε περισσότερο από το 70% των περιπτώσεων μαζί με άλλον ιό, ακολουθούμενος από τους κοροναϊούς HCoV OC43 και HCoV NL63 με 61% και 67% αντίστοιχα. Από την άλλη πλευρά, οι ιοί που εμφανίζονται πιο σπάνια σε συν-λοιμώξεις ήταν οι ιοί της γρίπης Α και Β καθώς και ο RSV. Οι συντελεστές συσχέτισης Pearson υπολογίστηκαν για να εξεταστεί η πιθανότητα συν-λοιμώξεων διαφορετικών ιών. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης συνοψίζονται στον Πίνακα 1 στον Πίνακα S1. Σημαντική συσχέτιση (P-value < 0,05) παρατηρήθηκε κυρίως για συν-λοιμώξεις με RSV, ωστόσο οι συσχετίσεις ήταν πολύ ασθενείς (r<0,3) και αρνητικές. Αυτό το εύρημα μπορεί πιθανώς να εξηγηθεί από το γεγονός ότι οι λοιμώξεις από RSV εμφανίστηκαν κυρίως στους πολύ νέους, όπου οι συν-λοιμώξεις παρατηρήθηκαν λιγότερο συχνά. Από την άλλη πλευρά, παρατηρήθηκε σημαντική θετική συσχέτιση για τη συνλοίμωξη από εντεροϊό και ρινοϊό, υπονοώντας ίσως ομοιότητες στα πρότυπα κυκλοφορίας ή/και στους τρόπους μετάδοσης. Όσον αφορά την εποχικότητα, μπορούν να παρατηρηθούν διαφορετικά πρότυπα κυκλοφορίας για τον RSV, τους ρινοϊούς και τους ιούς της γρίπης (Α και Β συνδυασμένο) (Εικ. 2), με τον RSV και τη γρίπη να παρουσιάζουν σαφή εποχικότητα με αξιοσημείωτες κορυφές τον Ιανουάριο/Φεβρουάριο, ενώ οι λοιμώξεις από ρινοϊό δεν εμφάνισαν έντονη εποχικότητα που ανιχνεύθηκε σχεδόν καθ' όλη τη διάρκεια του έτους. Ωστόσο, καθώς περισσότερα από 100 διαφορετικά στελέχη ρινοϊών έχουν εντοπιστεί ότι κυκλοφορούν παγκοσμίως παράλληλα και διαδοχικά, μια πιθανή εποχικότητα μεμονωμένων ορότυπων ρινοϊών μπορεί να καλύπτεται από επικαλυπτόμενα πρότυπα [18, 19] . Τα δεδομένα αναλύθηκαν περαιτέρω σε σχέση με την ηλικία κατανομή της μόλυνσης από τον ιό (βλ. Πίνακα 2). Σε βρέφη ηλικίας έως 3 μηνών, ο RSV ήταν μακράν το πιο κοινό παθογόνο (58,1%), ακολουθούμενος από τον ρινοϊό (20,3%) και τον PIV3 με 8,1% το καθένα. Η συχνότητα εμφάνισης του RSV, ωστόσο, μειώνεται σημαντικά με την αύξηση της ηλικίας (p-value < 0,0001) που πέφτει στο 13% σε παιδιά μεγαλύτερα των 3 ετών, ενώ η αντίστροφη σχέση παρατηρείται για τη γρίπη Α και Β και τον HAdV. Οι ρινοϊοί, ο HBoV και οι εντεροϊοί παρατηρούνται συχνότερα σε παιδιά ηλικίας από 4 μηνών έως 3 ετών. Η ηλικιακή εξάρτηση της επίπτωσης του ιού απεικονίζεται στο Σχήμα 3 για τους επτά πιο συχνά παρατηρούμενους ιούς. Το ποσοστό θετικότητας παρουσίασε επίσης μια τάση ανάλογα με την ηλικιακή ομάδα που μειώθηκε από 90,5% στις ηλικίες κάτω των 3 μηνών σε 78,3% στις ηλικίες 4-12 ετών (p-value = 0,020). Αυτό μπορεί να υποδηλώνει έναν αυξανόμενο ρόλο παθογόνων που δεν περιλαμβάνονται στις αναλύσεις, όπως βακτηριακές λοιμώξεις σε μεγαλύτερα παιδιά. Όσον αφορά τις πολλαπλές λοιμώξεις, τα παιδιά ηλικίας κάτω των 3 μηνών και τα μεγαλύτερα των 4 ετών είχαν σημαντικά μικρότερο κίνδυνο να εμφανιστούν με πολλαπλές λοιμώξεις σε σύγκριση με τις άλλες δύο ηλικιακές ομάδες (p-value = 0,014). Ένας λόγος για αυτό θα μπορούσε να είναι ότι τα πολύ μικρά παιδιά έχουν περιορισμένη επαφή με άλλους, μειώνοντας έτσι την πιθανότητα για συνλοίμωξη, ενώ τα παιδιά μεγαλύτερα των 3 ετών έχουν ήδη εδραιώσει ανοσία σε έναν αυξανόμενο αριθμό ιών που είχαν συναντήσει στο παρελθόν. Αυτή η μελέτη εξέτασε για πρώτη φορά την αιτιολογία των οξειών λοιμώξεων του αναπνευστικού σε παιδιά που νοσηλεύονται στην Κύπρο. Τέσσερις πολυπλέκτες αναλύσεις RT-PCR σε πραγματικό χρόνο αναπτύχθηκαν με σκοπό την ανίχνευση των πιο κοινών ιικών παθογόνων του αναπνευστικού συστήματος με γρήγορο και οικονομικά αποδοτικό τρόπο. Το υψηλό ποσοστό θετικών δειγμάτων (85,8%) αποτελεί ένδειξη της υψηλής ευαισθησίας των αναλύσεων Multiplex που χρησιμοποιήθηκαν και ότι το εύρος των ιών που περιλαμβάνονται στην ανάλυση είναι ολοκληρωμένο. Πολλές προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ποσοστά ανίχνευσης που κυμαίνονται από κάτω από 50% έως 75% [20] [21] [22] [23] [24] .Οι πιο συνηθισμένοι ιοί που ανιχνεύθηκαν ήταν ο RSV και ο ρινοϊός που αντιπροσωπεύουν σχεδόν το 60% όλων των περιπτώσεων. Και οι δύο ιοί αναφέρθηκαν προηγουμένως από άλλους ως η κύρια αιτιολογία για τις ιογενείς λοιμώξεις του αναπνευστικού σε μικρά παιδιά με ρινοϊούς που αναγνωρίζεται όλο και περισσότερο για το ρόλο τους στις λοιμώξεις του κατώτερου αναπνευστικού συστήματος [20, [25] [26] [27] [28] [29] [ 30] .Τα δεδομένα μας υποστηρίζουν τα αποτελέσματα παρόμοιων μελετών που πραγματοποιήθηκαν στην περιοχή της Μέσης Ανατολής. Μια πρόσφατα δημοσιευμένη μελέτη διαπίστωσε ότι ο RSV ήταν ο πιο συχνά ανιχνευμένος ιός σε ρινοφαρυγγικά επιχρίσματα από παιδιά που παρουσίαζαν συμπτώματα RTIs και επιπλέον έδειξε επίσης ότι οι λοιμώξεις από RSV ακολουθούν ένα παρόμοιο μοτίβο κυκλοφορίας με κορύφωση από τον Δεκέμβριο έως τον Μάρτιο [31] . Μια άλλη μελέτη αποκάλυψε ότι η συχνότητα των RSV και PIV3 μειώνεται σημαντικά με την ηλικία, ενώ το αντίθετο παρατηρείται για τις λοιμώξεις από γρίπη και αδενοϊό, μια τάση που παρατηρήθηκε και στη μελέτη μας [26] . Μικτές λοιμώξεις παρατηρήθηκαν σε περίπου 20% όλων των δειγμάτων, που βρίσκεται στη μέση των ποσοστών που αναφέρθηκαν προηγουμένως που κυμαίνονται από 10 έως σχεδόν 40%. Οι HBoV, HCoV και EV βρέθηκαν πιο συχνά σε συν-λοιμώξεις. Και οι τρεις υπότυποι του HCoV ταυτοποιήθηκαν ταυτόχρονα με αρκετούς άλλους ιούς, ενώ ο HBoV ταυτοποιήθηκε κυρίως με HRV και RSV. Στην περίπτωση των EV λοιμώξεων, το EV συσχετίστηκε σχεδόν κατά κύριο λόγο με HRV. Η σπάνια παρουσία των ιών InfA και InfB σε πολλαπλές λοιμώξεις που παρατηρήθηκε στη μελέτη μας, παρατηρήθηκε και αλλού [32, 33]. Παρόλο που αυτή η μελέτη δεν επέτρεψε τη διερεύνηση πιθανής συσχέτισης μεταξύ πολλαπλών λοιμώξεων και σοβαρότητας της νόσου, μια ανασκόπηση της βιβλιογραφίας δείχνει ότι μια τέτοια πιθανή συσχέτιση εξακολουθεί να υπόκειται σε αμφισβήτηση, καθώς υπάρχουν αναφορές που δεν δείχνουν σχέση της λοίμωξης από πολλαπλούς ιούς με την αναπνευστική νόσο σοβαρότητα από τη μια πλευρά ή μια σημαντική συσχέτιση από την άλλη. Μελέτες έχουν δείξει ότι η ιογενής συνλοίμωξη συσχετίστηκε σημαντικά με μεγαλύτερη διάρκεια των συμπτωμάτων της νόσου, αλλά με μειωμένη σοβαρότητα στα νοσηλευόμενα παιδιά όσον αφορά τις ανάγκες σε οξυγόνο και την εισαγωγή στη μονάδα εντατικής θεραπείας, ενώ τα ευρήματα άλλων μελετών έδειξαν ότι οι σοβαροί κλινικοί φαινότυποι ήταν πιο διαδεδομένοι. σε ασθενείς με ταυτόχρονη λοίμωξη, ειδικά σε συν-λοιμώξεις με RSV που μπορεί να αυξήσουν τη σοβαρότητα της νόσου που σχετίζεται με RSV σε παιδιά [25, [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] . Οι λοιμώξεις συνεχίζουν να αποτελούν παγκόσμια ανησυχία για την υγεία. Καθώς τα κλινικά συμπτώματα ασθενών με οξείες λοιμώξεις του αναπνευστικού συνήθως δεν επιτρέπουν τη διάκριση ιογενούς ή βακτηριακής αιτιολογίας, απαιτούνται γρήγορα και αξιόπιστα διαγνωστικά εργαλεία για την καλύτερη διαχείριση των αντιβιοτικών και την εφαρμογή κατάλληλων μέτρων ελέγχου των λοιμώξεων [4, 41] . Τα δεδομένα που παρουσιάζονται διευρύνουν την κατανόησή μας για την επιδημιολογία των ιογενών λοιμώξεων του αναπνευστικού συστήματος σε παιδιά της Κύπρου και θα είναι χρήσιμα στους κλινικούς ιατρούς και τους ερευνητές που ενδιαφέρονται για τη θεραπεία και τον έλεγχο των ιογενών λοιμώξεων του αναπνευστικού συστήματος.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 2053, "text": "δύο έως τρεις φορές πιο συχνά" } ], "id": 1609, "question": "Πόσο μεγαλύτερο κίνδυνο διατρέχουν τα παιδιά από τους ενήλικες για ιογενείς λοιμώξεις;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2626, "text": "οξεία RTI" } ], "id": 1610, "question": "Ποια είναι η πιο συχνή λοίμωξη στην παιδική ηλικία;" }, { "answers": [ { "answer_start": 11009, "text": "RSV" } ], "id": 1629, "question": "Ποια είναι η πιο κοινή ιογενής λοίμωξη για βρέφη έως 3 μηνών;" }, { "answers": [ { "answer_start": 11102, "text": "13%" } ], "id": 1630, "question": "Ποια είναι η συχνότητα εμφάνισης του RSV σε παιδιά ηλικίας άνω των 3 ετών;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Η πρώτη ανίχνευση του κορωνοϊού των ιπποειδών σε ενήλικα άλογα και πουλάρια στην Ιρλανδίαhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6832964/SHA: eee5a9068ade4c6776f189045115a90a53Ato, Man; Schofield, Warren; Cullinane, AnnΗμερομηνία: 2019-10-14DOI: 10.3390/v11100946 Άδεια: cc-byAbstract: Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν η διερεύνηση της παρουσίας κορωνοϊού ιπποειδών (ECoV) σε κλινικά δείγματα που υποβλήθηκαν σε διαγνωστικό εργαστήριο στην Ιρλανδία. Συνολικά 424 κλινικά δείγματα εξετάστηκαν από ιπποειδή με εντερική νόσο σε 24 κομητείες της Ιρλανδίας μεταξύ 2011 και 2015. Χρησιμοποιήθηκε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής σε πραγματικό χρόνο για την ανίχνευση του RNA του ECoV. Το νουκλεοκαψίδιο, η ακίδα και η περιοχή από τα γονίδια ρ4.7 έως ρ12.7 των θετικών δειγμάτων αλληλουχήθηκαν και διεξήχθησαν αναλύσεις αλληλουχίας και φυλογενετικές αναλύσεις. Πέντε δείγματα (1,2%) που συλλέχθηκαν το 2011 και το 2013 βρέθηκαν θετικά στον ECoV. Θετικά δείγματα συλλέχθηκαν από ενήλικα άλογα, καθαρόαιμα πουλάρια και ένα πουλάρι γάιδαρου. Η ανάλυση αλληλουχίας ή/και φυλογενετικής ανάλυσης έδειξε ότι τα γονίδια νουκλεοκαψιδίου, ακίδας και p12.7 διατηρήθηκαν σε μεγάλο βαθμό και σχετίζονταν στενά με τα ECoV που εντοπίστηκαν σε άλλες χώρες. Αντίθετα, η περιοχή από το p4.7 και η μη κωδικοποιητική περιοχή που ακολουθεί το γονίδιο p4.7 είχαν διαγραφές ή εισαγωγές. Οι διαφορές στην περιοχή p4.7 μεταξύ των ιρλανδικών ECoV και άλλων ECoV έδειξαν ότι οι Ιρλανδικοί ιοί ήταν διακριτοί από αυτούς που κυκλοφορούσαν σε άλλες χώρες. Αυτή είναι η πρώτη αναφορά ECoV που ανιχνεύθηκε τόσο σε πουλάρια όσο και σε ενήλικα άλογα στην Ιρλανδία. Κείμενο: Ο κορωνοϊός των ιπποειδών (ECoV) είναι ένας θετικός-κλώνος ιός RNA και ανήκει στο είδος Betacoronavirus 1 στο γένος Betacoronavirus [1, 2] . Τα κλινικά σημεία που σχετίζονται με τη μόλυνση από τον ECoV κατά τη διάρκεια επιδημιών στις ΗΠΑ [3] και στην Ιαπωνία [4] [5] [6] ήταν πυρετός, ανορεξία, λήθαργος και διάρροια. Τα ίδια κλινικά σημεία καταγράφηκαν επίσης σε μια πειραματική μελέτη πρόκλησης με χρήση Ιαπωνικών αλόγων έλξης [7] . Η κύρια οδός μετάδοσης θεωρείται ότι είναι τα κόπρανα-στοματικά [7] και ο ECoV συνήθως ανιχνεύεται σε δείγματα κοπράνων. Ωστόσο, η μοριακή ανίχνευση του ECoV σε κόπρανα αλόγων με διάρροια, δεν αποδεικνύεται αιτιότητα. Οι κοροναϊοί μπορούν να προκαλέσουν τόσο εντερική όσο και αναπνευστική νόσο σε πολλά είδη πτηνών και θηλαστικών, αλλά ο ECoV είναι λιγότερο πιθανό να βρεθεί στις αναπνευστικές εκκρίσεις παρά στα κόπρανα [8, 9] . Τόσο οι μοριακές όσο και οι οροεπιδημιολογικές μελέτες υποδηλώνουν ότι ο ECoV μπορεί να είναι πιο διαδεδομένος στις ΗΠΑ από σε άλλες χώρες [10] . Ο ECoV ανιχνεύθηκε σε δείγματα που συλλέχθηκαν από ιπποειδή σε 48 πολιτείες των ΗΠΑ [11] . Στο κεντρικό Κεντάκι, περίπου το 30% τόσο των υγιών όσο και των διαρροϊκών καθαρόαιμων πουλαριών μολύνθηκαν με ECoV [12] . Όλα τα θετικά qPCR πουλάρια με διάρροια μολύνθηκαν ταυτόχρονα με άλλα παθογόνα, όπως ο ροταϊός ή το Clostridium perfringens, υποδηλώνοντας ότι υπήρχε πιθανότητα υπερδιάγνωσης του ECoV ως αιτιολογικού παράγοντα σε σύνθετες ασθένειες. Αντίθετα στην Ιαπωνία, παρόλο που εμφανίστηκε ξέσπασμα διάρροιας μεταξύ των μολυσμένων με ECoV αλόγων έλξης σε ένα ιπποδρόμιο [4] [5] [6] , δεν υπήρξαν παρόμοια κρούσματα στη συνέχεια και όλα τα επιχρίσματα από το ορθό που συλλέχθηκαν από διαρροϊκά καθαρόαιμα πουλάρια ήταν αρνητικά. Επιπλέον, μόνο το 2,5% των επιχρισμάτων ορθού που συλλέχθηκαν από υγιή πουλάρια στη μεγαλύτερη περιοχή εκτροφής αλόγων καθαρόαιμων στην Ιαπωνία ήταν θετικά για ECoV [13] . Στη Γαλλία, το 2,8% από τα 395 δείγματα κοπράνων και το 0,5% από τα 200 αναπνευστικά δείγματα που συλλέχθηκαν σε 58 κομητείες βρέθηκαν θετικά στον ECoV [9] . Παρόμοια με τις αναφορές από την Ιαπωνία και τη Γαλλία, χαμηλός επιπολασμός του ECoV παρατηρήθηκε επίσης στο Ηνωμένο Βασίλειο [14] , τη Σαουδική Αραβία και το Ομάν [15] . Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να διερευνήσει την παρουσία του ECoV σε κλινικά δείγματα που υποβλήθηκαν σε διαγνωστικό εργαστήριο στην Ιρλανδία. Τα δείγματα δοκιμάστηκαν με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής σε πραγματικό χρόνο (rRT-PCR) καθώς έχει αποδειχθεί ότι είναι η πιο ευαίσθητη διαγνωστική μέθοδος για τον ECoV [16] και χρησιμοποιείται συστηματικά ως εναλλακτική λύση στην απομόνωση του ιού σε διαγνωστικά εργαστήρια παγκοσμίως. τόσο για έγκαιρη διάγνωση όσο και σε επιδημιολογικές μελέτες [9, 10] . Η απομόνωση του ιού και ο βιολογικός χαρακτηρισμός ήταν πέρα ​​από τις δυνατότητες αυτής της μελέτης, η οποία ήταν παρόμοια σε εύρος με αυτή των μελετών σε πληθυσμούς αλόγων στις ΗΠΑ, την Ευρώπη και την Ασία [8, 9, 13, 14]. Ο προσδιορισμός rRT-PCR πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως χρησιμοποιώντας ένα σύνολο εκκινητών που στοχεύει το γονίδιο του νουκλεοκαψιδίου (N) (ECoV-380f, ECoV-522r και ECoV-436p) [3] (Πίνακας 1) και AgPath-ID One-Step RT- Kit PCR (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για να αποδειχθεί ότι η εκχύλιση ήταν επιτυχής και ότι δεν υπήρξε αναστολή κατά την ενίσχυση rRT-PCR, ένας εσωτερικός θετικός εκκινητής/ανιχνευτής ελέγχου (PrimerDesign, Southampton, UK) προστέθηκε στο κύριο μείγμα. Οι συνθήκες θερμικού κύκλου ήταν? 48 • C για 10 λεπτά και 95 • C για 10 λεπτά, ακολουθούμενο από 40 κύκλους στους 94 • C για 15 δευτερόλεπτα και 60 • C για 45 δευτερόλεπτα. Το SuperScript III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelity (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση αλληλουχίας δύο από τα πέντε δείγματα ECoV που εντοπίστηκαν. Υπήρχε ανεπαρκές ιικό νουκλεϊκό οξύ στα άλλα τρία δείγματα για προσδιορισμό αλληλουχίας. Τα σετ εκκινητών που χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση του γονιδίου του νουκλεοκαψιδίου (Ν) [4], του γονιδίου μερικής ακίδας (S) [9] και της περιοχής από τα γονίδια p4.7 έως p12.7 μη δομικών πρωτεϊνών (Oue, προσωπική επικοινωνία ) φαίνονται στον Πίνακα 1. Η αλληλουχία των προϊόντων RT-PCR έγινε εμπορικά από την GATC Biotech (Κολωνία, Γερμανία). Η ανάλυση αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τα προγράμματα BLAST και CLUSTALW και το λογισμικό Vector NTI Advance 11.5 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA). Η φυλογενετική ανάλυση των αλληλουχιών νουκλεοτιδίων διεξήχθη με το λογισμικό MEGA Έκδοση 5.2 [17] . Κατασκευάστηκε ένα φυλογενετικό δέντρο με βάση νουκλεοτιδικές αλληλουχίες του K2+G (γονίδιο N) και TN93 (γονίδιο S) χρησιμοποιώντας τη μέθοδο μέγιστης πιθανότητας. Το λογισμικό MEGA χρησιμοποιήθηκε για την επιλογή των βέλτιστων μοντέλων υποκατάστασης. Η στατιστική ανάλυση του δέντρου πραγματοποιήθηκε με τη δοκιμή bootstrap (1000 επαναλήψεις) για πολλαπλές ευθυγραμμίσεις. Οι πλήρεις αλληλουχίες γονιδιώματος των NC99 (EF446615) [2] , Tokachi09 (LC061272), Obihiro12-1 (LC061273) και Obihiro12-2 (LC061274) [1] , το N (AB671298) και S. N γονίδιο του Hidaka-No.61/2012 (LC054263) και Hidaka-No.119/2012 (LC054264) [13] , το γονίδιο S του ECoV_FRA_2011/1 (KC178705), ECoV_FRA_2011117/2017/2011/2017/2011/2011/2011/2012FRA KC178703), ECoV_FRA_2012/2 (KC178702) και ECoV_FRA_2012/3 (KC178701) [9] χρησιμοποιήθηκαν σε ανάλυση αλληλουχίας ή/και φυλογενετικής ανάλυσης. Οι αριθμοί προσχώρησης που καταχωρήθηκαν στο GenBank/EMBL/DDBJ είναι οι ακόλουθες ; 11V11708/IRL (LC149485) και 13V08313/IRL (LC149486), οι μερικές αλληλουχίες του γονιδίου S. 11V11708/IRL (LC149487) και 13V08313/IRL (LC149488) και τις πλήρεις αλληλουχίες από τα γονίδια p4.7 έως p12.7. 11V11708/IRL (LC149489) και 13V08313/IRL (LC149490). Ένα πουλάρι έξι εβδομάδων ήταν το μόνο κλινικό περιστατικό σε μια δημόσια φάρμα με 30 φοράδες περίπου όταν παρουσίασε διάρροια. Η ανάρρωση διήρκεσε τρεις εβδομάδες κατά τη διάρκεια των οποίων έλαβε θεραπεία με υγρά, προβιοτικά, φάρμακα κατά του έλκους και αντιβιοτικά. Το δεύτερο πουλάρι ήταν 14 ημερών, το οποίο είχε νοσηλευτεί με διάρροια δύο ημέρες πριν από τη συλλογή του δείγματος. Το πουλάρι ανταποκρίθηκε καλά στην υποστηρικτική θεραπεία και τη στιγμή της συλλογής του δείγματος, η διάρροια είχε υποχωρήσει. Τα πέντε θετικά ECoV δείγματα ήταν αρνητικά για ροταϊό ιπποειδών. Οι αλληλουχίες νουκλεοτιδίων του πλήρους γονιδίου Ν, του μερικού γονιδίου S και η περιοχή από τα γονίδια p4.7 έως p12.7 δύο θετικών δειγμάτων (11V11708/IRL/2011 και 13V08313/ IRL/2013) καθορίστηκαν. Οι ταυτότητες νουκλεοτιδίων των γονιδίων N και S των δύο ιρλανδικών ECoV ήταν 99,8% (1338/1341 νουκλεοτίδια) και 99,5% (650/653 νουκλεοτίδια), αντίστοιχα. Οι ταυτότητες νουκλεοτιδίων του γονιδίου Ν των δύο ιρλανδικών ECoV και των ECoV από άλλες ηπείρους συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Πραγματοποιήθηκε φυλογενετική ανάλυση για τις αλληλουχίες νουκλεοτιδίων του πλήρους γονιδίου N και του μερικού S (Εικόνα 1). Η ανάλυση για το γονίδιο N έδειξε ότι τα ιρλανδικά ECoV συγκεντρώθηκαν ανεξάρτητα αν και σχετίζονταν στενά με ιαπωνικούς ιούς που εντοπίστηκαν μετά το 2009. Στο φυλογενετικό δέντρο του γονιδίου S, τα ιρλανδικά ECoV σχετίζονταν στενά με όλα τα άλλα ECoV που αναλύθηκαν. Το μήκος της περιοχής από τα γονίδια p4.7 έως p12.7 στους δύο ιούς ήταν 544 ζεύγη βάσεων. Σε σύγκριση με το NC99, τα ιρλανδικά ECoVs είχαν συνολικά 37 διαγραφές νουκλεοτιδίων εντός του p4.7 και της μη κωδικοποιητικής περιοχής μετά το γονίδιο p4.7. Σε σύγκριση με το Obihiro 12-1 και 12-2, τα ιρλανδικά ECoV είχαν παρεμβολή τριών νουκλεοτιδίων. Σε σύγκριση με το Tokachi09, τα ιρλανδικά ECoV είχαν εισαγωγή 148 νουκλεοτιδίων (βλ. Εικόνα S1). Το γονίδιο p12.7 των δύο ιρλανδικών ECoV δεν είχε διαγραφές ή παρεμβολές και οι ταυτότητες νουκλεοτιδίων ήταν 98,8-99,7% μεταξύ αυτών των ιών και των άλλων ECoV (NC99, Tokachi09, Obihiro12-1 και Obihiro12-2). Αυτή η μελέτη παρέχει την πρώτη αναφορά του ECoV που κυκλοφορεί στην Ιρλανδία, την τρίτη ευρωπαϊκή χώρα με σημαντική βιομηχανία αλόγων όπου ο ιός έχει ανιχνευθεί σε άλογα με εντερική νόσο. Ωστόσο, η ανίχνευση του ECoV σε δείγματα κοπράνων από άλογα με εντερική νόσο δεν αποδεικνύεται. Ωστόσο, η ανίχνευση του ECoV σε δείγματα κοπράνων από άλογα με εντερική νόσο δεν αποδεικνύει αιτιολογία. Σε αυτή τη μελέτη, εξετάστηκαν 424 δείγματα που συλλέχθηκαν μεταξύ 2011 και 2015 από ιπποειδή με εντερική νόσο και μόνο πέντε δείγματα (1,2%) ήταν θετικά για ECoV. Η συμπερίληψη ενός εσωτερικού θετικού μάρτυρα στην rRT-PCR εξαλείφει την πιθανότητα ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων λόγω της παρουσίας αναστολέων PCR, αλλά η υψηλή περιεκτικότητα σε νουκλεάσες που σχετίζονται με δείγματα κοπράνων μπορεί να έχει προκαλέσει κάποια υποβάθμιση του RNA. Ωστόσο, αυτός ο χαμηλός επιπολασμός του ECoV είναι παρόμοιος με αυτόν που εντοπίστηκε στη Γαλλία [9] και στα καθαρόαιμα πουλάρια στην Ιαπωνία [13] . Αν και ο ECoV έχει εντοπιστεί σε τρεις ηπείρους, λίγα είναι γνωστά για τη γενετική και παθογόνο ποικιλότητα στους ιούς των αγρών. Σε αυτή τη μελέτη, η αλληλουχία και η φυλογενετική ανάλυση (Εικόνα 1) κατέδειξαν υψηλό επίπεδο ομολογίας μεταξύ των ιών που ανιχνεύθηκαν σε έναν γάιδαρο και ένα άλογο σε δύο επαρχίες της Ιρλανδίας σε διαφορετικά έτη. Αυτό υποδηλώνει ότι τα ιρλανδικά ECoV μπορεί να έχουν χαμηλή γενετική ποικιλότητα. Σε σύγκριση με τα ECoV άλλων χωρών, τα γονίδια N, S και p12.7 των δύο ιρλανδικών ιών ήταν εξαιρετικά διατηρημένα. Αντίθετα, η περιοχή από το ρ4.7 και η μη κωδικοποιητική περιοχή που ακολουθεί το γονίδιο ρ4.7 είχαν διαγραφές ή παρεμβολές (Σχήμα S1). Λόγω του πολυμορφισμού σε αυτή την περιοχή, αυτή η περιοχή θα μπορούσε να είναι χρήσιμη για επιδημιολογική έρευνα [5] . Οι διαφορές στην περιοχή p4.7 μεταξύ των ιρλανδικών ECoV και άλλων ECoV έδειξαν ότι οι ιοί στην Ιρλανδία μπορεί να διακρίνονται από αυτούς που κυκλοφορούν σε άλλες χώρες. Τα θετικά δείγματα συλλέχθηκαν τον Νοέμβριο (1), τον Μάρτιο (1) και τον Απρίλιο (3) σε αυτή τη μελέτη. Μεγαλύτεροι αριθμοί κρουσμάτων εντοπίζονται στις ΗΠΑ κατά τους ψυχρότερους μήνες (Οκτώβριος έως Απρίλιος) [11] , και τα αποτελέσματά μας ήταν συνεπή με την περίοδο κυκλοφορίας στις ΗΠΑ. Έχει αναφερθεί ότι τα κρούσματα εκδηλώθηκαν κυρίως μεταξύ ενηλίκων ιππασίας, ιπποδρομιών και αλόγων επίδειξης στις ΗΠΑ [11] . Η επιλογή των περιπτώσεων που θα συμπεριληφθούν στην τρέχουσα μελέτη μπορεί να μην ήταν η βέλτιστη για την ανίχνευση του ECoV καθώς η πλειονότητα των δειγμάτων ήταν από πουλάρια. Ωστόσο, συλλέχθηκαν δύο θετικά δείγματα από ενήλικα άλογα σε μια αυλή συνδυασμένης σχολής ιππασίας/προβολής στη Δυτική Ιρλανδία. Κατά τη στιγμή της συλλογής του δείγματος τον Απρίλιο του 2013, οι μέσες μηνιαίες θερμοκρασίες ήταν κάτω από τον μακροπρόθεσμο μέσο όρο και σε μέρη της Δύσης, ήταν οι ψυχρότερες των τελευταίων 24 ετών [18] . Ο κρύος καιρός μπορεί να ήταν ένας προδιαθεσικός παράγοντας για τη μόλυνση από ECoV στο αγρόκτημα. Συλλέχθηκαν δύο θετικά δείγματα από καθαρόαιμα πουλάρια. Ένα δείγμα κοπράνων που συλλέχθηκε από ένα πουλάρι με σοβαρή υδαρή διάρροια και ανορεξία ήταν θετικό για ECoV, αλλά ένα δείγμα που συλλέχθηκε τρεις ημέρες αργότερα ήταν αρνητικό. Μια πιθανή δυσκολία στην ανίχνευση του ECoV από φυσικά μολυσμένα άλογα έχει σημειωθεί προηγουμένως καθώς σειριακά δείγματα από επτά άρρωστα άλογα στις ΗΠΑ πρότειναν ότι ο ECoV παρέμεινε μόνο για τρεις έως εννέα ημέρες στα κόπρανα [3] . Και στις δύο περιπτώσεις, η διάρροια μπορεί να έχει προκληθεί από άλλα μη ταυτοποιημένα παθογόνα, όπως έχει προταθεί από ερευνητές στις ΗΠΑ [12] . Αυτή είναι η πρώτη αναφορά ανίχνευσης ECoV σε δείγματα κοπράνων τόσο από πουλάρια όσο και από ενήλικα άλογα στην Ιρλανδία. Οι ιοί που εντοπίστηκαν στην Ιρλανδία σχετίζονται γενετικά στενά με τους ιαπωνικούς ιούς και τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης δεν παρέχουν καμία ένδειξη σημαντικής γενετικής ή φαινοτυπικής ποικιλομορφίας. Τα τελευταία χρόνια, έχει σημειωθεί αύξηση της ευαισθητοποίησης και των δοκιμών για τον ECoV στις ΗΠΑ και αλλού [10] . Οι δραστηριότητες εκτροφής αλόγων και ιπποδρομιών στην Ιρλανδία είναι οι πιο εξέχουσες και σημαντικές από οποιαδήποτε χώρα σε κατά κεφαλήν βάση. Υπάρχουν πάνω από 50 καθαρόαιμα άλογα ανά 10.000 πληθυσμού στην Ιρλανδία, σε σύγκριση με τρία έως πέντε για τη Μεγάλη Βρετανία, τη Γαλλία και τις ΗΠΑ [19] . Έτσι, μια έρευνα του ECoV στην Ιρλανδία είναι κατάλληλη όχι μόνο για την αύξηση της ευαισθητοποίησης σε εθνικό επίπεδο σχετικά με την επιδημιολογία του ιού και την προώθηση της συζήτησης σχετικά με την κλινική σημασία του, αλλά και για την ενημέρωση της βιομηχανίας παγκοσμίως για την κατάσταση της υγείας των ιρλανδικών αλόγων. Η Ιρλανδία εξάγει άλογα σε όλο τον κόσμο. Ενδεικτικά, το 2016 η χώρα ήταν ο δεύτερος μεγαλύτερος πωλητής αίματος σε δημόσιες δημοπρασίες, δεύτερη μόνο στις ΗΠΑ [19] .Πολλά ερωτήματα εξακολουθούν να υφίστανται όσον αφορά την κλινική σημασία του ECoV. Το ξέσπασμα σε μια ιπποδρομία βυθίσματος αλόγων στην Ιαπωνία το 2009 επηρέασε 132 από περίπου 600 άλογα και οδήγησε σε μη εκκινητές και την εφαρμογή περιορισμών κίνησης [4] . Ωστόσο, τα άλογα έλξης φαίνεται να έχουν υψηλότερο ποσοστό μόλυνσης από άλλες ράτσες και δεν έχει αναφερθεί ξέσπασμα παρόμοιας σοβαρότητας σε άλογα ιπποδρομιών Thoroughbred [10, 20] . Η πολύ μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης καθαρόαιμων πουλαριών θετικών ECoV που εντοπίστηκαν στο Κεντάκι σε σύγκριση με παρόμοιους πληθυσμούς διεθνώς υποδηλώνει αυξημένη ευαισθησία στη μόλυνση από ECoV σε αυτόν τον πληθυσμό. Στο παρελθόν, συγκεκριμένοι περιβαλλοντικοί παράγοντες σχετίζονταν με εκτεταμένη απώλεια αναπαραγωγής στην περιοχή του Κεντάκι και σε μικρότερο βαθμό σε άλλες πολιτείες [21], αλλά προδιαθεσικοί περιφερειακοί παράγοντες όπως διαφορές στη διαχείριση, το περιβάλλον ή την εκτροφή δεν έχουν εντοπιστεί για τον ECoV. Έχει προταθεί ότι ο ECoV είναι ένας παράγοντας ταυτόχρονης μόλυνσης σε πουλάρια με διάρροια και κλινικές λοιμώξεις έχουν αναφερθεί κυρίως σε ενήλικα άλογα με μονο-μόλυνση με EcoV [10] . Δεν υπήρχε καμία ένδειξη από τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης ότι ο κορωνοϊός είναι η κύρια αιτία διάρροιας στα ιρλανδικά άλογα, αλλά η εισαγωγή της rRT-PCR ως συνηθισμένης διαγνωστικής εξέτασης θα βοηθήσει στην αποσαφήνιση της σημασίας αυτού του ιού για την ιρλανδική αναπαραγωγή, τους αγώνες και τον αθλητισμό. βιομηχανίες. Η κύρια εστίαση στο μέλλον θα είναι στη δοκιμή ενήλικων αλόγων που παρουσιάζουν ανορεξία, λήθαργο, πυρετό και αλλαγές στον χαρακτήρα των κοπράνων καθώς έχει αποδειχθεί σημαντική συσχέτιση μεταξύ αυτής της κλινικής κατάστασης και της μοριακής ανίχνευσης του ECoV στα κόπρανα [11] .", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 9004, "text": "544 ζεύγη βάσεων" } ], "id": 2125, "question": "Ποια είναι η απόσταση μεταξύ των γονιδίων p4.7 και p12.7 στις παραλλαγές του κορωνοϊού Ιρλανδίας έναντι Ιαπωνικού ιπποειδούς;" }, { "answers": [ { "answer_start": 10778, "text": "υψηλό επίπεδο ομολογίας μεταξύ των ιών" } ], "id": 2127, "question": "Τι υποδηλώνει ότι οι κοροναϊοί των ιπποειδών της Ιρλανδίας μπορεί να έχουν χαμηλή γενετική ποικιλότητα;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Επίπτωση κοκκύτη με βάση τον πληθυσμό και παράγοντες κινδύνου σε βρέφη κάτω των 6 μηνών στο Νεπάλhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5907881/SHA: ef821e34873d4752ecae41cdachelute2000000000000000000000000000000000000000000000000; Englund, Janet A; Kuypers, Jane; Tielsch, James M; Khatry, Subarna K; Shrestha, Laxman; LeClerq, Steven C; Steinhoff, Mark; Katz, JoanneΗμερομηνία: 2017-03-01DOI: 10.1093/jpids/piw079Άδεια: cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Ο κοκκύτης εκτιμάται ότι προκαλεί το 2 τοις εκατό των παιδικών θανάτων παγκοσμίως και είναι ένα αυξανόμενο πρόβλημα δημόσιας υγείας στις ανεπτυγμένες χώρες παρά τον υψηλό εμβολιασμό. Τα βρέφη διατρέχουν τον μεγαλύτερο κίνδυνο νοσηρότητας και θνησιμότητας. Ο μητρικός εμβολιασμός κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης μπορεί να είναι αποτελεσματικός για την πρόληψη του κοκκύτη σε μικρά βρέφη, αλλά δεν υπάρχουν εκτιμήσεις βάσει πληθυσμού για την επιβάρυνση της νόσου στα βρέφη, ιδιαίτερα σε χώρες χαμηλού εισοδήματος. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν η εκτίμηση της επίπτωσης του κοκκύτη σε βρέφη ηλικίας μικρότερης των 6 μηνών στην περιφέρεια Sarlahi του Νεπάλ. ΜΕΘΟΔΟΙ: Σε μια τυχαιοποιημένη ελεγχόμενη δοκιμή εμβολιασμού κατά της γρίπης βάσει πληθυσμού, τα βρέφη επισκέπτονταν εβδομαδιαία από τη γέννηση έως τους 6 μήνες για να αξιολογηθεί η αναπνευστική νόσος την προηγούμενη εβδομάδα. Εάν είχαν εμφανιστεί οποιαδήποτε αναπνευστικά συμπτώματα, συλλέχθηκε ένα ρινικό επίχρισμα και δοκιμάστηκε με μια δοκιμασία αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πολυμεράσης πολλαπλών στόχων (PCR). Η προοπτική μελέτη κοόρτης περιλαμβάνει βρέφη που παρατηρήθηκαν μεταξύ Μαΐου 2011 και Αυγούστου 2014. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Η επίπτωση της επιβεβαιωμένης με PCR Bordetella pertussis ήταν 13,3 περιπτώσεις ανά 1000 βρεφικά έτη (95% διάστημα εμπιστοσύνης, 7,7–21,3) σε μια ομάδα 3483 βρεφών με τουλάχιστον 1 ημέρα παρακολούθησης. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Σε μια ενεργή κατ' οίκον επιτήρηση βάσει πληθυσμού για αναπνευστικές ασθένειες, εκτιμήθηκε χαμηλός κίνδυνος για κοκκύτη μεταξύ των βρεφών στην αγροτική περιοχή του Νεπάλ. Το πρόγραμμα ανοσοποίησης του Νεπάλ, το οποίο περιλαμβάνει ένα ολοκυτταρικό εμβόλιο κατά του κοκκύτη στην παιδική ηλικία, μπορεί να είναι αποτελεσματικό στον έλεγχο του κοκκύτη στα βρέφη. Κείμενο: Σε αρκετές χώρες έχει εμφανιστεί αναζωπύρωση του κοκκύτη σε όλες τις ηλικιακές ομάδες τα τελευταία χρόνια [1] . Οι χώρες μεσαίου και υψηλού εισοδήματος που χρησιμοποιούν ακυτταρικό εμβόλιο κοκκύτη για τη σειρά αρχικών εμβολιασμών έχουν πληγεί ιδιαίτερα [2, 3] και τα βρέφη και οι έφηβοι έχουν βιώσει τη μεγαλύτερη αύξηση [4]. Παράγοντες που μπορεί να συμβάλλουν στον αυξημένο κίνδυνο κοκκύτη περιλαμβάνουν την ταχεία εξασθένηση της ανοσίας από όσους εμβολιάστηκαν με ακυτταρικά εμβόλια [1, 5, 6], η ασυμπτωματική μετάδοση από άτομα που έχουν εμβολιαστεί με ακυτταρικά εμβόλια [7], η γενετική προσαρμογή του Bordetella pertussis [8] , ο εμβολιασμός καθυστέρηση ή άρνηση [9] , βελτιωμένη επιτήρηση και εργαστηριακές ικανότητες [2] , και γενικά αυξημένη ευαισθητοποίηση για τη συνεχιζόμενη κυκλοφορία του Β κοκκύτη [1] . Ορισμένες χώρες που αντιμετωπίζουν επιδημικό κοκκύτη, συμπεριλαμβανομένων των Ηνωμένων Πολιτειών, του Ηνωμένου Βασιλείου και της Αργεντινής, συνιστούν πλέον ανοσοποίηση κατά του κοκκύτη στην εγκυμοσύνη και εμβολιασμό στενών επαφών [10, 11] για την προστασία των νεότερων βρεφών από τον κοκκύτη προτού μπορέσουν να εμβολιαστούν τα ίδια [12] . Πρόσφατα δεδομένα από δοκιμές μητρικού εμβολιασμού καταδεικνύουν την ικανότητα των αντισωμάτων να μεταφέρονται από τις μητέρες στα βρέφη τους κατά την εγκυμοσύνη και την επιμονή τους στα βρέφη [13] . Οι παγκόσμιες εκτιμήσεις για τον κοκκύτη δείχνουν την υψηλότερη παιδική επιβάρυνση στη Νοτιοανατολική Ασία [14] . Σε αυτήν την περιοχή, ο μητρικός εμβολιασμός κατά του κοκκύτη κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης μπορεί να είναι ένας τρόπος προστασίας των βρεφών, παρόμοιος με την προσέγγιση που χρησιμοποιεί το εμβόλιο κατά του τοξοειδούς τετάνου. Ωστόσο, παγκοσμίως έχει πραγματοποιηθεί μόνο 1 εκτίμηση του κοκκύτη με βάση τον πληθυσμό σε βρέφη από τη γέννηση (Σενεγάλη) [15] , και οι δυνατότητες επιτήρησης και εργαστηρίου στην Ασία λείπουν [16, 17] . Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (ΠΟΥ) πρόσφατα συνέστησε στις χώρες που χρησιμοποιούν ολοκυτταρικά εμβόλια κοκκύτη να συνεχίσουν να το κάνουν υπό το φως πρόσφατων δεδομένων που δείχνουν ότι τα ακυτταρικά εμβόλια κοκκύτη είναι λιγότερο αποτελεσματικά από τα ολοκυτταρικά εμβόλια κοκκύτη [18] . Απαιτούνται δεδομένα με βάση τον πληθυσμό, ειδικά σε περιβάλλοντα χαμηλού εισοδήματος, για να παρέχουν μια πιο ακριβή εκτίμηση της επιβάρυνσης του κοκκύτη στα βρέφη για την ενημέρωση των πολιτικών ανοσοποίησης της παιδικής ηλικίας και της μητέρας [19, 20]. Αναφέρουμε μια προοπτική μελέτη κοόρτης μετά από βρέφη κάθε εβδομάδα στα σπίτια τους για την παρακολούθηση της νόσου του κοκκύτη από τη γέννηση έως την ηλικία των 6 μηνών. Ο στόχος ήταν να παράσχει μια εκτίμηση βάσει πληθυσμού της εργαστηριακά επιβεβαιωμένης επίπτωσης κοκκύτη σε βρέφη ηλικίας μικρότερης των 6 μηνών στην περιοχή Sarlahi, Νεπάλ. Η μελέτη ενσωματώθηκε σε 2 διαδοχικές τυχαιοποιημένες ελεγχόμενες δοκιμές εμβολιασμού της μητρικής γρίπης κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης που ορίστηκαν στο Περιοχή Sarlahi, που βρίσκεται στην κεντρική περιοχή Terai (χαμηλές πεδιάδες) του Νεπάλ [21] . Στην αρχή της δοκιμής, οι επικρατούσες εγκυμοσύνες εντοπίστηκαν μέσω απογραφής όλων των νοικοκυριών στη λεκάνη απορροής. Κατά τη διάρκεια της δοκιμής, οι εργαζόμενοι στον αγρό επισκέπτονταν όλα τα νοικοκυριά στις κοινότητες, κάθε 5 εβδομάδες, όπου διέμεναν παντρεμένες γυναίκες (15-40 ετών), για επιτήρηση περιστατικών κυήσεων. Μόλις διαπιστώθηκε μια εγκυμοσύνη, οι γυναίκες έδωσαν τη συγκατάθεσή τους και εγγράφηκαν. Από τις 25 Απριλίου 2011 έως τις 9 Σεπτεμβρίου 2013, οι γυναίκες μεταξύ 17 και 34 εβδομάδων κύησης τυχαιοποιήθηκαν και εμβολιάστηκαν είτε με εμβόλιο γρίπης είτε με εικονικό φάρμακο. Η μελέτη ήταν μια βασισμένη στον πληθυσμό προοπτική κοόρτη βρεφών που παρακολουθήθηκαν από τη γέννηση έως 6 μήνες μετά τον τοκετό. Έγκριση για τη μελέτη λήφθηκε από τις Επιτροπές Θεσμικής Ανασκόπησης της Σχολής Δημόσιας Υγείας Johns Hopkins Bloomberg, το Παιδικό Ιατρικό Κέντρο του Σινσινάτι, το Ινστιτούτο Ιατρικής στο Πανεπιστήμιο Tribhuvan του Κατμαντού και το Συμβούλιο Ερευνών Υγείας του Νεπάλ. Οι δοκιμές είναι καταχωρημένες στο Clinicaltrials.gov (NCT01034254). Στην αρχή, συλλέχθηκαν πληροφορίες σχετικά με τη δομή του νοικοκυριού, την κοινωνικοοικονομική κατάσταση και τα δημογραφικά στοιχεία. Κατά την εγγραφή, συλλέχθηκαν δεδομένα ημερομηνίας τελευταίας εμμήνου ρύσεως και ιστορικού εγκυμοσύνης. Το συντομότερο δυνατό μετά τον τοκετό, η μητέρα και το βρέφος επισκέφθηκαν για τη συλλογή λεπτομερών πληροφοριών γέννησης, συμπεριλαμβανομένου του βάρους του βρέφους και της κατάστασης του θηλασμού. Από τη γέννηση έως τους 6 μήνες, τα βρέφη μετά τον τοκετό επισκεπτόταν εβδομαδιαία εργαζόμενος στον αγρό, ο οποίος κατέγραψε τυχόν αναπνευστικά συμπτώματα των βρεφών τις τελευταίες 7 ημέρες. Εάν ένα βρέφος είχε οποιοδήποτε από τα ακόλουθα συμπτώματα, συλλέχθηκε ένα μάκτρο με νάιλον στη μέση της μύτης: πυρετός, βήχας, συριγμός, δυσκολία στην αναπνοή ή μόλυνση του αυτιού. Από τις 17 Αυγούστου 2012, νέα συμπτώματα, πιο ειδικά για τον κοκκύτη, προστέθηκαν στην εβδομαδιαία επίσκεψη νοσηρότητας: άπνοια, κυάνωση, βήχας με εμετό ή κοκκύτη. Τα επιχρίσματα αποθηκεύτηκαν για έως και 1 εβδομάδα σε θερμοκρασία δωματίου στο PrimeStore Molecular Transport Medium (Longhorn Diagnostics LLC, Bethesda, MD). Εκτός από αυτά τα σημάδια, οι μητέρες ρωτήθηκαν ποιοι, εάν υπήρχαν, βρεφικοί εμβολιασμοί έγιναν τις τελευταίες 7 ημέρες, συμπεριλαμβανομένου του εμβολιασμού κατά του κοκκύτη [22]. Συλλέγονταν επίσης ρινικά επιχρίσματα σε εβδομαδιαία βάση από μητέρες από την εγγραφή τους έως τους 6 μήνες μετά τον τοκετό που ανέφεραν πυρετό συν μία επιπλέον νοσηρότητα (βήχας, πονόλαιμος, ρινική συμφόρηση ή μυαλγία). Όλα τα ρινικά επιχρίσματα που συλλέχθηκαν από βρέφη δοκιμάστηκαν για B κοκκύτη, Bordetella parapertussis και Bordetella bronchispetica. Μόνο τα ρινικά επιχρίσματα μητέρων των οποίων τα βρέφη ήταν θετικά για οποιοδήποτε από αυτά τα παθογόνα δοκιμάστηκαν για τα ίδια παθογόνα. Η δοκιμή αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (PCR) διεξήχθη στο Εργαστήριο Μοριακής Ιολογίας του Πανεπιστημίου της Ουάσιγκτον σύμφωνα με προηγούμενα δημοσιευμένες μεθόδους [23] . Χρησιμοποιήθηκε PCR δύο στόχων για την αξιολόγηση της παρουσίας 3 ειδών Bordetella: B pertussis, B parapertussis και B bronchiseptica. Οι ενισχυμένοι στόχοι ήταν η χρωμοσωμική αλληλουχία επαναλαμβανόμενης εισαγωγής IS481 (IS) και η πολυμορφική τοξίνη κοκκύτη ptxA περιοχή προαγωγέα (PT). Μετά την ενίσχυση, τα σημεία τήξης των αμπλικονίων μετρήθηκαν σε iCycler (Bio-Rad). Ένα δείγμα ερμηνεύτηκε ως θετικό όταν οι στόχοι είχαν θερμοκρασία τήξης εντός του αποδεκτού εύρους για το συγκεκριμένο είδος και υπολογιστική τομογραφία ≤42. Ένα δείγμα ήταν αρνητικό εάν κανένας από τους στόχους δεν ήταν θετικός ή ένας μόνο θετικός στόχος δεν ήταν αναπαραγόμενος. Τα μητρικά ρινικά επιχρίσματα εξετάστηκαν για εκείνες τις μητέρες των οποίων τα βρέφη ήταν θετικά για οποιοδήποτε είδος Bordetella. Διενεργήθηκε επίσης αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης για αρκετές ιογενείς λοιμώξεις (γρίπη, ρινοϊός [RV], αναπνευστικός συγκυτιακός ιός [RSV], βοκαϊός [BoV], ανθρώπινος μεταπνευμοϊός, κορωνοϊός, αδενοϊός και παραγρίππη [1] [2] [3] [4] ) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21] . Από 3693 γυναίκες που εγγράφηκαν, 3646 βρέφη γεννήθηκαν ζωντανά από 3621 γυναίκες (Συμπληρωματικό Σχήμα 1). Τα βρέφη συμπεριλήφθηκαν σε αυτήν την ανάλυση εάν παρακολουθήθηκαν για οποιαδήποτε διάρκεια της περιόδου παρακολούθησης (0 έως 180 ημέρες). Η διάμεση συνολική παρακολούθηση ήταν 146 ημέρες ανά βρέφος (Συμπληρωματικό Σχήμα 2). Το τελικό σύνολο δεδομένων αποτελείται από 3483 βρέφη, συμβάλλοντας σε 1280 βρεφικά έτη παρατήρησης, με τουλάχιστον 1 επίσκεψη παρακολούθησης κατά τους πρώτους 6 μήνες. Αυτό περιλαμβάνει βρέφη από ολόκληρη τη δοκιμαστική περίοδο, τόσο πριν όσο και μετά από περισσότερες ειδικές για τον κοκκύτη προσθήκες στο εβδομαδιαίο ερωτηματολόγιο συμπτωμάτων. Στην αρχή, συγκεντρώθηκαν δεδομένα για τη δομή του νοικοκυριού. Κατά την εγγραφή, οι γυναίκες ανέφεραν την κατάσταση αλφαβητισμού (δυαδική) και το ιστορικό εγκυμοσύνης τους. Οι εργαζόμενοι στον αγρό προσδιόρισαν την εθνικότητα τους σε 2 μεγάλες ομάδες (Pahadi, μια ομάδα που προέρχεται από τους λόφους. ή Madeshi, μια ομάδα που προέρχεται από τη βόρεια Ινδία) από ονόματα και παρατήρηση. Οι γυναίκες κατηγοριοποιήθηκαν ως άτοκες ή πολύτοκες. Απαντήσεις σε 25 ερωτήσεις σχετικά με την κατασκευή νοικοκυριών, το νερό και την αποχέτευση και τα περιουσιακά στοιχεία των νοικοκυριών χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη ενός δείκτη για τη μέτρηση της κοινωνικοοικονομικής κατάστασης των νοικοκυριών. Οι δυαδικές μεταβλητές για καθεμία από τις 25 ερωτήσεις και μια μέση βαθμολογία SES υπολογίστηκαν για κάθε νοικοκυριό. Η ηλικία κύησης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την αναφορά μιας γυναίκας για την ημερομηνία της τελευταίας εμμήνου ρύσεως κατά την επιτήρηση της εγκυμοσύνης. Το βάρος γέννησης συλλέχθηκε το συντομότερο δυνατό μετά τη γέννηση χρησιμοποιώντας μια ψηφιακή ζυγαριά (Tanita μοντέλο BD-585, ακρίβεια πλησιέστερα στα 10 γραμμάρια). Τα βάρη γέννησης που συλλέχθηκαν >72 ώρες μετά τη γέννηση εξαιρέθηκαν από την ανάλυση. Το Small για την ηλικία κύησης (SGA) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το όριο του 10ου εκατοστημόριου για το φύλο που περιγράφεται από τους Alexander et al [24] και τα πρότυπα INTERGROWTH-21 [25] . Οι γυναίκες ρωτήθηκαν μέσα σε πόσες ώρες από τη γέννηση ξεκίνησε ο θηλασμός και δημιουργήθηκαν κατηγορίες δυαδικού θηλασμού (≤1 ώρα έναντι >1 ώρα μετά τον τοκετό). Η επίπτωση υπολογίστηκε ως ο αριθμός των περιπτώσεων κοκκύτη ανά 1000 βρεφικά έτη σε κίνδυνο. Κατασκευάστηκαν διαστήματα εμπιστοσύνης 95% Poisson (CIs). Τα χαρακτηριστικά των περιπτώσεων βρεφικού κοκκύτη συγκρίθηκαν με περιπτώσεις μη κοκκύτη χρησιμοποιώντας διμεταβλητή παλινδρόμηση Poisson. Τα χαρακτηριστικά όλων των αναπνευστικών επεισοδίων του κοκκύτη συγκρίθηκαν με τα μη κοκκύτικα αναπνευστικά επεισόδια. Τα τεστ t χρησιμοποιήθηκαν για συνεχείς προγνωστικούς παράγοντες και τα ακριβή τεστ Fisher χρησιμοποιήθηκαν για κατηγορικές συσχετίσεις λόγω του μικρού αριθμού επεισοδίων κοκκύτη. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις διεξήχθησαν στο Stata/SE 14.1. Συνολικά 3483 βρέφη είχαν 4283 επεισόδια αναπνευστικής νόσου μεταξύ 18 Μαΐου 2011 και 30 Απριλίου 2014. Τριάντα εννέα τοις εκατό (n = 1350) των βρεφών δεν παρουσίασαν αναπνευστικά επεισόδια. Η επίπτωση της αναπνευστικής νόσου ήταν 3,6 επεισόδια ανά βρέφος-έτος (95% CI, 3,5-3,7). Η μέση διάρκεια επεισοδίου ήταν 4,7 ημέρες (95% CI, 4,6-4,9). Συνολικά 3930 (92%) επεισόδια αντιστοιχίστηκαν με 1 ή περισσότερα ρινικά επιχρίσματα που δοκιμάστηκαν με κοκκύτη από 2026 βρέφη (Συμπληρωματικό Σχήμα 1). Δεκαεπτά περιπτώσεις Β κοκκύτη εντοπίστηκαν από 19 ρινικά επιχρίσματα (τα ρινικά επιχρίσματα ήταν θετικά για 2 συνεχόμενες εβδομάδες 2 βρέφη). Η επίπτωση του επιβεβαιωμένου με PCR Β κοκκύτη ήταν 13,3 περιπτώσεις ανά 1000 βρεφικά έτη (95% CI, 7,7-21,3). Ανιχνεύθηκαν πέντε περιπτώσεις Β parapertussis με συχνότητα εμφάνισης 3,9 περιπτώσεων ανά 1000 βρεφικά έτη (95% CI, 1,3-9,1). Δεν εντοπίστηκαν περιπτώσεις B bronchiseptica. Η μέση διάρκεια επεισοδίου κοκκύτη ήταν 8 ημέρες (εύρος, 2-33) (Πίνακας 1). Η μέση ηλικία έναρξης των συμπτωμάτων ήταν 83 ημέρες (εύρος, 19-137) (διάμεσος, 80; διατεταρτημόριο, 63-109). Τα πιο κοινά συμπτώματα ήταν βήχας, δυσκολία στην αναπνοή και βήχας με εμετό. Κανένα από τα πρόσθετα συμπτώματα που σχετίζονται με τον κοκκύτη που προστέθηκαν το έτος 2 (κυάνωση, άπνοια, βήχας με εμετό και κοκκύτη) δεν οδήγησε σε συλλογή ρινικών επιχρισμάτων με βάση μόνο αυτά τα πρόσθετα συμπτώματα. Τα επεισόδια κοκκύτη ήταν στατιστικά σημαντικά πιο πιθανό να περιλαμβάνουν δυσκολία στην αναπνοή, βήχα με εμετό και κοκκύτη σε σύγκριση με άλλες αναπνευστικές ασθένειες. Έξι βρέφη είχαν τουλάχιστον 1 εμβολιασμό κατά του κοκκύτη πριν από την εμφάνιση της νόσου του κοκκύτη (τρεις <2 εβδομάδες και τρεις >2 εβδομάδες πριν από την ασθένεια του κοκκύτη) με μέσο όρο 18 ημέρες από τον εμβολιασμό έως την ασθένεια σε σύγκριση με 49 ημέρες για τα επεισόδια μη κοκκύτη (P = 0,03). Πέντε βρέφη έλαβαν τον πρώτο τους εμβολιασμό κατά του κοκκύτη μετά την έναρξη της νόσου του κοκκύτη, ενώ 6 βρέφη δεν έλαβαν κανένα εμβόλιο κατά του κοκκύτη τις πρώτες 180 ημέρες. Τα τρία τέταρτα των επεισοδίων κοκκύτη μολύνθηκαν με τουλάχιστον 1 ιό, με τον RV και τον BoV τα πιο κοινά. Οι περιπτώσεις κοκκύτη ήταν πιο πιθανό να μολυνθούν από τον BoV από ό,τι οι αναπνευστικές περιπτώσεις λόγω άλλων αιτιών εκτός από τον κοκκύτη. Η πλειονότητα των περιπτώσεων σημειώθηκε μεταξύ Φεβρουαρίου 2013 και Ιανουαρίου 2014 (Εικόνα 1). Δεν τεκμηριώθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των παραγόντων κινδύνου για περιπτώσεις κοκκύτη και μη κοκκύτη (Πίνακας 2). Δεδομένου του μικρού αριθμού περιπτώσεων κοκκύτη, η έλλειψη στατιστικής συσχέτισης δεν αποτελεί ένδειξη μη συσχέτισης. Δεν σημειώθηκαν θάνατοι σε βρέφη που είχαν κοκκύτη. Από τις 8 μητέρες των βρεφών που είχαν θετικό στον κοκκύτη Β που είχαν συλλεχθεί ρινικό επίχρισμα (συνολικά 14 ρινικά επιχρίσματα) κατά τη διάρκεια της δικής τους παρακολούθησης, καμία δεν ήταν θετική για κανένα είδος κοκκύτη. εγγράμματος, και παχαντί εθνότητα (Συμπληρωματικός Πίνακας 1 ). Καμία μητέρα βρεφών που είχαν Β parapertussis δεν είχε συλλεχθεί ρινικό επίχρισμα κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης. Η μέση διάρκεια επεισοδίου B parapertussis ήταν 4 ημέρες (Συμπληρωματικός Πίνακας 2). Η μέση ηλικία έναρξης των συμπτωμάτων ήταν 58 ημέρες με εύρος 7-95 ημέρες. Τα πιο κοινά συμπτώματα ήταν ο βήχας και ο συριγμός. Ο ρινοϊός και ο RSV ήταν οι μόνες συνλοιμώξεις που παρατηρήθηκαν. Όλα τα περιστατικά Β παρακοίτη εμφανίστηκαν μεταξύ Σεπτεμβρίου 2011 και Φεβρουαρίου 2012 (Εικόνα 1). Μια χαμηλή συχνότητα εμφάνισης κοκκύτη και γενικά ήπια κλινική εικόνα βρέθηκε σε βρέφη <6 μηνών στο Νεπάλ. Από ό,τι γνωρίζουμε, αυτό αντιπροσωπεύει μια από τις πρώτες ενεργές επιτήρηση με βάση τον πληθυσμό του επιβεβαιωμένου με PCR κοκκύτη μεταξύ νεαρών βρεφών στην Ασία. Οι δοκιμές ακυτταρικού εμβολίου κοκκύτη που διεξήχθησαν τη δεκαετία του 1990 βρήκαν ότι η μέση συχνότητα εμφάνισης του κοκκύτη στις ολόκληρες ομάδες εμβολίων κυμαινόταν από 1 έως 37 περιπτώσεις ανά 1000 βρεφικά έτη [26]. Το εύρημα μας για 13 περιπτώσεις Β κοκκύτη ανά 1000 βρέφη βρισκόταν στο χαμηλότερο άκρο αυτού του εύρους. Στις Ηνωμένες Πολιτείες το 2014, η εκτιμώμενη συχνότητα εμφάνισης κοκκύτη σε βρέφη κάτω των 6 μηνών ήταν 2 περιπτώσεις ανά 1000 βρεφικά έτη [27], πολύ χαμηλότερη από αυτή που παρατηρήθηκε στη μελέτη μας. Ωστόσο, αυτό το σύστημα παθητικής επιτήρησης πιθανότατα υποτιμά πολύ τη συχνότητα εμφάνισης κοκκύτη. Επομένως, υπάρχει ανάγκη για δεδομένα ενεργητικής επιτήρησης όπως τα δικά μας. Επιπλέον, δεδομένης της εξαιρετικά ευαίσθητης μεθόδου μας για την ανίχνευση κρουσμάτων, πολλά από τα κρούσματα κοκκύτη πιθανότατα δεν θα είχαν ανιχνευθεί στις προηγούμενες δοκιμές ακυτταρικού εμβολίου κοκκύτη. Αυστηρότερα κριτήρια αναπνευστικών συμπτωμάτων θα μείωναν ακόμη περισσότερο την εκτίμηση της επίπτωσης. Η χαμηλή επίπτωση βρέθηκε σε πληθυσμό όπου το πενταδύναμο εμβόλιο (Pentavac: Διφθερίτιδα, Τέτανος, Κοκκύτης [Ολόκληρο Κύτταρο], Ηπατίτιδα-Β και Συζευγμένο εμβόλιο αιμόφιλου τύπου β. Serum Institute of India Pvt. Ltd), που έχει προγραμματιστεί για χορήγηση στις 6, 10 και 14 εβδομάδες, λαμβάνεται με σημαντικές καθυστερήσεις (7% των βρεφών έλαβαν και τα 3 συνιστώμενα εμβόλια κοκκύτη έως τους 6 μήνες) [22] . Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν τη σύσταση του ΠΟΥ ότι οι χώρες που χρησιμοποιούν ολοκυτταρικό εμβόλιο κοκκύτη να συνεχίσουν να το κάνουν, δεδομένου ότι η πλειονότητα των κρουσμάτων έχει συγκεντρωθεί σε χώρες που χρησιμοποιούν το ακυτταρικό εμβόλιο του κοκκύτη [2] . Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν ότι η προστασία από το ακυτταρικό εμβόλιο κοκκύτη δεν είναι τόσο ισχυρή ή μακροχρόνια όσο αυτή που παρέχεται από το ολοκυτταρικό εμβόλιο κοκκύτη [6, 28]. Ένας άλλος παράγοντας που συμβάλλει στη χαμηλή επίπτωση του κοκκύτη που παρατηρήθηκε θα μπορούσε να είναι ότι η επιτήρηση διεξήχθη κατά τη διάρκεια μιας περιόδου χαμηλή μετάδοση κοκκύτη. Ο κοκκύτης είναι μια κυκλική ασθένεια, που πιστεύεται ότι κορυφώνεται κάθε 2 έως 4 χρόνια και μπορεί να έχουμε συλλάβει το βάρος σε μια περίοδο χαμηλής κυκλοφορίας [6] . Παρατηρήσαμε πάνω από το 70% των περιπτώσεων Β κοκκύτη μας σε περίοδο 1 έτους. Αυτή η αύξηση από προηγούμενες περιόδους παρατήρησης θα μπορούσε να υποδεικνύει μια προσωρινή αύξηση του κοκκύτη σύμφωνα με το κυκλικό του πρότυπο ή μια πραγματική αύξηση της βασικής επιβάρυνσης. Προηγούμενη έρευνα σχετικά με την εποχικότητα του κοκκύτη σε διαφορετικούς τόπους και χρονικές περιόδους είχε δείξει διάφορες περιόδους αιχμής μετάδοσης ή καθόλου διακριτά μοτίβα [29, 30]. Παρόλο που τα δεδομένα μας δεν υποστηρίζουν εποχιακό μοτίβο, οι αριθμοί που παρατηρήθηκαν είναι πολύ χαμηλοί για να είναι οριστικοί. Η διάρκεια και η σοβαρότητα του συμπτώματος του κοκκύτη ήταν ήπιες σε σύγκριση με την κλασική παρουσίαση του περιστατικού κοκκύτη. Μόνο 3 από τις 17 περιπτώσεις πληρούσαν τα κριτήρια του ΠΟΥ, τα οποία απαιτούν τουλάχιστον 2 εβδομάδες βήχα, κοκκύτη ή μεταβηχικό έμετο [31] . Οι μελέτες για τον κοκκύτη σε βρέφη έχουν γενικά βασιστεί σε κλινικές, νοσοκομειακές ή σε ξέσπασμα, το οποίο επομένως απαιτούσε μια ορισμένη σοβαρότητα της ασθένειας για να αναγνωρίσουν οι γονείς την ανάγκη για ιατρική φροντίδα [29, 30, 32]. Επομένως, αυτοί οι σχεδιασμοί μελέτης και οι προσπάθειες παθητικής επιτήρησης μπορεί να έχουν χάσει πιο ήπιες περιπτώσεις κοκκύτη [33] . Η μελέτη μας, η οποία απαιτούσε μόνο 1 αναπνευστικό σύμπτωμα για τη συλλογή ρινικού επιχρίσματος, είχε αυξημένη ευαισθησία για την ανίχνευση μιας σειράς παρουσιάσεων περιπτώσεων κοκκύτη. Μια εναλλακτική εξήγηση για τις ήπιες περιπτώσεις που παρατηρήθηκαν θα μπορούσε να είναι η αύξηση του ποσοστού των ήπιων κρουσμάτων σε σύγκριση με τα σοβαρά περιστατικά κοκκύτη στο Νεπάλ. Αν και ο βήχας, η δυσκολία στην αναπνοή και ο βήχας με έμετο ήταν τα πιο κοινά συμπτώματα, κανένα σύμπτωμα δεν υπήρχε σε όλες τις περιπτώσεις Β κοκκύτη . Κατά τη διάρκεια μιας επιδημικής περιόδου στην πολιτεία της Ουάσιγκτον, μεταξύ βρεφών < 1 έτους, που είχαν τουλάχιστον 14 ημέρες βήχα συν ένα επιπλέον σύμπτωμα, το 82% είχε μεταβηχική έμετο, το 29% είχε άπνοια, το 26% είχε βουητό και το 42% είχε κυάνωση [32 ] . Μια μελέτη σε νεογνά στις ΗΠΑ με κοκκύτη έδειξε ότι ο επιπολασμός των συμπτωμάτων ήταν 97% για βήχα, 91% για κυάνωση, 58% για άπνοια και 3% για πυρετό [34] . Η μελέτη μας βρήκε χαμηλότερο ή ίσο επιπολασμό συμπτωμάτων με εξαίρεση τον πυρετό. Ο επιπολασμός πυρετού ήταν υψηλότερος στη μελέτη μας, παρόμοιος με αυτόν που βρέθηκε στο Περού [29] . Αν και δεν ήταν στατιστικά σημαντικά, τα βρέφη με κοκκύτη ήταν πιο πιθανό να είχαν γεννηθεί πρόωρα, χαμηλό βάρος γέννησης και SGA, και οι μητέρες τους ήταν πιο πιθανό να γεννηθούν πρωτότοκος. Αυτά τα ευρήματα είναι παρόμοια με προηγούμενες μελέτες που δεν έδειξαν διαφορά στις περιπτώσεις κοκκύτη ανά φύλο [29, 35, 36] ή συνωστισμό [35], αλλά έδειξαν διαφορές κατά βάρος γέννησης [36] . Οι συνλοιμώξεις ήταν συχνές, σύμφωνα με ευρήματα από άλλες μελέτες που βασίζονται σε νοσοκομεία [33]. Η συνανίχνευση του Β κοκκύτη και του Β parapertussis με ιούς του αναπνευστικού μπορεί να οφείλεται σε ασυμπτωματική μεταφορά κοκκύτη. Η συχνότητα εμφάνισης του B parapertussis 4 περιπτώσεων ανά 1000 ανθρωπο-έτη ήταν συγκρίσιμη με εκείνη των 2 ανά 1000 ανθρωπο-έτη που βρέθηκε στην ιταλική δοκιμή του ακυτταρικού εμβολίου κοκκύτη το 1992-1993 [37] . Η διάρκεια της νόσου ήταν μικρότερη για τον Β παρακοκκύτη με μέγιστη διάρκεια 6 ημέρες σε σύγκριση με το μέγιστο 33 ημέρες για τον Β παρακοκκύτη. Μια πιο ήπια εμφάνιση είναι σύμφωνη με την κλινική γνώση της λοίμωξης από Β parapertussis [37, 38]. Τα περιστατικά Bordetella parapertussis εμφανίστηκαν μόνο κατά τη διάρκεια μιας περιόδου 5 μηνών. Υπήρχαν αρκετοί περιορισμοί σχεδιασμού της μελέτης. Δεν μπορούμε να είμαστε σίγουροι εάν τα αναφερόμενα συμπτώματα προκλήθηκαν από κοκκύτη, άλλο οργανισμό ή εάν τα συμπτώματα σχετίζονται με 2 ή περισσότερους αιτιολογικούς παράγοντες. Δεν μπορέσαμε να πραγματοποιήσουμε πολυμεταβλητή μοντελοποίηση παλινδρόμησης για χαρακτηριστικά που σχετίζονται με τη νόσο του κοκκύτη και τα κρούσματα κοκκύτη λόγω του μικρού αριθμού περιπτώσεων που εντοπίσαμε. Αναφέρθηκαν βρεφικά αναπνευστικά συμπτώματα από γονείς, οι οποίοι μπορεί να έχασαν σημάδια που μπορεί να είχαν παρατηρηθεί από έναν εργαζόμενο στον τομέα της υγείας. Ωστόσο, τα κριτήρια για τη συλλογή του ρινικού επιχρίσματος ήταν ευρύ και δεν απαιτούσαν περίπλοκες κλινικές δεξιότητες. Ωστόσο, η άπνοια και η κυάνωση μπορεί να ήταν δύσκολο να αναγνωρίσουν οι γονείς. Αν και τα κριτήρια για τη συλλογή δειγμάτων άλλαξαν το έτος 2, κανένα βρέφος δεν εμφάνισε ένα σύμπτωμα που σχετίζεται με τον κοκκύτη μεμονωμένα χωρίς να έχει επίσης ένα από τα αρχικά καθορισμένα αναπνευστικά συμπτώματα. Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την υπόθεσή μας ότι ήταν απίθανο να χάσαμε περιπτώσεις κοκκύτη το έτος 1 με τα λιγότερο ευαίσθητα αναπνευστικά μας κριτήρια συμπτωμάτων. Συλλέχθηκαν ρινικά επιχρίσματα στη μεσαία περιοχή της μύτης για ανίχνευση του ιού της γρίπης, γεγονός που μπορεί να μείωσε την ευαισθησία της ανίχνευσης του κοκκύτη. Σε μια περιοχή πεδίου, η αποδοχή ενός επιπλέον ρινοφαρυγγικού στυλεού πιθανότατα θα είχε αυξήσει το ποσοστό άρνησης των συμμετεχόντων. Αυτό θα είχε μειώσει τη γενίκευση των αποτελεσμάτων μας σε ολόκληρο τον πληθυσμό. Αν και τα ρινοφαρυγγικά επιχρίσματα ή οι ρινοφαρυγγικές αναρροφήσεις είναι η συνιστώμενη μέθοδος συλλογής δειγμάτων [39] , η ρινοφαρυγγική περιοχή καθιερώθηκε ως η περιοχή συλλογής επιλογής όταν το διαγνωστικό μέτρο ήταν καλλιέργεια, η οποία έχει χαμηλή ευαισθησία. Πρόσφατα δεδομένα κατέδειξαν τη συγκρισιμότητα της χρήσης επιχρισμάτων μεσαίας μύτης και ρινοφαρυγγικών επιχρισμάτων για την ανίχνευση του κοκκύτη με PCR [40] . Τα πλεονεκτήματα της μελέτης περιελάμβαναν μια πληθυσμιακή, προοπτική μελέτη, με πολύ χαμηλά ποσοστά άρνησης. Οι παράγοντες κινδύνου, τα κλινικά συμπτώματα και οι συνλοιμώξεις εντοπίστηκαν μελλοντικά χωρίς την πιθανή μεροληψία που μπορεί να συμβεί όταν αυτά τα δεδομένα συλλέγονται αναδρομικά ή σε κλινικές συνθήκες. Ο σχεδιασμός που βασίζεται στην κοινότητα επιτρέπει τη γενίκευση αυτών των αποτελεσμάτων σε ολόκληρο τον πληθυσμό και όχι μόνο σε όσους αναζητούν φροντίδα σε μια μονάδα υγείας ή σε κατάσταση εστίας. Η περιφέρεια Sarlahi βρίσκεται στην περιοχή Terai όπου κατοικεί η πλειοψηφία των Νεπαλέζων και έχει παρόμοια δημογραφικά στοιχεία με ολόκληρο τον πληθυσμό του Νεπάλ [41] . Η τοποθεσία του Sarlahi κοντά στο επίπεδο της θάλασσας και στα σύνορα με την Ινδία υποστηρίζει τη γενίκευση αυτών των αποτελεσμάτων σε πολλούς πληθυσμούς που ζουν στην ινδική υποήπειρο. Η εβδομαδιαία ενεργή επιτήρηση με ευαίσθητα κριτήρια για τη δοκιμή κοκκύτη ήταν σε θέση να ανιχνεύσει ήπιες και άτυπες περιπτώσεις κοκκύτη, που μπορεί να είχαν χαθεί από την προηγούμενη παραδοσιακή επιτήρηση. Η μέθοδος PCR πολλαπλών στόχων επέτρεψε την εξαιρετικά ευαίσθητη και ειδική ανίχνευση 2 επιπλέον ειδών Bordetella πέρα ​​από τον πρωταρχικό στόχο του κοκκύτη. Παρατηρήσαμε χαμηλή συχνότητα εμφάνισης κοκκύτη σε βρέφη σε περιβάλλον ολοκυτταρικού εμβολίου. Οι περιπτώσεις κοκκύτη ήταν γενικά πιο ήπιες από το αναμενόμενο σε σύγκριση με τους παραδοσιακούς κλινικούς ορισμούς του κοκκύτη. Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν τους κλινικούς ιατρούς που εξετάζουν τον κοκκύτη στη διαφορική τους διάγνωση για βρέφη με ήπια αναπνευστικά συμπτώματα. Οι υπεύθυνοι χάραξης πολιτικής στο Νεπάλ θα πρέπει να σταθμίσουν το όφελος από ένα πρόσθετο προγεννητικό εμβόλιο κοκκύτη ή μια μετάβαση σε ακυτταρικό πρωτογενές εμβόλιο κοκκύτη με τη χαμηλή επιβάρυνση του κοκκύτη σε βρέφη κάτω των 6 μηνών. Η μελέτη μας έδειξε ότι τα μεσαία ρινικά επιχρίσματα ήταν σε θέση να ανιχνεύσουν τον κοκκύτη χρησιμοποιώντας μια ευαίσθητη PCR πολλαπλών στόχων. Το λιγότερο επεμβατικό μέσο ρινικού επιχρίσματος είναι μια ελκυστική εναλλακτική λύση για τη συλλογή ρινικού επιχρίσματος κοκκύτη και απαιτείται περαιτέρω έρευνα για τη σύγκριση αυτού του σημείου συλλογής με ρινοφαρυγγικά επιχρίσματα. Στο μέλλον, αυτή η μέθοδος μπορεί να ενισχύσει τις προσπάθειες παρακολούθησης βάσει πληθυσμού.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 3678, "text": "Νοτιοανατολική Ασία" } ], "id": 2168, "question": "Πού είναι το υψηλότερο ποσοστό παιδικού κοκκύτη παγκοσμίως;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4398, "text": "ολοκυτταρικά εμβόλια κοκκύτη" } ], "id": 2169, "question": "Ποιος τύπος εμβολίου κοκκύτη έχει προταθεί πρόσφατα από τον ΠΟΥ;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7290, "text": "άπνοια, κυάνωση, βήχας με εμετό ή κοκκύτη" } ], "id": 2170, "question": "Ποια είναι τα κλινικά συμπτώματα του κοκκύτη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 18248, "text": "κάθε 2 έως 4 χρόνια" } ], "id": 2173, "question": "Πόσο συχνά κορυφώνονται τα κρούσματα κοκκύτη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 19155, "text": "τουλάχιστον 2 εβδομάδες βήχα, κοκκύτη ή μεταβηχικό έμετο" } ], "id": 2174, "question": "Ποια είναι τα κριτήρια του ΠΟΥ για λοίμωξη από κοκκύτη;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Can't RIDD off viruseshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4061530/SHA: ef58c6e2790539f30df14acc260ae2af4b5f3d1fAuthors: Bhattacharyya, SankarDate: 2014-06-18DOI: 10.3389/fmicb.2014.00292License: cc-byAbstract: Το γονιδίωμα των θηλαστικών έχει εξελιχθεί για να κωδικοποιεί μια σειρά μηχανισμών, για να μετριάσει μια εξέλιξη στον κύκλο ζωής ενός διεισδυτικού ιικού παθογόνου. Αν και προφανώς μειονεκτούν από την εξάρτησή τους από τις βιοσυνθετικές διαδικασίες του ξενιστή, ένας εξαιρετικά ταχύτερος ρυθμός εξέλιξης παρέχει στους ιούς ένα πλεονέκτημα σε αυτή τη σύγκρουση. Σε αυτήν την ανασκόπηση, έχω συζητήσει την πιθανή αντι-ιική δράση του ενζύμου 1 που απαιτεί ινοσιτόλη (IRE1), ενός καλά χαρακτηρισμένου τελεστή της κυτταρικής ομοιοστατικής απόκρισης σε υπερφόρτωση της ικανότητας αναδίπλωσης πρωτεΐνης του ενδοπλασματικού δικτύου (ER). Η IRE1, μια ριβονουκλεάση που εδρεύει στη μεμβράνη ER (RNase), κατά την ενεργοποίηση καταλύει τη διάσπαση επιλεγμένων RNA ξενιστών που κωδικοποιούν πρωτεΐνες και μη κωδικοποιώντας, χρησιμοποιώντας μια περιοχή RNase η οποία είναι ομόλογη με αυτήν του γνωστού αντι-ιικού τελεστή RNaseL. Το τελευταίο λειτουργεί ως μέρος του συστήματος αντι-ιικής άμυνας OAS/RNaseL της ολιγοαδενυλικής συνθετάσης. Τα υποστρώματα RNA που κωδικοποιούν πρωτεΐνες υφίστανται διαφορική επεξεργασία από την IRE1 RNase είτε για να αυξήσουν, μέσω κυτταροπλασματικής ματίσματος ενός ιντρονίου στο μεταγράφημα Xbp1, είτε για να καταστείλουν την έκφραση γονιδίου. Αυτή η αναφερόμενη καταστολή της γονιδιακής έκφρασης μεσολαβείται μέσω της αποικοδομητικής διάσπασης μιας επιλεγμένης κοόρτης κυτταρικών μεταγραφών RNA, ξεκινώντας τη ρυθμισμένη οδό διάσπασης που εξαρτάται από το IRE1 (RIDD). Η ανασκόπηση αρχικά συζητά τον αντι-ιικό μηχανισμό του συστήματος OAS/RNaseL και τις τακτικές αποφυγής που χρησιμοποιούνται από διαφορετικούς ιούς. Ακολουθεί ανασκόπηση της οδού RIDD και της πιθανής επίδρασής της στη σταθερότητα των ιικών RNA. Ολοκληρώνω με μια σύγκριση της ενζυμικής δραστηριότητας των δύο RNases που ακολουθείται από προβληματισμούς σχετικά με τις φυσιολογικές συνέπειες της ενεργοποίησής τους. και μονοπάτια κυτταρικού θανάτου. Επομένως, η απόκριση του ξενιστή σε μια μόλυνση από ιό μπορεί να αποδειχθεί ανασταλτική για τον ιικό κύκλο ζωής με άμεσο ή έμμεσο τρόπο. Ο άμεσος μηχανισμός περιλαμβάνει την έκφραση πολλαπλών αντι-ιικών γονιδίων που έχουν εξελιχθεί για να αναγνωρίζουν, να αντιδρούν και να απαλλάσσουν έτσι τον μολυσμένο ξενιστή από το ιικό νουκλεϊκό οξύ (Zhou et al., 1997; Thompson et al., 2011). Από την άλλη πλευρά, οι οδοί, π.χ., αυτές που καταλήγουν στην έναρξη ενός αποπτωτικού θανάτου για το κύτταρο ξενιστή, χρησιμεύουν έμμεσα στον περιορισμό της εξάπλωσης του ιού (Roulston et al., 1999). Μια σημαντική διαφορά μεταξύ αυτών των δύο μηχανισμών είναι ότι ενώ η πρώτη απόκριση μεταδίδεται σε γειτονικά μη μολυσμένα κύτταρα μέσω σηματοδότησης ιντερφερόνης (IFN), η δεύτερη παρατηρείται κυρίως σε cis. Πρόσφατες αναφορές, ωστόσο, έχουν δείξει μετάδοση ενός αποπτωτικού σήματος μεταξύ κυττάρων που έρχονται σε επαφή μέσω κενών συνδέσεων, αν και μια τέτοια σηματοδότηση από ένα μολυσμένο με ιό κύτταρο ξενιστή σε ένα μη μολυσμένο δεν είναι ακόμη γνωστή (Cusato et al., 2003; Udawatte και Ripps, 2005; Kameritsch et al., 2013). Τα επιτυχημένα ιικά παθογόνα, μέσω μιας διαδικασίας ενεργού επιλογής, έχουν εξελιχθεί για να αναπαράγονται και ταυτόχρονα να αποφεύγουν ή να αποκλείουν οποιαδήποτε από αυτές τις αποκρίσεις ξενιστή. Τα ιικά νουκλεϊκά οξέα που θα μπορούσαν να είναι το γονιδίωμα (ιός μονόκλωνου RNA θετικής λογικής) ή το RNA που προέρχεται από τη μεταγραφή του γονιδιώματος [αρνητικό-κλωνικό μονόκλωνο RNA ή δίκλωνο RNA (dsRNA) ή ιός DNA], προσφέρουν κρίσιμους στόχους για τόσο την ανίχνευση όσο και την εκρίζωση. Οι οπλισμοί στόχευσης ιικών νουκλεϊκών οξέων στο οπλοστάσιο του ξενιστή περιλαμβάνουν εκείνους που αναγνωρίζουν τα σχετικά μοριακά μοτίβα όπως υποδοχείς τύπου toll (TLRs), DDX58 (ή RIG-1), IFIH1 (ή MDA5), πρωτεΐνες IFIT [γονίδια διεγερμένα από IFN (ISG )56 και ISF54], κ.λπ. (Aoshi et al., 2011; Bowzard et al., 2011; Jensen και Thomsen, 2012). Αυτό ακολουθείται από σηματοδότηση IFN και έκφραση ή ενεργοποίηση παραγόντων που στοχεύουν τον επαγωγέα για αποικοδόμηση ή τροποποίηση, όπως το σύστημα OAS/ριβονουκλεάσης L (RNaseL), το APOBEC3, το MCPIP1, το σύστημα ZC3HAV1/εξωσώματος και οι οδοί RNAi (Gao et al., 2002; Sheehy et al., 2002; Guo et al., 2007; Daffis et al., 2010; Sidahmed και Wilkie, 2010; Schmidt et al., 2012; Cho et al., 2013a; Lin et al., 2013). Σε αυτή την ανασκόπηση εστιάζουμε σε δύο πρωτεΐνες που περιέχουν ομόλογες περιοχές RNase, το RNaseL με γνωστή άμεση αντιική λειτουργία και το ένζυμο 1 που απαιτεί ινοσιτόλη (IRE1 ή ERN1) το οποίο έχει μια περιοχή RNase παρόμοια με RNaseL με γνωστό ρόλο στην ομοιοστατική απόκριση σε ξεδιπλωμένες πρωτεΐνες στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) και δυνατότητα λειτουργίας ως αντιικό (Εικόνα 1. Tirasophon et al., 2000). Στα κύτταρα θηλαστικών τα ενδεικτικά σημάδια μόλυνσης από ιό RNA, όπως η παρουσία κυτταροπλασματικού RNA που έχει 5 -ppp ή εκτεταμένα (>30 bp) τμήματα dsRNA ανιχνεύονται από αποκλειστικούς υποδοχείς μοριακού σχεδίου που σχετίζονται με παθογόνο ( PAMPs) ή υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων (PRRs) στο κύτταρο ξενιστή, όπως RIG-1, MDA5 και η οικογένεια πρωτεϊνών IFIT (Aoshi et al., 2011; Bowzard et al., 2011; Vabret και Blander, 2013). Η μεταγωγή ενός σήματος αυτής της αναγνώρισης έχει ως αποτέλεσμα την έκφραση των γονιδίων IFN τα προϊόντα www.frontiersin.org ΕΙΚΟΝΑ 1 | Σχηματική αναπαράσταση της δραστικότητας ριβονουκλεάσης των IRE1 και RNaseL που δείχνει διασταυρούμενη συζήτηση μεταξύ των μονοπατιών που καταλύονται από τα ένζυμα. Το σχήμα δείχνει την ενεργοποίηση της δραστικότητας της RNase μετά από διμερισμό που προκαλείται είτε από τη συσσώρευση ξεδιπλωμένων πρωτεϊνών στον αυλό ER ή τη σύνθεση 2-5Α από το ένζυμο OAS, αντίστοιχα, για τα IRE1 και RNaseL. Η διάσπαση του Xbp1u από το IRE1 απελευθερώνει ένα εσώνιο δημιουργώντας έτσι Xbp1. Οι στόχοι IRE1 στο μονοπάτι RIDD ή όλα τα υποστρώματα RNaseL αποδεικνύεται ότι υφίστανται αποικοδομητική διάσπαση. Τα προϊόντα διάσπασης που παράγονται μέσω της αποδόμησης του αντίστοιχου υποστρώματος φαίνεται ότι αλληλεπιδρούν δυνητικά με το RIG-I οδηγώντας έτσι σε έκκριση ιντερφερόνης και trans-ενεργοποίηση των γονιδίων Oas μέσω της σηματοδότησης ιντερφερόνης. Συντομογραφίες: RIG-I = επαγώγιμο γονίδιο ρετινοϊκού οξέος-Ι, Ifnb = γονιδιακές θέσεις βήτα ιντερφερόνης, IFN = ιντερφερόνες, ISG = ευαίσθητα στην ιντερφερόνη γονίδια, 2-5A = 2 -5 ολιγοαδενυλικά. εκ των οποίων κατά την έκκριση έξω από το κύτταρο συνδέονται με συγγενείς υποδοχείς, ξεκινώντας περαιτέρω κατάντη σηματοδότηση (Εικόνα 1; Randall και Goodbourn, 2008). Τα γονίδια που ρυθμίζονται ως αποτέλεσμα της σηματοδότησης IFN ονομάζονται γονίδια διεγερμένα από IFN ή ρυθμιζόμενα από IFN (ISGs ή IRGs. Sen and Sarkar, 2007; Schoggins and Rice, 2011). Τα γονίδια ολιγοαδενυλικής συνθετάσης ή OAS είναι κανονικά ISG που μετατρέπουν το ATP σε 2-5 συνδεδεμένα ολιγοαδενυλικά (2-5Α) μέσω ενός μοναδικού ενζυματικού μηχανισμού (Εικόνα 1. Hartmann et al., 2003). Επιπλέον, είναι πρωτεΐνες δέσμευσης RNA που λειτουργούν όπως οι PRRs, με τρόπο που η δραστηριότητα σύνθεσης 2-5Α πρέπει να επάγεται μέσω μιας αλληλεπίδρασης με το dsRNA (Minks et al., 1979; Hartmann et al., 2003). Σε ένα κύτταρο ξενιστή που έχει μολυνθεί από έναν ιό RNA, τέτοιο dsRNA υπάρχει με τη μορφή ενδιάμεσων αναδιπλασιασμών (RI), τα οποία συντίθενται από τις κωδικοποιούμενες από τον ιό RNA πολυμεράσες RNA (RdRp) και στη συνέχεια χρησιμοποιούνται από το ίδιο ένζυμο για τη σύνθεση περισσότερο γονιδιωματικό RNA, μέσω ασύμμετρης μεταγραφής (Weber et al., 2006). Ωστόσο, τα σύμπλοκα αντιγραφής (RCs) που φιλοξενούν αυτά τα μόρια RI βρίσκονται απομονωμένα μέσα σε κυστίδια που προέρχονται από τη μεμβράνη ξενιστή, τουλάχιστον σε ιούς RNA θετικού κλώνου, μια ομάδα που περιέχει πολλά ανθρώπινα παθογόνα (Uchil and Satchidanandam, 2003; Denison, 2008). Αναφορές από διαφορετικές ομάδες υποδεικνύουν ότι οι πρωτεΐνες OAS πρέπει να κατανέμονται τόσο στο κυτταρόπλασμα όσο και σε κλάσματα που σχετίζονται με τη μεμβράνη, ίσως υποδεικνύοντας μια εξέλιξη των αντι-ιικών μεθοδολογιών του ξενιστή προς την ανίχνευση των ιικών dsRNA που σχετίζονται με τη μεμβράνη (Marie et al., 1990 ; Lin et al., 2009). Οι ιοί DNA από την άλλη πλευρά, παράγουν dsRNA με ανόπτηση του RNA που προέρχεται από τη μεταγραφή και των δύο κλώνων στους ίδιους ιικούς γονιδιωματικούς τόπους, οι οποίοι πιθανώς ανιχνεύονται από την κυτταροπλασματική δεξαμενή πρωτεϊνών OAS (Jacobs and Langland, 1996; Weber et al., 2006). Μετά την ενεργοποίηση τα ένζυμα OAS συνθέτουν μόρια 2-5Α σε μια μη διεργατική αντίδραση που παράγει ολιγομερή τα οποία, αν και δυνητικά κυμαίνονται σε μεγέθη από διμερή έως πολυμερή, είναι λειτουργικά ενεργά μόνο σε τριμερή ή τετραμερή μορφή (Dong et al., 1994; Sarkar et al., 1999; Silverman, 2007). Αυτοί οι μικροί υποκαταστάτες, οι οποίοι φέρουν φωσφορικές ομάδες (1-3) στο 5ο άκρο και ομάδες υδροξυλίου στις θέσεις 2 και 3, χρησιμεύουν ως συμπαράγοντας που μπορεί να αλληλεπιδράσει ειδικά με και έτσι να ενεργοποιήσει αλλοστερικά, υπάρχοντα μόρια RNaseL (Knight et al. 1980; Zhou et al., 1997 Zhou et al., 2005 Sarkar et al., 1999). Ως μέρος ενός συστήματος φυσιολογικού ελέγχου, αυτά τα ολιγομερή 2-5Α είναι αρκετά ασταθή στο ότι είναι πολύ ευαίσθητα στην αποικοδόμηση από τις κυτταρικές 5-φωσφατάσες και την PDE12 (2-φωσφοδιεστεράση. Silverman et al., 1981; Johnston and Hearl, 1987; Kubota et al., 2004; Schmidt et al., 2012). Οι ιικές στρατηγικές για την αποφυγή ή την υπέρβαση αυτού του αμυντικού μηχανισμού ξενιστή κυμαίνονται από την πρόληψη της σηματοδότησης IFN που θα παρεμπόδιζε την επαγωγή της έκφρασης OAS ή την παρεμπόδιση της ενεργοποίησης των εκφραζόμενων πρωτεϊνών OAS είτε προστατεύοντας το ιικό dsRNA από την αλληλεπίδραση με αυτό είτε τροποποιώντας την οδό ξενιστή για να συνθέσει ανενεργό 2- 5Α παράγωγα (Cayley et αϊ., 1984; Hersh et al., 1984; Rice et αϊ., 1985; Maitra et al., 1994; Beattie et al., 1995; Rivas et al., 1998; Child et al., 2004; Min and Krug, 2006; Sanchez and Mohr, 2007; Sorgeloos et al., 2013) . Η θωράκιση του ιικού RNA από την αλληλεπίδραση με το OAS είναι δυνατή μέσω του εγκλεισμού των ενδιάμεσων αναδιπλασιασμού του dsRNA σε κλειστά διαμερίσματα με μεμβράνη, όπως παρατηρείται σε πολλούς φλαβοϊούς (Ahlquist, 2006; Miller και Krijnse-Locker, 2008; Miorin et al., 2013) Το RNaseL είναι μια πρωτεΐνη 741 αμινοξέων που περιέχει τρεις κυρίως δομημένες περιοχές, μια Ν-τερματική επαναλαμβανόμενη περιοχή αγκυρίνης (ARD), μια μέση καταλυτικά ανενεργή ψευδοκινάση (PK) και μια C-τερματική περιοχή RNase ( Σχήμα 2Α; Hassel et al., 1993; Zhou et al., 1993). Η δραστηριότητα της περιοχής RNase ρυθμίζεται αρνητικά από το ARD, το οποίο ανακουφίζεται με τη δέσμευση των μορίων 2-5Α στις επαναλήψεις 2 και 4 της αγκυρίνης που ακολουθείται από μια διαμορφωτική αλλαγή (Εικόνα 1; Hassel et al., 1993; Tanaka et al., 2004; Nakanishi et al., 2005). Προς υποστήριξη αυτού του ισχυρισμού, η διαγραφή του ARD έχει αποδειχθεί ότι παράγει συστατικά ενεργό RNaseL, αν και με δραματικά χαμηλότερη δραστηριότητα RNase (Dong and Silverman, 1997). Ωστόσο, πρόσφατες αναφορές υποδεικνύουν ότι ενώ το 2-5Α συνδέει τις επαναλήψεις αγκυρίνης από γειτονικά μόρια οδηγώντας σε σχηματισμό διμερών και δομών υψηλότερης τάξης, σε επαρκώς υψηλές συγκεντρώσεις in vitro, το RNaseL θα ​​μπορούσε να ολιγομεριστεί ακόμη και απουσία 2-5Α. Παρόλα αυτά, in vivo η δραστηριότητα νουκλεάσης RNaseL εξακολουθεί να φαίνεται να βρίσκεται υπό την αποκλειστική ρύθμιση του 2-5A (Al-Saif και Khabar, 2012). Προκειμένου να εκμεταλλευτεί αυτή την εξάρτηση, πολλαπλοί ιοί όπως ο ιός της ηπατίτιδας ποντικού (MHV) και η ομάδα Α ροταϊού (RVA) έχουν εξελιχθεί για να κωδικοποιούν φωσφοδιεστεράσες ικανές να υδρολύουν τους δεσμούς 2-5 στο 2-5Α και έτσι να εξασθενούν τη δραστηριότητα διάσπασης RNaseL (Zhao et al., 2012; Zhang et al., 2013). Εκτός από τις 5-φωσφατάσες και τις 2-φωσφοδιεστεράσες για τη μείωση της ευθυγράμμισης ClustalW της πρωτογενούς αλληλουχίας από ένα τμήμα της περιοχής ΡΚ που υποδεικνύει υπολείμματα αμινοξέων που είναι σημαντικά για την αλληλεπίδραση με νουκλεοτιδικούς συμπαράγοντες. Τα διατηρημένα υπολείμματα λυσίνης, κρίσιμα για αυτή την αλληλεπίδραση (Κ599 για IRE1 και Κ392 σε RNaseL) είναι υπογραμμισμένα. (Γ) Ευθυγράμμιση των τομέων KEN σε RNaseL και IRE1. Τα αμινοξέα που επισημαίνονται και αριθμούνται στο IRE1 είναι κρίσιμα για τη δράση IRE1 RNase (Tirasophon et al., 2000). Τα ενδογενή επίπεδα 2-5A, τα γονιδιώματα των θηλαστικών κωδικοποιούν μεταμεταγραφικούς και μετα-μεταφραστικούς αναστολείς της δραστηριότητας RNaseL με τη μορφή microRNA-29 και την πρωτεΐνη ABCE1 (αναστολέας RNaseL ή RLI), αντίστοιχα (Bisbal et al., 1995; Lee et al., 2013). Άμεση αναστολή της λειτουργίας RNaseL παρατηρείται επίσης κατά τη μόλυνση από Picornaviruses μέσω, είτε επαγωγής της έκφρασης του ABCE1 είτε μέσω άσκησης μιας μοναδικής ανασταλτικής ιδιότητας ενός τμήματος του ιικού RNA (Martinand et al., 1998 (Martinand et al., 1999 Townsend et al. al., 2008; Sorgeloos et al., 2013) . Μόλις ενεργοποιηθεί από το 2-5A, το RNaseL μπορεί να αποικοδομήσει το μονόκλωνο RNA ανεξάρτητα από την προέλευσή του (ιός ή ξενιστής) αν και φαίνεται να υπάρχει μια προκατάληψη προς τη διάσπαση του ιικού RNA (Wreschner et al., 1981a ; Silverman et al., 1983; Li et al., 1998). Οι αλληλουχίες RNA που διασπώνται κυρίως από το RNaseL είναι πλούσιες σε U με τα σημεία διάσπασης να είναι τυπικά στο 3 άκρο των δινουκλεοτιδίων UA ή UG ή UU, αφήνοντας ένα 5-ΟΗ και ένα 3-μονοφωσφορικό στο προϊόν διάσπασης (Floyd-Smith et al., 1981; Wreschner et αϊ., 1981b). Μια πρόσφατη αναφορά δείχνει μια γενικότερη συναίνεση του 5 -UNN-3 με το σημείο διάσπασης μεταξύ του δεύτερου και του τρίτου νουκλεοτιδίου (Han et al., 2014). Οι κυτταρικοί στόχοι του RNaseL περιλαμβάνουν τόσο ριβοσωμικό RNA (rRNA) όσο και mRNA, τα οποία αντιπροσωπεύουν κυρίως γονίδια που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση πρωτεϊνών (Wreschner et al., 1981a; Al-Ahmadi et al., 2009; Andersen et al., 2009). Επιπροσθέτως, η δραστηριότητα RNaseL μπορεί επίσης να αποικοδομήσει συγκεκριμένα μεταγραφήματα ISG mRNA και έτσι να μειώσει την επίδραση της σηματοδότησης IFN (Li et al., 2000). Πιθανώς μια εξέλιξη προς τη μόνωση της γονιδιακής έκφρασης από τη δραστηριότητα RNaseL παρατηρείται στην κωδικοποιητική περιοχή των γονιδίων των θηλαστικών όπου η συχνότητα των δινουκλεοτιδίων UU/UA είναι σπανιότερη (Bisbal et al., 2000; Khabar et al., 2003; Al-Saif και Khabar, 2012). Ίσως δεν αποτελεί έκπληξη, με πολύ ταχύτερο ρυθμό εξέλιξης, παρόμοιες παρατηρήσεις έχουν γίνει σε σχέση με την αποφυγή της αποικοδόμησης που προκαλείται από το RNaseL και από τα ιικά RNA (Han and Barton, 2002; Washenberger et al., 2007). Επιπλέον, τροποποιήσεις νουκλεοσιδίων στα mRNA ξενιστών, που σπάνια παρατηρούνται σε ιικά RNA, έχει επίσης αποδειχθεί ότι παρέχουν προστασία από το RNaseL (Anderson et al., 2011). Εκτός από την άμεση στόχευση του ιικού RNA, η μείωση των λειτουργικών ριβοσωμάτων και του mRNA της ριβοσωμικής πρωτεΐνης επηρεάζει τη σύνθεση και την αντιγραφή των πρωτεϊνών του ιού με έμμεσο τρόπο. Πιθανώς, ως αντανάκλαση αυτών των επιδράσεων στα κυτταρικά RNA, το RNaseL εμπλέκεται ως ένας από τους παράγοντες που καθορίζουν την αντι-πολλαπλασιαστική δράση της δραστικότητας της IFN. Η αντι-ιική δράση του RNaseL εκτείνεται πέρα ​​από την άμεση διάσπαση του ιικού RNA, μέσω της διέγερσης του RIG-I από το προϊόν διάσπασης (Malathi et al., 2007 (Malathi et al., 2010. Μια συνολική επίδραση του RNaseL παρατηρείται με τη μορφή αυτοφαγίας που προκαλείται μέσω της σηματοδότησης της Ν-τερματικής κινάσης της c-jun (JNK) και της απόπτωσης, πιθανώς ως συνέπεια της διάσπασης του rRNA (Li et al., 2004; Chakrabarti et al., 2012; Siddiqui και Malathi, 2012). Το RNaseL έχει επίσης αποδειχθεί ότι παίζει ρόλο στον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από φαρμακολογικούς παράγοντες επεκτείνοντας τον φυσιολογικό ρόλο αυτής της οδού πέρα ​​από το όριο ότι είναι μόνο ένας αντι-ιικός μηχανισμός (Castelli et al., 1997 (Castelli et al., 1998 .Το ER χρησιμεύει ως αγωγός για την ωρίμανση των κυτταρικών πρωτεϊνών που είτε εκκρίνονται είτε προορίζονται να συσχετιστούν με μια μεμβράνη για τη λειτουργία του. Ένα αποκλειστικό μικροπεριβάλλον (υψηλά ιόντα ασβεστίου και μοναδική αναλογία ανηγμένης προς οξειδωμένη γλουταθειόνη) μαζί με μια μπαταρία ενζύμων που κατοικούν στον αυλό ER (φολδάσες, συνοδούς και λεκτίνες) καταλύουν/διαμεσολαβούν την απαραίτητη αναδίπλωση, σχηματισμό δισουλφιδικού δεσμού και αντιδράσεις γλυκοζυλίωσης. Schroder και Kaufman, 2005). Μια διαταραχή της ικανότητας αναδίπλωσης, είτε λόγω φυσιολογικών διαταραχών είτε λόγω μόλυνσης από ιό, μπορεί να οδηγήσει σε συσσώρευση μη αναδιπλωμένων πρωτεϊνών στον αυλό του ER, που σηματοδοτεί μια απόκριση ξεδιπλωμένης πρωτεΐνης (UPR). Το UPR περιλαμβάνει ένα δικτυωμένο πρόγραμμα μεταγραφικής και μεταφραστικής γονιδιακής έκφρασης, το οποίο ξεκινά από τρεις μόνιμους αισθητήρες ER-μεμβράνης και συγκεκριμένα IRE1 ή ERN1, κινάση ER παρόμοια με PKR (PERK ή EIF2AK3) και ενεργοποιώντας τον μεταγραφικό παράγοντα 6 (ATF6; Hetz, 2012). Το IRE1 είναι μια μονοπερατή διαμεμβρανική πρωτεΐνη τύπου Ι στην οποία, παρόμοια με αυτό που παρατηρείται με το RNaseL, το Ν-τελικό που βρίσκεται στον αυλό του ER χρησιμεύει ως αισθητήρας και το κυτταροπλασματικό Ο-τελικό ως τελεστής (Εικόνα 1; Chen και Brandizzi, 2013). Το κωδικοποιητικό γονίδιο IRE1 υπάρχει σε γονιδιώματα που κυμαίνονται από ζυμομύκητες έως θηλαστικά και στα τελευταία εκφράζεται πανταχού παρόν σε όλους τους ιστούς (Tirasophon et al., 1998). Η μεταγωγή σήματος από διεγερμένο IRE1 εκκινεί πολλαπλά γονιδιακά ρυθμιστικά μονοπάτια με συνέπειες είτε υπέρ της επιβίωσης είτε προ-αποπτωτικές (Kaufman, 1999). Κατά τη διάρκεια της ομοιόστασης ή των συνθηκών χωρίς στρες, τα μόρια του αισθητήρα είναι μονομερή, μια κατάσταση που διατηρείται συνεργαζόμενα από την «απουσία» των ξεδιπλωμένων πρωτεϊνών και την «παρουσία» των μορίων HSPA5 (GRP78 ή Bip, συνοδός ERresident) που είναι συνδεδεμένα σε ένα διαταραγμένο τμήμα της μεμβράνης-εγγύς της πρωτεΐνης στο Nterminus που κατοικεί στο ER-αυλό (Credle et al., 2005). Οι συσσωρευμένες ξεδιπλωμένες πρωτεΐνες στον αυλό πυροδοτούν τη σύζευξη αυτής της περιοχής από γειτονικά μόρια αισθητήρων μέσω ενός συνδυασμού (α) τιτλοδότησης των δεσμευμένων μορίων συνοδού HSPA5 και (β) άμεσης πρόσδεσης από μόρια πρωτεΐνης με κακή πτυχή (Shamu and Walter, 1996; Credle et al., 2005; Aragon et al., 2009; Korennykh et al., 2009). Η επαφή των περιοχών του αυλού αντιπαραθέτει τα κυτταροπλασματικά C-τερματικά τμήματα, οδηγώντας σε συσσωμάτωση των μορίων IRE1 σε διακριτές εστίες μεμβράνης ER (Kimata et al., 2007; Li et al., 2010). Το Ο-τερματικό τμήμα έχει μια περιοχή κινάσης σερίνης/θρεονίνης και μια περιοχή RNase ομόλογη με αυτή της RNaseL (Εικόνα 1; Tirasophon et al., 1998 Tirasophon et al., 2000. Μια trans-αυτοφωσφορυλίωση από την περιοχή κινάσης ενεργοποιεί αλλοστερικά την περιοχή RNase (Tirasophon et al., 2000; Lee et al., 2008; Korennykh et al., 2009). Στην πραγματικότητα, η εξωγενής υπερέκφραση του IRE1 σε κύτταρα θηλαστικών οδηγεί σε ενεργοποίηση υποδηλώνοντας ότι, υπό ομοιοστατικές συνθήκες, η μη παράθεση κυτταροπλασματικών περιοχών διατηρεί ένα ανενεργό IRE1 (Tirasophon et al., 1998). Μόλις ενεργοποιηθεί, το IRE1 εκτελεί διάσπαση μιας ποικιλίας υποστρωμάτων RNA με τη μεσολάβηση της περιοχής του RNase, επιπλέον της φωσφορυλίωσης και κατά συνέπεια της ενεργοποίησης της JNK (Cox and Walter, 1996; Urano et al., 2000). Ανάλογα με το υπόστρωμα RNA, η διάσπαση που καταλύεται από την IRE1 RNase παράγει διαφορικές συνέπειες. Αν και η κοπή του μεταγράφου Xbp1 mRNA σε δύο εσωτερικές θέσεις ακολουθείται από μάτισμα του εσωτερικού τμήματος μέσω απολίνωσης των τερματικών προϊόντων διάσπασης, αυτό σε όλα τα άλλα γνωστά RNA στόχου IRE1 ακολουθείται από αποικοδόμηση (Εικόνα 1; Sidrauski και Walter, 1997; Calfon et al., 2002). Ο τελευταίος τρόπος αρνητικής ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης ορίζεται ως η ρυθμισμένη οδός διάσπασης που εξαρτάται από το IRE1 (RIDD) (Hollien and Weissman, 2006; Oikawa et al., 2007; Iqbal et al., 2008; Lipson et al., 2008). Τα γονιδιακά μεταγραφήματα που ρυθμίζονται από το μονοπάτι RIDD περιλαμβάνουν αυτό από το IRE1 (δηλαδή, αυτομεταγραφές), πιθανώς σε μηχανισμό βρόχου αρνητικής ανάδρασης (Tirasophon et al., 2000). Εκτός από το RNA που κωδικοποιεί πρωτεΐνη, η οδός RIDD ρυθμίζει προς τα κάτω το επίπεδο ενός ξενιστή προδρόμων microRNA (προ-miRNAs) και μπορεί δυνητικά να διασπαστεί στον βρόχο αντικωδικονίων του tRNA Phe (Korennykh et al., 2011; Upton et al., 2012). Ο τομέας IRE1 RNase διασπά το Xbp1u (u για μη ματισμένο) μεταγραφή mRNA σε δύο ακριβείς εσωτερικές θέσεις εντός του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης (ORF) δημιουργώντας τρία τμήματα, τα δύο τερματικά των οποίων συνδέονται με μια λιγάση tRNA σε ζυμομύκητες και από μια άγνωστη λιγάση σε κύτταρα θηλαστικών, για να παραχθεί το Xbp1s (s για ματισμένο) mRNA μεταγραφή (Εικόνα 1; Yoshida et al., 2001). Το Xbp1 που δημιουργείται με αυτόν τον τρόπο έχει μεγαλύτερο ORF, το οποίο δημιουργείται από μια μετατόπιση πλαισίου στην κωδικοποιητική ακολουθία κατάντη της θέσης ματίσματος (Cox and Walter, 1996; Calfon et al., 2002). Μια παρόμοια διπλή ενδονουκλεολυτική διάσπαση παρατηρείται επίσης για την έναρξη της εξαρτώμενης από XRN1 και Ski2-3-8 αποικοδόμησης των μεταγραφών στην οδό αποικοδόμησης RIDD (Hollien and Weissman, 2006). Τα γονίδια μεταγραφής στόχου RIDD είναι κυρίως εκείνα που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που σχετίζονται με τη μεμβράνη ή εκκρίνουσες πρωτεΐνες και τα οποία δεν είναι απαραίτητα για τις αντιδράσεις αναδίπλωσης πρωτεϊνών ER (Hollien and Weissman, 2006). Η διάσπαση του Xbp1 και των μεταγραφών στόχου RIDD συνιστά ομοιοστατική ή υπέρ της επιβίωσης απόκριση από το IRE1, καθώς το XBP1S trans-ενεργοποιεί γονίδια που κωδικοποιούν πολλαπλούς συνοδούς (για να αναδιπλωθούν οι πρωτεΐνες που έχουν ξεδιπλωθεί) και τα γονίδια της οδού ERAD (για την υποβάθμιση των τελικώς αναδιπλωμένων πρωτεϊνών D). πολυπεπτιδίων που εισέρχονται στον αυλό του ER (Lee et al., 2003; Hollien και Weissman, 2006). Από την άλλη πλευρά, η διάσπαση των μεταγραφών προ-miRNA που υποβάλλονται σε επεξεργασία στο κύτταρο για τη δημιουργία miRNAs ελέγχου της CASPASE-2 (Casp2), αποτελεί την προ-αποπτωτική λειτουργία του IRE1 (Upton et al., 2012). Ένα άλλο προ-αποπτωτικό σήμα από το IRE1 προέρχεται από τη σηματοδότηση μέσω φωσφορυλίωσης του JNK1 (Urano et al., 2000). Αν και στην αρχική φάση η δραστηριότητα του RIDD δεν διασπά τα mRNA που κωδικοποιούν βασικές πρωτεΐνες ER, σε μεταγενέστερα στάδια του χρόνιου UPR τέτοια μεταγραφήματα καθίστανται επιρρεπή στην αποδόμηση που προάγει την επαγωγή απόπτωσης (Han et al., 2009; Bhattacharyya et al., 2014) .Η μόλυνση κυττάρων θηλαστικών από πλήθος ιών προκαλεί UPR που μερικές φορές χαρακτηρίζεται από καταστολή της σηματοδότησης από έναν ή περισσότερους από τους τρεις αισθητήρες. Su et al., 2002; Tardif et al., 2002; Αυτός, 2006; Yu et al., 2006 Yu et al., , 2013 Medigeshi et al., 2007; Zhang et al., 2010; Merquiol et al., 2011). Μεταξύ αυτών των τουλάχιστον δύο ιών από διαφορετικές οικογένειες, ο HCMV (ένας ιός DNA) και ο ιός της ηπατίτιδας C (ένας ηπατοϊός), παρεμβαίνουν στη σηματοδότηση IRE1 με διαφορετικό μηχανισμό (Tardif et al., 2004; Stahl et al., 2013). Μια παρατηρούμενη αναστολή οποιασδήποτε κυτταρικής λειτουργίας από λοίμωξη από ιό θα μπορούσε να υποδηλώνει μια πιθανή λειτουργία κατά του ιού, την οποία ο ιός έχει εξελιχθεί για να αποφύγει μέσω του αποκλεισμού ορισμένων κρίσιμων βημάτων. Και στις δύο περιπτώσεις που αναφέρθηκαν παραπάνω, η σταθερότητα των ιικών πρωτεϊνών φαίνεται να επηρεάζεται από την αποικοδόμηση που προκαλείται από το ERAD, αν και άλλες πιθανές αντιικές επιδράσεις της ενεργοποίησης του IRE1 δεν είναι ακόμη σαφείς (Isler et al., 2005; Saeed et al., 2011). Είναι ενδιαφέρον ότι τα θραύσματα mRNA του ξενιστή που παράγονται μετά την ενεργοποίηση του IRE1 κατά τη διάρκεια της βακτηριακής μόλυνσης, έχει αποδειχθεί ότι ενεργοποιούν τη σηματοδότηση RIG-I (Εικόνα 1; Cho et al., 2013b). Θεωρητικά, άλλες λειτουργίες του IRE1 μπορούν επίσης να έχουν αντι-ιικό αποτέλεσμα που καθιστά αναγκαία την αναστολή του για μη ανασταλμένη ιική αντιγραφή. Ωστόσο, δεν είναι ακόμη σαφές εάν το IRE1 είναι ικανό να διασπάσει οποιοδήποτε ιικό RNA (ή mRNA) με τρόπο παρόμοιο με αυτόν άλλων στόχων RIDD (Εικόνα 1). Οι δυνατότητες μιας τέτοιας άμεσης αντι-ιικής λειτουργίας ενθαρρύνονται από το γεγονός ότι όλοι αυτοί οι ιοί κωδικοποιούν τουλάχιστον μία πρωτεΐνη η οποία, ως μέρος της διαδικασίας ωρίμανσης της, απαιτεί γλυκοζυλίωση και σχηματισμό δισουλφιδικού δεσμού. Μια τέτοια αναγκαιότητα θα συνεπαγόταν μετάφραση του mRNA που κωδικοποιεί μια τέτοια πρωτεΐνη, η οποία σε περίπτωση θετικής λογικής μονόκλωνων ιών RNA θα σήμαινε το γονιδίωμα, σε συνδυασμό με τη μεμβράνη ER (Εικόνα 1; Lerner et al., 2003). Επιπλέον για πολλούς ιούς RNA, τα σύμπλοκα αντιγραφής στεγάζονται σε φυσαλιδώδεις δομές που προέρχονται από ER (Denison, 2008; den Boon et al., 2010). Λαμβάνοντας υπόψη την εγγύτητα του IRE1 και αυτών των RNA που προέρχονται από ιό, είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι πιθανώς κάποια στιγμή στον κύκλο ζωής του ιού ένα ή περισσότερα σχετιζόμενα με τον ιό RNA θα ήταν ευαίσθητα σε διάσπαση από το IRE1. Ωστόσο, μελέτες με τουλάχιστον δύο ιούς έχουν δείξει ότι αντί να αυξάνει τον τίτλο του ιού, η αναστολή της δραστηριότητας RNase του ενεργοποιημένου IRE1 έχει αντίθετο αποτέλεσμα (Hassan et al., 2012; Bhattacharyya et al., 2014). Αυτό συνεπάγεται πιθανά οφέλη από την ενεργοποίηση του IRE1 μέσω ενός ή περισσότερων από τα ακόλουθα, (α) έκφραση συνοδών ή άλλων προ-ιικών μορίων κατάντη της Υπορρύθμισης XBP1 ή ενεργοποίησης JNK, (β) διάσπαση πιθανών μεταγραφών mRNA αντι-ιικού γονιδίου με δραστηριότητα RIDD . Ωστόσο, ο τρόπος προστασίας για το ιικό RNA από τη δραστηριότητα RIDD δεν είναι ακόμη σαφής. Είναι πιθανό οι ιικές πρωτεΐνες να δημιουργούν έναν υποτομέα εντός της μεμβράνης του ER, ο οποίος μέσω κάποιου μηχανισμού αποκλείει το IRE1 από τη διάχυση κοντά στο γονιδιωματικό RNA, προστατεύοντας έτσι τα σύμπλοκα αντιγραφής (Denison, 2008). Επομένως, μάλλον δεν προκαλεί έκπληξη το γεγονός ότι οι μονόκλωνοι ιοί συν-νοήματος RNA κωδικοποιούν μια πολυπρωτεΐνη, η οποία παράγει σύμπλοκα αντιγραφής στο cis, προάγοντας το σχηματισμό τέτοιων υποτομέων (Egger et al., 2000). Το γεγονός ότι το IRE1 σχηματίζει ογκώδη ολιγομερή υψηλότερης τάξης πιθανώς επιδεινώνει έναν τέτοιο αποκλεισμό των ενεργοποιημένων μορίων αισθητήρα από την περιοχή των συμπλεγμάτων ιικής αντιγραφής. Η σηματοδότηση UPR τελικά εξασθενεί κατά τη διάρκεια του χρόνιου στρες ER και δεδομένου ότι αυτό μιμείται το UPR που προκαλείται από τον ιό, πιθανώς το ιικό RNA χρειάζεται προστασία μόνο κατά την αρχική φάση της ενεργοποίησης του UPR (Lin et al., 2007). Δεδομένου ότι η επιλογή του στόχου RIDD φαίνεται να κατευθύνεται σε μεγάλο βαθμό προς τα mRNA που κωδικοποιούν παροδικές αλλά όχι βασικές πρωτεΐνες ER, είναι επίσης πιθανό μία ή περισσότερες ιικές πρωτεΐνες να έχουν εξελιχθεί για να μιμηθούν μια πρωτεΐνη ξενιστή, η μεταγραφή της οποίας είναι RIDD- ανθεκτικό (Hollien and Weissman, 2006) . Το μεγαλύτερο μέρος του mRNA στόχου RIDD παρατηρείται ότι σχετίζεται με τη μεμβράνη ER, η γειτνίαση με το IRE1 διευκολύνει τη σύνδεση και τη διάσπαση (Εικόνα 1; Hollien και Weissman, 2006). Αν και η συσχέτιση με ER για ένα mRNA είναι δυνατή χωρίς τη μεσολάβηση ριβοσωμάτων, ο Gaddam και οι συνεργάτες του ανέφεραν ότι η συνεχιζόμενη συσχέτιση με πολυσώματα για ένα συνδεδεμένο στη μεμβράνη mRNA μπορεί να προσφέρει προστασία από τη διάσπαση του IRE1 (Cui et al., 2012; Gaddam et al., 2013). Αυτό θα υποδηλώνει σημαντικές επιπτώσεις για την παρατηρούμενη ανθεκτική φύση του ιού της ιαπωνικής εγκεφαλίτιδας (JEV) και του ιού της γρίπης RNA στη διάσπαση RIDD (Hassan et al., 2012; Bhattacharyya et al., 2014). Σε αντίθεση με τον ιό της γρίπης, οι φλαβοϊοί (οι οποίοι περιλαμβάνουν το JEV) δεν καταστέλλουν την πρωτεϊνική σύνθεση του ξενιστή υποδηλώνοντας την απουσία συνολικής αναστολής στη μετάφραση, όπως θα αναμενόταν κατά τη διάρκεια του UPR (Clyde et al., 2006; Edgil et al., 2006). Ως εκ τούτου, μια συνεχής μετάφραση του ιικού RNA παρά την ενεργοποίηση UPR μπορεί κατ' αρχήν να προσφέρει προστασία από το πρότυπο διάσπασης RNA που παρατηρείται στην οδό RIDD.IRE1 και RNaseL, επιπλέον των βιοχημικών ομοιοτήτων στον τομέα της πρωτεϊνικής κινάσης και των δομικών ομοιοτήτων στον τομέα τους RNase , μοιράζονται τις λειτουργικές συνέπειες της ενεργοποίησής τους στην έναρξη της κυτταρικής απόπτωσης μέσω της σηματοδότησης JNK (Πίνακας 1 και Εικόνα 2. Liu και Lin, 2005; Dhanasekaran και Reddy, 2008). Αν και οι αρχικές ανακαλύψεις έγιναν στο πλαίσιο του ομοιοστατικού και αντι-ιικού ρόλου για το πρώτο και το δεύτερο, οι διαφορές μεταξύ των μονοπατιών περιορίζονται από περαιτέρω πρόοδο στην έρευνα. Στο ίδιο πνεύμα, ενώ η αναστολή της σηματοδότησης IRE1 σε κύτταρα μολυσμένα με ιό υποδηλώνει έναν πιθανό αντι-ιικό ρόλο, www.frontiersin.org (Tirasophon et al., 1998; Dong and Silverman, 1999; Papa et al., 2003; Lin et al., 2007) Nature of RNase substrates Τόσο το 28S rRNA όσο και το mRNA IRE1β μπορούν να διασπάσουν τόσο το 28S rRNA όσο και το mRNA, ενώ τα υποστρώματα IRE1α περιλαμβάνουν μόνο mRNAs (Iwawaki et al., 2001) Ανομοιότητες Διάσπαση υποστρωμάτων 28 σε μικτό RNA από το rRNA. (Andersen et al., 2009) Xbp1u και άλλα mRNA εκτός από πρόδρομες ουσίες microRNA που στοχεύουν ως μέρος της οδού RIDD. Η αλληλουχία RNA με τη συναίνεση του 5 -CUGCAG-3 σε συνδυασμό με μια δομή στελέχους βρόχου (SL) απαραίτητη για την αναγνώριση του Xbp1u και άλλων mRNAs (Oikawa et al., 2010) η συσχέτιση των μεταλλάξεων RNaseL με τη δημιουργία καρκίνου του προστάτη επεκτείνει τη φιλοσοφία της επίδρασης αυτού του αντι-ιικού τελεστή σε περισσότερες μη μολυσματικές φυσιολογικές διαταραχές (Silverman, 2003). Βιοχημικά, η ομοιότητα στους τομείς RNase τους δεν επεκτείνεται στην επιλογή υποστρωμάτων ή σημείου διάσπασης, τα οποία είναι κατάντη του UU ή του UA στο RNaseL και κατάντη του G (κυρίως) για το IRE1 (Εικόνα 2C. Yoshida et al., 2001; Hollien και Weissman, 2006; Upton et al., 2012). Περαιτέρω, ενώ το RNaseL διασπά κατά κύριο λόγο σε μονόκλωνη περιοχή, το IRE1 φαίνεται να διασπά εξίσου καλά σε μονόκλωνη και δίκλωνη περιοχή (Upton et al., 2012). Ωστόσο, μια πρόσφατη αναφορά πρότεινε μια συναινετική θέση διάσπασης με την αλληλουχία UN/N, στους στόχους RNaseL και σε εκείνα τα mRNA που διασπώνται από το IRE1 ως μέρος της οδού RIDD (Han et al., 2014). Η πρόσβαση σε πιθανό υπόστρωμα διάσπασης για το RNaseL εικάζεται ότι διευκολύνεται μέσω της συσχέτισής του με πολυριβοσώματα, ενώ δεν είναι γνωστή τέτοια συσχέτιση για το IRE1 (Salehzada et al., 1991). Υπάρχουν πιθανότητες ότι το IRE1 θα είχε προτιμησιακή κατανομή στο πρόχειρο ER, το οποίο, μετά την ενεργοποίηση, θα του έδινε άμεση πρόσβαση στα mRNA για την έναρξη της οδού RIDD. Στο πλαίσιο μιας μόλυνσης από ιούς, η οδός που οδηγεί και από τις δύο αυτές πρωτεΐνες έχει τη δυνατότητα στον κυτταρικό θάνατο. Παρά το γεγονός ότι αυτός μπορεί να είναι ένας αποτελεσματικός τρόπος εκκαθάρισης του ιού, προμηνύει επίσης παθολογικά αποτελέσματα για τον μολυσμένο οργανισμό. Η μελλοντική έρευνα θα οδηγήσει πιθανώς στο σχεδιασμό φαρμάκων που στοχεύουν αυτές τις πρωτεΐνες με βάση τη δομική ομολογία των περιοχών τελεστών τους, ρυθμίζοντας την παθολογική κατάργηση της ενεργοποίησής τους χωρίς να διακυβεύονται οι αντι-ιικές ή πιθανές αντι-ιικές λειτουργίες τους.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 1707, "text": "Η ανασκόπηση αρχικά συζητά τον αντι-ιικό μηχανισμό του συστήματος OAS/RNaseL και τις τακτικές αποφυγής που χρησιμοποιούνται από διαφορετικούς ιούς. Ακολουθεί ανασκόπηση της οδού RIDD και της πιθανής επίδρασής της στη σταθερότητα των ιικών RNA" } ], "id": 2467, "question": "Τι συζητείται σε αυτή τη δημοσίευση;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Σχεδόν πλήρης αλληλουχία γονιδιώματος ενός στελέχους Echovirus 30 από ένα σύμπλεγμα περιπτώσεων ασηπτικής μηνιγγίτιδας στην Καλιφόρνια, Σεπτέμβριος 2017https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc6953510/sha: f0c4d40e1879dd1a049298f151940ac168f5a7authors. Huynh, Thalia; Padilla, Tasha; Chen, Alice; Ng, Terry Fei Fan; Marine, Rachel L.; Castro, Christina J.; Nix, W. Allan; Wadford, Debra A.Date: 2019-10-31DOI: 10.1128/mra.01085-19License: cc-byAbstract: Αναφέρουμε τη σχεδόν πλήρη αλληλουχία γονιδιώματος ενός ανθρώπινου εντεροϊού, ενός στελέχους ηχοϊού 30, που λαμβάνεται από ένα υγρό εγκεφαλονωτιαίο ένας έφηβος ασθενής με άσηπτη μηνιγγίτιδα τον Σεπτέμβριο του 2017. Κείμενο: Οι χοϊοί Ε είναι μέλη του είδους του Εντεροϊού Β του γένους Εντεροϊών (EV) στην οικογένεια των Picornaviridae μη περιτυλιγμένων, μονόκλωνων, θετικών RNA ιών. Οι ηχοϊοί ονομάστηκαν από το ακρωνύμιο εντερικός κυτταροπαθητικός ανθρώπινος ορφανός ιός κατά την ανακάλυψή τους τη δεκαετία του 1950, αλλά αργότερα βρέθηκε ότι σχετίζονται με αναπνευστικές ασθένειες, νόσο του χεριού και αφθώδη πυρετού και άσηπτη μηνιγγίτιδα, παρόμοια με άλλους εντεροϊούς (1 ) .Σύμφωνα με τον Κώδικα Κανονισμών της Καλιφόρνια, τα περιστατικά μηνιγγίτιδας αναφέρονται στο Τμήμα Δημόσιας Υγείας της Καλιφόρνια (CDPH) εντός 1 ημέρας από τον προσδιορισμό της αιτιολογίας (2) . Το φθινόπωρο του 2017, αναφέρθηκε στο CDPH μια ομάδα περιπτώσεων άσηπτης μηνιγγίτιδας από ένα λύκειο της βόρειας Καλιφόρνια. Το Εργαστήριο Ιικών και Ρικέτσιας Νόσων (VRDL) στο CDPH ανίχνευσε EV από 19 από τους 30 ασθενείς (63%) με αντίστροφη μεταγραφή-PCR σε πραγματικό χρόνο (RT-PCR), όπως περιγράφηκε προηγουμένως (3) . Δημιουργήσαμε και αναλύσαμε αλληλουχίες μερικού καψιδίου (ιική πρωτεΐνη 1 [VP1]) χρησιμοποιώντας μεθόδους που αναπτύχθηκαν από τους Minnaar et al. (4) . Δεκαπέντε από τους 19 (79%) ασθενείς με EV-θετικά επιβεβαιώθηκε ότι έχουν ηχοϊό 30 (Ε-30), χρησιμοποιώντας δείγματα εγκεφαλονωτιαίου υγρού (ΕΝΥ). Αυτή η ομάδα περιπτώσεων μηνιγγίτιδας Ε-30 είναι παρόμοια με προηγουμένως αναφερθείσες περιπτώσεις άσηπτης μηνιγγίτιδας Ε-30 (5, 6) σε συμπτώματα και επιδημιολογία. Εδώ, αναφέρουμε μια σχεδόν πλήρη αλληλουχία γονιδιώματος από ένα από τα δείγματα ΕΝΥ θετικού Ε-30. Το CSF υποβλήθηκε σε επεξεργασία με φυγοκέντρηση, διήθηση 0,45 m και επεξεργασία με νουκλεάση πριν από την εκχύλιση χρησιμοποιώντας το σύστημα NucliSENS easyMAG (bioMérieux, Durham, NC) (7). Τα εκχυλισμένα νουκλεϊκά οξέα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DNase για να δώσουν RNA, το οποίο υποβλήθηκε σε τυχαία αντίστροφη μεταγραφή και PCR (7). Η βιβλιοθήκη αλληλουχίας επόμενης γενιάς (NGS) παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ Nextera XT και αναλύθηκε η αλληλουχία σε μια πλατφόρμα MiSeq 300 κύκλων ζευγαρωμένης εκτέλεσης (Illumina, San Diego, CA). Τα δεδομένα NGS αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας έναν αγωγό εσωτερικών Κέντρων Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων (CDC) που περιλαμβάνει την αφαίρεση αλληλουχιών ξενιστών χρησιμοποιώντας bowtie2/2.3.3.1, αφαίρεση εκκινητών, χαμηλής ποιότητας (κάτω από Q20) και μήκους ανάγνωσης (Ͻ50 νουκλεοτίδια ) φιλτράρισμα με χρήση cutadapt 1.18, ανάγνωση αφαίρεσης αντιγραφής χρησιμοποιώντας σενάριο Dedup.py, συγκρότηση de novo με χρήση προεπιλεγμένων παραμέτρων SPAdes 3.7 και αναζήτηση BLAST των συνεπειών που προκύπτουν (8) . Υπήρχαν συνολικά 141.329 αναγνώσεις FASTQ μετά την επεξεργασία. Το τελικό συναινετικό γονιδίωμα επιθεωρήθηκε και σχολιάστηκε χρησιμοποιώντας Geneious v10.0.9 (9) . Το contig κατασκευάστηκε από 15.712 αναγνώσεις, συναρμολογήθηκε σε ένα γονιδίωμα αναφοράς E-30 (αριθμός πρόσβασης GenBank JX976773) και θεωρήθηκε σχεδόν πλήρες σε σύγκριση με την αναφορά και τα άκρα προσδιορίστηκαν ως μέρος του πρωτοκόλλου (7). Η συνολική περιεκτικότητα σε GC είναι 48,3% για 7.155 βάσεις. Η μέση κάλυψη ανάγνωσης ήταν 260 φορές για το γονιδίωμα E-30. Η αλληλουχία γονιδιώματος ονομάστηκε E-30 USA/2017/CA-RGDS-1005. Η αλληλουχία του VP1 επιβεβαιώθηκε από το Εργαστήριο CDC Picornavirus ότι είναι σχεδόν πανομοιότυπη με εκείνες των E-30 που εντοπίστηκαν σε ένα ξέσπασμα ασηπτικής μηνιγγίτιδας που εμφανίστηκε το φθινόπωρο του 2017 στη Νεβάδα. έχει επίσης μεγαλύτερη από 99% ταυτότητα νουκλεοτιδίων με τις αλληλουχίες VP1 των στελεχών E-30 από τις νότιες Ηνωμένες Πολιτείες που ταυτοποιήθηκαν από το CDC τον Μάιο του 2017 (αριθμοί πρόσβασης GenBank MG584831 και MG584832), όπως μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την ηλεκτρονική έκδοση του blastn (https: //blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Η αλληλουχία γονιδιώματος του E-30 USA/2017/CA-RGDS-1005 μοιράζεται λιγότερο από 89% ταυτότητα νουκλεοτιδίου (NI) και λιγότερο από 98% ταυτότητα αμινοξέων (AI) με άλλες δημόσια διαθέσιμες αλληλουχίες Ε-30. Η αλληλουχία περιέχει την πλήρη περιοχή κωδικοποίησης πρωτεΐνης, με μικρές τομές στις μη μεταφρασμένες περιοχές (UTRs) να λείπουν λόγω έλλειψης κάλυψης ανάγνωσης (περίπου 182 και 90 νουκλεοτίδια των 5= και 3= UTR, αντίστοιχα). Η πολυπρωτεΐνη του εντεροϊού μπορεί να χωριστεί σε μία δομική (Ρ1-καψίδιο) και δύο μη δομικές (Ρ2 και Ρ3) περιοχές. Οι περιοχές πολυπρωτεϊνών του γονιδιώματος Ε-30 που αναφέρονται εδώ μοιράζονται 96%, 88% και 84% NI (P1, P2 και P3, αντίστοιχα) με άλλες αλληλουχίες Ε-30 στη διαθεσιμότητα GenBank.Data. Η αλληλουχία E-30 του USA/2017/CA-RGDS-1005 έχει κατατεθεί στη GenBank με τον αριθμό πρόσβασης MK238483. Οι ποιοτικά φιλτραρισμένες αναγνώσεις FASTQ έχουν κατατεθεί στο Αρχείο Ακολουθίας Ανάγνωσης με τον αριθμό πρόσβασης SRR10082176. Οι συνεισφορές του Εργαστηρίου Ιικών και Ρικέτσιων Νόσων του Τμήματος Δημόσιας Υγείας της Καλιφόρνια υποστηρίχθηκαν εν μέρει από τη Συνεργατική Συμφωνία Επιδημιολογίας και Εργαστηριακής Ικανότητας για Λοιμώδεις Νόσους αριθμός 6 NU50CK000410 από τα Κέντρα Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων των Η.Π.Α. Αυτή η εργασία χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από ομοσπονδιακές πιστώσεις προς τα Κέντρα Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων, μέσω του στοιχείου γραμμής Advanced Molecular Detection Initiative. Τα ευρήματα και τα συμπεράσματα σε αυτήν την έκθεση είναι του συγγραφέα ή των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραίτητα την επίσημη θέση του τα Κέντρα Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 1230, "text": "Τμήμα Δημόσιας Υγείας της Καλιφόρνια (CDPH)" } ], "id": 2990, "question": "Στην Καλιφόρνια, πού αναφέρονται τα κρούσματα μηνιγγίτιδας σύμφωνα με τον Κώδικα Κανονισμών της Καλιφόρνια;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1268, "text": "CDPH" } ], "id": 2992, "question": "Πού βρίσκεται το Εργαστήριο Ιικών και Ρικέτσιας Νόσων;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4649, "text": "Ε-30" } ], "id": 2993, "question": "Τι τύπος γονιδιώματος αναφοράς χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3786, "text": "260 φορές" } ], "id": 2994, "question": "Ποια ήταν η αναγνωσμένη κάλυψη για το γονιδίωμα E-30 σε αυτή τη μελέτη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4933, "text": "μία δομική (Ρ1-καψίδιο) και δύο μη δομικές (Ρ2 και Ρ3) περιοχές" } ], "id": 2995, "question": "Ποιες είναι οι δομικές περιοχές της πολυπρωτεΐνης του εντεροϊού σε αυτή τη μελέτη;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "iNR-Drug: Πρόβλεψη της αλληλεπίδρασης των φαρμάκων με τους πυρηνικούς υποδοχείς στο κυψελοειδές δίκτυοhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3975431/SHA: ee55aea26f816403476a7cb8ec. Xiao, Xuan; Min, Jian-Liang; Chou, Kuo-ChenΗμερομηνία: 2014-03-19DOI: 10.3390/ijms15034915Άδεια: cc-byAbstract: Οι πυρηνικοί υποδοχείς (NRs) συνδέονται στενά με διάφορες σημαντικές ασθένειες όπως ο καρκίνος, ο διαβήτης, η φλεγμονώδης νόσος και η οστεοπόρωση. Ως εκ τούτου, οι NR έχουν γίνει συχνός στόχος για την ανάπτυξη φαρμάκων. Κατά τη διαδικασία ανάπτυξης φαρμάκων ενάντια σε αυτές τις ασθένειες στοχεύοντας NRs, αντιμετωπίζουμε συχνά ένα πρόβλημα: Δεδομένου ενός NR και μιας χημικής ένωσης, μπορούμε να προσδιορίσουμε εάν είναι πραγματικά σε αλληλεπίδραση μεταξύ τους σε ένα κύτταρο; Για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος, αναπτύχθηκε ένας προγνωστικός παράγοντας που ονομάζεται «iNR-Drug». Στον προγνωστικό παράγοντα, η εν λόγω ένωση φαρμάκου διαμορφώθηκε από έναν 256-D (διάστατο) φορέα που προέρχεται από το μοριακό του αποτύπωμα, και το NR από έναν φορέα 500-D που σχηματίστηκε με την ενσωμάτωση των διαδοχικών πληροφοριών εξέλιξης και των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών στη γενική μορφή του ψευδο σύνθεση αμινοξέων και η μηχανή πρόβλεψης λειτουργούσε από τον αλγόριθμο SVM (μηχανή φορέα υποστήριξης). Σε σύγκριση με τις υπάρχουσες μεθόδους πρόβλεψης σε αυτόν τον τομέα, το iNR-Drug όχι μόνο μπορεί να αποφέρει υψηλότερο ποσοστό επιτυχίας, αλλά παρουσιάζεται επίσης από έναν φιλικό προς το χρήστη web-server που είναι εγκατεστημένος στη διεύθυνση http://www.jci-bioinfo.cn/iNR- Φάρμακο/, το οποίο είναι ιδιαίτερα χρήσιμο για τους περισσότερους πειραματικούς επιστήμονες για να αποκτήσουν έγκαιρα τα επιθυμητά δεδομένα. Αναμένεται ότι ο διακομιστής iNR-Drug μπορεί να γίνει ένα χρήσιμο εργαλείο υψηλής απόδοσης τόσο για τη βασική έρευνα όσο και για την ανάπτυξη φαρμάκων και ότι η τρέχουσα προσέγγιση μπορεί εύκολα να επεκταθεί για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων του φαρμάκου και με άλλους στόχους. Κείμενο: Με την ικανότητα Για να συνδεθούν απευθείας με το DNA (Εικόνα 1) και να ρυθμίσουν την έκφραση γειτονικών γονιδίων, οι πυρηνικοί υποδοχείς (NRs) είναι μια κατηγορία παραγόντων μεταγραφής που επάγονται από συνδέτη. Ρυθμίζουν διάφορες βιολογικές διεργασίες, όπως η ομοιόσταση, η διαφοροποίηση, η εμβρυϊκή ανάπτυξη και η φυσιολογία οργάνων [1] [2] [3] . Η υπεροικογένεια NR έχει ταξινομηθεί σε επτά οικογένειες: NR0 (knirps ή σαν DAX) [4, 5]; NR1 (όπως η ορμόνη του θυρεοειδούς), NR2 (όμοιο με το HNF4), NR3 (όπως τα οιστρογόνα), NR4 (όπως ο αυξητικός παράγοντας νεύρων IB), NR5 (όπως το fushi tarazu-F1) και NR6 (όπως ο πυρηνικός παράγοντας γεννητικών κυττάρων). Δεδομένου ότι εμπλέκονται σε όλες σχεδόν τις πτυχές της ανθρώπινης φυσιολογίας και εμπλέκονται σε πολλές μείζονες ασθένειες όπως ο καρκίνος, ο διαβήτης και η οστεοπόρωση, οι πυρηνικοί υποδοχείς έχουν γίνει κύριοι στόχοι φαρμάκων [6, 7], μαζί με τους υποδοχείς συζευγμένους με πρωτεΐνη G (GPCRs). 8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] , κανάλια ιόντων [18] [19] [20] και πρωτεΐνες κινάσης [21] [22 ] [23] [24] . Ο προσδιορισμός των αλληλεπιδράσεων φαρμάκου-στόχου είναι ένα από τα πιο σημαντικά βήματα για την ανάπτυξη της νέας ιατρικής [25, 26]. Η μέθοδος που συνήθως υιοθετείται σε αυτό το βήμα είναι η προσομοίωση μοριακής σύνδεσης [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] . Ωστόσο, για να καταστεί εφικτή η μελέτη μοριακής σύνδεσης, μια αξιόπιστη τρισδιάστατη (τρισδιάστατη) δομή της πρωτεΐνης στόχου είναι η απαραίτητη προϋπόθεση. Αν και η κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ είναι ένα ισχυρό εργαλείο για τον προσδιορισμό των τρισδιάστατων δομών πρωτεΐνης, είναι χρονοβόρα και δαπανηρή. Ειδικότερα, δεν μπορούν να κρυσταλλωθούν επιτυχώς όλες οι πρωτεΐνες. Για παράδειγμα, οι πρωτεΐνες της μεμβράνης είναι πολύ δύσκολο να κρυσταλλωθούν και οι περισσότερες από αυτές δεν θα διαλυθούν σε κανονικούς διαλύτες. Ως εκ τούτου, μέχρι στιγμής έχουν προσδιοριστεί πολύ λίγες τρισδιάστατες δομές πρωτεΐνης μεμβράνης. Αν και το NMR (πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός) είναι πράγματι ένα πολύ ισχυρό εργαλείο για τον προσδιορισμό των τρισδιάστατων δομών των μεμβρανικών πρωτεϊνών, όπως υποδεικνύεται από μια σειρά πρόσφατων δημοσιεύσεων (βλ., π.χ., [44] [45] [46] [47] [48] [ 49] [50] [51] και ένα άρθρο ανασκόπησης [20] ), είναι επίσης χρονοβόρα και δαπανηρή. Για να αποκτήσει κανείς τις τρισδιάστατες δομικές πληροφορίες έγκαιρα, πρέπει να καταφύγει σε διάφορα δομικά εργαλεία βιοπληροφορικής (βλέπε, π.χ., [37] ), ιδιαίτερα την ομόλογη προσέγγιση μοντελοποίησης όπως χρησιμοποιείται για μια σειρά πρωτεϊνικών υποδοχέων που χρειάζονται επειγόντως κατά τη διαδικασία λήψης φαρμάκου ανάπτυξη [19, [52] [53] [54] [55] [56] [57] . Δυστυχώς, ο αριθμός των αξιόπιστων προτύπων για την ανάπτυξη υψηλής ποιότητας τρισδιάστατων δομών μέσω μοντελοποίησης ομολογίας είναι πολύ περιορισμένος [37] . Για να ξεπεραστούν τα προαναφερθέντα προβλήματα, θα βοηθούσε να αναπτυχθεί μια υπολογιστική μέθοδος για την πρόβλεψη των αλληλεπιδράσεων των φαρμάκων με τους πυρηνικούς υποδοχείς στην κυψελοειδές δικτύωση με βάση τις πληροφορίες ακολουθιών της τελευταίας. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με αυτόν τον τρόπο μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον εκ των προτέρων αποκλεισμό των ενώσεων που δεν έχουν εντοπιστεί σε αλληλεπίδραση με τους πυρηνικούς υποδοχείς, έτσι ώστε να σταματήσει έγκαιρα η σπατάλη χρόνου και χρημάτων σε αυτές τις απρόβλεπτες ενώσεις [58] .Στην πραγματικότητα, με βάση τις λειτουργικές ομάδες και τα βιολογικά χαρακτηριστικά, Μια ισχυρή μέθοδος αναπτύχθηκε πρόσφατα [59] για το σκοπό αυτό. Ωστόσο, περαιτέρω ανάπτυξη σε αυτό το θέμα είναι σίγουρα απαραίτητη για τους ακόλουθους λόγους. (α) Ο He et al. [59] δεν παρείχαν έναν διακομιστή διαδικτύου προσβάσιμο στο κοινό για τη μέθοδό τους, και ως εκ τούτου η πρακτική του αξία εφαρμογής είναι αρκετά περιορισμένη, ιδιαίτερα για τους ευρύτερους πειραματιστές επιστήμονες. (β) Η ποιότητα πρόβλεψης μπορεί να βελτιωθεί περαιτέρω με την ενσωμάτωση ορισμένων βασικών χαρακτηριστικών στη σύνθεση δειγμάτων NR-φαρμάκου (πυρηνικός υποδοχέας και φάρμακο) μέσω της γενικής μορφής σύνθεσης ψευδοαμινοξέων [60] . Η παρούσα μελέτη ξεκίνησε με μια προσπάθεια να αναπτύξει μια νέα μέθοδο για την πρόβλεψη της αλληλεπίδρασης των φαρμάκων με τους πυρηνικούς υποδοχείς αντιμετωπίζοντας τα δύο σημεία. Όπως καταδεικνύεται από μια σειρά πρόσφατων δημοσιεύσεων [10, 18, [61] [62] [63] [64] [65] [66] ] [67] [68] [69] [70] και συνοψίζονται σε μια ολοκληρωμένη ανασκόπηση [60] , για να δημιουργηθεί ένας πραγματικά αποτελεσματικός στατιστικός παράγοντας πρόβλεψης για ένα βιοϊατρικό σύστημα, πρέπει να εξετάσουμε τα ακόλουθα βήματα: (α) να επιλέξουμε ή να κατασκευάσουμε ένα έγκυρο σύνολο δεδομένων αναφοράς για την εκπαίδευση και τη δοκιμή του προγνωστικού παράγοντα· (β) αντιπροσωπεύουν τα στατιστικά δείγματα με μια αποτελεσματική διατύπωση που μπορεί πραγματικά να αντικατοπτρίζει την εγγενή τους συσχέτιση με το αντικείμενο που πρόκειται να προβλεφθεί. (γ) να εισαγάγει ή να αναπτύξει έναν ισχυρό αλγόριθμο ή μηχανή για τη λειτουργία της πρόβλεψης· (δ) να εκτελεί σωστά δοκιμές διασταυρούμενης επικύρωσης για να αξιολογήσει αντικειμενικά την αναμενόμενη ακρίβεια του προγνωστικού παράγοντα· (ε) να δημιουργήσει έναν φιλικό προς τον χρήστη διακομιστή web για τον προγνωστικό παράγοντα που είναι προσβάσιμος στο κοινό. Παρακάτω, ας εξηγήσουμε πώς να αντιμετωπίσουμε αυτά τα βήματα. Τα δεδομένα που χρησιμοποιήθηκαν στην τρέχουσα μελέτη συλλέχθηκαν από το KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) [71] στη διεύθυνση http://www.kegg.jp/kegg/. Το KEGG είναι ένας πόρος βάσης δεδομένων για την κατανόηση λειτουργιών και χρησιμότητας υψηλού επιπέδου του βιολογικού συστήματος, όπως το κύτταρο, ο οργανισμός και το οικοσύστημα, από πληροφορίες μοριακού επιπέδου, ειδικά μεγάλης κλίμακας μοριακά σύνολα δεδομένων που παράγονται από αλληλουχία γονιδιώματος και άλλα υψηλής απόδοσης πειραματικές τεχνολογίες. Εδώ, το σύνολο δεδομένων αναφοράς μπορεί να διαμορφωθεί όπως είναι το θετικό υποσύνολο που αποτελείται μόνο από τα αλληλεπιδραστικά ζεύγη φαρμάκου-NR, ενώ το αρνητικό υποσύνολο που περιέχει μόνο τα ζεύγη μη αλληλεπιδρών φαρμάκων-NR και το σύμβολο αντιπροσωπεύει την ένωση στο σύνολο θεωρία. Το λεγόμενο \"διαδραστικό\" ζεύγος εδώ σημαίνει το ζεύγος του οποίου τα δύο αντίστοιχα αλληλεπιδρούν μεταξύ τους στα δίκτυα στόχων φαρμάκων όπως ορίζονται στη βάση δεδομένων KEGG [71]. ενώ το «μη διαδραστικό» ζεύγος σημαίνει ότι τα δύο αντίστοιχά του δεν αλληλεπιδρούν μεταξύ τους στα δίκτυα στόχων φαρμάκων. Το θετικό σύνολο δεδομένων περιέχει 86 ζεύγη φαρμάκου-NR, τα οποία ελήφθησαν από τους He et al. [59] . Το αρνητικό σύνολο δεδομένων περιέχει 172 μη αλληλεπιδραστικά ζεύγη φαρμάκου-NR, τα οποία προέκυψαν σύμφωνα με τις ακόλουθες διαδικασίες: (α) διαχωρισμός καθενός από τα ζεύγη σε μεμονωμένο φάρμακο και NR. (β) επανασύζευξη καθενός από τα μεμονωμένα φάρμακα με καθένα από τα μεμονωμένα NR σε ζεύγη με τρόπο που κανένα από αυτά δεν εμφανίστηκε σε (γ) επιλέγοντας τυχαία τα ζεύγη που σχηματίστηκαν έτσι μέχρι να φτάσουμε στον αριθμό δύο φορές περισσότερα από τα ζευγάρια στο . Τα 86 αλληλεπιδραστικά ζεύγη φαρμάκου-NR και 172 μη αλληλεπιδραστικά ζεύγη φαρμάκου-NR δίνονται στις Συμπληρωματικές Πληροφορίες S1, από τις οποίες μπορούμε να δούμε ότι τα 86 + 172 = 258 ζεύγη στο τρέχον σύνολο δεδομένων αναφοράς σχηματίζονται στην πραγματικότητα από 25 διαφορετικά NR και 53 διαφορετικές ενώσεις. Δεδομένου ότι καθένα από τα δείγματα στο τρέχον σύστημα δικτύου περιέχει ένα φάρμακο (ένωση) και μια NR (πρωτεΐνη), ακολουθήθηκαν οι ακόλουθες διαδικασίες για να αντιπροσωπεύσουν το δείγμα του ζεύγους φαρμάκου-NR. Πρώτον, για το μέρος του φαρμάκου στο τρέχον σημείο αναφοράς σύνολο δεδομένων, μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε ένα διάνυσμα 256-D για να το διατυπώσουμε όπως δίνεται από όπου το D αντιπροσωπεύει το φορέα για μια ένωση φαρμάκου και d i το i-ο (i = 1,2, ,256) συστατικό του που μπορεί να προκύψει ακολουθώντας το \" διαδικασία 2D μοριακών δακτυλικών αποτυπωμάτων» όπως αναλύεται στο [10] . Οι 53 φορείς μοριακών δακτυλικών αποτυπωμάτων που ελήφθησαν έτσι για τα 53 φάρμακα δίνονται, αντίστοιχα, στις Συμπληρωματικές Πληροφορίες S2. Οι πρωτεϊνικές αλληλουχίες των 25 διαφορετικών NRs παρατίθενται στις Συμπληρωματικές Πληροφορίες S3. Ας υποθέσουμε ότι η αλληλουχία μιας πρωτεΐνης πυρηνικού υποδοχέα P με υπολείμματα L εκφράζεται γενικά όπου το 1 R αντιπροσωπεύει το 1ο υπόλειμμα της πρωτεϊνικής αλληλουχίας P, το 2 R το 2ο υπόλειμμα, και ούτω καθεξής. Τώρα το πρόβλημα είναι πώς να αναπαραστήσουμε αποτελεσματικά την ακολουθία της Εξίσωσης (3) με ένα μη διαδοχικό ή διακριτό μοντέλο [72] . Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι όλοι οι υπάρχοντες κινητήρες λειτουργίας, όπως ο διαχωριστής συνδιακύμανσης (CD) [17, 65, [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] , νευρωνικό δίκτυο [80] [81 ] [82] , μηχανή διανυσμάτων υποστήριξης (SVM) [62] [63] [64] 83] , τυχαίο δάσος [84, 85] , τυχαίο πεδίο υπό όρους [66] , πλησιέστερος γείτονας (NN) [86, 87]; K-πλησιέστερος γείτονας (KNN) [88] [89] [90] , OET-KNN [91] [92] [93] [94] , και Fuzzy K-πλησιέστερος γείτονας [10, 12, 18, 69, 95] , μπορεί να χειριστεί μόνο δείγματα διανύσματος αλλά όχι ακολουθίας. Ωστόσο, ένα διάνυσμα που ορίζεται σε ένα διακριτό μοντέλο μπορεί να χάσει εντελώς όλες τις πληροφορίες σειράς-σειράς και ως εκ τούτου να περιορίσει την ποιότητα της πρόβλεψης. Αντιμετωπίζοντας ένα τέτοιο δίλημμα, μπορούμε να βρούμε μια προσέγγιση που να ενσωματώνει εν μέρει τα εφέ σειράς-τάξης; Στην πραγματικότητα, ένα από τα πιο δύσκολα προβλήματα στην υπολογιστική βιολογία είναι πώς να διατυπωθεί μια βιολογική ακολουθία με ένα διακριτό μοντέλο ή ένα διάνυσμα, αλλά να διατηρήσει ακόμα σημαντικές πληροφορίες σειράς ακολουθίας. Για να αποφευχθεί η πλήρης απώλεια των πληροφοριών σειράς σειράς για πρωτεΐνες, προτάθηκε η σύνθεση ψευδοαμινοξέων [96, 97] ή το PseAAC του Chou [98]. Από τότε που προτάθηκε η έννοια του PseAAC το 2001 [96] , έχει διεισδύσει σχεδόν σε όλους τους τομείς της υπολογιστικής πρωτεϊνικής, όπως η πρόβλεψη αντικαρκινικών πεπτιδίων [99] , η πρόβλεψη της υποκυτταρικής θέσης πρωτεΐνης [100] [101] [102] [103 ] [104] [105] [106] , πρόβλεψη τύπων πρωτεϊνών μεμβράνης [107, 108] , πρόβλεψη θέσεων πρωτεϊνικής υποχοόνδριας [109] [110] [111] [112] , πρόβλεψη πρωτεϊνών υποδοχέα GABA(A) [113] , πρόβλεψη Κατηγορίες υποοικογένειας ενζύμων [114] , πρόβλεψη αντιβακτηριακών πεπτιδίων [115] , πρόβλεψη υπερδευτερογενούς δομής [116] , πρόβλεψη βακτηριακών μολυσματικών πρωτεϊνών [117] , πρόβλεψη δομικής κατηγορίας πρωτεϊνών [118] , πρόβλεψη των συμπαραγόντων της οικογένειας οξειδοαναγωγικών [19]προτετασών οξειδοαναγωγικών [19]μεταλλοπροτεασών [19] προτετασών οξειδοαναγωγικών [19] μεταλλοφάσεων [19] 120] , ταυτοποίηση θέσεων S-νιτροζυλίωσης κυστεΐνης σε πρωτεΐνες [66] , ταυτοποίηση βακτηριακών εκκρινόμενων πρωτεϊνών [121] , ταυτοποίηση αντιβακτηριακών πεπτιδίων [115] , ταυτοποίηση αλλεργιογόνων πρωτεϊνών [122] , ταυτοποίηση πρωτεϊνικών τεταρτοταγών δομικών χαρακτηριστικών [123, 14] τύπος ιών ανθρώπινων θηλωμάτων [125] , ταυτοποίηση πρωτεϊνών κυκλίνης [126] , ταυτοποίηση GPCR και των τύπων τους [15, 16] , διάκριση πρωτεϊνών της εξωτερικής μεμβράνης [127] , ταξινόμηση αμινοξέων [128] , ανίχνευση απομακρυσμένων ομόλογων πρωτεϊνών μεταξύ [129], πολλά άλλα (δείτε μια μακρά λίστα εργασιών που αναφέρονται στην ενότητα Αναφορές του [60] ). Επιπλέον, η έννοια του PseAAC επεκτάθηκε περαιτέρω για να αντιπροσωπεύσει τους φορείς χαρακτηριστικών των νουκλεοτιδίων [65] , καθώς και άλλων βιολογικών δειγμάτων (βλέπε, π.χ., [130] [131] [132] ). Επειδή έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως και ολοένα και περισσότερο, πρόσφατα δύο ισχυρά λογισμικά, που ονομάζονται \"PseAAC-Builder\" [133] και \"propy\" [134], καθιερώθηκαν για τη δημιουργία διαφόρων ειδικών συνθέσεων ψευδο-αμινοξέων του Chou, επιπλέον των διακομιστής ιστού \"PseAAC\" [135] που κατασκευάστηκε το 2008. Σύμφωνα με μια ολοκληρωμένη ανασκόπηση [60] , η γενική μορφή του PseAAC για μια αλληλουχία πρωτεΐνης P διαμορφώνεται από όπου ο δείκτης  είναι ένας ακέραιος αριθμός και η τιμή του καθώς και τα συστατικά ( 1, 2, , ) u u   θα εξαρτηθεί από τον τρόπο εξαγωγής της επιθυμητής πληροφορίας από την αλληλουχία αμινοξέων του P (βλ. Εξίσωση (3)). Παρακάτω, ας περιγράψουμε τον τρόπο εξαγωγής χρήσιμων πληροφοριών για τον καθορισμό των συστατικών του PseAAC για τα σχετικά δείγματα NR. Πρώτον, πολλές προηγούμενες μελέτες (βλέπε, π.χ., [136] [137] [138] [139] [140] [141] ) έχουν δείξει ότι η σύνθεση αμινοξέων (AAC) μιας πρωτεΐνης παίζει σημαντικό ρόλο στον προσδιορισμό των ιδιοτήτων της . Το AAC περιέχει 20 συστατικά με το καθένα να αντιπροσωπεύει τη συχνότητα εμφάνισης ενός από τα 20 φυσικά αμινοξέα στη σχετική πρωτεΐνη. Έτσι, αυτά τα 20 στοιχεία AAC χρησιμοποιήθηκαν εδώ για να ορίσουν τα πρώτα 20 στοιχεία στην Εξίσωση (4). δηλ., (1) ( 1, 2, , 20) ii fi   (5) όπου f i (1) είναι η κανονικοποιημένη συχνότητα εμφάνισης του φυσικού αμινοξέος τύπου i-ου στον σχετικό πυρηνικό υποδοχέα. Εφόσον το AAC δεν περιείχε καμία πληροφορία σειράς αλληλουχίας, λήφθηκαν τα ακόλουθα βήματα για να καλυφθεί αυτό το μειονέκτημα. Για να αποφευχθεί η πλήρης απώλεια της τοπικής ή μικρής εμβέλειας πληροφοριών σειράς αλληλουχίας, εξετάσαμε την προσέγγιση της σύνθεσης διπεπτιδίου. Περιείχε 20 × 20 = 400 συστατικά [142] . Τέτοια 400 στοιχεία χρησιμοποιήθηκαν για τον ορισμό των επόμενων 400 στοιχείων στην Εξίσωση (4). δηλ., (2) 20 (1, 2, , 400) jj fj όπου (2) j f είναι η κανονικοποιημένη συχνότητα εμφάνισης των j-ου διπεπτιδίων στον σχετικό πυρηνικό υποδοχέα. Για να ενσωματώσουμε τις πληροφορίες σειράς καθολικής ή μεγάλης εμβέλειας, ας εξετάσουμε την ακόλουθη προσέγγιση. Σύμφωνα με τη μοριακή εξέλιξη, όλες οι βιολογικές αλληλουχίες έχουν αναπτυχθεί ξεκινώντας από έναν πολύ περιορισμένο αριθμό προγονικών δειγμάτων. Καθοδηγούμενα από διάφορες εξελικτικές δυνάμεις όπως μετάλλαξη, ανασυνδυασμός, μετατροπή γονιδίων, γενετική μετατόπιση και επιλογή, έχουν υποστεί πολλές αλλαγές, όπως αλλαγές μεμονωμένων υπολειμμάτων, εισαγωγές και διαγραφές πολλών υπολειμμάτων [143], διπλασιασμό γονιδίων και σύντηξη γονιδίων. Με τη συσσώρευση αυτών των αλλαγών για μεγάλο χρονικό διάστημα, πολλές αρχικές ομοιότητες μεταξύ της αρχικής και της προκύπτουσας αλληλουχίας αμινοξέων σταδιακά εξαφανίζονται, αλλά οι αντίστοιχες πρωτεΐνες μπορεί να εξακολουθούν να έχουν πολλά κοινά χαρακτηριστικά [37], όπως να έχουν βασικά την ίδια βιολογική λειτουργία και κατοικούν στην ίδια υποκυτταρική θέση [144, 145]. Για την εξαγωγή των πληροφοριών διαδοχικής εξέλιξης και τη χρήση τους για τον καθορισμό των συνιστωσών της Εξίσωσης (4), χρησιμοποιήθηκε ο PSSM (Position Specific Scoring Matrix) όπως περιγράφεται παρακάτω. Σύμφωνα με τον Schaffer [146], οι πληροφορίες εξέλιξης αλληλουχίας μιας πρωτεΐνης πυρηνικού υποδοχέα P με L τα υπολείμματα αμινοξέων μπορούν να εκφραστούν με μια μήτρα 20 L, όπως δίνεται από όπου (7) δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας PSI-BLAST [147] για αναζήτηση στη βάση δεδομένων UniProtKB/Swiss-Prot (The Universal Protein Resource (UniProt). http://www.uniprot.org/) μέσω τριών επαναλήψεων με 0,001 ως τιμή αποκοπής E-value για ευθυγράμμιση πολλαπλών αλληλουχιών έναντι της αλληλουχίας του σχετικού πυρηνικού υποδοχέα. Προκειμένου κάθε στοιχείο της εξίσωσης (7) να κλιμακωθεί από το αρχικό εύρος βαθμολογίας στην περιοχή του [0, 1], πραγματοποιήσαμε μια μετατροπή μέσω της τυπικής συνάρτησης σιγμοειδούς για να γίνειΤώρα εξάγουμε τις χρήσιμες πληροφορίες από την Εξίσωση (8 ) Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε την προσέγγιση μοντέλου γκρίζου συστήματος όπως αναλύθηκε στο [68] για να ορίσουμε περαιτέρω τις επόμενες 60 συνιστώσες της Εξίσωσης (4) ( 1, 2, , 20) Στην παραπάνω εξίσωση, w 1 , w 2 και w 3 είναι παράγοντες βάρους, οι οποίοι ορίστηκαν όλοι στο 1 στην τρέχουσα μελέτη. Η f j (1) έχει την ίδια έννοια όπως στην Εξίσωση (5) όπου   και Συνδυάζοντας τις εξισώσεις (5), (6), (10) και (12), βρήκαμε ότι ο συνολικός αριθμός των συστατικών που λήφθηκε μέσω της τρέχουσας προσέγγισης για το PseAAC της εξίσωσης (4) και καθένα από τα 500 συστατικά δίνεται από το (1) ( Εφόσον τα στοιχεία στις εξισώσεις (2) και (4) είναι καλά καθορισμένα, μπορούμε τώρα να διατυπώσουμε το ζεύγος φάρμακο-NR συνδυάζοντας τις δύο εξισώσεις όπως δίνεται από το   (19) όπου G παριστάνει το ζεύγος φαρμάκου-NR, Å το ορθογώνιο άθροισμα και τα 256 + 500 = 756 συνιστώσες ορίζονται από τις Εξισώσεις (2) και (18) . Για λόγους ευκολίας, ας χρησιμοποιήσουμε το x i (i = 1, 2, , 756) για να αναπαραστήσουμε τα 756 στοιχεία στην Εξίσωση (19). δηλ., (20) Για να βελτιστοποιήσουμε την ποιότητα πρόβλεψης με μια προσέγγιση εξοικονόμησης χρόνου, παρόμοια με την επεξεργασία [148] [149] [150] , ας μετατρέψουμε την εξίσωση (20) όπου το σύμβολο σημαίνει τη λήψη του μέσου όρου της ποσότητας σε αυτήν, και SD σημαίνει την αντίστοιχη τυπική παραγωγή. Σε αυτή τη μελέτη, το SVM (μηχανή φορέα υποστήριξης) χρησιμοποιήθηκε ως κινητήρας λειτουργίας. Το SVM έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως στον τομέα της βιοπληροφορικής (βλ., π.χ., [62] [63] [64] [151] [152] [153] [154] ). Η βασική ιδέα του SVM είναι να μετατρέψει τα δεδομένα σε ένα χώρο χαρακτηριστικών υψηλών διαστάσεων και στη συνέχεια να καθορίσει το βέλτιστο διαχωριστικό υπερεπίπεδο χρησιμοποιώντας μια συνάρτηση πυρήνα. Για μια σύντομη διατύπωση του SVM και πώς λειτουργεί, δείτε τις εργασίες [155, 156]. για περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με το SVM, δείτε μια μονογραφία [157] .Σε αυτή τη μελέτη, το πακέτο LIBSVM [158] χρησιμοποιήθηκε ως υλοποίηση του SVM, το οποίο μπορείτε να λάβετε από τη διεύθυνση http://www.csie.ntu.edu.tw/ ~cjlin/libsvm/, η δημοφιλής συνάρτηση ακτινικής βάσης (RBF) ελήφθη ως συνάρτηση πυρήνα. Για τον τρέχοντα ταξινομητή SVM, υπήρχαν δύο αβέβαιες παράμετροι: η παράμετρος ποινής C και η παράμετρος πυρήνα  . Η μέθοδος για τον προσδιορισμό των δύο παραμέτρων θα δοθεί αργότερα. Ο προγνωστικός παράγοντας που λαμβάνεται μέσω της προαναφερθείσας διαδικασίας ονομάζεται iNR-Drug, όπου \"i\" σημαίνει ταυτοποίηση και \"NR-Drug\" σημαίνει την αλληλεπίδραση μεταξύ πυρηνικού υποδοχέα και ένωσης φαρμάκου. Για να παρέχεται μια διαισθητική συνολική εικόνα, παρέχεται ένα διάγραμμα ροής στο Σχήμα 2 για να δείξει τη διαδικασία του τρόπου με τον οποίο λειτουργεί ο προγνωστικός παράγοντας στον εντοπισμό των αλληλεπιδράσεων μεταξύ πυρηνικών υποδοχέων και ενώσεων φαρμάκων. Για να παρέχεται μια πιο διαισθητική και πιο κατανοητή μέθοδος μέτρησης της ποιότητας πρόβλεψης, υιοθετήθηκε το ακόλουθο σύνολο μετρήσεων που βασίζονται στη διατύπωση που χρησιμοποιήθηκε από τον Chou [159] [160] [161] για την πρόβλεψη πεπτιδίων σήματος. Σύμφωνα με τη διατύπωση του Chou, η ευαισθησία, η ειδικότητα, η συνολική ακρίβεια και ο συντελεστής συσχέτισης του Matthew μπορούν αντίστοιχα να εκφραστούν ως [62, [65] [66] [67] Sn 1 όπου N  είναι ο συνολικός αριθμός των διαδραστικών ζευγών NR-φαρμάκων που διερευνήθηκαν ενώ N   ο αριθμός των αλληλεπιδραστικών ζευγών NR-φαρμάκων που προβλέφθηκαν λανθασμένα ως τα μη αλληλεπιδραστικά ζεύγη NR-φαρμάκων. N  ο συνολικός αριθμός των μη αλληλεπιδραστικών ζευγών NR-φαρμάκων που διερευνήθηκαν ενώ N   ο αριθμός των μη αλληλεπιδραστικών ζευγών NR-φαρμάκων που προβλέφθηκαν λανθασμένα ως τα διαδραστικά ζεύγη NR-φαρμάκων. Σύμφωνα με την εξίσωση (23) μπορούμε εύκολα να δούμε το ακόλουθο. Όταν 0 N    που σημαίνει ότι κανένα από τα αλληλεπιδραστικά ζεύγη NR-φαρμάκων δεν είχε προβλεφθεί λανθασμένα ότι ήταν ένα μη αλληλεπιδραστικό ζεύγος NR-φαρμάκου, έχουμε την ευαισθησία Sn = 1. ενώ NN    που σημαίνει ότι όλα τα αλληλεπιδραστικά ζεύγη NR-φαρμάκων είχαν προβλεφθεί λανθασμένα ως τα μη αλληλεπιδραστικά ζεύγη NR-φαρμάκων, έχουμε την ευαισθησία Sn = 0 . Ομοίως, όταν 0 N    που σημαίνει ότι κανένα από τα μη αλληλεπιδραστικά ζεύγη NR-φαρμάκων δεν προβλέφθηκε λάθος, έχουμε την ειδικότητα Sp έχουμε MCC = 0 που σημαίνει ολική διαφωνία μεταξύ πρόβλεψης και παρατήρησης. Όπως μπορούμε να δούμε από την παραπάνω συζήτηση, είναι πολύ πιο διαισθητικό και πιο εύκολο να γίνει κατανοητό όταν χρησιμοποιείται η Εξίσωση (23) να εξετάσουμε έναν προγνωστικό παράγοντα για τις τέσσερις μετρήσεις του, ιδιαίτερα για τον συντελεστή συσχέτισης του Mathew. Είναι ενδεικτικό να επισημανθεί ότι οι μετρήσεις όπως ορίζονται στην Εξίσωση (23) ισχύουν για συστήματα μεμονωμένης ετικέτας. για συστήματα πολλαπλών ετικετών, θα πρέπει να χρησιμοποιείται ένα σύνολο πιο περίπλοκων μετρήσεων όπως δίνεται στο [162] . Ο σωστός έλεγχος ενός προγνωστικού παράγοντα για τα αναμενόμενα ποσοστά επιτυχίας είναι πολύ σημαντικός για την ανάπτυξή του καθώς και για την πιθανή αξία εφαρμογής του. Σε γενικές γραμμές, οι ακόλουθες τρεις μέθοδοι διασταυρούμενης επικύρωσης χρησιμοποιούνται συχνά για την εξέταση της ποιότητας ενός προγνωστικού παράγοντα και της αποτελεσματικότητάς του στην πρακτική εφαρμογή: ανεξάρτητη δοκιμή δεδομένων, υποδειγματοληψία ή διπλάσια (όπως πενταπλάσια, επταπλάσια ή 10- πάσο) δοκιμή crossover και δοκιμή jackknife [163] . Ωστόσο, όπως επεξεργάζεται μια διεισδυτική ανάλυση στο [164] , υπάρχει σημαντική αυθαιρεσία στον ανεξάρτητο έλεγχο δεδομένων. Επίσης, όπως καταδεικνύεται στο [165], η δοκιμή υποδειγματοληψίας (ή επικύρωσης διασταύρωσης K-fold) δεν μπορεί να αποφύγει ούτε την αυθαιρεσία. Μόνο η δοκιμή jackknife είναι η λιγότερο αυθαίρετη που μπορεί πάντα να αποφέρει ένα μοναδικό αποτέλεσμα για ένα δεδομένο σύνολο δεδομένων αναφοράς [73, 74, 156, [166] [167] [168] . Ως εκ τούτου, το τεστ jackknife έχει αναγνωριστεί ευρέως και χρησιμοποιείται όλο και περισσότερο από τους ερευνητές για την εξέταση της ποιότητας διαφόρων προγνωστικών παραγόντων (βλ., π.χ., [14, 15, 68, 99, 106, 107, 124, 169, 170] ). Κατά συνέπεια, σε αυτή τη μελέτη υιοθετήθηκε επίσης η δοκιμή jackknife για την αξιολόγηση της ακρίβειας του τρέχοντος προγνωστικού δείκτη. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, ο κινητήρας λειτουργίας SVM περιέχει δύο αβέβαιες παραμέτρους C και . Για να βρεθούν οι βέλτιστες τιμές τους, πραγματοποιήθηκε μια διδιάστατη αναζήτηση πλέγματος με τη δοκιμή jackknife στο σύνολο δεδομένων αναφοράς . Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με αυτόν τον τρόπο φαίνονται στο Σχήμα 3, από το οποίο μπορεί να φανεί ότι ο προγνωστικός παράγοντας iNR-Drug φτάνει τη βέλτιστη κατάστασή του όταν C = 2 3 και 9 2    . Τα αντίστοιχα ποσοστά για τις τέσσερις μετρήσεις (βλ. Η εξίσωση (23)) δίνεται στον Πίνακα 1, όπου για διευκόλυνση της σύγκρισης, η συνολική ακρίβεια Acc που αναφέρεται από τους He et al. [59] στο ίδιο σύνολο δεδομένων αναφοράς δίνεται επίσης, αν και δεν αναφέρθηκαν αποτελέσματα από αυτούς για τα Sn, Sp και MCC. Μπορεί να παρατηρηθεί από τον πίνακα ότι η συνολική ακρίβεια που λαμβάνεται από το iNR-Drug είναι αξιοσημείωτα υψηλότερη από αυτή του He et al. [59] και ότι τα ποσοστά που επιτυγχάνονται από το iNR-Drug για τις άλλες τρεις μετρήσεις είναι επίσης αρκετά υψηλότερα. Αυτά τα γεγονότα δείχνουν ότι ο τρέχων προγνωστικός παράγοντας όχι μόνο μπορεί να αποφέρει υψηλότερη συνολική ακρίβεια πρόβλεψης αλλά είναι επίσης αρκετά σταθερός με χαμηλά ποσοστά ψευδούς πρόβλεψης. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω (Ενότητα 3.2), η δοκιμή jackknife είναι η πιο αντικειμενική μέθοδος για την εξέταση της ποιότητας ενός προγνωστικού. Ωστόσο, ως επίδειξη για να δείξουμε πώς να χρησιμοποιήσουμε πρακτικά τον τρέχοντα προγνωστικό παράγοντα, πήραμε 41 ζεύγη NR-φαρμάκων από τη μελέτη των Yamanishi et al. [171] που είχε επιβεβαιωθεί από πειράματα ως διαδραστικά ζεύγη. Για ένα τέτοιο ανεξάρτητο σύνολο δεδομένων, 34 αναγνωρίστηκαν σωστά από το iNR-Drug ως διαδραστικά ζεύγη, δηλ. Sn = 34 / 41 = 82,92%, το οποίο είναι αρκετά συνεπές με το ποσοστό 79,07% που επιτεύχθηκε από τον προγνωστικό παράγοντα στο σύνολο δεδομένων αναφοράς μέσω του jackknife δοκιμή όπως αναφέρεται στον Πίνακα 1. Αναμένεται ότι ο προγνωστικός παράγοντας iNR-Drug που αναπτύχθηκε σε αυτό το έγγραφο μπορεί να γίνει ένα χρήσιμο εργαλείο υψηλής απόδοσης τόσο για τη βασική έρευνα όσο και για την ανάπτυξη φαρμάκων και ότι η τρέχουσα προσέγγιση μπορεί εύκολα να επεκταθεί για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων του φαρμάκου και με άλλους στόχους. Δεδομένου ότι οι φιλικοί προς τον χρήστη και προσβάσιμοι στο κοινό διακομιστές Ιστού αντιπροσωπεύουν τη μελλοντική κατεύθυνση για την ανάπτυξη πρακτικά πιο χρήσιμων προγνωστικών παραγόντων [98, 172] , δημιουργήθηκε ένας διακομιστής διαδικτύου με πρόσβαση στο κοινό για το iNR-Drug. Για τη διευκόλυνση της συντριπτικής πλειοψηφίας των βιολόγων και των φαρμακευτικών επιστήμονες, εδώ ας παρέχουμε έναν οδηγό βήμα προς βήμα για να δείξουμε πώς οι χρήστες μπορούν εύκολα να λάβουν το επιθυμητό αποτέλεσμα χρησιμοποιώντας τον διακομιστή web iNR-Drug χωρίς να χρειάζεται να ακολουθήσουν τις περίπλοκες μαθηματικές εξισώσεις που παρουσιάζονται σε αυτό το άρθρο για τη διαδικασία ανάπτυξης ο προγνωστικός παράγοντας και η ακεραιότητά του.Βήμα 1. Ανοίξτε τον διακομιστή web στην τοποθεσία http://www.jci-bioinfo.cn/iNR-Drug/ και θα δείτε την επάνω σελίδα του προγνωστικού στην οθόνη του υπολογιστή σας, όπως φαίνεται στην Εικόνα 4 . Κάντε κλικ στο κουμπί Read Me για να δείτε μια σύντομη εισαγωγή σχετικά με το iNR-Drug predictor και την προειδοποίηση κατά τη χρήση του. Βήμα 2. Είτε πληκτρολογήστε είτε αντιγράψτε/επικολλήστε τα ζεύγη ερωτήματος NR-drug στο πλαίσιο εισαγωγής στο κέντρο της Εικόνας 4 . Κάθε ζεύγος ερωτημάτων αποτελείται από δύο μέρη: το ένα είναι για την αλληλουχία του πυρηνικού υποδοχέα και το άλλο για το φάρμακο. Η ακολουθία NR θα πρέπει να είναι σε μορφή FASTA, ενώ το φάρμακο στον κωδικό KEGG αρχίζει με το σύμβολο #. Παραδείγματα για την είσοδο των ζευγών ερωτημάτων και την αντίστοιχη έξοδο μπορούν να φανούν κάνοντας κλικ στο κουμπί Παράδειγμα ακριβώς πάνω από το πλαίσιο εισαγωγής. Βήμα 3. Κάντε κλικ στο κουμπί Υποβολή για να δείτε το προβλεπόμενο αποτέλεσμα. Για παράδειγμα, εάν χρησιμοποιήσετε τα τρία ζεύγη ερωτημάτων στο παράθυρο Παράδειγμα ως είσοδο, αφού κάνετε κλικ στο κουμπί Υποβολή, θα δείτε στην οθόνη σας ότι το \"hsa:2099\" NR και το φάρμακο \"D00066\" είναι ένα διαδραστικό ζεύγος και ότι το φάρμακο \"hsa:2908\" NR και το φάρμακο \"D00088\" είναι επίσης ένα αλληλεπιδραστικό ζεύγος, αλλά ότι το φάρμακο \"hsa:5468\" NR και το φάρμακο \"D00279\" δεν είναι ένα αλληλεπιδραστικό ζεύγος. Όλα αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν πλήρως με τις πειραματικές παρατηρήσεις. Χρειάζονται περίπου 3 λεπτά για να εμφανιστεί στην οθόνη καθένα από αυτά τα αποτελέσματα. Φυσικά, όσο περισσότερα ζεύγη ερωτημάτων υπάρχουν, τόσο περισσότερος χρόνος χρειάζεται συνήθως. Βήμα 4. Κάντε κλικ στο κουμπί Αναφορά για να βρείτε το σχετικό έγγραφο που τεκμηριώνει τη λεπτομερή ανάπτυξη και τον αλγόριθμο του iNR-Durg.Step 5. Κάντε κλικ στο κουμπί Δεδομένα για να κατεβάσετε το σύνολο δεδομένων αναφοράς που χρησιμοποιείται για την εκπαίδευση και τη δοκιμή του προγνωστικού iNR-Durg. Βήμα 6. Ο κώδικας προγράμματος είναι επίσης διαθέσιμος κάνοντας κλικ στο κουμπί λήψης στο κάτω πλαίσιο της Εικόνας 4.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 2126, "text": "πυρηνικοί υποδοχείς (NRs)" } ], "id": 3258, "question": "Τι σχετίζονται με τον καρκίνο, τον διαβήτη, τη φλεγμονώδη νόσο και την οστεοπόρωση;" }, { "answers": [ { "answer_start": 28083, "text": "επτά" } ], "id": 3261, "question": "Πόσες οικογένειες είναι στην υπεροικογένεια του NR;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3457, "text": "μια αξιόπιστη τρισδιάστατη (τρισδιάστατη) δομή της πρωτεΐνης στόχου" } ], "id": 3262, "question": "Ποια είναι η προϋπόθεση για να καταστεί εφικτή μια μελέτη μοριακής σύνδεσης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3565, "text": "κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ" } ], "id": 3263, "question": "Ποιο εργαλείο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της τρισδιάστατης δομής των πρωτεϊνών;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Χαρακτηρισμός ενός νέου μέλους του αλφακορωνοϊού με μοναδικά γονιδιωματικά χαρακτηριστικά σε Rhinolophus Bats Luo, Chuming; Liu, Haizhou; Yang, Xinglou; Hu, Ben; Zhang, Wei; Li, Bei; Zhu, Yan; Zhu, Guangjian; Shen, Xurui; Peng, Cheng; Shi, Zhengli Ημερομηνία: 2019-04-24DOI: 10.3390/v11040379Άδεια: cc-byAbstract: Οι νυχτερίδες έχουν αναγνωριστεί ως μια φυσική δεξαμενή μιας ποικιλίας κοροναϊών (CoVs). Αρκετά από αυτά έχουν προκαλέσει ασθένειες σε ανθρώπους και οικόσιτα ζώα με μετάδοση μεταξύ των ειδών. Λαμβάνοντας υπόψη την ποικιλομορφία των κοροναϊών, των ειδών και των πληθυσμών των νυχτερίδων, αναμένουμε να ανακαλύψουμε περισσότερα CoV νυχτερίδων μέσω της επιτήρησης ιών. Σε αυτή τη μελέτη, περιγράψαμε ένα νέο μέλος του alphaCoV (BtCoV/Rh/YN2012) σε νυχτερίδες με μοναδικά χαρακτηριστικά γονιδιώματος. Μοναδικά βοηθητικά γονίδια, ORF4a και ORF4b βρέθηκαν μεταξύ του γονιδίου ακίδας και του γονιδίου του φακέλου, ενώ το γονίδιο ORF8 βρέθηκε κατάντη του γονιδίου νουκλεοκαψιδίου. Όλα τα υποτιθέμενα γονίδια επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με αναλύσεις αντίστροφης μεταγραφής. Ένα μοναδικό γονίδιο στο 3' άκρο του γονιδιώματος BtCoV/Rh/YN2012, το ORF9, εμφανίζει ~30% ταυτότητα αμινοξέων με το ORF7a του κοροναϊού που σχετίζεται με το SARS. Η λειτουργική ανάλυση έδειξε ότι η πρωτεΐνη ORF4a μπορεί να ενεργοποιήσει την παραγωγή IFN-β, ενώ η ORF3a μπορεί να ρυθμίσει την παραγωγή NF-κB. Εξετάσαμε επίσης την είσοδο ιού με τη μεσολάβηση ακίδας χρησιμοποιώντας το σύστημα ρετροϊών με ψευδότυπο ακίδα, αν και δεν καταφέραμε να βρούμε πλήρως επιτρεπτά κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας διευρύνουν τη γνώση σχετικά με τη γενετική ποικιλομορφία των κοροναϊών των νυχτερίδων. Ο συνεχής έλεγχος των ιών των νυχτερίδων θα μας βοηθήσει να κατανοήσουμε περαιτέρω τον σημαντικό ρόλο που διαδραματίζουν οι νυχτερίδες στην εξέλιξη και μετάδοση του κορωνοϊού. Κείμενο: Τα μέλη της οικογένειας Coronaviridae είναι ιοί RNA θετικού κλώνου σε φάκελο, μη τμηματοποιημένοι, με μεγέθη γονιδιώματος που κυμαίνονται από 26-32 kb [1] . Αυτοί οι ιοί ταξινομούνται σε δύο υποοικογένειες: Letovirinae, που περιέχει το μόνο γένος: Alphaletovirus; και Orthocoronavirinae (CoV), που αποτελείται από άλφα, βήτα, γάμμα και δελτακορωνοϊούς (CoVs) [2, 3] . Οι άλφα και βήτα κορωνοϊοί προσβάλλουν κυρίως θηλαστικά και προκαλούν ασθένειες στον άνθρωπο και στα ζώα. Οι γάμμα και δέλτα-CoV μολύνουν κυρίως πτηνά, αλλά μερικοί μπορούν επίσης να μολύνουν θηλαστικά [4, 5]. Έξι ανθρώπινοι CoVs (HCoV) είναι γνωστό ότι προκαλούν ανθρώπινες ασθένειες. Τα HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-229E και HCoV-NL63 προκαλούν συνήθως ήπια αναπνευστική νόσο ή ασυμπτωματική λοίμωξη. Ωστόσο, ο κορωνοϊός με σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο (SARS-CoV) και όλες οι διαδικασίες δειγματοληψίας πραγματοποιήθηκαν από κτηνιάτρους, με έγκριση από την Επιτροπή Δεοντολογίας των Ζώων του Ινστιτούτου Ιολογίας της Γουχάν (WIVH5210201). Η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τον Οδηγό για τη φροντίδα και τη χρήση των άγριων θηλαστικών στην έρευνα της Λαϊκής Δημοκρατίας της Κίνας. Δείγματα κοπράνων και σφαιριδίων από νυχτερίδες συλλέχθηκαν από τον Νοέμβριο του 2004 έως τον Νοέμβριο του 2014 σε διαφορετικές εποχές στη Νότια Κίνα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16] .Το RNA του ιού εξήχθη από 200 µL δειγμάτων επιχρίσματος κοπράνων ή σφαιριδίων χρησιμοποιώντας το κιτ υψηλής καθαρότητας ιού RNA (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Γερμανία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το RNA εκλούστηκε σε 50 μL ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης, κατανεμήθηκε σε δείγματα και αποθηκεύτηκε στους -80 • C. Ημι-φωλιασμένη αντίστροφη μεταγραφή (RT-) PCR (Invitrogen, San Diego, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του κοροναϊού, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17, 18] .Για να επιβεβαιώσουμε το είδος νυχτερίδας ενός μεμονωμένου δείγματος, ενισχύσαμε με PCR το γονίδιο του κυτοχρώματος b (Cytob) και/ή της υπομονάδας 1 της αφυδρογονάσης NADH (ND1) χρησιμοποιώντας DNA που εξήχθη από τα κόπρανα ή τα επιχρίσματα [19, 20] . Οι αλληλουχίες γονιδίου συναρμολογήθηκαν εξαιρουμένων των αλληλουχιών εκκινητών. Το BLASTN χρησιμοποιήθηκε για την αναγνώριση ειδών ξενιστών με βάση τις πιο στενά συγγενείς αλληλουχίες με την υψηλότερη κάλυψη ερωτήματος και ελάχιστη ταυτότητα 95%. Οι πλήρεις γονιδιωματικές αλληλουχίες προσδιορίστηκαν με ενίσχυση PCR ενός σταδίου (Invitrogen, San Diego, CA, USA) με εκφυλισμένο εκκινητές (Πίνακας S1 ) σχεδιασμένοι με βάση πολλαπλές ευθυγραμμίσεις διαθέσιμων αλληλουχιών άλφα-CoV που έχουν κατατεθεί στην GenBank ή ενισχύονται με SuperScript IV Αντίστροφη Μεταγραφάση (Invitrogen) και Σύστημα Expand Long Template PCR (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Γερμανία) με συγκεκριμένους εκκινητές ( αλληλουχίες εκκινητών είναι διαθέσιμες κατόπιν αιτήματος). Οι αλληλουχίες των 5' και 3' γονιδιωματικών άκρων ελήφθησαν με 5' και 3' ταχεία ενίσχυση των άκρων cDNA (SMARTer Viruses 2019, 11, 379 3 από 19 RACE 5'/3' Kit; Clontech, Mountain View, CA, USA), αντίστοιχα. Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν με πήκτωμα και υποβλήθηκαν απευθείας σε προσδιορισμό αλληλουχίας. Προϊόντα PCR άνω των 5kb υποβλήθηκαν σε βαθύ προσδιορισμό αλληλουχίας χρησιμοποιώντας το σύστημα Hiseq2500. Για ορισμένα θραύσματα, τα προϊόντα PCR κλωνοποιήθηκαν στο pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI, USA) για προσδιορισμό αλληλουχίας. Τουλάχιστον πέντε ανεξάρτητοι κλώνοι αλληλουχήθηκαν για να ληφθεί μια συναινετική αλληλουχία. Τα δεδομένα Αλληλουχίας Επόμενης Γενιάς (NGS) φιλτραρίστηκαν και χαρτογραφήθηκαν στην ακολουθία αναφοράς του BatCoV HKU10 (Αριθμός πρόσβασης GenBank NC_018871) χρησιμοποιώντας Geneious 7.1.8 [21] . Τα γονιδιώματα συναρμολογήθηκαν προκαταρκτικά χρησιμοποιώντας DNAStar lasergene V7 (DNAStar, Madison, WI, USA). Τα υποτιθέμενα ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (ORF) προβλέφθηκαν χρησιμοποιώντας τον ανιχνευτή ORF του NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/) με ελάχιστο μήκος ORF 150 nt, ακολουθούμενο από χειροκίνητη επιθεώρηση. Οι αλληλουχίες της 5' αμετάφραστης περιοχής (5'-UTR) και 3'-UTR ορίστηκαν και η αλληλουχία οδηγός, η ρυθμιστική αλληλουχία μεταγραφής οδηγού και σώματος (TRS) αναγνωρίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Η διάσπαση των 16 μη δομικών πρωτεϊνών που κωδικοποιούνται από το ORF1ab προσδιορίστηκε με την ευθυγράμμιση των αλληλουχιών aa άλλων CoV και το πρότυπο αναγνώρισης της πρωτεϊνάσης που μοιάζει με 3C και της πρωτεϊνάσης που μοιάζει με παπαΐνη. Τα φυλογενετικά δέντρα που βασίζονται σε ακολουθίες nt ή aa κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο μέγιστης πιθανότητας με τιμές bootstrap που προσδιορίζονται από 1000 επαναλήψεις στο πακέτο λογισμικού MEGA 6 [23] . Οι πλήρους μήκους αλληλουχίες γονιδιώματος που ελήφθησαν σε αυτή τη μελέτη ευθυγραμμίστηκαν με αυτές των άλφα-CoV που είχαν αναφερθεί προηγουμένως χρησιμοποιώντας το MUSCLE [24] . Οι ευθυγραμμισμένες αλληλουχίες σαρώθηκαν για συμβάντα ανασυνδυασμού χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ανίχνευσης ανασυνδυασμού [25] . Τα πιθανά συμβάντα ανασυνδυασμού, όπως προτείνονται από ισχυρές τιμές p (<10 -20 ) επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας αναλύσεις γραφικής παράστασης ομοιότητας και bootscan που εφαρμόστηκαν στο Simplot 3.5.1 [26] . Ο αριθμός των συνώνυμων αντικαταστάσεων ανά συνώνυμη τοποθεσία, Ks, και ο αριθμός των μη συνωνύμων αντικαταστάσεων ανά μη συνώνυμη τοποθεσία, Ka, για κάθε περιοχή κωδικοποίησης υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το εργαλείο υπολογισμού Ka/Ks της Νορβηγικής Πλατφόρμας Βιοπληροφορικής (http://services.cbu. uib.no/tools/kaks) με προεπιλεγμένες παραμέτρους [27] . Η ανίχνευση ομολογίας πρωτεΐνης αναλύθηκε χρησιμοποιώντας HHpred (https://toolkit.tuebingen.mpg.de/#/tools/hhpred) με προεπιλεγμένες παραμέτρους [28] . Χρησιμοποιήθηκε ένα σύνολο ένθετων RT-PCR για τον προσδιορισμό της παρουσίας ιικού υπογονιδιωματικού mRNA στα δείγματα θετικά στον CoV [29] . Οι μπροστινοί εκκινητές σχεδιάστηκαν στοχεύοντας την αλληλουχία οδηγό στο 5'-άκρο του πλήρους γονιδιώματος, ενώ οι αντίστροφοι εκκινητές σχεδιάστηκαν εντός των ORF. Ειδικά και ύποπτα αμπλικόνια των αναμενόμενων μεγεθών καθαρίστηκαν και στη συνέχεια κλωνοποιήθηκαν στον φορέα pGEM-T Easy για προσδιορισμό αλληλουχίας. Πρωτεύοντα κύτταρα πνεύμονα Rhinolophus sinicus, RsLu4323; Αθανατισμένα κύτταρα εγκεφάλου Rhinolophus sinicus, RsBrT; Πρωτογενή κύτταρα νεφρού Rhinolophus affinis, RaK4324; Rousettus leschenaultii Κύτταρα απαθανατισμένα νεφρού, RlKT; Αθανατισμένα κύτταρα πνεύμονα Hipposideros pratti, HpLuT) που δημιουργήθηκαν στο εργαστήριό μας, όλα καλλιεργήθηκαν σε DMEM/F12 με 15% FBS. Τα νεφρικά κύτταρα Pteropus alecto (Paki) διατηρήθηκαν σε DMEM/F12 συμπληρωμένο με 10% FBS. Άλλα κύτταρα διατηρήθηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις της American Type Culture Collection (ATCC, www.atcc.org). Τα υποτιθέμενα βοηθητικά γονίδια του πρόσφατα ανιχνευθέντος ιού δημιουργήθηκαν με RT-PCR από ιικό RNA που εκχυλίστηκε από δείγματα κοπράνων, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. 30] . Το πλασμίδιο NS1 του ιού της γρίπης δημιουργήθηκε στο εργαστήριό μας [31] . Το πλασμίδιο VP2 του ανθρώπινου ιού μποκαϊού (HBoV) παρασχέθηκε ευγενικά από τον καθηγητή. Hanzhong Wang του Ινστιτούτου Ιολογίας της Γουχάν, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών. Το SARS-CoV ORF7a συντέθηκε από τη Sangon Biotech. Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν με Lipofectamine 3000 Reagent (Life Technologies). Η έκφραση αυτών των βοηθητικών γονιδίων αναλύθηκε με στύπωμα Western χρησιμοποιώντας mAb (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Γερμανία) έναντι της ετικέτας ΗΑ. Η απομόνωση του ιού πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12] . Εν συντομία, το υπερκείμενο κοπράνων αποκτήθηκε μέσω φυγοκέντρησης βαθμίδωσης και στη συνέχεια προστέθηκε σε κύτταρα Vero Ε6, 1:10 αραιωμένο σε DMEM. Μετά από επώαση στους 37°C για 1 ώρα, το εμβόλιο αντικαταστάθηκε από φρέσκο ​​DMEM που περιείχε 2% FBS και το αντιβιοτικό-αντιμυκωτικό (Gibco, Grand Island, ΝΥ, ΗΠΑ). Πραγματοποιήθηκαν τρία τυφλά περάσματα. Τα κύτταρα ελέγχονταν καθημερινά για κυτταροπαθητικό αποτέλεσμα. Τόσο το υπερκείμενο της καλλιέργειας όσο και το κυτταρικό ίζημα εξετάστηκαν για CoV με RT-PCR [17] . Η απόπτωση αναλύθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18] . Εν συντομία, 293Τ κύτταρα σε πλάκες 12 φρεατίων επιμολύνθηκαν με 3 μg πλασμιδίου έκφρασης ή κενού φορέα, και τα κύτταρα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση. Η απόπτωση ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης απόπτωσης Annexin V-FITC/PI (YEASEN, Σαγκάη, Κίνα) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα θετικά σε αννεξίνη και τα αρνητικά ΡΙ κύτταρα θεωρήθηκαν ότι βρίσκονται στην πρώιμη αποπτωτική φάση και εκείνα που χρωματίστηκαν τόσο για την Αννεξίνη V όσο και για το ΡΙ θεωρήθηκε ότι υπέστησαν όψιμη απόπτωση ή νέκρωση. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Το Student's t-test χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση των δεδομένων, με το p < 0,05 να θεωρείται σημαντικό. Τα κύτταρα HEK 293T σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και στη συνέχεια συν-μορφομετατράπηκαν με πλασμίδια αναφοράς (pRL-TK και pIFN-βIFN-ή pNF-κB- Luc) [30] , καθώς και πλασμίδια που εκφράζουν βοηθητικά γονίδια, πλασμίδιο κενού φορέα pcAGGS, ιός γρίπης NS1 [32] , SARS-CoV ORF7a [33] ή HBoV VP2 [34] . Στις 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με ιό Sendai (SeV) (100 μονάδες αιμοσυγκολλητίνης [HAU]/mL) ή ανθρώπινο παράγοντα νέκρωσης όγκου άλφα (TNF-α; σύστημα Ε&Α) για 6 ώρες για την ενεργοποίηση της IFNβ ή του NF-κB, αντίστοιχα. Παρασκευάστηκαν προϊόντα λύσης κυττάρων και μετρήθηκε η δραστηριότητα της λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας το κιτ προσδιορισμού διπλής λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι ρετροϊοί ψευδότυποι με BtCoV/Rh/YN2012 RsYN1, RsYN3, RaGD, ή RaGD, ή ακίδα, ή χωρίς ακίδα (ψευδή) χρησιμοποιήθηκαν για τη μόλυνση κυττάρων ανθρώπων, νυχτερίδων ή άλλων θηλαστικών σε πλάκες 96 φρεατίων. Τα σωματίδια ψευδοϊού επιβεβαιώθηκαν με στύπωμα Western και ηλεκτρομικροσκοπία αρνητικής χρώσης. Η διαδικασία παραγωγής, οι μετρήσεις της μόλυνσης και η δραστηριότητα της λουσιφεράσης διεξήχθησαν, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35, 36]. Οι πλήρεις αλληλουχίες νουκλεοτιδίων του γονιδιώματος των στελεχών BtCoV/Rh/YN2012 RsYN1, RsYN2, RsYN3 και RaGD που ελήφθησαν σε αυτή τη μελέτη υποβλήθηκαν σε η GenBank υπό MG916901 έως MG916904. Η επιτήρηση πραγματοποιήθηκε μεταξύ Νοεμβρίου 2004 και Νοεμβρίου 2014 σε 19 επαρχίες της Κίνας. Συνολικά, συλλέχθηκαν 2061 δείγματα κοπράνων από τουλάχιστον 12 είδη νυχτερίδων Rhinolophus (Εικόνα 1Α). CoV ανιχνεύθηκαν σε 209 από αυτά τα δείγματα (Εικόνα 1Β και Πίνακας 1). Μερικές αλληλουχίες RdRp υποδηλώνουν την παρουσία τουλάχιστον 8 διαφορετικών CoVs. Πέντε από αυτούς τους ιούς σχετίζονται με γνωστά είδη: Mi-BatCoV 1 (>94% ταυτότητα nt), Mi-BatCoV HKU8 [37] (>93% ταυτότητα nt), BtRf-AlphaCoV/HuB2013 [11] (>99% nt ταυτότητα), SARSr-CoV [38] (>89% ταυτότητα nt) και CoV που σχετίζεται με HKU2 [39] (>85% ταυτότητα nt). Ενώ οι άλλες τρεις αλληλουχίες CoV έδειξαν λιγότερο από 83% nt ταυτότητα σε γνωστά είδη CoV. Αυτοί οι τρεις ιοί θα πρέπει να αντιπροσωπεύουν νέα είδη CoV. Η απομόνωση του ιού πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12], αλλά δεν ήταν επιτυχής. Ταυτότητα). Ενώ οι άλλες τρεις αλληλουχίες CoV έδειξαν λιγότερο από 83% nt ταυτότητα σε γνωστά είδη CoV. Αυτοί οι τρεις ιοί θα πρέπει να αντιπροσωπεύουν νέα είδη CoV. Η απομόνωση του ιού πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12], αλλά δεν ήταν επιτυχής. Στη συνέχεια χαρακτηρίσαμε έναν νέο άλφα-CoV, BtCoV/Rh/YN2012. Ανιχνεύτηκε σε 3 R.affinis και 6 R.sinicus, αντίστοιχα. Με βάση τις αλληλουχίες, ορίσαμε τρεις γονότυπους, οι οποίοι αντιπροσωπεύονται από RsYN1, RsYN3 και RaGD, αντίστοιχα. Το στέλεχος RsYN2 ταξινομήθηκε στον γονότυπο RsYN3. Λήφθηκαν τέσσερα γονιδιώματα πλήρους μήκους. Τρεις από αυτούς ήταν από το R.sinicus (Στρέλεχος RsYN1, RsYN2 και RsYN3), ενώ το άλλο ήταν από το R.affinis (Στρέλεχος RaGD). Τα μεγέθη αυτών των 4 γονιδιωμάτων είναι μεταξύ 28.715 και 29.102, με περιεκτικότητα σε G+C μεταξύ 39,0% και 41,3%. Τα γονιδιώματα εμφανίζουν παρόμοιες δομές και ρυθμιστικές αλληλουχίες μεταγραφής (TRS) που είναι πανομοιότυπες με εκείνες άλλων άλφα-CoV (Εικόνα 2 και Πίνακας 2). Παρατηρήθηκαν εξαιρέσεις συμπεριλαμβανομένων τριών επιπλέον ORF (ORF3b, ORF4a και ORF4b). Και τα 4 στελέχη έχουν ORF4a & ORF4b, ενώ μόνο το στέλεχος RsYN1 έχει ORF3b. Το γονίδιο ρεπλικάσης, ORF1ab, καταλαμβάνει~20,4 kb του γονιδιώματος. Το γονίδιο ρεπλικάσης, ORF1ab, καταλαμβάνει~20,4 kb του γονιδιώματος. Κωδικοποιεί τις πολυπρωτεΐνες 1a και 1ab, οι οποίες θα μπορούσαν να διασπαστούν σε 16 μη δομικές πρωτεΐνες (Nsp1-Nsp16). Το 3'-άκρο των θέσεων διάσπασης που αναγνωρίστηκε από πρωτεϊνάση τύπου 3C (Nsp4-Nsp10, Nsp12-Nsp16) και πρωτεϊνάση παρόμοια με παπαΐνη (Nsp1-Nsp3) επιβεβαιώθηκαν. Οι πρωτεΐνες που περιλαμβάνουν Nsp3 (πρωτεΐνες τύπου παπαΐνης 2, PL2pro), Nsp5 (πρωτεάση τύπου χυμοθρυψίνης, 3CLpro), Nsp12 (RdRp), Nsp13 (ελικάση) και άλλες πρωτεΐνες άγνωστης λειτουργίας (Πίνακας 3). Οι 7 συνδεδεμένοι τομείς της πολυπρωτεΐνης 1 μοιράζονται <90% ταυτότητα αλληλουχίας aa με εκείνες άλλων γνωστών άλφα-CoV (Πίνακας 2), υποδηλώνοντας ότι αυτοί οι ιοί αντιπροσωπεύουν ένα νέο είδος CoV εντός του άλφα-CoV. Τα πλησιέστερα εκχωρημένα είδη CoV στο BtCoV/Rh/YN2012 είναι τα BtCoV-HKU10 και BtRf-AlphaCoV/Hub2013. Τα τρία στελέχη από την επαρχία Γιουνάν συγκεντρώθηκαν σε δύο γονότυπους (83% ταυτότητα γονιδιώματος) που συσχετίστηκαν με τη θέση δειγματοληψίας τους. Ο τρίτος γονότυπος που αντιπροσωπεύεται από το στέλεχος RaGD απομονώθηκε σε στελέχη που βρέθηκαν στο Yunnan (<75,4% ταυτότητα γονιδιώματος). Στη συνέχεια εξετάσαμε τα μεμονωμένα γονίδια (Πίνακας 2). Όλα τα γονίδια έδειξαν χαμηλή ταυτότητα αλληλουχίας aa σε γνωστούς CoV. Τα τέσσερα στελέχη του BtCoV/Rh/YN2012 έδειξαν γενετική ποικιλομορφία μεταξύ όλων των διαφορετικών γονιδίων εκτός από το ORF1ab (>83,7% ταυτότητα αα). Σημειωτέον, οι πρωτεΐνες ακίδας είναι πολύ αποκλίνουσες μεταξύ αυτών των στελεχών. Άλλες πρωτεΐνες δομής (Ε, Μ και Ν) είναι πιο διατηρημένες από την ακίδα και άλλες βοηθητικές πρωτεΐνες. Η σύγκριση των βοηθητικών γονιδίων μεταξύ αυτών των τεσσάρων στελεχών αποκάλυψε ότι τα στελέχη του ίδιου γονότυπου μοιράζονταν ένα 100% πανομοιότυπο ORF3a. Ωστόσο, οι πρωτεΐνες που κωδικοποιήθηκαν από το ORF3as ήταν εξαιρετικά αποκλίνουσες μεταξύ των διαφορετικών γονότυπων (<65% ταυτότητα αα). Τα υποτιθέμενα βοηθητικά γονίδια BLAST επίσης BLAST στα αρχεία της GenBank. Τα περισσότερα βοηθητικά γονίδια δεν έχουν ομόλογα στη βάση δεδομένων GenBank, εκτός από το ORF3a (52,0-55,5% ταυτότητα αα με BatCoV HKU10 ORF3) και το ORF9 (28,1-32,0% ταυτότητα αα με SARSr-CoV ORF7a). Αναλύσαμε την ομολογία πρωτεΐνης με το λογισμικό HHpred. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα ORF9 και SARS-CoV OR7a είναι ομόλογα (πιθανότητα: 100%, τιμή E <10 −48 ). Εξετάσαμε περαιτέρω τα γονιδιώματα για πιθανά στοιχεία ανασυνδυασμού. Δεν ανιχνεύθηκε σημαντικό σημείο διακοπής ανασυνδυασμού με ανάλυση bootscan. Για να επιβεβαιώσουμε την παρουσία υπογονιδιωματικού RNA, σχεδιάσαμε ένα σύνολο εκκινητών που στοχεύουν όλα τα προβλεπόμενα ORFs όπως περιγράφεται. Τα αμπλικόνια επιβεβαιώθηκαν αρχικά μέσω ηλεκτροφόρησης γέλης αγαρόζης και κατόπιν προσδιορισμού αλληλουχίας (Εικόνα 3 και Πίνακας 2). Οι αλληλουχίες έδειξαν ότι όλα τα ORF, εκτός από το ORF4b, είχαν προηγούμενο TRS. Ως εκ τούτου, το ORF4b μπορεί να μεταφραστεί από δισιστρονικά mRNA. Στο RsYN1, ένα επιπρόσθετο υπογονιδιωματικό RNA που ξεκινά μέσα στο ORF3a βρέθηκε μέσω προσδιορισμού αλληλουχίας, το οποίο οδήγησε σε ένα μοναδικό ORF3b. Για να επιβεβαιώσουμε την παρουσία υπογονιδιωματικού RNA, σχεδιάσαμε ένα σύνολο εκκινητών που στοχεύουν όλα τα προβλεπόμενα ORFs όπως περιγράφεται. Τα αμπλικόνια επιβεβαιώθηκαν αρχικά μέσω ηλεκτροφόρησης γέλης αγαρόζης και κατόπιν προσδιορισμού αλληλουχίας (Εικόνα 3 και Πίνακας 2). Οι αλληλουχίες έδειξαν ότι όλα τα ORF, εκτός από το ORF4b, είχαν προηγούμενο TRS. Ως εκ τούτου, το ORF4b μπορεί να μεταφραστεί από δισιστρονικά mRNA. Στο RsYN1, ένα επιπρόσθετο υπογονιδιωματικό RNA που ξεκινά μέσα στο ORF3a βρέθηκε μέσω προσδιορισμού αλληλουχίας, το οποίο οδήγησε σε ένα μοναδικό ORF3b. Τα φυλογενετικά δέντρα κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τις αλληλουχίες aa των RdRp και S του BtCoV/Rh/YN2012 και άλλων αντιπροσωπευτικών CoVs (Εικόνα 4) . Και στα δύο δέντρα, όλα τα BtCoV/Rh/YN2012 συγκεντρώθηκαν μαζί και σχημάτισαν μια ξεχωριστή γενεαλογία με άλλα γνωστά είδη κοροναϊού. Δύο διακριτές υπογραμμές παρατηρήθηκαν εντός του BtCoV/Rh/YN2012. Το ένα ήταν από το Ra που λήφθηκε δειγματοληπτικά στο Γκουανγκντόνγκ, ενώ το άλλο ήταν από το Rs που δειγματολήφθηκε στο Γιουνάν Μεταξύ των στελεχών από το Yunnan, τα RsYN2 και RsYN3 συγκεντρώθηκαν μαζί, ενώ το RsYN1 απομονώθηκε. Η τοπολογία αυτών των τεσσάρων στελεχών συσχετίστηκε με τη θέση δειγματοληψίας. Τα σχετικά μακριά κλαδιά αντικατοπτρίζουν μια υψηλή ποικιλομορφία μεταξύ αυτών των στελεχών, υποδεικνύοντας μια μακρά ανεξάρτητη ιστορία εξέλιξης. Τα φυλογενετικά δέντρα κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τις αλληλουχίες aa των RdRp και S του BtCoV/Rh/YN2012 και άλλων αντιπροσωπευτικών CoVs (Εικόνα 4) . Και στα δύο δέντρα, όλα τα BtCoV/Rh/YN2012 συγκεντρώθηκαν μαζί και σχημάτισαν μια ξεχωριστή γενεαλογία με άλλα γνωστά είδη κοροναϊού. Δύο διακριτές υπογραμμές παρατηρήθηκαν εντός του BtCoV/Rh/YN2012. Το ένα ήταν από το Ra που λήφθηκε δειγματοληπτικά στο Γκουανγκντόνγκ, ενώ το άλλο ήταν από το Rs που δειγματολήφθηκε στο Γιουνάν Μεταξύ των στελεχών από το Yunnan, τα RsYN2 και RsYN3 συγκεντρώθηκαν μαζί, ενώ το RsYN1 απομονώθηκε. Η τοπολογία αυτών των τεσσάρων στελεχών συσχετίστηκε με τη θέση δειγματοληψίας. Τα σχετικά μακριά κλαδιά αντικατοπτρίζουν μια υψηλή ποικιλομορφία μεταξύ αυτών των στελεχών, υποδεικνύοντας μια μακρά ανεξάρτητη ιστορία εξέλιξης. Τα φυλογενετικά δέντρα κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τις αλληλουχίες aa των RdRp και S του BtCoV/Rh/YN2012 και άλλων αντιπροσωπευτικών CoVs (Εικόνα 4) . Και στα δύο δέντρα, όλα τα BtCoV/Rh/YN2012 συγκεντρώθηκαν μαζί και σχημάτισαν μια ξεχωριστή γενεαλογία με άλλα γνωστά είδη κοροναϊού. Δύο διακριτές υπογραμμές παρατηρήθηκαν εντός του BtCoV/Rh/YN2012. Το ένα ήταν από το Ra που λήφθηκε δειγματοληπτικά στο Γκουανγκντόνγκ, ενώ το άλλο ήταν από το Rs που δειγματολήφθηκε στο Γιουνάν Μεταξύ των στελεχών από το Yunnan, τα RsYN2 και RsYN3 συγκεντρώθηκαν μαζί, ενώ το RsYN1 απομονώθηκε. Η τοπολογία αυτών των τεσσάρων στελεχών συσχετίστηκε με τη θέση δειγματοληψίας. Τα σχετικά μακριά κλαδιά αντικατοπτρίζουν μια υψηλή ποικιλομορφία μεταξύ αυτών των στελεχών, υποδεικνύοντας μια μακρά ανεξάρτητη ιστορία εξέλιξης. Οι αναλογίες Ka/Ks (Ks είναι ο αριθμός των συνώνυμων υποκαταστάσεων ανά συνώνυμες θέσεις και Ka είναι ο αριθμός των μη συνώνυμων αντικαταστάσεων ανά μη συνώνυμη θέση) υπολογίστηκαν για όλα τα γονίδια. Οι αναλογίες Ka/Ks για τα περισσότερα από τα γονίδια ήταν γενικά χαμηλές, πράγμα που δείχνει ότι αυτά τα γονίδια ήταν υπό καθαρή επιλογή. Ωστόσο, οι αναλογίες Ka/Ks των ORF4a, ORF4b και ORF9 (0,727, 0,623 και 0,843, αντίστοιχα) ήταν σημαντικά υψηλότερες από αυτές των άλλων ORF (Πίνακας 4). Για περαιτέρω αξιολόγηση της πίεσης επιλογής του γονιδίου ORF4a και ORF4b, προσδιορίσαμε την αλληλουχία άλλων τεσσάρων γονιδίων ORF4a και ORF4b (στέλεχος Rs4223, Rs4236, Rs4240 και Ra13576 φάνηκε στο Σχήμα 1Β Καθώς ο SARS-CoV ORF7a αναφέρθηκε ότι προκαλούσαμε απόπτωση, προκαλούσαμε απόπτωση, σε BtCoV/Rh/YN2012 ORF9, ένα ~ 30% αα ομόλογο ταυτότητας του SARSr-CoV ORF7a. Μολύναμε παροδικά το ORF9 του BtCoV/Rh/YN2012 σε κύτταρα HEK293T για να εξετάσουμε εάν αυτό το ORF9 πυροδοτεί απόπτωση. Πραγματοποιήθηκε στύπωμα Western για να επιβεβαιωθεί η έκφραση των ORF9s και SARS-CoV ORF7a (Εικόνα S1). Το ORF9 δεν μπορούσε να προκαλέσει απόπτωση ως το ORF7a του SARS-CoV Tor2 (Εικόνα S2). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το BtCoV/Rh/YN2012 ORF9 δεν εμπλέκεται στην επαγωγή απόπτωσης. Για να προσδιορίσουμε εάν αυτές οι βοηθητικές πρωτεΐνες ρυθμίζουν την επαγωγή IFN, επιμολύναμε πλασμίδια αναφοράς (pIFNβ-Luc και pRL-TK) και πλασμίδια έκφρασης σε κύτταρα 293T. Όλα τα κύτταρα που υπερεκφράζουν τα βοηθητικά γονίδια, καθώς και ο ιός της γρίπης NS1 (στέλεχος PR8), HBoV VP2 ή κενός φορέας εξετάστηκαν για δραστηριότητα λουσιφεράσης μετά από μόλυνση με SeV. Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης που διεγείρεται από το SeV ήταν αξιοσημείωτα υψηλότερη από εκείνη χωρίς θεραπεία με SeV όπως αναμενόταν. Ο ιός γρίπης NS1 αναστέλλει την έκφραση από τον προαγωγέα IFN, ενώ ο HBoV VP2 ενεργοποιεί την έκφραση. Σε σύγκριση με αυτούς τους ελέγχους, οι πρωτεΐνες ORF4a επιδεικνύουν ενεργό αποτέλεσμα ως HBoV VP2 (Εικόνα 5Α). Άλλες βοηθητικές πρωτεΐνες δεν έδειξαν καμία επίδραση στην παραγωγή IFN (Εικόνα S3). Η έκφραση αυτών των βοηθητικών γονιδίων επιβεβαιώθηκε με στύπωμα Western (Σχήμα S1). ήταν αξιοσημείωτα υψηλότερο από αυτό χωρίς θεραπεία με SeV όπως αναμενόταν. Ο ιός γρίπης NS1 αναστέλλει την έκφραση από τον προαγωγέα IFN, ενώ ο HBoV VP2 ενεργοποιεί την έκφραση. Σε σύγκριση με αυτούς τους ελέγχους, οι πρωτεΐνες ORF4a επιδεικνύουν ενεργό αποτέλεσμα ως HBoV VP2 (Εικόνα 5Α). Άλλες βοηθητικές πρωτεΐνες δεν έδειξαν καμία επίδραση στην παραγωγή IFN (Εικόνα S3). Η έκφραση αυτών των βοηθητικών γονιδίων επιβεβαιώθηκε με στύπωμα Western (Σχήμα S1). Τα δείγματα συλλέχθηκαν 6 ώρες μετά τη μόλυνση, ακολουθούμενη από δοκιμασία διπλής λουσιφεράσης. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως η τιμή της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας κανονικοποιημένη σε αυτήν της λουσιφεράσης Renilla. (Β) Η πρωτεΐνη ORF3a ενεργοποιεί τον NF-κB. 293Τ κύτταρα επιμολύνθηκαν με 100 ng pNF-κB-Luc, 10 ng pRL-TK, κενό φορέα (500 ng), πλασμίδιο που εκφράζει NS1 (500 ng), πλασμίδιο που εκφράζει SARS-CoV ORF7a (500 ng) ή Πλασμίδια που εκφράζουν ORF3a (500 ng). Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TNF-α. Η δραστικότητα διπλής λουσιφεράσης προσδιορίστηκε μετά από 6 ώρες. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως η δραστηριότητα της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας κανονικοποιημένη σε αυτήν της λουσιφεράσης Renilla. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν τρεις φορές ανεξάρτητα. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, με κάθε προσδιορισμό να πραγματοποιείται εις τριπλούν (μέσος όρος ± SD αλλαγής πτυχής). Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων (σε σύγκριση με το Empty vector-NC, p < 0,05, όπως προσδιορίστηκε από το student t test). Ο NF-κB παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης στην ιογενή λοίμωξη και είναι επίσης ένας βασικός παράγοντας που στοχεύεται συχνά από ιούς για την κατάληψη του κυττάρου ξενιστή. Σε αυτή τη μελέτη, δοκιμάσαμε εάν αυτές οι βοηθητικές πρωτεΐνες μπορούσαν να ρυθμίσουν τον NF-κB. 293Τ κύτταρα συν-μορφομετατράπηκαν με αναφορά. Δείγματα συλλέχθηκαν 6 ώρες μετά τη μόλυνση, ακολουθούμενη από δοκιμασία διπλής λουσιφεράσης. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως η τιμή της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας κανονικοποιημένη σε αυτήν της λουσιφεράσης Renilla. (Β) Η πρωτεΐνη ORF3a ενεργοποιεί τον NF-κB. 293Τ κύτταρα επιμολύνθηκαν με 100 ng pNF-κB-Luc, 10 ng pRL-TK, κενό φορέα (500 ng), πλασμίδιο που εκφράζει NS1 (500 ng), πλασμίδιο που εκφράζει SARS-CoV ORF7a (500 ng) ή Πλασμίδια που εκφράζουν ORF3a (500 ng). Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TNF-α. Η δραστικότητα διπλής λουσιφεράσης προσδιορίστηκε μετά από 6 ώρες. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως η δραστηριότητα της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας κανονικοποιημένη σε αυτήν της λουσιφεράσης Renilla. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν τρεις φορές ανεξάρτητα. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, με κάθε προσδιορισμό να πραγματοποιείται εις τριπλούν (μέσος όρος ± SD αλλαγής πτυχής). Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων (σε σύγκριση με το Empty vector-NC, p < 0,05, όπως προσδιορίστηκε από το student t test). Ο NF-κB παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης στην ιογενή λοίμωξη και είναι επίσης ένας βασικός παράγοντας που στοχεύεται συχνά από ιούς για την κατάληψη του κυττάρου ξενιστή. Σε αυτή τη μελέτη, δοκιμάσαμε εάν αυτές οι βοηθητικές πρωτεΐνες μπορούσαν να ρυθμίσουν τον NF-κB. Τα κύτταρα 293Τ συν-μορφομετατράπηκαν με πλασμίδια αναφοράς (pNF-κB-Luc και pRL-TK), καθώς και βοηθητικά πλασμίδια που εκφράζουν πρωτεΐνες ή μάρτυρες (κενός φορέας, NS1, SARS-CoV Tor2-ORF7a). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ψευδή αγωγή ή κατεργάστηκαν με TNF-α για 6 ώρες στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Προσδιορίστηκε η δράση της λουσιφεράσης. Τα RsYN1-ORF3a και RaGD-ORF3a ενεργοποίησαν τον NF-κB ως SARS-CoV ORF7a, ενώ το RsYN2-ORF3a ανέστειλε τον NF-κB ως NS1 (Εικόνα 5Β). Οι εκφράσεις του ORF3as επιβεβαιώθηκαν με στύπωμα Western (Σχήμα S1). Άλλες βοηθητικές πρωτεΐνες δεν ρυθμίζουν την παραγωγή NF-κB (Εικόνα S4). Για να κατανοήσουμε τη μολυσματικότητα αυτών των πρόσφατα ανιχνευθέντων BtCoV/Rh/YN2012, επιλέξαμε τις πρωτεΐνες αιχμής RsYN1, RsYN3 και RaGD για μελέτες εισόδου ψευδοϊών με τη μεσολάβηση ακίδων. Τόσο η ανάλυση Western blot όσο και η παρατήρηση με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο αρνητικής χρώσης επιβεβαίωσαν την παρασκευή του BtCoV/Rh/YN2012 με επιτυχία (Εικόνα S5). Συνολικά 11 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές, 8 κύτταρα νυχτερίδας και 9 άλλες κυτταρικές σειρές θηλαστικών δοκιμάστηκαν και δεν βρέθηκε ισχυρό θετικό (Πίνακας S2). Σε αυτή τη μελέτη, ένα νέο είδος άλφα-CoV, BtCoV/Rh/YN2012, ήταν ταυτοποιήθηκε σε δύο είδη Rhinolophus. Τα 4 στελέχη με πλήρους μήκους γονιδίωμα ήταν αλληλουχίες. Οι 7 διατηρημένες περιοχές αντιγραφής αυτών των ιών διέθεταν <90% ταυτότητα αλληλουχίας aa με εκείνες άλλων γνωστών άλφα-CoV, που ορίζει ένα νέο είδος σύμφωνα με το πρότυπο ταξινόμησης ICTV [42] . Αυτοί οι νέοι άλφα-CoV έδειξαν υψηλή γενετική ποικιλομορφία στα δομικά και μη δομικά τους γονίδια. Το στέλεχος RaGD από το R. affinis, που συλλέχθηκε στην επαρχία Γκουανγκντόνγκ, σχημάτισε έναν αποκλίνοντα ανεξάρτητο κλάδο από τα άλλα 3 στελέχη από το R. sinicus, που λήφθηκαν σε δείγμα στην επαρχία Γιουνάν, υποδεικνύοντας μια ανεξάρτητη διαδικασία εξέλιξης που σχετίζεται με τη γεωγραφική απομόνωση και τον περιορισμό του ξενιστή. Αν και συλλέχθηκαν από την ίδια επαρχία, αυτά τα τρία στελέχη ιού σχημάτισαν δύο γονότυπους που συσχετίστηκαν με τις τοποθεσίες δειγματοληψίας. Αυτοί οι δύο γονότυποι είχαν χαμηλή ταυτότητα αλληλουχίας γονιδιώματος, ειδικά στο γονίδιο S και στα βοηθητικά γονίδια. Λαμβάνοντας υπόψη την απομακρυσμένη γεωγραφική θέση του οικοτόπου της νυχτερίδας-ξενιστή, τον τροπισμό του ξενιστή και την ποικιλομορφία του ιού, υποθέτουμε ότι ο BtCoV/Rh/YN2012 μπορεί να έχει εξαπλωθεί σε αυτές τις δύο επαρχίες με μακρά ιστορία κυκλοφορίας στη φυσική τους δεξαμενή, τις νυχτερίδες Rhinolophus. Με τα στοιχεία της αλληλουχίας, υποθέτουμε ότι αυτοί οι ιοί εξακολουθούν να εξελίσσονται γρήγορα. Η μελέτη μας αποκάλυψε ότι το BtCoV/Rh/YN2012 έχει μια μοναδική δομή γονιδιώματος σε σύγκριση με άλλους άλφα-CoV. Πρώτον, νέα βοηθητικά γονίδια, τα οποία δεν είχαν ομόλογα, εντοπίστηκαν στα γονιδιώματα. Δεύτερον, βρέθηκαν πολλαπλά TRS μεταξύ των γονιδίων S και E ενώ άλλοι αλφακορωνοϊοί είχαν μόνο ένα TRS εκεί. Αυτά τα TRS προηγούνται των ORF3a, ORF3b (μόνο στο RsYN1) και ORF4a/b αντίστοιχα. Τρίτον, το βοηθητικό γονίδιο ORF9 έδειξε ομολογία με εκείνα άλλων γνωστών ειδών CoV σε άλλο γένος κοροναϊού, ειδικά με βοηθητικά γονίδια από το SARSr-CoV. Τα βοηθητικά γονίδια συνήθως εμπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις ιού-ξενιστή κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από CoV [43] . Στα περισσότερα CoV, τα βοηθητικά γονίδια είναι απαραίτητα για την αναπαραγωγή του ιού. Ωστόσο, ένα άθικτο γονίδιο 3c του CoV της γάτας χρειαζόταν για τον ιικό πολλαπλασιασμό στο έντερο [44] [45] [46] . Η διαγραφή των ειδικών για το γένος γονιδίων στον ιό της ηπατίτιδας των ποντικών οδήγησε σε μείωση της λοιμογόνου δράσης [47] . SARS-CoV ORF7a, το οποίο αναγνωρίστηκε ότι εμπλέκεται στην καταστολή της σίγησης του RNA [48] , στην αναστολή της σύνθεσης κυτταρικών πρωτεϊνών [49] , στον αποκλεισμό του κυτταρικού κύκλου [50] και στην επαγωγή απόπτωσης [51, 52] . Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι το BtCoV/Rh/YN2012 ORF9 μοιράζεται περίπου 30% ταυτότητα αλληλουχίας aa με το SARS-CoV ORF7a. Είναι ενδιαφέρον ότι οι BtCoV/Rh/YN2012 και SARSr-CoV εντοπίστηκαν και οι δύο στο R. sinicus από το ίδιο σπήλαιο. Υποθέτουμε ότι ο SARS-CoV και ο BtCoV/Rh/YN2012 μπορεί να έχουν αποκτήσει ORF7a ή ORF9 από έναν κοινό πρόγονο μέσω ανασυνδυασμού γονιδιώματος ή οριζόντιας μεταφοράς γονιδίων. Ενώ, το ORF9 του BtCoV/Rh/YN2012 απέτυχε να προκαλέσει απόπτωση ή να ενεργοποιήσει την παραγωγή NF-κB, αυτές οι διαφορές μπορεί να προκληθούν από την αποκλίνουσα εξέλιξη αυτών των πρωτεϊνών σε διαφορετική πίεση. Αν και διαφορετικό μερίδιο BtCoV/Rh/YN2012 ORF4a <64,4% αμινοξέος ταυτότητα, όλα αυτά θα μπορούσαν να ενεργοποιήσουν την IFN-β. Το ORF3a από το RsYN1 και το RaGD ρύθμισε προς τα πάνω τον NF-κB, αλλά το ομόλογο από το RsYN2 μείωσε την έκφραση του NF-κB. Αυτές οι διαφορές μπορεί να προκαλούνται από παραλλαγές αλληλουχίας αμινοξέων και μπορεί να συμβάλλουν στην παθογένεια ενός ιού με διαφορετική οδό. Αν και δεν υπάρχουν εντερικές κυτταρικές σειρές από τον φυσικό ξενιστή του BtCoV/Rh/YN2012, εξετάσαμε τον κυτταρικό τροπισμό της πρωτεΐνης ακίδας τους μέσω ψευδοτυπική είσοδος ρετροϊού με κυτταρικές σειρές ανθρώπου, νυχτερίδας και άλλων θηλαστικών. Οι περισσότερες κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν ήταν μη ευαίσθητες στον BtCoV/Rh/YN2012, υποδηλώνοντας χαμηλό κίνδυνο μετάδοσης μεταξύ των ειδών στον άνθρωπο και σε άλλα ζώα. Πολλοί λόγοι μπορεί να οδηγήσουν σε αποτυχία μόλυνσης του συστήματος ρετροϊού ψευδότυπου κορωνοϊού, συμπεριλαμβανομένης της απουσίας υποδοχέα στα κύτταρα-στόχους, της αποτυχίας αναγνώρισης του ομόλογου υποδοχέα από είδη μη ξενιστή, της κακής προσαρμογής σε κύτταρα μη ξενιστή κατά την ωρίμανση της ακίδας ή την είσοδο του ιού ή περιορισμός του συστήματος ρετροϊών στην τόνωση της εισόδου του κορωνοϊού. Η ασθενής μολυσματικότητα του ψευδότυπου ρετροϊού RsYN1 σε κύτταρα Huh-7 θα μπορούσε να εξηγηθεί από τη δέσμευση πρωτεΐνης ακίδας σε πολυσακχαρίτη που εκκρίνεται στην επιφάνεια. Η υπόθεση πρέπει να επιβεβαιωθεί περαιτέρω από πειράματα. Οι μακροχρόνιες επιτηρήσεις μας υποδηλώνουν ότι οι νυχτερίδες Rhinolophus φαίνεται να φιλοξενούν μια ευρεία ποικιλία CoVs. Συμπτωματικά, οι δύο εξαιρετικά παθογόνοι παράγοντες, ο SARS-CoV και ο Rh-BatCoV HKU2 προήλθαν και οι δύο από νυχτερίδες Rhinolophus. Λαμβάνοντας υπόψη την ποικιλομορφία των CoV που μεταφέρονται από αυτό το γένος νυχτερίδων και την ευρεία γεωγραφική τους κατανομή, ενδέχεται να υπάρχει χαμηλός κίνδυνος μετάδοσης αυτών των ιών σε άλλα ζώα και ανθρώπους. Οι μακροχρόνιες επιτηρήσεις και οι μελέτες παθογένειας θα βοηθήσουν στην πρόληψη μελλοντικών ασθενειών ανθρώπων και ζώων που προκαλούνται από αυτούς τους CoVs νυχτερίδων. /s1, Σχήμα S1: ανάλυση στυπώματος western της έκφρασης βοηθητικών πρωτεϊνών. Εικόνα S2: Ανάλυση απόπτωσης πρωτεϊνών ORF9 του BtCoV/Rh/YN2012. Σχήμα S3: Λειτουργική ανάλυση πρωτεϊνών ORF3a, ORF3b, ORF4b, ORF8 και ORF9 στην παραγωγή ιντερφερόνης Τύπου Ι. Σχήμα S4: Λειτουργική ανάλυση πρωτεϊνών ORF3b, ORF4a, ORF4b, ORF8 και ORF9 στην παραγωγή NF-κB. Εικόνα S5: Χαρακτηριστικό του ψευδοϊού που προκαλείται από ακίδα BtCoV/Rh/YN2012. Πίνακας S1: Γενικοί εκκινητές για την αλληλουχία γονιδιώματος AlphaCoVs. Πίνακας S2: Εκκινητές για την ανίχνευση ιικών sugbenomic mRNAs. Πίνακας S3", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 3054, "text": "από τον Νοέμβριο του 2004 έως τον Νοέμβριο του 2014" } ], "id": 3681, "question": "Πότε συλλέχθηκαν τα δείγματα κοπράνων;" }, { "answers": [ { "answer_start": 16335, "text": "BatCoV HKU10" } ], "id": 3682, "question": "Ποιο γονιδίωμα αναφοράς χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 14173, "text": "20,4 kb" } ], "id": 3684, "question": "Ποιο είναι το μήκος του γονιδίου ρεπλικάσης ORF1ab;" }, { "answers": [ { "answer_start": 15013, "text": "BtCoV/Rh/YN2012" } ], "id": 3683, "question": "Τι τύπος κοροναϊού εντοπίστηκε στα είδη R. affinis και R. sinicus;" }, { "answers": [ { "answer_start": 759, "text": "νυχτερίδες" } ], "id": 3675, "question": "Τι είναι η φυσική δεξαμενή του κορωνοϊού;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1989, "text": "26-32 kb" } ], "id": 3676, "question": "Ποιο είναι το μέγεθος του γονιδιώματος του κορωνοϊού;" }, { "answers": [ { "answer_start": 24358, "text": "NF-κB" } ], "id": 3685, "question": "Τι παίζει ρόλο στη ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης σε μια ιογενή λοίμωξη;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "In vitro Αντιιική Δραστηριότητα Κυκλικής Τριπλής Έλικας που Σχηματίζει Ολιγονουκλεοτιδικό RNA προς αναπαραγωγή του ιού της λοιμώδους περιτονίτιδας των αιλουροειδών Mehrbod, Parvaneh; Tejo, Bimo Ario; Omar, Abdul Rahman Ημερομηνία: 2014-02-20DOI: 10.1155/2014/654712Άδεια: cc-byAbstract: Feline Infectious Peritonitis (FIP) είναι μια σοβαρή θανατηφόρα επαυξημένη ανοσοποιητική ασθένεια στον πληθυσμό των γατών. Προκαλείται από τον ιό FIP (FIPV), ένα λοιμογόνο μεταλλαγμένο στέλεχος του εντερικού κοροναϊού της γάτας (FECV). Οι τρέχουσες θεραπείες και τα προφυλακτικά δεν είναι αποτελεσματικά. Οι in vitro αντιικές ιδιότητες πέντε κυκλικών RNA ολιγονουκλεοτιδίων που σχηματίζουν Triple-Helix (TFO1 έως TFO5), τα οποία στοχεύουν στις διαφορετικές περιοχές του στελέχους FIPV WSU ​​79-1146 του λοιμογόνου κορωνοϊού αιλουροειδών (FCoV), δοκιμάστηκαν σε μολυσμένο με FIPV Crandell. -Κύτταρα νεφρού αιλουροειδών Rees (CRFK). Τα αποτελέσματα της RT-qPCR έδειξαν ότι τα κυκλικά TFO RNA, εκτός από το TFO2, αναστέλλουν την αντιγραφή του FIPV, όπου οι αριθμοί αντιγράφων του ιικού γονιδιώματος μειώθηκαν σημαντικά κατά 5 φορές το log(10) από 10(14) στα ενοφθαλμισμένα με ιό κύτταρα σε 10(9) στα κυκλικά κύτταρα που έχουν διαμολυνθεί με TFO RNA. Επιπλέον, η δέσμευση του κυκλικού TFO RNA με το στοχευόμενο τμήμα ιικού γονιδιώματος επιβεβαιώθηκε επίσης με τη χρήση ανάλυσης μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας. Η ισχύς της κινητικής δέσμευσης μεταξύ των TFO RNAs και των περιοχών-στόχων τους αποδείχθηκε με τη δοκιμασία NanoITC. Συμπερασματικά, τα κυκλικά TFOs έχουν τη δυνατότητα να αναπτυχθούν περαιτέρω ως αντιιικοί παράγοντες κατά της λοίμωξης FIPV. Κείμενο: Ο ιός της λοιμώδους περιτονίτιδας των αιλουροειδών (FIPV) είναι ένας ιός με περίβλημα με γονιδίωμα μονόκλωνου RNA μη τμηματοποιημένο, θετικής αίσθησης. Το FIPV ομαδοποιείται ως κορωνοϊός αιλουροειδών (FCoV), στην οικογένεια Coronaviridae. Ο FCoV χωρίζεται σε δύο βιοτύπους, και συγκεκριμένα, τον εντερικό κορωνοϊό αιλουροειδών (FECV), έναν πανταχού παρόν εντερικό βιότυπο του FCoV και τον FIPV, έναν παθογόνο βιότυπο του FCoV [1] . Η σχέση μεταξύ αυτών των δύο βιοτύπων παραμένει ακόμη ασαφής. Έχουν προταθεί δύο υποθέσεις, (i) η θεωρία εσωτερικής μετάλλαξης και (ii) η κυκλοφορούσα θεωρία υψηλού λοιμογόνου-χαμηλού μολυσματικού. Η θεωρία της εσωτερικής μετάλλαξης ανέφερε ότι η ανάπτυξη του FIP οφείλεται στην έκθεση της γάτας σε παραλλαγές του FCoV που έχουν μεταλλαχθεί αποκτώντας την ικανότητα να αναπαράγονται μέσα στα μακροφάγα [2] , ενώ η κυκλοφορούσα θεωρία υψηλού λοιμογόνου-χαμηλού μολυσματισμού εξηγεί την ύπαρξη Τόσο οι χαρακτηριστικές παθογόνες όσο και οι καλοήθεις γενεαλογίες ιών στον πληθυσμό των γατών [3] .Μελέτη έδειξε ότι περίπου το 40-80% των γατών ανιχνεύεται με αποβολή FECV στα κόπρανα τους [4] . Περίπου το 12% αυτών των θετικών σε FECV γάτες έχουν αναπτύξει ανοσο-μεσολαβούμενη θανατηφόρα νόσο FIP [4] . Ο επιπολασμός του FIP μεταξύ των αιλουροειδών οφείλεται σε συνεχείς κύκλους μόλυνσης και επαναμόλυνσης του FECV και αδιάκριτα κλινικά συμπτώματα μολυσμένων γατών με FECV σε πρώιμο στάδιο πριν από την προοδευτική ανάπτυξη του FIPV. Εμβολιασμός κατά του FIPV με ένα εξασθενημένο, ευαίσθητο στη θερμοκρασία στέλεχος του τύπου II FIPV επάγει χαμηλό τίτλο αντισωμάτων σε γατάκια που δεν έχουν εκτεθεί σε FCoV. Ωστόσο, υπάρχει σημαντική διαμάχη σχετικά με την ασφάλεια και την αποτελεσματικότητα αυτού του εμβολίου, καθώς το εμβόλιο περιέχει στέλεχος τύπου 2, ενώ οι ιοί τύπου 1 είναι πιο διαδεδομένοι στο πεδίο [4] . Επιπλέον, τα αντισώματα έναντι του FIPV δεν προστατεύουν τις μολυσμένες γάτες, αλλά ενισχύουν τη μόλυνση των μονοκυττάρων και των μακροφάγων μέσω ενός μηχανισμού που είναι γνωστός ως Ενίσχυση Εξαρτημένης από Αντισώματα [1] . Εκτός από τα εμβόλια, πολλά αντιιικά φάρμακα όπως η ριμπαβιρίνη, οι ιντερφερόνες 2 BioMed Research International και τα ανοσοκατασταλτικά φάρμακα έχουν χρησιμοποιηθεί ως θεραπείες για γάτες που έχουν μολυνθεί από FIPV, κυρίως για την καταστολή της φλεγμονώδους και επιζήμιας ανοσολογικής απόκρισης [5] [6] [7] [8. ] . Ωστόσο, αυτές οι θεραπείες ήταν αναποτελεσματικές. Ως εκ τούτου, εξακολουθεί να υπάρχει σημαντική ανικανοποίητη ιατρική ανάγκη για την ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπειών και προφυλακτικών για τη λοίμωξη FIPV. Το ολιγονουκλεοτίδιο που σχηματίζει τριπλή έλικα (TFO) ορίζεται ως ολιγονουκλεοτίδια ομοπυριμιδίνης, τα οποία μπορούν να σχηματίσουν μια ειδική για την αλληλουχία τριπλή έλικα με δεσμούς Hoogsteen στην κύρια αύλακα ενός συμπληρωματική διάταση ομοπυριμιδινοομοπουρίνης σε διπλό DNA [9] . Επιπλέον, τα υβρίδια διπλού ελικοειδούς RNA ή DNA-RNA μπορούν να στοχευθούν ως πρότυπο για τον σχηματισμό τριπλής έλικας, αφού προσδιοριστεί η σύνθεση κλώνου στις σταθερότητες των τριπλών ελικοειδών συμπλεγμάτων [10] . Ως εκ τούτου, το TFO έχει χρησιμοποιηθεί για να εμποδίσει τις γονιδιακές εκφράσεις με αναστολή μεταγραφής ιικών γονιδίων ή ογκογονιδίων [11] [12] [13] [14] [15] [16] . Ο κύριος σκοπός αυτής της μελέτης είναι να αναπτύξει και να αξιολογήσει τις in vitro αντιικές ιδιότητες των κυκλικών TFO RNAs έναντι της αντιγραφής FIPV.ορότυπος II στέλεχος WSU 79-1146 (ATCC αρ. VR-1777) αναπτύχθηκε σε κύτταρα CRFK. Μια σειριακή 10-πλάσια αραίωση του FIPV παρασκευάστηκε από το απόθεμα εργασίας. Η συρρέουσα πλάκα 96 φρεατίων εμβολιάστηκε με 100 L από κάθε αραίωση ιού/φρεάτιο. Η πλάκα επωάστηκε σε έναν υγροποιημένο επωαστήρα στους 37 ∘ C, 5% CO2. Παρατηρήθηκε ανάπτυξη κυτταροπαθητικών επιδράσεων (CPE). Τα αποτελέσματα καταγράφηκαν μετά από 72 ώρες και η μολυσματική δόση 50 της καλλιέργειας ιστού ιού (TCID 50) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο των Reed και Muench [17] .Ολιγονουκλεοτιδικό RNA. Τα ολιγονουκλεοτίδια που σχηματίζουν τριπλή έλικα (TFOs) σχεδιάστηκαν με βάση την αλληλουχία γονιδιώματος του στελέχους WSU 79-1146 ορότυπου II FIPV (Αρ. πρόσβασης: AY994055) [18] . Κατασκευάστηκαν TFO, που στοχεύουν ειδικά τις διαφορετικές περιοχές του γονιδιώματος FIPV, και ένα άσχετο TFO (Πίνακας 1). Η ειδικότητα των TFO αναγνωρίστηκε χρησιμοποιώντας την αναζήτηση BLAST στη βάση δεδομένων NCBI. Τα σχεδιασμένα γραμμικά TFO συντέθηκαν από την Dharmacon Research (ΗΠΑ), όπου τα 5 και 3 άκρα των γραμμικών TFO τροποποιήθηκαν με ομάδα φωσφορικού (PO 4) και ομάδα υδροξειδίου (ΟΗ), αντίστοιχα. Αυτές οι τροποποιήσεις ήταν απαραίτητες για την κυκλοποίηση του γραμμικού TFO. Η διαδικασία της κυκλοποίησης, χρησιμοποιώντας τη λιγάση 1 RNA Τ4 (λιγάση ssRNA) (New England Biolabs Inc., Αγγλία), πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μετά την απολίνωση, τα κυκλικά TFO RNA ανακτήθηκαν με καθίζηση με αιθανόλη και η καθαρότητα των κυκλικών TFO RNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο. Η μετουσίωση της ηλεκτροφόρησης γέλης πολυακρυλαμιδίου ουρίας πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε πριν [19] με τροποποίηση. Εν συντομία, παρασκευάστηκε 20% πηκτής πολυακρυλαμιδίου μετουσιωμένης ουρίας και πολυμερίστηκε για 30 λεπτά. Κατόπιν, το πήκτωμα προεκτέθηκε στα 20 έως 40 V για 45 λεπτά. Πέντε L TFO RNA αναμεμειγμένα με 5 L ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης ουρίας θερμάνθηκαν στους 92 ∘ C για 2 λεπτά και ψύχθηκε αμέσως σε πάγο. Έτρεξε σε τζελ στα 200 V για 45 λεπτά. Τέλος, το πήκτωμα χρωματίστηκε με βρωμιούχο αιθίδιο (Sigma, ΗΠΑ) και παρατηρήθηκε με σύστημα Bio-Rad Gel Doc XR (CA, USA). (EMSA) . Οι περιοχές στόχοι του γονιδιώματος FIPV συντέθηκαν από την Dharmacon Research (ΗΠΑ) (Πίνακας 1). Κάθε TFO RNA αναμίχθηκε με την περιοχή στόχο σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης 1Χ που περιείχε 25 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl2 και 10 mMNaCl σε τελικό όγκο 10 L και στη συνέχεια επωάστηκε στους 37°C για 2 ώρες. Το δείγμα έτρεξε σε 15% φυσική γέλη πολυακρυλαμιδίου στα 80 V, σε ψυχρή κατάσταση. Η χρωματισμένη γέλη παρατηρήθηκε με σύστημα Bio-Rad Gel Doc XR. Regions. Η ισχύς δέσμευσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα νανοθερμιδόμετρο ισοθερμικής τιτλοδότησης (ITC) (TA instruments, Newcastle, UK). Τα μίγματα δειγμάτων RNA, αποτελούμενα από κυκλικά TFO (0,0002 mM), επωάστηκαν με τις αντίστοιχες συνθετικές περιοχές στόχους τους (0,015 mM) χρησιμοποιώντας 1Χ ρυθμιστικό δέσμευσης ως αραιωτικό. Το πείραμα διεξήχθη στους 37 ∘ C με 2 L/ένεση, για συνολικά 25 ενέσεις. Τα δεδομένα συλλέγονταν κάθε 250 δευτερόλεπτα και αναλύονταν χρησιμοποιώντας το λογισμικό NanoAnalyze v2.3.6 που παρέχεται από τον κατασκευαστή. Αυτό το πείραμα διεξήχθη σε κύτταρα CRFK, όπου 3 × 10 4 κύτταρα/φρεάτιο σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων για να φτάσει το 80% συρροή 24 ώρες πριν από τη διαμόλυνση. Εκατό ηΜ TFO RNAs διαμολύνθηκαν χωριστά στα κύτταρα CRFK χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο επιμόλυνσης HiPerFect (Qiagen, Γερμανία), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η πλάκα επωάστηκε στους 37 ∘ C με 5% CO2 για 6 ώρες. Στη συνέχεια, οι καλλιέργειες μολύνθηκαν με 100TCID 50 του FIPV ορότυπου II στελέχους WSU 79-1146 για 1 ώρα στους 37 ∘ C (100 L/φρεάτιο). Τέλος, το εμβόλιο του ιού αντικαταστάθηκε από φρέσκο ​​μέσο συντήρησης (MEM που περιέχει 1% FBS και 1% στυλό/στρεπτόκοκκο). Τα μολυσμένα με ιό και τα μη μολυσμένα κύτταρα διατηρήθηκαν ως θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες, αντίστοιχα. Η μορφολογία των καλλιεργειών καταγράφηκε 72 ώρες μετά τη μόλυνση και τα δείγματα συλλέχθηκαν σε αυτό το χρονικό σημείο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ∘ C πριν από την εκχύλιση RNA. Αναστολή. Διαφορετικές συγκεντρώσεις κυκλικού TFO1 RNA (25 ηΜ, 50 ηΜ, 100 ηΜ και 500 ηΜ) επιμολύνθηκαν σε κύτταρα CRFK. Η πλάκα επωάστηκε για 6 ώρες και ακολούθησε ενοφθαλμισμός ιού για 1 ώρα στους 37 ∘ C με 5% CO2. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται παραπάνω. Κύτταρο Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) (ATCC αρ. CCL-34), σε συγκέντρωση 4 χ 104 κύτταρα/φρεάτιο, σπάρθηκε σε πλάκα 96 φρεατίων για να φτάσει το 80% συρροή 24 ώρες πριν από τη διαμόλυνση. Η επιμόλυνση έγινε όπως και πριν. Εκατό ηΜ κυκλικού TFO RNA επιμολύνθηκαν σε κύτταρα MDCK. Μετά από 6 ώρες ORF1a/1b και 530-541ORF1a/1b και 7399-7411ORF1a/1b και 14048-14061- * Με έντονη γραφή υποδεικνύεται η περιοχή δέσμευσης. * * Άσχετη εγκύκλιος TFO. [20, 21] , αντίστοιχα. Η ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο ανάστροφης μεταγραφάσης (RT-qPCR) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα πραγματικού χρόνου Bio-Rad CFX96 (BioRad, ΗΠΑ). Η αντίδραση ενισχύθηκε σε τελικό όγκο 25 L χρησιμοποιώντας ένα κιτ SensiMix SYBR No-ROX One-Step Kit (Bioline, UK), το οποίο αποτελούνταν από 12,5 L 2X SensiMix SYBR No-Rox One-Step ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης, 10 M προς τα εμπρός και προς τα πίσω εκκινητές, 10 μονάδες αναστολέα RiboSafe RNase και 5 L εκμαγείου RNA. Η προσέγγιση απόλυτης ποσοτικοποίησης χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό των αποτελεσμάτων qPCR όπου σχεδιάστηκε μια τυπική καμπύλη μιας σειριακής αραίωσης του ιού πριν από τον ποσοτικό προσδιορισμό. Η ποσότητα του ιού στα δείγματα προσδιορίστηκε ποσοτικά με βάση αυτή την πρότυπη καμπύλη. Ανάλυση. Η στατιστική ανάλυση δεδομένων πραγματοποιήθηκε με χρήση του SPSS 18.0. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύτηκαν ως μέσος όρος ± SE τριών ανεξάρτητων δοκιμών. Χρησιμοποιήθηκε μονόδρομη ANOVA, Tukey post hoc test για την ανάλυση του σημαντικού επιπέδου μεταξύ των δεδομένων. ≤ 0,05 θεωρήθηκε σημαντικό. Το γονιδίωμα, το οποίο παίζει σημαντικό ρόλο στην αντιγραφή του ιού, επιλέχθηκαν ως θέσεις δέσμευσης στόχου για τον σχηματισμό τριπλών. Οι περιοχές στόχοι ήταν 5 αμετάφραστη περιοχή (5 UTR), Ανοιχτά Πλαίσια Ανάγνωσης (ORFs) 1a και 1b, και 3 αμετάφραστη περιοχή (3 UTR) (Πίνακας 1). Τα TFO σχεδιάστηκαν σε διπλή όψη, καθώς μπορούν να συνδεθούν με την μονόκλωνη περιοχή στόχο και να αναδιαμορφωθούν σε τρίπλεξ. Και τα δύο άκρα των διπλών TFO απολινώθηκαν με μια συνδετική αλληλουχία ή σφιγκτήρες (C-C) για την κατασκευή κυκλικού TFO RNA. Μετά τη διαδικασία σύνδεσης διεξήχθη ο προσδιορισμός μετουσίωσης PAGE για να προσδιοριστεί ο σχηματισμός του κυκλικού TFO. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, τα κυκλικά TFO RNA μετανάστευσαν ταχύτερα από τα γραμμικά TFO RNA, όταν υποβλήθηκαν σε 20% μετουσίωση PAGE.Target Region. Η ικανότητα δέσμευσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA) [23] . Η εμφάνιση της ζώνης αργής κινητικότητας υποδηλώνει τον επιτυχή υβριδισμό του κυκλικού TFO RNA με την περιοχή στόχο του. Η ικανότητα σύνδεσης διαφορετικών TFO RNA (TFO1 έως TFO5) έναντι των περιοχών-στόχων τους προσδιορίστηκε από το EMSA (Εικόνα 2). Τα TFO1, TFO3, TFO4 και TFO5 έδειξαν ζώνη αργής κινητικότητας, ενώ το TFO2 έδειξε την έλλειψη μετατοπισμένης ζώνης προς τα πάνω. Αυτό υποδηλώνει την κατοχή ικανότητας δέσμευσης triplex για όλα τα κυκλικά TFO RNA, εκτός από το TFO2.TFO RNA. Η μελέτη σχετικά με την αλληλεπίδραση και τον υβριδισμό του TFO προς την περιοχή στόχο του είναι ζωτικής σημασίας, καθώς όσο ισχυρότερη είναι η δέσμευση, τόσο πιο σταθερή σχηματίζεται η δομή τρίπλεξ. Όπως φαίνεται στο συμπληρωματικό Σχήμα 1 (Πίνακας 3). Η αντιική επίδραση των κυκλικών TFO RNAs διερευνήθηκε με ανάλυση RT-qPCR στις 72 ώρες μετά τη διαμόλυνση. Τα αποτελέσματα έδειξαν αριθμούς αντιγράφων ιικού RNA γονιδιώματος 3,65 × 10 9 , 3,22 × 10 14 , 5,04 × 10 9 , 5,01 × 10 9 , 4,41 × 10 9 , και 3,96 × 4, FO, T 3, 10 κύτταρα , TFO5 και TFO7, αντίστοιχα. Τα δεδομένα που αναλύθηκαν με μονόδρομο ANOVA, Tukey post hoc τεστ έδειξαν σημαντικό υψηλό αριθμό αντιγράφων ιικού RNA γονιδιώματος 4,03 × 10 14 για κύτταρα εμβολιασμένα με ιό σε σύγκριση με κυκλικές θεραπείες TFO1, TFO3, TFO4 και TFO5 (≤ 0,05). Τα αντίγραφα ιικού RNA των κυκλικών TFO2, γραμμικών TFO3 και TFO4 και μη σχετιζόμενων κυκλικών TFO7 RNA κυττάρων που έχουν διαμολυνθεί έδειξαν επίσης υψηλούς αριθμούς αντιγράφων ιικού RNA που δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές στα μολυσμένα κύτταρα (≥ 0,05) (Εικόνα 3). Οι μορφολογικές αλλαγές των κυττάρων καταγράφηκαν επίσης 72 ώρες μετά τη διαμόλυνση. Τα κύτταρα που διαμολύνθηκαν με κυκλικά TFO1, TFO3, TFO4 και TFO5 φάνηκαν να είναι σε καλή κατάσταση μετά τον ενοφθαλμισμό του ιού, ενώ τα κύτταρα που επιμολύνθηκαν με κυκλικό TFO2 και γραμμικό TFO3 και TFO4 έδειξαν ορατό κυτταροπαθητικό αποτέλεσμα (CPE), το ίδιο με τα εμβολιασμένα με ιό κύτταρα ( συμπληρωματικό Σχήμα 2) . Επιπλέον, τα κύτταρα που έχουν διαμολυνθεί με TFO παραμένουν βιώσιμα μόνο υποδεικνύοντας ότι η θεραπεία με TFO γενικά δεν είναι τοξική για τα κύτταρα. Ως εκ τούτου, αυτά τα αποτελέσματα απεικόνισαν την ικανότητα των κυκλικών TFO RNA (εκτός του TFO2) να αναστέλλουν την αναπαραγωγή του FIPV. Συγκεντρώσεις στην αντιγραφή FIPV. Το κυκλικό TFO1 χρησιμοποιήθηκε για να εξετάσει τη σχέση δόσης-απόκρισης ως αντιπροσωπευτικό σε άλλα TFO. Οι πειραματικές συνθήκες ήταν ίδιες με αυτές του προηγούμενου πειράματος, εκτός από τις συγκεντρώσεις TFO1 25 ηΜ, 50 ηΜ, 100 ηΜ και 500 ηΜ. Δεν υπήρξε σημαντική μείωση στα αντίγραφα του γονιδιώματος του ιικού RNA χρησιμοποιώντας τη συγκέντρωση 25 ηΜ TFO1. Οι άλλες συγκεντρώσεις προκάλεσαν σημαντικές μειώσεις στον αριθμό των αντιγράφων σε σύγκριση με τα μολυσμένα από τον ιό κύτταρα. Ωστόσο, δεν ανιχνεύθηκε σημαντική διαφορά στους αριθμούς αντιγράφων από όλες αυτές τις συγκεντρώσεις (Εικόνα 4). Η ειδικότητα του TFO προς το FIPV δοκιμάστηκε, χρησιμοποιώντας TFO1 και TFO5, ως τους κατάλληλους εκπροσώπους των TFO, στον ιό της γρίπης Α H1N1 New Jersey 8 /76. Τα δεδομένα που αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA, Tukey post hoc τεστ δεν έδειξαν σημαντικές μειώσεις στα αντίγραφα του ιικού RNA και για τα δύο TFO σε σύγκριση με τα εμβολιασμένα κύτταρα με τον ιό της γρίπης (≥ 0,05) (συμπληρωματικό Σχήμα 3). Σύνθετη δομή G4/Cir4 Σχήμα 2: Ανάλυση EMSA. Η ανάλυση EMSA απέδειξε τη δέσμευση των κυκλικών TFO 1, 3, 4 και 5 στις περιοχές-στόχους όπως αποδεικνύεται από τη μετατόπιση της ζώνης προς τα πάνω. Η σύνδεση κάθε κυκλικού TFO εκτός του κυκλικού TFO2 στον αντίστοιχο στόχο του σχηματίζει ένα σύμπλεγμα που μεταναστεύει πιο αργά από το μη δεσμευμένο TFO. Τα G1 έως G5 αντιπροσωπεύουν την περιοχή στόχο για κυκλικό TFO1 έως TFO5 και Cir1 έως Cir5 αντιπροσωπεύουν το κυκλικό TFO1 έως TFO5, αντίστοιχα. στη διαδικασία αντιγραφής [24] . Εν τω μεταξύ, το ORF1a/1b του FIPV μεταφράζεται σε πολυπρωτεΐνες που διασπώνται σε μη δομικές πρωτεΐνες οι οποίες συναρμολογούνται σε σύμπλοκα αντιγραφής μεταγραφής μαζί με άλλες ιικές πρωτεΐνες [24] . Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη μοριακής θεραπείας που στοχεύει αυτές τις κρίσιμες περιοχές μπορεί να παρέχει τη δυνατότητα αναστολής της αναπαραγωγής του FIPV. Ανάπτυξη αντιιικών θεραπειών έναντι του FIPV χρησιμοποιώντας siRNA [25] και αναστολείς ιικής πρωτεάσης [26] Εικόνα 4: Μελέτη δόσης-απόκρισης TFO1 για αναστολή αντιγραφής FIPV . Οι συγκεντρώσεις 50 nM και άνω έδειξαν σημαντικές αντιικές επιδράσεις. 50 nM κυκλικού TFO1 RNA μπόρεσε να μειώσει τον αριθμό αντιγράφων του ιού κατά 5 φορές το log 10 από 10 14 σε 10 9, ενώ 100 και 500 nM έδειξαν 4 φορές μείωση. Τα δεδομένα είναι μέσοι όροι 3 ανεξάρτητων δοκιμών (μέσος όρος ± SE). * Σημαντικά διαφορετική από την ομάδα που έχει μολυνθεί με FIPV.ως πιθανές νέες θεραπείες κατά της μόλυνσης από FIPV. Σε αυτή τη μελέτη, σχεδιάστηκαν και αξιολογήθηκαν κυκλικά RNA ολιγονουκλεοτιδίων σχηματισμού τριπλής έλικας (TFO), που στοχεύουν ειδικά τις βραχείες περιοχές του ιικού γονιδιώματος για σχηματισμό τριπλών ινών. Τα TFO1 και TFO2 στόχευαν τα 5 και 3 UTR του ιικού γονιδιώματος, αντίστοιχα. Το TFO3 έως το TFO5 στόχευσε διαφορετικές περιοχές του ORF1a/1b στο γονιδίωμα FIPV. Πριν από την in vitro αντιιική μελέτη, τα συνδεδεμένα κυκλικά TFO αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση PAGE. Όλα τα κυκλοποιημένα TFO έδειξαν ταχύτερο μοτίβο μετανάστευσης σε σύγκριση με το γραμμικό TFO. Ωστόσο, μόνο μικρή απόκλιση εντοπίστηκε για ορισμένα από τα TFO (Εικόνα 1). Ο λόγος για αυτό δεν είναι σαφής, αλλά πιθανώς οφείλεται στις διαφορές στο μήκος και στις τριτογενείς δομές των TFO που οδηγούν σε διαφορές στο ποσοστό μετανάστευσης. Το EMSA χρησιμοποιήθηκε για να δείξει την ικανότητα δέσμευσης κάθε κυκλικού TFO προς την περιοχή στόχο στο γονιδίωμα FIPV εκτός από το TFO2 που έδειξε έλλειψη σχηματισμού σύνθετης δομής κατά τον υβριδισμό (Εικόνα 2). Το αποτέλεσμα του EMSA ταυτίστηκε επίσης με την αντιιική μελέτη, όπου όλα τα κυκλικά TFO (εκτός από το TFO2) μπόρεσαν να επιδείξουν σημαντική μείωση στους αριθμούς αντιγράφων του ιικού RNA γονιδιώματος κατά 5 φορές log 10 από 10 14 σε κύτταρα εμβολιασμένα με ιό σε 10 9 σε TFO -διαμολυσμένα κύτταρα (Εικόνα 3). Ωστόσο, δεν ανιχνεύθηκαν αντιικές ιδιότητες από τα γραμμικά TFO και τα άσχετα κυκλικά TFO7 RNA, επιβεβαιώνοντας ότι η αντιϊκή δράση σχετίζεται με ειδική δέσμευση κυκλικών TFO προς στοχευμένες περιοχές. Επιπλέον, η σύνδεση του κυκλικού TFO στην περιοχή στόχο επιβεβαιώθηκε από το nanoITC ανάλυση; όπου η χαμηλή τιμή και η υψηλή σταθερότητα επέτρεψαν στα TFO να ανταγωνίζονται αποτελεσματικά τις περιοχές-στόχους για την αναστολή της μεταγραφής σε συστήματα χωρίς κύτταρα. Εφόσον, το TFO1 δείχνει τη χαμηλότερη τιμή (Πίνακας 3), οι αντιικές ιδιότητες αυτού του TFO αξιολογήθηκαν σε μελέτη δόσης απόκρισης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, τα 50 και 100 ηΜ TFO1 έδειξαν παρόμοια αντιϊκά αποτελέσματα που υποδεικνύουν την πιθανή θεραπευτική εφαρμογή του TFO1 στην αντιγραφή FIPV. Ωστόσο, η αύξηση της συγκέντρωσης του TFO1 στα 500 nm απέτυχε να μειώσει περαιτέρω το ιικό φορτίο πιθανώς λόγω της αναποτελεσματικότητας του αντιδραστηρίου επιμόλυνσης να διαμολύνει το TFO στα κύτταρα. Επιπλέον, ο ιός έχει γρήγορο ρυθμό αντιγραφής κατά τη μόλυνση in vitro, όπου προηγούμενη μελέτη για την ανάπτυξη του FIPV σε κύτταρα CRFK έδειξε ότι μετά από 2 ώρες περίπου το 67% του FIPV 79-1146 εσωτερικεύτηκε από τα κύτταρα CRFK με ενδοκυττάρωση αυξανόμενη σε περισσότερο από 70 % σε 3 ώρες [27, 28] . Το παραπάνω εύρημα πιθανώς εξήγησε επίσης τον λόγο για τον οποίο δεν ανιχνεύθηκε αντιϊκό αποτέλεσμα όταν πραγματοποιήθηκε η επιμόλυνση του TFO σε κύτταρα μολυσμένα από ιό (δεδομένα δεν φαίνονται). του TFO στην περιοχή στόχο, με βάση και τους δύο δεσμούς υδρογόνου Watson-Crick και Hoogsteen, οι οποίοι ενισχύουν τη σταθερότητα όσον αφορά την ενθαλπία, η οποία επιτυγχάνεται με την ένωση δύο από τις τρεις έλικες της τριπλής έλικας στον σωστό προσανατολισμό [ 29] . Επομένως, ο σχηματισμός triplex είναι στενά συνδεδεμένος και δεν είναι εύκολο να αποσπαστεί. Επιπλέον, τα κυκλικά TFO σχεδιάστηκαν με τέτοιο τρόπο ώστε η παρουσία δοτών και δεκτών δεσμών υδρογόνου στις πουρίνες να είναι ικανή να σχηματίσει δύο δεσμούς υδρογόνου, ενώ οι βάσεις πυριμιδίνης μπορούν να σχηματίσουν μόνο έναν επιπλέον δεσμό υδρογόνου με εισερχόμενες τρίτες βάσεις [30] . Ωστόσο, υπάρχουν διάφοροι παράγοντες που μπορεί να περιορίσουν τη δραστηριότητα των TFO στα κύτταρα, όπως η ενδοκυτταρική αποικοδόμηση του TFO και η περιορισμένη προσβασιμότητα του TFO στις θέσεις στόχους που μπορούν να αποτρέψουν το σχηματισμό τριπλών [31] . Αυτά τα ευρήματα μπορεί επίσης να εξηγήσουν την αδυναμία του σχεδιασμένου TFO1 να αναστέλλει την περαιτέρω αντιγραφή του ιού στη μελέτη δόσης-απόκρισης (Εικόνα 4). Έχουν αναπτυχθεί και δοκιμαστεί διάφορες μοριακές θεραπείες κατά μολυσματικών ασθενειών και καρκίνου. Ωστόσο, μόνο η θεραπεία που βασίζεται στο siRNA έχει μελετηθεί εκτενώς ως νέα αντιική και αντικαρκινική θεραπεία [32, 33]. Πρόσφατα, οι McDonagh et al. [25] ανέπτυξε το siRNA με αντιική δράση έναντι του FIPV 79-1146, όπου το σχεδιασμένο siRNA ήταν σε θέση να μειώσει τον αριθμό αντιγράφων του ιικού γονιδιώματος σε σύγκριση με κύτταρα μολυσμένα από ιό. Έχει επίσης αναφερθεί η πιθανή θεραπευτική εφαρμογή των TFO, όπως το γραμμικό TFO συζευγμένο με ψωραλένιο για την αναστολή της μεταγραφής του προϊού ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας [13] και το TFO για την αναστολή της μεταγραφής του κολλαγόνου 1(Ι) σε ινοβλάστες αρουραίου [14]. Επιπλέον, βραχύ TFO συζευγμένο με δαουνομυκίνη που στοχεύει την περιοχή προαγωγέα του ογκογονιδίου έχει σχεδιαστεί και αξιολογηθεί σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα [31] . Αυτές οι μελέτες έδειξαν την ευελιξία της χρήσης ολιγονουκλεοτιδίων που βασίζονται σε TFO ως πιθανή θεραπεία με μοριακή βάση. Σε αυτή τη μελέτη, επιδείξαμε βραχέα κυκλικά TFO RNA μεταξύ 28 και 34 mers (Πίνακας 1), τα οποία είναι ικανά να αναστείλουν την αναπαραγωγή του FIPV δεσμεύοντας σε συγκεκριμένες περιοχές στόχους του γονιδιώματος FIPV. Όλα τα σχεδιασμένα κυκλικά TFO (εκτός από το TFO2) έδειξαν σημαντικά ανασταλτικά αποτελέσματα έναντι της αντιγραφής FIPV. Τα TFO που σχημάτισαν δομές triplex έδειξαν αντιιικά αποτελέσματα έναντι της αναπαραγωγής του FIPV. Ο λόγος για τον οποίο το TFO2 απέτυχε να δείξει οποιαδήποτε αλληλεπίδραση με την περιοχή στόχο ή την αντιική δράση οφείλεται πιθανώς στο μήκος του TFO2 (δηλαδή, 24 mers), το οποίο μπορεί να είναι ανεπαρκές για σχηματισμό triplex κατά τον υβριδισμό (Εικόνα 2), να είναι αρκετά αποτελεσματικό για να καταστέλλουν τη μεταγραφή του ιικού RNA και τελικά αναστέλλουν την αντιγραφή του ιού. Ωστόσο, δεν μπορεί να αποκλειστεί η αδυναμία του TFO2 να επιδείξει αντιϊκό αποτέλεσμα λόγω αποτυχίας στο σχηματισμό λειτουργικής τριτοταγούς δομής του τριπλού σχηματισμού. In vitro αντιιική μελέτη που δεν έδειξε καμία αντιική ιδιότητα για άσχετο TFO (TFO7) και επίσης αδυναμία των κυκλικών TFO1 και TFO5 να αναστέλλουν κύτταρα μολυσμένα από τον ιό της γρίπης Α H1N1 επιβεβαιώνει την ειδικότητα της δραστηριότητας των TFO. Συμπερασματικά, το κυκλικό TFO RNA έχει τη δυνατότητα να αναπτυχθεί ως θεραπεία κατά του FIPV σε γάτες. Ωστόσο, περαιτέρω μελέτες σχετικά με την εξειδίκευση του TFO, τον πραγματικό μηχανισμό του κυκλικού TFO RNA στην συνέπεια της μεταγραφής αλλοίωσης της αναστολής της διαδικασίας μεταγραφής του ιού και in vivo μελέτες σε ζώα είναι σημαντικές για να λειτουργήσει αυτή η προσέγγιση ως θεραπεία στο μέλλον.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 3403, "text": "το εμβόλιο περιέχει στέλεχος τύπου 2, ενώ οι ιοί τύπου 1 είναι πιο διαδεδομένοι στο πεδίο" } ], "id": 4056, "question": "Γιατί είναι η διαμάχη τους γύρω από το εμβόλιο FIPV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6876, "text": "30 λεπτά" } ], "id": 4057, "question": "Για πόσο καιρό πολυμερίστηκε η μετουσιωμένη γέλη πολυακρυλαμιδίου;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Ανασταλτική επίδραση και πιθανός μηχανισμός δράσης του αλκοόλ πατσουλί έναντι του ιού της γρίπης Α (H2N2) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6264369/SHA: f2d842780b9928cc705f830374; Li, Beili; Wang, Xue; Jin, Mingyuan; Wang, GuonianΗμερομηνία: 2011-08-03DOI: 10.3390/molecules16086489Άδεια: cc-byAbstract: Στην παρούσα μελέτη, η δράση του ιού της αλκοόλης πατσουλί κατά της γρίπης A (H2N2) μελετήθηκε in vitro, in vivo και in sili. Το CC(50) της αλκοόλης πατσουλί ήταν πάνω από 20 μΜ. Η αλκοόλη πατσουλί θα μπορούσε να αναστείλει τον ιό της γρίπης με IC(50) 4,03 ± 0,23 μΜ. Η ανάλυση ΜΤΤ έδειξε ότι η αναστολή από την αλκοόλη πατσουλί εμφανίζεται έντονα μετά τη διείσδυση του ιού στο κύτταρο. Στο μοντέλο ποντικών με γρίπη, το αλκοόλ από πατσουλί έδειξε προφανή προστασία έναντι της ιογενούς λοίμωξης σε δόση 5 mg/kg/ημέρα. Η ευέλικτη σύνδεση και οι μοριακές δυναμικές προσομοιώσεις έδειξαν ότι η αλκοόλη πατσουλί ήταν συνδεδεμένη με την πρωτεΐνη νευραμινιδάσης του ιού της γρίπης, με ενέργεια αλληλεπίδρασης -40,38 kcal mol(-1). Τα αμετάβλητα υπολείμματα ενεργού θέσης κλειδιού Asp151, Arg152, Glu119, Glu276 και Tyr406 έπαιξαν σημαντικούς ρόλους κατά τη διαδικασία δέσμευσης. Με βάση χωρικά και ενεργειακά κριτήρια, το αλκοόλ από πατσουλί παρενέβαινε στις λειτουργίες ΝΑ. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ υποδηλώνουν ότι η αλκοόλη πατσουλί έχει ιδιότητες κατά του ιού της γρίπης Α (H2N2) και ως εκ τούτου αποτελεί πιθανή πηγή αντιγριπικών παραγόντων για τη φαρμακευτική βιομηχανία. λοιμώξεις στον άνθρωπο, μπορεί να οδηγήσει σε ετήσιες επιδημίες και σπάνιες πανδημίες. Οι δύο πανδημίες γρίπης του 20ου αιώνα, \"Asian Influenza (1957/H2N2)\" και \"Hong Kong Influenza (1968/H3N2)\" είχαν ως αποτέλεσμα τον θάνατο περίπου 2-3 ​​εκατομμυρίων ανθρώπων παγκοσμίως [1, 2] . Σήμερα, οι απόγονοί τους συνεχίζουν να προκαλούν την πλειονότητα των λοιμώξεων από γρίπη στους ανθρώπους [3] . Από όσο έχει μαθευτεί ότι το πιο αποτελεσματικό αντιικό φάρμακο είναι ο αναστολέας της νευραμινιδάσης (NA), ο οποίος στοχεύει τις γλυκοπρωτεΐνες ΝΑ του ιού της γρίπης Α και Β [4, 5] . Η απελευθέρωση νέων ιοσωμάτων από το μολυσμένο κύτταρο είναι ένα βασικό βήμα στον κύκλο ζωής της γρίπης και χρειάζονται νευραμινιδάση (NA) για να διασπαστεί η α-κετοσιδική σύνδεση μεταξύ του τερματικού σιαλικού οξέος και ενός παρακείμενου υπολείμματος σακχάρου [6] . Οι αναστολείς ΝΑ σχεδιάστηκαν για να αποτρέπουν το βασικό βήμα μπλοκάροντας την ενεργό θέση του ενζύμου και έτσι να αφήνουν αρκετό χρόνο στο ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή να απομακρύνει τους μολυσμένους ιούς [7] . Συνεπείς προσπάθειες έχουν αφιερωθεί στην ανάπτυξη αναστολέων ΝΑ, χρησιμοποιώντας την κρυσταλλική δομή της πρωτεΐνης NA του υποτύπου N2 [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] . Πράγματι, το oseltamivir (Tamiflu) είναι ο αντιπροσωπευτικός αναστολέας ΝΑ που έχει αποδειχθεί ότι είναι μοναδικά εφαρμόσιμο από του στόματος φάρμακο στην κλινική πράξη για τη θεραπεία της λοίμωξης από γρίπη [4, 8, 9]. Ωστόσο, με την αύξηση της ιατρικής χρήσης, τα στελέχη που είναι ανθεκτικά στο oseltamivir έχουν βρεθεί και πιθανότατα οδηγούν σε μεγάλης κλίμακας ξέσπασμα νέας πανδημικής γρίπης [16, 17]. Το αλκοόλ πατσουλί (Εικόνα 1) είναι πολύ γνωστό για περισσότερο από έναν αιώνα. Είναι ένα κύριο συστατικό του πικάντικου ελαίου από τον ανατολικό Ινδικό θάμνο Pogostemon cablin (Blanco) Benth και χρησιμοποιείται ευρέως σε αρώματα. Το έλαιο πατσουλί είναι ένα σημαντικό αιθέριο έλαιο στη βιομηχανία αρωμάτων, που χρησιμοποιείται για να δώσει βάση και διαρκή χαρακτήρα σε ένα άρωμα [16, 17] . Το αιθέριο έλαιο εκτιμάται πολύ για τη χαρακτηριστική ευχάριστη και μακροχρόνια ξυλώδη, γήινη και καμφορώδη οσμή του, καθώς και για τις σταθεροποιητικές του ιδιότητες, καθώς είναι κατάλληλο για χρήση σε σαπούνια και καλλυντικά προϊόντα [16, 17] . Το εναέριο τμήμα της καμπίνας Pogostemon έχει χρησιμοποιηθεί άγρια ​​για τη θεραπεία του κοινού κρυολογήματος και ως αντιμυκητιακός παράγοντας στην Κίνα [16, 17] . Επιπλέον, το φυτό χρησιμοποιείται ευρέως στην Παραδοσιακή Κινεζική Ιατρική καθώς παρουσιάζει διάφορους τύπους φαρμακολογικής δράσης ανάλογα με τη σύνθεση του ελαίου [16, 17] . Η αλκοόλη πατσουλί, ως το κύριο πτητικό συστατικό του ελαίου πατσουλί, έχει βρεθεί ότι αναστέλλει έντονα την αναπαραγωγή του H1N1 και αναστέλλει ασθενώς την αντιγραφή B/Ibaraki/2/85 [18] . Από όσο γνωρίζουμε, οι δράσεις κατά του ιού της γρίπης (H2N2) της αλκοόλης πατσουλί δεν έχουν ακόμη αξιολογηθεί. Ως εκ τούτου, ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογήσει τη δράση κατά του ιού της γρίπης Α (H2N2) της αλκοόλης πατσουλί με ανάλυση MTT και μοντέλο γρίπης ποντικών. Σε αυτή τη βάση, εφαρμόστηκαν ρητά διαλυτοποιημένες μέθοδοι σύνδεσης και μοριακής δυναμικής (MD) για τη διερεύνηση του τρόπου δέσμευσης που περιλαμβάνει αλκοόλη πατσουλί με πρωτεΐνη NA του ιού της γρίπης. Αναμένουμε ότι η γνώση για την κατανόηση του ανασταλτικού μηχανισμού θα έχει αξία στον ορθολογικό σχεδιασμό των νέων αντιγριπικών φαρμάκων. Αρχικά εξετάστηκε η αποτελεσματικότητα της αλκοόλης πατσουλί στην αντιγραφή του ιού της γρίπης Α (H2N2) και τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Το CC 50 χρησιμοποιήθηκε για να εκφράσει την κυτταροτοξικότητα της αλκοόλης πατσουλί στο MDCK. Το CC 50 της αλκοόλης πατσουλί ήταν πάνω από 20 mM, γεγονός που έδειξε ότι η αλκοόλη πατσουλί δεν επηρέασε την ανάπτυξη του MDCK (Πίνακας 1). Έτσι, φαίνεται ότι οι αντιικές επιδράσεις της αλκοόλης πατσουλί δεν οφείλονταν στην κυτταροτοξικότητα. Επιπλέον, η αλκοόλη πατσουλί βρέθηκε ότι αναστέλλει τον ιό της γρίπης Α (H2N2) με IC 50 4,03 ± 0,23 μΜ. Με βάση τις τιμές IC 50 και CC 50, ο δείκτης επιλεκτικότητας (SI) υπολογίστηκε ως >4,96. Αναφέρεται ότι ένα SI 4 ή περισσότερο είναι κατάλληλο για έναν αντιιικό παράγοντα [18], υποδηλώνοντας ότι η αλκοόλη πατσουλί μπορεί να κριθεί ότι έχει δράση κατά του ιού της γρίπης Α (H2N2). Μέχρι τώρα, έχει βρεθεί ότι η αλκοόλη πατσουλί έδειξε δοσοεξαρτώμενη δράση κατά του ιού της γρίπης (A/PR/8/34, H1N1), με τιμή IC50 2,635 μΜ. Επιπλέον, έδειξε ασθενή δράση έναντι του B/Ibaraki/2/85 (IC 50 = 40,82 μΜ) [19] . Με την προσθήκη της παραπάνω ανασταλτικής δραστηριότητας H2N2, έχουμε μια ολοκληρωμένη άποψη της αντιγριπικής δράσης της αλκοόλης πατσουλί. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με αλκοόλη πατσουλί πριν από τη μόλυνση από τον ιό (κύτταρα προεπεξεργασίας), οι ιοί υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία πριν από τη μόλυνση (ιός προεπεξεργασίας) και αλκοόλη πατσουλί προστέθηκε κατά τη διάρκεια της περιόδου προσρόφησης (προσρόφηση) ή μετά τη διείσδυση των ιών στα κύτταρα (αντιγραφή). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν ανεξάρτητα τρεις φορές και τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι ο μέσος όρος τριών πειραμάτων. Τα σύμβολα * έδειξαν πολύ σημαντική διαφορά p < 0,01 σε σχέση με άλλο τρόπο (ιός προεπεξεργασίας, προσρόφηση και κύτταρο προεπεξεργασίας). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, η αλκοόλη πατσουλί έδειξε δράση κατά της γρίπης Α (H2N2) με τρόπο εξαρτώμενο από το χρόνο. Έδειξε καλύτερη αντιϊκή δράση όταν προστέθηκε σε συγκέντρωση 8 μΜ κατά την περίοδο αντιγραφής με αναστολή της ιικής αντιγραφής 97,68% ± 2,09% για τη γρίπη Α (Η2Ν2) στις 72 ώρες. Ωστόσο, δεν ανιχνεύθηκε σημαντική επίδραση όταν χρησιμοποιήθηκε αλκοόλη πατσουλί για προεπεξεργασία κυττάρων ή ιών ή όταν η αλκοόλη πατσουλί προστέθηκε μόνο κατά τη φάση της προσρόφησης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αναστολή του ιού της γρίπης Α (H2N2) από την αλκοόλη πατσουλί φαίνεται να συμβαίνει πολύ πιο έντονα μετά τη διείσδυση του ιού στο κύτταρο. Επιπλέον, βιοχημικές μελέτες έχουν δείξει ότι η βιοδραστικότητα της πρωτεΐνης NA είναι ουσιαστικός καθοριστικός παράγοντας μετά την αναπαραγωγή του ιού της γρίπης Α (H2N2) [20] [21] [22] . Ως εκ τούτου, συμπεραίνουμε ότι η λειτουργία της πρωτεΐνης NA μπορεί να καταστέλλεται από την αλκοόλη πατσουλί. Για την αξιολόγηση της τοξικότητας της αλκοόλης πατσουλί, η μέση τιμή του σωματικού βάρους των ποντικών σε κάθε ομάδα αναλύθηκε στατιστικά. Τα μέσα βάρη των ποντικών που χορηγήθηκαν στα 2 mg/kg/δόση οσελταμιβίρη, 2 mg/kg/δόση αλκοόλης πατσουλί και 10 mg/kg/δόση αλκοόλης πατσουλί μία φορά την ημέρα για 7 ημέρες δεν ήταν σημαντικά διαφορετικά σε σύγκριση με τους κανονικούς ποντικούς ελέγχου , δεν δείχνει τοξικότητα της αλκοόλης πατσουλί και της οσελταμιβίρης εντός της συγκέντρωσης δοκιμής (P > 0,05). Η φυσιολογική κατάσταση παρατηρήθηκε σε ποντίκια μόλυνσης από ιό. Τρεις ημέρες μετά την ιογενή μόλυνση, ορισμένα ποντίκια, ειδικά τα ποντίκια στην ομάδα ελέγχου που είχαν μολυνθεί με H2N2, εμφάνισαν αλλαγές στη συμπεριφορά τους, όπως τάση για συσσώρευση, μειωμένη ζωτικότητα και αναστατωμένη γούνα κ.λπ. Στο μοντέλο της γρίπης των ποντικών, η ιογενής μόλυνση οδηγεί σε απώλεια σωματικού βάρους και υψηλή θνησιμότητα. Επομένως, η αποτελεσματικότητα της αλκοόλης πατσουλί και της οσελταμιβίρης αξιολογήθηκε με βάση το ποσοστό επιβίωσης που μετρήθηκε για 15 ημέρες μετά τη μόλυνση, για μολυσμένα ζώα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία σε σχέση με μολυσμένα ζώα (μάρτυρες) που δεν είχαν λάβει θεραπεία. Μια σύγκριση της αποτελεσματικότητας του αλκοολούχου πατσουλί και του οσελταμιβίρης in vivo μοντέλο γρίπης ποντικών (από του στόματος θεραπεία) έδειξε ότι σε δόση 5 mg/kg/ημέρα, το αλκοόλ από πατσουλί έδειξε προφανή προστασία έναντι του ιού της γρίπης, καθώς η μέση ημέρα θανάτου ανιχνεύθηκε ως 11,8 ± 1,1 (Πίνακας 2) . Όταν η δόση μειώθηκε στο 1 mg/kg/ημέρα, η αλκοόλη από πατσουλί έδειξε ασθενέστερη προστασία (μετρούμενη με Survivors/σύνολο) από αυτή των 5 mg/kg/ημέρα, η μέση ημέρα μέχρι θανάτου ήταν 7,5 ± 1,8. Ενώ η οσελταμιβίρη σε αυτό το επίπεδο δόσης (1 mg/kg/ημέρα) έδειξε προστασία 50% (μετρούμενη από επιζώντες/σύνολο) έναντι του ιού της γρίπης. Στην ομάδα ελέγχου που είχε μολυνθεί με H2N2, δεν υπήρχαν επιζώντες. Λαμβάνοντας υπόψη τόσο τα δεδομένα in vitro όσο και in vivo, συμπεραίνουμε ότι η αλκοόλη πατσουλί θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στη θεραπεία λοιμώξεων από τον ιό της ανθρώπινης γρίπης. Με βάση τα παραπάνω δεδομένα πειράματος, η αλκοόλη πατσουλί προσδιορίζεται ότι δεσμεύεται στην πρωτεΐνη ΝΑ. Όπως υποδεικνύουν οι συνολικές ενέργειες και οι αποκλίσεις μέσης τετραγωνικής ρίζας της ραχοκοκαλιάς (RMSD) στο Σχήμα 3, το σύμπλεγμα αλκοόλης πατσουλί-ΝΑ με ελαχιστοποίηση ενέργειας βρίσκεται σε ισορροπία από περίπου 0,5 ns και στη συνέχεια διατηρείται αρκετά σταθερό στα τελευταία 19,5 ns. Είναι σύμφωνο με τα προηγούμενα αποτελέσματα MD άλλων αναστολέων ΝΑ [23] [24] [25] [26] [27] [28] . Αντίστοιχα, οι γεωμετρικές και ενεργειακές αναλύσεις έγιναν στις μέσες δομές των τροχιών MD 0,5~20,0 ns, όπου το σύστημα ήταν ήδη σε ισορροπία. Η ενέργεια αλληλεπίδρασης (E inter ) της αλκοόλης πατσουλί με το NA υπολογίστηκε σε -40,38 kcal mol −1, όπου οι αλληλεπιδράσεις vdW αντί των ηλεκτροστατικών διαπιστώθηκε ότι παίζουν κυρίαρχο ρόλο, συμβάλλουν περίπου στο 72% (−29,18 kcal mol −1). . Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, η αλκοόλη πατσουλί δεσμεύτηκε στο ενεργό σημείο που δεσμεύτηκε επίσης με oseltamivir και zanamivir [28]. Όπως δείχνει το σχήμα 5, το άτομο οξυγόνου της αλκοόλης πατσουλί προσανατολίστηκε προς τις πλευρικές αλυσίδες των υπολειμμάτων Glu119 και Tyr406, με έναν δεσμό Η να σχηματίζεται με κάθε υπόλειμμα. Οι τιμές των αποστάσεων στο Σχήμα 6 αποκαλύπτουν περαιτέρω ότι το συνδεδεμένο σύμπλεγμα παραμένει μάλλον σταθερό καθ' όλη τη διάρκεια της προσομοίωσης, με τις μέσες αποστάσεις της αλκοόλης Glu119:OE2 πατσουλί:Ο και Tyr406:OH -πατσουλί αλκοόλης:Ο μικρότερη από 2,8 Α. Οι συνεισφορές αθροίσματος (E sum ) των υπολειμμάτων Glu119 και Tyr406 ανήλθαν σε −8,46 και −7,37 kcal mol −1, αντίστοιχα (Πίνακας 3) . Επιπλέον, η αλκοόλη πατσουλί σταθεροποιήθηκε από τα υπολείμματα Arg118, Asp151, Arg152, Trp178, Ala246, Glu276, Arg292, Asn294 και Gln347, ιδιαίτερα τα υπολείμματα Asp151, Arg152 και Glu276 και Tlu276 (Σχήμα 3). Στην πραγματικότητα, τα υπολείμματα Asp151, Arg152, Glu119, Glu276 και Tyr406 της πρωτεΐνης NA έχουν ήδη λάβει αρκετή προσοχή από ορθολογικούς σχεδιασμούς φαρμάκων [14, 30, 31]. Τα καταλυτικά υπολείμματα Asp151, Arg152 και Glu276 είναι κρίσιμα για τις λειτουργίες ΝΑ και τα υπολείμματα Glu119 και Tyr406 είναι σημαντικά για τη σταθεροποίηση των ενεργών θέσεων ΝΑ [32, 33]. Υποδηλώνει ότι οι λειτουργίες NA θα επηρεαστούν από την παρουσία αλκοόλης πατσουλί, σύμφωνα με τα παραπάνω πειράματα. Το αλκοόλ πατσουλί ταιριάζει με το ενεργό κέντρο NA και έχει μια αποδεκτή ενέργεια αλληλεπίδρασης. Λαμβάνοντας υπόψη τις προφανείς δομικές διαφορές έναντι των σημερινών αναστολέων ΝΑ, αντιπροσωπεύει μια ιδανική ένωση μολύβδου για τα σχέδια νέων αντιγριπικών παραγόντων. Η αλκοόλη από πατσουλί και η οσελταμιβίρη ελήφθησαν από τη Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA, καθαρότητα > 99%) και αποθηκεύτηκαν σε γυάλινα φιαλίδια με σφραγισμένα καπάκια από τεφλόν στους -20 ± 0,5 °C απουσία φωτός. MDCK ( νεφρός σκύλου Madin-Darby) αγοράστηκε από το Harbin Veterinary Research Institute (Harbin, Heilongjiang, Κίνα). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μονοστιβαδική καλλιέργεια με το ελάχιστο απαραίτητο μέσο Eagle (EMEM) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS), 100 U/mL πενικιλίνη και 100 μg/mL στρεπτομυκίνη. Οι μονοστρώσεις αφαιρέθηκαν από τις πλαστικές επιφάνειές τους και περνούσαν σειριακά όποτε συρρέουν. Τα κύτταρα απλώθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 96 φρεατίων για κυτταροτοξικούς και αντιγριπικούς προσδιορισμούς και πολλαπλασιάστηκαν στους 37 °C σε ατμόσφαιρα 5% CO2. Το στέλεχος γρίπης A/Leningrad/134/17/1957 H2N2) αγοράστηκε από Εθνικό Ινστιτούτο Ελέγχου Κτηνιατρικών Βιοπροϊόντων και Φαρμακευτικών Προϊόντων (Πεκίνο, Κίνα). Ο ιός αναπτύχθηκε συνήθως σε κύτταρα MDCK. Οι αποθεματικές καλλιέργειες παρασκευάστηκαν από υπερκείμενα μολυσμένα κύτταρα και αποθηκεύτηκαν στους -80 °C. Η κυτταρική τοξικότητα της αλκοόλης πατσουλί σε κύτταρα MDCK αξιολογήθηκε με τη μέθοδο MTT. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μια πλάκα μικροτιτλοδότησης απουσία ή παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων (20 μΜ -0,0098 μΜ) αλκοόλης πατσουλί (οκτώ αντίγραφα) και επωάστηκαν στους 37°C σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2 για 72 ώρες. Τα υπερκείμενα απορρίφθηκαν, πλύθηκαν με PBS δύο φορές και αντιδραστήριο ΜΤΤ (5 mg/mL σε PBS) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Μετά από επώαση στους 37 °C για 4 ώρες, τα υπερκείμενα αφαιρέθηκαν, στη συνέχεια προστέθηκαν 200 μL DMSO και επωάστηκαν στους 37 °C για άλλα 30 λεπτά. Μετά από αυτό οι πλάκες διαβάστηκαν σε συσκευή ανάγνωσης ELISA (Thermo Molecular Devices Co., Union City, USA) στα 570/630 nm. Η μέση OD των φρεατίων ελέγχου κυττάρου αποδόθηκε μια τιμή 100%. Η μέγιστη μη τοξική συγκέντρωση (TD0) και η 50% κυτταροτοξική συγκέντρωση (CC50) υπολογίστηκαν με ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης των καμπυλών δόσης-απόκρισης που δημιουργήθηκαν από τα δεδομένα. Η αναστολή της αναπαραγωγής του ιού μετρήθηκε με τη μέθοδο ΜΤΤ. Η σειριακή αραίωση του επεξεργασμένου ιού προσροφήθηκε στα κύτταρα για 1 ώρα στους 37 °C. Το υπολειπόμενο εμβόλιο απομακρύνθηκε και τα μολυσμένα κύτταρα προστέθηκαν με ΕΜΕΜ που περιείχε 2% FCS. Κάθε δοκιμασία πραγματοποιήθηκε σε οκτώ επαναλήψεις. Μετά από επώαση για 72 ώρες στους 37°C, οι καλλιέργειες μετρήθηκαν με τη μέθοδο ΜΤΤ όπως περιγράφεται παραπάνω. Η συγκέντρωση της αλκοόλης πατσουλί και της οσελταμιβίρης που ανέστειλε τους αριθμούς του ιού κατά 50% (IC 50) προσδιορίστηκε από τις καμπύλες δόσης-απόκρισης. Τα κύτταρα και οι ιοί επωάστηκαν με αλκοόλη πατσουλί σε διαφορετικά στάδια κατά τη διάρκεια του κύκλου ιογενούς μόλυνσης προκειμένου να προσδιοριστεί ο τρόπος αντιιικής δράση. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με αλκοόλη πατσουλί πριν από την ιογενή μόλυνση, οι ιοί επωάστηκαν με αλκοόλη πατσουλί πριν από τη μόλυνση και κύτταρα και ιοί επωάστηκαν μαζί με αλκοόλη πατσουλί κατά τη διάρκεια της προσρόφησης ή μετά τη διείσδυση του ιού στα κύτταρα-ξενιστές. Η αλκοόλη πατσουλί χρησιμοποιήθηκε πάντα σε μη τοξική συγκέντρωση. Οι μονοστοιβάδες κυττάρων υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με αλκοόλη πατσουλί πριν από τον εμβολιασμό με ιό με προσθήκη αλκοόλης πατσουλί στο μέσο καλλιέργειας και επώαση για 1 ώρα στους 37 °C. Η ένωση αναρροφήθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν αμέσως πριν προστεθεί το εμβόλιο γρίπης Α (Η2Ν2). Για τον ιό της προεπεξεργασίας, το Influenza A (H2N2) επωάστηκε σε μέσο που περιείχε αλκοόλη πατσουλί για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου πριν από τη μόλυνση των κυττάρων MDCK. Για την ανάλυση της αναστολής κατά της γρίπης Α (H2N2) κατά τη διάρκεια της περιόδου προσρόφησης, η ίδια ποσότητα γρίπης Α (H2N2) αναμίχθηκε με το φάρμακο και προστέθηκε αμέσως στα κύτταρα. Μετά από 1 ώρα προσρόφησης στους 37 °C, το εμβόλιο απομακρύνθηκε και DMEM συμπληρωμένο με 2 % FCS προστέθηκε στα κύτταρα. Η επίδραση της αλκοόλης πατσουλί έναντι της γρίπης Α (H2N2) δοκιμάστηκε επίσης κατά τη διάρκεια της περιόδου αναδιπλασιασμού προσθέτοντάς το μετά την προσρόφηση, όπως συμβαίνει συνήθως σε μελέτες ευαισθησίας κατά της γρίπης Α (H2N2). Κάθε δοκιμασία εκτελέστηκε σε οκτώ αντίγραφα. Ποντίκια Kunming, βάρους 18-22 g (ηλικίας 6 εβδομάδων) αγοράστηκαν από το Harbin Veterinary Research Institute Animal Co., Ltd. (Harbin, Heilongjiang, Κίνα). Πρώτον, η τοξικότητα της αλκοόλης πατσουλί και της οσελταμιβίρης αξιολογήθηκε στα υγιή ποντίκια με την απώλεια σωματικού βάρους σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (2% DMSO σε φυσιολογικό ορό). Στα ποντίκια χορηγήθηκε από το στόμα 10 mg/kg/δόση αλκοόλη πατσουλί, 2 mg/kg/δόση αλκοόλης πατσουλί ή 2 mg/kg/δόση οσελταμιβίρης (διαλυμένη σε 2% DMSO σε φυσιολογικό ορό) μία φορά την ημέρα για 7 ημέρες. Το βάρος των ποντικών προσδιοριζόταν καθημερινά. Διεξάγαμε διαδικασίες σύμφωνα με την Αρχή της Εργαστηριακής Φροντίδας των Ζώων (NiH Publication No. 85 -23, αναθεωρημένο 1985) και τις κατευθυντήριες γραμμές της Επιτροπής Ερευνών Ζώων του Πανεπιστημίου του Πεκίνου. Ποντίκια Kunming αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνιο και εκτέθηκαν στον ιό (A/Leningrad/134/17/1957) με ενδορινική ενστάλαξη. Τα φάρμακα παρασκευάστηκαν σε 2% DMSO σε φυσιολογικό ορό και χορηγήθηκαν 4 ώρες πριν από την έκθεση στον ιό και συνεχίστηκαν καθημερινά για 5 ημέρες. Όλα τα ποντίκια παρακολουθούνταν καθημερινά για αλλαγές στο βάρος και για τυχόν θανάτους. Οι παράμετροι για την αξιολόγηση της αντιϊκής δραστηριότητας περιελάμβαναν απώλεια βάρους, μείωση της θνησιμότητας και/ή αύξηση της μέσης ημέρας μέχρι θανάτου (MDD) που προσδιορίστηκε σε 15 ημέρες. Η κρυσταλλική δομή νευραμινιδάσης υποτύπου N2 (κωδικός PDB 1IVD) ελήφθη από τα δεδομένα πρωτεΐνης RCSB Τράπεζα [34] . Για λόγους ευκολίας, η δομή ονομάζεται εφεξής NA. Η γεωμετρία και τα μερικά ατομικά φορτία της αλκοόλης πατσουλί (Εικόνα 1) υπολογίστηκαν με τη μονάδα Discover 3.0 (Insight II 2005) [35] εφαρμόζοντας τον αλγόριθμο BFGS [36] και το πεδίο δύναμης συνεπούς σθένους (CVFF), με κριτήριο σύγκλισης 0,01 kcal mol −1 Å −1 . Οι προσομοιώσεις σύνδεσης και μοριακής δυναμικής (MD) πραγματοποιήθηκαν από τα γενικά πρωτόκολλα στα πακέτα λογισμικού Insight II 2005, σύμφωνα με τις προηγούμενες βιβλιογραφίες [24, 26, 28, 35, [37] [38] [39] . Κατά τη διάρκεια των προσομοιώσεων MD, το κανονικό σύνολο (NVT) χρησιμοποιήθηκε σε κανονική θερμοκρασία (300 K). Η θερμοκρασία MD ελεγχόταν από τον θερμοστάτη κλιμάκωσης της ταχύτητας [40] . Οι ενοποιήσεις των κλασικών εξισώσεων κίνησης επιτεύχθηκαν με τον αλγόριθμο Verlet. Τα συστήματα διαλύθηκαν σε μια μεγάλη σφαίρα μορίων νερού TIP3P [40] με ακτίνα 35,0 Å, η οποία είναι αρκετή για να συγκρατήσει τα σύνολα [40] . Οι τροχιές MD δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα χρονικό βήμα 1,0-fs για συνολικά 20,0 ns, που αποθηκεύτηκαν σε διαστήματα 5,0-ps. Οι ενέργειες αλληλεπίδρασης της αλκοόλης πατσουλί με το ΝΑ και τα αντίστοιχα υπολείμματα στην ενεργό θέση NA υπολογίστηκαν από τη μονάδα Docking [35], στις τροχιές MD 0,5~20,0 ns. Όλα τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσες τιμές ± τυπικές αποκλίσεις (SDs) n = 3). Η σημασία της διαφοράς υπολογίστηκε με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης και οι τιμές p < 0,001 θεωρήθηκαν σημαντικές. Συμπερασματικά, η αλκοόλη πατσουλί έχει δράση κατά του ιού της γρίπης Α (H2N2) μέσω παρεμβολής στη λειτουργία ΝΑ που διασπά το α -γλυκοσιδικός δεσμός μεταξύ σιαλικού οξέος και γλυκοσυζυγούς. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν τις ελπιδοφόρες πληροφορίες για την πιθανή χρήση αλκοόλης πατσουλί στη θεραπεία της μολυσματικής νόσου από τον ιό της γρίπης Α (H2N2). Απαιτούνται περαιτέρω μηχανιστικές μελέτες σχετικά με τη δράση κατά του ιού της γρίπης Α για να υποστηριχθεί αυτή η άποψη.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 2799, "text": "αναστολέας ΝΑ" } ], "id": 4073, "question": "Τι είναι το Tamiflu;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5177, "text": "CC 50" } ], "id": 4074, "question": "Ποιο ήταν το τεστ για το επίπεδο κυτταροτοξικότητας που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Ισοθερμική ενίσχυση με χρήση χημικής συσκευής θέρμανσης για ανίχνευση σημείου φροντίδας του HIV-1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3285652/SHA: ef7110a9022bac2e50c995b0f8A1826; Rudolph, Donna L.; Nejad, Irene; Singleton, Jered; Beddoe, Andy; Weigl, Bernhard; LaBarre, Paul; Owen, S. MicheleΗμερομηνία: 2012-02-23DOI: 10.1371/journal.pone.0031432 Άδεια χρήσης: cc0Abstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Μέχρι σήμερα, η χρήση των παραδοσιακών δοκιμών ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων (NAAT) για την ανίχνευση του HIV-1 έχει περιοριστεί στο DNA ή στο RNA σε εργαστηριακές ρυθμίσεις λόγω απαιτήσεων χρόνου, εξοπλισμού και τεχνικής εμπειρογνωμοσύνης. Η διαθεσιμότητα ενός γρήγορου NAAT με δυνατότητα εφαρμογής για ρυθμίσεις περιορισμένου πόρων ή σημείου φροντίδας (POC) θα κάλυπτε μια μεγάλη ανάγκη στη διάγνωση του HIV, επιτρέποντας την έγκαιρη διάγνωση ή επιβεβαίωση της κατάστασης μόλυνσης, καθώς και τη διευκόλυνση της διάγνωσης οξείας λοίμωξης , έλεγχος και αξιολόγηση βρεφών που γεννήθηκαν από μητέρες μολυσμένες με HIV. Οι μέθοδοι ισοθερμικής ενίσχυσης, όπως η αντίστροφη μεταγραφή, η ισοθερμική ενίσχυση με τη μεσολάβηση βρόχου (RT-LAMP), παρουσιάζουν χαρακτηριστικά που είναι ιδανικά για ρυθμίσεις POC, καθώς είναι συνήθως πιο γρήγορες, ευκολότερες στην εκτέλεση και επιτρέπουν την ενσωμάτωση σε φορητές συσκευές χαμηλής τεχνολογίας. συσκευές θέρμανσης. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ/ΣΗΜΑΝΤΙΚΑ ΕΥΡΗΜΑΤΑ: Σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήσαμε τον προσδιορισμό HIV-1 RT-LAMP χρησιμοποιώντας φορητές συσκευές θέρμανσης με ενίσχυση νουκλεϊκού οξέος χωρίς όργανα (NINA) που παράγουν θερμότητα από την εξώθερμη αντίδραση οξειδίου του ασβεστίου και νερού. Οι συσκευές θέρμανσης NINA εμφάνισαν σταθερές θερμοκρασίες σε όλη την αντίδραση ενίσχυσης και σταθερά αποτελέσματα ενίσχυσης μεταξύ τριών ξεχωριστών συσκευών και ενός θερμικού κυκλοποιητή. Η απόδοση των θερμαντήρων NINA επικυρώθηκε χρησιμοποιώντας δείγματα ολικού αίματος από ασθενείς μολυσμένους με HIV-1. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Η μέθοδος ισοθερμικής ενίσχυσης RT-LAMP που χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με μια χημική συσκευή θέρμανσης παρέχει μια φορητή, γρήγορη και στιβαρή πλατφόρμα NAAT που έχει τη δυνατότητα να διευκολύνει τον έλεγχο HIV-1 σε ρυθμίσεις περιορισμένων πόρων και POC.Κείμενο: HIV-1 diagnostic Οι δοκιμές διατηρούνται σε υψηλό επίπεδο απόδοσης, καθώς η διάγνωση έχει άμεσο αντίκτυπο στη φροντίδα του ασθενούς και στη μείωση της μετάδοσης. Παρά τις τεχνολογικές προόδους στον τομέα της διάγνωσης του HIV και την υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα που σχετίζεται με τα περισσότερα διαγνωστικά τεστ HIV που είναι διαθέσιμα επί του παρόντος, εκτιμάται ότι περίπου το 20% των ατόμων με HIV λοίμωξη που ζουν στις Ηνωμένες Πολιτείες παραμένουν αδιάγνωστα [1] . Επιπλέον, οι τοποθεσίες δοκιμών έχουν αναφέρει ότι το 35 έως 50% των ατόμων με ένα αρχικό θετικό αποτέλεσμα δοκιμής δεν θα επιστρέψουν για επιβεβαιωτική διάγνωση εάν απαιτηθεί εργαστηριακός έλεγχος παρακολούθησης [2] . Ταχείες δοκιμές με βάση τα αντισώματα HIV, οι οποίες μπορούν να πραγματοποιηθούν με ελάχιστη εκπαίδευση και συνήθως παρέχουν αποτελέσματα σε λιγότερο από 30 λεπτά [3] , διευκόλυναν τον έλεγχο HIV στο σημείο θεραπείας και στη συνέχεια αύξησαν τον αριθμό των ατόμων που γνωρίζουν την οροκατάστασή τους [4] . Οι γρήγορες δοκιμές αποτελούν επί του παρόντος βασικό συστατικό του προσυμπτωματικού ελέγχου HIV στο σημείο φροντίδας (POC), επεκτείνοντας σημαντικά τις διαγνωστικές δυνατότητες των τοποθεσιών δοκιμών στις ανεπτυγμένες χώρες, καθώς και ρυθμίσεις περιορισμένων πόρων. Παρά την πρόοδο που σημειώθηκε από την ευρεία διαθεσιμότητα γρήγορες δοκιμές, όλες οι δοκιμές που βασίζονται σε αντισώματα για την ανίχνευση του HIV παρουσιάζουν ορισμένους περιορισμούς. Το ειδικό για τον HIV αντίσωμα συνήθως αρχίζει να εμφανίζεται περίπου τρεις εβδομάδες μετά τη μόλυνση, επιτρέποντας την ανίχνευση από τις περισσότερες αναλύσεις που βασίζονται σε αντισώματα εντός 3-6 εβδομάδων [3, 5]. Το χρονικό διάστημα πριν ή κατά τη διάρκεια της πρώιμης ορομετατροπής μπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα των εξετάσεων σε πρόσφατα μολυσμένα άτομα. Επιπλέον, η ακριβής διάγνωση των βρεφών που γεννιούνται από μητέρες μολυσμένες με HIV μπορεί να είναι προκλητική εάν βασίζεται αποκλειστικά στη θετικότητα των αντισωμάτων, καθώς τα κάθετα μεταφερόμενα μητρικά αντισώματα μπορεί να επιμείνουν για 12-18 μήνες μετά τη γέννηση [6, 7]. Για την επιβεβαιωτική διάγνωση της πρώιμης λοίμωξης HIV ή της βρεφικής διάγνωσης, προτιμώνται οι δοκιμές ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος (NAAT), καθώς το RNA HIV-1 μπορεί να ανιχνευθεί ήδη 10-12 ημέρες μετά τη μόλυνση και το DNA ή/και το RNA HIV-1 είναι οριστικοί δείκτες. ενεργού μόλυνσης [5] . Στην τρέχουσα μορφή τους, ωστόσο, τα NAAT δεν είναι εφικτά για δοκιμές POC, επειδή είναι χρονοβόρα, ακριβά και τεχνικά περίπλοκα. Μέχρι σήμερα, ο προσδιορισμός RNA του Aptima HIV-1 (Gen-Probe, Inc., http://www.fda.gov/ BiologicsBloodVaccines/BloodBloodProducts/ApprovedProducts/ LicensedProductsBLAs/BloodDonorScreening/InfectiousDisease/UCM080 είναι πιστοποιημένος μόνο με το FDA6-provaNA). η διάγνωση ή η επιβεβαίωση της λοίμωξης HIV-1 και είναι κατάλληλο μόνο για εργαστηριακές εξετάσεις. Για την κάλυψη των αναγκών της διάγνωσης του HIV-1 στο POC, ένα γρήγορο NAAT που μπορεί να πραγματοποιηθεί με ελάχιστη εκπαίδευση, περιορισμένο εξοπλισμό και σχετικά σύντομη ολοκλήρωση ο χρόνος (,1 ώρα) είναι επιθυμητός [8] . Η ανάπτυξη ενός γρήγορου NAAT έχει αποδειχθεί ιδιαίτερα προκλητική, καθώς η τεχνολογία που εμπλέκεται στην απλοποίηση της διαδικασίας δοκιμής συχνά ισοδυναμεί με αυξημένο κόστος εξοπλισμού και υλικών [8] . Επιπλέον, η μείωση της τεχνικής πολυπλοκότητας δεν θα πρέπει να θέτει σε κίνδυνο την ευαισθησία και την ειδικότητα της δοκιμής. Για αυξημένη δυνατότητα εφαρμογής στο POC, έχει αναπτυχθεί ένας αυξανόμενος αριθμός νέων τεχνικών ισοθερμικής ενίσχυσης [9] . Η ισοθερμική ενίσχυση είναι μια ελκυστική εναλλακτική λύση στην παραδοσιακή PCR ή την RT-PCR, καθώς δεν απαιτείται θερμική ανακύκλωση, επιτρέποντας μεγαλύτερη ευελιξία όσον αφορά τις συσκευές θέρμανσης ή ενίσχυσης. Μια τέτοια μέθοδος ενίσχυσης, που ονομάζεται Ισοθερμική Ενίσχυση με Διαμεσολάβηση Βρόχου (LAMP) [10] , έχει βελτιστοποιηθεί για την ανίχνευση DNA και/ή RNA (RT-LAMP) από ένα ευρύ φάσμα βακτηριακών και ιικών παθογόνων [11, 12, 13. , 14, 15, 16, 17, 18, 19], συμπεριλαμβανομένου του HIV [20, 21]. Το LAMP ή το RT-LAMP εμφανίζει αρκετά χαρακτηριστικά που είναι ιδανικά για ενσωμάτωση σε μια ταχεία διαγνωστική δοκιμή με βάση νουκλεϊκό οξύ. Η αντίδραση ενίσχυσης απαιτεί έξι εκκινητές ειδικούς για οκτώ ξεχωριστές περιοχές εντός της αλληλουχίας στόχου, συμβάλλοντας στην υψηλή ειδικότητα της μεθόδου ενίσχυσης. Το ενισχυμένο υλικό μπορεί τυπικά να ανιχνευθεί μέσα σε 15-60 λεπτά όταν επωάζεται σε σταθερή θερμοκρασία αντίδρασης 60-65uC [22] . Το LAMP έχει επίσης αποδειχθεί λιγότερο ευαίσθητο σε βιολογικούς αναστολείς από την PCR [23, 24], η οποία επιτρέπει την άμεση ενίσχυση από κλινικά δείγματα, εξαλείφοντας έτσι την ανάγκη για ένα επιπλέον στάδιο εκχύλισης νουκλεϊκού οξέος. Άμεση ενίσχυση από το πλάσμα, το πλήρες αίμα και το στοματικό υγρό έχει προηγουμένως αποδειχθεί για τον HIV-1 [20, 21, 25]. Τέλος, η άμεση οπτική ανίχνευση των ενισχυμένων προϊόντων διευκολύνεται από τη μεγάλη ποσότητα DNA που παράγεται από κάθε αντίδραση. Αρκετές ομάδες έχουν ενσωματώσει μεθόδους ανίχνευσης φθορισμού στην ανάλυση LAMP για ανίχνευση σε πραγματικό χρόνο ή άμεση με γυμνό μάτι [15, 17, 21, 22, 26] . Η απλότητα και η ισοθερμική φύση της διαδικασίας LAMP ανοίγει την πόρτα για την αξιολόγηση των χαμηλών -ενσωματωμένες συσκευές τεχνολογίας ή νέα στοιχεία θέρμανσης, που είναι κατάλληλα για ρυθμίσεις χαμηλών πόρων, όπου δεν μπορεί να αποκτηθεί δαπανηρός εξοπλισμός και ηλεκτρική ενέργεια. Σε αυτή τη μελέτη, ο προσδιορισμός HIV-1 RT-LAMP αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας φορητές συσκευές ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος χωρίς όργανα (NINA) που παράγουν θερμότητα από την εξώθερμη αντίδραση οξειδίου του ασβεστίου και νερού [27, 28] . Δείξαμε τη σταθερότητα θερμοκρασίας των συσκευών θέρμανσης NINA και τη σκοπιμότητα για δοκιμές POC δειγμάτων ολικού αίματος από άτομα μολυσμένα με HIV-1. Οι πρωτότυποι θερμαντήρες NINA σχεδιάστηκαν και παρέχονται από το Πρόγραμμα για την Κατάλληλη Τεχνολογία στην Υγεία (PATH, Seattle, WA), όπως περιγράφεται [27, 28]. Εν συντομία, μια θερμοκρασία ενίσχυσης περίπου 60uC δόθηκε από την εξώθερμη αντίδραση του οξειδίου του ασβεστίου (CaO; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) και νερό. Οι συσκευές θέρμανσης, που περιέχουν τη χημική αντίδραση, σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας θερμικά μονωμένα, ανοξείδωτα δοχεία με πλαστικά βιδωτά καπάκια (Εικ. 1) . Τα καπάκια τροποποιήθηκαν ώστε να περιέχουν τρία φρεάτια δείγματος που ταιριάζουν σε τυπικούς σωλήνες PCR 200 ml και γεμίστηκαν με ένα αποκλειστικό υλικό αλλαγής φάσης (PCM) που χρησιμοποιήθηκε για να ρυθμίσει τη θερμότητα που προέρχεται από την εξώθερμη αντίδραση, παρέχοντας έτσι μια σταθερή θερμοκρασία. Τέλος, τα πλαστικά καπάκια που περιέχουν μόνωση αφρού σχεδιάστηκαν για να εφαρμόζουν στο επάνω μέρος των καπακιών του δοχείου. Τα θερμικά προφίλ των φρεατίων δείγματος μετρήθηκαν και καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας ψηφιακό θερμόμετρο (DaqPRO 5300 Data recorder; OMEGA Engineering, Inc., Stamford, CT). Παρασκευάστηκαν πάνελ γραμμικότητας DNA και RNA για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας της ειδικής για τον HIV προσδιορισμό RT-LAMP. Ένα πάνελ DNA δημιουργήθηκε από DNA που εξήχθη από την ανθρώπινη μονοκυτταρική κυτταρική σειρά OM-10.1 [29] , χρησιμοποιώντας ένα μίνι κιτ αίματος QIAamp DNA (QIAGEN, Valencia, CA). Ο αριθμός κυττάρων χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό του αριθμού αντιγράφου του DNA εισόδου, καθώς σε κάθε κύτταρο περιέχεται ένας μόνο ολοκληρωμένος προϊός [29] . Το εξαγόμενο DNA αραιώθηκε δεκαπλάσια σε νερό χωρίς RNase για να δημιουργηθεί ένα πλαίσιο γραμμικότητας, που κυμαίνεται από 105 αντίγραφα/ml έως 103 αντίγραφα/ml. Ένα πάνελ γραμμικότητας RNA ελήφθη στο εμπόριο (PRD801; SeraCare Life Sciences, Milford, MA) και κυμαινόταν από 2,9610 6 αντίγραφα/ml έως 8 αντίγραφα/ml, όπως προσδιορίστηκε από τη Roche AMPLICOR HIV MONITOR TM v 1,5, Bayer VERSANT HIV-1 RNA bDNA 3,0 Assay, bioMerieuxH NucliS QT και Abbott Real Time HIV-1 m2000 TM . Το RNA εξήχθη από τα μέλη του πάνελ χρησιμοποιώντας ένα κιτ Viral RNA mini (QIAGEN). Οι αρνητικοί μάρτυρες περιελάμβαναν DNA που εξήχθη από PBMC μολυσμένο με HIV-2 SLRHC [30] και RNA που εξήχθη από καθαρισμένο ιό HIV-2 NIH-Z (Advanced Biotechnologies Inc., Columbia, MD). Ολόκληρο αίμα από άτομα μολυσμένα με HIV-1 συλλέχθηκε ως μέρος μιας ξεχωριστής, εγκεκριμένης από το IRB μελέτης [31] , ή λαμβάνεται εμπορικά (SeraCare Life Sciences). Όλα τα οροθετικά δείγματα επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα τεστ: Genetic Systems HIV-1/HIV-2 plus O EIA (Bio-Rad Laboratories, Redmond, WA), GS HIV-1 Western blot (Bio-Rad Laboratories), Aptima HIV -1 Δοκιμασία RNA (Gen-Probe, Inc., San Diego, CA), και ανάλυση DNA του Amplicor HIV-1 (Roche Diagnostics, Branchburg, NJ). Τα ιικά και προϊικά φορτία είναι άγνωστα, καθώς τα δείγματα δοκιμάστηκαν με ποιοτικές αναλύσεις βασισμένες σε νουκλεϊκό οξύ. Όλα τα κλινικά δείγματα που αξιολογήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν από άτομα μολυσμένα με τον ιό HIV-1 υποτύπου Β. Ως αρνητικός μάρτυρας, οροαρνητικά δείγματα αίματος HIV-1 (SeraCare Life Sciences) συμπεριλήφθηκαν σε κάθε πείραμα που αφορούσε πλήρες αίμα. Ένας θετικός έλεγχος περιελάμβανε οροαρνητικό αίμα HIV-1 με 5610 6 σωματίδια ιού/ml HIV-1 BaL (Advanced Biotechnologies Inc.). Οι εκκινητές RT-LAMP ειδικοί για τον HIV-1 σχεδιάστηκαν για να αναγνωρίζουν μια διατηρημένη αλληλουχία εντός της αντίστροφης μεταγραφάσης ( RT) γονίδιο. Οι έξι εκκινητές που απαιτούνται για την αντίδραση RT-LAMP, εμπρός εξωτερικό (F3), προς τα πίσω εξωτερικό (B3), εμπρός εσωτερικό (FIP), προς τα πίσω εσωτερικό (BIP) και οι εκκινητές βρόχου (LoopF ​​και LoopB), σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το PrimerExplorer Λογισμικό V4 (Eiken Chemical Co. Ltd.; http:// primerexplorer.jp/e/). Οι εκκινητές LAMP και ο κύκλος ενίσχυσης έχουν περιγραφεί λεπτομερώς από τους Nagamine et al. [32] . Οι πρόσθετες τροποποιήσεις περιελάμβαναν μια συνδετική αλληλουχία τεσσάρων θυμιδινών που εισήχθη μεταξύ των αλληλουχιών F2 και F1c του εκκινητή FIP, όπως περιγράφεται [20], και την προσθήκη του φθορίζοντος μορίου HEX στο άκρο 59 του εκκινητή LoopF. Ο επισημασμένος εκκινητής, μαζί με έναν ανιχνευτή απόσβεσης, επέτρεψαν την άμεση οπτική ανίχνευση ενισχυμένων προϊόντων [21] . Ο ανιχνευτής σβέσης αποτελούνταν από τη συμπληρωματική αλληλουχία του εκκινητή LoopF ​​με την προσθήκη Black Hole Quencher-1 (BHQ-1) στο άκρο 39. Η αλληλουχία HIV-1 HXB2 (Αριθμός πρόσβασης GenBank AF033819) χρησιμοποιήθηκε ως η αναφορά για τη δημιουργία των εκκινητών RT-LAMP. Οι αλληλουχίες των HIV-1 RT-ειδικών εκκινητών και του αποσβεστήρα παρατίθενται στον Πίνακα 1. Η αντίδραση RT-LAMP διεξήχθη χρησιμοποιώντας το ακόλουθο μείγμα αντίδρασης: 0,2 mM (τελική συγκέντρωση) από κάθε εκκινητή F3 και B3, 1,6 mM από κάθε FIP και BIP εκκινητές, 0,8 mM από κάθε LoopF ​​και HEX-LoopB εκκινητές, 0,8 Μ βεταΐνη (Sigma-Aldrich), 10 mM MgSO4, 1,4 mM dNTPs, 16 ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης ThermoPol (New England Biolabs, Ipswich, Bst), DNA πολυμεράση (New England Biolabs) και 2 U AMV ανάστροφη μεταγραφάση (Invitrogen, Carlsbad, CA). Η αντίδραση διεξήχθη σε συνολικό όγκο 25 ml για ενίσχυση του εκχυλισμένου νουκλεϊκού οξέος, 10 ml του οποίου αποτελούσαν το δείγμα. Για την ενίσχυση δειγμάτων πλήρους αίματος, χρησιμοποιήθηκε όγκος αντίδρασης 100 ml για τη διευκόλυνση της οπτικής ανίχνευσης των ενισχυμένων προϊόντων. Ολόκληρο αίμα προστέθηκε απευθείας στην αντίδραση σε συνολικό όγκο 40 ml, μετά από αραίωση 1:4 με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης ερυθρών αιμοσφαιρίων (2,5 mM KHCO 3, 37,5 mM NH 4 Cl, και 0,025 mM EDTA), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ 21] . Το μίγμα της αντίδρασης επωάστηκε στους 60uC για 60 λεπτά, χρησιμοποιώντας ένα GeneAmpH PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) ή τους θερμαντήρες NINA. Για αντιδράσεις που ενισχύθηκαν στον θερμοκυκλοποιητή, προστέθηκε ένα επιπλέον στάδιο θέρμανσης δύο λεπτών 80 uC στο τέλος του κύκλου ενίσχυσης για να τερματιστεί η αντίδραση. 1 αναλογία σβηστήρα προς επισημασμένο εκκινητή, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21] . Η ενίσχυση προσδιορίστηκε οπτικά με παρατήρηση φθορισμού στους σωλήνες αντίδρασης, χρησιμοποιώντας τη λάμπα UV από ένα σύστημα ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Η ενίσχυση επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιώντας ένα πήκτωμα αγαρόζης 1,2% που περιέχει χρώση γέλης SYBRH Safe (Invitrogen), το οποίο στη συνέχεια οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα ChemiDoc XRS. Για να συγκριθεί η θερμοκρασία και η συνέπεια ενίσχυσης, δοκιμάστηκαν τρεις θερμαντήρες NINA παράλληλα. Η αντίδραση θέρμανσης ξεκίνησε με την προσθήκη 18 g CaO σε κάθε δοχείο NINA, ακολουθούμενο από 6 ml νερού. Το καπάκι κάθε δοχείου σφραγίστηκε στη συνέχεια για να περιέχει την εξώθερμη αντίδραση. Μετά την προσθήκη 200 ml νερού σε κάθε φρεάτιο δείγματος, ξεκίνησε η καταγραφή της θερμοκρασίας. Σωλήνες αντίδρασης προστέθηκαν στα φρεάτια δείγματος μόλις έκαστος θάλαμος αντίδρασης έφθασε σε θερμοκρασία 58,5 uC. Για όλα τα δείγματα που επωάστηκαν στον θερμαντήρα NINA, προστέθηκαν 15 ml ορυκτέλαιου στον σωλήνα αντίδρασης κατά την προετοιμασία του μίγματος αντίδρασης. Τα δείγματα επωάστηκαν στους θερμαντήρες για συνολικά 60 λεπτά. Όλες οι αντιδράσεις διεξήχθησαν σε εργαστήριο ελεγχόμενης θερμοκρασίας με θερμοκρασία περιβάλλοντος 28uC, εκτός εάν δηλώνεται διαφορετικά. Μετά την αντίδραση ενίσχυσης, τα δείγματα επωάστηκαν για δύο λεπτά σε θερμικό μπλοκ ρυθμισμένο στους 80uC. Μετά από κάθε κύκλο ενίσχυσης, το προφίλ θερμοκρασίας κάθε συσκευής αναλύθηκε με τον υπολογισμό της μέσης θερμοκρασίας, της τυπικής απόκλισης, της μέσης, της ελάχιστης και της μέγιστης από τα δεδομένα που παρέχονται από το DaqPRO 5300. Η σταθερότητα των θερμαντήρων NINA σε εξαιρετικά χαμηλές και υψηλές θερμοκρασίες ήταν αξιολογείται τοποθετώντας τα δοχεία σε ψυγείο που έχει ρυθμιστεί στους 4uC ή σε επωαστήρα 37uC κατά τη διάρκεια της αντίδρασης ενίσχυσης. Τα προφίλ θερμοκρασίας καταγράφηκαν και συγκρίθηκαν με εκείνα των αντιδράσεων που συνέβησαν σε θερμοκρασία δωματίου εργαστηρίου 28uC. Για να προσδιοριστεί η ευαισθησία της αντίδρασης RT-LAMP χρησιμοποιώντας RT-ειδικούς εκκινητές, εξετάστηκαν πάνελ γραμμικότητας DNA και RNA σε θερμοκυκλωτή. Το όριο ανίχνευσης για το DNA του HIV-1 ήταν 10 αντίγραφα/αντίδραση. Για τον πίνακα γραμμικότητας RNA, το δείγμα που περιείχε 1700 αντίγραφα/αντίδραση ανιχνεύθηκε και στα τρία αντίγραφα, ενώ το δείγμα που περιείχε 140 αντίγραφα/αντίδραση ανιχνεύθηκε σε τρία από τα πέντε αντίγραφα (60%). Και για τα πάνελ γραμμικότητας DNA και RNA, επιλέχθηκαν τα δύο δείγματα που είναι πλησιέστερα στο όριο ανίχνευσης για να αξιολογηθεί περαιτέρω η συνοχή απόδοσης μεταξύ του θερμοκυκλωτή και των θερμαντικών NINA. Όσον αφορά τη θετικότητα, τα αποτελέσματα της ενίσχυσης ήταν συνεπή μεταξύ και των τριών θερμαντήρων και του θερμοκυκλωτή (Πίνακας 2). Δεδομένου ότι η ανάλυση RT-LAMP απαιτεί σταθερή θερμοκρασία 60uC για το μήκος της αντίδρασης ενίσχυσης, τα προφίλ θερμοκρασίας των φρεατίων δείγματος συγκρίθηκαν κατά τη διάρκεια της επώασης και μεταξύ και των τριών θερμαντικών σωμάτων NINA. Ένα αντιπροσωπευτικό προφίλ θερμοκρασίας εμφανίζεται στο Σχήμα 2, που δείχνει μια σταθερή θερμοκρασία αντίδρασης σε ή κοντά στους 60uC για τη διάρκεια της αντίδρασης ενίσχυσης. Κατά τη διάρκεια της επώασης των 60 λεπτών, η μέση θερμοκρασία για κάθε συσκευή ήταν 60,2, 59,8 και 59,7 (Πίνακας 3). Η ελάχιστη θερμοκρασία που επιτεύχθηκε κατά τη διάρκεια της αντίδρασης αντανακλά το γεγονός ότι η θερμοκρασία της θύρας δείγματος έπεσε προσωρινά μετά την προσθήκη των σωλήνων δείγματος στη συσκευή, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2. Η μέγιστη θερμοκρασία των συσκευών απέκλινε από την επιθυμητή θερμοκρασία αντίδρασης των 60uC κατά λιγότερο από έναν βαθμό. Η ικανότητα των θερμαντήρων NINA να διατηρούν σταθερή θερμοκρασία αντίδρασης σε ένα ευρύ φάσμα θερμοκρασιών περιβάλλοντος είναι απαραίτητη για τη δοκιμή POC, είτε αναφέρεται σε αέρα -Κλιματισμένο εργαστήριο ή χώρο πεδίου υψηλής θερμοκρασίας. Για να αξιολογηθεί η απόδοση των θερμαντήρων NINA σε εξαιρετικά χαμηλές ή υψηλές θερμοκρασίες, τα δοχεία τοποθετήθηκαν σε ψυγείο 4uC ή επωαστήρα 37uC για τη διάρκεια της αντίδρασης ενίσχυσης. Το όριο ανίχνευσης για τα πάνελ γραμμικότητας DNA και RNA ήταν παρόμοιο με τα αποτελέσματα που λήφθηκαν στο ελεγχόμενο με θερμοκρασία εργαστήριό μας (28uC; Πίνακας 2). Ο μεγαλύτερος βαθμός μεταβολής της θερμοκρασίας των φρεατίων δείγματος παρατηρήθηκε στη θερμοκρασία περιβάλλοντος των 4uC (Πίνακας 3). Η μέση θερμοκρασία ήταν περίπου δύο βαθμούς χαμηλότερη από την επιθυμητή θερμοκρασία αντίδρασης των 60uC. Επιπλέον, η θερμοκρασία των συσκευών έτεινε να μειώνεται από τη σταθερή τους κατάσταση κατά τα τελευταία 20 λεπτά της αντίδρασης (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Τα προφίλ θερμοκρασίας στη θερμοκρασία περιβάλλοντος των 37uC, ωστόσο, ήταν παρόμοια με εκείνα στους 28uC. Δείγματα ολικού αίματος από άτομα μολυσμένα με HIV-1 προστέθηκαν απευθείας στην αντίδραση RT-LAMP και δοκιμάστηκαν στους θερμαντήρες NINA. Η θετικότητα των κλινικών δειγμάτων ήταν συνεπής μεταξύ του θερμικού ανακυκλωτή και των συσκευών (Πίνακας 4). Η συνέπεια ενίσχυσης ήταν πιο εμφανής σε δύο από τα δείγματα ασθενών (ασθενής #4 και #5) που ήταν θετικά μόνο σε μία από τις τρεις επαναλήψεις, ανεξάρτητα από τη συσκευή θέρμανσης που χρησιμοποιήθηκε. Όλα τα HIVαρνητικά δείγματα αίματος, που περιλαμβάνονται σε κάθε αντίδραση, ήταν αρνητικά (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα που χρησιμοποιεί τους θερμαντήρες NINA παρουσιάζεται στο Σχήμα 3, που δείχνει ανίχνευση από γέλη αγαρόζης και οπτική αναγνώριση του φθορισμού στους σωλήνες αντίδρασης. Σε αυτή τη μελέτη, επιδεικνύουμε την απόδοση φορητών, φθηνών, μη εξοπλισμένων θερμαντήρων νουκλεϊκού οξέος (NINA) για ενίσχυση του HIV-1 χρησιμοποιώντας RT-LAMP. Η αντίδραση ισοθερμικής ενίσχυσης σε συνδυασμό με μια συσκευή που παράγει θερμότητα από μια εξώθερμη χημική αντίδραση, σε αντίθεση με την ηλεκτρική ενέργεια του δικτύου ή την ισχύ μπαταρίας, περιλαμβάνει ένα NAAT σημείου φροντίδας που είναι πρακτικό για χρήση σε ρυθμίσεις περιορισμένων πόρων. Οι συσκευές θέρμανσης απαιτούν ελάχιστη εκπαίδευση και τεχνική εξειδίκευση για να λειτουργήσουν και χρειάζονται περίπου 10-15 λεπτά για να φτάσουν σε θερμοκρασία αντίδρασης 60uC μόλις ξεκινήσει η χημική αντίδραση [27, 28] . Επιπλέον, η θερμοκρασία των φρεατίων δείγματος παραμένει σχετικά σταθερή στην επιθυμητή θερμοκρασία αντίδρασης των 60uC καθ' όλη τη διάρκεια της αντίδρασης ενίσχυσης, όπως αποδεικνύεται από τα προφίλ θέρμανσης και τη συνέπεια στην ενίσχυση μεταξύ των συσκευών και του θερμικού κυκλοποιητή. Δεδομένου ότι η δοκιμή σημείου φροντίδας μπορεί να αναφέρεται στο ένα κλιματιζόμενο εργαστήριο ή ένας χώρος αγρού με υψηλές θερμοκρασίες και υγρασία, η σταθερότητα της θερμοκρασίας που παράγεται από τις συσκευές θέρμανσης πρέπει να είναι αξιόπιστη. Αν και τα προφίλ θερμοκρασίας σε αντιπροσωπευτική ψυχρή θερμοκρασία 4uC έδειξαν απώλεια στη θερμοκρασία αντίδρασης προς το τέλος της επώασης των 60 λεπτών, οι διακυμάνσεις της θερμοκρασίας δεν ήταν αρκετά σημαντικές ώστε να επηρεάσουν την αντίδραση ενίσχυσης. Ανεξάρτητα από αυτό, αυτή η θερμική επίδραση θα μπορούσε να μετριαστεί με μικρές τροποποιήσεις στη συσκευή για τη μείωση της απώλειας θερμότητας σε χαμηλότερες θερμοκρασίες. Θα πρέπει να είναι δυνατό να επεκταθεί το εύρος θερμοκρασίας των θερμαντήρων NINA στους 4uC και κάτω, είτε προσθέτοντας μεγαλύτερη ποσότητα θερμαντικού μείγματος, καλύτερη μόνωση ή και τα δύο. Μεγαλύτερη ανησυχία προκαλεί η απόδοση των θερμαντήρων NINA σε τοποθεσίες πεδίου υψηλής θερμοκρασίας, όπου ο έλεγχος θερμοκρασίας δεν αποτελεί επιλογή. Δεν επιδεικνύουμε διαφορά στη σταθερότητα θερμοκρασίας των θερμαντήρων NINA και στη συνοχή της ενίσχυσης σε θερμοκρασία περιβάλλοντος 37uC σε σύγκριση με τη θερμοκρασία μας- ελεγχόμενο εργαστήριο. Για αυξημένη δυνατότητα χρήσης στο POC, μπορούν να γίνουν αρκετές τροποποιήσεις στους θερμαντήρες NINA. Οι πρωτότυπες συσκευές που αξιολογήθηκαν σε αυτή τη μελέτη περιείχαν μόνο τρία φρεάτια δειγμάτων. Ωστόσο, μπορούν να προστεθούν έως και 16 φρεάτια δείγματος στο καπάκι των μονωμένων δοχείων για μεγαλύτερο όγκο δοκιμής. Σε αυτή τη μελέτη, τα δείγματα αφαιρέθηκαν από τους θερμαντήρες NINA μετά την αντίδραση ενίσχυσης και θερμάνθηκαν για άλλα δύο λεπτά σε θερμικό μπλοκ 80uC για να τερματιστεί η αντίδραση. Ενώ το πρόσθετο βήμα θέρμανσης δεν είναι απαραίτητο για την παρατήρηση των ενισχυμένων προϊόντων από εκχυλισμένο νουκλεϊκό οξύ, η σύντομη επώαση σε υψηλή θερμοκρασία διευκολύνει την οπτική παρατήρηση της φθορίζουσας ετικέτας στα δείγματα πλήρους αίματος. Μπορούν να γίνουν τροποποιήσεις στη μέθοδο προετοιμασίας του δείγματος ολικού αίματος για να εξαλειφθεί η ανάγκη για το βήμα θέρμανσης. Εναλλακτικά, ένα δεύτερο διαμέρισμα μετριασμού της θερμοκρασίας μπορεί να προστεθεί στο εναλλακτικό άκρο των δοχείων NINA, έτσι ώστε τα δείγματα να μπορούν να αφαιρεθούν από το διαμέρισμα ενίσχυσης και να επανατοποθετηθούν στο διαμέρισμα 80uC. Τέλος, ο καταγραφέας δεδομένων DaqPRO χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη μόνο για σκοπούς επικύρωσης και δεν θα ήταν απαραίτητος για το τελικό προϊόν POC. Η σκοπιμότητα χρήσης LAMP ως διαγνωστικής μεθόδου σε περιβάλλον περιορισμένους πόρους έχει αποδειχθεί για τη φυματίωση [33] . Για να μειωθεί ο χρόνος χρήσης και το σφάλμα προετοιμασίας, οι συγγραφείς περιγράφουν τη χρήση σωλήνων αντίδρασης προπαρασκευασμένων με λυοφιλοποιημένο μείγμα αντίδρασης. Για χρήση POC, είναι επιθυμητός περιορισμένος χειρισμός δείγματος και προετοιμασία αντιδραστηρίου και, επομένως, αναμένεται ότι η διαδικασία δοκιμής του τελικού προϊόντος θα περιλαμβάνει την ανασύσταση των αντιδραστηρίων ενίσχυσης σε νερό και την προσθήκη του δείγματος απευθείας στον σωλήνα αντίδρασης. Δείχνουμε τη χρήση των θερμαντήρων NINA για ενίσχυση απευθείας από δείγματα πλήρους αίματος, εξαλείφοντας την ανάγκη για μια χρονοβόρα διαδικασία εκχύλισης νουκλεϊκού οξέος και μειώνοντας τον όγκο του δείγματος που απαιτείται για την αντίδραση ενίσχυσης. Ένας συνολικός όγκος 10 ml πλήρους αίματος προστέθηκε σε κάθε σωλήνα αντίδρασης, ο οποίος μπορεί εύκολα να ληφθεί με ραβδί δακτύλου σε περιβάλλοντα όπου η φλεβοκέντηση δεν είναι εφικτή. Επιπλέον, η μέθοδος ανίχνευσης φθορισμού μας επιτρέπει την άμεση οπτικοποίηση των ενισχυμένων προϊόντων απουσία εξειδικευμένου εξοπλισμού. Για να αποφευχθεί η διασταυρούμενη μόλυνση του ενισχυμένου υλικού, προτιμάται οι σωλήνες αντίδρασης να παραμένουν κλειστοί μετά την ενίσχυση. Οι μελλοντικές τροποποιήσεις θα περιλαμβάνουν τη βελτιστοποίηση των σημασμένων αλληλουχιών εκκινητών/αποσβεστήρα έτσι ώστε όλα τα συστατικά να μπορούν να προστεθούν στο μείγμα αντίδρασης πριν από την ενίσχυση. Λόγω της διαθεσιμότητας, το σύστημα Bio-Rad ChemiDoc χρησιμοποιήθηκε ως πηγή UV σε αυτή τη μελέτη. Ωστόσο, ένα φθηνό φως μπρελόκ θα ήταν πιο κατάλληλο για ανίχνευση με γυμνό μάτι στο POC. Για την ευαίσθητη και ειδική ανίχνευση διαφορετικών απομονώσεων HIV-1, συμπεριλαμβανομένων των μη-Β υποτύπων, η αναγνώριση του βέλτιστου συνόλου/συνόλων εκκινητών είναι ένα βασικό βήμα στην ανάπτυξη της ανάλυσης RT-LAMP. Αν και όλα τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη αφορούσαν πρότυπα και δείγματα υποτύπου Β, η συνεχιζόμενη έρευνα περιλαμβάνει τη συνεχή ανάπτυξη και βελτιστοποίηση εκκινητών RT-LAMP με βάση περιοχές του γονιδιώματος HIV-1 που διατηρούνται μεταξύ διαφορετικών υποτύπων. Οι μελλοντικές μελέτες θα περιλαμβάνουν μεγάλης κλίμακας αξιολόγηση κλινικών δειγμάτων με τη βελτιστοποιημένη ανάλυση RT-LAMP και τη συσκευή NINA. Συνοπτικά, η μέθοδος ισοθερμικής ενίσχυσης RT-LAMP που χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με μια απλοποιημένη, χημική συσκευή θέρμανσης παρουσιάζει χαρακτηριστικά που είναι ιδανικά για μια γρήγορη δοκιμή NAAT για POC. Η απλοποιημένη, φορητή ανάλυση έχει τη δυνατότητα να καλύψει ένα σημαντικό κενό στη διάγνωση του HIV-1, παρέχοντας άμεση γνώση ή επιβεβαίωση της κατάστασης μόλυνσης από τον HIV-1 στο POC.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 7702, "text": "προσδιορισμός HIV-1 RT-LAMP" } ], "id": 4435, "question": "Ποια μέθοδος προσυμπτωματικού ελέγχου αξιολογήθηκε σε αυτή τη μελέτη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 18895, "text": "Δείγματα ολικού αίματος" } ], "id": 4436, "question": "Τι χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της απόδοσης των θερμαντήρων NINA;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2582, "text": "20%" } ], "id": 4437, "question": "Τι ποσοστό των ανθρώπων που έχουν μολυνθεί από τον ιό HIV μένουν απαρατήρητοι στις Ηνωμένες Πολιτείες;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2727, "text": "35 έως 50%" } ], "id": 4438, "question": "Ποιο είναι το ποσοστό των ασθενών που δεν επιστρέφουν για παρακολούθηση μετά το τεστ HIV;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Βακτηριδιακή δράση in vitro των 4- και 5-χλωρο-2-υδροξυ-Ν-[1-οξο-1-(φαινυλαμινο)αλκαν-2-υλ]βενζαμιδίων έναντι MRSAhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pmc/articles/PMC4321674/SHA: f0e6cef57dbae030aea2f324e21e00945ac659cfΣυγγραφείς: Zadrazilova, Iveta; Pospisilova, Sarka; Pauk, Karel; Imramovsky, Ales; Vinsova, Jarmila; Cizek, Alois; Jampilek, Josef Ημερομηνία: 2015-01-15DOI: 10.1155/2015/349534 Άδεια χρήσης: cc-byAbstract: Μια σειρά από εννέα υποκατεστημένα 2-υδροξυ-Ν-[1-οξο-1-(φαινυλαμινο)αλκαν-2-υλικά αξιολογήθηκαν]βενζαιμίδια] ως πιθανοί βακτηριοκτόνοι παράγοντες έναντι τριών κλινικών απομονώσεων του ανθεκτικού στη μεθικιλλίνη Staphylococcus aureus (MRSA) και του S. aureus ATCC 29213 ως στελέχους αναφοράς και ποιοτικού ελέγχου. Η ελάχιστη βακτηριοκτόνος συγκέντρωση προσδιορίστηκε με υποκαλλιέργεια κλασμάτων από τον προσδιορισμό MIC σε πλάκες άγαρ χωρίς ουσία. Η βακτηριοκτόνος κινητική των ενώσεων 5-χλωρο-2-υδροξυ-Ν-[(2S)-3-μεθυλ-1-οξο-1-{[4-(τριφθορομεθυλ)φαινυλ]αμινο}βουταν-2-υλ]βενζαμίδιο (1f ), Ν-{(2S)-1-[(4-βρωμοφαινυλ)αμινο]-3-μεθυλ-1-οξοβουταν-2-υλ}-4-χλωρο-2-υδροξυβενζαμίδιο (1 g) και 4-χλωρο-Ν -{(2S)-1-[(3,4-διχλωροφαινυλ)αμινο]-3-μεθυλ-1-οξοβουταν-2-υλ}-2-υδροξυβενζαμίδιο (1 ώρα) καθιερώθηκε με δοκιμασία θανάτωσης χρόνου με τελική συγκέντρωση η ένωση ίση με 1x, 2x και 4x MIC. κλάσματα αφαιρέθηκαν στα χρονικά σημεία 0, 4, 6, 8 και 24 h. Ο πιο ισχυρός βακτηριοκτόνος παράγοντας ήταν η ένωση 1f που παρουσίαζε αξιοσημείωτη ταχεία βακτηριοκτόνο δράση εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση ακόμη και σε 2x MIC στις 4, 6 και 8 ώρες (με μείωση του αριθμού βακτηρίων που κυμαίνεται από 3,08 έως 3,75 log(10) CFU/mL) και σε 4x MIC στις 4, 6, 8 και 24 ώρες (μείωση 5,30 log(10) CFU/mL στον αριθμό βακτηρίων) μετά από επώαση έναντι του MRSA 63718. Η αξιόπιστη βακτηριοκτόνος δράση έναντι άλλων στελεχών διατηρήθηκε σε 4x MIC στις 24 ώρες. Κείμενο: Η αντοχή στα αντιβιοτικά των διεισδυτικών παθογόνων έχει γίνει ένα από τα πιο προκλητικά και επίμονα προβλήματα υγείας [1] . Ο ανθεκτικός στη μεθικιλλίνη Staphylococcus aureus (MRSA) έχει γίνει το πιο κοινό κλινικά σχετικό πολυανθεκτικό παθογόνο [2] που προκαλεί τόσο λοιμώξεις που σχετίζονται με την υγειονομική περίθαλψη όσο και λοιμώξεις από την κοινότητα με ποσοστά θνησιμότητας έως και 40% [3] . Ο επιπολασμός του MRSA αυξάνεται παγκοσμίως και , σύμφωνα με τις τελευταίες πληροφορίες του Ευρωπαϊκού Κέντρου Πρόληψης και Ελέγχου Νοσημάτων από το 2012 [4] , μπορεί να θεωρηθεί ανησυχητικό σε ορισμένες ευρωπαϊκές χώρες, ιδιαίτερα στην Πορτογαλία και τη Ρουμανία, όπου ≥50% όλων των απομονώσεων S. aureus από διηθητικές λοιμώξεις ήταν αναγνωρίστηκε ως MRSA το 2012 (αν και, π.χ., στη Ρουμανία ο επιπολασμός του MRSA ήταν 25-50% το 2010), ακολουθούμενη από την Ιταλία, την Ελλάδα και την Πολωνία με 25-50% απομονώσεις να είναι MRSA το 2012 (για σύγκριση, στην Πολωνία MRSA απομονώσεις αποτελούσαν το 10-25% από όλα τα απομονωμένα στελέχη S. aureus το 2010). Η αποτυχία της θεραπείας της βανκομυκίνης, του θεραπευτικού αντι-MRSA παράγοντα επιλογής, λόγω των στελεχών με αυξημένες τιμές ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (MIC) βανκομυκίνης (δηλ. τη χαμηλότερη συγκέντρωση ενός αντιμικροβιακού που θα αναστείλει την ορατή ανάπτυξη ενός μικροοργανισμού) εντός του ευπαθούς εύρους περιγράφηκε προηγουμένως [5, 6]. Έτσι, η εμφάνιση του MRSA (και του ανθεκτικού στη βανκομυκίνη S. aureus επίσης τα τελευταία χρόνια [7] ) καθιστά προτεραιότητα την ανακάλυψη νέων μοριακών ικριωμάτων και η τρέχουσα κατάσταση απαιτεί ακόμη και τον ανασχεδιασμό και την επανατοποθέτηση ορισμένων παλαιών οικογενειών φαρμάκων. επιτύχουν επαρκή έλεγχο αυτών των βακτηρίων [8] . Ωστόσο, για τη θεραπεία των λοιμώξεων της κυκλοφορίας του αίματος S. aureus, οι βακτηριοκτόνες αντιμικροβιακές ουσίες θεωρούνται ανώτερες από τα βακτηριοστατικά φάρμακα [9] . Αυτό το γεγονός θα πρέπει να ληφθεί υπόψη κατά την ανάπτυξη αποτελεσματικών και ασφαλών επιλογών θεραπείας για τις λοιμώξεις από MRSA. Το ιστορικό της κλινικής χρήσης των σαλικυλανιλιδίων (2-υδροξυ-Ν-φαινυλοβενζαμίδια) χρονολογείται από τη δεκαετία του 1940 στη θεραπεία της τριχοειδούς κεφαλής, ακολουθούμενη από την ανακάλυψη Οι ανθελμινθικές τους ιδιότητες στα μέσα της δεκαετίας του 1950 [10] . Σήμερα, τα σαλικυλανιλίδια (SALs) είναι μια κατηγορία αρωματικών ενώσεων που διαθέτουν ένα ευρύ φάσμα ενδιαφέρουσες φαρμακολογικές δράσεις, όπως ανθελμινθικές [11] , αντιβακτηριακές [12, 13] , αντιμυκοβακτηριακές [13] , αντιμυκητιακές [14] και αντιικές [15, 16], μεταξύ άλλων. Παρά το γεγονός ότι μελετήθηκε από τη δεκαετία του 1960, ο μηχανισμός δράσης που είναι υπεύθυνος για τις βιολογικές δραστηριότητες αυτών των ενώσεων δεν έχει εξηγηθεί μέχρι στιγμής. Έχει βρεθεί ότι τα SAL αναστέλλουν τα ρυθμιστικά συστήματα δύο συστατικών (TCS) των βακτηρίων [17] . Οι τελευταίες μελέτες τα προσδιόρισαν επίσης ως εκλεκτικούς αναστολείς της παραγωγής ιντερλευκίνης-12p40 που παίζει συγκεκριμένο ρόλο στην έναρξη, επέκταση και έλεγχο της κυτταρικής απόκρισης στη φυματίωση [18] . Επιπλέον, τα σαλικυλανιλίδια έχουν αναγνωριστεί ως αναστολείς ορισμένων βακτηριακών ενζύμων, όπως η σορτάση Α από το S. aureus [19] , η λιγάση της d-αλανίνης-d-αλανίνης [20] ή οι τρανσγλυκοζυλάσες από το S. aureus (αλλά όχι από το M. tuberculosis ) [12] . Αυτά τα ένζυμα συμμετέχουν στην έκκριση διαφόρων πρωτεϊνών ή στη βιοσύνθεση του βακτηριακού κυτταρικού τοιχώματος. Πρόσφατα, τα παράγωγα που μοιάζουν με σαλικυλανιλίδια περιγράφηκαν ότι αναστέλλουν δύο ένζυμα απαραίτητα για τα μυκοβακτήρια: (i) αμινοπεπτιδάση μεθειονίνης, που καταλύει ένα βασικό βήμα της μεταμεταφραστικής τροποποίησης των εκκολαπτόμενων πρωτεϊνών και (ii) ισοκιτρική λυάση, η οποία είναι απαραίτητη για το μεταβολισμό των λιπαρών οξέων [21] . Έτσι, τα SALs φαίνεται να είναι πολλά υποσχόμενοι υποψήφιοι για την ανάπτυξη νέων αντιβακτηριακών παραγόντων με νέο μηχανισμό δράσης. Τέτοιοι νέοι παράγοντες θα μπορούσαν να αποτελέσουν λύση στις προκλήσεις της αντίστασης. Αυτή η μελέτη αποτελεί συνέχεια του άρθρου ενός πρόσφατα δημοσιευμένου άρθρου [13] . Η σύνθεση της σειράς νέων παραγώγων σαλικυλαμιδίων, 4-και 5-χλωρο-2-υδροξυ-Ν-[1-οξο-1-(φαινυλαμινο)αλκαν-2-υλ]βενζαμιδίων, που ονομάζονται διαμίδια λόγω του σκελετού τους (για γενική δομή βλέπε Πίνακα 1), περιγράφηκε προηγουμένως [13, 22] και αναφέρθηκαν οι αντιμυκοβακτηριακές και αντιβακτηριακές τους δράσεις έναντι διαφόρων βακτηριακών ειδών [13] . Καθώς αυτές οι ενώσεις εξέφρασαν πολύ σημαντική αντιβακτηριακή δράση με χαμηλές τιμές MIC έναντι κλινικών απομονώσεων του MRSA ως αντιπροσώπων πολυανθεκτικών βακτηρίων, αποφασίσαμε να επεκτείνουμε τη γνώση σχετικά με τις αντιβακτηριακές ιδιότητες αυτών των ενώσεων έναντι του MRSA. Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογήσει τη συνολική in vitro βακτηριοκτόνος δράση εννέα νεοσυντιθέμενων διαμιδίων σε εξάρτηση από το χρόνο και τη συγκέντρωση έναντι κλινικών απομονώσεων του MRSA ως αντιπροσώπων πολυανθεκτικών βακτηρίων. Από όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που ασχολείται με την αξιολόγηση νέων μικροβιολογικών χαρακτηριστικών των αναλόγων SAL και αποκαλύπτει τη βακτηριοκτόνο δράση τους. Η συνθετική οδός της σειράς νέων διαμιδίων περιγράφηκε πρόσφατα [13, 22] και οι δομές τους (βλέπε Πίνακα 1) επιβεβαιώθηκαν με φασματομετρία IR, NMR και MS και η καθαρότητα των ενώσεων ελέγχθηκε με ανάλυση CHN [13, 22]. [27]; και MRSA SA 3202 [27] (Εθνικό Ινστιτούτο Δημόσιας Υγείας, Πράγα, Τσεχική Δημοκρατία) και τα δύο ανθρώπινης προέλευσης. Οι ύποπτες αποικίες επιβεβαιώθηκαν με PCR. ανιχνεύθηκε ένα θραύσμα 108 bp ειδικό για S. aureus [28] . Όλα τα προϊόντα απομόνωσης δοκιμάστηκαν για την παρουσία του γονιδίου mecA που κωδικοποιεί την αντίσταση στη μεθικιλλίνη [29]. Αυτά τα τρία κλινικά στελέχη ταξινομήθηκαν ως ευαίσθητα στη βανκομυκίνη (αλλά με υψηλότερο MIC βανκομυκίνης ίσο με 2 g/mL (VA2-MRSA) εντός του εύρους ευαισθησίας για το MRSA 63718) ανθεκτικό στη μεθικιλλίνη S. aureus (VS-MRSA). Για τα MIC της βανκομυκίνης, δείτε τον Πίνακα 1. Ο ευαίσθητος στη βανκομυκίνη ευαίσθητος στη μεθικιλλίνη Staphylococcus aureus (VS-MSSA) ATCC 29213, που ελήφθη από την American Type Culture Collection, χρησιμοποιήθηκε ως στέλεχος αναφοράς και ποιοτικού ελέγχου. Τα βακτήρια αποθηκεύτηκαν στους -80 ∘ C και διατηρήθηκαν σε πλάκες με άγαρ αίματος (βάση άγαρ Columbia με 5% αίμα προβάτου) μεταξύ των πειραμάτων. (MBC) . Τα MBCs (δηλαδή, οι χαμηλότερες συγκεντρώσεις αντιβακτηριακών παραγόντων που απαιτούνται για τη θανάτωση ενός συγκεκριμένου βακτηρίου) προσδιορίστηκαν με υποκαλλιέργεια κλασμάτων (20 L) από φρεάτια χωρίς ορατή βακτηριακή ανάπτυξη και από φρεάτια ελέγχου προσδιορισμού MIC σε άγαρ Mueller-Hinton χωρίς ουσία ( MHA) πλάκες. Οι πλάκες επωάστηκαν αερόβια στους 37 ∘ C για 24 ώρες για μέτρηση αποικιών. Το MBC ορίστηκε ως η χαμηλότερη συγκέντρωση ουσίας, η οποία παρήγαγε ≥99,9% θανάτωση Πίνακας 1 : Χημικές δομές και in vitro τιμές MIC και MBC [g/mL] του ελεγμένου 5-και 4-χλωρο-2-υδροξυ-Ν-[ 1-οξο-1-(φαινυλαμινο)αλκαν-2-υλ]βενζαμίδια (βακτηριοκτόνο αποτέλεσμα μεμονωμένων ενώσεων έναντι συγκεκριμένων στελεχών που σημειώνονται με έντονους χαρακτήρες). μετά από 24 ώρες επώασης σε σύγκριση με τον αριθμό αποικιών του αρχικού εμβολίου [30] . Για να εξασφαλιστεί η αναπαραγωγιμότητα, κάθε προσδιορισμός MBC πραγματοποιήθηκε τουλάχιστον εις τριπλούν σε ξεχωριστές περιπτώσεις.N H O H N O OH 1 2 R 1 R 3 R 2 Comp. R 1 R 2 R 3 MIC [ g/mL] MBC [ g/mL] 1 2 3 4 1 2 3 4 1a 5-Cl 4-CH 3 (S)-CH 3 >256 >256 >256 >256 >256 >256 >256 >256 1b 5-Cl 4-CH 3 (S)-CH(CH 3 ) 2 >256 >256 32 32 >256 >256 128 >256 1c 5-Cl 4-CH 3 (S)-βενζύλιο >256 >256 >256 >256 >256 >256 >256 >256 1d 5-Cl 4-CH 3 (R)-CH2-ινδολυλ >256 >256 >256 >256 >256 >256 >256 >256 1e 5 -Cl 4-OCH 3 (S)-CH(CH 3 ) 2 >256 >256 >256 >256 >256 >256 >256 >256 1f 5-Cl 4-CF 3 (S)-CH(CH 3 ) 2 4 2 2 2 4 4 8 4 1g 4-Cl 4-Br (S)-CH(CH 3 ) 2 8 4 4 4 1 6 8 8 8 1h 4-Cl 3,4-Cl (S)-CH(CH 3 ) 2 2 1 1 1 4 1 4 2 1i 4-Cl 3,4-Cl (S)-βενζύλιο 1 1 0,5 0,5 8 1 8 1 AMP - - - >16 >16 >16 0,25 >16 >16 >16 0,25 CPX - - - >16 >16 >16 0,5 >16 >16 >16 0,5 VAN - - - 2 1 1 1 2 1 1 Πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις Time-kill με τη μέθοδο μακροαραίωσης ζωμού σύμφωνα με τη μεθοδολογία που περιγράφηκε προηγουμένως [30] με κάποιες τροποποιήσεις. Εν συντομία, φιάλες που περιείχαν αποστειρωμένο φρέσκο ​​ζωμό Mueller-Hinton (MHB) με τον κατάλληλο αντιμικροβιακό παράγοντα εμβολιάστηκαν με τον υπό δοκιμή οργανισμό σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης για να ληφθεί το αρχικό εμβόλιο με συγκέντρωση περίπου 7,5 × 10 6 CFU/mL (οι πραγματικές συγκεντρώσεις εμβολίου κυμαίνονται από 0,9 × 10 5 έως 2,9 × 10 6 CFU/mL) και τελική συγκέντρωση του αντιβιοτικού ίση με 1x, 2x και 4x MIC σε όγκο 10 mL. Για τον προσδιορισμό των βιώσιμων μετρήσεων, κλάσματα αφαιρέθηκαν σε χρονικά σημεία 0, 4, 6, 8 και 24 h μετά τον εμβολιασμό, αραιώθηκαν σειριακά σε στείρο αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά και κλάσματα (20 L) απλώθηκαν σε πλάκες MHA εις διπλούν. Οι μετρήσεις αποικιών πραγματοποιήθηκαν σε πλάκες που έδιναν 6 έως 60 αποικίες και υπολογίστηκε ο μέσος όρος. Η αντιμικροβιακή μεταφορά ελέγχθηκε με αραίωση και οπτική επιθεώρηση της κατανομής των αποικιών στις πλάκες με παρατήρηση πιθανής αναστολής της ανάπτυξης στη θέση των αρχικών ραβδώσεων. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ∘ C για 24 έως 48 ώρες και προσδιορίστηκε ο αριθμός των αποικιών. Για να εξασφαλιστεί η αναπαραγωγιμότητα, κάθε πείραμα θανάτωσης χρόνου πραγματοποιήθηκε εις διπλούν σε ξεχωριστές περιπτώσεις με τα αποτελέσματα να παρουσιάζονται ως ο μέσος όρος όλων των πειραμάτων. Ο έλεγχος ανάπτυξης χωρίς την προσθήκη αντιμικροβιακών παραγόντων και ο έλεγχος που περιέχει DMSO χωρίς κανένα αντιμικροβιακό παράγοντα για να αποκλειστεί η αντιβακτηριακή δράση αυτού του διαλύτη συμπεριλήφθηκαν. Κατασκευάστηκαν καμπύλες θανάτωσης χρόνου σχεδιάζοντας το log 10 CFU ανά χιλιοστόλιτρο σε σχέση με το χρόνο (πάνω από 24 ώρες) και προσδιορίστηκε η αλλαγή στη βακτηριακή συγκέντρωση. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν αξιολογώντας τον αριθμό των στελεχών που απέδωσαν τιμές Δ(log 10 CFU/mL) -1 (που αντιστοιχεί σε 90% θανάτωση), -2 (99% θανάτωση) και -3 (99,9% θανάτωση) στο 4 , 6, 8 και 24 ώρες σε σύγκριση με μετρήσεις στις 0 ώρες. Η βακτηριοκτόνος δράση ορίστηκε ως η μείωση τουλάχιστον 99,9% (≥3 log 10 ) του συνολικού αριθμού CFU/mL στο αρχικό εμβόλιο. Οι διαμίδες φαίνεται να είναι υποσχόμενοι υποψήφιοι για αντιβακτηριακούς παράγοντες με πολύ ισχυρή αντι-MRSA δράση, καθώς δημοσιεύτηκε πρόσφατα [13] . Στην παρούσα μελέτη η σειρά των εννέα νεοσυντιθέμενων διαμιδίων αξιολογήθηκε ως πιθανοί βακτηριοκτόνοι παράγοντες έναντι εκπροσώπων πολυανθεκτικών βακτηρίων, τριών κλινικών απομονώσεων του MRSA και Staphylococcus aureus ATCC 29213 (ευαίσθητο στη μεθικιλλίνη) ως στελέχη αναφοράς και ποιοτικού ελέγχου. Δεδομένου ότι τα SAL και τα ανάλογα τους είναι γνωστά ως ενώσεις με βακτηριοστατική δράση [31], αυτή είναι η πρώτη μελέτη όπου οι ενώσεις που μοιάζουν με SAL θεωρήθηκαν ως πιθανοί βακτηριοκτόνοι παράγοντες και αξιολογήθηκε η εξάρτηση της βακτηριοκτόνου δράσης αυτών των ενώσεων από το χρόνο και τη συγκέντρωση. Έτσι, στην παρούσα μελέτη αποκαλύφθηκαν απολύτως νέα μικροβιολογικά χαρακτηριστικά αυτών των ενώσεων. Πρόσφατα δημοσιεύθηκαν τιμές MIC των διαμιδίων που εκφράζονται ως μοριακές συγκεντρώσεις σε mol/L [13] . Για να καταστεί δυνατή η σύγκριση με τις τιμές MBC της παρούσας μελέτης, υπολογίστηκαν τα MIC σε g/mL και καταγράφονται στον Πίνακα 1 μαζί με τη δραστηριότητα των αντιβακτηριακών φαρμάκων αναφοράς, της αμπικιλλίνης, της σιπροφλοξασίνης και της βανκομυκίνης. Η πιθανή βακτηριοκτόνος δράση των διαμιδίων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία MBC [26] . Οι τιμές MBC όλων των εξεταζόμενων ενώσεων καταγράφονται επίσης στον Πίνακα 1. Με βάση τα ληφθέντα αποτελέσματα, όλες οι ενώσεις που αξιολογήθηκαν ως δραστικές σύμφωνα με τις τιμές MIC στην προηγούμενη μελέτη μας (1f-i) έδειξαν χαμηλές ή μέτριες τιμές MBC και στα τέσσερα στελέχη. Οι τιμές MBC αυτών των ενώσεων δεν υπερέβαιναν την υψηλότερη δοκιμασμένη συγκέντρωση φαρμάκου και κυμαίνονταν από 1 έως 16 g/mL. Σε όλες τις περιπτώσεις, υπήρχαν συγκρίσιμες τιμές MBC για τις κλινικές απομονώσεις του MRSA και του στελέχους αναφοράς S. aureus. Η βακτηριοκτόνος δραστηριότητα ορίζεται ως η αναλογία MBC προς MIC ≤4 [32] . Η βακτηριοκτόνος δραστηριότητα του Πίνακα 1 εκφράζεται με έντονους χαρακτήρες. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, τα SAL είναι γνωστό ότι παρουσιάζουν βακτηριοστατική δράση [31] , επομένως ήταν πολύ ενδιαφέρον να ανακαλυφθεί ότι τα διαμίδια διαθέτουν βακτηριοκτόνο δράση. Ο αμιδικός δεσμός (-CONH-) μπορεί να προκαλέσει αλληλεπιδράσεις με μια ποικιλία ενζύμων [33]. Επομένως, η παρουσία δύο αμιδικών δεσμών θα μπορούσε να είναι υπεύθυνη για τη βακτηριοκτόνο δράση των διαμιδίων έναντι του MRSA. Η δραστηριότητα των SAL και των αναλόγων τους προκύπτει από πολλούς μηχανισμούς, οι οποίοι βρίσκονται ακόμη υπό διερεύνηση. για παράδειγμα, βρέθηκε ότι τα SAL είναι ικανά να αναστέλλουν τις τρανσγλυκοζυλάσες σε μεταγενέστερα στάδια της βιοσύνθεσης του κυτταρικού τοιχώματος του S. aureus (συμπεριλαμβανομένου του MRSA) [12] . Αυτά τα ένζυμα καταλύουν το στάδιο πριν από τη διαπεπτιδοποίηση στη βιοσύνθεση της πεπτιδογλυκάνης και είναι υπεύθυνα για τον πολυμερισμό του λιπιδίου II, ο οποίος συμβαίνει στην εξωτερική επιφάνεια της μεμβράνης [12] . Δεδομένου ότι οι αντιβακτηριδακοί παράγοντες που στοχεύουν τη βιοσύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος δρουν ως βακτηριοκτόνοι παράγοντες [30, 34], η αποτυχία στη βιοσύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος λόγω της αναστολής των τρανσγλυκοζυλασών θα μπορούσε να ευθύνεται για τη βακτηριοκτόνο δράση των διαμιδίων έναντι του MRSA. Με βάση αυτά τα ευρήματα, τα αντιβακτηριακά δραστικά διάμ βακτηριοκτόνο αποτέλεσμα και στα τέσσερα ελεγμένα στελέχη ως υποψήφιοι βακτηριοκτόνοι παράγοντες επιλέχθηκαν για επακόλουθες μελέτες καμπύλης timekill για να προσδιοριστεί η πραγματική εξάρτηση του βακτηριοκτόνου αποτελέσματος από τη συγκέντρωση με την πάροδο του χρόνου. Η 1-οξοβουταν-2-υλ}-2-υδροξυβενζαμίδη (1 ώρα) δοκιμάστηκε έγκαιρα -σκοτώνει τις μελέτες σε 1x, 2x και 4x MIC έναντι όλων των απομονώσεων MRSA και του στελέχους αναφοράς S. aureus. Η αντιβακτηριακή δράση του DMSO [35] που χρησιμοποιήθηκε ως διαλύτης των ελεγχόμενων ενώσεων αποκλείστηκε σε αυτή τη δοκιμασία, καθώς οι καμπύλες χρόνου-θανάτωσης αυτού του διαλύτη ήταν πανομοιότυπες ή πολύ παρόμοιες με αυτές του ελέγχου ανάπτυξης. Η έκταση της βακτηριακής θανάτωσης υπολογίστηκε από τον αριθμό αυτών των στελεχών που εμφανίζουν μείωση που κυμαίνεται από 1 έως 3 log 10 CFU/mL στον αριθμό βιώσιμων κυττάρων σε διαφορετικούς χρόνους μετά την επώαση. Μια περίληψη αυτών των δεδομένων παρουσιάζεται στον Πίνακα 2. Με βάση αυτά τα δεδομένα μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι η βακτηριοκτόνος ισχύς των ελεγμένων διαμιδίων έναντι και των τεσσάρων στελεχών μειώθηκε ως εξής: 1f > 1h > 1g. Δεν παρατηρήθηκε βακτηριοκτόνος δράση (δηλ. μείωση ≥3 log 10 CFU/mL) σε 1x MIC για οποιοδήποτε στέλεχος και χρόνο μετά την επώαση που δοκιμάστηκε. Σε 4x MIC από τα τέσσερα στελέχη, οι ενώσεις 1f, 1 g και 1h σκότωσαν 2, 1 και 2 στελέχη, αντίστοιχα, στις 8 ώρες μετά την επώαση και 4, 2 και 2 στελέχη, αντίστοιχα, στις 24 ώρες μετά την επώαση. Τα ευρήματα των μελετών θανάτωσης χρόνου για καθένα από τα τέσσερα στελέχη σταφυλόκοκκων κατά την έκθεση στις ενώσεις 1f, 1g και 1h συνοψίζονται στον Πίνακα 3. Η βακτηριοκτόνος δραστηριότητα (δηλαδή, μείωση ≥3 log 10 CFU/mL) εκφράζεται με έντονους χαρακτήρες. Για την ένωση 1f καταγράφηκε ταχεία αντιβακτηριδιακή δράση εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση έναντι της κλινικής απομόνωσης του MRSA 63718. Ο χρόνος δεν ήταν ο προγνωστικός παράγοντας που επηρέαζε την αντιβακτηριακή δράση επειδή οι διαφορές log 10 σε CFU/mL από το αρχικό εμβόλιο ήταν οι ίδιες για 4x MIC (με την υψηλότερη αποτελεσματικότητα με μείωση του αριθμού βακτηρίων 5,30 log 10 CFU/mL) ή πολύ παρόμοια για 2x MIC (με μέτρια αναγέννηση μετά από 24 ώρες που προκαλεί απώλεια βακτηριοκτόνου δραστηριότητας) σε διάστημα 24 ωρών. Το βακτηριοκτόνο αποτέλεσμα διατηρήθηκε ακόμη και σε 2x MIC στις 4 ώρες μετά την επώαση για αυτό το στέλεχος (μείωση 3,08 log 10 CFU/mL). Για τα υπόλοιπα στελέχη, κλινικά απομονωμένα στελέχη MRSA SA 630, MRSA SA 3202 και S. aureus ATCC 29213, καταγράφηκε αξιόπιστη βακτηριοκτόνο δράση σε 4x MIC στις 24 ώρες μετά την επώαση για όλα αυτά τα στελέχη με μείωση του αριθμού βακτηρίων κατά 3,302, , και 3,65 log 10 CFU/mL, αντίστοιχα. Για την ένωση 1g παρατηρήθηκε βακτηριοκτόνο αποτέλεσμα έναντι του MRSA 63718 σε 2x MIC στις 6 και 8 ώρες μετά την επώαση και σε 4x MIC στις 4, 6 και 8 ώρες μετά την επώαση με μείωση της βακτηριακής μέτρηση που κυμαίνεται από 3,10 έως 3,58 log 10 CFU/mL. Η πιο αποτελεσματική θανάτωση επιτεύχθηκε στις 6 ώρες και για τις δύο συγκεντρώσεις. Όπως και στην περίπτωση της ένωσης 1f, παρατηρήθηκε εκ νέου ανάπτυξη μετά από 24 ώρες μετά την επώαση. Για τις υπόλοιπες απομονώσεις MRSA, SA 630 και SA 3202, η βακτηριοκτόνος δράση εμφανίστηκε μόνο σε 4x MIC στις 24 ώρες μετά την επώαση με μείωση του αριθμού βακτηρίων 3,38 και 4,01 log 10 CFU/mL, αντίστοιχα. Το υψηλότερο βακτηριοκτόνο αποτέλεσμα καταγράφηκε για το MRSA SA 3202 σε 4x MIC στις 24 ώρες μετά την επώαση. Σε άλλες συγκεντρώσεις με την πάροδο του χρόνου και για τα δύο στελέχη παρατηρήθηκε μείωση που συνάδει με βακτηριοστατική δράση (0,03 έως 2,37 log 10 CFU/mL). Δεν παρατηρήθηκε βακτηριοκτόνο αποτέλεσμα για το στέλεχος αναφοράς S. aureus. Η ένωση 1 g έδειξε ένα πρότυπο βακτηριοστατικής δραστικότητας έναντι αυτού του στελέχους με μείωση του αριθμού βακτηρίων που κυμαίνεται από 0,07 έως 2,33 log 10 CFU/mL σε 4x MIC με την πάροδο του χρόνου. Σε άλλες περιπτώσεις, παρατηρήθηκε μια ελαφρά αύξηση στον αριθμό των βακτηρίων (δηλ. υπερανάπτυξη) σε σύγκριση με το αρχικό εμβόλιο με τιμές που κυμαίνονται από 0,10 έως 1,57 log 10 CFU/mL για αυτό το στέλεχος αναφοράς. 4x MIC στις 6 και 8 ώρες μετά την επώαση με μείωση του αριθμού βακτηρίων 3,54 και 3,31 log 10 CFU/mL, αντίστοιχα. Το ίδιο όπως και για 1 g, το πιο ισχυρό βακτηριοκτόνο αποτέλεσμα διατηρήθηκε στις 6 ώρες μετά την επώαση. Η επανανάπτυξη στις 24 ώρες μετά την επώαση που προκάλεσε απώλεια βακτηριοκτόνου δραστηριότητας καταγράφηκε παρόμοια όπως με τις προηγούμενες ενώσεις. Ο λόγος για την εκ νέου ανάπτυξη του δοκιμαστικού οργανισμού στις 24 ώρες στο πείραμα είναι άγνωστος. Πιθανότατα, η επιλογή ανθεκτικών μεταλλαγμένων είναι υπεύθυνη για αυτό το φαινόμενο [30]. αποικοδόμηση του φαρμάκου στο μέσο ανάπτυξης δεν θεωρείται δεδομένο, καθώς η εκ νέου ανάπτυξη ήταν Ο αριθμός στελεχών που εμφανίζουν την ακόλουθη μείωση log 10 CFU/mL a στον καθορισμένο χρόνο επώασης δεν παρατηρήθηκε για κανένα άλλο ελεγμένο στέλεχος. Για το MRSA SA 630 θανάτωση εξαρτώμενης από τη συγκέντρωση καταγράφηκε σε 4x MIC στις 6, 8 και 24 ώρες μετά την επώαση με log 10 διαφορές σε CFU/mL από το αρχικό εμβόλιο να είναι πολύ παρόμοιες με την πάροδο του χρόνου (που κυμαίνονται από 3,18 έως 3,39 log 10 CFU/ mL). Για το MRSA SA 3202, το αξιόπιστο βακτηριοκτόνο αποτέλεσμα διατηρήθηκε μόνο σε 4x MIC στις 24 ώρες μετά την επώαση με μείωση του αριθμού βακτηρίων κατά 3,02 log 10 CFU/mL. Όσον αφορά την ένωση 1 g, παρατηρήθηκε βακτηριοστατική δράση έναντι του στελέχους αναφοράς S. aureus με μείωση του αριθμού βακτηρίων που κυμαίνεται από 0,34 έως 2,62 log 10 CFU/mL σε 2x και 4x MIC. Η υπερανάπτυξη (τιμές που κυμαίνονται από 0,04 έως 1,43 log 10 CFU/mL) καταγράφηκε σε 1x MIC για αυτό το στέλεχος. Αξίζει να σημειωθεί ότι σε όλα τα στελέχη σταφυλόκοκκων με παρόμοια MICs και MBCs για τις ενώσεις 1g και 1h, η ανταπόκριση στην αντιβακτηριακή δράση αυτών των ενώσεων διέφερε με κλινικά στελέχη MRSA να σκοτώνονται αποτελεσματικά και το στέλεχος αναφοράς να παραμένει ανεπηρέαστο σε 4x MIC. Υπάρχει διαφορά μεταξύ των βακτηριοκτόνων αποτελεσμάτων της δοκιμασίας MBC σε σύγκριση με την κινητική του χρόνου-θανάτωσης. Αυτή η διαφορά θα μπορούσε να προκληθεί συγκρίνοντας τις αραιώσεις μικροτιτλοδότησης (δοκιμή MBC) με αραιώσεις μακροζωμού (δοκιμασία χρόνου-θανάτωσης) [36] . Επιπλέον, παρόλο που οι δοκιμασίες θανάτωσης χρόνου είναι πιο εντατικές και χρονοβόρες από τις αναλύσεις MBC, αναγνωρίζεται ότι παρέχουν μεγαλύτερο βαθμό χαρακτηρισμού της δυνατότητας εκρίζωσης κυττάρων των αντιβακτηριακών παραγόντων [37] . Όσον αφορά την αντιβακτηριακή δράση, δεν είναι γενικά σημαντικό εάν ο αντιβακτηριακός παράγοντας είναι επίσης βακτηριοκτόνος σε υψηλότερες συγκεντρώσεις, επειδή η αναστολή του πολλαπλασιασμού των βακτηρίων συνήθως επιτυγχάνει ένα θεραπευτικό αποτέλεσμα. το ανοσοποιητικό σύστημα του ασθενούς είναι ικανό να αντιμετωπίσει τη μόλυνση τότε [34] . Ωστόσο, η βακτηριοκτόνος θεραπεία θα μπορούσε να παράγει καλύτερα αποτελέσματα θεραπείας με ταχεία μείωση του βακτηριακού φορτίου [38] . Επιπλέον, σε περίπτωση διαταραχής του ανοσοποιητικού συστήματος (π.χ. ανοσοκατασταλτική θεραπεία, ασθενείς με AIDS κ.λπ.) βακτηριοκτόνοι παράγοντες ενδείκνυνται κατηγορηματικά. Λαμβάνοντας υπόψη τον σταθερά αυξανόμενο αριθμό ανοσοκατεσταλμένων ασθενών με ενδοκαρδίτιδα, μηνιγγίτιδα ή οστεομυελίτιδα τα τελευταία χρόνια, είναι απαραίτητο να επιτευχθεί βακτηριακή θανάτωση και να διευρυνθεί το φάσμα των αντιμικροβιακών παραγόντων με βακτηριοκτόνες δραστικές ενώσεις [30] . Η κλινική έκβαση του MRSA επηρεάζεται σημαντικά από τη βακτηριαιμία MIC βανκομυκίνης. Η αποτυχία θεραπείας άνω του 60% για το S. aureus με MIC βανκομυκίνης 4 g/mL είχε ως αποτέλεσμα την αλλαγή του σημείου διακοπής ευαισθησίας από 4 g/mL σε 2 g/mL από το Ινστιτούτο Κλινικών και Εργαστηριακών Προτύπων (CLSI) το 2006 [23] ως καθώς και από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων των ΗΠΑ (FDA) το 2008 [39] . Έχει προταθεί ότι για λοιμώξεις που προκαλούνται από στελέχη MRSA με αυξημένα MIC βανκομυκίνης (2 g/mL), θα πρέπει να εξετάζεται η εναλλακτική θεραπεία [40] . Αξίζει να σημειωθεί ότι με βάση τις αναλύσεις time-kill στην παρούσα μελέτη, όλα τα ελεγμένα διαμίδια (ιδιαίτερα η ένωση 1f που εμφανίζει ταχεία βακτηριοκτόνο δράση εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση ακόμη και σε 2x MIC) ήταν πιο αποτελεσματικά έναντι της απομόνωσης MRSA 63718, που είναι το στέλεχος με αυξημένη βανκομυκίνη MIC 2 g/mL. Η δράση έναντι των υπολοίπων απομονώσεων με MIC βανκομυκίνης 1 g/mL ήταν χαμηλότερη. Λαμβάνοντας υπόψη την εμφάνιση μειωμένης ευαισθησίας στη βανκομυκίνη των απομονώσεων MRSA και επομένως τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα της θεραπείας με βανκομυκίνη, στόχος μας ήταν να προσδιορίσουμε τον πιθανό βακτηριοκτόνο ρόλο των νέων αντιβακτηριακών ενώσεων MRSA in vitro. Με βάση τα ληφθέντα αποτελέσματα, τα διαμίδια μπορούν να είναι κατάλληλοι υποψήφιοι για τέτοιες νέες βακτηριοκτόνες δραστικές ενώσεις που παρουσιάζουν ένα πολλά υποσχόμενο σημείο εκκίνησης για περαιτέρω έρευνες για να εξακριβωθεί η πραγματική in vivo δραστηριότητα και ο ακριβής μηχανισμός δράσης. Η παρούσα μελέτη είναι η πρώτη ένδειξη βακτηριοκτόνου δράσης των αναλόγων SAL. Εναντίον άλλων στελεχών, η αξιόπιστη βακτηριοκτόνο δράση διατηρήθηκε σε 4x MIC στις 24 ώρες μετά την επώαση. Λαμβάνοντας υπόψη την ανάγκη να διευρυνθεί το φάσμα των βακτηριοκτόνων παραγόντων, τα διαμίδια από την τρέχουσα μελέτη με έναν νέο μηχανισμό δράσης θα μπορούσαν να αποτελέσουν μια πολλά υποσχόμενη και ενδιαφέρουσα λύση σε αυτήν την πρόκληση για το μέλλον.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 3084, "text": "βανκομυκίνη" } ], "id": 5227, "question": "Ποια είναι η θεραπεία εκλογής για τις λοιμώξεις από MRSA;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5586, "text": "ισοκιτρική λυάση" } ], "id": 5228, "question": "Ποιο ένζυμο είναι απαραίτητο για το μεταβολισμό των λιπαρών οξέων;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Προθεραπεία Αντικαταστάσεις σχετιζόμενες με την αντίσταση του ιού της ηπατίτιδας C NS5A/NS5B σε ασθενείς με λοίμωξη από Ουρουγουάη με γονότυπο 1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6112080/SHA: f01ad3545240bAb49; Echeverría, Natalia; Chiodi, Daniela; López, Pablo; Sánchez-Cicerón, Adriana; Fajardo, Alvaro; Soñora, Martín; Cristina, Juan; Hernández, Nelia; Moreno, PilarDate: 2018-08-14DOI: 10.1155/2018/2514901Άδεια: cc-byΠερίληψη: Η θεραπεία λοίμωξης από τον ιό της ηπατίτιδας C (HCV) έχει αλλάξει δραματικά με την εμφάνιση των αντιικών παραγόντων άμεσης δράσης (DAAs). Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα των DAA μπορεί να μετριαστεί με την παρουσία υποκαταστάσεων που σχετίζονται με την αντίσταση (RAS) πριν και μετά τη θεραπεία. Πράγματι, τα RASs που ανιχνεύονται σε ασθενείς που έχουν μολυνθεί με HCV που δεν είχαν λάβει προηγούμενη θεραπεία με DAA θα μπορούσαν να είναι χρήσιμα για την κλινική διαχείριση και την πρόβλεψη της έκβασης. Αν και η συχνότητα των φυσικών HCV NS5A και NS5B RAS έχει αντιμετωπιστεί σε πολλές χώρες, υπάρχουν μόνο λίγες αναφορές σχετικά με τον επιπολασμό τους στην περιοχή της Νότιας Αμερικής. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να διερευνήσει την παρουσία RAS σε αναστολείς NS5A και NS5B σε μια κοόρτη που δεν είχε λάβει θεραπεία με DAA ασθενών από Ουρουγουάη που είχαν μολυνθεί από χρόνια ηπατίτιδα C και να τα συγκρίνει με αναφορές από άλλες χώρες της Νότιας Αμερικής. Εδώ, διαπιστώσαμε ότι οι φυσικές υποκαταστάσεις που προσδίδουν αντοχή στους αναστολείς NS5A και NS5B ήταν παρούσες στο 8% και στο 19,2%, αντίστοιχα, των ασθενών που είχαν μολυνθεί με γονότυπο 1 HCV που δεν είχαν λάβει προηγούμενη θεραπεία. Είναι σημαντικό ότι οι βασικές υποκαταστάσεις στο NS5A και NS5B που προσδιορίζονται εδώ διαφέρουν από τις μελέτες που αναφέρθηκαν προηγουμένως στη Βραζιλία. Επιπλέον, τα στελέχη της Ουρουγουάης υποτύπου 1a συγκεντρώθηκαν σε όλα τα μεγάλα παγκόσμια κλάδια, δείχνοντας ότι οι παραλλαγές του HCV που κυκλοφορούν αυτή τη στιγμή σε αυτή τη χώρα χαρακτηρίζονται από μια αξιοσημείωτη γενετική ποικιλομορφία. Κείμενο: Η θεραπεία λοίμωξης από τον ιό της ηπατίτιδας C (HCV) έχει βελτιωθεί δραματικά χάρη στην εισαγωγή δρώντες αντιιικοί παράγοντες (DAAs). Αυτά τα αντιιικά φάρμακα έχουν σημαντικά αυξημένα ποσοστά ανταπόκρισης (έως 98%) και πολύ μειωμένη διάρκεια θεραπείας [1] . Τα επί του παρόντος διαθέσιμα DAA ταξινομούνται σε τέσσερις κατηγορίες δεδομένων των μοριακών τους στόχων στον κύκλο αντιγραφής του HCV: (1) Οι αναστολείς πρωτεάσης NS3/4A (PIs) συνδέονται με την ενεργή θέση της πρωτεάσης NS3/4A. (2) Οι αναστολείς NS5A αλληλεπιδρούν με την περιοχή 1 του διμερούς NS5A, αν και ο ακριβής μηχανισμός της αναστολής του NS5A παραμένει να διευκρινιστεί πλήρως. (3) Αναστολείς πολυμεράσης NS5B ανάλογο νουκλεο(t)ιδών ενσωματώνονται στην αναγεννόμενη αλυσίδα RNA με αποτέλεσμα τον τερματισμό της αλυσίδας διακυβεύοντας τη δέσμευση του εισερχόμενου νουκλεοτιδίου. (4) οι μη νουκλεοσιδικοί αναστολείς πολυμεράσης NS5B αλληλεπιδρούν είτε με τον αντίχειρα 1, τον αντίχειρα 2, την παλάμη 1 ή την παλάμη 2 του τομέα NS5B και αναστέλλουν τη δραστηριότητα της πολυμεράσης με αλλοστερικούς μηχανισμούς [2] [3] [4] . Ωστόσο, η ακραία μετάλλαξη και τα υψηλά ποσοστά αναπαραγωγής του HCV, μαζί με την πίεση του ανοσοποιητικού συστήματος, οδηγούν σε μια αξιοσημείωτη γενετική μεταβλητότητα που μπορεί να θέσει σε κίνδυνο τα υψηλά ποσοστά απόκρισης στα DAAs λόγω της προϋπάρξεως αντικαταστάσεων που σχετίζονται με την αντίσταση (RAS) [5, 6] . Κάθε φάρμακο ή κατηγορία DAA χαρακτηρίζεται από συγκεκριμένα προφίλ αντοχής. Η πιθανότητα ότι ένα DAA θα επιλέξει και θα επιτρέψει την ανάπτυξη ιικών πληθυσμών που φέρουν RASs εξαρτάται από το γενετικό φραγμό του DAA στην αντίσταση (τον αριθμό και τον τύπο των μεταλλάξεων που απαιτούνται για τη δημιουργία μιας υποκατάστασης αμινοξέων που προσδίδει αντίσταση), την ικανότητα του ιού (αντιγραφική ικανότητα) της ανθεκτικής παραλλαγής και των ιικών γονότυπων και υποτύπων [7, 8] . Ο επιπολασμός των RAS σε ασθενείς που δεν είχαν λάβει προηγούμενη θεραπεία έχει ευρέως αναφερθεί παγκοσμίως [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] ] [16] . Ωστόσο, εκτός από τη Βραζιλία και την Αργεντινή, αυτό το ζήτημα δεν έχει ακόμη αντιμετωπιστεί πλήρως σε άλλες χώρες της Νότιας Αμερικής [9, [17] [18] [19] . Η έλλειψη πληροφοριών σε σχέση με προϋπάρχοντα βασικά RASs, που προστίθεται στο υψηλό κόστος αυτών των νέων φαρμάκων, είναι οι κύριοι περιοριστικοί παράγοντες για την ευρεία εφαρμογή αυτών των νέων θεραπειών στην Ουρουγουάη καθώς και σε άλλες χώρες της Λατινικής Αμερικής (χαμηλό ή χαμηλότερο μεσαίο εισόδημα). των ανθεκτικών στον HCV παραλλαγών στην περιοχή της Νότιας Αμερικής. Δείγματα. Ελήφθησαν δείγματα ορού από 31 ασθενείς με ορολογικούς δείκτες για HCV, οι οποίοι προσλήφθηκαν μεταξύ 2015 και 2017 στη Γαστρεντερολογική Κλινική από το Hospital de Clínicas, Μοντεβιδέο, Ουρουγουάη. Η μόλυνση από HCV επιβεβαιώθηκε από την Abbott HCV σε πραγματικό χρόνο (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, ΗΠΑ). Οι ασθενείς που επιλέχθηκαν για αυτή τη μελέτη ήταν και οι δύο χρόνια μολυσμένοι με γονότυπο 1 του HCV και δεν είχαν λάβει προηγούμενη θεραπεία με DAA τη στιγμή της αιμοληψίας. Ελήφθη γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση από όλους τους ασθενείς. Οι μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί σύμφωνα με τη Διακήρυξη της Παγκόσμιας Ιατρικής Εταιρείας του Ελσίνκι και έχουν εγκριθεί από το αρμόδιο θεσμικό συμβούλιο (Hospital de Clínicas ethical Committee).2.2. Εκχύλιση RNA, Σύνθεση cDNA και ενίσχυση NS5A και NS5B. Το ιικό RNA εξήχθη από 140 μl ορού χρησιμοποιώντας το κιτ QIAamp Viral RNA mini (QIAgen, Hilden, Γερμανία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το ιικό RNA θερμάνθηκε στους 65°C για 5 λεπτά και χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο για αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής. Το μείγμα αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής περιείχε 5 μl του προτύπου RNA, 1 μl τυχαίου εξαμερούς 100 ng/μl (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), 1 μl μίγματος dNTP (10 mM το καθένα), 4 μl 5Χ πρώτα -ρυθμιστικό διάλυμα κλώνου, 2 μl DTT 0,1 M, 1 μl ανάστροφης μεταγραφάσης SuperScript II (200 U/μl) (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) και 1 μl (40 U/μl) RNaseOUT (Invitrogen Life Technologies , Carlsbad, CA, ΗΠΑ). Η αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε στους 42°C για 50 λεπτά και στη συνέχεια το ένζυμο της αντίστροφης μεταγραφάσης απενεργοποιήθηκε στους 70°C για 15 λεπτά. Η ενίσχυση PCR των περιοχών γονιδιώματος NS5A και NS5B πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές και συνθήκες που περιγράφηκαν προηγουμένως [10]. Τα αμπλικόνια καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ καθαρισμού Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, UK) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.2.3. NS5A και NS5B Sequencing. Το καθαρισμένο προϊόν στη συνέχεια αναλύθηκε ως προς την αλληλουχία χρησιμοποιώντας τα ίδια σετ εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση PCR. Η αμφίδρομη αλληλουχία Sanger πραγματοποιήθηκε από τη Macrogen Korea (http://www.macrogen.com).2.4. Προσδιορισμός Γονότυπου NS5A και NS5B. Οι συναινετικές αλληλουχίες NS5A και NS5B HCV που ελήφθησαν από ασθενείς της Ουρουγουάης ευθυγραμμίστηκαν με αλληλουχίες από HCV που αντιπροσωπεύουν όλους τους γονότυπους και τους κύριους υποτύπους που απομονώθηκαν σε διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές του κόσμου. Αυτές οι αλληλουχίες ελήφθησαν από τη βάση δεδομένων αλληλουχιών HCV του Los Alamos και από τη βάση δεδομένων και τον πόρο ανάλυσης παθογόνων ιών NIAID (ViPR) [21, 22]. Για στελέχη που περιλαμβάνονται σε αυτές τις μελέτες, βλέπε Συμπληρωματικό Υλικό Πίνακα S1. Οι αλληλουχίες ευθυγραμμίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό CLUSTAL W [23] . Μόλις ευθυγραμμιστεί, το καλύτερο εξελικτικό μοντέλο που περιέγραψε τα δεδομένα της αλληλουχίας μας αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ModelGenerator [24] . Χρησιμοποιώντας το μοντέλο GTR + G + I (General time reversible + gamma + αμετάβλητες θέσεις), κατασκευάστηκαν φυλογενετικά δέντρα μέγιστης πιθανότητας τόσο για το NS5A όσο και για το NS5B χρησιμοποιώντας το λογισμικό MEGA 5.0 [25] . Για το NS5A, 953 νουκλεοτίδια (θέσεις 6367 έως 7319, σε σχέση με το στέλεχος αναφοράς HCV 1a, H77 NC_004102) συμπεριλήφθηκαν στη φυλογενετική ανάλυση, ενώ για το NS5B, μόνο 361 νουκλεοτίδια που αντιστοιχούν στην περιοχή Okamoto 26, σε θέσεις 7 σε σχέση με το 8 NC_004102) συμπεριλήφθηκαν. Ως μέτρο της ευρωστίας κάθε κόμβου, χρησιμοποιήσαμε τη μέθοδο bootstrapping (1000 ψευδοδιπλότυπα). Για αλληλουχίες NS5A 1a Ουρουγουάης (n = 20), δημιουργήθηκε μια δεύτερη ευθυγράμμιση και φυλογενετικό δέντρο μέγιστης πιθανότητας προκειμένου να αναλυθούν οι εξελικτικές σχέσεις HCV μεταξύ της Ουρουγουάης , βραζιλιάνικα και παγκόσμια στελέχη. Για μη-ουρουγουανά στελέχη που περιλαμβάνονται σε αυτήν την ανάλυση, βλέπε Συμπληρωματικό Υλικό Πίνακα S2. 2.5. Ανάλυση αλληλουχίας NS5A και NS5B. Προκειμένου να εντοπιστούν σωστά οι αλλαγές υποκατάστασης σε περιοχές NS5A και NS5B από στελέχη HCV που κυκλοφορούν σε ασθενείς της Ουρουγουάης, δημιουργήσαμε αλληλουχίες παγκόσμιας συναίνεσης για τους υποτύπους 1a και 1b χρησιμοποιώντας ένα ευρύ φάσμα αλληλουχιών NS5A και NS5B από στελέχη HCV που απομονώθηκαν παγκοσμίως. Για το σκοπό αυτό, οι αλληλουχίες γονιδίου NS5A που αντιστοιχούν στους υποτύπους 1a (n = 160) και 1b (n = 88) ανακτήθηκαν από τη βάση δεδομένων αλληλουχιών HCV Los Alamos και από το NIAID ViPR [21, 22]. Παρομοίως, δημιουργήθηκαν σύνολα δεδομένων 150 και 124 αλληλουχιών NS5B για τους υποτύπους 1a και 1b, αντίστοιχα. Χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Seqman, που υλοποιήθηκε στο πακέτο DNAStar 5.01 (DNASTAR, Madison, ΗΠΑ), δημιουργήθηκαν αλληλουχίες νουκλεοτιδίων παγκόσμιας συναίνεσης για κάθε γονίδιο και υποτύπο. Κάθε αλληλουχία της Ουρουγουάης στη συνέχεια ευθυγραμμίστηκε με τις αντίστοιχες αλληλουχίες αναφοράς και στη συνέχεια μεταφράστηκε σε silico. Οι αλληλουχίες αμινοξέων που ελήφθησαν συγκρίθηκαν προκειμένου να διερευνηθεί η παρουσία RAS καθώς και η παρουσία πολυμορφισμών σε θέση RAS (RAPs) σε στελέχη HCV της Ουρουγουάης. Τα RAP ορίζονται ως οποιαδήποτε αλλαγή από την αλληλουχία αναφοράς για έναν συγκεκριμένο γονότυπο σε μια θέση που σχετίζεται με την αντίσταση NS5A [26] . Για τη μελέτη της γενετικής μεταβλητότητας των περιοχών NS5A και NS5B των στελεχών HCV που κυκλοφορούν σε ασθενείς της Ουρουγουάης, ακολουθίες αυτών των περιοχών (αριθμοί πρόσβασης MH070029 -MH070090) ευθυγραμμίστηκαν με αντίστοιχες αλληλουχίες από 59 στελέχη HCV που απομονώθηκαν αλλού, που αντιπροσωπεύουν όλους τους γονότυπους και τους κύριους υποτύπους (για στελέχη που περιλαμβάνονται σε αυτές τις αναλύσεις, βλέπε Συμπληρωματικό Υλικό Πίνακα S1). Ως εκ τούτου, κατασκευάστηκαν φυλογενετικά δέντρα μέγιστης πιθανότητας. Τα αποτελέσματα αυτών των μελετών φαίνονται στο Σχήμα 1 Όλα τα στελέχη στις φυλογένειες εκχωρήθηκαν σύμφωνα με τον γονότυπο τους και κάθε ομάδα υποστηρίχθηκε από πολύ υψηλές τιμές εκκίνησης και για τις δύο αναλυόμενες περιοχές. Τα στελέχη που απομονώθηκαν από ασθενείς της Ουρουγουάης (n = 31) εκχωρήθηκαν στον γονότυπο 1, 20 από τα οποία αντιστοιχούσαν στον υποτύπο 1a και το 11 στον υποτύπο 1b. Τα αποτελέσματα των φυλογενετικών αναλύσεων NS5A (Εικόνα 1 (α)) και NS5B (Εικόνα 1 Γονότυπος 1b) ήταν σύμφωνα και για τις δύο γονιδιωματικές περιοχές και στις 31 αλληλουχίες, υποδηλώνοντας ότι δεν υπάρχουν γεγονότα ανασυνδυασμού μεταξύ αυτών των περιοχών. Για περαιτέρω ανάλυση των εξελικτικών σχέσεων μεταξύ των στελεχών της Ουρουγουάης και αυτά που κυκλοφορούν στη Βραζιλία και αλλού, κατασκευάστηκε ένα δεύτερο φυλογενετικό δέντρο μέγιστης πιθανότητας αλληλουχιών HCV-1a της μερικής περιοχής NS5A (Εικόνα 2). Όπως περιγράφηκε προηγουμένως, παρατηρήθηκαν δύο διακριτές κλάσεις 1a (clades 1 και 2). Οι ακολουθίες της Βραζιλίας συγκεντρώθηκαν σε μια μεγάλη ομάδα σχετικών ακολουθιών μέσα στο clade 1 [9] . Ενώ τα στελέχη NS5A της Ουρουγουάης (με κόκκινο) δεν συγκεντρώθηκαν σε ένα συγκεκριμένο κλάδο, αντίθετα, ομαδοποιήθηκαν διασκορπισμένα σε όλα τα μεγάλα κλάδια του κόσμου. Με σκοπό τη μελέτη των υποκαταστάσεων αμινοξέων (ΑΑ) κατά μήκος της πρωτεΐνης NS5A, οι αλληλουχίες HCV AA της Ουρουγουάης ευθυγραμμίστηκαν με παγκόσμιες συναινετικές αλληλουχίες NS5A (υπολείμματα 23 έως 354 σε σχέση με την αλληλουχία πρωτεΐνης NS5A). Εντοπίστηκαν υποκαταστάσεις ΑΑ σε θέσεις που είχαν προηγουμένως βρεθεί ότι δυνητικά σχετίζονται με αντοχή σε αναστολείς NS5A, καθώς και πολυμορφισμοί σε θέση RAS. Αυτά τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Οι αναστολείς RAS σε NS5A (L31M και L31V) ταυτοποιήθηκαν σε 2 στελέχη από 25 (8%) δείγματα με πλήρη αλληλουχία. Τα RAP βρέθηκαν σε 3 στελέχη (υποτύπος 1a): 2 εμφάνισαν την υποκατάσταση H58P και 1 την υποκατάσταση K24Q. Αν και αυτές οι αντικαταστάσεις δεν αναφέρθηκαν ως ανθεκτικές, ορισμένες αλλαγές σε αυτές τις θέσεις είχαν περιγραφεί προηγουμένως ως RAS στον υποτύπο 1a, συγκεκριμένα H58D και K24R [27, 28]. Τέλος, η υποκατάσταση E62D βρέθηκε σε ένα στέλεχος υποτύπου 1a. Αυτή η αλλαγή θεωρείται ως δευτερεύουσα υποκατάσταση επειδή, αν και δεν προσδίδει αντίσταση από μόνη της, όταν συνδυάζεται με ένα γνωστό RAS προκαλεί. Στην πραγματικότητα, προσδίδει υψηλότερο επίπεδο αντίστασης από αυτό που επιτυγχάνεται μόνο από το RAS [26] . Επιπλέον, ανιχνεύθηκαν επίσης αρκετοί πολυμορφισμοί που δεν έχουν αναφερθεί προηγουμένως ότι σχετίζονται με ανθεκτικό φαινότυπο (βλ. Συμπληρωματικό Πίνακα Υλικού S3). Για να μελετηθούν οι υποκαταστάσεις κατά μήκος της πρωτεΐνης NS5B, οι αλληλουχίες HCV AA της Ουρουγουάης ευθυγραμμίστηκαν με τις παγκόσμιες συναινετικές αλληλουχίες NS5B . Σχεδόν πλήρους μήκους αλληλουχίες ΑΑ ελήφθησαν σε 26 από τα 31 στελέχη που αναλύθηκαν. 23 αλληλουχίες καλύπτουν υπολείμματα 36 έως 539 ενώ οι υπόλοιπες 3 υπολείμματα 36 έως 557 της πρωτεΐνης NS5B. Αυτό το ζήτημα περιόρισε τις μελέτες μας, καθώς πολλά από τα περιγραφόμενα RASs παρατηρούνται στο υπόλειμμα 553. Σημαντικό είναι ότι τα RASs προς NS5B αναστολείς 2 ήταν T (Τ) παρατηρήθηκε σε 5 στελέχη από 26 δείγματα αλληλουχίας (19,2%). Το C451R βρέθηκε σε δύο απομονώσεις ενώ το A421V βρέθηκε μόνο σε ένα. Σε 2 από τα 3 στελέχη για τα οποία μπορέσαμε να λάβουμε μεγαλύτερες αλληλουχίες, παρατηρήθηκαν RASs S556G (υποτύπος 1a) και Q556R (υποτύπος 1b). Τέλος, βρήκαμε δύο RAP: A421V (σε 2 στελέχη υποτύπου 1b) και A553G (in 1 υποτύπος στέλεχος 1a). Αν και το A421V έχει συσχετιστεί με αντοχή στη μπεκαμπουβίρη (BCV) σε ασθενείς που έχουν μολυνθεί από τον υποτύπο 1a του HCV, αυτός ο ανθεκτικός φαινότυπος δεν έχει αποδειχθεί στα στελέχη του υποτύπου 1b [29] . Στη θέση 553, η υποκατάσταση που αναφέρθηκε ως ανθεκτική ήταν το A553T [8] . Όπως συνέβη για το NS5A, διαφορετικοί πολυμορφισμοί που δεν είχαν συσχετιστεί προηγουμένως με ανθεκτικό φαινότυπο ανιχνεύθηκαν επίσης στο NS5B (βλ. Συμπληρωματικό Πίνακα Υλικού S4). Η εμφάνιση των θεραπειών DAA αποτελεί μία από τις σημαντικότερες ανακαλύψεις στη διαχείριση ασθενών με λοίμωξη HCV. Ωστόσο, αυτές οι νέες θεραπευτικές επιλογές απέχουν πολύ από το να είναι παγκοσμίως διαθέσιμες, ιδίως για ασθενείς με HCV λοίμωξη που βασίζονται στα δημόσια συστήματα υγειονομικής περίθαλψης της Λατινικής Αμερικής. Οι κύριοι περιοριστικοί παράγοντες για την παγκόσμια πρόσβαση στα DAA στην περιοχή μας αφορούν το υψηλό κόστος, την ανεπαρκή διαχείριση των δημόσιων συστημάτων υγειονομικής περίθαλψης, την περιορισμένη πρόσβαση πληθυσμών με χαμηλό εισόδημα ή ανασφάλιστους σε παρόχους υγειονομικής περίθαλψης και την έλλειψη ακριβών επιδημιολογικών πληροφοριών [20, 30] [31] [32] . Στην Ουρουγουάη, αυτές οι θεραπείες έγιναν πρόσφατα διαθέσιμες, και παρόλο που ορισμένες έχουν εγκριθεί για χρήση από τις αρχές δημόσιας υγείας (θεραπείες Viekira pak και sofosbuvir/ledipasvir), δεν καλύπτονται προς το παρόν οικονομικά, εκτός από συγκεκριμένες περιπτώσεις. Παρά τα υψηλά ποσοστά ιικής ανταπόκρισης που επιτυγχάνονται με θεραπείες που βασίζονται σε DAA, ακόμα 1 έως 10% των ασθενών αποτυγχάνει να εξαλείψει τη λοίμωξη και σε αυτές τις περιπτώσεις, οι βασικές παραλλαγές αντίστασης και οι επείγουσες παραλλαγές αντίστασης αποδεικνύονται βασικοί παράγοντες που συμβάλλουν στην αποτυχία της θεραπείας [5, 17 , 33] .Δυστυχώς, επί του παρόντος δεν είμαστε σε θέση να αξιολογήσουμε σωστά τον αριθμό των ατόμων που έχουν μολυνθεί με HCV στην Ουρουγουάη και ακόμη περισσότερο να καταλάβουμε τη συχνότητα και τον τύπο των RAS που κυκλοφορούν. Αυτά τα γεγονότα θα μπορούσαν να θέσουν σε κίνδυνο την αποτελεσματικότητα αυτών των νέων θεραπειών στη χώρα μας. Έχουμε αναφέρει προηγουμένως ότι φυσικές υποκαταστάσεις που προσδίδουν αντοχή στους αναστολείς NS3 υπάρχουν σε σημαντικό ποσοστό ασθενών από την Ουρουγουάη που έχουν μολυνθεί με γονότυπο 1 HCV και δείξαμε ότι αυτή η συχνότητα φαινόταν να είναι υψηλότερα από ό,τι σε άλλες χώρες της Νότιας Αμερικής (Βραζιλία και Αργεντινή) [34] . Η παρούσα μελέτη περιγράφει τον επιπολασμό των βασικών NS5A και NS5B RAS σε ασθενείς που δεν είχαν μολυνθεί με γονότυπο 1 HCV σε μια ομάδα της Ουρουγουάης. Η παρουσία υποκαταστάσεων που προσδίδουν αντίσταση στους αναστολείς NS5A έχει αναφερθεί ευρέως τόσο σε ασθενείς που δεν έχουν υποβληθεί σε θεραπεία όσο και σε ασθενείς με υποτροπή από την Ευρώπη [10, 33, [35] [36] [37] [38] , ΗΠΑ [37, 39, 40] και Ασία [41] [42] [43] . Ωστόσο, οι αλληλουχίες NS5A από τη Νότια Αμερική έχουν αναλυθεί ελάχιστα ακόμη [9, 44]. Πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι ο μέσος επιπολασμός των RASs βασικής γραμμής γονότυπου 1 NS5A σε διαφορετικούς αναστολείς κυμαίνεται από 6% έως 16% χρησιμοποιώντας προσδιορισμό αλληλουχίας πληθυσμού ή ανάλυση σε βάθος [27, 37, 45, 46]. Είναι σημαντικό ότι ο επιπολασμός και ο τύπος των βασικών NS5A RAS ποικίλλει ελαφρώς ανά γεωγραφική περιοχή. Για παράδειγμα, το L31M βρέθηκε στο 2,2% των ασθενών με μολυσμένο γονότυπο 1α στην Ευρώπη, στο 4,1% αυτών στην Ωκεανία και εντυπωσιακά σε κανέναν ασθενή από τις ΗΠΑ [27] . Για το λόγο αυτό, πιστεύουμε ότι υπάρχει ανάγκη να συνεισφέρουμε δεδομένα από την περιοχή μας, για την οποία δεν έχουμε ακόμα αρκετές πληροφορίες, εκτός από τη Βραζιλία [9, 44] . Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης υποδεικνύουν την παρουσία DAA NS5A RAS σε 2 στελέχη HCV (8% των ασθενών που εγγράφηκαν σε αυτή τη μελέτη), με τα βασικά RAS να ανιχνεύονται στη θέση 31 (βλ. Πίνακα 1). Η υποκατάσταση L31M προσδίδει αντοχή στο daclatasvir (DCV), ledipasvir (LDV) και elbasvir (EBV) και στους δύο υποτύπους 1a και 1b [5, 6, 8, 28, 47, 48], ενώ η υποκατάσταση L31V το κάνει σε DCV στους υποτύπους 1a και 1b, σε LDV στον υποτύπο 1b, και σε EBV στον υποτύπο 1a [5, 6, 28]. Δεδομένου ότι τόσο το L31V όσο και το L31M είναι κλινικά σχετικά RAS, η ανίχνευσή τους κατά την έναρξη μπορεί να επηρεάσει την επιλογή των θεραπευτικών σχημάτων πρώτης γραμμής [28] .Οι υποκαταστάσεις H58P και K24Q που βρέθηκαν σε δύο ασθενείς θεωρούνται ως πολυμορφισμοί που σχετίζονται με την αντίσταση (RAPs). Τα RAS που χαρακτηρίστηκαν σε αυτές τις θέσεις ήταν H58D και K24G/N/R [5, 6, 27, 28, 49, 50]. Η υποκατάσταση H58P βρέθηκε ως βασική RAP σε υποτροπιάζοντες σε LDV (συνταγή HARVONI, https://www.gilead.com/-/ media/files/pdfs/medicines/liver-disease/harvoni/harvoni_pi. pdf?la=en). Ωστόσο, μερικές φορές θεωρείται ως RAS [10, 51], παρά το γεγονός ότι παρέχει μόνο 1,2 φορές αλλαγή στην αντίσταση σε μελέτες in vitro χρησιμοποιώντας το σύστημα αντιγραφής 1a [39]. Δεν βρήκαμε M28T/V, Q30R/H ή Y93H αντικαταστάσεις όπως είχαν αναφερθεί προηγουμένως στη Βραζιλία και παγκοσμίως [9, 27, 44] . Η υποκατάσταση αμινοξέος E62H βρέθηκε σε έναν ασθενή από την Ουρουγουάη. Αν και αυτή η αλλαγή δεν προσδίδει αντίσταση από μόνη της, αλλά σε συνδυασμό με το Q30R, δημιουργεί υψηλό επίπεδο αντίστασης στο DCV [52] . Η παρουσία βασικών NS5A RAS επηρεάζει την έκβαση της θεραπείας σε ορισμένες ομάδες ασθενών επηρεάζοντας τα ποσοστά SVR. Η ανίχνευση προϋπαρχόντων NS5A RAS μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην επιλογή των θεραπευτικών σχημάτων πρώτης γραμμής ή στην απλούστευση/βράχυνση των συνιστώμενων σχημάτων, προκειμένου να έρθουν τα ποσοστά SVR κοντά στα υψηλότερα επιτεύξιμα [27, 38, 41, 53] , ιδιαίτερα σε χώρες όπως η Ουρουγουάη, όπου μόνο δύο διαφορετικά θεραπευτικά σχήματα που περιέχουν DAA έχουν εγκριθεί για τη χρήση τους. Όσον αφορά το γονίδιο NS5B, η παγκόσμια ανάλυση (με εξαίρεση τη Νότια Αμερική [17, 19] ) αποκάλυψε ότι οι υποκαταστάσεις αντοχής στο NS5B DAA είναι σπάνια [14] . Η μελέτη μας έδειξε την παρουσία αναστολέων NS5B RAS σε 5 από τους 26 που αναλύθηκαν με HCV μολυσμένους ασθενείς της Ουρουγουάης που δεν είχαν λάβει θεραπεία (19,2%). Οι υποκαταστάσεις που βρέθηκαν σε αυτή την εργασία ήταν οι A421V και S556G που σχετίζονται στον υποτύπο 1a με αντοχή στο BCV και το dasabuvir (DSV), αντίστοιχα [8, 28, 29, 54, 55] και Q556R που σχετίζονται με αντοχή στο DSV τόσο στον γονότυπο 1a όσο και στο 1b. 12, 28]. Υποκατάσταση C451R, που παρατηρήθηκε σε δύο ασθενείς της Ουρουγουάης, αναφέρθηκε προηγουμένως σε ασθενείς που απέτυχαν να καθαρίσουν τη λοίμωξη μετά από θεραπεία με OBV/PTV/r + DSV ± RBV. Σε αυτές τις περιπτώσεις, εμφανίστηκε σε συνδυασμό με το G558R (Trial Coral I-Cohort 2: http:// www.hcv-trials.com/showStudy.asp?Study=86). Βρέθηκαν επίσης RAP στις θέσεις 421 και 553 (A421V σε δύο απομονώσεις υποτύπου 1b και A553G σε μία απομόνωση υποτύπου 1b). Αν και το A421V έχει συσχετιστεί με αντοχή στον BCV σε ασθενείς με υποτύπο 1a, αυτός ο φαινότυπος δεν έχει αποδειχθεί σε στελέχη του υποτύπου 1b [29] . Στη θέση 553, οι αντικαταστάσεις που αναφέρθηκαν ως ανθεκτικές είναι A553T στον υποτύπο 1a [8] και A553V στον υποτύπο 1b [54] , προσδίδοντας αντίσταση στο DSV. Σε αντίθεση με τα αποτελέσματά μας, ο Noble και οι συνεργάτες μας (2016) ανέφεραν την παρουσία V321A, A421G , M414V, Y448H, L159F και C316N σε βραζιλιάνικα στελέχη [17], ωστόσο καμία από αυτές τις μεταλλάξεις δεν βρέθηκε σε αυτή τη μελέτη, πιθανώς λόγω της ποικιλομορφίας που βρέθηκε μεταξύ των στελεχών της Ουρουγουάης και της Βραζιλίας (Εικόνα 2). Ωστόσο, η αντικατάσταση A421V βρέθηκε στη Βραζιλία [17] , την Αργεντινή [19] και την Ουρουγουάη. Το RAS S282T δεν εντοπίστηκε ούτε στις αναφορές της Βραζιλίας ούτε σε αυτήν την τρέχουσα εργασία (Ουρουγουάη) [17, 18, 56] . Τα ευρήματά μας επιβεβαιώνουν περαιτέρω και συμπληρώνουν προηγούμενες μελέτες που απέδειξαν χαμηλό επιπολασμό αυτής της υποκατάστασης in vivo, πιθανώς λόγω της χαμηλής αντιγραφικής καταλληλότητάς της [14, 18, 57]. Παρά τα αποτελέσματά μας, αξίζει να αναφέρουμε ότι η παρουσία βασικών NS5B RAS που προσδίδουν αντίσταση σε νουκλεοτιδικούς ή μη νουκλεοσιδικούς αναστολείς NS5B δεν έχει αποδειχθεί ότι έχει καμία επίδραση στις ιολογικές αποκρίσεις μέχρι στιγμής [53, 58] . Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν και τις δύο ποικιλομορφία στη βασική γραμμή πολυμορφισμοί που βρέθηκαν σε διαφορετικές χώρες της Λατινικής Αμερικής και στις εξελικτικές σχέσεις των απομονώσεων της Ουρουγουάης (Εικόνα 2). Το γεγονός αυτό θα μπορούσε να συνδεθεί όχι μόνο με τη γεωγραφική περιοχή των απομονώσεων και τα εγγενή χαρακτηριστικά του ιού αλλά και με το γενετικό υπόβαθρο του ξενιστή. Αξίζει να αναφέρουμε ότι ζούμε σε μια τεράστια ήπειρο που κατοικείται από πληθυσμούς με διαφορετικά γονοτυπικά χαρακτηριστικά που μπορεί, ανάλογα με την κατάσταση, να απαιτούν διαφορετικές προσεγγίσεις στη θεραπεία. Πράγματι, ανακαλύψαμε πρόσφατα ότι οι συχνότητες αλληλόμορφων και γονότυπου στον τόπο IL28B των ατόμων της Ουρουγουάης μοιάζουν πολύ με αυτές ενός μικτού πληθυσμού και όχι με έναν ομοιόμορφα ευρωπαϊκού απογόνου [59] . Συνολικά, πιστεύουμε ότι θα μπορούσε να είναι σημαντικό να πραγματοποιηθούν μελέτες σε ολόκληρη την περιοχή της Νότιας Αμερικής προκειμένου να διαπιστωθεί ο επιπολασμός των RAS σε NS5A και NS5B σε διαφορετικές χώρες. Στην πραγματικότητα, αυτό θα βοηθήσει στην κατανόηση ότι δεν μπορεί να είναι επαρκές κάθε θεραπευτικό σχήμα για κάθε ασθενή και κάθε χώρα. Τα δεδομένα που παρουσιάσαμε εδώ μπορεί να καθοδηγήσουν όχι μόνο τους γιατρούς στη λήψη θεραπευτικών αποφάσεων αλλά και τις αρχές δημόσιας υγείας στην έγκριση πιο διαφορετικών συνδυασμών θεραπείας. Αυτά τα σκευάσματα θεραπείας θα κάλυπταν τα περισσότερα από τα κυκλοφορούντα στελέχη στην περιοχή μας, μια περιοχή με εξαιρετικά διαφορετικό γενετικό υπόβαθρο πληθυσμού. Από ό,τι γνωρίζουμε, η παρούσα μελέτη αποκάλυψε για πρώτη φορά την παρουσία RASs στις περιοχές NS5A και NS5B του γονότυπου 1 του HCV Στελέχη της Ουρουγουάης από ασθενείς που δεν έχουν λάβει προηγουμένως θεραπεία με DAA και είναι μία από τις λίγες χώρες της Νότιας Αμερικής που αναφέρουν αυτό το θέμα. Δεν είναι επί του παρόντος ασαφές εάν προϋπάρχουσες ιικές παραλλαγές με μειωμένη ευαισθησία στα DAA είναι κλινικά σημαντικές για την πρόβλεψη της αποτυχίας της ιολογικής θεραπείας. Ωστόσο, η εξατομικευμένη θεραπεία DAA που βασίζεται στην αρχική ανάλυση αντίστασης μπορεί να είναι επωφελής για τη βελτιστοποίηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας σε ασθενείς με λοίμωξη γονότυπου 1 HCV και παράγοντες κινδύνου για αποτυχία της θεραπείας. Ως εκ τούτου, ο πιθανός ρόλος της αρχικής δοκιμής αντίστασης παραμένει μια περιοχή κρίσιμης έρευνας και κλινικών ερωτημάτων. Τα δεδομένα που χρησιμοποιούνται για την υποστήριξη των ευρημάτων αυτής της μελέτης περιλαμβάνονται στο άρθρο. Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν έχουν σύγκρουση συμφερόντων. Fabián Aldunate και Natalia Ο Echeverría συνέβαλε εξίσου σε αυτήν την εργασία. Πίνακας Συμπληρωματικού Υλικού S1: Οι αλληλουχίες NS5A και NS5B του ιού της ηπατίτιδας C που χρησιμοποιούνται ως εκπρόσωποι κάθε γονότυπου για τη διεξαγωγή της φυλογενετικής ανάλυσης. Υποδεικνύεται ο αντίστοιχος γονότυπος τους, η χώρα απομόνωσης και ο αριθμός προσχώρησης GenBank. Συμπληρωματικό υλικό Πίνακας S2: Αλληλουχίες υποτύπου 1a του ιού ηπατίτιδας C NS5A που χρησιμοποιούνται για την αποκάλυψη εξελικτικών σχέσεων μεταξύ στελεχών της Ουρουγουάης και άλλων στελεχών που έχουν απομονωθεί αλλού. Υποδεικνύεται η αντίστοιχη χώρα απομόνωσής τους και ο αριθμός προσχώρησης στη GenBank. Συμπληρωματικό υλικό Πίνακας S3: υποκαταστάσεις αμινοξέων σε πρωτεΐνη NS5A που δεν είχαν συσχετιστεί προηγουμένως με αντίσταση σε αναστολείς NS5A. Συμπληρωματικό υλικό Πίνακας S4: υποκαταστάσεις αμινοξέων στην πρωτεΐνη NS5B που δεν είχαν συσχετιστεί προηγουμένως με αντοχή σε αναστολείς πολυμεράσης. (Συμπληρωματικά Υλικά)", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 8038, "text": "31" } ], "id": 3898, "question": "Πόσοι ασθενείς μελετήθηκαν;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5773, "text": "5 μl" } ], "id": 3900, "question": "Πόσο από το εκμαγείο RNA βρισκόταν στο μείγμα αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής;" }, { "answers": [ { "answer_start": 12988, "text": "προσδίδει υψηλότερο επίπεδο αντίστασης από αυτό που επιτυγχάνεται μόνο από το RAS" } ], "id": 3902, "question": "Γιατί είναι σημαντική η υποκατάσταση E62D στην αντοχή στα φάρμακα;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Αποτελεσματική παραγωγή ιών ανασυνδυασμένου RNA χρησιμοποιώντας στοχευμένη μεταλλαξογένεση με τη μεσολάβηση ανασυνδυασμού βακτηριακών τεχνητών χρωμοσωμάτων που περιέχουν cDNA πλήρους μήκους Risager, Peter Christian; Fahnøe, Ulrik; Friis, Martin Barfred; Belsham, Graham J; Höper, Dirk; Reimann, Ilona; Beer, Martin Ημερομηνία: 2013-11-22DOI: 10.1186/1471-2164-14-819Άδεια: cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Οι μολυσματικοί κλώνοι cDNA αποτελούν προϋπόθεση για κατευθυνόμενο γενετικό χειρισμό των ιών RNA. Εδώ, περιγράφεται μια στρατηγική για τη διευκόλυνση του χειρισμού και της διάσωσης των ιών της κλασικής πανώλης των χοίρων (CSFVs) από πλήρους μήκους cDNA που υπάρχουν σε βακτηριακά τεχνητά χρωμοσώματα (BAC). Αυτή η στρατηγική επιτρέπει τον χειρισμό του ιικού cDNA με στοχευμένη μεταλλαξογένεση που προκαλείται από ανασυνδυασμό μέσα στα βακτήρια. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Ένα νέο CSFV-BAC (pBeloR26) που προέρχεται από το στέλεχος εμβολίου Riems κατασκευάστηκε και στη συνέχεια τροποποιήθηκε στην κωδικοποιητική αλληλουχία Ε2, χρησιμοποιώντας τη στρατηγική στοχευμένου ανασυνδυασμού για να καταστεί δυνατή η διάσωση χιμαιρικών λοιμοϊών (vR26_E2gif και vR26_E2Gif και vR2, δυναμικό vaccc) υποψηφίους. Η αλληλούχιση των BAC αποκάλυψε υψηλή γενετική σταθερότητα κατά τη διάρκεια διελεύσεων μέσα στα βακτήρια. Οι πλήρεις αλληλουχίες γονιδιώματος των διασωθέντων ιών, μετά από εκτεταμένα περάσματα σε κύτταρα θηλαστικών έδειξαν ότι οι τροποποιήσεις στην κωδικοποιητική αλληλουχία της πρωτεΐνης Ε2 διατηρήθηκαν σταθερά. Μια απλή υποκατάσταση αμινοξέος (D3431G) στην εξαρτώμενη από RNA πολυμεράση RNA παρατηρήθηκε στους διασωθέντες ιούς vR26_E2gif και vR26, η οποία ήταν επαναφορά στη γονική αλληλουχία Riems. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η στοχευμένη μεταλλαξογένεση που προκαλείται από ανασυνδυασμό παρέχει ένα ισχυρό εργαλείο για την επιτάχυνση της κατασκευής νέων γονιδιωμάτων RNA και θα πρέπει να είναι εφαρμόσιμο στον χειρισμό άλλων ιών RNA. Κείμενο: Τα βακτηριακά τεχνητά χρωμοσώματα (BAC) είναι ιδανικά κατάλληλα για σταθερή συντήρηση μεγάλων αλληλουχιών DNA που προέρχονται από ιικά γονιδιώματα [1] . Ένας σημαντικός αριθμός συστημάτων BAC έχει καθιερωθεί για μεγάλους ιούς DNA. Συγκεκριμένα, πολλά διαφορετικά γονιδιώματα ιού έρπητα έχουν κλωνοποιηθεί σε BAC (για ανασκόπηση βλ. [2] ). Τα πρώτα συστήματα BAC που χρησιμοποιούν cDNA ιού RNA περιγράφηκαν για κοροναϊούς [3] [4] [5] [6] και πρόσφατα περιγράφηκε το πρώτο BAC που περιέχει ένα πλήρους μήκους cDNA για έναν ιό αρνητικού κλώνου RNA [7] . Ομοίως, cDNA που αντιστοιχούν στα γονιδιώματα πλήρους μήκους των μελών της οικογένειας Flaviviridae (ιός της Ιαπωνικής εγκεφαλίτιδας [8] και ιός του δάγκειου πυρετού [9] ) έχουν εισαχθεί σε BAC. BACs που περιέχουν πλήρους μήκους cDNA των λοιμοϊών (επίσης εντός των Flaviviridae) , συμπεριλαμβανομένου του ιού της ιογενούς διάρροιας των βοοειδών (BVDV) και του ιού της κλασικής πανώλης των χοίρων (CSFV) έχουν πρόσφατα καθιερωθεί [10, 11]. Οι λοιμώδεις παρασιτοϊοί μπορούν να διασωθούν χρησιμοποιώντας μεταγραφές RNA που προέρχονται από αυτά τα BAC. Οι λοιμοϊοί έχουν μονόκλωνα γονιδιώματα RNA θετικής αίσθησης, μήκους περίπου 12,3 kb, το οποίο περιλαμβάνει ένα ενιαίο μακρύ ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης, που κωδικοποιεί μια μεγάλη πολυπρωτεΐνη, πλαισιωμένη από 5' και 3' αμετάφραστες περιοχές (UTRs) που είναι κρίσιμες για την αυτόνομη αντιγραφή του γονιδίωμα [12, 13] . Η πολυπρωτεΐνη διασπάται από κυτταρικές και ιικές πρωτεάσες σε τέσσερις δομικές πρωτεΐνες (πρωτεΐνη νουκλεοκαψιδίου C, γλυκοπρωτεΐνες φακέλου Erns, E1 και E2) και οκτώ μη δομικές πρωτεΐνες (N pro, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5BSA). Η διαθεσιμότητα γενετικά καθορισμένων και σταθερών BAC των παρασιτοϊών διευκολύνει τη λειτουργική μελέτη ιικών πρωτεϊνών ή δομών RNA και επίσης την ανάπτυξη νέων υποψηφίων εμβολίων δεικτών. Πολλά εμβόλια CSFV με ιδιότητες δεικτών που βασίζονται σε χιμαιρικούς παρασιτοϊούς έχουν αναπτυχθεί όλα αυτά τα χρόνια [14]. Συγκεκριμένα, έχουν περιγραφεί χιμαιρικοί παρασιτοϊοί με υποκατάσταση ολόκληρης της πρωτεΐνης Ε2 [15] [16] [17] αλλά και μεταλλάκτες με πιο λεπτές τροποποιήσεις, όπως η τροποποίηση του σημαντικού επιτόπου TAV [18] εντός του CSFV-E2 Η πρωτεΐνη [19, 20] είναι πολλά υποσχόμενα εμβόλια δεικτών. Ο χειρισμός των BACs χρησιμοποιώντας παραδοσιακές διαδικασίες κλωνοποίησης μπορεί να είναι δύσκολος (π.χ. λόγω έλλειψης βολικών θέσεων περιοριστικών ενζύμων) και συνεπώς μιας σειράς μεθοδολογιών που εφαρμόζουν τη βακτηριακή γενετική, συμπεριλαμβανομένου του ομόλογου ανασυνδυασμού (π.χ. Ο ομόλογος ανασυνδυασμός ερυθρού/ΕΤ) εντός του ξενιστή E. coli έχει αναπτυχθεί (για ανασκόπηση, βλ. [21] ). Η χρήση ομόλογου ανασυνδυασμού επιτρέπει την κατευθυνόμενη μεταλλαξιογένεση των BACs [22] και, χρησιμοποιώντας ένα σχήμα αντιεπιλογής, μπορούν να επιτευχθούν συγκεκριμένες τροποποιήσεις χωρίς να αφήνονται υπολειμματικές «ξένες» αλληλουχίες [23] . Το κύριο πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι δεν υπάρχουν περιορισμοί στόχου (π. με βάση το μέγεθος ή την τοποθεσία) και δεν χρειάζονται κατάλληλες θέσεις περιορισμού. Η ενσωμάτωση της τροποποιημένης αλληλουχίας πραγματοποιείται in vivo (εντός του E. coli) και έτσι είναι δυνητικά πιο ακριβής από τις in vitro προσεγγίσεις όπως οι μέθοδοι που βασίζονται σε PCR. Παρόλο που οι in vitro προσεγγίσεις κλωνοποίησης που βασίζονται στη χρήση πολυμερασών υψηλής πιστότητας για ενίσχυση PCR έχουν βελτιωθεί σημαντικά τα τελευταία χρόνια, η χρήση in vivo προσεγγίσεων θα πρέπει να επιτρέπει μια πιο ακριβή μέθοδο μεταλλαξιογένεσης λόγω της χρήσης των κυττάρων υψηλής πιστότητας αντιγραφής σύστημα που περιλαμβάνει αποδεικτική ανάγνωση. Ενώ ο ανασυνδυασμός BAC έχει χρησιμοποιηθεί συνήθως για την τροποποίηση ιών DNA, υπάρχουν μόνο πολύ λίγες αναφορές σχετικά με τη χρήση αυτής της τεχνολογίας για ιούς RNA [7, 24, 25]. Εδώ, μια γενικά εφαρμόσιμη στρατηγική για τον χειρισμό και τη διάσωση χιμαιρικών παρασιτοιών από Τα BACs περιγράφονται ως μοντέλο και η ευελιξία αυτής της προσέγγισης αποδεικνύεται με τη δημιουργία διαφορετικών τροποποιήσεων στο ιικό cDNA του νέου CSFV-BAC, pBeloR26, που προέρχεται από το τροποποιημένο στέλεχος ζωντανού εμβολίου \"C-strain Riems\". Η στοχευμένη μεταλλαξογένεση με τη μεσολάβηση ανασυνδυασμού που περιγράφεται εδώ περιλαμβάνει την υποκατάσταση του γραμμικού επιτόπου TAV 9 αμινοξέων (TAVSPTTLR) που υπάρχει στην πρωτεΐνη Ε2 με την αντίστοιχη περιοχή (TTVSTSTLA) ενός ετερόλογου παρασιτοϊού (ιός οριακής νόσου, BDV, στέλεχος \"Gifhorn\") και επίσης την αντικατάσταση ολόκληρης της περιοχής κωδικοποίησης της πρωτεΐνης CSFV E2 με ολόκληρη την κωδικεύουσα περιοχή Ε2 από το ίδιο BDV, για τη δημιουργία σημαντικών ιών εμβολίων που μπορούν να διακριθούν χρησιμοποιώντας ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα αντι-Ε2. Η γενετική σταθερότητα τόσο των κατασκευών BAC (εντός του E. coli) όσο και των διασωθέντων ιών έχουν επίσης αξιολογηθεί. Κύτταρα νεφρού χοίρου (PK15) και εμβρυϊκού θυμοειδούς προβάτου (SFT-R) αναπτύχθηκαν στους 37°C (με 5% (v /v) CO 2 ) στο ελάχιστο απαραίτητο μέσο Dulbecco (DMEM) συμπληρωμένο με 5% (v/v) ορό εμβρύου μόσχου χωρίς λοιμοϊούς. Ο ιός από ένα δόλωμα που περιέχει το τροποποιημένο ζωντανό εμβόλιο CSFV \"C-strain Riems\" (Riemser Arzneimittel AG, Γερμανία) πολλαπλασιάστηκε μία φορά σε κύτταρα ΡΚ15 και ονομάστηκε vRiemser. Το RNA που ελήφθη από το στέλεχος BDV \"Gifhorn\" [26] χρησιμοποιήθηκε για την ενίσχυση της κωδικεύουσας αλληλουχίας Gifhorn E2. Οι εκκινητές ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιούνται παρατίθενται στο πρόσθετο αρχείο 1: Πίνακας S1. Το κατασκεύασμα BAC, pBeloR26, κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας τη μακρά RT-PCR μέθοδος όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11] χρησιμοποιώντας RNA που προέρχεται από το \"C-strain Riems\". Εν συντομία, πλήρους μήκους ιικά cDNA που πλαισιώνονται από θέσεις NotI ενισχύθηκαν με μακρά RT-PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές 5'Cstrain_T7_Not1 (ο οποίος περιλαμβάνει έναν προαγωγέα Τ7 για in vitro μεταγραφή, μια θέση NotI και μια περιοχή που αντιστοιχεί στα πρώτα 44 nt του γονιδιώματος) και 3'CSFV_Not1 (που περιέχει μια θέση NotI και αλληλουχία συμπληρωματική προς το 3'-τελικό 35 nt του γονιδιώματος που διατηρούνται μεταξύ πολλών CSFV συμπεριλαμβανομένου του Cstrain). Το προϊόν (περ. 12,3 kbp) υπέστη πέψη με NotI και εισήχθη σε παρόμοια χωνευμένο pBeloBAC11 (New England Biolabs, GenBank accession U51113). Όλα τα BAC τροποποιήθηκαν και διατηρήθηκαν σε κύτταρα E. coli DH10B (Invitrogen) που αναπτύχθηκαν στους 37°C σε μέσο LB που περιείχε χλωραμφενικόλη (Cam, 15 μg/ml). Η ηλεκτροδιάτρηση των βακτηρίων πραγματοποιήθηκε σε κυψελίδες 0,1 cm με χρήση 1 παλμού στα 1800 V, 25 μF και 200 ​​Ω σε Gene Pulser Xcell (Bio-Rad). Τα BAC που θα χρησιμοποιηθούν ως εκμαγεία για μακροχρόνια PCR ή για διαλογή με πέψη με περιοριστικά ένζυμα καθαρίστηκαν από 4 ml ολονύκτια καλλιέργειες Ε. coli DH10B χρησιμοποιώντας το κιτ ZR BAC DNA Miniprep (Zymo Research). Τα BACs που απαιτούνται για τον άμεσο προσδιορισμό της αλληλουχίας του γονιδιώματος καθαρίστηκαν από καλλιέργειες 500 ml χρησιμοποιώντας το κιτ μεγάλης κατασκευής (Qiagen). Οι τροποποιήσεις στο πλήρους μήκους cDNA CSFV πραγματοποιήθηκαν σε E. coli DH10B (ανθεκτικό σε στρεπτομυκίνη, Strep R) χρησιμοποιώντας το Counter Selection BAC Κιτ (Gene Bridges, Heidelberg, Germany). Ο ανασυνδυασμός Red/ET περιλάμβανε τρία στάδια (i-iii). Βήμα i) το ευαίσθητο στη θερμοκρασία πλασμίδιο έκφρασης pRedET (Gene Bridges) εισήχθη σε κύτταρα E.coli DH10B ικανά για ηλεκτροδιάτρηση που περιείχαν το γονικό BAC (φαινότυπος Cam R, Strep R). Το pRedET εκφράζει τις πρωτεΐνες φάγου λάμδα reda, redβ και redγ, υπό τον έλεγχο του επαγόμενου από αραβινόζη προαγωγέα pBAD, επιτρέποντας την εμφάνιση ομόλογου ανασυνδυασμού. Αμέσως μετά την ηλεκτροδιάτρηση, προστέθηκε προθερμασμένο μέσο LB χωρίς αντιβιοτικά (1 ml) στα κύτταρα τα οποία στη συνέχεια επωάστηκαν στους 30°C για 1 ώρα, πριν απλωθούν σε πλάκες άγαρ που περιέχουν Cam (15 μg/ml) και τετρακυκλίνη (Tet ) (3 μg/ml) και στη συνέχεια επωάστηκε στους 30°C όλη τη νύχτα για να διατηρηθεί το pRedET. Η παρουσία του πλασμιδίου pRedET (που προσδίδει TetR) επαληθεύτηκε με οπτική επιθεώρηση παρασκευασμάτων BAC-DNA από τις αποικίες Cam R/Tet R χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης. Βήμα ii) κασέτες δεικτών αντιεπιλογής με μια επιπλέον θέση NotI για σκοπούς διαλογής (rpsL-neo, 1325 bp) ενισχύθηκαν με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές με επεκτάσεις 30 nt ή 50 nt που ήταν ομόλογες με τη θέση στόχο στο BAC χρησιμοποιώντας το πλασμίδιο rpsL-neo (Gene Bridges) ως πρότυπο και το Phusion hot start II HF DNA πολυμεράση (Thermo Scientific) με συνθήκες κύκλου ως εξής: 98°C για 30 δευτερόλεπτα, ακολουθούμενο από 35 κύκλους 98°C για 10 δευτερόλεπτα, 60°C για 20 δευτερόλεπτα, 72°C για 60 δευτερόλεπτα και 1 κύκλο στους 72°C για 4 ελάχ. Τα προϊόντα PCR (περ. 1400 bp) απομονώθηκαν σε γέλες αγαρόζης ΤΒΕ 1% (β/ο) και καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ εκχύλισης γέλης GeneJET (Thermo Scientific). Δείγματα (30 μl), από καλλιέργεια E. coli που περιέχει pRedET και το γονικό BAC που αναπτύχθηκε όλη τη νύχτα στους 30°C σε μέσο LB (Cam, Tet), χρησιμοποιήθηκαν για τον εμβολιασμό 1,4 ml φρέσκου μέσου LB με τα ίδια αντιβιοτικά για να ληφθούν εκθετικά ανάπτυξη βακτηρίων στους 30°C. Οι πρωτεΐνες ανασυνδυασμού κόκκινου/ΕΤ προκλήθηκαν με την προσθήκη 50 μl L-αραβινόζης 10% (w/v) (Sigma). Το προϊόν PCR (200 ng) που περιέχει την κασέτα rpsL-neo εισήχθη σε αυτά τα βακτήρια χρησιμοποιώντας ηλεκτροδιάτρηση (όπως παραπάνω). Μετά την ηλεκτροδιάτρηση, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37°C για 70 λεπτά (για να επιτραπεί ο ανασυνδυασμός) και στη συνέχεια επιλέχθηκαν σε πλάκες που περιείχαν Cam (15 μg/ml), Tet (3 μg/ml) και καναμυκίνη (Kan, 15 μg/ml) όλη τη νύχτα στους 30°C για να διατηρηθεί το pRedET. Σημείωση, η κασέτα rpsL προσδίδει ευαισθησία στη στρεπτομυκίνη (Strep S) στο ανθεκτικό στέλεχος DH10B και η κασέτα neo προσδίδει αντοχή στην καναμυκίνη (Kan R). Ο σωστός φαινότυπος (Cam R, Kan R, Tet R, Strep S) των αποικιών που προέκυψαν επιβεβαιώθηκε με ρίψη των αποικιών σε πλάκες που περιείχαν Cam (15 μg/ml), Tet (3 μg/ml) και Kan (15 μg/ml). ml) και αναπτύχθηκε στους 30°C. Είναι σημαντικό ότι για το τρίτο βήμα, την αντικατάσταση της κασέτας rpsL-neo (με χρήση αντι-επιλογής), οι επιλεγμένες αποικίες στρώθηκαν επίσης σε πλάκες που περιείχαν Cam (15 μg/ml) συν Strep (50 μg/ml) και αποδείχθηκαν ότι είναι Strep S που δείχνει την ενσωμάτωση ενός λειτουργικού γονιδίου rpsL. Οι δομές των ενδιάμεσων BAC επαληθεύτηκαν με ανάλυση ενζύμου περιορισμού και αλληλούχιση γύρω από τα ένθετα. Βήμα iii) η αντικατάσταση των κασετών επιλογής rpsL-neo από τα ενδιάμεσα κατασκευάσματα χρησιμοποιώντας γραμμικά θραύσματα DNA επιτεύχθηκε μέσω αντι-επιλογής και ανασυνδυασμού Ερυθρού/ΕΤ. Και πάλι, οι ομόλογες αλληλουχίες στα άκρα του θραύσματος DNA χρησιμοποιήθηκαν για συμβάντα ανασυνδυασμού που προκαλούνται από Red/ET για να αντικαταστήσουν την κασέτα rpsL-neo με την αλληλουχία που μας ενδιαφέρει. Χρησιμοποιήθηκε αντιεπιλογή έναντι της κασέτας rpsL-neo (φαινότυπος Cam R , Kan R , Tet R , Strep S ) χρησιμοποιώντας μέσα που περιέχουν Cam (15 μg/ml) και Strep (50 μg/ml) για την απομόνωση των απαιτούμενων παραγώγων (φαινότυπος Cam R και Strep R). Αρχικά, το ενδιάμεσο κατασκεύασμα, pBeloR26_E2rpsLneo (Εικόνα 1), δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμό Red/ET με εισαγωγή της κασέτας rpsL-neo με μια επιπλέον θέση NotI για σκοπούς διαλογής, η οποία ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές Criems-TAVfor και Criems-TAV -TAVrev (Πρόσθετο αρχείο 1: Πίνακας S1 ) στη θέση της ακολουθίας κωδικοποίησης TAVSPTTLR (27 nt) . Δεύτερον, η κασέτα rpsL-neo σε αυτό το ενδιάμεσο κατασκεύασμα στη συνέχεια αντικαταστάθηκε χρησιμοποιώντας αντιεπιλογή ανασυνδυασμού Red/ET χρησιμοποιώντας ένα μονόκλωνο ολιγονουκλεοτίδιο, Riems_TAV_Gifhorn (Πρόσθετο αρχείο 1: Πίνακας S1 ) με τους ίδιους βραχίονες ομολογίας που χρησιμοποιήθηκαν για το rpsL-neo κασέτα, για την εισαγωγή της κωδικοποιητικής ακολουθίας για την ακολουθία επιτόπου BDV \"Gifhorn\" (TTVSTSTLA). Το κατασκεύασμα που προέκυψε ονομάστηκε pBeloR26_TAV (Εικόνα 1). Το αρχικό ενδιάμεσο κατασκεύασμα (με rpsL-neo) στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για να παραχθεί το κατασκεύασμα pBeloR26_E2gif (Εικόνα 1). Για αυτό, η κωδικοποιητική αλληλουχία Ε2 ενισχύθηκε από cDNA που παρασκευάστηκε από RNA BDV \"Gifhorn\" χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά ζεύγη εκκινητών, το ένα σετ με βραχίονες ομολογίας 50 nt (Criems_E2_gifFlong/Criems_ E2_gifRlong) και ένα άλλο με 30 nt ομόλογες αλληλουχίες (2_Criif_Fequence) Για τη δημιουργία BAC με αντικατάσταση ολόκληρων κωδικοποιητικών αλληλουχιών Ε2, δημιουργήθηκαν προϊόντα PCR που αποτελούνται από την αλληλουχία ενδιαφέροντος που πλαισιώνεται με βραχίονες ομολογίας πανομοιότυπους με την περιοχή στόχου (όπως για την κασέτα rpsLneo). Για την κατασκευή κατασκευών με αντικατάσταση μικρότερων αλληλουχιών (π.χ. τον επίτοπο TAV), ο ανασυνδυασμός επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας συνθετικά μονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια αντί για προϊόντα PCR. Η προθέρμανση των μονόκλωνων ολιγονουκλεοτιδίων στους 95°C για 2 λεπτά ακολουθούμενη από ταχεία κατάψυξη, πριν από την ηλεκτροδιάτρηση, έδειξε εμπειρικά τα καλύτερα αποτελέσματα. Σε κάθε περίπτωση, τα μόρια DNA εισήχθησαν σε Ε. coli που περιέχει τα παράγωγα BAC συμπεριλαμβανομένων των κασετών rpsL-neo μαζί με το πλασμίδιο pRedET με ηλεκτροδιάτρηση όπως περιγράφεται παραπάνω. Οι δομές των τροποποιημένων BAC επαληθεύτηκαν με ανάλυση ενζύμου περιορισμού και επακόλουθο προσδιορισμό αλληλουχίας πλήρους γονιδιώματος (βλ. παρακάτω). Το BAC DNA (1 μg) γραμμικοποιήθηκε με NotI ή 1 μl BAC DNA χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για μακροχρόνια ενίσχυση PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές 5' C-strain_T7_Not1 και 3′CSFV (Επιπλέον αρχείο 1: Πίνακας S1 ). Τα γραμμικά BAC ή τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν με το κιτ καθαρισμού GeneJet PCR (Thermo Scientific) και μεταγράφηκαν in vitro χρησιμοποιώντας κιτ Megascript Τ7 (Invitrogen). Οι ιοί διασώθηκαν από μεταγραφές RNA (1 έως 5 μg) με ηλεκτροδιάτρηση κυττάρων χοίρου (PK15) ή προβάτου (SFT-R) ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24] . Τα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο ανοσοφθορισμού (συνήθως μετά από 3 ημέρες) για την έκφραση των πρωτεϊνών NS3 και E2 χρησιμοποιώντας ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs), αυτά ήταν αντι-NS3 (WB103/105, παν-πεστιϊός), αντι-CSFV E2 (WH211, WH303, τόσο ειδικό για CSFV) όσο και αντι-BDV E2 (WB166, BVDV/BDV ειδικό) (AHVLA Scientific, Ηνωμένο Βασίλειο) μαζί με το συζευγμένο Alexa 488 αντίσωμα κατσίκας IgG αντιποντικού (Molecular Probes, Invitrogen). Οι πυρήνες των κυττάρων οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας DAPI (Vector Laboratories) και οι εικόνες καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού BX63 (Olympus). Για τη χρώση με υπεροξειδάση, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για την παρουσία αντιγόνων παρασιτοϊού χρησιμοποιώντας βιοτινυλιωμένη πολυκλωνική IgG αντι-CSFV/BVDV χοίρου ακολουθούμενη από συζευγμένη με αβιδίνη υπεροξειδάση χρένου (eBioscience) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Η ίδια διαδικασία χρώσης πραγματοποιήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας τα mAbs αντι-Ε2. Δείγματα που περιείχαν κύτταρα θετικά στον ιό μεταβιβάστηκαν σε νέα κύτταρα. Οι καμπύλες ανάπτυξης ιών δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24] . Εν συντομία, κύτταρα PK15 ή SFT-R μολύνθηκαν σε πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 0,1 pfu/κύτταρο και αναπτύχθηκαν για τρεις ημέρες. BAC DNA (5 μg), που καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ μεγάλης κατασκευής (Qiagen) ή προϊόντα PCR (1 μg) που ενισχύθηκαν από ιικό cDNA ή από BAC χρησιμοποιώντας τη μέθοδο long PCR (όπως παραπάνω) αλληλουχήθηκαν με συναίνεση χρησιμοποιώντας ένα 454 FLX (Roche ) ή ένα Ion PGM (Life Technologies). Τόσο ο Newbler (Roche) όσο και ο αλγόριθμος ευθυγράμμισης bwa.bwasw [28] χρησιμοποιήθηκαν για την αντιστοίχιση των αναγνώσεων στην αναμενόμενη ακολουθία. Ένας συνδυασμός Samtools [29] και LoFreq SNV-caller [30] χρησιμοποιήθηκε για την κατάντη ανάλυση παραλλαγής ενός νουκλεοτιδίου (SNV). Τέλος, οι συναινετικές αλληλουχίες κλώνων ευθυγραμμίστηκαν χρησιμοποιώντας MAFFT στην πλατφόρμα λογισμικού Geneious (Biomatters). Δημιουργία ενός BAC που περιέχει πλήρους μήκους cDNA που αντιστοιχεί στα τροποποιημένα ζωντανά εμβόλια \"C-strain Riems\" BAC που περιέχουν το πλήρους μήκους cDNA που αντιστοιχεί στο γονικό Το vRiemser (\"C-strain Riems\") κατασκευάστηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως για το στέλεχος \"Paderborn\" του CSFV [11] . Τα BAC που περιέχουν τα πλήρη cDNA του CSFV ταυτοποιήθηκαν με περιορισμό Σχήμα 1 Σχηματική αναπαράσταση της οργάνωσης του γονιδιώματος CSFV και των BAC που κατασκευάστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Τοποθεσίες νουκλεοτιδίων (nt) και αμινοξέων (aa) εντός R26 για τα άκρα 5' και 3' μαζί με τα κωδικόνια έναρξης και λήξης της μετάφρασης της κωδικοποιητικής περιοχής πολυπρωτεΐνης συν θέσεις διάσπασης που χρησιμοποιούνται για την κατασκευή των μεμονωμένων πρωτεϊνών (N pro, C, E Τα rns, Ε1, Ε2, ρ7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A και NS5B) υποδεικνύονται. Η εισαγωγή του rpsL-neo στη θέση του επιτόπου TAV εντός του CSFV E2 για το ενδιάμεσο κατασκεύασμα (R26_rpsLneo) και η επακόλουθη αντικατάσταση με την ακολουθία TTVSTSTLA (R26_TAV) και η πλήρης αντικατάσταση της αλληλουχίας Ε2 (R26_E2gif). Τα ονόματα των κατασκευών BAC ξεκινούν με \"pBelo\" και οι διασωθέντες ιοί με \"v\" (π.χ. pBeloR26 και vR26). Πέρασμα κυτταροκαλλιέργειας αρ. του ιού υποδεικνύεται με \"/P\" (π.χ. vR26/P-4) ανάλυση πέψεως και μετά από γραμμικοποίηση με NotI, παράχθηκαν μεταγραφές RNA και ηλεκτροδιατρήθηκαν σε κύτταρα ΡΚ15. Αυτή η διαλογή οδήγησε στην ταυτοποίηση ενός BAC που περιέχει ένα ένθετο cDNA 12316 nt, pBeloR26 (Εικόνα 1), το οποίο έδωσε μολυσματικό ιό, που ονομάζεται vR26, που θα μπορούσε να πολλαπλασιαστεί σε κύτταρα SFT-R (Εικόνα 2, άνω πίνακες) και σε PK15 κύτταρα (Εικόνα 3). Το διασωθέν vR26 εμφάνισε υψηλότερο ρυθμό ανάπτυξης στο αρχικό στάδιο (περίπου 10 φορές διαφορά στην απόδοση του ιού στις 24 ώρες) σε σύγκριση με τον γονικό ιό του εμβολίου, αλλά μετά από 48 ώρες ελήφθησαν παρόμοιοι τίτλοι ιού (Εικόνα 3). Η αλληλουχία πλήρους γονιδιώματος του κλωνοποιημένου προτύπου BAC, pBeloR26, αποκάλυψε έναν αριθμό διαφορών σε όλο το γονιδίωμα σε σύγκριση με την πλήρους μήκους συναινετική αλληλουχία του cDNA που χρησιμοποιήθηκε για τη διαδικασία κλωνοποίησης (βλ. Πίνακα 1). Αυτές οι διαφορές είναι μη αντιπροσωπευτικές παραλλαγές εντός του cDNA. Συνολικά, η αλληλουχία BAC διέφερε από την αλληλουχία cDNA σε 18 θέσεις, 9 από αυτές οδηγούν σε προβλεπόμενες υποκαταστάσεις αμινοξέων εντός της πολυπρωτεΐνης. μία σε κάθε ένα από τα Npro, Erns, E1, E2 και NS3 και τέσσερις υποκαταστάσεις αμινοξέων στο NS5B (Πίνακας 1). Σε σύγκριση με τη δημοσιευμένη αλληλουχία αναφοράς (GenBank accession AY259122.1), η αλληλουχία pBeloR26 BAC διέφερε σε επιπλέον 11 θέσεις, 1 από αυτές οδηγεί σε μια προβλεπόμενη υποκατάσταση αμινοξέος και υπήρξε μία μεγάλη εισαγωγή (27 nt) στην υπερμεταβλητή περιοχή του 3'-UTR (Επιπρόσθετο αρχείο 2: Πίνακας S2). Για να προσδιοριστεί η χρησιμότητα του συστήματος στοχευόμενης μεταλλαξογένεσης με μεσολάβηση ανασυνδυασμού για παρασιτοϊούς, δημιουργήθηκαν δύο διαφορετικές τροποποιήσεις της κωδικοποιητικής αλληλουχίας πρωτεΐνης Ε2 εντός του pBeloR26 χρησιμοποιώντας τη μεθοδολογία ανασυνδυασμού Red/ET. Αρχικά, η αλληλουχία που κωδικοποιεί τον γραμμικό επίτοπο TAV (TAVSPTTLR) εντός του CSFV-E2 αντικαταστάθηκε με την αλληλουχία που κωδικοποιεί την αντίστοιχη περιοχή (που κωδικοποιεί TTVSTSTLA) από το στέλεχος BDV \"Gifhorn\" όπως περιγράφεται στην ενότητα Υλικά και Μέθοδοι. Περισσότερο από το 90% των αποικιών που ελήφθησαν χρησιμοποιώντας αυτή τη διαδικασία περιείχαν το απαιτούμενο BACAnti-CSFV E2 (WH211) Σχήμα 2 Μοτίβα αντίδρασης αντισωμάτων κυττάρων μολυσμένων με λοιμοϊό. Τα κύτταρα SFT-R μολύνθηκαν με vR26 και τα δύο παράγωγά του vR26_E2gif και vR26_TAV συν vGifhorn [26] . Μετά από 72 ώρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με μονοκλωνικά αντισώματα κατά της πρωτεΐνης NS3 (WB103/105, αριστερή στήλη), της πρωτεΐνης CSFV E2 (WH303 και WH211, μεσαίες στήλες) και της πρωτεΐνης BDV E2 (WB166, δεξιά στήλη) ως υποδεικνύεται και παρατηρείται χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού. δομή όπως προσδιορίζεται από τις πέψεις NotI. Οι πλήρεις αλληλουχίες γονιδιώματος του cDNA του CSFV εντός δύο επιλεγμένων BAC, που ονομάζονται pBeloR26_TAV έχουν επαληθευτεί (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, η πλήρης κωδικεύουσα αλληλουχία (1119 nt) για την πρωτεΐνη CSFV-E2 αντικαταστάθηκε από την αντίστοιχη αλληλουχία από το BDV \"Gifhorn\". Πάλι περισσότερο από το 90% των αποικιών που ελήφθησαν περιείχαν το απαιτούμενο BAC και η ίδια αναλογία σωστά ανασυνδυασμένων BAC ελήφθη χρησιμοποιώντας βραχίονες ομολογίας είτε 30 nt είτε 50 nt. Το χιμαιρικό BAC ορίστηκε, pBeloR26_E2gif και επαληθεύτηκε η πλήρης αλληλουχία γονιδιώματος του ιού (cDNA) (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Μετά από ηλεκτροδιάτρηση με μεταγραφές RNA που προέρχονται είτε από pBeloR26_TAV είτε από pBeloR26_E2gif, ένας μεγάλος αριθμός κυττάρων CSFV NS3-θετικά δεν μπορούσε να παρατηρηθεί που φαίνεται) και αποθέματα χιμαιρικού ιού, που ονομάζονται vR26_TAV και vR26_E2gif, δημιουργήθηκαν μετά από περαιτέρω διελεύσεις σε κύτταρα. Κύτταρα που μολύνθηκαν με αυτούς τους ιούς και με τα γονικά στελέχη vR26 και vGifhorn χρωματίστηκαν όλα με mAbs που κατευθύνονται εναντίον της πρωτεΐνης NS3 (Εικόνα 2). Ωστόσο, σε αντίθεση με τον γονικό ιό vR26, οι χιμαιρικοί ιοί που διασώθηκαν από τα ανασυνδυασμένα BACs δεν αναγνωρίστηκαν από mAbs αντι-Ε2 ειδικά για τις πρωτεΐνες CSFV-E2 (Εικόνα 2) και έτσι, σύμφωνα με τη δομή τους, εμφάνισαν την ίδια αντίδραση αντισώματος μοτίβο ως vGifhorn. Δύο διαφορετικά αντι-CSFV E2 mAbs, τα WH211 και WH303, χρησιμοποιήθηκαν για τη χρώση και το τελευταίο έχει αποδειχθεί προηγουμένως ότι στοχεύει τον επίτοπο TAV [18] . Όπως αναμενόταν, κύτταρα μολυσμένα είτε με το vGifhorn είτε με το χιμαιρικό vR26_E2gif θα μπορούσαν να φανούν ότι εκφράζουν την πρωτεΐνη Ε2 \"Gifhorn\" χρησιμοποιώντας χρώση με ένα mAb αντι-Βϋν (Εικόνα 2). Η παρουσία του επιτόπου BDV TTVSTSTLA στο vR26_ TAV ήταν ανεπαρκής για να επιτρέψει την αποτελεσματική αναγνώριση από αυτό το αντι-BDV mab, αν και παρατηρήθηκε ασθενές σήμα σε ορισμένα κύτταρα. Τα κατασκευάσματα BAC pBeloR26 και pBeloR26_E2gif αναλύθηκαν για τη γενετική σταθερότητα του cDNA την καταλληλότητα του φορέα BAC για τη διατήρηση πλήρους μήκους cDNA του παρασιτοϊού. Κύτταρα Ε. coli DH10B που περιείχαν τα BACs διαβιβάστηκαν 15 φορές, με ολονύκτια ανάπτυξη, και τα πλήρη ιικά cDNA εντός των BAC αλληλουχήθηκαν μετά την 1η και την 15η διέλευση. Δεν παρατηρήθηκαν μεταλλάξεις στις αλληλουχίες cDNA του ιού 12316 nt μετά από αυτόν τον εκτεταμένο πολλαπλασιασμό των BAC στον βακτηριακό ξενιστή, υποδεικνύοντας ένα εξαιρετικά σταθερό σύστημα για τη διατήρηση πλήρους cDNA αλληλουχιών λοιμοϊού. Οι ιοί, vR26 και vR26_E2gif, διασώθηκαν από το αντίστοιχο κατασκεύασμά τους , δοκιμάστηκαν επίσης για τη γενετική τους σταθερότητα σε κύτταρα θηλαστικών. Το γραμμικοποιημένο BAC DNA μεταγράφηκε in vitro και το RNA ηλεκτροδιατρήθηκε σε κύτταρα ΡΚ15. Τρεις ημέρες μετά την ηλεκτροδιάτρηση τα κύτταρα χρωματίστηκαν με το αντίσωμα αντι-NS3 για να ανιχνευθεί η παρουσία αναδιπλασιαζόμενου ιού. Δείγματα που περιείχαν κύτταρα θετικά στον ιό διαβιβάστηκαν σε νέα κύτταρα, αυτή η διαδικασία *Nt θέση 10665 στο vR26/P-12 επανέρχεται από το Α στο G όπως στο γονικό cDNA. επαναλήφθηκε για 12 ξεχωριστά περάσματα (κάθε από τρεις ημέρες). Ο τίτλος του ιού (ως TCID 50/ml) προσδιορίστηκε για κάθε πέρασμα. Η διέλευση του διασωθέντος χιμαιρικού ιού vR26_E2gif σε κύτταρα ΡΚ15 είχε ως αποτέλεσμα την ταχεία μείωση των τίτλων του ιού και διακόπηκε μετά το 2ο πέρασμα (Εικόνα 4Α). Αντίθετα, περαιτέρω διέλευση αυτού του χιμαιρικού ιού πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα SFT-R προβάτου (ο προτιμώμενος κυτταρικός τύπος για BDV) και είχε ως αποτέλεσμα πολύ υψηλότερους τίτλους του χιμαιρικού ιού. Οι τίτλοι του ιού έφτασαν περισσότερο από 106 TCID50/ml μετά την 1η διέλευση και παρέμειναν σταθεροί για 12 διελεύσεις (Εικόνα 4Α). Το διασωθέν vR26 πολλαπλασιάστηκε επίσης αποτελεσματικά στα κύτταρα SFT-R, αλλά διατήρησε έναν ελαφρώς χαμηλότερο τίτλο από τον χιμαιρικό ιό vR26_E2gif (Εικόνα 4Α). με ιούς από το 12ο πέρασμα κυτταροκαλλιέργειας SFT-R (που ονομάζεται vR26/P-12 και vR26_E2gif/P-12) και χρωματισμένο με πολυκλωνικό ορό κατά των λοιμώξεων και με ειδικά mAbs που στρέφονται ενάντια στις πρωτεΐνες CSFV-E2 και BDV-E2 ( Εικόνα 4Β). Κύτταρα που μολύνθηκαν είτε με το vR26/P-12 είτε με το χιμαιρικό vR26_E2gif/P-12 ανιχνεύθηκαν το καθένα από τον πολυκλωνικό ορό κατά των λοιμώξεων όπως αναμενόταν. Το mAb αντι-CSFV-E2 ανίχνευσε ειδικά κύτταρα μολυσμένα με vR26/P-12 αλλά όχι κύτταρα μολυσμένα από τον χιμαιρικό ιό που περιέχει την πρωτεΐνη BDV-E2 (σύμφωνα με τα αποτελέσματα που φαίνονται στο Σχήμα 2). Αντίθετα, το mAb αντι-BDV-E2 ανίχνευσε ειδικά μόλυνση από το vR26_E2gif/P-12 και δεν αναγνώρισε κύτταρα μολυσμένα με vR26/P-12. Κάθε αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με τη δομή των ιών. Η 4η δίοδος του vR26 (vR26/P-4) εμφάνισε βραδύτερο ρυθμό ανάπτυξης από τον ιό που ελήφθη μετά από 12 περάσματα (βλ. Εικόνα 5Α). Είχε επίσης μειωμένο ρυθμό ανάπτυξης σε σύγκριση με το vR26_E2gif/P-4 και το vR26_E2gif/P-12. Η πλήρους μήκους αλληλουχία του pBeloR26 είχε αποκαλύψει δέκα μη σιωπηλές μεταλλάξεις σε σύγκριση με την αλληλουχία αναφοράς (AY25 9122.1) για αυτόν τον ιό (Επιπρόσθετο αρχείο 2: Πίνακας S2). Οποιαδήποτε από αυτές τις μεταλλάξεις μπορεί να είναι υπεύθυνη για την εξασθενημένη ανάπτυξη που ενεργεί μόνη της ή σε συνεννόηση. Για περαιτέρω διερεύνηση αυτού του ζητήματος, πλήρους μήκους cDNA που παρασκευάστηκαν από τα vR26/P-4, vR26/P-12, vR26_E2gif/P-4 και vR26_E2gif/P-12 αναλύθηκαν σε βάθος χρησιμοποιώντας και τις δύο πλατφόρμες 454 FLX και Ion PGM για σύγκριση και για τον προσδιορισμό της κατανομής οιονεί ειδών (Πρόσθετο αρχείο 3: Εικόνα S1 και Πρόσθετο αρχείο 4: Εικόνα S2 ). Τα δεδομένα αλληλούχισης και από τις δύο πλατφόρμες αποκάλυψαν ότι τόσο το vR26/P-12 όσο και το vR26_E2gif/P-12 άλλαξαν σχεδόν 100% στη θέση nt A10665G σε σύγκριση με τους κλώνους BAC (με αποτέλεσμα την προβλεπόμενη υποκατάσταση αμινοξέων D3431G εντός της πρωτεΐνης NS5B, RNA εξαρτώμενη RNA πολυμεράση, βλέπε Εικόνα 5Β). Αυτή η προσαρμογή είναι μια επαναφορά στη συναινετική αλληλουχία cDNA του γονικού ιού εμβολίου, vRiemser (Επιπλέον αρχείο 2: Πίνακας S2 ). Επιπλέον, τα vR26/P-4 και vR26_E2gif/P-4 έδειξαν ήδη ενδείξεις για την ύπαρξη αυτής της αναστροφής στον πληθυσμό. Για το vR26/P-4, το επίπεδο αναστροφής ήταν 57%, ενώ για το vR26_E2gif/P-4 η έκταση της αλλαγής ήταν 73% (βλ. Εικόνα 5B). Σε αυτή τη μελέτη, δημιουργήσαμε το πρώτο BAC που περιέχει το πλήρες μήκος cDNA ενός στελέχους εμβολίου CSFV. Το BAC διέφερε από τη γονική αλληλουχία cDNA σε 18 θέσεις που οδηγούσαν σε 9 υποκαταστάσεις αα (Πίνακας 1). Η μέθοδος που έχει χρησιμοποιηθεί για τη δημιουργία του pBeloR26 βασίζεται στην πλήρη ενίσχυση γονιδιώματος του cDNA που ακολουθείται από άμεση κλωνοποίηση για τη λήψη των BACs [11] . Αυτή η προσέγγιση έχει ως αποτέλεσμα κλώνους cDNA που αντικατοπτρίζουν τη σύνθεση οιονεί ειδών του γονικού ιικού RNA και επομένως δεν είναι εγγυημένη η λήψη κλώνων cDNA που αντιστοιχούν στη συναινετική αλληλουχία του cDNA που χρησιμοποιείται. Ωστόσο, είναι δυνατό να διορθωθούν οι μεταλλάξεις χρησιμοποιώντας την προσέγγιση ανασυνδυασμού BAC εάν απαιτείται συναινετικός κλώνος. Για να δείξουμε τη χρησιμότητα της μεθόδου ανασυνδυασμού με τη μεσολάβηση Red/ET, δημιουργήσαμε μια σειρά τροποποιημένων BAC που προέρχονται από αυτό το πλήρους μήκους cDNA του CSFV. Αυτά περιλαμβάνουν BACs με υποκατάσταση του γραμμικού επιτόπου TAV που υπάρχει στην πρωτεΐνη Ε2 και επίσης BACs με υποκατάσταση της πλήρους πρωτεΐνης Ε2 με ετερόλογες αλληλουχίες λοιμοϊού. Έχουμε επίσης χρησιμοποιήσει την ίδια προσέγγιση για μια σειρά διαφορετικών στοχευμένων τροποποιήσεων εντός των CSFV BAC, συμπεριλαμβανομένων συγκεκριμένων διαγραφών και αντικαταστάσεων στο 5'UTR του CSFV [24] και για εισαγωγές ετερόλογων αλληλουχιών αναφοράς σε ρεπλικόνια CSFV [25] . Χρησιμοποιώντας μεταλλαξογένεση που διαμεσολαβείται από ανασυνδυασμό Red/ET για τον στοχευμένο σχεδιασμό, η εργασία μπορεί να επιταχυνθεί και να επικεντρωθεί, κυρίως, σε οποιαδήποτε αλληλουχία εντός του ιικού γονιδιώματος και δεν εξαρτάται από τη χρήση εσωτερικών θέσεων περιορισμού. Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η μεταλλαξογένεση των BAC cDNA των παρασιτοϊών που προκαλείται από ανασυνδυασμό Red/ET παρέχει ένα χρήσιμο εργαλείο για την προώθηση της κατασκευής τροποποιημένων παρασιτοϊών. Τα κύτταρα που μολύνθηκαν με τον γονικό ιό vR26 αναγνωρίστηκαν από τα δύο mAbs αντι-Ε2 (WH211 και WH303) ειδικά για τις πρωτεΐνες CSFV-E2, σε αντίθεση με τα κύτταρα που μολύνθηκαν με τους τροποποιημένους ιούς vR26_TAV και vR26_E2gif, που διασώθηκαν από τα ανασυνδυασμένα BAC, δεν ανιχνεύθηκαν, από αυτά τα mAbs. Επιπλέον, όπως αναμενόταν, τα κύτταρα που μολύνθηκαν με το vR26_E2gif αναγνωρίστηκαν από το mAb αντι-BDV (WB166) ενώ δεν παρατηρήθηκε χρώση με αυτό το αντίσωμα σε κύτταρα μολυσμένα με vR26 ή σε κύτταρα με vR26_TAV. Το mAb WH303 αναγνωρίζει τον επίτοπο CSFV TAV [18] και η διαφορά σε 4 aa μεταξύ του επιτόπου TAV και της αντίστοιχης αλληλουχίας από το στέλεχος BDV \"Gifhorn\" είναι αρκετή για να καταργήσει πλήρως την αναγνώριση από αυτό το mAb. Η έλλειψη χρώσης κυττάρων μολυσμένων με vR26_TAV από το WH211 έδειξε ότι η αλληλουχία TAV είναι επίσης σημαντική για τον επίτοπο που αναγνωρίζεται από αυτό το mAb. Έτσι, οι χιμαιρικοί λοιμοϊοί, vR26_TAV και vR26_E2gif, που περιέχουν ετερόλογες αλληλουχίες Ε2 μπορούν εύκολα να διακριθούν από τον vR26 χρησιμοποιώντας ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα αντι-Ε2. Αυτοί οι νέοι χιμαιρικοί λοιμοϊοί αντιπροσωπεύουν υποψήφια εμβόλια με βάση το Cstrain με τα επιθυμητά χαρακτηριστικά για ασφαλή και αποτελεσματικά εμβόλια DIVA κατά του CSFV. Πράγματι, οι εμβολιασμένοι χοίροι με vR26_E2gif θα μπορούσαν να διακριθούν αποτελεσματικά από χοίρους εμβολιασμένους με στέλεχος C και από χοίρους μολυσμένους με CSFV χρησιμοποιώντας ELISA ειδικών αντισωμάτων CSFV-E2 (Rasmussen et al., μη δημοσιευμένα αποτελέσματα). Τα δεδομένα αλληλουχίας νουκλεοτιδίων για τον αριθμό pBeloR26 αλλάζουν δημοσιευμένη ακολουθία αναφοράς για το \"C-strain Riems\". Μερικές από αυτές τις διαφορές υπάρχουν στο cDNA που προέρχεται από το απόθεμα του εμβολίου σε ανιχνεύσιμο επίπεδο, ενώ άλλες μπορεί να αντιπροσωπεύουν παραλλαγές χαμηλού επιπέδου εντός του cDNA ή σφάλματα που εισάγονται από την ενίσχυση RT-PCR. Η αλληλουχία πλήρους μήκους αποκάλυψε ότι δεν σημειώθηκαν αλλαγές στο cDNA κατά τη διάρκεια εκτεταμένης διάδοσης στο E. coli DH10B του pBeloR26 και του χιμαιρικού παραγώγου E2, pBeloR26_E2gif, υποδεικνύοντας μια πολύ υψηλή σταθερότητα αυτών των cDNA του CSFV που έχουν κλωνοποιηθεί με BAC. Αυτό είναι απαραίτητο εάν αυτό το σύστημα πρόκειται να είναι χρήσιμο για την κλωνοποίηση και τον χειρισμό αλληλουχίας και έρχεται σε αντίθεση με τα προβλήματα σταθερότητας που αντιμετωπίζονται με τα συμβατικά πλασμίδια που περιέχουν cDNA του παρασιτοϊού πλήρους μήκους [31] . Η σταθερότητα αυτών των BAC είναι σύμφωνη με προηγούμενες αναφορές σχετικά με τη σταθερότητα των BAC που περιέχουν άλλους ιούς της οικογένειας Flaviviridae στο E. coli [8, 10] . Η εκτεταμένη διέλευση του διασωθέντος vR26 και του χιμαιρικού παραγώγου του ιού, vR26_E2gif, οδήγησε σε αλλαγή στη νουκλεοτιδική θέση A10665G (με αποτέλεσμα την προβλεπόμενη αα", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 401, "text": "μολυσματικοί κλώνοι cDNA" } ], "id": 5242, "question": "Τι χρειάζεται για να κατευθυνθούν γενετικές μεταλλάξεις σε ιούς RNA;" }, { "answers": [ { "answer_start": 33072, "text": "αα" } ], "id": 5246, "question": "Το BAC διέφερε από τη γονική αλληλουχία cDNA με ποιες υποκαταστάσεις αμινοξέων;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Τι είδους όγκοι λειτουργίας του παρόχου έχουν σημασία; Συσχετίσεις μεταξύ του κινδύνου μόλυνσης από το χειρουργικό σημείο της CABG και του όγκου χειρουργικής επέμβασης σε νοσοκομεία και χειρουργούς μεταξύ των ιατρικών κέντρων στην Ταϊβάν https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4459823/SHA: f3cbc0503581249a83948749a83948953 Tung, Yu-Chi; Chung, Kuo-PiaoDate: 2015-06-08DOI: 10.1371/journal.pone.0129178License: cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Οι σχέσεις όγκου-λοίμωξης έχουν εξεταστεί για χειρουργικές επεμβάσεις υψηλού κινδύνου, αλλά τα συμπεράσματα παραμένουν αμφιλεγόμενα. Η ασυνέπεια μπορεί να οφείλεται σε ανακριβή εντοπισμό περιπτώσεων μόλυνσης και σε διαφορετικές μεθόδους κατηγοριοποίησης του όγκου των υπηρεσιών. Αυτή η μελέτη λαμβάνει ως παράδειγμα τις λοιμώξεις της χειρουργικής θέσης με μόσχευμα στεφανιαίας αρτηρίας (CABG) για να εξετάσει εάν υπάρχει σχέση μεταξύ των όγκων επέμβασης και των SSIs, όταν εφαρμόστηκαν διαφορετικοί προσδιορισμοί περιπτώσεων SSI, ορισμοί και μέθοδοι κατηγοριοποίησης των όγκων επέμβασης. ΜΕΘΟΔΟΙ: Πραγματοποιήθηκε μια πολυεπίπεδη συγχρονική μελέτη με βάση τον πληθυσμό. Προσλήφθηκαν συνολικά 7.007 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση CABG μεταξύ 2006 και 2008 από 19 ιατρικά κέντρα στην Ταϊβάν. Τα SSI που σχετίζονται με τη χειρουργική επέμβαση CABG αναγνωρίστηκαν χρησιμοποιώντας κωδικούς Διεθνούς Ταξινόμησης Νοσημάτων, 9ης Αναθεώρησης, Κλινικής Τροποποίησης (ICD-9 CM) και μοντέλου Δένδρων Ταξινόμησης και Παλινδρόμησης (CART). Χρησιμοποιήθηκαν δύο ορισμοί του όγκου χειρουργικής και νοσοκομειακής λειτουργίας: (1) οι αθροιστικοί όγκοι χειρουργικών επεμβάσεων CABG εντός της περιόδου μελέτης. και (2) τους αθροιστικούς όγκους επέμβασης CABG το προηγούμενο έτος πριν από κάθε χειρουργική επέμβαση CABG. Οι όγκοι λειτουργίας αντιμετωπίστηκαν περαιτέρω με τρεις διαφορετικούς τρόπους: (1) μια συνεχής μεταβλητή. (2) μια κατηγορική μεταβλητή με βάση το τεταρτημόριο. και (3) μια κατηγορική μεταβλητή που βασίζεται σε δεδομένα και βασίζεται στον αλγόριθμο ομαδοποίησης k-means. Επιπλέον, διενεργήθηκε ανάλυση υποομάδας για συννοσηρότητες. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Αυτή η μελέτη έδειξε ότι οι όγκοι των νοσοκομείων δεν συσχετίστηκαν σημαντικά με τα SSI, ανεξάρτητα από το ποιοι ορισμοί ή μέθοδοι κατηγοριοποίησης του όγκου επέμβασης ή προσεγγίσεις αναγνώρισης περιπτώσεων SSIs χρησιμοποιήθηκαν. Αντίθετα, οι σχέσεις μεταξύ των τόμων του χειρουργού διέφεραν. Τα περισσότερα από τα μοντέλα έδειξαν ότι οι χειρουργοί χαμηλού όγκου είχαν υψηλότερο κίνδυνο από τους χειρουργούς μεγάλου όγκου. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Οι όγκοι των χειρουργών ήταν πιο σημαντικοί από τους όγκους των νοσοκομείων για τη διερεύνηση της σχέσης μεταξύ των όγκων επέμβασης CABG και των SSIs στην Ταϊβάν. Ωστόσο, οι σχέσεις δεν ήταν εύρωστες. Οι ορισμοί και οι μέθοδοι κατηγοριοποίησης του όγκου λειτουργίας και η σωστή αναγνώριση των SSIs είναι σημαντικά ζητήματα για μελλοντική έρευνα. Κείμενο: δεδομένα, τα οποία θα πρέπει να χρησιμοποιούν ιεραρχικά μοντέλα, μπορεί να οδηγήσουν σε μεροληπτική εκτίμηση της διακύμανσης και επίσης να οδηγήσουν σε εσφαλμένα συμπεράσματα. Τα SSI μετά από παράκαμψη στεφανιαίας αρτηρίας Οι διαδικασίες (CABG) επιβαρύνουν σοβαρά τους ασθενείς και τα συστήματα υγειονομικής περίθαλψης. Η συνολική διάρκεια παραμονής και οι δαπάνες για ασθενείς με SSIs μετά από χειρουργική επέμβαση CABG είναι σημαντικά μεγαλύτερη και μεγαλύτερη από εκείνες χωρίς SSIs. [20, 21] Το 2008, τα Cents for Medicare & Medicaid των Ηνωμένων Πολιτειών της Αμερικής εφάρμοσαν την πολιτική \"Ποτέ Συμβάν\", όπου τα νοσοκομεία δεν θα λαμβάνουν πλέον υψηλότερες πληρωμές για το πρόσθετο κόστος που σχετίζεται με τη θεραπεία ασθενών για ορισμένες λοιμώξεις που αποκτήθηκαν από την υγειονομική περίθαλψη , συμπεριλαμβανομένων εκείνων που σχετίζονται με το CABG. Λόγω της ακρίβειας της αναγνώρισης των SSIs και της ετερογένειας των μεθόδων ορισμού και κατηγοριοποίησης, καμία υπάρχουσα μελέτη δεν έχει χρησιμοποιήσει διαφορετική αναγνώριση κρουσμάτων μόλυνσης ούτε ορισμούς και μεθόδους κατηγοριοποίησης του όγκου λειτουργίας ταυτόχρονα για να διερευνήσει τη σχέση μεταξύ των όγκων λειτουργίας και μόλυνση. Η τρέχουσα μελέτη λαμβάνει τα CABG SSIs ως παράδειγμα για να εξετάσει εάν υπάρχει σχέση μεταξύ των όγκων λειτουργίας και των SSI, λαμβάνοντας υπόψη τον προσδιορισμό διαφορετικών περιπτώσεων SSI, τους ορισμούς του όγκου λειτουργίας και τις μεθόδους κατηγοριοποίησης. Αυτή η αναδρομική και συγχρονική μελέτη υιοθέτησε έναν πολυεπίπεδο σχεδιασμό για να εξετάσει τις σχέσεις μεταξύ όγκοι παρόχων και SSI μετά από προσαρμογή για συμμεταβλητές σε επίπεδο ασθενών, χειρουργών και νοσοκομείων. Χρησιμοποιήσαμε δεδομένα από την Εθνική Ερευνητική Βάση Δεδομένων Ασφάλισης Υγείας της Ταϊβάν (NHIRD) από το 2005 και το 2008. Το NHIRD, που δημοσιεύεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Ερευνών Υγείας της Ταϊβάν, περιλαμβάνει όλα τα αρχικά δεδομένα αξιώσεων και αρχεία εγγραφής για δικαιούχους που είναι εγγεγραμμένοι στο πρόγραμμα Εθνικής Ασφάλισης Υγείας (NHI). Η βάση δεδομένων καλύπτει τα 23 εκατομμύρια Ταϊβανέζους εγγεγραμμένους (περίπου το 98% του πληθυσμού) στο πρόγραμμα NHI. Πρόκειται για μια μη αναγνωρισμένη δευτερεύουσα βάση δεδομένων που περιέχει δημογραφικές και διοικητικές πληροφορίες σε επίπεδο ασθενούς. Ωστόσο, τα στοιχεία θεραπείας είναι συγκεντρωτικά και χωρίς χρονικά και κλινικές πληροφορίες. Τα δεδομένα δημοσιεύονται για ερευνητικούς σκοπούς. Το πρωτόκολλο για τη μελέτη εγκρίθηκε από το Συμβούλιο Θεσμικής Αναθεώρησης του Εθνικού Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου της Ταϊβάν (πρωτόκολλο #201001027R). Το σύνολο δεδομένων που χρησιμοποιήσαμε σε αυτή τη μελέτη ήταν δευτερεύοντα δεδομένα. όλες οι πληροφορίες αποπροσδιορίστηκαν από τους κατόχους δεδομένων. Σε αυτή τη μελέτη, υιοθετήσαμε τους κωδικούς SSI ICD-9-CM (εφεξής θα αναφέρεται ως μοντέλο που βασίζεται στο ICD-9-CM) και το μοντέλο Δέντρων ταξινόμησης και παλινδρόμησης (CART), το οποίο αναπτύχθηκε στην προηγούμενη εργασία μας [11] για τον εντοπισμό περιπτώσεων SSI. Όπως αναφέραμε παραπάνω, οι κωδικοί ICD-9-CM SSI ήταν το πιο δημοφιλές εργαλείο για τον εντοπισμό των υποθέσεων SSI στα δεδομένα αξιώσεων. Στο μοντέλο που βασίζεται στο ICD-9-CM, οι περιπτώσεις SSI χωρίστηκαν σε δύο κατηγορίες: συμβάντα ευρετηρίου νοσηλείας και συμβάντα μετά την έξοδο (δηλαδή, SSI που συνέβησαν εντός 1 έτους μετά την έξοδο και απαιτούσαν επανεισαγωγή σε νοσοκομείο ή/και χρήση περιπατητικού Υπηρεσίες). Ακολουθώντας τους Wu et al [13], αυτή η μελέτη υιοθέτησε τους δευτερεύοντες κωδικούς διάγνωσης ICD-9-CM για ευρετήρια συμβάντα νοσηλείας (κωδικός ICD-9-CM: 996.03, 996.61, 996.72 και 998.5) και τους κωδικούς πρωτογενούς και δευτερογενούς διάγνωσης για συμβάντα μετά την έξοδο (κωδικός ICD-9-CM: 038.0-038. 4 ) ως κριτήρια αναγνώρισης SSI, προκειμένου να αποφευχθούν περιπτώσεις στις οποίες υπήρχε μόλυνση πριν από τη νοσηλεία. Εάν ένα κρούσμα είχε ένα ευρετήριο συμβάν νοσηλείας ή ένα συμβάν μετά το εξιτήριο, τότε θα αναγνωριστεί ως SSIs από το μοντέλο που βασίζεται στο ICD-9-CM. Στο μοντέλο CART, υιοθετήσαμε τον τύπο των αντιβιοτικών, τη δόση της κεφαζολίνης, τη διάρκεια παραμονής και τον αριθμό των αγγείων που αποφράσσονται (ως δείκτης μεσολάβησης της διάρκειας της λειτουργίας) ως παραμέτρους για την αναγνώριση των SSIs, σύμφωνα με τα προηγούμενα ευρήματά μας. [11] Στην προηγούμενη εργασία μας, χρησιμοποιήσαμε τα δεδομένα αξιώσεων της Εθνικής Ασφάλισης Υγείας 2005-2008 και τα δεδομένα επιτήρησης λοιμώξεων που σχετίζονται με την υγειονομική περίθαλψη από δύο ιατρικά κέντρα για την ανάπτυξη μοντέλων και την επαλήθευση μοντέλου. Τα κρούσματα μόλυνσης με βάση την επιτήρηση εντοπίστηκαν από το προσωπικό ελέγχου λοιμώξεων εάν ο ασθενής πληρούσε τα κριτήρια του CDC της Ταϊβάν, τα οποία είναι τα ίδια με αυτά που υιοθετήθηκαν στο CDC των ΗΠΑ. Εξετάζουν χειροκίνητα τα ιατρικά αρχεία όλων των ασθενών που διατρέχουν κίνδυνο για την καθορισμένη λοίμωξη που σχετίζεται με την υγειονομική περίθαλψη. Οι αλγόριθμοι ταξινόμησης, το μοντέλο πολυμεταβλητής παλινδρόμησης και το μοντέλο εξόρυξης δεδομένων υιοθετήθηκαν για την ανάπτυξη εναλλακτικών μοντέλων που βασίζονται σε υποκατάστατους δείκτες για τον εντοπισμό περιπτώσεων CABG SSIs και συγκρίνετε την απόδοση μεταξύ αυτών των μοντέλων και του μοντέλου που βασίζεται στο ICD-9-CM. Για τους αλγόριθμους ταξινόμησης, οι ερευνητές δημιουργούν διάφορα κριτήρια και εάν ένα κρούσμα ικανοποιεί (ή υπερβαίνει) έναν συγκεκριμένο αριθμό κριτηρίων, τότε θα προσδιορίζεται ως περίπτωση μόλυνσης. Για το μοντέλο πολυμεταβλητής παλινδρόμησης, οι ερευνητές υπολόγιζαν συνήθως μια βαθμολογία κινδύνου με το μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης και το βέλτιστο σημείο αποκοπής προσδιορίστηκε σύμφωνα με την προκύπτουσα χαρακτηριστική καμπύλη λειτουργίας του δέκτη. Τα χαρακτηριστικά είναι: αυτόματη ανακάλυψη μοτίβων, πρόβλεψη πιθανών αποτελεσμάτων, δημιουργία πληροφοριών που μπορούν να γίνουν πράξη και εστίαση σε μεγάλα σύνολα δεδομένων και βάσεις δεδομένων. Το μοντέλο ταξινόμησης και παλινδρόμησης του δέντρου (CART), που είναι η πιο δημοφιλής προσέγγιση που εφαρμόζεται στην εργασία μας, καθώς και η ανάπτυξη, η διακοπή και το κλάδεμα του δέντρου καθορίστηκαν από μέτρα βελτίωσης Gini. [22, 23] Μετά από αναφορά στη βιβλιογραφία και σε συνεννόηση με ειδικούς λοιμωξιολόγους, υιοθετήσαμε τις ακόλουθες επτά παραμέτρους: τύπος αντιβιοτικού, δόσεις αντιβιοτικού, δόσεις κεφαζολίνης, χρήση αντιβιοτικών δεύτερης γραμμής, διάρκεια παραμονής και αριθμός εμπόδια αγγείων. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε επίσης διασταυρούμενη επικύρωση, όπου χρησιμοποιήθηκαν δεδομένα από ένα ιατρικό κέντρο για την ανάπτυξη μοντέλων και ένα άλλο για επικύρωση μοντέλου. Τα αποτελέσματα της προηγούμενης εργασίας μας αποκάλυψαν ότι το μοντέλο CART προσέφερε καλύτερη απόδοση από αυτό της άλλης αναγνώρισης μοντέλα ή το μοντέλο που βασίζεται στο ICD-9-CM, ειδικά στη θετική προγνωστική τιμή (>70%), η οποία βρέθηκε να είναι μόνο 20% στο μοντέλο που βασίζεται στο ICD-9-CM. (Πίνακας 1) Τα ευρήματα υπονοούσαν επίσης ότι το CART ήταν ένα αναμφισβήτητα καλύτερο εργαλείο για τον εντοπισμό περιπτώσεων SSI στη βάση δεδομένων Εθνικής Ασφάλισης Υγείας της Ταϊβάν. Ως εκ τούτου, αυτή η μελέτη υιοθέτησε επίσης το μοντέλο CART για τον προσδιορισμό των SSIs CABG. Για να εξασφαλιστεί η ομοιογένεια, η τρέχουσα μελέτη ανέλυσε 7.007 ασθενείς από 19 ιατρικά κέντρα στην Ταϊβάν που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση CABG (κωδικοί διαδικασίας ICD-9-CM 36.1x-36.2x) μεταξύ 2006 και 2008. Οι ασθενείς με CABG ηλικίας κάτω των 18 ετών ή άνω των 85 ετών αποκλείστηκαν σε αυτή τη μελέτη. Συνολικά 302 περιπτώσεις αναγνωρίστηκαν ως SSI με το μοντέλο που βασίζεται στο ICD-9-CM και συνολικά 107 περιπτώσεις αναγνωρίστηκαν ως SSIs από το μοντέλο CART. Σε αυτήν τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε τους ακόλουθους δύο ορισμούς για να ορίσουμε τους όγκους λειτουργίας: (1) τους αθροιστικούς όγκους χειρουργικών επεμβάσεων από κάθε χειρουργό και νοσοκομείο εντός της περιόδου μελέτης, που ήταν ο πιο κοινός ορισμός στη βιβλιογραφία. και (2) ακολουθώντας τους Yasunaga et al. 's μελέτη, [24] αθροιστικοί όγκοι επέμβασης από κάθε χειρουργό και νοσοκομείο κατά το προηγούμενο έτος για κάθε χειρουργική επέμβαση. Ωστόσο, τα δεδομένα μας ήταν λοξά, τα οποία δεν ακολούθησαν κανονική κατανομή. Επομένως, πραγματοποιήσαμε τους μετασχηματισμούς καταγραφής σε όγκους λειτουργίας. Η τρέχουσα εργασία αντιμετώπισε τους όγκους λειτουργίας με τρεις διαφορετικούς τρόπους: (1) μια συνεχή μεταβλητή. (2) μια κατηγορική μεταβλητή που βασίζεται στο πρώτο και το τρίτο τεταρτημόριο ως σημεία αποκοπής (η πιο κοινή μέθοδος για την κατηγοριοποίηση όγκων υπηρεσιών/λειτουργίας) [25] [26] [27] [28]. και (3) μια κατηγορική μεταβλητή που βασίζεται σε δεδομένα και βασίζεται στον αλγόριθμο ομαδοποίησης k-means. Αυτή η μελέτη κατηγοριοποίησε τους όγκους χειρουργών και νοσοκομείων σε ομάδες χαμηλού, μεσαίου και μεγάλου όγκου με βάση τη μέθοδο τεταρτημορίου και τον αλγόριθμο ομαδοποίησης kmeans. Στη μέθοδο τεταρτημορίου, η τιμή αποκοπής (μετασχηματισμένη με λογάριθμο) του πρώτου τεταρτημορίου (<25%) για το νοσοκομείο όγκοι ήταν 5,65 και το τρίτο τεταρτημόριο (>75%) ήταν 6,43. Όσον αφορά τους όγκους των χειρουργών, το πρώτο τεταρτημόριο ήταν 4,38 και το τρίτο ήταν 5,35, όταν χρησιμοποιήσαμε ως ορισμό τους αθροιστικούς όγκους επέμβασης εντός της περιόδου μελέτης. Ενώ ο ορισμός άλλαξε, το πρώτο τεταρτημόριο (<25%) για τους όγκους των νοσοκομείων ήταν 4,66 και το τρίτο τεταρτημόριο (>75%) ήταν 5,31. Όσον αφορά τους όγκους των χειρουργών, το πρώτο τεταρτημόριο ήταν 3,40 και το τρίτο ήταν 4,32. Η ομαδοποίηση μέσων είναι ένας αλγόριθμος μηχανικής μάθησης χωρίς επίβλεψη που εισήχθη από τον MacQueen τη δεκαετία του 1960. Αυτή η μέθοδος δεν είναι μόνο μια απλή και πολύ αξιόπιστη μέθοδος στην κατηγοριοποίηση/ταξινόμηση, αλλά αναγνωρίζεται και ως ένας από τους 10 κορυφαίους αλγόριθμους στην εξόρυξη δεδομένων. [29] Αυτή η μέθοδος έχει εφαρμοστεί συχνά σε πολλούς τομείς. [30] [31] [32] Ο Yu και οι συνάδελφοί του το εφάρμοσαν ακόμη και για να ορίσουν την ποιότητα της φροντίδας CABG και να διερευνήσουν τη σχέση μεταξύ της εισοδηματικής κατάστασης του ασθενούς, του επιπέδου ποιότητας της περίθαλψης και της θνησιμότητας των νοσοκομείων. [33] Η κύρια ιδέα αυτής της μεθόδου είναι να χωρίσει τα παρατηρούμενα σημεία δεδομένων σε k μη επικαλυπτόμενες συστάδες ελαχιστοποιώντας το άθροισμα των τετραγώνων εντός της ομάδας. Κάθε σημείο εκχωρείται στον μέσο όρο του συμπλέγματός του χρησιμοποιώντας την Ευκλείδεια απόσταση. Πρώτον, δημιουργήθηκαν τυχαία k κέντρα συστάδων. Προηγούμενες μελέτες συνήθως χώριζαν τους χειρουργούς και τα νοσοκομεία σε ομάδες χαμηλού, μεσαίου και μεγάλου όγκου. Ως εκ τούτου, προκαθορίσαμε επίσης τους όγκους υπηρεσιών χειρουργού και νοσοκομείων σε 3 ομάδες (k = 3). Στη συνέχεια, οι συμμετέχοντες κατατάχθηκαν στο σύμπλεγμα με τη μικρότερη απόσταση από αυτά τα κέντρα συστάδων. Τέλος, τα κέντρα συμπλέγματος υπολογίστηκαν εκ νέου χρησιμοποιώντας τη νέα ανάθεση συμπλέγματος και αυτά τα βήματα θα επαναλαμβάνονταν μέχρι να επιτευχθεί σύγκλιση. [34] Οι οριακές τιμές των νοσοκομειακών όγκων ήταν 5,21 και 5,69 και για τους όγκους του χειρουργού ήταν 2,40 και 4,38 αντίστοιχα, όταν ως ορισμός χρησιμοποιήθηκαν οι αθροιστικοί όγκοι επέμβασης εντός της περιόδου μελέτης. Ομοίως, όταν οι αθροιστικοί όγκοι επέμβασης πριν από κάθε χειρουργική επέμβαση χρησιμοποιήθηκαν ως ορισμός, οι τιμές αποκοπής ήταν 4,11 και 4,89 για τους όγκους του νοσοκομείου και 2,64 και 3,91 για τους όγκους του χειρουργού. Όλες οι τιμές αποκοπής μετασχηματίστηκαν με λογάριθμο. Τα αποτελέσματα της ομαδοποίησης k-means παρουσιάζονται στα Σχήματα 1-4. Όπως δείχνουν τα αποτελέσματα, οι όγκοι λειτουργίας χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες χωριστά. Εκτός από τους όγκους χειρουργών και νοσοκομείων και SSI, συλλέξαμε δεδομένα σε επίπεδο ασθενών, χειρουργών και νοσοκομείων. Πρώτον, οι μεταβλητές σε επίπεδο ασθενούς περιελάμβαναν την ηλικία, το φύλο, τη διάρκεια παραμονής στη ΜΕΘ, τον αριθμό των αγγείων που εμπλέκονται στη χειρουργική επέμβαση και την παρουσία σημαντικών υποκείμενων ασθενειών (π. σακχαρώδης διαβήτης, χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (ΧΑΠ), καρδιακή ανεπάρκεια, νεφρική ανεπάρκεια και νεφρική ανεπάρκεια, που συσχετίστηκαν με SSI). [13] Δεύτερον, οι μεταβλητές σε επίπεδο χειρουργού περιελάμβαναν την ηλικία και το φύλο. Τρίτον, οι μεταβλητές σε επίπεδο νοσοκομείου περιελάμβαναν την ιδιοκτησία του νοσοκομείου και τη γεωγραφική θέση. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις της σχέσης όγκου-λοίμωξης πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας SAS (έκδοση 9.2, SAS Institution Inc., Cary, NC, USA). Σε στατιστικές δοκιμές, μια τιμή p διπλής όψης 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Οι ιδιότητες κατανομής των συνεχών μεταβλητών εκφράστηκαν με μέσο όρο ± τυπική απόκλιση (SD), ενώ οι κατηγορικές μεταβλητές παρουσιάστηκαν κατά συχνότητα και ποσοστό. Σε μονομεταβλητή ανάλυση, οι πιθανοί προγνωστικοί παράγοντες τριών επιπέδων του SSI εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμή chi-square ή τη δοκιμή t δύο δειγμάτων ανάλογα με την περίπτωση. Στη συνέχεια, για να ληφθούν υπόψη οι συσχετίσεις μεταξύ του χειρουργού (επίπεδο-2) και του νοσοκομείου (επίπεδο-3), διεξήχθη πολυπαραγοντική ανάλυση με την προσαρμογή μοντέλων λογιστικής παλινδρόμησης μικτών επιπτώσεων στα δεδομένα κάθε ασθενούς για την εκτίμηση των επιπτώσεων των προγνωστικών τριών επιπέδων στην πιθανότητα του μετεγχειρητικού SSI. Επιπλέον, διενεργήθηκε ανάλυση υποομάδας για συννοσηρότητες. Ο Πίνακας 2 δείχνει ότι υπήρχαν 7.007 ασθενείς με CABG που πραγματοποιήθηκαν από 199 χειρουργούς σε 19 νοσοκομεία κατά την περίοδο 2006-2008 στην Ταϊβάν. Η πλειοψηφία των ασθενών ήταν άνδρες (77,5%) και η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 65,3 έτη. Η μέση παραμονή στη ΜΕΘ ήταν 6,05 ημέρες, το μέσο επίπεδο του αριθμού των αγγείων που αποφράσσονταν ήταν περίπου 1,6, ενώ το 51,8% των ασθενών είχε σακχαρώδη διαβήτη, το 33,3% είχε καρδιακή ανεπάρκεια, το 14,1% είχε νεφρική ανεπάρκεια και νεφρική ανεπάρκεια και το 22,0% είχε ΧΑΠ. Τριακόσιοι δύο ασθενείς (4,31%) ταυτοποιήθηκαν ότι είχαν τους κωδικούς ICD-9-CM SSI. Ωστόσο, η ταυτοποίηση με το μοντέλο CART αποκάλυψε μόνο 107 περιπτώσεις μόλυνσης και 94 περιπτώσεις εντοπίστηκαν και στα δύο μοντέλα. Οι περισσότερες περιπτώσεις υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση CABG από άνδρες χειρουργούς, με μέση ηλικία τα 45,0 έτη, και ο μέσος όγκος χειρουργικών επεμβάσεων του χειρουργού κατά την περίοδο μελέτης ήταν 151,64, ενώ ο μέσος όγκος επέμβασης πριν από την επέμβαση ήταν 52,18. Περισσότερες από τις μισές περιπτώσεις πραγματοποιήθηκαν με CABG σε μη κερδοσκοπικά νοσοκομεία και ο μέσος όγκος λειτουργίας των νοσοκομείων κατά την περίοδο της μελέτης ήταν 473,60, ενώ ο μέσος όγκος επέμβασης πριν από κάθε χειρουργική επέμβαση ήταν 158,79. Επιπλέον, οι περισσότεροι ασθενείς υποβλήθηκαν στις χειρουργικές επεμβάσεις τους από χειρουργούς μεγάλου όγκου και νοσοκομεία, όταν χρησιμοποιήθηκε ο αλγόριθμος k-means για την κατηγοριοποίηση, ανεξάρτητα από τον ορισμό των όγκων επέμβασης. Ο Πίνακας 3 δείχνει τα αποτελέσματα μοντέλων μικτών επιπτώσεων πολλαπλών επιπέδων, με τα SSI να αναγνωρίζονται από τους κωδικούς ICD-9-CM και τους όγκους λειτουργίας να ορίζονται ως οι αθροιστικοί όγκοι εντός της περιόδου μελέτης. Τα αποτελέσματα του Μοντέλου 1 (συνεχές) αποκαλύπτουν ότι οι όγκοι του χειρουργού συσχετίστηκαν αρνητικά με SSIs, ενώ οι όγκοι του νοσοκομείου δεν συσχετίστηκαν με SSIs λοίμωξης του χειρουργικού σημείου. Το μοντέλο 2 (τεταρτημόριο) προτείνει ότι οι χειρουργοί χαμηλού όγκου είχαν υψηλότερο κίνδυνο SSI (OR = 2,220, p-value = 0,022) από τους χειρουργούς μεγάλου όγκου. Επίσης, δεν υπήρχαν συσχετισμοί μεταξύ του όγκου λειτουργίας του νοσοκομείου και των SSI. Το μοντέλο 3 (k-means) δείχνει ότι η συσχέτιση δεν υπήρχε μεταξύ των τόμων του νοσοκομείου/χειρουργού και των SSIs. Ο Πίνακας 4 εμφανίζει τα αποτελέσματα μοντέλων μικτών επιπτώσεων πολλαπλών επιπέδων, στα οποία τα SSI προσδιορίστηκαν από το μοντέλο CART και οι όγκοι λειτουργίας ορίστηκαν επίσης ως οι αθροιστικοί όγκοι εντός της περιόδου μελέτης. Το μοντέλο 1 έδειξε πάλι αρνητική συσχέτιση μεταξύ των όγκων του χειρουργού και των SSIs και οι όγκοι του νοσοκομείου δεν βρέθηκαν να σχετίζονται με SSIs. Στο Μοντέλο 2, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η σχέση μεταξύ των όγκων νοσοκομείου/χειρουργού και των SSIs δεν υπήρχε. Στο Μοντέλο 3, τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι οι χειρουργοί χαμηλού όγκου είχαν υψηλότερο κίνδυνο (OR = 1,691, p = 0,002) από τους χειρουργούς μεγάλου όγκου. Ο Πίνακας 5 εμφανίζει τα αποτελέσματα μοντέλων μικτού αποτελέσματος πολλαπλών επιπέδων, στα οποία τα SSI ταυτοποιήθηκαν με κωδικούς ICD-9-CM, αλλά οι όγκοι επέμβασης ορίστηκαν ως ο αθροιστικός όγκος το προηγούμενο έτος για κάθε χειρουργική επέμβαση. Το μοντέλο 1 έδειξε επίσης αρνητική συσχέτιση μεταξύ των όγκων του χειρουργού και των SSIs και οι όγκοι του νοσοκομείου δεν βρέθηκαν να σχετίζονται με SSIs. Στο Μοντέλο 2, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η σχέση μεταξύ των όγκων νοσοκομείου/χειρουργού και των SSIs δεν υπήρχε. Στο Μοντέλο 3, τα αποτελέσματα αποκάλυψαν επίσης ότι οι χειρουργοί χαμηλού όγκου είχαν υψηλότερο κίνδυνο (OR = 1,642, p = 0,040) από τους χειρουργούς μεγάλου όγκου. Ο Πίνακας 6 εμφανίζει τα αποτελέσματα μοντέλων μικτού αποτελέσματος πολλαπλών επιπέδων, στα οποία τα SSI προσδιορίστηκαν από το μοντέλο CART και οι όγκοι επέμβασης ορίστηκαν επίσης ως ο αθροιστικός όγκος το προηγούμενο έτος για κάθε χειρουργική επέμβαση. Στο Μοντέλο 1, διαφορετικά από τα παραπάνω ευρήματα, δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ του όγκου του νοσοκομείου/χειρουργού και των SSIs. Στο Μοντέλο 2, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η σχέση μεταξύ των όγκων νοσοκομείου/χειρουργού και των SSIs δεν υπήρχε. Στο Μοντέλο 3, τα αποτελέσματα αποκάλυψαν επίσης ότι οι χειρουργοί χαμηλού όγκου είχαν υψηλότερο κίνδυνο (OR = 1,163, p = 0,020) από τους χειρουργούς μεγάλου όγκου. Εξετάσαμε περαιτέρω τις συσχετίσεις του όγκου χειρουργών και νοσοκομείων με SSIs σε αναλύσεις στρωματοποίησης από υποκείμενες ασθένειες. Όταν οι όγκοι χειρουργικών επεμβάσεων ορίστηκαν ως ο αθροιστικός όγκος χειρουργικών επεμβάσεων εντός της περιόδου της μελέτης, δεν υπήρχαν σχέσεις μεταξύ των όγκων χειρουργικών επεμβάσεων νοσοκομείου/χειρουργού και των SSI. (Πίνακας 7) Ωστόσο, όταν οι όγκοι επέμβασης ορίστηκαν ως οι αθροιστικοί όγκοι επέμβασης το προηγούμενο έτος για κάθε χειρουργική επέμβαση, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπήρχε αρνητική συσχέτιση μεταξύ του όγκου των χειρουργών και των SSI στην ομάδα του διαβήτη, εκτός από το ότι οι όγκοι ήταν αντιμετωπίστηκαν ως συνεχείς μεταβλητές και τα κρούσματα μόλυνσης προσδιορίστηκαν με κωδικούς ICD-9. Όσον αφορά τους όγκους λειτουργίας των νοσοκομείων, η ένωση δεν υπήρχε. (Πίνακας 8 ) Καμία μελέτη δεν έχει αξιολογήσει πώς οι διαφορετικοί ορισμοί όγκων υπηρεσιών/λειτουργίας και μέθοδοι κατηγοριοποίησης επηρεάζουν τις σχέσεις όγκου-λοίμωξης. Επιπλέον, αρκετές μελέτες έχουν επισημάνει την ακατάλληλη αναγνώριση περιπτώσεων μόλυνσης χρησιμοποιώντας τους κωδικούς ICD-9-CM στα δεδομένα των αξιώσεων. Δεδομένων αυτών των λόγων, αυτή η μελέτη υιοθέτησε δύο προσεγγίσεις για τον προσδιορισμό των SSI, δύο ορισμούς των όγκων λειτουργίας και τρεις μεθόδους για την κατηγοριοποίηση των όγκων λειτουργίας για να εξετάσει τις σχέσεις μεταξύ των όγκων λειτουργίας και των SSI. Τα ευρήματά μας έδειξαν ότι οι σχέσεις μεταξύ των νοσοκομειακών όγκων και των SSIs δεν υπήρχαν, ανεξάρτητα από το ποιοι ορισμοί, μέθοδοι κατηγοριοποίησης ή προσεγγίσεις αναγνώρισης περιπτώσεων SSIs χρησιμοποιήθηκαν. Αντίθετα, οι σχέσεις μεταξύ του όγκου των χειρουργών και των SSIs δεν ήταν ισχυρές στα δεδομένα μας. Μπορεί να επηρεαστεί από διαφορετικούς ορισμούς και μεθόδους κατηγοριοποίησης των όγκων λειτουργίας, καθώς και από διαφορετικές προσεγγίσεις προσδιορισμού περιπτώσεων SSI. Συνοπτικά, τα περισσότερα από τα μοντέλα έδειξαν ότι οι χειρουργοί χαμηλού όγκου είχαν υψηλότερο κίνδυνο από τους χειρουργούς μεγάλου όγκου και έδειξαν επίσης ότι οι κίνδυνοι ήταν παρόμοιοι μεταξύ των χειρουργών μεσαίου και μεγάλου όγκου. Ωστόσο, γιατί ο όγκος του χειρουργού αφορούσε τα SSI, αλλά ο όγκος του νοσοκομείου όχι; Εκτός από εκείνα τα θέματα που μας απασχολούσαν σε αυτή τη μελέτη, υπάρχουν κάποιες διαφωνίες στη βιβλιογραφία. Όπως \"Ο όγκος του παρόχου αντιπροσωπεύει πραγματικά την ποιότητα της περίθαλψης;\" [12, 35] Ή \"Είναι ο όγκος του παρόχου ο μόνος προγνωστικός παράγοντας για την έκβαση της φροντίδας;\" [35, 36] Αυτά τα ζητήματα αξίζουν περαιτέρω συζήτησης, αλλά βρίσκονται εκτός του πεδίου αυτής της μελέτης. Οι όγκοι υπηρεσιών/λειτουργίας αντιμετωπίζονται ως δείκτης μεσολάβησης για εμπειρίες. Προηγούμενες μελέτες το χρησιμοποιούσαν για να εξετάσουν εάν η πρακτική κάνει τέλεια ή όχι. Όμως, εκτός από τις εμπειρίες του παρόχου, τα SSI επηρεάζονται επίσης από πολλούς παράγοντες, όπως περιβαλλοντικούς και κλινικούς παράγοντες. Ο Wu et al χρησιμοποίησε κάποτε δεδομένα αξιώσεων του NHI της Ταϊβάν το 2001 για να διερευνήσει τη σχέση μεταξύ των όγκων λειτουργίας του παρόχου CABG και των SSI. [13] Βρήκαν ότι οι όγκοι των νοσοκομείων είχαν μεγαλύτερη επίδραση από τους όγκους των χειρουργών και ισχυρίστηκαν ότι αυτό μπορεί να σημαίνει ότι η ομαδική εργασία του νοσοκομείου είναι πιο σημαντική από τον μεμονωμένο χειρουργό. Ωστόσο, τα ευρήματά μας έδειξαν ότι δεν υπήρχε σχέση μεταξύ του όγκου των νοσοκομείων και των SSIs. Οι Wu et al. υιοθέτησε ως ορισμό τους αθροιστικούς όγκους λειτουργίας εντός της περιόδου μελέτης και προσδιόρισε τα SSI με κωδικούς ICD-9-CM. Εκτός, υπήρχαν δύο διαφορές μεταξύ της εργασίας μας και των Wu et al., που ήταν η διάρκεια και το έτος των δεδομένων. Τα δεδομένα μας ήταν μεγαλύτερα και πιο ενημερωμένα από τα δικά τους. Επιπλέον, αξίζει να σημειωθεί ότι υπήρξε ξέσπασμα σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου (SARS) στην Ταϊβάν το 2003, μετά το οποίο αναθεωρήθηκε και επανασχεδιάστηκε το σύστημα ελέγχου νοσοκομειακών λοιμώξεων στην Ταϊβάν. Τα δεδομένα των Wu et al ήταν πριν από το SARS, επομένως αυτές οι προσπάθειες μπορεί επίσης να βελτίωσαν το επίπεδο ελέγχου των SSIs στα νοσοκομεία, οδηγώντας σε διαφορετικά ευρήματα σε αυτή τη μελέτη. Επιπλέον, αν και τα περισσότερα μοντέλα αποκάλυψαν ότι υπήρχαν αρνητικές σχέσεις μεταξύ του όγκου του χειρουργού και της λοίμωξης του χειρουργικού σημείου , οι σχέσεις δεν ήταν εύρωστες. Τα αποτελέσματα διέφεραν μεταξύ διαφορετικών ορισμών και μεθόδων κατηγοριοποίησης των όγκων λειτουργίας, και μεταξύ των προσεγγίσεων αναγνώρισης SSI. Οι ερευνητές πρέπει να εξετάσουν πώς να αναγνωρίζουν σωστά τα SSI, πώς να επιλέγουν τις βέλτιστες τιμές αποκοπής και πώς να αποφασίζουν ποιος ορισμός είναι κατάλληλος. Τέλος, τα αποτελέσματα των αναλύσεων στρωματοποίησης έδειξαν ότι ο χειρουργός χαμηλού όγκου είχε υψηλότερο κίνδυνο από τον χειρουργό μεγάλου όγκου στην ομάδα του σακχαρώδους διαβήτη, όταν χρησιμοποιήθηκε ως ορισμός η αθροιστική επέμβαση κατά το προηγούμενο έτος πριν από την επέμβαση. Ένας μεγάλος αριθμός μελετών έχει δείξει ότι ο σακχαρώδης διαβήτης σχετίζεται με υψηλότερο κίνδυνο SSIs, [37] [38] [39] και τα ευρήματα αυτής της μελέτης υποδηλώνουν ότι οι ασθενείς με CABG με σακχαρώδη διαβήτη θα πρέπει να φροντίζονται από έμπειρους χειρουργούς. Η ανάλυση εφαρμόστηκε για τη διαχείριση των ένθετων παραγόντων και υιοθετήθηκαν δύο ορισμοί του όγκου λειτουργίας μαζί με τρεις διαφορετικές μεθόδους κατηγοριοποίησης του όγκου λειτουργίας για να εξεταστεί η σχέση μεταξύ όγκου και SSIs σε δύο είδη προσεγγίσεων αναγνώρισης SSI. Ωστόσο, η μελέτη υπέφερε από αρκετούς σημαντικούς περιορισμούς. Πρώτον, η ακρίβεια της ταυτοποίησης των SSI ήταν ακόμα ένα ζήτημα. Αν και η απόδοση του μοντέλου CART για την αναγνώριση των CABG SSIs ήταν καλύτερη από τους κωδικούς ICD-9-CM στα δεδομένα αξιώσεων του NHI της Ταϊβάν, δεν έφτασε στο τέλειο σενάριο. Η ακρίβεια της αναγνώρισης των SSI ήταν ακόμα μια πρόκληση στη δουλειά μας. Ο δεύτερος περιορισμός σχετίζεται με μη μετρημένες μεταβλητές, όπως η διάρκεια παραμονής πριν την επέμβαση, η κατάσταση μόλυνσης, η αποτρίχωση, οι κλινικές πληροφορίες (π. επίπεδο γλυκόζης στο αίμα, αιτιολογικός μικροοργανισμός), πληροφορίες που σχετίζονται με το χρόνο (π.χ. τη διάρκεια της επέμβασης), το περιβάλλον, τις χειρουργικές δεξιότητες, τη χρήση μετεγχειρητικών παροχετεύσεων, τον αριθμό των εμπλεκόμενων επεμβάσεων και τη φροντίδα του χειρουργικού σημείου και του τραύματος κ.λπ. [40] Επιπλέον, πληροφορίες σχετικά με τον τύπο (εκλεκτική ή επείγουσα) και τη θέση τομής για χειρουργική επέμβαση δεν ήταν διαθέσιμες στα δεδομένα των αξιώσεων NHI της Ταϊβάν. Συμπερασματικά, τα ευρήματα αυτής της μελέτης υποδηλώνουν ότι διαφορετικοί ορισμοί και μέθοδοι κατηγοριοποίησης των όγκων επέμβασης και διαφορετικοί SSIs Οι προσεγγίσεις αναγνώρισης μπορεί να οδηγήσουν σε διαφορετικά ευρήματα, αν και οι όγκοι των χειρουργών ήταν πιο σημαντικοί από τους όγκους των νοσοκομείων για τη διερεύνηση των σχέσεων μεταξύ των όγκων χειρουργικών επεμβάσεων CABG και των SSIs στην Ταϊβάν, αλλά και πάλι δεν ήταν ισχυροί. Οι ορισμοί και οι μέθοδοι κατηγοριοποίησης των όγκων λειτουργίας και η σωστή αναγνώριση των SSI είναι σημαντικά ζητήματα για μελλοντική έρευνα.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 3216, "text": "Η συνολική διάρκεια παραμονής και οι δαπάνες για ασθενείς με SSIs μετά από χειρουργική επέμβαση CABG είναι σημαντικά μεγαλύτερη και μεγαλύτερη από εκείνες χωρίς SSIs" } ], "id": 5248, "question": "Γιατί τα SSI είναι σημαντικά για τη συνολική επιβάρυνση του συστήματος υγειονομικής περίθαλψης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3513, "text": "τα νοσοκομεία δεν θα λαμβάνουν πλέον υψηλότερες πληρωμές για το πρόσθετο κόστος που σχετίζεται με τη θεραπεία ασθενών για ορισμένες λοιμώξεις που αποκτήθηκαν από την υγειονομική περίθαλψη" } ], "id": 5249, "question": "Ποια είναι η πολιτική \"Ποτέ Συμβάν\";" }, { "answers": [ { "answer_start": 12528, "text": "19" } ], "id": 5250, "question": "Ασθενείς από πόσα ιατρικά κέντρα μελετήθηκαν;" }, { "answers": [ { "answer_start": 10340, "text": "ασθενείς με CABG ηλικίας κάτω των 18 ετών ή άνω των 85 ετών" } ], "id": 5251, "question": "Ποιοι ασθενείς αποκλείστηκαν από τη μελέτη;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Αλληλουχίες γονιδιώματος του ιού της διάρροιας της επιδημίας χοίρων: Φαινότυποι in Vivo και in vitro Bumgardner, Eric; Bey, Russell F.; Stine, Douglas; Bumgarner, Roger E.Date: 2014-06-12DOI: 10.1128/genomea.00503-14License: cc-byAbstract: Από το ξέσπασμα του ιού της διάρροιας της επιδημίας των χοίρων (PEDV) τον Μάιο του 2013, πέντε εκατομμύρια παραγωγοί στις Η.Π.Α. . Σε μια προσπάθεια να κατανοήσουμε την εξέλιξη του PEDV στις Ηνωμένες Πολιτείες και να αναπτύξουμε πιθανώς μια στρατηγική ελέγχου, συγκρίναμε τις αλληλουχίες γονιδιώματος ενός στελέχους PEDV που απομονώθηκε από ένα μολυσμένο χοιρίδιο με την προσαρμοσμένη in vitro εκδοχή του. Το αρχικό στέλεχος PEDV αναπτύχθηκε σε κύτταρα Vero και πέρασε 10 φορές σειριακά σε κυτταρική σειρά MARC145. Η ανάλυση αλληλουχίας του φυσικού στελέχους PEDV και του ιού που έχει περάσει in vitro δείχνει ότι η προσαρμογή της κυτταροκαλλιέργειας τροποποιεί ειδικά την πρωτεΐνη ακίδας PEDV ενώ το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης 1a/b (ORF1a/b)-κωδικοποιημένη πολυπρωτεΐνη, η νουκλεοπρωτεΐνη, NS3B (ORF3) και οι πρωτεΐνες της μεμβράνης και του φακέλου παραμένουν αμετάβλητες.Κείμενο: εξαιρετικά μεταδοτική νόσος των χοίρων. Ενώ τα μεγαλύτερα γουρούνια έχουν πιθανότητες επιβίωσης, το 80 έως 100 τοις εκατό των μολυσμένων με PEDV χοιριδίων πεθαίνουν μέσα σε 24 ώρες από τη μόλυνση. Το PEDV εξαπλώνεται κυρίως μέσω της κοπράνων-στοματικής επαφής (1, 2) . Μόλις ο ιός εσωτερικευθεί, καταστρέφει την επένδυση των εντέρων των χοιριδίων, καθιστώντας τα ανίκανα να χωνέψουν και να αντλήσουν τροφή από το γάλα και τις ζωοτροφές (1) . Ο ιός προκαλεί διάρροια, έμετο και θάνατο από αφυδάτωση και ασιτία (2). Το PEDV είναι μέλος της υποοικογένειας Coronavirinae και ανήκει στο γένος Alphacoronavirus. Το γονιδιωματικό του μέγεθος κυμαίνεται από περίπου 26 έως 32 kb, το οποίο είναι σχετικά μεγάλο για έναν ιό RNA. Αν και υπάρχουν εμβόλια για το PEDV στην Κίνα, την Ιαπωνία και τη Νότια Κορέα, δεν υπάρχει εγκεκριμένο εμβόλιο στις Ηνωμένες Πολιτείες ή την Ευρώπη (3) . Επιπλέον, το PEDV εξακολουθεί να εξελίσσεται στον πληθυσμό των χοίρων των ΗΠΑ. Αυτή η αναφορά περιγράφει εν συντομία τη σύγκριση των αλληλουχιών γονιδιώματος ενός στελέχους PEDV που απομονώθηκε από δείγματα λεπτού εντέρου ενός μολυσμένου χοιριδίου και της προσαρμοσμένης in vitro εκδοχής του. Το αρχικό στέλεχος PEDV ονομάστηκε NPL-PEDV/2013, αναπτύχθηκε σε κύτταρα Vero και πέρασε 10 φορές σε κυτταρική σειρά MARC145. Το σειριακό in vitro στέλεχος διέλευσης ονομάστηκε NPL-PEDV/2013/P10. Το συνολικό ιικό RNA εκχυλίστηκε με αντιδραστήριο TRIZol LS και αλληλουχήθηκε με διδεοξυ αλληλουχία Sanger χρησιμοποιώντας μια τεχνική βάδισης εκκινητή. Οι ακατέργαστες ακολουθίες εισήχθησαν στο Geneious assembler (Biomatters, CA), συναρμολογήθηκαν, σχολιάστηκαν και συγκρίθηκαν μεταξύ τους χρησιμοποιώντας USA/Colorado/2013 (GenBank accession αρ. KF272920) ως αλληλουχία αναφοράς. Οι αλληλουχίες ολόκληρου του γονιδιώματος των NPL-PEDV/2013 και NPL-PEDV/2013/P10 περιέχουν 28.038 και 28.025 νουκλεοτίδια (nt), αντίστοιχα, συμπεριλαμβανομένων των 5= και 3= μη μεταφρασμένων περιοχών (UTR). Το γονιδίωμα NPL-PEDV/2013 μοιράζεται 99% ταυτότητα με όλα τα απομονωμένα στελέχη των Η.Π.Α. που έχουν προσδιοριστεί ως σήμερα, καθώς και με πολλά κινεζικά στελέχη. Οι τρεις κορυφαίες επιτυχίες BLAST ήταν εναντίον απομονώσεων των Η.Π.Α., USA/Colora-do/2013 (προσχώρηση GenBank αρ. KF272920), IA1 (αρ. προσχώρησης GenBank. KF468753.1), και ένα προϊόν απομόνωσης από την Iowa, 13-019349 (GenBank accession αρ. KF267450.1). Η απομόνωση NPL-PEDV/2013 μοιράζεται επίσης κατά 99% ταυτότητα με την κινεζική απομόνωση επιδημίας AH2012 (Αρ. KC210145). Όταν το στέλεχος NPL-PEDV/2013/P10 συγκρίθηκε με το NPL-PEDV/2013, βρέθηκε ότι η πολυπρωτεΐνη 1a/b (ORF1a/b) ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης, η νουκλεοπρωτεΐνη, το NS3B και οι πρωτεΐνες μεμβράνης και φακέλου 100% πανομοιότυπο σε επίπεδο αμινοξέων. Αντίθετα, το γονίδιο της ακίδας περιέχει έξι μη συνώνυμους μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς, με αποτέλεσμα υποκαταστάσεις αμινοξέων (aa) στις ακόλουθες θέσεις: 375 (F¡L), 486 (T¡P), 856 (D¡E), 1081 (A ¡V), 1099 (A¡S) και 1253 (Y¡D). Η περιοχή S1 της πρωτεΐνης ακίδας περιέχει 2 υποκαταστάσεις aa, ενώ η περιοχή S2 περιέχει 4 υποκαταστάσεις aa. Το PEDV έχει αποδειχθεί ότι χρησιμοποιεί την αμινοπεπτιδάση Ν χοίρου (pAPN) ως τον κύριο υποδοχέα για την είσοδο στα κύτταρα (4, 5) . Ωστόσο, τα κύτταρα Vero και MARC145 στερούνται pAPN, υποδεικνύοντας ξεκάθαρα ότι άλλοι υποδοχείς ή ανεξάρτητες από τον υποδοχέα μονοπάτια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για είσοδο (6) . Η πρωτεΐνη ακίδας στην τριμερή της διαμόρφωση αλληλεπιδρά με τον κυτταρικό υποδοχέα και περιέχει πολυάριθμους επιτόπους δέσμευσης αντισωμάτων εξουδετέρωσης (7) . Η ανάλυση της ακίδας από το PeptideCutter (http://web.expasy.org/ peptide_cutter/) δείχνει ότι η φυσική πρωτεΐνη ακίδας του NPL-PEDV/2013 έχει 63 θέσεις διάσπασης θρυψίνης και 2 χυμοθρυψίνης σε 100% αποτελεσματικότητα ενώ η NPL-PEDV/2 /Ρ10 έχει χάσει μία θέση διάσπασης θρυψίνης αλλά ο αριθμός των θέσεων χυμοθρυψίνης παραμένει αμετάβλητος. Αυτό υποδεικνύει ότι η προσαρμογή της κυτταρικής καλλιέργειας τροποποιεί ειδικά την πρωτεΐνη ακίδας PEDV. Ωστόσο, οι ανοσολογικές επιπτώσεις είναι άγνωστες. Αριθμοί προσχώρησης αλληλουχίας νουκλεοτιδίων. Οι αλληλουχίες ολόκληρου του γονιδιώματος των στελεχών NPL-PEDV/2013 και NPL-PEDV/2013/P10 έχουν κατατεθεί στο DDBJ/EMBL/GenBank με αρ. KJ778615 και KJ778616.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 1417, "text": "καταστρέφει την επένδυση των εντέρων των χοιριδίων" } ], "id": 5267, "question": "Πώς το PEDV προκαλεί ασθένεια;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1779, "text": "26 έως 32 kb" } ], "id": 5268, "question": "Ποιο είναι το μέγεθος του γονιδιώματος PEDV;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Ορολογικές Αναλύσεις Βασισμένες σε Ανασυνδυασμένες Ιικές Πρωτεΐνες για τη Διάγνωση Αιμορραγικών Πυρετών Αρεναϊών Tani, Hideki; Yoshikawa, Tomoki; Saijo, Masayuki; Morikawa, ShigeruDate: 2012-10-12DOI: 10.3390/v4102097License: cc-byAbstract: Η οικογένεια Arenaviridae, γένος Arenavirus, αποτελείται από δύο φυλογενετικά ανεξάρτητες ομάδες: σύμπλοκα Παλαιού Κόσμου (OW) και Νέου Κόσμου (NW). Οι ιοί Lassa και Lujo στο σύμπλεγμα OW και οι ιοί Guanarito, Junin, Machupo, Sabia και Chapare στο σύμπλεγμα NW προκαλούν ιογενή αιμορραγικό πυρετό (VHF) στους ανθρώπους, οδηγώντας σε σοβαρές ανησυχίες για τη δημόσια υγεία. Αυτοί οι ιοί θεωρούνται επίσης πιθανοί παράγοντες βιοτρομοκρατίας. Ως εκ τούτου, είναι πολύ σημαντικό να ανιχνευθούν αυτά τα παθογόνα ταχέως και συγκεκριμένα, προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί ο κίνδυνος και η κλίμακα των εστιών αρένα ιού. Ωστόσο, αυτοί οι αρεναιοί ταξινομούνται ως παθογόνα BSL-4, καθιστώντας έτσι δύσκολη την ανάπτυξη διαγνωστικών τεχνικών για αυτές τις λοιμώξεις από ιούς σε ινστιτούτα χωρίς εγκαταστάσεις BSL-4. Για να ξεπεραστούν αυτές οι δυσκολίες, αναπτύχθηκαν συστήματα ανίχνευσης αντισωμάτων με τη μορφή μιας ενζυμικής ανοσοπροσροφητικής δοκιμασίας (ELISA) και μιας έμμεσης δοκιμασίας ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένες νουκλεοπρωτεΐνες (rNPs) που προέρχονται από αυτούς τους ιούς. Επιπλέον, αναπτύχθηκαν αρκετές δοκιμασίες ανίχνευσης αντιγόνου. Για παράδειγμα, δημιουργήθηκαν νέα μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs) στα rNP των ιών Lassa και Junin. Αναπτύχθηκαν και επιβεβαιώθηκε ότι είναι ευαίσθητες και ειδικές για την ανίχνευση των αντίστοιχων NP του αρεναϊού ELISA σύλληψης αντιγόνου σάντουιτς (Ag-capture) που χρησιμοποιούν αυτά τα mAbs ως αντισώματα σύλληψης. Αυτές οι αναλύσεις που βασίζονται σε rNP προτάθηκαν να είναι χρήσιμες όχι μόνο για μια αιτιολογική διάγνωση των VHFs, αλλά και για οροεπιδημιολογικές μελέτες σε VHFs. Πρόσφατα αναπτύξαμε δοκιμές εξουδετέρωσης αρεναϊού χρησιμοποιώντας ψευδότυπους βασισμένους στον ιό της φυσαλιδώδους στοματίτιδας (VSV) που φέρουν ανασυνδυασμένες γλυκοπρωτεΐνες αρεναϊού. Ο στόχος αυτού του άρθρου είναι να επανεξετάσει τις πρόσφατες προόδους στην ανάπτυξη εργαστηριακών διαγνωστικών δοκιμών που βασίζονται σε ανασυνδυασμένες ιικές πρωτεΐνες για τη διάγνωση των VHF και επιδημιολογικές μελέτες για τους VHF που προκαλούνται από ιούς αρένα. Κείμενο: Η οικογένεια ιών Arenaviridae αποτελείται από ένα μόνο γένος, αλλά τα περισσότερα Οι ιοί σε αυτό το γένος μπορούν να χωριστούν σε δύο διαφορετικές ομάδες: τους αρένα ιούς του Παλαιού Κόσμου και τους αρένα ιούς του Νέου Κόσμου (γνωστοί και ως σύμπλεγμα Tacaribe) [1, 2] . Οι διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων έχουν αποδειχθεί μέσω της χρήσης ορολογικών αναλύσεων. Οι περισσότεροι από τους αρένα ιούς προκαλούν επίμονη μόλυνση σε τρωκτικά χωρίς συμπτώματα και οι άνθρωποι αποκτούν μια ποικιλία ασθενειών όταν μολύνονται ζωονοσογόνα. Ο ιός της λεμφοκυτταρικής χοριομηνιγγίτιδας (LCMV) είναι ο μόνος αρένας ιός που παρουσιάζει παγκόσμια κατανομή και προκαλεί ασθένειες όπως η μηνιγγίτιδα [3, 4] . Συγγενείς λοιμώξεις από LCMV έχουν επίσης αναφερθεί [4, 5]. Το πιο σημαντικό, ο ιογενής αιμορραγικός πυρετός (VHF) μπορεί να προκληθεί από αρκετούς αρένα ιούς. Ο πυρετός Lassa, που προκαλείται από τον ιό Lassa (LASV), έναν αρένα ιό του Παλαιού Κόσμου, είναι ένας από τους πιο καταστροφικούς VHF στους ανθρώπους [6] . Αιμορραγία και ανεπάρκεια οργάνων εμφανίζονται σε ένα υποσύνολο ασθενών που έχουν μολυνθεί από αυτόν τον ιό και σχετίζεται με υψηλή θνησιμότητα. Πολλές περιπτώσεις πυρετού Lassa εμφανίζονται στη Δυτική Αφρική σε χώρες όπως η Γουινέα, η Σιέρα Λεόνε και η Νιγηρία [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] . Το σύμπλεγμα Tacaribe η γενεαλογία Β των αρένα ιών του Νέου Κόσμου αποτελείται από τον ιό Junin (JUNV), τον ιό Guanarito (GUNV), τον ιό Sabia (SABV) και τον ιό Machupo (MACV), τους αιτιολογικούς παράγοντες των αιμορραγικών πυρετών της Αργεντινής, της Βενεζουέλας, της Βραζιλίας και της Βολιβίας. , αντίστοιχα [14, 15] . Αν και γενετικά διαφορετικά μεταξύ τους, φαίνεται να προκαλούν παρόμοια συμπτώματα, συνοδευόμενα από αιμορραγία στον άνθρωπο [14, 15]. Αυτά τα παθογόνα είδη αρένα ιού του Νέου Κόσμου συνδέονται στενά με ένα συγκεκριμένο είδος τρωκτικών [6] .Οι άνθρωποι συνήθως μολύνονται με παθογόνους αρένα ιούς μέσω άμεσης επαφής με ιστό ή αίμα ή μετά από εισπνοή αεροζόλ σωματιδίων από ούρα, κόπρανα και σάλιο μολυσμένων τρωκτικών. Μετά από μια περίοδο επώασης 1-3 εβδομάδων, τα μολυσμένα άτομα αναπτύσσουν απότομα πυρετό, οπισθοστερνικό πόνο, πονόλαιμο, οσφυαλγία, βήχα, κοιλιακό άλγος, έμετο, διάρροια, επιπεφυκίτιδα, πρήξιμο προσώπου, πρωτεϊνουρία και αιμορραγία του βλεννογόνου. Έχουν επίσης περιγραφεί νευρολογικά προβλήματα, όπως απώλεια ακοής, τρόμος και εγκεφαλίτιδα. Επειδή τα συμπτώματα της παθογόνου ασθένειας που σχετίζεται με αρένα ιούς είναι ποικίλα και μη ειδικά, η κλινική διάγνωση είναι συχνά δύσκολη [14, 16]. Η μετάδοση από άνθρωπο σε άνθρωπο μπορεί να συμβεί μέσω βλεννογονικής ή δερματικής επαφής ή μέσω νοσοκομειακής μόλυνσης [14, 16] . Αυτοί οι ιοί θεωρούνται επίσης ως πιθανοί παράγοντες βιοτρομοκρατίας [2] .Ένας αριθμός ειδών ιών αρένα έχουν ανακαλυφθεί πρόσφατα ως αποτέλεσμα τόσο ερευνών σε τρωκτικά όσο και ως αποτέλεσμα εστιών ασθενειών [17] [18] [19] [20] [21] [22] ] [23] [24] [25] [26] . Ένας νέος παθογόνος αρέναϊος του Νέου Κόσμου, ο ιός Chapare (CHPV), απομονώθηκε από ένα θανατηφόρο κρούσμα VHF στη Βολιβία [20] . Επιπλέον, πέντε περιπτώσεις VHF έχουν αναφερθεί στη Νότια Αφρική και ένας νέος αρένας ιός, ο ιός Lujo, απομονώθηκε από έναν ασθενή [17] . Ο ιός Lujo σχετίζεται πιο απομακρυσμένα με τους άλλους αρένα ιούς του Παλαιού Κόσμου [17] . Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχουν πληροφορίες σχετικά με τον ξενιστή των σπονδυλωτών για τους ιούς Chapare και Lujo. Υπάρχουν κάποιες ενδείξεις ενδημικότητας του ιού Lassa σε γειτονικές χώρες [27, 28] . Ωστόσο, καθώς το μέγεθος του διεθνούς εμπορίου και των ταξιδιών αυξάνεται συνεχώς και η διαταραχή του περιβάλλοντος (λόγω είτε της ανθρώπινης δραστηριότητας είτε λόγω φυσικών οικολογικών αλλαγών) μπορεί να οδηγήσει σε αλλαγές συμπεριφοράς των τρωκτικών ρεζερβουάρ, οι υψηλά παθογόνοι αρένα ιοί θα μπορούσαν να εισαχθούν σε μη ιούς χώρες από ενδημικές περιοχές. Στην πραγματικότητα, περισσότερες από είκοσι περιπτώσεις πυρετού Lassa έχουν αναφερθεί εκτός της ενδημικής περιοχής σε περιοχές όπως οι ΗΠΑ, ο Καναδάς, η Ευρώπη και η Ιαπωνία [29] [30] [31] [32] [33] . Είναι πολύ σημαντικό να ανιχνευθούν αυτά τα παθογόνα ταχέως και ειδικά προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί ο κίνδυνος και η κλίμακα των επιδημιών VHF που προκαλούνται από αρεναϊούς. Ωστόσο, αυτοί οι αρέναιοί ταξινομούνται ως παθογόνα επιπέδου βιοασφάλειας (BSL)-4, γεγονός που καθιστά δύσκολη την ανάπτυξη διαγνωστικών τεχνικών για αυτές τις λοιμώξεις από ιούς σε εργαστήρια χωρίς εγκαταστάσεις BSL-4. Για να ξεπεραστούν αυτές οι δυσκολίες, έχουμε καθιερώσει ορολογικές δοκιμασίες βασισμένες σε ανασυνδυασμένες ιικές νουκλεοπρωτεΐνες (rNPs), όπως η ανοσοπροσροφητική δοκιμασία συνδεδεμένη με ένζυμο IgG (ELISA), η έμμεση δοκιμασία ανοσοφθορισμού (IFA) και η ELISA σύλληψης αντιγόνου (Ag) για τη διάγνωση των VHFs που προκαλούνται από εξαιρετικά παθογόνους αρένα ιούς. Περαιτέρω, έχουν αναπτυχθεί δοκιμασίες εξουδετέρωσης ιών με χρήση ψευδοτύπων αρρενοϊών GP που φέρουν ιούς. Σε αυτήν την ανασκόπηση, περιγράφουμε τη χρησιμότητα τέτοιων διαγνωστικών αναλύσεων με βάση ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες για τη διάγνωση VHF που προκαλούνται από αρεναϊούς. Σε εστίες VHF, οι λοιμώξεις επιβεβαιώνονται με διάφορες εργαστηριακές διαγνωστικές μεθόδους. Η ανίχνευση του ιού πραγματοποιείται με απομόνωση ιού, ανάστροφη μεταγραφή-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR) και ELISA σύλληψης αντιγόνου. Έχει αποδειχθεί ότι τα πάνελ μονοκλωνικών αντισωμάτων κατά των παθογόνων αρεναϊών είναι χρήσιμα για την ανίχνευση ιικών αντιγόνων στα μολυσμένα από τον ιό κύτταρα καθώς και για τη διερεύνηση των αντιγονικών σχέσεων των αρεναϊών [34] [35] [36] . Η ανίχνευση του γονιδιώματος του ιού είναι κατάλληλη για μια γρήγορη και ευαίσθητη διάγνωση ασθενών με VHF στο πρώιμο στάδιο της νόσου και έχουν περιγραφεί εκτενείς ανασκοπήσεις τέτοιων αναλύσεων RT-PCR [37, 38]. Πιο πρόσφατα, έχει επίσης αναφερθεί πρόοδος στη μέθοδο RT-PCR που καλύπτει γενετικές παραλλαγές των ιών του αιμορραγικού πυρετού (HFVs) [39, 40] και μια πολυπλεγμένη μικροσυστοιχία ολιγονουκλεοτιδίων για τη διαφορική διάγνωση των VHF [41] . Από την άλλη πλευρά, τα αντισώματα έναντι αυτών των ιών μπορούν να ανιχνευθούν με την έμμεση δοκιμασία ανοσοφθορισμού (IFA) ή IgG-και IgM-ELISA. Μια IFA ανιχνεύει το αντίσωμα στον ορό, το οποίο είναι σε θέση να δεσμεύεται στη σταθερή μονοστιβάδα των μολυσμένων από τον ιό κυττάρων. Αν και η ερμηνεία των αποτελεσμάτων ανοσοφθορισμού απαιτεί εμπειρία, η δοκιμασία έχει πλεονεκτήματα έναντι άλλων μεθόδων, καθώς κάθε ιός δημιουργεί ένα χαρακτηριστικό πρότυπο φθορισμού που προσθέτει ειδικότητα στη δοκιμασία σε σύγκριση με μια απλή ανάγνωση ELISA. Η ορολογική διάγνωση με την ανίχνευση ειδικών αντισωμάτων IgM και IgG στα HFVs πρέπει να είναι ευαίσθητη, ειδική και αξιόπιστη, γιατί μια λανθασμένη διάγνωση μπορεί να οδηγήσει σε πανικό στον γενικό πληθυσμό. Μια ειδική για IgM ELISA είναι κατάλληλη για την ανίχνευση πρόσφατης λοίμωξης, αλλά η συνάφεια της εξέτασης IgM για οξεία VHF εξαρτάται από τον ιό και τη διάρκεια της νόσου. Η ειδική IgM δεν είναι συχνά παρούσα στο πολύ πρώιμο στάδιο της νόσου και οι ασθενείς που πεθαίνουν από VHF συχνά αποτυγχάνουν να ορομετατραπούν καθόλου. Η ειδική για IgG ELISA είναι αποτελεσματική, όχι μόνο στη διάγνωση μεγάλου αριθμού περιπτώσεων VHF, ειδικά κατά την ανάρρωση, αλλά και για επιδημιολογικές μελέτες στις ενδημικές περιοχές. Οι λεπτομερείς μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τα IFA και IgG-και IgM-ELISA για τη διάγνωση της VHF χρησιμοποιώντας αυθεντικά αντιγόνα ιού έχουν περιγραφεί λεπτομερώς [42] [43] [44] [45] .Οι αρεναιοιοί έχουν διτμηματοποιημένη, αρνητική αίσθηση , μονόκλωνο γονιδίωμα RNA με μια μοναδική στρατηγική κωδικοποίησης ambisense που παράγει μόνο τέσσερις γνωστές πρωτεΐνες: μια γλυκοπρωτεΐνη, μια νουκλεοπρωτεΐνη (NP), μια πρωτεΐνη μήτρας (Z) και μια πολυμεράση (L) [46] . Από αυτές τις πρωτεΐνες, το NP είναι το πιο άφθονο στα μολυσμένα από ιό κύτταρα. Η τεχνολογία ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών θα μπορούσε να καλύψει τη ζήτηση για ένα απλό και αξιόπιστο σύστημα δοκιμών VHF και το ανασυνδυασμένο NP (rNP) έχει αποδειχθεί χρήσιμο για ορολογικές έρευνες αντισωμάτων IgM-και IgG έναντι των αρεναϊών [47] [48] [49] [50 ] . Έχουν δημιουργηθεί ανασυνδυασμένοι βακουλοϊοί που εκφράζουν το πλήρους μήκους rNP των αρεναϊών [48, 50, 51] . Η μέθοδος που χρησιμοποιείται για τον καθαρισμό του αρεναϊού rNP από κύτταρα Tn5 εντόμων που έχουν μολυνθεί με ανασυνδυασμένους βακουλοϊούς είναι αποτελεσματική και απλή σε σύγκριση με εκείνες για τον ιό Έμπολα, Μάρμπουργκ και rNP του αιμορραγικού πυρετού Κριμαίας-Κονγκό [51] [52] [53] [54] [ 55] . Τα περισσότερα από τα rNP του αρεναϊού που εκφράζονται σε κύτταρα εντόμων χρησιμοποιώντας τους ανασυνδυασμένους βακουλοϊούς κρυσταλλώνονται [56] και διαλυτοποιούνται σε PBS που περιέχει 8Μ ουρία. Εφόσον η πλειονότητα των κυτταρικών πρωτεϊνών Tn5 διαλυτοποιείται σε PBS που περιέχει 2Μ ουρία, τα rNPs του αρεναϊού στο αδιάλυτο κλάσμα σε PBS που περιέχει 2Μ ουρία μπορούν να διαλυτοποιηθούν με υπερήχους σε PBS που περιέχει 8Μ ουρία. Μετά από μια απλή φυγοκέντρηση των προϊόντων λύσης σε PBS που περιέχει 8Μ ουρία, τα υπερκείμενα κλάσματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως καθαρισμένα αντιγόνα rNP χωρίς περαιτέρω στάδια καθαρισμού [51] . Το αντιγόνο ελέγχου παράγεται από κύτταρα Tn5 μολυσμένα με βακουλοϊό που δεν έχουν το γονίδιο πολυεδρίνης (ΔΡ) με τον ίδιο τρόπο όπως τα rNPs του arenavirus (Εικόνα 1). Καθαρισμένα rNPs. Η απόδοση έκφρασης και καθαρισμού του rNP του αρεναϊού αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) μετά από χρώση των πηκτωμάτων με μπλε Coomassie. Δείχνονται καθαρισμένα αντιγόνα NP με κατά προσέγγιση μοριακά βάρη 62 kDa από ιούς Luna, LCM, Lassa, Lujo, Junin, Machupo, Guanarito, Sabia και Chapare και το καθαρισμένο αντιγόνο αρνητικού ελέγχου (ΔP). Όπως περιγράφεται παραπάνω, οι ανασυνδυασμένοι βακουλοϊοί επιτρέπουν την παράδοση αντιγόνων rNP χωρίς τη χρήση μολυσματικών ζωντανών αρεναϊών. Μια πλάκα ELISA επικαλυμμένη με την προκαθορισμένη βέλτιστη ποσότητα καθαρισμένων rNPs (περίπου 100 ng/φρεάτιο) χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό ανίχνευσης αντισωμάτων IgG. Ένα πλεονέκτημα της χρήσης ανασυνδυασμένου rNP για το IgG-ELISA είναι ότι επιτρέπει την άμεση σύγκριση της διασταυρούμενης αντιδραστικότητας αντισωμάτων μεταξύ των rNP του αρεναϊού, καθώς οι παρασκευές αντιγόνου όλων των rNP του αρεναϊού που δοκιμάστηκαν εκτελούνται χρησιμοποιώντας την ίδια μέθοδο [51] . Οι αντιοροί κουνελιών που αναπτύχθηκαν έναντι LCMV-rNP και LASV-rNP δείχνουν διασταυρούμενη αντιδραστικότητα σε LASV-rNP και LCMV-rNP, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι τα αντισώματα κουνελιού έναντι rNP των αρεναϊών του Παλαιού Κόσμου αντιδρούν διασταυρούμενα με rNP άλλων αρναϊών του Παλαιού Κόσμου (Table 1 ) [51] . Ομοίως, οι αντιοροί κουνελιών που δημιουργούνται έναντι του JUNV-NP παρουσιάζουν διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με τα LASV-rNP και LCMV-rNP, αν και η αντίδραση είναι ασθενής. Ωστόσο, οι αντιοροί κουνελιών κατά LASV-NP και LCMV-NP δείχνουν αρνητική αντίδραση στο JUNV-rNP (Πίνακας 1) [51] , υποδεικνύοντας ότι τα αντισώματα κουνελιού κατά του JUNV (παθογόνος αρένας του Νέου Κόσμου) NP ενδέχεται να αντιδράσουν διασταυρούμενα με το NP του αρένα ιού του Παλαιού Κόσμου, ενώ τα αντισώματα κατά των NP του αρένα ιού του Παλαιού Κόσμου ενδέχεται να μην είναι σε θέση να αντιδράσουν με τα παθογόνα NP του αρένα ιού του Νέου Κόσμου. Το IgG-ELISA που βασίζεται σε rNP έχει επίσης χρησιμοποιηθεί για τον χαρακτηρισμό ενός μονοκλωνικού αντισώματος ποντικού (MAb). Nakauchi et al. [50] έχουν διερευνήσει τη διασταυρούμενη αντιδραστικότητα των MAb έναντι του JUNV rNP σε παθογόνα rNP του αρένα του Νέου Κόσμου, καθώς και του LASV rNP. Το MAb C11-12 αντιδρά στο ίδιο επίπεδο με τα rNP όλων των παθογόνων αρεναϊών του Νέου Κόσμου, συμπεριλαμβανομένων των JUNV, GTOV, MACV, SABV και CHPV, υποδεικνύοντας ότι αυτό το MAb αναγνωρίζει έναν επίτοπο που διατηρείται μεταξύ των παθογόνων αρεναϊών του Νέου Κόσμου. Ένα άλλο MAb, το C6-9, αντιδρά ειδικά με το rNP του JUNV, αλλά δεν αντιδρά με αυτά των άλλων παθογόνων αρεναϊών του Νέου Κόσμου [50] . Αυτό υποδεικνύει ότι το MAb C6-9 αναγνωρίζει έναν ειδικό για τον JUNV επίτοπο. Κανένα από αυτά τα MAbs δεν αντιδρά με το rNP του ανθρώπινου παθογόνου αρένα ιού του Παλαιού Κόσμου LASV. Έτσι, το MAb C11-12 θεωρείται ότι είναι ένα ευρέως αντιδραστικό MAb έναντι των αρεναϊών του Νέου Κόσμου, ενώ το MAb C6-9 είναι ειδικό για το JUNV. Αυτά τα ευρήματα επιβεβαιώθηκαν με λεπτομερείς αναλύσεις επιτόπων χρησιμοποιώντας χαρτογράφηση πεπτιδίων [50] . Ομοίως, έχει αναλυθεί η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα των MAbs έναντι του LASV rNP [51] . Το MAb 4A5 αντιδρά διασταυρούμενη με τον ιό Mopeia (MOPV) αλλά όχι με τον LCMV rNP. Το MAb 6C11 αντιδρά διασταυρούμενη με LCMV rNP, ενώ το MAb 2-11 δεν αντιδρά διασταυρούμενη με LCMV rNP [51] . Τραπέζι 1 . Αντιδραστικότητα κατά του ορού για rNP διαφορετικών αραϊών σε IgG ELISA. Αντιδραστικότητα για rNP από το LASV LCMV JUNV anti-LASV NPIt είναι σημαντική για να αξιολογηθεί εάν η ELISA που βασίζεται σε rNP είναι χρήσιμη για τη διάγνωση περιπτώσεων ανθρώπινης VHF. Η ειδικότητα του IgG ELISA που βασίζεται σε LASV-rNP έχει επιβεβαιωθεί με τη χρήση ορών που ελήφθησαν από ασθενείς με πυρετό Lassa [51] . Οι οροί ασθενών με πυρετό Lassa δείχνουν μια εξαιρετικά θετική αντίδραση στο IgG-ELISA που βασίζεται στο LASV-rNP, αλλά οι οροί από ασθενείς με αργεντινικό αιμορραγικό πυρετό (AHF), ο οποίος προκαλείται από JUNV, δεν το κάνουν. Ο ορός από έναν ασθενή με AHF έδειξε μια εξαιρετικά θετική αντίδραση στο IgG-ELISA που βασίζεται σε JUNV-rNP [49] . Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι, χρησιμοποιώντας ορούς που ελήφθησαν από περιπτώσεις AHF, τα αποτελέσματα της ELISA IgG που βασίζεται σε JUNV rNP συσχετίζονται καλά με μια αυθεντική ELISA IgG που βασίζεται σε αντιγόνο JUNV [49] . Μια ELISA σύλληψης IgM που χρησιμοποιεί καθαρισμένο LASV-rNP ως αντιγόνο έχει αναπτυχθεί με τον ίδιο τρόπο όπως σε προηγούμενες αναφορές [54, 57] και ανιχνεύει ένα αντίσωμα LASV-IgM [58] . Επιπροσθέτως, αναλύσεις ανοσοστύπωσης που βασίζονται σε αμινοτελικά περικομμένο LASV rNP έχουν αναπτυχθεί για την ανίχνευση αντισωμάτων IgG και IgM έναντι του LASV. Αυτές οι μέθοδοι μπορεί να παρέχουν μια γρήγορη και απλή δοκιμή πυρετού Lassa για χρήση υπό συνθήκες πεδίου [47] . Μια IFA που χρησιμοποιεί κύτταρα μολυσμένα από ιούς είναι μια κοινή δοκιμή αντισωμάτων για ιούς VHF [59] [60] [61] [62] [63] . Για να αποφευχθεί η χρήση εξαιρετικά παθογόνων ιών για την παρασκευή αντιγόνου, έχουν αναπτυχθεί κύτταρα θηλαστικών που εκφράζουν ανασυνδυασμένο rNP [51, 57, [64] [65] [66] [67] [68] . Το αντιγόνο NP του ιού Lassa για IFA μπορεί να παρασκευαστεί απλά όπως περιγράφεται [51] . Εν συντομία, η διαδικασία περιλαμβάνει (1) επιμόλυνση κυττάρων HeLa με φορέα έκφρασης κυττάρων θηλαστικού που έχει εισαχθεί με το κλωνοποιημένο NP cDNA. (2) επέκταση των σταθερών κυττάρων που εκφράζουν NP με επιλογή αντιβιοτικού. (3) ανάμιξη των κυττάρων που εκφράζουν rNP με μη επιμολυνθέντα κύτταρα HeLa (σε αναλογία 1:1). (4) κηλίδες των κυτταρικών μιγμάτων σε γυάλινες πλάκες, στη συνέχεια στέγνωμα και στερέωση τους σε ακετόνη. Στο IFA που είναι ειδικό για το LASV-NP, οι θετικοί αντισώματα οροί εμφανίζουν χαρακτηριστικά κοκκώδη μοτίβα χρώσης στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 2) [69], καθιστώντας έτσι είναι εύκολο να διακρίνει κανείς τα θετικά από τα αρνητικά δείγματα. Η ειδικότητα της ανάλυσης έχει επίσης επιβεβαιωθεί με τη χρήση ορών που ελήφθησαν από ασθενείς με πυρετό Lassa [51] . Επιπλέον, μια IFA που χρησιμοποιεί κύτταρα HeLa που εκφράζουν JUNV rNP έχει αναπτυχθεί για την ανίχνευση αντισωμάτων κατά του JUNV και η ανάλυση έχει αξιολογηθεί χρησιμοποιώντας ορούς ασθενών με AHF [70] . Τα συστήματα ανίχνευσης αντισωμάτων που βασίζονται στο LASV-rNP, όπως το ELISA και το IFA, προτείνονται να είναι χρήσιμα όχι μόνο για τη διάγνωση του πυρετού Lassa, αλλά και για οροεπιδημιολογικές μελέτες μόλυνσης από LASV. Στην προκαταρκτική μας μελέτη, περίπου το 15% των ορών που συλλέχθηκαν από 334 Γκανέζους και λιγότερο από το 3% από 280 Ζάμπιας παρουσίασαν θετικές αντιδράσεις στην ELISA IgG που βασίζεται στο LASV-rNP [58] . Αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν με το γεγονός ότι ο πυρετός Lassa είναι ενδημικός στην περιοχή της Δυτικής Αφρικής, συμπεριλαμβανομένης της Γκάνας, αλλά λιγότερο στην περιοχή της Ανατολικής Αφρικής. Για τη διάγνωση πολλών ιογενών λοιμώξεων, οι αναλύσεις PCR έχουν αποδειχθεί ότι έχουν εξαιρετική αναλυτική ευαισθησία, αλλά οι καθιερωμένες τεχνικές περιορίζονται από την απαίτησή τους για ακριβό εξοπλισμό και τεχνική εμπειρογνωμοσύνη. Επιπλέον, ο υψηλός βαθμός γενετικής μεταβλητότητας των ιών RNA, συμπεριλαμβανομένου του αρεναϊού και του ιού bunya, δημιουργεί δυσκολίες στην επιλογή εκκινητών για προσδιορισμούς RT-PCR που μπορούν να ανιχνεύσουν όλα τα στελέχη του ιού. Δεδομένου ότι η ευαισθησία της ELISA σύλληψης Ag είναι συγκρίσιμη με εκείνη της RT-PCR για αρκετές λοιμώδεις νόσους που προκαλούνται από ιούς, συμπεριλαμβανομένου του πυρετού Lassa και του αιμορραγικού πυρετού από φιλοϊό [51, [71] [72] [73] , το Ag-capture ELISA είναι μια εξελιγμένη προσέγγιση που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διάγνωση ιογενών λοιμώξεων. Οι ELISA σύλληψης Ag που ανιχνεύουν το ιικό NP σε ιαιμικούς ορούς έχουν εφαρμοστεί ευρέως για την ανίχνευση διαφόρων ιών, καθώς είναι τα πιο άφθονα ιικά αντιγόνα και έχουν εξαιρετικά διατηρημένες αλληλουχίες αμινοξέων [50, 51, 54, 71, 72, 74, 75]. Οι πολυκλωνικοί αντιοροί ή ένα μείγμα MAbs που υπάρχουν στα ασκητικά υγρά από ζώα που έχουν ανοσοποιηθεί για HFVs έχουν χρησιμοποιηθεί για αντισώματα σύλληψης στο Ag-capture ELISA [36, [76] [77] [78] [79] . Τα MAbs που αναγνωρίζουν διατηρημένους επιτόπους του rNP χρησιμοποιούνται επίσης ως αντισώματα σύλληψης, καθώς έχουν υψηλή ειδικότητα για τα αντιγόνα και η αναγνώριση των επιτόπων αυτών των MAbs είναι ζωτικής σημασίας για την αξιολόγηση της ειδικότητας και της διασταυρούμενης αντιδραστικότητας του συστήματος ανάλυσης [50, 51, 53, 54, 71, 75]. Προκειμένου να αναπτυχθεί ένα ευαίσθητο διαγνωστικό τεστ για τον πυρετό Lassa και το AHF, έχουν παρασκευαστεί rNPs του LASV και του JUNV (βλέπε παραπάνω) και τα νεοϊδρυθέντα MAbs εναντίον τους έχουν χαρακτηριστεί και χρησιμοποιηθεί για ELISA σύλληψης Ag [50, 51] . Η ELISA σύλληψης Ag με χρήση MAb 4A5 έχει επιβεβαιωθεί ότι είναι χρήσιμη στην ανίχνευση αυθεντικού αντιγόνου LASV σε ορούς που συλλέγονται σειριακά από χάμστερ που έχουν μολυνθεί με LASV [51] . Η ευαισθησία της ELISA σύλληψης Ag με βάση το MAb 4A5 ήταν παρόμοια με εκείνη της συμβατικής RT-PCR, υποδηλώνοντας ότι η ELISA σύλληψης Ag μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποτελεσματικά στη διάγνωση του πυρετού Lassa [51] . Επομένως, η ELISA Ag-capture με βάση το MAb 4A5 θεωρείται χρήσιμη στη διάγνωση του πυρετού Lassa. Επίσης, με τη χρήση MAbs που εγείρονται έναντι του rNP του JUNV, έχουν αναπτυχθεί ELISA δέσμευσης Ag-σύλληψης ειδικά για το JUNV και ευρέως αντιδραστικά σε ανθρώπινους παθογόνους αρένα ιούς του Νέου Κόσμου [50] . Το Ag-capture ELISA χρησιμοποιώντας MAb E4-2 και C11-12 ανίχνευσε τα Ags όλων των παθογόνων αρένα ιών του Νέου Κόσμου που δοκιμάστηκαν, συμπεριλαμβανομένου του JUNV. Από την άλλη πλευρά, το Ag-capture ELISA χρησιμοποιώντας MAb C6-9 ανιχνεύει μόνο το JUNV Ag. Λαμβάνοντας υπόψη ότι τα συμπτώματα της λοίμωξης από JUNV στους ανθρώπους δεν διακρίνονται από εκείνα που οφείλονται σε άλλους παθογόνους ιούς του Νέου Κόσμου, η ELISA σύλληψης Ag με χρήση MAb C6-9 μπορεί να είναι ένα χρήσιμο διαγνωστικό εργαλείο, ειδικά για το AHF [50] . Η δοκιμασία εξουδετέρωσης του ιού είναι αποδεκτή ως ο οροδιαγνωστικός προσδιορισμός «χρυσού προτύπου» για την ποσοτικοποίηση της απόκρισης αντισωμάτων στη μόλυνση και τον εμβολιασμό μιας μεγάλης ποικιλίας ιών που σχετίζονται με ανθρώπινες ασθένειες [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] . Η παρουσία εξουδετερωτικών αντισωμάτων είναι ένας αξιόπιστος δείκτης προστατευτικής ανοσίας έναντι του VHF [87] [88] [89] . Η πιο άμεση μέθοδος για την ανίχνευση εξουδετερωτικών αντισωμάτων έναντι των HFVs είναι με δοκιμές εξουδετέρωσης μείωσης της πλάκας με χρήση μολυσματικών ιών. Ωστόσο, λόγω της υψηλής παθογονικότητας των HFV για τον άνθρωπο και της αυστηρής ρύθμισης επιλεγμένων παραγόντων, μόνο ένας περιορισμένος αριθμός εργαστηρίων είναι σε θέση να πραγματοποιήσει τέτοιες δοκιμές εξουδετέρωσης. Για πολλούς HFV, τα σωματίδια ψευδότυπου ιού με ανίκανη αναπαραγωγή και που φέρουν πρωτεΐνη φακέλου ιού (GP) έχει αποδειχθεί ότι μιμούνται τις αντίστοιχες λοιμώξεις από HFV, επομένως, οι δοκιμές εξουδετέρωσης που χρησιμοποιούν τους ψευδότυπους μπορεί να είναι επωφελείς σε ορισμένες εργαστηριακές ρυθμίσεις για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι των HFV χωρίς ανάγκη για αυξημένες απαιτήσεις βιοπεριορισμού. Ο φορέας που βασίζεται σε VSV έχει ήδη χρησιμοποιηθεί για τη δημιουργία ικανών για αναπαραγωγή ανασυνδυασμένων VSV για τη μελέτη του ρόλου των GP διαφόρων ιών [90] [91] [92] . Οι πρόσφατες εξελίξεις στην παραγωγή σωματιδίων ψευδοτύπου ιού επέτρεψαν τη διερεύνηση της εισόδου των κυττάρων του ιού, του ιικού τροπισμού και της επίδρασης των αναστολέων εισόδου, καθώς και τη μέτρηση των τίτλων εξουδετέρωσης, χρησιμοποιώντας ιούς ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας, ιού ανοσοανεπάρκειας αιλουροειδών, ιού λευχαιμίας ποντικού - ή διανύσματα που βασίζονται σε VSV [86, [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100] [101] [102] [103] . Οι ψευδότυποι που βασίζονται σε VSV έχουν πλεονεκτήματα σε σύγκριση με άλλους ψευδότυπους που βασίζονται σε ρετροϊούς για τους ακόλουθους λόγους. Πρώτον, ο τίτλος του ψευδοτύπου ιού που λαμβάνεται με το σύστημα VSV είναι γενικά υψηλότερος από εκείνον του ψευδότυπου συστήματος ρετροϊού [104] . Δεύτερον, η μόλυνση των κυττάρων-στόχων με έναν ψευδότυπο VSV μπορεί εύκολα να ανιχνευθεί ως θετικά στην πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) κύτταρα 7-16 ώρες μετά τη μόλυνση λόγω του υψηλού επιπέδου έκφρασης GFP στο σύστημα VSV [104, 105] . Αντίθετα, ο χρόνος που απαιτείται για τη μόλυνση στο ψευδότυπο σύστημα ρετροϊού είναι 48 ώρες [106, 107], ο οποίος είναι παρόμοιος με τον χρόνο που απαιτείται για τους λοιμώδεις ιούς να αναπαραχθούν σε ένα επίπεδο που οδηγεί σε σχηματισμό πλάκας ή κυτταροπαθητικά αποτελέσματα σε μολυσμένα κύτταρα. Έχει επίσης αναπτυχθεί μια δοκιμασία υψηλής απόδοσης για τον προσδιορισμό των τίτλων εξουδετερωτικών αντισωμάτων χρησιμοποιώντας ψευδότυπους VSV που εκφράζουν εκκρινόμενη αλκαλική φωσφατάση [108, 109] ή λουσιφεράση (Εικόνα 3). Πρόσφατα αναπτύξαμε έναν ψευδότυπο βασισμένο σε VSV που φέρει τον ιό Lassa GP (VSV-LAS-GP) για την ανίχνευση εξουδετερωτικών αντισωμάτων στους ορούς που ελήφθησαν από έναν ασθενή με πυρετό Lassa. Παρουσιάζεται ένα παράδειγμα της δοκιμασίας εξουδετέρωσης LASV χρησιμοποιώντας τον ψευδότυπο VSV (Εικόνα 4). Παρουσία ορού από ασθενείς με πυρετό Lassa, ο αριθμός των θετικών σε GFP κυττάρων (μολυσματικότητα του VSV-LAS-GP) μειώνεται σημαντικά σε σύγκριση με τον αριθμό απουσία ορού του ασθενούς (Εικόνα 4Α). Ο ψευδότυπος ελέγχου VSV που φέρει VSV GP (VSV-VSV-G) δεν εξουδετερώνεται από κανέναν ορό. Όταν η οριακή αραίωση ορού ορίζεται σε 50% αναστολή της μολυσματικότητας σε σύγκριση με τη μολυσματικότητα απουσία του ορού δοκιμής, ο τίτλος εξουδετέρωσης του ορού αυτού του ασθενούς για VSV-LAS-GP υπολογίζεται ότι είναι 75 (Εικόνα 4Β). Ομοίως, ένας ψευδότυπος βασισμένος σε VSV που φέρει τον ιό Junin GP έχει αναπτυχθεί για την ανίχνευση εξουδετερωτικών αντισωμάτων από ορούς ασθενών με AHF. Η ακρίβεια των αποτελεσμάτων των δοκιμασιών εξουδετέρωσης που βασίζονται σε VSV έχει επιβεβαιωθεί σε σύγκριση με τα αποτελέσματα της δοκιμασίας εξουδετέρωσης χρησιμοποιώντας ζωντανό ιό Junin [70] . Ο ιός Lujo είναι ένα νέο μέλος της οικογένειας των αρναϊών που σχετίζονται με τον αιμορραγικό πυρετό από τη Ζάμπια και τη νότια Αφρική και ο ιός ταξινομείται ως παθογόνος παράγοντας BSL-4 [17] . Η ανάλυση της αλληλουχίας του γονιδιώματος του ιού Lujo υποδηλώνει ότι ο ιός είναι γενετικά διαφορετικός από τους προηγουμένως χαρακτηρισμένους αρεναϊούς. Προκειμένου να μελετήσουμε τη μολυσματικότητα αυτού του ιού αρένα που εντοπίστηκε πρόσφατα, αναπτύξαμε πρόσφατα έναν ψευδότυπο VSV που εκφράζει τη λουσιφεράση και φέρει τον ιό Lujo GPC (VSV-Lujo-GP). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, η μόλυνση με VSV-Lujo-GPC εξουδετερώνεται ειδικά με ορό αντι-Lujo GPC κουνελιού. Έτσι, το VSV-Lujo-GP μπορεί να είναι ένα χρήσιμο εργαλείο όχι μόνο για τον προσδιορισμό του τίτλου του εξουδετερωτικού αντισώματος στον ορό, αλλά και για την εξερεύνηση των κυτταρικών υποδοχέων που δεν έχουν ακόμη καθοριστεί για μόλυνση από τον ιό Lujo ή για τον έλεγχο αναστολέων η είσοδος κυττάρων με τη μεσολάβηση του GP του ιού Lujo. Τα κρούσματα αιμορραγικού πυρετού που προκαλούνται από παθογόνους αρένα ιούς έχουν ως αποτέλεσμα υψηλά ποσοστά θνησιμότητας. Μια γρήγορη και ακριβής διάγνωση είναι ένα κρίσιμο πρώτο βήμα σε κάθε ξέσπασμα. Οι ορολογικές διαγνωστικές μέθοδοι για VHF χρησιμοποιούν συχνότερα μια δοκιμασία ELISA, IFA ή/και εξουδετέρωσης ιού. Έχουν αναπτυχθεί διαγνωστικές μέθοδοι που χρησιμοποιούν ανασυνδυασμένες ιικές πρωτεΐνες και έχουν αναθεωρηθεί οι χρησιμότητες τους για τη διάγνωση του VHF. Τα IgG-και IgM-ELISAs και IFAs που χρησιμοποιούν rNPs ως αντιγόνα είναι χρήσιμα για την ανίχνευση αντισωμάτων που προκαλούνται στους ορούς των ασθενών. Αυτές οι μέθοδοι είναι επίσης χρήσιμες για οροεπιδημιολογικές έρευνες για HFV. Οι ELISA σύλληψης Ag που χρησιμοποιούν MAbs στα rNP του αρεναϊού είναι ειδικά για το είδος του ιού ή μπορούν να είναι ευρέως αντιδραστικά για τους αρένα ιούς του Νέου Κόσμου, ανάλογα με το MAb που χρησιμοποιείται. Επιπλέον, το σύστημα ψευδοτύπων που βασίζεται σε VSV παρέχει ένα ασφαλές και γρήγορο εργαλείο για τη μέτρηση των τίτλων αντισωμάτων εξουδετέρωσης του ιού, καθώς και ένα μοντέλο για την ανάλυση της εισόδου του αντίστοιχου αρενοϊού σε ευαίσθητα κύτταρα χωρίς τη χρήση ζωντανών αρεναϊών. Πρόσφατες ανακαλύψεις νέων ειδών αρεναϊών [17, 26, 110] και η δυνατότητά τους να εξελίσσονται κυρίως μέσω εναλλαγής ξενιστή, παρά με τους ξενιστές τους [110, 111] , υποδηλώνουν ότι ένας άγνωστος παθογόνος αρενοϊός μπορεί να εμφανιστεί στο μέλλον και ότι η διαγνωστική Οι μέθοδοι για το VHF που προκαλείται από αρεναϊούς θα πρέπει επομένως να αναπτυχθούν περαιτέρω και να βελτιωθούν.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 393, "text": "ιοί Lassa και Lujo" } ], "id": 5271, "question": "Ποιοι ιοί αποτελούν μέρος του συμπλέγματος του Παλαιού Κόσμου των Arenaviridae;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2663, "text": "μέσω της χρήσης ορολογικών αναλύσεων" } ], "id": 5272, "question": "Πώς μπορούν να διαφοροποιηθούν οι Arenaviruses του Παλαιού Κόσμου και του Νέου Κόσμου;" }, { "answers": [ { "answer_start": 10007, "text": "μια γλυκοπρωτεΐνη, μια νουκλεοπρωτεΐνη (NP), μια πρωτεΐνη μήτρας (Z) και μια πολυμεράση (L)" } ], "id": 5275, "question": "Ποιες πρωτεΐνες παράγει ο Arenavirus;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Η γλυκυρριζίνη ασκεί αντιοξειδωτική δράση σε κύτταρα που έχουν μολυνθεί από τον ιό H5N1 και αναστέλλει την αναπαραγωγή του ιού και την προφλεγμονώδη έκφραση γονιδίου Geiler, Janina; Naczk, Patrizia; Sithisarn, Patchima; Leutz, Anke; Doerr, Hans Wilhelm; Cinatl, JindrichΗμερομηνία: 2011-05-17DOI: 10.1371/journal.pone.0019705Άδεια χρήσης: cc-byAbstract: Η γλυκυρριζίνη είναι γνωστό ότι ασκεί αντιϊκά και αντιφλεγμονώδη αποτελέσματα. Εδώ, διερευνήθηκαν τα αποτελέσματα ενός εγκεκριμένου παρεντερικού σκευάσματος γλυκυρριζίνης (Stronger Neo-Minophafen C) στην αντιγραφή του ιού της γρίπης A H5N1 υψηλής παθογονικότητας, στην απόπτωση που προκαλείται από το H5N1 και στις προφλεγμονώδεις αποκρίσεις που προκαλούνται από το H5N1 στα επιθηλιακά κύτταρα του πνεύμονα (A549). Οι θεραπευτικές συγκεντρώσεις γλυκυρριζίνης ανέστειλαν ουσιαστικά την επαγόμενη από το H5N1 έκφραση των προφλεγμονωδών μορίων CXCL10, ιντερλευκίνης 6, CCL2 και CCL5 (αποτελεσματικές συγκεντρώσεις γλυκυρριζίνης 25 έως 50 μg/ml) αλλά παρενέβαιναν στην αντιγραφή του H5N1 αποτελεσματικές συγκεντρώσεις γλυκυρριζίνης 100 μg/ml ή υψηλότερες). Η γλυκυρριζίνη μείωσε επίσης τη μετανάστευση μονοκυττάρων προς τα υπερκείμενα των μολυσμένων με H5N1 κυττάρων Α549. Ο μηχανισμός με τον οποίο η γλυκυρριζίνη παρεμβαίνει στην αντιγραφή του H5N1 και στην επαγόμενη από το H5N1 έκφραση προφλεγμονώδους γονιδίου περιλαμβάνει την αναστολή του επαγόμενου από το H5N1 σχηματισμού αντιδραστικών ειδών οξυγόνου και (με τη σειρά του) μειωμένη ενεργοποίηση των NFκB, JNK και p38, γνωστά γεγονότα σηματοδότησης ευαίσθητα στην οξειδοαναγωγή να σχετίζονται με την αναπαραγωγή του ιού της γρίπης Α. Ως εκ τούτου, η γλυκυρριζίνη μπορεί να συμπληρώσει το οπλοστάσιο των πιθανών φαρμάκων για τη θεραπεία της νόσου H5N1. Κείμενο: Οι υψηλά παθογόνοι ιοί της γρίπης Α H5N1 θεωρούνται πιθανοί πρόγονοι της πανδημίας γρίπης [1] [2] [3] [4] [5] [6 ] . Τουλάχιστον για το πρώτο κύμα μιας πανδημίας H5N1, δεν θα είναι διαθέσιμες επαρκείς ποσότητες επαρκών εμβολίων [1] [2] [3] [4] [6] [7] [8] . Ως εκ τούτου, η αντιική θεραπεία για τους ιούς της γρίπης Α, συμπεριλαμβανομένων των εξαιρετικά παθογόνων στελεχών του ιού H5N1, παραμένει μεγάλης σημασίας για την πρώτη γραμμή άμυνας έναντι του ιού [1] [2] [3] [4] 6, 9] . Οι αναστολείς νευραμινιδάσης oseltamivir και zanamivir ως καθώς και τα adamantane amantadin και rimantadin που παρεμβαίνουν στην πρωτεΐνη M2 της γρίπης έχουν άδεια για τη θεραπεία της γρίπης [1] [2] [3] [4] 6] . Ωστόσο, η χρήση και των δύο κατηγοριών φαρμάκων περιορίζεται από την εμφάνιση ανθεκτικών στελεχών του ιού. Στα στελέχη της εποχικής γρίπης, η πλειονότητα των ιών H3N2 και ένα μεγάλο ποσοστό των ιών H1N1 στον άνθρωπο θεωρείται πλέον ότι είναι ανθεκτικό στην αμανταδίνη και τη ριμανταδίνη [10] [11] [12] [13] . Επιπλέον, μια δραστική αύξηση των ανθεκτικών στο oseltamivir ιών H1N1 έχει αναφερθεί κατά την περίοδο της γρίπης 2007/2008 στο βόρειο ημισφαίριο [14] [15] [16] [17] . Προκαταρκτικά δεδομένα από τις Ηνωμένες Πολιτείες προβλέπουν περαιτέρω άνοδο για την περίοδο 2008/2009, με πιθανό αποτέλεσμα πάνω από το 90% των κυκλοφορούντων στελεχών H1N1 να είναι ανθεκτικά στο oseltamivir [14] .Τα στελέχη του ιού H5N1 φαίνεται να είναι γενικά λιγότερο ευαίσθητα στην αντιική θεραπεία από Εμφανίζονται στελέχη του ιού της εποχικής γρίπης Α και στελέχη H5N1 ανθεκτικά στη θεραπεία [1] [2] [3] [4] 6, [18] [19] [20] [21] . Επιπλέον, λείπουν παρεντερικοί παράγοντες για τη θεραπεία βαρέως πασχόντων ασθενών. Η γλυκυρριζίνη, μια τριτερπενική σαπωνίνη, είναι συστατικό της ρίζας γλυκόριζας. Έχει βρεθεί ότι παρεμβαίνει στην επαγωγή πολλαπλών ιών και/ή κυτταροπαθογόνου δράσης (CPE) πολλών ιών συμπεριλαμβανομένων των αναπνευστικών ιών όπως ο αναπνευστικός συγκυτιακός ιός, ο κορωνοϊός SARS, ο HIV και οι ιοί της γρίπης [22] [23] [24] [25] [ 26] [27] [28] . Επιπλέον, αντιφλεγμονώδεις και ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες αποδίδονταν στη γλυκυρριζίνη [26] . Η σοβαρότητα της ανθρώπινης νόσου H5N1 έχει συσχετιστεί με υπερκυτταροκιναιμία («καταιγίδα κυτοκινών») [29, 30]. Η καθυστερημένη θεραπεία με αντιικά και ανοσοτροποποιητικά μείωσε τη θνησιμότητα που προκαλείται από τον H5N1 σε ποντίκια [31]. Επομένως, οι αντιφλεγμονώδεις και ανοσοτροποποιητικές επιδράσεις που ασκεί η γλυκυρριζίνη μπορεί να είναι ευεργετικές για τη θεραπεία του H5N1. Επίσης, η γλυκυρριζίνη είναι ένα γνωστό αντιοξειδωτικό [26] και τα αντιοξειδωτικά έχουν ήδη αποδειχθεί ότι παρεμβαίνουν στην αντιγραφή του ιού της γρίπης Α και στις προφλεγμονώδεις αποκρίσεις που προκαλούνται από τον ιό [32] [33] [34] . Το ισχυρότερο Neo-Minophagen C (SNMC) είναι Παρασκεύασμα γλυκυρριζίνης (διατίθεται ως δισκία ή παρεντερική σύνθεση) που είναι εγκεκριμένο στην Ιαπωνία για τη θεραπεία χρόνιων ηπατικών παθήσεων και κυκλοφορεί στην Ιαπωνία, την Κίνα, την Κορέα, την Ταϊβάν, την Ινδονησία, την Ινδία και τη Μογγολία. Εδώ, ερευνήσαμε την επίδραση του SNMC στην αντιγραφή του H5N1, στην επαγόμενη από H5N1 έκφραση κυτοκίνης, στο επαγόμενο από το H5N1 κυτταρικό οξειδωτικό στρες και στα κρίσιμα συμβάντα κυτταρικής σηματοδότησης που προκαλούνται από H5N1 σε ανθρώπινα πνευμονοκύτταρα (κυτταρική σειρά A549). Γ) ελήφθη από την Minophagen Pharmaceuticals Co., Ltd. (Τόκιο, Ιαπωνία). Το στέλεχος γρίπης Α/Βιετνάμ/1203/04 (Η5Ν1) ελήφθη από το Κέντρο Γρίπης του ΠΟΥ (Εθνικό Ινστιτούτο Ιατρικής Έρευνας, Λονδίνο, ΗΒ). Το στέλεχος γρίπης H5N1 A/Thailand/ 1(Kan-1)/04 ελήφθη από τον καθηγητή Pilaipan Puthavathana (Mahidol University, Bangkok, Thailand). ATCC, Manassas, VA) και κλάσματα αποθηκεύτηκαν στους 280uC. Οι τίτλοι του ιού προσδιορίστηκαν ως μολυσματική δόση ιστοκαλλιέργειας 50% (TCID 50/ml) σε συρρέοντα κύτταρα Vero σε πλάκες μικροτίτλου 96 φρεατίων. Κύτταρα Α549 (ανθρώπινο καρκίνωμα πνεύμονα, ATCC: Το CCL-185, που ελήφθη από την LGC Standards GmbH, Wesel, Γερμανία) αναπτύχθηκε στους 37uC σε ελάχιστο βασικό μέσο (MEM) συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 IU/ml πενικιλίνης και 100 mg/ml στρεπτομυκίνη. Απομονώθηκαν ανθρώπινα μονοκύτταρα από φουσκωτά στρώματα υγιών δοτών, που ελήφθησαν από το Ινστιτούτο Μεταγγίσεων Ιατρικής και Ανοσολογικής Αιματολογίας, Κέντρο Αιμοδοτών του Γερμανικού Ερυθρού Σταυρού, Πανεπιστήμιο Johann Wolfgang Goethe, Frankfurt am Main. Μετά από φυγοκέντρηση σε βαθμίδωση πυκνότητας Ficoll (Biocoll)-Hypaque (Biochrom AG, Βερολίνο, Γερμανία), συλλέχθηκαν μονοπύρηνα κύτταρα από τη διεπιφάνεια και πλύθηκαν με PBS. Στη συνέχεια, τα μονοκύτταρα απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας μαγνητικά επισημασμένα CD14 MicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Γερμανία) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα μονοκύτταρα καλλιεργήθηκαν σε IMDM συμπληρωμένο με 10% ομαδοποιημένο ανθρώπινο ορό, 100 IU/ml πενικιλίνης και 100 mg/ml στρεπτομυκίνη. Η κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε σε συρρέουσες κυτταρικές στοιβάδες με CellTiter-GloH Luminescent Cell Viability Assay, MannheimH, Γερμανία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών. Η κυτταρική βιωσιμότητα εκφράστηκε ως ποσοστό του μη επεξεργασμένου μάρτυρα. Για να προσδιοριστεί η ενδοκυτταρική εντόπιση του NP, το μολυσμένο με H5N1 A549 σταθεροποιήθηκε 8 ώρες p.i. για 15 λεπτά με παγωμένη ακετόνη/μεθανόλη (40:60, Mallinckrodt Baker B.V., Deventer, The Netherlands) και χρωματίστηκε με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (1 ώρα επώαση, 1:1000 σε PBS) που στρέφεται κατά του ιού της γρίπης Α (πυρήνα της γρίπης Α NP) (Millipore, Molsheim, Γαλλία). Ένα Alexa Fluor 488 κατσίκας αντι-ποντικού IgG (H&L) (Invitrogen, Eugene, Oregon, USA) χρησιμοποιήθηκε (1 ώρα επώαση, 1:1000 σε PBS) ως δευτερεύον αντίσωμα. Οι πυρήνες χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας 49,6-διαμιδινο-2φαινυλινδόλη (DAPI) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Μόναχο, Γερμανία). Ο φθορισμός οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού Olympus IX 1 (Olympus, Planegg, Γερμανία). Για την κυτταρομετρική ανάλυση ροής χρησιμοποιήθηκαν τα ίδια αντισώματα. Ο προσδιορισμός μείωσης του κυτταροπαθογόνου αποτελέσματος (CPE) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Οι συρρέουσες μονοστοιβάδες κυττάρων Α549 που αναπτύχθηκαν σε πλάκες μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων μολύνθηκαν με στελέχη γρίπης Α στις υποδεικνυόμενες πολλαπλότητες μόλυνσης (MOIs). Μετά από περίοδο προσρόφησης μίας ώρας, τα κύτταρα πλύθηκαν για να απομακρυνθεί ο μη αποκολλημένος ιός. Το CPE που προκαλείται από τον ιό καταγράφηκε 24 ώρες μετά τη μόλυνση (p.i. Εκτός εάν δηλώνεται διαφορετικά, τα κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε συνεχή αγωγή με γλυκυρριζίνη ξεκινώντας με περίοδο 1 ώρας προ-επώασης. Για πειράματα χρονικής προσθήκης, η γλυκυρριζίνη προστέθηκε αποκλειστικά κατά τη διάρκεια της περιόδου προ-επώασης 1 ώρας, αποκλειστικά κατά τη διάρκεια της περιόδου προσρόφησης 1 ώρας ή μετά αποκλειστικά μετά την έκπλυση του ιού εισόδου. Το συνολικό RNA απομονώθηκε από κυτταροκαλλιέργειες χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο TRI ( Sigma-Aldrich, Μόναχο, Γερμανία). Η PCR πραγματικού χρόνου για το H5 πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μεθόδους που περιγράφονται [35]. Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθοι εκκινητές: sense 59 acg tat gac tac ccg cag tat tca g 39; antisense 59 aga cca gcy acc atg att gc 39; ανιχνευτής 6-FAM-tca aca gtg gcg agt tcc cta gca-TAMRA. Το κλάσμα κυττάρων με κλασματική περιεκτικότητα σε DNA (υποπληθυσμός κυττάρων ''sub-G1'') υποδεικνύει κυτταροτοξικότητα. Τα κύτταρα Sub-G1 θεωρούνται νεκρά (συνήθως αποπτωτικά) κύτταρα. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 70% αιθανόλη για δύο ώρες στους 220uC. Το κυτταρικό DNA χρωματίστηκε χρησιμοποιώντας ιωδιούχο προπίδιο (20 mg/ml) και αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής (FacsCalibur, BD Biosciences, Heidelberg, Γερμανία). Η ενεργοποίηση της κασπάσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τις δοκιμασίες Caspase-Glo 8, 9, ή 3/7 (Promega , Mannheim, Γερμανία) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα υπερκείμενα κυτταροκαλλιέργειας συλλέχθηκαν και καταψύχθηκαν στους 280uC. Οι κυτοκίνες/χημειοκίνες ποσοτικοποιήθηκαν με ειδικά ELISA Duo Sets (R&D Systems GmbH, Wiesbaden, Γερμανία) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η δραστηριότητα του NFkB διερευνήθηκε σε κύτταρα μολυσμένα με H5N1 (MOI 0,01) με ποσοτικοποίηση των υπομονάδων NFkB Rel A (p6kB1) και NFkB1 (ρ50) από πυρηνικά εκχυλίσματα με χρήση των ELISA που δεσμεύουν τον DNA μεταγραφικό παράγοντα TransAM TM (Active Motif, Rixensart, Βέλγιο). Το πυρηνικό εκχύλισμα παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Nuclear Extract (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα υπερκείμενα κυτταροκαλλιέργειας ερευνήθηκαν για χημειοτακτική δράση με μέτρηση της δραστικότητας για πρόκληση μετανάστευσης μονοκυττάρων μέσω μεμβρανικών ενθέτων σε πλάκες 24 φρεατίων ( μέγεθος πόρων 8 mm; BD Biosciences, Χαϊδελβέργη, Γερμανία). Μονοκύτταρα (16106 σε 100 ml IMDM με 10% συγκεντρωμένο ανθρώπινο ορό) προστέθηκαν στα ένθετα κυτταροκαλλιέργειας (άνω θάλαμος) και υπερκείμενα κυτταροκαλλιέργειας (300 ml) προστέθηκαν στον κάτω θάλαμο του φρεατίου. Μετά από μια περίοδο επώασης 48 ωρών, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και διαπερατήθηκαν με PBS που περιείχε 0,3% Tritron X-100. Στη συνέχεια, οι πυρήνες χρωματίστηκαν με 49,6-διαμιδινο-2φαινυλινδόλη (DAPI). Η επάνω πλευρά της μεμβράνης σκουπίστηκε με ένα υγρό μάκτρο για να αφαιρεθούν τα κύτταρα, ενώ η κάτω πλευρά της μεμβράνης ξεπλύθηκε με PBS. Ο αριθμός των κυττάρων στην κάτω πλευρά κάθε μεμβράνης ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση των κυττάρων από τρεις τυχαία επιλεγμένες τομές (3,7 mm 2) χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού Olympus IX 1 (Olympus, Planegg, Γερμανία). Τα κύτταρα λύθηκαν σε δείγμα Triton X buffer και διαχωρίζονται με SDS-PAGE. Τα πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ Nuclear Extract (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων κατά της βακτίνης (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Μόναχο, Γερμανία), JNK, φωσφορυλιωμένης JNK, p38 ή φωσφορυλιωμένης p38, (όλα που αγοράστηκαν από τη New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Γερμανία) και οπτικοποιήθηκαν από ενισχυμένη χημειοφωταύγεια χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ (Amersham, Freiburg, Γερμανία). Ανιχνεύθηκαν αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) χρησιμοποιώντας το κιτ Image-iT LIVE Green Reactive Oxygen Species Kit (Molecular Probes, που διανέμεται από την Invitrogen, Καρλσρούη, Γερμανία). σε σύγκριση με το t-test. Περισσότερες ομάδες συγκρίθηκαν με ANOVA με την επακόλουθη δοκιμή Student-Newman-Keuls. Η κυτταρική σειρά A549, που προέρχεται από ανθρώπινο πνευμονικό αδενοκαρκίνωμα, είναι ένα καθιερωμένο μοντέλο για πνευμονοκύτταρα τύπου II [36] και χρησιμοποιείται συνήθως για τη διερεύνηση της επίδρασης της γρίπης ιοί σε αυτόν τον τύπο κυττάρου [βλέπε π.χ. 6,37,38]. Εάν δεν δηλώνεται διαφορετικά, η γλυκυρριζίνη ήταν συνεχώς παρούσα στα μέσα κυτταροκαλλιέργειας ξεκινώντας με μια περίοδο προμόλυνσης 1 ώρας. Η γλυκυρριζίνη 200 mg/ml (η μέγιστη ελεγχόμενη συγκέντρωση) δεν επηρέασε τη βιωσιμότητα των κυττάρων Α549 (δεδομένα δεν φαίνονται) αλλά μείωσε σαφώς τον σχηματισμό CPE σε κύτταρα Α549 που είχαν μολυνθεί με το στέλεχος της γρίπης H5N1 A/Thailand/1(Kan-1)/04 σε MOIs 0,01, 0,1 ή 1 (Εικόνα 1Α). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε κύτταρα Α549 μολυσμένα με στέλεχος A/Vietnam/1203/04 (H5N1) (Suppl. Σχήμα 1Α). Η χρώση των κυττάρων Α549 για νουκλεοπρωτεΐνη γρίπης Α 24 ώρες μετά τη μόλυνση με στέλεχος H5N1 A/Tailand/1(Kan-1)/04 έδειξε ότι η γλυκυρριζίνη 200 mg/ml μειώνει σημαντικά τον αριθμό των θετικών για νουκλεοπρωτεΐνη της γρίπης Α κυττάρων (Εικόνα 1Β). εξετάστε την επίδραση της γλυκυρριζίνης στους απογόνους του ιού, τα κύτταρα A549 μολύνθηκαν με το στέλεχος γρίπης H5N1 A/ Thailand/1(Kan-1)/04 στο MOI 0,01 ή MOI 1 και οι τίτλοι του μολυσματικού ιού καθορίστηκαν 24 ώρες μετά τη μόλυνση (Εικόνα 1C) . Ενώ η γλυκυρριζίνη σε συγκεντρώσεις έως και 50 mg/ml δεν επηρέασε την αντιγραφή του H5N1, μέτριες επιδράσεις ασκήθηκαν από τη γλυκυρριζίνη 100 mg/ml και πιο έντονες από τη γλυκυρριζίνη 200 mg/ml (MOI 0,01: μείωση 13 φορές, MOI 1: 10- μείωση πτυχής). Στη συνέχεια, η επίδραση της γλυκυρριζίνης στην αντιγραφή του H5N1 επιβεβαιώθηκε με την ανίχνευση ιικού (H5) RNA χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR. Μόνο οι συγκεντρώσεις γλυκυρριζίνης $100 mg/ml μείωσαν σημαντικά το Σχήμα 1Β) ή τα μολυσμένα με H5N1 A/Vietnam/1203/04 (Suppl. Σχήμα 1C) Κύτταρα A549 (MOI 0.01) 24 ώρες μετά τη μόλυνση. Τα πειράματα χρόνου προσθήκης αποκάλυψαν ότι τα μέγιστα αποτελέσματα επιτεύχθηκαν όταν η γλυκυρριζίνη ήταν συνεχώς παρούσα ξεκινώντας με μια περίοδο προ-επώασης 1 ώρας (Εικόνα 1D). Η προσθήκη γλυκυρριζίνης μετά τη μόλυνση έδειξε μειωμένες αντιικές επιδράσεις, ενώ η προεπώαση μόνη της ή η προσθήκη γλυκυρριζίνης κατά τη διάρκεια της περιόδου προσρόφησης δεν επηρέασε σημαντικά την αντιγραφή του H5N1. της νόσου της γρίπης: CXCL10 (γνωστή επίσης ως επαγώγιμη από ιντερφερόνη πρωτεΐνη 10, IP-10), ιντερλευκίνη 6 (IL6), ιντερλευκίνη 8, (IL8; επίσης γνωστό ως CXCL8), CCL2 (γνωστό επίσης ως χημειοελκυστική πρωτεΐνη μονοκυττάρων 1, MCP-1) και CCL5 (επίσης γνωστό ως RANTES). Τα κύτταρα A549 μολύνθηκαν με H5N1 A/Tailand/ 1(Kan-1)/04 ή H5N1 A/Vietnam/1203/04 σε MOI 0,01, 0,1 ή 1. Η θεραπεία με γλυκυρριζίνη πραγματοποιήθηκε με 25, 50, 100 ή 200 mg/ml. Η έκφραση κυτοκίνης ανιχνεύθηκε 24 ώρες μετά τη μόλυνση με ELISA. Η γλυκυρριζίνη δεν επηρέασε την έκφραση κυτοκινών των μη μολυσμένων κυττάρων (τα δεδομένα δεν φαίνονται) αλλά ανέστειλε την έκφραση όλων των κυτοκινών που ερευνήθηκαν σε κύτταρα μολυσμένα με H5N1 με τρόπο δοσοεξαρτώμενο (Εικόνα 2, Σχήμα 3Α). Τα αποτελέσματα ήταν πιο έντονα σε χαμηλότερα MOI. Σημειωτέον, η έκφραση όλων των κυτοκινών εκτός από την IL8 ανεστάλη σημαντικά μετά από θεραπεία με γλυκυρριζίνη 50 mg/ml Εικόνα 3Α ) αν και αυτές οι συγκεντρώσεις γλυκυρριζίνης δεν είχαν καμία επίδραση στην αντιγραφή H5N1 στα κύτταρα A549 (Εικόνα 1, Εικόνα S1). Έκφραση κυτοκίνης από τον ιό της γρίπης- Τα μολυσμένα αναπνευστικά κύτταρα προκαλούν στρατολόγηση μονοκυττάρων του περιφερικού αίματος στους πνεύμονες των ασθενών όπου διαφοροποιούνται σε μακροφάγα που πιστεύεται ότι συμβάλλουν στην παθογένεια του ιού της γρίπης Α [5, 39]. Σε μια δοκιμασία χημειοταξίας, διερευνήθηκε η επίδραση της γλυκυρριζίνης στη μετανάστευση μονοκυττάρων προς υπερκείμενα κύτταρα Α549 μολυσμένα με H5N1 A/Thailand/1(Kan-1)/04 (MOI 0.1) μέσω φίλτρων 8 mm. Η μετανάστευση μονοκυττάρων προς υπερκείμενα κύτταρα μολυσμένων με H5N1 αυξήθηκε σημαντικά σε σχέση με τη μετανάστευση προς υπερκείμενα μη μολυσμένων κυττάρων. Η θεραπεία των μολυσμένων με H5N1 κυττάρων με γλυκυρριζίνη 100 mg/ml κατέστειλε σαφώς τη δραστηριότητα χημειοέλξης των υπερκειμένων (Εικόνα 3Β). Οι ιοί της γρίπης συμπεριλαμβανομένου του H5N1 έχουν αποδειχθεί ότι προκαλούν απόπτωση εξαρτώμενη από κασπάση στα κύτταρα των αεραγωγών και αυτή η απόπτωση έχει συσχετιστεί παθογόνος δράση του ιού [ 40, 41]. Οι συγκεντρώσεις γλυκυρριζίνης έως 200 mg/ml δεν επηρέασαν την ενεργοποίηση της κασπάσης σε μη μολυσμένα κύτταρα (Εικόνα 4A-C). Οι συγκεντρώσεις γλυκυρριζίνης $100 mg/ml ανέστειλαν την επαγόμενη από το H5N1 A/Tailand/1(Kan-1)/04 (MOI 0.01) ενεργοποίηση των κασπασών εκκίνησης 8 και 9 καθώς και των κασπασών-τελεστών 3/7 στα κύτταρα A549 όπως προσδιορίστηκε 24 h μετά τη μόλυνση (Εικόνα 4A-C). Οι χαμηλότερες συγκεντρώσεις γλυκυρριζίνης δεν επηρέασαν την επαγόμενη από το H5N1 απόπτωση. Η ανίχνευση κυττάρων στη φάση υπο-G1 οδήγησε σε παρόμοια ευρήματα (Εικόνα 4D). Ουσίες που αναστέλλουν την επαγόμενη από το H5N1 ενεργοποίηση της κασπάσης 3, συμπεριλαμβανομένων των αναστολέων της κασπάσης 3, προκαλούν πυρηνική κατακράτηση συμπλεγμάτων RNP [34, 42]. Σύμφωνα με αυτό, η γλυκυρριζίνη επίσης παρενέβη στην πυρηνική εξαγωγή RNP στο MOI 1 (Εικόνα S2). Παρόμοια αποτελέσματα λήφθηκαν σε μολυσμένα κύτταρα MOI 0,01 H5N1 A/Thailand/1(Kan-1)/04 (Εικόνα S3). Επίδραση της γλυκυρριζίνης στην επαγόμενη από H5N1 ενεργοποίηση του πυρηνικού παράγοντα kB (NFkB), p38 και σε H5N1-επαγόμενη Σχηματισμός αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) Η ενεργοποίηση των NFkB, p38 και JNK έχει συσχετιστεί με την αντιγραφή του ιού της γρίπης Α και την επαγόμενη από τον ιό έκφραση προφλεγμονώδους γονιδίου [34, [43] [44] [45] [46] [47] . Ενώ η γλυκυρριζίνη δεν επηρέασε τη δραστηριότητα του NFkB σε μη μολυσμένα κύτταρα Α549 στις δοκιμασμένες συγκεντρώσεις (δεδομένα δεν φαίνονται), η γλυκυρριζίνη ανέστειλε την ενεργοποίηση του NFkB σε κύτταρα μολυσμένα με H5N1 (Εικόνα 5Α). Επιπλέον, η γλυκυρριζίνη ανέστειλε την επαγόμενη από το H5N1 φωσφορυλίωση των MAPKs p38 και JNK (Εικόνα 5Β). Εκτός από τους ρόλους τους κατά την αντιγραφή του ιού της γρίπης Α και την επαγόμενη από τον ιό έκφραση κυτοκίνης/χημειοκίνης, τα NFkB, p38 και JNK είναι ερυθροκίνητα συστατικά μονοπάτια σηματοδότησης [48] [49] [50] [51] . Τα αντιοξειδωτικά είχαν ήδη βρεθεί ότι παρεμβαίνουν στη σηματοδότηση που προκαλείται από τον ιό της γρίπης Α μέσω των NFkB, p38 και JNK, με την αντιγραφή του ιού της γρίπης Α και με την προφλεγμονώδη έκφραση γονιδίου που προκαλείται από τον ιό της γρίπης Α [32] [33] [34] . Δεδομένου ότι η γλυκυρριζίνη είναι γνωστό ότι ασκεί αντιοξειδωτική δράση [26], υποθέσαμε ότι η γλυκυρριζίνη μπορεί να παρεμβαίνει στον σχηματισμό ROS που προκαλείται από το H5N1. Πράγματι, η γλυκυρριζίνη άσκησε ξεκάθαρα αντιοξειδωτικά αποτελέσματα σε κύτταρα μολυσμένα με H5N1 (MOI 0.01) (Εικόνα 5C) προκαλώντας σημαντική μείωση του σχηματισμού ROS ήδη σε συγκέντρωση 25 mg/ml (Εικόνα 5D). Εδώ, δείχνουμε ότι η γλυκυρριζίνη αναστέλλει την αναπαραγωγή σε μεγάλο βαθμό παθογόνος ιός γρίπης Α H5N1, απόπτωση που προκαλείται από το H5N1 και έκφραση προφλεγμονωδών κυτοκινών που προκαλούνται από H5N1 σε κύτταρα A549 που προέρχονται από πνεύμονα. Μετά από ενδοφλέβια χορήγηση, οι επιτεύξιμες συγκεντρώσεις της γλυκυρριζίνης στο πλάσμα έχουν περιγραφεί ότι είναι περίπου 100 mg/ml [52] . Ως εκ τούτου, οι συγκεντρώσεις γλυκυρριζίνης που διαπιστώθηκε ότι παρεμποδίζουν την αντιγραφή του H5N1 και την επαγόμενη από το H5N1 προφλεγμονώδη γονιδιακή έκφραση στην παρούσα αναφορά βρίσκονται στο εύρος των θεραπευτικών επιπέδων στο πλάσμα. Σημειωτέον, αν και χρειάζονταν υψηλότερες συγκεντρώσεις γλυκυρριζίνης για να παρέμβουν στην αντιγραφή του κοροναϊού SARS [22] από ό,τι στην αντιγραφή του H5N1, αναφέρθηκαν ευεργετικά αποτελέσματα σε ασθενείς με SARS που έλαβαν θεραπεία με γλυκυρριζίνη (SNMC) σε σύγκριση με ασθενείς με SARS που δεν έλαβαν γλυκυρριζίνη [23] . Συγκεκριμένα, η έρευνα διαφορετικών παραγώγων γλυκυρριζίνης κατά του κορωνοϊού SARS οδήγησε στον εντοπισμό ενώσεων με ενισχυμένη αντιική δράση [53] . Ως εκ τούτου, η γλυκυρριζίνη μπορεί επίσης να χρησιμεύσει ως βασική δομή για την ανάπτυξη νέων φαρμάκων κατά της γρίπης. Πειραματικά αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η γλυκυρριζίνη μπορεί να επηρεάσει τη νόσο του ιού της εποχικής γρίπης Α με αντιικές και ανοσοτροποποιητικές επιδράσεις [26, 27]. Τα ποντίκια αποτράπηκαν από τη θανατηφόρα μόλυνση H2N2 από τη γλυκυρριζίνη, αν και δεν ανιχνεύθηκε καμία επίδραση στην αναπαραγωγή του ιού. Ο μηχανισμός προτάθηκε να είναι η επαγωγή της ιντερφερόνης-c σε Τ-κύτταρα από τη γλυκυρριζίνη [54] . Επιπλέον, η γλυκυρριζίνη αποδείχθηκε ότι επηρεάζει την αναπαραγωγή του ιού της εποχικής γρίπης Α μέσω αλληλεπίδρασης με την κυτταρική μεμβράνη [25, 28]. Ωστόσο, αυτές οι επιδράσεις παρατηρήθηκαν μόνο σε συγκεντρώσεις $200 mg/ml όταν προστέθηκε γλυκυρριζίνη κατά τη διάρκεια της περιόδου προσρόφησης του ιού. Δεδομένου ότι η προσθήκη γλυκυρριζίνης κατά την περίοδο προσρόφησης δεν επηρέασε την αναπαραγωγή του H5N1 στα πειράματά μας, δεν φαίνεται πιθανό ότι τα αποτελέσματα της μεμβράνης συμβάλλουν στα αποτελέσματα κατά του H5N1 που ανιχνεύονται εδώ σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις. Τα αποτελέσματά μας μάλλον υποδηλώνουν ότι η γλυκυρριζίνη παρεμβαίνει στο οξειδωτικό στρες που προκαλείται από το H5N1. Η μόλυνση από τον ιό της γρίπης Α (συμπεριλαμβανομένου του H5N1) προκαλεί σχηματισμό ROS. Βρέθηκε ότι τα αντιοξειδωτικά αναστέλλουν την αντιγραφή του ιού της γρίπης Α και την προφλεγμονώδη γονιδιακή έκφραση που προκαλείται από τον ιό της γρίπης Α [32] [33] [34] και η γλυκυρριζίνη είναι γνωστό ότι ασκεί αντιοξειδωτική δράση [26] . Εδώ, η γλυκυρριζίνη παρενέβη στην επαγόμενη από το H5N1 ενεργοποίηση των NFkB, p38 και JNK που αντιπροσωπεύουν συμβάντα σηματοδότησης ευαίσθητα στην οξειδοαναγωγή [48] [49] [50] [51] που εμπλέκονται στην αναπαραγωγή του ιού της γρίπης Α και στην παραγωγή κυτταρικής κυτοκίνης [/χημειοκίνης που προκαλείται από τον ιό της γρίπης Α. 34, [43] [44] [45] [46] 55] . Η γλυκυρριζίνη 50 mg/ml μείωσε σημαντικά την επαγόμενη από το H5N1 ενεργοποίηση του NFkB. Επιπλέον, συγκεντρώσεις γλυκυρριζίνης τόσο χαμηλές όσο 25 mg/ml επηρέασαν αποτελεσματικά τον επαγόμενο από το H5N1 σχηματισμό ROS και τη φωσφορυλίωση των ευαίσθητων στην οξειδοαναγωγή MAPKs p38 και JNK. Στο μοντέλο μας, η ενεργοποίηση της p38 φαίνεται να είναι κρίσιμη για τη σηματοδότηση οξειδοαναγωγής που σχετίζεται με το H5N1, καθώς η αναστολή της p38 είχε αποδειχθεί στο παρελθόν ότι μιμείται τα αποτελέσματα του αντιοξειδωτικού Ν-ακετυλο-κυστεΐνης (NAC) [34] . Είναι ενδιαφέρον και σε αντίθεση με τη γλυκυρριζίνη, το NAC απέτυχε να αναστείλει την αντιγραφή του H5N1 ή την επαγόμενη από το H5N1 έκφραση κυτοκίνης/χημειοκίνης σε θεραπευτικά σχετικές συγκεντρώσεις. Η γλυκυρριζίνη μείωσε την επαγόμενη από H5N1 κυτταρική παραγωγή κυτοκίνης/χημειοκίνης σε συγκεντρώσεις μεταξύ των mg/ml (#5) Η αντιγραφή του H5N1, αν και έχουν περιγραφεί οδοί σηματοδοσίας ευαίσθητες στην οξειδοαναγωγή, ότι εμπλέκονται και στις δύο διαδικασίες. Ως εκ τούτου, η επαγόμενη από το H5N1 προφλεγμονώδη γονιδιακή έκφραση φαίνεται να είναι πιο ευαίσθητη στην αναστολή του σχηματισμού ROS από την αντιγραφή του H5N1. Πράγματι, οι ιοί της γρίπης είχε αποδειχθεί ότι επάγουν κυτταρικές οδούς μέσω συμβάντων που εξαρτώνται από τον αναδιπλασιασμό και ανεξάρτητων [56] . Σε μια προηγούμενη αναφορά, θα μπορούσαμε να δείξουμε ότι παρόμοιες συγκεντρώσεις γλυκυρριζίνης όπως αυτές που διερευνήθηκαν εδώ παρενέβαιναν στην επαγόμενη από το H5N1 έκφραση προφλεγμονώδους γονιδίου αλλά όχι στην αντιγραφή του H5N1 σε μακροφάγα που προέρχονται από ανθρώπινα μονοκύτταρα [57] . Επιπλέον, άλλα ανοσοτροποποιητικά θεραπευτικά σχήματα που δεν επηρέασαν την αναπαραγωγή του H5N1 μείωσαν τη θνησιμότητα σε μολυσμένα με H5N1 ποντίκια [31, 58]. Ως εκ τούτου, η γλυκυρριζίνη αντιπροσωπεύει μια πιθανή πρόσθετη θεραπευτική επιλογή που παρεμποδίζει τόσο την αντιγραφή του H5N1 όσο και την επαγόμενη από τον H5N1 έκφραση προφλεγμονωδών κυτοκινών στα κύτταρα του πνεύμονα. Η παρεμβολή στις ανοσολογικές αποκρίσεις μπορεί επίσης να οδηγήσει στην απώλεια του ελέγχου της αναπαραγωγής του ιού από τα κυτταροτοξικά ανοσοκύτταρα συμπεριλαμβανομένων των φυσικών φονικών κυττάρων και κυτταροτοξικά CD8 + Τ-λεμφοκύτταρα. Τα παγκόσμια ανοσοκατασταλτικά όπως τα κορτικοστεροειδή απέτυχαν να προστατεύσουν από τη θανατηφόρα μόλυνση από τον ιό της γρίπης [59]. Επιπλέον, τα αντιιικά φάρμακα μπορεί να επηρεάσουν τα κυτταροτοξικά κύτταρα που ελέγχουν την αναπαραγωγή του ιού, όπως αποδείχθηκε για τη ριμπαβιρίνη που αποδείχθηκε ότι παρεμποδίζει την κυτταρολυτική δραστηριότητα των ΝΚ κυττάρων [60] . Σε αυτό το πλαίσιο, η γλυκυρριζίνη είχε ήδη αποδειχθεί ότι δεν επηρεάζει τη δραστηριότητα των φυσικών φονικών κυττάρων στις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται εδώ. παθογόνος αναδιπλασιασμός του ιού της γρίπης Α H5N1 και έκφραση προφλεγμονώδους γονιδίου που προκαλείται από H5N1, τουλάχιστον εν μέρει μέσω παρεμβολής στο σχηματισμό ROS που προκαλείται από το H5N1 και με τη σειρά της μειωμένης ενεργοποίησης των p38, JNK και NFkB στα πνευμονικά κύτταρα. Δεδομένου ότι χρησιμοποιήσαμε το κλινικό σκεύασμα SNMC, τα αποτελέσματα άλλων συστατικών όπως η γλυκίνη ή η κυστεΐνη δεν μπορούν να αποκλειστούν. Τα εμβόλια και οι αντιιικοί παράγοντες θα αποτύχουν να καλύψουν τις παγκόσμιες ανάγκες τουλάχιστον στην αρχή μιας σοβαρής πανδημίας του ιού της γρίπης Α [61] . Οι αντιφλεγμονώδεις και ανοσοτροποποιητικοί παράγοντες θεωρούνται σημαντικοί υποψήφιοι ως συστατικά των στρατηγικών θεραπείας κατά της γρίπης που μπορεί να σώσουν ζωές σε μια κατάσταση πανδημίας γρίπης [61] . Επομένως, η γλυκυρριζίνη μπορεί να συμπληρώσει το οπλοστάσιο των πιθανών φαρμάκων για τη θεραπεία της νόσου που προκαλείται από το H5N1.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 2251, "text": "αναστολείς νευραμινιδάσης" } ], "id": 5236, "question": "Ποια είναι η επίδραση της οσελταμιβίρης και της ζαναμιβίρης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3477, "text": "μια τριτερπενική σαπωνίνη" } ], "id": 5237, "question": "Τι είναι η γλυκυρριζίνη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3986, "text": "καταιγίδα κυτοκινών»" } ], "id": 5239, "question": "Ποια είναι άλλη λέξη για την υπερκυτταροκιναιμία;" }, { "answers": [ { "answer_start": 20307, "text": "η γλυκυρριζίνη μπορεί επίσης να χρησιμεύσει ως βασική δομή για την ανάπτυξη νέων φαρμάκων κατά της γρίπης" } ], "id": 5241, "question": "Ποιο είναι το συμπέρασμα της μελέτης;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Σύνδρομο επείγουσας σοβαρής οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας που προκαλείται από αδενοϊό τύπου 55 σε ανοσοεπαρκείς ενήλικες το 2013: μια προοπτική μελέτη παρατήρησης Αυτός, Hangyong; Wang, Zheng; Qu, Jiuxin; Li, Xuyan; Ban, Chengjun; Wan, Jun; Cao, Bin; Tong, Zhaohui; Wang, ChenΗμερομηνία: 2014-08-12DOI: 10.1186/s13054-014-0456-6 Άδεια χρήσης: cc-byAbstract: ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Από το 2008, έχουν αναφερθεί σοβαρές περιπτώσεις αναδυόμενου ανθρώπινου αδενοϊού τύπου 55 (HAdV-55 ανοσοποιητικά σε ενήλικες) Κίνα. Τα κλινικά χαρακτηριστικά και τα αποτελέσματα των πιο βαρέως πασχόντων ασθενών με σύνδρομο σοβαρής οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας (ARDS) που προκαλείται από HAdV-55 που απαιτεί επεμβατικό μηχανικό αερισμό (IMV) ή/και εξωσωματική οξυγόνωση μεμβράνης (ECMO) λείπουν. ΜΕΘΟΔΟΙ: Πραγματοποιήσαμε μια προοπτική, μονοκεντρική μελέτη παρατήρησης της πνευμονίας με ARDS σε ανοσοεπαρκείς ενήλικες που εισήχθησαν στη ΜΕΘ του αναπνευστικού μας. Προοπτικά συλλέξαμε και αναλύσαμε κλινικά, εργαστηριακά, ακτινολογικά χαρακτηριστικά, διαδοχικές εξετάσεις ιικού φορτίου στην αναπνευστική οδό και στο αίμα, θεραπείες και αποτελέσματα. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Συμπεριλήφθηκαν τα αποτελέσματα για συνολικά πέντε διαδοχικούς ασθενείς με σοβαρό ARDS με επιβεβαιωμένη λοίμωξη HAdV-55. Και οι πέντε ασθενείς ήταν ανοσοεπαρκείς νεαροί άνδρες με μέση ηλικία τα 32 έτη. Ο μέσος χρόνος από την έναρξη έως την δύσπνοια ήταν 5 ημέρες. Η ανάλυση αερίων αρτηριακού αίματος κατά την εισαγωγή στη ΜΕΘ αποκάλυψε βαθιά υποξία. Η μέση μερική πίεση οξυγόνου/κλάσμα του εισπνεόμενου οξυγόνου ήταν 58,1. Η μέση διάρκεια από την έναρξη έως τη σταθεροποίηση ενός λοβού που εμφανίζεται στις ακτινογραφίες θώρακος (CXR) και, από την πρώτη θετική CXR έως τις αμφοτερόπλευρες πολυλοβικές διηθήσεις του πνεύμονα, ήταν 2 ημέρες και 4,8 ημέρες, αντίστοιχα. Το ιικό φορτίο ήταν υψηλότερο από 1 × 10 (8) αντίγραφα σε τρεις ασθενείς και ήταν 1 × 10 (4) σε έναν ασθενή. Ήταν αρνητικό στον μοναδικό ασθενή που επέζησε. Η μέση διάρκεια για την αποτυχία μη επεμβατικού αερισμού θετικής πίεσης (NPPV) και την αποτυχία IMV ήταν 30,8 ώρες και 6,2 ημέρες, αντίστοιχα. Τέσσερις ασθενείς έλαβαν φλεβικό ECMO. Τέσσερις (80%) από τους πέντε ασθενείς πέθαναν παρά την κατάλληλη αναπνευστική υποστήριξη. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Ο HAdV-55 μπορεί να προκαλέσει σοβαρό ARDS σε ανοσοεπαρκείς νεαρούς άνδρες. Ο επίμονος υψηλός πυρετός, η δύσπνοια και η ταχεία εξέλιξη σε αναπνευστική ανεπάρκεια εντός 2 εβδομάδων, μαζί με αμφοτερόπλευρες ενοποιήσεις και διηθήσεις, είναι οι πιο συχνές κλινικές εκδηλώσεις του σοβαρού ARDS που προκαλείται από τον HAdV-55. Η παρακολούθηση του ιικού φορτίου μπορεί να βοηθήσει στην πρόβλεψη της σοβαρότητας και της έκβασης της νόσου. Τα ποσοστά αποτυχίας NPPV και IMV ήταν πολύ υψηλά, αλλά η ECMO μπορεί να εξακολουθεί να είναι η θεραπεία αναπνευστικής υποστήριξης εκλογής. ΕΓΓΡΑΦΗ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ: Clinicaltrials.gov NCT01585922. Καταχωρήθηκε στις 20 Απριλίου 2012 Κείμενο: Οι ανθρώπινοι αδενοϊοί (HAdVs) είναι διαβόητα παθογόνα σε άτομα με μειωμένη ανοσολογική λειτουργία και συχνή αιτία εστιών οξείας αναπνευστικής νόσου στα μικρά παιδιά. Η απειλητική για τη ζωή αδενοϊική πνευμονία έχει προηγουμένως τεκμηριωθεί σε εκπαιδευόμενους στρατιωτικούς, ασθενείς με AIDS και λήπτες μοσχευμάτων [1] [2] [3] [4] [5] . Ο ανθρώπινος αδενοϊός τύπου 55 (HAdV-55), ο οποίος αναδεικνύεται ως ένα εξαιρετικά λοιμογόνο παθογόνο για την οξεία θανατηφόρα αδενοϊική πνευμονία μεταξύ ανοσοεπαρκών ενηλίκων στην Κίνα, έχει κερδίσει αυξανόμενη προσοχή [6] . Το HAdV-55 είναι ένα πρόσφατα αναγνωρισμένο, αναδυόμενο παθογόνο οξείας αναπνευστικής νόσου που προκαλεί δύο πρόσφατα κρούσματα στην Κίνα το 2006 [7] και στη Σιγκαπούρη το 2005 [8] . Το 2011, αυτό το παθογόνο προφανώς επανεμφανίστηκε στο Πεκίνο της Κίνας, προκαλώντας αρκετές περιπτώσεις σοβαρής πνευμονίας από την κοινότητα [9] . Αυτό το παθογόνο χαρακτηρίστηκε πλήρως από αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος [10] . Συγκριτικές μελέτες έδειξαν ότι η ικανότητα του HAdV να προκαλεί σοβαρή νόσο μπορεί να σχετίζεται με τους ορότυπους των HAdV. Η σοβαρή αδενοϊική πνευμονία που προκαλείται από το HAdV-55 έχει αναφερθεί ότι σχετίζεται πιο στενά με σοβαρές περιπτώσεις σε σύγκριση με άλλους ορότυπους (HAdV-3, HAdV-7 και HAdV-14) [6] . Τρέχουσα γνώση της σοβαρής οξείας επαγόμενης από HAdV-55 Το σύνδρομο αναπνευστικής δυσχέρειας (ARDS) που απαιτεί επεμβατικό μηχανικό αερισμό και/ή υποστήριξη εξωσωματικής οξυγόνωσης μεμβράνης (ECMO) σε ανοσοεπαρκείς ενήλικες προέρχεται από αναφορές μεμονωμένων περιστατικών ή σχετικά μικρές σειρές ενός κέντρου. Ως αποτέλεσμα, λίγες πληροφορίες είναι διαθέσιμες για την πνευμονία HAdV-55 που επιπλέκεται με σοβαρό ARDS, η συχνότητα της οποίας αναμένεται να αυξηθεί τα επόμενα χρόνια. Εδώ περιγράφουμε τα κλινικά χαρακτηριστικά και τα αποτελέσματα πέντε πιθανών περιπτώσεων πνευμονίας HAdV-55 που επιπλέκονται με σοβαρό ARDS σε ανοσοεπαρκείς ενήλικες στη ΜΕΘ. Ξεκινώντας τον Μάιο του 2012, πραγματοποιήθηκε μια τυχαιοποιημένη δοκιμή μη επεμβατικού αερισμού θετικής πίεσης (NPPV) σε ασθενείς με ARDS στο κέντρο μας (ClinicalTrials.gov ID: NCT01585922). Από τον Μάιο του 2012 έως τον Απρίλιο του 2014, όλοι οι ενήλικες ασθενείς με ARDS που προκλήθηκε από πνευμονία που εισήχθησαν στη ΜΕΘ της αναπνευστικής οδού του νοσοκομείου Chao-Yang του Πεκίνου εγγράφηκαν μελλοντικά. Το σοβαρό ARDS διαγνώστηκε σύμφωνα με τον ορισμό του Βερολίνου: (1) αναπτύσσεται εντός 1 εβδομάδας από μια γνωστή κλινική προσβολή ή νέα ή επιδεινούμενα αναπνευστικά συμπτώματα. (2) αμφοτερόπλευρες θολερότητες που δεν εξηγούνται πλήρως από συλλογές, λοβική ή/και πνευμονική κατάρρευση ή οζίδια. (3) αναπνευστική ανεπάρκεια που δεν εξηγείται πλήρως από καρδιακή ανεπάρκεια ή υπερφόρτωση υγρών. (4) μερική πίεση οξυγόνου/κλάσμα εισπνεόμενου οξυγόνου (PaO 2 /FiO 2 ) ≤100 mmHg με θετική τελική εκπνευστική πίεση (PEEP) ≥5 cmH 2 O. και (5) ακτινογραφία θώρακος με τρία ή τέσσερα τεταρτημόρια με αδιαφάνεια. Ασθενείς με λοίμωξη HAdV-55 και σοβαρό ARDS που απέτυχαν στο συμβατικό NPPV και τον επεμβατικό μηχανικό αερισμό (IMV) συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση. Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από το Συμβούλιο Θεσμικής Αναθεώρησης του Νοσοκομείου Chao-Yang του Πεκίνου (LLKYPJ2012031). Τα δεδομένα αναλύθηκαν ανώνυμα. Κάθε ασθενής έδωσε γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση ώστε τα δεδομένα του να χρησιμοποιηθούν για έρευνα και δημοσίευση. Οι κλινικές πληροφορίες που συλλέχθηκαν από ερευνητές με τυποποιημένη φόρμα δεδομένων περιελάμβαναν τα ακόλουθα: δημογραφικά χαρακτηριστικά (ηλικία και φύλο), συννοσηρότητες, κλινικά συμπτώματα (πυρετός, βήχας, πτύελα, δύσπνοια, πόνος στο στήθος, εξάνθημα, ναυτία, έμετος, κοιλιακό άλγος, διάρροια και πονοκέφαλος), σημεία (θερμοκρασία σώματος, καρδιακός ρυθμός, συχνότητα αναπνοής, αρτηριακή πίεση και τριξίματα στους πνεύμονες), εργαστηριακές εξετάσεις (αριθμός ολικού αίματος και χημεία αίματος ) και μικροβιολογικά ευρήματα και εικόνες του πνεύμονα (ακτινογραφία θώρακος (CXR) και αξονική τομογραφία). Καταγράφηκαν επίσης ταυτόχρονες φαρμακευτικές αγωγές, αναπνευστική υποστήριξη, επιπλοκές και εκβάσεις. Δείγματα ασθενών, συμπεριλαμβανομένων δειγμάτων πτυέλων, ολικού αίματος και ορού, συλλέχθηκαν κατά την εισαγωγή και κατά τη διάρκεια της νοσηλείας. Μικροβιολογικές εξετάσεις πραγματοποιήθηκαν στο Τμήμα Λοιμωδών Νοσημάτων και Κλινικής Μικροβιολογίας του κέντρου μας και οι μέθοδοι ανίχνευσης που χρησιμοποιήθηκαν περιγράφηκαν στην προηγούμενη έκθεσή μας [6] . Οι κοινοί ιοί που προκαλούν αναπνευστικές ασθένειες εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ με 15 διαφορετικές ιικές αναλύσεις. Δείγματα ορού χρησιμοποιήθηκαν για αντισώματα Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae και Legionella pneumophila. Σε όλους τους ασθενείς επιβεβαιώθηκε η λοίμωξη από HAdV-55 με ανάλυση RT-PCR. Μερικές αλληλουχίες του γονιδίου εξονίου αναλύθηκαν για τον τύπο της φυλογένεσης των στελεχών HAdV-55. Το αδενοϊικό φορτίο διεξήχθη επίσης τόσο σε αναπνευστικά δείγματα όσο και σε αίμα με δοκιμασία πολλαπλής RT-PCR. Η ιογενής πνευμονία διαγνώστηκε με βάση την παρουσία HAdV που ανιχνεύτηκε σε δείγματα πτυέλων ή λαιμού με μοριακές μεθόδους. Συνεχείς μεταβλητές συνοψίστηκαν ως μέσος όρος (± πρότυπο SD) ή διάμεσος (διατεταρτημόριο εύρος). Κατά τη διάρκεια της περιόδου της μελέτης, συνολικά οκτώ ασθενείς που διαγνώστηκαν με λοίμωξη HAdV και αναπνευστική ανεπάρκεια εισήχθησαν στη ΜΕΘ μας και επτά από αυτούς έλαβαν διάγνωση ARDS. Πέντε διαδοχικοί ασθενείς με σοβαρό ARDS με επιβεβαιωμένη λοίμωξη HAdV-55 εισήχθησαν στη ΜΕΘ μας μεταξύ Απριλίου και Ιουλίου 2013. Συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση. Οι άλλοι δύο ασθενείς είχαν ήπιο ARDS και είχαν μολυνθεί με άλλους τύπους HAdVs. Και οι πέντε ασθενείς ήταν ανοσοεπαρκείς νέοι άνδρες με μέση ηλικία 32 ετών (εύρος, 28 έως 40 έτη). Όλοι οι ασθενείς είχαν ομάδα αίματος Β και προέρχονταν από την ίδια πόλη: την πόλη Baoding, την επαρχία Hebei, στη βόρεια Κίνα. Όλοι οι ασθενείς δεν είχαν έκθεση σε ζώα φάρμας, καλαμπόκι ή σανό. Ο ασθενής 3 είχε φυματιώδη πλευρίτιδα και έλαβε αντιφυματική θεραπεία κατά την εισαγωγή στη ΜΕΘ. Οι εξετάσεις αίματος του, συμπεριλαμβανομένης της δοκιμασίας φυματίωσης T-SPOT (Oxford Immunotec, Marlborough, MA, ΗΠΑ) και του αντισώματος του Mycobacterium tuberculosis, ήταν αρνητικές. Συμπτώματα γρίπης, όπως πυρετός, βήχας και λίγα πτύελα, παρατηρήθηκαν συνήθως κατά την έναρξη της νόσου . Όλοι οι ασθενείς παρουσίασαν υψηλό πυρετό, με μέση θερμοκρασία σώματος 39,5°C (εύρος, 39,0°C έως 40,0°C), η οποία παρέμεινε για 8 ημέρες (εύρος, 6 έως 11 ημέρες). Παραγωγικός βήχας παρατηρήθηκε σε δύο ασθενείς. Θαμπός υποστερνικός πόνος στο στήθος και εξάνθημα παρατηρήθηκαν επίσης σε δύο ασθενείς. Όλοι οι ασθενείς είχαν δύσπνοια. Ο μέσος χρόνος από την έναρξη έως τη δύσπνοια ήταν 5 ημέρες (εύρος, 1 έως 10 ημέρες). Μετά την έναρξη της δύσπνοιας, οι ασθενείς συνήθως εξελίσσονταν σε αναπνευστική ανεπάρκεια ή υποξαιμία. Ο μέσος χρόνος από την έναρξη έως την εισαγωγή στη ΜΕΘ ήταν 9,6 ημέρες (εύρος, 8 έως 11 ημέρες) (Πίνακας 1). Όλοι οι ασθενείς παρουσίασαν ταχύπνοια κατά την εισαγωγή τους στη ΜΕΘ, με μέσο ρυθμό 43 αναπνοές ανά λεπτό (εύρος = 38 έως 52). Η ανάλυση αερίων αρτηριακού αίματος κατά την εισαγωγή στη ΜΕΘ αποκάλυψε βαθιά υποξία, με μέση τιμή PaO 2 / FiO 2 58,1 (εύρος = 49 έως 62,5). Ο αριθμός των λευκών αιμοσφαιρίων ήταν χαμηλός ή στο φυσιολογικό εύρος. Όλοι οι ασθενείς είχαν αυξημένη ασπαρτική αμινοτρανσφεράση ορού (AST), γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) και υδροξυβουτυρική αφυδρογονάση (HBDH) (Πίνακας 1). Κατά την εισαγωγή, τα επίπεδα ανοσοσφαιρίνης όλων των ασθενών (ανοσοσφαιρίνες ορού G και M) και των συστατικών C3 και C4 ήταν στο φυσιολογικό εύρος. Τέσσερις ασθενείς είχαν χαμηλότερο από το κανονικό αριθμό υποομάδων Τ-κυττάρων (Πίνακας 2). ενοποίηση στους πνεύμονες και των πέντε ασθενών και οι ακτινογραφικές βλάβες προχώρησαν γρήγορα μετά την εισαγωγή στη ΜΕΘ (Εικόνα 1). Τρεις ασθενείς εξετάστηκαν με αξονική τομογραφία υψηλής ανάλυσης (HRCT). Μονόπλευρες ή αμφοτερόπλευρες ενοποιήσεις και διηθήσεις βρέθηκαν σε σαρώσεις HRCT και των τριών αυτών ασθενών. Οι ενοποιήσεις εντός ενός μόνο λοβού ή πολλών λοβών με καθαρό περίγραμμα και βρογχογράφημα αέρα ήταν τα πιο κοινά ευρήματα στις σαρώσεις HRCT. Οζίδια, κηλίδες, υπεζωκοτική συλλογή, απόστημα και κοιλότητα φάνηκαν επίσης ορατά με HRCT (Εικόνα 2). Η μέση διάρκεια από την έναρξη έως την ενοποίηση ενός λοβού σε CXR ήταν 2 ημέρες (εύρος = 1 έως 5 ημέρες). Η μέση διάρκεια από την πρώτη θετική CXR έως τις αμφοτερόπλευρες πολυλοβιακές πνευμονικές διηθήσεις ήταν 4,8 ημέρες (εύρος = 4 έως 7 ημέρες). Όλοι οι ασθενείς είχαν ιαιμία HAdV-55. Σε τέσσερις από τους πέντε ασθενείς, ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά σε δείγματα ενδοτραχειακής αναρρόφησης (ETA). Ο χρόνος μεταξύ της αρχικής συλλογής δείγματος ETA των αδενοϊών και των θετικών αποτελεσμάτων για νουκλεϊκό οξύ HAdV-55 στο αίμα ήταν 1 έως 10 ημέρες (Πίνακας 3). Τα αντίγραφα DNA του ιού σε ETA προσδιορίστηκαν για όλους τους ασθενείς κατά τη διάρκεια της παραμονής τους στη ΜΕΘ. Το ιικό φορτίο ήταν υψηλότερο από 1 × 10 8 αντίγραφα σε τρεις ασθενείς και 1 × 10 4 σε έναν ασθενή. Το ιικό φορτίο έγινε αρνητικό στον μόνο ασθενή που επέζησε. Στους τέσσερις ασθενείς που δεν επέζησαν, τα αντίγραφα του DNA δεν μειώθηκαν, ακόμη και με αντιική θεραπεία (Εικόνα 3). Η οξυγόνωση δεν διατηρήθηκε με συμβατική υποστήριξη NPPV ή IMV σε κανέναν από τους ασθενείς. Η μέση διάρκεια μέχρι την αποτυχία του NPPV ήταν 30,8 ώρες (εύρος = 22 έως 48 ώρες) και ο μέσος χρόνος μέχρι την αποτυχία IMV ήταν 6,2 ημέρες (εύρος 2 = έως 13 ημέρες) (Πίνακας 1) . Τέσσερις ασθενείς έλαβαν φλεβικό ECMO για να διατηρηθεί ο κορεσμός οξυγόνου και ένας ασθενής αρνήθηκε την υποστήριξη ECMO και έλαβε αντ' αυτού ταλαντευόμενο αερισμό υψηλής συχνότητας. Ο Πίνακας 4 δίνει τα δεδομένα οξυγόνωσης των ασθενών πριν και μετά τη φλεβική υποστήριξη ECMO. Όλοι οι ασθενείς έλαβαν αντιική θεραπεία, συμπεριλαμβανομένης της ακυκλοβίρης (10 mg/kg, κάθε 8 ώρες, ενδοφλέβια ενστάλαξη), γκανσικλοβίρη (5 mg/kg, κάθε 12 ώρες, ενδοφλέβια ενστάλαξη ) και ριμπαβιρίνη (250 mg, δύο φορές την ημέρα, ενδοφλέβια ενστάλαξη). Λαμβάνοντας υπόψη ότι η βακτηριακή συνλοίμωξη μπορεί να συνδυαστεί με σοβαρή ιογενή λοίμωξη, χορηγήθηκαν ενδοφλέβια αντιβιοτικά ευρέως φάσματος σε όλους τους ασθενείς. Οι δοκιμές για βακτηριακά παθογόνα ήταν αρνητικές μόνο για έναν ασθενή (Πίνακας 3). Τέσσερις (80%) από τους πέντε ασθενείς πέθαναν. Μεταξύ των τεσσάρων ασθενών που έλαβαν φλεβικό ECMO, μόνο ένας ασθενής επέζησε. Οι άλλοι τέσσερις ασθενείς πέθαναν λόγω ARDS, συνλοίμωξης Aspergillus fumigatus, σηπτικού σοκ και λοίμωξης που σχετίζεται με τον καθετήρα λόγω του Acinetobacter baumannii, αντίστοιχα. Από όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη μελέτη παρατήρησης κοόρτης σχετικά με τα κλινικά χαρακτηριστικά ασθενών με σοβαρό ARDS που προκαλείται από επείγουσα λοίμωξη HAdV-55 και επίσης η πρώτη για την αξιολόγηση μιας δοκιμής ιικού φορτίου για την παρακολούθηση της αντίδρασης στη θεραπεία και για πρόβλεψη της έκβασης του ασθενούς. Τα ακόλουθα είναι τα κύρια ευρήματα αυτής της μελέτης. (1) Το HAdV-55 μπορεί να προκαλέσει σοβαρό ARDS σε ανοσοεπαρκείς νεαρούς άνδρες με ομάδα αίματος Β. Όλοι οι ασθενείς μας ήταν από την ίδια πόλη της επαρχίας Hebei, στη βόρεια Κίνα. (2) Ο επίμονος υψηλός πυρετός, η δύσπνοια και η ταχεία εξέλιξη σε αναπνευστική ανεπάρκεια εντός 2 εβδομάδων, μαζί με αμφοτερόπλευρες ενοποιήσεις και διηθήσεις ταυτόχρονα, είναι οι πιο συχνές κλινικές εκδηλώσεις του σοβαρού ARDS που προκαλείται από HAdV-55. (3) Η παρακολούθηση του ιικού φορτίου μπορεί να βοηθήσει στην πρόβλεψη της σοβαρότητας της νόσου και της έκβασης του ασθενούς. (4) Τα ποσοστά αποτυχίας NPPV και IMV ήταν πολύ υψηλά και η ECMO μπορεί να είναι η τελευταία μέθοδος υποστήριξης για αυτήν την ομάδα ασθενών. (5) Το σοβαρό ARDS που προκαλείται από το HAdV-55 έχει πολύ υψηλό ποσοστό θνησιμότητας (80%) παρά την κατάλληλη αναπνευστική υποστήριξη. Σποραδική σοβαρή αδενοϊική λοίμωξη σε υγιείς ενήλικες έχει ιστορικά περιγραφεί για τον ορότυπο 4 [11] , τον ορότυπο 7 [4, 12] και, πιο πρόσφατα, ο ορότυπος 14 στο γενικό πληθυσμό και σε εκπαιδευόμενους στρατιωτικούς [13, 14] . Ο HAdV-55 αρχικά χαρακτηρίστηκε πλήρως στο Shaanxi της Κίνας [7] και στη συνέχεια επανεμφανίστηκε στο Hebei, μια επαρχία κοντά στο Πεκίνο, όπου προκάλεσε αρκετές περιπτώσεις οξείας αναπνευστικής νόσου [9] . Θεωρήθηκε ότι το HAdV-55 ήταν μια ανασυνδυασμένη μορφή του είδους Β2 των HAdV-14 και HAdV-11 [7, 15] λόγω του ότι μοιράζεται ένα γονίδιο εξονίου με το σασί HAdV-11 και HAdV-14 [16] . Τα αποτελέσματα της μελέτης μας δείχνουν ότι το HAdV-55, ως αναδυόμενο παθογόνο μεταξύ ανοσοεπαρκών ενηλίκων, μπορεί να προκαλέσει σοβαρό ARDS. Ο επιπολασμός της σοβαρής θανατηφόρας αδενοϊικής πνευμονίας που προκαλείται από τον HAdV-55 στη μελέτη μας είναι κάπως παρόμοιος με αυτόν που περιγράφεται από τον Cao και τους συνεργάτες του. 6] . Όλες οι περιπτώσεις του αναφερθέντος HAdV-55 στη μελέτη μας ήταν από την ίδια πόλη: Baoding, επαρχία Hebei, βόρεια Κίνα. Εμφανίστηκαν μεταξύ Απριλίου και Ιουλίου 2013, απλώς εν μέρει αλληλεπικαλυπτόμενες ή μετά από την επιδημία γρίπης. Οι ασθενείς με σοβαρή νόσο προέρχονταν επίσης από την ίδια περιοχή και υποβλήθηκαν σε θεραπεία κατά τη διάρκεια παρόμοιας χρονικής περιόδου, γεγονός που υποδηλώνει ότι το HAdV-55 μπορεί να είναι ένα σημαντικό ιικό παθογόνο που προέρχεται από αυτήν την περιοχή. Τα αποτελέσματα της μελέτης μας υποδηλώνουν ότι τα ακόλουθα μπορεί να είναι κλινικά χαρακτηριστικά του ARDS που προκαλείται από HAdV-55: επίμονος υψηλός πυρετός, ταχεία εξέλιξη της δύσπνοιας, ανάγκη για υποστήριξη μηχανικού αερισμού, αυξημένο επίπεδο AST και ταχεία εξέλιξη από μονόπλευρες διηθήσεις σε αμφοτερόπλευρες ενοποιήσεις. Αυτά τα κλινικά χαρακτηριστικά είναι πολύ παρόμοια με εκείνα του ARDS που προκαλείται από άλλους τύπους HAdV που περιγράφονται σε προηγούμενες αναφορές [6, 9] . Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι το ανοσοποιητικό σύστημα παίζει καθοριστικό ρόλο στην κάθαρση της ιαιμίας του HAdV και στην επιβίωση του ξενιστή [6]. 17] . Οι Chen et al. ανέφερε ότι, στην οξεία φάση της μόλυνσης από HAdV-55, οι ασθενείς με σοβαρή νόσο μπορεί να έχουν υψηλά επίπεδα δενδριτικών κυττάρων και κυττάρων Th17 [18] . Στη μελέτη μας, ο μόνος ασθενής που ανάρρωσε από σοβαρή λοίμωξη είχε υψηλότερο αριθμό Τ-κυττάρων. Τρεις από τους πέντε ασθενείς είχαν σχετικά χαμηλό αριθμό Τ-κυττάρων όταν εισήχθησαν. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι αυτοί οι τρεις ασθενείς μπορεί να ήταν σχετικά ανοσοκατεσταλμένοι και ότι ένας χαμηλότερος αριθμός Τ-κυττάρων μπορεί να αποτελεί παράγοντα κινδύνου για μόλυνση από HAdV-55 σε νεαρούς ενήλικες. Το DNA του HAdV-55 είχε αναφερθεί στο παρελθόν στο 41,2% των ασθενών με σοβαρή λοίμωξη [18] . Στη μελέτη μας, το DNA του HAdV-55 ανιχνεύθηκε και παρακολουθήθηκε σε όλους τους ασθενείς με σοβαρό ARDS. Το αρχικό και η τάση του ιικού φορτίου που παρουσιάζεται ως αντίγραφα DNA του HAdV-55 στα δείγματα και το αίμα της αναπνευστικής οδού μπορεί να υποδηλώνει τη σοβαρότητα της λοίμωξης και μπορεί να προβλέψει τόσο την αντίδραση στη θεραπεία όσο και την έκβαση του ασθενούς. Η χρήση μηχανικού αερισμού και ECMO σε ασθενείς με ARDS που προκαλείται από HAdV-55 δεν έχει αναφερθεί λεπτομερώς σε προηγούμενες μελέτες. Στην κοόρτη μας, διαπιστώσαμε ότι η σοβαρή λοίμωξη HAdV-55 θα μπορούσε να προκαλέσει ταχεία εξέλιξη της αναπνευστικής ανεπάρκειας, με πολύ υψηλό ποσοστό αποτυχίας για NPPV και IMV. Αυτό το ποσοστό αποτυχίας μπορεί να είναι αποτέλεσμα της μεγάλης περιοχής ενοποίησης που προκάλεσε μια σοβαρή διακλάδωση στον πνεύμονα, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε έλλειψη ανταπόκρισης στον αερισμό θετικής πίεσης. Για ασθενείς με σοβαρό ARDS, το ECMO θα πρέπει να θεωρείται καλύτερη επιλογή για οξυγόνωση. Η μελέτη μας έχει περιορισμούς. Είναι μια μελέτη παρατήρησης χωρίς ομάδα σύγκρισης, επομένως η διαφορά μεταξύ των σοβαρών και μέτριων λοιμώξεων δεν μπορούσε να διευκρινιστεί ως προς την ανοσολογική κατάσταση, τα κλινικά χαρακτηριστικά, τα ακτινολογικά ευρήματα, το ιικό φορτίο και τα αποτελέσματα της θεραπείας στην αναπνευστική υποστήριξη και την αντιική θεραπεία. Απαιτείται διαδοχική δυναμική ανάλυση για να προσδιοριστεί η σχέση μεταξύ ιαιμίας HAdV-55 και ανταπόκρισης στη θεραπεία.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 2080, "text": "2 ημέρες" } ], "id": 3240, "question": "Ποια είναι η μέση χρονική διάρκεια από τη σταθεροποίηση ενός λοβού έως τις αμφοτερόπλευρες πολυλοβιακές πνευμονικές διηθήσεις στον ανθρώπινο αδενοϊό τύπου 55 (HAdV-55);" }, { "answers": [ { "answer_start": 11387, "text": "4,8 ημέρες" } ], "id": 3241, "question": "Ποια είναι η μέση χρονική διάρκεια από την πρώτη θετική ακτινογραφία θώρακος έως τις αμφοτερόπλευρες πολυλοβιακές διηθήσεις του πνεύμονα στον ανθρώπινο αδενοϊό τύπου 55 (HAdV-55);" }, { "answers": [ { "answer_start": 3808, "text": "Αυτό το παθογόνο χαρακτηρίστηκε πλήρως από αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος" } ], "id": 3243, "question": "Τι γνωρίζουμε για τη γονιδιωματική του ανθρώπινου αδενοϊού τύπου 55 (HAdV-55);" }, { "answers": [ { "answer_start": 9828, "text": "9,6 ημέρες" } ], "id": 3246, "question": "Ποιος είναι ο μέσος χρόνος έναρξης των συμπτωμάτων για εισαγωγή στη ΜΕΘ στον ανθρώπινο αδενοϊό τύπου 55 (HAdV-55);" }, { "answers": [ { "answer_start": 9962, "text": "43 αναπνοές ανά λεπτό" } ], "id": 3247, "question": "Ποιος είναι ο μέσος ρυθμός αναπνοής κατά την εισαγωγή στη ΜΕΘ όταν γίνεται εισαγωγή για ανθρώπινο αδενοϊό τύπου 55 (HAdV-55);" }, { "answers": [ { "answer_start": 11424, "text": "Όλοι οι ασθενείς είχαν ιαιμία HAdV-55. Σε τέσσερις από τους πέντε ασθενείς, ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά σε δείγματα ενδοτραχειακής αναρρόφησης (ETA)" } ], "id": 3251, "question": "Πού θα μπορούσε ένας κλινικός ιατρός να αποκτήσει ένα θετικό δείγμα ιού σε σοβαρές περιπτώσεις ανθρώπινου αδενοϊού τύπου 55 (HAdV-55);" }, { "answers": [ { "answer_start": 9646, "text": "1 έως 10 ημέρες" } ], "id": 3252, "question": "Πόσος χρόνος χρειάστηκε για ασθενείς με θετικές ενδοτραχειακές αναρροφήσεις ανθρώπινου αδενοϊού τύπου 55 (HAdV-55) για να αναπτύξουν μια μετρήσιμη ιαιμία;" }, { "answers": [ { "answer_start": 13896, "text": "ο HAdV-55 μπορεί να προκαλέσει σοβαρό ARDS σε ανοσοεπαρκείς νεαρούς άνδρες με ομάδα αίματος Β" } ], "id": 3253, "question": "Παίζει ρόλο η ομάδα αίματος στη σοβαρότητα της μόλυνσης από τον ανθρώπινο αδενοϊό τύπου 55 (HAdV-55);" }, { "answers": [ { "answer_start": 17309, "text": "ένας χαμηλότερος αριθμός Τ-κυττάρων μπορεί να αποτελεί παράγοντα κινδύνου για μόλυνση από HAdV-55 σε νεαρούς ενήλικες" } ], "id": 3256, "question": "Τι ρόλο παίζει ο αριθμός των Τ-κυττάρων στη σοβαρή μόλυνση από ανθρώπινο αδενοϊό τύπου 55 (HAdV-55);" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Διαγνωστική ακρίβεια της C-αντιδρώσας πρωτεΐνης και της προκαλσιτονίνης σε ενήλικες ύποπτης πνευμονίας από την κοινότητα που επισκέπτονται το τμήμα επειγόντων περιστατικών και κάνουν συστηματική αξονική τομογραφία θώρακος Bel, Josselin; Hausfater, Pierre; Chenevier-Gobeaux, Camille; Blanc, François-Xavier; Benjoar, Mikhael; Ficko, Cécile; Ray, Patrick; Choquet, Christophe; Duval, Xavier; Claessens, Yann-ErickΗμερομηνία: 2015-10-16DOI: 10.1186/s13054-015-1083-6Άδεια: cc-byAbstract: ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Η πνευμονία που αποκτάται από την κοινότητα (CAP) απαιτεί έγκαιρη θεραπεία, αλλά η διάγνωση της. Η βελτίωση της διάγνωσης της βακτηριακής CAP από βιοδείκτες έχει αξιολογηθεί χρησιμοποιώντας διήθηση ακτίνων Χ θώρακα ως χρυσό πρότυπο CAP, παράγοντας αντικρουόμενα αποτελέσματα. Αναλύσαμε τη διαγνωστική ακρίβεια των βιοδεικτών σε ύποπτους ενήλικες με CAP που επισκέπτονταν τμήματα επειγόντων περιστατικών για τους οποίους η διάγνωση CAP καθιερώθηκε από μια επιτροπή κρίσης η οποία θεμελίωσε την κρίση της σε μια συστηματική αξονική τομογραφία θώρακα με πολλαπλούς ανιχνευτές. ΜΕΘΟΔΟΙ: Σε μια επικουρική μελέτη μιας πολυκεντρικής προοπτικής μελέτης που αξιολογούσε την επίδραση της συστηματικής αξονικής τομογραφίας θώρακα στη διάγνωση της CAP, αξιολογήθηκε η ευαισθησία και η ειδικότητα της C-αντιδρώσας πρωτεΐνης (CRP) και της προκαλσιτονίνης (PCT). Πραγματοποιήθηκε συστηματική PCR του ρινοφαρυγγικού πολλαπλού αναπνευστικού ιού κατά την ένταξη. Μια επιτροπή κρίσης ταξινόμησε τη διαγνωστική πιθανότητα CAP σε μια κλίμακα Likert 4 επιπέδων, με βάση όλα τα διαθέσιμα δεδομένα. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Αναλύθηκαν διακόσιοι ασθενείς με ύποπτη ΚΑΠ. Η επιτροπή κρίσης κατέταξε 98 ασθενείς (49,0 %) ως οριστική CAP, 8 (4,0 %) ως πιθανή, 23 (11,5 %) ως πιθανή και απέκλεισε σε 71 (35,5 %), συμπεριλαμβανομένων 29 ασθενών με πνευμονικές διηθήσεις στην ακτινογραφία θώρακος. Μεταξύ των ασθενών με ακτινολογική πνευμονική διήθηση, το 23 % ταξινομήθηκαν τελικά ως αποκλεισμένοι. Οι ιοί αναγνωρίστηκαν με PCR στο 29 % των ασθενών που ταξινομήθηκαν ως σαφείς. Η περιοχή κάτω από την καμπύλη ήταν 0,787 [διάστημα εμπιστοσύνης 95 % (95 % CI), 0,717 έως 0,857] για τη CRP και 0,655 (95 % CI, 0,570 έως 0,739) για το PCT για την ανίχνευση ορισμένου CAP. Ο ουδός CRP στα 50 mg/L οδήγησε σε θετική προγνωστική τιμή 0,76 και αρνητική προγνωστική τιμή 0,75. Καμία αποκοπή PCT δεν οδήγησε σε ικανοποιητικές θετικές ή αρνητικές προγνωστικές τιμές. Η ακρίβεια CRP και PCT δεν βελτιώθηκε με τον αποκλεισμό των 25 (25,5 %) ορισμένων περιπτώσεων ιικής CAP. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Για ασθενείς με υποψία CAP που επισκέπτονται τμήματα επειγόντων περιστατικών, η διαγνωστική ακρίβεια της CRP και της PCT δεν επαρκεί για να επιβεβαιώσει τη διάγνωση CAP που καθιερώθηκε χρησιμοποιώντας ένα χρυσό πρότυπο που περιλαμβάνει αξονική τομογραφία θώρακα. Η διαγνωστική ακρίβεια αυτών των βιοδεικτών είναι επίσης ανεπαρκής για τη διάκριση της βακτηριακής CAP από την ιική CAP. ΕΓΓΡΑΦΗ ΔΟΚΙΜΑΣΤΙΚΗΣ: Μητρώο ClinicalTrials.gov NCT01574066 (7 Φεβρουαρίου 2012) ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ: Η ηλεκτρονική έκδοση αυτού του άρθρου (doi:10.1186/s13054-015-1083) είναι διαθέσιμο: συμπληρωματικό υλικό στους χρήστες. Η πνευμονία της κοινότητας (CAP) είναι μια συχνά εμφανιζόμενη νόσος, με υψηλή νοσηρότητα και θνησιμότητα, με 600.000 νοσηλεία κάθε χρόνο. Αντιπροσωπεύει την έβδομη κύρια αιτία θανάτου στις ΗΠΑ [1] . Η πρόγνωση της ΚΑΠ εξαρτάται από την ταχύτητα της ειδικής θεραπείας, η οποία ιδανικά θα πρέπει να ξεκινά εντός τεσσάρων ωρών και το αργότερο οκτώ ώρες μετά τη διάγνωση [2, 3] . Η διάγνωση της CAP βασίζεται στη ομαδοποίηση των μη ειδικών πνευμονικών και γενικών συμπτωμάτων [4, 5], στην αύξηση των βιοδεικτών που αντικατοπτρίζουν το σύνδρομο συστημικής φλεγμονώδους απόκρισης (SIRS) και στην παρουσία νέων παρεγχυματικών διηθήσεων στην ακτινογραφία θώρακα. Ωστόσο, η διάγνωση της ΚΑΠ παραμένει αβέβαιη σε πολλές περιπτώσεις με εναλλακτικές διαγνώσεις, όπως καρδιακή ανεπάρκεια, οξεία βρογχίτιδα, παροξύνσεις χρόνιας αποφρακτικής πνευμονοπάθειας (ΧΑΠ), πνευμονική εμβολή, νεοπλασία και σήψη [6, 7] . Μέρος της αβεβαιότητας της διάγνωσης της ΚΑΠ μπορεί να οφείλεται στο υψηλό ποσοστό λανθασμένης διάγνωσης με ακτινογραφία θώρακα [8, 9]. Η υπερδιάγνωση της ΚΑΠ είναι συχνή όταν συνυπάρχουν διηθήσεις μη λοιμώδους προέλευσης με πνευμονικά ή γενικά συμπτώματα και η διάγνωση της ΚΑΠ συχνά αγνοείται όταν οι διηθήσεις των πνευμόνων βρίσκονται στο όριο ορατότητας ή είναι κρυμμένες λόγω υπέρθεσης [10] . Πρόσφατα δημοσιεύσαμε μια μελέτη στην οποία διεξήχθη συστηματικά αξονική τομογραφία θώρακα σε πληθυσμό κλινικά ύποπτων ασθενών με ΚΑΠ που επισκέπτονταν το τμήμα επειγόντων περιστατικών για ΚΑΠ (η μελέτη ESCAPED) [11] . Δείξαμε ότι η διάγνωση CAP με βάση την ακτινογραφία θώρακα οδήγησε σε ψευδή διάγνωση CAP σε πολλούς ασθενείς: μεταξύ των ασθενών με υποψία CAP με ακτινολογική πνευμονική διήθηση, η διάγνωση CAP αποκλείστηκε σε περίπου 30 % των ασθενών με βάση τα αποτελέσματα της αξονικής τομογραφίας. Αντίθετα, μεταξύ των ασθενών χωρίς ακτινολογική πνευμονική διήθηση, το ένα τρίτο είχε πνευμονική διήθηση σε αξονική τομογραφία θώρακα. Αναφέραμε επίσης την απομόνωση ιών στο ένα τρίτο των ασθενών [11, 12] . Έχουν γίνει αρκετές προσπάθειες για τη βελτίωση της διάγνωσης CAP με βάση βιοδείκτες, όπως η C-αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP) και η προκαλσιτονίνη (PCT). Ωστόσο, υπάρχουν αντικρουόμενα δεδομένα σχετικά με την αξιοπιστία τους [13] [14] [15] [16] [17] . Αυτό θα μπορούσε να οφείλεται στη θεώρηση της διάγνωσης CAP με βάση την ακτινογραφία θώρακα ως θεμελίωσης πνευμονικής λοίμωξης. Στην παρούσα μελέτη, στοχεύσαμε να αναλύσουμε τις τιμές CRP και PCT στον πληθυσμό της μελέτης ESCAPED που αναφέρθηκε παραπάνω για τον οποίο η διάγνωση CAP καθιερώθηκε από μια επιτροπή κρίσης η οποία θεμελίωσε την κρίση της σε όλα τα συνήθη διαθέσιμα δεδομένα, συστηματική αξονική τομογραφία θώρακος πολλαπλών ανιχνευτών που πραγματοποιήθηκε κατά την ένταξη , και προκύπτει από παρακολούθηση της 28ης ημέρας. Αναλύσαμε επίσης εάν η ιογενής αιτιολογία της καθορισμένης CAP με βάση το πολυμερές ρινοφαρυγγικό επίχρισμα αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) παρενέβαινε στην ακρίβεια των βιοδεικτών. Το Setting ESCAPED ήταν μια πολυκεντρική, προοπτική, παρεμβατική μελέτη, με τίτλο \"Early Thoracic CT-Scan for Πνευμονία από την Κοινότητα στο Τμήμα Επειγόντων Περιστατικών (ESCAPED)\" [11] , που διεξήχθη από τον Νοέμβριο του 2011 έως τον Ιανουάριο του 2013, σε τέσσερα τμήματα επειγόντων περιστατικών (EDs) τεσσάρων τριτοβάθμιων νοσοκομείων στο Παρίσι, Γαλλία, σχεδιασμένα για τη μέτρηση του αντίκτυπου της αξονικής τομογραφίας θώρακα στην κλινική απόφαση. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε και παρακολουθήθηκε από τα δημόσια νοσοκομεία υγείας του Παρισιού και χρηματοδοτήθηκε από το Υπουργείο Υγείας της Γαλλίας. Οι γαλλικές υγειονομικές αρχές (Agence nationale de sécurité des medicaments et produits desanté, ANSM) και η θεσμική επιτροπή αναθεώρησης για την προστασία των ανθρώπινων υποκειμένων ενέκριναν το πρωτόκολλο της μελέτης και τις διαδικασίες συναίνεσης κατόπιν ενημέρωσης του ασθενούς. Όλοι οι εγγεγραμμένοι ασθενείς παρείχαν γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση για ένταξη. Το πρωτόκολλο καταχωρήθηκε στον ιστότοπο κλινική trial.gov με το ακρωνύμιο PACSCAN, τη γαλλική μετάφραση του αγγλικού ακρωνύμιου ESCAPED (NCT01574066). Η Επιτροπή Δεοντολογίας του Ile de France (Comité de Protection des Personnes. Paris N°2 011-oct-12749) ενέκρινε το πρωτόκολλο της μελέτης. Ο πρωταρχικός στόχος ήταν να συγκριθούν οι τιμές CRP και PCT στις τέσσερις διαφορετικές κατηγορίες του επιπέδου βεβαιότητας της ΚΑΠ χρησιμοποιώντας την ταξινόμηση της επιτροπής κρίσης ημέρας-28. Οι τέσσερις κατηγορίες ήταν: 1) απουσία ΚΑΠ στο εξής αναφέρεται ως διάγνωση αποκλεισμένης ΚΑΠ. 2) πιθανή ΚΑΠ? 3) πιθανή ΚΑΠ? και 4) οριστική ΚΑΠ. Οι δευτερεύοντες στόχοι ήταν να αξιολογηθεί εάν η CRP και η PCT συσχετίστηκαν με τη διάγνωση CAP χρησιμοποιώντας αναλύσεις ευαισθησίας σε τρεις διαδοχικές υποομάδες που επιλέχθηκαν a priori. 1) όταν εξετάζονται ειδικά οι ασθενείς που έχουν ταξινομηθεί ως έχουν αποκλειστεί τη διάγνωση CAP και την οριστική CAP (δηλαδή, οι ασθενείς για τους οποίους το επίπεδο βεβαιότητας ήταν το υψηλότερο), 2) όταν οι ασθενείς με διάγνωση αποκλεισμένης ΚΑΠ και διαγνωσμένη εξωπνευμονική λοιμώδης νόσος (η οποία μπορεί να αυξήσει τις τιμές των βιοδεικτών) δεν ελήφθησαν υπόψη, στην ομάδα της αποκλεισμένης ΚΑΠ· και 3) όταν οι ασθενείς που ταξινομήθηκαν ως ιική ΚΑΠ δεν λήφθηκαν υπόψη στην καθορισμένη ομάδα CAP, καθώς η PCT έχει αναφερθεί ότι είναι χαμηλότερη στις ιογενείς λοιμώξεις σε σύγκριση με τις βακτηριακές λοιμώξεις [18]. -Η σάρωση πραγματοποιήθηκε μετά από ακτινογραφία θώρακος, ιδανικά εντός τεσσάρων ωρών μετά την έγκλειση. Η ακτινογραφία θώρακος και η αξονική τομογραφία θώρακα πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο πρωτόκολλο. Τα τέσσερα επίπεδα πιθανότητας CAP σύμφωνα με την αξονική τομογραφία ορίστηκαν ως οριστικά (συστηματική κυψελιδική συμπύκνωση, κυψελιδική συμπύκνωση με περιφερικές και εντοπισμένες θολότητες από εσμυρισμένο γυαλί, βρογχιολικά εστιακά ή πολυεστιακά μικροοζίδια), πιθανά (περιφερική κυψελιδική συμπύκνωση, συστηματική συστηματική συμπύκνωση κυψελιδικών κυψελίδων, συστηματική συστηματική συμπύκνωση κυψελιδικών κυψελών, συστηματική συμπύκνωση κυψελιδικών κυψελίδων, συστηματική συστηματική κυψελιδική συμπύκνωση, βρογχιολική εστιακή ή πολυεστιακή συμπύκνωση. θολότητες γυαλιού), πιθανές (πνευμονικό έμφραγμα) ή εξαιρούνται (πνευμονική μάζα, άλλες ανωμαλίες ή φυσιολογικές εικόνες). Οι προβολές σάρωσης καταγράφηκαν σε ένα DVD. Με βάση δεδομένα που συλλέχθηκαν από βασικές τυποποιημένες φόρμες αναφοράς περιπτώσεων, εγγεγραμμένες σε DVD εικόνες ακτινογραφίας και αξονικής τομογραφίας, και τυφλές σε τοπικές ερμηνείες, μια επιτροπή κρίσης αποτελούμενη από τρεις ανεξάρτητους ανώτερους ειδικούς σε λοιμώδεις νόσους, πνευμονολογία και Η ακτινολογία ανέθεσε αναδρομικά την πιθανότητα διάγνωσης CAP χρησιμοποιώντας την ίδια κλίμακα Likert 4 επιπέδων, με όλα τα διαθέσιμα δεδομένα, συμπεριλαμβανομένης της περίληψης εξιτηρίου των ασθενών και των δεδομένων παρακολούθησης που ελήφθησαν από βοηθούς ερευνητές που επικοινώνησαν τηλεφωνικά είτε με τον ασθενή, τους συγγενείς ή τους γενικούς ιατρούς την ημέρα 28. Για αυτήν τη μελέτη, το χρυσό πρότυπο της ΚΑΠ ήταν η διάγνωση που αξιολογήθηκε από αυτήν την επιτροπή κρίσης. Καθιερώθηκαν εναλλακτικές διαγνώσεις για την αποκλεισμένη ΚΑΠ και ταξινομήθηκαν ως πνευμονικές ασθένειες εκτός ΚΑΠ και εξωπνευμονικές λοιμώδεις νόσοι και άλλες. Δείγματα αίματος συλλέχθηκαν κατά τη συμπερίληψη σε σωλήνες που υπέστησαν θεραπεία με ηπαρίνη νατρίου, φυγοκεντρήθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -40°C μέχρι την ολοκλήρωση της μελέτη. Οι συγκεντρώσεις CRP και PCT μετρήθηκαν εκ των υστέρων στη συλλογή πλάσματος (βλ. Πρόσθετο αρχείο 1 για τη μεθοδολογία), εκτός από τους ασθενείς στους οποίους η δόση δείκτη πραγματοποιήθηκε από τον επαγγελματία έκτακτης ανάγκης με δική του πρωτοβουλία. Ρινοφαρυγγικά επιχρίσματα συλλέχθηκαν κατά την εγγραφή και τοποθετήθηκαν σε Μέσο μεταφοράς Middle Virocult MWE (Sigma®). Τα δείγματα διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου και στάλθηκαν στο ιολογικό εργαστήριο του νοσοκομείου Bichat -Claude Bernard (Παρίσι) το συντομότερο δυνατό μετά τη συλλογή. Τα δείγματα δεν καταψύχθηκαν και αποψύχθηκαν. Πραγματοποιήθηκε Multiplex PCR (ανάλυση RespiFinder-19 (Pathofinder®, Maastricht, Ολλανδία)) σε ρινοφαρυγγικά επιχρίσματα για την ανίχνευση 15 αναπνευστικών ιών -coronavirus 229E, NL63, OC43, ανθρώπινος μεταπνευμοϊός (hMPV, A201), γρίπης (hMPV) και ιοί Β, ιοί παραγρίππης 1, 2, 3 και 4, αναπνευστικός συγκυτιακός ιός (RSV) Α και Β, ρινοϊός, αδενοϊός και 4 ενδοκυτταρικά βακτήρια -Bordetella pertussis, Chlamydophila pneumoniae, Legionella pneumophilae, one reaction. Τα αποτελέσματα της multiplex PCR δεν ήταν διαθέσιμα στην επιτροπή κρίσης. Οι μικροβιολογικές εξετάσεις ρουτίνας πραγματοποιήθηκαν επίσης κατά την κρίση των ιατρών έκτακτης ανάγκης και περιελάμβαναν καλλιέργεια αίματος, καλλιέργεια πτυέλων και αντιγονουρία (βλ. Πρόσθετο αρχείο 1 για μεθοδολογία). Η CAP, που ταξινομήθηκε ως οριστική, θεωρήθηκε ότι είναι ιικής προέλευσης όταν η multiplex PCR ήταν θετική για τουλάχιστον έναν από τους 15 ιούς του αναπνευστικού και δεν βρέθηκαν βακτήρια χρησιμοποιώντας PCR και συνηθισμένα βακτηριακά μικροβιολογικά δείγματα (πτύελα, αιμοκαλλιέργεια, αντιγονουρία). Τα χαρακτηριστικά της γραμμής αναφοράς και της παρακολούθησης περιγράφηκαν με μέσους όρους και τυπικές αποκλίσεις (SD) ή με διάμεσο και διατεταρτημόριο εύρος (IQR) για συνεχείς μεταβλητές που κατανέμονται κανονικά ή με λοξή κατανομή, αντίστοιχα, και με ποσοστά για κατηγορικές μεταβλητές, για το συνολικό πληθυσμό της μελέτης και για τις ομάδες μελέτης. Πραγματοποιήσαμε ακριβείς δοκιμές chi-square ή Fisher όταν είναι κατάλληλο για ποιοτικές μεταβλητές και τις δοκιμές Student ή Mann-Whitney για συνεχείς μεταβλητές με λοξές κατανομές για να συγκρίνουμε τα βασικά χαρακτηριστικά ασθενών και τα αποτελέσματα της μελέτης μεταξύ των ομάδων μελέτης. Οι τιμές κατανομής των βιοδεικτών προσδιορίστηκαν σε οι διαφορετικοί πληθυσμοί ασθενών που χρησιμοποιούν κουτιά. Οι επιδόσεις της CRP και της PCT στην πρόβλεψη οριστικής ΚΑΠ αξιολογήθηκαν με ανάλυση ευαισθησίας (ορισμένη ΚΑΠ έναντι αποκλεισμένης ΚΑΠ). Η CRP αξιολογήθηκε σε διάφορα σημεία αποκοπής των 20 mg/L, 30 mg/L, 50 mg/L, 70 mg/L και 100 mg/L, τιμές που χρησιμοποιήθηκαν σε προηγούμενες μελέτες [15, 20, 21]. Επιλέχθηκαν αρκετά σημεία αποκοπής για PCT στο επίπεδο των 0,10 μg/L [18] και στα δύο επίπεδα για ύποπτη βακτηριακή λοίμωξη όπως δηλώνεται από τον κατασκευαστή, δηλαδή 0,25 μg/L και 0,50 μg/L. Υπολογίστηκαν οι ευαισθησίες, οι ειδικότητες, οι θετικές προγνωστικές τιμές (PPV), οι αρνητικές προγνωστικές τιμές (NPV) και ο λόγος πιθανότητας. Σχεδιάστηκαν οι καμπύλες χαρακτηριστικών λειτουργιών του δέκτη (ROC), η περιοχή κάτω από την καμπύλη AUC υπολογίστηκε και η βέλτιστη αποκοπή προσδιορίστηκε με τη μεγιστοποίηση του δείκτη Youden, συγκρίνοντας τις τιμές βιοδεικτών σε ασθενείς με αποκλεισμένη CAP και καθορισμένη CAP. Από αυτές τις βέλτιστες τιμές αποκοπής για CRP και PCT, πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις ευαισθησίας συνδυάζοντας τις αποκοπές CRP και PCT. Δημιουργήθηκε ένα πολυπαραγοντικό μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης για τον εντοπισμό παραγόντων που σχετίζονται με την ύπαρξη οριστικής CAP σε σύγκριση με την ύπαρξη μιας αποκλεισμένης διάγνωσης CAP. Εξαιρέσαμε από την αποκλεισμένη ομάδα διάγνωσης ΚΑΠ, ασθενείς με εξωπνευμονική λοιμώδη νόσο. Όλες οι μεταβλητές με τιμή p < 0,25 στη διμεταβλητή ανάλυση εισήχθησαν σε μια πολυμεταβλητή λογιστική παλινδρόμηση με μια προς τα πίσω σταδιακή προσέγγιση. η διάκριση αξιολογήθηκε με τον δείκτη C και το διάστημα εμπιστοσύνης 95 % του (95 % CI) και η βαθμονόμηση αξιολογήθηκε με τη δοκιμή καλής προσαρμογής Hosmer Lemeshow. Όλες οι δοκιμές ήταν διπλής όψης και οι τιμές p κάτω από 0,05 ήταν θεωρείται ότι δηλώνει στατιστική σημασία. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας στατιστικό λογισμικό SPSS έκδοση 21.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Διακόσιοι ασθενείς με ύποπτη CAP από τους 319 στη μελέτη ESCAPED συμπεριλήφθηκαν στην παρούσα μελέτη, για την οποία αναλύσεις CRP και PCT και ρινοφαρυγγικό επίχρισμα για multiplex PCR ήταν διαθέσιμα (Εικ. 1) . Τα χαρακτηριστικά των 200 ασθενών (ηλικία, ηλικία άνω των 65 ετών, φύλο, πιθανότητα διάγνωσης CAP από την επιτροπή κρίσης) δεν ήταν σημαντικά διαφορετικά από αυτά των 119 άλλων ασθενών της μελέτης ESCAPED και συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Οι αναλύσεις CRP και PCT πραγματοποιήθηκαν με βάση την πρωτοβουλία του γιατρού έκτακτης ανάγκης σε 70 ασθενείς για CRP και 131 για PCT ή πραγματοποιήθηκαν εκ των υστέρων σε δείγματα πλάσματος των υπόλοιπων ασθενών. Η αναλογία φύλου ήταν περίπου 1. Περισσότεροι από τους μισούς ασθενείς (54 %) ήταν ηλικίας 65 ετών ή μεγαλύτεροι. Οι πνευμονικές διηθήσεις παρατηρήθηκαν στην ακτινογραφία θώρακος σε 127 (63,5 %) ασθενείς. Η αξονική τομογραφία θώρακα απέκλεισε τη διάγνωση CAP στο 16,5 % αυτών των 127 ασθενών. Αντίθετα, η αξονική τομογραφία θώρακα αποκάλυψε παρεγχυματική διήθηση στο 27 % από τους 73 ασθενείς χωρίς διήθηση στην ακτινογραφία θώρακος. Με βάση όλα τα διαθέσιμα δεδομένα, συμπεριλαμβανομένων των αποτελεσμάτων αξονικής τομογραφίας πολλαπλών ανιχνευτών (αλλά εξαιρουμένων των αποτελεσμάτων PCR), η απόφαση The CRP και PCT οι κατανομές στους 200 ασθενείς παρουσιάζονται στο Σχ. 2 Μια στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων (εξαιρουμένης ΚΑΠ έναντι οριστικής ΚΑΠ) καταδείχθηκε για αρκετά σημεία αποκοπής για CRP και PCT (Πίνακας 2). Για την CRP, η τιμή των 50 mg/L οδήγησε σε PPV 0,76 και NPV 0,75. Για το PCT, καμία τιμή δεν οδήγησε σε ικανοποιητικό PPV ή NPV. Για αυτούς τους δύο βιοχημικούς δείκτες, η ικανότητα πρόβλεψης της CAP αξιολογήθηκε με μια καμπύλη ROC. Η AUC ήταν 0,787 (95 % CI 0,717-0,857), βέλτιστη αποκοπή = 45,9 mg/L για CRP (Εικ. 3) και 0,655 (95 % CI 0,570-0,739), βέλτιστη αποκοπή = 0,13 μg/L για PCT (Εικ. 4) Οι αναλύσεις ευαισθησίας για το συνδυασμό CRP και PCT, χρησιμοποιώντας αυτές τις βέλτιστες αποκοπές, κατέληξαν σε PPV 0,74 και NPV 0,58. Η χρήση των άλλων περικοπών PCT δεν οδήγησε σε καλύτερη PPV ή NPV (Πίνακας 2). Η παρούσα μελέτη είναι νέα καθώς οι ασθενείς προοπτικά ωφελήθηκαν από εκτεταμένη έρευνα για τον προσδιορισμό της διάγνωσης της ΚΑΠ στο ΣΔ, συμπεριλαμβανομένης τόσο της πρώιμης πολυανιχνευτικής αξονικής τομογραφίας θώρακα όσο και της επιτροπής κρίσης ημέρας 28. Αυτό οδήγησε στη διόρθωση της διάγνωσης CAP που προηγουμένως βασιζόταν σε ακτινογραφία θώρακος σε μεγάλο αριθμό ασθενών. Σε αυτούς τους εκτενώς χαρακτηρισμένους ασθενείς, τόσο η CRP όσο και η PCT δεν είχαν λειτουργική ακρίβεια ώστε να επιτρέψει στη διαδικασία λήψης αποφάσεων να αποκλείσει ή να επιβεβαιώσει τη διάγνωση της ΚΑΠ ακόμη και σε επιλεγμένες υποομάδες. Τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών που περιλαμβάνονται σε αυτή την υπομελέτη είναι σύμφωνα με εκείνα της τρέχουσας βιβλιογραφία. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, οι ασθενείς είχαν συχνά ιστορικό αναπνευστικών διαταραχών, καρκίνου και συμφορητικής καρδιακής ανεπάρκειας [21, 22]. Ο σχεδιασμός της μελέτης ESCAPED απαιτούσε τον αποκλεισμό ασθενών από τις υψηλότερες κατηγορίες CRB 65, γεγονός που περιόρισε τη συμπερίληψη ασθενών άνω των 65 ετών. Αυτό μπορεί να εξηγήσει γιατί η μέση ηλικία των ασθενών μας (64 έτη) εμπίπτει στις χαμηλότερες τιμές από αυτές που αναφέρονται αλλού [19] . Τα δεδομένα για τον εντοπισμό του μικροβιακού παράγοντα που ευθύνεται για τη νόσο συλλέχθηκαν με τις συνήθεις τεχνικές και την πολυπλεξία PCR. Η ταυτοποίηση του ιού με τη χρήση ρινοφαρυγγικής PCR που αποκάλυψε ιογενή αναπνευστική λοίμωξη σε περίπου το ένα τρίτο των περιπτώσεων ήταν σύμφωνη με τις τιμές που αναφέρονται στη βιβλιογραφία [23] . Ως εκ τούτου, πιστεύουμε ότι τα αποτελέσματά μας μπορούν να επεκταθούν στους περισσότερους ασθενείς έκτακτης ανάγκης που πάσχουν από ΚΑΠ. Στην παρούσα μελέτη, οι ασθενείς στρατολογήθηκαν με βάση την αρχική κλινική αξιολόγηση για τη διάγνωση της ΚΑΠ. Ως εκ τούτου, πιστεύουμε ότι τα χαρακτηριστικά των ασθενών αντιστοιχούν στενά με εκείνα που οδηγούν τους ιατρούς να εξετάσουν μια πιθανή διάγνωση ΚΑΠ. Σε αυτούς τους ασθενείς, ο σχεδιασμός της μελέτης μας επέτρεψε να επιβεβαιώσουμε ή να αντικρούσουμε τη διάγνωση CAP με υψηλό επίπεδο βεβαιότητας. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την κακή προγνωστική αξία των κλινικών συμπτωμάτων (νέα εμφάνιση συστηματικών χαρακτηριστικών και συμπτωμάτων οξείας νόσου της κατώτερης αναπνευστικής οδού) στην αναγνώριση ασθενών με ΚΑΠ [21] . Πράγματι, η κλινική παρουσίαση των ασθενών με ΚΑΠ που είχαν αποκλειστεί ήταν παρόμοια με αυτή των ασθενών με καθορισμένη ΚΑΠ εκτός από τον πυρετό και τον βήχα που ήταν πιο συχνά σε ασθενείς με καθορισμένη ΚΑΠ. Επιπλέον, ο σχεδιασμός αποκάλυψε επίσης ότι ο συνδυασμός κλινικών συμπτωμάτων και αποτελεσμάτων ακτινογραφίας θώρακα οδήγησε σε λανθασμένη διάγνωση CAP σε μεγάλο αριθμό ασθενών, συμπεριλαμβανομένων των 98 των οποίων η διάγνωση CAP αποκλείστηκε από την επιτροπή κρίσης και οι οποίοι θα είχαν θεωρηθεί ως πιθανοί. πιθανή ή οριστική ΚΑΠ χωρίς τη χρήση της αξονικής τομογραφίας. Αυτή η χαμηλή εξειδίκευση κλινικών προτύπων ακτινολογικής αξιολόγησης οδήγησε στη συνεκτίμηση είτε μη μολυσματικών πνευμονικών παθήσεων (όπως καρδιακή ανεπάρκεια, πνευμονική εμβολή, πνευμονική νεοπλασία ή βρογχίτιδα) είτε εξωπνευμονικές λοιμώδεις νόσους ως ΚΑΠ. Αξίζει να σημειωθεί ότι ορισμένες από αυτές τις ασθένειες σχετίζονται επίσης με αυξημένες τιμές βιοδεικτών. Αυτό εγείρει ανησυχίες σχετικά με προηγούμενες αξιολογήσεις βιοδεικτών σε ασθενείς με υποψία CAP, οι οποίες χρησιμοποιούσαν κλινικές και τυπικές ακτινολογικές (ακτινογραφία θώρακος) αξιολογήσεις ως το χρυσό πρότυπο για τη διάγνωση της ΚΑΠ [15] . Η χρήση βιοδεικτών έχει υποστηριχθεί για τη βελτίωση της διάγνωσης και της διαχείρισης ασθενών με λοιμώξεις της κατώτερης αναπνευστικής οδού [14] . Ωστόσο, αυτό το ζήτημα παραμένει άλυτο [24] , με αντικρουόμενες θέσεις [14, 15, 25, 26] . Στη μελέτη μας, ενώ οι διάμεσες τιμές και των δύο βιοδεικτών αυξήθηκαν με το επίπεδο βεβαιότητας για τη διάγνωση CAP, δεν μπορέσαμε να καθορίσουμε διακριτικές τιμές για το PCT. Πρόσφατα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η CRP θα μπορούσε να βοηθήσει περισσότερο στη διάγνωση λοιμώξεων της κατώτερης αναπνευστικής οδού (LRTI) [15, 27, 28]. Στη μελέτη μας, αν και η CRP φαίνεται πιο διακριτική από την PCT, ούτε ο πειραματικός αποκλεισμός εξωπνευμονικών βακτηριακών λοιμώξεων από την αποκλεισμένη ομάδα CAP, ούτε ο αποκλεισμός της ιικής CAP από την καθορισμένη ομάδα ασθενών με CAP, δεν κατέστησαν δυνατό τον προσδιορισμό μιας διακριτικής αποκοπής. Ο συνδυασμός CRP και PCT δεν ήταν πιο διακριτικός από κάθε βιοδείκτη ξεχωριστά. Ένας λειτουργικός αλγόριθμος κυκλοφόρησε για να βοηθήσει τους γιατρούς να συνταγογραφήσουν αντιμικροβιακή θεραπεία [14, 26, 29]. Σύμφωνα με αυτή τη στρατηγική, μια συγκέντρωση PCT υψηλότερη από 0,25 μg/L θα πρέπει να οδηγήσει στη χορήγηση αντιβιοτικών σε ασθενείς με υποψία LRTI. Στη μελέτη μας, αυτή η τιμή συνδέθηκε με κακή απόδοση. Επιπλέον, τα μέσα επίπεδα PCT παρέμειναν πάνω από αυτό το όριο τόσο σε αποκλεισμένους ασθενείς με ΚΑΠ χωρίς μολυσματικές διαταραχές όσο και σε οριστική ΚΑΠ που πιθανώς σχετίζεται με τον ιό. Επομένως, το χρυσό πρότυπο για τη διάγνωση της ΚΑΠ μπορεί να επηρεάσει την απόδοση και τη χρησιμότητα του PCT σε αυτό το πλαίσιο. Αυτή η μελέτη έχει ορισμένους περιορισμούς. Πρώτον, η επιτροπή κρίσης δεν τυφλώθηκε ως προς την τιμή των βιοδεικτών που μετρήθηκαν δίπλα στο κρεβάτι σε ορισμένους ασθενείς (70 για την CRP και 131 για την PCT) και η ταξινόμηση CAP της θα μπορούσε επομένως να έχει επηρεαστεί από αυτά τα αποτελέσματα. Ωστόσο, η έλλειψη στατιστικά σημαντικών διαφορών στις μέσες τιμές CRP και PCT στις συγκεκριμένες περιπτώσεις CAP, ανεξάρτητα από το αν αυτοί οι βιοδείκτες ήταν διαθέσιμοι για την επιτροπή κρίσης, συνηγορεί κατά του σημαντικού αντίκτυπου αυτών των αποτελεσμάτων στην ταξινόμηση της επιτροπής κρίσης. Δεύτερον, ένα άλλο κρίσιμο σημείο είναι η συνταγογράφηση αντιβιοτικής θεραπείας (34 %) πριν από την ένταξη. Δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ότι αυτοί οι ασθενείς με CAP που έλαβαν προηγουμένως θεραπεία μπορεί να έχουν αλλάξει την απόδοση των βιοδεικτών και να έχουν μειώσει την απόδοση των βακτηριακών καλλιεργειών, αν και ένας τέτοιος πληθυσμός αντικατοπτρίζει τη συνήθη πρακτική του τμήματος επειγόντων περιστατικών. Τρίτον, η multiplex PCR πραγματοποιήθηκε σε ρινοφαρυγγική δειγματοληψία και όχι σε δείγματα κατώτερης αναπνευστικής οδού, γεγονός που δεν επιτρέπει σαφή επιβεβαίωση της ιικής προέλευσης της CAP. Ωστόσο, μια πρόσφατη μεγάλη μελέτη σε ασθενείς με ΚΑΠ που ανέφερε ιογενή αιτιολογία της ΚΑΠ με ​​συγκρίσιμο ρυθμό, δεν βρήκε έκπτωση της ανώτερης αναπνευστικής οδού σε πληθυσμό ελέγχου χωρίς ΚΑΠ που διερευνήθηκε κατά τη διάρκεια της ίδιας χρονιάς και εποχής [30] . Τέλος, ακόμα κι αν η αξονική τομογραφία πολλαπλών ανιχνευτών θώρακα είναι καλύτερη απεικονιστική εξέταση από την ακτινογραφία για τη διερεύνηση του θώρακα, μόνο τα επεμβατικά τοπικά μικροβιολογικά δείγματα θα έδιναν μια διάγνωση με βεβαιότητα. Δεδομένης της ποικιλομορφίας των κλινικών και ακτινολογικών παρουσιάσεων CAP, η διάγνωση CAP είναι συχνά αβέβαιος. Στον πληθυσμό μας των ασθενών που έλαβαν θεραπεία στο δωμάτιο έκτακτης ανάγκης με κλινικά συμπτώματα που προκαλούν CAP, ούτε οι τιμές αποκοπής CRP ούτε PCT είχαν επαρκή βαρύτητα για να επιβεβαιώσουν ή να αντικρούσουν τη διάγνωση CAP δίπλα στο κρεβάτι. Αυτό υπογραμμίζει ότι αυτοί οι βιοδείκτες είναι ενδεικτικές της φλεγμονώδους απόκρισης του ξενιστή στην εισβολή μικροοργανισμών ανεξάρτητων από το σημείο της μόλυνσης. Αυτά τα αποτελέσματα, που βασίζονται σε μια συστηματική αξιολόγηση θωρακικής αξονικής τομογραφίας ασθενών με υποψία CAP, δεν υποστηρίζουν τη χρήση CRP και PCT στη συνήθη φροντίδα για τη διάγνωση της ΚΑΠ με ​​βεβαιότητα σε ασθενείς που επισκέπτονται το ΕΔ για ύποπτη ΚΑΠ.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 3259, "text": "600.000" } ], "id": 5253, "question": "Πόσοι ασθενείς με πνευμονία της κοινότητας νοσηλεύονται κάθε χρόνο;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Πανδημική γρίπη Λόγω του ιού PH1N1/2009: Εκτίμηση του επιβάρυνσης μόλυνσης στο νησί Reunion μέσω ενός μελλοντικού Serosurvey, Austral Winter 2009https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc3183080/sha: EE6D70A53E3262CEAEAD85BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BD8BDARAYSOY ; Rollot, Olivier; Temmam, Sarah; Salez, Nicolas; Guernier, Vanina; Pascalis, Hervé; Gérardin, Patrick; Fianu, Adrian; Lapidus, Nathanael; Naty, Nadège; Tortosa, Pablo; Boussaïd, Karim; Jaffar-Banjee, Marie-Christine; Filleul, Laurent; Flahault, Antoine; Carrat, Fabrice; Favier, Francois; de Lambalerie, XavierDate: 2011-09-29DOI: 10.1371/journal.pone.0025738License: cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Μέχρι σήμερα, υπάρχουν λίγες πληροφορίες που αντικατοπτρίζουν την πραγματική έκταση της εξάπλωσης του pH1N1 σε επίπεδο πανδημίας γρίπης/2009 καθώς η μόλυνση οδηγεί συχνά σε ήπια ή καθόλου κλινικά συμπτώματα. Αυτή η μελέτη στόχευε στην αξιολόγηση μέσω μιας προοπτικής μελέτης, του ποσοστού προσβολής του ιού pH1N1/2009 στο νησί Reunion και των παραγόντων κινδύνου μόλυνσης, κατά τη διάρκεια της σεζόν 2009. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ/ΚΥΡΙΑ ΕΥΡΗΜΑΤΑ: Διεξήχθη ορολογική έρευνα κατά τον αυστραλιανό χειμώνα του 2009, στο πλαίσιο μιας προοπτικής πληθυσμιακής μελέτης. Συλλέχθηκαν ζεύγη ορών από 1687 άτομα που ανήκαν σε 772 νοικοκυριά, κατά τη διάρκεια και μετά το πέρασμα του πανδημικού κύματος. Τα αντισώματα έναντι του pH1N1/2009v τιτλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία αναστολής αιμοσυγκόλλησης (HIA) με τίτλους ≥1/40 να θεωρούνται θετικοί. Ο οροθετικός επιπολασμός κατά τις δύο πρώτες εβδομάδες ανίχνευσης του pH1N1/2009v στο νησί Reunion ήταν 29,8% σε άτομα ηλικίας κάτω των 20 ετών, 35,6% σε ενήλικες (20-59 ετών) και 73,3% σε ηλικιωμένους (≥60 ετών) (P< 0,0001). Τα σωρευτικά ποσοστά επίπτωσης που διορθώθηκαν κατά την έναρξη ήταν 42,9%, 13,9% και 0% σε αυτές τις ηλικιακές ομάδες αντίστοιχα (P<0,0001). Σημαντική μείωση στους τίτλους αντισωμάτων σημειώθηκε αμέσως μετά το πέρασμα του επιδημικού κύματος. Τα ποσοστά ορομετατροπής σε pH1N1/2009 συσχετίστηκαν αρνητικά με την ηλικία: 63,2%, 39,4% και 16,7%, σε κάθε ηλικιακή ομάδα αντίστοιχα (P<0,0001). Ορομετατροπή εμφανίστηκε στο 65,2% των ατόμων που ήταν οροαρνητικά κατά την ένταξη σε σύγκριση με 6,8% σε εκείνα που ήταν αρχικά οροθετικά. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Η οροεπίπτωση της λοίμωξης από pH1N1/2009v ήταν τριπλάσια από εκείνη που εκτιμήθηκε από την κλινική παρακολούθηση, υποδεικνύοντας ότι σχεδόν τα δύο τρίτα των λοιμώξεων που εμφανίζονται σε επίπεδο κοινότητας έχουν διαφύγει της ιατρικής ανίχνευσης. Τα άτομα κάτω των 20 ετών ήταν η πιο επηρεασμένη ομάδα. Προ-επιδημικοί τίτλοι ≥1/40 απέτρεψαν την ορομετατροπή και είναι πιθανώς προστατευτικοί έναντι λοιμώξεων. Προβλήθηκε μια ανησυχία σχετικά με τη μακροπρόθεσμη σταθερότητα των αποκρίσεων των αντισωμάτων. Κείμενο: Τον Απρίλιο του 2009, τα πρώτα κρούσματα οξειών αναπνευστικών λοιμώξεων που προκλήθηκαν από έναν νέο ιό της γρίπης τριπλής ανασυγκρότησης, pH1N1/ 2009v, εμφανίστηκαν στο Μεξικό και στις Ηνωμένες Πολιτείες [1 ] . Η ταχεία εξάπλωση της λοίμωξης σε άλλες ηπείρους οδήγησε τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (ΠΟΥ) να δηλώσει στις 11 Ιουνίου 2009 ότι βρισκόταν σε εξέλιξη μια πανδημία γρίπης pH1N1/2009v, γεγονός που προκάλεσε μεγάλη διεθνή ανησυχία σχετικά με τον κίνδυνο υψηλής νοσηρότητας και θνησιμότητας και το ενδεχόμενο για σοβαρές κοινωνικοοικονομικές επιπτώσεις. Στην πραγματικότητα, ο πιθανός αντίκτυπος αυτής της πανδημίας γρίπης της πρώτης τρίτης χιλιετίας έχει επανεξεταστεί προς τα κάτω, καθώς τα ποσοστά νοσηρότητας και θνησιμότητας ήταν λιγότερο σοβαρά από ό,τι αρχικά αναμενόταν [2] . Τα δεδομένα επιτήρησης ασθενειών δεν επιτρέπουν την ακριβή εκτίμηση του πραγματικού ποσοστού μόλυνσης από γρίπη, καθώς ένα σημαντικό ποσοστό των λοιμώξεων είναι ασυμπτωματικές ή ήπιες [3] . Οι ορολογικές έρευνες μπορούν να ξεπεράσουν αυτόν τον περιορισμό, αλλά πρέπει να λάβουν υπόψη ότι ένα σημαντικό ποσοστό του πληθυσμού που εμφάνιζε διασταυρούμενους τίτλους αντισωμάτων πριν από την κυκλοφορία του pH1N1/2009v [4] . Αυτή η αποκαλούμενη «βασική ανοσία» πρέπει να αφαιρεθεί από τον οροθετικό επιπολασμό που παρατηρήθηκε μετά το κύμα της πανδημίας, για να προσδιοριστεί η οροεπίπτωση στις ορολογικές έρευνες [5] [6] [7] [8] . Ωστόσο, εκτός από λίγες μελέτες [9] [10] [11] , οι περισσότερες από αυτές τις ορολογικές έρευνες δεν χρησιμοποίησαν σειριακές μετρήσεις στο ίδιο άτομο, γεγονός που επιτρέπει την καλύτερη κατανόηση της κινητικής των αντισωμάτων και της δυναμικής της μόλυνσης σε άτομα και κοινότητες. Επανασύνδεση Το νησί (805.500 κάτοικοι) είναι ένα γαλλικό υπερπόντιο διαμέρισμα που βρίσκεται στον νοτιοδυτικό Ινδικό Ωκεανό, 700 χλμ ανατολικά της Μαδαγασκάρης και 200 ​​χλμ νοτιοδυτικά του Μαυρικίου. Το πρώτο εισαγόμενο κρούσμα pH1N1/2009v εντοπίστηκε στις 5 Ιουλίου 2009 (εβδομάδα 29) σε έναν ταξιδιώτη που επέστρεφε από την Αυστραλία. Το πρώτο κρούσμα που υποδεικνύει μετάδοση στην κοινότητα εντοπίστηκε στις 21 Ιουλίου (εβδομάδα 30). Το pH1N1/2009v έγινε ο κυρίαρχος κυκλοφορούν ιός γρίπης μέσα σε τέσσερις εβδομάδες από την πρώτη του ανίχνευση, η δραστηριότητά του κορυφώθηκε κατά τη διάρκεια της εβδομάδας 35 (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) και τελείωσε την εβδομάδα 38 [ 12] . Σε αντίθεση με τους αρχικούς φόβους, το σύστημα υγειονομικής περίθαλψης δεν κατακλύζεται, καθώς τα ποσοστά νοσηρότητας και θνησιμότητας ήταν χαμηλότερα από τα προβλεπόμενα [12] [13] [14] . Προκειμένου να εκτιμηθεί σε κοινοτικό επίπεδο, το πραγματικό μέγεθος της πανδημίας pH1N1/2009v και την έκταση της ανοσίας της αγέλης που αποκτήθηκε μετά το πέρασμα του επιδημικού κύματος, διεξήχθη μια προοπτική πληθυσμιακή έρευνα στο νησί Reunion κατά τη διάρκεια του κύματος επιδημίας την αυστραλιανή χειμερινή περίοδο του 2009 (Ιούλιος-Δεκέμβριος 2009): ο επιπολασμός της μόλυνσης αξιολογήθηκε στις σε εβδομαδιαία βάση και τα ποσοστά ορομετατροπής μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ζευγαρωμένους ορούς. Το CoPanFLu-RUN ήταν μέρος του διεθνούς έργου CoPanFLu, μιας κοινοπραξίας μεταξύ του Γαλλικού Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας και Ιατρικής Έρευνας (INSERM), του Ινστιτούτου Έρευνας για Ανάπτυξη (IRD) και το Ίδρυμα Mérieux υπό την προώθηση της Σχολής Προηγμένων Σπουδών στη Δημόσια Υγεία (EHESP). Για να καταστεί δυνατή η ταχεία υλοποίηση της μελέτης εν όψει της επικείμενης εξάπλωσης του πανδημικού κύματος, χρησιμοποιήσαμε ένα προϋπάρχον δείγμα 2442 νοικοκυριών που ιδρύθηκαν τον Οκτώβριο του 2006 για τη διερεύνηση της επιδημίας Chikungunya (SEROCHIK) και ενημερώθηκαν τον Μάιο του 2008 σε τηλεφωνική έρευνα παρακολούθησης (TELECHIK) σε βάση 1148 νοικοκυριών [15, 16] . Δώσαμε ιδιαίτερη προσοχή σε επιλεγμένα νοικοκυριά που αντιπροσωπεύουν ένα ευρύ φάσμα γεωγραφικών τοποθεσιών, προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί η μεροληψία ανακατανομής. Η φάση ένταξης ξεκίνησε στις 21 Ιουλίου (30η εβδομάδα) και συνεχίστηκε μέχρι την εβδομάδα 44, καθ' όλη τη διάρκεια του κύματος της επιδημίας και μετά. Ένα πρώτο δείγμα ορού (δείγμα 1) ελήφθη από κάθε μέλος του νοικοκυριού. Στη συνέχεια, διενεργήθηκε ενεργή τηλεφωνική έρευνα δύο φορές την εβδομάδα για την καταγραφή συμπτωμάτων συμβατών με ασθένεια τύπου γρίπης (ILI) που εμφανιζόταν σε νοικοκυριά. Η αναφορά ILI (πυρετός $37,8uC που σχετίζεται με οποιοδήποτε αναπνευστικό ή συστηματικό σύμπτωμα) οδήγησε σε τρεις διαδοχικές επισκέψεις νοσοκόμας στην κατοικία του περιστατικού (την ημέρα 0, +3 και +8 μετά την αναφορά) για την καταγραφή των συμπτωμάτων και τη συλλογή ρινικών επιχρισμάτων από όλα τα μέλη της οικογένειας (για ανίχνευση qRT-PCR του pH1N1/2009v. Την εβδομάδα 45, η ενεργός έρευνα διακόπηκε και ελήφθη ένα δεύτερο (μετα-επιδημικό) δείγμα ορού (δείγμα 2) (εβδομάδες 45-52) για τον προσδιορισμό των ρυθμών ορομετατροπής. Οι οροί μοιράστηκαν και αποθηκεύτηκαν στους 280uC. Το πρωτόκολλο διεξήχθη σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι και τη γαλλική νομοθεσία για τη βιοϊατρική έρευνα (Nu ID RCB AFSSAPS: 2009-A00689-48) και εγκρίθηκε από την τοπική Επιτροπή Δεοντολογίας (Comité de Protection des Personnes of Bordeaux 2 University). Κάθε άτομο που πληροί τις προϋποθέσεις για συμμετοχή κλήθηκε να δώσει τη γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεσή του. Ανίχνευση γονιδιώματος ιού με RT-PCR. Το ιικό RNA εκχυλίστηκε από 140 mL εκλούσματος ρινικού επιχρίσματος χρησιμοποιώντας το κιτ QIAamp Viral RNA (Qiagen) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για ανίχνευση με TaqMan qRT-PCR στοχεύοντας το γονίδιο HA της αιμοσυγκολλητίνης (SuperScript III Platinum ενός σταδίου σύστημα qRT-PCR, Invitrogen) τις συστάσεις του Ινστιτούτου Παστέρ (Van der Werf S. & Enouf V., SOP/FluA/130509). Η επιβεβαιωμένη λοίμωξη με pH1N1/2009v ορίστηκε ως θετική ανίχνευση qRT-PCR του γονιδίου HA σε τουλάχιστον ένα ρινικό στειλεό. Δοκιμασία αναστολής αιμοσυγκόλλησης (HIA). Μια τυπική τεχνική αναστολής αιμοσυγκόλλησης προσαρμόστηκε για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των αντισωμάτων pH1N1/2009v [17] . Το αντιγόνο παρασκευάστηκε με αραίωση ενός μη απενεργοποιημένου υπερκειμένου κυτταροκαλλιέργειας που παράγει ένα στέλεχος H1N1v pdm (στέλεχος OPYFLU-1 που απομονώθηκε από νεαρό ασθενή που επέστρεψε από το Μεξικό στις αρχές Μαΐου 2009) [18] . Εν συντομία, ο ιός πολλαπλασιάστηκε σε κύτταρα MDCK υπό τυπικές συνθήκες. Η τελευταία διέλευση (που χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή αντιγόνου) πραγματοποιήθηκε απουσία θρυψίνης και ht-FBS. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε την έβδομη ημέρα p.i. διαυγάζεται με φυγοκέντρηση στα 8006 g για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, μοιράζεται σε κλάσματα και διατηρείται στους 280uC. Ο τίτλος αιμοσυγκόλλησης του μη απενεργοποιημένου ιικού αντιγόνου προσδιορίστηκε αμέσως υπό τη μορφή HIA που περιγράφεται παρακάτω. Η αραίωση που παρείχε 5,33 μονάδες αιμοσυγκόλλησης σε όγκο 25 mL χρησιμοποιήθηκε για την επακόλουθη HIA. Οι οροί απενεργοποιήθηκαν με θερμότητα στους 56uC για 30 λεπτά πριν από τη χρήση. Πραγματοποιήθηκαν διαδοχικές διπλές αραιώσεις σε PBS (1/10 έως 1/1280) σε όγκους 25 mL και κατανεμήθηκαν σε μικροπλάκες 96 φρεατίων με πυθμένα V. Τα ανθρώπινα ερυθρά αιμοσφαίρια (RBC) χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα αιμοσυγκόλλησης. Η ανίχνευση και η ποσοτικοποίηση του αντισώματος έναντι του pH1N1/2009v πραγματοποιήθηκε ως εξής: 25 mL εναιωρήματος ιού προστέθηκαν στην αραίωση ορού (25 mL) και επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Κάθε φρεάτιο στη συνέχεια γεμίστηκε με 25 mL ενός εναιωρήματος RBC 1% σε PBS (ν/ν: 0,33%), και ακολούθησε επώαση για άλλα 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ο τίτλος HIA προσδιορίστηκε ως η τελευταία αραίωση παρέχοντας σαφή αναστολή της αιμοσυγκόλλησης. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν παρουσία των ίδιων αρνητικών και θετικών μαρτύρων, με τους τελευταίους να περιλαμβάνουν ορούς με τίτλους αντισωμάτων 1/40, 1/80, 1/160 και 1/320. Τα αποτελέσματα που αναφέρθηκαν σε αυτή τη μελέτη βασίστηκαν μόνο σε ορολογική ανάλυση ζευγαρωμένων ορών. Για λόγους ανάλυσης, εντοπίστηκαν τέσσερις διαδοχικές φάσεις σε όλο το πανδημικό κύμα: η φάση Α (εβδομάδες 30-31) αντιστοιχούσε στον πρώιμο χρόνο της επιδημίας, η φάση Β (W32-39) στην εξέλιξη της επιδημίας, η φάση C (W40-44) σε το άμεσο μετα-επιδημικό στάδιο και η φάση Δ (W45-52) έως το όψιμο μετα-επιδημικό στάδιο. Η οροθετικότητα ορίστηκε ως τίτλος HIA 1/40 ή περισσότερο. Ο βασικός δείκτης οροεπιπολασμού υπολογίστηκε σε δείγματα ορού που συλλέχθηκαν στη φάση Α. Το αθροιστικό ποσοστό επίπτωσης της μόλυνσης μέτρησε την αύξηση μεταξύ του πρωτογενούς ποσοστού οροεπιπολασμού σε οποιαδήποτε δεδομένη στιγμή κατά τη διάρκεια των επιδημικών φάσεων (S2pi) και του ειδικού για την ηλικία βασικού δείκτη οροεπιπολασμού (S1pA) (s2pi-s1 pA). Η ορομετατροπή ορίστηκε ως μια μετατόπιση από οροαρνητικό κατά την ένταξη (δείγμα 1: HIA ,1/40) σε οροθετικό κατά την παρακολούθηση (δείγμα 2: HIA $1/40) ή για ορούς που δοκιμάστηκαν οροθετικοί κατά την ένταξη ως τετραπλάσια αύξηση του Τίτλοι HIA μεταξύ των ζευγαρωμένων ορών δείγματος 1 και δείγματος 2. Υπολογίσαμε επίσης την αναλογία ορών που δοκιμάστηκαν οροθετικοί στο δείγμα 1 για τον οποίο ο τίτλος HIA μειώθηκε τετραπλασιασμένο και πέρασε κάτω από την τιμή αποκοπής 1/40 στο δείγμα 2. Θεωρήσαμε αυτή την αναλογία ως ποσοστό «οροάρνησης». Το μέγεθος του δείγματος υπολογίστηκε για τον προσδιορισμό των παραγόντων κινδύνου στην προοπτική μελέτη κοόρτης. Λαμβάνοντας υπόψη κατά μέσο όρο τρία άτομα ανά νοικοκυριό, μια ενδοοικιακή συσχέτιση 0,3, θα μπορούσε να ληφθεί ισχύς μεγαλύτερη από 80% με ένα μέγεθος δείγματος 840 που περιλαμβάνει 2500 άτομα, υποθέτοντας επίπεδα έκθεσης που κυμαίνονται από 10% έως 90% και σχετικό κίνδυνο μεγαλύτερο από 1.3. Με 2.500 άτομα, η μελέτη επέτρεψε απόλυτη ακρίβεια 1-2% γύρω από τις εκτιμώμενες τιμές για τα ποσοστά ορομετατροπής. Η εισαγωγή δεδομένων χρησιμοποιήθηκε EpiData έκδοση 3.1 (The Epidata Association, Odense, Δανία). Η έκδοση SAS 9.1 (SAS Inc., Cary, NC, USA) χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση. Τα χαρακτηριστικά της κοόρτης της μελέτης συγκρίθηκαν με εκείνα του πληθυσμού του νησιού Reunion και χρησιμοποιήθηκε ένα τεστ Chi2 (ή το ακριβές τεστ Fisher όταν δεν ισχύει) για την ανάλυση των διαφορών στην ηλικία, το φύλο και τη γεωγραφική θέση. Σωρευτικά ποσοστά επίπτωσης μόλυνσης (δηλ. οροσυχνότητα) και τα ποσοστά ορομετατροπής τυποποιήθηκαν σύμφωνα με την ηλικιακή δομή της κοινότητας (πηγή Γαλλικού Εθνικού Ινστιτούτου Στατιστικών και Οικονομικών Μελετών (INSEE)). εκφρασμένα σε ποσοστά. Οι αθροιστικές καμπύλες αντίστροφης κατανομής χρησιμοποιήθηκαν για να δείξουν την κατανομή των τίτλων αντισωμάτων. Σε όλες τις δοκιμές, μια τιμή P, 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Υπολογίσαμε 95% διαστήματα εμπιστοσύνης (CIs) αναλογιών χρησιμοποιώντας μια τεχνική εκκίνησης συμπλέγματος με 1000 εκ νέου δείγματα [19] . Μετά το bootstraping, χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο ANOVA για να συγκρίνουμε τις μέσες αθροιστικές αναλογίες επίπτωσης μεταξύ των φάσεων της πανδημίας, σε κάθε ηλικιακή ομάδα. Χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο εναλλασσόμενης λογιστικής παλινδρόμησης (ALR) με έναν ανταλλάξιμο λογαριθμικό λόγο πιθανοτήτων (OR) για να ελέγξουμε την προσαρμοσμένη συσχέτιση εντός του νοικοκυριού μεταξύ παραγόντων και του αποτελέσματος ορομετατροπής. Τα δεδομένα αναλύθηκαν σε σχέση με την ηλικία του υποκειμένου. Αρχικά, εξετάστηκαν τέσσερις ηλικιακές ομάδες: τα παιδιά και οι έφηβοι (20 ετών), οι νέοι ενήλικες (20-39 ετών), οι ενήλικες μέσης ηλικίας (40-59 ετών) και οι ηλικιωμένοι (60 $ ετών). Καθώς η αθροιστική συχνότητα μόλυνσης της δεύτερης και της τρίτης ομάδας ήταν πολύ κοντά, και οι δύο ομάδες συγχωνεύτηκαν σε μία ομάδα ενηλίκων (20-59 ετών). Ως εκ τούτου, αναφερόμαστε περαιτέρω στη μελέτη μας σε τρεις ηλικιακές ομάδες: παιδιά και έφηβοι (,20 ετών), ενήλικες (20-59 ετών), ηλικιωμένοι ($60 ετών). Συνολικά 2.164 άτομα από 772 νοικοκυριά εγγράφηκαν μεταξύ 30 και 44 εβδομάδων στην κοόρτη CoPanFlu-RUN, επιτρέποντας τη συλλογή 1.932 ορών κατά την ένταξη (δείγμα 1). Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου, 136 νοικοκυριά (17,7% των νοικοκυριών) που περιείχαν 464 άτομα (21,4% των ατόμων) ανέφεραν τουλάχιστον ένα κρούσμα ILI. Εξήντα άτομα μεταξύ των 464 ατόμων (12,9%, που ανήκαν σε 33 νοικοκυριά [24,3%)) ήταν θετικά σε qRT-PCR, γεγονός που τεκμηρίωσε τη μόλυνση pH1N1/2009v. Δεν ανιχνεύθηκε θετική qRT-PCR μετά την εβδομάδα 37 και δεν αναφέρθηκε ILI μετά την εβδομάδα 40, το τέλος του επιδημικού κύματος. Το δεύτερο δείγμα ορού παρακολούθησης (δείγμα 2) λήφθηκε για 1.759 άτομα τουλάχιστον πέντε εβδομάδες μετά το τέλος του επιδημικού κύματος (εβδομάδες 45-52) που επέτρεψε τη σύσταση μιας οροτράπεζας 1.687 ζευγών ορών. Το προφίλ της κοόρτης και τα κύρια αποτελέσματα εμφανίζονται στο Σχήμα 1. Λεπτομέρειες σχετικά με τα εγκλείσματα και το χρόνο δειγματοληψίας ορού σε σχέση με την κυκλοφορία του pH1N1/2009v στο νησί παρέχονται στο σχήμα 2. Τα κοινωνικοδημογραφικά και χωροχρονικά χαρακτηριστικά της κοόρτης περιγράφονται λεπτομερώς στον Πίνακα 1. Σε σύγκριση με την κοινότητα του Reunion Island, το δείγμα των 1.687 ατόμων για τα οποία ήταν διαθέσιμα ζευγάρια ορών, ήταν μεγαλύτερης ηλικίας (,20 ετών: 27% έναντι 35% και 60 $ ετών: 17,9% έναντι 11,3%) και αποτελούνταν από ελαφρά υπέρβαση των θηλυκών (54,1% έναντι 51,5%). Η ανισορροπία οφειλόταν σε ένα έλλειμμα σε άτομα ηλικίας κάτω των 40 ετών, που αντανακλά τους άνδρες στην εργασία και στο γεγονός ότι οι γονείς αρνήθηκαν τον δεύτερο ορό για παιδιά κάτω των πέντε ετών. μετρήθηκε στο δείγμα 1 (Πίνακας 2), που ελήφθη από 249 άτομα (103 νοικοκυριά) που στρατολογήθηκαν στην αρχή της έρευνας κατά τη διάρκεια των εβδομάδων 30 και 31 (φάση Α, Εικόνα 2), όταν η επιδημική δραστηριότητα στην κοόρτη ήταν ακόμη πολύ χαμηλή. Η ηλικιακή κατανομή σε αυτή την ομάδα ήταν παρόμοια με εκείνη ολόκληρης της κοόρτης (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Το συνολικό ποσοστό οροεπιπολασμού του βασικού αντιπροσώπου (HIA $1/40), σε όλες τις ηλικίες, ήταν 43,4% (95%CI: 37,4%-49,6%). Ωστόσο, η πλειονότητα των θετικών ορών είχε χαμηλούς τίτλους αντισωμάτων, στην τιμή αποκοπής για επιβεβαίωση (δηλ. = 1/40). Οι αναλογίες ορών με τίτλο HIA 0,1/40 ήταν 0%, 3,0% και 24,6% στις νεαρές, μεσήλικες και μεγαλύτερες ηλικιακές ομάδες αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα αντισωμάτων πριν από την επιδημία ήταν ισχυρότερη στους ηλικιωμένους ($60 ετών) και πιο αδύναμη σε παιδιά και εφήβους (20 ετών) και ενήλικες (20-59 ετών), με πολύ σημαντικές διαφορές μεταξύ των ηλικιακών ομάδων (Ρ. 0,0001). Οι καμπύλες αντίστροφης αθροιστικής κατανομής των τίτλων HIA εμφανίζονται για κάθε ηλικιακή ομάδα και για ολόκληρη την κοόρτη στο Σχήμα 3. Η αναλογία των οροθετικών ορών (HI $1/40) αυξήθηκε σταθερά κατά την εξέλιξη της επιδημίας (φάση Β, W32-39) και στην αμέσως μετά την επιδημική περίοδο (φάση C, W40-44) όταν έφτασε στο μέγιστο επίπεδό της, και στη συνέχεια μειώθηκε στο όψιμη μετα-επιδημική περίοδος (φάση Δ, W45-52). Αυτή η μείωση ήταν αρκετά σημαντική ώστε να επαναφέρει την αντίστροφη αθροιστική καμπύλη κατανομής στα βασικά επίπεδα στους ηλικιωμένους. Τα σωρευτικά ποσοστά επίπτωσης, τα οποία ελήφθησαν μετά την αφαίρεση του οροθετικού επιπολασμού της βασικής γραμμής-αντίστοιχης συγκεκριμένης ηλικίας από τον ακατέργαστο οροεπιπολασμό σε κάθε φάση της επιδημίας φαίνονται στον Πίνακα 2 (σημειώστε ότι τα σωρευτικά ποσοστά επίπτωσης μόλυνσης αντιπροσωπεύονται για την ομάδα \"όλες τις ηλικίες\" τυποποιήθηκαν σύμφωνα με την ηλικιακή δομή της κοινότητας). Τα σωρευτικά ποσοστά επίπτωσης ήταν πολύ υψηλότερα σε παιδιά και εφήβους (20 ετών), υποδεικνύοντας πολύ ενεργή μετάδοση της λοίμωξης σε αυτήν την ηλικιακή ομάδα. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, τα σωρευτικά ποσοστά επίπτωσης κορυφώθηκαν στη φάση C (W40-44) και στη συνέχεια μειώθηκαν, υποδεικνύοντας κάποια αστάθεια της χυμικής ανοσολογικής απόκρισης έναντι του pH1N1/2009v. Η σχετιζόμενη με την ηλικία διαφορά που παρατηρήθηκε στα ποσοστά επίπτωσης ήταν πολύ στατιστικά σημαντική (P,0,0001). Για να εκτιμήσουμε καταλληλότερα τη μείωση των τίτλων αντισωμάτων που σημειώθηκε μετά την κορύφωση της χυμικής απόκρισης στο pH1N1/ 2009v, εξετάσαμε τους ζευγαρωμένους ορούς από το ομάδα 264 ατόμων για τα οποία ελήφθη το πρώτο δείγμα ορού (δείγμα 1) αμέσως μετά το επιδημικό κύμα (φάση C, W40-44) και το αντίστοιχο δεύτερο δείγμα συλλέχτηκε στο τέλος της έρευνας (φάση Δ, W45-52 ). Τα ποσοστά οροάρνησης ήταν 27,0% (61/226) για όλες τις ηλικιακές ομάδες, 17,4% (12/69) σε παιδιά και εφήβους (20 ετών), 32,3% (41/127) στους ενήλικες (20-59 ετών) και 26,7% (8/30) σε ηλικιωμένους ($60 ετών). Οι διαφορές μεταξύ των ποσοστών οροάρνησης ανάλογα με την ηλικία ήταν στατιστικά ασθενώς σημαντικές (P = 0,0671). Στη συνέχεια, εξετάσαμε τα 1687 άτομα για τα οποία ήταν διαθέσιμοι ζευγαρωμένοι οροί και μετρήσαμε τα ποσοστά ορομετατροπής ανάλογα με την ηλικία και τον χρόνο της πρώτης συλλογής δείγματος ορού (φάση Α, Β ή Γ). Τα κριτήρια ορομετατροπής ορίστηκαν στην ενότητα της μεθόδου. Όπως φαίνεται στον πίνακα 3, υπήρξε μια απότομη μείωση στα ποσοστά ορομετατροπής σε όλες τις ηλικιακές ομάδες, ανάλογα με το αν οι συμμετέχοντες είχαν εγγραφεί κατά τη φάση Α, φάση Β ή φάση Γ (P,0,0001). Για την ερμηνεία αυτών των δεδομένων, θα πρέπει να θυμόμαστε ότι τα αντισώματα σε οροπροστατευτικά επίπεδα (HIA $1/40), σε δείγματα ορού 1 που συλλέγονται κατά τη διάρκεια της φάσης Β ανά επιδημία ή την πρώιμη μετα-επιδημική φάση C θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν είτε διασταυρούμενα αντιδραστικά αντισώματα γραμμής βάσης είτε αυξανόμενο pH1N1/2009 συγκεκριμένα αντισώματα λόγω πρόσφατης ή συνεχιζόμενης λοίμωξης. Αυτή η ασάφεια θα μπορούσε να οδηγήσει σε υποεκτίμηση του ρυθμού ορομετατροπής για άτομα που εγγράφηκαν στις φάσεις Β και Γ. Προκειμένου να λυθεί αυτή η ασάφεια, εξετάσαμε συγκεκριμένα την ομάδα των 249 ατόμων στα οποία ανιχνεύθηκαν διασταυρούμενα αντιδραστικά αντισώματα τη στιγμή της φάσης Α (W30- 31). Το ποσοστό ορομετατροπής αυτής της ομάδας είναι το πιο ενδεικτικό της έκθεσης των ατόμων σε όλο το επιδημικό κύμα. Ήταν το υψηλότερο (63,2%, P,0,0001) σε παιδιά και εφήβους (,20 ετών) και ακόμα σημαντικά υψηλό στους ενήλικες (39,4%, P,0,0001). Στη συνέχεια, δοκιμάσαμε σε αυτή τη συγκεκριμένη ομάδα, την επίδραση του (βασική γραμμή) προ-επιδημικά διασταυρούμενα αντιδραστικά αντισώματα στον ρυθμό ορομετατροπής σε pH1N1/2009 (Πίνακας 4) . Κανένα άτομο με τίτλο HIA μεγαλύτερο από 1/40 δεν είχε ενδείξεις ορομετατροπής σε pH1N1/2009. Το ποσοστό ορομετατροπής σε άτομα με τίτλο HIA ίσο με 1/40 συνδέθηκε με την ηλικία, και ήταν πιο σημαντικό στα παιδιά και τους εφήβους (,20 ετών). Το υψηλότερο ποσοστό ορομετατροπής (0,56%) καταγράφηκε σε άτομα με τίτλους HIA κάτω του 1/40, ιδιαίτερα για τα άτομα κάτω των 20 ετών όπου έφτασε το 85%. Ως εκ τούτου, ο κίνδυνος ορομετατροπής μειώθηκε όταν ο προ-επιδημικός τίτλος HIA ήταν υψηλός μετά τον έλεγχο της ηλικίας (P,0,0001) (Εικόνα 4) . Η πολυπαραγοντική προσαρμοσμένη αναλογία πιθανοτήτων για ορομετατροπή ήταν 0,15 (95%CI: 0,06-0,37, P,0,0001) ανά διπλάσια αύξηση του βασικού τίτλου, 1,79 (95%CI: 1,23-2,59, P,0,003) ανά άλλα μέλη του νοικοκυριού ορομετατροπή, 5,33 (95%CI: 1,56-19,27, Ρ, 0,008) Σχήμα 1 . Το προφίλ της κοόρτης και τα κύρια αποτελέσματα. Το σχήμα 1 παρουσιάζει λεπτομερώς τις τρεις φάσεις του πρωτοκόλλου: i) συμπερίληψη (εβδομάδες 30-44) και συλλογή δειγμάτων ορού S1. ii) παρακολούθηση για την ανίχνευση ILI στα νοικοκυριά, qRT-PCR σε ρινικά επιχρίσματα και εκτίμηση των σωρευτικών ποσοστών οροεμφάνισης. iii) τέλος της μελέτης (εβδομάδες 45-52) και συλλογή δειγμάτων S2. Η HIA σε ζευγαρωμένους ορούς (S1+S2) επέτρεψε την εκτίμηση των ρυθμών ορομετατροπής. doi:10.1371/journal.pone.0025738.g001 Τα ποσοστά οροεπιπολασμού της Bp (βασική γραμμή αντιπροσώπευσης) υπολογίστηκαν στις εβδομάδες 30-31 σε κάθε ηλικιακή ομάδα. β Τα αθροιστικά ποσοστά επίπτωσης μέτρησαν την αύξηση μεταξύ των ακατέργαστων ποσοστών οροεπιπολασμού και του ποσοστού οροεπιπολασμού της βασικής γραμμής αναφοράς της συγκεκριμένης ηλικίας. Στην ομάδα ''Όλες οι ηλικίες'', τα σωρευτικά ποσοστά επίπτωσης τυποποιήθηκαν σύμφωνα με την ηλικιακή δομή της κοινότητας. doi:10.1371/journal.pone.0025738.t002 Τα δεδομένα είναι αριθμοί, ποσοστά (95% διαστήματα εμπιστοσύνης) και τιμή P δοκιμής παραμέτρου ALR για σύγκριση των αναλογιών ορομετατροπής σύμφωνα με το χρόνο συλλογής του πρώτου δείγματος (S1) κατά τη συμπερίληψη, σε κάθε ηλικιακή ομάδα , μετά από έλεγχο για επιλογή νοικοκυριού. Στην ομάδα ''Όλες οι ηλικίες'', τα ποσοστά ορομετατροπής τυποποιήθηκαν σύμφωνα με την ηλικιακή δομή της κοινότητας. ΝΑ: δεν αξιολογήθηκε. Η ορομετατροπή ορίστηκε ως μια μετατόπιση από την οροαρνητική κατά την ένταξη (δηλ. Τίτλος HIA, 1/40) έως οροθετικός στο δείγμα παρακολούθησης, ή ως τετραπλάσια αύξηση του αμοιβαίου τίτλου HIA μεταξύ του πρώτου και του δεύτερου ζευγαριού δειγμάτων για ορούς που δοκιμάστηκαν οροθετικοί κατά την ένταξη (δηλ. τίτλος HIA $1/40). για ηλικία, 20 ετών (έναντι ηλικίας 60 $ ετών) και 11,35 (95%CI: 0,41-4,47, P = 0,62) για ηλικία 20-60 ετών (έναντι ηλικίας 60 $ ετών). Τα παρατηρούμενα και προβλεπόμενα ποσοστά ορομετατροπής σύμφωνα με την ηλικία και τον βασικό τίτλο HIA εμφανίζονται στο Σχήμα 4. Τέλος, εξετάσαμε τα 46 άτομα που είχαν μολυνθεί από τον πανδημικό ιό κατά τη διάρκεια της μελέτης, τα οποία επαληθεύτηκαν με ένα θετικό ρινικό επίχρισμα qRT-PCR. και για τους οποίους ήταν διαθέσιμοι ζευγαρωμένοι οροί. Οι αρχικοί τίτλοι αντισωμάτων HIA σε αυτήν την ομάδα ήταν 1/40, η κοόρτη CoPanFlu-RUN δημιουργήθηκε για τη διεξαγωγή μιας προοπτικής πληθυσμιακής μελέτης που διερευνά την ανοσία της αγέλης που προκλήθηκε από τον ιό της πανδημίας γρίπης το 2009 και τον εντοπισμό παραγόντων κινδύνου για μόλυνση από pH1N1/2009v από ζευγαρωμένοι οροί που συλλέγονται σε μια ολόκληρη κοινότητα. Οι περισσότερες εργασίες που έχουν δημοσιευθεί μέχρι σήμερα έχουν χρησιμοποιήσει είτε εκτεταμένες οροεπιδημιολογικές έρευνες σε ανεξάρτητα δείγματα ορού πριν και μετά την επιδημία, ενώ η βασική ανοσία αξιολογείται από αποθηκευμένα κατεψυγμένα δείγματα [5, 7, 8] ή μη αντιπροσωπευτικές κοόρτες ενηλίκων (στρατιωτικοί, υγεία εργαζόμενοι στον τομέα της φροντίδας, ασθενείς μακράς διαμονής). Οι τίτλοι αντισωμάτων μετρήθηκαν με HIA χρησιμοποιώντας μια τιμή αποκοπής που ορίστηκε στο 1/40 όπως συνιστάται κλασικά. Αυτός ο τίτλος HIA στο 1/40 θεωρείται προστατευτικός, δηλ. παρέχοντας 50% προστασία έναντι μιας ιογενούς πρόκλησης [20] . Η δοκιμασία μας εισήγαγε κάποιες αλλαγές στο πειραματικό πρωτόκολλο σε σύγκριση με το κλασικό. Η χρήση ενός μη απενεργοποιημένου ιικού αντιγόνου, δηλ. ένας φυσικός ιός, με μη μετουσιωμένους επιτόπους πιθανώς επιτρέπει την ανίχνευση αντισωμάτων σε επιτόπους της αιμοσυγκολλητίνης που δεν ανιχνεύονται στην κλασική εξέταση HIA. Αυτό μπορεί να προκαλέσει ελαφρές διαφορές στην ευαισθησία της ανίχνευσης αντισωμάτων διασταυρούμενης αντίδρασης, αλλά αυτό δεν τροποποιεί την κινητική του Ab και την επιδημιολογική εξέλιξη της οροεπιπολασμού και δεν θέτει σε κίνδυνο την παγκόσμια συγκρισιμότητα των ορολογικών αποτελεσμάτων. Αυτό επιβεβαιώνεται από το γεγονός ότι η ανάλυση HI ανίχνευσε τίτλους οροπροστατευτικών αντισωμάτων στο 93,5% και έδωσε στοιχεία ορομετατροπής στο 73,9% της γρίπης με qRT-PCR επιβεβαιωμένο pH1N1/2009, όλα τα στοιχεία κοντά σε αυτά που αναφέρονται στη βιβλιογραφία [5, 21]. θεώρησε ότι οι τίτλοι 0,1/40, στους ορούς που συλλέχθηκαν από άτομα που εγγράφηκαν κατά τη διάρκεια των εβδομάδων 30 και 31 ήταν αντισώματα διασταυρούμενης αντίδρασης και όχι αντισώματα de novo που πυροδοτήθηκαν από τον πανδημικό ιό και ως εκ τούτου τα χρησιμοποίησαν ως υποκατάστατο για την αρχική προ-επιδημική ανοσία. Διάφορα επιχειρήματα υποστηρίζουν αυτήν την υπόθεση: i) η πρώτη περίπτωση που υποδηλώνει αυτόχθονη μετάδοση στο νησί Ρεϋνιόν αναφέρθηκε από το τμήμα επιδημιολογικής επιτήρησης της La Réunion στις 21 Ιουλίου (εβδομάδα 30), δηλ. την ίδια μέρα που ξεκίνησε η ένταξη στην κοόρτη της μελέτης μας. ii) Απαιτούνται 7 έως 15 ημέρες για την ανάπτυξη ανταπόκρισης αντισωμάτων μετά από ιογενή μόλυνση. iii) Τις εβδομάδες 30 και 31, η επιδημική δραστηριότητα λόγω του πανδημικού ιού ήταν πολύ χαμηλή στην κοόρτη της μελέτης μας και έγινε σημαντική μόνο μετά την εβδομάδα 32. Ως εκ τούτου, κατά τη διάρκεια των εβδομάδων 30-31, στρατολογήθηκαν 103 νοικοκυριά και μόνο 2 νοικοκυριά ανέφεραν περιπτώσεις ILI. Τα ρινικά επιχρίσματα που συλλέχθηκαν από αυτά τα 2 άτομα εξετάστηκαν αρνητικά ως qRT-PCR στον πανδημικό ιό, ενώ το ένα είχε ενδείξεις κοροναϊού και ρινοϊού χρησιμοποιώντας πολυπλεξία RT-PCR σε αναπνευστικούς ιούς (H. Pascalis, χειρόγραφο υπό προετοιμασία). Αντίθετα, κατά τη διάρκεια των εβδομάδων 32 έως 39, 199 άτομα που ανήκαν σε 99 νοικοκυριά ανέφεραν ILI, μεταξύ των οποίων 60 άτομα είχαν τεκμηριωθεί μόλυνση από τον ιό της πανδημίας. Η μελέτη μας δείχνει ότι ένα σημαντικό ποσοστό του πληθυσμού του νησιού Reunion είχε προϋπάρχουσα ανοσία στην πανδημική γρίπη του 2009 ιός με το υψηλότερο βασικό δείκτη οροεπιπολασμού που παρατηρήθηκε σε ενήλικες ηλικίας 60 ετών και άνω. Άλλες μελέτες από όλες τις ηπείρους ανέφεραν επίσης υψηλά προ-επιδημικά ποσοστά οροθετικότητας μεταξύ των ηλικιωμένων [5, 6, 8, [22] [23] [24] [25] [26] , αν και υπάρχουν μεγάλες διακυμάνσεις μεταξύ των χωρών [10, 11, 23, 27, 28]. Αυτά τα διασταυρούμενα αντιδραστικά αντισώματα έχουν ερμηνευτεί ως η υπολειπόμενη υπογραφή της απομακρυσμένης έκθεσης αυτών των ατόμων σε ιούς H1N1 που κυκλοφορούσαν πριν από το 1957 [24, 25, 29, 30]. Τα βασικά ποσοστά οροθετικότητας που αναφέρουμε σε παιδιά και σε νεότερους ενήλικες (δηλ. 30%-35%) ήταν σημαντικά υψηλότερα από αυτά που αναφέρθηκαν από άλλα μέρη του κόσμου [6, 8, 22, 23, [31] [32] [33] . Ωστόσο, θα πρέπει να σημειωθεί ότι αυτά τα βασικά αντισώματα ήταν χαμηλού τίτλου, ακριβώς στο επίπεδο του ορίου HIA (δηλ. 1/40). Διάφοροι παράγοντες θα μπορούσαν να έχουν συμβάλει σε αυτά τα σχετικά υψηλά βασικά ποσοστά που βρέθηκαν στη μελέτη μας: i) Μπορεί να αντικατοπτρίζει το γεγονός ότι το τεστ HI που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη μας ήταν οριακά πιο ευαίσθητο από το κλασικό [17]. ii) Μερικά άτομα μπορεί να έχουν ήδη μολυνθεί με τον ιό pH1N1/ 2009 τις εβδομάδες 30 και 31 και μπορεί να έχουν προκαλέσει μια απόκριση αντισωμάτων στον ιό. Αυτή η υπόθεση φαίνεται απίθανη εν όψει των επιχειρημάτων που παρουσιάστηκαν παραπάνω και του παρόμοιου υψηλού ποσοστού τιτλοδότησης ορών HIA = 1/40 μεταξύ 122 ορών από ενήλικες ασθενείς που στάλθηκαν για διαγνωστικούς σκοπούς στο μικροβιολογικό εργαστήριο του Περιφερειακού Νοσοκομείου, κατά το πρώτο εξάμηνο του 2009 (δηλ. πριν από την πανδημία του 2009) (τα στοιχεία δεν εμφανίζονται). Ωστόσο, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε επισήμως αυτή την υπόθεση εν όψει μιας πρόσφατα αναφερθείσας μελέτης από την Ταϊβάν [11] που έδειξε στοιχεία υποκλινικής κοινοτικής μετάδοσης με αποδεδειγμένη ορομετατροπή αρκετές εβδομάδες πριν από την αναφορά του πρώτου τεκμηριωμένου περιστατικού στο νησί. Ένα παρόμοιο συμπέρασμα εξήχθη επίσης από την Αυστραλία [34]. iii) η ορολογική μας δοκιμή μπορεί να ανιχνεύσει αντισώματα διασταυρούμενης αντίδρασης που προκαλούνται από πρόσφατο εμβολιασμό με τριδύναμο εμβόλιο εποχικής γρίπης όπως αναφέρεται [4, [35] [36] [37] [38] [39] . Ωστόσο, τα εμβόλια κατά της εποχικής γρίπης ήταν μάλλον περιορισμένης χρήσης στο νησί Reunion, ειδικά σε παιδιά και νεαρούς ενήλικες. iv) Τέλος, οι υψηλοί βασικοί τίτλοι μπορεί να αντικατοπτρίζουν το μολυσματικό ιστορικό των ατόμων σε ιούς της εποχικής γρίπης διασταυρούμενα αντιγονικά με τον ιό pH1N1/2009 όπως προτάθηκε πρόσφατα για την εποχική λοίμωξη H1N1 του 2007 [40] . Αυτή η οροέρευνα δείχνει ότι ένα μεγάλο μέρος του πληθυσμού του νησιού Reunion είχε μολυνθεί από τον πανδημικό ιό. Οι νεότεροι άνθρωποι έχουν αποδώσει τον κύριο φόρο τιμής στην επιδημία καθώς σχεδόν τα δύο τρίτα δείχνουν στοιχεία ορομετατροπής, επιβεβαιώνοντας προηγούμενες κλινικές αναφορές από το νησί [12] και συσσωρεύοντας αναφορές από άλλες χώρες [17, 32, 41, 42] και προτείνοντας ότι τα παιδιά σχολικής ηλικίας πιθανότατα έπαιξαν τον κεντρικό ρόλο στην επιδημική διάχυση του πανδημικού ιού. Χαμηλότερα ποσοστά μόλυνσης βρέθηκαν σε ενήλικες και τα χαμηλότερα ποσοστά καταγράφηκαν στους ηλικιωμένους. Με βάση τις κλινικές περιπτώσεις που αναφέρθηκαν στις υπηρεσίες επιδημιολογικής επιτήρησης [12], υπολογίστηκε ότι 66.915 άτομα στο νησί Reunion που συμβουλεύτηκαν γιατρό είχαν μολυνθεί από το pH1N1/ του ιού του 2009 κατά τις 9 εβδομάδες της επιδημίας, δίνοντας σωρευτικό ποσοστό προσβολής 8,26%. Λαμβάνοντας υπόψη όσους δεν συμβουλεύτηκαν γιατρό, ο αριθμός των συμπτωματικά μολυσμένων ατόμων υπολογίστηκε σε 104.067 (ποσοστό προσβολής: 12,85%). Στην πραγματικότητα, το ποσοστό προσβολής της λοίμωξης από pH1N1/2009 στην οροερεύνασή μας ήταν περίπου 42%-44% στην κορυφή της απόκρισης αντισωμάτων (δηλαδή, εβδομάδες 40-44), ποσοστό που είναι τουλάχιστον 3 έως 4 φορές υψηλότερο από τα ποσοστά της λοίμωξης με βάση κλινικές περιπτώσεις Το μεγάλο χάσμα μεταξύ των δύο εκτιμήσεων δείχνει ότι ένα μεγάλο μέρος (σχεδόν τα δύο τρίτα) όσων μολύνθηκαν από τον ιό pH1N1/2009 διέφυγαν την ιατρική ανίχνευση, πιθανώς επειδή ανέπτυξαν ήπια νόσο ή ασυμπτωματική λοίμωξη, μια περαιτέρω ένδειξη της καλοήθους φύσης του ιού, τουλάχιστον σε κοινοτικό επίπεδο. Στην Αγγλία, οι Baguelin et al. [43] υπολόγισε ότι τα σωρευτικά ποσοστά επίπτωσης της μόλυνσης από τον πανδημικό ιό στα παιδιά ήταν 20 έως 40 φορές υψηλότερα από αυτά που εκτιμήθηκαν από την κλινική παρακολούθηση. Η μελέτη μας, όπως και άλλες [6] , δείχνει ότι προϋπάρχοντα διασταυρούμενα αντιδραστικά αντισώματα στο pH1N1/ Το 2009 σε τίτλους $1/40 απέτρεψε την ορομετατροπή ως απάντηση στον πανδημικό ιό. Αυτό το επίπεδο προϋπάρχουσας διασταυρούμενης αντιδραστικής ανοσίας πιθανότατα προσφέρει αληθινή προστασία έναντι της λοίμωξης καθώς περίπου τα δύο τρίτα και το ένα τρίτο της τεκμηριωμένης λοίμωξης (qRT-PCR θετική) στη σειρά μας έχουν συμβεί σε άτομα με βασικούς τίτλους HIA, 1/40 και = 1/ 40 αντίστοιχα και λιγότερο από το 5% των τεκμηριωμένων λοιμώξεων εμφανίστηκαν σε άτομα με τίτλους γραμμής βάσης 0,1/40. Η προστασία ήταν αποτελεσματική όχι μόνο σε ενήλικες μεγαλύτερης ηλικίας αλλά και σε νεότερα άτομα. Αυτό υποδηλώνει ότι η προστασία χορηγήθηκε όχι μόνο από τα βασικά διασταυρούμενα αντιδραστικά αντισώματα που προκαλούνται από στενούς ιούς pH1N1/2009 που κυκλοφορούσαν πριν από το 1957 (όπως στους ηλικιωμένους), αλλά και από αντισώματα που πιθανόν να προέρχονται από πρόσφατη έκθεση σε επιδημίες εποχικής γρίπης (όπως φαίνεται σε νεότερα άτομα ) [40] . Τα παρατηρούμενα ποσοστά ορομετατροπής εξαρτώνται από την ηλικία, μετά από προσαρμογή για τους τίτλους του αρχικού pH1N1/2009. Ο προστατευτικός ρόλος της αύξησης της ηλικίας μπορεί να εξηγηθεί από μια ισχυρότερη διασταυρούμενη ανοσία σε ενήλικες και ηλικιωμένους ή από υψηλότερη έκθεση νεαρών ατόμων στον ιό κατά την επιδημία του 2009 (λόγω κοινωνικών επαφών και προτύπων ανάμειξης). Μπορεί επίσης να υποδεικνύει ότι ανοσοποιητικοί μηχανισμοί εκτός από διασταυρούμενα αντιδραστικά αντισώματα που ανιχνεύονται από HIA (δηλ. Η ανοσία στη νευραμινιδάση και στους διατηρημένους επιτόπους Τ-λεμφοκυττάρων [44] μπορεί να αναπτυχθεί καθ 'όλη τη διάρκεια της ζωής, παρέχοντας πρόσθετη προστασία από λοίμωξη ή σοβαρή ασθένεια, ειδικά στους ηλικιωμένους. Είναι ενδιαφέρον ότι υπάρχουν ενδείξεις για μείωση των τίτλων αντισωμάτων, η οποία συνέβη αμέσως μετά το πέρασμα του επιδημικού κύματος. Σε ζευγαρωμένους ορούς, αυτή η μείωση ήταν αρκετά σημαντική ώστε να φέρει, μέσα σε λίγες εβδομάδες, σχεδόν το 27% των ορών που βρέθηκαν θετικοί (δηλ. Τίτλοι HI $1/40) στην αμέσως μετά την επιδημική φάση σε επίπεδα κάτω από την τιμή αποκοπής στο δεύτερο δείγμα ορού. Αυτή η αποσύνθεση οφείλεται στην παρατήρηση ότι οι ηλικιωμένοι ενήλικες ($60 ετών) στην κοόρτη της μελέτης προφανώς γλιτώθηκαν σχεδόν εντελώς από την επιδημία, αν ληφθούν υπόψη μόνο τα σωρευτικά ποσοστά επίπτωσης που προέρχονται από την τιτλοδότηση IHA στα δείγματα 2 (εβδομάδες 45-52). Στην πραγματικότητα, το σωρευτικό ποσοστό επίπτωσης σε ενήλικες μεγαλύτερης ηλικίας μετρήθηκε αμέσως μετά την κορύφωση της επιδημίας (δηλ. εβδομάδες 40-44) ήταν 20,4%. Παρόμοια αποτελέσματα πρώιμης αποσύνθεσης αντισωμάτων αναφέρθηκαν πρόσφατα [10, 45]. Γενικότερα, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι οι ορολογικές έρευνες που πραγματοποιήθηκαν μήνες μετά το πέρασμα της επιδημίας, πιθανότατα υποτιμούν την πραγματική έκταση της μόλυνσης από pH1N1/2009, σε σύγκριση με την τιτλοδότηση αντισωμάτων που πραγματοποιήθηκε νωρίτερα, όταν οι χυμικές αποκρίσεις είναι στο υψηλότερο επίπεδο. Το εάν η μείωση των τίτλων αντισωμάτων έχει λειτουργικές ανοσολογικές συνέπειες σε άτομα ή εντός των κοινοτήτων απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Ωστόσο, θα πρέπει να σημειωθεί ότι δεν υπήρξε δεύτερο κύμα επιδημίας στο νησί Ρεϋνιόν κατά τις επόμενες αυστραλιανές χειμερινές περιόδους το 2010 και το 2011. Η γρίπη κατά τη διάρκεια του χειμώνα του 2010 ήταν σε επίπεδο όχι υψηλότερο από τα συνηθισμένα περάσματα της εποχικής γρίπης, αν και σχεδόν τα δύο τρίτα της τεκμηριωμένες περιπτώσεις το 2010 οφείλονταν επίσης σε pH1N1/2009v [46] . Επιπλέον, πολλά λιγότερα απομονωμένα στελέχη πανδημικού ιού σημειώθηκαν κατά τη διάρκεια του συνεχιζόμενου αυστραλιανού χειμώνα του 2011, υποδηλώνοντας έντονα ότι το πρώτο επιδημικό κύμα είχε προσδώσει μια σταθερή ανοσία της αγέλης, σε επίπεδο κοινότητας. Η μελέτη μας έχει ορισμένους περιορισμούς. Το γεγονός ότι η εξέλιξη της επιδημίας συνέπεσε με την υλοποίηση της προοπτικής μελέτης, δεν μπορέσαμε να συλλέξουμε, αυστηρά, προ-επιδημικούς ορούς από τα μέλη της κοόρτης. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε ως αντιπροσώπους βασικά δεδομένα οροεπιπολασμού από άτομα που στρατολογήθηκαν στην αρχή της έρευνας όταν η επιδημική δραστηριότητα στην κοόρτη ήταν πολύ χαμηλή. Αυτό μπορεί να υπερεκτιμήσει την ανοσία της γραμμής βάσης εάν είχε συμβεί υποκλινική κοινοτική μετάδοση πριν από την αναφορά των πρώτων κρουσμάτων γρίπης pH1N1/2009. Τα αντισώματα στον πανδημικό ιό ανιχνεύθηκαν από το HIA, ένα τεστ που έχει καλή ειδικότητα αλλά μάλλον χαμηλή ευαισθησία [46] . Ως εκ τούτου, το όριο του 1/40 μπορεί να υποτιμήσει τον αριθμό των μολυσμένων ατόμων. Ωστόσο, τα ποσοστά ορομετατροπής, το ορολογικό τεστ χρυσού που βασίζεται σε ζευγαρωμένους ορούς, πιθανότατα έδωσε την πιο ακριβή εικόνα της πανδημίας σε επίπεδο κοινότητας στο νησί Reunion.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 3171, "text": "11 Ιουνίου 2009" } ], "id": 5256, "question": "Πότε ο ΠΟΥ κήρυξε πανδημία γρίπης pH1N1/2009v;" }, { "answers": [ { "answer_start": 25940, "text": "1/40" } ], "id": 5257, "question": "Ποια είναι η κλασική τιμή αποκοπής για τους τίτλους αντισωμάτων;" }, { "answers": [ { "answer_start": 30956, "text": "9 εβδομάδες" } ], "id": 5261, "question": "Πόσο κράτησε το ξέσπασμα του ιού pH1N1/2009;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Υψηλή επιβάρυνση ιών μη γρίπης σε ασθένειες που μοιάζουν με γρίπη κατά τις πρώτες εβδομάδες της επιδημίας H1N1v στη Γαλλία Resche-Rigon, Matthieu; Chaillon, Antoine; Scemla, Anne; Gras, Guillaume; Semoun, Oren; Taboulet, Pierre; Molina, Jean-Michel; Simon, François; Goudeau, Alain; LeGoff, JérômeDate: 2011-08-17DOI: 10.1371/journal.pone.0023514License: cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Η ασθένεια που μοιάζει με γρίπη (ILI) μπορεί να προκληθεί από μια ποικιλία παθογόνων παραγόντων. Οι κλινικές παρατηρήσεις βοηθούν ελάχιστα στην αναγνώριση της λοίμωξης από μυξοϊό και στην εφαρμογή κατάλληλων μέτρων πρόληψης. Η περιορισμένη χρήση μοριακών εργαλείων υποτιμά τον ρόλο άλλων κοινών παθογόνων. ΣΤΟΧΟΙ: Κατά τις πρώτες εβδομάδες της πανδημίας γρίπης 2009–2010, πραγματοποιήθηκε κλινική και ιολογική έρευνα σε ενήλικες και παιδιατρικούς ασθενείς με ILI που παραπέμφθηκαν σε δύο γαλλικά πανεπιστημιακά νοσοκομεία στο Παρίσι και στο Tours. Στόχοι ήταν η διερεύνηση των διαφορετικών παθογόνων που εμπλέκονται στην ILI και η περιγραφή των σχετικών συμπτωμάτων. ΜΕΘΟΔΟΙ: Η διάγνωση της πανδημικής γρίπης H1N1v πραγματοποιήθηκε με ανάλυση RT-PCR σε πραγματικό χρόνο. Άλλες ιικές αιτιολογίες διερευνήθηκαν με τη μοριακή πολυπλεξική δοκιμασία RespiFinder19®. Τα κλινικά δεδομένα συλλέχθηκαν προοπτικά από γιατρούς χρησιμοποιώντας ένα τυπικό ερωτηματολόγιο. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Από την εβδομάδα 35 έως 44, συλλέχθηκαν ενδορινικά επιχρίσματα σε 413 ασθενείς. Συνολικά, 68 δείγματα (16,5%) ήταν θετικά για H1N1v. Σε 13 από αυτά ανιχνεύθηκαν και άλλα παθογόνα του αναπνευστικού. Μεταξύ των αρνητικών δειγμάτων H1N1v, 213 (61,9%) ήταν θετικά για διάφορους αναπνευστικούς παράγοντες, 190 σε μεμονωμένες λοιμώξεις και 23 σε μικτές λοιμώξεις. Οι πιο διαδεδομένοι ιοί στις μεμονωμένες λοιμώξεις αρνητικού H1N1v ήταν ο ρινοϊός (62,6%), ακολουθούμενοι από τους ιούς της παραγρίπης (24,2%) και τους αδενοϊούς (5,3%). Το 70,6% των περιπτώσεων H1N1v εντοπίστηκαν σε ασθενείς κάτω των 40 ετών και κανένα μετά από 65 χρόνια. Δεν υπήρξε διαφορά μεταξύ των κλινικών συμπτωμάτων που παρατηρήθηκαν σε ασθενείς που είχαν μολυνθεί με H1N1v ή με άλλα παθογόνα. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Τα αποτελέσματά μας υπογραμμίζουν την υψηλή συχνότητα των ιών μη γρίπης που εμπλέκονται στην ILI κατά την προ-επιδημική περίοδο ενός συναγερμού γρίπης και την έλλειψη συγκεκριμένων κλινικών σημείων που σχετίζονται με λοιμώξεις γρίπης. Ο γρήγορος διαγνωστικός έλεγχος μιας μεγάλης ομάδας παθογόνων του αναπνευστικού μπορεί να είναι κρίσιμος για τον καθορισμό και την έρευνα της κατάστασης της επιδημίας και για την παροχή κρίσιμων πληροφοριών για τη διαχείριση των ασθενών. . Στη Γαλλία, ένα δίκτυο 1300 γενικών γιατρών, «Réseau Sentinelles», που εργάζεται σε όλη τη χώρα, παρέχει κλινικά δεδομένα σε πραγματικό χρόνο που χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση της περιφερειακής και εθνικής εξάπλωσης της γρίπης [1, 2] . Τα κριτήρια που χρησιμοποιούνται από αυτό το δίκτυο για τον ορισμό της κλινικής ασθένειας που μοιάζει με γρίπη (ILI) είναι η εμφάνιση αιφνίδιου πυρετού πάνω από 39 oC με μυαλγία και αναπνευστικά σημεία. Γενικά δεν πραγματοποιείται επίσημη ιογενής διάγνωση. Το Groupes Régionaux d'Observation de la Grippe (GROG) είναι ένα δεύτερο γαλλικό δίκτυο που ερευνά την εμφάνιση και την εξάπλωση των ιών της γρίπης [3, 4] . Αυτό το δίκτυο βασίζεται στην κλινική παρακολούθηση των οξειών αναπνευστικών λοιμώξεων και στην εργαστηριακή ανάλυση ρινικών δειγμάτων που συλλέγονται από ενήλικες και παιδιά από εθελοντές γενικούς ιατρούς και παιδιάτρους. Σύμφωνα με τα κριτήρια του δικτύου φρουρών, οι γαλλικές υγειονομικές αρχές ανακοίνωσαν ότι επιτεύχθηκε επίπεδο επιδημίας γρίπης τη δεύτερη εβδομάδα Σεπτεμβρίου 2009 (εβδομάδα 37) [5, 6] . Αντίθετα, τα στοιχεία που παρέχονται από το GROG έδειξαν μόνο σποραδική δραστηριότητα H1N1v μέχρι την τελευταία εβδομάδα του Οκτωβρίου (εβδομάδα 44) [6, 7] . Έτσι, έγινε γρήγορα προφανές ότι μια ποικιλία ιών κυκλοφορούσε στην κοινότητα και ότι διακυβευόταν μια υπερεκτίμηση της μόλυνσης από μυξοϊό [8, 9, 10, 11] . Καθώς η καλύτερη γνώση της κατάστασης της επιδημίας ήταν βασικό χαρακτηριστικό για την εθνική οργάνωση υγειονομικής περίθαλψης, ετοιμότητα νοσοκομείων, διαχείριση ασθενών και έλεγχος ασθενειών, η σαφής ιογενής διάγνωση φαινόταν κρίσιμη. Στη Γαλλία, τα δεδομένα σχετικά με τις ιικές αιτιολογίες που σχετίζονται με το ILI ήταν στην καλύτερη περίπτωση σποραδικά και συχνά δεν υπήρχαν συσχετίσεις με κλινικά συμπτώματα. Εκτεταμένες μοριακές αναλύσεις για τον έλεγχο για αναπνευστικούς ιούς δεν ήταν διαθέσιμες σε όλη τη χώρα για διάγνωση ρουτίνας. Ως εκ τούτου, το επιδημιολογικό πρότυπο των αναπνευστικών παθογόνων με επικαλυπτόμενη εποχικότητα ήταν ελάχιστα γνωστό. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει τα αναπνευστικά παθογόνα που εμπλέκονται στην ILI κατά τις πρώτες εβδομάδες της διάδοσης του H1N1v στη Γαλλία (εβδομάδες 35 έως 44) και να περιγράψει το συσχετισμένα συμπτώματα σε παιδιατρικούς και ενήλικους πληθυσμούς. Αυτή η μελέτη ήταν μια μη παρεμβατική μελέτη χωρίς προσθήκη στις συνήθεις διαδικασίες. Βιολογικό υλικό και κλινικά δεδομένα ελήφθησαν μόνο για τυπική ιική διαγνωστική μετά από συνταγές γιατρών (καμία ειδική δειγματοληψία, καμία τροποποίηση του πρωτοκόλλου δειγματοληψίας, καμία συμπληρωματική ερώτηση στο εθνικό τυποποιημένο ερωτηματολόγιο). Οι αναλύσεις δεδομένων πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ανώνυμη βάση δεδομένων. Σύμφωνα με το Γαλλικό Δημόσιο Δίκαιο Υγείας (CSP Art L 1121-1.1), τέτοιο πρωτόκολλο δεν απαιτεί έγκριση από επιτροπή δεοντολογίας και εξαιρείται από αίτηση συναίνεσης μετά από ενημέρωση. Στα δύο ακαδημαϊκά νοσοκομεία, το νοσοκομείο Saint-Louis (SLS) στο Παρίσι και Το Tours Hospital (TRS), η γριππώδης νόσος (ILI) ορίστηκε ως ένας ασθενής που πάσχει από τουλάχιστον ένα γενικό σύμπτωμα (πυρετός άνω των 38 oC, εξασθένηση, μυαλγία, ρίγη ή πονοκέφαλος) και ένα αναπνευστικό σύμπτωμα (βήχας, δύσπνοια, ρινίτιδα ή φαρυγγίτιδα ), σε συμφωνία με τις κατευθυντήριες γραμμές του Γαλλικού Ινστιτούτου De Veille Sanitaire (InVS), ενός κυβερνητικού ιδρύματος υπεύθυνου για την επιτήρηση και την επαγρύπνηση σε όλους τους τομείς της δημόσιας υγείας [12] . Κριτήρια για σοβαρή κλινική εμφάνιση ήταν θερμοκρασία κάτω από 35uC ή πάνω από 39uC παρά αντιπυρετικό, καρδιακή συχνότητα πάνω από 120/min, αναπνευστική συχνότητα πάνω από 30/min, αναπνευστική δυσχέρεια, συστολική αρτηριακή πίεση κάτω από 90 mmHg ή αλλοιωμένη συνείδηση. Προδιαθεσικοί παράγοντες κρίσιμης ασθένειας ήταν παιδιά κάτω του ενός έτους, έγκυες γυναίκες, διαβήτης, χρόνια προϋπάρχουσα νόσος (όπως αναπνευστικά, καρδιαγγειακά, νευρολογικά, νεφρικά, ηπατικά ή αιματολογικά νοσήματα) και η ανοσοκαταστολή (που σχετίζεται με λοίμωξη από τον ιό HIV, όργανο ή αιμοποιητικό μεταμόσχευση βλαστοκυττάρων, λήψη χημειοθεραπείας ή κορτικοστεροειδών) [13, 14] . Μια ομάδα ύποπτων λοιμώξεων γρίπης ορίστηκε ως τουλάχιστον τρία πιθανά κρούσματα σε μια εβδομάδα σε μια κλειστή κοινότητα (νοικοκυριό, σχολείο,…) [15] .Στα δύο ιδρύματα, η συνταγογράφηση μοριακών δοκιμών H1N1v συνιστάται για ασθενείς με ILI και είτε με σοβαρή κλινική εικόνα, έναν υποκείμενο παράγοντα κινδύνου επιπλοκών ή μια κατάσταση που δεν βελτιωνόταν με αντιική θεραπεία. Προτάθηκε επίσης η διερεύνηση ομαδοποιημένων ύποπτων περιπτώσεων. Από την εβδομάδα 35 (την περασμένη εβδομάδα του Αυγούστου) έως την 44η (τελευταία εβδομάδα του Οκτωβρίου), συλλέχθηκαν 413 ενδορινικά επιχρίσματα σε 3 ml Universal Transport Medium (Copan Diagnostics Inc, Murrieta, CA) από ενήλικες και παιδιά που παρατηρήθηκαν σε χώρους έκτακτης ανάγκης για ύποπτη ILI (Πίνακας 1) και εστάλη στα εργαστήρια SLS και TRS για ανίχνευση H1N1v. Τα δύο μικροβιολογικά εργαστήρια συμμετείχαν στο δίκτυο εργαστηρίων αναφοράς για την ανίχνευση της πανδημικής γρίπης H1N1v. Τα κλινικά δεδομένα συλλέχθηκαν τη στιγμή της ιατρικής φροντίδας και αναφέρθηκαν από τους κλινικούς γιατρούς σε ένα εθνικό τυποποιημένο ερωτηματολόγιο που παρέχεται από την InVS [1, 12] . Αυτό το ερωτηματολόγιο περιελάμβανε την παρουσία ή την απουσία των κύριων γενικών και αναπνευστικών συμπτωμάτων που σχετίζονται με το ILI (πυρετός, εξασθένιση, μυαλγία, ρίγη, πονοκέφαλος, βήχας, ρινίτιδα, φαρυγγίτιδα, αιφνίδια έναρξη) [12]. Το συνολικό νουκλεϊκό οξύ εξήχθη από 400 mL Universal Transport Medium χρησιμοποιώντας το σύστημα EasyMag (Biomérieux, Marcy l'Etoile, Γαλλία) σε SLS ή το EZ1 Advanced XL (Qiagen, Courtaboeuf, Γαλλία) στο TRS, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (όγκος έκλουσης: 100 mL σε SLS ή 90 mL σε TRS). Πριν από την εκχύλιση, προστέθηκαν στο δείγμα 5 ml ενός Εσωτερικού Ελέγχου Ενίσχυσης (IAC) που περιείχε ένα αντίγραφο RNA του ιού της εγκεφαλομυοκαρδίτιδας (EMC). Η πανδημική λοίμωξη H1N1v διαγνώστηκε με ανάλυση αντίστροφης μεταγραφής-PCR (RT-PCR) σε πραγματικό χρόνο σε 7500 Σύστημα PCR σε πραγματικό χρόνο (Applied Biosystems, Foster City, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο των Κέντρων Ελέγχου Νοσημάτων (CDC) [16] . Άλλες αναπνευστικές λοιμώξεις διερευνήθηκαν με πολυπλεξία μοριακή ανάλυση που βασίζεται στην τεχνολογία Multiplex Ligation-dependent Probe-Amplification (MLPA) (RespiFinder19H, Pathofinder, Μάαστριχτ, Ολλανδία) που επιτρέπει την ανίχνευση και διαφοροποίηση 14 αναπνευστικών ιών, συμπεριλαμβανομένου του ιού της γρίπης (A). InfA), ιός γρίπης Β (InfB), ρινοϊός (RHV), ιοί παραγρίπης 1 έως 4 (PIV-1 έως PIV-4), ανθρώπινος μεταπνευμοϊός (hMPV), αδενοϊός (ADV), αναπνευστικός συγκυτιακός ιός Α (RSVA), αναπνευστικό συγκυτιακός ιός Β (RSVB) και ανθρώπινοι κοροναϊοί 229E, OC43 και NL63 (Cor-229E, Cor-OC43, Cor-NL63) [17] . Το τεστ επιτρέπει επίσης την ανίχνευση του ιού της γρίπης Α H5N1 και τεσσάρων βακτηρίων: Chlamydophila pneumoniae (CP), Mycoplasma pneumoniae (MP), Legionella pneumophila (LP) και Bordetella pertussis (BP). Τα ενισχυμένα προϊόντα MLPA αναλύθηκαν σε γενετικό αναλυτή ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Πραγματοποιήθηκε ανάλυση μεγέθους θραυσμάτων με το λογισμικό GeneMarker (SoftGenetics, LLC, State College, PA). Περαιτέρω δοκιμές για H1N1v διενεργήθηκαν με Simplexa TM Influenza A H1N1 (2009) (Focus Diagnostics, Cypress, California) όταν το CDC σε πραγματικό χρόνο RT -Η δοκιμασία PCR ήταν αρνητική για H1N1 και η ανάλυση RespiFinder19H ήταν θετική για τη γρίπη Α. Εάν αυτή η τελευταία ανάλυση ήταν αρνητική, η τυποποίηση H3N2 πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18] . Τα δεδομένα από τη μελέτη μας συνοψίζονται ως συχνότητες και ποσοστά για κατηγορικές μεταβλητές. Οι ποσοτικές μεταβλητές παρουσιάζονται ως διάμεσοι, 25ο και 75ο εκατοστημόριο. Για να συγκριθούν αυτές οι μεταβλητές ανάλογα με την κατάσταση ιογενούς λοίμωξης, δοκιμές Fisher Με τη χρήση της ανάλυσης αναφοράς CDC, το H1N1v ανιχνεύθηκε σε 66 δείγματα από 413 (16,6%), πιο συχνά στο SLS (38 δείγματα) παρά στο TRS (28 δείγματα) (σ. , 10 24 ). Συνολικά, το εβδομαδιαίο ποσοστό των ενδορινικών επιχρισμάτων θετικών για H1N1v παρέμεινε κάτω από 10% μέχρι την εβδομάδα 41 και αυξήθηκε σημαντικά μετά (Τάση P, 0,0001) (Εικόνα 1). Το ποσοστό ανίχνευσης H1N1v έφτασε το 30% στο SLS την εβδομάδα 42 και στο TRS την εβδομάδα 44. Συνολικά, αυτό το ποσοστό ήταν σε συμφωνία με τα αποτελέσματα που παρείχε το δίκτυο GROG, που έδειξαν προηγούμενη έναρξη της επιδημίας H1N1v στην περιοχή του Παρισιού [7, 19]. Και τα 413 εκχυλίσματα νουκλεϊκών οξέων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία RespiFinder19H (Εικόνα 2). Εξήντα έξι ασθενείς που εξετάστηκαν θετικοί για H1N1v με τη δοκιμασία CDC σε πραγματικό χρόνο RT-PCR επιβεβαιώθηκαν με την πολυπλεξία. Δεκατρείς μολύνθηκαν επίσης από ένα ή δύο άλλα παθογόνα του αναπνευστικού (πολλαπλές λοιμώξεις) (Εικόνα 2). Τρία από τα 347 αρνητικά H1N1v δείγματα δεν μπόρεσαν να μελετηθούν με τη δοκιμασία πολυπλεξίας επειδή περιείχαν αναστολείς RT-PCR (χωρίς ενίσχυση του εσωτερικού ελέγχου). Διακόσια δεκαπέντε (62,5%) από τα υπόλοιπα 344 H1N1v αρνητικά δείγματα βρέθηκαν θετικά για τουλάχιστον ένα αναπνευστικό παθογόνο (Εικόνα 2). Διακόσιες δώδεκα ήταν θετικές για μη παθογόνα της γρίπης (189 μεμονωμένες λοιμώξεις και 23 μικτές λοιμώξεις με δύο, τρεις ή τέσσερις ιούς) και τρεις επιπλέον μεμονωμένες λοιμώξεις από τη γρίπη Α εντοπίστηκαν στο SLS, συμπεριλαμβανομένων δύο από πανδημία H1N1v και μία από εποχικό H3N2. όπως προσδιορίστηκε μετά τον μοριακό τύπο (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Συνολικά, 68 ασθενείς (16,5%) ήταν στη συνέχεια θετικοί για H1N1v, ένας για H3N2 και 212 για παθογόνα μη γρίπης. Υπήρξαν 245 μεμονωμένες λοιμώξεις (55 με H1N1v και 190 με άλλα παθογόνα του αναπνευστικού) και 36 μικτές λοιμώξεις (13 με H1N1v και 23 χωρίς H1N1v) (Εικόνα 2). Μεταξύ των αρνητικών μεμονωμένων λοιμώξεων H1N1v, οι πιο διαδεδομένοι ιοί ήταν οι ρινοϊοί (6). 119 ασθενείς), ακολουθούμενοι από τους ιούς της παραγρίπης 1 έως 4 (24,2%, 46 ασθενείς), τον αδενοϊό (5,3%, 10 ασθενείς), τον ανθρώπινο κορωνοϊό 229E, OC43 και NL63 (3,2%, 6 ασθενείς) και τον αναπνευστικό συγκυτιακό ιό Α και Β ( 2,6%, 5 ασθενείς) (Εικόνα 2). Επιπλέον, η ανάλυση RespiFinder19H εντόπισε τρεις ασθενείς με βακτηριακή λοίμωξη, δύο με Mycoplasma pneumoniae (μία γυναίκα 25 ετών σε SLS και μία γυναίκα 39 ετών σε TRS) και έναν με Bordetella pertussis (ένας άνδρας 60 ετών σε SLS). Δεν εντοπίστηκε μεμονωμένη λοίμωξη από γρίπη Β, hMPV, Chlamydophila pneumoniae ή Legionella pneumophila ( Εικόνα 2 Για να αναλύσουμε εάν οι ιογενείς συν-λοιμώξεις εμφανίζονταν πιο συχνά για ορισμένους ιούς, πραγματοποιήσαμε συγκρίσεις δύο προς δύο, που έδειξε υψηλότερο ποσοστό λοίμωξη μόνο για ADV (p = 0,05). Οι αναπνευστικοί ιοί μη γρίπης παρουσίασαν διαφορετικό επιδημικό προφίλ σε σύγκριση με τον H1N1v. Συνολικά, και στα δύο νοσοκομεία, το εβδομαδιαίο ποσοστό των μη H1N1v αναπνευστικών ιών είτε μόνοι είτε εμπλέκονται σε συνλοίμωξη αυξήθηκε μεταξύ της εβδομάδας 37 και 39 (από 51,4% σε 81,3%) και στη συνέχεια μειώθηκε σταθερά (Εικόνα 3). Οι λοιμώξεις RHV που αντιπροσώπευαν σχεδόν τις μισές ιογενείς λοιμώξεις που δεν ήταν H1N1v (141 από τις 213, 66,2%) ήταν ένας σημαντικός παράγοντας που συνέβαλε. Και στα δύο νοσοκομεία, η εμφάνιση κρουσμάτων H1N1v συσχετίστηκε με ταχεία μείωση του ποσοστού μόλυνσης από RHV από 50-60% σε λιγότερο από 20% με διαφορά μίας έως δύο εβδομάδων μεταξύ SLS και TRS. Δεδομένα ηλικίας ( Και στα δύο ιδρύματα, Το 85,5% (106/124) παιδιά ηλικίας κάτω των 15 ετών μολύνθηκαν από τουλάχιστον ένα παθογόνο του αναπνευστικού (Πίνακας 2). Οι ασθενείς με H1N1v δεν ήταν σημαντικά νεότεροι από τους μη μολυσμένους ασθενείς με H1N1v (27 ετών έναντι 25 ετών, p = 0,80) (Εικόνα 4) . Ωστόσο, το 70,6% (48/68) των περιπτώσεων H1N1v εντοπίστηκε σε ασθενείς ηλικίας κάτω των 40 ετών (22 σε SLS και 26 σε TRS) και δεν παρατηρήθηκε καμία περίπτωση σε ασθενείς άνω των 65 ετών (Πίνακας 2). Η λοίμωξη από PIV εμφανίστηκε σε πολύ νεαρούς ασθενείς (διάμεση τιμή (Εικόνα 4) . Συνεπώς, η PIV και η ADV ανιχνεύθηκαν συχνότερα στον νεότερο πληθυσμό του TRS έναντι του SLS (ρ, 10 24 και p, 10 23 αντίστοιχα). Αντίθετα, αν και τα άτομα με λοίμωξη από RHV ήταν ελαφρώς νεότερα από τα άτομα χωρίς (διάμεση ηλικία = 24 έναντι 29 για ασθενείς χωρίς RHV, p = 0,05) (Εικόνα 4), η γριππώδης νόσος που σχετίζεται με RHV ήταν πιο συχνή στο SLS από ό,τι σε TRS (ρ = 0,012). Τέλος, οι ασθενείς με ιογενή πολλαπλή λοίμωξη ήταν σημαντικά νεότεροι από εκείνους με μεμονωμένη λοίμωξη (διάμεση τιμή, IDR: 4, 2-18,5 έναντι 25, 6-43) και ποσοστά μικτής λοίμωξης τη στιγμή της ιατρικής φροντίδας, 383 (92,7%) συλλέχθηκαν τυποποιημένα κλινικά ερωτηματολόγια από 413 ασθενείς. Τέσσερα από αυτά δεν μπορούσαν να αξιοποιηθούν επειδή ήταν πολύ ελλιπή. Μια ανασκόπηση των 379 εφαρμόσιμων ερωτηματολογίων έδειξε ότι το 90,8% (344/379) των ασθενών που συμπεριλήφθηκαν σε αυτή τη μελέτη πληρούσαν τα κριτήρια της ILI όπως ορίζονται παραπάνω και το 52,5% είχε είτε σοβαρή κλινική εικόνα είτε έναν υποκείμενο παράγοντα κινδύνου επιπλοκών (45,9 %, 174/379), ή βρίσκονταν σε μια ύποπτη ομάδα ομαδοποιημένων περιπτώσεων (6,6%, 25/379). Συνολικά, οι περισσότεροι ασθενείς έχουν πυρετό (93,9%) και βήχα (86,1%) (Πίνακας 3). Άλλα κλασικά κλινικά σημεία που σχετίζονται με την ILI, όπως εξασθένηση, μυαλγία, ρίγη, πονοκέφαλος, ρινίτιδα ή φαρυγγίτιδα ήταν λιγότερο συχνά. Ξαφνική έναρξη περιγράφηκε επίσης στο 59,2% των περιπτώσεων. Μόνο το 32,5% των ασθενών είχαν θερμοκρασία πάνω από 39 oC. η ηλικία αυτών των ασθενών κυμαινόταν από μηδέν έως 86 έτη, με μέση ηλικία τα 32 έτη και μέση ηλικία τα 34 έτη (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε ασθενείς με λοίμωξη H1N1v (συμπεριλαμβανομένων μεμονωμένων και πολλαπλών λοιμώξεων), τα κύρια συμπτώματα ήταν επίσης πυρετός (98,2%) και βήχας (89,5%) ( Στη συνέχεια, συγκρίναμε τα κλινικά χαρακτηριστικά μεταξύ ασθενών θετικών για H1N1v, ασθενών θετικών για άλλα παθογόνα του αναπνευστικού και αρνητικούς για H1N1v και ασθενών χωρίς καμία ανίχνευση παθογόνων του αναπνευστικού (όπως ανιχνεύθηκε με το RespiFin-der19H) ( Πίνακας 3). Δεν υπήρχε διαφορά μεταξύ των τριών ομάδων εκτός από πυρετό, βήχα, φαρυγγίτιδα. Ωστόσο, για αυτά τα τελευταία συμπτώματα, η σύγκριση μεταξύ ασθενών θετικών για H1N1v και θετικών για άλλα παθογόνα του αναπνευστικού ή μεταξύ ασθενών θετικών για H1N1v και εκείνων χωρίς ανίχνευση παθογόνων του αναπνευστικού, δεν έδειξε διαφορά εκτός από τη φαρυγγίτιδα, η οποία ήταν λιγότερο συχνή σε ασθενείς θετικούς για H1N1v από ό,τι σε ασθενείς θετικούς για άλλα παθογόνα του αναπνευστικού (Πίνακας 3). Καθώς ο RHV ήταν η πιο συχνή αιτιολογία στην ILI, συγκρίναμε επίσης κλινικά συμπτώματα που παρατηρήθηκαν σε ασθενείς με μία μόνο λοίμωξη από RHV ή από H1N1v (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Δεν υπήρχε διαφορά εκτός από το ότι η ρινίτιδα και η φαρυγγίτιδα ήταν σημαντικά πιο συχνές στη μόλυνση με RHV (62,7% έναντι 34,1% [p = 0,006] και 39,0% έναντι 10,0% [p = 0,001], αντίστοιχα). Η πολλαπλή ιογενής λοίμωξη (συμπεριλαμβανομένων δειγμάτων με H1N1v) δεν συσχετίστηκε με διαφορετική κλινική εικόνα. Πυρετός και βήχας παρατηρήθηκαν σε πάνω από το 90% των ασθενών (90,6% και 90,3%, αντίστοιχα), αλλά μόνο το 33,3% αυτών των ασθενών είχαν θερμοκρασία πάνω από 39 oC, η οποία δεν διέφερε από ασθενείς με μονήρη ιογενή λοίμωξη (28,6%). Τα αποτελέσματά μας υπογραμμίζουν την υψηλή συχνότητα ιών μη γρίπης που εμπλέκονται σε οξείες αναπνευστικές λοιμώξεις κατά την περίοδο επιδημίας ενός συναγερμού γρίπης, όπως ορίζεται από το Réseau Sentinelles σύμφωνα με τον ορισμό ILI (ξαφνικός πυρετός πάνω από 39 oC που συνοδεύεται από μυαλγία και αναπνευστικά σημεία). Αυτά τα δεδομένα επεκτείνουν τις προηγούμενες παρατηρήσεις στην Ευρώπη που αναφέρουν υψηλό επιπολασμό λοιμώξεων από RHV πριν από την εποχική γρίπη [4, 20] ή το 2009, πριν από την πανδημία γρίπης H1N1v [1, 8, 9, 11, 21]. Επιβεβαιώνουμε ότι ο RHV αντιπροσωπεύει την πιο συχνή αιτιολογία της οξείας αναπνευστικής οδού Πίνακας 2. Ηλικία ασθενών με αναπνευστικά δείγματα θετικά για H1N1v, θετικά για άλλα παθογόνα του αναπνευστικού ή αρνητικά. λοιμώξεις τόσο σε ενήλικες όσο και σε παιδιατρικούς πληθυσμούς και μπορεί να αντιπροσωπεύουν περισσότερο από το 50% των περιπτώσεων. Δείχνουμε ότι άλλες ιογενείς λοιμώξεις εκτός από τη γρίπη και τον RHV μπορεί να αντιπροσωπεύουν έως και το 30% των αιτιολογιών. Παρατηρήσαμε διαφορές μεταξύ των δύο νοσοκομείων, με υψηλότερη συχνότητα λοιμώξεων από παραγρίπη και ADV στο Tours σε αντίθεση με μια υψηλότερη συχνότητα RHV στο Παρίσι, που πιθανώς εξηγείται από το υψηλότερο ποσοστό παιδιατρικών δειγμάτων που συλλέχθηκαν στο Tours. Ωστόσο, παρά την απόσταση μεταξύ των δύο ιδρυμάτων (περίπου 250 km) και τις διαφορές μεταξύ των δύο πληθυσμών, και οι δύο παρουσίασαν παρόμοια πρότυπα υψηλής συχνότητας ιών μη γρίπης σε οξείες αναπνευστικές λοιμώξεις πριν από το επιδημικό κύμα γρίπης και μείωση όταν η γρίπη έφτασε σε επίπεδα επιδημίας Στις δύο πόλεις, υψηλές συχνότητες RHV παρατηρήθηκαν στο ίδιο επίπεδο με πιθανή διαφορετική ταχύτητα εξέλιξης, με ξαφνική αύξηση και μείωση του SLS και πιο προοδευτική διακύμανση του TRS. Και στα δύο ιδρύματα, σημειώθηκε μείωση στο ποσοστό και τον αριθμό των διαγνώσεων RHV περίπου παράλληλα με την αύξηση των διαγνώσεων γρίπης. Πράγματι, ο H1N1v υπερβαίνει το 20% του ποσοστού θετικής ανίχνευσης μόνο όταν ο RHV έπεσε κάτω από το 40%. Αυτά τα δεδομένα είναι επομένως συνεπή με την αρνητική αλληλεπίδραση των δύο επιδημιών σε επίπεδο πληθυσμού. Είχε προηγουμένως υποτεθεί ότι η επιδημία RHV θα μπορούσε να επηρεάσει την εξάπλωση της πανδημικής γρίπης [20, 21, 22]. Λίγα δεδομένα in vitro υποστηρίζουν αυτή την υπόθεση. Έχει αναφερθεί ότι η παραγωγή ιντερφερόνης και άλλων κυτοκινών από κύτταρα μολυσμένα με RHV προκάλεσε μια ανθεκτική κατάσταση σε λοίμωξη από ιούς Αυτά τα δεδομένα περιλαμβάνουν τους τρεις ασθενείς των οποίων τα αναπνευστικά δείγματα δεν μπορούσαν να μελετηθούν με την πολυπλεξία λόγω αναστολέων RT-PCR. γειτονικών κυττάρων [23] . Απαιτείται περαιτέρω εργασία για να επιβεβαιωθούν in vitro και in vivo τέτοιες αρνητικές αλληλεπιδράσεις και εάν η ιική παρεμβολή μεταφράζεται πραγματικά σε επίπεδο πληθυσμού. Η ανάλυση των επιδημιών ρινοϊού και γρίπης τα προηγούμενα χρόνια θα πρέπει επίσης να βοηθήσει στον προσδιορισμό του εάν παρατηρήθηκαν παρόμοιες παρεμβολές με την εποχική γρίπη και στην εκπόνηση μοντελοποίησης και πρόβλεψης της εξάπλωσης της γρίπης σύμφωνα με την κυκλοφορία των αναπνευστικών ιών. Για το σκοπό αυτό θα πρέπει να εφαρμοστεί συστηματικός εκτεταμένος έλεγχος των αναπνευστικών ιών σε εθνικό επίπεδο. Πολύ λίγες λοιμώξεις από RSV παρατηρήθηκαν σε αντίθεση με τη συνήθη επιδημιολογία που χαρακτηρίστηκε τα τελευταία τέσσερα τελευταία χρόνια από έναρξη επιδημιών στις εβδομάδες 44-45 [1] . Έχει επιβεβαιωθεί από άλλα εργαστήρια και το γαλλικό InVS ότι η επιδημία RSV 2009-10 καθυστέρησε και είχε μικρότερο αντίκτυπο σε σύγκριση με την προηγούμενη χειμερινή περίοδο [1, 24] . Η καθυστερημένη και μειωμένη εξάπλωση του RSV μπορεί να οφείλεται σε ιογενή παρεμβολή μεταξύ του RSV και της γρίπης. Μια άλλη πιθανή εξήγηση είναι η καλύτερη προληπτική συμπεριφορά σχετικά με τις αναπνευστικές λοιμώξεις, όπως προτείνεται από μια εθνική εκστρατεία που περιλαμβάνει συστάσεις για πλύσιμο χεριών μετά το φτέρνισμα και χρήση μάσκας [1] .Οι λοιμώξεις από γρίπη εντοπίστηκαν κυρίως σε ασθενείς κάτω των 40 ετών και δεν βρέθηκε κανένα κρούσμα σε ασθενείς άνω των 65. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν προηγούμενα δεδομένα που υποδηλώνουν ότι προηγούμενες εποχικές λοιμώξεις από τον Η1Ν1 ή εμβολιασμοί μπορεί να παρέχουν μερική διασταυρούμενη προστασία [10, 13, 25]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι οι τίτλοι εξουδετέρωσης έναντι του πανδημικού ιού H1N1v συσχετίζονται σημαντικά με τους τίτλους εξουδετέρωσης έναντι ενός εποχικού ιού H1N1 και ότι ο τίτλος εξουδετέρωσης του ιού της πανδημίας γρίπης H1N1v ήταν σημαντικά υψηλότερος σε άτομα που είχαν πρόσφατα εμβολιαστεί με εποχικό τριδύναμο εμβόλιο γρίπης [26. ] . Οι ιογενείς συν-λοιμώξεις παρατηρήθηκαν κυρίως σε παιδιατρικούς ασθενείς, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4, 27, 28, 29], τόσο σε περιπτώσεις γρίπης όσο και σε περιπτώσεις μη γρίπης με παρόμοιο ρυθμό. Δεν παρατηρήθηκαν ενδείξεις πιο έντονης αναπνευστικής επίπτωσης σε αυτούς τους ασθενείς. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν την έλλειψη συγκεκριμένων κλινικών σημείων που σχετίζονται με αποδεδειγμένες λοιμώξεις H1N1v. Τα κλινικά χαρακτηριστικά δεν διέφεραν μεταξύ λοιμώξεων από γρίπη ή άλλων ιογενών λοιμώξεων. Ειδικότερα, το ποσοστό των ασθενών με πυρετό άνω των 39 οC δεν ήταν υψηλότερο στους H1N1v ασθενείς. Επιπλέον, οι ασθενείς χωρίς καμία ένδειξη ιογενών λοιμώξεων του αναπνευστικού δεν είχαν διαφορετικά συμπτώματα. Αυτοί οι ασθενείς μπορεί να έχουν μολυνθεί με άλλον ιό που δεν περιλαμβάνεται στην πολυπλεξία (human Bocavirus, coronavirus HKU1) [9, 10, 11] ή εμφανίστηκαν πολύ αργά τη στιγμή της αποβολής του ιού [30] . Ωστόσο, για να προσδιοριστεί πόσο συγκεκριμένα είναι τα συμπτώματα για τη γρίπη θα χρειαστεί να αξιολογηθεί επίσης η κατανομή των παθογόνων του αναπνευστικού (H1N1v και άλλοι αναπνευστικοί ιοί) και των σχετικών συμπτωμάτων σε ασθενείς που παρουσιάζονται στα τμήματα επειγόντων περιστατικών του SLS και του TRS με αναπνευστικά σύνδρομα, αλλά δεν έχουν δοκιμαστεί για H1N1v. Επιπλέον, παρά ορισμένες υποκείμενες καταστάσεις που σχετίζονταν με επιπλοκές που δεν είχαν παρατηρηθεί προηγουμένως στην εποχική γρίπη, οι περισσότερες ασθένειες που προκλήθηκαν από τον ιό H1N1v ήταν οξείες και αυτοπεριοριζόμενες [13, 31]. Επομένως, το υψηλότερο ποσοστό ιών μη γρίπης που αναφέρθηκαν στην ILI το 2009 ήταν πιθανότατα συνέπεια των συχνότερων επισκέψεων σε γιατρό για λοιμώξεις της αναπνευστικής οδού από ό,τι συνήθως παρατηρείται λόγω του φόβου της πανδημίας γρίπης. Η γενική έλλειψη διαφοράς στα συμπτώματα στο συγκεκριμένο πλαίσιο της πανδημίας H1N1v πρέπει επομένως να λαμβάνεται υπόψη με προσοχή και δεν αποκλείει ότι ενδέχεται να προκύψουν πιο σημαντικές διαφορές σε μελλοντικές επιδημίες γρίπης με άλλους ιούς γρίπης. Τα δεδομένα μας επιβεβαιώνουν ότι μπορεί να είναι σχεδόν αδύνατο να αναγνωριστούν συμπτώματα που προαναγγέλλουν λοιμώξεις από H1N1v και τα ιολογικά δεδομένα θα πρέπει να είναι χρήσιμα μαζί με κλινικές αναφορές για την παρακολούθηση της επιδημίας γρίπης [10] . Η μοριακή ανίχνευση πολυπλεξίας αναδείχθηκε πρόσφατα ως ένα ισχυρό διαγνωστικό εργαλείο για τον προσδιορισμό των οξειών αναπνευστικών λοιμώξεων». αιτιολογίες [11, 32, 33]. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η ευαίσθητη μοριακή πολλαπλή ανίχνευση των αναπνευστικών ιών είναι εφικτή και αποτελεσματική για την ανίχνευση του ιού που εμπλέκεται σε οξείες αναπνευστικές λοιμώξεις και παρέχει πληροφορίες για το προφίλ της επιδημίας τους. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν την απόδοση της ανάλυσης RespiFinder19H στην ανίχνευση αναπνευστικών ιών στο γενικό πληθυσμό όπως φάνηκε πρόσφατα σε μεταμοσχευμένους ασθενείς με ILI [34] . Το RespiFinder19H επιβεβαίωσε όλες τις λοιμώξεις H1N1 που ανιχνεύθηκαν από την ανάλυση αναφοράς CDC και μπόρεσε να εντοπίσει δύο επιπλέον περιπτώσεις H1N1 που υποδηλώνουν υψηλή ευαισθησία αυτής της πολυπλεξίας για την ανίχνευση λοιμώξεων από τη γρίπη Α. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας υπογραμμίζουν ότι διαδοχικές και μικτές εστίες ιογενών λοιμώξεων του αναπνευστικού μπορεί να επηρεάζει την επιδημιολογία της γρίπης και μπορεί να οδηγήσει σε παρερμηνεία της πρώιμης ανάπτυξης μιας επιδημίας γρίπης. Ο γρήγορος διαγνωστικός έλεγχος μιας μεγάλης ομάδας παθογόνων του αναπνευστικού μπορεί να είναι κρίσιμος για τον καθορισμό και την έρευνα της κατάστασης της επιδημίας και για την παροχή κρίσιμων πληροφοριών για τη διαχείριση του ασθενούς.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 18058, "text": "Réseau Sentinelles" } ], "id": 5263, "question": "Ποιο δίκτυο ιατρών παρέχει κλινικά δεδομένα σε πραγματικό χρόνο για την εξάπλωση της γρίπης στη Γαλλία;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1785, "text": "ρινοϊός" } ], "id": 5265, "question": "Ποιος ιός ήταν ο πιο κοινός στους ασθενείς με H1N1v;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Κτηνοτροφικά ναρκωτικά και ασθένειες: Ο θανατηφόρος συνδυασμός πίσω από την αναπαραγωγική αποτυχία σε απειλούμενους γενειοφόρους γύπεςhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2994777/SHA: f4f804bac7b32c84ad65762845filler; Lemus, Jesús A.Date: 2010-11-30DOI: 10.1371/journal.pone.0014163License: cc-byAbstract: Υπάρχει αυξανόμενη ανησυχία σχετικά με τον αντίκτυπο των κτηνιατρικών φαρμάκων και των ζωικών παθογόνων ως παραγόντων που βλάπτουν την υγεία της άγριας ζωής, ιδιαίτερα των απειλούμενων ζωοτροφών πάνω σε φαρμακούχα πτώματα ζώων. Πραγματοποιήσαμε μια ολοκληρωμένη μελέτη αποτυχημένων αυγών και νεκρών φωλιασμένων σε γενειοφόρους γύπες (Gypaetus barbatus) για να προσπαθήσουμε να αποσαφηνίσουμε τις άμεσες αιτίες της αποτυχίας αναπαραγωγής πίσω από την πρόσφατη μείωση της παραγωγικότητας στα Ισπανικά Πυρηναία. Βρήκαμε υψηλές συγκεντρώσεις πολλαπλών κτηνιατρικών φαρμάκων, κυρίως φθοριοκινολονών, στα περισσότερα αποτυχημένα αυγά και φωλιές, που σχετίζονται με πολλαπλές βλάβες στα εσωτερικά όργανα και παθογόνα των ζώων που προκαλούν ασθένειες, ιδιαίτερα σηψαιμία από παθογόνα των χοίρων και λοιμώδη θυλακική νόσο. Ο συνδυασμένος αντίκτυπος φαρμάκων και ασθενειών ως στοχαστικών παραγόντων μπορεί να οδηγήσει σε δυνητικά καταστροφικές συνέπειες που επιδεινώνουν έναν ήδη υψηλό κίνδυνο εξαφάνισης και θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη στα τρέχοντα προγράμματα διατήρησης για γενειοφόρους γύπες και άλλα είδη οδοκαθαριστών, ειδικά όσον αφορά τα επικίνδυνα κτηνιατρικά φάρμακα και τα πουλερικά υψηλής παθογονικότητας ιοί.Κείμενο: Οι περιβαλλοντικοί ρύποι τεκμηριώνονται ολοένα και περισσότερο ως κινητήρια δύναμη της απειλής της άγριας ζωής λόγω του ρόλου τους σε βλάβες οργάνων, ορμονικές διαταραχές και αλλοίωση του ανοσοποιητικού συστήματος [1, 2] . Η ασθένεια μπορεί επίσης να διευκολύνει τον κίνδυνο και την εξαφάνιση σε παγκόσμια και τοπική κλίμακα, ειδικά όταν τα παθογόνα αλληλεπιδρούν με άλλους παράγοντες όπως οι ρύποι [3] . Υπάρχει αυξανόμενη ανησυχία για τον αντίκτυπο των κτηνιατρικών φαρμάκων και των παθογόνων παραγόντων των ζώων ως παραγόντων που βλάπτουν την υγεία της άγριας ζωής [4] [5] [6] , και προκαλούν ακόμη και παρακμή που πλησιάζει στην εξαφάνιση [7] . Αυτές οι απειλές μπορεί να είναι ιδιαίτερα επιζήμιες για την άγρια ​​ζωή καθώς ολοένα και περισσότερο συμπίπτουν και αλληλεπιδρούν ως συνέπεια της εξάλειψης των υπολειμμάτων ζώων που περιέχουν κτηνιατρικά φάρμακα και ανθεκτικά παθογόνα λόγω των αυξανόμενων εντατικών εργασιών κτηνοτροφίας παγκοσμίως [6, 8, 9]. Ειδικότερα, η κατάποση αντιμικροβιακών, κυρίως φθοριοκινολονών, έχει πρόσφατα συσχετιστεί με την απόκτηση ευκαιριακών παθογόνων και ασθενειών με τη μεσολάβηση της ανοσοκαταστολής, καθώς και με βλάβη οργάνων σε γύπες που φωλιάζουν [6, 10, 11]. Υπολείμματα φθοροκινολόνης έχουν επίσης βρεθεί σε αυγά οδοκαθαριστών πτηνών και σχετίζονται με σοβαρές αλλοιώσεις στην ανάπτυξη του χόνδρου και των οστών του εμβρύου που θα μπορούσαν να εμποδίσουν την κίνηση του εμβρύου και στη συνέχεια την κανονική ανάπτυξη, τη θέση πριν από την εκκόλαψη και την επιτυχή εκκόλαψη [12] . Ως εκ τούτου, τα αντιμικροβιακά και άλλα φάρμακα μπορεί να επηρεάσουν αρνητικά την υγεία των εμβρύων και της φωλιάς με δυνητικά καταστροφικές συνέπειες στην επιτυχία της αναπαραγωγής και στη διατήρηση των γύπων και άλλων απειλούμενων οδοκαθαριστών πτηνών. Ο γενειοφόρος γύπας (Gypaetus barbatus) είναι ένα από τα πιο απειλούμενα πτηνά στην Ευρώπη, με κύριο προπύργιο στα Πυρηναία. Αυξανόμενες μειώσεις στην παραγωγικότητα (μέσος αριθμός νεογνών που εκτρέφονται ανά εδαφικό ζεύγος) έχουν πρόσφατα αναφερθεί στα ισπανικά Πυρηναία που σχετίζονται με διαδικασίες κορεσμού των οικοτόπων [13, 14] . Δεδομένου ότι οι γενειοφόροι γύπες μπορεί να εκτρέφουν μόνο ένα νεογνό ανά προσπάθεια αναπαραγωγής, αυτή η μείωση της παραγωγικότητας θα πρέπει να συνδέεται με την αυξανόμενη αναπαραγωγική αποτυχία όταν το ποσοστό των εδαφικών ζευγών που αναπαράγονται δεν ποικίλλει σημαντικά με το χρόνο [15] . Οι κοντινοί μηχανισμοί με τους οποίους η πυκνότητα μπορεί να επηρεάσει την παραγωγικότητα έχουν διερευνηθεί, συμπεριλαμβανομένης της ετερογένειας των οικοτόπων, με τη χρήση σταδιακά φτωχότερων περιοχών, τη συρρίκνωση της περιοχής και την παρέμβαση με εκτροφείς και πλωτήρες [13] . Ωστόσο, οι κοντινές αιτίες της αποτυχίας αναπαραγωγής είναι ελάχιστα γνωστές παρά τα μακροπρόθεσμα ενδιαφέροντα για τη διατήρηση αυτού του είδους [16] . Για την αξιολόγηση αυτών των αιτιών, η εξέταση αποτυχημένων αυγών και νεκρών φωλιών είναι επιτακτική, συμπεριλαμβανομένης της μελέτης της παρουσίας και των επιπτώσεων τραυματισμού, αναπτυξιακών προβλημάτων, κακής διατροφικής κατάστασης, ρύπων, βλάβης οργάνων, παθογόνων που προκαλούν ασθένειες κ.λπ. Για να προσδιορίσουμε την πιο πιθανή αιτία της αναπαραγωγικής αποτυχίας. Εδώ, πραγματοποιήσαμε μια ολοκληρωμένη μελέτη αποτυχημένων αυγών και νεκρών γενειοφόρου γύπας που συλλέχθηκαν τα τελευταία χρόνια στα Πυρηναία. Τόσο η παραγωγικότητα όσο και τα ποσοστά επιβίωσης των ενηλίκων και των νεαρών πτηνών έχουν φτάσει τις χαμηλότερες τιμές από την κρίση της σπογγώδους εγκεφαλοπάθειας των βοοειδών (ΣΕΒ) [13, 14, 17]. Αυτή η χρονική μείωση θα μπορούσε να σχετίζεται με παράνομη δηλητηρίαση [17] και πρόσφατες αλλαγές στην αφθονία, τη διανομή και την ποιότητα των πτωμάτων που διατίθενται στους οδοκαθαριστές ως συνέπεια των κανονισμών της ΕΕ που προέρχονται από την κρίση της ΣΕΒ [6, [18] [19] [20] ] . Ειδικότερα, η κρίση της ΣΕΒ προκάλεσε την έλλειψη ή την έλλειψη ασταθών ζώων που διατίθενται στους οδοκαθαριστές και την επακόλουθη αύξηση της κατανάλωσης πτωμάτων από στάβλο ζώα, τα οποία θεραπεύονται εντατικά [21] . Ως εκ τούτου, εστιάσαμε ειδικά στον προσδιορισμό του εάν η αποτυχία αναπαραγωγής σε γενειοφόρους γύπες σχετίζεται με την κατάποση κτηνιατρικών φαρμάκων από πτώματα ζώων, όπως τεκμηριώνεται σε άλλα είδη οδοκαθαριστών πτηνών [12] . Αξιολογήσαμε επίσης τις πιθανές επιδράσεις των κτηνιατρικών φαρμάκων στη βλάβη των εμβρύων και στην ανοσοκαταστολή αυξάνοντας την πιθανότητα απόκτησης και πολλαπλασιασμού παθογόνων που προκαλούν θανατηφόρα νόσο [6, [10] [11] [12] 21] . Επειδή τα κτηνιατρικά φάρμακα θα πρέπει να λαμβάνονται αποκλειστικά από την κατάποση πτωμάτων από ζώα που χορηγούνται φαρμακευτική αγωγή για την καταπολέμηση ασθενειών, προβλέπουμε ότι η παρουσία τους θα πρέπει να σχετίζεται με αυτή των παθογόνων που λαμβάνονται από το ίδιο ζωικό κεφάλαιο, ειδικά παθογόνων πουλερικών που είναι πιο πιθανό να μεταδοθούν μεταξύ των ειδών των πτηνών [22] . Εναλλακτικά, εάν η χρονική μείωση της παραγωγικότητας σχετιζόταν πρωτίστως με αποτυχία αναπαραγωγής λόγω των επιπτώσεων των διαδικασιών κορεσμού των οικοτόπων [13, 17] , θα πρέπει να αναμένουμε ότι η θνησιμότητα των αυγών και της φωλιάς θα σχετίζεται άμεσα με αναπτυξιακά και διατροφικά προβλήματα που υποδεικνύουν προοδευτικά χαμηλότερης ποιότητας περιοχές. π.χ. αδυνάτισμα εμβρύου, λιμοκτονία κατά τη διάρκεια της ωοτοκίας) και παρέμβαση τόσο από ομοειδείς όσο και από ετεροειδείς (π.χ. αποτυχία επώασης, τραυματισμός λόγω προσπαθειών θήρευσης ή διαταραχής). Αποτυχημένα αυγά (n = 5) και νεκρά φωλιά (n = 4) συλλέχθηκαν από φωλιές γενειοφόρου γύπα που βρίσκονται στα Ισπανικά Πυρηναία μεταξύ 2005 και 2008. Η μελέτη αυτού του υλικού δεν απαιτούσε την έγκριση μιας επιτροπής δεοντολογίας, επειδή συλλέχθηκε αφού επιβεβαιώθηκε στο χωράφι η αποτυχία αναπαραγωγής (αυγό ή θάνατος φωλιάς). Τρία από τα δείγματα (δύο φωλιές και ένα αυγό) συλλέχθηκαν το 2005, το 2007 και το 2008 από μια συγκεκριμένη περιοχή. Τα αυγά και τα φωλιά συλλέχθηκαν μετά από αποτυχία αναπαραγωγής και καταψύχθηκαν. Πραγματοποιήθηκαν νεκροψίες σε όλα τα δείγματα σύμφωνα με τυπικά πρωτόκολλα [12] . Η ηλικία των εμβρύων και των φωλιασμένων υπολογίστηκε ανάλογα με το μέγεθος και την ανάπτυξη. Δείγματα ήπατος, νεφρού, σπλήνας, παχέος και λεπτού εντέρου, πνευμόνων, εγκεφάλου, λεμφικών οργάνων (θύμος, θώρακας Fabricius, έμπλαστρα Peyer) και αρθρώσεων γονάτων στερεώθηκαν σε φορμαλίνη 10% με ρυθμιστικό διάλυμα, τεμαχίστηκαν στα 4 mm και χρωματίστηκαν για ιστοπαθολογική ανάλυση. 10, 12]. Το συκώτι (νεκρά φωλιά και αποτυχημένα έμβρυα) και ο κρόκος (αποτυχημένα έμβρυα) χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της παρουσίας κτηνιατρικών φαρμάκων, συμπεριλαμβανομένων των φθοριοκινολονών (ενροφλοξασίνη και σιπροφλοξασίνη), άλλων αντιμικροβιακών (αμοξυκιλλίνη και μη οξυτετραδεκυκλίνη), αντιφλεγμονώδη (ΜΣΑΦ) όπως δικλοφενάκη, φλουνιξίνη μεγλουμίνη, κετοπροφαίνη, ιβουπροφαίνη, μελοξικάμη, σαλικυλικό νάτριο, ακεταμινοφαίνη και αντιπαρασιτικά (μετρονιδαζόλη, δικλαζουρίλ, φενβενδαζόλη, ιβερμεκτίνη) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Τα όρια ποσοτικού προσδιορισμού, ποσοστιαίων ανακτήσεων και αναπαραγωγιμότητας μεταξύ και εντός της ανάλυσης ήταν επαρκή [10, 12] . Άλλοι μολυντές που δυνητικά επηρεάζουν τα αυγά και τα έμβρυα προσδιορίστηκαν στο ήπαρ, συμπεριλαμβανομένων των βαρέων μετάλλων (Cd, Zn, Pb και Hg), σύμφωνα με τους Blanco et al. [23] , διθειοκαρβαμικό thiram, disulfuram, πολυβρωμιωμένοι διφαινυλαιθέρες, οργανοχλωρίδια και βρωμιούχα επιβραδυντικά φλόγας, σύμφωνα με τους Lemus et al. [12] και καρβαμιδικά και οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα (carbofuran, aldicarb και fenthion) σύμφωνα με τους Elliot et al. [24] . Μετρήσαμε τη δραστηριότητα της χολινεστεράσης του εγκεφάλου για να αξιολογήσουμε την πρώιμη έκθεση σε φυτοφάρμακα αντιχολινεστεράσης [25]. Η πιθανή μόλυνση αξιολογήθηκε σε σύγκριση με επίπεδα από φαινομενικά φυσιολογικά άγρια ​​πτηνά άλλων ειδών [26] απουσία βασικών επιπέδων για γενειοφόρους γύπες. Ο προσδιορισμός των βακτηριακών και μυκητιακών παθογόνων πραγματοποιήθηκε με δειγματοληψία στοματοφάρυγγα, πνεύμονα, ήπαρ, νεφρό, σπλήνα και έντερο με αποστειρωμένα επιχρίσματα και καλλιεργούνται χρησιμοποιώντας τυπικά πρωτόκολλα μικροβιολογίας [10, 12, 27, 28] . Οι ορότυποι της σαλμονέλας και οι τύποι φάγων προσδιορίστηκαν στο Ισπανικό Εργαστήριο Αναφοράς (Laboratorio Central Veterinario, Algete, Μαδρίτη). Για την επιβεβαίωση της ταυτοποίησης του άλφα αιμολυτικού Streptococcus pneumoniae χρησιμοποιήσαμε ένα ειδικό τεστ αναγνώρισης (Accuprobe, Salem, MA) που βασίζεται στην ανίχνευση συγκεκριμένων αλληλουχιών ριβοσωμικού RNA. Δείγματα βλαβών που βρέθηκαν σε εσωτερικά όργανα και ιστούς κατά τη διάρκεια νεκροψιών ελήφθησαν με στείρα επιχρίσματα και καλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας τα ίδια τυπικά πρωτόκολλα μικροβιολογίας. Επιπλέον, προσδιορίσαμε την παρουσία επιλεγμένων παθογόνων πτηνών, συμπεριλαμβανομένων παθογόνων βακτηρίων, ιών, μυκήτων και πρωτόζωων μέσω μεθόδων που βασίζονται σε PCR (βλ. Πίνακα S1 για λεπτομέρειες). Η παρουσία των Chlamyophila psittaci και Mycoplasma sp. στο αίμα προσδιορίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29, 30]. Η παρουσία του ιού ευλογιάς, του παραμυξοϊού που προκαλεί τη νόσο του Newcastle, των ορότυπων H5, H7 και H9 της γρίπης των πτηνών, του αδενοϊού του γερακιού, του κυκλοϊού, του ιού του έρπητα, του πολυομαϊκού ιού, του ρεοϊού και του ιού του Δυτικού Νείλου προσδιορίστηκαν σύμφωνα με τις μεθόδους που βασίζονται σε PCR που είναι διαθέσιμες στη βιβλιογραφία [31. ] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] . Αναζητήσαμε επίσης ελμίνθους και πρωτόζωα στη γαστρεντερική οδό με μακροσκοπικές και μικροσκοπικές παρατηρήσεις χρησιμοποιώντας τυπικά πρωτόκολλα [40] . Χρησιμοποιήθηκαν ειδικές ανοσοκυτταροχημικές διαδικασίες για την ανίχνευση του μυελοκαταθλιπτικού ιού, συμπεριλαμβανομένου του ιού του άλφα ερπητοϊού που προκαλεί τη νόσο Marek [41] στους νεφρούς και στον θώρακα του Fabrici ο γυροϊός που προκαλεί μολυσματική αναιμία κοτόπουλου [42] στον θύμο αδένα και το μυελό των οστών, ο ιός birna που προκαλεί μολυσματική θυλακική νόσο (IBD, [43] ) στον πρύμα του Fabricius και ο κορωνοϊός που προκαλεί μολυσματική βρογχίτιδα κοτόπουλου στα νεφρά [44] . Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε μια ειδική ανοσοκυτταροχημική διαδικασία για την ανίχνευση αντιγόνου του ιού του Δυτικού Νείλου [45] στον εγκέφαλο, το νωτιαίο μυελό, τον θύμο αδένα και τον θυρεοειδή. Όλες οι αναλύσεις ανοσοϊστοχημείας πραγματοποιήθηκαν στο Τμήμα Κτηνιατρικής Ανατομίας, Κτηνιατρική Σχολή, Universidad Complutense de Madrid, Ισπανία και στο Παθολογικό Τμήμα της Κτηνιατρικής Σχολής, Πανεπιστήμιο της Ουτρέχτης, Ολλανδία. Η παρουσία αυτών των ιών προσδιορίστηκε επίσης με μεθόδους που βασίζονται στην PCR [43, [46] [47] [48] . Όλα τα νεκρά φωλιά και τα τρία από τα πέντε μη εκκολαφθέντα έμβρυα έδειξαν δύο έως έξι διαφορετικά κτηνιατρικά φάρμακα στο ήπαρ (φωλιά) και τον κρόκο αυγού (έμβρυα). Επιπλέον, τα δύο έμβρυα με φθοριοκινολόνες στον κρόκο τα είχαν και στο συκώτι (Πίνακας 1). Οι φθοροκινολόνες ήταν τα πιο διαδεδομένα φάρμακα και εμφάνισαν τις υψηλότερες συγκεντρώσεις (Πίνακας 1). Άλλα φάρμακα όπως τα ΜΣΑΦ και τα αντιπαρασιτικά βρέθηκαν στα περισσότερα νεογνά σε μεταβλητές συγκεντρώσεις, αλλά σε κανένα αυγό (Πίνακας 1). Άλλες τοξικές ενώσεις ανιχνεύθηκαν σε χαμηλότερο επιπολασμό και συγκεντρώσεις (βλ. Πίνακα 1 για αυτές τις πιο σχετικές τιμές. Όλα τα εντομοκτόνα βρέθηκαν σε συγκεντρώσεις 0,001 ppb), κάτι που υποστηρίχθηκε περαιτέρω από βασικά επίπεδα χολινεστεράσης του εγκεφάλου (Πίνακας 1). Τα νεκρά έμβρυα και τα φωλιά έδειξαν μέτρια έως καλή θρεπτική κατάσταση. Οι κύριες ιστοπαθολογικές βλάβες εντοπίστηκαν κυρίως στο νεφρό, συμπεριλαμβανομένης της σπειραματονεφρίτιδας και/ή της σπειραματονεφρίτιδας που υπάρχει σε όλα τα άτομα με φθοριοκινολόνες, αλλά όχι σε αυτά που δεν έχουν φάρμακα (Πίνακας 1). Όλα τα άτομα με φθοροκινολόνες εμφάνισαν επίσης βλάβες στις αρθρώσεις, συμπεριλαμβανομένης της αρθρίτιδας και/ή της αρθρίτιδας των αρθρώσεων των μακρών οστών, καθώς και ογκώδες οστικό στρώμα των σπογγωδών οστών. Οι μύκητες Candida albicans απομονώθηκαν από τη στοματική κοιλότητα πέντε ατόμων. Όλα τα άτομα εμφάνισαν μη ειδική μικτή βακτηριακή χλωρίδα. Εντεροτοξιγονικό Escherichia coli και Salmonella spp. απομονώθηκαν σε τέσσερις περιπτώσεις ( Πίνακας 1 (συνέχεια) *Δείγματα από την ίδια περιοχή σε διαφορετικά έτη. 1 Κτηνιατρικά φάρμακα. EN: ενροφλοξασίνη (mg/g), CI: σιπροφλοξασίνη (mg/g), OX: οξυτετρακυκλίνη (mg/g), FL: flunixin meglumine (mg/g), AS: σαλικυλικό νάτριο (ng/g), IV: Ιβερμεκτίνη (mg/g). 2 Άλλα τοξικά. Ή: οργανοχλωρίδια (ng/g), Pb: μόλυβδος (ng/g). 12. z29 (τρεις περιπτώσεις, βλ. Πίνακα 1). Ένα άτομο εμφάνισε λοίμωξη από Salmonella enterica enteritidis (βλ. παραπάνω) και εντεροτοξιγονικό Escherichia coli O86 σε όλα τα εξεταζόμενα όργανα (σηψαιμία) εκτός από τον εγκέφαλο, ο οποίος απέρριψε την πιθανότητα μεταθανάτιας μόλυνσης. Η Pasteurella multocida απομονώθηκε σε ένα μεμονωμένο άτομο που έδειξε επίσης εντεροτοξιγονικό Escherichia coli O86 (Πίνακας 1). όλα αυτά τα άτομα περιείχαν φθοροκινολόνες. Ένα από τα αποτυχημένα έμβρυα χωρίς κτηνιατρικά φάρμακα εμφάνισε πυώδη μυοκαρδίτιδα, πολλαπλά μικροαποστήματα στους μύες της κεφαλής, πυώδη λεπτομηνιγγίτιδα, καθώς και γάγγραινα φλεγμονή της κάτω γνάθου με απώλεια του οστικού στρώματος λόγω μικτής λοίμωξης με Streptococcus suis και Streptococcus meining και Streptococcus pneum. μύες του λαιμού? αυτό το έμβρυο έδειξε επίσης μόλυνση από μολυσματική βρογχίτιδα κοτόπουλου (Πίνακας 1). Τόσο η ανοσοκυτταροχημεία για την ανίχνευση ιών πουλερικών όσο και η έρευνα παθογόνων PCR ήταν θετικά σε IBDV σε έξι άτομα με φθοριοκινολόνες (Πίνακας 1). Οι ανοσοκυτταροχημικές διαδικασίες απέτυχαν να ανιχνεύσουν αντιγόνα του ιού του Δυτικού Νείλου σε άτομα στα οποία η PCR για αυτόν τον ιό ήταν θετική. Η παρασιτολογία ήταν αρνητική για όλους τους έλμινθους, τα αυγά των ελμινθών και τα πρωτόζωα. Βρήκαμε πολλά κτηνιατρικά φάρμακα, κυρίως φθοριοκινολόνες, στα περισσότερα αποτυχημένα αυγά και νεκρούς γενειοφόρους γύπες από τα Πυρηναία. Έδειξαν επίσης πολλαπλές βλάβες εσωτερικών οργάνων και παθογόνα που δυνητικά αποκτήθηκαν από φαρμακευτικά πτώματα ζώων, ειδικά ιούς που συχνά μολύνουν τα πουλερικά. Οι καταγεγραμμένες συγκεντρώσεις φαρμάκου ήταν από τις υψηλότερες που αναφέρθηκαν σε οδοκαθαριστές πτηνών [6, [10] [11] [12] 21] . Τα ΜΣΑΦ και τα αντιπαρασιτικά βρέθηκαν σε χαμηλότερο επιπολασμό από τις φθοριοκινολόνες, αλλά σε υψηλότερες συγκεντρώσεις από εκείνες που βρέθηκαν σε άλλους οδοκαθαριστές πτηνών, ειδικά για τη φλουνιξίνη μεγλουμίνη και το σαλικυλικό νάτριο [6, 12, 21]. Αντίθετα, δεν βρήκαμε στείρα αυγά, κακές διατροφικές συνθήκες ή τραυματισμό σε κανένα αποτυχημένο έμβρυο ή φωλιά. Άλλοι ρύποι βρέθηκαν σε χαμηλό επιπολασμό και συγκεντρώσεις που θέτουν χαμηλό κίνδυνο για την υγεία των εμβρύων και των φωλεών. Οι φθοροκινολόνες μπορεί να προκαλέσουν γενικευμένη άμεση αναπτυξιακή βλάβη αποκλείοντας την εκκόλαψη των εμβρύων, φυσιολογικές αλλοιώσεις λόγω της επίδρασής τους στο ήπαρ και τους νεφρούς και την ανοσοκαταστολή μειώνοντας την αντίσταση σε ευκαιριακά παθογόνα [6, 10] [11] [12] 21] . Αυτά τα παθογόνα μπορούν να αποκτηθούν ταυτόχρονα με την κατάποση φαρμάκων που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία άρρωστων ζώων, όπως φαίνεται από τον υψηλό επιπολασμό τους στα έμβρυα και τα φωλιά. Ως εκ τούτου, παρά το σχετικά μικρό μέγεθος δείγματος που προκύπτει από τη χαμηλή αφθονία, τον κίνδυνο και τις λογιστικές δυσκολίες στην πρόσβαση σε φωλιές σε αυτό το είδος, τα αποτελέσματα παρέχουν στοιχεία για συνδυασμένη επίδραση των κτηνιατρικών φαρμάκων και των ασθενειών των ζώων ως την κύρια αιτία της αναπαραγωγικής αποτυχίας στα άτομα του δείγματος. Η παρουσία του ιού του Δυτικού Νείλου δεν είναι πιθανό να συσχετιστεί με ασθένεια ή θνησιμότητα λόγω της έλλειψης βλαβών στους ιστούς στόχους και σωματιδίων ιικού αντιγόνου στη μελέτη ανοσοϊστοχημείας. Θανατηφόρα σηψαιμία που προκαλείται από τον Streptococcus suis, ένα από τα σημαντικότερα παθογόνα των χοίρων παγκοσμίως [49] , σε συνδυασμό με σηψαιμία από Streptococcus pneumoniae και μόλυνση από τον ιό της λοιμώδους βρογχίτιδας κοτόπουλου βρέθηκαν σε ένα μόνο έμβρυο. Αυτή η συγκέντρωση παθογόνων για τα ζώα δεν έχει αναφερθεί στο παρελθόν και, από ό,τι γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη αναφορά των τριών παθογόνων που προκαλούν ασθένεια σε ένα άγριο πτηνό. Άλλα παθογόνα που καταγράφηκαν σε έμβρυα και φωλιά, συμπεριλαμβανομένων των ορότυπων της σαλμονέλας και των φάγων τυπικών ζώων [50] και της εντεροτοξιγονικής Escherichia coli O86 που προκαλεί σηψαιμία, μεταδόθηκαν δυνητικά με την κατανάλωση σφαγίων μολυσμένων πουλερικών και άλλων ζώων [22, 27, 22, 27, . Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι ο ιός IBD μόλυνε τα περισσότερα άτομα μόνο του ή μαζί με άλλα παθογόνα που επίσης δυνητικά αποκτήθηκαν από πτώματα ζώων. Αυτός ο ιός προκαλεί μια εξαιρετικά μεταδοτική ανοσοκατασταλτική νόσο του θυλακίου στα πουλερικά [51] και μπορεί να μεταδοθεί στην άγρια ​​ζωή σε επαφή με τα απόβλητα πουλερικών ή με την κατάποση σφαγίων [22, 52] . Τα φωλιά είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα στην IBD λόγω του πρωταρχικού ρόλου του θύλακα του Fabricius στην ανάπτυξη της ανοσολογικής λειτουργίας σε αυτή την ηλικία. Στην πραγματικότητα, η ανοσοκαταστολή λόγω IBD υποδεικνύεται από τη φλεγμονή, τη νέκρωση και την απώλεια λεμφοκυττάρων στον θώρακα του Fabricius μαζί με την παρουσία ιικών αντιγόνων που καταγράφηκαν μέσω ανοσοκυτταροχημικών διαδικασιών. Ο πιθανός αντίκτυπος των εξαιρετικά παθογόνων και μεταδοτικών ιών των πουλερικών έχει αναγνωριστεί προηγουμένως ως απειλή για την υγεία της άγριας ζωής λόγω της αυξανόμενης επαφής της άγριας ζωής με τις κτηνοτροφικές δραστηριότητες γενικά, και τις πτηνοτροφικές εκμεταλλεύσεις και τα υπολείμματά τους ειδικότερα, σε φυσικές περιοχές παγκοσμίως [52] [52] 53] [54] [55] . Ωστόσο, η βλάβη από τον ιό της IBD στον θύλακα του Fabricius αντιπροσωπεύει, από όσο γνωρίζουμε, την πρώτη ένδειξη κλινικής ασθένειας συμβατής με θάνατο που προκαλείται από αυτόν τον ιό των πουλερικών στην άγρια ​​ζωή. Η παρουσία του IBD δεν έχει καταγραφεί προηγουμένως σε έμβρυα άγριων πτηνών, πιθανώς επειδή έχει αποκλειστεί η κάθετη μετάδοση στα πουλερικά και, κατά συνέπεια, πιθανότατα δεν έχει αξιολογηθεί σε άλλα είδη μέχρι τώρα. Αυτό το εντυπωσιακό και ανησυχητικό αποτέλεσμα θα μπορούσε να σχετίζεται με τις μεγαλύτερες περιόδους ανάπτυξης αυγών και επώασης γενειοφόρου γύπα σε σύγκριση με τα πουλερικά ή/και λόγω αντίθετων περιβαλλοντικών συνθηκών κατά την επώαση μεταξύ γενειοφόρου γύπα και πουλερικών. Έτσι, η μόλυνση του εμβρύου με ΙΦΝΕ μπορεί να συμβεί μέσω του θηλυκού ή κατά τη διάρκεια της επώασης ως συνέπεια της επαφής αυγού μεταξύ του αυγού και των υπολειμμάτων πουλερικών στις φωλιές γενειοφόρου γύπα, κάτι που απαιτεί περισσότερη έρευνα. Παρά τις πιθανές επιπτώσεις τους στη δυναμική του πληθυσμού και τη διατήρηση μέσω μείωσης της παραγωγικότητας και των αλλαγών στη συμπεριφορά ζευγαρώματος [13, 14], οι διαδικασίες κορεσμού των οικοτόπων προφανώς δεν σχετίζονταν άμεσα με συγκεκριμένες κοντινές αιτίες αποτυχίας αυγών και φωλιάς σε αυτή τη μελέτη ή σε αυτά τα άτομα του δείγματος. Ως εναλλακτική μη αμοιβαία αποκλειστική εξήγηση, προτείνουμε ότι η πρόσφατη μείωση της παραγωγικότητας θα μπορούσε επίσης να συνδεθεί με την αυξανόμενη κατάποση κτηνιατρικών φαρμάκων και την απόκτηση παθογόνων παραγόντων από φαρμακευτικά στάβλα σφάγια ζώων λόγω της μειωμένης διαθεσιμότητας ασταθών σφαγίων ζώων - την παραδοσιακή πρωτογενή τροφή των γενειοφόρους γύπες [16] από την κρίση της ΣΕΒ [21] , συνοδευόμενη από πιθανή αυξανόμενη χρήση αντιβιοτικών σε εκμεταλλεύσεις στάβλων ζώων. Υπό αυτή την έννοια, είναι αξιοσημείωτο ότι οι γενειοφόροι γύπες τρέφονται κυρίως με οστά ζώων, τα οποία είναι ένας από τους κύριους ιστούς-στόχους των φθοριοκινολονών στα φαρμακούχα ζώα [56], επομένως, καθιστώντας αυτό το είδος ιδιαίτερα ευαίσθητο στις συνέπειες της αύξησης της κατανάλωσης στάβλο εντατικά φαρμακούχο ζωικό κεφάλαιο. Η παρουσία κτηνιατρικών φαρμάκων στα αυγά υποδηλώνει την προηγούμενη παρουσία τους τουλάχιστον σε αναπαραγωγικά θηλυκά [12] , αλλά πιθανώς και σε αναπαραγωγικά αρσενικά και μη που χρησιμοποιούν συχνά χώρους τεχνητής σίτισης και χωματερές σφαγίων ζώων [17] , όπου τα κτηνιατρικά φάρμακα μπορούν να καταποθούν από φαρμακούχα σφάγια ζώων [10, 21] . Ως εκ τούτου, απαιτείται περαιτέρω έρευνα για τον προσδιορισμό του αντίκτυπου των κτηνιατρικών φαρμάκων και των ασθενειών των ζώων στη φυσική κατάσταση των ενήλικων ατόμων, συμπεριλαμβανομένων των δυνητικά λεπτών, υποθανατηφόρων ή έμμεσων επιδράσεων αυτών των παραγόντων στη δυναμική του πληθυσμού. Η σχέση μεταξύ κτηνιατρικών φαρμάκων και ασθενειών των ζώων πρέπει να είναι διερευνήθηκε περαιτέρω σε είδη οδοκαθαριστών, επειδή και οι δύο απειλές μπορεί να συνυπάρχουν στα τρόφιμα και επειδή τα ανοσοκατασταλτικά αποτελέσματα και άλλες φυσιολογικές αλλοιώσεις που προκαλούνται από τα φάρμακα μπορεί να διευκολύνουν την απόκτηση και τον πολλαπλασιασμό παθογόνων [6, 11, 21]. Δεδομένου ότι και οι δύο απειλές που δρουν μαζί μπορεί να συμβάλουν σε μεγάλο βαθμό στην αποτυχία αναπαραγωγής μειώνοντας την παραγωγικότητα, η πιθανότητα τους ως στοχαστικοί παράγοντες με δυνητικά καταστροφικές επιπτώσεις που αυξάνουν τον κίνδυνο εξαφάνισης δεν πρέπει να αγνοηθεί στα τρέχοντα προγράμματα διατήρησης γενειοφόρου γύπα και άλλων ειδών οδοκαθαριστών, ειδικά όσον αφορά τα επικίνδυνα κτηνιατρικά φάρμακα. και ιούς υψηλής παθογονικότητας που προσβάλλουν συχνά τα πουλερικά. Επιπλέον, η περιορισμένη γεωγραφική κατανομή και η χαμηλή γενετική μεταβλητότητα [57] που είναι κοινά σε πολλά απειλούμενα είδη μπορεί να ευνοήσει τη μετάδοση παθογόνων και να μειώσει την ικανότητα ενός αφελούς ανοσοποιητικού συστήματος να καταπολεμά νέα παθογόνα [3, 28, 58], καθιστώντας τα ιδιαίτερα ευάλωτα στα πιθανή μετάδοση μεταξύ ειδών στελεχών ιού υψηλής μολυσματικότητας ικανά να προκαλέσουν σημαντικές εστίες, όπως αναφέρεται στα πουλερικά [59] [60] [61] . Η συσχέτιση της ρύπανσης και της ασθένειας μπορεί να αυξήσει περαιτέρω τον κίνδυνο εξαφάνισης εάν αλληλεπιδράσει με τις επιπτώσεις του κορεσμού των οικοτόπων διεργασίες [13, 14, 17]. Αυτές οι διεργασίες μπορεί να διευκολύνουν την ταυτόχρονη επαφή και αλληλεπιδράσεις που είναι επίσης πιθανό να αυξήσουν τα ποσοστά μετάδοσης παθογόνων εντός και μεταξύ των ειδών στις περιοχές αναπαραγωγής και σίτισης, ειδικά σε εξαιρετικά μεταδοτικές ασθένειες των πουλερικών [22] . Αυτό θα μπορούσε να ενισχυθεί περαιτέρω από τον τεχνητά μεγάλο αριθμό γενειοφόρους γύπες και άλλους οδοκαθαριστές που προσελκύονται από τα σημεία σίτισης και τις χωματερές απορριμμάτων σφαγίων, τόσο ως αποτέλεσμα της διαχείρισης όσο και λόγω της σπανιότητας ασταθών σφαγίων ζώων από την κρίση της ΣΕΒ [17, 21] . Όποια και αν είναι η πιθανή συμβολή των υποκείμενων τελικών μηχανισμών που μειώνουν την παραγωγικότητα, τα ευρήματά μας υπογραμμίζουν την ανάγκη να προσδιοριστούν οι άμεσες αιτίες της αποτυχίας αναπαραγωγής και της θνησιμότητας σε πληθυσμούς άγριας ζωής, προκειμένου να κατανοηθούν οι διαδικασίες που ρυθμίζουν τη δημογραφία από την άποψη του οικολογικού πλαισίου. Πίνακας S1Βρέθηκε στο: doi:10.1371 /journal.pone.0014163.s001 (0,05 MB DOC)", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 4887, "text": "τα Πυρηναία" } ], "id": 5270, "question": "Πού βρίσκεται συνήθως ο γενειοφόρος γύπας (Gypaetus barbatus);" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Ένα σύμπλεγμα χαλκού (II) που προέρχεται από τη βάση Schiff είναι ένας ισχυρός επαγωγέας της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου ενεργοποιώντας την ενδογενή οδό Maryam; Paydar, Mohammadjavad; Zorofchian Moghadamtousi, Soheil; Hassandarvish, Pouya; Gwaram, Nura Suleiman; Zahedifard, Maryam; Rouhollahi, Elham; Karimian, Hamed; Looi, Chung Yeng; Ali, Hapipah Mohd; Abdul Majid, Nazia; Abdulla, Mahmood AmeenΗμερομηνία: 2014-03-05DOI: 10.1155/2014/540463Άδεια: cc-byAbstract: Τα φάρμακα με βάση το μέταλλο με εκτεταμένες κλινικές εφαρμογές υπόσχονται πολλά για την ανάπτυξη χημειοθεραπευτικών παραγόντων για τον καρκίνο. Τις τελευταίες δεκαετίες, οι βάσεις Schiff και τα συμπλέγματά τους έχουν γίνει γνωστά για το εκτεταμένο βιολογικό τους δυναμικό. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την αντιπολλαπλασιαστική επίδραση ενός συμπλόκου χαλκού (II) στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου HT-29. Η ένωση βάσης Cu(BrHAP)(2) Schiff επέδειξε ισχυρό αντιπολλαπλασιαστικό αποτέλεσμα στα κύτταρα HT-29, με τιμή IC(50) 2,87 μg/ml μετά από 72 ώρες θεραπείας. Τα κύτταρα HT-29 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με σύμπλοκα Cu (II) υπέστησαν θάνατο απόπτωσης, όπως επιδεικνύεται από μια προοδευτική αύξηση στην αναλογία του πληθυσμού των κυττάρων G(1). Σε συγκέντρωση 6,25 μg/ml, η ένωση Cu(BrHAP)(2) προκάλεσε σημαντική αύξηση στην παραγωγή ROS μετά από διαταραχή του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης και την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c, όπως αξιολογήθηκε με τη μέτρηση της έντασης φθορισμού σε χρωματισμένα κύτταρα. Επιπλέον, η ενεργοποίηση των κασπασών 3/7 και 9 ήταν μέρος της επαγόμενης από το σύμπλεγμα Cu (II) απόπτωσης, η οποία επιβεβαίωσε τη συμμετοχή της απόπτωσης που προκαλείται από μιτοχόνδρια. Εν τω μεταξύ, δεν υπήρξε σημαντική ενεργοποίηση της κασπάσης-8. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ένωση Cu(BrHAP)(2) είναι πιθανός υποψήφιος για περαιτέρω in vivo και κλινικές μελέτες καρκίνου του παχέος εντέρου για την ανάπτυξη νέων χημειοθεραπευτικών παραγόντων που προέρχονται από παράγοντες με βάση το μέταλλο. Κείμενο: Ο καρκίνος είναι μια εξουθενωτική ασθένεια που προσβάλλει ένα σημαντικό μέρος του παγκόσμιου πληθυσμού σε όλες τις γενιές και αποτελεί μείζον πρόβλημα υγείας παγκόσμιου ενδιαφέροντος [1] . Μεταξύ των διαφόρων τύπων καρκίνου, ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι ο δεύτερος και τρίτος πιο διαδεδομένος καρκίνος μεταξύ ανδρών και γυναικών στις Ηνωμένες Πολιτείες, αντίστοιχα. Παρά τη σημαντική πρόοδο στις προστατευτικές μεθόδους και τις πρόσφατες βελτιώσεις στις τεχνικές προσυμπτωματικού ελέγχου και στη χημειοθεραπεία, τα ποσοστά σχετικής επιβίωσης 1 έτους και 5 ετών για ασθενείς που πάσχουν από καρκίνο του παχέος εντέρου είναι 83,2% και 64,3% αντίστοιχα [2] . Επιπλέον, λόγω της έντονης διαμάχης σχετικά με τις βέλτιστες μεθόδους έγκαιρης ανίχνευσης, η πλήρης συμμόρφωση των ασθενών με τις συστάσεις προσυμπτωματικού ελέγχου παραμένει σημαντικό εμπόδιο για τη διάγνωση στα πρώιμα στάδια ανάπτυξης καρκίνου. Η ανάπτυξη αντοχής στη χημειοθεραπεία αντιπροσωπεύει επίσης ένα κρίσιμο ζήτημα για το οποίο η ταυτόχρονη θεραπεία με διάφορες κατηγορίες θεραπευτικών για τη μείωση της αντοχής έχει αποφέρει κάποια επιτυχία [3] . Επιπλέον, οι πολυάριθμες παρενέργειες των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων σε ασθενείς με καρκίνο, συμπεριλαμβανομένης της τριχόπτωσης, της διάρροιας, της αιμορραγίας και της ανοσοκαταστολής, έχουν κάνει τη διαδικασία 2The Scientific World Journal of θεραπείας πιο περίπλοκη [4] . Η εξαιρετικά ρυθμιζόμενη διαδικασία προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου της απόπτωσης είναι θέμα μεγάλου ενδιαφέροντος στην ογκολογία και τη θεραπεία του καρκίνου και αντιπροσωπεύει μια κοινή μοριακή οδό για την αντοχή στα φάρμακα και την καρκινογένεση [5] . Η διατήρηση ενός σταθερού αριθμού κυττάρων στον βλεννογόνο του παχέος εντέρου ρυθμίζεται σε μεγάλο βαθμό μέσω του ισορροπία μεταξύ της απόπτωσης και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Η διαταραχή αυτής της ισορροπίας οδηγεί σε διαφυγή από την ομοιόσταση του φυσιολογικού αριθμού κυττάρων και σχετίζεται με την εξέλιξη των καρκινικών κυττάρων [6, 7]. Έτσι, η καταστολή του πολλαπλασιασμού και η αύξηση της απόπτωσης σε αυτά τα ανώμαλα κύτταρα προτείνεται να είναι ο βασικός μηχανισμός για την αναστολή του καρκίνου του παχέος εντέρου. Επιπλέον, η απόπτωση και οι παράγοντες που εμπλέκονται στον μηχανισμό δράσης της αποτελούν επίσης ένα παράθυρο που μπορεί να αξιοποιηθεί για τη βελτίωση πιθανών θεραπευτικών παραγόντων με υψηλή αποτελεσματικότητα και λιγότερες ανεπιθύμητες παρενέργειες [8] . Ως εκ τούτου, ο έλεγχος για νέες ενώσεις ικανές να προκαλέσουν απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου που μπορούν να χρησιμοποιηθούν μόνα τους ή σε συνδυασμό με άλλα χημειοθεραπευτικά φάρμακα είναι μια σημαντική ανάγκη και αντιπροσωπεύει μια κρίσιμη πρόκληση στη φαρμακευτική χημεία. Τα σύμπλοκα μετάλλων έχουν χρησιμοποιηθεί εκτενώς στις κλινικές για αιώνες και έχουν προσελκύσει πολλούς ανόργανους χημικούς να τα αναλύσουν, με κύρια εστίαση τις ιατρικές εφαρμογές [9, 10] . Ο χαλκός, ένα απαραίτητο ιχνοστοιχείο με οξειδωτική φύση και βιοουσιαστική δράση στον ανθρώπινο μεταβολισμό, δεν υπάρχει σε ιοντική μορφή στα βιολογικά συστήματα. Έτσι, η μέτρηση του χαλκού στο σώμα αξιολογείται με τη μορφή συμπλεγμάτων με οργανικές ενώσεις [11] . Οι βάσεις Schiff είναι μια κρίσιμη κατηγορία ενώσεων στην ιατρική χημεία που έχουν επιδείξει σημαντική χημειοθεραπευτική και αντιβακτηριακή εφαρμογή [12, 13]. Τα σύμπλοκα Schiff βάσης Cu(II) αποκάλυψαν μεγάλες δυνατότητες για αντιπολλαπλασιαστική, αντιβακτηριακή και γαστροπροστατευτική δράση [14] [15] [16] [17] [18] . Αυτή η μελέτη αξιολόγησε το αντικαρκινικό δυναμικό ενός συμπλόκου χαλκού (II) που προέρχεται από Ν,Ν-διμεθυλαιθυλενοδιαμίνη και συνδέτη βάσης Schiff 2-υδροξυακετοφαινόνης, Cu(BrHAP) 2 . Επιπλέον, εξετάστηκε επίσης ο πιθανός αποπτωτικός μηχανισμός που κρύβεται πίσω από αυτή τη δραστηριότητα. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Life Technologies, Inc., Rockville, MD) που περιέχει 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 100 g/mL στρεπτομυκίνη και 100 U/mL πενικιλλίνη G στους 37 ∘ C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2 /95% αέρα. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε κατάλληλη πυκνότητα σε φιάλες ιστοκαλλιέργειας (Corning, ΗΠΑ) σύμφωνα με κάθε πειραματική κλίμακα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με μια συμβατική δοκιμασία αναγωγής ΜΤΤ [3-(4,5-διμεθυλθειαζολ-2υλ)-2,5-διφαινυλτετραζόλιο βρωμιούχο]. Μετά από 48 ώρες έκθεσης σε έξι συγκεντρώσεις Cu(BrHAP) 2, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάλυμα ΜΤΤ (2 mg/mL) για 2 ώρες. Οι σκούροι κρύσταλλοι φορμαζάνης που σχηματίστηκαν σε άθικτα κύτταρα διαλύθηκαν σε DMSO και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm και 650 nm ως φόντο χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών (Hidex, Turku, Φινλανδία). Η τιμή IC50 προσδιορίστηκε ως η συγκέντρωση του Cu(BrHAP) 2 που απαιτείται για τη μείωση της απορρόφησης των επεξεργασμένων κυττάρων στο 50% των κυττάρων ελέγχου που υποβλήθηκαν σε αγωγή με DMSO. Όλα τα δείγματα παρασκευάστηκαν εις τριπλούν. Δοκιμασία. Η μέτρηση της απελευθέρωσης γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) είναι ένας βιοδείκτης για τον προσδιορισμό της κυτταροτοξικότητας μιας ένωσης. Εν συντομία, τα κύτταρα HT-29 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις Cu(BrHAP) 2 και Triton X-100 (θετικός έλεγχος) για 48 ώρες και τα υπερκείμενα των μη επεξεργασμένων και επεξεργασμένων κυττάρων μεταφέρθηκαν σε μια νέα πλάκα 96 φρεατίων για LDH ανάλυση δραστηριότητας. Στη συνέχεια, 100 L διαλύματος αντίδρασης LDH προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, η πλάκα επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά και η απορρόφηση διαβάστηκε στα 490 nm χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών Tecan Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, Ελβετία). Η ποσότητα του άλατος φορμαζάνης και η ένταση του κόκκινου χρώματος στα επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα δείγματα αντιπροσωπεύτηκαν ως η δραστικότητα LDH των κυττάρων. Το επίπεδο απελευθέρωσης LDH σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με Cu(BrHAP) 2 εκφράστηκε ως ποσοστό του θετικού ελέγχου. Διεξήχθη μια δοκιμασία διπλής χρώσης ιωδιούχου προπιδίου (PI) και πορτοκαλιού ακριδίνης (AO) για ανίχνευση απόπτωσης στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Leica συνδεδεμένο με λογισμικό Q-Floro) σύμφωνα με μια τυπική διαδικασία. Κύτταρα ΗΤ-29 (5 χ 104 κύτταρα/mL σε φιάλη καλλιέργειας 25 mL) επιστρώθηκαν, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Cu(BrHAP) 2 στη συγκέντρωση IC50 και επωάστηκαν για 24, 48 και 72 ώρες. Μετά τη συλλογή των κυττάρων, χρωματίστηκαν με φθορίζουσες βαφές και παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού υπεριώδους ακτινοβολίας (Olympus BX51) εντός 30 λεπτών. Εν συντομία, συμπληρώθηκαν κύτταρα HT-29 (1 × 10 4 κύτταρα/πηγάδι σε πλάκα 96 φρεατίων). με Cu(BrHAP) 2 (2 g/mL) ή DMSO (αρνητικός έλεγχος) για 24 ώρες. Τα ζωντανά κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με βαφές BrdU και Phospho-Histone H3 για 30 λεπτά. Αφού τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν όπως περιγράφεται από τις οδηγίες του κατασκευαστή, οπτικοποιήθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη Cellomics ArrayScan HCS (Thermo Scientific). Οι εντάσεις φθορισμού των χρωστικών μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας μια μονάδα βιοεφαρμογής ενεργοποίησης στόχου. Για να επιβεβαιωθεί το αποτέλεσμα της ανάλυσης του κυτταρικού κύκλου φθορισμού, κύτταρα HT-29 (5 × 104 κύτταρα/mL) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Cu(BrHAP) 2 για 24, 48 και 72 ώρες για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Μετά την επώαση, τα κύτταρα ΗΤ-29 περιστράφηκαν στις 1800 rpm για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε μονιμοποίηση ενός κυτταρικού πληθυσμού για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για την αποκατάσταση της ακεραιότητας. Εν συντομία, τα σφαιρίδια κυττάρων σταθεροποιήθηκαν αναμειγνύοντάς τα με 700 L ψυχρής αιθανόλης (90%) και στη συνέχεια διατηρήθηκαν στους 4 ∘ C όλη τη νύχτα. Τα επεξεργασμένα κύτταρα ΗΤ-29 περιδινήθηκαν και η αιθανόλη απορρίφθηκε. Μετά από πλύση και εναιώρηση των κυττάρων σε PBS, 25 L RNase A (10 mg/mL) και 50 L ιωδιούχου προπιδίου (PI) (1 mg/mL) προστέθηκαν στα σταθεροποιημένα κύτταρα για 1 ώρα στους 37 ∘ C. Η προσθήκη RNase Α περιόρισε την ικανότητα του PI να συνδέεται μόνο με μόρια DNA. Στο τέλος, η περιεκτικότητα σε DNA των κυττάρων αναλύθηκε με ένα κυτταρόμετρο ροής (BD FACSCanto II). Η δοκιμασία αντιοξειδωτικής ικανότητας ριζών οξυγόνου (ORAC) πραγματοποιήθηκε με βάση τα πρωτόκολλα που περιγράφηκαν λεπτομερώς προηγουμένως [19] . Εν συντομία, Cu(BrHAP) 2 σε συγκέντρωση 100 g/mL χρησιμοποιήθηκε για αυτόν τον προσδιορισμό σε συνολικό όγκο αντίδρασης 200 L. Το πείραμα διεξήχθη σε μαύρη μικροπλάκα 96 φρεατίων με 25 L ένωσης, τυφλό (διαλύτης /PBS), στάνταρ (trolox) ή θετικό μάρτυρα (κουερσετίνη). Η πλάκα στη συνέχεια συμπληρώθηκε με το διάλυμα εργασίας φλουορεσκεΐνης (150 L), που ακολουθήθηκε από επώαση 5 λεπτών στους 37°C. Ο συνολικός όγκος των 200 L συμπληρώθηκε με την προσθήκη 25 L διαλύματος εργασίας AAPH. Η ένταση φθορισμού μετρήθηκε σε μήκος κύματος διέγερσης 485 nm και μήκος κύματος εκπομπής 538 nm κάθε 2 λεπτά για 2 ώρες. Το αποτέλεσμα ποσοτικοποιήθηκε με τον υπολογισμό των διαφορών του εμβαδού κάτω από την καμπύλη διάσπασης φθορισμού (AUC) των δειγμάτων και του τυφλού. Οι τιμές ήταν ισοδύναμα Trolox (TE). Εν συντομία, κύτταρα HT-29 (1 × 104 κύτταρα/mL) σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις Cu(BrHAP) 2 και DMSO (αρνητικός έλεγχος) για 24 h. Μετά από επεξεργασία 30 λεπτών με βαφή διυδροαιθιδίου (DHE), τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης όπως περιγράφεται από τις οδηγίες του κατασκευαστή. Παρουσία υπεροξειδίων, η χρωστική DHE οξειδώνεται σε αιθίδιο. Η ένταση φθορισμού προσδιορίστηκε από μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας φθορισμού σε μήκος κύματος επέκτασης 520 nm και μήκος κύματος εκπομπής 620 nm. Οι κρίσιμοι παράγοντες για την παρακολούθηση της υγείας των κυττάρων, συγκεκριμένα, απώλεια κυττάρων, αλλαγές στην κυτταρική διαπερατότητα, απελευθέρωση κυτοχρώματος, μιτοχονδριακή μεμβράνη οι αλλαγές, το μέγεθος του πυρήνα και οι μορφολογικές αλλαγές, μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ Cellomics Multiparameter Cytotoxicity 3, όπως περιγράφηκε λεπτομερώς προηγουμένως [20] . Οι πλάκες με χρωματισμένα κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ArrayScan HCS (Cellomics, PA, USA). Οι κασπάσες 3/7, -8 και 9 προσδιορίστηκαν με χρήση του εμπορικού κιτ δοκιμασίας caspase-Glo 3/7, 8 και 9 (Promega , Μάντισον, WI). Κύτταρα ΗΤ-29 (1,0 χ 104 κύτταρα/φρεάτιο) σπάρθηκαν όλη τη νύχτα σε πλάκες 96 φρεατίων με λευκά τοιχώματα και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις Cu(BrHAP) 2 για 24 ώρες. Σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, τα επεξεργασμένα κύτταρα συμπληρώθηκαν με αντιδραστήριο κασπάσης-Glo (100 L) και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Οι ενεργές κασπάσες από αποπτωτικά κύτταρα προκάλεσαν τη διάσπαση του σημασμένου με αμινολουσιφερίνη συνθετικού τετραπεπτιδίου, οδηγώντας στην απελευθέρωση υποστρώματος για το ένζυμο λουσιφεράση. Οι δραστηριότητες κασπάσης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών Tecan Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, Ελβετία). Εν συντομία, κύτταρα HT-29 (1,0 × 104 κύτταρα/πηγάδι σε πλάκα 96 φρεατίων) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις Cu ( BrHAP) 2 για 3 ώρες, ακολουθούμενη από διέγερση με TNF-(1 ng/mL) για 30 λεπτά. Μετά την απόρριψη του μέσου, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ενεργοποίησης πυρήνα παράγοντα-Β της Cellomics (NF-B) (Thermo Scientific) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε συσκευή ανάγνωσης HCS Scan Array για την αξιολόγηση της πλάκας. Οι αναλογίες κυτταροπλασματικής και πυρηνικής έντασης NF-B υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Cytoplasm to Nucleus Translocation Bioapplication. Προσδιορίστηκε η μέση ένταση 200 κυττάρων/φρεάτιο. Συγκρίθηκαν οι αναλογίες για μη επεξεργασμένα, επεξεργασμένα και διεγερμένα από TNF κύτταρα. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές ανεξάρτητα. Τα αποτελέσματα παρουσιάστηκαν ως η μέση ± τυπική απόκλιση (SD) του αριθμού των πειραμάτων που παρουσιάζονται στα υπομνήματα. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιώντας το στατιστικό πακέτο πρίσματος (GraphPad Software, USA). < 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντικό.Κύτταρα του παχέος εντέρου. Αρχικά, η κυτταροτοξικότητα του Cu(BrHAP) 2 δοκιμάστηκε σε κυτταρικές σειρές HT-29 και CCD 841. Οι τιμές IC50 της ένωσης βάσης Schiff προσδιορίστηκαν με βάση το αποτέλεσμα που συλλέχτηκε από τρία ανεξάρτητα πειράματα ΜΤΤ. Όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα 1, το Cu(BrHAP) 2 προκάλεσε σημαντική κυτταροτοξικότητα και ανασταλτικό αποτέλεσμα κυττάρων μετά από 24, 48 και 72 ώρες θεραπείας σε κύτταρα ΗΤ-29. 2 -Επαγόμενη απελευθέρωση LDH. Η απελευθέρωση της γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) στο μέσο είναι ένας δείκτης που δείχνει την απώλεια της ακεραιότητας της μεμβράνης, την απόπτωση ή τη νέκρωση. Η κυτταροτοξικότητα της ένωσης Cu(BrHAP) 2, όπως προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία απελευθέρωσης LDH, προσδιορίστηκε ποσοτικά σε κύτταρα ΗΤ-29 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις της ένωσης βάσης Schiff για 48 ώρες. Το Cu(BrHAP) 2 προκάλεσε σημαντική αύξηση στην απελευθέρωση LDH, επιδεικνύοντας κυτταροτοξικότητα στις συγκεντρώσεις 6,25 και 12,5 g/mL σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 2). Μικροσκόπηση και Διπλή χρώση ΑΟ/ΡΙ. Μορφολογικές αλλαγές σε κύτταρα HT-29 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένωση Cu(BrHAP) 2 παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού στις 24, 48 και 72 ώρες. Τα κύτταρα βαθμολογήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού για να αναλυθούν βιώσιμα κύτταρα, πρώιμη απόπτωση και όψιμη απόπτωση. Η πρώιμη απόπτωση, που ορίζεται ως παρεμβαλλόμενη ΑΟ εντός του κατακερματισμένου DNA, παρατηρήθηκε υπό φωτεινό πράσινο φθορισμό. Ταυτόχρονα, τα κύτταρα ελέγχου οπτικοποιήθηκαν με μια πράσινη άθικτη πυρηνική δομή. Μετά από 24 και 48 ώρες θεραπείας με Cu(BrHAP) 2, παρατηρήθηκε μέτρια απόπτωση με τη μορφή φυσαλίδων και συμπύκνωσης πυρηνικής χρωματίνης. Επιπλέον, στο τελευταίο στάδιο της απόπτωσης, παρατηρήθηκαν αλλαγές, όπως η παρουσία ενός κοκκινωπό-πορτοκαλί χρώματος λόγω δέσμευσης του PI με μετουσιωμένο DNA, μετά από 72 ώρες θεραπείας (Εικόνα 3). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ένωση Cu(BrHAP) 2 προκάλεσε μορφολογικά χαρακτηριστικά απόπτωσης με τρόπο εξαρτώμενο από το χρόνο. Το Σχήμα 4, έδειξε ότι δεν υπάρχει διακοπή του κυτταρικού κύκλου στις φάσεις S/M. Η έλλειψη διακοπής του κυτταρικού κύκλου στις φάσεις S/M πρότεινε πιθανή διακοπή του κυτταρικού κύκλου στις φάσεις G 1 / G 2. Για να προσδιοριστεί η ακριβής σταματημένη φάση, τα επεξεργασμένα κύτταρα HT-29 αναλύθηκαν για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Όπως ήταν αναμενόμενο, δεν υπήρξε σημαντική σύλληψη στις φάσεις του Σ/Μ. Εν τω μεταξύ, σημαντική διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G 1 παρατηρήθηκε για κύτταρα HT-29 μετά από 24 και 48 ώρες θεραπείας (Εικόνα 5). Δοκιμασία. Η αντιοξειδωτική ικανότητα μετρήθηκε με τον προσδιορισμό ORAC, ο οποίος είναι ο μόνος προσδιορισμός που περιλαμβάνει τη χρήση ρίζας υπεροξυλίου ως προοξειδωτικού και ποσοτικοποιεί τη δραστηριότητα μέσω της τεχνικής της περιοχής κάτω από την καμπύλη (AUC). Στο πείραμά μας, η κερσετίνη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι το Cu(BrHAP) 2 εμφάνισε χαμηλή έως μέτρια αντιοξειδωτική δράση σε σύγκριση με την κερσετίνη (Πίνακας 2). Σχηματισμός. Τα κύτταρα HT-29 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις Cu(BrHAP) 2 για 24 ώρες και χρωματίστηκαν με χρωστική DHE για να προσδιοριστεί η επίδραση της ένωσης βάσης Schiff στην παραγωγή ROS. Οι εντάσεις φθορισμού της οξείδωσης DHE με ROS ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας φθορισμού. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 6, η έκθεση στην ένωση βάσης Schiff προκάλεσε σημαντική αύξηση στα επίπεδα ROS των επεξεργασμένων κυττάρων HT-29 στη συγκέντρωση 6,25 g/mL. σε κύτταρα HT-29 αναλύθηκαν με ανίχνευση πυρηνικής συμπύκνωσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7, η χρώση Hoechst 33342 έδειξε ότι η πυρηνική συμπύκνωση, η οποία σχετίζεται άμεσα με τις αλλαγές της αποπτωτικής χρωματίνης, εμφανίστηκε σε ορισμένα κύτταρα μετά από επεξεργασία με Cu(BrHAP) 2 . Εν τω μεταξύ, η διαπερατότητα των επεξεργασμένων κυττάρων ήταν επίσης αυξημένη. Τα μιτοχόνδρια είναι η κύρια πηγή για την παραγωγή ROS και τριφωσφορικής αδενοσίνης (ATP) και είναι κρίσιμα για τον έλεγχο του θανάτου και της επιβίωσης των κυττάρων. Η μείωση της έντασης φθορισμού που απεικονίζεται στο Σχήμα 6 Cu(BrHAP) 2 πυροδότησε τη μετατόπιση του κυτοχρώματος από τα μιτοχόνδρια στο κυτταρόπλασμα κατά τη διάρκεια της απόπτωσης στα κύτταρα HT-29. Ενεργοποίηση. Η αύξηση της παραγωγής ROS που σχετίζεται με μια κατάρρευση της MMP μπορεί να οδηγήσει στην ενεργοποίηση του καταρράκτη κασπάσης. Για τη διερεύνηση της ενεργοποίησης της κασπάσης, οι εντάσεις βιοφωταύγειας που αντιπροσωπεύουν τις δραστηριότητες των κασπασών 3/7, 8 και 9 ποσοτικοποιήθηκαν σε κύτταρα HT-29 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις Cu(BrHAP) 2 για 24 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 8, σημαντική αύξηση της δραστηριότητας της κασπάσης-3/7 στη συγκέντρωση 6,25 g/mL και της κασπάσης-9 στις συγκεντρώσεις 6,25 και 12,5 g/mL παρατηρήθηκε σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Cu(BrHAP) 2, ενώ καμία σημαντική αλλαγή στη δραστηριότητα της κασπάσης-8 ανιχνεύθηκε μεταξύ των επεξεργασμένων και των μη επεξεργασμένων κυττάρων HT-29. Έτσι, η απόπτωση που προκαλείται από την ένωση βάσης Schiff σε κύτταρα HT-29 πιθανώς μεσολαβείται μέσω της ενδογενούς οδού, αλλά όχι της εξωτερικής οδού. είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που έχει κρίσιμο ρόλο στην έκφραση γονιδίου κυτοκίνης. Η ενεργοποίηση και η μετατόπιση του NF-B στον πυρήνα για να ενεργοποιηθεί η δραστηριότητα δέσμευσης DNA και να διευκολυνθεί η έκφραση γονιδίου στόχου μεσολαβούνται από φλεγμονώδεις κυτοκίνες όπως ο παράγοντας νέκρωσης όγκου-(TNF-). Η ένωση βάσης Cu(BrHAP) 2 Schiff δεν έδειξε καμία ανασταλτική επίδραση στη μετατόπιση του διεγερμένου από τον TNF NF-B σε κύτταρα που έχουν υποστεί αγωγή με HT-29 και η διέγερση του TNF οδήγησε σε μετατόπιση του NF-B από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα ( Εικόνα 9). Η καρκινογένεση είναι μια διαδικασία πολλαπλών σταδίων στην οποία ο μη ρυθμισμένος κυτταρικός πολλαπλασιασμός καθώς και η μείωση της συχνότητας της απόπτωσης χρησιμεύουν ως αρχικοί χαρακτηρισμοί για την εξέλιξή της [21] . Μία από τις διαδικασίες άμυνας στους πολυκύτταρους οργανισμούς είναι η καταστροφή της ανεπιθύμητης κυτταρικής ανάπτυξης, η οποία ορίζεται ως προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος. Η απόπτωση είναι ο πιο εμφανής προγραμματισμένος μηχανισμός κυτταρικού θανάτου και χαρακτηρίζεται από διακριτές μορφολογικές αλλαγές όπως η διαπερατότητα της μεμβράνης, η κυτταρική συρρίκνωση, η διάσπαση της μιτοχονδριακής μεμβράνης και η συμπύκνωση της χρωματίνης [22, 23]. Η διαταραχή της κυτταρικής ομοιόστασης μεταξύ του κυτταρικού θανάτου και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού οδηγεί σε εμφάνιση καρκίνου [24] και οι παράγοντες που μπορούν να προκαλέσουν απόπτωση είναι γνωστό ότι έχουν πιθανές αντικαρκινικές επιδράσεις [25, 26]. Οι οδοί απόπτωσης είναι αποτελεσματικοί στόχοι για τη θεραπεία του καρκίνου καθώς και για τη χημειοπρόληψη. Πολλά χημειοπροληπτικά φάρμακα έχουν προσδιοριστεί για τη ρύθμιση βασικών συμβάντων ή μορίων σε μονοπάτια μεταγωγής σήματος που προκαλούν απόπτωση [27] . Στην παρούσα μελέτη, η ένωση βάσης Cu(BrHAP) 2 Schiff αξιολογήθηκε ως προς την ικανότητά της να αναστέλλει την ανάπτυξη κυττάρων ΗΤ-29 χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία ΜΤΤ. Τα κύτταρα HT-29 έχουν πρόσφατα χαρακτηριστεί ως κατάλληλο μοντέλο για μελέτες καρκίνου του παχέος εντέρου [28] [29] [30] . ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου με τρόπο εξαρτώμενο από το χρόνο και τη δόση. Εν τω μεταξύ, η μη ογκογονική κυτταρική σειρά παχέος εντέρου (CCD 841) δεν έδειξε κυτταροτοξικότητα μετά από θεραπεία με την ένωση. Η κυτταροτοξική δράση της ένωσης Cu(II) επιβεβαιώθηκε επίσης με μέτρηση του επιπέδου απελευθέρωσης LDH από τα επεξεργασμένα κύτταρα. Σημαντικά αυξημένη απελευθέρωση LDH έδειξε ότι η κυτταροτοξικότητα της ένωσης Cu(BrHAP) 2 πιθανώς συνέβη μέσω της απώλειας της ακεραιότητας της μεμβράνης, είτε μέσω της ενεργοποίησης της απόπτωσης είτε μέσω της οδού νέκρωσης [31] . Η παρατήρηση της πρώιμης απόπτωσης και της όψιμης απόπτωσης με ανάλυση φθορίζουσας μικροσκοπίας και διπλή χρώση AO/PI μετά από θεραπεία των κυττάρων HT-29 με την ένωση περιελάμβανε ορισμένα σημεία απόπτωσης, συγκεκριμένα, κυτταροπλασματική συρρίκνωση, φυσαλίδες μεμβράνης και κατακερματισμό του DNA [32, 33] . Βρήκαμε ότι ο αριθμός των κυττάρων με χαρακτηριστικά πρώιμης απόπτωσης ήταν υψηλότερος στα προηγούμενα στάδια της θεραπείας. Ωστόσο, όταν ο χρόνος θεραπείας αυξήθηκε στις 72 ώρες, οι χαρακτηρισμοί όψιμης απόπτωσης ή νέκρωσης ήταν κυρίαρχοι μεταξύ των κυττάρων HT-29 που υποβλήθηκαν σε θεραπεία. Η ταυτόχρονη ανίχνευση όψιμης απόπτωσης ή νέκρωσης είναι επιστημονικά δυνατή επειδή τα κύτταρα HT-29 που έχουν υποστεί απόπτωση μπορεί να έχουν εξελιχθεί σε νέκρωση λόγω της παρατεταμένης επώασης με την ένωση βάσης Schiff. στα καρκινικά κύτταρα, η κατανομή του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε χρησιμοποιώντας χρώση BrdU και φωσφο-ιστόνη Η3 μαζί με κυτταρομετρία ροής [34] [35] [36] . Η χρωστική BrdU μπορεί να προσκολληθεί στο συντιθέμενο DNA των αναδιπλασιαζόμενων κυττάρων κατά τη διάρκεια της φάσης S του κυτταρικού κύκλου, ενώ η βαφή φωσφο-ιστόνης H3 λερώνει τα κύτταρα σε διαφορετικά μιτωτικά στάδια. Τα αποτελέσματα του κυτταρικού κύκλου από τον προσδιορισμό διπλής χρώσης BrdU και φωσφο-ιστόνης Η3 έδειξαν ότι δεν υπήρχαν σημαντικές αλλαγές στον αριθμό των κυττάρων στις φάσεις S/M μετά την έκθεση των κυττάρων ΗΤ-29 στην ένωση βάσης Schiff. Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει την πιθανότητα τα κύτταρα να ακινητοποιήθηκαν στη φάση G 1 ή G 2 του κυτταρικού κύκλου. Έτσι, η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του κυτταρικού κύκλου πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η ακριβής σταματημένη φάση και τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική διακοπή του κυτταρικού κύκλου στο G 1 μετά από 24 και 48 ώρες θεραπείας, υποδηλώνοντας πολλαπλασιαστική καταστολή μέσω επαγωγής απόπτωσης [37, 38] .Η διαταραχή του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης είναι ένα από τα πρώτα ενδοκυτταρικά συμβάντα που συμβαίνουν μετά την επαγωγή της απόπτωσης [39] . Ως κύρια πηγή κυτταρικών ROS και τριφωσφορικής αδενοσίνης (ATP), τα μιτοχόνδρια είναι οι βασικοί ρυθμιστές των μηχανισμών που ελέγχουν την επιβίωση ή τον θάνατο των κυττάρων. Αφού επιβεβαιώθηκε ότι η ένωση βάσης Cu(BrHAP) 2 Schiff δεν είχε σημαντική αντιοξειδωτική ικανότητα σε καρκινικά κύτταρα HT-29 χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ORAC, αναλύθηκε η επαγωγή της παραγωγής ROS στα επεξεργασμένα κύτταρα. Σύμφωνα με τη μελέτη μας, μετά την έκθεση της ένωσης Cu(II) σε κύτταρα HT-29 και την ανάλυση των επιπέδων του ROS, αποδείχθηκε ότι το επίπεδο του ROS στα επεξεργασμένα κύτταρα HT-29 ήταν σημαντικά αυξημένο σε συγκέντρωση ένωσης 6,25 g/ mL. Στην απόπτωση που προκαλείται από μέταλλα, τα μιτοχόνδρια έχουν τον κρίσιμο ρόλο στη μεσολάβηση της απόπτωσης μέσω των ROS που προκαλούνται από μέταλλα [40] . Η εγγενής ή εξαρτώμενη από μιτοχόνδρια οδός σηματοδότησης περιλαμβάνει διαφορετικούς παράγοντες ερεθισμάτων που δεν προκαλούνται από υποδοχείς που επάγουν ενδοκυτταρικά σήματα. Αυτά τα σήματα, κυρίως μέσω της πρωτεΐνης p53, δρουν στα μιτοχονδριακά γεγονότα. Η υπερβολική παραγωγή ROS είναι ένα αρνητικό σήμα που μπορεί να οδηγήσει σε αποτυχία καταστολής των αντιαποπτωτικών παραγόντων, πυροδοτώντας έτσι την απόπτωση. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε φθορίζοντες ανιχνευτές δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης (MMP) για να εξετάσουμε την επίδραση της αυξημένης παραγωγής ROS στη λειτουργία των μιτοχονδρίων σε επεξεργασμένα κύτταρα HT-29. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7, οι αλλαγές στη ΜΜΡ μετά από επεξεργασία με την ένωση βάσης Cu(BrHAP) 2 Schiff που οδήγησαν στην εκπόλωση της μεμβράνης των μιτοχονδρίων καταδείχθηκαν με την απελευθέρωση Ροδαμίνης 123 στο κυτταρόπλασμα από τη μήτρα των μιτοχονδρίων. Το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι η επαγωγή απόπτωσης από σύμπλοκα βάσης Cu(II) Schiff μπορεί να σχετίζεται με τη μιτοχονδριακή οδό [26, 41, 42]. Ένα από τα σημαντικά σήματα για την έναρξη της διαδικασίας απόπτωσης είναι το κυτοσολικό κυτόχρωμα. Η απελευθέρωση του κυτοχρώματος στο κυτοσόλιο και η μείωση των επιπέδων του στα μιτοχόνδρια έχει αποδειχθεί ότι συμβαίνει ως αποτέλεσμα αλλαγών στη MMP [30] . Όπως φαίνεται από το αποτέλεσμα, η συνθετική ένωση βάσης Schiff οδήγησε επίσης σε αύξηση του επιπέδου του κυτοχρώματος στο κυτοσόλιο σε σύγκριση με τον έλεγχο. Η υπερβολική παραγωγή ROS από τα μιτοχόνδρια και η κατάρρευση του MMP μπορεί να ενεργοποιήσει τα κατάντη μόρια κασπάσης και κατά συνέπεια να οδηγήσει σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Μετά τη δέσμευση του κυτοχρώματος με τον αποπτωτικό παράγοντα ενεργοποίησης-1, η κασπάση-9 ενεργοποιείται μέσω σχηματισμού αποπτοσώματος, ο οποίος οδηγεί στην ενεργή κασπάση-3/7, την πιο αποτελεσματική κασπάση με πολλούς κυτταρικούς στόχους [43] . Στην εξωγενή οδό, η απόπτωση προκαλείται από υποδοχείς θανάτου. Για παράδειγμα, ο συνδέτης FAS αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα FAS, οδηγώντας στην ενεργοποίηση της κασπάσης-8 [44] . Η ενεργοποίηση της κασπάσης-8 διασπά και ενεργοποιεί τις μεταγενέστερες κασπάσεις, όπως η κασπάση-3/7 [45, 46]. Στη μελέτη μας, η ένωση βάσης σχιφ Cu(BrHAP) 2 προκάλεσε σημαντική αύξηση στις δραστηριότητες των κασπασών 3/7 και 9 σε σύγκριση με τον έλεγχο. Εν τω μεταξύ, δεν υπήρξε ενεργοποίηση της κασπάσης-8, υποδηλώνοντας ότι η απόπτωση που προκλήθηκε στα κύτταρα HT-29 προκλήθηκε μέσω της ενδογενούς μιτοχονδριακής οδού αλλά όχι της εξωγενούς οδού κασπάσης-8 που συνδέεται με τον υποδοχέα θανάτου. Τα υποστηρικτικά στοιχεία της απελευθέρωσης LDH, ROS η παραγωγή, η καταστολή MMP, η αύξηση του επιπέδου του κυτοχρώματος και η ενεργοποίηση των κασπασών 3/7 και 9 απέδειξαν την πολλά υποσχόμενη αντικαρκινική δράση της ένωσης βάσης Cu(BrHAP) 2 Schiff έναντι της κυτταρικής σειράς καρκίνου του παχέος εντέρου HT-29 μέσω της ενδογενούς μιτοχονδριακής οδού .", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 2641, "text": "καρκίνο του παχέος εντέρου" } ], "id": 5278, "question": "Ποιος είναι ο τρίτος πιο διαδεδομένος καρκίνος στις γυναίκες στις Ηνωμένες Πολιτείες;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2674, "text": "83,2%" } ], "id": 5279, "question": "Ποιο είναι το ποσοστό επιβίωσης ενός έτους για ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2684, "text": "64,3%" } ], "id": 5280, "question": "Ποιο είναι το ποσοστό 5ετούς επιβίωσης για ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου;" }, { "answers": [ { "answer_start": 17800, "text": "ανίχνευση πυρηνικής συμπύκνωσης" } ], "id": 5281, "question": "Πώς μετρήθηκαν οι πυρηνικές μορφολογικές αλλαγές στα κύτταρα HT-29;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Clara Cell 10 kDa Protein Alleviates Murine Hepatitis Virus Strain 3-Induced Fulminant Hepatitis by Inhibiting Fibrinogen-Like Protein 2 Expressionhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6300492/SHA: f0c2cd2793d71f1ea11a810442a2c06d5013e899Authors: Yu, Haijing; Liu, Yang; Wang, Hongwu; Wan, Xiaoyang; Huang, Jiaquan; Yan, Weiming; Xi, Dong; Luo, Xiaoping; Shen, Guanxin; Ning, QinDate: 2018-12-13DOI: 10.3389/fimmu.2018.02935Άδεια: cc-byAbstract: Ιστορικό: Η φλεγμονώδης ηπατίτιδα (FH) είναι μια σοβαρή απειλή για την ανθρώπινη ζωή, που συνοδεύεται από μαζική και ταχεία νεκροφλεγμονή. Τα κύτταρα Kupffer, ο κύριος πληθυσμός ανοσοκυττάρων που εμπλέκονται στις έμφυτες ανοσολογικές αποκρίσεις, θεωρούνται ότι είναι κεντρικά για την FH. Η πρωτεΐνη 2 που μοιάζει με ινωδογόνο (Fgl2) είναι μια προπηκτική πρωτεΐνη που επάγεται ουσιαστικά σε μακροφάγους μετά από ιογενή μόλυνση και η μείωση του Fgl2 καταστέλλει τη μόλυνση από τον ιό της ηπατίτιδας ποντικού στελέχους 3 (MHV-3). Η πρωτεΐνη Clara cell 10 kDa (CC10) είναι μια εκκριτική πρωτεΐνη με αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες στην αλλεργική ρινίτιδα και το άσθμα. Ωστόσο, οι μηχανισμοί δράσης και οι παθογόνοι ρόλοι του σε άλλες ασθένειες είναι ακόμη ασαφείς. Σε αυτή τη μελέτη, στοχεύσαμε να προσδιορίσουμε το ρόλο του CC10 στην FH και τη ρύθμιση του Fgl2 από το CC10. Μέθοδοι: Δημιουργήθηκε ένα μοντέλο FH ποντικού με περιτοναϊκή ένεση MHV-3. Τα ποντίκια έλαβαν πρωτεΐνη CC10 μέσω ένεσης στη φλέβα της ουράς πριν από την ιογενή μόλυνση. Εξετάστηκαν το ποσοστό επιβίωσης, η ηπατική λειτουργία, η ιστολογία του ήπατος, η εναπόθεση ινώδους και η νέκρωση. Η ρυθμιστική επίδραση του CC10 στην έκφραση του Fgl2 διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας κύτταρα THP-1 και περιτοναϊκά μακροφάγα ποντικού in vitro. Αποτελέσματα: Στο μοντέλο FH ποντικού που προκλήθηκε από MHV-3, το ποσοστό επιβίωσης αυξήθηκε από 0 σε 12,5% στην ομάδα CC10 σε σύγκριση με αυτό στην ομάδα ελέγχου μόνο με αλατούχο διάλυμα. Εν τω μεταξύ, τα επίπεδα ALT και AST στον ορό μειώθηκαν σημαντικά και η ηπατική βλάβη μειώθηκε. Επιπλέον, η ηπατική έκφραση Fgl2, TNF-α και IL-1β ήταν προφανώς μειωμένη μαζί με την εναπόθεση ινώδους και η απόπτωση των ηπατοκυττάρων μειώθηκε μετά τη χορήγηση της πρωτεΐνης CC10. In vitro, το CC10 βρέθηκε ότι αναστέλλει σημαντικά την έκφραση του Fgl2 σε κύτταρα THP-1 που έχουν υποστεί αγωγή με IFN-γ και περιτοναϊκά μακροφάγα ποντικού μολυσμένα με MHV-3 με στύπωμα western και PCR πραγματικού χρόνου. Ωστόσο, δεν υπήρξε άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ CC10 και Fgl2 όπως φαίνεται από την ταυτόχρονη ανοσοκαταβύθιση. Οι έρευνες μικροσυστοιχιών πρότειναν ότι ο μεταγραφικός παράγοντας 1 του κουτιού HMG (HBP1) ήταν σημαντικά χαμηλός σε κύτταρα ΤΗΡ-1 που είχαν υποστεί αγωγή με CC10 και με IFN-γ. Η θεραπεία με HBP1-siRNA ακύρωσε την ανασταλτική δράση του CC10 στην έκφραση Fgl2 σε ενδοθηλιακά κύτταρα ανθρώπινης ομφαλικής φλέβας (HUVECs). Συμπέρασμα: Το CC10 προστατεύει από FH που προκαλείται από MHV-3 μέσω καταστολής της έκφρασης Fgl2 σε μακροφάγους. Τέτοιες επιδράσεις μπορεί να διαμεσολαβούνται από τον μεταγραφικό παράγοντα HBP1. Κείμενο: Η κεραυνοβόλος ηπατίτιδα (FH) είναι μια σοβαρή απειλητική για τη ζωή ασθένεια που χαρακτηρίζεται από μαζική νέκρωση ηπατοκυττάρων, σοβαρή ηπατική βλάβη και υψηλή θνησιμότητα. Οι υποκείμενοι μηχανισμοί και η παθογένεια της FH δεν είναι ξεκάθαροι. Ωστόσο, συσσωρευμένα στοιχεία υποδηλώνουν ότι, ανεξάρτητα από την παθογένεια της FH, οι φλεγμονώδεις αποκρίσεις του ξενιστή συμβάλλουν σε διαταραχές και τραυματισμούς της μικροκυκλοφορίας του ήπατος. Συνεπώς, έχει αποδειχθεί ότι η ενεργοποίηση των ανοσοκυττάρων και οι φλεγμονώδεις κυτοκίνες παίζουν σημαντικό ρόλο στην FH (1) . Τα τελευταία χρόνια, το εργαστήριό μας διεξήγαγε εκτεταμένη έρευνα για την παθογένεση της FH και διαπίστωσε ότι τα κύτταρα του ανοσοποιητικού παίζουν βασικό ρόλο σε αυτήν. Κύτταρα Kupffer, κύτταρα φυσικού φονέα (NK) (2, 3), κυτταροτοξικά Τ-λεμφοκύτταρα (CTL) και διπλά αρνητικά Τ-κύτταρα (DNT) (4) (5) (6) στο ήπαρ και τις κυτοκίνες που παράγονται από Αυτά τα κύτταρα προκαλούν ηπατική βλάβη. Η προθρομβινάση Fgl2 ανήκει στην υπεροικογένεια του ινωδογόνου και παράγεται από ενεργοποιημένα μακροφάγα ή ενδοθηλιακά κύτταρα, μετατρέποντας την προθρομβίνη απευθείας σε θρομβίνη, έτσι ώστε να ξεκινήσει γρήγορα η διαδικασία της πήξης. Αυτό προάγει τη μετατροπή του ινωδογόνου σε ινώδες, με αποτέλεσμα τη θρόμβωση (7) (8) (9) (10) (11) (12) . Η μελέτη μας διαπίστωσε ότι το Fgl2 εκφραζόταν σε μεγάλο βαθμό σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) και σε ηπατικό ιστό ανθρώπων ή ποντικών με σοβαρή ιογενή ηπατίτιδα και σχετιζόταν θετικά με τη σοβαρότητα της νόσου (13, 14). Η γονιδιακή θεραπεία που στοχεύει τη σίγαση Fgl2 έδειξε ότι το ποσοστό επιβίωσης των ποντικών με κεραυνοβόλο ηπατίτιδα αυξήθηκε από 0 σε 33,3% (15) . Μέχρι στιγμής, η ανακάλυψη και η σχετική έρευνα που περιλαμβάνει το Fgl2 έχουν παράσχει νέες γνώσεις σχετικά με τον μοριακό μηχανισμό της ηπατοκυτταρικής νέκρωσης στην FH. Λαμβάνοντας υπόψη τον σημαντικό ρόλο του Fgl2 στη σοβαρή ιογενή ηπατίτιδα, οι έρευνες σχετικά με τη ρύθμιση του Fgl2 θα είναι ωφέλιμες στην αναζήτηση νέων στρατηγικών για τη θεραπεία της σοβαρής ηπατίτιδας. Η πρωτεΐνη Clara 10 kDa κυττάρων (CC10), που θεωρείται επίσης μητροσφαιρίνη, Clara κυτταροεκκριτική πρωτεΐνη, είναι ένα από τα μέλη της υπεροικογένειας εκκριτοσφαιρίνης. Εκφράζεται σε επιθηλιακά κύτταρα του βλεννογόνου οργάνων (συμπεριλαμβανομένων των πνευμόνων και της μύτης) που επικοινωνούσαν με τον έξω κόσμο (16) . Το CC10 έχει ανοσοτροποποιητικά και αντιφλεγμονώδη αποτελέσματα. Σε σύγκριση με ποντίκια άγριου τύπου, τα ποντίκια CC10-knockout εμφάνισαν υπερβολική φλεγμονή των αεραγωγών Συντομογραφίες: FH, κεραυνοβόλος ηπατίτιδα. MHV-3, στέλεχος 3 ιού ηπατίτιδας ποντικού; Fgl2, πρωτεΐνη τύπου ινωδογόνου 2; CC10, Clara cell 10 KDa πρωτεΐνη; ALF, οξεία ηπατική ανεπάρκεια. PFU, μονάδες σχηματισμού πλάκας. PBS, αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά; ALT, αμινοτρανσφεράση αλανίνης; AST, ασπαρτική αμινοτρανσφεράση; PCA, προπηκτική δράση. HRP, υπεροξειδάση χρένου; TUNEL, τελική επισήμανση άκρων δεοξυνουκλεοτιδυλικής τρανσφεράσης dUTP. που προκαλείται από αλλεργική αντίδραση και βακτηριακές και ιογενείς λοιμώξεις (17) . Τα μειωμένα επίπεδα του CC10 σχετίζονται με φλεγμονώδεις και αλλεργικές ασθένειες των αεραγωγών, συμπεριλαμβανομένης της ιγμορίτιδας, του άσθματος και της αλλεργικής ρινίτιδας (18) (19) (20) (21). αναστέλλει την έκφραση των σχετικών μορίων των δενδριτικών κυττάρων και των κυτοκινών σε ποντίκια με αλλεργική ρινίτιδα, αλλά μπορεί επίσης να αναστείλει την πρωτεΐνη 1 όπως η χιτοζάνη-3 (22, 23). Επιπλέον, το CC10 αναστέλλει την έκφραση ενός σημαντικού ανοσολογικού ρυθμιστή, της οστεοποντίνης (OPN), σε μοντέλα αλλεργικής ρινίτιδας (21). Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε το ρόλο του CC10 στο στέλεχος 3 (MHV-3) που προκαλείται από τον ιό της ηπατίτιδας FH σε ποντίκια και διερεύνησαν εάν η πρωτεΐνη CC10 θα μπορούσε να ρυθμίσει το Fgl2 στη διαδικασία της νόσου. Κρατήθηκαν θηλυκά ποντίκια BALB/cJ (Shanghai Shilaike Animal Seed Center, Shanghai, Κίνα), ηλικίας 6-8 εβδομάδων, με σωματικό βάρος 18,0-20,0 g στο Νοσοκομείο Tongji με φαγητό και νερό. Τα ποντίκια χωρίστηκαν σε δύο ομάδες: ομάδα CC10 (πειραματική ομάδα) και ομάδα φυσιολογικού ορού ρυθμισμένου με φωσφορικά (PBS) (ομάδα ελέγχου). Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις συστάσεις των κατευθυντήριων γραμμών των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας και της Επιτροπής Πειραμάτων με Ζώα του νοσοκομείου Tongji. Αυτή η μελέτη αναθεωρήθηκε και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Πειράματος Ζώων του νοσοκομείου Tongji. Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά μονοκυττάρων THP-1 αγοράστηκε από το Ινστιτούτο Κυττάρων της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Τα ενδοθηλιακά κύτταρα ανθρώπινης ομφαλικής φλέβας (HUVECs) ελήφθησαν από το Biology Treasure Center του Πανεπιστημίου Wuhan, Κίνα. Η κυτταρική σειρά ωοθηκών κινέζικου χάμστερ (CHO) αποκτήθηκε από την τυπική τράπεζα κυττάρων της επιτροπής συντήρησης καλλιέργειας, την Κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Τα ενδοθηλιακά κύτταρα ανθρώπινης ομφαλικής φλέβας (HUVECs) και τα κύτταρα CHO καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle's Dulbecco (DMEM) και τα κύτταρα THP-1 διατηρήθηκαν σε RPMI 1.640 που περιείχε 10% αδρανοποιημένο με θερμότητα εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS, Gibco USA Life Technologies), 100 U/mL πενικιλίνης και 100 mg/mL στρεπτομυκίνης και καλλιεργήθηκαν στους 37 • C, 50 mL/L CO 2 και 95% υγρασία. Περιτοναϊκά εξιδρωματικά μακροφάγα (PEMs) ελήφθησαν από ποντικούς BALB/cJ. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε RPMI 1.640 συμπληρωμένο με 10% FBS σε 1-2 × 106 κύτταρα/mL σε πλάκα 6 φρεατίων και επωάστηκαν για 4 ώρες. Στη συνέχεια πλύθηκαν με μέσο RPMI 1640 και τα μη προσκολλημένα κύτταρα απορρίφθηκαν. Τα προσκολλημένα κύτταρα ήταν μακροφάγα και επωάστηκαν για άλλες 12 ώρες. Τα περιτοναϊκά εξιδρωματικά μακροφάγα (PEMs) χωρίστηκαν σε δύο ομάδες. Η μία ομάδα συμπληρώθηκε με πρωτεΐνη CC10 (150 ng/mL) και στην άλλη ομάδα, προστέθηκε PBS. Μετά από 2 ώρες διέγερσης, 1.000 μονάδες σχηματισμού πλάκας (PFUs) MHV-3 προστέθηκαν στα κύτταρα, τα οποία στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 4 ώρες. Τα περιτοναϊκά εξιδρωματικά μακροφάγα (PEMs) συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε λύση για ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο και western blotting. Η κυτταρική απόπτωση ανιχνεύθηκε με τη μέθοδο τερματικής επισήμανσης άκρων της δεοξυνουκλεοτιδυλικής τρανσφεράσης dUTP (TUNEL) με κιτ ανίχνευσης απόπτωσης TUNEL (Roche, Switzerland). Εν συντομία, τμήματα 5 μm αποπαραφινώθηκαν, αφυδατώθηκαν μέσω μιας σειράς αλκοόλης και επωάστηκαν με πρωτεϊνάση Κ για 30 λεπτά στους 37 • C. Μετά τη διακοπή της αντίδρασης πέψης πρωτεϊνάσης Κ με PBS, τα δείγματα επωάστηκαν με κοκτέιλ τελικής επισήμανσης δεοξυνουκλεοτιδυλικής τρανσφεράσης (ένα μείγμα τερματικής δεοξυνουκλεοτιδυλ τρανσφεράσης και dUTP σε αναλογία 2:29, αντίστοιχα), για 2 ώρες στους 37 • C σε ένα υγρό κουτί ανοσοϊστοχημείας. Μετά την πλύση και τον αποκλεισμό, κάθε τμήμα συμπληρώθηκε με αντιδραστήριο (μετατροπέας-POD) για να καλύψει τους ιστούς και επωάστηκε για 30 λεπτά στους 37 • C σε ένα υγρό κουτί. Στη συνέχεια, τα τμήματα ιστού ήπατος πλύθηκαν με PBS και χρωματίστηκαν με διαμινοβενζιδίνη (DAB) στη συνέχεια. Ηπατοκύτταρα με πυρήνα χρωματισμένο με καστανοκίτρινο θεωρήθηκαν ως αποπτωτικά κύτταρα. Η έκφραση του Fgl2 σε κύτταρα ΤΗΡ-1 μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής (BD FACS Canto II, USA). Εν συντομία, τα κύτταρα (2 × 105 ανά σωλήνα) επωάστηκαν με Human TruStrain FcX (διάλυμα αποκλεισμού υποδοχέα Fc, BioLegend, ΗΠΑ) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια επωάστηκαν στο σκοτάδι με αντίσωμα ποντικού anti-Fgl2 (1:100, Abnova,) ή κανονικός ορός κατσίκας (ισότυπος έλεγχος) στους 4 • C για 40 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν στο σκοτάδι με αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG συζευγμένο με ΡΕ (1:50, BioLegend, ΗΠΑ) στους 4 • C για 30 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και επαναιωρήθηκαν σε 300 μL PBS για μελέτη. Οι ηπατικές φέτες σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και στη συνέχεια ενσωματώθηκαν σε παραφίνη. Η ανοσοϊστοχημεία των ιστών του ήπατος πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ ανίχνευσης SP-9001 SPlink (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) (ZSGB-BIO, Πεκίνο, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για χρώση ανοσοϊστοχημείας, η έκφραση του Fgl2, του ινωδογόνου, του Fas και του υποδοχέα TNF 1 σε ιστούς ήπατος ποντικού ανιχνεύθηκε με πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού κατά Fgl2 ποντικού (1:100, Proteintech, ΗΠΑ), πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού κατά ινωδογόνου ποντικού (11 :1.000, Abcam, EngLand), πολυκλωνικό αντίσωμα Fas αντιποντικού κουνελιού (1:50, Abcam, EngLand) και πολύκλωνο αντίσωμα 1 αντι-ποντικού TNF-υποδοχέα κουνελιού (1:500, Abcam, EngLand), αντίστοιχα. Μετά από επώαση με ένα κλάσμα IgG κατσίκας σημασμένο με υπεροξειδάση χρένου (HRP) σε IgG Fc κουνελιού, η πρωτεΐνη στόχος ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας κιτ DAB (ZSGB-BIO, Πεκίνο, Κίνα). Οι αντικειμενοφόρες πλάκες στη συνέχεια βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη και οπτικοποιήθηκαν υπό μικροσκόπιο (Olympus, Τόκιο, Ιαπωνία). Ο ιστός του ήπατος και τα κύτταρα ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RIPA με αναστολέα πρωτεάσης φαινυλομεθανοσουλφονυλοφθοριδίου (PMSF). Τα προϊόντα λύσης πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και πραγματοποιήθηκε αποτύπωση western χρησιμοποιώντας ένα μονόκλωνο ποντίκι κατά του ανθρώπου/ποντικού Fgl2 (1:750, Abnova), ενός μονοκλωνικού ποντικού κατά του ανθρώπου HBP1 (1:100, Santa Cruz, ΗΠΑ) και ενός μονοκλωνικού κουνελιού β-ακτίνη αντι-ανθρώπου/ποντικού (1:1.000, Cell Signaling Technology, USA). Συλλέχθηκαν ιστοί ήπατος από μολυσμένους με MHV-3 ποντικούς BALB/cJ στις 72 ώρες και το συνολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας Trizol Reagent (Invitrogen, Η.Π.Α. ) και στη συνέχεια μεταγράφεται αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας το κιτ ReverTra Ace qPCR RT (TOYOBO, Ιαπωνία). Το cDNA στη συνέχεια ενισχύθηκε με RT-PCR χρησιμοποιώντας Dream Taq Green PCR Master Mix (2 χ) (Thermo Scientific, USA). Πραγματοποιήθηκε ποσοτική PCR (qPCR) σε πραγματικό χρόνο με SYBR Green Real-time PCR Master Mix (TOYOBO, Ιαπωνία) χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανίχνευσης PCR σε πραγματικό χρόνο CFX96 (Bio-Rad, ΗΠΑ) και τα επίπεδα mRNA κανονικοποιήθηκαν σε σχέση με αυτά του σπιτιού διατήρηση του γονιδίου GAPDH. Οι αλληλουχίες εκκινητών για την ενίσχυση qPCR ήταν οι εξής: mTNF-α προς τα εμπρός, 5' -TTT GAG ATC CAT GCC GTT GG-3'; mTNF-α αντίστροφη, 5 '-GCCA CCA CGC TCT TCT GT-3'; mIL-1β προς τα εμπρός, 5 '-TGT AAT GAA AGA CGG CAC ACC-3'; mIL-1β αντίστροφη, 5 '-TCT TCT TTG GGT ATT GCT TGG-3'. mFgl2 προς τα εμπρός, 5 ′ -GCC AAA TGT GAG TCC CTG GAA-3 ′; mFgl2 αντίστροφη, 5 ′ -TTC CAC CCA AGA GCA CGT TTA AG-3 ′; hFgl2 προς τα εμπρός 5 ′ -ACA GTT CAG GCT GGT GGT-3 ′; hFgl2 αντίστροφη, 5 ′ -GGC TTA AAG TGC TTG GGT-3 ′; HBP1 προς τα εμπρός, 5 ′ -TGA AGC AGA AGC TGG GAGT-3 ′; Τα κύτταρα HBP1 αντίστροφα, ΤΗΡ-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng/ml 13-οξικής 12-μυριστικής φορβόλης (PMA) (Sigma, ΗΠΑ) για 48 ώρες για να προκληθεί διαφοροποίηση προς προσκολλημένα κύτταρα που μοιάζουν με μακροφάγους όπως αναφέρθηκε προηγουμένως (24). Η ομάδα CC10 συμπληρώθηκε με πρωτεΐνη CC10 (150 ng/ml). Μετά από 2 ώρες διέγερσης, προστέθηκε IFN-γ (10 ng/ml) σε αυτά τα κύτταρα, τα οποία στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 12 ώρες προτού συλλέχθηκαν για μελέτες Western blotting και PCR σε πραγματικό χρόνο. Τα κύτταρα ωοθηκών κινέζικου χάμστερ (CHO) καλλιεργήθηκαν σε δίσκους κυτταροκαλλιέργειας 10 cm με DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS μέχρι 80-90% συρροή. Στη συνέχεια, 12 μg pcDNA3.1-hFgl2 (που κατασκευάστηκαν στο εργαστήριό μας) αναμίχθηκαν με 12 μg pcDNA3.1-hCC10 σε DMEM χωρίς ορό. Το μίγμα στη συνέχεια συνδυάστηκε με Lipofectamine 2.000 (Invitrogen, USA) και αναμίχθηκε απαλά. Μετά από επώαση στους 27 • C για 20 λεπτά, το διάλυμα προστέθηκε σε κύτταρα CHO και επωάστηκε στους 37 • C σε 5% CO2. Τέσσερις έως έξι ώρες μετά τη διαμόλυνση, το μέσο απομακρύνθηκε και προστέθηκε φρέσκο ​​μέσο που περιείχε 10% FBS. Στις 48 ώρες μετά τη διαμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση συν-ανοσοκαθίζησης για να αξιολογηθεί η αλληλεπίδραση του CC10 με το Fgl2. Τόσο τα κύτταρα HUVEC όσο και τα THP-1 εκφράζουν fgl2. Ωστόσο, στα πειράματα επιμόλυνσης, είναι δύσκολο να επιμολυνθούν τα κύτταρα THP-1 με siRNA, επομένως χρησιμοποιούμε HUVEC αντί για THP-1. Ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφαλικής φλέβας (HUVECs) καλλιεργήθηκαν στο ΣΧΗΜΑ 1 | Η πρωτεΐνη CC10 αύξησε το ποσοστό επιβίωσης και μείωσε τη βλάβη του ήπατος στα ποντίκια. (Α) Το ποσοστό επιβίωσης της ομάδας CC10 είναι υψηλότερο από την ομάδα ελέγχου που αποτελείται από μολυσμένους με MHV-3 ποντικούς BALB/cJ που έλαβαν φυσιολογικό ορό. Πρωτεΐνη CC10 (2 μg) ή αλατούχο διάλυμα εγχύθηκε σε ποντικούς μέσω φλέβας ουράς. Τα ποντίκια BALB/cJ έλαβαν στη συνέχεια 100 PFU MHV-3 ενδοπεριτοναϊκά 24 ώρες αργότερα για να αναπτύξουν κεραυνοβόλο ιογενή ηπατίτιδα. Στη συνέχεια, πρωτεΐνη CC10 (2 μg) ή αλατούχο διάλυμα εγχύθηκε σε ποντικούς μέσω φλέβας ουράς μετά από μόλυνση MHV-3 24 ώρες αργότερα. Το ποσοστό επιβίωσης παρατηρήθηκε για 10 ημέρες (n = 24/ομάδα). Παρουσιάζονται αντιπροσωπευτικά δεδομένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η καμπύλη επιβίωσης αναλύθηκε με τη χρήση του Log-Rank Test. ***P < 0,001 σε σύγκριση με την ομάδα φυσιολογικού ορού. (Β) Ιστοπαθολογία των ηπατικών ιστών (χρώση Η&Ε. αρχική μεγέθυνση, × 400, n = 5/ομάδα) στις 72 ώρες μετά τη μόλυνση με MHV-3 αξιολογήθηκε στις δύο ομάδες ποντικών BALB/cJ μολυσμένων με MHV-3. Τα συκώτια συλλέχθηκαν από ποντίκια BALB/cJ που υποβλήθηκαν σε αγωγή με αλατούχο διάλυμα (α) και CC10 (β) στις 72 ώρες μετά τη μόλυνση με MHV-3. Τα βέλη δείχνουν σε περιοχές διήθησης φλεγμονωδών κυττάρων ή νεκρωτικές περιοχές με φλεγμονή. (Γ) Επίδραση του CC10 στα επίπεδα ALT και AST ορού (n = 6-8/ομάδα). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο και το τυπικό σφάλμα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. **P < 0,01 σε σύγκριση με την ομάδα αλατούχου πλακών έξι φρεατίων με DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS μέχρι 70-80% συρροή. 50 pmol HBP1-siRNA αναμίχθηκαν με 125 μΙ DMEM χωρίς ορό. Δύο μικρολίτρα Lipofectamine 2.000 αναμίχθηκαν απαλά με DMEM χωρίς ορό. Μετά από επώαση στους 27 • C για 5 λεπτά, το διάλυμα προστέθηκε σε HUVECs και επωάστηκε στους 37 • C. Τέσσερις ώρες μετά τη διαμόλυνση, το μέσο απομακρύνθηκε και προστέθηκε φρέσκο ​​μέσο που περιείχε 10% FBS. Στις 48 ώρες μετά τη διαμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για PCR σε πραγματικό χρόνο και ανάλυση στυπώματος western για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της HBP1 στο Fgl2. Στις 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση, η ομάδα CC10 συμπληρώθηκε με την πρωτεΐνη CC10 (150 ng/mL). Μετά από 4 ώρες διέγερσης, IFN-γ (10 ng/mL) προστέθηκε σε αυτά τα κύτταρα. Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες προτού συλλεχθούν για μελέτες PCR σε πραγματικό χρόνο για την αξιολόγηση των επιδράσεων του CC10 στο Fgl2 από το HBP1. Ο αρνητικός έλεγχος χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Για να ανιχνευθεί εάν υπήρχε πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ της πρωτεΐνης CC10 και του Fgl2, τα κύτταρα CHO επιμολύνθηκαν με pcDNA3.1-hCC10 και pcDNA3.1-hFgl2 για 48 ώρες. Κύτταρα που διαμολύνθηκαν με κενό πλασμίδιο pcDNA3.1 (ψευδή) χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι για τη διαμόλυνση γονιδίου CC10. Η ανοσοκατακρήμνιση και η ανοσοστύπωση διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας κιτ συν-ανοσοκατακρήμνισης Pierce (Pierce, USA). Οι ολικές πρωτεΐνες κυττάρων εκχυλίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (25). Οι πρωτεΐνες ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντίσωμα ποντικού κατά του ανθρώπου Fgl2 (1:500, Abnova). Για πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης, πραγματοποιήθηκε κηλίδωση Western με χρήση αντισωμάτων αντι-ανθρώπινης μητροσφαιρίνης αρουραίου/SCGB1A1 (1:750, R&D, ΗΠΑ) Frontiers in Immunology | www.frontiersin.org και αντίσωμα κατά του ανθρώπου Fgl2 ποντικού (1:500, Abnova). Το ισότυπο IgG1 αρουραίου ελέγχου χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας για πρωτογενή αντισώματα. Το γονίδιο της ανθρώπινης κωδικεύουσας περιοχής CC10, συμπεριλαμβανομένης μιας αλληλουχίας 389 bp, ενισχύθηκε από ομογενοποιημένο ανθρώπινο ιστό στροβίλου με RT-PCR. Σε αυτή τη μελέτη, οι αλληλουχίες των εκκινητών PCR για το CC10 ήταν οι εξής: hCC10-προς τα εμπρός, 5 '-CCC TCC ACC ATG AAA CTCG-3'; hCC10-αντίστροφη, 5 ′ -TGA GAT GCT TGT GGT TTA TTG AAG-3 ′ . Τα προϊόντα PCR κλωνοποιήθηκαν σε φορέα κλωνοποίησης pEASY-T1 (TransGEN, Πεκίνο, Κίνα) και στη συνέχεια υποκλωνοποιήθηκαν στη θέση HindIII/XbaI του φορέα pcDNA3.1 (Invitrogen, USA) για να σχηματίσουν πλασμίδια ευκαρυωτικής έκφρασης, ανάλυση pcDNA3.1-hCC10 ήταν Microarray. χρησιμοποιείται για τη διαλογή αλλαγών στα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης σε όλο το γονιδίωμα σε κύτταρα THP-1 με ή χωρίς πρωτεΐνη CC10. Οι αλλαγές σε περισσότερα από 47.000 πρότυπα έκφρασης ανθρώπινων γονιδίων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες γονιδίων Affymetrix (Human Genome U133 Plus 2.0) (CapitalBio Co., Ltd., Beijing, China). Τρία αντίγραφα χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση μικροσυστοιχιών. Τα δεδομένα που λαμβάνονται από τα πειράματα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SEM. Οι συγκρίσεις καμπύλης επιβίωσης πραγματοποιήθηκαν με τη δοκιμή Log Rank. Οι αναλύσεις πολλαπλών ομάδων για δεδομένα αξιολογήθηκαν με μονόδρομες αναλύσεις διακύμανσης. Πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις αποτελεσμάτων δύο ομάδων χρησιμοποιώντας το Student's t-test για να αξιολογηθεί η στατιστική σημασία των διαφορών. Τιμές Ρ < 0,05 έδειξαν σημασία. Για να δημιουργηθεί ένα ζωικό μοντέλο FH ποντικού, το MHV-3 εγχύθηκε ενδοπεριτοναϊκά σε ποντικούς BALB/cJ (24 ποντίκια/ομάδα). Για περαιτέρω μελέτη του ρόλου του CC10 στην FH, ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη CC10 ποντικού (2 μg/ποντικό) ή αλατούχο ορό χορηγήθηκε στην ουραία φλέβα 24 ώρες πριν από τη μόλυνση με MHV-3. Η ίδια δόση πρωτεΐνης CC10 ή φυσιολογικού ορού χορηγήθηκε στη συνέχεια 24 ώρες αργότερα. Το ποσοστό επιβίωσης των ομάδων CC10 και φυσιολογικού ορού παρατηρήθηκε για 10 ημέρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα ποντίκια στις δύο ομάδες άρχισαν να πεθαίνουν στις 48 ώρες μετά την ένεση του MHV-3 και εμφάνισαν συμπτώματα τρόμου, αργής δραστηριότητας και μειωμένης κατανάλωσης τροφής. Στην ομάδα CC10 24 ποντίκια ήταν ζωντανά την 3η ημέρα μετά τη μόλυνση, 4 ποντίκια ζωντανά την 4η ημέρα και 3 από τα 24 (12,5%) ποντίκια ανάρρωσαν από κεραυνοβόλο ιογενή ηπατίτιδα. Ταυτόχρονα, στην ομάδα που έλαβε φυσιολογικό ορό, υπήρχαν 5 ποντίκια ζωντανά την 3η ημέρα, 1 ποντίκι ζωντανά την 4η ημέρα μετά τη μόλυνση και κανένα ποντίκι δεν επέζησε μέχρι την 5η ημέρα. Δηλαδή, τα ποντίκια στην ομάδα φυσιολογικού ορού πέθαναν μέσα σε 3 ή 4 ημέρες. Τρία από τα 24 (12,5%) ποντίκια της ομάδας CC10 ανάρρωσαν από κεραυνοβόλο ιογενή ηπατίτιδα (Εικόνα 1Α). Για την καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών που κρύβονται πίσω από τις βιολογικές επιδράσεις της πρωτεΐνης CC10, η ηπατική λειτουργία (επίπεδα ALT και AST στον ορό) και η ιστολογία του ήπατος σε διεξήχθη ποντίκια μολυσμένων με MHV-3. Οι ιστοί του ήπατος συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά τη μόλυνση με MHV-3 και η ιστολογία του ήπατος ανιχνεύθηκε με χρώση Η&Ε. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπήρχε σημαντική διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων και εκτεταμένη νέκρωση ηπατοκυττάρων στον ηπατικό ιστό των ποντικών της ομάδας αλατούχου ορού (Εικόνα 1Ba). Υπήρχαν σπάνια ή καθόλου διηθητικά φλεγμονώδη κύτταρα και λίγες ή καθόλου νέκρωση ηπατοκυττάρων στα ήπατα ποντικών στην ομάδα CC10 72 ώρες μετά τη μόλυνση με MHV-3 (Εικόνα 1Bb). Τα επίπεδα ALT και AST ορού σε ποντικούς παρατηρήθηκαν 72 ώρες μετά τη μόλυνση με MHV-3. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα ALT και AST ορού στην ομάδα φυσιολογικού ορού έφθασαν στο μέγιστο 72 ώρες μετά τη μόλυνση με MHV-3, αλλά δεν υπήρξε σημαντική αύξηση στην ομάδα CC10 σε σύγκριση με τα επίπεδα στην ομάδα ελέγχου (P <0,01, Εικόνα 1C) . Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η πρωτεΐνη CC10 έχει ρόλο στην προστασία έναντι της ηπατικής βλάβης που προκαλείται από MHV-3 σε ποντίκια. Για να διευκρινιστούν περαιτέρω οι μηχανισμοί μειωμένης ηπατικής βλάβης μετά από ένεση πρωτεΐνης CC10, ερευνήσαμε την έκφραση των κυτοκινών TNF-α και IL-1β. Επειδή αυτές οι δύο κυτοκίνες παίζουν κρίσιμο ρόλο στην ηπατική βλάβη της FH. Χαρακτηρίζονται από αύξηση της απόπτωσης. Τα επίπεδα TNF-α και IL-1β στους ιστούς του ήπατος μειώθηκαν σημαντικά στην ομάδα CC10 (όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α). Η ηπατική απόπτωση (Εικόνα 2Β) μειώθηκε σημαντικά στην ομάδα CC10. Εμείς και οι συνεργάτες μας έχουμε μακροχρόνιο ενδιαφέρον να μελετήσουμε το ρόλο του fgl2 στην ιογενή ηπατίτιδα. Το Fgl2 έχει επαληθευτεί ότι παίζει ουσιαστικό ρόλο στην εξέλιξη της κεραυνοβόλο ιογενή ηπατίτιδα, όπως εκτιμούμε από προηγούμενες αναφορές. Παρέχουμε στοιχεία για την παθολογία του ήπατος και τη λειτουργία του ήπατος για μολυσμένα με MHV-3 ποντίκια με νοκ-άουτ γονιδίου fgl2, όπως φαίνεται στο Συμπληρωματικό Σχήμα 1. Τα δεδομένα ήταν συγκρίσιμα με προηγούμενες αναφορές από το κέντρο και τους συνεργάτες μας. Από αυτήν την τρέχουσα μελέτη δείξαμε ότι το CC10 παίζει προστατευτικό ρόλο στην ηπατική βλάβη. Για να μελετήσουμε τα σχετικά μόρια του CC10 σε ποντίκια FH που προκλήθηκαν από MHV-3, αξιολογήσαμε εάν υπήρχε διαφωνία μεταξύ Fgl2 και CC10. Βρήκαμε ότι η έκφραση του Fgl2 στο ήπαρ ποντικών μειώθηκε 72 ώρες μετά τη μόλυνση με MHV-3 και τη θεραπεία με πρωτεΐνη CC10 (Εικόνες 3Α, Β). Επιπλέον, η εναπόθεση ινώδους, ένας δείκτης ηπατικής βλάβης που σχετίζεται με την έκφραση Fgl2 στην FH, μειώθηκε επίσης στα συκώτια ποντικών που υποβλήθηκαν σε αγωγή με CC10 σε σύγκριση με εκείνη των μαρτύρων (Εικόνα 3C). Αυτό δείχνει ότι η θεραπεία με CC10 μείωσε τη βλάβη του ήπατος μετά από ιογενή λοίμωξη αναστέλλοντας την έκφραση Fgl2. Εξετάσαμε την επίδραση των αυξανόμενων δόσεων πρωτεΐνης CC10 (0, 50, 150 και 300 ng/mL) στην επαγόμενη από IFN-γ έκφραση Fgl2 σε THP- 1 κύτταρα. Η θεραπεία με CC10 έδειξε μείωση 10,1% στα κύτταρα THP-1 σε σύγκριση με εκείνη στον έλεγχο μετά από διέγερση με 10 ng/mL IFN-γ για 12 ώρες. Η πρωτεΐνη CC10 ανέστειλε την έκφραση Fgl2 μεταξύ δόσεων 0 ng/mL και 300 ng/mL (Εικόνα 4Α). Συγκεκριμένα, 150 ng/mL πρωτεΐνης CC10 είχε την ισχυρότερη ανασταλτική επίδραση στην έκφραση του Fgl2 μεταξύ των δόσεων και επιλέξαμε αυτή τη δόση για τα ακόλουθα πειράματα. Εξερευνήσαμε την επίδραση διαφορετικών χρονικών σημείων διέγερσης με συγκέντρωση 150 ng/mL πρωτεΐνης CC10. Μετά από διέγερση με πρωτεΐνη CC10 για 6, 12 και 24 ώρες σε σύγκριση με τον έλεγχο PBS, το ισχυρότερο ανασταλτικό αποτέλεσμα στην έκφραση του Fgl2 σημειώθηκε στις 12 ώρες. Ως εκ τούτου, επιλέξαμε αυτό το χρονικό σημείο για τις ακόλουθες μελέτες (Εικόνα 4Β). Ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών υποδηλώνει ότι τα μακροφάγα είναι η κύρια πηγή του Fgl2. Προκειμένου να επιβεβαιωθεί ότι το CC10 έχει άμεση επίδραση στα μακροφάγα, επεξεργαστήκαμε κύτταρα THP-1 με ανασυνδυασμένο CC10 και αξιολογήσαμε την έκφραση του Fgl2. Σε αντίθεση με τους ελέγχους, η IFN-γ προκάλεσε σημαντική αύξηση στην έκφραση του Fgl2. Αυτό το αποτέλεσμα μειώθηκε όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πρωτεΐνη CC10 (Εικόνες 4C, D), αποκαλύπτοντας ότι το CC10 μειώνει άμεσα τα επίπεδα του Fgl2 στα μακροφάγα. Για να διερευνήσουμε περαιτέρω την πιθανότητα ότι η πρωτεΐνη CC10 δρα απευθείας στα μακροφάγα, μολύναμε PEM ποντικού με MHV-3 παρουσία ανασυνδυασμένου CC10 και προσδιορίσαμε την έκφραση Fgl2. Σε σύγκριση με τα επίπεδα στους μάρτυρες, τα μακροφάγα μολυσμένα με MHV-3 εμφάνισαν σημαντική αύξηση στην παραγωγή Fgl2 και αυτό το αποτέλεσμα καταργήθηκε με τη χρήση πρωτεΐνης CC10 (Εικόνες 5Α, Β), υποδεικνύοντας ότι το CC10 ρυθμίζει άμεσα την παραγωγή Fgl2 στα μακροφάγα. Προκειμένου να προσδιοριστούν τα γονίδια που ρυθμίστηκαν προς τα κάτω μετά από διέγερση από την πρωτεΐνη CC10, χρησιμοποιήσαμε ανάλυση μικροσυστοιχίας DNA για να εξετάσουμε για διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια. Κύτταρα ΤΗΡ-1 καλλιεργήθηκαν και προστέθηκε ΡΜΑ για να προκληθεί διαφοροποίηση σε μακροφάγους. Η παραγωγή του Fgl2 διεγέρθηκε από την IFNγ. Η πειραματική ομάδα υποβλήθηκε σε θεραπεία με πρωτεΐνη CC10 για ανίχνευση μικροσυστοιχιών διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα πιο προφανώς υπορυθμισμένα γονίδια ήταν τα UBE2W, HECTD1, MIR612, ATRX, SOX4, HBP1 και Fgl2 (Συμπληρωματικός Πίνακας 1). Και στη συνέχεια αυτά τα γονίδια δοκιμάστηκαν με qPCR. Ωστόσο, τα UBE2W, HECTD1, MIR612, ATRX και SOX4 δεν εκφράστηκαν διαφορετικά από το qPCR, ενώ τα HBP1 και fgl2 εξακολουθούσαν να είναι γονίδια που ρυθμίζονται προς τα κάτω. Η ανάλυση μικροσυστοιχίας DNA αναγνώρισε το HBP1 ως ένα γονίδιο που ρυθμίζεται προς τα κάτω που εμπλέκεται στις παθολογικές διεργασίες της ρύθμισης του CC10. Πρόσφατα, πολύ περιορισμένες μελέτες έχουν διερευνήσει το ρόλο του HBP1 στην FH. Ωστόσο, οι μηχανιστικές λειτουργίες του HBP1 στο FH παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητες. Ως εκ τούτου, επιλέξαμε αυτό το γονίδιο για περαιτέρω μελέτη. Η ανάλυση qPCR επιβεβαίωσε ότι τα επίπεδα mRNA της HBP1 μειώθηκαν σημαντικά στα κύτταρα THP-1 μετά από διέγερση με πρωτεΐνη CC10 σε σύγκριση με εκείνη στην ομάδα ελέγχου PBS (Εικόνα 6Α). Καταρρίψαμε το HBP1 χρησιμοποιώντας HBP1-siRNA. Στη συνέχεια, η επιμόλυνση του HBP1-SiRNA σε HUVECs ανιχνεύθηκε με μεθόδους qPCR και western-blotting. Όπως αναμενόταν, η αναστολή της HBP1 οδήγησε σε σημαντικά μειωμένη έκφραση της HBP1 (Εικόνες 6Β, Γ). Περαιτέρω, η μείωση του HBP1 μείωσε την έκφραση του Fgl2 (Εικόνα 6D), υποδηλώνοντας ότι η HBP1 ήταν ικανή να ενεργοποιήσει το Fgl2. Το HBP1-SiRNA χρησιμοποιήθηκε για τη διαμόλυνση των HUVECs. Στη συνέχεια, προστέθηκε ΙΡΝ-γ για να επάγει την έκφραση του Fgl2 ακολουθούμενη από διέγερση με πρωτεΐνη CC10 (150 ng/ml) μετά από 2 ώρες. Τέλος, διερευνήσαμε την έκφραση του Fgl2 με qPCR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία με HBP1-SiRNA ακύρωσε την ανασταλτική επίδραση του CC10 στην έκφραση Fgl2 σε HUVECs (Εικόνα 7). Δηλαδή, το CC10 θα μπορούσε να καταστείλει την έκφραση Fgl2 σε μακροφάγους. Ένα τέτοιο αποτέλεσμα μπορεί να προκαλείται από τον μεταγραφικό παράγοντα HBP1. Είναι ευρέως γνωστό ότι η πρωτεΐνη CC10 μπορεί να καταστείλει την ανοσολογική απόκριση. Σε ζωικά μοντέλα αλλεργικών ασθενειών της αναπνευστικής οδού, τα περισσότερα στοιχεία επιβεβαιώνουν αυτή την αναστολή (26) . Η λειτουργία του στο FH δεν έχει ακόμη διερευνηθεί. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο FH ποντικού που καθιερώθηκε από μόλυνση MHV-3 για να διερευνήσουμε τα αποτελέσματα του CC10 σε αυτή τη διαδικασία ασθένειας. Για να προσδιοριστεί ο ρόλος του CC10 στην παθογένεση της FH, η πρωτεΐνη CC10 εγχύθηκε σε ένα μοντέλο FH ποντικού που δημιουργήθηκε με μόλυνση MHV-3. Ηπατική βλάβη που προκαλείται από MHV-3 σε ποντίκια που έλαβαν CC10 εμφανίστηκε σπάνια και οι περιοχές των βλαβών ήταν πολύ λιγότερες από εκείνες σε ποντικούς ελέγχου που έλαβαν αγωγή με φυσιολογικό ορό. Συνοπτικά, αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι το CC10 θα μπορούσε να μειώσει την παθολογική ηπατική βλάβη σε αυτό το μοντέλο FH μαζί με χαμηλότερα ποσοστά θνησιμότητας ακολουθούμενα από μόλυνση από MHV-3. Η κεραυνοβόλος ιογενής ηπατίτιδα που προκαλείται από MHV-3 εξελίσσεται γρήγορα και τα μολυσμένα ποντίκια πεθαίνουν μέσα σε 3-5 ημέρες. Προηγούμενες μελέτες πρότειναν ότι το fgl2 έπαιξε ζωτικό ρόλο σε αυτή τη διαδικασία με 15-40% αύξηση της επιβίωσης όταν το fgl2 διαγράφηκε (12, 15, 27, 28) . Πολλαπλοί φλεγμονώδεις παράγοντες ή μεσολαβητές, συμπεριλαμβανομένων των TNF-α και IFN-γ, IL-1β και C5aR έχουν αποδειχθεί ότι προάγουν την εξέλιξη της FH με σημαντικές αποκλίσεις μεταξύ ηπατικής βλάβης και ποσοστού επιβίωσης (29) (30) (31) (32), που είναι σύμφωνα με την παρατήρησή μας ότι το CC10 ανακούφισε ουσιαστικά την ηπατική βλάβη αν και το ποσοστό επιβίωσης βελτιώθηκε ήπια. Το ποσοστό επιβίωσης με βάση τις ώρες μπορεί να είναι πιο ακριβές για την εξέταση της επίδρασης του CC10 στην FH. Εικάζεται ότι το fgl2 μπορεί να μεσολαβήσει στη θνησιμότητα σε FH που προκαλείται από MHV-3. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι το fgl2 επάγει την εναπόθεση ινωδογόνου, η οποία οδηγεί στην ενεργοποίηση του καταρράκτη πήξης και στην επαγωγή της προπηκτικής δραστηριότητας (15) . Για να προσδιοριστεί εάν η νέκρωση του ιστού προκλήθηκε από το Fgl2 σε ποντίκια που έλαβαν CC10 μετά από μόλυνση, παρατηρήθηκε έκφραση Fgl2. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση του Fgl2 ήταν σημαντικά αυξημένη σε ποντίκια FH που προκλήθηκαν από MHV-3 και η θεραπεία με CC10 μείωσε σημαντικά την παραγωγή Fgl2 στο μολυσμένο ήπαρ και στον ορό. Επιπλέον, μειωμένη εναπόθεση ινωδογόνου παρατηρήθηκε επίσης στα ήπατα ποντικών που έλαβαν CC10. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα της έρευνάς μας διευκρινίζουν έντονα ότι η χαμηλότερη θνησιμότητα των ποντικών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με CC10 μετά τη μόλυνση με MHV-3 οφείλεται στα χαμηλότερα επίπεδα Fgl2 και στη μειωμένη εναπόθεση ινωδογόνου. Πράγματι, έχει αναφερθεί ότι το Fgl2 εκφράζεται σε μακροφάγα και η έκφραση του Fgl2 πιστεύεται ότι επάγεται από IFN-γ και TNF-α (22). Καλλιεργημένα κύτταρα THP-1 που ενεργοποιούνται από IFN-γ ή IL-2 έχουν αποδειχθεί, με επαγωγή έκφρασης Fgl2 και ενισχυμένη ενεργοποίηση ανθρώπινης προθρομβίνης (23) . Επομένως, σε αυτή τη μελέτη, εξερευνήσαμε αυτήν την κυτταρική σειρά για να διερευνήσουμε τη διαμόρφωση του CC10 στο Fgl2. Παραδόξως, βρήκαμε ότι το CC10 ανέστειλε άμεσα την επαγόμενη από IFN-γ έκφραση Fgl2 σε κύτταρα ΤΗΡ-1. Όπως γνωρίζουμε, η IFN-γ έχει αποδειχθεί ότι είναι η κύρια κυτοκίνη που οδηγεί στην ανάπτυξη και εξέλιξη της FH. Επίσης, αποδείχθηκε ότι η IFN-γ μπορεί να ασκήσει τη δική της προφλεγμονώδη βιολογική λειτουργία μέσω της ενίσχυσης της έκφρασης Fgl2. Επομένως, στη μελέτη μας, το CC10 μπορεί να αντισταθμίσει την επίδραση της IFN-γ στη ρύθμιση της FH, γεγονός που τεκμηριώνει τον ρόλο της στην FH. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το CC10 ρυθμίζει την έκφραση του Fgl2 σε μακροφάγους. Στην τρέχουσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε συν-ανοσοκαθίζηση για να αναλύσουμε τη σύνδεση μεταξύ CC10 και Fgl2. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε πιθανές αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης μεταξύ CC10 και Fgl2 in vitro. Τα κύτταρα ωοθήκης κινέζικου χάμστερ (CHO) επιμολύνθηκαν με pcDNA3.1-hCC10 και pcDNA3.1-hFgl2. Οι κυτταρικές πρωτεΐνες ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντίσωμα αντι-CC10 ή αντίσωμα αντι-Fgl2. Η ανοσοστύπωση πραγματοποιήθηκε με αντισώματα αντι-Fgl2 και αντι-CC10. Η ανοσοκατακρήμνιση εκχυλισμάτων πρωτεΐνης από pcDNA 3.1-CC10 και pcDNA3.1-Fgl2 συν-επιμολυσμένα κύτταρα CHO με αντίσωμα anti-Fgl2 ή αντι-CC10 που ακολουθείται από στύπωμα western με αντισώματα Fgl2 και CC10 έδειξε ότι το CC10 δεν συν-ανοσοποιούσε, εμφανίζοντας F2cipl ότι δεν υπάρχει άμεση σχέση μεταξύ CC10 και Fgl2 (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το CC10 δεν έχει άμεση αλληλεπίδραση με το Fgl2. Από την προηγούμενη μελέτη μας, το γονίδιο του fgl2 συνέβαλε σε μεγάλο βαθμό στην επαγόμενη από τον MHV-3 κεραυνοβόλο ηπατίτιδα και εκφράζεται εκτενώς σε μακροφάγα και ενδοθήλιο (12, 33). Η μικροσυστοιχία μας έδειξε μια CC10 προς τα κάτω ρυθμισμένη έκφραση fgl2 και αυτό επιβεβαιώνεται περαιτέρω με qPCR και στύπωμα Western in vivo (περιτοναϊκά μακροφάγα) και in vitro (THP-1, κυτταρική σειρά μακροφάγων). Επομένως, είναι λογικό να εστιάσουμε στα μακροφάγα για να εμφανίσουμε την επίδραση του CC10 στην έκφραση fgl2 και τελικά στην επιβίωση των ποντικών. Συμφωνούμε απόλυτα ότι μπορεί να υπάρχουν άλλες πιθανότητες για μια προστατευτική δράση του CC10 να συμβάλει στη διαδικασία της νόσου. Αυτό αξίζει περαιτέρω μελέτες. Ο πιθανός υποδοχέας του CC10 δεν έχει αποκαλυφθεί ακόμη. Η προηγούμενη μελέτη μας είχε δείξει ότι το CC10 έχει επίδραση των δενδριτικών κυττάρων στην αλλεργική ρινίτιδα (34) . Σε αυτήν την έρευνα, αξιολογήσαμε την επίδραση του CC10 στις λειτουργίες των μακροφάγων και βρήκαμε ότι το Fgl2 ήταν ουσιαστικά μειωμένο κατά τη θεραπεία με CC10, επομένως, εικάζουμε ότι ο πιθανός υποδοχέας CC10 μπορεί επίσης να εκφράζεται σε μακροφάγα. Ο πιθανός στόχος του CC10 σε άλλα κύτταρα του ανοσοποιητικού δεν μπορεί να αποκλειστεί. Η ανάλυση μικροσυστοιχίας DNA είναι μια από τις πιο ισχυρές προσεγγίσεις για την πιθανή ταυτοποίηση απροσδόκητων γονιδίων που εμπλέκονται σε παθογόνες διεργασίες. Με τη χρήση αυτής της προσέγγισης, ο μεταγραφικός παράγοντας 1 HMGbox (HBP1) βρέθηκε ότι είναι ένα από τα πιο ρυθμισμένα γονίδια μετά την αγωγή με CC10 των κυττάρων THP-1. Το HBP1 είναι ένας καλά περιγραφόμενος μεταγραφικός καταστολέας που ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Σε μια πρόσφατη μελέτη, διαπιστώθηκε ότι η HBP1 είναι άμεσος στόχος του miR-21 και επιβεβαίωσε ότι η HBP1 ρυθμίζει την ανασταλτική λειτουργία του miR-21-ASO στην ηπατοστεάτωση και την καρκινογένεση ταυτόχρονα (23) . Η HBP1 είναι ένας ενδογενής αναστολέας της οδού σηματοδότησης Wnt τόσο στα φυσιολογικά όσο και στα καρκινικά κύτταρα. Ο ογκοκατασταλτικός ρόλος της HBP1 έχει αναφερθεί σε ορισμένες κακοήθειες, όπως ο καρκίνος του στόματος και το γλοίωμα (35). Ωστόσο, η συσχέτιση μεταξύ HBP1 και Fgl2 δεν έχει διερευνηθεί ακόμη. Η τρέχουσα μελέτη έδειξε ξεκάθαρα ότι το CC10 προστατεύει από FH που προκαλείται από MHV-3 μέσω καταστολής της έκφρασης Fgl2. Τέτοιες επιδράσεις μπορεί να προκαλούνται από την HBP1. Ωστόσο, η λειτουργική κατάσταση του HBP1 στο μονοπάτι CC10 απαιτεί περαιτέρω έρευνα και τέτοιες μελέτες διεξάγονται στο εργαστήριό μας. Συμπερασματικά, δείξαμε ότι το CC10 θα μπορούσε να περιορίσει την ανοσοπαθολογική βλάβη σε ποντίκια FH που προκαλούνται από MHV-3. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι η ενίσχυση της έκφρασης CC10 με μια ανοσοθεραπευτική προσέγγιση μπορεί να είναι μια αποτελεσματική θεραπεία για το FH.HY που πραγματοποίησε όλα τα περιγραφόμενα πειράματα και έγραψε το χειρόγραφο. Ο YL βοήθησε σε ορισμένα πειράματα, ανέλυσε πειραματικά αποτελέσματα και επεξεργάστηκε το χειρόγραφο. Η HW ανέλυσε πειραματικά αποτελέσματα. Ο XW εξέτασε και επεξεργάστηκε το χειρόγραφο. Οι JH, WY, DX, XL, GS και QN παρείχαν πειραματική βοήθεια και σχεδιασμό.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 792, "text": "μια προπηκτική πρωτεΐνη" } ], "id": 5292, "question": "Τι είναι η πρωτεΐνη 2 που μοιάζει με ινωδογόνο (FgI2);" }, { "answers": [ { "answer_start": 3108, "text": "μια σοβαρή απειλητική για τη ζωή ασθένεια που χαρακτηρίζεται από μαζική νέκρωση ηπατοκυττάρων" } ], "id": 5295, "question": "Τι είναι η κεραυνοβόλος ηπατίτιδα;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Στοιχεία για το μοντέλο σύγκλισης: Η εμφάνιση της γρίπης των πτηνών υψηλής παθογονικότητας (H5N1) στο Βιετνάμ Fox, Jefferson; Epprecht, Michael; Tran, Chinh C.; Nong, Duong H.; Spencer, James H.; Nguyen, Lam; Finucane, Melissa L.; Tran, Vien D.; Wilcox, Bruce A.Date: 2015-09-23DOI: 10.1371/journal.pone.0138138License: cc-byAbstract: Βασιζόμενη σε μια σειρά πρωτοποριακών κριτικών που για πρώτη φορά καθόρισαν και επέστησαν την προσοχή στις αναδυόμενες μολυσματικές ασθένειες (EID), το «convergence» μοντέλο» προτάθηκε για να εξηγήσει την πολυπαραγοντική αιτιότητα της εμφάνισης της νόσου. Το μοντέλο υποθέτει σε γενικές γραμμές ότι η εμφάνιση της νόσου καθοδηγείται από τη συνύπαρξη γενετικών, φυσικών περιβαλλοντικών, οικολογικών και κοινωνικών παραγόντων. Αναπτύξαμε και δοκιμάσαμε ένα μοντέλο εμφάνισης του H5N1 της γρίπης των πτηνών υψηλής παθογονικότητας (HPAI) με βάση πιθανούς παράγοντες σύγκλισης που σχετίζονται κυρίως με την αλλαγή χρήσης γης. Βασιζόμενοι σε προηγούμενες γεωχωρικές στατιστικές μελέτες που εντόπισαν φυσικούς και ανθρώπινους παράγοντες κινδύνου που σχετίζονται με την αστικοποίηση, προσθέσαμε νέους παράγοντες για να ελέγξουμε εάν οι αιτιακοί μηχανισμοί και τα παθογόνα τοπία θα μπορούσαν να εντοπιστούν πιο συγκεκριμένα. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η αστικοποίηση συνδυάζει χωροταξικά παράγοντες κινδύνου για την παραγωγή συγκεκριμένων τύπων περιαστικών τοπίων με σημαντικά υψηλότερο κίνδυνο εμφάνισης HPAI H5N1. Η εργασία υπογραμμίζει ότι οι περιαστικές περιοχές του Βιετνάμ έχουν υψηλότερα επίπεδα πυκνότητας κοτόπουλων, ποικιλίες μεγέθους κοπαδιού πάπιων και χήνων και κλάσμα της γης με ρύζι ή υδατοκαλλιέργεια από τις αγροτικές και τις αστικές περιοχές. Βρήκαμε επίσης ότι η ποικιλομορφία χρήσης γης, ένα υποκατάστατο μέτρο για πιθανή ανάμειξη πληθυσμών ξενιστών και άλλων παραγόντων που πιθανώς επηρεάζουν τη μετάδοση του ιού, βελτιώνει σημαντικά την προβλεψιμότητα του μοντέλου. Ομοίως, τοπία όπου αλληλεπικαλύπτονται εντατικές και εκτεταμένες μορφές παραγωγής πουλερικών βρέθηκαν σε μεγαλύτερο κίνδυνο. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την υπόθεση της σύγκλισης γενικά και καταδεικνύουν τη δυνατότητα βελτίωσης της πρόληψης και ελέγχου της EID συνδυάζοντας τη γεωχωρική παρακολούθηση αυτών των παραγόντων μαζί με τα προγράμματα επιτήρησης παθογόνων. Ως νέα κατηγορία μικροβιακών απειλών, η αέναη και απροσδόκητη φύση της εμφάνισης μολυσματικών ασθενειών παραμένει πρόκληση, παρά τις σημαντικές προόδους της κλινικής και βιοϊατρικής έρευνας [2] . Η υψηλής παθογονικότητας γρίπη των πτηνών (HPAI) (υπότυπος H5N1) είναι η πιο σημαντική νεοεμφανιζόμενη πανδημική ασθένεια μετά το HIV/AIDS. Η έκρηξή του στη Νοτιοανατολική Ασία το 2003-4 και η επακόλουθη εξάπλωση του παγκοσμίως σε περισσότερες από 60 χώρες ταιριάζει με τον σύνθετο ορισμό των συστημάτων της «έκπληξης» [3] . Την ίδια χρονιά που ο ΔΟΜ είχε δημοσιεύσει την τελική του έκθεση για τις μικροβιακές απειλές, η οποία υπογράμμιζε την επιτυχή καταπολέμηση του H5N1 στο Χονγκ Κονγκ το 1997 [4] , μαζικά κρούσματα εμφανίστηκαν στη Νοτιοανατολική Ασία όπου παραμένει ενδημικό, μαζί με το Δέλτα του Νείλου της Αιγύπτου. Από το 2003, ο HPAI H5N1 έχει σκοτώσει εκατομμύρια πουλερικά σε χώρες σε όλη την Ασία, την Ευρώπη και την Αφρική και 402 άνθρωποι έχουν πεθάνει από αυτό σε δεκαέξι χώρες σύμφωνα με στοιχεία του ΠΟΥ από τον Ιανουάριο του 2015. Η απειλή μιας πανδημίας που θα οδηγήσει σε εκατομμύρια ανθρώπινα κρούσματα παγκοσμίως παραμένει μια πιθανότητα [5] .Lederberg et al. [1] αρχικά επεσήμανε την πολλαπλότητα των παραγόντων που οδηγούν στην εμφάνιση της νόσου, οι οποίοι αργότερα επεξεργάστηκαν και περιγράφηκαν με όρους «μοντέλου σύγκλισης» [6] . Το μοντέλο προτείνει ότι τα γεγονότα εμφάνισης επισπεύδονται από την εντατικοποίηση βιολογικών, περιβαλλοντικών, οικολογικών και κοινωνικοοικονομικών παραγόντων. Η μικροβιακή «προσαρμογή και αλλαγή», μαζί με την «αλλαγή των οικοσυστημάτων» και την «οικονομική ανάπτυξη και χρήση γης» αποτελούν κύρια θέματα. Ο Joshua Lederberg, η κύρια πνευματική δύναμη πίσω από τις μελέτες συνόψισε λέγοντας: «Οι οικολογικές αστάθειες προκύπτουν από τους τρόπους με τους οποίους αλλάζουμε το φυσικό και βιολογικό περιβάλλον, τους μικροβιακούς και ζωικούς ενοικιαστές (συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων) αυτών των περιβαλλόντων και τις αλληλεπιδράσεις μας (συμπεριλαμβανομένων των υγιεινών και θεραπευτικών παρεμβάσεις) με τα παράσιτα». Μια προσέγγιση που προτάθηκε ήταν η χρησιμοποίηση της θεωρίας των κοινωνικών-οικολογικών συστημάτων που επιχειρεί να συλλάβει τη συμπεριφορά των λεγόμενων «συζευγμένων φυσικών-ανθρώπινων συστημάτων», συμπεριλαμβανομένης της αναπόφευκτης απροσδόκητης εμφάνισης νέων ασθενειών, οι οποίες οι ίδιες είναι μια από τις «αναδυόμενες ιδιότητες» των πολύπλοκων προσαρμοστικών συστήματα (CAS) [7, 8] . Το μοντέλο σύγκλισης μπορεί να προσαρμοστεί έτσι ενσωματώνοντας τη δυναμική των μετασχηματισμών αστικών, γεωργικών και φυσικών οικοσυστημάτων που προτείνονται με αυτό το πλαίσιο. Αυτές οι συσχετισμένες πολύπλευρες αλληλεπιδράσεις, συμπεριλαμβανομένων των ανατροφοδοτήσεων που επηρεάζουν τις οικολογικές κοινότητες, τους ξενιστές και τους πληθυσμούς των παθογόνων, είναι οι άμεσοι οδηγοί εμφάνισης ασθενειών. Οι αρχικές εστίες HPAI H5N1 στο Βιετνάμ αντιπροσωπεύουν μια ιδανική ευκαιρία προσαρμογής και δοκιμής ενός μοντέλου σύγκλισης CAS. Ο κίνδυνος εμφάνισης θα πρέπει να είναι υψηλότερος στις αστικές περιοχές που μετασχηματίζονται ταχύτερα, στις περιαστικές ζώνες όπου οι συνδυασμοί αστικών-αγροτικών, σύγχρονων-παραδοσιακών χρήσεων γης και πτηνοτροφίας συμπίπτουν πιο έντονα. Συγκεκριμένα, υποθέσαμε μια θετική συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας εστιών HPAI στα πουλερικά σε επίπεδο κοινότητας και: 1) περιαστικών περιοχών, όπως ορίζονται από τους Saksena et al. [9] , 2) ποικιλομορφία χρήσης γης και 3) συστέγαση εντατικών και εκτεταμένων συστημάτων πουλερικών. Χρησιμοποιήσαμε ως εξαρτημένη μεταβλητή την παρουσία ή την απουσία σε επίπεδο κοινότητας εστιών HPAI H5N1 στα πουλερικά. Το Βιετνάμ γνώρισε το πρώτο του ξέσπασμα HPAI H5N1 στα τέλη του 2003, από τότε, έχουν καταγραφεί πέντε κύματα και σποραδικές εστίες κατά τη διάρκεια των ετών [10, 11] . Επιλέξαμε να μελετήσουμε το πρώτο κύμα (Κύμα 1) που έληξε τον Φεβρουάριο του 2004 και το δεύτερο κύμα (Κύμα 2) που εμφανίστηκε μεταξύ Δεκεμβρίου 2004 και Απριλίου 2005. Χρησιμοποιήσαμε δεδομένα από την Απογραφή Γεωργίας του Βιετνάμ το 2006 για να αναπτύξουμε μια ταξινόμηση αστικότητας που χρησιμοποίησε δεδομένα που συλλέχθηκαν σε ένα μόνο χρονικό σημείο (2006) αλλά σε όλο το διάστημα (10.820 κοινότητες) για να συναγάγουμε διαδικασίες αλλαγής (αστικοποίηση, διαφοροποίηση χρήσης γης και πουλερικά εντατικοποίηση) [9] . Οι 58 επαρχίες του Βιετνάμ (χωρίς να υπολογίζονται οι 5 αστικές επαρχίες που διοικούνται κεντρικά) χωρίζονται σε αγροτικές περιοχές, επαρχιακές πόλεις και επαρχιακές πόλεις. Οι αγροτικές περιοχές χωρίζονται περαιτέρω σε κοινότητες (αγροτικές περιοχές) και κωμοπόλεις, και οι επαρχιακές πόλεις και πόλεις χωρίζονται σε περιφέρειες (αστικές υποπεριοχές) και κοινότητες. Μια κοινότητα στο Βιετνάμ είναι επομένως η διοικητική υποδιαίρεση τρίτου επιπέδου, που αποτελείται από χωριά/οικισμούς. Για λόγους απλότητας θα χρησιμοποιούμε εφεξής τον όρο «κομμούνα» για να αναφερόμαστε στη μικρότερη διοικητική μονάδα είτε πρόκειται για κοινότητα, πόλη ή περιφέρεια. Συμπεριλάβαμε παράγοντες κινδύνου που τεκμηριώθηκαν σε προηγούμενες εργασίες. Στοχεύαμε επίσης να κατανοήσουμε τις διαφορές, εάν υπάρχουν, στη δυναμική κινδύνου σε διαφορετικές κλίμακες. συγκρίνοντας τους κινδύνους σε εθνική κλίμακα με αυτούς σε δύο υποεθνικές αγροοικολογικές ζώνες. Για το σκοπό αυτό επιλέξαμε να μελετήσουμε τα δέλτα του Κόκκινου Ποταμού και του Μεκόνγκ, γνωστά hot spots της νόσου. Ως εκ τούτου, πραγματοποιήσαμε δύο σετ αναλύσεων (κύματα 1 και 2) για τρία μέρη (έθνος, Δέλτα του Κόκκινου Ποταμού και Δέλτα του Μεκόνγκ) παράγοντας συνολικά 6 αναλύσεις κυμάτων τόπου. Τα δεδομένα για τα κρούσματα ελήφθησαν από τη δημόσια διαθέσιμη βάση δεδομένων του Τμήματος Υγείας των Ζώων του Βιετνάμ. Δεδομένης της εξαιρετικά περίπλοκης δυναμικής των επιδημιών και σύμφωνα με τις πρόσφατες μεθοδολογικές τάσεις, χρησιμοποιήσαμε πολλαπλές προσεγγίσεις μοντελοποίησης - παραμετρικές και μη παραμετρικές - με έμφαση στη χωρική ανάλυση. Χρησιμοποιήσαμε μοντέλα προσανατολισμένα στον τόπο που μπορούν να λάβουν υπόψη παραλλαγές σε παράγοντες όπως οι πολιτικές και η διοίκηση, καθώς και μοντέλα προσανατολισμένα στο χώρο που αναγνωρίζουν τη σημασία της φυσικής εγγύτητας στο φυσικό φαινόμενο [12]. Πολύ λίγες εμπειρικές μελέτες έχουν προσπαθήσει να προσδιορίστε εάν η αστικοποίηση σχετίζεται με εστίες EID ή εάν η αστικοποίηση σχετίζεται κυρίως με άλλους παράγοντες που σχετίζονται με τις εστίες EID. Ένα άμεσο πρόβλημα που αντιμετωπίζουν οι ερευνητές είναι να ορίσουν τι είναι αγροτικό, αστικό και μεταβατικό (δηλαδή, περιαστικό). Ορισμένες μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει επίσημους διοικητικούς ορισμούς αστικών και αγροτικών περιοχών, αλλά αυτή η προσέγγιση είναι περιορισμένη ως προς την ωμή της [13] . Άλλες μελέτες έδωσαν προτεραιότητα στην πυκνότητα του ανθρώπινου πληθυσμού ως ικανοποιητικό υποκατάστατο [11, [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] , αλλά αυτή η προσέγγιση αγνοεί το σημαντικό γεγονός ότι η πυκνότητα δεν αποτελεί παράγοντα κινδύνου εάν συνοδεύεται από επαρκή υποδομή για τη διαχείριση του πληθυσμού. Ο Spencer [21] εξέτασε την αστικοποίηση ως ένα μη γραμμικό χαρακτηριστικό, χρησιμοποιώντας μεταβλητές σε επίπεδο νοικοκυριού, όπως υπηρεσίες ύδρευσης και αποχέτευσης. Βρήκε στοιχεία ότι η αυξημένη ποικιλομορφία στις πηγές ύδρευσης και στις υποδομές αποχέτευσης συσχετίστηκε με υψηλότερα κρούσματα HPAI. Αυτές οι μελέτες χρησιμοποίησαν έναν περιορισμένο ορισμό της αστικοποίησης που δεν διέθετε έναν καλά καθορισμένο χαρακτηρισμό της περιαστικοποίησης. Άλλες μελέτες έχουν χαρτογραφήσει τη σχετική αστική φύση ενός τόπου, μια ευρεία έννοια που συχνά αναφέρεται ως «αστικότητα» [22] [23 ] [24] [25] . Ενώ αυτές οι μελέτες δείχνουν διαφορές στην αγροτική/αστική φύση των κοινοτήτων σε χώρο και χρόνο, έχουν περιοριστεί σε μικρής έως μεσαίας κλίμακας μελέτες παρατήρησης. και δεν έχουν καταφέρει να διακρίνουν μεταξύ των διαφορετικών επιπέδων «αγροτικότητας». Ίσως το πιο γνωστό μοντέλο περι-αστικοποίησης είναι η έννοια του McGee για το desakota (ινδονησιακά σημαίνει \"χωριό-πόλη\") [26] . Ο McGee εντόπισε έξι χαρακτηριστικά των περιοχών desakota: 1) μεγάλο πληθυσμό μικροκαλλιεργητών. 2) αύξηση των μη γεωργικών δραστηριοτήτων. 3) εξαιρετική ρευστότητα και κινητικότητα του πληθυσμού. 4) ένα μείγμα χρήσεων γης, γεωργίας, οικοτεχνίας, προαστιακής ανάπτυξης. 5) Αυξημένη συμμετοχή του γυναικείου εργατικού δυναμικού. και 6) «γκρίζες ζώνες», όπου ομαδοποιούνται άτυπες και παράνομες δραστηριότητες [26] . Saksena et al. [9] βασίστηκε στις έννοιες desakota του McGee και τα δεδομένα από την Αγροτική Απογραφή του 2006 στο Βιετνάμ για να καθορίσει μια ταξινόμηση αστικότητας. Αυτή η μελέτη προσδιόρισε και χαρτογράφησε τις 10.820 κοινότητες, τη μικρότερη διοικητική μονάδα για την οποία συλλέγονται δεδομένα, ως αγροτικό, περιαστικό, αστικό ή αστικό πυρήνα. Αυτό το έργο χρησιμοποίησε την ταξινόμηση Saksena για να αξιολογήσει τις συσχετίσεις μεταξύ τάξεων αστικότητας, άλλων παραγόντων κινδύνου και εστιών HPAI. Οι ερευνητές υπολόγισαν ότι σχεδόν το 75% των ζωονοσογόνων ασθενειών σχετίζονται με την κάλυψη του εδάφους και τις αλλαγές χρήσης γης (LCLUC) [27, 28] . Τα LCLUC, όπως η περιαστικοποίηση και η γεωργική διαφοροποίηση συχνά οδηγούν σε πιο διαφορετικά και κατακερματισμένα τοπία (αριθμός καλύψεων γης ή χρήσεις γης ανά μονάδα γης). Η σημασία του μοτίβου τοπίου, συμπεριλαμβανομένης της ποικιλότητας και των σχετικών διεργασιών, που ισοδυναμούν με το μέγεθος και την κατανομή του οικοτόπου του είδους ξενιστή, και επομένως τη δυναμική μετάδοσης των παθογόνων είναι αξιωματική αν και οι συγκεκριμένοι μηχανισμοί εξαρτώνται από την ασθένεια [29, 30]. Ο κατακερματισμός του τοπίου δημιουργεί οικοτόνους, που ορίζονται ως απότομες ακμές ή ζώνες μετάβασης μεταξύ διαφορετικών οικολογικών συστημάτων, που πιστεύεται ότι διευκολύνουν την εμφάνιση ασθενειών αυξάνοντας την ένταση και τη συχνότητα της επαφής μεταξύ των ειδών ξενιστών [31] Επιπλέον, ο κατακερματισμός του φυσικού οικοτόπου τείνει να διακόπτει και να υποβαθμίζει τις φυσικές διεργασίες. συμπεριλαμβανομένων των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των ειδών που ρυθμίζουν τις πυκνότητες των κατά τα άλλα ευκαιριακών ειδών που μπορεί να χρησιμεύσουν ως ικανοί ξενιστές [32] , αν και δεν είναι σαφές εάν η μειωμένη ποικιλότητα των ειδών αυξάνει αναγκαστικά τη μετάδοση των παθογόνων [33] . Σπάνια η έρευνα έχει συνδέσει τη διαφοροποίηση της χρήσης γης με τελικά καταληκτικά σημεία για την υγεία σε ανθρώπους ή ζώα. Αυτή η μελέτη επιχειρεί να συνδέσει την ποικιλομορφία της χρήσης γης με τις εστίες HPAI H5N1. Οι ανθρώπινοι πληθυσμοί στις πόλεις του αναπτυσσόμενου κόσμου που αστικοποιούνται γρήγορα απαιτούν πρόσβαση σε λαχανικά, φρούτα, κρέας κ.λπ. συνήθως παράγεται αλλού. Όπως θεωρήθηκε από τον von Thünen το 1826 [34] , μεγάλο μέρος αυτής της ζήτησης καλύπτεται από αγροκτήματα κοντά σε πόλεις [35] , πολλές σε περιοχές που υφίστανται διαδικασίες περιαστικοποίησης [26] . Λόγω της παγκοσμιοποίησης του εμπορίου πουλερικών, μεγάλης κλίμακας φάρμες κοτόπουλου που εκτρέφουν χιλιάδες πτηνά έχουν επεκταθεί γρήγορα στη Νοτιοανατολική Ασία και ανταγωνίζονται τους υπάρχοντες μικρούς αγρότες στην αυλή [36] . Οι επιχειρήσεις μεγάλης κλίμακας (15.000-100.000 πουλιά) εξακολουθούν να είναι σπάνιες στο Βιετνάμ (μόνο 33 κοινότητες διαθέτουν τέτοιες εγκαταστάσεις). Από την άλλη πλευρά, οι εγχώριες και πολυεθνικές εταιρείες συχνά αναθέτουν σε αγρότες την εκτροφή μεταξύ 2.000 και 15.000 πτηνών. Πρόσφατες μελέτες εξέτασαν τον σχετικό ρόλο των εκτεταμένων συστημάτων (πίσω αυλής) και των εντατικών συστημάτων [15, [17] [18] [19] 37] . Σε μεγάλο μέρος της Ασίας υπάρχει συχνά ένας συνδυασμός εμπορικής και αυλής καλλιέργειας σε οποιαδήποτε τοποθεσία [36] . Οι ειδικοί έχουν προτείνει ότι από την άποψη της βιοασφάλειας η συνεγκατάσταση εκτεταμένων και εντατικών συστημάτων είναι ένας πιθανός παράγοντας κινδύνου [38] . Τα εντατικά συστήματα επιτρέπουν την εξέλιξη του ιού (π. Χαμηλή παθογόνος γρίπη των πτηνών σε HPAI) και μεταμόρφωση, ενώ τα εκτεταμένα συστήματα επιτρέπουν την περιβαλλοντική ανθεκτικότητα και την κυκλοφορία [39] . Προηγούμενες μελέτες πληθυσμών κοτόπουλων ως παράγοντα κινδύνου έχουν κάνει διάκριση μεταξύ συστημάτων παραγωγής - γηγενών κοτόπουλων, κοτόπουλων αυλής. πυκνότητα κοπαδιού? κοτόπουλα εμπορίου, κοτόπουλα κρεατοπαραγωγής και πυκνότητα στρωμάτων κ.λπ. [15, [17] [18] [19] 37] . Μεμονωμένα, ωστόσο, καμία από αυτές τις μετρήσεις πουλερικών με βάση τον αριθμό ή/και την πυκνότητα δεν μετρά επαρκώς την έκταση της συντοποθεσίας εντατικών και εκτεταμένων συστημάτων σε οποιοδήποτε δεδομένο μέρος. Τα εντατικά και εκτεταμένα συστήματα στο Βιετνάμ έχουν τα δικά τους αρκετά καλά καθορισμένα μεγέθη κοπαδιών. Ένας δείκτης ποικιλομορφίας του σχετικού αριθμού των εντατικών και εκτεταμένων συστημάτων εκτροφής πουλερικών μπορεί να εκτιμήσει καλύτερα το αποτέλεσμα μιας τέτοιας συστέγασης. αυτή η μελέτη επιχειρεί να συνδέσει έναν δείκτη ποικιλότητας ζώων με την παρουσία ή απουσία εστιών HPAI H5N1 σε επίπεδο κοινότητας. Αυτή η μελέτη διερεύνησε για τις 10.820 κοινότητες του Βιετνάμ μια ευρεία γκάμα κοινωνικοοικονομικών, γεωργικών, κλιματικών και οικολογικών μεταβλητών που σχετίζονται με τα πουλερικά διαχείρισης και μετάδοσης και επιμονής του ιού HPAI. Πολλές από αυτές τις μεταβλητές προσδιορίστηκαν με βάση προηγούμενες μελέτες του HPAI (όπως ανασκοπήθηκαν στους Gilbert και Pfeiffer [40] ). Τρεις νέες μεταβλητές συμπεριλήφθηκαν με βάση τις υποθέσεις που δημιουργήθηκαν από αυτό το έργο. Όλες οι μεταβλητές μετρήθηκαν ή συγκεντρώθηκαν σε επίπεδο κοινότητας. Οι νέες μεταβλητές ήταν: • Βαθμός αστικοποίησης: Χρησιμοποιήσαμε την ταξινόμηση της αστικότητας που αναπτύχθηκε από τους Saksena et al. [9] για να καθορίσει τον αστικό χαρακτήρα κάθε κοινότητας. Το πλαίσιο ταξινόμησης βασίζεται σε τέσσερα χαρακτηριστικά: 1) ποσοστό νοικοκυριών των οποίων το κύριο εισόδημα προέρχεται από τη γεωργία, την υδατοκαλλιέργεια και τη δασοκομία, 2) ποσοστό νοικοκυριών με σύγχρονες μορφές τουαλέτας, 3) ποσοστό γης υπό γεωργία, υδατοκαλλιέργεια και δασοκομία και 4) ο Δείκτης Κανονοποιημένης Διαφοροποιημένης Βλάστησης (NDVI). Η τριμερής ταξινόμηση επέτρεψε τη δοκιμή για μη γραμμικές και μη μονότονες αποκρίσεις.• Ποικιλότητα χρήσης γης: Μετρήσαμε την ποικιλότητα χρήσης γης χρησιμοποιώντας τον Δείκτη Ποικιλομορφίας Gini-Simpson [41] . Ο Δείκτης Ποικιλομορφίας Gini-Simpson δίνεται από το 1-λ, όπου το λ ισούται με την πιθανότητα δύο οντότητες που λαμβάνονται τυχαία από το σύνολο δεδομένων ενδιαφέροντος να αντιπροσωπεύουν τον ίδιο τύπο. Σε καταστάσεις με μία μόνο κλάση (πλήρης ομοιογένεια) ο δείκτης Gini-Simpson θα είχε τιμή ίση με μηδέν. Τέτοιοι δείκτες ποικιλότητας έχουν χρησιμοποιηθεί για τη μέτρηση της ποικιλότητας των χρήσεων γης [42] . Χρησιμοποιήσαμε τις ακόλουθες πέντε κατηγορίες χρήσεων γης: ετήσιες καλλιέργειες, πολυετείς καλλιέργειες, δάση, υδατοκαλλιέργεια και δομημένη γη (συμπεριλαμβανομένων των διάφορων χρήσεων) για τις οποίες συλλέχθηκαν δεδομένα στην Απογραφή Γεωργίας του 2006. Το εμβαδόν κάτω από την τελευταία τάξη υπολογίστηκε ως η διαφορά μεταξύ της συνολικής επιφάνειας και του αθροίσματος των τεσσάρων πρώτων κατηγοριών. Οι ακόλουθες μεταβλητές παρατίθενται ανάλογα με το ρόλο τους στην εισαγωγή, τη μετάδοση και την εμμονή της νόσου, αν και ορισμένοι από αυτούς τους παράγοντες μπορεί να έχουν πολλαπλούς ρόλους.• Μετάδοση που σχετίζεται με τον ανθρώπινο πληθυσμό. Πυκνότητα ανθρώπινου πληθυσμού [11, 14-16, 18, 19, 44, 45 ] .• Εμπόριο και αγορά πουλερικών. Οι πόλεις και οι πόλεις θεωρούνταν ενεργοί τόποι εμπορίας [10, 18, 37, 44, 46] . Έτσι, η απόσταση από την πλησιέστερη πόλη/πόλη χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης του εμπορίου πουλερικών. Το εμπόριο διευκολύνεται από την πρόσβαση σε υποδομές μεταφορών [37, 47, 48] . Έτσι, η απόσταση από τον πλησιέστερο α) εθνικό και β) επαρχιακό αυτοκινητόδρομο χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης μεταφορικής υποδομής.• Εισαγωγή και ενίσχυση της νόσου. Οι πυκνότητες του κοτόπουλου υπολογίστηκαν με βάση την περιοχή της κοινότητας [15, 19, 37, 49] . • Ενδιάμεσοι ξενιστές. Οι πυκνότητες πάπιας και χήνας υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη συνολική έκταση της κοινότητας [11, 19, 49] . Καθώς προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει μια σχέση μεταξύ της σάρωσης στους ορυζώνες από πάπιες και των εστιών, υπολογίσαμε επίσης την πυκνότητα πάπιας χρησιμοποιώντας μόνο την περιοχή με ρύζι .• Αγροοικολογικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες κινδύνου. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η έκταση της καλλιέργειας ρυζιού αποτελεί παράγοντα κινδύνου, κυρίως λόγω της συσχέτισής της με πάπιες ελεύθερης βοσκής που δρουν ως οδοκαθαριστές [10] . Χρησιμοποιήσαμε το ποσοστό της γης υπό καλλιέργεια ρυζιού ως μέτρο έκτασης. Η ένταση καλλιέργειας ρυζιού είναι επίσης γνωστός παράγοντας κινδύνου [11, 17, 37]. Χρησιμοποιήσαμε τον μέσο αριθμό καλλιεργειών ρυζιού ανά έτος ως μέτρο έντασης. Η έκταση της υδατοκαλλιέργειας είναι ένας γνωστός παράγοντας κινδύνου [10], πιθανώς επειδή τα υδάτινα σώματα προσφέρουν διαδρομές μετάδοσης και εμμονής του ιού. Το ποσοστό της γης υπό υδατοκαλλιέργεια χρησιμοποιήθηκε ως μέτρηση. Η εγγύτητα σε υδάτινα σώματα αυξάνει τον κίνδυνο εστιών [47, [50] [51] [52] , πιθανώς αυξάνοντας την πιθανότητα επαφής μεταξύ άγριων πουλερικών και κατοικίδιων πουλερικών. Μετρήσαμε την απόσταση μεταξύ της κοινότητας και του πλησιέστερου: α) λίμνη και β) ποτάμι. Κλιματικές μεταβλητές - μέση ετήσια θερμοκρασία και ετήσια βροχόπτωση - έχουν συσχετιστεί με σημαντικές αλλαγές στον κίνδυνο [48, 53] . Υψόμετρο, που σχετίζεται με τύπους της κάλυψης γης και της γεωργίας, έχει αποδειχθεί ότι είναι ένας σημαντικός παράγοντας κινδύνου στο Βιετνάμ [10]. Ο Σύνθετος Τοπογραφικός Δείκτης (CTI, γνωστός και ως Τοπογραφικός Δείκτης Υγρασίας) είναι ένα μέτρο της τάσης του νερού να λιμνάζει. Μελέτες στην Ταϊλάνδη και αλλού [54] έδειξαν ότι η έκταση των επιφανειακών υδάτων είναι ένας ισχυρός παράγοντας κινδύνου, πιθανώς λόγω του ρόλου του νερού στη μακροπρόθεσμη μετάδοση και την επιμονή του ιού. Ελλείψει αξιόπιστων και φθηνών στοιχείων σχετικά με την έκταση των επιφανειακών υδάτων χρησιμοποιήσαμε το CTI ως πληρεξούσιο. Το CTI έχει χρησιμοποιηθεί σε Ecological Niche Models (ENM) του HPAI H5N1 [55, 56] . Ωστόσο, δεδομένης της φύσης των μελετών ENM, η επίδραση του CTI ως παράγοντα κινδύνου ήταν μέχρι στιγμής άγνωστη. Το CTI έχει χρησιμοποιηθεί ως παράγοντας κινδύνου στη μελέτη άλλων μολυσματικών και μη λοιμωδών νόσων [57] . Ορισμένες μελέτες έχουν δείξει ότι σε τοπική κλίμακα, η κλίση του εδάφους (συστατικό του CTI) συσχετίστηκε σημαντικά με την κυριαρχία των ειδών δεξαμενής [58] . Το CTI είναι συνάρτηση τόσο της κλίσης όσο και της ανάντη συνεισφέρουσας περιοχής ανά μονάδα πλάτους ορθογώνια προς την κατεύθυνση ροής. Το CTI υπολογίζεται ως εξής: CTI = ln (A s / (tan (β)) όπου; A s = Τιμή επιφάνειας που υπολογίζεται ως ((συσσώρευση ροής + 1) Ã (εμβαδόν εικονοστοιχείων σε m 2 )) και β είναι η κλίση που εκφράζεται σε ακτίνια [59] . Αν και προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ο δείκτης κανονικοποιημένης διαφοράς βλάστησης (NDVI) είναι παράγοντα κινδύνου [10, 20, 55, 60, 61], δεν τον συμπεριλάβαμε ρητά στα μοντέλα μας, καθώς ο δείκτης αστικής ταξινόμησης που χρησιμοποιήσαμε περιελάμβανε το NDVI [9] . Λάβαμε δεδομένα σε επίπεδο κοινότητας για επιδημίες HPAI H5N1 από τα δημόσια διαθέσιμα βάση δεδομένων του Τμήματος Υγείας των Ζώων [10] . Το Βιετνάμ γνώρισε τα πρώτα μεγάλα επιδημικά κύματα μεταξύ Δεκεμβρίου 2003 και Φεβρουαρίου 2006 [10] . Επιλέξαμε να μελετήσουμε το πρώτο κύμα (Κύμα 1) που έληξε τον Φεβρουάριο του 2004 και το δεύτερο κύμα (Κύμα 2) που εμφανίστηκε μεταξύ Δεκεμβρίου 2004 και Απριλίου 2005. Στο κύμα 1, το 21% των κοινοτήτων και στο κύμα 2, το 6% των κοινοτήτων παρουσίασαν κρούσματα. Χρησιμοποιήσαμε δεδομένα από την Απογραφή Πληθυσμού του Βιετνάμ το 1999 για να υπολογίσουμε τον ανθρώπινο πληθυσμό ανά κοινότητα. Βασιστήκαμε σε δεδομένα από δύο Απογραφές Γεωργίας του Βιετνάμ. Αυτή η έρευνα διενεργείται κάθε πέντε χρόνια και καλύπτει όλα τα αγροτικά νοικοκυριά και τα περιαστικά νοικοκυριά που διαθέτουν αγροκτήματα. Έτσι περιλαμβάνονται περίπου τα τρία τέταρτα του συνόλου των νοικοκυριών της χώρας. Τα περιεχόμενα της έρευνας περιλαμβάνουν τον αριθμό των νοικοκυριών σε μεγάλες παραγωγικές δραστηριότητες, τον πληθυσμό, την εργασία ταξινομημένα ανά φύλο, ηλικία, προσόντα, απασχόληση και κύρια πηγή εισοδήματος. γης γεωργίας, δασοκομίας και υδατοκαλλιέργειας που χρησιμοποιείται από νοικοκυριά, ταξινομημένη ανά πηγή, τύπο, περιοχή καλλιέργειας ανά τύπο καλλιέργειας· και αγροτικού εξοπλισμού ανά σκοπό. Οι έρευνες σε επίπεδο κοινότητας περιλαμβάνουν πληροφορίες για τις αγροτικές υποδομές, δηλαδή ηλεκτρισμό, μεταφορές, ιατρικούς σταθμούς, σχολεία. πηγή γλυκού νερού, επικοινωνία, αγορές κ.λπ. Συλλέγονται αναλυτικά οικονομικά στοιχεία για μεγάλες εκμεταλλεύσεις. Χρησιμοποιήσαμε την Απογραφή Γεωργίας του 2006 για τις περισσότερες μεταβλητές επειδή τα τρία πρώτα επιδημικά κύματα εμφανίστηκαν μεταξύ των Αγροτικών Απογραφών του 2001 και του 2006 αλλά ήταν πιο κοντά χρονικά στην απογραφή του 2006 [10] . Ωστόσο, για δεδομένα σχετικά με τον αριθμό των πουλερικών χρησιμοποιήσαμε το σύνολο δεδομένων της Απογραφής Γεωργίας του 2001, επειδή μεταξύ 1991 και 2003 ο πληθυσμός των πουλερικών αυξήθηκε με μέσο ρυθμό 7% ετησίως. Ωστόσο, το 2004, μετά το πρώτο κύμα της επιδημίας H5N1, ο πληθυσμός των πουλερικών μειώθηκε κατά 15%. Μόλις στα μέσα του 2008 ο πληθυσμός των πουλερικών επέστρεψε κοντά στα προ-επιδημικά επίπεδα. Έτσι, θεωρήσαμε πιο αντιπροσωπευτικά τα στοιχεία του πληθυσμού των πουλερικών από την απογραφή του 2001. Συγκεντρώσαμε τα δεδομένα των νοικοκυριών της απογραφής σε επίπεδο κοινότητας. Μια τριπλή ταξινόμηση της μετάβασης από αγροτική σε πόλη βασίστηκε σε μια σχετική μελέτη [9]. Τα δεδομένα ράστερ για τη μέση ετήσια θερμοκρασία και τη βροχόπτωση ελήφθησαν από τη βάση δεδομένων World-Clim και μετατράπηκαν σε δεδομένα σε επίπεδο κοινότητας. Οι βιοκλιματικές μεταβλητές συγκεντρώθηκαν από τις μηνιαίες τιμές θερμοκρασίας και βροχόπτωσης και παρεμβλήθηκαν σε επιφάνειες με χωρική ανάλυση 90 m [62] . Αυτή η δημόσια βάση δεδομένων παρέχει δεδομένα για τις μέσες κλιματολογικές συνθήκες της περιόδου 1950-2000. Το υψόμετρο δημιουργήθηκε από ψηφιακά υψομετρικά μοντέλα SRTM 90 μέτρων (DEM) που αποκτήθηκαν από την Κοινοπραξία Χωρικών Πληροφοριών (CGIAR-CSI). Τα δεδομένα σύνθετου τοπογραφικού δείκτη (CTI) δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας την εργαλειοθήκη Geomorphometry and Gradient Metrics για το Arc-GIS 10.1. Πριν από την ανάλυση παραγόντων κινδύνου καθαρίσαμε τα δεδομένα προσδιορίζοντας παράλογες τιμές για όλες τις μεταβλητές και στη συνέχεια είτε εκχωρώντας μια τιμή που λείπει σε αυτές είτε προσαρμόζοντας την αξίες. Παράλογες τιμές εμφανίστηκαν κυρίως (λιγότερο από το 1% των περιπτώσεων) για μεταβλητές που σχετίζονται με τη γη, όπως το ποσοστό της κοινοτικής γης υπό συγκεκριμένο τύπο χρήσης γης. Στη συνέχεια, δοκιμάσαμε κάθε μεταβλητή για κανονικότητα χρησιμοποιώντας το λογισμικό BestFit (Palisade Corporation). Οι περισσότερες από τις μεταβλητές βρέθηκαν να ακολουθούν μια λογαριθμική κανονική κατανομή και χρησιμοποιήθηκε ένας μετασχηματισμός καταγραφής σε αυτές. Στη συνέχεια, εξετάσαμε τις διμεταβλητές συσχετίσεις μεταξύ όλων των παραγόντων κινδύνου (ή του log-transform τους, ανάλογα με την περίπτωση). Οι συσχετισμοί αναλύθηκαν ξεχωριστά για κάθε μέρος. Ορισμένοι παράγοντες κινδύνου στη συνέχεια εξαλείφθηκαν από την εξέταση όταν |r| ! 0,5 (r είναι ο συντελεστής συσχέτισης Pearson). Όταν δύο παράγοντες κινδύνου είχαν υψηλή συσχέτιση, επιλέξαμε να συμπεριλάβουμε αυτόν που δεν είχε μελετηθεί επαρκώς επαρκώς σε προηγούμενα δημοσιευμένα μοντέλα κινδύνου. Συγκεκριμένα, εξαιρέσαμε α) υψόμετρο (συσχετισμένο με την πυκνότητα του ανθρώπινου πληθυσμού, πυκνότητα κοτόπουλου, πυκνότητα πάπιας, ποσοστό γης κάτω από ορυζώνα, ετήσια θερμοκρασία και σύνθετο τοπογραφικό δείκτη), β) πυκνότητα ανθρώπινου πληθυσμού (συσχετισμένη με υψόμετρο και CTI), γ) πυκνότητα κοτόπουλου (μόνο σε εθνικό επίπεδο, σε συσχέτιση με CTI), δ) πυκνότητα πάπιας και χήνας (συσχετίζεται με υψόμετρο, πυκνότητα κοτόπουλου, ποσοστό γης σε ορυζώνα, δείκτης ποικιλομορφίας χρήσης γης και CTI), ε) ετήσια θερμοκρασία (σε σχέση με υψόμετρο και CTI) και στ) ένταση καλλιέργειας (συσχετίζεται με το ποσοστό της γης κάτω από ορυζώνες). Λαμβάνοντας υπόψη τη σημασία της χωρικής αυτοσυσχέτισης σε τέτοιες επιδημίες, χρησιμοποιήσαμε δύο προσεγγίσεις μοντελοποίησης: 1) Γενικευμένο Γραμμικό Μικτό Μοντέλο πολλαπλών επιπέδων (GLMM) και 2) Δέντρα ενισχυμένης παλινδρόμησης (BRT) [63, 64] με αυτοπαλινδρομικό όρο [65] . Το GLMM είναι μια προσέγγιση προσανατολισμένη στον τόπο που είναι κατάλληλη για την ανάλυση των επιπτώσεων των διοικητικών ομαδοποιήσεων, ενώ το BRT είναι μια προσέγγιση προσανατολισμένη στο χώρο που λαμβάνει υπόψη τα αποτελέσματα της φυσικής εγγύτητας. Ξεκινήσαμε εξάγοντας έναν αυτοπαλινδρομικό όρο υπολογίζοντας τον μέσο όρο της παρουσίας/απουσίας μεταξύ ενός συνόλου γειτόνων που ορίζονται από το όριο της αυτοσυσχέτισης, σταθμισμένο με το αντίστροφο της Ευκλείδειας απόστασης [65] . Το όριο της αυτοσυσχέτισης της μεταβλητής απόκρισης λήφθηκε από το εύρος του χωρικού συσχετισμού ρ (h) [66] . Για να προσδιορίσουμε ποιες μεταβλητές πρόβλεψης θα συμπεριληφθούν στα δύο μοντέλα, πραγματοποιήσαμε μοντελοποίηση λογιστικής παλινδρόμησης ξεχωριστά για καθένα από αυτά ένα προς ένα, αλλά συμπεριλάβαμε τον αυτοπαλινδρομικό όρο κάθε φορά. Τελικά συμπεριλάβαμε μόνο εκείνες τις μεταβλητές των οποίων ο συντελεστής είχε τιμή σημασίας p 0,2 (σε τουλάχιστον έναν συνδυασμό κύματος-τόπου) και σημειώσαμε το πρόσημο του συντελεστή. Αυτή η επιλογή της τιμής p για τον έλεγχο των παραγόντων κινδύνου είναι κοινή σε παρόμοιες μελέτες [15, 18, 45, 67]. Χρησιμοποιήσαμε ένα GLMM δύο επιπέδων (κοινότητες φωλιασμένες κάτω από περιοχές) για να λάβουμε υπόψη τα τυχαία αποτελέσματα για μια περιοχή που επηρεάζεται από τους γείτονές της, και έτσι, μελετήσαμε την επίδραση της χωρικής αυτοσυσχέτισης. Χρησιμοποιήσαμε ισχυρά τυπικά σφάλματα για δοκιμές σταθερών αποτελεσμάτων. Τα δέντρα ενισχυμένης παλινδρόμησης, επίσης γνωστά ως ενίσχυση στοχαστικής κλίσης, πραγματοποιήθηκε για να προβλεφθεί η πιθανότητα εμφάνισης HPAI H5N1 και να προσδιοριστεί η σχετική επίδραση κάθε παράγοντα κινδύνου στην εμφάνιση HPAI H5N1. Αυτή η μέθοδος αναπτύχθηκε πρόσφατα και εφαρμόστηκε ευρέως για την πρόβλεψη κατανομής σε διάφορους τομείς της οικολογίας [63, 64]. Χρησιμοποιείται ευρέως για μοντελοποίηση κατανομής ειδών όπου είναι γνωστές μόνο οι τοποθεσίες εμφάνισης του είδους [68] . Η μέθοδος έχει εφαρμοστεί σε πολυάριθμες μελέτες για την πρόβλεψη της κατανομής της νόσου HPAI H5N1 [16, 51, [69] [70] [71] . Το BRT χρησιμοποιεί δέντρα παλινδρόμησης και αλγόριθμους ενίσχυσης για να προσαρμόσει πολλά μοντέλα και τα συνδυάζει για τη βελτίωση της πρόβλεψης εκτελώντας επαναληπτικό βρόχο σε όλο το μοντέλο [63, 64]. Το πλεονέκτημα του BRT είναι ότι εφαρμόζει στοχαστικές διαδικασίες που περιλαμβάνουν πιθανολογικά στοιχεία για τη βελτίωση της προγνωστικής απόδοσης. Χρησιμοποιήσαμε δέντρα παλινδρόμησης για να επιλέξουμε σχετικές μεταβλητές πρόβλεψης και ενίσχυση για να βελτιώσουμε την ακρίβεια σε ένα μόνο δέντρο. Η διαδοχική διαδικασία επιτρέπει στα δέντρα να τοποθετούνται επαναληπτικά μέσω μιας διαδικασίας προς τα εμπρός σταδιακά στο μοντέλο ενίσχυσης. Δύο σημαντικές παράμετροι που καθορίζονται στο μοντέλο BRT είναι ο ρυθμός εκμάθησης (lr) και η πολυπλοκότητα του δέντρου (tc) για τον προσδιορισμό του αριθμού των δέντρων για βέλτιστη πρόβλεψη [63, 64]. Στο μοντέλο μας χρησιμοποιήσαμε 10 σετ σημείων εκπαίδευσης και δοκιμής για διασταυρούμενη επικύρωση, πολυπλοκότητα δέντρου 5, ποσοστό εκμάθησης 0,01 και κλάσμα σάκου 0,5. Άλλα πλεονεκτήματα του BRT περιλαμβάνουν την έλλειψη ευαισθησίας του στη συγγραμμικότητα και τις μη γραμμικές αποκρίσεις. Ωστόσο, για λόγους συνέπειας με τη μέθοδο GLMM, επιλέξαμε να εξαλείψουμε τους προγνωστικούς παράγοντες που είχαν μεγάλη συσχέτιση με άλλους προγνωστικούς παράγοντες και να πραγματοποιήσουμε μετασχηματισμούς καταγραφής όπου χρειάζεται. Στα μοντέλα GLMM χρησιμοποιήσαμε p 0,05 για να προσδιορίσουμε σημαντικούς παράγοντες κινδύνου. Οι προγνωστικές επιδόσεις των μοντέλων αξιολογήθηκαν από την περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) της καμπύλης χαρακτηριστικής λειτουργίας δέκτη (ROC). Η AUC είναι ένα μέτρο της συνολικής προσαρμογής του μοντέλου που κυμαίνεται από 0,5 (τυχαίο συμβάν) έως 1,0 (τέλεια προσαρμογή) [72] . Μια σύγκριση της AUC με άλλες μετρήσεις ακρίβειας κατέληξε στο συμπέρασμα ότι είναι το πιο ισχυρό μέτρο της απόδοσης του μοντέλου επειδή παρέμεινε σταθερό σε ένα ευρύ φάσμα ποσοστών επικράτησης [73] . Χρησιμοποιήσαμε τα διορθωμένα Κριτήρια Πληροφοριών Akaike (AICc) για να συγκρίνουμε κάθε μοντέλο GLMM με και χωρίς την αντίστοιχη σουίτα σταθερών προβλέψεων. Χρησιμοποιήσαμε SPSS έκδοση 21 (IBM Corp., Νέα Υόρκη, 2012) για GLMM και R έκδοση 3.1.0 (Η R Foundation for Statistical Computing, 2014) για το BRT. Για τον υπολογισμό του χωρικού αντιστοιχογράμματος χρησιμοποιήσαμε το πακέτο spdep του R. Οι δεκατέσσερις μεταβλητές πρόβλεψης που μοντελοποιήσαμε (βλ. πίνακες) βρέθηκαν όλες να σχετίζονται σημαντικά με εστίες HPAI H5N1 (ρ 0,2) σε τουλάχιστον έναν συνδυασμό κύματος-τόπου με βάση μονομεταβλητή ανάλυση (αλλά συμπεριλαμβανομένου του αυτοπαλινδρομικού όρου) (Πίνακας 1) . Η ποικιλομορφία χρήσης γης, η πυκνότητα των κοτόπουλου, η ποικιλομορφία μεγέθους κοπαδιού πουλερικών και η απόσταση από την εθνική οδό βρέθηκαν να έχουν σημαντικές συσχετίσεις σε πέντε από τους έξι συνδυασμούς κυμάτων-τόπων. Η ισχύς των μοντέλων GLMM, όπως μετράται από το AUC, είναι πολύ καλή με την AUC τιμές που κυμαίνονται από 0,802 έως 0,952 (Πίνακες 2-7). Η προγνωστική δύναμη των εθνικών μοντέλων ήταν υψηλότερη από αυτή των μοντέλων δέλτα. Η προγνωστική ισχύς των μοντέλων BRT είναι καλή, με AUC να κυμαίνονται από 0,737 έως 0,914. Τα μοντέλα BRT είχαν επίσης καλύτερη προγνωστική ισχύ σε εθνικό επίπεδο από ό,τι σε επίπεδο δέλτα. Αυτές οι τιμές είναι υψηλότερες από αυτές που αναφέρθηκαν για το Κύμα 1 (AUC = 0,69) και το Κύμα 2 (AUC = 0,77) από τους Gilbert et al. [11] . Τόσο οι Gilbert et al. [11] και αυτή η μελέτη διαπίστωσε ότι σε εθνικό επίπεδο η προγνωστική απόδοση για το κύμα 2 ήταν υψηλότερη από εκείνη για το κύμα 1. Το κύμα 2 επηρέασε κυρίως το Δέλτα του ποταμού Μεκόνγκ. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η πυκνότητα της πάπιας ήταν ένας σημαντικός προγνωστικός παράγοντας [11]. Τα αποτελέσματά μας, ωστόσο, έδειξαν ότι η ποικιλομορφία του μεγέθους του κοπαδιού πάπιας ήταν πιο σημαντικός παράγοντας πρόβλεψης από την πυκνότητα της πάπιας. Και τα δύο μοντέλα GLMM και BRT βρήκαν ότι η ετήσια βροχόπτωση είναι σημαντικός παράγοντας. Το μοντέλο GLMM έδειξε αρνητική συσχέτιση. παρόμοια με αυτά που βρέθηκαν από μελέτες στην Κίνα [51] και στο Δέλτα του Κόκκινου Ποταμού [53] . Μια παγκόσμια μελέτη ανθρώπινων κρουσμάτων βρήκε επίσης ότι η εμφάνιση είναι υψηλότερη υπό ξηρότερες συνθήκες [74] . Γενικά, ο ρόλος της βροχόπτωσης βρέθηκε πολύ πιο σημαντικός στα δέλτα από ό,τι για τη χώρα συνολικά. Ο μη προσαρμοσμένος σχετικός κίνδυνος (RR) των περιαστικών περιοχών σε σύγκριση με τις μη περιαστικές περιοχές ήταν 1,41 και 1,60 για Κύματα 1 και 2, αντίστοιχα. Όσον αφορά την πολεοδομικότητα, βρήκαμε ότι η πυκνότητα κοτόπουλου, το ποσοστό της γης με ρύζι, το ποσοστό της γης υπό υδατοκαλλιέργεια, η ποικιλομορφία μεγέθους κοπαδιού για πάπιες και χήνες και ο Σύνθετος Τοπογραφικός Δείκτης (CTI) είναι υψηλότερος στις περιαστικές περιοχές (Εικόνα 1α -1ε) . Βρήκαμε επίσης ότι η ποικιλομορφία της χρήσης γης ήταν υψηλότερη στις αγροτικές περιοχές, αλλά οι περιαστικές περιοχές είχαν οριακά χαμηλότερα επίπεδα ποικιλομορφίας (Εικόνα 1στ). Ωστόσο, η μεταβλητή αστικότητας από μόνη της δεν βρέθηκε να σχετίζεται σημαντικά με τον HPAI H5N1 σε κανένα μέρος σύμφωνα με το μοντέλο GLMM εκτός από το αστικό επίπεδο στο Δέλτα του Κόκκινου Ποταμού για το Κύμα 2 και στο Δέλτα του Ποταμού Μεκόνγκ για το Κύμα 1. Το μοντέλο BRT κατέταξε την αστικότητα ως μια από τις μεταβλητές με τη μικρότερη επιρροή. Η ποικιλομορφία της χρήσης γης βρέθηκε να σχετίζεται σημαντικά με τον HPAI H5N1 και στα δύο κύματα για το Βιετνάμ σύμφωνα με το μοντέλο GLMM, αλλά σε επίπεδο δέλτα η συσχέτιση ήταν σημαντική μόνο για το κύμα 2 στο Δέλτα του ποταμού Μεκόνγκ. Το μοντέλο BRT έδειξε ότι η ποικιλομορφία της χρήσης γης επηρέασε σε μεγάλο βαθμό τον HPAI H5N1 σε εθνικό επίπεδο στο Wave 2. Για τους υπόλοιπους συνδυασμούς κυματοτοπίων, η ποικιλομορφία χρήσης γης είχε μεσαία έως κάτω από τη μέση κατάταξη επιρροής. Και τα δύο μοντέλα GLMM και BRT έδειξαν ότι η ποικιλομορφία του μεγέθους του κοπαδιού κοτόπουλου είχε ισχυρή σχέση με τον HPAI H5N1 και για τα δύο κύματα σε εθνικό επίπεδο. Αυτό γενικά βρέθηκε να ισχύει στα επίπεδα δέλτα με ορισμένες εξαιρέσεις. Η ποικιλομορφία του μεγέθους του κοπαδιού πάπιας και χήνας συσχετίστηκε επίσης σημαντικά με τον HPAI H5N1 σε όλα τα μέρη, αλλά οι συσχετίσεις ήταν πολύ ισχυρότερες στο κύμα 2 από ό,τι στο κύμα 1. Το μοντέλο GLMM έδειξε ότι το CTI είχε πολύ ισχυρή συσχέτιση με τον HPAI H5N1 στο εθνικό επίπεδο και στα δύο κύματα, αν και αυτό δεν ίσχυε στα δύο δέλτα. Ο CTI είναι ένας δείκτης υγρασίας σταθερής κατάστασης που χρησιμοποιείται συνήθως για την ποσοτικοποίηση του τοπογραφικού ελέγχου σε υδρολογικές διεργασίες. Οι αριθμοί συσσώρευσης σε επίπεδες περιοχές, όπως τα δέλτα, είναι πολύ μεγάλοι. Ως εκ τούτου, το CTI δεν ήταν μια σχετική μεταβλητή στο μοντέλο GLMM σε αυτούς τους τομείς. Το μοντέλο BRT ωστόσο έδειξε ότι το CTI είχε μέση έως χαμηλή επιρροή σε όλα τα κύματα και τα μέρη. Βρήκαμε πολύ υψηλά φαινόμενα χωρικής ομαδοποίησης, όπως υποδεικνύεται από το γεγονός ότι σε όλα τα κύματα και τα μέρη το μοντέλο BRT βρήκε ότι ο όρος χωρικής αυτοσυσχέτισης έχει την υψηλότερη κατάταξη επιρροής. Όπως ήταν αναμενόμενο, η σχετική επιρροή του όρου αυτοσυσχέτισης σε εθνικό επίπεδο ήταν υψηλότερη (60-78%) από ό,τι στα επίπεδα δέλτα (14-35%). Στα μοντέλα GLMM βρήκαμε το Akaike Information Criterion (AIC) που χρησιμοποιεί ολόκληρο το σύνολο των 14 μεταβλητών να είναι πολύ χαμηλότερο από τα AIC ενός μοντέλου GLMM χωρίς σταθερά εφέ. Αυτό έδειξε ότι αν και τα αποτελέσματα της ομαδοποίησης ήταν σημαντικά, οι μεταβλητές πρόβλεψης που βασίζονται στη θεωρία βελτίωσαν την απόδοση του μοντέλου. Ένας περιορισμός στη χρήση μεθόδων επιτήρησης για την εξαρτημένη μεταβλητή (ξεσπάσματα πουλερικών) είναι ότι τα δεδομένα μπορεί να έχουν προκαταλήψεις αναφοράς/ανίχνευσης [11] . Είναι δυνατή η υποαναφορά/ανίχνευση σε αγροτικές περιοχές σε σύγκριση με περιαστικές περιοχές. Πιστεύουμε ότι οι παράγοντες κινδύνου αστικότητας και η μικρότερη απόσταση από την πλησιέστερη πόλη χρησιμεύουν ως πρόχειροι δείκτες για την αποτελεσματικότητα αναφοράς/ανίχνευσης. Προηγούμενες μελέτες είχαν την τάση να χρησιμοποιούν την πυκνότητα του ανθρώπινου πληθυσμού ως υποκατάστατο για το σκοπό αυτό. Στη μελέτη μας βρήκαμε μια ισχυρή σχέση μεταξύ της πυκνότητας του ανθρώπινου πληθυσμού και της αστικότητας. Ωστόσο, αναγνωρίζουμε ότι μια κατηγορική μεταβλητή όπως η αστικότητα μπορεί να παρέχει λιγότερη ευαισθησία από μια συνεχή μεταβλητή όπως η πυκνότητα του ανθρώπινου πληθυσμού σε αυτό το συγκεκριμένο πλαίσιο. Αυτή η μελέτη διερεύνησε την εγκυρότητα ενός γενικού μοντέλου για την εμφάνιση ασθενειών που συνδύαζε το «μοντέλο σύγκλισης» του ΔΟΜ [6 ] και το μοντέλο κοινωνικο-οικολογικών συστημάτων [7, 8] , για τη διερεύνηση της συγκεκριμένης περίπτωσης HPAI στο Βιετνάμ. Επιδιώξαμε να ελέγξουμε τις υποθέσεις ότι τα μέτρα αστικοποίησης, διαφοροποίησης χρήσης γης και εντατικοποίησης των πουλερικών συσχετίζονται με εστίες στα πουλερικά. Τα αποτελέσματά μας γενικά υποστηρίζουν την υπόθεση ότι οι μετασχηματισμοί του κοινωνικο-οικολογικού συστήματος σχετίζονται με εστίες H5NI στα πουλερικά. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ υπογραμμίζουν τρία κύρια ευρήματα: 1) όταν λαμβάνονται υπόψη οι σχετικοί παράγοντες κινδύνου, η αστικοποίηση γενικά δεν αποτελεί σημαντικό ανεξάρτητο παράγοντα κινδύνου. Αλλά στα περιαστικά τοπία οι παράγοντες εμφάνισης συγκλίνουν, συμπεριλαμβανομένων υψηλότερων επιπέδων πυκνότητας κοτόπουλων, ποικιλιών μεγέθους κοπαδιών πάπιων και χήνων και κλάσματος της γης με ρύζι ή υδατοκαλλιέργεια. 2) Τα τοπία υψηλής ποικιλομορφίας χρήσης γης, μια μεταβλητή που δεν είχε προηγουμένως ληφθεί υπόψη σε χωρικές μελέτες του HPAI H5N1, διατρέχουν σημαντικά μεγαλύτερο κίνδυνο για εστίες HPAI H5N1. όπως είναι 3) τοπία όπου συστεγάζονται εντατικές και εκτεταμένες μορφές παραγωγής πουλερικών. Μόνο μια άλλη μελέτη εξέτασε ρητά την πολεοδομία στο πλαίσιο του HPAI H5N1. Οι Loth et al. [17] διαπιστώθηκε ότι οι περιαστικές περιοχές στην Ινδονησία συσχετίστηκαν σημαντικά με κρούσματα HPAI H5N1, ακόμη και με βάση πολυπαραγοντικά μοντέλα. Η μελέτη μας, ωστόσο, προσπάθησε τόσο να συσχετίσει το HPAI H5N1 με τον βαθμό αστικότητας όσο και να καθορίσει τα χαρακτηριστικά των περιαστικών περιοχών που τις θέτουν σε κίνδυνο. Όταν αυτά τα χαρακτηριστικά (δηλαδή οι πυκνότητες κοτόπουλου, οι ποικιλίες μεγέθους κοπαδιού πάπιας και χήνες και το κλάσμα της γης με ρύζι ή υδατοκαλλιέργεια) περιλαμβάνονται σε πολυπαραγοντικά μοντέλα, ο ρόλος της μεταβλητής αστικοποίησης καθαυτή μειώνεται. Βρήκαμε στα κύρια δέλτα των ποταμών στο Βιετνάμ (Κόκκινο Ποτάμι και Μεκόνγκ), η αστικοποίηση δεν είχε σημαντική συσχέτιση με τον HPAI H5N1. Αυτό μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι τα δέλτα είναι πιο ομοιογενή, όσον αφορά την αστικοποίηση, από τη χώρα στο σύνολό της. Αυτή είναι η πρώτη μελέτη που εξετάζει την ποικιλότητα της χρήσης γης ως παράγοντα κινδύνου για τον HPAI H5N1. Μετρήθηκε με τον δείκτη ποικιλομορφίας Gini-Simpson των πέντε τάξεων χρήσης γης για τις οποίες συλλέχθηκαν δεδομένα στην Απογραφή Γεωργίας του Βιετνάμ του 2006 και την παρουσία ή απουσία εστιών HPAI σε επίπεδο κοινότητας, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της γης χρησιμοποιούν τη διαφορετικότητα και τον HPAI H5N1 σε εθνικό επίπεδο και στο Δέλτα του ποταμού Μεκόνγκ. Αυτή η μέτρηση καταγράφει τόσο την ποικιλία των οικοτόπων όσο και την πολυπλοκότητα του γεωχωρικού μοτίβου που πιθανόν σχετίζεται με την ένταση μετάδοσης. Τα αποτελέσματά μας είναι παρόμοια με αυτά που έχουν παρατηρηθεί από μελέτες άλλων EID που χρησιμοποιούν μετρήσεις κατακερματισμού (π.χ. [75] [76] [77] . Αυτή είναι μια από τις λίγες μελέτες, ωστόσο, που συνδέει τον κατακερματισμό του τοπίου με μια ασθένεια EID στα πουλερικά και όχι μόνο με τον φορέα και/ή τους ξενιστές του EID. Προηγούμενες μελέτες έχουν επικεντρωθεί σε παράγοντες παραγωγής πουλερικών, όπως ο τύπος του είδους, το μέγεθος σμήνη και έκταση εμπορευματοποίησης (π.χ. [15, [17] [18] [19] . Αυτή η μελέτη επεκτείνει αυτά τα ευρήματα παρέχοντας στοιχεία ότι όταν συνυπάρχουν εντατικά και εκτεταμένα συστήματα παραγωγής κοτόπουλου ή/και πάπιας και χήνας στην ίδια κοινότητα, η κοινότητα αντιμετωπίζει υψηλότερο κίνδυνο εκδήλωσης ασθένειας. Οι μελλοντικές μελέτες πρέπει να εξετάσουν τους βιολογικούς αιτιολογικούς μηχανισμούς σε αυτό το πλαίσιο. Προτείνουμε ότι τα δεδομένα εθνικών απογραφών (ιδιαίτερα οι γεωργικές απογραφές) που συγκεντρώνονται σε τοπικά επίπεδα διοίκησης παρέχουν πολύτιμες πληροφορίες που δεν είναι διαθέσιμες από δεδομένα τηλεπισκόπησης (όπως πυκνότητες πουλερικών) ή απαιτούν μεγάλη ποσότητα εργασίας για χαρτογράφηση σε εθνική έως μεγαλύτερη κλίμακα (ποικιλομορφία χρήσης γης). Η χαρτογράφηση των κατηγοριών χρήσεων γης σε εθνική κλίμακα για τις τοπικές διοικητικές μονάδες (δηλαδή τις 10.820 κοινότητες στο Βιετνάμ) δεν είναι ασήμαντο έργο. Μελλοντικές μελέτες, ωστόσο, θα μπορούσαν να εξετάσουν τη συσχέτιση μεταξύ μιας μέτρησης που βασίζεται στην απογραφή με μετρήσεις που προέρχονται από την τηλεπισκόπηση που χρησιμοποιούνται για τη μέτρηση της αναλογικής αφθονίας κάθε τύπου κάλυψης εδάφους σε ένα τοπίο [78] . Το Βιετνάμ έχει προχωρήσει σχετικά με τη διάθεση ψηφιακών εθνικών δεδομένων απογραφής πληθυσμού και γεωργίας σε μορφή που μπορεί να συνδεθεί με διοικητικά όρια. Ενώ άλλα έθνη αρχίζουν να αναπτύσσουν παρόμοιες ικανότητες, βραχυπρόθεσμα η εφαρμογή αυτής της μεθόδου σε άλλες χώρες μπορεί να είναι περιορισμένη. Τελικά, τόσο τα δεδομένα απογραφής όσο και τα δεδομένα τηλεπισκόπησης μπορούν να χρησιμοποιηθούν ανεξάρτητα για τη χαρτογράφηση της αστικής μετάβασης και της ποικιλομορφίας της χρήσης γης. Αυτά τα εργαλεία, ωστόσο, μπορούν να παρέχουν τις μεγαλύτερες γνώσεις τους όταν χρησιμοποιούνται μαζί. Μια άλλη σημαντική συμβολή αυτής της μελέτης ήταν η ανακάλυψη της σημασίας του CTI. Μέχρι στιγμής το CTI είχε χρησιμοποιηθεί μόνο σε μελέτες οικολογικής μοντελοποίησης του HPAI H5N1. Ο συγκεκριμένος ρόλος και η κατεύθυνση επιρροής του CTI ήταν μέχρι στιγμής άγνωστος. Η μελέτη μας, η πρώτη που χρησιμοποίησε το CTI ως παράγοντα κινδύνου, διαπίστωσε ότι είχε μεγάλη θετική επίδραση στον κίνδυνο HPAI H5N1 σε εθνικό επίπεδο. Προηγούμενες μελέτες έχουν υπογραμμίσει το ρόλο της έκτασης των επιφανειακών υδάτων στην εμμονή και τη μετάδοση του ιού HPAI H5N1. Αυτές οι μελέτες μέτρησαν την έκταση των επιφανειακών υδάτων ως περιοχή που καλύπτεται από νερό, μέγεθος εποχιακών πλημμυρών, απόσταση από το πλησιέστερο υδάτινο σώμα ή άλλες μεταβλητές που συχνά είναι δύσκολο να χαρτογραφηθούν χρησιμοποιώντας δεδομένα τηλεπισκόπησης, ειδικά για μελέτες μεγάλης περιοχής. Το CTI από την άλλη πλευρά έχει τη δυνατότητα να χρησιμεύσει ως ένα εξαιρετικό υποκατάστατο που μπορεί εύκολα να μετρηθεί σε μια βάση δεδομένων GIS. Τα εθνικά και περιφερειακά μοντέλα (δέλτα) διέφεραν αρκετά σημαντικά, τόσο ως προς την απόδοση όσο και ως προς τους σημαντικούς παράγοντες κινδύνου. Στα δέλτα βρίσκουμε συνήθως μόνο την πυκνότητα των κοτόπουλων, την ποικιλομορφία μεγέθους κοπαδιού πάπιας και την ετήσια βροχόπτωση να είναι σημαντικές. Αυτό υποδηλώνει ότι η δυναμική του κινδύνου σε επίπεδο κοινότητας εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το χωρικό εύρος της ανάλυσης, σύμφωνα με μια άλλη μελέτη στο Δέλτα του Μεκόνγκ [61] . Αν και το μοντέλο αυτής της μελέτης αρχικά περιελάμβανε τρεις δωδεκάδες κοινώς γνωστούς παράγοντες κινδύνου, οι σημαντικοί παράγοντες κινδύνου περιορίζονταν στην πυκνότητα του κοπαδιού πουλερικών, στην αναλογία νοικοκυριών με ηλεκτρική ενέργεια, στην αναπροσαρμοσμένη μέση τιμή NDVI Μαΐου-Οκτώβρη, στην πυκνότητα βουβάλου και στην απόδοση γλυκοπατάτας. Μια άλλη μελέτη στο Δέλτα του Κόκκινου Ποταμού [79] διαπίστωσε ότι εκτός από τις τυπικές μετρήσεις πυκνότητας πουλερικών, μόνο η παρουσία εμπόρων πουλερικών ήταν σημαντική. Εικάζουμε ότι για μικρότερες περιοχές, ειδικά για γνωστά hot spots, οι σχετικοί παράγοντες κινδύνου είναι αυτοί που αντικατοπτρίζουν βραχυπρόθεσμες, βραχυπρόθεσμες κινητήριες δυνάμεις όπως το εμπόριο πουλερικών, η παρουσία αγορών ζωντανών πτηνών και υγρών αγορών κ.λπ. Η βελτίωση της απόδοσης του μοντέλου για μικρότερες περιοχές θα απαιτούσε εξαιρετικά εκλεπτυσμένες και διαφοροποιημένες μετρήσεις για το εμπόριο πουλερικών, τις οδικές υποδομές, τα υδάτινα σώματα κ.λπ. δεδομένα που συνήθως δεν είναι διαθέσιμα μέσω απογραφών. Οι διαφορές μεταξύ των εθνικών και περιφερειακών μοντέλων υποδηλώνουν ότι τα αποτελέσματά μας μπορούν να ενημερώσουν τους σχεδιαστές που λαμβάνουν αποφάσεις σε διαφορετικά ιεραρχικά επίπεδα δικαιοδοσίας: εθνικό, περιφερειακό και τοπικό. Η μελέτη μας έχει τη δυνατότητα να ενημερώσει τον σχεδιασμό μελλοντικής έρευνας που σχετίζεται με την επιδημιολογία άλλων EIDs σε Βιετνάμ και αλλού. Για παράδειγμα, εικάζουμε ότι στη Νοτιοανατολική Ασία, η ιαπωνική εγκεφαλίτιδα, η μετάδοση της οποίας συνδέεται με την καλλιέργεια ρυζιού και την πλημμυρική άρδευση [80] , μπορεί επίσης να δείξει ισχυρή σχέση με την περιαστικοποίηση. Σε ορισμένες περιοχές της Ασίας αυτές οι οικολογικές συνθήκες συμβαίνουν κοντά ή περιστασιακά μέσα σε αστικά κέντρα. Ομοίως, ο ιός Hantaan, η αιτία του κορεατικού αιμορραγικού πυρετού, σχετίζεται με το ποντίκι Apodemus agrarius και τη συγκομιδή ρυζιού σε χωράφια όπου υπάρχουν τα τρωκτικά [80] . Η εργασία μας έχει δείξει ότι το ποσοστό της γης με ρύζι σε περιαστικές και αγροτικές περιοχές είναι παρόμοιο. Ως εκ τούτου, οι ασθένειες που σχετίζονται με την παραγωγή ρυζιού είναι πιθανό να κορυφωθούν σε περιαστικές περιοχές, δεδομένων άλλων παραγόντων κινδύνου, όπως η ποικιλομορφία της χρήσης γης, η CTI και η απόσταση από τις υποδομές. Τα ευρήματά μας για την ποικιλομορφία μεγέθους κοπαδιού πουλερικών μπορεί επίσης να είναι σχετικά με την κατανόηση της δυναμικής άλλων λοιμώξεων που σχετίζονται με τα πουλερικά, όπως η νόσος του Newcastle. Τέλος, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν την εγκυρότητα ενός γενικού μοντέλου εμφάνισης ζωονοσογόνων νόσων που ενσωματώνει το μοντέλο σύγκλισης του IOM με τα μεταγενέστερα προτεινόμενα κοινωνικο-οικολογικά συστήματα και το πλαίσιο EID. Έτσι, η σύγκλιση αντιπροσωπεύει τη συνένωση στο χρόνο και το χώρο των διαδικασιών που σχετίζονται με τις αλλαγές κάλυψης και χρήσης γης. Τα αποτελέσματα του έργου διερωτώνται εάν η διχοτόμηση αστικής/αγροτικής χρήσης γης είναι χρήσιμη όταν μεγάλες περιοχές και τμήματα του πληθυσμού βρίσκονται μεταξύ των δύο. Οι σχεδιαστές χρειάζονται καλύτερα εργαλεία για τη χαρτογράφηση της μετάβασης αγροτικής πόλης και για να κατανοήσουν πώς η ειδική φύση των περιαστικών περιβαλλόντων δημιουργεί αυξημένο κίνδυνο για την υγεία που απαιτεί προσαρμογή του υπάρχοντος σχεδιασμού, χρήσης γης και πρακτικών ανάπτυξης.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 1927, "text": "τοπία όπου αλληλεπικαλύπτονται εντατικές και εκτεταμένες μορφές παραγωγής πουλερικών βρέθηκαν σε μεγαλύτερο κίνδυνο" } ], "id": 587, "question": "Ποια είναι η σχέση μεταξύ της μετάδοσης του ιού HIN1 και της παραγωγής πουλερικών." }, { "answers": [ { "answer_start": 28940, "text": "Το πλεονέκτημα του BRT είναι ότι εφαρμόζει στοχαστικές διαδικασίες που περιλαμβάνουν πιθανολογικά στοιχεία για τη βελτίωση της προγνωστικής απόδοσης." } ], "id": 591, "question": "Ποιο είναι το πλεονέκτημα της μεθόδου Boosted Regression Tree;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5298, "text": "Ο κίνδυνος εμφάνισης θα πρέπει να είναι υψηλότερος στις αστικές περιοχές που μετασχηματίζονται ταχύτερα, στις περιαστικές ζώνες όπου οι συνδυασμοί αστικών-αγροτικών, σύγχρονων-παραδοσιακών χρήσεων γης και πτηνοτροφίας συμπίπτουν πιο έντονα." } ], "id": 589, "question": "Πού είναι ο υψηλότερος κίνδυνος εμφάνισης ασθένειας τύπου HPAI H5N1;" }, { "answers": [ { "answer_start": 11859, "text": "Ο κατακερματισμός του τοπίου δημιουργεί οικοτόνους, που ορίζονται ως απότομες ακμές ή ζώνες μετάβασης μεταξύ διαφορετικών οικολογικών συστημάτων, που πιστεύεται ότι διευκολύνουν την εμφάνιση ασθενειών αυξάνοντας την ένταση και τη συχνότητα της επαφής μεταξύ των ειδών ξενιστών [31] Επιπλέον, ο κατακερματισμός του φυσικού οικοτόπου τείνει να διακόπτει και να υποβαθμίζει τις φυσικές διεργασίες. συμπεριλαμβανομένων των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των ειδών που ρυθμίζουν τις πυκνότητες των κατά τα άλλα ευκαιριακών ειδών που μπορεί να χρησιμεύσουν ως ικανοί ξενιστές" } ], "id": 594, "question": "Πώς ο κατακερματισμός των χρήσεων γης αυξάνει τον κίνδυνο νοσημάτων που μοιάζουν με γρίπη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 18987, "text": "Η έκταση της υδατοκαλλιέργειας είναι ένας γνωστός παράγοντας κινδύνου [10], πιθανώς επειδή τα υδάτινα σώματα προσφέρουν διαδρομές μετάδοσης και εμμονής του ιού" } ], "id": 597, "question": "Ποια είναι η σχέση μεταξύ της υδατοκαλλιέργειας και της εξάπλωσης ασθενειών που μοιάζουν με τον H5N1;" }, { "answers": [ { "answer_start": 34612, "text": "η ποικιλομορφία του μεγέθους του κοπαδιού κοτόπουλου είχε ισχυρή σχέση με τον HPAI H5N1" } ], "id": 599, "question": "Ποια είναι η επίδραση της ποικιλομορφίας του κοπαδιού κοτόπουλου στη νόσο H5N1;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Η υδροξυχλωροκίνη, ένα λιγότερο τοξικό παράγωγο της χλωροκίνης, είναι αποτελεσματική στην αναστολή της λοίμωξης από SARS-CoV-2 in vitrohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7078228/SHA: 1cf54d1c77bd7f290104; Cao, Ruiyuan; Xu, Mingyue; Wang, Xi; Zhang, Huanyu; Hu, Hengrui; Li, Yufeng; Hu, Zhihong; Zhong, Wu; Wang, ManliDate: 2020-03-18DOI: 10.1038/s41421-020-0156-0 License: cc-byAbstract: nanΚείμενο: Η υδροξυχλωροκίνη, ένα λιγότερο τοξικό παράγωγο της χλωροκίνης, είναι αποτελεσματικό στη μόλυνση από SARS2 in vitrobit , Ruiyuan Cao 2 , Mingyue Xu 1,3 , Xi Wang 1 , Huanyu Zhang 1,3 , Hengrui Hu 1,3 , Yufeng Li 1,3 , Zhihong Hu 1 , Wu Zhong 2 και Manli Wang 1 Αγαπητέ εκδότη, Το ξέσπασμα του Η νόσος του κοροναϊού 2019 (COVID-19) που προκαλείται από το σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο κορωνοϊός 2 (SARS-CoV-2/2019-nCoV) αποτελεί σοβαρή απειλή για την παγκόσμια δημόσια υγεία και τις τοπικές οικονομίες. Από τις 3 Μαρτίου 2020, περισσότερα από 80.000 κρούσματα έχουν επιβεβαιωθεί στην Κίνα, συμπεριλαμβανομένων 2.946 θανάτων καθώς και πάνω από 10.566 επιβεβαιωμένων κρουσμάτων σε 72 άλλες χώρες. Τέτοιος τεράστιος αριθμός μολυσμένων και νεκρών ανθρώπων απαιτεί επείγουσα ζήτηση αποτελεσματικών, διαθέσιμων και οικονομικά φαρμάκων για τον έλεγχο και τη μείωση της επιδημίας. Πρόσφατα αναφέραμε ότι δύο φάρμακα, η ρεμδεσιβίρη (GS-5734) και η φωσφορική χλωροκίνη (CQ), είναι αποτελεσματικά ανέστειλε τη μόλυνση SARS-CoV-2 in vitro 1 . Το Remdesivir είναι ένα προφάρμακο ανάλογο νουκλεοσιδίου που αναπτύχθηκε από την Gilead Sciences (ΗΠΑ). Μια πρόσφατη αναφορά περιστατικού έδειξε ότι η θεραπεία με ρεμδεσιβίρη βελτίωσε την κλινική κατάσταση του πρώτου ασθενούς που μολύνθηκε από SARS-CoV-2 στις Ηνωμένες Πολιτείες 2 και μια κλινική δοκιμή φάσης ΙΙΙ του remdesivir κατά του SARS-CoV-2 ξεκίνησε στη Γουχάν τον Φεβρουάριο. 4, 2020. Ωστόσο, ως πειραματικό φάρμακο, το remdesivir δεν αναμένεται να είναι σε μεγάλο βαθμό διαθέσιμο για την έγκαιρη θεραπεία πολύ μεγάλου αριθμού ασθενών. Επομένως, από τα δύο πιθανά φάρμακα, το CQ φαίνεται να είναι το φάρμακο εκλογής για χρήση σε μεγάλη κλίμακα λόγω της διαθεσιμότητάς του, του αποδεδειγμένου ιστορικού ασφάλειας και του σχετικά χαμηλού κόστους του. Υπό το φως των προκαταρκτικών κλινικών δεδομένων, το CQ προστέθηκε στη λίστα των δοκιμαστικών φαρμάκων στις Κατευθυντήριες οδηγίες για τη διάγνωση και τη θεραπεία του COVID-19 (έκτη έκδοση) που δημοσιεύτηκε από την Εθνική Επιτροπή Υγείας της Λαϊκής Δημοκρατίας της Κίνας. Το CQ (Ν4-(7-χλωρο-4-κινολινυλ)-Ν1,Ν1-διαιθυλ-1,4πεντανοδιαμίνη) έχει χρησιμοποιηθεί από καιρό για τη θεραπεία της ελονοσίας και της αμεβίασης. Ωστόσο, το Plasmodium falciparum ανέπτυξε ευρεία αντίσταση σε αυτό και με την ανάπτυξη νέων ανθελονοσιακών φαρμάκων, έγινε επιλογή για την προφύλαξη από την ελονοσία. Επιπλέον, μια υπερβολική δόση CQ μπορεί να προκαλέσει οξεία δηλητηρίαση και θάνατο 3 . Τα τελευταία χρόνια, λόγω της σπάνιας χρήσης του CQ στην κλινική πράξη, η παραγωγή και η προσφορά του στην αγορά μειώθηκαν σημαντικά, τουλάχιστον στην Κίνα. Η θειική υδροξυχλωροκίνη (HCQ), ένα παράγωγο του CQ, συντέθηκε για πρώτη φορά το 1946 με την εισαγωγή μιας ομάδας υδροξυλίου στο CQ και αποδείχθηκε ότι είναι πολύ λιγότερο (~40%) τοξικό από το CQ στα ζώα 4 . Το πιο σημαντικό, το HCQ εξακολουθεί να είναι ευρέως διαθέσιμο για τη θεραπεία αυτοάνοσων ασθενειών, όπως ο συστηματικός ερυθηματώδης λύκος και η ρευματοειδής αρθρίτιδα. Δεδομένου ότι το CQ και το HCQ μοιράζονται παρόμοιες χημικές δομές και μηχανισμούς δράσης ως αδύναμη βάση και ανοσοδιαμορφωτή, είναι εύκολο να δημιουργηθεί η ιδέα ότι το HCQ μπορεί να είναι ένας ισχυρός υποψήφιος για τη θεραπεία της λοίμωξης από τον SARS-CoV-2. Στην πραγματικότητα, από τις 23 Φεβρουαρίου 2020, βρέθηκαν επτά μητρώα κλινικών δοκιμών στο Κινεζικό Μητρώο Κλινικών Δοκιμών (http://www.chictr.org.cn) για τη χρήση του HCQ για τη θεραπεία του COVID-19. Το εάν το HCQ είναι τόσο αποτελεσματικό όσο το CQ στη θεραπεία της λοίμωξης SARS-CoV-2 εξακολουθεί να λείπει τα πειραματικά στοιχεία. Για το σκοπό αυτό, αξιολογήσαμε την αντιική επίδραση του HCQ έναντι της λοίμωξης SARS-CoV-2 σε σύγκριση με το CQ in vitro. Πρώτον, η κυτταροτοξικότητα του HCQ και του CQ σε κύτταρα VeroE6 νεφρού αφρικανικού πράσινου πιθήκου (ATCC-1586) μετρήθηκε με την τυπική ανάλυση CCK8 και το αποτέλεσμα έδειξε Άδεια χρήσης, η οποία επιτρέπει τη χρήση, την κοινή χρήση, την προσαρμογή, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο ή μορφή, αρκεί να αποδίδετε τα κατάλληλα εύσημα στους αρχικούς δημιουργούς και την πηγή, να παρέχετε έναν σύνδεσμο προς την άδεια Creative Commons και να υποδεικνύετε εάν αλλάζει φτιαχτηκαν. Οι εικόνες ή άλλο υλικό τρίτων σε αυτό το άρθρο περιλαμβάνονται στην άδεια Creative Commons του άρθρου, εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά σε ένα πιστωτικό όριο για το υλικό. Εάν το υλικό δεν περιλαμβάνεται στην άδεια Creative Commons του άρθρου και η χρήση για την οποία προορίζεται δεν επιτρέπεται από νομοθετική ρύθμιση ή υπερβαίνει την επιτρεπόμενη χρήση, θα χρειαστεί να λάβετε άδεια απευθείας από τον κάτοχο των πνευματικών δικαιωμάτων. Για να δείτε ένα αντίγραφο αυτής της άδειας, επισκεφθείτε τη διεύθυνση http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. (Σύκο. 1α). Για να συγκριθεί καλύτερα η αντιϊκή δραστηριότητα του CQ έναντι του HCQ, οι καμπύλες δόσης-απόκρισης των δύο ενώσεων κατά του SARS-CoV-2 προσδιορίστηκαν σε τέσσερις διαφορετικές πολλαπλότητες μόλυνσης (MOIs) με ποσοτικοποίηση των αριθμών αντιγράφων ιικού RNA στο υπερκείμενο του κυττάρου στο 48 h μετά τη μόλυνση (p.i.). Τα δεδομένα που συνοψίζονται στο Σχ. Το 1a και ο συμπληρωματικός πίνακας S1 δείχνουν ότι, σε όλα τα MOI (0,01, 0,02, 0,2 και 0,8), η μέγιστη αποτελεσματική συγκέντρωση 50% (EC 50 ) για το CQ (2,71, 3,81, 7,14 και 7,36 μΜ) ήταν χαμηλότερη από αυτή του HCQ (4,51, 4,06, 17,31 και 12,96 μΜ). Οι διαφορές στις τιμές EC50 ήταν στατιστικά σημαντικές σε ΜΟΙ 0,01 (Ρ < 0,05) και ΜΟΙ 0,2 (Ρ < 0,001) (Συμπληρωματικός Πίνακας S1). Αξίζει να σημειωθεί ότι οι τιμές EC 50 του CQ φάνηκαν να είναι λίγο υψηλότερες από αυτές στην προηγούμενη έκθεσή μας (1,13 μM σε MOI 0,05) 1 , κάτι που πιθανότατα οφείλεται στην προσαρμογή του ιού σε κυτταροκαλλιέργεια που αυξήθηκε σημαντικά ιογενής μολυσματικότητα κατά τη συνεχή διέλευση. Συνεπώς, ο δείκτης επιλεκτικότητας (SI = CC 50 /EC 50 ) του CQ (100,81, 71,71, 38,26 και 37,12) ήταν υψηλότερος από αυτόν του HCQ (55,32, 61,45, 14,41, 19,21, 2,00) στα . και 0,8, αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού όπως αποδεικνύεται από διαφορετικά επίπεδα έκφρασης νουκλεοπρωτεΐνης ιού (ΝΡ) στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις φαρμάκου στις 48 ώρες p.i. (Συμπληρωματικό Σχ. S1). Συνολικά, τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η δράση κατά του SARS-CoV-2 του HCQ φαίνεται να είναι λιγότερο ισχυρή σε σύγκριση με το CQ, τουλάχιστον σε ορισμένα MOI. Και το CQ και το HCQ είναι αδύναμες βάσεις που είναι γνωστό ότι αυξάνουν το pH του όξινου ενδοκυτταρικού οργανίδια, όπως ενδοσώματα/λυσοσώματα, απαραίτητα για τη σύντηξη μεμβράνης 5 . Επιπλέον, το CQ θα μπορούσε να αναστείλει την είσοδο του SARS-CoV αλλάζοντας τη γλυκοζυλίωση του υποδοχέα ACE2 και της πρωτεΐνης ακίδας 6 . Το πείραμα χρόνου προσθήκης επιβεβαίωσε ότι το HCQ ανέστειλε αποτελεσματικά το στάδιο εισόδου, καθώς και τα στάδια μετά την είσοδο του SARS-CoV-2, το οποίο βρέθηκε επίσης κατά τη θεραπεία με CQ (Συμπληρωματικό Σχ. S2). Για περαιτέρω διερεύνηση του λεπτομερούς μηχανισμού δράσης των CQ και HCQ στην αναστολή της εισόδου του ιού, ο συνεντοπισμός ιοσωμάτων με πρώιμα ενδοσώματα (EEs) ή ενδολυσοσώματα (ELs) αναλύθηκε με ανάλυση ανοσοφθορισμού (IFA) και συνεστιακή μικροσκοπία. Η ποσοτική ανάλυση έδειξε ότι, στα 90 λεπτά p.i. σε κύτταρα που δεν υποβλήθηκαν σε αγωγή, το 16,2% των εσωτερικοποιημένων ιοσωμάτων (αντι-ΝΡ, κόκκινο) παρατηρήθηκαν στα πρώιμα θετικά για το αντιγόνο ενδοσωμάτων 1 (EEA1) EE (πράσινα), ενώ περισσότερα ιοσωμάτια (34,3%) μεταφέρθηκαν στην όψιμη ενδοσωμική-λυσοσωμική πρωτεΐνη LAMP1 + EL (πράσινο) (n > 30 κελιά για κάθε ομάδα). Αντίθετα, παρουσία CQ ή HCQ, σημαντικά περισσότερα ιοσωμάτια (35,3% για το CQ και 29,2% για το HCQ. P < 0,001) ανιχνεύθηκαν στα EE, ενώ μόνο πολύ λίγα ιοσωμάτια (2,4% για το CQ και 0,03% για το HCQ. P < 0,001) βρέθηκε να ταυτίζεται με LAMP1 + ELs (n > 30 κύτταρα) (Εικ. 1β, γ). Αυτό υποδηλώνει ότι τόσο το CQ όσο και το HCQ εμπόδισαν τη μεταφορά του SARS-CoV-2 από EE σε EL, κάτι που φαίνεται να αποτελεί απαίτηση για την απελευθέρωση του ιικού γονιδιώματος όπως στην περίπτωση του SARS-CoV 7. Είναι ενδιαφέρον ότι βρήκαμε ότι το CQ και το HCQ η θεραπεία προκάλεσε αξιοσημείωτες αλλαγές στον αριθμό και το μέγεθος/μορφολογία των EE και ELs (Εικ. 1γ). Στα μη επεξεργασμένα κύτταρα, τα περισσότερα EE ήταν πολύ μικρότερα από τα ELs (Εικ. 1γ). Σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με CQand HCQ, παρατηρήθηκαν ασυνήθιστα διευρυμένα κυστίδια EE (Εικ. 1c , βέλη στα επάνω πλαίσια), πολλά από τα οποία είναι ακόμη μεγαλύτερα από τα EL στα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Αυτό συμφωνεί με την προηγούμενη αναφορά ότι η θεραπεία με CQ προκάλεσε το σχηματισμό διευρυμένων κυτταροπλασματικών κυστιδίων 8 . Εντός των κυστιδίων ΕΕ, ιοσωμάτια (κόκκινα) εντοπίστηκαν γύρω από τη μεμβράνη (πράσινη) του κυστιδίου. Η θεραπεία CQ δεν προκάλεσε εμφανείς αλλαγές στον αριθμό και το μέγεθος των EL. Ωστόσο, η κανονική δομή των κυστιδίων φαινόταν να έχει διαταραχθεί, τουλάχιστον εν μέρει. Αντίθετα, στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με HCQ, το μέγεθος και ο αριθμός των EL αυξήθηκαν σημαντικά (Εικ. 1c , βέλη στα κάτω πλαίσια). Δεδομένου ότι η οξίνιση είναι ζωτικής σημασίας για την ωρίμανση και τη λειτουργία του ενδοσώματος, υποθέτουμε ότι η ωρίμανση του ενδοσώματος μπορεί να αποκλειστεί σε ενδιάμεσα στάδια της ενδοκυττάρωσης, με αποτέλεσμα την αποτυχία περαιτέρω μεταφοράς ιοσωμάτων στην τελική θέση απελευθέρωσης. Το CQ αναφέρθηκε ότι ανέβασε το pH (βλ. σχήμα στην προηγούμενη σελίδα) Εικ. 1 Συγκριτική αντιική αποτελεσματικότητα και μηχανισμός δράσης των CQ και HCQ έναντι της λοίμωξης SARS-CoV-2 in vitro. Κυτταροτοξικότητα και αντιικές δράσεις των CQ και HCQ. Η κυτταροτοξικότητα των δύο φαρμάκων σε κύτταρα Vero Ε6 προσδιορίστηκε με προσδιορισμούς CCK-8. Τα κύτταρα Vero E6 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαφορετικές δόσεις είτε της ένωσης είτε με PBS στους μάρτυρες για 1 ώρα και στη συνέχεια μολύνθηκαν με SARS-CoV-2 σε MOI 0,01, 0,02, 0,2 και 0,8. Η απόδοση του ιού στο υπερκείμενο του κυττάρου ποσοτικοποιήθηκε με qRT-PCR στις 48 ώρες p.i. Ο άξονας Υ αντιπροσωπεύει τη μέση ποσοστιαία αναστολή κανονικοποιημένη στην ομάδα PBS. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές. β, γ Μηχανισμός CQ και HCQ στην αναστολή εισόδου του ιού. Τα κύτταρα Vero E6 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CQ ή HCQ (50 μΜ) για 1 ώρα, ακολουθούμενη από δέσμευση ιού (MOI = 10) στους 4°C για 1 ώρα. Στη συνέχεια τα μη δεσμευμένα ιοσωμάτια αφαιρέθηκαν και τα κύτταρα συμπληρώθηκαν περαιτέρω με φρέσκο ​​μέσο που περιείχε φάρμακο στους 37°C για 90 λεπτά πριν σταθεροποιηθούν και χρωματιστούν με IFA χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-ΝΡ για ιοσωμάτια (κόκκινο) και αντισώματα κατά EEA1 για EEs ( πράσινο) ή LAMP1 για EL (πράσινο). Οι πυρήνες (μπλε) χρωματίστηκαν με χρωστική Hoechst. Το τμήμα των βιριόντων που συνεντοπίστηκε με EEs ή ELs σε κάθε ομάδα (n > 30 κύτταρα) ποσοτικοποιήθηκε και φαίνεται στο β. Αντιπροσωπευτικές ομοεστιακές μικροσκοπικές εικόνες ιικών σωματιδίων (κόκκινο), EEA1 + EE (πράσινο) ή LAMP1 + EL (πράσινο) σε κάθε ομάδα εμφανίζονται σε c. Οι μεγεθυσμένες εικόνες στα κουτιά υποδεικνύουν ένα μόνο ιόδιο που περιέχει κυστίδια. Τα βέλη έδειχναν τα ασυνήθιστα μεγεθυσμένα κυστίδια. Μπάρες, 5 μm. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) με GraphPad Prism (F = 102,8, df = 5,182, ***P < 0,001). λυσοσώματος από περίπου 4,5 έως 6,5 στα 100 μM 9 . Από όσο γνωρίζουμε, υπάρχει έλλειψη μελετών σχετικά με την επίδραση του HCQ στη μορφολογία και τις τιμές pH των ενδοσωμάτων/λυσοσωμάτων. Οι παρατηρήσεις μας πρότειναν ότι ο τρόπος δράσης του CQ και του HCQ φαίνεται να είναι διακριτός σε ορισμένες πτυχές. Έχει αναφερθεί ότι η από του στόματος απορρόφηση του CQ και του HCQ στους ανθρώπους είναι πολύ αποτελεσματική. Στα ζώα, και τα δύο φάρμακα μοιράζονται παρόμοια πρότυπα κατανομής στους ιστούς, με υψηλές συγκεντρώσεις στο ήπαρ, τον σπλήνα, τους νεφρούς και τους πνεύμονες να φτάνουν σε επίπεδα 200-700 φορές υψηλότερα από εκείνα στο πλάσμα 10 . Αναφέρθηκε ότι η ασφαλής δόση (6-6,5 mg/kg ημερησίως) θειικού HCQ θα μπορούσε να δημιουργήσει επίπεδα ορού 1,4-1,5 μM σε ανθρώπους 11 . Επομένως, με μια ασφαλή δόση, η συγκέντρωση του HCQ στους παραπάνω ιστούς είναι πιθανό να επιτευχθεί για την αναστολή της λοίμωξης από SARS-CoV-2. Η κλινική έρευνα διαπίστωσε ότι ανιχνεύθηκαν υψηλές συγκεντρώσεις κυτοκινών στο πλάσμα ασθενών σε κρίσιμη κατάσταση που είχαν μολυνθεί με SARS-CoV- 2, υποδηλώνοντας ότι η καταιγίδα κυτοκινών συσχετίστηκε με τη σοβαρότητα της νόσου 12 . Εκτός από την άμεση αντιική του δράση, το HCQ είναι ένας ασφαλής και επιτυχημένος αντιφλεγμονώδης παράγοντας που έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς σε αυτοάνοσα νοσήματα και μπορεί να μειώσει σημαντικά την παραγωγή κυτοκινών και, ειδικότερα, προφλεγμονωδών παραγόντων. Ως εκ τούτου, σε ασθενείς με COVID-19, το HCQ μπορεί επίσης να συμβάλει στην άμβλυνση της φλεγμονώδους απόκρισης. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το HCQ μπορεί να αναστείλει αποτελεσματικά τη μόλυνση από SARS-CoV-2 in vitro. Σε συνδυασμό με την αντιφλεγμονώδη λειτουργία του, προβλέπουμε ότι το φάρμακο έχει καλές δυνατότητες να καταπολεμήσει τη νόσο. Αυτή η πιθανότητα περιμένει επιβεβαίωση από κλινικές δοκιμές. Πρέπει να επισημάνουμε, αν και το HCQ είναι λιγότερο τοξικό από το CQ, η παρατεταμένη χρήση και η υπερβολική δόση μπορεί να προκαλέσει δηλητηρίαση. Και το σχετικά χαμηλό SI του HCQ απαιτεί προσεκτικό σχεδιασμό και διεξαγωγή κλινικών δοκιμών για την επίτευξη αποτελεσματικού και ασφαλούς ελέγχου της λοίμωξης SARS-CoV-2.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 2005, "text": "δύο πιθανά φάρμακα, το CQ φαίνεται να είναι το φάρμακο εκλογής για χρήση σε μεγάλη κλίμακα λόγω της διαθεσιμότητάς του, του αποδεδειγμένου ιστορικού ασφάλειας και του σχετικά χαμηλού κόστους του." } ], "id": 651, "question": "Ποιο θα είναι το φάρμακο εκλογής για τη θεραπεία του COVID-19 μεταξύ Χλωροκίνης και Ρεμντεσιβίρης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 12896, "text": "το HCQ είναι ένας ασφαλής και επιτυχημένος αντιφλεγμονώδης παράγοντας" } ], "id": 662, "question": "Αποδείξεις ότι η υδροξυχλωροκίνη (HCQ) είναι αντιφλεγμονώδης σε βαρέως πάσχοντες από SARS-CoV-2 με αυξημένες κυτοκίνες πλάσματος;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Παράγοντες που σχετίζονται με τα αποτελέσματα της ψυχικής υγείας μεταξύ των εργαζομένων στον τομέα της υγείας που εκτέθηκαν στη νόσο του κοροναϊού 2019https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7090843/SHA: 0a08fddd9dcee1b1254a03:33ccAut; Ma, Siming; Wang, Ying; Cai, Zhongxiang; Hu, Jianbo; Wei, Ning; Wu, Jiang; Du, Hui; Chen, Tingting; Li, Ruiting; Tan, Huawei; Kang, Lijun; Yao, Lihua; Huang, Manli; Wang, Huafen; Wang, Gaohua; Liu, Zhongchun; Hu, Shaohua Ημερομηνία: 2020-03-23DOI: 10.1001/jamanetworkopen.2020.3976Άδεια: cc-byAbstract: ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Οι εργαζόμενοι στον τομέα της υγείας που εκτέθηκαν στη νόσο του κοροναϊού το 2019 (COVID-19) θα μπορούσαν να υποστούν ψυχολογικό στρες. ΣΚΟΠΟΣ: Να εκτιμηθεί το μέγεθος των αποτελεσμάτων ψυχικής υγείας και των σχετικών παραγόντων μεταξύ των εργαζομένων στον τομέα της υγείας που θεραπεύουν ασθενείς που εκτέθηκαν στον COVID-19 στην Κίνα. ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ, ΡΥΘΜΙΣΕΙΣ ΚΑΙ ΣΥΜΜΕΤΕΧΟΝΤΕΣ: Αυτή η συγχρονική, βασισμένη σε έρευνες, στρωματοποιημένη σε περιοχή μελέτη συνέλεξε δημογραφικά δεδομένα και μετρήσεις ψυχικής υγείας από 1257 εργαζόμενους στον τομέα της υγείας σε 34 νοσοκομεία από τις 29 Ιανουαρίου 2020 έως τις 3 Φεβρουαρίου 2020 στην Κίνα. Οι εργαζόμενοι στον τομέα της υγειονομικής περίθαλψης σε νοσοκομεία που διαθέτουν κλινικές πυρετού ή θαλάμους για ασθενείς με COVID-19 ήταν επιλέξιμοι. ΚΥΡΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΜΕΤΡΑ: Ο βαθμός των συμπτωμάτων της κατάθλιψης, του άγχους, της αϋπνίας και της δυσφορίας αξιολογήθηκε από τις κινεζικές εκδόσεις του ερωτηματολογίου υγείας των ασθενών 9 σημείων, της κλίμακας γενικευμένης αγχώδους διαταραχής 7 στοιχείων, του δείκτη σοβαρότητας αϋπνίας 7 στοιχείων, και το Impact of Event Scale–Αναθεωρημένο με 22 στοιχεία, αντίστοιχα. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση πολυμεταβλητής λογιστικής παλινδρόμησης για τον εντοπισμό παραγόντων που σχετίζονται με τα αποτελέσματα της ψυχικής υγείας. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Συνολικά 1257 από τα 1830 άτομα που ήρθαν σε επαφή ολοκλήρωσαν την έρευνα, με ποσοστό συμμετοχής 68,7%. Συνολικά 813 (64,7%) ήταν ηλικίας 26 έως 40 ετών και 964 (76,7%) ήταν γυναίκες. Από όλους τους συμμετέχοντες, 764 (60,8%) ήταν νοσηλευτές και 493 (39,2%) γιατροί. 760 (60,5%) εργάζονταν σε νοσοκομεία της Γουχάν και 522 (41,5%) ήταν εργαζόμενοι στην πρώτη γραμμή υγείας. Ένα σημαντικό ποσοστό συμμετεχόντων ανέφερε συμπτώματα κατάθλιψης (634 [50,4%), άγχους (560 [44,6%), αϋπνίας (427 [34,0%)) και αγωνίας (899 [71,5%). Νοσοκόμοι, γυναίκες, εργαζόμενοι στον τομέα της υγείας πρώτης γραμμής και εκείνοι που εργάζονται στη Γουχάν της Κίνας, ανέφεραν πιο σοβαρούς βαθμούς όλων των μετρήσεων των συμπτωμάτων ψυχικής υγείας από άλλους εργαζόμενους στον τομέα της υγείας (π.χ. διάμεση βαθμολογία του ερωτηματολογίου υγείας ασθενών [IQR] μεταξύ γιατρών έναντι νοσηλευτών: 4.0 [1,0-7,0] έναντι 5,0 [2,0-8,0]; P = .007; διάμεσος [διατεταρτημόριο εύρος {IQR}] Βαθμολογίες κλίμακας γενικευμένης αγχώδους διαταραχής μεταξύ ανδρών έναντι γυναικών: 2,0 [0-6,0] έναντι 4,0 [1,0-7,0]; P <.001; Διάμεσος [IQR] Βαθμολογίες του Δείκτη Σοβαρότητας Αϋπνίας μεταξύ εργαζομένων πρώτης γραμμής έναντι εργαζομένων δεύτερης γραμμής: 6,0 [2,0-11,0] έναντι 4,0 [1,0-8,0]. P <.001; διάμεσος [IQR] Αντίκτυπος της κλίμακας συμβάντων–Αναθεωρημένες βαθμολογίες μεταξύ αυτών στο Wuhan έναντι εκείνων στο Hubei εκτός Wuhan και εκείνων εκτός Hubei: 21,0 [8,5-34,5] έναντι 18,0 [6,0-28,0] στο Hubei εκτός Wuhan και 15,0 [4,0]2 έξω από το Hubei? P < .001). Η ανάλυση πολυμεταβλητής λογιστικής παλινδρόμησης έδειξε ότι οι συμμετέχοντες εκτός της επαρχίας Hubei σχετίζονταν με χαμηλότερο κίνδυνο να εμφανίσουν συμπτώματα δυσφορίας σε σύγκριση με εκείνους στη Γουχάν (αναλογία πιθανοτήτων [OR], 0,62· 95% CI, 0,43-0,88; P = .008). Οι εργαζόμενοι στην πρώτη γραμμή υγείας που ασχολούνται με την άμεση διάγνωση, θεραπεία και φροντίδα ασθενών με COVID-19 συσχετίστηκαν με υψηλότερο κίνδυνο συμπτωμάτων κατάθλιψης (OR, 1,52; 95% CI, 1,11-2,09; P = 0,01), άγχος (OR, 1,57; 95% CI, 1,22-2,02; P < .001), αϋπνία (OR, 2.97; 95% CI, 1,92-4,60; P < .001) και αγωνία (OR, 1.60; 95% CI, 1,25-2,04; P < .001). ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΧΕΤΙΚΟΤΗΤΑ: Σε αυτήν την έρευνα εργαζομένων σε νοσοκομεία εξοπλισμένα με κλινικές πυρετού ή πτέρυγες για ασθενείς με COVID-19 στη Γουχάν και σε άλλες περιοχές στην Κίνα, οι συμμετέχοντες ανέφεραν ότι αντιμετώπισαν ψυχολογική επιβάρυνση, ειδικά νοσηλευτές, γυναίκες, στη Γουχάν και στην πρώτη γραμμή εργαζόμενοι στον τομέα της υγειονομικής περίθαλψης που ασχολούνται άμεσα με τη διάγνωση, τη θεραπεία και τη φροντίδα ασθενών με COVID-19. Κείμενο: Συντομογραφία: PHQ-9, Ερωτηματολόγιο υγείας ασθενών 9 στοιχείων. GAD-7, Γενικευμένη Αγχώδης Διαταραχή 7 στοιχείων. ISI, Δείκτης σοβαρότητας αϋπνίας 7 στοιχείων. IES-R, Συντομογραφία Impact of Event 22 στοιχείων: IES-R, 22-item Impact of Event Scale-Revised; IQR, διατεταρτημόριο εύρος. Υπερδιέγερση, διάμεσος (IQR) 6,0 (2,0, 10,0) 6,0 (2,0, 9,0) 0,29", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 2331, "text": "50,4%" } ], "id": 3459, "question": "Ποιο ποσοστό των εργαζομένων στον τομέα της υγείας ανέφερε συμπτώματα κατάθλιψης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2351, "text": "[44,6" } ], "id": 3460, "question": "Ποιο ποσοστό των εργαζομένων στον τομέα της υγείας ανέφερε συμπτώματα άγχους;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2374, "text": "34,0%" } ], "id": 3461, "question": "Ποιο ποσοστό των εργαζομένων στον τομέα της υγείας ανέφερε συμπτώματα αϋπνίας;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2399, "text": "[71,5" } ], "id": 3462, "question": "Ποιο ποσοστό ανέφερε δυσφορία;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Μια λανθασμένη μετάλλαξη στο Katnal1 βασίζεται σε συμπεριφορικές, νευρολογικές και ακτινωτές ανωμαλίεςhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5761721/SHA: f4cebabd74b16e710fb41a737d58ef85sd8 Lassi, G; Hoerder-Suabedissen, A; Tinarelli, F; Simon, Μ Μ; Wilcox, Α; Lau, Ρ; Lawson, Τ Ν; Johnson, S; Rutman, Α; Sweeting, M; Chesham, J E; Barnard, A R; Horner, Ν; Westerberg, Η; Smith, L B; Molnár, Ζ; Hastings, Μ Η; Hirst, R A; Tucci, V; Nolan, P MDate: 2017-04-04DOI: 10.1038/mp.2017.54Άδεια: cc-byAbstract: Τα ένζυμα διαχωρισμού μικροσωληνίσκων εφαρμόζουν ένα ευρύ φάσμα ειδικών για τον ιστό μοριακών λειτουργιών κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και στην ενήλικη ζωή. Αν και η αποκοπή των μικροσωληνίσκων είναι θεμελιώδης σε πολλές δυναμικές νευρικές διεργασίες, λίγα είναι γνωστά σχετικά με τον ρόλο της υπομονάδας A-like 1 του μέλους της οικογένειας Katanin p60, KATNAL1, στη λειτουργία του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ). Πρόσφατες μελέτες που αναφέρουν ότι οι μικροδιαγραφές που ενσωματώνουν τον τόπο KATNAL1 στους ανθρώπους έχουν ως αποτέλεσμα τη διανοητική αναπηρία και τη μικροκεφαλία υποδηλώνουν ότι το KATNAL1 μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στο ΚΝΣ. Ωστόσο, τέτοιες συσχετίσεις δεν διαθέτουν τα λειτουργικά δεδομένα που απαιτούνται για την ανάδειξη πιθανών μηχανισμών που συνδέουν το γονίδιο με τα συμπτώματα της νόσου. Εδώ αναγνωρίζουμε και χαρακτηρίζουμε μια γραμμή ποντικιού που φέρει αλληλόμορφο απώλειας λειτουργίας στο Katnal1. Δείχνουμε ότι τα μεταλλαγμένα εκφράζουν ελλείμματα συμπεριφοράς, συμπεριλαμβανομένων των κιρκάδιων ρυθμών, του ύπνου, του άγχους και της μάθησης/μνήμης. Επιπλέον, στους εγκεφάλους μεταλλαγμένων ποντικών Katnal1 αποκαλύπτουμε πολυάριθμες μορφολογικές ανωμαλίες και ελαττώματα στη μετανάστευση και τη μορφολογία των νευρώνων. Επιπλέον, επιδεικνύουμε ελαττώματα στις κινητικές βλεφαρίδες των κοιλιακών επενδυματικών κυττάρων των μεταλλαγμένων, υποδηλώνοντας έναν ρόλο για το Katnal1 στην ανάπτυξη της ακτινωτής λειτουργίας. Πιστεύουμε ότι τα δεδομένα που παρουσιάζουμε εδώ είναι τα πρώτα που συσχετίζουν το KATNAL1 με τέτοιους φαινοτύπους, αποδεικνύοντας ότι η πρωτεΐνη διαδραματίζει βασικούς ρόλους σε μια σειρά διεργασιών που είναι αναπόσπαστες στην ανάπτυξη της νευρωνικής λειτουργίας και συμπεριφοράς. Κείμενο: Τα ένζυμα διαχωρισμού μικροσωληνίσκων είναι μια οικογένεια ΑΑΑ- Πρωτεΐνες ATPase που συμμετέχουν σε θεμελιώδεις κυτταρικές διεργασίες όπως η μίτωση, η βιογένεση των βλεφαρίδων και η κινητικότητα του κώνου ανάπτυξης. Στους νευρώνες αυτή η οικογένεια είναι γνωστό ότι ελέγχει τέτοιες διεργασίες όπως η επιμήκυνση αξόνων 1 και η συναπτική ανάπτυξη. 2 Επιπλέον, μεταλλάξεις στα γονίδια του ενζύμου SPG4, KATNB1 και KATNAL2 που αποκόπτουν μικροσωληνίσκους σχετίζονται με κληρονομική σπαστική παραπληγία, εγκεφαλικές δυσπλασίες και αυτισμό, αντίστοιχα, [3] [4] [5] [6] και οι μεταλλάξεις στο Fign προκαλούν μια σειρά φαινοτύπων σε ποντίκια. 7 Επί του παρόντος, το ένζυμο διακοπής μικροσωληνίσκων KATNAL1 χαρακτηρίζεται ελάχιστα και δεν είναι ακόμη κατανοητό πώς λειτουργεί το ένζυμο στο νευρικό σύστημα. Πρόσφατα στοιχεία από γενετικό χαρακτηρισμό ανθρώπινων ασθενών υποδηλώνουν ότι η απλοανεπάρκεια του KATNAL1 συνδέεται με έναν αριθμό συμπτωμάτων, όπως η νοητική αναπηρία (ID) και οι κρανιοπροσωπικές δυσμορφολογίες. 8, 9 Είναι επίσης αξιοσημείωτο ότι μια πολύ σπάνια μετάλλαξη KATNAL1 έχει συσχετιστεί με τη σχιζοφρένεια 10 (http://atgu.mgh.harvard.edu/~spurcell/genebook/gene book.cgi?user = guest&cmd = verb-gene&tbox = KATNAL1) και ότι το σύνδρομο Peters και ο αυτισμός έχουν συσχετιστεί και τα δύο με τη χρωμοσωμική περιοχή που περιέχει τον τόπο KATNAL1. 11, 12 Αν και τέτοιες μελέτες συσχέτισης υποδηλώνουν έντονα ότι το KATNAL1 παίζει θεμελιώδη ρόλο στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ), απαιτούνται πρόσθετες μελέτες που χρησιμοποιούν κυτταρικά ή ζωικά μοντέλα για να κατανοηθεί πώς το γονίδιο μπορεί να είναι αιτιολογικό για ασθένεια. Εδώ παρουσιάζουμε την πρώτη μελέτη που περιγράφει νευρικά ελλείμματα και ελλείμματα συμπεριφοράς που σχετίζονται με απώλεια λειτουργικού αλληλόμορφου του Katnal1 στο ποντίκι. Αυτή η μεταλλαγμένη γραμμή ποντικού ταυτοποιήθηκε ανεξάρτητα σε δύο παράλληλες οθόνες φαινοτύπου, οι οποίες απέδειξαν ότι τα μεταλλαγμένα ποντίκια έδειξαν τόσο αρσενική στειρότητα όσο και κιρκαδικούς φαινότυπους. Μεταγενέστερες συμπεριφορικές έρευνες έδειξαν ότι αυτή η μετάλλαξη σχετίζεται με άγχος και ελλείμματα μνήμης. Κάτω από αυτούς τους φαινοτύπους συμπεριφοράς, εντοπίσαμε ιστοπαθολογικές ανωμαλίες στους εγκεφάλους μεταλλαγμένων Katnal1 1H/1H, συμπεριλαμβανομένων διαταραγμένων κυτταρικών στοιβάδων στον ιππόκαμπο και τον φλοιό και ουσιαστικά μεγαλύτερες κοιλίες. Περαιτέρω έρευνες έδειξαν ότι τα ποντίκια Katnal1 1H/1H εμφανίζουν μετανάστευση νευρώνων και ελλείμματα βλεφαρικής λειτουργίας υποδηλώνοντας ότι το KATNAL1 παίζει ουσιαστικό ρόλο σε αυτές τις διαδικασίες. Αυτά τα ευρήματα είναι τα πρώτα που γνωρίζουμε που δείχνουν οριστικά ότι οι μεταλλάξεις στο Katnal1 οδηγούν σε συμπεριφορικές και νευρωνικές διαταραχές και παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τις κλινικές συσχετίσεις που έχουν συνδεθεί με το γονίδιο. εκτελέστηκε σε κοόρτες ποντικιών που ήταν εν μέρει ή πλήρως συγγενείς στο υπόβαθρο C57BL/6 J. Η λειτουργία του κιρκάδιου τροχού πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως. 14 Αξιολόγηση ύπνου με ηλεκτροεγκεφαλογραφία και ηλεκτρομυογραφία Η ηλεκτροεγκεφαλογραφία και η ηλεκτρομυογραφία διενεργήθηκαν όπως περιγράφηκαν προηγουμένως. 15 Φαινότυπος συμπεριφοράς Αυθόρμητη εναλλαγή. Τα ποντίκια τοποθετήθηκαν σε λαβύρινθο Τ με τοίχο (μαύρο χλωριούχο πολυβινύλιο, επενδεδυμένο με πριονίδι. στέλεχος = 88 × 13 cm; βραχίονες = 32 × 13 cm) και τους επιτρέπεται να μπουν σε ένα σκέλος γκολ της επιλογής τους. Το ποντίκι περιορίστηκε στον βραχίονα τέρματος για 30 δευτερόλεπτα, προτού του επιτραπεί μια δεύτερη ελεύθερη επιλογή του βραχίονα τέρματος. Καταγράφηκε εναλλαγή εάν η δεύτερη επιλογή διέφερε από αυτή της πρώτης. Πραγματοποιήθηκε μία δοκιμή την ημέρα για 10 ημέρες. Συμπεριφορά ανοιχτού πεδίου. Τα ποντίκια τοποθετήθηκαν σε μια αρένα με τοίχους (γκρίζο πολυβινυλοχλωρίδιο. 45 × 45 cm) και αφέθηκε να εξερευνηθεί για 20 λεπτά. Τα ζώα παρακολουθήθηκαν με λογισμικό ανάλυσης EthoVision XT (Noldus, Wageningen, Ολλανδία). Παρακολούθηση βίντεο στο οικιακό κλουβί. Η δραστηριότητα στο κλουβί του σπιτιού καταγράφηκε με παρακολούθηση βίντεο όπως περιγράφηκε προηγουμένως. 16 υδάτινος λαβύρινθος Morris και φωνητική υπερήχων. Αυτές οι δοκιμές πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως. 17 Ιστολογία εγκεφάλου και ανοσοφθορισμός Οι εγκέφαλοι τοποθετήθηκαν σε OCT (VWR) και λήφθηκαν στεφανιαίες τομές 12 μm. Οι τομές χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη ή ανοσοεπισημάνθηκαν σύμφωνα με τυπικά πρωτόκολλα. Διεξήχθη in vivo αξιολόγηση μετανάστευσης νευρώνων όπως περιγράφηκε προηγουμένως 18 χρησιμοποιώντας έμβρυα είτε σε Ε13 είτε Ε15 (τρεις μητέρες ανά ηλικιακή ομάδα) και νεογνά στο Ρ9. Οι μετρήσεις κυττάρων πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA). Η in vitro αξιολόγηση της μετανάστευσης των νευρώνων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο μετανάστευσης θαλάμου Boyden όπως περιγράφηκε προηγουμένως. 19 Σάρωση μικροϋπολογιστικής τομογραφίας Η μικροϋπολογιστική τομογραφία πραγματοποιήθηκε με χρήση Skyscan 1172 στα 90 kV, 112 μΑ χρησιμοποιώντας φίλτρο αλουμινίου και χαλκού, βήμα περιστροφής 0,250 μοιρών και μέγεθος pixel 4,96 μm. Τμηματοποίηση και υπολογισμός όγκου3D πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το ITK-SNAP έκδοση 3.0.0 (αναφ. 20) και 3DSlicer. 21 Χρώση Golgi-Cox νευρώνων Η νευρωνική χρώση Golgi-Cox πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ FD Rapid GolgiStain (FD NeuroTechnologies, Columbia, MD, USA). Οι νευρώνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το ImageJ. Εγκέφαλοι από ποντίκια P2 ανατέμθηκαν και το ραχιαίο εγκεφαλικό μισό τεμαχίστηκε (250 μm) μέσω του εδάφους της πλάγιας και 3ης κοιλίας χρησιμοποιώντας δονητή. Η συχνότητα και το μοτίβο του παλμικού παλμού αναλύθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως. 22 Ηλεκτρονική μικροσκοπία Για Ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης η επενδυματική επένδυση της πλάγιας κοιλίας στερεώθηκε σε 2,5% γλουταραλδεΰδη, 2% παραφορμαλδεΰδη σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 0,1 Μ, επωάστηκε σε διάλυμα τετροξειδίου οσμίου 2% διαμέσου δεθανόλης. Τα δείγματα ξηράνθηκαν σε κρίσιμο σημείο χρησιμοποιώντας Emitech K850 (Quorum Technologies, East Sussex, Η.Β.), επικαλυμμένα με πλατίνα χρησιμοποιώντας ένα Quorom Q150R S Sputter Coater (Quorum Technologies). και οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης JEOL LSM-6010 (Jeol, Herts, UK). Η ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως. 22 Στατιστική ανάλυση Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση δύο ουρών Student T test ή AVOVA χρησιμοποιώντας SPSS (IBM) ή GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Το επίπεδο σημαντικότητας για όλες τις αναλύσεις ορίστηκε στο Po 0,05. Παρουσιάζονται όλα τα γραφήματα που δείχνουν τη μέση τιμή ± s.e.m. Πρόσθετες και πιο λεπτομερείς μέθοδοι μπορούν να βρεθούν σε συμπληρωματικές πληροφορίες. Αναγνώριση και κλωνοποίηση της μετάλλαξης Katnal1 1H Για τον εντοπισμό νέων γονιδιακών μεταλλάξεων που επηρεάζουν τη συμπεριφορά του κιρκάδιου, πραγματοποιήσαμε μια οθόνη του κιρκάδιου τροχού με γενεαλογία Ν-αιθυλο- Ποντίκια μεταλλαξιγενή με Ν-νιτροζουρία. 13 Σε μια γενεαλογία, το 17,65% των ζώων εμφάνισε μια σύντομη κιρκαδική περίοδο σε σταθερό σκοτάδι (ο 23 ώρες που παρατηρήθηκαν σε 12 από τα 68 ζώα που εξετάστηκαν). Μια διασταύρωση χρησιμοποιώντας ένα προσβεβλημένο θηλυκό δεν παρήγαγε κανένα προσβεβλημένο ζώο (33 ζώα εξετάστηκαν). Σε επακόλουθες διασταυρούμενες διασταυρώσεις προσβλήθηκε το 15,5% των ζώων (53 από τα 342 ζώα που εξετάστηκαν), υποδηλώνοντας ότι η γενεαλογία φέρει μια μετάλλαξη που προκαλεί έναν υπολειπόμενο κιρκάδιο φαινότυπο ο οποίος είναι 60% διεισδυτικός. Δεν βρήκαμε προκατάληψη φύλου στα προσβεβλημένα ζώα (αναλογία προσβεβλημένων ζώων: αρσενικό = 47,2%· θηλυκό = 52,8%). Ταυτόχρονα, εντοπίστηκε φαινότυπος στειρότητας αρσενικού στην ίδια γενεαλογία. 23 Η ανάλυση σύνδεσης SNP σε όλο το γονιδίωμα χαρτογράφησε τους κιρκαδικούς φαινοτύπους και τη στειρότητα στην ίδια περιοχή στο χρωμόσωμα 5 και η επακόλουθη αλληλούχιση αναγνώρισε την αιτιολογική μετάλλαξη ως μετάλλαξη ενός σημείου Τ σε G εντός του εξονίου επτά του γονιδίου Katnal1. Για πλήρεις λεπτομέρειες της χαρτογράφησης και της αναγνώρισης της μετάλλαξης, ανατρέξτε στην αναφορά 23. Αυτό το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο ονομάστηκε Katnal1 1 Η, και έχει ως αποτέλεσμα μια υποκατάσταση λευκίνης προς βαλίνη στο υπόλειμμα 286 της πρωτεΐνης. In vitro λειτουργική ανάλυση έδειξε ότι η μετάλλαξη είναι ένα υπολειπόμενο αλληλόμορφο απώλειας-λειτουργίας. 23 Η τρισδιάστατη μοντελοποίηση της πρωτεΐνης υποδηλώνει ότι αυτή η απώλεια λειτουργίας οφείλεται σε υδρόφοβες αλλαγές στην περιοχή ΑΑΑ του ενζύμου (Συμπληρωματικό Σχήμα S1). Ο γονότυπος επιβεβαίωσε ότι η μετάλλαξη ήταν ομόζυγη στα προσβεβλημένα κιρκαδικά ζώα και άγριου τύπου ή ετερόζυγη σε μη προσβεβλημένα ζώα, επιβεβαιώνοντας ότι το Katnal1 1H ήταν αιτιολογικό για τον κιρκάδιο φαινότυπο. Katnal1 1H/1H ) και άγριου τύπου γέννα (Katnal1 +/+) επιβεβαίωσαν ότι τα ποντίκια Katnal1 1H/1H είχαν μικρότερη κιρκαδική περίοδο ελεύθερης λειτουργίας (Εικόνες 1a-c) και επιπλέον αποκάλυψαν ότι τα ζώα Katnal1 1H/1H ήταν πιο δραστήρια σε η φωτεινή φάση του κύκλου φωτός/σκότους (Εικόνα 1δ), έδειξε αυξημένη πρόβλεψη μεταπτώσεων φωτός προς σκοτάδι και μεγαλύτερη μετατόπιση στην έναρξη της δραστηριότητας όταν απελευθερώθηκε από τους κύκλους φωτός/σκότους σε σταθερό σκοτάδι (Εικόνα 1e). Τα δεδομένα και οι λεπτομέρειες κοόρτης δίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1. Οι καταγραφές βιοφωταύγειας που πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ποντίκια αναφοράς PER2::LUCIFERASE που έφεραν τη μετάλλαξη Katnal1 1H αποκάλυψαν ότι αυτές οι κιρκαδικές αλλαγές δεν οφείλονταν σε αλλαγές στο μοριακό ρολόι του πυρήνα του υπερχιασματικού πυρήνα (η θέση του κύριου κιρκαδικού ρολογιού στον εγκέφαλο. Συμπληρωματικό Σχήμα S2). Οι κιρκαδικές διαταραχές συχνά συνδέονται με ελλείμματα στην ομοιόσταση του ύπνου. Επομένως, για να συμπληρώσουμε τις κιρκαδικές μελέτες μας, πραγματοποιήσαμε καταγραφές ασύρματης ηλεκτροεγκεφαλογραφίας σε μια βασική περίοδο 24 ωρών και μετά από μια περίοδο στέρησης ύπνου 6 ωρών. Μια λεπτομερής περίληψη της ηλεκτροεγκεφαλογραφικής ανάλυσης δίνεται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1. Σε σύγκριση με τα γέννα άγριου τύπου, η ισχύς δέλτα μη REM των ποντικών Katnal1 1H/1H ήταν υψηλότερη στη σκοτεινή φάση του βασικού ύπνου (μικτή ANOVA, παράγοντες αλληλεπίδρασης 'γενότυπος Χ χρόνος, F(1,88) = 8,91, P = 0,0175) (Εικόνα 1στ) και τόσο στη φωτεινή όσο και στη σκοτεινή φάση του ύπνου ανάκτησης (μικτή ANOVA, παράγοντες αλληλεπίδρασης «γενότυπος X χρόνος», F(1.136) = 11,93, P = 0,0086; Εικόνα 1g). Όλες οι άλλες παράμετροι ύπνου δεν επηρεάστηκαν στα ζώα Katnal1 1H/1H. Τα ποντίκια Katnal1 1H/1H εμφανίζουν ένα φάσμα συμπεριφορικών ελλειμμάτων Ανθρώπινοι ασθενείς που φέρουν μια ετερόζυγη διαγραφή που ενσωματώνει τον τόπο Katnal1 εμφανίζουν έναν αριθμό γνωστικών ελλειμμάτων, συμπεριλαμβανομένης της ID και μιας καθυστέρησης στη γλώσσα. 8, 9 Επομένως, ερευνήσαμε εάν αυτά τα ελλείμματα διαμορφώθηκαν σε ποντίκια Katnal1 1H/1H υποβάλλοντας κοόρτες ζώων σε μια σειρά δοκιμών συμπεριφοράς. Τα δεδομένα και οι λεπτομέρειες κοόρτης δίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S2. Τόσο η μνήμη εργασίας όσο και η χωρική μνήμη ήταν σημαντικά φτωχότερες σε ποντίκια Katnal1 1H/1H, όπως αποδεικνύεται από μειωμένες αυθόρμητες εναλλαγές σε έναν λαβύρινθο Τ (Εικόνα 2α) και στον υδάτινο λαβύρινθο Morris όπου τα μεταλλάγματα χρειάζεται περισσότερος χρόνος για να βρεθεί η πλατφόρμα σε δοκιμές απόκτησης (Εικόνα 2β Σε σύγκριση με άγριου τύπου γέννα, τα ζώα Katnal1 1H/1H έχουν μικρότερη περίοδο (c), είναι πιο ενεργά στη φάση φωτός του κύκλου φωτός/σκότους (δ) και δείχνουν πρώιμη έναρξη δραστηριότητας σε μεταβάσεις φωτός/σκότους και στη μετάβαση από κύκλους φωτός/σκότους στο σταθερό σκοτάδι (ε). Σε καταγραφές ΗΕΓ κατά τη διάρκεια του ύπνου, τα ποντίκια Katnal1 1H/1H εμφανίζουν αυξημένη ισχύ δέλτα μη REM στη σκοτεινή φάση του κύκλου φωτός/σκότους (f) και μετά από στέρηση ύπνου (g). *P ⩽ 0,05; **P ⩽ 0,01; ***P ⩽ 0,001. ΗΕΓ, ηλεκτροεγκεφαλογραφία; DD, συνεχές σκοτάδι. LD, κύκλος φωτός/σκότους. τύπος = 164 ± 12 m, Katnal1 1H/1H = 243 ± 20 m, P = 0,02; απόσταση που διανύθηκε στην περιφέρεια ανοιχτού πεδίου: άγριος τύπος = 4,3 ± 0,2 m, Katnal1 1H/1H = 6 ± 0,3 m, P = 0,004). Αντίθετα, όταν καταγράφηκε δραστηριότητα ποντικιού στο οικιακό κλουβί, δεν βρήκαμε διαφορά μεταξύ των γονότυπων (απόσταση που διανύθηκε σε 24 ώρες: άγριος τύπος = 399 ± 77 m, Katnal1 1H/1H = 418 ± 41 m, P = 0,833) που υποδηλώνει ότι το πρώτο Οι διαφορές δραστηριότητας οφείλονταν στο νέο περιβάλλον του ανοιχτού πεδίου και όχι στη γενικευμένη υπερδραστηριότητα στα ζώα Katnal1 1H/1H. Τέλος, σε ορισμένες συνθήκες (όπως ο μητρικός χωρισμός) τα ποντίκια εκπέμπουν υπερηχητικές φωνές (USV). Για να ελέγξουμε εάν τα ζώα Katnal1 1H/1H φώναζαν διαφορετικά από τους άγριους τύπους, διαχωρίσαμε τα κουτάβια στις μεταγεννητικές ημέρες 7-8 (η ηλικία στην οποία τα ποντίκια εμφανίζουν μέγιστη εκπομπή USV 24) και καταγράψαμε τα USV τους. Σε αυτές τις δοκιμές, σε σύγκριση με τους άγριους τύπους, τα νεογνά Katnal1 1H/1H παρήγαγαν λιγότερες (Εικόνα 2g) και μικρότερες (Εικόνα 2h) φωνητικά, που περιέχουν λιγότερες φράσεις (Εικόνα 2i). Μεγάλες μορφολογικές ανωμαλίες του εγκεφάλου σε ποντίκια Katnal1 1H/1H Εφόσον παρατηρήσαμε έναν αριθμό φαινοτύπων συμπεριφοράς σε ποντίκια Katnal1 1H/1H, πραγματοποιήσαμε ιστολογική ανάλυση για να εξακριβώσουμε εάν οι διαφορές στην ιστολογία του εγκεφάλου οδήγησαν σε αυτές τις συμπεριφορές. Τα δεδομένα και οι λεπτομέρειες κοόρτης δίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S3. Η ανάλυση των τμημάτων εγκεφάλου που χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη αποκάλυψε ότι, σε σύγκριση με τα άγρια ​​ζώα, τα ζώα Katnal1 1H/1H είχαν λιγότερο σφιχτά συσκευασμένα στρώματα πυραμιδικών κυττάρων στον ιππόκαμπο (Εικόνες 3α και β) και ένα στενότερο φλοιώδες στρώμα 1 και ευρύτερο φλοιώδες στρώμα 3γ-ε) . Για να επιβεβαιωθούν αυτές οι διαφορές στο φλοιώδες στρώμα, πραγματοποιήθηκε ανοσοφθορισμός χρησιμοποιώντας το (Εικόνες 31 και m) . Η ποσοτικοποίηση της έντασης φθορισμού έδειξε ότι στον φλοιό Katnal1 1H/1H τόσο η σήμανση της καλμπινδίνης όσο και η επισήμανση CUX1 ήταν πιο έντονη πιο κοντά στην επιφάνεια του φλοιού, κάτι που συνάδει με τη μείωση του μεγέθους του στρώματος 1 (αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), αλληλεπίδραση παράγοντες «γονότυπος Χ απόσταση φθορισμού από την επιφάνεια του φλοιού», καλβινδίνη: F(75,988) = 16,8, P o 0,0005; CUX1: F(93,372 = 2,17, P = 0,001; Σχήματα 3h και k) . Παρόμοια ποσοτικοποίηση αποκάλυψε ότι η επισήμανση FOXP2 επεκτάθηκε περαιτέρω από το στρώμα 6b (όπως επισημαίνεται από το CTGF) στον φλοιό Katnal1 1H/1H, κάτι που είναι σύμφωνο με μια αύξηση στο μέγεθος του στρώματος 6 (αμφίδρομη ANOVA, παράγοντες αλληλεπίδρασης «γονότυπος Χ απόσταση φθορισμός από σήμανση CTGF:' F(93,372) = 1,32, P = 0,038; Εικόνα 3n). Τέλος, κατασκευάστηκαν τρισδιάστατα μοντέλα του κοιλιακού συστήματος από σαρώσεις μικροϋπολογιστικής τομογραφίας εγκεφάλου (Εικόνες 3o και p). Η ογκομετρική ανάλυση αποκάλυψε ότι τα ποντίκια Katnal1 1H/1H είχαν ουσιαστικά μεγαλύτερες κοιλίες από τους άγριους τύπους (Εικόνα 3q). Νευρωνική μετανάστευση και μορφολογικά ελαττώματα σε εγκεφάλους Katnal1 1H/1H Οι ιστολογικοί φαινότυποι του Katnal1 1H/1H εγκεφάλου ποντικών που περιγράφονται παραπάνω υποδηλώνουν . 18 Επομένως, ερευνήσαμε εάν τα ποντίκια Katnal1 1H/1H εμφάνισαν ανώμαλη μετανάστευση νευρώνων χρησιμοποιώντας σήμανση BrdU των εμβρύων E13 και E15 και ποσοτικοποιήσαμε επισημασμένα κύτταρα στον φλοιό των P9 νεογνών (που περιγράφεται στην αναφορά 18). Και στις δύο ηλικίες τα ζώα Katnal1 1H/1H είχαν μεγαλύτερο αριθμό επισημασμένων νευρώνων σε κάδους κοντά στους νευρώνες της φλοιικής επιφάνειας τοποθετημένους πιο κοντά στην επιφάνεια του φλοιού σε σύγκριση με τον άγριο τύπο. Για να επιβεβαιώσουμε αυτά τα αποτελέσματα χρησιμοποιήσαμε έναν θάλαμο Boyden 19 και πραγματοποιήσαμε in vitro ανάλυση μετανάστευσης νευρώνων σε πρωτεύουσες καλλιέργειες νευρώνων του φλοιού Ε13.5. Εδώ βρήκαμε ότι ένα μεγαλύτερο ποσοστό των νευρώνων του φλοιού Katnal1 1H/1H μετανάστευσε στη βάση του ενθέτου κυτταροκαλλιέργειας σε σύγκριση με μάρτυρες άγριου τύπου (Συμπληρωματικό Σχήμα S3). Δεδομένου ότι τόσο στην επισήμανση BrdU όσο και στους νευρώνες της δοκιμασίας Boyden από τα ζώα Katnal1 1H/1H μετανάστευσαν πέρα από εκείνα των άγριου τύπου νεογνών, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι νευρώνες του φλοιού Katnal1 1H/1H εμφανίζουν ελαττώματα στον τερματισμό της μετανάστευσης των νευρώνων του φλοιού. Δεδομένου του ρόλου του στην κυτταροσκελετική οργάνωση, υποθέσαμε επίσης ότι η μορφολογία των νευρώνων διαμορφώνεται από το Katnal1. Η ανάλυση των νευρώνων με χρωματισμό golgi από τα στρώματα 2-3 του φλοιού (Εικόνες 4g και i) έδειξε ότι, σε σύγκριση με άγριου τύπου νεογνά, οι νευρώνες Katnal1 1H/1H είχαν μεγαλύτερο σώμα (Εικόνα 4k) και μικρότερους και λεπτότερους άξονες (Εικόνες 4l και ιγ) (τα δεδομένα και οι λεπτομέρειες κοόρτης δίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S3 ). Επιπλέον, η ανάλυση σε υψηλότερη μεγέθυνση (Εικόνες 4h και j), έδειξε ότι ο αριθμός των συναπτικών άκρων στους νευρώνες Katnal1 1H/1H μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με τον άγριο τύπο (Εικόνα 4n). Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι οι μεταλλάξεις σε ορισμένα ένζυμα διαχωρισμού μικροσωληνίσκων μπορούν προκαλούν ελαττώματα στις βλεφαρίδες. 5 Δεδομένου ότι τέτοια βλεφαρικά ελαττώματα θα μπορούσαν να αποτελούν τη βάση των φαινοτύπων που περιγράφηκαν παραπάνω, μελετήσαμε τις κινητικές βλεφαρίδες της επενδυματικής επένδυσης της πλάγιας κοιλίας σε τομές εγκεφάλου ποντικιών μεταγεννητικής ημέρας 2 από Katnal1 1H/1H (n = 4) και άγριου τύπου ζώα (n = 3). Βρήκαμε ότι η συχνότητα ακτινοβολίας (CBF) των ζώων Katnal1 1H/1H ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με τον άγριο τύπο (CBF: άγριος τύπος = 22,39 ± 0,94 Hz, Katnal1 1H/1H = 14,25 ± 0,92 Hz, P = 01; Εικόνα 5α, Συμπληρωματικές ταινίες S1). Αυτή η μείωση της CBF σε ζώα Katnal1 1H/1H συσχετίστηκε επίσης με αυξημένη αναλογία βλεφαρίδων με μη φυσιολογικό μοτίβο παλμών (δυσκινησία των βλεφαρίδων) (αναλογία δυσκινητικών βλεφαρίδων: άγριος τύπος = 17%, Katnal1 1H/1H = 75%) (Εικόνα 5β και συμπληρωματικές ταινίες S1). Η οπτική επιθεώρηση των βλεφαρίδων εντόπισε έναν αριθμό βλεφαρικών ανωμαλιών, όπως μια διογκωμένη ακτινωτή άκρη (Συμπληρωματική ταινία S3) ή εξαιρετικά μακριές βλεφαρίδες (Συμπληρωματική ταινία S4) διάσπαρτες σε όλο το πεδίο των βλεφαρίδων στις κοιλίες Katnal1 1H/1H. Αυτές οι ανωμαλίες παρατηρήθηκαν σε περίπου 25% των εγκεφαλικών τομών Katnal1 1H/1H. Οι μη φυσιολογικές βλεφαρίδες έδειχναν πάντα ένα μοτίβο δυσκινητικών παλμών και χαμηλότερη συχνότητα παλμών. Για να διερευνήσουμε περαιτέρω τη μορφολογία των ακτίνων, πραγματοποιήσαμε ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης στην επενδυματική επένδυση των πλευρικών κοιλιών τόσο του Katnal1 1H/1H (n = 3) όσο και των ζώων άγριου τύπου (n = 3; Σχήματα 5γ και δ) . Οι μετρήσεις των βλεφαρίδων δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές στο μέσο μήκος των βλεφαρίδων μεταξύ των γονότυπων (μέσο μήκος βλεφαρίδων: άγριος τύπος = 6,22 ± 0,86 μm, Katnal1 1H/1H = 6,54 ± 0,94 Hz, P = 0,303). Ωστόσο, στα δείγματα Katnal1 1H/1H παρατηρήσαμε την παρουσία τόσο μακριών όσο και κοντών βλεφαρίδων (Εικόνες 5e και f; ορίζονται ως δύο τυπικές αποκλίσεις μεγαλύτερες ή μικρότερες από το μέσο μήκος των βλεφαρίδων) που δεν υπήρχαν σε δείγματα άγριου τύπου. Επιπλέον, η επιθεώρηση των βλεφαρίδων Katnal1 1H/1H εντόπισε ανωμαλίες των βλεφαρίδων, συμπεριλαμβανομένων των διχασμένων βλεφαρίδων (Εικόνα 5g), μη φυσιολογικές συστροφές και κάμψεις στις βλεφαρίδες (Εικόνα 5h) και διογκώσεις κατά μήκος των βλεφαρίδων (Εικόνα 5i). Η ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης των επενδυματικών βλεφαρίδων διαπίστωσε ότι η διαταραχή της φυσαλιδώδους συσσωμάτωσης Katnal1 επηρεάζει τις λειτουργίες του ΚΝΣ. Αν και αυτές οι ανωμαλίες ήταν παρούσες μόνο σε ένα μικρό ποσοστό (o1%) των βλεφαρίδων Katnal1 1H/1H, απουσίαζαν σημαντικά από βλεφαρίδες άγριου τύπου. Τα ένζυμα αποκοπής μικροσωληνίσκων παίζουν διάφορους ρόλους στο νευρικό σύστημα. 1, 2 Ωστόσο, προς το παρόν το ένζυμο διαχωρισμού μικροσωληνίσκων Katnal1 δεν έχει καθοριστεί ελάχιστα στο πλαίσιο της ανάπτυξης και της λειτουργίας του ΚΝΣ. Εδώ παρουσιάζουμε μια λεπτομερή φαινοτυπική ανάλυση του Katnal1 1H και δείχνουμε ότι η μετάλλαξη σχετίζεται με αλλαγές στους κιρκάδιους ρυθμούς, τον ύπνο και τη συμπεριφορά. Επιπλέον, αποδεικνύουμε ότι ελαττώματα στην ιστοπαθολογία του εγκεφάλου, τη μετανάστευση των νευρώνων και τη νευρωνική μορφολογία αποτελούν τη βάση αυτών των φαινοτύπων. Τέλος, αποδεικνύουμε επίσης ότι το Katnal1 1H προκαλεί μια σειρά από ελαττώματα στις κινητές βλεφαρίδες των κοιλιακών επενδυματικών κυττάρων. Τα δεδομένα που παρουσιάζουμε εδώ είναι τα πρώτα που συσχετίζουν το KATNAL1 με τέτοιες δυσλειτουργίες με σημαντικές επιπτώσεις για κλινικές μελέτες συσχέτισης. Η μετάλλαξη Katnal1 1H αρχικά αναγνωρίστηκε με κιρκαδικό έλλειμμα που περιελάμβανε μια σύντομη περίοδο ελεύθερης λειτουργίας και προχωρημένη έναρξη δραστηριότητας. Ωστόσο, μεταγενέστερα ex vivo πειράματα χρησιμοποιώντας φέτες SCN ζώων που έφεραν το γονίδιο αναφοράς PER2::LUC δεν έδειξαν ελαττώματα στους κυτταρικούς ρυθμούς SCN, υποδηλώνοντας ότι το κιρκάδιο ρολόι του πυρήνα δεν διαταράχθηκε από τη μετάλλαξη. Φαινότυποι σε ρυθμούς κιρκάδιου τροχού που δεν σχετίζονται με αλλαγές στον μηχανισμό του πυρήνα του ρολογιού έχουν επίσης αναφερθεί σε μοντέλα σχιζοφρένειας σε ποντίκια. 25 Εδώ έχει προταθεί ότι οι μεταβολές λειτουργίας του τροχού που παρατηρούνται είναι αποτέλεσμα ελαττωμάτων στις οδούς εξόδου από το κιρκάδιο ρολόι SCN. Ομοίως, σε ποντίκια Katnal1 1H/1H υποθέτουμε ότι τα ελαττώματα που επιδεικνύουμε στην ανατομία των νευρώνων και τη μορφολογία των νευρώνων μπορεί να διαταράξουν τα σήματα εξόδου από το SCN. Εναλλακτικά, δεδομένου ότι διάφορα νευροπεπτίδια όπως η ωκυτοκίνη εκκρίνονται με κιρκάδιο τρόπο από τα επενδυματικά κύτταρα που καλύπτουν την τρίτη κοιλία του εγκεφάλου, 26 η αλλαγμένη κοιλιακή μορφολογία και η ακτινοειδής λειτουργία σε ποντικούς Katnal1 1H/1H μπορεί να διαταράξει την κυκλοφορία των παραγόντων που εκκρίνονται από την βλεφαροειδή κοιλία. Τα κύτταρα και συμβάλλουν στη διαταραχή των ρυθμών συμπεριφοράς που παρατηρούνται. Επί του παρόντος, οι περιγραφόμενοι φαινότυποι περιορίζονται σε κινητική δυσλειτουργία σε ποντίκια που δεν έχουν το γονίδιο Spg4 27 και το κεφάλι κουνιέται και κάνει κύκλους στο μετάλλαγμα Fign. 7, 28, 29 Αντίθετα, εδώ αποδεικνύουμε ότι η απώλεια της λειτουργίας του Katnal1 σχετίζεται με μια σειρά φαινοτύπων συμπεριφοράς, συμπεριλαμβανομένων αλλαγών στην κιρκαδική δραστηριότητα, κακής μάθησης και μνήμης, υπερκινητικότητας σε νέο περιβάλλον (το ανοιχτό πεδίο) και ελλειμμάτων σε USV. Ιδιαίτερα οι φαινότυποι μάθησης και μνήμης, άγχους και φωνητικής επανεμφάνισης των κλινικών συμπτωμάτων της ID, αυξημένου άγχους σε νέες καταστάσεις και καθυστερήσεων στην κατάκτηση της γλώσσας που αναφέρθηκαν σε ανθρώπους ασθενείς που φέρουν μικροδιαγραφές που ενσωματώνουν απλοανεπάρκεια του KATNAL1. 8, 9 Ενώ αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι τα μεταλλαγμένα ποντίκια περνούν περισσότερο χρόνο στο κέντρο του ανοιχτού πεδίου από τα άγρια ​​είδη (που σημαίνει ότι τα ζώα Katnal1 1H/1H παρουσιάζουν μειωμένο άγχος), προτείνουμε ότι αυτό το αποτέλεσμα συγχέεται από την υπερκινητικότητα σε νέα περιβάλλοντα φαινότυπο που περιγράφουμε επίσης σε μεταλλαγμένα ποντίκια. Αυτή η παρατήρηση υποστηρίζεται από το γεγονός ότι τα μεταλλαγμένα ζώα εμφάνισαν αυξημένη δραστηριότητα σε όλες τις περιοχές του ανοιχτού πεδίου και όχι μόνο στην αγχολυτική περιφέρεια. Εδώ επισημαίνουμε επίσης ελαττώματα σε ποντίκια Katnal1 1H/1H, όπως η μειωμένη νευρωνική μετανάστευση και η μορφολογία που μπορεί να υποστηρίξουν τέτοιους φαινοτύπους. Στη Drosophila, το ομόλογο του Katnal1 (kat-60L1) έχει αποδειχθεί ότι παίζει κρίσιμο ρόλο στη μορφολογία των νευρώνων κατά την ανάπτυξη, 30 ωστόσο τα δεδομένα που παρουσιάζουμε εδώ είναι τα πρώτα που επιδεικνύουν παρόμοιο φαινότυπο στα θηλαστικά και επιπλέον υποδηλώνουν πόσο ανεπαίσθητες διαταραχές Η λειτουργία του KATNAL1 μπορεί να συμβάλλει σε συγκεκριμένες νευρικές καταστάσεις και καταστάσεις συμπεριφοράς. Για παράδειγμα, ελαττώματα στη μετανάστευση των νευρώνων, στις συναπτικές σπονδυλικές στήλες και στη μορφολογία των νευρώνων όπως αυτές που δείξαμε εδώ, έχουν προταθεί ότι υποστηρίζουν την ID σε καταστάσεις όπως η λισεγκεφαλία, το σύνδρομο Down 31 και το σύνδρομο Rett. 32 Αν και δεν προτείνουμε ότι το Katnal1 είναι αιτιολογικό για αυτές τις καταστάσεις, θα πρέπει να εκτιμηθούν οι ομοιότητες στα συμπτώματα και στους νευρωνικούς φαινοτύπους μεταξύ αυτών των καταστάσεων και εκείνων που συνδέονται με τη δυσλειτουργία του Katnal1. Επιπλέον, μια σπάνια μετάλλαξη στο KATNAL1 έχει συσχετιστεί με τη σχιζοφρένεια 10 (http://atgu.mgh.harvard.edu/~spurcell/gene book/genebook.cgi?user = guest&cmd = verb-gene&tbox = KATNAL1) και το KATNAL1 έχει εμφανιστεί να αλληλεπιδράσει με το γονίδιο DISC1 που σχετίζεται με τη σχιζοφρένεια. 33 Σύμφωνα με αυτές τις παρατηρήσεις, σημειώνουμε ότι αυξήσεις στον όγκο της κοιλίας και μειώσεις στις συναπτικές σπονδυλικές στήλες έχουν αναφερθεί σε σχιζοφρενείς ασθενείς 34, 35 και τα δεδομένα μας δείχνουν τους ίδιους φαινότυπους σε ποντίκια Katnal1 1H/1H. Έτσι, το εύρος των φαινοτύπων που σχετίζονται με ελαττώματα στη λειτουργία του Katnal1 υποδηλώνει έντονα ότι το γονίδιο πρέπει να λαμβάνεται υπόψη στην παθολογία διαταραχών όπως η ID και η σχιζοφρένεια. Σημειώνουμε μια βασική γενετική διαφορά μεταξύ των ανθρώπων ασθενών και των ζώων Katnal1 1H/1H. Ενώ οι άνθρωποι ασθενείς ήταν όλοι ετερόζυγοι για τη διαγραφή Katnal1, δεν βρήκαμε φαινότυπο σε ετερόζυγα μεταλλαγμένα ποντίκια (τα δεδομένα δεν φαίνονται) υποδηλώνοντας ότι ενώ η απλοανεπάρκεια είναι αιτιολογική για τους φαινότυπους στους ανθρώπους, τα ποντίκια χρειάζονται πλήρη απώλεια της λειτουργίας KATNAL1 για να εμφανίσουν παρόμοια αποτελέσματα. Μια παρόμοια διαφορά μεταξύ ανθρώπων και ποντικών έχει επίσης σημειωθεί για το υποψήφιο γονίδιο διανοητικής αναπηρίας CTNNB1. 17 Ενώ οι ετερόζυγες μεταλλάξεις απώλειας λειτουργίας στο CTNNB1 είναι αιτίες για διανοητική αναπηρία στους ανθρώπους, τα εξαρτημένα νοκ άουτ για το CTNNB1 δεν έχουν αναφερθεί συμπεριφορικούς ή κρανιοπροσωπικούς φαινότυπους. 36, 37 Αυτές οι διαφορές αποδεικνύουν ότι ενώ τα μοντέλα διανοητικής αναπηρίας ποντικιών είναι πολύ χρήσιμα στην κατανόησή μας των αιτιολογικών μηχανισμών που αποτελούν τη βάση της πάθησης, εξακολουθούν να υπάρχουν γενετικές και νευροαναπτυξιακές διαφορές μεταξύ των ειδών που πρέπει επίσης να ληφθούν υπόψη. Σημειώνουμε επίσης ότι ενώ η μετάλλαξη Katnal1 1H δείχνει απώλεια της καταλυτικής λειτουργίας τόσο στα κύτταρα HEK293 όσο και στα κύτταρα Sertoli 23, αυτή η απώλεια λειτουργίας δεν έχει επαληθευτεί σε νευρωνικά κύτταρα. Ωστόσο, δεδομένου ότι τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η μετάλλαξη Katnal1 1H βρίσκεται σε έναν ουσιαστικό καταλυτικό τομέα και ότι δείχνουμε νευρωνικούς φαινοτύπους σε ποντίκια Katnal1 1H/1H, θα περιμέναμε να δούμε την ίδια απώλεια καταλυτικής λειτουργίας στους νευρώνες. Τα δεδομένα που παρουσιάζουμε εδώ επιδεικνύουν επίσης ελαττώματα στις κινητικές βλεφαρίδες σε ποντικούς Katnal1 1H/1H. Οι διαταραχές του βλεννογόνου στους ανθρώπους (κοιλιοπάθειες) περιλαμβάνουν το σύνδρομο Bardet-Biedl και Joubert. 38 Ενώ υπάρχουν επί του παρόντος περιορισμένα διαθέσιμα δεδομένα σχετικά με τους φαινοτύπους συμπεριφοράς των μοντέλων βλεφαρίδων ποντικών, σημειώνουμε ότι η δυσλειτουργία των βλεφαρίδων σε ποντίκια έχει συνδεθεί με φαινοτύπους μάθησης και μνήμης 39 και φωνητικής φωνής, 40 εκ των οποίων και οι δύο διαταράχθηκαν στα ποντίκια Katnal1 1H/1H περιγράφεται εδώ. Είναι επίσης αξιοσημείωτο ότι η μετανάστευση των νευρώνων και οι φαινότυποι της διευρυμένης κοιλίας που περιγράφουμε στα ποντίκια Katnal1 1H/1H ανακεφαλαιώνουν χαρακτηριστικά που σχετίζονται με γνωστές μεταλλάξεις γονιδίου βλεφαρικής βλεφαρίδας. [41] [42] [43] [44] Επιπλέον, σε μοντέλα ποντικιών με σύνδρομο Bardet-Biedl, έχουν περιγραφεί βλεφαρικά ελαττώματα όπως μειωμένο CBF 45 και δομικά ελαττώματα όπως μη φυσιολογική επιμήκυνση και οιδήματα στο μήκος τους 41, παρόμοια με εκείνα που έχουμε περιγράφουν σε ποντικούς Katnal1 1H/1H. Υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις ότι τα γονίδια που σχετίζονται με την βλεφαροειδή παίζουν διάφορους ρόλους στην ανάπτυξη των νευρώνων επηρεάζοντας διαδικασίες όπως ο πολλαπλασιασμός των προγονικών ή η διατήρηση του ικριώματος της ακτινικής γλοίας. 43 Ωστόσο, είναι επίσης σαφές ότι τα ελαττώματα στην οργάνωση των μικροσωληνίσκων επηρεάζουν επίσης τη συναπτική δομή. 2 Προς το παρόν είναι δύσκολο να διαχωριστούν οι σχετικές συνεισφορές των ελαττωμάτων στην αποκοπή των μικροσωληνίσκων και στις ανωμαλίες των βλεφαρίδων στους συνολικούς φαινότυπους που παρατηρούμε σε ποντικούς Katnal1 1H/1H. Απαιτούνται περαιτέρω έρευνες για να διευκρινιστούν οι επιπτώσεις αυτών των δύο διαδικασιών. Ωστόσο, είναι αξιοσημείωτο ότι ενώ τα ελαττώματα στη δομή των βλεφαρίδων μπορεί να συμβάλλουν στους φαινοτύπους που περιγράφουμε στα ποντίκια Katnal1 1H/1H, είναι πολύ λιγότερο εμφανή στα ποντίκια Katnal1 1H/1H από ό,τι σε άλλα μοντέλα βλεφαρίδων ποντικών, 41 υποδηλώνοντας ότι το βλεφαρικό συστατικό του KATNAL1 η δυσλειτουργία μπορεί να είναι ήπια σε σύγκριση με άλλες βλεφαρίδες. Παρομοίως, ενώ ο υδροκέφαλος έχει προταθεί ως συστατικό ορισμένων μοντέλων ποντικών με βλεφαρίδες, 46 ποντίκια Katnal1 1H/1H εμφάνισαν μόνο αυξημένο μέγεθος κοιλίας παρά αυξημένη συχνότητα υδροκεφαλίας, υποδηλώνοντας περαιτέρω ότι τα βλεφαρικά ελαττώματα σε αυτά τα ζώα είναι ήπια σε σύγκριση με άλλες βλεφαρίδες. Συνοπτικά, τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ καταδεικνύουν ξεκάθαρα ότι το KATNAL1 παίζει σημαντικό ρόλο σε μια ποικιλία νευρωνικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένης της μετανάστευσης των νευρώνων, της νευρωνικής μορφολογίας και της επενδυματικής ακτινωτής λειτουργίας. Η μεταγενέστερη επίδραση αυτών των ελαττωμάτων οδηγεί με τη σειρά της σε μια σειρά από αλλαγές συμπεριφοράς, όπως στη μάθηση και τη μνήμη, την αντίδραση σε αγχογονικές καταστάσεις και τους κιρκάδιους ρυθμούς. Επομένως, αυτά τα δεδομένα υπογραμμίζουν πώς οι διαταραχές στο KATNAL1 μπορεί να διαδραματίσουν ρόλο στη νευρωνική δυσλειτουργία και καταδεικνύουν ότι το ένζυμο είναι νέος υποψήφιος στη μελέτη συμπεριφορικών και νευροαναπτυξιακών διαταραχών. Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 24388, "text": "Spg4" } ], "id": 926, "question": "Ποια γενετική μετάλλαξη σχετίζεται με την κληρονομική σπαστική παραπληγία;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2661, "text": "KATNB1" } ], "id": 927, "question": "Ποια γενετική μετάλλαξη σχετίζεται με εγκεφαλικές δυσπλασίες;" }, { "answers": [ { "answer_start": 22127, "text": "ένζυμο διαχωρισμού μικροσωληνίσκων" } ], "id": 929, "question": "Τι είναι το KATNAL1;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3718, "text": "κεντρικό νευρικό σύστημα" } ], "id": 930, "question": "Ποιο όργανο σχετίζεται περισσότερο με το γονίδιο KATNAL1;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Έλεγχος εγκεκριμένων φαρμάκων από την FDA για αναστολείς της λοίμωξης από τον ιό της ιαπωνικής εγκεφαλίτιδαςhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5640845/SHA: 1bd2f6497996fc0fccd8dffd7f34384fc0fcd8dffd7f343848fd7f30388fd7f3038488fd7f3038488fd7f3838488fd7f30388476688847688747884 Liu, Yang; Guo, Jiao; Wang, Peilin; Zhang, Leike; Xiao, Gengfu; Wang, WeiDate: 2017-10-13DOI: 10.1128/jvi.01055-17 Άδεια χρήσης: cc-byAbstract: Ιαπωνικός ιός εγκεφαλίτιδας (JEV), ένας φλαβοϊός που μεταδίδεται από τα αρθρόποδα, είναι μια κύρια αιτία οξείας ιογενούς εγκεφαλίτιδας στους ανθρώπους. Δεν διατίθεται εγκεκριμένο φάρμακο για την ειδική θεραπεία των λοιμώξεων από JEV και τα διαθέσιμα εμβόλια δεν είναι αποτελεσματικά έναντι όλων των κλινικών απομονώσεων JEV. Στη μελέτη που περιγράφεται εδώ, πραγματοποιήθηκε έλεγχος υψηλής απόδοσης μιας εγκεκριμένης από το FDA βιβλιοθήκης φαρμάκων για αναστολείς του JEV. Ταυτοποιήθηκαν πέντε φάρμακα που ανέστειλαν τη μόλυνση από JEV με επιλεκτικό δείκτη >10. Επικυρώθηκαν επίσης οι αντιικές δραστηριότητες αυτών των πέντε φαρμάκων κατά άλλων φλαβοϊών, συμπεριλαμβανομένου του ιού Ζίκα. Καθώς τρία από τα πέντε χτυπημένα φάρμακα ήταν αναστολείς ασβεστίου, χρησιμοποιήθηκαν πρόσθετοι τύποι αναστολέων ασβεστίου που επιβεβαίωσαν ότι το ασβέστιο είναι απαραίτητο για τη μόλυνση από JEV, πιθανότατα κατά τη διάρκεια της ιικής αναπαραγωγής. Η προσαρμοστική ανάλυση μεταλλάξεων αποκάλυψε ότι η αντικατάσταση του Q130, που βρίσκεται στη διαμεμβρανική περιοχή 3 της μη δομικής πρωτεΐνης NS4B, η οποία είναι σχετικά διατηρημένη στους φλαβοϊούς, με το R ή το K να προσδίδει αντίσταση στο JEV στη μανιδιπίνη, ένα κανάλι Ca(2+) με πύλη τάσης (VGCC) αναστολέα, χωρίς εμφανή απώλεια του προφίλ ανάπτυξης του ιού. Επιπλέον, η μανιδιπίνη υποδείχθηκε ότι προστατεύει τα ποντίκια έναντι της επαγόμενης από JEV θνησιμότητας μειώνοντας το ιικό φορτίο στον εγκέφαλο, ενώ ακύρωσε τις ιστοπαθολογικές αλλαγές που σχετίζονται με τη μόλυνση από JEV. Αυτή η μελέτη παρέχει πέντε υποψηφίους αντιφλαβοϊούς και προσδιορίζει το κυτταροπλασματικό ασβέστιο ως νέο αντιικό στόχο για τη θεραπεία της λοίμωξης από JEV. Τα ευρήματα που αναφέρονται εδώ παρέχουν θεραπευτικές δυνατότητες για την καταπολέμηση λοιμώξεων που προκαλούνται από φλαβοϊούς. ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ Δεν διατίθεται προς το παρόν εγκεκριμένη θεραπεία για τη θεραπεία της λοίμωξης από τον ιό της Ιαπωνικής εγκεφαλίτιδας. Η επαναχρησιμοποίηση εγκεκριμένων φαρμάκων θα επιτάχυνε την ανάπτυξη μιας θεραπευτικής στρατηγικής. Σε αυτή τη μελέτη, εξετάσαμε μια βιβλιοθήκη εγκεκριμένων από τον FDA φαρμάκων και εντοπίσαμε πέντε φάρμακα που χτυπήθηκαν, ειδικά αναστολείς ασβεστίου, που ασκούσαν αντιφλαβοϊική δράση που εμπόδιζε την αναπαραγωγή του ιού. Η in vivo αποτελεσματικότητα και τοξικότητα της μανιδιπίνης διερευνήθηκαν με ένα μοντέλο ποντικού μόλυνσης από JEV και ο ιικός στόχος αναγνωρίστηκε δημιουργώντας ένα προσαρμοστικό μεταλλάκτη. διαφορετικά παθογόνα, όπως ο ιός της ιαπωνικής εγκεφαλίτιδας (JEV), ο ιός Zika (ZIKV), ο ιός του δάγκειου πυρετού (DENV), ο ιός του Δυτικού Νείλου (WNV) και ο ιός του κίτρινου πυρετού (YFV). Οι περισσότεροι φλαβοϊοί προέρχονται από αρθρόποδα και προκαλούν προβλήματα δημόσιας υγείας παγκοσμίως (1) . Η ανάπτυξη και η χρήση εμβολίων κατά ορισμένων φλαβοϊών, όπως ο JEV, ο YFV και ο ιός της εγκεφαλίτιδας που μεταδίδεται από κρότωνες (TBEV), έχουν μειώσει τα ποσοστά νοσηρότητας και θνησιμότητας από λοιμώξεις που προκαλούνται από αυτούς τους ιούς (2). Ωστόσο, οι ασθένειες που προκαλούνται από φλαβοϊούς εξακολουθούν να είναι πανδημικές και λίγες θεραπείες πέρα ​​από την εντατική υποστηρικτική θεραπεία είναι διαθέσιμες επί του παρόντος. Οι φλαβιοί έχουν ένα θετικό-κλώνο γονιδίωμα RNA περίπου 11 kb που περιέχει ένα ενιαίο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) που πλαισιώνεται από μη μεταφρασμένες περιοχές (UTRs) και τα δύο τερματικά. Το ORF κωδικοποιεί τρεις δομικές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένου του καψιδίου (C), της μεμβράνης (προμεμβράνη [prM] και μεμβράνης [Μ]) και του φακέλου (Ε) και επτά μη δομικές πρωτεΐνες (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, και NS5) (3) . Αυτές οι επτά μη δομικές πρωτεΐνες συμμετέχουν στην αντιγραφή του ιού, στη συγκρότηση ιοσωμάτων και στη διαφυγή του ιού από την ανοσολογική επιτήρηση. Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχουν διαθέσιμα ειδικά αντιιικά φάρμακα με δράση έναντι των φλαβοϊών. Για να το αντιμετωπίσουμε αυτό, πραγματοποιήσαμε μια εξέταση βιβλιοθήκης 1.018 εγκεκριμένων από τον FDA φαρμάκων. Δεδομένου ότι οι φλαβοϊοί είναι παρόμοιοι στη δομή και την παθογένεση, χρησιμοποιήσαμε αρχικά το JEV ως πρωτότυπο για τη διαλογή της βιβλιοθήκης φαρμάκων και στη συνέχεια επικυρώσαμε τις αντιικές δραστηριότητες με ZIKV, WNV και DENV τύπου 2 (DENV-2). Τα επιτυχημένα φάρμακα που εντοπίστηκαν σε αυτή τη μελέτη προσφέρουν πιθανές νέες θεραπείες για τη θεραπεία της λοίμωξης και της νόσου από φλαβοϊό. Έλεγχος μιας εγκεκριμένης από το FDA βιβλιοθήκης φαρμάκων για αναστολείς της λοίμωξης JEV. Ανασυνδυασμένα ιικά σωματίδια (RVPs) με το ρεπλικόνιο αναφοράς λουσιφεράσης που περιβάλλεται από τις δομικές πρωτεΐνες JEV χρησιμοποιήθηκαν για την επιλογή αναστολέων, με εστίαση σε αυτούς που αναστέλλουν την είσοδο και την αναπαραγωγή του ιού, με μια δοκιμασία διαλογής υψηλής απόδοσης (HTS) (4, 5 ) . Ο αριθμός των αντιγράφων γονιδιωματικού RNA του RVP προσδιορίστηκε σε 8,4 ϫ 10 6 αντίγραφα/ml χρησιμοποιώντας μια τυπική καμπύλη που δημιουργήθηκε με πλασμίδια που φέρουν τον μολυσματικό κλώνο. Οι συνθήκες της δοκιμασίας HTS, συμπεριλαμβανομένης της πυκνότητας των κυττάρων σποράς και της δόσης RVP, βελτιστοποιήθηκαν ώστε να είναι 10.000 κύτταρα ανά πλάκα 96 φρεατίων και 20 λίτρα (16 αντίγραφα/κύτταρο) RVP για τη μολυσματική δόση, αντίστοιχα. Υπό τις βελτιστοποιημένες συνθήκες, η αναλογία σήματος προς βασική (S/B), ο συντελεστής διακύμανσης (CV) και ο παράγοντας Z= ήταν 38.374, 2,8% και 0,89, αντίστοιχα, γεγονός που έδειξε ότι η ανάλυση ήταν ισχυρή και κατάλληλη για η μεγάλης κλίμακας διαλογή των ενώσεων. Μια σχηματική απεικόνιση της δοκιμασίας HTS απεικονίζεται στο Σχ. 1Β . Μετά από τρεις γύρους διαλογής, πέντε επιτυχίες με επιλεκτικό δείκτη (SI; που ισούται με την 50% κυτταροτοξική συγκέντρωση [CC 50 [/50% ανασταλτική συγκέντρωση [IC 50]) του φ10 επιλέχθηκαν. Οι τιμές CC 50 των φαρμάκων που έχουν χτυπηθεί που παρουσιάζονται στο Σχ. Το 1B ήταν παρόμοιο με εκείνα που είχαν δημοσιευθεί προηγουμένως για διαφορετικά κυτταρικά συστήματα, αλλά προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας διαφορετικές δοκιμές τοξικότητας (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) . Τρία από τα χτυπημένα φάρμακα, η μανιδιπίνη, η σιλνιδιπίνη και η υδροχλωρική βενιδιπίνη, ήταν ανταγωνιστές του διαύλου Ca 2ϩ (VGCC) με πύλη τάσης διυδροπυριδίνης (DHP), ενώ η πιμεκρόλιμους είναι αναστολέας της φλεγμονώδους έκκρισης κυτοκίνης και η μεσυλεράση του HIV-1 είναι αναστολέας της HIV-1. Και τα πέντε φάρμακα εμφάνισαν δοσοεξαρτώμενη αναστολή της μόλυνσης από JEV RVP (Εικ. 1C). Για την επικύρωση του αντιικού αποτελέσματος, αγοράστηκαν φάρμακα από άλλες εμπορικές πηγές και δοκιμάστηκαν. Στην οθόνη επανεπιβεβαίωσης, όλα τα χτυπημένα φάρμακα εμφάνισαν αντιιικά και κυτταροτοξικά αποτελέσματα παρόμοια με αυτά που βρέθηκαν στην αρχική οθόνη. Επικύρωση φαρμάκων που έχουν χτυπηθεί. Για να επαληθεύσουμε τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από τις αναλύσεις αναφοράς λουσιφεράσης, διερευνήσαμε επίσης την αντιική επίδραση των πέντε φαρμάκων που χτυπήθηκαν στο στέλεχος AT31 JEV άγριου τύπου. Όπως αναμενόταν από τον προσδιορισμό HTS, και τα πέντε φάρμακα ανέστειλαν δραστικά την παραγωγή του ιού, με μείωση περίπου 4 έως 5 λογαριθμικών μονάδων στην υψηλότερη συγκέντρωση και μείωση κατά προσέγγιση 1 λογαριθμικής μονάδας με 2,5 Μ των φαρμάκων (Εικ. 2Β). Ανιχνεύθηκε επίσης μια απότομη μείωση στα επίπεδα RNA του JEV (Εικ. 2C). Τα εξασθενημένα επίπεδα RNA στις ομάδες υψηλής δόσης, μεσαίας δόσης και χαμηλής δόσης ήταν όλα πάνω από 40%. Ειδικότερα, στην ομάδα που έλαβε αγωγή με μανιδιπίνη, το ανασταλτικό αποτέλεσμα ήταν τουλάχιστον 80% σε σύγκριση με αυτό του ελέγχου, το οποίο έδειξε ισχυρή αναστολή της ιικής αναπαραγωγής. Σε συμφωνία με την αναστολή της αναπαραγωγής και της παραγωγής του ιού, η έκφραση της ιικής δομικής πρωτεΐνης prM ήταν δύσκολα ανιχνεύσιμη μετά από θεραπεία με τα φάρμακα σε υψηλή συγκέντρωση (Εικ. 2D). Συνολικά, τα αποτελέσματα στο Σχ. 2 επιβεβαίωσε ότι τα πέντε χτυπημένα φάρμακα ανέστειλαν τη μόλυνση από JEV με τρόπο δοσοεξαρτώμενο in vitro. Τα φάρμακα αναστέλλουν τη μόλυνση από JEV κατά τη σύνθεση ιικού RNA. Επειδή τα RVP, τα οποία έχουν έναν φυσικό φάκελο που μοιάζει με ιό στο εξωτερικό και ένα ρεπλικόνιο στο εσωτερικό, επέτρεψαν τον ποσοτικό προσδιορισμό της παραγωγικής εισόδου και αναπαραγωγής του JEV, διεξήχθη ένα πείραμα χρόνου προσθήκης για να διερευνηθεί εάν τα φάρμακα που χτυπήθηκαν εμπόδισαν το βήμα εισόδου ή το βήμα αντιγραφής. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Β, δεν παρατηρήθηκε καταστολή της δραστηριότητας της λουσιφεράσης από κανένα από τα χτυπημένα φάρμακα όταν χρησιμοποιήθηκαν ως θεραπείες πριν από τη μόλυνση ή κατά τη διάρκεια της μόλυνσης ή ως ιοκτόνο, υποδηλώνοντας ότι αυτά τα φάρμακα δεν αναστέλλουν τη μόλυνση από JEV είτε απενεργοποιώντας τον ιό άμεσα είτε αναστέλλοντας το JEV είσοδος. Ωστόσο, αυτά τα φάρμακα άσκησαν πλήρως ανασταλτικά αποτελέσματα όταν προστέθηκαν 1 ώρα μετά τη μόλυνση, υποδηλώνοντας ότι η αντιγραφή του ιού ήταν το στάδιο στο οποίο αυτά τα φάρμακα έδειξαν ανασταλτική δράση. Για να επιβεβαιώσουμε αυτήν την πρόταση, διερευνήσαμε τα ανασταλτικά αποτελέσματα αυτών των φαρμάκων στο ρεπλικόνιο JEV. Η υψηλότερη συγκέντρωση μανιδιπίνης και μεσυλικής νελφιναβίρης που δοκιμάστηκε σε κύτταρα νεφρού μωρού χάμστερ (BHK-21) προσαρμόστηκε στα 5 Μ και 10 Μ, αντίστοιχα. Φάνηκε ότι και τα πέντε φάρμακα ανέστειλαν τη σύνθεση του JEV RNA με τρόπο εξαρτώμενο από τη δόση, ενώ κανένα από τα δύο φάρμακα δεν ανέστειλε την αρχική μετάφραση του ρεπλικού RNA (5, 14) (Εικ. 3C), επιβεβαιώνοντας ότι αυτά τα φάρμακα ανέστειλαν τη λοίμωξη από JEV στο στάδιο της αντιγραφής. Τα φάρμακα χτυπημάτων παρουσιάζουν ευρέως φάσματος αντιφλαβοϊική δράση. Προκειμένου να προσδιορίσουμε εάν η αντιική δράση των πέντε φαρμάκων επεκτείνεται και σε άλλους φλαβοϊούς, διερευνήσαμε την αντιική τους δράση έναντι του ZIKV. Παρόμοια με τα ευρήματα για το JEV, ο τίτλος ZIKV μειώθηκε κατά πολλαπλές μονάδες καταγραφής όταν το ZIKV υποβλήθηκε σε θεραπεία με υψηλή συγκέντρωση καθενός από τα φάρμακα (Εικ. 4Α). Επιπλέον, το ZIKV επέδειξε υψηλότερη ευαισθησία στους αναστολείς των δύο διαύλων ασβεστίου μανιδιπίνη και σιλνιδιπίνη από το JEV, χωρίς να παρατηρείται σχηματισμός πλάκας στα 10 Μ. Σε συμφωνία με αυτό το αποτέλεσμα, απότομες μειώσεις στο επίπεδο αντιγραφής του ZIKV RNA και στο επίπεδο έκφρασης του Ανιχνεύθηκαν επίσης ιικές πρωτεΐνες (Εικ. 4Α). Αξιοσημείωτα, η θεραπεία με 5 Μ μανιδιπίνη παρήγαγε 95% αναστολή της ιικής αντιγραφής, της μετάφρασης και των αποδόσεων του ιού. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα χτυπημένα φάρμακα θα μπορούσαν να αναστείλουν αποτελεσματικά τη λοίμωξη από ZIKV. Δεδομένου ότι αυτά τα φάρμακα παρουσίασαν τα αντι-JEV αποτελέσματά τους στο στάδιο της ιικής αντιγραφής, δοκιμάσαμε περαιτέρω τα αποτελέσματα έναντι των WNV και DENV-2 χρησιμοποιώντας WNV και DENV-2 αντίγραφα. Παρόμοια με τα αποτελέσματα για το JEV, παρατηρήθηκε δοσοεξαρτώμενη μείωση στο επίπεδο αντιγραφής του WNV με τις φαρμακευτικές αγωγές. Ο ίδιος φαινότυπος παρατηρήθηκε για το DENV-2 για όλα τα φάρμακα εκτός από τη μεσυλική νελφιναβίρη, η οποία δεν έδειξε καμία επίδραση στις συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν (Εικ. 4Β και Γ). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα πέντε επιτυχημένα φάρμακα είναι εξαιρετικοί υποψήφιοι για θεραπεία ευρέως φάσματος κατά των φλαβοϊών. Αντιϊκή δράση των αναστολέων ασβεστίου. Δεδομένου ότι τρία χτυπημένα φάρμακα, η μανιδιπίνη, η σιλνιδιπίνη και η υδροχλωρική βενιδιπίνη, ήταν αναστολείς της DHP VGCC, ρωτήσαμε εάν άλλοι ανταγωνιστές ασβεστίου θα μπορούσαν να εμποδίσουν τη μόλυνση από JEV. Για να αντιμετωπίσουμε αυτό το ερώτημα, χρησιμοποιήσαμε τέσσερις διαφορετικές κατηγορίες αναστολέων. Η βεραπαμίλη, ένας πρωτότυπος αναστολέας VGCC φαινυλαλκυλαμίνης (PAA) (15), εμφάνισε μια δοσοεξαρτώμενη αναστολή του JEV τόσο σε κύτταρα νεφρού Αφρικανικής Πράσινης πιθήκου (Vero) όσο και σε κύτταρα ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (Huh-7) (Εικ. 5), το οποίο ήταν σύμφωνο με τις ανασταλτικές επιδράσεις των αναστολέων DHP, υποδηλώνοντας ότι τα κανάλια ασβεστίου παίζουν σημαντικό ρόλο στη μόλυνση από JEV. Η κυκλοσπορίνη και το βορικό 2-αμινοδιφαινυλεστέρα (2-APB), που αναστέλλουν την εκροή Ca 2ϩ από το μιτοχονδριακό και ενδοπλασματικό δίκτυο (ER), αντίστοιχα (16) (17) (18) (19) βρέθηκε επίσης ότι μπλοκάρουν το JEV λοίμωξη αποτελεσματικά. Ομοίως, η επεξεργασία με τον διαπερατό σε κύτταρα Ca 2ϩ χηλικό παράγοντα 1,2-δις-(ο-αμινοφαινοξυ)-αιθάνιο-N,N,N=,N=-τετραοξικό οξύ, τετραακετοξυμεθυλεστέρας (BAPTA-AM), θα μπορούσε επίσης να καταστείλει το JEV μόλυνση. Συνολικά, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το ενδοκυτταρικό Ca 2ϩ είναι απαραίτητο για τη μόλυνση από JEV και το κυτταροπλασματικό ασβέστιο είναι ένας ισχυρός στόχος για τη θεραπεία κατά των φλαβοϊών. Επιλογή και χαρακτηρισμός ανθεκτικού στη μανιδιπίνη JEV. Για να προσδιορίσουμε τον ιικό στόχο του αναστολέα διαύλων ασβεστίου, επιλέξαμε έναν ιό ανθεκτικό στη μανιδιπίνη με σειριακή διέλευση του JEV παρουσία μανιδιπίνης. Οι ιοί από το πέρασμα 20 (P20) έδειξαν ισχυρή αντίσταση σε σύγκριση με τον άγριο τύπο (WT) (Εικ. 6Α). Όταν το JEV από το P20 υποβλήθηκε σε θεραπεία με 5 M ή 10 M μανιδιπίνη, ο τίτλος του ιού ήταν περίπου 10 και 100 φορές υψηλότερος από αυτόν του WT, αντίστοιχα. Μεμονωμένοι κλώνοι ιού απομονώθηκαν και δύο προϊόντα απομόνωσης επιλέχθηκαν τυχαία και ενισχύθηκαν. Παρατηρήθηκε μια υποκατάσταση αμινοξέος σε δύο απομονωμένους κλώνους, με αποτέλεσμα έναν διακόπτη γλουταμίνης (Q)-προς-αργινίνη (R) στη θέση αμινοξέος 130 στη διαμεμβρανική περιοχή 3 (TMD3) του NS4B, δηλ., στη θέση 2401 της μεταφρασμένης πολυπρωτεΐνης σε ο κλώνος JEV μολυσματικού cDNA (Εικ. 6Β). Η ευθυγράμμιση αλληλουχίας του NS4B έδειξε ότι το Q130 διατηρήθηκε σε όλους τους φλαβοϊούς εκτός από τον YFV, ο οποίος διέθετε λυσίνη σε αυτή τη θέση (Εικ. 6Β). Το διατηρημένο Q130 του NS4B μπορεί να ευθύνεται για την ευαισθησία των JEV, ZIKV, WNV και DENV-2 στη μανιδιπίνη, όπως περιγράφεται παραπάνω (Εικ. 4), ενώ το YFV έδειξε αντοχή στο φάρμακο (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Για να επιβεβαιώσουμε ότι η μετάλλαξη Q130R προσέφερε αντίσταση στη μανιδιπίνη και για να διερευνήσουμε τον ρόλο του Q130 στη λειτουργία NS4B, δημιουργήσαμε κλώνους JEV με τα Q130R, Q130K, Q130E ή Μετάλλαξη Q130A με την εισαγωγή των επιθυμητών μεταλλάξεων στον λοιμώδη κλώνο cDNA και τη διάσωση των μεταλλαγμένων ιών. Για να διερευνήσουμε τις βιολογικές ιδιότητες των μεταλλαγμένων ιών, εξετάσαμε πρώτα την κινητική ανάπτυξης των διασωθέντων ιών. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6C, όλοι οι μεταλλαγμένοι ιοί είχαν συσσώρευση μολυσματικών βιριόντων και έφτασαν τον υψηλότερο τίτλο στις 60 ώρες μετά τη μόλυνση. Η μόλυνση των μεταλλαγμένων ιών Q130R και Q130K οδήγησε σε καμπύλες ανάπτυξης παρόμοιες με την καμπύλη ανάπτυξης για το WT (Εικ. 6C), ενώ τα μεταλλάγματα Q130E και Q130A παρήγαγαν μικρότερες ποσότητες ιών μεταξύ 24 και 60 ωρών. Η ανάλυση της μορφολογίας της πλάκας αποκάλυψε ότι οι πλάκες των μεταλλαγμάτων Q130R, Q130K και Q130E ήταν παρόμοιες με τις πλάκες του μεταλλάγματος WT, ενώ οι πλάκες του μεταλλάγματος Q130A ήταν μικρότερες από αυτές του WT. Στη συνέχεια ερευνήσαμε την ευαισθησία των τεσσάρων μεταλλαγμένοι ιοί στη μανιδιπίνη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6D, οι μεταλλαγμένοι ιοί Q130R και Q130K ήταν ανθεκτικοί στη μανιδιπίνη. Σε συγκέντρωση 10 Μ, η μανιδιπίνη ανέστειλε αποτελεσματικά τη μόλυνση από WT JEV και μείωσε τις ιικές αποδόσεις κατά περίπου 4 λογαριθμικές μονάδες, ενώ οι μεταλλαγμένοι ιοί Q130R και Q130K ήταν ανθεκτικοί στη μανιδιπίνη και ο τίτλος του ιού μειώθηκε λιγότερο από 2 λογαριθμικές μονάδες. Ο μεταλλαγμένος ιός Q130A επέδειξε μέτρια αντοχή και ελαφρώς υψηλότερη Συνολικά, θα μπορούσε να συναχθεί το συμπέρασμα ότι το Q130 όχι μόνο είναι κρίσιμο για την παροχή ευαισθησίας στη μανιδιπίνη αλλά είναι επίσης σημαντικό για την αντιγραφή του JEV. Η αντικατάσταση της γλουταμίνης με βασικά αμινοξέα προσέδωσε αντίσταση στη μανιδιπίνη χωρίς εμφανή απώλεια ανάπτυξης. Η αποτελεσματικότητα της μανιδιπίνης in vivo. Καθώς η μανιδιπίνη εμφάνισε τις ισχυρότερες ανασταλτικές δραστηριότητες στον αναδιπλασιασμό του JEV καθώς και στη μόλυνση με ZIKV όταν οι δραστηριότητές της συγκρίθηκαν με εκείνες των πέντε φαρμάκων που χτυπήθηκαν (Εικ. 2 και 4Α), εξετάσαμε περαιτέρω την προστατευτική επίδραση της μανιδιπίνης έναντι της επαγόμενης από JEV θνησιμότητας σε ένα μοντέλο ποντικού. Όπως αναμενόταν, τα ποντίκια στην ομάδα που υποβλήθηκε σε θεραπεία με όχημα που είχε μολυνθεί με JEV άρχισαν να εμφανίζουν συμπτώματα, όπως παράλυση άκρων, περιορισμό της κίνησης, στύση, σκλήρυνση σώματος και τρόμο ολόκληρου του σώματος, από την 5η ημέρα μετά τη μόλυνση. Μέσα σε 21 ημέρες μετά τη μόλυνση, τα περισσότερα ποντίκια στην ομάδα που είχε μολυνθεί με JEV υπέκυψαν στη μόλυνση, με το ποσοστό θνησιμότητας να είναι 73% (4 από τα 15 ζώα επέζησαν). Η θεραπεία με μανιδιπίνη μετά τη μόλυνση από JEV μείωσε το ποσοστό θνησιμότητας στο 20% (12 από τα 15 ζώα επέζησαν) (Εικ. 7Α). Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με μανιδιπίνη μόνο ή έλαβαν θεραπεία με μανιδιπίνη και μολύνθηκαν με JEV εμφάνισαν μικρή ανώμαλη συμπεριφορά, παρόμοια με τα ευρήματα για τα ποντίκια στην ομάδα που έλαβε θεραπεία με όχημα. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η μανιδιπίνη παρείχε αποτελεσματική προστασία έναντι της θνησιμότητας που προκαλείται από JEV. Για περαιτέρω συσχέτιση αυτών των προστατευτικών επιδράσεων με το ιικό φορτίο και τις ιστοπαθολογικές αλλαγές στον εγκέφαλο του ποντικού, προσδιορίστηκε ο τίτλος του ιού και συλλέχθηκαν τομές εγκεφάλου ποντικού και προσδιορίστηκαν την ημέρα 5 και 21 μετά τη μόλυνση , αφού τα ποντίκια άρχισαν να εμφανίζουν συμπτώματα μόλυνσης από JEV από την 5η ημέρα μετά τη μόλυνση και τα περισσότερα από τα ποντίκια που επέζησαν είχαν αναρρώσει την 21η ημέρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της νόσου, η θεραπεία με μανιδιπίνη μείωσε σημαντικά το ιικό φορτίο σε μολυσμένα ποντίκια σε σύγκριση με αυτό σε μολυσμένα ποντίκια που δεν έλαβαν θεραπεία, ενώ δεν σχηματίστηκαν πλάκες ούτε στην ομάδα που έλαβαν θεραπεία με μανιδιπίνη ούτε με όχημα και τα ιικά φορτία ήταν μη ανιχνεύσιμες σε κάθε ομάδα την 21η ημέρα μετά τη μόλυνση (Εικ. 7Β). Καθώς το JEV απομακρύνθηκε γρήγορα από το αίμα μετά τον εμβολιασμό και ήταν παρόν στο λεμφικό σύστημα κατά την προκλινική φάση, οι επιδράσεις της μανιδιπίνης στη μόλυνση του ορού και της σπλήνας αξιολογήθηκαν σε προηγούμενα χρονικά σημεία για να ανιχνευθεί εάν το φάρμακο μείωσε τα περιφερειακά ιικά φορτία ( 20, 21). Όπως φαίνεται στο Σχ. 7C, η μανιδιπίνη είχε μικρή επίδραση στην περιφερική λοίμωξη από JEV, γεγονός που έδειξε ότι η μανιδιπίνη προστάτευε τα ποντίκια έναντι της επαγόμενης από το JEV θνησιμότητας μειώνοντας το ιικό φορτίο στον εγκέφαλο. Παρομοίως, εμφανής βλάβη στον εγκέφαλο, συμπεριλαμβανομένης της μηνιγγίτιδας, του περιαγγειακού περιβλήματος, του εκφυλισμού των κενοτοπίων και των νευρογλοιακών όζων, παρατηρήθηκε στην ομάδα που είχε μολυνθεί από JEV και έλαβε θεραπεία με όχημα την 5η ημέρα μετά τη μόλυνση, ενώ η θεραπεία με μανιδιπίνη ανακούφισε αξιοσημείωτα αυτά τα φαινόμενα (Εικ. 7D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ανακούφιση των ιστοπαθολογικών αλλαγών συνοδεύτηκε από μείωση του ιικού φορτίου καθώς και μείωση του ποσοστού θνησιμότητας, επιβεβαιώνοντας περαιτέρω τις θεραπευτικές επιδράσεις της μανιδιπίνης στην ιογενή εγκεφαλίτιδα. και η υδροχλωρική βενιδιπίνη ήταν αναστολείς VGCC. Έχει τεκμηριωθεί καλά στη βιβλιογραφία ότι οι αναστολείς Ca2ϩ χρησιμεύουν για την αναστολή της μόλυνσης από τον ιό στο στάδιο είτε της εισόδου (15, 22) είτε της αναπαραγωγής (18) και ακόμη και στο στάδιο της εκβλάστησης (23) . Για το σκοπό αυτό, εξετάσαμε πρώτα και τους 21 αναστολείς ασβεστίου που περιλαμβάνονται στην τρέχουσα βιβλιοθήκη εγκεκριμένων από τον FDA φαρμάκων και βρήκαμε ότι, εκτός από τους τέσσερις αναστολείς DHP VGCC που αναφέρονται στο Σχήμα. 1Β, δύο άλλοι αναστολείς ασβεστίου, δηλ., η διυδροχλωρική φλουναριζίνη και η υδροχλωρική λομεριζίνη, ταυτοποιήθηκαν επίσης ως κύριοι υποψήφιοι με επίπεδα αναστολής Ͼ90%. Ομοίως, τρεις ανταγωνιστές διαύλων ασβεστίου, η νισολδιπίνη, η φελοδιπίνη και η υδροχλωρική νικαρδιπίνη, έδειξαν επίπεδα αναστολής 75%, 72% και 66%, αντίστοιχα, στην αρχική εξέταση. Μαζί, 9 από τους 21 αναστολείς ασβεστίου στη βιβλιοθήκη, που αντιπροσωπεύουν σχεδόν τους μισούς αναστολείς ασβεστίου, εμφάνισαν επίπεδα αναστολής του φλαβοϊού άνω του 50%, υποδηλώνοντας ότι το ασβέστιο, ειδικά ο δίαυλος ασβεστίου, είναι ένας πιθανός αντιιικός στόχος. Για να αντιμετωπιστεί αυτό, διερευνήθηκε ένας άλλος τύπος αναστολέα VGCC, η βεραπαμίλη, ένα φάρμακο εγκεκριμένο από την FDA που δεν περιλαμβάνεται ακόμη στη βιβλιοθήκη φαρμάκων που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη. Ομοίως, ένας χηλικός παράγοντας Ca 2ϩ, BAPTA-AM, καθώς και οι αναστολείς Ca 2ϩ 2-APB και κυκλοσπορίνη, που στοχεύουν το ER και το μιτοχονδριακό κανάλι Ca 2ϩ, αντίστοιχα, χρησιμοποιήθηκαν για τη διερεύνηση της απόκρισης της μόλυνσης JEV στη μείωση του ενδοκυτταρικού Ca 2 επίπεδα. Σύμφωνα με τις δραστηριότητες των τριών φαρμάκων αναστολέων DHP VGCC, οι πρόσθετοι αναστολείς Ca 2ϩ άσκησαν αντι-JEV δράση, γεγονός που έδειξε ότι το Ca 2ϩ είναι απαραίτητο για τη μόλυνση από JEV. Έτσι, οι αναστολείς Ca 2ϩ θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως αποτελεσματικές θεραπείες για τη μόλυνση από φλαβοϊό. Καθώς τα χτυπημένα φάρμακα άσκησαν πλήρη ανασταλτική δράση όταν προστέθηκαν μετά τη θεραπεία, πιστεύουμε ότι το Ca 2ϩ είναι σημαντικό για την αντιγραφή του γονιδιώματος του φλαβοϊού. Επιπλέον, η επιλογή και η γενετική ανάλυση των ανθεκτικών στα φάρμακα ιών αποκάλυψε ότι το NS4B είναι ο ιικός στόχος της μανιδιπίνης. Το NS4B είναι μέρος του συμπλέγματος αντιγραφής του ιού και υποτίθεται ότι αγκυρώνει το ιικό αντίγραφο στη μεμβράνη ER (24) . Εν τω μεταξύ, η Ν-τερματική περιοχή 125 αμινοξέων του DENV NS4B υποδείχθηκε ότι είναι υπεύθυνη για την αναστολή της ανοσοαπόκρισης (25) . Σημειωτέον, αρκετές δομικά διακριτές ενώσεις έχουν ταυτοποιηθεί ότι αναστέλλουν την αναπαραγωγή του φλαβοϊού στοχεύοντας εντατικά το TMD του NS4B (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32) . Είναι επομένως κατανοητό ότι οι αναστολείς που στοχεύουν το TMD του NS4B θα διαταράσσουν τη λειτουργία του, οδηγώντας στην καταστολή της αντιγραφής του ιικού RNA. Σε αυτή τη μελέτη, η αντικατάσταση του Q130 του NS4B με ένα βασικό αμινοξύ προσέφερε το αποτέλεσμα αντίστασης χωρίς να καταστέλλει την αντιγραφή του JEV, υποδηλώνοντας ότι η θέση 130 θα μπορούσε να ανεχθεί ένα βασικό αμινοξύ και ότι το βασικό αμινοξύ μπορεί να εμπλέκεται στην αλληλεπίδραση του NS4B με τον ξενιστή πρωτεΐνες και όχι ιικές πρωτεΐνες. Επιπλέον, η αποτελεσματικότητα και η τοξικότητα της μανιδιπίνης παρακολουθήθηκαν in vivo, με τη μανιδιπίνη να επιδεικνύει αποτελεσματική αντιική δράση με ευνοϊκή βιοσυμβατότητα. Ωστόσο, η δόση που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη ήταν υψηλότερη από τη δόση που χρησιμοποιείται τυπικά κλινικά, αντιπροσωπεύοντας ένα από τα σενάρια που συναντώνται πιο συχνά στην επαναχρησιμοποίηση φαρμάκων (33, 34). Καθώς η μανιδιπίνη εγκρίθηκε για χρήση για τη μακροχρόνια θεραπεία της υπέρτασης (35, 36), η θεραπεία με παλμική δόση με μανιδιπίνη για το μικρότερο χρονικό διάστημα που απαιτείται για τη θεραπεία της λοίμωξης από τον ιό μπορεί να είναι σχετικά ασφαλής. Επιπλέον, η χρήση συνδυασμού μανιδιπίνης με άλλους αναστολείς Ca 2ϩ μπορεί να βελτιώσει τη θεραπευτική της αποτελεσματικότητα, να μειώσει την τοξικότητά της και να μειώσει τον κίνδυνο ανάπτυξης αντοχής (37) (38) (39). Η πιμεκρόλιμους και η μεσυλική νελφιναβίρη, έδειξαν ισοδύναμες ανασταλτικές δράσεις στην αντιγραφή των JEV, ZIKV, WNV και DENV-2. Αν και δεν έχει υπάρξει αναφορά σχετικά με τη χρήση του pimecrolimus για τη θεραπεία μολυσματικών ασθενειών, δείξαμε ότι είχε ισχυρή επίδραση έναντι του JEV με SI Ͼ32. Η μέγιστη συγκέντρωση στο πλάσμα (Cmax) της μεσυλικής νελφιναβίρης που επιτεύχθηκε με δόση για ενήλικες ήταν 3 έως 4 g/ml (40), η οποία ήταν συγκρίσιμη με την IC 50 που αναφέρεται εδώ. Συγκεκριμένα, η μεσυλική νελφιναβίρη επιβεβαιώθηκε ότι αναστέλλει τον ιό του απλού έρπητα 1 (HSV-1) και την αναπαραγωγή αρκετών άλλων ερπητοϊών παρεμβαίνοντας άμεσα ή έμμεσα στα μεταγενέστερα στάδια σχηματισμού του ιού, όπως η ωρίμανση γλυκοπρωτεΐνης ή η απελευθέρωση ιού, εκτός από τη λειτουργία σε ιούς έρπητα πρωτεάση (41, 42). Το εάν η μεσυλική νελφιναβίρη αναστέλλει τον φλαβοϊό μέσω παρεμβολής στην πρωτεάση του ιού ή με άλλες επιδράσεις εκτός στόχου είναι άγνωστο. Η κατανόηση του μηχανισμού των επιδράσεων αυτών των φαρμάκων κατά των φλαβοϊών μπορεί να αποκαλύψει νέους στόχους των φαρμάκων, παρέχοντας περαιτέρω πληροφορίες για την παθογένεση των φλαβοϊών. Πάνω απ 'όλα, τα ευρήματα που αναφέρονται εδώ παρέχουν νέες ιδέες για τους μοριακούς μηχανισμούς που κρύβονται πίσω από τη μόλυνση από φλαβοϊούς και προσφέρουν νέα και πολλά υποσχόμενα θεραπευτικές δυνατότητες για την καταπολέμηση των λοιμώξεων που προκαλούνται από φλαβοϊούς.Κύτταρα και ιοί. Τα κύτταρα BHK-21, SH-SY5Y (ανθρώπινο νευροβλάστωμα), Vero και Huh-7 καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο με Dulbecco μέσο Eagle (HyClone, Logan, UT, ΗΠΑ) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Gibco, Grand Island, NY, ΗΠΑ). Το στέλεχος JEV AT31, το αντίγραφο WNV και το ρεπλικόνιο DENV-2 που εκφράζει τη λουσιφεράση Renilla (Rluc) παρασχέθηκαν ευγενικά από τον Bo Zhang, Ινστιτούτο Ιολογίας Wuhan, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών (CAS), Κίνα. Τα ανασυνδυασμένα ιικά σωματίδια αντιγράφου JEV (RVPs) δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (4, 5). Το στέλεχος ZIKV H/PF/2013, που παρέχεται ευγενικά από το European Virus Archive Goes Global, πολλαπλασιάστηκε και τιτλοποιήθηκε σε κύτταρα Vero. Βελτιστοποίηση των συνθηκών ανάλυσης HTS. Η κυτταρική πυκνότητα και η δόση RVP βελτιστοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό HTS. Κύτταρα Vero σε διαφορετικές πυκνότητες (2.500 έως 12.500 κύτταρα ανά φρεάτιο) μολύνθηκαν με από 1,25 έως 20 l RVPs (1 έως 16 αντίγραφα ανά φρεάτιο). Η κατάλληλη κυτταρική πυκνότητα καθώς και η δόση RVP επιλέχθηκε συγκρίνοντας την αναλογία S/B, τις τιμές CV και Z= υπό διαφορετικές συνθήκες όπως περιγράφηκε προηγουμένως (43) . Η μεθυλ-␤-κυκλοδεξτρίνη και το διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι, αντίστοιχα. Δοκιμασία HTS μιας εγκεκριμένης από το FDA βιβλιοθήκης ενώσεων. Μια βιβλιοθήκη 1.018 εγκεκριμένων από τον FDA φαρμάκων αγοράστηκε από τη Selleck Chemicals (Χιούστον, Τέξας, ΗΠΑ). Οι ενώσεις αποθηκεύτηκαν ως μητρικά διαλύματα 10 mM σε DMSO στους 4°C μέχρι τη χρήση. Ο πρώτος γύρος της δοκιμασίας HTS πραγματοποιήθηκε όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α. Τα κριτήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την ταυτοποίηση των πρωταρχικών υποψηφίων ήταν η μη εμφανής κυτταροτοξικότητα και ένα μέσο επίπεδο αναστολής Ͼ90% σε διπλά φρεάτια. Τα κριτήρια της δοσοεξαρτώμενης αναστολής και της κυτταρικής βιωσιμότητας Ͼ80% εφαρμόστηκαν για την οθόνη επανεπιβεβαίωσης. Επιπλέον, υπολογίστηκε το CC 50 κάθε ένωσης και εκείνες οι ενώσεις που εμφανίζουν SI πάνω από 10 θεωρήθηκαν επιτυχίες σε αυτή τη μελέτη. Προσδιορισμός αντιιικών επιδράσεων πέντε φαρμάκων που έχουν χτυπηθεί. Τα αντιιικά αποτελέσματα των φαρμάκων αξιολογήθηκαν με ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή-PCR (qRT-PCR), δοκιμασία ανοσοφθορισμού (IFA) και δοκιμασία πλάκας όπως αναφέρθηκε προηγουμένως (44) (45) (46) (47) . Το πειραματικό χρονοδιάγραμμα απεικονίζεται στο Σχ. 2A .Για να εξασφαλιστεί η αποτελεσματικότητα των φαρμάκων που έχουν χτυπηθεί στην αντιγραφή του φλαβοϊού, κύτταρα BHK-21 που επιμολύνθηκαν με το ρεπλικόνιο JEV, WNV ή DENV-2 επωάστηκαν με κάθε φάρμακο στις συγκεντρώσεις που υποδεικνύονται παραπάνω και οι δραστικότητες της λουσιφεράσης προσδιορίστηκαν 24 ώρες, 48 ώρες ή 72 ώρες αργότερα, αντίστοιχα. Πείραμα χρόνου προσθήκης. Για να αξιολογηθεί ποιο στάδιο του κύκλου ζωής του JEV αναστέλλεται από κάθε χτύπημα, πραγματοποιήθηκε ένα πείραμα χρόνου προσθήκης όπως περιγράφηκε προηγουμένως (43) . Τα κύτταρα Vero μολύνθηκαν με 20 λίτρα RVPs για 1 ώρα (0 έως 1 ώρα). Οι ενώσεις δοκιμής επωάστηκαν με τα κύτταρα για 1 ώρα πριν από τη μόλυνση (Ϫ1 έως 0 ώρα), κατά τη διάρκεια της μόλυνσης (0 έως 1 ώρα) και για 23 ώρες μετά τη μόλυνση (1 έως 24 ώρες) (Εικ. 3Α). Για να αποκλειστεί μια πιθανή άμεση αδρανοποιητική επίδραση των φαρμάκων, τα RVP επωάστηκαν με κάθε φάρμακο στους 37°C για 1 ώρα και τα μείγματα αραιώθηκαν 25 φορές για να μολύνουν κύτταρα Vero. Είκοσι τέσσερις ώρες αργότερα, οι δραστικότητες της λουσιφεράσης προσδιορίστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω (Εικ. 3Α) .Ιός ανθεκτικός στη μανιδιπίνη. Ο ανθεκτικός στη μανιδιπίνη ιός δημιουργήθηκε με διέλευση του JEV σε κύτταρα Vero παρουσία μανιδιπίνης. Τα περάσματα 1 έως 10 χρησιμοποιούσαν 5 Μ μανιδιπίνη και τα περάσματα 11 έως 20 χρησιμοποιούσαν 10 Μ μανιδιπίνη. Ως έλεγχος, ο ιός WT διαβιβάστηκε παρουσία 2% DMSO παράλληλα. Η διέλευση τερματίστηκε στο πέρασμα 20, όταν δεν ανιχνεύθηκε περαιτέρω βελτίωση στην αντίσταση. Δύο στελέχη ιού ανθεκτικά στη μανιδιπίνη καθαρίστηκαν με πλάκα και ενισχύθηκαν παρουσία μανιδιπίνης. Το ιικό RNA εκχυλίστηκε, ενισχύθηκε και καθαρίστηκε για αλληλούχιση. Ένας μολυσματικός κλώνος cDNA του JEV, στέλεχος AT31 (pMWJEAT), που παρέχεται ευγενικά από τον T. Wakita, Tokyo Metropolitan Institute for Neuroscience, χρησιμοποιήθηκε για την ανάκτηση WT και μεταλλαγμένων ιών όπως περιγράφηκε προηγουμένως (4). Οι τίτλοι του ιού και οι ευαισθησίες στη μανιδιπίνη προσδιορίστηκαν με δοκιμασία πλάκας σε κύτταρα Vero. Χορήγηση μανιδιπίνης σε μολυσμένους με JEV ποντικούς. Ενήλικα θηλυκά ποντίκια BALB/c (ηλικίας, 4 εβδομάδων) διατηρήθηκαν στο Εργαστηριακό Κέντρο Ζώων του Ινστιτούτου Ιολογίας Wuhan, CAS (Wuhan, Κίνα). Τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες (30 ποντίκια ανά ομάδα): μια ομάδα που είχε μολυνθεί με JEV και ένα όχημα (2% Tween 80 συν 5% DMSO σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά [PBS]), μια ομάδα που έλαβε αγωγή με μανιδιπίνη, μια Ομάδα μολυσμένη με JEV και αγωγή με μανιδιπίνη, και ομάδα που υποβλήθηκε σε θεραπεία με όχημα. Για μόλυνση, τα ποντίκια μολύνθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με 5 ϫ 10 6 PFU του στελέχους AT31 JEV. Για τις θεραπείες μανιδιπίνης και φορέα, τα ποντίκια ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με 25 mg/kg σωματικού βάρους μανιδιπίνης ή PBS με 2% Tween 80 και 5% DMSO, αντίστοιχα. Οι θεραπείες χορηγήθηκαν δύο φορές την ημέρα για τις πρώτες 2 ημέρες και στη συνέχεια χορηγήθηκαν διαδοχικά μία φορά την ημέρα για έως και 21 ημέρες. Πέντε ποντίκια από κάθε ομάδα θυσιάστηκαν τις ημέρες 1, 3 και 5 μετά τη μόλυνση. Δείγματα ορού, ιστού σπλήνας και εγκεφαλικού ιστού συλλέχθηκαν για προσδιορισμό του τίτλου του ιού και ιστοπαθολογική διερεύνηση. Δεκαπέντε ποντίκια παρακολουθούνταν καθημερινά για νοσηρότητα και θνησιμότητα. Τα ποντίκια που εμφάνισαν νευρολογικά σημάδια ασθένειας υποβλήθηκαν σε ευθανασία σύμφωνα με τους Κανονισμούς για τη Διοίκηση Υποθέσεων σχετικά με Πειραματικά Ζώα στην Κίνα. Τα πρωτόκολλα εξετάστηκαν και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Εργαστηριακής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων στο Ινστιτούτο Ιολογίας της Γουχάν, CAS (Wuhan, Κίνα).", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 3121, "text": "αρθρόποδα" } ], "id": 1220, "question": "Πώς μεταδίδεται η ιαπωνική εγκεφαλίτιδα;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2048, "text": "ασβέστιο" } ], "id": 1222, "question": "Ποιο στοιχείο είναι απαραίτητο για την προώθηση της μόλυνσης από JEV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 25510, "text": "ανασυνδυασμένα ιικά σωματίδια" } ], "id": 1230, "question": "Τι είναι τα RVP;" }, { "answers": [ { "answer_start": 805, "text": "έλεγχος υψηλής απόδοσης" } ], "id": 1231, "question": "Τι είναι το HTS;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6082, "text": "50% κυτταροτοξική συγκέντρωση" } ], "id": 1232, "question": "Ποιος είναι ο επιλεκτικός δείκτης στον έλεγχο υψηλής απόδοσης;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Ροταϊός Α σε άγρια ​​και οικόσιτα ζώα από περιοχές με περιβαλλοντική υποβάθμιση στον Αμαζόνιο της Βραζιλίαςhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6298726/SHA: f3c309c596c20f48f493b77e714ce957d8777d Chagas, Elaine Nunes; Bezerra, Luna Wanessa; Ribeiro, Laila Graziela; Duarte Júnior, Jose Wandilson Barboza; Περέιρα, Ντιέγκο; da Penha Junior, Edvaldo Tavares; Silva, Julia Rezende; Bezerra, Delana Andreza Melo; Bandeira, Renato Silva; Pinheiro, Helder Henrique Costa; Guerra, Sylvia de Fátima dos Santos; Guimarães, Ricardo José de Paula Souza e; Mascarenhas, Joana D'Arc Pereira Ημερομηνία: 2018-12-18DOI: 10.1371/journal.pone.0209005Άδεια: cc-byAbstract: Η οξεία γαστρεντερίτιδα είναι μια από τις κύριες αιτίες θνησιμότητας σε ανθρώπους και νεαρά ζώα. Τα οικόσιτα και κυρίως άγρια ​​ζώα όπως οι νυχτερίδες, τα μικρά τρωκτικά και τα πτηνά είναι ζώα με μεγάλη διαφοροποίηση σε σχέση με τα ενδιαιτήματα και τις οικολογικές τους κόγχες και είναι ευρέως διαδεδομένα γεωγραφικά σε περιβάλλοντα κατακερματισμού δασών σε ορισμένες περιοχές του Αμαζονίου, θεωρώντας σημαντικές πηγές για ιούς που επηρεάζουν ανθρώπους και άλλα ζώα. Λόγω των ανθρωπογενών δραστηριοτήτων, αυτά τα ζώα άλλαξαν το φυσικό τους περιβάλλον και προσαρμόστηκαν σε αστικοποιημένα περιβάλλοντα, αντιπροσωπεύοντας έτσι κινδύνους για την υγεία των ανθρώπων και των ζώων. Αν και η γνώση της παγκόσμιας ποικιλομορφίας των εντερικών ιών είναι σπάνια, υπάρχουν αναφορές που καταδεικνύουν την ανίχνευση του ροταϊού σε κατοικίδια ζώα και ζώα παραγωγικών συστημάτων, όπως τα βοοειδή και οι χοίροι. Η παρούσα μελέτη διερεύνησε τον επιπολασμό του Ροταϊού Α σε 648 δείγματα κοπράνων διαφορετικών ζωικών ειδών από τη βορειοανατολική μεσοπεριοχή της πολιτείας Πάρα της Βραζιλίας, η οποία χαρακτηρίζεται ως αστικοποιημένη περιοχή με θραύσματα δασών. Τα δείγματα κοπράνων συλλέχθηκαν από τον Οκτώβριο του 2014 έως τον Απρίλιο του 2016 και υποβλήθηκαν σε ποιοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (RT-qPCR), χρησιμοποιώντας το γονίδιο NSP3 ως στόχο. Παρατηρήθηκε ότι το 27,5% (178/648) των δειγμάτων παρουσίασε θετικά αποτελέσματα για RVA, με 178 δείγματα κατανεμημένα σε πτηνά (23,6%), κυνόδοντες (21,35%), χειρόπτερα (17,98%), βοοειδή (14,6%), άλογα (8,43%), μικρά τρωκτικά (6,74%), χοίρους (3,93%) και αιλουροειδή (3,37%), αποδεικνύοντας την κυκλοφορία του RVA σε οικόσιτα ζώα και υποδηλώνοντας ότι μια τέτοια εγγύτητα θα μπορούσε να προκαλέσει μεταδόσεις μεταξύ διαφορετικών ειδών και την εμφάνιση ανακατατάξεων στο γονιδίωμα του RVA όπως έχει ήδη περιγραφεί στη βιβλιογραφία, που σχετίζεται με τα ίχνη περιβαλλοντικής υποβάθμισης στις υπό μελέτη περιοχές. Κείμενο: Οι αναδυόμενες και επανεμφανιζόμενες μολυσματικές ασθένειες αυξάνονται κάθε χρόνο σε αρκετές χώρες, με αντίκτυπο τόσο στους ανθρώπινους πληθυσμούς όσο και στα κατοικίδια και άγρια ​​ζώα που ζουν σε περιοχές με σημαντικά υπολείμματα δασών [1] . Οι περισσότερες από αυτές τις ασθένειες είναι ιογενούς προέλευσης, υποδηλώνοντας την εμφάνιση και την επανεμφάνιση ιών που προκαλούνται από ανθρώπινες δραστηριότητες που τροποποιούν το περιβάλλον [2] .Οι πληθυσμοί άγριων ζώων που κατοικούν θραύσματα δασών είναι στρατηγικές ομάδες για μελέτες δημόσιας υγείας και μετάδοσης της ζωονόσωσης, δεδομένου ότι λειτουργούν ως δείκτες στη βοήθεια και παρέμβαση στους ανθρώπινους πληθυσμούς, με στόχο την πρόληψη εστιών και επιδημιών [3] . Η οξεία γαστρεντερίτιδα μπορεί να προκληθεί από λοίμωξη στο γαστρεντερικό σωλήνα, που προκαλείται από διαφορετικούς λοιμογόνους ή παρασιτικούς παράγοντες [4] [5] [6] [7] . Αντιπροσωπεύουν μία από τις κύριες αιτίες θνησιμότητας στους ανθρώπους και στα νεαρά ζώα, αντιπροσωπεύοντας περίπου το 25% της θνησιμότητας [8] . Ο ροταϊός είναι ευρέως διαδεδομένος σε ζώα, τα οποία δρουν ως πηγές αναδυόμενων στελεχών ροταϊού, με αυτά τα ζώα να δρουν στη μετάδοση μεταξύ των ειδών και μέσω της αναδιάταξης που οδηγεί στην εμφάνιση νέων στελεχών που έχουν αναφερθεί σε ανθρώπινες λοιμώξεις [9] [10] [11 ] [12] .Ο ροταϊός (RV) ανήκει στην οικογένεια Reoviridae και περιλαμβάνει εννέα είδη γνωστά ως ομάδα Rotavirus A έως I, με μια πρόσφατη πρόταση του είδους J [13, 14] . Ο ροταϊός Α (RVA) είναι ευρέως διαδεδομένος παγκοσμίως και μολύνει κυρίως ανθρώπους, βοοειδή και άλλα είδη θηλαστικών, καθώς και τα πουλιά [15] . Έχουν ένα γονιδίωμα δίκλωνου ριβονουκλεϊκού οξέος (dsRNA), χωρισμένο σε 11 τμήματα που κωδικοποιούν δομικές πρωτεΐνες (VP1-VP4, VP6 και VP7) και μη δομικές (NSP1-NSP5/NSP6) πρωτεΐνες [16, 17] . Υπάρχουν αρχεία μια στενή σχέση μεταξύ της άγριας ζωής του Αμαζονίου και των ανθρώπινων πληθυσμών [18] και αυτή η αλληλεπίδραση είναι το αποτέλεσμα ανθρωπογενών δραστηριοτήτων αστικοποίησης που έχουν ως αποτέλεσμα την αποψίλωση δασικών περιοχών, προκαλώντας την υποβάθμιση προηγουμένως απομονωμένων περιοχών, όπως σπηλιές και μικρές σπηλιές, μια συνεχής και φύση προοδευτική διαδικασία που οδήγησε όχι μόνο σε αλλαγές στους βιότοπους της άγριας ζωής αλλά και σε μια μεγαλύτερη σχέση με τους ανθρώπινους πληθυσμούς σε αγροτικά και αστικά περιβάλλοντα, συμβάλλοντας στην εμφάνιση και την εμφάνιση ασθενειών διαφορετικών από ό,τι συνήθως εμφανίζεται σε ενδημικές περιοχές [19] [20] [ 21] [22] .Αν και τα αποτελέσματα της RVA έχουν ήδη περιγραφεί παγκοσμίως [12, [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] , στη Βραζιλία, το περιστατικό, η ποικιλομορφία και ο ρόλος του ροταϊού σε αυτά τα ζώα δεν έχουν ακόμη μελετηθεί ελάχιστα, λαμβάνοντας υπόψη τον μεγάλο αριθμό των σημερινών ειδών [4, [31] [32] [33] [34] .Στον Αμαζόνιο της Βραζιλίας, ειδικά στην πολιτεία Πάρα, η πόλη του Belém και των βορειοανατολικών μητροπολιτικών μεσοπεριοχών είναι μερικές από τις περιοχές με τους υψηλότερους δείκτες περιβαλλοντικών αλλαγών [35] , οι οποίοι είναι συγκεντρωμένοι, μαζί με το γεγονός ότι η γνώση της παγκόσμιας ποικιλομορφίας του εντερικού ιού στα ζώα είναι σπάνια [36] . Είναι σημαντικό να παρακολουθείται η υγεία των κατοικίδιων και άγριων ζώων στο φυσικό τους περιβάλλον, ειδικά σε περιοχές με ανθρωπικές αλλοιώσεις που έχουν διεπαφή με αγροτικές κοινότητες και επιχειρήσεις, προκειμένου να διερευνηθεί η εμφάνιση RVA σε αυτόν τον πληθυσμό. Αυτές οι κοινότητες είναι οικολογικά περίπλοκες, επειδή έχουν πολλαπλούς ξενιστές και ατελείωτα παθογόνα που μπορεί τελικά να κυκλοφορούν σε συνεχόμενα αστικά κέντρα, επιπλέον του γεγονότος ότι πρέπει επίσης να ληφθεί υπόψη ότι υπάρχει ακόμη έλλειψη μελετών που να δείχνουν τη σημασία αυτών των ιών που μολύνουν αυτό πληθυσμού, καθώς στο πλαίσιο της επιδημιολογικής επιτήρησης, αυτά τα ζώα καθίστανται σημαντικά, καθώς μπορούν να θεωρηθούν ως φυσικές πηγές, με δυνατότητα μετάδοσης στον άνθρωπο [37] [38] [39] . Η ποιοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο ( qRT-PCR) χρησιμοποίησε το γονίδιο NSP3 και τον ανιχνευτή TaqMan από μια εξαιρετικά συντηρημένη περιοχή της μη δομικής πρωτεΐνης 3 (NSP3) του ροταϊού, η οποία χρησιμοποιήθηκε προηγουμένως σε δείγματα ανθρώπινης προέλευσης και με χαμηλά ιικά φορτία. Τα δεδομένα κατακρήμνισης ελήφθησαν από το The Brazilian Εθνικό Ινστιτούτο Μετεωρολογίας (Inmethttp://www.inmet.gov.br/) για τα έτη σύλληψης στον οικισμό Expedito Ribeiro (2014) και Açailândia (2015) των Πλατφορμών Συλλογής Δεδομένων (PCDs) του Belém, που βρίσκεται 50 χλμ. από τη Santa Bárbara do Pará και την Tracuateua, που βρίσκεται 50χλμ. από το Peixe-Boi και 100χλμ. από το Viseu. Οι συντεταγμένες Garmin GPSMap 64s Global Positioning System (GPS) συλλέχθηκαν στο πεδίο. Τα δημοτικά όρια λήφθηκαν στον ιστότοπο του Ινστιτούτου Γεωγραφίας και Στατιστικής της Βραζιλίας (IBGE) (http://www.ibge.gov.br/) και δεδομένα σχετικά με την αποψίλωση και τη χρήση γης ελήφθησαν από το PRODES [43] και το TerraClass [44] Έργα. Η PRODES έχει ετήσια δεδομένα σε ψηφιακή μορφή από το 2000 και η TerraClass παρουσιάζει εξαμηνιαία δεδομένα από το 2004. Η δορυφορική εικόνα δημιουργήθηκε με χρήση του αισθητήρα Sentinel 2 του Ευρωπαϊκού Οργανισμού Διαστήματος (ESA) (https://sentinel.esa.int/ web/sentinel/ user-guides/sentinel-2-msi) με άδεια CC-BY Open Access (http://open.esa.int/) από τα έτη 2017 και 2018. Όλα τα δεδομένα που ελήφθησαν αποθηκεύτηκαν σε μια Γεωγραφική Βάση Δεδομένων (BDG) . Το BDG εισήχθη/αποθηκεύτηκε σε GIS για την επεξεργασία των γραφικών στοιχείων, τη δημιουργία τοπολογικών σχέσεων μεταξύ των στοιχείων και των αντίστοιχων ιδιοτήτων τους, τη χωρική ανάλυση και οπτικοποίηση του αποτελέσματος μέσω θεματικών χαρτών. Για την παρούσα μελέτη, θραύσματα δασών παρόμοιου μεγέθους Επιλέχθηκαν, το σχήμα και η Φυτοφυσιολογία, λαμβάνοντας υπόψη μια ανοιχτή περιαστική μήτρα με παρόμοια χρήση εδάφους. Τα επιλεγμένα θραύσματα κατανεμήθηκαν εντός των μεσοπεριοχών που μελετήθηκαν και σε κάθε επιλεγμένο θραύσμα συλλέχθηκαν τυχαία δείγματα κοπράνων από οικόσιτα και άγρια ​​ζώα [45] . Οι τάξεις χρήσης του εδάφους ελήφθησαν από το μωσαϊκό δεδομένων TerraClass από το 2004 έως το 2016, επειδή οι περιοχές μελέτης ήταν περιοχή με υψηλή παρουσία σύννεφων, η οποία εμπόδιζε την παρατήρηση (η περιοχή δεν παρατηρήθηκε). Η επεξεργασία των δεδομένων, η ερμηνεία, η οπτικοποίηση και η χωρική ανάλυση πραγματοποιήθηκαν στο λογισμικό ArcGIS (http://www.arcgis.com/). Για την ανάλυση δεδομένων που σχετίζονται με τον προσδιορισμό του πλούτου, της σύνθεσης και της αφθονίας της πανίδας των ζώων που μελετήθηκαν στην περιοχή μελέτης, λαμβάνοντας υπόψη τις μεθόδους συλλογής που υιοθετήθηκαν και τα διαθέσιμα είδη σε κάθε πόλη, κάθε δείγμα θεωρήθηκε ως ανεξάρτητο δείγμα. Ο πλούτος της άγριας πανίδας και των οικόσιτων ζώων προσδιορίστηκε από τον συνολικό αριθμό των ειδών συμπεριλαμβανομένων όλων των μεθόδων συλλογής και η ομοιότητα των ειδών έγινε με την ανάλυση χ-τετράγωνο μεταξύ των δειγμάτων των διαφορετικών θεραπειών με τη βοήθεια του λογισμικού EstimateS 8.0 [ 46] .Για τον υπολογισμό του Test T χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό Statistica και οι δείκτες των μολυσμένων ζώων στα δύο περιβάλλοντα (δάσος θραύσμα και περιτομήλιο) υπολογίστηκαν για κάθε θεραπεία που ελήφθη δειγματοληπτικά ανά περιοχή συλλογής, χρησιμοποιώντας το λογισμικό Past 1.92. Με στόχο τη σύγκριση των τιμών των δεικτών ποικιλομορφίας μέσω του ζευγαρωμένου τεστ, καθώς και της περιγραφικής ανάλυσης των ανθρωπικών επιδράσεων [47] . Τα δεδομένα που ελήφθησαν για την εμφάνιση RVA και τα ερωτηματολόγια εισήχθησαν σε μια βάση δεδομένων για περιγραφική ανάλυση των επιδημιολογικό προφίλ του ζωικού πληθυσμού στα τρία δασικά οικοσυστήματα που μελετήθηκαν. Σε αυτή την ανάλυση, πραγματοποιήθηκαν περιγραφικές στατιστικές επεξεργασίες, χρησιμοποιώντας προσαρμοσμένα διαγράμματα τύπου «γραμμών-στήλων», με αναφορά στα δεδομένα, προκειμένου να χαρακτηριστεί το δείγμα και να ποσοτικοποιηθούν τα αποτελέσματα χρησιμοποιώντας τιμές απόλυτες συχνότητας με τη χρήση του τεστ chi-square και του Test T. .Μελέτη πληθυσμού, συλλογή κλινικών δειγμάτων και εργαστηριακή μεθοδολογία. Τα ιπτάμενα ζώα (άγρια ​​πτηνά και χειρόπτερα) αιχμαλωτίστηκαν χρησιμοποιώντας δίχτυα ομίχλης που άνοιγαν την αυγή (04:00 π.μ.) και έκλειναν το πρωί (9:00 π.μ.) και ελέγχονταν κάθε μία ώρα μέχρι το κλείσιμο, με προσπάθεια δειγματοληψίας των 15 ημερών. Αυτή η έρευνα εγκρίθηκε από την National. Όλες οι διαδικασίες με ζώα πραγματοποιήθηκαν από κτηνιάτρους, τα πτηνά και οι νυχτερίδες που ταυτοποιήθηκαν και απελευθερώθηκαν στον ίδιο χώρο σύλληψης. Τα δείγματα κοπράνων συλλέχθηκαν με διέγερση της αμπούλας του ορθού με τη χρήση \"Zaragatoa\", συσκευάστηκαν σε κρυογονικά φιαλίδια, αναγνωρίστηκαν, αποθηκεύτηκαν σε υγρό άζωτο και αργότερα στάλθηκαν στο Εργαστήριο. Παγιδεύτηκαν άγρια ​​ζώα (μικρά μη ιπτάμενα θηλαστικά). μέσα σε παγίδες συγκράτησης ζωντανής ροής του κλουβιού Tomahawk (μέγεθος 45x16x16 cm) και αλουμινίου τύπου Sherman (μέγεθος 30x9x8 cm). Σε κάθε οικόπεδο δείγματος, μοιράστηκαν 61 παγίδες, 20 Shermans και 41 Tomahawks δολώθηκαν με ένα μείγμα φτιαγμένο με φυστικοπολτό, σαρδέλες, μουρουνέλαιο και καλαμποκάλευρο, καθώς και φρούτα όπως μπανάνα, μήλο και ανανά. Όλες οι παγίδες που χρησιμοποιήθηκαν ελέγχονταν καθημερινά το πρωί, τα δολώματα ανταλλάσσονταν όταν χρειαζόταν και αργότερα μετά τη σύλληψη σε υφασμάτινες σακούλες και επιλέχθηκαν τουλάχιστον πέντε δείγματα από κάθε είδος για τη συλλογή βιολογικού υλικού. Τα άγρια ​​ζώα υποβλήθηκαν σε καταστολή με συνδυασμό κεταμίνης 20 mg/kg και ξυλαζίνης 2 mg/kg ενδομυϊκά και στη συνέχεια, υποβλήθηκαν σε ευθανασία με αναισθητική υπερδοσολογία 2% λιδοκαΐνης στο τρήμα, σύμφωνα με τη σύσταση του Εθνικού Συμβουλίου για τον Έλεγχο των Ζώων (Πείραμα CONCEA). Από τον Οκτώβριο του 2014 έως τον Απρίλιο του 2016, συλλέχθηκαν 1.282 δείγματα κοπράνων από άγρια ​​και οικόσιτα ζώα. Μεταξύ αυτών, 648 (50,5%) δείγματα επιλέχθηκαν τυχαία για έρευνα RVA και χειρίστηκαν στο Εργαστήριο Βιοασφάλειας Επιπέδου Τρίτου (NB3). Το γονιδίωμα του ιού εξήχθη χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο TRIZOL LS REAGENT (INVITRO-GEN, USA/KIT QIAGEN), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή συστάσεις, με μικρή προσαρμογή σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται στα συμπληρωματικά δεδομένα. Η qRT-PCR διεξήχθη σύμφωνα με τους Zeng et al. [40] για την ανίχνευση του RVA χρησιμοποιώντας το τμήμα NSP3 του RVA ως αλληλουχία γονιδίου στόχου. Η δοκιμασία διεξήχθη σε ένα μείγμα που περιείχε: H 2 O χωρίς RNAse, Mix TaqMan RT-PCR (2x), TAqMan RT Enzyme Mix (40x), εκκινητές για το γονίδιο NSP3, Primer NSP3 Forward (20mM), Primer NSP3 Reverse ( 20mM), ανιχνευτής NSP3 S (10nm), Πρότυπο (RNA) 3μL, με συνολικό όγκο αντίδρασης 17μL και κύκλο αντίστροφης μεταγραφής 50˚C, 30 λεπτά, μετουσίωση 95˚C, 10 λεπτά, ανόπτηση 45 κύκλων των 95 ˚C, 15 δευτερόλεπτα και επέκταση 60˚C, 1 λεπτό. Οι αναλύσεις θεωρήθηκαν θετικές κατά την παρουσίαση του ουδού κύκλου (CT) � 40. Προκειμένου να διασφαλιστεί ένα αξιόπιστο αποτέλεσμα δοκιμής, οι μετρήσεις του ελέγχου μόλυνσης πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση θετικού μάρτυρα ζώων (πρωτότυπο SA11) και αρνητικού ελέγχου (υπερκαθαρό νερό). Όλα τα θετικά σε RVA δείγματα υποβλήθηκαν σε αλυσιδωτή αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής-πολυμεράσης (RT-PCR) σύμφωνα με τους Mijatovic et al [41] για τον προσδιορισμό γονότυπου δειγμάτων χαμηλού ιικού φορτίου. Ο πρώτος γύρος διεξήχθη με συναινετικούς εκκινητές N-VP4F1/N-VP4R1 και η Nested-PCR διεξήχθη με εκκινητές N-VP4F2/N-VP4R2 για την ενίσχυση του γονιδίου VP4. Τα αμπλικόνια καθαρίστηκαν και προσδιορίστηκε η αλληλουχία για το γονίδιο VP4 χρησιμοποιώντας τους ίδιους εκκινητές της Nested-PCR. Οι αλληλουχίες συλλέχθηκαν από έναν αυτοματοποιημένο προσδιοριστή αλληλουχίας DNA ABI Prism 3130xl (Applied Biosystems). Τα τμήματα της αλληλουχίας συναρμολογήθηκαν και επεξεργάστηκαν χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα λογισμικού Geneious Bioinformatics v.8.1.7. Εκ των υστέρων, τα δεδομένα συγκρίθηκαν με άλλες ακολουθίες από τη βάση δεδομένων του Εθνικού Κέντρου Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας GenBank χρησιμοποιώντας το εργαλείο ευθυγράμμισης BLAST για την αποσαφήνιση του γονότυπου RVA των δειγμάτων. Από τον Οκτώβριο του 2014 έως τον Απρίλιο του 2016, συνολικά 648 δείγματα κοπράνων άγριων και κατοικίδιων ζώων τρεις περιοχές δασικών θραυσμάτων δοκιμάστηκαν για το γονίδιο NSP3 με ποιοτική qPCR και 178 (27,5%) ήταν θετικές για RVA, κατανεμημένες μεταξύ των ειδών: πτηνά (23,6%), κυνόδοντες (21,35%), νυχτερίδες (17,98%), βοοειδή ( 14,6%), άλογα (8,43%), μικρά τρωκτικά (6,74%), χοίρους (3,93%) και αιλουροειδή (3,37%). Το διάστημα CT κυμαινόταν από 28. 47 Ήταν δυνατό να ανιχνευθούν ιικά στελέχη σε όλα τα φύλα των ζώων που μελετήθηκαν και κατά την περίοδο συγκομιδής κανένα από τα ζώα δεν παρουσίασε σημεία οξείας μόλυνσης ή/και διάρροιας. Ο ροταϊός Α (RVA) ανιχνεύθηκε στην παρούσα μελέτη άγριων και κατοικίδιων ζώων που ανήκουν σε οι τρεις περιοχές του δασικού θραύσματος, σύμφωνα με το σχήμα 2. Σε σχέση με τα βοοειδή που αξιολογήθηκαν, μόνο στην πόλη Viseu, τα είδη αυτά μελετήθηκαν γιατί δημιουργήθηκαν εκτενώς. Επιπλέον, τα περισσότερα από τα ζώα ήταν νεαρά με ηλικίες που κυμαίνονταν από 1 ημέρας έως 8 ετών, ιστορικό ελλιπούς εμβολιασμού, έλλειψη τεχνικής βοήθειας και μεγαλωμένα με τη μορφή διαβίωσης. Τα ζώα δεν εμφάνισαν συμπτώματα διάρροιας, μόνο απόδοση χαμηλού βάρους και κακή κατάσταση υγειονομικής διαχείρισης. Σε σχέση με τα χειρόπτερα, 32 (17,98%) θετικά δείγματα για RVA κατανεμήθηκαν μεταξύ των ειδών Carrollia perspicillata, με 12 (37,5%) να είναι όλα ενήλικα, 9 (28,12%) δείγματα Desmodus rotundus (4 νέοι και 5 ενήλικες), 5 (15,6). %) Uroderma bilobata (15,62%), 3 (9,37%) Artibeus lituratus και τα είδη Artibeus Planirostus, Diaemus iyoug και Glossophagine με 1 (3,12%) έκαστο. Αυτά τα ζώα προέρχονταν από περιοχές θραυσμάτων δασών που βρίσκονται κοντά σε φάρμες βοοειδών και ιπποειδών, εκτός από το ότι κατοικούσαν σε μικρές φάρμες κοτόπουλου. Το Σχήμα 3 δείχνει τα αποτελέσματα που προέκυψαν για όλα τα είδη ζώων που ερευνήθηκαν στο θραύσμα του δάσους καθώς και στην περιοχή του περιδομήλιου. Οι ανθρωπικές μεταβλητές αναλύθηκαν για τις τρεις πόλεις που μελετήθηκαν, καθώς και τη χρήση του εδάφους εντός της περιοχής των ζώων , υπακούοντας στην κατοικία, την περιτομή και το θραύσμα του δάσους όπου αιχμαλωτίστηκαν οι παγίδες μικρών τρωκτικών, πτηνών και διαφόρων ειδών ζώων (Εικ. 4 και Εικ. 5). Λαμβάνοντας υπόψη τους παράγοντες που σχετίζονται με τις ανθρωπικές δραστηριότητες στις τρεις υπό μελέτη περιοχές εντός των τριών πόλεις της παρούσας μελέτης, παρατηρήθηκε ότι η πόλη Santa Bárbara είναι αυτή που έχει καλύτερη έκταση διατηρητέου δάσους και η πόλη Viseu μικρότερη. Ωστόσο, στην πόλη Santa Bárbara, παρατηρήθηκε μεγαλύτερη συγκέντρωση επαγγελμάτων γύρω από την περιοχή του θραύσματος του δάσους. Παρατηρήθηκε σε αυτήν την επιλεγμένη περιοχή της πόλης, η παρουσία διαφορετικών οικογενειών που ζουν σε αγροτικό οικισμό, που επιβιώνουν από την εκμετάλλευση των δασικών πόρων και τη δημιουργία μικρών ζώων για επιβίωση, όπως πτηνοτροφία και ιχθυοκαλλιέργεια, καθώς και οικογενειακή καλλιέργεια. προϊόντα.Η εκτροφή ζώων σε αυτοφυείς βοσκοτόπους παρατηρήθηκε μόνο στις πόλεις Peixe Boi και Viseu. Η εκτεταμένη κτηνοτροφία ασκούνταν με βοοειδή, ιπποειδή για εργασία και μικρά ζώα (χοίρους και κατσίκες). Σε σχέση με την πιο διατηρημένη βοσκοτόπια, η πόλη Peixe Boi είχε τη μεγαλύτερη έκταση, σύμφωνα με τα δεδομένα που φαίνονται στο Σχήμα 5, ωστόσο, στην πόλη Viseu, παρατηρήθηκε υψηλότερη αναγέννηση στα βοσκοτόπια κατά την περίοδο της μελέτης. , με σημαντική δευτερεύουσα βλάστηση. Συγκρίνοντας τα κλίματα των τριών περιοχών παρατηρήθηκε ότι το κυρίαρχο κλίμα είναι μεγαθερμικό και υγρό με μέση ετήσια θερμοκρασία γύρω στους 27˚C. Οι μήνες Οκτώβριος, Νοέμβριος και Δεκέμβριος είναι οι πιο ζεστοί, με θερμοκρασίες μεταξύ 32˚C και 34˚C και απόλυτες μέγιστες γύρω στους 41˚C. Οι ετήσιες βροχοπτώσεις είναι αρκετά υψηλές, γενικά γύρω στα 2.350 mm, αλλά συγκεντρώνονται έντονα από τον Ιανουάριο έως τον Ιούνιο (80%). Από τον Σεπτέμβριο έως τον Δεκέμβριο, αντίθετα, οι βροχοπτώσεις είναι σπάνιες, περίπου 7%, με σύντομη ξηρή περίοδο, μέτριας έλλειψης νερού τους μήνες αυτούς. Η σχετική υγρασία του μέσου αέρα ταλαντώνεται γύρω στο 85%, όπως φαίνεται στο Σχήμα 6 [48] . Η περιγραφή της συσσωρευμένης βροχόπτωσης το έτος σύλληψης των δειγμάτων κοπράνων σε σύγκριση με τα Κλιματολογικά Κανονικά (CLINO) για την περίοδο από το 1961- Το 1990 των PCD που βρίσκονται πιο κοντά στις τοποθεσίες του οικισμού Expedito Ribeiro / Santa Bárbara (Belém PCD), Vila Ananim / Peixe-Boi και Açaiteua / Viseu (Tracauateua PCD) δείχνουν τη συχνότητα των βροχοπτώσεων στις περιοχές, γεγονός που διευκολύνει την ανανέωση του βοσκοτόπια και η αναγέννηση των επηρεαζόμενων δασών, αποτελώντας σημαντικό δείκτη της μείωσης των ζημιών που προκαλούνται από την αποψίλωση των δασών στην περιοχή. Ο μέσος δείκτης αποψίλωσης των δασών στις τρεις περιοχές μελέτης υπολογίστηκε από δεδομένα που ελήφθησαν από τα πληροφοριακά συστήματα INPE. Παρατηρήθηκε ότι τα έτη 2013 έως 2014 δεν υπήρξαν αλλαγές σε αυτές τις περιοχές. την περίοδο από το 2014 έως το 2015 άλλαξε περίπου το 4,1% της πόλης του Viseu και το 1,6% της πόλης Peixe Boi. Σε σχέση με την περίοδο του 2016, μεγάλες αλλαγές παρατηρήθηκαν στο Peixe Boi (79%) και στην πόλη Viseu (70%), αποδεικνύοντας έτσι ότι οι αλλαγές στο φυσικό οικοσύστημα μπορεί να σχετίζονται με τις συχνότητες για RVA στις υπό μελέτη περιοχές. , σύμφωνα με το σχήμα 7. Κατά την αξιολόγηση των μολυσμένων ζώων σε σχέση με τα μη μολυσμένα ζώα τόσο στο θραύσμα του δάσους όσο και στο περιδομήλιο, λαμβάνοντας υπόψη ως ζώα του θραύσματος του δάσους τα πουλιά, τα χειρόπτερα και τα μικρά τρωκτικά και ως ζώα του περιδοκιμίου τους κυνόδοντες, τα βοοειδή, τους χοίρους, τα αιλουροειδή και άλογα, λήφθηκε ποσοστό 37,07% μολυσμένων περιοικόσιτων ζώων (86/232) και 22,12% μολυσμένων δασικών θραυσμάτων (92/416). Εφαρμόζοντας την επιλεγμένη στατιστική ανάλυση, προέκυψε μια τιμή Pearson x2 Chi-square: 16,7159, df = 1 και p <0,001, που σημαίνει ότι η υπόθεση επιβεβαιώθηκε, δηλαδή όσο μεγαλύτερη είναι η υποβάθμιση του περιβάλλοντος, τόσο πιο πιθανό θα είναι την αναζήτηση τροφής από άγρια ​​ζώα σε παρακείμενες περιοχές, ή στην άκρη του δάσους ή ακόμα και στην περιοικία. Υπό αυτή την έννοια, η πιθανότητα μετάδοσης με άλλα είδη ζώων, ακόμη και με ανθρώπους, θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη λόγω της ικανότητας του ροταϊού να μεταδίδεται μέσω των κοπράνων/στοματικών οδών ή μέσω άμεσης επαφής με το περιβάλλον. Είναι σημαντικό να επισημανθεί ότι τα ζώα που ανιχνεύθηκαν σε αυτή τη μελέτη είναι σημαντικές πηγές ιικών στελεχών. Επιλέχθηκαν συνολικά 80 δείγματα κοπράνων, επανεκχυλίστηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας PCR για το γονίδιο VP4. Οκτώ στελέχη (10%) ήταν θετικά για το γονίδιο VP4, είναι 2 στελέχη με γονότυπο P [6] και 6 σε P[4] τύπου, σύμφωνα με Στην παρούσα μελέτη, ανιχνεύθηκε RVA να κυκλοφορεί στο 27,5% των ζώων. 36% σε κατοικίδια ζώα και 64% σε άγρια ​​ζώα, παρέχοντας ένα μοναδικό σύνολο δεδομένων με qRT-PCR που ανιχνεύει χαμηλό ιικό φορτίο RVA σε διαφορετικά είδη, το οποίο συσχετίζεται περαιτέρω με τον δείκτη αποψίλωσης των δασών. Αυτά τα δεδομένα είναι σημαντικά επειδή υπάρχει έλλειψη δοκιμών για τη διάγνωση RVA σε ζώα, καθώς οι τρέχουσες μέθοδοι ανίχνευσης RVA δεν ανιχνεύονται πάντα σε αυτούς τους πληθυσμούς [8] . Με την εμφάνιση της PCR σε πραγματικό χρόνο (qPCR), σημειώθηκε εκθετική ανάπτυξη, σε σύγκριση με τα συμβατικά δοκίμια PCR, καθώς η ανώτερη ακρίβεια, ευαισθησία και ειδικότητά της είναι αξιοσημείωτες και είναι δυνατός ο ροταϊός Α σε άγρια ​​και κατοικίδια ζώα να ανιχνευθεί η RVA σε μια ποικιλία ζωικών ειδών που χρησιμοποιούν το γονίδιο NSP3 [49] . Η ευαισθησία του RT-qPCR βελτίωσε σημαντικά τον ρυθμό ανίχνευσης RVA σε κλινικά δείγματα από ζώα και σε αυτό το πλαίσιο, η παρούσα μελέτη πρότεινε μια ενδιαφέρουσα μελέτη μετρήσεων χρησιμοποιώντας την εξάπλωση του ιού στα άγρια ​​ζώα που κατοικούν σε θραύσματα δασών για να υποδείξουν παρεμβάσεις στον ανθρώπινο πληθυσμό, με Ο στόχος της πρόληψης των εστιών του ιού αξιοποιήθηκε στα μοναδικά γεωγραφικά χαρακτηριστικά της Βραζιλίας και του μεγάλου αριθμού ειδών της στον Αμαζόνιο. Επί του παρόντος, δεν έχουν περιγραφεί δεδομένα στη βιβλιογραφία σχετικά με την ανίχνευση RVA χρησιμοποιώντας την τεχνική qPCR σε πραγματικό χρόνο σε μια μεγάλη ποικιλία άγριων ζώων είδος. Ωστόσο, μια μελέτη των Soltan et al. [50] που διεξήχθη με άλογα και βοοειδή ανίχνευσε RVA με RT-PCR, εμπορική RT-PCR και RT-qPCR σε 36,7%, 51,4% και 56,9% αντίστοιχα, διαφορετικά από την παρούσα μελέτη που έδειξε υψηλότερη θετικότητα για τα chiropterans (17,98%), κυνόδοντες (21,35%), πτηνά (23,6%) και βοοειδή (14,6%). Η πρώτη περιγραφή της RVA στα χειρόπτερα καταγράφηκε στα κόπρανα του Eidolon helvum που αλιεύτηκε στη Vihiga της Κένυας [51] . Στη συνέχεια, ανιχνεύθηκαν διάφορα στελέχη RVA με διαφορετικές μοριακές τεχνικές που περιλαμβάνουν χειρόπτερα, σε πολλές χώρες, όπως η Κένυα (E. helvum), η Κίνα (Rhinolophus hipposideros και Aselliscus stoliczkanus), η Γαλλία (Myotis mystacinus), το Καμερούν (E. helvum) και η Βραζιλία [31, [51] [52] [53] [54] [55] . Η παρούσα μελέτη δείχνει την εμφάνιση RVA στο 17,98% των χειροπτέρων, μεταξύ των ειδών Carolia perspicillata (37,5%), Desmodus rotundus (28,12%), Uroderma bilobata (15,6%), Artibeus lituratus (9,37%), Artibeus Plani 3,12%), Diaemus iyoug and Glossophagine (3,12%).Barquez et al. [56] ανέφερε ότι το Desmodus rotundus είναι ένα από τα τρία αιματοφάγα είδη της οικογένειας Phyllostomidae, που βρίσκεται σε όλη τη Νότια Αμερική, την Κεντρική Αμερική και το Μεξικό. Από τα θετικά χειρόπτερα για RVA στην παρούσα μελέτη, ο επιπολασμός 28,12% ήταν του Desmodus rotundus. Αυτό το είδος τρέφεται με πουλιά, μπορεί να τρέφεται με θηλαστικά, κυρίως μεσαία ή μεγάλα, διευκολύνοντας τη διάδοση ιικών σπορίων μεταξύ της κοινότητας εντός του οικοτόπου, όπως παρατηρήθηκε στην παρούσα μελέτη. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν τη σημασία των επιδημιολογικών δεδομένων για τα είδη που μελετήθηκαν λόγω της έλλειψης μελετών που να αφορούν είδη νεοτροπικών χειροπτέρων και δεν είναι δυνατό να καθοριστούν συγκριτικές παράμετροι για αυτά τα ζώα. Όσον αφορά την κυκλοφορία του RVA σε κυνόδοντες και πτηνά, ο επιπολασμός ήταν 53% και 29%, αντίστοιχα. Αν και στην περιοχή του Αμαζονίου υπάρχουν αρχεία RVA, RVD, RVF και RVG που μολύνουν πτηνά [57] [58] και RVD σε αποδημητικά πτηνά [59] , όλα ανιχνεύθηκαν με προσδιορισμούς RT-PCR διαφορετικά από την παρούσα μελέτη που ανίχνευσε RVA με RT-qPCR που αφορούσε μια ποικιλία ζωικών ειδών. Από την άλλη πλευρά, ο επιπολασμός στα αιλουροειδή (16%) και στους χοίρους (22%) ήταν χαμηλότερος, πιθανώς επειδή υπάρχουν λίγα ζώα αυτών των ειδών στην περιοχή, καθώς και λίγες δημιουργίες. Η μελέτη ανίχνευσε την παρουσία RVA σε διαφορετικά είδη ζώων τόσο σε περιοχές κοντά στο σπίτι όσο και σε περιοχές που βρίσκονται σε θραύσματα δάσους, που χαρακτηρίζονται ως υπολείμματα δασών, καθώς βρίσκονταν σε πόλεις που υπέστησαν υψηλές περιβαλλοντικές επιπτώσεις λόγω της φυτικής εξαγωγής , σχηματισμός βοσκοτόπων για εκτροφή βοοειδών, εκμετάλλευση φυσικών πόρων και άμεσα αντανακλαστικά στα ενδιαιτήματα άγριων ζώων που μπορούν να χρησιμεύσουν ως πηγές ιών, διευκολύνοντας έτσι τη διασπορά του RVA μεταξύ των κοινοτήτων συνυπάρχοντα ζώων. Αξίζει να τονιστεί ότι αυτά τα ζώα έχουν μεγαλύτερη επαφή με τους ανθρώπινους πληθυσμούς των περιοχών που μελετήθηκαν αφού συζούν με τους ανθρώπους της περιοχής, εκτός από υψηλή ροή κίνησης μεταξύ των δασικών εκχυλισμάτων και των περιβαλλόντων που επιλέχθηκαν για την παρούσα μελέτη. Ωστόσο, είναι αξιοσημείωτο ότι μόνο στις κοινότητες Santa Bárbara και Viseu συλλέχθηκαν δείγματα κοπράνων από ασυμπτωματικούς ανθρώπους για διάρροια και εξετάστηκαν για RVA, αλλά όλα ήταν αρνητικά. Είναι διαβόητη ακόμη, η ύπαρξη διαφορετικών επιπέδων υποβάθμισης στα υπό μελέτη περιβάλλοντα, λαμβάνοντας υπόψη τα δεδομένα που παρουσιάζονται. Ο κατακερματισμός του δάσους δημιουργεί πολλές συνέπειες στον βιό οργανισμό του Αμαζονίου, καθώς μπορεί να αλλάξει την ποικιλότητα και τη σύνθεση των ζωικών κοινοτήτων στα θραύσματα και ακόμη και να παρεμβαίνει στις οικολογικές διαδικασίες, χωρίς να λαμβάνεται υπόψη ότι επηρεάζονται τα θραύσματα του δάσους στον Αμαζόνιο. από το κλίμα, διευκολύνοντας πιθανώς τη διασπορά των παθογόνων από το περιβάλλον, καθώς τα άγρια ​​ζώα που ανιχνεύθηκαν στην παρούσα μελέτη είναι ασυμπτωματικά και έχουν χαμηλό ιικό φορτίο για RVA. Η εμφάνιση RVA σε αυτόν τον πληθυσμό ζώων μπορεί να εξηγήσει την πιθανότητα διασποράς του ιού στελέχη, καθώς υπάρχει εγγύτητα με τον ανθρώπινο πληθυσμό, εκτός από τα βιολογικά χαρακτηριστικά αυτών των ειδών που μπορεί να αντιπροσωπεύουν σημαντικές πηγές για γαστρεντερικούς ιούς, μαζί με το γεγονός ότι όλα τα ζώα ήταν ασυμπτωματικά για διάρροια. Τα άγρια ​​πτηνά έχουν απεριόριστη ικανότητα πτήσης, αιχμαλωτίστηκαν στο μια περιοχή διεπαφής μεταξύ του περιδομηλίκου και των δασικών θραυσμάτων και πιστεύεται ότι αυτή η περιοχή δεν έχει επηρεαστεί από ανθρωπικές δραστηριότητες όπως αυτές που παρατηρήθηκαν στην περιοχή της παρούσας μελέτης. Από την άλλη πλευρά, η μέθοδος εκτροφής πουλερικών και κυνόδοντων κοντά στα σπίτια και στο δασικό οικοσύστημα, όπως δημιουργούνται στις κοινότητες που ερευνήθηκαν, πιθανώς διευκολύνει την άμεση επαφή με πιθανές πηγές μόλυνσης, καθώς στις περιοχές η χρήση σηπτικών δεξαμενών είναι ανεπαρκής. και μερικές φορές ανύπαρκτο, το οποίο μπορεί να διευκολύνει ή ακόμη και να αυξήσει τον κίνδυνο διασποράς του ιού σε όλο το περιβάλλον. Τα υψηλά ποσοστά αύξησης και η ανάλυση της χρήσης γης στις περιοχές που ερευνήθηκαν μπορεί να είναι σημαντικοί δείκτες για το πώς αυτά τα ζώα αλληλεπιδρούν, καθώς με την αποψίλωση των δασών, οι πληθυσμοί των άγριων ζώων αναζητούν καταφύγιο σε κοντινές κοινότητες διευκολύνοντας τη διασπορά μολυσματικών παραγόντων και την πιθανή εμφάνιση ζώων-φορέων μέσω άμεσης επαφής ή μόλυνσης του τοπικού περιβάλλοντος. Από όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη μελέτη στην οποία μια ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο εφαρμόστηκε για την ανίχνευση RVA που περιλαμβάνει μεγάλη ποικιλία κατοικίδιων και άγριων ζώων, διευκολύνοντας την πρακτική χρησιμότητα σε επιδημιολογικές και μοριακές μελέτες και βοηθώντας σε μια προοπτική την εκπόνηση υγειονομικού ελέγχου και παρακολούθησης, αποτρέποντας πιθανές εστίες στις υπό μελέτη κοινότητες. Η ανίχνευση θετικών ζώων ήταν χρήσιμη για την παρακολούθηση της μόλυνσης του παράγοντα στον ζωικό πληθυσμό και για την παροχή ενός έγκαιρου προειδοποιητικού σήματος για την πρόβλεψη μιας επικείμενης επιδημίας και ενός ευνοϊκού κινδύνου για τον ανθρώπινο πληθυσμό, δεδομένων των ενδείξεων κυκλοφορίας RVA στα διάφορα δασικά θραύσματα .Επιπλέον, η ανάλυση RT-qPCR μπορεί να είναι μια χρήσιμη εναλλακτική λύση για τη διαφορική διάγνωση της RV σε πιθανές συνυπάρχουσες μικτές λοιμώξεις κλινικά δυσδιάκριτες όπως αυτές που προκαλούνται από άλλα ιικά στελέχη που προκαλούν γαστρεντερίτιδα όπως: αστροϊός, κορωνοϊός, picobirnavirus, καλυκοϊός, μεταξύ των άλλοι όπως παρατηρήθηκαν στις μελέτες των Jing et al. [60] και Waruhiu et al. [61] .Η διάρροια που σχετίζεται με λοιμώξεις από RVA στους χοίρους είναι μια σημαντική αιτία αυξημένης θνησιμότητας και οικονομικών απωλειών στην Ευρώπη. Οι πιο διαδεδομένοι γονότυποι που απομονώθηκαν από κόπρανα βελγικών διαρροϊκών και μη διαρροϊκών χοιριδίων το 2012 [62] επιδεικνύουν ένα ευρύ φάσμα συνδυασμών των γονότυπων G/P, συμπεριλαμβανομένων: G3P [6] , G4P [6] , G5P [6] , G4P [7] , G5P [7] , G9P [7] , G9P [13] και G9P [23] . Από την άλλη πλευρά, στην παρούσα μελέτη ήταν δυνατό να ανιχνευθεί μόνο ο γονότυπος P [6], καθώς τα περισσότερα δείγματα ήταν ασυμπτωματικά για διάρροια. Τα ευρήματα δείχνουν ότι διαφορετικοί γονότυποι P των στελεχών RVA αλληλεπιδρούν με διαφορετικά ιστολογικά αντιγόνα της ομάδας αίματος (HBGA, ABOH , Lewis) και τα σιαλικά οξέα μέσω του VP4 που παρέχουν πληροφορίες για τον περιφερειακό επιπολασμό και την αυξημένη ζωονοσογόνου δυνατότητα ορισμένων χοίρων προέλευσης RVA [63] . Ο γονότυπος P [6] εντοπίστηκε σε χοιρίδια στη Βραζιλία [64] και στην Ιταλία και την Ιαπωνία που μοιάζει με τον γονότυπο P [6] στον άνθρωπο [65, 66] . Στον πληθυσμό των ζώων που μελετήθηκαν η ζωονοσογόνος μετάδοση μπορεί να είναι συχνή, καθώς τα ζώα ζουν σε επαφή με ανθρώπους και σε επισφαλείς συνθήκες υγιεινής. Στη Βραζιλία, αυτός ο γονότυπος περιγράφηκε σε πληθυσμούς ζώων και ανθρώπων σε μελέτες των Luchs et al. [32] ; Οι Honma et al. [67] ; Araújo et al. [68] ; Mascarenhas et al. [69] και Lorenzetti et al. [70] τέτοιες μελέτες επιβεβαιώνουν τη σημασία της συνέχισης της παρακολούθησης των γονότυπων για να επαληθευτεί εάν εμφανίζονται ασυνήθιστα στελέχη ή νέα στελέχη και μπορούν να μολύνουν πληθυσμούς ζώων ή μεταδόσεις μεταξύ των ειδών. Όσον αφορά τον γονότυπο P [4] , ανιχνεύτηκε περισσότερο στα δείγματά μας σε νυχτερίδες , σκύλοι, χοίροι και αιλουροειδείς. Αυτός ο γονότυπος δεν είναι κοινός στα ζώα, καθώς ανιχνεύεται περισσότερο σε δείγματα ανθρώπων και περιβάλλοντος σε διάφορα μέρη του κόσμου και περιλάμβανε την περιοχή μας [71] . Είναι σημαντικό να τονιστεί ότι οι δείκτες περιβαλλοντικής μόλυνσης στη Βραζιλία είναι σημαντικοί και συμβάλλουν στην πιθανότητα μετάδοσης από άνθρωπο-ζώο [71] . Τέτοια δεδομένα χρειάζονται περαιτέρω διερεύνηση σε μεταγενέστερες εργασίες για τον καλύτερο χαρακτηρισμό της μετάδοσης μεταξύ των ειδών, καθώς η εμφάνιση εντερικών ιών σε διαφορετικές μήτρες καταδεικνύει τον ανθρωπογενή αντίκτυπο του εκτεθειμένου πληθυσμού γύρω και δείχνει τον πιθανό κίνδυνο μόλυνσης από την πιθανή έκθεση ατόμων που είναι ευαίσθητα. Τα ευρήματά μας μπορεί να είναι χρήσιμα για την παρακολούθηση της μόλυνσης με κόπρανα στο περιβάλλον χρησιμοποιώντας ζώα ως πιθανές πηγές, ελαχιστοποιώντας έτσι τον κίνδυνο μόλυνσης από έκθεση σε ευαίσθητα άτομα, σε αυτήν την περίπτωση διαφορετικά ζωικά είδη ή ακόμα και ανθρώπινους πληθυσμούς. Ανιχνεύθηκαν RVA σε άγρια ​​και κατοικίδια ζώα χρησιμοποιώντας Δοκιμασία RT-qPCR που ανέλυσε δείγματα που είχαν χαμηλό ιικό φορτίο για RVA. Αν και τα δείγματα είναι ασυμπτωματικά για διάρροια, είναι απαραίτητο να διεξαχθούν στρατηγικές για την παρακολούθηση και τον έλεγχο των ζώων στις περιοχές που μελετήθηκαν στον ανθρώπινο πληθυσμό καθώς και σε άλλα είδη ζώων, καθώς και η εφαρμογή προληπτικών μέτρων που στοχεύουν στο μέλλον. εστίες σε κοινότητες ζώων στον μόνιμο πληθυσμό σε αυτές τις πληγείσες περιοχές. Ως εκ τούτου, η παρούσα μελέτη είναι πρωτόγνωρη στην περιοχή και στη χώρα σε σχέση με την έρευνα της RVA σε άγρια ​​ζώα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, αν και η ποιότητα των αναλυόμενων δειγμάτων χαρακτηρίζεται ως χαμηλό ανιχνεύσιμο ιικό φορτίο, η τεχνική παρουσίασε καλή αναλυτική απόκριση στην ανίχνευση των ζώων πηγής για RVA, διευκολύνοντας την επιλογή των δειγμάτων για μελλοντικές δοκιμές γενετικού χαρακτηρισμού.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 4031, "text": "εννέα είδη" } ], "id": 430, "question": "Πόσα γνωστά είδη ροταϊού υπάρχουν;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4390, "text": "VP1-VP4, VP6 και VP7" } ], "id": 432, "question": "Ποιες δομικές πρωτεΐνες κωδικοποιούνται από τον ροταϊό;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4428, "text": "NSP1-NSP5/NSP6" } ], "id": 433, "question": "Ποιες μη δομικές πρωτεΐνες κωδικοποιούνται από τον ροταϊό;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6609, "text": "ποιοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο" } ], "id": 434, "question": "Τι είναι το qRT-PCR;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Ρύθμιση και συντήρηση μιας δεξαμενής κυττάρων εξαρτώμενης από τα κύτταρα T-εξαρτώμενης μνήμης https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5120830/SHA: f4a82ad66962355ffb09e4d1b57fde3e3sonAuthores; Amado, Inês; Mailhé, Marie-Pierre; Donnadieu, Emmanuel; Garcia, Sylvie; Huetz, François; Freitas, Antonio A.Date: 2016-11-23DOI: 10.1371/journal.pone.0167003License: cc-byAbstract: Διερευνήσαμε την ικανότητα των μονοκλωνικών Β κυττάρων να αποκαθιστούν πρωτογενείς και δευτερογενείς εξαρτώμενες από Τ-κύτταρα αποκρίσεις αντισωμάτων σε θετικούς ανοσολογικούς ξενιστές . Προκαλούμενη ενεργοποίηση και επέκταση Β κυττάρων, έκφραση AID, παραγωγή αντισωμάτων και δημιουργία υποσυνόλων Β-κυττάρων με εμπειρία IgM(+)IgG(-) και IgM(-)IgG(+) που παρέμειναν στο λεμφοπενικό περιβάλλον με κυτταρική διαίρεση . Κατά τη δευτερογενή μεταφορά και ανάκληση, τα κύτταρα IgM(-)IgG(+) ανταποκρίθηκαν με την παραγωγή αντιγονοειδικής IgG ενώ τα κύτταρα μνήμης IgM(+) εκκρίνουν κυρίως IgM και μικρή IgG, αλλά δημιούργησαν νέα Β κύτταρα που εκφράζουν δείκτες βλαστικού κέντρου. Οι αποκρίσεις ανάκλησης ήταν πιο αποτελεσματικές εάν η αντιγονική ενίσχυση καθυστερούσε, υποδηλώνοντας ότι είναι απαραίτητη μια περίοδος προσαρμογής προτού τα μεταφερθέντα κύτταρα μπορέσουν να ανταποκριθούν. Συνολικά, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η ανασύσταση μιας λειτουργικής και πλήρους δεξαμενής μνήμης απαιτεί μεταφορά όλων των διαφορετικών υποσυνόλων Β-λεμφοκυττάρων με εμπειρία αντιγόνου. Βρήκαμε επίσης ότι το μέγεθος της δεξαμενής κυττάρων Β μνήμης δεν βασιζόταν στον αριθμό των αποκρινόμενων αποκρινόμενων κυττάρων Β, υποδεικνύοντας αυτόνομους ομοιοστατικούς ελέγχους για τα πρωτογενή και τα Β κύτταρα της μνήμης. Με την ανασύσταση μιας σταθερής δεξαμενής κυττάρων Β μνήμης σε ξενιστές με ανοσοανεπάρκεια χρησιμοποιώντας έναν πληθυσμό μονοκλωνικών κυττάρων Β υψηλής συγγένειας, καταδεικνύουμε την πιθανή αξία της ανοσοθεραπείας που υιοθετεί τα Β κύτταρα. Κείμενο: Οι ανοσοαποκρίσεις σε λοιμογόνους παράγοντες έχουν διαφορετικά αποτελέσματα που μπορούν είτε να προστατεύσουν είτε αποτυγχάνουν να ελέγξουν την ασθένεια. Η προστασία από την επαναμόλυνση βασίζεται στην εγκαθίδρυση αποτελεσματικών δευτερογενών ανοσοαποκρίσεων που απαιτούν τη δημιουργία ειδικών για αντιγόνο «μνήμης» λεμφοκυττάρων Β και Τ. Η δημιουργία και η επιλογή των εξαρτώμενων από Τ-κύτταρα «μνήμης» Β κυττάρων περιλαμβάνει διακριτούς μοριακούς μηχανισμούς: ανασυνδυασμό ισοτύπου ανοσοσφαιρίνης και σωματική υπερμετάλλαξη, που εξαρτώνται και οι δύο από την έκφραση του AID [1] . Επομένως, ένα μακροχρόνιο παράδειγμα όρισε τα Β κύτταρα μνήμης ως κύτταρα με μεταγωγή ισοτύπου IgM -IgG + [2] . Διαφορετικές αποδείξεις δείχνουν ότι αυτό δεν συμβαίνει πάντα. Στους ανθρώπους, έχει αποδειχθεί ότι ορισμένα κύτταρα IgM + B φέρουν τον φαινότυπο άλλων κυττάρων μνήμης, που είναι CD27 + και φέρουν συχνές σημειακές μεταλλάξεις στην περιοχή V των γονιδίων Ig, γεγονός που υποδηλώνει ότι πρέπει να αντιπροσωπεύουν υψηλά επιλεγμένους πληθυσμούς Β κυττάρων. 3] . Σε ποντίκια, έχουν εντοπιστεί πληθυσμοί CD19 + IgM + ικανοί να δημιουργούν δευτερεύουσες αποκρίσεις [4] [5] [6] [7] . Συνολικά, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η δεξαμενή κυττάρων Β μνήμης που εξαρτάται από Τ-κύτταρα περιλαμβάνει διακριτά υποσύνολα Β κυττάρων μνήμης με διαφορετικές ιδιότητες και λειτουργίες τελεστή [4] [5] [6] . Οι βιολογικές ιδιότητες που διασφαλίζουν τη μακροπρόθεσμη διατήρηση της μνήμης και αποτελεσματικές δευτερογενείς αποκρίσεις αντισωμάτων δεν έχουν ακόμη πλήρως τεκμηριωθεί. Ενώ οι αρχικές μελέτες πρότειναν ότι μετά τη μεταφορά της μνήμης τα Β κύτταρα εξασθενούσαν γρήγορα [8, 9] υποδηλώνοντας ότι η μακροχρόνια μνήμη απαιτούσε τη συνεχή στρατολόγηση νέων κυττάρων [8] ή/και την επιμονή του αντιγόνου [9, 10] , άλλοι πρότειναν ότι τα Β κύτταρα της μνήμης μπόρεσαν να επιβιώσουν χωρίς κυτταρική διαίρεση [11] απουσία αντιγόνου [2] . Η μακροχρόνια επιμονή των αποκρίσεων αντισωμάτων έχει επίσης αποδοθεί σε πληθυσμούς μακρόβιων κυττάρων πλάσματος που κατοικούν κυρίως στον μυελό των οστών μετά από ανοσοποίηση [12, 13]. Η επίδειξη της διαμερισματοποίησης της «μνήμης αντισωμάτων» σε διαφορετικά κυτταρικά στρώματα πρότεινε ότι τα ξεχωριστά υποσύνολα των κυττάρων Β της μνήμης συμπεριφέρονται διαφορετικά. Αντίστοιχα, έχει αναφερθεί ότι τα κύτταρα IgG+ που μπορούσαν να ανταποκριθούν γρήγορα κατά την πρόκληση δεν παρέμειναν για πολύ, ενώ τα κύτταρα IgM+ θα μπορούσαν να δημιουργήσουν ένα δεύτερο κύμα αποκρίσεων βλαστικού κέντρου επιτρέποντας την επιμονή της μνήμης [4] [5] [6] 14] . Επί του παρόντος, οι προσεγγίσεις ανοσοθεραπείας που χρησιμοποιούν παθητική μεταφορά αντισωμάτων [15, 16]) περιορίζονται από τη σύντομη ημιζωή της ανοσοσφαιρίνης. Ως εκ τούτου, οι νέες στρατηγικές θεραπείας μπορεί να απαιτούν τη μεταβίβαση των κυττάρων Β μνήμης υψηλής συγγένειας, έτοιμα να ανταποκριθούν και ικανά να επιμείνουν. Η ανάπτυξη αυτών των νέων στρατηγικών απαιτεί μια βαθιά κατανόηση των μηχανισμών που ρυθμίζουν τους αριθμούς των κυττάρων Β της μνήμης και εξασφαλίζουν μακροχρόνια επιμονή κατά τη μεταφορά. Επιπλέον, η γνώση των μηχανισμών που καθορίζουν το μέγεθος της δεξαμενής κυττάρων Β μνήμης μπορεί να είναι επίσης κρίσιμη για τη δημιουργία νέων στρατηγικών ανασύστασης. Μέχρι στιγμής, οι μελέτες που συγκρίνουν πληθυσμούς πρωτογενών και μνημονικών Β κυττάρων έχουν παρεμποδιστεί τόσο από την τεράστια κλωνική ετερογένεια των εμπλεκόμενων κυττάρων όσο και από την αδυναμία μας να δημιουργήσουμε σημαντικό αριθμό αντιγονοειδικών κυττάρων μνήμης Β. Πράγματι σε ένα κανονικό εργαστηριακό ποντίκι ο πληθυσμός των Β κυττάρων που φέρουν \"φαινότυπο μνήμης IgG +\" αντιπροσωπεύει ένα μικρό κλάσμα της συνολικής δεξαμενής Β κυττάρων (<0,5%) και κατά την ανοσοποίηση τον αριθμό των κλωνικών ποικίλων αντιγονοειδικών κυττάρων μνήμης Β που δημιουργούνται είναι γενικά πολύ περιορισμένη (<10 3 ) [1, 6] .Για να παρακάμψουμε αυτά τα όρια, αποφασίσαμε να συγκρίνουμε τις ιδιότητες ομοιογενών πληθυσμών αρχαίων και μνημονικών Β κυττάρων γνωστής εξειδίκευσης αντιγόνου, που ανήκουν στον ίδιο κλώνο. Χρησιμοποιήσαμε διαγονιδιακά ποντίκια SW HEL όπου τα Β κύτταρα φέρουν BCR υψηλής συγγένειας ειδικά για το HEL και είναι ικανά για ανασυνδυασμό με διακόπτη κατηγορίας και σωματική υπερμετάλλαξη (SHM) [17, 18] . Για να ταυτοποιηθούν τα \"κύτταρα Β μνήμης\" τα ποντίκια SW HEL διασταυρώθηκαν με ποντίκια όπου η μεταγραφή του AID προκαλεί τη μόνιμη έκφραση ενός ανταποκριτή YFP σε λεμφοκύτταρα μετά το βλαστικό κέντρο [19] . Αυτά τα ποντίκια ήταν σε υπόβαθρο με έλλειψη Rag2 και επομένως περιέχουν έναν καθαρό πληθυσμό μονοκλωνικών Β-λεμφοκυττάρων ειδικά για HEL. Για να δημιουργηθούν κύτταρα μνήμης, καθαρισμένα αρχέγονα Β κύτταρα από τα SW HEL.AID/YFP.Rag2 -/ποντίκια μεταφέρθηκαν σε θετικούς ξενιστές μαζί με μονοκλωνικά OVA-ειδικά CD4 + Τ κύτταρα από διαγονιδιακά ποντίκια OTII.Rag2-/-TCR. Μετά την ανοσοποίηση με σύμπλοκα OVA-HEL, λάβαμε έναν σημαντικό αριθμό επιμένουν HEL-ειδικών IgM + Ig-G -YFP + και IgM -IgG + YFP + κυττάρων μνήμης Β, αριθμός που δεν συσχετίστηκε με τον αριθμό των προδρομικών κυττάρων αρχικά εγχύθηκε υποδηλώνοντας ότι η δεξαμενή κυττάρων Β μνήμης ρυθμίζεται ανεξάρτητα. Χαρακτηρίσαμε τη λειτουργική ικανότητα αυτών των δύο τύπων κυττάρων μνήμης σε ξενιστές με ανοσοανεπάρκεια. Ποντίκια B6 και B6.Rag2-/- [20] ποντίκια κρατήθηκαν στο Centre Des Techniques Avancées (CDTA), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) , Ορλεάνη, Γαλλία; SWHEL.AID/YFP.Rag-/-ποντίκια, που ελήφθησαν με διασταύρωση SWHEL (18) (δώρο του Dr. Robert Brink) και AID/YFP [19] (δώρο του Dr. Rafael Casellas) με B6.Rag2-/ -ποντίκια. Τα ποντίκια OTII.Rag-/- κρατήθηκαν στις εγκαταστάσεις μας για ζώα στο Ινστιτούτο Παστέρ. Τα πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με την Επιτροπή Ασφάλειας του Ινστιτούτου Παστέρ σύμφωνα με τις γαλλικές και ευρωπαϊκές οδηγίες και την επιτροπή δεοντολογίας του Παρισιού 1 (άδειες 2010-0002, -0003 και -0004). Η ευθανασία των ποντικών έγινε με εξάρθρωση του τραχήλου της μήτρας. Η συγκεκριμένη μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή του Ευρωπαϊκού Συμβουλίου Έρευνας (ERC) που σχετίζεται με την επιχορήγηση AdG09 249740-QSIS. Η γενική κατάσταση των ποντικών ελεγχόταν καθημερινά παρακολουθώντας την εμφάνιση εμφανούς πόνου, αγωνίας ή ταλαιπωρίας (κατάκλιση, αναπνευστικά προβλήματα, απώλεια βάρους). Το τελικό σημείο του πειράματος προσδιορίστηκε με απώλεια άνω του 20% του βάρους ή μόλις εμφανίστηκαν τα σημάδια κινδύνου. Σε αυτή την περίπτωση, το πείραμα σταμάτησε και τα ζώα υπέστησαν ευθανασία. Εναιωρήματα μονοκυττάρων Β κυττάρων από σπλήνες και λεμφαδένες SW HEL .AID/YFP.Rag -/ποντίκια μαζί με CD4 + Τ κύτταρα από σπλήνα και λεμφαδένες του OTII Τα .Rag -/ποντίκια μεταφέρθηκαν ενδοφλεβίως στον οπισθοκογχικό κόλπο των ποντικών B6.Ly5a IgHa ή B6.Rag2-/λήπτες. Τα ποντίκια έλαβαν 10 6 HEL + Β κύτταρα και 10 6 CD4 + Τ κύτταρα εκτός εάν δηλώνεται διαφορετικά. Τα ποντίκια ανοσοποιήθηκαν 24 ώρες αργότερα με 1 mg ωολευκωματίνης συζευγμένη με λυσοζύμη αυγού κότας (OVA-HEL) σε 50 μg Alu-S-Gel (Serva) που προσδιορίσαμε ως τη βέλτιστη δόση Ag (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Υποσύνολα .AID/YFP.Rag-/ποντίκια και μνήμης Β κυττάρων από ανοσοποιημένα ποντίκια Β6.Rag-/ξενιστές καθαρίστηκαν από σπλήνες και λεμφαδένες με ταξινόμηση κυτταρομετρίας ροής. Εναιωρήματα μονοκυττάρου που περιείχαν 5x104 Β κύτταρα και 106 Τ κύτταρα μεταφέρθηκαν ενδοφλεβίως σε ξενιστές B6.Rag2-/δέκτη. Η καθαρότητα των ταξινομημένων κυττάρων ήταν πάνω από 98%. 24 ώρες μετά τη μεταφορά, τα ποντίκια ανοσοποιήθηκαν με 1 mg OVA-HEL. Εναιωρήματα μονοκυττάρου σπλήνα, μυελού των οστών, βουβωνικών και μεσεντερικών λεμφαδένων χρωματίστηκαν για κυτταρική επιφάνεια ή ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες με κατάλληλους συνδυασμούς των ακόλουθων μονοκλωνικών αντισωμάτων συζευγμένων με μπλε του Ειρηνικού , Qdot-655, Brillant Violet 605, αλλοφυκοκυανίνη, περιδινίνη χλωροφύλλη πρωτεΐνη-κυανίνη 5,5, φυκοερυθρίνη, φυκοερυθρίνη-κυανίνη 7: αντι-CD19 (6D5), αντι-IgM (R6-60,2), αντι-CDIG (281-2), αντι-Gl7 (Gl7), αντι-CD95 (Jo2), αντι-CD62L (MEL-14), αντι-CD69 (H1-2F3), αντι-BAFFR (7H22-E16), αντι-CXCR5 (L138D7), anti-IA b (AF6-120.1), anti-CD80 (16-10A1), anti-CD73 (TY-11-8) και anti-PDL2 (TY25) και anti-Ki-67 (mm1) από την Becton Dickinson Pharmingen, Biolegend, Invitrogen και eBioscience. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν επίσης με HEL (Sigma) σε συνδυασμό με AF594 χρησιμοποιώντας κιτ επισήμανσης πρωτεΐνης Alexa Fluor1 594 από τις τεχνολογίες Life. Πριν από τη χρώση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Fc-Block (CD16/CD32, Becton Dickinson Pharmingen). Τα νεκρά κύτταρα αποκλείστηκαν κατά την ανάλυση σύμφωνα με τα χαρακτηριστικά σκέδασης φωτός τους. Για ενδοκυτταρικές χρώσεις, τα κύτταρα χρωματίστηκαν πρώτα με αντισώματα ειδικά για αντιγόνα κυτταρικής επιφάνειας. Στη συνέχεια, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και διαπερατήθηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή (BD Bisciences). Για τον προσδιορισμό πολλαπλασιασμού, τα ποντίκια ενέθηκαν i.p. με 50 mg/kg BrdU (Sigma-Aldrich) και θανατώθηκαν 24 ή 72 ώρες αργότερα. Το ενσωματωμένο BrdU ανιχνεύθηκε ενδοκυτταρικά χρησιμοποιώντας αντισώματα συζευγμένα με αντι-BrdU APC σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή (BD Biosciences). Όλες οι συλλογές δεδομένων και οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το LSRFortessa (Becton Dickinson) σε διασύνδεση με το λογισμικό BD FACSDiva (Becton Dickinson) και FlowJo (Tree Star). Τα υποσύνολα των κυττάρων Β μνήμης ταξινομήθηκαν ως CD19 + HEL + YFP + IgM + ή IgG + και τα απλά κύτταρα ως CD19 + HEL + YFP -IgM + χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής FACSAriaIII. Η καθαρότητα των ταξινομημένων πληθυσμών κυμαινόταν από 90-95%. Οι ειδικές για HEL συγκεντρώσεις Ig ορού ποσοτικοποιήθηκαν με ELISA. Οι πλάκες επικαλύφθηκαν με HEL και κορέστηκαν με PBS-5% γάλα. Προστέθηκαν αραιώσεις ορών. Μετά από επώαση (2 ώρες, 37°C) και πλύση, προστέθηκαν σημασμένα με HRP αντισώματα IgM ή IgG ποντικού. Μετά από επώαση και πλύση, αποκαλύφθηκαν δεσμευμένα αντισώματα με το υπόστρωμα Ο-φαινυλενοδιαμίνη και Η2Ο2. Η αντίδραση σταμάτησε μετά από 10 λεπτά. με προσθήκη 10% SDS και η απορρόφηση που διαβάζεται στα 492 nm σε φασματόμετρο πολλαπλής σάρωσης. Οι συγκεντρώσεις Ig προσδιορίστηκαν με σύγκριση της μετατόπισης των καμπυλών αραίωσης στο γραμμικό διάστημα μεταξύ των προτύπων σε συγκέντρωση 1 mg/ml και των δειγμάτων ορού. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των κυττάρων που εκκρίνουν IgG ή IgM προσδιορίστηκε με τεχνική ELISpot. Εν συντομία, οι πλάκες επικαλύφθηκαν με HEL. Μετά τον κορεσμό, τα κύτταρα κατανεμήθηκαν στα μικροφρεάτια σε RPMI1640-2%FCS. Οι πλάκες επωάστηκαν για 12 ώρες στους 37°C, 5% ατμόσφαιρα CO2. Μετά από εκτεταμένη πλύση, οι πλάκες επωάστηκαν με IgM αντι-ποντικού κατσίκας ή αντι-IgG επισημασμένο με αλκαλική φωσφατάση. Μετά το πλύσιμο, προστέθηκε το αποκαλυπτικό υπόστρωμα (2,3 mM 5-βρωμο-4-χλωρο-3-ινδολυλ φωσφορικό άλας αραιωμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα 2-αμινο-2-μεθυλ-1-προπρενολόλης). Στερεώθηκε με παραφορμαλδεΰδη και ενσωματώθηκε σε αγαρόζη 4% χαμηλής πηκτωματοποίησης (τύπος VII-A. Sigma-Aldrich) που παρασκευάστηκε σε PBS. Οι φέτες των 150 μm κόπηκαν με δονητή (VT 1000S; Leica) σε ένα λουτρό παγωμένου PBS. Για την ανοσοσήμανση, τα δείγματα κορέστηκαν με PBS συμπληρωμένο με 10% ορού εμβρύου μόσχου, στη συνέχεια επισημάνθηκαν με πρωτογενή αντισώματα αντι-Β220-APC (κλώνος RA3-6B2) και αντι-IgD-PE (κλώνος 11-26c.2a) και αναλύθηκαν με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο περιστρεφόμενου δίσκου εξοπλισμένο με κάμερα CoolSnap HQ2 (Photometrics) και αντικειμενικό φακό 20x. Οι εικόνες ελήφθησαν και αναλύθηκαν με το λογισμικό απεικόνισης MetaMorph 7 Molecular Devices). Οι μέσοι όροι του δείγματος συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το Student's t test. Οι μέσοι όροι του δείγματος θεωρήθηκαν σημαντικά διαφορετικοί σε p < 0,05. Κατά τη διάρκεια μιας ανοσολογικής απόκρισης, η πολυπλοκότητα των καθοριστικών παραγόντων που εκφράζονται από το ανοσοποιητικό αντιγόνο και ο εκφυλισμός της ειδικής για το αντιγόνο αναγνώρισης έχει ως αποτέλεσμα μια τεράστια ετερογένεια των κυττάρων που αποκρίνονται καθιστώντας αδύνατη την άμεση σύγκριση των ιδιοτήτων των προγενέστερων και Β κύτταρα μνήμης που ανήκουν στον ίδιο κλώνο. Επινοήσαμε ένα πειραματικό σύστημα που επιτρέπει τη σύγκριση μεταξύ των αρχέγονων και των μνημονικών Β κυττάρων που εκφράζουν τον ίδιο υποδοχέα αντιγόνου και επιτρέπει τη μόνιμη σήμανση των κυττάρων Β μνήμης. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε διαγονιδιακά ποντίκια SW HEL σε υπόβαθρο με έλλειψη Rag2 που κρατούσαν έναν μόνο πληθυσμό μονοκλωνικών Β κυττάρων, όλα φέρουν BCR υψηλής συγγένειας ειδικά για HEL και ικανά για ανασυνδυασμό κλάσης διακόπτη και σωματική υπερμετάλλαξη (SHM) [17, 18 ] . Για τον εντοπισμό Β-λεμφοκυττάρων με εμπειρία αντιγόνου το SW HEL . Τα Rag2 -/ποντίκια διασταυρώθηκαν με ποντίκια όπου η μεταγραφή του AID επάγει τη μόνιμη έκφραση ενός ανταποκριτή YFP σε λεμφοκύτταρα μετά το βλαστικό κέντρο [19]. Δεδομένου ότι σε άθικτα ποντίκια Tg οι ανοσοαποκρίσεις δεν ήταν ανιχνεύσιμες, πιθανώς λόγω της παρουσίας χαμηλού επιπέδου προϋπάρχοντα αντισωμάτων anti-HEL που εξουδετερώνουν την ανοσοποιητική πρωτεΐνη, χρησιμοποιήσαμε μια στρατηγική μεταβίβασης κυττάρων για να μελετήσουμε την ικανότητα του μονοκλωνικού κυττάρου Β υψηλής συγγένειας για την ανασύσταση της απόκρισης σε ξενιστές με ανοσοανεπάρκεια και τη δημιουργία μνήμης αντισωμάτων. Καθαρισμένα αρχέγονα Β κύτταρα από τα SW HEL .AID/YFP.Rag2 -/ποντίκια μεταφέρθηκαν σε ποντικούς με έλλειψη Rag2 μαζί με μονοκλωνικά OVA-ειδικά CD4 + Τ βοηθητικά κύτταρα από διαγονιδιακά ποντίκια OTII.Rag2-/-TCR. Την επόμενη μέρα, ποντικοί-ξενιστές ανοσοποιήθηκαν με σύμπλοκα OVA-HEL (Σχήμα 1Α). Σε αυτές τις συνθήκες, η αντιγονική πρόκληση είχε ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των Β κυττάρων και την ανάπτυξη σημαντικού αριθμού κυττάρων CD19 + HEL + AID/YFP + Β, τα οποία δεν ανιχνεύθηκαν σε μη ανοσοποιημένα ποντίκια ή σε ποντικούς που ανοσοποιήθηκαν απουσία βοηθητικών Τ κυττάρων (Εικ. 1Β). Ακολουθήσαμε την πρώιμη κινητική αυτής της απόκρισης. Ο αριθμός των HEL-ειδικών Β κυττάρων αυξήθηκε από το αρχικό 2x106 που μεταφέρθηκε σε περίπου 15x106 την ημέρα 14 (Εικ. 1C αριστερά) τα Β κύτταρα που εκφράζουν AID/YFP είναι ο κυρίαρχος πληθυσμός (Εικ. 1C δεξιά). Ένα κλάσμα των HEL-ειδικών Β κυττάρων υποβλήθηκε σε ανασυνδυασμό αλλαγής τάξης και την ημέρα 14 ανακτήσαμε και τους κυτταρικούς πληθυσμούς IgM + IgG -AID/YFP + και IgM -IgG + AID/YFP + (Σχήμα 1Β). Η επέκταση των Β κυττάρων και οι φαινοτυπικές αλλαγές συνοδεύτηκαν από την παραγωγή αντισωμάτων IgM και IgG HEL-ειδικών (Εικόνα 1D). Δύο εβδομάδες μετά την αντιγονική πρόκληση παρατηρήσαμε τον σχηματισμό βλαστικών κέντρων στη σπλήνα των ποντικών-ξενιστών (Εικόνα 1Ε). Συνεκτικά βρήκαμε ότι ενώ κατά την αποδεκτή μεταφορά όλα τα Β κύτταρα εξέφρασαν CD95, μόνο μετά από αντιγονική πρόκληση τα περισσότερα κύτταρα YFP + Β εξέφρασαν τον ειδικό δείκτη του βλαστικού κέντρου GL7 (Σχήμα 1F). απόκριση με ενεργοποίηση και επέκταση Β-λεμφοκυττάρων, επαγωγή έκφρασης AID, ανασυνδυασμό με διακόπτη κατηγορίας, παραγωγή αντιγονοειδικών αντισωμάτων IgM και IgG και σχηματισμό βλαστικού κέντρου. Μελετήσαμε την εξέλιξη της απόκρισης Β κυττάρων. Από τις δύο εβδομάδες και μετά ο συνολικός αριθμός των Β κυττάρων συσπάστηκε και στις τέσσερις εβδομάδες ανακτήσαμε περίπου 2-4x10 6 κύτταρα, αριθμός που παρέμεινε σταθερός μέχρι την εβδομάδα 20 (Εικ. 2Α) . Οι υψηλοί τίτλοι της ειδικής για HEL IgG διατηρήθηκαν από την εβδομάδα 3 έως την 8η, μειώθηκαν στη συνέχεια, αλλά ήταν ακόμα σημαντικά αυξημένοι 20 εβδομάδες αργότερα (Εικόνα 2Β). Ένας πληθυσμός κυττάρων που εκκρίνουν Igs ειδικά για HEL ήταν παρόν στον σπλήνα (Σχήμα 2C), αλλά όχι στο BM (δεν φαίνεται) ακόμη και στα τελευταία χρονικά σημεία. Περίπου το 60% των ανακτημένων κυττάρων εμφάνισαν τον φαινότυπο του αντιγόνου (\"μνήμη\") CD19 + HEL + AID/YFP + που εκφράζει είτε IgM είτε IgG (Σχήμα 2D και 2Ε). Συγκρίναμε τον φαινότυπο των δύο πληθυσμών κυττάρων μνήμης AID/YFP + IgM + και AID/YFP + IgM -IgG + που ανακτήθηκαν με αυτόν των αρχαίων Β κυττάρων (Εικ. 2F). Βρήκαμε ότι η εμπειρία αντιγόνου και τα παρθένα Β κύτταρα εξέφρασαν παρόμοια επίπεδα CD62L, CD69 και BAFFR (δεν παρουσιάζονται). Κύτταρα με εμπειρία αντιγόνου παρουσίασαν παρατεταμένη έκφραση του CD95 και αυξημένα επίπεδα PNA, αλλά η συντριπτική πλειονότητα έχασε την έκφραση του δείκτη βλαστικού κέντρου GL7 που υπήρχε σε παλαιότερους χρόνους μετά την ανοσοποίηση (Σχήμα 2F σε σύγκριση με Σχήμα 1 ΣΤ). Σε σύγκριση με τα πρωτογενή Β κύτταρα, τα κύτταρα AID/YFP+ εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα CD80 και MHC τάξης II και μειωμένη έκφραση του CXCR5 (Εικ. 2F). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα AID/YFP + Β του μεταβλαστικού κέντρου εκφράζουν έναν ενεργοποιημένο φαινότυπο [5, 21], έχουν αυξημένη ικανότητα παρουσίασης αντιγόνου [22], αλλά μπορεί να χάσουν την ικανότητα να εισέλθουν ξανά στα πρωτογενή ωοθυλάκια επειδή είναι χαμηλός CXCR5 [ 23] . Συγκρίναμε επίσης τα μοτίβα γονιδιακής έκφρασης (RNAseq) από αφελή, ενεργοποιημένα (YFP κύτταρα ανοσοποιημένων ποντικών) και αμφότερους τους πληθυσμούς των κυττάρων μνήμης YFP +. Τα δεδομένα δείχνουν μια σαφή διάκριση των αρχαίων και των ενεργοποιημένων/μνήμης κυττάρων, ενώ υποδεικνύουν μόνο μικρές διαφορές μεταξύ των δύο υποσυνόλων των κυττάρων μνήμης YFP + (Εικ. 3). + IgGor IgM -IgG + HEL + CD19 + YFP + Β κύτταρα μνήμης από σπλήνα διαφορετικών ποντικών-λήπτες. Σύνολο συνιστάται από τον κατασκευαστή. Οι επικυρωμένες βιβλιοθήκες στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε προσδιορισμό αλληλουχίας DNA. Η ανάλυση πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας το λογισμικό R, πακέτα Bioconductor συμπεριλαμβανομένου του DESeq2 και του πακέτου PF2tools (έκδοση 1.2.9) που αναπτύχθηκε στο PF2 (Institut Pasteur). Η κανονικοποίηση και η διαφορική ανάλυση πραγματοποιούνται σύμφωνα με το μοντέλο και το πακέτο DESeq2 (έκδοση 1.8.1). Το Σχήμα 3Α δείχνει έναν αντιπροσωπευτικό χάρτη θερμότητας των διαφορετικών πληθυσμών κυττάρων. Το Σχήμα 3Β δείχνει στα τέλη της ανοσολογικής απόκρισης, οι επίμονοι αριθμοί Β κυττάρων διατηρήθηκαν με ενεργή κυτταρική διαίρεση καθώς ένα σημαντικό κλάσμα των κυττάρων ήταν Ki67 + (Εικ. 2G αριστερά) και ενσωματώθηκε BrdU (Σχήμα 2G στη μέση). Η συχνότητα των κυττάρων BrdU + ήταν υψηλότερη μεταξύ των κυττάρων AID/YFP (15%) από ό,τι στον κύριο πληθυσμό μνήμης AID/YFP + (3%) και παρόμοια μεταξύ των πληθυσμών IgM + και IgM -AID/ YFP + (Εικ. 2G μεσαίο και δεν φαίνεται). Τρεις ημέρες μετά οι παλμικοί πληθυσμοί BrdU ήταν καθαροί από κύτταρα BrdU + (Εικ. 2G δεξιά) επιβεβαιώνοντας τον υψηλό ρυθμό διαίρεσης τους. Παρά τον αυξημένο ρυθμό πολλαπλασιασμού τους, οι αριθμοί των κυττάρων μνήμης ήταν σταθεροί, υποδεικνύοντας ότι ο πολλαπλασιασμός μπορεί να αντισταθμιστεί από τον κυτταρικό θάνατο, όπως υποδηλώνεται από τη συχνότητα των κυττάρων κασπάσης3+ (Σχήμα 2Η) . Η συχνότητα των κυττάρων Caspase3 + ήταν υψηλότερη μεταξύ των κυττάρων AID/YFP + υποδηλώνοντας ότι ένα κλάσμα αυτών των κυττάρων μπορεί να αντιπροσωπεύει κύτταρα που υφίστανται τερματική διαφοροποίηση. Είναι σημαντικό ότι αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν ότι η στρατηγική μεταφοράς επέτρεψε τη δημιουργία σημαντικού αριθμού κυττάρων YFP + που είχαν εμπειρία με αντιγόνο. Δεν είναι ακόμη γνωστό εάν ο αριθμός των κυττάρων μνήμης Β που είχαν βιώσει αντιγόνο συσχετίζεται με τον αριθμό των αρχέγονων Β κυττάρων ή εάν ελέγχεται ανεξάρτητα από τον αρχικό αριθμό των αντιγονοειδικών Β κυττάρων που υπάρχουν. Για να προσεγγίσουμε αυτήν την ερώτηση, μεταφέραμε διαφορετικούς αριθμούς ώριμων κυττάρων Β από SW HEL .AID/YFP.Rag2 -/δότες (που κυμαίνονται από 10 5 έως 5,10 6 ) σε ποντικούς με έλλειψη Rag2 μαζί με περίσσεια βοηθητικών κυττάρων CD4 + T ( 10 6 ) και ανοσοποιήστε τους ξενιστές την ημέρα μετά τη μεταφορά κυττάρων με OVA-HEL σε βέλτιστες μη περιοριστικές ποσότητες. Για να συγκρίνουμε άμεσα τα αποτελέσματα που ελήφθησαν μετά τη μεταφορά διαφορετικών όλων των αριθμών, αφήσαμε τις αποκρίσεις να φτάσουν σε σταθερή κατάσταση οκτώ εβδομάδες μετά την αντιγονική πρόκληση. Μελετήσαμε το εύρος της ανοσολογικής απόκρισης μετρώντας τους τίτλους ορού των αντισωμάτων IgG ειδικών για HEL και απαριθμώντας τον αριθμό των ειδικών για HEL Β κυττάρων που ανακτήθηκαν. Βρήκαμε ότι παρουσία περίσσειας βοήθειας Τ-λεμφοκυττάρων, ανακτήθηκαν τα επίπεδα των ειδικών για HEL IgG (Εικ. 4C) και τόσο ο συνολικός αριθμός των ειδικών για HEL (Σχήμα 4Α) όσο και των κυττάρων μνήμης YFP + B (Εικ. 4Β) , δεν συσχετίστηκε με τον αριθμό των ειδικών για το αντιγόνο πρωτογενών Β-λεμφοκυττάρων που αρχικά μεταφέρθηκαν. Τα κύτταρα Β μνήμης ορίζονται λειτουργικά από την ικανότητά τους να επάγουν δευτερογενείς αποκρίσεις αντισωμάτων IgG κατά τη δευτερογενή αντιγονική πρόκληση. Ερευνήσαμε εάν τα υποσύνολα των Β-λεμφοκυττάρων AID/YFP + IgM + και AID/YFP + IgM -IgG + με εμπειρία αντιγόνου (μνήμης) που επιμένουν σε καθυστερημένα χρονικά σημεία θα μπορούσαν να δημιουργήσουν δευτερογενείς αποκρίσεις IgG και να επιμείνουν μετά τη δευτερογενή μεταφορά. Για το σκοπό αυτό ακολουθήσαμε δύο διαφορετικές πειραματικές στρατηγικές. Στο πρώτο, 5x10 4 κύτταρα είτε IgM + είτε IgM -IgG + κυττάρων μνήμης Β, μεταφέρθηκαν με μια περίσσεια βοηθητικών OTII CD4 + Τ κυττάρων σε δευτερεύοντες ξενιστές με έλλειψη Rag που ενισχύθηκαν με OVA-HEL την ημέρα μετά τη μεταφορά των κυττάρων. Ελλείψει ανοσοποίησης τα επίπεδα αντισωμάτων ήταν μη ανιχνεύσιμα (δεν φαίνεται) και τρεις εβδομάδες μετά τη μεταφορά, η ανάκτηση και των δύο υποσυνόλων κυττάρων Β μνήμης ήταν περίπου 10-20% της αρχικής κυτταρικής εισαγωγής, υπερβαίνοντας την απλή ανάκτηση Β κυττάρων (Εικ. 5Α), υποστηρίζοντας την ιδέα ότι τα κύτταρα Β μνήμης μπορεί να μην απαιτούν ειδική αναγνώριση συνδέτη για να επιβιώσουν (2). Δεν μπορεί να αποκλειστεί, ωστόσο, ότι η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα του διαγονιδίου BCR με περιβαλλοντικά αντιγόνα μπορεί να επιτρέψει επαρκή σήματα για να διατηρηθεί η επιβίωση των αφελών κυττάρων και της μνήμης απουσία HEL [24] . Μετά την ανοσοποίηση, τα δευτερογενώς μεταφερθέντα κύτταρα AID/YFP + IgM -IgG + ανταποκρίθηκαν αμέσως με την αποκλειστική παραγωγή σημαντικών επιπέδων ειδικής για HEL IgG επιβεβαιώνοντας έτσι το καθεστώς μνήμης τους (11) . Τα κύτταρα AID/YFP + IgM + B σε απόκριση στην αντιγονική ενίσχυση παρήγαγαν μόνο περιορισμένες ποσότητες αντισωμάτων IgM (Εικ. 4Β), λίγα αντισώματα IgG, αλλά παρήγαγαν κύτταρα GL7 + Β πιο αποτελεσματικά από τον πληθυσμό Β κυττάρων μνήμης IgG + (Εικ. 5D ) . Έτσι, το υποσύνολο IgM + μπορεί να περιέχει πρόδρομες ουσίες ικανές να δημιουργήσουν μια δευτερογενή αντίδραση βλαστικού κέντρου και έναν νέο απόγονο τελεστών IgG + (4). Με την πάροδο του χρόνου, τα επίπεδα αντισωμάτων μειώθηκαν γρήγορα, υποδηλώνοντας ότι ο αριθμός των μεταφερόμενων Β κυττάρων μνήμης μειώθηκε στους δευτερεύοντες ξενιστές μετά την αντιγονική ενίσχυση. Πράγματι, τα Β κύτταρα μνήμης IgM + και IgG + απέτυχαν να επεκταθούν και 3 εβδομάδες μετά την ανοσοποίηση η ανάκτηση των κυττάρων ήταν παρόμοια με την ανάκτηση που παρατηρήθηκε στους μη ανοσοποιημένους ξενιστές (σύγκριση Εικ. 5Ε και 5Α). Σε παρόμοιες πειραματικές συνθήκες, τα προγενέστερα Β κύτταρα μετά την ανοσοποίηση επεκτάθηκαν, απέκτησαν έκφραση AID/YFP και ο αριθμός τους υπερδιπλασιάστηκε από τον αριθμό που είχε αρχικά εγχυθεί (Εικ. 5F και 2A). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι ένα σημαντικό κλάσμα των κυττάρων Β μνήμης που δημιουργούνται έχουν μειωμένη ικανότητα επέκτασης που προγραμματίζεται για ταχεία διαφοροποίηση για λειτουργίες τελεστή. Εκτός από τη μακροπρόθεσμη επιβίωση, τα κύτταρα Β μνήμης πρέπει να διατηρούν λειτουργική δραστηριότητα απουσία ονομαστικού αντιγόνου για να είναι πλήρως αποτελεσματικά. Για να το ελέγξουμε αυτό χρησιμοποιήσαμε μια εναλλακτική προσέγγιση όπου τα κύτταρα μνήμης ήταν σταθμευμένα σε δευτερεύοντες ξενιστές με έλλειψη Rag για 30 ημέρες πριν από την εκ νέου ανοσοποίηση. Βρήκαμε ότι κάτω από αυτές τις συνθήκες η αντιγονική πρόκληση είχε ως αποτέλεσμα την παραγωγή αντισωμάτων IgG ειδικών για HEL και σε 100πλάσια αύξηση του αριθμού των κυττάρων που ανακτήθηκαν, επέκταση που υπερβαίνει σε μεγάλο βαθμό αυτή που παρατηρήθηκε μετά από άμεση πρόκληση (Εικ. 5G). Ο στόχος αυτής της μελέτης επρόκειτο να χαρακτηρίσει τη μοίρα των ενεργοποιημένων Β-λεμφοκυττάρων και τη δημιουργία κυττάρων Β μνήμης. Για να γίνει αυτό, μεταφέραμε με υιοθέτηση μονοκλωνικά Β κύτταρα σε ανοσοανεπαρκείς ξενιστές που ακολουθείται από ανοσοποίηση παρουσία βοήθειας Τ κυττάρων. Αυτή η στρατηγική είχε ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη διαφορετικών υποσυνόλων μνήμης Β κυττάρων, συγκεκριμένα IgM + και IgG +, όπως περιγράφεται για τα κύτταρα μνήμης που δημιουργούνται in situ [4, 6, 14]. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι τα διακριτά υποσύνολα Β-λεμφοκυττάρων μνήμης δεν είναι το αποτέλεσμα της ετερογένειας των αρχικά ανταποκρινόμενων κυττάρων, αλλά προέρχονται από τη διαφοροποίηση ενός μόνο κλώνου Β κυττάρων. Ενώ μελετάμε τον αντίστοιχο ρυθμό πολλαπλασιασμού και των δύο τύπων κυττάρων Β μνήμης, βρήκε τον ίδιο υψηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού για τα Β κύτταρα μνήμης IgM + και IgG +. Αυτά τα αποτελέσματα έρχονται σε αντίθεση με προηγούμενα δημοσιευμένα δεδομένα. Αρχικά αναφέρθηκε ότι τα «in situ» Β κύτταρα της μνήμης παραμένουν ως ακίνητα μη διαιρούμενα κύτταρα [11, 25]. Ωστόσο, δείξαμε ότι κατά τη μεταβίβαση υιοθέτησης και απουσία ανταγωνιστικών κυττάρων, τα Β κύτταρα αυξάνουν τον ρυθμό διαίρεσης τους για να καταλάβουν τη διαθέσιμη κενή θέση [26] , γεγονός που μπορεί να εξηγήσει τον υψηλότερο ρυθμό διαίρεσης που παρατηρείται εδώ χρησιμοποιώντας αυτήν τη στρατηγική μεταφοράς θετικού κυττάρου. Δεύτερον, συγκρίνοντας τη διάρκεια ζωής μεταξύ ετερογενών πληθυσμών κυττάρων μνήμης Β, αναφέρθηκε προηγουμένως χαμηλότερο ποσοστό διαίρεσης μεταξύ της υποομάδας IgM + σε σύγκριση με την πολυκλωνική υποομάδα IgG + [6] . Οι διαφορές στη συγγένεια BCR μεταξύ των κλώνων μνήμης IgM + και IgG + μπορεί να εξηγήσουν τον υψηλότερο ρυθμό διαίρεσης που παρατηρήθηκε προηγουμένως μεταξύ των κυττάρων IgG + [6] . Αντίθετα, συγκρίναμε υποσύνολα κυττάρων Β μνήμης που ανήκουν στον ίδιο κλώνο που φέρουν το ίδιο BCR υψηλής συγγένειας. Συνολικά, αυτές οι παρατηρήσεις υποστηρίζουν την αντίληψη ότι οι ρυθμοί διαίρεσης και η διάρκεια ζωής των λεμφοκυττάρων δεν αποτελούν εγγενή κυτταρική ιδιότητα, αλλά μάλλον καθορίζονται από το περιβάλλον και την παρουσία ανταγωνιστικών πληθυσμών [27] . Αποδεικνύουν ότι υπό τις σωστές συνθήκες τα κύτταρα Β της μνήμης μπορούν να επιμείνουν με κυτταρική διαίρεση. Ένα σημαντικό ερώτημα ήταν εάν ο αριθμός των κυττάρων Β μνήμης εξαρτάται από τον αριθμό των αρχικών αρχικών κυττάρων Β. Διαπιστώσαμε ότι, παρουσία περίσσειας βοήθειας Τ-κυττάρων, αυτό δεν συνέβαινε. Ωστόσο, αναφέρθηκε προηγουμένως κατά τις πολυκλωνικές αποκρίσεις ότι οι τίτλοι ορού του anti-HSA ήταν ανάλογοι με τον αριθμό των κυττάρων που μεταφέρθηκαν σε ακτινοβολημένα ποντίκια [28]. Είναι πιθανό ότι περιορισμένες αντιγονο-ειδικές συναντήσεις Τ-Β κυττάρων μπορεί να περιορίσουν τον αριθμό των Β-λεμφοκυττάρων που ανταποκρίνονται και έτσι να προσδιορίσουν γραμμικό πρόδρομο-απόγονο μεταξύ των πρωτογενών και των κυττάρων Β μνήμης. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι μέσα σε έναν μόνο κλώνο ο αριθμός των πρόδρομων μη κυττάρων Β που υπάρχουν στην περιφερική δεξαμενή κυττάρων Β δεν καθορίζει ούτε την ένταση ούτε τον τελικό αριθμό των κυττάρων Β μνήμης ως απόκριση σε μια βέλτιστη δόση αντιγόνου. Προτείνουν ότι το μέγεθος της δεξαμενής κυττάρων Β μνήμης μπορεί να ελέγχεται ανεξάρτητα από τον αριθμό των πρωτογενών προδρόμων Β κυττάρων και ότι απουσία κλωνικού ανταγωνισμού η θέση της μνήμης μπορεί να γεμίσει με έναν μόνο μονοκλωνικό πληθυσμό. Λαμβάνοντας υπόψη διαφορετικούς πολυκλωνικούς πληθυσμούς, η περιορισμένη θέση για κύτταρα μνήμης θα συνεπάγεται ισχυρό ανταγωνισμό μεταξύ των κλώνων με αποτέλεσμα την επιλογή των κυττάρων με την καλύτερη προσαρμογή (υψηλής συγγένειας): σπάνιοι μεταλλαγμένοι κλώνοι μπορούν να ανταγωνίζονται πιο συχνούς αλλά λιγότερο άπληστους κλώνους. Στις ρυθμίσεις μας, τα διαγονιδιακά κύτταρα Β μνήμης είναι πιθανό να αντιμετωπίσουν επιλεγμένους νέους μεταλλαγμένους κλώνους, καθώς εκφράζουν ένα BCR πολύ υψηλής συγγένειας που επιλέγεται κατά τη διάρκεια μιας δευτερογενούς ανοσοαπόκρισης [29]. Έτσι, παρά την έκφραση του AID και του πολλαπλασιασμού, δεν ανιχνεύσαμε μεταλλάξεις νουκλεοτιδίων της αλυσίδας Ig BCR VH και VL μεταξύ των ανακτημένων Β κυττάρων μνήμης (δεν φαίνεται). Αυτά τα ευρήματα μπορεί να έχουν επιπτώσεις στα πρωτόκολλα εμβολιασμού καθώς υποδεικνύουν ότι κάθε νέα αντιγονική έκθεση ή άσχετη ανοσοποίηση θα πρόσθεταν επιπλέον ανταγωνιστικούς κλώνους που υποστηρίζουν την ανάγκη για επαναλαμβανόμενες αντιγονικές ενισχύσεις για την πρόληψη της τριβής των Β κυττάρων της μνήμης. Αποδεικνύουν επίσης ότι η δεξαμενή κυττάρων Β μνήμης μπορεί να ανασυσταθεί από έναν σχετικά μικρό αριθμό αντιγονοειδικών κυττάρων. Είναι πιθανό ότι η σχετικά φτωχή επέκταση των κυττάρων Β μνήμης που παρατηρείται μετά από άμεση ενίσχυση μετά την εγκριτική μεταφορά θα μπορούσε να οφείλεται στην έλλειψη του Rag- ανεπαρκείς ξενιστές του κατάλληλου περιβάλλοντος που απαιτείται για την επιβίωση και τη λειτουργία των Β κυττάρων της μνήμης. Πρέπει να σημειωθεί ότι η μεταφορά Β κυττάρων σε διαγονιδιακούς ξενιστές με ανεπάρκεια ML5 Rag που εκφράζουν χαμηλά επίπεδα HEL [29] οδήγησε σε ταχεία απώλεια και ανάκτηση κυττάρων υποδηλώνοντας ότι σε αυτούς τους ξενιστές, τα Β κύτταρα παγιδεύονται από το αντιγόνο σε θέσεις όπου δεν μπορούν να επιβιώνουν (δεν φαίνεται). Ωστόσο, έχει αποδειχθεί ότι τα Β κύτταρα μπορούν να οδηγήσουν την ωρίμανση των ωοθυλακικών δενδριτικών κυττάρων και την οργάνωση των λεμφοειδών ωοθυλακίων [30] . Ομοίως, τα μεταφερόμενα βοηθητικά κύτταρα μπορούν επίσης να τροποποιήσουν το άμεσο περιβάλλον τους. Έτσι, επιτρέποντας στα λεμφοκύτταρα να προσαρμοστούν και να τροποποιήσουν το άμεσο περιβάλλον τους, βελτιώσαμε την απόκρισή τους και πιο σημαντικό, ανακτήσαμε το μέγεθος της δεξαμενής των κυττάρων Β μνήμης που υπήρχε στα αρχικά ποντίκια δότες. Σε αυτή τη μελέτη δείχνουμε ότι είναι δυνατή η πλήρης ανασύσταση μιας πρωτογενούς απόκρισης και την εγκαθίδρυση μνήμης αντισωμάτων σε ποντίκια με ανοσοανεπάρκεια μετά από μεταβίβαση ειδικών για αντιγόνο μονοκλωνικών Β κυττάρων μαζί με πληθυσμό μονοκλωνικών βοηθητικών Τ κυττάρων. Πράγματι, γενικά πιστεύεται ότι σε ανοσοανεπάρκειες, η θεραπεία με Β κύτταρα έχει περιορισμένη εφαρμογή λόγω εγγενών ελαττωμάτων της δομής των λεμφικών οργάνων του ξενιστή που μπορεί να εμποδίσουν την ανάπτυξη ανοσοαποκρίσεων, το σχηματισμό βλαστικού κέντρου, τη δημιουργία μνήμης αντισωμάτων και τον περιορισμό της κυτταρικής επιβίωσης. Αντίθετα, δείξαμε ότι μετά από θετική μεταφορά σε ανοσοανεπαρκείς ξενιστές η ανοσοποίηση αντιγόνου προκάλεσε ενεργοποίηση και επέκταση Β-λεμφοκυττάρων, επαγωγή έκφρασης AID, ανασυνδυασμό αλλαγής τάξης, παραγωγή αντιγονοειδικών αντισωμάτων IgM και IgG, σχηματισμός βλαστικού κέντρου και δημιουργία δύο υποομάδων AID /YFP + IgM + IgGand AID/YFP + Ig-M -IgG + υποσύνολα Β-λεμφοκυττάρων με εμπειρία αντιγόνου ικανά να επιμένουν σε λεμφοπενικό περιβάλλον με κυτταρική διαίρεση μιμούμενη αποκρίσεις που λαμβάνονται σε άθικτα ποντίκια χωρίς Tg [4]. Κατά την πρόκληση, τα κύτταρα AID/YFP + IgM -IgG + ανταποκρίθηκαν αμέσως με την παραγωγή HEL-ειδικής IgG ενώ τα AID/YFP + IgM + Β κύτταρα εκκρίνουν μόνο περιορισμένες ποσότητες αντισωμάτων IgM και αποτυγχάνουν να παράγουν IgG. Αντίθετα, τα AID/YFP + IgM + Β κύτταρα θα μπορούσαν να δημιουργήσουν νέα κύτταρα GL7 + B, υποδηλώνοντας ότι η πλήρης ανασύσταση της δεξαμενής κυττάρων μνήμης Β μπορεί να απαιτεί μεταφορά των διαφορετικών υποομάδων Β κυττάρων που έχουν βιώσει αντιγόνο. Είναι σημαντικό ότι βρήκαμε ότι οι αποκρίσεις ανάκλησης ήταν πιο αποτελεσματικές εάν τα μεταφερόμενα κύτταρα μνήμης είχαν τον απαιτούμενο χρόνο για να προσαρμοστούν στο νέο τους περιβάλλον, υποδηλώνοντας ότι απαιτείται μια περίοδος προσαρμογής πριν τα μεταφερόμενα κύτταρα είναι πλήρως ικανά να ανταποκριθούν. Τα ευρήματά μας δείχνουν επίσης ότι διαφορετικές διαδικασίες μπορούν να τροποποιήσουν τις συνθήκες επιβίωσης των Β κυττάρων της μνήμης. Τέλος, διαπιστώσαμε ότι η δημιουργία της δεξαμενής Β-λεμφοκυττάρων μνήμης ως απόκριση σε μια βέλτιστη δόση Ag δεν βασιζόταν στον αριθμό των αρχικώς αποκρινόμενων Β κυττάρων, υποδηλώνοντας αυτόνομους ομοιοστατικούς ελέγχους για τα αδύνατα κύτταρα και τα κύτταρα Β μνήμης μια ιδιότητα που μπορεί να επιτρέψει την ανασύσταση της δεξαμενής μνήμης σε ξενιστές με ανοσοανεπάρκεια χρησιμοποιώντας περιορισμένο αριθμό προδρομικών αρχέγονων Β κυττάρων. Ένας αυτόνομος έλεγχος της δεξαμενής κυττάρων Β μνήμης, όπου κάθε αντιγονική έκθεση προσθέτει νέους ανταγωνιστικούς κλώνους, υποστηρίζει την ιδέα των στρατηγικών εμβολιασμού που χρησιμοποιούν αντιγονική ενίσχυση για την πρόληψη της τριβής των Β κυττάρων της μνήμης. Συνολικά, τα ευρήματα που αναφέρθηκαν καταδεικνύουν ότι είναι δυνατή η ανασύσταση της δεξαμενής κυττάρων Β μνήμης ενός ξενιστή με ανοσοανεπάρκεια με έναν τεχνητά επαγόμενο πληθυσμό μονοκλωνικών κυττάρων μνήμης Β υψηλής συγγένειας.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 12256, "text": "τεχνική ELISpot" } ], "id": 4257, "question": "Τι χρησιμοποιήθηκε για να ποσοτικοποιηθεί η ποσότητα των κυττάρων που εκκρίνουν IgM;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Μέθοδος βελτιστοποίησης για την πρόβλεψη επιβεβαιωμένων περιπτώσεων COVID-19 στην Κίναhttps://doi.org/10.3390/jcm9030674SHA: 1d7f8850c5244fdc9b387038e7eeae9bcbbde6d2Qauthorness: Al-hamed. ΕΝΑ.; Ewees, Ahmed A.; Fan, Χονγκ; Abd El Aziz, MohamedΗμερομηνία: 2020DOI: 10.3390/jcm9030674Άδεια: cc-byAbstract: Τον Δεκέμβριο του 2019, ένας νέος κορονοϊός, που ονομάζεται COVID-19, ανακαλύφθηκε στη Γουχάν της Κίνας και εξαπλώθηκε σε διαφορετικές πόλεις της Κίνας καθώς και σε 24 άλλες χώρες. Ο αριθμός των επιβεβαιωμένων κρουσμάτων αυξάνεται καθημερινά και έφτασε τα 34.598 στις 8 Φεβρουαρίου 2020. Στην τρέχουσα μελέτη, παρουσιάζουμε ένα νέο μοντέλο πρόβλεψης για την εκτίμηση και την πρόβλεψη του αριθμού των επιβεβαιωμένων κρουσμάτων COVID-19 τις επόμενες δέκα ημέρες με βάση τα προηγούμενα επιβεβαιωμένα κρούσματα που έχουν καταγραφεί στην Κίνα. Το προτεινόμενο μοντέλο είναι ένα βελτιωμένο προσαρμοστικό σύστημα νευροασαφούς συμπερασμάτων (ANFIS) που χρησιμοποιεί έναν αλγόριθμο βελτιωμένης επικονίασης λουλουδιών (FPA) χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο σμήνος αλόγων (SSA). Γενικά, το SSA χρησιμοποιείται για τη βελτίωση του FPA για να αποφευχθούν τα μειονεκτήματά του (δηλαδή η παγίδευση στο τοπικό βέλτιστο). Η κύρια ιδέα του προτεινόμενου μοντέλου, που ονομάζεται FPASSA-ANFIS, είναι να βελτιώσει την απόδοση του ANFIS προσδιορίζοντας τις παραμέτρους του ANFIS χρησιμοποιώντας το FPASSA. Το μοντέλο FPASSA-ANFIS αξιολογείται με βάση τα επίσημα στοιχεία του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (ΠΟΥ) για το ξέσπασμα του COVID-19 για την πρόβλεψη των επιβεβαιωμένων κρουσμάτων του προσεχούς δεκαημέρου. Επιπλέον, το μοντέλο FPASSA-ANFIS συγκρίνεται με πολλά υπάρχοντα μοντέλα και έδειξε καλύτερη απόδοση όσον αφορά το μέσο απόλυτο ποσοστό σφάλματος (MAPE), το ριζικό μέσο τετράγωνο σχετικό σφάλμα (RMSRE), το ριζικό μέσο τετράγωνο σχετικό σφάλμα (RMSRE), τον συντελεστή του προσδιορισμού (R2), και του χρόνου υπολογισμού. Επιπλέον, δοκιμάσαμε το προτεινόμενο μοντέλο χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά σύνολα δεδομένων εβδομαδιαίων επιβεβαιωμένων κρουσμάτων γρίπης σε δύο χώρες, δηλαδή τις ΗΠΑ και την Κίνα. Τα αποτελέσματα έδειξαν επίσης καλές επιδόσεις.Κείμενο: Μια μεγάλη οικογένεια ιών, που ονομάζονται κοροναϊοί, είναι σοβαρά παθογόνα για τον άνθρωπο, τα οποία μολύνουν αναπνευστικές, ηπατικές, γαστρεντερικές και νευρολογικές ασθένειες. Κατανέμονται σε ανθρώπους, πουλιά, ζώα, ποντίκια, νυχτερίδες και άλλα άγρια ​​ζώα [1] [2] [3] . Τα κρούσματα δύο προηγούμενων κοροναϊών, του SARS-CoV και του MERS-CoV το 2003 και το 2012, αντίστοιχα, έχουν εγκρίνει τη μετάδοση από ζώο σε ζώο και από άνθρωπο σε άνθρωπο [4] . Τον Δεκέμβριο του 2019, ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (ΠΟΥ) έλαβε ειδοποιήσεις από την Κίνα για πολλές περιπτώσεις αναπνευστικών ασθενειών που συνδέονταν με ορισμένα άτομα που είχαν επισκεφτεί μια αγορά θαλασσινών στη Γουχάν [5] . Επί του παρόντος, η πόλη της Γουχάν υποφέρει από την εξάπλωση ενός νέου κοροναϊού, που ονομάζεται COVID-19 (προηγουμένως ονομαζόταν 2019-nCoV). Στο [6], οι συγγραφείς κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι το COVID-19 πιθανότατα προέρχεται από νυχτερίδες, επειδή μοιάζει περισσότερο με δύο στελέχη κορωνοϊού που προέρχονται από νυχτερίδες. Ωστόσο, η πηγή του COVID-19 δεν έχει ακόμη επιβεβαιωθεί και οι κοινότητες, το Χονγκ Κονγκ και το Τορόντο, ήταν 1,2 και 1,32, αντίστοιχα. Ong et al. [20] πρότεινε ένα μοντέλο παρακολούθησης και πρόβλεψης για τη γρίπη Α (H1N1-2009). Επιπλέον, οι Nah et al. [21] πρότεινε ένα μοντέλο που βασίζεται σε πιθανότητες για την πρόβλεψη της εξάπλωσης του MERS. Το Adaptive Neuro-Fuzzy Inference System (ANFIS) [22] εφαρμόζεται ευρέως σε προβλήματα πρόβλεψης και πρόβλεψης χρονοσειρών και έδειξε καλή απόδοση σε πολλές υπάρχουσες εφαρμογές . Προσφέρει ευελιξία στον προσδιορισμό της μη γραμμικότητας στα δεδομένα χρονοσειρών, καθώς και στο συνδυασμό των ιδιοτήτων τόσο των τεχνητών νευρωνικών δικτύων (ANN) όσο και των συστημάτων ασαφούς λογικής. Έχει εφαρμοστεί σε διάφορες εφαρμογές πρόβλεψης, για παράδειγμα, στο [23] , προτάθηκε ένα μοντέλο πρόβλεψης τιμών μετοχών χρησιμοποιώντας ANFIS και εμπειρική αποσύνθεση. Οι Chen et al. [24] πρότεινε ένα μοντέλο πρόβλεψης χρονοσειρών TAIEX βασισμένο σε ένα υβρίδιο ANFIS και διατεταγμένο σταθμισμένο μέσο όρο (OWA). Στο [25] , παρουσιάστηκε μια άλλη μέθοδος πρόβλεψης χρονοσειρών για τις τιμές ηλεκτρικής ενέργειας με βάση το ANFIS. Svalina et al. [26] πρότεινε ένα μοντέλο πρόβλεψης με βάση το ANFIS για δείκτες κλεισίματος τιμών για ένα χρηματιστήριο για πέντε ημέρες. Οι Ekici και Aksoy [27] παρουσίασαν ένα μοντέλο πρόβλεψης κατανάλωσης ενέργειας κτιρίου βασισμένο στο ANFIS. Επιπλέον, το ANFIS εφαρμόζεται επίσης για την πρόβλεψη φορτίων ηλεκτρικής ενέργειας [28] . Kumar et al. [29] πρότεινε ένα μοντέλο βασισμένο στο ANFIS για την πρόβλεψη προϊόντων επιστροφής. Οι Ho και Tsai [30] εφάρμοσαν το ANFIS για να προβλέψουν την απόδοση ανάπτυξης προϊόντων. Ωστόσο, η εκτίμηση των παραμέτρων ANFIS είναι μια πρόκληση που πρέπει να βελτιωθεί. Ως εκ τούτου, σε προηγούμενες μελέτες, ορισμένες μέθοδοι μεμονωμένης νοημοσύνης σμήνους (SI) έχουν εφαρμοστεί στις παραμέτρους ANFIS για τη βελτίωση της πρόβλεψης χρονοσειρών, επειδή αυτές οι παράμετροι έχουν σημαντική επίδραση στην απόδοση του ANFIS. Οι μέθοδοι SI περιλαμβάνουν τη βελτιστοποίηση σμήνος σωματιδίων (PSO) [31, 32] , τη βελτιστοποίηση κοινωνικής αράχνης [33] , τον αλγόριθμο ημιτόνου-συνημιτόνου (SCA) [34] και τον βελτιστοποιητή πολλαπλών στίχων (MVO) [35] . Για παράδειγμα, στο [34] εφαρμόστηκε ο αλγόριθμος SCA για τη βελτίωση του μοντέλου ANFIS για την πρόβλεψη της κατανάλωσης πετρελαίου σε τρεις χώρες, δηλαδή τον Καναδά, τη Γερμανία και την Ιαπωνία. Στο ίδιο πλαίσιο, στο [35] , ο αλγόριθμος MVO χρησιμοποιήθηκε για τη βελτίωση του μοντέλου ANFIS για την πρόβλεψη της κατανάλωσης πετρελαίου σε δύο χώρες. Επιπλέον, στο [36] το PSO χρησιμοποιήθηκε με ANFIS για την πρόβλεψη της απόδοσης βιοαπανθράκων. Ωστόσο, μεμονωμένοι αλγόριθμοι SI μπορεί να αποθηκεύονται στα τοπικά βέλτιστα. Επομένως, μια λύση είναι η εφαρμογή υβριδικών αλγορίθμων SI για την αποφυγή αυτού του προβλήματος. Στο [37] , ένα υβρίδιο δύο αλγορίθμων SI, δηλαδή GA και SSA, παρουσιάστηκε για τη βελτίωση του μοντέλου ANFIS. Το προτεινόμενο νέο μοντέλο που ονομάζεται GA-SSA-ANFIS εφαρμόστηκε για την πρόβλεψη των τιμών του αργού πετρελαίου για μακροπρόθεσμα δεδομένα χρονοσειρών. Ωστόσο, οι προαναφερθείσες μέθοδοι υποφέρουν από ορισμένους περιορισμούς που μπορούν να επηρεάσουν την απόδοση της προβλεπόμενης παραγωγής, όπως η αργή σύγκλιση και η ικανότητα ισορροπίας μεταξύ των φάσεων εξερεύνησης και εκμετάλλευσης μπορεί να επηρεάσει την ποιότητα της τελικής παραγωγής. Αυτό μας παρακίνησε να προτείνουμε μια εναλλακτική μέθοδο πρόβλεψης που εξαρτάται από την έννοια του υβριδισμού. Αυτή η ιδέα αποφεύγει τους περιορισμούς των παραδοσιακών τεχνικών SI συνδυάζοντας τα δυνατά σημεία διαφορετικών τεχνικών και αυτό παράγει νέες τεχνικές SI που είναι καλύτερες από τις παραδοσιακές. Στην τρέχουσα μελέτη, προτείνουμε ένα βελτιωμένο μοντέλο ANFIS που βασίζεται σε έναν τροποποιημένο αλγόριθμο επικονίασης λουλουδιών (FPA ) χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο σμήνος αλάτων (SSA). Ο FPA είναι ένας αλγόριθμος βελτιστοποίησης που προτάθηκε από τον Yang [38] , ο οποίος εμπνεύστηκε από τη διαδικασία επικονίασης ροής των ανθοφόρων φυτών. Το FPA χρησιμοποιήθηκε σε διάφορες εφαρμογές βελτιστοποίησης, για παράδειγμα για την εκτίμηση της παραμέτρου ηλιακών φωτοβολταϊκών [39, 40] , επίλυση παζλ sudoku [41] , επιλογή χαρακτηριστικών [42] , σχεδιασμό κεραίας [43] και άλλες εφαρμογές [44] [45] [46] [47] . Επιπλέον, ο SSA είναι επίσης ένας αλγόριθμος βελτιστοποίησης που προτείνεται από τους Mirjalili et al. [48] ​​εμπνευσμένο από τη συμπεριφορά των αλυσίδων αλάτων. Τα τελευταία χρόνια, το SSA χρησιμοποιήθηκε για την επίλυση διαφορετικών προβλημάτων βελτιστοποίησης, όπως η επιλογή χαρακτηριστικών [49, 50] , η ταξινόμηση δεδομένων [51] , η τμηματοποίηση εικόνας [52] και άλλα [53, 54] . Η προτεινόμενη μέθοδος που ονομάζεται FPASSA είναι ένα υβρίδιο FPA και SSA, στο οποίο το SSA εφαρμόζεται ως τοπική μέθοδος αναζήτησης για FPA. Το προτεινόμενο FPASSA ξεκινά με τη λήψη του ιστορικού δεδομένων COVID-19. Στη συνέχεια δημιουργείται ένα σύνολο λύσεων όπου καθεμία από αυτές αντιπροσωπεύει την τιμή για τις παραμέτρους του μοντέλου ANFIS. Στη συνέχεια, η ποιότητα κάθε λύσης υπολογίζεται χρησιμοποιώντας την τιμή καταλληλότητας και η λύση που έχει την καλύτερη αξία καταλληλότητας επιλέγεται για να αντιπροσωπεύει την καλύτερη λύση. Στη συνέχεια υπολογίζεται η πιθανότητα κάθε λύσης. Στη συνέχεια, η τρέχουσα λύση θα ενημερωθεί, είτε χρησιμοποιώντας παγκόσμια είτε τοπική στρατηγική στο FPA. Ωστόσο, στην περίπτωση τοπικής στρατηγικής, οι φορείς εκμετάλλευσης SSA ή FPA θα χρησιμοποιηθούν σύμφωνα με την πιθανότητα της τιμής καταλληλότητας για κάθε λύση. Η διαδικασία ενημέρωσης των λύσεων επαναλαμβάνεται έως ότου επιτευχθεί η κατάσταση διακοπής και χρησιμοποιούνται οι καλύτερες διαμορφώσεις παραμέτρων για την πρόβλεψη του αριθμού των επιβεβαιωμένων κρουσμάτων COVID-19. Τα κύρια σημεία συμβολής της τρέχουσας μελέτης είναι τα εξής:1.Προτείνουμε αποτελεσματικό μοντέλο πρόβλεψης για την πρόβλεψη των επιβεβαιωμένων κρουσμάτων του COVID-19 στην Κίνα για τις επόμενες δέκα ημέρες με βάση προηγούμενα επιβεβαιωμένα κρούσματα. Προτείνεται ένα βελτιωμένο μοντέλο ANFIS χρησιμοποιώντας έναν τροποποιημένο αλγόριθμο FPA, χρησιμοποιώντας SSA. Συγκρίνουμε το προτεινόμενο μοντέλο με το αρχικό ANFIS και υπάρχοντα τροποποιημένα μοντέλα ANFIS, όπως PSO, GA, ABC και FPA. Το υπόλοιπο αυτής της μελέτης οργανώνεται ως εξής. Τα προκαταρκτικά των ANFIS, FPA και SSA περιγράφονται στην Ενότητα 2. Η ενότητα 3 παρουσιάζει την προτεινόμενη FPASSA και η Ενότητα 4 παρουσιάζει την πειραματική ρύθμιση και τα αποτελέσματα. Ολοκληρώνουμε αυτή τη μελέτη στην Ενότητα 5. Οι αρχές του ANFIS δίνονται σε αυτήν την ενότητα. Το μοντέλο ANFIS συνδέει τη ασαφή λογική και τα νευρωνικά δίκτυα [22] . Δημιουργεί μια αντιστοίχιση μεταξύ της εισόδου και της εξόδου εφαρμόζοντας κανόνες IF-THEN (ονομάζεται επίσης μοντέλο συμπερασμάτων Takagi-Sugeno). Το σχήμα 1 απεικονίζει το μοντέλο ANFIS όπου τα y και x ορίζουν τις εισόδους στο Layer 1 ενώ το O 1i είναι η έξοδος του κόμβου i που υπολογίζεται ως εξής: όπου το μ υποδηλώνει τις γενικευμένες συναρτήσεις ιδιότητας μέλους Gauss. Τα A i και B i ορίζουν τις τιμές μέλους του μ. Τα α i και ρ i δηλώνουν το σύνολο των παραμέτρων της υπόθεσης. Η έξοδος του στρώματος 2 (είναι επίσης γνωστή ως η ισχύς πυροδότησης ενός κανόνα) υπολογίζεται ως εξής: Εν τω μεταξύ, η έξοδος του στρώματος 3 (είναι επίσης γνωστή ως η κανονικοποιημένη ισχύς πυροδότησης) υπολογίζεται ως εξής: Η έξοδος του στρώματος 4 (είναι επίσης γνωστός ως προσαρμοστικός κόμβος) υπολογίζεται ως εξής: όπου τα r i , q i και p i ορίζουν τις επακόλουθες παραμέτρους του κόμβου i. Το επίπεδο 5 περιέχει μόνο έναν κόμβο. Η έξοδος του υπολογίζεται ως εξής: Ο αλγόριθμος επικονίασης λουλουδιών είναι μια μέθοδος βελτιστοποίησης που προτείνεται από τον Yang [38] . Προσομοιώνει τη μεταφορά της γύρης των λουλουδιών από επικονιαστές στη φύση. Αυτός ο αλγόριθμος χρησιμοποιεί τους δύο τύπους επικονίασης (δηλαδή, αυτο-επικονίαση και διασταυρούμενη επικονίαση). Στην αυτο-επικονίαση, η επικονίαση πραγματοποιείται χωρίς επικονιαστές, ενώ, στη διασταυρούμενη επικονίαση, η γύρη μετακινείται μεταξύ διαφορετικών φυτών. Πιο αναλυτικά, η αυτο-επικονίαση μπορεί να αναπαρασταθεί ως τοπική επικονίαση ενώ η διασταυρούμενη επικονίαση μπορεί να ονομαστεί παγκόσμια επικονίαση. Η συνολική επικονίαση ή η διασταυρούμενη επικονίαση μπορεί να σχηματιστεί μαθηματικά ως εξής: όπου το x t i ορίζει τη γύρη i στην επανάληψη t. Το L υποδηλώνει τη δύναμη της επικονίασης ή το μέγεθος του βήματος. Το F * είναι η θέση στόχος ή η καλύτερη λύση. Σε ορισμένες περιπτώσεις, τα έντομα μπορούν να πετάξουν με διαφορετικά βήματα απόστασης για μεγάλο διάστημα. Επομένως, η κατανομή μύγας Levy εφαρμόζεται για την προσομοίωση αυτής της κίνησης.όπου λ = 1,5. Το γ(λ) δηλώνει τη συνάρτηση γάμμα. Αυτή η κατανομή είναι διαθέσιμη για μεγάλα βήματα s > 0. Η αυτογονιμοποίηση ή η τοπική επικονίαση μπορεί να σχηματιστεί μαθηματικά ως εξής: όπου τα x t i και x k i αντιπροσωπεύουν γύρη από διαφορετικό λουλούδι στο ίδιο φυτό. στο εύρος [0,1] Η διαδικασία της επικονίασης μπορεί να γίνει χρησιμοποιώντας διασταυρούμενη επικονίαση ή αυτογονιμοποίηση. Επομένως, η τυχαία μεταβλητή p, στην περιοχή [0, 1], χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό αυτής της διαδικασίας. Το SSA είναι μια τεχνική βελτιστοποίησης που εισήχθη από τον [48] . Προσομοιώνει τη συμπεριφορά των Salps στη φύση. Αυτή η συμπεριφορά ονομάζεται αλυσιδωτή αλυσίδα. Το μαθηματικό μοντέλο του SSA ξεκινά με τον διαχωρισμό του πληθυσμού του σε μια ομάδα ηγετών και μια ομάδα οπαδών. Ο ηγέτης είναι το μπροστινό σαλπ, ενώ οι ακόλουθοι είναι οι άλλοι σαλπ. Ο χώρος αναζήτησης προσδιορίζεται σε n-διαστάσεις με n μεταβλητές. Η εξίσωση (10) λειτουργεί για να ενημερώσει τις θέσεις των σαλπ. όπου x 1 j υποδηλώνει τη θέση του ηγέτη στην j-η διάσταση. F j είναι η θέση στόχου. Τα ub j και lb j αντιπροσωπεύουν τα μέγιστα και ελάχιστα όρια, αντίστοιχα. Τα c 2 και c 3 δηλώνουν τυχαίους αριθμούς στο [0, 1]. Το c 1 είναι μια σημαντική παράμετρος. ισορροπεί μεταξύ των φάσεων εξερεύνησης και εκμετάλλευσης. Υπολογίζεται ως εξής: όπου ο τρέχων αριθμός βρόχου είναι t και ο μέγιστος αριθμός βρόχου είναι t max . Στη συνέχεια, η θέση των ακολούθων ενημερώνεται ως εξής: όπου x i j ορίζει την i-η θέση του ακόλουθου στην j-η διάσταση. i > 1.Αυτή η ενότητα εξηγεί την προτεινόμενη μέθοδο FPASSA-ANFIS. Είναι μια μέθοδος χρονοσειράς για την πρόβλεψη των επιβεβαιωμένων κρουσμάτων του COVID-19, όπως δίνεται στο Σχήμα 2. Το FPASSA-ANFIS χρησιμοποιεί το βελτιωμένο FPA για να εκπαιδεύσει το μοντέλο ANFIS βελτιστοποιώντας τις παραμέτρους του. Το FPASSA-ANFIS περιέχει πέντε επίπεδα όπως το κλασικό μοντέλο ANFIS. Το επίπεδο 1 περιέχει τις μεταβλητές εισόδου (τα ιστορικά επιβεβαιωμένα κρούσματα COVID-19). Ενώ το επίπεδο 5 παράγει τις προβλεπόμενες τιμές. Στη φάση εκμάθησης, το FPASSA χρησιμοποιείται για την επιλογή των καλύτερων βαρών μεταξύ του επιπέδου 4 και του επιπέδου 5. Το FPASSA-ANFIS ξεκινά μορφοποιώντας τα δεδομένα εισόδου σε μορφή χρονοσειράς. Στην περίπτωσή μας, ελήφθη υπόψη η συνάρτηση αυτοσυσχέτισης (ACF). Το ACF είναι μία από τις μεθόδους που εφαρμόζονται για την εύρεση προτύπων στα δεδομένα. Παρουσιάζει πληροφορίες σχετικά με τη συσχέτιση μεταξύ σημείων που χωρίζονται από διάφορες χρονικές υστερήσεις. Επομένως, σε αυτήν την εργασία, οι μεταβλητές με ACF μεγαλύτερο από 0,2 θεωρούνται, δηλαδή, 5-υστερήσεις. Επιπλέον, τα δεδομένα εκπαίδευσης περιέχουν το 75% του συνόλου δεδομένων, ενώ τα δεδομένα δοκιμής περιέχουν το 25% αυτών. Ο αριθμός των συστάδων ορίζεται με τη μέθοδο fuzzy c-mean (FCM) για την κατασκευή του μοντέλου ANFIS. Οι παράμετροι του μοντέλου ANFIS προετοιμάζονται από τον αλγόριθμο FPASSA. Στη φάση εκπαίδευσης, το σφάλμα υπολογισμού (όπως στην Εξίσωση (13)) μεταξύ των πραγματικών δεδομένων και των προβλεπόμενων δεδομένων χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση της ποιότητας των παραμέτρων. όπου T είναι τα πραγματικά δεδομένα και P είναι τα προβλεπόμενα δεδομένα. N s είναι το μήκος του δείγματος. Οι μικρότερες τιμές της αντικειμενικής συνάρτησης υποδεικνύουν καλή παράμετρο ANFIS. Από την άλλη πλευρά, η φάση ενημέρωσης των θέσεων των ακολούθων στον αλγόριθμο SSA εφαρμόζεται για τη βελτίωση της συνολικής φάσης επικονίασης στον αλγόριθμο FPA. Σε αυτή τη βελτίωση, υπάρχει μια τυχαία μεταβλητή (r) που χρησιμοποιείται για εναλλαγή μεταξύ των δύο φάσεων. Εάν r > 0,5, τότε χρησιμοποιούνται οι τελεστές του SSA. Διαφορετικά, χρησιμοποιούνται οι φορείς εκμετάλλευσης του FPA. Γενικά, το FPASSA ξεκινά με την κατασκευή του πληθυσμού (X). Στη συνέχεια, υπολογίζεται η αντικειμενική συνάρτηση για κάθε λύση. Η λύση με τη χαμηλότερη τιμή σφάλματος αποθηκεύεται στην επόμενη επανάληψη. Αυτή η ακολουθία επαναλαμβάνεται μέχρι να ικανοποιηθεί η συνθήκη διακοπής, η οποία σε αυτό το άρθρο είναι ο μέγιστος αριθμός επαναλήψεων. Στη συνέχεια περνά η καλύτερη λύση για την εκπαίδευση των παραμέτρων του μοντέλου ANFIS. Μετά την ολοκλήρωση της φάσης εκπαίδευσης, ξεκινά η φάση δοκιμής με την καλύτερη λύση για τον υπολογισμό της τελικής παραγωγής. Η απόδοση της προτεινόμενης μεθόδου αξιολογείται συγκρίνοντας τα πραγματικά δεδομένα με τα προβλεπόμενα δεδομένα χρησιμοποιώντας τα μέτρα απόδοσης. Τέλος, το FPASSA παράγει μια προβλεπόμενη αξία για επιβεβαιωμένα κρούσματα COVID-19 στην Κίνα την επόμενη μέρα. Τα βήματα του προτεινόμενου FPASSA παρουσιάζονται στον Αλγόριθμο 1. Εισαγωγή: Ιστορικό σύνολο δεδομένων COVID-19, μέγεθος πληθυσμού N, συνολικός αριθμός επαναλήψεων t max. Διαχωρίστε τα δεδομένα σε σύνολα εκπαίδευσης και δοκιμών. Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Fuzzy c-mean για τον προσδιορισμό του αριθμός συναρτήσεων μέλους.Κατασκευάζοντας το δίκτυο ANFIS.Ορίστε την αρχική τιμή για Ν λύσεις (X). Επιστρέψτε την καλύτερη λύση που αντιπροσωπεύει την καλύτερη διαμόρφωση για ANFIS. Εφαρμόστε το σετ δοκιμών στο καλύτερο μοντέλο ANFIS. Πρόβλεψη του COVID-19 για τις επόμενες δέκα ημέρες. Αυτή η ενότητα παρουσιάζει την περιγραφή του χρησιμοποιούμενου συνόλου δεδομένων, τα μέτρα απόδοσης, τη ρύθμιση παραμέτρων για όλες τις μεθόδους, τα αποτελέσματα του πειράματος και τις συζητήσεις. Το κύριο σύνολο δεδομένων αυτής της μελέτης είναι το σύνολο δεδομένων COVID-19. Συλλέχτηκε από τον ιστότοπο του ΠΟΥ (https: //www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports/). Περιλαμβάνει τα καθημερινά επιβεβαιωμένα κρούσματα στην Κίνα από τις 21 Ιανουαρίου 2020 έως τις 18 Φεβρουαρίου 2020, όπως φαίνεται στον Πίνακα 1. Χρησιμοποιήσαμε το 75% από το σύνολο δεδομένων για την εκπαίδευση του μοντέλου ενώ το υπόλοιπο χρησιμοποιείται για τη δοκιμή του. Επιπλέον, αξιολογήσαμε την απόδοση της προτεινόμενης μεθόδου χρησιμοποιώντας δύο σύνολα δεδομένων εβδομαδιαίων επιβεβαιωμένων κρουσμάτων γρίπης. Το πρώτο ονομάζεται DS1. συλλέχθηκε από τα Κέντρα Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων (CDC) (https://www.cdc.gov/flu/weekly/). Ξεκινά από την εβδομάδα νούμερο 40 το 2015 και συνεχίζεται μέχρι την εβδομάδα νούμερο 6 το 2020. Ενώ, το δεύτερο ονομάζεται DS2. Συλλέχτηκε από τον ιστότοπο του ΠΟΥ (https://www.who.int/influenza). Περιέχει τα δεδομένα των εβδομαδιαίων επιβεβαιωμένων κρουσμάτων γρίπης στην Κίνα από την εβδομάδα νούμερο 1 το 2016 έως την εβδομάδα νούμερο 8 το 2020. Η ποιότητα της προτεινόμενης μεθόδου αξιολογείται χρησιμοποιώντας ένα σύνολο μετρήσεων απόδοσης ως εξής:• Μέσο τετράγωνο σφάλμα ρίζας (RMSE): όπου Yp και Y είναι οι προβλεπόμενες και οι αρχικές τιμές, αντίστοιχα. • Μέσο απόλυτο σφάλμα (MAE):• Μέσο απόλυτο ποσοστό σφάλματος (MAPE):• Σχετικό σφάλμα μέσου τετραγώνου ρίζας (RMSRE): N s αντιπροσωπεύει το μέγεθος του δείγματος των δεδομένων. • Συντελεστής Προσδιορισμού (R 2): όπου το Y αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο του Y. Η χαμηλότερη τιμή των RMSE, MAE, MAPE και RMSRE αναφέρεται στην καλύτερη μέθοδο. Η υψηλότερη τιμή του R 2 υποδηλώνει καλύτερη συσχέτιση για τη μέθοδο. Αυτή η εργασία στοχεύει να αξιολογήσει την ικανότητα του FPASSA να προβλέπει τον COVID-19 συγκρίνοντας την απόδοσή του με άλλες μεθόδους, συγκεκριμένα το ANFIS και τα εκπαιδευμένα μοντέλα ANFIS που χρησιμοποιούν PSO, GA, ABC, FPA και FPASSA. Η ρύθμιση των παραμέτρων για αυτά τα μοντέλα παρατίθεται στον Πίνακα 2. Οι κοινές παράμετροι, όπως το μέγεθος του πληθυσμού, ορίζονται σε 25 και εφαρμόζονται 100 επαναλήψεις. Επιπλέον, κάθε αλγόριθμος εκτελείται για 30 ανεξάρτητες εκτελέσεις σε δίκαιες συγκρίσεις. Οι επιλεγμένες παράμετροι επιλέγονται επειδή παρήγαγαν καλή συμπεριφορά σε προηγούμενα πειράματα, όπως [34, 35, 55, 56]. Πίνακας 2 . Ρύθμιση παραμέτρων. Ρύθμιση παραμέτρωνΜέγ. εποχές = 100, Στόχος σφάλματος = 0, Αρχικό βήμα = 0,01, Ποσοστό μείωσης = 0,9, Ποσοστό αύξησης = 1. Σε αυτή την ενότητα, συζητείται η απόδοση του προτεινόμενου FPASSA για την πρόβλεψη των DS1 και DS2. Μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα από τον Πίνακα 3 ότι η απόδοση του FPASSA ξεπέρασε τις συγκριτικές μεθόδους σε όλα τα μέτρα, ενώ η FPA κατατάσσεται δεύτερη. Τα αποτελέσματα του DS2 υποδεικνύουν ότι ο FPASSA κατατάσσεται πρώτος όσον αφορά τα RMSE, MAPE, R 2 και τον χρόνο CPU. Ενώ, το PSO κατατάσσεται δεύτερο, ακολουθούμενο από το FPA, GA και μετά το ABC. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η προτεινόμενη μέθοδος μπορεί να βελτιστοποιήσει αποτελεσματικά τις παραμέτρους του μοντέλου ANFIS και να παράγει καλά αποτελέσματα όσον αφορά τα μέτρα απόδοσης. Τα αποτελέσματα σύγκρισης μεταξύ του προτεινόμενου FPASSA και άλλων μοντέλων για την πρόβλεψη του COVID-19 δίνονται στον Πίνακα 4. Μπορούμε να συμπεράνουμε ότι το FPASSA υπερτερεί των άλλων μοντέλων. Για παράδειγμα, αναλύοντας τα αποτελέσματα των χρόνων RMSE, MAE, MAPE, RMSRE και CPU μπορεί να παρατηρηθεί ότι το FPASSA επιτυγχάνει τη μικρότερη τιμή μεταξύ των αλγορίθμων σύγκρισης, και αυτό υποδηλώνει την υψηλή ποιότητα του FPASSA. Εν τω μεταξύ, η FPA κατανέμει τη δεύτερη κατάταξη, η οποία παρέχει καλύτερα αποτελέσματα από τις υπόλοιπες μεθόδους. Επιπλέον, η τιμή του R 2 αναφέρεται στην υψηλή συσχέτιση μεταξύ της πρόβλεψης που προκύπτει από την προτεινόμενη μέθοδο FPASSA και του αρχικού COVID-19, που έχει σχεδόν 0,97. Αυτό μπορεί επίσης να παρατηρηθεί από το Σχήμα 3, το οποίο απεικονίζει την εκπαίδευση των αλγορίθμων χρησιμοποιώντας τα ιστορικά δεδομένα του COVID-19 καθώς και τις τιμές πρόβλεψής τους για δέκα ημέρες. Ο Πίνακας 5 απεικονίζει την τιμή πρόβλεψης για τα επιβεβαιωμένα κρούσματα του COVID-19 στην Κίνα από 19/2/2020 έως 28/2/2020. Από αυτά τα αποτελέσματα, μπορεί να παρατηρηθεί ότι η επιδημία θα φτάσει στο υψηλότερο επίπεδο την ημέρα 28/2/2020. Το μέσο ποσοστό της αύξησης κατά την προβλεπόμενη περίοδο είναι 10%, το υψηλότερο ποσοστό είναι 12% στις 28/2/2020 και το χαμηλότερο ποσοστό είναι 8,7% στις 19/2/2020. Από τα προηγούμενα αποτελέσματα, μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι το προτεινόμενο FPASSA-ANFIS έχει υψηλή ικανότητα να προβλέπει το σύνολο δεδομένων COVID-19. Αυτά τα αποτελέσματα αποφεύγουν τους περιορισμούς του παραδοσιακού ANFIS λόγω του συνδυασμού με την τροποποιημένη μέθοδο FPA. Επιπλέον, οι φορείς εκμετάλλευσης της SSA συνδυάζονται με την τοπική στρατηγική της FPA για την ενίσχυση της εκμεταλλευτικής τους ικανότητας. Ωστόσο, ο υπολογισμός του χρόνου της προτεινόμενης μεθόδου FPASSA εξακολουθεί να απαιτεί περισσότερες βελτιώσεις. Αυτό το έγγραφο πρότεινε μια τροποποιημένη έκδοση για τον αλγόριθμο επικονίασης λουλουδιών (FPA) χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο σμήνος αλάτων (SSA). Αυτή η τροποποιημένη έκδοση, που ονομάζεται FPASSA, εφαρμόζεται για τη βελτίωση της απόδοσης του ANFIS μέσω του προσδιορισμού της βέλτιστης τιμής για τις παραμέτρους του. Το αναπτυγμένο μοντέλο FPASSA-ANFIS εφαρμόζεται ως τεχνική πρόβλεψης για έναν νέο κορωνοϊό, που ονομάζεται COVID-19, που ανακαλύφθηκε στη Γουχάν της Κίνας στα τέλη του περασμένου έτους και τον Ιανουάριο του τρέχοντος έτους. Το προτεινόμενο μοντέλο FPASSA-ANFIS έχει υψηλή ικανότητα να προβλέπει τον αριθμό των επιβεβαιωμένων κρουσμάτων εντός δέκα ημερών. Επιπλέον, το FPASSA-ANFIS ξεπερνά τα άλλα μοντέλα πρόβλεψης όσον αφορά τα RMSE, MAE, MAPE, RMSRE και R 2 . Επιπλέον, δύο σύνολα δεδομένων εβδομαδιαίων επιβεβαιωμένων κρουσμάτων γρίπης στις ΗΠΑ και την Κίνα χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της προτεινόμενης μεθόδου και τα αποτελέσματα της αξιολόγησης έδειξαν την καλή της απόδοση. Σύμφωνα με τα πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα που λαμβάνονται από το προτεινόμενο FPASSA-ANFIS, μπορεί να εφαρμοστεί σε διαφορετικές εφαρμογές πρόβλεψης.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 560, "text": "34.598" } ], "id": 4394, "question": "Ποιος είναι ο αριθμός των επιβεβαιωμένων κρουσμάτων στις 8 Φεβρουαρίου 2020;" }, { "answers": [ { "answer_start": 632, "text": "νέο μοντέλο πρόβλεψης για την εκτίμηση και την πρόβλεψη του αριθμού των επιβεβαιωμένων κρουσμάτων COVID-19 τις επόμενες δέκα ημέρες με βάση τα προηγούμενα επιβεβαιωμένα κρούσματα που έχουν καταγραφεί στην Κίνα" } ], "id": 4395, "question": "Τι παρουσιάζεται σε αυτή τη μελέτη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1282, "text": "να βελτιώσει την απόδοση του ANFIS προσδιορίζοντας τις παραμέτρους του ANFIS χρησιμοποιώντας το FPASSA." } ], "id": 4398, "question": "Ποια είναι η κύρια ιδέα πίσω από το προτεινόμενο μοντέλο;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1956, "text": "χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά σύνολα δεδομένων εβδομαδιαίων επιβεβαιωμένων κρουσμάτων γρίπης σε δύο χώρες, δηλαδή τις ΗΠΑ και την Κίνα" } ], "id": 4402, "question": "Πώς δοκιμάστηκε το προτεινόμενο μοντέλο;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3590, "text": "σε προβλήματα πρόβλεψης και πρόβλεψης χρονοσειρών" } ], "id": 4406, "question": "Σε τι εφαρμόζεται ευρέως το Adaptive Neuro-Fuzzy Inference System (ANFIS) [22];" }, { "answers": [ { "answer_start": 3918, "text": "σε διάφορες εφαρμογές πρόβλεψης, για παράδειγμα, στο [23] , προτάθηκε ένα μοντέλο πρόβλεψης τιμών μετοχών χρησιμοποιώντας ANFIS και εμπειρική αποσύνθεση" } ], "id": 4408, "question": "Σε ποιες εφαρμογές έχει εφαρμοστεί;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7955, "text": "είναι ένα υβρίδιο FPA και SSA, στο οποίο το SSA εφαρμόζεται ως τοπική μέθοδος αναζήτησης για FPA" } ], "id": 4431, "question": "Ποια είναι η προτεινόμενη μέθοδος FPASSA;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Ο αναστολέας κενοτοπίου ATPase archazolid αυξάνει την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα συσσωρεύοντας εξωκυτταρικό κολλαγόνο Schwenk, Rebecca; Bräutigam, Jacqueline; Müller, Rolf; Menche, Dirk; Bischoff, Iris; Fürst, RobertDate: 2018-09-11DOI: 10.1371/journal.pone.0203053Άδεια: cc-byAbstract: Η vacuolar-τύπου H(+)-ATPase (v-ATPase) είναι η κύρια αντλία πρωτονίων που οξινίζει τα ενδοκυτταρικά σύνθετα κύτταρα. Δεδομένου ότι η αναστολή της v-ATPase οδήγησε σε αντικαρκινικά και αντι-μεταστατικά αποτελέσματα σε διαφορετικά μοντέλα όγκου, αυτό το ένζυμο έχει αναδειχθεί ως πολλά υποσχόμενη στρατηγική κατά του καρκίνου. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε τον καθιερωμένο αναστολέα v-ATPase archazolid, ένα φυσικό προϊόν που απομονώθηκε για πρώτη φορά από το μυξοβακτήριο Archangium gephyra, για να μελετήσουμε τις συνέπειες της αναστολής της v-ATPase στα ενδοθηλιακά κύτταρα (ECs), ιδιαίτερα στην αλληλεπίδραση μεταξύ ECs και καρκίνου. κελιά, τα οποία μέχρι στιγμής έχουν παραμεληθεί. Τα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με αρχαζολίδη εμφάνισαν αυξημένη προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων, ενώ η διαενδοθηλιακή μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων μειώθηκε. Η διαδικασία προσκόλλησης ήταν ανεξάρτητη από τα μόρια προσκόλλησης EC ICAM-1, VCAM-1, Ε-σελεκτίνη και Ν-καντερίνη. Αντίθετα, η προσκόλληση προκλήθηκε από β1-ιντεγκρίνες που εκφράζονται σε κύτταρα όγκου, καθώς ο αποκλεισμός της υπομονάδας β1 ιντεγκρίνης ανέστρεψε αυτή τη διαδικασία. Τα καρκινικά κύτταρα που προσκολλήθηκαν κατά προτίμηση στο κολλαγόνο και στην αρχαζολίδη του συνδέτη β1-ιντεγκρίνης οδήγησαν σε αύξηση της ποσότητας κολλαγόνου στην επιφάνεια των ECs. Η συσσώρευση κολλαγόνου συνοδεύτηκε από έντονη μείωση της έκφρασης και της δραστικότητας της πρωτεάσης καθεψίνης Β. Η υπερέκφραση της καθεψίνης Β στα ECs εμπόδισε την ικανότητα της αρχαζολίδης να αυξάνει την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων στα ECs. Η μελέτη μας δείχνει ότι η αναστολή της v-ATPase από την αρχαζολίδη επάγει έναν προ-συγκολλητικό φαινότυπο στα ενδοθηλιακά κύτταρα που προάγει την αλληλεπίδρασή τους με τα καρκινικά κύτταρα, ενώ η μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων μειώθηκε. Αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν περαιτέρω το archazolid ως μια πολλά υποσχόμενη αντι-μεταστατική ένωση. Κείμενο: Η κενοτοπικού τύπου H + -ATPase (v-ATPase) είναι η κύρια αντλία πρωτονίων που είναι υπεύθυνη για την οξίνιση των ενδοκυτταρικών διαμερισμάτων στα ευκαρυωτικά κύτταρα [1] . Το ένζυμο αποτελείται από δύο σύμπλοκα πολλαπλών υπομονάδων, το διαλυτό V 1 διαμεμβρανικό υποσύμπλοκο V o που απαιτείται για τη μεταφορά πρωτονίων μέσω των μεμβρανών [1, 2] . Στους περισσότερους κυτταρικούς τύπους οι v-ATPases εκφράζονται μόνο στο σύστημα της ενδομεμβράνης για να ρυθμίσουν και να διατηρήσουν το όξινο pH των ενδοκυτταρικών διαμερισμάτων όπως τα λυσοσώματα, τα ενδοσώματα, η συσκευή Golgi, οι εκκριτικοί κόκκοι και τα επικαλυμμένα κυστίδια [3]. Η λειτουργία των v-ATPases είναι απαραίτητη για κυτταρικές διεργασίες όπως η διακίνηση φυσαλίδων, η ενδοκυττάρωση που προκαλείται από υποδοχείς και η αποικοδόμηση και επεξεργασία πρωτεϊνών. Σε εξειδικευμένους κυτταρικούς τύπους συμπεριλαμβανομένων των οστεοκλαστών και των νεφρικών επιθηλιακών κυττάρων, οι v-ATPases μπορούν επίσης να εκφραστούν στην πλασματική μεμβράνη, όπου αντλούν πρωτόνια στον εξωκυτταρικό χώρο [2] [3] [4] . Στα καρκινικά κύτταρα οι v-ATPase εκφράζονται στην πλασματική μεμβράνη για την εξάλειψη του τοξικού κυτταροζολικού H+. Το πιο σημαντικό, οι v-ATPases συμβάλλουν στο όξινο μικροπεριβάλλον του όγκου, το οποίο οδηγεί στην ενεργοποίηση των πρωτεασών, διευκολύνοντας έτσι τη μετανάστευση, την εισβολή και την αγγειογένεση των κυττάρων του όγκου [5] [6] [7] . Δεδομένου ότι η αναστολή της v-ATPase αποδείχθηκε ότι μειώνει τη διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων και το σχηματισμό μεταστάσεων [8, 9], αυτό το ένζυμο έχει αναδειχθεί ως ένας πολλά υποσχόμενος στόχος φαρμάκου τα τελευταία χρόνια. Η αρχαζολίδη Α και Β είναι ιδιαίτερα ισχυροί και ειδικοί αναστολείς των v-ATPases [10] . Αρχικά απομονώθηκαν από το μυξοβακτήριο Archangium gephyra [11] . Αυτές οι ενώσεις αναστέλλουν την v-ATPase σε χαμηλές νανομοριακές συγκεντρώσεις [10, 12] δεσμεύοντας στην υπομονάδα c του συμπλόκου V o. Καθώς η βιολογική τους δράση είναι συγκρίσιμη με τους αναστολείς v-ATPase, bafilomycin και concanamycin [10, 11], τα αρχαζολίδια είναι φυσικές ενώσεις υψηλού ενδιαφέροντος που μπορούν να χρησιμοποιηθούν τόσο ως εργαλείο για τη μελέτη των συνεπειών της αναστολής της v-ATPase όσο και ως μόλυβδο για ανάπτυξη φαρμάκων. Τα αρχαζολίδια μπορούν να παραχθούν είτε με ζύμωση [11] είτε με ολική σύνθεση [13, 14] . Στον τομέα της έρευνας για τον καρκίνο αρκετές μελέτες ανέφεραν ενδιαφέρουσες φαρμακολογικές επιδράσεις της αρχαζολίδης: Μείωσε τη μετανάστευση διαφορετικών διεισδυτικών καρκινικών κυττάρων in vitro και καρκινικών κυττάρων μετάσταση in vivo σε μοντέλο ποντικού όγκου μαστού [15] . Επιπλέον, η αρχαζολίδη ενεργοποίησε μονοπάτια απόκρισης κυτταρικού στρες και απόπτωσης σε κύτταρα όγκου υψηλής διήθησης [16] . Σε κλασικά ενεργοποιημένα μακροφάγα, η αρχαζολίδη προκάλεσε εκλεκτικά τη δημιουργία παράγοντα νέκρωσης όγκου α (TNFα), ο οποίος μπορεί έμμεσα να προάγει την καταστολή του όγκου [17] . Μέχρι τώρα, ο ρόλος των v-ATPases στα ενδοθηλιακά κύτταρα έχει μόνο σπάνια διερευνηθεί. Το ενδοθήλιο παίζει καθοριστικό ρόλο στην παθογένεση και την εξέλιξη του καρκίνου: Ο μεταστατικός καταρράκτης περιλαμβάνει τοπική αγγειογένεση στη θέση του πρωτοπαθούς όγκου και προσκόλληση καρκινικών κυττάρων στη θέση της μετάστασης [18] . Η αγγειογένεση, η ανάπτυξη νέων αιμοφόρων αγγείων από τα υπάρχοντα, εξαρτάται από τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και τη διαφοροποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων [19] . Αυτή η διαδικασία εξασφαλίζει την παροχή θρεπτικών στοιχείων του όγκου και την ανάπτυξή του [20] . Τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα μπορούν να προσκολληθούν στο ενδοθήλιο σε απομακρυσμένα σημεία. Αυτή η κολλητική αλληλεπίδραση μεσολαβείται από υποδοχείς και αντίστοιχους συνδέτες που εκφράζονται σε κύτταρα όγκου και ενδοθηλίου [18, 21]. Οι V-ATPases έχουν αναφερθεί ότι ρυθμίζουν το ενδοκυτταρικό pH και τη μετανάστευση των κυττάρων σε μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα [22, 23]. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η αναστολή της v-ATPase από την κονκαναμυκίνη εμπόδισε τον πολλαπλασιασμό, μείωσε τη μετανάστευση και μείωσε τη σηματοδότηση που σχετίζεται με την αγγειογένεση στα ενδοθηλιακά κύτταρα [24]. Μέχρι στιγμής, δεν υπάρχουν έρευνες για το ρόλο των ενδοθηλιακών v-ATPases για τη διαδικασία προσκόλλησης των καρκινικών κυττάρων στο ενδοθήλιο. Έτσι, ενδιαφερθήκαμε για τις συνέπειες της αναστολής της ενδοθηλιακής v-ATPase από την αρχαζολίδη στην αλληλεπίδραση μεταξύ ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων. Διάφορα μόρια κυτταρικής προσκόλλησης στο ενδοθήλιο, όπως το μόριο διακυτταρικής προσκόλλησης 1 (ICAM-1), η πρωτεΐνη προσκόλλησης αγγείων κυττάρων (VCAM-1), η Ε-σελεκτίνη ή η Ν-καντερίνη [21] καθώς και οι ιντεγκρίνες που εκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα έχουν αναφέρθηκε ότι μεσολαβεί στην κυτταρική προσκόλληση καρκινικών κυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα [25] [26] [27] . Αντίστοιχα, εστιάσαμε σε αυτά τα μόρια κυτταρικής προσκόλλησης και τις ιντεγκρίνες. Για πρώτη φορά, η μελέτη μας αποκάλυψε μια σύνδεση μεταξύ της λειτουργίας των v-ATPases και των ιδιοτήτων προσκόλλησης και μετανάστευσης των ενδοθηλιακών κυττάρων. Η δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων CellTiter-Blue (Promega, Mannheim, Γερμανία) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή για τον προσδιορισμό της κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από θεραπεία με αρχαζολίδη. Αυτή η ανάλυση βασίζεται στην ικανότητα των μεταβολικά ενεργών κυττάρων να μειώνουν τη ρεσαζουρίνη, η οποία οδηγεί σε φθορίζουσα ρεσορουφίνη. Το αντιδραστήριο CellTiter-Blue προστέθηκε στα κύτταρα 4 ώρες πριν από το τελικό σημείο της θεραπείας. Ο φθορισμός μετρήθηκε με έναν αναγνώστη μικροπλακών Infinite F200 pro (Tecan, Männedorf, Ελβετία) στα 560 nm (διέγερση) και 590 nm (εκπομπή). Διεξήχθη η δοκιμασία απορράδισης μη ραδιενεργού κυτταροτοξικότητας CytoTox 96 (Promega για τις οδηγίες του κατασκευαστή) απελευθέρωση γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) μετά από θεραπεία με αρχαζολίδη. Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης προστέθηκε σε μη επεξεργασμένα κύτταρα 45 λεπτά πριν από το τέλος της θεραπείας για να προκληθεί η απελευθέρωση αυτού του ενζύμου. Η LDH είναι ένα κυτταροπλασματικό ένζυμο που απελευθερώνεται από διαρροή κύτταρα. Η απελευθερωμένη LDH καταλύει την ενζυματική μετατροπή του γαλακτικού σε πυροσταφυλικό που παρέχει NADH για τη μετατροπή του ιώδους ιωδονιτροτετραζολίου σε ένα ερυθρό προϊόν φορμαζάνης παρουσία διαφοράσης. Η απορρόφηση μετρήθηκε με συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific) στα 490 nm. Το LysoTracker Red DND-99 (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific) είναι μια χρωστική ουσία για τη μέτρηση τιμών pH σε βιώσιμα κύτταρα. Τα HUVEC καλλιεργήθηκαν για να συρρικνωθούν σε μ-πλάκες με επικάλυψη κολλαγόνου G (80826, ibidi, Martinsried, Γερμανία) προτού υποβληθούν σε επεξεργασία με αρχαζολίδη για 24 ώρες. 1 μg/ml Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, Μόναχο, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση των πυρήνων και 50 nM LysoTracker Red DND-99 χρησιμοποιήθηκε για την απεικόνιση των όξινων διαμερισμάτων που αντιστοιχούν στα λυσοσώματα. Και οι δύο βαφές επωάστηκαν για 10 λεπτά στους 37°C πριν από τη λήψη μεμονωμένων εικόνων με μικροσκόπιο φθορισμού Leica DMI6000 B (Leica Microsystems, Wetzlar, Γερμανία). ημέρες πριν από τη θεραπεία. Τα κύτταρα επωάστηκαν με ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις αρχαζολίδης για 24 ώρες. Μη επεξεργασμένα κύτταρα MDA-MB-231 ή PC-3 επισημάνθηκαν με CellTracker Green CMFDA Dye (5 μM σε DMEM χωρίς ορό, 37˚C) για 30 λεπτά προτού προστεθούν 100.000 κύτταρα ανά φρεάτιο στα HUVEC και αφέθηκαν να προσκολληθούν για διάφορα χρονικά σημεία στους 37˚C. Τα μη προσκολλημένα καρκινικά κύτταρα ξεπλύθηκαν τρεις φορές με PBS που περιείχε Ca2+ και Mg2+. Η προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων προσδιορίστηκε με μετρήσεις φθορισμού με συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών Infinite F200 pro (Tecan) στα 485 nm (διέγερση) και 535 nm (εκπομπή). Για τον αποκλεισμό της υπομονάδας β1 ιντεγκρίνης σε κύτταρα MDA-MB-231 ή PC-3, CellTracker Κύτταρα MDA-MB-231 ή PC-3 με σήμανση Green επωάστηκαν με αντίσωμα β1 κατά της ιντεγκρίνης (P5D2, ab24693, Abcam, Cambridge, Ηνωμένο Βασίλειο) σε συγκέντρωση 1 μg αντισώματος ανά εκατομμύριο κύτταρα σε 1 ml DMEM. Πριν από την προσθήκη σε HUVEC που έχουν υποστεί επεξεργασία με αρχαζολίδη, τα κύτταρα MDA-MB-231 ή PC-3 πλύθηκαν μία φορά με DMEM. Για τον αποκλεισμό της υπομονάδας ιντεγκρίνης β1 σε HUVECs, τα κύτταρα επωάστηκαν με το αντίσωμα κατά της ιντεγκρίνης β1 (0,1 μg/πηγάδι σε ECGM). Τα HUVECs πλύθηκαν μία φορά με ECGM πριν προστεθούν μη επεξεργασμένα κύτταρα MDA-MB-231 ή PC-3 στα HUVEC. Για την προσκόλληση κυττάρων MDA-MB-231 ή PC-3 σε συστατικά εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) επικαλύφθηκαν πλάκες 24 φρεατίων με κολλαγόνο G (10 μg/ml σε PBS), φιμπρονεκτίνη ανθρώπινου πλάσματος (10 μg/ml PBS) ή λαμινίνη-411 (10 μg/ml σε Dulbecco's PBS [DPBS] που περιέχει Ca 2+ και Mg 2+) στους 4˚C διανυκτέρευση. Η προσκόλληση των κυττάρων MDA-MB-231 και PC-3 σε αυτά τα τρία πιο σημαντικά συστατικά ECM πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω (προσκόλληση 10 λεπτών στους 37˚C). Τα HUVECs αναπτύχθηκαν σε μια πορώδη μεμβράνη φίλτρου (ένθετο Transwell, πολυανθρακική μεμβράνη , πόροι 8 μm. Corning, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) για 48 ώρες και αντιμετωπίστηκαν όπως υποδεικνύεται. Μη επεξεργασμένα κύτταρα MDA-MB-231 επισημάνθηκαν με CellTracker Green CMFDA Dye (όπως περιγράφεται στην ενότητα ανάλυση κυτταρικής προσκόλλησης) και επαναιωρήθηκαν σε μέσο 199 (PAN-Biotech) που περιέχει 0,1% BSA. Τα HUVEC πλύθηκαν δύο φορές με μέσο 199 που περιείχε 0,1% BSA προτού τα κύτταρα MDA-MB-231 αφεθούν να μεταναστεύσουν μέσω της ενδοθηλιακής μονοστιβάδας για 24 ώρες. Το μέσο 199 που περιείχε 0,1% BSA χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας και το μέσο 199 που περιείχε 20% FCS χρησιμοποιήθηκε ως χημειοελκτικό για μετεμψύχωση στο κάτω διαμέρισμα. Τα μη μεταναστευμένα κύτταρα που παρέμειναν στο άνω διαμέρισμα αφαιρέθηκαν προσεκτικά χρησιμοποιώντας μια μπατονέτα. Τα μεταναστευμένα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα ραδιοανοσοκαθίζησης (RIPA) και η μετεμψύχωση ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση του σήματος φθορισμού στα 485 nm (διέγερση) και 535 nm (εκπομπή). 12 h. Τα κύτταρα προκλήθηκαν να ρυθμίσουν προς τα πάνω τη γονιδιακή έκφραση των μορίων κυτταρικής προσκόλλησης από τον TNFa. Το RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το RNeasy Mini Kit από την Qiagen (Hilden, Γερμανία) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Πραγματοποιήθηκε πέψη DNase επί στήλης για την απομάκρυνση του γονιδιωματικού DNA. Το RNA μεταγράφηκε σε cDNA από το Superscript II (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific). Τα πειράματα qPCR πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα StepOnePlus (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) και τα δεδομένα αναλύθηκαν από το λογισμικό StepOne και Ste-pOnePlus v2.3. Χρησιμοποιήθηκαν Power SYBR Green PCR Master Mix (Life Technologies) και η συγκριτική μέθοδος ποσοτικοποίησης C T (2 -ΔΔCT ). Τα HUVEC αναπτύχθηκαν σε συρροή σε πλάκες 12 φρεατίων προτού υποβληθούν σε επεξεργασία με αρχαζολίδη για 24 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TNFa για 24 ώρες για να προκληθεί η έκφραση μορίων κυτταρικής προσκόλλησης. Στη συνέχεια, τα κύτταρα αποσπάστηκαν με HyClone HyQTase (GE Healthcare, Freiburg, Γερμανία). Στην περίπτωση του ICAM-1 τα αποκολλημένα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη (Polysciences, Hirschberg an der Bergstraße, Γερμανία) σε PBS για 10 λεπτά και πλύθηκαν μία φορά με PBS πριν από την επώαση με την ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC)-επισημασμένη κατά του ανθρώπου. CD54 (ποντικού, ICAM-1) αντίσωμα (MCA1615F, Biozol, Eching, Γερμανία) σε θερμοκρασία δωματίου για 45 λεπτά. Για όλες τις άλλες πρωτεΐνες, τα κύτταρα δεν σταθεροποιήθηκαν και δεν πλύθηκαν μία φορά με PBS πριν από την επώαση με τα αντισώματα επισημασμένα με φυκοερυθρίνη (PE) αντι-ανθρώπινο CD106 (ποντικός, VCAM-1), σημασμένο με PE αντι-ανθρώπινο CD62E (ποντικό, Ε- σελεκτίνη) και σημασμένο με ΡΕ αντι-ανθρώπινο CD325 (ποντίκι, Ν-καντερίνη) από Becton Dickinson σε πάγο για 45 λεπτά. Αυτά τα αντισώματα αραιώθηκαν σε PBS που περιείχε 0,2% BSA. Η επιφανειακή έκφραση των μορίων κυτταρικής προσκόλλησης μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής (FACSVerse, Becton Dickinson, Heidelberg, Γερμανία). Για να χρωματιστεί το επιφανειακό κολλαγόνο σε HUVECs, τα κύτταρα επωάστηκαν με ένα αντίσωμα κατά του ανθρώπινου κολλαγόνου (κουνέλι, 1:40, ab36064, Abcam) σε πάγο για 30 λεπτά. Η διαδικασία χρώσης πραγματοποιήθηκε σε πάγο για να διασφαλιστεί ότι οι επιφανειακές πρωτεΐνες ή τα αντισώματα δεν έχουν ενδοκυτταρωθεί. Τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS που περιέχει Ca 2+ και Mg 2+ πριν σταθεροποιηθούν με Roti-Histofix (Carl Roth). Ως δευτερεύον αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε συζευγμένο Alexa Fluor 488 αντίσωμα κατά κουνελιού (κατσίκας, 1:400, A11008, Life Technologies) και το Hoechst 33342 (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) για την οπτικοποίηση των πυρήνων. Confluent HUVECs σε Οι πλάκες φρεατίων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται. Τα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS και λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης (Complete Mini-free EDTA; Roche, Mannheim, Γερμανία), ορθοβαναδικό νάτριο, φθοριούχο νάτριο, φαινυλομεθυλσουλφονυλοφθορίδιο, β-γλυκεροφωσφορικό, πυροφωσφορικό νάτριο και Η2Ο2. Ο προσδιορισμός της πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific). Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών (10-20 μg) διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE; Bio-Rad Laboratories, Μόναχο, Γερμανία). Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου με στύπωμα δεξαμενής (Bio-Rad Laboratories) για ανοσοανίχνευση. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν με 5% σκόνη γάλακτος (Carl Roth) σε TBS που περιείχε 0,1% Tween 20 (Sigma-Aldrich). Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντισώματα: αντίσωμα κατά ποντικού κατά της ανθρώπινης καθεψίνης Β (IM27L, Merck) (1:500), αντίσωμα αντι-β-ακτίνης-υπεροξειδάσης ποντικού (A3854, Sigma-Aldrich) (1:100.000) και IgG ραπανάκι ποντικού αντίσωμα συνδεδεμένο με υπεροξειδάση (HRP) (7076, Cell Signaling, Φρανκφούρτη, Γερμανία) (1:5,000). Η έκδοση ImageJ 1,49m χρησιμοποιήθηκε για πυκνομετρική ανάλυση. Η δοκιμασία δραστικότητας της καθεψίνης Β πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στη δημοσίευση των Kubisch et al. [28] . Τα συρρέοντα HUVEC ή HMEC-1 σπαρμένα σε πλάκες 6 φρεατίων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και λύθηκαν με το μη μετουσιωτικό αντιδραστήριο εκχύλισης πρωτεϊνών θηλαστικών M-PER (78501, Thermo Fisher Scientific) συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης (Complete Mini EDTA-free, Roche), ορθοβαναδικό νάτριο, φθοριούχο νάτριο, φαινυλομεθυλοσουλιδουρίδιο. Το φθορογόνο υπόστρωμα καθεψίνης Β υδροχλωρική Z-Arg-Arg-7-αμιδο-4-μεθυλοκουμαρίνη (C5429, Sigma-Aldrich) προστέθηκε σε 30 μg του κυτταρολύματος αραιωμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα ανάλυσης συμπληρωμένο με 2 mM L-κυστεΐνη (C780 -Aldrich) και επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 40˚C. Ο φθορισμός μετρήθηκε στα 348 nm (διέγερση) και 440 nm (εκπομπή) με συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (Varioskan Flash, Thermo Fisher Scientific). Η ένταση του σήματος φθορισμού αντιστοιχούσε στη δραστηριότητα του ενζύμου καθεψίνης Β. Για την αφαίρεση υποβάθρου, ο αναστολέας της καθεψίνης Β CA-074Me (Enzo Life Sciences, Lörrach, Γερμανία) προστέθηκε σε μια πρόσθετη αντίδραση. Το κιτ HUVEC Nucleofector (Lonza, Κολωνία, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε για τη διαμόλυνση HUVECs. Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας 2,5 μg πλασμιδικού DNA για 500.000 κύτταρα (Nucleofector 2b Device, Lonza). 48 ώρες μετά τη διαμόλυνση τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για περαιτέρω πειράματα. Το πλασμίδιο προσθήκης γονιδίου #11249 hCathepsin B παρασχέθηκε ευγενικά από τον Hyeryun Choe [29] . Η ικαθεψίνη Β υποβλήθηκε σε πέψη με PmeI και XbaI και το γραμμικό θραύσμα DNA που δεν αντιστοιχεί στο ανθρώπινο γονίδιο CTSB επανασυνδέθηκε για να δημιουργήσει το κενό pcDNA3.1 (-) δέλτα πλασμίδιο MCS που χρησιμοποιήθηκε για επιμολύνσεις ελέγχου. Η αρχική ραχοκοκαλιά της hCathepsin B είναι το pcDNA3.1 (-) της Thermo Fisher Scientific. Ο φορέας ελέγχου pcDNA3.1 (-) δέλτα MCS που χρησιμοποιήθηκε για τις επιμολύνσεις μας κλωνοποιήθηκε με βάση την hCathepsin B και επομένως δεν έχει σχεδόν ολόκληρο το μέρος της θέσης πολλαπλής κλωνοποίησης του pcDNA3.1 (-). Στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 5.0 (Σαν Ντιέγκο, ΗΠΑ). Η μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενη από το post-hoc τεστ Tukey ή το μη ζευγαρωμένο t-test χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι αριθμοί των πειραμάτων που εκτελούνται ανεξάρτητα (n) δηλώνονται στις αντίστοιχες μαρτυρίες του σχήματος. Το p 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντικό. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM). Δεδομένου ότι ο αναστολέας v-ATPase archazolid δεν έχει χρησιμοποιηθεί ποτέ για μελέτες σε ενδοθηλιακά κύτταρα, πραγματοποιήσαμε πρώτα προσδιορισμούς κυτταροτοξικότητας. Αντιμετωπίσαμε συρρέοντα HUVEC με έως και 1 nM αρχαζολίδη για 24 και 48 ώρες και παρατηρήσαμε ότι αυτή η θεραπεία δεν έχει καμία επίδραση στη μεταβολική δραστηριότητα ούτε στην απελευθέρωση της LDH μετά από 24 ώρες (Εικ. 1Α και 1Β, αριστερά πλαίσια) . Η μεταβολική δραστηριότητα και η απελευθέρωση της LDH επηρεάστηκαν ελαφρά μόνο από την υψηλότερη συγκέντρωση αρχαζολίδης μετά από 48 ώρες (Εικ. 1Α και 1Β, δεξιά πλαίσια). Συνεπώς, τα ακόλουθα πειράματα διεξήχθησαν όλα μετά από 24 ώρες (ή λιγότερο) θεραπείας με αρχαζολίδη, προκειμένου να αποκλειστούν τυχόν κυτταροτοξικές επιδράσεις της αρχαζολίδης στις πειραματικές μας ρυθμίσεις. αλλά τα κύτταρα έδειξαν ελαφρώς διαφορετική μορφολογία (Εικ. 2Α): Τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με αρχαζολίδη ήταν διογκωμένα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, κάτι που δεν ήταν απροσδόκητο, καθώς η δημιουργία κενοτοπίων του ενδοπλασματικού δικτύου (ER) έχει περιγραφεί για άλλους τύπους κυττάρων και είναι τυπική για v -Αναστολείς της ΑΤΡάσης [11, 16, 24, 30]. Αυτό το αποτέλεσμα ήταν προφανές τόσο σε υποσυρρέοντα όσο και σε συρρέοντα κύτταρα (Σχήμα 2Α). Η αναστολή της v-ATPase αποτρέπει την οξίνιση των λυσοσωμάτων [1, 31]. Χρησιμοποιώντας τη διαπερατή από κύτταρα χρωστική LysoTracker Red DND-99, είναι δυνατή η επισήμανση των όξινων λυσοσωμάτων σε ζωντανά κύτταρα. Έτσι, αυτή η βαφή μπορεί να χρησιμεύσει ως δείκτης αναστολής της v-ATPase. Για να αποδειχθεί ότι η αρχαζολίδη είναι επίσης λειτουργικά ενεργή ως αναστολέας v-ATPase σε HUVECs, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 nM αρχαζολίδης προτού επωαστούν με LysoTracker Red DND-99 και Hoechst 33342. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, η κόκκινη φυσαλιδώδης χρώση που αντιστοιχεί σε οξινισμένα λυσοσώματα στα κύτταρα ελέγχου εξαφανίστηκε εντελώς μετά την επεξεργασία με archazolid. Συνοπτικά, η θεραπεία με αρχαζολίδη για 24 ώρες δεν ήταν κυτταροτοξική για τα HUVECs σε ηρεμία, αλλά ανέστειλε τη λειτουργικότητα της v-ATPase. Αναλύσαμε την προσκόλληση των MDA-MB-231 κυττάρων σε HUVECs. Τα συρρέοντα HUVEC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με έως και 1 ηΜ αρχαζολίδης για 24 ώρες. Μη επεξεργασμένα κύτταρα MDA-MB-231 επισημάνθηκαν με Cell-Tracker Green CMFDA Dye. Είναι ενδιαφέρον ότι η αναστολή της v-ATPase αύξησε έντονα την προσκόλληση της κυτταρικής σειράς μεταστατικού καρκινώματος μαστού MDA-MB-231 σε HUVECs μετά από 10 και 120 λεπτά προσκόλλησης (Εικ. 3Α και 3Β). Ερευνήσαμε επίσης την επίδραση της αρχαζολίδης στη διαενδοθηλιακή μετανάστευση των κυττάρων MDA-MB-231. Τα HUVEC που σπάρθηκαν σε θάλαμο Boyden υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 ηΜ αρχαζολίδης για 24 ώρες. CellTracker Green-επισημασμένα κύτταρα MDA-MB-231 (δεν υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αρχαζολίδη) αφέθηκαν να μεταναστεύσουν μέσω της ενδοθηλιακής μονοστιβάδας για 24 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, η αρχαζολίδη μείωσε σημαντικά τη διαενδοθηλιακή μετανάστευση των MDA-MB-231 κυττάρων. Η επίδραση της αρχαζολίδης στην προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων δεν μελετήθηκε μόνο σε HUVEC, τα οποία αντιπροσωπεύουν μακροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα, αλλά και σε μικροαγγειακά κύτταρα HMEC-1. Επιπλέον, εκτός από την κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού MDA-MB-231, χρησιμοποιήθηκαν επίσης καρκινικά κύτταρα προστάτη PC-3 ως δεύτερη μεταστατική κυτταρική σειρά καρκίνου. Η επεξεργασία των ενδοθηλιακών κυττάρων με Archazolid αύξησε την προσκόλληση των MDA-MB-231 κυττάρων στη μονοστοιβάδα HMEC-1 μετά από 120 λεπτά προσκόλλησης (Σχήμα 4Α) και αύξησε τη σύνδεση των κυττάρων PC-3 στη μονοστοιβάδα HUVEC μετά από 30 και 60 λεπτά προσκόλλησης (Εικ. 4Β) . Αξίζει να σημειωθεί ότι η προσκόλληση των μη μεταστατικών κυττάρων Jurkat, μιας οξείας κυτταρικής γραμμής λευχαιμίας Τ-λεμφοκυττάρων, παρέμεινε ανεπηρέαστη μετά την επεξεργασία των HUVECs με αρχαζολίδη (Σχήμα S1A). Συνολικά, η θεραπεία με archazolid αύξησε τις συγκολλητικές ιδιότητες τόσο των μικρο- και των μακροαγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων για μεταστατικά καρκινικά κύτταρα, αλλά όχι για μη μεταστατικά. Αξίζει να σημειωθεί ότι η προσκόλληση καρκινικών κυττάρων σε ενεργοποιημένα από αρχαζολίδη ενδοθηλιακά κύτταρα αυξήθηκε με το χρόνο της προσκόλλησης. Η προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων στο ενδοθήλιο είναι κατ' αρχήν παρόμοια με εκείνη των λευκοκυττάρων, αλλά διαφέρει ελαφρώς στα μόρια που μεσολαβούν στη διαδικασία προσκόλλησης. Προσδέματα για τα μόρια προσκόλλησης ενδοθηλιακών κυττάρων ICAM-1, VCAM-1, Ε-σελεκτίνη και Ν-καντερίνη βρέθηκαν να εκφράζονται σε κύτταρα όγκου και να μεσολαβούν στην αλληλεπίδραση όγκου-ενδοθηλιακού κυττάρου [21] . Η αναστολή της v-ATPase μπορεί να επηρεάσει την έκφραση των μορίων προσκόλλησης ενδοθηλιακών κυττάρων σε επίπεδα mRNA ή πρωτεΐνης. Για να προσδιοριστεί η έκφραση mRNA των ICAM-1, VCAM-1, Ε-σελεκτίνης και Ncadherin, τα HUVEC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αρχαζολίδη για 12 ώρες. Ο TNFa είναι γνωστό ότι ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση των ICAM-1, VCAM-1 και E-selectin [32] και, επομένως, χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος. Η ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου έδειξε ότι η αναστολή της v-ATPase στα HUVECs δεν άλλαξε τα επίπεδα mRNA των ICAM-1, VCAM-1, Ε-σελεκτίνης και Ν-καντερίνης (Σχήμα 5Α). Η έκφραση πρωτεΐνης αυτών των μορίων προσκόλλησης στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Το Archazolid (1 nM, 24 h) δεν επηρέασε την έκφραση της κυτταρικής επιφάνειας των ICAM-1, VCAM-1, E-selectin και N-cadherin (Εικόνα 5B). Εκτός από το ICAM-1, VCAM-1, E-selectin και N -καντερίνη, επίσης οι ιντεγκρίνες είναι σε θέση να μεσολαβούν στη διαδικασία της κυτταρικής προσκόλλησης [33] [34] [35] . Δεδομένου ότι κανένα από τα μόρια κυτταρικής προσκόλλησης που εκφράζονται στα HUVECs δεν ρυθμίστηκε κατά την επεξεργασία με αρχαζολίδη, θεωρήσαμε τις ιντεγκρίνες ως πιθανούς συνεργάτες αλληλεπίδρασης. Εντός αυτής της οικογένειας πρωτεϊνών, οι β1-ιντεγκρίνες έχουν αναφερθεί ότι μεσολαβούν στην προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων σε ήρεμα ενδοθηλιακά κύτταρα [25]. Προκειμένου να αποσαφηνιστεί ο ρόλος των β1-ιντεγκρινών για την επαγόμενη από αρχαζολίδη προσκόλληση κυττάρων όγκου, η β1-υπομονάδα ιντεγκρίνης αποκλείστηκε είτε σε κύτταρα MDA-MB-231, κύτταρα PC-3 ή σε κύτταρα HUVEC. (Αξίζει να σημειωθεί, όπως σε όλα τα πειράματα σε όλη αυτή τη μελέτη, μόνο τα ενδοθηλιακά κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με archazolid.) Μετά τον αποκλεισμό των β1-ιντεγκρινών σε κύτταρα MDA-MB-231 ή PC-3, η επαγόμενη από αρχαζολίδη προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων μειώθηκε σχεδόν στο επίπεδο ελέγχου (Εικ. 6Α και 6Β, αριστερά πλαίσια), ενώ ο αποκλεισμός των β1-ιντεγκρινών στα HUVECs δεν είχε σημαντική επίδραση στην αύξηση της προσκόλλησης των καρκινικών κυττάρων μέσω της αναστολής της v-ATPase (Εικ. 6Α και 6Β, δεξιά πλαίσια). Ανάλογα με την α υπομονάδα τους, οι β1-ιντεγκρίνες έχουν μια ποικιλία συνδετών συμπεριλαμβανομένων των συστατικών εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) όπως κολλαγόνο, ινονεκτίνη και λαμινίνη [35] . Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η θεραπεία με αρχαζολίδια των ενδοθηλιακών κυττάρων μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη ρύθμιση αυτών των συστατικών. Τα κύτταρα MDA-MB-231 και PC-3 αφέθηκαν να προσκολληθούν σε πλαστικό που ήταν επικαλυμμένο με αυτά τα εξαρτήματα ECM. Αυτή η δοκιμασία προσκόλλησης κυττάρων αποκάλυψε ότι τα κύτταρα MDA-MB-231 καθώς και τα κύτταρα PC-3 ευνοούν την αλληλεπίδραση με το κολλαγόνο του συστατικού ECM, καθώς η πρόσφυση στο κολλαγόνο είναι πολύ υψηλότερη από ό,τι στον μη επικαλυμμένο πλαστικό μάρτυρα (Εικ. 7Α). Τα κύτταρα MDA-MB-231 και PC-3 προσκολλήθηκαν επίσης σε πλαστικό επικαλυμμένο με φιμπρονεκτίνη, αλλά σε πολύ μικρότερο βαθμό σε σύγκριση με την επικάλυψη κολλαγόνου. Ως εκ τούτου, εστιάσαμε στην αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των δύο κυτταρικών γραμμών όγκου και του κολλαγόνου. Ο αποκλεισμός της υπομονάδας ιντεγκρίνης β1 σε κύτταρα MDA-MB-231 και PC-3 κατήργησε σαφώς την αλληλεπίδραση με το κολλαγόνο (Σχήμα 7Β), υποδεικνύοντας ότι η προσκόλληση αυτών των καρκινικών κυττάρων στο κολλαγόνο προκαλείται από τις β1-ιντεγκρίνες. Δεδομένου ότι το κολλαγόνο είναι η κύρια Το συστατικό ECM MDA-MB-231 και τα κύτταρα PC-3 αλληλεπιδρούν με, το επόμενο βήμα ήταν να αποδειχθεί εάν η αναστολή της v-ATPase επηρεάζει την ποσότητα κολλαγόνου που εκφράζεται από τα HUVECs ως εξωκυτταρική μήτρα. Για την ανίχνευση του κολλαγόνου στην ενδοθηλιακή επιφάνεια, τα HUVEC που υποβλήθηκαν σε αγωγή με αρχαζολίδη επισημάνθηκαν με ένα αντίσωμα κατά του κολλαγόνου τύπου I-IV στον πάγο για να αποφευχθεί η ενδοκυττάρωση και να διασφαλιστεί ότι το αντίσωμα δεν δεσμεύεται στο ενδοκυτταρικό κολλαγόνο. Είναι ενδιαφέρον ότι το archazolid αύξησε την ποσότητα του επιφανειακού κολλαγόνου στα HUVECs κατά περίπου 50% (Εικ. 7C). Οι χρώσεις ελέγχου πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα έναντι της υπομονάδας του κυτοσολικού ρ65 του μεταγραφικού παράγοντα πυρηνικού παράγοντα κΒ (NFκB) για να δείξουν ότι οι ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες δεν ανιχνεύθηκαν με αυτή τη μέθοδο χρώσης (S2 Σχήμα). Αναφέρθηκε ότι η αναστολή της v-ATPase από την αρχαζολίδη βλάπτει τη δραστηριότητα της καθεψίνης Β [28, 36], ενός λυσοσωμικού ενζύμου που αποικοδομεί τα συστατικά της εξωκυτταρικής μήτρας συμπεριλαμβανομένου του κολλαγόνου [37] [38] [39] [40] [41] . Καθώς το κολλαγόνο αποικοδομείται από την καθεψίνη Β και η ενεργοποίηση της καθεψίνης Β εξαρτάται από τη δραστηριότητα της v-ATPase [28, [36] [37] [38] 42], προτείναμε ότι μια συσσώρευση κολλαγόνου στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων μπορεί να είναι συνέπεια της μειωμένης λειτουργικότητας της καθεψίνης Β. Ως εκ τούτου, πραγματοποιήθηκε ένας προσδιορισμός ενζυμικής δραστικότητας βασισμένος στην πρωτεόλυση ενός υποστρώματος φθορογόνου καθεψίνης Β. Σε HUVEC και HMEC-1 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με αρχαζολίδη, η δράση της καθεψίνης Β επάγει τόσο το mRNA (1 ng/ml TNF) όσο και την έκφραση της κυτταρικής επιφάνειας (10 ng/ml TNF) των ICAM-1, VCAM-1, E-selectin και Ncadherin.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0203053.g005 Η αναστολή της ενδοθηλιακής vATPase αυξάνει την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα μειώνεται σημαντικά κατά περίπου 50% σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου σε συγκέντρωση αρχαζολιδίου 1 nM (Εικ. 8Α). Σύμφωνα με αυτό το αποτέλεσμα, η ανάλυση western blot έδειξε ότι το archazolid (1 nM) μειώνει την έκφραση πρωτεΐνης της ώριμης, δραστικής μορφής της καθεψίνης Β σε λιγότερο από 40% του ελέγχου στα HUVECs (Εικ. 8B). Για να αποδειχθεί εάν η επαγόμενη από αρχαζολίδη προσκόλληση καρκινικών κυττάρων είναι συνέπεια της μειωμένης ποσότητας καθεψίνης Β, τα HUVECs επιμολύνθηκαν με ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί την ανθρώπινη καθεψίνη Β ή με τον κενό φορέα ως έλεγχο. Μετά από 48 ώρες, τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 ηΜ αρχαζολίδη. Το επίπεδο της καθεψίνης Β μετά τη διαμόλυνση και τη θεραπεία αξιολογήθηκε με ανάλυση στυπώματος western (Εικόνα 9Α). Η υπερέκφραση της καθεψίνης Β μείωσε έντονα τόσο τη βασική όσο και την επαγόμενη από αρχαζολίδη προσκόλληση των κυττάρων MDA-MB-231 (Εικ. 9Β). Η στόχευση της αντλίας πρωτονίων v-ATPase για θεραπεία καρκίνου έχει κερδίσει μεγάλο ενδιαφέρον αφού η αναστολή της αναφέρθηκε ότι μειώνει την επεμβατικότητα των καρκινικών κυττάρων και, το πιο σημαντικό, επίσης της μετάστασης [8, 9] . Έτσι, εντατική έρευνα σχετικά με τις v-ATPases έγινε σε καρκινικά κύτταρα, ενώ υπάρχουν μόνο λίγες μελέτες που διερευνούν τις v-ATPase σε ενδοθηλιακά κύτταρα που υποδεικνύουν ρόλο στη μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό και πιθανώς την αγγειογένεση [22] [23] [24] . Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήσαμε το μυξοβακτηριακό φυσικό προϊόν archazolid για να διερευνήσουμε τις συνέπειες της αναστολής της v-ATPase στο ενδοθήλιο στις αλληλεπιδράσεις όγκου-ενδοθηλιακών κυττάρων. Για πρώτη φορά, μπορέσαμε να δείξουμε μια σύνδεση μεταξύ της v-ATPase και της προσκόλλησης και μεταναστευτικές ιδιότητες του ενδοθηλίου. Η αναστολή της v-ATPase στα ενδοθηλιακά κύτταρα από την αρχαζολίδη αύξησε σημαντικά την προσκόλληση των μεταστατικών καρκινικών κυττάρων και μείωσε τη διαενδοθηλιακή μετανάστευση καρκινικών κυττάρων που αποδόθηκε σε αυξημένα επίπεδα κολλαγόνου στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με αρχαζολίδη. Αξίζει να σημειωθεί ότι η προσκόλληση της μη μεταστατικής κυτταρικής σειράς Jurkat σε ενδοθηλιακά κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με αρχαζολίδη παρέμεινε ανεπηρέαστη. Η επαγόμενη από αρχαζολιδίνη προσκόλληση κυττάρων όγκου ήταν ανεξάρτητη από τα μόρια προσκόλλησης ενδοθηλιακών κυττάρων ICAM-1, VCAM-1, Ε-σελεκτίνη και Ν-καντερίνη, καθώς η έκφρασή τους δεν ρυθμιζόταν από την ένωση. Ωστόσο, διαπιστώσαμε ότι η επαγόμενη από αρχαζολίδη προσκόλληση καρκινικών κυττάρων προκλήθηκε από β1-ιντεγκρίνες που εκφράζονται σε MDA-MB-231 καρκίνο του μαστού και καρκινικά κύτταρα PC-3 του προστάτη καθώς ο αποκλεισμός της β1 υπομονάδας ιντεγκρίνης σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα ανέστρεψε την προ-συγκολλητική επίδραση της αρχαζολίδης. Σε πειράματα προσκόλλησης σε πλαστικό επικαλυμμένο με συστατικά εξωκυτταρικής μήτρας, θα μπορούσαμε να δείξουμε ότι τα κύτταρα MDA-MB-231 και PC-3 ευνοούσαν σαφώς την αλληλεπίδραση με το κολλαγόνο, ενώ η προσκόλληση των μη μεταστατικών κυττάρων Jurkat ήταν σε μεγάλο βαθμό ανεξάρτητη από τις πρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας (S1B Σύκο). Οι διαφορετικές ιδιότητες προσκόλλησης των μεταστατικών καρκινικών κυττάρων και των κυττάρων Jurkat μπορεί να είναι αποτέλεσμα του ξεχωριστού σχεδίου έκφρασης ιντεγκρίνης κάθε κυτταρικής σειράς. Τα κύτταρα MDA-MB-231 και PC-3 εκφράζουν α2β1-και α3β1-ιντεγκρίνες, οι οποίες αντιπροσωπεύουν υποδοχείς κολλαγόνου [43, 44], ενώ τα κύτταρα Jurkat εκφράζουν α4β1-ιντεγκρίνες αλλά στερούνται α2β1-, α3β1-ιντεγκρίνες [44]. Οι α4β1 ιντεγκρίνες είναι υποδοχείς για το VCAM-1 και τη φιμπρονεκτίνη [35] και έχει αποδειχθεί ότι τα κύτταρα Jurkat αλληλεπιδρούν με ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα που εκφράζουν το VCAM-1 μετά από θεραπεία με κυτοκίνη ή κύτταρα που έχουν διαμολυνθεί με VCAM-1 [45]. Τα αποτελέσματά μας συμβαδίζουν με προηγούμενες μελέτες που έδειξαν ότι τα κύτταρα MDA-MB-231 και PC-3 που εκφράζουν α2β1 και α3β1-ιντεγκρίνη ήταν σε θέση να προσκολληθούν γρήγορα στο κολλαγόνο στη μήτρα του φλοιού των οστών. Αντίθετα, τα κύτταρα Jurkat δεν ήταν σε θέση να προσκολληθούν [44] και ενδέχεται να αλληλεπιδράσουν κατά προτίμηση με μόρια κυτταρικής προσκόλλησης παρά με πρωτεΐνες ECM. Οι α2β1-και α3β1-ιντεγκρίνες μπορούν επιπλέον να δράσουν ως υποδοχείς λαμινίνης [46] και τουλάχιστον οι α3β1 ιντεγκρίνες αναγνωρίζουν τη φιμπρονεκτίνη [46, 47]. Αν και εκφράζουν υποδοχείς για φιμπρονεκτίνη και λαμινίνη, τα κύτταρα MDA-MB-231 και PC-3 προσκολλήθηκαν στη φιμπρονεκτίνη σε πολύ μικρότερο βαθμό και δεν προσκολλήθηκαν στη λαμινίνη, πιθανώς λόγω χαμηλότερων συγγενειών με αυτά τα συστατικά της εξωκυτταρικής μήτρας. Σημαντικό, η αναστολή της v-ATPase από το archazolid αύξησε τα επιφανειακά επίπεδα του κολλαγόνου του συστατικού εξωκυτταρικής μήτρας, γεγονός που μπορεί να εξηγήσει ότι η αύξηση των κυττάρων MDA-MB-231 και PC-3 σε HUVECs που έχουν υποστεί αγωγή με αρχαζολίδη είναι ανεξάρτητη από τα μόρια προσκόλλησης ενδοθηλιακών κυττάρων. Με την εκτέλεση μιας δοκιμασίας πρωτεόλυσης ζωντανών κυττάρων, οι Cavallo-Medved et al. έδειξε αποικοδόμηση της ECM, ιδιαίτερα της ζελατίνης και του κολλαγόνου IV, σε συνδυασμό με τη δραστική καθεψίνη Β σε κοιλότητες των ενδοθηλιακών κυττάρων κατά τον σχηματισμό σωλήνων [40] . Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες ανέφεραν ότι η αναστολή της v-ATPase μειώνει τη δραστηριότητα της καθεψίνης Β στα καρκινικά κύτταρα [28, 36]. Επομένως, προτείναμε ότι η συσσώρευση κολλαγόνου στην ενδοθηλιακή επιφάνεια μπορεί να είναι συνέπεια της μειωμένης δραστηριότητας ή έκφρασης της καθεψίνης Β στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Στην πραγματικότητα, επιβεβαιώσαμε την εξασθένηση της δραστικότητας της καθεψίνης Β από την αρχαζολίδη καθώς τα επίπεδα έκφρασης της ώριμης δραστικής μορφής αυτού του ενζύμου μειώθηκαν σημαντικά. Η καθεψίνη Β συντίθεται ως προπροκαθεψίνη Β σε δεσμευμένα στη μεμβράνη ριβοσώματα. Μετά τη μεταφορά στη συσκευή Golgi, η προπροκαθεψίνη Β γλυκοζυλιώνεται με ολιγοσακχαρίτες που περιέχουν μαννόζη. Η στόχευση της προκαθεψίνης Β στα λυσοσώματα εξαρτάται από τον υποδοχέα της μαννόζης-6-φωσφορικής και η διάσπασή της από τον υποδοχέα καθώς και η πρωτεολυτική της επεξεργασία σε ώριμη καθεψίνη Β απαιτεί οξίνιση του διαμερίσματος [48] . Στα καρκινικά κύτταρα, η αναστολή της v-ATPase από την αρχαζολίδη μείωσε τη διακίνηση που προκαλείται από τον υποδοχέα της μαννόζης-6-φωσφορικής από το δίκτυο trans-Golgi προς τα προλυσοσωμικά διαμερίσματα με αποτέλεσμα τη μείωση των ενεργών λυσοσωμικών πρωτεασών όπως η καθεψίνη Β [28]. Υποθέσαμε ότι η προκαλούμενη από την αρχαζολίδη μείωση στη δραστηριότητα και την έκφραση της καθεψίνης Β βασίστηκε στον ίδιο μηχανισμό. Είναι ενδιαφέρον ότι η υπερέκφραση της καθεψίνης Β εξασθένησε την επαγόμενη από το αρχαζολίδιο προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων του μαστού σε ενδοθηλιακά κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι η προσκόλληση συσχετίζεται αρνητικά με την έκφραση της καθεψίνης Β. Καθώς η καθεψίνη Β μπορεί επίσης να αποικοδομήσει άλλα συστατικά εξωκυτταρικής μήτρας όπως η φιμπρονεκτίνη [38 και , 49], η αναστολή της v-ATPase θα μπορούσε να οδηγήσει σε συσσώρευση αυτών των πρωτεϊνών και αυξημένη προσκόλληση κυττάρων που εκφράζουν υποδοχείς φιμπρονεκτίνης ή λαμινίνης. Ωστόσο, δεν επικεντρωθήκαμε σε αυτά τα συστατικά ECM, καθώς δεν ήταν σχετικά με την προσκόλληση των κυττάρων MDA-MB-231 και PC-3. Αυτά τα κύτταρα προσκολλήθηκαν κυρίως στο κολλαγόνο, ενώ η προσκόλληση των κυττάρων Jurkat είναι ως επί το πλείστον ανεξάρτητη από τις πρωτεΐνες ECM κολλαγόνο, φιμπρονεκτίνη ή λαμινίνη (Σχήμα S1B). Είναι ενδιαφέρον [50] . Στα ηπατικά καρκινικά κύτταρα, η αρχαζολίδη μειώνει τη σηματοδότηση Ras/Raf/MEK/ERK αλλάζοντας τη σύνθεση και τη ρευστότητα της μεμβράνης [51] . Υποθέτουμε ότι η αρχαζολίδη επηρεάζει τα ενδοθηλιακά κύτταρα με παρόμοιο τρόπο οδηγώντας σε αναστολή της σηματοδότησης Ras και, επομένως, σε μειωμένη διαενδοθηλιακή μετανάστευση των κυττάρων MDA-MB-231. Συνολικά, η μελέτη μας δείχνει ότι η αρχαζολίδη μειώνει τη δραστηριότητα και την έκφραση της καθεψίνης Β στο ενδοθηλιακό κύτταρα. Ως αποτέλεσμα, η ποσότητα κολλαγόνου στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω, γεγονός που τελικά οδήγησε σε αυξημένη προσκόλληση των μεταστατικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών MDA-MB-231 και PC-3 που εκφράζουν β1-ιντεγκρίνη σε ενδοθηλιακά κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με αρχαζολίδια. ενώ η προσκόλληση των μη μεταστατικών κυττάρων Jurkat δεν επηρεάστηκε. Αυτή η μελέτη δείχνει ότι η v-ATPase παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της προσκόλλησης των κυττάρων που εκφράζουν υποδοχείς για συστατικά εξωκυτταρικής μήτρας. Το Archazolid αντιπροσωπεύει ένα πολλά υποσχόμενο εργαλείο για την αποσαφήνιση του ρόλου της v-ATPase στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Επιπλέον, συνδέσαμε για πρώτη φορά τη λειτουργία της v-ATPase με την προσκόλληση και τη μετανάστευση καρκινικών κυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα καθώς και με την αναδιαμόρφωση της εξωκυτταρικής μήτρας στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων. Το γεγονός ότι η προσκόλληση μεταστατικών κυττάρων όγκου σε ενδοθηλιακά κύτταρα αυξάνεται ενώ η διαενδοθηλιακή τους μετανάστευση μειώνεται κατά την αναστολή της ενδοθηλιακής ν-ΑΤΡάσης από την αρχαζολίδη υποστηρίζει περαιτέρω την άποψη της αρχαζολίδης ως πιθανής αντι-μεταστατικής ένωσης.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 18985, "text": "αναστολέας v-ATPase" } ], "id": 5302, "question": "Τι είναι το archazolid;" }, { "answers": [ { "answer_start": 9278, "text": "δύο" } ], "id": 5303, "question": "Πόσα σύμπλοκα υπάρχουν εντός της v-ATPase;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5626, "text": "τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και τη διαφοροποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων" } ], "id": 5305, "question": "Από τι εξαρτάται η αγγειογένεση;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Επιδημίες γαστρεντερίτιδας και αναπνευστικών λοιμώξεων σε γαλλικά γηροκομεία από το 2007 έως το 2018: Νοσηρότητα και θνησιμότητα από κάθε αιτία σύμφωνα με τα μεμονωμένα χαρακτηριστικά των κατοίκων Gaspard, Philippe; Mosnier, Anne; Simon, Loic; Ali-Brandmeyer, Olivia; Rabaud, Christian; Larocca, Sabrina; Heck, Béatrice; Aho-Glélé, Serge; Pothier, Pierre; Ambert-Balay, KatiaΗμερομηνία: 2019-09-24DOI: 10.1371/journal.pone.0222321Άδεια: cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Οι εστίες γαστρεντερίτιδας (GE) και λοιμώξεων του αναπνευστικού συστήματος (RTI) είναι ένα σημαντικό πρόβλημα στο σπίτι. Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να περιγράψει εστίες GE και RTI με λοιμώξεις και ποσοστά θνησιμότητας από όλες τις αιτίες σύμφωνα με τα μεμονωμένα χαρακτηριστικά των κατοίκων του γηροκομείου. ΜΕΘΟΔΟΙ: Πραγματοποιήθηκε κλινική και ιολογική επιτήρηση (2007 έως 2018). Οι διαστρωμάτωση ιών για την ανάλυση ήταν: κρούσματα με θετικές ταυτοποιήσεις νοροϊού ή γρίπης (αντίστοιχα NoV+ ή Flu+), επεισόδια χωρίς ταυτοποίηση ή δοκιμή NoV ή γρίπης (αντίστοιχα NoV- ή Flu-). Οι συσχετίσεις μεταξύ μεμονωμένων μεταβλητών (φύλο, ηλικία, διάρκεια παραμονής (LOS), κατάσταση αυτονομίας) και ποσοστά μόλυνσης και θνησιμότητας δοκιμάστηκαν με μονομεταβλητές μεθόδους και μεθόδους Mantel-Haenszel (MH). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Καταγράφηκαν 61 κρούσματα GE και 76 εστίες RTI (συνολικά 137 κρούσματα) με 4309 και 5862 κατοίκους αντίστοιχα. Στη μονομεταβλητή ανάλυση, τα υψηλότερα ποσοστά μόλυνσης και η ηλικία συσχετίστηκαν σε περιβάλλοντα NoV+, NoV- και Flu+ και τα χαμηλότερα ποσοστά μόλυνσης συσχετίστηκαν με μεγαλύτερη παραμονή (NoV+ και NoV-). Στη στρωματοποιημένη ανάλυση MH (ιός, φύλο (γυναίκα/άρρεν)) προσαρμοσμένη για LOS (<4 ή ≥4 έτη), οι πιθανότητες μόλυνσης παρέμειναν σημαντικές μεταξύ των ηλικιωμένων κατοίκων (≥86 ετών): NoV+/άνδρες (Αναλογία πιθανοτήτων (OR (MH)): 1,64, 95% διάστημα εμπιστοσύνης (CI): 1,16–2,30) και Flu+/θηλυκό και αρσενικό (αντίστοιχα OR(MH): 1,50, CI: 1,27–1,79 και 1,73, CI: 1,28–2,33). Στη μονομεταβλητή ανάλυση, η χαμηλότερη κατάσταση αυτονομίας (NoV+, Flu+ και Flu-) και η αυξημένη ηλικία (Flu+) συσχετίστηκαν με υψηλότερη θνησιμότητα. Στην προσαρμοσμένη ανάλυση MH, η σημαντική OR(ηλικία) προσαρμοσμένη για αυτονομία ήταν: Γρίπη+/ ≥86 ετών σε σύγκριση με <86 ετών, 1,97 (1,19–3,25) και OR(αυτονομία) προσαρμοσμένη για την ηλικία για την πιο αυτόνομη ομάδα (σε σύγκριση με την λιγότερο αυτόνομη ομάδα) ήταν: Flu+, 0,41 (0,24–0,69); Γρίπη-, 0,42 (0,20, 0,90). ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Οι κάτοικοι των γηροκομείων είναι όλο και πιο ηλικιωμένοι και εξαρτημένοι. Οι συγκεκριμένοι κίνδυνοι μόλυνσης και θνησιμότητας σύμφωνα με αυτούς τους δύο παράγοντες υποδεικνύουν ότι τα μέτρα επιτήρησης και ελέγχου των λοιμώξεων είναι απαραίτητα και υψηλής προτεραιότητας. Κείμενο: Εισαγωγή Τα κρούσματα γαστρεντερίτιδας (GE) και λοίμωξης της αναπνευστικής οδού (RTI) αντιπροσωπεύουν σημαντικό βάρος ασθενειών στα γηροκομεία. Οι ιοί προκαλούν την πλειονότητα αυτών των εστιών και οι νοροϊοί και οι ιοί της γρίπης είναι τα πιο κοινά παθογόνα [1, 2] .Προηγούμενες μελέτες έχουν προτείνει ότι οι ιογενείς λοιμώξεις του αναπνευστικού και οι εστίες νοροϊών είναι μια κοινή αιτία νοσηλείας ή θανάτου, ιδιαίτερα μεταξύ των ηλικιωμένων [3 ] [4] [5] .Ο αντίκτυπος των εστιών έχει περιγραφεί τόσο ως προς τη συχνότητα όσο και ως προς την επιδημιολογία, αλλά λίγα είναι γνωστά για τα ποσοστά μόλυνσης και τη θνησιμότητα από όλες τις αιτίες στα κρούσματα γηροκομείων GE και RTI σε σχέση με τα μεμονωμένα χαρακτηριστικά του κάτοικοι [6] . Οι κάτοικοι αυτών των ιδρυμάτων είναι ολοένα και πιο ηλικιωμένοι και εξαρτημένοι, και ο αντίκτυπος αυτής της τάσης στην επιβάρυνση της εποχικής επιδημίας απαιτεί εις βάθος έρευνα. Τα αποτελέσματα των μελετών που επικεντρώθηκαν σε αυτό το θέμα θα μπορούσαν να δώσουν πολύτιμες πληροφορίες για τους οίκους ευγηρίας, επιτρέποντάς τους να προσαρμόσουν τις στρατηγικές ελέγχου των λοιμώξεων, ιδίως για τη βελτίωση της αξιολόγησης του κινδύνου μόλυνσης. Στόχος μας ήταν να περιγράψουμε τα ποσοστά θνησιμότητας από GE και RTI στα μεμονωμένα χαρακτηριστικά των κατοίκων γηροκομείου (φύλο, ηλικία, διάρκεια παραμονής, κατάσταση αυτονομίας) και στον εντοπισμό συγκεκριμένων προτύπων ευαισθησίας που σχετίζονται με αυτούς τους τύπους ιικών εστιών σε αυτές τις εγκαταστάσεις. Η παρούσα μελέτη διερεύνησε κρούσματα σε 14 τοποθεσίες (28 μονάδες με δραστηριότητες γηροκομείου για συνολικά 1121 κλίνες) που φροντίζουν εξαρτημένα άτομα στη νότια Αλσατία (περιοχή στη βορειοανατολική Γαλλία). Τα δεδομένα συλλέχθηκαν μεταξύ Σεπτεμβρίου 2007 και Αυγούστου 2018 [7, 8] . Κάθε τοποθεσία ήταν γεωγραφικά ανεξάρτητη και αυτόνομη για κοινωνική διαχείριση και διαχείριση φροντίδας. Οι μονάδες βρίσκονταν εντός των μεγαλύτερων τοποθεσιών και ορίστηκαν ως ένας χώρος με ειδική ομάδα σε μία τοποθεσία. Κατά τη διάρκεια των εστιών σε μία τοποθεσία, συμπεριλήφθηκαν μόνο οι κάτοικοι στις μονάδες με επιβεβαιωμένα κρούσματα. Η συμπερίληψη της επιδημίας εξαρτιόταν από την επαγρύπνηση του ιδρύματος στην ομάδα υγιεινής. Η επιτήρηση γινόταν σε κάθε μονάδα ανεξάρτητα και τα μέλη του προσωπικού έπρεπε να ενημερώσουν έναν γιατρό ή μια νοσοκόμα επιβάρυνσης όταν παρατηρήθηκαν δύο ή περισσότερες σχετικές περιπτώσεις πνευμονίας ή ΓΟ εντός τεσσάρων ημερών και όταν τρεις ή περισσότερες περιπτώσεις για άλλες RTI. Οι μονάδες έπρεπε επίσης να ενημερώσουν την ομάδα υγιεινής σε περίπτωση υπέρβασης αυτών των οριακών τιμών. Για τη γρίπη, το πρώτο ύποπτο κρούσμα οδήγησε σε τοπικό συναγερμό και επικοινωνήθηκε με την ομάδα υγιεινής. Ένας επαγγελματίας από την ομάδα υγιεινής συνέλεξε τις πληροφορίες και αξιολόγησε τα κλινικά σημεία, τις ιολογικές πληροφορίες και το επιδημιολογικό πλαίσιο με τον γιατρό στην πληγείσα μονάδα. Το σύμπλεγμα που ανιχνεύτηκε τέθηκε υπό επιτήρηση μόνο εάν η ομάδα υγιεινής έκρινε ότι υπήρχε πιθανό φαινόμενο εστίας. Η διάρκεια των 4 ημερών ήταν σε σχέση με το εθνικό πρωτόκολλο με προειδοποίηση προς τις αρχές όταν σημειώθηκαν 5 περιπτώσεις εντός 4 ημερών [9, 10] . Σε τοπικό επίπεδο και εκτός από τις συστάδες που αναφέρθηκαν στις αρχές, θα μπορούσαν να καταγραφούν συστάδες με τουλάχιστον 3 κρούσματα εντός περιόδου επτά ημερών σε μία μονάδα, εάν αναφέρονταν στην ομάδα υγιεινής. Επειδή ενδέχεται να εμφανιστούν πολλά κρούσματα στην ίδια μονάδα κατά τη διάρκεια της περιόδου επιτήρησης, ένας κάτοικος θα μπορούσε να συμπεριληφθεί επανειλημμένα σε διαφορετικές ομάδες. Ως αποτέλεσμα, τα παρατηρούμενα πρότυπα αντανακλούσαν τα χαρακτηριστικά ενός θεσμικού πληθυσμού με διαχρονικές και πολυετής εκθέσεις. Οι προσωπικές πληροφορίες και οι κλινικές πληροφορίες συλλέχθηκαν από έναν επαγγελματία από την ομάδα υγιεινής απευθείας από τα αρχεία υγειονομικής περίθαλψης των κατοίκων. Συγκεντρώθηκαν προσωπικές πληροφορίες για όλους όσοι ήταν παρόντες την πρώτη ημέρα της επιδημίας. Οι πληροφορίες που συλλέχθηκαν περιελάμβαναν: μήνα και έτος γέννησης, φύλο, ημερομηνία άφιξης στο γηροκομείο και καθεστώς αυτονομίας. Το καθεστώς αυτονομίας των κατοίκων στα γαλλικά γηροκομεία αξιολογείται χρησιμοποιώντας την κλίμακα AGGIR (Autonomy Gerontology Groups Iso-Resources), η οποία είναι το νομικό εργαλείο για την αξιολόγηση της εξάρτησης στους ηλικιωμένους και της οποίας πρωταρχικός σκοπός είναι η κατανομή μέσων και πόρων [11] . Με την κλίμακα AGGIR, η αυτονομία ταξινομείται σε 6 Ομάδες Iso-Resource (GIR): GIR 1 (κατάκοιτοι ή δεμένοι σε πολυθρόνα, νοητικές λειτουργίες σοβαρά αλλοιωμένες και απαιτούν συνεχή παρουσία), GIR 2 (κατάκοιτοι ή δεμένοι σε πολυθρόνα άτομα, νοητικές λειτουργίες δεν έχει αλλάξει τελείως και απαιτεί βοήθεια στις περισσότερες δραστηριότητες της καθημερινής ζωής, ή νοητικές λειτουργίες αλλοιωμένες με διατηρημένη ικανότητα μετακίνησης), GIR 3 (διατηρημένη νοητική αυτονομία με μερική διατήρηση της κινητικής αυτονομίας και βοήθεια πολλές φορές την ημέρα για σωματική αυτονομία), GIR 4 ( μετακινήσεις στο σπίτι και μερικές φορές βοήθεια για πλύσιμο, ντύσιμο, σωματικές δραστηριότητες ή φαγητό), GIR 5 (μόνο περιστασιακή βοήθεια για πλύσιμο, προετοιμασία γευμάτων και οικιακές εργασίες), GIR 6 (αυτονομία για βασικές εργασίες της καθημερινής ζωής). Σε κρούσματα όπου εντοπίστηκε ο ιός της γρίπης, καταγράφηκε επίσης η κατάσταση εμβολιασμού κατά της γρίπης και οι συνταγές οσελταμιβίρης. Ένα αρχείο μεταδίδεται στις Υποστηρικτικές Πληροφορίες με όλα τα προηγούμενα δεδομένα (Δεδομένα S1). Η GE ορίστηκε ως η ξαφνική έναρξη εμέτου και/ή διάρροιας σε διάστημα 24 ωρών: (i) διάρροια �3 επεισόδια, (ii) και/ή έμετος �3 επεισόδια, (iii) ή διάρροια ή έμετος <3 επεισόδια με δύο ή περισσότερα άλλα συμπτώματα (διάρροια, έμετος, πόνος στο στομάχι, κοιλιακές κράμπες, ναυτία, πυρετός, βλέννα στα κόπρανα) [1] .Η παρουσίαση RTI σε ηλικιωμένους ενήλικες μπορεί να είναι άτυπη, όπως για άλλες οξείες ασθένειες αυτής της ηλικιακής ομάδας [12] . Χρησιμοποιήσαμε τους προτεινόμενους ορισμούς για την επιτήρηση RTI σε γηριατρικές μονάδες, χωρισμένους σε 3 υποκατηγορίες: (i) σύνδρομα κοινού κρυολογήματος ή φαρυγγίτιδα (τουλάχιστον δύο από τα ακόλουθα κριτήρια: καταρροή ή φτάρνισμα, βουλωμένη μύτη (δηλ. συμφόρηση), πονόλαιμος ή βραχνάδα ή δυσκολία στην κατάποση, ξηρός βήχας, πρησμένοι ή ευαίσθητοι αδένες στο λαιμό (αυχενική λεμφαδενοπάθεια)), (ii) ασθένεια που μοιάζει με γρίπη (πρέπει να πληρούνται και τα δύο ακόλουθα κριτήρια: πυρετός ΚΑΙ τουλάχιστον τρία άλλα συμπτώματα (ρίγη, νέος πονοκέφαλος ή πόνος στα μάτια, μυαλγία ή πόνοι στο σώμα, κακουχία ή απώλεια όρεξης, πονόλαιμος, νέος ή αυξημένος ξηρός βήχας)) και (iii) λοίμωξη του κατώτερου αναπνευστικού (πρέπει να πληρούνται και τα δύο ακόλουθα κριτήρια: τουλάχιστον δύο αναπνευστικά σημεία ή συμπτώματα (νέος ή αυξημένος βήχας, νέος/αυξημένη παραγωγή πτυέλων, κορεσμός O 2 <94% ή μειωμένος >3% από την έναρξη, μη φυσιολογική εξέταση πνευμόνων (νέο ή αλλαγμένο), πλευριτικός πόνος στο στήθος, αναπνευστικός ρυθμός �25 αναπνοές/ ελάχιστα ΚΑΙ ένα ή περισσότερα δομικά σημεία/συμπτώματα (πυρετός, λευκοκυττάρωση, σύγχυση, οξεία λειτουργική έκπτωση)) [13] [14] [15] [16] . Η λοίμωξη που αντιστοιχεί σε μία από αυτές τις τρεις υποκατηγορίες συμπεριλήφθηκε σε αυτή τη μελέτη και ταξινομήθηκε ως RTI. Και για τους δύο τύπους μόλυνσης, ο γιατρός από την ομάδα υγιεινής έλαβε κλινικές πληροφορίες από τα αρχεία υγειονομικής περίθαλψης του ασθενούς και ζητήθηκε η γνώμη των μελών της ομάδας υγειονομικής περίθαλψης εάν ήταν απαραίτητο για να συμπληρώσετε τυχόν πληροφορίες που λείπουν. Στο τέλος του επεισοδίου (εντός επτά ημερών μετά το τελευταίο ταυτοποιημένο κρούσμα), προσδιορίστηκε η συμπερίληψη των κρουσμάτων ως εκτεθειμένα και μη μολυσμένα (ΕΝΙ) ή εκτεθειμένα και μολυσμένα (ΕΙ). Προκειμένου να μελετηθεί η θνησιμότητα, η παρουσία κάθε μολυσμένου κατοίκου αξιολογήθηκε μία φορά τουλάχιστον 56 ημέρες μετά το τελευταίο κρούσμα κάθε εστίας. Κάθε κάτοικος παρακολουθήθηκε αναδρομικά κατά τη διάρκεια του όγδοου μεσοδιαστήματος 7 ημερών (I n, n = 1 έως 8, συνολικά 56 ημέρες, μεταξύ της ημερομηνίας έναρξης των συμπτωμάτων και της πεντηκοστής έκτης ημέρας της υπό μελέτη περιόδου) με τρεις διαφορετικές πιθανότητες: παρόν (ζωντανός και επίσημα διαμένοντας στο ίδρυμα), έχασε λόγω παρακολούθησης (ζωντανός την ημερομηνία αναχώρησης αλλά δεν διαμένει πλέον στο ίδρυμα (επιστροφή στην πατρίδα, μεταφορά σε άλλο ίδρυμα)) ή θάνατος (θάνατος καταγεγραμμένος στο αρχείο υγειονομικής περίθαλψης) . Καταγράφηκαν οι ημερομηνίες θανάτου και απώλειας για την παρακολούθηση. Ο έλεγχος για τον ιό δεν ήταν συστηματικός και αποφασίστηκε από τους γιατρούς σε κάθε ίδρυμα παρουσία κλινικών σημείων. Ιοί στη Ντιζόν για εργαστηριακές δοκιμές, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8] . Για την επιτήρηση RTI, χρησιμοποιήθηκαν ταχείες δοκιμές για τον εντοπισμό του ιού της γρίπης. Τα τεστ διάγνωσης ταχείας ανοσοδοκιμασίας που χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση της γρίπης ήταν: Clearview1 Exact Influenza A και B (Inverness Medical, Κολωνία, Γερμανία) από το 2007 έως το 2014 και InfluenzaTop1 (Alldiag, Στρασβούργο, Γαλλία) από το 2014 έως το 2018. Δεδομένης της χαμηλής ευαισθησίας των γρήγορων δοκιμών γρίπης, δεν χρησιμοποιήθηκαν πλέον μετά την εφαρμογή των μέτρων ελέγχου και το ξέσπασμα της γρίπης ήταν υπό έλεγχο. Τα δείγματα αποστέλλονταν επίσης περιστασιακά σε νοσοκομειακά εργαστήρια ή στο Εθνικό Κέντρο Αναφοράς για τους Ιούς της Γρίπης για την ανίχνευση ιών με RT-PCR σε πραγματικό χρόνο [17] . Οι περισσότερες δοκιμές στόχευαν τον νοροϊό (NoV) και τον ιό της γρίπης, αλλά άλλες δοκιμές πραγματοποιήθηκαν περιστασιακά από το Εθνικό Κέντρο Αναφοράς για Ιούς Γρίπης (ρινοϊός, αναπνευστικό συγκυτιακό ιό, ανθρώπινος μεταπνευμοϊός, παραγρίππη 1, 2, 3 και 4 και κορωνοϊός) και Εθνικό Κέντρο Αναφοράς για Εντερικούς Ιούς (ροταϊούς, αστροϊούς και αδενοϊούς). Επειδή οι δοκιμές για τους ιούς ήταν ποικίλες (από το ένα ίδρυμα/ιατρό στο άλλο, δεν χρησιμοποιήθηκαν σε ορισμένα κρούσματα, αναζητήθηκαν τύποι ιών) και λαμβάνοντας υπόψη την κακή ευαισθησία του ταχείας δοκιμές γρίπης, αυτές οι δύο πηγές δεδομένων χρησιμοποιήθηκαν για τον καθορισμό του επιδημιολογικού πλαισίου των επιβεβαιωμένων εστιών. Κατά συνέπεια, μεμονωμένες περιπτώσεις συμπεριλήφθηκαν με συνέπεια σε όλα τα επεισόδια σύμφωνα με τα κλινικά σημεία και την ιατρική αξιολόγηση. Όταν ο έλεγχος του ιού ήταν αρνητικός, τα κλινικά σημεία καταγράφηκαν και η ιατρική αξιολόγηση χρησιμοποιήθηκε όπως προηγουμένως για να ταξινομηθούν οι ενταγμένοι κάτοικοι ως μολυσμένοι ή μη. Ένα ή περισσότερα θετικά δείγματα οδήγησαν στον χαρακτηρισμό ενός πλαισίου NoV (NoV+) ή γρίπης (Flu+). Τα άλλα επεισόδια χαρακτηρίστηκαν ως κρούσματα γρίπης ή NoV χωρίς συγκεκριμένη αναγνώριση ή δοκιμή (NoV-and Flu-). Τα πλαίσια της γρίπης και του NoV δεν εξάλειψαν άλλα πιθανά εντερικά ή αναπνευστικά παθογόνα. Φύλο, ηλικία, διάρκεια παραμονής (LOS, σε έτη ) και το καθεστώς αυτονομίας περιγράφηκαν για όλους τους εκτεθειμένους κατοίκους. Τα ποσοστά αντιγριπικού εμβολιασμού και χορήγησης οσελταμιβίρης υπολογίστηκαν για επιβεβαιωμένα κρούσματα γρίπης. Οι διχοτομικές ή κατηγορικές μεταβλητές εκφράστηκαν ως ποσοστά. Στη μονομεταβλητή ανάλυση, οι κατηγορίες ήταν συγκεκριμένες προκειμένου να ληφθεί μια ακριβής περιγραφή των μεταβλητών ηλικίας και LOS. Τα μεσοδιαστήματα μαθημάτων ήταν 5 έτη για την ηλικία και ένα έτος για το LOS. Οι κάτοικοι που ταξινομήθηκαν ως GIR 4 έως 6 (μερικές φορές, περιστασιακά και χωρίς βοήθεια) ομαδοποιήθηκαν επειδή ήταν λίγοι. Για την ανάλυση πολλαπλών επιπέδων με πίνακες 2x2, χρησιμοποιήθηκε μια διάμεση τιμή για τον καθορισμό των ηλικιακών κατηγοριών δύο επιπέδων. Για το LOS, η αξιολόγηση της μεγαλύτερης διάρκειας παραμονής ήταν απαραίτητη για να προσδιοριστεί η επίδραση της μεγαλύτερης έκθεσης σε ένα γηροκομείο. Κατά συνέπεια, επιλέχθηκε μια τετραετής διακοπή για τη δημιουργία των δύο κατηγοριών. Για την αυτονομία, οι δύο πιο εξαρτημένες κατηγορίες (GIR � 2) ομαδοποιήθηκαν και συγκρίθηκαν με τις πιο αυτόνομες κατηγορίες (GIR � 3). Τα επιδημιολογικά πλαίσια της επιδημίας χρησιμοποιήθηκαν με τις τέσσερις κατηγορίες: NoV+, Flu+, NoV-και flu-. Περιστασιακά εντοπίστηκαν και άλλοι ιοί GE ή RTI, αλλά ο αριθμός των αποτελεσμάτων ήταν πολύ περιορισμένος για να αναπτυχθούν ξεχωριστές αναλύσεις. Ωστόσο, όλα τα αποτελέσματα είναι διαθέσιμα στους πίνακες σχετικά με τις έρευνες για τον ιό μαζί με τις ταυτοποιήσεις NoV και γρίπης. Για τις διαφορετικές κατηγορίες, το ποσοστό μόλυνσης (EI/Exposed Residents (ER), σε ποσοστό) υπολογίστηκε ανάλογα με το φύλο, την ηλικιακή ομάδα, το LOS και καθεστώς αυτονομίας. Για τη διερεύνηση της θνησιμότητας όλων των αιτιών και τον καθορισμό της κατάλληλης περιόδου για την παρακολούθηση των 56 ημερών (D 1 έως 56 ), υπολογίστηκε το ποσοστό θνησιμότητας όλων των αιτιών ανά διάστημα 7 ημερών (LR n /I n, n = 1 έως 8 ) : (αριθμός θανάτων κατά το διάστημα I n / (EI ζωντανός την πρώτη ημέρα του n ου μελετημένου μεσοδιαστήματος μείον το χαμένο ΕΙ παρακολούθησης κατά τη διάρκεια του διαστήματος I n ) � 100). Θεωρώντας ότι θα μπορούσαν να εμφανιστούν διαδοχικές ομάδες εντός της ίδιας τοποθεσίας, ενδεχομένως επηρεάζοντας τη θνησιμότητα όλων των αιτιών, υπολογίστηκε το σειριακό διάστημα σε ημέρες (SI d ). Το SI d ήταν η χρονική περίοδος μεταξύ της έναρξης των συμπτωμάτων της τελευταίας περίπτωσης στην αρχική εστία (Ν) και της έναρξης των συμπτωμάτων της πρώτης περίπτωσης στην επόμενη εστία (Ν+1). Διεξήχθησαν έρευνες όταν το SI d ήταν μικρότερο ή ίσο με το μήκος του προηγούμενου D 1 έως 56 και αξιολογήθηκαν οι ακόλουθες παράμετροι για αυτές τις συγκεκριμένες καταστάσεις: αριθμός επεισοδίων, κάτοικοι που μολύνθηκαν και στα δύο κρούσματα και θάνατος μεταξύ των ατόμων που εντοπίστηκαν. Σύμφωνα με το ποσοστό θνησιμότητας και τον αντίκτυπο των διαδοχικών κρουσμάτων, ορίστηκε ο αριθμός των διαστημάτων 7 ημερών (N.I n ) που πρέπει να ληφθούν υπόψη και το ποσοστό θνησιμότητας από κάθε αιτία αναλύθηκε κατά τη διάρκεια αυτών των περιόδων (I 1 έως N .I n ή D 1 έως 7 � N ). Τα ποσοστά θνησιμότητας για όλες τις αιτίες υπολογίστηκαν με τον ακόλουθο τύπο: (αριθμός θανάτων από D 1 έως 7 � N / (Αριθμός EI στο D 1 μείον χάθηκε στην παρακολούθηση μεταξύ EI κατά τη διάρκεια του περίοδος D 1 έως 7 � N ) � 100). Η εκτίμηση του ποσοστού κύκλου εργασιών ανά διάστημα 7 ημερών μεταξύ των μολυσμένων κατοίκων υπολογίστηκε με βάση το LOS (διάμεσος σε έτη) με τον ακόλουθο τύπο: (αναλογία απολυμένων κατοίκων: 50,0% στην περίπτωση του διάμεσου)/[( διάμεσος LOS � 365)/7)]. Το μέσο ποσοστό κατοίκων που εξήλθαν ανά περίοδο 7 ημερών υπολογίστηκε: [(αριθμός χαμένων προς παρακολούθηση κατά την περίοδο D 1 έως 7 � N / αριθμός εκτεθειμένων και μολυσμένων κατοίκων στο D 1 )/N μεσοδιάστημα 7 ημερών] � 100. Καθώς ορισμένοι κάτοικοι συμπεριλήφθηκαν σε πολλά κρούσματα κατά τη διάρκεια της επιτήρησης, οι παρατηρήσεις δεν ήταν εντελώς ανεξάρτητες. Ως αποτέλεσμα χρησιμοποιήθηκαν μη παραμετρικές δοκιμές. Σε μονομεταβλητή ανάλυση, χρησιμοποιήθηκαν ακριβείς δοκιμές Chi-square ή Fisher (αναμενόμενος αριθμός συχνοτήτων μικρότερος από 5) για τη σύγκριση των ποσοστών μόλυνσης και θνησιμότητας σύμφωνα με τις παραμέτρους που μελετήθηκαν και ο λόγος πιθανοτήτων υπολογίστηκε με μέση-αμερόληπτη εκτίμηση. Η δοκιμή Kruskal-Wallis χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των διάμεσων τιμών. Τα διαστήματα εμπιστοσύνης για τις διάμεσες υπολογίστηκαν με μεθόδους bootstrap. Διεξήχθησαν αναλύσεις προσαρμοσμένες σε συμμεταβλητές με δύο πίνακες (2x2). Ο αντίστοιχος αντίκτυπος κάθε μεμονωμένου παράγοντα δοκιμάστηκε με τεστ Mantel-Haenszel chi-squared. Η ισότητα των αναλογιών πιθανοτήτων του στρώματος δοκιμάστηκε με το τεστ ομοιογένειας Woolf. Τέλος, για κάθε περιβάλλον ιού, δημιουργήθηκαν πολλαπλοί πίνακες (2x2) και δοκιμάστηκαν με συγχυτικές μεταβλητές, τροποποιητές εφέ ή συμμεταβλητές. Οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν χρησιμοποιώντας το λογισμικό R για Mas OS X έκδοση R 3.4.1 με RStudio έκδοση 1.0.153. Ένα αρχείο μεταδίδεται στις Υποστηρικτικές Πληροφορίες με όλους τους κωδικούς R και τα πακέτα που χρησιμοποιούνται (S1 R Codes). Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές στο p � 0,05. Η Γαλλική Αρχή Προστασίας Δεδομένων ενέκρινε τη συλλογή και ανάλυση δεδομένων (DE-2013-074) και η τοπική επιτροπή δεοντολογίας (Espace Local de Réflexion Ethique, Centre Hospitalier de Rouffach) ενέκρινε το πρωτόκολλο μελέτης (ERLE- 32). Σύμφωνα με τη γαλλική νομοθεσία για τη βιοϊατρική έρευνα και τον ανθρώπινο πειραματισμό, δεν απαιτείται ατομική γραπτή συγκατάθεση από τους ασθενείς ή τους συγγενείς τους για τη συλλογή δεδομένων. Κάθε χρόνο, ο παραπέμπων τοπικός ιατρός της μελέτης συντονιζόταν με τους γιατρούς που εργάζονταν στο γηροκομείο. Στην αρχή της περιόδου επιτήρησης, πληροφορίες σχετικά με τη συμμετοχή στη μελέτη εμφανίζονταν στον χώρο επίσκεψης της οικογένειας, συμπεριλαμβανομένου ενός εγγράφου σχετικά με το δικαίωμά τους να έχουν πρόσβαση και να διορθώνουν προσωπικά δεδομένα. Μετά τη συλλογή, τα δεδομένα κατέστησαν ανώνυμα. Δεν χρειάστηκε ειδική εξουσιοδότηση για την αναδρομική ανάλυση των ανώνυμων δεδομένων που συλλέχθηκαν κατά τη συνήθη φροντίδα στο πλαίσιο της τακτικής επιτήρησης. Συνολικά καταγράφηκαν 137 κρούσματα στις 14 τοποθεσίες. Τα κρούσματα RTI ήταν πιο συχνά από τα κρούσματα GE (76 κρούσματα και 5862 εκτεθειμένοι κάτοικοι έναντι 61 εστιών και 4309 εκτεθειμένων κατοίκων, αντίστοιχα). Συνολικά, 7643 από τους εκτεθειμένους κατοίκους ήταν γυναίκες και 2528 ήταν άνδρες. Η διάμεση ηλικία ήταν 86,7 έτη (διατεταρτημόριο: 81,1-91,0 έτη). Οι έρευνες για ιούς (αντίστοιχα 389 δείγματα για RTI και 143 για GE με όλα τα λεπτομερή αποτελέσματα στους πίνακες S1-S4) επιβεβαίωσαν σημαντικό αριθμό εστιών GE που σχετίζονται με νοροϊούς (34/61) και επιδημίες RTI που σχετίζονται με τη γρίπη (46/76). Για τα κρούσματα GE, 2524 κάτοικοι βρίσκονταν σε ένα πλαίσιο NoV+ έναντι του 1785 σε ένα πλαίσιο NoV, και για τα κρούσματα RTI, 3479 κάτοικοι ήταν σε ένα πλαίσιο γρίπης+ έναντι 2383 σε ένα πλαίσιο γρίπης. Για την επιτήρηση GE στο πλαίσιο NoV+, υπήρχαν 1093 Κάτοικοι EI έναντι 1431 κατοίκων ENI, ενώ στο πλαίσιο NoV, υπήρχαν 583 κάτοικοι EI έναντι 1202 κατοίκων ENI. Επομένως, το ποσοστό μόλυνσης ήταν υψηλότερο στο πλαίσιο NoV+ (43,3%) από ό,τι στο πλαίσιο NoV (32,7%, (αναλογία πιθανοτήτων (OR): 0,63, 95% διάστημα εμπιστοσύνης (CI): 0,56-0,72), p < 0,001 Για την επιτήρηση RTI, τα ποσοστά μόλυνσης ήταν παρόμοια με και χωρίς επιβεβαιωμένη γρίπη: 31,5% (N = 1095 κάτοικοι EI /3479 εκτεθειμένοι κάτοικοι) έναντι 30,5% (N = 728 κάτοικοι EI/ 2383 εκτεθειμένοι κάτοικοι, OR: 0,96, CI: 0,85-1,07, p = 0,47). Επιπλέον, το ποσοστό μόλυνσης στο πλαίσιο NoV + ήταν υψηλότερο από τα τρία άλλα πλαίσια: NoV-(OR: 0,63, CI: 0,56-0,72), Flu+ (OR: 0,60, CI: 0,54-0,67) και Flu-(OR: 0,58 , CI: 0,51-0,65). Σε μονομεταβλητή ανάλυση, ορισμένα μεμονωμένα χαρακτηριστικά συσχετίστηκαν με σημαντικές διακυμάνσεις στο ποσοστό μόλυνσης (Πίνακας S5). Το ποσοστό μόλυνσης αυξήθηκε με την ηλικία (εκτός από το Flucontext) και μειώθηκε με το LOS κατά τη διάρκεια των εστιών GE. Η προσαρμοσμένη ανάλυση συμμεταβλητών αποκάλυψε συγκεκριμένη σημαντική τροποποίηση επίδρασης ανάλογα με το φύλο (NoV+) και το LOS (NoV-) (Πίνακας S6). Σε αναλύσεις που στρωματοποιήθηκαν ανάλογα με τον ιό και το φύλο, η ηλικία προσαρμοσμένη για LOS παρέμεινε σημαντική για τα κρούσματα γρίπης+ και NoV+ (άρρενες). Στο πλαίσιο NoV, η τροποποίηση του αποτελέσματος του LOS παρέμεινε σημαντική (Πίνακας 1). Τέλος, όταν συμπεριλήφθηκε η αυτονομία και προσαρμόστηκε για την ηλικία (ιός, φύλο, διαστρωμάτωση LOS), οι λιγότερο αυτόνομοι κάτοικοι (γυναίκες/LOS<4 ετών/ηλικία<86/GIR 1-2) επηρεάστηκαν πιο σοβαρά από κρούσματα γρίπης+ με συγκεκριμένο αποτέλεσμα. τροποποίηση ανάλογα με την ηλικία (Πίνακας S7) . Η μελέτη των ποσοστών θνησιμότητας σε μολυσμένους κατοίκους κατά τη διάρκεια των 56 ημερών μετά την έναρξη έδειξε ότι υπήρχαν σημαντικές διακυμάνσεις για το RTI αλλά καμία αλλαγή για το GE (Πίνακας 2). Σημαντικές διαφορές εμφανίστηκαν μετά από 28 ημέρες στο πλαίσιο των κρουσμάτων γρίπης+ και άλλων εστιών RTI. Η ανάλυση διαδοχικών ή ταυτόχρονων συστάδων στα ίδια ιδρύματα πραγματοποιήθηκε όταν το χρονικό διάστημα μεταξύ της εμφάνισης των συμπτωμάτων του τελευταίου περιστατικού στην εστία Ν και της έναρξης τα συμπτώματα του πρώτου κρούσματος στην εστία N+1 ήταν £56 ημέρες (Πίνακας S8) . Ταυτοποιήθηκαν 44 από τα 137 κρούσματα (32,12%) και 194 από τους 3499 εκτεθειμένους και μολυσμένους κατοίκους προσβλήθηκαν από πολλαπλές λοιμώξεις. Το ποσοστό των εκτεθειμένων και μολυσμένων κατοίκων που εμπλέκονται σε περισσότερες από μία διαστρωμάτωση ιών ήταν 11,09% ((194 � 2)/3499). Επιπλέον, δύο νεκροί κάτοικοι συμπεριλήφθηκαν στις αναλύσεις θνησιμότητας NoV-Na και Flu επειδή ο θάνατος επήλθε εντός 56 ημερών και για τις δύο λοιμώξεις. Η ανάλυση της διαστρωμάτωσης του ιού των 44 εστιών έδειξε την απουσία διαδοχικών συστάδων για την ίδια κατηγορία. Η ίδια ανάλυση για τα πρώτα τέσσερα μεσοδιαστήματα 7 ημερών (Ημέρες 1 έως 28) έδειξε τις αντίστοιχες τιμές: 26 κρούσματα (18,98%), 117 κάτοικοι ((6,69% ​​(((117 � 2)/3499)), ένας νεκρός κάτοικος. Τέλος, σύμφωνα με τον υψηλότερο αντίκτυπο θνησιμότητας κατά τη διάρκεια των πρώτων τεσσάρων διαστημάτων 7 ημερών και για να περιοριστεί ο αντίκτυπος των διαδοχικών συστάδων στην ίδια τοποθεσία, μελετήθηκαν όλα τα ποσοστά θνησιμότητας των αιτιών σύμφωνα με μεμονωμένες παραμέτρους για τα τέσσερα διαστήματα των 7 ημερών με τον αντίστοιχο αριθμό Σύμφωνα με τον τύπο επιτήρησης (GE ή RTI), τα ποσοστά θνησιμότητας διέφεραν σημαντικά: 1,6% έναντι 3,4% (αντίστοιχα NoV+ και NoV-πλαίσια, OR: 2,24, CI: 1,16-4,39, p = 0,02) και 8,3% έναντι 5. (αντίστοιχα Flu+ και Flu-, OR: 0,67, CI: 0,45-0,97, p = 0,04). Στη μονομεταβλητή ανάλυση (Πίνακας S9), η κατάσταση χαμηλής αυτονομίας στα πλαίσια NoV+, Flu+ και Flu συσχετίστηκε πιο σημαντικά με την αύξηση όλων προκαλούν θνησιμότητα και η ηλικία συσχετίστηκε με υψηλότερη θνησιμότητα στο πλαίσιο της γρίπης+. Στην προσαρμοσμένη ανάλυση, δεν εντοπίστηκαν σημαντικές στατιστικές διαφορές στις επιδημίες ΓΟ. Για τα επεισόδια RTI, η προσαρμοσμένη ανάλυση έδειξε ότι η αυτονομία είχε σημαντικό αντίκτυπο όταν προσαρμόστηκε για το φύλο, την ηλικία ή το LOS (Flu+ και Flu-NA) και ότι η ηλικία είχε σημαντικό αντίκτυπο όταν προσαρμόστηκε για το φύλο, την αυτονομία ή το LOS (Flu+) (Πίνακας S10 ) .Στον Πίνακα 3 ελέγχθηκαν οι συγκεκριμένες επιπτώσεις της ηλικίας ή της αυτονομίας. Σημαντική ηλικία OR προσαρμοσμένη για αυτονομία ήταν: Γρίπη+/ηλικία £86 ετών (σε σύγκριση με την ομάδα <86), 1,97 (1,19-3,25). Ή αυτονομία προσαρμοσμένη για την ηλικία ήταν για GIR 3-6 (σε σύγκριση με GIR 1-2): Flu+, 0,41 (0,24-0,69); Γρίπη-, 0,42 (0,20, 0,90). Τέλος, παρά τον χαμηλό αριθμό κατοίκων και θανάτων ανά κατηγορία, και κατά συνέπεια την περιορισμένη ευρωστία των αποτελεσμάτων, η αυτονομία προσαρμοσμένη για την ηλικία με διαστρωμάτωση ανάλογα με τον ιό, το φύλο και το LOS έδειξε ότι τα αποτελέσματα ήταν υψηλότερη μεταξύ των υποομάδων με λιγότερο αυτόνομους κατοίκους (γυναίκες ή άνδρες/LOS<4 ετών/GIR 1-2) σε κρούσματα γρίπης+ και επίσης υψηλότερη θνησιμότητα στη μικρή υποομάδα αυτόνομων ανδρών με LOS � 4 έτη (υψηλότερη θνησιμότητα) (S11 Πίνακας) .Στο πλαίσιο της γρίπης+, δεδομένα σχετικά με την κατάσταση εμβολιασμού και τις συνταγές οσελταμιβίρης ήταν διαθέσιμα αλλά δεν χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Στην παρούσα μελέτη, τα δεδομένα επιτήρησης που ελήφθησαν κατά τη διάρκεια επιδημιών GE και RTI σε οίκους ευγηρίας χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή στρωματοποιημένων αναλύσεων και για τον προσδιορισμό συγκεκριμένων ποσοστά μόλυνσης και θνησιμότητας από κάθε αιτία ανάλογα με τα ατομικά χαρακτηριστικά των κατοίκων. Τα ποσοστά μόλυνσης που παρατηρήθηκαν εδώ ήταν παρόμοια με αυτά που βρέθηκαν σε προηγούμενες μελέτες των επιδημιών NoV και γρίπης (οι πιθανότητες μόλυνσης κατά τη διάρκεια μιας εστίας γρίπης+ ήταν περίπου 40% μικρότερες από ό,τι κατά τη διάρκεια ξέσπασμα NoV+). Τα αναφερθέντα ποσοστά μόλυνσης ήταν κοντά στο 30,0% στα κρούσματα γρίπης και στο 40,0% στα κρούσματα του Νοέμβρη [18] [19] [20] . Η μεγαλύτερη ηλικία φάνηκε να αυξάνει την πιθανότητα μόλυνσης από ΓΟ και γρίπη, με αυξανόμενα ποσοστά στους ηλικιωμένους κατοίκους. Η ηλικία είναι ένας πολύ γνωστός παράγοντας για τη σοβαρότητα της γρίπης και του νοροϊού στους ηλικιωμένους και στα γηροκομεία [21, 22]. Για τον Νοέμβριο, οι υψηλότερες εκτιμήσεις επίπτωσης (στρώματα ηλικίας 5 ετών) βρέθηκαν στην κατηγορία των 85 ετών (περίπου 800 άνδρες και για 1.400 γυναίκες ανά 100.000 κατοίκους). Στη μελέτη μας, η μονομεταβλητή ανάλυση (NoV+) έδειξε ότι οι πιθανότητες μόλυνσης ήταν 1,5 έως 1,6 φορές υψηλότερες εάν ένας κάτοικος ήταν μεγαλύτερος από 85 ετών. Επιπλέον, μια προσαρμοσμένη ανάλυση των εστιών ΓΟ ανέδειξε διαφορετικές επιδράσεις μεταξύ των υποομάδων κατοίκων ανάλογα με το φύλο και το LOS. Πράγματι, η πολλαπλή και/ή η επαναλαμβανόμενη έκθεση σε ιούς GE ενώ είναι εγκατεστημένος μπορεί να οδηγήσει σε ευαισθησία ή πιθανή αυξημένη ανοσία σε ορισμένους κατοίκους [23] . Για τη μεταβλητή του φύλου, δύο παράγοντες θα μπορούσαν να εξηγήσουν το αποτέλεσμα: μια πιθανή προκατάληψη επιλογής με τους άνδρες να αναφέρουν ήπιες λοιμώξεις λιγότερο από τις γυναίκες (ιδιαίτερα στην υποομάδα <86 ετών) ή ότι η ευαισθησία των ανδρών ήταν διαφορετική (ηλικία, LOS, ανοσία, . . . ). Μια γερμανική μελέτη του 2013 ανέφερε επίσης μεγαλύτερη επίδραση στις γυναίκες [21] . Επιπλέον, όταν η ανάλυση ηλικίας στρωματοποιήθηκε ανά φύλο και LOS, δεν παρατηρήθηκε σημαντική επίδραση επιδημίας σε γηροκομεία στις γυναίκες. Οι μόνες σημαντικές διαφορές ήταν λιγότερες λοιμώξεις στους άνδρες στην υποομάδα <86 (εκτός από την NoV-με LOS <4 έτη). Για τις επιδημίες RTI, οι μεταβλητές φύλου και LOS δεν είχαν σημαντική επίδραση. Σε κατοίκους ηλικίας άνω των 86 ετών, οι πιθανότητες να μολυνθούν στο πλαίσιο της γρίπης+ ήταν 1,5 φορές υψηλότερες για τις γυναίκες και 1,7 για τους άνδρες. Σε μονομεταβλητή ανάλυση, σε αντίθεση με τα άλλα περιβάλλοντα ιών όπου οι αναλογίες πιθανοτήτων ήταν σπάνια πάνω από 2, οι κάτοικοι άνω των 95 ετών είχαν αυξημένες πιθανότητες μόλυνσης κατά £ 2,8 σε σύγκριση με την κατηγορία των 70 ετών και για την ομάδα των 100 ετών οι πιθανότητες ήταν περίπου 3,8. Στο πλαίσιο της γρίπης+, η αυτονομία προσαρμοσμένη για την ηλικία (ιός, φύλο και διαστρωμάτωση LOS) αποκάλυψε μια πιθανή αύξηση στα ποσοστά μόλυνσης σε λιγότερο αυτόνομους κατοίκους. Μια προηγούμενη μελέτη διαπίστωσε ότι όταν οι ηλικιωμένοι κάτοικοι εκτέθηκαν στον ιό A(H3N2), υπήρχαν υψηλότερα ποσοστά μόλυνσης και επαναμόλυνσης και πιο σημαντικές επιπτώσεις στο ίδρυμα σε σχέση με άλλους τύπους/υποτύπους γρίπης. Στην κοινότητα, η αναλογία σχετικής ασθένειας (RIR) στα [22, 24] . Η συχνότητα της λοίμωξης από γρίπη και οι σχετικοί κίνδυνοι περιγράφηκαν καλά ανά ηλικιακή ομάδα, αλλά ο συγκεκριμένος αντίκτυπος ανάλογα με την ηλικία δεν μελετήθηκε. Τα αποτελέσματα αυτής της εργασίας τόνισαν τη συγκεκριμένη ηλικιακή κατανομή των ασθενειών της γρίπης μεταξύ των κατοίκων του γηροκομείου και τον σημαντικότερο αντίκτυπο μεταξύ των κατοίκων μεγαλύτερης ηλικίας. Αυτή η ειδική ευαισθησία θα μπορούσε να είναι ένας κρίσιμος παράγοντας για την έκθεση σε ιδρύματα και τη διάδοση της γρίπης και θα μπορούσε εν μέρει να εξηγήσει τον υψηλό αντίκτυπο της λοίμωξης στον ηλικιωμένο ιδρυματικό πληθυσμό.Σε αυτή την εργασία, η κατάσταση αυτονομίας δεν ήταν ο κύριος παράγοντας που σχετίζεται με τη μόλυνση (χωρίς σημαντική επίδραση στη Γ.Σ. και σε Flu-contexts). Ωστόσο, σε κρούσματα γρίπης+, ένα υψηλό επίπεδο εξάρτησης συσχετίστηκε με υψηλότερο κίνδυνο να αρρωστήσετε. Αυτή η παρατήρηση υποδηλώνει ότι το προσωπικό θα μπορούσε να παίξει ρόλο στην εξάπλωση της λοίμωξης (υψηλά εξαρτημένοι και λιγότερο μετακινούμενοι κάτοικοι είναι λιγότερο πιθανό να μολυνθούν) ή ότι οι πιο ενεργοί κάτοικοι μπορεί να είναι λιγότερο εύθραυστοι και/ή να έχουν μεγαλύτερη συμμετοχή στον προτεινόμενο έλεγχο λοιμώξεων μέτρα. Τέλος, η βελτίωση της συμμόρφωσης με τα μέτρα προσωπικής υγιεινής τόσο για το νοσηλευτικό προσωπικό όσο και για τους κατοίκους μπορεί να αναμένεται να έχει ευεργετική επίδραση στα ποσοστά μόλυνσης. Προηγούμενες μελέτες εντόπισαν υψηλότερα ποσοστά λοίμωξης NoV σε εξαιρετικά εξαρτημένα άτομα, αλλά τα αποτελέσματα δεν προσαρμόστηκαν για την ηλικία και το LOS ώστε να ληφθεί υπόψη η πιθανή συσχέτιση με την κατάσταση της αυτονομίας [20] . Η θνησιμότητα είναι δύσκολο να εκτιμηθεί σε οίκους ευγηρίας επειδή ο θάνατος είναι συχνός. Τα επεισόδια GE και RTI εμφανίστηκαν κατά τη διάρκεια των χειμερινών περιόδων και υπάρχουν πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των επιδημιών και της αυξημένης θνησιμότητας αυτή την εποχή του έτους [25] . Το ποσοστό θνησιμότητας όλων των αιτιών των μολυσμένων κατοίκων στη μελέτη μας αντανακλούσε την παγκόσμια θνησιμότητα, συμπεριλαμβανομένων των επιδημιών GE και RTI και το παγκόσμιο επιδημιολογικό πλαίσιο. Δεν αποτελεί έκπληξη το γεγονός ότι ένα υψηλότερο ποσοστό θνησιμότητας από όλες τις αιτίες παρατηρήθηκε στα πλαίσια της γρίπης, όπως αναφέρθηκε σε προηγούμενες μελέτες [25] [26] [27] . Η ηλικία και η αυτονομία είχαν παρόμοια αποτελέσματα στα διαφορετικά περιβάλλοντα, αλλά στη ΓΟ και σε μικρότερο βαθμό στις επιδημίες γρίπης, ο σχετικά μικρός αριθμός θανάτων θα μπορούσε να έχει περιορίσει τη δύναμη των στατιστικών δοκιμών. Στα γηροκομεία, οι κάτοικοι γενικά παίρνουν εξιτήριο λόγω θανάτου. Ο αριθμός των κατοίκων που χάθηκαν για παρακολούθηση ήταν χαμηλός (0,14% τις πρώτες 28 ημέρες), επομένως ο ρυθμός εναλλαγής διαστήματος 7 ημερών που υπολογίστηκε με βάση το διάμεσο LOS παρέχει μια καλή ένδειξη του μέσου ποσοστού θνησιμότητας από κρούσματα. Το ποσοστό θνησιμότητας για τις επιδημίες NoV+ ήταν παρόμοιο με το εκτιμώμενο ποσοστό κύκλου εργασιών σε διάστημα 7 ημερών (1,6%), υποδεικνύοντας ότι αυτό το πλαίσιο είχε περιορισμένη επίδραση στο ποσοστό θνησιμότητας. Το ποσοστό θνησιμότητας όλων των αιτιών επηρεάστηκε περισσότερο από την ηλικία και την αυτονομία. Και τα δύο μεμονωμένα χαρακτηριστικά ήταν σημαντικά στα κρούσματα γρίπης+ και η αυτονομία προσαρμοσμένη για την ηλικία ήταν σημαντική στα επεισόδια γρίπης. Η επίδραση της ηλικίας στη θνησιμότητα σε ένα πλαίσιο γρίπης έχει ήδη περιγραφεί: ένα πολύ υψηλό ποσοστό θνησιμότητας (831/100.000 κατοίκους) αναφέρθηκε σε άτομα ηλικίας 90 ετών και άνω σε σύγκριση με τα άτομα ηλικίας 65-69 ετών (23/100.000 κατοίκους). ) [28] . Στη μονομεταβλητή ανάλυσή μας, ο υψηλότερος κίνδυνος παρατηρήθηκε στην ομάδα £ 90 της οποίας ο κίνδυνος θανάτου ήταν τουλάχιστον 2,6 υψηλότερος από την ομάδα <70. Όταν προσαρμόστηκε για αυτονομία, η επίδραση της ηλικίας δεν ήταν σημαντική σε πιο αυτόνομους κατοίκους στο πλαίσιο του Flu+ και καθόλου στο Flucontext. Η αντίθετη ανάλυση (αυτονομία προσαρμοσμένη για την ηλικία) έδειξε υψηλότερο παγκόσμιο αντίκτυπο στην λιγότερο αυτόνομη ομάδα (Flu-) ή μόνο στην ηλικιακή ομάδα 86 ετών (Flu+). Η ηλικία και η αυτονομία αντικατοπτρίζουν το επίπεδο αδυναμίας των κατοίκων. Οι βαθμολογίες κλινικής αδυναμίας δεν χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, αλλά σε μια προηγούμενη μελέτη ασθενών με κρίσιμη ασθένεια, συσχετίστηκαν με μεγαλύτερη θνησιμότητα, ανεξάρτητα από την ηλικία [29]. Αυτό υποδηλώνει ότι εκτός από την ηλικία, η αυτονομία μπορεί να είναι ένας πολύτιμος δείκτης για την αξιολόγηση του αντίκτυπου της επιδημίας στην επιτήρηση εστιών. Άλλες μελέτες έχουν προτείνει ότι η ηλικία και ορισμένες συννοσηρότητες είναι ανεξάρτητοι παράγοντες κινδύνου για το ποσοστό θνησιμότητας από τη γρίπη ή ότι η θνησιμότητα αυξάνεται ανάλογα με τον αριθμό των παραγόντων κινδύνου [28, 30]. Συννοσηρότητες και υποκείμενες ασθένειες ποικίλης βαρύτητας θα μπορούσαν να αντικατοπτρίζουν τη συνολική αδυναμία και κατά συνέπεια τον κίνδυνο θανάτου. Στους οίκους ευγηρίας, οι πληροφορίες σχετικά με την αυτονομία και την ηλικία είναι πιο εύκολο να συλλεχθούν και να ερμηνευτούν από τα δεδομένα σχετικά με τις συννοσηρότητες. Αυτές οι διάφορες προσεγγίσεις θα πρέπει να αξιολογηθούν και να συγκριθούν με στόχο τη βελτιστοποίηση της αξιολόγησης κινδύνου μεταξύ των κατοίκων του γηροκομείου. Η παρούσα εργασία έχει δύο βασικούς περιορισμούς. Πρώτον, οι πληροφορίες για τον ιό ήταν ελλιπείς (περιορισμένη αναγνώριση, κυρίως γρήγορες δοκιμές γρίπης για το RTI). Κατά συνέπεια, ορισμένα επεισόδια σε επίπεδα χωρίς διαθέσιμη ταυτοποίηση μπορεί επίσης να έχουν συσχετιστεί με γρίπη ή νοροϊό και πολλαπλές μολύνσεις θα μπορούσαν να έχουν υποτιμηθεί ή να μην ληφθούν υπόψη. Επιπλέον, οι συνταγές εμβολιασμού και οσελταμιβίρης καταγράφηκαν αλλά δεν συμπεριλήφθηκαν επειδή ο γονότυπος της γρίπης δεν καθορίστηκε και η ταυτοποίηση ήταν περιορισμένη. Συμπερασματικά, παρατηρήθηκαν συγκεκριμένα πρότυπα ευαισθησίας μεταξύ των εκτεθειμένων κατοίκων. Σε αυτήν την ομάδα γηροκομείων, τα ποσοστά μόλυνσης διέφεραν ανάλογα με τον ιό, το φύλο, τη διάρκεια παραμονής και την ηλικία, και υπήρχαν σημαντικές διαφορές στη θνησιμότητα ανάλογα με τον ιό, την ηλικία και τη βαθμολογία αυτονομίας. Τα δεδομένα που συλλέχθηκαν ήταν εύκολο να καταγραφούν και θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τη βελτίωση του χαρακτηρισμού των εποχικών εστιών σε οίκους ευγηρίας, των οποίων οι κάτοικοι είναι ιδιαίτερα ευάλωτοι. Τέλος, καθώς η μέση ηλικία και το επίπεδο εξάρτησης των κατοίκων συνεχίζει να αυξάνεται, αυξάνοντας στη συνέχεια τον κίνδυνο μόλυνσης και θανάτου, το προσωπικό υγειονομικής περίθαλψης θα πρέπει να είναι ολοένα πιο προσεκτικό κατά τη διάρκεια εποχικών εστιών και θα πρέπει να εφαρμόζονται στοχευμένες παρεμβάσεις. Υποστηρικτικές πληροφορίες S1 Data. (CSV) Κωδικοί S1 R. (R) Πίνακας S1. (XLSX) S10 Τραπέζι. (XLSX) S11 Πίνακας. (XLSX)", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 26552, "text": "30,0%" } ], "id": 5308, "question": "Ποιο ήταν το αναφερόμενο ποσοστό μόλυνσης για τη γρίπη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 27174, "text": "1,5 έως 1,6 φορές" } ], "id": 5309, "question": "Πόσες φορές πιθανότερο ήταν να βρεθεί λοίμωξη σε ασθενείς άνω των 85 ετών;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Απόκριση εντατικής θεραπείας σε νοσοκομειακό ξέσπασμα της λοίμωξης 2019-nCoV στο Shenzhen της Κίναςhttps://doi.org/10.1186/s13054-020-2786-xSHA: 6a93283b499ae5bc6aaf29f14e7010138f; Li, Jinxiu; Feng, YongwenΗμερομηνία: 2020DOI: 10.1186/s13054-020-2786-xLicense: cc-byAbstract: nanText: Η κύρια πρόκληση μπορεί να περιλαμβάνει (1) έγκαιρη αναγνώριση της εστίας, (2) ταχεία επέκταση των ασθενών, (3) υψηλό κίνδυνο νοσηλείας μετάδοση, (4) απρόβλεπτο μέγεθος που επηρεάζεται και (5) έλλειψη εφεδρικού πόρου. Αυτές οι προκλήσεις έχουν προκαλέσει σοβαρή έλλειψη εργαζομένων στον τομέα της υγείας, ιατρικού υλικού και κλινών με απομόνωση. Οι διακοπές του Ανοιξιάτικου Φεστιβάλ επιδείνωσαν σημαντικά την έλλειψη ανθρώπινου δυναμικού και την έντονη ροή κυκλοφορίας λόγω των διακοπών των υγιών εργαζομένων και των εργαζομένων στα εργοστάσια, γεγονός που αύξησε περαιτέρω τον κίνδυνο μετάδοσης. Το βασικό σημείο είναι να γίνει διάκριση της επιδημίας μολυσματικών ασθενειών από την τακτική ομαδοποίηση των κρουσμάτων που μοιάζουν με γρίπη σε πρώιμο στάδιο. Υπάρχει μια αντιστάθμιση μεταξύ του ψευδούς συναγερμού που προκαλεί πανικό στον πληθυσμό και της καθυστερημένης αναγνώρισης που οδηγεί σε κοινωνική κρίση. Η έγκαιρη αναγνώριση της λοίμωξης 2019-nCoV αποτελεί σημαντική πρόκληση για τους κλινικούς ιατρούς πρώτης γραμμής. Τα κλινικά συμπτώματά του αλληλεπικαλύπτονται σε μεγάλο βαθμό με αυτά των κοινών οξειών αναπνευστικών παθήσεων, συμπεριλαμβανομένου του πυρετού (98%), του βήχα (76%) και της διάρροιας (3%), συχνά πιο σοβαρά σε ενήλικες μεγαλύτερης ηλικίας με προϋπάρχουσες χρόνιες συννοσηρότητες [1] . Συνήθως, οι εργαστηριακές ανωμαλίες περιλαμβάνουν λεμφοκυτταροπενία και υποξαιμία [1] . Οι αρχικές ακτινογραφίες θώρακος μπορεί να ποικίλλουν από ελάχιστη ανωμαλία έως αμφοτερόπλευρη αδιαφάνεια από εσμυρισμένο γυαλί ή υποτμηματικές περιοχές ενοποίησης [1] . Επιπλέον, τα ασυμπτωματικά περιστατικά και η έλλειψη κιτ διάγνωσης έχουν ως αποτέλεσμα την καθυστερημένη ή ακόμα και τη χαμένη διάγνωση αναπόφευκτη και κάνει πολλούς άλλους ασθενείς, επισκέπτες και εργαζόμενους στον τομέα της υγείας να εκτίθενται στη λοίμωξη 2019-nCoV. σε επίπεδο νοσοκομείου, αλλά και σε επίπεδο πόλης που κυριαρχείται από την κυβέρνηση. Στο αρχικό στάδιο, το μέγεθος του πληθυσμού των ασθενών δεν υπερβαίνει τις δυνατότητες του τοπικού νοσοκομείου λοιμωδών νοσημάτων (IDH). Το γενικό νοσοκομείο είναι υπεύθυνο για τη διαλογή πυρετού, τον εντοπισμό ύποπτων περιπτώσεων και τη μεταφορά στο τοπικό IDH. Ένα τέτοιο σχέδιο είναι υποχρεωτικό για κάθε νοσοκομείο. Η πόλη Shenzhen έχει καθιερώσει ένα προϋπάρχον Σχέδιο Επιδημίας Λοιμωδών Νοσημάτων (IDEP), το οποίο έχει διευκολύνει τη διαχείριση και τον περιορισμό της τοπικής επιδημίας του 2019-nCoV. Σε περίπτωση που το φορτίο του ασθενούς υπερβαίνει τις νοσοκομειακές δυνατότητες του IDH, θα πρέπει να ληφθούν υπόψη νέες IDH είτε με την κατασκευή ενός προσωρινού νέου IDH είτε με την ανακατασκευή ενός υπάρχοντος νοσοκομείου. Το Wuhan, το επίκεντρο της επιδημίας, αγωνίζεται με τον χρόνο για να χτίσει δύο εξειδικευμένα νοσοκομεία για ασθενείς με nCoV, συγκεκριμένα το νοσοκομείο Huoshenshan και Leishenshan, ενώ μια διαφορετική στρατηγική έχει αναληφθεί στην πόλη Shenzhen με την ανακατασκευή ενός υπάρχοντος νοσοκομείου για να γίνει IDH με ικανότητα 800 κρεβάτια. Οι ασθενείς 2019-nCoV θα πρέπει να εισάγονται σε μονόκλινα δωμάτια αρνητικής πίεσης σε απομονωμένες μονάδες με εντατική φροντίδα και παρακολούθηση [2] . Η κλινική μηχανική θα πρέπει να έχει σχέδια για την ανακατασκευή των τυπικών δωματίων [2] . Η μετασκευή των δωματίων με εξωτερικά εξαντλημένα φίλτρα HEPA μπορεί να είναι μια βολική λύση. Επίσης, το γενικό νοσοκομείο μπορεί να εξετάσει διαδικασίες όπως η αναστολή των εκλεκτικών χειρουργείων, η ακύρωση περιπατητών κλινικών και διαγνωστικών διαδικασιών εξωτερικών ασθενών, η μεταφορά ασθενών σε άλλα ιδρύματα και ο περιορισμός των επισκεπτών του νοσοκομείου [2] . Το πιο σημαντικό, επειδή η ικανότητα των νοσοκομείων να ανταποκριθούν στο ξέσπασμα εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τις διαθέσιμες κλίνες ΜΕΘ, πρέπει να καθοριστεί το σχέδιο αύξησης της χωρητικότητας κλινών ΜΕΘ. Η φροντίδα των ασθενών με 2019-nCoV αντιπροσωπεύει σημαντικό κίνδυνο έκθεσης για το προσωπικό της ΜΕΘ λόγω ακόλουθοι λόγοι: εξαιρετικά μεταδοτική με πολλαπλές οδούς μετάδοσης, υψηλή δόση έκθεσης, μεγάλες ημερήσιες ώρες επαφής και παραμονή στη ΜΕΘ. Ο βασικός αναπαραγωγικός αριθμός εκτιμήθηκε ότι είναι 2,2 (95% CI, 1,4 έως 3,9) [3] , ή τόσο υψηλός μεταξύ 3,6 και 4,0 [4] . Ο 2019-nCoV έχει αποδειχθεί ότι μεταδίδεται με σταγονίδια του αναπνευστικού, την επαφή και τα κόπρανα-στοματικά, ακόμη και η μετάδοση μέσω του ματιού είναι δυνατή [5, 6] . Το υψηλότερο ιικό φορτίο και οι διαδικασίες παραγωγής αερολύματος, όπως ο μη επεμβατικός αερισμός, μεγεθύνουν τον κίνδυνο έκθεσης και μετάδοσης [2, 7, 8] . Επιπλέον, η αποβολή του ιού μπορεί να παραταθεί και να διαρκέσει για > 3 εβδομάδες σύμφωνα με κάποια βιβλιογραφία και τα αδημοσίευτα δεδομένα μας [2] . Οι πάροχοι υγειονομικής περίθαλψης και όσοι έρχονται σε επαφή με μολυσμένους ασθενείς θα πρέπει να χρησιμοποιούν προφυλάξεις επαφής, σταγονιδίων και αερομεταφερόμενων με τον αναπνευστήρα N95. Αυστηρές πρακτικές πρόληψης και ελέγχου των λοιμώξεων έχουν εφαρμοστεί και ελεγχθεί στις μονάδες μας σύμφωνα με το σχέδιο πρόληψης και ελέγχου των λοιμώξεων που δημοσιεύτηκε από την Εθνική Επιτροπή Υγείας της Κίνας (CNHC). Επιπλέον, έχει δημιουργηθεί μια καλά εξοπλισμένη κλινική πυρετού ως σταθμός διαλογής με εκπαιδευμένο προσωπικό που γνωρίζει τους ορισμούς των περιπτώσεων 2019-nCoV. Για την ύποπτη λοίμωξη 2019-nCoV, αρκετά βασικά σημεία είναι κρίσιμες διαδικασίες: καταγραφή λεπτομερούς ιστορικού, τυποποίηση της εξέτασης πνευμονίας, λήψη δειγμάτων κατώτερης αναπνευστικής οδού [2, 8] και εφαρμογή απομόνωσης σταγονιδίων για να σπάσει η αλυσίδα μετάδοσης στο πλαίσιο της υγειονομικής περίθαλψης [2] .Ο κίνδυνος έκθεσης στον 2019-nCoV μπορεί να προκαλέσει σημαντικό ψυχοκοινωνικό στρες στους εργαζόμενους στον τομέα της υγείας [2] . Ο θάνατος ενός συνταξιούχου ΩΡΛ ιατρού από λοίμωξη 2019-nCoV έχει αυξήσει τους φόβους τον Ιανουάριο του 2020. Οι ψυχοθεραπευτές έχουν επίσης προσκληθεί να συμμετάσχουν σε ιατρικές ομάδες για να αξιολογήσουν και να αντιμετωπίσουν το πιθανό άγχος και κατάθλιψη για την ασφάλεια των εργαζομένων στον τομέα της υγείας. Η κρίσιμη διαχείριση Η διαχείριση του 2019-nCoV ήταν σε μεγάλο βαθμό υποστηρικτική, συμπεριλαμβανομένης της διασωλήνωσης, της πρώιμης θέσης σε επιρρεπή θέση, του νευρομυϊκού αποκλεισμού και της οξυγόνωσης της εξωσωματικής μεμβράνης (ECMO) σύμφωνα με τις συστάσεις που ενημερώθηκαν από την CNHC. Ενθαρρύνθηκαν συστηματικά κορτικοστεροειδή χαμηλής δόσης, λοπιναβίρη/ριτοναβίρη και εισπνοή ιντερφερόνης με ψεκασμό. Αυτές οι κρίσιμες διαχειρίσεις έχουν λειτουργήσει καλά μέχρι στιγμής, καθώς οι ασθενείς μας με 2019-nCoV είχαν μηδενική θνησιμότητα. Αντίθετα, η προηγουμένως αναφερθείσα θνησιμότητα ασθενών με 2019-nCoV στη Γουχάν κυμαινόταν από 11 έως 15% [1, 9].", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 1199, "text": "Η έγκαιρη αναγνώριση της λοίμωξης 2019-nCoV αποτελεί σημαντική πρόκληση" } ], "id": 642, "question": "Γιατί η έγκαιρη αναγνώριση των ασθενών με COVID-19 μπορεί να είναι δύσκολη;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Ο ιός της φυσαλιδώδους στοματίτιδας με τη γλυκοπρωτεΐνη του ιού της λύσσας κατευθύνει την ανάδρομη διασυναπτική μεταφορά μεταξύ των νευρώνων in vivohttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3566411/SHA: ee48061797d29eeef5a411bd0; Saunders, Arpiar B.; Oldenburg, Ian A.; Sabatini, Bernardo L.; Cepko, Constance L.Date: 2013-02-07DOI: 10.3389/fncir.2013.00011License: cc-byAbstract: Ο καθορισμός των συνδέσεων μεταξύ των νευρώνων είναι κρίσιμος για την κατανόηση της δομής και της λειτουργίας του νευρικού συστήματος. Οι ανασυνδυασμένοι ιοί που έχουν σχεδιαστεί για να μεταδίδονται στις συνάψεις παρέχουν μια ισχυρή προσέγγιση για την ανατομή των νευρωνικών κυκλωμάτων in vivo. Πρόσφατα αποδείξαμε ότι ο ανασυνδυασμένος ιός φυσαλιδώδους στοματίτιδας (VSV) μπορεί να είναι προικισμένος με πρόσθια ή οπισθοδρομική ικανότητα διασυναπτικής ανίχνευσης παρέχοντας στον ιό διαφορετικές γλυκοπρωτεΐνες. Εδώ επεκτείνουμε τον χαρακτηρισμό της μετάδοσης και της γονιδιακής έκφρασης του ανασυνδυασμένου VSV (rVSV) με τη γλυκοπρωτεΐνη του ιού της λύσσας (RABV-G) και παρέχουμε παραδείγματα της δραστηριότητάς του σε σχέση με την προγενέστερη μορφή διασυναπτικού ιχνηθέτη του rVSV. Το rVSV με RABV-G βρέθηκε να οδηγεί ισχυρή έκφραση διαγονιδίων και να εξαπλώνεται γρήγορα από νευρώνα σε νευρώνα μόνο με ανάδρομο τρόπο. Ανάλογα με τον τρόπο με τον οποίο χορηγήθηκε το RABV-G, το VSV χρησίμευε ως πολυσυναπτικός ή μονοσυναπτικός ιχνηθέτης ή ήταν σε θέση να ορίσει προβολές μέσω αξονικής πρόσληψης και ανάδρομης μεταφοράς. Σε ζώα που έχουν μολυνθεί ταυτόχρονα με rVSV στην πρόσθια μορφή του, το rVSV με RABV-G θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για να αρχίσει να χαρακτηρίζει τις ομοιότητες και τις διαφορές στις συνδέσεις σε διαφορετικές περιοχές. Το rVSV με RABV-G παρέχει ένα ευέλικτο, γρήγορο και ευέλικτο εργαλείο ιχνηλάτησης που συμπληρώνει τον προηγουμένως περιγραφέντα προσθιοβάθμιο διασυναπτικό ανιχνευτή που βασίζεται σε VSV. Κείμενο: Η χαρτογράφηση της συνδεσιμότητας των νευρώνων στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ) ακόμη και απλών οργανισμών είναι μια δύσκολη εργασία. Οι ανασυνδυασμένοι ιοί που έχουν κατασκευαστεί για να ανιχνεύουν συναπτικές συνδέσεις και να εκφράζουν διαγονίδια υπόσχονται να επιτρέψουν τη χαρτογράφηση συνδέσεων μεταξύ νευρώνων υψηλότερης απόδοσης από άλλες μεθόδους, π.χ. Briggman et al., 2011). Οι ιοί ψευδολύσσας (PRV) και ιοί της λύσσας (RABV) είναι οι καλύτερα χαρακτηρισμένοι και πιο χρησιμοποιημένοι ιοί εντοπισμού κυκλωμάτων μέχρι σήμερα (Ugolini et al., 1989; Kelly και Strick, 2000). Το RABV τροποποιήθηκε πρόσφατα από τον Wickersham και τους συνεργάτες του έτσι ώστε να μπορεί να ταξιδεύει σε μία μόνο σύναψη, επιτρέποντας έναν απλό ορισμό των μονοσυναπτικών συνδέσεων (Wickersham et al., 2007b). Αυτή η στρατηγική επέτρεψε την πρώτη σαφή ταυτοποίηση ανάδρομα συνδεδεμένων κυττάρων από ένα αρχικά μολυσμένο κύτταρο («κύτταρο εκκίνησης»), χωρίς την ανάγκη ηλεκτροφυσιολογίας. Επιπλέον, το αρχικό κύτταρο θα μπορούσε να οριστεί μέσω της έκφρασης ενός συγκεκριμένου ιικού υποδοχέα που περιόριζε την αρχική μόλυνση. Πρόσφατα, δημιουργήσαμε έναν προσόδιο μονοσυναπτικό ιό που συμπληρώνει τους προηγουμένως διαθέσιμους ανάδρομους ιικούς ιχνηθέτες (Beier et al., 2011). Ο ιός της φυσαλιδώδους στοματίτιδας (VSV), ένας ιός που σχετίζεται με τον RABV, με το δικό του γονίδιο γλυκοπρωτεΐνης (G) (VSV-G) ή με ένα G από τον άσχετο ιό της λεμφοκυτταρικής χοριομηνιγγίτιδας (LCMV-G), εξαπλώνεται στην πρόσθια κατεύθυνση στις συνάψεις . Το VSV μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως πολυσυναπτικός ιχνηθέτης που εξαπλώνεται σε πολλές συνάψεις, λόγω του γεγονότος ότι η φυσιολογική, ικανή για αναπαραγωγή μορφή του ιού δεν προκαλεί σοβαρές ασθένειες στον άνθρωπο (Brandly and Hanson, 1957; Johnson et al., 1966; Brody et al., 1967). Το εάν ο ιός είναι μονοσυναπτικός ή πολυσυναπτικός ιχνηθέτης προσδιορίζεται με τη μέθοδο χορήγησης του γονιδίου G (Εικόνα 1Α). Τα πλεονεκτήματα του VSV είναι ότι είναι καλά χαρακτηρισμένο, είναι σχετικά απλό σε σύγκριση με το PRV και αναπτύσσεται γρήγορα σε υψηλό τίτλο σε κύτταρα ιστοκαλλιέργειας. Αναπτύσσεται επίσης ως φορέας εμβολίου, χρησιμοποιώντας συχνά ένα G άλλου ιού ως ανοσογόνο, καθώς και ως κυτταροκτόνος παράγοντας που θα στοχεύει κύτταρα όγκου σε ανθρώπους (Balachandran and Barber, 2000; Stojdl et al., 2000 Stojdl et al., , 2003. Προηγούμενες μελέτες των ανατομικών προτύπων μετάδοσης, καθώς και φυσιολογικές καταγραφές, έχουν δείξει ότι η μετάδοση του VSV και του RABV μεταξύ των νευρώνων γίνεται μέσω συνάψεων (Kelly and Strick, 2000; Wickersham et al., 2007b; Beier et al., 2011). Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι ο RABV, καθώς και οι φακοϊοί με RABV-G στο περίβλημά τους, ταξιδεύουν ανάδρομα από ένα σημείο της ένεσης (Mazarakis et al., 2001; Wickersham et al., 2007a). Υποθέσαμε ότι η παροχή ενός ανασυνδυασμένου VSV (rVSV) με το RABV-G θα δημιουργούσε έναν ανάδρομο πολυσυναπτικό διασυναπτικό ιχνηθέτη χωρίς τις εγγενείς ανησυχίες για τη βιοασφάλεια του RABV. Ο αρχικός μας χαρακτηρισμός του rVSV με RABV-G έδειξε ότι πράγματι ΣΧΗΜΑ 1 | Στρατηγικές συναπτικής ανίχνευσης με χρήση VSV. (Α) Σχηματική απεικόνιση των στρατηγικών για πολυσυναπτική ή μονοσυναπτική ανάδρομη ή προοδευτική διασυναπτική μετάδοση του rVSV που κωδικοποιεί το GFP. Το αρχικά μολυσμένο κύτταρο υποδεικνύεται με έναν αστερίσκο. Ο VSV που κωδικοποιεί μια γλυκοπρωτεΐνη (G) στο γονιδίωμά του μπορεί να εξαπλωθεί πολυσυναπτικά. Η κατεύθυνση της εξάπλωσης εξαρτάται από την ταυτότητα της γλυκοπρωτεΐνης. Οι μολυσμένοι νευρώνες εμφανίζονται με πράσινο χρώμα. Σε ορισμένες περιπτώσεις, το αρχικά μολυσμένο κύτταρο εκκίνησης μπορεί να οριστεί από την έκφραση ενός υποδοχέα πτηνών, TVA (επισημασμένο με μια κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη). Οι νευρώνες που εκφράζουν TVA μπορούν στη συνέχεια να μολυνθούν ειδικά από το rVSV G με τη γλυκοπρωτεΐνη EnvA/RABV-G (A/RG) (Wickersham et al., 2007b) στην επιφάνεια του ιού [rVSV G(A/RG)]. Αυτά τα αρχικά κύτταρα είναι στη συνέχεια κίτρινα, λόγω της ιικής GFP και του mCherry από την έκφραση TVA-mCherry. Για τη μονοσυναπτική ιχνηλάτηση, η πρωτεΐνη G εκφράζεται σε trans στο κύτταρο που εκφράζει TVA, και έτσι συμπληρώνει το rVSV G για να επιτρέψει τη μετάδοση σε μια συγκεκριμένη κατεύθυνση. (Β) Γονιδιωματικά διαγράμματα φορέων rVSV. Όλα τα VSV περιέχουν τέσσερις βασικές πρωτεΐνες: N, P, M και L. Ορισμένοι ιοί κωδικοποιούν ένα γονίδιο G στο γονιδίωμά τους, το οποίο τους επιτρέπει να εξαπλωθούν πολυσυναπτικά. Οι φορείς rVSV τυπικά κωδικοποιούν ένα διαγονίδιο στην πρώτη θέση, ενώ άλλοι φέρουν ένα επιπλέον διαγονίδιο στη θέση G. (Γ) Μορφολογικός χαρακτηρισμός νευρώνων που έχουν μολυνθεί με rVSV σε διάφορες θέσεις εντός του εγκεφάλου του ποντικού. (i,ii) Νευρώνες Caudate-putamen (CP) στα 4 dpi από ένεση του CP με ιούς rVSV(VSV-G) που κωδικοποιούν (i) CFP ή (ii) Korange. (iii) Οι επισημασμένοι νευρώνες της περιοχής CA1 του ιππόκαμπου φαίνονται στα 5 dpi μετά την έγχυση στον ιππόκαμπο του rVSV(VSV-G) που κωδικοποιεί την Αφροδίτη. (iv,v) Οι πυραμιδικοί νευρώνες του φλοιού εμφανίζονται μετά την έγχυση στην CP του rVSV(RABV-G) που εκφράζει (iv) GFP στα 24 hpi ή (v) mCherry στα 48 hpi. Το ένθετο στο (iv) είναι μια υψηλή μεγέθυνση του νευρώνα στο πλαίσιο (iv), υπογραμμίζοντας την επισήμανση των δενδριτικών άκρων. (vi) Πολλαπλοί ιοί μπορούν να εγχυθούν ταυτόχρονα στο ίδιο ζώο. Εδώ, μεμονωμένοι ιοί rVSV G(VSV-G) που κωδικοποιούν CFP, GFP, Venus, Korange και mCherry χρησιμοποιήθηκαν για τη μόλυνση του φλοιού. Ράβδοι κλίμακας = 50 μm.www.frontiersin.org Φεβρουάριος 2013 | Τόμος 7 | Άρθρο 11 | 2 θα μπορούσε να ληφθεί ως ανάδρομος ιχνηθέτης (Beier et al., 2011). Για να προσδιοριστεί εάν θα μπορούσε να μεταδώσει μεταξύ των νευρώνων μετά την αντιγραφή του στους νευρώνες και για να αναλυθούν περαιτέρω τα πρότυπα μετάδοσης τόσο της μονοσυναπτικής όσο και της πολυσυναπτικής μορφής του rVSV με RABV-G, κάναμε ενέσεις σε πολλά ΚΝΣ και περιφερειακά σημεία. Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε συν-λοιμώξεις του rVSV με το RABV-G και την πρόσθια μορφή του rVSV προκειμένου να εκμεταλλευτούμε τις διαφορές στην κατευθυντικότητα μετάδοσης αυτών των δύο ιών στα κυκλώματα χαρτογράφησης. Εμφανίζονται σχηματικά σχήματα ιών που δημιουργήθηκαν και χρησιμοποιούνται σε όλη αυτή τη μελέτη στο Σχήμα 1. Δημιουργήσαμε πλασμίδια φορέα rVSV που φέρουν διαφορετικά διαγονίδια είτε στην πρώτη είτε στην πέμπτη γονιδιωματική θέση (Εικόνα 1Β). Μετά τη διάσωση κάθε ιού, δοκιμάσαμε την ικανότητα του καθενός να εκφράζει διαγονίδια σε διαφορετικές περιοχές του εγκεφάλου μέσω ενδοκρανιακών ενέσεων (Εικόνα 1C). Όλοι οι φορείς rVSV οδήγησαν σε ισχυρή έκφραση φθοροφόρου 1 ή 2 ημέρες μετά τη μόλυνση (hpi) (Εικόνα 1C) (van den Pol et al., 2009). Στην πραγματικότητα, κατά 12 hpi, η επισήμανση ήταν αρκετά φωτεινή για να απεικονίσει λεπτές μορφολογικές λεπτομέρειες, όπως οι δενδριτικές ράχες (Εικόνα 1C, iv). Για να χαρακτηρίσουμε τις φυσιολογικές ιδιότητες των κυττάρων που έχουν μολυνθεί με rVSV, δοκιμάσαμε ένα ικανό για αναπαραγωγή rVSV που κωδικοποιεί GFP, με RABV-G στο γονιδίωμα στη θέση του VSV-G [εφεξής ορίζεται rVSV(RABV-G)]. van den Pol et al. ανέφερε ότι οι νευρώνες του ιππόκαμπου που είχαν μολυνθεί με ανίκανο για αναπαραγωγή (διαγραμμένο G ή \"G\") rVSV ήταν φυσιολογικά υγιείς στους 12-14 hpi, αλλά ήταν λιγότεροι 1 ημέρα μετά τη μόλυνση (dpi) (van den Pol et al., 2009 ) . Δεδομένης της γνωστής τοξικότητας τόσο του VSV όσο και του RABV-G (Coulon et al., 1982), δοκιμάσαμε τη φυσιολογία των φλοιωδών πυραμιδικών νευρώνων στον κινητικό φλοιό (Μ1) που έχουν μολυνθεί με rVSV (RABV-G). Μεταξύ 12 και 18 hpi, η χωρητικότητα της μεμβράνης, η αντίσταση εισόδου, το δυναμικό ηρεμίας μεμβράνης και η σχέση πυροδότησης ρεύματος προς δράση ήταν δυσδιάκριτα μεταξύ μολυσμένων και μη μολυσμένων νευρώνων (Εικόνα 2) . Ωστόσο, κατά 2 dpi, οι ηλεκτροφυσιολογικές ιδιότητες ήταν τόσο ανώμαλες στα μολυσμένα φλοιώδη πυραμιδικά κύτταρα που δεν μπορούσαν να γίνουν φυσιολογικές μετρήσεις. Η ταχύτητα και η ισχύς της έκφρασης των διαγονιδίων που κωδικοποιούνται από το VSV εξαρτάται από τη γονιδιωματική θέση του γονιδίου (van den Pol et al. , 2009; Beier et al., 2011). Τα γονίδια στην πρώτη θέση εκφράζονται πιο έντονα, με μείωση του επιπέδου έκφρασης σε θέσεις περισσότερες 3 εντός του κλώνου του ιού συν. Όταν το GFP εισήχθη στην πρώτη θέση του VSV, ο φθορισμός του GFP ήταν αρχικά ανιχνεύσιμος σε περίπου 1 hpi σε καλλιεργημένα κύτταρα (van den Pol et al., 2009). Προκειμένου να ποσοτικοποιηθεί η σχετική έκφραση μιας φθορίζουσας πρωτεΐνης στην πρώτη γονιδιωματική θέση σε νευρώνες, φέτες ιππόκαμπου αρουραίου μολύνθηκαν με ένα rVSV ανίκανο για αναπαραγωγή που εκφράζει mCherry (rVSV G, Σχήματα 1Α, Β). Αυτός ήταν ένας ιός G στον οποίο το RABV-G χορηγήθηκε σε trans κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας του αποθέματος του ιού [αναφέρεται ως rVSV G(RABV-G)]. Η μέση ένταση φθορισμού των μολυσμένων κυττάρων μετρήθηκε κάθε ώρα κατά τη διάρκεια του 18 η. Μέχρι 4 hpi στους 37 • C, ο κόκκινος φθορισμός ήταν καθαρά ορατός και έφτασε στα μέγιστα επίπεδα κατά περίπου 14 hpi (N = 3, Εικόνα 3 ). Παρόμοια αποτελέσματα λήφθηκαν με έναν ιό που κωδικοποιεί το GFP στην πρώτη γονιδιωματική θέση αντί για το mCherry (δηλαδή, Σχήμα 1Β) (Ν = 3). Προηγουμένως δείξαμε ότι ο rVSV (RABV-G) μπορούσε να ληφθεί ανάδρομα από νευρώνες (Beier et al. ., 2011), αλλά αυτά τα πειράματα δεν έκαναν διάκριση μεταξύ της άμεσης αξονικής πρόσληψης του αρχικού εμβολίου έναντι της ανάδρομης διασυναπτικής μετάδοσης μετά από ιική αντιγραφή. Για τη διάκριση μεταξύ αυτών των δύο μηχανισμών και για την επέκταση των προηγούμενων αναλύσεων, πραγματοποιήσαμε περαιτέρω πειράματα στο οπτικό σύστημα των θηλαστικών (Εικόνες 4A-G). Καθώς η περιοχή του οπτικού φλοιού 1 (V1) δεν λαμβάνει άμεσες προβολές από γαγγλιακά κύτταρα του αμφιβληστροειδούς (RGCs), αλλά μάλλον λαμβάνει δευτερεύουσα είσοδο από RGCs μέσω του πλευρικού γονιδιακού πυρήνα (LGN), η μόλυνση των RGCs από την έγχυση του V1 θα έδειχνε ανάδρομη μετάδοση από τα κύτταρα που υποστήριξε τουλάχιστον έναν γύρο ιικής αναπαραγωγής. Μετά από ένεση V1 με rVSV(RABV-G), παρατηρήθηκαν θετικά στο GFP RGC στον αμφιβληστροειδή κατά 3 dpi (Ν = 3; Εικόνα 4G ). Είναι σημαντικό ότι η επισήμανση του ιού στον εγκέφαλο περιορίστηκε σε πρωτογενείς και δευτερεύουσες περιοχές προβολής, ακόμη και στα 7 dpi. Αυτά περιελάμβαναν το LGN (Εικόνα 4D) και τον υποθάλαμο (Εικόνα 4Ε), δύο περιοχές που είναι γνωστό ότι προβάλλουν απευθείας στο V1 (Kandel, 2000). Επιλεκτική επισήμανση παρατηρήθηκε σε άλλες περιοχές, όπως οι περιοχές του φλοιού που περιβάλλουν το V1 (Εικόνα 4C), οι οποίες προβάλλουν απευθείας στο V1, καθώς και στο ανώτερο colliculus (SC) στρώμα griseum centrale, το οποίο προβάλλει στο LGN (Εικόνα 4F). Επισήμανση παρατηρήθηκε επίσης στον βασικό πυρήνα, ο οποίος προβάλλει στον φλοιό, καθώς και σε πολλά συστατικά του κυκλώματος των βασικών γαγγλίων, τα οποία παρέχουν είσοδο στον θάλαμο [όπως ο κερκοφόρος ποδός (CP), ο ωχρός σφαίρας (GP) και ο υποθαλαμικός πυρήνας (STn)]. Η αμυγδαλή, η οποία προβάλλει στον υποθάλαμο, επισημάνθηκε επίσης. Σύμφωνα με την έλλειψη εκτεταμένης μετάδοσης του ιού, τα ζώα δεν εμφάνισαν σημεία ασθένειας στα 7 dpi. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι ο rVSV(RABV-G) μπορεί να εξαπλωθεί σε ανάδρομη κατεύθυνση από το σημείο της ένεσης, αλλά δεν εξετάζουν εάν ο ιός μπορεί να εξαπλωθεί αποκλειστικά προς την ανάδρομη κατεύθυνση. Η κατευθυντική διασυναπτική εξειδίκευση μπορεί να αντιμετωπιστεί οριστικά μόνο χρησιμοποιώντας ένα μονοκατευθυντικό κύκλωμα. Ως εκ τούτου, στραφήκαμε στον πρωτεύοντα κινητικό φλοιό (M1) με τη σύνδεση CP, στην οποία οι νευρώνες προβάλλουν από τον φλοιό προς το CP, αλλά όχι προς την άλλη κατεύθυνση (Εικόνα 4Η) (Beier et al., 2011). Οι ενέσεις rVSV(RABV-G) στο M1 δεν θα πρέπει να επισημαίνουν τους νευρώνες στο CP, εάν ο ιός μπορεί να επισημάνει κύτταρα μόνο στις συνάψεις προς την ανάδρομη κατεύθυνση. Πράγματι, στα 2 dpi, επισημάνθηκαν οι περιοχές που προβάλλουν απευθείας στο σημείο της ένεσης, συμπεριλαμβανομένου του ετερόπλευρου φλοιού (Εικόνα 4I). Μόνο άξονες από φλοιώδη κύτταρα παρατηρήθηκαν στο CP, χωρίς να υπάρχουν επισημασμένα με GFP κυτταρικά σώματα στο CP (Εικόνα 4J), σύμφωνα με την έλλειψη προγενέστερης διασυναπτικής εξάπλωσης. Μέχρι 3 dpi, παρατηρήθηκε ένας μικρός αριθμός μεσαίων ακανθωδών νευρώνων (MSNs) στο CP, πιθανότατα μέσω δευτερογενούς εξάπλωσης από αρχικά μολυσμένους θαλαμικούς νευρώνες ή νευρώνες GP (δεδομένα δεν εμφανίζονται). Ένα ιδιαίτερο πλεονέκτημα των ανάδρομων ιικών ανιχνευτών είναι η ικανότητα επισήμανσης των νευρώνων του ΚΝΣ που προβάλλουν σε περιφερειακές θέσεις. Αυτή ήταν μια ισχυρή εφαρμογή τόσο του RABV όσο και του PRV (Ugolini et al., 1989; Standish et al., 1994). Για να ελέγξουμε εάν το rVSV(RABV-G) θα μπορούσε επίσης να εκτελέσει αυτή τη λειτουργία, εξετάσαμε τη νεύρωση της επιφάνειας της σκληράς μήνιγγας από νευρώνες του τριδύμου γαγγλίου, ένα νευρωνικό κύκλωμα που πιστεύεται ότι εμπλέκεται στους πονοκεφάλους ημικρανίας (Penfield και McNaughton, 1940; Mayberg et αϊ., 1984). Αυτοί οι νευρώνες έχουν άξονες, αλλά όχι κανονικούς δενδρίτες και στέλνουν προβολές στον νωτιαίο μυελό και το εγκεφαλικό στέλεχος. Επομένως, ο μόνος τρόπος με τον οποίο οι νευρώνες του τριδύμου θα μπορούσαν να επισημανθούν από την ιική εφαρμογή στη μήνιγγα είναι μέσω της ανάδρομης πρόσληψης του ιού. Εφαρμόσαμε rVSV(RABV-G) στην άθικτη σκληρή μήνιγγα και αναλύσαμε τη μήνιγγα, το τρίδυμο γάγγλιο και το ΚΝΣ για επισήμανση (Εικόνα 4Κ). Στο πιο πρώιμο χρονικό σημείο που εξετάστηκε, 3 dpi, παρατηρήσαμε άξονες να ταξιδεύουν κατά μήκος της μήνιγγας, αλλά ελάχιστα άλλα στοιχεία μόλυνσης (Εικόνα 4L). Δεν παρατηρήθηκαν επισημασμένα νευρωνικά κυτταρικά σώματα στη μήνιγγα, κάτι που συνάδει με την έλλειψη νευρώνων σε αυτή την επιφάνεια. Αντίθετα, βρήκαμε σημασμένα κυτταρικά σώματα στο τρίδυμο γάγγλιο (Εικόνα 4Μ). Δεν παρατηρήθηκε μόλυνση στο ΚΝΣ, ακόμη και στα 4 dpi, σύμφωνα με την έλλειψη εισροών από τον εγκέφαλο στο τρίδυμο γάγγλιο (N = 4 ζώα). του rVSV (RABV-G) έγιναν στο CP (Σχήμα 5Α). Προκειμένου να προσδιοριστεί ποια κύτταρα επισημάνθηκαν με άμεση πρόσληψη ιού στο εμβόλιο, ένα ξεχωριστό σύνολο ζώων εγχύθηκε στο CP με το ανίκανο για αναπαραγωγή rVSV G(RABV-G) (Ν = 3 ζώα, αναλύθηκαν 3 dpi). Κύτταρα επισημασμένα με rVSV G(RABV-G) παρατηρήθηκαν στο CP, GP, στη μέλαινα ουσία (SN), στον θάλαμο και στα στρώματα 3 και 5 του φλοιού, σύμφωνα με μόλυνση στο άκρο του άξονα και ανάδρομη επισήμανση κυτταρικών σωμάτων νευρώνων γνωστό ότι προβάλλει απευθείας στο CP (Εικόνα 5C) (Albin et al., 1995). Οι περιοχές που επισημαίνονται με έγχυση CP υποδεικνύονται στο Σχήμα 5Β. Τα πρότυπα εξάπλωσης για το ικανό για αναπαραγωγή rVSV(RABV-G) χαρακτηρίστηκαν κατά τη διάρκεια 1-5 dpi (Εικόνες 5D-H). Κατά τη διάρκεια αυτού του διαστήματος, προοδευτικά περισσότερα κύτταρα σε μολυσμένες περιοχές σημάνθηκαν με rVSV(RABV-G), συμπεριλαμβανομένων εντός της CP, του βασικού πυρήνα, του φλοιού και της GP (αναφέρονται στο Σχήμα 5Β). Επιπλέον, περισσότερα φλοιώδη κύτταρα επισημάνθηκαν σε ομάδες κοντά στους φλοιώδεις πυραμιδικούς νευρώνες, αμφότερες και ετερόπλευρες από την πλευρά που έγινε η ένεση, συμπεριλαμβανομένων των νευρογλοιακά κυττάρων (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Αυτά τα δεδομένα έρχονται σε αντίθεση με εκείνα που παρατηρήθηκαν μετά από μόλυνση με έναν προγενέστερο διασυναπτικό ιχνηθέτη ιό, όπως ο rVSV με το δικό του γονίδιο G, rVSV(VSV-G) (Εικόνα 5Β). Στα 3 dpi μετά την έγχυση rVSV(VSV-G) στο CP, ο εγκεφαλικός φλοιός δεν επισημάνθηκε, αλλά οι περιοχές που έλαβαν προβολές από το CP, όπως το STn, GP και SN, επισημάνθηκαν (Beier et al., 2011) Προκειμένου να διερευνηθούν άλλες περιοχές για ενδείξεις ανάδρομης διασυναπτικής εξάπλωσης από κύτταρο σε κύτταρο, ο βασικός πυρήνας εξετάστηκε μετά από μόλυνση του CP με ικανό για αναπαραγωγή rVSV (RABV-G). Ο βασικός πυρήνας επισημάνθηκε με 2 dpi (Εικόνες 5Ε-Η), σύμφωνα με τουλάχιστον ένα μόνο διασυναπτικό άλμα, καθώς αυτή η περιοχή δεν προβάλλει απευθείας στο CP. Ο ιός φάνηκε να ταξιδεύει διασυναπτικά με ρυθμό περίπου 1 σύναψης την ημέρα, όπως αποδεικνύεται από την έλλειψη επισημασμένων νευρογλοιαφόρων κυττάρων στον φλοιό και την έλλειψη νευρώνων στον βασικό πυρήνα σε 1 dpi και την ετικέτα που εμφανίζεται σε αυτούς τους τύπους/περιοχές κυττάρων στα 2 dpi, όπως παρατηρήθηκε προηγουμένως (Beier et al., 2011) . Η επισήμανση παρέμεινε καλά περιορισμένη στα αναμενόμενα κυκλώματα του φλοιού στα 5 dpi, υποδηλώνοντας ότι η εξάπλωση του ιού γίνεται λιγότερο αποτελεσματική μετά τη διασταύρωση μιας ή δύο συνδέσεων, σύμφωνα με τις ενέσεις στο V1 (Εικόνα 4) . Ενώ τα γλοιακά κύτταρα μπορούν να μολυνθούν και παρατηρήθηκαν κοντά στο σημείο της ένεσης (van den Pol et al., 2002; Chauhan et al., 2010), γενικά δεν παρατηρήθηκαν μολυσμένα γλοιακά κύτταρα μακριά από το σημείο της ένεσης. Ένα πλεονέκτημα της ύπαρξης τόσο πρόσθιων όσο και ανάδρομων μορφών του ίδιου ιού είναι ότι μπορούν να χρησιμοποιηθούν παράλληλα ή παράλληλα, για τον εντοπισμό κυκλωμάτων προς και από ένα μόνο ή πολλαπλά σημεία ένεσης, με κάθε ιό να έχει παρόμοια κινητική εξάπλωσης και γονιδιακής έκφρασης. Στην πραγματικότητα, εάν χρησιμοποιούνται διαφορετικά φθοροφόρα σε διαφορετικούς ιούς, π.χ., rVSV(VSV-G) και rVSV(RABV-G), τότε οι ιοί μπορούν να εγχυθούν ταυτόχρονα στην ίδια θέση και η μετάδοσή τους μπορεί να ανιχνευθεί ανεξάρτητα (Εικόνα 6Α ). Αυτό είναι πιο απλό εάν δεν υπάρχουν κύτταρα στο σημείο της ένεσης που να έχουν αρχικά μολυνθεί και από τους δύο ιούς. Τα συν-μολυνθέντα κύτταρα μπορούν εύκολα να ανιχνευθούν, καθώς θα εκφράζουν και τις δύο φθορίζουσες πρωτεΐνες λίγο μετά την ένεση. Για να καθοριστεί εάν δύο ιοί θα επέτρεπαν την ταυτόχρονη πρόσθια και ανάδρομη διασυναπτική ιχνηλάτηση από ένα μόνο σημείο ένεσης, μια Αφροδίτη που εκφράζει rVSV (VSV-G) και ένα mCherry που εκφράζει rVSV (RABV-G) εγχύθηκαν μεμονωμένα (Εικόνες 6B-D) ή συν-έγχυσαν (Εικόνες 6E-G) στον κινητικό φλοιό και οι εγκέφαλοι εξετάστηκαν 3 dpi. Το πρότυπο σήμανσης από τους εγκεφάλους που εγχύθηκαν ταυτόχρονα ήταν ισοδύναμο με τα πρότυπα που παρατηρήθηκαν όταν κάθε ιός εγχύθηκε μεμονωμένα: ο rVSV(VSV-G) παρατηρήθηκε ότι μολύνει νευρώνες στον φλοιό, το CP και τους κατάντη πυρήνες, ενώ ο rVSV(RABV- G) δεν παρατηρήθηκε να μολύνει νευρώνες στο CP, αλλά μάλλον στον θάλαμο και τον βασικό πυρήνα (N = 4). Το αρχικό ποσοστό συν-μόλυνσης εξαρτάται από την παρουσία ή την απουσία επισήμανσης υποδεικνύεται με (+) και (-), αντίστοιχα. Η έκταση της επισήμανσης υποδεικνύεται από τον αριθμό (+). Μερικά ζώα μολύνθηκαν με ιούς G για να προσδιοριστεί ποιες περιοχές επισημάνθηκαν με άμεση πρόσληψη των ιοσωμάτων, παρά με αντιγραφή και μετάδοση. Αυτά θυσιάστηκαν στα 3 dpi. (Γ) Παρακολπική τομή εγκεφάλου μολυσμένου με VSV[ελληνικό δέλτα]G(RABV-G). Το σημείο της ένεσης σημειώνεται με ένα κόκκινο βέλος. Αρκετές περιοχές που προβάλλουν απευθείας στο CP επισημάνθηκαν λόγω της άμεσης πρόσληψης των βιριόντων, συμπεριλαμβανομένου του φλοιού, του θαλάμου και του GP (κεφαλές βέλους), 3 dpi. η δόση του αρχικού εμβολιασμού. Κατά την ένεση 3 × 10 3 μονάδων σχηματισμού εστίασης (ffu) rVSV(VSV-G) και 3 × 104 ffu rVSV(RABV-G), δεν παρατηρήθηκε συνλοίμωξη στο σημείο της ένεσης. Έτσι, η συν-μόλυνση της ίδιας περιοχής του εγκεφάλου, χωρίς ταυτόχρονη μόλυνση των ίδιων κυττάρων, δεν αλλάζει τη συμπεριφορά εξάπλωσης είτε του rVSV(VSV-G) είτε του rVSV(RABV-G). Ένα παράδειγμα του τρόπου με τον οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί αυτό το διπλό ανάδρομο και προοδευτικό σύστημα διασυναπτικής ιχνηλάτησης είναι να προσδιοριστεί εάν τρία σύνορα σε νευρωνικά κυκλώματα www.frontiersin.org Φεβρουάριος 2013 | Τόμος 7 | Άρθρο 11 | Συνδέονται 8 διακριτές περιοχές και η κατευθυντικότητα οποιωνδήποτε συνδέσεων. Για παράδειγμα, ο πρόσθιος διασυναπτικός ιός μπορεί να εγχυθεί σε μια περιοχή, ο ανάδρομος σε μια άλλη, και μια τρίτη περιοχή μπορεί στη συνέχεια να εξεταστεί για ενδείξεις επισήμανσης από τον έναν ή και τους δύο ιούς (π.χ., Σχήμα 6Η). Για να δοκιμαστεί αυτή η πιθανότητα, ο rVSV(VSV-G) εγχύθηκε στον κινητικό φλοιό, ο rVSV(RABV-G) εγχύθηκε στη μέλαινα ουσία pars reticulara (SNr) και τα ζώα θυσιάστηκαν στα 3 dpi. Παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα επισημάνθηκαν μεμονωμένα, είτε με Venus [rVSV(VSV-G)] είτε με mCherry [rVSV(RABV-G)], και εντοπίστηκαν σε μεγάλο βαθμό σε διαφορετικές περιοχές της CP (Εικόνες 6I,J) (N = 3) . Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι πρόσθετες συνδέσεις από τα κύτταρα που μολύνθηκαν με rVSV(VSV-G) στο Μ1 ήταν με CP MSN που δεν προβάλλονταν στην περιοχή του SNr που εγχύθηκε με rVSV(RABV-G) (Ν = 3 ζώα). Εκτός από την πολυσυναπτική ανίχνευση, το VSV μπορεί να τροποποιηθεί για να ανιχνεύει κυκλώματα μονοσυναπτικά (Beier et al., 2011). Με το RABV, αυτό επιτεύχθηκε in vivo με μόλυνση πρώτα με έναν αδενο-σχετιζόμενο ιό (AAV) που εκφράζει TVA, έναν υποδοχέα για έναν ρετροϊό πτηνών, και RABV-G (Wall et al., 2010). Αυτό ακολούθησε 3 εβδομάδες αργότερα από μόλυνση με G RABV με χιμαιρική γλυκοπρωτεΐνη EnvA/RABV-G στην επιφάνεια του ιού (Wickersham et al., 2007b), η οποία επέτρεψε τη μόλυνση ειδικά των κυττάρων που εκφράζουν TVA. Μια παρόμοια στρατηγική χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί η ικανότητα του rVSV να εντοπίζει μονοσυναπτικά αναδρομικά συνδεδεμένους νευρώνες in vivo. Για τη δοκιμή αυτή χρησιμοποιήθηκαν είσοδοι σε νευρώνες που εκφράζουν την ακετυλοτρανσφεράση χολίνης (ChAT) στο ραβδωτό σώμα. Αυτοί οι νευρώνες λαμβάνουν κυρίως εισροή από τον φλοιό και τον θάλαμο (Thomas et al., 2000; Bloomfield et al., 2007) (Εικόνα 7Α). Για να επισημάνουμε αυτόν τον πληθυσμό, διασταυρώσαμε ποντίκια ChAT-Cre με ποντίκια Ai9, τα οποία εκφράζουν tdTomato σε κύτταρα με ιστορικό έκφρασης Cre (Madisen et al., 2010). Ποντίκια ηλικίας έξι εβδομάδων από αυτή τη διασταύρωση ενέθηκαν στην CP με δύο φορείς AAV: ο ένας εκφράζει μια πρωτεΐνη σύντηξης TVA-mCherry υπό όρους Cre-contition και ένας άλλος που εκφράζει μια συντηγμένη πρωτεΐνη RABV-G. Δύο εβδομάδες αργότερα, στα ποντίκια έγινε ένεση στις ίδιες συντεταγμένες με rVSV G με τη χιμαιρική γλυκοπρωτεΐνη EnvA/RABV-G στην επιφάνεια του ιού [rVSV G(A/RG)] (Beier et al., 2011) . Κύτταρα που μολύνθηκαν επιτυχώς με αυτούς τους δύο φορείς AAV θα μπορούσαν να φιλοξενήσουν μόλυνση από έναν rVSV και θα πρέπει να μπορούν να παράγουν ιοσωμάτια rVSV με RABV-G στην επιφάνεια. Τέτοια κύτταρα εκκίνησης θα πρέπει επίσης να εκφράζουν tdTomato και GFP. Εάν ο rVSV επρόκειτο να παραχθεί και εάν επρόκειτο να μεταδοθεί σε όλη τη σύναψη ανάδρομα, οι νευρώνες του φλοιού και του θαλάμου θα πρέπει να επισημαίνονται με GFP. Τα ποντίκια στα οποία έγινε ένεση με αυτούς τους ιούς AAV και rVSV θυσιάστηκαν 5 ημέρες μετά τη μόλυνση με rVSV και οι εγκέφαλοι αναλύθηκαν για φθορισμό. Όπως αναμενόταν για τα κύτταρα εκκίνησης, ορισμένοι νευρώνες στο CP εξέφρασαν τόσο tdTomato όσο και GFP (Εικόνα 7Β). Εκτός του CP, παρατηρήθηκαν μικροί αριθμοί νευρώνων GFP+ που δεν ήταν mCherry+ στον φλοιό (Εικόνες 7C,D) και στον θάλαμο (Εικόνα 7Ε), σύμφωνα με την ανάδρομη εξάπλωση. Ζώα ελέγχου που δεν εκφράζουν Cre, ή δεν έχουν λάβει ένεση με AAV που κωδικοποιεί RABV-G, δεν επισήμαναν κύτταρα στον φλοιό ή στον θάλαμο (N = 3 και για τους μάρτυρες και για την πειραματική κατάσταση). Εδώ, αναφέρουμε τη χρήση του rVSV ως ανάδρομου διασυναπτικού ιχνηθέτης για κύκλωμα ΚΝΣ. Το VSV μπορεί να τροποποιηθεί για να κωδικοποιεί την πρωτεΐνη RABV-G στο ιικό γονιδίωμα, επιτρέποντας στον ιό να αναπαραχθεί και να μεταδοθεί σε πολλαπλά συναπτικά συνδεδεμένα κύτταρα, δηλαδή ως πολυσυναπτικός ιχνηθέτης. Εναλλακτικά, εάν ο ιός έχει διαγραφεί το γονίδιο G από το γονιδίωμά του και το RABV-G παρέχεται σε trans, συμπεριφέρεται ως μονοσυναπτικός ιχνηθέτης (Beier et al., 2011). Αν και είναι γνωστό εδώ και πολλά χρόνια ότι το RABV ταξιδεύει ανάδρομα μεταξύ των νευρώνων (Astic et al., 1993; Ugolini, 1995; Kelly and Strick, 2003) και η ψευδοτυποποίηση φακοϊών με RABV-G είναι επαρκής για αξονική μεταφορά (Mazarakis et al., 2001), η εξειδίκευση της ανάδρομης μετάδοσης μεταξύ των νευρώνων δεν είχε σαφώς αποδειχθεί ότι είναι ιδιότητα της ίδιας της πρωτεΐνης G, όπως μπορεί να οφείλεται σε άλλες ιικές πρωτεΐνες επιπλέον ή αντί της ιικής πρωτεΐνης G. Εφόσον το εγγενές VSV δεν έχει αυτές τις ανάδρομες διασυναπτικές ιδιότητες (van den Pol et al., 2002; Beier et al., 2011) και η μόνη αλλαγή στο γονιδίωμα VSV ήταν η αντικατάσταση του γονιδίου VSV G με το γονίδιο G του RABV, είναι σαφές ότι η γλυκοπρωτεΐνη RABV είναι υπεύθυνη για την ανάδρομη κατεύθυνση της μετάδοσης του ιού στις συνάψεις, στο τουλάχιστον στην περίπτωση του rVSV. Η πρώιμη έναρξη της γονιδιακής έκφρασης από το VSV σε σχέση με το RABV (μία ώρα έναντι πολλαπλών ωρών) το καθιστά ευεργετικό σε πειραματικά παραδείγματα στα οποία το πείραμα πρέπει να γίνει μέσα σε ένα στενό χρονικό διάστημα, όπως ο ιστός φέτες και εκφυτεύματα. Επιπλέον, περισσότερα από ένα διαγονίδια μπορούν να κωδικοποιηθούν στο γονιδίωμα του ιού χωρίς την ανάγκη στοιχείου 2Α ή IRES. Η χρήση της πρώτης θέσης του γονιδιώματος ενισχύει το επίπεδο έκφρασης του διαγονιδίου που έχει εισαχθεί σε αυτή τη θέση, καθώς το VSV (και το RABV) εκφράζουν γονίδια σε μεταγραφική κλίση. Επομένως, το πρώτο γονίδιο είναι το πιο υψηλά μεταγραφόμενο (Knipe, 2007) . Αυτό οδηγεί σε ορθολογικές προβλέψεις των επιπέδων έκφρασης, έτσι ώστε κάποιος να μπορεί να επιλέξει τη θέση εισαγωγής ενός διαγονιδίου, ή διαγονιδίων, σύμφωνα με αυτήν την κλίση και το επιθυμητό επίπεδο έκφρασης. Το μέγεθος του ιικού καψιδίου προφανώς δεν είναι άκαμπτο, επιτρέποντας τη συμπερίληψη γονιδιωμάτων που είναι σημαντικά μεγαλύτερα από το φυσικό γονιδίωμα, σε αντίθεση με την άκαμπτη χωρητικότητα για ορισμένους άλλους ιικούς φορείς, όπως AAV Yan et al., 2000). Το VSV μπορεί να γίνει για να εξαπλωθεί προς τα κάτω (Beier et al., 2011) ή ανάδρομα στις συνάψεις με την αλλαγή ενός μόνο γονιδίου προσφέρει πολλά πλεονεκτήματα σε σχέση με τους ιικούς ιχνηθέτες που μέχρι τώρα δεν έχουν δείξει τέτοια ευελιξία στην κατευθυντικότητα της ανίχνευσης. Εκτός από την προφανή εφαρμογή της ιχνηλάτησης των πρόσθιων συνδέσεων, μπορούν να γίνουν συνδυασμοί για την εκμετάλλευση των διαφορετικών μορφών του ιού. Ένα παράδειγμα που χρησιμοποιεί την ταυτόχρονη μόλυνση με μια πρόσθια και ανάδρομη μορφή του VSV παρουσιάζεται στο Σχήμα 6. Αυτό το πείραμα σχεδιάστηκε για να εξετάσει εάν οι πρόσθιες προβολές από τον φλοιό προς το CP θα σημείωναν τις ίδιες περιοχές του εγκεφάλου που επισημάνθηκαν από έναν ανάδρομο ιό που εγχύθηκε στο SN. Αν και ένα μπλοκ επιμόλυνσης από τον ιό μπορεί να αποκλείει τη μόλυνση του ίδιου κυττάρου με πολλαπλούς rVSVs, τα γειτονικά κύτταρα θα μπορούσαν ακόμα να επισημανθούν από διαφορετικούς ιούς (Whitaker-Dowling et al., 1983). Τα παρατηρούμενα αποτελέσματα θα μπορούσαν να οφείλονται σε μια προτιμώμενη επισήμανση από τον προσόδιο διασυναπτικό ιό των MSN έμμεσης οδού σε αυτό το πείραμα, τα οποία στη συνέχεια συνάπτονται στον GP, αντανακλώντας έτσι μια ιογενή προκατάληψη. Εναλλακτικά, θα μπορούσε να υποδείξει ότι οι νευρώνες του φλοιού στην περιοχή της ένεσης σε μεγάλο βαθμό δεν επισημαίνουν τα MSN που προβάλλουν στην περιοχή του SN στην οποία εγχύεται ο ανάδρομος ιός. Μια επιπλέον πιθανότητα είναι ότι χρησιμοποιήθηκε πολύ λίγος ιός για την παρατήρηση της συνεπισήμανσης μιας δεδομένης περιοχής. Ωστόσο, δεδομένης της πυκνότητας της μόλυνσης (δηλαδή, Σχήματα 6I, J), η τελευταία πιθανότητα φαίνεται απίθανη. Επιπλέον, η εξάπλωση του πολυσυναπτικού rVSV (RABV-G) φαίνεται να μειώνεται με αυξανόμενους αριθμούς συνάψεων που διασταυρώνονται, επιτρέποντας μια ανάλυση πιο περιορισμένης ιικής εξάπλωσης. Αυτό είναι εντελώς τυχαίο, καθώς αν συνεχιζόταν η εξάπλωση, θα οδηγούσε σε εκτεταμένη μόλυνση και θανατηφόρο θάνατο. Επιπλέον, η ανακατασκευή της συνδεσιμότητας θα ήταν πιο δύσκολη. Αυτή η μειωμένη απόδοση φαίνεται να ισχύει και για τη μονοσυναπτική μορφή του VSV που συμπληρώνεται με RABV-G, καθώς η αποτελεσματικότητα μετάδοσης εμφανίστηκε χαμηλότερη από το συγκρίσιμο πείραμα με το RABV (Watabe-Uchida et al., 2012). Αυτό πιθανότατα οφείλεται στην εξασθένηση του ιού όταν το VSV-G αντικατασταθεί με το RABV-G. Μας προσέλκυσε η χρήση του VSV ως ιικού ιχνηθέτη λόγω του μακροχρόνιου ιστορικού του ως ασφαλούς, ικανού για αναπαραγωγή παράγοντα εργαστηρίου. Οι εργαζόμενοι στο εργαστήριο που χρησιμοποιούν VSV δεν έχουν προσβληθεί από καμία ασθένεια και οι φυσικές μολύνσεις από VSV μεταξύ των ανθρώπινων πληθυσμών στην Κεντρική Αμερική και τις νοτιοδυτικές Ηνωμένες Πολιτείες (Rodríguez, 2002) συμβαίνουν χωρίς εμφανή παθολογία (Johnson et al., 1966; Brody et al., 1967). Το VSV ήταν επομένως ένας ελκυστικός υποψήφιος για τη χρήση του ως πολυσυναπτικός ιχνηθέτης για μελέτες ΚΝΣ, κάτι που απαιτεί ικανότητα αναπαραγωγής μέσω πολλαπλών κύκλων μετάδοσης. Τόσο οι ικανές για αναπαραγωγή όσο και οι μη ικανές μορφές VSV χρησιμοποιούνται υπό περιορισμό Βιοασφάλειας Επιπέδου 2. Το RABV με ικανότητα αναπαραγωγής είναι Επίπεδο Βιοασφάλειας 3, λόγω του γεγονότος ότι η μόλυνση με ικανό για αναπαραγωγή RABV είναι σχεδόν πάντα θανατηφόρα για τον άνθρωπο και τα ποντίκια όταν μολύνονται ενδοεγκεφαλικά (Smith, 1981; Knipe, 2007). Οι διαφορές στην παθογένεια μεταξύ του VSV και του RABV είναι πιθανό να οφείλονται στην ικανότητα του RABV να αποφεύγει το έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα, ιδιαίτερα την ιντερφερόνη (Hangartner et al., 2006; Junt et al., 2007; Lyles and Rupprecht, 2007; Rieder και Conzelmann, 2009; Iannacone et al., 2010). Η μόλυνση από VSV πυροδοτεί αποτελεσματικά μια απόκριση ιντερφερόνης και δεν έχει εξελίξει μια μέθοδο διαφυγής από αυτήν την απόκριση, σε αντίθεση με το RABV (Brzózka et al., 2006). Στην πραγματικότητα, το VSV επιδιώκεται ως εμβόλιο για άλλους ιούς, συμπεριλαμβανομένου του RABV (Lichty et al., 2004; Publicover et al., 2004; Kapadia et al., 2005; Schwartz et al., 2007; Iyer et al., 2009; Geisbert και Feldmann, 2011). Ο VSV τυπικά δεν εξαπλώνεται πέρα ​​από την αρχικά μολυσμένη περιοχή στην περιφέρεια (Kramer et al., 1983; Vogel και Fertsch, 1987). Αυτό πιθανότατα είναι η αιτία των ήσσονος σημασίας ή απόντων συμπτωμάτων σε ανθρώπους και ζώα που έχουν μολυνθεί στη φύση. Έτσι, οι πολυσυναπτικοί φορείς VSV προβλέπεται ότι είναι πολύ πιο ασφαλείς από τους πολυσυναπτικούς φορείς RABV. Δοκιμάσαμε αυτήν την πρόβλεψη με ένεση σε μια σειρά ποντικών στα πέλματα και στους μύες των πίσω ποδιών με rVSV(RABV-G), με αποτέλεσμα κανένα ζώο που έλαβαν ένεση να έδειξε καμία ένδειξη νοσηρότητας ή θνησιμότητας (Beier, Goz et al., κατά την προετοιμασία ) . Αν και είναι ασφαλέστερο για τους εργαζόμενους στο εργαστήριο από το RABV, το κύριο μειονέκτημα στη χρήση του VSV είναι η ταχεία κυτταρική του τοξικότητα (van den Pol et al., 2009; Beier et al., 2011). Η τοξικότητα οφείλεται στην καταστολή της κυτταρικής μεταγραφής και στην παρεμπόδιση της εξαγωγής κυτταρικών RNA από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα (Black and Lyles, 1992; Her et al., 1997; Ahmed and Lyles, 1998; Petersen et al., 2000; von Kobbe et al., 2000), καθώς και αναστολή της μετάφρασης κυτταρικών mRNAs (Francoeur et al., 1987; Jayakar et al., 2000; Kopecky et al., Frontiers in Neural Circuits www.frontiersin.org Φεβρουάριος 2013 | Τόμος 7 | Άρθρο 11 | 10 2001). Το VSV είναι πολύ πιο γρήγορο να εφαρμόσει το πρόγραμμα γονιδιακής έκφρασης του από το RABV, έτσι ώστε τα κύτταρα να υποφέρουν τις τοξικές επιδράσεις πιο γρήγορα από ό,τι μετά τη μόλυνση με RABV. Μια πτυχή του VSV που μπορεί να αξιοποιηθεί στο μέλλον για να βελτιωθεί η ταχύτητα της τοξικότητας είναι η χρήση μεταλλαγμάτων και παραλλαγών του VSV. Ένας τέτοιος μεταλλαγμένος είναι ο M51R, ο οποίος μας επέτρεψε να διεξάγουμε φυσιολογικές αναλύσεις προ- και μετασυναπτικών κυττάρων (Beier et al., 2011). Βρισκόμαστε στη διαδικασία εξέτασης των ιδιοτήτων μετάδοσης αυτού του μεταλλάγματος in vivo, καθώς και των επιδράσεων άλλων μεταλλάξεων ή ιικών παραλλαγών στην παράταση της υγείας των νευρώνων μετά τη μόλυνση. Οι φορείς rVSV μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη μελέτη της συνδεσιμότητας των νευρωνικών κυκλωμάτων. Εκτός από τους συνδυασμούς μορφών VSV με ικανότητα αναπαραγωγής, οι μονοσυναπτικές μορφές του ιού που δεν έχουν ικανότητα αναπαραγωγής μπορούν εύκολα να συνδυαστούν, χωρίς να απαιτείται αλλαγή ιών (Beier et al., 2011). Αυτό επιτρέπει έναν απλό τρόπο μελέτης τόσο των προβολών εντός όσο και εκτός ενός γενετικά καθορισμένου κυτταρικού πληθυσμού. Αυτό μπορεί να γίνει με το ίδιο ιικό γονιδίωμα, με μόνη αλλαγή που χρειάζεται να είναι η γλυκοπρωτεΐνη, για την επιλογή της κατεύθυνσης μετάδοσης. Αυτή η ευελιξία του VSV το καθιστά ένα ισχυρό φορέα πολλαπλών εφαρμογών για τη μελέτη της συνδεσιμότητας στο CNS. Όλοι οι κλώνοι rVSV κλωνοποιήθηκαν από τη ραχοκοκαλιά rVSV G (Chandran et al., 2005). Το mCherry, το Kusabira orange, η Venus και η CFP κλωνοποιήθηκαν στην πρώτη θέση (GFP) χρησιμοποιώντας τοποθεσίες XhoI και MscI και VSV-G (δώρο από τον Richard Mulligan, Harvard Medical School, Boston, MA) και RABV-G (δώρο από τον Ed Callaway, Salk Institute, San Diego, CA) κλωνοποιήθηκαν στην πέμπτη θέση (G) χρησιμοποιώντας τις θέσεις περιορισμού MluI και NotI. Γονίδια για φθορίζουσες πρωτεΐνες ελήφθησαν από την Clontech. Οι ιοί διασώθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Whelan et al., 1995). Σε συρροή 95%, οκτώ πλάκες 10 cm κυττάρων BSR μολύνθηκαν σε ΜΟΙ 0,01. Τα ιικά υπερκείμενα συλλέχθηκαν σε χρονικά διαστήματα 24 ωρών και υπερφυγοκεντρήθηκαν στις 21.000 RPM χρησιμοποιώντας ρότορα SW28 και επαναιωρήθηκαν στο 0,2% του αρχικού όγκου. Για τιτλοδότηση, συγκεντρωμένα αποθέματα ιού εφαρμόστηκαν σε σειρά αραιώσεων σε 100% συρρέοντα κύτταρα BSR και οι πλάκες εξετάστηκαν στους 12 hpi. Τα αποθέματα ιών αποθηκεύτηκαν στους -80 C. Για τους ιούς G, 293Τ κύτταρα επιμολύνθηκαν με PEI (Ehrhardt et al., 2006) σε συρροή 70% σε δίσκους 10 cm με 5 μg pCAG-RABV-G. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα μολύνθηκαν σε ΜΟΙ 0,01 με rVSV G που εκφράζει είτε GFP είτε mCherry. Τα ιικά υπερκείμενα συλλέχθηκαν για τις επόμενες 4 ημέρες σε διαστήματα 24 ωρών. Τα παρασκευάσματα ιών είναι τώρα διαθέσιμα από τον ιικό πυρήνα Salk GT3 (http://vectorcore.salk.edu/). Όλα τα πλασμίδια είναι διαθέσιμα από την Addgene (http://www.addgene.org/). Τα πλασμίδια AAV-FLEx-RABV-G και AAV-FLEx-TVA-mCherry προέρχονται από το εργαστήριο του Naoshige Uchida (Watabe-Uchida et al., 2012) και τα αποθέματα ιών ήταν γενναιόδωρα δώρα από τον Brad Lowell, την Ιατρική Σχολή του Χάρβαρντ.ChAT-Cre (B6;129S6-Chat tm1(cre)Lowl /J) και Ai9 (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor<tm9(CAG -tdTomato)Hze>/J) ποντίκια ελήφθησαν από το Jackson Laboratory (Madisen et al., 2010). Ποντίκια CD-1 ηλικίας οκτώ εβδομάδων εγχύθηκαν χρησιμοποιώντας τραβηχτούς τριχοειδείς μικροδιανομείς (Drummond Scientific, Cat. No: 5-000-2005), χρησιμοποιώντας συντεταγμένες από το The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates (Franklin and Paxinos, 1997). Οι συντεταγμένες έγχυσης (σε mm) που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: Για πολύχρωμη ανάλυση (Σχήματα 1C,D), 3 × 10 9 ffu/mL rVSV εγχύθηκε σε διάφορες περιοχές. Για ενέσεις CP, εγχύθηκαν 100 nL rVSV(RABV-G) ή rVSV(VSV-G) στα 3 × 10 7 ffu/mL με ρυθμό 100 nL/min. Για τους ιούς που δεν έχουν ικανότητα αναπαραγωγής, εγχύθηκαν 100 nL 1 × 10 7 ffu/mL rVSV G(RABV-G) ή rVSV G (VSV-G). Στον κινητικό φλοιό, εγχύθηκαν 100 nL 1 × 10 7 ffu/mL rVSV (RABV-G) και τα ποντίκια συγκέντρωσαν 2 dpi. Για τις ενέσεις V1, εγχύθηκαν 100 nL 3 × 10 10 ffu/mL rVSV (RABV-G) και τα ποντίκια εξετάστηκαν 3 ή 7 dpi. Για λοιμώξεις της σκληρής μήνιγγας, 1 μL 3 × 10 10 ffu/mL rVSV (RABV-G) εφαρμόστηκε στην επιφάνεια της μήνιγγας. Ο ιός αφέθηκε να απορροφηθεί και η επιφάνεια καλύφθηκε στη συνέχεια με οστικό κερί και το τραύμα ράφτηκε. Για συνενέσεις ιού στο ίδιο ζώο, 100 nL ενός συνδυασμού 3 × 10 7 ffu/mL rVSV (VSV- G) και 3 × 10 8 ffu/mL rVSV (RABV-G) εγχύθηκαν ταυτόχρονα στον κινητικό φλοιό και οι εγκέφαλοι εξετάστηκαν 3 dpi. Για ενέσεις των ιών σε διαφορετικές περιοχές, 100 nL 3 × 10 7 ffu/mL rVSV(VSV-G) εγχύθηκαν στο M1 και 100 nL 3 × 10 8 ffu/mL rVSV(RABV-G) στο SNr , και οι εγκέφαλοι εξετάστηκαν 3 dpi. Χρησιμοποιήθηκε χαμηλότερος τίτλος rVSV(VSV-G), καθώς το rVSV(RABV-G) είναι εξασθενημένο. Όλη η εργασία με ποντίκια διεξήχθη σε συνθήκες περιορισμού βιοασφάλειας επιπέδου 2 και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ιδρυματικής Περίθαλψης και Χρήσης Ζώων της Ιατρικής Περιοχής του Longwood. Καταγραφές κατασκευάστηκαν από πυραμιδικούς νευρώνες του φλοιού σε φέτες που ελήφθησαν από ποντίκια της μεταγεννητικής ημέρας 12-18, εμβολιασμένα στο CP 12-18 ώρες πριν με rVSV (RABV-G). Οι φέτες κορώνας (πάχους 300 μm) κόπηκαν σε παγωμένο εξωτερικό διάλυμα που περιείχε (σε mM): 110 χολίνη, 25 NaHCO3, 1,25 NaH2PO4, 2,5 KCl, 7 MgCl2, 0,5 CaCl 1 , 2 γλυκόζη, 2 -ασκορβικό, και 3,1 Na-πυροσταφυλικό, με φυσαλίδες με 95% O2 και 5% CO2. Οι φέτες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ACSF) που περιείχε (σε mM): 127 NaCl, 25 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 2,5 KCl, 1 MgCl 2, 2 CaCl 2 και 25 φυσαλίδες γλυκόζης 95%, 2 και 5% CO 2 . Μετά από μια περίοδο επώασης Σύνορα σε νευρωνικά κυκλώματα www.frontiersin.org Φεβρουάριος 2013 | Τόμος 7 | Άρθρο 11 | 11 από 30-40 λεπτά στους 34 • C, οι φέτες αποθηκεύτηκαν σε θερμοκρασία δωματίου. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σε θερμοκρασία δωματίου (25 • C). Σε όλα τα πειράματα, 50 μΜ πικροτοξίνη, 10 μΜ 2,3-Διοξο-6-νιτρο-1, 2, 3, 4-τετραϋδροβενζο[f]κινοξαλινο-7-σουλφοναμίδιο (NBQX) και 10 μΜ 3-((R) Το -2-καρβοξυπιπεραζιν-4-υλο)-προπυλο-1-φωσφονικό οξύ (CPP) ήταν παρόν στο ACSF για να εμποδίσει τη μετάδοση με τη μεσολάβηση του υποδοχέα GABAA/C, AMPA και NMDA, αντίστοιχα. Όλες οι χημικές ουσίες προέρχονταν από τη Sigma ή την Tocris. Οι καταγραφές ολόκληρων κυττάρων ελήφθησαν από μολυσμένους και μη μολυσμένους πυραμιδικούς νευρώνες του φλοιού βαθιάς στιβάδας που ταυτοποιήθηκαν με φθορισμό βίντεο-IR/DIC και GFP ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας φωτισμό επιφθορισμού. Με τα βαθιά στρώματα του φλοιού, χρησιμοποιήθηκε μικροσκοπία σάρωσης λέιζερ 2 φωτονίων (2PLSM) για την επιβεβαίωση των τύπων κυττάρων με βάση τη μορφολογία. Οι πυραμιδικοί νευρώνες βαθιάς στιβάδας είχαν μεγάλα κυτταρικά σώματα, κλασικό πυραμιδικό σχήμα και δενδριτικές ράχες. Γυάλινα ηλεκτρόδια (2-4 Μ) γεμίστηκαν με εσωτερικό διάλυμα που περιείχε (σε mM): 135 KMeSO 4, 5 KCl, 5 HEPES, 4 MgATP, 0,3 NaGTP, 10 Na 2 HPO 4, 1 EGTA και 0,01 Alexa Fluor-594 (για απεικόνιση νευρωνικής μορφολογίας) ρυθμισμένο σε ρΗ 7,4 με ΚΟΗ. Οι καταγραφές ρεύματος και τάσης έγιναν σε θερμοκρασία δωματίου χρησιμοποιώντας έναν ενισχυτή AxoPatch 200B ή Multiclamp 700B. Τα δεδομένα φιλτραρίστηκαν στα 5 kHz και ψηφιοποιήθηκαν στα 10 kHz. Τα δεδομένα απεικόνισης και φυσιολογίας αποκτήθηκαν και αναλύθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Carter και Sabatini, 2004). Το δυναμικό ηρεμίας της μεμβράνης προσδιορίστηκε από τον μέσο όρο τριών σαρώσεων 5 δευτερολέπτων χωρίς ρεύμα έγχυσης. Οι παθητικές ιδιότητες του στοιχείου, η μεμβράνη (Rm) και η αντίσταση σειράς (Rs) και η χωρητικότητα (Cm), μετρήθηκαν κατά τη σύσφιξη των κυττάρων στα -65 mV και την εφαρμογή βημάτων τάσης από -55 έως -75 mV. Η σχέση ρεύματος-πυροδότησης προσδιορίστηκε στον τρέχοντα σφιγκτήρα με περιόδους 1 δευτερολέπτου εγχυόμενου ρεύματος από 100 έως 500 pA. Η χρονική πορεία των πειραμάτων έκφρασης ιικού γονιδίου διεξήχθη σε οργανοτυπικές καλλιέργειες φέτες ιππόκαμπου που παρασκευάστηκαν από τη μεταγεννητική ημέρα 5-7 Sprague-Dawley αρουραίους όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Stoppini et αϊ., 1991). Οι φέτες μολύνθηκαν μετά από 7 ημέρες in vitro και οι εικόνες αποκτήθηκαν σε μικροσκόπιο δύο φωτονίων.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 21438, "text": "πρόσθιο" } ], "id": 1936, "question": "Σε ποια κατεύθυνση εξαπλώνεται ο ιός της φυσαλιδώδους στοματίτιδας μέσω του νευρικού συστήματος;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Η ενδορρινική εφαρμογή της Zanamivir και της Carrageenan είναι συνεργιστικά ενεργή κατά του ιού της γρίπης Α στο μοντέλο των ποντικώνhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4459876/SHA: f0b1fa4036434b57c8350007d König-Schuster, Marielle; Koller, Christiane; Graf, Christine; Graf, Philipp; Kirchoff, Norman; Reutterer, Benjamin; Seifert, Jan-Marcus; Unger, Hermann; Grassauer, Andreas; Prieschl-Grassauer, Eva; Nakowitsch, SabineΗμερομηνία: 2015-06-08DOI: 10.1371/journal.pone.0128794Άδεια: cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Η Carrageenan είναι μια κλινικά αποδεδειγμένη και διατίθεται στην αγορά ένωση για τη θεραπεία ιογενών λοιμώξεων του ανώτερου αναπνευστικού συστήματος. Καθώς οι λοιμώξεις που προκαλούνται από τον ιό της γρίπης συνοδεύονται συχνά από λοιμώξεις με άλλους αναπνευστικούς ιούς, ο συνδυασμός μιας ειδικής αντιγριπικής ένωσης με το ευρέως ενεργό αντιικό πολυμερές έχει τεράστιες δυνατότητες για τη θεραπεία λοιμώξεων του αναπνευστικού. Έτσι, ο συνδυασμός του ειδικού αντιγριπικού φαρμάκου Zanamivir μαζί με καραγενάνη σε σκεύασμα κατάλληλο για ενδορινική εφαρμογή αξιολογήθηκε in vitro και in-vivo. ΚΥΡΙΑ ΕΥΡΗΜΑΤΑ: Δείχνουμε in vitro ότι η καραγενάνη και η ζαναμιβίρη δρουν συνεργικά έναντι πολλών στελεχών του ιού της γρίπης Α (H1N1(09)pdm, H3N2, H5N1, H7N7). Επιπλέον, αποδεικνύουμε σε ένα μοντέλο θανατηφόρου γρίπης με χαμηλό παθογόνο ιό H7N7 (ΗΑ στενά συνδεδεμένο με τον ιό της γρίπης των πτηνών A(H7N9)) και έναν ιό γρίπης H1N1(09)pdm σε ποντικούς C57BL/6 ότι η συνδυασμένη χρήση και των δύο ενώσεων αυξάνει σημαντικά την επιβίωση των μολυσμένων ζώων σε σύγκριση τόσο με μονοθεραπείες όσο και με εικονικό φάρμακο. Είναι αξιοσημείωτο ότι αυτό το όφελος διατηρείται ακόμη και όταν η θεραπεία ξεκινά έως και 72 ώρες μετά τη μόλυνση. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Ένα ρινικό σπρέι που περιέχει καραγενάνη και Zanamivir θα πρέπει επομένως να δοκιμαστεί για την πρόληψη και τη θεραπεία της μη επιπλεγμένης γρίπης σε κλινικές δοκιμές. Κείμενο: Η περιοδική εμφάνιση νέων παραλλαγών γρίπης αποτελεί παγκόσμια απειλή πανδημίας. Από την εμφάνιση του νέου ιού A(H7N9), περισσότερα από 400 ανθρώπινα κρούσματα αναφέρθηκαν στον ΠΟΥ με ποσοστό θνησιμότητας άνω του 35%. Οι περισσότεροι ασθενείς με λοιμώξεις A(H7N9) είχαν επαφή με πουλερικά ή επισκέπτονταν αγορές ζώντων ζώων. Ωστόσο, ορισμένα σποραδικά κρούσματα φάνηκε να είναι αποτέλεσμα μετάδοσης από άνθρωπο σε άνθρωπο [1, 2] . Σε αντίθεση με τους πανδημικούς ιούς που εισέρχονται πυρετωδώς στον ανθρώπινο πληθυσμό και προκαλούν υψηλά ποσοστά θνησιμότητας, οι ιοί της εποχικής γρίπης προκαλούν γενικά μη επιπλεγμένες και παροδικές λοιμώξεις στον άνθρωπο, με την αντιγραφή του ιού να εντοπίζεται στην ανώτερη αναπνευστική οδό [3, 4]. Ωστόσο, στην πλήρως ανεπτυγμένη της μορφή, η γρίπη είναι μια οξεία αναπνευστική νόσος που οδηγεί σε νοσηλεία και θανάτους κυρίως μεταξύ των ομάδων υψηλού κινδύνου. Παγκοσμίως, οι ετήσιες επιδημίες έχουν ως αποτέλεσμα περίπου τρία έως πέντε εκατομμύρια περιπτώσεις σοβαρών ασθενειών και περίπου 250.000 έως 500.000 θανάτους [5] . Για αυτόν τον λόγο ο ΠΟΥ [6] και το CDC [7] συνιστούν αντιική θεραπεία για κάθε ασθενή με υποψία γρίπης που κινδυνεύει για επιπλοκές γρίπης χωρίς προηγούμενη εργαστηριακή επιβεβαίωση. Είναι γνωστό ότι οι λοιμώξεις από τον ιό της γρίπης συχνά συνοδεύονται από άλλα ιικά παθογόνα [8] . Ανάλογα με τη μέθοδο ανίχνευσης (qRT-PCR ή ανοσοφθορισμός) έχουν βρεθεί διαφορετικές αναλογίες συν-λοιμώξεων. Η ανάλυση με qRT-PCR αποκάλυψε ότι το 54,5-83,3% των θετικών ασθενών στη γρίπη Α ή Β βρέθηκε να έχουν τουλάχιστον μία ταυτόχρονη ιογενή λοίμωξη του αναπνευστικού [9] [10] [11] [12] . Η συχνότητα ανίχνευσης με ανοσοφθορισμό βρέθηκε να είναι ακόμη υψηλότερη (90-100%) [13, 14]. Πιθανά συνακόλουθα ιικά παθογόνα των λοιμώξεων από τον ιό της γρίπης περιλαμβάνουν τον ανθρώπινο ρινοϊό (hRV), τον αναπνευστικό συγκυτιακό ιό, τον αδενοϊό, τον ανθρώπινο κορωνοϊό, τον ανθρώπινο μεταπνευμοϊό και τον ιό της παραγρίπης [14, 15] . Ως αποτέλεσμα των πολλαπλών λοιμώξεων, ένα ειδικό αντιγριπικό μονο- Η θεραπεία θεραπεύει μόνο τη λοίμωξη από τον ιό της γρίπης, αλλά όχι τη μόλυνση με το συνοδό ιικό παθογόνο. Ως εκ τούτου, η θεραπεία συχνά αποτυγχάνει να επιλύσει επαρκώς τα συμπτώματα. Αυτό αντικατοπτρίζεται επίσης από το γεγονός ότι οι αναστολείς νευραμινιδάσης (NI) είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικοί σε ζωικά μοντέλα που διερευνούν μονο-λοιμώξεις γρίπης [16, 17] αλλά παρουσιάζουν χαμηλότερη αποτελεσματικότητα έναντι των συμπτωμάτων της γρίπης σε κλινικές δοκιμές σε ενήλικες με φυσικές λοιμώξεις [18] . Ως εκ τούτου, υπάρχει μεγάλη ιατρική ανάγκη για μια ευρείας δράσης αντιική θεραπεία σε συνδυασμό με μια ειδική θεραπεία κατά της γρίπης για τη θεραπεία ασθενών που πάσχουν από συμπτώματα της ανώτερης αναπνευστικής οδού. Στην ιδανική περίπτωση, οι ουσίες που υπάρχουν στον συνδυασμό αλληλοσυμπληρώνονται με διαφορετικούς τρόπους δράσης, οδηγώντας σε μια θεραπεία που παρέχει πλήρη προστασία έναντι ενός ευρέος φάσματος διαφορετικών αναπνευστικών ιών καθώς και διαφορετικών στελεχών γρίπης με χαμηλή πιθανότητα πρόκλησης μεταλλάξεων διαφυγής. Μία προσέγγιση για μια ευρεία αντιική θεραπεία είναι η δημιουργία ενός προστατευτικού φυσικού φραγμού στη ρινική κοιλότητα με χρήση καραγενάνης. Το Carrageenan είναι ένα υψηλού μοριακού βάρους θειικό πολυμερές που προέρχεται από κόκκινα φύκια (Rhodophyceae) που έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς στη βιομηχανία τροφίμων, καλλυντικών και φαρμακευτικών προϊόντων και είναι γενικά αναγνωρισμένο ως ασφαλές από το FDA (GRAS) (ανασκόπηση στο [19]). Τρεις κύριες μορφές καρραγηνών χρησιμοποιούνται στο εμπόριο: κάπα, γιώτα και λάμδα. Διαφέρουν μεταξύ τους ως προς τον βαθμό θείωσης, τη διαλυτότητα και τις ιδιότητες πηκτωματοποίησης [20] . Ο αντιιικός μηχανισμός της καραγενάνης βασίζεται στην παρεμβολή στην προσκόλληση του ιού. ως συνέπεια, η είσοδος του ιού αναστέλλεται [21, 22]. Η αντιϊκή του δράση εξαρτάται από τον τύπο του πολυμερούς καθώς και από τον ιό και τα κύτταρα-ξενιστές [23] [24] [25] [26] [27] [27] [28] [29] [30] [31] [32] και έχει αναθεωρηθεί στο [33] [34] [35] . Δημοσιεύσαμε ότι το yota-carrageenan είναι ένας ισχυρός αναστολέας της αντιγραφής του hRV [36] και της γρίπης Α [37] και καταδείξαμε την αντιική αποτελεσματικότητα του iota-carrageenan έναντι των ιών του κοινού κρυολογήματος με ενδορινική εφαρμογή σε αρκετές τυχαιοποιημένες, διπλά-τυφλές, παράλληλες ομάδες, εικονικό φάρμακο -ελεγχόμενες κλινικές δοκιμές [38] [39] [40] . Η συγκεντρωτική ανάλυση δύο μελετών που διεξήχθησαν σε 153 παιδιά και 203 ενήλικες αποκάλυψε ότι οι ασθενείς που είχαν μολυνθεί από οποιονδήποτε αναπνευστικό ιό, οι οποίοι υποβλήθηκαν σε ενδορρινική θεραπεία με γιώτα-καρραγενάνη εμφάνισαν 1,9 ημέρες ταχύτερη ανάρρωση από τα συμπτώματα του κοινού κρυολογήματος από τους ασθενείς που έλαβαν εικονικό φάρμακο στην πρόθεση να- θεραπεία πληθυσμού [41, 42] . Η δράση κατά της γρίπης φάνηκε με ανάλυση υποομάδας 49 ασθενών με γρίπη που επωφελήθηκαν από 3,3 ημέρες ταχύτερη ανάρρωση από τα συμπτώματα. Η χρήση ρινικού εκνεφώματος καραγενάνης συσχετίστηκε με σημαντική μείωση του ιικού φορτίου της γρίπης στα ρινικά υγρά και σημαντική αύξηση του αριθμού των ασθενών χωρίς ιούς εντός της περιόδου θεραπείας των 7 ημερών. Σε καλή συμφωνία οι Prieschl-Grassauer είναι συνιδρυτές της Marinomed Biotechnologie GmbH. Η Marinomed Biotechnologie GmbH είχε ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση δεδομένων, την απόφαση για δημοσίευση, την προετοιμασία του χειρογράφου και χρηματοδοτεί τη χρέωση επεξεργασίας του χειρογράφου. με τη βιβλιογραφία [9] [10] [11] [12] [13] [14] παρατηρήσαμε ότι η πλειονότητα των ασθενών που είχαν μολυνθεί από τον ιό της γρίπης υπέφεραν από ταυτόχρονη ιογενή λοίμωξη του αναπνευστικού (66%) όπως προσδιορίστηκε με PCR σε πραγματικό χρόνο. Τα ρινικά σπρέι που περιέχουν καραγενάνη κυκλοφορούν ήδη στην αγορά για τη θεραπεία αναπνευστικών ιογενών λοιμώξεων με διαφορετικές εμπορικές ονομασίες σε 18 χώρες. Προς το παρόν, τα μόνα διαθέσιμα αποτελεσματικά φάρμακα για τη θεραπεία και την πρόληψη μετά την έκθεση της γρίπης είναι το NI (Oseltamivir και Zanamivir παγκοσμίως. Peramivir στην Ιαπωνία και τη Νότια Κορέα). Δεδομένου ότι η μεγάλης κλίμακας χρήση των αναστολέων M2 για προφύλαξη και θεραπεία σε ανθρώπους [43] και γεωργία [44] , οι ιοί της γρίπης που κυκλοφορούν ήδη στερούνται ευαισθησίας σε αυτήν την ομάδα φαρμάκων [45] . Έχουμε ήδη δείξει μια αθροιστική θεραπευτική δράση ενός συνδυαστική θεραπεία με ενδορινικά εφαρμοζόμενη γιώτα-καρραγενάνη και από του στόματος χορηγούμενη οσελταμιβίρη σε θανατηφόρα μολυσμένα H1N1 A/PR/ 8/34 ποντίκια και έναρξη θεραπείας 48 ώρες μετά τη μόλυνση (hpi) [37] . Λόγω αυτών των πολύ υποσχόμενων αποτελεσμάτων αναπτύξαμε περαιτέρω την ιδέα συνδυασμού καρραγενάνης με θεραπεία ΝΙ. Σε αντίθεση με το Oseltamivir, το οποίο πρέπει να ενεργοποιηθεί με μεταβολική μετατροπή, το Zanamivir εφαρμόζεται απευθείας ως δραστικό φάρμακο και μπορεί επίσης να χορηγηθεί ενδορινικά [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] . Η δυνατότητα ενδορρινικής χορήγησης Zanamivir διερευνήθηκε από την GlaxoSmithKline. Σε επτά κλινικές δοκιμές πρόκλησης, 66 εθελοντές μολύνθηκαν από τη γρίπη B/Yamagata/16/88 και 213 από τη γρίπη A/Texas/36/91 (H1N1). 156 από αυτούς τους συμμετέχοντες έλαβαν ενδορινική εφαρμογή Zanamivir σε διαφορετικές δόσεις (ημερήσια επίπεδα δόσης από 6,4 mg έως 96 mg) για προφύλαξη ή θεραπεία [46, 47, 53, 54]. Αυτές οι δοκιμές πρόκλησης έδειξαν ότι η θεραπεία που ξεκίνησε πριν και έως και 36 ώρες μετά τον εμβολιασμό του ιού συσχετίστηκε με την πρόληψη εργαστηριακά επιβεβαιωμένης γρίπης και εμπύρετης νόσου καθώς και με μείωση του τίτλου του ιού, της διάρκειας αποβολής και των συμπτωμάτων. Συνολικά, δημοσιεύθηκαν δεδομένα ασφάλειας από 1092 ασθενείς μετά από ενδορρινική εφαρμογή Zanamivir και δεν βρέθηκαν στοιχεία για ανεπιθύμητες ενέργειες που προκλήθηκαν από Zanamivir ή αυξημένες συχνότητες τοπικής ρινικής δυσανεξίας σε σύγκριση με ομάδες εικονικού φαρμάκου [46, 49, 52] . Λαμβάνοντας μαζί, ο συνδυασμός ενός ρινικού εκνεφώματος καραγενάνης που παρέχει ευρεία αντιική δράση έναντι λοιμώξεων του ανώτερου αναπνευστικού - συμπεριλαμβανομένης της γρίπης - με Zanamivir, ένα ειδικό φάρμακο κατά της γρίπης, ανταποκρίνεται στην υπάρχουσα ιατρική ανάγκη για τη θεραπεία πολλαπλών ιογενών λοιμώξεων. Στην παρούσα εργασία διερευνούμε το θεραπευτικό αποτέλεσμα ενός συνδυασμού καρραγενάνης και Zanamivir in-vitro και σε ένα ζωικό μοντέλο. Η Κάπα-καρραγενάνη και η γιώτα-καρραγενάνη αγοράστηκαν από την FMC Biopolymers (Philadelphia, PA). Η ταυτότητα, η καθαρότητα (>95%) των υποτύπων καρραγενάνης και το μοριακό βάρος (>100.000) επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση NMR όπως περιγράφεται αλλού [55] και η παρουσία λάμδα-καρραγενάνης ήταν κάτω από το όριο ανίχνευσης του 3%. Οι ξηρές σκόνες πολυμερούς διαλύθηκαν σε aqua bidest (Fresenius Kabi, Αυστρία) σε τελική συγκέντρωση 2,4 mg/ml γιώτα-και 0,8 mg/ml κάπα-καρραγενάνη. Αυτό το αποθεματικό διάλυμα 2x διηθήθηκε αποστειρωμένο μέσω φίλτρου 0,22 μm (PAA, Ελβετία) και αποθηκεύτηκε σε θερμοκρασία δωματίου μέχρι τη χρήση. Για περαιτέρω δοκιμή, το απόθεμα διαλύματος αραιώθηκε σε ένα μείγμα που περιείχε 1,2 mg/ml γιώτα-καρραγενάνη και 0,4 mg/ml κάπα-καρραγενάνη (εφεξής καλούμενη «καρραγενάνη»). Η Zanamivir αγοράστηκε ως σκόνη (Haosun Pharma, Κίνα) και το Η ταυτότητα και η καθαρότητα επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση NMR. Η ζαναμιβίρη διαλύθηκε είτε σε διαλύματα καραγενάνης είτε σε διαλύματα εικονικού φαρμάκου, ακολουθούμενη από στείρα διήθηση μέσω φίλτρου 0,22 μm (Sarstedt, Γερμανία). Για μελέτες in vivo όλα τα διαλύματα που περιείχαν Zanamivir παρασκευάστηκαν πρόσφατα. Κύτταρα νεφρού σκύλου Madin-Darby (MDCK) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν σε επωαστήρα 37°C (Sanyo, Ιαπωνία; CO 2 : 5%, σχετική υγρασία: >95%). Κύτταρα MDCK αναπτύχθηκαν σε ελάχιστα απαραίτητο (DMEM) μέσο υψηλής γλυκόζης της Dulbecco (PAA, Αυστρία) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS; PAA, Αυστρία; αδρανοποιημένος με θερμότητα). Ιός γρίπης A/Hansa Hamburg/01/09 (H1N1(09)pdm) παρασχέθηκε ευγενικά από τον Peter Staeheli Τμήμα Ιολογίας, Πανεπιστήμιο του Φράιμπουργκ, Γερμανία και περιγράφηκε προηγουμένως στο [56]. Τα A/Teal/Germany/Wv632/05 (H5N1) που είχαν δημοσιευθεί προηγουμένως στο [57] (αριθμοί πρόσβασης CY061882-9) και A/Turkey/Germany/R11/01 (H7N7) (αναγνωριστικό ταξινόμησης 278191, αριθμός προσχώρησης προστέθηκε από την AEZ67) Ευγενική προσφορά του Martin Beer, Ινστιτούτο Διαγνωστικής Ιολογίας, Friedrich-Loeffler-Institute, Riems, Γερμανία· Το A/Aichi/2/68 (H3N2) αγοράστηκε από το ATCC. Όλοι οι ιοί γρίπης πολλαπλασιάστηκαν σε κύτταρα MDCK στους 37°C και 5% CO 2 σε μέσο γρίπης [Μέσο χωρίς ορό Opti-Pro (Gibco, Αυστρία) συμπληρωμένο με 4 mM L-γλουταμίνη (PAA, Αυστρία), 1% αντιβιοτικό-αντιμυκητιακό μίγμα (PAA, Αυστρία) και 5 μg/ml θρυψίνης (Sigma Aldrich, Αυστρία)]. Για τον προσδιορισμό της ανασταλτικής συγκέντρωσης 50% (IC 50 ) και της συνδυαστικής επίδρασης της καραγενάνης και της Ζαναμιβίρης, αναπτύχθηκε μια ημι-υγρή ανάλυση πλάκας. Σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας 96 φρεατίων 1,7x10 4 MDCK κύτταρα/φρεάτιο σπάρθηκαν και μολύνθηκαν σε συρροή 90% (24-28 ώρες αργότερα). Σειριακές αραιώσεις καραγενάνης και Ζαναμιβίρης παρασκευάστηκαν σε μέσο ανάλυσης (μέσο γρίπης χωρίς θρυψίνη). Για μόλυνση, οι ιοί αραιώθηκαν σε MOI 0,003 (H1N1(09)pdm και H3N2 Aichi), 0,015 (H5N1) ή 0,004 (H7N7), αντίστοιχα, σε μέσο ανάλυσης και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου (RT) για 10 λεπτά με το σειριακές αραιώσεις καρραγενάνης και/ή Zanamivir, αντίστοιχα. Για την αξιολόγηση της συνδυαστικής επίδρασης της καραγενάνης και της Ζαναμιβίρης, οι ιοί αραιώθηκαν σε μέσο ανάλυσης που περιείχε σταθερές συγκεντρώσεις είτε καραγενάνης είτε ζαναμιβίρης. Η άλλη ουσία αραιώθηκε σειριακά και χρησιμοποιήθηκε για την επώαση του ιού. Τα κύτταρα μολύνθηκαν σε 6 επαναλήψεις/ αραίωση ένωσης, αντίστοιχα, και επωάστηκαν σε RT για 45 λεπτά πριν την απομάκρυνση του εμβολίου. Τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω με την αντίστοιχη συγκέντρωση των ερευνημένων ουσιών που υπάρχουν στην επικάλυψη [μέσο γρίπης με 2,25% καρβοξυμεθυλοκυτταρίνη (CMC, Fluka, Αυστρία)] για 30-42 ώρες στους 37°C. Οι εξελισσόμενες πλάκες αξιολογήθηκαν μετά από μονιμοποίηση κυττάρων μεθανόλης/ακετόνης με ανοσολογική χρώση με αντισώματα είτε κατά της νουκλεοπρωτεΐνης Α της γρίπης (AbD Serotec, Γερμανία) (για H1N1(09)pdm, H5N1 και H7N7) ή αιμοσυγκολλητίνη (AbD Serotec) για H3N2). Η ανάλυση έγινε με ένα επισημασμένο με HRP αντίσωμα ανίχνευσης (Thermo Scientific, Germany) χρησιμοποιώντας TMB (Biolegend, Germany) ως υπόστρωμα και έναν αναγνώστη μικροπλάκας στα 450 nm. Η μείωση του ανιχνευόμενου σήματος αντιπροσωπεύει μείωση του αριθμού και του μεγέθους των πλακών και υποδηλώνει καταστολή της ιικής αναπαραγωγής κατά τη διάρκεια της μόλυνσης και της καλλιέργειας. Αφού τα κύτταρα ανοσοχρώσης χρωματίστηκαν με 0,005% κρυσταλλικό ιώδες διάλυμα για να εκτιμηθεί η κατάσταση της κυτταρικής στιβάδας και η τοξικότητα του οι ενώσεις. Οι τιμές IC 50 και οι τυπικές αποκλίσεις υπολογίστηκαν για ένα μοντέλο απόκρισης σιγμοειδούς δόσης χρησιμοποιώντας το πρόσθετο XLfit Excel έκδοση 5.3.1.3. Όλα τα πειράματα σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες της «Ευρωπαϊκής Σύμβασης για την Προστασία των Σπονδυλωτών Ζώων που χρησιμοποιούνται για Πειραματικά και άλλους επιστημονικούς σκοπούς» και τον αυστριακό νόμο για πειράματα σε ζώα. Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την επιτροπή ιδρυματικής δεοντολογίας του Κτηνιατρικού Πανεπιστημίου της Βιέννης και πραγματοποιήθηκαν υπό τους αριθμούς άδειας χρήσης πειραματόζωων του Αυστριακού Ομοσπονδιακού Υπουργείου Επιστήμης και Έρευνας BMWF-68.205/0262-II/3b/2011 και BMWF-68.205/0142-II/3b2012 . Τα ποντίκια C57BL/6 αγοράστηκαν από την Janvier Labs, Γαλλία και διατηρήθηκαν υπό τυπικές εργαστηριακές συνθήκες στις εγκαταστάσεις ζώων του Κτηνιατρικού Πανεπιστημίου της Βιέννης. Για την ευθανασία και την αναισθησία χρησιμοποιήθηκε ασφυξία μέσω CO 2 και καταβλήθηκαν όλες οι προσπάθειες για να ελαχιστοποιηθεί η ταλαιπωρία. Για πειράματα μόλυνσης, θηλυκά ποντίκια ηλικίας 3-5 εβδομάδων εμβολιάστηκαν ενδορινικά με 50 μl διαλύματος ιού της γρίπης (25 μl/ρουθούνι) που περιείχε 2,27x10 3 ή 1,65x10 3 μονάδα σχηματισμού πλάκας H1N1(09)pdm ή H7N7, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, η θεραπεία ξεκίνησε με 24, 48 ή 72 hpi, όπως υποδεικνύεται για τα διάφορα πειράματα. Η θεραπεία πραγματοποιήθηκε ενδορινικά είτε με 50 μl θεραπευτικού διαλύματος είτε εικονικό φάρμακο δύο φορές την ημέρα για 5 ημέρες. Ως θεραπεία είτε καραγενάνη (που περιέχει 1,2 mg/ml γιώτα-καρραγενάνη και 0,4 mg/ml κάπα-καρραγενάνη για παροχή ημερήσιας δόσης 12 mg/kg σωματικού βάρους (BW)), Zanamivir (που περιέχει είτε 130 μg/ml είτε 390 μg/ ml Ζαναμιβίρης, για την παροχή ημερήσιας δόσης 1 ή 3 mg/kg Σ.Β., αντίστοιχα) ή συνδυασμός καρραγενάνης και ζαναμιβίρης. Το Carrageenan και το Zanamivir χρησιμοποιούνται σε μη τοξικές συγκεντρώσεις όπως φαίνεται από τα [58] και [59]. Τα ποντίκια παρακολουθούνταν δύο φορές την ημέρα για 15 ημέρες για επιβίωση και απώλεια βάρους. Η θνησιμότητα περιλαμβάνει επίσης ποντίκια που θυσιάστηκαν για ηθικούς λόγους όταν είχαν χάσει περισσότερο από το 25% του αρχικού σωματικού τους βάρους. Επιβεβαιώνουμε την ιογενή λοίμωξη σε αυτά τα ζώα με νεκροψία και βαθμολόγηση της φλεγμονής του πνεύμονα. Καθώς οι μηχανισμοί που διέπουν την αντιική δράση του NI και των καραγενανών είναι θεμελιωδώς διακριτοί, είναι πιθανό να εμφανίζουν διαφορετικές δραστηριότητες προς τα μεμονωμένα στελέχη του ιού της γρίπης. Ως αποτέλεσμα, σε συνδυασμό θα μπορούσαν να αλληλοσυμπληρώνονται για να παρέχουν προστασία έναντι ενός ευρύτερου φάσματος στελεχών του ιού της γρίπης από τις μεμονωμένες ενώσεις. Για να ελέγξουμε αυτήν την υπόθεση, ερευνήσαμε την ευαισθησία διαφόρων στελεχών του ιού της γρίπης στη Zanamivir και την καραγενάνη σε μια προσαρμοσμένη μείωση της πλάκας δοκιμασία με ημι-υγρή επικάλυψη σε κύτταρα MDCK [60, 61]. Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, προσδιορίσαμε το IC 50 της Zanamivir και της καραγενάνης έναντι των ιών της γρίπης Α ανθρώπινης και ζωικής προέλευσης, συγκεκριμένα H1N1(09)pdm (A/Hansa Hamburg/01/09), H3N2 (A/Aichi/2/68) , χαμηλής παθογονικότητας (LP) H5N1 (A/Teal/Germany/ Wv632/05) και LP H7N7 (A/Turkey/Germany/R11/01) (Πίνακας 1) . Και οι δύο ουσίες ήταν μη τοξικές στην υψηλότερη ελεγχόμενη συγκέντρωση (400 μM Zanamivir και 533 μg/ml καραγενάνη), ούτε ο συνδυασμός τους. Επιπλέον, το CMC στην επικάλυψη δεν έδειξε καμία ανασταλτική δράση του ιού (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Η αναστολή της ιικής αντιγραφής όλων των ελεγμένων στελεχών της γρίπης επιτεύχθηκε και με τις δύο ουσίες. Ωστόσο, οι τιμές IC 50 διέφεραν ευρέως ανάλογα με το στέλεχος του ιού της γρίπης. Οι τιμές IC 50 της Zanamivir κυμαίνονταν μεταξύ 0,18 μM για το H5N1 και 22,97 μM για το H7N7 και εκείνη της καραγενάνης από 0,39 μg/ml έως 118,48 μg/ml για H1N1(09)pdm και H7N7, αντίστοιχα (βλ. Table 1). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η καραγενάνη και η Ζαναμιβίρη στοχεύουν μεμονωμένα στελέχη γρίπης σε διαφορετικό βαθμό, έτσι ώστε να μπορούν να αλληλοσυμπληρώνονται για να παρέχουν ευρύτερη αντιγριπική δράση. Ο τύπος της αλληλεπίδρασης της ένωσης χαρακτηρίστηκε με τη χρήση ισοβολογραφημάτων (Εικ. 1) . Όπως περιγράφεται στο [62], τα ισοβόλογραφα συγκρίνουν γραφικά τις δόσεις δύο ενώσεων που απαιτούνται για την επίτευξη 50% αναστολής με τις προβλεπόμενες δόσεις που υπολογίζονται με βάση ένα μοντέλο προσθετικότητας φαρμάκου. Αναμένεται μια γραμμικότητα καμπύλης ~ 1 για μια αλληλεπίδραση πρόσθετης ένωσης, ενώ μια πρόοδος καμπύλης <1 συνηγορεί για συνεργιστική και >1 για ανταγωνιστική αλληλεπίδραση ένωσης. Δύο στελέχη ιού επιλέχθηκαν για αυτά τα πειράματα, ένα από τα οποία είναι το πιο ευαίσθητο στην καραγενάνη (H1N1 09)pdm) και ένα είναι το λιγότερο ευαίσθητο (H7N7). Και στις δύο περιπτώσεις τα ισοβολογραφήματα δείχνουν μια συνεργική αλληλεπίδραση καρραγενάνης και ζαναμιβίρης (Εικ. 1) . Έτσι, αποδείχθηκε ότι το Zanamivir και το carrageenan στοχεύουν μεμονωμένους ιούς γρίπης με διαφορετική αποτελεσματικότητα, πιθανότατα λόγω των διαφορετικών αντιικών στρατηγικών τους. Ως αποτέλεσμα, ο συνδυασμός παρέχει συνεργιστική δράση με υψηλότερη προστασία έναντι ενός ευρύτερου φάσματος στελεχών του ιού της γρίπης από τις μεμονωμένες ενώσεις. Στο ζωικό μοντέλο της γρίπης, τα ποντίκια C57Bl/6 προκαλούνται με μια θανατηφόρα δόση του αντίστοιχου ιού και λαμβάνουν θεραπεία με διαφορετικά σχήματα σε σύγκριση με έναν μάρτυρα φορέα (εικονικό φάρμακο). Η μόλυνση και η θεραπεία (δύο φορές την ημέρα για 5 ημέρες) γίνονται ενδορινικά χωρίς αναισθησία. Ερευνήσαμε εάν ο συνδυασμός Zanamivir και carrageenan είναι πιο αποτελεσματικός στη μείωση της θνησιμότητας από τις αντίστοιχες μονοθεραπείες. Αρχικά, προσδιορίσαμε την ελάχιστη αποτελεσματική δόση μιας μονοθεραπείας με Zanamivir που βελτίωσε σημαντικά τον χρόνο επιβίωσης των μολυσμένων με H1N1 και H7N7 ποντικών. Για τη θανατηφόρα λοίμωξη H7N7, η ελάχιστη αποτελεσματική δόση Zanamivir ως μονοθεραπεία κυμαινόταν μεταξύ 1 και 3 mg/kg ΣΒ/ημέρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια, συγκρίναμε την αντιική δράση της καραγενάνης (12 mg/kg ΣΒ/ημέρα) και της Ζαναμιβίρης (1 και 3 mg/kg ΣΒ/ημέρα) με τον αντίστοιχο συνδυασμό έναντι της θεραπείας με εικονικό φάρμακο. Τα ποσοστά επιβίωσης ποντικών με έναρξη θεραπείας 24 hpi παρουσιάζονται στο Σχήμα 2Α. Όλα τα ποντίκια που έλαβαν εικονικό φάρμακο πέθαναν μεταξύ 7ης και 9ης ημέρας και επίσης σε όλες τις ομάδες μονοθεραπείας παρατηρήθηκε 100% θνησιμότητα μέχρι την ημέρα 15. Αντίθετα, οι συνδυαστικές θεραπείες οδήγησαν σε 50% και 90% επιβίωση, ανάλογα με τη συγκέντρωση της Zanamivir. Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι η μονο-θεραπεία με Zanamivir 1 mg/kg ΣΒ/ημέρα δεν έδειξε σημαντικό όφελος (p = 0,1810), ενώ η μονοθεραπεία με 3 mg/kg Σ.Β./ημέρα αύξησε σημαντικά το ποσοστό επιβίωσης σε σύγκριση με το εικονικό φάρμακο ποντίκια (ρ = 0,0016). Και οι δύο συγκεντρώσεις Zanamivir παρουσίασαν σημαντικό όφελος στην επιβίωση από το συνδυασμό με καραγενάνη (p<0,0001). Ομοίως, οι συνδυαστικές θεραπείες οδήγησαν σε αξιοσημείωτα αυξημένη επιβίωση (p = 0,0421 για 1 mg και p<0,0001 για 3 mg/kg ΣΒ/ημέρα) σε σύγκριση με τη μονο-θεραπεία με καραγενάνη. Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ του συνδυασμού που περιείχε 3 mg/kg ΣΒ/ημέρα Zanamivir και αυτού που περιείχε 1 mg/kg ΣΒ/ημέρα (p = 0,0525). Ωστόσο, ήταν εμφανής μια τάση για αυξημένο ποσοστό επιβίωσης με την υψηλότερη συγκέντρωση Zanamivir. Ως εκ τούτου, για περαιτέρω διερεύνηση, η θεραπεία συνδυασμού που περιείχε 3 mg/kg BW/ημέρα Zanamivir αξιολογήθηκε σε θανατηφόρα μολυσμένα με H7N7 ποντίκια. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η θεραπευτική δυνατότητα του συνδυασμού με καθυστερημένη έναρξη θεραπείας 48 ή 72 hpi έναντι της θεραπείας με εικονικό φάρμακο. Τα ποσοστά επιβίωσης των ποντικών φαίνονται στο Σχήμα 2Β. Όλα τα ποντίκια που έλαβαν εικονικό φάρμακο πέθαναν μέχρι την ημέρα 10 και επίσης στην ομάδα με την έναρξη της θεραπείας βρέθηκε 72 hpi 100% θνησιμότητα. Αντίθετα, η συνδυαστική θεραπεία με έναρξη 48 hpi παρείχε ένα στατιστικά σημαντικό αυξημένο ποσοστό επιβίωσης σε σύγκριση με ποντίκια που έλαβαν εικονικό φάρμακο (p = 0,0010). Συνοπτικά, ο συνδυασμός δύο αποτελεσματικών, καθιερωμένων μονοθεραπειών οδήγησε σε σημαντικά αυξημένη επιβίωση σε θανατηφόρα Ποντίκια μολυσμένα με H7N7. Επιπλέον, η συνδυαστική θεραπεία ήταν εξαιρετικά αποτελεσματική σε σύγκριση με τη θεραπεία με εικονικό φάρμακο, ακόμη και μετά από έναρξη θεραπείας έως και 48 ίππους. Η ζαναμιβίρη που χρησιμοποιήθηκε ως μονο-θεραπεία αξιολογήθηκε σε ένα θανατηφόρο μοντέλο ποντικού H1N1(09)pdm, ακολουθώντας το ίδιο σχήμα όπως περιγράφεται στα πειράματα H7N7. Η χαμηλότερη αποτελεσματική δόση Zanamivir μετά από έναρξη θεραπείας 24 hpi ήταν 1 mg/kg ΣΒ/ημέρα και ο συνδυασμός της με καραγενάνη ήταν εξαιρετικά αποτελεσματικός (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στο ακόλουθο πείραμα διερευνήθηκε το θεραπευτικό δυναμικό του συνδυασμού με έναρξη θεραπείας 48 ή 72 hpi σε σύγκριση με την αντίστοιχη θεραπεία εικονικού φαρμάκου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, τα ποσοστά επιβίωσης των ποντικών που έλαβαν θεραπεία συνδυασμού ήταν πολύ σημαντικά αυξημένα σε σύγκριση στην ομάδα εικονικού φαρμάκου (p<0,0001). Δεν υπήρχε διαφορά στην επιβίωση μεταξύ των δύο σημείων έναρξης της θεραπείας, 48 ή 72 hpi, που προέκυψαν και τα δύο. Ερευνήσαμε την αντιική επίδραση ενός συνδυασμού καραγενάνης με το NI Zanamivir σε μελέτες κυτταροκαλλιέργειας και σε μοντέλα μόλυνσης από γρίπη ποντικών. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι μια συνδυασμένη θεραπεία γιώτα-καρραγενάνης με NI Oseltamivir οδήγησε σε σημαντικά αυξημένη επιβίωση σε ποντίκια που είχαν μολυνθεί με H1N1 PR/8/34 σε σύγκριση με τις αντίστοιχες μονοθεραπείες [37] . Ωστόσο, το Oseltamivir είναι ένα προφάρμακο που χορηγείται από το στόμα, το οποίο πρέπει να μετατραπεί στη δραστική του μορφή με μεταβολική επεξεργασία. Ως εκ τούτου, δεν ήταν δυνατή η περαιτέρω ανάπτυξη συνδυασμού ρινικού εκνεφώματος με το Oseltamivir. Αντίθετα, το Zanamivir-a NI που εφαρμόζεται ως δραστικό φάρμακο- επιλέχθηκε για την ανάπτυξη ενός συνδυασμού ένωσης. Κατά τη διαδικασία αξιολόγησης διαπιστώσαμε ότι η αποτελεσματικότητα δέσμευσης διαφορετικών υποτύπων καραγενάνης σε διαφορετικά στελέχη γρίπης ποικίλλει. Η συνδυασμένη χρήση γιώτα-και κάπα-καρραγενάνης για τη θεραπεία ποντικών C57Bl/6 μολυσμένων με θανατηφόρα γρίπη αποκάλυψε ένα καλύτερο θεραπευτικό αποτέλεσμα από τη χρήση μόνο της γιώτα-καρραγενάνης (Σχήμα S1). Έτσι, για την παροχή ενός ευρύτερου φάσματος δράσης έναντι διαφορετικών στελεχών του ιού της γρίπης, χρησιμοποιήθηκε ένα μείγμα γιώτα-και κάπα-καρραγενάνης (που ορίζεται ως καρραγενάνη). εξέτασε την αποτελεσματικότητά τους αναστολής, μεμονωμένα και σε συνδυασμό, έναντι των ιών της γρίπης σε μια προσαρμοσμένη ανάλυση μείωσης της πλάκας με ημι-υγρή επικάλυψη σε κύτταρα MDCK. Ο συνδυασμός έδειξε συνεργιστική αναστολή της αντιγραφής του ιού σε in-vitro προσδιορισμούς με όλους τους δοκιμασμένους ιούς γρίπης (Εικόνα 1) . Αυτό δείχνει ότι η φυσική αλληλεπίδραση του πολυμερούς με τον ιό δεν διαταράσσει την αναστολή της νευραμινιδάσης από το Zanamivir. Αυτό επιβεβαιώθηκε σε δοκιμές in-vitro που εξέτασαν μια πιθανή επίδραση του πολυμερούς στην ανασταλτική δράση της νευραμινιδάσης της Zanamivir (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, η παρατηρούμενη συνεργική επίδραση βασίζεται στον συνδυασμό δύο διακριτών υποκείμενων μηχανισμών. Ως αποτέλεσμα, στον προτεινόμενο συνδυασμό και οι δύο μηχανισμοί θα αλληλοσυμπληρώνονται για να παρέχουν πιο αποτελεσματική προστασία έναντι ενός ευρύτερου φάσματος στελεχών του ιού της γρίπης από τις μεμονωμένες ενώσεις. Η παθογένεια των ιών της γρίπης στα ποντίκια ποικίλλει και εξαρτάται από το στέλεχος και την προσαρμογή του στον ξενιστή. Ανάλογα με τη δόση και το στέλεχος του ιού, οι ιοί της γρίπης μπορούν να προκαλέσουν θανατηφόρες λοιμώξεις σε ορισμένα στελέχη ποντικών συνήθως εντός δύο εβδομάδων [37, 63]. Στο μοντέλο μας, τα ποντίκια C57Bl/6 προκλήθηκαν ενδορινικά με μια θανατηφόρα δόση του αντίστοιχου ιού και υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διαφορετικά σχήματα σε σύγκριση με έναν μάρτυρα φορέα (εικονικό φάρμακο). Σε ένα τέτοιο μοντέλο, η πρώιμη αναπαραγωγή του ιού λαμβάνει χώρα στην ανώτερη αναπνευστική οδό. Από εκεί, ο ιός εξαπλώνεται στον πνεύμονα και προκαλεί θανατηφόρα πνευμονία. Η επίδραση της θεραπείας στη θνησιμότητα αξιολογείται σε σύγκριση με ποντίκια ελέγχου που έλαβαν εικονικό φάρμακο. Από όλα τα στελέχη γρίπης που δοκιμάστηκαν in vitro, το H1N1(09)pdm και το LP H7N7 είναι ιδιαίτερα ενδιαφέροντα για δύο λόγους. Πρώτον, είναι πολύ σχετικά παθογόνα, ως εικονικό φάρμακο ή με τις μονοθεραπείες που αποτελούνται από καραγενάνη (12 mg/kg ΣΒ/ημέρα) ή Zanamivir (1 και 3 mg/kg ΣΒ/ημέρα) ή συνδυασμό αυτών. Η θεραπεία ξεκίνησε με 24 hpi και συνεχίστηκε για 5 ημέρες. (Β) Ποντίκια (n = 20 ανά ομάδα) μολύνθηκαν θανατηφόρα ενδορινικά χωρίς αναισθησία την ημέρα 0 και έλαβαν ενδορινική θεραπεία δύο φορές την ημέρα είτε με εικονικό φάρμακο είτε με συνδυασμό καραγενάνης με Zanamivir (3 mg/kg ΣΒ/ημέρα). Η θεραπεία ξεκίνησε είτε με 48 hpi είτε με 72 hpi και συνεχίστηκε για 5 ημέρες. Στον άξονα y δίνεται η επιβίωση των ποντικών [%] και στον άξονα x ο χρόνος μετά τη μόλυνση [ημέρες]. Τα μη μολυσμένα ποντίκια ελέγχου που έλαβαν εικονικό φάρμακο έδειξαν 100% επιβίωση και στα δύο πειράματα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι στατιστικές αναλύσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τεστ log rank και φαίνονται κάτω από τα γραφήματα. Οι τιμές του p<0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. μη σημασία (n.s.) ελήφθη με τιμές p >0,05. και οι δύο εμπλέκονται σε πρόσφατα κρούσματα γρίπης. Το H1N1(09)pdm σχετίζεται με περισσότερους από 18.400 θανάτους την περίοδο 2009/2010, ενώ το LP H7N7 φέρει ένα HA στενά συνδεδεμένο με αυτόν του ιού της γρίπης των πτηνών H7N9 που έχει προκαλέσει περισσότερους από 175 θανάτους μέχρι τον Οκτώβριο του 2014 [64] . Δεύτερον, παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον για την προσέγγιση συνδυασμού καραγενάνης/Ζαναμιβίρης. Έχει αποδειχθεί ότι διαφέρουν ως προς την in vitro ευαισθησία στην καραγενάνη, τη Ζαναμιβίρη (Πίνακας 1) και τον συνδυασμό τους (Εικ. 1). Ενώ το H1N1(09)pdm ήταν εξαιρετικά ευαίσθητο στην αναστολή και από τις δύο ουσίες μόνο, το H7N7 απαιτούσε πολύ υψηλότερες συγκεντρώσεις καραγενάνης και Zanamivir, αντίστοιχα, για να επιτύχει παρόμοια αποτελεσματικότητα αναστολής. Επομένως, επιλέχθηκαν και τα δύο στελέχη του ιού για να διερευνηθεί περαιτέρω η αποτελεσματικότητα της συνδυαστικής θεραπείας σε ένα μοντέλο ποντικού. Καθιερώσαμε θανατηφόρα μοντέλα ποντικών και με τους δύο ιούς που είχαν ως αποτέλεσμα 6,8 και 8,5 μέσες ημέρες επιβίωσης για το LP H7N7 και το H1N1(09)pdm, αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα είναι σε καλή συμφωνία με παρόμοια ήδη δημοσιευμένα μοντέλα θανατηφόρου γρίπης [65] [66] [67] . Στα μοντέλα μας η χαμηλότερη αποτελεσματική δόση για Zanamivir σε έναρξη θεραπείας 24 hpi βρέθηκε να είναι μεταξύ 1 έως 3 mg/kg ΣΒ/ημέρα και για τους δύο ιούς. Αυτό το εύρος συγκέντρωσης είναι σχετικά υψηλό σε σύγκριση με άλλες δημοσιευμένες μελέτες. Ωστόσο, αυτές οι μελέτες έγιναν υπό αναισθησία με διαφορετικούς ιούς και μια προφυλακτική έναρξη θεραπείας [65, 66]. Το γεγονός ότι απαιτείται υψηλότερη δόση NI για μια αποτελεσματική θεραπεία όταν η θεραπεία ξεκινά 24 hpi είναι ήδη γνωστό για το Oseltamivir [68] . Ωστόσο, δημοσιεύτηκαν επίσης δεδομένα με πολύ υψηλότερες αποτελεσματικές συγκεντρώσεις (10 mg/kg ΣΒ/ημέρα [69] ) και με παρόμοιες συγκεντρώσεις Zanamivir (2,5 mg/kg ΣΒ/ημέρα [67] ). Διαπιστώσαμε ότι ο συνδυασμός καραγενάνη με 3 mg/kg ΣΒ/ημέρα Zanamivir που χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία ποντικών που είχαν μολυνθεί με H7N7 οδήγησε σε σημαντικά αυξημένη επιβίωση των ποντικών σε σύγκριση με τις δύο μονοθεραπείες (Εικόνα 2) . Η σημαντικά ενισχυμένη επιβίωση σε σύγκριση με την ομάδα που έλαβε εικονικό φάρμακο βρέθηκε επίσης μετά από καθυστερημένη έναρξη θεραπείας 48 hpi. Επιπλέον, στο μοντέλο H1N1(09)pdm ο συνδυασμός καραγενάνης με 1 mg/kg ΣΒ/ημέρα Zanamivir έδειξε στατιστικά σημαντική ενισχυμένη επιβίωση σε σύγκριση με τη θεραπεία με εικονικό φάρμακο ακόμη και μετά από έναρξη θεραπείας 72 hpi. Αυτό είναι ένα αξιοσημείωτο εύρημα, καθώς τα NI δεν είναι συνήθως αποτελεσματικά όταν εφαρμόζονται 72 hpi. Το εύρημα υποστηρίζει την ανάπτυξη της προσέγγισης συνδυασμού Zanamivir και carrageenan. Καθώς το καθεστώς ενδορρινικής θεραπείας δεν είναι ικανό να αντιμετωπίσει αποτελεσματικά τις ιικές λοιμώξεις του πνεύμονα, ο πρωταρχικός στόχος ενός τέτοιου προϊόντος είναι η προφύλαξη και η θεραπεία της μη επιπλεγμένης γρίπης. Δεδομένου ότι η πλειονότητα των λοιμώξεων από γρίπη προκαλεί απλές ασθένειες και σχεδόν όλες οι περιπτώσεις γρίπης ξεκινούν με μόλυνση της ρινικής κοιλότητας ή της ανώτερης αναπνευστικής οδού, οι θεραπευτικές δυνατότητες είναι τεράστιες. Ωστόσο, απαιτούνται κλινικές μελέτες για την αποσαφήνιση και την επίδειξη των δυνατοτήτων της προτεινόμενης συνδυαστικής θεραπείας. Ο συνδυασμός αντιιικών στρατηγικών έχει οδηγήσει σε εντυπωσιακά επιτεύγματα στην καταπολέμηση άλλων ιογενών ασθενειών όπως ο HIV. Ειδικότερα, το πρόβλημα της αντοχής στα αντιικά θα μπορούσε να αντιμετωπιστεί με αυτή τη στρατηγική. Την τελευταία δεκαετία έχουν εκφραστεί ανησυχίες σχετικά με την αυξημένη εμφάνιση ανθεκτικών ιών γρίπης στο Oseltamivir. Η αυξημένη εμφάνιση ιών που φέρουν τη μετάλλαξη H275Y στη νευραμινιδάση των ιών H1N1(09)pdm που προσδίδει αντοχή στο Oseltamivir άφησε τη Zanamivir ως τη μόνη θεραπευτική επιλογή για συμπτωματικούς ασθενείς που έχουν μολυνθεί με ένα στέλεχος γρίπης ανθεκτικό στο Oseltamivir [70] . Σε αντίθεση με το Oseltamivir, η αντοχή στη Zanamivir είναι λιγότερο συχνή. Μέχρι σήμερα, η ανθεκτική στη Zanamivir γρίπη έχει ανιχνευθεί μόνο μία φορά, σε ανοσοκατεσταλμένο ασθενή [71, 72]. Ωστόσο, θα πρέπει να αντληθούν διδάγματα από προηγούμενες παρεμβάσεις κατά της γρίπης που είχαν ως αποτέλεσμα την εμφάνιση αντοχής έναντι των επί του παρόντος εγκεκριμένων φαρμάκων [73] . Επομένως, είναι κατανοητές οι ανησυχίες ότι η αυξημένη χρήση Zanamivir μπορεί επίσης να οδηγήσει στην ταχεία εμφάνιση αντιστάσεων [74] . Για να ξεπεραστεί αυτή η απειλή, ένας συνδυασμός αντιικών φαρμάκων που αναστέλλουν την αναπαραγωγή του ιού με διαφορετικούς μηχανισμούς είναι μια έγκυρη στρατηγική. Ελέγξαμε για τη δυνατότητα δημιουργίας μεταλλαγμένων ιών διαφυγής διπλής ένωσης κατά τη διέλευση ιών παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων συνδυασμών ενώσεων. Μετά από 10 περάσματα σε κύτταρα MDCK δεν βρέθηκε αντίσταση στον συνδυασμό ένωσης για οποιονδήποτε δοκιμασμένο ιό γρίπης (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Ωστόσο, αυτό το εύρημα δεν εγγυάται ότι η εμφάνιση μεταλλαγμάτων διαφυγής Zanamivir μπορεί να σταματήσει εντελώς. Συνοπτικά, δείξαμε ότι οι μηχανισμοί κατά της γρίπης και των δύο μεμονωμένων ενώσεων αλληλοσυμπληρώνονται. Ο συνδυασμός παρέχει συνεργιστικά καλύτερη προστασία έναντι ενός ευρύτερου φάσματος ιών γρίπης από τις μεμονωμένες ενώσεις. Ένα ρινικό σπρέι που περιέχει καραγενάνη μαζί με Zanamivir παρέχει μια εύκολη στην εφαρμογή θεραπεία λοιμώξεων του ανώτερου αναπνευστικού σε ασθενείς με υποψία ότι έχουν μολυνθεί από γρίπη. Οι ασθενείς θα επωφεληθούν από τη γρήγορη και αποτελεσματική θεραπεία της γρίπης χωρίς επιπλοκές στην ανώτερη αναπνευστική οδό. Λόγω της ταχύτερης κάθαρσης του ιού της γρίπης από την ανώτερη αναπνευστική οδό και του ανεξάρτητου αντιιικού μηχανισμού της καραγενάνης και της Ζαναμιβίρης, η πιθανότητα ανάπτυξης μεταλλάξεων διαφυγής έναντι της Ζαναμιβίρης θα μειωθεί. Και οι δύο μεμονωμένες ενώσεις είναι σε θέση να μειώσουν τη σοβαρότητα ή/και τη διάρκεια της νόσου της γρίπης και ένας συνδυασμός αναμένεται να λειτουργεί παρόμοια. Επιπρόσθετα, λόγω της ευρείας αντιϊκής αποτελεσματικότητας της καραγενάνης, οι ασθενείς θα λαμβάνουν παράλληλα θεραπεία για ταυτόχρονες ιογενείς λοιμώξεις. Επομένως, οι ασθενείς θα ωφεληθούν από μειωμένη πιθανότητα να αναπτύξουν επιπλοκές. Λαμβάνοντας υπόψη τις επιπλοκές που είναι γνωστό ότι συνοδεύουν μια ασθένεια του ιού της γρίπης, αυτή η συνδυαστική θεραπεία ανταποκρίνεται σε μια επείγουσα ιατρική ανάγκη. Ένας δεύτερος σκοπός αυτού του συνδυασμού είναι η προστασία έναντι των νεοεμφανιζόμενων πανδημικών ιών κατά τη διάρκεια του χρόνου μέχρι την ταυτοποίηση του ιού ακολουθούμενη από την κατασκευή και διανομή εμβολίων [43] . Ακόμη και αν, λόγω των νέων αντίστροφων γενετικών τεχνικών, απαιτείται λιγότερος χρόνος για την παραγωγή εμβολίων, χρειάζονται ακόμη μήνες μέχρι να διατεθούν μεγάλες ποσότητες εμβολίου [75] . Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου, ο ανθρώπινος πληθυσμός θα πρέπει να προστατεύεται για την επιβράδυνση της εξάπλωσης του ιού. Προς το παρόν, οι μόνες διαθέσιμες ευκαιρίες για προσωπική προστασία είναι τα μέτρα υγιεινής και η χρήση του Tamiflu (εμπορική ονομασία Oseltamivir). Χρειάζονται απεγνωσμένα νέες επιλογές προστασίας και θεραπείας για τη γρίπη. Με βάση τα ενθαρρυντικά μας αποτελέσματα σε ποντίκια, προτείνουμε τη δοκιμή ενός ρινικού σπρέι που περιέχει καραγενάνη σε συνδυασμό με τον αναστολέα νευραμινιδάσης Zanamivir σε κλινικές δοκιμές για την πρόληψη ή τη θεραπεία μη επιπλεγμένων λοιμώξεων γρίπης. Υποστηρικτικές πληροφορίες S1 Εικ. Θεραπευτική αποτελεσματικότητα της γιώτα-καρραγενάνης αποκλειστικά ή μαζί με κάπα-καρραγενάνη σε θανατηφόρα μολυσμένα με γρίπη H7N7 ποντίκια. Ποντίκια (n = 20 ανά ομάδα) μολύνθηκαν θανατηφόρα ενδορινικά χωρίς αναισθησία την ημέρα 0 και κατά συνέπεια έλαβαν ενδορινική αγωγή δύο φορές την ημέρα είτε με εικονικό φάρμακο είτε με γιώτα-καρραγενάνη ή με ένα μείγμα γιώτα-και κάπα-καρραγενάνης. Η θεραπεία ξεκίνησε με 24 hpi και συνεχίστηκε για 5 ημέρες. Στον άξονα y δίνεται η επιβίωση των ποντικών [%] και στον άξονα x ο χρόνος μετά τη μόλυνση [ημέρες]. Τα μη μολυσμένα ποντίκια ελέγχου που έλαβαν εικονικό φάρμακο έδειξαν 100% επιβίωση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι στατιστικές αναλύσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τεστ log rank και φαίνονται κάτω από τα γραφήματα. Οι τιμές του p<0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. μη σημασία (n.s.) ελήφθη με τιμές p >0,05. (ΚΑΒΓΑΔΑΚΙ)", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 541, "text": "μια κλινικά αποδεδειγμένη και διατίθεται στην αγορά ένωση για τη θεραπεία ιογενών λοιμώξεων του ανώτερου αναπνευστικού συστήματος" } ], "id": 2141, "question": "Τι είναι το Carrageenan;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1152, "text": "η καραγενάνη και η ζαναμιβίρη δρουν συνεργικά έναντι πολλών στελεχών του ιού της γρίπης Α (H1N1(09)pdm, H3N2, H5N1, H7N7)" } ], "id": 2142, "question": "Ποιο είναι το πιθανό θεραπευτικό όφελος της καραγενάνης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1724, "text": "72 ώρες μετά τη μόλυνση" } ], "id": 2143, "question": "Ποιο είναι το βέλτιστο παράθυρο για την έναρξη θεραπείας με καραγενάνη και Zanamivir;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2156, "text": "Οι περισσότεροι ασθενείς με λοιμώξεις A(H7N9) είχαν επαφή με πουλερικά ή επισκέπτονταν αγορές ζώντων ζώων" } ], "id": 2146, "question": "Πώς προσβλήθηκαν οι περισσότεροι ασθενείς από τη γρίπη, έναν υπότυπο ιού h7n9;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2717, "text": "η γρίπη είναι μια οξεία αναπνευστική νόσος" } ], "id": 2148, "question": "Τι είδους ασθένεια προκαλείται από τη γρίπη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2968, "text": "250.000 έως 500.000" } ], "id": 2150, "question": "Πόσοι θάνατοι συμβαίνουν ετησίως ως αποτέλεσμα ετήσιων επιδημιών γρίπης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3204, "text": "οι λοιμώξεις από τον ιό της γρίπης συχνά συνοδεύονται από άλλα ιικά παθογόνα" } ], "id": 2151, "question": "Είναι η συνλοίμωξη συχνή στη λοίμωξη από γρίπη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3397, "text": "Η ανάλυση με qRT-PCR αποκάλυψε ότι το 54,5-83,3% των θετικών ασθενών στη γρίπη Α ή Β βρέθηκε να έχουν τουλάχιστον μία ταυτόχρονη ιογενή λοίμωξη του αναπνευστικού [9] [10] [11] [12] . Η συχνότητα ανίχνευσης με ανοσοφθορισμό βρέθηκε να είναι ακόμη υψηλότερη (90-100%) [13, 14]" } ], "id": 2153, "question": "Τι ποσοστό των ανθρώπων που έχουν μολυνθεί από γρίπη έχουν ιογενή συνλοίμωξη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5660, "text": "Ο αντιιικός μηχανισμός της καραγενάνης βασίζεται στην παρεμβολή στην προσκόλληση του ιού. ως συνέπεια, η είσοδος του ιού αναστέλλεται" } ], "id": 2155, "question": "Ποιος είναι ο αντι-ιικός μηχανισμός δράσης της καραγενάνης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6781, "text": "Η δράση κατά της γρίπης φάνηκε με ανάλυση υποομάδας 49 ασθενών με γρίπη που επωφελήθηκαν από 3,3 ημέρες ταχύτερη ανάρρωση από τα συμπτώματα" } ], "id": 2159, "question": "Ποιο είναι το αντιγριπικό όφελος της καραγενάνης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6978, "text": "σημαντική μείωση του ιικού φορτίου της γρίπης στα ρινικά υγρά και σημαντική αύξηση του αριθμού των ασθενών χωρίς ιούς εντός της περιόδου θεραπείας των 7 ημερών" } ], "id": 2160, "question": "Ποια είναι η σχέση μεταξύ του ιικού φορτίου της γρίπης και της καραγενάνης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 8677, "text": "Σε αντίθεση με το Oseltamivir, το οποίο πρέπει να ενεργοποιηθεί με μεταβολική μετατροπή, το Zanamivir εφαρμόζεται απευθείας ως δραστικό φάρμακο και μπορεί επίσης να χορηγηθεί ενδορινικά" } ], "id": 2163, "question": "Είναι αποτελεσματικό το Oseltamivir όταν λαμβάνεται ενδορρινικά;" }, { "answers": [ { "answer_start": 9309, "text": "δοκιμές πρόκλησης έδειξαν ότι η θεραπεία που ξεκίνησε πριν και έως και 36 ώρες μετά τον εμβολιασμό του ιού συσχετίστηκε με την πρόληψη εργαστηριακά επιβεβαιωμένης γρίπης και εμπύρετης νόσου καθώς και με μείωση του τίτλου του ιού, της διάρκειας αποβολής και των συμπτωμάτων" } ], "id": 2164, "question": "Ποια είναι η επίδραση του ενδορινικού Zanamivir στην εργαστηριακά επιβεβαιωμένη λοίμωξη από γρίπη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 28870, "text": "Ενώ το H1N1(09)pdm ήταν εξαιρετικά ευαίσθητο στην αναστολή και από τις δύο ουσίες μόνο, το H7N7 απαιτούσε πολύ υψηλότερες συγκεντρώσεις καραγενάνης και Zanamivir, αντίστοιχα, για να επιτύχει παρόμοια αποτελεσματικότητα αναστολής" } ], "id": 2179, "question": "Υπάρχει δοσοεξαρτώμενη απόκριση στην ενδορρινική θεραπεία με καραγενάνη και Zanamavir;" }, { "answers": [ { "answer_start": 30637, "text": "το μοντέλο H1N1(09)pdm ο συνδυασμός καραγενάνης με 1 mg/kg ΣΒ/ημέρα Zanamivir έδειξε στατιστικά σημαντική ενισχυμένη επιβίωση σε σύγκριση με τη θεραπεία με εικονικό φάρμακο ακόμη και μετά από έναρξη θεραπείας 72 hpi" } ], "id": 2180, "question": "Το carageenan και το Zanamavir μαζί έχουν μεγαλύτερο όφελος από ό,τι καθένα από τα δύο στη μονοθεραπεία;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Αιτιολογία των ασθενειών που μοιάζουν με τη γρίπη από επαγγελματίες του δικτύου Sentinel στη νήσο Ρεϋνιόν, 2011-2012https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5031398/SHA: f5ff89ebfdd0375d0160cutiset; Jaffar-Bandjee, Marie-Christine; Li-Pat-Yuen, Ghislaine; Filleul, LaurentΗμερομηνία: 2016-09-21DOI: 10.1371/journal.pone.0163377Άδεια: cc-byAbstract: Στο νησί Réunion, παρά την επιτήρηση της γρίπης που καθιερώθηκε από το 1996 από τον φρουρό γενικού ιατρού, ελάχιστα γνωστός για τον influenza ασθένεια (ILI) που διαφέρει από τους ιούς της γρίπης σε μια τροπική περιοχή. Δημιουργήσαμε μια αναδρομική μελέτη χρησιμοποιώντας ρινικά επιχρίσματα που συλλέχθηκαν από παθολόγους φρουρούς από ασθενείς με ILI το 2011 και το 2012. Συνολικά 250 επιχρίσματα επιλέχθηκαν τυχαία και αναλύθηκαν με πολλαπλή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης (RT-PCR) συμπεριλαμβανομένης της έρευνας 18 ιών και 4 βακτηρίων. Ανιχνεύσαμε ιούς του αναπνευστικού σε 169/222 (76,1%) δείγματα, κυρίως ρινοϊό (23,4%), ιό γρίπης Α (21,2%), ιό γρίπης Β (12,6%), κοροναϊό (4,9%) και ανθρώπινο μεταπνευμοϊό (3,6%). Εννέα επιχρίσματα (5,3% των θετικών επιχρισμάτων) αποκάλυψαν συν-λοιμώξεις με δύο ιούς που εντοπίστηκαν, μεταξύ των οποίων έξι αφορούσαν συν-λοιμώξεις με ιούς γρίπης. Παρατηρήσαμε σημαντικές εποχιακές διαφορές, με την κυκλοφορία των Ανθρώπινων Μεταπνευμοϊών, του RSV A και B και του κορωνοϊού μόνο κατά τη διάρκεια του καλοκαιριού. ενώ οι ιοί της παραγρίπης εντοπίστηκαν μόνο κατά τη διάρκεια του χειμώνα. Συμπερασματικά, αυτή η μελέτη υπογραμμίζει μια σημαντική κυκλοφορία πολλαπλών παθογόνων του αναπνευστικού στο νησί Ρεϋνιόν καθ' όλη τη διάρκεια του έτους. Δείχνει ότι το ILI δεν μπορεί να αποδοθεί μόνο στη γρίπη και υπογραμμίζει την ανάγκη για βιολογική επιτήρηση. Καθώς η χρήση της multiplex RT-PCR έδειξε την αποτελεσματικότητά της, χρησιμοποιείται πλέον συστηματικά στην παρακολούθηση της ILI. Κείμενο: Η γρίπη (ILI) ή οξείες αναπνευστικές λοιμώξεις μπορεί να προκληθούν από διάφορους τύπους ιών ή βακτηρίων του αναπνευστικού συστήματος στον άνθρωπο. 1] . Οι ιοί της γρίπης, οι ιοί του αναπνευστικού συγκυτίου (RSV) και οι ιοί της παραγρίπης αναγνωρίζονται ως κύριοι ιοί που ευθύνονται κυρίως για την ILI και την πνευμονία σε αρκετές μελέτες [2] . Ωστόσο, οι επαγγελματίες δεν μπορούν να διαγνώσουν τη λοίμωξη χωρίς επιβεβαίωση βιολογικού τεστ. Δυστυχώς, αυτές οι αιτίες λοιμώξεων εντοπίζονται σε λιγότερο από το 50% [3] .Το νησί Ρεϋνιόν, μια γαλλική υπερπόντια επικράτεια με 850.000 κατοίκους, βρίσκεται στο νότιο ημισφαίριο μεταξύ Μαδαγασκάρης και Μαυρίκιου στον Ινδικό Ωκεανό (Γεωγραφικό πλάτος: 21°05.2920: S Longitude 55°36.4380 E.). Το νησί επωφελείται από ένα σύστημα υγειονομικής περίθαλψης παρόμοιο με την ηπειρωτική Γαλλία και η επιδημιολογική επιτήρηση έχει αναπτυχθεί από το περιφερειακό γραφείο του Γαλλικού Ινστιτούτου Επιτήρησης Δημόσιας Υγείας (Cire OI), με βάση το σύστημα επιτήρησης της ηπειρωτικής Γαλλίας [4] . Η δραστηριότητα της γρίπης γενικά αυξάνεται κατά τη διάρκεια του αυστραλιανού χειμώνα, που αντιστοιχεί στο καλοκαίρι στην Ευρώπη [5] . Από το 2011, η εκστρατεία εμβολιασμού της γρίπης στο νησί Reunion ξεκινά τον Απρίλιο και το εμβόλιο που χρησιμοποιείται αντιστοιχεί στις συστάσεις του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας για το νότιο ημισφαίριο. Από το 1996, η κλινική και βιολογική επιτήρηση της γρίπης βασίζεται σε ένα δίκτυο ιατρών φρουρών [6] . Το 2014, αυτό το δίκτυο αποτελούνταν από 58 γενικούς ιατρούς (GPs) κατανεμημένους σε όλο το νησί και αντιπροσώπευαν περίπου το 7% όλων των γενικών γιατρών του νησιού Réunion. Τα ρινικά επιχρίσματα συλλέγονται τυχαία καθ' όλη τη διάρκεια του έτους και ελέγχονται με RT-PCR για ιούς γρίπης. Μεταξύ αυτών των δειγμάτων επιτήρησης, το 40 έως 50% είναι θετικό για τον ιό της γρίπης Α, τον ιό A(H1N1)pdm09 ή τον ιό Β από το ιολογικό εργαστήριο του Πανεπιστημιακού Νοσοκομειακού Κέντρου της Ρεϋνιόν. Επομένως, τα δείγματα ILI που εξετάστηκαν αρνητικά για γρίπη είναι άγνωστης αιτιολογίας. Αρκετά βιολογικά εργαλεία επιτρέπουν τον εντοπισμό παθογόνων του αναπνευστικού από το ρινικό επίχρισμα. Τα τελευταία χρόνια, έχει αναπτυχθεί αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πολλαπλής αντίστροφης μεταγραφάσης (RT-PCR) για την ταυτοποίηση αρκετών ιών ταυτόχρονα [7] [8] [9] [10] . Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε αυτή τη νέα μέθοδο για να δημιουργήσουμε μια αναδρομική μελέτη χρησιμοποιώντας επιχρίσματα που συλλέχθηκαν από παθολόγους-φρουρούς από το 2011 έως το 2012. Ο κύριος στόχος της μελέτης μας ήταν να χαρακτηρίσει τα αναπνευστικά παθογόνα που ήταν υπεύθυνα για τις επισκέψεις ILI σε παθολόγους φρουρούς το 2011 και το 2012. Δευτερεύοντες στόχοι ήταν η επισήμανση των εποχιακών τάσεων στην κυκλοφορία των αναπνευστικών παθογόνων και η περιγραφή της εμφάνισης συν-λοιμώξεων, ειδικά κατά την περίοδο της γρίπης. Η ILI ορίστηκε ως η ξαφνική έναρξη πυρετού άνω των 38 βαθμών Κελσίου και βήχας, που σχετίζεται ή όχι με άλλα συμπτώματα όπως π. όπως δυσκολία στην αναπνοή, πονοκέφαλος κ.λπ. Κάθε εβδομάδα, όλοι οι γιατροί του δικτύου φρουρών ενθαρρύνονταν να συλλέγουν ένα ρινικό επίχρισμα από τους δύο πρώτους ασθενείς που παρουσίασαν ILI για λιγότερο από τρεις ημέρες. Μετά από δοκιμή για ιούς γρίπης, τα 994 επιχρίσματα που συλλέχθηκαν το 2011 και το 2012 καταψύχονται στους -80°C στο εργαστήριο του πανεπιστημιακού νοσοκομειακού κέντρου (CHU). για να περιγράψει τους κυκλοφορούντες ιούς, συμπεριλαμβανομένης της περιόδου εκτός της γρίπης. Πραγματοποιήθηκε τυχαία δειγματοληψία με το Excel 1 χρησιμοποιώντας την ανώνυμη βάση δεδομένων επιτήρησης του Cire OI. Το πλαίσιο δειγματοληψίας περιείχε τον αριθμό αναγνώρισης του στυλεού που εκχωρήθηκε από την Cire OI, τον αριθμό αναγνώρισης εργαστηρίου, το φύλο, την ηλικία, την ημερομηνία έναρξης των συμπτωμάτων, την ημερομηνία συλλογής του επιχρίσματος και το αποτέλεσμα της RT-PCR της γρίπης. Χρησιμοποιήσαμε κιτ Respifinder 1 Smart 22 πολυπλεξίας RT- PCR (PathoFinder, Μάαστριχτ, Ολλανδία) που μπορεί να ανιχνεύσει 22 παθογόνα του αναπνευστικού. Αυτή η ανάλυση βασίζεται στην τεχνολογία πολλαπλής σύνδεσης-εξαρτώμενης ενίσχυσης ανιχνευτή (MLPA). Τα στάδια αντίστροφης μεταγραφής και προενίσχυσης πραγματοποιήθηκαν στο εκβαθμισμένο Mastercycler 1 (Eppendorf) και τα στάδια υβριδισμού, σύνδεσης και ανίχνευσης στο σύστημα LightCycler 1 480 (Roche Applied Science). Αυτή η μέθοδος επιλέχθηκε λόγω της υψηλής ειδικότητάς της, σε σύγκριση με άλλες ίδιες μεθόδους (78% έναντι 33%) [3, 11] . Η πολυπλεξία επιτρέπει την ταχεία παραγωγή διαγνωστικών αποτελεσμάτων. Επιτρέπει έτσι να τονιστεί η πιθανή παρουσία δεκαοκτώ αναπνευστικών ιών και τεσσάρων βακτηρίων σε μία αντίδραση με ανάλυση καμπύλης τήγματος: Γρίπη A όχι (H1N1 Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με Stata 1 και Excel 1 . Ορίστηκαν δύο εποχές για τον εντοπισμό πιθανών εποχιακών τάσεων στην κυκλοφορία των ιών: χειμερινή περίοδος κατά τις εβδομάδες 23 έως 39 μεταξύ Ιουνίου και Σεπτεμβρίου και θερινή περίοδος κατά τον υπόλοιπο χρόνο. Τα δεδομένα και τα επιχρίσματα προκύπτουν από ένα σύστημα επιτήρησης που έλαβε ρυθμιστικές εγκρίσεις, συμπεριλαμβανομένων την έγκριση CNIL (National Commission for Information Technology and Civil Liberties Number 1592205) τον Ιούλιο του 2012. Όλοι οι ασθενείς έλαβαν προφορικές πληροφορίες και έδωσαν τη συγκατάθεσή τους για επιχρίσματα και συλλογή δεδομένων. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν για σκοπούς επιτήρησης και είναι εντελώς ανώνυμα. Μεταξύ των 250 επιχρισμάτων που επιλέχθηκαν τυχαία, τα 26 δεν ήταν πλέον διαθέσιμα καθώς στάλθηκαν στο Κέντρο Αναφοράς Γρίπης για επιβεβαίωση και χαρακτηρισμό του παθογόνου παράγοντα. Σύμφωνα με την ευαισθησία της ανάλυσης, δύο δείγματα θα μπορούσαν να είναι ασυμβίβαστα μεταξύ των αποτελεσμάτων της Influenza PCR που πραγματοποιήθηκε αρχικά και της Multiplex PCR. Έτσι, διαγράφηκαν από την ανάλυση: ένα είναι θετικό για Influenza σε singleplex και αρνητικό για όλα τα ελεγμένα παθογόνα σε multiplex και ένα είναι θετικό για Influenza σε singleplex και θετικό για PIV2 σε multiplex. Συνολικά, εξετάστηκαν 222 αναλύσεις. Επιπλέον, 53 δείγματα ήταν αρνητικά για όλα τα αναλυθέντα παθογόνα του αναπνευστικού (23,9%) και 169 δείγματα είχαν τουλάχιστον ένα ανιχνευμένο παθογόνο (76,1%), τελικά εντοπίστηκαν συνολικά 178 παθογόνα. Κατά την περίοδο της μελέτης, μια μειοψηφία των εβδομάδων (21 δηλ. Το 20%) δεν περιελάμβανε κανένα δείγμα δειγματοληψίας, κυρίως εκτός εποχής γρίπης. Η αναλογία φύλου των ασθενών ήταν 0,63 (86 άνδρες και 136 γυναίκες) και η μέση ηλικία ήταν 28,4 έτη [min 0; μέγιστο 81]. Το 10% είχε ηλικία μικρότερη των 5 ετών, το 24% 5-15 ετών, το 63% 15-65 ετών και μόνο το 3% ήταν 65 ετών και άνω. Τα αναπνευστικά παθογόνα που εντοπίστηκαν συχνότερα στα επιχρίσματα ILI ήταν ο ρινοϊός (23,4%), η γρίπη Α και όχι H1N1 (21,2%) και γρίπη Β (12,6%) (Πίνακας 1) . Μεταξύ των 22 παθογόνων του αναπνευστικού που δοκιμάστηκαν από το πολυπλέκτη, μόνο τρία δεν βρέθηκαν σε κανένα αναλυόμενο δείγμα: Parainfluenza3, Legionella pneumophila και Bordetella pertussis. Όσον αφορά τις συν-λοιμώξεις, εννέα Τα επιχρίσματα αποκάλυψαν την παρουσία δύο ιών, μεταξύ των οποίων 6 αφορούσαν ιούς γρίπης (Πίνακας 2). Οι αναλύσεις έδειξαν ότι ορισμένοι ιοί είναι πιθανώς εποχικοί και κυκλοφορούσαν σε μια συγκεκριμένη περίοδο του έτους. Ανιχνεύονται μόνο το καλοκαίρι για τον ανθρώπινο μεταπνευμοϊό, τον RSV A και B και τη γρίπη A(H1N1)pdm09. Για το τελευταίο, είναι ειδικό για την περίοδο που μελετήθηκε, αφού ο ιός της γρίπης A(H1N1)pdm09 επανεμφανίστηκε στο νησί Réunion τον Οκτώβριο του 2012 και δεν κυκλοφορούσε πλέον από τα τέλη του 2010. Αντίθετα, οι ιοί Parainfluenza 1,2 και 4 εντοπίστηκαν μόνο το χειμώνα. Για άλλα παθογόνα, δεν παρατηρήθηκε συγκεκριμένη περίοδος ανίχνευσης. Πραγματοποιήθηκε μια εβδομαδιαία περιγραφή δειγμάτων για τη μελέτη της κατανομής των παθογόνων του αναπνευστικού το 2011 και το 2012 (Εικόνα 1) . Τα αποτελέσματα των βιολογικών αναλύσεων συγκρίθηκαν με τα δεδομένα των διαβουλεύσεων της ILI που δήλωσαν οι παθολόγοι φρουροί το 2011 και το 2012. Παρατηρήσαμε το 2011, μετά από ένα πρώτο κύμα τον Ιούνιο που οφείλεται κυρίως στον ιό της γρίπης Α και όχι στον ιό H1N1, ένα δεύτερο κύμα διαβουλεύσεων με ILI με κυρίως ταυτοποίηση ιών Parainfluenza και όχι ιών γρίπης. Το 2012, το δεύτερο κύμα επιδημίας στο τέλος του αυστραλιανού χειμώνα συνέπεσε με τους ιούς της γρίπης και την κυκλοφορία του ρινοϊού. Όσον αφορά τα αρνητικά επιχρίσματα (Εικ. 2), δεν παρατηρήσαμε εποχικότητα κατά την περίοδο της μελέτης με παρόμοια αναλογία ανεξάρτητα από την εποχή. Αυτή η αναδρομική μελέτη που βασίζεται σε ένα δίκτυο γιατρών φρουρών έδειξε ότι δεν είναι μόνο οι ιοί της γρίπης υπεύθυνοι για τις διαβουλεύσεις με την ILI. Πράγματι, παρατηρήθηκε σημαντική κυκλοφορία πολλαπλών παθογόνων παραγόντων καθ' όλη τη διάρκεια του έτους, με 12 διαφορετικούς τύπους παθογόνων που εντοπίστηκαν το 2011 και το 2012. Τα αναπνευστικά ιικά παθογόνα ήταν παρόντα στο 76,1% των δειγμάτων, ποσοστό που υπερβαίνει κατά πολύ τα αποτελέσματα της ετήσιας επιτήρησης της γρίπης [12] . Μετά τους ιούς της γρίπης, ο Ρινοϊός και ο Κορωνοϊός ήταν οι πιο συνηθισμένοι ιοί του αναπνευστικού στο νησί Ρεϋνιόν. Παρόλο που τα δείγματα δεν λαμβάνονταν κάθε εβδομάδα, το δείγμα ήταν αντιπροσωπευτικό της δραστηριότητας του ILI και συνάδει με την εποχή της γρίπης. Ωστόσο, σύμφωνα με τον μικρό αριθμό δειγμάτων, είναι δύσκολο να εξαχθούν συμπεράσματα σχετικά με την εποχικότητα. Ωστόσο, στη μελέτη μας, ο RSV κυκλοφορούσε την καλοκαιρινή περίοδο που είναι ζεστή και βροχερή, κάτι που επιβεβαιώνεται από άλλες μελέτες σε τροπικές περιοχές [13] . Αυτή η μελέτη ανέδειξε επίσης αρκετές συν-λοιμώξεις, δείχνοντας ότι συνοδευόταν από την πολλαπλή αιτιολογία του ILI. Συνκυκλοφορία είχε ήδη παρατηρηθεί στο νησί Réunion κατά τη διάρκεια της πανδημίας pdm09 A(H1N1) εκτός από τον ιό της γρίπης, με ταυτοποίηση άλλων αναπνευστικών ιών όπως ο ρινοϊός ή ο κορωνοϊός [14] . Στην ηπειρωτική Γαλλία, κατά τη διάρκεια αυτής της πανδημίας, βρέθηκε κυκλοφορία σημαντικών αναπνευστικών ιών, όπως ο ρινοϊός, η παραγρίππη, ο κορωνοϊός, ο ανθρώπινος μεταπνευμοϊός, όπως στη δημοσίευσή μας [15] [16] . Στη μελέτη μας, μόνο το 5,3% των θετικών επιχρισμάτων ήταν συν-λοιμώξεις ενώ σε δύο μελέτες στη Μαδαγασκάρη οι συν-λοιμώξεις αντιπροσώπευαν το 27,3% και το 29,4% [17] [18] . Παρά την απόσταση 9.300 km μεταξύ Ρεϋνιόν και Γαλλίας, το νησί είναι απευθείας σύνδεση με την Ευρώπη με τέσσερις καθημερινές πτήσεις προς τη Γαλλία. Αυτές οι ανταλλαγές μπορούν να επηρεάσουν την κυκλοφορία των αναπνευστικών παθογόνων στο νότιο και το βόρειο ημισφαίριο. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης μπορούν επομένως να είναι ενδιαφέροντα τόσο για τις χώρες του Ινδικού Ωκεανού όσο και για τις χώρες της Ευρώπης. Μεταξύ των 148 επιχρισμάτων που ήταν αρχικά αρνητικά για γρίπη επειδή δεν είχαν δοκιμαστεί προηγουμένως για άλλους ιούς, η μελέτη βρήκε αιτιολογία για 95 επιχρίσματα. Συνολικά, μόνο 53 επιχρίσματα, που αντιπροσωπεύουν το 24% του δείγματος, παρέμειναν χωρίς αιτιολογία με αρνητικά αποτελέσματα multiplex PCR καθ' όλη τη διάρκεια του έτους. Πολλαπλές υποθέσεις μπορούν να εξηγήσουν αυτό το αποτέλεσμα: κακή ποιότητα επιχρισμάτων, που εμποδίζουν τον εντοπισμό ενός παθογόνου, μη μολυσματικά αίτια ή άλλα παθογόνα που δεν περιλαμβάνονται στη multiplex PCR. Ωστόσο, δεν μπορέσαμε να δοκιμάσουμε τα αρνητικά επιχρίσματα για RNAse P, έναν δείκτη ανθρώπινων κυττάρων, που θα μπορούσε να παράσχει μια ελάχιστη βεβαιότητα ότι το στειλεό περιείχε ανθρώπινα κύτταρα. Όσον αφορά τα δύο δείγματα που αποκλίνουν για αναγνώριση γρίπης μεταξύ της πολυπλεξίας και της singleplex PCR, τα πέταξε για την ανάλυση? Το ένα ήταν θετικό στη γρίπη με singleplex και θετικό στο PIV με multiplex. Θα μπορούσε να είναι ένα ψευδώς θετικό αποτέλεσμα από το singleplex. Πράγματι, καθώς η δοκιμασία multiplex PCR έχει καλή ευαισθησία και θεωρείται ως χρυσό πρότυπο, αποφασίσαμε να διατηρήσουμε επτά αρνητικά αποτελέσματα για Influenza σε singleplex και θετικά στη Influenza in multiplex [7] [8] [9] [10] . Σε αυτή τη μελέτη δεν εντοπίστηκε περίπτωση Bordetella pertussis που προκαλεί κοκκύτη και Legionella pneumophila που προκαλεί τη νόσο των Λεγεωναρίων. Ωστόσο, αυτές οι ασθένειες είναι σπάνιες στο νησί Ρεϋνιόν, περίπου τρία κρούσματα νόσου των Λεγεωνάριων δηλώνονται κάθε χρόνο. Ένα όριο της μελέτης είναι ότι δεν υπήρχαν διαθέσιμα κλινικά δεδομένα στο σύστημα ιολογικής επιτήρησης της γρίπης στη νήσο Ρεϋνιόν. Ήταν αδύνατο να συγκριθούν τα κλινικά συμπτώματα σύμφωνα με κάθε παθογόνο και να γνωρίζουμε εάν υπάρχουν διαφορετικά παθογόνα που προκαλούν, για παράδειγμα, ρινίτιδα, λαρυγγίτιδα ή βρογχίτιδα (ασθένειες που περιλαμβάνονται στο ILI). Μια συγκεκριμένη προοπτική μελέτη που περιλαμβάνει κλινικά δεδομένα μπορεί να παρέχει χρήσιμα στοιχεία στη σημειωτική των ασθενειών. Συμπερασματικά, αυτή η μελέτη ανέδειξε μια σημαντική κυκλοφορία πολλαπλών παθογόνων στο νησί Réunion καθ' όλη τη διάρκεια του έτους. Δείχνει ότι το ILI δεν είναι ειδικό για τη γρίπη και επομένως είναι απαραίτητο να έχουμε βιολογικά αποτελέσματα προκειμένου να τεθεί η διαφορική διάγνωση και να εξηγηθεί έτσι η αιτιολογία των συμπτωμάτων. Για την καλύτερη κατανόηση των παθογόνων του αναπνευστικού που κυκλοφορούν στο νησί Ρεϋνιόν, οι πληροφορίες από αυτή τη μελέτη μπορεί επίσης να είναι χρήσιμες για τους επαγγελματίες που βλέπουν πολλούς ασθενείς σε συνεννόηση με το ILI. Καθώς η χρήση της multiplex RT-PCR έδειξε την αποτελεσματικότητά της στην επιτήρηση της ILI και επέτρεψε να τονίσει την κυκλοφορία άλλων ιών και βακτηριακών αιτιών αναπνευστικών λοιμώξεων, χρησιμοποιείται πλέον συστηματικά στην επιτήρηση της ILI. Επιπλέον, θα ήταν ενδιαφέρον να επαναλαμβάνεται αυτή η μελέτη κάθε 3 ή 5 χρόνια προσθέτοντας κλινικά δεδομένα για την παρακολούθηση της εξέλιξης των παθογόνων του αναπνευστικού στο νησί Réunion με την πάροδο του χρόνου.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 624, "text": "ρινικά επιχρίσματα που συλλέχθηκαν από παθολόγους φρουρούς από ασθενείς με ILI το 2011 και το 2012." } ], "id": 4033, "question": "Τι χρησιμοποιεί η αναδρομική μελέτη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7351, "text": "250" } ], "id": 4034, "question": "Πόσα επιχρίσματα επιλέχθηκαν και αναλύθηκαν τυχαία;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1096, "text": "Εννέα επιχρίσματα (5,3% των θετικών επιχρισμάτων) αποκάλυψαν συν-λοιμώξεις με δύο ιούς που εντοπίστηκαν, μεταξύ των οποίων έξι αφορούσαν συν-λοιμώξεις με ιούς γρίπης." } ], "id": 4038, "question": "Ποιες συν-λοιμώξεις βρέθηκαν;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2481, "text": "850.000" } ], "id": 4089, "question": "Ποιος είναι ο αριθμός των κατοίκων του νησιού Reunion;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2980, "text": "κατά τη διάρκεια του αυστραλιανού χειμώνα, που αντιστοιχεί στο καλοκαίρι στην Ευρώπη" } ], "id": 4092, "question": "Πότε αυξάνεται η δραστηριότητα της γρίπης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3554, "text": "Τα ρινικά επιχρίσματα συλλέγονται τυχαία καθ' όλη τη διάρκεια του έτους και ελέγχονται με RT-PCR για ιούς γρίπης" } ], "id": 4096, "question": "Πώς γίνονται τα τεστ γρίπης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3734, "text": "για τον ιό της γρίπης Α, τον ιό A(H1N1)pdm09 ή τον ιό Β" } ], "id": 4097, "question": "Σε τι βγαίνει θετικό το 40-50% των δειγμάτων;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3933, "text": "είναι άγνωστης αιτιολογίας" } ], "id": 4098, "question": "Ποια είναι τα δείγματα ILI που είναι αρνητικά για επιρροή;" }, { "answers": [ { "answer_start": 9485, "text": "ιοί Parainfluenza 1,2 και 4" } ], "id": 4109, "question": "Ποιοι ιοί εντοπίστηκαν μόνο τον χειμώνα;" }, { "answers": [ { "answer_start": 12765, "text": "53 επιχρίσματα, που αντιπροσωπεύουν το 24% του δείγματος" } ], "id": 4113, "question": "Πόσα επιχρίσματα παρέμειναν χωρίς αιτιολογία;" }, { "answers": [ { "answer_start": 14685, "text": "κυκλοφορία πολλαπλών παθογόνων στο νησί Réunion καθ' όλη τη διάρκεια του έτους." } ], "id": 4116, "question": "Τι αναδεικνύει αυτή η μελέτη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 15482, "text": "να επαναλαμβάνεται αυτή η μελέτη κάθε 3 ή 5 χρόνια προσθέτοντας κλινικά δεδομένα για την παρακολούθηση της εξέλιξης των παθογόνων του αναπνευστικού στο νησί Réunion με την πάροδο του χρόνου." } ], "id": 4118, "question": "Τι θα ήταν ενδιαφέρον να κάνουμε;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Δεν υπάρχουν αξιόπιστα αποδεικτικά στοιχεία που να υποστηρίζουν τους ισχυρισμούς της εργαστηριακής μηχανικής του SARS-CoV-2https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7054935/SHA: 5a9154aee79901dd8fecd58b7bcd9b2-2351u;anshor Saif, Linda J.; Weiss, Susan R.; Su, LishanΗμερομηνία: 2020-02-26DOI: 10.1080/22221751.2020.1733440Άδεια χρήσης: cc-byAbstract: nanΚείμενο: Η εμφάνιση και το ξέσπασμα μιας πρόσφατα ανακαλυφθείσας οξείας αναπνευστικής νόσου, έχει σκοτώσει περισσότερους από 1 στην Κίνα, 400, έχει σκοτώσει περισσότερους από 400 ανθρώπους στη Γουχάν από τις 10 Φεβρουαρίου 2020. Ένας νέος ανθρώπινος κοροναϊός, ο SARS-CoV-2, εντοπίστηκε γρήγορα και η σχετική ασθένεια αναφέρεται πλέον ως νόσος του κοροναϊού που ανακαλύφθηκε το 2019 (COVID-19) (https://globalbiodefense. com/novel-coronavirus-covid-19-portal/).Σύμφωνα με όσα έχουν αναφερθεί [1] [2] [3] , ο COVID-2019 φαίνεται να έχει παρόμοιες κλινικές εκδηλώσεις με αυτές του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου (SARS) που προκαλείται από τον SARS-CoV. Η αλληλουχία του γονιδιώματος SARS-CoV-2 έχει επίσης ~80% ταυτότητα με τον SARS-CoV, αλλά είναι περισσότερο παρόμοια με ορισμένους βήτα κορονοϊούς νυχτερίδων, με την υψηλότερη ταυτότητα >96% [4, 5] . Επί του παρόντος, υπάρχουν εικασίες , φήμες και θεωρίες συνωμοσίας ότι ο SARS-CoV-2 είναι εργαστηριακής προέλευσης. Μερικοί άνθρωποι ισχυρίστηκαν ότι ο ανθρώπινος SARS-CoV-2 διέρρευσε απευθείας από ένα εργαστήριο στη Γουχάν όπου αναφέρθηκε πρόσφατα ένας CoV νυχτερίδας (RaTG13), ο οποίος μοιράστηκε ~96% ομολογία με τον SARS-CoV-2 [4] . Ωστόσο, όπως γνωρίζουμε, ο ανθρώπινος SARS-CoV και ο ενδιάμεσος ξενιστής παλάμης παλάμης SARSlike CoV μοιράζονται 99,8% ομολογία, με συνολικά 202 μονονουκλεοτιδικές (nt) παραλλαγές (SNV) που προσδιορίζονται σε όλο το γονιδίωμα [6] . Δεδομένου ότι υπάρχουν περισσότερες από 1.100 nt διαφορές μεταξύ του ανθρώπινου SARS-CoV-2 και της νυχτερίδας RaTG13-CoV [4] , οι οποίες κατανέμονται σε όλο το γονιδίωμα με ένα φυσικό πρότυπο ακολουθώντας τα τυπικά εξελικτικά χαρακτηριστικά των CoVs, είναι εξαιρετικά απίθανο ότι ο RaTG13 CoV είναι η άμεση πηγή του SARS-CoV-2. Η απουσία ενός λογικού στοχευμένου σχεδίου στις νέες αλληλουχίες ιών και ενός στενού συγγενή σε ένα είδος άγριας ζωής (νυχτερίδες) είναι τα πιο αποκαλυπτικά σημάδια ότι ο SARS-CoV-2 εξελίχθηκε από τη φυσική εξέλιξη. Απαιτείται αναζήτηση ενός ενδιάμεσου ζώου ξενιστή μεταξύ νυχτερίδων και ανθρώπων για τον εντοπισμό ζωικών CoV που σχετίζονται στενότερα με τον ανθρώπινο SARS-CoV-2. Υπάρχουν εικασίες ότι οι παγκολίνοι μπορεί να φέρουν CoVs στενά συνδεδεμένους με τον SARS-CoV-2, αλλά τα δεδομένα που να τεκμηριώνουν αυτό δεν έχουν ακόμη δημοσιευθεί (https:// www.nature.com/articles/d41586-020-00364-2). Άλλο ο ισχυρισμός στα κινεζικά μέσα κοινωνικής δικτύωσης παραπέμπει σε ένα έγγραφο της Nature Medicine που δημοσιεύθηκε το 2015 [7] , το οποίο αναφέρει την κατασκευή ενός χιμαιρικού CoV με ένα γονίδιο CoV S νυχτερίδας (SHC014) στη ραχοκοκαλιά ενός SARS CoV που έχει προσαρμοστεί να μολύνει ποντίκια (MA15 ) και είναι ικανό να μολύνει ανθρώπινα κύτταρα [8] . Ωστόσο, αυτός ο ισχυρισμός στερείται επιστημονικής βάσης και πρέπει να απορριφθεί λόγω σημαντικής απόκλισης στη γενετική αλληλουχία αυτού του κατασκευάσματος με το νέο SARS-CoV-2 (>5.000 νουκλεοτίδια). Ο ιός SARS προσαρμοσμένος σε ποντίκια (MA15) [9] ήταν που δημιουργείται από σειριακή διέλευση ενός μολυσματικού κλώνου SARS CoV άγριου τύπου στην αναπνευστική οδό ποντικών BALB/c. Μετά από 15 περάσματα σε ποντίκια, ο SARS-CoV απέκτησε αυξημένη αντιγραφή και παθογένεση των πνευμόνων σε ηλικιωμένα ποντίκια (εξ ου και M15), λόγω έξι κωδικοποιητικών γενετικών μεταλλάξεων που σχετίζονται με την προσαρμογή του ποντικού. Είναι πιθανό ότι το MA15 είναι εξαιρετικά εξασθενημένο για να αναδιπλασιαστεί σε ανθρώπινα κύτταρα ή ασθενείς λόγω της προσαρμογής του ποντικού. Προτάθηκε ότι το γονίδιο S από τον CoV που προέρχεται από νυχτερίδα, σε αντίθεση με αυτό από ανθρώπινους ασθενείς ή ιούς που προέρχονται από civets, δεν ήταν σε θέση να χρησιμοποιήσει το ανθρώπινο ACE2 ως υποδοχέας εισόδου στα ανθρώπινα κύτταρα [10, 11] . Τα Civets προτάθηκαν ως ενδιάμεσος ξενιστής των νυχτερίδων CoV, ικανός να μεταδώσει τον SARS CoV στους ανθρώπους [6, 12]. Ωστόσο, το 2013 απομονώθηκαν αρκετοί νέοι κοροναϊοί νυχτερίδων από νυχτερίδες με νυχτερίδες και η νυχτερίδα τύπου SARS ή SL-CoV-WIV1 μπόρεσε να χρησιμοποιήσει το ACE2 από ανθρώπους, μοσχοκάρφι και κινέζικες νυχτερίδες πέταλου για είσοδο [8] . Σε συνδυασμό με εξελικτικά στοιχεία ότι το γονίδιο ACE2 της νυχτερίδας έχει επιλεγεί θετικά στις ίδιες θέσεις επαφής με το ανθρώπινο γονίδιο ACE2 για αλληλεπίδραση με το SARS CoV [13], προτάθηκε ότι μπορεί να μην είναι απαραίτητος ένας ενδιάμεσος ξενιστής και ότι ορισμένοι SL-CoV της νυχτερίδας μπορεί να είναι σε θέση να μολύνει άμεσα ανθρώπινους ξενιστές. Για να αντιμετωπιστεί άμεσα αυτή η πιθανότητα, το ακριβές γονίδιο S από τον κοροναϊό της νυχτερίδας SL-SHC014 συντέθηκε και χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία ενός χιμαιρικού ιού στη ραχοκοκαλιά MA15 SARS-CoV προσαρμοσμένη σε ποντίκι. Ο προκύπτων ιός SL-SHC014-MA15 θα μπορούσε πράγματι να χρησιμοποιήσει αποτελεσματικά το ανθρώπινο ACE2 και να αναπαραχθεί σε πρωτεύοντα κύτταρα ανθρώπινου αεραγωγού με παρόμοιους τίτλους με τα επιδημικά στελέχη του SARS-CoV. Ενώ το SL-SHC014-MA15 μπορεί να αναπαραχθεί αποτελεσματικά σε νεαρούς και ηλικιωμένους πνεύμονες ποντικιού, η μόλυνση μειώθηκε και λιγότερο αντιγόνο ιού υπήρχε στο επιθήλιο των αεραγωγών σε σύγκριση με το SARS MA15, το οποίο προκαλεί θανατηφόρα αποτελέσματα σε ηλικιωμένα ποντίκια [7]. αυξημένη παθογόνος δραστηριότητα του χιμαιρικού ιού SHC014-MA15 σε σχέση με τον χιμαιρικό ιό MA15 με το αρχικό ανθρώπινο γονίδιο SARS S σε ποντίκια, τέτοια πειράματα με τον χιμαιρικό ιό SL-SHC014-MA15 περιορίστηκαν αργότερα ως μελέτες κέρδους λειτουργίας (GOF) υπό την κυβέρνηση των ΗΠΑ -πολιτική υποχρεωτικής παύσης (https://www.nih.gov/about-nih/who-weare/nih-director/statements/nih-lifts-funding-pausegain-function-research). Η τρέχουσα επιδημία COVID-2019 έχει επανεκκινήσει τη συζήτηση σχετικά με τους κινδύνους κατασκευής τέτοιων ιών που θα μπορούσαν να έχουν δυνατότητα πανδημίας, ανεξάρτητα από το εύρημα ότι αυτοί οι CoVs νυχτερίδων υπάρχουν ήδη στη φύση. Ανεξάρτητα, μετά από προσεκτικές φυλογενετικές αναλύσεις από πολλές διεθνείς ομάδες [5, 14], ο SARS-CoV-2 είναι αναμφίβολα διαφορετικός από τον SL-SHC014-MA15, με >6.000 διαφορές νουκλεοτιδίων σε ολόκληρο το γονιδίωμα. Επομένως, για άλλη μια φορά δεν υπάρχουν αξιόπιστα στοιχεία που να υποστηρίζουν τον ισχυρισμό ότι ο SARS-CoV-2 προέρχεται από τον χιμαιρικό ιό SL-SHC014-MA15. Υπάρχουν επίσης φήμες ότι ο SARS-CoV-2 δημιουργήθηκε τεχνητά ή σκόπιμα από ανθρώπους στο εργαστήριο, και αυτό επισημαίνεται σε ένα χειρόγραφο που υποβλήθηκε στο BioRxiv (ένας ιστότοπος κοινής χρήσης χειρογράφων πριν από οποιαδήποτε αξιολόγηση από ομοτίμους), υποστηρίζοντας ότι ο SARS-CoV-2 έχει αλληλουχία HIV και, επομένως, πιθανότατα δημιουργήθηκε στο εργαστήριο. Σε ένα έγγραφο διάψευσης με επικεφαλής έναν ιολόγο HIV-1, Δρ. Φενγκ Γκάο, χρησιμοποίησαν προσεκτικές αναλύσεις βιοπληροφορικής για να αποδείξουν ότι ο αρχικός ισχυρισμός για πολλαπλές εισαγωγές HIV στον SARS-CoV-2 δεν είναι ειδικός για τον HIV-1 αλλά τυχαίος [15] . Λόγω των πολλών ανησυχιών που εγείρει η διεθνής κοινότητα, οι συγγραφείς που έκαναν τον αρχικό ισχυρισμό έχουν ήδη αποσύρει αυτήν την έκθεση. Η εξέλιξη είναι σταδιακά και συγκεντρώνει μεταλλάξεις σταδιακά με την πάροδο του χρόνου, ενώ οι συνθετικές κατασκευές συνήθως χρησιμοποιούν μια γνωστή ραχοκοκαλιά και εισάγουν λογικές ή στοχευμένες αλλαγές από τις τυχαία εμφανιζόμενες μεταλλάξεις που υπάρχουν σε φυσικά απομονωμένους ιούς όπως ο CoV RaTG13 της νυχτερίδας. Κατά την άποψή μας, δεν υπάρχουν επί του παρόντος αξιόπιστα στοιχεία που να υποστηρίζουν τον ισχυρισμό ότι ο SARS-CoV-2 προήλθε από έναν εργαστηριακά κατασκευασμένο CoV. Είναι πιο πιθανό ότι ο SARS-CoV-2 είναι ένας ανασυνδυασμένος CoV που δημιουργείται στη φύση μεταξύ ενός CoV νυχτερίδας και ενός άλλου κοροναϊού σε ένα ενδιάμεσο ζώο ξενιστή. Απαιτούνται περισσότερες μελέτες για τη διερεύνηση αυτής της πιθανότητας και την επίλυση της φυσικής προέλευσης του SARS-CoV-2. Πρέπει να τονίσουμε ότι, παρόλο που ο SARS-CoV-2 δεν παρουσιάζει στοιχεία εργαστηριακής προέλευσης, οι ιοί με τόσο μεγάλες απειλές για τη δημόσια υγεία πρέπει να αντιμετωπίζονται σωστά στο εργαστήριο και επίσης να ρυθμίζονται κατάλληλα από την επιστημονική κοινότητα και τις κυβερνήσεις. Δεν αναφέρθηκε πιθανή σύγκρουση συμφερόντων από τους συγγραφείς.Susan R. Weiss http://orcid.org/0000-0002-8155-4528", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 3599, "text": "λόγω έξι κωδικοποιητικών γενετικών μεταλλάξεων που σχετίζονται με την προσαρμογή του ποντικού" } ], "id": 3601, "question": "Πώς ο SARS-CoV απέκτησε αυξημένη αντιγραφή και παθογένεση των πνευμόνων σε ηλικιωμένα ποντίκια;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5053, "text": "Ο προκύπτων ιός SL-SHC014-MA15 θα μπορούσε πράγματι να χρησιμοποιήσει αποτελεσματικά το ανθρώπινο ACE2 και να αναπαραχθεί σε πρωτεύοντα κύτταρα ανθρώπινου αεραγωγού με παρόμοιους τίτλους με τα επιδημικά στελέχη του SARS-CoV. Ενώ το SL-SHC014-MA15 μπορεί να αναπαραχθεί αποτελεσματικά σε νεαρούς και ηλικιωμένους πνεύμονες ποντικιού, η μόλυνση μειώθηκε και λιγότερο αντιγόνο ιού υπήρχε στο επιθήλιο των αεραγωγών σε σύγκριση με το SARS MA15, το οποίο προκαλεί θανατηφόρα αποτελέσματα σε ηλικιωμένα ποντίκια" } ], "id": 3608, "question": "Ποια ήταν τα αποτελέσματα αυτής της δοκιμής;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6242, "text": "μετά από προσεκτικές φυλογενετικές αναλύσεις από πολλές διεθνείς ομάδες [5, 14], ο SARS-CoV-2 είναι αναμφίβολα διαφορετικός από τον SL-SHC014-MA15, με >6.000 διαφορές νουκλεοτιδίων σε ολόκληρο το γονιδίωμα." } ], "id": 3610, "question": "Γιατί δεν υπάρχουν αξιόπιστα στοιχεία που να υποστηρίζουν τον ισχυρισμό ότι ο SARS-CoV-2 προέρχεται από τον χιμαιρικό ιό SL-SHC014-MA15;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7049, "text": "χρησιμοποίησαν προσεκτικές αναλύσεις βιοπληροφορικής για να αποδείξουν ότι ο αρχικός ισχυρισμός για πολλαπλές εισαγωγές HIV στον SARS-CoV-2 δεν είναι ειδικός για τον HIV-1 αλλά τυχαίος" } ], "id": 3612, "question": "Τι αναφέρθηκε σε ένα έγγραφο διάψευσης με επικεφαλής έναν ιολόγο HIV-1, Δρ Φενγκ Γκάο;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Αποτελεσματικότητα των συμπληρωμάτων ψευδαργύρου στη διάρροια και το μέσο ημερήσιο κέρδος σε μόσχους γαλακτοπαραγωγής που είχαν απογαλακτιστεί πριν από τον απογαλακτισμό: Μια διπλά τυφλή, τυχαιοποιημένη με αποκλεισμό, ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο κλινική δοκιμή https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6619766/ SHA: ef20a0cd67ce018cf061f154bd8be9d0e58d0f23Συγγραφείς: Feldmann, Hillary R.; Williams, Deniece R.; Champagne, John D.; Lehenbauer, Terry W.; Aly, Sharif S.Date: 2019-07-10DOI: 10.1371/journal.pone.0219321License: cc-byAbstract: Ο στόχος αυτής της κλινικής δοκιμής ήταν να αξιολογήσει την αποτελεσματικότητα των συμπληρωμάτων ψευδαργύρου στη διάρροια και τη μέση ημερήσια αύξηση βάρους (ADG) σε μόσχοι γαλακτοπαραγωγής που είχαν προαπογαλακτιστεί. Συνολικά 1.482 υγιείς μόσχοι δαμαλίδων και ταύρων Holstein από ένα μεγάλο γαλακτοκομείο στην Καλιφόρνια εγγράφηκαν σε ηλικία 24 έως 48 ωρών μέχρι την έξοδο από την καλύβα σε ηλικία περίπου 90 ημερών. Τα μοσχάρια τυχαιοποιήθηκαν κατά μπλοκ με χρόνο σε μία από τις τρεις θεραπείες: 1) εικονικό φάρμακο, 2) μεθειονίνη ψευδαργύρου (ZM) ή 3) θειικός ψευδάργυρος (ZS) που χορηγήθηκε στο γάλα μία φορά την ημέρα για 14 ημέρες. Μετρήθηκαν η ολική πρωτεΐνη ορού κατά την εγγραφή και το σωματικό βάρος κατά τη γέννηση, το τέλος της θεραπείας και την έξοδο από την καλύβα. Η συνοχή των κοπράνων αξιολογούνταν καθημερινά για 28 ημέρες μετά την εγγραφή. Για ένα τυχαίο δείγμα 127 μόσχων, πραγματοποιήθηκαν συγκεντρώσεις ψευδαργύρου στον ορό πριν και μετά τη θεραπεία και ELISA αντιγόνου κοπράνων κατά την έναρξη και την επίλυση της διάρροιας για Escherichia coli K99, ροταϊό, κοροναϊό και Cryptosporidium parvum. Η γραμμική παλινδρόμηση έδειξε ότι οι ταύροι που έλαβαν θεραπεία με ZM είχαν 22 g αυξημένη ADG σε σύγκριση με τους ταύρους που έλαβαν εικονικό φάρμακο (P = 0,042). Οι δαμαλίδες που έλαβαν θεραπεία με ZM είχαν 9 g μειωμένη ADG σε σύγκριση με τις δαμαλίδες που έλαβαν εικονικό φάρμακο (P = 0,037), μετά από προσαρμογή για το μέσο βάρος γέννησης. Μοντέλα στρωματοποιημένα με βάση το φύλο έδειξαν ότι οι δαμαλίδες υψηλού βάρους γέννησης που έλαβαν θεραπεία με ZM κέρδισαν περισσότερο από τις δαμαλίδες που έλαβαν εικονικό φάρμακο ίδιου βάρους γέννησης, γεγονός που υποδηλώνει μια επίδραση δόσης-απόκρισης παρά μια πραγματική επίδραση του ZM στο ADG. Η παλινδρόμηση Cox έδειξε ότι οι μόσχοι που έλαβαν θεραπεία με ZM και ZS είχαν 14,7% (P = 0,015) και 13,9% (P = 0,022) μειωμένο κίνδυνο διάρροιας, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τους μόσχους που έλαβαν εικονικό φάρμακο. Μόσχοι που έλαβαν συμπλήρωμα για τουλάχιστον τις πρώτες πέντε ημέρες της διάρροιας με ZM και ZS είχαν 21,4% (P = 0,027) και 13,0% (P = 0,040) αυξημένο κίνδυνο θεραπείας από διάρροια, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τους μόσχους που έλαβαν εικονικό φάρμακο. Η λογιστική παλινδρόμηση έδειξε ότι οι πιθανότητες μικροβιολογικής θεραπείας στην επίλυση της διάρροιας για τον ροταϊό, το C. parvum ή οποιοδήποτε μεμονωμένο παθογόνο των κοπράνων δεν ήταν διαφορετικές μεταξύ των ομάδων θεραπείας. Η λήψη συμπληρωμάτων ψευδαργύρου καθυστέρησε τη διάρροια και επιτάχυνε την ανάρρωση της διάρροιας σε μόσχους που είχαν προαπογαλακτιστεί. Επιπρόσθετα, ο ψευδάργυρος βελτίωσε διαφορετικά την αύξηση βάρους στους ταύρους σε σύγκριση με τις δαμαλίδες, υποδεικνύοντας την ανάγκη έρευνας για δοσολογία ανάλογα με το φύλο. Κείμενο: Εισαγωγή Η διάρροια είναι η κύρια αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας και ο πιο κοινός λόγος για θεραπείες με αντιμικροβιακά φάρμακα σε προ-απογαλακτισμένες γαλακτοκομικές δαμαλίδες [1, 2] . Μια έρευνα του USDA σε προ-απογαλακτισμένες δαμαλίδες ανέφερε ότι το 24% παρουσίασε διάρροια και το 18% έλαβε αντιμικροβιακή αγωγή για αυτήν [1] . Η διάρροια είναι επίσης η κύρια αιτία νοσηρότητας και η δεύτερη κύρια αιτία θνησιμότητας σε παιδιά με πάνω από 1 δισεκατομμύριο περιπτώσεις και μισό εκατομμύριο θανάτους ετησίως [3, 4]. Η λήψη συμπληρωμάτων ψευδαργύρου στα παιδιά μειώνει τη συχνότητα, τη διάρκεια και τη σοβαρότητα της διάρροιας, αυξάνει τα ποσοστά αποκατάστασης, μειώνει τη χρήση αντιβιοτικών και αντιδιαρροϊκών φαρμάκων και μειώνει τη θνησιμότητα [5] [6] [7] [8] [9] [10] . Σε μια κλινική δοκιμή που καθιέρωσε μια μη τοξική δόση ψευδαργύρου και διερεύνησε τη θεραπευτική χρήση του για τη διάρροια σε νεογνά γαλακτοκομικά μοσχάρια, τα μοσχάρια που έλαβαν θεραπεία με ψευδάργυρο είχαν αριθμητικά ταχύτερη κλινική ανάκαμψη, αυξημένη αύξηση βάρους και υψηλότερες πιθανότητες κάθαρσης των κοπράνων του Cryptosporidium parvum μεταξύ της έναρξης της διάρροιας. και ανάκτηση σε σύγκριση με μόσχους που έλαβαν εικονικό φάρμακο [11] . Ως αποτέλεσμα, η λήψη συμπληρωμάτων ψευδαργύρου μπορεί να είναι ευεργετική για την πρόληψη της διάρροιας σε μόσχους γαλακτοπαραγωγής και, επομένως, να ελαχιστοποιήσει τη χρήση αντιμικροβιακών. Ωστόσο, δεν υπάρχουν μελέτες που να διερευνούν την πιθανή αποτελεσματικότητα του ψευδαργύρου. Στα παιδιά, τόσο τα οργανικά (οξικός ψευδάργυρος, γλυκονικός ψευδάργυρος και μεθειονίνη ψευδάργυρου) όσο και τα ανόργανα (θειικός ψευδάργυρος και οξείδιο του ψευδαργύρου) είναι ευεργετικά για την πρόληψη και τη θεραπεία της παιδικής διάρροιας [12] [13] [14] [15] . Ωστόσο, διαφορετική βιοδιαθεσιμότητα παρατηρήθηκε σε αρκετές μελέτες σε ζώα [16] [17] [18] [19] . Επιπλέον, ο υποκείμενος μηχανισμός δράσης του ψευδαργύρου από το στόμα είναι άγνωστος [6] . Ως εκ τούτου, η αντίθεση της επίδρασης, εάν υπάρχει, των οργανικών σκευασμάτων σε σύγκριση με τα ανόργανα σκευάσματα ψευδαργύρου σε προ-απογαλακτισμένους μόσχους μπορεί να βοηθήσει στον εντοπισμό διαφορών στον τρόπο δράσης. Ο στόχος αυτής της κλινικής δοκιμής ήταν η σύγκριση της μέσης ημερήσιας αύξησης βάρους (ADG) και της συχνότητας εμφάνισης και διάρκεια της διάρροιας σε προ-απογαλακτισμένους μόσχους γαλακτοπαραγωγής που τυχαία έλαβαν είτε οργανικό ψευδάργυρο μεθειονίνη (ZM), ανόργανο θειικό ψευδάργυρο (ZS) ή ένα εικονικό φάρμακο σε γάλα μία φορά την ημέρα για 14 ημέρες. Με την αποσαφήνιση του πιθανού ρόλου του συμπληρώματος ψευδαργύρου στην πρόληψη της διάρροιας σε προαγαλακτισμένους μόσχους, η νοσηρότητα των μόσχων, η θνησιμότητα και η χρήση αντιμικροβιακών μπορεί να μετριαστεί. Μια διπλή τυφλή, τυχαιοποιημένη, ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο κλινική δοκιμή διεξήχθη μεταξύ 14 Δεκεμβρίου 2015 και 15 Ιουνίου 2016 σε ένα μεγάλο γαλακτοκομείο στην κοιλάδα San Joaquin της Καλιφόρνια. Το γαλακτοκομείο επιλέχθηκε με βάση την προθυμία του ιδιοκτήτη και του διευθυντή μοσχαριού να συμμετάσχει στη μελέτη. Το κοπάδι γαλακτοπαραγωγής αποτελούνταν από 5.500 θηλάζουσες αγελάδες, κυρίως Holstein, και στέγαζε περίπου 1.600 προαπογαλακτισμένα μοσχάρια. Περίπου το 75% των μόσχων γεννήθηκαν στο συμμετέχον γαλακτοκομείο και το 25% γεννήθηκαν σε ένα συνδεδεμένο γαλακτοκομείο που βρίσκεται περίπου 10 μίλια μακριά. Μόσχοι που εγγράφηκαν στη δοκιμή περιελάμβαναν υγιείς μόσχους από δαμάλες Holstein ή ταύρο ηλικίας 24 έως 48 ωρών. Οι μόσχοι προσδιορίστηκαν ότι είναι υγιείς μέσω οπτικής εξέτασης από κτηνίατρο (HF) ή εκπαιδευμένο ερευνητή. Τα μοσχάρια αποκλείστηκαν εάν είχαν εμφανείς νοσηρότητες ή συγγενή ελαττώματα, ήταν μη Holstein, γεννήθηκαν στο συνδεδεμένο γαλακτοκομείο, ηλικίας μικρότερης των 24 ωρών ή μεγαλύτερης των 48 ωρών κατά τη στιγμή της εγγραφής. Μόσχοι από το συνδεδεμένο γαλακτοκομείο αποκλείστηκαν λόγω διαφορών στη φυσική τοποθεσία και στις πρακτικές διαχείρισης των αγελάδων πριν τον τοκετό. Όλες οι διαδικασίες εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Πανεπιστημίου της Καλιφόρνια Davis (αριθμός πρωτοκόλλου 18067 Εγκρίθηκε: 6 Μαρτίου 2014) 0,107 g μεταξύ των ομάδων θεραπείας (Stata, College Station, TX). Αφού επιτράπηκε η τριβή 15% και υποθέσαμε ότι η επίπτωση της διάρροιας είναι 50% με βάση τη γνώμη των ειδικών των συγγραφέων της μελέτης και μια διαφορά στην ADG των 107 g [11] , κρίθηκε απαραίτητο ένα μέγεθος δείγματος 500 μόσχων ανά ομάδα θεραπείας (n = 1500 συνολικά). Τα νεογέννητα μοσχάρια αφαιρέθηκαν από το φράγμα μέσα σε μία ώρα από τη γέννηση και τοποθετήθηκαν σε ένα ομαδικό μοσχαράκι με άχυρο, όπου οι ομφαλοί τους βυθίστηκαν σε διάλυμα με βάση το ιώδιο. Κάθε μοσχάρι έλαβε 4 λίτρα πρωτόγαλα μέσα σε 1 ώρα από τη γέννηση και ένα δεύτερο τάισμα με πρωτόγαλα (2 λίτρα) 6-10 ώρες μετά τη γέννηση. Το πρωτόγαλα ψύχθηκε για < 48 ώρες και θερμάνθηκε σε λουτρό ζεστού νερού πριν από τη σίτιση χρησιμοποιώντας τροφοδότη οισοφαγικού σωλήνα. Εντός 18 ωρών από τη γέννηση, τα προ-απογαλακτισμένα μοσχάρια μεταφέρθηκαν σε μεμονωμένες μεταλλικές καλύβες που είχαν αρχικά στρωμένες με κοχύλια αμυγδάλου. Αργότερα, ο άχυρος σανός προστέθηκε σε υγρές και λασπώδεις καλύβες καθ' όλη τη διάρκεια της περιόδου προαπογαλακτισμού. Για τις πρώτες 14 ημέρες της ζωής τους, τα προαπογαλακτισμένα μοσχάρια ταΐζονταν με μπιμπερό 1,9 λίτρα γάλα δύο φορές την ημέρα και 1,9 λίτρα εμπορικού πόσιμου διαλύματος ηλεκτρολυτών (Calva Lyte; Calva Products, Inc., Acampo, CA) μία φορά την ημέρα μεταξύ των γαλακτοτροφών. Το γάλα αποτελούνταν από ένα συνδυασμό παστεριωμένου άχρηστου γάλακτος, επανενυδατωμένης εμπορικής σκόνης υποκατάστατου γάλακτος (Strauss Feeds LLC, Watertown, WI), τετρακυκλίνης και σκόνης νεομυκίνης και πρόσθετων συμπληρωμάτων (Πίνακας S1). Η αναλογία παστεριωμένου άχρηστου γάλακτος προς υποκατάστατο γάλακτος ποικίλλει με κάθε τάισμα, καθώς ο όγκος του υπολειμματικού γάλακτος ποικίλλει ανάλογα με τις αλλαγές στον αριθμό και την παραγωγή των αγελάδων που συνεισφέρουν στη δεξαμενή υπολειμμάτων γάλακτος. Μετά την ηλικία των 14 ημερών, τα μοσχάρια ταΐζονταν με μπιμπερό 2,8 λίτρα γάλα δύο φορές την ημέρα. Μόσχοι με κλινική διάρροια έλαβαν 1,9 λίτρα ενός εμπορικού πόσιμου διαλύματος ηλεκτρολυτών (NuLife; Genex Cooperative, Inc., Shawano, WI) μία φορά την ημέρα μεταξύ των γαλακτοτροφών. Μια λίστα συστατικών που συνθέτουν τα δύο πόσιμα ηλεκτρολυτικά διαλύματα μπορεί να βρεθεί στον Πίνακα S2. Όλα τα προ-απογαλακτισμένα μοσχάρια είχαν ελεύθερη επιλογή πρόσβασης σε νερό και ένα μείγμα δημητριακών εκκίνησης μόσχων. Τα μοσχάρια απογαλακτίστηκαν σταδιακά σε μια περίοδο 10 ημερών, ξεκινώντας από την ηλικία των 60 ημερών περίπου, μετά την οποία τα μοσχάρια έλαβαν ένα μείγμα σιτηρών μέχρι την ηλικία των 90 ημερών, όταν μεταφέρθηκαν σε ομαδικά μοσχαράκια. Κάθε μοσχάρι έλαβε 1 mL συμπληρώματος σεληνίου (MU -SE; Merck Animal Health, Boxmeer, Ολλανδία) ενδομυϊκά εντός 24 ωρών από την ηλικία και ένα ενδορρινικό εμβόλιο (Inforce 3, Zoetis, Inc., Florham Park, NJ) εντός 48 ωρών από την ηλικία και πάλι κοντά στη στιγμή του απογαλακτισμού. Περίπου το 8,3% (n = 126) όλων των εγγεγραμμένων μόσχων εμβολιάστηκαν επίσης χρησιμοποιώντας ένα αυτογενές εμβόλιο βακτηριδίου Moraxella bovis/bovoculi (Newport Laboratories, Inc., Worthington, MN) για την πρόληψη του pinkeye στην ηλικία των 5 και 7 εβδομάδων. Όλοι οι μόσχοι που είχαν απογαλακτιστεί πριν από τον απογαλακτισμό αξιολογούνταν καθημερινά από το γαλακτοκομικό προσωπικό για ασθένειες των μόσχων και έλαβαν θεραπεία σύμφωνα με τα τυπικά πρωτόκολλα θεραπείας στο αγρόκτημα. Όσον αφορά τη θεραπεία της διάρροιας, μόσχοι ηλικίας κάτω των δύο εβδομάδων με κλινική διάρροια έλαβαν από του στόματος μείγμα 118,5 mL (2,08 g) υποσαλικυλικού βισμούθιου (Bismusal Suspension, Durvet, Inc., Blue Springs, MO) και 31,5 mL (1575 mg) σπεκτινομυκίνη (SpectoGard, Bimeda, Inc., Le Sueur, MN) μία φορά την ημέρα για δύο ημέρες. Μόσχοι ηλικίας άνω των δύο εβδομάδων με κλινική διάρροια έλαβαν από του στόματος σουλφαμεθοξαζόλη (1600 mg)/τριμεθοπρίμη (320 mg) (Amneal Pharmaceuticls of NY, Hauppauge, NY) μία φορά την ημέρα για 2 έως 3 ημέρες. Η επαναλαμβανόμενη θεραπεία ήταν στη διακριτική ευχέρεια του διευθυντή μόσχου. (επαγωγικά συζευγμένη φασματομετρία μάζας πλάσματος). Οι οικονομικοί περιορισμοί περιόρισαν τη δυνατότητα δοκιμής περισσότερων από δύο δειγμάτων από κάθε διατροφικό συστατικό. Λόγω της διακύμανσης της περιεκτικότητας σε ψευδάργυρο σε διπλά δείγματα, η μέγιστη συγκέντρωση χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση της ημερήσιας πρόσληψης ψευδαργύρου κατά τις πρώτες 14 ημέρες της ζωής (Πίνακας S3). Σε ομάδες των 36, οι εγγεγραμμένοι μόσχοι τυχαιοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μια γεννήτρια τυχαίων αριθμών (Microsoft Corporation , Redmond, WA) σε μία από τις τρεις ομάδες θεραπείας: 1) εικονικό φάρμακο, 2) ZM, ή 3) ZS που θα χορηγείται το πρωί με γάλα, μία φορά την ημέρα για 14 ημέρες, ξεκινώντας την επόμενη ημέρα μετά την εγγραφή. Κατά τη διάρκεια της περιόδου θεραπείας με ψευδάργυρο 14 ημερών, τα μοσχάρια της μελέτης που δεν ήπιαν ολόκληρο το μπουκάλι γάλα τάισαν με σωλήνα το υπόλοιπο γάλα από εκπαιδευμένους τεχνικούς χρησιμοποιώντας μια οισοφαγική τροφοδοσία που απολυμαίνεται μεταξύ των χρήσεων. Η ομάδα θεραπείας ZM έλαβε 0,45 g συμπλόκου ψευδαργύρου μεθειονίνης (ισοδύναμο με 80 mg στοιχειακού ψευδαργύρου) ως προϊόν Zinpro180 (Zinpro Corporation, Eden Prairie, MN) σε συνδυασμό με 0,44 g σκόνης αντικατάστασης γάλακτος. Η ομάδα θεραπείας ZS έλαβε 0,22 g μονοένυδρου θειικού ψευδαργύρου (ισοδύναμο με 80 mg στοιχειακού ψευδαργύρου) (Sigma-Aldrich Company, St. Louis, ΜΟ) σε συνδυασμό με 0,44 g σκόνης αντικατάστασης γάλακτος. Η ομάδα θεραπείας με εικονικό φάρμακο έλαβε περίπου 0,44 g σκόνης υποκατάστατου φρέσκου γάλακτος. Τα συμπληρώματα ψευδαργύρου βασίστηκαν σε μια προηγουμένως δημοσιευμένη κλινική δοκιμή, τοξικολογικές μελέτες και διατροφικές οδηγίες [11, [22] [23] [24] [25] . Η σκόνη αντικατάστασης γάλακτος που χρησιμοποιήθηκε στην προετοιμασία της θεραπείας ήταν το ίδιο προϊόν που χρησιμοποιήθηκε στο σιτηρέσιο γάλακτος μόσχου προαπογαλακτισμού. Οι θεραπείες ζυγίστηκαν (ζυγαριά ακριβείας GX-2000. A&D Co Ltd., San Jose, CA) στο Dairy Epidemiology Laboratory στο Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, Davis Veterinary Medicine Teaching and Research Center (VMTRC; Aly Lab) στο Tulare, CA και τοποθετήθηκε σε σωλήνες μικροφυγοκέντρησης 2,0 mL με κουμπωτά πώματα πολυπροπυλενίου (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Πριν από την έναρξη της μελέτης, ένα χρώμα εκχωρήθηκε τυχαία και μόνιμα σε κάθε ομάδα θεραπείας, μετά την οποία οι σωλήνες θεραπείας, τα μπουκάλια μοσχαρίσιου γάλακτος και οι καλύβες μοσχαριών σημειώθηκαν είτε με ροζ, πορτοκαλί ή κίτρινο μελάνι. Οι ερευνητές της μελέτης και οι τεχνικοί που ήταν υπεύθυνοι για την προετοιμασία, την κατανομή, τη χορήγηση και τη συλλογή δεδομένων της μελέτης τυφλώθηκαν ως προς την εκχώρηση χρώματος μέχρι την ολοκλήρωση της δοκιμής. Το μοσχάρι βγήκε από την καλύβα (ηλικίας περίπου 90 ημερών) και από εδώ και πέρα ​​θα αναφέρεται ως «η περίοδος πριν από τον απογαλακτισμό». Οι διαδικασίες εγγραφής και μελέτης μόσχων πραγματοποιούνταν καθημερινά την ώρα του πρωινού ταΐσματος. Κατά την εγγραφή, καταγράφηκαν χαρακτηριστικά των μόσχων, συμπεριλαμβανομένου του φύλου, της ημερομηνίας γέννησης, της ώρας της πρώτης σίτισης με πρωτόγαλα και του χρώματος της θεραπείας. Η στάση και τα περιττώματα αξιολογούνταν καθημερινά μέχρι 28 ημέρες μετά την εγγραφή χρησιμοποιώντας προηγουμένως δημοσιευμένες μεθόδους [11] από δύο ερευνητές της μελέτης, έναν κτηνίατρο και έναν εκπαιδευμένο ερευνητή. Η βαθμολόγηση της στάσης βασίστηκε σε μια κλίμακα τριών βαθμών. Ένα μοσχάρι με βαθμολογία στάσης 1 ήταν λαμπερό, σε εγρήγορση και στάθηκε εύκολα με διέγερση. Ένα μοσχάρι με βαθμολογία 2 ήταν ήσυχο, σε εγρήγορση και στεκόταν μόνο με μέτρια διέγερση. ένα μοσχάρι με βαθμολογία 3 εμφάνισε μια θαμπή νοοτροπία και παρέμεινε ξαπλωμένο ως απόκριση στη διέγερση. Η βαθμολόγηση των κοπράνων πραγματοποιήθηκε μόνο σε φρέσκα κόπρανα και βασίστηκε επίσης σε μια κλίμακα τριών βαθμών, όπως 1 (στερεό), 2 (ημι-σχηματισμένο/χαλαρό) ή 3 (υδατώδες). Εάν δεν παρατηρήθηκαν φρέσκα κόπρανα στην καλύβα, καταγράφηκε \"δεν φαίνεται\" (NS). Το σωματικό βάρος μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μια ψηφιακή ζυγαριά κατά τη γέννηση, το τέλος της θεραπείας και την έξοδο από την καλύβα από τους υπαλλήλους της φάρμας, με εξαίρεση τα βάρη στο τέλος της θεραπείας, τα οποία καταγράφηκαν από τους ερευνητές της μελέτης. Οι θεραπείες για ασθένειες που διαγνώστηκαν στο αγρόκτημα πραγματοποιήθηκαν και καταγράφηκαν σε κάρτες καλύβας από τον υπεύθυνο μόσχου. Οι ερευνητές της μελέτης κατέγραφαν τακτικά αυτές τις πληροφορίες από κάρτες εκτός από την εξαγωγή αναφορών συμβάντων θεραπείας από το DairyComp 305 (Valley Agricultural Software, Tulare, CA). Αν και η καθημερινή διάγνωση και θεραπεία των μόσχων της μελέτης διεξαγόταν και καταγραφόταν από τον υπεύθυνο μόσχων, ένας κτηνίατρος ήταν υπεύθυνος για την εξέταση και τον προσδιορισμό του εάν τα μοσχάρια της μελέτης πληρούσαν συγκεκριμένα κριτήρια για ευθανασία. Ένα μοσχάρι υποβλήθηκε σε ευθανασία εάν η νοσηρότητα ήταν αρκετά σοβαρή ώστε να καταστείλει σημαντικά την όρεξη, την κατάσταση ενυδάτωσης, τη στάση, τη νοημοσύνη και/ή την περιπατητική ικανότητα και το μοσχάρι έδειξε περιορισμένη έως καθόλου άμεση ανταπόκριση στη θεραπεία ή υποστηρικτική φροντίδα. Τα μοσχάρια της μελέτης υποβλήθηκαν σε ευθανασία από τον διαχειριστή μόσχων χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο αιχμαλωσίας μπουλονιού στο αγρόκτημα που καθιερώθηκε από τον κτηνίατρο της αγέλης εντός 3 ωρών από την απόφαση για ευθανασία. Οι εγγεγραμμένοι μόσχοι που πέθαναν πριν την έξοδο από την καλύβα υποβλήθηκαν σε νεκροψία εντός 24 ωρών από τον θάνατο από έναν κτηνίατρο. Όλοι οι μόσχοι παρακολουθήθηκαν καθ' όλη την περίοδο της μελέτης για ενδείξεις τοξικότητας ψευδαργύρου. Στο τέλος της περιόδου της μελέτης, οι μόσχοι φροντίστηκαν στο γαλακτοκομείο σύμφωνα με τις τυπικές εμπορικές λειτουργίες. Χρησιμοποιώντας την ίδια γεννήτρια τυχαίων αριθμών, επιλέχθηκε ένα τυχαίο δείγμα 127 μόσχων για πρόσθετη βιολογική δειγματοληψία. Περίπου το 8 έως 10% του πληθυσμού της μελέτης επιλέχθηκε λόγω των οικονομικών περιορισμών των πρόσθετων εργαστηριακών δοκιμών. Η συγκέντρωση ψευδαργύρου στον ορό κατά την έναρξη και ως απόκριση στη θεραπεία αξιολογήθηκε για τις τρεις ομάδες θεραπείας. Τα κόπρανα που συλλέχθηκαν την πρώτη ημέρα της διάρροιας και κατά την υποχώρηση της διάρροιας αξιολογήθηκαν για τέσσερα παθογόνα κοπράνων (Escherichia. coli K99, ροταϊός βοοειδών και κορωνοϊός και ωοκύστεις Cryptosporidium parvum). Ολική πρωτεΐνη ορού. Κατά την εγγραφή, αίμα από κάθε μοσχάρι συλλέχθηκε από τη σφαγίτιδα φλέβα χρησιμοποιώντας μια βελόνα πολλαπλών δειγμάτων 1 ίντσας 20 gauge (Exelint International Co., Redondo Beach, CA) και τοποθετήθηκε σε έναν κόκκινο σωλήνα ορού 10 mL (BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ) για τον προσδιορισμό της ολικής πρωτεΐνης. Τα δείγματα παρέμειναν σε θερμοκρασία δωματίου για έως και 12 ώρες μέχρι την πήξη και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν (International Equipment Company, CRU-5000, Needham Heights, MA) για 15 λεπτά. Η ολική πρωτεΐνη (g/dL) μετρήθηκε με έναν μόνο ερευνητή (HF) σε μεταγγισμένο ορό χρησιμοποιώντας ένα διαθλασίμετρο χειρός (Sper Scientific, Model 300005, Scottsdale, ΑΖ). Ορός ψευδάργυρος. Για τους 127 μόσχους που έλαβαν τυχαία δειγματοληψία, συλλέχθηκε επιπλέον αίμα κατά την εγγραφή και την τελευταία ημέρα της θεραπείας, όπως περιγράφεται παραπάνω, και τοποθετήθηκε σε σωλήνες ιχνοστοιχείων των 6,0 mL (BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ). Ο ορός εκχυλίστηκε, όπως περιγράφηκε παραπάνω, και τοποθετήθηκε σε σωληνάριο μικροφυγοκέντρησης 2,0 mL με καπάκι από πολυπροπυλένιο (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) και αποθηκεύτηκε στους -20˚C μέχρι την ανάλυση. Χρησιμοποιώντας την ίδια γεννήτρια τυχαίων αριθμών, επιλέχθηκαν τυχαία για ανάλυση 36 από τους 127 μόσχους που έλαβαν δείγμα λόγω περιορισμένων οικονομικών πόρων. Τα δείγματα ορού πριν και μετά τη συμπλήρωση ψευδαργύρου από κάθε μόσχο (n = 72) αναλύθηκαν για συγκέντρωση ψευδαργύρου (ppm) με ICP-OES (επαγωγικά συζευγμένη φασματοσκοπία οπτικής εκπομπής πλάσματος) στο εργαστήριο CAHFS. Δείγματα ποιοτικού ελέγχου, συμπεριλαμβανομένων τυφλων μεθόδων, αιχμών εργαστηρίου ελέγχου και ορού αναφοράς Sigma, εκτελέστηκαν με κάθε σύνολο δειγμάτων μελέτης. Ανάλυση κοπράνων. Για 127 μόσχους που έλαβαν τυχαία δειγματοληψία στο πρώτο επεισόδιο διάρροιας, συλλέχθηκαν δείγματα κοπράνων σε δύο χρονικά σημεία, την πρώτη ημέρα της διάρροιας (βαθμολογία κοπράνων > 1) και την ημέρα που υποχώρησε η διάρροια (δεύτερη ημέρα βαθμολογίας κοπράνων = 1). Χρησιμοποιώντας νέα γάντια και αποστειρωμένο λιπαντικό, τα φρέσκα κόπρανα συλλέχθηκαν με ψηφιακή διέγερση του ορθού σε δοχεία με περιστρεφόμενη κορυφή πολυπροπυλενίου των 20 mL (The Cary Company, Addison, IL) και αποθηκεύτηκαν στους -20˚C μέχρι την ανάλυση. Δείγματα κοπράνων δοκιμάστηκαν στο Dairy Epidemiology Laboratory, VMTRC από κτηνίατρο για E. coli K99, ροταϊό βοοειδών και κοροναϊό και ωοκύστεις C. parvum χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ (Pathasure Enteritis 4; Biovet, Κεμπέκ, Καναδάς) που είναι ιδιαίτερα ειδικό (> 90%) και ευαίσθητο (E. coli K99, 93%; ροταϊός, 100%; κορωνοϊός, 77%) [26, 27] . Για μόσχους με δείγμα διάρροιας πρώτης ημέρας στην ηλικία των 7 ημερών ή πριν, και τα δύο δείγματα κοπράνων εξετάστηκαν και για τα τέσσερα παθογόνα. Για μόσχους με δείγμα διάρροιας πρώτης ημέρας μετά την ηλικία των 7 ημερών, και τα δύο δείγματα κοπράνων εξετάστηκαν για τρία παθογόνα (C. parvum, ροταϊό βοοειδών και κοροναϊό). Δείγματα από μόσχους ηλικίας άνω των 7 ημερών δεν δοκιμάστηκαν για E. coli K99 με βάση την ευαισθησία των μόσχων [28] . Η δοκιμή διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή του κιτ και χρησιμοποιήθηκε θερμοκοιτίδα χαμηλής θερμοκρασίας (Fisher Scientific, Model 146, Pittsburgh, PA) κατά τις περιόδους επώασης. Τα αποτελέσματα της δοκιμής καταγράφηκαν ως θετικά ή αρνητικά χρησιμοποιώντας φρεάτια ελέγχου για σύγκριση χρώματος. Εάν η αλλαγή χρώματος ήταν πιο σκούρα από τον αρνητικό έλεγχο, το δείγμα θεωρήθηκε θετικό. Γάλα ψευδάργυρος. Για καθεμία από τις 107 ημέρες μελέτης (15 Δεκεμβρίου 2015 έως 31 Μαρτίου 2016) συμπληρωμάτων ψευδαργύρου, περίπου 1,5 mL επεξεργασμένου γάλακτος από δύο μπουκάλια κάθε ομάδας θεραπείας συλλέχθηκαν τυχαία σε σωλήνες μικροφυγοκέντρησης 2,0 mL με επιστημονικά καπάκια πολυπροπυλενίου (Fis , Pittsburgh, PA) και αποθηκεύτηκε στους -20˚C μέχρι την ανάλυση. Κατά τη στιγμή της ανάλυσης, τα δείγματα γάλακτος αποψύχθηκαν στους 4˚C, στροβιλίστηκαν, συγκεντρώθηκαν ανά εβδομάδα και ομάδα θεραπείας και αναλύθηκαν για συγκέντρωση ψευδαργύρου (ppm) με ICP-MS (επαγωγικά συζευγμένη φασματομετρία μάζας πλάσματος) στο εργαστήριο CAHFS. Δείγματα ποιοτικού ελέγχου, συμπεριλαμβανομένων τυφλά μεθόδων, αιχμές εργαστηριακού ελέγχου, υλικά αναφοράς του Εθνικού Ινστιτούτου Προτύπων και Τεχνολογίας (NIST) (NIST 1640) και ένα δείγμα γάλακτος με αιχμή, εκτελέστηκαν με κάθε σετ δειγμάτων μελέτης. Η ανάλυση δεδομένων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση R Statistic Έκδοση λογισμικού 3.3.1 και Stata IC 14.2 (College Station, TX). Οι στατιστικές διαφορές προσδιορίστηκαν στο επίπεδο σημαντικότητας 5% χρησιμοποιώντας ανάλυση ανά πρωτόκολλο. Μια ANOVA χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των μόσχων σε κάθε ομάδα θεραπείας κατά την εγγραφή σε σχέση με το βάρος γέννησης (kg), τη συνολική πρωτεΐνη ορού (g/dL), τη βαθμολογία στάσης και τη βαθμολογία κοπράνων. Η από του στόματος δόση ψευδάργυρου στην αρχή και στο τέλος της θεραπείας υπολογίστηκε ως η δόση συμπληρώματος ψευδαργύρου (80 mg) διαιρεμένη με το σωματικό βάρος μόσχου (kg) κατά τη γέννηση και την τελευταία ημέρα της θεραπείας, αντίστοιχα. Χρησιμοποιήθηκε ANOVA για τη σύγκριση της από του στόματος δόσης ψευδαργύρου (mg/kg) κατά την έναρξη και το τέλος της θεραπείας καθώς και το μέσο σωματικό βάρος (kg) κατά τη γέννηση, το τέλος της θεραπείας και την έξοδο από την καλύβα μεταξύ των ομάδων θεραπείας και μεταξύ ταύρων και δαμαλίδων. Ένα τεστ ανεξαρτησίας Chi-Square χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των αναλογιών των μοσχαριών ανά φύλο καθώς και της θνησιμότητας μεταξύ των ομάδων θεραπείας. Για όλες τις αναλύσεις, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος Honest Significant Difference του Tukey για τη δημιουργία συγκρίσεων ανά ζεύγη για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό σημαντικών διαφορών που προσδιορίζονται με ANOVA. Τα υπολειμματικά διαγνωστικά, συμπεριλαμβανομένων των γραφημάτων Residuals vs. Το μη παραμετρικό τεστ Kruskal-Wallis Rank Sum χρησιμοποιήθηκε όταν παραβιάστηκαν οι υποθέσεις. Για τα τυχαία δείγματα μόσχων, χρησιμοποιήθηκαν ακριβείς δοκιμές Fisher για τη σύγκριση του επιπολασμού των παθογόνων κοπράνων την πρώτη ημέρα της διάρροιας και κατά την επίλυση της διάρροιας μεταξύ των ομάδων θεραπείας. Χρησιμοποιήθηκαν συγκρίσεις κατά ζεύγη με προσαρμογή Bonferroni για τον εντοπισμό ειδικών διαφορών στον επιπολασμό των παθογόνων. Χρησιμοποιήθηκε ANOVA για τη σύγκριση της συγκέντρωσης ψευδαργύρου στον ορό πριν και μετά τη θεραπεία μεταξύ ομάδων θεραπείας και μεταξύ ταύρων και δαμαλίδων. Χρησιμοποιήθηκε μια δοκιμή Kruskal-Wallis Rank Sum για τη σύγκριση των αθροισμάτων κατάταξης των συγκεντρώσεων ψευδαργύρου σε συγκεντρωμένα δείγματα γάλακτος από διαφορετικές ομάδες θεραπείας. Post-hoc Nemenyi-δοκιμές για κατά ζεύγη πολλαπλές συγκρίσεις ταξινομημένων δεδομένων χρησιμοποιήθηκαν για τον εντοπισμό συγκεκριμένων διαφορών στις συγκεντρώσεις ψευδαργύρου μεταξύ των ομάδων. Για όλα τα μοντέλα παλινδρόμησης σε αυτή τη μελέτη, η μονομεταβλητή παλινδρόμηση χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά για να αξιολογηθούν οι συσχετίσεις μεταξύ των μεμονωμένων μεταβλητών πρόβλεψης και των αποτελεσμάτων. Όλες οι μεταβλητές με στατιστική ή/και βιολογική σημασία συμπεριλήφθηκαν αρχικά σε πολυμεταβλητά μοντέλα παλινδρόμησης. Τα τελικά μοντέλα κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας μια χειροκίνητη διαδικασία εξάλειψης προς τα πίσω, με το επίπεδο σημαντικότητας P > 0,05 ως κριτήριο αφαίρεσης. Η σύγχυση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της αλλαγής των εκτιμήσεων, όπου μια αλλαγή 10% ή μεγαλύτερη στην εκτίμηση του συντελεστή παλινδρόμησης της ομάδας θεραπείας μεταξύ των μοντέλων με και χωρίς τη μεταβλητή σύγχυσης χρησιμοποιήθηκε ως ένδειξη συγχύσεως [29] [30] [31 ] [32] . Οι μεταβλητές που προσδιορίστηκαν ως συγχυτικοί παράγοντες συμπεριλήφθηκαν στο τελικό μοντέλο. Όλες οι πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ της ομάδας θεραπείας και των μεταβλητών πρόβλεψης διερευνήθηκαν και διατηρήθηκαν στο τελικό μοντέλο εάν ήταν στατιστικά σημαντικές. Μικροβιολογική θεραπεία. Για τους μόσχους που έλαβαν τυχαία δειγματοληψία, χρησιμοποιήθηκε λογιστική παλινδρόμηση για να αξιολογηθούν οι συσχετίσεις μεταξύ της ομάδας μικροβιολογικής θεραπείας και θεραπείας. Άλλες προγνωστικές μεταβλητές ενδιαφέροντος περιελάμβαναν το φύλο, τη συνολική πρωτεΐνη ορού και την ηλικία την πρώτη ημέρα της διάρροιας. Η μικροβιολογική θεραπεία ορίστηκε ως αρνητικό τεστ ELISA κοπράνων στην επίλυση της κλινικής διάρροιας για μόσχους με θετικό τεστ ELISA την πρώτη ημέρα της διάρροιας για τουλάχιστον ένα από τα τέσσερα παθογόνα των κοπράνων (E. coli K99, ροταϊός βοοειδών και κορωνοϊός και C . parvum). Δημιουργήθηκαν μοντέλα για κάθε παθογόνο κοπράνων ξεχωριστά και ένα συνολικό μοντέλο, το οποίο αξιολόγησε τη μικροβιολογική θεραπεία σε κλινική ανάλυση διάρροιας για μόσχους που ήταν θετικοί για οποιοδήποτε μεμονωμένο παθογόνο την πρώτη ημέρα της διάρροιας. Η ολική πρωτεΐνη ορού και η ηλικία των μόσχων κατά την πρώτη διάρροια συμπεριλήφθηκαν σε όλα τα τελικά μοντέλα για τον έλεγχο πιθανής σύγχυσης από την κατάσταση παθητικής μεταφοράς και την ηλικία. Μέση ημερήσια αλλαγή βάρους. Χρησιμοποιήθηκε γραμμική παλινδρόμηση για να αξιολογηθούν οι συσχετίσεις μεταξύ της ADG (kg) και της ομάδας θεραπείας κατά τη διάρκεια της περιόδου θεραπείας και της περιόδου πριν από τον απογαλακτισμό ξεχωριστά. Άλλες προγνωστικές μεταβλητές ενδιαφέροντος περιελάμβαναν το φύλο, το βάρος γέννησης (kg), την ολική πρωτεΐνη ορού, τον αριθμό των ημερών με διάρροια, την ηλικία και τον όγκο (L) γάλακτος, τους ηλεκτρολύτες Calva και NuLife που τροφοδοτήθηκαν σε κάθε άκρο της θεραπείας ή στην έξοδο από την καλύβα. Για κάθε μοσχάρι, η ADG κατά τη διάρκεια της περιόδου θεραπείας και προ-απογαλακτισμού υπολογίστηκε ως η διαφορά μεταξύ της γέννησης και της τελικής θεραπείας ή του βάρους εξόδου από την καλύβα, αντίστοιχα, διαιρεμένη με τον αριθμό των ημερών μεταξύ αυτών των χρονικών σημείων. Για να διερευνηθεί η πιθανότητα αλληλεπίδρασης μεταξύ της ομάδας θεραπείας, του φύλου και του βάρους γέννησης, το τελικό μοντέλο γραμμικής παλινδρόμησης για το ADG κατά την περίοδο πριν από τον απογαλακτισμό στρωματοποιήθηκε ανά φύλο. Η ηλικία στο τέλος της θεραπείας ή η έξοδος από την καλύβα και ο αριθμός των ημερών με διάρροια αφαιρέθηκαν από όλα τα τελικά μοντέλα προς όφελος του βελτιωμένου κριτηρίου πληροφοριών Akaike (AIC). Έναρξη διάρροιας και κλινική θεραπεία. Για όλες τις αναλύσεις επιβίωσης, η διάρροια ορίστηκε ως βαθμολογία κοπράνων μεγαλύτερη από 1 ενώ η θεραπεία της διάρροιας ορίστηκε ως η δεύτερη συνεχόμενη ημέρα φυσιολογικών κοπράνων (βαθμολογία κοπράνων 1) μετά το πρώτο επεισόδιο διάρροιας. Τα επόμενα επεισόδια διάρροιας δεν συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση. Μόσχοι που πέθαναν ή δεν παρουσίασαν διάρροια ή θεραπεία από διάρροια λογοκρίθηκαν. Εάν δεν παρατηρήθηκαν φρέσκα κόπρανα κατά την ημερήσια αξιολόγηση του κοίλου μοσχαριού, δεν καταγράφηκε βαθμολογία κοπράνων για εκείνη την ημέρα και δεν συμπεριλήφθηκε στις αναλύσεις. Η ανάλυση Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των διάμεσων ημερών έως το πρώτο συμβάν διάρροιας και, για τα μοσχάρια που εμφάνισαν διάρροια κατά την περίοδο αξιολόγησης, οι διάμεσες ημέρες έως την κλινική θεραπεία της διάρροιας. Χρησιμοποιήθηκε ένα τεστ ισότητας Log Rank για τη σύγκριση των λειτουργιών επιζώντων μεταξύ των θεραπειών. Χρησιμοποιήθηκε ανάλυση παλινδρόμησης Cox Proportional Hazards για την εκτίμηση και σύγκριση του κινδύνου διάρροιας και θεραπείας διάρροιας μεταξύ των ομάδων θεραπείας. Το φύλο, η ηλικία, η ολική πρωτεΐνη ορού κατά την εγγραφή, το βάρος γέννησης (kg), η αντιμικροβιακή θεραπεία και η εφαρμογή φρέσκου άχυρου στις καλύβες αξιολογήθηκαν ως προγνωστικές μεταβλητές και πιθανοί συγχυτικοί παράγοντες. Κατά τη μοντελοποίηση του κινδύνου θεραπείας της διάρροιας, μια δυαδική μεταβλητή που ονομάζεται θεραπευτική συμπλήρωση που υποδεικνύει εάν οι μόσχοι υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ZM, ZS ή εικονικό φάρμακο για όλες ή τουλάχιστον τις πρώτες 5 ημέρες της διάρροιας αξιολογήθηκε ως πρόσθετη συμμεταβλητή. Μια περίοδος πέντε ημερών επιλέχθηκε από τους συγγραφείς με βάση την κλινική εμπειρία, καθώς οι πέντε ημέρες αντιπροσωπεύουν μια λογική διάρκεια κατά την οποία θα πρέπει να εφαρμόζονται οι περισσότερες θεραπευτικές θεραπείες για τη διάρροια των μόσχων και αναμένεται να ανακουφίσουν τη νόσο. Η υπόθεση αναλογικών κινδύνων ότι ο κίνδυνος της διάρροιας είναι ανεξάρτητος από το χρόνο αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση των υπολειμμάτων Schoenfeld και ελέγχοντας εάν η συνάρτηση αναλογίας καταγραφής κινδύνου είναι σταθερή με την πάροδο του χρόνου. Οποιαδήποτε μεταβλητή βρέθηκε ότι παραβιάζει την υπόθεση των αναλογικών κινδύνων συμπεριλήφθηκε στο τελικό μοντέλο παλινδρόμησης ως συνμεταβλητή χρονικά μεταβλητή. Συνολικά 1.513 μόσχοι εγγράφηκαν στη δοκιμή. Ωστόσο, λόγω μη άμεσης αναγνώρισης των κριτηρίων αποκλεισμού, 23 μόσχοι αποκλείστηκαν λίγο μετά την εγγραφή τους. Επιπλέον, 8 μόσχοι αποκλείστηκαν λόγω λαθών θεραπείας. Ως εκ τούτου, συνολικά 1.482 μόσχοι (εικονικό φάρμακο = 500, ZM = 491, ZS = 491) συμπεριλήφθηκαν στις τελικές αναλύσεις. Συνολικά 242 μόσχοι (16,3%) είχαν ελάχιστη παραγωγή κοπράνων τη στιγμή της εγγραφής ενώ 125 μόσχοι (8,4%) είχαν μη φυσιολογική βαθμολογία κοπράνων 2 ή 3 που περιγράφηκαν ως μηκώνιο. Όλοι οι εγγεγραμμένοι μόσχοι φάνηκαν υγιείς στην οπτική αξιολόγηση και ως εκ τούτου θεωρήθηκε ότι είχαν κανονική βαθμολογία κοπράνων τη στιγμή της εγγραφής. Οι τρεις ομάδες θεραπείας κατά την εγγραφή τους δεν διέφεραν σημαντικά ως προς το μέσο βάρος γέννησης (kg) (P = 0,244), τη μέση ολική πρωτεΐνη ορού (g/dL) (P = 0,541), τη μέση βαθμολογία στάσης (P = 0,845), τη μέση βαθμολογία κοπράνων (Ρ = 0,522), όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, ή κατανομή φύλου μόσχου (Ρ = 0,472). Από τα 1.482 μοσχάρια της μελέτης, 21 (1,4%) πέθαναν κατά τη διάρκεια της δοκιμής: 5 μόσχοι στην ομάδα εικονικού φαρμάκου (1,0%), 11 μόσχοι στην ομάδα ZM (2,2%) και 5 μόσχοι στην ομάδα ZS (1,0%). Από αυτά τα 21 μοσχάρια που πέθαναν, τα 14 (66,7%) ήταν ταύροι και τα 7 (33,3%) ήταν δαμαλίδες. Δεκαοκτώ από τα 21 μοσχάρια (85,7%) βρέθηκαν νεκρά, αντί να υποβληθούν σε ευθανασία, λόγω οξέος και αυθόρμητου θανάτου χωρίς προηγούμενα εμφανή κλινικά σημεία της νόσου. Τα υπόλοιπα 3 μοσχάρια υποβλήθηκαν σε ευθανασία πριν από το θάνατο λόγω σοβαρής ή/και παρατεταμένης νοσηρότητας. Τα χαρακτηριστικά και οι αιτίες θανάτου με βάση την νεκροψία πεδίου αυτών των μόσχων βρίσκονται στον Πίνακα S4. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο ποσοστό των μόσχων που πέθαναν μεταξύ των ομάδων θεραπείας (P = 0,168), αν και η θνησιμότητα ήταν σημαντικά υψηλότερη στους ταύρους σε σύγκριση με τους μόσχους με δαμαλίδες (P = 0,049). Τα δεδομένα βάρους γέννησης ήταν διαθέσιμα και για τα 1.482 μοσχάρια. Λόγω της θνησιμότητας των μόσχων μεταξύ της εγγραφής και της ολοκλήρωσης της θεραπείας (n = 4), ήταν διαθέσιμα δεδομένα βάρους τελικής θεραπείας για 1.478 μόσχους. Ομοίως, λόγω θνησιμότητας μόσχων (n = 21) ή ελλείψεων στοιχείων για το σωματικό βάρος κατά την έξοδο από την καλύβα από τα αρχεία του γαλακτοκομείου (n = 40), τα δεδομένα βάρους εξόδου από την καλύβα ήταν διαθέσιμα για 1.421 μόσχους. Μια σύνοψη των δεδομένων σωματικού βάρους που διαστρωματώνονται ανά ομάδα θεραπείας και φύλο παρουσιάζεται στον Πίνακα 2. Σε κάθε ομάδα θεραπείας, οι μόσχοι ταύρων εμφάνισαν σταθερά υψηλότερο βάρος γέννησης (P < 0,001), βάρος τελικής θεραπείας (P < 0,001) και βάρος εξόδου από την αυλή (P < 0,001) σε σύγκριση με τους μόσχους δαμαλίδων. Ωστόσο, κατά τη γέννηση, το τέλος της θεραπείας ή την έξοδο από την καλύβα δεν υπήρχαν διαφορές στο σωματικό βάρος μεταξύ των ομάδων θεραπείας για ταύρους (P > 0,1) ή δαμαλίδες (P > 0,1). Οι μέσες βαθμολογίες στάσης κατά την περίοδο της μελέτης ήταν 1,2 στις τρεις ομάδες θεραπείας (P = 0,208). Από 1.482 μόσχους που συμπεριλήφθηκαν στην τελική ανάλυση, ελήφθησαν συνολικά 629 δείγματα γάλακτος που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία κατά τη διάρκεια της περιόδου μελέτης 107 ημερών και συγκεντρώθηκαν ανά ομάδα θεραπείας και εβδομάδα, δίνοντας συνολικά 16 συγκεντρωμένα δείγματα ανά ομάδα θεραπείας. Οι συγκεντρώσεις ψευδαργύρου (ppm) ήταν σημαντικά υψηλότερες σε δείγματα ομαδοποιημένου γάλακτος που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ZM (P <0,001) και ZS (P <0,001) σε σύγκριση με δείγματα που έλαβαν εικονικό φάρμακο και δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ZM και ZS (P = 1.000), όπως φαίνεται στον Πίνακα S5. Στις ομάδες θεραπείας με ψευδάργυρο, η από του στόματος δόση ψευδάργυρου στην αρχή και στο τέλος της θεραπείας συνοψίζεται ανά φύλο στον Πίνακα S6. Και για τους μόσχους που έλαβαν θεραπεία με ZM και ZS, η από του στόματος δόση ψευδαργύρου στην αρχή (P <0,001) και στο τέλος (P <0,001) της θεραπείας ήταν σημαντικά υψηλότερη σε μόσχους δαμαλίδων έναντι ταύρου. Οι συγκεντρώσεις ψευδαργύρου στον ορό πριν και μετά τη θεραπεία ελήφθησαν από 36 μόσχους (n = 12 για κάθε ομάδα θεραπείας) και συνοψίζονται στον Πίνακα S7. Συνολικά, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στις μέσες συγκεντρώσεις ψευδάργυρου στον ορό πριν από τη θεραπεία μεταξύ των ομάδων θεραπείας (P = 0,233). Οι μέσες συγκεντρώσεις ψευδάργυρου στον ορό μετά τη θεραπεία ήταν σημαντικά υψηλότερες σε μόσχους που έλαβαν ZM (P < 0,001) και ZS (P = 0,002) σε σύγκριση με μόσχους που έλαβαν εικονικό φάρμακο, και δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των μόσχων που έλαβαν θεραπεία με ZM και ZS (P = 0,406). Η διαστρωμάτωση των δεδομένων ψευδάργυρου ορού ανά ομάδα θεραπείας και φύλο έδειξε ότι για τους μόσχους που έλαβαν ZM, οι δαμαλίδες είχαν αριθμητικά υψηλότερη συγκέντρωση ψευδάργυρου στον ορό μετά τη θεραπεία σε σύγκριση με τους ταύρους, αν και η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (P = 0,199). Αντίθετα, στους μόσχους ZStreated, οι δαμαλίδες είχαν αριθμητικά χαμηλότερη συγκέντρωση ψευδαργύρου μετά τη θεραπεία σε σύγκριση με τους ταύρους, αν και η διαφορά δεν ήταν επίσης στατιστικά σημαντική (P = 0,538). Τα δεδομένα ανάλυσης κοπράνων αναλύθηκαν για 92 από τους 127 τυχαία επιλεγμένους μόσχους . Οι υπόλοιποι 35 μόσχοι δεν συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση λόγω μη εμφάνισης διάρροιας κατά την περίοδο αξιολόγησης (n = 10), θανάτου πριν από την τελική δειγματοληψία (n = 1), αποκλεισμού λόγω ακατάλληλης θεραπευτικής αγωγής (n = 1) ή λανθασμένου ημέρα δειγματοληψίας (n = 23). Οι 92 μόσχοι είχαν μέση ηλικία κατά την έναρξη της διάρροιας 13,3, 11,0 και 11,3 ημέρες για τις ομάδες ZM, ZS και εικονικό φάρμακο, αντίστοιχα. και μέση ηλικία κατά την επίλυση της διάρροιας 18,8, 16,1 και 15,7 ημέρες για τις ομάδες ZM, ZS και εικονικό φάρμακο, αντίστοιχα. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στον επιπολασμό του E. coli K99 (P = 0,694), του ροταϊού (P = 0,331), του κορωνοϊού (P = 0,819) ή του C. parvum (P = 0,719) αποβολή κοπράνων την πρώτη ημέρα της διάρροιας μεταξύ των ομάδων θεραπείας (Πίνακας S8) . Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στον επιπολασμό του E. coli K99 (P = 0,256), του ροταϊού (P = 0,344) ή του κορωνοϊού (P = 1,000) αποβολή κοπράνων κατά την επίλυση της διάρροιας μεταξύ των ομάδων θεραπείας, αν και υπήρχε διαφορά στο C parvum (P = 0,006) αποβολή κοπράνων μεταξύ των ομάδων θεραπείας (Πίνακας S9). Ο επιπολασμός της αποβολής κοπράνων C. parvum κατά την υποχώρηση της διάρροιας ήταν σημαντικά υψηλότερος σε μόσχους που έλαβαν θεραπεία με ZM (P = 0,009) και ZS (P = 0,023) σε σύγκριση με μόσχους που έλαβαν εικονικό φάρμακο, και δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των μόσχων που έλαβαν θεραπεία με ZM και ZS (P = 1.000). Τα αποτελέσματα των μοντέλων λογιστικής παλινδρόμησης για συνολική και ειδική για παθογόνο μικροβιολογική θεραπεία παρουσιάζονται στους Πίνακες 3-5. Για θεραπεία ειδικής για το παθογόνο, όλα τα μοσχάρια που βρέθηκαν θετικά την πρώτη ημέρα της διάρροιας για κοροναϊό (n = 4) ήταν αρνητικά στην κλινική επίλυση της διάρροιας. Για τα μοσχάρια που βρέθηκαν θετικά την πρώτη ημέρα της διάρροιας για E. coli K99 (n = 9), όλα τα μοσχάρια που έλαβαν εικονικό φάρμακο (n = 2) ήταν αρνητικά στην κλινική ανάλυση της διάρροιας, ενώ τα μισά (n = 2) από όλα τα μοσχάρια που έλαβαν θεραπεία με ZS Οι μόσχοι δοκιμάστηκαν είτε θετικοί είτε αρνητικοί στην κλινική επίλυση της διάρροιας, με αποτέλεσμα την παράλειψη της μεταβλητής θεραπείας ZS από το μοντέλο λόγω συγγραμμικότητας. Ως εκ τούτου, οι αναλύσεις λογιστικής παλινδρόμησης για μικροβιολογική θεραπεία σε μόσχους που βρέθηκαν θετικοί στον κοροναϊό και το E. coli K99 δεν ήταν δυνατές. Για 59 μόσχους που βρέθηκαν θετικοί στον ροταϊό την πρώτη ημέρα της διάρροιας (Πίνακας 3), τα μοσχάρια που έλαβαν θεραπεία με ΖΜ είχαν 50% αυξημένες πιθανότητες να βγουν αρνητικές εξετάσεις στην ανάλυση της διάρροιας σε σύγκριση με μόσχους που έλαβαν εικονικό φάρμακο, αν και αυτή η διαφορά δεν ήταν σημαντική (Ρ = 0,549). Ομοίως, οι μόσχοι που έλαβαν θεραπεία με ZS είχαν 100% αυξημένες πιθανότητες (2 φορές τις πιθανότητες) να είναι αρνητικές για ροταϊό σε ανάλυση διάρροιας σε σύγκριση με μόσχους που έλαβαν εικονικό φάρμακο, αν και αυτή η διαφορά δεν ήταν επίσης σημαντική (P = 0,314). Ωστόσο, αυτό το μοντέλο έδειξε μια σημαντική κύρια επίδραση της ολικής πρωτεΐνης ορού, έτσι ώστε για κάθε 1 μονάδα (g/dL) αύξηση της ολικής πρωτεΐνης ορού κατά την εγγραφή, οι πιθανότητες μικροβιολογικής θεραπείας του ροταϊού μειώθηκαν κατά 79% (P = 0,026). Για 40 μόσχους που βρέθηκαν θετικοί στο Cryptosporidium parvum την πρώτη ημέρα της διάρροιας (Πίνακας 4), οι μόσχοι που έλαβαν θεραπεία με ZM είχαν 87% μειωμένες πιθανότητες να είναι αρνητικές στην ανάλυση της διάρροιας. αν και αυτή η διαφορά δεν ήταν σημαντική (P = 0,119). Ομοίως, τα μοσχάρια που έλαβαν θεραπεία με ZS είχαν 74% μειωμένες πιθανότητες να είναι αρνητικές για το Cryptosporidium parvum στην ανάλυση της διάρροιας σε σύγκριση με τους μόσχους που έλαβαν εικονικό φάρμακο, αν και αυτή η διαφορά δεν ήταν επίσης σημαντική (P = 0,183). Για 55 μόσχους που βρέθηκαν θετικοί σε οποιοδήποτε από τα τέσσερα παθογόνα των κοπράνων (E. coli K99, ροταϊός, κορωνοϊός, Cryptosporidium parvum) την πρώτη ημέρα της διάρροιας (Πίνακας 5), τα μοσχάρια που έλαβαν θεραπεία με ZM είχαν 25% αυξημένες πιθανότητες εξέτασης αρνητικό στην ανάλυση της διάρροιας σε σύγκριση με μόσχους που έλαβαν εικονικό φάρμακο, αν και αυτή η διαφορά δεν ήταν σημαντική (P = 0,769). Ομοίως, τα μοσχάρια που έλαβαν θεραπεία με ZS είχαν 52% αυξημένες πιθανότητες να είναι αρνητικές για το Cryptosporidium parvum στην επίλυση της διάρροιας σε σύγκριση με τους μόσχους που έλαβαν εικονικό φάρμακο, αν και αυτή η διαφορά δεν ήταν επίσης σημαντική (P = 0,633). Ωστόσο, αυτό το μοντέλο έδειξε ότι τα μοσχάρια δαμαλίδων είχαν 71% χαμηλότερες πιθανότητες μικροβιολογικής θεραπείας οποιουδήποτε μεμονωμένου παθογόνου κοπράνων σε σύγκριση με τα μοσχάρια ταύρου (P = 0,076). Συνολικά 1.482 μόσχοι συμπεριλήφθηκαν στα αποτελέσματα του μοντέλου γραμμικής παλινδρόμησης για ADG κατά τη διάρκεια της περιόδου θεραπείας , τα οποία παρουσιάζονται στον Πίνακα 6 . Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην ADG για μόσχους που έλαβαν θεραπεία με ZM ή ZS σε σύγκριση με τους μόσχους που έλαβαν εικονικό φάρμακο, αν και υπήρχαν σημαντικές κύριες επιπτώσεις του φύλου, του βάρους γέννησης και του όγκου γάλακτος. Συγκεκριμένα, τα μοσχάρια δαμαλίδων κέρδισαν 70 g σωματικού βάρους την ημέρα λιγότερο σε σύγκριση με τα μοσχάρια ταύρου (P <0,001). Για κάθε 1 κιλό αύξηση του βάρους γέννησης, τα μοσχάρια έπαιρναν 16 g ημερησίως λιγότερο από τα σύντροφά τους (P < 0,001). Για κάθε 1 L αύξηση του όγκου του γάλακτος την ημέρα κατά τη διάρκεια της περιόδου θεραπείας, οι μόσχοι κέρδιζαν επιπλέον 13 g την ημέρα (P < 0,001). Ο Πίνακας 7 συνοψίζει την ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης του ADG κατά τη διάρκεια της περιόδου προαπογαλακτισμού για 1.421 μόσχους που έδειξε σημαντική διαφορά στην ADG για μόσχους που έλαβαν θεραπεία με ZM σε σύγκριση με μόσχους που έλαβαν εικονικό φάρμακο και σε μόσχους ταύρου έναντι δαμαλίδων. Ο όγκος του γάλακτος είχε σημαντική επίδραση στην ADG, έτσι ώστε για κάθε 1 L αύξηση του όγκου του γάλακτος την ημέρα κατά τη διάρκεια της περιόδου θεραπείας, οι μόσχοι κέρδιζαν επιπλέον 2 g σωματικού βάρους την ημέρα (P = 0,001). Τα αποτελέσματα του τελικού μοντέλου έδειξαν μια σημαντική κύρια επίδραση για τα μοσχάρια ταύρου που έλαβαν θεραπεία με ZM και έναν σημαντικό όρο αλληλεπίδρασης για τη θεραπεία με ZM ανά φύλο. Μετά τον έλεγχο του όγκου του γάλακτος που ελήφθη κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Οι δαμαλίδες που έλαβαν θεραπεία με ZM κέρδισαν 12 g λιγότερο σωματικό βάρος την ημέρα κατά μέσο όρο σε σύγκριση με τις δαμαλίδες που έλαβαν εικονικό φάρμακο (P = 0,019). Κατά την εξέταση των μοντέλων συντελεστών για την ομάδα θεραπείας, το φύλο και την αλληλεπίδρασή τους, τα μοσχάρια ταύρου που έλαβαν θεραπεία με ZM κέρδισαν 454 g την ημέρα (0,432 + 0,022) ενώ τα θηλυκά μοσχάρια που έλαβαν θεραπεία με ZM κέρδισαν 0,404 g την ημέρα (0,432 + 0,022-0,034-0). , επομένως 50 g ημερησίως περισσότερο κέρδος στους αρσενικούς μόσχους σε σύγκριση με τις δαμαλίδες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ZM (P = 0,019). Για τους μόσχους που έλαβαν θεραπεία με ZS, υπήρξε μια αριθμητική μείωση στην αύξηση βάρους κατά 5 g την ημέρα στους ταύρους και 11 g την ημέρα στις δαμαλίδες σε σύγκριση με τους μόσχους που έλαβαν εικονικό φάρμακο, αν και οι διαφορές δεν ήταν σημαντικές (P = 0,673 ταύροι; Ρ = 0,681 δαμαλίδες). Τα μοντέλα γραμμικής παλινδρόμησης του ADG κατά την περίοδο πριν από τον απογαλακτισμό στρωματοποιήθηκαν ανά φύλο προκειμένου να αποφευχθεί η ερμηνεία μιας τριμερούς αλληλεπίδρασης μεταξύ της ομάδας θεραπείας, του φύλου και του βάρους γέννησης. Στο μοντέλο της δαμαλίδας (Πίνακας S10), η αλληλεπίδραση μεταξύ της θεραπείας με ΖΜ και του βάρους γέννησης ήταν σημαντική, γεγονός που υπονοούσε ότι το βάρος γέννησης τροποποίησε την επίδραση της θεραπείας με ΖΜ στην ADG. Με βάρος γέννησης 29 kg (δύο τυπικές αποκλίσεις κάτω από το μέσο όρο), οι δαμαλίδες που έλαβαν θεραπεία με ZM κέρδισαν 49 g σωματικού βάρους την ημέρα κατά μέσο όρο λιγότερο από τις δαμαλίδες που έλαβαν εικονικό φάρμακο (P = 0,037). Ωστόσο, με βάρος γέννησης 49 kg (δύο τυπικές αποκλίσεις πάνω από το μέσο όρο), οι δαμαλίδες που έλαβαν θεραπεία με ZM κέρδισαν 30 g σωματικού βάρους την ημέρα κατά μέσο όρο περισσότερο από τις δαμαλίδες που έλαβαν εικονικό φάρμακο (P = 0,037). Στο μοντέλο μόσχων ταύρου (Πίνακας S11) δεν υπήρχε σημαντική αλληλεπίδραση μεταξύ της ομάδας θεραπείας και του βάρους γέννησης. Συνολικά 1.482 μόσχοι συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier του χρόνου έως το πρώτο συμβάν διάρροιας (Εικ. 1). Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στη διάμεση ηλικία κατά την έναρξη της διάρροιας, συγκεκριμένα, 8, 8 και 7 ημερών για τους μόσχους που έλαβαν ZM, ZS και εικονικό φάρμακο, αντίστοιχα (P = 0,402). Το μοντέλο αναλογικής παλινδρόμησης κινδύνου Cox για τον κίνδυνο διάρροιας παρουσιάζεται στον Πίνακα 8. Μετά τον έλεγχο της ηλικίας, οι μόσχοι που έλαβαν θεραπεία με ZM είχαν 14,7% μειωμένο κίνδυνο διάρροιας σε σύγκριση με τους μόσχους που έλαβαν εικονικό φάρμακο (P = 0,015). Μόσχοι που έλαβαν θεραπεία με ZS είχαν 13,9% μειωμένο κίνδυνο διάρροιας σε σύγκριση με μόσχους που έλαβαν εικονικό φάρμακο (P = 0,022). μοσχάρια (n = 1.421) Συνολικά 1.394 μόσχοι συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier του χρόνου μέχρι την κλινική θεραπεία της διάρροιας (Εικ. 2), καθώς 88 μόσχοι απέτυχαν να εμφανίσουν διάρροια κατά την περίοδο αξιολόγησης. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στις διάμεσες ημέρες μέχρι τη θεραπεία της διάρροιας που ήταν 7 ημέρες και στις 3 ομάδες θεραπείας (P = 0,264). Το μοντέλο αναλογικής παλινδρόμησης κινδύνου Cox για τον κίνδυνο θεραπείας της διάρροιας παρουσιάζονται στον Πίνακα 9. Τα αποτελέσματα του τελικού μοντέλου έδειξαν έναν σημαντικό όρο αλληλεπίδρασης μεταξύ της θεραπείας και της θεραπευτικής συμπλήρωσης καθώς και την ανάγκη για την ηλικία ως μεταβλητή συμμεταβλητή. Όταν εξετάστηκαν μόσχοι που δεν έλαβαν συμπλήρωμα, αντίστοιχα σε καθεμία από τις 3 ομάδες, για τουλάχιστον τις πρώτες πέντε ημέρες της διάρροιας δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των μόσχων που έλαβαν θεραπεία με ZM και ZS σε σύγκριση με μόσχους που έλαβαν εικονικό φάρμακο (P = 0,223 ΖΜ, Ρ = 0,134 ZS). Ωστόσο, όταν εξετάζονται τα μοσχάρια που έλαβαν συμπληρώματα για τουλάχιστον τις πρώτες πέντε ημέρες της διάρροιας, τα μοσχάρια που έλαβαν θεραπεία με ZM παρουσίασαν 21,4% υψηλότερο κίνδυνο θεραπείας από διάρροια σε σύγκριση με μόσχους που έλαβαν εικονικό φάρμακο (P = 0,027). Ομοίως, οι μόσχοι που έλαβαν θεραπεία με ZS παρουσίασαν 13,0% υψηλότερο κίνδυνο ίασης από διάρροια σε σύγκριση με τους μόσχους που έλαβαν εικονικό φάρμακο (P = 0,040). Η τρέχουσα δοκιμή έδειξε στοιχεία για την ευεργετική επίδραση του ZM στην ADG και τη νεογνική διάρροια, καθώς και την επίδραση του ZS στη διάρροια σε μόσχους γαλακτοπαραγωγής κατά την περίοδο πριν από τον απογαλακτισμό. Είναι σημαντικό να ληφθούν υπόψη αυτά τα αποτελέσματα στο πλαίσιο ολόκληρης της περιόδου πριν από τον απογαλακτισμό και την περίοδο κολύμβησης. Κατά μέσο όρο, μετά από 90 ημέρες από τη γέννηση έως την έξοδο από την καλύβα, τα μοσχάρια ταύρου που έλαβαν εικονικό φάρμακο κέρδισαν 38,88 kg σωματικού βάρους ενώ τα μοσχάρια ταύρου που έλαβαν θεραπεία με ZM κέρδισαν επιπλέον 1,98 kg (40,86 kg). Αντίθετα, η επίδραση του ψευδαργύρου στην αύξηση βάρους στις δαμαλίδες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία εξαρτιόταν από το βάρος γέννησης. Οι δαμαλίδες χαμηλού βάρους γέννησης που έλαβαν θεραπεία με ZM κέρδισαν κατά μέσο όρο λιγότερο από μια δαμαλίδα που έλαβε εικονικό φάρμακο με το ίδιο βάρος γέννησης. Αντίθετα, οι δαμαλίδες υψηλού βάρους γέννησης που έλαβαν θεραπεία με ZM κέρδισαν περισσότερα από τις δαμαλίδες του ίδιου βάρους γέννησης που έλαβαν εικονικό φάρμακο. Η αλλαγή στην κατεύθυνση της συσχέτισης μεταξύ θεραπείας με ZM και ADG σε μόσχους δαμαλίδων ανάλογα με το βάρος γέννησης υποδηλώνει μια επίδραση δοσοαπόκρισης αντί για μια πραγματική επίδραση του ZM στο ADG ειδικά για το φύλο. Ως εκ τούτου, οι μόσχοι χαμηλού βάρους γέννησης (συμπεριλαμβανομένων των δαμαλίδων) μπορεί να απαιτούν χαμηλότερη δόση ZM για να μετριάσουν τυχόν αρνητικές επιπτώσεις της κατά τα άλλα κατάλληλης δόσης για μόσχους υψηλότερου βάρους γέννησης. Αυτά τα ευρήματα συμφωνούν με μια προηγούμενη τυχαιοποιημένη κλινική δοκιμή που δοκίμαζε την επίδραση του ημερήσιου ψευδαργύρου από το στόμα σε διαρροϊκά νεογνά μοσχάρια Holstein, η οποία έδειξε ότι οι μόσχοι που έλαβαν θεραπεία με ZM είχαν αριθμητικά, αν και όχι σημαντικά αυξημένο ADG σε σύγκριση με μόσχους που έλαβαν θεραπεία με οξείδιο ψευδαργύρου ή εικονικό φάρμακο λόγω σε μικρό μέγεθος δείγματος [11] . Γενικά, τα ευρήματά μας από τις δοκιμές συμφωνούν με το μεγάλο μέρος της ανθρώπινης βιβλιογραφίας που υποστηρίζει τη χρήση ψευδαργύρου από το στόμα για την πρόληψη και τη θεραπεία της διάρροιας και της διαταραχής ανάπτυξης στα παιδιά [5, 10, 33] . Τα συμπληρώματα ψευδαργύρου είναι ευρέως αποδεκτά από την παγκόσμια υγεία οργανισμοί ως ζωτικό συστατικό της θεραπείας για την παιδική διάρροια [3, 4], ωστόσο, πρόσφατες ανασκοπήσεις της βιβλιογραφίας κατέδειξαν ετερογένεια στα αποτελέσματα της μελέτης με βάση την ηλικία, την αρχική κατάσταση ψευδάργυρου, τη γεωγραφική θέση και το σχήμα συμπληρωμάτων [10, 34]. Παρόμοια με τα ευρήματά μας, μια ειδική για το φύλο απόκριση στη λήψη συμπληρωμάτων ψευδαργύρου έχει αποδειχθεί σε αρκετές μελέτες σε ανθρώπους. Ο γλυκονικός ψευδάργυρος που χορηγήθηκε για την πρόληψη της διάρροιας μείωσε τη συχνότητα της δυσεντερίας σε αγόρια που έλαβαν θεραπεία αλλά όχι σε κορίτσια [35]. Όταν χορηγήθηκε θεραπευτικά, μείωσε τη διάρκεια και τη συχνότητα της διάρροιας πιο δραματικά στα αγόρια σε σύγκριση με τα κορίτσια [36] . Ομοίως, ο θειικός ψευδάργυρος αποδείχθηκε ότι βελτιώνει Επίδραση του ψευδαργύρου στη διάρροια στα μοσχάρια Τα αποτελέσματα της διάρροιας στα αγόρια αλλά βελτίωσαν τους ρυθμούς ανάπτυξης στα κορίτσια [13] . Σε γενικές γραμμές, αυτές οι διαφορές μεταξύ της ανταπόκρισης ανδρών και γυναικών στη συμπλήρωση ψευδάργυρου δεν είναι κατανοητές, αν και έχουν προταθεί θεωρίες σχετικά με τις διαφορές στη λειτουργία και την απόκριση του ανοσοποιητικού [13, 35], την αιτιολογία της διάρροιας [13] και τις απαιτήσεις σε θρεπτικά συστατικά [35]. Στην τρέχουσα μελέτη, οι ταύροι που έλαβαν θεραπεία με ZM εμφάνισαν αυξημένη ADG σε σύγκριση με τους ταύρους που έλαβαν εικονικό φάρμακο ενώ οι δαμαλίδες που έλαβαν ZM εμφάνισαν μειωμένη ADG σε σύγκριση με τις δαμαλίδες που έλαβαν εικονικό φάρμακο. Ωστόσο, λόγω μιας σημαντικής αλληλεπίδρασης μεταξύ της θεραπείας με ZM και του βάρους γέννησης, αυτή η μείωση της ADG σε δαμαλίδες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ZM ξεπεράστηκε με την αύξηση του βάρους γέννησης, έτσι ώστε οι δαμαλίδες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ZM με βάρος γέννησης άνω των 42 kg παρουσίασαν αυξημένη ADG κατά την περίοδο πριν από τον απογαλακτισμό. σε σύγκριση με τις δαμαλίδες που έλαβαν εικονικό φάρμακο με βάρος γέννησης άνω των 42 kg. Οι διαφορές στην απόκριση ανάπτυξης στη συμπλήρωση ZM μεταξύ μόσχων ταύρου και δαμαλίδων μπορεί να σχετίζονται με την επίδρασή της στην πρόσληψη τροφής. Προηγούμενη έρευνα σχετικά με τα αποτελέσματα της χορήγησης διαφόρων δόσεων από του στόματος οξειδίου του ψευδαργύρου σε μόσχους γαλακτοπαραγωγής προμηρυκαστικών έδειξε ότι τα υψηλά επίπεδα συμπληρωμάτων ψευδαργύρου από το στόμα είχαν ως αποτέλεσμα μειωμένη πρόσληψη τροφής [23] . Στην τρέχουσα δοκιμή, η από του στόματος δόση ZM εκτιμήθηκε ότι ήταν σημαντικά υψηλότερη στις δαμαλίδες σε σύγκριση με τους ταύρους λόγω του σημαντικά χαμηλότερου βάρους γέννησης των δαμαλίδων. Επιπλέον, οι συγκεντρώσεις ψευδάργυρου στον ορό σε δαμαλίδες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ZM ήταν αριθμητικά υψηλότερες από αυτές των ταύρων, αν και αυτή η διαφορά δεν ήταν σημαντική, πιθανότατα λόγω του μικρού μεγέθους δείγματος. Ίσως η υψηλότερη δόση ψευδαργύρου στις δαμαλίδες να συσχετίστηκε με μειωμένη πρόσληψη τροφής, οδηγώντας σε μειωμένη ανάπτυξη και ότι αυτό το αποτέλεσμα ήταν πιο έντονο για το ZM σε σύγκριση με το ZS. Το γεγονός ότι οι δαμαλίδες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ZM με βάρος γέννησης πλησιάζει το βάρος των μεσαίων μόσχων ταύρων (και, επομένως, παρόμοια δόση ψευδαργύρου με αυτή στους ταύρους) παρουσίασαν αύξηση της ADG σε σχέση με τις δαμαλίδες που έλαβαν εικονικό φάρμακο παρόμοια με αυτή των μόσχων ταύρων υποστηρίζει εν μέρει αυτή τη θεωρία. . Αν και οι πρακτικές διαχείρισης στο γαλακτοκομείο της μελέτης σχεδιάστηκαν ώστε να είναι πανομοιότυπες τόσο για τους ταύρους όσο και για τις δαμαλίδες, είναι πιθανό ότι οι ανεπαίσθητες, μη αναγνωρισμένες διαφορές στη διαχείριση της διατροφής και της υγείας μπορεί επίσης να συνέβαλαν σε διαφορές ανάλογα με το φύλο στην αύξηση βάρους. Ωστόσο, δικαιολογούνται μελλοντικές δοκιμές για τη διερεύνηση των πιθανών διαφορών στη δόση-απόκριση στη συμπλήρωση ψευδαργύρου μεταξύ ταύρων και δαμαλίδων. Υποθέσαμε ότι η ADG θα αυξανόταν σε μόσχους με συμπλήρωμα ψευδαργύρου σε σύγκριση με μόσχους με συμπλήρωμα ψευδαργύρου λόγω των πιθανών προληπτικών και θεραπευτικών επιδράσεων συμπληρωμάτων ψευδαργύρου στη νεογνική διάρροια. Με άλλα λόγια, η διάρροια των μοσχαριών μετριάζεται με τη λήψη συμπληρωμάτων ψευδαργύρου και, επομένως, στην αιτιολογική οδό μεταξύ ψευδαργύρου και ADG. Ωστόσο, λαμβάνοντας υπόψη τον παρομοίως μειωμένο κίνδυνο διάρροιας και τον αυξημένο κίνδυνο θεραπείας από τη διάρροια και στις δύο ομάδες θεραπείας με ZM και ZS, αλλά την έλλειψη επίδρασης του ZS στο ADG, είναι πιθανό ότι η επίδραση του ZM στο ADG δεν μεσολαβείται αποκλειστικά μέσω του επιπτώσεις στη διάρροια. Μπορεί επίσης να υπάρχουν διαφορές στην αποτελεσματικότητα μεταξύ οργανικών και ανόργανων σκευασμάτων. Στην πραγματικότητα, ο υποκείμενος μηχανισμός δράσης του ψευδαργύρου από το στόμα παραμένει άγνωστος [6] . Υπάρχουν αρκετές θεωρίες για τους μηχανισμούς δράσης του ψευδαργύρου στην πρόληψη και τη θεραπεία της παιδικής διάρροιας, συμπεριλαμβανομένου ενός προστατευτικού ρόλου του βλεννογόνου, μιας ανεπάρκειας ψευδαργύρου που προκαλείται από τη διάρροια, ενός ουσιαστικού στοιχείου στην κυτταρική ανοσία και ενός τροποποιητή του ενδοαυλικού ηλεκτρολύτη. έκκριση και απορρόφηση [6, [37] [38] [39] . Πρέπει να ληφθούν υπόψη οι κλινικές και πρακτικές επιπτώσεις των επιδράσεων της συμπλήρωσης ZM στην ADG και τη διάρροια. Η προ-απογαλακτισμένη διάρροια μόσχου παραμένει ένα διαρκές πρόβλημα για τη γαλακτοβιομηχανία. Οι επιβλαβείς επιπτώσεις στην υγεία και την απόδοση των μόσχων και η συνεπαγόμενη οικονομική επιβάρυνση δημιουργούν ένα ισχυρό κίνητρο για τη θεραπεία και την πρόληψη της διάρροιας σε μόσχους που έχουν απογαλακτιστεί πριν από τον απογαλακτισμό. Σε μεγάλες γαλακτοκομικές επιχειρήσεις όπως αυτές στο Central Valley της Καλιφόρνια, μικρές αλλαγές στη συχνότητα εμφάνισης και τη διάρκεια της νόσου καθώς και στην ανάπτυξη και απόδοση των ζώων μπορεί να έχουν βαθιές οικονομικές συνέπειες. Ως μη αντιμικροβιακό προϊόν, ο ψευδάργυρος μπορεί να γίνει όλο και πιο ελκυστικός καθώς τα αντιμικροβιακά στις ζωοτροφές υπόκεινται σε αυξημένο έλεγχο και ρύθμιση λόγω ανησυχιών σχετικά με τη μικροβιακή αντοχή [2, 40] . Ο επιπολασμός της αποβολής κοπράνων C. parvum σε ένα τυχαίο δείγμα 92 μόσχων της μελέτης κατά την έναρξη και την υποχώρηση της διάρροιας ήταν σημαντικά υψηλότερος σε μόσχους που έλαβαν θεραπεία με ψευδάργυρο σε σύγκριση με μόσχους που έλαβαν εικονικό φάρμακο. Αντίθετα, μια προηγούμενη μελέτη όπου μόσχοι που βρέθηκαν θετικοί για C. parvum στην αρχή της διάρροιας και έλαβαν θεραπεία με ZM είχαν 16 φορές υψηλότερες πιθανότητες να είναι αρνητικοί ELISA κοπράνων κατά την έξοδο σε σύγκριση με την ομάδα εικονικού φαρμάκου (P = 0,08; ισχύς = 72,3%) [11] . Η διαφορά στα ευρήματα μπορεί να οφείλεται στις διαφορές στο χρόνο εμφάνισης της διάρροιας μεταξύ των ομάδων θεραπείας. Για το τυχαίο δείγμα μόσχων της τρέχουσας μελέτης που απέκτησαν, επέζησαν και δειγματολήφθηκαν τις σωστές ημέρες, η μέση ηλικία των μόσχων τόσο στην έναρξη όσο και στην υποχώρηση της διάρροιας ήταν υψηλότερη για τους μόσχους ZM και ZS σε σύγκριση με τους μόσχους που έλαβαν εικονικό φάρμακο. Αν και η αποβολή ωοκύστης C. parvum σε μολυσμένους μόσχους μπορεί να συμβεί ήδη από την ηλικία των 3 ημερών, η μέγιστη αποβολή εμφανίζεται περίπου στην ηλικία των 14 ημερών [41] . Είναι πιθανό ότι η αύξηση του επιπολασμού της αποβολής C. parvum στις ομάδες που έλαβαν θεραπεία με ZM και ZS οφειλόταν στην αυξημένη ηλικία των μόσχων που έλαβαν θεραπεία με ψευδάργυρο σε σύγκριση με τους μόσχους που έλαβαν εικονικό φάρμακο κατά την επίλυση της διάρροιας. Η τελευταία εξήγηση υποστηρίζεται επίσης από τα ευρήματά μας ότι οι πιθανότητες μικροβιολογικής θεραπείας από το C. parvum μειώθηκαν σημαντικά σε μεγαλύτερους μόσχους, χωρίς σημαντικές διαφορές στις πιθανότητες ίασης μεταξύ των ομάδων θεραπείας. Επιπλέον, η τρέχουσα δοκιμή δεν υπολόγισε τη συγκέντρωση της αποβολής C. parvum, η οποία μπορεί να διαφέρει ακόμα μεταξύ των ομάδων θεραπείας. Παρά το μεγάλο μέγεθος δείγματος, η τρέχουσα δοκιμή περιορίστηκε σε ένα μόνο γαλακτοκομείο Καλιφόρνιας, το οποίο μπορεί να αντιπροσωπεύει άλλα μεγάλα γαλακτοκομεία αλλά δεν αντικατοπτρίζουν όλα τα συστήματα διαχείρισης γαλακτοκομικών προϊόντων στην Καλιφόρνια ή αλλού. Επιπλέον, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα μοσχάρια ανταποκρίνονται διαφορετικά στη λήψη συμπληρωμάτων ψευδαργύρου για την πρόληψη της διάρροιας ανάλογα με τη χημική σύνθεση και το φύλο των μόσχων. Το τελευταίο θα μπορούσε να οφείλεται σε διαφορές στο σωματικό βάρος μεταξύ ταύρων και δαμαλίδων και μπορεί να υποδηλώνει την ανάγκη για συγκεκριμένη δοσολογία για το φύλο. Επιπλέον, η τρέχουσα έρευνα δεν αξιολόγησε την πιθανή οικονομική χρησιμότητα του συμπληρώματος ψευδαργύρου. Μελλοντικές μελέτες σχετικά με την ακριβέστερη δοσολογία ψευδάργυρου ανά φύλο μόσχου, την πρακτική σκοπιμότητα της δοσολογίας με βάση το βάρος και την αναμενόμενη σχέση κόστους-αποτελεσματικότητας της χορήγησης ψευδάργυρου ως μέρος της διαχείρισης μόσχων προαπογαλακτισμένων γαλακτοπαραγωγών είναι δικαιολογημένες. Τέλος, η κλινική μας δοκιμή διεξήχθη σε ένα μόνο, μεγάλο, κυρίως γαλακτοκομείο Holstein της Καλιφόρνια σε περίοδο έξι μηνών, κάτι που απέκλεισε την ικανότητά μας να αξιολογούμε διαφορές λόγω εποχής ή φυλής. Ως εκ τούτου, απαιτούνται επίσης μελλοντικές μελέτες για την αξιολόγηση οποιασδήποτε τροποποιητικής επίδρασης της φυλής και των εποχιακών διαφορών στην επίδραση του ψευδαργύρου στην υγεία των μοσχαριών και στην αύξηση βάρους. Η τρέχουσα διπλή τυφλή, τυχαιοποιημένη ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο κλινική δοκιμή εξέτασε την επίδραση ενός προφυλακτικού καθημερινού από του στόματος ψευδάργυρου συμπληρώματα σε νεογνά μοσχάρια Holstein. Τα μοσχάρια ταύρου που έλαβαν θεραπεία με ZM είχαν σημαντικά αυξημένη ADG (22 g την ημέρα) κατά την περίοδο πριν από τον απογαλακτισμό σε σύγκριση με τους ταύρους που έλαβαν εικονικό φάρμακο. Συγκριτικά, οι δαμαλίδες που έλαβαν θεραπεία με ZM είχαν σημαντικά χαμηλότερο μέσο ημερήσιο κέρδος (9 g την ημέρα) σε σύγκριση με τις δαμαλίδες που έλαβαν εικονικό φάρμακο, αν και υψηλότερες δόσεις ZM σε δαμαλίδες χαμηλού βάρους γέννησης μπορεί να εξηγήσουν τη χαμηλότερη ADG. Μόσχοι που έλαβαν θεραπεία είτε με ZM είτε με ZS είχαν σημαντικά χαμηλότερο κίνδυνο διάρροιας και σημαντικά υψηλότερο κίνδυνο ίασης από διάρροια κατά τις πρώτες 30 ημέρες της ζωής τους σε σύγκριση με τους μόσχους που έλαβαν εικονικό φάρμακο και ως εκ τούτου η τρέχουσα δοκιμή έδειξε ότι η λήψη συμπληρωμάτων ψευδαργύρου καθυστέρησε τη διάρροια και επιτάχυνε την ανάρρωση της διάρροιας σε προ-απογαλακτισμένα μοσχάρια. Επιπλέον, ο ψευδάργυρος βελτίωσε διαφορετικά την αύξηση βάρους στους ταύρους σε σύγκριση με τις δαμαλίδες, υποδεικνύοντας την ανάγκη περαιτέρω έρευνας για τη διερεύνηση της δοσολογίας ψευδαργύρου σε μόσχους. Υποστηρικτικές πληροφορίες S1 (DOCX) S1 Dataset. Ακατέργαστα δεδομένα που συλλέχθηκαν από τη δοκιμή, οργανωμένα ως ξεχωριστά φύλλα excel για εγγραφή, ημερήσια αξιολόγηση, συνολική πρωτεΐνη ορού, βάρος γέννησης, βάρος θεραπείας εξόδου, βάρος δοκιμής εξόδου, δοκιμή ψευδαργύρου ορού, δείγματα κοπράνων, δοκιμές κοπράνων, δοκιμή γάλακτος και νεκρούς μόσχους. (XLSX)", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 52261, "text": "συμπλήρωμα ψευδαργύρου" } ], "id": 5174, "question": "Ποια προληπτικά μέτρα έχουν ληφθεί για τη μείωση της συχνότητας της διάρροιας στα παιδιά;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Οι ιοί Hanta στην Αμερική και ο ρόλος τους ως αναδυόμενα παθογόναhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3185593/SHA: efe13a8d42b60ef9f7387ea539a1b2eeb5f80101A; Torres-Pérez, Fernando Ημερομηνία: 2010-11-25DOI: 10.3390/v2122559Άδεια: cc-byAbstract: Η συνεχιζόμενη εμφάνιση και επανεμφάνιση παθογόνων αντιπροσωπεύει μια συνεχή, μερικές φορές σημαντική, απειλή για τους πληθυσμούς. Οι Hantaviruses (οικογένεια Bunyaviridae) και οι σχετικές ανθρώπινες ασθένειες θεωρήθηκαν ότι περιορίζονταν στην Ευρασία, αλλά η εμφάνιση μιας επιδημίας το 1993-94 στις νοτιοδυτικές Ηνωμένες Πολιτείες οδήγησε σε μεγάλη αύξηση στη μελέτη τους μεταξύ των ιολόγων παγκοσμίως. Έχουν περιγραφεί πάνω από 40 γονότυποι χανταϊών, η μεγάλη πλειοψηφία από το 1993, και σχεδόν οι μισοί από αυτούς είναι παθογόνοι για τον άνθρωπο. Οι ιοί Hanta προκαλούν επίμονες λοιμώξεις στους ξενιστές της δεξαμενής τους και στην Αμερική, η ανθρώπινη ασθένεια εκδηλώνεται ως καρδιοπνευμονικό συμβιβασμό, καρδιοπνευμονικό σύνδρομο hantavirus (HCPS), με αναλογίες περιστατικών-θνησιμότητας, για τους πιο κοινούς ιικούς ορότυπους, μεταξύ 30% και 40%. Η διαταραχή των οικοτόπων και οι οικολογικές διαταραχές μεγαλύτερης κλίμακας, ίσως συμπεριλαμβανομένης της κλιματικής αλλαγής, είναι μεταξύ των παραγόντων που μπορεί να έχουν αυξήσει τον ανθρώπινο φόρτο κρουσμάτων HCPS μεταξύ 1993 και σήμερα. Εξετάζουμε εδώ τα χαρακτηριστικά που επηρεάζουν τη δομή της δυναμικής του πληθυσμού ξενιστή που μπορεί να οδηγήσουν σε ιικές εστίες, καθώς και τους μακρομοριακούς καθοριστικούς παράγοντες των hantaviruses που έχουν θεωρηθεί ότι έχουν πιθανή συμβολή στην παθογένεια. και μεταξύ αυτών, οι αναδυόμενες ζωονοσογόνες ασθένειες αποτελούν μείζονα ανησυχία μεταξύ των επιστημόνων που μελετούν τις μολυσματικές ασθένειες σε διαφορετικές χωρικές και χρονικές κλίμακες [1, 2] . Οι αλλαγές στις βιοτικές και αβιοτικές συνθήκες μπορεί να αλλάξουν τη δυναμική των ασθενειών του πληθυσμού και να οδηγήσουν στην εμφάνιση ζωονοσογόνων λοιμώξεων [3] [4] [5] [6] . Κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών, έχουν εμφανιστεί αρκετές επιδημίες αναδυόμενων και επανεμφανιζόμενων ιικών παθογόνων, που επηρεάζουν τόσο την αμιγώς τοπική όσο και την παγκόσμια/πανδημική συμμετοχή των ανθρώπινων πληθυσμών. Μεταξύ των ευδιάκριτων παραδειγμάτων είναι η γρίπη Α, ο ιός Έμπολα, ο ιός της ηπατίτιδας C, η σοβαρή αναπνευστική δυσχέρεια των ενηλίκων (SARS), ο κορωνοϊός και ο ιός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας, που αμφισβητούν τα μέτρα πρόληψης και ελέγχου των συστημάτων δημόσιας υγείας [7] . Στην Αμερική, το πρόσφατο ξέσπασμα της πανδημίας γρίπης Α υποτύπου H1N1 έγινε κύριος στόχος για τον έλεγχο λόγω της ταχείας εξάπλωσής του και των αβεβαιοτήτων ως προς τη λοιμογόνο δύναμη και τη μεταδοτικότητα, ωστόσο η διαθεσιμότητα του εμβολίου ήταν περιορισμένη όταν σημειώθηκε σημαντική δραστηριότητα πριν από την παραδοσιακή εποχή της γρίπης [8. ] . Ωστόσο, τον περασμένο αιώνα εμφανίστηκαν ή επανεμφανίστηκαν εστίες αρκετών ασθενειών που σχετίζονται με ιούς που αφορούσαν αρεναϊούς και ιούς δάγκειου πυρετού, και πιο πρόσφατα, χανταϊούς και την επέκταση της γεωγραφικής περιοχής του ιού του Δυτικού Νείλου. Μεταξύ των ζωονοσογόνων ασθενειών, τα μικρά θηλαστικά είναι ξενιστές αρκετών παθογόνων ιών RNA, ιδιαίτερα των Arenaviridae και Bunyaviridae: Hantavirus [9] [10] [11] .Οι λοιμώξεις από hantavirus έγιναν ανησυχητικό στην Αμερική μετά την περιγραφή μιας εστίας οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας που σημειώθηκε στην την περιοχή Four Corners το 1993 [12] . Η πρόσφατα αναγνωρισμένη ασθένεια, το καρδιοπνευμονικό σύνδρομο hantavirus, HCPS (ή πνευμονικό σύνδρομο hantavirus), συνδέθηκε με μόλυνση από τον πρόσφατα ανακαλυφθέν ιό Sin Nombre (SNV) και το τρωκτικό Peromyscus maniculatus (ποντίκι ελάφι) αναγνωρίστηκε ως η δεξαμενή [13] . Ωστόσο, οι λοιμώξεις από hantavirus έχουν πολύ μεγαλύτερο ιστορικό. Μια ανασκόπηση αρχαίων κινεζικών γραπτών, που χρονολογούνται περίπου από το 960 μ.Χ., αποκάλυψε περιγραφές που μοιάζουν πολύ με αιμορραγικό πυρετό με νεφρικό σύνδρομο (HFRS), το σύνδρομο που προκαλείται από τους χανταϊούς του Παλαιού Κόσμου [14] . Κατά τη διάρκεια του εικοστού αιώνα, περιεγράφησαν περιπτώσεις οξείας εμπύρετης νόσου με νεφρική διαταραχή από πολλές ευρασιατικές χώρες και την Ιαπωνία, συχνά σε συνδυασμό με στρατιωτικές εμπλοκές [15] . Το HFRS ως ξεχωριστό σύνδρομο, ωστόσο, τέθηκε για πρώτη φορά στην προσοχή της δυτικής ιατρικής σε συνδυασμό με ένα ξέσπασμα που εμφανίστηκε μεταξύ των στρατευμάτων των Ηνωμένων Εθνών κατά τη διάρκεια της σύγκρουσης στην Κορέα μεταξύ 1951 και 1954, όπου περισσότεροι από 3.200 στρατιώτες προσβλήθηκαν [16] . Χρειάστηκαν περισσότερες από δύο δεκαετίες έως ότου ο αιτιολογικός παράγοντας, ο ιός Hantaan (HTNV), απομονώθηκε από το ριγέ ποντίκι χωραφιού Apodemus agrarius, που ανιχνεύθηκε εν μέρει από τη δέσμευση αντισωμάτων από δείγματα ορού ασθενών στους ιστούς των πνευμόνων ενός υγιούς αγρού. ποντίκια [17, 18] . Αργότερα βρέθηκε ότι ο ιός αντιπροσωπεύει το είδος ενός νέου γένους Hantavirus της οικογένειας Bunyaviridae, αν και αργότερα έγινε φανερό ότι ο πρώτος hantavirusς που απομονώθηκε ήταν ο ιός Thottapalayam που γεννήθηκε από την αιδώ [19] . Η κατηγοριοποίηση των hantaviruses που ανήκουν στην οικογένεια Bunyaviridae οφείλεται εν μέρει στη σταθερή παρουσία τριών γονιδιωμάτων RNA που κυκλοφορούν in vivo ως αποτέλεσμα της παρουσίας τερματικών συμπληρωματικών νουκλεοτιδίων που βοηθούν στην αναδίπλωση του γονιδιώματος σε μορφολογία -φουρκέτα, πρώτα περιγράφεται για τον φλεβοϊό Uukuniemi [19, 20]. Ο Πίνακας 1 είναι ένας κατάλογος των κυρίαρχων, ορολογικά διακριτών παθογόνων χανταϊών. Περιγράφονται πολλοί άλλοι ονομασμένοι γονότυποι, αλλά τέτοιες άλλες παθογόνες μορφές γενικά σχετίζονται στενά με τον ιό των Άνδεων ή, σε ορισμένες περιπτώσεις, με τον ιό Sin Nombre. Κατά την ωρίμανση του ιού, η πρόδρομη μορφή GPC υποβάλλεται σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας μια πρωτεάση δεσμευμένη στη μεμβράνη σε Gn και Gc, μια διάσπαση που συμβαίνει και φαίνεται να σηματοδοτείται μετά το συντηρημένο πεπτιδικό σήμα WAASA στο C-τερματικό του Gn [24]. Αν και οι δύο πρωτεΐνες μπορούν να εκφραστούν ανεξάρτητα μέσω της επιμόλυνσης, μπορούν να διατηρηθούν σε λάθος κυτταρικό διαμέρισμα (ER ή agresome). Πρέπει επομένως να συνεκφράζονται για να τους επιτραπεί η σταθερότητα, ώστε να μπορούν να συναρμολογηθούν σωστά στο Golgi [25, [27] [28] [29] .Έχουν εντοπιστεί ένας αριθμός δραστηριοτήτων και ιδιοτήτων για τις γλυκοπρωτεΐνες του φακέλου του hantavirus, συμπεριλαμβανομένων ορισμένων χαρακτηριστικών για τα οποία υπάρχει η υποψία ότι εμπλέκονται στην παθογένεια των ορότυπων που προκαλούν νόσο, μια πιθανότητα που έχει προκαλέσει πειραματική προσοχή. Οι γλυκοπρωτεΐνες είναι οι γνωστοί ή υποτιθέμενοι συνδέτες για τουλάχιστον δύο διακριτούς κυτταρικούς υποδοχείς, την αλυσίδα ιντεγκρίνης 3 και τον παράγοντα επιτάχυνσης της αποσύνθεσης ή DAF [30, 31]. με gC1qR/p32 που ταυτοποιήθηκε επίσης ως ένας άλλος δυνητικός υποδοχέας εισόδου [32] . Συγκρίσεις με την πρωτεΐνη Ε του ιού της εγκεφαλίτιδας που μεταδίδεται από κρότωνες, οδήγησε τους Tischler et al. να θεωρηθεί η γλυκοπρωτεΐνη Gc ως μια πιθανή πρωτεΐνη σύντηξης κατηγορίας II, που ίσως προσδίδει δραστηριότητα σύντηξης στο ιοσωμάτιο, και αυτή η υπόθεση έχει υποστηριχθεί σε άλλες μελέτες [33, 34] . Πρόσθετες δραστηριότητες έχουν ταυτοποιηθεί ή έχουν υποστηριχθεί ότι σχετίζονται με Γν. Για πολλές από αυτές τις μελέτες, μια υποκείμενη υπόθεση υποστήριξε ότι υπάρχουν διαφορές μεταξύ των γλυκοπρωτεϊνών των -παθογόνων- hantaviruses σε σχέση με τους ιούς του γένους που ονομάζονται -μη παθογόνοι-. Αν και είναι αλήθεια ότι δεν έχει καταστεί ακόμη δυνατό να συνδεθεί ο ιός Prospect Hill (PHV) με την ανθρώπινη ασθένεια, η απουσία στοιχείων για την παθογένειά του δεν πρέπει ίσως να εξισωθεί με τα στοιχεία της απουσίας του. Θα μπορούσε κανείς μόνο να θεωρήσει ότι το επίπεδο της νόσου (π.χ. λήθαργος, πυρετός, πρωτεϊνουρία και αζωθαιμία) που σχετίζεται με μόλυνση μη ανθρώπινων πρωτευόντων από PHV δεν διαφέρει σημαντικά από αυτό που καταγράφηκε για μοντέλα πρωτευόντων πλην του ανθρώπου που χρησιμοποιούν τον γνωστό παθογόνο ιό Puumala (PUUV) [35, 36]. Για τους σκοπούς αυτής της συζήτησης θα υποθέσουμε ότι οι απαθογόνοι χανταϊοί είναι όντως απαθογόνοι. Ενώ ορισμένες μελέτες έχουν προτείνει ότι οι γλυκοπρωτεΐνες Gn κατευθύνονται πιο γρήγορα στην οδό ουβικιτίνης-πρωτεοσώματος από ό,τι οι απαθογόνοι μορφές, άλλες έχουν ερμηνεύσει διαφορές στον χειρισμό των γλυκοπρωτεϊνών Gn είδη hantavirus από το σύστημα ουβικιτίνης-πρωτεοσωμικού ως ανεξάρτητο από την παθογένεια [37] [38] [39] . Ορισμένοι ερευνητές έχουν κατευθύνει τις προσπάθειές τους προς τον εντοπισμό μιας διαφορικής ικανότητας, είτε κινητικής είτε σε απόλυτο μέγεθος, στην ικανότητα των παθογόνων και απαθογόνων χανταϊών να προκαλούν μια απόκριση ιντερφερόνης στα κύτταρα. Μια υπόθεση που προκύπτει είναι ότι οι απαθογόνοι μορφές θα τείνουν να προκαλέσουν μια πρώιμη έμφυτη απόκριση που θα καθιστούσε πιο πιθανό ότι ο ιός θα καθαριζόταν γρήγορα ή θα καθιστούσε λιγότερο ικανός στην αντιγραφή του, ώστε να αμβλύνει οποιαδήποτε παθολογική απόκριση στον ξενιστή [40] [40] [ 41] [42] . Η έμφυτη απόκριση κατά του hantavirus μπορεί σε ορισμένες περιπτώσεις να αποδοθεί σε ιική αλληλεπίδραση ως συνδέτης του TLR-3, αλλά όχι σε άλλες, και στα ενδοθηλιακά κύτταρα, φαίνεται να μην απαιτεί περισσότερα από το ίδιο το ιικό σωματίδιο, ακόμη και όταν εισάγεται σε αντιγραφή -αναρμόδιο έντυπο [43, 44] . Οι πρωτεΐνες και τα mRNA που επάγονται εμφανώς από τους hantavirus περιλαμβάνουν MxA και IFIT-1 (ISG-56) και άλλες, συμπεριλαμβανομένων ορισμένων με γνωστή ή ύποπτη αντι-ιική δράση. Αυτοί οι χανταϊοί, συχνά εξαιρετικά παθογόνα στελέχη, που αποτυγχάνουν να προκαλέσουν μια ισχυρή αντιική απόκριση, υποπτεύονται ή υποτίθεται ότι έχουν έναν (πιο) ισχυρό μηχανισμό ανταγωνισμού της οδού ιντερφερόνης σε σχέση με άλλους ιούς, έναν μηχανισμό που δρα θετικά για να αποτρέψει μια αποτελεσματική έμφυτη απόκριση από που σχηματίζονται, τουλάχιστον νωρίς στη μόλυνση [42, 45]. Ωστόσο, έχουν αναφερθεί ορισμένες περιπτώσεις όπου οι υψηλά παθογόνοι χανταϊοί, όπως ο SNV, είναι επίσης ικανοί να προκαλέσουν έκφραση mRNA γονιδίων που διεγείρονται από ιντερφερόνη, ακόμη και πολύ νωρίς στη μόλυνση, με πρωτεΐνες ISG, όπως αναμενόταν, να καθυστερούν να εμφανιστούν στο κύτταρο [44] . Οι δράσεις κατά της ιντερφερόνης έχουν επίσης αποδοθεί στην πρωτεΐνη NSs που μπορεί να αναπτυχθεί σε κύτταρα μολυσμένα από ορότυπους που κωδικοποιούν αυτήν την πρωτεΐνη [46]. Άλλοι ερευνητές έχουν εξετάσει τις δραστηριότητες των γλυκοπρωτεϊνών hantavirus και άλλων πρωτεϊνών που ενδέχεται να επηρεάσουν άμεσα ορισμένες πτυχές της παθογόνου εξέλιξης που σχετίζεται με τη μόλυνση από hantavirus των ανθρώπων, όπως αλλαγές αγγειακής διαπερατότητας. Ενώ οι πρώιμες προσπάθειες να προκαλέσουν άμεσα αυξήσεις στη διαπερατότητα των ενδοθηλιακών μονοστιβάδων με ιικά σωματίδια ή ιογενή λοίμωξη ήταν σε μεγάλο βαθμό απογοητευτικές, οι hantaviruss έχουν αναγνωριστεί ότι επηρεάζουν δυσμενώς την ενδοθηλιακή μετανάστευση πάνω από τα υποστρώματα και ενισχύουν την επαγόμενη από VEG-F ενδοθηλιακή διαπερατότητα [47, 48]. Το βραχύτερο (50-kD) νουκλεοκαψίδιο ή πρωτεΐνη Ν είναι ένα δομικό συστατικό του ιικού νουκλεοκαψιδίου, μαζί με τα τμήματα γονιδιωματικού ιικού RNA. Ως πρωτεΐνη δέσμευσης RNA που εμπλέκει τα άκρα της φουρκέτας των γονιδιωματικών τμημάτων με υψηλή συγγένεια [49, 50], περιορίζει την πρόσβαση του RNA στις νουκλεάσες του ξενιστή και βοηθά να καταστεί η ιική αντιγραφή μια κλειστή διαδικασία μέσα στο κυτταρόπλασμα. Λειτουργεί επίσης ως πρωτεΐνη περιφερικής μεμβράνης, όπως και η πρωτεΐνη L [51] , μια δραστηριότητα που θα μπορούσε να παίξει ρόλο στην υποτιθέμενη, αλλά όχι ακόμη αποδεδειγμένη λειτουργία της ως μήτρα [52] . Μέχρι πρόσφατα, δεν είχε εκτιμηθεί ότι το Ν έχει μια μεγάλη ποικιλία από άλλες δραστηριότητες, μερικές από τις οποίες μπορούν να συνδεθούν, όχι μόνο με τις θεμελιώδεις απαιτήσεις αντιγραφής, αλλά και με την παρέμβαση σε μια σειρά από τις ενδοκυτταρικές διεργασίες του φυσιολογικού κυττάρου. Έτσι, έχει προταθεί μια αλληλεπίδραση μεταξύ του αμινοτελικού άκρου της πρωτεΐνης Ν hantavirus και της κυτταρικής πρωτεΐνης Daxx, με την πρόταση πιθανών προ-αποπτωτικών συνεπειών [51] . Το Ν αναφέρεται επίσης ότι αλληλεπιδρά με τα μικρονημάτια ακτίνης και την πρωτεΐνη SUMO-1 [53, 54]. Χρησιμοποιώντας αναλύσεις που βασίζονται στο γονίδιο αναφοράς, η Connie Schmaljohn και οι συνεργάτες της ανέφεραν ότι η πρωτεΐνη νουκλεοκαψιδίου του ιού Hantaan έχει ανασταλτικό ρόλο στις φλεγμονώδεις αποκρίσεις που προκαλούνται από το NF κάπα Β (NF-B). Τα αποτελέσματα στην έκφραση του NF-B φάνηκε να περιορίζονται στην πρόληψη της πυρηνικής μετατόπισής του μετά την απόπειρα ενεργοποίησής του με λιποπολυσακχαρίτη, LPS [55] . Στο κυτταρόπλασμα των μολυσμένων κυττάρων, η πρωτεΐνη Ν μπορεί να βρεθεί σε κυτταρικά σώματα P όπου απομονώνει και προστατεύει τα 5' καλύμματα. Μπορεί να εντοπίσει τα καπάκια μέσω της αλληλεπίδρασής του με το DCP1, ένα βασικό συστατικό των σωμάτων P. Κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από hantavirus, τα ιικά RNA συγκεντρώνονται σε σώματα P, μέσω της αλληλεπίδρασής τους με το N και το DCP1. Η πρωτεΐνη Ν επιδεικνύει προνομιακή προστασία των mRNAs που έχουν κατασκευαστεί για να τερματίζουν πρόωρα την κωδικοποιημένη πρωτεΐνη τους σε σύγκριση με τα φυσικά mRNA [56] . Η πρωτεΐνη Ν έχει συνδεθεί όλο και περισσότερο με την ιική αντιγραφή και μετάφραση, μερικές φορές με απροσδόκητους τρόπους. Είναι μεταξύ μιας αναπτυσσόμενης οικογένειας διαφορετικών ιικών πρωτεϊνών που μπορούν να χρησιμεύσουν ως μη ειδικός συνοδός -RNA, μια δραστηριότητα που θα πρέπει να διευκολύνει την πρόσβαση της πολυμεράσης L στο vRNA για μεταγραφή και αντιγραφή, καθώς μπορεί να διαχωρίσει παροδικά τις λανθασμένες δομές RNA [57] . Ορισμένες από τις επιδράσεις της πρωτεΐνης Ν στη μετάφραση μπορεί να μην αναγνωριστούν αμέσως ως προσαρμοστικές στη φύση τους. Μπορεί να αντικαταστήσει ολόκληρο το σύμπλεγμα μεταφραστικής έναρξης EIF4F, παρουσιάζοντας ταυτόχρονα το ριβόσωμα με μια αντικατάσταση της δραστηριότητας δέσμευσης καπακιού του eIF 4E, δεσμεύοντας στο σύμπλεγμα προ-έναρξης 43S όπως και το eIF 4G, ενώ αντικαθιστά τη δραστηριότητα ελικάσης του eIF 4A, η οποία θεωρείται ότι χρειάζεται για να διαχωριστεί η δομή RNA ανώτερης τάξης [56, 58]. Αυτοί οι τρεις παράγοντες συνήθως συνεργάζονται για την επίτευξη μεταφραστικής έναρξης. Στα σώματα P, η ικανότητα της πρωτεΐνης Ν να δεσμεύεται σε υψηλή συγγένεια με καλυμμένα φυσικά κυτταρικά ολιγοριβονουκλεοτίδια, μαζί με τη δραστηριότητά της στην προστασία των καλυμμένων RNA από την αποικοδόμηση πιθανότατα διευκολύνει την πρόσβαση των καλυμμένων ολιγονουκλεοτιδίων για χρήση σε μεταγραφική εκκίνηση από L πολυμεράση (-άρπαγμα καπακιού‖). Διακίνηση Ν για ιική συναρμολόγηση: Κλασικά, η πρωτεΐνη Ν σε μολυσμένα κύτταρα φαίνεται να είναι συγκεντρωμένη ή σωματιδιακή στη φύση, με μεγάλη συγκέντρωση σε μια μοναδική περιπυρηνική τοποθεσία, που ευρέως θεωρείται ως το Golgi [27] . Οι πρωτεΐνες Ν των hantaviruses βρίσκονται σε συσχέτιση με σωματιδιακά κλάσματα και η ομοεστιακή μικροσκοπία και οι μελέτες βιοχημικών αναστολέων έχουν δείξει ότι το N παρακολουθεί κατά μήκος των μικροσωληνίσκων αλλά όχι με τα νήματα ακτίνης [52] . Ο απόλυτος προορισμός για το Ν, για τη συναρμολόγησή του σε ιικά σωματίδια είναι το Golgi, και διακινείται εκεί μέσω του ενδοπλασματικού δικτύου-ενδιάμεσου συμπλέγματος Golgi (ERGIC), γνωστό και ως φυσαλιδώδες-σωληνοειδές σύμπλεγμα [52] . Ένας κυρίαρχος αρνητικός αναστολέας, η δυναμιτίνη, που σχετίζεται με τη μεταφορά μέσω της δυνεΐνης, μείωσε τη συσσώρευση Ν στο Golgi. Μεταγενέστερες μελέτες πρότειναν ότι η ειδική εξάρτηση από τη μεταφορά μικροσωληνίσκων είναι ειδική για τους χανταϊούς του Παλαιού Κόσμου όπως ο HTNV, αλλά ότι ο ιός hanta του Νέου Κόσμου ANDV συνδέεται με νημάτια ακτίνης [59] . Ωστόσο, πρόσφατα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η μικροσωληνοειδής μεταφορά χρησιμοποιείται όντως για τον hantavirus SNV του Νέου Κόσμου [60] . Οι ασθένειες του ανθρώπινου ιού Hantavirus εδώ και πολύ καιρό υποπτεύονται ότι έχουν ανοσοπαθογόνο βάση εν μέρει λόγω της σχετικά μεγάλης περιόδου επώασης 2-3 εβδομάδων και της παρατηρήθηκε χρονική συσχέτιση μεταξύ των ανοσολογικών διαταραχών και της πρώτης εμφάνισης σημείων και συμπτωμάτων της νόσου του hantavirus. Το HFRS και το HCPS μοιράζονται πολλά κλινικά χαρακτηριστικά, με αποτέλεσμα πολλοί ερευνητές να θεωρούν ότι είναι, στην ουσία, διαφορετικές εκδηλώσεις μιας παρόμοιας παθογόνου διαδικασίας, που διαφέρουν κυρίως στα κύρια όργανα-στόχους έκφρασης της νόσου (Πίνακας 2). Η παθογένεση των λοιμώξεων από hantavirus είναι το θέμα μιας συνεχώς ενημερωμένης ανασκόπησης στη σειρά UpToDate [61] . Μέχρι να εμφανιστούν τα συμπτώματα στο HCPS, τόσο ισχυρές αντιικές αποκρίσεις όσο και, για τους πιο λοιμογόνους ιικούς γονότυπους, το ιικό RNA μπορεί να ανιχνευθεί σε πλάσμα αίματος ή εμπύρηνα κύτταρα αίματος αντίστοιχα [63, 64] . Τουλάχιστον τρεις μελέτες έχουν συσχετίσει το ιικό RNA του πλάσματος με τη σοβαρότητα της νόσου για HCPS και HFRS, υποδηλώνοντας ότι η αναπαραγωγή του ιού παίζει έναν συνεχή και σε πραγματικό χρόνο ρόλο στην παθογένεση του ιού [65] [66] [67] . Έχουν εντοπιστεί αρκετές χαρακτηριστικές παθολογικές αλλαγές που συμβαίνουν τόσο στο HFRS όσο και στο HCPS. Ένα κρίσιμο χαρακτηριστικό και των δύο είναι μια παροδική (~ 1-5 ημέρες) τριχοειδική διαρροή που περιλαμβάνει τον νεφρό και τον οπισθοπεριτοναϊκό χώρο στο HFRS και τους πνεύμονες στο HCPS. Η προκύπτουσα διαρροή είναι εξιδρωματικού χαρακτήρα, με χημική σύνθεση υψηλή σε πρωτεΐνη και μοιάζει με πλάσμα. Η συνεχής εμπειρία που υποδεικνύει τον ισχυρό τροπισμό των ιστών για τα ενδοθηλιακά κύτταρα, συγκεκριμένα, είναι μεταξύ των πολλών παραγόντων που καθιστούν τη β3 ιντεγκρίνη ιδιαίτερα ελκυστική υποψήφια ως σημαντικό in vivo υποδοχέα για ιούς hanta. Είναι πιθανό οι χανταϊοί να φτάνουν στους ιστούς-στόχους τους μέσω της πρόσληψης από τους περιφερειακούς λεμφαδένες, ίσως με ή μέσα σε ένα συνοδευτικό ιστιοκύτταρο πνεύμονα. Ο ιός σπέρνει το τοπικό ενδοθήλιο, όπου τα πρώτα λίγα μολυσμένα κύτταρα προκαλούν, τελικά, μια πρωτογενή ιαιμία, μια διαδικασία που φαίνεται να παίρνει πολύ χρόνο για τις λοιμώξεις από hantavirus [62, 63]. Μέχρι τη στιγμή που εμφανίζεται η δευτερογενής ιαιμία, οι παράγοντες των πιο σοβαρών μορφών HFRS και HCPS έχουν αρχίσει να επιτυγχάνουν επαρκή μάζα ώστε να επάγουν, μέσω αλληλεπιδράσεων PAMP-PRR και άλλων μέσων, την έκφραση προφλεγμονωδών κυτοκινών [64] . Για το HCPS, αυτή η έκφραση ευνοεί την πνευμονική κλίνη και τα λεμφοειδή όργανα, ωστόσο, για άγνωστους λόγους, γλιτώνει το οπισθοπεριτόναιο και, γενικά, το νεφρό. Στο HFRS η κατάσταση αντιστρέφεται, και ωστόσο συχνά δεν εκτιμάται ότι ο αναμενόμενος προτιμησιακός τροπισμός ιστών των ιών που σχετίζονται με το HFRS και των αντίστοιχων που σχετίζονται με το HCPS για το νεφρικό και το πνευμονικό κρεβάτι, αντίστοιχα, δεν είναι όπως θα προέβλεπε κανείς μέσω των εκδηλώσεων Οι δύο ασθένειες. Η τοπική επεξεργασία φλεγμονωδών και χημειοτακτικών μεσολαβητών θεωρείται απαίτηση για την ανάπτυξη συμπτωμάτων συστηματικής νόσου, με αυτές τις ανωμαλίες μερικές φορές να καταλήγουν σε σοκ και θάνατο. Ωστόσο, δεν είναι η υποξαιμία, λόγω του προεξέχοντος πνευμονικού οιδήματος, που οδηγεί σε θάνατο στις περισσότερες θανατηφόρες περιπτώσεις HCPS, αλλά μάλλον η δηλητηρίαση της καρδιάς από απροσδιόριστους ακόμη μεσολαβητές που οδηγεί στην κατάσταση χαμηλής καρδιακής παροχής και στο σχετικό σύνδρομο σοκ. [64, 65]. Είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι οι μεσολαβητές που παράγονται στον πνεύμονα σε σχέση με το φλεγμονώδες διήθημα μπορούν να διεισδύσουν μέσω της στεφανιαίας κυκλοφορίας με ελάχιστη αραίωση σε HCPS, μια μειονεκτική συνέπεια της στενής ανατομικής παράθεσης των δύο οργάνων. Έτσι, τουλάχιστον τρεις κατηγορίες δυνητικών μηχανισμών, ορισμένοι αλληλοεπικαλυπτόμενοι και όλοι ασφαλώς μη αποκλειστικοί από τους άλλους, θα μπορούσαν να θεωρηθούν ότι αποτελούν τη βάση της παθογένεσης του HCPS. Αυτά περιλαμβάνουν: (1) Έμφυτους ανοσοποιητικούς μηχανισμούς. Η φύση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των μοριακών προτύπων που σχετίζονται με το παθογόνο του hantavirus (PAMP) με τους υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων (PRR) των ευαίσθητων ενδοθηλιακών κυττάρων έχει αρχίσει να αποσαφηνίζεται. Το πρωτότυπο HTNV φαίνεται να αναγνωρίζεται από το TLR-3 [43] . Μια τέτοια μόλυνση έχει συνέπειες όπως αυξημένη έκφραση του HLA-DR σε δενδριτικά κύτταρα [66] και διαφοροποίηση των μονοκυττάρων προς τα δενδριτικά κύτταρα [67] . (2) Άμεσες ιογενείς επιδράσεις. Η παρατηρούμενη συσχέτιση μεταξύ του ιικού φορτίου και της σοβαρότητας της νόσου αφήνει ανοιχτή την πιθανότητα ότι τα σωματίδια του hantavirus ή το RNA μπορεί να έχουν τοξικές επιδράσεις στα κύτταρα ή στη σηματοδότηση. Ορισμένοι ερευνητές έχουν ευνοήσει την άμεση ιική τοξικότητα, που δρα μέσω της αναστολής της λειτουργίας του φραγμού των ενδοθηλιακών κυττάρων, ως εξήγηση για μεγάλο μέρος της τριχοειδούς διαρροής, αν και υπάρχει ευρέως διαδεδομένη συμφωνία ότι πολλαπλοί μηχανισμοί που μεσολαβούν στην παθογένεση πιθανόν να λειτουργούν ταυτόχρονα στον πάσχοντα ασθενή [68] . Μια δυνητικά σημαντική ένδειξη για τον μηχανισμό με τον οποίο οι λοιμώξεις από hantavirus εξαντλούν τα αιμοπετάλια και, σε ορισμένες περιπτώσεις προκαλούν αιμορραγικές εκδηλώσεις, προέκυψε από την πρόσφατη ανακάλυψη ότι οι παθογόνοι ιοί είναι ικανοί να στρατολογήσουν αιμοπετάλια για να προσκολληθούν στις επιφάνειες των ενδοθηλιακών κυττάρων, με την ιντεγκρίνη β3 που χρησιμοποιείται ως κρίσιμο δεσμευτικό στοιχείο [69] . (3) Παθογόνες επιδράσεις που προκαλούνται από τις δραστηριότητες συγκεκριμένων ιικών μακρομορίων. Εξετάσαμε μερικές από τις δραστηριότητες που σχετίζονται με τα Gn, Gc και N, κωδικοποιημένα από ιό πολυπεπτίδια σε προηγούμενες ενότητες. Τα μοντέλα δοκιμών της παθογένεσης μπορούν να γίνουν πιο αποτελεσματικά όταν υπάρχει ένα ζωικό μοντέλο που μιμείται βασικές πτυχές της νόσου. Δεν υπάρχει τέτοιο μοντέλο που να μιμείται στενά το HFRS, αλλά υπάρχουν ζωικά μοντέλα τόσο για την ασυμπτωματική μεταφορά του PUUV όσο και του SNV από τα εγγενή τρωκτικά-φορείς τους, το bank vole Myodes glareolus και το ελάφι ποντίκι P. maniculatus. καθώς και ένα μοντέλο συριακού χάμστερ που χρησιμοποιεί ANDV ή τον σχετικό ιό Maporal από τη Βενεζουέλα, για τον οποίο παρατηρείται μια μιμητική ασθένεια HCPS [70] [71] [72] [73] .Το μοντέλο ANDV-Συριακό χάμστερ έχει μια σειρά από χαρακτηριστικά κοινά με την ανθρώπινη ασθένεια, καθώς και κάποιες διαφορές. Σε αντίθεση με τις νευρολογικές ασθένειες που ήταν δυνατό να προκληθούν με τον HTNV, το μοντέλο χάμστερ για το HCPS φαίνεται να προκαλείται από τριχοειδική διαρροή που οδηγεί σε πνευμονικό οίδημα και την παραγωγή υπεζωκοτικής συλλογής με εξιδρωματικά χαρακτηριστικά. Συνήθως τα χάμστερ πεθαίνουν μεταξύ 11 και 14 ημερών μετά τον εμβολιασμό, αντανακλώντας μια ελαφρώς επιταχυνόμενη περίοδο επώασης σε σύγκριση με τις ανθρώπινες μολύνσεις. Όπως και με το ανθρώπινο HCPS, η μικροσκοπική εξέταση του πνεύμονα αποκαλύπτει άφθονη εναπόθεση ινώδους, παχύρρευστα κυψελιδικά διαφράγματα και ιικό αντιγόνο που εκφράζεται άφθονα στο μικροαγγειακό ενδοθήλιο. Τα μολυσμένα με ANDV χάμστερ που ήταν εξοπλισμένα με συσκευές φυσιολογικής παρακολούθησης εμφάνισαν μειωμένες πιέσεις σφυγμού, ταχυκαρδία και υπόταση που φαίνεται να μιμούνται πολύ το σοκ που πιστεύεται ότι είναι η κοντινή αιτία θανάτου σε ασθενείς που υποκύπτουν σε HCPS [65, 74]. ανθρώπινη ασθένεια, τα μολυσμένα με ANDV χάμστερ εμφανίζουν εξαιρετικά υψηλούς τίτλους ζωντανού ANDV στους ιστούς τους, με μεγάλο μέρος της ιικής αντιγραφής να συμβαίνει στα ηπατοκύτταρα, τα οποία εξοικονομούνται από την ανθρώπινη ασθένεια. Οι τίτλοι του ζωντανού ANDV σε ορισμένες περιπτώσεις υπερβαίνουν τα 108/g, ενώ τα απομονωμένα στελέχη του hantavirus από ανθρώπινους ιστούς ήταν εμφανώς δύσκολο να ληφθούν. Παρά την παγκόσμια εμφάνιση ελαφρώς αυξημένων ηπατικών ενζύμων σε ασθενείς με HCPS, τα ηπατικά ένζυμα δεν φαίνεται να υπάρχουν σε υψηλά επίπεδα στο αίμα των νοσούντων χάμστερ ακόμη και αμέσως πριν από το θάνατο [75] . Η παρατεταμένη περίοδος επώασης που σχετίζεται με τη νόσο του hantavirus δίνει να φιλοξενήσει σημαντικό χρόνο για να δημιουργήσει μια ώριμη ανοσοαπόκριση έναντι του ιού. Έτσι, σε αντίθεση με τις λοιμώξεις συγκρίσιμης σοβαρότητας και τη σχετική συμπτωματολογία που σχετίζεται με αρένα ιούς και φιλοϊούς, οι λοιμώξεις από χανταϊούς των ανθρώπων συνδέονται με αποκρίσεις αντισωμάτων σημαντικού τίτλου μέχρι την έναρξη των συμπτωμάτων. Παρά την παρατήρηση αυτή, φαίνεται ότι είναι πιθανό ότι η φυσική διακύμανση στις ατομικές αποκρίσεις εξουδετερωτικών αντισωμάτων μεταξύ ασθενών με λοιμώξεις SNV μπορεί να συνδεθεί με τη σοβαρότητα της νόσου, υποδηλώνοντας ότι η χορήγηση αντιιικών αντισωμάτων θα μπορούσε να αποδειχθεί αποτελεσματική θεραπευτικά [76] . Στην περίπτωση της λοίμωξης ANDV, έχουν προκύψει νέα στοιχεία που υποδεικνύουν ότι η φαινομενική κάθαρση του ιού από το αίμα δεν έχει ως αποτέλεσμα την πλήρη απομάκρυνση του αντιγονικού ερεθίσματος από τον ιό, υποδηλώνοντας ότι ο ιός μπορεί να επιμένει, ίσως σε ορισμένες ακόμη αδιευκρίνιστες ανοσολογικά προνομιούχος θέση [77] .Ο ρόλος των παθολογικών αποκρίσεων που προκαλούνται από Τ κύτταρα στο HFRS και το HCPS ήταν η πηγή εικασιών για διάφορους λόγους. Η σοβαρότητα του HCPS που σχετίζεται με τον SNV μπορεί να έκανε πιο εμφανές ότι η εμφάνιση πνευμονικού οιδήματος, ταχυκαρδίας και υπέρτασης φαινόταν να σχετίζεται, εκτός από γενικά, χρονικά με την εμφάνιση ενός φάσματος υψηλά ενεργοποιημένων κυττάρων της λεμφικής γενεαλογίας στο περιφερικό αίμα . Κύτταρα με στενή μορφολογική ομοιότητα με αυτούς τους -ανοσοβλάστες- ανιχνεύθηκαν στους συμφορημένους, βαρείς πνεύμονες ασθενών που προσήλθαν σε νεκροψία, καθώς και σε λεμφοειδή όργανα και στις πυλιακές τριάδες [63, [78] [79] [80] . Αυτές οι παρατηρήσεις οδήγησαν σε εικασίες ότι κάποιο συστατικό της παθογένεσης του hantavirus θα μπορούσε να συνδεθεί με την εμφάνιση αντιιικών Τ κυττάρων που θα μπορούσαν να διεγείρουν ή να συμβάλουν στην εμφάνιση μιας «καταιγίδας» μεσολαβητών και του σχετικού φαινοτύπου τριχοειδούς διαρροής. Μεταγενέστερες μελέτες έχουν επιβεβαιώσει την προσδοκία ότι ένα σημαντικό κλάσμα του πληθυσμού των ανοσοβλαστών σε ασθενείς με HCPS είναι Τ κύτταρα με ειδικότητα για συγκεκριμένους επιτόπους ιικών αντιγόνων που παρουσιάζονται από HLA κατηγορίας Ι, συμπεριλαμβανομένων των Gn, Gc και N [77, [81] [82]. ] [83] . Προφανώς, οι αντιικές δραστηριότητες τέτοιων κυττάρων, που εκδηλώνονται εν μέρει μέσω της επεξεργασίας μεσολαβητών στο προσβεβλημένο διάμεσο διάμεσο, μπορούν να συμβάλουν στην ενδοθηλιακή/τριχοειδική διαρροή που βρίσκεται στην καρδιά της παθογένεσης του hantavirus. κατέστη δυνατή η εξέταση ιστών που έχουν υποστεί νεκροψία για έκφραση κυτοκινών. Η μελέτη των Mori et al. (1999) αποκάλυψε υψηλή σχετική έκφραση προφλεγμονωδών κυτοκινών συμπεριλαμβανομένων των TNF, IL-1, IL-6, παρέχοντας στοιχεία υπέρ ενός μοντέλου -καταιγίδας κυτοκινών για παθογένεση [64] . Οι συγγραφείς πίστευαν, με βάση τη μορφολογία των κυττάρων που εκκρίνουν κυτοκίνη, ότι τόσο τα μονοκύτταρα όσο και τα λεμφοκύτταρα συνέβαλαν στην παραγωγή κυτοκινών. Το ότι οι προφλεγμονώδεις μεσολαβητές βρίσκονται σε αυξημένα επίπεδα στο πλάσμα καθώς και στο νεφρικό διάμεσο των ασθενών με οξεία χανταϊική νόσο έχει επίσης αναγνωριστεί εδώ και αρκετό καιρό [84, 85]. Ενώ η διάγνωση του HCPS καθώς και του HFRS επιτυγχάνεται καλύτερα με IgM ορολογία, στο οξύ στάδιο της λοίμωξης από SNV, η RT-PCR μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί εάν χρησιμοποιούνται αιμοσφαίρια ή θρόμβος αίματος αντί για πλάσμα ή ορό, όπου η ευαισθησία ακόμη και με χρήση ένθετων εκκινητών PCR πέφτει σε περίπου 70% [86] [87] [ 88] . Σε μια εγκατάσταση στην οποία αντιμετωπίζονται πολλά περιστατικά HCPS, το ιατρικό κέντρο του Πανεπιστημίου του Νέου Μεξικού στο Αλμπουκέρκη, προσφέρεται εδώ και καιρό μια διαγνωστική υπηρεσία στην οποία αναλύονται τα αιματολογικά ευρήματα του ασθενούς για να διαπιστωθεί η πιθανότητα ότι ένας ασθενής έχει HCPS. Ο συνδυασμός θρομβοπενίας, αυξημένης αφθονίας λεμφοκυττάρων -ανοσοβλαστών, πληθυσμού πολυμορφοπύρηνων κυττάρων με μετατόπιση προς τα αριστερά χωρίς ισχυρές μορφολογικές ενδείξεις για την ενεργοποίησή τους και αυξημένες τιμές αιμοσφαιρίνης ή αιματοκρίτη είναι ιδιαίτερα ειδικός για το HCPS και επιτρέπει στους κλινικούς γιατρούς την ικανότητα να βάλουν τους ασθενείς με HCPS εξωσωματική οξυγόνωση μεμβράνης (ECMO), η οποία πιστεύεται ότι έχει σώσει πολλούς ασθενείς από θανατηφόρο αποτέλεσμα [89] . Η ανθρώπινη μόλυνση από ιούς hanta πιστεύεται ότι ακολουθεί την επαφή με εκκρίσεις ή εκκρίσεις που παράγονται από μολυσμένα τρωκτικά. Στις Ηνωμένες Πολιτείες, 538 ανθρώπινες μολύνσεις από hantavirus αναφέρθηκαν μέχρι τα τέλη Δεκεμβρίου 2009 [90] , με το Νέο Μεξικό, την Αριζόνα και το Κολοράντο να παρουσιάζουν τα υψηλότερα κρούσματα. Ενώ ο πρωτότυπος κεντροαμερικανικός χανταϊός στην κεντρική Αμερική ήταν ο ιός Rio Segundo του Reithrodontomys mexicanus από την Κόστα Ρίκα, η πρώτη ανθρώπινη ασθένεια εμφανίστηκε μερικά χρόνια αργότερα στον Παναμά, όπου ο ιός Choclo (CHOV) εμφανίστηκε ως ο αιτιολογικός παράγοντας και πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνος για όλα τα γνωστές περιπτώσεις HCPS. Ο πυγμαίος αρουραίος ρυζιού Oligoryzomys fulvescens έχει αναγνωριστεί ως η δεξαμενή τρωκτικών [91] . Στον Παναμά, τα πρώτα κρούσματα HCPS, αν και με ελάχιστη ή καθόλου εμφανή καρδιακή συμμετοχή, αναφέρθηκαν το 1999 και έκτοτε, έχουν συμβεί 106 ανθρώπινες λοιμώξεις με ποσοστό θνησιμότητας 26% [92] . Οι ορολογικές έρευνες σε θηλαστικά στο Μεξικό και την Κόστα Ρίκα έχουν βρει αντισώματα κατά του hantavirus [93] [94] [95] [96] και αναφέρθηκαν οροεπιπολασμοί που κυμαίνονται μεταξύ 0,6 και 1,6% στους ανθρώπινους πληθυσμούς παρά την απουσία γνωστών περιπτώσεων HCPS [97] . Στη Νότια Αμερική, κρούσματα HCPS έχουν εντοπιστεί στην Αργεντινή, τη Βολιβία, τη Βραζιλία, τη Χιλή, την Παραγουάη και την Ουρουγουάη και στοιχεία για ανθρώπινη έκθεση σε ιούς hanta έχουν επίσης αναφερθεί στη Βενεζουέλα [98] και στο Περού [99] . Στη νότια Νότια Αμερική, ο ANDV είναι ο κύριος αιτιολογικός παράγοντας με περιπτώσεις στη Χιλή και την Αργεντινή που αναφέρθηκαν από το 1995. Στη Χιλή, 671 περιπτώσεις HCPS λόγω ANDV έχουν εμφανιστεί κατά την περίοδο 2001-2009 [100] . Από το 1995, περισσότερα από 1.000 κρούσματα HCPS έχουν αναφερθεί στην Αργεντινή [101]. στη Βραζιλία, περίπου 1.100 περιπτώσεις HCPS έχουν εντοπιστεί μεταξύ 1993 και 2008 [102] . Οι αναλογίες κρουσμάτων-θνησιμότητας σε αυτές τις τρεις χώρες ήταν παρόμοιες, κυμαινόμενες από 30% (Αργεντινή), 36% (Χιλή) και 39% (Βραζιλία). Οι λοιμώξεις από τον ιό Hanta εμφανίζονται συχνότερα στους άνδρες παρά στις γυναίκες, αν και η αναλογία ανδρών/γυναικών είναι υψηλή μεταβλητός. Για παράδειγμα, οι κοινότητες του Παναμά έδειξαν μια αναλογία 55 ανδρών προς 45 γυναίκες [103] , ενώ στη Χιλή η αναλογία είναι πιο προκατειλημμένη προς τους άνδρες (71%) [104] . Στο Τσάκο της Παραγουάης η αναλογία ανδρών-γυναικών πλησιάζει το 50% [105] . Στη Βόρεια Αμερική, έως τον Δεκέμβριο του 2009, το 63% των περιστατικών ασθενών ήταν άνδρες [90]. Όλες οι εθνοτικές και φυλετικές ομάδες φαίνεται να είναι ευαίσθητες σε μολύνσεις από hantavirus και οι διαφορές μεταξύ ορισμένων ομάδων (ως αυτόχθονες και μη αυτόχθονες) συσχετίζονται πιθανότερα με τον τύπο του οικοτόπου όπου κατοικεί ο πληθυσμός (π.χ. αγροτικές και αστικές περιοχές). Στην πραγματικότητα, οι αγροτικές κοινότητες ευθύνονται για την υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης hantavirus συνολικά και επομένως διατρέχουν υψηλότερο κίνδυνο [92, [105] [106] [107] [108] [109] [110] [111] , αν και η σημασία των περιοικιακών ρυθμίσεων ως έχει επίσης τονιστεί ένας σημαντικός τομέας έκθεσης [112, 113]. Ο κύριος μηχανισμός με τον οποίο οι άνθρωποι αποκτούν μόλυνση από hantavirus είναι με έκθεση σε αερολύματα μολυσμένων περιττωμάτων τρωκτικών, ούρων και σάλιου [114, 115]. Αυτό μπορεί να συμβεί όταν οι άνθρωποι κατοικούν σε περιοχές κοντά σε εκείνες που κατοικούν τα τρωκτικά, ζουν σε περιοχές μολυσμένες από τρωκτικά ή όταν τα τρωκτικά εισβάλλουν σε ανθρώπινα περιβάλλοντα, τα οποία είναι πιο συχνά σε αγροτικούς βιότοπους. Υπάρχει μακρά ιστορία ανθρώπινης συνύπαρξης με τρωκτικά, εγείροντας ερωτήματα σχετικά με τις προφανείς πρόσφατες αυξήσεις στις ασθένειες που σχετίζονται με τον hantavirus, ιδιαίτερα το HCPS. Εκτός από μια προφανή συσχέτιση με συμβάντα νότιας ταλάντωσης El Niño (ENSO) σε ορισμένες περιοχές [116, 117], οι πρόσφατες αυξήσεις στη συχνότητα εμφάνισης του HCPS δεν φαίνεται να ακολουθούν ένα άμεσα καθορισμένο χρονικό ή χωρικό πρότυπο. Ωστόσο, ορισμένα χαρακτηριστικά του τοπίου, όπως ο κατακερματισμός των οικοτόπων ή οι διαταραγμένες από τον άνθρωπο περιοχές μπορεί να επηρεάσουν τη δυναμική του πληθυσμού των τρωκτικών και να επηρεάσουν την επίπτωση του ιού [118] [119] [120] [121] . Παρά τη στοχαστικότητα που σχετίζεται με τη σύσπαση της λοίμωξης από hantavirus, ορισμένα σενάρια έχουν αναγνωριστεί ότι θέτουν υψηλότερο κίνδυνο. Οι ανθρώπινες δραστηριότητες σε κακώς αεριζόμενα κτίρια που διασπούν τα σωματίδια που στη συνέχεια εισπνέονται (δηλαδή, καθαρισμός, τίναγμα χαλιών, ξεσκόνισμα) εντοπίζονται συχνά μεταξύ των ασθενών που εισάγονται για HCPS [11, 122]. Οι υπαίθριες δραστηριότητες πιστεύεται ότι μεταφέρουν χαμηλότερο κίνδυνο λόγω της αστάθειας των χανταϊών στην υπεριώδη ακτινοβολία και της υποτιθέμενης τάσης να διασπείρονται στον άνεμο, αν και ορισμένες περιβαλλοντικές συνθήκες φαίνεται να διατηρούν τον ιό για μεγαλύτερες περιόδους εκτός του φυσικού του ξενιστή, επιτρέποντας την έμμεση μετάδοση [123] . Μια εναλλακτική αλλά ασυνήθιστη οδός μετάδοσης του ιού είναι τα τσιμπήματα τρωκτικών [124] [125] [126] . Οι εργαζόμενοι στον αγρό που χειρίζονται θηλαστικά διατρέχουν δυνητικά υψηλότερο κίνδυνο έκθεσης με λοιμώξεις από hantavirus, αν και όταν προσδιορίζεται ποσοτικά μέσω ορολογικών ερευνών ο απόλυτος κίνδυνος φαίνεται μάλλον μικρός [127] . Μια νέα μελέτη στο Κολοράντο προτείνει την πιθανότητα ότι ένα τσίμπημα τρωκτικού μπορεί να ήταν το κοντινό όχημα για την εξωτερική μετάδοση του SNV [128] , το οποίο δίνει εκ νέου έμφαση στη χρήση ατομικού προστατευτικού εξοπλισμού κατά τη διάρκεια εργασιών πεδίου [129] . Ως ειδική περίπτωση στους hantaviruses, η μετάδοση από άτομο σε άτομο έχει τεκμηριωθεί αποκλειστικά για τον ιό των Άνδεων της Νότιας Αμερικής [130] [131] [132] [133] [134] [135] . Η αναγνώριση αυτής της οδού μετάδοσης έχει γίνει με τη χρήση τόσο μοριακών εργαλείων όσο και επιδημιολογικών ερευνών, αλλά ο μηχανισμός της διαπροσωπικής μετάδοσης δεν είναι καλά εδραιωμένος. Πρόσφατα ευρήματα δείχνουν ότι οι οικογενειακές ομάδες και συγκεκριμένα οι σεξουαλικοί σύντροφοι μοιράζονται τον μεγαλύτερο κίνδυνο διαπροσωπικής μετάδοσης, αν και η σεξουαλική μετάδοση αυτή καθαυτή δεν μπορεί ούτε να συναχθεί ούτε να διαψευσθεί επί του παρόντος [130, 135]. Είναι ενδιαφέρον ότι το ANDV μπορεί επίσης να αποβληθεί από τον άνθρωπο μέσω άλλων βιολογικών υγρών όπως τα ούρα [136] , απεικονίζοντας τις ιδιαίτερες ιδιότητες που διαφοροποιούν αυτόν τον ιό από άλλους hantaviruses. Αν και η διαπροσωπική μετάδοση φαίνεται να είναι μοναδική για τον ANDV, το ιικό RNA του PUUV έχει ανιχνευθεί στο σάλιο ασθενών με HFRS και ορισμένοι ασθενείς με SNV-HCPS έχουν ιικό RNA στις τραχειακές εκκρίσεις [88, 137]. Οι ιοί Hanta στην Αμερική φιλοξενούνται φυσικά από τρωκτικά (Muridae και Cricetidae) καθώς και από μύες (Soricidae) και τυφλοπόντικες (Talpidae) (Εικόνα 1) . Έχουν αναφερθεί τρία είδη γριούλας και ένα τυφλοπόντικο ότι φιλοξενούν ιούς hanta και η παθογένειά τους για τον άνθρωπο παραμένει άγνωστη [22, 138, 139]. Τουλάχιστον 15 είδη τρωκτικών έχουν ταυτοποιηθεί ως φορείς διαφορετικών παθογόνων χανταϊών, με ορισμένους γονότυπους της Νότιας Αμερικής όπως το Castelo do Sonhos (CDSV) ή το Hu39694 να έχουν ταυτοποιηθεί μόνο μετά από ανθρώπινες μολύνσεις (Εικόνα 1). Οι ιοί Hanta παρουσιάζουν τυπικά υψηλή εξειδίκευση σε είδη και χωρίς ενδιάμεσο ξενιστή [140] . Ωστόσο, ορισμένοι γονότυποι hantavirus έχουν περιγραφεί στο ίδιο είδος τρωκτικών. Τέτοια είναι η περίπτωση των Playa de Oro (OROV) και Catacamas (CATV) που προσδιορίζονται στο Oryzomys couesi [141, 142] ή στο Maporal (MAPV) και στο Choclo (CHOV) που φιλοξενούνται από τον O. fulvescens [91, 143]. Στη Βόρεια Αμερική και οι δύο χανταϊοί Muleshoe και Black Creek Canal έχουν ανιχνευθεί σε γεωγραφικά απομακρυσμένο Sigmodon hispidus [144, 145]. Επίσης, ένας γονότυπος hantavirus (π.χ. ιός που μοιάζει με Juquitiba) μπορεί να φέρει περισσότερα από ένα είδη τρωκτικών (O. nigripes, Oxymycterus judex, Akodon montesis). Ένα άλλο παράδειγμα είναι ο ιός Laguna Negra (LANV) ο οποίος αφού εντοπίστηκε στο Calomys laucha [146] έχει επίσης αναφερθεί στον C. callosus [147] . Η ταχεία αύξηση της ανακάλυψης νέων hantaviruses και η ταυτοποίηση των ξενιστών τους δεν φαίνεται πιθανό να τελειώσει σύντομα, καθώς εξετάζονται νέα είδη μικρών θηλαστικών [95] . Αυτό το θέμα περιπλέκεται από τη συνεχιζόμενη διαμάχη στα κριτήρια για την ταξινόμηση διαφορετικών hantaviruses [148, 149], η οποία συνδέεται επίσης με την ταξινόμηση ξενιστών και τις ταξινομικές ανακατατάξεις. Η μετάδοση μεταξύ ειδών είναι μια σημαντική διαδικασία κατά τη διάδοση, την εμφάνιση και την εξέλιξη του Ιοί RNA [6, 150]. Ιδιαίτερα στους hantaviruses, η μετάδοση σε δευτερεύοντες ξενιστές αναγνωρίζεται όλο και περισσότερο καθώς εκτελούνται πιο εκτεταμένες μελέτες [151] [152] [153] [154] [155] [156] . Για παράδειγμα, ο ANDV είναι ο κυρίαρχος αιτιολογικός παράγοντας του HCPS στη Νότια Αμερική και το O. longicaudatus η κύρια δεξαμενή τρωκτικών. Έχει εντοπιστεί διάχυση σε τουλάχιστον τέσσερα άλλα είδη τρωκτικών που συνυπάρχουν με τη δεξαμενή, με το Abrothrix longipilis να δείχνει τον δεύτερο υψηλότερο επιπολασμό στα αντισώματα ANDV, και επί του παρόντος δεν υπάρχει αμφιβολία ότι ο ιός είναι εξαιρετικά παρόμοιος γενετικά μεταξύ των δύο τρωκτικών ξενιστών [157, 158]. Στη Βόρεια Αμερική, η διάχυση του ιού Bayou (BAYV) μπορεί να έχει συμβεί από την κύρια δεξαμενή O. palustris στους S. hispidus, R. fulvescens, P. leucopus και B. taylori [159] [160] [161] . Η διάχυση του Hantavirus είναι πιο πιθανό να συμβεί με πληθυσμούς ξενιστές που κατοικούν σε συμπατρικές ή συντοπικές περιοχές [151, 162] και η μετάδοση μεταξύ ειδών θα είχε πιθανώς μεγαλύτερες πιθανότητες επιτυχίας εάν το είδος ξενιστή είναι στενά συνδεδεμένο [163]. Μια ενδιαφέρουσα εξαίρεση βρίσκεται μεταξύ του ιού Oxbow (OXBV) και του ιού Asama (ASAV) όπου μια διαδικασία αλλαγής ξενιστή φαινόταν να έχει συμβεί μεταξύ θηλαστικών που ανήκουν σε δύο οικογένειες (Talpidae και Soricidae), πιθανόν ως αποτέλεσμα εναλλασσόμενων και επαναλαμβανόμενων συν- απόκλιση ορισμένων κατηγοριών κατά τη διάρκεια του εξελικτικού χρόνου [138] .Οι ιοί Hanta μεταδίδονται οριζόντια μεταξύ των τρωκτικών και δεν μεταδίδονται από τα αρθρόποδα (σε αντίθεση με άλλους ιούς της οικογένειας Bunyaviridae). Η λοίμωξη από διάχυση σε μη ανθρώπινα θηλαστικά συνήθως δεν οδηγεί σε περαιτέρω μετάδοση (ή σε αδιέξοδο), αλλά εάν μολυνθούν οι άνθρωποι μπορεί να οδηγήσει σε υψηλή νοσηρότητα και θνησιμότητα [122, 164] . Κατά τη διάρκεια της άνοιξης του 1993, ένα ξέσπασμα ασθενών με HCPS λόγω SNV εμφανίστηκε στις πολιτείες Four Corners με αποτέλεσμα περισσότερο από 60% θνησιμότητα μεταξύ των αρχικών περιπτώσεων, πολλές από τις οποίες αφορούσαν μέλη της φυλής Ναβάχο [12, 121]. Στον Παναμά, αναφέρθηκε ένα ξέσπασμα κατά την περίοδο 1999-2000 στο Λος Σάντος και εντοπίστηκαν 12 περιπτώσεις με τρεις θανάτους [165, 166]. Αυτό αντιπροσώπευε την πρώτη αναφορά μολύνσεων από ανθρώπινο hantavirus στην Κεντρική Αμερική. Στη Νότια Αμερική, η πρώτη μεγαλύτερη επιδημία που εντοπίστηκε εμφανίστηκε στην περιοχή Τσάκο στη βορειοδυτική Παραγουάη κατά την περίοδο 1995-1996. Δεκαεπτά άτομα ταυτοποιήθηκαν με αντίσωμα SNV (ELISA) ή ήταν θετικά στο αντιγόνο (IHC) από 52 ύποπτες περιπτώσεις [167] . Μεγάλα ξεσπάσματα λόγω ANDV εμφανίστηκαν το 1996 στη νότια Αργεντινή [131, 134]. στη νότια Χιλή ομάδες ασθενών που παρουσιάστηκαν με ασθένεια hantavirus το 1997 [158] . Στη Βραζιλία, το πρώτο ξέσπασμα εντοπίστηκε στον Αμαζόνιο της Βραζιλίας (Πολιτεία Maranhão) το 2000 και αφορούσε μικρά χωριά που οδήγησαν σε επικράτηση 13,3% αυτών που εξετάστηκαν (398 συνολικά κάτοικοι) [168] . Οι παράγοντες που πυροδοτούν τα κρούσματα του hantavirus εξακολουθούν να είναι ελάχιστα κατανοητά, πιθανώς επειδή προκύπτουν από πολλά αλληλεπιδρώντα βιοτικά και αβιοτικά χαρακτηριστικά των οποίων οι βασικές παράμετροι είναι δύσκολο να μοντελοποιηθούν. Ωστόσο, η χρήση νέων προσεγγίσεων μοντελοποίησης που περιλαμβάνουν γεωγραφικά και περιβαλλοντικά χαρακτηριστικά φαίνεται να είναι πολλά υποσχόμενη για την πρόβλεψη πιθανών επιδημιών hantavirus ή/και περιοχών υψηλότερου κινδύνου [169] [170] [171] [172] . Επειδή οι χανταϊοί είναι γνωστό ότι μεταδίδονται απευθείας από μολυσμένους σε ευαίσθητους ξενιστές, η πρώτη φυσική προσέγγιση είναι να συσχετιστούν τα κρούσματα με την οικολογία των ιικών ξενιστών. Η μετάδοση και η επιμονή του Hantavirus στους πληθυσμούς τρωκτικών εξαρτάται από διάφορους παράγοντες που αλληλεπιδρούν για να επηρεάσουν την οικολογική δυναμική του ξενιστή, ο οποίος με τη σειρά του επηρεάζεται έντονα από τα χαρακτηριστικά συμπεριφοράς μεμονωμένων ειδών τρωκτικών, τη δομή του τοπίου και τα περιβαλλοντικά χαρακτηριστικά [173, 174]. Η μετάδοση του ιού εξαρτάται από τα ποσοστά επαφής μεταξύ των ευαίσθητων ξενιστών και παρά την επικρατούσα αντίληψη ότι η υψηλότερη πυκνότητα αυξάνει τις συναντήσεις και συνεπώς τους δευτερογενείς μολυσμένους ξενιστές, μπορούν να βρεθούν αντίθετα πρότυπα που σχετίζονται με το μέγεθος του πληθυσμού των τρωκτικών και τον επιπολασμό του ιού [175] . Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι η μετάδοση του SNV ακολουθεί ένα πρότυπο ετερογένειας επαφής, όπου τα άτομα στον πληθυσμό έχουν διαφορετική πιθανότητα μετάδοσης της λοίμωξης [176] . Η κατανόηση της μετάδοσης του ιού αποδεικνύεται πολύ πιο περίπλοκη όταν στο μοντέλο ενσωματώνονται είδη άλλα από τον κύριο ξενιστή της δεξαμενής. Πράγματι, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η ποικιλομορφία των ειδών των ξενιστών συσχετίζεται με χαμηλότερο επιπολασμό μόλυνσης στη Βόρεια Αμερική για το P. maniculatus [177] , στην Κεντρική Αμερική για το O. fulvescens (δεξαμενή του ιού Choclo) και το Zygodontomys brevicauda (δεξαμενή του ιού Calabazo ) [178] , και στη Νότια Αμερική για το Akodon montensis (δεξαμενή του ιού Jabora) [162] . Τα ποσοστά επαφής ποικίλλουν ανάλογα με τη χωρική κατανομή των πληθυσμών και φαίνεται να επηρεάζονται έντονα από τη δομή του τοπίου. Για παράδειγμα, ο επιπολασμός του SNV στο P. maniculatus ήταν υψηλότερος σε τοπία με υψηλότερο επίπεδο κατακερματισμού του προτιμώμενου οικοτόπου [179] . Επιπλέον, ορισμένες ιδιότητες του τοπίου όπως το υψόμετρο, η κλίση και η κάλυψη του εδάφους φαίνεται να είναι χρήσιμες για την ανίχνευση περιοχών με επίμονες λοιμώξεις από SNV και επομένως θεωρείται ότι είναι καταφύγιες όπου ο ιός μπορεί να διατηρηθεί για χρόνια [169] . Αλλαγές στο φυσικό περιβάλλον των ειδών δεξαμενών, όπως ο κατακερματισμός των δασών και η απώλεια ενδιαιτημάτων, μπορεί να αλλάξουν την αφθονία και την κατανομή του πληθυσμού και να οδηγήσουν σε εστίες hantavirus, όπως παρατηρείται στη χερσόνησο Azurero του Παναμά [118, 119] . Επίσης, οι διαφορές στον μικροβιότοπο, συμπεριλαμβανομένης της κάλυψης της υπερβολικής ιστορίας, μπορεί να οδηγήσουν σε διαφορές στην οικολογική δυναμική εντός των πληθυσμών και να επηρεάσουν το ποσοστό έκθεσης στον ιό [180] . Διαφορές στις μολύνσεις από hantavirus μέσω αντίθετων τοπίων στο γεωγραφικό πλάτος έχουν βρεθεί σε πληθυσμούς τρωκτικών του O. longicaudatus στη Χιλή, υποδηλώνοντας ότι οι άνθρωποι εκτίθενται διαφορετικά στον ιό [107, 181] . Η δυναμική του πληθυσμού των τρωκτικών επηρεάζεται από τις εποχικές αλλαγές του καιρού και κλίμα [182, 183] . Στην περίπτωση των εστιών που σχετίζονται με το ENSO, ένας πολύπλοκος καταρράκτης γεγονότων που προκλήθηκαν από εξαιρετικά ασυνήθιστες βροχοπτώσεις το προηγούμενο έτος θεωρείται ότι θα οδηγήσει σε αύξηση της πρωτογενούς παραγωγής και της πυκνότητας των τρωκτικών, αυξάνοντας επίσης την πιθανότητα μετάδοσης του ιού στον άνθρωπο , αλλά έχει αποδειχθεί δύσκολο να αποδειχθούν επακριβώς τα προτεινόμενα ενδιάμεσα συμβάντα, όπως η αυξημένη πυκνότητα τρωκτικών στο αυξημένο φορτίο περιπτώσεων [116, 121, 184]. Στη Νότια Αμερική, οι επιπτώσεις της κλιματικής αλλαγής και των εστιών hantavirus δεν έχουν μελετηθεί καλά, παρά τη γνώση ότι αρκετά είδη τρωκτικών που αποτελούν δεξαμενές αναδυόμενων ασθενειών έχουν επηρεαστεί δραματικά από γεγονότα όπως το El Niño [185] . Οι αλλαγές στη δυναμική του πληθυσμού ξενιστή επηρεάζονται επίσης από την εποχικότητα, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε εστίες ασθενειών όταν διακόπτονται διαδικασίες που εξισορροπούν τους πληθυσμούς τρωκτικών από εποχή σε εποχή [186] . Η εμφάνιση του ιού μπορεί να συνεχίσει να προωθείται καθώς οι αλλαγές που εισάγονται από τον άνθρωπο συνεχίζουν να αυξάνονται στο περιβάλλον σε διαφορετικές γεωγραφικές κλίμακες. Οι ανθρώπινες εισβολές σε προηγουμένως ακαλλιέργητα περιβάλλοντα μπορεί να οδηγήσουν σε νέες επαφές μεταξύ των δεξαμενών τρωκτικών και των ανθρώπων, αυξάνοντας την πιθανότητα μόλυνσης [187] . Αυτές οι αλλαγές μπορεί επίσης να αλλάξουν τη δομή και τη δυναμική του πληθυσμού των τρωκτικών και τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ειδών δημιουργώντας συνθήκες που μπορεί να οδηγήσουν σε ιικές επιδημίες, εγκατάσταση ιού σε νέους ξενιστές και εμφάνιση HCPS [102, 162], ακόμη και με φαινομενικά ελαφρά οικολογική διαταραχή στο σύστημα ιού-ξενιστή [188] .Ορισμένα παθοφυσιολογικά χαρακτηριστικά, συμπεριλαμβανομένης της θρομβοπενίας και του σοκ, των ασθενειών του hantavirus των ανθρώπων, έχουν ουσιαστική ομοιότητα με τους αιμορραγικούς πυρετούς που προκαλούνται από άλλους ιούς, όπως αρεναϊούς, φιλοϊούς και φλαβοϊούς, παρόλο που ουσιαστικά δεν μοιράζονται ομοιότητες αλληλουχίας με αυτούς. Τέτοιες παρατηρήσεις εγείρουν ερωτήματα σχετικά με το εάν τέτοια κοινά στοιχεία στην παθογένεση είναι τυχαίες ομοιότητες φαινοτύπου ή αντ' αυτού αναφέρουν την παρουσία κοινών μοριακών μηχανισμών μεταξύ των ιών. Σε αυτήν την ανασκόπηση συζητάμε τις γενικές ιδιότητες, ανακαλύψεις και επιδημιολογία/οικολογία των μορφών παθογόνων του Νέου Κόσμου hantaviruses, και επίσης επιδιώκουν να αναγνωρίσουν ορισμένα από τα χαρακτηριστικά των ιικών μακρομορίων και των ανοσολογικών μηχανισμών που έχουν προταθεί ως πιθανοί άμεσοι μεσολαβητές των παθογόνων συμβάντων που χαρακτηρίζουν την ανθρώπινη ασθένεια HCPS. Αν και είναι απίθανο η έκφραση οποιασδήποτε συγκεκριμένης ιικής πρωτεΐνης ή RNA σε απομόνωση μπορεί να βασιστεί για την αναπαραγωγή βασικών φαινοτύπων μόλυνσης από τον πλήρη ιό, ορισμένα από τα ευρήματα ήταν επαρκώς συνεπή με όσα είναι γνωστά για την παθογένεση in vivo που προσφέρουν αληθοφανείς πρωτοπόροι στην αναζήτηση θεραπευτικών στόχων. Ανυπομονούμε για τις μηχανιστικές αποκαλύψεις που θα ακολουθήσουν την αναπόφευκτα διευρυμένη χρήση ισχυρών μεθόδων όπως η βαθειά αλληλούχιση, οι ολοένα πιο προηγμένες απεικονίσεις και οι μικροσκοπικές μέθοδοι και τα ζωικά μοντέλα που μπορούν επιτέλους να ειπωθούν ότι μιμούνται την ασθένεια του ανθρώπινου hantavirus.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 675, "text": "πάνω από 40" } ], "id": 4443, "question": "Πόσοι γονότυποι χανταϊού έχουν περιγραφεί" }, { "answers": [ { "answer_start": 42480, "text": "επίμονες λοιμώξεις" } ], "id": 4445, "question": "Τι προκαλούν οι ιοί Hanta στους ξενιστές της δεξαμενής τους;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1087, "text": "μεταξύ 30% και 40%" } ], "id": 4448, "question": "Ποια είναι η αναλογία κρούσματος-θνητότητας για τους πιο συνηθισμένους ιικούς ορότυπους;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1493, "text": "τους μακρομοριακούς καθοριστικούς παράγοντες των hantaviruses που έχουν θεωρηθεί ότι έχουν πιθανή συμβολή στην παθογένεια." } ], "id": 4451, "question": "Τι εξετάζουν οι συγγραφείς σε αυτή τη μελέτη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1637, "text": "αναδυόμενες ζωονοσογόνες ασθένειες" } ], "id": 4452, "question": "Ποιες ασθένειες προκαλούν μεγάλη ανησυχία μεταξύ των επιστημόνων που μελετούν τις μολυσματικές ασθένειες;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3164, "text": "μικρά θηλαστικά" } ], "id": 4457, "question": "Μεταξύ των ζωονοσογόνων νοσημάτων, ποιοι είναι οι ξενιστές αρκετών παθογόνων ιών RNA;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3236, "text": "Arenaviridae και Bunyaviridae: Hantavirus" } ], "id": 4458, "question": "Ποιους παθογόνους ιούς RNA φιλοξενούν μικρά θηλαστικά;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3667, "text": "το τρωκτικό Peromyscus maniculatus (ποντίκι ελάφι)" } ], "id": 4461, "question": "Τι αναγνωρίστηκε ως η δεξαμενή του SNV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4382, "text": "με ένα ξέσπασμα που εμφανίστηκε μεταξύ των στρατευμάτων των Ηνωμένων Εθνών κατά τη διάρκεια της σύγκρουσης στην Κορέα μεταξύ 1951 και 1954" } ], "id": 4463, "question": "Πώς τέθηκε για πρώτη φορά το HFRS στην προσοχή της δυτικής ιατρικής;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4955, "text": "Hantavirus της οικογένειας Bunyaviridae" } ], "id": 4466, "question": "Ποιο νέο γένος βρέθηκε αργότερα να αντιπροσωπεύει ο ιός;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5844, "text": "μια πρωτεάση δεσμευμένη στη μεμβράνη σε Gn και Gc, μια διάσπαση που συμβαίνει" } ], "id": 4470, "question": "Πώς γίνεται η επεξεργασία της πρόδρομης μορφής GPC κατά την ωρίμανση του ιού;" }, { "answers": [ { "answer_start": 10997, "text": "επαγόμενη από VEG-F ενδοθηλιακή διαπερατότητα" } ], "id": 4493, "question": "Τι έχουν εντοπίσει οι χανταϊοί στην ενίσχυση;" }, { "answers": [ { "answer_start": 11109, "text": "ένα δομικό συστατικό του ιικού νουκλεοκαψιδίου" } ], "id": 4494, "question": "Τι είναι η Ν-πρωτεΐνη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 11320, "text": "περιορίζει την πρόσβαση του RNA στις νουκλεάσες του ξενιστή" } ], "id": 4496, "question": "Ως πρωτεΐνη δέσμευσης RNA που εμπλέκει τα άκρα της φουρκέτας των γονιδιωματικών τμημάτων, τι κάνει η Ν-πρωτεΐνη του hantavirus;" }, { "answers": [ { "answer_start": 13020, "text": "μέσω της αλληλεπίδρασής τους με το N και το DCP1" } ], "id": 4502, "question": "Πώς συγκεντρώνονται τα ιικά RNA σε σώματα P κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από χανταϊό;" }, { "answers": [ { "answer_start": 15493, "text": "το Golgi" } ], "id": 4505, "question": "Ποιος είναι ο απόλυτος προορισμός για το Ν, για τη συναρμολόγησή του σε ιικά σωματίδια;" }, { "answers": [ { "answer_start": 15408, "text": "δυναμιτίνη" } ], "id": 4507, "question": "Τι είναι ο κυρίαρχος αρνητικός αναστολέας;" }, { "answers": [ { "answer_start": 15469, "text": "μείωσε τη συσσώρευση Ν στο Golgi" } ], "id": 4509, "question": "Με τι σχετίζεται η δυναμιτίνη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 17619, "text": "β3 ιντεγκρίνη" } ], "id": 4544, "question": "Ποιος είναι ένας ιδιαίτερα ελκυστικός υποψήφιος ως σημαντικός in vivo υποδοχέας για τους ιούς hanta;" }, { "answers": [ { "answer_start": 17899, "text": "τοπικό ενδοθήλιο" } ], "id": 4546, "question": "Τι σπέρνει ο ιός;" }, { "answers": [ { "answer_start": 17922, "text": "τα πρώτα λίγα μολυσμένα κύτταρα προκαλούν, τελικά, μια πρωτογενή ιαιμία" } ], "id": 4547, "question": "Τι συμβαίνει με τη σπορά του ιού στο τοπικό ενδοθήλιο;" }, { "answers": [ { "answer_start": 18014, "text": "φαίνεται να παίρνει πολύ χρόνο" } ], "id": 4548, "question": "Πόσο διαρκεί η διαδικασία πρόκλησης πρωτοπαθούς ιαιμίας για λοιμώξεις από hantavirus;" }, { "answers": [ { "answer_start": 18143, "text": "οι παράγοντες των πιο σοβαρών μορφών HFRS και HCPS έχουν αρχίσει να επιτυγχάνουν επαρκή μάζα" } ], "id": 4549, "question": "Τι συμβαίνει μέχρι να εμφανιστεί δευτεροπαθής ιαιμία;" }, { "answers": [ { "answer_start": 18253, "text": "μέσω αλληλεπιδράσεων PAMP-PRR και άλλων μέσων" } ], "id": 4550, "question": "Πώς προκαλείται η έκφραση των προφλεγμονωδών κυτοκινών;" }, { "answers": [ { "answer_start": 18834, "text": "τοπική επεξεργασία φλεγμονωδών και χημειοτακτικών μεσολαβητών" } ], "id": 4554, "question": "Τι θεωρείται απαίτηση για την ανάπτυξη συμπτωμάτων συστηματικής νόσου;" }, { "answers": [ { "answer_start": 19193, "text": "δηλητηρίαση της καρδιάς από απροσδιόριστους ακόμη μεσολαβητές που οδηγεί στην κατάσταση χαμηλής καρδιακής παροχής και στο σχετικό σύνδρομο σοκ" } ], "id": 4557, "question": "Τι οδηγεί σε θάνατο στις περισσότερες θανατηφόρες περιπτώσεις HCPS;" }, { "answers": [ { "answer_start": 20350, "text": "Άμεσες ιογενείς επιδράσεις" } ], "id": 4559, "question": "Ποιος πιθανός μηχανισμός θα μπορούσε να θεωρηθεί ότι αποτελεί τη βάση της παθογένεσης του HCPS;" }, { "answers": [ { "answer_start": 21383, "text": "Παθογόνες επιδράσεις που προκαλούνται από τις δραστηριότητες συγκεκριμένων ιικών μακρομορίων." } ], "id": 4560, "question": "Ποιος πιθανός μηχανισμός θα μπορούσε να θεωρηθεί ότι αποτελεί τη βάση της παθογένεσης του HCPS;" }, { "answers": [ { "answer_start": 20636, "text": "άμεση ιική τοξικότητα, που δρα μέσω της αναστολής της λειτουργίας του φραγμού των ενδοθηλιακών κυττάρων" } ], "id": 4561, "question": "Ποια εξήγηση έχουν προτιμήσει ορισμένοι ερευνητές για μεγάλο μέρος της τριχοειδούς διαρροής;" }, { "answers": [ { "answer_start": 22831, "text": "άφθονη εναπόθεση ινώδους, παχύρρευστα κυψελιδικά διαφράγματα και ιικό αντιγόνο που εκφράζεται άφθονα στο μικροαγγειακό ενδοθήλιο." } ], "id": 4566, "question": "Τι αποκαλύπτει η μικροσκοπική εξέταση του πνεύμονα, όπως και στο ανθρώπινο HCPS;" }, { "answers": [ { "answer_start": 23061, "text": "μειωμένες πιέσεις σφυγμού, ταχυκαρδία και υπόταση" } ], "id": 4567, "question": "Τι παρουσιάζουν τα μολυσμένα με ANDV χάμστερ που διαθέτουν συσκευές φυσιολογικής παρακολούθησης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 23142, "text": "το σοκ που πιστεύεται ότι είναι η κοντινή αιτία θανάτου σε ασθενείς που υποκύπτουν σε HCPS" } ], "id": 4568, "question": "Τι φαίνεται να μιμούνται στενά οι μειωμένες παλμικές πιέσεις, η ταχυκαρδία και η υπόταση σε μολυσμένα με ANDV χάμστερ;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Προϋπάρχουσα ανοσία έναντι των φορέων εμβολίων – φίλος ή εχθρός;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3542731/SHA: f5bdf18567bb3760e1ce05008135f0270badbd:Saxenahors Van, Thi Thu Hao; Baird, Fiona J.; Coloe, Peter J.; Smooker, Peter M.Date: 2013-01-27DOI: 10.1099/mic.0.049601-0License: cc-byAbstract: Τον τελευταίο αιώνα, η επιτυχής εξασθένηση πολλαπλών βακτηριακών και ιικών παθογόνων οδήγησε σε μια αποτελεσματική, ισχυρή και ασφαλή μορφή εμβολιασμός. Πρόσφατα, αυτά τα εμβόλια έχουν αξιολογηθεί ως φορείς παροχής για ετερόλογα αντιγόνα, ως μέσο ταυτόχρονου εμβολιασμού έναντι δύο παθογόνων. Η γενική συναίνεση από δημοσιευμένες μελέτες είναι ότι αυτοί οι φορείς εμβολίων έχουν τη δυνατότητα να είναι ασφαλείς και αποτελεσματικοί. Ωστόσο, μερικοί από τους κοινώς χρησιμοποιούμενους φορείς, για παράδειγμα σαλμονέλα και αδενοϊός, έχουν συχνά προϋπάρχουσες ανοσολογικές αποκρίσεις στον ξενιστή και αυτό έχει τη δυνατότητα να τροποποιήσει την επακόλουθη ανοσοαπόκριση σε ένα αντιγόνο φορέα. Αυτή η ανασκόπηση εξετάζει τη βιβλιογραφία σχετικά με αυτό το θέμα και καταλήγει στο συμπέρασμα ότι για τους βακτηριακούς φορείς μπορεί πράγματι, σε ορισμένες περιπτώσεις, να υπάρξει ενίσχυση της ανοσογονικότητας, συνήθως χυμικής, ενώ για τους ιικούς φορείς η προϋπάρχουσα ανοσία αποτελεί εμπόδιο για επακόλουθη πρόκληση κυτταρικής διαμεσολαβημένες απαντήσεις. Κείμενο: Στους τομείς της ιατρικής και της κτηνιατρικής, υπάρχουν πολλά ζωντανά, εξασθενημένα βακτηριακά και ιικά εμβόλια που χρησιμοποιούνται σήμερα παγκοσμίως. Η ασφάλεια και η αποτελεσματικότητα τέτοιων εμβολίων είναι καλά τεκμηριωμένη και επιτρέπει την περαιτέρω ανάπτυξη ως συστήματα φορέων για την παροχή αντιγόνου που προέρχεται από άλλα παθογόνα. Διάφορα εξασθενημένα βακτήρια, συμπεριλαμβανομένων των Escherichia coli, Vibrio cholerae, βακτηρίων γαλακτικού οξέος (LAB), συγκεκριμένα Lactococcus lactis, Mycobacterium, Listeria, Shigella και Salmonella, έχουν δοκιμαστεί για τη στοχευμένη παροχή ετερόλογων αντιγόνων βακτηριακής, ιικής και παρασιτικής προέλευσης σε μια ποικιλία ξενιστών ζώων (Bahey-El-Din et al., 2010; Innocentin et al., 2009; Johnson et al., 2011; Tobias et al., 2008 Tobias et al., , 2010 Tobias & Svennerholm, 2012). Τα βακτήρια όπως το E. coli και τα βακτήρια γαλακτικού οξέος έχουν κερδίσει πρόσφατα την εύνοια, καθώς το E. coli είναι ένα συγγενικό και βακτήρια γαλακτικού οξέος υπάρχουν στα περισσότερα τρόφιμα που έχουν υποστεί ζύμωση και επομένως υπάρχουν φυσικά στον ξενιστή. Αποτελούν επίσης μια πολύ πιο ασφαλή επιλογή από τα παραδοσιακά εξασθενημένα εμβόλια σε παιδιά και άτομα με ανοσοκαταστολή. Καθώς αυτή η ανασκόπηση συζητά τα αποτελέσματα των προϋπαρχουσών ανοσολογικών αποκρίσεων σε εξασθενημένα εμβόλια, δεν θα γίνει περαιτέρω συζήτηση για τα LAB και E. coli ως πιθανούς φορείς. Ωστόσο, ο αναγνώστης κατευθύνεται σε αρκετές ενδιαφέρουσες κριτικές (Bermú dez-Humarán et al., 2011; Wells & Mercenier, 2008). Τα ενδοκυτταρικά βακτήρια από τα γένη Mycobacterium (Guleria et al., 1996), Listeria (Gentschev et al., 2001), Shigella (Levine et al., 1997) και Salmonella (Dougan et al., 1987) θεωρούνται ως κατάλληλοι υποψήφιοι για τη χορήγηση αντιγόνων εμβολίου λόγω της ικανότητάς τους να επάγουν ισχυρές ανοσοαποκρίσεις Τ-λεμφοκυττάρων (Alderton et al., 1991; Lo et al., 1999; Mastroeni et al., 2001; Mittrücker & Kaufmann, 2000; Nauciel, 1990). Η σαλμονέλα είναι ένα γένος που έχει εξεταστεί καλά ως φορέας, με βάση την εκτεταμένη έρευνα που είναι διαθέσιμη για τη φυσιολογία και την παθογένεση του μικροοργανισμού (Basso et al., 2000; Killeen & DiRita, 2000; Sirard et al., 1999; Ward et al., 1999). Υπάρχουν αρκετά εμπορικά εμβόλια που χρησιμοποιούνται ως εμβόλια κατά της σαλμονέλας σε ανθρώπους και ζώα (π. Ty21a για τυφοειδή πυρετό σε ανθρώπους, αρκετοί οροί Salmonella κατά της σαλμονέλωσης σε κοτόπουλα και άλλα ζώα). Η γενική στρατηγική για τον φορέα ετερόλογου αντιγόνου απεικονίζεται στο Σχ. 1 . Η πρώτη κλινική δοκιμή ενός ανασυνδυασμένου προϊόντος, η οποία διεξήχθη πριν από περισσότερα από 20 χρόνια χρησιμοποιώντας εξασθενημένη σαλμονέλα ως φορέα παροχής, οδήγησε στην ευρεία δοκιμή αυτού του βακτηρίου ως βλεννογόνου συστήματος χορήγησης για αντιγόνα από παθογόνα που δεν ανήκουν στη Σαλμονέλα (Dougan et al., 1987). Αυτές οι μελέτες έχουν δείξει τη χρησιμότητα των ζωντανών βακτηρίων για την παροχή εκφρασμένων αντιγόνων και εμβολίων DNA στο ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή (Atkins et al., 2006; Husseiny & Hensel, 2008; Jiang et al., 2004; Kirby et al., 2004). Έκτοτε, αρκετοί άλλοι ενδοκυτταρικοί βακτηριακοί φορείς έχουν δοκιμαστεί επιτυχώς για την ικανότητά τους να παρέχουν μια ποικιλία αντιγόνων από διάφορα παθογόνα, καθώς και εμβολιασμό κατά του καρκίνου. Ένα γένος που έχει δοκιμαστεί ευρέως ως φορέας είναι η Listeria. Τα είδη της Listeria είναι θετικά κατά Gram ενδοκυτταρικά τροφιμογενή παθογόνα. Τα πλεονεκτήματα της Listeria είναι ότι μπορεί να εισβάλει σε μια ποικιλία κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των αντιγονοπαρουσιαζόντων κυττάρων (APCs). Μετά την εισβολή στο κύτταρο ξενιστή, η Listeria κατοικεί μέσα στο φαγόσωμα. Ωστόσο, μπορεί να ξεφύγει από το φαγόσωμα με τη βοήθεια της λιστεριολυσίνης Ο (LLO; Hly) και βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων, παρουσιάζοντας έτσι αποτελεσματικά αντιγόνο και στα CD8 και στα CD4 Τ κύτταρα (Cossart & Mengaud, 1989; Kaufmann, 1993; Pamer et αϊ., 1997). Αρκετές μελέτες έχουν δείξει την αποτελεσματικότητα και την ευκολία χρήσης της Listeria monocytogenes για την παροχή ετερόλογων αντιγόνων εμβολίων και εμβολίων DNA Jensen et al., 1997; Johnson et al., 2011; Peters et al., 2003; Shen et al., 1995; Yin et al., 2011). Παρομοίως, διάφοροι ιικοί φορείς έχουν δοκιμαστεί επιτυχώς ως προς την ικανότητά τους να παρέχουν ετερόλογα αντιγόνα εμβολίου, και αυτό γενικά έχει ως αποτέλεσμα την επαγωγή ισχυρών ανοσοαποκρίσεων CTL. Στον κτηνιατρικό τομέα, υπάρχουν πολυάριθμα εμβόλια ιικών φορέων που έχουν επί του παρόντος άδεια χρήσης σε ζώα και οικόσιτα ζώα. Αυτά τα ανασυνδυασμένα εμβόλια βασίζονται τόσο σε ιούς DNA (όπως εμβόλια με βάση τον ιό της ευλογιάς των πτηνών που στοχεύουν τον ιό της γρίπης των πτηνών και τον ιό της ευλογιάς των ορνίθων ή φορείς με βάση τον ιό δαμαλίτιδας κατά του ιού της λύσσας στην άγρια ​​ζωή) όσο και σε ιούς RNA [όπως τα εμβόλια που βασίζονται στον ιό της νόσου του Newcastle να χρησιμοποιηθεί σε εμβόλια με βάση τον ιό των πουλερικών ή τον κίτρινο πυρετό (YFV) που θα χρησιμοποιηθούν σε άλογα κατά του ιού του Δυτικού Νείλου] (Draper & Heeney, 2010) . Με βάση το ιστορικό ασφάλειας στον κτηνιατρικό τομέα, πολλοί ιοί έχουν μελετηθεί για ανθρώπινη χρήση ως φορέας στην ανάπτυξη εμβολίων (Beukema et al., 2006; Esteban, 2009; Schirrmacher & Fournier, 2009; Stoyanov et al., 2010; Weli & Tryland, 2011). Μεταξύ αυτών, το YFV (στέλεχος YF-17D) ήταν το πρώτο που αδειοδοτήθηκε για χρήση σε ανθρώπους, όπου τα cDNA που κωδικοποιούσαν τις πρωτεΐνες φακέλου του YFV αντικαταστάθηκαν με τα αντίστοιχα γονίδια ενός εξασθενημένου στελέχους ιού ιαπωνικής εγκεφαλίτιδας, SA14-14-2 ( Appaiahgari & Vrati, 2010; Rollier et al., 2011). Οι ιοί ευλογιάς μελετώνται επίσης εκτενώς ως υποψήφιοι φορείς για ανθρώπινη χρήση, μεταξύ των οποίων εξασθενημένα παράγωγα του ιού δαμαλίτιδας [όπως τροποποιημένος ιός δαμαλίτιδας (MVA) και στελέχη ιού εξασθενημένης δαμαλίτιδας της Νέας Υόρκης NYVAC] είναι οι πιο υποσχόμενοι φορείς (Esteban, 2009; Gó mez et al., 2008; Rimmelzwaan & Sutter, 2009). Είναι ιδανικοί υποψήφιοι φορείς λόγω της μεγάλης τους ικανότητας συσκευασίας DNA και της θερμικής και γενετικής τους σταθερότητας (Minke et al., 2004). Ο φορέας NYVAC έχει αποδειχθεί ότι επάγει αποκρίσεις που κυριαρχούν στα CD4 + Τ κύτταρα και ο MVA επάγει αποκρίσεις Τ κυττάρων CD4 + και CD8 + (Mooij et al., 2008). Ο φορέας αδενοϊού (Ad) είναι ένας άλλος από τους πιο ευρέως αξιολογημένους φορείς μέχρι σήμερα για την έκφραση ετερόλογων αντιγόνων, λόγω της ευκολίας παραγωγής, του προφίλ ασφάλειας, της γενετικής σταθερότητας, της ευκολίας χειρισμού του γονιδιώματος του DNA και της ικανότητας να διεγείρει τόσο το έμφυτο όσο και το προσαρμοστικό ανοσοποιητικό αποκρίσεις και επάγουν αποκρίσεις Τ και Β κυττάρων (Alexander et al., 2012; Fitzgerald et al., 2003; Gabitzsch & Jones, 2011; Lasaro & Ertl, 2009; Vemula & Mittal, 2010; Weyer et al., 2009). Έχουν εξεταστεί εκτενώς ως φορέας παράδοσης σε αρκετές προκλινικές και κλινικές μελέτες για λοιμώδεις νόσους όπως ο άνθρακας, η ηπατίτιδα Β, ο ιός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV)-1, η γρίπη, η ιλαρά, το σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο (SARS), η ελονοσία και η φυματίωση M. Saxena και άλλοι (Chengalvala et al., 1994; Gao et al., 2006; Hashimoto et al., 2005; Hsu et al., 1992; Limbach & Richie, 2009; Radosevic et al., 2007; Shiver et al., 2002) .Ωστόσο, για να μπορέσουν να χρησιμοποιηθούν τα εμβόλια με φορέα στον ανθρώπινο πληθυσμό, πρέπει να πληρούν αρκετά σημαντικά κριτήρια. Η ασφάλεια είναι μια σημαντική ανησυχία, καθώς ακόμη και ένα χαμηλό επίπεδο τοξικότητας είναι απαράδεκτο (φυσικά η μικρή ενόχληση που συνοδεύει πολλούς εμβολιασμούς είναι φυσιολογική). Δεύτερον, ένα εμβόλιο θα πρέπει να είναι φθηνό, ώστε να μπορεί να χορηγηθεί σε μεγάλο πληθυσμό με ελάχιστο κόστος, και αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό σε χώρες με φτωχούς πόρους (Killeen & DiRita, 2000). Παρόμοιοι περιορισμοί ισχύουν για τα κτηνιατρικά εμβόλια, με το κόστος συχνά να αποτελεί ακόμη πιο σημαντικό ζήτημα. Τέλος, μακροχρόνιες κυτταρικές και (όπου ενδείκνυται) χυμικές ανοσοαποκρίσεις στο αντιγόνο φορέα πρέπει να προκληθούν μετά τη χορήγηση αυτών των εμβολίων, κατά προτίμηση με μία μόνο δόση (Atkins et al., 2006) . έχει παρατηρηθεί από το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή πριν από τον εμβολιασμό, πρέπει να εξεταστεί λεπτομερώς εάν η παρουσία προϋπαρχουσών ανοσολογικών αποκρίσεων είναι επιζήμια για την περαιτέρω ανάπτυξη ενός σχήματος εμβολίου που βασίζεται σε φορέα ή μπορεί να αυξήσει τις αποκρίσεις στο φορέα αντιγόνο. Αυτό είναι το αντικείμενο αυτής της αναθεώρησης. Κατά τη συζήτηση των πιθανών επιπτώσεων στην προϋπάρχουσα ανοσία, πρέπει να ληφθεί υπόψη η φυσική ανοσία στον φορέα. Επομένως, λαμβάνοντας υπόψη έναν φορέα όπως η σαλμονέλα, εάν ένας ξενιστής έχει μολυνθεί προηγουμένως, θα υπάρχουν ισχυρές αποκρίσεις μνήμης Β και Τ, και ως εκ τούτου, όταν χορηγείται ένας εμβολιασμός, θα προκληθεί μια αναμνηστική απόκριση στα αντιγόνα της σαλμονέλας (ενώ η απόκριση στο φορέα αντιγόνο θα είναι μια πρωταρχική απόκριση). Αυτό θα μειώσει θεωρητικά την έκθεση του ετερόλογου αντιγόνου στο ανοσοποιητικό σύστημα, καθώς ο φορέας καθαρίζεται γρήγορα. Παραδόξως, όπως θα φανεί σε μερικά από τα παραδείγματα που δίδονται παρακάτω, αυτό μπορεί να έχει αποτελέσματα που διαφέρουν ανάλογα με το μέγεθος της απόκρισης στο διανυσματικό αντιγόνο. Παρομοίως, για αντιγόνα που φέρουν ιούς, η ύπαρξη προϋπάρχουσας ανοσίας στον φορέα (ιδιαίτερα εξουδετερωτικό αντίσωμα) θα περιορίσει την παροχή του ιού στα κύτταρα, μειώνοντας έτσι αποτελεσματικά τη δόση του αντιγόνου που έχει φορέα. Και πάλι, αυτό μπορεί να αναμένεται ότι θα οδηγήσει σε μείωση της αντιγονικότητας του φορέα αντιγόνου. Στην περίπτωση των βακτηριακών φορέων, η επίδραση των προϋπαρχουσών ανοσολογικών αποκρίσεων έχει δοκιμαστεί μόνο με τη χρήση ορών Salmonella και Listeria spp. Η ανησυχία ότι η προηγούμενη ανοσολογική εμπειρία του ξενιστή είτε με το ομόλογο στέλεχος φορέα Salmonella είτε με ένα σχετικό στέλεχος μπορεί να θέσει σε κίνδυνο την ικανότητά του να απελευθερώνει ετερόλογο αντιγόνο εμβολίου πρωτοεμφανίστηκε το 1987 (Dougan et al., 1987). Οι Bao και Clements ανέφεραν στη συνέχεια πειραματικά στοιχεία των συνεπειών της προηγούμενης έκθεσης ζώων στο στέλεχος φορέα (Bao & Clements, 1991). Αυτή η εργασία έδειξε ότι τόσο οι αποκρίσεις αντισωμάτων ορού όσο και βλεννογόνων έναντι του ξένου αντιγόνου ήταν στην πραγματικότητα ρυθμισμένες προς τα πάνω σε ζώα με προηγούμενη έκθεση στο στέλεχος φορέα. Οι Whittle & Verma (1997) ανέφεραν παρόμοια ευρήματα. Τα ποντίκια που ανοσοποιήθηκαν μέσω της ενδοπεριτοναϊκής οδού με ένα μετάλλαγμα Salmonella dublin aroA που εκφράζει ετερόλογο αντιγόνο αφού εκτέθηκαν στον ίδιο φορέα εμφάνισαν υψηλότερη ανοσολογική απόκριση στο φορέα αντιγόνο σε σύγκριση με ποντίκια χωρίς ανοσολογική μνήμη έναντι του φορέα. Στη συνέχεια, αρκετές μελέτες έχουν διεξήχθη για να εξεταστεί η επίδραση της προϋπάρχουσας ανοσίας στον ξενιστή έναντι της σαλμονέλας. Αυτά τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Οι διάφορες αναφορές είναι αντιφατικές στα ευρήματά τους και φαίνεται να δίνουν μια μάλλον συγκεχυμένη εικόνα. Μερικές μελέτες κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η προϋπάρχουσα ανοσία έναντι του φορέα Salmonella οδηγεί σε ισχυρότερες ανοσολογικές αποκρίσεις έναντι του χορηγούμενου αντιγόνου (Bao & Clements, 1991; Jespersgaard et al., 2001; Kohler et al., 2000a, b; Metzger et al., 2004; Saxena et al., 2009; Sevil Domènech et al., 2008; Whittle & Verma, 1997), με άλλους να θεωρούν ότι η προϋπάρχουσα ανοσία αποτελεί περιοριστικό παράγοντα στη μακροχρόνια χρήση της σαλμονέλας ως αποτελεσματικού φορέα για την παροχή αντιγόνου (Attridge et al., 1997; Gahan et al., 2008; Roberts et al., 1999; Sevil Domènech et al., 2007; Vindurampulle & Attridge, 2003a, β). Μια μικρή πλειονότητα των μελετών που παρατίθενται στον Πίνακα 1 (10 έναντι οκτώ) υποδεικνύουν την ανοδική ρύθμιση των ανοσολογικών αποκρίσεων αφού τα ζώα έχουν εκτεθεί είτε σε ομόλογα είτε σε σχετικά στελέχη πριν από τη χορήγηση ετερόλογου αντιγόνου με χρήση σαλμονέλας διάνυσμα. Μια μελέτη από τον Metzger και τους συναδέλφους του σε ανθρώπους εθελοντές που χρησιμοποιούσαν Salmonella Typhi ως φορέα έδειξε ότι δεν υπήρξε αλλαγή στην ανοσολογική απόκριση των Τ κυττάρων έναντι του ετερόλογου αντιγόνου σε ανθρώπους εθελοντές που εκτέθηκαν σε κενό φορέα σε σύγκριση με εθελοντές που ήταν ανοσολογικά αφελείς του στελέχους φορέα (Metzger et al., 2004). Σε αυτά τα άτομα, οι χυμικές αποκρίσεις ήταν μέτρια αυξημένες σε άτομα που είχαν προεκτεθεί. Ομοίως, οι Saxena et al. (2009) έδειξαν υψηλότερες αποκρίσεις χυμικών και Τ κυττάρων σε ποντίκια που είχαν προεκτεθεί σε ομόλογα ή ετερόλογα στελέχη Salmonella. Η απόκριση ιντερλευκίνης 4 (IL4) ήταν σημαντικά υψηλότερη όταν ο ζώος ξενιστής εκτέθηκε στο ομόλογο στέλεχος, ενώ η προέκθεση σε ένα σχετικό είδος δεν είχε τέτοιο αντίκτυπο στις αποκρίσεις IL4. Αντίθετα, οι αποκρίσεις ιντερφερόνης (IFN)-c ήταν υψηλότερες, ανεξάρτητα από το στέλεχος στο οποίο τα ποντίκια είχαν προεκτεθεί. Αυτή η μελέτη έδειξε επίσης ότι η παρουσία ομόλογων ή ετερόλογων αντισωμάτων οψωνισμού οδηγεί σε υψηλότερη πρόσληψη σαλμονέλας από μακροφάγους in vitro, γεγονός που μπορεί να εξηγήσει τις υψηλότερες ανοσολογικές αποκρίσεις σε εκτεθειμένους ποντικούς. Όπως είναι αναμενόμενο, η πρόσληψη ήταν υψηλότερη όταν χρησιμοποιήθηκαν ομόλογοι οροί ως οψονίνη παρά ως ετερόλογοι οροί. Αυτό απεικονίζεται στο Σχ. 2. Αντίθετα, υπάρχουν αναφορές που υποδεικνύουν ότι η προϋπάρχουσα ανοσία έναντι του βακτηριακού φορέα ρυθμίζει προς τα κάτω τις ανοσοαποκρίσεις έναντι του χορηγούμενου ετερόλογου αντιγόνου χρησιμοποιώντας παρόμοιους ή σχετικούς φορείς. Ο Attridge και οι συνάδελφοι ανέφεραν ότι η παρουσία ανοσίας έναντι του βακτηριακού φορέα πριν από τη χορήγηση της αντιγονικής πρωτεΐνης Microbiology 159 με φορέα μπορεί να μειώσει τις ανοσοαποκρίσεις σε ποντίκια έναντι του χορηγούμενου αντιγόνου (Attridge et al., 1997). Παρόμοια αποτελέσματα αναφέρθηκαν από τους Roberts et al. (1999) και Vindurampulle & Attridge (2003a, b). Ωστόσο, οι τελευταίοι συγγραφείς διαπίστωσαν ότι η υπο-ανταπόκριση θα μπορούσε να εξαλειφθεί σε μεγάλο βαθμό με την έκθεση των ζώων στο ξένο αντιγόνο πριν από την εκκίνηση του φορέα (Vindurampulle & Attridge, 2003b). Δυστυχώς, αυτό φαίνεται ότι δεν είναι πρακτικό για ένα σχήμα εμβολιασμού! Μια μελέτη που παρουσιάστηκε από τους Gahan et al. (2008) ανοσοποιήθηκαν ποντίκια με S. Typhimurium που εκφράζει θραύσμα C αντιγόνου τοξίνης τετάνου από ένα πλασμίδιο έκφρασης ή ως εμβόλιο DNA. Τα εμβολιασμένα ποντίκια ανέπτυξαν χυμικές αποκρίσεις σε LPS και tetC (για τα εμβόλια που φέρουν πλασμίδιο). Ζώα από όλες τις ομάδες (συμπεριλαμβανομένης μιας προηγουμένως μη εμβολιασμένης ομάδας) ανοσοποιήθηκαν την ημέρα 182 με Salmonella που εκφράζει tetC. Αυτή τη στιγμή, οι τίτλοι anti-LPS και tetC άρχισαν να μειώνονται. Δεκατέσσερις ημέρες μετά τη δεύτερη ανοσοποίηση, αξιολογήθηκε ο αποικισμός διαφόρων οργάνων ποντικού. Η ικανότητα αποικισμού βρέθηκε να είναι σημαντικά μειωμένη σε ομάδες που είχαν προηγουμένως εμβολιαστεί με σαλμονέλα. Λαμβάνοντας υπόψη αυτό το εύρημα, ίσως δεν ήταν περίεργο ότι την ημέρα 210 οι τίτλοι του LPS δεν ήταν σημαντικά διαφορετικοί μεταξύ των ομάδων που έλαβαν έναν ή δύο εμβολιασμούς. Το πιο ενδιαφέρον είναι ότι τα ποντίκια που είχαν εκκινήσει μόνο με Salmonella και στη συνέχεια είχαν ενισχυθεί με Salmonella που εκφράζει tetC, προκάλεσαν πολύ χαμηλότερες αποκρίσεις anti-tetC από ποντίκια που δεν είχαν εκκινηθεί. Αυτό υποστηρίζει έντονα ότι η προηγούμενη ανοσολογική ανοσία στον φορέα μπορεί να μειώσει σοβαρά τις επακόλουθες ειδικές για το αντιγόνο χυμικές αποκρίσεις. Δεν αξιολογήθηκε εάν το ίδιο ισχύει για τις κυτταρικές αποκρίσεις. Άλλες μελέτες έχουν αξιολογήσει τις κυτταρικές αποκρίσεις. Μια μελέτη από τον Sevil Domènech και τους συνεργάτες του ανέφερε ότι η προϋπάρχουσα ανοσία κατά του φορέα θέτει σε σοβαρό κίνδυνο τις αποκρίσεις CD8 + σε ποντίκια όταν εκτίθενται σε ένα παρόμοιο στέλεχος που χρησιμοποιείται ως φορέας (Sevil Domènech et al., 2007). Αντίθετα, μια άλλη μελέτη από τους ίδιους συγγραφείς ανέφερε ότι τα ζώα που εκτέθηκαν σε σχετικούς φορείς προκαλούν πολύ υψηλότερες αποκρίσεις CD8 + σε σύγκριση με ζώα που δεν έχουν προϋπάρχουσα ανοσία από σαλμονέλα (Sevil Domènech et al., 2008). Η διαφορά μεταξύ αυτών των δύο μελετών ήταν ότι στην πρώτη, το prime και το boost ήταν με πανομοιότυπους ορούς, ενώ στη δεύτερη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικοί οροί. Αυτό μπορεί να υποδηλώνει έναν τρόπο αποφυγής της υπορρύθμισης των αποκρίσεων CD8 μέσω της προϋπάρχουσας ανοσίας. Αυτό είναι σημαντικό, καθώς ένα από τα πλεονεκτήματα της χρήσης της Salmonella (ενδοκυτταρικού παθογόνου) είναι ότι μπορούν να προκληθούν ισχυρές κυτταρικές ανοσολογικές αποκρίσεις. Πρέπει να σημειωθεί ότι στην περίπτωση των εμβολίων Salmonella, επιδράσεις εκτός από αυστηρά ανοσολογικές αποκρίσεις (ιδιαίτερα προσαρμοστικές αποκρίσεις) θα πρέπει να ληφθεί υπόψην. Στο πλαίσιο της έμφυτης ανοσίας, αποδείχθηκε ότι η χορήγηση μη μολυσματικής σαλμονέλας σε γνοβιοτικούς χοίρους εξάλειψε τη νόσο μετά από πρόκληση με ένα λοιμογόνο στέλεχος (Foster et al., 2003). Είναι ενδιαφέρον ότι η προστασία δεν γινόταν με ανταγωνιστικό αποκλεισμό, καθώς το λοιμογόνο στέλεχος ήταν σε υψηλούς αριθμούς στο έντερο, αλλά δεν κατανεμήθηκε συστηματικά. Η προστασία προτάθηκε να διαμεσολαβείται από τη διείσδυση μεγάλου αριθμού πολυμορφοπύρηνων λευκοκυττάρων στο έντερο, και παρόλο που ίσως δεν είναι πρακτική ως γενική προφυλακτική μέθοδος (καθώς ο χρόνος μεταξύ εμβολιασμού και μόλυνσης είναι σύντομος), αυτό μπορεί να είναι μια επιλογή για βραχυπρόθεσμη ή ίσως θεραπευτικός εμβολιασμός (όπως αναθεωρήθηκε από τους Foster et al., 2012) .Τα κοτόπουλα (Gallus gallus) είναι μια φυσική δεξαμενή ζώων για τη σαλμονέλα, γεγονός που τα καθιστά σημαντική πηγή γαστρεντερίτιδας που σχετίζεται με τη σαλμονέλα στους ανθρώπους. Η ικανότητα χρήσης εμβολίων σαλμονέλας από το στόμα για ανοσοποίηση έναντι ετερόλογων παθογόνων θα ήταν τεράστιο όφελος για την Πρόσληψη STM-1 από τα μακροφάγα J774, σε σχέση με το υψηλότερο ποσοστό πρόσληψης. X, Opsonized with naive sera; m, οψωνισμένο με ορό από ποντίκια που εκτέθηκαν σε εντεριδίτιδα από σαλμονέλα. &, οψωνοποιημένος με ορό από ποντίκια που εκτέθηκαν σε STM-1. Προϋπάρχουσα ανοσία έναντι των φορέων εμβολίων στη βιομηχανία πουλερικών τόσο σε κοπάδια κοτόπουλων κρεατοπαραγωγής όσο και σε στιβάδες. Τόσο η κάθετη όσο και η οριζόντια μετάδοση σχετίζεται με τη σαλμονέλα στα κοτόπουλα (Liljebjelke et al., 2005). Η κατακόρυφη μετάδοση μέσω μετάδοσης in ovo είναι ιδιαίτερα σημαντική, διότι εάν υπάρξει προηγούμενη έκθεση στο στέλεχος του εμβολίου, ο μετέπειτα εμβολιασμός με χρήση φορέα σαλμονέλας από το στόμα θα μπορούσε να διακυβευτεί σοβαρά. Ένας σημαντικός αριθμός μελετών σχετικά με τη διασταυρούμενη προστατευτική ανοσία και τον ανταγωνιστικό αποκλεισμό έχει πραγματοποιηθεί σε κοτόπουλα. Η προστατευτική διασταυρούμενη αντιδραστική ανοσία έναντι των στελεχών της Salmonella έχει αποδειχθεί τόσο έναντι ομόλογων όσο και ετερόλογων προκλήσεων (Beal et al., 2006), αν και η προστασία μεταξύ οροομάδων δεν ήταν ισχυρή. Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι η προεπεξεργασία νεοεκκολάψεων κοτόπουλων με διαφορετικά στελέχη σαλμονέλας θα μπορούσε να προκαλέσει πλήρη αναστολή της εισβολής σε οποιαδήποτε επακόλουθη έκθεση τόσο σε ομόλογα όσο και σε ετερόλογα στελέχη (Methner et al., 2010). Η προέκθεση με μια άκρως διεισδυτική μορφή Salmonella Enteritidis προκάλεσε μεγάλη εισροή ετεροφίλων στον βλεννογόνο του τυφλού σε νεοσσούς ηλικίας 1 ημέρας και ο επακόλουθος ετερόλογος αποικισμός στο τυφλό αναστέλλεται για μια περίοδο 48 ωρών (Methner et al., 2010) . Οι επιπτώσεις αυτού του είδους της μελέτης αποικισμού-αναστολής στην ανοσολογική κατάσταση των προσβεβλημένων κοτόπουλων δεν έχουν ακόμη αποσαφηνιστεί πλήρως. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι μελέτες που παρατίθενται στους Πίνακες 1 και 2 είναι ελεγχόμενες εργαστηριακές μελέτες, χωρίς να συζητείται η πιθανότητα ανταγωνιστικού αποκλεισμού στην ανοσία. Παρόμοια μελέτες για το L. monocytogenes και τα αποτελέσματα των προϋπαρχουσών ανοσολογικών αποκρίσεων δείχνουν αντικρουόμενα αποτελέσματα. Μια μελέτη των Bouwer et al. (1999) υποδεικνύει ότι οι προϋπάρχουσες ανοσολογικές αποκρίσεις έναντι του φορέα Listeria δεν μειώνουν τις ανοσοαποκρίσεις έναντι του χορηγούμενου ετερόλογου αντιγόνου και μια παρόμοια μελέτη από τους Starks et al. (2004) κατέληξε επίσης στο συμπέρασμα ότι η προηγούμενη έκθεση ποντικών στον κενό φορέα Listeria δεν επηρέασε τις αντικαρκινικές ανοσολογικές αποκρίσεις όταν ένα παρόμοιο μετάλλαγμα χρησιμοποιήθηκε ως φορέας ενός αντιγόνου καρκίνου μελανώματος. Παρόμοια ευρήματα αναφέρθηκαν από τους Whitney et al. (2011) σε μακάκους rhesus στους οποίους χρησιμοποιήθηκε το L. monocytyogens ως φορέας του αντιγόνου gag-HIV. Αντίθετα, μελέτες των Stevens et al. (2005) όπου το L. monocytogens χρησιμοποιήθηκε για την παροχή πρωτεΐνης gag του ιού ανοσοανεπάρκειας αιλουροειδών (FIV) και ως φορέας εμβολίων DNA για τον εμβολιασμό γατών κατά της πρωτεΐνης φακέλου FIV, έδειξε χαμηλότερες ανοσοαποκρίσεις έναντι του χορηγούμενου αντιγόνου σε γάτες που εκτέθηκαν σε κενό φορέα Listeria σε σύγκριση με αφελή ζώα (Stevens et al., 2005) . Παρόμοια ευρήματα έχουν αναφερθεί από τους Tvinnereim et al. (2002) και Leong et al. (2009) . Ωστόσο, συνολικά, αυτές οι μελέτες καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι η προηγούμενη έκθεση των ζώων ξενιστών σε κενό φορέα δεν αναιρεί τις ανοσολογικές αποκρίσεις στο αντιγόνο που έχει φορέας, αλλά μόνο τις μειώνει κάπως. Μόνο η μελέτη των Vijh et al. (1999) έδειξε ότι η έκθεση στον κενό φορέα μπορεί να καταργήσει πλήρως τις ανοσολογικές αποκρίσεις έναντι των χορηγούμενων αντιγόνων (Vijh et al., 1999). Ωστόσο, αυτές οι μελέτες υποδεικνύουν επίσης ότι η προς τα κάτω ρύθμιση των αντιγονοειδικών ανοσοαποκρίσεων εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη δόση και τον χρόνο. Οι Leong et al. (2009) απέδειξε επίσης ότι ο αρνητικός αντίκτυπος των ειδικών για τον φορέα ανοσοαποκρίσεις μπορεί επίσης να αντιμετωπιστεί με επαναλαμβανόμενη ανοσοποίηση με το ίδιο εμβόλιο και δόση. Αυτό στην πραγματικότητα οδηγεί σε υψηλότερη εκκίνηση των αφελών Τ κυττάρων έναντι του χορηγούμενου αντιγόνου. Φυσικά, τέτοιος επαναλαμβανόμενος εμβολιασμός μπορεί να μην είναι πρακτικός σε πραγματικές καταστάσεις. Παρά τα πολλά πλεονεκτήματα που μπορεί να προσφέρει ο ιικός φορέας, η προϋπάρχουσα ανοσία αποτελεί σημαντικό εμπόδιο για πολλά εμβόλια με ιικό φορέα, όπως ο ορότυπος Ad 5 ή ο ιός του απλού έρπη τύπου 1 (HSV-1), όπου το ποσοστό οροεπιπολασμού σε αυτούς τους ιούς είναι πολύ υψηλό [40-45 % και 70 % (ή περισσότερο) του πληθυσμού των ΗΠΑ, αντίστοιχα] (Hocknell et al., 2002; Pichla-Gollon et al., 2009). Τα ειδικά για τον φορέα αντισώματα μπορεί να εμποδίσουν την επαγωγή ανοσολογικών αποκρίσεων στα αντιγόνα που κωδικοποιούνται από το εμβόλιο, καθώς μπορεί να μειώσουν τη δόση και τον χρόνο έκθεσης των κυττάρων-στόχων στα εμβολιασμένα αντιγόνα (Pichla-Gollon et al., 2009; Pine et al., 2011). Σε μια μεγάλης κλίμακας κλινική δοκιμή (STEP) ενός εμβολίου HIV-1 με βάση τον ορότυπο 5 (AdHu5), τα εμβόλια έδειξαν έλλειψη αποτελεσματικότητας και έτειναν να αυξάνουν τον κίνδυνο μόλυνσης από τον HIV-1 σε λήπτες εμβολίου που είχαν προ- υπάρχοντα εξουδετερωτικά αντισώματα στο AdHu5 (Buchbinder et al., 2008). Για ένα εμβόλιο φορέα που βασίζεται σε HSV-1, έχει αποδειχθεί ότι η προϋπάρχουσα ανοσία κατά του HSV-1 μείωσε, αλλά δεν κατάργησε τις χυμικές και κυτταρικές ανοσοαποκρίσεις έναντι του κωδικοποιούμενου από το εμβόλιο αντιγόνου (Hocknell et al., 2002; Lauterbach et al., 2005). Ωστόσο, οι Brockman και Knipe διαπίστωσαν ότι η επαγωγή ανθεκτικών αποκρίσεων αντισωμάτων και κυτταρικών πολλαπλασιαστικών αποκρίσεων στο αντιγόνο με κωδικοποίηση HSV δεν επηρεάστηκαν από την προηγούμενη ανοσία του HSV (Brockman & Knipe, 2002). Ομοίως, η προϋπάρχουσα ανοσία στον ιό της πολιομυελίτιδας έχει μικρή επίδραση στην αποτελεσματικότητα του εμβολίου σε ένα εμβόλιο με φορέα της πολιομυελίτιδας (Mandl et al., 2001). Οι διαφορετικές επιδράσεις της προϋπάρχουσας ανοσίας στην αποτελεσματικότητα των ανασυνδυασμένων ιικών φορέων εμβολίων συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Υπάρχουν διάφορες προσεγγίσεις για την αποφυγή προϋπάρχουσας ανοσίας φορέων, όπως η χρήση φορέων που προέρχονται από μη ανθρώπινες πηγές, χρησιμοποιώντας ανθρώπινους ιούς σπάνιων οροτύπων (Kahl et al., 2010; Lasaro & Ertl, 2009), ετερόλογες προσεγγίσεις αρχικής ενίσχυσης (Liu et al., 2008), ομόλογη επαναανοσοποίηση (Steffensen et al., 2012) και αφαίρεση βασικών εξουδετερωτικών επιτόπων στην επιφάνεια πρωτεϊνών ιικού καψιδίου (Gabitzsch, 201 & Jo; Roberts et al., 2006). Η ανασταλτική επίδραση της προϋπάρχουσας ανοσίας μπορεί επίσης να αποφευχθεί με την κάλυψη του φορέα Ad μέσα στα δενδριτικά κύτταρα (DCs) (Steffensen et al., 2012). Επιπλέον, ο εμβολιασμός του βλεννογόνου ή η χορήγηση υψηλότερων δόσεων εμβολίου μπορεί να ξεπεράσει προϋπάρχοντα προβλήματα ανοσίας (Alexander et al., 2012; Belyakov et al., 1999; Priddy et al., 2008; Xiang et al., 2003). Καθώς αναζητούμε νέες προσεγγίσεις εμβολίων για τη σειρά παθογόνων για τα οποία κανένα δεν είναι ακόμη διαθέσιμο, η επανεξέταση των αποδεδειγμένων εμβολίων και η περαιτέρω ανάπτυξή τους έχει αποκτήσει δυναμική στον M. Saxena και σε άλλους. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιούνται εξασθενημένα βακτήρια και ιοί που έχουν μακρά ιστορία αποτελεσματικότητας και ασφάλειας. Αν και είναι πολύ ελκυστικό, ένα κοινό θέμα σε αυτές τις πειραματικές προσεγγίσεις ήταν οι περιορισμοί που μπορεί να θέτει η προϋπάρχουσα ανοσία στον φορέα. Ωστόσο, όπως δείχνει αυτή η εξέταση της σχετικής βιβλιογραφίας, υπάρχει μια μάλλον συγκεχυμένη εικόνα, με ορισμένες μελέτες στην πραγματικότητα να υποδεικνύουν ότι η προϋπάρχουσα ανοσία μπορεί να είναι φίλος και όχι εχθρός. Λίγες μελέτες που χρησιμοποιούν ιικούς φορείς έχουν αναφέρει την επίδραση του προ -υπάρχουσα ανοσία στις χυμικές αποκρίσεις. Σε γενικές γραμμές, για τα αντιγόνα που χορηγούνται από βακτήρια, οι χυμικές αποκρίσεις επηρεάστηκαν από προϋπάρχουσα ανοσία, με ελαφρώς περισσότερες μελέτες να βρίσκουν αύξηση παρά μείωση. Γιατί υπάρχει παραλλαγή; Αυτό μπορεί να οφείλεται σε διάφορους παράγοντες, συμπεριλαμβανομένου του τύπου της σαλμονέλας που χρησιμοποιείται και της διεισδυτικότητάς της. Ο Dunstan και οι συνεργάτες του εξέτασαν την ικανότητα έξι ισογονικών στελεχών Salmonella serovar Typhimurium που φιλοξενούν διαφορετικές μεταλλάξεις για την ικανότητά τους να επάγουν ανοσολογικές αποκρίσεις έναντι του θραύσματος C της τοξίνης του τετάνου και κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι το στέλεχος που είχε τη μικρότερη ικανότητα να αποικίζει τα έμπλαστρα Peyer προκάλεσε τη χαμηλότερη ανοσοαπόκριση ( Dunstan et al., 1998). Παρομοίως, ο χρόνος ενίσχυσης και η φύση του αντιγόνου που χρησιμοποιείται μπορεί να είναι σημαντικές. Ο Attridge και οι συνεργάτες του ανέφεραν τη σημασία της ενίσχυσης του χρόνου. Σε ένα πείραμα, η ενίσχυση ποντικών στις 10 εβδομάδες οδήγησε σε πλήρη αναστολή των αποκρίσεων αντισωμάτων έναντι του χορηγούμενου ετερόλογου αντιγόνου. Ωστόσο, όταν τα ποντίκια έλαβαν ενίσχυση στις 4 εβδομάδες, η μείωση της ρύθμισης των αποκρίσεων αντισωμάτων δεν ήταν τόσο εμφανής (Attridge et al., 1997). Μια παρόμοια μελέτη που διεξήχθη από τον Kohlers και τους συνεργάτες δείχνει ότι η ενίσχυση στις 7 εβδομάδες μετά την προέκθεση των ζώων σε κενό φορέα οδηγεί σε χαμηλότερες αποκρίσεις IgG και εκκριτικού IgA στο αντιγόνο. Ωστόσο, η ενίσχυση στις 14 εβδομάδες οδηγεί σε υψηλότερες αποκρίσεις IgG και εκκριτική IgA (Kohler et al., 2000b). Αυτό έρχεται σε αντίθεση με το παραπάνω αποτέλεσμα, αν και πρέπει να αναφερθεί ότι χρησιμοποίησαν διαφορετικά είδη Salmonella. Οι Vindurampulle και Attridge εξέτασαν επίσης την επίδραση του στελέχους Salmonella και τη φύση των αντιγόνων που χρησιμοποιήθηκαν. Στη μελέτη τους, χρησιμοποίησαν μεταλλάγματα S. Dublin και Salmonella Stanley aroA για να χορηγήσουν αντιγόνα E. coli K88 και LT-B και κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η επίδραση της προϋπάρχουσας ανοσίας εξαρτάται τόσο από το στέλεχος που χρησιμοποιείται όσο και από τον τύπο του αντιγόνου που χορηγείται (Vindurampulle & Attridge, 2003b). Όλες αυτές οι μελέτες σχετικά με την επίδραση της προϋπάρχουσας ανοσίας συζητούν τον αντίκτυπο στις χυμικές αποκρίσεις. Ο Sevil Domenech και οι συνεργάτες του ανέφεραν ότι η προέκθεση των ζώων στον ομόλογο φορέα Salmonella οδηγεί σε σημαντική μείωση των αποκρίσεων CD8 +. Ωστόσο, η έκθεση των ζώων σε ένα ετερόλογο στέλεχος οδηγεί σε σημαντικά υψηλότερες αποκρίσεις CD8+ (Sevil Domènech et al., 2007, 2008. Ο Saxena και οι συνεργάτες του ανέφεραν επίσης ότι οι αντιγονοειδικές αποκρίσεις Τ-λεμφοκυττάρων ήταν είτε παρόμοιες είτε σημαντικά υψηλότερες, χωρίς να παρατηρείται μείωση των αποκρίσεων των Τ κυττάρων μετά την προέκθεση ποντικών είτε σε ομόλογα είτε σε ετερόλογα στελέχη (Saxena et al., 2009). Για ιικούς φορείς, Η επίδραση της κυτταρικής ανοσίας ήταν πιο έντονη και όπως απεικονίζεται στον Πίνακα 2, σχεδόν πάντα είχε ως αποτέλεσμα μείωση της επακόλουθης ανοσοαπόκρισης. Πιθανώς αυτό οφείλεται στο ότι οι ιοί θα επάγουν εξουδετερωτικό αντίσωμα στην πρώτη δόση και σε επόμενες δόσεις αυτό το αντίσωμα θα περιορίσει τον αριθμό των κυττάρων που έχουν υποστεί μεταγωγή, περιορίζοντας επομένως τις αποκρίσεις. Αυτό είναι ιδιαίτερα ένα πρόβλημα με έναν κοινό ιικό φορέα όπως το Ad, όπου ένα μεγάλο ποσοστό του πληθυσμού θα έχει ανοσολογική μνήμη έναντι κοινών ορότυπων (Lasaro & Ertl, 2009). Όπως συμπεραίνουν αυτοί οι συγγραφείς, θα είναι δυνατή η χρήση τέτοιων φορέων μόνο με την ανάπτυξη εμβολίων από εναλλακτικούς ορότυπους. Ενδέχεται να είναι χρήσιμος σε αυτό το πλαίσιο ένας φορέας όπως η προϋπάρχουσα ανοσία έναντι των φορέων εμβολίων, ο εξασθενημένος ιός γρίπης, με την ικανότητα να αναπτύσσει εύκολα ανασυνδυαστές. Επιπλέον, η ανοσολογική μνήμη με τη μορφή οψωνοποιητικού αντισώματος σίγουρα παίζει σημαντικό ρόλο στην πρώιμη πρόσληψη της σαλμονέλας από μακροφάγους και DC. Αυτό μπορεί να είναι ευεργετικό, καθώς ο ζωντανός βακτηριακός φορέας που χρησιμοποιείται για σκοπούς παροχής φιλοξενεί μεταλλάξεις σε γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες υπεύθυνες για την επιβίωσή τους στον ζώο ξενιστή. Αυτό όχι μόνο επιβαρύνει την ικανότητά τους να προκαλούν ασθένειες, καθιστώντας τους ασφαλείς ζωντανούς φορείς, αλλά περιορίζει επίσης τον αριθμό των επαναλήψεων. Η παρουσία αντισωμάτων οψωνισμού θα πρέπει να σημαίνει υψηλότερο επίπεδο βακτηριακής πρόσληψης, οδηγώντας σε υψηλότερη παρουσίαση στο ανοσοποιητικό σύστημα και επομένως καλύτερη ανοσολογική απόκριση. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι αυτό είναι πράγματι έτσι (Saxena et al., 2009) (που απεικονίζεται στην Εικ. 2). Θα ήταν πολύ ωφέλιμο να αντιμετωπιστούν αυτά τα ζητήματα όχι μόνο σε ποντίκια αλλά και σε άλλους οργανισμούς όπως τα κοτόπουλα, τα οποία είναι ο πιο πιθανός ξενιστής να στοχευθούν για τη χρήση ζωντανών φορέων σαλμονέλας, ειδικά όπου τα εμβόλια αναπτύσσονται για χρήση σε ζώα και πουλερικά. Συνοψίζοντας, βακτηριακούς φορείς όπως η σαλμονέλα και ιικοί φορείς όπως το Ad δείχνουν πολλά υποσχόμενοι ως φορείς παροχής ετερόλογων αντιγόνων. Ωστόσο, πρέπει να ληφθεί υπόψη η προηγούμενη έκθεση στον φορέα. Με τη συνετή επιλογή του στελέχους/ορότυπου θα είναι δυνατό να αποφευχθούν οι αρνητικές επιπτώσεις και μπορεί πράγματι να είναι δυνατό να επηρεαστεί θετικά η απόκριση, ιδιαίτερα για τη χυμική ανοσία.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 3711, "text": "Ty21a για τυφοειδή πυρετό σε ανθρώπους, αρκετοί οροί Salmonella κατά της σαλμονέλωσης σε κοτόπουλα και άλλα ζώα" } ], "id": 809, "question": "Ποια είναι παραδείγματα φορέων χορήγησης για εμπορικά εμβόλια κατά της σαλμονέλας;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4747, "text": "Τα είδη της Listeria είναι θετικά κατά Gram ενδοκυτταρικά τροφιμογενή παθογόνα" } ], "id": 812, "question": "Τι είναι η Listeria;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6722, "text": "το YFV (στέλεχος YF-17D) ήταν το πρώτο που αδειοδοτήθηκε για χρήση σε ανθρώπους, όπου τα cDNA που κωδικοποιούσαν τις πρωτεΐνες φακέλου του YFV αντικαταστάθηκαν με τα αντίστοιχα γονίδια ενός εξασθενημένου στελέχους ιού ιαπωνικής εγκεφαλίτιδας, SA14-14-2" } ], "id": 825, "question": "Ποιος φορέας χορήγησης ιικού εμβολίου αδειοδοτήθηκε για πρώτη φορά;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7376, "text": "Είναι ιδανικοί υποψήφιοι φορείς λόγω της μεγάλης τους ικανότητας συσκευασίας DNA και της θερμικής και γενετικής τους σταθερότητας" } ], "id": 833, "question": "Γιατί ορισμένοι ιοί ευλογιάς είναι ιδανικά κατάλληλοι ως φορείς παροχής εμβολίου;" }, { "answers": [ { "answer_start": 9013, "text": "ένα εμβόλιο θα πρέπει να είναι φθηνό, ώστε να μπορεί να χορηγηθεί σε μεγάλο πληθυσμό με ελάχιστο κόστος" } ], "id": 838, "question": "Ποια είναι τα σημαντικά κριτήρια για την επιλογή φορέων χορήγησης εμβολίου;" }, { "answers": [ { "answer_start": 23946, "text": "Τα ειδικά για τον φορέα αντισώματα μπορεί να εμποδίσουν την επαγωγή ανοσολογικών αποκρίσεων στα αντιγόνα που κωδικοποιούνται από το εμβόλιο, καθώς μπορεί να μειώσουν τη δόση και τον χρόνο έκθεσης των κυττάρων-στόχων στα εμβολιασμένα αντιγόνα" } ], "id": 875, "question": "Ποια είναι η επίδραση της ανοσοαπόκρισης του ξενιστή στον ιικό φορέα παροχής στην αποτελεσματικότητα του εμβολιασμού;" }, { "answers": [ { "answer_start": 24237, "text": "Σε μια μεγάλης κλίμακας κλινική δοκιμή (STEP) ενός εμβολίου HIV-1 με βάση τον ορότυπο 5 (AdHu5), τα εμβόλια έδειξαν έλλειψη αποτελεσματικότητας και έτειναν να αυξάνουν τον κίνδυνο μόλυνσης από τον HIV-1 σε λήπτες εμβολίου που είχαν προ- υπάρχοντα εξουδετερωτικά αντισώματα στο AdHu5 (" } ], "id": 876, "question": "Ποια είναι η επίδραση της ανοσοαπόκρισης του ξενιστή στον φορέα παροχής στην αποτελεσματικότητα του εμβολιασμού;" }, { "answers": [ { "answer_start": 25870, "text": "Η ανασταλτική επίδραση της προϋπάρχουσας ανοσίας μπορεί επίσης να αποφευχθεί με την κάλυψη του φορέα Ad μέσα στα δενδριτικά κύτταρα (DCs) (Steffensen et al., 2012). Επιπλέον, ο εμβολιασμός του βλεννογόνου ή η χορήγηση υψηλότερων δόσεων εμβολίου μπορεί να ξεπεράσει προϋπάρχοντα προβλήματα ανοσίας (Alexander et al., 2012; Belyakov et al., 1999; Priddy et al., 2008; Xiang et al., 2003)" } ], "id": 878, "question": "Ποιες είναι οι μέθοδοι για την αποφυγή της επίδρασης της ανοσοαπόκρισης του φορέα στην αποτελεσματικότητα του εμβολιασμού;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Ανοσοποιητικές αποκρίσεις του βλεννογόνου που προκαλούνται από από του στόματος χορήγηση ανασυνδυασμένου Bacillus subtilis που εκφράζει το COE αντιγόνο του PEDV σε νεογέννητα χοιρίδια Huang, Lulu; Mou, Chunxiao; Zhang, En; Wang, Yongheng; Cao, Yanan; Yang, QianΗμερομηνία: 2019-03-15DOI: 10.1042/bsr20182028Άδεια: cc-byAbstract: Η επιδημική διάρροια των χοίρων (PED) είναι μια εξαιρετικά μεταδοτική ασθένεια στα νεογέννητα χοιρίδια και προκαλεί σημαντικές οικονομικές απώλειες στον κόσμο. Ο ιός PED (PEDV) εξαπλώνεται με επαφή κοπράνων-στοματικής και μπορεί να προληφθεί με ανοσοποίηση από το στόμα. Ως εκ τούτου, είναι απαραίτητο να αναπτυχθεί ένα αποτελεσματικό από του στόματος εμβόλιο κατά της μόλυνσης από PEDV. Επί του παρόντος, ο Bacillus subtilis ως φορέας ανασυνδυασμένου εμβολίου έχει χρησιμοποιηθεί για τη χορήγηση αντιγόνου και έχει αποδειχθεί καλά ως προς το ανοσοποιητικό αποτέλεσμα και την ασφάλεια. Η παρούσα μελέτη αξιολόγησε την ανοσογονικότητα του ανασυνδυασμένου Bacillus subtilis (B. subtilis-RC) σε χοιρίδια μέσω χορήγησης από το στόμα. Μετά την από του στόματος ανοσοποίηση σε χοιρίδια, το B. subtilis-RC αύξησε σημαντικά τις τοπικές ανοσοαποκρίσεις του βλεννογόνου. Η από του στόματος χορήγηση με B. subtilis-RC βελτίωσε σημαντικά το επίπεδο των ειδικών αντισωμάτων της βλεννογόνου ανοσοσφαιρίνης Α (IgA) κατά της λοίμωξης PEDV, μέσω της διεύρυνσης της περιοχής των επιθεμάτων Peyer (PPs) και της αύξησης του αριθμού των κυττάρων που εκκρίνουν IgA(+) ειλεού (SIgA). . Εν τω μεταξύ, το B. subtilis-RC αύξησε αξιοσημείωτα τον αριθμό των ενδοεπιθηλιακών λεμφοκυττάρων (IEL). Παρατηρήσαμε επίσης ότι η από του στόματος χορήγηση του B. subtilis-RC αύξησε σημαντικά τον αριθμό των CD3(+)T λεμφοκυττάρων και ρύθμισε προς τα πάνω την αναλογία των CD4(+)/CD8(+) Τ κυττάρων. Επιπλέον, υψηλοί τίτλοι ειδικής ανοσοσφαιρίνης G ορού (IgG) αποκάλυψαν ικανοποιητική συστηματική ανοσοαπόκριση έναντι της μόλυνσης από PEDV. Συνοπτικά, η μελέτη μας έδειξε ότι η από του στόματος χορήγηση του B. subtilis-RC θα μπορούσε να προκαλέσει υψηλό επίπεδο τοπικών και συστημικών ανοσολογικών αποκρίσεων και θα ήταν ένα πολλά υποσχόμενο υποψήφιο εμβόλιο κατά της μόλυνσης από PEDV σε χοιρίδια. Κείμενο: Επιδημική διάρροια χοίρου (PED) που χαρακτηρίζεται από εξαιρετικά θανατηφόρα οξεία διάρροια σε χοιρίδια, έχει ως αποτέλεσμα τεράστιες απώλειες στην παγκόσμια χοιροβιομηχανία [1] . Ο αιτιολογικός παράγοντας ιός PED (PEDV) ανήκει στους κοροναϊούς των χοίρων (CoVs). Η λοίμωξη από PEDV εξαπλώνεται κυρίως μέσω της πεπτικής οδού [2] και βλάπτει τις επιφάνειες του βλεννογόνου του εντέρου του ξενιστή μολύνοντας τα επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου [3]. Επομένως, η ενίσχυση της ανοσίας του εντερικού βλεννογόνου μπορεί να προκαλέσει αποτελεσματικές ανοσοαποκρίσεις του βλεννογόνου έναντι της μόλυνσης από PEDV [4] . Επί του παρόντος, παραδοσιακά εμβόλια (ενδομυϊκής οδού ή υποδόριας ένεσης) έχουν αναπτυχθεί και εφαρμοστεί ευρέως στην αγορά [5] . Αυτά τα εμβόλια που χορηγούνται παρεντερικά δεν μπορούν να επάγουν αποτελεσματικά υψηλούς τίτλους μητρικών αντισωμάτων και αντισωμάτων IgA ειδικά για τον ιό, με αποτέλεσμα την ανεπαρκή προστασία του βλεννογόνου έναντι της μόλυνσης από PEDV [6] . Επιπλέον, αυτά τα μητρικά αντισώματα στο γάλα αποικοδομούνταν πάντα από το γαστρικό οξύ και την πεψίνη πριν εισέλθουν στον εντερικό σωλήνα. Τα αποτελεσματικά εμβόλια PEDV πρέπει να παρέχουν επαρκή προστασία του βλεννογόνου στην εντερική οδό. Ωστόσο, επί του παρόντος λείπουν τα αποτελεσματικά εμβόλια [7] . Ως ανώτερος τρόπος ανοσοποίησης του βλεννογόνου, η από του στόματος χορήγηση μπορεί να προστατεύσει το έντερο και να διεγείρει το κοινό ανοσοποιητικό σύστημα του βλεννογόνου [8] . Επιπλέον, ο εμβολιασμός από του στόματος έχει πολλά ελκυστικά χαρακτηριστικά που περιλαμβάνουν την ασφάλεια και μια απλή, φθηνή και χωρίς βελόνα προσέγγιση [9] . Ως εκ τούτου, η από του στόματος ανοσοποίηση συχνά παρέχει μεγάλες ποσότητες αντιγόνων για την πρόληψη των διαρροϊκών ασθενειών [10] . Ωστόσο, υπάρχουν αρκετές προκλήσεις από την από του στόματος ανοσοποίηση, οι οποίες αποτελούνται από φυσικούς, χημικούς και βιολογικούς φραγμούς κατά την παροχή αντιγόνων στον γαστρεντερικό σωλήνα (όπως γαστρικά οξέα, πεψίνη και θρυψίνη στο γαστρεντερικό σωλήνα) [11] . Είναι ένα σημαντικό πρόβλημα ότι τα πεπτικά οξέα και οι πρωτεάσες μπορούν να αποικοδομήσουν τις πρωτεΐνες αντιγόνου για την απορρόφηση των θρεπτικών συστατικών [12] . Ως εκ τούτου, το σύστημα χορήγησης εμβολίου έχει εφαρμοστεί για την επίλυση του προβλήματος. Το σύστημα μπορεί να προστατεύσει τα αντιγόνα από το σοβαρό περιβάλλον της γαστρεντερικής οδού και να μεταφέρει αντιγόνα στον εντερικό βλεννογόνο [13] . Επί του παρόντος, ο Bacillus subtilis (B. subtilis) χρησιμοποιείται ευρέως ως σύστημα χορήγησης εμβολίου για τα μοναδικά χαρακτηριστικά του. Ως μη παθογόνο Gram-θετικό βακτήριο, το B. subtilis έχει θεωρηθεί ως νέο προβιοτικό και πρόσθετο τροφίμων σε ανθρώπους και ζώα [14] . Το B. subtilis έχει επικουρική δράση και μπορεί να μεταφέρει ετερόλογα αντιγόνα στην γαστρεντερική οδό, παρέχοντας πρόσθετη διέγερση της ανοσίας [15] . Επιπλέον, η έρευνα είχε δείξει ότι η από του στόματος χορηγούμενη B. subtilis θα μπορούσε επίσης να ενισχύσει την ανοσολογική ρύθμιση και την υγεία του εντέρου στους χοίρους [16] . Επιπλέον, η από του στόματος χορήγηση του B. subtilis θα μπορούσε να προκαλέσει χυμικές και κυτταρικές ανοσοαποκρίσεις στη διατήρηση της ομοιόστασης του εντέρου από τα δενδριτικά κύτταρα (DCs) [17] . Τα DCs είναι τα πιο σημαντικά επαγγελματικά αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και μπορούν να ρυθμίσουν αποτελεσματικά τους τίτλους αντισωμάτων [18] . Τα DCs υπάρχουν φυσικά στον λεμφικό ιστό που σχετίζεται με το έντερο (GALT), συμπεριλαμβανομένων των επιθεμάτων Peyer (PPs), των απομονωμένων λεμφοειδών ωοθυλακίων (ILFs), των μεσεντερικών λεμφαδένων (MLNs) και διασκορπίζονται σε όλο το υποεπιθηλιακό lamina propria (LP) του λεπτού εντέρου και άνω και κάτω τελεία [19] . Επιπλέον, το B. subtilis είναι βολικό για γενετικούς χειρισμούς και έχει αναπτύξει μια μεγάλη ποικιλία γενετικών εργαλείων [20] . Ως εκ τούτου, το B. subtilis χρησιμοποιείται ευρέως ως αποτελεσματικό σύστημα χορήγησης εμβολίου για την επαγωγή ανοσολογικών αποκρίσεων του βλεννογόνου και παρουσιάζει μοναδική επίδραση στο ανοσοποιητικό σύστημα. Στην παρούσα έκθεση, διερευνήσαμε το ανοσοποιητικό αποτέλεσμα ενός ανασυνδυασμένου B. subtilis (B. subtilis-RC ) που είχε κατασκευαστεί επιτυχώς με έκφραση πρωτεΐνης PEDV COE σε χοιρίδια. Η έρευνά μας έδειξε ότι το B. subtilis-RC ήταν ευεργετικό για την ανάπτυξη του ανοσοποιητικού συστήματος του βλεννογόνου και θα μπορούσε να δημιουργήσει αποτελεσματικά ειδικά αντισώματα κατά της λοίμωξης PEDV, υποδηλώνοντας μια πιθανή προσέγγιση για την πρόληψη της μόλυνσης από PEDV. Το B. subtilis WB800 παρασχέθηκε ευγενικά από τον Δρ. Xuewen Gao (από το τμήμα φυτοπαθολογίας του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Nanjing) [21] . Το B. subtilis-RC που κατασκευάστηκε προηγουμένως στο εργαστήριό μας ήταν σε θέση να εκφράσει το γονίδιο COE (499-638 αμινοξέα στην πρωτεΐνη S). Πριν από τη χορήγηση από το στόμα, το ανασυνδυασμένο στέλεχος αναπτύχθηκε σε ζωμό LB στους 37 • C για 12 ώρες, και στη συνέχεια πλύθηκε δύο φορές με PBS και εναιωρήθηκε σε PBS για να φτάσει σε τελική συγκέντρωση 1 × 10 10 CFU/ml. Το στέλεχος PEDV Zhejiang08 παρασχέθηκε από το Κέντρο Έρευνας Κτηνιατρικής Ιατρικής της Beijing Dabeinong Technology Group Co., Ltd. [22] . Ο ιός καλλιεργήθηκε σε κύτταρα νεφρού αφρικανικού πράσινου πιθήκου (κύτταρα Vero) και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας μια ασυνεχή βαθμίδα πυκνότητας σακχαρόζης. Ο ιός απενεργοποιήθηκε από την υπεριώδη ακτινοβολία σε δόση UV 4 J/cm 2 για 24 ώρες για να επιτευχθεί πλήρης απώλεια μολυσματικότητας [23] . Η συγκέντρωση καθαρισμένου ιού μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA (Thermo Fisher, ΜΑ, U.S.A.). ELISA: IgG κατά των χοίρων κουνελιού (υπεροξειδάση χρένου (HRP)), IgA κατσίκας αντι-χοίρου (HRP) αγοράστηκαν από την Abcam. Δεύτερο αντίσωμα: DyLight 649-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας κατά IgG ποντικού, DyLight 488-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού IgG, DyLight 594-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού IgG αγοράστηκαν από τη Multi-science, Hangzhou, Κίνα. Το σύστημα που βασίζεται σε ABC (βιοτινυλιωμένο αντίσωμα κατσίκας κατά κουνελιού IgG) χρησιμοποιήθηκε ως δευτερεύον αντίσωμα με DAB καθώς ένα χρωμογόνο αγοράστηκε από το Boster, Wuhan, Κίνα. Ειδικά χοιρίδια DLY χωρίς παθογόνα (SPF) (Duroc and Landrace and Yorkshire) παρέχεται ευγενικά από την Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, Κίνα). Τα πειράματα σε ζώα είχαν εγκριθεί από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Γεωπονικού Πανεπιστημίου της Ναντζίνγκ και ακολουθούσαν τις οδηγίες του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας για τη διεξαγωγή πειραμάτων σε ζώα. Δώδεκα νεογέννητα χοιρίδια χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες (τέσσερα χοιρίδια σε κάθε ομάδα) και στεγάστηκαν υπό παρόμοιες συνθήκες σε διαφορετικούς στάβλους προκειμένου να αποφευχθεί η διασταυρούμενη μόλυνση με προβιοτικά. Στα χοιρίδια χορηγήθηκε από το στόμα 100 μl B. subtilis-RC. Οι ομάδες ελέγχου των χοιριδίων χορηγήθηκαν από το στόμα με απενεργοποιημένο PEDV (100 μg/δόση) και ίσο όγκο PBS. Το πρωτόκολλο ανοσοποίησης πραγματοποιήθηκε στα χοιρίδια ηλικίας 5 ημερών (Εικόνα 1C) και υπογράφηκε ως 0 ημέρας. Στη συνέχεια χορηγήθηκαν αναμνηστικές ανοσοποιήσεις σε 5 ημέρες. Στη συνέχεια, η συλλογή του δείγματος πραγματοποιήθηκε κάθε 7 ημέρες μετά την αναμνηστική ανοσοποίηση (Εικόνα 1C). Δείγματα αίματος συλλέγονταν εβδομαδιαίως από όλα τα χοιρίδια μετά την ενισχυτική ανοσοποίηση και αφέθηκαν να πήξουν όλη τη νύχτα σε θερμοκρασία δωματίου για τη συλλογή ορού. Τα δείγματα αίματος διαχωρίστηκαν με φυγοκέντρηση και αποθηκεύτηκαν στους -20 • C προκειμένου να ανιχνευθούν τα επίπεδα των ειδικών IgG και IgA. Συλλέγονταν τρία επιχρίσματα κάθε εβδομάδα με διάρκεια 1 μήνα, συμπεριλαμβανομένων ρινικών, στοματικών και κοπράνων για την ELISA. Τα γουρουνάκια θυσιάστηκαν σε 33 ημέρες. Η ίδια θέση των ιστών του λεπτού εντέρου και του ειλεού από κάθε χοιρίδιο στερεώθηκε με υγρό Bonn και 4% παραφορμαλδεΰδη. Οι ιστοί του λεπτού εντέρου στην ίδια θέση στερεώθηκαν με Bouin Fixative Solution για 24 ώρες, ενσωματώθηκαν σε παραφίνη και τεμαχίστηκαν στα 4 μm πάχος. Τα τμήματα τοποθετήθηκαν σε γυάλινες διαφάνειες. Εφαρμόστηκε χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης στις τομές παραφίνης, στη συνέχεια παρατήρηση και λήψη φωτογραφιών σε οπτικό μικροσκόπιο (OLYMPUS CX23). Ο αριθμός των ενδοεπιθηλιακών λεμφοκυττάρων (IELs) μετρήθηκε σε κάθε 100 επιθηλιακά κύτταρα κάτω από το ίδιο μικροσκόπιο πολλαπλού φωτός μεταξύ δέκα εικόνων από κάθε ομάδα [24] . Η ανίχνευση ανοσοϊστοχημείας πραγματοποιήθηκε με το κιτ SABC (Boster Bioscience). Το υπεροξείδιο του υδρογόνου χρησιμοποιήθηκε για την απενεργοποίηση της ενδογενούς υπεροξειδάσης. Η ανάκτηση αντιγόνου διεξήχθη σε λουτρό νερού χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό κιτρικού-EDTA (10 mM κιτρικό οξύ, 2 mM EDTA, 0,05% Tween 20, ρΗ 6,2). Οι τομές επωάστηκαν με αραιωμένο αντίσωμα αντι-IgA (1:100; Abcam) κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 • C. Ως αρνητικοί μάρτυρες, η ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε με επώαση δειγμάτων με αντιορό ελέγχου αντί για πρωτογενές αντίσωμα. Η προσθήκη σημασμένου με βιοτίνη δευτερογενούς αντισώματος στις αντικειμενοφόρους πλάκες ακολουθήθηκε με προσθήκη σημασμένης με HRP στρεπταβιδίνης. Μετά τη χρώση με DAB, οι διαφάνειες καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας ψηφιακή κάμερα (Leica-DM4000B) [25] . Τα απομονωμένα έντερα με PP μεταφέρθηκαν σε παγωμένο PBS. Στη συνέχεια, το υπόλοιπο λίπος και ο συνδετικός ιστός αφαιρέθηκαν και πλύθηκαν επιμελώς με παγωμένο PBS. Στη συνέχεια, το έντερο κόπηκε κατά μήκος σε θραύσματα 0,5 cm. Τα θραύσματα επωάστηκαν με 5 ml 30 mM EDTA και τοποθετήθηκαν σε 5 ml διαλύματος πέψης που περιείχε 4% FBS, 0,5 mg/ml έκαστο κολλαγενάσης D (Roche) και DNase I (Sigma) και 50 U/ml Dispase (Fisher) . Τα θραύσματα επωάστηκαν με Dulbecco's PBS (DPBS) για 20 λεπτά στους 37 • C με αργή περιστροφή (100 rpm). Μετά την επώαση, η στιβάδα των επιθηλιακών κυττάρων που περιείχε τα IELs διαχωρίστηκε με έντονη δίνη και πέρασε μέσα από ένα φίλτρο κυττάρων 70 μm. Το εναιώρημα ενός κυττάρου συλλέχθηκε και πλύθηκε δύο φορές με DPBS, το διάλυμα στροβιλίστηκε έντονα και πέρασε μέσα από ένα φίλτρο κυττάρων 40 μm. Τα υπερκείμενα πλύθηκαν με προψυγμένο μέσο RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific) και εναιωρήθηκαν με 10 ml του κλάσματος 40% μιας βαθμίδωσης Percoll 40:80, που επιστρώθηκε σε 5 ml του κλάσματος 80% σε ένα σωλήνα Falcon 15 ml. Ο διαχωρισμός κλίσης Percoll πραγματοποιήθηκε με φυγοκέντρηση για 20 λεπτά στις 2500 rpm. Τα LP λεμφοκύτταρα (LPLs) συλλέχθηκαν στη μεσοφάση της βαθμίδωσης Percoll, στη συνέχεια πλύθηκαν και εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα FACS ή μέσο Τ κυττάρων. Στο μεταξύ, πραγματοποιήθηκε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής σε όργανα BD Facscalibur (BD Biosciences) και αναλύθηκε από το λογισμικό FlowJo. Όλα τα αντισώματα αγοράστηκαν από την BD Pharmingen ή την eBiosciences. Τα απομονωμένα εναιωρήματα μονοκυττάρων χρωματίστηκαν με αντι-CD3-APC, αντι-CD4-FITC, αντι-CD8-PE, όλα σε αραίωση 1:100 για 30 λεπτά σε πάγο, και πλύθηκαν με PBS δύο φορές και αναλύθηκαν με FACS [26 Οι κυτοκίνες ιντερλευκίνη (IL) 10 (IL-10) και IL-1β (Abcam) μετρήθηκαν με ELISA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δεδομένα ελήφθησαν σε έναν αυτοματοποιημένο αναγνώστη πλακών ELISA σε OD 450 nm αμέσως. Τα εξουδετερωτικά αντισώματα PEDV μετρήθηκαν σε υγρό πλύσης εντέρου με δοκιμή εξουδετέρωσης μείωσης της πλάκας (PRNT). Η δοκιμή πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως με μικρές τροποποιήσεις [27] . Συνολικά 450 μl υγρού πλυσίματος εντέρου αραιώθηκαν δύο φορές σειριακά και αναμίχθηκαν με 50 μl ιικού εναιωρήματος που περιείχε 10 3 TCID 50 ιό PEDV για 1 ώρα στους 37 • C σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας με επίπεδο πυθμένα 12 φρεατίων. Το μίγμα στη συνέχεια εμβολιάστηκε για 1 ώρα στους 37 • C και 5% CO2. Στη συνέχεια, το μείγμα εμβολιάστηκε με εναιώρημα κυττάρων Vero (περίπου 1,0 × 10 6 ml −1 ) για άλλες 3-4 ημέρες. Μετά τη χρώση με Crystal Violet, οι πλάκες παρατηρήθηκαν σε μικροσκόπιο για κυτταροπαθητικό αποτέλεσμα. Τα δεδομένα λήφθηκαν ως μέσος όρος + − S.E.M. τριών επαναλήψεων ανά δοκιμή σε ένα μόνο πείραμα. Το GraphPad Prism V6.0 (San Diego, CA, U.S.A.) χρησιμοποιείται για την εκτέλεση στατιστικών αναλύσεων. Οι δοκιμές πολλαπλής σύγκρισης του Tukey και η μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση της σημασίας της διαφοράς μεταξύ των μέσων. Οι τιμές P μικρότερες από 0,05 (P<0,05) θεωρήθηκαν σημαντικές και οι τιμές P μικρότερες από 0,01 (P<0,01) ως εξαιρετικά σημαντικές. Τα PPs είναι ένα συμπύκνωμα λεμφικού ιστού και η κύρια θέση για την παραγωγή ανοσοσφαιρίνης Α (IgA) που είναι ζωτικής σημασίας για τη ρύθμιση της ομοιοστατικής ισορροπίας του εντέρου [28] . Η περιοχή των ΡΡ είναι βασικός δείκτης ανοσίας. Η από του στόματος χορήγηση με B. subtilis-RC αύξησε σημαντικά (Ρ<0,01) την περιοχή των ΡΡ σε σύγκριση με δύο ομάδες ελέγχου όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α. Επιπλέον, το μήκος των λαχνών του ειλεού μεγάλωσε με χορήγηση από το στόμα με B. subtilis-RC (Ρ<0,01) από τις άλλες δύο ομάδες (Εικόνα 1Β). Αυτά επιβεβαίωσαν κυρίως ότι το B. subtilis-RC ήταν ευεργετικό για τη διατήρηση της δομής του εντέρου. Τα εντερικά IEL είναι ένας μεγάλος και ποικίλος πληθυσμός λεμφοειδών κυττάρων που κατοικούν στα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα (IECs) και σχηματίζουν τον φραγμό του εντερικού βλεννογόνου [29] . Τα IEL είναι σημαντικό μέρος του ανοσοποιητικού συστήματος του εντερικού βλεννογόνου. Το επίπεδο του ειδικού αντισώματος αντι-PEDV εκκρίνουσας IgA + ειλεού (SIgA) σε χοιρίδια μετρήθηκε με ELISA στο στόμα και στα κόπρανα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, Β, η ειδική για αντιγόνο βλεννογόνος SIgA στις παραπάνω θέσεις ήταν σαφώς υψηλότερη από την απενεργοποιημένη ομάδα PEDV (Ρ<0,05 ή Ρ<0,01). Όπως αναμενόταν, το στόμα είχε υψηλότερα επίπεδα SIgA από άλλα σημεία. Μετά την από του στόματος ανοσοποίηση, το επίπεδο του αντισώματος αντι-PEDV IgG ορού σε χοιρίδια ανοσοποιημένα με B. subtilis-RC, απενεργοποιημένο PEDV ή PBS προσδιορίστηκε με ELISA, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι παρόλο που οι τίτλοι έπεσαν κατά τη διάρκεια της περιόδου δειγματοληψίας, το επίπεδο IgG του B. subtilis-RC εξακολουθεί να αυξάνεται σημαντικά από 0 σε 33 ημέρες σε σχέση με την ομάδα του απενεργοποιημένου PEDV (P<0,05 ή P<0,01). Τα λεμφοκύτταρα CD3 + Τ είναι τα θεμελιώδη δείκτες κυτταρικής επιφάνειας των Τ λεμφοκυττάρων, επομένως, ο αριθμός των CD3 + Τ λεμφοκυττάρων θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει την ποσότητα των Τ λεμφοκυττάρων. Κατά συνέπεια, αναλύσαμε τον αριθμό των CD3 + Τ λεμφοκυττάρων στον ειλεό. Τα δεδομένα έδειξαν ότι τόσο το B. subtilis-RC όσο και το απενεργοποιημένο PEDV θα μπορούσαν δραματικά (Ρ<0,05) να αυξήσουν τα CD3 + Τ λεμφοκύτταρα σε σύγκριση με την ομάδα PBS (Εικόνα 4Α). Αυτές οι αλλαγές έδειξαν σίγουρες ενδείξεις ότι η από του στόματος χορήγηση με B. subtilis-RC είχε καλή επίδραση στην ανοσία του εντερικού βλεννογόνου στα χοιρίδια. Το SIgA είναι ο κύριος ισότυπος ανοσοσφαιρίνης στα ζώα, που εκκρίνεται σε μεγάλο βαθμό στην επιφάνεια του εντερικού βλεννογόνου ειδικά στο λεπτό έντερο [30] . Το SIgA παίζει σημαντικό ρόλο στην ανοσία του εντερικού βλεννογόνου και αντανακλά την ανοσία του εντερικού βλεννογόνου. Μετά τη χορήγηση από το στόμα με B. subtilis-RC, ο αριθμός των κυττάρων που εκκρίνουν IgA είχε αυξηθεί γρήγορα σε σύγκριση με τις άλλες δύο ομάδες (Ρ<0,05) (Εικόνα 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η από του στόματος χορήγηση με B. subtilis-RC ήταν ευνοϊκή για την ανοσία του εντερικού βλεννογόνου και θα μπορούσε να αυξήσει τον αριθμό των κυττάρων που εκκρίνουν IgA για να παράγουν θετικά αποτελέσματα έναντι της μόλυνσης από PEDV. Πολλά κύτταρα του ανοσοποιητικού είναι διάσπαρτα στα επιθηλιακά κύτταρα. Τα IEC αλληλεπιδρούν έμμεσα ή άμεσα με τα έμφυτα και προσαρμοστικά κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος παρουσιάζοντας αντιγόνα στα λεμφοκύτταρα [31] . Κατά συνέπεια, η εκμάθηση για το πώς κατανέμονται τα λεμφοκύτταρα στον βλεννογόνο του λεπτού εντέρου είναι πολύ σημαντική για την ανοσολογία του βλεννογόνου. Προηγούμενα δεδομένα είχαν δείξει ότι τα CD3 + Τ λεμφοκύτταρα αυξήθηκαν σημαντικά (Ρ<0,05) (Εικόνα 4Α), επομένως αναλύσαμε περαιτέρω την ανοσολογική ταξινόμηση των CD3 + Τ λεμφοκυττάρων. Το λεμφοκύτταρο του ειλεού με τη σύνδεση PPs απομονώθηκε και τα λεμφοκύτταρα των CD3, CD4 και CD8 αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής τριών χρωμάτων (Εικόνα 5Α). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα CD3 + CD4 + Τ κύτταρα έχουν προφανώς αυξηθεί (Ρ<0,01) (Σχήμα 5Β), ωστόσο τα CD3 + CD8 + Τ κύτταρα μειώθηκαν αξιοσημείωτα (Ρ<0,05) (Εικόνα 5C). Μετά τον υπολογισμό, η αναλογία των CD4 + / CD8 + Τ κυττάρων αυξήθηκε (Εικόνα 5D). Αυτή η αναλογία θα μπορούσε επίσης να μετρήσει περαιτέρω τα επίπεδα ανοσίας των χοιριδίων. Τα επίπεδα κυτοκίνης IL-1β και IL-10 προσδιορίστηκαν για να αξιολογηθούν οι κυτταρικές ανοσοαποκρίσεις που προκαλούνται από το B. subtilis-RC όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, Β. Όπως μπορούμε να δούμε από το διάγραμμα, σημαντικά (Ρ<0,01) υψηλότερη IL-1β και IL-10 παρήχθησαν μετά από χορήγηση από το στόμα με B. subtilis-RC από τις άλλες δύο ομάδες. Όλα αυτά αποκάλυψαν ότι το B. subtilis-RC θα μπορούσε να διεγείρει την απελευθέρωση κυτοκινών για να μεσολαβήσει στην επικοινωνία με και μεταξύ των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος, βελτιώνοντας την ανοσοαπόκριση του βλεννογόνου στη μόλυνση από PEDV. Τα εξουδετερωτικά αντισώματα PEDV ανιχνεύθηκαν με ανάλυση PRNT. Η από του στόματος χορήγηση με B. subtilis-RC θα μπορούσε να μειώσει αποτελεσματικά την ικανότητα σχηματισμού πλάκας του PEDV (P<0,01) σε σύγκριση με άλλες δύο ομάδες στο Σχήμα 7. Αυτό αποκάλυψε ότι το B. subtilis-RC θα μπορούσε να διεγείρει υψηλά επίπεδα εξουδετερωτικών αντισωμάτων PEDV έναντι της μόλυνσης από PEDV. Εν μέσω της επιδημίας PEDV, έχουν αναπτυχθεί διάφορα εμβόλια για τον έλεγχο ασθενειών και τα αποτελέσματα δεν είναι ικανοποιητικά. Τα από του στόματος εμβόλια μπορούν να προκαλέσουν πιο ισχυρή ανοσία του βλεννογόνου από τα ενέσιμα εμβόλια [32] . Επομένως, η από του στόματος ανοσοποίηση έχει εμφανιστεί ως μια αποτελεσματική στρατηγική για τον έλεγχο της επιδημίας PEDV [33] . Είναι πλέον σαφές ότι η αποτελεσματική ανοσολογική απόκριση του βλεννογόνου απαιτεί IgG ορού και SIgA του βλεννογόνου [34] . Το SIgA είναι η βάση του ανοσοποιητικού συστήματος του βλεννογόνου, διαδραματίζοντας σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης του ανοσοποιητικού και στην εξουδετέρωση των διεισδυτικών παθογόνων. Η IgG ορού αντιπροσωπεύει συστημικές ανοσολογικές αποκρίσεις. Κατά τη διάρκεια λοιμώξεων από PEDV, η ανοσοποίηση από το στόμα προκαλεί πολύ καλά όχι μόνο βλεννογονικές αλλά και συστημικές ανοσολογικές αποκρίσεις [35]. Τα δεδομένα μας έδειξαν ότι μια ισχυρή και μακροχρόνια απόκριση αντι-PEDV IgG ανιχνεύθηκε με χορήγηση από το στόμα με B. subtilis-RC σε χοιρίδια. Αν και όσο περνούσε ο καιρός, οι τίτλοι των αντισωμάτων μειώθηκαν λίγο, παρέμενε σε γενικές γραμμές σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου και σύμφωνα με την μεταβλητή τάση των αντισωμάτων. Η αλλαγή της ειδικής IgA έδειξε παρόμοια αποτελέσματα στον βλεννογόνο του στόματος και των κοπράνων. Όλες αυτές οι αλλαγές είχαν συμβάλει στην καταπολέμηση της λοίμωξης PEDV. Καθώς η επιπλέον ενίσχυση της ανοσίας, το B. subtilis-RC μείωσε την ικανότητα των παθογόνων να διασχίζουν τον εντερικό βλεννογόνο και τη συστηματική εξάπλωση των διεισδυτικών παθογόνων [36] . Το ανοσοποιητικό σύστημα του βλεννογόνου δημιουργεί ανοσολογικές αποκρίσεις μέσω των ανοσοκυττάρων που βρίσκονται στα διαμερίσματα του βλεννογόνου. Τα Τ λεμφοκύτταρα που βρίσκονται στον βλεννογόνο παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανοσία του βλεννογόνου [37]. Εξερευνήσαμε περαιτέρω τα είδη, τις ποσότητες και την κατανομή των Τ λεμφοκυττάρων στον βλεννογόνο του εντέρου. Το CD3 είναι ένας θεμελιώδης δείκτης κυτταρικής επιφάνειας των Τ λεμφοκυττάρων [38] . Το αποτέλεσμα έδειξε ότι ο αριθμός των CD3 + Τ λεμφοκυττάρων αυξήθηκε σημαντικά και αυτά αποκάλυψαν ότι το B. subtilis-RC θα μπορούσε να διεγείρει την ωρίμανση των Τ-κυττάρων. Σύμφωνα με τα μόρια που εκφράζονται στην κυτταρική επιφάνεια, τα Τ λεμφοκύτταρα μπορούν περαιτέρω να διαιρεθούν σε Τ βοηθητικά κύτταρα (CD4 + Τ κύτταρα) και κυτταροτοξικά Τ κύτταρα (CD8 + Τ κύτταρα) [39] . Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι η αναλογία των CD4 + / CD8 + Τ κυττάρων αυξήθηκε με χορήγηση από το στόμα. Η αναλογία CD4/CD8 μετρά την αναλογία Τ βοηθητικών κυττάρων προς κυτταροτοξικά Τ κύτταρα. Ως εκ τούτου, θα μπορούσαμε να δούμε ότι η από του στόματος χορήγηση B. subtilis-RC θα μπορούσε να ενισχύσει την Th1 ανοσοαπόκριση αυξάνοντας την αναλογία των CD4 + / CD8 + Τ κυττάρων. Η μορφολογία του λεπτού εντέρου μπορεί να αντανακλά άμεσα την υγεία του εντέρου και παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ανοσίας του εντέρου σύστημα [40] . Το πρώιμο στάδιο της λοίμωξης από PEDV συχνά συνοδεύεται από νέκρωση και απολέπιση μολυσμένων επιθηλιακών κυττάρων λαχνών, που τελικά οδηγεί σε οξεία, σοβαρή ατροφία των λαχνών [41] . Επομένως, η αποτελεσματική εργασία της διατήρησης της μορφολογίας του εντέρου είναι ένας καλός δείκτης για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας των εμβολίων. Μετά την από του στόματος χορήγηση με B. subtilis-RC, διαπιστώσαμε ότι η περιοχή των PPs επεκτάθηκε σημαντικά. Τα PP είναι μικρές μάζες λεμφικού ιστού και αποτελούν σημαντικό μέρος του ανοσοποιητικού συστήματος στρατολογώντας και επάγοντας τα Τ κύτταρα για να αποτρέψουν την ανάπτυξη παθογόνων στα έντερα. Επιπλέον, μια αύξηση στον αριθμό των IEL έδειξε την αποτελεσματικότητα του B. subtilis-RC. Επιπλέον, το μήκος των λαχνών του ειλεού έδειξε μερικά ενθαρρυντικά αποτελέσματα ότι μια καλά σχηματισμένη μορφολογία εντέρου δημιουργήθηκε από το B. subtilis-RC. Η ικανοποιητική μορφολογία του εντέρου ήταν το πρώτο βήμα στον δρόμο κατά της μόλυνσης από PEDV. Αρκετά μορφολογικά αποτελέσματα απέδειξαν ότι το B. subtilis-RC μπορούσε να διατηρήσει αξιοσημείωτα τη μορφολογία του εντέρου και να σχηματίσει ολοκληρωμένη προστασία. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, η από του στόματος χορήγηση με B. subtilis-RC θα μπορούσε να διεγείρει τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των Τ-κυττάρων και να ρυθμίσει την ανοσοαπόκριση. Επιπλέον, οι κυτοκίνες είναι πρωτεΐνες μικρού μορίου με ευρεία βιολογική δραστηριότητα, που συντίθενται και εκκρίνονται από κύτταρα του ανοσοποιητικού και ορισμένα μη ανοσοκύτταρα [42] . Ως κυτταρικό μόριο σηματοδότησης, δρα κυρίως για τη ρύθμιση των ανοσολογικών αποκρίσεων, συμμετέχοντας στη διαφοροποίηση και ανάπτυξη των ανοσοκυττάρων, μεσολαβώντας στις φλεγμονώδεις αποκρίσεις, διεγείροντας την αιμοποίηση και συμμετέχοντας στην επισκευή των ιστών. Προηγούμενες μελέτες είχαν δείξει ότι το PEDV ανέστειλε τόσο τις NF-κB όσο και τις προφλεγμονώδεις κυτοκίνες [43] . Επομένως, οι κυτοκίνες αποτελούν βασικό δείκτη για την αξιολόγηση της ικανότητας ενός εμβολίου να διεγείρει τις ανοσολογικές αποκρίσεις. Σε αυτή τη μελέτη, είχαμε παρατηρήσει ότι η IL-1β και η IL-10 αυξήθηκαν σημαντικά (P<0,01). Η IL-1β είναι μια από τις πρώτες προφλεγμονώδεις κυτοκίνες και εμπλέκεται κεντρικά στην έναρξη και ρύθμιση φλεγμονωδών και εγγενών ανοσολογικών αποκρίσεων. Η έρευνα είχε δείξει ότι η IL-1β θα μπορούσε να ρυθμίσει σημαντικά τους τοπικούς και συστημικούς ανοσοποιητικούς ιστούς μετά τη μικροβιακή μόλυνση [44] . Επιπλέον, η IL-10 είναι μια ισχυρή αντιφλεγμονώδης κυτοκίνη που παίζει ουσιαστικό ρόλο στην πρόληψη φλεγμονωδών και αυτοάνοσων παθολογιών [45] . Συνοπτικά, και τα δύο δεδομένα έδειξαν ότι η από του στόματος χορήγηση με B. subtilis-RC ρύθμισε και ενίσχυσε την ανοσία ρυθμίζοντας προς τα πάνω τις κυτοκίνες IL-1β και IL-10. Συμπερασματικά, τα παρόντα αποτελέσματα έδειξαν ότι η από του στόματος ανοσοποίηση με B. subtilis-RC θα μπορούσε αποτελεσματικά επάγουν τοπικές βλεννογονικές και συστηματικές ανοσολογικές αποκρίσεις κατά της λοίμωξης PEDV, ενώ ενισχύουν και ρυθμίζουν την ανοσοποιητική λειτουργία αυξάνοντας την αναλογία των CD4 + / CD8 + Τ κυττάρων και των κυτοκινών IL-1β και IL-10, υποδεικνύοντας έτσι ένα πολλά υποσχόμενο από του στόματος εμβόλιο υποψήφιο για PEDV μόλυνση σε χοιρίδια.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 2608, "text": "επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου" } ], "id": 603, "question": "Ποια κύτταρα μολύνονται από τον ιό PED;" }, { "answers": [ { "answer_start": 15621, "text": "βλεννογόνος" } ], "id": 604, "question": "Τι είδους ανοσοαποκρίσεις είναι πιο αποτελεσματικές στην πρόληψη του ιού PED;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4171, "text": "γαστρικά οξέα, πεψίνη και θρυψίνη" } ], "id": 605, "question": "Ποιοι εντερικοί παράγοντες μπορεί να μειώσουν την αποτελεσματικότητα των από του στόματος χορηγούμενων εμβολιασμών;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4807, "text": "Gram-θετικό βακτήριο" } ], "id": 606, "question": "Τι είναι ο Bacillus subtilis;" }, { "answers": [ { "answer_start": 20153, "text": "IgG ορού και SIgA του βλεννογόνου" } ], "id": 611, "question": "Ποιοι παράγοντες καθορίζουν μια αποτελεσματική ανοσολογική απόκριση του βλεννογόνου;" }, { "answers": [ { "answer_start": 25443, "text": "κυτοκίνες" } ], "id": 612, "question": "Ποιος είναι ένας αποτελεσματικός δείκτης της ικανότητας ενός εμβολίου να δημιουργεί ανοσοαπόκριση;" }, { "answers": [ { "answer_start": 24576, "text": "προφλεγμονώδεις κυτοκίνες" } ], "id": 613, "question": "Τι είναι η ιντερλευκίνη-1βήτα;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "SARS στον νέο κορονοϊό – παλιά μαθήματα και νέα μαθήματαhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7026896/SHA: 5d254ed178c092d3639ce70ae9653593acc471f9Συγγραφείς: Brian McClos; Heymann, David L.Date: 2020-02-05DOI: 10.1017/s0950268820000254License: cc-byAbstract: Η απάντηση στο νέο ξέσπασμα του κοροναϊού στην Κίνα υποδηλώνει ότι πολλά από τα μαθήματα από την επιδημία του 2003 έχουν βελτιωθεί και η αντιμετώπιση του SARS συνέπεια. Ωστόσο, ορισμένα ερωτήματα παραμένουν και δεν ήταν όλα τα μαθήματα επιτυχημένα. Η εθνική και διεθνής ανταπόκριση καταδεικνύει τη σύνθετη σχέση μεταξύ της δημόσιας υγείας, της επιστήμης και της πολιτικής όταν μια επιδημία απειλεί να επηρεάσει τις παγκόσμιες οικονομίες και τη φήμη. Τα πρωτοφανή μέτρα που εφαρμόζονται στην Κίνα είναι μια τολμηρή προσπάθεια για τον έλεγχο της επιδημίας – πρέπει να κατανοήσουμε την αποτελεσματικότητά τους για να εξισορροπήσουμε το κόστος και τα οφέλη για παρόμοια γεγονότα στο μέλλον. Κείμενο: Στις 29 Δεκεμβρίου 2019 οι κλινικοί γιατροί σε ένα νοσοκομείο στην πόλη Γουχάν της Κίνας παρατήρησαν ομαδοποίηση περιπτώσεων ασυνήθιστης πνευμονίας (με το πρώτο κρούσμα που εντοπίστηκε εκείνη την εποχή στις 12 Δεκεμβρίου) με προφανή σχέση με μια αγορά που πουλά ζωντανά ψάρια, πουλερικά και ζώα στο κοινό. Αυτό το συμβάν αναφέρθηκε στον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (ΠΟΥ) στις 31 Δεκεμβρίου [1]. Μέσα σε 4 εβδομάδες, έως τις 26 Ιανουαρίου 2020, ο αιτιολογικός οργανισμός είχε εντοπιστεί ως νέος κοροναϊός, το γονιδίωμα του ιού είχε προσδιοριστεί και δημοσιευτεί, αναπτύχθηκαν τεστ αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής, είχε ενεργοποιηθεί το προσχέδιο Ε&Α του ΠΟΥ για επιτάχυνση διαγνωστικά, θεραπευτικά και ανάπτυξη εμβολίων και ένα υποψήφιο εμβόλιο ήταν έτοιμο για αρχική εργαστηριακή δοκιμή. Επί του παρόντος οι κινεζικές υγειονομικές αρχές χτίζουν ένα νοσοκομείο 1000 κλινών στη Γουχάν σε 10 ημέρες. Μέχρι τις 26 Ιανουαρίου επίσης, σχεδόν 50 εκατομμύρια άνθρωποι στη Γουχάν και τις γειτονικές πόλεις είχαν τεθεί ουσιαστικά σε καραντίνα, ενώ ο ΠΟΥ είχε αποφασίσει ότι το συμβάν δεν θα έπρεπε ακόμη να δηλωθεί ως Έκτακτης Έκτακτης Ανάγκης για τη Δημόσια Υγεία Διεθνούς Ανησυχίας (PHEIC) [2] και δεν είχε συστήσει συγκεκριμένους ταξιδιωτικούς περιορισμούς. Ο ΠΟΥ έχει υπογραμμίσει τη σημασία του ελέγχου εξόδου σε λιμάνια σε χώρες που παρουσιάζουν μετάδοση του νέου κοροναϊού και έχει παράσχει καθοδήγηση για τις χώρες που εφαρμόζουν έλεγχο εισόδου στα αεροδρόμια, ενώ αναγνωρίζει ότι τα στοιχεία για την αποτελεσματικότητα του ελέγχου εισόδου είναι αμφίβολα. Αυτή η απάντηση είναι μια από τις πιο γρήγορες , συντονισμένες παγκόσμιες απαντήσεις σε μια αναδυόμενη μολυσματική ασθένεια που έχει δει ο κόσμος στη σύγχρονη εποχή, αλλά είναι η κατάλληλη απάντηση, θα είναι αποτελεσματική και είναι βιώσιμη; Σύμφωνα με την έκθεση κατάστασης που δημοσιεύθηκε από τον ΠΟΥ στις 28 Ιανουαρίου 2020 [3], συνολικά 2798 επιβεβαιωμένα κρούσματα 2019-nCoV έχουν αναφερθεί παγκοσμίως. Από αυτά, 2761 κρούσματα ήταν από την Κίνα, συμπεριλαμβανομένου του Χονγκ Κονγκ (8 περιπτώσεις), του Μακάο (5) και της Ταϊπέι (4). Τριάντα επτά επιβεβαιωμένα κρούσματα έχουν αναφερθεί εκτός Κίνας σε έντεκα χώρες στην Ευρώπη, τη Βόρεια Αμερική, την Αυστραλία και την Ασία. Από αυτά τα 37 κρούσματα που εξήχθησαν, τα 36 είχαν ιστορικό ταξιδιού από την Κίνα ή επιδημιολογική σύνδεση με κρούσμα από την Κίνα. Από τα επιβεβαιωμένα κρούσματα στην Κίνα, 461 έχουν αναφερθεί ως σοβαρά άρρωστα, με 80 θανάτους μέχρι σήμερα. Αυτό το ξέσπασμα και η ανταπόκριση σε αυτό καταδεικνύουν ορισμένα βασικά ζητήματα σχετικά με τον τρόπο με τον οποίο έχει εξελιχθεί η παγκόσμια ετοιμότητα και η ικανότητα ανταπόκρισης για εστίες κατά τη διάρκεια σχεδόν δύο δεκαετιών από τη σοβαρή επιδημία του οξέος αναπνευστικού συνδρόμου (SARS) του 2002/3 και ποια διδάγματα έχουν, ή όχι, αντληθεί. Εγείρει επίσης ερωτήματα σχετικά με τον αντίκτυπο που είχαν αυτά τα μαθήματα στον τρόπο με τον οποίο οι υπηρεσίες και οι κυβερνήσεις ανταποκρίνονται σε αυτά τα γεγονότα και για τον ρόλο του ΠΟΥ και των Διεθνών Κανονισμών Υγείας (IHR). Ένα από τα κρίσιμα μαθήματα από την εμπειρία του SARS ήταν η απόλυτη αναγκαιότητα να είναι σε θέση να συντονίζει τους διεθνείς πόρους που είναι διαθέσιμοι σε ένα ξέσπασμα και να τους επικεντρώνει στον προσδιορισμό προτεραιοτήτων και στην επίλυση προβλημάτων. Ο ΠΟΥ καθιέρωσε τα μέσα για να γίνει αυτό για το SARS και έκτοτε έχει αναπτυχθεί περαιτέρω και ενσωματωθεί στην παγκόσμια ετοιμότητα, ειδικά μετά την επιδημία Έμπολα στη Δυτική Αφρική. Οργανισμοί όπως το Global Outbreak Alert and Response Network (GOARN), η Coalition for Epidemic Preparedness Innovations (CEPI), η Global Research Collaboration for Infectious Disease Preparedness (GloPID-R) και η Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID) έχουν υποστηρίχθηκε από το Ερευνητικό Προσχέδιο του ΠΟΥ και τον Παγκόσμιο Συντονιστικό Μηχανισμό του για να παρέχει ένα φόρουμ όπου όσοι έχουν την τεχνογνωσία και την ικανότητα να συμβάλλουν στη διαχείριση νέων απειλών μπορούν να συναντηθούν τόσο μεταξύ όσο και κατά τη διάρκεια των εστιών για να αναπτύξουν καινοτόμες λύσεις σε αναδυόμενα προβλήματα. Αυτός ο παγκόσμιος συντονισμός ήταν ενεργός στο ξέσπασμα του νέου κοροναϊού. Το σύστημα ανταπόκρισης του ΠΟΥ περιλαμβάνει τρεις εικονικές ομάδες που βασίζονται σε αυτές που αναπτύχθηκαν για το SARS για τη συλλογή πληροφοριών σε πραγματικό χρόνο για την ενημέρωση κατευθυντήριων γραμμών σε πραγματικό χρόνο και ένα πρώτο υποψήφιο εμβόλιο είναι έτοιμο για εργαστηριακή δοκιμή εντός 4 εβδομάδων από την αναγνώριση του ιού. Ένας άλλος βασικός παράγοντας για την επιτυχή πρόληψη και Η διαχείριση των αναδυόμενων απειλών είναι η ταχεία και διαφανής ανταλλαγή πληροφοριών μεταξύ χωρών και φορέων. Υπήρξε εκτεταμένη κριτική στην Κίνα για την αντιληπτή αποτυχία της να μοιραστεί πληροφορίες σχετικά με την αναδυόμενη λοίμωξη SARS αρκετά νωρίς κατά το ξέσπασμα, ώστε να επιτρέψει στις χώρες να προετοιμαστούν και να ανταποκριθούν. Υπήρχαν παρόμοιες ανησυχίες σχετικά με την ανταλλαγή πληροφοριών καθώς το αναπνευστικό σύνδρομο της Μέσης Ανατολής (MERS) εμφανίστηκε και εξελίχθηκε στη Μέση Ανατολή το 2012, ιδιαίτερα στη Σαουδική Αραβία, και για την εμφάνιση του Έμπολα στη Δυτική Αφρική το 2014. Σε αυτήν την περίπτωση, η ανταλλαγή πληροφοριών φαίνεται να έχει ήταν γρήγορη και αποτελεσματική (ενώ αναγνωρίζεται ότι οι διαθέσιμες πληροφορίες στα αρχικά στάδια μιας επιδημίας είναι πάντα λιγότερες από ό,τι θα ήθελε η παγκόσμια κοινότητα). Ο ΠΟΥ ειδοποιήθηκε για την αρχική ομαδοποίηση εντός ημερών και η πλήρης γονιδιωματική αλληλουχία του νέου ιού δημοσιεύτηκε λιγότερο από 2 εβδομάδες μετά την πρώτη ανίχνευση της συστάδας. Ο ΠΟΥ εξέφρασε την ικανοποίησή του για τις ενέργειες των κινεζικών αρχών όσον αφορά την ανταλλαγή πληροφοριών με τον ΠΟΥ. Η συνεργασία με δημοσιογράφους και τα μέσα ενημέρωσης για να τους βοηθήσει να κατανοήσουν την επιστήμη και την επιδημιολογία, ιδιαίτερα σε ένα γεγονός που εξελίσσεται γρήγορα, θα βελτιώσει την επικοινωνία κινδύνου στο κοινό και μειώστε τις ακατάλληλες ανησυχίες και τον πανικό. Ενώ η αναφορά αυτής της επιδημίας δείχνει σημάδια των προσπαθειών επιδημιολόγων, ειδικών λοιμωξιογόνων, εθνικών και διεθνών φορέων δημόσιας υγείας και άλλων που ασχολούνται με δημοσιογράφους, υπάρχουν επίσης ενδείξεις ότι αυτό δεν έχει ακόμη επιτύχει τον στόχο του. Για παράδειγμα, η κοινή αντίληψη είναι ότι η αύξηση των αριθμών κρουσμάτων που αναφέρονται καθημερινά από τις κινεζικές αρχές αντιπροσωπεύει μια καθημερινή κλιμάκωση της επιδημίας, ενώ η πραγματικότητα είναι ότι αυτοί οι αριθμοί είναι επίσης αποτέλεσμα ενεργών, επιθετικών, εύρεσης κρουσμάτων στην Κίνα και ορισμένων από αυτές. Τα κρούσματα είναι «παλιές» περιπτώσεις που πρόσφατα αναγνωρίστηκαν ότι οφείλονται στον νέο κορωνοϊό. Ομοίως, ο ιός συνήθως περιγράφεται από τα μέσα ενημέρωσης ως «θανατηφόρος» και παρόλο που αυτό ισχύει με την έννοια ότι έχει προκαλέσει θανάτους, οι αποχρώσεις των αβέβαιων ποσοστών θνησιμότητας στα αρχικά στάδια μιας επιδημίας δεν κοινοποιούνται. Το τρέχον εκτιμώμενο ποσοστό θνησιμότητας φαίνεται να είναι περίπου 3%, το οποίο είναι σημαντικό αλλά δεν συγκρίνεται με το ποσοστό 10% για το SARS ή 34% που αναφέρθηκε για το MERS. Αυτές οι λανθασμένες αντιλήψεις εξακολουθούν να προκαλούν ανησυχία στο κοινό. Για τη συμπλήρωση των επίσημων μηχανισμών αναφοράς μεταξύ των χωρών και με τον ΠΟΥ (συμπεριλαμβανομένου του ΔΚΥ), υποστηρίχθηκε η χρήση άτυπων μηχανισμών όπως τα μέσα ενημέρωσης και οι αναφορές των μέσων κοινωνικής δικτύωσης υπό το πρίσμα της εμπειρίας του SARS. Υπάρχουν πλέον παγκοσμίως πολλά συστήματα που παρέχουν συγκεντρωμένες πληροφορίες από ανεπίσημες αναφορές, συμπεριλαμβανομένων δικτύων εμπειρογνωμόνων και σάρωσης μέσων και μέσων κοινωνικής δικτύωσης. Αυτά συμβάλλουν και ενισχύουν την επιδημική ευφυΐα και ενσωματώνονται με εθνικά και διεθνή συστήματα επιτήρησης. Η αξία και οι προκλήσεις αυτής της πρόσθετης πηγής πληροφοριών είναι εμφανείς στο τρέχον ξέσπασμα. Η αξία προέρχεται από τη διασφάλιση ότι έχουν εντοπιστεί πρώιμες ενδείξεις κρουσμάτων πέρα ​​από την αρχική πόλη εστίας και μπορεί να συμπληρώσει την παγκόσμια εκτίμηση κινδύνου και την παρακολούθηση της εξέλιξης της επιδημίας. Οι προκλήσεις έγκεινται στον όγκο και την ποικιλομορφία των διαθέσιμων πληροφοριών και τη σχετική έλλειψη μηχανισμών επαλήθευσης, έτσι ώστε ένα από αυτά τα συστήματα (ProMed) σχολίασε ότι γινόταν όλο και πιο δύσκολο να αφομοιωθούν οι πληροφορίες που παρέχονται [4] και να έχουν νόημα ερμηνείες. Στις αρχές της επιδημίας αναφέρθηκε ότι οι εργαζόμενοι στον τομέα της υγείας δεν είχαν μολυνθεί. Αυτό ήταν καθησυχαστικό γιατί οι εργαζόμενοι στον τομέα της υγείας είναι αυτοί που πολλές φορές, και ακούσια, ενισχύουν τη μετάδοση. Η αποτυχία πλυσίματος των χεριών μεταξύ ασθενών, για παράδειγμα, μπορεί να οδηγήσει όχι μόνο σε αυτομόλυνση, αλλά και σε μόλυνση ασθενών που νοσηλεύονται για άλλες αιτίες όταν παρέχουν φροντίδα. Η αυτομόλυνση δεν αποτελεί κίνδυνο μόνο για τον εργαζόμενο στον τομέα της υγείας, αλλά και για τις οικογένειές του και τις κοινότητες στις οποίες ζουν, ανάλογα με τη μεταδοτικότητα και τα μέσα μετάδοσης. Πιο πρόσφατα επιβεβαιώθηκε μόλυνση και τουλάχιστον ένας θάνατος σε εργαζόμενους στον τομέα της υγείας. Αν και δεν ήταν απροσδόκητο, αυτό αυξάνει τον επιδημιολογικό κίνδυνο. Ένα χαρακτηριστικό της επιδημίας SARS ήταν η μεταβλητότητα της μεταδοτικότητας μεταξύ των κρουσμάτων και η εμφάνιση «υπερδιασπαρμένων συμβάντων» όπου ένα κρούσμα μόλυνε σημαντικά περισσότερες επαφές από τον μέσο όρο. Αυτό φάνηκε επίσης με τον MERS στο ξέσπασμα στη Δημοκρατία της Κορέας (RoK). Σε αυτήν την τρέχουσα έξαρση του νέου κοροναϊού, τέτοια γεγονότα υπερδιάδοσης δεν έχουν τεκμηριωθεί, αλλά η επιδημιολογία δεν είναι ακόμα σαφής. Η επιβεβαίωση του εάν αυτό συμβαίνει ή όχι πρέπει να είναι μια επείγουσα αποστολή για την κινεζική έρευνα. Οι μοντελιστές έχουν προτείνει αναπαραγωγικούς ρυθμούς (R 0 ) 3,8 (95% διάστημα εμπιστοσύνης, 3,6-4,0) [5] και 2,6 (1,5-3,5) [6]. Το R 0 για το SARS υπολογίστηκε σε περίπου 3 ελλείψει μέτρων ελέγχου [7] .Ο οικονομικός αντίκτυπος των μεγάλων εστιών μπορεί να είναι σημαντικός για την πληγείσα χώρα. Αυτό φάνηκε ξεκάθαρα στο SARS, το MERS στο RoK και τον Έμπολα στη Δυτική Αφρική. Ένας αναλυτής εκτιμά ότι ο πιθανός αντίκτυπος της τρέχουσας επιδημίας του κοροναϊού θα κυμαίνεται από μείωση 0,8% στο πραγματικό ΑΕΠ εάν η επιδημία ελεγχθεί εντός 3 μηνών, σε κόστος 1,9% για το ΑΕΠ εάν η επιδημία διαρκέσει 9 μήνες [8] . Αυτό μπορεί να αυξηθεί σημαντικά υπό το πρίσμα των εκτεταμένων περιορισμών στις μετακινήσεις, και συνεπώς στο εμπόριο και στο εμπόριο, εντός της Κίνας. Η εμφάνιση μιας σημαντικής αναπνευστικής νόσου που συνδέεται με έναν νέο κορωνοϊό αντιπροσωπεύει μια δοκιμή της παγκόσμιας ικανότητας εντοπισμού και διαχείρισης απειλών αναδυόμενων ασθενειών. Η εμφάνισή του στην Κίνα προσθέτει μια πρόσθετη διάσταση υπό το πρίσμα της προηγούμενης εμπειρίας με το SARS. Ο χρόνος εμφάνισης της επιδημίας αμέσως πριν από το Κινεζικό Σεληνιακό Νέο Έτος με τις συνακόλουθες μετακινήσεις πληθυσμού προσθέτει επιπλέον κίνδυνο και επείγουσα ανάγκη στην ανταπόκριση. Η ταχεία ανταλλαγή πληροφοριών σε αυτήν την εστία και η ταχύτητα της συντονισμένης αντίδρασης τόσο στη χώρα όσο και διεθνώς υποδηλώνουν ότι έχουν μάθει από το SARS ότι βελτιώνουν την παγκόσμια ικανότητα. Τα διεθνή δίκτυα και φόρουμ που υπάρχουν τώρα έχουν διευκολύνει τη συγκέντρωση εμπειρογνωμοσύνης από όλο τον κόσμο για να επικεντρωθούν οι προσπάθειες έρευνας και ανάπτυξης και να μεγιστοποιηθεί ο αντίκτυπος.Σε αυτό το πρώιμο στάδιο της έξαρσης οι πληροφορίες παραμένουν ελλιπείς και βασικά κλινικά και επιδημιολογικά ερωτήματα δεν έχουν ακόμη διευθετηθεί απάντησε, αλλά το έλλειμμα φαίνεται να οφείλεται περισσότερο στους περιορισμούς της διερεύνησης μιας αναδυόμενης ασθένειας παρά σε οποιαδήποτε απροθυμία να εμπλακούν και να μοιραστούν πληροφορίες με τους εταίρους. Υπάρχουν ορισμένες ενδείξεις για τομείς στους οποίους απαιτείται περαιτέρω βελτίωση. Η παγκόσμια ανταπόκριση των μέσων ενημέρωσης στα εξελισσόμενα γεγονότα ήταν σχετικά ισορροπημένη και ενημερωμένη, αλλά οι αποχρώσεις της εξελισσόμενης κατάστασης δεν έχουν εξεταστεί κριτικά σε συνεργασία με τα μέσα ενημέρωσης και ως εκ τούτου η δημόσια αντίληψη του κινδύνου μπορεί να είναι υπερβολική, αν και φυσικά παραμένει πιθανό ότι το ξέσπασμα θα αναπτυχθεί με τρόπο που να ταιριάζει με τον αντιληπτό κίνδυνο. Η έλλειψη εκτίμησης των αβεβαιοτήτων στον καθορισμό ενός σημαντικού ποσοστού θνησιμότητας κρουσμάτων και η σημασία της μεροληψίας διαπίστωσης στην αρχή μιας επιδημίας, μαζί με τον αντίκτυπο της επιθετικής εύρεσης κρουσμάτων στους αριθμούς των κρουσμάτων, είναι παραδείγματα όπου θα μπορούσε να βελτιωθεί η κατανόηση. Αυτή είναι πάντα μια προκλητική διαδικασία κατά την εξισορρόπηση των πόρων που επικεντρώνονται στην ανάλυση της κατάστασης στο έδαφος με πόρους που στοχεύουν στην ερμηνεία των πληροφοριών για τους δημοσιογράφους, αλλά στο SARS, το R 0 φάνηκε να μειώνεται ως απόκριση στις πληροφορίες που έφτασαν στο κοινό και στη συνέχεια το κοινό υιοθετούσε δράσεις μείωσης του κινδύνου [6]· Έτσι, η ακριβής επικοινωνία του δημόσιου κινδύνου είναι κρίσιμη για την επιτυχία. Θα ήταν χρήσιμο να βρεθεί ένα φόρουμ όπου αυτό μπορεί να διερευνηθεί με την κοινότητα των μέσων ενημέρωσης μετά την εκδήλωση. Η αύξηση της πρόσβασης σε πρώιμες πληροφορίες από διάφορες πηγές, συμπεριλαμβανομένων των μέσων ενημέρωσης και των μέσων κοινωνικής δικτύωσης προσθέτει μια σημαντική διάσταση στον εντοπισμό και την παρακολούθηση νέων γεγονότων παγκοσμίως και αποτελεί βασικό μέρος του συνολικού συστήματος πληροφοριών για την επιδημία. Ωστόσο, είναι επίσης μια πιθανή πηγή παραπληροφόρησης. Όταν, όπως έχει φανεί σε αυτήν την επιδημία, ο όγκος των πληροφοριών που έρχονται υπερβαίνει κάθε ικανότητα αντιπαραβολής και ανάλυσής τους και προσπάθειας διασταύρωσης και επαλήθευσης ξεχωριστών στοιχείων, υπάρχει κίνδυνος οι πληροφορίες να τροφοδοτούν εικασίες και μέσα ενημέρωσης και δημόσια ανησυχία . Και πάλι, υπάρχει μια λεπτή ισορροπία μεταξύ των πληροφοριών που ενθαρρύνουν κατάλληλες ενέργειες αποφυγής κινδύνου και των πληροφοριών που ενθαρρύνουν ακατάλληλες ενέργειες. Ωστόσο, η δημόσια υγεία συνήθως εξυπηρετείται καλύτερα από περισσότερες πληροφορίες παρά λιγότερες. Ο ρόλος μιας δήλωσης PHEIC στη διαχείριση μιας σοβαρής εστίας έχει αμφισβητηθεί υπό το φως του Έμπολα στη Δυτική Αφρική και στη Λαϊκή Δημοκρατία του Κονγκό [9] και αμφισβητήθηκε ξανά με αυτό το ξέσπασμα. Η δυαδική φύση μιας δήλωσης PHEIC (είτε ένα συμβάν είναι PHEIC είτε δεν είναι, δεν υπάρχουν ενδιάμεσες επιλογές) και η ιδιαιτερότητα των τριών καθορισμένων κριτηρίων για μια PHEIC έχουν προκαλέσει δυσκολία στις Επιτροπές Έκτακτης Ανάγκης να εξετάσουν εάν ένα δεδομένο γεγονός θα πρέπει να είναι PHEIC. Η έλλειψη σαφής κατανόησης του τι προορίζεται να επιτύχει μια δήλωση PHEIC προσθέτει στις δυσκολίες της Επιτροπής Έκτακτης Ανάγκης, όπως και η σχετική έλλειψη κλινικών και επιδημιολογικών απαντήσεων σε αυτό το στάδιο της έρευνας. Σε αυτήν την περίπτωση, η Επιτροπή Έκτακτης Ανάγκης διχάστηκε ως προς το συμπέρασμα, αλλά αποφάσισε εξίσου ότι η τρέχουσα κατάσταση, αν και είναι έκτακτη, δεν θα έπρεπε ακόμη να κηρυχθεί PHEIC [2]. Όπως και με τον Έμπολα στη ΛΔΚ, υπήρξε κριτική στον ΠΟΥ για αυτή την απόφαση, αλλά, όπως και με τον Έμπολα, δεν είναι αμέσως σαφές τι θα ήταν διαφορετικό στην απάντηση εάν δηλωθεί PHEIC. Ο ΠΟΥ εργάζεται για τη βελτίωση του τρόπου τις οποίες οι Επιτροπές Έκτακτης Ανάγκης αναπτύσσουν τις συμβουλές τους για τον Γενικό Διευθυντή, αλλά, όπως προτείνεται από αυτήν την Επιτροπή Έκτακτης Ανάγκης και την Επιτροπή Αναθεώρησης IHR μετά τον Έμπολα το 2015, η ανάπτυξη μιας ενδιάμεσης προειδοποίησης παράλληλα με τη διαδικασία αξιολόγησης κινδύνου του ΠΟΥ μπορεί να είναι χρήσιμη. Μια βασική λειτουργία ενός PHEIC Η δήλωση είναι ότι είναι η (μόνη) πύλη προς τις Προσωρινές Συστάσεις του ΠΟΥ για πιθανούς περιορισμούς ταξιδιών και εμπορίου για τον περιορισμό της διεθνούς εξάπλωσης μιας ασθένειας. Σε αυτήν την περίπτωση, αρκετές χώρες παγκοσμίως είχαν ήδη εφαρμόσει έλεγχο εισόδου στα αεροδρόμια και η Κίνα είχε αρχίσει να κλείνει τα διεθνή ταξίδια από το Γουχάν προτού η Επιτροπή Έκτακτης Ανάγκης ολοκληρώσει τις συζητήσεις της. Ενώ ο ΠΟΥ δεν θα επενέβαινε και δεν θα μπορούσε να παρέμβει στις κυρίαρχες αποφάσεις των κρατών μελών, η έλλειψη επιρροής στις ταξιδιωτικές και εμπορικές αποφάσεις θα μπορούσε να αποδειχθεί προβληματική. Παράλληλα με την ταχύτητα της αντίδρασης σε αυτήν την επιδημία, έχουμε δει δραματικές αλλαγές στην κλίμακα της απάντησης. Η επιβολή πολύ εκτεταμένων μέτρων καραντίνας σε εκατομμύρια ανθρώπους ως προσπάθεια να σπάσει η μετάδοση του ιού είναι άνευ προηγουμένου. Δεν γνωρίζουμε αν θα είναι αποτελεσματικά. Πράγματι, δεν ξέρουμε πώς θα προσδιορίσουμε εάν ήταν αποτελεσματικά ποιο τελικό σημείο μπορούμε να μετρήσουμε που θα δώσει απάντηση σε αυτό το ερώτημα; Εάν επιβεβαιωθούν οι πρόσφατες προτάσεις ότι τα άτομα που έχουν μολυνθεί από αυτόν τον κοροναϊό μπορεί να είναι μολυσματικά κατά την επώαση ή ασυμπτωματικά και οι αναφορές ότι έως και 5 εκατομμύρια άνθρωποι έφυγαν από την Ουχάν πριν επιβληθούν οι ταξιδιωτικοί περιορισμοί, επιβεβαιωθούν, η αποτελεσματικότητα αυτών των μέτρων ελέγχου θα αμφισβητηθεί περισσότερο. τον πιθανό αντίκτυπο τουλάχιστον στην κινεζική οικονομία και πιθανώς στην παγκόσμια οικονομία, θα είναι σημαντικό να κατανοήσουμε τον ρόλο και την αποτελεσματικότητα των μέτρων δημόσιας υγείας σε αυτήν την κλίμακα για το μέλλον. Ωστόσο, η επιβολή αυτών των δραματικών μέτρων δημιουργεί επίσης ένα ευρύτερο ερώτηση: εάν υπάρχει αντίκτυπος από αυτά τα μέτρα, ποιες άλλες χώρες θα (ή θα μπορούσαν) να εφαρμόσουν τέτοια μέτρα; Θα αποδέχονταν άλλες χώρες την αυτοεπιβεβλημένη οικονομική ζημιά που δέχθηκε η Κίνα για να προσπαθήσει να περιορίσει αυτό το ξέσπασμα; Είναι λογικό να θεωρηθεί ότι οι εθνικές κυβερνήσεις θα έκλειναν τις δημόσιες συγκοινωνίες προς και από το Λονδίνο, τη Νέα Υόρκη ή το Παρίσι την εβδομάδα πριν από τα Χριστούγεννα, ακόμη κι αν αποδεικνυόταν ότι ήταν ένα αποτελεσματικό μέτρο ελέγχου; Αυτές οι αποφάσεις και τα ερωτήματα διασχίζουν τη διεπαφή μεταξύ της δημόσιας υγείας , επιστήμη και πολιτική. Η απάντηση σε αυτό το ξέσπασμα στην Κίνα επηρεάστηκε αναπόφευκτα από την ιστορική αντίδραση στην απάντηση της χώρας στο SARS και την υποψία του κόσμου για την έλλειψη συνεργασίας της Κίνας εκείνη την εποχή. Επομένως, η τρέχουσα ανταπόκριση πλαισιώνεται σε ένα πλαίσιο που δεν θέλει να δει ότι συμπεριφέρεται με τον ίδιο τρόπο με αυτό το συμβάν. Αυτό μπορεί να υποδηλώνει μια άλλη επίδραση της εμπειρίας του SARS (και του MERS και του Έμπολα) στην ανταπόκριση σε επακόλουθη τάση εμφάνισης επιδημίας στη χειρότερη περίπτωση και να ανταποκριθεί ανάλογα και φόβος «να το κάνουμε λάθος». Αυτό μπορεί να αποτρέψει τους ηγέτες σε όλα τα επίπεδα, από τις ομάδες επιδημιών έως τις εθνικές κυβερνήσεις, από το να κάνουν κρίσεις όταν όλες οι πληροφορίες που θα ήθελαν δεν είναι διαθέσιμες σε περίπτωση που αυτές οι κρίσεις αποδειχθούν λανθασμένες όταν καταστούν διαθέσιμες οι πλήρεις πληροφορίες. Σε περίπτωση αντιμετώπισης έκτακτης ανάγκης είναι γενικά καλύτερα να αντιδράσετε υπερβολικά και στη συνέχεια να μειώσετε εάν είναι απαραίτητο παρά να υποχωρήσετε και μετά να ενεργήσετε πολύ αργά. Η ανταπόκριση θα πρέπει να βασίζεται σε «χωρίς λύπη» να λαμβάνει τις καλύτερες δυνατές αποφάσεις βάσει των καλύτερων πληροφοριών και επιστημών που είναι διαθέσιμες εκείνη τη στιγμή, αλλά μην κρίνετε ή επικρίνετε εάν μεταγενέστερες πληροφορίες προτείνουν διαφορετική πορεία δράσης. Η πρώιμη ανταπόκριση πρέπει να αναγνωρίζει τι είναι γνωστό και τι δεν είναι γνωστό και να εξετάζει τι από τα άγνωστα μπορεί εύλογα να εκτιμηθεί με αναφορά σε προηγούμενα κρούσματα, παρόμοια παθογόνα, έγκαιρη αναφορά και μοντελοποίηση κ.λπ. Η εκτίμηση κινδύνου και η απόκριση μπορούν στη συνέχεια να τροποποιηθούν και να βελτιωθούν καθώς εξελίσσονται οι πληροφορίες για τα άγνωστα. Κλειδί σε αυτήν την προσέγγιση, ωστόσο, είναι η εμπιστοσύνη ότι οι αποφάσεις δεν θα επικριθούν με βάση πληροφορίες που δεν ήταν διαθέσιμες εκείνη τη στιγμή. Είναι επίσης σημαντικό να είμαστε έτοιμοι να αλλάζουμε αποφάσεις όταν αλλάζουν οι διαθέσιμες πληροφορίες κάτι που μπορεί να δυσκολευτεί τόσο οι επιστήμονες όσο και οι πολιτικοί. Σε αυτό το πλαίσιο, η Κίνα δεν θα πρέπει να κριθεί για την εφαρμογή ακραίων μέτρων, αλλά η Κίνα θα πρέπει επίσης να είναι έτοιμη να σταματήσει τα μέτρα γρήγορα εάν τα στοιχεία δείχνουν ότι δεν είναι ο καλύτερος τρόπος επίλυσης του προβλήματος. Με το κλείσιμο των αεροδρομίων η διεθνής εξάπλωση από τη Γουχάν μπορεί να μειωθεί, αλλά η επιτυχία θα εξαρτηθεί από το πόσο αποτελεσματικά είναι πραγματικά τα μέτρα για την αναχαίτιση της μετακίνησης των ανθρώπων από την πληγείσα περιοχή καθώς και από τη συμπεριφορά του ιού. Όπως πάντα, μόνο ο χρόνος θα δείξει, αλλά ο χρόνος είναι σπάνιος.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 1338, "text": "31 Δεκεμβρίου" } ], "id": 1202, "question": "Πότε ενημερώθηκε για πρώτη φορά ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (ΠΟΥ) για την επιδημία SARS-CoV-2 στην πόλη Γουχάν της Κίνας;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1386, "text": "26 Ιανουαρίου 2020" } ], "id": 1203, "question": "Πότε ανακαλύψαμε ότι ο SARS-CoV-2, που προκαλεί το COVID-19, ήταν ένας νέος κορονοϊός;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1365, "text": "4 εβδομάδες" } ], "id": 1204, "question": "Πόσος χρόνος χρειάστηκε για να εντοπιστεί η αιτία του COVID-19;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1836, "text": "νοσοκομείο 1000 κλινών" } ], "id": 1206, "question": "Πόσο μεγάλο ήταν το προσωρινό νοσοκομείο που κατασκευάστηκε στην πόλη Γουχάν για τη θεραπεία ασθενών με COVID-19;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5651, "text": "διαφανής ανταλλαγή πληροφοριών μεταξύ χωρών και φορέων" } ], "id": 1208, "question": "Ποιος είναι ο βασικός παράγοντας για τη διαχείριση των αναδυόμενων απειλών μολυσματικών ασθενειών;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6107, "text": "2012" } ], "id": 1209, "question": "Ποια χρονιά εμφανίστηκε η επιδημία MERS;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6582, "text": "2 εβδομάδες" } ], "id": 1210, "question": "Πόσος χρόνος χρειάστηκε για τη δημοσίευση της πλήρους γονιδιωματικής αλληλουχίας του SARS-CoV-2 μετά την ταυτοποίησή του;" }, { "answers": [ { "answer_start": 8109, "text": "10%" } ], "id": 1211, "question": "Ποιο ήταν το ποσοστό θνησιμότητας για τον SARS-CoV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 8127, "text": "34%" } ], "id": 1212, "question": "Ποιο ήταν το ποσοστό θνησιμότητας για τον MERS;" }, { "answers": [ { "answer_start": 9166, "text": "τον όγκο και την ποικιλομορφία των διαθέσιμων πληροφοριών και τη σχετική έλλειψη μηχανισμών επαλήθευσης" } ], "id": 1213, "question": "Ποιες είναι μερικές προκλήσεις που σχετίζονται με τη χρήση των μέσων ενημέρωσης και των μέσων κοινωνικής δικτύωσης για τη λήψη πληροφοριών σχετικά με μια αναδυόμενη επιδημία;" }, { "answers": [ { "answer_start": 11326, "text": "3" } ], "id": 1216, "question": "Ποιο ήταν το R0 του SARS ελλείψει μέτρων ελέγχου;" }, { "answers": [ { "answer_start": 10383, "text": "όπου ένα κρούσμα μόλυνε σημαντικά περισσότερες επαφές από τον μέσο όρο" } ], "id": 1217, "question": "Τι είναι η υπερδιάδοση;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Ο βαθύς προσδιορισμός της αλληλουχίας των πρωτογενών ανθρώπινων επιθηλιακών κυττάρων του πνεύμονα που προκαλούνται με τον ιό της γρίπης H5N1 αποκαλύπτει έναν προϊικό ρόλο για το CEACAM1 Cowled, Christopher J.; Yap, Cheng-Hon; Stambas, JohnDate: 2018-10-19DOI: 10.1038/s41598-018-33605-6License: cc-byAbstract: Οι τρέχουσες προφυλακτικές και θεραπευτικές στρατηγικές που στοχεύουν τους ιούς της ανθρώπινης γρίπης περιλαμβάνουν εμβόλια και αντιικά. Δεδομένων των μεταβλητών ποσοστών αποτελεσματικότητας του εμβολίου και αντίστασης κατά των ιών, απαιτούνται επειγόντως εναλλακτικές στρατηγικές για τη βελτίωση των εκβάσεων της νόσου. Εδώ περιγράφουμε τη χρήση της βαθιάς αλληλουχίας HiSeq για την ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου ξενιστή σε πρωτογενή ανθρώπινα κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα τύπου ΙΙ που έχουν μολυνθεί από τον εξαιρετικά παθογόνο ιό H5N1 της γρίπης των πτηνών. 24 ώρες μετά τη μόλυνση, 623 γονίδια ξενιστές ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω, συμπεριλαμβανομένου του μορίου κυτταρικής προσκόλλησης CEACAM1. Η μόλυνση από τον ιό H5N1 διέγειρε σημαντικά υψηλότερη έκφραση πρωτεΐνης CEACAM1 σε σύγκριση με τον ιό της γρίπης A PR8 (H1N1), υποδηλώνοντας έναν βασικό ρόλο για το CEACAM1 στην παθογένεια του ιού της γρίπης. Επιπλέον, η σίγαση του ενδογενούς CEACAM1 είχε ως αποτέλεσμα μειωμένα επίπεδα προφλεγμονώδους παραγωγής κυτοκίνης/χημειοκίνης, καθώς και μειωμένα επίπεδα αναπαραγωγής του ιού μετά από μόλυνση από H5N1. Η μελέτη μας παρέχει στοιχεία για τη συμμετοχή του CEACAM1 σε ένα κλινικά σχετικό μοντέλο μόλυνσης από H5N1 και μπορεί να βοηθήσει στην ανάπτυξη αντιιικών στρατηγικών προσανατολισμένων στον ξενιστή. Κείμενο: Οι ιοί της γρίπης προκαλούν οξεία και εξαιρετικά μεταδοτική εποχική αναπνευστική νόσο σε όλες τις ηλικιακές ομάδες. Κάθε χρόνο αναφέρονται 3-5 εκατομμύρια περιπτώσεις σοβαρής ασθένειας που σχετίζεται με τη γρίπη και περισσότεροι από 250.000 θάνατοι. Εκτός από τα συνεχή εποχιακά κρούσματα, τα εξαιρετικά παθογονικά στελέχη της γρίπης των πτηνών (HPAI), όπως το H5N1, παραμένουν μια συνεχιζόμενη πανδημική απειλή με πρόσφατα στοιχεία του ΠΟΥ να δείχνουν 454 επιβεβαιωμένες εργαστηριακές λοιμώξεις και ποσοστό θνησιμότητας 53%. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι οι άνθρωποι έχουν πολύ μικρή προϋπάρχουσα ανοσία έναντι των στελεχών του ιού της γρίπης των πτηνών. Επιπλέον, δεν υπάρχει εμπορικά διαθέσιμο εμβόλιο για τον ανθρώπινο H5N1. Δεδομένης της πιθανότητας για τους ιούς H5N1 να πυροδοτήσουν μια πανδημία 1,2, υπάρχει επείγουσα ανάγκη να αναπτυχθούν νέες θεραπευτικές παρεμβάσεις για την καταπολέμηση γνωστών ελλείψεων στην ικανότητά μας να ελέγχουμε τα κρούσματα. Οι τρέχουσες προφυλακτικές και θεραπευτικές στρατηγικές για τον ιό της εποχικής γρίπης περιλαμβάνουν τη χρήση εμβολιασμού και αντιιικών φαρμάκων. Η αποτελεσματικότητα του εμβολίου ποικίλλει σε μεγάλο βαθμό, όπως αποδεικνύεται από μια ιδιαίτερα σοβαρή επιδημία του 2017/18, και απαιτείται συχνή επανασκευή του εμβολίου για την καταπολέμηση των συνεχιζόμενων μεταλλάξεων στο γονιδίωμα του ιού της γρίπης. Επιπλέον, έχει αναφερθεί αντίσταση κατά των ιών για πολλά στελέχη που κυκλοφορούν, συμπεριλαμβανομένου του ιού H7N9 της γρίπης των πτηνών που εμφανίστηκε το 2013 3, 4 . Οι ιοί της γρίπης Α έχει επίσης αποδειχθεί ότι στοχεύουν και παραβιάζουν πολλαπλές κυτταρικές οδούς του ξενιστή για να προάγουν την επιβίωση και την αναπαραγωγή 5, 6 . Ως εκ τούτου, υπάρχουν αυξανόμενα στοιχεία που υποδηλώνουν ότι η στόχευση των μονοπατιών του ξενιστή θα επηρεάσει την αναπαραγωγή του ιού, τη φλεγμονή, την ανοσία και την παθολογία 5, 7 . Εναλλακτικές στρατηγικές παρέμβασης που βασίζονται στη διαμόρφωση της απόκρισης του ξενιστή θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για να συμπληρώσουν τα τρέχοντα προφυλακτικά και θεραπευτικά πρωτόκολλα. Ενώ ο αντίκτυπος της λοίμωξης από τον ιό της γρίπης έχει μελετηθεί σχετικά καλά σε ζωικά μοντέλα 8, 9, οι ανθρώπινες κυτταρικές αποκρίσεις είναι ανεπαρκώς καθορισμένες λόγω έλλειψη διαθέσιμου ανθρώπινου υλικού αυτοψίας, ειδικά από ασθενείς που έχουν μολυνθεί από τον ιό HPAI. Στην παρούσα μελέτη, χαρακτηρίσαμε τη μόλυνση από τον ιό της γρίπης πρωτογενών ανθρώπινων κυψελιδικών επιθηλιακών κυττάρων τύπου II (ATII) που απομονώθηκαν από φυσιολογικό ανθρώπινο πνευμονικό ιστό που δωρήθηκε από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε εκτομή πνεύμονα. Τα κύτταρα ATII είναι ένα φυσιολογικά σχετικό μοντέλο μόλυνσης καθώς αποτελούν κύριο στόχο για τους ιούς της γρίπης Α κατά την είσοδο στην αναπνευστική οδό 10 . Η έκφραση του ανθρώπινου γονιδίου ξενιστή μετά από μόλυνση από τον ιό HPAI H5N1 (A/Chicken/ Vietnam/0008/04) των πρωτογενών κυττάρων ATII αναλύθηκε με τη χρήση βάθους αλληλουχίας Illumina HiSeq. Προκειμένου να κατανοήσουμε καλύτερα τους μηχανισμούς που διέπουν τη ρύθμιση της ανοσίας του ξενιστή σε ένα αντιφλεγμονώδες περιβάλλον, αναλύσαμε επίσης τις αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση μετά από μόλυνση HPAI H5N1 παρουσία του αναστολέα αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), της αποκυνίνης, μιας ένωσης γνωστό ότι παρεμβαίνει στη διάταξη υπομονάδας οξειδάσης NADPH 5, 6. Η ανάλυση HiSeq που περιγράφεται εδώ έχει επικεντρωθεί σε διαφορικά ρυθμιζόμενα γονίδια μετά από μόλυνση από H5N1. Πολλά κριτήρια λήφθηκαν υπόψη κατά την επιλογή ενός «χτύπημα» για περαιτέρω μελέτη. Αυτά περιελάμβαναν: (1) Καινοτομία. έχει μελετηθεί στο παρελθόν αυτό το γονίδιο στο πλαίσιο της λοίμωξης/παθογένεσης από τον ιό της γρίπης; (2) Ανοσορρύθμιση. έχει αυτό το γονίδιο ρυθμιστικό ρόλο στις ανοσολογικές αποκρίσεις του ξενιστή, έτσι ώστε να έχει τη δυνατότητα χειραγώγησης για τη βελτίωση της ανοσίας; (3) Θεραπευτικά αντιδραστήρια. υπάρχουν κάποια υπάρχοντα εμπορικά διαθέσιμα θεραπευτικά αντιδραστήρια, όπως ειδικοί αναστολείς ή ανασταλτικά αντισώματα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για in vitro και in vivo μελέτη προκειμένου να βελτιστοποιηθούν οι θεραπευτικές στρατηγικές; (4) Ζωικά μοντέλα. υπάρχει διαθέσιμο μοντέλο ποντικιού knock-out για in vivo μελέτες λοίμωξης γρίπης; Με βάση αυτά τα κριτήρια, το μόριο 1 κυτταρικής προσκόλλησης που σχετίζεται με καρκινοεμβρυονικό αντιγόνο (CEA) (CEACAM1) επιλέχθηκε ως βασικό γονίδιο ενδιαφέροντος. Το CEACAM1 (επίσης γνωστό ως BGP ή CD66) εκφράζεται σε επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κύτταρα 11 , καθώς και σε Β κύτταρα, Τ κύτταρα, ουδετερόφιλα, ΝΚ κύτταρα, μακροφάγους και δενδριτικά κύτταρα (DCs) [12] [13] [14] . Το ανθρώπινο CEACAM1 έχει αποδειχθεί ότι δρα ως υποδοχέας για πολλά ανθρώπινα βακτηριακά και μυκητιακά παθογόνα, συμπεριλαμβανομένων των Haemophilus influenza, Escherichia coli, Salmonella typhi και Candida albicans, αλλά δεν έχει ακόμη ενοχοποιηθεί για την είσοδο του ιού [15] [16] [17] . Ωστόσο, υπάρχουν αναδυόμενες ενδείξεις που υποδηλώνουν ότι το CEACAM1 εμπλέκεται στην ανοσία του ξενιστή, καθώς ανιχνεύθηκε ενισχυμένη έκφραση σε λεμφοκύτταρα σε έγκυες γυναίκες μολυσμένες με κυτταρομεγαλοϊό 18 και σε ιστό τραχήλου της μήτρας που απομονώθηκε από ασθενείς με λοίμωξη από ιό θηλώματος 19 .Έντεκα παραλλαγές ματίσματος CEACAM120 έχουν αναφερθεί σε ανθρώπους . Οι ισομορφές CEACAM1 (Uniprot P13688-1 έως -11) μπορεί να διαφέρουν ως προς τον αριθμό των παρόντων περιοχών που μοιάζουν με ανοσοσφαιρίνη, παρουσία ή απουσία διαμεμβρανικής περιοχής και/ή το μήκος της κυτταροπλασματικής τους ουράς (δηλ. L, μακρύ ή S, κοντό). Η πλήρους μήκους ανθρώπινη πρωτεΐνη CEACAM1 (CEACAM1-4L) αποτελείται από τέσσερις εξωκυτταρικές περιοχές (μία περιοχή παρόμοια με μεταβλητή περιοχή ανοσοσφαιρίνης (όπως IgV) και τρεις τομείς σταθερής περιοχής 2 (όμοια με IgC2) ανοσοσφαιρίνης), μια διαμεμβρανική περιοχή, και μια μακριά (L) κυτταροπλασματική ουρά. Η μακριά κυτταροπλασματική ουρά περιέχει δύο ανασταλτικά μοτίβα με βάση την τυροσίνη (ITIMs) ανοσοϋποδοχέων που απουσιάζουν στη σύντομη μορφή 20 . Οι πιο κοινές ισομορφές που εκφράζονται από ανθρώπινα ανοσοκύτταρα είναι το CEACAM1-4L και το CEACAM1-3L21. Το CEACAM1 αλληλεπιδρά ομοφιλικά με τον εαυτό του 22 ή ετεροφιλικά με το CEACAM5 (ένα συγγενικό μέλος της οικογένειας του CEACAM) 23 . Η διμερής κατάσταση επιτρέπει τη στρατολόγηση μορίων σηματοδότησης όπως οι κινάσες της οικογένειας SRC, συμπεριλαμβανομένης της περιοχής ομολογίας SRC 2 (SH2) της τυροσίνης φωσφατάσης που περιέχει πρωτεΐνη φωσφατάση τυροσίνης 1 (SHP1) και μέλη SHP2 για τη φωσφορυλίωση των ITIMs 24. Ως εκ τούτου, η παρουσία ή η απουσία ITIMs στις ισομορφές CEACAM1 επηρεάζει τις ιδιότητες σηματοδότησης και την κατάντη κυτταρική λειτουργία. Οι ομοφιλικές ή ετερόφιλες αλληλεπιδράσεις CEACAM1 και η φωσφορυλίωση ITIM είναι κρίσιμες για πολλές βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης της λειτουργίας των λεμφοκυττάρων, της ανοσοεπιτήρησης, της κυτταρικής ανάπτυξης και διαφοροποίησης 25, 26 και της ενεργοποίησης και προσκόλλησης ουδετερόφιλων στα κύτταρα στόχους κατά τη διάρκεια φλεγμονωδών αποκρίσεων 27 . Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η έκφραση CEACAM1 έχει διαμορφωθεί in vivo χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-CEACAM1 (MRG1) για την αναστολή της ανάπτυξης ξενομοσχεύματος μελανώματος θετικού CEACAM1 σε ποντικούς SCID/NOD 28 . Το MRG1 εμπόδισε τις ομοφιλικές αλληλεπιδράσεις του CEACAM1 που αναστέλλουν τη λειτουργία τελεστών Τ κυττάρων, ενισχύοντας τη θανάτωση των κυττάρων μελανώματος CEACAM1+ από τα Τ κύτταρα 28 . Αυτό υπογραμμίζει μια πιθανή οδό παρέμβασης που μπορεί να αξιοποιηθεί σε άλλες διαδικασίες ασθένειας, συμπεριλαμβανομένης της μόλυνσης από ιούς. Επιπλέον, ποντίκια Ceacam1-knockout είναι διαθέσιμα για περαιτέρω in vivo μελέτες μόλυνσης. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα επίπεδα έκφρασης του mRNA και της πρωτεΐνης CEACAM1 ήταν πολύ αυξημένα μετά τη μόλυνση από HPAI H5N1. Επιπλέον, η μικρή παρεμβαλλόμενη αναστολή του CEACAM1 με τη μεσολάβηση του RNA (siRNA) μείωσε την παραγωγή φλεγμονωδών κυτοκίνης και χημειοκίνης και το πιο σημαντικό, ανέστειλε την αντιγραφή του ιού H5N1 σε πρωτεύοντα ανθρώπινα κύτταρα ATII και στη συνεχή ανθρώπινη κυτταρική σειρά A549 του αναπνευστικού επιθηλίου τύπου II. Συνολικά, αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι το CEACAM1 είναι ένας ελκυστικός υποψήφιος για τη ρύθμιση της ειδικής ανοσίας για τη γρίπη. Συνοπτικά, η μελέτη μας εντόπισε έναν νέο στόχο που μπορεί να επηρεάσει την ανοσία του HPAI H5N1 και χρησιμεύει για να τονίσει τη σημασία του χειρισμού των αποκρίσεων του ξενιστή ως τρόπου βελτίωσης των αποτελεσμάτων της νόσου στο πλαίσιο της μόλυνσης από ιούς. Τρεις πειραματικές ομάδες συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση HiSeq Λοίμωξη H5N1 παρουσία ή απουσία του αναστολέα ROS, αποκυνίνη: (i) μη μολυσμένα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1% DMSO (έλεγχος φορέα) (ND), (ii) κύτταρα μολυσμένα με H5N1 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1% DMSO (HD) και (iii ) Κύτταρα μολυσμένα με H5N1 κατεργασμένα με 1 mM αποκυνίνη διαλυμένη σε DMSO (ΗΑ). Αυτές οι τρεις ομάδες αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας συγκρίσεις ανά ζεύγη: ND έναντι HD, ND έναντι HA και HD έναντι HA. Η λοίμωξη H5N1 και η θεραπεία με αποκυνίνη προκαλούν διαφορική έκφραση των γονιδίων του ξενιστή. Κύτταρα ATII που απομονώθηκαν από ανθρώπους ασθενείς 29, 30 μολύνθηκαν με H5N1 στην κορυφαία πλευρά σε πολλαπλότητα μόλυνσης (MOI) 2 για 24 ώρες και εκχυλίστηκε RNA. Το HiSeq εκτελέστηκε σε δείγματα και αναγνώσεις που χαρτογραφήθηκαν στο ανθρώπινο γονιδίωμα όπου στη συνέχεια συναρμολογήθηκαν σε μεταγραφώματα για ανάλυση διαφορικής έκφρασης. Συνολικά 13.649 γονίδια ταυτοποιήθηκαν με FPKM (θραύσματα ανά κιλοβάση εξονίου ανά εκατομμύριο θραύσματα χαρτογραφημένα) > 1 σε τουλάχιστον μία από τις τρεις πειραματικές ομάδες. Συνολικά 623 γονίδια ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω και 239 γονίδια ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα κάτω (τιμή q < 0,05, ≥2 φορές αλλαγή) μετά τη μόλυνση από H5N1 (ND έναντι HD) (Εικ. 1Α; Πίνακας S1). Η μόλυνση από HPAI H5N1 των κυττάρων ATII ενεργοποίησε μια αντιική κατάσταση, όπως αποδεικνύεται από την ανοδική ρύθμιση πολυάριθμων γονιδίων που προκαλούνται από ιντερφερόνη, γονιδίων που σχετίζονται με την άμυνα των παθογόνων, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση και τον μεταβολισμό (Πίνακας 1. Πίνακας S2). Επιπλέον, η χαρτογράφηση μονοπατιών της εγκυκλοπαίδειας των γονιδίων και γονιδιωμάτων του Κιότο (KEGG) έδειξε ότι πολλά από τα γονίδια που ρυθμίζονται προς τα πάνω στην ομάδα HD χαρτογραφήθηκαν σε σηματοδότηση TNF (hsa04668), σηματοδότηση υποδοχέα τύπου Toll (hsa04620), αλληλεπίδραση υποδοχέα κυτοκίνης-κυτοκίνης0406h ( ) και σηματοδότηση υποδοχέα τύπου RIG-I (hsa04622) ( Στην ομάδα που είχε μολυνθεί με H5N1 και υποβλήθηκε σε αγωγή με αποκυνίνη (HA), ένας μεγάλος αριθμός γονιδίων ρυθμίστηκε επίσης σημαντικά προς τα πάνω (509 γονίδια) ή μειώθηκε (782 γονίδια) (Εικ. 1Β; Πίνακας S1) σε σχέση με την ομάδα ελέγχου ND. Ενώ ένα υποσύνολο γονιδίων εκφράστηκε διαφορικά και στις ομάδες HD και HA, είτε ρυθμίζονται προς τα πάνω (247 γονίδια, Εικ. 1D ) ή μειωμένη ρύθμιση (146 γονίδια, Εικ. 1Ε), η πλειονότητα των γονιδίων στην πραγματικότητα δεν αλληλεπικαλύπτονταν μεταξύ των ομάδων HD και HA (Εικ. 1D, E). Αυτό υποδηλώνει ότι η θεραπεία με αποκυνίνη μπορεί να επηρεάσει την έκφραση γονιδίων ανεξάρτητα από τη μόλυνση από H5N1. Η ανάλυση εμπλουτισμού γονιδιακής οντολογίας (GO) γονιδίων που ρυθμίζονται προς τα πάνω από την αποκυνίνη έδειξε τη συμμετοχή του μονοπατιού σηματοδότησης ιντερφερόνης τύπου Ι (GO:0060337), την αμυντική απόκριση στον ιό (GO:0009615), την αρνητική ρύθμιση των ιικών διεργασιών (GO:48525) και η απόκριση στο στρες (GO:0006950) ( Πίνακας S2 , \"ND vs. HA Up\"). Τα γονίδια που ρυθμίζονται προς τα κάτω από την αποκυνίνη περιλαμβάνουν εκείνα που εμπλέκονται στην κυτταρική προσκόλληση (GO:0007155), στη ρύθμιση της κυτταρικής μετανάστευσης (GO:0030334), στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (GO:0042127), στη μεταγωγή σήματος (GO: 0007165) και στις διαδικασίες οξείδωσης-αναγωγής (GO:0055114) ( Πίνακας S2 , \"ND vs. HA Down\"). Συνολικά 623 γονίδια ρυθμίστηκαν προς τα πάνω μετά τη μόλυνση από H5N1 (\"ND vs. HD Up\", Εικ. 1F). Με την επικάλυψη των δύο καταλόγων γονιδίων από το \"ND vs. HD Up\" και το \"HD vs. HA Down\", 245 γονίδια αποδείχθηκε ότι ρυθμίζονται προς τα κάτω παρουσία αποκυνίνης (Εικ. 1F). Με την επικάλυψη τριών λιστών γονιδίων από τα \"ND vs. HD Up\", \"HD vs. HA Down\" και \"ND vs. HA Up\", 55 γονίδια από τα 245 γονίδια (190 συν 55 γονίδια) υπήρχαν και στις τρεις λίστες (Σύκο. 1G), υποδεικνύοντας ότι αυτά τα 55 γονίδια αναστέλλονταν σημαντικά από την αποκυνίνη αλλά σε επίπεδο που ήταν ακόμα σημαντικά υψηλότερο από αυτό σε μη μολυσμένα κύτταρα. Τα 55 γονίδια περιλαμβάνουν εκείνα που εμπλέκονται στην ανοσία της γρίπης Α (hsa05164; DDX58, IFIH1, IFNB1, MYD88, PML, STAT2), σηματοδότηση Jak-STAT (hsa04630; IFNB1, IL15RA, IL22RA1, STAT2), σηματοδότηση υποδοχέα τύπου RIG-I (hsa04622; DDX58, IFIH1, IFNB1) και επεξεργασία και παρουσίαση αντιγόνου (hsa04612; TAP2, TAP1, HLA-DOB) (Πίνακες S3 και S4) . Ως εκ τούτου, οι κρίσιμες ανοσολογικές αποκρίσεις που προκλήθηκαν μετά τη μόλυνση από H5N1 δεν μετριάστηκαν μετά τη θεραπεία με αποκυνίνη. Τα υπόλοιπα 190 από τα 245 γονίδια δεν υπήρχαν στη λίστα \"ND vs. HA Up\", υποδηλώνοντας ότι αυτά τα γονίδια αναστέλλονταν σημαντικά από την αποκυνίνη σε επίπεδο παρόμοιο με τα μη μολυσμένα κύτταρα ελέγχου (Εικ. 1G). Τα 190 γονίδια περιλαμβάνουν εκείνα που εμπλέκονται στη σηματοδότηση TNF (hsa04668; CASP10, CCL2, CCL5, CFLAR, CXCL5, END1, IL6, TRAF1, VEGFC), αλληλεπίδραση υποδοχέα κυτοκίνης-κυτοκίνης (hsa04060; VEGFC, IL6, CCL2, CXCL5, CXCL16, IL2RG, CD40, CCL5, CCL7, IL1A), μονοπάτι σηματοδότησης NF-kappa B (hsa04064: TRAF1, CFLAR, CARD11, TNFSF13B, TICAM1, σημείωση TICAM1, CD301; CCND1, GNB4, IL2RG, IL6, ITGA2, JAK2, LAMA1, MYC, IPK3AP1, TLR2, VEGFC) (Πίνακες S3 και S4). Αυτό συμφωνεί με τον ρόλο της αποκυνίνης στη μείωση της φλεγμονής 31 . Με την επικάλυψη των τριών λιστών γονιδίων από τα \"ND vs. HD Up\", \"HD vs. HA Down\" και \"ND vs. HA Down\", βρέθηκαν 11 γονίδια και στις τρεις συγκρίσεις (Εικ. 1Η). Αυτό υποδηλώνει ότι αυτά τα 11 γονίδια ρυθμίζονται προς τα πάνω μετά τη μόλυνση από H5N1 και μειώνονται σημαντικά με τη θεραπεία με αποκυνίνη σε επίπεδο χαμηλότερο από αυτό που παρατηρείται σε μη μολυσμένα κύτταρα ελέγχου (Εικ. 1Η). Μεταξύ αυτών ήταν γονίδια φλεγμονωδών κυτοκινών/χημειοκινών, συμπεριλαμβανομένων των CXCL5, IL1A, AXL (μέλος της οικογένειας υποδοχέων TAM κινασών υποδοχέων τυροσίνης) και TMEM173/STING (Διεγέρτης των γονιδίων IFN) (Πίνακας S4). Η προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι η λοίμωξη H5N1 των κυττάρων Α549 παρουσία αποκυνίνης ενίσχυσε την έκφραση αρνητικών ρυθμιστών σηματοδότησης κυτοκίνης (SOCS), SOCS1 και SOCS3 6 . Αυτό, με τη σειρά του, είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση της διεγειρόμενης από το H5N1 παραγωγής κυτοκίνης και χημειοκίνης (IL6, IFNB1, CXCL10 και CCL5 στα κύτταρα A549), η οποία δεν αποδόθηκε σε χαμηλότερο πολλαπλασιασμό του ιού, καθώς οι τίτλοι του ιού δεν επηρεάστηκαν από τη θεραπεία με αποκυνίνη 6 . Πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση qRT-PCR στα ίδια δείγματα RNA που υποβλήθηκαν για ανάλυση HiSeq για την επικύρωση των αποτελεσμάτων HiSeq. IL6 (Εικ. 2A), IFNB1 (Εικ. 2B) , CXCL10 (Εικ. 2C) και CCL5 (Εικ. Η έκφραση του γονιδίου 2D) ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα ΑΤΙΙ μετά από μόλυνση και μειώθηκε με την προσθήκη αποκυνίνης (εκτός από την IFNB1). Σε συμφωνία με προηγούμενα ευρήματα στα κύτταρα A549 6, η μόλυνση από H5N1 από μόνη της προκάλεσε την έκφραση του SOCS1 όπως φαίνεται από την ανάλυση HiSeq και qRT-PCR (Εικ. 2Ε). Η θεραπεία με αποκυνίνη αύξησε περαιτέρω την έκφραση mRNA του SOCS1 (Εικ. 2Ε). Αν και η ανάλυση HiSeq δεν ανίχνευσε στατιστικά σημαντική αύξηση του SOCS1 μετά από θεραπεία με αποκυνίνη, οι αναδιπλώσεις Log2 στην έκφραση του γονιδίου SOCS1 ήταν παρόμοιες μεταξύ των ομάδων HD και HA (4,8 φορές έναντι 4,0 φορές) (Εικ. 2Ε). Η ανάλυση HiSeq της μεταγραφής SOCS3 έδειξε σημαντική αύξηση μετά τη μόλυνση από H5N1 και τη θεραπεία με αποκυνίνη (Εικ. 2F). Η ανάλυση qRT-PCR έδειξε ότι αν και το mRNA του SOCS3 αυξήθηκε ελαφρώς μετά τη μόλυνση από H5N1, ρυθμίστηκε περαιτέρω σημαντικά παρουσία του Πίνακα 2. Εκπρόσωποι υπερεκπροσωπούμενων μονοπατιών KEGG με μέγιστη τιμή P 0,05 και τον αριθμό των γονιδίων που συμβάλλουν σε κάθε μονοπάτι που ρυθμίζεται σημαντικά προς τα πάνω μετά τη μόλυνση από H5N1 (\"ND vs HD Up\"). Ο πλήρης κατάλογος των οδών KEGG παρουσιάζεται στον Πίνακα S3. της αποκυνίνης (Εικ. 2F). Ως εκ τούτου, η αποκυνίνη συμβάλλει επίσης στη μείωση της διεγερμένης από το H5N1 παραγωγής κυτοκίνης και χημειοκίνης στα κύτταρα ΑΤΙΙ. Η αποκυνίνη, μια ένωση που αναστέλλει την παραγωγή ROS, έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζει τις ειδικές για τη γρίπη αποκρίσεις in vitro 6 και in vivo 5 . Αν και οι τίτλοι του ιού δεν επηρεάζονται από τη θεραπεία με αποκυνίνη in vitro 6 , παρατηρείται κάποια αντιική δράση in vivo όταν τα ποντίκια έχουν μολυνθεί με έναν ιό χαμηλής παθογονικότητας A/HongKong/X31 H3N2 6 . Η ανάλυση HiSeq της μεταγραφής του γονιδίου του ιού HPAI H5N1 έδειξε ότι παρόλο που υπήρχε μια τάση για αυξημένη έκφραση γονιδίου του ιού της γρίπης μετά από θεραπεία με αποκυνίνη, μόνο η έκφραση του γονιδίου μη δομικής (NS) της γρίπης αυξήθηκε σημαντικά (Εικ. 2G). Η μειωμένη παραγωγή κυτοκίνης και χημειοκίνης σε κύτταρα ATII μολυσμένα με H5N1 (Εικ. 2A-F) είναι απίθανο να συσχετιστεί με χαμηλότερο πολλαπλασιασμό του ιού. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση εμπλουτισμού GO σε γονίδια που ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω μετά από μόλυνση HPAI H5N1 σε κύτταρα ATII παρουσία ή απουσία αποκυνίνης για τον εντοπισμό υπερπαρουσιαζόμενων όρων GO. Πολλά από τα γονίδια που ρυθμίζονται προς τα πάνω από το H5N1 συμμετείχαν ευρέως στην αμυντική απόκριση (GO:0006952), την απόκριση σε εξωτερικό βιοτικό ερέθισμα (GO:0043207), τις διεργασίες του ανοσοποιητικού συστήματος (GO:0002376), το μονοπάτι σηματοδότησης με τη μεσολάβηση κυτοκίνης (GO:0019221) και οδός σηματοδότησης ιντερφερόνης τύπου Ι (GO:0060337) ( Πίνακας 1; Πίνακας S2). Επιπλέον, πολλά από τα γονίδια που ρυθμίζονται προς τα πάνω του H5N1 χαρτογραφούνται σε μεταβολικά μονοπάτια (hsa01100), αλληλεπίδραση υποδοχέα κυτοκίνης-κυτοκίνης (hsa04060), γρίππη Α (hsa05164), σηματοδότηση TNF (hsa04668) ή σηματοδότηση Jak-STAT (Signing S3h)0460 . Ωστόσο, δεν αναστέλλονται όλα τα γονίδια που ρυθμίζονται προς τα πάνω από το H5N1 σε αυτές τις οδούς από τη θεραπεία με αποκυνίνη όπως αναφέρθηκε παραπάνω (Εικ. 1F Πίνακας S3). . Οι αναδιπλώσεις μετά την ανάλυση qRT-PCR υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2 -ΔΔCt (δεξιός άξονας Y) κανονικοποιημένη σε β-ακτίνη και συγκρίθηκαν με την ομάδα ND. Τα δεδομένα από το HiSeq υπολογίστηκαν ως Log2 fold-change (αριστερός άξονας Y) σε σύγκριση με την ομάδα ND. Η μεταγραφή IFNB1 δεν ανιχνεύθηκε στο ND, επομένως τα δεδομένα HiSeq IFNB1 από ομάδες HD και HA εκφράστηκαν ως FPKM. *p < 0,05 και **p < 0,01, ***p < 0,001 σε σύγκριση με ND; # p < 0,05, ## p < 0,01, σε σύγκριση με το HD. (Ζ) Ανάλυση Hiseq των προφίλ γονιδιακής έκφρασης του ιού της γρίπης H5N1 με ή χωρίς θεραπεία με αποκυνίνη σε πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα ATII. # p < 0,05, σε σύγκριση με το HD. Ανοδική ρύθμιση του μορίου προσκόλλησης κυττάρων CEACAM1 σε κύτταρα ATII μολυσμένα με H5N1. Το μόριο κυτταρικής προσκόλλησης CEACAM1 έχει αποδειχθεί ότι είναι κρίσιμο για τη ρύθμιση των ανοσολογικών αποκρίσεων κατά τη διάρκεια μόλυνσης, φλεγμονής και καρκίνου 20 . Το μεταγράφημα CEACAM1 ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω μετά τη μόλυνση από H5N1 (Εικ. 3Α). Αντίθετα, ένα συγγενικό μέλος της οικογένειας CEACAM, το CEACAM5, δεν επηρεάστηκε από τη μόλυνση από τον H5N1 (Εικ. 3Β). Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι ελήφθησαν περισσότερες αναγνώσεις για το CEACAM5 (>1000 FPKM) (Εικ. 3B ) από το CEACAM1 (~7 FPKM) (Εικ. 3Α) σε μη μολυσμένα κύτταρα ΑΤΙΙ, το οποίο είναι σύμφωνο με τα φυσιολογικά πρότυπα έκφρασης στον ανθρώπινο πνευμονικό ιστό 32 . Επομένως, αν και το CEACAM1 σχηματίζει ετεροδιμερή με το CEACAM5 23, η υψηλότερη βασική έκφραση του CEACAM5 στα κύτταρα ATII μπορεί να εξηγεί γιατί η έκφρασή του δεν ενισχύθηκε από τη μόλυνση από H5N1. Η έκφραση της ενδογενούς πρωτεΐνης CEACAM1 αναλύθηκε επίσης σε μη μολυσμένο ή μολυσμένο από τον ιό της γρίπης Α549 (Εικ. 3C ) και κύτταρα ATII (Εικ. 3D). Η έκφραση της πρωτεΐνης CEACAM1 ήταν ελαφρώς, αλλά όχι σημαντικά, αυξημένη στα κύτταρα A549 που είχαν μολυνθεί με τον ιό A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 (PR8) για 24 ή 48 ώρες σε σύγκριση με μη μολυσμένα κύτταρα (Εικ. 3C). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στα επίπεδα πρωτεΐνης CEACAM1 σε διάφορα MOI (2, 5 ή 10) ή μεταξύ των χρονικών σημείων 24 και 48 hpi (Εικ. 3Γ) . Μετά την εξέταση της έκφρασης της πρωτεΐνης CEACAM1 μετά από μόλυνση με τον ιό PR8 σε κύτταρα A549, η έκφραση της πρωτεΐνης CEACAM1 εξετάστηκε στη συνέχεια σε πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα ATII μολυσμένα με HPAI H5N1 και συγκρίθηκε με τη μόλυνση από τον ιό PR8 (Εικ. 3D). Κύτταρα ΑΤΙΙ μολύνθηκαν με ιό PR8 σε ΜΟΙ 2, μια δόση που προκάλεσε ανοδική ρύθμιση των κυτοκινών και του γονιδίου Matrix της γρίπης (Μ) που αναλύθηκε με qRT-PCR (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα χαμηλότερα MOI των 0,5, 1 και 2 του HPAI H5N1 δοκιμάστηκαν λόγω της ισχυρής κυτταροπαθογόνου επίδρασης που προκαλεί το H5N1 σε υψηλότερα MOI. Τα επίπεδα ενδογενούς πρωτεΐνης CEACAM1 ήταν σημαντικά και παρομοίως αυξημένα σε κύτταρα ATII μολυσμένα με H5N1 στα τρία MOI που δοκιμάστηκαν. Η έκφραση της πρωτεΐνης CEACAM1 σε κύτταρα ATII μολυσμένα με H5N1 σε MOI 0,5 ήταν υψηλότερη στους 48 hpi από εκείνες που παρατηρήθηκαν στους 24 hpi (Εικ. 3D). Η μόλυνση από τον ιό HPAI H5N1 σε MOI 0,5, 1 και 2 διεγείρει υψηλότερα ενδογενή επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης CEACAM1 σε σύγκριση με τη μόλυνση από τον ιό PR8 σε MOI 2 στο αντίστοιχο χρονικό σημείο (μέγιστη ~ 9-πλάσια αύξηση που προκαλείται από το H5N1 σε MOI 0,5 και 1 στους 48 hpi σε σύγκριση με το PR8 στο MOI του 2), υποδηλώνοντας πιθανό ρόλο για το CEACAM1 στην παθογένεια του ιού της γρίπης (Εικ. 3D). Προκειμένου να κατανοηθεί ο ρόλος του CEACAM1 στην παθογένεση της γρίπης, τα κύτταρα Α549 και ATII επιμολύνθηκαν με siCEACAM1 για να καταστείλουν την έκφραση της ενδογενούς πρωτεΐνης CEACAM1. Τα κύτταρα ΑΤΙΙ και Α549 επιμολύνθηκαν με αρνητικό έλεγχο siCEACAM1 ή siNeg. Η έκφραση τεσσάρων κύριων παραλλαγών CEACAM1, CEACAM1-4L, -4S, -3L και -3S, και η πρωτεΐνη CEACAM1 αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας SYBR Green qRT-PCR και Western blotting, αντίστοιχα. Η ανάλυση SYBR Green qRT-PCR έδειξε ότι τα κύτταρα ATII που διαμολύνθηκαν με 15 pmol siCEACAM1 μείωσαν σημαντικά την έκφραση των CEACAM1-4L και -4S σε σύγκριση με τον έλεγχο siNeg, ενώ η έκφραση των CEACAM1-3L και -3S δεν άλλαξε (Εικ. 4Α). Η έκφραση της πρωτεΐνης CEACAM1 μειώθηκε κατά περίπου 50% και στα κύτταρα ATII και A549 μετά από επιμόλυνση siCEACAM1 σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με siNeg (Εικ. 4Β). Οι αυξανόμενες δόσεις του siCEACAM1 (10, 15 και 20 pmol) δεν μείωσαν περαιτέρω την έκφραση της πρωτεΐνης CEACAM1 στα κύτταρα Α549 (Εικ. 4Β). Ως εκ τούτου, επιλέχθηκαν 15 pmol siCEACAM1 για επακόλουθες μελέτες εξουδετέρωσης σε κύτταρα ΑΤΙΙ και Α549. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι το αντίσωμα anti-CEACAM1 ανιχνεύει μόνο ισομορφές L με βάση τις πληροφορίες επίτοπων που παρέχονται από την Abcam. Ως εκ τούτου, οι παρατηρούμενες μειώσεις στην έκφραση της πρωτεΐνης CEACAM1 μπορούν να αποδοθούν κυρίως στην κατάργηση του CEACAM1-4L. Οι λειτουργικές συνέπειες της εξουδετέρωσης του CEACAM1 εξετάστηκαν στη συνέχεια στα κύτταρα ATII και A549 μετά από μόλυνση από H5N1. Η παραγωγή IL6, IFNB1, CXCL10, CCL5 και TNF αναλύθηκε σε κύτταρα ATII και Α549 μολυσμένα με H5N1 χρησιμοποιώντας qRT-PCR. ATII (Εικ. 5Α) και Α549 κύτταρα (Εικ. 5Β) διαμολυνθέντα με siCEACAM1 έδειξε σημαντικά χαμηλότερη έκφραση των IL6, CXCL10 και CCL5 σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με siNeg. Ωστόσο, η έκφραση της αντι-ιικής κυτοκίνης, IFNB1, δεν επηρεάστηκε και στους δύο τύπους κυττάρων. Επιπλέον, η έκφραση του TNF, η οποία μπορεί να προκληθεί από IFNs τύπου Ι 33, ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε κύτταρα Α549 που έχουν επιμολυνθεί με siCEACAM1 (Εικ. 5Β), αλλά δεν επηρεάστηκε σε κύτταρα ΑΤΙΙ που έχουν επιμολυνθεί με siCEACAM1 (Εικ. 5Α). Η υπερκυτταροκιναιμία ή η «καταιγίδα κυτοκινών» σε ασθενείς που έχουν μολυνθεί από τον ιό H5N1 και H7N9 πιστεύεται ότι συμβάλλει στη φλεγμονώδη βλάβη των ιστών 34, 35 . Η μείωση της ρύθμισης του CEACAM1 στο πλαίσιο σοβαρής ιογενούς λοίμωξης μπορεί να μειώσει τη φλεγμονή που προκαλείται από λοίμωξη H5N1 χωρίς να μειώνει την αντιική απόκριση. Επιπλέον, η αντιγραφή του ιού μειώθηκε σημαντικά κατά 5,2 φορές στο ATII (Εικ. 5C) και 4,8 φορές σε κύτταρα A549 (Εικ. 5D) επιμολύνθηκαν με siCEACAM1 σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με siNeg. Οι τίτλοι του ιού στα κύτταρα ελέγχου που είχαν επιμολυνθεί με siNeg δεν ήταν σημαντικά διαφορετικοί από εκείνους που παρατηρήθηκαν σε κύτταρα ελέγχου που είχαν διαμολυνθεί με ψευδή τρόπο (Εικ. 5C,D). Οι ιοί της γρίπης χρησιμοποιούν κυτταρικό μηχανισμό του ξενιστή για να χειριστούν τις φυσιολογικές κυτταρικές διεργασίες προκειμένου να προωθήσουν την αναπαραγωγή και να αποφύγουν τις ανοσολογικές αποκρίσεις του ξενιστή. Οι μελέτες στο πεδίο επικεντρώνονται όλο και περισσότερο στην κατανόηση και την τροποποίηση βασικών παραγόντων ξενιστή προκειμένου να βελτιωθεί η ασθένεια. Παραδείγματα περιλαμβάνουν τη ρύθμιση του ROS για τη μείωση της φλεγμονής 5 και την αναστολή του NFκB και της μιτογόνου ενεργοποίησης καταρράκτη κινάσης Raf/MEK/ERK για την καταστολή της ιικής αντιγραφής 36, 37 . Αυτές οι στρατηγικές στόχευσης κεντρικού υπολογιστή θα προσφέρουν μια εναλλακτική λύση στις τρέχουσες παρεμβάσεις που επικεντρώνονται στη στόχευση του ιού. Στην παρούσα μελέτη, αναλύσαμε τα προφίλ έκφρασης του ανθρώπινου γονιδίου ξενιστή μετά από μόλυνση HPAI H5N1 και θεραπεία με το αντιοξειδωτικό, την αποκυνίνη. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα γονίδια που ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω μετά τη μόλυνση από H5N1 εμπλέκονταν σε βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της σηματοδότησης κυτοκινών, της ανοσίας και της απόπτωσης. Επιπλέον, γονίδια που ρυθμίζονται προς τα πάνω του H5N1 συμμετείχαν επίσης στη ρύθμιση της φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών, του κυτταρικού μεταβολισμού και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, τα οποία πιστεύεται ότι αξιοποιούνται από ιούς για αντιγραφή 38 . Η θεραπεία με αποκυνίνη είχε τόσο αντι-ιικό (Πίνακες S2-S4) 5 όσο και προ-ιικό αντίκτυπο (Εικ. 2G), το οποίο δεν προκαλεί έκπληξη καθώς τα ROS είναι ισχυροί μικροβιοκτόνοι παράγοντες, καθώς και σημαντικά μόρια ανοσοποιητικής σηματοδότησης σε διαφορετικές συγκεντρώσεις 39 . Στα χέρια μας, η θεραπεία με αποκυνίνη μείωσε τη φλεγμονή που προκαλείται από τον H5N1, αλλά επηρέασε επίσης την κυτταρική αμυντική απόκριση, την παραγωγή κυτοκίνης και τη σηματοδότηση με τη μεσολάβηση κυτοκίνης. Είναι σημαντικό ότι οι κρίσιμες αντιικές αποκρίσεις δεν διακυβεύτηκαν, π.χ. έκφραση υποδοχέων αναγνώρισης προτύπων (π.χ. Το DDX58 (RIG-I), TLRs, IFIH1 (MDA5)) δεν ρυθμίστηκε προς τα κάτω (Πίνακας S1). Δεδομένης της σημαντικής παρεμβολής των ιών της γρίπης στην ανοσία του ξενιστή, εστιάσαμε την προσοχή μας σε βασικούς ρυθμιστές της ανοσολογικής απόκρισης. Μέσω της ανάλυσης HiSeq, αναγνωρίσαμε το μόριο κυτταρικής προσκόλλησης CEACAM1 ως κρίσιμο ρυθμιστή της ανοσίας. Η καταστροφή του ενδογενούς CEACAM1 ανέστειλε την αναπαραγωγή του ιού H5N1 και μείωσε την παραγωγή φλεγμονωδών κυτοκίνης/χημειοκίνης που διεγείρεται από το H5N1. Η λοίμωξη H5N1 οδήγησε σε σημαντική ανοδική ρύθμιση ενός αριθμού φλεγμονωδών γονιδίων κυτοκινών/χημειοκινών, συμπεριλαμβανομένων των AXL και STING, τα οποία μειώθηκαν σημαντικά με τη θεραπεία με αποκυνίνη σε επίπεδο χαμηλότερο από αυτό που παρατηρήθηκε σε μη μολυσμένα κύτταρα (Πίνακας S4). Έχει αποδειχθεί προηγουμένως ότι η θεραπεία με αντισώματα αντι-AXL ποντικών που είχαν μολυνθεί με PR8 μείωσε σημαντικά τη φλεγμονή των πνευμόνων και τους τίτλους του ιού 40 . Το STING έχει αποδειχθεί ότι είναι σημαντικό για την προαγωγή των αντι-ιικών αποκρίσεων, καθώς τα κύτταρα THP-1 με νοκ-άουτ STING παράγουν λιγότερη IFN τύπου Ι μετά από μόλυνση από τον ιό της γρίπης Α 41 . Μείωση της έκφρασης του γονιδίου STING ή άλλων αντι-ιικών παραγόντων (π.χ. IFNB1, MX1, ISG15; Ο Πίνακας S1) από την αποκυνίνη, μπορεί εν μέρει, να εξηγεί την ελαφρά αύξηση στη μεταγραφή του γονιδίου της γρίπης μετά από θεραπεία με αποκυνίνη (Εικ. 2G). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν επίσης ότι η θεραπεία με αποκυνίνη μπορεί να μειώσει τη φλεγμονή και την απόπτωση που προκαλείται από τον H5N1. Πράγματι, οι αντιφλεγμονώδεις και αντι-αποπτωτικές επιδράσεις της αποκυνίνης έχουν αποδειχθεί προηγουμένως σε πολλά μοντέλα ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του σακχαρώδους διαβήτη 42 , του εμφράγματος του μυοκαρδίου 43 , της νευροφλεγμονής 44 και της λοίμωξης από τον ιό της γρίπης 6 . Αναγνώριση ενδοκυτταρικού ιικού RNA από την αναγνώριση προτύπων (PRRs) πυροδοτεί την απελευθέρωση προφλεγμονωδών κυτοκινών/χημοκινών που στρατολογούν τα έμφυτα ανοσοκύτταρα, όπως τα ουδετερόφιλα και τα κύτταρα ΝΚ, στο σημείο της μόλυνσης για να βοηθήσουν στην κάθαρση του ιού 45 . Τα ουδετερόφιλα ασκούν την κυτταροτοξική τους λειτουργία πρώτα προσκολλώνται σε μολυσμένα από γρίπη επιθηλιακά κύτταρα μέσω μορίων προσκόλλησης, όπως το CEACAM1 46 . Επιπλέον, μελέτες έχουν δείξει ότι η μόλυνση από τον ιό της γρίπης προάγει την απόπτωση των ουδετερόφιλων 47 , καθυστερώντας την αποβολή του ιού 48 . Η φωσφορυλίωση των μοτίβων CEACAM1 ITIM και η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 είναι κρίσιμης σημασίας για τη μεσολάβηση αντι-αποπτωτικών συμβάντων και για την προώθηση της επιβίωσης των ουδετερόφιλων 27 . Αυτό υποδηλώνει ότι τα αντι-αποπτωτικά συμβάντα με τη μεσολάβηση CEACAM1 μπορεί να είναι σημαντικά για την επίλυση της λοίμωξης από τον ιό της γρίπης in vivo, η οποία μπορεί να διερευνηθεί περαιτέρω μέσω μελετών μόλυνσης με ποντίκια Ceacam1-knockout. Τα κύτταρα NK διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στην έμφυτη άμυνα κατά των ιών της γρίπης με αναγνώριση και θανάτωση μολυσμένων κυττάρων. Οι ιοί της γρίπης, ωστόσο, χρησιμοποιούν διάφορες στρατηγικές για να ξεφύγουν από τις λειτουργίες του τελεστή ΝΚ, συμπεριλαμβανομένης της τροποποίησης της γλυκοζυλίωσης της αιμοσυγκολλητίνης της γρίπης (ΗΑ) για να αποφευχθεί η δέσμευση του υποδοχέα που ενεργοποιεί τη ΝΚ 49 . Οι ομο-ή ετερόφιλες αλληλεπιδράσεις CEACAM1 έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλουν τη θανάτωση της ΝΚ 25, 26 και πιστεύεται ότι συμβάλλουν στην ανοσοδιαφυγή των κυττάρων όγκου 50 . Δεδομένων αυτών των ευρημάτων, θα μπορούσε κανείς να προτείνει την πιθανότητα ότι η ανοδική ρύθμιση του CEACAM1 (για την αναστολή της δραστηριότητας του ΝΚ) μπορεί να είναι μια νέα και αχαρακτήριστη στρατηγική ανοσοδιαφυγής που χρησιμοποιείται από τους ιούς της γρίπης. Το εργαστήριό μας διερευνά τώρα το ρόλο του CEACAM1 στη λειτουργία των κυττάρων ΝΚ. Μικρομοριακοί αναστολείς πρωτεϊνικών κινασών ή πρωτεϊνικών φωσφατάσεων (π.χ. αναστολείς για Src, JAK, SHP2) έχουν αναπτυχθεί ως θεραπείες για καρκίνο, φλεγμονές, ανοσολογικές και μεταβολικές ασθένειες 51 . Η τροποποίηση της φωσφορυλίωσης του CEACAM1, ο διμερισμός και η κατάντη λειτουργία με αναστολείς μικρού μορίου μπορεί να βοηθήσουν στην ανατομή της συμβολής του CEACAM1 στη δραστηριότητα των κυττάρων ΝΚ. Ο μοριακός μηχανισμός της δράσης του CEACAM1 μετά τη μόλυνση έχει επίσης διερευνηθεί σε κύτταρα A549 χρησιμοποιώντας τον ιό PR8 52 . Οι Vitenshtein et al. έδειξε ότι το CEACAM1 ρυθμίστηκε προς τα πάνω μετά την αναγνώριση του ιικού RNA από το RIG-I και ότι αυτή η ανοδική ρύθμιση ήταν εξαρτώμενη από τον ρυθμιστικό παράγοντα 3 (IRF3) της ιντερφερόνης. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση του CEACAM1 από το SHP2 ανέστειλε την αντιγραφή του ιού μειώνοντας τη φωσφορυλίωση του στόχου της ραπαμυκίνης (mTOR) των θηλαστικών για την καταστολή της παγκόσμιας παραγωγής κυτταρικής πρωτεΐνης. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ένα πιο σχετικό φυσιολογικά μοντέλο μόλυνσης, τα πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα ATII, για να μελετήσουμε τον ρόλο του Θα απαιτηθούν περαιτέρω μελέτες για τη διερεύνηση/επιβεβαίωση των μοριακών μηχανισμών της ανοδικής ρύθμισης του CEACAM1 μετά τη μόλυνση από τον ιό της γρίπης, ειδικά in vivo. Καθώς έχει παρατηρηθεί ανοδική ρύθμιση του CEACAM1 σε άλλες λοιμώξεις από ιούς, όπως ο κυτταρομεγαλοϊός 18 και ο ιός των θηλωμάτων 19, θα είναι σημαντικό να προσδιοριστεί εάν ένας κοινός μηχανισμός δράσης μπορεί να αποδοθεί στο CEACAM1 προκειμένου να προσδιοριστεί η λειτουργική του σημασία. Εάν αυτό μπορεί να διαπιστωθεί, το CEACAM1 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως στόχος για την ανάπτυξη ενός παν-αντιικού παράγοντα. Συνοπτικά, μόρια στην κυτταρική επιφάνεια όπως το CEACAM1 είναι ιδιαίτερα ελκυστικά υποψήφια για θεραπευτική ανάπτυξη, καθώς τα φάρμακα δεν χρειάζεται να διασχίζουν το κυτταρική μεμβράνη προκειμένου να είναι αποτελεσματική. Η στόχευση γονιδίων που κωδικοποιούνται από τον ξενιστή σε συνδυασμό με τρέχοντα αντιιικά και εμβόλια μπορεί να είναι ένας τρόπος μείωσης της νοσηρότητας και της θνησιμότητας που σχετίζεται με τη μόλυνση από τον ιό της γρίπης. Η μελέτη μας δείχνει ξεκάθαρα ότι παρατηρείται αυξημένη έκφραση CEACAM1 σε πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα ATII που έχουν μολυνθεί με τον ιό της γρίπης HPAI H5N1. Είναι σημαντικό ότι η μείωση της έκφρασης του CEACAM1 είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση της αντιγραφής του ιού της γρίπης και υποδηλώνει ότι η στόχευση αυτού του μορίου μπορεί να βοηθήσει στη βελτίωση των αποτελεσμάτων της νόσου. Απομόνωση και καλλιέργεια πρωτογενών ανθρώπινων ATII κυττάρων. Δείγματα ανθρώπινου πνευμονικού ιστού χωρίς όγκο δόθηκαν από ανώνυμους ασθενείς που υποβλήθηκαν σε εκτομή πνεύμονα στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο, Geelong, Αυστραλία. Τα ερευνητικά πρωτόκολλα και η ανθρώπινη ηθική εγκρίθηκαν από τις Επιτροπές Ανθρώπινης Ηθικής του Πανεπιστημίου Deakin, του Barwon Health και του Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization (CSIRO). Ελήφθη ενημερωμένη συγκατάθεση από όλους τους δότες ιστών. Όλη η έρευνα διεξήχθη σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές που αναφέρονται στην Εθνική Δήλωση για την Ηθική Συμπεριφορά στην Έρευνα του Ανθρώπου (2007) . Η δειγματοληψία φυσιολογικού πνευμονικού ιστού επιβεβαιώθηκε από την Victorian Cancer Biobank, Αυστραλία. Τα δείγματα πνεύμονα διατηρήθηκαν σε διάλυμα Hartmann (Baxter) για 4-8 ώρες ή O/N στους 4 °C για να διατηρηθεί η κυτταρική ακεραιότητα και βιωσιμότητα πριν από την απομόνωση των κυττάρων. Ανθρώπινα κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα τύπου II (ATII) απομονώθηκαν και καλλιεργήθηκαν χρησιμοποιώντας μια προηγουμένως περιγραφείσα μέθοδο 30, 53 με μικρές τροποποιήσεις. Εν συντομία, ο πνευμονικός ιστός με ορατούς βρόγχους αφαιρέθηκε και εγχύθηκε με άφθονο PBS και βυθίστηκε σε 0,5% Trypsin-EDTA (Gibco) δύο φορές για 15 λεπτά στους 37 °C. Ο μερικώς χωνεμένος ιστός τεμαχίστηκε σε τομές και χωνεύτηκε περαιτέρω σε Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) που περιείχε ελαστάση (12,9 μονάδες/mL. Roche Diagnostics) και DNase I (0,5 mg/mL; Roche Diagnostics) για 60 λεπτά στους 37 °C. Εναιωρήματα μεμονωμένων κυττάρων λήφθηκαν με διήθηση μέσω φίλτρου κυττάρων 40 μm και τα κύτταρα (συμπεριλαμβανομένων των μακροφάγων και των ινοβλαστών) αφέθηκαν να προσκολληθούν σε τρυβλία Petri που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ιστοκαλλιέργεια σε ένα μίγμα 1:1 μέσου DMEM/F12 (Gibco) και μικρής ανάπτυξης αεραγωγών μέσο (SAGM) μέσο (Lonza) που περιέχει 5% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) και 0,5 mg/mL DNase I για 2 ώρες στους 37 °C. Τα μη προσκολλημένα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων ΑΤΙΙ, συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση στα 300 g για 20 λεπτά σε μια ασυνεχή βαθμίδα πυκνότητας Percoll (1,089 και 1,040 g/mL). Καθαρισμένα κύτταρα ATII από τη διεπιφάνεια δύο βαθμίδων πυκνότητας συλλέχθηκαν, πλύθηκαν σε HBSS και επαναιωρήθηκαν σε μέσο SAGM συμπληρωμένο με 1% φιλτραρισμένο με άνθρακα FCS (Gibco) και 100 μονάδες/mL πενικιλίνη και 100 μg/mL στρεπτομυκίνη (Gibco) . Τα κύτταρα ATII επιστρώθηκαν σε πολυεστερικά ένθετα Transwell (πόροι 0,4 μm. Corning) επικαλυμμένο με κολλαγόνο ανθρώπινου πλακούντα τύπου IV (0,05 mg/mL; Sigma) σε 300.000 κύτταρα/cm2 και καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες καλυμμένες με υγρό σε υγροποιημένο επωαστήρα (5% CO2, 37 °C). Το μέσο ανάπτυξης άλλαζε κάθε 48 ώρες. Αυτές οι συνθήκες καλλιέργειας κατέστειλαν την επέκταση των ινοβλαστών εντός των πρόσφατα απομονωθέντων κυττάρων ΑΤΙΙ και ενθάρρυναν τα κύτταρα ΑΤΙΙ να σχηματίσουν συρρέουσες μονοστοιβάδες με τυπική μεγάλη και κάπως τετράγωνη μορφολογία 54 Κυτταρική καλλιέργεια και μέσα. Α549 καρκινοματικά ανθρώπινα κυψελιδικά βασικά επιθηλιακά κύτταρα τύπου II και κύτταρα νεφρού σκύλου Madin-Darby (MDCK) παρασχέθηκαν από την εγκατάσταση καλλιέργειας ιστών του Australian Animal Health Laboratory (AAHL), CSIRO. Τα κύτταρα A549 και MDCK διατηρήθηκαν σε μέσο Ham's F12K (GIBCO) και μέσο RPMI-1640 (Invitrogen), αντίστοιχα, συμπληρωμένα με 10% FCS, 100 U/mL πενικιλλίνη και 100 μg/mL στρεπτομυκίνη (GIBCO) και διατηρήθηκαν στους 37 °C , 5% CO 2 .Ιός και ιογενής λοίμωξη. HPAI A/κοτόπουλο/Βιετνάμ/0008/2004 Το H5N1 (H5N1) ελήφθη από την AAHL, CSIRO. Αποθέματα ιού του A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 (PR8) ελήφθησαν από το Πανεπιστήμιο της Μελβούρνης. Τα αποθέματα ιού παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τυπικό ενοφθαλμισμό εμβρυϊκών αυγών ηλικίας 10 ημερών. Παρασκευάστηκε ένα μόνο απόθεμα ιού για χρήση σε όλες τις αναλύσεις. Όλα τα πειράματα H5N1 πραγματοποιήθηκαν σε εργαστήρια επιπέδου βιοασφάλειας 3 (BSL3) στο AAHL, CSIRO. Τα κύτταρα μολύνθηκαν με ιούς της γρίπης Α όπως περιγράφηκε προηγουμένως 6, 29 . Εν συντομία, τα μέσα καλλιέργειας απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα πλύθηκαν με θερμό PBS τρεις φορές και ακολούθησε εμβολιασμός με ιό για 1 ώρα. Ο ιός στη συνέχεια απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν με θερμό PBS τρεις φορές και επωάστηκαν στο κατάλληλο φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας χωρίς ορό που περιείχε 0,3% BSA στους 37 °C. Τα μη μολυσμένα και τα μολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον ίδιο τρόπο. Για την ανάλυση HiSeq, κύτταρα ATII από τρεις δότες μολύνθηκαν στην κορυφαία πλευρά με H5N1 σε MOI 2 για 24 ώρες σε μέσο SAGM χωρίς ορό συμπληρωμένο με 0,3% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) που περιέχει 1 mM αποκυνίνη διαλυμένη σε DMSO ή 1 % Έλεγχος οχήματος DMSO. Μη μολυσμένα κύτταρα ΑΤΙΙ που επωάστηκαν σε μέσα που περιείχαν 1% DMSO χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος. Για άλλες επακόλουθες μελέτες μόλυνσης από ιούς, κύτταρα ATII από ένα διαφορετικό σύνολο τριών δοτών (διαφορετικά από αυτά που χρησιμοποιούνται στην ανάλυση HiSeq) ή κύτταρα A549 από τουλάχιστον τρία διαφορετικά περάσματα μολύνθηκαν με ιούς γρίπης Α σε διάφορα MOI όπως υποδεικνύεται στο κείμενο. Για μελέτες H5N1 μετά τη διαμόλυνση με siRNA, η μολυσματική δόση βελτιστοποιήθηκε σε MOI 0,01, μια δόση στην οποία προκλήθηκε σημαντικά υψηλότερη έκφραση πρωτεΐνης CEACAM1 με ελάχιστο κυτταρικό θάνατο στους 24 hpi. Για μελέτες μόλυνσης με PR8, μια τελική συγκέντρωση 0,5 μg/mL θρυψίνη (Worthington) που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με L-1-Τοσυλαμίδη-2-φαινυλαιθυλοχλωρομεθυλκετόνη (TPCK) συμπεριλήφθηκε στα μέσα μετά τον εμβολιασμό για να υποβοηθηθεί ο αναδιπλασιασμός. Οι τίτλοι του ιού προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τυπικές δοκιμασίες πλάκας σε κύτταρα MDCK όπως περιγράφηκε προηγουμένως 55 .RNA εκχύλιση, ποιοτικός έλεγχος (QC) και ανάλυση HiSeq. Κύτταρα ΑΤΙΙ από τρεις δότες χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση HiSeq. Ολικό RNA εκχυλίστηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας κιτ RNeasy Mini (Qiagen). Τα μολυσμένα με γρίπη κύτταρα πλύθηκαν με PBS τρεις φορές και τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RLT συμπληρωμένο με β-μερκαπτοαιθανόλη (10 μL/mL. Gibco). Τα κυτταρολύματα ομογενοποιήθηκαν με στήλες QIAshredder που ακολουθήθηκε από πέψη DNA επί στήλης με το σύνολο DNase χωρίς RNase (Qiagen) και το RNA εκχυλίστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο αρχικός QC διεξήχθη για να διασφαλιστεί ότι η ποσότητα και η ποιότητα των δειγμάτων RNA για ανάλυση HiSeq πληρούσαν τα ακόλουθα κριτήρια. 1) Τα δείγματα RNA είχαν αναλογίες OD260/280 μεταξύ 1,8 και 2,0 όπως μετρήθηκε με το φασματοφωτόμετρο NanoDrop TM (Thermo Scientific). 2) Οι συγκεντρώσεις του δείγματος ήταν τουλάχιστον 100 ng/μl. 3) Το RNA αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Η ακεραιότητα και η ποιότητα του RNA επικυρώθηκαν με την παρουσία αιχμηρών διαυγών ζωνών ριβοσωμικού RNA 28S και 18S, με αναλογία 28S:18S 2:1, μαζί με την απουσία γονιδιωματικού DNA και αποικοδομημένου RNA. Ως μέρος του αρχικού QC και ως ένδειξη συνεπούς μόλυνσης από H5N1, πραγματοποιήθηκε εις διπλούν, όπως περιγράφηκε προηγουμένως 6, παράλληλη ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφάσης σε πραγματικό χρόνο (qRT-PCR) χρησιμοποιώντας τα ίδια δείγματα RNA που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση HiSeq. IL6, IFNB1, CXCL10, CCL5, TNF, SOCS1 και SOCS3, τα οποία είναι γνωστό ότι ρυθμίζονται προς τα πάνω μετά τη μόλυνση από HPAI H5N1 των κυττάρων A549 6 Ανάλυση αλληλουχίας και σχολιασμός. Μετά την επιβεβαίωση των αθροισμάτων ελέγχου και την αξιολόγηση της ποιότητας των ακατέργαστων δεδομένων των αρχείων FASTQ με FASTQC, οι αναγνώσεις RNA-Seq υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σύμφωνα με τα τυπικά πρωτόκολλα αγωγών Tuxedo 56, χρησιμοποιώντας το σχολιασμένο ανθρώπινο γονιδίωμα (GRCh37, που λήφθηκε από την Illumina iGenomes) ως αναφορά. Εν συντομία, οι ακατέργαστες αναγνώσεις για κάθε δείγμα χαρτογραφήθηκαν στο ανθρώπινο γονιδίωμα χρησιμοποιώντας TopHat2, ταξινομήθηκαν και μετατράπηκαν σε μορφή SAM χρησιμοποιώντας Samtools και στη συνέχεια συναρμολογήθηκαν σε μεταγραφήματα χρησιμοποιώντας Μανικετόκουμπα. Το Cuffmerge χρησιμοποιήθηκε για να συνδυάσει σχολιασμούς μεταγραφής από μεμονωμένα δείγματα σε ένα μόνο μεταγραφικό αναφοράς και το Cuffquant χρησιμοποιήθηκε για να ληφθούν οι μετρήσεις ανάγνωσης ανά δείγμα. Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε μανσέτα για τη διεξαγωγή ανάλυσης διαφορικής έκφρασης. Όλα τα προγράμματα εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας συνιστώμενες παραμέτρους. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι το αρχείο αναφοράς gtf που παρέχεται στο cuffmerge επεξεργάστηκε για πρώτη φορά χρησιμοποιώντας μια προσαρμοσμένη δέσμη ενεργειών python για να εξαιρεθούν γραμμές που περιέχουν χαρακτηριστικά εκτός από το exon/cds και contigs εκτός από τα χρωμοσώματα 1-22, X, Y. Όρος GO και εμπλουτισμός KEGG. Τα επίσημα αναγνωριστικά γονιδίων για μεταγραφές που διαμορφώθηκαν διαφορικά μετά από μόλυνση HPAI H5N1 με ή χωρίς θεραπεία με αποκυνίνη συγκεντρώθηκαν σε έξι λίστες στόχων από συγκρίσεις ανά ζεύγη (\"ND vs. HD Up\", \"ND vs. HD Down\", \"ND vs. HA Up \", \"ND vs. HA Down\", \"HD vs. HA Up\", \"HD vs. HA Down\"). Στατιστικά σημαντικά διαφορικά εκφρασμένα μεταγραφήματα ορίστηκαν ως έχοντα ≥2 φορές αλλαγή με μια προσαρμοσμένη τιμή Ρ Benjamini-Hochberg < 0,01. Μια λίστα υποβάθρου γονιδίων καταρτίστηκε με την ανάκτηση όλων των αναγνωριστικών γονιδίων που προσδιορίστηκαν από την παρούσα ανάλυση HiSeq με FPKM > 1. Ο εμπλουτισμός της βιολογικής διεργασίας GO πραγματοποιήθηκε με χρήση Gorilla, συγκρίνοντας μη ταξινομημένες λίστες υποβάθρου και στόχων 57 . Οι περιττοί όροι GO καταργήθηκαν χρησιμοποιώντας το REVIGO 58 . Οι λίστες στόχων υποβλήθηκαν επίσης σε ανάλυση μονοπατιού KEGG χρησιμοποιώντας έναν βασικό χαρτογράφο οδών KEGG 59 και Εργαλείο λειτουργικού σχολιασμού του DAVID Bioinformatics Resources 60,61 .Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης σε πραγματικό χρόνο (qRT-PCR). Οι συγκεντρώσεις mRNA των γονιδίων που μας ενδιαφέρουν αξιολογήθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας qRT-PCR που πραγματοποιήθηκε εις διπλούν όπως περιγράφηκε προηγουμένως 6 . Εν συντομία, μετά την εξαγωγή ολικού RNA από κύτταρα μολυσμένα με γρίπη, το cDNA ήταν ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΗ ΑΝΑΦΟΡΕΣ | (2018) 8:15468 | DOI:10.1038/s41598-018-33605-6 που παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας SuperScript™ III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen). Η γονιδιακή έκφραση διαφόρων κυτοκινών αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασίες έκφρασης γονιδίου TaqMan (Applied Biosystems) με εμπορικούς εκκινητές και ανιχνευτές TaqMan, με εξαίρεση το γονίδιο Matrix (Μ) της γρίπης (εμπρός εκκινητήρας 5'-CTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA-3'; αντίστροφο αστάρι 5′-GGTGACAGGATTGGTCTTGTCTTTA-3′; probe 5'-FAM-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGAG-NFQ-3') 62 . Ειδικοί εκκινητές 63 (Πίνακας S5) σχεδιάστηκαν για την εκτίμηση της έκφρασης των CEACAM1-4L, -4S, -3L και -3S σε κύτταρα ATII και A549 χρησιμοποιώντας iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η απουσία μη ειδικής ενίσχυσης επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης προϊόντων qRT-PCR (15 μL) (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Η γονιδιακή έκφραση κανονικοποιήθηκε σε mRNA β-ακτίνης χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 2 -ΔΔCT όπου προσδιορίστηκαν τα επίπεδα έκφρασης σε σχέση με μη μολυσμένα κύτταρα ελέγχου. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα PCR σε πραγματικό χρόνο Applied Biosystems ® StepOnePlus TM. Ανάλυση Western blot. Η έκφραση πρωτεΐνης του CEACAM1 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση στυπώματος Western όπως περιγράφηκε προηγουμένως 6. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης σε κυτταρολύματα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ποσοτικοποίησης πρωτεΐνης EZQ® (Molecular Probes ΤΜ, Invitrogen). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης φορτώθηκαν σε πηκτώματα NuPAGE 4-12% Bis-Tris (Invitrogen), αναλύθηκαν με SDS/PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Bio-Rad). Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού κατά του ανθρώπου CEACAM1 EPR4049 (ab108397, Abcam) ακολουθούμενο από δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με HRP κατσίκας κατά κουνελιού (Invitrogen). Οι πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν με επώαση μεμβρανών με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια Pierce (ECL) Plus Western Blotting Substrate (Thermo Scientific) που ακολουθήθηκε από ανίχνευση σε σύστημα απεικόνισης Bio-Rad ChemiDoc™ MP ή σε Amersham™ Hyperfilm™ ECL (GE Healthcare). ακτίνη ως μάρτυρας φόρτωσης, η ίδια μεμβράνη αφαιρέθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα απογύμνωσης (1,5% (β/ό) γλυκίνη, 0,1% (β/ό) SDS, 1% (ν/ν) Tween-20, ρΗ 2,2) και εκ νέου ανιχνεύθηκε με ένα συζευγμένο με HRP μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-β-ακτίνης κουνελιού (Cell Signaling). Σε ορισμένες περιπτώσεις, πραγματοποιήθηκαν δύο SDS/PAGE ταυτόχρονα με ίσες ποσότητες πρωτεΐνης φορτωμένες σε κάθε πήκτωμα για ανάλυση της έκφρασης πρωτεΐνης CEACAM1 και β-ακτίνης σε κάθε δείγμα, αντίστοιχα. Η πυκνότητα της ζώνης πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό Fiji (έκδοση 1.49J10) 64. Η πυκνότητα της ζώνης της πρωτεΐνης CEACAM1 κανονικοποιήθηκε έναντι αυτής της β-ακτίνης και εκφράστηκε ως πολλαπλές αλλαγές σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Καταστροφή του ενδογενούς CEACAM1. Τα κύτταρα ATII και Α549 αναπτύχθηκαν σε συρροή 80% σε πλάκες 6 φρεατίων και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) που στοχεύει το ανθρώπινο γονίδιο CEACAM1 (siCEACAM1; s1976, Silencer ® Επιλέξτε προσχεδιασμένο siRNA, Ambion ® ) ή έλεγχο siRNA (siNeg; Silencer ® Επιλέξτε Αρ. Αρ. 1 siRNA, Ambion ® ) χρησιμοποιώντας Lipofetamine 3000 (ThermoFisher Scientific) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης και σίγησης αξιολογήθηκαν μετά από 48 ώρες με ανάλυση στυπώματος Western της έκφρασης πρωτεΐνης CEACAM1 και με ανάλυση qRT-PCR των παραλλαγών CEACAM1. Σε παράλληλα πειράματα, ο αναδιπλασιασμός του ιού και η παραγωγή κυτοκίνης/χημειοκίνης αναλύθηκαν σε κύτταρα επιμολυσμένα με siCEACAM1 ή siNeg μολυσμένα με ιό H5N1 (MOI = 0,01) στους 24 hpi. Στατιστική ανάλυση. Οι διαφορές μεταξύ δύο πειραματικών ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Student's unpaired, two-tailed t test. Οι διαφορές αναδίπλωσης της έκφρασης του mRNA (qRT-PCR) μεταξύ τριών πειραματικών ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) ακολουθούμενη από δοκιμή πολλαπλής σύγκρισης Bonferroni. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές με τιμή p <0,05. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (SEM) από τρία ή τέσσερα μεμονωμένα πειράματα. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το GraphPad Prism για Windows (v5.02). Όλα τα δεδομένα που δημιουργήθηκαν ή αναλύθηκαν κατά τη διάρκεια αυτής της μελέτης περιλαμβάνονται σε αυτό το δημοσιευμένο άρθρο ή στο συμπληρωματικό αρχείο πληροφοριών. Τα ακατέργαστα και επεξεργασμένα δεδομένα HiSeq έχουν κατατεθεί στο GEO (GSE119767; https://www.ncbi. nlm.nih.gov/geo/).", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 2163, "text": "53%" } ], "id": 1941, "question": "Ποιο είναι το ποσοστό θνησιμότητας του στελέχους H5N1 της γρίπης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7260, "text": "τέσσερις" } ], "id": 1944, "question": "Πόσες εξωκυτταρικές περιοχές υπάρχουν στην πρωτεΐνη CEAMCAM1;" }, { "answers": [ { "answer_start": 30375, "text": "ετερόφιλα" } ], "id": 1948, "question": "Πώς αλληλεπιδρούν το CEACAM1 και το CEACAM5;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Βελτιωμένες φαρμακολογικές και δομικές ιδιότητες του αναστολέα σύντηξης HIV AP3 έναντι της ενφουβιρτίδης: Επισήμανση των πλεονεκτημάτων της στρατηγικής για τεχνητά πεπτίδιαhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4541410/SHA: F2fcc1663991f Zhu, Yun; Ye, Sheng; Wang, Qian; Xu, Wei; Su, Shan; Sun, Zhiwu; Yu, Fei; Liu, Qi; Wang, Chao; Zhang, Tianhong; Zhang, Zhenqing; Zhang, Xiaoyan; Xu, Jianqing; Du, Lanying; Liu, Keliang; Lu, Lu; Zhang, Rongguang; Jiang, ShiboDate: 2015-08-19DOI: 10.1038/srep13028License: cc-byAbstract: Το Enfuvirtide (T20), είναι ο πρώτος αναστολέας σύντηξης HIV που εγκρίθηκε για τη θεραπεία ασθενών με HIV/AIDS που αποτυγχάνουν να ανταποκριθούν στα τρέχοντα αντιρετροϊκά φάρμακα. Ωστόσο, η κλινική του εφαρμογή είναι περιορισμένη λόγω του μικρού χρόνου ημιζωής, της αντοχής στο φάρμακο και της διασταυρούμενης αντιδραστικότητας με τα προϋπάρχοντα αντισώματα σε ασθενείς με HIV λοίμωξη. Χρησιμοποιώντας μια στρατηγική τεχνητού πεπτιδίου, σχεδιάσαμε ένα πεπτίδιο με μη εγγενή πρωτεϊνική αλληλουχία, το AP3, το οποίο εμφάνισε ισχυρή αντιική δράση έναντι ενός ευρέος φάσματος στελεχών HIV-1, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που είναι ανθεκτικά στο Τ20, και είχε αξιοσημείωτα μεγαλύτερο χρόνο ημιζωής in vivo από Τ20. Ενώ τα προϋπάρχοντα αντισώματα σε ασθενείς μολυσμένους με HIV κατέστειλαν σημαντικά την αντιική δράση του Τ20, αυτά τα αντισώματα ούτε αναγνώρισαν την ΑΡ3 ούτε εξασθένησαν την αντι-HIV-1 δράση της. Δομικά διαφορετικό από το T20, το AP3 θα μπορούσε να διπλωθεί σε μονή έλικα και να αλληλεπιδράσει με το gp41 NHR. Τα δύο υπολείμματα, Met και Thr, στο Ν-άκρο του AP3 σχηματίζουν μια δομή που μοιάζει με άγκιστρο για να σταθεροποιήσει την αλληλεπίδραση μεταξύ των ελίκων AP3 και NHR. Επομένως, το AP3 έχει δυνατότητα περαιτέρω ανάπτυξης ως νέος αναστολέας σύντηξης HIV με βελτιωμένη αντιική αποτελεσματικότητα, προφίλ αντοχής και φαρμακολογικές ιδιότητες έναντι της ενφουβιρτίδης. Εν τω μεταξύ, αυτή η μελέτη τόνισε τα πλεονεκτήματα των τεχνητά σχεδιασμένων πεπτιδίων και επιβεβαίωσε ότι αυτή η στρατηγική θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη τεχνητών αναστολέων ιικής σύντηξης με βάση τα πεπτίδια κατά του HIV και άλλων ιών με περίβλημα. Κείμενο: Οι αλληλουχίες των πεπτιδίων που προέρχονται από gp41 NHR ή CHR. Τα υπολείμματα που αντιστοιχούν στην περιοχή του θύλακα NHR σημειώνονται με κόκκινο χρώμα. Τα υπολείμματα για το PBD σημειώνονται με μπλε και τα υπολείμματα MT-αγκίστρου δίπλα στο Ν άκρο του PBD σημειώνονται με πράσινο. Το πεπτίδιο 5HRu αποτελείται από 5 αντίγραφα υπογραμμισμένου προτύπου τεχνητής ακολουθίας (AEELAKK). Τα υπολείμματα μεταλλαγμάτων στο PBD των AP2 και AP3 επισημάνθηκαν με ροζ. (β) Η ανασταλτική δράση των AP1, AP2, AP3 και T20 στη μόλυνση από HIV-1 IIIB (υποτύπος B, X4) σε κύτταρα MT-2 (αριστερό πλαίσιο) από HIV-1 Bal (υποτύπος B, R5) σε κύτταρα M7 (δεξιός πίνακας). Κάθε δείγμα δοκιμάστηκε εις τριπλούν και το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SD.Scientific Reports | 5:13028 | DOi: 10 .1038/srep13028Για να αντιμετωπιστούν αυτά τα εμπόδια, έχουν γίνει πολλές προσπάθειες για τη βελτιστοποίηση των πεπτιδίων που προέρχονται από T20 και gp41 CHR. Μερικά από αυτά τα πεπτίδια έχουν καλύτερες ανασταλτικές δραστηριότητες έναντι στελεχών ανθεκτικών στο Τ20 και/ή μεγαλύτερο χρόνο ημιζωής από το Τ20. Ωστόσο, εξακολουθούν να έχουν το πρόβλημα να αντιδρούν διασταυρούμενα με τα προϋπάρχοντα αντισώματα στους ορούς ασθενών με HIV λοίμωξη επειδή περιέχουν ορισμένες εγγενείς αλληλουχίες CHR. Με βάση το καθολικό πρότυπο τεχνητού πεπτιδίου του 5HRu, σχεδιάσαμε προηγουμένως τα τεχνητά πεπτίδια του AP1 (PBD-m4HR) και του AP2 (PBDtrp-m4HR) και έχουμε κάνει προκαταρκτική έρευνα σχετικά με την ανασταλτική τους δράση έναντι των κυττάρων που διαμεσολαβούνται από τον HIV-1 Env. σύντηξη 16 . Στην παρούσα μελέτη, σχεδιάσαμε ένα νέο τεχνητό πεπτίδιο, το AP3 (Εικ. 1a), με στόχο την εφαρμογή της δομής \"M-T hook\" για τη σταθεροποίηση της αλληλεπίδρασης του τεχνητού πεπτιδίου με τον υδρόφοβο θύλακα στο τριμερές gp41 NHR 17, 18. Μετά από διεξοδική μελέτη της αντιϊκής του δράσης, της βιοχημικής του ιδιότητας, της κρυσταλλικής δομής, του λειτουργικού μηχανισμού, του χρόνου ημιζωής in vivo και, για πρώτη φορά, της επίδρασης των προϋπαρχόντων αντισωμάτων στον ορό ασθενών με HIV λοίμωξη, διαπιστώσαμε ότι το πρόσφατα σχεδιασμένο τεχνητό πεπτίδιο , AP3, εμφάνισε βελτιωμένη αντιική δράση, προφίλ αντοχής στο φάρμακο και φαρμακολογικές ιδιότητες έναντι του T20. Ιδιαίτερα, τα προϋπάρχοντα αντισώματα στους ορούς ασθενών με HIV λοίμωξη δεν κατέστειλαν, αλλά ενίσχυσαν την αντι-HIV-1 δράση του AP3. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το AP3 έχει δυνατότητες ανάπτυξης ως νέο φάρμακο κατά του HIV και επιβεβαιώνουν ότι αυτή η στρατηγική μπορεί να χρησιμοποιηθεί για το σχεδιασμό τεχνητών αντιιικών πεπτιδίων έναντι άλλων ιών με περίβλημα, όπως SARS-CoV 19, MERS-CoV 20 και παραμυξοϊός 21. Το AP3 ανέστειλε τη μόλυνση από τον HIV-1 με υψηλότερη ισχύ από το T20. Τα προηγουμένως σχεδιασμένα τεχνητά πεπτίδια μας AP1 και AP2 θα μπορούσαν να αναστείλουν τη σύντηξη μεμβράνης κυττάρων-κυττάρου που προκαλείται από τον HIV-1 Env 16 . Αυτός και οι συνεργάτες του ανέφεραν ότι η προσθήκη δύο αμινοξέων του Met και του Thr στο Ν-άκρο ενός πεπτιδίου CHR θα μπορούσε να ενισχύσει τη δράση τους κατά του HIV-1 17, 18 . Εδώ σχεδιάσαμε ένα νέο τεχνητό πεπτίδιο, το AP3, προσθέτοντας Met και Thr στο Ν-άκρο του AP2 (Εικ. 1α). Στη συνέχεια, συγκρίναμε το AP3 με τα AP1, AP2 και T20 για την αντι-HIV-1 δράση τους έναντι αποκλίνων στελεχών HIV-1, συμπεριλαμβανομένων των προσαρμοσμένων στο εργαστήριο ιών, IIIB (υποτύπος B, X4) και Bal (υποτύπος B, R5) και σειρά πρωτογενών απομονώσεων HIV-1, καθώς και των ανθεκτικών στην Τ20 στελεχών. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1b, το AP3 εμφάνισε υψηλότερες ανασταλτικές δραστηριότητες στη μόλυνση από στελέχη Bal HIV-1 IIIB και HIV-1 (IC 50: 3,06 και 15,09 nM, αντίστοιχα) από το AP1 (IC 50: 86,25 και 396,14 nM, αντίστοιχα), IC502 23,05 και 49,95 ηΜ, αντίστοιχα), και Τ20 (IC 50: 13,63 και 30,21 ηΜ, αντίστοιχα). Η ανασταλτική δράση του AP3 στη μόλυνση από αποκλίνοντα πρωτογενή στελέχη HIV-1 με διακριτούς γονότυπους (υποτύπους Α-Ε και ομάδα Ο) και φαινότυπους (R5 και X4) ήταν επίσης υψηλότερη από εκείνη των ΑΡ2 και Τ20 (Πίνακας 1). Ενώ το Τ20 δεν ήταν αποτελεσματικό έναντι των ανθεκτικών σε Τ20 στελεχών HIV-1 σε συγκέντρωση έως και 2.000 nM, το AP3 θα μπορούσε αποτελεσματικά να αναστείλει τη μόλυνση αυτών των στελεχών με IC 50 στην περιοχή από 13 ~ 90 nM, που ήταν περίπου 2 έως 4- φορές πιο αποτελεσματικό από το AP2 (Πίνακας 1). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το τεχνητό πεπτίδιο ΑΡ3 έχει αξιοσημείωτα βελτιωμένη αντι-Ηΐν-1 δραστικότητα έναντι ενός ευρέος φάσματος στελεχών HIV-1, συμπεριλαμβανομένων των ανθεκτικών στον Τ20 παραλλαγών, έναντι του Τ20 και των τεχνητών πεπτιδίων ΑΡ1 και ΑΡ2. Τα προϋπάρχοντα αντισώματα σε ασθενείς μολυσμένους με HIV-1 ούτε αναγνώρισαν την ΑΡ3 ούτε εξασθένησαν την αντι-HIV-1 δράση της. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα προϋπάρχοντα αντισώματα σε ασθενείς μολυσμένους με HIV-1, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που αντιδρούν διασταυρούμενα με το Τ20 και εκείνων που είναι ειδικά για τις θέσεις δέσμευσης του Τ20 στο gp120 (π.χ. οι περιοχές βρόχου C1 και V3) και το gp41 (π.χ. τομέας NHR), θα μπορούσε να εμποδίσει σημαντικά την ανασταλτική δραστηριότητα σύντηξης του T20 14, 15. Εδώ διερευνήσαμε την επίδραση των προϋπαρχόντων αντισωμάτων κατά του πεπτιδίου AP3. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2a, τόσο το T20 όσο και το C46 αντέδρασαν με τα αντισώματα στους ορούς πέντε ασθενών μολυσμένων με HIV-1. Ωστόσο, κανένα από τα τρία τεχνητά πεπτίδια ΑΡ1, ΑΡ2 και ΑΡ3 δεν αναγνωρίστηκε από τα προϋπάρχοντα αντισώματα. Η ανασταλτική δραστηριότητα του Τ20 στη μόλυνση από HIV-1 IIIB μειώθηκε περίπου 1,9 φορές σε > 3,6 φορές παρουσία ορών από ασθενείς μολυσμένους με HIV-1 (Εικ. 2b και Συμπληρωματικός Πίνακας S1), επιβεβαιώνοντας ότι τα προϋπάρχοντα αντισώματα στους ορούς ασθενών με HIV/AIDS μπορούν να μετριάσουν την αντι-HIV-1 δραστηριότητα του Τ20 14, 15 . Ωστόσο, κανένα από τα τεχνητά πεπτίδια στην παρούσα μελέτη δεν έδειξε σημαντική μείωση της αντι-HIV-1 δραστηριότητας παρουσία ορών ασθενών. Αντίθετα, η αντιϊκή δράση του AP3 αυξήθηκε παρουσία αντιορών από ασθενείς μολυσμένους με HIV-1 (Εικ. 2b και Συμπληρωματικός Πίνακας S1), υποδηλώνοντας ότι τα αντισώματα anti-HIV-1 ενίσχυσαν στην πραγματικότητα την αντι-HIV-1 δράση του AP3, πιθανώς επειδή η δέσμευση των αντισωμάτων σε ορισμένες θέσεις στο gp120 ή gp41 προάγει την αλληλεπίδραση του AP3 με το ιικό gp41 NHR Το AP3 είχε μεγαλύτερο χρόνο ημιζωής από το T20. Αν και το T20 έχει δείξει αποτελεσματικότητα στην αναστολή της λοίμωξης HIV-1, η κύρια αδυναμία του έγκειται στον σύντομο χρόνο ημιζωής του στο πλάσμα (περίπου 2 ώρες) [22] [23] [24] . Ως αποτέλεσμα, το T20 πρέπει να χορηγείται υποδόρια δύο φορές την ημέρα σε 90 mg ανά δόση, προκαλώντας συχνά σοβαρές αντιδράσεις στο σημείο της ένεσης 25, 26 . Εδώ, πραγματοποιήσαμε φαρμακοκινητικές μελέτες με ενδοφλέβια χορήγηση AP3, AP2 και T20, αντίστοιχα, σε αρουραίο SD σε δόση 1 mg/kg, προκειμένου να συγκρίνουμε τον in vivo χρόνο κυκλοφορίας τους. Όπως αναμενόταν, το T20 εμφάνισε μικρότερο χρόνο ημιζωής και χαμηλότερη AUC (0-t) από τη συστηματική κυκλοφορία, ενώ τα AP3 και AP2 έδειξαν πολύ υψηλότερη συγκέντρωση και μεγαλύτερο χρόνο κυκλοφορίας (Πίνακας 2). Τα φαρμακοκινητικά προφίλ των AP3 και AP2 ταιριάζουν σε ένα μοντέλο χωρίς διαμέρισμα. Οι φαρμακοκινητικές παράμετροι υπολογίστηκαν με PK Solver. Ο in vivo χρόνος ημιζωής αποβολής του AP3 (t 1/2 = 6,02 h) ήταν περίπου 2,8 φορές μεγαλύτερος από αυτόν του T20 (t 1/2 = 1,57 h). Αυτό το αποτέλεσμα παρείχε τη θεωρητική βάση για τη μείωση της συχνότητας της ένεσης και της δόσης του αναστολέα σύντηξης, σε σύζευξη με τη βελτιωμένη αντιική ισχύ του AP3. Επομένως, η αντικατάσταση του T20 με AP3 μπορεί να μειώσει σημαντικά τις αντιδράσεις στο σημείο της ένεσης και το κόστος του φαρμάκου, γεγονός που θα προωθούσε τις κλινικές εφαρμογές του αναστολέα σύντηξης HIV σε περιοχές ή χώρες με φτωχούς πόρους. Το AP3 ήταν πολύ πιο ανθεκτικό από το T20 στην πρωτεολυτική αποικοδόμηση από την πρωτεϊνάση Ομογενοποίηση ήπατος Κ και αρουραίου. Συγκρίναμε τη σταθερότητα των Τ20 και ΑΡ3 παρουσία πρωτεϊνάσης Κ (μια πρωτεϊνάση σερίνης ευρέως φάσματος) και ομογενοποιήματος ήπατος αρουραίου. Μετά από επεξεργασία με 20 ng/mL πρωτεϊνάσης Κ για 2 ώρες στους 37 °C, παρέμεινε μόνο το 29% του γονικού πεπτιδίου Τ20, όπως ανιχνεύθηκε με ανάλυση LC-MS. Υπό τις ίδιες συνθήκες, το AP3 διατήρησε το 100% του πρωτοτύπου του (Εικ. 3α). Επιπλέον, το AP3 έδειξε μια σημαντικά ενισχυμένη in vitro μεταβολική σταθερότητα έναντι του T20 παρουσία ομογενοποιήματος ήπατος (Εικ. 3β) .Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το τεχνητό πεπτίδιο AP3 είναι πολύ πιο ανθεκτικό στην πρωτεολυτική αποικοδόμηση από το φυσικό πεπτίδιο Τ20, το οποίο μπορεί να συμβάλει στη σημαντικά μεγαλύτερη in vivo ημιζωή του από το Τ20 όπως περιγράφεται παραπάνω. Το AP3 σχημάτισε σταθερό α-ελικοειδές σύμπλεγμα και μπλοκ σχηματισμού gp41 6-HB. Για τη διερεύνηση του αντιϊκού μηχανισμού του AP3, η θερμική σταθερότητα του συμπλόκου AP3/N36 συγκρίθηκε με εκείνη των συμπλεγμάτων AP1/N36, AP2/N36, T20/N36 και C34/N36 με φασματοσκοπία κυκλικού διχρωμισμού (CD) 27 . Επειδή το T20 στερείται το pocket-binding domain (PBD), το σύμπλεγμα T20/N36 δεν έδειξε τυπική α-ελικοειδές διαμόρφωση, σε συμφωνία με τις προηγούμενες μελέτες μας 8, 9 . Παρόμοια με την α-ελικοτητα του συμπλόκου C34/N36 3, τα σύμπλοκα AP1/N36, AP2/N36 και AP3/N36 σχημάτισαν όλα μια αρνητική κορυφή σε σχήμα σέλας στα 208 nm και 222 nm, υποδεικνύοντας τις α-ελικοειδείς δομές τους (Εικ. 4α) Εικ. 4β), υποδεικνύοντας ότι το α-ελικοειδές σύμπλοκο που σχηματίζεται από ΑΡ3 και Ν36 είναι το πιο σταθερό μεταξύ των τεσσάρων συμπλεγμάτων. Στη συνέχεια συγκρίναμε την ανασταλτική δράση του ΑΡ3 με εκείνη των ΑΡ1 και ΑΡ2 στον σχηματισμό 6-ΗΒ μεταξύ C34 και Ν36. Εφόσον το Τ20 δεν μπορεί να αποκλείσει τον σχηματισμό 6-ΗΒ 8, 9, χρησιμοποιήσαμε έναν μικρομοριακό αναστολέα σύντηξης HIV-1, τον ADS-J1 28, 29, για να αντικαταστήσουμε το Τ20 ως έλεγχο της αναστολής του 6-ΗΒ. Όπως αναμενόταν, το ADS-J1 θα μπορούσε να αναστείλει αποτελεσματικά το σχηματισμό 6-HB με IC 50 2,75 μ M 8, 9, [27] [28] [29] . Το AP3 ήταν εξαιρετικά αποτελεσματικό έναντι του σχηματισμού 6-HB με δοσοεξαρτώμενο τρόπο με τιμή IC 50 0,24 μ M, περίπου 30 και 15 φορές πιο ισχυρό από το AP1 και το AP2, αντίστοιχα (Εικ. 4γ), επιβεβαιώνοντας ότι το AP3 μπορεί να μπλοκάρει δυναμικά το σχηματισμό πυρήνα σύντηξης gp41 6-HB, αναστέλλοντας έτσι τη σύντηξη HIV-1 με τη μεμβράνη του κυττάρου στόχου. Δομική βάση για την ισχυρή ανασταλτική δράση σύντηξης του τεχνητού πεπτιδίου ΑΡ3. Για να διασαφηνίσουμε τους μοριακούς προσδιοριστές αυτών των τεχνητών πεπτιδίων, επιλύσαμε επιτυχώς και τις τρεις πολύπλοκες δομές των πεπτιδίων AP1/AP2/AP3 που συνδέονται με το gp41 NHR. Για τα AP1 και AP2, ένας βελτιστοποιημένος συνδέτης Κάθε δείγμα δοκιμάστηκε εις τριπλούν και το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SD. *Ρ < 0,05, **Ρ < 0,01, ***Ρ < 0,001. Το \"SGGRGG\" χρησιμοποιήθηκε για τη συναρμολόγηση του NHR και του τεχνητού πεπτιδίου σε μια μοναδική ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη (N36-L6-AP1 ή N36-L6-AP2). Ωστόσο, μια παρόμοια στρατηγική απέτυχε στην κρυστάλλωση του AP3. Ως εκ τούτου, αποφασίσαμε να συνκρυσταλλώσουμε το συνθετικό πεπτίδιο N45 και το πεπτίδιο AP3, και τελικά ελήφθησαν οι σύμπλοκοι κρύσταλλοι. Είναι ενδιαφέρον ότι οι κρύσταλλοι τριών διαφορετικών αναστολέων ανήκουν σε τρεις διακριτές διαστημικές ομάδες: P2 1 για N36-L6-AP1, R32 για N36-L6-AP2 και P6 3 για N45/AP3. Όπως αναμενόταν, τα τμήματα NHR σε τρεις δομές σχηματίζουν όλα έναν τριμερή πυρήνα, ενώ το τμήμα AP1, AP2 ή AP3 διπλώνει σε μια διαμόρφωση μονής έλικας και συνδέεται με το τριμερές NHR για να σχηματίσει ένα τυπικό 6-HB, παρόμοιο με αυτό του HIV -1 δομή πυρήνα gp41 που σχηματίζεται από το φυσικό πεπτίδιο CHR C34 και N36 (Εικ. 5α). Επίσης, τα διατηρημένα υδρόφοβα υπολείμματα, όπως τα W43, W46 και I50, στα τεχνητά πεπτίδια θάφτηκαν βαθιά στον υδρόφοβο Πίνακα 2. Φαρμακοκινητικές παράμετροι των AP2, AP3 και T20 μετά από ενδοφλέβια χορήγηση σε 1 mg/kg σε αρσενικούς αρουραίους SD (n = 2). Εικόνα 3. Ευαισθησία των AP3 και T20 σε πρωτεολυτική αποικοδόμηση από πρωτεϊνάση Κ και ομογενοποίηση ήπατος αρουραίου. (α) Μετά από πέψη με πρωτεϊνάση Κ σε ρΗ 7,2 και (β) ομογενοποίηση ήπατος αρουραίου, η υπολειπόμενη ποσότητα ΑΡ3 και Τ20 ανιχνεύθηκε με ανάλυση LC-MS. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SD. Η αναστολή των ΑΡ1, ΑΡ2, ΑΡ3, Τ20 και ADS-J1 έναντι σχηματισμού 6-ΗΒ μεταξύ Ν36 και C34 ανιχνεύθηκε με ELISA χρησιμοποιώντας το ειδικό για 6-ΗΒ mAb NC-1. Κάθε δείγμα δοκιμάστηκε εις τριπλούν και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SD. αυλακώσεις που σχηματίστηκαν μεταξύ κάθε ζεύγους ελίκων NHR, παρόμοιες με τα αντίστοιχα υπολείμματα των W628, W631 και I635 στο φυσικό gp41 CHR (Εικ. 5β). Τα πεπτίδια ΑΡ επέδειξαν καλύτερη συγγένεια έναντι της φυσικής CHR της gp41. Στο C34, το οποίο περιέχει τη φυσική αλληλουχία CHR από το W628 έως το L661, δεν βρέθηκε ισχυρή αλληλεπίδραση μεταξύ I642 και Q565 στο ιικό σύμπλεγμα gp41 NHR-CHR (Εικ. 5γ). Ωστόσο, στην αντίστοιχη αλληλουχία (από W43 έως K76) των AP1 και AP2, ένας δεσμός υδρογόνου δημιουργήθηκε μεταξύ S57 (που αντιστοιχεί στο I642 στο CHR) και Q18 (που αντιστοιχεί στο Q565 στο NHR) στα N36-L6-AP1, N36-L6 -AP2 και N45/AP3. Έτσι, το S57 στο AP1/AP2/AP3 παίζει ρόλο στη σταθεροποίηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ του τεχνητού αναστολέα πεπτιδίου και του στόχου NHR του, με αποτέλεσμα την ισχυρότερη συγγένεια πρόσδεσής τους. Επιπλέον, στο NHR-CHR, τα L567 και L568 σε δύο γειτονικά NHR σχηματίζουν μια υδρόφοβη αύλακα, στην οποία είναι θαμμένο το T639 (Συμπληρωματικό Σχ. S1a). Ωστόσο, στα N36-L6-AP1, N36-L6-AP2 και N45/AP3, το I54 (που αντιστοιχεί στο T639 στο CHR) μπορεί να συνδεθεί ισχυρά με τα L20 και L21 μέσω πλήρως υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων πλευρικής αλυσίδας. Ομοίως, η αλληλεπίδραση του I64 (που αντιστοιχεί στο S659 στο CHR) με το L10 και το L11 (που αντιστοιχεί στο L567 και το L568 στο NHR, αντίστοιχα) στο N36-L6-AP1, N36-L6-AP2 και N45/AP3 (Συμπληρωματικό Σύκο. S1b). Όπως η έλικα gp41 CHR, οι έλικες των AP1, AP2 και AP3 έχουν επίσης δύο διαφορετικές πλευρές, μια υδρόφοβη πλευρά που βλέπει προς το NHR και μια υδρόφιλη στραμμένη προς τα έξω. Αναμένεται ότι η ενίσχυση της υδροφιλικότητας της εκτεθειμένης πλευράς των αναστολέων μπορεί να αυξήσει την αντιική δράση και τη διαλυτότητά τους. Για να επιτευχθεί αυτός ο στόχος, τα υπολείμματα αμινοξέων με υδροφοβικότητα ή χαμηλή υδροφιλία, όπως τα N637, S640, L641 και S644 στο CHR, άλλαξαν σε υπολείμματα αμινοξέων με υψηλή υδροφιλία, όπως E52, K55, K56 και E59 σε AP1, AP2. και AP3, αντίστοιχα. Επιπλέον, το υδρόφοβο υπόλειμμα M629 στο CHR αντικαταστάθηκε με ένα υδρόφιλο υπόλειμμα Ε44 σε AP2 και AP3 (Συμπληρωματικό Σχήμα 2). S2). Αυτά τα υδρόφιλα υπολείμματα, όπως το γλουταμικό οξύ και η λυσίνη, μπορούν να αυξήσουν τη διαλυτότητα ολόκληρου του πεπτιδίου και, ως εκ τούτου, να σταθεροποιήσουν το σύμπλοκο που σχηματίζεται από τον αναστολέα και τον στόχο του. Έχει αποδειχθεί ότι η διπλή γέφυρα άλατος EE-KK μπορεί να σταθεροποιήσει τη διαμόρφωση της έλικας 30 . Έχουμε εντοπίσει αυτό το είδος αλληλεπίδρασης μεταξύ i και i + 3 ή i + 4 θέσεων στις τρεις σύνθετες δομές. Στο N36-L6-AP1, το R48 αλληλεπιδρά με τα E45 και E52 για να σχηματίσει ένα δίκτυο γέφυρας αλατιού. Στο N36-L6-AP2, το E45 αλληλεπιδρά με το K48 και το E52 συνδέεται με το K56, ενώ στο N45/AP3, το K69 συνδέεται με το E66 (Συμπληρωματικό Σχ. S2). Αυτές οι ισχυρές γέφυρες αλατιού που σχηματίζονται από τα αντίθετα φορτισμένα υπολείμματα σταθεροποιούν τη διαμόρφωση του πεπτιδίου AP, φέρνοντας πλήρως την ανασταλτική του δράση. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, η προσθήκη του \"M-T hook\" στα CHR πεπτίδια C34 και sifuvertide θα μπορούσε να βελτιώσει δραματικά το anti-HIV-1 δραστηριότητα 17, 18 . Όπως αναμενόταν, το Ν-τερματικό Met και Thr του AP3 σχηματίζει μια δομή που μοιάζει με άγκιστρο (Εικ. 5δ). Η υδρόφοβη πλευρική αλυσίδα μεθειονίνης του M41 φιλοξενεί την αυλάκωση μεταξύ των ελίκων AP3 και NHR, καλύπτοντας την υδρόφοβη θήκη. Αυτή η αλληλεπίδραση οδηγεί σε μια σειρά διαμορφωτικών αλλαγών. Η κύρια αλυσίδα του AP3 στο W43 κινείται 1,91 Å πιο κοντά στο NHR σε σύγκριση με το AP2 (Συμπληρωματικό Σχ. S3). Η πλευρική αλυσίδα του W43 στο AP3 ανατρέπεται κατά 90 μοίρες και είναι θαμμένη πιο βαθιά από αυτή του AP2. Η πλευρική αλυσίδα του E44 γυρίζει πίσω για να αλληλεπιδράσει στο D47, αλλά η πλευρική αλυσίδα E45 γυρίζει πίσω από το K48 και αλληλεπιδρά με το T42. Ως εκ τούτου, αυτή η δομή αγκίστρου M-T θα μπορούσε να σταθεροποιήσει περαιτέρω τη δέσμευση μεταξύ του στόχου AP3 και NHR. Η ενφουβιρτίδη, γνωστή και ως T20, εγκρίθηκε από τον FDA των ΗΠΑ ως το πρώτο αντιιικό φάρμακο που βασίζεται στον αναστολέα εισόδου του HIV για χρήση με άλλα φάρμακα κατά του HIV για τη θεραπεία Ενήλικες και παιδιά με μόλυνση από HIV-1 ηλικίας 6-16 ετών 23,31,32 (http://www.fuzeon.com). Αν και το T20 είναι ένα απαραίτητο αντι-HIV φάρμακο για ασθενείς με HIV/AIDS που δεν έχουν ανταποκριθεί στην τρέχουσα αντιρετροϊκή θεραπεία, οι ελλείψεις του έχουν περιορίσει την κλινική του εφαρμογή. Το T20 έχει χαμηλότερη αντι-HIV δράση και μικρότερο χρόνο ημιζωής από άλλα πεπτίδια CHR που περιέχουν PBD, όπως τα C34 και C38 8, 9, 33. Επιπλέον, οι ανθεκτικές στο T20 παραλλαγές HIV-1 εμφανίστηκαν σύντομα (π.χ. 14 ημέρες) μετά τη χρήση του σε ασθενείς 34 . Οι περισσότεροι από τους ανθεκτικούς στο T20 ιούς έφεραν μεταλλάξεις στο μοτίβο GIV (υπολείμματα 36-45: GIVQQQNNLL) στον τομέα 10 του gp41 NHR, [34] [35] [36] [37] [38] . Η έλλειψη PBD συμβάλλει στις κύριες αδυναμίες του T20 που περιγράφονται παραπάνω. Δεδομένου ότι ο διατηρημένος υδρόφοβος θύλακας στο τριμερές gp41 NHR παίζει κρίσιμο ρόλο στη σταθεροποίηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ του gp41 NHR και του CHR και στο σχηματισμό του συντηκτικού πυρήνα 6-HB 1, 39, 40, το πεπτίδιο CHR που περιέχει PBD, όπως το C34 , μπορεί να συνδεθεί με το τριμερές gp41 του ιού πιο ισχυρά και σταθερά, κατέχοντας έτσι πιο ισχυρή αντι-HIV δράση από το T20, ένα πεπτίδιο CHR χωρίς PBD 8, 9. Απουσία PBD, το T20 αλληλεπιδρά κυρίως με τη μεσαία περιοχή του τομέα NHR που περιέχει το μοτίβο GIV. Επομένως, ένας ιός με μεταλλάξεις σε αυτό το μοτίβο είναι γενικά ανθεκτικός στο T20 10, [34] [35] [36] [37] [38] . Σε σύγκριση με άλλα φάρμακα κατά του HIV, μια άλλη αδυναμία του Τ20 είναι η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα του με τα προϋπάρχοντα αντισώματα σε ασθενείς με μόλυνση από τον HIV-1. Εκτός από το gp41, το T20 θα μπορούσε επίσης να συνδεθεί σε ορισμένες περιοχές στο gp120. Τα προϋπάρχοντα αντισώματα ειδικά για τις θέσεις δέσμευσης του T20 στα gp120 και gp41 μπορεί έμμεσα να καταστέλλουν την αντι-HIV δράση του T20 14, 15 . Η προσθήκη PBD στο Ν-άκρο του T20, όπως το T-1249, θα μπορούσε να βελτιώσει σημαντικά την αντι-HIV Προφίλ δραστικότητας, ημιζωής και αντοχής στα φάρμακα HIV-1 33, [41] [42] [43] . Η προσθήκη δομής αγκίστρου Μ-Τ στο Ν-άκρο ενός πεπτιδίου CHR που περιέχει PBD, όπως το MT-C34 ή το MT-SFT, θα μπορούσε να αυξήσει περαιτέρω τη δράση κατά του HIV-1 των αντίστοιχων πεπτιδίων CHR 17, 18. Η διαγραφή της περιοχής δέσμευσης μοτίβου GIV από ένα πεπτίδιο CHR, όπως το CP621-652 και το CP32M, είναι μια άλλη αποτελεσματική προσέγγιση για την αύξηση του γενετικού φραγμού στην αντοχή στο φάρμακο 44, 45. Ωστόσο, καμία από τις παραπάνω προσεγγίσεις δεν είναι αποτελεσματική στην πρόληψη της διασταυρούμενης αντίδρασης του Τ20 με τα προϋπάρχοντα αντισώματα αντι-gp41 σε ασθενείς με HIV/AIDS, αφού τα παραπάνω τροποποιημένα πεπτίδια περιέχουν κυρίως τις φυσικές αλληλουχίες της περιοχής HIV-1 gp41 CHR. Οι προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι τα AP1 και AP2, τεχνητά πεπτίδια με μη εγγενείς πρωτεϊνικές αλληλουχίες, θα μπορούσαν να σχηματίσουν δομή περιελιγμένης σπείρας για να αλληλεπιδράσουν με το gp41 NHR και να αναστείλουν τη σύντηξη κυττάρων-κυττάρου που προκαλείται από τον HIV-1 Env 16 . Στην παρούσα μελέτη, σχεδιάσαμε ένα νέο τεχνητό πεπτίδιο, το AP3, προσθέτοντας δομή αγκίστρου Μ-Τ στο Ν-άκρο του AP2 (Εικ. 1α), ακολουθούμενη από διερεύνηση της επίδρασης των προϋπαρχόντων αντισωμάτων anti-gp41 σε ασθενείς με HIV λοίμωξη στο AP3, χρησιμοποιώντας AP1, AP2 και T20 ως μάρτυρες. Αποδείξαμε ότι οι οροί ασθενών με HIV λοίμωξη θα μπορούσαν να συνδεθούν με το T20 και να μειώσουν σημαντικά την ισχύ του έναντι του HIV-1. Ωστόσο, αυτά τα ίδια δείγματα ορού δεν αλληλεπιδρούν με τα τρία τεχνητά πεπτίδια και ελάχιστα βλάπτουν την αντιική τους δράση. Παραδόξως, τα αντισώματα στους ορούς θα μπορούσαν ακόμη και να ενισχύσουν την αντι-HIV-1 δραστηριότητα του AP3 (Εικ. 2a,b και συμπληρωματικός πίνακας S1). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν, για πρώτη φορά, ότι η αντικατάσταση της εγγενούς ιικής αλληλουχίας στο Τ20 με μια τεχνητή αλληλουχία είναι μια αποτελεσματική προσέγγιση για να ξεπεραστεί ένα βασικό μειονέκτημα του Τ20, όπου η αντι-HIV δράση του θα μπορούσε να εξασθενήσει με προϋπάρχοντα αντισώματα anti-gp41 στον HIV /Ασθενείς με AIDS. Αξίζει τον κόπο να διερευνηθεί γιατί τα αντισώματα στους ορούς είναι ικανά να ενισχύσουν την αντι-HIV-1 δράση του AP3. Η πρόσφατη μελέτη μας έδειξε ότι η αντι-HIV-1 δράση του T20 ενισχύεται από ένα μη εξουδετερωτικό αντίσωμα που κατευθύνεται ενάντια στον τομέα NHR του HIV-1 gp41 46 . Υποθέτουμε λοιπόν ότι ορισμένα από τα αντισώματα anti-gp41 σε ασθενείς με HIV/AIDS μπορεί να συνδεθούν σε μια θέση στον τομέα NHR δίπλα στην περιοχή δέσμευσης του AP3, με αποτέλεσμα αυξημένη αλληλεπίδραση μεταξύ AP3 και NHR-τριμερούς και ενισχυμένη αντιική δράση του AP3. Στη συνέχεια συνέκρινε την ανασταλτική δράση του AP3 με M-T hook και T20/AP2 χωρίς M-T hook σε μόλυνση από αποκλίνοντα στελέχη HIV-1. Το AP3 ήταν πιο αποτελεσματικό από το AP2 ή το T20 στην αναστολή της μόλυνσης από τα εργαστηριακά προσαρμοσμένα στελέχη και τα πρωτεύοντα στελέχη του HIV-1, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που είναι ανθεκτικά στο T20 (Εικ. 1β, Πίνακας 1). Κάποιος μπορεί να αμφισβητήσει εάν το AP3 μπορεί επίσης να προκαλέσει ιούς ανθεκτικούς στα φάρμακα σε ασθενείς εάν χρησιμοποιείται σε κλινικές για τη θεραπεία ασθενών με HIV λοίμωξη. Πιστεύουμε ότι το AP3 αναμένεται να έχει πολύ υψηλότερο γενετικό φραγμό αντίστασης από το T20 επειδή το AP3 περιέχει PBD, ενώ το T20 στερείται PBD. Οι Dwyer et al. 33 χρησιμοποίησε το Τ2544, ένα πεπτίδιο CHR που περιέχει PBD, για να πραγματοποιήσει ένα πείραμα διέλευσης, χρησιμοποιώντας το Τ20 ως έλεγχο. Έδειξαν ότι ο Τ20 θα μπορούσε να προκαλέσει έναν μεταλλαγμένο ιό με υψηλή αντίσταση (81 φορές) στον Τ20 σε περίπου 1 μήνα, ενώ ο Τ2544 απέτυχε να προκαλέσει ένα ανθεκτικό στέλεχος σε περισσότερο από 2 μήνες σε καλλιέργεια. Μετά από παράταση του πειράματος διέλευσης για σχεδόν 8 μήνες, εντόπισαν ένα στέλεχος με ασθενή αντίσταση (8,3 φορές) στο T-2544 και οι σχετικές θέσεις μετάλλαξης δεν ήταν στην περιοχή του θύλακα gp41, υποδηλώνοντας ότι τα πεπτίδια CHR που περιέχουν PBD , συμπεριλαμβανομένου του ΑΡ3, μπορεί να έχει δυσκολία να προκαλέσει αντοχή στο φάρμακο. Το ΑΡ3 είχε επίσης μεγαλύτερο χρόνο ημιζωής από το Τ20 (Πίνακας 2), πιθανώς επειδή το τεχνητό πεπτίδιο ΑΡ3 είναι λιγότερο ευαίσθητο στα πρωτεολυτικά ένζυμα από το Τ20 με φυσική αλληλουχία πρωτεΐνης ιού. Η αφαίρεση των θέσεων διάσπασης των πρωτεολυτικών ενζύμων στο πεπτίδιο AP3 αναμένεται να παρατείνει περαιτέρω τον χρόνο ημιζωής του. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι η αντικατάσταση της φυσικής αλληλουχίας πρωτεΐνης με τεχνητή αλληλουχία και η προσθήκη του αγκίστρου M-T στο πεπτίδιο που περιέχει PBD είναι μια καλή στρατηγική για τον σχεδιασμό πεπτιδίων αναστολής της σύντηξης HIV με βελτιωμένη αντιική δράση και φαρμακολογικές ιδιότητες σε σύγκριση με το T20. Οι διαστατικές δομές των πεπτιδίων ΑΡ δεν είχαν διερευνηθεί πριν από την παρούσα μελέτη, η βελτιστοποίηση αυτών των τεχνητών πεπτιδικών αναστολέων δεν μπορούσε να πραγματοποιηθεί ορθολογικά. Οι δομικές μελέτες μας για τα τεχνητά πεπτίδια AP1/AP2/AP3 σε σύμπλοκο με NHR έδειξαν ότι τα πεπτίδια AP, ακριβώς όπως το πεπτίδιο CHR C34, μπορούσαν να συνδεθούν με το gp41 NHR για να σχηματίσουν μια κανονική δομή 6-HB (Εικ. 5α). Είναι ευρέως γνωστό ότι υπάρχει ένας βαθύς υδρόφοβος θύλακας σε κάθε αυλάκωση στην επιφάνεια του τριμερούς ιικού gp41 NHR. Τα υδρόφοβα υπολείμματα I635, W631 και W628 στο gp41 CHR συνδέονται με τα υδρόφοβα υπολείμματα στο τοίχωμα αυτού του θύλακα, με αποτέλεσμα το σχηματισμό σταθερού 6-HB από την ισχυρή αλληλεπίδραση μεταξύ CHR και NHR. Αυτό το σημαντικό χαρακτηριστικό έχει διατηρηθεί καλά στις δομές AP1/AP2/AP3 6-HB (Εικ. 5β), που μπορεί να ευθύνονται για τις ισχυρές ανασταλτικές δραστηριότητες σύντηξης HIV-1 αυτών των τεχνητών πεπτιδίων. Ένας νέος δεσμός υδρογόνου, ο οποίος δημιουργήθηκε μεταξύ S57 και Q18 στα σύμπλοκα AP1/AP2/AP3, δεν υπάρχει στο ιικό gp41 CHR-NHR σύμπλοκο, υποδηλώνοντας ότι το S57 μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στη σταθεροποίηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ του πεπτιδίου και του NHR, με αποτέλεσμα συγγένειες δέσμευσης του AP1/AP2/AP3 που είναι ισχυρότερες από εκείνες του HIV-1 gp41 CHR με το NHR. Επιπλέον, η γέφυρα διπλού άλατος ΕΕ-ΚΚ που σχηματίζεται μεταξύ των θέσεων i και i + 4 στις δομές ΑΡ1/ΑΡ2/ΑΡ3 θα μπορούσε να σταθεροποιήσει τη διαμόρφωση της έλικας και να αυξήσει την ανασταλτική δράση αυτών των πεπτιδίων. Σε σύγκριση με το AP1, εισήχθησαν μεταλλάξεις τριπλής θέσης σε AP2 και AP3, δηλ. M44E, R48K και E49K. Αυτές οι υποκαταστάσεις όχι μόνο αυξάνουν τη διαλυτότητα του πεπτιδίου, αλλά προκαλούν επίσης μια σειρά από αναδιατάξεις ορισμένων ενδοελικοειδών γεφυρών άλατος για τη βελτίωση της σταθερότητας της δομής της έλικας CHR και της ανασταλτικής δραστηριότητας σύντηξης HIV-1. Το άγκιστρο M-T είχε προηγουμένως αποδειχθεί ότι είναι ένα αποτελεσματικό βήμα προς την αύξηση τη σταθερή αλληλεπίδραση μεταξύ ενός CHR-πεπτιδίου και του θύλακα HIV-1 gp41 17, 18. Ως εκ τούτου, το AP2 βελτιστοποιήθηκε περαιτέρω με την ενσωμάτωση Met και Thr στο Ν-άκρο του. Τα αποτελέσματα της φασματοσκοπίας CD και της θερμικής μετουσίωσης υποδεικνύουν ότι η ενσωμάτωση του αγκίστρου M-T συμβάλλει στο σχηματισμό μιας πιο σταθερής δομής πυρήνα 6-HB μεταξύ AP3 (M-T hook-optimized AP2) και N36. Επιπλέον, η διπλή γέφυρα άλατος EE-KK που σχηματίστηκε μεταξύ των θέσεων i και i + 4 στη δομή N36-L6-AP3 συνέβαλε στην αυξημένη σταθερότητα της έλικας CHR και 6-HB, με αποτέλεσμα βελτιωμένη ισχύ του AP3, όπως έχει σημειωθεί σε μελέτες πεπτιδίων CHR με διπλές μεταλλάξεις ΕΕ-ΚΚ 30, 33, 47, 48. Επίσης, η δραστηριότητα σύντηξης HIV-1 και ο χρόνος ημιζωής του AP2 μπορεί να έχουν ενισχυθεί και παραταθεί, αντίστοιχα, με την προσθήκη αγκίστρου M-T στο σχεδιασμό του AP3. Συμπερασματικά, το AP3, ένα τεχνητό πεπτίδιο με δομές αγκίστρου PBD και M-T , εμφάνισε βελτιωμένη αντι-HIV-1 δράση και προφίλ ανθεκτικότητας στα φάρμακα, καθώς και παρατεταμένο χρόνο ημιζωής. Επιπλέον, δεν αντέδρασε με τα προϋπάρχοντα αντισώματα στους ορούς ασθενών με HIV/AIDS. Κατά συνέπεια, η αντιϊκή του δράση Επιστημονικές Εκθέσεις | 5:13028 | DOi: 10.1038/srep13028 δεν επηρεάστηκε σημαντικά από αυτά τα αντισώματα. Ως εκ τούτου, το AP3 δείχνει πολλά υποσχόμενο ως υποψήφιο για περαιτέρω ανάπτυξη ως νέος αναστολέας σύντηξης HIV για κλινική χρήση. Αυτή η μελέτη παρέχει επίσης σημαντικές πληροφορίες δομής και δραστηριότητας για τον ορθολογικό σχεδιασμό νέων τεχνητά πεπτιδικών αναστολέων. Επιπλέον, τα αποτελέσματά μας τόνισαν τα πλεονεκτήματα των τεχνητά σχεδιασμένων πεπτιδίων και επιβεβαίωσαν ότι αυτή η στρατηγική θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ευρέως στην ανάπτυξη τεχνητών αναστολέων σύντηξης ιών που βασίζονται σε πεπτίδια ενάντια στον HIV-1 και άλλους ιούς με περίβλημα με πρωτεΐνες σύντηξης μεμβράνης κατηγορίας Ι, όπως ο SARS-CoV 19 , MERS-CoV 20 και παραμυξοϊός 49 .Δήλωση δεοντολογίας. Αυτή η μελέτη δεν περιελάμβανε πειραματισμούς σε ανθρώπους. τα μόνα ανθρώπινα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν ήταν δείγματα ορού που ελήφθησαν από άτομα μολυσμένα με HIV-1 με έγκριση από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Κλινικού Κέντρου Δημόσιας Υγείας της Σαγκάης, Πανεπιστήμιο Fudan (Πρωτόκολλο Αρ. SPHCC-125-2). Οι μέθοδοι πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις εγκεκριμένες οδηγίες. Όλα αυτά τα δείγματα ορών προήλθαν από ενήλικες. κανένας ανήλικος δεν συμμετείχε σε αυτή τη μελέτη. Λήφθηκε γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση για τη χρήση των κλινικών δειγμάτων από όλους τους ασθενείς που συμμετείχαν σε αυτή τη μελέτη. Σύνθεση πεπτιδίων. Ένα πάνελ πεπτιδίων (Εικ. 1a), συμπεριλαμβανομένων των Τ20, C34, C46, ​​ΑΡ1, ΑΡ2, ΑΡ3, καθώς και Ν-πεπτίδια που προέρχονται από NHR, Ν36 και Ν45, συντέθηκαν με μια τυπική μέθοδο FMOC στερεάς φάσης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως 8, 50. Όλα τα πεπτίδια ακετυλιώθηκαν στο Ν άκρο και αμιδώθηκαν στο Ο άκρο. Τα πεπτίδια βρέθηκαν να είναι περίπου 95% καθαρά με HPLC και ταυτοποιήθηκαν με φασματομετρία μάζας (Perseptive Biosystems, Framingham, ΜΑ, ΗΠΑ). Οι συγκεντρώσεις των πεπτιδίων προσδιορίστηκαν με απορρόφηση υπεριώδους ακτινοβολίας και έναν θεωρητικά υπολογισμένο συντελεστή γραμμομοριακής εξάλειψης με βάση τα υπολείμματα τρυπτοφάνης και τυροσίνης. Δοκιμασία πιστοποίησης. Οι χρωματογραφικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας στήλη ODS-C8 (5 μ m, 100 mm × 2,0 mm ID) που διατηρήθηκε σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Η κινητή φάση αποτελούνταν από ακετονιτρίλιο-νερό-μυρμηκικό οξύ σε αναλογία 50:50:0,1 (ν/ν/ν) με ρυθμό ροής 0,3 mL/min. Ο όγκος έγχυσης του δείγματος ήταν 10 μ L. Το ακετονιτρίλιο ήταν ποιότητας HPLC και άλλα χημικά αντιδραστήρια και διαλύτες ήταν αναλυτικής ποιότητας. Για ανάλυση LC-MS χρησιμοποιήθηκε ένα Thermo TSQ Quantum Discovery MAX τριπλού τετραπλού διαδοχικού φασματόμετρου μάζας εξοπλισμένο με πηγή ESI (San Jose, CA) και αντλία LC Surveyor. Η απόκτηση και η επεξεργασία δεδομένων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού Xcalibur και του προγράμματος ανάλυσης δεδομένων LCQuan 2.0 (Thermo Finnigan), αντίστοιχα. Οι βελτιστοποιημένες παράμετροι MS ήταν ως εξής: τάση ψεκασμού 4800 V, πίεση αερίου περιβλήματος 40,0 psi, ροή βοηθητικής βαλβίδας 1,0 psi και τριχοειδική θερμοκρασία 300 °C. Όταν εκτελείται διάσταση επαγόμενης από σύγκρουση (CID), η πίεση ρυθμίστηκε στο 1,5 mTorr. Ο επιλεγμένος τρόπος παρακολούθησης αντίδρασης (SRM) χρησιμοποιήθηκε για το AP3 ενώ ο επιλεγμένος τρόπος παρακολούθησης ιόντων (SIM) προδιαμορφώθηκε για το T20. Καταγράφηκαν οι ακόλουθες μεταβάσεις: m/z 670,5 για AP3, m/z 1498,6 για T20. Οι μάζες των συνθετικών πεπτιδίων T20, AP1, AP2 και AP3 προσδιορίστηκαν με MALDI-TOF-MS (Συμπληρωματικό Σχ. S4 και S5). Έκφραση και καθαρισμός της πρωτεΐνης σύντηξης N36-L6-AP1 και N36-L6-AP2. Χρησιμοποιώντας επικαλυπτόμενη PCR, το θραύσμα DNA που κωδικοποιεί το πεπτίδιο ΑΡ1 ή ΑΡ2 συνδέθηκε στο 3'-άκρο του cDNA του gp41 NHR (\"Ν36\", 546-581), με έναν βραχύ συνδετήρα (\"L6\", SGGRGG) μεταξύ τους. Στη συνέχεια, ολόκληρη η αλληλουχία υποκλωνοποιήθηκε στον φορέα pET-28a (Novagen, ΗΠΑ) με μια τεχνητή ετικέτα SUMO μεταξύ της Ν-τερματικής ετικέτας His και της πρωτεΐνης στόχου. Τα κύτταρα Ε. coli που μετασχηματίστηκαν με pET-28a-SUMO-N36-L6-AP1-ή pET-28a-SUMO-N36-L6-AP2 προκλήθηκαν με προσθήκη 1 mM IPTG και επώαση όλη τη νύχτα στους 16°C. Η πρωτεΐνη σύντηξης καθαρίστηκε με ρητίνη συγγένειας Ni-NTA (Qiagen, Valencia, CA, USA) και η επισήμανση His-SUMO αποκόπηκε με επεξεργασία με ένζυμο Ulp1 στους 4 °C για 2 ώρες. Το καθαρισμένο N36-L6-AP1 ή N36-L6-AP2 εφαρμόστηκε σε στήλη διήθησης γέλης Superdex-75 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Κλάσματα που περιέχουν N36-L6-AP1 ή N36-L6-AP2 τριμερές συλλέχθηκαν και συμπυκνώθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις με υπερδιήθηση. Κρυστάλλωση, συλλογή δεδομένων και προσδιορισμός δομής. Η πρωτεΐνη σύντηξης N36-L6-AP1 κρυσταλλώθηκε στους 16°C χρησιμοποιώντας τη μέθοδο αιωρούμενης σταγόνας, διάχυσης ατμού. Οι σταγόνες τοποθετήθηκαν σε ένα σιλικονοποιημένο κάλυμμα με εξισορρόπηση ενός μίγματος που περιείχε 1 μ l διάλυμα πρωτεΐνης (25 mg/ml τριμερές N36-L6-AP1 σε 20 mM Tris-HCl pH 8,0 και 150 mM NaCl) και 1 μ l διάλυμα δεξαμενής ( 0,1 M Tris-HCl pH 8,5, 32% (w/v) PEG3350 και 0,2 M MgCl 2) έναντι διαλύματος δεξαμενής 400 μ l. Μετά από μία εβδομάδα, σχηματίστηκαν μονοκρυστάλλοι και καταψύχθηκαν με υγρό άζωτο για μελλοντική συλλογή δεδομένων. Η πρωτεΐνη σύντηξης N36-L6-AP2 κρυσταλλώθηκε με παρόμοιο τρόπο με διαφορετικό διάλυμα δεξαμενής (0,1 Μ Tris-HCl ρΗ 8,0, 34% (β/ο) PEG3350 και 0,2 Μ MgCl2). Για να ληφθεί ο σύμπλοκος κρύσταλλος του AP3 και του NHR, το συντιθέμενο AP3 αναμίχθηκε πρώτα με το πεπτίδιο N45 σε μοριακή αναλογία 1:1 και στη συνέχεια εφαρμόστηκε σε στήλη διήθησης γέλης Superdex-75 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) για να απομονωθεί το σχηματισμένο 6 -HB. Τα κλάσματα που περιείχαν τριμερές N45/AP3 συλλέχθηκαν και συμπυκνώθηκαν στα 30 mg/ml, στη συνέχεια κρυσταλλώθηκαν στους 16 °C χρησιμοποιώντας τη μέθοδο κολλημένης σταγόνας, διάχυσης ατμού. διάλυμα (20 mM Tris-HCl pH 8,0 και 150 mM NaCl) και δεξαμενή διαλύματος 1 μ l (0,2 M Θειικό αμμώνιο, 0,1 M Bis-Tris pH 6,5 και 25% w/v PEG 3350) έναντι δεξαμενής διαλύματος 400 μl . Μετά από 3 ημέρες, σχηματίστηκαν μονοκρυστάλλοι και καταψύχθηκαν με υγρό άζωτο για μελλοντική συλλογή δεδομένων. Τα σύνολα δεδομένων του N36-L6-AP1 συλλέχθηκαν στους 100 K στη γραμμή δέσμης 19-ID της Προηγμένης πηγής φωτονίων (Argonne National Laboratory, USA). Τα σύνολα δεδομένων του N36-L6-AP2 συλλέχθηκαν σε μια εσωτερική πηγή ακτίνων Χ (γεννήτρια ακτίνων Χ MicroMax 007, Rigaku, Ιαπωνία) στο Ινστιτούτο Βιοφυσικής, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών. Τα σύνολα δεδομένων των σύνθετων κρυστάλλων AP3/N45 συλλέχθηκαν στη γραμμή δέσμης BL-19U1 της εγκατάστασης ακτινοβολίας Synchrotron της Σαγκάης, Κίνα. Τα δεδομένα περίθλασης ακτίνων Χ ενσωματώθηκαν και κλιμακώθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα HKL2000 51 . Το πρόβλημα της φάσης και των τριών δομών επιλύθηκε με τη μέθοδο μοριακής αντικατάστασης χρησιμοποιώντας το PHENIX.phaser 52 με μια κρυσταλλική δομή του HIV gp41 NHR-CHR (καταχώρηση PDB: 1SZT) ως μοντέλο αναζήτησης. Τα τελικά μοντέλα προσαρμόστηκαν χειροκίνητα σε COOT 53 και βελτιώθηκαν με το PHENIX.refine 54 . Όλες οι συντεταγμένες κατατέθηκαν στην Τράπεζα Δεδομένων Πρωτεϊνών (N36-L6-AP1: 5CMU; N36-L6-AP2: 5CN0; και N45/AP3: 5CMZ). Τα στατιστικά στοιχεία της συλλογής δεδομένων και της βελτίωσης της δομής δίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S2. Προσδιορισμός της διασταυρούμενης αντιδραστικότητας των φυσικών και τεχνητών πεπτιδίων με τα προϋπάρχοντα αντισώματα σε ασθενείς μολυσμένους με HIV-1 με ELISA σάντουιτς. Διεξήχθη ELISA σάντουιτς για να προσδιοριστεί η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα των πεπτιδίων με τα προϋπάρχοντα αντισώματα σε ασθενείς μολυσμένους με HIV-1. Τα T20, C46, ​​AP1, AP2 και AP3 επικαλύφθηκαν στα φρεάτια πλακών πολυστυρενίου 96 φρεατίων (Costar, Corning Inc., Corning, NY) στα 10 μg/ml. Τα φρεάτια στη συνέχεια μπλοκαρίστηκαν με 1% ζελατίνη, ακολουθούμενη από προσθήκη 50 μl σειριακά αραιωμένων ορών από ασθενείς μολυσμένους με HIV-1 και επώαση στους 37 °C για 1 ώρα. Στη συνέχεια, προστέθηκαν διαδοχικά σημασμένο με HRP κατσίκα-αντι-ανθρώπινο IgG (Abcam, UK) και TMB. Το Α450 προσδιορίστηκε με έναν αναγνώστη ELISA (Ultra 384, Tecan). ασθενείς. Η αναστολή των πεπτιδίων στη μόλυνση HIV-1 IIIB (υποτύπος Β, Χ4) παρουσία ορών ασθενών μολυσμένων με HIV-1 προσδιορίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως 55. Εν συντομία, κάθε πεπτίδιο αναμίχθηκε με σειριακά αραιωμένο ορό από έναν ασθενή μολυσμένο με HIV-1 σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, το μίγμα πεπτιδίου/ορού και HIV-1 (100 TCID50) προστέθηκαν σε κύτταρα ΜΤ-2 (1 χ 105/ml) σε μέσο RPMI 1640 που περιείχε 10% FBS. Μετά από επώαση στους 37°C όλη τη νύχτα, τα υπερκείμενα της καλλιέργειας αντικαταστάθηκαν με φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας. Την τέταρτη ημέρα μετά τη μόλυνση, τα υπερκείμενα της καλλιέργειας συλλέχθηκαν για ανίχνευση του αντιγόνου p24 με Φασματοσκοπία ELISA.CD και Ανάλυση Θερμικού Μέσου Σημείου. Η δευτερογενής δομή των πεπτιδίων ΑΡ1, ΑΡ2 ή ΑΡ3 αναμεμιγμένων με Ν36 αναλύθηκε με φασματοσκοπία CD όπως περιγράφηκε προηγουμένως 56. Εν συντομία, κάθε μίγμα πεπτιδίου ή πεπτιδίου διαλύθηκε σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS: 50 mM φωσφορικό νάτριο και 150 mM NaCl, pH 7,2) στην τελική συγκέντρωση 10 μ M και επωάστηκε στους 37 °C για 30 λεπτά πριν ψυχθεί σε 4 °C. Τα φάσματα CD κάθε δείγματος αποκτήθηκαν σε φασματοπολόμετρο Jasco (Model J-815, Jasco Inc., Japan) στους 4 °C χρησιμοποιώντας εύρος ζώνης 5 nm, ανάλυση 0,1 nm, μήκος διαδρομής 0,1 cm και μέσο χρόνο 5,0 sec. . Τα φάσματα διορθώθηκαν με την αφαίρεση ενός τυφλού που αντιστοιχεί στη σύνθεση διαλύτη κάθε δείγματος. Η θερμική ανάλυση μεσαίου σημείου χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας στην οποία θα αποσυντεθεί το 50% του 6-HB που σχηματίζεται από το CHR και το NHR. Παρακολουθήθηκε στα 222 nm από 4 °C έως 98 °C με εφαρμογή θερμικής διαβάθμισης 5 °C/min. Η καμπύλη τήξης εξομαλύνθηκε και το μέσο σημείο των τιμών μετάπτωσης θερμικής ξεδίπλωσης (Tm) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας βοηθητικά προγράμματα λογισμικού Jasco όπως περιγράφεται παραπάνω. Αναστολή σχηματισμού δέσμης έξι έλικας gp41 με ELISA σάντουιτς. Η αναστολή του σχηματισμού δέσμης έξι έλικας gp41 από ένα δοκιμαστικό πεπτίδιο προσδιορίστηκε με ELISA σάντουιτς που περιγράφηκε προηγουμένως 57 . Εν συντομία, ένα δοκιμαστικό πεπτίδιο (ADS-J1 ως έλεγχος) σε διαβαθμισμένες συγκεντρώσεις προεπωάστηκε με πεπτίδιο N36 (1 μ M) στους 37 °C για 30 λεπτά, ακολουθούμενο από την προσθήκη του πεπτιδίου C34 (1 μΜ) και επώαση στους 37 °C για άλλα 30 λεπτά. Το μίγμα προστέθηκε σε πλάκα πολυστυρενίου 96 φρεατίων (Costar, Corning Inc., Corning, NY) προεπικαλυμμένο με αντισώματα αντι-Ν36/C34 (2 μg/ml) καθαρισμένα από αντιορούς ποντικού ειδικά έναντι της δέσμης έξι έλικας gp41 58 . Στη συνέχεια, mAb NC-1, σημασμένο με HRP IgG κουνελιού-αντι-ποντικού (Sigma) και TMB προστέθηκαν με τη σειρά. Το Α450 προσδιορίστηκε με έναν αναγνώστη ELISA (Ultra 384, Tecan). Οι δραστικότητες αναστολής των ΑΡ1, ΑΡ2 και ΑΡ3 σε μόλυνση HIV-1 προσδιορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως 57. Για την αναστολή της λοίμωξης HIV-1 IIIB (υποτύπος Β, Χ4), προστέθηκαν 100 TCID 50 του ιού σε 1 × 10 5/ml κύτταρα MT-2 σε μέσο RPMI 1640 που περιέχει 10% FBS παρουσία ή απουσία της δοκιμής πεπτίδιο όλη τη νύχτα. Στη συνέχεια, τα υπερκείμενα της καλλιέργειας άλλαξαν σε φρέσκα μέσα. Την τέταρτη ημέρα μετά τη μόλυνση, τα υπερκείμενα της καλλιέργειας συλλέχθηκαν για ανίχνευση του αντιγόνου p24 με ELISA. Για την αναστολή της μόλυνσης από το HIV-1 στέλεχος Bal (υποτύπος Β, R5), τα κύτταρα Μ7 (1 × 105/ml) προκαλλιεργήθηκαν όλη τη νύχτα και μολύνθηκαν με Bal στα 100 TCID 50 παρουσία ή απουσία του ελεγχόμενου πεπτιδίου ή πρωτεΐνης διανυκτέρευση. Στη συνέχεια, τα υπερκείμενα της καλλιέργειας άλλαξαν σε φρέσκα μέσα. Την τέταρτη ημέρα μετά τη μόλυνση, τα υπερκείμενα της καλλιέργειας απορρίφθηκαν και τα φρέσκα μέσα συμπληρώθηκαν ξανά. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν την έβδομη ημέρα μετά τη μόλυνση και δοκιμάστηκαν για αντιγόνο ρ24 με ELISA όπως περιγράφηκε προηγουμένως 55 . Υπολογίστηκε η εκατοστιαία αναστολή της παραγωγής ρ24. Ανάλυση του χρόνου ημιζωής των πεπτιδικών αναστολέων. Τέσσερις αρσενικοί αρουραίοι SD βάρους περίπου 200 g ο καθένας ελήφθησαν από το Κέντρο Ζώων της Ιατρικής Σχολής της Σαγκάης και χρησιμοποιήθηκαν για τη δοκιμασία ημιζωής. Τα ζώα αντιμετωπίστηκαν σύμφωνα με τον Νόμο για την Ευημερία των Ζώων και τον «Οδηγό για τη Φροντίδα και τη Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου» (NIH Publication 86-23, αναθεωρημένο 1985). Είτε το ΑΡ2 είτε το ΑΡ3 εγχύθηκε ενδοφλεβίως σε συγκέντρωση 1 mg/ml. Μετά την ένεση, δείγματα αίματος ελήφθησαν από την τροχιά του αρουραίου σε διάφορα χρονικά σημεία (8 και 30 λεπτά και 1,5, 3, 6, 9, 12 και 24 ώρες μετά την ένεση πεπτιδίου) και τοποθετήθηκαν σε καθαρούς σωλήνες. Για τη μελέτη της φαρμακοκινητικής των AP2 και AP3 σε αρουραίους και για την παροχή πειραματικών στοιχείων για την πιθανή φαρμακοκινητική στον άνθρωπο, καθιερώθηκε μια μέθοδος ELISA σάντουιτς διπλού αντισώματος για τον γρήγορο προσδιορισμό των AP2 και AP3 στο πλάσμα αρουραίων. Εν συντομία, πλάκες πολυστυρενίου 96 φρεατίων (Costar, Corning Inc., Corning, ΝΥ) επικαλύφθηκαν εκ των προτέρων με αντίσωμα έναντι ΑΡ2 ή ΑΡ3 (5 μg/ml) που καθαρίστηκαν από αντιορούς κουνελιού 59 . Στη συνέχεια προεπωάστηκαν με δείγματα ορού αραιωμένα 20 φορές στους 37 °C για 1 ώρα, ακολουθούμενη από την προσθήκη αντισώματος αντι-ΑΡ2 ή αντι-ΑΡ3 (1:1000) καθαρισμένου από αντιορούς ποντικού ειδικά έναντι AP2 ή AP3 59 στους 37 °C για άλλη 1 ώρα. Στη συνέχεια, προστέθηκαν με τη σειρά επισημασμένη με HRP IgG κουνελιού-αντι-ποντικού (Sigma, ΗΠΑ) και TMB. Η απορρόφηση στα 450 nm προσδιορίστηκε από έναν αναγνώστη ELISA (Ultra 384, Tecan). Οι τυπικές παράμετροι πεπτιδίου ελήφθησαν πρώτα. Στη συνέχεια, οι συγκεντρώσεις των πεπτιδίων στο πλάσμα προσδιορίστηκαν ως συνάρτηση του χρόνου και ο χρόνος ημιζωής υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το PK Solver για το Microsoft Excel για τη λήψη φαρμακοκινητικών παραμέτρων. Εκτίμηση της ευαισθησίας των πεπτιδίων στην πρωτεολυτική πέψη από την πρωτεϊνάση Κ και τα πρωτεολυτικά ένζυμα σε ομογενοποίηση ήπατος . Τα πεπτίδια (10 μg/mL) παρασκευάστηκαν σε PBS ρΗ 7,2 που περιείχε 20 ng/ml πρωτεϊνάση Κ. Το προκύπτον μίγμα επωάστηκε στους 37 °C σε λουτρό νερού και αφαιρέθηκε σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα (0, 5, 15, 30, 60, 120 λεπτά), που ακολουθείται από σβήσιμο των δειγμάτων με αιθυλική αλκοόλη και ποσοτικό προσδιορισμό των πεπτιδίων με ανάλυση LC-MS όπως περιγράφεται παραπάνω. Για να ελεγχθεί η ευαισθησία των πεπτιδίων στα πρωτεολυτικά ένζυμα σε ομογενοποίηση ήπατος, 3 αρσενικοί αρουραίοι SD (250 ± 20 g) θυσιάστηκαν υπό αναισθησία. Ολόκληρο το ήπαρ απομακρύνθηκε γρήγορα από κάθε αρουραίο, πλύθηκε σε παγωμένο PBS (50 mM, ρΗ 7,2), ζυγίστηκε και κόπηκε σε μικρά κομμάτια, τα οποία επαναιωρήθηκαν σε PBS σε 100 mg υγρού ηπατικού ιστού/2,5 ml PBS. Τα δείγματα συνενώθηκαν και ομογενοποιήθηκαν, ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση στα 9.000 g για 20 λεπτά στους 4 °C. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν. Τα δοκιμαστικά πεπτίδια προστέθηκαν στο ομογενοποίημα του ήπατος σε τελική συγκέντρωση 10 μg/ml. Το προκύπτον μίγμα επωάστηκε στους 37°C σε λουτρό νερού και τα υπολείμματα πεπτιδίων στο μίγμα προσδιορίστηκαν ποσοτικά όπως περιγράφηκε παραπάνω.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 1779, "text": "αναστολέας σύντηξης HIV" } ], "id": 2250, "question": "Τι είναι το Enfuvirtide;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2260, "text": "υπολείμματα που αντιστοιχούν στην περιοχή του θύλακα NHR" } ], "id": 2251, "question": "Τι αναγράφεται με κόκκινο χρώμα;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2351, "text": "υπολείμματα για το PBD" } ], "id": 2252, "question": "Τι σημειώνεται με μπλε χρώμα;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4637, "text": "το AP3 έχει δυνατότητες ανάπτυξης ως νέο φάρμακο κατά του HIV" } ], "id": 2257, "question": "Τι υποδηλώνουν τα αποτελέσματα;" }, { "answers": [ { "answer_start": 23935, "text": "Εικ. 1β" } ], "id": 2259, "question": "Ποιο σχήμα δείχνει ότι το AP3 εμφάνισε υψηλότερες ανασταλτικές δραστηριότητες στη μόλυνση από στελέχη HIV-1 IIIB και HIV-1 Bal;" }, { "answers": [ { "answer_start": 8729, "text": "περίπου 2 ώρες" } ], "id": 2260, "question": "Ποιος είναι ο χρόνος ημιζωής του T20 στον ορό;" }, { "answers": [ { "answer_start": 9390, "text": "μοντέλο χωρίς διαμέρισμα" } ], "id": 2261, "question": "Ποιο είδος μοντέλου περιγράφει καλύτερα τα φαρμακοκινητικά προφίλ των AP3 και AP2;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Ιοί που προκαλούν γαστρεντερίτιδα: Οι γνωστοί, οι νέοι και αυτοί που πέρασαν van der Hoek, LiaDate: 2016-02-19DOI: 10.3390/v8020042Άδεια: cc-byAbstract: Ο κατάλογος των γαστρεντερικών ιών που ανακαλύφθηκαν πρόσφατα επεκτείνεται γρήγορα. Το αν αυτοί οι παράγοντες εμπλέκονται πράγματι σε μια ασθένεια όπως η διάρροια είναι το βασικό ερώτημα, αλλά δύσκολο να απαντηθεί. Σε αυτή την ανασκόπηση παρουσιάζεται μια περίληψη όλων των ιών που βρίσκονται στη διάρροια, μαζί με τις τρέχουσες γνώσεις σχετικά με τη σύνδεσή τους με τη νόσο. . Η φλεγμονή του στομάχου και των εντέρων (γαστρεντερίτιδα) μπορεί να προκαλέσει ναυτία, έμετο και διάρροια. Η γαστρεντερίτιδα ευθύνεται για δύο έως τρία εκατομμύρια θανάτους κάθε χρόνο, καθιστώντας την μια από τις πιο κοινές αιτίες θνησιμότητας [1] . Κυρίως παιδιά στις αναπτυσσόμενες χώρες, αλλά και άτομα με ανοσοκαταστολή στις ανεπτυγμένες χώρες, υποφέρουν από διάρροια. Ενώ οι βακτηριακές και παρασιτικές γαστρεντερικές λοιμώξεις μειώνονται ως αποτέλεσμα της σωστής διάθεσης των λυμάτων και του ασφαλούς πόσιμου νερού, η ιογενής γαστρεντερίτιδα δεν μειώνεται στις αναπτυσσόμενες χώρες [2] . Στον ανεπτυγμένο κόσμο, οι ιοί είναι ήδη τα πιο κοινά παθογόνα που προκαλούν διάρροια [3] . Αν και οι ιοί που μολύνουν τον άνθρωπο είχαν ήδη περιγραφεί από το 1901 [4] και οι ιοί υποπτευόταν ότι έπαιζαν ρόλο στη διάρροια, διήρκεσε μέχρι το 1972, όταν η πρώτη Ο ιός που προκαλεί γαστρεντερίτιδα (νοροϊός) εντοπίστηκε σε ένα ξέσπασμα διάρροιας στο Norwalk (Καλιφόρνια, Ηνωμένες Πολιτείες) [5] . Λίγο μετά την ανακάλυψη του νοροϊού ανακαλύφθηκαν αρκετοί άλλοι ιοί που προκαλούν γαστρεντερίτιδα: ροταϊός σε επιθηλιακά κύτταρα παιδιών με γαστρεντερίτιδα [6] , αστροϊός σε περιπτώσεις βρεφικής διάρροιας [7] , εντερικοί αδενοϊοί στα κόπρανα παιδιών με οξεία διάρροια [8], και σαποϊός κατά τη διάρκεια εστίας γαστρεντερίτιδας σε ορφανοτροφείο στο Sapporo της Ιαπωνίας [9] . Όλοι αυτοί οι ιοί μεταδίδονται μέσω της κοπράνων-στοματικής οδού μέσω της μετάδοσης από άτομο σε άτομο και περιγράφονται με περισσότερες λεπτομέρειες παρακάτω. και στον στρατό, αλλά ο νοροϊός είναι επίσης υπεύθυνος για περίπου το 60% όλων των περιπτώσεων σποραδικής διάρροιας (περιπτώσεις διάρροιας όπου μπορεί να βρεθεί εντεροπαθογόνο), που ανασκοπούνται στη βιβλιογραφία [10, 11] . Η παθογένεια της μόλυνσης από νοροϊό έχει δοκιμαστεί in vivo. Διηθημένος νοροϊός χορηγήθηκε σε υγιείς εθελοντές μετά τον οποίο οι περισσότεροι από αυτούς εμφάνισαν διάρροια [12] . Η καλλιέργεια του ιού, ωστόσο, ήταν ένα πρόβλημα από την ανακάλυψή του, ωστόσο μια μελέτη περιέγραψε πρόσφατα την καλλιέργεια του νοροϊού σε Β κύτταρα και αποκάλυψε ότι πιθανώς χρειάζονται συμπαράγοντες, όπως τα εντερικά βακτήρια που εκφράζουν αντιγόνο ιστο-αίματος. προτού οι εντερικοί ιοί μπορούν να καλλιεργηθούν in vitro [13] . Οι σαποϊοί είναι επίσης μέλη των Caliciviridae. Υπάρχουν πέντε ανθρώπινες γονοομάδες σαπωνοϊών που περιγράφονται [14] που αντιπροσωπεύουν το 2,2%-12,7% όλων των περιπτώσεων γαστρεντερίτιδας σε όλο τον κόσμο [14, 15] . Τα κρούσματα του σαποϊού συμβαίνουν καθ' όλη τη διάρκεια του έτους και μπορεί να είναι τροφιμογενή [16] . Για τους σαποϊούς έχει περιγραφεί ότι ο ιός δεν βρέθηκε πριν από την έναρξη της επιδημίας και ότι βρέθηκε στο 95% των ασθενών κατά τη διάρκεια μιας εστίας, ενώ μειώθηκε στο 50% μετά από ένα ξέσπασμα, υποδεικνύοντας ότι ο ιός εισάγει ασθένεια σε ένας φυσικά μολυσμένος ξενιστής [17] .Η μόλυνση από ροταϊό είναι η πιο κοινή αιτία ιογενούς γαστρεντερίτιδας στα παιδιά. Ωστόσο, οι γονείς μολυσμένων παιδιών επίσης συχνά αρρωσταίνουν και ως αποτέλεσμα ο ροταϊός είναι η δεύτερη πιο κοινή αιτία γαστρεντερίτιδας στους ενήλικες [18] . Μελέτες σε ανθρώπους εθελοντές έδειξαν ότι η μόλυνση με ροταϊό προκαλεί διάρροια, έχει ως αποτέλεσμα την απόρριψη του ιού και αύξηση του τίτλου αντι-ιών αντισωμάτων μετά τη μόλυνση [19] . Επιπλέον, οι λοιμώξεις από αστροϊούς είναι συχνές, αντιπροσωπεύοντας περίπου το 10% όλων των περιπτώσεων σποραδικής διάρροιας [20] . Ο αστροϊός απομονώθηκε από άρρωστα άτομα, διηθήθηκε και χορηγήθηκε σε υγιή άτομα μετά από το οποίο σε μερικούς από τους εθελοντές παρατηρήθηκε διαρροϊκή νόσος και ο αστροϊός αποβλήθηκε στα κόπρανα τους [21] . Ο ιός μπορεί να αναπαραχθεί σε ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα και ανιχνεύθηκε με ηλεκτρονική μικροσκοπία (EM) [21] . Οι αδενοϊοί ευθύνονται για περίπου 1,5%-5,4% των περιπτώσεων διάρροιας σε παιδιά ηλικίας κάτω των 2 ετών, που ανασκοπούνται στη βιβλιογραφία [22] . Από τους 57 αναγνωρισμένους τύπους αδενοϊών [23] , μόνο οι αδενοϊοί τύπου 40 και 41 σχετίζονται με διάρροια [24] . Δίπλα σε αυτούς τους δύο τύπους, ο αδενοϊός τύπου 52 μπορεί επίσης να προκαλέσει γαστρεντερίτιδα [25] , αν και έχει υποστηριχθεί εάν ο τύπος 52 είναι στην πραγματικότητα ξεχωριστός τύπος αφού δεν υπάρχει επαρκής απόσταση από τον αδενοϊό τύπου 41 [26] . Οι αδενοϊοί μπορούν γενικά να πολλαπλασιαστούν σε κυτταρικές σειρές. Ωστόσο, ο εντερικός αδενοϊός 40/41 είναι δύσκολο να καλλιεργηθεί, ανασκοπείται στη βιβλιογραφία [27] . Στη δεκαετία του 1980 και του 1990 εντοπίστηκαν ορισμένοι ιικοί παράγοντες για τους οποίους η άμεση συσχέτιση με τη νόσο είναι λιγότερο σαφής. Οι ιοί Aichi είναι μέλη των Picornaviridae που εντοπίστηκαν σε δείγματα κοπράνων ασθενών με γαστρεντερίτιδα [28] . Η μόλυνση από τον ιό Aichi έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί ανοσοαπόκριση [29] . Από την ανακάλυψή τους, πραγματοποιήθηκαν δύο μελέτες περιπτώσεων ελέγχου, αλλά, παρόλο που και οι δύο μελέτες εντόπισαν τον ιό Aichi μόνο στα κόπρανα διαρροϊκών ασθενών, ο επιπολασμός του ιού Aichi (0,5% και 1,8%) ήταν πολύ χαμηλός για να βρεθεί σημαντική συσχέτιση με τη διάρροια. 30, 31]. Σε ανοσοκατεσταλμένους ξενιστές ο ιός βρίσκεται σε μεγαλύτερες ποσότητες και δεν σχετίζεται με διάρροια [32] . Οι τοροϊοί, μέρος των Coronaviridae, εντοπίστηκαν για πρώτη φορά το 1984 σε κόπρανα παιδιών και ενηλίκων με γαστρεντερίτιδα [33] . Η μόλυνση από τοροϊό σχετίζεται με διάρροια [34] και παρατηρείται συχνότερα σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς και σε νοσοκομειακά μολυσμένα άτομα [34] . Η αναδρομική ανάλυση της νοσοκομειακής ιογενούς γαστρεντερίτιδας σε παιδιατρικό νοσοκομείο αποκάλυψε ότι στο 67% των περιπτώσεων ο τοροϊός μπορούσε να ανιχνευθεί [35] . Ωστόσο, μόνο ένας περιορισμένος αριθμός μελετών αναφέρει την ανίχνευση του τοροϊού και ως εκ τούτου η πραγματική παθογένεση και επικράτηση αυτού του ιού παραμένει αδιευκρίνιστη. Οι Picobirnaviruses ανήκουν στους Picobirnaviridae και ανιχνεύθηκαν για πρώτη φορά στα κόπρανα παιδιών με γαστρεντερίτιδα [36] . Από την αρχική ανακάλυψη, ο ιός έχει ανιχνευθεί σε δείγματα κοπράνων πολλών ζωικών ειδών και έχει αποδειχθεί ότι οι ιοί είναι γενετικά πολύ διαφορετικοί χωρίς σαφή συστάδα ειδών, που ανασκοπείται στη βιβλιογραφία [37] . Αυτή η υψηλή ποικιλομορφία αλληλουχίας έχει επίσης παρατηρηθεί σε συγκεκριμένες εστίες γαστρεντερίτιδας [38, 39] , περιορίζοντας την πιθανότητα ότι οι ιοί picobirna προκαλούν πραγματικά εστίες, καθώς δεν μπορεί να εντοπιστεί ξεχωριστή μεμονωμένη πηγή μόλυνσης. Το 1907 αναπτύχθηκε το πρώτο σύστημα καλλιέργειας ιστών που θεωρήθηκε ως το χρυσό πρότυπο για την ανίχνευση ιών για μεγάλο χρονικό διάστημα, που αναθεωρήθηκε στη βιβλιογραφία [40] . Στη δεκαετία του 1930 εισήχθησαν η ορολογία και η ηλεκτρονική μικροσκοπία που ενίσχυσαν την ανακάλυψη νέων ιών. Κατά τη διάρκεια αυτών των ετών, αυτές οι μέθοδοι αναπτύχθηκαν γόνιμα, αλλά οι ιοί που μολύνουν τη γαστρεντερική οδό ήταν ιδιαίτερα δύσκολο να καλλιεργηθούν. Τις τελευταίες δεκαετίες, έχουν αναπτυχθεί διάφορες τεχνικές που βασίζονται στο DNA για την ανακάλυψη ιών που ενίσχυσαν την ταυτοποίηση νέων ιών σε δείγματα κοπράνων. Οι τέσσερις πιο χρησιμοποιούμενες μέθοδοι είναι: 1. Universal primer-PCR [41] ; 2. PCR βασισμένη σε τυχαία εκκίνηση [42] ; 3. cDNA ανακάλυψης ιού, πολυμορφισμός μήκους τεμαχίου ενισχυμένου (VIDISCA) [43]; και 4. Ενίσχυση απλού εκκινητή ανεξάρτητης αλληλουχίας (SISPA) [44] . Το Universal primer-PCR είναι μια τεχνική ανακάλυψης ιών που χρησιμοποιεί γενικούς εκκινητές σχεδιασμένους σε διατηρημένα μέρη μιας συγκεκριμένης οικογένειας ιών, οι οποίοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση νέων παραλλαγών αυτής της οικογένειας ιών. Η PCR βασισμένη σε τυχαία εκκίνηση είναι μια τεχνική που ενισχύει τυχαία όλα τα νουκλεϊκά οξέα που υπάρχουν στα δείγματα, μετά την οποία τα προκύπτοντα προϊόντα PCR μπορούν να κλωνοποιηθούν και να προσδιοριστεί η αλληλουχία τους. Το SISPA και το VIDISCA είναι τεχνικές ανακάλυψης ιών που βασίζονται στην πέψη με ένζυμα περιορισμού, μετά την οποία μπορούν να συνδεθούν οι προσαρμογείς. Αυτές οι μέθοδοι ήταν επιτυχείς στην ανακάλυψη νέων ιών, αλλά υπάρχουν ορισμένοι περιορισμοί. Οι καθολικοί εκκινητές είναι χρήσιμοι για την ανακάλυψη νέων ιών μιας επιλεγμένης οικογένειας, αλλά οι εκκινητές, με βάση τις τρέχουσες γνώσεις μας για την οικογένεια των ιών, μπορεί να μην ταιριάζουν σε όλες τις άγνωστες παραλλαγές. Η τυχαία εκκίνηση PCR, SISPA και VIDISCA είναι τεχνικές ενίσχυσης ανεξάρτητες αλληλουχίας. Το μειονέκτημα της τυχαίας εκκίνησης PCR, SISPA και VIDISCA είναι ότι ο ιός χρειάζεται να υπάρχει σε υψηλή συγκέντρωση, ενώ το DNA και/ή το RNA του υποβάθρου του ξενιστή θα πρέπει να είναι ελάχιστα και κατά προτίμηση όχι πολύπλοκα. Τα τελευταία χρόνια, οι τεχνικές ενίσχυσης ανεξάρτητες αλληλουχίας βελτιώθηκαν σημαντικά με τη σύζευξη αυτών των τεχνικών με πλατφόρμες αλληλούχισης επόμενης γενιάς και ως αποτέλεσμα έχουν περιγραφεί αρκετοί νέοι ιοί σε περιπτώσεις γαστρεντερίτιδας, όπως ο κοζαϊός [45] , ο ιός Saffold [46] , ο ιός klasse/salivirus [47, 48] , ο ιός πολυομάτου [49] , bufavirus [50] , tusavirus [51] και recovirus [52] . Αν και αυτοί οι ιοί βρίσκονται σε άτομα με διάρροια, για τους περισσότερους από αυτούς ο βαθμός κυκλοφορίας (επιπολασμός) και η ικανότητα πρόκλησης νοσηρών καταστάσεων ή ασθένειας (παθογένεση) παραμένει να προσδιοριστεί, όπως περιγράφεται παρακάτω (βλ. επίσης Πίνακα 1). Βρέθηκε μόνο σε χαμηλό επιπολασμό. **: Μόνο περιορισμένα δεδομένα είναι διαθέσιμα για αυτόν τον ιό. ***: Παρατηρήθηκαν αντισώματα κατά του αστροϊού HMO-C, ενώ δεν βρέθηκαν αντισώματα κατά του αστροϊού HMO-A (HMO = αστροϊός που μοιάζει με άνθρωπο-βιζόν-πρόβατα). -Δεν υπάρχουν διαθέσιμα δημοσιευμένα δεδομένα;ˆΟ Picobirnavirus, ο tusavirus και ο ρεκοϊός εντοπίστηκαν στο γαστρεντερικό σωλήνα μετά τον προσδιορισμό της αλληλουχίας επόμενης γενιάς, αλλά δεν υπάρχουν διαθέσιμες πληροφορίες σχετικά με την απόκριση αντισωμάτων ή τη συσχέτιση με τη διάρροια. Την τελευταία δεκαετία, ανακαλύφθηκαν δύο νέες κατηγορίες αστροϊών δείγματα κοπράνων από ασθενείς με διάρροια που διαφέρουν γενετικά πολύ από τους κλασικούς αστροϊούς. Η πρώτη κλάση αποτελείται από τους αστροϊούς VA-1, VA-2, VA-3, VA-4 και VA-5, οι οποίοι σχετίζονται γενετικά με αστροϊούς αιλουροειδών και χοίρων, ενώ η δεύτερη κλάση αποτελείται από τους MLB1, MLB2 και MLB3. αστροϊούς και σχηματίζουν ένα ξεχωριστό σύμπλεγμα [55, 57, [74] [75] [76] [77] [78] . Για αυτά τα νέα clades, η παθογένεια μένει να προσδιοριστεί, καθώς οι ιοί έχουν εντοπιστεί σε ασθενείς με και χωρίς διάρροια, και σε ορισμένες μελέτες οι ιοί συσχετίστηκαν με διάρροια, ενώ σε άλλες δεν βρέθηκε συσχέτιση [55] [56] [57] . Επιπλέον, παρατηρήθηκε απόκριση αντισωμάτων έναντι ορισμένων αλλά όχι όλων των νέων τύπων αστροϊών [54, 58]. Πρόσφατα, ο αστροϊός MLB2 έχει επίσης ανιχνευθεί στο πλάσμα του αίματος ενός εμπύρετου παιδιού [79] και ο αστροϊός VA1 σε δείγμα βιοψίας μετωπιαίου φλοιού από ασθενή με εγκεφαλίτιδα [80], γεγονός που υποδηλώνει ότι η λοίμωξη από αστροϊό μπορεί να μην περιορίζεται στο γαστρεντερικό σωλήνα. Το 2008, ο ιός του κρόκου ανιχνεύθηκε σε δείγμα κοπράνων από παιδιατρικό ασθενή με πυρετό άγνωστης προέλευσης [46] . Αν και ο ιός Saffold τύπου 3 καλλιεργήθηκε σε κυτταρική σειρά ανθρώπινου επιθηλιακού καρκινώματος τραχήλου της μήτρας (HeLa), παρατηρήθηκαν κυτταροπαθητικά αποτελέσματα και έχουν βρεθεί εξουδετερωτικά αντισώματα σε δείγματα ορού [59], μεταγενέστερες μελέτες περιπτώσεων ελέγχου έδειξαν ότι ο ιός δεν συσχετίστηκε σημαντικά με διάρροια [53, 60, 61] . Επιπλέον, το 2008 εντοπίστηκε ο κοζαϊός σε ασθενή με διάρροια [45] . Ωστόσο, μια μελέτη περιπτώσεων ελέγχου έδειξε ότι αυτός ο ιός ανιχνεύτηκε επίσης σε σημαντικό αριθμό ατόμων χωρίς διάρροια και δεν σχετίζεται με διάρροια [32, 62, 63]. Ο ιός Klasse/Salivirus εντοπίστηκε το 2009 σε δύο δείγματα κοπράνων από βρέφη με γαστρεντερικές διαταραχές [47, 48]. Σε δύο μελέτες η ανίχνευση αυτού του ιού συσχετίστηκε με διάρροια [48, 53], ενώ σε άλλη μελέτη δεν βρέθηκε συσχέτιση με ασθένεια [65]. Ελήφθησαν ορολογικές ενδείξεις μόλυνσης από τον ανθρώπινο ιό klasse, υποδηλώνοντας ότι ο ιός μολύνει ανθρώπινα κύτταρα [64] . Με τη χρήση τεχνικών προσδιορισμού αλληλουχίας επόμενης γενιάς, εντοπίστηκαν επίσης τρεις νέοι ιοί πολυωματικών σε δείγματα ανθρώπινων κοπράνων. Ο πολυωμαϊκός ιός MW εντοπίστηκε στα κόπρανα ενός υγιούς παιδιού από το Μαλάουι το 2012 [49] και την ίδια χρονιά βρέθηκε ο πολυωμαϊκός ιός MX σε δείγματα κοπράνων ασθενών με και χωρίς διάρροια από το Μεξικό, τις Ηνωμένες Πολιτείες και το Χίλι [68]. Ένα χρόνο αργότερα, ο πολυομαϊκός ιός STL βρέθηκε στα κόπρανα ενός υγιούς παιδιού από το Μαλάουι [71] . Παρατηρήθηκε μια απόκριση αντισωμάτων έναντι του ιού του πολυωματικού MX [66] και του ιού πολυομάτου MW [69], αν και ο ιός πολυωματικού MW [67] και ο ιός πολυωματικού STL [70] δεν συσχετίστηκαν σημαντικά με τη διάρροια σε δύο ανεξάρτητες μελέτες περιπτώσεων ελέγχου. Ο ιούς Bufa είναι μέλος Parvoviridae και περιγράφηκε για πρώτη φορά το 2012 [50] . Δύο περιπτώσεις-μάρτυρες στην Ταϊλάνδη και στην Τουρκία έδειξαν ότι ο ιός βρέθηκε μόνο σε ασθενείς με διάρροια και όχι σε μάρτυρες [72, 73]. Ωστόσο, λόγω του χαμηλού επιπολασμού (αντίστοιχα 0,3% στην Ταϊλάνδη και 1,4% στην Τουρκία), δεν βρέθηκε σημαντική συσχέτιση με τη νόσο. Ο Tusavirus, ένα άλλο πρόσφατα περιγραφόμενο μέλος των Parvoviridae, εντοπίστηκε στα κόπρανα ενός παιδιού από την Τυνησία με ανεξήγητη διάρροια [51] , και μέχρι στιγμής αυτή είναι η μόνη μελέτη που περιγράφει αυτόν τον ιό. Ο Recovirus είναι ένα νέο μέλος των Caliciviridae και βρέθηκε σε δείγματα διάρροιας από το Μπαγκλαντές [52] . Παρόμοια με τον ιό tusa, αυτή είναι η μόνη μελέτη που περιγράφει αυτόν τον ιό μέχρι στιγμής. Η ταυτοποίηση των προαναφερθέντων νέων ιών σίγουρα αύξησε τις γνώσεις μας σχετικά με τους ιούς που μπορούν να βρεθούν στο γαστρεντερικό σωλήνα των ανθρώπων, ωστόσο είναι άγνωστο πόσοι από αυτούς τους νέους Οι ιοί είναι στην πραγματικότητα εντεροπαθογόνα. Τα ανθρώπινα κόπρανα περιέχουν μια μεγάλη ποικιλία ιών που μπορούν να προέρχονται από διαφορετικούς ξενιστές: Εκτός από τους γνήσιους ανθρώπινους ιούς, ιοί φυτικής διατροφής [32, 81] και ιοί ζωικής διατροφής [82] μπορούν επίσης να βρεθούν στα ανθρώπινα κόπρανα, καθώς και βακτηριοφάγοι και ιοί μολύνοντας πρωτόζωα [32] . Ακόμη και ιοί που προέρχονται από άλλα μέρη του σώματος μπορούν να βρεθούν σε δείγματα κοπράνων, όπως ο ιός John Cunningham Polyoma που προέρχεται από το νεφρό που καταλήγει στα κόπρανα μέσω των ούρων [83] και οι ρινοϊοί [84], οι βοκαϊοί [85] και οι κοροναϊοί [85] 86] που προέρχεται από την αναπνευστική οδό και πιθανώς καταπίνεται. Επιπλέον, ιοί που μολύνουν τα κύτταρα του αίματος όπως ο ιός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV)-1 μπορούν επίσης να ανιχνευθούν σε δείγματα κοπράνων [87] . Επομένως, από τη στιγμή που ένας νέος ιός έχει εντοπιστεί σε δείγματα ανθρώπινων κοπράνων, δεν σημαίνει ότι αυτός ο ιός αναπαράγεται στα ανθρώπινα εντερικά κύτταρα. Ο Koch αναγνώρισε ήδη από το 1891 ότι η συσχέτιση της παρουσίας ενός συγκεκριμένου παράγοντα με μια συγκεκριμένη ασθένεια είναι περίπλοκη και Ως εκ τούτου, υπέθεσε κατευθυντήριες γραμμές που πρέπει να ακολουθούνται προτού ένας παράγοντας μπορεί να ταξινομηθεί ως παθογόνος [88] . Τα αξιώματά του μπορούν να συνοψιστούν σε τρία σημεία: (1) Το μικρόβιο εμφανίζεται σε κάθε περίπτωση της εν λόγω ασθένειας και υπό συνθήκες που μπορούν να εξηγήσουν τις παθολογικές αλλαγές και την κλινική πορεία της νόσου. (2) το μικρόβιο δεν εμφανίζεται σε καμία άλλη ασθένεια ως τυχαίο και μη παθογόνο παράσιτο. και (3), αφού απομονωθεί πλήρως από το σώμα και αναπτύχθηκε επανειλημμένα σε καθαρή καλλιέργεια, το μικρόβιο μπορεί να προκαλέσει εκ νέου την ασθένεια. Εάν ένα μικρόβιο έχει εκπληρώσει αυτά τα τρία αξιώματα, μπορεί να δηλωθεί ότι «η εμφάνιση του μικροβίου στη νόσο δεν μπορεί πλέον να είναι τυχαία, αλλά σε αυτήν την περίπτωση δεν υπάρχει άλλη σχέση μεταξύ αυτού και της ασθένειας εκτός από το ότι το μικρόβιο είναι η αιτία της νόσου μπορεί να θεωρηθεί\". Για τους εντερικούς ιούς, ωστόσο, αυτά τα αξιώματα δεν ισχύουν. Πρώτον, οι εντερικοί ιοί δεν καλλιεργούνται εύκολα [89] [90] [91] και, δεύτερον, έχουν περιγραφεί παρατεταμένη επικάλυψη ιικών παραγόντων και ασυμπτωματική λοίμωξη [92] , αναθεωρημένη στη βιβλιογραφία [93] . Παρόλο που έχουν γίνει προσπάθειες προσαρμογής των αξιώσεων του Koch ειδικά για ιούς και οι τρέχουσες μεθοδολογίες που εφαρμόζονται [94] [95] [96] , η εκπλήρωση αυτών των αξιώσεων εξακολουθεί να μην είναι εφικτή στις περισσότερες περιπτώσεις λόγω της έλλειψης ενός αποτελεσματικού συστήματος κυτταροκαλλιέργειας, δυσκολίες στη σύνθεση αντιγόνου και σε υψηλά επίπεδα ιικής γενετικής ποικιλότητας εντός ιικών ομάδων, που ανασκοπούνται στη βιβλιογραφία [97] . Έχουν γίνει αρκετές προσεγγίσεις για την ανάπτυξη μιας μεθοδολογίας που προσθέτει μεγαλύτερη σημασία στην ανακάλυψη ενός νέου ιού. Μια προσέγγιση βασίζεται στον εμπλουτισμό ανοσογόνων ιών πριν από τον προσδιορισμό της αλληλουχίας επόμενης γενιάς, χρησιμοποιώντας τη σύλληψη αυτόλογων αντισωμάτων πριν από τον προσδιορισμό της αλληλουχίας. Αυτή η μέθοδος δοκιμάστηκε και επικυρώθηκε σε πολλά δείγματα κοπράνων που περιείχαν αδενοϊό, σαπωνοϊό και νοροϊό, και έχει δείξει ότι εμπλουτίζει ανοσογονικούς ιούς, ενώ οι φυτικοί ιοί και οι βακτηριοφάγοι δεν εμπλουτίστηκαν μετά τη σύλληψη αντισωμάτων [98] . Μια άλλη μέθοδος εμπλουτισμού για σχετικούς ιούς πριν από τον προσδιορισμό αλληλουχίας επόμενης γενιάς είναι η λεγόμενη πλατφόρμα σύλληψης αλληλουχίας ιού για ιούς σπονδυλωτών (VirCapSeq-VERT), η οποία χρησιμοποιεί περίπου 2 εκατομμύρια ανιχνευτές που καλύπτουν τα γονιδιώματα όλων των μελών της ιικής κατηγορίας που είναι γνωστό ότι μολύνουν σπονδυλωτά [99] . Ωστόσο, και οι δύο μέθοδοι έχουν περιορισμούς: Για τη μέθοδο σύλληψης αντισωμάτων, οι ιοί πρέπει να υπάρχουν σε υψηλά ιικά φορτία και να υπάρχει διαθέσιμο αίμα, ορός ή πλάσμα για την ανάρρωσή τους. Ένα μειονέκτημα της τεχνικής VirCapSeq-VERT είναι ότι δεν θα εντοπιστούν εντελώς νέοι ιοί, π.χ. ιοί από μια οικογένεια νέων ιών. Η πιο απλή μέθοδος για να αποδειχθεί η συσχέτιση με ασθένεια είναι η χρήση μελετών περιπτώσεων ελέγχου. Για τη διενέργεια τέτοιων μελετών, πρέπει να συλλεχθούν αντίστοιχα δείγματα κοπράνων σε ομάδες περιστατικών και μαρτύρων από τις ίδιες γεωγραφικές τοποθεσίες την ίδια περίοδο του έτους. Επιπλέον, ενώ τα τελευταία χρόνια έχουν πραγματοποιηθεί μελέτες περιπτώσεων ελέγχου με χρήση συμβατικών PCR πραγματικού χρόνου (RT-PCR), στο μέλλον, οι ανεξάρτητες από αλληλουχία τεχνικές αλληλούχισης επόμενης γενιάς μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τέτοιες μελέτες περιπτώσεων ελέγχου. Δεδομένου ότι επιτρέπει την ανίχνευση σχεδόν όλων των νουκλεϊκών οξέων, ο προσδιορισμός αλληλουχίας επόμενης γενιάς έχει πολλά πλεονεκτήματα σε σύγκριση με συγκεκριμένες RT-PCR. Ο προσδιορισμός αλληλουχίας επόμενης γενιάς αποτρέπει την ανάγκη να πραγματοποιηθούν πολυάριθμες RT-PCR για τον έλεγχο όλων των ιών για τους οποίους υπάρχει υποψία ότι σχετίζονται με ασθένεια και μπορούν να ανιχνευθούν νέες παραλλαγές γνωστών επί του παρόντος γνωστών οικογενειών ιών ή νέων ειδών ιών που μπορεί να είναι ιδιαίτερα ευεργετικές εάν μόνο λίγα γονιδιώματα αναφοράς είναι διαθέσιμα. Το κύριο πλεονέκτημα μιας τέτοιας βάσης δεδομένων είναι ότι στο άμεσο μέλλον μπορεί να απαντηθεί το πιο σημαντικό ερώτημα εάν εντοπιστεί νέος ιός σε περιπτώσεις διάρροιας: Είναι ο ιός πιθανό να προκαλέσει ασθένεια; Συμπερασματικά, ο μακρύς κατάλογος των ιών που εντοπίζονται στο γαστρεντερικό η οδός πιθανότατα δεν είναι ακόμη οριστική. Αναμένεται ότι αρκετοί νέοι ιοί θα περιγραφούν στο εγγύς μέλλον, καθώς η ανίχνευση αυτών των παραγόντων χρησιμοποιώντας τις τρέχουσες τεχνολογίες ακολουθίας επόμενης γενιάς δεν αποτελεί πλέον δυσκολία. Επομένως, η προσθήκη συνάφειας στην ανακάλυψη νέων ιών θα πρέπει να είναι ο κύριος στόχος για μελλοντικές μελέτες.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 2122, "text": "60%" } ], "id": 901, "question": "Τι ποσοστό της σποραδικής διάρροιας προκαλείται από νοροϊό;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3561, "text": "ροταϊός" } ], "id": 902, "question": "Ποια είναι η πιο κοινή αιτία ιογενούς γαστρεντερίτιδας στα παιδιά;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4507, "text": "τύπου 40 και 41" } ], "id": 903, "question": "Ποιοι τύποι αδενοϊών σχετίζονται με τη διάρροια;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6959, "text": "1907" } ], "id": 904, "question": "Πότε αναπτύχθηκε το πρώτο σύστημα καλλιέργειας ιστών;" }, { "answers": [ { "answer_start": 15849, "text": "το μικρόβιο δεν εμφανίζεται σε καμία άλλη ασθένεια ως τυχαίο και μη παθογόνο παράσιτο" } ], "id": 908, "question": "Ποιο είναι το δεύτερο αξίωμα του Koch;" }, { "answers": [ { "answer_start": 16337, "text": "μικρόβιο είναι η αιτία της νόσου" } ], "id": 911, "question": "Εάν πληρούνται και τα 3 αξιώματα του Koch, τι δείχνει αυτό;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Αντισώματα που παρεμβάλλονται στην εξουδετέρωση: Ένα «νέο» παράδειγμα χυμικής ανοσολογικής δυσλειτουργίας που διευκολύνει τη διαφυγή από ιούς; Sautto, Giuseppe; Clementi, Nicola; Diotti, Roberta A.; Criscuolo, Elena; Castelli, Matteo; Solforosi, Laura; Clementi, Massimo; Burioni, RobertoΗμερομηνία: 2012-09-24DOI: 10.3390/v4091731Άδεια: cc-byAbstract: Η ανοσολογική απόκριση έναντι ορισμένων ιικών παθογόνων, ιδιαίτερα εκείνων που προκαλούν χρόνιες λοιμώξεις, είναι συχνά αναποτελεσματική παρά την ισχυρή χυμική εξουδετερωτική απόκριση. Έχουν περιγραφεί αρκετοί μηχανισμοί διαφυγής ικανοί να ανατρέψουν τη δραστηριότητα των εξουδετερωτικών αντισωμάτων (nAbs). Μεταξύ αυτών, η πρόκληση μη εξουδετερωτικών και παρεμβατικών κοιλιακών έχει υποτεθεί. Πρόσφατα, αυτός ο μηχανισμός φοροδιαφυγής έχει αποκτήσει αυξανόμενο ενδιαφέρον δεδομένης της πιθανής επίδρασής του σε νέες αντιικές θεραπευτικές και προφυλακτικές προσεγγίσεις που βασίζονται σε nAb. Σε αυτήν την ανασκόπηση, παρουσιάζουμε τους μηχανισμούς της παρεμβολής που προκαλείται από το Ab και τα ιικά παθογόνα που περιγράφονται στη βιβλιογραφία ως ικανά να υιοθετήσουν αυτήν τη «καινοφανή» στρατηγική αποφυγής. Κείμενο: Οι υπερμεταβλητοί ιοί υιοθετούν διάφορους μηχανισμούς για να αντιμετωπίσουν τη χυμική ανοσοαπόκριση του ξενιστή. Ο πιο μελετημένος μηχανισμός είναι η συσσώρευση σημειακών μεταλλάξεων σε ανοσοκυρίαρχες περιοχές επιφανειακών πρωτεϊνών, καθιστώντας τις πλέον μη αναγνωρίσιμες από προηγουμένως δημιουργημένα εξουδετερωτικά αντισώματα (nAbs) [1] [2] [3] [4] . Άλλοι μηχανισμοί διαφυγής που περιλαμβάνουν επιφανειακές πρωτεΐνες περιλαμβάνουν τη γλυκοζυλίωση λειτουργικά βασικών υπολειμμάτων (ασπίδα γλυκάνης) ή τη συσχέτισή τους με συστατικά ορού ξενιστή (π.χ. λιποπρωτεΐνες) προκειμένου να καλυφθούν από το ανοσοποιητικό σύστημα [5] [6] [7] [8] [9] (Εικόνα 1Α). Άλλοι γνωστοί μηχανισμοί διαφυγής είναι (i) ένα είδος προστατευμένης οδού εξάπλωσης του ιού, όπως η μετάδοση από κύτταρο σε κύτταρο [10, 11]. (ii) ο μοριακός μιμητισμός μεταξύ των ιικών πρωτεϊνών και των αυτο-αντιγόνων του ξενιστή ή (iii) η επαγόμενη από τον ιό διέγερση των περιορισμένων από την οικογένεια αντισωμάτων (Abs), και τα δύο με προφανείς επιπτώσεις σε αυτοάνοσες ασθένειες που προκαλούνται από ιούς, όπως η κρυοσφαιριναιμία για HCV [12] [13] [14] . Η πιθανή επίδραση παρεμβολής των μη εξουδετερωτικών Abs (non-nAbs) προτάθηκε αρχικά από τους Dulbecco et al. το 1956 [15] , για να εξηγήσει τη φαινομενική αναστολή της εξουδετέρωσης του ιού που ασκείται από ορισμένα δείγματα ορού. Πρόσφατα, αυτός ο προτεινόμενος μηχανισμός διαφυγής του ανοσοποιητικού έχει αποκτήσει εκ νέου σχετικό ενδιαφέρον, ειδικά λαμβάνοντας υπόψη την πιθανή κλινική χρήση εξουδετερωτικών αντι-μολυσματικών nAbs ή τον σχεδιασμό εμβολιακών προσεγγίσεων που βασίζονται σε επίτοπο [16] . Μέχρι σήμερα, έχουν προταθεί δύο κύριοι μηχανισμοί για τα παρεμβαλλόμενα αποτελέσματα των μη nAbs: (i) παρεμβολή άμεσης δέσμευσης από στερική παρεμπόδιση, (ii) αναστολή της δέσμευσης μετά από αλλαγές διαμόρφωσης του ιικού αντιγόνου που δεσμεύεται από παρεμβαλλόμενα μη nAbs. Επιπλέον, έχει υποτεθεί ότι, ακόμη και όταν δεν παρεμβαίνουν άμεσα στη δέσμευση των nAbs, τα μη nAbs μπορεί επίσης να οδηγήσουν στην ενίσχυση της ιογενούς λοίμωξης μέσω αλληλεπίδρασης με υποδοχείς Fc ή υποδοχείς συμπληρώματος [17] .Συνολικά, πιθανώς να προκληθούν μη nAbs σε μολυσμένα ή τα εμβολιασμένα άτομα μπορεί να επηρεάσουν τη δυνατότητα εξουδετέρωσης των nAbs. Πιο αναλυτικά, αυτά τα παρεμβαλλόμενα Abs είναι ικανά να δεσμεύουν ιικές πρωτεΐνες στο επίπεδο των ανοσοκυρίαρχων αλλά λειτουργικά άσχετων περιοχών ιικών πρωτεϊνών, μειώνοντας ή εμποδίζοντας τη σύνδεση των nAbs σε κρίσιμους ιικούς επιτόπους (π.χ. τομείς δέσμευσης υποδοχέα) (Εικόνα 1Β) [ 18] . Ένα υποψήφιο αντιιικό μονοκλωνικό αντίσωμα (mAb) ή πολυκλωνικό παρασκεύασμα δεν θα πρέπει να υποβάλλεται σε αυτόν τον μηχανισμό παρεμβολής ή στους άλλους μηχανισμούς διαφυγής που αναφέρθηκαν προηγουμένως. Ομοίως, οι νέες εμβολιαστικές προσεγγίσεις θα πρέπει να αποφεύγουν την πρόκληση παρεμβολικών κοιλιακών που θα μπορούσαν ακόμη και να επιδεινώσουν τη νόσο σε περίπτωση πραγματικής μόλυνσης. Στις ακόλουθες παραγράφους συζητάμε αυτούς τους μηχανισμούς με συγκεκριμένα παραδείγματα του ρόλου τους στην πορεία των ιογενών λοιμώξεων όπου έχουν προσβληθεί Ο ιός της ηπατίτιδας C (HCV) είναι ένας θετικής λογικής μονόκλωνος ιός με περίβλημα RNA που προκαλεί χρόνια ηπατίτιδα στους περισσότερους ασθενείς που δεν λαμβάνουν θεραπεία (περίπου 80%), με επακόλουθο κίνδυνο ανάπτυξης κίρρωσης και ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. Περισσότεροι από 170 εκατομμύρια άνθρωποι (2%-3% του παγκόσμιου πληθυσμού) έχουν μολυνθεί παγκοσμίως και δεν υπάρχει ακόμη διαθέσιμο προστατευτικό εμβόλιο, ενώ οι θεραπευτικές επιλογές εξακολουθούν να είναι περιορισμένες και όχι πλήρως αποτελεσματικές [19] . Για αυτούς τους λόγους η χρόνια λοίμωξη από HCV αντιπροσωπεύει την κύρια ένδειξη για μεταμόσχευση ήπατος στην Ευρώπη και τις Ηνωμένες Πολιτείες. Επιπλέον, οι μεταμοσχευμένοι λήπτες υπόκεινται σε υψηλό κίνδυνο επαναμόλυνσης μοσχεύματος και σε πιο σοβαρή και ταχεία εξέλιξη της ηπατικής νόσου [20]. , γλυκοζυλίωση λειτουργικά βασικών υπολειμμάτων (ασπίδα γλυκάνης) των πρωτεϊνών της επιφάνειας του ιού και συσχέτιση του ιού με συστατικά ορού ξενιστή (π.χ. λιποπρωτεΐνες) (Β) Μηχανισμοί παρεμβολής στην εξουδετέρωση του ιού που προκαλείται από nAb με τη δέσμευση παρεμβαλλόμενων μη nAbs: μη Τα εξουδετερωτικά/παρεμβολικά Abs μπορεί να παρεμβαίνουν στη δέσμευση των nAbs με στερεοχημική παρεμπόδιση μετά από χωρική κατάληψη του επιτόπου τους ή ανταγωνισμό για τη δέσμευση. Διαφορετικά, η δέσμευση των μη εξουδετερωτικών/παρεμβαλλομένων Abs μπορεί να προκαλέσει αλλαγές διαμόρφωσης στην ιική πρωτεΐνη, επηρεάζοντας έτσι τη σύνδεση του nAb στο αντιγόνο. Τα μη εξουδετερωτικά/παρεμβολικά Abs απεικονίζονται με μαύρο χρώμα ενώ τα nAbs με κίτρινο. Το γονιδίωμα HCV κωδικοποιεί μια μεμονωμένη πολυπρωτεΐνη περίπου 3.000 αμινοξέων που υποβάλλεται σε επεξεργασία από πρωτεάσες ξενιστή και ιού σε τουλάχιστον 3 δομικές (πυρήνας, E1 και E2) και 7 μη δομικές (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A και NS5B) πρωτεΐνες [21, 22]. Ειδικότερα, οι γλυκοπρωτεΐνες μεμβράνης τύπου Ι φακέλου Ε1 και Ε2 σχηματίζουν μη ομοιοπολικά ετεροδιμερή στην επιφάνεια του φακέλου του HCV και επιτρέπουν την ενδοκυττάρωση του ιού που προκαλείται από κλαθρίνη να αλληλεπιδρά διαδοχικά με διάφορους κυτταρικούς παράγοντες εισόδου, όπως οι γλυκοζαμινογλυκάνες [23] [24] [25] , υποδοχέας λιποπρωτεϊνών χαμηλής πυκνότητας [26, 27] , υποδοχέας σαρωτής κατηγορίας Β τύπου I [28] , η τετρασπανίνη CD81 [29] , οι πρωτεΐνες σφιχτής σύνδεσης κλαουδίνη-1 και οκλουδίνη και το πρόσφατα περιγραφόμενο Niemann-Pick C1-όπως 1 υποδοχέας απορρόφησης χοληστερόλης [30] [31] [32] [33] [34] . Η ανάπτυξη αποτελεσματικών προφυλακτικών και θεραπευτικών προσεγγίσεων έναντι αυτού του ιού έχει παρεμποδιστεί κυρίως από το υψηλό ποσοστό μετάλλαξης του που οδηγεί σε εξαιρετικά διαφοροποιημένες παραλλαγές του ιού, ακόμη και σε έναν μόνο ασθενή (οιονεί είδος) [35] . Πράγματι, αναγνωρίζονται επτά κύριοι γονότυποι, που ποικίλλουν έως και 30% στην αλληλουχία νουκλεοτιδίων και αρκετοί υποτύποι, ο καθένας χαρακτηρίζεται από διαφορετικά κλινικά χαρακτηριστικά όπως διαφορετικά εξελικτικά ποσοστά σε χρόνιες ηπατικές παθήσεις ή διαφορετική απόκριση στις διαθέσιμες αντιικές θεραπείες [21, 36, 37 ] .Η ανάπτυξη και η χρήση αντι-HCV mAbs ικανών να στοχεύουν δομικά και λειτουργικά διατηρημένες περιοχές των εξαιρετικά μεταβλητών ιικών σωματιδίων θεωρούνται ως νέα θεραπευτικά εργαλεία [38] [39] [40] [41] [42] [43] . Ειδικότερα, η παραγωγή ισχυρών nAbs σε οξείες λοιμώξεις έχει αποδειχθεί ότι συσχετίζεται με την ιική κάθαρση σε μια κοόρτη εστίας μίας πηγής [44] . Επιπλέον, σε εμβολιασμένους χιμπατζήδες, μια παρατεταμένη απόκριση Ab στις γλυκοπρωτεΐνες φακέλου Ε1 και Ε2 συσχετίζεται με μειωμένη ιαιμία [45] , ενώ η παθητική χορήγηση εξουδετερωτικών mAbs σε ένα μοντέλο μόλυνσης με χιμαιρικό ποντίκι uPA-SCID ήταν ικανή να προστατεύσει από πρόκληση με HCV εμβόλιο quasispecies [46] . Τα ανθρώπινα mAb ευρέως διασταυρούμενης εξουδετέρωσης που κατευθύνονται ενάντια στην επιφανειακή γλυκοπρωτεΐνη Ε2 του HCV (HCV/E2) κατευθύνονται τυπικά ενάντια σε λειτουργικά σημαντικές περιοχές εντός της θέσης δέσμευσης CD81 [47] [48] [49] [50] [51] [52] [ 53] [54] , καθώς και έναντι άλλων κρίσιμων υπολειμμάτων που διατηρούνται σε μεγάλο βαθμό μεταξύ διαφορετικών γονότυπων [55, 56] . Αυτή η πτυχή είναι ζωτικής σημασίας για την πιθανή θεραπευτική in vivo χρήση τέτοιων mAbs, αλλά μπορεί να μην είναι επαρκής, καθώς έχει υποτεθεί πρόσφατα ότι άλλοι πληθυσμοί μη nAb μπορεί να παρεμβαίνουν στην εξουδετερωτική τους δραστηριότητα [39, [57] [58] [59] ] [60] [61] . Στην πραγματικότητα, σε επίμονα μολυσμένα άτομα τα αντι-HCV/E2 cross-nAbs γενικά προκαλούνται σε χαμηλό τίτλο και σε όψιμο στάδιο της λοίμωξης, οδηγώντας σε ανεπαρκή έλεγχο της ιαιμίας, ενώ τα οιονεί είδη εξουδετερωτικά ή υψηλού τίτλου μη nAbs είναι προκλήθηκε νωρίτερα [53, [58] [59] [60] [61] [62] . Επιπλέον, η in vivo χρήση παρασκευασμάτων αντι-HCV πολυκλωνικής ανοσοσφαιρίνης τόσο σε χιμπατζήδες όσο και σε ανθρώπους ήταν απογοητευτική και οι κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι αυτά τα σκευάσματα αποτυγχάνουν να αποτρέψουν υποτροπιάζουσες λοιμώξεις σε ασθενείς μετά από μεταμόσχευση ήπατος [63] . Από την άποψη αυτή, μια πρόσφατη Το έγγραφο έχει προτείνει ότι η επίδραση ορισμένων από αυτά τα nAbs, που στρέφονται ενάντια σε λειτουργικά σημαντικά υπολείμματα που εμπλέκονται στην ιική σύνδεση με το CD81 (εντός του επιτόπου Ι, που περιλαμβάνει τα υπολείμματα αμινοξέων 412-426), θα μπορούσε να παρεμποδιστεί από την παρουσία υπολειμμάτων που δεσμεύουν μη nAbs εντός επίτοπος II σε HCV/E2 (υπολείμματα αμινοξέων 434-446) [58]. Ειδικότερα, ο αποκλεισμός αυτών των παρεμβαλλόμενων Abs που είναι ειδικά για τον επίτοπο II όχι μόνο αύξησε τον τίτλο εξουδετέρωσης του ορού που περιείχε τόσο τον επίτοπο Ι όσο και τον επίτοπο II ειδικά Abs, αλλά αποκάλυψε επίσης μια ευρύτερη απόκριση εξουδετέρωσης διασταυρούμενης γονότυπου [58] . Ωστόσο, ο ρόλος (και η ίδια η ύπαρξη) αυτών των κοιλιακών που παρεμβαίνουν στον επηρεασμό της λοίμωξης από HCV εξακολουθεί να είναι αμφιλεγόμενος. Ορισμένοι συγγραφείς επιβεβαίωσαν πρόσφατα τα δεδομένα των Zhang et al. με δοκιμασίες εξουδετέρωσης in vitro χρησιμοποιώντας HCV προερχόμενο από ορό του γονότυπου 4a και πολυκλωνικά Abs που προέρχονται από ανοσοποιημένες κατσίκες με διαφορετικά διατηρημένα πεπτίδια που καλύπτουν υπολείμματα αμινοξέων 412-419, 430-447 και 517-531 HCV/E2 glyco. Συγκεκριμένα, αυτή η ομάδα βρήκε μια παρεμβαλλόμενη δραστηριότητα που ασκείται από τα ασθενώς εξουδετεροποιούμενα Abs που προκαλούνται από 430-447 στην εξουδετερωτική δραστηριότητα τόσο των 412-419 όσο και των Abs που προκαλούνται από 517-531 [64] . Είναι ενδιαφέρον ότι, σύμφωνα με το υποτιθέμενο μοντέλο για την αναδίπλωση E2, και οι τρεις προαναφερθείσες περιοχές θα βρίσκονται η μία δίπλα στην άλλη στη γλυκοπρωτεΐνη [48] . Επομένως, αυτή η δομική πρόβλεψη πιθανώς υποστηρίζει την παρεμποδιστική επίδραση των κοιλιακών που κατευθύνονται από τον επίτοπο II. Ωστόσο, ενώ αυτή η προβλεπόμενη δομή είναι επί του παρόντος το καλύτερο διαθέσιμο μοντέλο, αυτά τα συμπεράσματα δεν μπορούν να εξακριβωθούν απολύτως. Για το σκοπό αυτό, η διαθεσιμότητα του κρυστάλλου Ε1-Ε2 σίγουρα θα επιταχύνει τη λεπτή διασαφήνιση των χωρικών γειτνίασης των εξουδετερωτικών και παρεμβαλλόμενων mAb στη δομή Ε1-Ε2 και, κατά συνέπεια, την πρόοδο του εμβολίου βάσει δομής. Επιπλέον, είναι αξιοσημείωτο ότι άτομα με Οι κοιλιακοί που στοχεύουν την περιοχή του Ε2 που περιλαμβάνει τον επίτοπο Ι συχνά φιλοξενούν κοιλιακούς που αναγνωρίζουν την περιοχή που περιέχει τον επίτοπο II, επιβεβαιώνοντας έτσι τη συν-ανοσογονικότητα αυτών των επιτόπων [58] . Τέλος, έχει αποδειχθεί τόσο χαμηλός επιπολασμός (λιγότερο από 2,5%) όσο και χαμηλός τίτλος Abs που αντιδρούν με επίτοπο Ι στους ορούς τόσο από χρόνιες όσο και από οξείες επιλυμένες λοιμώξεις, υποστηρίζοντας έτσι την υπόθεση μιας διαμορφωτικής κάλυψης από γειτονικές περιοχές όπως αυτή που περιέχει επίτοπος II [65] . Στην πραγματικότητα, οι Zhang et al. αρχικά πρότεινε την ιδέα ότι μόλις ο επίτοπος II συνδεθεί με ένα Ab, η θέση του επιτόπου Ι καλύπτεται και δεν μπορεί πλέον να αναγνωριστεί από συγκεκριμένα nAbs. Πράγματι, η εξάντληση των Abs στον επίτοπο II στο πλάσμα από έναν χρόνια μολυσμένο ασθενή με HCV και εμβολιασμένους χιμπατζήδες ανέκτησε μια κατά τα άλλα μη ανιχνεύσιμη δραστηριότητα εξουδετέρωσης του διασταυρούμενου γονότυπου [58] . Μια άλλη πιθανότητα είναι ότι η αρχική δέσμευση των παρεμβαλλόμενων Abs στην περιοχή που περιέχει τον επίτοπο II μπορεί να προκαλέσει αλλαγές διαμόρφωσης στο Ε2 που αναστέλλουν τη δέσμευση από Abs που κατευθύνονται από τον επίτοπο Ι, όπως προτείνεται πρόσφατα από τους Lapierre et al. για άλλα αντι-HCV/E2 Abs [66] .Αντίστροφα, αυτά τα συμπεράσματα δεν υποστηρίχθηκαν σε μια πρόσφατη μελέτη από τους Tarr et al. χρησιμοποιώντας mAbs ποντικού (ΑΡ33) και αρουραίου (2/69a), καθώς και κλάσματα ανθρώπινης ανοσοσφαιρίνης καθαρισμένα με συνάφεια σε γραμμικά πεπτίδια που αντιπροσωπεύουν διακριτές περιοχές HCV/E2 που συγκεντρώνονται εντός των περιοχών 412-426 και 434-446 [67]. Αν και επιβεβαιώνουν την προηγουμένως αναφερθείσα συν-ανοσογονικότητα αυτών των δύο περιοχών, οι συγγραφείς απέτυχαν να επιδείξουν οποιαδήποτε αναστολή μεταξύ αυτών των δύο ομάδων Abs. Λαμβάνοντας υπόψη τα αποτελέσματά τους, οι συγγραφείς πρότειναν πράγματι ότι η παρεμβολή από μη nAbs, τουλάχιστον στην περιοχή που περιλαμβάνει τα υπολείμματα 434-446, δεν είναι ένας πιθανός μηχανισμός για την επιμονή του HCV σε χρόνια μολυσμένα άτομα, όπως είχε προταθεί αρχικά από τους Zhang et al. Σύμφωνα με τα ευρήματα των Tarr και συνεργατών, οι Keck et al. περιέγραψε αντι-HCV/E2 ανθρώπινα mAbs που δεσμεύουν ευαίσθητους στη διαμόρφωση επίτοποι που περιλαμβάνουν επίσης ορισμένα υπολείμματα εντός της περιοχής παρεμβολής 434-446 [56] . Αυτά τα mAbs είναι ευρέως εξουδετερωτικά και δεν οδηγούν σε μεταλλάξεις διαφυγής ιού, καταδεικνύοντας τη λειτουργική σημασία των επιτόπων τους. Οι συγγραφείς καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι δεν παρεμβαίνουν όλα τα Abs που στρέφονται κατά του επιτόπου II, αλλά επίσης εικάζουν ότι η παρεμβαλλόμενη δραστηριότητα θα μπορούσε να περιοριστεί σε ABS που αναγνωρίζουν γραμμικούς επιτόπους μέσα σε αυτό [56] .Πρόσφατα, επιβεβαιώσαμε εν μέρει τις παρατηρήσεις των Zhang et al. χρησιμοποιώντας ένα πάνελ αντι-HCV/E2 mAb: το καλά χαρακτηρισμένο mAb AP33 ποντικού anti-HCV/E2, του οποίου ο επίτοπος περιλαμβάνει τον επίτοπο Ι (υπολείμματα αμινοξέων 412-423) και ένα ασθενώς εξουδετερωτικό ανθρώπινο αντι-HCV/E2 mAb (ονομάζεται e509 ), του οποίου ο επίτοπος περιλαμβάνει τον επίτοπο II [68] . Συγκεκριμένα, διαπιστώσαμε ότι το e509 είναι σε θέση να παρεμβαίνει στην εξουδετερωτική δραστηριότητα του AP33 στον ιό γονότυπου 1a (στέλεχος H77). Αντίθετα, διαπιστώσαμε ότι το e509 δεν παρεμβαίνει ελάχιστα στη δραστηριότητα δύο άλλων ευρείας διασταυρούμενης εξουδετέρωσης ανθρώπινων αντι-HCV/E2 mAbs, που ονομάζονται e20 και e137 [49, 69]. Είναι ενδιαφέρον ότι βρήκαμε ότι τόσο το e20 όσο και το e137 δεσμεύουν επίσης υπολείμματα εντός του επιτόπου II, σε υψηλότερη συγγένεια σε σύγκριση με το e509, εκτοπίζοντάς τον έτσι από τον παρεμβαλλόμενο επίτοπο και, ως εκ τούτου, διατηρώντας αναλλοίωτη την εξουδετερωτική τους δραστηριότητα. Έτσι, κατά τη γνώμη μας, οι περιγραφόμενες αποκλίνουσες παρατηρήσεις που αναφέρονται παραπάνω μπορεί να εξαρτώνται από τις διαφορετικές ειδικότητες Ab που υπάρχουν στα πολυκλωνικά παρασκευάσματα που χρησιμοποιούνται και, πιθανώς, επίσης από τους διαφορετικούς γονότυπους HCV που μολύνουν τους ασθενείς που μελετήθηκαν [68] . Επιπλέον, οι διαφορετικές στρατηγικές που υιοθετήθηκαν για την απομόνωση των κοιλιακών που κατευθύνονται από τον επίτοπο Ι και τον επίτοπο II που ακολουθήθηκαν στις παραπάνω μελέτες θα μπορούσαν να εξηγήσουν τα διαφορετικά δεδομένα που ελήφθησαν. Στην πραγματικότητα, οι ανοσοσφαιρίνες που καθαρίζονται σε πεπτίδια που αντιπροσωπεύουν διακριτές περιοχές HCV/E2 [67] στρέφονται προφανώς εναντίον γραμμικών επιτόπων. αυτά τα παρασκευάσματα είναι σίγουρα διαφορετικά από τα mAbs που κλωνοποιήθηκαν με χρήση μιας πλήρους μήκους γλυκοπρωτεΐνης HCV/E2, τα οποία πιθανότατα στρέφονται εναντίον διαμορφωτικών επιτόπων, συμπεριλαμβανομένων και υπολειμμάτων εκτός των διερευνημένων γραμμικών περιοχών [54]. Για να συνοψίσουμε, στο πεδίο του HCV αρκετές εργασίες υποστηρίζουν την ύπαρξη των παρεμβαλλόμενων πληθυσμών Ab και υποθέστε τον πιθανό ρόλο τους στην επιμονή του HCV, όπως αποδεικνύεται χρησιμοποιώντας παρασκευάσματα ανοσοσφαιρίνης που προέρχονται από ανθρώπινο πλάσμα, ανθρώπινα mAbs και ορούς ζώων που εμβολιάστηκαν με ανασυνδυασμένα πεπτίδια HCV/E2. Ο πιθανός μηχανισμός που οδηγεί στην παρεμβολή εξακολουθεί να είναι αμφιλεγόμενος, αλλά έχουν υποτεθεί τόσο η άμεση στερική παρεμπόδιση όσο και οι επαγόμενες διαμορφωτικές αλλαγές αντιγόνου. Από την άλλη πλευρά, άλλες εργασίες δεν επιβεβαιώνουν αυτά τα ευρήματα, υποδηλώνοντας ότι ο υποτιθέμενος παρεμβαλλόμενος επίτοπος II μπορεί να στοχευτεί από κοιλιακούς προικισμένους με μια ευρέως εξουδετερωτική δραστηριότητα. Η πρόσφατη εργασία μας, χρησιμοποιώντας καλά χαρακτηρισμένα mAbs [68], δείχνει ότι τα παρεμβαλλόμενα Abs υπάρχουν αλλά ότι η συνολική τους επίδραση μπορεί να επηρεάζεται από την παρουσία nAbs με διαφορετικά χαρακτηριστικά δέσμευσης και από τον μολυσματικό γονότυπο του HCV. Μελλοντικές εργασίες που θα διερευνήσουν τον in vivo ρόλο αυτών των παρεμβαλλόμενων υποπληθυσμών Ab στην επιμονή του HCV θα είναι σίγουρα πολύ χρήσιμες. Οι ιοί της γρίπης κυκλοφορούν παγκοσμίως σε δεξαμενές ζώων, ειδικά σε υδρόβια πτηνά, επηρεάζοντας δυνητικά ανθρώπους οποιασδήποτε ηλικιακής ομάδας. Οι ιοί της γρίπης ταξινομούνται σε τύπους A, B ή C με βάση τις αντιγονικές διαφορές της νουκλεοπρωτεΐνης τους και της πρωτεΐνης μήτρας. Ο πιο κλινικά σχετικός και μεταβλητός τύπος είναι η γρίπη Α, η οποία χωρίζεται σε διάφορους υποτύπους, σύμφωνα με το αντιγονικό χαρακτηριστικό των δύο γλυκοπρωτεϊνών του φακέλου, και προκαλεί επιδημικές και πανδημικές λοιμώξεις [70] . Οι ετήσιες επαναλαμβανόμενες επιδημίες γρίπης συνδέονται με σημαντική νοσηρότητα και θνησιμότητα, ιδιαίτερα μεταξύ των ομάδων κινδύνου (όπως ηλικιωμένοι ή άτομα με χρόνιες παθήσεις, έγκυες γυναίκες και παιδιά) [71]. η παγκόσμια εξάπλωση των πανδημικών ιών γρίπης μπορεί να προκαλέσει εκατομμύρια θανάτους [72] . Εντός του περικαλυμμένου ιού της γρίπης οκτώ τμήματα αρνητικού μονόκλωνου RNA προστατεύονται από την πρωτεΐνη νουκλεοκαψιδίου, σχηματίζοντας τη ριβονουκλεοπρωτεΐνη (RNP). Τα πρώτα έξι τμήματα RNA κωδικοποιούν το καθένα για μια μοναδική πρωτεΐνη: PB2, PB1 και PA (όλα αποτελούν την εξαρτώμενη από RNA πολυμεράση RNA), την αιμοσυγκολλητίνη (HA), τη νουκλεοπρωτεΐνη (NP), τη νευραμινιδάση (NA). Τα δύο τελευταία τμήματα κωδικοποιούν το καθένα για δύο διαφορετικές πρωτεΐνες: τις πρωτεΐνες μήτρας (M1 και M2) και τις μη δομικές πρωτεΐνες (NS1 και NS2). Τρεις διαφορετικές πρωτεΐνες (ΗΑ, ΝΑ και Μ2) υπάρχουν στον ιικό φάκελο. Η γλυκοπρωτεΐνη ΗΑ είναι η πιο άφθονη και είναι ο κύριος στόχος της χυμικής ανοσολογικής απόκρισης. Μαζί με τη διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη NA, το HA είναι ικανό να προκαλεί μια υποτύπο-ειδική ανοσοαποκρίσεις που είναι πλήρως προστατευτική εντός, αλλά μόνο εν μέρει προστατευτική σε διαφορετικούς υποτύπους [73] . Το ΗΑ συντίθεται ως ανενεργός πρόδρομος που μεταβαίνει στην ενεργή του μορφή κατά τη διάσπαση από πρωτεάσες του κυττάρου ξενιστή και ο οποίος υπάρχει στην ιική μεμβράνη ως ομοτριμερή. Τα τριμερή ΗΑ συνδέονται με μόρια σιαλικού οξέος συνδεδεμένα με 2,6 σε πρωτεΐνες ή λιπίδια της κυτταρικής μεμβράνης μέσω περιοχών που βρίσκονται στη σφαιρική κεφαλή κάθε μονομερούς. Στη συνέχεια, το περίβλημα του ιού συντήκεται με μηχανισμούς που εξαρτώνται από την κλαθρίνη και είναι ανεξάρτητοι με τη μεμβράνη του ενδοκυτταρικού κυστιδίου μέσω του πεπτιδίου σύντηξης ΗΑ που βρίσκεται στην περιοχή του στελέχους κάθε μονομερούς. Κατά συνέπεια, ιικά συστατικά απελευθερώνονται στο κύτταρο ξενιστή και μπορούν να ανατρέψουν τις συνθετικές ικανότητες του κυττάρου ξενιστή για παραγωγή και απελευθέρωση σωματιδίων απογόνων [74] . Η χυμική ανοσία παίζει σημαντικό ρόλο στην άμυνα του ξενιστή έναντι της μόλυνσης από τον ιό της γρίπης όπως οι περισσότεροι των Abs εξουδετερώνουν τους ιούς της γρίπης και, ως εκ τούτου, περιορίζουν τη μόλυνση [75] [76] [77] [78] . Στην πραγματικότητα, ένας μεγάλος όγκος πειραματικών εργασιών υποδηλώνει ότι η απόφραξη της θέσης δέσμευσης υποδοχέα στο HA από Abs είναι ο κύριος μηχανισμός εξουδετέρωσης του ιού της γρίπης. Λιγότερο συνηθισμένο, αλλά ευρύτερα τα nAbs μπορεί να εξουδετερώσουν τον ιό της γρίπης αναστέλλοντας τη σύντηξη του περιβλήματος του ιού με τη μεμβράνη του ενδοκυτταρικού κυστιδίου [50, [79] [80] [81] [82] [83] . Οι αλλαγές αμινοξέων στο HA, πιο συχνές στην ανοσοκυρίαρχη σφαιρική κεφαλή, έχουν πολύπλοκα αποτελέσματα στην εξουδετέρωση του ιού από τα Abs, επιτρέποντας συνήθως στις μεταλλαγμένες παραλλαγές να διαφύγουν από τα nAbs που είχαν δημιουργηθεί προηγουμένως [84]. Κλασικές μελέτες που χρησιμοποιούν εξουδετερωτικά mAbs ποντικού εντόπισαν πέντε διακριτές αντιγονικές θέσεις (A-E) στην περιοχή της σφαιρικής κεφαλής HA1 στην τρισδιάστατη δομή του μορίου H3 HA (A/Hong Kong/1/68) [85] [86] [87] καθώς και στους υποτύπους Η1 [88] και Η2 [89] . Κατά τις πρώτες ημέρες μιας λοίμωξης, ο τίτλος nAb είναι συχνά χαμηλός, ενώ ο τίτλος των μη nAbs είναι υψηλότερος και μπορεί να παίζει ρόλο στην έκβαση μιας λοίμωξη, όπως παρατηρήθηκε πρόσφατα για ασθενείς που έχουν μολυνθεί από τον πανδημικό ιό της γρίπης A/2009 H1N1 από τους To et al. [90] . Συγκεκριμένα, αυτή η ομάδα διαπίστωσε ότι η ποσότητα, καθώς και η απληστία, των μη nAbs ήταν υψηλότερη για τους ασθενείς με σοβαρή νόσο από ό,τι για εκείνους με ήπια νόσο. Οι συγγραφείς κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι μια υπερβολική απόκριση μη nAb κατά το πρώιμο στάδιο της μόλυνσης συσχετίστηκε με σοβαρή νόσο [90]. Επιπλέον, οι συγγραφείς υπέθεσαν ότι τα μη nAbs που υπάρχουν στους ορούς των ασθενών κατά το πρώιμο στάδιο της μόλυνσης ήταν πιθανό είτε να προϋπάρχουν είτε να είναι αποτέλεσμα δευτερογενούς ετερουποτυπικής χυμικής ανοσολογικής απόκρισης έναντι πιο διατηρημένων επιτόπων σε αρκετές πρωτεΐνες γρίπης [91] . Αυτή η πρώιμη χυμική απόκριση μπορεί να προκληθεί εντός λίγων ημερών μετά τη μόλυνση, λόγω της ανοσολογικής εκκίνησης από προηγούμενη έκθεση σε κοινούς ιικούς επιτόπους. Στην πραγματικότητα, οι πρωτεΐνες της μήτρας και η νουκλεοπρωτεΐνη έχουν διατηρηθεί αλληλουχίες αμινοξέων και επομένως θα μπορούσαν να προκληθούν Abs έναντι αυτών των πρωτεϊνών από προηγούμενη μόλυνση ή εμβολιασμό από τον ιό της εποχικής γρίπης [92] . Πράγματι, μετά τη μόλυνση με τον ιό της γρίπης, τα Β-κύτταρα της μνήμης μπορούν να πολλαπλασιαστούν γρήγορα και να δημιουργήσουν μια μεγάλη ποσότητα από αυτά τα μη nAbs υψηλής απληστίας, ειδικά σε ασθενείς με σοβαρή νόσο. Αυτό συμφωνεί με την παρατήρηση ότι ο αριθμός των Β-κυττάρων του περιφερικού αίματος είναι υψηλότερος σε ασθενείς με σοβαρή νόσο από ό,τι σε εκείνους με ήπια νόσο κατά το πρώιμο στάδιο της λοίμωξης. Ο μηχανισμός της παρεμβολής εξουδετέρωσης του Ab έχει έμμεσα εικασίες επίσης από τους Ndifon et al. ., ο οποίος παρατήρησε ότι ορισμένες αλλαγές αμινοξέων στο HA στην πραγματικότητα αυξάνουν την αποτελεσματικότητα της εξουδετέρωσης των παραλλαγών διαφυγής από προηγουμένως δημιουργημένα Abs, ακόμη και αν δεν επηρεάζουν άμεσα τη σύνδεσή τους [93] . Αναλυτικά, αυτή η ομάδα πρότεινε ότι η αύξηση της εξουδετερωτικής δραστηριότητας μετά από μετάλλαξη ΗΑ θα μπορούσε να είναι το αποτέλεσμα μιας μικρότερης στερικής παρεμβολής μεταξύ των Abs. Συγκεκριμένα, εάν υπάρχει στερικός ανταγωνισμός για δέσμευση σε ΗΑ από Abs με διαφορετική αποτελεσματικότητα εξουδετέρωσης, τότε μια μετάλλαξη που μειώνει τη δέσμευση των Abs με χαμηλή εξουδετερωτική δραστηριότητα θα μπορούσε να αυξήσει τη συνολική εξουδετέρωση του ιού. Πράγματι, παρόμοια με ό,τι εικάζεται για τον HCV, τα Abs που συνδέονται με επιτόπους ΗΑ που βρίσκονται σε απόσταση από τη θέση δέσμευσης του υποδοχέα μπορεί επομένως να αποτύχουν να καταλάβουν αυτή τη θέση αποτελεσματικά, οδηγώντας έτσι σε μειωμένη ιική εξουδετέρωση. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι τα Abs που δεσμεύονται σε ένα συγκεκριμένο επίτοπο ΗΑ μπορούν να αποτρέψουν την περαιτέρω δέσμευση των Abs με άλλους επιτόπους της ίδιας πρωτεΐνης ΗΑ, ακόμη και με επιτόπους που βρίσκονται σε γειτονικές πρωτεΐνες ΗΑ. Οι παραπάνω παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι τα Abs που συνδέονται με επιτόπους ΗΑ χαμηλής απόδοσης εξουδετέρωσης μπορεί να παρεμβαίνουν στη δέσμευση των nAbs για να κλείσουν επίτοπους υψηλής απόδοσης εξουδετέρωσης, εμποδίζοντας έτσι την εξουδετέρωση των ιών της γρίπης. Λαμβάνοντας υπόψη τη δομή του ΗΑ, η δέσμευση των παρεμβαλλόμενων Abs θα βρίσκεται στο επίπεδο των επιτόπων C και E που βρίσκονται μακριά από τη θέση δέσμευσης του υποδοχέα στη σφαιρική κεφαλή του ΗΑ. Ωστόσο, η δέσμευση αυτών των Abs μπορεί να επηρεάσει τη σύνδεση των nAbs στους επίτοπους Α, Β και D, που βρίσκονται πιο κοντά στη θέση δέσμευσης του υποδοχέα [93]. Από αυτή την άποψη, οι αλλαγές στους επιτόπους Α, Β και Δ θα μπορούσαν να ευνοηθούν ιδιαίτερα από τη φυσική επιλογή, ενώ οι αλλαγές στους επιτόπους C και Ε θα μπορούσαν να είναι μειονεκτική για τους ιούς της γρίπης [93]. λόγω της κρυσταλλικής δομής, αυτές οι εικασίες εγείρουν την ενδιαφέρουσα πιθανότητα ότι οι ιοί της γρίπης μπορεί να έχουν εξελιχθεί ευνοώντας την προνομιακή δημιουργία επιτόπων αναγνώρισης Abs με προφίλ χαμηλής εξουδετέρωσης. Πράγματι, η στερική παρεμπόδιση από τα Abs που δεσμεύουν αυτούς τους επιτόπους θα μπορούσε να μειώσει σημαντικά την έκταση της μετάλλαξης που απαιτείται για να αποφύγει ένας ιός την εξουδετέρωση από τα Abs του ξενιστή. Κατά συνέπεια, μια μείωση της συγγένειας των Abs για επιτόπους με χαμηλή αποτελεσματικότητα εξουδετέρωσης θα μπορούσε να οδηγήσει σε αύξηση της εξουδετέρωσης του ιού. Αυτό υποδηλώνει μια πιθανή προσέγγιση για το σχεδιασμό εμβολίων «χαμηλής παρεμβολής» που θα μπορούσε να μειώσει σημαντικά τον αντίκτυπο της παρεμβολής Ab. Αυτά τα ανοσογόνα είναι γενετικά τροποποιημένα από τον ιικό στόχο μόνο στο επίπεδο των επιτόπων χαμηλής αποτελεσματικότητας εξουδετέρωσης. Πράγματι, οι κοιλιακοί που προκαλούνται από το εμβόλιο αναγνωρίζουν μόνο επιτόπους υψηλής απόδοσης εξουδετέρωσης του στόχου και οι κοιλιακοί που προκαλούνται από στέλεχος εμβολίου χαμηλής παρεμβολής έχουν χαμηλή συγγένεια για τους επιτόπους χαμηλής απόδοσης εξουδετέρωσης του στελέχους του ιού που κυκλοφορεί. Επομένως, δεν παρεμβαίνουν στα Abs σε επίτοπους υψηλής απόδοσης εξουδετέρωσης, υποδηλώνοντας βελτιωμένη εξουδετέρωση. Συνεπώς, περιορίζοντας την παρεμβολή που προκαλείται από το Ab, ο ιός στόχος δεν μπορεί να διαφύγει από τους κοιλιακούς που προκαλούνται από το εμβόλιο μέσω μικρών αλλαγών επιτόπου. Εναλλακτικά, τα εμβόλια θα μπορούσαν να σχεδιαστούν ώστε να περιλαμβάνουν μόνο εκείνες τις περιοχές που αντιστοιχούν σε επιτόπους με υψηλή αποτελεσματικότητα εξουδετέρωσης. Επιπλέον, τα αντιιικά φάρμακα θα μπορούσαν να σχεδιαστούν ώστε να περιλαμβάνουν ιικές πρωτεΐνες που φέρουν τροποποιήσεις στο επίπεδο των επιτόπων υψηλής απόδοσης εξουδετέρωσης. αυτές οι πρωτεΐνες «δόλωμα» θα ανταγωνίζονταν τον ιό για τη σύνδεση με κοιλιακούς χαμηλής απόδοσης εξουδετέρωσης με τρόπο παρόμοιο με αυτόν που παίζουν οι αναστολείς νευραμινιδάσης. Στη σύνθεση, η διαθεσιμότητα της κρυσταλλικής δομής HA βοήθησε να επιβεβαιωθεί η ύπαρξη και να εξηγηθούν οι μηχανισμοί παρεμβολής με μη ή ασθενώς εξουδετερωτικά αντι-ΗΑ Abs. Η πρόσφατη εργασία των To et al. [90] η απόδειξη ότι μια απόκριση μη nAb κατά το πρώιμο στάδιο της μόλυνσης σχετίζεται με μια σοβαρή ασθένεια, μπορεί να είναι η πρώτη απόδειξη του ρόλου αυτών των κοιλιακών που παρεμβαίνουν στην πορεία μιας φυσικής λοίμωξης. Το [94] . Περισσότερα από 8.000 κρούσματα, συμπεριλαμβανομένων σχεδόν 800 θανάτων, αναφέρθηκαν κατά την περίοδο της επιδημίας και η αύξηση της ηλικίας και η συννοσηρότητα ήταν παράγοντες κινδύνου για σοβαρή νόσο και θάνατο [95] . Από το 2003, έχουν αναφερθεί μόνο σποραδικά κρούσματα. Ωστόσο, η πιθανότητα οι επιδημίες του SARS να επανεμφανιστούν φυσικά ή να απελευθερωθούν σκόπιμα αποτελεί ανησυχία για τη δημόσια υγεία. Όπως οι ιοί της γρίπης, ο SARS-CoV κυκλοφορεί σε δεξαμενές ζώων, με τις νυχτερίδες που πιστεύεται ότι μεταδίδουν τον ιό σε μικρά θηλαστικά με την έκθεση σε αυτά τα μικρά ζώα ως πηγή ανθρώπινων λοιμώξεων [96] . Η κλινική νόσος είναι παρόμοια με άλλες σοβαρές οξείες αναπνευστικές λοιμώξεις, συμπεριλαμβανομένης της γρίπης, και ο ορισμός του περιστατικού SARS περιλαμβάνει κλινικά, επιδημιολογικά και εργαστηριακά κριτήρια [97, 98]. Η βασική οργάνωση του γονιδιώματος και ο αναδιπλασιαστικός κύκλος είναι παρόμοια για όλους τους CoV. Το γονίδιο 1 κωδικοποιεί όλες τις προβλεπόμενες πρωτεΐνες ρεπλικάσης/μεταγραφάσης, οι οποίες μεταφράζονται από το γονιδιωματικό RNA εισόδου, ενώ τα γονίδια 2-9 κωδικοποιούν δομικές και βοηθητικές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένης της πρωτεΐνης ακίδας φακέλου (S), που μεταφράζονται από ξεχωριστά υπογονιδιωματικά mRNA. Τα CoV χρησιμοποιούν έναν μοναδικό ασυνεχή μηχανισμό για τη μεταγραφή μιας σειράς προοδευτικά μεγαλύτερων υπογονιδιωματικών mRNAs και το καθένα περιέχει μια αλληλουχία οδηγού RNA που προέρχεται από το 5' άκρο του γονιδιώματος [99] . Η πρωτεΐνη S των CoV εισάγεται στο φάκελο του ιοσωμάτια που μεσολαβούν στη δέσμευση και τη σύντηξη συμβάντων απαραίτητα για τη μόλυνση και είναι ο κύριος στόχος της χυμικής προστατευτικής ανοσίας [100] . Αν και η πρωτεΐνη S του SARS-CoV (SARS-S) μοιράζεται μικρή ταυτότητα αμινοξέων (περίπου 20%-27%), μοιράζεται κοινά δομικά χαρακτηριστικά με τις πρωτεΐνες S των άλλων μελών της οικογένειας Coronaviridae. Η πρωτεΐνη SARS-S είναι μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη τύπου Ι μήκους περίπου 1.255 αμινοξέων και χωρισμένη σε δύο λειτουργικές περιοχές: S1 (υπολείμματα αμινοξέων 15-680) και S2 (υπολείμματα αμινοξέων 681-1.255) [101]. Σε πολλά CoV, η πρωτεΐνη S διασπάται κατά τη βιογένεση και αυτοί οι δύο λειτουργικοί τομείς συγκρατούνται μαζί μη ομοιοπολικά. Ωστόσο, όπως στην περίπτωση του ανθρώπινου CoV 229E, η πρωτεΐνη S δεν διασπάται στον SARS-CoV [102] . Η περιοχή S1 σχηματίζει μια σφαιρική δομή που μεσολαβεί στην αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης S με τον κύριο υποδοχέα της, το ένζυμο μετατροπής της αγγειοτενσίνης 2 (ACE2), ενώ η περιοχή S2 μεσολαβεί στη σύντηξη και περιέχει το υποτιθέμενο πεπτίδιο σύντηξης και δύο διατηρημένες ελικοειδείς περιοχές (HR1 και HR2). ότι κατά τη διάσπαση από την ενδοσωμική πρωτεάση καθεψίνη L σχηματίζουν τον πυρήνα σύντηξης με έξι έλικες [103] . Οι στρατηγικές εμβολίων που στοχεύουν στον αποκλεισμό/περιορισμό της μόλυνσης από τον SARS-CoV εστιάζουν κυρίως στη στόχευση της ιικής γλυκοπρωτεΐνης SARS-S [100] . Ωστόσο, μια τέτοια στρατηγική θέτει ένα μοναδικό δίλημμα για τους CoV, καθώς τα προηγούμενα πρωτόκολλα εμβολιασμού έχουν τονίσει τη δυνατότητα ανοσολογικής ενίσχυσης της νόσου [104] . Από αυτή την άποψη, η ομάδα των Zhong et al. διερεύνησε τον ρόλο των μη εξουδετερωτικών παρεμβαλλόμενων κοιλιακών κοιλιών και στην περίπτωση μόλυνσης από SARS-CoV [105] . Συγκεκριμένα, βρήκαν ότι δύο mAbs που στρέφονται ενάντια στην περιοχή που περιλαμβάνει τα υπολείμματα αμινοξέων 491-510 του SARS-S (341C και 540C) δρουν συνεργικά για να αναστέλλουν τη μόλυνση SARS-CoV in vitro, ενώ ένα μη εξουδετερωτικό mAb (240C) του οποίου ο επίτοπος περικλείει η προαναφερθείσα περιοχή, διέκοψε την εξουδετερωτική δραστηριότητα τόσο του 341C όσο και του 540C [105, 106]. Αναλύοντας την κρυσταλλική δομή της πρωτεΐνης SARS-S, οι συγγραφείς πρότειναν μια πιθανή εξήγηση σε αυτό που παρατηρήθηκε, αποδεικνύοντας ότι οι επίτοποι όλων των mAbs είναι στενά συσκευασμένοι και εγγύς μεταξύ τους αλλά μακριά από τη θέση δέσμευσης του υποδοχέα ACE2 [105]. Επιπλέον, ο επίτοπος του μη εξουδετερωτικού mAb 240C επικαλύπτεται μερικώς κατά τουλάχιστον 2 αμινοξέα (Ρ507 και Α508) με αυτόν του εξουδετερωτικού mAb 341C. Κατά συνέπεια, το mAb 240C θα μπορούσε να αναστείλει τη σύνδεση του mAb 341C με τρόπο που σχετίζεται με την ισορροπία. Από την άλλη πλευρά, οι συγγραφείς διαπίστωσαν ότι το mAb 240C θα μπορούσε να παρεμβαίνει στερικά στη δέσμευση του mAb 540C μέσω του προτεινόμενου μηχανισμού χωρικής κατάληψης (Εικόνα 1Β). Στην πραγματικότητα, η προσβασιμότητα του mAb 540C στον επίτοπό του μπορεί να αποκλειστεί από τη σύνδεση mAb 240C που καλύπτει την επιφάνεια που το περιέχει. Στην πραγματικότητα, όπως εικάζουν οι Davies και Cohen, η θαμμένη περιοχή ενός Ab μπορεί να κυμαίνεται από 500 Å 2 έως περισσότερα από 800 Å 2 που αντιστοιχούν σε 21-32 αμινοξέα, αν και μόνο 9-20 υπολείμματα αμινοξέων (ο πραγματικός επίτοπος) κάνουν άμεσες επαφές με το Ab [107] . Στην πραγματικότητα, όπως παρατηρήθηκε προηγουμένως για τον HCV, τη γρίπη και άλλους ανθρώπινους και ζωικούς ιούς [108] , ένας από τους πιθανούς μηχανισμούς είναι ότι ο στερικός αποκλεισμός από μη nAbs μειώνει τη σύνδεση των nAbs στην πρωτεΐνη SARS-S που απενεργοποιεί την εξουδετέρωση. Αντίθετα, παρά τους επιτόπους των mAbs 341C και 540C βρίσκονται σε έναν μόνο βρόχο. Διαχωρίζονται χωρικά παρέχοντας έτσι διακριτές διεπαφές για ανεξάρτητη δέσμευση Ab. Συμπερασματικά, ο SARS-CoV μπορεί να προκαλέσει δυνητικά παρεμβαλλόμενα μη nAbs παρουσιάζοντας στην επιφάνειά του στενά γεμάτες περιοχές με διαφορετικά βιολογικά χαρακτηριστικά. Από την άλλη πλευρά, ο ξενιστής μπορεί να δημιουργήσει μια έντονη χυμική απόκριση εξουδετέρωσης παράγοντας κοιλιακούς που αναγνωρίζουν διακριτούς επιτόπους και δρουν συνεργικά. Συγκεκριμένα, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ένα κοκτέιλ εξουδετερωτικού ανθρώπινου mAb που μπορεί να συνδεθεί με μοναδικούς επιτόπους και να έχει διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης μπορεί να είναι κλινικά χρήσιμο κατά της λοίμωξης SARS-CoV και υποδεικνύουν ότι μπορεί να εφαρμοστεί παρόμοια προσέγγιση για τη θεραπεία άλλων ιογενών λοιμώξεων [109] .Ο ιός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV) είναι ένας θετικός μονόκλωνος ρετροϊός RNA, που προκαλεί σημαντική νοσηρότητα και θνησιμότητα σε ολόκληρο τον κόσμο, ιδιαίτερα στις αναπτυσσόμενες χώρες. Οι ιοί ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας τύπου 1 και 2 (HIV-1 και HIV-2) είναι τα αποτελέσματα των μεταδόσεων πολλαπλών ειδών από τον ιό του πιθήκου στον άνθρωπο. Ο επιπολασμός του HIV-2 είναι χαμηλός και υπάρχει υψηλότερο ποσοστό ατόμων που έχουν μολυνθεί με HIV-2 που δεν εξελίσσονται σε σύνδρομο επίκτητης ανοσοανεπάρκειας (AIDS) σε σύγκριση με εκείνα που έχουν μολυνθεί με HIV-1 [110] . Οι ιοί HIV-1 είναι πολύ αποκλίνοντες και ταξινομούνται σε τέσσερις ομάδες: Μ, Ν, Ο και Ρ. Συγκεκριμένα, η ομάδα Μ υποδιαιρείται σε εννέα υποτύπους και σε πολυάριθμες κυκλοφορούσες ανασυνδυασμένες μορφές [111] . Το γονιδίωμα όλων των ρετροϊών κωδικοποιεί το Gag δομικές πρωτεΐνες Pol και Env. Μεταξύ των δομικών πρωτεϊνών HIV, οι επιφανειακές γλυκοπρωτεΐνες φακέλου gp120 και gp41 σχηματίζουν ετεροδιμερή που οργανώνονται ως τριμερή στην επιφάνεια της ιικής μεμβράνης. Η είσοδος του HIV-1 στα κύτταρα-στόχους ξεκινά από την αλληλεπίδραση αυτών των γλυκοπρωτεϊνών επιφανειακού φακέλου με το CD4 και έναν συν-υποδοχέα (συνήθως CCR5 ή CXCR4) στα κύτταρα στόχους [112] . Το τμήμα gp120 δεσμεύει τους υποδοχείς των κυττάρων-στόχων, ενώ το gp41 προάγει τη σύντηξη ιικών και κυτταρικών μεμβρανών [113]. Κατά τη δέσμευση στον υποδοχέα CD4, το gp120 υφίσταται μια διαμορφωτική αλλαγή, με αποτέλεσμα την έκθεση επιτόπων που μπορούν να δεσμευτούν από μόρια συν-υποδοχέα και στον τελικό σχηματισμό της παροδικής ενδιάμεσης διαμόρφωσης πριν από τη φουρκέτα [114] [115] [116] . Στο ενδιάμεσο προ-φουρκέτας, τα μόρια gp41 αναδιοργανώνονται έτσι ώστε τα Ν-τερματικά πεπτίδια να σχηματίζουν ένα τριμερές ελίκων που εκθέτουν το πεπτίδιο σύντηξης στο κύτταρο στόχο, ενώ οι C-τερματικές έλικες παραμένουν αγκυρωμένες στην ιική μεμβράνη [113]. Αυτό το στάδιο είναι ευάλωτο σε έναν αριθμό nAbs και πεπτιδίων ικανών να δεσμεύουν είτε τα αμινοτελικά είτε τα καρβοξυτελικά πεπτίδια [117, 118]. Κατά τη σύντηξη με τη μεμβράνη του κυττάρου στόχου, περαιτέρω αναδιοργάνωση του gp41 έχει ως αποτέλεσμα τη σύνδεση των πεπτιδίων Ν-και C-τερματικού άκρου για τη δημιουργία μιας δέσμης έξι έλικας μετά τη σύντηξη [119] . Μετά τη σύντηξη και την παράδοση του ιικού καψιδίου στο κυτταρόπλασμα, η αποκάλυψη οδηγεί στην απελευθέρωση ιικών ενζύμων, πρωτεϊνών και γονιδιωματικού RNA μέσα στο κύτταρο. Στη συνέχεια ξεκινά η αντίστροφη μεταγραφή του ιικού γονιδιωματικού μονόκλωνου θετικού RNA για να δώσει ένα δίκλωνο προϊικό DNA που θα εισαχθεί στον πυρήνα και θα ενσωματωθεί στο χρωμόσωμα του ξενιστή. Η ενεργή μεταγραφή από το ενσωματωμένο προϊικό DNA λαμβάνει χώρα παρουσία NF-κB και ιικού Tat. Το μάτισμα του mRNA του ιού αποδίδει πρώιμες βοηθητικές πρωτεΐνες όπως οι Tat, Rev και Nef, οι οποίες βοηθούν στη μεταγραφή, το μάτισμα και την τροποποίηση του κυτταρικού μηχανισμού, αντίστοιχα. Η συσσώρευση του Rev προστατεύει το mRNA του ιού από το μάτισμα, αποδίδοντας έτσι όλο και πιο μακρύτερα mRNA ικανά να κωδικοποιούν δομικές πρωτεΐνες και πρωτεΐνες φακέλου, και τελικά τα ιικά γονιδιωματικά RNA είναι έτοιμα να ενθυλακωθούν [111] . Η θεραπεία με αντιρετροϊκά φάρμακα για τον HIV είναι εξαιρετικά αποτελεσματική στον έλεγχο της λοίμωξης. Ωστόσο, η εξάλειψη αυτού του ιού δεν είναι επί του παρόντος εφαρμόσιμη και, ως εκ τούτου, η θεραπεία είναι δια βίου και επιβαρύνεται από σημαντική τοξικότητα και αντοχή στα φάρμακα. Ένα εμβόλιο θεωρείται ευρέως ως κρίσιμο για τον έλεγχο της επιδημίας, αλλά αρκετές προηγμένες προσπάθειες για την ανάπτυξη μιας αποτελεσματικής προφύλαξης απέτυχαν [120, 121]. Μία από τις μεγαλύτερες προκλήσεις στην ανάπτυξη ενός εμβολίου κατά του HIV είναι να ξεπεραστεί η ικανότητά του να μεταλλάσσεται συνεχώς και να ξεφεύγει από τις ανοσοαποκρίσεις κατά του HIV [122] . Αυτός ο υψηλός ρυθμός μετάλλαξης είναι άμεσο αποτέλεσμα της παρουσίας της χαμηλής πιστότητας RNA πολυμεράσης του ιού καθώς και των υψηλών επιπέδων ανασυνδυασμού που υφίσταται και της συνεχώς εξελισσόμενης ασπίδας γλυκάνης των γλυκοπρωτεϊνών του φακέλου [123] [124] [125] . Από αυτή την άποψη, τόσο τα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα όσο και τα nAbs έχουν αναφερθεί εδώ και καιρό ότι επιλέγουν παραλλαγές ανοσολογικής διαφυγής κατά τη διάρκεια της λοίμωξης HIV-1 [126] [127] [128] . Μια υποψήφια παθητική ανοσοθεραπεία θα μπορούσε να αποτελείται, όπως προτάθηκε προηγουμένως για το SARS -Λοίμωξη από CoV, με τη χορήγηση ενός κοκτέιλ ευρέως εξουδετερωτικών mAbs, που θα μπορούσε να ελαχιστοποιήσει την εμφάνιση μεταλλαγμάτων διαφυγής ιού [129] . Διάφοροι συνδυασμοί ανθρώπινων mAbs έχουν μελετηθεί τα τελευταία αρκετά χρόνια που έχουν δείξει αθροιστικά, συνεργιστικά ή ανταγωνιστικά αποτελέσματα στην εξουδετέρωση του HIV-1 [130] [131] [132] [133] [134] [135] . Ανταγωνιστική επίδραση στην εξουδετέρωση του HIV-1 έχει αναφερθεί προηγουμένως με ένα ζεύγος mAbs anti-gp120 που στρέφονται ενάντια στον βρόχο V3 και στη θέση δέσμευσης CD4, αντίστοιχα [136]. Οι μοριακοί μηχανισμοί που καθορίζουν τον ανταγωνισμό δεν έχουν μελετηθεί περαιτέρω λεπτομερώς. Η μόνη μελέτη που περιγράφει για πρώτη φορά σε μοριακό επίπεδο έναν πιθανό μηχανισμό παρεμβολής επίσης για τον HIV πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας συνδυασμούς ζευγών αντι-gp41 mAbs [137]. Πιο αναλυτικά, οι συγγραφείς σημείωσαν ένα ανταγωνιστικό αποτέλεσμα όταν τα αντι-gp41 εξουδετερωτικά mAb 2F5 ή 50-69 συνδυάστηκαν με το μη εξουδετερωτικό mAb αντι-gp41 98-6 [137] . Ειδικότερα τα mAbs 50-69 και 98-6 αναγνωρίζουν διαφορετικούς επιτόπους gp41 που βρίσκονται εντός της συστάδας Ι (υπολείμματα αμινοξέων 579-613) και της συστάδας II (υπολείμματα αμινοξέων 644-667), αντίστοιχα. Από την άλλη πλευρά, το mAb 2F5 αναγνωρίζει ένα διαφορετικό επίτοπο από το mAb 98-6, εντός της εγγύς εξωτερικής περιοχής μεμβράνης gp41 (MPER), σε ένα τμήμα δίπλα στην περιοχή συστάδας II του gp41. Επιπλέον, υπάρχει κάποια επικάλυψη μεταξύ των επιτόπων της συστάδας II και του επιτόπου που αναγνωρίζεται από το mAb 2F5 [138] , εξηγώντας την αναστολή της δέσμευσης του mAb 2F5 από το mAb 98-6 [137, 139] . Έτσι, στην περίπτωση του ανταγωνισμού μεταξύ mAbs και 98-6 ο συγγραφέας υπέθεσε έναν μηχανισμό στερεογενούς παρεμπόδισης μεταξύ των δύο mAbs καθώς θα μπορούσαν να δεσμεύουν πεπτίδια και πεπτιδικά σύμπλοκα που αντιπροσωπεύουν τις προ-συντηκογόνες μορφές του gp41 [140] . Συγκεκριμένα, το mAb 98-6 είχε υψηλότερη συγγένεια για τα πεπτιδικά σύμπλοκα που αντιπροσωπεύουν τη συντηκτική μορφή, από ότι το 2F5. Έτσι, η δέσμευση του 98-6, που αποτυγχάνει να εξουδετερώσει την απομόνωση HIV-1 89.6 (HIV-1 89.6), θα μπορούσε να παρέμβει στη δέσμευση του 2F5, οδηγώντας στον ανταγωνισμό εξουδετέρωσης. Αντίθετα, τα mAbs 50-69 και 2F5 αναγνωρίζουν διακριτούς επιτόπους στο gp41 και εμφανίζουν ανεξάρτητη (προσθετική) αντιδραστικότητα έναντι του HIV-1 89,6 σε συνδυασμό με τα περισσότερα από τα άλλα mAbs anti-gp41 και anti-gp120 που δοκιμάστηκαν [137]. Τα αντι-gp120 και anti-gp41 Abs επάγονται σε άτομα μολυσμένα με HIV-1, αλλά είναι κατά κύριο λόγο μη εξουδετερωτικά, καθώς οι λειτουργικά σημαντικές περιοχές των επιφανειακών πρωτεϊνών του HIV είναι σχεδόν εντελώς κρυμμένες στο ανοσοποιητικό σύστημα [139] . Μια ενδιαφέρουσα υπόθεση είναι ότι, μαζί με άλλους μηχανισμούς διαφυγής HIV, η επίδραση των εξαιρετικά σπάνιων nAbs anti-gp41 και anti-gp120 μπορεί επίσης να παρεμποδιστεί από τη συντριπτική ποσότητα παρεμβαλλόμενων μη nAbs. Μέχρι σήμερα, η ύπαρξη παρεμβαλλόμενων μη nAbs έχει αποδειχθεί ξεκάθαρα μόνο με χρήση mAbs αντι-gp41 με διαφορετικά βιολογικά χαρακτηριστικά, ενώ δεν έχουν δημιουργηθεί δεδομένα με χρήση mAbs αντι-gp120. Ο πιθανός ρόλος της μη διαμεσολαβούμενης παρέμβασης στη διευκόλυνση της διαφυγής του HIV κατά τη διάρκεια της φυσικής μόλυνσης αξίζει σίγουρα μελλοντικές μελέτες. Οι ανοσοπροληπτικές ή ανοσοθεραπευτικές προσεγγίσεις με mAbs εξακολουθούν να θεωρούνται πιθανό υποστηρικτικό εργαλείο στη διαχείριση μολυσματικών ασθενειών. Συγκεκριμένα, η διαθεσιμότητα ευρέως εξουδετερωτικών mAbs που στρέφονται κατά των ιικών παθογόνων, των οποίων οι πραγματικές προφυλακτικές και θεραπευτικές προσεγγίσεις δεν είναι καθόλου αποτελεσματικές, έχει οδηγήσει σε πολλές συνεχιζόμενες κλινικές δοκιμές. Ωστόσο, τα στοιχεία που αναφέρονται σε αυτήν την ανασκόπηση υποδεικνύουν ότι τα υποψήφια mAbs που θα χρησιμοποιηθούν πιθανώς σε προσεγγίσεις παθητικής ανοσοποίησης κατά του ιού ή που θα προκληθούν από μελλοντικές στρατηγικές εμβολίων, δεν πρέπει μόνο να είναι μόρια υψηλής διασταυρούμενης εξουδετέρωσης [141, 142], αλλά και προσαρμοσμένα μόρια των οποίων η δραστηριότητα δεν επηρεάζεται από πιθανά παρεμβαλλόμενα Abs που παράγονται κατά τη διάρκεια της μόλυνσης. Για το σκοπό αυτό, πρέπει είτε να στρέφονται εναντίον επιτόπων υψηλής εξουδετέρωσης που δεν υπόκεινται στον μηχανισμό παρεμβολής είτε πρέπει να έχουν υψηλή συγγένεια για το αντιγόνο προκειμένου να αντικαταστήσουν τη δέσμευση πιθανών παρεμβαλλόμενων Abs [51, 68].", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 6059, "text": "p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A και NS5B" } ], "id": 5166, "question": "Ποιες είναι οι μη δομικές πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από το γονιδίωμα του HCV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6868, "text": "υψηλό ποσοστό μετάλλαξης" } ], "id": 5167, "question": "Γιατί ήταν δύσκολο να αναπτυχθεί μια θεραπεία για τον ιό της ηπατίτιδας C;" }, { "answers": [ { "answer_start": 17733, "text": "αντιγονικές διαφορές της νουκλεοπρωτεΐνης τους και της πρωτεΐνης μήτρας" } ], "id": 5169, "question": "Πώς προσδιορίζονται οι ιοί τύπου Α, Β και Γ;" }, { "answers": [ { "answer_start": 17858, "text": "γρίπη Α" } ], "id": 5170, "question": "Ποιος τύπος γρίπης προκαλεί επιδημίες και πανδημίες;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Πέρα από την εμφάνιση φάγων: μη παραδοσιακές εφαρμογές του νηματοειδούς βακτηριοφάγου ως φορέα εμβολίου, θεραπευτικό βιολογικό και βιοσύζευξη ικρίωμα https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4523942/SHA: f0016000000: f0010000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000003666888 .; Arbabi-Ghahroudi, Mehdi; Scott, Jamie K.Date: 2015-08-04DOI: 10.3389/fmicb.2015.00755License: cc-byAbstract: Τα τελευταία 25 χρόνια, η τεχνολογία εμφάνισης φάγων ήταν ένα ανεκτίμητο εργαλείο για μελέτες αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Ωστόσο, οι εγγενείς βιολογικές, βιοχημικές και βιοφυσικές ιδιότητες του νηματοειδούς βακτηριοφάγου, καθώς και η ευκολία του γενετικού χειρισμού του, τον καθιστούν επίσης μια ελκυστική πλατφόρμα έξω από τον παραδοσιακό κανόνα εμφάνισης φάγων. Αυτή η ανασκόπηση θα επικεντρωθεί στις μοναδικές ιδιότητες του νηματοειδούς βακτηριοφάγου και θα τονίσει τις ποικίλες εφαρμογές του στην τρέχουσα έρευνα. Ιδιαίτερη έμφαση δίνεται στα: (i) τα πλεονεκτήματα του φάγου ως φορέα εμβολίου, συμπεριλαμβανομένης της υψηλής ανοσογονικότητάς του, της σχετικής αντιγονικής απλότητας και της ικανότητας να ενεργοποιεί μια σειρά από ανοσολογικές αποκρίσεις, (ii) τη δυνατότητα του φάγου ως προφυλακτικού και θεραπευτικού παράγοντα για μολυσματικές και χρόνιες ασθένειες, (iii) η κανονικότητα του πλέγματος πρωτεϊνών του κύριου περιβλήματος του ιού, που επιτρέπει μια ποικιλία εφαρμογών βιοσύζευξης και χημείας επιφανειών, ιδιαίτερα σε νανοϋλικά, και (iv) τα μεγάλα μεγέθη πληθυσμού του φάγου και οι γρήγοροι χρόνοι παραγωγής, που τον καθιστούν ένα εξαιρετικό μοντέλο συστήματος για κατευθυνόμενη εξέλιξη πρωτεϊνών. Παρά την πανταχού παρουσία τους στη βιόσφαιρα, το έργο της μεταγονιδιωματικής μόλις αρχίζει να διερευνά την οικολογία των νηματωδών και μη νηματοειδών φάγων και τον ρόλο τους στην εξέλιξη των βακτηριακών πληθυσμών. Έτσι, ο νηματώδης φάγος αντιπροσωπεύει έναν ισχυρό, φθηνό και ευέλικτο μικροοργανισμό του οποίου οι εφαρμογές βιομηχανικής συνεχίζουν να επεκτείνονται προς νέες κατευθύνσεις, αν και οι περιορισμοί του σε ορισμένες σφαίρες επιβάλλουν εμπόδια στην ευρεία υιοθέτηση και χρήση του. Κείμενο: Ο νηματώδης βακτηριοφάγος (γένος Inovirus and Plectrovirus) είναι ιοί Escherichia coli χωρίς περίβλημα, σε σχήμα ράβδου, των οποίων τα μακρά ελικοειδή καψίδια ενθυλακώνουν ένα μονόκλωνο κυκλικό γονιδίωμα DNA. Μετά την ανεξάρτητη ανακάλυψη του βακτηριοφάγου από τους Twort (1915) και d'Hérelle (1917), ο πρώτος νηματοειδής φάγος, f1, απομονώθηκε στο Loeb (1960) και αργότερα χαρακτηρίστηκε ως μέλος μιας μεγαλύτερης ομάδας φάγων (Ff, συμπεριλαμβανομένων f1, M13 και fd φάγος) ειδικοί για τον συζευκτικό F pilus E. coli (Hofschneider and Mueller-Jensen, 1963; Marvin και Hoffmann-Berling, 1963; Zinder et al., 1963; Salivar et al., 1964). Λίγο αργότερα, ανακαλύφθηκαν νηματοειδείς φάγοι που δεν χρησιμοποιούν F-pili για είσοδο (If και Ike; Meynell and Lawn, 1968; Khatoon et al., 1972) και με την πάροδο του χρόνου ο κατάλογος των γνωστών νηματωδών φάγων έχει επεκταθεί σε πάνω από 60 μέλη (Fauquet et al., 2005), συμπεριλαμβανομένων των εύκρατων και των θετικών κατά Gram ειδών. Η εργασία από πολλαπλές ομάδες τα τελευταία 50 χρόνια συνέβαλε σε μια σχετικά περίπλοκη κατανόηση της δομής, της βιολογίας και του κύκλου ζωής των νηματωδών φάγων (ανασκόπηση στο Marvin, 1998; Rakonjac et al., 2011; Rakonjac. Parmley and Smith, 1988). Με βάση τις ιδέες που περιγράφονται στους Parmley και Smith (1988), ομάδες στην Καλιφόρνια, τη Γερμανία και το Ηνωμένο Βασίλειο ανέπτυξαν πλατφόρμες εμφάνισης φάγων για τη δημιουργία και την εξέταση βιβλιοθηκών πεπτιδίων και παραλλαγών διπλωμένης πρωτεΐνης (Bass et al., 1990; Devlin et al., 1990; McCafferty et al., 1990; Scott and Smith, 1990; Breitling et al., 1991; Kang et αϊ., 1991). Αυτή η τεχνολογία επέτρεψε, για πρώτη φορά, την ικανότητα απρόσκοπτης σύνδεσης γενετικών πληροφοριών με πρωτεϊνική λειτουργία για μεγάλο αριθμό παραλλαγών πρωτεΐνης ταυτόχρονα, και έχει αξιοποιηθεί ευρέως και παραγωγικά σε μελέτες αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών. Πολλές εξαιρετικές ανασκοπήσεις είναι διαθέσιμες στις βιβλιοθήκες εμφάνισης φάγων και στις εφαρμογές τους (Kehoe and Kay, 2005; Bratkovic, 2010; Pande et al., 2010). Ωστόσο, ο φάγος έχει επίσης έναν αριθμό μοναδικών δομικών και βιολογικών ιδιοτήτων που τον καθιστούν εξαιρετικά χρήσιμο σε τομείς έρευνας που έχουν λάβει πολύ λιγότερη προσοχή. Επομένως, ο σκοπός αυτής της ανασκόπησης είναι να τονίσει την πρόσφατη και τρέχουσα εργασία που χρησιμοποιεί νηματοειδείς φάγους σε νέα και νέα δεδομένα. μη παραδοσιακές εφαρμογές. Συγκεκριμένα, αναφερόμαστε σε έργα που βασίζονται στον νηματοειδές φάγο ως βασικό στοιχείο, αλλά των οποίων ο πρωταρχικός σκοπός δεν είναι η δημιουργία ή η διαλογή βιβλιοθηκών που εμφανίζονται σε φάγο για να ληφθούν συνδετικά πολυπεπτιδικά προσδέματα. Αυτά τείνουν να εμπίπτουν σε τέσσερις κύριες κατηγορίες χρήσης: (i) νηματώδης φάγος ως φορέας εμβολίου. (ii) κατασκευασμένος νηματοειδής φάγος ως θεραπευτικός βιολογικός παράγοντας σε μολυσματικές και χρόνιες ασθένειες· (iii) νηματώδης φάγος ως ικρίωμα για βιοσύζευξη και χημεία επιφανειών. και (iv) νηματοειδής φάγος ως μηχανή για εξελισσόμενες παραλλαγές εμφανιζόμενων πρωτεϊνών με νέες λειτουργίες. Μια τελευταία ενότητα είναι αφιερωμένη στις πρόσφατες εξελίξεις στην οικολογία των νηματωδών φάγων και στις αλληλεπιδράσεις φάγου-ξενιστή. Τα κοινά θέματα που μοιράζονται σε όλες αυτές τις εφαρμογές περιλαμβάνουν τις μοναδικές βιολογικές, ανοσολογικές και φυσικοχημικές ιδιότητες του φάγου, την ικανότητά του να εμφανίζει μια ποικιλία βιομορίων με αρθρωτό τρόπο και τη σχετική απλότητα και ευκολία χειρισμού του. Σχεδόν όλες οι εφαρμογές του νηματώδους φάγου εξαρτώνται σχετικά με την ικανότητά του να εμφανίζει πολυπεπτίδια στην επιφάνεια του ιού ως συντήξεις με πρωτεΐνες επικάλυψης φάγου (Πίνακας 1). Ο τρόπος εμφάνισης καθορίζει το μέγιστο ανεκτό μέγεθος του συντηγμένου πολυπεπτιδίου, τον αριθμό αντιγράφων του στον φάγο και ενδεχομένως τη δομή του εμφανιζόμενου πολυπεπτιδίου. Η εμφάνιση μπορεί να επιτευχθεί με σύντηξη DNA που κωδικοποιεί ένα πολυπεπτίδιο ενδιαφέροντος απευθείας στο γονίδιο που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη περιβλήματος εντός του γονιδιώματος του φάγου (τύπου 8 εμφάνιση στο pVIII, εμφάνιση τύπου 3 στο pIII, κ.λπ. ), καταλήγοντας σε πλήρως ανασυνδυασμένο φάγο. Πολύ πιο συχνά, ωστόσο, μόνο ένα αντίγραφο της πρωτεΐνης του περιβλήματος τροποποιείται παρουσία ενός δεύτερου αντιγράφου άγριου τύπου (π.χ. εμφάνιση τύπου 88 εάν και τα δύο ανασυνδυασμένα και άγριου τύπου pVIII γονίδια βρίσκονται στο γονιδίωμα του φάγου, τύπου 8+ 8 εμφανίζουν εάν οι Parmley and Smith (1988), McConnell et al. (1994), Rondot et αϊ. (2001) Υβριδικό (σύστημα τύπου 33 και 3+3) Σύστημα τύπου 3+3 <1 2 Smith and Scott (1993) , Smith and Petrenko (1997) pVI Hybrid (σύστημα τύπου 6+6) Ναι <1 2 >25 kDa Οι Hufton et al. (1999) pVII Πλήρως ανασυνδυασμένο (σύστημα τύπου 7) Νο ~5 >25 kDa Kwasnikowski et al. (2005) Υβριδικό (σύστημα τύπου 7+7) Ναι <1 2 Gao et al. (1999) pVIII Πλήρως ανασυνδυασμένος (τοπικός φάγος; τύπου 8 σύστημα)No 2700 3 ~5-8 υπολείμματα Kishchenko et al. (1994), Petrenko et αϊ. (1996) Hybrid (τύπου 88 και 8+8 συστήματα) Τύπος 8+8 σύστημα ~1-300 2 >50 kDa Scott and Smith (1990), Greenwood et al. (1991), Smith and Fernandez (2004) pIX Πλήρως ανασυνδυασμένο (τύπος 9+9 * σύστημα) Ναι ~5 >25 kDa Gao et al. (2002) Hybrid (σύστημα τύπου 9+9) No <1 2 Gao et al. (1999), Shi et αϊ. (2010), Tornetta et al. (2010) 1 Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν ότι υπάρχουν μη λειτουργικά αντίγραφα της πρωτεΐνης περιβλήματος στο γονιδίωμα του βοηθητικού φάγου που χρησιμοποιείται για τη διάσωση ενός φαγομιδίου του οποίου η πρωτεΐνη του περιβλήματος έχει συντηχθεί με ένα ανασυνδυασμένο πολυπεπτίδιο. 2 Ο αριθμός αντιγράφων εξαρτάται από το μέγεθος του πολυπεπτιδίου. τυπικά <1 αντίγραφο ανά σωματίδιο φάγου αλλά για την εμφάνιση πεπτιδίου pVIII μπορεί να είναι έως και ~ 15% των μορίων pVIII σε υβριδικά ιοσωμάτια. 3 Ο συνολικός αριθμός των μορίων pVIII εξαρτάται από το μέγεθος του γονιδιώματος του φάγου. Ένα μόριο pVIII προστίθεται για κάθε 2,3 νουκλεοτίδια στο γονιδίωμα του ιού. Το ανασυνδυασμένο γονίδιο 8 βρίσκεται σε ένα πλασμίδιο με αρχή αντιγραφής φάγου) με αποτέλεσμα ένα υβριδικό ιοσωμάτιο που φέρει δύο διαφορετικούς τύπους μιας δεδομένης πρωτεΐνης περιβλήματος. Η πολυσθενής εμφάνιση σε ορισμένες πρωτεΐνες περιβλήματος μπορεί επίσης να επιβληθεί χρησιμοποιώντας βοηθητικούς φάγους που φέρουν μη λειτουργικά αντίγραφα του σχετικού γονιδίου πρωτεΐνης περιβλήματος (π.χ. εμφάνιση τύπου 3 * +3). Μακράν οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες πρωτεΐνες επικάλυψης για εμφάνιση είναι η κύρια πρωτεΐνη επικάλυψης, pVIII, και η δευτερεύουσα πρωτεΐνη περιβλήματος, pIII, με το κύριο πλεονέκτημα της πρώτης να είναι η εμφάνιση υψηλότερου αριθμού αντιγράφων (έως ~ 15% των ανασυνδυασμένων μορίων pVIII σε υβριδικό ιοσωμάτιο, τουλάχιστον για βραχείες πεπτιδικές συντήξεις), και του τελευταίου είναι η ικανότητα εμφάνισης ορισμένων αναδιπλωμένων πρωτεϊνών σε έναν αξιόλογο αριθμό αντιγράφων (1-5 ανά σωματίδιο φάγου). Ενώ η εμφάνιση του pVIII διπλωμένων πρωτεϊνών σε υβριδικό φάγο είναι δυνατή, συνήθως οδηγεί σε αριθμό αντιγράφων πολύ μικρότερο από 1 ανά ιοσωμάτιο (Sidhu et al., 2000). Για τους σκοπούς αυτής της ανασκόπησης, χρησιμοποιούμε τον όρο \"έκθεση φάγου\" για να αναφερθούμε σε έναν ανασυνδυασμένο νηματοειδές φάγο που εμφανίζει μια μοναδική πολυπεπτιδική αλληλουχία στην επιφάνειά του (ή πιο σπάνια, διειδική εμφάνιση που επιτυγχάνεται μέσω σύντηξης πολυπεπτιδίων σε δύο διαφορετικές πρωτεΐνες καψιδίου) και ο όρος \"παρουσιαζόμενη σε φάγο βιβλιοθήκη\" για να αναφέρεται σε μια ποικιλόμορφη δεξαμενή ανασυνδυασμένων νηματωδών φάγων που εμφανίζει μια σειρά παραλλαγών πολυπεπτιδίου (π.χ. θραύσματα αντισώματος, π.χ. πεπτίδια). Τέτοιες βιβλιοθήκες τυπικά υποβάλλονται σε διαλογή με επαναλαμβανόμενους κύκλους panning έναντι μιας ακινητοποιημένης πρωτεΐνης ενδιαφέροντος (π.χ. αντίσωμα για βιβλιοθήκες πεπτιδίων που εμφανίζονται σε φάγο) που ακολουθείται από ενίσχυση του δεσμευμένου φάγου σε κύτταρα E. coli. Η πρώιμη εργασία με αντιορούς αντιφάγου που δημιουργήθηκαν για σκοπούς ταξινόμησης ειδών έδειξε ότι το ιοσίδιο του νηματώδους φάγου είναι εξαιρετικά ανοσογονικό απουσία ανοσοενισχυτικών (Meynell και Lawn, 1968) και ότι μόνο η κύρια πρωτεΐνη περιβλήματος, η pVIII, και η δευτερεύουσα πρωτεΐνη επικάλυψης, η pIII, στοχεύονται από αντισώματα (Pratt et al., 1969; Woolford et al., 1977). Έτσι, η ιδέα της χρήσης του φάγου ως φορέα για την πρόκληση αντισωμάτων έναντι ελάχιστα ανοσογόνων απτενίων ή πολυπεπτιδίων ήταν μια φυσική επέκταση της ικανότητας εμφάνισης ανασυνδυασμένων εξωγενών αλληλουχιών στην επιφάνειά του, η οποία καταδείχθηκε για πρώτη φορά από τους de la Cruz et al. (1988). Το χαμηλό κόστος παραγωγής του σωματιδίου φάγου, η υψηλή σταθερότητα και η δυνατότητα για εμφάνιση ξένου αντιγόνου υψηλού σθένους (μέσω εμφάνισης pVIII) το κατέστησαν επίσης ελκυστικό ως φορέα εμβολίου, ειδικά κατά τα πρώτα στάδια ανάπτυξης της τεχνολογίας ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών. Με βάση τα υπάρχοντα πεπτίδια τεχνολογία φορέα, τα πρώτα ανοσογόνα εμβολίου με βάση νηματοειδείς φάγους εμφάνισαν σύντομες αλληλουχίες αμινοξέων προερχόμενες απευθείας από πρωτεΐνες ενδιαφέροντος ως ανασυνδυασμένες συντήξεις στο pVIII ή το pIII (de la Cruz et al., 1988). Καθώς η τεχνολογία της βιβλιοθήκης αναπτύχθηκε και βελτιωνόταν, αντιγόνα βασισμένα σε φάγο που εμφανίζουν πεπτιδικούς συνδέτες μονοκλωνικών αντισωμάτων (επιλεγμένα από τυχαίες βιβλιοθήκες πεπτιδίων χρησιμοποιώντας το αντίσωμα, προσομοιώνοντας έτσι με διάφορους βαθμούς επιτυχίας τον διπλωμένο επίτοπο του αντισώματος στο συγγενές του αντιγόνο. Geysen et al., 1986; Knittelfelder et al., 2009) δημιουργήθηκαν επίσης για σκοπούς ανοσοποίησης, με στόχο την πρόκληση αντι-πεπτιδικών αντισωμάτων που αναγνωρίζουν επίσης τη φυσική πρωτεΐνη. Ορισμένες από τις πρωτοποριακές εργασίες σε αυτόν τον τομέα χρησιμοποίησαν πεπτίδια που προέρχονται από αντιγόνα μολυσματικών ασθενειών (ή πεπτιδικούς συνδέτες αντισωμάτων έναντι αυτών των αντιγόνων. Πίνακας 2), συμπεριλαμβανομένου του ιού της ελονοσίας και της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας τύπου 1 (HIV-1). Όταν εμφανίστηκαν σε φάγο, τα πεπτίδια που κωδικοποιούν τις επαναλαμβανόμενες περιοχές της πρωτεΐνης περισποροζωίτη ελονοσίας και της επιφανειακής πρωτεΐνης μεροζωίτη 1 ήταν ανοσογόνα σε ποντίκια και κουνέλια (de la Cruz et al., 1988; Greenwood et al., 1991; Willis et al., 1993; Demangel et al., 1996) και τα αντισώματα που αναπτύχθηκαν εναντίον του τελευταίου αντέδρασαν διασταυρούμενα με την πρωτεΐνη πλήρους μήκους. Διάφοροι προσδιοριστές πεπτιδίων (ή μιμητές αυτών) των HIV-1 gp120, gp41, gag και ανάστροφης μεταγραφάσης ήταν ανοσογονικοί όταν εμφανίζονταν ή συζευγνύονταν με πρωτεΐνες περιβλήματος φάγου (Minenkova et al., 1993; di Marzo Veronese et al., 1994; De Berardinis et al., 1999; Scala et al., 1999; Chen et al., 2001; van Houten et al., 2006 van Houten et al., , 2010, και σε ορισμένες περιπτώσεις προκάλεσαν αντισώματα που ήταν σε θέση να εξουδετερώσουν ασθενώς ιούς προσαρμοσμένους στο εργαστήριο (di Marzo Veronese et al., 1994; Scala et al., 1999). Ο κατάλογος των λοιμώξεων από ζώα και ανθρώπους για τις οποίες έχουν αναπτυχθεί πεπτιδικά ανοσογόνα που εμφανίζονται σε φάγο ως απαγωγείς εμβολίων συνεχίζει να διευρύνεται και περιλαμβάνει βακτηριακά, μυκητιακά, ιικά και παρασιτικά παθογόνα (Πίνακας 2). Ενώ σε ορισμένες περιπτώσεις τα αποτελέσματα αυτών των μελετών ήταν πολλά υποσχόμενα, τα πεπτιδικά εμβόλια που βασίζονται σε επίτοπο αντισώματος δεν αποτελούν πλέον πεδίο ενεργούς έρευνας για διάφορους λόγους: (i) σε πολλές περιπτώσεις, τα πεπτίδια μιμούνται ατελώς ή ανεπαρκώς τους επιτόπους σε διπλωμένες πρωτεΐνες (Irving et al., 2010; Δες παρακάτω); (ii) τα αντισώματα έναντι ενός μόνο επιτόπου μπορεί να είναι περιορισμένης χρησιμότητας, ειδικά για εξαιρετικά μεταβλητά παθογόνα (Van Regenmortel, 2012). και (iii) για παθογόνα για τα οποία δημιουργούνται αποτελεσματικά προστατευτικές ανοσολογικές αποκρίσεις κατά τη διάρκεια φυσικής μόλυνσης, τα πεπτιδικά εμβόλια προσφέρουν λίγα πλεονεκτήματα σε σχέση με τα εμβόλια ανασυνδυασμένης υπομονάδας και ζωντανού φορέα, τα οποία έχουν γίνει ευκολότερα να παραχθούν με την πάροδο του χρόνου. Πιο πρόσφατα, έχουν χρησιμοποιηθεί φάγοι που εμφανίζουν πεπτίδια σε προσπάθειες δημιουργίας θεραπευτικών αντισωμάτων για χρόνιες ασθένειες, καρκίνο, ανοσοθεραπεία και ανοσοαντισύλληψη. Η ανοσοποίηση με φάγους που εμφανίζουν πεπτίδια ινιδίων β-αμυλοειδούς νόσου Αλτσχάιμερ προκάλεσε αντισυγκεντρωτικά αντισώματα σε ποντίκια και ινδικά χοιρίδια (Frenkel et al., 2000 (Frenkel et al., 2003 Esposito et al., 2008; Tanaka et al., 2011), πιθανώς μείωσε τον σχηματισμό αμυλοειδούς πλάκας σε ποντίκια (Frenkel et al., 2003; Solomon, 2005; Esposito et al., 2008) και μπορεί να βοήθησε στη διατήρηση των γνωστικών ικανοτήτων σε ένα διαγονιδιακό μοντέλο ποντικού της νόσου του Alzheimer (Lavie et al., 2004). Ωστόσο, παραμένει ασαφές πώς προτείνονται τέτοια αντισώματα για να διασχίσουν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό. Οι Yip et al. (2001) διαπίστωσαν ότι τα αντισώματα που αναπτύχθηκαν σε ποντίκια κατά ενός πεπτιδίου ERBB2/HER2 θα μπορούσαν να αναστείλουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του μαστού. Οι φάγοι που εμφανίζουν πεπτιδικά προσδέματα ενός αντισώματος αντι-IgE προκάλεσαν αντισώματα που δέσμευαν καθαρισμένα μόρια IgE (Rudolf et al., 1998), τα οποία μπορεί να είναι χρήσιμα στην ανοσοθεραπεία αλλεργιών. Έχουν προταθεί αρκετές στρατηγικές για αντισυλληπτικά εμβόλια με βάση τους φάγους για τον έλεγχο των ζωικών πληθυσμών. Για παράδειγμα, η ανοσοποίηση με φάγους που εμφανίζουν πεπτίδια ορμόνης διέγερσης του ωοθυλακίου στο pVIII προκάλεσε αντισώματα που βλάπτουν τη γονιμότητα ποντικών και προβατινών (Abdennebi et al., 1999). Οι φάγοι που εμφανίζουν ή συζευγνύονται χημικά Rubinchik and Chow (2000) με πεπτίδια αντιγόνου σπέρματος ή μιμητές πεπτιδίων (Samoylova et al., 2012a,b) και ορμόνη απελευθέρωσης γοναδοτροπίνης (Samoylov et al., 2012) βρίσκονται επίσης στο μεγαλύτερο μέρος της ανάπτυξης. , τα πεπτίδια που εμφανίζονται σε φάγους προκαλούν αντισώματα σε πειραματόζωα (Πίνακας 2), αν και αυτό εξαρτάται από τα χαρακτηριστικά του πεπτιδίου και τη μέθοδο εμφάνισής του: οι συντήξεις pIII τείνουν προς χαμηλότερη ανοσογονικότητα από τις συντήξεις pVIII (Greenwood et al., 1991) πιθανώς λόγω διαφορές αριθμού αντιγράφων (pIII: 1-5 αντίγραφα έναντι pVIII: εκτιμάται σε αρκετές εκατοντάδες αντίγραφα. Malik et al., 1996). Στην πραγματικότητα, ο φάγος είναι τουλάχιστον εξίσου ανοσογονικός με τις παραδοσιακές πρωτεΐνες-φορείς όπως η αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA) και η αιμοκυανίνη πεταλούδας κλειδαρότρυπας (KLH; Melzer et al., 2003; Su et al., 2007) και έχει συγκριτικά λίγους ενδογενείς επιτόπους Β-κυττάρων για να εκτρέψει την απόκριση αντισώματος από τον επιδιωκόμενο στόχο (Henry et al., 2011). Με εξαίρεση τους μικρούς επιτόπους που μπορούν να αναπαρασταθούν με ακρίβεια από μια συνεχόμενη σύντομη αλληλουχία αμινοξέων, ωστόσο, ήταν εξαιρετικά δύσκολο να προκληθούν αποκρίσεις αντισωμάτων που αντιδρούν διασταυρούμενα με φυσικούς πρωτεϊνικούς επιτόπους χρησιμοποιώντας πεπτίδια. Η συνολική εικόνα είναι πολύ πιο ζοφερή από αυτή που απεικονίζεται στον Πίνακα 2, καθώς σε αρκετές μελέτες είτε: (i) πεπτιδικοί συνδέτες που επιλέχθηκαν από βιβλιοθήκες που εμφανίζονται σε φάγους ταξινομήθηκαν από τους συγγραφείς ως μιμητές ασυνεχών επιτόπων εάν δεν είχαν προφανή ομολογία αλληλουχίας με τους εγγενείς πρωτεΐνη, η οποία είναι αδύναμη απόδειξη μη γραμμικότητας, ή (ii) η απόδειξη για διασταυρούμενη αντιδραστικότητα αντισωμάτων που προκαλείται από ανοσοποίηση με πεπτίδια που εμφανίζονται σε φάγο με φυσική πρωτεΐνη δεν ήταν επιτακτικά. Οι Irving et al. (2010) περιγράφουν τουλάχιστον έναν λόγο για αυτήν την έλλειψη επιτυχίας: φαίνεται ότι τα πεπτιδικά αντιγόνα προκαλούν ένα σύνολο τοπολογικά περιορισμένων αντισωμάτων που είναι σε μεγάλο βαθμό ανίκανα να αναγνωρίσουν ασυνεχείς ή σύνθετους επιτόπους σε μεγαλύτερα βιομόρια. Ενώ το πεπτίδιο μπορεί να μιμείται τη χημεία ενός δεδομένου επιτόπου σε μια διπλωμένη πρωτεΐνη (επιτρέποντάς του να αντιδρά διασταυρούμενα με ένα στοχευμένο αντίσωμα), όντας ένα μικρότερο μόριο, δεν μπορεί να μιμηθεί την τοπολογία του πλήρους επιτόπου αυτού του αντισώματος. Παρά το γεγονός αυτό, ο νηματώδης φάγος παραμένει σε υψηλό βαθμό χρήσιμος ως φορέας για πεπτίδια με σχετικά απλές δευτερογενείς δομές, τα οποία μπορούν να σταθεροποιηθούν μέσω αγκύρωσης στις πρωτεΐνες του περιβλήματος (Henry et al., 2011). Αυτό μπορεί να ισχύει ιδιαίτερα για πεπτίδια με φτωχή εγγενή ανοσογονικότητα, η οποία μπορεί να αυξηθεί με την εμφάνιση υψηλού σθένους και την επικουρικότητα που σχετίζεται με τους φάγους (βλέπε παρακάτω Ανοσολογικούς Μηχανισμούς Εμβολιασμού με Νηματώδη Φάγο). Ο νηματοειδής φάγος έχει χρησιμοποιηθεί σε μικρότερο βαθμό ως φορέας για επιτόπους πεπτιδίων Τ-κυττάρων, κυρίως ως πρωτεΐνες σύντηξης με το pVIII (Πίνακας 3). Πρώιμη εργασία, που δείχνει ότι η ανοσοποίηση με φάγο οδήγησε τα Τ-κύτταρα (Kölsch et al., 1971; Willis et al., 1993), επιβεβαιώθηκε από αρκετές μεταγενέστερες μελέτες (De Berardinis et al., 1999; Ulivieri et al., 2008). Από την άποψη του εμβολιασμού κατά λοιμωδών νόσων, οι De Berardinis et al. (2000) έδειξε ότι ένας επίτοπος κυτταροτοξικού Τ-κυττάρου (CTL) από την ανάστροφη μεταγραφάση HIV-1 θα μπορούσε να προκαλέσει αντιγονοειδικά CTL in vitro και in vivo χωρίς την προσθήκη εξωγενών επιτόπων βοηθητικών Τ-κυττάρων, πιθανώς επειδή υπάρχουν ήδη στον φάγο πρωτεΐνες περιβλήματος (Mascolo et al., 2007). Ομοίως, αποτελεσματική εκκίνηση των CTLs παρατηρήθηκε έναντι επιτόπων Τ-κυττάρων που εμφανίζονται σε φάγο από τον ιό της ηπατίτιδας Β (Wan et al., 2001) και την Candida albicans (Yang et al., 2005a; Wang et al., 2006 Wang et al., , 2014d, το οποίο, μαζί με άλλους τύπους ανοσολογικών αποκρίσεων, προστάτευσε τα ποντίκια από τη συστηματική καντιντίαση. Ο εμβολιασμός με έναν συνδυασμό πεπτιδίων που εμφανίστηκαν σε φάγο οδήγησε σε αντιγονοειδικά CTL που αποδείχθηκαν αποτελεσματικά στη μείωση της κυστικέρκωσης των χοίρων σε μια τυχαιοποιημένη ελεγχόμενη δοκιμή (Manoutcharian et al., 2004; Morales et al., 2008). Ενώ οι συσχετισμοί της επαγόμενης από εμβόλια ανοσοπροστασίας για μολυσματικές ασθένειες, όπου είναι γνωστοί, είναι σχεδόν αποκλειστικά αντισώματα ορού ή βλεννογόνου (Plotkin, 2010), Σε ορισμένες εφαρμογές εμβολίων, ο νηματοειδής φάγος έχει χρησιμοποιηθεί ως φορέας για μεγαλύτερα μόρια που θα ήταν ανοσογόνα ακόμη και μεμονωμένα. Αρχικά, τα κύρια πλεονεκτήματα στην εμφάνιση τέτοιων αντιγόνων σε φάγους ήταν η ταχύτητα, η ευκολία καθαρισμού και το χαμηλό κόστος παραγωγής (Gram et al., 1993). Η προσκολλητίνη E. coli F17a-G (Van Gerven et al., 2008), το αντιγόνο πυρήνα της ηπατίτιδας Β (Bahadir et al., 2011) και το επιφανειακό αντιγόνο ηπατίτιδας Β (Balcioglu et al., 2014) προκάλεσαν αποκρίσεις αντισωμάτων όταν εμφανίζονται σε pIII, αν και καμία από αυτές τις μελέτες δεν συνέκρινε την ανοσογονικότητα των πρωτεϊνών που εμφανίζονται στον φάγο με εκείνη της καθαρισμένης πρωτεΐνης μόνο. Φάγος που εμφανίζει Schistosoma mansoni γλουταθειόνη S-τρανσφεράση στο pIII προκάλεσε μια απόκριση αντισώματος που ήταν τόσο υψηλότερη σε τίτλο όσο και διαφορετικών ισοτύπων σε σύγκριση με την ανοσοποίηση μόνο με την πρωτεΐνη (Rao et al., 2003). Δύο μελέτες αντιιδιοτυπικών εμβολίων έχουν χρησιμοποιήσει τον φάγο ως φορέα για θραύσματα αντισωμάτων που φέρουν ανοσογονικούς ιδιότυπους. Η ανοσοποίηση με φάγο που εμφανίζει τον ιδιότυπο 1Ε10 scFv (που μιμείται έναν επιτόπιο επιφάνειας Vibrio anguillarum) προκάλεσε αντισώματα που προστάτευαν τα ψάρια καλαμιών από την πρόκληση Vibrio anguillarum (Xia et al., 2005). Ένα χημικά συνδεδεμένο εμβόλιο ιδιότυπου όγκου-ειδικού για τον όγκο του φάγου BCL1 ήταν ασθενώς ανοσογονικό σε ποντίκια αλλά παρατεταμένο χρόνο επιβίωσης σε μοντέλο λεμφώματος Β-κυττάρων (Roehnisch et al., 2013) και ήταν καλά ανεκτό και ανοσογονικό σε ασθενείς με πολλαπλό μυέλωμα (Roehnisch et al. ., 2014). Μια μελέτη εμβολιασμού DNA με scFv αντι-λαμιναρίνης διαπίστωσε ότι το DNA που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη σύντηξης pIII-scFv προκάλεσε ισχυρότερες χυμικές και μεσολαβούμενες από κύτταρα ανοσοαποκρίσεις από το DNA που κωδικοποιεί μόνο το scFv (Cuesta et al., 2006), γεγονός που υποδηλώνει ότι υπό ορισμένες συνθήκες , ενδογενείς επίτοποι Τ-κυττάρων φάγου μπορούν να ενισχύσουν την ανοσογονικότητα των σχετικών πρωτεϊνών. Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτών των μελετών δείχνουν ότι ως σωματιδιακό σωματίδιο που μοιάζει με ιό, ο νηματώδης φάγος πιθανώς πυροδοτεί διαφορετικούς τύπους ανοσολογικών αποκρίσεων από τα ανασυνδυασμένα πρωτεϊνικά αντιγόνα και παρέχει πρόσθετη βοήθεια Τ-κυττάρων σε εμφανιζόμενες ή συζευγμένες πρωτεΐνες. Ωστόσο, ο χαμηλός αριθμός αντιγράφων των πρωτεϊνών που εμφανίζονται στο pIII, καθώς και η δυνητικά ανεπιθύμητη επικουρικότητα που σχετίζεται με φάγο, μπορεί να καταστήσει την εμφάνιση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών από φάγο μια υποβέλτιστη επιλογή εμβολίου. Αν και η κατανόησή μας για την ανοσολογική απόκριση έναντι του νηματοειδούς φάγου είναι ωχρή σε σύγκριση με κλασικά μοντέλα αντιγόνων όπως η ωολευκωματίνη, πρόσφατη εργασία έχει αρχίσει να ρίχνει φως στους ανοσολογικούς μηχανισμούς που ενεργοποιούνται ως απόκριση στον εμβολιασμό με φάγους (Εικόνα 1). Το σωματίδιο φάγου είναι ανοσογονικό χωρίς ανοσοενισχυτικό σε όλα τα είδη που έχουν δοκιμαστεί μέχρι σήμερα, συμπεριλαμβανομένων ποντικών (Willis et al., 1993), αρουραίων (Dente et al., 1994), κουνέλια (de la Cruz et al., 1988), ινδικά χοιρίδια ( Frenkel et al., 2000; Kim et al., 2004), fish (Coull et al., 1996; Xia et al., 2005), μη ανθρώπινα πρωτεύοντα (Chen et al., 2001) και άνθρωποι (Roehnisch et al., 2014). Έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορες οδοί ανοσοποίησης, συμπεριλαμβανομένης της στοματικής χορήγησης (Delmastro et al., 1997) καθώς και της υποδόριας (Grabowska et al., 2000), ενδοπεριτοναϊκής (van Houten et al., 2006), ενδομυϊκής (Samoylova et al.. 2012a), ενδοφλέβια (Vaks and Benhar, 2011) και ενδοδερμική ένεση (Roehnisch et al., 2013); καμία δημοσιευμένη μελέτη δεν έχει συγκρίνει άμεσα την επίδραση της οδού χορήγησης στην ανοσογονικότητα των νηματωδών φάγων. Τα αντισώματα δημιουργούνται ενάντια σε τρεις μόνο κύριες θέσεις στο ιοσωμάτιο: (i) τα εκτεθειμένα στην επιφάνεια αμινοτελικά ~12 υπολείμματα του πλέγματος μονομερούς pVIII (Terry et al., 1997; Kneissel et al., 1999); (ii) οι Ν-τερματικές περιοχές Ν1 και Ν2 του pIII (van Houten et al., 2010); και (iii) βακτηριακός λιποπολυσακχαρίτης (LPS) ενσωματωμένος στο κάλυμμα φάγου (Henry et al., 2011). Σε ποντίκια, οι τίτλοι αντισωμάτων ορού κατά του φάγου φτάνουν τυπικά το 1:10 5 -1:10 6 μετά από 2-3 ανοσοποιήσεις και διατηρούνται για τουλάχιστον 1 χρόνο μετά την ανοσοποίηση (Frenkel et al., 2000). Οι πρωτογενείς αποκρίσεις αντισωμάτων κατά του φάγου φαίνεται να αποτελούνται από ένα μείγμα ισοτύπων IgM και IgG2b σε ποντικούς C57BL/6, ενώ οι δευτερογενείς αποκρίσεις αντισωμάτων αποτελούνται κυρίως από ισότυπους IgG1 και IgG2b, με μικρότερη συμβολή των ισοτύπων IgG2c και IgG3 alshiguetH ( ., 2010). Η διαγραφή των εκτεθειμένων στην επιφάνεια περιοχών Ν1 και Ν2 του pIII παράγει μια κολοβωμένη μορφή αυτής της πρωτεΐνης που δεν προκαλεί αντισώματα, αλλά επίσης οδηγεί σε ένα μη μολυσματικό σωματίδιο φάγου με χαμηλότερη συνολική ανοσογονικότητα (van Houten et al., 2010) .ΕΙΚΟΝΑ 1 | Τύποι ανοσοαποκρίσεων που προκαλούνται σε απόκριση στην ανοσοποίηση με νηματοειδείς βακτηριοφάγους. Ως σωματίδιο που μοιάζει με ιό, ο νηματώδης φάγος εμπλέκεται σε πολλαπλούς βραχίονες του ανοσοποιητικού συστήματος, ξεκινώντας με κυτταρικούς τελεστές έμφυτης ανοσίας (μακροφάγα, ουδετερόφιλα και πιθανώς φυσικά κύτταρα φονείς), τα οποία στρατολογούνται σε θέσεις όγκου από φάγο που εμφανίζουν τμήματα στόχευσης όγκου . Ο φάγος πιθανώς ενεργοποιεί αποκρίσεις αντισωμάτων ανεξάρτητων από Τ-κύτταρα, είτε μέσω συνδετών TLR που σχετίζονται με φάγο είτε μέσω διασταύρωσης μέσω του πλέγματος pVIII. Μετά την επεξεργασία από κύτταρα που παρουσιάζουν αντιγόνο, τα πεπτίδια που προέρχονται από φάγο παρουσιάζονται σε MHC κατηγορίας II και διασταυρώνονται σε MHC κατηγορίας Ι, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση βραχύβιων CTL και μια σειρά βοηθητικών τύπων Τ-κυττάρων, τα οποία βοηθούν στην εκκίνηση των CTL μνήμης και αποκρίσεις Β-κυττάρων υψηλής συγγένειας. Frontiers in Microbiology | www.frontiersin.orgΑν και οι τίτλοι αντισωμάτων αντι-φάγου ορού φαίνεται να εξαρτώνται τουλάχιστον εν μέρει από τα Τ κύτταρα (Kölsch et al., 1971; Willis et al., 1993; De Berardinis et al., 1999; van Houten et al., 2010), πολλά κυκλοφορούντα ειδικά για το pVIII Β κύτταρα στο αίμα στερούνται σωματικής μετάλλαξης ακόμη και μετά από επαναλαμβανόμενες διεβδομαδιαίες ανοσοποιήσεις, γεγονός που υποδηλώνει ότι κάτω από αυτές τις συνθήκες, ο φάγος ενεργοποιεί επιπλέον αποκρίσεις Β-κυττάρων ανεξάρτητες από Τ-κύτταρα σε αποκρίσεις εξαρτώμενες από Τ-κύτταρα υψηλής συγγένειας (Murira, 2014). Τα σωματίδια νηματοειδούς φάγου μπορούν να υποβληθούν σε επεξεργασία από κύτταρα που παρουσιάζουν αντιγόνο και να παρουσιαστούν σε μόρια MHC τάξης II (Gaubin et al., 2003; Ulivieri et al., 2008) και μπορεί να ενεργοποιήσει τα βοηθητικά Τ κύτταρα T H 1, T H 2 και T H 17 (Yang et al., 2005a; Wang et al., 2014d). Οι αποκρίσεις TH2 κατά του φάγου ενισχύθηκαν μέσω εμφάνισης πεπτιδίων CTLA-4 συντηγμένων με το pIII (Kajihara et al., 2000). Οι πρωτεΐνες φάγων μπορούν επίσης να διασταυρωθούν σε μόρια MHC τάξης Ι (Wan et al., 2005) και μπορούν να εκκινήσουν δύο κύματα αποκρίσεων CTL, που αποτελούνται πρώτα από βραχύβια CTL και αργότερα από CTL μακράς διάρκειας μνήμης που απαιτούν CD4 + T -βοήθεια κυττάρων (Del Pozzo et al., 2010) . Τα τελευταία CTL μεσολαβούν σε μια καθυστερημένου τύπου αντίδραση υπερευαισθησίας (Fang et al., 2005; Del Pozzo et al., 2010). Το σωματίδιο του φάγου αυτοεπικουρείται μέσω πολλαπλών μηχανισμών. Το LPS που προέρχεται από το τοίχωμα του κυττάρου ξενιστή ενισχύει την ανοσογονικότητα του ιού και η απομάκρυνσή του με χρωματογραφία πολυμυξίνης Β μειώνει τους τίτλους αντισωμάτων έναντι των πρωτεϊνών του περιβλήματος του φάγου (Grabowska et al., 2000). Το μονόκλωνο γονιδίωμα DNA του φάγου περιέχει μοτίβα CpG και μπορεί επίσης να έχει επικουρική δράση. Η απόκριση αντισωμάτων έναντι του φάγου εξαρτάται εξ ολοκλήρου από τη σηματοδότηση MyD88 και ρυθμίζεται από τη διέγερση αρκετών υποδοχέων τύπου Toll (Hashiguchi et al., 2010), υποδεικνύοντας ότι η έμφυτη ανοσία παίζει σημαντικό αλλά σε μεγάλο βαθμό αχαρακτήριστο ρόλο στην ενεργοποίηση των αντιφάγων. προσαρμοστικές ανοσολογικές αντιδράσεις. Μελέτες βιοκατανομής του φάγου μετά από ενδοφλέβια ένεση δείχνουν ότι απομακρύνεται από το αίμα μέσα σε λίγες ώρες μέσω του δικτυοενδοθηλιακού συστήματος (Molenaar et al., 2002), ιδιαίτερα του ήπατος και του σπλήνα, όπου διατηρείται για μέρες (Zou et al., 2004), δυνητικά ενεργοποιώντας αποκρίσεις Β-κυττάρων οριακής ζώνης. Έτσι, ο νηματώδης φάγος δεν είναι μόνο ένας εξαιρετικά ανοσογόνος φορέας, αλλά λόγω της ενεργοποίησης μιας σειράς έμφυτων και προσαρμοστικών ανοσολογικών αποκρίσεων, χρησιμεύει ως ένα εξαιρετικό μοντέλο σωματιδιακό αντιγόνο που μοιάζει με ιό. Πολύ πριν από την ταυτοποίηση του νηματοειδούς φάγου, άλλοι τύποι βακτηριοφάγων είχαν ήδη χρησιμοποιηθεί για αντιβακτηριακή θεραπεία στην πρώην Σοβιετική Ένωση και την Ανατολική Ευρώπη (ανασκόπηση στο Sulakvelidze et al., 2001). Ο νηματώδης φάγος, με τον μη λυτικό κύκλο ζωής του, έχει λιγότερο προφανείς κλινικές χρήσεις, παρά το γεγονός ότι η εξειδίκευση του ξενιστή του Ινοϊού και του Πλεκτροϊού περιλαμβάνει πολλά παθογόνα ιατρικής σημασίας, συμπεριλαμβανομένων των ειδών Salmonella, E. coli, Shigella, Pseudomonas, Clostridium και Mycoplasma. Σε μια προσπάθεια να ενισχυθεί η βακτηριοκτόνος δράση τους, γενετικά τροποποιημένοι νηματοειδείς φάγοι έχουν χρησιμοποιηθεί ως «δούρειος ίππος» για την εισαγωγή διαφόρων αντιβακτηριακών παραγόντων στα κύτταρα. Οι M13 και Pf3 φάγοι κατασκευασμένοι για να εκφράζουν είτε την περιοριστική ενδονουκλεάση BglII (Hagens and Blasi, 2003; Hagens et al., 2004), ο λάμδα φάγος S holin (Hagens and Blasi, 2003) ή μια πρωτεΐνη ενεργοποιητή γονιδίου θανατηφόρου καταβολίτη (Moradpour et al., 2009) σκότωσε αποτελεσματικά τα κύτταρα E. coli και Pseudomonas aeruginosa, αντίστοιχα, χωρίς σύγχυση του LPS (Hagens and Blasi, 2003; Hagens et al., 2004). Δυστυχώς, η ταχεία εμφάνιση ανθεκτικών βακτηρίων με τροποποιημένο F pili αντιπροσωπεύει ένα σημαντικό και πιθανώς ανυπέρβλητο εμπόδιο σε αυτή την προσέγγιση. Ωστόσο, υπάρχουν ορισμένες ενδείξεις ότι οι νηματοειδείς φάγοι μπορούν να ασκήσουν χρήσιμες αλλά πιο λεπτές επιδράσεις στους βακτηριακούς ξενιστές τους που μπορεί να μην έχουν ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη αντίστασης στη μόλυνση. Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει αυξημένη ευαισθησία στα αντιβιοτικά σε βακτηριακούς πληθυσμούς που έχουν μολυνθεί ταυτόχρονα είτε με νηματοειδείς φάγους άγριου τύπου (Hagens et al., 2006) είτε με φάγους που έχουν κατασκευαστεί για να καταστέλλουν την κυτταρική απόκριση SOS (Lu and Collins, 2009). Η μόλυνση από νηματοειδείς φάγους f1 ανέστειλε το σχηματισμό βιοφίλμ πρώιμου σταδίου, αλλά όχι ώριμης ηλικίας στο E. coli (May et al., 2011). Έτσι, ο μη τροποποιημένος νηματώδης φάγος μπορεί να έχει μελλοντικό ενδιαφέρον ως στοιχεία συνδυαστικής θεραπείας έναντι ορισμένων ανθεκτικών στα φάρμακα λοιμώξεων. Πιο προηγμένες θεραπευτικές εφαρμογές του νηματοειδούς φάγου εμφανίζονται όταν τροποποιείται για να εκφράζει ένα τμήμα στόχευσης ειδικό για παθογόνα κύτταρα και/ή πρωτεΐνες για το θεραπεία μολυσματικών ασθενειών, καρκίνου και αυτοανοσίας (Εικόνα 2) . Η πρώτη εργασία σε αυτόν τον τομέα έδειξε ως απόδειξη της ιδέας ότι ο φάγος που κωδικοποιεί μια κασέτα έκφρασης GFP και εμφανίζει ένα HER2 ειδικό scFv σε όλα τα αντίγραφα του pIII εσωτερικεύτηκαν σε κύτταρα όγκου μαστού, με αποτέλεσμα την έκφραση GFP (Poul and Marks, 1999). Ο M13 ή ο φάγος fd που εμφανίζει είτε ένα πεπτίδιο στόχευσης είτε ένα θραύσμα αντισώματος και προσδεμένο στη χλωραμφενικόλη μέσω ενός ασταθούς διασυνδετικού παράγοντα ήταν πιο ισχυροί αναστολείς της ανάπτυξης του Staphylococcus aureus από ότι η ελεύθερη χλωραμφενικόλη υψηλής συγκέντρωσης (Yacoby et al., 2006; Vaks και Benhar, 2011). Φάγος Μ13 φορτωμένος με δοξορουβικίνη και εμφανίζοντας ένα πεπτίδιο στόχευσης στο pIII σκότωσε ειδικά κύτταρα καρκίνου του προστάτη in vitro (Ghosh et al., 2012a). Ογκοειδικό πεπτίδιο: pVIII συντηγμένες πρωτεΐνες επιλεγμένες από φάγο \"τοπίου\" (Romanov et al., 2001; Abbineni et al., 2010; Fagbohun et al., 2012 Fagbohun et al., , 2013 Lang et al., 2014; Οι Wang et al., 2014a) μπόρεσαν να στοχεύσουν και να απελευθερώσουν λιποσώματα που περιέχουν siRNA, πακλιταξέλη και δοξορουβικίνη σε κύτταρα όγκου (Jayanna et al., 2010a; Wang et al., 2010a Wang et al., ,b,c, 2014b Bedi et al., 2011 Bedi et al., , 2013 Bedi et al., , 2014; ήταν μη τοξικά και αύξησαν τα ποσοστά ύφεσης του όγκου σε μοντέλα ποντικών (Jayanna et al., 2010b; Wang et al., 2014b,c). Χρησιμοποιώντας το μοντέλο όγκου B16-OVA, οι Eriksson et al. (2007) έδειξε ότι οι φάγοι που εμφανίζουν πεπτίδια και/ή Fabs ειδικά για αντιγόνα όγκου καθυστέρησαν την ανάπτυξη του όγκου και βελτίωσαν την επιβίωση, λόγω σε μεγάλο βαθμό της ενεργοποίησης των μακροφάγων που σχετίζονται με τον όγκο και της στρατολόγησης ουδετερόφιλων στην περιοχή του όγκου (Eriksson et al., 2009). . Ο φάγος που εμφανίζει scFv έναντι των β-αμυλοειδών ινιδίων έδειξε υπόσχεση ως διαγνωστικό (Frenkel and Solomon, 2002) και θεραπευτικό (Solomon, 2008) αντιδραστήριο για τη νόσο του Alzheimer και τη νόσο του Πάρκινσον λόγω της απρόβλεπτης ικανότητας του φάγου να διεισδύει στον εγκεφαλικό ιστό et al., 2012). Ομοίως, ο φάγος που εμφανίζει έναν ανοσοκυρίαρχο επίτοπο πεπτιδίου που προέρχεται από παθογόνα απομυελινωτικά αντισώματα γλυκοπρωτεΐνης ολιγοδενδροκυττάρων μυελίνης στον εγκεφαλικό ιστό στο πειραματικό μοντέλο αυτοάνοσης εγκεφαλομυελίτιδας σκλήρυνσης κατά πλάκας (Rakover et al., 2010). Τα πλεονεκτήματα του νηματώδους φάγου σε αυτό το πλαίσιο έναντι των παραδοσιακών συζυγών αντισώματος-φαρμάκου ή πρωτεΐνης-πεπτιδίου είναι (i) η ικανότητά του να μεταφέρει πολύ υψηλές ποσότητες φαρμάκου ή πεπτιδίου και (ii) η ικανότητά του να έχει πρόσβαση σε ανατομικά διαμερίσματα που γενικά δεν είναι εφικτό. με συστηματική χορήγηση μιας πρωτεΐνης. Σε αντίθεση με τα περισσότερα θεραπευτικά βιολογικά, η παραγωγή του νηματώδους φάγου σε βακτήρια περιπλέκει τη χρήση του στον άνθρωπο με διάφορους τρόπους. Πρώτα και κύρια, τα ακατέργαστα παρασκευάσματα νηματοειδούς φάγου τυπικά περιέχουν πολύ υψηλά επίπεδα μολυσματικού LPS, στην περιοχή από ~10 2 - 10 4 μονάδες ενδοτοξίνης (EU)/mL (Boratynski et al., 2004; Branston et al., 2015), τα οποία έχουν τη δυνατότητα να προκαλέσουν σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες. Το LPS δεν αφαιρείται πλήρως με κατακρήμνιση πολυαιθυλενογλυκόλης ή φυγοκέντρηση βαθμιδωτής πυκνότητας χλωριούχου καισίου (Smith and Gingrich, 2005; Branston et al., 2015), αλλά τα επίπεδά του μπορούν να μειωθούν δραματικά χρησιμοποιώντας πρόσθετα στάδια καθαρισμού όπως η χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους (Boratynski et al., 2004; Zakharova et al., 2005), χρωματογραφία πολυμυξίνης Β (Grabowska et al., 2000) και επεξεργασία με απορρυπαντικά όπως Triton X-100 ή Triton X-114 (Roehnisch et al., 2014; Branston et al., 2015). Αυτές οι στρατηγικές επιτυγχάνουν τακτικά επίπεδα ενδοτοξίνης <1 EU/mL, όπως μετρήθηκαν με την ανάλυση limulus amebocyte lysate (LAL), πολύ κάτω από το όριο του FDA για παρεντερική χορήγηση 5 EU/kg σωματικού βάρους/δόση, αν και εξακολουθούν να υπάρχουν ανησυχίες σχετικά με την παρουσία υπολειμμάτων LPS που σχετίζεται με ιοσωμάτιο που μπορεί να μην είναι ανιχνεύσιμο. Μια δεύτερη και ίσως αναπόφευκτη συνέπεια της βακτηριακής παραγωγής του νηματοειδούς φάγου είναι η εγγενής ετερογένεια του μεγέθους των σωματιδίων και του φάσματος των σχετιζόμενων με το ιό και διαλυτών μολυσματικών ουσιών που προέρχονται από κύτταρα ξενιστή, που μπορεί να προκαλέσει ανησυχίες για την ασφάλεια και να περιορίσει τη χρήση του σε ομάδες υψηλού κινδύνου. Πολλοί τύποι βακτηριοφάγων και κατασκευασμένων παραλλαγών φάγων, συμπεριλαμβανομένων των νηματοειδών φάγων, έχουν προταθεί για προφυλακτική χρήση ex vivo στην ασφάλεια των τροφίμων, είτε στη γραμμή παραγωγής (ανασκόπηση στο Dalmasso et al., 2014) είτε για ανίχνευση τροφιμογενών παθογόνων μετά την παραγωγή (ανασκόπηση στο Schmelcher και Loessner, 2014). Νηματώδεις φάγοι που εμφανίζουν ετικέτα τετρακυστεΐνης στο pIII χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση κυττάρων Ε. coli μέσω χρώσης με διαρσενική χρωστική. Οι φάγοι Μ13 που ενεργοποιήθηκαν με μεταλλικό άργυρο ήταν εξαιρετικά βακτηριοκτόνοι κατά του Ε. coli και του Staphylococcus epidermidis. Βιοαισθητήρες που βασίζονται στον συντονισμό του επιφανειακού πλασμονίου (Nanduri et al., 2007), τους πιεζοηλεκτρικούς μετατροπείς (Olsen et al., 2006), τον γραμμικό διχρωμισμό (Pacheco-Gomez et al., 2012) και την τεχνολογία μαγνητοελαστικού αισθητήρα (Lakshman) ; Οι Huang et al., 2009) επινοήθηκαν χρησιμοποιώντας νηματοειδείς φάγους που εμφανίζουν scFv ή συζευγμένους με ολόκληρο IgG έναντι E. coli, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium και Bacillus anthracis με όρια ανίχνευσης της τάξης των 10 2 - 10 6 βακτηριακών κυττάρων/m . Η απόδειξη της ιδέας έχει αποδειχθεί για τη χρήση τέτοιων βιοαισθητήρων με βάση τους φάγους για την ανίχνευση βακτηριακής μόλυνσης ζωντανών προϊόντων (Li et al., 2010b) και αυγών (Chai et al., 2012). Το σωματίδιο νηματοειδούς φάγου περικλείεται από μια ράβδο όπως το πρωτεϊνικό καψίδιο, μήκους ~1000 nm και πλάτους 5 nm, που αποτελείται σχεδόν εξ ολοκλήρου από επικαλυπτόμενα μονομερή pVIII, καθένα από τα οποία βρίσκεται ~27 angstroms από τον πλησιέστερο γείτονά του και εκθέτει δύο ομάδες αμίνης καθώς και τουλάχιστον τρεις ομάδες καρβοξυλίου (Henry et al. ., 2011). Η κανονικότητα του πλέγματος του φάγου pVIII και η ποικιλομορφία των χημικά διευθυνσιοδοτούμενων ομάδων το καθιστούν ιδανικό ικρίωμα για βιοσύζευξη (Εικόνα 3) . Η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη προσέγγιση είναι η λειτουργικοποίηση ομάδων αμίνης με εστέρες NHS (van Houten et al., 2006 (van Houten et al., , 2010 Yacoby et al., 2006), αν και αυτό μπορεί να οδηγήσει σε ανεπιθύμητη ακυλίωση του pIII και τυχόν εμφανιζόμενων βιομόρια. Οι ομάδες καρβοξυλίου και τα υπολείμματα τυροσίνης μπορούν επίσης να λειτουργήσουν χρησιμοποιώντας σύζευξη καρβοδιιμιδίου και σύζευξη διαζωνίου, αντίστοιχα (Li et al., 2010a). Οι Carrico et al. (2012) ανέπτυξαν μεθόδους για την ειδική επισήμανση των Ν-άκρων του pVIII χωρίς τροποποίηση των εκτεθειμένων υπολειμμάτων λυσίνης μέσω μιας αντίδρασης σχηματισμού τρανσαμίνωσης-οξίμης δύο σταδίων. Η ειδική τροποποίηση των πρωτεϊνών του περιβλήματος του φάγου επιτυγχάνεται ακόμη πιο εύκολα χρησιμοποιώντας γενετικά τροποποιημένα πεπτίδια που εμφανίζουν φάγους (Ng et al., 2012) ή ένζυμα (Chen et al., 2007; Hess et al., 2012), αλλά αυτό μπορεί να είναι επαχθές και είναι λιγότερο γενικό στην εφαρμογή. Για περισσότερο από μια δεκαετία, το ενδιαφέρον για τον νηματώδη φάγο ως δομικό στοιχείο για νανοϋλικά αυξάνεται λόγω των μοναδικών φυσικοχημικών ιδιοτήτων του, με αναδυόμενες εφαρμογές στη μαγνητική, την οπτική και την ηλεκτρονική. Είναι από καιρό γνωστό ότι πάνω από ένα ορισμένο όριο συγκέντρωσης, ο φάγος μπορεί να σχηματίσει διατεταγμένα κρυσταλλικά εναιωρήματα (Welsh et al., 1996). Οι Lee et al. (2002) κατασκεύασε τον φάγο M13 για να εμφανίσει ένα πεπτίδιο που δεσμεύει ZnS στο pIII και έδειξε ότι, παρουσία νανοσωματιδίων ZnS, αυτοσυναρμολογούνται σε βιοϋλικά υψηλής τάξης φιλμ που μπορούν να ευθυγραμμιστούν χρησιμοποιώντας μαγνητικά πεδία. Εκμεταλλευόμενος την ικανότητα εμφάνισης ειδικών για το υπόστρωμα πεπτιδίων σε γνωστές θέσεις στο νήμα φάγου Hess et al., 2012), αυτό το πρωτοποριακό ΣΧΗΜΑ 3 | Χημικά διευθυνσιοδοτούμενες ομάδες του πλέγματος πρωτεϊνών της κύριας επένδυσης νηματώδους βακτηριοφάγου. Το βιριόν του νηματώδους φάγου αποτελείται από περίπου 2.500-4.000 επικαλυπτόμενα αντίγραφα της κύριας πρωτεΐνης περιβλήματος των 50 υπολειμμάτων, pVIII, που είναι διατεταγμένα σε πλέγμα τύπου έρπητα ζωστήρα. Κάθε μονομερές έχει μια σειρά από χημικά διευθυνσιοδοτούμενες ομάδες διαθέσιμες για βιοορθογώνια σύζευξη, συμπεριλαμβανομένων δύο ομάδων πρωτοταγών αμίνης (εμφανίζονται με κόκκινο), τριών καρβοξυλομάδων (εμφανίζονται με μπλε) και δύο ομάδων υδροξυλίου (εμφανίζονται με πράσινο). Τα 12 Ν-τερματικά υπολείμματα που εκτίθενται γενικά στο ανοσοποιητικό σύστημα για δέσμευση αντισωμάτων είναι με έντονη υπογράμμιση. Το σχήμα προσαρμοσμένο από δομικά δεδομένα του Marvin, 1990, ελεύθερα διαθέσιμο στις βάσεις δεδομένων PDB και SCOPe. Το έργο έγινε η βάση για την κατασκευή δισδιάστατων και τρισδιάστατων νανοϋλικών με πιο προηγμένες αρχιτεκτονικές, συμπεριλαμβανομένων των ημιαγώγιμων νανοσυρμάτων (Mao et al., 2003 (Mao et al. , , 2004 , νανοσωματίδια και νανοσύνθετα (Oh et al., 2012; Chen et al., 2014). Χρησιμοποιώντας τον υβριδικό φάγο M13 που εμφανίζει πεπτίδια Co 3 O 4 και δέσμευσης χρυσού στο pVIII ως ικρίωμα για τη συναρμολόγηση νανοσυρμάτων σε πολυστιβάδες πολυηλεκτρολύτη, οι Nam et al. (2006) παρήγαγε μια λεπτή, εύκαμπτη μπαταρία ιόντων λιθίου, η οποία μπορούσε να αποτυπωθεί σε συλλέκτες ρεύματος μικροζώνης πλατίνας (Nam et al., 2008). Οι ηλεκτροχημικές ιδιότητες τέτοιων μπαταριών βελτιώθηκαν περαιτέρω μέσω της εμφάνισης pIII πεπτιδίων που δεσμεύουν νανοσωλήνες άνθρακα μονού τοιχώματος (Lee et al., 2009), προσφέροντας μια προσέγγιση για βιώσιμη παραγωγή νανοδομημένων ηλεκτροδίων από κακώς αγώγιμα υλικά εκκίνησης. Τα νανοϋλικά με βάση τους φάγους έχουν βρει εφαρμογές στην απεικόνιση του καρκίνου (Ghosh et al., 2012b; Yi et al., 2012), photocatalytic water splitting (Nam et al., 2010a; Neltner et al., 2010), ελαφριά συγκομιδή (Nam et al., 2010b; Chen et al., 2013), τεχνολογίες φωτοαπόκρισης (Murugesan et al., 2013), νευρικά ηλεκτρόδια (Kim et al., 2014) και παραγωγή πιεζοηλεκτρικής ενέργειας (Murugesan et al., 2013). Έτσι, οι μοναδικές φυσικοχημικές ιδιότητες Οι φάγοι, σε συνδυασμό με τη σπονδυλωτή εμφάνιση πεπτιδίων και πρωτεϊνών με γνωστή ειδικότητα δέσμευσης, έχουν δημιουργήσει εντελώς νέα υλικά με ποικίλες εφαρμογές. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι ασυνήθιστες βιοφυσικές ιδιότητες του νηματοειδούς φάγου μπορούν επίσης να αξιοποιηθούν στη μελέτη δομών άλλων μακρομορίων. Η μαγνητική ευθυγράμμιση νηματοειδούς φάγου υψηλής συγκέντρωσης σε διάλυμα μπορεί εν μέρει να παραγγείλει DNA, RNA, πρωτεΐνες και άλλα βιομόρια για τη μέτρηση των αλληλεπιδράσεων διπολικής σύζευξης (Hansen et al., 1998 (Hansen et al., 2000 Dahlke Ojennus et al., 1. ) στη φασματοσκοπία NMR. Λόγω του μεγάλου πληθυσμού τους, των σύντομων χρόνων παραγωγής, των μικρών μεγεθών του γονιδιώματος και της ευκολίας χειρισμού, διάφοροι νηματοειδείς και μη νηματοειδείς βακτηριοφάγοι έχουν χρησιμοποιηθεί ως μοντέλα πειραματικής εξέλιξης (ανασκόπηση στο Husimi, 1989; Wichman and Brown, 2010; Kawecki et al., 2012; Hall et al., 2013). Ο νηματώδης φάγος έχει πρόσθετες πρακτικές χρήσεις στη μηχανική πρωτεϊνών και στην κατευθυνόμενη εξέλιξη πρωτεΐνης, λόγω της μοναδικής του ανοχής σε γενετικές τροποποιήσεις που επιτρέπουν στα βιομόρια να εμφανίζονται στην επιφάνεια του ιού. Πρώτη και κύρια μεταξύ αυτών των εφαρμογών είναι η in vitro ωρίμανση συγγένειας θραυσμάτων αντισωμάτων που εμφανίζονται στο pIII. Βιβλιοθήκες παραλλαγών Fabs και αντισωμάτων μονής αλυσίδας μπορούν να δημιουργηθούν μέσω τυχαίας ή κατευθυνόμενης σε τοποθεσία μεταλλαξογένεσης και να επιλεγούν με βάση βελτιωμένη ή τροποποιημένη δέσμευση, μιμούμενοι κατά προσέγγιση τη στρατηγική σωματικής εξέλιξης του ανοσοποιητικού συστήματος (Marks et al., 1992; Bradbury et al., 2011). Ωστόσο, άλλα συστήματα απεικόνισης in vitro, όπως η εμφάνιση ζυμομύκητα, έχουν σημαντικά πλεονεκτήματα έναντι του νηματώδους φάγου για την ωρίμανση της συγγένειας (αν και κάθε τεχνολογία απεικόνισης έχει συμπληρωματικές αντοχές. Koide και Koide, 2012) και ανεξάρτητα από τη μέθοδο εμφάνισης, η επιλογή \"βελτιωμένων\" παραλλαγών μπορεί να είναι αργή και δυσκίνητη. Έχουν αναπτυχθεί επαναληπτικές μέθοδοι για να συνδυάσουν υπολογιστικά σχεδιασμένες μεταλλάξεις (Lippow et al., 2007) και να παρακάμψουν τη διαλογή συνδυαστικών βιβλιοθηκών, αλλά αυτές είχαν περιορισμένη επιτυχία μέχρι σήμερα. Πρόσφατα, οι Esvelt et al. (2011) ανέπτυξε μια νέα στρατηγική για την κατευθυνόμενη εξέλιξη των πρωτεϊνών που εμφανίζονται σε νηματοειδείς φάγους, που ονομάζεται συνεχής εξέλιξη με τη βοήθεια φάγου (PACE), η οποία επιτρέπει πολλαπλούς γύρους εξέλιξης ανά ημέρα με μικρή πειραματική παρέμβαση. Οι συγγραφείς κατασκεύασαν τον φάγο Μ13 για να κωδικοποιήσει μια εξωγενή πρωτεΐνη (το θέμα για κατευθυνόμενη εξέλιξη), της οποίας η λειτουργική δραστηριότητα πυροδοτεί την έκφραση του γονιδίου III από ένα βοηθητικό πλασμίδιο. παραλλαγές της εξωγενούς πρωτεΐνης προκύπτουν από τυχαία μεταλλαξογένεση κατά τη διάρκεια της αντιγραφής φάγου, ο ρυθμός της οποίας μπορεί να αυξηθεί με επαγώγιμη έκφραση των επιρρεπών σε σφάλματα DNA πολυμερασών. Με την παροχή περιοριστικών ποσοτήτων δεκτικών κυττάρων Ε. coli στις παραλλαγές φάγου που έχουν κατασκευαστεί, οι Esvelt et al. (2011) συνδέουν κομψά τη μολυσματικότητα του φάγου και την παραγωγή απογόνων με την παρουσία ενός επιθυμητού φαινοτύπου πρωτεΐνης. Οι Carlson et al. (2014) αργότερα έδειξε ότι η αυστηρότητα της επιλογής PACE θα μπορούσε να ρυθμιστεί παρέχοντας μικρές ποσότητες pIII ανεξάρτητα από τον πρωτεϊνικό φαινότυπο και οι ανεπιθύμητες πρωτεϊνικές λειτουργίες επιλέγονται αρνητικά συνδέοντάς τις με την έκφραση μιας κολοβωμένης παραλλαγής pIII που βλάπτει τη μολυσματικότητα με κυρίαρχο αρνητικό τρόπο. Το PACE περιορίζεται επί του παρόντος σε πρωτεϊνικές λειτουργίες που μπορούν να συνδεθούν με κάποιο τρόπο με την έκφραση ενός ανταποκριτή γονιδίου III, όπως η αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, ο ανασυνδυασμός, η δέσμευση DNA ή RNA και η ενζυματική κατάλυση (Meyer and Ellington, 2011). Αυτή η προσέγγιση αντιπροσωπεύει μια πολλά υποσχόμενη οδό τόσο για τη βασική έρευνα στη μοριακή εξέλιξη (Dickinson et al., 2013) όσο και για τη συνθετική βιολογία, συμπεριλαμβανομένης της μηχανικής αντισωμάτων. παράκτιο γλυκό νερό (Xue et al., 2012), αλπικές λίμνες (Hofer and Sommaruga, 2001) και βακτήρια βαθέων υδάτων (Jian et al., 2012), αλλά όχι, ίσως παραδόξως, το ανθρώπινο έντερο (Kim et al., 2011 ) . Το περιβαλλοντικό «φάγο» στο έδαφος και το νερό αντιπροσωπεύει τη μεγαλύτερη πηγή αντιγραφής DNA στον πλανήτη και εκτιμάται ότι περιέχει πάνω από 1030 ιικά σωματίδια (Ashelford et al., 2003; Chibani-Chennoufi et al., 2004; Suttle, 2005). Οι λίγες μελέτες που προσπάθησαν να διερευνήσουν την περιβαλλοντική οικολογία των νηματωδών φάγων χρησιμοποιώντας κλασσικές τεχνικές περιβαλλοντικής μικροβιολογίας (συνήθως άμεση παρατήρηση με ηλεκτρονική μικροσκοπία) διαπίστωσαν ότι ο νηματώδης φάγος αποτελεί από 0 έως 100% όλων των ιικών σωματιδίων (Demuth et al., 1993; Pina et al., 1998; Hofer και Sommaruga, 2001). Υπήρξαν κάποιες ενδείξεις εποχιακής διακύμανσης των πληθυσμών νηματωδών φάγων σε συνδυασμό με τη σχετική αφθονία ελεύθερων ετερότροφων βακτηρίων (Hofer and Sommaruga, 2001). Οι προσπάθειες περιβαλλοντικής μεταγονιδιωματικής μόλις αρχίζουν να αποκαλύπτουν τη σύνθεση των ιικών οικοσυστημάτων. Τα υπάρχοντα δεδομένα υποδηλώνουν ότι οι νηματοειδείς φάγοι αποτελούν δευτερεύοντα συστατικά ιικών κοινοτήτων στο γλυκό νερό (Roux et al., 2012) και στο ανακυκλωμένο και πόσιμο νερό (Rosario et al., 2009), αλλά έχουν πολύ υψηλότερες συχνότητες σε λύματα και λύματα (Cantalupoet. , 2011; Alhamlan et al., 2013), με την προειδοποίηση ότι οι προκαταλήψεις που είναι εγγενείς στις μεθοδολογίες για την εξακρίβωση αυτών των δεδομένων (καθαρισμός ιικών σωματιδίων, προκαταλήψεις αλληλουχίας) δεν έχουν επικυρωθεί καλά. Δεν υπάρχουν δεδομένα που να περιγράφουν τη δυναμική του πληθυσμού των νηματωδών φάγων και των ειδών ξενιστών τους στο φυσικό περιβάλλον. Σε επίπεδο μεμονωμένου ιού-βακτηρίου, είναι σαφές ότι ο νηματώδης φάγος μπορεί να ρυθμίσει τον φαινότυπο του ξενιστή, συμπεριλαμβανομένης της λοιμογόνου δράσης σημαντικών παθογόνων για τον άνθρωπο και τις καλλιέργειες. Αυτό μπορεί να συμβεί είτε μέσω άμεσων επιδράσεων της αντιγραφής φάγου στην κυτταρική ανάπτυξη και φυσιολογία, είτε, πιο τυπικά, με οριζόντια μεταφορά γενετικού υλικού που περιέχεται στα επισώματα και/ή χρωμοσωμικά ενσωματωμένο προφάγο. Ο εύκρατος νηματώδης φάγος μπορεί επίσης να παίζει ρόλο στην εξέλιξη του γονιδιώματος (ανασκόπηση στο Canchaya et al., 2003). Ίσως το καλύτερα μελετημένο παράδειγμα διαμόρφωσης μολυσματικότητας από νηματώδη φάγο είναι αυτό του Vibrio cholerae, του οποίου η πλήρης λοιμογόνος δράση απαιτεί λυσογονική μετατροπή από τον φάγο CTXφ που κωδικοποιεί την τοξίνη χολέρας (Waldor and Mekalanos, 1996). Η ενσωμάτωση του φάγου CTXφ συμβαίνει σε συγκεκριμένες θέσεις στο γονιδίωμα. αυτές οι αλληλουχίες εισάγονται μέσω της συνδυασμένης δράσης ενός άλλου νηματώδους φάγου, του fs2φ, και ενός νηματοειδούς φάγου δορυφόρου, TLC-Knφ1 (Hassan et al., 2010). Έτσι, τα είδη νηματοειδών φάγων αλληλεπιδρούν και συνεξελίσσονται μεταξύ τους εκτός από τους ξενιστές τους. Η μόλυνση από νηματώδη φάγο έχει εμπλακεί στη λοιμογόνο δράση του Yersinia pestis (Derbise et al., 2007), Neisseria meningitidis (Bille et al., 2005 (Bille et al., , 2008, Vibrio parahaemolyticus 1,00) , E. coli 018:K1:H7 (Gonzalez et al., 2002), Xanthomonas campestris (Kamiunten and Wakimoto, 1982) και P. aeruginosa (Webb et al., 2004), αν και στις περισσότερες από αυτές τις περιπτώσεις, η συγκεκριμένη οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν τη λοιμογόνο δύναμη είναι ασαφείς. Η μόλυνση από φάγο μπορεί να ενισχύσει ή να καταστείλει τη λοιμογόνο δύναμη ανάλογα με τα χαρακτηριστικά του φάγου, του βακτηρίου ξενιστή και του περιβαλλοντικού περιβάλλοντος, όπως συμβαίνει με το βακτηριακό παθογόνο μαρασμού Ralstonia solanacearum (Yamada, 2013). Δεδομένου ότι η μόλυνση έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της ρύθμισης της πίσσας που χρησιμοποιείται για την είσοδο του ιού, η θεραπεία με νηματοειδείς φάγους έχει προταθεί ως υποθετικό μέσο αναστολής της βακτηριακής σύζευξης και της οριζόντιας μεταφοράς γονιδίων, έτσι ώστε να αποτραπεί η εξάπλωση των γονιδίων αντοχής στα αντιβιοτικά (Lin et al., 2011). Τέλος, ο νηματώδης φάγος μπορεί επίσης να παίξει μελλοντικό ρόλο στη διατήρηση της βιοποικιλότητας άλλων οργανισμών σε οικοσυστήματα που βρίσκονται σε κίνδυνο. Οι κατασκευασμένοι φάγοι έχουν προταθεί για χρήση στη βιοαποκατάσταση, είτε εμφανίζοντας θραύσματα αντισωμάτων επιθυμητής ειδικότητας για διήθηση τοξινών και περιβαλλοντικών ρύπων (Petrenko and Makowski, 1993) είτε ως βιοαποικοδομήσιμα πολυμερή που εμφανίζουν πεπτίδια επιλεγμένα για την ικανότητά τους να συσσωματώνουν ρύπους, όπως πετρελαϊκές άμμους απορριμμάτων (Curtis et al., 2011 (Curtis et al., 2013. Μηχανικά πεπτίδια που εμφανίζουν φάγους που δεσμεύουν ειδικά ανόργανα υλικά έχουν επίσης προταθεί για χρήση σε πιο προηγμένες και λιγότερο παρεμβατικές τεχνολογίες διαχωρισμού ορυκτών (Curtis et al., 2009). επιλογή συνάφειας αντισωμάτων και πολυπεπτιδίων επιθυμητής ειδικότητας. Η υψηλή ανοσογονικότητά του και η ικανότητά του να εμφανίζει μια ποικιλία επιφανειακών αντιγόνων καθιστούν τον φάγο έναν εξαιρετικό φορέα εμβολίου σωματιδίων, αν και η ετερογένεια βακτηριακής παραγωγής και παρασκευής του πιθανότατα περιορίζει τις εφαρμογές του σε ανθρώπινα εμβόλια επί του παρόντος, παρά το γεγονός ότι είναι φαινομενικά ασφαλής και καλά ανεκτός σε ζώα και ανθρώπους . Απροσδόκητα χαρακτηριστικά του σωματιδίου φάγου, όπως η διέλευση του αιματοεγκεφαλικού φραγμού και ο σχηματισμός υγρών κρυσταλλικών φάσεων υψηλής τάξης, έχουν ανοίξει εντελώς νέους δρόμους έρευνας στη θεραπευτική για χρόνιες ασθένειες και στο σχεδιασμό νανοϋλικών. Η συγκριτικά λεπτομερής κατανόησή μας για τις αλληλεπιδράσεις του μοντέλου νηματοειδούς φάγου με τους βακτηριακούς ξενιστές τους επέτρεψε στους ερευνητές να αξιοποιήσουν τον κύκλο ζωής του φάγου για να κατευθύνουν την εξέλιξη της πρωτεΐνης στο εργαστήριο. Ας ελπίσουμε ότι η βαθύτερη γνώση των αλληλεπιδράσεων φάγου-ξενιστή σε οικολογικό επίπεδο μπορεί να παράγει νέες στρατηγικές για τον έλεγχο της βακτηριακής παθογένεσης. Ενώ οι νέες εφαρμογές του νηματοειδούς φάγου συνεχίζουν να αναπτύσσονται, ο φάγος είναι πιθανό να διατηρήσει τη θέση του ως ίππος εργασίας για την ανακάλυψη θεραπευτικών αντισωμάτων για πολλά ακόμη χρόνια, ακόμη και με την έλευση ανταγωνιστικών τεχνολογιών. Οι KH και JS συνέλαβαν και έγραψαν το χειρόγραφο. Ο MA-G διάβασε το χειρόγραφο και σχολίασε το κείμενο.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 571, "text": "εγγενείς βιολογικές, βιοχημικές και βιοφυσικές ιδιότητες του νηματοειδούς βακτηριοφάγου, καθώς και η ευκολία του γενετικού χειρισμού του" } ], "id": 1722, "question": "Τι κάνει την τεχνολογία απεικόνισης φάγων χρήσιμη για άλλες εφαρμογές;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1392, "text": "επιτρέπει μια ποικιλία εφαρμογών βιοσύζευξης και χημείας επιφανειών, ιδιαίτερα σε νανοϋλικά" } ], "id": 1725, "question": "Σε τι είναι χρήσιμο η κανονικότητα του πλέγματος πρωτεϊνών της κύριας στρώσης του virion;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1494, "text": "τα μεγάλα μεγέθη πληθυσμού του φάγου και οι γρήγοροι χρόνοι παραγωγής" } ], "id": 1726, "question": "Γιατί ο φάγος ab είναι εξαιρετικό σύστημα μοντέλου για κατευθυνόμενη εξέλιξη πρωτεΐνης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3820, "text": "την ικανότητα απρόσκοπτης σύνδεσης γενετικών πληροφοριών με πρωτεϊνική λειτουργία για μεγάλο αριθμό παραλλαγών πρωτεΐνης ταυτόχρονα, και έχει αξιοποιηθεί ευρέως και παραγωγικά σε μελέτες αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών" } ], "id": 1730, "question": "Τι έχει ενεργοποιήσει η τεχνολογία βακτηριοφάγων και η βιβλιοθήκη παραλλαγών διπλωμένης πρωτεΐνης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4874, "text": "(i) νηματώδης φάγος ως φορέας εμβολίου. (ii) κατασκευασμένος νηματοειδής φάγος ως θεραπευτικός βιολογικός παράγοντας σε μολυσματικές και χρόνιες ασθένειες· (iii) νηματώδης φάγος ως ικρίωμα για βιοσύζευξη και χημεία επιφανειών. και (iv) νηματοειδής φάγος ως μηχανή για εξελισσόμενες παραλλαγές εμφανιζόμενων πρωτεϊνών με νέες λειτουργίε" } ], "id": 1731, "question": "Ποιες είναι οι πιθανές νέες εφαρμογές του νηματοειδούς φάγου;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5429, "text": "μοναδικές βιολογικές, ανοσολογικές και φυσικοχημικές ιδιότητες του φάγου, την ικανότητά του να εμφανίζει μια ποικιλία βιομορίων με αρθρωτό τρόπο και τη σχετική απλότητα και ευκολία χειρισμού του" } ], "id": 1732, "question": "Ποια θέματα είναι κοινά στις εφαρμογές των νηματωδών φάγων;" }, { "answers": [ { "answer_start": 24435, "text": "οι τίτλοι αντισωμάτων ορού κατά του φάγου φτάνουν τυπικά το 1:10 5 -1:10 6 μετά από 2-3 ανοσοποιήσεις και διατηρούνται για τουλάχιστον 1 χρόνο μετά την ανοσοποίηση (Frenkel et al., 2000)" } ], "id": 1750, "question": "Ποια είναι τα αποτελέσματα των ανοσοποιήσεων νηματοειδών φάγων σε ποντίκια;" }, { "answers": [ { "answer_start": 27697, "text": "Το LPS που προέρχεται από το τοίχωμα του κυττάρου ξενιστή ενισχύει την ανοσογονικότητα του ιού και η απομάκρυνσή του με χρωματογραφία πολυμυξίνης Β μειώνει τους τίτλους αντισωμάτων έναντι των πρωτεϊνών του περιβλήματος του φάγου (Grabowska et al., 2000). Το μονόκλωνο γονιδίωμα DNA του φάγου περιέχει μοτίβα CpG και μπορεί επίσης να έχει επικουρική δράση" } ], "id": 1752, "question": "Γιατί ο φάγος είναι αυτοενισχυτικός;" }, { "answers": [ { "answer_start": 31049, "text": "ως στοιχεία συνδυαστικής θεραπείας έναντι ορισμένων ανθεκτικών στα φάρμακα λοιμώξεων." } ], "id": 1756, "question": "Ποιο είναι το μελλοντικό δυναμικό του νηματοειδούς φάγου;" }, { "answers": [ { "answer_start": 32746, "text": "Χρησιμοποιώντας το μοντέλο όγκου B16-OVA, οι Eriksson et al. (2007) έδειξε ότι οι φάγοι που εμφανίζουν πεπτίδια και/ή Fabs ειδικά για αντιγόνα όγκου καθυστέρησαν την ανάπτυξη του όγκου και βελτίωσαν την επιβίωση, λόγω σε μεγάλο βαθμό της ενεργοποίησης των μακροφάγων που σχετίζονται με τον όγκο και της στρατολόγησης ουδετερόφιλων στην περιοχή του όγκου (Eriksson et al., 2009)" } ], "id": 1759, "question": "Ποια ήταν η επίδραση του φάγου που εμφανίζει πεπτίδια στον όγκο;" }, { "answers": [ { "answer_start": 37554, "text": "Η κανονικότητα του πλέγματος του φάγου pVIII και η ποικιλομορφία των χημικά διευθυνσιοδοτούμενων ομάδων" } ], "id": 1762, "question": "Τι κάνει τον νηματώδη φάγο ιδανικό ικρίωμα για βιοσύζευξη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 39067, "text": "Οι Lee et al. (2002) κατασκεύασε τον φάγο M13 για να εμφανίσει ένα πεπτίδιο που δεσμεύει ZnS στο pIII και έδειξε ότι, παρουσία νανοσωματιδίων ZnS, αυτοσυναρμολογούνται σε βιοϋλικά υψηλής τάξης φιλμ που μπορούν να ευθυγραμμιστούν χρησιμοποιώντας μαγνητικά πεδία." } ], "id": 1763, "question": "Ποιες δοκιμές έχουν γίνει για να καταδειχθεί η δυνατότητα των φάγων σε εφαρμογές για νανοϋλικά;" }, { "answers": [ { "answer_start": 39329, "text": "Εκμεταλλευόμενος την ικανότητα εμφάνισης ειδικών για το υπόστρωμα πεπτιδίων σε γνωστές θέσεις στο νήμα φάγου Hess et al., 2012), αυτό το πρωτοποριακό ΣΧΗΜΑ 3 | Χημικά διευθυνσιοδοτούμενες ομάδες του πλέγματος πρωτεϊνών της κύριας επένδυσης νηματώδους βακτηριοφάγου" } ], "id": 1764, "question": "Ποιες δοκιμές έχουν γίνει για να καταδειχθεί η δυνατότητα των φάγων σε εφαρμογές για νανοϋλικά;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Η αλληλουχία νανοπόρων ως επαναστατικό διαγνωστικό εργαλείο για σύμπλοκα ιογενών εντερικών ασθενειών χοίρων προσδιορίζει τον ιό kobuvirus των χοίρων ως σημαντικό εντερικό ιό https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6026206/SHA: eff8bed68ef6109e4bed68ef6109e8a8f0; Vanmechelen, Bert; Bernaert, Quinten; Deboutte, Ward; Vandenhole, Μαριλού; Beller, Leen; Matthijnssens, Jelle; Maes, Piet; Nauwynck, Hans J.Date: 2018-06-29DOI: 10.1038/s41598-018-28180-9Άδεια: cc-byAbstract: Οι εντερικές ασθένειες στους χοίρους προκαλούνται συχνά από διαφορετικά παθογόνα και επομένως η μεταγονιδιωματική είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για τη διαγνωστική. Οι ικανότητες της αλληλουχίας νανοπόρων για ιικές διαγνώσεις διερευνήθηκαν εδώ. Πρώτον, ο ιός της επιδημικής διάρροιας χοίρων που έχει αναπτυχθεί σε κυτταροκαλλιέργεια και ο ροταϊός Α συγκεντρώθηκαν και αναλύθηκαν η αλληλουχία τους σε ένα MinION. Οι αναγνώσεις ανιχνεύθηκαν ήδη 7 δευτερόλεπτα μετά την έναρξη της αλληλουχίας, με αποτέλεσμα υψηλά βάθη αλληλουχίας (19,2 έως 103,5Χ) μετά από 3 ώρες. Στη συνέχεια, αναλύθηκαν τα διαρροϊκά κόπρανα ενός χοιριδίου μιας εβδομάδας. Σχεδόν όλες οι αναγνώσεις (99%) ανήκαν σε βακτηριοφάγους, οι οποίοι μπορεί να αναμόρφωσαν το μικροβίωμα του χοιριδίου. Τα Contigs ταίριαξαν με φάγους Bacteroides, Escherichia και Enterococcus. Επιπλέον, ο κοβουϊός των χοίρων ανακαλύφθηκε στα κόπρανα για πρώτη φορά στο Βέλγιο. Τα θηλάζοντα χοιρίδια αποβάλλουν τον κοβουϊό από την ηλικία της μίας εβδομάδας, αλλά δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ της κορύφωσης της αποβολής του ιού (10(6,42)–10(7,01) αντίγραφα/μπατονέτα) και των διαρροϊκών σημείων κατά τη διάρκεια μιας μελέτης παρακολούθησης. Η αναδρομική ανάλυση έδειξε την ευρεία εξάπλωση (n = 25, 56,8% θετικά) γενετικά μέτρια συγγενή κοβουϊών μεταξύ των βελγικών διαρροϊκών χοιριδίων. Το MinION επιτρέπει την ταχεία ανίχνευση εντερικών ιών. Τέτοιες νέες μεθοδολογίες θα αλλάξουν τα διαγνωστικά, αλλά θα πρέπει να διεξαχθούν πιο εκτενείς επικυρώσεις. Η πραγματική εντερική παθογένεια του κοβουϊού των χοίρων θα πρέπει να αμφισβητηθεί, ενώ η υποκλινική σημασία του δεν μπορεί να αποκλειστεί. Κείμενο: η μεταγονιδιωματική είναι ένα πολύτιμο πλεονέκτημα για τη διάγνωση σε χοίρους, που οδηγεί στην ανακάλυψη νέων ιών και στην ταυτοποίηση συμπλεγμάτων ιογενούς εντερικής νόσου των χοίρων. Αν και έχουν αναπτυχθεί τυποποιημένες διαδικασίες για τη μελέτη ιικών μεταγονιδιωμάτων σε δείγματα κοπράνων, εξακολουθούν να απαιτούν εκτεταμένη προετοιμασία δειγμάτων, συμπεριλαμβανομένης της τυχαίας ή στοχευμένης προενίσχυσης των ιικών γονιδιωμάτων που υπάρχουν στο δείγμα 13 . Οι περισσότερες πλατφόρμες αλληλουχίας εξακολουθούν να απαιτούν επενδύσεις κεφαλαίου και υψηλά ποσοστά κύκλου εργασιών δειγμάτων για να είναι οικονομικά αποδοτικές. Η εκτέλεση των απαραίτητων αναλύσεων οδηγεί συχνά σε μεγάλες χρονικές περιόδους μεταξύ της άφιξης του δείγματος και της διαγνωστικής αναφοράς, καθώς τα αποτελέσματα μπορούν να υποβληθούν σε επεξεργασία μόνο μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας αλληλουχίας. Η αλληλουχία τρίτης γενιάς με χρήση MinION (Oxford Nanopore Technologies, ONT) μπορεί να είναι ένα χρήσιμο και προσιτό διαγνωστικό εργαλείο για την κτηνιατρική των χοίρων, καθώς επιτρέπει την ταχεία προετοιμασία δειγμάτων και την ανάλυση αλληλουχίας σε πραγματικό χρόνο. Τα κύτταρα ροής που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας αποτελούνται από μια μεμβράνη που περιέχει πολλαπλές πρωτεΐνες νανοπόρου CsgG από Escherichia coli 14 . Ένα ρεύμα ιόντων δημιουργείται μέσω αυτού του πόρου με αποτέλεσμα τυπικές αλλαγές ρεύματος κατά τη διέλευση συγκεκριμένων νουκλεοτιδίων. Αυτό το σήμα μετατρέπεται σε νουκλεοτιδική ακολουθία με υπολογιστικούς αλγόριθμους (βασική κλήση). Από την κυκλοφορία της τεχνολογίας MinION, έχουν γίνει σημαντικές πρόοδοι όσον αφορά τον αριθμό και την ποιότητα των αναγνώσεων που παράγονται 15 . Στον τομέα της ιολογίας, η τεχνολογία έχει εφαρμοστεί κυρίως στην ιατρική. Χρησιμοποιώντας την αλληλουχία νανοπόρου, ήταν δυνατό να διακριθούν τρεις ιοί ευλογιάς με 98% ομοιότητα νουκλεοτιδίων σε επίπεδο στελέχους 16 . Το MinION έχει επίσης χρησιμοποιηθεί ως διαγνωστικό εργαλείο κατά τη διάρκεια πρόσφατων κρουσμάτων του ιού Έμπολα στη Δυτική Αφρική, επιτρέποντας τον γρήγορο επιτόπιο χαρακτηρισμό των κυκλοφορούντων στελεχών 17, 18 . Σε συνδυασμό με μια ροή εργασιών βιοπληροφορικής που βασίζεται σε φορητό υπολογιστή, το MinION κατάφερε να ανιχνεύσει τον ιό Chikungunya, τον ιό Έμπολα και τον ιό της ηπατίτιδας C σε λιγότερο από 6 ώρες χρησιμοποιώντας προηγούμενες εκδόσεις της τεχνολογίας 19 . Μια μέθοδος multiplex PCR για πλήρη επιτόπια αλληλούχιση του γονιδιώματος του ιού Zika σε δείγματα με χαμηλό ιικό φορτίο αναπτύχθηκε πρόσφατα από την Quick και τους συνεργάτες 20 . Μερικά γονιδιώματα του ιού του δάγκειου πυρετού ενισχύθηκαν ισοθερμικά και ακολούθησε αλληλούχιση, επιτρέποντας την ταξινόμηση των στελεχών στους ορότυπους 21 . Στην κτηνιατρική ιολογία, η χρήση της αλληλουχίας νανοπόρου αυξάνεται. Ένα νέο είδος ιού θηλώματος εντοπίστηκε σε κονδυλώματα από καμηλοπαρδάλεις, χρησιμοποιώντας ενίσχυση κυλιόμενου κύκλου και αλληλουχία νανοπόρου 22 . Ολόκληρο το γονιδίωμα ενός ιού parapox που απομονώθηκε από μια φώκια ελήφθη συνδυάζοντας δεδομένα από την αλληλουχία επόμενης γενιάς της Illumina με δεδομένα αλληλουχίας νανοπόρου 23 . Μια μελέτη ανέφερε την ανίχνευση του ιού της εγκεφαλίτιδας των ίππων της Βενεζουέλας από μη ενισχυμένο cDNA που δημιουργήθηκε από RNA με ουρά πολυ-Α χρησιμοποιώντας ιούς που έχουν αναπτυχθεί σε κυτταροκαλλιέργεια 24 . Εξ όσων γνωρίζει ο συγγραφέας, η παρούσα μελέτη είναι η πρώτη που χρησιμοποιεί το MinION ως βοήθημα στη διαχείριση της υγείας των χοίρων. Αυτή η μελέτη είχε στόχο να διερευνήσει τις δυνατότητες του MinION ως ενός γρήγορου και εύχρηστου διαγνωστικού εργαλείου στη διαχείριση της υγείας των χοίρων για τη διάγνωση συμπλεγμάτων ιογενούς εντερικής νόσου. Αξιολογήθηκε η ικανότητα ανίχνευσης υψηλών φορτίων ροταϊού και κοροναϊού που αναπτύσσονται σε κυτταρική καλλιέργεια, μιμούμενοι τις ποσότητες αποβολής που παρατηρήθηκαν σε διαρροϊκά χοιρίδια. Σε μια δεύτερη περίπτωση, διερευνήθηκε η ικανότητα ανίχνευσης (νέων) ιών σε διαρροϊκά κόπρανα ενός χοιριδίου μιας εβδομάδας με διάρροια. Δεν πραγματοποιήθηκε καμία ειδική για γονίδιο ή τυχαία προενίσχυση ιικών νουκλεϊκών οξέων για να αμφισβητηθεί η ευαισθησία του MinION. Στην τελευταία περίπτωση ανακαλύφθηκε ένας κοβουϊός χοίρου και στη συνέχεια διεξήχθη μια διαχρονική μελέτη πεδίου για να διαλευκανθούν τα μοτίβα αποβολής αυτού του ιού. Επιπλέον, αρχειακά (2014) δείγματα κοπράνων από διαρροϊκά θηλάζοντα χοιρίδια ηλικίας μικρότερης των δύο εβδομάδων διερευνήθηκαν για την παρουσία κοβουϊών, για να μελετηθεί η επιδημιολογία τους στο Βέλγιο.be για 243.313 αναγνώσεις με μέσο μήκος 740 νουκλεοτίδια. Οι αναγνώσεις με q-score χαμηλότερο από 7 φιλτραρίστηκαν, με αποτέλεσμα 179.015 υπόλοιπες ακολουθίες (μέσο μήκος 816 nt) για χρήση σε αναλύσεις κατάντη. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης αλληλουχίας, συμπεριλαμβανομένης της ταξινομικής ταξινόμησης και της χαρτογράφησης των αναγνώσεων έναντι των γονιδιωμάτων αναφοράς PEDV και ροταϊού Α (RVA) φαίνονται στο Σχήμα. 1Α. Μετά από 24 ώρες αλληλουχίας, συνολικά 15.232 αναγνώσεις ταξινομήθηκαν ως ιογενείς με ευαίσθητη σύγκριση tBLASTx έναντι μιας πλήρους βάσης δεδομένων ιών. Από αυτούς, το 39,3% (n = 5.985) και το 10.3% (n = 1.564) κατατάχθηκαν σε οικογένειες ιών που περιλαμβάνουν τον ιό της επιδημικής διάρροιας των χοίρων (οικογένεια Coronaviridae) και τον ροταϊό (οικογένεια Reoviridae, υποοικογένεια Sedoreovirina), αντίστοιχα. Ένα κλάσμα των αναγνώσεων (29,3%, n = 4.468) εκχωρήθηκε για την παραγγελία Caudovirales. Αυτές οι αναγνώσεις προήλθαν από το DNA φάγου λάμδα που χρησιμοποιήθηκε σε προηγούμενη εκτέλεση ελέγχου στο ίδιο κύτταρο ροής. Στα 7,5 και 24,2 δευτερόλεπτα μετά την έναρξη της αλληλουχίας, αντίστοιχα, οι πρώτες μετρήσεις που ταιριάζουν με το PEDV και το RVA μεταφέρθηκαν μέσω ενός νανοπόρου. Οι περισσότερες αναγνώσεις δημιουργήθηκαν τις πρώτες δώδεκα ώρες της αλληλουχίας και η συσσώρευση ανάγνωσης ήταν πιο εκθετική στις πρώτες τρεις ώρες της αλληλουχίας (Εικ. 1Β). Οι αλληλουχίες PEDV και RVA εξήχθησαν από το σύνολο δεδομένων και χαρτογραφήθηκαν με γονίδια αναφοράς ιού για να υπολογιστούν τα βάθη αλληλουχίας με την πάροδο του χρόνου (Εικ. 1C). Μετά από μία ώρα, τα βάθη προσδιορισμού αλληλουχίας ήταν μεγαλύτερα για το PEDV (43,0Χ) από ότι για το RVA (4,9 έως 22,1Χ). Υψηλά βάθη αλληλούχισης αποκτήθηκαν μετά από τρεις ώρες αλληλούχισης για το PEDV (103,5X) και για τα περισσότερα τμήματα γονιδίου RVA (19,2 έως 48,2Χ). Η συναρμολόγηση De novo εκτελέστηκε στις ποιοτικά φιλτραρισμένες αναγνώσεις πριν από την ταυτοποίηση (tBLASTx) για την ανάκτηση ιικών γονιδιωμάτων . Αυτό είχε ως αποτέλεσμα την ανάκτηση του σχεδόν πλήρους γονιδιώματος PEDV και τμημάτων γονιδίου RVA με ταυτότητες που κυμαίνονται μεταξύ 95 και 99% σε σύγκριση με τα γονίδια αναφοράς (Πίνακας 1). Μεγαλύτερες ακρίβειες συναρμολόγησης (97 έως 99%) λήφθηκαν όταν συμπεριλήφθηκαν μόνο οι ενδείξεις που ταιριάζουν έναντι του ροταϊού και του PEDV για την de novo συναρμολόγηση (Πίνακας 1). Ωστόσο, η εκτέλεση της de novo συναρμολόγησης πριν από την ταξινομική ταξινόμηση (tBLASTx) μείωσε το χρόνο ταυτοποίησης ολόκληρων ιικών γονιδιωμάτων στο σύνολο δεδομένων. Σύνθεση ιού ενός νεαρού διαρροϊκού χοιριδίου χρησιμοποιώντας αλληλουχία νανοπόρου. Συνολικά 30.088 αναγνώσεις δημιουργήθηκαν με προσδιορισμό της αλληλουχίας του διαρροϊκού δείγματος κοπράνων για τρεις ώρες. Από αυτές, 25.466 αναγνώσεις (q-score >7, μέσο μήκος ανάγνωσης 653 nt) χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω αναλύσεις. Χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές μέθοδοι για τη σύγκριση των αναγνώσεων έναντι μιας βάσης δεδομένων ιών χρησιμοποιώντας το σύμπλεγμα HPC του Πανεπιστημίου της Γάνδης και τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα. 2 . Η σύγκριση με μια πλήρη βάση δεδομένων ιών είχε ως αποτέλεσμα τον εντοπισμό 6.781 έως 8.677 πιθανών αναγνώσεων ιών, ανάλογα με τις ρυθμίσεις BLAST. Το BLASTn οδήγησε σε ταχεία ταξινομική αναγνώριση αναγνώσεων με σχεδόν παρόμοια ευαισθησία σε σύγκριση με το tBLASTx. Ωστόσο, υπήρχε πολύ μεγάλη διαφορά μεταξύ των χρόνων τοιχώματος στο σύμπλεγμα HPC, με μόνο 26 δευτερόλεπτα χρόνο ανάλυσης για το BLASTn, έναντι σχεδόν 24 ωρών για το tBLASTx. Η πλειονότητα των αλληλουχιών εκχωρήθηκε σε βακτηριοφάγους της τάξης Caudovirales και τις οικογένειες Siphoviridae (n = 3.213 έως 4.163 αναγνώσεις), Podoviridae (n = 2.506 έως 3.002 αναγνώσεις) και Myoviridae (n = 912 έως 1,20 αναγνώσεις). Εκτελέστηκε ένα de novo συγκρότημα στις ονομαζόμενες, ποιοτικά φιλτραρισμένες αναγνώσεις και οι προκύπτουσες συνθέσεις χρησιμοποιήθηκαν ως υλικό εισόδου για ανάλυση VirSorter. Δεκαεννέα contigs ταξινομήθηκαν ως σίγουροι (n = 4; κατηγορία 1), κάπως σίγουρος (=14; κατηγορία 2) και όχι τόσο σίγουρος (=1; κατηγορίας 3) να είναι φάγο-ειδείς αγκυλώσεις (Εικ. 2Β). Η σύγκριση αυτών των στοιχείων με τη βάση δεδομένων GenBank χρησιμοποιώντας BLAST επέτρεψε την ταξινόμηση σε τέσσερις διαφορετικές ομάδες. Δέκα contigs έδειξαν μέτριες έως υψηλές ομοιότητες νουκλεοτιδίων με τον φάγο B124-14 Bacteroides, υποδηλώνοντας ότι όλα ανήκαν σε ένα γονιδίωμα φάγου. Αυτό υποστηρίχθηκε επίσης από το γεγονός ότι όλα αυτά τα contigs χαρτογραφήθηκαν όμορφα και κατανεμήθηκαν στο γονιδίωμα αναφοράς του φάγου B124-14 Bacteroides (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Το μεγαλύτερο contig με μέγεθος 39.069 νουκλεοτίδια, μαζί με τέσσερα άλλα contigs παρουσίασαν ομοιότητες (95% nt ταυτότητα) με διαφορετικούς φάγους Escherichia. Καθώς χαρτογράφησαν επίσης όμορφα κατανεμημένα σε όλο το γονιδίωμα αναφοράς του φάγου Escherichia vB_EcoP_PhAPEC7, φαίνεται ότι πρέπει επίσης να ανήκουν σε ένα γονιδίωμα φάγου (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Δύο contigs έδειξαν μικρή ομοιότητα τόσο με τον φάγο Enterococcus vB_EfaS_IME_196, που απομονώθηκε από νοσοκομειακά λύματα στην Κίνα από ένα στέλεχος Enterococcus faecalis, όσο και με το βακτηριακό γονιδίωμα Enterococcus hirae. Το τελευταίο μπορεί να είναι ένας προφάγος που έχει εισαχθεί στο βακτηριακό γονιδίωμα. Είναι ενδιαφέρον ότι εντοπίστηκαν τρία contigs για τα οποία δεν βρέθηκαν ομοιότητες με υπάρχοντες ιούς στο GenBank, αλλά το contig 0105 χαρτογραφήθηκε στο γονιδίωμα αναφοράς του φάγου Enterococcus vB_EfaS_IME196 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτοί μπορεί να είναι νέοι φάγοι ή αποκλίνουσες παραλλαγές από υπάρχοντες φάγους που υπάρχουν στην GenBank. Τρεις ευκαρυωτικοί ιοί χοίρων, ο κοβουϊός των χοίρων (n = 18 έως 22 αναγνώσεις), ο εντεροϊός G (n = 5 έως 9 αναγνώσεις) και ο αστροϊός (n = 4 αναγνώσεις) βρίσκονται σε πολύ μικρότερη αφθονία. Τα γένη Kobuvirus και Enterovirus ανήκουν στην οικογένεια Picornaviridae, ενώ το γένος Mamastrovirus ανήκει στην οικογένεια Astroviridae. Οι αναγνώσεις του Kobuvirus χαρτογραφήθηκαν έναντι ενός ευρωπαϊκού στελέχους αναφοράς S-1/HUN/2007/Hungary, όπως φαίνεται στην Εικ. 2C. Ωστόσο, δεν επιτεύχθηκε κάλυψη πλήρους γονιδιώματος σε υψηλό βάθος αλληλουχίας. Αποβολή του κοβουϊού των χοίρων και των ροταϊών σε θηλάζοντα χοιρίδια. Η αποβολή του κοβουϊού χοίρου, του RVA και του ροταϊού C (RVC) διερευνήθηκε ποσοτικά σε 5 θηλάζοντες χοίρους της ίδιας φάρμας από την οποία προήλθαν τα διαρροϊκά κόπρανα. Τα μοτίβα αποβολής κοπράνων των διαφορετικών ιών και η παρουσία διαρροϊκών σημείων φαίνονται στο Σχήμα. 3Α. Όλα τα χοιρίδια άρχισαν να αποβάλλουν τον κοβουϊό των χοίρων στο τέλος της πρώτης εβδομάδας μετά τον τοκετό. Σε δύο χοιρίδια (Α και Δ) η αποβολή διατηρήθηκε και διήρκεσε για τουλάχιστον 2 εβδομάδες (πάνω από το όριο ποσοτικού προσδιορισμού). Οι τίτλοι κορυφαίας αποβολής του κοβουϊού χοίρου κυμαίνονταν μεταξύ 6,42 και 7,01 log 10 αντίγραφα/μάκτρο, που είναι γενικά χαμηλότερο από τη μέγιστη αποβολή που παρατηρήθηκε για τυπικούς εντερικούς ιούς όπως ο ροταϊός και ο PEDV. Επιπλέον, η αιχμή της αποβολής δεν σχετιζόταν με διαρροϊκά επεισόδια, αμφισβητώντας τον ρόλο αυτού του ιού στην παθογένεση της διάρροιας στο αγρόκτημα. Διαρροϊκά σημεία παρατηρήθηκαν μόνο σε δύο χοιρίδια (Α και Β). Στο χοιρίδιο Β, παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ της υψηλής αποβολής RVC και των διαρροϊκών επεισοδίων. Αντίθετα, δεν υπήρχε άμεση συσχέτιση μεταξύ της κορυφαίας αποβολής του κοβουϊού και των διαρροϊκών επεισοδίων. Είναι ενδιαφέρον ότι μια αιχμή στην αποβολή του κοβουϊού παρατηρήθηκε στο χοιρίδιο C την 11η ημέρα μετά τον τοκετό. Αυτό το ζώο πέθανε λίγο αργότερα, αλλά δεν ήταν σαφές εάν αυτό μπορεί να αποδοθεί στη μόλυνση από τον ιό kobuvirus. Οξεία αποβολή RVA παρατηρήθηκε στο τέλος της περιόδου θηλασμού σε τρία από τα πέντε χοιρίδια, παρόλο που όλες οι χοιρομητέρες εμβολιάστηκαν πριν από τον τοκετό χρησιμοποιώντας ένα εμβόλιο αδρανοποιημένου ροταϊού βοοειδών. Συνολικά 44 δείγματα διαρροϊκών κοπράνων που συλλέχθηκαν το 2014 υποβλήθηκαν σε διαλογή για την παρουσία ιού kobuvirus χρησιμοποιώντας τη νέα RT-qPCR. Από αυτά, 25 δείγματα (56,8%) βρέθηκαν θετικά και 18 δείγματα έδειξαν ποσοτικοποιήσιμα ιικά φορτία (4,31 έως 6,83 log 10 αντίγραφα/μάκτρο). Επτά δείγματα ήταν θετικά, αλλά τα ιικά φορτία ήταν πολύ χαμηλά για να καταστεί δυνατή η ακριβής ποσοτικοποίηση. Η παρουσία RVA και RVC είχε αξιολογηθεί ποσοτικά σε αυτά τα δείγματα σε προηγούμενη μελέτη και η εμφάνιση συν-λοιμώξεων μεταξύ ροταϊών και κοβουϊού φαίνεται στο Σχήμα. 3Β 25 . Ο Kobuvirus βρέθηκε σε ίσες αναλογίες σε δείγματα αρνητικών και θετικών ως προς τον ροταϊό. Δώδεκα δείγματα περιείχαν μία μόνο μόλυνση ροταϊού με υψηλό φορτίο RVA και σε τέσσερα από αυτά, παρατηρήθηκε υψηλό φορτίο κοβουϊού (5,16 έως 5,42 log 10 αντίγραφα/g). Μια μεμονωμένη μόλυνση RVC βρέθηκε σε επτά δείγματα και σε τέσσερα από αυτά βρέθηκαν θετικά για τον ιό kobu σε υψηλά φορτία (4,31 έως 5,59 log 10 αντίγραφα/g). Μια διπλή μόλυνση RVA/RVC παρατηρήθηκε σε δύο δείγματα, αλλά κανένα δεν περιείχε ποσοτικά μετρήσιμα φορτία ιού kobuvirus. Πολλά (n = 10) από τα αρνητικά σε ροταϊό δείγματα περιείχαν υψηλά φορτία κοβουϊού. Το στέλεχος 17V079 έδειξε υψηλή ομοιότητα με άλλα απομονωμένα στελέχη βελγικού κοβουϊού χοίρου από το 2014 (ταυτότητα αλληλουχίας νουκλεοτιδίων 92,1 έως 94,0%) και το ουγγρικό στέλεχος αναφοράς/Hun/S-1 2017 (93,4%). Επιπλέον, υπήρχε υψηλό επίπεδο γενετικής μεταβλητότητας μεταξύ των απομονώσεων του βελγικού κοβουϊού χοίρων του 2014, με ταυτότητες αλληλουχίας νουκλεοτιδίων που κυμαίνονταν μεταξύ 90,1 και 97,2%. Μια φυλογενετική ανάλυση, χρησιμοποιώντας το 3D γονίδιο του 17V079 και δώδεκα βελγικών απομονώσεων από το 2014 (Εικ. 3C), δείχνει τα βελγικά στελέχη που συγκεντρώνονται μεταξύ στελεχών από διαφορετικές γεωγραφικές τοποθεσίες. Η πρόληψη και η θεραπεία προβλημάτων εντερικής νόσου σε νεαρά χοιρίδια παρεμποδίζεται συχνά από την έλλειψη διαγνωστικών εργαλείων. Οι κτηνίατροι περιορίζονται σε μια σύντομη λίστα γνωστών ιών, βακτηρίων, παρασίτων και παραγόντων διαχείρισης για να ορίσουν μια διαφορική διάγνωση. Μόνο η πιο πιθανή αιτία της νόσου θα διερευνηθεί διαγνωστικά, οδηγώντας συχνά σε αρνητικά, ασαφή ή ελλιπή αποτελέσματα. Ωστόσο, μελέτες μεταγονιδιωματικής έχουν υποδείξει την ύπαρξη συμπλεγμάτων ιογενούς εντερικής νόσου, που ενδεχομένως περιλαμβάνουν πολλαπλούς γνωστούς και νέους ιούς 3, 4, 6, 7, 9, 10. Η ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων από παθογόνα χρησιμοποιώντας προσεγγίσεις μεταγονιδιωματικής που βασίζονται στο NGS είναι μια μερική λύση σε προβλήματα διαγνωστικών δοκιμών και μπορεί να παρέχει πλήρη ανάγνωση των ιών και άλλων παθογόνων που υπάρχουν σε ένα δείγμα. Ωστόσο, οι περισσότερες πλατφόρμες NGS απαιτούν μεγάλες επενδύσεις και η επεξεργασία των αναγνώσεων μπορεί να ξεκινήσει μόνο στο τέλος της σειράς εκτέλεσης. Η ιική μεταγονιδιωματική απαιτεί επίσης εκτεταμένες εργαστηριακές προετοιμασίες, συμπεριλαμβανομένης της φυγοκέντρησης, της διήθησης και της επεξεργασίας με νουκλεάση για την απόρριψη νουκλεϊκών οξέων βακτηρίων και ξενιστών που αποτελούν το μεγαλύτερο μέρος όλων των νουκλεϊκών οξέων που υπάρχουν 13 . Επιπλέον, η ποσότητα των ιικών νουκλεϊκών οξέων σε ένα δείγμα είναι πολύ χαμηλή, και απαιτεί στοχευμένη ή τυχαία ενίσχυση αυτών των γονιδιωμάτων πριν από την ανάλυση NGS. Η ενίσχυση μπορεί να προκαλέσει μεροληψία και να εμποδίσει την ανάπτυξη γρήγορων διαγνωστικών αγωγών λόγω σημαντικής απώλειας χρόνου. Όλοι αυτοί οι παράγοντες οδηγούν σε μεγάλο χρόνο κύκλου εργασιών μεταξύ της συλλογής δειγμάτων και της διαγνωστικής αναφοράς. Η συσκευή προσδιορισμού αλληλουχίας τρίτης γενιάς MinION (ONT), υπόσχεται ως διαγνωστική πλατφόρμα, καθώς επιτρέπει την αλληλούχιση και αναλύσεις σε πραγματικό χρόνο όλων των DNA/RNA σε ένα δείγμα, θεωρητικά χωρίς να απαιτείται προενίσχυση ιικών νουκλεϊκών οξέων. Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η αξιολόγηση αυτής της τεχνολογίας για χρήση ως γρήγορο εργαλείο για την αναγνώριση συμπλόκου ιογενούς εντερικής νόσου χοίρων, χωρίς τη διεξαγωγή ενίσχυσης ιικού νουκλεϊκού οξέος. Σε ένα πρώτο πείραμα, PEDV και RVA που αναπτύχθηκαν σε κυτταρική καλλιέργεια, που είναι γνωστό ότι προκαλούν διάρροια σε νεαρούς χοίρους, συγκεντρώθηκαν σε υψηλά φορτία που μιμούνται ποσότητες αποβολής σε διαρροϊκά χοιρίδια. Η αλληλούχιση αυτού του συγκεντρωμένου δείγματος με το MinION είχε ως αποτέλεσμα την ταχεία ταυτοποίηση και των δύο ιών. Η ανάλυση σε πραγματικό χρόνο των αναγνώσεων αλληλουχίας δεν διεξήχθη, αλλά είναι εφικτή όπως είχε αποδειχθεί προηγουμένως από τον Greninger και τους συνεργάτες του χρησιμοποιώντας τη γραμμή ανάλυσης SURPI για ταχεία ταυτοποίηση ανθρώπινων ιών από διαφορετικές κλινικές μήτρες 19 . Είναι ενδιαφέρον ότι οι πρώτες αναγνώσεις που ταιριάζουν με PEDV και RVA δημιουργήθηκαν αντίστοιχα μετά από 7 και 24 δευτερόλεπτα αλληλουχίας. Υψηλά βάθη προσδιορισμού αλληλουχίας (43,0Χ) αποκτήθηκαν εντός μίας ώρας από τον προσδιορισμό της αλληλουχίας για το PEDV και εντός τριών ωρών για τα περισσότερα από τα έντεκα τμήματα γονιδίου RVA (19,2-48,2Χ). Συνολικά, δημιουργήθηκαν υψηλότερα βάθη αλληλουχίας για το PEDV που θα μπορούσαν να υποδεικνύουν ότι η αλληλουχία μακρύτερων ιικών γονιδιωμάτων ευνοείται έναντι μικρότερων τμημάτων γονιδίου, καθώς το PEDV έχει μέγεθος γονιδιώματος περίπου 28 kb και τα τμήματα γονιδίου RVA είναι μικρότερα (0,6 έως 3,3 kb). Αυτή η μεροληψία μπορεί να είχε εισαχθεί κατά τη διάρκεια της σύνδεσης των προσαρμογών αλληλουχίας στα ιικά νουκλεϊκά οξέα. Μπορεί να υποτεθεί ότι οι προσαρμογείς συνδέονται ευκολότερα σε μακρύτερα θραύσματα DNA και η μεροληψία θα πρέπει να αποφευχθεί με την τυποποίηση του μήκους εισόδου του ιικού νουκλεϊκού οξέος. Η παραγωγή ταχείας ανάγνωσης επιτρέπει την ευέλικτη χρήση της πλατφόρμας προσδιορισμού αλληλουχίας και οι αλληλουχίες μπορούν να διαβαστούν έως ότου είναι διαθέσιμες αρκετές πληροφορίες γονιδιώματος των ιών που ενδιαφέρουν. Ενώ η τεχνολογία μπορεί να είναι χρήσιμη για την παροχή γρήγορων αναγνώσεων ιών (<3 ωρών) που υπάρχουν σε ένα δείγμα, ενδελεχής επικύρωση, χρησιμοποιώντας καλά καθορισμένα αποθέματα ιών, εμβολικά πειράματα σε πίνακες (π.χ. κόπρανα) και πραγματικά κλινικά δείγματα είναι απαραίτητα για να διασφαλιστεί ότι όλα τα μέλη του συμπλέγματος ιογενούς εντερικής νόσου των χοίρων διαγιγνώσκονται με ακρίβεια. Επιπλέον, η ακρίβεια της τεχνολογίας χρειάζεται περαιτέρω βελτίωση, καθώς τα ποσοστά σφαλμάτων των contigs από συγκροτήματα de novo εξακολουθούν να κυμαίνονται μεταξύ 1 και 5%, εμποδίζοντας την ακριβή ανάλυση λεπτών αλλά σημαντικών μεταλλάξεων στο ιικό γονιδίωμα. Μετά την επιτυχή ταυτοποίηση της κυτταρικής καλλιέργειας -αναπτυσσόμενοι ιοί, η απόδοση του MinION διερευνήθηκε περαιτέρω με την ανάλυση ενός διαρροϊκού δείγματος κοπράνων ενός θηλάζοντος χοιριδίου ηλικίας μιας εβδομάδας. Πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις PCR σε πραγματικό χρόνο για RVA, RVC, PEDV και TGEV. Ο Enterococcus hirae απομονώθηκε σε ιδιωτικό διαγνωστικό εργαστήριο, αλλά αυτό το βακτηριακό είδος δεν θεωρείται τυπική αιτία διαρροϊκής νόσου στους χοίρους 26 . Η ιική μεταγονιδιωματική διεξήχθη σε αυτό το δείγμα χρησιμοποιώντας το MinION και δύο διαφορετικοί αλγόριθμοι αναζήτησης BLAST χρησιμοποιήθηκαν για την ταξινομική αναγνώριση των αναγνώσεων συγκρίνοντάς τα με μια πλήρη βάση δεδομένων ιών. Συνολικά, το tBLASTx με e-value 10 -3 ήταν σε θέση να αναγνωρίσει τις πιο ιογενείς αναγνώσεις σε σύγκριση με άλλες επιλογές αναζήτησης που πραγματοποιήθηκαν. Ωστόσο, οι επιλογές αναζήτησης BLASTn έφτασαν επίσης σε υψηλή ευαισθησία, αλλά με πολύ χαμηλότερο κόστος χρόνου: 26 δευτερόλεπτα αντί για σχεδόν 24 ώρες. Για ανάλυση ταχείας ανάγνωσης και αναζήτηση στενά σχετιζόμενων μη αποκλίνουσες αλληλουχίες ιών, θα πρέπει επομένως να χρησιμοποιείται κατά προτίμηση το BLASTn ή άλλη γρήγορη μεθοδολογία. Ωστόσο, ο tBLASTx μπορεί να συλλάβει περισσότερους αποκλίνοντες ή νέους ιούς, βελτιώνοντας τη συνολική ευαισθησία. Στο δείγμα 17V079 εντοπίστηκαν τρεις ιοί χοίρων, συμπεριλαμβανομένου του kobuvirus του χοίρου, του mamastrovirus του χοίρου και του εντεροϊού G. Αστροϊοί και εντεροϊοί έχουν ανιχνευθεί νωρίτερα τόσο σε διαρροϊκά όσο και σε μη διαρροϊκά κόπρανα βελγικών χοίρων και σε κόπρανα από χοίρους σε όλο τον κόσμο 9,10,27 . Σε μια πρόσφατη μελέτη από την Ταϊλάνδη, η διαφορά στον επιπολασμό του αστροϊού σε διαρροϊκά (8,4%) έναντι μη διαρροϊκών (4,6%) χοιριδίων ηλικίας μικρότερης των 4 εβδομάδων δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Επίσης άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι ο ρόλος του αστροϊού των χοίρων στην παθογένεση της διάρροιας των χοίρων δεν είναι απολύτως σαφής 28 . Αντίθετα, έχουν γίνει συσχετισμοί μεταξύ της διάρροιας και των λοιμώξεων από ανθρώπινους αστροϊούς 29 . Μια πρόσφατη μελέτη σε 5 ευρωπαϊκές χώρες (Ουγγαρία, Ισπανία, Γερμανία, Αυστρία και Σουηδία) έδειξε την ευρεία εξάπλωση των αστροϊών των χοίρων στον πληθυσμό των χοίρων. Εκατό τοις εκατό επιπολασμός του αστροϊού βρέθηκε σε διαρροϊκούς και μη διαρροικούς χοίρους από την Αυστρία και την Ισπανία. Οι αστροϊοί των χοίρων έχουν επίσης συνδεθεί πρόσφατα με κρούσματα νευρολογικών διαταραχών σε απογαλακτισμένα χοιρίδια από την Ουγγαρία και σε χοίρους και χοιρομητέρες ηλικίας 5 εβδομάδων στις Ηνωμένες Πολιτείες 30, 31 . Το έντερο μπορεί να είναι μια υποθετική θύρα εισόδου για τέτοιες νευρολογικές λοιμώξεις από αστροϊούς. Οι εντεροϊοί έχουν γενικότερα συνδεθεί με νευρολογικές διαταραχές στους χοίρους, αν και βρίσκονται συνήθως και στα κόπρανα 11, 12, [32] [33] [34] . Σε μια μελέτη από το Βιετνάμ, δεν βρέθηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της κατάστασης διάρροιας και της παρουσίας του εντεροϊού G στα κόπρανα 35 . Η συμμετοχή τόσο των αστροϊών όσο και των εντεροϊών στην παθογένεση των εντερικών διαταραχών μπορεί να αμφισβητηθεί εδώ, αλλά δεν μπορεί να αποκλειστεί εντελώς. Επιπλέον, ενώ οι ευαίσθητες αναζητήσεις tBLASTx χρησιμοποιήθηκαν εδώ, εξακολουθεί να υπάρχει η πιθανότητα να υπάρχει ένας εντελώς νέος ιός στη σκοτεινή ύλη των αναγνώσεων αλληλουχίας. Ωστόσο, η αναφορά ενός κοβουϊού χοίρου σε βελγικά χοιρίδια με MinION είναι μοναδική. Στο Βέλγιο, οι κοβουϊοί είχαν προηγουμένως βρεθεί μόνο σε διαρροϊκά δείγματα μόσχων και νεαρών βοοειδών στο Βέλγιο 36 . Στην παρούσα μελέτη, μια νέα ανάλυση RT-qPCR, που στοχεύει το διατηρημένο 3D γονίδιο που κωδικοποιεί την RNA-εξαρτώμενη-RNA-πολυμεράση, αναπτύχθηκε και χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει, για πρώτη φορά, τη διαμήκη ποσοτική απόρριψη του ιού κοβουϊού των χοίρων σε αγρό. συνθήκες. Παρόμοιες κινητικές αναλύθηκαν επίσης για τον ροταϊό των χοίρων Α και C. Ενώ τα θηλάζοντα χοιρίδια άρχισαν να αποβάλλουν τον κοβουϊό των χοίρων από την ηλικία της μίας εβδομάδας, δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ της μέγιστης αποβολής του ιού (6,42 έως 7,01 log 10 αντίγραφα/μπατονέτα) και των διαρροϊκών σημείων. Σε έναν χοίρο, έγινε συσχέτιση μεταξύ των διαρροϊκών επεισοδίων και της κορύφωσης της αποβολής του ροταϊού C, ενός πολύ γνωστού εντερικού παθογόνου 37, 38. Είναι πολύ ενδιαφέρον ότι τα φορτία των κοπράνων του kobuvirus ήταν συνήθως χαμηλότερα από εκείνα που αναφέρθηκαν για καλά περιγραφμένους εντερικούς ιούς των οποίων η παθογένεια έχει αποδειχθεί χρησιμοποιώντας μοντέλα μόλυνσης χοιριδίων, όπως ο PEDV και ο ροταϊός [39] [40] [41] . Παρόμοια ιικά φορτία για τον κοβουϊό των χοίρων βρέθηκαν επίσης σε περίπτωση (4,60 ± 1,76 αντίγραφα/αντίδραση qPCR) και χοίρους ελέγχου (4,79 ± 1,72 αντίγραφα/αντίδραση qPCR) κατά τη διάρκεια πρόσφατης μελέτης στη Δανία για την αξιολόγηση του ρόλου των ιών στην παθογένεση του νέου νεογνού σύνδρομο διάρροιας χοίρου. Η μελέτη έδειξε ότι ο κοβουϊός, ο αστροϊός, ο ροταϊός Α, ο τεσχοϊός χοίρου, ο νοροϊός χοίρου και οι κοροναϊοί των χοίρων δεν εμπλέκονται στην παθογένεση του συνδρόμου 42 . Η εύρεση χαμηλών φορτίων κοβουϊού στα κόπρανα θέτει υπό αμφισβήτηση τον πραγματικό εντερικό παθογόνο τροπισμό του ιού. Υποθετικά, η αντιγραφή του πιθανότατα δεν κατανέμεται σε ολόκληρη τη λάχνη, αλλά περιορίζεται είτε στα εντεροκύτταρα στις άκρες της λάχνης είτε στα κύτταρα του ανοσοποιητικού που υπάρχουν στο έντερο. Η παρουσία του RNA του kobuvirus στον ορό έχει επίσης αποδειχθεί σε Ουγγρικούς χοίρους, αλλά δεν ήταν γνωστό εάν ο ιός αναπαράγεται επίσης σε άλλα όργανα 43 . Τόσο η στοματική οδός όσο και η χορήγηση γάλακτος σε θηλάζοντες χοίρους θα μπορούσαν να εμπλέκονται στη μετάδοση του ιού. Τα υψηλότερα ποσοστά μόλυνσης παρατηρήθηκαν σε θηλάζοντα χοιρίδια, σε σύγκριση με τα μεγαλύτερα σε ηλικία χοίρους, σε άλλες χώρες [44] [45] [46] . Στη μελέτη μας, παρατηρήθηκε σχετικά μεγάλη αποβολή του κοβουϊού των χοίρων σε τρία στα πέντε ζώα, γεγονός που μπορεί να υποδεικνύει ότι αυτός ο ιός μπορεί να προκαλέσει επίμονες λοιμώξεις. Μια βραζιλιάνικη μελέτη του 2011 έδειξε την παρουσία RNA του κοβουϊού στον ορό από χοιρίδια ηλικίας 3 ημερών, τα οποία είχαν εξαφανιστεί την 21η ημέρα, υποδεικνύοντας την κάθαρση του ιού από το αίμα και αποκλείοντας τη συστηματική εμμονή 45 . Δεν μπορεί να αποκλειστεί πλήρης έλλειψη παθογένειας, καθώς οι κοβουϊοί των χοίρων μπορεί να διαδραματίσουν ρόλο ως υποκλινικά σημαντικός ιός. Τέτοιες υποκλινικές, αλλά ανοσοκατασταλτικές ιδιότητες έχουν αποδοθεί στον οικονομικά σημαντικό παθογόνο των χοίρων κυκλοϊό χοίρων 47 . Ενδιαφέρον, ένα από τα χοιρίδια πέθανε στην κορύφωση της αποβολής του ιού του κοβουϊού, αν και δεν ήταν σαφές εάν υπήρχε κάποια αιτιότητα μεταξύ της αναπαραγωγής του ιού και του θανάτου του χοιριδίου. Θα πρέπει να διεξαχθούν πειράματα in vivo σε ζώα σε ένα μοντέλο νεογνών, συμβατικών αρνητικών στον κοβουϊό χοιριδίων για να διαλευκανθεί η παθογένεση των κοβουϊών των χοίρων. Έγιναν προσπάθειες απομόνωσης του ιού σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές (MA104, ST και SK) και μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος. Δεν υπήρξε ένδειξη κυτταροπαθογόνου δράσης μετά από αρκετές ημέρες επώασης. Αντισώματα για την οπτικοποίηση της έκφρασης αντιγόνου δεν ήταν διαθέσιμα και επομένως η δυνατότητα αντιγραφής χωρίς ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ | (2018) 8:9830 | DOI:10.1038/s41598-018-28180-9 δεν μπορεί να αποκλειστεί εμφανής κυτταροπαθογόνος δράση. Θα καταβληθούν προσπάθειες για την απομόνωση του ιού σε πρωτογενείς καλλιέργειες εντεροκυττάρων χοίρου, μόλις διατεθούν. Για να εκτιμηθεί ευρύτερα ο επιπολασμός του κοβουϊού στη βελγική βιομηχανία χοίρων, διεξήχθη αναδρομική ανάλυση δειγμάτων διάρροιας από θηλάζοντα χοιρίδια ηλικίας μικρότερης των δύο εβδομάδων. Ένα υψηλό ποσοστό (40,9%) των δειγμάτων (n = 44) περιείχε μετρήσιμα ιικά φορτία που κυμαίνονταν μεταξύ 4,31 και 6,83 log 10 αντίγραφα/g περιττωμάτων. Τα ιικά φορτία που βρέθηκαν ήταν επομένως συγκρίσιμα με τα φορτία που απεκκρίνονταν από τα χοιρίδια στη διαχρονική ανάλυση και στην προαναφερθείσα μελέτη από τη Δανία, καταδεικνύοντας την ενδημική παρουσία του ιού στον βελγικό πληθυσμό χοίρων 42 . Στην παρούσα μελέτη, τα μη διαρροϊκά χοιρίδια δεν ήταν περιλαμβάνεται και επομένως δεν μπορεί να γίνει συσχέτιση μεταξύ του επιπολασμού του ιού κοβουϊού και της νόσου. Ωστόσο, ο επιπολασμός του kobuvirus έχει περιγραφεί ευρέως σε χοίρους από πολλές ευρωπαϊκές χώρες (Ολλανδία (16,7%), Σλοβακία (63,4%), Ουγγαρία (81,0%), Τσεχία (87,3%), Αυστρία (46,2%), Ιταλία (52,4%), Γερμανία (54,5%) και Σουηδία (45,0%), αμερικανικές χώρες (Ηνωμένες Πολιτείες (21,9%) και Βραζιλία (53,0%)), αφρικανικές χώρες (Κένυα (14,9%) και Ουγκάντα ​​(15,5%) ) και ασιατικές χώρες (Ταϊλάνδη (99%), Νότια Κορέα (52,1%) και Βιετνάμ (29,3%)) [44] [45] [46] [48] [49] [50] [51] [52] [53 ] . Σε ένα μικρό ποσοστό αυτών των μελετών, καταδείχθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ του επιπολασμού του ιού kobuvirus και της διάρροιας στους χοίρους, όπως στην Ουγγαρία (54,5% επιπολασμός σε υγιείς χοίρους έναντι 92,3% επιπολασμός σε διαρροϊκούς χοίρους), Ισπανία (47,5% υγιείς έναντι 74,4% διάρροια), Βραζιλία (41% έναντι 78,4%), Ταϊλάνδη (19,3% έναντι 84,5%) και Βιετνάμ (27,6% έως 40,9%) 35, 45, 46, 52 . Πράγματι, είναι δύσκολο να γίνουν συσχετισμοί μεταξύ του επιπολασμού του ιού και της διάρροιας, καθώς η παθογένεια του ιού θα μπορούσε να επηρεαστεί σε μεγάλο βαθμό από άλλους παράγοντες, όπως συν-λοιμώξεις με άλλους εντερικούς ιούς, μικροχλωρίδα και παράγοντες διαχείρισης. Οι βελγικές απομονώσεις έδειξαν γενετική μέτρια έως υψηλή γενετική μεταβλητότητα, με ταυτότητες νουκλεοτιδίων μεταξύ 90,1 και 97,2%. Επιπλέον, συγκεντρώθηκαν διάχυτα μεταξύ στελεχών από διαφορετικές χώρες σε όλο τον κόσμο, υποδεικνύοντας ότι τα στελέχη δεν διακρίνονται με βάση τη γεωγραφική τους προέλευση. Επειδή οι περισσότερες (99%) από τις αναγνώσεις που δημιουργήθηκαν κατά την αλληλουχία του δείγματος κοπράνων 17V079 ταίριαξαν με βακτηριοφάγους κατά την ανάλυση με BLAST. Οι βακτηριοφάγοι μπορεί να έπαιξαν σημαντικό ρόλο στην παθογένεση της διαρροϊκής νόσου. Τα de novo συναρμολογημένα contigs αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το VirSorter, ένα πακέτο λογισμικού για την εξόρυξη ιικών σημάτων από μικροβιακά γονιδιωματικά δεδομένα. Τέτοια εργαλεία επιτρέπουν τη μεγιστοποίηση της δυνατότητας ανίχνευσης φάγων dsDNA 54 . Αρκετά contigs έδειξαν υψηλές ομοιότητες με τον φάγο B124-14 Bacteroides, που βρέθηκε σε δείγματα αστικών λυμάτων και ανθρώπινων κοπράνων. Φάνηκε ότι απουσίαζε σε 30 δείγματα που συλλέχθηκαν από διαφορετικά ζωικά είδη, συμπεριλαμβανομένων των χοίρων, και επομένως θεωρείται ένας ειδικός για τον άνθρωπο φάγος 55, 56. Το εύρημα αρκετών μολύνσεων, γενετικά παρόμοιων με τον φάγο Β124 και πιθανόν να ανήκουν σε ένα γονιδίωμα φάγου, δείχνει ότι αυτός ο φάγος που βρέθηκε στο δείγμα κοπράνων χοίρου μπορεί επίσης να αναπαραχθεί στο μικροβίωμα του εντέρου του νεαρού χοίρου και όχι μόνο στον άνθρωπο. Ωστόσο, είναι πιθανό ότι η ικανότητα αντιγραφής του φάγου στο έντερο του χοίρου εξαρτάται από την ηλικία και ότι οι πολύ νεαρές ηλικιακές ομάδες δεν ελήφθησαν δείγμα σε προηγούμενες μελέτες. Είναι ενδιαφέρον ότι αρκετά από τα contigs που βρέθηκαν έδειξαν επίσης ομοιότητες με τους φάγους Escherichia. Δύο από τα contigs ήταν παρόμοια με τους φάγους Escherichia PhAPEC5 και PhAPEC7, που απομονώθηκαν από βελγικά ποτάμια στη γειτονιά των πτηνοτροφείων και είναι γνωστό ότι προκαλούν λυτικές λοιμώξεις στο παθογόνο Escherichia coli των πτηνών. Ηλεκτρονικές μικροσκοπικές εικόνες των φάγων PhAPEC5 και PhAPEC7 έδειξαν ότι ανήκαν στην οικογένεια Podoviridae 57 . Δύο άλλα contigs ήταν παρόμοια με δύο στενά συγγενείς φάγους Escherichia, τους St11Ph5 και G7C, που βρέθηκαν στα λύματα και στα κόπρανα αλόγου, αντίστοιχα 58 . Τέλος, ένα contig έδειξε περιορισμένη ομοιότητα με έναν φάγο Enterococcus, που απομονώθηκε από νοσοκομειακά λύματα στην Κίνα, ενώ ένα τελευταίο contig έδειξε μέτριες ομοιότητες με το βακτηριακό γονιδίωμα Enterococcus hirae. Αυτή η περιοχή μπορεί να είναι ένας προφάγος, που έχει εισαχθεί στο βακτηριακό γονιδίωμα. Οι φάγοι που βρέθηκαν σε αυτό το χοιρίδιο μπορεί να έχουν αναμορφώσει τη μικροχλωρίδα του εντέρου, επιτρέποντας σε ευκαιριακά βακτήρια όπως ο Enterococcus hirae να πολλαπλασιαστούν και να αρχίσουν να εκκρίνουν τοξίνες. Είναι επίσης πιθανό ότι μια μόλυνση από φάγο από βακτήρια στο έντερο του χοίρου οδήγησε σε κατάσταση στρες για αυτά τα βακτήρια, προκαλώντας την έκκριση τοξινών. Το νέο σύνδρομο νεογνικής διάρροιας που περιγράφεται παραπάνω παρουσιάζει υψηλές ομοιότητες με την ασθένεια που περιγράφεται στην περίπτωση 17V079 και μπορεί να εμπλέκονται βακτηριοφάγοι στην παθογένεση αυτού του συνδρόμου. Μέχρι στιγμής, ο ρόλος των φάγων δεν έχει ληφθεί υπόψη στην παθογένεση αρκετών εντερικών διαταραχών, αλλά δεδομένης της μεγάλης αφθονίας εδώ, θα πρέπει να είναι σε μελλοντικές μελέτες. Είναι σαφές ότι οι νέες τεχνολογίες θα αλλάξουν τον τρόπο με τον οποίο γίνονται τα διαγνωστικά στο εγγύς μέλλον μελλοντικός. Η τιμολόγηση μπορεί επί του παρόντος να είναι μια πτυχή που εμποδίζει την ανάλυση δειγμάτων υψηλής απόδοσης στην κτηνιατρική των χοίρων, αλλά καθώς η τεχνολογία εξελίσσεται γρήγορα, αυτό μπορεί να γίνει πολύ σύντομα λιγότερο σχετικό. Πλήρεις επισκοπήσεις όλων των ιών και άλλων παθογόνων σε ένα δείγμα θα δοθούν σε μία μόνο ανάγνωση αντί να απαιτούνται διαφορετικές διαγνωστικές δοκιμασίες. Ωστόσο, πρέπει να δίνεται προσοχή στην ερμηνεία τέτοιων αποτελεσμάτων, καθώς θα πρέπει να αναλύονται μόνο από εκπαιδευμένους κτηνιάτρους. Ιοί. Το στέλεχος RVA/Pig-tc/BEL/12R046/2012/G9P [23] ροταϊού χοίρου Α (RVA) απομονώθηκε από ένα διαρροϊκό χοιρίδιο και αναπτύχθηκε για τρεις διαδοχικές διελεύσεις σε κύτταρα ΜΑ104 σε έναν τίτλο μολυσματικού ιού 10 7,8 ml CCID 50 / . Οι αλληλουχίες νουκλεοτιδίων των 11 τμημάτων γονιδίου αυτού του στελέχους επιλύθηκαν νωρίτερα με τη χρήση αλληλουχίας Sanger (αριθμοί προσχώρησης GenBank: KM82070 (VP1), KM820707 (VP2), KM827014 (VP3), KM820720 (VP607V), KM820720 (VP675M), KM820720 (VP675M) ), KM820742 (NSP1), KM820672 (NSP2), KM820679 (NSP3), KM820686 (NSP4) και KM820693 (NSP5)) 59 . Ένα στέλεχος ιού επιδημίας διάρροιας χοίρων (PEDV, CV777) που απομονώθηκε στο Βέλγιο τη δεκαετία του 1970 προσαρμόστηκε για ανάπτυξη σε κύτταρα Vero τη δεκαετία του 1980 60 . Στο Εργαστήριό μας, ο ιός αναπτύχθηκε σε τίτλο μολυσματικού ιού 10 6,0 CCID 50 /ml (Αριθμός πρόσβασης GenBank: AF353511). Προέλευση δείγματος κοπράνων από διαρροϊκά θηλάζοντα χοιρίδια. Συλλέχθηκε δείγμα κοπράνων με διάρροια από έναν βελγικό χοίρο σε μια φάρμα που στεγαζόταν συνολικά 620 χοιρομητέρες και χρησιμοποιώντας ένα σύστημα παραγωγής παρτίδας 2 εβδομάδων, με ηλικία απογαλακτισμού 23 ημέρες. Οι χοιρομητέρες Topigs Norsvin διασταυρώθηκαν με κάπρους Piétrain, παράγοντας 32. τοξίνες (Suiseng, Hipra). Ο εμβολιασμός κατά του ροταϊού Α έγινε εκτός επισήμανσης με ένα αδρανοποιημένο εμβόλιο βοοειδούς ροταϊού Α (Lactovac, Zoetis). Μέχρι πρόσφατα, διαρροϊκά προβλήματα υπήρχαν σπάνια στα θηλάζοντα χοιρίδια και επίσης παρατηρήθηκαν πολύ χαμηλά ποσοστά θνησιμότητας (6,2-7,1%). Από την άνοιξη του 2017, η εντερική νόσος άρχισε να προκαλεί σοβαρότερα προβλήματα συνοδευόμενα με θνησιμότητα σε αυτό το αγρόκτημα, κυρίως σε θηλάζοντα χοιρίδια ηλικίας 7 ημερών. Ένα δείγμα διαρροϊκών κοπράνων ενός τέτοιου χοιριδίου διερευνήθηκε σε ιδιωτικό διαγνωστικό εργαστήριο (Dialab, Belsele, Βέλγιο) και φέρει την ένδειξη 17V079. Δεν βρέθηκε ιολογική αιτία που να εξηγεί τα προβλήματα διάρροιας στο αγρόκτημα. Το μόνο απομονωμένο βακτήριο ήταν ο Enterococcus hirae. Αυτό το βακτήριο προστέθηκε εκεί στο πρόγραμμα εμβολιασμού της χοιρομητέρας (αδρανοποιημένο αυτοεμβόλιο). Δεν βρέθηκαν άλλα παθογόνα σε αυτό το δείγμα. Καθώς η κλινική εικόνα υπαινίσσεται μια ιογενή αιτία της νόσου, το δείγμα στάλθηκε στο Εργαστήριο Ιολογίας στη Σχολή Κτηνιατρικής (Πανεπιστήμιο της Γάνδης) για περαιτέρω ανάλυση. Το δείγμα ήταν αρνητικό για RVA, RVC, PEDV και TGEV χρησιμοποιώντας εσωτερικές δοκιμασίες RT-qPCR 25, 61, 62. Ως εκ τούτου, αποφασίστηκε να γίνει μια μεταγονιδιωματική ανάλυση με MinION που περιγράφεται σε αυτή τη μελέτη. Καθαρισμός ιικών νουκλεϊκών οξέων. Πρώτον, ο ιικός εμπλουτισμός έγινε με βάση το πρωτόκολλο NetoVIR για να ληφθούν καθαρά ιικά νουκλεϊκά οξέα για την προετοιμασία της βιβλιοθήκης προσδιορισμού αλληλουχίας 13 . Οι αναλύσεις MinION των ιών RVA και PEDV που έχουν αναπτυχθεί σε κυτταρικές καλλιέργειες διεξήχθησαν στο Εργαστήριο Κλινικής Ιολογίας (Rega Institute, KU Leuven), ενώ το δείγμα διαρροϊκών κοπράνων αναλύθηκε στο Εργαστήριο Ιολογίας (Σχολή Κτηνιατρικής, Πανεπιστήμιο της Γάνδης). Τα αποθέματα RVA και PEDV φυγοκεντρήθηκαν στα 17.000 χ g για 3 λεπτά. Το υπερκείμενο και των δύο εναιωρημάτων αραιώθηκε σε 6 log 10 CCID 50/ml και 500 μΙ από κάθε εναιώρημα αναμίχθηκαν για να επιτευχθεί ίση συγκέντρωση και των δύο ιών. Αυτό το μίγμα διηθήθηκε χρησιμοποιώντας φίλτρο πολυαιθεροσουλφόνης 0,8 μm για 1 λεπτό στα 17.000 × g, ακολουθούμενη από επεξεργασία νουκλεάσης για 2 ώρες στους 37 °C για πέψη των ελεύθερων νουκλεϊκών οξέων στο εναιώρημα: 250 μl του δείγματος προστέθηκαν σε 14 μl οικιακό ρυθμιστικό διάλυμα (1 Μ Tris, 100 mM CaCl 2 και 30 mM MgCl 2, ρΗ 8), 4 μl νουκλεάσης βενζονάσης (Millipore) και 2 μl Μικροκοκκικής νουκλεάσης (NEB) όπως περιγράφηκε προηγουμένως 13 . Δεκατέσσερα μικρολίτρα EDTA προστέθηκαν για να σταματήσει η αντίδραση, ακολουθούμενη από εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων από τα ιικά σωματίδια χρησιμοποιώντας το κιτ QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen). Ακολουθήθηκαν οι οδηγίες του κατασκευαστή αλλά δεν προστέθηκε RNA φορέας και έγινε έκλουση σε 30 μl AVE για να συμπυκνωθεί το εκχύλισμα νουκλεϊκού οξέος του ιού. Το διαρροϊκό δείγμα κοπράνων 17V079 υποβλήθηκε σε επεξεργασία παρόμοια με τους ιούς που αναπτύχθηκαν σε κυτταροκαλλιέργεια, με μερικές μικρές τροποποιήσεις. Ένα εναιώρημα 10% w/v της διάρροιας παρασκευάστηκε σε Minimum Essential Medium και φυγοκεντρήθηκε. Το υπερκείμενο διηθήθηκε μέσω φίλτρου σύριγγας 0,45 μm (Sarstedt) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με νουκλεάση βενζονάσης για 1 ώρα για να επιταχυνθεί η διαγνωστική σωλήνωση. Τα ιικά νουκλεϊκά οξέα εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας το QIAamp Cador Pathogen Mini Kit σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χωρίς προσθήκη RNA φορέα. Η έκλουση έγινε σε όγκο 50 μΐ. cDNA και σύνθεση δεύτερου κλώνου για αλληλούχιση νανοπόρου. Τα νουκλεϊκά οξέα θερμάνθηκαν στους 95 °C για 2 λεπτά και ψύθηκαν σε πάγο για να διαχωριστούν οι δευτερογενείς δομές RNA και να μετουσιωθεί το δίκλωνο RNA. Το Superscript IV Reverse Transcriptase (ThermoScientific) χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία cDNA. Δέκα μικρολίτρα νουκλεϊκών οξέων μήτρας αναμίχθηκαν με 0,5 μΙ τυχαίου εξαμερούς εκκινητές (Random Primer 6, New England Biolabs), 1 μΙ μίγματος dNTP (NEB) και 2,5 μΙ νερού χωρίς νουκλεάση. Η ανόπτηση του εκκινητή πραγματοποιήθηκε στους 65 °C για 5 λεπτά, μετά τα οποία προστέθηκαν 4 μl ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης Superscript IV (ThermoScientific), 1 μl διθειοθρεϊτόλης (ThermoScientific) και 1 μl SuperScript IV Αντίστροφης Μεταγραφάσης (ThermoScientific) σε συνολικό όγκο αντίδρασης 20 μl. . Οι συνθήκες αντίδρασης ήταν οι εξής: 23 °C για 10 λεπτά, 50 °C για 10 λεπτά, 80 °C για 10 λεπτά και ένα άπειρο βήμα συγκράτησης στους 10 °C. Ένας δεύτερος κλώνος DNA δημιουργήθηκε από μονόκλωνα (c) μόρια DNA χρησιμοποιώντας το NEBNext Second Strand Synthesis Kit (NEB). Είκοσι μικρολίτρα μίγματος αντίδρασης cDNA προστέθηκαν σε 10 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης σύνθεσης NEBNext δεύτερου κλώνου, 5 μΙ ενζυμικού μίγματος σύνθεσης NEBNext δεύτερου κλώνου και 45 μΙ νερού χωρίς νουκλεάση (80 μΙ συνολικός όγκος αντίδρασης). Η ισοθερμική ενίσχυση έγινε στους 16 °C για 1 ώρα και τα δίκλωνα νουκλεϊκά οξέα καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας 144 μl μαγνητικών AMPure XP Beads (Beckman Coulter). Διεξήχθησαν δύο στάδια πλύσης με πρόσφατα παρασκευασμένη αιθανόλη 70% πριν από την έκλουση σε 52 μΐ νερού χωρίς νουκλεάση. Παρασκευή βιβλιοθήκης αλληλουχίας Nanopore. Μια δεοξυαδενοσίνη απολινώθηκε στο 3'-άκρο των δίκλωνων νουκλεϊκών οξέων για να επιτραπεί η δέσμευση συμπληρωματικών προσαρμογέων προσδιορισμού αλληλουχίας. Πενήντα μικρολίτρα (μη) ενισχυμένου DNA αναμίχθηκαν με 7 μl Ultra II End-Prep Reaction Buffer (New England Biolabs) και 3 μl Ultra II End-prep μίγματος ενζύμων (New England Biolabs) και επωάστηκαν στους 20 °C για 5 λεπτά. και 65 °C για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, τα νουκλεϊνικά οξέα καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας 60 μΐ AMPure XP Beads και εκλούστηκαν σε 31 μΙ νερό χωρίς νουκλεάση. Οι προσαρμογείς προσδιορισμού αλληλουχίας, που παρέχονται με το κιτ αλληλουχίας απολίνωσης 1D (R9.4) (SQK-LSK108, ONT), συνδέθηκαν στα νουκλεϊκά οξέα με ουρά dA. Το τελικό προετοιμασμένο DNA (30 μl) αναμίχθηκε με 20 μl μείγματος προσαρμογέα (AMX, ONT) και 50 μl Blunt/TA Ligation Master Mix (New England Biolabs) σε συνολικό όγκο αντίδρασης 100 μl και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά . Η βιβλιοθήκη προσδιορισμού αλληλουχίας, που περιέχει δίκλωνο DNA με προσαρμογείς συνδεδεμένους στα άκρα 3', στη συνέχεια καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας σφαιρίδια AMPure XP 40 μΐ. Διεξήχθησαν δύο στάδια πλύσης χρησιμοποιώντας 140 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης σφαιριδίων προσαρμογέα (ABB, ΟΝΤ) πριν από την έκλουση σε 15 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης (ELB, ΟΝΤ). (EXP-LLB001, ONT), 12 µl προσαρμοσμένη και δεμένη βιβλιοθήκη και 12,5 μl νερό χωρίς νουκλεάση. Η αλληλούχιση έγινε με τη χρήση του λογισμικού προγράμματος λογισμικού MinKNOW (ONT). Βιο-πληροφορικές αναλύσεις. Οι ακατέργαστες αναγνώσεις παράγονται από την MinKNOW. Η ζωντανή βασική κλήση ενεργοποιήθηκε για το πρώτο πείραμα χρησιμοποιώντας την έκδοση 1.5.5 του MinKNOW. Στο δεύτερο πείραμα, η βασική κλήση έγινε μετά την εκτέλεση της αλληλουχίας χρησιμοποιώντας το Albacore (έκδοση 1.2.5., ONT). Οι βαθμολογίες ποιότητας και τα μήκη ανάγνωσης οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το NanoPlot, ακολουθούμενο από φιλτράρισμα ποιότητας με NanoFilt 63. Οι αναγνώσεις με q-score χαμηλότερο από 7 παραλήφθηκαν. Οι αλληλουχίες στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας διαφορετικές μεθόδους BLAST συμπεριλαμβανομένων των BLASTn και tBLASTx (BLAST έκδοση 2.6.0; e-value cut-off 1e −3 -1e −10 ) για σύγκριση της ευαισθησίας και των χρόνων εκτέλεσης για την ανίχνευση αλληλουχιών ιών μεταξύ των αναγνώσεων. Μια πλήρης βάση δεδομένων ιών αποτελείται από όλες τις αλληλουχίες ιών στο GenBank (ταξονομία ID 10239, που περιέχει αλληλουχίες έως τις 17 Σεπτεμβρίου 2017). Η καλύτερη επιτυχία (χαμηλότερη ηλεκτρονική αξία) οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το KronaTools 64 . Οι ιοί που ταιριάζουν με τις αναγνώσεις εξήχθησαν χρησιμοποιώντας το Seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) και χρησιμοποιήθηκαν σε αναλύσεις κατάντη. Το GraphMap (έκδοση 0.5.2) και το Samtools (έκδοση 1.6) χρησιμοποιήθηκαν για τη χαρτογράφηση αναγνώσεων έναντι αλληλουχιών αναφοράς, ενώ το Canu 1.6 χρησιμοποιήθηκε για de novo συναρμολόγηση ιικών γονιδιωμάτων [65] [66] [67] [68] . Το VirSorter εκτελέστηκε με τη χρήση της βάσης δεδομένων «Viromes» για την αναζήτηση φάγων, με ενεργοποιημένη τη λειτουργία απολύμανσης του ιού για την αναγνώριση συσσωρευτών φάγων 54 . Οι αναλύσεις βιοπληροφορικής εκτελέστηκαν σε ένα τοπικό σύμπλεγμα υπολογιστών και στις εγκαταστάσεις υπολογιστών υψηλής απόδοσης του Πανεπιστημίου της Γάνδης. Τα σύνολα δεδομένων που δημιουργήθηκαν κατά τη διάρκεια ή/και αναλύθηκαν κατά τη διάρκεια της τρέχουσας μελέτης είναι διαθέσιμα από τον αντίστοιχο συγγραφέα κατόπιν εύλογου αιτήματος. Αλληλουχία Sanger του γονιδίου πολυμεράσης κοβουϊού χοίρου. Ένας κοβουϊός χοίρου ανακαλύφθηκε στο δείγμα 17V079 χρησιμοποιώντας το MinION. Η αλληλουχία του τρισδιάστατου γονιδίου του κοβουϊού χοίρου κωδικοποιεί την πολυμεράση και θεωρείται ότι είναι πιο διατηρημένη μεταξύ των διαφορετικών στελεχών. Η ακριβής αλληλουχία νουκλεοτιδίων αυτού του ιού επαληθεύτηκε χρησιμοποιώντας αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής ακολουθούμενη από αλληλουχία Sanger, καθώς ελήφθη χαμηλή κάλυψη με το MinION. Η RT-PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RT-PCR OneStep (Qiagen) με τους πρόσφατα σχεδιασμένους εκκινητές Kobu_6049Fw και Kobu_7524Rv (IDT DNA Technologies) (Πίνακας 2). Η αντίδραση RT-PCR περιείχε 5 μl 5 × Qiagen OneStep ρυθμιστικού διαλύματος RT-PCR, 1 μl dNTPs, 3 μl από κάθε εκκινητή (10 μm), 7 μl νερό χωρίς νουκλεάση, 1 μl μίγμα ενζύμου OneStep RT-PCR και 5 μl εκμαγείου RNA ή νερό (συνολικός όγκος αντίδρασης 25 µl). Οι συνθήκες RT-PCR ήταν οι εξής: 50 °C για 30 λεπτά, 95 °C για 15 λεπτά, ακολουθούμενο από 30 κύκλους ενίσχυσης (94 °C για 30 δευτερόλεπτα, 50 °C για 30 δευτερόλεπτα και 72 °C για 90 δευτερόλεπτα) και ένα τελικό βήμα επέκτασης στους 72 °C για 1 λεπτό. Οι αντιδράσεις διατηρήθηκαν στους 10°C πριν από τη φόρτωση 5 μΙ προϊόντος PCR με 1 μΙ χρωστικής φόρτωσης σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5%. Διεξήχθη ηλεκτροφόρηση για 30 λεπτά στα 100 V και το προϊόν PCR έγινε ορατό με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου και υπεριώδες φως. Το αμπλικόνιο στάλθηκε στο GATC (Κωνστάντζα, Γερμανία) για προσδιορισμό αλληλουχίας Sanger χρησιμοποιώντας σύστημα ABI 3730xl DNA Analyzer. Ο ποιοτικός έλεγχος των ακατέργαστων χρωματογραφημάτων έγινε χρησιμοποιώντας 4Peaks (Nucleobytes BV, The Netherlands) και BLASTn (NCBI, Ηνωμένες Πολιτείες). Σχεδιάστηκαν ειδικοί εκκινητές RT-qPCR (Πίνακας 2) για το γονίδιο που κωδικοποιεί την πολυμεράση του κοβουϊού χοίρου χρησιμοποιώντας Primerquest και Oligoanaly IDT DNA Technologies) για να επιτρέψει την ακριβή ποσοτικοποίηση στα κόπρανα των χοιριδίων. Κάθε αντίδραση RT-qPCR αποτελούνταν από 10 μl PrecisionPlus OneStep qRT-PCR Mastermix που περιείχε SYBR Green, ROX και μια αδρανή μπλε βαφή με πιπέτα (Primerdesign, Southampton, Ηνωμένο Βασίλειο), 0,4 μl από κάθε εκκινητή (200 nM) και 6,2 μl νουκλεάσης νερό. Τρία μικρολίτρα εκμαγείου RNA ή νερό προστέθηκαν σε κάθε σωληνάριο που περιείχε 17 μΙ mastermix. Ένας συνθετικός θετικός μάρτυρας RNA (175nt) δημιουργήθηκε με RT-PCR χρησιμοποιώντας τους εκκινητές Kobu3D_qPCR +T7_Fw και Kobu3D_qPCR_Rv, ακολουθούμενο από in vitro μεταγραφή αυτού του προϊόντος PCR χρησιμοποιώντας πολυμεράση Τ7 RNA. Ο θετικός έλεγχος μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Nanodrop και χρησιμοποιήθηκε για τη ρύθμιση μιας τυπικής καμπύλης σε ένα γραμμικό δυναμικό εύρος (LDR) από έξι έως ένα log 10 αντίγραφα/αντίδραση. Οι συνθήκες αντίδρασης ήταν οι εξής: 55 °C για 10 λεπτά και 95 °C για 2 λεπτά, ακολουθούμενοι από 40 κύκλους μετουσίωσης (95 °C για 10 δευτερόλεπτα) και ανόπτηση (58 °C για 60 δευτερόλεπτα). Η ανίχνευση του φθορισμού SYBR Green έγινε στο τέλος κάθε φάσης ανόπτησης. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση καμπύλης τήξης για να εκτιμηθεί η ειδικότητα των αμπλικονίων που δημιουργήθηκαν. Κάθε σημείο αραίωσης στην τυπική καμπύλη και κάθε δείγμα δοκιμάστηκαν εις διπλούν. Τα αμπλικόνια αναλύθηκαν μία φορά σε πήκτωμα αγαρόζης για να εκτιμηθεί το σωστό μήκος του αμπλικονίου και η αλληλουχία Sanger διεξήχθη για να επιβεβαιωθεί η ενίσχυση του μερικού γονιδίου πολυμεράσης κοβουϊού χοίρου. Οι δοκιμασίες ήταν έγκυρες εάν η απόδοση έναντι του LDR ήταν μεταξύ 90 και 110%, και το R 2 των επαναλήψεων της τυπικής καμπύλης ήταν >0,99. Η ποσοτικοποίηση των ιικών φορτίων ήταν δυνατή εάν οι τιμές Cq δύο επαναλήψεων qPCR εμπίπτουν στο LDR της δοκιμασίας. Και τα δύο αντίγραφα έπρεπε να είναι θετικά για να θεωρηθεί ένα δείγμα ως θετικό. Εάν οι τιμές Cq συγκεκριμένων αμπλικονίων έχουν πέσει πίσω από το χαμηλότερο σημείο της τυπικής καμπύλης, το δείγμα θεωρήθηκε θετικό αλλά όχι ποσοτικοποιήσιμο. Διαχρονική διερεύνηση της αποβολής του κοβουϊού και του ροταϊού σε θηλάζοντα χοιρίδια. Μετά τον χαρακτηρισμό του ιού με το MinION, οργανώθηκε μια διαχρονική μελέτη παρακολούθησης μεταξύ Αυγούστου και Σεπτεμβρίου 2017. Για να διασφαλιστεί η κατάσταση της υγείας του αποθέματος χοίρων, η είσοδος στο αγρόκτημα ήταν αυστηρά ρυθμισμένη. Η δειγματοληψία έγινε από τον αγρότη. Λεπτομερείς οδηγίες και υλικά δειγματοληψίας δόθηκαν στον αγρότη. Η συλλογή δειγμάτων στη διαχρονική μελέτη πεδίου έγινε σε συμφωνία με την ευρωπαϊκή νομοθεσία για τα πειράματα σε ζώα. Η συλλογή δειγμάτων εγκρίθηκε και έγινε σύμφωνα με τις απαιτήσεις της Τοπικής Επιτροπής Δεοντολογίας της Σχολής Μηχανικών Κτηνιατρικής και Βιοεπιστημών του Πανεπιστημίου της Γάνδης. Μία ημέρα μετά τον τοκετό των χοιρομητέρων, επιλέχθηκαν τυχαία πέντε γέννες. Μέσα σε κάθε γέννα, εντοπίστηκε ένα χοιρίδιο για διαχρονική παρακολούθηση κατά τη διάρκεια ολόκληρης της περιόδου θηλασμού. Ένα στεγνό βαμβάκι από το ορθό (Copan) συλλέχθηκε από κάθε μεμονωμένο χοιρίδιο τις ημέρες 1, 5, 8, 11, 14, 17, 20 και 22 μετά τη γέννηση. Το στυλεό τοποθετήθηκε αμέσως σε 2 ml ιικού μέσου μεταφοράς (αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικά που περιέχει 1000 U/ml πενικιλλίνη (Continental Pharma, Puurs, Belgium), 1 mg/ml στρεπτομυκίνη (Certa, Braine l'Alleud, Βέλγιο), 1 mg/ ml γενταμυκίνη (Life Technologies) και 0,01% v/v Fungizone (Bristol-Myers Squibb, Braine l'Alleud, Βέλγιο)) σε αποστειρωμένο σωληνάριο Falcon των 15 ml (Sarstedt) και φυλάσσεται στους -20 °C. Κάθε εβδομάδα συλλέγονταν δείγματα από το αγρόκτημα και μεταφέρονταν στο Εργαστήριο Ιολογίας. Ζητήθηκε από τον αγρότη να σημειώσει το σωληνάριο κάθε δείγματος για παρουσία ή απουσία διαρροϊκών σημείων. Κατά την άφιξη στο Εργαστήριο Ιολογίας, τα δείγματα αποψύχθηκαν και τοποθετήθηκαν σε αναδευτήρα για 30 λεπτά στους 4 °C για να απελευθερωθούν ιικά σωματίδια στο μέσο μεταφοράς. Τα δείγματα εξήχθησαν χρησιμοποιώντας το QIAamp Cador Pathogen Mini Kit σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και τα καθαρισμένα νουκλεϊκά οξέα εκλούστηκαν σε 100 μl AVE και αποθηκεύτηκαν στους -70 °C μέχρι την ανάλυση RT-qPCR. Η ανάλυση RT-qPCR διεξήχθη, όπως περιγράφηκε παραπάνω, για να ποσοτικοποιηθούν τα αντίγραφα του γονιδιώματος του κοβουϊού χοίρου ανά στειλεό. Επιπλέον, η αποβολή RVA και RVC αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας προηγουμένως περιγραφείσες εσωτερικές δοκιμασίες RT-qPCR 25, 61. Βελγικοί θηλάζοντες χοίροι. Δείγματα κοπράνων (n = 44) διαρροϊκών θηλαζόντων χοιριδίων ηλικίας μικρότερης των 2 εβδομάδων στάλθηκαν σε ιδιωτικό εργαστήριο από κτηνιάτρους (Dialab, Belsele, Βέλγιο) για αιτιολογική διάγνωση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Αυτά τα δείγματα συλλέχθηκαν το 2014 και αποθηκεύτηκαν στους -70 °C στο εργαστήριο. Είχαν προηγουμένως αξιολογηθεί για την παρουσία ροταϊών χρησιμοποιώντας RT-qPCR 25. Η εκχύλιση RNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας το QIAamp Cador Pathogen Mini Kit (Qiagen) όπως περιγράφηκε παραπάνω και πραγματοποιήθηκε RT-qPCR για να ποσοτικοποιηθεί το φορτίο των αντιγράφων RNA του ιού kobuvirus. Δείγματα με ποσοτικοποιήσιμο ιικό φορτίο υποβλήθηκαν σε RT-PCR για την ενίσχυση του γονιδίου της 3D πολυμεράσης, μετά την οποία πραγματοποιήθηκε η αλληλουχία Sanger. Οι αλληλουχίες που κωδικοποιούν την πολυμεράση 11 βελγικών προϊόντων απομόνωσης κοβουϊού χοίρου κατατέθηκαν στην GenBank με αριθμούς εισαγωγής MH184664-MH184674. Οι αλληλουχίες χρησιμοποιήθηκαν για τη διεξαγωγή μιας ευθυγράμμισης πολλαπλών αλληλουχιών μαζί με άλλα στελέχη κοβουϊού χοίρου στο MEGA 7 χρησιμοποιώντας το πρόσθετο ClustalW 69 . Ένα φυλογενετικό δέντρο μέγιστης πιθανότητας κατασκευάστηκε με RAxML χρησιμοποιώντας ένα γενικό αναστρέψιμο μοντέλο χρόνου με κατανομή γάμμα (20 γάτες, άλφα: 0,121, LogLK = 14938,461) και ευρετική εναλλαγή κλάδων 70 . Η επεξεργασία δέντρου έγινε χρησιμοποιώντας το Affinity Designer (Serif). Οι αποστάσεις κατά ζεύγη υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το μοντέλο p-distance στο Mega με τιμές bootstrap που έχουν οριστεί σε 500 επαναλήψεις.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 1002, "text": "19,2 έως 103,5Χ" } ], "id": 5288, "question": "Ποιο ήταν το εύρος των βάθους γονιδιωματικής αλληλουχίας;" }, { "answers": [ { "answer_start": 42910, "text": "χαμηλότερο από 7" } ], "id": 5289, "question": "Ποιες αναγνώσεις βαθμολογίας q εξαλείφθηκαν από την ανάλυση;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6858, "text": "816 nt" } ], "id": 5290, "question": "Ποιο ήταν το μέσο μήκος της αλληλουχίας ανάγνωσης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 16255, "text": "17V079" } ], "id": 5291, "question": "Ποιο στέλεχος ήταν παρόμοιο με άλλα απομονωμένα στελέχη κοβουϊού χοίρου του Βελγίου;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Το C. difficile 630Δerm Spo0A Ρυθμίζει τη δημιουργία σπορίων, αλλά δεν συμβάλλει στην παραγωγή τοξινών, μέσω άμεσης σύνδεσης υψηλής συγγένειας με το DNA-στόχοhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3485338/SHA: f0fbd34bbd0000: f0fbd34bd0000: f0fbd3bbd0000: f0fbd3bbd006 Katharina E.; Bakker, Dennis; Kuijper, Ed J.; Smits, Wiep KlaasΗμερομηνία: 2012-10-31DOI: 10.1371/journal.pone.0048608Άδεια: cc-byAbstract: Το Clostridium difficile είναι ένα Gram θετικό, αναερόβιο βακτήριο που μπορεί να σχηματίσει εξαιρετικά ανθεκτικά ενδοσπόρια. Το βακτήριο είναι ο αιτιολογικός παράγοντας της λοίμωξης από C. difficile (CDI), για την οποία τα συμπτώματα μπορεί να κυμαίνονται από ήπια διάρροια έως δυνητικά θανατηφόρα ψευδομεμβρανώδη κολίτιδα και τοξικό μεγάκολο. Ο σχηματισμός ενδοσπόρων στα Firmicutes, συμπεριλαμβανομένου του C. difficile, διέπεται από τον βασικό ρυθμιστή για τη δημιουργία σπορίων, το Spo0A. Στον Bacillus subtilis, αυτός ο μεταγραφικός παράγοντας εμπλέκεται επίσης άμεσα ή έμμεσα σε διάφορες άλλες κυτταρικές διεργασίες. Εδώ, αναφέρουμε ότι το C. difficile Spo0A δείχνει υψηλό βαθμό ομοιότητας με την καλά χαρακτηρισμένη πρωτεΐνη B. subtilis και αναγνωρίζει μια παρόμοια αλληλουχία δέσμευσης. Διαπιστώνουμε ότι το εργαστηριακό στέλεχος C. difficile 630Δerm περιέχει διπλασιασμό 18 bp κοντά στον τομέα δέσμευσης DNA σε σύγκριση με το προγονικό του στέλεχος 630. Δοκιμασίες δέσμευσης in vitro με χρήση καθαρού C-τερματικού τομέα δέσμευσης DNA της πρωτεΐνης Spo0A C. difficile επιδεικνύουν άμεση σύνδεση με DNA ανοδικά των spo0A και sigH, γονίδια πρώιμης σπορίωσης και αρκετούς άλλους πιθανούς στόχους. Οι δοκιμές δέσμευσης in vitro υποδηλώνουν ότι το γονίδιο που κωδικοποιεί την κύρια κλωστριδιακή τοξίνη TcdB μπορεί να είναι άμεσος στόχος του Spo0A, αλλά το υπερκείμενο που προέρχεται από ένα αρνητικό στέλεχος spo0A δεν ήταν λιγότερο τοξικό για τα κύτταρα Vero από αυτό που ελήφθη από ένα στέλεχος άγριου τύπου, σε αντίθεση με το προηγούμενο Αναφορές. Αυτά τα αποτελέσματα εντοπίζουν για πρώτη φορά άμεσους (υποθετικούς) στόχους της πρωτεΐνης Spo0A στο C. difficile και καθιστούν απίθανη τη θετική επίδραση του Spo0A στην παραγωγή των μεγάλων κλωστριδιακών τοξινών. Κείμενο: Η σπορίωση είναι μια προσαρμοστική στρατηγική που επιτρέπει στα βακτήρια να επιβιώσουν σε σκληρό περιβάλλον συνθηκών για παρατεταμένες χρονικές περιόδους και αποτελεί αναπόσπαστο μέρος της μετάδοσης των σποριογενών παθογόνων και της ανοχής και αντοχής τους σε αντιμικροβιακές ενώσεις. Το Spo0A είναι ο βασικός ρυθμιστής για τη δημιουργία σπορίων [1, 2] . Οι περισσότερες από τις γνώσεις μας σχετικά με την πρωτεΐνη βασίζονται στην εργασία σε Bacilli. Το Spo0A είναι ένας ρυθμιστής απόκρισης που επιδεικνύει δέσμευση που εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση στο DNA [3] [4] [5] . Η φωσφορυλίωση λαμβάνει χώρα μέσω της συντονισμένης δράσης πολλών πρωτεϊνών που μαζί σχηματίζουν ένα λεγόμενο φωσφορικό στρώμα [6] . Ο καταρράκτης σηματοδότησης επιτρέπει την ενσωμάτωση περιβαλλοντικών σημάτων στη ρύθμιση των διαδικασιών που εξαρτώνται από το Spo0A, συμπεριλαμβανομένης της σπορίωσης. Οι δύο λειτουργικές περιοχές, η Ν-τερματική περιοχή φωσφορυλίωσης και διμερισμού (τομέας δέκτη) και η C-τερματική περιοχή σύνδεσης DNA (ενεργός) διαχωρίζονται από μια περιοχή άρθρωσης που είναι σχετικά ανεπαρκώς συντηρημένη [7] . Η φωσφορυλίωση πιστεύεται ότι έχει ως αποτέλεσμα μια δομική αναδιάταξη που διευκολύνει τον διμερισμό [8, 9], με αποτέλεσμα τη διακοπή των επαφών αναστολής της μεταγραφής μεταξύ των περιοχών δέκτη και τελεστή. Η απομονωμένη περιοχή δέσμευσης DNA μπορεί να δεσμεύσει νόμιμους στόχους της πρωτεΐνης Spo0A λόγω της απουσίας επαφών αναστολής της μεταγραφής, παρακάμπτοντας έτσι την ανάγκη για φωσφορυλίωση [10] . Ο εκτενής χαρακτηρισμός των στόχων Spo0A έχει αποκαλύψει ένα μοτίβο που αντιπροσωπεύει μια θέση δέσμευσης Spo0A υψηλής συγγένειας, το πλαίσιο 0A [10, 11] . Η κρυσταλλική δομή της περιοχής δέσμευσης DNA επιβεβαιώνει ειδικές και μη ειδικές επαφές μεταξύ της πρωτεΐνης και της συναινετικής αλληλουχίας [12, 13]. Αξίζει να σημειωθεί ότι το Spo0A ρυθμίζει πολλές άλλες διεργασίες εκτός από τη δημιουργία σπορίων, όπως η ικανότητα για γενετικό μετασχηματισμό, αντιγραφή DNA και σχηματισμός βιοφίλμ στο B. subtilis [14] [15] [16] , παράγοντες λοιμογόνου δράσης και αποκρίσεις στρες για παράδειγμα B. anthracis και B. thuringiensis [17] [18] [19] [20] [21] , και παραγωγή διαλυτών σε Clostridium acetobutylicum [22, 23] .C. Το difficile είναι ένα Gram θετικό, αναερόβιο βακτήριο που είναι ο αιτιολογικός παράγοντας της λοίμωξης από C. difficile (CDI) (για πρόσφατες ανασκοπήσεις βλέπε [24, 25] ). Αν και πολλοί άνθρωποι αποικίζονται ασυμπτωματικά από το C. difficile, το βακτήριο μπορεί να προκαλέσει σοβαρά προβλήματα υγείας, όπως ψευδομεμβρανώδη κολίτιδα και τοξικό μεγάκολο, υπό την επίδραση παραγόντων κινδύνου όπως η ηλικία και η χρήση αντιβιοτικών. Ως αποτέλεσμα, η CDI θεωρούνταν από καιρό ως νοσοκομειακή λοίμωξη. Πρόσφατα, ωστόσο, μπορεί να παρατηρηθεί αύξηση των περιπτώσεων κοινοτικής επίκτητης CDI [26] . Οι εστίες CDI έχουν συνδεθεί με τα λεγόμενα υπερμολυσματικά στελέχη, όπως οι ριβοτύποι PCR 027 (BI/NAP1) και 078 [27, 28]. Οι κύριοι λοιμογόνοι παράγοντες του είναι οι κύριες κλωστριδιακές τοξίνες Α και Β [29, 30]. Επιπλέον, ορισμένα στελέχη του C. difficile, συμπεριλαμβανομένων των ριβοτύπων 027 και 078, κωδικοποιούν επιπλέον μια δυαδική τοξίνη [31, 32]. Το C. difficile μεταδίδεται μέσω της κοπράνων-στοματικής οδού. Πιστεύεται ότι τα σπόρια είναι ζωτικής σημασίας για την επιτυχή μόλυνση των νέων ξενιστών, καθώς είναι σε θέση να αντέξουν το σκληρό περιβάλλον του στομάχου και να επιβιώσουν σε θεραπείες με αντιβιοτικά που μεταβάλλουν την ενδογενή χλωρίδα, μετά την οποία το C. difficile μπορεί να υπεραναπτυχθεί [24, 25] . είναι περιορισμένες γνώσεις για τη ρύθμιση της σπορίωσης στο C. difficile. Έχει αναφερθεί ότι το spo0A, όπως αναμενόταν, απαιτείται για το σχηματισμό σπορίων [33] και το γονίδιο απαιτείται για εμμονή και μετάδοση σε ποντίκια [34] . Αν και τα μονοπάτια κατάντη του Spo0A φαίνονται σε μεγάλο βαθμό διατηρημένα μεταξύ B. subtilis και Clostridia, αυτό ισχύει λιγότερο για τις οδούς που οδηγούν στην ενεργοποίηση του Spo0A [2] . Έχει προταθεί ότι η ορφανή κινάση ιστιδίνης CD2492 εμπλέκεται στην ενεργοποίηση του Spo0A [35] . Ομοίως, αναφέρθηκε ότι πολλαπλές ορφανές κινάσες ιστιδίνης μπορούν να φωσφορυλιώσουν το Spo0A στο C. acetobutylicum [36] . Πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι το spo0A μπορεί να μεταγραφεί από έναν εξαρτώμενο από SigH προαγωγέα [37] . Είναι άγνωστο ποια γονίδια ρυθμίζονται από την άμεση δέσμευση του Spo0A στις ανάντη περιοχές τους. Εδώ, καθιερώνουμε μια in vitro δοκιμασία δέσμευσης για το C. difficile Spo0A και αποδεικνύουμε για πρώτη φορά την άμεση σύνδεση αυτού του μεταγραφικού παράγοντα στο DNA ανάντη αρκετών πιθανών στόχων γονίδια. Τα στελέχη Escherichia coli αναπτύχθηκαν συνήθως σε ζωμό ή πλάκες Luria-Bertani, συμπληρωμένα με κατάλληλα αντιβιοτικά. Η χλωραμφενικόλη χρησιμοποιήθηκε σε τελική συγκέντρωση 20 mg/mL για πλάκες άγαρ και 10 mg/mL για υγρές καλλιέργειες. Η αμπικιλλίνη χρησιμοποιήθηκε σε τελική συγκέντρωση 100 mg/mL. Η καναμυκίνη χρησιμοποιήθηκε σε τελική συγκέντρωση 20 mg/mL. Η κλωνοποίηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας Ε. coli DH5a, η υπερέκφραση πραγματοποιήθηκε σε Ε. coli Rosetta (DE3) pLysS (Novagen). Τα στελέχη του C. difficile αναπτύχθηκαν σε ένα μέσο με βάση τη ζύμη τρυπτόνης χωρίς γλυκόζη (TTY; 3% w/v βακτοτρυπτόνη (BD), 2% εκχύλισμα ζύμης (Fluka), 0,1% w/v θειογλυκολικό (Sigma) pH 7,4), συμπληρωμένο με 20 mg/mL λινκομυκίνης όταν χρειάζεται, ή σε πλάκες CLO ή TSS (Biomerieux Όλα τα πλασμίδια παρατίθενται στον Πίνακα 1. Οι εκκινητές (που λαμβάνονται από τη Sigma Aldrich) παρατίθενται στο Κείμενο S1 και συγκεκριμένες συνθήκες ποδηλασίας είναι διαθέσιμες κατόπιν αιτήματος. Εκτός εάν σημειώνεται διαφορετικά, οι αντιδράσεις PCR διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας πολυμεράση Pfu (Fermentas) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το πλασμίδιο pWKS1251, για την υπερπαραγωγή Spo0A-DBD που φέρει μια C-τερματική ετικέτα 66His, κατασκευάστηκε ως εξής. Μια αλληλουχία που αντιστοιχεί στην περιοχή δέσμευσης DNA του Spo0A ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές oWKS-1123a και oWKS-1124 χρησιμοποιώντας χρωμοσωμικό DNA από το στέλεχος C. difficile 630Derm ως εκμαγείο. Το προκύπτον θραύσμα κλωνοποιήθηκε σε pCR2.1-TOPO (Invitrogen), αποδίδοντας pWKS1247. Αυτό το πλασμίδιο υπέστη πέψη με NdeI και XhoI, διαχωρίστηκε σε πήκτωμα 1% αγαρόζης/0,56 TAE (20 mM Tris Acetate, 0,5 mM EDTA), το θραύσμα που αντιστοιχεί στην περιοχή δέσμευσης DNA ανακτήθηκε με απομόνωση γέλης (χρησιμοποιώντας GeneJET Gel Extraction κιτ, Fermentas) και κλωνοποιήθηκε σε pMF14 με παρόμοια πέψη [10] που είχε απομονωθεί με γέλη με τον ίδιο τρόπο. Το κατασκεύασμα επαληθεύτηκε με PCR, αναλύσεις περιορισμού και προσδιορισμό αλληλουχίας DNA χρησιμοποιώντας εκκινητές oWKS-135 και oWKS-136 (βλ. παρακάτω). Το πλασμίδιο pWKS1245, για την παραγωγή πλήρους μήκους Spo0A που φέρει μια C-τερματική ετικέτα 6xHis, κατασκευάστηκε σε παρόμοια τρόπο που χρησιμοποιεί το χρωμοσωμικό DNA από το C. difficile 630Derm ως εκμαγείο, αλλά χρησιμοποιώντας το προϊόν PCR των εκκινητών oWKS-1122 και oWKS-1123a. Τα πλασμίδια που χρησιμοποιήθηκαν ως εκμαγεία PCR για τη δημιουργία ανιχνευτών EMSA κατασκευάστηκαν με κλωνοποίηση των προϊόντων PCR-ΤΟΡΟΡΟ21. . Τα ένθετα, και στην περίπτωση των μεταλλαγμένων προαγωγέων PabrB, η παρουσία των επιθυμητών σημειακών μεταλλάξεων στο πλαίσιο συναίνεσης 0Α, επαληθεύτηκαν με προσδιορισμό αλληλουχίας DNA χρησιμοποιώντας εκκινητές oWKS-24 και oWKS-25 (βλ. παρακάτω). Τα πλασμίδια βαθμού αλληλουχίας απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ Nucleospin Plasmid QuickPure (Macherey Nagel) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, εκτός από το ότι δύο αντιδράσεις λύσης συνδυάστηκαν σε ένα μόνο φίλτρο και εκλούστηκαν με 65uC προθερμασμένο ρυθμιστικό διάλυμα ΑΕ. Όλα τα κατασκευάσματα αναλύθηκαν με τη χρήση χημείας BigDye Terminator (Invitrogen) σε έναν προσδιοριστή αλληλουχίας ABI3130 (Perkin Elmer), σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Εν συντομία, 200 ng πλασμιδίου αναμίχθηκαν με 3,2 pmol εκκινητή, 1 mL Μείγμα Έτοιμου Αντίδρασης Τερματιστή (Invitrogen) σε τελικό όγκο 20 mL. Μετά τη θερμοκυκλοποίηση, το DNA καταβυθίστηκε και πλύθηκε με 65% ισοπροπανόλη, και διαλύθηκε σε 12 mL φορμαμιδίου HiDi (Invitrogen) στους 96 uC για 2 λεπτά και αποθηκεύτηκε στο σκοτάδι στους 4 uC μέχρι την εκτέλεση της αλληλουχίας. Οι αναλύσεις αλληλουχίας πραγματοποιήθηκαν σε CloneManager Professional Suite 7 (SciEd) και Geneious έκδοση 5.6.2 (Biomatters Ltd). Τα πλασμίδια pWKS1245 και pWKS1251 μετασχηματίστηκαν σε E. coli Rosetta(DE3) pLysS (Novagen). Τα προϊόντα μετασχηματισμού χρησιμοποιήθηκαν για τον εμβολιασμό 25 mL LB με κατάλληλα αντιβιοτικά. Μετά από ολονύκτια επώαση, τα κύτταρα αραιώθηκαν 1:100 σε 500 mL φρέσκου μέσου που περιείχε κατάλληλα αντιβιοτικά. Η παραγωγή πρωτεΐνης προκλήθηκε με 1 mM IPTG σε OD600 0,7 και η ανάπτυξη συνεχίστηκε για άλλες τρεις ώρες πριν από τη συγκομιδή. Τα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS και αποθηκεύτηκαν στους 280uC για μετέπειτα χρήση. Ο καθαρισμός των πρωτεϊνών έγινε ουσιαστικά όπως περιγράφεται [10] . Εν συντομία, τα κύτταρα διασπάστηκαν σε ρυθμιστικό λύσης 4 mL (2 mM PMSF, 10 mM ιμιδαζόλη, 5 mM β-μερκαπτοαιθανόλη, 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, ρΗ 7,9). Διαυγασμένα κυτταρολύματα επωάσαμε με 2 mL προ-ισορροπημένης ιλύς 50% TALON (Clontech) σε τελικό όγκο ρυθμιστικού λύσης 15 mL για 1 ώρα. Η ρητίνη αφέθηκε να κατακαθίσει σε στήλη Poly-Prep (BioRad) και πλύθηκε με 2 mL ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (20 mM ιμιδαζόλη, 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, ρΗ 7,9). Η πρωτεΐνη εκλούστηκε σταδιακά σε κλάσματα του 1 mL μετά την εφαρμογή 2 mL ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης στη στήλη (πανομοιότυπο με το ρυθμιστικό έκπλυσης αλλά με 50, 100, 250 ή 500 mM ιμιδαζόλη). Η όλη διαδικασία πραγματοποιήθηκε στους 4uC. Τα κλάσματα προσδιορίστηκαν ως προς την καθαρότητα και την απόδοση και τα κατάλληλα κλάσματα υποβλήθηκαν σε διαπίδυση έναντι 26 1 L ρυθμιστικού διαλύματος διαπίδυσης (50 mM Tris-HCl ρΗ 8, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT) χρησιμοποιώντας κασέτες Slide-A-Lyzer με αποκοπή μοριακού βάρους 35. kDa (Pierce). Οι πρωτεΐνες αποθηκεύτηκαν στους 280 uC σε ρυθμιστικό διάλυμα αποθήκευσης (πανομοιότυπο με το ρυθμιστικό διάλυμα αιμοκάθαρσης αλλά περιείχε 20% γλυκερίνη). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Bradford (BioRad), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Θραύσματα DNA για χρήση στο πείραμα EMSA δημιουργήθηκαν με PCR χρησιμοποιώντας πολυμεράση GoTaq (Promega) και χρωμοσωμικό DNA από B. subtilis JH642 (Bacillus Genetic Stock Center 1A96; http://www.bgsc.org), πλασμίδια που αναφέρονται στον Πίνακα 1, ή χρωμοσωμικό DNA από το C. difficile 630Derm [38] ως πρότυπο. Οι εκκινητές και οι συγκεκριμένες συνθήκες κύκλου για τη δημιουργία των ανιχνευτών EMSA παρατίθενται στο Κείμενο S1. Θραύσματα DNA του αναμενόμενου μεγέθους απομονώθηκαν από 16TAE/8% φυσικό πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάχυσης (0,5 Μ οξικό αμμώνιο, 10 mM οξικό μαγνήσιο, 1 mM EDTA pH 8, 0,1% SDS) και κιτ QIAExII (Qiagen), σύμφωνα με σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το ανακτηθέν DNA επισημάνθηκε στο τέλος με 32P-c-ATP χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα FR και κινάση Τ4 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ειδική δραστηριότητα προσδιορίστηκε σε μετρητή σπινθηρισμού LS6000 (Beckman). Οι συνθήκες EMSA βασίστηκαν σε προηγούμενες μελέτες [10] . Εν συντομία, οι αντιδράσεις δέσμευσης πραγματοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης (10 mM Tris-HCl ρΗ 7,6, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 5% γλυκερόλη) παρουσία 200 mg/mL αλβουμίνης ορού βοείου (NEB) και 200 ​​cpm/mL ραδιοσημασμένο θραύσμα DNA. Οι αντιδράσεις επωάστηκαν για 20 λεπτά στους 30 uC πριν από τη φόρτωση σε ένα μη μετουσιωτικό πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 16 ΤΑΕ/8% που είχε προκατασκευαστεί για 20 λεπτά στα 50 V σε ρυθμιστικό διάλυμα 16 ΤΑΕ. Διεξήχθη ηλεκτροφόρηση για 120 λεπτά στα 85 V. Μετά από ξήρανση υπό κενό οι γέλες σε διηθητικό χαρτί, απεικονίστηκαν μετά από ολονύκτια έκθεση σε οθόνες Phosphorimager σε ένα όργανο Typhoon (GE Healthcare). Οι τοξικές επιδράσεις των υπερκειμένων καλλιέργειας C. difficile σε κύτταρα Vero (ένα ευγενικό δώρο του Eric Snijder [39] ) καθορίστηκαν ως εξής. Το υπερκείμενο από μια βακτηριακή καλλιέργεια συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση κυττάρων για 3 λεπτά στα 140006 g και διηθήθηκε σε ένα φίλτρο οξικής κυτταρίνης 0,45 mM χρησιμοποιώντας μια σύριγγα. Τα υπερκείμενα αραιώθηκαν 2 φορές σειριακά σε μέσο κυτταροκαλλιέργειας (με Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (Lonza) συμπληρωμένο με 100 mg/mL πενικιλλίνη, 100 U/mL στρεπτομυκίνη, 10% ορό εμβρύου μόσχου), πριν την εφαρμογή τους σε μια μονοστοιβάδα κυττάρων Vero, και η επώαση συνεχίστηκε για άλλη μία ώρα. Ως θετικός έλεγχος, προστέθηκαν στα κύτταρα 50 mL 1:10 αραιωμένη καθαρισμένη τοξίνη (Techlab). Για να προσδιοριστεί εάν οι παρατηρούμενες κυτταροτοξικές επιδράσεις ήταν ειδικές για τις μεγάλες κλωστριδιακές τοξίνες, η εμπορικά διαθέσιμη αντι-τοξίνη έναντι των TcdA και TcdB (Techlab) προστέθηκε σε 10 φορές αραιωμένο βακτηριακό υπερκείμενο για 60 λεπτά πριν από την επώαση στα κύτταρα Vero. Οι τίτλοι τελικού σημείου τοξίνης ορίστηκαν ως η χαμηλότερη αραίωση στην οποία δεν παρατηρήθηκαν κυτταροπαθολογικές επιδράσεις (στρογγυλοποίηση κυττάρων). Η στατιστική σημασία αξιολογήθηκε με ανεξάρτητο δείγμα t-test. Η ανοσοποίηση ποντικών με πλήρους μήκους C. difficile Spo0A-6xHis έγινε ευγενικά στο Welcome Trust Sanger Institute (Hinxton, UK). Κύτταρα από 1 mL καλλιέργειας C. difficile συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις 14000 rpm σε επιτραπέζιο φυγόκεντρο και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα επαναιώρησης 200 mL (10 mM Tris HCl ρΗ 8, 10 mM EDTA, 0,5 mg/mL mM Pefabloc SC (Roche)). Μετά από επώαση για 30 λεπτά στους 37uC, προστέθηκαν 50 mL ρυθμιστικού διαλύματος δειγμάτων 56 SDS (0,1 M DTT, 2% SDS, 50 mM Tris HCl ρΗ 6,8, 10% γλυκερίνη, 0,0025% BPB) και τα δείγματα θερμάνθηκαν στους 59°C. λεπτά. Τα ολικά κυτταρολύματα (ποσότητες που διορθώθηκαν για OD600) διαχωρίστηκαν σε ένα πήκτωμα 12% SDS-PAGE πριν από την ημίξηρη κηλίδωση για 1 ώρα στα 10 V σε μια μεμβράνη φθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα PBST (αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό με 0,1% ν/ν Tween-20) που περιείχε 5% αντιδραστήριο αποκλεισμού μεμβράνης (Amersham Biosciences). Για να απεικονιστεί ο καθαρισμένος από πρωτεΐνη Spo0A πολυκλωνικός ορός από ένα μόνο ποντίκι σε αραίωση 1:3000, χρησιμοποιήθηκε είτε ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με HRP κατσίκας-αντί-ποντικού που ακολουθείται από ανίχνευση ECL+ (Amersham Bioscience), είτε από μια κατσικίσια αντι-ποντικού-βιοτίνη -συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (Dako) ακολουθούμενο από ένα τριτοταγές αντίσωμα συζευγμένο με αντιβιοτίνη ποντικού Cy3 (Jackson). Η ανίχνευση έγινε χρησιμοποιώντας ένα όργανο Typhoon (GE Healthcare). Οι όγκοι κορυφής που διορθώθηκαν στο υπόβαθρο ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ImageQuant TL (Amersham Biosciences). Οι ευθυγραμμίσεις των B. subtilis και C. difficile spo0A έγιναν χρησιμοποιώντας ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) στο με βάση τις δημοσιευμένες αλληλουχίες γονιδιώματος, τους αριθμούς πρόσβασης Genbank AL009126 και AM180355, αντίστοιχα, και την αλληλουχία 630Derm spo0A όπως προσδιορίζεται σε αυτή τη μελέτη. Η αλληλουχία για spo0A του στελέχους C. difficile 630Derm κατατέθηκε στην Genbank (αριθμός πρόσβασης JX050222). Τα πλαίσια Consensus Spo0A αναγνωρίστηκαν χρησιμοποιώντας μια εντολή Single string Search στο Genome2D [40] , επιτρέποντας 0 αναντιστοιχίες. Οι θέσεις του πλαισίου συνδέθηκαν με γονίδια προς τα πάνω και προς τα κάτω χρησιμοποιώντας τη δυνατότητα \"Προσθήκη πλησιέστερου γονιδίου στη λίστα μοτίβων DNA\" και το Microsoft Excel. Τα αποτελέσματα επιθεωρήθηκαν χειροκίνητα για αυτά τα κουτιά εντός 500 bp ανάντη ενός γονιδίου στον ίδιο κλώνο. Οι εικόνες για δημοσίευση παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ImageQuant TL (Amersham Biosciences), Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems Inc) και Corel Graphics Suite X5 (Corel Corporation). Προκειμένου να χαρακτηριστεί το C. difficile Spo0A, η πρωτεΐνη πλήρους μήκους και ο τομέας δέσμευσης DNA της ( DBD) εκφράστηκαν ως πρωτεΐνη με επισήμανση Cterminally 66His στον ετερόλογο ξενιστή Escherichia coli (Εικ. 1Α) και καθαρίστηκε σε σχεδόν ομοιογένεια χρησιμοποιώντας χρωματογραφία συγγένειας μετάλλου (Εικ. 1Α; λωρίδες P). Η πρωτεΐνη πλήρους μήκους χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη αντισωμάτων για την ανίχνευση Spo0A σε ολικά προϊόντα λύσης των στελεχών C. difficile και η καθαρισμένη περιοχή σύνδεσης DNA χρησιμοποιήθηκε σε επακόλουθες in vitro προσδιορισμούς δέσμευσης (βλέπε παρακάτω). Προσδιορίσαμε την έκφραση του C. difficile Spo0A σε όλη την ανάπτυξη . Βρήκαμε ότι η πρωτεΐνη υπάρχει σε προϊόντα λύσης από κύτταρα εκθετικής έως σταθερής φάσης ανάπτυξης. Πραγματοποιήσαμε ανοσοστύπωση χρησιμοποιώντας πολυκλωνικά αντισώματα κατά του C. difficile Spo0A σε ολικά προϊόντα λύσης άγριου τύπου και μεταλλαγμένων κυττάρων spo0A που αναπτύχθηκαν σε μέσο με βάση τη ζύμη τρυπτόνης (TTY). Βρήκαμε ένα σαφές σήμα του αναμενόμενου μεγέθους για πλήρους μήκους Spo0A (,31 kDa) ήδη από 3 ώρες μετά τον εμβολιασμό (φάση εκθετικής ανάπτυξης), έως τη φάση μετάβασης (8 ώρες) καθώς και 24 και 48 ώρες μετά τον εμβολιασμό (στάσιμη ανάπτυξη φάση) ( Εικόνα 1Β; 630Δέρμα) . Τα σήματα ήταν ειδικά για το C. difficile Spo0A καθώς απουσίαζαν από προϊόντα λύσης από το μετάλλαγμα C. difficile spo0A (Εικ. 1B, CT::spo0A). Λάβαμε παρόμοια αποτελέσματα σε άλλα μέσα, όπως ο συνήθως χρησιμοποιούμενος συμπληρωμένος ζωμός έγχυσης εγκεφάλου καρδιάς (BHIS; Δεδομένα δεν φαίνονται). Για τον προσδιορισμό των σχετικών επιπέδων Spo0A σε όλη την ανάπτυξη, πραγματοποιήσαμε ένα πείραμα ανοσοστύπωσης χρησιμοποιώντας φθορίζοντα αντισώματα, το οποίο δίνει περισσότερες ποσοτικές πληροφορίες σε σύγκριση με τη χρήση συζευγμένων αντισωμάτων υπεροξειδάσης χρένου στα χέρια μας. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα του Spo0A αυξάνονται περίπου 20 φορές από 6 ώρες μετά τον εμβολιασμό και παραμένουν σε παρόμοια επίπεδα από 8 έως 48 ώρες μετά τον εμβολιασμό (Εικόνα 1C). Αν και θα πρέπει να σημειωθεί ότι τα στυπώματα Western δεν παρέχουν πληροφορίες για τη φωσφορυλίωση κατάσταση της πρωτεΐνης, συμπεραίνουμε ότι η πρωτεΐνη σε ενεργή ή ανενεργή μορφή υπάρχει σε όλη την ανάπτυξη και είναι πιο άφθονη στη στατική φάση ανάπτυξης. χαρακτηρίστηκε πρωτεΐνη Spo0A B. subtilis στο C. difficile 630 (CD1214) και προηγούμενες εργασίες κατέδειξαν ότι ένα μετάλλαγμα spo0A (μια αδρανοποίηση παρεμβολής του cd1214) -όπως αναμενόταν - δεν σχηματίζει πλέον σπόρια [41] . Οι αναλύσεις στο silico προτείνουν παρόμοια δευτερογενή δομή και για τις δύο πρωτεΐνες (Εικ. 2A), με έναν διατηρημένο τομέα διμερισμού και δέσμευσης DNA, που διαχωρίζεται από μια κακώς συντηρημένη περιοχή άρθρωσης [7, 12]. Συγκρίναμε την αλληλουχία του CD1214 που ελήφθη από το εργαστηριακό μας στέλεχος 630Derm [38] με αυτή του δημοσιευμένου γονιδιώματος C. difficile 630 [42] . Το στέλεχος 630Derm είναι ένα αυθόρμητο στέλεχος ευαίσθητο στην ερυθρομυκίνη, το οποίο χρησιμοποιείται συνήθως σε μελέτες μεταλλαξιογένεσης και ελήφθη με σειριακή διέλευση του στελέχους 630 [33, 38]. Η αλληλουχία 630Derm spo0A (Genbank accession no JX050222) προήλθε από τα πλασμίδια έκφρασης που κατασκευάστηκαν για αυτή τη μελέτη και επιβεβαιώθηκε σε μια ολόκληρη αλληλουχία γονιδιώματος του στελέχους 630Derm που δημιουργήθηκε στο εργαστήριό μας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Βρήκαμε ότι το 630Derm spo0A περιέχει μια άμεση επανάληψη 18 ζευγών βάσεων, με αποτέλεσμα διπλασιασμό 6 αμινοξέων (NVGNIE) σε σύγκριση με τη δημοσιευμένη αλληλουχία αναφοράς. Ο διπλασιασμός χαρτογραφείται σε μια περιοχή της πρωτεΐνης με σχετικά χαμηλή διατήρηση αλληλουχίας (άρθρωσης), πλευρίζοντας την εξαιρετικά συντηρημένη περιοχή σύνδεσης DNA (Εικ. 2Α και Β). Επαληθεύσαμε την απουσία αυτού του διπλασιασμού στο στέλεχος 630 με PCR (Εικ. 2C ) καθώς και τον προσδιορισμό της αλληλουχίας από το χρωμοσωμικό DNA του C. difficile 630 (τα δεδομένα δεν φαίνονται), για να αποκλειστεί ένα σφάλμα στην αρχική αλληλουχία γονιδιώματος και να αποδειχθεί ότι η διαφορά στο μέγεθος του προϊόντος PCR ήταν ειδική για την εισαγωγή 18 bp . Επιπλέον, ελέγξαμε διάφορα άλλα στελέχη ριβοτύπων 12 PCR (στα οποία ανήκουν τα 630 και 630Derm) με PCR, αλλά ο διπλασιασμός βρέθηκε να είναι μοναδικός για το 630Derm μεταξύ των απομονώσεων που δοκιμάστηκαν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).C. Το difficile Spo0A-DBD Δείχνει παρόμοια εξειδίκευση με το B. subtilis Spo0A-DBD Στη συνέχεια, εξετάσαμε τη διατήρηση του τομέα δέσμευσης DNA του Spo0A (Spo0A-DBD) μεταξύ του B. subtilis και του C. difficile. Στο B. subtilis έχουν οριστεί υπολείμματα αμινοξέων που έρχονται σε επαφή με τη ραχοκοκαλιά του DNA και αλληλεπιδρούν με συγκεκριμένα υπολείμματα της αλληλουχίας δέσμευσης Spo0A [13] . Βρήκαμε ότι όλα αυτά τα υπολείμματα διατηρήθηκαν στην αλληλουχία πρωτεΐνης C. difficile (Εικ. 2B), υποδεικνύοντας ότι η πρωτεΐνη πιθανότατα αναγνωρίζει ένα παρόμοιο μοτίβο. Η δέσμευση DNA από Spo0A πλήρους μήκους στο B. subtilis απαιτεί διμερισμό που εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση [8, 9]. Ωστόσο, αποδείχθηκε ότι το απομονωμένο DBD είναι ικανό να συνδέεται με νόμιμους στόχους της πρωτεΐνης πλήρους μήκους [10] . Ανάλογα, καθαρίσαμε το C. difficile Spo0A-DBD για χρήση σε in vitro προσδιορισμούς δέσμευσης. Καθώς μέχρι στιγμής δεν έχουν αναφερθεί άμεσοι στόχοι για την πρωτεΐνη C. difficile, χρησιμοποιήσαμε την ανάντη περιοχή του γονιδίου abrB (PabrB) του B. subtilis. Το PabrB χρησιμοποιείται συνήθως ως μάρτυρας υψηλής συγγένειας σε προσδιορισμούς δέσμευσης με την πρωτεΐνη B. subtilis Spo0A ή Spo0A-DBD [43, 44]. Αξίζει να σημειωθεί ότι δεν καταφέραμε να αναγνωρίσουμε ένα ομόλογο του abrB στο C. difficile χρησιμοποιώντας το BLAST, υποδεικνύοντας ότι η πιθανή έμμεση ρύθμιση από το Spo0A δεν μπορεί να συμβεί μέσω του abrB στο C. difficile όπως συμβαίνει στο B. subtilis. Βρήκαμε ότι το C. difficile Spo0A-DBD συνδέεται με υψηλή συγγένεια με το PabrB (Εικ. 2D και E) . Πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς ηλεκτροφορητικής μετατόπισης κινητικότητας (EMSAs) χρησιμοποιώντας ραδιοσημασμένο PabrB και αυξανόμενες ποσότητες καθαρισμένου C. difficile Spo0A-DBD που καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας μια C-τερματική ετικέτα 66His. Η προσθήκη πρωτεΐνης οδηγεί σε δοσοεξαρτώμενη επιβράδυνση του θραύσματος DNA με εμφανή KD ,50 nM. Στο ίδιο εύρος συγκεντρώσεων πρωτεΐνης, δεν παρατηρήθηκε δέσμευση για έναν αρνητικό έλεγχο (ένα θραύσμα DNA του B. subtilis citG [45] ) (Εικ. 2Ε), υποδηλώνοντας ότι η δέσμευση ήταν ειδική για την περιοχή προαγωγέα abrB.Β. Το subtilis Spo0A αναγνωρίζει μια ξεχωριστή ακολουθία (0A κουτί), που χαρακτηρίζεται από ένα μοτίβο πυρήνα 7 bp (TGTCGAA) [10, 11] . Δομικές μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι η πρωτεΐνη κάνει συγκεκριμένες επαφές με το G στη θέση 2 (G2) και το C στη θέση 4 (C4) και 5 (G5) αυτού του μοτίβου [13] . Εισαγάγαμε μεταλλάξεις G2A, C4A, G5A, G2A/C4A και C4A/G5A στο τέλειο συναινετικό 0A-box που υπάρχει στο PabrB. Βρήκαμε ότι η συγγένεια του C. difficile Spo0A για αυτά τα μεταλλαγμένα θραύσματα PabrB ήταν πολύ μειωμένη (Εικ. 2Ε). Πραγματοποιήσαμε EMSA χρησιμοποιώντας ραδιοσημασμένο PabrB που περιέχει τη μεταλλαγμένη αλληλουχία πυρήνα. Για τις μονοσημειακές μεταλλάξεις στο DNA, η συγγένεια μειώθηκε 10 φορές. Δεν φάνηκε να υπάρχει αθροιστική επίδραση μιας δεύτερης σημειακής μετάλλαξης για τους δύο συνδυασμούς που δοκιμάστηκαν. Καμία από τις μεταλλάξεις δεν κατάργησε τη σύνδεση του C. difficile Spo0A εντελώς, πιθανότατα ως αποτέλεσμα της δέσμευσης του Spo0A σε άλλα (χωρίς συναίνεση) κουτιά 0A στον προαγωγέα abrB [44] . Συνολικά, συμπεραίνουμε ότι τα υπολείμματα γουανίνης και κυτοσίνης στον πυρήνα το μοτίβο TGTCGAA του PabrB είναι σημαντικά για την ειδική δέσμευση αυτού του θραύσματος από το C. difficile Spo0A-DBD. Τιμή για δέσμευση από το C. difficile Spo0A-DBD Παραπάνω, έχουμε διαπιστώσει ότι το Spo0A-DBD του C. difficile είναι εξαιρετικά ομόλογο με αυτήν της πρωτεΐνης Spo0A του B. subtilis και ότι οι πρωτεΐνες αναγνωρίζουν μια παρόμοια συναινετική αλληλουχία (Εικ. 2). Με βάση αυτές τις πληροφορίες, εντοπίσαμε τα διάφορα γονίδια ως πιθανούς άμεσους στόχους του C. difficile Spo0A. Ζητήσαμε την αλληλουχία γονιδιώματος του C. difficile 630 για τέλεια αντιστοιχία με το πλαίσιο πυρήνα 0A χρησιμοποιώντας το Genome2D [40] . Μια τέτοια ανάλυση αποκάλυψε την παρουσία 102 ταιριασμένων μοτίβων, από τα οποία τα 45 βρίσκονταν εντός 500 bp από το εναρκτήριο ATG ενός ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης στον ίδιο κλώνο (βλέπε Πίνακα S1). Η προσοχή μας στράφηκε στα spo0A και sigH, καθώς αυτά τα δύο γονίδια είχαν προηγουμένως βρεθεί ότι ρυθμίζονται από το Spo0A στο B. subtilis ή/και παίζουν σημαντικό ρόλο στη δημιουργία σπορίων [3, [46] [47] [48] . Βρήκαμε ότι το C. difficile Spo0A δεσμεύτηκε σε αλληλουχίες DNA ανάντη του spo0A και του sigH. Πραγματοποιήσαμε EMSAs με DNA που περιελάμβανε 220-281 bp ανάντη του κωδικονίου ATG έναρξης των ανοιχτών πλαισίων ανάγνωσης spo0A, sigH και spoVG. Βρήκαμε ότι η προσθήκη Spo0A-DBD στις αντιδράσεις προκάλεσε επιβράδυνση των θραυσμάτων spo0A και sigH DNA (Εικ. 3Α), αλλά όχι ενός θραύσματος spoVG που δεν περιείχε ένα πλαίσιο συναίνεσης 0Α (Εικ. 3Β). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η συγγένεια του Spo0A-DBD για την περιοχή ανάντη του spo0A ήταν η υψηλότερη που έχουμε παρατηρήσει μέχρι στιγμής για οποιοδήποτε DNA του C. difficile. Επιπλέον, η παρουσία πολλαπλών μετατοπισμένων ειδών θα μπορούσε να υποδηλώνει την παρουσία περισσότερων από μία ισχυρών θέσεων δέσμευσης. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι το spo0A και το sigH είναι πιθανώς νόμιμοι στόχοι του Spo0A στο C. difficile και επιβεβαιώνουν ότι το spoVG δεν είναι σύμφωνο με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν στο B. subtilis [10] . Μας ενδιέφερε να δούμε εάν το Spo0A στο C. difficile θα μπορούσε δυνητικά ρυθμίζουν γονίδια που δεν έχουν τεκμηριωμένη λειτουργία στη σπορίωση. Η ανάλυσή μας σε silico εντόπισε πολλά γονίδια χωρίς προφανή σύνδεση με σπορίωση που είχαν ένα πλαίσιο συναίνεσης 0Α εντός 100 bp ανάντη του κωδικονίου έναρξης τους. Αυτή η τοποθέτηση είναι παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε για spo0A (275) και sigH (278). Επιβεβαιώσαμε τη δέσμευση in vitro του C. difficile Spo0A-DBD στις περιοχές προαγωγέα των lplA και ssuA. Πραγματοποιήσαμε πειράματα EMSA χρησιμοποιώντας ανιχνευτές που περιλάμβαναν την τέλεια θέση συναίνεσης και καθαρισμένη πρωτεΐνη Spo0A-DBD. Παρατηρήσαμε σύνδεση της πρωτεΐνης σε θραύσματα ανάντη του γονιδίου lplA (CD1654; κουτί στο 267) και το γονίδιο ssuA (CD1484; κουτί στο 282) (Εικ. 3Α). Το γονίδιο lplA κωδικοποιεί μια προβλεπόμενη λιποϊκή-πρωτεϊνική λιγκάση και το ssuA σημειώνεται ως μεταφορέας αλειφατικών σουλφονικών ABC. από ό,τι γνωρίζουμε, κανένα από αυτά δεν έχει εμπλακεί άμεσα στη δημιουργία σπορίων ή έχει βρεθεί ότι είναι στόχος για Spo0A σε άλλους οργανισμούς. Μαζί τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν τη δυνατότητα δέσμευσης του Spo0A στο DNA πριν από τα spo0A και sigH, δύο γονίδια που είναι σημαντικά για τη δημιουργία σπορίων , και υποδεικνύουν ότι το Spo0A μπορεί να έχει λειτουργίες που υπερβαίνουν τη ρύθμιση της σπορίωσης στο C. difficile. Έχει διαπιστωθεί ότι ένα μετάλλαγμα spo0A του C. difficile δεν παράγει σπόρια, σύμφωνα με έναν κρίσιμο ρόλο στην οδό σπορίωσης [33] . Ωστόσο, η in silico ταυτοποίηση των ανάντη περιοχών με μια συναινετική θέση δέσμευσης Spo0A δεν έδειξε κανένα από τα πρώιμα γονίδια σπορίωσης (κατάντη του ίδιου του spo0A) ως άμεσους στόχους του Spo0A. Αυτό είναι πιθανόν το αποτέλεσμα παραλλαγών στο πλαίσιο 0A σε αυτούς τους προαγωγείς που αγνοήθηκαν στην αναζήτηση πλαισίου. Προς υποστήριξη αυτού, πολλοί καλά χαρακτηρισμένοι νόμιμοι άμεσοι στόχοι του B. subtilis Spo0A (όπως spoIIAA και spoIIE) δεν περιέχουν 100% αντιστοιχία με το βασικό μοτίβο, αλλά μάλλον ένα ή περισσότερα πλαίσια σχεδόν συναίνεσης [5, 49] . Βρήκαμε ότι Spo0A- Πραγματοποιήσαμε πειράματα EMSA χρησιμοποιώντας αυξανόμενες ποσότητες καθαρισμένου Spo0A-DBD από το C. difficile 630Derm και τα θραύσματα DNA που υποδεικνύονται παραπάνω (Εικ. 3Β). Για το spoIIAA (που κωδικοποιεί έναν αντι-σίγμα παράγοντα) και το spoIIE (που κωδικοποιεί μια φωσφατάση σερίνης), παρατηρήσαμε ένα μετατοπισμένο είδος χαμηλής έντασης σε συγκεντρώσεις τόσο χαμηλές όσο 150 nM. Για το spoIIGA (που κωδικοποιεί μια ειδική πρωτεάση για σπορίωση) παρατηρήσαμε το μετατοπισμένο είδος μόνο σε υψηλότερες συγκεντρώσεις πρωτεΐνης (0,200 nM). Ο αρνητικός έλεγχος (spoVG) δεν έδειξε δέσμευση του Spo0A-DBD σε αυτές τις συγκεντρώσεις. Επιπλέον, η μετατόπιση που παρατηρήσαμε ήταν αναστρέψιμη χρησιμοποιώντας μη επισημασμένο DNA που περιείχε μια θέση σύνδεσης υψηλής συγγένειας, αλλά όχι χρησιμοποιώντας μη επισημασμένο DNA που δεν είχε τέτοια θέση (Εικόνα S1B-D). Επομένως, θεωρούμε τη σύνδεση με τα γονίδια spoIIAA, spoIIE και spoIIGA ως ειδική, παρά το γεγονός ότι η αύξηση της ποσότητας πρωτεΐνης δεν φαινόταν να προκαλεί σημαντική αύξηση στην ποσότητα του DNA στο σύμπλεγμα. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το Spo0A στο C. difficile μπορεί να ρυθμίσει τη μεταγραφή τουλάχιστον μιας υποομάδας πρώιμων γονιδίων σπορίωσης μέσω άμεσης δέσμευσης στις περιοχές προαγωγέα τους.C. Το difficile Spo0A-DBD δεσμεύεται στο DNA Ανοδικά του tcdB Έχει προηγουμένως αναφερθεί ότι η διαγραφή του Spo0A στο C. difficile έχει ως αποτέλεσμα σημαντικά χαμηλότερη παραγωγή τοξίνης και 1000 φορές μείωση της τοξικότητας του υπερκειμένου καλλιέργειας που προέρχεται από αρνητικά spo0A κύτταρα προς Κυψέλες Vero [35] . Λαμβάνοντας υπόψη την απουσία ομόλογου του καταστολέα abrB, η άμεση δέσμευση του Spo0A και η ταυτόχρονη ενεργοποίηση της μεταγραφής του γονιδίου τοξίνης είναι ένας πιθανός μηχανισμός μέσω του οποίου θα μπορούσε να συμβεί αυτό. Βρήκαμε στοιχεία για άμεση δέσμευση του Spo0A-DBD στην περιοχή ανάντη του tcdB, που κωδικοποιεί ένα από τα κύρια γονίδια κλωστριδιακής τοξίνης και πιθανώς tcdC, αλλά αυτό δεν φάνηκε να οδηγεί σε χαμηλότερα επίπεδα τοξίνης στα χέρια μας. Πραγματοποιήσαμε EMSA χρησιμοποιώντας DNA ανάντη του tcdR (που κωδικοποιεί έναν παράγοντα σίγμα που είναι υπεύθυνος για την ενεργοποίηση της μεταγραφής του γονιδίου της τοξίνης), του tcdB (που κωδικοποιεί την τοξίνη Β), του tcdA (που κωδικοποιεί την τοξίνη Α). Προκειμένου να δοκιμάσουμε περιοχές ανάντη όλων των ανοιχτών πλαισίων ανάγνωσης στο PaLoc, δοκιμάσαμε επίσης τη δέσμευση του Spo0A στο DNA πριν από το tcdE (που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη παρόμοια με χολίνη [50, 51] ) και το tcdC (που κωδικοποιεί έναν υποτιθέμενο αρνητικό ρυθμιστή της παραγωγής τοξινών [52] [53] [54] ), παρόλο που αυτός ο ρυθμιστής δεν έχει σημαντική επίδραση στα επίπεδα τοξινών υπό τις συνθήκες που χρησιμοποιήσαμε [55, 56] . Από τις περιοχές που δοκιμάστηκαν, παρατηρήσαμε μόνο ένα σαφές μετατοπισμένο είδος, ενδεικτικό της δέσμευσης Spo0A, για tcdB (Εικόνα 4Α). το μετατοπισμένο είδος στον προσδιορισμό μας EMSA αντιστράφηκε με την προσθήκη μη επισημασμένου DNA που περιέχει μια θέση σύνδεσης υψηλής συγγένειας, αλλά όχι με DNA που δεν έχει τέτοια θέση (Εικόνα S1E). Για το tcdC, παρατηρήθηκε κάποια κηλίδωση σε όλες τις συγκεντρώσεις των πρωτεϊνών που δοκιμάστηκαν (Εικόνα 4Α) και δεν φάνηκε να υπάρχει σαφές αποτέλεσμα της προσθήκης μη επισημασμένων θραυσμάτων DNA (Εικόνα S1F). Οι ανιχνευτές για tcdA, tcdE και tcdR δεν διακρίνονταν από αυτούς που ελήφθησαν με τον αρνητικό μας έλεγχο, spoVG. Θέλαμε να προσδιορίσουμε εάν τα επίπεδα τοξίνης στα υπερκείμενα καλλιέργειας επηρεάζονταν άμεσα ή έμμεσα από το Spo0A, όπως προτάθηκε προηγουμένως. Δεν βρήκαμε χαμηλότερη τοξικότητα στα κύτταρα Vero υπερκείμενων καλλιεργειών που προέρχονται από μεταλλαγμένα κύτταρα spo0A σε σύγκριση με άγριου τύπου. Αναπτύξαμε τρία ανεξάρτητα βιολογικά αντίγραφα άγριου τύπου (630Derm) ή μετάλλαξης spo0A που δημιουργήθηκε από το Closron (CT::spo0A - ένα είδος δώρου το εργαστήριο Minton) σε μέσο TTY χωρίς γλυκόζη. Συλλέξαμε το υπερκείμενο καλλιέργειας στην όψιμη εκθετική φάση (περίπου 7 ώρες μετά τον εμβολιασμό), τη μεταβατική φάση μεταξύ εκθετικής και στατικής φάσης ανάπτυξης (περίπου 9 ώρες μετά τον εμβολιασμό), καθώς και δύο χρονικά σημεία στη στατική φάση (24 και 48 ώρες μετά τον εμβολιασμό ) και προσδιόρισε τους τίτλους τελικού σημείου της τοξίνης (βλ. Υλικά και Μέθοδοι). Σε αντίθεση με τα προηγούμενα ευρήματα, παρατηρήσαμε μια μικρή (#4-πλάσια) αύξηση στην τοξικότητα των υπερκειμένων που προέρχονται από μεταλλαγμένα κύτταρα spo0A σε σύγκριση με τα άγριου τύπου, αλλά σε όλες τις περιπτώσεις αυτή η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (p.0.05, ανεξάρτητο δείγμα t -δοκιμή). Σε άλλο μέσο (BHIS), δεν παρατηρήσαμε καθόλου διαφορές (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Συμπεραίνουμε ότι το Spo0A δεν επηρεάζει θετικά την παραγωγή τοξίνης στο C. difficile 630Derm και την in vivo συνάφεια της δέσμευσης σε περιοχές ανάντη του tcdB και/ή Το tcdC είναι επομένως περιορισμένο υπό τις πειραματικές μας συνθήκες. Το κουτί Spo0A του C. difficile Στο B. subtilis, η θέση δέσμευσης του Spo0A στο DNA στόχο έχει χαρακτηριστεί καλά, μέσω ενός συνδυασμού δοκιμασιών δέσμευσης in vitro, προσδιορισμού της in vivo σύνδεσης προφίλ και μεταλλαξιογένεση ρυθμισμένων αλληλουχιών προαγωγέα. Αυτή η εργασία οδήγησε στην αναγνώριση ενός διατηρημένου μοτίβου πυρήνα, TGTCGAA ή κουτιού Spo0A [5, 10, 11, 45] . Ανάλογα με την ανάλυση, αυτό το μοτίβο πλαισιώνεται από ένα ή περισσότερα υπολείμματα αδενίνης ή θυμίνης [10, 11] . Είναι ενδιαφέρον ότι πολλά γονίδια-στόχοι δεν ταιριάζουν απόλυτα με αυτή τη συναινετική αλληλουχία, αλλά μάλλον περιέχουν ένα ή περισσότερα εκφυλισμένα μοτίβα. Οι διαφορές σε αυτά τα μοτίβα μπορεί να αντικατοπτρίζουν διαφορετικές αρχιτεκτονικές υποκινητή (π.χ. περιεχόμενο AT), τρόποι δράσης (π.χ. ενεργοποίηση ή καταστολή) ή επίπεδα ρύθμισης. Τα γονίδια Spo0A στο B. subtilis μπορούν να χωριστούν σε διαφορετικές κατηγορίες που ανταποκρίνονται σε διαφορετικά επίπεδα φωσφορυλιωμένου Spo0A [43, 57] . Για το C. difficile, συμπεραίνουμε ότι η πρωτεΐνη Spo0A πιθανότατα αναγνωρίζει ένα μοτίβο που είναι παρόμοιο με το B. subtilis Spo0A κουτί με βάση τέσσερις σειρές αποδεικτικών στοιχείων· 1. Όλα τα υπολείμματα σύνδεσης/επαφής DNA διατηρούνται (Εικ. 2Β), 2. Το C. difficile Spo0A μπορεί να συνδεθεί με υψηλή συγγένεια σε έναν στόχο του B. subtilis Spo0A (Εικ. 2D), 3. Η μεταλλαξογένεση βασικών υπολειμμάτων στο κουτί Spo0A του B. subtilis μειώνει τη συγγένεια του C. difficile Spo0A για το DNA (Εικ. 2Ε) και 4. Ένα κουτί Spo0A B. subtilis έχει προγνωστική αξία για τη δέσμευση DNA από το C. difficile Spo0A (Εικ. 3Α). Είναι κατανοητό ότι το σύστημά μας μοντέλου, χρησιμοποιώντας τον καθαρισμένο τομέα δέσμευσης DNA, δεν αντικατοπτρίζει με ακρίβεια τη δέσμευση σε όλες τις θέσεις στόχους, εάν η επιλεκτικότητα της θέσης στόχου καθορίζεται εν μέρει από άλλα μέρη από την πρωτεΐνη πλήρους μήκους. Είναι πιθανό να υπάρχουν διαφορές μεταξύ των προτιμώμενων θέσεων δέσμευσης και για τις δύο πρωτεΐνες που θα είναι εμφανείς όταν εκτελείται μια ολοκληρωμένη ανάλυση της in vivo δέσμευσης DNA του C. difficile Spo0A. με βάση το περιορισμένο σύνολο δεδομένων αυτής της μελέτης, μια ανάλυση MEME [58] προτείνει ήδη πιθανές διαφορές στο εκτεταμένο μοτίβο Spo0A (W.K. Smits, αδημοσίευτες παρατηρήσεις). Αυτές οι διαφορές μπορεί να σχετίζονται με την πολύ υψηλότερη περιεκτικότητα σε AT του C. difficile σε σύγκριση με το B. subtilis (71 έναντι 56,5%, αντίστοιχα) ή τον εξαρτώμενο από φωσφορυλίωση διμερισμό, για παράδειγμα. Η έναρξη της σπορίωσης στο B. subtilis υπόκειται σε πολύπλοκη ρύθμιση (για επανεξέταση βλέπε αναφορά [1, 59] ). Η ενεργοποίηση του Spo0A ελέγχεται από μια πολυσυστατική φωσφορική δέσμη που μπορεί να ενσωματώσει περιβαλλοντικά στοιχεία [60] και εξασφαλίζει σταδιακή αύξηση του επιπέδου του φωσφορυλιωμένου Spo0A στο κύτταρο [57] . Επιπλέον, η μεταγραφή του γονιδίου spo0A ελέγχεται από πολλαπλούς βρόχους ανάδρασης. Για παράδειγμα, το Spo0A ρυθμίζει τη δική του μεταγραφή δεσμεύοντας τον υποκινητή spo0A [46] , καθώς και διεγείροντας έμμεσα τη μεταγραφή του sigH, κωδικοποιώντας έναν παράγοντα σίγμα που αναγνωρίζει τον υποκινητή spo0A [48] .Στο C. difficile, υπάρχουν μερικά ενδιαφέρουσες διαφορές και ομοιότητες στις ρυθμιστικές οδούς. Το πιο αξιοσημείωτο είναι ότι δεν φαίνεται να υπάρχει φωσφορογραμμή [2] και η κατάσταση φωσφορυλίωσης του Spo0A υποτίθεται ότι ελέγχεται από ορφανές κινάσες ιστιδίνης [35] . Η μεταγραφή του spo0A στο C. difficile είναι υπό τον έλεγχο του παράγοντα σίγμα της μεταβατικής κατάστασης Sigma H [37] , όπως συμβαίνει στο B. subtilis [61] . Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι τόσο το spo0A όσο και το sigH θα μπορούσαν να είναι στόχοι για άμεση ρύθμιση από το Spo0A στο C. difficile (Εικ. 3A), αυξάνοντας τη δυνατότητα αυτόματης ρύθμισης του spo0A. Η υποτιθέμενη άμεση ρύθμιση του sigH από το Spo0A μπορεί να αντανακλά ότι το γονιδίωμα του C. difficile δεν φιλοξενεί ομόλογο του πλειοτροπικού ρυθμιστή AbrB, ο οποίος είναι υπεύθυνος για την εξαρτώμενη από Spo0A ρύθμιση του sigH στο B. subtilis [48] . Σε συμφωνία με ένα μοντέλο στο οποίο το spo0A αυτορυθμίζεται θετικά, παρατηρήσαμε μια απότομη αύξηση στα επίπεδα του Spo0A καθώς τα κύτταρα πλησιάζουν τη φάση στατικής ανάπτυξης (Εικόνα 1C). Κατάντη του Spo0A, βρήκαμε τη δέσμευση του Spo0A σε DNA ανάντη αρκετών πρώιμων γονιδίων σπορίωσης , όπως spoIIAA, spoIIE και spoIIGA (Εικ. 3Β). Όλες αυτές οι παρατηρήσεις συνάδουν με την άμεση ρύθμιση αυτών των γονιδίων από το Spo0A σε άλλους οργανισμούς [5, 45, 49, 62] και τη διατήρηση της οδού σπορίωσης [2] . Αν και το Spo0A είναι ο βασικός ρυθμιστής για τη δημιουργία σπορίων στο Firmicutes, ρυθμίζει πολλές άλλες διεργασίες σε διάφορα βακτήρια. Στο μη παθογόνο B. subtilis, για παράδειγμα, η πρωτεΐνη επηρεάζει επίσης την ανάπτυξη ικανοτήτων, το σχηματισμό βιοφίλμ, την παραγωγή και την αντοχή σε αντιμικροβιακές ενώσεις, τη δυναμική των χρωμοσωμάτων και πτυχές της βιολογίας των φάγων [10, [14] [15] [16] . Είναι σημαντικό ότι αρκετές από αυτές τις διαδικασίες ρυθμίζονται έμμεσα, μέσω της εξαρτώμενης από Spo0A καταστολής του abrB. Επιπλέον, η μεταγραφή του abrB ανταποκρίνεται ήδη σε χαμηλά επίπεδα Spo0A,P [43] . Ως αποτέλεσμα, αυτές οι επιδράσεις είναι ανιχνεύσιμες σε όψιμη εκθετική και πρώιμη στατική φάση, καθώς κάποια Spo0A υπάρχει σε όλη την ανάπτυξη στα κύτταρα B. subtilis. Αν και το abrB απουσιάζει από το C. difficile, αυτό δεν αποκλείει την πιθανότητα έμμεσης μεταγραφικής ρύθμισης μέσω του Spo0Adependent επιπτώσεις σε άλλους ρυθμιστές. Εναλλακτικά, το Spo0A μπορεί να ασκήσει άμεση επίδραση. Στο Clostridium acetobutylicum και στο C. beijerinckii, το Spo0A είναι ένας άμεσος ρυθμιστής του σχηματισμού διαλυτών, καθώς και της δημιουργίας σπορίων [22, 23]. Φαίνεται επομένως κατανοητό ότι το Spo0A στο C. difficile επηρεάζει επίσης πτυχές του μεταβολισμού. Από αυτή την άποψη, είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι και στο C. difficile το Spo0A είναι ανιχνεύσιμο από την πρώιμη φάση εκθετικής ανάπτυξης (Εικόνα 1Β). Παρατηρήσαμε άμεση σύνδεση του C. difficile Spo0A στην περιοχή προαγωγέα του sigH (Εικ. 3Α). Αυτό το γονίδιο κωδικοποιεί τον βασικό παράγοντα σίγμα για τη φάση μετάβασης και ρυθμίζει επίσης διαδικασίες εκτός σπορίων [37] . Επιπλέον, βρήκαμε σημαντικά επίπεδα Spo0A από την πρώιμη στατική φάση (Εικ. 1B και μη δημοσιευμένες παρατηρήσεις), υποδεικνύοντας ότι οι ρυθμιστικές δράσεις του Spo0A δεν χρειάζεται να περιορίζονται στη στατική φάση στο C. difficile. Σύμφωνα με αυτήν την ιδέα, βρήκαμε μια πιθανή ρυθμιστική σύνδεση μεταξύ του Spo0A και δύο γονιδίων που από ό,τι γνωρίζουμε δεν σχετίζονται με τη διαδικασία σπορίωσης, τη λιπώδη λιγάση lplA και τον μεταφορέα αλειφατικών σουλφονικών ssuA (Εικ. 3Α). Η παρουσία μιας πιθανής θέσης δέσμευσης Spo0A ανάντη αυτών των γονιδίων, καθώς και η απόσταση σε σύγκριση με το κωδικόνιο έναρξης, διατηρείται στο προβληματικό στέλεχος Stoke-Mandeville (R20291), μέλος του ριβοτύπου PCR 27. Αυτό θα μπορούσε να υποδηλώνει ότι αυτές οι πτυχές ρύθμισης από το Spo0A διατηρούνται σε πολλαπλά στελέχη του C. difficile. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η εργασία μας μέχρι στιγμής έχει περιοριστεί σε μια in vitro ανάλυση της δέσμευσης Spo0A και επομένως δεν υποδεικνύει εάν ενεργοποίηση ή καταστολή των υποτιθέμενων γονιδίων-στόχων εμφανίζεται in vivo. Για να απαντηθεί αυτή η ερώτηση, πρέπει να πραγματοποιηθούν λεπτομερείς μελέτες μεταγραφής και/ή πρωτεϊνών. Προκειμένου να διακριθούν οι άμεσες από τις έμμεσες επιδράσεις, θα πρέπει να εκτελούνται in vivo προφίλ δέσμευσης του Spo0A. Τα αντισώματα που δημιουργούνται για αυτή τη μελέτη θα πρέπει να αποδειχθούν χρήσιμα για αυτού του είδους τα πειράματα. Μεταξύ των παθογόνων Firmicutes, το Spo0A έχει αναφερθεί ότι επηρεάζει την παραγωγή τοξινών σε πολλά είδη. Στο B. anthracis μια μετάλλαξη spo0A οδηγεί σε αυξημένα επίπεδα AbrB και ταυτόχρονα χαμηλότερα επίπεδα των γονιδίων της τοξίνης pagA, cya και lef που βρίσκονται υπό έλεγχο AbrB [17] . Ομοίως, η παραγωγή της εμετικής τοξίνης cereulide στο B. cereus καταστέλλεται σε μεγάλο βαθμό σε ένα μετάλλαγμα spo0A, με τρόπο που εξαρτάται από το AbrB [63] . Αντίθετα, το Spo0A καταστέλλει άμεσα την έκφραση των γονιδίων της τοξίνης κραυγής στο B. thuringiensis και ένα μετάλλαγμα spo0A είναι επομένως ένας υπερ-παραγωγός της εντομοκτόνου κρυσταλλικής πρωτεΐνης [18, 21]. Στο Clostridium perfringens TpeL, ένα μέλος των μεγάλων κλωστριδιακών τοξινών όπως το TcdA και το TcdB, εξαρτάται άμεσα από το Spo0A [64] και επίσης η παραγωγή εντεροτοξίνης σε αυτόν τον οργανισμό φαίνεται να εξαρτάται (έμμεσα) από τη δημιουργία σπορίων [65, 66]. Στο C. difficile, ένα μεταλλαγμένο spo0A που δημιουργήθηκε με χρήση της τεχνολογίας Closron αναφέρθηκε ότι είχε 10 φορές μειωμένα επίπεδα τοξίνης Α (TcdA), τόσο ενδοκυτταρικά όσο και εξωκυτταρικά καθώς και 1000 φορές μειωμένη τοξικότητα προς τα κύτταρα Vero, τα οποία είναι κυρίως ευαίσθητα προς την τοξίνη Β (TcdB) [35] . Τα δεδομένα δέσμευσής μας in vitro υποδεικνύουν μια πιθανή θέση δέσμευσης για το Spo0A ανάντη του tcdB και πιθανώς του tcdC (Εικ. 4Α). Ωστόσο, η in vivo συνάφεια αυτής της δέσμευσης φαίνεται περιορισμένη καθώς στα χέρια μας είναι ένα ανεξάρτητα προερχόμενο αλλά κατά τα άλλα πανομοιότυπο μετάλλαγμα (ένα ευγενικό δώρο του εργαστηρίου Minton. [33] ) δεν έδειξε μειωμένη τοξικότητα στα κύτταρα Vero. Αντίθετα, διαπιστώσαμε ότι στο μέσο TTY τα επίπεδα τοξίνης ήταν ελαφρώς αυξημένα στα μεταλλαγμένα κύτταρα spo0A σε σύγκριση με τα άγριου τύπου (#2 φορές σε κύτταρα εκθετικής φάσης έως και 4 φορές σε κύτταρα όψιμης στάσιμης φάσης). Οι μικρές και όχι σημαντικές διαφορές στα επίπεδα τοξίνης στα πειράματά μας μπορεί να αποδοθούν σε διαφορές στην ευαισθησία των κυττάρων για λύση παρά στην παραγωγή τοξίνης, αλλά θα μπορούσαν επίσης να υποδεικνύουν αρνητική ρυθμιστική επίδραση του Spo0A στην παραγωγή τοξίνης. Προς υποστήριξη της τελευταίας υπόθεσης, αναφέρθηκε πρόσφατα ότι ένα μετάλλαγμα spo0A του στελέχους R20291 του C. difficile (επιδημικό στέλεχος ριβοτύπων PCR 027/BI/NAP1) επιδεικνύει, 10 φορές υψηλότερα επίπεδα τοξίνης από τον ισογενή άγριου τύπου του 30 ώρες μετά τον εμβολιασμό, και είναι σημαντικά πιο λοιμογόνος σε ένα μοντέλο ασθένειας σε ποντίκια [34] . Οι διαφορές μεταξύ των Underwood et al [35] αφενός και της μελέτης μας καθώς και της μελέτης του Deakin και των συναδέλφων [34] αφετέρου μπορούν να εξηγηθούν από διαφορές στις πειραματικές συνθήκες, όπως το χρησιμοποιούμενο μέσο. Ωστόσο, δεν παρατηρήσαμε διαφορά στην κυτταροτοξικότητα μεταξύ του υπερκειμένου που προέρχεται από μεταλλαγμένα κύτταρα άγριου τύπου ή spo0A όταν αυτά αναπτύχθηκαν σε BHIS, ένα μέσο σχεδόν πανομοιότυπο με αυτό που χρησιμοποιήθηκε προηγουμένως (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Εναλλακτικά, οι διαφορές θα μπορούσαν να υποδηλώνουν ενσωμάτωση του ιντρονίου της ομάδας II σε περισσότερες από μία θέσεις στο χρωμόσωμα στο στέλεχος που χρησιμοποιείται στο Underwood et al [35]. Ελλείψει πειράματος συμπλήρωσης ή/και δεδομένων στυπώματος Southern, αυτό μένει να διαπιστωθεί. Συνοπτικά, τα δεδομένα μας είναι σύμφωνα με ένα μοντέλο στο οποίο η ρύθμιση των κύριων κλωστριδιακών τοξινών στο C. difficile δεν επηρεάζεται θετικά από το Spo0A. σε αντίθεση με προηγούμενα ευρήματα και άλλα παθογόνα Κλωστρίδια. Το εάν το Spo0A είναι πραγματικά ένας αρνητικός ρυθμιστής της παραγωγής τοξινών μένει να επιβεβαιωθεί χρησιμοποιώντας in vitro και in vivo προσδιορισμούς μεταγραφής. Στην παρούσα μελέτη έχουμε για πρώτη φορά επιδείξει την άμεση δέσμευση της περιοχής δέσμευσης DNA του C. difficile Spo0A στο υποτιθέμενο DNA στόχο . Αυτή η εργασία αποκάλυψε ότι οι πτυχές της δέσμευσης Spo0A διατηρούνται μεταξύ Bacillus και C. difficile (0A κουτί, πιθανή αυτόματη ρύθμιση και δέσμευση σε πρώιμους προαγωγείς σπορίωσης), ενώ άλλες όχι (η απουσία του abrB ως άμεσου στόχου στο C. difficile , δέσμευση στο DNA ανοδικά του lplA, ssuA). Οι επιδράσεις του Spo0A στην παραγωγή τοξινών μπορεί να είναι παρόμοιες με αυτές που παρατηρήθηκαν για το B. thuringiensis [18, 21] . Η μελλοντική εργασία θα στοχεύει στον προσδιορισμό της επίδρασης του Spo0A στη μεταγραφή των υποτιθέμενων γονιδίων-στόχων και θα πραγματοποιήσει μια ολοκληρωμένη ανάλυση της δέσμευσης Spo0A in vivo. Η ταυτοποίηση των γονιδίων που επηρεάζονται από το Spo0A στο C. difficile μπορεί να ρίξει φως στον ρόλο της πρωτεΐνης στη λοιμογόνο δράση και στην παθογένεση αυτού του οργανισμού. Εικόνα S1 Έλεγχοι ειδικότητας για δέσμευση από Spo0A-DBD-his6. Τα βέλη υποδεικνύουν τη θέση των μετατοπισμένων ειδών (DNA: σύμπλοκα πρωτεΐνης). Οι τιτλοδοτήσεις με θραύσματα PCR του PabrB (που περιέχουν μια θέση σύνδεσης υψηλής συγγένειας) και του PtcdA (που στερείται τέτοιας θέσης) αντιστοιχούν σε περίπου 0,1 nM/mL -0,03 nM/mL. ΕΝΑ. Σύγκριση δέσμευσης Spo0A-DBD-his6, Spo0A-his6 και CD2195-his6 δέσμευσης στην ανάντη περιοχή του spoIIAA. ΣΙ. Η δέσμευση του Spo0A-DBD-his6 στην ανάντη περιοχή του spoIIAA αντιστρέφεται με την προσθήκη PabrB, αλλά όχι με την προσθήκη PtcdA). Γ. Η δέσμευση του Spo0A-DBD-his6 στην ανάντη περιοχή του spoIIE αντιστρέφεται με την προσθήκη PabrB, αλλά όχι με την προσθήκη PtcdA. Δ. Η δέσμευση του Spo0A-DBD-his6 στην ανάντη περιοχή του spoIIGA αντιστρέφεται με την προσθήκη PabrB, αλλά όχι με την προσθήκη PtcdA. Ε. Η δέσμευση του Spo0A-DBD-his6 στην ανάντη περιοχή του tcdB αντιστρέφεται με την προσθήκη PabrB, αλλά όχι με την προσθήκη PtcdA. ΣΤ. Η δέσμευση του Spo0A-DBD-his6 στην ανάντη περιοχή του tcdC δεν επηρεάζεται ή επηρεάζεται μετρίως από την προσθήκη PabrB και/ή PtcdA. (TIF) Κείμενο S1 Ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη και συνθήκες κύκλου PCR για τους ανιχνευτές EMSA. (PDF)", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 4443, "text": "Gram θετικό, αναερόβιο βακτήριο" } ], "id": 913, "question": "Τι είναι το Clodstridium difficile;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2646, "text": "Spo0A" } ], "id": 915, "question": "Ποιος είναι ο βασικός ρυθμιστής της σπορίωσης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5202, "text": "τοξίνες Α και Β" } ], "id": 916, "question": "Ποιοι είναι οι κύριοι παράγοντες λοιμογόνου δράσης στο C. difficle;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Ο ιός της εγκεφαλίτιδας των ιπποειδών της Βενεζουέλας προκαλεί απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης απόκρισης πρωτεϊνών που δεν έχει ξεδιπλωθεί του EGR1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4794670/SHA: f4aa788ab898b28b00ea4Adut40; Lundberg, Lindsay; Swales, Danielle; Waybright, Nicole; Pinkham, Chelsea; Dinman, Jonathan D.; Jacobs, Jonathan L.; Kehn-Hall, KyleneΗμερομηνία: 2016-03-11DOI: 10.1128/jvi.02827-15 Άδεια χρήσης: cc-byAbstract: Ο ιός της εγκεφαλίτιδας των ίππων της Βενεζουέλας (VEEV) είναι ένας προηγουμένως οπλισμένος ιός από αρθρόποδα, ένας οξεία και θανατηφόρος ιός που μεταδίδεται από τον άνθρωπο και είναι θανατηφόρος Οικοδεσπότες. Η αυξημένη κυκλοφορία και εξάπλωση στην Αμερική του VEEV και άλλων εγκεφαλιτικών αρβοϊών, όπως ο ιός της ανατολικής εγκεφαλίτιδας των ιπποειδών και ο ιός του Δυτικού Νείλου, υπογραμμίζουν την ανάγκη για έρευνα με στόχο τον χαρακτηρισμό της παθογένεσης της ιογενούς εγκεφαλομυελίτιδας για την ανάπτυξη νέων ιατρικών αντιμέτρων. Η δυναμική ξενιστή-παθογόνου των κυττάρων ανθρώπινου αστροκυτώματος U87MG που έχουν μολυνθεί από VEEV Trinidad γαϊδουριού προσδιορίστηκε με τη διενέργεια προσδιορισμού αλληλουχίας RNA (RNA-Seq) πολυ(Α) και mRNAs. Για τον εντοπισμό των κρίσιμων αλλαγών που λαμβάνουν χώρα στο μεταγράφημα του ξενιστή μετά από μόλυνση VEEV, συλλέχθηκαν δείγματα στις 4, 8 και 16 ώρες μετά τη μόλυνση και τα δεδομένα RNA-Seq αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας μια πλατφόρμα Ion Torrent PGM. Παρατηρήθηκε διαφορική έκφραση της απόκρισης ιντερφερόνης, των παραγόντων απόκρισης στο στρες και των συστατικών της απόκρισης ξεδιπλωμένης πρωτεΐνης (UPR). Ο βραχίονας ενδοπλασματικής κινάσης του δικτύου πρωτεϊνικής κινάσης RNA (PERK) του UPR ενεργοποιήθηκε, καθώς η έκφραση τόσο του ενεργοποιητικού μεταγραφικού παράγοντα 4 (ATF4) όσο και του CHOP (DDIT3), των κρίσιμων ρυθμιστών της οδού, μεταβλήθηκε μετά τη μόλυνση. Η έκφραση του παράγοντα μεταγραφής πρώιμης ανάπτυξης απόκρισης 1 (EGR1) προκλήθηκε με τρόπο που εξαρτάται από το PERK. Οι εμβρυϊκοί ινοβλάστες ποντικού EGR1(−/−) (MEFs) επέδειξαν χαμηλότερη ευαισθησία στον επαγόμενο από VEEV κυτταρικό θάνατο από τα ισογονικά MEFs άγριου τύπου, υποδεικνύοντας ότι το EGR1 ρυθμίζει προαποπτωτικές οδούς μετά τη μόλυνση από VEEV. Η επίδραση του EGR1 είναι μεγάλης σημασίας, καθώς η νευρωνική βλάβη μπορεί να οδηγήσει σε μακροπρόθεσμα επακόλουθα σε άτομα που έχουν επιβιώσει από τη μόλυνση από VEEV. ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ Οι αλφαϊοί αντιπροσωπεύουν μια ομάδα κλινικά σχετικών ιών που μεταδίδονται από τα κουνούπια στον άνθρωπο. Σε σοβαρές περιπτώσεις, η εξάπλωση του ιού στοχεύει τον νευρωνικό ιστό, με αποτέλεσμα σημαντική και απειλητική για τη ζωή φλεγμονή που εξαρτάται από έναν συνδυασμό αλληλεπιδράσεων ιού-ξενιστή. Επί του παρόντος δεν υπάρχουν θεραπευτικά μέσα για λοιμώξεις που προκαλούνται από εγκεφαλιτικούς αλφαϊούς λόγω της ελλιπούς κατανόησης της μοριακής τους παθογένειας. Ο ιός της εγκεφαλίτιδας των ίππων της Βενεζουέλας (VEEV) είναι ένας αλφαϊός που είναι διαδεδομένος στην Αμερική και είναι ικανός να μολύνει άλογα και ανθρώπους. Εδώ χρησιμοποιήσαμε την αλληλουχία RNA επόμενης γενιάς για να αναγνωρίσουμε διαφορικές αλλοιώσεις σε αστροκύτταρα μολυσμένα με VEEV. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η αφθονία των μεταγραφών που σχετίζονται με την ιντερφερόνη και τα μονοπάτια απόκρισης πρωτεϊνών που ξεδιπλώθηκαν μεταβλήθηκαν μετά τη μόλυνση και έδειξαν ότι η πρώιμη αναπτυξιακή απόκριση 1 (EGR1) συνέβαλε στον επαγόμενο από το VEEV κυτταρικό θάνατο. είναι ένας αλφαϊός του Νέου Κόσμου της οικογένειας Togaviridae που είναι ενδημικός στην Αμερική. Ο VEEV είναι ένας ιός θετικού κλώνου RNA που μεταδίδεται από τα κουνούπια και που υπάρχει φυσικά στις δεξαμενές τρωκτικών (1) . Υπάρχουν έξι υποτύποι που κατηγοριοποιούνται ανάλογα με το γεωγραφικό εύρος και την παθολογία τους σε άλογα και ανθρώπους. Τα δύο επιζωοτικά στελέχη, IA/B και IC, προέκυψαν από μεταλλάξεις μεταξύ των ενζωοτικών στελεχών (2) . Τα στελέχη IA/B και IC προκαλούν ιδιαίτερη ανησυχία λόγω των αυξημένων ποσοστών νοσηρότητας και θνησιμότητας και των κινδύνων που σχετίζονται με την ενίσχυση του ιού και την πιθανή διάχυση ειδών (2) . Στους ανθρώπους, το VEEV προκαλεί μια εμπύρετη ασθένεια που χαρακτηρίζεται από πυρετό, κακουχία και έμετο. Σε ορισμένες περιπτώσεις, η μόλυνση εξελίσσεται στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ) και εκδηλώνονται νευρολογικά συμπτώματα, όπως σύγχυση, αταξία και επιληπτικές κρίσεις. Το ποσοστό θνησιμότητας μεταξύ των περιπτώσεων με νευρολογικά συμπτώματα μπορεί να φτάσει το 35% στα παιδιά και το 10% στους ενήλικες, με μακροχρόνια νευρολογικά ελλείμματα να παρατηρούνται συχνά σε επιζώντες (2) . Το 1995, ένα ξέσπασμα του VEEV στην Κολομβία και τη Βενεζουέλα οδήγησε σε περισσότερα από 100.000 ανθρώπινα κρούσματα (3) . Εκτός από τις φυσικές εστίες, το VEEV είναι επίσης ανησυχητικό από την άποψη της βιοτρομοκρατίας, καθώς μπορεί να αναπτυχθεί σε υψηλούς τίτλους, απαιτεί χαμηλή μολυσματική δόση και περιέχει πολλαπλούς ορότυπους. Τόσο η πρώην Σοβιετική Ένωση όσο και οι Ηνωμένες Πολιτείες χρησιμοποίησαν προηγουμένως όπλα για τον ιό, παράγοντας μεγάλες ποσότητες για τα επιθετικά προγράμματα βιοόπλων που δεν λειτουργούν πλέον (4) . Επί του παρόντος, το στέλεχος εμβολίου TC83 χρησιμοποιείται σε άλογα και για προσωπικό υψηλού κινδύνου. Ωστόσο, λόγω του χαμηλού ποσοστού ορομετατροπής που επιτυγχάνεται με αυτό το εμβόλιο (5) και της εξάρτησής του από δύο μεμονωμένες μεταλλάξεις εξασθένησης (6) , θεωρείται ακατάλληλο για μαζική κατανομή (7) . Μέχρι σήμερα δεν υπάρχουν εγκεκριμένα από τον FDA θεραπευτικά για τη μόλυνση από VEEV και απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για την αποσαφήνιση των μηχανισμών που σχετίζονται με την υποκείμενη παθογένεση του VEEV. Οι μεταγραφικές μελέτες ιών και ξενιστών μπορούν να παρέχουν πληθώρα πληροφοριών σχετικά με τους υποκείμενους παθογόνους μηχανισμούς και τις αλληλεπιδράσεις που ακολουθούν την πορεία μιας λοίμωξης. Η χρήση της αλληλουχίας επόμενης γενιάς υψηλής απόδοσης οδήγησε στην ανακάλυψη ιών που δεν είχαν χαρακτηριστεί προηγουμένως και στη δημιουργία πολυάριθμων νέων πειραματικών συστημάτων που επαναπροσδιορίζουν τις αλληλεπιδράσεις ιού-ξενιστή. Μέχρι σήμερα, ένας αριθμός μελετών έχει εξετάσει τις αλλαγές στο μεταγραφικό σώμα του ξενιστή μετά από μόλυνση από VEEV. Μια συγκριτική ανάλυση μικροσυστοιχίας μεταξύ κυττάρων που μολύνονται επίμονα με VEEV και κυττάρων ικανών να καθαρίσουν το VEEV οδήγησε στην ταυτοποίηση του PARP12L ως αντιιικού παράγοντα (8) . Μια μοριακή σύγκριση που χρησιμοποιεί μικροσυστοιχίες αποκρίσεων με βάση τον ξενιστή στο στέλεχος TC83 μπόρεσε να αναγνωρίσει βιοδείκτες που διαφοροποιούν τις ομάδες που ανταποκρίνονται στο εμβόλιο και τις ομάδες που δεν ανταποκρίνονται στο εμβόλιο, καθώς και τη συμμετοχή της ιντερφερόνης (IFN), των οδών που προκαλούνται από ιντερφερόνη, του υποδοχέα τύπου Toll (TLR). ), και οδούς που σχετίζονται με την ιντερλευκίνη 12 (IL-12) (9) . Μια μελέτη που εξέτασε τον ρόλο της προσκόλλησης και των φλεγμονωδών παραγόντων σε μολυσμένα με VEEV ποντίκια CD-1 βρήκε ιική τροποποίηση της έκφρασης της εξωκυτταρικής μήτρας και των γονιδίων προσκόλλησης, όπως οι ιντεγκρίνες (Itg␣X, Itg2, 3 και 7), οι καντερίνες 1 και 2, μόριο προσκόλλησης αγγειακών κυττάρων 1, και μόριο ενδοκυτταρικής προσκόλλησης 1 (ICAM-1), στους εγκεφάλους ποντικών μολυσμένων με VEEV (10). Πειράματα παρακολούθησης που χρησιμοποιούν ποντίκια ICAM-1-knockout κατέδειξαν μειωμένη φλεγμονή στον εγκέφαλο και επακόλουθη καθυστέρηση στην έναρξη των νευρολογικών επακόλουθων (10) . Μια μελέτη από τους Sharma et al. χρησιμοποίησε μικροσυστοιχίες για να αναλύσει τις αλλαγές γονιδιακής έκφρασης στον εγκεφαλικό ιστό ποντικών μολυσμένων με VEEV κατά τη διάρκεια μιας λοίμωξης, ανακαλύπτοντας πολυάριθμες ανοσολογικές οδούς που εμπλέκονται στην παρουσίαση αντιγόνου, τη φλεγμονή, την απόπτωση και την παραδοσιακή αντιική απόκριση (Cxcl10, CxCl11, Ccl5, Ifr7, Ifi27, ​​Oas1b, Fcerg1, Mif, clusterin και κύριο σύμπλεγμα ιστοσυμβατότητας [MHC] κατηγορίας II) (11) . Μια δεύτερη μελέτη από την ίδια ομάδα εντόπισε τη ρύθμιση των microRNAs (miRNAs) στους εγκεφάλους ποντικών μολυσμένων με VEEV, η οποία επέτρεψε τη συσχέτιση των αλλαγών miRNA με προηγούμενα δεδομένα έκφρασης mRNA (11, 12) . Αυτές οι αναλύσεις υποδεικνύουν ότι το VEEV μπορεί να χρησιμοποιεί κυτταρικά miRNA για να ρυθμίσει το κατώτερο mRNA, το οποίο μπορεί να αντιστοιχεί με τις επαγόμενες από το VEEV ιστολογικές αλλαγές στο νευρικό σύστημα (11, 12). Στην τρέχουσα μελέτη, η αλληλουχία RNA επόμενης γενιάς (RNA- Seq) χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό κλινικά σχετικών αλλαγών στο μεταγραφικό mRNA ανθρώπινων αστροκυττάρων που έχουν μολυνθεί με άγριου τύπου (WT) στέλεχος VEEV Trinidad Donkey (TrD). Η ανάλυση των mRNA ξενιστών από το RNA-Seq παρέχει νέα εικόνα για το πώς ένας ξενιστής ανταποκρίνεται σε μια ιογενή μόλυνση μέσω της αναγνώρισης ενός ευρέος και δυναμικού εύρους μεταγραφών με αμερόληπτο τρόπο. Η επιλεκτική αλληλουχία των mRNA, συγκεκριμένα, των πολυαδενυλιωμένων μεταγραφών [πολυ(Α)], που αντιπροσωπεύουν το ϳ1% ολόκληρου του μεταγραφώματος, ενισχύει την ανίχνευση των πιο σχετικών και χαμηλής αφθονίας μεταγραφών (13) . Καθώς το VEEV έχει αποδειχθεί ότι μολύνει παραγωγικά τα αστροκύτταρα τόσο in vitro όσο και in vivo (14, 15), επιλέξαμε τα αστροκύτταρα ως μοντέλο ενδιαφέροντός μας. Τα αστροκύτταρα είναι το πιο άφθονο κύτταρο στον εγκέφαλο, υπερτερώντας των νευρώνων κατά τουλάχιστον 5 φορές (16) , παρέχοντας άφθονη πηγή για την αναπαραγωγή του ιού εντός του εγκεφάλου. Εκτός από τον καλά περιγραφόμενο δομικό τους ρόλο στον νευρωνικό ιστό, τα ατροκύτταρα παίζουν κρίσιμους ρόλους σε άλλες διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης της ροής του αίματος και του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, της μετάδοσης των συνάψεων και της απόκρισης στη μόλυνση (16) . Τα αστροκύτταρα που έχουν μολυνθεί με VEEV έχει αποδειχθεί ότι παράγουν πολλαπλές κυτοκίνες, συμπεριλαμβανομένων των IL-8, IL-17, ιντερφερόνης γάμμα (IFN-␥) και πρωτεΐνης 10 που προκαλείται από ιντερφερόνη γάμμα, οι οποίες βρέθηκαν να σχετίζονται με εξασθένηση του ιού (14 Για να ληφθεί μια δυναμική άποψη της αλληλεπίδρασης ιού-ξενιστή, χρησιμοποιήθηκε το RNA-Seq για την παρακολούθηση αλλαγών στην έκφραση γονιδίου σε αστροκύτταρα μολυσμένα με VEEV TrD στις 4, 8 και 16 ώρες μετά τη μόλυνση (hpi). Με την προβολή των αλλαγών σε πολλαπλά πρώιμα χρονικά σημεία χρησιμοποιώντας τριπλούν βιολογικά αντίγραφα, δημιουργείται ένα ισχυρό και δυναμικό εύρος πληροφοριών και αυτές οι πληροφορίες παρέχουν αύξηση τόσο στην ισχύ όσο και στην ακρίβεια της ανίχνευσης των διαφορικά εκφρασμένων μεταγραφών σε ένα εξαιρετικά σχετικό κλινικό μοντέλο ( 17) . Μεταξύ των μολυσμένων με VEEV κυττάρων, παρατηρήθηκε αύξηση στα ρυθμιζόμενα από ιντερφερόνη γονίδια, συμπεριλαμβανομένων των IFIT1, IFIT2, IFIT3 και OASL. Σημειώθηκε επίσης η αυξημένη έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην οδό που προκαλείται από το στρες ξεδιπλωμένης απόκρισης πρωτεΐνης (UPR). Είναι ενδιαφέρον ότι η μόλυνση από VEEV οδήγησε σε αύξηση της πρωτεΐνης 1 πρώιμης απόκρισης ανάπτυξης (EGR1), η οποία μπορεί να χρησιμεύσει ως σύνδεσμος μεταξύ των δύο οδών. Η αναγνώριση των mRNA ξενιστών των οποίων η έκφραση μεταβάλλεται μετά την αντιγραφή VEEV, συγκεκριμένα, το EGR1 και οι αλληλεπιδρώντες του προς τα πάνω και προς τα κάτω, μπορεί να παρέχει νέους θεραπευτικούς στόχους βασισμένους σε ξενιστές κρίσιμους για την αντιγραφή VEEV και μεγαλύτερη κατανόηση των υποκείμενων μηχανισμών που υποστηρίζουν την αναπαραγωγή του αλφαϊού. Ιογενείς λοιμώξεις και αναλύσεις πλάκας. Το VEEV TrD ελήφθη από την BEI Resources. Όλα τα πειράματα με το VEEV TrD πραγματοποιήθηκαν υπό συνθήκες βιοασφάλειας επιπέδου 3 (BSL-3). Όλες οι εργασίες που αφορούν επιλεγμένους παράγοντες καταχωρίζονται στα Κέντρα Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων και διενεργήθηκαν στο Εργαστήριο Βιοϊατρικής Έρευνας του Πανεπιστημίου George Mason, το οποίο είναι εγγεγραμμένο σύμφωνα με τους ομοσπονδιακούς κανονισμούς επίλεκτων παραγόντων. Για λοιμώξεις, το VEEV προστέθηκε σε συμπληρωμένο μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (DMEM) για να επιτευχθεί πολλαπλότητα μόλυνσης (MOI) 0,05, 0,5 ή 5. Τα κύτταρα μολύνθηκαν για 1 ώρα στους 37°C και περιστρέφονταν κάθε 15 λεπτά για να εξασφαλιστεί επαρκής κάλυψη. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με φυσιολογικό ορό με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) και πλήρες μέσο ανάπτυξης προστέθηκε ξανά στα κύτταρα. Τα υπερκείμενα και τα κύτταρα του ιού συλλέχθηκαν σε διάφορους χρόνους μετά τη μόλυνση για περαιτέρω ανάλυση. Οι δοκιμασίες πλάκας πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (18). Απομόνωση mRNA και προετοιμασία βιβλιοθήκης πολυ(Α). Το RNA από κύτταρα U87MG καθαρίστηκε τόσο από μολυσμένα με VEEV TrD (επίπεδο βιοασφάλειας 3) όσο και από ψευδομολυσμένα κύτταρα U87MG στα 4, 8 και 16 hpi χρησιμοποιώντας κιτ απομόνωσης mirVana (Life Technologies). Έλεγχος ποιότητας του καθαρισμένου RNA πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας έναν βιοαναλυτή Agilent 2100 και χρησιμοποιήθηκε αποκοπή αριθμού ακεραιότητας RNA (RIN) 8 για όλα τα δείγματα. Στη συνέχεια, ένα μίγμα ελέγχου ταχείας εισαγωγής RNA Εξωτερικών Ελέγχων Κοινοπραξίας RNA (ERCC) προστέθηκε στις συνολικές εισροές RNA (10 g RNA) πριν από την επιλογή πολυ(Α) χρησιμοποιώντας ένα κιτ mRNA Direct Dynabeads της Life Technologies. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε η παρασκευή μιας βιβλιοθήκης RNA ολόκληρου μεταγραφώματος από καθαρισμένο mRNA χρησιμοποιώντας κιτ Ολικής RNA-Seq (v2; Τεχνολογίες Ζωής). Έλεγχος ποιότητας των βιβλιοθηκών cDNA πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας τον βιοαναλυτή Agilent 2100 μαζί με δοκιμή στειρότητας για αφαίρεση βιβλιοθηκών για αλληλούχιση από ένα εργαστήριο BSL-3 σε BSL-2. Αλληλουχία RNA. Η προετοιμασία του προτύπου της βιβλιοθήκης πραγματοποιήθηκε σε πλατφόρμα One Touch 2 (Life Technologies). Ο προσδιορισμός αλληλουχίας RNA επόμενης γενιάς πραγματοποιήθηκε σε μια πλατφόρμα PGM Torrent ιόντων και πραγματοποιήθηκε για κάθε δείγμα για να αξιολογηθεί η διαφορική έκφραση γονιδίου μολυσμένων έναντι μη μολυσμένων κυττάρων με την πάροδο του χρόνου. Φιλτράρισμα δεδομένων και σωλήνωση ανάλυσης RNA-Seq. Συνολικά ϳ119 εκατομμύρια αναγνώσεις αλληλουχίας και κατά μέσο όρο 6,6 εκατομμύρια αναγνώσεις ανά δείγμα χρησιμοποιήθηκαν ως είσοδος στον αγωγό ανάλυσής μας. Εκτός εάν σημειώνεται διαφορετικά, η ανάλυση κατάντη RNA-Seq πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον πάγκο εργασίας CLC bio Genomics (v7). Οι αναγνώσεις ακατέργαστων RNA-Seq περικόπηκαν για να αφαιρεθούν τυχόν υπολειμματικά θραύσματα προσαρμογέα αλληλουχίας που παρέμειναν στα άκρα 5= ή 3= μετά τον προσδιορισμό της αλληλουχίας. Επιπλέον, η τελική περικοπή των αναγνώσεων έγινε χρησιμοποιώντας τον τροποποιημένο αλγόριθμο Mott με βαθμολογία ποιότητας Q20 και τυχόν αναγνώσεις μικρότερες από 15 bp απορρίφθηκαν. Μετά την περικοπή ανάγνωσης, οι αναγνώσεις χαρτογραφήθηκαν στο ανθρώπινο γονιδίωμα hg19 με τις ακόλουθες παραμέτρους RNA-Seq: όριο 10 χτυπημάτων για πολλαπλές χαρτογραφημένες θέσεις, κλάσμα ομοιότητας 0,8, κλάσμα μήκους 0,8, κόστος αναντιστοιχίας 2 και κόστος indel 3. Το επίπεδο έκφρασης μεμονωμένων γονιδίων και μεταγραφών υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον αριθμό αναγνώσεων ανά κιλοβάση του μοντέλου εξονίου ανά εκατομμύριο χαρτογραφημένες αναγνώσεις (RPKM) της μεθόδου των Mortazavi et al. (19) . Επιπλέον, μη χαρτογραφημένες αναγνώσεις χαρτογραφήθηκαν επίσης στο σύνολο αλληλουχιών συνθετικού RNA ERCC92 (20), καθώς και στο γονιδίωμα αναφοράς VEEV (αριθμός πρόσβασης GenBank L01442). Σε όλα τα δείγματα, ο συντελεστής συσχέτισης (R 2 ) μεταξύ του αναμενόμενου και του αντιστοιχισμένου αριθμού αναγνώσεων για τους μάρτυρες spike-in ERCC92 ήταν πάνω από 0,90. Μια σύνοψη των συνολικών αποτελεσμάτων αλληλουχίας παρουσιάζεται στον Πίνακα 1. Το φιλτράρισμα μετά τη χαρτογράφηση όλων των δεδομένων RNA-Seq πραγματοποιήθηκε στη συνέχεια για να συμπεριληφθούν μόνο γονίδια με τουλάχιστον μία μοναδικά χαρτογραφημένη ανάγνωση (26.230 γονίδια παρέμειναν σε όλα τα σύνολα δεδομένων) και μόνο εκείνα με μη μηδενικό διατεταρτημόριο σε όλο το πείραμα. Η ανάλυση του κύριου συστατικού του προκύπτοντος φιλτραρισμένου συνόλου δεδομένων (13.906 γονίδια συνολικά) διεξήχθη χρησιμοποιώντας ακατέργαστες μετρήσεις μοναδικά χαρτογραφημένων αναγνώσεων (βλ. 2Α). Οι υπόλοιπες τιμές έκφρασης RPKM για κάθε γονίδιο που περιλαμβάνεται στο φιλτραρισμένο σύνολο δεδομένων υποβλήθηκαν σε κανονικοποίηση ποσοστού με αποκοπή 5%. Ένα διάγραμμα πλαισίου με τιμές RPKM που έχουν μετατραπεί με log 2 για κάθε δείγμα πριν από την κανονικοποίηση φαίνεται στο Σχήμα. 2Β . Η τιμή R2 για ζεύγη διακύμανσης από δείγμα σε δείγμα σε κάθε σετ βιολογικών αντιγράφων παρατηρήθηκε ότι κυμαίνεται από 0,89 έως 0,99, υποδεικνύοντας ότι τα βιολογικά μας αντίγραφα ήταν συνεπή και δεν έδειξαν ισχυρή προκατάληψη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ανάλυση διαφορικής γονιδιακής έκφρασης. Τα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια (DEGs) ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας δύο προσεγγίσεις. Πρώτον, η εμπειρική ανάλυση του αλγορίθμου διαφορικής έκφρασης γονιδίων, μέρος του πακέτου edgeR Bioconductor (21), εφαρμόστηκε στο ολοκληρωμένο σύνολο δεδομένων και των 18 πειραμάτων χρησιμοποιώντας τις προεπιλεγμένες παραμέτρους και μια τιμή P, διορθωμένη με το ρυθμό ανακάλυψης. Σε κάθε χρονική στιγμή, συγκρίθηκαν μολυσμένα και ψευδομολυνθέντα δείγματα και γονίδια των οποίων η έκφραση διέφερε περισσότερο από 2 φορές με σημαντικότητα με τιμή Ρ 0,05 θεωρήθηκαν προσωρινά ότι εκφράζονται διαφορικά. Επιπλέον της μεθόδου που περιγράφηκε παραπάνω, μια ορθογώνια στατιστική δοκιμή διαφορικής έκφρασης εφαρμόστηκε στα δεδομένα χρησιμοποιώντας μια στατιστική δοκιμή που αναπτύχθηκε από τους Baggerly et al. (22) για την καταμέτρηση του αριθμού των εκφραζόμενων ετικετών αλληλουχίας που σχετίζονται με μεμονωμένα γονίδια, ένα κοινό χαρακτηριστικό τόσο της σειριακής ανάλυσης δεδομένων γονιδιακής έκφρασης (SAGE) όσο και των δεδομένων RNA-Seq. Όταν συγκρίθηκαν μολυσμένα και ψευδώς μολυσμένα δείγματα, τα μεμονωμένα γονίδια θεωρήθηκαν προσωρινά διαφοροποιημένα όταν η έκφρασή τους διέφερε περισσότερο από 2 φορές με σημαντικότητα με τιμή Ρ 0,05. Τα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια που βρέθηκαν να βρίσκονται στη διασταύρωση των συνόλων γονιδίων που ταυτοποιήθηκαν και με τις δύο μεθόδους που περιγράφονται παραπάνω θεωρήθηκαν υποψήφια υψηλής ποιότητας και χρησιμοποιήθηκαν ως το σημείο εκκίνησης για περαιτέρω έρευνα. Ομαδοποίηση και GSEA. Τα φιλτραρισμένα, κανονικοποιημένα δεδομένα έκφρασης υποβλήθηκαν σε ομαδοποίηση k-means χρησιμοποιώντας ένα ευκλείδειο μετρικό απόστασης όπου τα γονίδια ομαδοποιήθηκαν μέσω τιμών κανονικοποιημένης γονιδιακής έκφρασης (RPKM) για κάθε πειραματική συνθήκη. Η ομαδοποίηση προσαρμόστηκε σε 20 διακριτές ομάδες ομαδοποίησης και τα μεμονωμένα προφίλ γονιδιακής έκφρασης που συγκεντρώθηκαν δοκιμάστηκαν περαιτέρω για εμπλουτισμό όρων γονιδιακής οντολογίας (GO) που σχετίζονται με μεμονωμένα γονίδια. Οι σχολιασμοί γονιδίων ελήφθησαν από το Reactome, μια βάση δεδομένων βιολογικών οδών και γονιδιακών λειτουργικών σχολιασμών (23) . Η ανάλυση εμπλουτισμού πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας δύο προσεγγίσεις. Πρώτον, διεξήχθη μια υπεργεωμετρική δοκιμή στους σχολιασμούς GO χρησιμοποιώντας μια υλοποίηση του πακέτου GOstats σε καθεμία από τις μεμονωμένες συστάδες που προέκυψαν από την ομαδοποίηση k-means (24) . Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε ανάλυση εμπλουτισμού συνόλου γονιδίων (GSEA) σε ολόκληρο το φιλτραρισμένο σύνολο δεδομένων χρησιμοποιώντας 100.000 μεταθέσεις, ενώ αφαιρέθηκαν τα αντίγραφα και εφαρμόστηκε ανάλυση διακύμανσης. Συνολικά 1.419 κατηγορίες πέρασαν ένα ελάχιστο μέγεθος χαρακτηριστικών 10 και χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω έρευνα. Οι κοόρτες γονιδίων με κοινά πρότυπα έκφρασης με την πάροδο του χρόνου αναγνωρίστηκαν με ομαδοποίηση k-means. Αυτά που βρέθηκαν να είναι εμπλουτισμένα για DEG υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε ανάλυση μονοπατιού χρησιμοποιώντας το σύστημα GeneMania (25) . Χρησιμοποιώντας μια ad hoc χειροκίνητη προσέγγιση, τα σχετικά μονοπάτια και οι συνδέσεις μεταξύ τους προσδιορίστηκαν με βάση τα υπάρχοντα δεδομένα στη βιβλιογραφία σε συνδυασμό με τα δεδομένα χρονικής γονιδιακής έκφρασης που ελήφθησαν από αυτή τη μελέτη. Ανάλυση qRT-PCR. Το καθαρισμένο mRNA μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας κιτ υψηλής χωρητικότητας RNA-to-cDNA (Life Technologies) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ανάλυση των αριθμών αντιγράφων του ιού πραγματοποιήθηκε με ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή-PCR (qRT-PCR) όπως περιγράφηκε προηγουμένως (26). Η έκφραση του ξενιστή των ακόλουθων γονιδίων προσδιορίστηκε με προσδιορισμούς TaqMan (που υποδεικνύονται σε παρενθέσεις): ενεργοποιώντας τον μεταγραφικό παράγοντα 3 (ATF3; Hs00231069_m1), ATF4 (Hs00909569_g1), CEBPB (Hs00270923_s1), CEBPD (Hs00270931_s1), DDIT3 (Hs00358796_g1), FOS (Hs04194186_s1), JUN (Hs01103582_s1), EGR1 (Hs00152928_m1), IFI6 (Hs00242571_m1), IFIT1 (Hs01911452_s1), IFIT2 ( Hs01922738_s1), IFIT3 (Hs01922738_s1), ISG15 (Hs01921425_s1), ISG20 (Hs00158122_m1), OASL (Hs00984387_m1), BI_01P59M. Δοκιμασίες για 18S rRNA (Hs99999901_s1 ή Mm04277571_s1) χρησιμοποιήθηκαν για κανονικοποίηση. Οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας ένα όργανο ABI StepOne Plus. Θεραπεία με PERKi και συλλογή για ανάλυση Western blot. Τα κύτταρα U87MG υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία για 2 ώρες με 10 Μ αναστολέα κινάσης (PERK) κινάσης (PERK) του ενδοπλασματικού δικτύου πρωτεϊνικής κινάσης RNA ομοειδούς RNA (ER) (PERKi) GSK2606414 (αριθμός καταλόγου 516535; EMD Millipore) ή διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) σε DMEM πριν από τη μόλυνση με VEEV TrD (MOI, 5). Μετά από 1 ώρα, το εμβόλιο του ιού απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν με στείρο PBS (1ϫ). Το μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο που περιέχει τον αναστολέα ή DMSO. Στους 16 hpi, το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια συλλέχθηκαν για ανάλυση στυπώματος Western. Καταστροφή του EGR1 με siRNA. Κύτταρα U87MG που εμβολιάστηκαν στα 6,7 ϫ 104 κύτταρα ανά φρεάτιο σε μια πλάκα 12 φρεατίων επιμολύνθηκαν με παρασκεύασμα λύματος πρωτεΐνης siGenome 50 nM και ανάλυση Western blot. Η παρασκευή προϊόντος λύσης πρωτεΐνης και η ανάλυση στυπώματος Western πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (27). Χρησιμοποιήθηκαν πρωτογενή αντισώματα στα ακόλουθα: EGR1 (αντίσωμα 44D5; αριθμός καταλόγου 4154; Cell Signaling), πολυκλωνική αντι-βενιζελική εγκεφαλίτιδα των ιπποειδών ιός TC83 (υπότυπος IA/B) καψιδική πρωτεΐνη (BEI Resources), CHOP (αντίσωμα L63F7; αριθμός καταλόγου 2895; Cell Signaling), φωσφορυλιωμένη ␣ υπομονάδα του ευκαρυωτικού παράγοντα έναρξης 2 (p-eIF2␣; Ser51; αντίσωμα D9G8; αριθμός καταλόγου 3398; Cell Signaling), ATF4 (αντίσωμα D4B8; αριθμός καταλόγου 11815; Cell Signaling), ενεργοποιημένη κασπάση 3 (αντίσωμα Asp175; αριθμός καταλόγου 9661; Cell Signaling), και συζευγμένη με υπεροξειδάση χρένου ␤-ακτίνη (αριθμός καταλόγου ab49900-100; Abcam).Ανάλυση ανοσοφθορισμού. Κύτταρα U87MG αναπτύχθηκαν σε καλυπτρίδες σε πλάκα 6 φρεατίων, μολύνθηκαν με VEEV TrD όπως περιγράφεται παραπάνω, πλύθηκαν με PBS (χωρίς Ca και Mg) και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με φορμαλδεΰδη 4%. Τα κύτταρα διαπερατήθηκαν με 0,5% Triton X-100 σε PBS για 20 λεπτά και στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Τα κύτταρα αποκλείστηκαν για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε 3% αλβουμίνη βόειου ορού σε PBS. Πρωτογενή αντισώματα που αποτελούνται από πρωτεΐνη καψιδίου VEEV (αριθμός καταλόγου NR-9403; BEI Resources) αραιωμένο 1:600 ​​και ένα αντίσωμα EGR1 (αντίσωμα 44D5; αριθμός καταλόγου 4154; Cell Signaling) αραιωμένα 1:400 επωάστηκαν σε φρέσκο ​​ρυθμιστικό αποκλεισμού στους 37°C για 1 ώρα και πλύθηκαν 3 φορές για 3 λεπτά κάθε φορά σε 300 mM NaCl με 0,1% Triton Χ-100. Alexa Fluor 568 δευτερεύον αντίσωμα γαϊδουριού κατά της κατσίκας (αριθμός καταλόγου A11057; Invitrogen) και Alexa Fluor 488 δευτερεύον αντίσωμα γαϊδουριού κατά ποντικού (αριθμός καταλόγου A21202; Invitrogen) αραιωμένα 1:400 χρησιμοποιήθηκαν ως δευτερεύοντα αντισώματα και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον ίδιο τρόπο όπως τα πρωτεύοντα αντισώματα. Το DAPI (4=,6-δι-αμιδινο-2-φαινυλινδόλη) αραιωμένο 1:1.000 χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση των πυρήνων. Τα καλύμματα τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες χρησιμοποιώντας 10 λίτρα μέσου στερέωσης Fluoromount G (αριθμός καταλόγου 0100-01; Southern Biotech). Για μικροσκόπιο φθορισμού χρησιμοποιήθηκε μικροσκόπιο φθορισμού Nikon Eclipse TE2000-U. Οι εικόνες προβλήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν αντικειμενικό φακό εμβάπτισης λαδιού 60°. Ελήφθησαν πέντε εικόνες από κάθε δείγμα και μια αντιπροσωπευτική εικόνα κάθε δείγματος φαίνεται παρακάτω. Όλες οι εικόνες υποβλήθηκαν σε μέσο όρο τεσσάρων γραμμών. Οι εικόνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μέσω του λογισμικού Nikon NIS-Elements AR Analysis (v3.2). Αναλύσεις CellTiter Glo και Caspase 3/7 Glo. Οι εμβρυονικοί ινοβλάστες ποντικού Ϫ/Ϫ άγριου τύπου και EGR1 (MEF) μολύνθηκαν με TrD σε διάφορα MOI για μία ώρα και στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και το μέσο αντικαταστάθηκε. Η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε 24 ώρες μετά τη μόλυνση χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία βιωσιμότητας φωταυγών κυττάρων Promega CellTiter (αριθμός καταλόγου G7571) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η ανάγνωση της φωτεινότητας έγινε χρησιμοποιώντας έναν ανιχνευτή πολλαπλών λειτουργιών Beckman Coulter DTX 880 με χρόνο ενσωμάτωσης 100 ms ανά φρεάτιο. Ομοίως, η ενεργοποίηση κασπάσης σε μολυσμένο άγριο τύπο και EGR1 Ϫ/Ϫ MEFs μετρήθηκε 24 ώρες μετά τη μόλυνση χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία Promega Caspase 3/7 Glo (αριθμός καταλόγου G8090) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η φωταύγεια διαβάστηκε χρησιμοποιώντας τον πολυτροπικό ανιχνευτή DTX 880 με χρόνο ολοκλήρωσης 100 ms ανά φρεάτιο. Αριθμοί προσχώρησης ακολουθίας νουκλεοτιδίων. Τα ακατέργαστα δεδομένα αλληλουχίας για όλες τις εκτελέσεις RNA-Seq που περιλαμβάνονται σε αυτήν την εργασία είναι δημόσια διαθέσιμα στη βάση δεδομένων NCBI BioProject με αριθμό πρόσβασης PRJNA300864 (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA300864). Κινητική αντιγραφής VEEV σε Αστροκύτταρα U87MG. Το VEEV αντιγράφεται in vivo σε μονοκύτταρα, μακροφάγους, νευρώνες και αστροκύτταρα (14) . Οι κοινές κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη της μόλυνσης από VEEV περιλαμβάνουν κύτταρα Vero και BHK. Σε αυτή τη μελέτη, τα αστροκύτταρα U87MG επιλέχθηκαν ως μοντέλο in vitro λόγω της φυσιολογικής τους συνάφειας και της μεγαλύτερης κλινικής τους σημασίας. Πραγματοποιήθηκαν αρχικά πειράματα για τον χαρακτηρισμό της ιικής αντιγραφής σε κύτταρα U87MG. Η κινητική αντιγραφής VEEV σε κύτταρα U87MG μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμές πλάκας και παρακολουθώντας τα επίπεδα έκφρασης ιικών πρωτεϊνών και RNA και το κυτταροπαθητικό αποτέλεσμα (CPE) στα μολυσμένα κύτταρα (Εικ. 1) . Η απελευθέρωση του ιού παρατηρήθηκε ήδη από τους 4 hpi, με ϳ4 λογαριθμικές μονάδες ιού να παρατηρούνται, ακολουθούμενη από μια σταθερή αύξηση της αναπαραγωγής στους 8 και 16 hpi (Εικ. 1Α). Η αντιγραφή του ιού κορυφώθηκε στους 16 hpi και δεν παρατηρήθηκε πρόσθετη αύξηση στους τίτλους του ιού στους 24 hpi. Η έκφραση του ιικού καψιδίου ακολούθησε παρόμοιο μοτίβο, με την πρωτεΐνη να ανιχνεύεται στους 8 hpi και την έκφραση να αυξάνεται στα 16 hpi (Εικ. 1Β). Μεταξύ των μολυσμένων κυττάρων U87MG, ένα σημαντικό CPE παρατηρήθηκε με μικροσκοπία στους 24 hpi, με ελάχιστο έως καθόλου CPE να ανιχνεύεται στους 16 hpi (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σύμφωνα με αυτές τις παρατηρήσεις, αυξημένη δραστηριότητα κασπάσης 3/7 παρατηρήθηκε μόνο στους 24 hpi (Εικ. 1C). Με βάση αυτά τα δεδομένα, επιλέχθηκαν για ανάλυση RNA-Seq χρόνους 4, 8 και 16 hpi, που αντικατοπτρίζουν τα πρώιμα, μεσαία και όψιμα στάδια του κύκλου ζωής του ιού, ώστε να παρέχεται μια δυναμική άποψη του Προφίλ μεταγραφώματος ξενιστή-παθογόνου. Ανάλυση αλληλουχίας RNA αστροκυττάρων μολυσμένων με VEEV. Το mRNA από εις τριπλούν σύνολα ψευδο- και μολυσμένων με VEEV κυτταροκαλλιέργειες U87MG απομονώθηκε, καθαρίστηκε στα 4, 8 και 16 hpi και χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή βιβλιοθηκών cDNA για κατάντη RNA-Seq (βλ. Υλικά και Μέθοδοι). Μια σύνοψη υψηλού επιπέδου των αποτελεσμάτων RNA-Seq παρουσιάζεται στον Πίνακα 1. Τα δείγματα RNA VEEV προσδιορίστηκαν με ποσοτική RT-PCR σε κάθε χρονικό σημείο ως έλεγχος για να καταδειχθεί το αυξανόμενο φορτίο ιικού RNA με την πάροδο του χρόνου (Εικ. 1D), σε συμφωνία με τον αυξανόμενο αριθμό αναγνώσεων RNA-Seq που χαρτογραφήθηκαν στο γονιδίωμα VEEV σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία (Πίνακας 1). Για την ανάλυση RNA-Seq, τα μεμονωμένα γονίδια εκφράστηκαν ως ο αριθμός αναγνώσεων ανά κιλοβάση του μοντέλου εξονίου ανά εκατομμύριο χαρτογραφημένες αναγνώσεις (RPKM) (19) . Log 2 -κανονικοποιημένες τιμές έκφρασης RPKM για κάθε πειραματικό δείγμα φαίνονται στο Σχήμα. 2Α και μπορεί να βρεθεί στο σύνολο δεδομένων S1 στο συμπληρωματικό υλικό. Ελάχιστη διακύμανση από δείγμα σε δείγμα στις τιμές έκφρασης εντός βιολογικών αντιγράφων ανιχνεύτηκε σταθερά (R 2 Ͼ 0,89 για όλα τα αντίγραφα. δεδομένα δεν εμφανίζονται). Επιπλέον, η διακύμανση μεταξύ των δειγμάτων βρέθηκε επίσης να είναι ελάχιστη όταν δοκιμάστηκε κατά ζεύγη σε ολόκληρο το πείραμα χρησιμοποιώντας τιμές RPKM για ERCC97 συνθετικά RNA ελέγχου ακίδας (R 2 Ͼ 0,90 για όλες τις συγκρίσεις. Τα δεδομένα δεν φαίνονται). Όπως αναμενόταν, η ανάλυση δύο συστατικών βασικών συστατικών των δεδομένων RNA-Seq για ψευδο-μολυσμένα κύτταρα έναντι κυττάρων μολυσμένων με VEEV έδειξε έναν σαφή διαχωρισμό των δειγμάτων στους 16 hpi από τα δείγματα σε προηγούμενα χρονικά σημεία (Εικ. 2Β). Ωστόσο, η ομαδοποίηση δειγμάτων μολυσμένων με VEEV με δείγματα μολυσμένα με ψευδή μόλυνση σε προηγούμενα χρονικά σημεία υποδηλώνει ότι η ανταπόκριση στην ιογενή λοίμωξη περιοριζόταν σε ένα στενό υποσύνολο γονιδίων πρώιμης απόκρισης, θέτοντας έτσι μεγαλύτερο βάρος απόδειξης στον εντοπισμό διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων (DEGs ) κατά τις πρώτες ώρες της μόλυνσης. Σε αυτές τις γραμμές, χρησιμοποιήθηκαν δύο ορθογώνιες μέθοδοι για τον προσδιορισμό των DEG κατάλληλων για περαιτέρω χαρακτηρισμό: η μέθοδος edgeR (21) και η μέθοδος που αναπτύχθηκε από τους Baggerly et al. (22) . Τα γονίδια που ταυτοποιήθηκαν με μία μέθοδο θεωρήθηκαν προσωρινά DEG και αυτά που ταυτοποιήθηκαν και με τις δύο μεθόδους ήταν υποψήφια DEG προς επιβεβαίωση με qRT-PCR. Εκτός από τη σύγκριση μεμονωμένων τιμών γονιδιακής έκφρασης για ψευδομολυσμένα κύτταρα και κύτταρα μολυσμένα με VEEV σε κάθε χρονική στιγμή, οι τιμές γονιδιακής έκφρασης συγκρίθηκαν επίσης σειριακά σε κάθε χρονοσειρά κυττάρων μολυσμένων με VEEV για γονίδια που δεν έδειξαν στατιστικά σημαντικές αλλαγές στο έκφραση σε ψευδο-μολυσμένα κύτταρα. Μια σχηματική παράσταση της συγκριτικής ανάλυσης φαίνεται στο Σχ. 2C. Ο αριθμός των στατιστικά σημαντικών DEG που προσδιορίζονται από καθεμία από αυτές τις συγκρίσεις φαίνεται στο Σχήμα. 2D . Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε ομαδοποίηση k-means (έναντι κανονικοποιημένων τιμών RPKM) για τον προσδιορισμό των ακαθάριστων αλλαγών στη γονιδιακή έκφραση με την πάροδο του χρόνου για ομάδες γονιδίων που δυνητικά μοιράζονται την ίδια οδό ή ρυθμιστικούς παράγοντες ενεργοποίησης (Εικ. 3; δείτε επίσης Σετ δεδομένων S2 στο συμπληρωματικό υλικό). Ανάλυση εμπλουτισμού γονιδιακού συνόλου (GSEA; βλέπε Υλικό και Μέθοδοι και Σύνολο Δεδομένων S3 στο συμπληρωματικό υλικό) πραγματοποιήθηκε σε κάθε σύμπλεγμα kmeans. Ειδικότερα, το σύμπλεγμα 20 (Πίνακας 2) εμπλουτίστηκε σημαντικά για γονίδια που εμπλέκονται στον μεταφραστικό έλεγχο, το μονοπάτι σηματοδότησης με τη μεσολάβηση ιντερφερόνης τύπου Ι και το μονοπάτι απόκρισης μη αναδιπλωμένης πρωτεΐνης (UPR) (τιμή GSEA P Ͻ 0,01). Παρόλο που υπάρχει μια καλά εδραιωμένη σύνδεση μεταξύ του μεταφραστικού ελέγχου και του UPR, μια νέα σύνδεση μεταξύ του UPR και της απόκρισης που διαμεσολαβείται από ιντερφερόνη τύπου Ι ως απόκριση στην αντιγραφή του ιού προτάθηκε με ανάλυση μονοπατιού (βλ. Υλικά και Μέθοδοι), που εμπλέκει την πρώιμη απόκριση ανάπτυξης 1 (EGR1) ως πιθανή γέφυρα μεταξύ αυτών των δύο μονοπατιών (Εικ. 4) . Το EGR1 ανήκει στη συστάδα 20 και προκαλείται έντονα κατά τη μόλυνση από VEEV και αρκετά άλλα γονίδια που σχετίζονται με την απόκριση ιντερφερόνης ανήκουν στην ίδια ομάδα: IRF1, IFIT1, IFIT2, ISG15 και ILF3. Το EGR1 έχει συσχετιστεί με αυξήσεις στην έκφραση του ενεργοποιητικού μεταγραφικού παράγοντα 3 (ATF3) (28) , ο οποίος είναι βασικό συστατικό του UPR και ο οποίος επίσης ανήκει στο σύμπλεγμα 20. Αυτή η σύνδεση αντιπροσώπευε πιθανούς σχολιασμούς βιολογικής διεργασίας που ελήφθησαν από το Reactome για το σύμπλεγμα 20. Τα αναγνωριστικά σχολιασμού Reactome υποδεικνύονται για κάθε σχολιασμό. Λαμβάνονται υπόψη μόνο οι ταξινομημένοι σχολιασμοί υποβολής ιχνηλασιμότητας συγγραφέα (TAS). TAP, μεταφορέας που σχετίζεται με την επεξεργασία αντιγόνου. SRP, σωματίδιο αναγνώρισης σήματος. β Πλήρες σύνολο, ο συνολικός αριθμός γονιδίων στο γονιδίωμα με μια σχολιασμένη βιολογική διαδικασία. υποσύνολο, συνολικός αριθμός διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων με σχολιασμένη βιολογική διαδικασία. Δίκτυο γονιδίων που σχετίζονται με την απόκριση ιντερφερόνης τύπου Ι και το UPR. Μεγάλοι κύκλοι, διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια. μικροί κύκλοι, γονίδια χωρίς σημαντική αλλαγή στην έκφραση. κόκκινοι κύκλοι, παράγοντες απόκρισης ιντερφερόνης τύπου Ι. κίτρινοι κύκλοι, γονίδια που ρυθμίζουν τη μεταγραφή του DNA. μπλε κύκλοι, ξεδιπλωμένα γονίδια απόκρισης πρωτεΐνης. κόκκινες γραμμές, γονίδια που εμπλέκονται σε φυσικές αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. μπλε γραμμές, γονίδια που εμπλέκονται σε ένα κοινό μονοπάτι. Αυτό το δίκτυο σπάρθηκε με ομάδες k-means 18 και 20, και αφαιρέθηκαν πολλά γονίδια ριβοσωμικής πρωτεΐνης. γέφυρα μεταξύ της οδού UPR και της οδού απόκρισης ιντερφερόνης, με το EGR1 να είναι ένας από τους πιθανούς βασικούς μεταγραφικούς παράγοντες που οδηγεί αυτή τη σύνδεση. Συνεπώς, 15 γονίδια από αυτή την ανάλυση επιλέχθηκαν για περαιτέρω χαρακτηρισμό με qRT-PCR (βλ. παρακάτω): ATF3, ενεργοποιητικός μεταγραφικός παράγοντας 4 (ATF4), CEBPB, CEBPD, DDIT3/CHOP, EGR1, FOS, IFI6, IFIT1, IFIT2, IFIT3 , ISG15, ISG20, JUN και OASL. Οι τιμές έκφρασης αυτών των γονιδίων, όπως μετρήθηκαν με το RNA-Seq, φαίνονται στο Σχ. 5Α και Β. Η επιβεβαιωτική ανάλυση qRT-PCR έδειξε σύμφωνη γονιδιακή έκφραση (Εικ. 5C και D). Τα γονίδια απόκρισης ιντερφερόνης που προκαλούνται συμφωνούν με αυτά που ανιχνεύθηκαν σε προηγούμενες δημοσιευμένες μελέτες (11, 29, 30) και αυτά τα γονίδια χρησίμευσαν ως εσωτερικός θετικός έλεγχος. Επιπλέον, η σύνδεση μεταξύ του EGR1 και της οδού ιντερφερόνης έχει αποδειχθεί. Το EGR1 επάγεται από την IFN-␥ σε ινοβλάστες ποντικού και από τις IFN-␣, -␤ και -␥ σε ανθρώπινους ινοβλάστες (31, 32). Το EGR1 και η οδός UPR επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση, καθώς ο ρόλος τους στη μόλυνση VEEV δεν έχει διευκρινιστεί. Τα δεδομένα ανάλυσης RNA-Seq και μονοπατιού έδειξαν ότι τα γονίδια UPR και απόκρισης στρες προκλήθηκαν μετά τη μόλυνση VEEV. Κατά τη διάρκεια μιας μόλυνσης, τα κύτταρα-ξενιστές ανταποκρίνονται στις κυτταρικές πιέσεις που προκύπτουν από την αυξημένη μετάφραση και έκκριση πρωτεϊνών του ιού πυροδοτώντας την έναρξη της οδού UPR. Η οδός UPR είναι μια προσαρμοστική κυτταρική απόκριση που ενεργοποιείται από το στρες του ενδοπλασματικού δικτύου (ER) λόγω λανθασμένης αναδίπλωσης πρωτεΐνης. Προκειμένου να ρυθμιστεί η κυτταρική ομοιόσταση κατά την αναδίπλωση και την έκκριση πρωτεϊνών, η οδός UPR έχει αναπτύξει τρεις κατηγορίες αισθητήρων για τη διασφάλιση της σωστής κυτταρικής ρύθμισης: το ένζυμο 1 που απαιτεί ινοσιτόλη (IRE1), την κινάση πρωτεΐνης RNA τύπου ER (PERK) και τον παράγοντα μεταγραφής ενεργοποίησης 6 (ATF6) (33, 34) . Κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από VEEV, ο βραχίονας PERK του UPR φάνηκε να έχει αλλοιωθεί, καθώς δύο κρίσιμοι ρυθμιστές αυτής της οδού εκφράστηκαν διαφορετικά: ATF4 και CHOP (DDIT3) (35) . Για να προσδιοριστεί εάν τα DEG άλλαξαν την έκφραση πρωτεΐνης που ακολουθεί, πραγματοποιήθηκε ανάλυση στυπώματος Western για CHOP, ATF4 και φωσφορυλιωμένο eIF2␣ (p-eIF2␣). Η τουνικαμυκίνη, ένας αναστολέας γλυκοζυλίωσης και επαγωγέας του UPR (36), συμπεριλήφθηκε ως θετικός έλεγχος. Μια ανάλυση χρονικής πορείας κυττάρων U87MG που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 Μ τουνικαμυκίνη έδειξε ότι 8 ώρες θεραπείας παρείχαν την πιο ισχυρή επαγωγή πρωτεϊνών UPR (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα μολυσμένα με VEEV αλλά όχι μολυσμένα από ψευδή ή αδρανοποιημένα κύτταρα VEEV (UV-VEEV) εμφάνισαν μια δραματική αύξηση στην έκφραση p-eIF2␣ και μια μέτρια αλλά σταθερή αύξηση στην έκφραση CHOP και ATF4 στους 16 hpi (Εικ. 6Α). Δεν παρατηρήθηκε αλλαγή στην έκφραση πρωτεΐνης στους 4 hpi (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Η ομοεστιακή μικροσκοπία επιβεβαίωσε την ανοδική ρύθμιση CHOP και ATF4, επιδεικνύοντας ένα πιο ισχυρό και πυρηνικό μοτίβο χρώσης σε κύτταρα μολυσμένα με VEEV από ό,τι σε κύτταρα μολυσμένα με ψευδή μόλυνση (Εικ. 6C έως E). Ενώ τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης ATF4 αυξήθηκαν, οι αφθονίες mRNA του ATF4 μειώθηκαν μετά τη μόλυνση VEEV (Εικ. 5Β και Δ). Αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν με την παρατήρηση ότι η έκφραση ATF4 ρυθμίζεται σε μεταφραστικό επίπεδο κατά την επαγωγή UPR (37) . Δεδομένου ότι το eIF2␣ μπορεί να φωσφορυλιωθεί από πολλαπλές κινάσες (PERK, εξαρτώμενο από δίκλωνο RNA πρωτεϊνικής κινάσης [PKR], μη καταθλιπτικό-2 γενικού ελέγχου [GCN2] και αιμορυθμισμένος αναστολέας [HRI]) (38) , ο αναστολέας PERK (PERKi) G41SK20 χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί εάν η παρατηρούμενη φωσφορυλίωση ήταν εξαρτημένη από PERK. Η θεραπεία των μολυσμένων με VEEV κυττάρων με PERKi οδήγησε σε σημαντική μείωση της φωσφορυλίωσης eIF2␣ (Εικ. 6Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το PERK συνεισφέρει στη φωσφορυλίωση eIF2␣ αλλά ότι υπάρχει πιθανότητα μια πρόσθετη κινάση που συμβάλλει στο γεγονός φωσφορυλίωσης. Συλλογικά, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι ο βραχίονας PERK της οδού UPR προκαλείται σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία μετά τη μόλυνση από VEEV. Το EGR1 ρυθμίζεται προς τα πάνω σε μολυσμένα κύτταρα και εντοπίζεται στον πυρήνα. Το EGR1 είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που μπορεί να προκληθεί από πολυάριθμα σήματα, συμπεριλαμβανομένου του οξειδωτικού στρες, της υποξαιμίας και των αυξητικών παραγόντων (39, 40). Μπορεί επίσης να ενεργοποιηθεί κατά τη μόλυνση από ιούς DNA και RNA, συμπεριλαμβανομένου του ιού Epstein-Barr, του ιού της ηπατίτιδας ποντικών, του κοροναϊού ποντικού και του ιού της ιαπωνικής εγκεφαλίτιδας (41) (42) (43) . Η θεραπεία των MEFs με τον ενεργοποιητή UPR thapsigargin έχει αποδειχθεί ότι επάγει την έκφραση EGR1 με τρόπο που εξαρτάται από το PERK (44) . Δεδομένης της σχέσης μεταξύ EGR1 και UPR και της ισχυρής επαγωγής της έκφρασης mRNA του EGR1 μετά από μόλυνση VEEV (Εικ. 4 και 5), το EGR1 επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη. Η έκφραση της πρωτεΐνης EGR1 μετά από μόλυνση VEEV αναλύθηκε με ανάλυση στυπώματος Western. Όπως έχουν υποδείξει προηγούμενες μελέτες ότι το EGR1 μπορεί να ενεργοποιηθεί από τον ιό της ηπατίτιδας ποντικού ανεξάρτητα από την αναπαραγωγή του ιού (πιθανόν λόγω διαταραχής της κυτταρικής μεμβράνης μετά την είσοδο) (41), συμπεριλήφθηκε ένας μάρτυρας αδρανοποιημένου με υπεριώδη ακτινοβολία (UV-VEEV). Τα επίπεδα πρωτεΐνης EGR1 αυξήθηκαν μετά από μόλυνση VEEV σε σύγκριση με εκείνα σε κύτταρα μολυσμένα με ψευδή και μολυσμένα με UV-VEEV κύτταρα (Εικ. 7Α; συγκρίνετε τις λωρίδες 3, 6 και 9). Η πιο δραματική ανοδική ρύθμιση του EGR1 σημειώθηκε στους 16 hpi. αυτό συσχετίζεται με τα υψηλότερα επίπεδα παραγωγής καψιδίου VEEV (Εικ. 1Β). Μετά την επαγωγή, το EGR1 έχει δειχθεί ότι μετατοπίζεται στον πυρήνα για να επάγει γονιδιακή έκφραση μέσω δέσμευσης στην αλληλουχία δέσμευσης Egr (EBS) [GCG(G/T)GGCG] (40, 45) . Η ομοεστιακή μικροαντίγραφη αποκάλυψε υψηλά επίπεδα EGR1 στους πυρήνες των μολυσμένων κυττάρων, ενώ μόνο χαμηλά επίπεδα τόσο του πυρηνικού όσο και του κυτταροπλασματικού EGR1 ανιχνεύθηκαν σε ψευδο-μολυσμένα κύτταρα (Εικ. 7Β). Η θεραπεία με PERKi των μολυσμένων με VEEV κυττάρων είχε ως αποτέλεσμα την πλήρη απώλεια της επαγωγής EGR1 (Εικ. 7C), υποδεικνύοντας ότι το EGR1 προκλήθηκε με τρόπο που εξαρτάται από το PERK. Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης EGR1 και ο πυρηνικός εντοπισμός αυξάνονται μετά τη μόλυνση από VEEV και ότι η επαγωγή του EGR1 εξαρτάται από το PERK. Η απώλεια του EGR1 αναστέλλει την επαγόμενη από το VEEV απόπτωση αλλά δεν αλλάζει την κινητική αντιγραφής του VEEV. Καθώς το EGR1 επηρεάζει την κυτταρική επιβίωση και την απόπτωση (46), εκτιμήθηκε η επίδραση του EGR1 στον επαγόμενο από το VEEV κυτταρικό θάνατο. Η διάσπαση της κασπάσης 3 παρατηρήθηκε σε WT MEF στους 24 hpi όταν μολύνθηκαν με MOI 0,5 και ξεκίνησε ήδη από τους 16 hpi όταν μολύνθηκαν με MOI 5 (Εικ. 8Α). Αντίθετα, τα κύτταρα EGR1 Ϫ/Ϫ έδειξαν μικρή έως καθόλου ανιχνεύσιμη διάσπαση κασπάσης μετά από μόλυνση με VEEV. Πραγματοποιήθηκαν δύο σειρές πειραμάτων για να επιβεβαιωθούν ποσοτικά αυτά τα αποτελέσματα: δοκιμασίες CellTiter Glo για τη μέτρηση της συνολικής κυτταρικής βιωσιμότητας (παραγωγή ΑΤΡ) και δοκιμασίες Caspase 3/7 Glo για τη μέτρηση της δραστηριότητας κασπάσης 3/7. Τόσο τα WT όσο και τα EGR1 Ϫ/Ϫ MEF εμφάνισαν δοσοεξαρτώμενες μειώσεις στη βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από μόλυνση VEEV, με τα κύτταρα EGR1 Ϫ/Ϫ να έχουν σημαντικά πιο βιώσιμα κύτταρα σε κάθε MOI που εξετάστηκε (Εικ. 8Β). Ομοίως, μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στη δραστηριότητα της κασπάσης 3/7 παρατηρήθηκε μετά τη μόλυνση από VEEV, με τα κύτταρα EGR1 Ϫ/Ϫ να δείχνουν μειωμένη δραστηριότητα κασπάσης 3 σε MOI 0,5 και 5 (Εικ. 8C). Αυτά τα αποτελέσματα αντιγράφηκαν σε κύτταρα U87MG που είχαν διαμολυνθεί με siRNA που στοχεύει EGR1 (Εικ. 8D). Το EGR1 έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει αρνητικά τη μεταγραφή του BIRC5 (survivin), ενός μέλους της οικογένειας του αναστολέα της απόπτωσης (IAP) (47) . Τα δεδομένα RNA-Seq έδειξαν ότι η έκφραση του γονιδίου BIRC5 μειώθηκε μετά από μόλυνση VEEV: οι τιμές αλλαγής λογαριθμικής 2-μετασχηματισμένης πτυχής της κανονικοποιημένης γονιδιακής έκφρασης ήταν Ϫ1.16, Ϫ1.18 και Ϫ1.50 σε 4, 8 και 16 hpi, αντίστοιχα ( δείτε τον Πίνακα S1 στο συμπληρωματικό υλικό και τον αριθμό πρόσβασης του NCBI BioProject PRJNA300864). Τα MEF WT και EGR1 Ϫ/Ϫ χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί εάν το EGR1 επηρέασε την έκφραση του γονιδίου BIRC5 μετά από μόλυνση VEEV. Η έκφραση του BIRC5 μειώθηκε σημαντικά στους 16 hpi σε μολυσμένα με VEEV WT MEF, αλλά αυτή η μείωση δεν παρατηρήθηκε σε μολυσμένα με VEEV EGR1 Ϫ/Ϫ MEFs (Εικ. 8Ε). Η έκφραση του γονιδίου για τον X-συνδεδεμένο αναστολέα της απόπτωσης (XIAP), άλλο μέλος της οικογένειας IAP, δεν μεταβλήθηκε σημαντικά διαφορικά μετά τη μόλυνση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι το EGR1 συμβάλλει στην επαγόμενη από το VEEV απόπτωση. Οι κινητικές αντιγραφής VEEV προσδιορίστηκαν τόσο για τα EGR1 Ϫ/Ϫ όσο και για τα WT MEF για να προσδιοριστεί η συνάφεια του EGR1 στην ιική αντιγραφή. Τα κύτταρα μολύνθηκαν σε δύο διαφορετικά ΜΟΙ (0,5 και 5) και τα ιικά υπερκείμενα συλλέχθηκαν στα 4, 8, 16 και 24 hpi και αναλύθηκαν με ανάλυση πλάκας. Οι κινητικές αντιγραφής ήταν παρόμοιες μεταξύ των EGR1 Ϫ/Ϫ και των WT MEF και στα δύο MOI, με τους τίτλους να κορυφώνονται στους 16 hpi (Εικ. 9Α). Η έλλειψη έκφρασης EGR1 επιβεβαιώθηκε με στύπωμα Western (Εικ. 9Β). Αυτά τα αποτελέσματα αντιγράφηκαν σε κύτταρα U87MG επιμολυνθέντα με siRNA που στοχεύει EGR1. Η επιμόλυνση του siRNA που στοχεύει το EGR1 οδήγησε σε μείωση κατά Ͼ90% στην έκφραση της πρωτεΐνης EGR1 (Εικ. 9D ) χωρίς καμία σημαντική επίδραση στην αντιγραφή του ιού (Εικ. 9C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η μείωση της απόπτωσης που παρατηρήθηκε σε EGR1 Ϫ/Ϫ MEFs δεν οφειλόταν σε αλλοιωμένη κινητική αντιγραφής VEEV. Παρά το γεγονός ότι αναγνωρίζεται ως αναδυόμενη απειλή, σχετικά λίγα είναι γνωστά για τους μηχανισμούς λοιμογόνου δράσης των αλφαϊών, σε μεγάλο βαθμό λόγω ενός κενού γνώσης σε την αλληλεπίδραση ξενιστή-παθογόνου. Η λοίμωξη VEEV συχνά οδηγεί σε θανατηφόρα εγκεφαλίτιδα και είναι γνωστό ότι αναστέλλει τόσο την κυτταρική μεταγραφή όσο και τη μετάφραση προκειμένου να μειωθεί η έμφυτη ανοσολογική απόκριση (1, 48) . Αντίθετα, στο ΚΝΣ το VEEV έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει προς τα πάνω πολλά γονίδια τόσο στη φλεγμονώδη απόκριση όσο και στην αποπτωτική οδό (1, 48) . Συγκεκριμένα, πολυάριθμες προφλεγμονώδεις κυτοκίνες, συμπεριλαμβανομένων των ιντερλευ-κιν-1␤ (IL-1␤), IL-6, IL-12, κινάση συνθάσης γλυκογόνου 3␤, επαγώγιμη συνθάση νιτρικού οξειδίου και παράγοντα νέκρωσης όγκου άλφα (TNF-␣), Όλα έχουν αποδειχθεί ότι παίζουν ρόλο στην παθογένεση του VEEV (49) (50) (51) (52) (53) . Η χρήση τεχνολογιών αλληλουχίας επόμενης γενιάς υψηλής απόδοσης, όπως το RNA-Seq, επιτρέπει μια εις βάθος και αμερόληπτη ματιά στο μεταγραφικό στοιχείο ιού-ξενιστή, επιτρέποντας έτσι τις αλλαγές στην έκφραση συγκεκριμένων mRNA να συνδέονται με φαινοτυπικά αποτελέσματα. Για το σκοπό αυτό, η αναγνώριση κρίσιμων διαφορικά εκφραζόμενων μεταγραφών μεταξύ κλινικά σχετικών μολυσμένων κυττάρων θα βοηθήσει στην καλύτερη κατανόηση της παθογένεσης του ιού και μπορεί να αποδειχθεί ευεργετική για τον προσδιορισμό θεραπευτικών στόχων.Σε αυτή τη μελέτη, τα δεδομένα ανάλυσης δικτύου/RNA-Seq και τα αποτελέσματα Μελέτες έκφρασης πρωτεϊνών αποκάλυψαν ότι η μόλυνση VEEV είχε ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του βραχίονα PERK της οδού UPR, συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποίησης της φωσφορυλίωσης ATF4, CHOP και eIF2␣. Αρκετοί αλφαϊοί έχουν αναφερθεί προηγουμένως ότι παραβιάζουν βασικά συστατικά της οδού UPR για να προωθήσουν την ιική αντιγραφή, καθώς η εξάρτηση των ιών με περίβλημα στο ER για τη σύνθεση γλυκοπρωτεϊνών που σχετίζονται με το φάκελο του ιού και τη μεταφορά τους στη μεμβράνη πλάσματος συχνά τονίζει το ER λόγω της ταχείας παραγωγής ιικής πρωτεΐνης (54, 55) . Η διαμόρφωση του UPR δεν είναι μοναδική στους αλφαϊούς. Μάλλον, είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό πολλών ιών θετικής αίσθησης RNA. Ο ιός του δάγγειου πυρετού έχει αποδειχθεί ότι καταστέλλει το PERK αναστέλλοντας τη συνεχιζόμενη φωσφορυλίωση eIF2␣ προκειμένου να αναστείλει την άμεση απόπτωση, αυξάνοντας τη μετάφραση ιικών πρωτεϊνών και επεκτείνοντας το μήκος της παραγωγικής ιικής αντιγραφής (34) . Μελέτες με τον ιό της ηπατίτιδας Ε (HEV) έχουν δείξει ότι η έκφραση του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης 2 της πρωτεΐνης καψιδίου HEV (ORF2) ενεργοποιεί την έκφραση των CHOP και ATF4 (56) . Στο HEV, το ORF2 αποδείχθηκε ότι διεγείρει το CHOP τόσο μέσω στρεσογόνων παραγόντων ER όσο και μέσω των στοιχείων απόκρισης αμινοξέων (AARE) μέσω αλληλεπίδρασης με το ATF4 (56). Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ δείχνουν ότι κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από VEEV, η έναρξη της οδού UPR και η επακόλουθη ενεργοποίηση του παιχνιδιού EGR1 ρόλο στην έκβαση της απόπτωσης που προκαλείται από τον ιό. Κατά την αρχική ανίχνευση του στρες ER, το PERK είναι σε θέση να αναγνωρίσει λανθασμένα διπλωμένες πρωτεΐνες στον αυλό του ER και φωσφορυλιώνει το eIF2␣ προκειμένου να ξεκινήσει μονοπάτια προεπιβίωσης στο UPR μέσω της γενικής δραστηριότητας κασπάσης 3/7 στους 24 hpi που αναλύθηκε χρησιμοποιώντας την κασπάση Δοκιμασία 3/7 Glo. Οι τιμές αλλαγής αναδίπλωσης για πλαστά μολυσμένα κύτταρα ορίστηκαν σε τιμή 1. **, P Ͻ 0,001. (Ε) Τα EGR1 Ϫ/Ϫ και WT MEFs ήταν μολυσμένα με ψευδή ή VEEV (MOI, 5). Παρασκευάστηκε RNA και προσδιορίστηκε η γονιδιακή έκφραση με qRT-PCR χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς TaqMan για BIRC5 (survivin). Τα δεδομένα που εμφανίζονται είναι οι τιμές της αλλαγής του διπλώματος της κανονικοποιημένης γονιδιακής έκφρασης που προσδιορίζονται με τη μέθοδο του ⌬⌬C T threshold cycle (C T ). *, P Ͻ 0,005 (σύγκριση μολυσμένων με VEEV κυττάρων WT και EGR1 Ϫ/Ϫ). αναστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης (33, 34) . Το VEEV φαίνεται να επάγει το UPR και να προάγει αυξημένη φωσφορυλίωση eIF2␣, η οποία έχει ως αποτέλεσμα τη μεταφραστική αναστολή των περισσότερων mRNA, ενώ το UPR αυξάνει επιλεκτικά τη μετάφραση του ATF4. Το ATF4 είναι υπεύθυνο για την έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην απόπτωση, τις διεργασίες οξειδοαναγωγής, το μεταβολισμό των αμινοξέων και τη στρατολόγηση συνοδών ER και είναι ένας πολύ γνωστός μεσολαβητής της οδού PERK και του CHOP (33, 34). Η ενεργοποίηση CHOP διευκολύνει την αυξημένη έκφραση των κυτταρικών συνοδών προκειμένου να εξουδετερωθεί η συσσώρευση λανθασμένων πρωτεϊνών (57) . Η αποτυχία καταστολής της λανθασμένης αναδίπλωσης των πρωτεϊνών σε επίμονα στρεσαρισμένα κύτταρα, όπως κατά τη διάρκεια μιας ιογενούς λοίμωξης, μπορεί στη συνέχεια να οδηγήσει σε ενεργοποίηση του προαποπτωτικού μεταγραφικού παράγοντα CHOP, οδηγώντας σε καταστολή του λεμφώματος-2 των αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών Β κυττάρων (Bcl-2). Το CHOP μπορεί επίσης να λειτουργήσει ως μεταγραφικός παράγοντας προεπιβίωσης αποφωσφορυλιώνοντας το eIF2␣ μέσω της ενεργοποίησης της πρωτεΐνης που προκαλεί βλάβη στο DNA (GADD34) σε μια αυτορυθμιζόμενη ανατροφοδότηση (33, 34) . Ωστόσο, τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ υποστηρίζουν ένα μοντέλο σύμφωνα με το οποίο η λοίμωξη VEEV οδηγεί το CHOP να λειτουργεί στον προαποπτωτικό του ρόλο, καθώς δεν ανιχνεύθηκε καμία αλλαγή στην έκφραση του γονιδίου GADD34 με ανάλυση RNA-Seq. Ενώ το UPR προκλήθηκε μετά τη μόλυνση VEEV, δεν παρατηρήθηκε ισχυρή ενεργοποίηση μέχρι αργότερα χρονικά σημεία μετά τη μόλυνση. Αυτό είναι κάπως εκπληκτικό, καθώς η μόλυνση VEEV αναμένεται να προκαλέσει σημαντικό στρες ER λόγω της μαζικής παραγωγής ιικών πρωτεϊνών κατά τη διάρκεια μιας οξείας ισχυρής μόλυνσης. Οι δομικές πρωτεΐνες του VEEV μεταφράζονται από το ιικό υπογονιδιωματικό RNA σε πολυπρωτεΐνες στο ακατέργαστο ER. Οι πρόδρομες γλυκοπρωτεΐνες Ε1 και ρΕ2 στη συνέχεια συναρμολογούνται ως ετεροδιμερή στο ER, υφίστανται διαμορφωτικές αλλαγές που απαιτούν πολυάριθμους συνοδούς (1, 58) . Είναι πιθανό η VEEV να έχει αναπτύξει μηχανισμούς για να ανατρέψει την επαγωγή του UPR. Προκειμένου να εξουδετερωθεί το UPR, οι μη δομικές πρωτεΐνες (nsPs) του ιού Chikungunya (CHIKV) έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλουν την έκφραση του ATF4 και άλλων γνωστών γονιδίων-στόχων UPR, συμπεριλαμβανομένων των GRP78/BiP, GRP94 και CHOP (59) . Μέσω της δραστηριότητας nsP, το CHIKV έχει αναπτύξει ένα μέσο καταστολής της δραστηριότητας UPR που προκύπτει από το στρες ER που προκαλείται από την γλυκοπρωτεΐνη του ιού, αποτρέποντας έτσι την άμεση αυτοφαγία και την αποπτωτική ενεργοποίηση. Το καψίδιο VEEV είναι υπεύθυνο για την παρεμβολή στην νουκλεοκυτταροπλασματική διακίνηση και την αναστολή της μεταγραφής rRNA και mRNA και έχει εμπλακεί στη ρύθμιση της σηματοδότησης IFN τύπου Ι και της αντιϊκής απόκρισης μέσω της ρύθμισης τόσο του ιικού RNA όσο και της παραγωγής πρωτεΐνης (1, 48, 60). Επομένως, υποθέτουμε ότι η ικανότητα του καψιδίου VEEV να αναστέλλει την κυτταρική μεταγραφή και να μπλοκάρει την νουκλεοκυτταροπλασματική διακίνηση έχει ως αποτέλεσμα καθυστερημένη επαγωγή του UPR. Τα αποτελέσματα μιας λεπτομερούς ανάλυσης δικτύου με βάση τα υπάρχοντα δεδομένα στη βιβλιογραφία, σε συνδυασμό με τα χρονικά προφίλ γονιδιακής έκφρασης που λαμβάνονται από αυτή τη μελέτη, δείχνουν ότι το EGR1 είναι ένας σημαντικός κόμβος στη νέα σύνδεση μεταξύ της ενεργοποίησης VEEV της απόκρισης ιντερφερόνης τύπου Ι και του UPR. Το EGR1 είναι γνωστό ότι σχηματίζει ένα σύμπλοκο δέσμευσης DNA με το C/EBPB, έναν κρίσιμο συνεργάτη διμερισμού του CHOP (61) . Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ο πυρηνικός εντοπισμός του CHOP μπορεί να δράσει ως επαγωγέας του EGR1 και ότι το CHOP μπορεί να λειτουργήσει ως μεταγραφικός συμπαράγοντας για τη ρύθμιση των γονιδίων-στόχων C/EBPB-EGR1 (61) . Τα αποτελέσματα της ανάλυσης Western blot και μικροσκοπίας που παρουσιάζονται σε αυτή τη μελέτη υποστηρίζουν αυτό το μοντέλο, καθώς η μόλυνση VEEV βρέθηκε να αυξάνει τόσο τα συνολικά επίπεδα όσο και την πυρηνική κατανομή του CHOP μαζί με αυτά του EGR1. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν επαγωγή EGR1 mRNA από IFN-␥ σε ινοβλάστες ποντικού και από TNF-␣, TNF-␤, IL-1, IFN-␣, IFN-␤, και IFN-␥ σε ανθρώπινους ινοβλάστες (31, 32) . Το EGR1, επίσης γνωστό ως Zif268 και NGF1-A, είναι μια πρωτεΐνη δακτύλου ψευδαργύρου και μεταγραφικός παράγοντας θηλαστικών. Έχει εμπλακεί στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση, αλλά μπορεί επίσης να έχει προαποπτωτικές λειτουργίες, ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου και το ερέθισμα (62) . Ιδιαίτερου ενδιαφέροντος, το EGR1 ελέγχει άμεσα τον πολλαπλασιασμό όταν ενεργοποιείται από την ενεργοποιημένη από μιτογόνο πρωτεϊνική κινάση/εξωκυτταρικό μονοπάτι κινάσης που ρυθμίζεται από σήμα σε διεγερμένα από μιτογόνο αστροκύτταρα (63) . Αλλαγές που προκαλούνται από τον ιό στην έκφραση του EGR1 έχουν παρατηρηθεί σε αρκετά συστήματα in vitro. Σε αστροκύτταρα μολυσμένα με HIV-1, η ανοδική ρύθμιση του EGR1 βρέθηκε ότι προκαλείται από το Tat μέσω της μετενεργοποίησης του προαγωγέα EGR1, οδηγώντας σε κυτταρική δυσλειτουργία και νευροτοξικότητα που προκαλείται από Tat (64) . Αυξημένες ποσότητες mRNA EGR1 έχει επίσης αποδειχθεί ότι δρα με έναν ειδικό για την περιοχή τρόπο, που αντιστοιχεί χρονικά με την παραγωγή ιικού RNA στους εγκεφαλικούς ιστούς αρουραίων που έχουν μολυνθεί είτε με τον ιό της λύσσας είτε με τον ιό της νόσου Borna (65). Συνοπτικά, η τρέχουσα μελέτη δείχνει μια πιθανή σύνδεση μεταξύ της ενεργοποίησης UPR και του EGR1. Τα EGR1 Ϫ/Ϫ MEFs έδειξαν χαμηλότερα επίπεδα ευαισθησίας στον επαγόμενο από VEEV κυτταρικό θάνατο από τα MEF άγριου τύπου, υποδεικνύοντας ότι το EGR1 ρυθμίζει προαποπτωτικές οδούς μετά τη μόλυνση. Μελέτες βρίσκονται σε εξέλιξη για να προσδιοριστεί εάν η αλλαγή του UPR μέσω αναστολέων μικρών μορίων ή η παρεμβολή του siRNA επηρεάζει την αντιγραφή του VEEV και/ή τον κυτταρικό θάνατο. Μέχρι σήμερα, οι μηχανισμοί που κρύβονται πίσω από την παθογένεση του VEEV και τον επακόλουθο νευρωνικό εκφυλισμό έχουν αποσαφηνιστεί μόνο εν μέρει. Επομένως, ο προσδιορισμός του ρόλου του EGR1 και του UPR μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη ενός νέου θεραπευτικού στόχου με αποτέλεσμα μειωμένο νευρωνικό θάνατο και τα επακόλουθα νευρωνικά επακόλουθα που προκύπτουν από μόλυνση.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 50845, "text": "Western blot" } ], "id": 941, "question": "Ποια εργαστηριακή εξέταση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παρακολούθηση της πρωτεϊνικής έκφρασης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2481, "text": "από τα κουνούπια" } ], "id": 933, "question": "Πώς μεταδίδεται ο ιός της εγκεφαλίτιδας των ιπποειδών της Βενεζουέλας;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4471, "text": "35%" } ], "id": 935, "question": "Ποιο είναι το ποσοστό θνησιμότητας από τον ιό της εγκεφαλίτιδας των ίππων της Βενεζουέλας στα παιδιά;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4493, "text": "10%" } ], "id": 936, "question": "Ποιο είναι το ποσοστό θνησιμότητας από τον ιό της εγκεφαλίτιδας των ίππων της Βενεζουέλας σε ενήλικες;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6505, "text": "TC83" } ], "id": 937, "question": "Ποιο εμβόλιο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την πρόληψη του ιού της εγκεφαλίτιδας των ιπποειδών της Βενεζουέλας;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Host resilience to emerging coronaviruseshttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7079962/SHA: f7cfc37ea164f16393d7f4f3f2b32214dea1ded4Authors: Jamieson, Amanda MDate: 2016-07-01DOI: 10.2217/fvl-2016-0060License: cc-byAbstract : Πρόσφατα, δύο κοροναϊοί, ο κορονοϊός με σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο και ο κορωνοϊός με αναπνευστικό σύνδρομο της Μέσης Ανατολής, εμφανίστηκαν για να προκαλέσουν ασυνήθιστα σοβαρή αναπνευστική νόσο στους ανθρώπους. Επί του παρόντος, υπάρχει έλλειψη αποτελεσματικών αντιικών επιλογών θεραπείας ή διαθέσιμων εμβολίων. Δεδομένης της σοβαρότητας αυτών των εστιών και της πιθανότητας εμφάνισης πρόσθετων ζωονοσογόνων κορωνοϊών στο εγγύς μέλλον, είναι απαραίτητη η διερεύνηση διαφορετικών θεραπευτικών στρατηγικών. Η ανθεκτικότητα στην ασθένεια είναι η ικανότητα ενός δεδομένου ξενιστή να ανεχθεί μια μόλυνση και να επιστρέψει σε κατάσταση υγείας. Αυτή η ανασκόπηση επικεντρώνεται στη διερεύνηση διάφορων μηχανισμών ανθεκτικότητας του ξενιστή που θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για τη θεραπεία του κορωνοϊού σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου, του κορωνοϊού με αναπνευστικό σύνδρομο της Μέσης Ανατολής και άλλων αναπνευστικών ιών που προκαλούν οξεία πνευμονική βλάβη και σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας. Κείμενο: Ο 21ος αιώνας προαναγγέλθηκε με την εμφάνιση δύο νέων κοροναϊών (CoV) που έχουν ασυνήθιστα υψηλή παθογένεια και θνησιμότητα [1] [2] [3] [4] [5] . Ο κορωνοϊός με σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο (SARS-Cov) εντοπίστηκε για πρώτη φορά το 2003 [6] [7] [8] [9] . Ενώ αρχικά υπήρχε μεγάλη ανησυχία για τον SARS-CoV, όταν δεν εμφανίστηκαν νέα κρούσματα, η χρηματοδότηση και η έρευνα μειώθηκαν. Ωστόσο, μια δεκαετία αργότερα, ο κορωνοϊός του αναπνευστικού συνδρόμου της Μέσης Ανατολής (MERS-CoV), επίσης γνωστός ως HCoV-EMC, εμφανίστηκε αρχικά στη Σαουδική Αραβία [3, 10]. Ο SARS-CoV μόλυνε περίπου 8000 άτομα και είχε ως αποτέλεσμα το θάνατο περίπου του 10% των μολυσμένων [11] . Ενώ ο MERS-CoV δεν είναι τόσο διαδεδομένος όσο ο SARS-CoV, φαίνεται να έχει ακόμη υψηλότερο ποσοστό θνησιμότητας, με το 35-50% των διαγνωσμένων λοιμώξεων να καταλήγουν σε θάνατο [3, [12] [13] . Αυτοί οι θανατηφόροι ιοί του betacoronavirus υπήρχαν σε δεξαμενές ζώων [4] [5] 9, [14] [15] . Πρόσφατα, άλλοι CoV έχουν ανιχνευθεί σε πληθυσμούς ζώων αυξάνοντας την πιθανότητα να δούμε επανάληψη αυτών των τύπων εστιών στο εγγύς μέλλον [11, [16] [17] [18] [19] [20] . Και οι δύο αυτοί ζωονοσογόνοι ιοί προκαλούν μια πολύ πιο σοβαρή ασθένεια από αυτή που παρατηρείται συνήθως για τους CoV, γεγονός που τους καθιστά παγκόσμια ανησυχία για την υγεία. Τόσο ο SARS-CoV όσο και ο MERS-CoV οδηγούν σε σοβαρή παθολογία των πνευμόνων. Πολλοί μολυσμένοι ασθενείς έχουν οξεία πνευμονική βλάβη (ALI), μια κατάσταση που διαγιγνώσκεται με βάση την παρουσία πνευμονικού οιδήματος και αναπνευστικής ανεπάρκειας χωρίς καρδιακή αιτία. Σε ορισμένους ασθενείς υπάρχει εξέλιξη στην πιο σοβαρή μορφή της ALI, το σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας (ARDS) [21] [22] [23] . Για να επιβιώσει από μια δεδομένη λοίμωξη, ένας επιτυχημένος ξενιστής δεν πρέπει μόνο να μπορεί να εξαφανιστεί το παθογόνο, αλλά ανέχονται τη βλάβη που προκαλείται από το ίδιο το παθογόνο και επίσης από την ανοσολογική απόκριση του ξενιστή [24] [25] [26] . Αναφερόμαστε στην ανθεκτικότητα ως την ικανότητα ενός ξενιστή να ανέχεται τις επιδράσεις των παθογόνων και την ανοσολογική απόκριση στα παθογόνα. Ένας ανθεκτικός ξενιστής είναι σε θέση να επιστρέψει σε κατάσταση υγείας αφού ανταποκριθεί σε μια μόλυνση [24, [27] [28] . Οι περισσότερες διαθέσιμες επί του παρόντος θεραπευτικές επιλογές για μολυσματικές ασθένειες είναι τα αντιμικροβιακά. Για παραγγελίες επανεκτύπωσης, επικοινωνήστε με τη διεύθυνση: [email protected] REviEW Jamieson μελλοντική επιστημονική ομάδα και έτσι στοχεύστε το ίδιο το παθογόνο. Δεδομένης της βλάβης που μπορούν να προκαλέσουν τα παθογόνα, αυτή η εστίαση στην ταχεία εκκαθάριση των παθογόνων είναι κατανοητή. Ωστόσο, μια εξίσου σημαντική ιατρική παρέμβαση είναι η αύξηση της ικανότητας του ξενιστή να ανέχεται τις άμεσες και έμμεσες επιδράσεις του παθογόνου και αυτός είναι ένας τομέας που μόλις αρχίζει να διερευνάται [29] . Η βλάβη στο επιθήλιο του πνεύμονα από παθογόνα του αναπνευστικού είναι μια κοινή αιτία μειωμένης ανθεκτικότητας [30] [31] [32] . Αυτή η ανασκόπηση διερευνά ορισμένες από τις πιθανές οδούς ανθεκτικότητας του ξενιστή σε ιογενείς λοιμώξεις, με ιδιαίτερη έμφαση στους αναδυόμενους κοροναϊούς. Θα εξετάσουμε επίσης παράγοντες που καθιστούν ορισμένους ασθενείς ανεκτικούς στη νόσο και άλλους ασθενείς λιγότερο ανεκτικούς στην ιογενή λοίμωξη. Αυτοί οι παράγοντες μπορούν να χρησιμεύσουν ως οδηγός για νέες πιθανές θεραπείες για βελτιωμένη φροντίδα των ασθενών. Τόσο ο SARS-CoV όσο και ο MERS-CoV χαρακτηρίζονται από μια ταχεία εξέλιξη σε ARDS, ωστόσο, υπάρχουν ορισμένες διακριτές διαφορές στη μολυσματικότητα και την παθογένεια. Οι δύο ιοί έχουν διαφορετικούς υποδοχείς που οδηγούν σε διαφορετικό κυτταρικό τροπισμό και ο SARS-CoV είναι πιο πανταχού παρών στον κυτταρικό τύπο και στα είδη που μπορεί να μολύνει. Ο SARS-CoV χρησιμοποιεί τον υποδοχέα ACE2 για να αποκτήσει είσοδο στα κύτταρα, ενώ ο MERS-CoV χρησιμοποιεί την εκτοπεπτιδάση DPP4 [33] [34] [35] [36] . Σε αντίθεση με τη λοίμωξη SARS-CoV, η οποία προκαλεί κυρίως σοβαρό αναπνευστικό σύνδρομο, η μόλυνση MERS-CoV μπορεί επίσης να οδηγήσει σε νεφρική ανεπάρκεια [37, 38]. Ο SARS-CoV εξαπλώνεται επίσης πιο γρήγορα μεταξύ των ξενιστών, ενώ ο MERS-CoV περιορίστηκε πιο εύκολα, αλλά δεν είναι σαφές εάν αυτό οφείλεται στους πληγέντες πληθυσμούς και περιοχές ασθενών [3] [4] 39 ]. Δεδομένου ότι ο MERS-CoV είναι ένας ιός που ανακαλύφθηκε πολύ πρόσφατα, [40, 41] έχουν γίνει περισσότερες έρευνες για τον SARS-CoV. Ωστόσο, δεδομένων των ομοιοτήτων, ελπίζουμε ότι ορισμένα από αυτά τα ευρήματα μπορούν επίσης να εφαρμοστούν στον MERS-CoV και σε άλλους πιθανούς αναδυόμενους ζωονοσογόνους κοροναϊούς. Και οι δύο ιογενείς λοιμώξεις προκαλούν μια πολύ ισχυρή φλεγμονώδη απόκριση και μπορούν επίσης να παρακάμψουν την ανοσολογική απόκριση. Φαίνεται ότι υπάρχουν διάφοροι τρόποι με τους οποίους αυτοί οι ιοί αποφεύγουν και με άλλο τρόπο ανακατευθύνουν την ανοσολογική απόκριση [1, [42] [43] [44] [45] . Οι οδοί που οδηγούν στην επαγωγή της απόκρισης ιντερφερόνης τύπου Ι κατά του ιού (IFN) είναι κοινοί στόχοι πολλών ιών και οι κοροναϊοί δεν αποτελούν εξαίρεση. Το SARS-CoV και το MERS-CoV περιέχονται σε κυστίδια διπλής μεμβράνης (DMVs), που εμποδίζει την αίσθηση του γονιδιώματός του [1, 46] . Όπως με τους περισσότερους κοροναϊούς, αρκετές ιικές πρωτεΐνες καταστέλλουν την απόκριση IFN τύπου Ι και άλλες πτυχές της έμφυτης αντιϊκής ανοσίας [47] . Αυτές οι αλλαγές της απόκρισης IFN τύπου Ι φαίνεται να παίζουν ρόλο στην ανοσοπαθολογία με περισσότερους από έναν τρόπους. Σε ασθενείς με υψηλούς αρχικούς τίτλους ιού υπάρχει κακή πρόγνωση [39, 48] . Αυτό υποδεικνύει ότι η μείωση της αντιϊκής απόκρισης μπορεί να οδηγήσει σε άμεση παθολογία που προκαλείται από τον ιό. Υπάρχουν επίσης στοιχεία ότι η καθυστερημένη απόκριση IFN τύπου Ι μπορεί να οδηγήσει σε εσφαλμένη ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης που μπορεί να προκαλέσει ανοσοπαθολογία. Σε ένα μοντέλο ποντικού με μόλυνση από SARS-CoV, η απόκριση IFN τύπου Ι καθυστερεί [49] . Η καθυστέρηση αυτής της ισχυρής αντιϊκής απόκρισης οδηγεί σε μειωμένη ιική κάθαρση, ενώ ταυτόχρονα υπάρχει αύξηση των φλεγμονωδών κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος που προκαλούν υπερβολική ανοσοπαθολογία [49] . Σε αυτή την περίπτωση, η καθυστερημένη αντιική απόκριση όχι μόνο προκαλεί ανοσοπαθολογία, αλλά επίσης αποτυγχάνει να ελέγξει σωστά την αντιγραφή του ιού. Ενώ χρειάζεται περισσότερη έρευνα, φαίνεται ότι το MERS έχει παρόμοια επίδραση στην έμφυτη ανοσοαπόκριση [5, 50] .Οι τρέχουσες επιλογές θεραπείας και πρόληψης για τους SARS-CoV και MERS-CoV είναι περιορισμένες. Μέχρι στιγμής δεν υπάρχουν αδειοδοτημένα εμβόλια για SAR-CoV ή MERS-CoV, αν και έχουν δοκιμαστεί αρκετές στρατηγικές σε ζωικά μοντέλα [51, 52]. Δεν υπάρχουν επίσης αντιικές στρατηγικές που να είναι σαφώς αποτελεσματικές σε ελεγχόμενες δοκιμές. Κατά τη διάρκεια των επιδημιών δοκιμάστηκαν εμπειρικά αρκετές αντιικές στρατηγικές, αλλά αυτές οι ανεξέλεγκτες μελέτες έδωσαν μικτά αποτελέσματα [5, 39]. Τα κύρια αντιικά που χρησιμοποιήθηκαν ήταν η ριμπαβιρίνη, η λοπιναβίρη και η ριτοναβίρη [38, 53]. Αυτά χρησιμοποιούνταν συχνά σε συνδυασμό με θεραπεία με IFN [54] . Ωστόσο, η αναδρομική ανάλυση αυτών των δεδομένων δεν οδήγησε σε σαφή συμπεράσματα σχετικά με την αποτελεσματικότητα αυτών των επιλογών θεραπείας. Η έρευνα σε αυτόν τον τομέα είναι ακόμη σε εξέλιξη και ελπίζουμε ότι σύντομα θα έχουμε αποτελεσματικές στρατηγικές για την αντιμετώπιση του νέου CoV [3,36,38,40, [55] [56] [57] [58] [59] [60] [ 61] [62] [63] [64] .Η έλλειψη αποτελεσματικών αντιιικών φαρμάκων καθιστά απαραίτητη την εξέταση άλλων πιθανών θεραπειών για τον SARS-CoV και τον MERS-CoV. Ακόμη και αν υπήρχαν αποτελεσματικές στρατηγικές για τη μείωση του ιικού φορτίου, για αυτούς τους ιούς, η πιθανότητα εμφάνισης νέων ζωονοσογόνων CoV παρουσιάζει πρόσθετες επιπλοκές. Τα εμβόλια δεν μπορούν να παραχθούν εγκαίρως για να σταματήσουν την εξάπλωση ενός αναδυόμενου ιού. Επιπλέον, όπως αποδείχθηκε κατά τη διάρκεια των επιδημιών SARS-CoV και MERS-CoV, υπάρχει πάντα μια πρόκληση κατά τη διάρκεια μιας κατάστασης κρίσης να γνωρίζουμε ποιος οικοδεσπότης θα είναι ανθεκτικός σε αναδυόμενους κοροναϊούς REviEW μελλοντική επιστημονική ομάδα www.futuremedicine.com antivirus που θα λειτουργήσει σε έναν δεδομένο ιό. Μια μέθοδος αντιμετώπισης αυτού είναι η ανάπτυξη αντιικών ευρέος φάσματος που στοχεύουν σε διατηρημένα χαρακτηριστικά μιας δεδομένης κατηγορίας ιού [65] . Ωστόσο, δεδομένων των ταχέων ρυθμών μετάλλαξης των ιών, υπάρχουν αρκετές προκλήσεις σε αυτή τη στρατηγική. Μια άλλη μέθοδος είναι να αυξηθεί η ικανότητα ενός δεδομένου ασθενούς να ανέχεται την ασθένεια, δηλαδή να στοχεύει τους μηχανισμούς ανθεκτικότητας του ξενιστή. Μέχρι στιγμής αυτό ήταν σε μεγάλο βαθμό με τη μορφή υποστηρικτικής φροντίδας, η οποία βασίζεται στον μηχανικό αερισμό και την οξυγόνωση [29, 39, 66] . Δεδομένου ότι οι SARS-CoV και MERS-CoV ανακαλύφθηκαν σχετικά πρόσφατα, υπάρχει έλλειψη δεδομένων τόσο ασθενών όσο και πειραματικών . Ωστόσο, πολλοί άλλοι ιοί προκαλούν ALI και ARDS, συμπεριλαμβανομένου του ιού της γρίπης Α (IAV). Εξετάζοντας δεδομένα από άλλους ιούς υψηλής παθολογίας, μπορούμε να υπολογίσουμε διάφορες οδούς που θα μπορούσαν να στοχευθούν κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από αυτούς τους αναδυόμενους CoVs. Αυτό μπορεί να προσθέσει στην κατανόησή μας για τους μηχανισμούς ανθεκτικότητας στις ασθένειες που έχουμε μάθει από άμεσες μελέτες για τους SARS-CoV και MERS-CoV. Η αυξημένη κατανόηση των μηχανισμών ανθεκτικότητας του ξενιστή μπορεί να οδηγήσει σε μελλοντικές θεραπείες βασισμένες στον ξενιστή που θα μπορούσαν να αυξήσουν την επιβίωση των ασθενών [29] .Ένα κοινό θέμα που εμφανίζεται σε πολλούς αναπνευστικούς ιούς συμπεριλαμβανομένων των SARS-CoV και MERS-CoV είναι ότι μεγάλο μέρος της παθολογίας οφείλεται σε υπερβολική φλεγμονώδη απόκριση. Μια μελέτη από τους Josset et al. εξετάζει την απόκριση του ξενιστή του κυττάρου τόσο στον MERS-CoV όσο και στον SARS-CoV και ανακάλυψε ότι ο MERS-CoV απορρυθμίζει το μεταγραφικό σώμα του ξενιστή σε πολύ μεγαλύτερο βαθμό από τον SARS-CoV [67] . Αποδεικνύει ότι τα γλυκοκορτικοειδή μπορεί να είναι ένας πιθανός τρόπος αλλαγής των αλλαγών στο μεταγραφικό ιστό του ξενιστή σε καθυστερημένα χρονικά σημεία μετά τη μόλυνση. Εάν διατηρηθούν οι αποκρίσεις του γονιδίου του ξενιστή, αυτό μπορεί να αυξήσει την ανθεκτικότητα της νόσου. Δεδομένης της σοβαρής ασθένειας που εκδηλώθηκε κατά την έξαρση του SARS-CoV, πολλές διαφορετικές θεραπευτικές επιλογές δοκιμάστηκαν εμπειρικά σε ανθρώπους ασθενείς. Μια ανοσοτροποποιητική θεραπεία που δοκιμάστηκε κατά τη διάρκεια της επιδημίας SARS-CoV ήταν τα συστηματικά κορτικοστεροειδή. Αυτό δοκιμάστηκε με και χωρίς τη χρήση IFN τύπου Ι και άλλων θεραπειών που θα μπορούσαν να στοχεύσουν άμεσα τον ιό [68] . Η αναδρομική ανάλυση αποκάλυψε ότι, όταν χορηγείται τη σωστή στιγμή και στους κατάλληλους ασθενείς, η χρήση κορτικοστεροειδών θα μπορούσε να μειώσει τη θνησιμότητα και επίσης τη διάρκεια της παραμονής στο νοσοκομείο [68] . Επιπλέον, υπάρχουν ορισμένες ενδείξεις ότι η ταυτόχρονη θεραπεία με IFNs θα μπορούσε να αυξήσει τα πιθανά οφέλη [69] . Αν και αυτές οι θεραπείες δεν είναι χωρίς επιπλοκές, και υπήρξε έλλειψη μιας τυχαιοποιημένης ελεγχόμενης δοκιμής [5, 39] .Τα κορτικοστεροειδή είναι σε γενικές γραμμές ανοσοκατασταλτικά και έχουν πολλές φυσιολογικές επιδράσεις [5, 39]. Αρκετές πρόσφατες μελέτες έχουν προτείνει ότι άλλες ενώσεις θα μπορούσαν να είναι χρήσιμες στην αύξηση της ανθεκτικότητας του ξενιστή σε ιογενείς πνευμονικές λοιμώξεις. Ένα πρόσφατο έγγραφο καταδεικνύει ότι η τοποϊσομεράση Ι μπορεί να προστατεύσει από τον θάνατο που προκαλείται από φλεγμονή από μια ποικιλία ιογενών λοιμώξεων συμπεριλαμβανομένου του IAV [70] . Ο αποκλεισμός της σηματοδότησης του συμπληρώματος C5a έχει επίσης προταθεί ως πιθανή επιλογή για τη μείωση της φλεγμονής κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από IAV [71] . Άλλοι ανοσοτροποποιητές περιλαμβάνουν celecoxib, mesalazine και eritoran [72, 73]. Μια άλλη κατηγορία φαρμάκων που έχουν προταθεί είναι οι στατίνες. Δρουν για να σταθεροποιήσουν την ενεργοποίηση πτυχών της έμφυτης ανοσολογικής απόκρισης και να αποτρέψουν την υπερβολική φλεγμονή [74] . Ωστόσο, η μείωση της ανοσοπαθολογίας μέσω της ανοσορύθμισης είναι προβληματική επειδή μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένο φορτίο παθογόνων και έτσι να αυξήσει την επαγόμενη από τον ιό παθολογία [75, 76]. Μια άλλη πιθανή θεραπευτική επιλογή είναι η αύξηση των οδών αποκατάστασης των ιστών για την αύξηση της ανθεκτικότητας του ξενιστή στις ασθένειες. Αυτό έχει αποδειχθεί από τη βιοπληροφορική [77] , καθώς και από διάφορα ζωικά μοντέλα [30-31,78-79]. Αυτές οι θεραπείες έχουν αποδειχθεί αποτελεσματικές σε συστήματα μοντέλων κυτταροκαλλιέργειας ή ζωικά μοντέλα, αλλά δεν έχουν αποδειχθεί σε ανθρώπους ασθενείς. Ο σωστός χρόνος των θεραπειών είναι απαραίτητος. Η έγκαιρη παρέμβαση έχει αποδειχθεί ότι είναι η πιο αποτελεσματική σε ορισμένες περιπτώσεις, αλλά άλλες θεραπείες λειτουργούν καλύτερα όταν χορηγούνται λίγο αργότερα κατά τη διάρκεια της λοίμωξης. Καθώς η έναρξη των συμπτωμάτων διαφέρει ελαφρώς από ασθενή σε ασθενή, η ανάγκη για ακριβή χρονισμό θα είναι μια πρόκληση. Η εξέταση των πιθανών επιλογών θεραπείας για τον SARS-CoV και τον MERS-CoV θα πρέπει να περιλαμβάνει την εξέταση της ανθεκτικότητας του ξενιστή [29] . Εκτός από τις ιογενείς επιδράσεις και την παθολογία που προκαλείται από την ανοσολογική απόκριση, υπάρχουν διάφορες συννοσηρότητες που σχετίζονται με τον SARS-CoV και τον MERS-CoV που οδηγούν σε δυσμενή έκβαση. Είναι ενδιαφέρον ότι αυτοί οι πρόσθετοι παράγοντες κινδύνου που οδηγούν σε πιο σοβαρή ασθένεια είναι διαφορετικοί μεταξύ των δύο ιών. Δεν είναι σαφές εάν αυτές οι διαφορές οφείλονται σε διαφορετικούς πληθυσμούς που επηρεάζονται από τους ιούς, λόγω των ιδιοτήτων του ίδιου του ιού ή και των δύο. Η κατανόηση αυτών των παραγόντων θα μπορούσε να είναι το κλειδί για την αύξηση της ανθεκτικότητας του ξενιστή στις λοιμώξεις. Οι ασθενείς με MERS-CoV είχαν αυξημένη νοσηρότητα και θνησιμότητα εάν ήταν παχύσαρκοι, ανοσοκατεσταλμένοι, διαβητικοί ή είχαν καρδιακή νόσο [4, 12] .ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΗ Jamieson μελλοντική επιστημονική ομάδα Οι παράγοντες κινδύνου για ασθενείς με SARS-CoV περιλάμβαναν μια μεγαλύτερη ηλικία και έναν άνδρα [39]. Οι ανοσοποιητικοί παράγοντες που αύξησαν τη θνησιμότητα για τον SARS-CoV ήταν ο υψηλότερος αριθμός ουδετερόφιλων και ο χαμηλός αριθμός Τ-κυττάρων [5, 39, 77]. Ένας παράγοντας που αύξησε τη νόσο για ασθενείς που είχαν μολυνθεί με SARS-CoV και MERS-CoV ήταν η μόλυνση με άλλους ιούς ή βακτήρια [5, 39]. Αυτό είναι παρόμοιο με αυτό που παρατηρείται με πολλές άλλες λοιμώξεις του αναπνευστικού. Μια πρόσφατη μελέτη που εξέτασε τις μολύνσεις από ελονοσία σε ζωικά μοντέλα και ανθρώπους σε ασθενείς έδειξε ότι μπορούν να προβλεφθούν ανθεκτικοί ξενιστές [28] . Κλινικές μελέτες έχουν αρχίσει να συσχετίζουν συγκεκριμένους βιοδείκτες με την έκβαση της νόσου σε ασθενείς με ARDS [80] . Κατανοώντας τους παράγοντες κινδύνου για τη σοβαρότητα της νόσου μπορούμε ίσως να προβλέψουμε εάν ένας ξενιστής μπορεί να είναι μη ανθεκτικός και να προσαρμόσουμε κατάλληλα τις θεραπευτικές επιλογές. Ένα σαφές πλεονέκτημα της στόχευσης των μονοπατιών ανθεκτικότητας του ξενιστή είναι ότι αυτές οι θεραπείες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη θεραπεία μιας ποικιλίας διαφορετικών λοιμώξεων. Επιπλέον, δεν υπάρχει ανάγκη να αναπτυχθεί εμβόλιο ή να κατανοηθεί η αντιϊκή ευαισθησία ενός νέου ιού. Προς το σκοπό αυτό, η κατανόηση του γιατί ορισμένοι ασθενείς ή πληθυσμοί ασθενών έχουν αυξημένη ευαισθησία είναι υψίστης σημασίας. Επιπλέον, η ανάγκη για καλά μοντέλα συστημάτων για τη μελέτη των απαντήσεων σε αυτούς τους νέους αναδυόμενους κοροναϊούς είναι απαραίτητη. Η έρευνα και στα δύο αυτά θέματα θα μας οδηγήσει στη βελτιωμένη θεραπεία των αναδυόμενων ιών που προκαλούν ALI, όπως SARS-CoV και MERS-CoV. Ο συγγραφέας δεν έχει σχετικές σχέσεις ή οικονομική ανάμειξη με οποιονδήποτε οργανισμό ή οντότητα με οικονομικό συμφέρον ή οικονομική σύγκρουση με το θέμα ή τα υλικά που συζητούνται στο χειρόγραφο. Αυτό περιλαμβάνει απασχόληση, συμβούλους, αμοιβές, ιδιοκτησία ή δικαιώματα προαίρεσης, μαρτυρίες εμπειρογνωμόνων, επιχορηγήσεις ή διπλώματα ευρεσιτεχνίας που ελήφθησαν ή εκκρεμούν, ή δικαιώματα. Δεν χρησιμοποιήθηκε γραπτή βοήθεια για την παραγωγή αυτού του χειρογράφου.• Σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο κορωνοϊός και αναπνευστικό σύνδρομο Μέσης Ανατολής κορωνοϊός είναι ζωονοσογόνοι κοροναϊοί που προκαλούν οξεία πνευμονική βλάβη και σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας.• Τα αντιιικά φάρμακα έχουν περιορισμένες επιδράσεις στην πορεία της λοίμωξης με αυτούς τους κοροναϊούς.• Επί του παρόντος δεν υπάρχει εμβόλιο είτε για τον κορονοϊό του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου είτε για τον κορωνοϊό του αναπνευστικού συνδρόμου της Μέσης Ανατολής.• Η ανθεκτικότητα του ξενιστή είναι η ικανότητα του ξενιστή να ανέχεται τις επιπτώσεις μιας μόλυνσης και να επιστρέφει σε κατάσταση υγείας.• Διάφορες οδοί, συμπεριλαμβανομένου του ελέγχου της φλεγμονής, του μεταβολισμού και της επιδιόρθωσης των ιστών μπορεί να στοχεύουν στην αύξηση της ανθεκτικότητας του ξενιστή.• Η μελλοντική πρόκληση είναι να στοχεύστε τις οδούς ανθεκτικότητας του ξενιστή με τέτοιο τρόπο ώστε να υπάρχουν περιορισμένες επιδράσεις στις οδούς εκκαθάρισης του παθογόνου. Μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να καθορίσουν την ασφάλεια αυτών των τύπων θεραπειών για ασθενείς.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 1402, "text": "κορωνοϊός" } ], "id": 1250, "question": "Σε ποια οικογένεια ιών βρίσκεται το SARS;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1402, "text": "κορωνοϊός" } ], "id": 1251, "question": "Σε ποια οικογένεια ιών βρίσκεται το MERS;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1489, "text": "2003" } ], "id": 1252, "question": "Πότε εντοπίστηκε για πρώτη φορά ο SARS-CoV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1845, "text": "8000" } ], "id": 1253, "question": "Πόσα άτομα μολύνθηκε από τον SARS-CoV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2047, "text": "35-50%" } ], "id": 1256, "question": "Τι ποσοστό των ανθρώπων που μολύνθηκαν από τον MERS-CoV πέθανε;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1901, "text": "10%" } ], "id": 1255, "question": "Τι ποσοστό των ανθρώπων που μολύνθηκαν από SARS-CoV πέθανε;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2177, "text": "δεξαμενές ζώων" } ], "id": 1258, "question": "Ποια ήταν η δεξαμενή για τον SARS-CoV και τον MERS-CoV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2614, "text": "σοβαρή παθολογία των πνευμόνων" } ], "id": 1260, "question": "Ποιο ήταν το πρωταρχικό απειλητικό κλινικό εύρημα σε ασθενείς που είχαν προσβληθεί από SARS-CoV και MERS-CoV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2646, "text": "Πολλοί μολυσμένοι ασθενείς έχουν οξεία πνευμονική βλάβη (ALI)" } ], "id": 1262, "question": "Ποια είναι η σχέση μεταξύ του SARS-CoV και της οξείας πνευμονικής βλάβης (ALI);" }, { "answers": [ { "answer_start": 2837, "text": "Σε ορισμένους ασθενείς υπάρχει εξέλιξη στην πιο σοβαρή μορφή της ALI, το σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας (ARDS)" } ], "id": 1263, "question": "Ποια είναι η σχέση μεταξύ του SARS-CoV και του συνδρόμου οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας (ARDS);" }, { "answers": [ { "answer_start": 5048, "text": "Ο SARS-CoV χρησιμοποιεί τον υποδοχέα ACE2 για να αποκτήσει είσοδο στα κύτταρα, ενώ ο MERS-CoV χρησιμοποιεί την εκτοπεπτιδάση DPP4" } ], "id": 1266, "question": "Πώς διαφέρει η είσοδος κυττάρων μεταξύ του SARS-CoV και του MERS-CoV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5200, "text": "Σε αντίθεση με τη λοίμωξη SARS-CoV, η οποία προκαλεί κυρίως σοβαρό αναπνευστικό σύνδρομο, η μόλυνση MERS-CoV μπορεί επίσης να οδηγήσει σε νεφρική ανεπάρκεια" } ], "id": 1267, "question": "Ποια είναι η σημαντική διαφορά στην κλινική εξέλιξη μεταξύ SARS-CoV και MERS-CoV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6756, "text": "Σε ασθενείς με υψηλούς αρχικούς τίτλους ιού υπάρχει κακή πρόγνωση" } ], "id": 1270, "question": "Τι ρόλο παίζει ο αρχικός τίτλος του ιού στην πρόγνωση του SARS-CoV και του MERS-CoV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6518, "text": "αρκετές ιικές πρωτεΐνες καταστέλλουν την απόκριση IFN τύπου Ι και άλλες πτυχές της έμφυτης αντιϊκής ανοσίας" } ], "id": 1271, "question": "Πώς αλληλεπιδρούν οι πρωτεΐνες του ιού SARS-CoV με την ανοσολογική απόκριση;" }, { "answers": [ { "answer_start": 12701, "text": "Ένα πρόσφατο έγγραφο καταδεικνύει ότι η τοποϊσομεράση Ι μπορεί να προστατεύσει από τον θάνατο που προκαλείται από φλεγμονή από μια ποικιλία ιογενών λοιμώξεων συμπεριλαμβανομένου του IAV" } ], "id": 1276, "question": "Ποιος είναι ο ρόλος της τοποϊσομεράσης Ι στη βελτίωση της ανθεκτικότητας του ξενιστή σε ιογενείς πνευμονικές λοιμώξεις;" }, { "answers": [ { "answer_start": 12894, "text": "Ο αποκλεισμός της σηματοδότησης του συμπληρώματος C5a έχει επίσης προταθεί ως πιθανή επιλογή για τη μείωση της φλεγμονής κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από IAV" } ], "id": 1277, "question": "Ποιος είναι ο ρόλος του συμπληρώματος 5a (C5a) στην αύξηση της ανθεκτικότητας του ξενιστή στην ιογενή λοίμωξη του πνεύμονα;" }, { "answers": [ { "answer_start": 13209, "text": "Δρουν για να σταθεροποιήσουν την ενεργοποίηση πτυχών της έμφυτης ανοσολογικής απόκρισης και να αποτρέψουν την υπερβολική φλεγμονή" } ], "id": 1278, "question": "Ποιος είναι ο ρόλος των στατινών στην αύξηση της ανθεκτικότητας του ξενιστή σε ιογενείς πνευμονικές λοιμώξεις;" }, { "answers": [ { "answer_start": 15169, "text": "εάν ήταν παχύσαρκοι, ανοσοκατεσταλμένοι, διαβητικοί ή είχαν καρδιακή νόσο" } ], "id": 1279, "question": "Ποιες ιατρικές συννοσηρότητες επηρέασαν περισσότερο τα αποτελέσματα του MERS-CoV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 15960, "text": "Κλινικές μελέτες έχουν αρχίσει να συσχετίζουν συγκεκριμένους βιοδείκτες με την έκβαση της νόσου σε ασθενείς με ARDS" } ], "id": 1283, "question": "Μπορούν να χρησιμοποιηθούν βιοδείκτες για την πρόβλεψη των αποτελεσμάτων σε ασθενείς με οξεία αναπνευστική δυσχέρεια (ARDS);" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Πιθανή ταχεία διάγνωση, εμβόλιο και θεραπείες για τον νέο κορονοϊό του 2019 (2019-nCoV): Μια συστηματική ανασκόπησηhttps://doi.org/10.3390/jcm9030623SHA: 9b0c87f808b1b66f2957737d10ng; Wang, Min Xian; Ang, Ian Yi Han; Tan, Sharon Hui Xuan; Lewis, Ruth Frances; Chen, Jacinta I. Pei; Gutierrez, Ramona A.; Gwee, Sylvia Xiao Wei; Chua, Pearleen Ee Yong; Yang, Qian; Ng, Xian Yi; Yap, Rowena K. S.; Tan, Hao Yi; Teo, Yik Ying; Tan, Chorh Chuan; Cook, Alex R.; Yap, Jason Chin-Huat; Hsu, Li YangDate: 2020DOI: 10.3390/jcm9030623License: cc-byAbstract: Τα ταχεία διαγνωστικά, τα εμβόλια και τα θεραπευτικά μέσα είναι σημαντικές παρεμβάσεις για τη διαχείριση της επιδημίας του νέου κοροναϊού (2019-nCoV) του 2019. Είναι επίκαιρη η συστηματική αναθεώρηση των δυνατοτήτων αυτών των παρεμβάσεων, συμπεριλαμβανομένων εκείνων για το αναπνευστικό σύνδρομο της Μέσης Ανατολής-Coronavirus (MERS-CoV) και το σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο (SARS)-CoV, για να καθοδηγηθούν οι υπεύθυνοι χάραξης πολιτικής παγκοσμίως σχετικά με την ιεράρχηση πόρων για έρευνα και ανάπτυξη . Πραγματοποιήθηκε συστηματική αναζήτηση σε τρεις μεγάλες ηλεκτρονικές βάσεις δεδομένων (PubMed, Embase και Cochrane Library) για τον εντοπισμό δημοσιευμένων μελετών σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές για τα Προτιμώμενα στοιχεία αναφοράς για συστηματικές αναθεωρήσεις και μετα-αναλύσεις (PRISMA). Χρησιμοποιήθηκαν συμπληρωματικές στρατηγικές μέσω της Αναζήτησης Google και προσωπικών επικοινωνιών. Συνολικά 27 μελέτες πληρούσαν τα κριτήρια για ανασκόπηση. Έχουν δημοσιευτεί αρκετά εργαστηριακά πρωτόκολλα για επιβεβαίωση ύποπτων περιπτώσεων 2019-nCoV με χρήση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης ανάστροφης μεταγραφής (RT-PCR) σε πραγματικό χρόνο. Ένα εμπορικό κιτ RT-PCR που αναπτύχθηκε από το Γονιδιωματικό Ινστιτούτο του Πεκίνου χρησιμοποιείται σήμερα ευρέως στην Κίνα και πιθανότατα στην Ασία. Ωστόσο, ορολογικές αναλύσεις καθώς και κιτ δοκιμών σημείου φροντίδας δεν έχουν αναπτυχθεί, αλλά είναι πιθανό στο εγγύς μέλλον. Αρκετά υποψήφια εμβόλια βρίσκονται στα σκαριά. Η πιθανή πρώιμη δοκιμή εμβολίου Φάσης 1 είναι υποψήφιος με βάση το συνθετικό DNA. Ορισμένες νέες ενώσεις καθώς και θεραπευτικά φάρμακα που έχουν λάβει άδεια για άλλες παθήσεις φαίνεται ότι έχουν in vitro αποτελεσματικότητα έναντι του 2019-nCoV. Ορισμένα δοκιμάζονται σε κλινικές δοκιμές κατά του MERS-CoV και του SARS-CoV, ενώ άλλα έχουν καταγραφεί για κλινικές δοκιμές κατά του 2019-nCoV. Ωστόσο, επί του παρόντος δεν υπάρχουν αποτελεσματικά συγκεκριμένα αντιιικά ή συνδυασμοί φαρμάκων που να υποστηρίζονται από στοιχεία υψηλού επιπέδου. Κείμενο: Από τα μέσα Δεκεμβρίου 2019 και από τις αρχές Φεβρουαρίου 2020, ο νέος κοροναϊός του 2019 (2019-nCoV) προέρχεται από τη Γουχάν (επαρχία Χουμπέι, Κίνα ) έχει μολύνει πάνω από 25.000 εργαστηριακά επιβεβαιωμένα κρούσματα σε 28 χώρες με περίπου 500 θανάτους (ποσοστό θνησιμότητας περίπου 2%). Πάνω από το 90% των κρουσμάτων και των θανάτων ήταν στην Κίνα [1] . Με βάση την αρχική αναφερθείσα αύξηση των κρουσμάτων στη Γουχάν, η πλειονότητα ήταν άνδρες με μέση ηλικία τα 55 έτη και συνδέονταν με την αγορά χονδρικής πώλησης θαλασσινών Huanan [2] . Οι περισσότερες από τις αναφερόμενες περιπτώσεις είχαν παρόμοια συμπτώματα κατά την έναρξη της νόσου, όπως πυρετό, βήχα και μυαλγία ή κόπωση. Οι περισσότερες περιπτώσεις ανέπτυξαν πνευμονία και ορισμένες σοβαρές, ακόμη και θανατηφόρες αναπνευστικές ασθένειες, όπως το σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας [3] .Ο νέος κοροναϊός του 2019 (2019-nCoV), ένας βήτα κορωνοϊός, σχηματίζει ένα κλάδο στο υπογένος sarbecovirus της υποοικογένειας Orthocoronavirinae [4]. Ο κορωνοϊός του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου (SARS-CoV) και ο κορωνοϊός του αναπνευστικού συνδρόμου της Μέσης Ανατολής (MERS-CoV) είναι επίσης βήτα κορωνοϊοί που έχουν ζωονοσογόνους προέλευση και έχουν συνδεθεί με πιθανές θανατηφόρες ασθένειες κατά τα κρούσματα το 2003 και το 2012, αντίστοιχα [5. 6] . Με βάση τα τρέχοντα στοιχεία, η παθογένεια για τον 2019-nCoV είναι περίπου 3%, που είναι σημαντικά χαμηλότερη από τον SARS-CoV (10%) και τον MERS-CoV (40%) [7] . Ωστόσο, ο 2019-nCoV έχει δυνητικά υψηλότερη μεταδοτικότητα (R0: 1,4-5,5) από τον SARS-CoV (R0: [2] [3] [4] [5] και τον MERS-CoV (R0: <1) [7] . Με την πιθανή επέκταση του 2019-nCoV παγκοσμίως [8] και την κήρυξη της επιδημίας 2019-nCoV ως Έκτακτης Ανάγκης για τη Δημόσια Υγεία διεθνούς ανησυχίας από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για ταχεία διάγνωση, εμβόλια και θεραπευτικά μέσα για τον εντοπισμό, να αποτρέψουν και να περιλάβουν τον 2019-nCoV αμέσως. Ωστόσο, επί του παρόντος, υπάρχει έλλειψη κατανόησης του τι είναι διαθέσιμο στην πρώιμη φάση της επιδημίας 2019-nCoV. Η συστηματική ανασκόπηση περιγράφει και αξιολογεί τα πιθανά ταχεία διαγνωστικά, τα εμβόλια και τα θεραπευτικά μέσα για τον 2019-nCoV, βασισμένη εν μέρει στις εξελίξεις για τον MERS-CoV και τον SARS-CoV. Πραγματοποιήθηκε συστηματική αναζήτηση σε τρεις μεγάλες ηλεκτρονικές βάσεις δεδομένων (PubMed, Embase και Cochrane Library) για τον εντοπισμό δημοσιευμένων μελετών που εξετάζουν τη διάγνωση, τα θεραπευτικά φάρμακα και τα εμβόλια για το Σοβαρό Οξύ Αναπνευστικό Σύνδρομο (SARS), το Αναπνευστικό Σύνδρομο Μέσης Ανατολής (MERS) και τον νέο κορωνοϊό του 2019 (2019-nCoV), σύμφωνα με τα Προτιμώμενα Στοιχεία Αναφοράς για Οδηγίες Συστηματικών Ανασκοπήσεων και Μετα-Αναλύσεων (PRISMA). Υπήρχαν δύο ανεξάρτητοι αναθεωρητές που επικεντρώθηκαν ο καθένας στους SARS, MERS και 2019-nCoV, αντίστοιχα. Ένας τρίτος ανεξάρτητος κριτής προσλήφθηκε για την επίλυση τυχόν αντικρουόμενων άρθρου συμφερόντων. Χρησιμοποιήσαμε τις λέξεις-κλειδιά \"SARS\", \"coronavirus\", \"MERS\", \"2019 Novel coronavirus\", \"Wuhan virus\" για να προσδιορίσουμε τις ασθένειες στη στρατηγική αναζήτησης. Οι συστηματικές αναζητήσεις για διάγνωση, θεραπευτικά φάρμακα και εμβόλια πραγματοποιήθηκαν ανεξάρτητα και χρησιμοποιήθηκαν οι λέξεις-κλειδιά \"φάρμακο\", \"θεραπεία\", \"εμβόλιο\", \"διάγνωση\", \"δοκιμή σημείου φροντίδας\" και \"ταχεία διαγνωστική δοκιμή\" με τις λέξεις-κλειδιά ασθένειας για τις αντίστοιχες αναζητήσεις.Παραδείγματα συμβολοσειρών αναζήτησης βρίσκονται στον Πίνακα S1 . Αναζητήσαμε τυχαιοποιημένες ελεγχόμενες δοκιμές (RCT) και δοκιμές επικύρωσης (για διαγνωστικό τεστ) δημοσιευμένες στα αγγλικά, οι οποίες μέτρησαν (α) την ευαισθησία ή/και την ειδικότητα μιας ταχείας διαγνωστικής δοκιμής ή ενός κιτ δοκιμής σημείου φροντίδας, (β) ο αντίκτυπος της φαρμακευτικής θεραπείας ή (γ) η αποτελεσματικότητα του εμβολίου έναντι μιας από αυτές τις ασθένειες χωρίς να εφαρμόζεται περιορισμός ημερομηνίας. Για τον 2019-nCoV, αναζητήσαμε όλες τις in vitro μελέτες, σε ζώα ή ανθρώπους που δημοσιεύτηκαν στα αγγλικά μεταξύ 1ης Δεκεμβρίου 2019 και 6 Φεβρουαρίου 2020, με τα ίδια αποτελέσματα ενδιαφέροντος. Επιπλέον, εξετάσαμε τις αναφορές των ανακτημένων άρθρων για να εντοπίσουμε πρόσθετες μελέτες ή αναφορές που δεν ανακτήθηκαν από τις αρχικές αναζητήσεις. Μελέτες που εξέτασαν τους μηχανισμούς των διαγνωστικών δοκιμών, τη φαρμακευτική θεραπεία ή την αποτελεσματικότητα του εμβολίου κατά του SARS, του MERS και του 2019-nCoV αποκλείστηκαν. Μια αναζήτηση Google για διαγνωστικά 2019-nCoV (από τις 6 Φεβρουαρίου 2020· Ο Πίνακας S2 έδωσε πέντε συνδέσμους ιστοσελίδων από κυβερνητικούς και διεθνείς φορείς με επίσημες πληροφορίες και κατευθυντήριες γραμμές (WHO, Europe CDC, US CDC, US FDA), τρεις συνδέσμους ιστοσελίδων για διαγνωστικά πρωτόκολλα και επιστημονικά σχόλια και πέντε συνδέσμους ιστοσελίδων σε νέα της αγοράς και δελτία τύπου . Έξι πρωτόκολλα για διαγνωστικά χρησιμοποιώντας αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης της αντίστροφης μεταγραφάσης (RT-PCR) από έξι χώρες δημοσιεύτηκαν στον ιστότοπο του ΠΟΥ [9] . Η αναζήτηση στο Google για τα εμβόλια 2019-nCoV απέδωσε 19 σχετικά άρθρα. Με την εμφάνιση του 2019-nCoV, η RT-PCR σε πραγματικό χρόνο παραμένει το κύριο μέσο για τη διάγνωση του νέου στελέχους του ιού μεταξύ των πολλών διαγνωστικών πλατφορμών που είναι διαθέσιμες ( [10] [11] [12] ] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19]; Πίνακας S3 ). Μεταξύ των 16 διαγνωστικών μελετών που επιλέχθηκαν, μία μελέτη εξέτασε τη χρήση της RT-PCR στη διάγνωση ασθενών με 2019-nCoV [11] (Πίνακας 1). Η περίοδος και ο τύπος του δείγματος που συλλέγεται για RT-PCR διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διάγνωση του 2019-nCoV. Διαπιστώθηκε ότι τα αναπνευστικά δείγματα ήταν θετικά στον ιό ενώ ο ορός ήταν αρνητικός στην πρώιμη περίοδο. Έχει επίσης προτείνει ότι στις πρώτες ημέρες της νόσου, οι ασθενείς έχουν υψηλά επίπεδα ιού παρά τα ήπια συμπτώματα. Εκτός από τη RT-PCR που χρησιμοποιείται συνήθως στη διάγνωση του MERS-CoV, τέσσερις μελέτες εντόπισαν διάφορες διαγνωστικές μεθόδους όπως η ανάστροφη μεταγραφή με τη μεσολάβηση βρόχου ισοθερμική ενίσχυση (RT-LAMP), ισοθερμική PCR με μόνωση RT (RT-iiPCR) και δοκιμασία rRT-PCR ενός σταδίου που βασίζεται σε ειδικούς ανιχνευτές TaqMan. Το RT-LAMP έχει παρόμοια ευαισθησία με το RT-PCR σε πραγματικό χρόνο. Είναι επίσης εξαιρετικά ειδικό και χρησιμοποιείται για την ανίχνευση του MERS-CoV. Είναι συγκρίσιμο με τις συνήθεις διαγνωστικές εξετάσεις και είναι γρήγορο, απλό και βολικό. Ομοίως, η RT-iiPCR και μια δοκιμασία rRT-PCR ενός σταδίου έχουν επίσης δείξει παρόμοια ευαισθησία και υψηλή ειδικότητα για τον MER-CoV. Τέλος, μια μελέτη επικεντρώθηκε στην επικύρωση των έξι εμπορικών πραγματικών κιτ RT-PCR, με υψηλή ακρίβεια. Αν και η RT-PCR σε πραγματικό χρόνο είναι μια κύρια μέθοδος για τη διάγνωση του MERS-CoV, τα υψηλά επίπεδα αναστολής της PCR μπορεί να εμποδίσουν την ευαισθησία στην PCR (Πίνακας 1). Υπάρχουν έντεκα μελέτες που εστιάζουν στη διαγνωστική δοκιμή SARS-CoV (Πίνακας 1) . Αυτές οι εργασίες περιέγραψαν διαγνωστικές μεθόδους για την ανίχνευση του ιού με την πλειοψηφία τους να χρησιμοποιούν μοριακές δοκιμές για διάγνωση. Η σύγκριση μεταξύ της μοριακής δοκιμής (δηλαδή RT-PCR) και της ορολογικής δοκιμής (δηλαδή, ELISA) έδειξε ότι η μοριακή δοκιμή έχει καλύτερη ευαισθησία και ειδικότητα. Ως εκ τούτου, έγιναν βελτιώσεις στην τρέχουσα μοριακή δοκιμή για τη βελτίωση της διάγνωσης. Μελέτες εξέτασαν τη χρήση ένθετης PCR για τη συμπερίληψη ενός σταδίου προενίσχυσης ή την ενσωμάτωση του γονιδίου Ν ως πρόσθετου ευαίσθητου μοριακού δείκτη για τη βελτίωση της ευαισθησίας (Πίνακας 1). Επιπλέον, υπάρχουν επτά πιθανά κιτ ταχείας διάγνωσης (από τις 24 Ιανουαρίου 2020. Πίνακας 2 ) διαθέσιμος στην αγορά για το 2019-nCoV. Έξι από αυτά είναι μόνο για ερευνητικούς σκοπούς. Μόνο ένα κιτ από το Beijing Genome Institute (BGI) έχει εγκριθεί για χρήση σε κλινικό περιβάλλον για γρήγορη διάγνωση. Τα περισσότερα από τα κιτ είναι για RT-PCR. Υπήρχαν δύο κιτ (BGI, Κίνα και Veredus, Σιγκαπούρη) με δυνατότητα ανίχνευσης πολλαπλών παθογόνων με χρήση τεχνολογιών αλληλούχισης και μικροσυστοιχιών, αντίστοιχα. Το όριο ανίχνευσης της μεθόδου ενισχυμένης PCR πραγματικού χρόνου ήταν 10 2 φορές υψηλότερο από την τυπική ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο και 10 7 φορές υψηλότερο από τις συμβατικές μεθόδους PCR Στην κλινική άποψη, η μέθοδος ενισχυμένης PCR πραγματικού χρόνου ήταν σε θέση να ανιχνεύσει 6 περιπτώσεις SARS -Δείγματα θετικά για τον κορωνοϊό που δεν επιβεβαιώθηκαν με καμία άλλη ανάλυση [25] • Η PCR σε πραγματικό χρόνο έχει οριακή ευαισθησία 10 ισοδύναμα γονιδιώματος ανά αντίδραση και έχει καλή αναπαραγωγιμότητα με συντελεστές διακύμανσης μεταξύ των δοκιμασιών από 1,73 έως 2,72%. • 13 δείγματα από 6 ασθενείς ήταν θετικά με εύρος ιικού φορτίου από 362 έως 36.240.000 ισοδύναμα γονιδιώματος/mL. Η αντίδραση RT-PCR σε πραγματικό χρόνο ήταν πιο ευαίσθητη από την ένθετη αντίδραση PCR, καθώς το όριο ανίχνευσης για την ένθετη αντίδραση PCR ήταν περίπου 103 ισοδύναμα γονιδιώματος στον τυπικό έλεγχο cDNA. [34] PCR αντίστροφης μεταγραφής σε πραγματικό χρόνο (rRT-PCR). RNA-εξαρτώμενη RNA πολυμεράση (RdRp); ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης 1a (ORF1a). Ισόθερμη ενίσχυση με μεσολάβηση βρόχου (LAMP). συνδεδεμένη με ένζυμο ανοσοπροσροφητικό προσδιορισμό (ELISA); δοκιμασία ανοσοφθορισμού (IFA); ανοσοχρωματογραφική δοκιμή (ΤΠΕ); ρινοφαρυγγική αναρρόφηση (NPA). Με την εμφάνιση του 2019-nCoV, υπάρχουν περίπου 15 πιθανά υποψήφια εμβόλια παγκοσμίως (Πίνακας 3), στα οποία ένα ευρύ φάσμα τεχνολογίας (όπως αγγελιοφόρο RNA, βασισμένο σε DNA, νανοσωματίδια, συνθετικά και τροποποιημένα σωματίδια τύπου ιού ) εφαρμόστηκε. Πιθανότατα θα χρειαστεί περίπου ένας χρόνος για να ξεκινήσουν οι περισσότεροι υποψήφιοι κλινικές δοκιμές φάσης 1, εκτός από εκείνες που χρηματοδοτούνται από τον Συνασπισμό καινοτομιών για την ετοιμότητα για επιδημίες (CEPI). Ωστόσο, το κιτ που αναπτύχθηκε από το BGI έχει περάσει τη διαδικασία έγκρισης έκτακτης ανάγκης της Εθνικής Διοίκησης Ιατρικών Προϊόντων και χρησιμοποιούνται επί του παρόντος σε κλινικά και κέντρα επιτήρησης της Κίνας [40] .Από το σύνολο των 570 μοναδικών μελετών για 2019-nCoV, SARS CoV ή Τα εμβόλια MERS-CoV που εξετάστηκαν, μόνο τέσσερα συμπεριλήφθηκαν τελικά στην ανασκόπηση. Οι περισσότερες μελέτες για τα εμβόλια SARS και MERS αποκλείστηκαν καθώς πραγματοποιήθηκαν σε κυτταρικά ή ζωικά μοντέλα (Εικόνα 1). Οι τέσσερις μελέτες που περιλαμβάνονται σε αυτήν την ανασκόπηση ήταν κλινικές δοκιμές Φάσης Ι σε εμβόλια SARS ή MERS (Πίνακας 4) [44] [45] [46] [47] . Δεν υπήρξαν μελέτες οποιουδήποτε τύπου πληθυσμού (κύτταρο, ζώο, άνθρωπο) για τον 2019-nCoV στο σημείο του ελέγχου. Οι δημοσιευμένες κλινικές δοκιμές έγιναν ως επί το πλείστον στις Ηνωμένες Πολιτείες εκτός από μία για το εμβόλιο SARS που έγινε στην Κίνα [44] . Όλα τα υποψήφια εμβόλια για SARS και MERS αναφέρθηκαν ότι ήταν ασφαλή, καλά ανεκτά και ικανά να πυροδοτήσουν τις σχετικές και κατάλληλες ανοσολογικές αντιδράσεις στους συμμετέχοντες. Επιπλέον, επισημαίνουμε έξι συνεχιζόμενες κλινικές δοκιμές Φάσης Ι που προσδιορίζονται στο μητρώο ClinicalTrials.gov ( [48, 49]). Πίνακας S4 ) [50] [51] [52] . Όλες αυτές οι δοκιμές δοκιμάζουν την ασφάλεια και την ανοσογονικότητα των αντίστοιχων υποψηφίων εμβολίων MERS-CoV, αλλά αποκλείστηκαν καθώς δεν έχουν δημοσιευθεί ακόμη αποτελέσματα. Οι δοκιμές αναμένεται να ολοκληρωθούν τον Δεκέμβριο του 2020 (δύο μελέτες στη Ρωσία [50, 51] ) και τον Δεκέμβριο του 2021 (στη Γερμανία [52] ). Η υπάρχουσα βιβλιογραφία δεν έδωσε αποτελέσματα σε ολοκληρωμένες δοκιμές 2019-nCoV κατά τη στιγμή της συγγραφής. . Μεταξύ 23 δοκιμών που βρέθηκαν από τη συστηματική ανασκόπηση (Πίνακας 5), υπάρχουν εννέα κλινικές δοκιμές που έχουν καταχωρηθεί στο μητρώο κλινικών δοκιμών (ClinicalTrials.gov) για 2019-nCoV therapeutics [53] [54] [55] [56] [57] [ 58] [59] [60] [61] . Από τις οποίες πέντε μελέτες για την υδροξυχλωροκίνη, τη λοπιναβίρη συν ριτοναβίρη και την αρβιδόλη, τα μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα, την παραδοσιακή κινεζική ιατρική και τη χρήση θεραπείας με γλυκοκορτικοειδή έχουν αρχίσει να προσλαμβάνονται. Οι υπόλοιπες τέσσερις μελέτες περιλαμβάνουν διερεύνηση αντιικών φαρμάκων, ψεκασμό ιντερφερόνης, χρήση δαρουναβίρης και κομπισιστάτης, αρβιδόλης και ρεμντεσιβίρης για ασθενείς με 2019-nCoV (Πίνακας 5). Η ορομετατροπή που μετρήθηκε με S1-ELISA εμφανίστηκε στο 86% και στο 94% των συμμετεχόντων μετά από 2 και 3 δόσεις, αντίστοιχα, και διατηρήθηκε στο 79% των συμμετεχόντων μέχρι το τέλος της μελέτης την εβδομάδα 60. Τα εξουδετερωτικά αντισώματα ανιχνεύθηκαν στο 50% των συμμετεχόντων σε ένα ή περισσότερα χρονικά σημεία κατά τη διάρκεια της μελέτης, αλλά μόνο το 3% διατήρησε τη δραστηριότητα εξουδετέρωσης μέχρι το τέλος της μελέτης. Οι αποκρίσεις των Τ-κυττάρων ανιχνεύθηκαν σε 71% και 76% συμμετέχοντες μετά από 2 και 3 δόσεις, αντίστοιχα. Δεν υπήρχαν διαφορές στις ανοσολογικές αποκρίσεις μεταξύ των ομάδων δόσης μετά από 6 εβδομάδες και οι προκαλούμενες από το εμβόλιο χυμικές και κυτταρικές αποκρίσεις ανιχνεύθηκαν αντίστοιχα στο 77% και στο 64% των συμμετεχόντων την εβδομάδα 60. [47] Μόρια που αναπτύχθηκαν από τους επιστήμονες του πανεπιστημίου αναστέλλουν δύο ένζυμα του κορωνοϊού και εμποδίζουν την αναπαραγωγή του. Οι στόχοι φαρμάκων που ανακαλύφθηκαν λέγεται ότι είναι περισσότερο από 95% παρόμοιοι με ενζυμικούς στόχους που βρέθηκαν στον ιό SARS. Οι ερευνητές σημειώνουν ότι τα ταυτοποιημένα φάρμακα μπορεί να μην είναι διαθέσιμα για την αντιμετώπιση της συνεχιζόμενης επιδημίας, αλλά ελπίζουν να τα καταστήσουν προσβάσιμα για μελλοντικά κρούσματα. [85] Εκτός από τις έξι ολοκληρωμένες τυχαιοποιημένες ελεγχόμενες δοκιμές (RCT) που επιλέχθηκαν από τη συστηματική ανασκόπηση (Πίνακας 6) , υπάρχει μόνο μία εν εξελίξει τυχαιοποιημένη ελεγχόμενη δοκιμή που στοχεύει στη θεραπεία του SARS [92] . Οι μελέτες που βρέθηκαν από το ClinicalTrials.gov δεν έχουν ενημερωθεί από το 2013. Ενώ πολλές προοπτικές και αναδρομικές μελέτες κοόρτης που διεξήχθησαν κατά τη διάρκεια της επιδημίας επικεντρώθηκαν στη χρήση της ριμπαβιρίνης μόνο με λοπιναβίρη/ριτοναβίρη ή ριμπαβιρίνη, δεν υπάρχουν ακόμη καλά σχεδιασμένες κλινικές δοκιμές που να διερευνούν τη χρήση τους. Τρεις ολοκληρωμένες τυχαιοποιημένες ελεγχόμενες δοκιμές διεξήχθησαν κατά τη διάρκεια της επιδημίας SARS-3 στην Κίνα, 1 στην Ταϊβάν και 2 στο Χονγκ Κονγκ [93] [94] [95] [96] [97] . Οι μελέτες διερεύνησαν αντίστοιχα τη χρήση αντιβιοτικών με 190 συμμετέχοντες, συνδυασμό δυτικής και κινεζικής θεραπείας έναντι κινεζικής θεραπείας σε 123 συμμετέχοντες, ολοκληρωμένη κινεζική και δυτική θεραπεία σε 49 ασθενείς, χρήση συγκεκριμένου κινέζικου φαρμάκου σε τέσσερις συμμετέχοντες και πρώιμη χρήση κορτικοστεροειδών σε 16 συμμετέχοντες . Μια άλλη αξιοσημείωτη μελέτη ήταν μια ανοιχτή μη τυχαιοποιημένη μελέτη που διερεύνησε τη χρήση ριμπαβιρίνης/λοπιναβίρης/ριτοναβίρης σε 152 συμμετέχοντες [98] . Μία τυχαιοποιημένη ελεγχόμενη δοκιμή που διερεύνησε την ολοκληρωμένη δυτική και κινεζική θεραπεία κατά τη διάρκεια της επιδημίας SARS αποκλείστηκε καθώς ήταν ένα κινεζικό άρθρο [94] . Υπάρχει μόνο μία σε εξέλιξη τυχαιοποιημένη ελεγχόμενη δοκιμή που στοχεύει στη θεραπεία MERS [99] . Διερευνά τη χρήση Lopinavir/Ritonavir και Interferon Beta 1B. Ομοίως, πολλές προοπτικές και αναδρομικές μελέτες κοόρτης που διεξήχθησαν κατά τη διάρκεια της επιδημίας επικεντρώθηκαν στη χρήση της ριμπαβιρίνης με λοπιναβίρη/ριτοναβίρη/ριμπαβιρίνη, ιντερφερόνη και χρήση στο πλάσμα ανάρρωσης. Μέχρι σήμερα, έχει ολοκληρωθεί μόνο μία δοκιμή. Μία κλινική δοκιμή φάσης 1 που διερεύνησε την ασφάλεια και την ανεκτικότητα μιας πλήρως ανθρώπινης πολυκλωνικής IgG ανοσοσφαιρίνης (SAB-301) βρέθηκε στη διαθέσιμη βιβλιογραφία [46] . Η δοκιμή που διεξήχθη στις Ηνωμένες Πολιτείες το 2017 έδειξε ότι το SAB-301 είναι ασφαλές και καλά ανεκτό σε εφάπαξ δόσεις. Μια άλλη δοκιμή για τα θεραπευτικά MERS βρέθηκε στη δοκιμή φάσης 2/3 του ClinicalTrials.gov στις Ηνωμένες Πολιτείες που αξιολογεί την ασφάλεια, την ανεκτικότητα, τη φαρμακοκινητική (PK) και την ανοσογονικότητα στα συγχορηγούμενα αντισώματα MERS-CoV REGN3048 & REGN3051 [100] diagnosticsR. παίζει σημαντικό ρόλο στη διαχείριση ασθενειών και εστιών. Η γρήγορη και ακριβής διάγνωση μιας συγκεκριμένης ιογενούς λοίμωξης επιτρέπει την έγκαιρη και ακριβή παρακολούθηση της δημόσιας υγείας, την πρόληψη και τα μέτρα ελέγχου. Η τοπική μετάδοση και οι συστάδες μπορούν να αποτραπούν ή να καθυστερήσουν με την απομόνωση εργαστηριακά επιβεβαιωμένων κρουσμάτων και τις στενές επαφές τους σε καραντίνα και παρακολούθηση στο σπίτι. Η ταχεία διάγνωση διευκολύνει επίσης άλλες ειδικές παρεμβάσεις δημόσιας υγείας, όπως το κλείσιμο εγκαταστάσεων υψηλού κινδύνου και περιοχών που σχετίζονται με τα επιβεβαιωμένα κρούσματα για έγκαιρο έλεγχο λοιμώξεων και περιβαλλοντική απολύμανση [11, 101] .Η εργαστηριακή διάγνωση μπορεί να πραγματοποιηθεί με: (α) ανίχνευση της γενετικής υλικό του ιού, (β) ανίχνευση των αντισωμάτων που εξουδετερώνουν τα ιικά σωματίδια ενδιαφέροντος, (γ) ανίχνευση των ιικών επιτόπων ενδιαφέροντος με αντισώματα (ορολογικός έλεγχος) ή (δ) καλλιέργεια και απομόνωση βιώσιμων σωματιδίων ιού. Οι βασικοί περιορισμοί της ανίχνευσης γενετικού υλικού είναι η έλλειψη γνώσης της παρουσίας βιώσιμου ιού, η πιθανή διασταυρούμενη αντίδραση με μη ειδικές γενετικές περιοχές και το σύντομο χρονικό πλαίσιο για την ακριβή ανίχνευση κατά τη φάση της οξείας μόλυνσης. Οι βασικοί περιορισμοί των ορολογικών δοκιμών είναι η ανάγκη συλλογής ζευγαρωμένων δειγμάτων ορού (στην οξεία και φάση ανάρρωσης) από περιπτώσεις υπό διερεύνηση για επιβεβαίωση για την εξάλειψη της πιθανής διασταυρούμενης αντιδραστικότητας από μη ειδικά αντισώματα από προηγούμενη έκθεση ή/και μόλυνση από άλλους κοροναϊούς. Ο περιορισμός της καλλιέργειας και της απομόνωσης του ιού είναι η μεγάλη διάρκεια και οι εξαιρετικά εξειδικευμένες δεξιότητες που απαιτούνται από τους τεχνικούς για την επεξεργασία των δειγμάτων. Όλοι οι ασθενείς ανάρρωσαν. Σημαντικά συντομεύτηκε ο χρόνος από την έναρξη της νόσου έως τη βελτίωση των συμπτωμάτων στη θεραπεία (5,10 ± 2,83 ημέρες) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (7,62 ± 2,27 ημέρες) (p < 0,05) Καμία σημαντική διαφορά στη βελτίωση ρουτίνας αίματος, πνευμονική θωρακική σκιά σε βελτίωση του φιλμ στο στήθος και χρήση κορτικοστεροειδών μεταξύ των 2 ομάδων. Ωστόσο, ιδιαίτερα όσον αφορά τη βελτίωση των κλινικών συμπτωμάτων, την ανύψωση της ποιότητας ζωής, την προώθηση της αποκατάστασης της λειτουργίας του ανοσοποιητικού, την προώθηση της απορρόφησης της πνευμονικής φλεγμονής, τη μείωση της δόσης των κορτιστεροειδών και τη συντόμευση της θεραπευτικής πορείας, η θεραπεία με ολοκληρωμένη κινεζική και δυτική ιατρική θεραπεία είχε εμφανή υπεροχή σε σύγκριση με τη χρήση μόνο θεραπείας ελέγχου. Οι εφάπαξ εγχύσεις SAB-301 έως 50 mg/kg φαίνεται να είναι ασφαλείς και καλά ανεκτές σε υγιείς συμμετέχοντες. [46] Από όπου λαμβάνονται τα βιολογικά δείγματα παίζει επίσης ρόλο στην ευαισθησία αυτών των δοκιμών. Για τους SARS-CoV και MERS-CoV, τα δείγματα που συλλέγονται από την κατώτερη αναπνευστική οδό, όπως τα πτύελα και οι αναρροφήσεις τραχείας, έχουν υψηλότερα και πιο παρατεταμένα επίπεδα ιικού RNA λόγω του τροπισμού του ιού. Τα ιικά φορτία του MERS-CoV είναι επίσης υψηλότερα για σοβαρές περιπτώσεις και έχουν μεγαλύτερη αποβολή του ιού σε σύγκριση με τις ήπιες περιπτώσεις. Αν και μπορούν να χρησιμοποιηθούν δείγματα της ανώτερης αναπνευστικής οδού, όπως ρινοφαρυγγικά ή στοματοφαρυγγικά επιχρίσματα, έχουν δυνητικά χαμηλότερο ιικό φορτίο και μπορεί να έχουν υψηλότερο κίνδυνο ψευδώς αρνητικών μεταξύ των ήπιων περιπτώσεων MERS και SARS [102, 103] και πιθανώς μεταξύ των περιπτώσεων 2019-nCoV Οι υπάρχουσες πρακτικές για την ανίχνευση γενετικού υλικού κοροναϊών όπως ο SARS-CoV και ο MERS-CoV περιλαμβάνουν (α) αλυσιδωτή αντίδραση ανάστροφης μεταγραφής-πολυμεράσης (RT-PCR), (β) RT-PCR σε πραγματικό χρόνο (rRT-PCR) , (γ) ισοθερμική ενίσχυση με μεσολάβηση βρόχου αντίστροφης μεταγραφής (RT-LAMP) και (δ) RT-LAMP σε πραγματικό χρόνο [104] . Οι δοκιμές νουκλεϊκής ενίσχυσης (NAAT) συνήθως προτιμώνται όπως στην περίπτωση της διάγνωσης MERS-CoV, καθώς έχει την υψηλότερη ευαισθησία στο πρώιμο χρονικό σημείο στην οξεία φάση της μόλυνσης [102] . Οι κινεζικές υγειονομικές αρχές δημοσίευσαν πρόσφατα το πλήρες γονιδίωμα του 2019-nCoV στην GenBank και στην πύλη GISAID για να διευκολύνουν τον εντοπισμό του ιού [11] . Έχουν αναπτυχθεί αρκετές εργαστηριακές δοκιμές για την ανίχνευση του νέου κοροναϊού στη Γουχάν, όπως επισημαίνεται στην προσωρινή καθοδήγηση του ΠΟΥ σχετικά με τις εργαστηριακές δοκιμές nCoV ύποπτων περιπτώσεων. Αυτά περιλαμβάνουν πρωτόκολλα από άλλες χώρες όπως η Ταϊλάνδη, η Ιαπωνία και η Κίνα [105] . Η πρώτη επικυρωμένη διαγνωστική δοκιμή σχεδιάστηκε στη Γερμανία. Corman et al. είχε αρχικά σχεδιάσει μια υποψήφια διαγνωστική ανάλυση RT-PCR βασισμένη στον κορονοϊό SARS ή που σχετίζεται με το SARS, καθώς προτάθηκε ότι ο κυκλοφορούν ιός ήταν σαν SARS. Μετά την απελευθέρωση της αλληλουχίας, επιλέχθηκαν δοκιμές με βάση την αντιστοιχία έναντι του 2019-nCoV κατά την επιθεώρηση της ευθυγράμμισης της αλληλουχίας. Χρησιμοποιήθηκαν δύο δοκιμές για το γονίδιο RNA πολυμεράσης (RdRP) που εξαρτάται από το RNA και το γονίδιο Ε, όπου η ανάλυση γονιδίου Ε δρα ως εργαλείο διαλογής πρώτης γραμμής και η δοκιμασία γονιδίου RdRp ως επιβεβαιωτική δοκιμή. Όλες οι αναλύσεις ήταν εξαιρετικά ευαίσθητες και ειδικές καθώς δεν αντέδρασαν διασταυρούμενα με άλλους κοροναϊούς, καθώς και με ανθρώπινα κλινικά δείγματα που περιείχαν ιούς του αναπνευστικού [11] . Το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ χρησιμοποίησε δύο μονοπλεξικές αναλύσεις που αντιδρούσαν με κοροναϊούς υπό το υπογένος Sarbecovirus (που αποτελούνταν του 2019-nCoV, του SARS-CoV και του κορωνοϊού τύπου SARS). Το ιικό RNA που εξάγεται από το SARS-CoV μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως θετικός μάρτυρας για το προτεινόμενο πρωτόκολλο, με την προϋπόθεση ότι ο SARS έχει εκριζωθεί. Προτείνεται ότι το γονίδιο Ν RT-PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως προσδιορισμός διαλογής ενώ ο προσδιορισμός Orf1b δρα ως επιβεβαιωτική δοκιμή. Ωστόσο, αυτό το πρωτόκολλο έχει αξιολογηθεί μόνο με μια ομάδα ελέγχων με το μόνο θετικό μάρτυρα SARS-CoV RNA. Ο θετικός μάρτυρας συνθετικού ολιγονουκλεοτιδίου ή 2019-nCoV δεν έχει ακόμη δοκιμαστεί [106] . Το CDC των ΗΠΑ μοιράστηκε το πρωτόκολλο για την ανάλυση RT-PCR σε πραγματικό χρόνο για την ανίχνευση του 2019-nCoV με τους εκκινητές και τους ανιχνευτές που έχουν σχεδιαστεί για την καθολική ανίχνευση Ο κορωνοϊός τύπου SARS και η ειδική ανίχνευση του 2019-nCoV. Ωστόσο, το πρωτόκολλο δεν έχει επικυρωθεί σε άλλες πλατφόρμες ή χημικές ουσίες εκτός από το πρωτόκολλο που περιγράφεται. Υπάρχουν ορισμένοι περιορισμοί για την ανάλυση. Οι εμπλεκόμενοι αναλυτές πρέπει να είναι εκπαιδευμένοι και εξοικειωμένοι με τη διαδικασία δοκιμών και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Μπορεί να προκύψουν ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα λόγω ανεπαρκών οργανισμών στο δείγμα που προκύπτουν από ακατάλληλη συλλογή, μεταφορά ή χειρισμό. Επίσης, οι ιοί RNA μπορεί να παρουσιάζουν σημαντική γενετική μεταβλητότητα. Αυτό θα μπορούσε να οδηγήσει σε αναντιστοιχία μεταξύ του εκκινητή και των ανιχνευτών με την αλληλουχία στόχο που μπορεί να μειώσει την απόδοση της ανάλυσης ή να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα [107]. Το κιτ δοκιμών σημείου φροντίδας μπορεί ενδεχομένως να ελαχιστοποιήσει αυτούς τους περιορισμούς, στους οποίους θα πρέπει να δοθεί μεγάλη προτεραιότητα για έρευνα και ανάπτυξη τους επόμενους μήνες. Οι ορολογικές δοκιμές όπως οι δοκιμές ELISA, IIFT και εξουδετέρωσης είναι αποτελεσματικές στον προσδιορισμό της έκτασης της μόλυνσης, συμπεριλαμβανομένης της εκτίμησης ασυμπτωματικών και ποσοστό επίθεσης. Σε σύγκριση με την ανίχνευση του ιικού γονιδιώματος μέσω μοριακών μεθόδων, ο ορολογικός έλεγχος ανιχνεύει αντισώματα και αντιγόνα. Θα υπήρχε μια περίοδος καθυστέρησης, καθώς τα αντισώματα που στοχεύουν ειδικά τον ιό θα εμφανίζονταν κανονικά μεταξύ 14 και 28 ημερών μετά την έναρξη της νόσου [108] . Επιπλέον, μελέτες υποδεικνύουν ότι οι χαμηλοί τίτλοι αντισωμάτων τη δεύτερη εβδομάδα ή η καθυστερημένη παραγωγή αντισωμάτων θα μπορούσαν να συσχετιστούν με θνησιμότητα με υψηλό ιικό φορτίο. Ως εκ τούτου, ορολογικές διαγνώσεις είναι πιθανό να χρησιμοποιούνται όταν οι δοκιμές πυρηνικής ενίσχυσης (NAAT) δεν είναι διαθέσιμες ή προσβάσιμες [102] . Τα εμβόλια μπορούν να αποτρέψουν και να προστατεύσουν από μόλυνση και εμφάνιση ασθένειας όταν εκτίθενται στο συγκεκριμένο παθογόνο ενδιαφέροντος, ειδικά σε ευάλωτους πληθυσμούς που είναι πιο επιρρεπείς σε σοβαρά αποτελέσματα. Στο πλαίσιο της τρέχουσας επιδημίας 2019-nCoV, τα εμβόλια θα βοηθήσουν στον έλεγχο και τη μείωση της μετάδοσης της νόσου δημιουργώντας ανοσία της αγέλης εκτός από την προστασία των υγιών ατόμων από μόλυνση. Αυτό μειώνει την αποτελεσματική τιμή R0 της νόσου. Ωστόσο, υπάρχουν κοινωνικά, κλινικά και οικονομικά εμπόδια για τα προγράμματα εμβολιασμού και εμβολιασμού, όπως (α) η προθυμία του κοινού να εμβολιαστεί με ένα νέο εμβόλιο, (β) οι παρενέργειες και οι σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες του εμβολιασμού, (γ) η πιθανή διαφορά και/ή χαμηλή αποτελεσματικότητα του εμβολίου σε πληθυσμούς διαφορετικούς από τους πληθυσμούς των κλινικών δοκιμών και (δ) την προσβασιμότητα των εμβολίων σε έναν δεδομένο πληθυσμό (συμπεριλαμβανομένου του κόστους και της διαθεσιμότητας του εμβολίου). Τα εμβόλια κατά του 2019-nCoV είναι επί του παρόντος υπό ανάπτυξη και κανένα δεν βρίσκεται σε δοκιμή (τη στιγμή που γράφεται το άρθρο). Στις 23 Ιανουαρίου 2020, η Coalition for Epidemic Preparedness Innovations (CEPI) ανακοίνωσε ότι θα χρηματοδοτήσει προγράμματα ανάπτυξης εμβολίων με την Inovio, το University of Queensland και τη Moderna, Inc αντίστοιχα, με στόχο να δοκιμαστούν κλινικά τα πειραματικά εμβόλια σε 16 εβδομάδες (Μέχρι τον Ιούνιο 2020). Τα υποψήφια εμβόλια θα αναπτυχθούν από τις πλατφόρμες εμβολίων DNA, ανασυνδυασμένου και mRNA από αυτούς τους οργανισμούς [109] . Με βάση την πιο πρόσφατη έξαρση του MERS-CoV, υπάρχει ήδη ένας αριθμός υποψηφίων εμβολίων που αναπτύσσονται, αλλά τα περισσότερα βρίσκονται ακόμη σε προκλινικές δοκιμές στάδιο. Τα εμβόλια υπό ανάπτυξη περιλαμβάνουν εμβόλιο που βασίζεται σε ιικό φορέα, εμβόλιο DNA, εμβόλιο υπομονάδας, εμβόλιο που βασίζεται σε σωματίδια ιού (VLPs), εμβόλιο απενεργοποιημένου ολόκληρου ιού (IWV) και ζωντανό εξασθενημένο εμβόλιο. Τα τελευταία ευρήματα για αυτά τα εμβόλια βασίζονται στην ανασκόπηση των Yong et al. (2019) τον Αύγουστο του 2019 [110] . Μέχρι την ημερομηνία αναφοράς, υπάρχει μόνο μία δημοσιευμένη κλινική μελέτη για το εμβόλιο MERS-CoV από την GeneOne Life Science & Inovio Pharmaceuticals [47] . Διεξήχθη μία δοκιμή εμβολίου SARS από το Εθνικό Ινστιτούτο Αλλεργιών και Λοιμωδών Νοσημάτων των ΗΠΑ. Και οι δύο κλινικές δοκιμές Φάσης Ι ανέφεραν θετικά αποτελέσματα, αλλά μόνο μία έχει ανακοινώσει σχέδια να προχωρήσει στη δοκιμή Φάσης 2 [111] . Λόγω της στενής γενετικής συσχέτισης του SARS-CoV (79%) με τον 2019-nCoV [112] , ενδέχεται να υπάρξει πιθανή διασταυρούμενη προστατευτική επίδραση της χρήσης ενός ασφαλούς εμβολίου SARS-CoV εν αναμονή του εμβολίου 2019-nCoV. Ωστόσο, αυτό θα απαιτούσε μικρής κλίμακας εφαρμογή φάση προς φάση και στενή παρακολούθηση των εμβολιασμένων πριν από οποιαδήποτε εφαρμογή μεγάλης κλίμακας. Πέρα από την έγκαιρη διάγνωση των περιπτώσεων, η επίτευξη ευνοϊκών κλινικών αποτελεσμάτων εξαρτάται από την έγκαιρη χορηγούμενη θεραπεία. Το ACE2 έχει αναφερθεί ότι είναι ο ίδιος υποδοχέας εισόδου κυττάρων που χρησιμοποιείται από τον 2019-nCoV για να μολύνει ανθρώπους με τον SARS-CoV [113] . Ως εκ τούτου, αναμένεται κλινική ομοιότητα μεταξύ των δύο ιών, ιδιαίτερα σε σοβαρές περιπτώσεις. Επιπλέον, οι περισσότεροι από αυτούς που πέθαναν από MERS-CoV, SARS-CoV και 2019-nCoV ήταν προχωρημένοι σε ηλικία και είχαν υποκείμενες παθήσεις όπως υπέρταση, διαβήτης ή καρδιαγγειακή νόσο που έθεταν σε κίνδυνο το ανοσοποιητικό τους σύστημα [114] . Οι κοροναϊοί έχουν επιρρεπείς σε σφάλματα εξαρτώμενες από RNA πολυμεράσες RNA (RdRP), οι οποίες έχουν ως αποτέλεσμα συχνές μεταλλάξεις και συμβάντα ανασυνδυασμού. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την ποικιλομορφία οιονεί ειδών που συνδέεται στενά με την προσαρμοστική εξέλιξη και την ικανότητα ενίσχυσης της εισόδου των ιικών κυττάρων για την πρόκληση ασθένειας με την πάροδο του χρόνου σε έναν συγκεκριμένο πληθυσμό σε κίνδυνο [115] . Δεδομένου ότι το ACE2 υπάρχει σε αφθονία στους ανθρώπους στο επιθήλιο του πνεύμονα και του λεπτού εντέρου, οι κοροναϊοί είναι πιθανό να μολύνουν την ανώτερη αναπνευστική και γαστρεντερική οδό και αυτό μπορεί να επηρεάσει τον τύπο της θεραπείας κατά του 2019-nCoV, παρόμοια με τον SAR-CoV. τα χρόνια μετά τις δύο μεγάλες επιδημίες του κορωνοϊού SARS-CoV το 2003 και του MERS-CoV το 2012, δεν υπάρχει συναίνεση σχετικά με τη βέλτιστη θεραπεία για καμία από τις δύο νόσους [116, 117]. Οι καλά σχεδιασμένες κλινικές δοκιμές που παρέχουν το χρυσό πρότυπο για την αξιολόγηση των θεραπευτικών μέτρων είναι σπάνιες. Κανένας αναστολέας πρωτεάσης του κοροναϊού δεν έχει ολοκληρώσει επιτυχώς ένα πρόγραμμα προκλινικής ανάπτυξης παρά τις μεγάλες προσπάθειες για την εξερεύνηση των αναστολέων SARS-CoV. Το μεγαλύτερο μέρος των πιθανών θεραπευτικών στρατηγικών παραμένει στην πειραματική φάση, με μόνο μια χούφτα να ξεπερνά το εμπόδιο in vitro. Απαιτούνται ισχυρότερες προσπάθειες στην έρευνα για επιλογές θεραπείας για μείζονες κοροναϊούς, δεδομένης της πανδημικής τους δυνατότητας. Οι αποτελεσματικές θεραπευτικές επιλογές είναι απαραίτητες για τη μεγιστοποίηση της αποκατάστασης της καλής υγείας των προσβεβλημένων πληθυσμών μετά από λοιμώξεις. Στην Κίνα ξεκίνησαν κλινικές δοκιμές για τον εντοπισμό αποτελεσματικών θεραπειών για τον 2019-nCoV με βάση τα στοιχεία θεραπείας από το SARS και το MERS. Επί του παρόντος δεν υπάρχει αποτελεσματικό ειδικό αντιιικό με στοιχεία υψηλού επιπέδου. οποιαδήποτε ειδική αντιική θεραπεία θα πρέπει να παρέχεται στο πλαίσιο κλινικής μελέτης/δοκιμής. Λίγες θεραπείες έχουν δείξει πραγματική θεραπευτική δράση κατά του SARS και του MERS και η βιβλιογραφία γενικά περιγράφει μεμονωμένες περιπτώσεις ή μικρές σειρές περιπτώσεων. Πολλές ιντερφερόνες από τις τρεις κατηγορίες έχουν δοκιμαστεί για τις αντιικές τους δράσεις κατά του SARS-CoV τόσο in vitro όσο και σε ζωικά μοντέλα. Η ιντερφερόνη β έχει αποδειχθεί σταθερά ως η πιο δραστική, ακολουθούμενη από την ιντερφερόνη α. Η χρήση κορτικοστεροειδών με ιντερφερόνη alfacon-1 (συνθετική ιντερφερόνη α) φάνηκε να έχει βελτιωμένη οξυγόνωση και ταχύτερη επίλυση των ανωμαλιών της ακτινογραφίας θώρακα σε μελέτες παρατήρησης με μάρτυρες χωρίς θεραπεία. Η ιντερφερόνη έχει χρησιμοποιηθεί σε πολλαπλές μελέτες παρατήρησης για τη θεραπεία ασθενών με SARS-CoV και MERS-CoV [116, 117]. Οι ιντερφερόνες, με ή χωρίς ριμπαβιρίνη και λοπιναβίρη/ριτοναβίρη είναι πολύ πιθανό να είναι ωφέλιμες και δοκιμάζονται στην Κίνα για το 2019-nCoV. Αυτή η φαρμακευτική θεραπεία φαίνεται να είναι η πιο προηγμένη. Ο χρόνος της θεραπείας είναι πιθανότατα σημαντικός παράγοντας αποτελεσματικότητας. Ένας συνδυασμός ριμπαβιρίνης και λοπιναβίρης/ριτοναβίρης χρησιμοποιήθηκε ως προφύλαξη μετά την έκθεση σε εργαζόμενους στον τομέα της υγείας και μπορεί να μείωσε τον κίνδυνο μόλυνσης. Η ριμπαβιρίνη μόνη της είναι απίθανο να έχει ουσιαστική αντιική δράση σε κλινικά χρησιμοποιούμενες δόσεις. Ως εκ τούτου, η ριμπαβιρίνη με ή χωρίς κορτικοστεροειδή και με λοπιναβίρη και ριτοναβίρη είναι μεταξύ των συνδυασμών που χρησιμοποιούνται. Αυτός ήταν ο πιο κοινός παράγοντας που αναφέρθηκε στη διαθέσιμη βιβλιογραφία. Η αποτελεσματικότητά του έχει αξιολογηθεί σε μελέτες παρατήρησης, αναδρομικές σειρές περιπτώσεων, αναδρομική μελέτη κοόρτης, προοπτική μελέτη παρατήρησης, προοπτική μελέτη κοόρτης και τυχαιοποιημένη ελεγχόμενη δοκιμή που κυμαίνεται από επτά έως 229 συμμετέχοντες [117] . Η λοπιναβίρη/ριτοναβίρη (Kaletra) ήταν ο πιο πρώιμος συνδυασμός αναστολέων πρωτεάσης που εισήχθη για τη θεραπεία του SARS-CoV. Η αποτελεσματικότητά του τεκμηριώθηκε σε αρκετές μελέτες, προκαλώντας σημαντικά χαμηλότερη συχνότητα εμφάνισης ανεπιθύμητων ενεργειών από ό,τι με τη ριμπαβιρίνη μόνο. Η συνδυασμένη χρήση με ριμπαβιρίνη συσχετίστηκε επίσης με χαμηλότερη συχνότητα εμφάνισης συνδρόμου οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας, νοσοκομειακής λοίμωξης και θανάτου, μεταξύ άλλων ευνοϊκών εκβάσεων. Πρόσφατες in vitro μελέτες έδειξαν ότι ένας άλλος αναστολέας πρωτεάσης του HIV, η νελφιναβίρη, έχει αντιική ικανότητα έναντι του SARS-CoV, αν και δεν έχει ακόμη δείξει ευνοϊκά αποτελέσματα σε μελέτες σε ζώα [118] . Το ανάλογο νουκλεοσιδίου Remdesivir (Gilead Sciences, GS-5734) in vitro και in vivo υποστηρίζει την ανάπτυξη του GS-5734 ως δυνητικού αντιικού παν-κορονοϊού με βάση τα αποτελέσματα κατά αρκετών κορωνοϊών (CoVs), συμπεριλαμβανομένων των εξαιρετικά παθογόνων CoV και των δυνητικά αναδυόμενων BatCoVs. Η χρήση του remdesivir μπορεί να είναι καλός υποψήφιος ως ερευνητική θεραπεία. Βελτιωμένη θνησιμότητα μετά τη λήψη πλάσματος ανάρρωσης σε διάφορες δόσεις αναφέρθηκε σταθερά σε αρκετές μελέτες παρατήρησης που αφορούσαν περιπτώσεις με σοβαρές οξείες αναπνευστικές λοιμώξεις (SARIs) ιογενούς αιτιολογίας. Παρατηρήθηκε σημαντική μείωση στις συγκεντρωτικές πιθανότητες θνησιμότητας μετά από θεραπεία 0,25 σε σύγκριση με εικονικό φάρμακο ή καθόλου θεραπεία [119]. Ωστόσο, οι μελέτες διέτρεχαν μέτριο έως υψηλό κίνδυνο μεροληψίας, δεδομένου του μικρού μεγέθους δείγματος, της κατανομής της θεραπείας με βάση την κρίση του ιατρού και της διαθεσιμότητας πλάσματος. Παράγοντες όπως η ταυτόχρονη θεραπεία μπορεί επίσης να έχουν μπερδέψει τα αποτελέσματα. Οι συσχετίσεις μεταξύ πλάσματος ανάρρωσης και διάρκειας παραμονής στο νοσοκομείο, επιπέδων ιικών αντισωμάτων και ιικού φορτίου αντίστοιχα ήταν ομοίως ασυνεπείς σε όλη τη διαθέσιμη βιβλιογραφία. Το αναρρώσιμο πλάσμα, αν και πολλά υποσχόμενο, είναι πιθανό να μην είναι ακόμη εφικτό, δεδομένης της περιορισμένης δεξαμενής πιθανών δοτών και των προβλημάτων επεκτασιμότητας. Η θεραπεία με μονοκλωνικά αντισώματα προχωρά. Ο SARS-CoV εισέρχεται στα κύτταρα ξενιστές μέσω της δέσμευσης της πρωτεΐνης ακίδας (S) τους στο ένζυμο μετατροπής της αγγειοτενσίνης 2 (ACE2) και στο CD209L [118] . Τα ανθρώπινα μονοκλωνικά αντισώματα στην πρωτεΐνη S έχει αποδειχθεί ότι μειώνουν σημαντικά τη σοβαρότητα της παθολογίας του πνεύμονα σε πρωτεύοντα πλην του ανθρώπου μετά από μόλυνση MERS-CoV [120] . Τέτοια εξουδετερωτικά αντισώματα μπορούν να προκληθούν με ενεργητική ή παθητική ανοσοποίηση χρησιμοποιώντας εμβόλια ή πλάσμα ανάρρωσης αντίστοιχα. Ενώ τέτοια εξουδετερωτικά αντισώματα μπορούν θεωρητικά να συλλεχθούν από άτομα που έχουν ανοσοποιηθεί με εμβόλια, υπάρχει αβεβαιότητα σχετικά με την επίτευξη θεραπευτικών επιπέδων αντισωμάτων. Έχουν επίσης αναφερθεί και άλλοι θεραπευτικοί παράγοντες. Ένας γνωστός ανθελονοσιακός παράγοντας, η χλωροκίνη, προκαλεί αντιικά αποτελέσματα έναντι πολλών ιών, συμπεριλαμβανομένων του HIV τύπου 1, της ηπατίτιδας Β και του HCoV-229E. Η χλωροκίνη είναι επίσης ανοσοτροποποιητική, ικανή να καταστέλλει την παραγωγή και την απελευθέρωση παραγόντων που μεσολαβούν στις φλεγμονώδεις επιπλοκές των ιογενών ασθενειών (παράγοντας νέκρωσης όγκου και ιντερλευκίνη 6) [121] . Υποτίθεται ότι η χλωροκίνη δρα μεταβάλλοντας τη γλυκοζυλίωση του ACE2 και το ενδοσωματικό pH. Οι αντιφλεγμονώδεις ιδιότητές του μπορεί να είναι ευεργετικές για τη θεραπεία του SARS. Niclosamide ως γνωστό φάρμακο που χρησιμοποιείται στην αντιελμινθική θεραπεία. Η αποτελεσματικότητα της νικλοσαμίδης ως αναστολέα της αντιγραφής του ιού αποδείχθηκε σε αρκετές αναλύσεις. Και στις δύο αναλύσεις ανοσοστύπωσης και σε προσδιορισμούς ανοσοφθορισμού, η θεραπεία με νικλοσαμίδη παρατηρήθηκε ότι αναστέλλει πλήρως τη σύνθεση ιικού αντιγόνου. Η μείωση της απόδοσης του ιού στα μολυσμένα κύτταρα ήταν δοσοεξαρτώμενη. Η νικλοσαμίδη πιθανότατα δεν παρεμβαίνει στα πρώιμα στάδια της προσκόλλησης και της εισόδου του ιού στα κύτταρα, ούτε λειτουργεί ως αναστολέας πρωτεάσης. Οι μηχανισμοί δραστικότητας νικλοσαμίδης απαιτούν περαιτέρω διερεύνηση [122] . Η γλυκυρριζίνη αναφέρεται επίσης ότι αναστέλλει την προσρόφηση και τη διείσδυση του ιού στα πρώτα στάδια της αντιγραφής του ιού. Η γλυκυρριζίνη ήταν ένας σημαντικά ισχυρός αναστολέας με χαμηλό δείκτη εκλεκτικότητας όταν δοκιμάστηκε έναντι πολλών παθογόνων φλαβοϊών. Ενώ τα προκαταρκτικά αποτελέσματα υποδηλώνουν παραγωγή οξειδίου του αζώτου (το οποίο αναστέλλει την αναπαραγωγή του ιού) μέσω επαγωγής συνθάσης υποξειδίου του αζώτου, ο μηχανισμός της γλυκυρριζίνης κατά του SARS-CoV παραμένει ασαφής. Η ένωση έχει επίσης σχετικά χαμηλότερη τοξικότητα σε σύγκριση με τους αναστολείς πρωτεάσης όπως η ριμπαβιρίνη [123]. Ανασταλτική δράση ανιχνεύθηκε επίσης στη baicalin [124] , που εξάγεται από ένα άλλο βότανο που χρησιμοποιείται στη θεραπεία του SARS στην Κίνα και το Χονγκ Κονγκ. Τα ευρήματα για αυτές τις ενώσεις περιορίζονται σε in vitro μελέτες [121] [122] [123] [124] . Λόγω της ταχέως εξελισσόμενης κατάστασης του 2019-nCoV, θα υπάρξουν πιθανοί περιορισμοί στη συστηματική ανασκόπηση. Η συστηματική ανασκόπηση είναι πιθανό να έχει μεροληψία δημοσίευσης, καθώς ορισμένες εξελίξεις δεν έχουν ακόμη αναφερθεί, ενώ για άλλες εξελίξεις δεν υπάρχει πρόθεση να αναφερθούν δημόσια (ή σε επιστημονικές πλατφόρμες) λόγω ανησυχιών σχετικά με το απόρρητο. Ωστόσο, αυτό μπορεί να περιορίζεται σε μερικές μόνο εξελίξεις για αναθεώρηση, καθώς η δημοσιότητα βοηθά στην επωνυμία σε κάποιο βαθμό για την εταιρεία ή/και τον χρηματοδότη. Επιπλέον, λόγω της ταχείας ανάγκης κοινοποίησης της κατάστασης αυτών των εξελίξεων, ενδέχεται να υπάρχει μεροληψία αναφοράς σε ορισμένες λεπτομέρειες που παρέχονται από τους συγγραφείς των επιστημονικών άρθρων ή των άρθρων σχολίων στα παραδοσιακά μέσα. Τέλος, ενώ δεν είναι βιώσιμο για οποιαδήποτε μορφή αξιολόγησης ποιότητας και μεταανάλυσης των επιλεγμένων άρθρων λόγω των περιορισμένων δεδομένων που παρέχονται και του ετερογενούς τρόπου αναφοράς από διαφορετικά άρθρα, η παρούσα εργασία παρέχει μια ολοκληρωμένη επισκόπηση των πιθανών εξελίξεων αυτών των φαρμακευτικών παρεμβάσεων. κατά την πρώιμη φάση της επιδημίας. Αυτή η συστηματική ανασκόπηση θα ήταν χρήσιμη για διασταυρούμενο έλεγχο όταν η αξιολόγηση της ποιότητας και η μετα-ανάλυση αυτών των εξελίξεων εκτελούνται ως μελέτη παρακολούθησης. Η ταχεία διάγνωση, τα εμβόλια και η θεραπευτική είναι βασικές φαρμακευτικές παρεμβάσεις για τον περιορισμό της μετάδοσης μολυσματικών ασθενειών του αναπνευστικού. Πολλές πιθανές εξελίξεις σε αυτές τις φαρμακευτικές παρεμβάσεις για το 2019-nCoV βρίσκονται σε εξέλιξη στη φάση περιορισμού αυτής της επιδημίας, πιθανώς λόγω της καλύτερης ετοιμότητας για την πανδημία από πριν. Ωστόσο, τα διδάγματα από το MERS-CoV και το SARS-CoV έχουν δείξει ότι τα ταξίδια για αυτές τις εξελίξεις μπορεί να είναι ακόμα προκλητικά για να προχωρήσουμε. πλήρης στρατηγική αναζήτησης στο Pubmed, Πίνακας S2 : Αναζήτηση Google: Διαγνωστικά 2019-nCoV, Πίνακας S3 : Σύνοψη διαγνωστικών δοκιμασιών που αναπτύχθηκαν για το 2019-nCoV, Πίνακας S4", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 1056, "text": "Πραγματοποιήθηκε συστηματική αναζήτηση σε τρεις μεγάλες ηλεκτρονικές βάσεις δεδομένων (PubMed, Embase και Cochrane Library) για τον εντοπισμό δημοσιευμένων μελετών σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές για τα Προτιμώμενα στοιχεία αναφοράς για συστηματικές αναθεωρήσεις και μετα-αναλύσεις (PRISMA). Χρησιμοποιήθηκαν συμπληρωματικές στρατηγικές μέσω της Αναζήτησης Google και προσωπικών επικοινωνιών" } ], "id": 3617, "question": "Τι εργασία έχει πραγματοποιηθεί αυτή η μελέτη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2749, "text": "25.000" } ], "id": 3618, "question": "Πόσα επιβεβαιωμένα κρούσματα εντοπίστηκαν τον Φεβρουάριο του 2020;" }, { "answers": [ { "answer_start": 11229, "text": "2%" } ], "id": 3619, "question": "Ποιο ήταν το ποσοστό θνησιμότητας;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3894, "text": "Με βάση τα τρέχοντα στοιχεία, η παθογένεια για τον 2019-nCoV είναι περίπου 3%, που είναι σημαντικά χαμηλότερη από τον SARS-CoV (10%) και τον MERS-CoV (40%)" } ], "id": 3625, "question": "Πώς συγκρίνεται η παθογένεια του 2019-nCOV με άλλους ιούς;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1143, "text": "PubMed, Embase και Cochrane Library" } ], "id": 3627, "question": "Ποιες ηλεκτρονικές βάσεις δεδομένων χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 8817, "text": "RT-PCR σε πραγματικό χρόνο" } ], "id": 3632, "question": "Ποιο είναι το κύριο μέσο για τη διάγνωση του νέου στελέχους του ιού;" }, { "answers": [ { "answer_start": 8775, "text": "Το RT-LAMP έχει παρόμοια ευαισθησία με το RT-PCR σε πραγματικό χρόνο. Είναι επίσης εξαιρετικά ειδικό και χρησιμοποιείται για την ανίχνευση του MERS-CoV. Είναι συγκρίσιμο με τις συνήθεις διαγνωστικές εξετάσεις και είναι γρήγορο, απλό και βολικό." } ], "id": 3635, "question": "Πώς συγκρίνεται το RT-LAMP με άλλες μεθόδους;" }, { "answers": [ { "answer_start": 9078, "text": "έχουν επίσης δείξει παρόμοια ευαισθησία και υψηλή ειδικότητα για τον MER-CoV." } ], "id": 3636, "question": "Πώς συγκρίνονται η RT-iiPCR και η rRT-PCR ενός βήματος με άλλες μεθόδους;" }, { "answers": [ { "answer_start": 9357, "text": "υψηλά επίπεδα αναστολής της PCR μπορεί να εμποδίσουν την ευαισθησία στην PCR" } ], "id": 3637, "question": "Γιατί η RT-PCR δεν είναι η καλύτερη μέθοδος μερικές φορές;" }, { "answers": [ { "answer_start": 9785, "text": "ότι η μοριακή δοκιμή έχει καλύτερη ευαισθησία και ειδικότητα" } ], "id": 3638, "question": "Τι έδειξε η σύγκριση μεταξύ του μοριακού τεστ και του ορολογικού τεστ;" }, { "answers": [ { "answer_start": 11092, "text": "10 ισοδύναμα γονιδιώματος ανά αντίδραση" } ], "id": 3640, "question": "Ποια είναι η οριακή ευαισθησία της PCR σε πραγματικό χρόνο;" }, { "answers": [ { "answer_start": 12388, "text": "το κιτ που αναπτύχθηκε από το BGI έχει περάσει τη διαδικασία έγκρισης έκτακτης ανάγκης της Εθνικής Διοίκησης Ιατρικών Προϊόντων και χρησιμοποιούνται επί του παρόντος σε κλινικά και κέντρα επιτήρησης της Κίνας" } ], "id": 3643, "question": "Ποιο κιτ χρησιμοποιείται αυτή τη στιγμή στην Κίνα;" }, { "answers": [ { "answer_start": 12759, "text": "Οι περισσότερες μελέτες για τα εμβόλια SARS και MERS αποκλείστηκαν καθώς πραγματοποιήθηκαν σε κυτταρικά ή ζωικά μοντέλα" } ], "id": 3644, "question": "Γιατί συμπεριλήφθηκαν μόνο τέσσερις μελέτες;" }, { "answers": [ { "answer_start": 12960, "text": "κλινικές δοκιμές Φάσης Ι σε εμβόλια SARS ή MERS" } ], "id": 3645, "question": "Ποιες τέσσερις μελέτες συμπεριλήφθηκαν;" }, { "answers": [ { "answer_start": 14169, "text": "εννέα" } ], "id": 3648, "question": "Πόσες κλινικές δοκιμές έχουν καταχωρηθεί;" }, { "answers": [ { "answer_start": 14782, "text": "Η ορομετατροπή που μετρήθηκε με S1-ELISA εμφανίστηκε στο 86% και στο 94% των συμμετεχόντων μετά από 2 και 3 δόσεις, αντίστοιχα, και διατηρήθηκε στο 79% των συμμετεχόντων μέχρι το τέλος της μελέτης την εβδομάδα 60." } ], "id": 3650, "question": "Ποια είναι τα αποτελέσματα στην ορομετατροπή;" }, { "answers": [ { "answer_start": 14996, "text": "Τα εξουδετερωτικά αντισώματα ανιχνεύθηκαν στο 50% των συμμετεχόντων σε ένα ή περισσότερα χρονικά σημεία κατά τη διάρκεια της μελέτης, αλλά μόνο το 3% διατήρησε τη δραστηριότητα εξουδετέρωσης μέχρι το τέλος της μελέτης." } ], "id": 3651, "question": "Ποια ήταν τα αποτελέσματα στα αντισώματα;" }, { "answers": [ { "answer_start": 17617, "text": "Διερευνά τη χρήση Lopinavir/Ritonavir και Interferon Beta 1B." } ], "id": 3655, "question": "Τι ερευνά η εν εξελίξει τυχαιοποιημένη δοκιμή;" }, { "answers": [ { "answer_start": 18139, "text": "Η δοκιμή που διεξήχθη στις Ηνωμένες Πολιτείες το 2017 έδειξε ότι το SAB-301 είναι ασφαλές και καλά ανεκτό σε εφάπαξ δόσεις" } ], "id": 3657, "question": "Ποιο ήταν το αποτέλεσμα της δοκιμής φάσης 1 της ανοσοσφαιρίνης IgG;" }, { "answers": [ { "answer_start": 19024, "text": "ειδικές παρεμβάσεις δημόσιας υγείας, όπως το κλείσιμο εγκαταστάσεων υψηλού κινδύνου και περιοχών που σχετίζονται με τα επιβεβαιωμένα κρούσματα για έγκαιρο έλεγχο λοιμώξεων και περιβαλλοντική απολύμανση" } ], "id": 3659, "question": "Ποια άλλα μέτρα διευκολύνει η ταχεία διάγνωση;" }, { "answers": [ { "answer_start": 20734, "text": "όσον αφορά τη βελτίωση των κλινικών συμπτωμάτων, την ανύψωση της ποιότητας ζωής, την προώθηση της αποκατάστασης της λειτουργίας του ανοσοποιητικού, την προώθηση της απορρόφησης της πνευμονικής φλεγμονής, τη μείωση της δόσης των κορτιστεροειδών και τη συντόμευση της θεραπευτικής πορείας" } ], "id": 3665, "question": "Ποια υπεροχή είχε η θεραπεία με ολοκληρωμένη κινεζική και δυτική ιατρική θεραπεία σε σύγκριση με τη χρήση μόνο θεραπείας ελέγχου;" }, { "answers": [ { "answer_start": 21505, "text": "έχουν υψηλότερα και πιο παρατεταμένα επίπεδα ιικού RNA λόγω του τροπισμού του ιού" } ], "id": 3666, "question": "Ποιο ήταν το χαρακτηριστικό του SARS-CoV και του MERS-CoV, δειγμάτων που συλλέχθηκαν από την κατώτερη αναπνευστική οδό, όπως πτύελα και αναρροφήσεις τραχείας;" }, { "answers": [ { "answer_start": 22513, "text": "έχει την υψηλότερη ευαισθησία στο πρώιμο χρονικό σημείο στην οξεία φάση της μόλυνσης" } ], "id": 3670, "question": "Γιατί συνήθως προτιμώνται οι δοκιμές νουκλεϊκής ενίσχυσης (NAAT) όπως στην περίπτωση της διάγνωσης MERS-CoV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 23491, "text": "Χρησιμοποιήθηκαν δύο δοκιμές για το γονίδιο RNA πολυμεράσης (RdRP) που εξαρτάται από το RNA και το γονίδιο Ε, όπου η ανάλυση γονιδίου Ε δρα ως εργαλείο διαλογής πρώτης γραμμής και η δοκιμασία γονιδίου RdRp ως επιβεβαιωτική δοκιμή" } ], "id": 3673, "question": "Πώς χρησιμοποιήθηκαν οι αναλύσεις;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Port d'Entrée για λοιμώξεις του αναπνευστικού – Ανοίγει ο ιός της γρίπης Α τον δρόμο για τα βακτήρια; Oehmcke-Hecht, Sonja; Mettenleiter, Thomas C.; Kreikemeyer, Bernd; Valentin-Weigand, Peter; Hammerschmidt, SvenΗμερομηνία: 2017-12-21DOI: 10.3389/fmicb.2017.02602Άδεια: cc-byAbstract: Οι βακτηριακές και ιογενείς συν-λοιμώξεις της αναπνευστικής οδού είναι απειλητικές για τη ζωή και αποτελούν παγκόσμιο βάρος για την παγκόσμια κοινότητα. Ο Staphylococcus aureus, ο Streptococcus pneumoniae και ο Streptococcus pyogenes είναι συχνοί αποικιστές της ανώτερης αναπνευστικής οδού. Οι ανισορροπίες μέσω της απόκτησης εποχιακών ιών, π.χ. του ιού της γρίπης Α, μπορεί να οδηγήσουν σε διάδοση βακτηρίων στην κατώτερη αναπνευστική οδό, η οποία με τη σειρά της μπορεί να οδηγήσει σε σοβαρή πνευμονία. Σε αυτήν την ανασκόπηση, συνοψίζουμε την τρέχουσα γνώση σχετικά με τις βακτηριακές και ιογενείς συν-λοιμώξεις της αναπνευστικής οδού και επικεντρωνόμαστε σε πιθανά πειραματικά μοντέλα κατάλληλα για τη μίμηση αυτής της νόσου. Η μετάδοση του IAV και της πνευμονίας διαμορφώνεται κυρίως με λοίμωξη από ποντίκια. Λίγες μελέτες που χρησιμοποιούν κουνάβια, αρουραίους, ινδικά χοιρίδια, κουνέλια και πρωτεύοντα πλην του ανθρώπου είναι επίσης διαθέσιμες. Η γνώση που αποκτήθηκε από αυτές τις μελέτες οδήγησε σε σημαντικές ανακαλύψεις και προόδους στην κατανόηση αυτών των μολυσματικών ασθενειών. Ωστόσο, τα μοντέλα ποντικιών και άλλων λοιμώξεων έχουν περιορισμούς, ειδικά στη μετάφραση των ανακαλύψεων στους ανθρώπους. Εδώ, προτείνουμε τη χρήση ανθρώπινου μηχανικού πνευμονικού ιστού, ανθρώπινου ex vivo πνευμονικού ιστού και μοντέλων χοίρων για τη μελέτη αναπνευστικών συν-λοιμώξεων, που μπορεί να συμβάλουν σε μεγαλύτερη μετάφραση των αποτελεσμάτων στον άνθρωπο και να βελτιώσουν την υγεία τόσο των ζώων όσο και των ανθρώπων. : Τα τελευταία χρόνια η ανθρώπινη μικροχλωρίδα αναγνωρίζεται όλο και περισσότερο ότι παίζει καθοριστικό ρόλο στην παθογένεση πολλών ασθενειών (Weinstock, 2012). Η ανώτερη αναπνευστική οδός είναι μια φυσική θέση για δυνητικά παθογόνα βακτήρια που είναι ενσωματωμένα σε κοινότητες που σχηματίζουν το ρινοφαρυγγικό μικροβίωμα. Συγκεκριμένα, οι μικροβιακές κοινότητες του ρινοφάρυγγα (Hilty et al., 2012) σχετίζονται με αναπνευστικές ασθένειες, δηλαδή σοβαρή πνευμονία, που ευθύνεται για σημαντική θνησιμότητα και νοσηρότητα στους ανθρώπους παγκοσμίως (Prina et al., 2016). Η σύνθεση του ρινοφαρυγγικού μικροβιώματος είναι εξαιρετικά δυναμική (Biesbroek et al., 2014a,b,c) και πολλοί παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων περιβαλλοντικών παραγόντων και παραγόντων ξενιστή, μπορούν να επηρεάσουν τον μικροβιακό αποικισμό (Koppen et al., 2015). Πρόσφατες μελέτες σε νεογνά έδειξαν ότι το αναπνευστικό μικροβίωμα αναπτύσσεται από την αρχικά μεταδιδόμενη από τη μητέρα μικτή χλωρίδα με κυριαρχία των ειδών Streptococcus viridans σε εξειδικευμένα βακτηριακά προφίλ που περιέχουν κυρίως Staphylococcus aureus σε ηλικία περίπου 1 εβδομάδας (Bosch et al., 2016a). Μεταξύ 2 εβδομάδων και 6 μηνών μετά τη γέννηση, η επικράτηση του σταφυλόκοκκου μειώνεται και εμφανίζεται ο αποικισμός με Streptococcus pneumoniae (πνευμονόκοκκοι) ως κυρίαρχο παθογόνο (Miller et al., 2011; Bosch et al., 2016a,b). Η δυναμική σύνθεση μικροβιώματος είναι εγγυημένη μέσω της αλληλεπίδρασης μεταξύ βακτηριακών ειδών, άλλων μικροβίων και μεταβαλλόμενων περιβαλλοντικών συνθηκών, καθώς και αλληλεπιδράσεων ξενιστή-βακτηρίων (Blaser and Falkow, 2009). Τις περισσότερες φορές, το μικροβίωμα και η αλληλεπίδρασή του με τον ανθρώπινο ξενιστή πιστεύεται ότι είναι ευεργετικά και για τους δύο (Pettigrew et al., 2008; Murphy et al., 2009). Ωστόσο, οι ανισορροπίες στη μικροβιακή σύνθεση μπορεί να οδηγήσουν σε απόκτηση νέων ιικών ή βακτηριακών ειδών και εισβολή πιθανών παθογόνων, τα οποία με τη σειρά τους μπορεί να γίνουν επιζήμια, ειδικά σε ηλικιωμένους και παιδιά με εξαντλημένο ή ανώριμο ανοσοποιητικό σύστημα (Pettigrew et al., 2008; Blaser και Falkow, 2009; Murphy et al., 2009) .Ένα συγκεκριμένο παράδειγμα που δείχνει ανισορροπίες που εισάγονται με μία δόση αντιβιοτικών καταδείχθηκε από τον Ichinohe και τους συνεργάτες του (Ichinohe et al., 2011). Ενώ η κοινή αναπνευστική μικροχλωρίδα διευκόλυνε την ανοσολογική υποστήριξη έναντι της λοίμωξης από τον ιό της γρίπης Α (IAV), η από του στόματος θεραπεία με αντιβιοτικά οδήγησε όχι μόνο σε αλλαγή της βακτηριακής σύνθεσης, αλλά και σε εξασθενημένη ανοσία των CD4 T-, CD8 T- και Β-κυττάρων μετά τη μόλυνση με IAV σε ποντίκια (Ichinohe et al., 2011). Οι αναλύσεις ανθρώπινων στοματοφαρυγγικών μικροβιωμάτων κατά τη διάρκεια της πανδημίας H1N1 IAV του 2009 αποκάλυψαν ότι σε επίπεδο φυλής, η αφθονία των Fermicutes και των Proteobacteria αυξήθηκε σε ασθενείς με πνευμονία σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες (Leung et al., 2013). Ωστόσο, μια άλλη μελέτη που δημοσιεύθηκε την ίδια χρονιά αντέκρουσε αυτά τα αποτελέσματα (Chaban et al., 2013) . Ο Chaban και οι συνεργάτες του ανέλυσαν μικροβιώματα 65 ασθενών από ξέσπασμα H1N1 IAV το 2009. Αν και η φυλογενετική σύνθεση των ασθενών με πνευμονία κυριαρχούνταν από Fermicutes, Proteobacteria και Actinobacteria, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ασθενών και των υγιών μαρτύρων ή οποιωνδήποτε άλλων μεταβλητών που δοκιμάστηκαν, συμπεριλαμβανομένης της ηλικίας και του φύλου (Chaban et al., 2013). ανασκόπηση, συζητάμε δευτερογενείς βακτηριακές λοιμώξεις της αναπνευστικής οδού μετά από πρωτογενή μόλυνση από IAV με έμφαση στους μηχανισμούς μέσω των οποίων αυτές οι αλληλεπιδράσεις δυνητικά μεσολαβούνται και θα παρέχουμε πληροφορίες για τη συμβολή του ξενιστή και τις ανοσολογικές συνέπειες. Εστιάζουμε περαιτέρω σε πιθανά ζωικά μοντέλα κατάλληλα για μίμηση ασυμπτωματικού βακτηριακού αποικισμού και εξέλιξης της νόσου και έτσι, δίνοντας τη δυνατότητα να μελετηθούν στρατηγικές προσαρμογής, αλληλεπιδράσεις ιού-βακτηριδίου και ανοσολογικές αποκρίσεις σε αυτές τις εξαιρετικά θανατηφόρες συν-λοιμώξεις. Οι ιοί της γρίπης Α ανήκουν στην οικογένεια των Orthomyxoviridae και με βάση την αντιγονικότητα της αιμοσυγκολλητίνης τους (ΗΑ) και της νευραμινιδάσης (ΝΑ) ταξινομούνται σε 16 κλασικούς υποτύπους ΗΑ και 9 κλασικούς ΝΑ (Neumann et al., 2009). Τα γονιδιώματα 8 τμημάτων των ιών της γρίπης Α χαρακτηρίζονται από σημαντική πλαστικότητα. Λόγω σημειακών μεταλλάξεων και γεγονότων ανακατάταξης εμφανίζονται νέες παραλλαγές ή στελέχη με δυνατότητα επιδημίας ή πανδημίας (Neumann et al., 2009). Επιπλέον, η γρίπη μπορεί να μεταδοθεί μεταξύ ζώων, συμπεριλαμβανομένων των χοίρων, των πτηνών, των αλόγων και των ανθρώπων, καθιστώντας τη ζωονοσογόνο νόσο (van der Meer et al., 2010). Η εποχική γρίπη συνήθως υποχωρεί χωρίς συνέπειες σε υγιή άτομα. Ωστόσο, εκτιμάται ότι η εποχική γρίπη επηρεάζει το 5-10% του παγκόσμιου πληθυσμού με αποτέλεσμα περίπου 250.000 έως 500.000 θανάτους ετησίως (Tjon-Kon-Fat et al., 2016). Σε μεγαλύτερο κίνδυνο να αναπτύξουν δευτερογενή βακτηριακή πνευμονία βρίσκονται τα άτομα με συννοσηρότητες, οι ηλικιωμένοι (ηλικία > 65 ετών), οι έγκυες γυναίκες και τα παιδιά κάτω του ενός έτους (Rothberg et al., 2008). Για μεγάλο χρονικό διάστημα θεωρήθηκε ότι ο Η1Ν1 στέλεχος, ένας ιός H1N1 που μοιάζει με πτηνά, προκάλεσε άμεσα τους περισσότερους θανάτους κατά τη διάρκεια της πανδημίας του 1918-1919 (ισπανική γρίπη), συχνά από αιμορραγική πνευμονίτιδα που εξελίσσεται γρήγορα σε σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας και θάνατο (Osterholm, 2005; Gerberding, 2006; Oxford et al., 2006). Η πανδημία σκότωσε περίπου 50 εκατομμύρια ανθρώπους σε όλο τον κόσμο και παραμένει μοναδική ως προς τη σοβαρότητά της σε σύγκριση με άλλες μεγάλες επιδημίες. Ωστόσο, πολλά από τα ευρήματα έχουν ερμηνευτεί εκ νέου τα τελευταία χρόνια (Brundage and Shanks, 2007; Chien et al., 2009). Υπολογίζεται ότι περίπου το 95% όλων των σοβαρών περιπτώσεων και θανάτων αποδίδονταν σε δευτερογενείς λοιμώξεις με βακτηριακά παθογόνα, κυρίως από τον Streptococcus pneumoniae (Morens et al., 2008). Μεμονωμένες μελέτες περιορισμένες σε ορισμένες περιοχές εντόπισαν επίσης άλλα παθογόνα που αποικίζουν συνήθως την αναπνευστική οδό, συμπεριλαμβανομένων του Staphylococcus aureus, του στρεπτόκοκκου της ομάδας Α (GAS) και του Haemophilus influenzae (Brundage and Shanks, 2008). Κατά τη διάρκεια των επόμενων δύο πανδημιών (H2N2 Asian Flu 1957 και H3N2 Hong Kong Flu 1968 −1969 οι βακτηριακές συν-λοιμώξεις ήταν λιγότερο πιθανές η αιτία θανάτου σε σύγκριση με την ισπανική γρίπη (Giles and Shuttleworth, 1957; Trotter et al., 1959). Ωστόσο, η πνευμονία αντιπροσώπευε περίπου το 44% των θανάτων κατά τη διάρκεια της ασιατικής γρίπης (Giles and Shuttleworth, 1957). Οι περισσότεροι θάνατοι που προέκυψαν από πνευμονία συνέβησαν σε άτομα με χρόνιες παθήσεις, δηλαδή χρόνιες πνευμονικές παθήσεις, ρευματική καρδίτιδα και υπέρταση (Giles and Shuttleworth, 1957). Το 1957-1958, ο S. aureus απομονώθηκε κυρίως από θανατηφόρες περιπτώσεις πνευμονίας (Hers et al., 1957 (Hers et al., 1958 Robertson et al., 1958; Martin et al., 1959), ενώ ο S. pneumoniae επέστρεψε ως κυρίαρχη αιτία σοβαρής πνευμονίας κατά τη διάρκεια της γρίπης του Χονγκ Κονγκ (Sharrar, 1969; Bisno et al., 1971; Burk et αϊ., 1971; Schwarzmann et αϊ., 1971). Σαράντα χρόνια αργότερα, το 2009, ένας νέος ιός Η1Ν1 προέλευσης των χοίρων εμφανίστηκε και προκάλεσε ξανά πανδημία (Dawood et al., 2009 (Dawood et al., 2012). Σε αντίθεση με τη γρίπη της Ασίας και του Χονγκ Κονγκ, τα ποσοστά θνησιμότητας ήταν μάλλον χαμηλά, αλλά οι περισσότεροι θάνατοι συνέβησαν σε υγιή νεαρά άτομα χωρίς υποκείμενα νοσήματα (Reichert et al., 2010; Monsalvo et al., 2011; Dawood et al., 2012). Περίπου το 25-50% των σοβαρών ή θανατηφόρων περιπτώσεων συνδέθηκε με επιπλοκές λόγω βακτηριακής πνευμονίας (Dominguez-Cherit et al., 2009; Estenssoro et al., 2010; Mauad et al., 2010; Shieh et al., 2010). Αν και εμφανίστηκαν περιφερειακές παραλλαγές, οι πνευμονόκοκκοι και ο S. aureus ήταν τα πιο συχνά απομονωμένα βακτηριακά είδη (Mauad et al., 2010; Shieh et al., 2010; Rice et al., 2012). Ο στρεπτόκοκκος της ομάδας Α απουσίαζε σε πολλές τοπικές εστίες πνευμονίας που σχετίζονται με ιούς, αλλά ήταν κυρίαρχος σε άλλες (Brundage and Shanks, 2008; Ampofo et al., 2010). Όταν εμφανίζεται, είναι συνήθως τρίτο σε συχνότητα εμφάνισης (Chaussee et al., 2011). Συνολικά, τα δεδομένα για τα κρούσματα πανδημίας υποδηλώνουν ότι η σοβαρότητα και η θνησιμότητα της νόσου μπορούν να συνδεθούν με δευτερογενή βακτηριακά παθογόνα με παραλλαγές ανάλογα με τις περιοχές και την κατάσταση ανοσίας του πληθυσμού (Brundage and Shanks, 2008; Shanks et al., 2010 Shanks et al., , 2011 McCullers, 2013). Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι το ρινοφαρυγγικό μικρόβιο παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση των οξέων ιογενών λοιμώξεων του αναπνευστικού (Teo et al., 2015; de Steenhuijsen Piters et al., 2016; Rosas-Salazar et al., 2016a,b). Οι αναπνευστικοί ιοί, συμπεριλαμβανομένου του IAV, έχει αποδειχθεί ότι μεταβάλλουν τη βακτηριακή προσκόλληση και τον αποικισμό οδηγώντας σε αυξημένο κίνδυνο δευτερογενών βακτηριακών λοιμώξεων (Tregoning and Schwarze, 2010). Οι πνευμονιόκοκκοι, το S. aureus και το GAS είναι σημαντικά ανθρώπινα θετικά κατά Gram παθογόνα. Όλοι τους είναι συχνοί αποικιστές του ανθρώπινου ρινοφάρυγγα και μοιράζονται πολλά χαρακτηριστικά, συμπεριλαμβανομένων παθογόνων μηχανισμών και κλινικών πτυχών (Εικόνα 1). Ωστόσο, έχουν επίσης μοναδικές ιδιότητες. Ο χρυσίζων σταφυλόκοκκος αποικίζει επίμονα περίπου το 30% του ανθρώπινου πληθυσμού και οι τυπικές κόγχες περιλαμβάνουν τις μασχάλες, τις μασχάλες και το δέρμα (Peacock et al., 2001; von Eiff et al., 2001; van Belkum et al., 2009). Προκαλούν ποικίλες κλινικές εκδηλώσεις που κυμαίνονται από ήπιες λοιμώξεις του δέρματος έως θανατηφόρα νεκρωτική πνευμονία. Τις τελευταίες δεκαετίες, το παθογόνο έγινε ανθεκτικό σε έναν αυξανόμενο αριθμό αντιβιοτικών και το ανθεκτικό στη μεθικιλλίνη S. aureus (MRSA) αποτελεί πλέον κύρια αιτία νοσοκομειακών λοιμώξεων (Hartman and Tomasz, 1984; Ubukata et al., 1989; Zetola et al., 2005). Επίσης, η αύξηση των στελεχών του S. aureus που αποκτήθηκαν από την κοινότητα προκαλεί ιδιαίτερη ανησυχία, επειδή ορισμένοι κλώνοι σχετίζονται με πολύ σοβαρές λοιμώξεις (Rasigade et al., 2010). Πρόσφατες προοπτικές μελέτες κατέδειξαν αύξηση του ποσοστού του S. aureus ευαίσθητου στη μεθικιλλίνη που αποκτήθηκε από την κοινότητα σε περιπτώσεις σοβαρής πνευμονίας (McCaskill et al., 2007; Sicot et al., 2013) .Ο πνευμονιόκοκκος είναι ένας τυπικός αποικιστής του ανθρώπινου ρινοφάρυγγα. Περίπου το 20-50% των υγιών παιδιών και το 8-30% των υγιών ενηλίκων αποικίζονται ασυμπτωματικά (McCullers, 2006). Οι πνευμονιόκοκκοι προκαλούν ασθένειες που κυμαίνονται από ήπιες, π.χ., ιγμορίτιδα, επιπεφυκίτιδα και μέση ωτίτιδα, έως πιο σοβαρές και δυνητικά απειλητικές για τη ζωή λοιμώξεις, συμπεριλαμβανομένης της πνευμονίας της κοινότητας, της βακτηριαιμίας και της μηνιγγίτιδας (Bogaert et al., 2004; Valles et al., 2016). Αυτό το βακτήριο σχετίζεται με υψηλά ποσοστά νοσηρότητας και θνησιμότητας σε ομάδες κινδύνου όπως ανοσοκατεσταλμένα άτομα, παιδιά και ηλικιωμένους (Black et al., 2010; Valles et al., 2016) .Οι στρεπτόκοκκοι της ομάδας Α αποικίζουν το στόμα και την ανώτερη αναπνευστική οδό σε περίπου 2-5% του παγκόσμιου πληθυσμού (Okumura και Nizet, 2014). Οι πιο συχνές, μη επεμβατικές και ήπιες λοιμώξεις που προκαλούνται από το GAS είναι η αμυγδαλίτιδα και η φαρυγγίτιδα με εκτιμώμενες 600 εκατομμύρια περιπτώσεις ετησίως (Carapetis et al., 2005). et al., 2005), είναι προφανές ότι αυτό το παθογόνο μπορεί να προκαλέσει σοβαρές επεμβατικές λοιμώξεις, συμπεριλαμβανομένης της πνευμονίας, της σήψης, του συνδρόμου του στρεπτοκοκκικού τοξικού σοκ και των νεκρωτικών δερματικών λοιμώξεων (Cunningham, 2000; Carapetis et al., 2005) . Αν και και τα τρία παθογόνα είναι ικανά να προκαλέσουν εξαιρετικά θανατηφόρες ασθένειες, ο πιο θανατηφόρος παραμένει ο πνευμονιόκοκκος, που εκτιμάται ότι προκαλεί περίπου. Το 10% όλων των θανάτων σε παιδιά ηλικίας κάτω των 5 ετών (O'Brien et al., 2009), σε ηλικιωμένους (Marrie et al., 2017) και σε ανοσοκατεσταλμένα άτομα (Baxter et al., 2016). Ο ιός της γρίπης Α συνδέεται μέσω ΗΑ είτε με α2,3 είτε με α2,6-συνδεδεμένο σιαλικό οξύ στην επιφάνεια των επιθηλιακών κυττάρων της ανώτερης και κατώτερης αναπνευστικής οδού (Webster et al., 1992). Τα εποχιακά στελέχη δείχνουν συνήθως συγγένεια με α2,6-συνδεδεμένα σιαλικά οξέα που εκφράζονται στην ανθρώπινη τραχεία, ενώ οι ιοί που μοιάζουν με πτηνά δεσμεύονται κατά προτίμηση με α2,3-συνδεδεμένα σιαλικά οξέα κυψελιδικών κυττάρων τύπου II (Shinya et al., 2006; van Riel et al., 2007 van Riel et al., , 2010. Η απελευθέρωση ιικού γονιδιωματικού RNA στο κυτταρόπλασμα ενεργοποιεί διαφορετικές οδούς ανοσοαπόκρισης. Η δέσμευση του ιικού RNA στο επαγόμενο γονίδιο 1 του ρετινοϊκού οξέος επάγει την έκφραση των ιντερφερονών τύπου Ι και ΙΙΙ και ενεργοποιεί τον μεταγραφικό παράγοντα NF-κB, ο οποίος με τη σειρά του ενεργοποιεί την απελευθέρωση προφλεγμονωδών κυτοκινών (Durbin et al., 2013; Iwasaki και Pillai, 2014). Επιπλέον, η ενεργοποίηση του φλεγμονώδους σώματος οδηγεί στην απελευθέρωση της IL-1β και της IL-18 (Pothlichet et al., 2013; Iwasaki και Pillai, 2014). Όλες αυτές οι απαντήσεις υποτίθεται ότι προάγουν την κάθαρση του ιού. Ωστόσο, η παρουσία ιικών πρωτεϊνών κατά τη διάρκεια της μόλυνσης προκαλεί επίσης άμεση ενεργοποίηση της ενδογενούς ή έμμεσα ενεργοποίησης της εξωγενούς αποπτωτικής οδού μέσω παραγωγής φλεγμονωδών κυτοκινών, με αποτέλεσμα την απόπτωση ή ακόμη και τη νέκρωση του επιθηλίου (Korteweg and Gu, 2008). Επιπλέον, η ανώμαλη πήξη που προκαλείται από λοίμωξη από τον ιό προκαλεί υπερφλεγμονώδη απόκριση (Yang and Tang, 2016). Όλα αυτά τα συμβάντα συμβάλλουν στον τραυματισμό του πνευμονικού ιστού (Imai et al., 2008; Davidson et al., 2014). Η επιθηλιακή βλάβη λόγω ιικής αντιγραφής παρέχει ένα ευεργετικό περιβάλλον για την αρχική βακτηριακή προσκόλληση (Plotkowski et al., 1993). Από την άλλη πλευρά, τα ήδη αποικισμένα βακτήρια ενδέχεται να ενισχύσουν τη λοιμογόνο δύναμη του ιού της γρίπης είτε με την άμεση έκκριση πρωτεασών που διασπούν και ενεργοποιούν την ΗΑ (Εικόνα 2) (Bottcher-Friebertshauser et al., 2013) είτε, έμμεσα, ενεργοποιώντας πρωτεάσες ξενιστή όπως το πλασμινογόνο, το οποίο αυξάνει τους ρυθμούς αντιγραφής και τη μολυσματικότητα του ιού (Scheiblauer et al., 1992; Tse and Whittaker, 2015). Δυνητικά παθογόνα βακτήρια, συμπεριλαμβανομένων των τριών ειδών που αναφέρθηκαν παραπάνω, εκφράζουν ένα οπλοστάσιο παραγόντων λοιμογόνου δράσης που είναι υπεύθυνοι για την προσκόλληση στις ανθρώπινες δομές ξενιστή. Μικροβιακά συστατικά επιφάνειας που αναγνωρίζουν μόρια συγκολλητικής μήτρας ΕΙΚΟΝΑ 1 | Πιθανά μοντέλα για τη μελέτη βακτηριακών και ιογενών συν-λοιμώξεων της αναπνευστικής οδού. Οι S. pneumoniae, S. aureus, S. pyogenes και S. suis είναι συχνοί αποικιστές της ανώτερης αναπνευστικής οδού. Η εποχική λοίμωξη από IAV μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένο κίνδυνο δευτερογενών βακτηριακών λοιμώξεων, π.χ. πνευμονίας. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν διάφορα πειραματικά μοντέλα για τη μελέτη αυτών των σοβαρών λοιμώξεων. Τα δείγματα ασθενών, συμπεριλαμβανομένου ex vivo πνευμονικού ιστού είναι υλικά εκλογής, αλλά είναι σπάνια λόγω ηθικών κριτηρίων. Οι προσεγγίσεις της μηχανικής ιστών μοιάζουν πολύ με την τρισδιάστατη αρχιτεκτονική, την κυτταρική σύνθεση και την πολυπλοκότητα της μήτρας του αντίστοιχου οργάνου και έχουν αποδειχθεί χρήσιμο εργαλείο για τη μελέτη μολυσματικών ασθενειών. Οι in vivo βακτηριακές και ιικές συν-λοιμώξεις πραγματοποιούνται κυρίως σε ποντίκια, κάτι που δεν μοιάζει απαραίτητα με την ανθρώπινη φυσιολογία και το ανοσοποιητικό σύστημα. Επομένως, προτείνουμε να χρησιμοποιήσετε το μοντέλο χοίρου, το οποίο μοιάζει σχεδόν με πάνω από το 80% του ανθρώπινου ανοσοποιητικού συστήματος. (MSCRAMM), όπως PspC, PspA και PsaA σε πνευμονιόκοκκους (Hammerschmidt, 2006), SPA, FnbA, ClfA και ClfB σε S. aureus (Bartlett and Hulten, 2010; Otto, 2010) και Μ-πρωτεΐνη, PrtF1 και PrtF2 στο GAS (Cunningham, 2000), αντίστοιχα, και οι λεγόμενες πρωτεΐνες αστραπής σελήνης που εκφράζονται και από τα τρία είδη, π.χ. ), επιτρέπουν στα βακτήρια να προσκολληθούν σε κατεστραμμένα κύτταρα ή μόρια της εξωκυτταρικής μήτρας, συμπεριλαμβανομένης της φιμπρονεκτίνης, του ινώδους, του ινωδογόνου και του κολλαγόνου, ή ινωδολυτικών πρωτεϊνών όπως το πλασμινογόνο (McCullers and Rehg, 2002; Bergmann και Hammerschmidt, 2007; Linke et al., 2012; Siemens et al., 2012; Voss et al., 2012). Μόλις συμβεί η αρχική προσκόλληση, βακτηριακές κυτταροτοξίνες συμπεριλαμβανομένης της πνευμονολυσίνης των πνευμονόκοκκων (Garcia-Suarez Mdel et al., 2007; Zahlten et al., 2015), α-αιμολυσίνη και λευκοσιδίνες του S. aureus (Mairpady Shambat et al., 2015) και Streptolysins S και O και Στρεπτοκοκκική πυρογενής εξωτοξίνη Β του S. pyogenes (Tsai et al., Gurel et al., 2013; Οι Siemens et al., 2015 Siemens et al., , 2016, μπορούν να συνεργαστούν με αντίστοιχους ιούς για να αυξήσουν περαιτέρω την παθολογία του πνευμονικού ιστού. Πρόσθετοι δυνητικοί μηχανισμοί με τους οποίους μπορεί να συμβεί ο αρχικός αποικισμός της κατώτερης αναπνευστικής οδού και η βλάβη του πνευμονικού ιστού περιλαμβάνουν την ενίσχυση της ανάπτυξης πνευμονίας από νευραμινιδάση IAV μέσω ενζυματικής απομάκρυνσης του σιαλικού οξέος από τον πνεύμονα, εκθέτοντας έτσι τους υποδοχείς του ξενιστή για πνευμονιοκοκκική προσκόλληση (McCullers και Bartmess , 2003). Η φλεγμονώδης κατάσταση του ξενιστή ως απόκριση σε ιογενή μόλυνση μπορεί να αλλάξει την παρουσία των υποδοχέων στην επιφάνεια, επιτρέποντας έτσι τη βακτηριακή εισβολή (Cundell and Tuomanen, 1994). Καθώς ο ασθενής αρχίζει να αναρρώνει από ιογενή λοίμωξη, μπορεί να εμφανιστούν δευτερογενείς βακτηριακές λοιμώξεις (Louria et al., 1959) λόγω της ατελούς επούλωσης του τραύματος και της έκθεσης των συστατικών της μεμβράνης του ξενιστή, συμπεριλαμβανομένης της λαμινίνης, των κολλαγόνων τύπου Ι και IV σε κλασικά βακτηριακά MSCRAMM (Louria et al., 1959; Puchelle et al., 2006) Τα επιθηλιακά κύτταρα είναι τα πρώτα ανταποκρινόμενα σε λοιμώξεις στον πνεύμονα, ακολουθούμενα από τα μόνιμα κυψελιδικά μακροφάγα ιστού. Προάγουν την κάθαρση του ιού μέσω φαγοκυττάρωσης, εφεροκυττάρωσης και απελευθέρωσης κυτοκινών και χημειοκινών για την προώθηση των ανοσολογικών αποκρίσεων (Hashimoto et al., 2007; Kumagai et al., 2007; Wang et al., 2012; Hillaire et al., 2013). Οι αναπνευστικοί ιοί όπως ο IAV είναι ικανοί να προκαλέσουν καταστολή και θανάτωση των μόνιμων κυψελιδικών μακροφάγων (Εικόνα 2) (Ghoneim et al., 2013). Αυτά τα κύτταρα συνήθως αντικαθίστανται από τη διαφοροποίηση των στρατολογημένων μονοκυττάρων που προέρχονται από το αίμα σε μακροφάγα διαφορετικών προτύπων πόλωσης. Αυτό με τη σειρά του δημιουργεί καθυστέρηση στην κάθαρση του παθογόνου και ανοίγει ένα παράθυρο για την ευαισθησία του ξενιστή σε δευτερογενείς βακτηριακές λοιμώξεις, που ονομάζονται στην καθομιλουμένη υπερλοιμώξεις (Ghoneim et al., 2013). Επιπλέον, η επαγωγή ιντερφερονών ως απάντηση σε ιογενή λοίμωξη θέτει σε κίνδυνο την ανοσολογική αίσθηση των θετικών κατά Gram βακτηρίων από ουδετερόφιλα και μακροφάγα, τα οποία κανονικά θα καθαρίζουν τα βακτήρια από τους πνεύμονες (Εικόνα 2) (Sun and Metzger, 2008; Tian et al., 2012). Ο ακριβής μηχανισμός που κρύβεται πίσω από αυτό το φαινόμενο δεν είναι ακόμα κατανοητός. Αρκετές μελέτες υποδεικνύουν ότι το ιικό RNA ενεργοποιεί τους υποδοχείς τύπου Toll (TLR) 2 και TLR4 και, κατά συνέπεια, την παραγωγή ιντερφερονών τύπου Ι για την προώθηση μιας κατάστασης κατά του ιού (Shahangian et al., 2009). Η επακόλουθη μόλυνση με θετικά κατά Gram βακτήρια, π.χ. πνευμονιόκοκκους, ενισχύει την έκφραση της ιντερφερόνης τύπου Ι, η οποία με τη σειρά της καταστέλλει την παραγωγή της χημειοκίνης CCL2 και τη στρατολόγηση μακροφάγων (Nakamura Frontiers in Microbiology | www.frontiersin.org ΕΙΚΟΝΑ 2 | Η αλληλεπίδραση μεταξύ IAV, βακτήρια και ο ανθρώπινος ξενιστής. Η επιθηλιακή βλάβη λόγω της ιικής αντιγραφής παρέχει ένα ευεργετικό περιβάλλον για βακτηρίδια (Bact.) συνημμένο. Το IAV είναι ικανό να προκαλέσει καταστολή και θανάτωση των μόνιμων κυψελιδικών μακροφάγων (AM), γεγονός που με τη σειρά του καθυστερεί την κάθαρση του ιού. Η απελευθέρωση ιικού RNA ενεργοποιεί διαφορετικές οδούς ανοσοαπόκρισης με αποτέλεσμα καταιγίδα κυτοκινών. Οι ιντερφερόνες τύπου Ι και ΙΙΙ υπονομεύουν την ανοσολογική αναγνώριση των θετικών κατά Gram βακτηρίων από ουδετερόφιλα και μακροφάγα. Επιπλέον, μπορεί να καταστέλλουν τη λειτουργία των φυσικών φονικών κυττάρων (NK), συμπεριλαμβανομένης της απελευθέρωσης του TNF, που ενεργοποιεί τα κυψελιδικά μακροφάγα. Μετά την αρχική φλεγμονή, η κατάσταση μπορεί να επιδεινωθεί λόγω της κυτταρικής διήθησης των πνευμόνων από ουδετερόφιλα (PMN), που οδηγεί σε αυξημένη αποκοκκίωση και βλάβη ιστού από μόρια τελεστών, συμπεριλαμβανομένης της πρωτεΐνης που δεσμεύει την ηπαρίνη (HBP). et al., 2011). Μια άλλη μελέτη από τους Shahangian et al. (2009) αποκάλυψε ότι η κατάσταση κατά του ιού οδηγεί σε μειωμένη παραγωγή ουδετερόφιλων χημειοελκυστικών CXCL1 και CXCL2, τα οποία με τη σειρά τους προάγουν λιγότερο αποτελεσματικές ανοσολογικές αποκρίσεις λόγω εξασθενημένων λειτουργιών ουδετερόφιλων κατά την πρώιμη φάση της πνευμονιοκοκκικής εισβολής. Άλλες μελέτες διαπίστωσαν ότι οι πνεύμονες που εκτέθηκαν σε IAV είχαν επηρεάσει τις αποκρίσεις των φυσικών κυττάρων φονέων (ΝΚ) στον αεραγωγό σε επακόλουθη μόλυνση από S. aureus (Small et al., 2010). Η μειωμένη παραγωγή TNFα από κύτταρα ΝΚ αναγνωρίστηκε ως ένας κρίσιμος μηχανισμός ανάντη της καταστολής των αντιμικροβιακών δραστηριοτήτων από κυψελιδικά μακροφάγα (Εικόνα 2) (Small et al., 2010). Φαίνεται πιθανό ότι το IAV NA είναι επίσης ικανό να ενεργοποιεί υποδοχείς των κυττάρων-ξενιστών με τρόπο εξαρτώμενο από τον TGF-β, ο οποίος με τη σειρά του προάγει την εισβολή GAS και την επακόλουθη παθολογία των πνευμόνων (Li et al., 2015). Μελέτες in vitro σχετικά με την αλληλεπίδραση μεταξύ IAV-πνευμονιόκοκκου και ανθρώπινων δενδριτικών κυττάρων αποκάλυψαν το TLR3 ως έναν κρίσιμο αισθητήρα ιικού και βακτηριακού RNA που οδηγεί σε ενισχυμένη παραγωγή IL-12p70, η οποία με τη σειρά της μπορεί να προάγει μια κατάσταση κατά του ιού με την ανοδική ρύθμιση των ιντερφερονών (Yamamoto et. al., 2004; Spelmink et al., 2016). Ωστόσο, θα πρέπει να σημειωθεί ότι ανάλογα με το βακτηριακό είδος, η εκδήλωση της νόσου και οι υποκείμενες έμφυτες ανοσολογικές αποκρίσεις μπορεί να ποικίλλουν (Sharma-Chawla et al., 2016). βακτηριακή λοίμωξη εντός ωρών ή λίγων ημερών μετά τη μόλυνση με IAV. Ωστόσο, οι βακτηριακές διηθήσεις των πνευμόνων μπορεί να συμβούν πολύ αργότερα, δηλαδή κατά την έναρξη της επούλωσης του τραύματος μετά τη μερική κάθαρση του IAV, κάτι που έχει αναφερθεί στις περισσότερες μελέτες που πραγματοποιήθηκαν τα τελευταία χρόνια (Snelgrove et al., 2008; Hussell και Cavanagh, 2009). Αυτές οι διεργασίες χαρακτηρίζονται από μια γενική αντιφλεγμονώδη κατάσταση και καταστολή των μηχανισμών που εμπλέκονται στην κάθαρση των παθογόνων λόγω της αυξημένης παραγωγής ιντερλευκίνης-10 (van der Sluijs et al., 2004; Metzger και Sun, 2013). Η αντιφλεγμονώδης κατάσταση καταστέλλει την έκφραση των υποδοχέων αναγνώρισης προτύπων (PRR) σε επαγγελματικά φαγοκύτταρα, οδηγώντας σε εξασθενημένη φαγοκυττάρωση και θανάτωση μικροβίων. Αυτά τα συμβάντα μπορεί να επιτρέψουν την υπερανάπτυξη βακτηρίων στους πνεύμονες και την παθολογία των ιστών (Sun and Metzger, 2008; Goulding et al., 2011). Όπως και άλλες σοβαρές λοιμώδεις ασθένειες που προκαλούνται από μεμονωμένους παράγοντες, η πνευμονία χαρακτηρίζεται από υπερφλεγμονώδεις καταστάσεις των πνευμόνων κατά την έναρξη της λοίμωξης ακολουθούμενη από μια υποφλεγμονώδη κατάσταση με ανοσοπαράλυση (Morton et al., 2014) . Στις συν-λοιμώξεις, μετά την αρχική φλεγμονή ως απόκριση σε ιογενή λοίμωξη, η κατάσταση μπορεί να επιδεινωθεί λόγω βακτηριακής εισβολής και ενισχυμένης κυτταρικής διήθησης των πνευμόνων από ουδετερόφιλα, οδηγώντας σε αυξημένη ιστική βλάβη και καταιγίδα κυτοκινών (Εικόνα 2) (Conenello et al., 2007; McAuley et al., 2007 McAuley et al., , 2010 Porto and Stein, 2016). Επιπλέον, το σύστημα πήξης ενεργοποιείται και συμβάλλει στην παθοφυσιολογική απόκριση στη μόλυνση (van der Poll and Herwald, 2014). Βακτήρια όπως ο πνευμονιόκοκκος, το S. aureus και το GAS μπορούν να ενεργοποιήσουν και να ρυθμίσουν το σύστημα πήξης, οδηγώντας σε εκτεταμένη έκφραση του ιστικού παράγοντα και αυξάνοντας τον κίνδυνο σοβαρής πηκτοπάθειας Shannon et al., 2013; Walters et al., 2016) Τα βακτηριακά παθογόνα εκφράζουν επίσης μια ποικιλία κυτταρολυτικών τοξινών που μπορούν να συμβάλουν στη φλεγμονή και στην παθολογία των ιστών. Η πνευμονολυσίνη, μια τοξίνη που σχηματίζει πόρους του πνευμονιόκοκκου με χαμηλή συγγένεια με τα επιθηλιακά κύτταρα του πνεύμονα, μπορεί να βλάψει τα ουδετερόφιλα χρησιμοποιώντας τον υποδοχέα P2X7 (Domon et al., 2016). Οι σταφυλοκοκκικές κυτταροτοξίνες (α-τοξίνη και λευκοσιδίνες, συμπεριλαμβανομένης της λευκοσιδίνης Panton-Valentine, PVL) σχετίζονται με σοβαρή παθολογία των ιστών, ισχυρή ανοδική ρύθμιση των χημειοκινών και αυξημένη εισροή ουδετερόφιλων στους πνεύμονες (Mairpady Shambat et al., 2015). Οι τοξίνες GAS, συμπεριλαμβανομένων των SLO και SpeB, είναι ικανές να προκαλέσουν άμεσα βλάβη στους ιστούς και να προάγουν προφλεγμονώδεις καταστάσεις μέσω της λύσης των ουδετερόφιλων (Snall et al., 2016; Uhlmann et al., 2016). Οι κυτταρολυτικές επιδράσεις που προκαλούνται από βακτηριακές τοξίνες μπορεί να συνεργαστούν με το αποτέλεσμα της κυτταροτοξικής βοηθητικής πρωτεΐνης IAV, PB1-F2, που προκαλείται από παθολογία ιστού που οδηγεί σε ενισχυμένη παραγωγή κυτοκίνης (Ramos and Fernandez-Sesma, 2012). Συνολικά, πιθανότατα οι συνεργιστικές επιδράσεις των οδών που εμπλέκονται στη βακτηριακή και ιική φλεγμονή οδηγούν σε ενισχυμένη ανοσολογική ενεργοποίηση και υψηλότερη νοσηρότητα και θνησιμότητα (Joyce et al., 2009; Koppe et al., 2012; Ramos και Fernandez-Sesma, 2012; Bucasas et al., 2013; Kuri et al., 2013). Το σχήμα 2 συνοψίζει την αλληλεπίδραση μεταξύ ιού, βακτηρίων και ξενιστή. Τα πειραματικά ζωικά μοντέλα είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για τη μελέτη in vivo επιδράσεων διαφορετικών μολυσματικών παραγόντων και αντιπροσωπεύουν περίπου το 3% του συνόλου της έρευνας για την πνευμονία που δημοσιεύεται σε περιοδικά αξιολόγησης (Hraiech et al., 2015 ) . Ωστόσο, η συνεχής αύξηση των μελετών σε ζώα τις τελευταίες δεκαετίες έρχεται σε αντίθεση με την αναπαραγωγιμότητά τους στον άνθρωπο (Hackam and Redelmeier, 2006). Ο Hackam και οι συνεργάτες του εντόπισαν 2.000 άρθρα που δημοσιεύθηκαν μεταξύ 1980 και 2006 σε επτά κορυφαία επιστημονικά περιοδικά που δημοσιεύουν τακτικά μελέτες σε ζώα (Hackam and Redelmeier, 2006). Εβδομήντα έξι από τις 2.000 αναφέρθηκαν ιδιαίτερα με μέσο αριθμό αναφορών 889. Από αυτές τις 76 μελέτες, οι 28 επαναλήφθηκαν σε τυχαιοποιημένες δοκιμές σε ανθρώπους, οι 14 αντικρούστηκαν και οι 34 παρέμειναν μη δοκιμασμένες (Hackam and Redelmeier, 2006). Μόνο το 1,4% των μελετών σε ζώα που δημοσιεύθηκαν σε περιοδικά υψηλής απήχησης μεταφράστηκαν σε τυχαιοποιημένες δοκιμές σε ανθρώπους (Hackam and Redelmeier, 2006), ενώ περίπου το 44% ποσοστό αναπαραγωγής αναφέρθηκε για μελέτες σε ανθρώπους με υψηλή αναφορά (Ιωαννίδης, 2005). Σε μοντέλα πνευμονίας, τα θηλαστικά χρησιμοποιούνται κυρίως λόγω της ανατομικής και φυσιολογικής τους εγγύτητας με τον άνθρωπο (Hraiech et al., 2015). Για την παρακολούθηση εκτεταμένων φυσιολογικών μελετών, μεγαλύτερα είδη θηλαστικών, συμπεριλαμβανομένων των κουναβιών, των σκύλων, των κουνελιών, των χοίρων και των μπαμπουίνων είναι τα μοντέλα επιλογής (Mizgerd and Skerrett, 2008). Ωστόσο, τα τρωκτικά και ιδιαίτερα τα ποντίκια χρησιμοποιούνται πιο συχνά ως οργανισμοί πρότυπο πνευμονίας. Ο γρήγορος αναπαραγωγικός ρυθμός, το μικρό μέγεθος, ο λιγότερο περίπλοκος χειρισμός, η ικανότητα αναπαραγωγής και σύγκρισης αποτελεσμάτων με ήδη δημοσιευμένες βακτηριακές και ιογενείς μονο-λοιμώξεις, λεπτομερής γνώση της γενετικής και των ανοσολογικών αποκρίσεων και μια πληθώρα διαθέσιμων αντιδραστηρίων για τη μελέτη λοιμώξεων σε ποντίκια είναι οι λόγοι τη χρήση αυτών των ζώων. Για την αποφυγή διαφοροποιήσεων στις αποκρίσεις λόγω γενετικής ποικιλομορφίας, τα στελέχη ποντικών είναι χρήσιμα εργαλεία για μελέτες που στοχεύουν στην αποσαφήνιση των μοριακών μηχανισμών των ασθενειών. Επιπλέον, η γενετική μηχανική επέτρεψε τη δημιουργία μιας μεγάλης ποικιλίας παραλλαγών ποντικών με γονίδια κέρδους-λειτουργίας, απώλειας λειτουργίας ή αναφοράς (Mizgerd and Skerrett, 2008). Οι λοιμώξεις παρείχαν χρήσιμες πληροφορίες για τη σοβαρή πνευμονία, συμπεριλαμβανομένου (i) του γεγονότος ότι η ιογενής λοίμωξη ενεργοποιεί τον ξενιστή για βακτηριακή ευαισθησία που οδηγεί σε σοβαρή δευτερογενή μόλυνση (Hashimoto et al., 2007; Shahangian et al., 2009; Chaussee et al., 2011; Nakamura et al., 2011), (ii) συνέργεια παθογόνου (Tsai et al., 1998; McCullers and Rehg, 2002; Garcia-Suarez Mdel et al., 2007; Gurel et al., 2013; Mairpady Shambat et al., 2015; Zahlten et al., 2015), (iii) ενισχυμένη φλεγμονώδη απόκριση κατά την έναρξη της μόλυνσης (Korteweg and Gu, 2008; Durbin et al., 2013; Pothlichet et al., 2013; Iwasaki και Pillai, 2014) που οδηγεί σε αυξημένη φατνιακή βλάβη ακολουθούμενη από παράλυση του ανοσοποιητικού με ελαττωματική κάθαρση μικροοργανισμών (Shinya et al., 2006; van Riel et al., 2007 van Riel et al., 2010, και (iv) διαθεσιμότητα υποδοχέα ξενιστή για παρατεταμένη βακτηριακή μόλυνση (Louria et al., 1959; Plotkowski et al., 1993; Cundell and Tuomanen, 1994; Puchelle et al., 2006; Korteweg και Gu, 2008). Ωστόσο, τα μοντέλα ποντικιών για βακτηριακές και/ή ιογενείς λοιμώξεις έχουν αρκετούς περιορισμούς. Τα περισσότερα από τα υπό μελέτη βακτηριακά και ιικά είδη είναι ανθρώπινα παθογόνα. Τα τελευταία χρόνια αποδείχθηκε επίσης ότι οι γενετικές παραλλαγές του ξενιστή και οι διαφορές φύλου έχουν αντίκτυπο στην προδιάθεση, τη σοβαρότητα και την έκβαση της μόλυνσης (Chella Krishnan et al., 2015 Ενώ τα ποντίκια C57BL/6 και BALB/c χαρακτηρίζονται από υψηλότερη αντίσταση, Τα στελέχη DBA/2 είναι πιο ευαίσθητα και επιτρεπτά σε βακτηριακά και ιικά στελέχη (Alymova et al., 2011; Chella Krishnan et al., 2015. Επιπλέον, η μετάδοση του IAV και των βακτηρίων είναι αναποτελεσματική σε ενήλικα ποντίκια, απαιτώντας έτσι εναλλακτικά ζωικά μοντέλα, συμπεριλαμβανομένων νεογνών ποντικών ή κουναβιών (Diavatopoulos et al., 2010; McCullers et al., 2010). Ο IAV αποδείχθηκε ότι είναι απαραίτητος για τη μετάδοση του πνευμονιόκοκκου από αποικισμένα ποντίκια στα αφελή συγγενή τους και η μετάδοση συνέβη μόνο όταν όλα τα ποντίκια είχαν μολυνθεί με IAV (Diavatopoulos et al., 2010). et al., 2010). Τα κουνάβια είναι φυσικά ευαίσθητα στον IAV που απομονώνονται από διαφορετικά είδη, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων, των πτηνών και των χοίρων (Thangavel and Bouvier, 2014). Η μόλυνση των κουναβιών με ανθρώπινα εποχιακά απομονωμένα στελέχη IAV οδηγεί σε λοίμωξη της ανώτερης αναπνευστικής οδού παρόμοια με τη μόλυνση από ανθρώπινη γρίπη (Tripp and Tompkins, 2009). Σε αντίθεση με τα ποντίκια, για τη μόλυνση μπορεί να χρησιμοποιηθεί μη προσαρμοσμένο ανθρώπινο IAV. Δυστυχώς, υπάρχουν λίγες μόνο αναφορές σχετικά με βακτηριακές και IAV συν-λοιμώξεις σε αυτόν τον οργανισμό-μοντέλο. Μια αναφορά από τους Sanford και Ramsay έδειξε ενισχυμένο σταφυλοκοκκικό αποικισμό της ανώτερης αναπνευστικής οδού σε ζώα μολυσμένα με IAV σε σύγκριση με μη μολυσμένα, ενώ δεν παρατηρήθηκε διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων στη λοίμωξη από στρεπτοκοκκική ομάδα Β (Sanford and Ramsay, 1987). Αντίθετα, οι Smith και Mc Cullers ανέφεραν έλλειψη εγκαθίδρυσης σταφυλοκοκκικής λοίμωξης ακόμη και όταν τα κουνάβια είχαν προμολυνθεί με IAV (Smith and McCullers, 2014). Τα μεγαλύτερα πλεονεκτήματα της χρήσης κουνάβων ως μοντέλου περιλαμβάνουν (i) την ευαισθησία τους σε μη προσαρμοσμένα ανθρώπινα παθογόνα, (ii) την αποτελεσματικότητα στη μετάδοση IAV και βακτηρίων από το ένα άτομο στο άλλο και (iii) την παρουσίαση των κλινικών σημείων εκδήλωσης της νόσου παρόμοια με τον άνθρωπο. λοίμωξη από γρίπη. Δυστυχώς, η περιορισμένη διαθεσιμότητά τους, η σύνθετη εκτροφή και η περιορισμένη πρόσβαση σε αντιδραστήρια ειδικά για κουνάβια καθιστούν δύσκολη την εκτέλεση αυτής της έρευνας (Bouvier and Lowen, 2010). Τα τελευταία χρόνια, το ινδικό χοιρίδιο (Cavia porcellus) χρησιμοποιήθηκε επίσης στην έρευνα για την πνευμονία. Η φυσιολογία και η ανατομία του πνεύμονα του ινδικού χοιριδίου μοιάζει σε κάποιο βαθμό με τον ανθρώπινο πνεύμονα και αυτός ο πρότυπος οργανισμός χρησιμοποιείται συχνά σε μη λοιμώδεις πνευμονικές παθήσεις, συμπεριλαμβανομένου του άσθματος και της χρόνιας αποφρακτικής πνευμονοπάθειας (Canning and Chou, 2008). Επιπλέον, η εμπορική του διαθεσιμότητα, η ευκολία εκτροφής, η ικανότητα εργασίας με μη προσαρμοσμένα παθογόνα και η αποτελεσματικότητα της μετάδοσης είναι λόγοι για τη χρήση αυτού του μοντέλου in vivo (Bouvier and Lowen, 2010). Τα ινδικά χοιρίδια είναι ευαίσθητα στους ιούς της γρίπης του ανθρώπου, των πτηνών και των χοίρων. Αν και η αναπαραγωγή του ιού μπορεί εύκολα να ανιχνευθεί κατά τον ενδορρινικό ενοφθαλμισμό στην ανώτερη αναπνευστική οδό και στους πνεύμονες, τα ινδικά χοιρίδια εμφανίζουν μόνο μικρά κλινικά συμπτώματα (Lowen et al., 2006; Gabbard et al., 2014). Ωστόσο, η πνευμονική παθολογία των ανθρώπινων ινδικών χοιριδίων που έχουν μολυνθεί με IAV συσχετίζεται με την κλινική σοβαρότητα της ανθρώπινης μόλυνσης (Gabbard et al., 2014). Η μετάδοση πνευμονόκοκκου σε ινδικά χοιρίδια προωθείται με συν-μόλυνση με τον ιό Sendai (Saito et al., 1988). Τα ινδικά χοιρίδια που μολύνθηκαν μόνο με πνευμονόκοκκο και ζευγαρώθηκαν σε κλουβιά με ζώα επαφής που δεν είχαν λάβει θεραπεία μετέδωσαν τα βακτήρια μόνο στο 7% των περιπτώσεων, ενώ τα μολυσμένα με τον ιό Sendai ινδικά χοιρίδια που στεγάστηκαν μαζί απέκτησαν πνευμονιοκοκκική λοίμωξη στο 83% των επαφών (Saito et al. , 1988). Μια άλλη μελέτη αξιολόγησε την αποτελεσματικότητα των αντιβιοτικών σε διεισδυτική πνευμονική λοίμωξη που προκαλείται από ανθεκτικό στην πενικιλλίνη πνευμονιόκοκκο (Ponte et al., 1996). Η ενδοτραχειακή ενστάλαξη 3 χ 109 CFU S. pneumoniae προκάλεσε θανατηφόρα πνευμονία και βακτηριαιμία στο 85% των ζώων που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία εντός 46 ωρών (Ponte et al., 1996). Όπως και με τα κουνάβια, υπάρχει έλλειψη δεδομένων που περιγράφουν τις ανοσολογικές αποκρίσεις σε πνευμονικούς λοιμογόνους παράγοντες. Αυτό οφείλεται εν μέρει στην έλλειψη αντιδραστηρίων για συγκεκριμένα είδη, κάτι που αποτελεί μειονέκτημα στη χρήση αυτού του μοντέλου οργανισμού. Πρόσφατα, ο αρουραίος βαμβακιού (Sigmodon hispidus) αναφέρθηκε ότι είναι ευαίσθητος στον IAV. Ρινική και πνευμονική λοίμωξη σε ενήλικους αρουραίους από βαμβάκι δεν χρειάστηκε προσαρμογή του ιού (Ottolini et al., 2005). Η μόλυνση οδήγησε σε αυξημένους ρυθμούς αναπνοής συνοδευόμενους από απώλεια βάρους και μειωμένη θερμοκρασία σώματος. Ο αναδιπλασιασμός του IAV ήταν πιο εκτεταμένος στους ρινικούς ιστούς από τον πνεύμονα και παρέμεινε για έξι διαδοχικές ημέρες. Η παθολογία των ιστών περιελάμβανε βλάβη του βρογχιολικού επιθηλίου και τα ζώα ανέπτυξαν πνευμονία που παρέμεινε για σχεδόν 3 εβδομάδες (Ottolini et al., 2005). Σε βακτηριολογικές μελέτες οι αρουραίοι χρησιμοποιούνται συχνότερα. Υπάρχουν πολλά μοντέλα αρουραίων που διερευνούν την επίδραση του διαβήτη (Oliveira et al., 2016), των μεταβολικών συνδρόμων (Feng et al., 2015), της κίρρωσης, της φαρμακοκινητικής και της δυναμικής (Antonopoulou et al., 2015; Hoover et al., 2015), η δηλητηρίαση (Davis et al., 1991), η ανοσοποίηση (Iinuma and Okinaga, 1989) και γενικοί παράγοντες βακτηριακής λοιμογόνου δράσης (Shanley et al., 1996) στην ανάπτυξη πνευμονιοκοκκικών, στρεπτόκοκκων και πνευμονιοκοκκικών, και παθολογία των πνευμόνων. Δυστυχώς, υπάρχουν λίγες μόνο μελέτες για βακτηριακές και ιογενείς συν-λοιμώξεις σε αρουραίους. Το πρώτο εκτελέστηκε από τους Harford et al., 1946 (Harford et al., 1946 . Οι συγγραφείς κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η δευτερογενής βακτηριακή πνευμονία δεν μετατρέπει την υποθανατηφόρα ιογενή λοίμωξη σε θανατηφόρο αποτέλεσμα (Harford et al., 1946). Μια άλλη μελέτη για τον ανθρώπινο αναπνευστικό συγκυτιακό ιό και το S. pneumoniae αποκάλυψε ότι οι αρουραίοι αποικίζονταν εύκολα με πνευμονιόκοκκους, αλλά η αναπαραγωγή του ιού μετά από επακόλουθη μόλυνση ήταν εξαρτώμενη από το στέλεχος. Επιπλέον, ούτε ο πνευμονιόκοκκος ούτε ο ιός εξαπλώθηκαν από την ανώτερη στην κατώτερη αναπνευστική οδό και κανένα παθογόνο δεν μεταδόθηκε σε αφελείς συντρόφους του κλουβιού. Αν και οι αρουραίοι μοιράζονται πολλά ανοσολογικά χαρακτηριστικά με τον άνθρωπο, συμπεριλαμβανομένης της παραγωγής μονοξειδίου του αζώτου από μακροφάγα (Carsillo et al., 2009), τα μεγαλύτερα μειονεκτήματα είναι η χαμηλή διαθεσιμότητα των ζώων, η επιθετικότητα του είδους και η έλλειψη ειδικών αντιδραστηρίων. Κουνέλια (Oryctolagus cuniculus ) είναι ευρέως γνωστά για τη χρήση τους στη μελέτη καρδιαγγειακών παθήσεων, στην παραγωγή αντισωμάτων και στην έρευνα των ματιών. Τα κουνέλια χρησιμοποιήθηκαν επίσης για τη μελέτη της πνευμονίας, αν και μόνο λίγα μοντέλα είναι διαθέσιμα. Οι τυπικές παράμετροι ανάγνωσης περιλαμβάνουν την επιβίωση, τη διήθηση λευκοκυττάρων στους πνεύμονες, την παθολογία των πνευμόνων και την εκτίμηση της συγκέντρωσης του φαρμάκου στον ορό. Μία από τις πρώτες μελέτες για την πνευμονιοκοκκική πνευμονία σε κουνέλια πραγματοποιήθηκε στο Kline and Winternitz (1913). Αυτή η μελέτη αποκάλυψε ότι τα κουνέλια διαθέτουν ενεργή ανοσία εάν έχουν αναρρώσει από μια επίθεση πειραματικής πνευμονίας και μπορεί στη συνέχεια να αντισταθούν σε επαναλαμβανόμενες ενδοτραχειακές δόσεις πνευμονιόκοκκων (Kline and Winternitz, 1913). Το 1926 μια λοίμωξη με εισπνοή πνευμονιόκοκκου Τύπου Ι διαπιστώθηκε σε κουνέλια (Stillman and Branch, 1926). Τα βακτήρια διείσδυσαν εύκολα στην κατώτερη αναπνευστική οδό και οι πνευμονιόκοκκοι που έφταναν στους πνεύμονες συνήθως εξαφανίζονταν μέσα σε λίγες ώρες και εμφανίστηκε θανατηφόρα σηψαιμία σε μερικά από τα ζώα (Stillman and Branch, 1926). Τα πιο πρόσφατα μοντέλα πνευμονιοκοκκικής και σταφυλοκοκκικής πνευμονίας κουνελιών βασίζονται σε ενδοβρογχικές ή ενδοπνευμονικές λοιμώξεις που τα καθιστούν χρήσιμα για την παθογένεση (Diep et al., 2010 (Diep et al., 2017, καθώς και μελέτες αποτελεσματικότητας και αποτελεσματικότητας φαρμάκων (Cabellos et al., 1992; Croisier-Bertin et al., 2011). Ωστόσο, αυτή η οδός μόλυνσης απαιτεί χειρουργική επέμβαση και τα ειδικά για το είδος αντιδραστήρια είναι σπάνια. Στην έρευνα για την IAV, τα κουνέλια χρησιμοποιούνται συχνά για παραγωγή αντισωμάτων και για μελέτες σχετικά με την κινητική των αντισωμάτων μετά από εφάπαξ ή πολλαπλές χορηγήσεις IAV (Loza-Tulimowska et al., 1977). Επίσης, τα κουνέλια χρησιμοποιούνται για έρευνες ασφάλειας των εμβολίων (π.χ. CoVaccine HT ή Aflunov) (Heldens et al., 2010; Gasparini et al., 2012). Τα τελευταία χρόνια η απόρριψη του IAV πτηνών από βαμβακοουρές (Sylvilagus spp.) διερευνήθηκε αποκαλύπτοντας ότι οι ρινικά και στοματικά ενοφθαλμισμένες βαμβακερές ουρές αποβάλλουν σχετικά μεγάλες ποσότητες ιικού RNA (Root et al., 2014). Σημειωτέον, οι χαμηλοί ιικοί τίτλοι βρέθηκαν να είναι επαρκείς για την έναρξη της αναπαραγωγής του ιού στις βαμβακερές ουρές (Root et al., 2017). Ωστόσο, παρά την ευαισθησία τους στη μόλυνση με IAV, τα κουνέλια χρησιμοποιούνται μόνο σπάνια ως μοντέλο για την παθογένεση του IAV, καθώς δεν προσφέρουν καμία βελτίωση σε σχέση με άλλα καθιερωμένα μοντέλα μόλυνσης. Οι μακάκοι αντιπροσωπεύουν το κύριο μη ανθρώπινο πρωτεύον για τη μελέτη μολυσματικών ασθενειών. Είναι παμφάγοι και προσαρμόσιμοι. Τα είδη που χρησιμοποιούνται πιο συχνά είναι οι μακάκοι rhesus (Macaca mulatta) και οι cynomolgus macaques (Macaca fasciluraris). Αν και αποδείχθηκε νωρίς ότι οι μακάκοι ήταν ευαίσθητοι στο IAV (Saslaw et al., 1946), τα ζωικά μοντέλα επιλογής παρέμειναν τα κουνάβια και τα ποντίκια. Πρόσφατα, οι μακάκοι έχουν χρησιμοποιηθεί για τη σύγκριση της παθογένεσης της πανδημίας IAV του 1918 και του παθογόνου στελέχους της γρίπης των πτηνών (H5N1) με ένα συμβατικό στέλεχος H1N1 (Rimmelzwaan et al., 2001). Οι μακάκοι Cynomolgus που μολύνθηκαν με εξαιρετικά παθογόνο H5N1 ανέπτυξαν σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας, πυρετό και νεκρωτική πνευμονία (Rimmelzwaan et al., 2001). Το στέλεχος IAV του 1918 προκάλεσε δυσρύθμιση της αντιϊκής απόκρισης οδηγώντας σε ανεπαρκή προστασία του ξενιστή, η οποία με τη σειρά της είχε ως αποτέλεσμα οξεία αναπνευστική δυσχέρεια και θανατηφόρο αποτέλεσμα (Kobasa et al., 2007). Η πανδημία H1N1 στις ΗΠΑ του 2009 προκάλεσε σοβαρές παθολογικές βλάβες στους πνεύμονες των μακάκων (Itoh et al., 2009). Οι τρεις μελέτες που αναφέρονται παραπάνω χρησιμοποίησαν συνδυασμένη ενδοτραχειακή παροχή υψηλών δόσεων ιού. Μια πρόσφατη μελέτη των Marriott et al. ανέλυσε το αποτέλεσμα των οδών πρόκλησης, συμπεριλαμβανομένου του εισπνεόμενου αερολύματος και της ενδορινικής ενστάλαξης με χαμηλές έως μέτριες δόσεις H1N1 σε μακάκους cynomolgus (Marriott et al., 2016). Ο πολλαπλασιασμός του ιού ανιχνεύθηκε σε όλες τις ομάδες πρόκλησης, αν και η ασθένεια παρέμεινε υποκλινική. Σε βακτηριολογικές μελέτες χρησιμοποιούνται σπάνια πρωτεύοντα πλην του ανθρώπου. Για τη λοίμωξη από στρεπτοκοκκική ομάδα Α πραγματοποιήθηκαν διαμήκεις αναλύσεις μεταγραφοτομής σε πειραματική φαρυγγίτιδα (Virtaneva et al., 2005) και λοίμωξη του κατώτερου αναπνευστικού συστήματος σε cynomolgus macaques (Olsen et al., 2010a). Η νόσος της κατώτερης αναπνευστικής οδού που παρατηρήθηκε στους μακάκους μετά από μόλυνση με GAS μιμήθηκε τα κλινικά και παθολογικά χαρακτηριστικά της σοβαρής βρογχοπνευμονίας στους ανθρώπους (Olsen et al., 2010a). Μια άλλη μελέτη από τον Olsen και τους συνεργάτες του ανέλυσε τη συμβολή του PVL ενός εξαιρετικά λοιμογόνου στελέχους USA300 S. aureus σε λοίμωξη του αναπνευστικού (Olsen et al., 2010b). Αν και η νόσος της κατώτερης αναπνευστικής οδού που παρατηρήθηκε σε πιθήκους μιμήθηκε τα κλινικά και παθολογικά χαρακτηριστικά της πρώιμης ήπιας έως μέτριας πνευμονίας στον άνθρωπο, δεν μπόρεσε να ανιχνευθεί καμία εμπλοκή της PVL στην παθολογία των πνευμόνων ή την εισροή ανοσοκυττάρων στους πνεύμονες (Olsen et al., 2010b). Η ίδια ερευνητική ομάδα έχει αναπτύξει ένα μη θανατηφόρο IAV (H3N2)-S. Μοντέλο συν-λοίμωξης aureus σε cynomolgus macaques (Kobayashi et al., 2013). Η εξέλιξη της πνευμονίας παρακολουθήθηκε με αξιολόγηση κλινικών παραμέτρων, χημεία αίματος, ρινικά επιχρίσματα και παθολογία των πνευμόνων. Η εποχιακή λοίμωξη από IAV σε υγιείς μακάκους cynomolgus προκάλεσε ήπια πνευμονία, αλλά δεν προδιέθετε τα ζώα σε επακόλουθη σοβαρή μόλυνση με τον κλώνο USA300 (Kobayashi et al., 2013). από 13-δύναμο συζευγμένο πνευμονιόκοκκο εμβόλιο και 23-δύναμο πνευμονιόκοκκο πολυσακχαριδικό εμβόλιο σε ειδικά για αντιγόνο ρεπερτόρια Β-κυττάρων μνήμης (Jia et al., 2017), μόνο δύο μελέτες σχετικά με την πνευμονιοκοκκική μεταφορά και την πνευμονία διεξήχθησαν την τελευταία δεκαετία. Το 2013, ο Philipp και οι συνεργάτες του ανέλυσαν τον ρυθμό μεταφοράς του πνευμονιόκοκκου σε 158 ζώα αποικίας. Κανένας από τους ερωτηθέντες μακάκους rhesus δεν έφερε S. pneumoniae στο ρινοφάρυγγα (Philipp et al., 2012). Οι συγγραφείς κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι ο μακάκος ρέζους δεν είναι πιθανότατα φυσικός ξενιστής πνευμονιόκοκκου. Όμως, όταν τα βρέφη αποικίστηκαν με στέλεχος 19F μέσω ρινοφαρυγγικής ενστάλαξης, ο αποικισμός προκλήθηκε σε οκτώ από τα οκτώ βρέφη, διήρκεσε για 2 εβδομάδες σε όλα τα ζώα και για 7 εβδομάδες σε περισσότερο από το 60% (Philipp et al., 2012). Η ίδια ομάδα δοκίμασε την αποτοξινωμένη πνευμονολυσίνη (dPly) και την τριαδική πρωτεΐνη D πνευμονιοκοκκικής ιστιδίνης (PhtD) ως πιθανά υποψήφια εμβόλια για την πρόληψη της πνευμονίας (Denoel et al., 2011). Μετά την ανοσοποίηση οι μακάκοι ρέζους προκλήθηκαν με ένα πνευμονιοκοκκικό στέλεχος 19F. Το ανοσοενισχυμένο εμβόλιο PhtD-dPly με AS02 προστάτευσε τα ζώα από πνευμονία που προκαλείται από S. pneumoniae, η οποία συνδέθηκε με την ικανότητα (i) να μειώνει σημαντικά το βακτηριακό φορτίο μέσα στην πρώτη εβδομάδα μετά την πρόκληση και (ii) τα επίπεδα PhtD-και Ply -ειδικά αντισώματα (Denoel et al., 2011). Αν και υπάρχουν λίγες μόνο μελέτες για μακάκους για την πνευμονία, λόγω της στενής γειτνίασης με τους ανθρώπους από άποψη φυσιολογίας και ανοσίας, αυτά τα ζώα μπορούν να αποτελέσουν ένα καλό μοντέλο στο πλαίσιο μεταφραστικών μελετών που αξιολογούν τη θεραπευτική και την προφύλαξη. Παρά την ευρεία χρήση διαφορετικών ζωικών μοντέλων , το βέλτιστο μοντέλο in vivo για την ανθρώπινη πνευμονία μένει να προσδιοριστεί. Τα μικρά θηλαστικά συμπεριλαμβανομένων των τρωκτικών είναι πολύ γνωστά από βιολογική, γενετική και ανοσολογική άποψη και είναι εύκολο να διατηρηθούν. Η επιλογή αυτών των συγκεκριμένων ζώων για μελέτες μολυσματικών ασθενειών είναι συχνά αποτέλεσμα συμβιβασμού μεταξύ τεχνικών και οικονομικών επιλογών. Ωστόσο, απέχουν επίσης πολύ από την ανατομία, τη φυσιολογία, την ανοσολογία και την ευαισθησία του ανθρώπου σε αποκλειστικά ανθρώπινα παθογόνα. Το μοντέλο πειραματόζωων θα πρέπει να επιλέγεται με βάση αποκρίσεις συγκρίσιμες με τους ανθρώπους. Τα πρωτεύοντα συνήθως δεσμεύονται νομικά για συγκεκριμένα θέματα. Σε αυτή την περίπτωση, οι χοίροι θα μπορούσαν να είναι ένα κατάλληλο μοντέλο συστήματος για τη μελέτη μολυσματικών ασθενειών συμπεριλαμβανομένης της πνευμονίας (Εικόνα 1) . Η σύνθεση και το μέγεθος του γονιδιώματος του χοίρου είναι συγκρίσιμα με αυτά των ανθρώπων (Hart et al., 2007). Επιπλέον, τα όργανα του ανθρώπου και του χοίρου έχουν πολλά κοινά χαρακτηριστικά και λειτουργίες (Swindle et al., 2012). Η ανώτερη αναπνευστική οδός των ανθρώπων και των χοίρων, συμπεριλαμβανομένου του λεμφικού ιστού στο ρινοφάρυγγα, είναι ανατομικά παρόμοια. Επιπλέον, όπως και οι άνθρωποι, οι χοίροι έχουν αμυγδαλές, οι οποίες απουσιάζουν στα ποντίκια (Horter et al., 2003). Ένα σημαντικό πλεονέκτημα της μελέτης μολυσματικών ασθενειών χρησιμοποιώντας τους χοίρους ως οργανισμό ξενιστή είναι ότι οι χοίροι έχουν ένα πλήρες σύνολο έμφυτων και προσαρμοστικών ανοσολογικών τελεστών. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της αλληλουχίας ολόκληρου του γονιδιώματος, το ανοσοποιητικό σύστημα των χοίρων μοιάζει με πάνω από το 80% του ανθρώπινου ανοσοποιητικού συστήματος, ενώ τα ποντίκια μοιράζονται λιγότερο από 10% με τους ανθρώπους (Dawson et al., 2016). Τα περισσότερα από τα διαμερίσματα ανοσοκυττάρων που εντοπίστηκαν στον άνθρωπο είναι επίσης παρόντα στους χοίρους (Piriou-Guzylack and Salmon, 2008; Fairbairn et al., 2011). Σε αντίθεση με τα ποντίκια και παρόμοια με τους ανθρώπους, οι χοίροι έχουν το 50-70% των κυκλοφορούντων πολυμορφικών πυρηνικών κυττάρων (Fairbairn et al., 2011). Επιπλέον, όλες οι λειτουργικές κυτοκίνες ή ορθόλογοι που εμπλέκονται στο παράδειγμα Th1, Th2, Th17 και Treg και τα αντίστοιχα κύτταρα του ανοσοποιητικού έχουν περιγραφεί σε χοίρους (Murtaugh et al., 2009; Kaser et al., 2011; Kiros et al., 2011) . Ειδικά το πολύ σημαντικό ανθρώπινο προφλεγμονώδες χημειοελκτικό, CXCL8, υπάρχει ως ορθολόγος στους χοίρους, ενώ δεν υπάρχει ομόλογο σε ποντίκια (Fairbairn et al., 2011). Σε αντίθεση με τα ανθρώπινα μονοκύτταρα, τα οποία μπορούν να χωριστούν σε τρεις υποκατηγορίες (κλασικά CD14 + CD16 − , μη κλασικά CD14 + CD16 + και ενδιάμεσα CD14 ++ CD16 + ), τα μονοκύτταρα χοίρου αποτελούνται από τέσσερις υποκατηγορίες (Chamorro et al., 2005; Fairbairn et al., 2013). Όπως τα ανθρώπινα μονοκύτταρα, εκφράζουν μόρια προσκόλλησης, όπως τα VLA-4 και LFA-1 και συνδιεγερτικά μόρια, συμπεριλαμβανομένων των CD80 και CD86 (Chamorro et al., 2005). Παραδείγματα λοιμώξεων από S. aureus με αυτόν τον πρότυπο οργανισμό είναι οι λοιμώξεις τραυμάτων Svedman et al., 1989), η οστεομυελίτιδα (Jensen et al., 2010) και η σήψη (Nielsen et al., 2009). Ο ενδοφλέβιος εμβολιασμός των χοιριδίων με πνευμονιόκοκκο οδήγησε σε βακτηριαιμία κατά τη διάρκεια μιας περιόδου 5 ημερών και συσχετίστηκε με πυρετό και σηπτική αρθρίτιδα. Ο ενδορινικός εμβολιασμός των χοιριδίων οδήγησε σε αποικισμό για τουλάχιστον έξι συνεχόμενες ημέρες χωρίς να προκαλέσει κλινικά συμπτώματα (De Greeff et al., 2016). Επιπλέον, έρευνα για αναπνευστικές λοιμώξεις χοίρων από ανθρώπινα παθογόνα συμπεριλαμβανομένου του S. aureus (Luna et al., 2009), Mycobacterium tuberculosis (Gil et al., 2010) , Bordetella pertussis (Elahi et al., 2007), Pseudominosas (ae Luna et al., 2009) και IAV (Khatri et al., 2010) , πραγματοποιήθηκαν τα τελευταία χρόνια. Το γεγονός ότι οι χοίροι και οι άνθρωποι μολύνονται με πανομοιότυπους υποτύπους IAV (H1N1, H3N2) και παρουσιάζουν παρόμοια κλινική εικόνα και παθογένεση, καθιστά τους χοίρους ιδανικό πρότυπο οργανισμό για μελέτες σχετικά με αναπνευστικές συν-λοιμώξεις (Van Reeth et al., 1998). Ειδικά οι λοιμώξεις από IAV είναι ήδη καλά εδραιωμένες στους χοίρους (Van Reeth et al., 1998, 2002a Jung et al., 2007; Khatri et al., 2010; Barbe et al., 2011) .Εκτός από τον περιορισμένο αριθμό δημοσιεύσεων για τους χοίρους και τα ανθρώπινα παθογόνα, πολλά μπορούν να μεταφραστούν και να μαθευτούν από μελέτες για το ζωονοσογόνο παθογόνο των χοίρων Streptococcus suis. Το S. suis κατοικεί συνήθως στις βλεννογόνες επιφάνειες των αμυγδαλών, των νυχιών, των γεννητικών οργάνων και του πεπτικού συστήματος των χοιριδίων. Μόλις διαταραχθεί η μικροβιακή ισορροπία, τα βακτήρια μπορούν να προκαλέσουν μηνιγγίτιδα, σηψαιμία, αρθρίτιδα και πνευμονία στους χοίρους (Staats et al., 1997). Ορισμένα στελέχη S. suis θεωρούνται υπερ-μολυσματικά και άλλα υπο-ή μη λοιμώδη. Γενικά, ο ορότυπος 2 απομονώνεται συχνότερα από άρρωστους χοίρους (Staats et al., 1997). Το S. suis μπορεί επίσης να προκαλέσει σοβαρές ασθένειες στους ανθρώπους, όπως σηψαιμία, μηνιγγίτιδα, αρθρίτιδα και σύνδρομο στρεπτοκοκκικού τοξικού σοκ (Tang et al., 2006; Yu et al., 2006; Gottschalk et al., 2007). Αν και πολλές in vivo μελέτες για το S. suis έχουν πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας ποντίκια ως πρότυπο οργανισμό (Seitz et al., 2012; Auger et al., 2016), αρκετές άλλες μελέτες έχουν δείξει το πλεονέκτημα της χρήσης χοίρων ως φυσικού ξενιστή για το S. suis (Bi et al., 2014; Ferrando et al., 2015). Μια πρόσφατη δημοσίευση από τον Lin και τους συναδέλφους του σχετικά με τα συν-μολυσμένα χοιρίδια H1N1 και S. suis έδειξε τις συνεργιστικές επιδράσεις και των δύο παθογόνων (Lin et al., 2015). Τα συν-μολυσμένα χοιρίδια είχαν πιο σοβαρή κλινική εικόνα και παθολογικές αλλαγές στον πνεύμονα, σε σύγκριση με ζώα που είχαν μολυνθεί με μεμονωμένα παθογόνα (Lin et al., 2015). Επιπλέον, τα γονίδια που σχετίζονται με τις ανοσολογικές αποκρίσεις, την παραγωγή φλεγμονώδους κυτοκίνης και τα αποπτωτικά μονοπάτια υπερεκφράστηκαν σε μεγάλο βαθμό στην ομάδα που είχε μολυνθεί από κοινού (Lin et al., 2015). Αν και το μοντέλο χοίρου φαίνεται να είναι ιδανικό για μίμηση ανθρώπινων μολυσματικών ασθενειών, υπάρχουν επίσης μειονεκτήματα, όπως π.χ. η απαίτηση για εξειδικευμένες εγκαταστάσεις πειραματόζωων, η χρονοβόρα διαχείριση, το υψηλό κόστος συντήρησης και η περιορισμένη διαθεσιμότητα διαγονιδιακών ζώων. Αν και η χρήση ζώων συμβάλλει σημαντικά στην κατανόησή μας για τις μολυσματικές ασθένειες, θα πρέπει να ληφθούν υπόψη τα τρισδιάστατα οργανοτυπικά μοντέλα ανθρώπινου ιστού και οι ex vivo ιστοί οργάνων, καθώς είναι τα πιο πολύτιμα εργαλεία για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων ξενιστή-παθογόνου σε ένα πιο περίπλοκο περιβάλλον (Εικόνα 1). Οι προσεγγίσεις της μηχανικής ιστών επικεντρώθηκαν αρχικά στην αναγεννητική ιατρική (Langer and Vacanti, 1993). Σε αντίθεση με τις τυπικές μονοστιβαδικές κυτταρικές καλλιέργειες, τα μοντέλα ιστών μοιάζουν πολύ περισσότερο με την τρισδιάστατη αρχιτεκτονική, την κυτταρική σύνθεση και την πολυπλοκότητα της μήτρας του αντίστοιχου οργάνου. Τα τελευταία χρόνια η μηχανική ιστών χρησιμοποιήθηκε επίσης με επιτυχία σε μια σειρά από μελέτες σε μολυσματικές ασθένειες, συμπεριλαμβανομένων των λοιμώξεων από τον ιό Zika των εγκεφαλικών οργανοειδών (Lancaster et al., 2013; Dang et al., 2016), λοιμώξεις από ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού των γαστρικών επιθηλιακών οργανοειδών (McCracken et al., 2014; Schlaermann et al., 2016), Escherichia coli και λοιμώξεις από ροταϊό γαστρεντερικών και εντεροειδών λεπτού εντέρου (Saxena et al., 2015; VanDussen et al., 2015), Entamoeba histolytica ή λοιμώξεις από τον ιό της ηπατίτιδας Β του ηπατικού ημιτονοειδούς ιστού (Petropolis et al., 2014 (Petropolis et al., , 2016, ομάδα Α και G στρεπτόκοκκοι ή σταφυλοκοκκικά μοντέλα λοιμώξεων του δέρματος al., 2016), και λοιμώξεις από σταφυλοκοκκικό και χανταϊό των Άνδεων του ανθρώπινου πνευμονικού ιστού (Mairpady Shambat et al., 2015; Sundstrom et al., 2016). Η προσαρμοστικότητα αυτών των μοντέλων μηχανικής ιστών σε πολλαπλά παθογόνα υποδηλώνει μεγάλη δυνατότητα για μελέτες μολυσματικών ασθενειών. Για παράδειγμα, το μοντέλο πνευμονικού ιστού που σχετίζεται με την πνευμονία αποτελείται από πνευμονικούς ινοβλάστες ενσωματωμένους σε μια μήτρα κολλαγόνου με ένα στρωματοποιημένο επιθηλιακό στρώμα στην κορυφή (Nguyen Hoang et al., 2012). Ο κατασκευασμένος ιστός είναι κατάλληλος για εμφύτευση και μελέτη ανοσοκυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των δενδριτικών κυττάρων, μονοκυττάρων, μακροφάγων, ακόμη και μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος (Nguyen Hoang et al., 2012; Mairpady Shambat et al., 2015). Μια πρόσφατη δημοσίευση έδειξε ένα συμβάν δύο χτυπημάτων πνευμονικής παθολογίας στη σταφυλοκοκκική νεκρωτική πνευμονία (Mairpady Shambat et al., 2015). Ενώ η α-τοξίνη είχε άμεση καταστροφική επίδραση στο πνευμονικό επιθήλιο, η PVL προκάλεσε παθολογία των πνευμόνων έμμεσα μέσω της λύσης των ουδετερόφιλων (Mairpady Shambat et al., 2015). Όλες οι μελέτες που αναφέρονται παραπάνω υπογραμμίζουν μια σημαντική πρόοδο στον τομέα των μολυσματικών ασθενειών όχι μόνο από επιστημονική άποψη αλλά και συνεισφέροντας στην αρχή των τριών R του πειραματισμού σε ζώα (Russell, 1995). Με αυτούς τους όρους, η χρήση καλλιεργημένων π Οι βιοψίες ανθρώπινων οργάνων vivo, οι οποίες είναι σπάνιες λόγω ηθικών κριτηρίων, είναι μια πρόσθετη επιλογή για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων ξενιστή-παθογόνου. Αυτό το ex vivo σύστημα μπορεί να ξεπεράσει ακόμη και τους περιορισμούς του κατασκευασμένου ιστού. Τα τελευταία χρόνια λοιμώξεις του ανθρώπινου πνευμονικού ιστού ex vivo με διάφορους μικροοργανισμούς, συμπεριλαμβανομένων των πνευμονόκοκκων (Szymanski et al., 2012; Fatykhova et al., 2015), Bacillus anthracis (Chakrabarty et al., 2007), Haemophilus influenzae (Zhang et al., 2016) και IAV (Nicholls et al., 2007; Chan et al., 2009), πραγματοποιήθηκαν. Στο ανθρώπινο περιβάλλον, το μεγαλύτερο μέρος της εργασίας επικεντρώθηκε στον τροπισμό, τη σοβαρότητα των λοιμώξεων, την απελευθέρωση φλεγμονωδών μεσολαβητών και τα ποσοστά αναπαραγωγής των μικροοργανισμών. Επιπλέον, πρόσφατα αναφέρθηκαν επίσης πειράματα σχετικά με συν-λοιμώξεις του ιού της γρίπης των χοίρων (SIV) και του S. suis των ex vivo φετών πνεύμονα χοίρου. Ο Meng και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι το SIV προάγει επακόλουθες βακτηριακές λοιμώξεις σε μια διαδικασία δύο σταδίων της οποίας το πρώτο αρχικό βήμα εξαρτιόταν από την έκφραση της κάψουλας, ενώ το δεύτερο βήμα της βακτηριακής εισβολής σε βαθύτερα στρώματα ήταν ανεξάρτητο από την κάψουλα και απαιτούσε βλάβη από τον ιό (Meng et al. ., 2015). Ωστόσο, αυτή είναι μόνο μια αρχή και χρειάζονται περισσότερες έρευνες για να αποκαλυφθεί η πολυπλοκότητα που κρύβεται πίσω από αυτές τις εξαιρετικά επεμβατικές λοιμώξεις. Συνοπτικά, οι βακτηριακές και ιογενείς συν-λοιμώξεις της αναπνευστικής οδού είναι εξαιρετικά θανατηφόρες και αποτελούν δραματική επιβάρυνση για το παγκόσμιο σύστημα υγείας. Η συνέργεια μεταξύ βακτηριακών και ιικών μολυσματικών παραγόντων σχετίζεται με μια ποικιλία παραγόντων, συμπεριλαμβανομένης της βλάβης του επιθηλιακού φραγμού, της υπερβολικής εγγενούς ανοσολογικής απόκρισης και της καταιγίδας κυτοκινών. Παρά τις πολλές προόδους τα τελευταία χρόνια, απαιτείται περισσότερη γνώση σχετικά με τους μηχανισμούς και την ανοσολογία της εξέλιξης της νόσου. Οι συνεργιστικοί μηχανισμοί μεταξύ ιών και βακτηρίων που οδηγούν σε αυξημένη νοσηρότητα και θνησιμότητα είναι ελάχιστα κατανοητοί. Οι in vivo χαρακτηρισμοί αυτών των σοβαρών λοιμώξεων πραγματοποιούνται κυρίως σε ποντίκια που μοιάζουν ελάχιστα με την ανθρώπινη φυσιολογία και το ανοσοποιητικό σύστημα. Έχουν γίνει αρκετές προσπάθειες για την καθιέρωση άλλων μοντέλων, συμπεριλαμβανομένων των κουναβιών, των ινδικών χοιριδίων, των κουνελιών, των αρουραίων και των πρωτευόντων πλην του ανθρώπου. Ωστόσο, όλα έχουν περιορισμούς. Εδώ, προτείνουμε τη χρήση του μοντέλου χοίρου, το οποίο παρέχει προφανή πλεονεκτήματα στις μελέτες ανθρώπινων μολυσματικών ασθενειών και θα πρέπει να θεωρείται πολύ πιο συχνό για μελλοντικές μελέτες για σοβαρές μολυσματικές ασθένειες, συμπεριλαμβανομένης της πνευμονίας.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 11526, "text": "ήπιες λοιμώξεις του δέρματος έως θανατηφόρα νεκρωτική πνευμονία" } ], "id": 5175, "question": "Ποιες καταστάσεις προκαλούνται από τον Staphylococcus aureus;" }, { "answers": [ { "answer_start": 12383, "text": "8-30%" } ], "id": 5176, "question": "Τι ποσοστό των υγιών ενηλίκων αποικίζεται ασυμπτωτικά από βακτήρια πνευμονιόκοκκου;" }, { "answers": [ { "answer_start": 22309, "text": "κυψελιδικά μακροφάγα" } ], "id": 5177, "question": "Ποιοι τύποι κυττάρων ακολουθούν τα επιθηλιακά κύτταρα στην ανοσολογική απόκριση σε λοιμώξεις στον πνεύμονα;" }, { "answers": [ { "answer_start": 21295, "text": "Η επακόλουθη μόλυνση με θετικά κατά Gram βακτήρια" } ], "id": 5178, "question": "Τι ενισχύει την έκφραση της ιντερφερόνης τύπου Ι;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Ο εμβολιασμός του βλεννογόνου με ανασυνδυασμένο γαλακτοβάκιλλο casei-Εμφανιζόμενη με CTA1-Συζευγμένη Συναινετική Μήτρα Πρωτεΐνη-2 (sM2) Επάγει ευρεία προστασία έναντι αποκλίνων υποτύπων γρίπης σε ποντίκια BALB/chttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc2397 SHA: efaa556b484fbcd9cc34832ffac53ef3e834e9c0Συγγραφείς: Chowdhury, Mohammed Y. E.; Li, Rui; Kim, Jae-Hoon; Park, Min-Eun; Kim, Tae-Hwan; Pathinayake, Prabuddha; Weeratunga, Prasanna; Τραγούδι, Man Ki; Γιος, Hwa-Young; Hong, Seung-Pyo; Sung, Moon-Hee; Lee, Jong-Soo; Kim, Chul-JoongDate: 2014-04-08DOI: 10.1371/journal.pone.0094051Άδεια: cc-byAbstract: Για να αναπτύξουμε ένα ασφαλές και αποτελεσματικό εμβόλιο του βλεννογόνου κατά των παθογόνων ιών της γρίπης, κατασκευάσαμε ανασυνδυασμένες περιπτώσιμες πρωτεΐνες Lactobactrix. (pgsA-CTA1-sM2/L. casei) ή χωρίς (pgsA-sM2/L. casei) υπομονάδα A1 τοξίνης χολέρας (CTA1) στην επιφάνεια. Ο επιφανειακός εντοπισμός της πρωτεΐνης σύντηξης επαληθεύτηκε με αναλύσεις κυτταρικής κλασματοποίησης, κυτταρομετρία ροής και μικροσκοπία ανοσοφθορισμού. Στοματικοί και ρινικοί εμβολιασμοί ανασυνδυασμένου L. casei σε ποντικούς είχαν ως αποτέλεσμα υψηλά επίπεδα ανοσοσφαιρίνης G (IgG) ορού και IgA του βλεννογόνου. Ωστόσο, η σύζευξη της υπομονάδας Α1 της τοξίνης χολέρας προκάλεσε πιο ισχυρές βλεννογονικές, χυμικές και κυτταρομεσολαβούμενες ανοσοαποκρίσεις. Σε δοκιμασία πρόκλησης με 10 MLD(50) A/EM/Korea/W149/06(H5N1), A/Puerto Rico/8/34(H1N1), A/Aquatic bird /Korea/W81/2005(H5N2), Ιοί A/Aquatic bird/Korea/W44/2005(H7N3) και A/Chicken/Korea/116/2004(H9N2), οι ανασυνδυασμένοι pgsA-CTA1-sM2/L. Το casei παρείχε καλύτερη προστασία έναντι θανατηφόρων προκλήσεων από το pgsA-sM2/L. casei, pgsA/L. casei και PBS σε ποντίκια. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η ανοσοποίηση του βλεννογόνου με ανασυνδυασμένο L. casei που εκφράζει συζευγμένη με CTA1 πρωτεΐνη sM2 στην επιφάνειά του είναι ένα αποτελεσματικό μέσο πρόκλησης προστατευτικών ανοσολογικών αποκρίσεων έναντι διαφόρων υποτύπων γρίπης. Κείμενο: Ο εμβολιασμός παραμένει το πιο οικονομικό και αποτελεσματικό μέσο κατά των αναπνευστικών ασθενειών που προκαλούνται από ιούς γρίπης [1] . Με βάση τους ιούς που κυκλοφορούν στον πληθυσμό, τρισθενή στελέχη εμβολίων έχουν αναπτυχθεί και χρησιμοποιούνται για την προστασία από τον ιό της γρίπης [2] . Η πιο αποδεκτή τρέχουσα διαθέσιμη στρατηγική είναι η ενδομυϊκή χορήγηση αδρανοποιημένων εμβολίων που παράγονται από συστήματα παραγωγής με βάση τα αυγά, τα οποία ενώ είναι αποτελεσματικά, παρεμποδίζονται από την περιορισμένη ικανότητα και ευελιξία [3] . Ωστόσο, τα στελέχη των εμβολίων πρέπει να προσαρμόζονται συχνά για να ταιριάζουν με τους ιούς που κυκλοφορούν σε όλο τον κόσμο [4] . Επιπλέον, τα επίπεδα αντισωμάτων που προκαλούνται από το αδρανοποιημένο εμβόλιο έχει παρατηρηθεί να μειώνονται κατά 75% σε μια περίοδο 8 μηνών [2, 5]. Ως εκ τούτου, οι εναλλακτικές στρατηγικές για την ανάπτυξη ευρέως διασταυρούμενων, ασφαλών και αποτελεσματικών εμβολίων κατά των ιογενών λοιμώξεων της γρίπης είναι εξέχουσας σημασίας. Η πρωτεΐνη Matrix 2 (M2) διατηρείται σε μεγάλο βαθμό μεταξύ των στελεχών του ιού της γρίπης Α, υποδεικνύοντας ότι το M2 είναι ένας ελκυστικός στόχος για την ανάπτυξη ενός καθολικού εμβόλιο [6] . Σε προηγούμενες μελέτες, διάφορες κατασκευές του εμβολίου Μ2 έχουν αναπτυχθεί και δοκιμαστεί, συμπεριλαμβανομένης της ανασυνδυασμένης Escherichia coli (E. coli) που εκφράζει πρωτεΐνη σύντηξης Μ2, αδενοϊικών φορέων που εκφράζουν την πρωτεΐνη Μ2, πλασμιδικού DNA που κωδικοποιεί το Μ2 [7] [8] [9] και πεπτίδια που κωδικοποιούν το M2e [11] , καθένα από τα οποία ήταν ικανό να προκαλέσει προστατευτικές ανοσολογικές αποκρίσεις σε ποντίκια. Ωστόσο, το μειονέκτημα αυτών των εμβολίων με βάση το Μ2 είναι η χαμηλή ανοσογονικότητά τους. Επιπλέον, οι περισσότερες από αυτές θα απαιτούσαν ενδομυϊκές ενέσεις. Ως εκ τούτου, έχουν εφαρμοστεί πολλές στρατηγικές που επικεντρώνονται στην αύξηση της ανοσογονικότητας των εμβολίων με βάση το M2, για παράδειγμα, η σύντηξη του Μ2 με διαφορετικά μόρια φορείς όπως η πρωτεΐνη L του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων [12] , η αιμοκυανίνη πεταλούδας κλειδαρότρυπας [10] και η μαστίγωση [13] . Επιπλέον, έχουν εφαρμοστεί εμβολιασμοί με διαφορετικά ανοσοενισχυτικά και οδούς χορήγησης για την αξιολόγηση της προστασίας τους έναντι διαφορετικών στελεχών των ιών της γρίπης. Τα ποντίκια που ανοσοποιήθηκαν μέσω του βλεννογόνου με ένα Μ2 ή σωματίδια παρόμοια με τον ιό (VLPs) ενισχυμένα με τοξίνη χολέρας (CT) επέδειξαν καλύτερη προστασία σε σύγκριση με ποντίκια που υποβλήθηκαν σε παρεντερική ανοσοποίηση [14, 15]. Ωστόσο, λόγω των δυσμενών επιπτώσεων της CT στους ανθρώπους, οι ερευνητές προσπάθησαν να αναγνωρίσουν μη τοξικές υπομονάδες με επικουρικότητα αφαιρώντας είτε την υπομονάδα Α είτε την υπομονάδα Β [16] . Η υπομονάδα A1 της τοξίνης χολέρας που εκφράζει το E. coli (CTA1) συντηγμένη με το θραύσμα D του Staphylococcus aureus έδειξε τις επικουρικές επιδράσεις χωρίς καμία αντιδραστικότητα της υπομονάδας Α1 στο εμβόλιο του βλεννογόνου [6] . Αν και η χημική ή γενετική σύζευξη του Μ2 μπορεί να μην παρουσιάζει το Μ2 στη φυσική του τετραμερή μορφή, τα εξωκυτταρικά προσβάσιμα αντιγόνα που εκφράζονται στις επιφάνειες των βακτηρίων αναγνωρίζονται καλύτερα από το ανοσοποιητικό σύστημα από εκείνα που είναι ενδοκυτταρικά [17] . Έτσι, η επιλογή του φορέα παροχής είναι επίσης μια σημαντική ανησυχία για πιθανά εμβόλια του βλεννογόνου. Πρόσφατα, τα βακτήρια γαλακτικού οξέος (LAB) που παρουσιάζουν αντιγόνα του ιού της γρίπης έχουν μελετηθεί [3, 18, 19]. Για την ανοσοποίηση του βλεννογόνου, το LAB είναι ένα πιο ελκυστικό σύστημα χορήγησης από άλλους ζωντανούς φορείς εμβολίων, όπως η Shigella, η Salmonella και η Listeria [20, 21]. Θεωρείται ασφαλές και παρουσιάζει επικουρική δράση στη βλεννογόνο και συστηματική ανοσία [18, 22, 23]. Η αγκύρωση της πρωτεΐνης στόχου στις κυτταρικές επιφάνειες του LAB προορίζεται κυρίως για χρήση σε εμβόλια βλεννογόνων. Η διαμεμβρανική πρωτεΐνη pgsA είναι ένα από τα σύμπλοκα πολυ-γλουταμινικής συνθετάσης του Bacillus subtilis [17, 24, 25], η οποία είναι μια καλά μελετημένη πρωτεΐνη αγκύρωσης που μπορεί να συντήξει την πρωτεΐνη στόχο στο άκρο C και να σταθεροποιήσει το σύμπλοκο αγκυρώνοντάς το στην κυτταρική μεμβράνη. Δεδομένου ότι το sM2 είναι ένας εξαιρετικά διατηρημένος και πολλά υποσχόμενος στόχος για ένα καθολικό εμβόλιο και το CTA1 είναι ισχυρό ανοσοενισχυτικό βλεννογόνου, σε αυτή τη μελέτη, αναπτύξαμε κατασκευές χρησιμοποιώντας ένα συναινετικό γονίδιο sM2 που ανασυστάθηκε από την ανάλυση των ιών της γρίπης H1N1, H5N1 και H9N2 (χωρίς διαμεμβρανική περιοχή ) με ή χωρίς τη σύντηξη του CTA1. Για να το επιτύχουμε αυτό, χρησιμοποιήσαμε έναν νέο φορέα έκφρασης που μπορεί να εκφράσει ένα προϊόν γονιδίου pgsA ως πλέγμα αγκύρωσης. Τα αντιγόνα-στόχοι μας, sM2 και CTA1, εμφανίστηκαν στην επιφάνεια του Lactobacillus casei και η στοματική ή ενδορινική χορήγηση του ανασυνδυασμένου L. casei προκάλεσε συστημικές και βλεννογονικές ανοσολογικές αποκρίσεις που έχουν τη δυνατότητα να προστατεύουν από τις θανατηφόρες προκλήσεις των αποκλίνων υποτύπων γρίπης. συνολικά 672 θηλυκά ποντίκια BALB/c (ηλικίας 5 εβδομάδων) αγοράστηκαν από το Samtako (Σεούλ, Κορέα) και στεγάστηκαν σε αεριζόμενα κλουβιά. Τα ποντίκια αντιμετωπίστηκαν με σφαιροποιημένη τροφή και νερό της βρύσης κατά βούληση, διατηρήθηκαν σε περιβάλλον απαλλαγμένο από συγκεκριμένα παθογόνα και καταβλήθηκαν όλες οι προσπάθειες για να ελαχιστοποιηθεί η ταλαιπωρία μετά από έγκριση από την Επιτροπή Θεσμικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων της Bioleaders Corporation, Daejeon, Νότια Κορέα, αριθμός πρωτοκόλλου: BSL-ABLS-13-002. Οι ανοσοποιήσεις ζώων διεξήχθησαν σε εργαστηριακές εγκαταστάσεις επιπέδου βιοασφάλειας (BSL)-2. Τα ποντίκια χωρίστηκαν σε 6 πειραματικά σύνολα, το καθένα αποτελούμενο από 2 υποομάδες: 1 για από του στόματος και 1 για ενδορινική χορήγηση που περιείχαν 4 ομάδες το καθένα. Από τα 6, 4 σετ είχαν 14 ποντίκια ανά ομάδα. Το ένα σετ είχε 17 (3 ποντίκια για ιστοπαθολογία πνεύμονα και ανοσοϊστοχημεία) και το τελευταίο περιείχε 11 ποντίκια ανά ομάδα (3 ποντίκια για απόκριση CTL). Οι συγκεντρώσεις του ανασυνδυασμένου L. casei προσδιορίστηκαν με μονάδες σχηματισμού αποικιών (CFU). Σε κάθε υποομάδα, 2 ομάδες έλαβαν 1010 CFU pgsA-sM2/L. casei ή pgsA-CTA1-sM2/L. casei, και οι υπόλοιπες δύο ομάδες έλαβαν την ίδια συγκέντρωση pKV-pgsA/L. casei ή PBS σε 100 ml από το στόμα μέσω ενδογαστρικής πλύσης τις ημέρες 0 έως 3, 7 έως 9 και 21 έως 23. Παρομοίως, 109 CFU ανασυνδυασμένων κυττάρων χορηγήθηκαν σε εναιωρήματα των 20 ml στα ρουθούνια ποντικών ελαφρά αναισθητοποιημένων τις ημέρες 0 έως 3, 7 έως 9 και 21. Συλλέχθηκαν δείγματα αίματος από το οπισθοτροχιακό πλέγμα τις ημέρες 21, 14 και 28. Οι οροί διαχωρίστηκαν με φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στα 12.0006 g και αποθηκεύτηκαν στους 220uC μέχρι την ανάλυση. Την ημέρα 28, 3 ποντίκια σε κάθε ομάδα θυσιάστηκαν τυχαία για τη συλλογή δείγματος IgA από πνεύμονες και έντερο και αποθηκεύτηκαν στους 270uC μέχρι την ανάλυση. Οι σπλήνες συλλέχθηκαν άσηπτα την ημέρα 28 για την ανάλυση της απόκρισης CTL τυχαία από 3 ποντίκια του ενός σετ. Τα υπόλοιπα ποντίκια από το ίδιο σετ διατηρήθηκαν για 6 μήνες από την ημερομηνία της τελευταίας ενίσχυσης για να μετρηθούν οι μακροχρόνιες ανοσολογικές αποκρίσεις και η αποτελεσματικότητα προστασίας. Οι ιοί της γρίπης των πτηνών A/EM/Korea/W149/06(H5N1), A/Puerto Rico/8/34(H1N1), A/Aquatic bird/Korea/W81/2005 (H5N2), A/Aquatic bird/Korea/W44/2005(H7N3) και A/Κοτόπουλο/Κορέα/116/2004 (H9N2) που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη παρασχέθηκαν ευγενικά από τον Dr. Young-Ki Choi (Ινστιτούτο Ιατρικής και Ιατρικής Έρευνας, Εθνικό Πανεπιστήμιο Chungbuk, Cheongju, Δημοκρατία της Κορέας). Όλοι οι ιοί πολλαπλασιάστηκαν στο αλλαντοϊκό υγρό εμβρύων κοτόπουλου ηλικίας 10 ημερών και προσδιορίστηκαν θανατηφόρες δόσεις ποντικού 50% (MLD 50) σε αφελείς ποντικούς BALB/c ηλικίας 8 εβδομάδων. Ποντίκια που αναισθητοποιήθηκαν με νάρκωση με αιθέρα μολύνθηκαν ενδορινικά με 10 φορές το MLD 50 των ιών πρόκλησης σε 20 ml PBS. Έξι ποντίκια σε κάθε ομάδα θυσιάστηκαν σε 3 και 5 dpi για να ελεγχθεί ο τίτλος του ιού στους πνεύμονες και άλλα 5 ποντίκια που παρέμειναν σε κάθε ομάδα χρησιμοποιήθηκαν για επιβίωση. Τα ποντίκια παρακολουθούνταν κάθε μέρα σε καθορισμένο χρονικό σημείο για τη μέτρηση της απώλειας βάρους και της επιβίωσης. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία εάν ήταν ετοιμοθάνατα, δηλ. Η απώλεια βάρους, η αναστατωμένη γούνα, το ρίγος, η ταχύπνοια, η αναπνευστική δυσχέρεια, η υποθερμία και η ελλιπής απόκριση στα εξωτερικά ερεθίσματα, η παραμονή θεωρήθηκαν ως αριθμός επιβίωσης. Μετά την τελική παρακολούθηση, όλα τα ποντίκια που επιβίωσαν ευθανατίστηκαν με ανθρώπινη χρήση χρησιμοποιώντας εισπνοή CO 2 για 5 λεπτά. Στις 180 ημέρες μετά τον τελικό εμβολιασμό, τα ποντίκια από ένα σετ προκλήθηκαν με H5N2 για μέτρηση των μακροχρόνιων ανοσολογικών αποκρίσεων. Όλες οι δοκιμές πρόκλησης πραγματοποιήθηκαν σε εγκεκριμένη εγκατάσταση BSL-3+ υπό κατάλληλες συνθήκες. Βακτηριακά στελέχη και κλωνοποίηση για την κατασκευή ανασυνδυασμένου πλασμιδίου PgsA-sM2/L. casei και PgsA-CTA1-sM2/L. casei Σε αυτή τη μελέτη, το E. coli JM83 χρησιμοποιήθηκε για κλωνοποίηση και το L. casei L525 για την επιφανειακή έκφραση της πρωτεΐνης στόχου. Αυτά τα βακτήρια αναπτύχθηκαν σε μέσα LB και MRS, αντίστοιχα. Το πλασμίδιο pKV-Pald-PgsA, που φιλοξενεί τα γονίδια pgsA του Bacillus subtilis, χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή του πλασμιδίου επιφανειακής εμφάνισης, το οποίο ήταν ένα ευγενικό δώρο από την Bioleaders Corporation (Daejeon, Νότια Κορέα). Δημιουργήθηκε ένα γονίδιο που κωδικοποιεί τη συναινετική αλληλουχία του Μ2 που καλύπτει τα υπολείμματα της εξωκυτταρικής και κυτταροπλασματικής περιοχής χωρίς τη διαμεμβρανική περιοχή του ιού της γρίπης. Οι συναινετικές αλληλουχίες δημιουργήθηκαν με βάση τα πιο κοινά αμινοξέα σε κάθε θέση της ευθυγράμμισης των H1N1, H5N1 και H9N2. Στη συνέχεια, συντέθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν ως εκμαγεία για την κατασκευή των πλασμιδίων pgsA-sM2/L. casei και pgsA-CTA1-sM2/L. casei με κλωνοποίηση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26, 27]. Το γονίδιο sM2 τροποποιήθηκε προσθέτοντας μια θέση ΚρηΙ στο 59 τερματικό και Sal Ι στο 39 τερματικό για κλωνοποίηση. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) διεξήχθη για την ενίσχυση του γονιδίου χρησιμοποιώντας το ζεύγος εκκινητών 59-GGGGTACCTCATTATTAACA-39 και 59-ACGTCGACT-CATTATTCAAGTTCAATTAATG AC-39. Ομοίως, μια θέση BamH Ι στο 59 τερματικό και μια θέση ΚρηΙ στο 39 τερματικό άκρο προστέθηκαν στο γονίδιο CTA1 χρησιμοποιώντας εκκινητές 59-CGGGATCCAAT-GATGATAAGTTATAT-39 και 59-GGGT ACCCGAT-GATCTTGGAGC ATT-39. Τα τροποποιημένα γονίδια συνδέθηκαν στο Τ Easy Vector (Invitrogen, Σεούλ, Κορέα). Τα γονίδια στη συνέχεια χωνεύτηκαν με KpnI-Sal Ι για sM2 και BamH I-KpnI για CTA1. Το χωνευμένο sM2 συνδέθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pKV-pgsA για την κατασκευή του pKV-pgsA-sM2. Παρομοίως, το CTA1 απολινώθηκε για την κατασκευή του pKV-pgsA-CTA1-sM2. Τα απολινωμένα προϊόντα μετασχηματίστηκαν σε ικανά κύτταρα E. coli JM83, όπως περιγράφηκε προηγουμένως, χρησιμοποιώντας μια μέθοδο ηλεκτροδιάτρησης [17] . Τα προφίλ των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων επιβεβαιώθηκαν με πέψη με περιοριστική ενδονουκλεάση και προσδιορισμό αλληλουχίας DNA (Solgent, Σεούλ, Κορέα). Μετά την επιβεβαίωση, τα πλασμίδια μετασχηματίστηκαν σε L. casei L525 με ηλεκτροδιάτρηση και ονομάστηκαν pgsA-sM2/L. casei και pgsA-CTA1-sM2/L. casei. Τα ανασυνδυασμένα γονίδια L. casei που περιέχουν pgsA, pgsA-sM2 και pgsA-CTA1-sM2 αναπτύχθηκαν στους 30uC για 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 6.0006 g για 10 λεπτά στους 4uC, ακολουθούμενη από πλύση δύο φορές με στείρο αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS). Οι βακτηριακές λύσεις πραγματοποιήθηκαν με υπερήχους και φυγοκεντρήθηκαν στα 12.0006 g για 20 λεπτά στους 4uC. Το κυτταρικό τοίχωμα και τα κυτταροπλασματικά κλάσματα διαχωρίστηκαν με φυγοκέντρηση στα 25.0006 g στους 4uC για 2 ώρες. Τα σφαιρίδια (κυτταρικό τοίχωμα) επαναιωρήθηκαν σε 100 ml 1% σαρκοσόλης που περιέχει 1 mM φαινυλμεθυλσουλφονυλοφθορίδιο (PMSF, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) ως αναστολέα πρωτεάσης. Τα κλάσματα αναλύθηκαν με στύπωμα western, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Για την ανοσολογική ανίχνευση πρωτεϊνών σύντηξης, οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με αντισώματα κουνελιού κατά της χολέρας (1:2000, Abcam, UK), αντισώματα κουνελιού αντι-pgsA (1:1000) και αντι-Μ2 κουνελιού (1:1000). Τα αντισώματα κουνελιού αντι-pgsA και κουνελιού αντι-Μ2 που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτό το πείραμα δημιουργήθηκαν από την i.m. ενοφθαλμισμός πεπτιδίου pgsA ή Μ2 συζευγμένου με KLH σε κουνέλι, αντίστοιχα, δύο φορές σε διάστημα 2 εβδομάδων. Οι μεμβράνες αντέδρασαν με αραίωση 1:10.000 ανοσοσφαιρίνης G αντι-κουνελιού συζευγμένης με υπεροξειδάση χρένου (IgG HRP). Τέλος, οι πρωτεΐνες στόχοι ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης στυπώματος WEST-ZOL συν Western Blot (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi-do, Κορέα) και οπτικοποιήθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL) [17, 26, 28] . Για να διερευνηθεί η έκφραση του sM2 ή CTA1-sM2 στην επιφάνεια του L. casei, ανασυνδυασμένο L. casei αναπτύχθηκε σε 30uC για 48 ώρες στον ζωμό MRS. Τα βακτήρια συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 5.0006 g για 10 λεπτά στους 4uC, πλύθηκαν τρεις φορές με στείρο αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά που περιείχε 0,01% Tween-20 (PBST) και ανιχνεύθηκαν με πολύκλωνο αντίσωμα κουνελιού αντι-Μ2 ή αντι-CT κουνελιού όλη τη νύχτα. Μετά από άλλη πλύση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αντισώματα IgG κουνελιού συζευγμένα με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) (Burlingame, CA, USA) για 2 ώρες. Τέλος, 10.000 κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (Becton Dickinson, Oxnard, CA, USA). Για τον ανοσοφθορισμό, τα κύτταρα παρασκευάστηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες που περιγράφηκαν για την κυτταρομετρία ροής. Το pgsA/L. Το casei χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος και η ανάλυση ανοσοφθορισμού εξετάστηκε χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού Carl Zeiss Axioskop 2. Οι τίτλοι αντισωμάτων ELISA μετρήθηκαν με ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA) χρησιμοποιώντας δείγματα ορού ή βλεννογόνου από εμβολιασμένα ποντίκια. Πρώτον, ανοσοπροσροφητικές πλάκες 96 φρεατίων (Nunc) επωάστηκαν με 300 ng/φρεάτιο καθαρισμένες πρωτεΐνες sM2 ή CTA1 στους 4uC όλη τη νύχτα. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες sM2 και CTA1 που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη καθαρίστηκαν από Ε. coli. Στη συνέχεια, τα φρεάτια μπλοκαρίστηκαν με 10% αποβουτυρωμένο γάλα για 2 ώρες σε RT, πλύθηκαν πέντε φορές με PBST, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αραιωμένα δείγματα ορού (1:200) εις τριπλούν για ανίχνευση IgG και μη αραιωμένο ομογενοποιημένο υπερκείμενο ιστού για ανίχνευση τοπικού IgA και επωάστηκαν για 2 ώρες στους 37uC. Μετά από τρεις φορές πλύση, προστέθηκε HRP κατσίκας αντι-ποντικού IgG (1:1000, σίγμα) ή αντι-ποντικού IgA σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκε για επιπλέον 2 ώρες στους 37uC. Μετά από έναν άλλο γύρο πλύσης, οι πλάκες αντέδρασαν με το διάλυμα υποστρώματος που περιείχε τετραμεθυλβενζιδίνη και Η2Ο2 και αφέθηκαν να προηγηθούν της αντίδρασης για 10 λεπτά. Μετά την προσθήκη του διαλύματος τερματισμού 2N-H 2 SO 4 , η οπτική πυκνότητα (OD) μετρήθηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας ένα ELISA autoreader (Molecular devices). Η ανάπτυξη και η μέτρηση των κυτοκινών πραγματοποιήθηκαν με ELISPOTs, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31, 32 ] . Εν συντομία, την ημέρα πριν από την απομόνωση των σπληνοκυττάρων, πλάκες 96 φρεατίων ELISPOT επικαλύφθηκαν με μονοκλωνικά αντισώματα σύλληψης IFN-c και IL-4 ποντικού (5 mg/ml) σε PBS και επωάστηκαν στους 4uC όλη τη νύχτα. Οι πλάκες πλύθηκαν με PBS και 200 ​​ml/φρεάτιο διαλύματος αποκλεισμού που περιείχε πλήρες μέσο RPMI 1640 και 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, προστέθηκαν (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και επωάστηκαν για 2 ώρες σε ΘΔ. Οι σπλήνες από τα εμβολιασμένα ποντίκια απομονώθηκαν ασηπτικά και προστέθηκαν σε 5610 4 κύτταρα/φρεάτιο σε μέσα που περιείχαν πρωτεΐνη sM2, πεπτίδιο M2 (SLLTEVETPTRNGWECKCSD) (1 mg/φρεάτιο), μόνο μέσο (αρνητικός έλεγχος) ή 5 mg/ml φυτοαιμοσυγκολλητίνη (θετικός έλεγχος , Invitrogen, Carlsbad, CA, ΗΠΑ). Μετά την προσθήκη κυττάρων και διεγερτών, οι πλάκες επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37uC με 5% CO2. Οι πλάκες κατεργάστηκαν διαδοχικά με βιοτινυλιωμένα αντισώματα IFN-c και IL-4 ποντικού, υπεροξειδάση στρεπταβιδίνης και διάλυμα υποστρώματος. Τέλος, οι κηλίδες μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν αναλυτή ImmunoScan Entry (Cellular Technology, Shaker Heights, USA). Οι πνεύμονες συλλέχθηκαν ασηπτικά και οι τίτλοι του ιού προσδιορίστηκαν με 50% μολυσματική δόση καλλιέργειας ιστών (TCID 50), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33] . Εν συντομία, οι ιστοί των πνευμόνων ομογενοποιήθηκαν σε 500 ml PBS που περιείχε αντιβιοτικά (πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη) και αντιμυκητιασικές ενώσεις (Fungizone) (Gibco, Grand Island, ΝΥ, ΗΠΑ). Μηχανικά ομογενοποιημένα δείγματα πνεύμονα φυγοκεντρήθηκαν (15 λεπτά, 12.0006 g και 4uC) για να αφαιρεθούν τα κυτταρικά υπολείμματα πριν από την αποθήκευση τους στους 280uC. Κύτταρα MDCK εμβολιάστηκαν με 10 φορές σειριακά αραιωμένο δείγμα και επωάστηκαν στους 37uC σε υγρή ατμόσφαιρα 5% CO2 για μία ώρα. Μετά την απορρόφηση, το μέσο απομακρύνθηκε και το μέσο επικάλυψης που περιείχε L-1-τοσυλλαμιδο-2-φαινυλαιθυλοχλωρομεθυλκετόνη (TPCK) θρυψίνη (Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA) προστέθηκε στα μολυσμένα κύτταρα και επωάστηκε για 72 ώρες. Οι ιικές κυτταροπαθητικές επιδράσεις παρατηρήθηκαν καθημερινά και οι τίτλοι προσδιορίστηκαν με τη δοκιμή ΗΑ. Ο ιικός τίτλος κάθε δείγματος εκφράστηκε ως 50% μολυσμένες δόσεις ιστών χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Reed-Muench [34] . Για την ιστοπαθολογία, συλλέχθηκαν ιστοί πνεύμονα στα 5 dpi από ποντίκια που είχαν αναισθητοποιηθεί με νάρκωση με αιθέρα. Οι ιστοί σταθεροποιήθηκαν αμέσως σε ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει φορμαλίνη 10%, ενσωματώθηκαν σε κερί παραφίνης, τεμαχίστηκαν σε πάχος 4-6 mm χρησιμοποιώντας μηχανή μικροτόμου, τοποθετήθηκαν σε αντικειμενοφόρες πλάκες και χρωματίστηκαν με χρώση ηωσίνης. Οι ιστοπαθολογικές αλλαγές εξετάστηκαν με μικροσκόπιο φωτός, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29, 30, 35]. Περαιτέρω, οι αντικειμενοφόρες πλάκες χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας μια μέθοδο ανοσοϋπεροξειδάσης με ένα αντίσωμα (κουνελιού αντι-Μ2, 1:500) που κατευθύνεται έναντι της πρωτεΐνης μήτρας-2 του ιού της γρίπης Α. Ως δευτερεύον αντίσωμα για την ανίχνευση κυττάρων μολυσμένων με ιό σε αντίστοιχους ιστούς χρησιμοποιήθηκε ένα IgG HRP κατσίκας-αντι-κουνελιού (1:2000, Sigma-Aldrich, St. Louis, ΗΠΑ) [57] . Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο 6 τυπικές αποκλίσεις (S.D.) και είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν με ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) και οι μέσοι όροι συγκρίθηκαν με Student's t-test. Οι τιμές P μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές. Τα αποτελέσματα για το επί τοις εκατό αρχικό βάρος σώματος συγκρίθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Student's t. Η σύγκριση της επιβίωσης έγινε με τη δοκιμή log-rank χρησιμοποιώντας την έκδοση GraphPad Prism 6. Ο φορέας που εκφράζει pgsA χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή πλασμιδίων που περιέχουν το εξαιρετικά διατηρημένο συναινετικό γονίδιο sM2, με (pgsA-CTA1-sM2) ή χωρίς (pgsA-sM2) την υπομονάδα A1 της τοξίνης χολέρας (CTA1, Εικ. 1Α). Τα πλασμίδια μετασχηματίστηκαν σε κύτταρα L. casei. Τα επίπεδα έκφρασης των pgsA-sM2 και pgsA-CTA1-sM2 παρακολουθήθηκαν με ανοσοστύπωμα χρησιμοποιώντας πολυκλωνικά αντισώματα anti-pgsA, anti-M2 ή anti-CT (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Για να προσδιοριστεί ο κυτταρικός εντοπισμός των πρωτεϊνών sM2 και CTA1 που εκφράζονται σε η επιφάνεια του L. casei μέσω της πρωτεΐνης αγκύρωσης του κυτταρικού τοιχώματος pgsA, η μεμβράνη και τα κυτταροπλασματικά κλάσματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση στυπώματος western. Όπως αναμενόταν, και οι δύο πρωτεΐνες σύντηξης pgsA-sM2 και pgsA-CTA1-sM2 ανιχνεύθηκαν από πολυκλωνικά αντισώματα anti-pgsA, anti-M2 ή anti-CT στη μεμβράνη, όχι σε κυτταροπλασματικά κλάσματα (Εικ. 1Β, λωρίδα 2, 3 και 4). Πραγματοποιήθηκαν ανοσοαντιδράσεις με αντι-pgsA και ανιχνεύθηκαν ζώνες που αντιπροσωπεύουν το μέγεθος των συντηγμένων πρωτεϊνών pgsA-sM2 και pgsA-CTA1-sM2, ενώ κατά τη διάρκεια των αντιδράσεων με αντισώματα anti-M2 ή anti-CT, δεν ανιχνεύθηκαν άλλες ζώνες (Εικ. . 1Β, λωρίδα 3 και 4). Αυτό το εύρημα μπορεί να προέκυψε από την αποικοδόμηση που συμβαίνει κατά τη διαδικασία κλασμάτωσης μεμβράνης. Η ταξινόμηση κυττάρων ενεργοποιούμενη με φθορισμό (FACS) και η επισήμανση ανοσοφθορισμού των κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν για να επαληθευτεί ο εντοπισμός της πρωτεΐνης σύντηξης pgsA-sM2 και pgsA-CTA1-sM2 σε η επιφάνεια του L. casei. Η κυτταρομετρική ανάλυση ροής χρησιμοποιώντας αντισώματα αντι-Μ2 και αντι-CT κουνελιού αποκάλυψε αύξηση του επιπέδου της έντασης φθορισμού του pgsA-sM2/L. casei ή pgsA-CTA1-sM2/L. κύτταρα casei, σε σύγκριση με αυτά των κυττάρων ελέγχου L. casei (Εικ. 1C). Η μικροσκοπία ανοσοφθορισμού έδειξε επίσης ανασυνδυασμένα βακτήρια που φιλοξενούν pgsA-sM2 ή pgsA-CTA1-sM2 που ήταν ανοσοχρωματισμένα θετικά για sM2 και CTA1, αλλά αυτό δεν βρέθηκε στα κύτταρα ελέγχου. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το ανασυνδυασμένο L. casei μπορούσε να εμφανίσει αποτελεσματικά τις πρωτεΐνες σύντηξης sM2 και CTA1-sM2 στην επιφάνεια, χρησιμοποιώντας pgsA ως πρωτεΐνη αγκύρωσης μεμβράνης. διεξήχθη για τον προσδιορισμό των δόσεων και του προγράμματος pgsA-CTA1-sM2/L. υποψήφιο εμβόλιο casei για την προστασία από τον ιό της γρίπης (δεδομένα δεν φαίνονται). Για να χαρακτηριστεί η ανοσογονικότητα του sM2 που εμφανίζεται στην επιφάνεια του L. casei και του συζευγμένου sM2 με CTA1, ποντίκια BALB/c ανοσοποιήθηκαν ρινικά (10 9 κύτταρα/δόση 20 ml) ή από το στόμα (10 10 κύτταρα/ δόση 100 ml) με ανασυνδυασμένο ζωντανό pgsA-sM2 /ΜΕΓΑΛΟ. casei και pgsA-CTA1-sM2/L. βακτήρια casei. Ως αρνητικός έλεγχος, τα ποντίκια ανοσοποιήθηκαν με L. casei που φέρει το γονικό πλασμίδιο pKV-pgsA (pgsA/L. casei) και PBS. Δείγματα ορού συλλέχθηκαν στις 0, 14 και 28 ημέρες και αναλύθηκαν με ELISA, χρησιμοποιώντας πρωτεΐνες sM2 και CTA1 (καθαρισμένες από Ε. coli) ως αντιγόνο επικάλυψης. Μετά την πρώτη σειρά ανοσοποιήσεων, συγκριτικά χαμηλά επίπεδα IgG ορού ανιχνεύθηκαν τόσο στο i.n. και από του στόματος ανοσοποιημένη ομάδα. Ωστόσο, ανιχνεύθηκαν υψηλά επίπεδα αντισωμάτων λίγο μετά τη δεύτερη σειρά ανοσοποίησης και η συζευγμένη με CTA1 ομάδα sM2 προκάλεσε IgG ορού σε σημαντικό επίπεδο, σε σύγκριση με την ομάδα μόνο με sM2 και τους αρνητικούς μάρτυρες (Εικ. 2Α και Β). Αν και η σύζευξη του CTA1 με το sM2 αναμενόταν να έχει μόνο επικουρική λειτουργία, ένα σημαντικό επίπεδο αντισωμάτων αντι-CTA1 ανιχνεύθηκε τόσο στον ρινικό όσο και στον από του στόματος εμβολιασμό (Εικ. 2Α και Β δεξιός πίνακας) . Σε σύγκριση με την ομάδα από του στόματος, η ρινικά ανοσοποιημένη ομάδα εμφάνισε υψηλότερα επίπεδα IgG ορού ειδικού τόσο για το sM2 όσο και για το CTA1. Για να αξιολογηθούν οι ανοσοαποκρίσεις του βλεννογόνου, τα τοπικά επίπεδα IgA προσδιορίστηκαν με ELISA. Οι ιστοί του πνεύμονα και του εντέρου συλλέχθηκαν την ημέρα 28 της ανοσοποίησης και εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας πρωτεΐνη sM2 ως αντιγόνο επικάλυψης. Και στις δύο οδούς εμβολιασμού, pgsA-CTA1-sM2/L. Το casei προκάλεσε σημαντικά αυξημένα επίπεδα IgA του βλεννογόνου του sM2 σε σύγκριση με το pgsA-sM2/L. ομάδες casei και ελέγχου. Ωστόσο, όπως ήταν αναμενόμενο, ανιχνεύθηκαν υψηλότερα επίπεδα τίτλων αντισωμάτων στο σημείο του εμβολιασμού από ότι στο απομακρυσμένο σημείο. Ένα παρόμοιο πρότυπο αποκρίσεων αντισωμάτων παρατηρήθηκε και για τις δύο οδούς ανοσοποίησης, στις οποίες το pgsA-CTA1-sM2/L. Κυριάρχησαν οι ομάδες casei (Εικ. 2C και D). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι το συζευγμένο με υπομονάδα A1 τοξίνης χολέρας sM2 οδήγησε σε σημαντικές βελτιώσεις στα επίπεδα IgG και βλεννογόνου IgA του sM2 σε σύγκριση με το sM2 μόνο ή με μάρτυρες που ανοσοποιήθηκαν με pgsA/L. casei ή PBS. Βλεννογονική ανοσοποίηση με L. casei Επιφανειακή εμφανιζόμενη sM2 και CTA1-sM2 Διεγερμένη για το M2 κυτταρική ανοσοαπόκριση Για να προσδιοριστεί εάν ο εμβολιασμός του βλεννογόνου με το sM2 που εμφανίζεται στην επιφάνεια του L. casei και το συζευγμένο με CTA1 sM2 θα μπορούσε να προκαλέσει κυτταρική ανοσία, πραγματοποιήθηκαν IFN-c και IL-4 ELISPOT. Τα σπληνοκύτταρα από εμβολιασμένους ποντικούς διεγέρθηκαν με 10 mg/ml ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης sM2 ή πεπτιδίου Μ2 και αναπτύχθηκαν τα ELISPOT κυτοκίνης. Οι κηλίδες μετρήθηκαν για να μετρηθούν οι διαφορές στις αποκρίσεις CTL μεταξύ των ομάδων. Κύτταρα από τα ποντίκια που ανοσοποιήθηκαν i.n. με pgsA-CTA1-sM2/L. Το casei έδειξε σημαντικά επίπεδα IFN-c ως απόκριση στη διέγερση με πρωτεΐνη sM2 και πεπτίδιο M2 (Εικ. 3Α). Ομοίως, παρατηρήσαμε ότι ο ι.ν. χορηγήθηκαν ομάδες και για το pgsA-sM2/L. casei και pgsA-CTA1-sM2/L. Το casei έδειξε ανιχνεύσιμα επίπεδα σπληνοκυττάρων που εκκρίνουν IL-4 μετά από διέγερση είτε με πρωτεΐνη sM2 είτε με πεπτίδιο M2 (Εικ. 3Β). Κύτταρα που εκκρίνουν IFN-c και IL-4 παρατηρήθηκαν επίσης σε ποντικούς που ανοσοποιήθηκαν από το στόμα με pgsA-sM2/L. casei και pgsA-CTA1-sM2/L. casei (Εικ. 3C ) αν και τα επίπεδά τους ήταν χαμηλότερα από το i.n. ομάδα και δεν ήταν σημαντικές. Ομάδα ελέγχου ανοσοποιημένη με pgsA/L. Το casei έδειξε επίπεδο κηλίδων υποβάθρου τόσο για τις ενδορινικές όσο και για τις στοματικές ομάδες. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι το εξαιρετικά συντηρημένο sM2 μπορεί να προκαλέσει αποκρίσεις Τ-λεμφοκυττάρων που εκκρίνουν ειδικές για το M2, ενώ η χορήγηση του βλεννογόνου μέσω σύζευξης L. casei και CTA1 με sM2 ενίσχυσε την κυτταρική ανοσία, η οποία μπορεί να συμβάλει στη διεύρυνση της προστατευτικής ανοσίας Το .M2 είναι γνωστό ως πιθανός στόχος για την ανάπτυξη εμβολίου γρίπης ευρέος φάσματος με ελάχιστη μεταβλητότητα [36, 37] . Για να επιβεβαιώσουμε τη μεταβλητότητα των αλληλουχιών sM2 των προσβαλλόμενων ιών που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, συγκρίναμε το sM2 των υποτύπων γρίπης που διατίθενται από το Εθνικό Κέντρο Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας των ΗΠΑ (NCBI) με τη συναινετική μας αλληλουχία sM2, ιδιαίτερα ολόκληρη τη διατηρημένη έκτο και κάποιο τμήμα της κυτταροπλασματικής περιοχής (CD) αν και ολόκληρο το CD συμπεριλήφθηκε στο κατασκεύασμα εμβολίου (Πίνακας 1). Βρήκαμε ότι οι ιοί που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη περιέχουν 0-8 αταίριαστα αμινοξέα μεταξύ των αμινοξέων του sM2 σε σύγκριση με αυτήν τη μελέτη. Για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα του εμβολίου sM2, εβδομάδα μετά την τελική ανοσοποίηση, τα ποντίκια προκλήθηκαν i.n. με το 10 MLD 50 των υποτύπων του ιού της γρίπης A/Aquatic bird/Korea/W81/2005 (H5N2) που ήταν ομόλογο με τη συναινετική αλληλουχία sM2. Ποντικοί ανοσοποιήθηκαν από το στόμα με pgsA-sM2/L. casei και pgsA-CTA1-sM2/L. Το casei έδειξε προστασία 40 και 60% αντίστοιχα. Ομοίως, ο i.n. Οι ομάδες ανοσοποίησης απέδωσαν 40 και 80%, έναντι της θανατηφόρου μόλυνσης με τον εξαιρετικά λοιμογόνο ιό H5N2. Αντίθετα, κανένα από τα μη ανοσοποιημένα ποντίκια δεν επέζησε μετά από θανατηφόρα μόλυνση (Εικ. 4Α και Β, δεξιός πίνακας) . Η νοσηρότητα αυξήθηκε στα ποντίκια που ανοσοποιήθηκαν μέσω της στοματικής οδού, ενώ τα ποντίκια που έλαβαν i.n. ανοσοποίηση με pgsA-CTA1-sM2/L. Το casei έχασε το 20% του αρχικού σωματικού του βάρους και άρχισε να αναρρώνει 9 ημέρες μετά τη μόλυνση (dpi) και είχε αναρρώσει πλήρως την ημέρα 13 (Εικ. 4Α και Β, αριστερό πλαίσιο). Στη συνέχεια αξιολογήσαμε την αποτελεσματικότητα προστασίας του υποψήφιου εμβολίου sM2 έναντι του A/Puerto Rico/8/34(H1N1), το οποίο περιέχει 8 αταίριαστα αμινοξέα σε σχέση με τη συναινετική αλληλουχία sM2. Σετ εμβολιασμένων ποντικών προκλήθηκαν με 10 MLD 50 του ιού Η1Ν1. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4C και D, τα ποντίκια που ανοσοποιήθηκαν από τα ποντίκια The ομαδοποιήθηκαν όπως αναφέρεται στα υλικά και τις μεθόδους και έλαβαν στοματικές ή ρινικές χορηγήσεις, σύμφωνα με το πρόγραμμα. Τα βέλη έδειξαν τις οδούς και περιόδους ανοσοποίησης των pgsA/L. casei, pgsA-sM2/L. casei ή pgsA-CTA1-sM2/L. κύτταρα καζείου. Οι οροί συλλέχθηκαν τις ημέρες 0, 14 και 28. δείγματα από τους πνεύμονες και τα έντερα συλλέχθηκαν την ημέρα 28 μετά την ανοσοποίηση. Μία εβδομάδα μετά την τελική ανοσοποίηση, οι σπλήνες αποκόπηκαν από 3 ποντίκια σε κάθε ομάδα, με ένα σετ για ανάλυση CTL. Δύο ή 24 εβδομάδες μετά την τελευταία ανοσοποίηση, όλα τα ποντίκια προκλήθηκαν με μια θανατηφόρα δόση υποτύπων γρίπης μέσω ενδορινικής οδού και παρακολουθήθηκαν για 13 ημέρες. Τις ημέρες 3 και 5 μετά τη μόλυνση, οι πνεύμονες αφαιρέθηκαν από 3 ποντίκια σε κάθε ομάδα για να προσδιοριστεί ο τίτλος του ιού. Στα 5 dpi, τα ποντίκια από ένα σετ θυσιάστηκαν για ιστοπαθολογία πνεύμονα και ανοσοϊστοχημεία. doi:10.1371/journal.pone.0094051.g001 CTA1-sM2 Επάγει προστατευτική ανοσία σε παθογόνους ιούς γρίπης Α PLOS ONE | Το www.plosone.org i.n οδός εμφάνισε υψηλότερο επίπεδο προστασίας από τις από του στόματος ανοσοποιημένες ομάδες και τα ποντίκια που ανοσοποιήθηκαν με pgsA-CTA1-sM2/L. casei έδειξαν σημαντικά υψηλότερο επίπεδο προστασίας σε σύγκριση με τα ποντίκια που ανοσοποιήθηκαν με pgsA-sM2/L. casei (Εικ. 4C και D, δεξιός πίνακας) . Τα μη ανοσοποιημένα ποντίκια έχασαν έως και το 40% του σωματικού τους βάρους και πέθαναν κατά 9 dpi. Ποντικοί ανοσοποιημένοι με pgsA-CTA1-sM2/L. Το casei έχασε περίπου το 10% του σωματικού τους βάρους, ενώ τα ποντίκια ανοσοποιήθηκαν με pgsA-sM2/L. Το casei έχασε 0,20% του αρχικού σωματικού του βάρους κατά 9 dpi και ανέκαμψε πιο αργά από τα ποντίκια που ανοσοποιήθηκαν με pgsA-CTA1-sM2/L. casei (Εικ. 4C και D, αριστερό πλαίσιο). Ένα άλλο σύνολο εμβολιασμένων ποντικών μολύνθηκε με A/Chicken/ Korea/116/2004(H9N2) για να ελεγχθεί το εύρος της ικανότητας προστασίας των ανοσοαποκρίσεων που προκαλούνται από το εμβόλιο sM2. Η αλληλουχία sM2 του H9N2 περιέχει 2 αταίριαστα σε σχέση με τη συναινετική αλληλουχία sM2. Τα ποντίκια ανοσοποιήθηκαν με pgsA-CTA1-sM2/L. Το casei έδειξε αμελητέες απώλειες σωματικού βάρους και σταδιακή ανάκαμψη σε σύγκριση με εκείνες των ποντικών που ανοσοποιήθηκαν με pgsA-sM2/L. Casei και τα μη ανοσοποιημένα ποντίκια τόσο για την i.n όσο και για την στοματική οδό (Εικ. 4E και F αριστερό πλαίσιο) . Κανένας από τα μη ανοσοποιημένα ποντίκια δεν επέζησε, ενώ το 100% και το 80% των ποντικών που ανοσοποιήθηκαν με pgsA-CTA1-sM2/L. casei μέσω του i.n. και οι στοματικές διαδρομές επέζησαν, αντίστοιχα. Τα ποσοστά επιβίωσης ποντικών που ανοσοποιήθηκαν με pgsA-sM2/L. casei ήταν 80% και 60% για το i.n. και στοματικές οδοί, αντίστοιχα (Εικ. 4E και F, δεξιό πλαίσιο). Αξιολογήθηκε επίσης το εύρος προστασίας του εμβολίου sM2 έναντι των αποκλίνων υποτύπων της γρίπης. Σύνολο ανοσοποιημένων ποντικών προκλήθηκαν με υψηλής παθογονικότητας γρίπη των πτηνών (HPAI) A/EM/Korea/W149/06(H5N1), που περιέχει 2 αναντιστοιχίες αμινοξέων σε σχέση με τη συναινετική αλληλουχία sM2. Ποντικοί ανοσοποιημένοι μέσω του i.n. και στοματικές οδοί με pgsA-CTA1-sM2/L. Το casei έδειξε υψηλότερη αποτελεσματικότητα προστασίας, 80% και 60%, αντίστοιχα, σε σύγκριση με ποντίκια που ανοσοποιήθηκαν με pgsA-sM2/L. casei, για τα οποία τα ποσοστά ήταν 60% και 20%, αντίστοιχα (Εικ. 4G και H, δεξιός πίνακας) . Όσον αφορά τη νοσηρότητα, ποντίκια ανοσοποιήθηκαν με pgsA-CTA1-sM2/L. Το casei έδειξε χαμηλότερη νοσηρότητα από τα ποντίκια που ανοσοποιήθηκαν με pgsA-sM2/L. casei (Εικ. 4G και H, αριστερό πλαίσιο) . Ένα ακόμη σύνολο εμβολιασμένων ποντικών προκλήθηκε με τον ιό A/Aquatic bird/ Korea/W44/2005 (H7N3), ο οποίος περιέχει 1 αναντιστοιχία σε σχέση με τη συναινετική αλληλουχία sM2 και το σωματικό βάρος και η επιβίωση παρατηρήθηκαν για 13 dpi. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4Ι και J, τα μη ανοσοποιημένα ποντίκια έχασαν έως και 30% του σωματικού τους βάρους από τα ποντίκια που ανοσοποιήθηκαν με pgsA-sM2/L. casei και pgsA-CTA1-sM2/L. casei (Εικ. 4I και J, αριστερό πλαίσιο) . Ποντικοί ανοσοποιημένοι με pgsA-CTA1-sM2/L. Το casei μέσω της οδού i.n έδειξε σημαντικά υψηλότερο επίπεδο προστασίας έναντι του ιού της γρίπης H7N3 από τις άλλες ομάδες (Εικ. 4I και J, δεξιός πίνακας) . Συνολικά, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι i.n. ανοσοποίηση με pgsA-CTA1-sM2/L. Το casei προκάλεσε ανοσοαποκρίσεις που παρείχαν σημαντικά επίπεδα προστασίας έναντι διαφορετικών υποτύπων ιών γρίπης που περιείχαν αταίριαστα αμινοξέα που κυμαίνονταν από 0 έως 8 της συναινετικής sM2, ανεξάρτητα από το αν ήταν πλήρης ή μερική. Οι τίτλοι του ιού στους πνεύμονες των προσβεβλημένων ποντικών μετρήθηκαν σε υπολογίστε την αναπαραγωγή στα 3 και 5 dpi. Τα ποντίκια ανοσοποιήθηκαν μέσω i.n και στοματικών οδών με pgsA-sM2/L. casei και pgsA-CTA1-sM2/ L. casei και προκλήθηκαν με τους υποτύπους γρίπης H5N2, H1N1, H9N2, H5N1 ή H7N3. Στα 3 και 5 dpi, 3 ποντίκια θυσιάστηκαν τυχαία από κάθε ομάδα και οι τίτλοι του ιού του πνεύμονα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο TCID 50. Ποντικοί ανοσοποιημένοι με pgsA-CTA1-sM2/L. Το casei είχε χαμηλότερους τίτλους στα 3 dpi και είχε σημαντικά μειωμένη ιική αντιγραφή στα 5 dpi σε σύγκριση με ποντίκια που ανοσοποιήθηκαν με pgsA-sM2/L. casei ή τις ομάδες ελέγχου ταυτόχρονα (Εικ. 5A-J). Μειωμένοι ιικοί τίτλοι στους πνεύμονες παρατηρήθηκαν σε ομάδες ποντικών που ανοσοποιήθηκαν μέσω της οδού i.n σε σχέση με τα ποντίκια που ανοσοποιήθηκαν μέσω της στοματικής οδού, ιδιαίτερα την ημέρα 3 μετά τις μολύνσεις (Εικ. 5) . Αυτοί οι μειωμένοι τίτλοι μπορεί να οφείλονται στο ότι οι οδοί εμβολιασμού και πρόκλησης είναι οι ίδιες και οι τίτλοι συσχετίζονται με τα αποτελέσματα επιβίωσης για θανατηφόρες λοιμώξεις με H5N2, H1N1, H9N2, H5N1 και H7N3. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η συναινετική πρωτεΐνη sM2 συντηγμένη με CTA1 παρείχε καλύτερη προστασία από την sM2 και η οδός i.n ήταν πιο ισχυρή από την στοματική οδό ανοσοποίησης σε σχέση με την προστασία έναντι μιας θανατηφόρας πρόκλησης αποκλίνων υποτύπων γρίπης. Η ιστοπαθολογία και η ανοσοϊστοχημεία ήταν πραγματοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει τα ευρήματα του τίτλου του ιού του πνεύμονα. Στα 5 dpi, οι πνεύμονες συλλέχθηκαν τυχαία από κάθε ομάδα του ενός σετ, σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με ηωσίνη προτού εξεταστούν σε μικροσκόπιο φωτός. Όπως φαίνεται στο σχήμα 5Κ, σαφείς ενδείξεις βαθιάς πνευμονικής φλεγμονής παρατηρήθηκαν στους πνεύμονες ποντικών που έλαβαν PBS ή pgsA/L. casei τόσο για την από του στόματος όσο και για i.n οδό χορήγησης, ενώ οι πνεύμονες των ποντικών που ανοσοποιήθηκαν με pgsA-CTA1-sM2/L. Το casei δεν έδειξε αξιοσημείωτη πνευμονική φλεγμονή σε σύγκριση με το pgsA-sM2/L. ποντίκια που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με καζεΐνη (Εικ. 5K, μεσαίο και αριστερό πλαίσιο). Για την ανοσοϊστοχημεία, χρησιμοποιήθηκε μέθοδος ανοσοϋπεροξειδάσης με αντίσωμα που στρέφεται κατά της πρωτεΐνης-2 του ιού της γρίπης Α για την ανίχνευση κυττάρων μολυσμένων με ιό στους αντίστοιχους ιστούς. Το αντιγόνο του ιού στα επιθηλιακά κύτταρα εμφανίζεται ως καφέ χρωματισμός του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος. Όπως φαίνεται στο σχήμα 5Κ, στις 5 ημέρες p.i., ανιχνεύθηκαν πολυάριθμα μολυσμένα από ιούς κύτταρα στον έλεγχο ή στο pgsA-sM2/L. ποντίκια που εμβολιάστηκαν με casei, ενώ στα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με pgsA-CTA1-sM2/L βρέθηκε πολύ μειωμένος αριθμός θετικών αντιγόνων κυττάρων. casei, τόσο σε i.n. και από του στόματος ανοσοποιημένη ομάδα (Εικ. 5K δεξιός πίνακας). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ποντίκια ανοσοποιήθηκαν με pgsA-CTA1-sM2/L. Το casei ανέπτυξε ανοσοαποκρίσεις που είναι αρκετά ισχυρές ώστε να αναστέλλουν την αναπαραγωγή του ιού, γεγονός που προάγει την επιβίωση των ποντικών μετά από μια θανατηφόρα μόλυνση από τη γρίπη A. The PgsA-CTA1-sM2/L. casei Προκαλούμενη από εμβολιασμό Μακροχρόνια Διασταυρούμενη Προστασία Η διάρκεια της προστασίας είναι ένα σημαντικό κριτήριο για ένα πιθανό εμβόλιο. Έτσι, η μακροζωία της ανοσίας που προκαλείται από το sM2 και το συζευγμένο με CTA1 sM2 διερευνήθηκε ανιχνεύοντας IgG ορού και IgA του βλεννογόνου με ELISA. Σημαντικά αυξημένα επίπεδα της ειδικής για το sM2 IgG ορού καθώς και της IgA του πνεύμονα και του εντέρου παρατηρήθηκαν 180 ημέρες μετά τον εμβολιασμό (Εικ. 6Α και Γ) σε σύγκριση με PBS και pgsA/L. ομάδες casei. Τα ποντίκια προκλήθηκαν με A/Aquatic bird/Korea/W81/2005(H5N2) και οι αλλαγές σωματικού βάρους και η επιβίωση παρακολουθήθηκαν μέχρι τα 13 dpi. Τα μη ανοσοποιημένα ποντίκια εμφάνισαν 0,30% απώλεια σωματικού βάρους (Εικ. 6Β και Δ αριστερό πλαίσιο) και πέθανε την 9η ημέρα μετά τη μόλυνση τόσο στο στοματικό όσο και στο i.n. ομάδες. Αντίθετα, τα ποντίκια ανοσοποιήθηκαν με pgsA-CTA1-sM2/L. Το casei έδειξε αμελητέα απώλεια σωματικού βάρους, η οποία ανακτήθηκε κατά 13 dpi. Το 80% επέζησε στον ι.ν. ανοσοποιημένη ομάδα (Εικ. 6Β δεξιός πίνακας) και το 60% επέζησε στην από του στόματος ανοσοποιημένη ομάδα (Εικ. 6D δεξιός πίνακας). Αυτό το αποτέλεσμα υποδεικνύει ότι το εμβόλιο βλεννογόνου sM2 συζευγμένο με CTA1 προσέφερε προστασία από μια θανατηφόρα λοίμωξη 6 μήνες μετά την τελική ανοσοποίηση. Το ανοσοποιητικό σύστημα του βλεννογόνου είναι ο πρώτος ανοσολογικός φραγμός ενάντια στα παθογόνα που εισβάλλουν στο σώμα μέσω της επιφάνειας του βλεννογόνου. Έτσι, η επαγωγή της ανοσίας του βλεννογόνου είναι απαραίτητη για να εξασφαλιστεί η προστασία έναντι πολλαπλών υποτύπων του ιού της γρίπης Α. Ένας αναπνευστικός ιός, η γρίπη Α είναι υπεύθυνη για ετήσιες εποχικές επιδημίες παγκοσμίως και, περιστασιακά, πανδημίες, οι οποίες προκαλούνται από αναδυόμενους νέους υποτύπους/στελέχη που προέρχονται από ανακατανομή με ιούς πτηνών ή χοίρων. Τα τρέχοντα εμβόλια γρίπης παρέχουν μόνο ειδική προστασία για το στέλεχος. Επομένως, είναι ζωτικής σημασίας η δημιουργία ενός ευρέως διασταυρούμενου προστατευτικού εμβολίου κατά της γρίπης. Τα αντιγόνα που είναι καλά διατηρημένα μεταξύ των ιών της γρίπης Α θεωρούνται πολλά υποσχόμενοι στόχοι για την πρόκληση διασταυρούμενης προστασίας έναντι αυτών των διαφορετικών υποτύπων. Ωστόσο, ο στόχος πρέπει να είναι η ανάπτυξη μιας πρώτης γραμμής άμυνας με την αποτελεσματική εξάλειψη των παθογόνων στην επιφάνεια του βλεννογόνου. Η πρωτεΐνη-2 (M2) της μήτρας γρίπης διατηρείται σχετικά καλά μεταξύ των υποτύπων της γρίπης και μπορεί να θεωρηθεί ένα πολλά υποσχόμενο αντιγόνο εμβολίου γρίπης [30] . Αποτελείται από τις ακόλουθες τρεις δομικές περιοχές: μια εξωκυτταρική περιοχή 24-αμινοξέων, μια διαμεμβρανική περιοχή 19-αμινοξέων και μια περιοχή κυτταροπλασματικής ουράς 54-αμινοξέων [39, 40]. Οι εξωκυτταρικές και κυτταροπλασματικές περιοχές, οι οποίες είναι καλά διατηρημένες μεταξύ των ιών της γρίπης και παίζουν σημαντικό ρόλο στη συναρμολόγηση και τη μορφογένεση του ιού, χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Εδώ, αναπτύξαμε τη συναίνεση sM2 που προέρχεται από την ανάλυση αλληλουχιών των υποτύπων H5N1, H1N1 και H9N2 στη βάση δεδομένων. Λαμβάνοντας υπόψη τα προηγούμενα ευρήματα ότι ο εξωκυττάριος τομέας ιδιαίτερα (aa, 1-13) είναι ιδιαίτερα διατηρημένος μεταξύ των υποτύπων του ιού της γρίπης και αναγνωρίζεται ως επίτοπος για την επαγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων, τα οποία θα μπορούσαν να προστατεύσουν τη μόλυνση από τον ιό της γρίπης [56] , η ραχοκοκαλιά αλληλουχία sM2 από το H5N1 χρησιμοποιήθηκαν ιοί. Για την πιθανή ομολογία μεταξύ άλλων υποτύπων αλλάξαμε στη θέση 14 (E-G) και 18 (R-K) και διατηρήσαμε αμετάβλητο το διατηρημένο επίτοπο (aa, 1-13). Όπως φαίνεται στην ευθυγράμμιση αλληλουχίας, το sM2 της συναινετικής αλληλουχίας έχει 0-8 αναντιστοιχίες μεταξύ των υποτύπων που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη (Πίνακας 1). Επιπλέον, η ενσωμάτωση ενός ανοσοενισχυτικού θεωρείται απαραίτητη για την ενίσχυση της αλληλεπίδρασης του εμβολίου με το ανοσοποιητικό σύστημα του βλεννογόνου. 41] . Διάφορα ανοσοενισχυτικά, όπως λιποσώματα, νανοσωματίδια και ανοσοδιεγερτικά σύμπλοκα (ISCOMs), έχουν μελετηθεί και βρέθηκε ότι βελτιώνουν την ανοσολογική απόκριση [42], αλλά η αποτελεσματικότητά τους δεν ήταν βέλτιστη. Παρά το δυναμικό της ως ανοσοενισχυτικό του βλεννογόνου [43] , η χρήση της τοξίνης χολέρας (CT) στα εμβόλια περιορίζεται από την έμφυτη τοξικότητά της. Έτσι, η τοξικότητα της CT θα πρέπει να διαχωριστεί από την επικουρικότητά της πριν χρησιμοποιηθεί ως ανοσοενισχυτικό εμβολίου. Μελέτες έχουν δείξει ότι οι κατασκευές που αποτελούνται από M2e συντηγμένο με την υπομονάδα A1 της τοξίνης χολέρας μαζί με έναν ισχυρό παράγοντα ADPριβοσυλίωσης και ένα διμερές του θραύσματος D του εμβολίου πρωτεΐνης Α Staphylococcus aureus προκάλεσαν πλήρη προστασία και μειωμένη νοσηρότητα [6, 44]. Το CTA1 διατηρεί την επικουρική λειτουργία του CT χωρίς τις τοξικές παρενέργειές του, όπως η αντιδραστικότητα στο σημείο της χορήγησής του και η δέσμευση ή η συσσώρευση στους νευρικούς ιστούς [45] . Με βάση προηγούμενα ευρήματα, έχει υποτεθεί ότι το συναινετικό θραύσμα sM2, όταν συντήκεται με το ισχυρό ανοσοενισχυτικό του βλεννογόνου CTA1, μπορεί να προκαλέσει ευρεία προστατευτική ανοσία έναντι διαφορετικών υποτύπων του ιού της γρίπης. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ολόκληρη την πρωτεΐνη CTA1 των 22 kDa (μια ριβοσυλτρανσφεράση ADP), η οποία αποτελείται από τρεις διακριτούς υποτομείς: CTA11 (υπολείμματα 1 έως 132), CTA12 (υπολείμματα 133 έως 161) και CTA13 (υπολείμματα 162 έως 192) . Έχει αναφερθεί ότι το CTA1 χωρίς CTB έχει ισχυρές επικουρικές δράσεις χωρίς καμία τοξικότητα. Το CTA1 ενισχύει τις αποκρίσεις των αντισωμάτων IgA και IgG, καθώς και τη δραστηριότητα CTL [47] . Για την ανάπτυξη ενός καθολικού εμβολίου γρίπης του βλεννογόνου με διατηρημένο πεπτίδιο sM2 και ισχυρό ανοσοενισχυτικό CTA1, ανασυνδυασμένο L. casei που εμφανίζει sM2 συντηγμένο με ή χωρίς CTA1 τον πνεύμονα τα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με pgsA-CTA1-sM2/L. Το casei έδειξε καθαρές κυψελίδες χωρίς διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων, σε αντίθεση με τους πνεύμονες ποντικών που εμβολιάστηκαν με pgsA-sM2/L. ποντίκια casei ή ελέγχου, τα οποία και τα δύο αποκάλυψαν χαρακτηριστικά σοβαρής πνευμονίτιδας (μεσαίο και αριστερό πλαίσιο). Μειωμένος αριθμός ιικού αντιγόνου ανιχνεύθηκε στους πνεύμονες των ποντικών που εμβολιάστηκαν με pgsA-CTA1-sM2/L. casei, σε αντίθεση με τους πνεύμονες ποντικών που εμβολιάστηκαν με pgsA-sM2/L. casei ή ελέγχου αποκάλυψε χαρακτηριστικά σοβαρής πνευμονίτιδας με αύξηση του αντιγόνου του ιού (δεξιό πλαίσιο). Οι μικρογραφίες είναι αντιπροσωπευτικές για κάθε ομάδα θεραπείας σε μεγέθυνση 200Χ. Το αντιγόνο του ιού στα επιθηλιακά κύτταρα εμφανίζεται ως καφέ χρωματισμός του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος. Στους τίτλους πνευμόνων, οι ράβδοι δηλώνουν το μέσο 6 S.D. Ο αστερίσκος υποδεικνύει μια σημαντική διαφορά μεταξύ pgsA-CTA1-sM2/L. casei και άλλες ομάδες (*P,0,05). Τα doi:10.1371/journal.pone.0094051.g005 κατασκευάστηκαν για χορήγηση στον βλεννογόνο από το ευρέως χρησιμοποιούμενο όχημα ζωντανού εμβολίου LAB [38] . Το γονίδιο pgsA που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη είναι μια άγκυρα για εμφάνιση στην επιφάνεια του LAB που προέρχεται από το σύμπλοκο ενζύμου pgsBCA του Bacillus subtilis και αποτελείται από διαμεμβρανική περιοχή κοντά στο Ν-άκρο του με την περιοχή που βρίσκεται στο εξωτερικό της κυτταρικής μεμβράνης. Έτσι, το pgsA είναι σε θέση να διασχίσει το κυτταρικό τοίχωμα και να εμφανίσει την ετερόλογη πρωτεΐνη συντηγμένη στο C-άκρο του [17] . Τα εμβόλια που αναπτύχθηκαν δοκιμάστηκαν μέσω δύο μεγάλων οδών. Βρήκαμε ότι ο εμβολιασμός με pgsA-CTA1-sM2/L. Το casei μπόρεσε να προκαλέσει σημαντικά υψηλότερο επίπεδο IgG ορού ειδικής για sM2 (Εικ. 2Α και Β) και IgA του βλεννογόνου (Εικ. 2C και D) σε σύγκριση με το pgsA-sM2/L. casei, και παρέχει προστασία έναντι των αποκλίνων υποτύπων γρίπης τόσο της φυλογενετικής ομάδας 1 (H1, H5, H9) όσο και της ομάδας 2 (H7) [46] (Εικ. 4) . Αυτή η μελέτη αποκάλυψε επίσης ότι ο i.n. Η χορήγηση ήταν ανώτερη από την από του στόματος οδό εμβολιασμού, κάτι που είναι σύμφωνο με άλλες παρατηρήσεις [48] . Μπορεί να υπάρχουν δύο πιθανοί λόγοι για να εξηγηθεί αυτό το φαινόμενο. Πρώτον, η οδός πρόκλησης είναι η ίδια με αυτή του εμβολιασμού. Η ειδική IgA του βλεννογόνου μπορεί να αποτρέψει τον αποικισμό του ιού στην αναπνευστική οδό. Δεύτερον, ο όγκος του εμβολιασμού ήταν 5 φορές μικρότερος από αυτόν για τον εμβολιασμό από το στόμα, γεγονός που μπορεί να επέτρεψε τη συμπυκνωμένη μορφή του αντιγόνου να παρουσιαστεί στα κύτταρα του ανοσοποιητικού. Επειδή ανιχνεύθηκαν μεγαλύτερα επίπεδα IgG ορού και IgA του βλεννογόνου σε ενδορινικά ανοσοποιημένα ποντίκια από ό,τι σε αυτά που ανοσοποιήθηκαν από το στόμα (Εικ. 2), μια εναλλακτική εξήγηση θα μπορούσε να είναι ότι τα αντιγόνα υποβάλλονται σε επεξεργασία και/ή παρουσιάζονται διαφορετικά στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος στα δύο διαμερίσματα του βλεννογόνου. Είναι σημαντικό ότι η μελέτη μας έδειξε για πρώτη φορά ότι η ανοσοποίηση του βλεννογόνου με το υποψήφιο εμβόλιο sM2 συζευγμένο με CTA1 που εμφανίζεται στην επιφάνεια LAB προκάλεσε ευρεία προστασία έναντι πρόκλησης με αποκλίνοντες υποτύπους γρίπης. Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο τα Abs έναντι του sM2 μεσολάβησαν σε αυτήν την ευρεία προστασία είναι δεν είναι πλήρως κατανοητό. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα Abs στο Ν-άκρο του M2e, ιδιαίτερα οι θέσεις 1-10, ανέστειλαν την αναπαραγωγή του ιού της γρίπης Α [49, 50] . Άλλες μελέτες αποκάλυψαν ότι η κυτταροτοξικότητα ή η φαγοκυττάρωση που προκαλείται από αντι-M2e IgG μπορεί να προκαλέσει την απομάκρυνση μολυσμένων κυττάρων πριν από την εκβλάστηση και εξάπλωση του ιού των απογόνων [54, 55], γεγονός που υποστηρίζει τα ευρήματά μας για τον τίτλο του ιού του πνεύμονα και τα δεδομένα ανοσοϊστοχημείας που ανιχνεύθηκαν στα 5 dpi πειράματα πρόκλησης. Επομένως, σε αυτή τη μελέτη, ο συνδυασμός αυτών των αποκρίσεων και των Abs στο Ν-άκρο της αλληλουχίας sM2 που διατηρείται μεταξύ των ιών πρόκλησης (Πίνακας 1) μπορεί να προστατεύσει τους αποκλίνοντες υποτύπους γρίπης μετά την ανοσοποίηση του βλεννογόνου με το ανασυνδυασμένο LAB CTA1-συζευγμένο sM2- με βάση υποψήφιο εμβόλιο. Επιπλέον, η κυτταρική ανοσολογική απόκριση παίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της ιικής αντιγραφής. Εξετάσαμε τις αποκρίσεις κυτοκίνης τύπου Th1 (IFN-c) και Th2-τύπου (IL-4) με τον προσδιορισμό ELISPOT. Σημαντικά υψηλότερα επίπεδα IFN-c ανιχνεύθηκαν ως απόκριση στη διέγερση τόσο με την πρωτεΐνη sM2 όσο και με το πεπτίδιο Μ2 σε ποντικούς ανοσοποιημένους με pgsA-CTA1-sM2/L. casei σε σύγκριση με τα επίπεδα σε ποντίκια στο pgsA-sM2/L. ομάδες casei και ελέγχου (Εικ. 3Α και Γ). Παρομοίως, σημαντικά υψηλά επίπεδα IL-4 παρατηρήθηκαν σε ποντίκια ανοσοποιημένα με pgsA-CTA1-sM2/L. casei κατά τη διέγερση με την πρωτεΐνη sM2 και το πεπτίδιο M2 (Εικ. 3Β και Δ) . Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν περαιτέρω τα ευρήματα ότι τα αντισώματα και η κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από κύτταρα ήταν ειδικά για το αντιγόνο Μ2 και ότι οι αντι-ιικές τους δράσεις προκλήθηκαν από το μονομερές Μ2, τρία αντίγραφα του Μ2 συγχωνευμένα με ASP-1 [34, 51, 52]. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το sM2 ενισχυμένο με συντηγμένο CTA1 προκάλεσε ανοσοαποκρίσεις σε ποντίκια, οι οποίες τους προστάτευαν από αποκλίνοντες υποτύπους γρίπης. Από αυτή την άποψη, τα αποτελέσματά μας έχουν σημασία για τη χρήση του CTA1, το οποίο έχει επικουρική λειτουργία, σε υποψήφιους εμβολιασμούς. Καθώς η κλινική προστασία δεν είναι η μόνη παράμετρος με την οποία αξιολογείται η απόδοση του εμβολίου, αξιολογήσαμε την ανοσογονικότητα του ανασυνδυασμένου εμβολίου LAB με βάση άλλων παραμέτρων, όπως η μείωση των παθολογικών βλαβών και η αποβολή του ιού. Σε αυτή τη μελέτη, χαμηλοί τίτλοι του ιού πρόκλησης τιτλοδοτήθηκαν από τους πνεύμονες μετά τον εμβολιασμό με pgsA-CTA1-sM2/L. casei, ενώ ο ιός πρόκλησης θα μπορούσε να ανιχνευθεί σε υψηλότερους τίτλους στα εικονικά ποντίκια και σε αυτούς που εμβολιάστηκαν με pgsA-sM2/L. casei (Εικ. 5A-J). Οι μειωμένες αδρές ​​και ιστοπαθολογικές βλάβες που συνάδουν με ιογενή λοίμωξη είναι οι κύριες παράμετροι ενδεικτικές της αποτελεσματικότητας του αντιγριπικού εμβολίου. Εδώ, δείξαμε ότι ο εμβολιασμός με pgsA-CTA1-sM2/L. Casei περιόρισε αξιοσημείωτα τη σοβαρότητα της βλάβης αναστέλλοντας τον ιικό αναδιπλασιασμό και τη συσσώρευση φλεγμονωδών κυττάρων και αντιγόνου ιού στους κυψελιδικούς ιστούς του πνεύμονα, σε σχέση με τη σοβαρότητα στα μη ανοσοποιημένα ποντίκια και τα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με pgsA-sM2/L. casei (Εικ. 5K). Η μελέτη μας έδειξε περαιτέρω, για πρώτη φορά, ότι το ανασυνδυασμένο L. casei που εκφράζει το CTA1-sM2 προκάλεσε μακροχρόνια ανοσία και προσέφερε προστασία από θανατηφόρες λοιμώξεις από τη γρίπη, ακόμη και 6 μήνες μετά τον τελικό εμβολιασμό (Εικ. 6), το οποίο είναι σημαντικό για κάθε επιτυχημένο εμβόλιο. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε προηγούμενες μελέτες, στις οποίες το M2 VLP παρείχε μακροχρόνια ανοσία και διασταυρούμενη προστασία και τα αντισώματα στους ορούς και τους βλεννογόνους ήταν μακρόβιοι [53, 54]. Συμπερασματικά, τα ευρήματά μας αποκάλυψαν ότι η βλεννογονική ανοσοποίηση ποντικών με ανασυνδυασμένο Το L. casei που εκφράζει το συζευγμένο CTA1 sM2 μπορεί να προκαλέσει συστημικές και τοπικές, καθώς και κυτταρομεσολαβούμενες, ανοσοαποκρίσεις έναντι αποκλίνων υποτύπων του ιού της γρίπης. Έτσι, το ανασυνδυασμένο εμβόλιο L. casei που εκφράζει CTA1 συζευγμένο εμβόλιο βλεννογόνου sM2 μπορεί να είναι ένα πολλά υποσχόμενο εμβόλιο για ετοιμότητα πανδημίας γρίπης.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 1652, "text": "pgsA-sM2/L. casei" } ], "id": 5182, "question": "Ποιο στέλεχος Lactobacililus casei δεν έχει την υπομονάδα της τοξίνης της χολέρας A1 (CTA1) στην επιφάνεια;" }, { "answers": [ { "answer_start": 25719, "text": "εμβολιασμός" } ], "id": 5183, "question": "Ποια είναι η πιο αποτελεσματική θεραπεία κατά της γρίπης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2786, "text": "75%" } ], "id": 5184, "question": "Ποια είναι η ποσοστιαία μείωση των αντισωμάτων της γρίπης μετά από 8 μήνες μετά τον εμβολιασμό με το αδρανοποιημένο εμβόλιο;" }, { "answers": [ { "answer_start": 40988, "text": "λιποσώματα, νανοσωματίδια και ανοσοδιεγερτικά σύμπλοκα (ISCOMs)" } ], "id": 5190, "question": "Ονομάστε μερικά ανοσοενισχυτικά που έχουν χρησιμοποιηθεί με εμβόλιο γρίπης." } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο Coronavirus Viroporin 3a Ενεργοποιεί το NLRP3 Inflammasome Moriyama, Miyu; Chang, Ming-Fu; Ichinohe, Takeshi Ημερομηνία: 2019-01-29DOI: 10.3389/fmicb.2019.00050 Άδεια χρήσης: cc-byAbstract: Οικογένεια υποδοχέων τύπου Nod, 3 που περιέχει περιοχή πυρίνης (NLRP3) ρυθμίζει την έκκριση της προφλεγμονώδους κυτταρίτιδας β1 και της IL IL-18. Δείξαμε προηγουμένως ότι οι πρωτεΐνες 2Β του ιού της γρίπης M2 ή του ιού της εγκεφαλομυοκαρδίτιδας (EMCV) διεγείρουν την έκκριση IL-1β μετά την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3. Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο ο κορονοϊός του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου (SARS-CoV) ενεργοποιεί το φλεγμονώδες NLRP3 παραμένει άγνωστος. Εδώ, παρέχουμε άμεσες αποδείξεις ότι η πρωτεΐνη SARS-CoV 3a ενεργοποιεί το φλεγμονώδες NLRP3 σε μακροφάγα που έχουν εκκινήσει με λιποπολυσακχαρίτες. Το SARS-CoV 3a ήταν αρκετό για να προκαλέσει την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3. Η δραστικότητα του διαύλου ιόντων της πρωτεΐνης 3a ήταν απαραίτητη για την έκκριση IL-1β με τη μεσολάβηση 3a. Ενώ κύτταρα μη μολυσμένα ή μολυσμένα με φακοϊό που εκφράζει μια πρωτεΐνη 3a με ελαττωματική δραστηριότητα διαύλου ιόντων εξέφραζε το NLRP3 ομοιόμορφα σε όλο το κυτταρόπλασμα, το NLRP3 ανακατανεμήθηκε στον περιπυρηνικό χώρο σε κύτταρα μολυσμένα με φακοϊό που εκφράζει την πρωτεΐνη 3a. Η εκροή K(+) και τα μιτοχονδριακά αντιδραστικά είδη οξυγόνου ήταν σημαντικά για την επαγόμενη από τον SARS-CoV 3a ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3. Αυτά τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν τη σημασία των βιροπορινών, ιικών πρωτεϊνών που σχηματίζουν διαμεμβρανικούς πόρους, στην επαγόμενη από τον ιό ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3. Κείμενο: Ο κορωνοϊός με σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο (SARS-CoV), μέλος του γένους Betacoronavirus στην οικογένεια Coronaviridae, είναι ένα περίβλημα ιός με μονόκλωνο γονιδίωμα θετικής αίσθησης RNA μήκους περίπου 30 kb. Τα 5 δύο τρίτα του γονιδιώματος κωδικοποιούν μεγάλους πρόδρομους πολυπρωτεϊνών, ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) 1 και ORF1b, τα οποία διασπώνται πρωτεολυτικά για να δημιουργήσουν 16 μη δομικές πρωτεΐνες (Tan et al., 2005). Το 3 ένα τρίτο του γονιδιώματος κωδικοποιεί τέσσερις δομικές πρωτεΐνες, την ακίδα (S), τον φάκελο (E), τη μήτρα (M) και το νουκλεοκαψίδιο (N) και μη δομικές πρωτεΐνες, μαζί με ένα σύνολο βοηθητικών πρωτεϊνών (3a, 3b , 6, 7a, 7b, 8a, 8b και 9b) (Perlman και Dandekar, 2005; Tan et al., 2005). Ο SARS-CoV είναι ο αιτιολογικός παράγοντας του SARS (Drosten et al., 2003; Fouchier et al., 2003; Ksiazek et al., 2003; Kuiken et al., 2003; Peiris et al., 2003). Τουλάχιστον 8.098 εργαστηριακά επιβεβαιωμένες περιπτώσεις ανθρώπινης μόλυνσης, με ποσοστό θνησιμότητας 9,6%, αναφέρθηκαν στον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας από τον Νοέμβριο του 2002 έως τον Ιούλιο του 2003. Υψηλά επίπεδα προφλεγμονωδών κυτοκινών, συμπεριλαμβανομένου του παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF)-α, της ιντερλευκίνης (IL)-1β και της IL-6, ανιχνεύθηκαν σε ιστούς αυτοψίας από ασθενείς με SARS (He et al., 2006). Παρόλο που η απορρύθμιση των φλεγμονωδών κυτοκινών μπορεί να εμπλέκεται στον τραυματισμό του πνεύμονα και στην παθογένεση του SARS-CoV, οι υποκείμενοι μοριακοί μηχανισμοί δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Το έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα χρησιμοποιεί υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων (PRRs) για την ανίχνευση μοριακών μοτίβων που σχετίζονται με το παθογόνο (Medzhitov, 20 ; Kawai και Akira, 2010). Η αναγνώριση της λοίμωξης από τον ιό παίζει σημαντικό ρόλο στον περιορισμό της αναπαραγωγής του ιού στα αρχικά στάδια της μόλυνσης. Η οικογένεια υποδοχέων που μοιάζει με νεύμα, η περιοχή πυρίνης που περιέχει 3 (NLRP3) ενεργοποιείται από μια μεγάλη ποικιλία ερεθισμάτων, συμπεριλαμβανομένης της μόλυνσης από ιούς (Bauernfeind et al., 2011). Μέχρι στιγμής έχουν προταθεί τέσσερα μοντέλα που περιγράφουν την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 (Hornung and Latz, 2010; Schroder et al., 2010; Tschopp και Schroder, 2010). Πρώτον, οι διαταραχές στις ενδοκυτταρικές ιοντικές συγκεντρώσεις, συμπεριλαμβανομένης της εκροής K + και της εισροής Ca 2+, παίζουν σημαντικό ρόλο (Fernandes-Alnemri et al., 2007; Petrilli et al., 2007; Arlehamn et al., 2010; Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Murakami et al., 2012; Munoz-Planillo et al., 2013). Δεύτερον, η καθεψίνη Β και L, που είναι ειδικές λυσοσωμικές πρωτεάσες κυστεΐνης, φαίνεται ότι παίζουν ρόλο μετά τη φαγοκυττάρωση των κρυστάλλων χοληστερόλης (Duewell et al., 2010), το ινιδικό πεπτίδιο αμυλοειδές-βήτα, τους κρυστάλλους πυριτίου και τα άλατα αργιλίου. Τρίτον είναι η απελευθέρωση δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) ή μιτοχονδριακού DNA από κατεστραμμένα μιτοχόνδρια (Zhou et al., , 2011 Nakahira et al., 2011; Shimada et al., 2012). Τέλος, προϊόντα διάσπασης ιικού RNA ή RNA που παράγονται από RNase L ενεργοποιούν το φλεγμονώδες NLRP3 μέσω της ελικάσης DExD/H-box, DHX33 (Allen et al., 2009; Mitoma et al., 2013; Chen et al., 2014; Chakrabarti et al., 2015). Κατά την ενεργοποίηση, το NLRP3 στρατολογείται στα μιτοχόνδρια μέσω συσχέτισης με μιτοχονδριακή αντιική σηματοδότηση (MAVS) ή μιτοφουσίνη 2 που εκφράζεται στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη Subramanian et al., 2013). Αυτά τα μόρια στη συνέχεια στρατολογούν την πρωτεΐνη τύπου speck που σχετίζεται με την απόπτωση που περιέχει έναν τομέα πρόσληψης κασπάσης (ASC) και προ-κασπάση-1 για να σχηματίσουν το φλεγμονώδες NLRP3. Αυτό το συμβάν ενεργοποιεί το κατάντη μόριο, την κασπάση-1, η οποία καταλύει την πρωτεολυτική επεξεργασία των pro-IL-1β και pro-IL-18 στις ενεργές τους μορφές και διεγείρει την έκκρισή τους (Kayagaki et al., 2015; Shi et al., 2015). Είναι ολοένα και πιο προφανές ότι το NLRP3 ανιχνεύει ιούς RNA ανιχνεύοντας την κυτταρική βλάβη ή δυσφορία που προκαλείται από τις βιροπορίνες (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Τριανταφίλου κ.ά., 2013; Nieto-Torres et al., 2015), πρωτεΐνες που σχηματίζουν διαμεμβρανικούς πόρους, που κωδικοποιούνται από ορισμένους ιούς RNA. Αυτές οι πρωτεΐνες μεταβάλλουν τη διαπερατότητα της μεμβράνης στα ιόντα σχηματίζοντας διαύλους μεμβράνης (Tan et al., 2005; Chen και Ichinohe, 2015). Μια πρόσφατη μελέτη δείχνει ότι η πρωτεΐνη SARS-CoV E, η οποία περιλαμβάνει μόνο 76 αμινοξέα, σχηματίζει διαπερατούς από Ca 2+ διαύλους ιόντων και ενεργοποιεί το φλεγμονώδες NLRP3 (Nieto-Torres et al., 2015). Αν και οι πρωτεΐνες E και 3a του SARS-CoV, οι οποίες περιλαμβάνουν 274 αμινοξέα και περιέχουν τρεις διαμεμβρανικούς τομείς (Zeng et al., 2004; Οι Lu et al., 2006), πιστεύεται ότι δρουν ως κανάλια Na + /K + και K +, αντίστοιχα (Wilson et al., 2004; Lu et al., 2006; Torres et al., 2007; Parthasarathy et al., 2008; Pervushin et al., 2009; Wang et al., 2011), ο ρόλος της πρωτεΐνης 3a στην ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 παραμένει άγνωστος. Εδώ, εξετάσαμε τον ρόλο της πρωτεΐνης 3a στην ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3. Θηλυκά ποντίκια C57BL/6 ηλικίας έξι εβδομάδων αγοράστηκαν από το The Jackson Laboratory. Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από τις Επιτροπές Ζώων του Ινστιτούτου Ιατρικής Επιστήμης (The University of Tokyo). Μακροφάγα που προέρχονται από μυελό των οστών (BMMs) παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Ichinohe et al., 2009). Εν συντομία, ο μυελός των οστών ελήφθη από την κνήμη και το μηριαίο οστό με έκπλυση με το τροποποιημένο μέσο Eagle's Dulbecco (DMEM; Nacalai Tesque). Κύτταρα μυελού των οστών καλλιεργήθηκαν για 5 ημέρες σε DMEM συμπληρωμένο με 30% υπερκείμενο υγρό κυττάρων L929 που περιέχει παράγοντα διέγερσης αποικίας μακροφάγων, 10% εμβρυϊκό βόειο ορό απενεργοποιημένο με θερμότητα (FBS) και L-γλουταμίνη (2 mM) στους 37 • C/5 % CO 2 . Τα κύτταρα HEK293FT (μια ανθρώπινη εμβρυϊκή κυτταρική σειρά νεφρού) και τα κύτταρα HeLa (κυτταρική σειρά ανθρώπινου επιθηλίου καρκινώματος) διατηρήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS, πενικιλλίνη (100 μονάδες/ml) ​​και στρεπτομυκίνη (100 μg/ml) (Nacalai Tesque ). Κύτταρα MDCK (κύτταρα νεφρού σκύλου Madin-Darby) και κύτταρα HT-1080 (κυτταρική σειρά ανθρώπινου ινοσάρκωμα) αναπτύχθηκαν στο ελάχιστο απαραίτητο μέσο του Eagle (E-MEM; Nacalai Tesque) συμπληρωμένο με 10% FBS, πενικιλλίνη (100 μονάδες/ml) ​​και στρεπτομυκίνη (100 μg/ml) (Nacalai Tesque). Το στέλεχος του ιού της γρίπης Α A/PR8 (H1N1) αναπτύχθηκε στους 35 • C για 2 ημέρες σε οι αλλαντοϊκές κοιλότητες των γόνιμων αυγών κοτόπουλου ηλικίας 10 ημερών (Ichinohe et al., 2009) . Ο τίτλος του ιού ποσοτικοποιήθηκε σε μια τυπική δοκιμασία πλάκας χρησιμοποιώντας κύτταρα MDCK (Pang et al., 2013). Τα cDNA πλασμιδίων που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες Ε και Μ του στελέχους SARS-CoV Frankfurt 1 (Matsuyama et al., 2005) ελήφθησαν με αντίστροφη μεταγραφή και PCR ολικού RNA που εκχυλίστηκε από κύτταρα Vero μολυσμένα με SARS, ακολουθούμενη από ενίσχυση PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές. Το pcDNA3.1D-3a-V5His παρασχέθηκε από τον Ming-Fu Chang (National Taiwan University College of Medicine, Taipei, Taiwan). Για να δημιουργηθούν τα πλασμίδια pLenti6-E-V5His, pLenti6-3a-V5His και pLenti-M-V5His, κλάσματα cDNA των E, 3a και M ενισχύθηκαν από pcDNA3.1D-E-V5His, pcDNA3.1D-3a-V5 και pcDNA3.1D-M-V5His χρησιμοποιώντας συγκεκριμένα σετ εκκινητών και στη συνέχεια συνδέθηκε σε φορείς pLenti6-TOPO (Invitrogen). Για τη δημιουργία πλασμιδίων pCA7-flag-E, pCA7-flag-3a και pCA7flag-M, pCA7-HA-E, pCA7-HA-3a και pCA7-HA-M, ενισχύθηκαν θραύσματα cDNA των E, 3a και M από τα pcDNA3.1D-E-V5His, pcDNA3.1D-3a-V5His και pcDNA3.1D-M-V5His χρησιμοποιώντας συγκεκριμένα σετ εκκινητών, χωνευμένα με EcoR I και Not I και υποκλωνοποιημένα στις θέσεις EcoR I-Not I του Το πλασμίδιο pCA7-flag-ASC ή το πλασμίδιο pCA7-HA-M2, αντίστοιχα (Ito et al., 2012). Για να κατασκευαστούν πλασμίδια που εκφράζουν το μεταλλαγμένο Ε V25F, τα μεταλλαγμένα Ε θραύσματα ενισχύθηκαν με αντίστροφη PCR με πλασμίδια άγριου τύπου που περιέχουν Ε και ειδικά σετ εκκινητών. Τα προϊόντα PCR διασπάστηκαν με Dpn Ι, απολινώθηκαν σε μια αντίδραση που περιείχε λιγάση και Τ4 κινάση και στη συνέχεια μετασχηματίστηκαν σε κύτταρα ικανά για DH5a (TOYOBO). Για να κατασκευαστούν πλασμίδια που εκφράζουν το μεταλλαγμένο 3a 3a-CS, τα θραύσματα ενισχύθηκαν από πλασμίδια που περιέχουν άγριου τύπου 3a χρησιμοποιώντας σετ εκκινητών ειδικών 3a και μετασχηματίστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα κύτταρα HEK293FT σπάρθηκαν σε πλάκες συστάδας 24 φρεατίων και επιμολύνθηκαν με 1 μg-pL. /3a/M-V5His, pLenti-GFP (πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη) ή pLenti-M2 με χρήση πολυαιθυλενιμίνης (PEI) Μέγ. Στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (50 mM Tris-HCl, 1% ΝΡ-40, 0,05% δωδεκυλοθειικό νάτριο (SDS), 150 mM NaCl και 1 mM EDTA). Και τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση γέλης SDS-πολυακρυλαμιδίου (PAGE) ακολουθούμενη από ηλεκτροστύπωμα σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF). Οι μεμβράνες επωάστηκαν κατά τη διάρκεια της νύχτας με ετικέτα αντι-V5 ποντικού (R960-25, Invitrogen), ιούς κατά της γρίπης Α ποντικού M2 (14C2, Abcam), αντι-GFP ποντικού (GF200, Nacalai Tesque) ή αντισωληναρίου κουνελιού (DM1A , Santa Cruz) αντισώματα, ακολουθούμενα από συζευγμένο με υπεροξείδιο χρένου αντι-ποντικού IgG (Jackson Immuno Research Laboratories) ή αντι-κουνελιού IgG (Invitrogen). Μετά από πλύση 3 φορές με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (0,05% Tween-20/PBS), οι μεμβράνες εκτέθηκαν χρησιμοποιώντας Chemi-Lumi One Super (Nacalai Tesque) και τα σήματα χημειοφωταύγειας καταγράφηκαν από μια μίνι συσκευή ImageQuant LAS-4000 (GE Healthcare) Για τη δημιουργία φακοϊών που εκφράζουν πρωτεΐνες SARS-CoV E, 3a και M με επισήμανση V5, το πλήρους μήκους cDNA που κωδικοποιεί κάθε ιική πρωτεΐνη κλωνοποιήθηκε στον φορέα pLenti6.3/V5-TOPO (Invitrogen) χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: SARS- CoV E προς τα εμπρός, 5 -caccatgtactcattcgttttcgga-3 και αντίστροφα, 5 -gaccagaagatcaggaactc-3; SARS-CoV 3a προς τα εμπρός, 5caccatggatttgtttatgagatt-3 και αντίστροφα, 5 -caaaggcacgctagtagtcg-3; SARS-CoV M προς τα εμπρός, 5 -caccatggcagacaacggtactat-3 και αντίστροφα, 5 -ctgtactagcaaagcaatat-3. Υπο-συρρέουσες μονοστοιβάδες κυττάρων HEK293FT που σπάρθηκαν σε ένα επικαλυμμένο με κολλαγόνο πιάτο (διαμέτρου 10 cm) επιμολύνθηκαν με 3 μg φορέα pLenti6.3/V5-TOPO που εκφράζει κάθε ιική πρωτεΐνη ή EGFP μαζί με ViraPower Packaging Mix (Invitrogen) χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Τα υπερκείμενα που περιέχουν φακοϊούς συλλέχθηκαν και διηθήθηκαν μέσω ενός φίλτρου 0,45 μm (Millipore) στις 72-96 ώρες μετά την επιμόλυνση (Ito et al., 2012). Ο τίτλος του φακοϊού στη συνέχεια ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κύτταρα HT-1080 όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Μακροφάγα που προέρχονται από μυελό των οστών επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 8 × 105 σε πλάκα 24 φρεατίων και μολύνθηκαν με τον ιό της γρίπης A/PR8 ή τον φακοϊό σε πολλαπλή μόλυνση (MOI) 5 ή 0,2 για 1 ώρα, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, τα BMM διεγέρθηκαν με 1 μg/ml LPS και καλλιεργήθηκαν για επιπλέον 23 ώρες σε πλήρες μέσο. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά τη μόλυνση και φυγοκεντρήθηκαν για να απομακρυνθούν τα κυτταρικά υπολείμματα. Η ποσότητα της IL-1β στα υπερκείμενα μετρήθηκε σε μια συνδεδεμένη με ένζυμο ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA) χρησιμοποιώντας ζευγαρωμένα αντισώματα (eBioscience) (Ichinohe et al., 2010). Κύτταρα SARS-CoV, HeLa καλλιεργήθηκαν σε καλυπτρίδες και επιμολύνθηκαν με 1 μg pCA7-flag-3a ή pCD7-flag-3a-CS μαζί με 0,5 μg ER-mCherry ή DsRed-Golgi (Ito et al., 2012). Στις 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και διαπερατήθηκαν με 1% Triton X-100/PBS. Μετά από πλύση με PBS και αποκλεισμό με 4% BSA/PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με ένα αντίσωμα κατά της σημαίας ποντικού (M2, Sigma) ακολουθούμενο από επώαση με συζευγμένο με Alexa Fluor 488 κατσίκα αντι-ποντικού IgG (H+L) (Life Τεχνολογίες). Για να παρατηρηθεί η κυτταρική κατανομή του NLRP3 στα κύτταρα που εκφράζουν Ε-ή 3α, τα κύτταρα HeLa καλλιεργήθηκαν σε καλυπτρίδες και επιμολύνθηκαν με 1 μg pCA7-HA-E, pCA7-HA-EV25F, pCA7-HA-3a, pCA7-HA-3a-CS, ή φορέας ελέγχου pCA7 μαζί με 0,5 μg pCA7-NLRP3. Στις 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και διαπερατήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και 1% Triton X-100/PBS. Μετά από πλύση και αποκλεισμό, τα κύτταρα επωάστηκαν με αντι-ΗΑ κουνελιού (561, MBL) και αντι-NLRP3 ποντικού (Cryo-2; AdipoGen) αντισώματα, ακολουθούμενα από Alexa Fluor 488-συζευγμένο κατσικίσιο IgG αντι-κουνελιού (H+L) και συζευγμένο με Alexa Fluor 568 κατσίκα αντι-ποντικού IgG (H+L) (Life Technologies). Τα σήματα φθορισμού παρατηρήθηκαν με ομοεστιακή μικροσκοπία (A1R +, Nikon). Η στατιστική σημασία δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας ένα t-test Student δύο ουρών. Οι τιμές P < 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Προηγουμένως αποδείξαμε ότι η πρωτεΐνη M2 του ιού της γρίπης (ένας επιλεκτικός ως προς το πρωτόνιο κανάλι ιόντων), το μετάλλαγμα H37G του (που έχει χάσει την εκλεκτικότητά του πρωτονίων και επιτρέπει τη μεταφορά άλλων κατιόντων όπως Na + και K +), και η πρωτεΐνη EMCV 2B (ένας δίαυλος Ca 2+) διεγείρει την έκκριση IL-1β που προκαλείται από το φλεγμονώδες NLRP3 (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012). Επιπλέον, η πρωτεΐνη SARS-CoV E δρα ως διαπερατά από Ca 2+ κανάλια ιόντων που ενεργοποιούν το φλεγμονώδες NLRP3 (Nieto- Torres et al., 2015). Το γεγονός ότι η πρωτεΐνη 3a του SARS-CoV δρα ως βιροπορίνη, μας ώθησε να εξετάσουμε εάν ενεργοποιεί επίσης την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους σώματος. Έτσι, δημιουργήσαμε αρχικά πλασμίδια φακοϊού που εκφράζουν πρωτεΐνες με επισήμανση V5 και επιβεβαιώσαμε την έκφρασή τους σε κύτταρα HEK293FT με ανάλυση ανοσοστύπωσης (Εικόνες 1A-C). Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε μεταγωγή BMM με εκκίνηση με λιποπολυσακχαρίτες (LPS) με τους φακοϊούς που εκφράζουν τις πρωτεΐνες SARS-CoV E, 3a, M, M2 ή EMCV 2B του ιού της γρίπης. Σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές (Ichinohe et al., Εικόνα 1D). Ομοίως, οι φακοϊοί που εκφράζουν τις πρωτεΐνες SARS-CoV E ή 3a διέγειραν την απελευθέρωση IL-1β από BMM που είχαν εκκινήσει με LPS (Εικόνα 1D). Επιπλέον, η έκκριση IL-1β από LPSprimed BMMs που έχουν μολυνθεί ταυτόχρονα με φακοϊούς που εκφράζουν E-και 3a ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη από κύτταρα μολυσμένα με φακοϊό που εκφράζουν SARS-CoV (Εικόνα 1Ε). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η έκφραση της βιροπορίνης 3a του SARS-CoV είναι επαρκής για να διεγείρει την έκκριση της IL-1β από BMM που εκκινούν με LPS. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι τα αμινοξέα αμινοξέα 40 της πρωτεΐνης SARS-CoV E είναι σημαντικά για το σχηματισμό διαύλων ιόντων , και ότι οι μεταλλάξεις N15A και V25F [που βρίσκονται στη διαμεμβρανική περιοχή (από τα υπολείμματα αμινοξέων 7-38)] εμποδίζουν την αγωγιμότητα των ιόντων (Wilson et al., 2004; Torres et al., 2007; Verdia-Baguena et al., 2012). Επιπλέον, η πρωτεΐνη SARS-CoV 3a περιέχει μια περιοχή πλούσια σε κυστεΐνη (υπολείμματα αμινοξέων 127-133) που εμπλέκεται στο σχηματισμό ενός ομοδιμερούς για τη δημιουργία του διαύλου ιόντων (Lu et al., 2006; Chan et al., 2009). Έτσι, η μετάλλαξη της πλούσιας σε κυστεΐνη τομέα μπλοκάρει την αγωγιμότητα των ιόντων από την πρωτεΐνη 3a (Chan et al., 2009). Για το σκοπό αυτό, αντικαταστήσαμε τα αμινοξέα Cys-127, Cys-130 και Cys-133 εντός της πλούσιας σε κυστεΐνη τομέα της πρωτεΐνης SARS-CoV 3a με σερίνη για να δημιουργήσουμε έναν φακοϊό που εκφράζει το μετάλλαγμα απώλειας δραστηριότητας διαύλου ιόντων, 3a- CS (Chan et al., 2009; Εικόνα 2Α). Για να ελέγξουμε εάν η δραστηριότητα διαύλων ιόντων της πρωτεΐνης SARS-CoV 3a απαιτείται για την τόνωση της έκκρισης της IL-1β, μετατρέψαμε LPSprimed BMM με φακοϊούς που εκφράζουν τις πρωτεΐνες SARS-CoV E, V25F, 3a, 3a-CS ή M. Σε συμφωνία με μια προηγούμενη αναφορά (Nieto-Torres et al., 2015), βρήκαμε ότι ο μεταλλαγμένος φακοϊός V25F απέτυχε να διεγείρει την απελευθέρωση IL-1β από BMM (Εικόνα 2Β). Συγκεκριμένα, το μετάλλαγμα 3a-CS ακύρωσε πλήρως την έκκριση IL-1β (Εικόνα 2Β), υποδηλώνοντας ότι η δραστηριότητα διαύλου ιόντων της πρωτεΐνης 3a απαιτείται για την επαγόμενη από τον SARS-CoV 3a έκκριση IL-1β. ΕΙΚΟΝΑ 4 | Ενεργοποίηση φλεγμονώδους NLRP3 από τον SARS-CoV 3a. Τα κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν με το πλασμίδιο έκφρασης που κωδικοποιεί το NLRP3 και αυτό που κωδικοποιεί SARS-CoV 3a, 3a-CS, E ή V25F με επισήμανση HA και με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο. Ράβδοι κλίμακας, 10 μm. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Στη συνέχεια, προσδιορίσαμε τον υποκυτταρικό εντοπισμό της πρωτεΐνης SARS-CoV 3a χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία. Όταν τα υπερκείμενα χωρίς κύτταρα SARS-CoV συλλέχθηκαν στις 24 ώρες (φακοϊοί) ή 6 ώρες (ATP) μετά τη μόλυνση ή διέγερση και αναλύθηκαν για IL-1β με ELISA. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων και υποδεικνύουν τη μέση τιμή ± SD. * * P < 0,01 και * * * P < 0,001,3a πρωτεΐνη εκφράστηκε σε κύτταρα HeLa, παρατηρήσαμε δύο κύρια πρότυπα κατανομής. Σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές (Yu et al., 2004; Yuan et al., 2005), η πρωτεΐνη 3a που εντοπίζεται στη συσκευή Golgi (Εικόνα 3Α). Επιπλέον, οι πρωτεΐνες 3a συγκεντρώθηκαν σε δομές κηλίδων, οι οποίες εντοπίστηκαν κυρίως στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) (Εικόνα 3Β). Αντίθετα, το μετάλλαγμα 3a-CS συγκεντρώθηκε στη συσκευή Golgi αντί στο ER και δεν σχημάτισε δομές κηλίδων (Εικόνες 3Α, Β). Στη συνέχεια εξετάσαμε τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό του NLRP3. Η ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 οδήγησε σε ανακατανομή από το κυτταρόπλασμα στον περιπυρηνικό χώρο, μια διαδικασία που θεωρείται ως χαρακτηριστικό γνώρισμα της ενεργοποίησης του NLRP3 (Zhou et al., 2011; Ito et al., 2012; Johnson et al., 2013; Moriyama et al., 2016). Αν και τα κύτταρα που εκφράζουν τους μεταλλάκτες απώλειας δραστηριότητας διαύλου ιόντων 3a-CS ή V25F εξέφρασαν ομοιόμορφα το NLRP3 σε όλο το κυτταρόπλασμα, ανακατανεμήθηκε στην περιπυρηνική περιοχή σε κύτταρα που εκφράζουν SARS-CoV 3a-ή E (Εικόνα 4) . Μαζί, αυτά τα δεδομένα παρέχουν ενδείξεις ότι η δραστηριότητα διαύλων ιόντων της πρωτεΐνης SARS-CoV 3a είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3. Τόσο η παραγωγή K + Eflux όσο και η παραγωγή ROS εμπλέκονται στην απελευθέρωση της IL-1β που προκαλείται από την πρωτεΐνη SARS-CoV 3a Τέλος, ερευνήσαμε τον μηχανισμό με τον οποίο ο SARS-CoV 3a πυροδοτεί την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η πρωτεΐνη 3a του SARS-CoV δρα ως κανάλι K+ (Lu et al., 2006). Επιπλέον, η εκροή K + είναι ένας πολύ γνωστός ενεργοποιητής του φλεγμονώδους NLRP3 (Mariathasan et al., 2006; Petrilli et al., 2007). Αυτές οι παρατηρήσεις μας ώθησαν να εξετάσουμε εάν απαιτείται εκροή K + για την έκκριση IL-1β που προκαλείται από 3a. Για το σκοπό αυτό, τα BMM σε θρεπτικό υλικό πλούσιο σε K + μολύνθηκαν με ιό της γρίπης Α ή φακοϊούς που εκφράζουν τις πρωτεΐνες SARS-CoV E ή 3a. Σε συμφωνία με ένα προηγούμενο αποτέλεσμα (Ichinohe et al., 2010), βρήκαμε ότι η έκκριση IL-1β που προκαλείται από τον ιό της γρίπης αποκλείστηκε πλήρως όταν η εξωκυτταρική συγκέντρωση Κ+ αυξήθηκε στα 130 mM (Εικόνα 5Α). Η ανασταλτική επίδραση του πλούσιου σε K + μέσου παρατηρήθηκε επίσης όταν τα κύτταρα διεγέρθηκαν με φακοϊούς που εκφράζουν τις πρωτεΐνες SARS-CoV E ή 3a (Εικόνα 5Β). Δεδομένου ότι τα μιτοχονδριακά ROS είναι σημαντικά για την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 (Nakahira et al., 2011; Zhou et al., 2011), στη συνέχεια διεγείραμε BMM με εξωκυτταρικό ATP ή φακοϊούς που εκφράζουν τις πρωτεΐνες SARS-CoV E ή 3a παρουσία ή απουσία του αντιοξειδωτικού Mito-TEMPO, ενός σαρωτή που είναι ειδικός για τα μιτοχονδριακά ROS Trnka et al. ., 2009). Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως (Nakahira et al., 2011; Ito et al., 2012), η θεραπεία των ΒΜΜ με το Mito-TEMPO απέκρουσε πλήρως την έκκριση IL-1β σε απόκριση στο ΑΤΡ (Εικόνα 6Α). Ομοίως, η απελευθέρωση IL-1β που προκλήθηκε από τις πρωτεΐνες SARS-CoV E και 3a ανεστάλη σημαντικά από το Mito-TEMPO (Εικόνα 6Β). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι η πρωτεΐνη SARS-CoV 3a διαταράσσει τις ενδοκυτταρικές ιοντικές συγκεντρώσεις και προκαλεί μιτοχονδριακές βλάβες, ενεργοποιώντας έτσι το φλεγμονώδες NLRP3. Συνοπτικά, διαπιστώσαμε ότι η δραστηριότητα διαύλου ιόντων της πρωτεΐνης SARS-CoV 3a είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3. Επιπλέον, τόσο η εκροή K + όσο και η παραγωγή μιτοχονδριακών ROS απαιτούνται για την έκκριση IL-1β που προκαλείται από τον SARS-CoV 3a. Μέχρι στιγμής, έχουν προταθεί αρκετά μοντέλα για να εξηγήσουν την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 από ιούς RNA. Πρώτον, τα προϊόντα διάσπασης ιικού RNA ή RNA που δημιουργούνται από τη RNase L ενεργοποιούν το φλεγμονώδες NLRP3 μέσω της ελικάσης DExD/H-box, DHX33 (Allen et al., 2009; Mitoma et al., 2013; Chen et al., 2014; Chakrabarti et al., 2015). Δεύτερον, οι βιροπορίνες που κωδικοποιούνται από ιούς RNA ενεργοποιούν το φλεγμονώδες NLRP3 (Ichinohe et al., 2010; Ito et al., 2012; Τριανταφίλου κ.ά., 2013; Nieto-Torres et al., 2015). Στην περίπτωση του ιού της γρίπης, ο επιλεκτικός ως προς το πρωτόνιο κανάλι ιόντων M2 στο όξινο δίκτυο trans-Golgi ενεργοποιεί το φλεγμονώδες NLRP3 (Ichinohe et al., 2010). Είναι ενδιαφέρον ότι ένα μετάλλαγμα M2 στο οποίο η ιστιδίνη αντικαταστάθηκε με γλυκίνη στη θέση 37 (H37G), προκαλώντας απώλεια της εκλεκτικότητας πρωτονίων, επιτρέπει τη μεταφορά άλλων κατιόντων (δηλ. Na + και K +), οδηγώντας έτσι σε ενισχυμένη έκκριση IL-1β από BMM και δενδριτικά κύτταρα που έχουν εκκινήσει με LPS σε σύγκριση με την πρωτεΐνη Μ2 άγριου τύπου. Επιπλέον, οι πρωτεΐνες 2Β του EMCV, του ιού της πολιομυελίτιδας, του εντεροϊού 71 (EV71) και του ανθρώπινου ρινοϊού (μέλος της οικογένειας Picornaviridae) πυροδοτούν την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 από επαγωγή ροής Ca 2+ από τα διαμερίσματα ER και Golgi (Ito et al., 2012; Τριανταφίλου κ.ά., 2013) . Επιπλέον, ο ιός της ηπατίτιδας C διεγείρει την παραγωγή IL-1β που προκαλείται από το φλεγμονώδες NLRP3 μέσω της ρ7 βιροπορίνης του (Negash et al., 2013; Farag et al., 2017). Τρίτον, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η τρισδιάστατη πρωτεΐνη του EV71 αλληλεπιδρά άμεσα με το NLRP3 για να διευκολύνει τη συναρμολόγηση του φλεγμονώδους συμπλέγματος NLRP3 (Wang et al., 2017). Στην περίπτωση του SARS-CoV, η βιροπορίνη Ε σχηματίζει Ca 2+ διαπερατά κανάλια ιόντων και ενεργοποιεί το φλεγμονώδες NLRP3 (Nieto-Torres et al., 2015). Επιπλέον, μια άλλη βιροπορίνη 3α βρέθηκε ότι επάγει την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 (Yue et al., 2018). Αν και η υποκατάσταση αλανίνης στο Cys-133, η οποία απαιτείται για το σχηματισμό διμερών ή τετραμερών (Lu et al., 2006), εξακολουθεί να επιτρέπει την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 αλληλεπιδρώντας με την κασπάση-1 (Yue et al., 2018), το κανάλι ιόντων δραστικότητας-απώλειας μετάλλαξης 3a-CS (υποκατάσταση Cys-to-Ser στις θέσεις Cys-127, Cys-130 και Cys-133) (Chan et al., 2009) ακύρωσε πλήρως την έκκριση IL-1β από LPS-primed BMMs, υποδηλώνοντας ότι η πρωτεΐνη 3a του SARS-CoV έχει την ικανότητα να επάγει την ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 με πολλαπλούς μηχανισμούς. Προηγούμενες μελέτες δείχνουν ότι η πρωτεΐνη 3a του SARS-CoV εντοπίζεται στην πλασματική μεμβράνη (Minakshi and Padhan, 2014) και δρα ως κανάλι K + (Lu et al., 2006), διεγείροντας έτσι (πιθανώς) την εκροή K + την πλασματική μεμβράνη. Πράγματι, διαπιστώσαμε ότι η έκκριση IL-1β που προκαλείται από την πρωτεΐνη 3a αναστέλλεται σημαντικά όταν η εξωκυτταρική συγκέντρωση Κ+ αυξήθηκε στα 130 mM. Αν και παραμένει ασαφές εάν μια άλλη βιροπορίνη 8a του SARS-CoV (Castano-Rodriguez et al., 2018) ενεργοποιεί το φλεγμονώδες NLRP3, αυτά τα δεδομένα υπογραμμίζουν τη σημασία των βιροπορινών στην ενεργοποίηση του φλεγμονώδους NLRP3 που προκαλείται από τον SARS-CoV. Η καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού που διέπει το φλεγμονώδες NLRP3 θα διευκολύνει την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών παρεμβάσεων για τη θεραπεία μολυσματικών ασθενειών και θα αυξήσει την κατανόησή μας για την παθογένεση του ιού.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 795, "text": "σε μακροφάγα που έχουν εκκινήσει με λιποπολυσακχαρίτες" } ], "id": 280, "question": "Πού ενεργοποιείται το φλεγμονώδες NLRP3 μετά από λοίμωξη από SARS-CoV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 17605, "text": "δραστηριότητα διαύλου ιόντων της πρωτεΐνης 3a" } ], "id": 281, "question": "Ποιος δίαυλος ιόντων είναι απαραίτητος για την έκκριση IL-1Beta με τη μεσολάβηση 3a;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1782, "text": "Coronaviridae" } ], "id": 284, "question": "Ποια είναι η οικογένεια του κορωνοϊού SARS;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2565, "text": "Τουλάχιστον 8.098" } ], "id": 288, "question": "Πόσες εργαστηριακά επιβεβαιωμένες περιπτώσεις λοιμώξεων από κορωνοϊό SARS αναφέρθηκαν μεταξύ Νοεμβρίου 2002 και Ιουλίου 2003;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2668, "text": "9,6%" } ], "id": 289, "question": "Ποιο ήταν το ποσοστό θνησιμότητας από το ξέσπασμα του κοροναϊού SARS μεταξύ Νοεμβρίου 2002 και Ιουλίου 2003;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6098, "text": "76 αμινοξέα" } ], "id": 293, "question": "Πόσα αμινοξέα υπάρχουν στην πρωτεΐνη SARS-CoV E;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Μια νέα αντιμυκοβακτηριακή λειτουργία της ενεργοποιημένης από μιτογόνο πρωτεϊνικής κινάσης φωσφατάσης-1https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2804704/SHA: f6ed1f1e9999e57793addb1c9c54f1c9c54f61997; Yim, Howard CH; Lee, Norris CM; Lau, Allan SYDate: 2009-12-17DOI: 10.1186/1471-2172-10-64License: cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Το Mycobacterium tuberculosis (MTB) είναι μια κύρια αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας στον κόσμο. Για την καταπολέμηση αυτού του παθογόνου, τα κύτταρα του ανοσοποιητικού απελευθερώνουν κυτοκίνες, συμπεριλαμβανομένου του παράγοντα νέκρωσης όγκου-α (TNF-α), ο οποίος είναι καθοριστικός για την ανάπτυξη προστατευτικών κοκκιωμάτων. Τα προηγούμενα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το Bacillus Calmette Guerin (BCG), ένα μυκοβακτηρίδιο που χρησιμοποιείται ως μοντέλο για τη διερεύνηση της ανοσολογικής απόκρισης κατά της MTB, διεγείρει την επαγωγή του TNF-α μέσω της ενεργοποιημένης από μιτογόνο πρωτεϊνικής κινάσης (MAPK) στα μονοκύτταρα του ανθρώπινου αίματος. Δεδομένου ότι η MAPK φωσφατάση-1 (MKP-1) είναι γνωστό ότι ρυθμίζει τις δραστηριότητες MAPK, εξετάσαμε εάν η MKP-1 παίζει ρόλο στην επαγόμενη από BCG ενεργοποίηση της MAPK και στην έκφραση της κυτοκίνης. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Πρωτογενή μονοκύτταρα ανθρώπινου αίματος υποβλήθηκαν σε αγωγή με BCG και προσδιορίστηκαν για έκφραση ΜΚΡ-1. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι μετά από έκθεση σε BCG, υπήρξε αύξηση στην έκφραση του MKP-1. Επιπλέον, η επαγωγή του MKP-1 ρυθμίστηκε από την ρ38 MAPK και την εξωκυτταρική κινάση 1 και 2 που ρυθμίζεται με σήμα (ERK1/2). Παραδόξως, όταν η έκφραση του MKP-1 μπλοκαρίστηκε από το ειδικό του siRNA, υπήρξε σημαντική μείωση στα επίπεδα της φωσφο-MAPK (ρ38 MAPK και ERK1/2) και του TNF-α που επάγεται από το BCG. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Δεδομένου ότι ο TNF-α είναι καθοριστικός στον σχηματισμό κοκκιωμάτων, τα αποτελέσματα έδειξαν μια απροσδόκητη θετική λειτουργία του MKP-1 έναντι της μυκοβακτηριδιακής λοίμωξης σε αντίθεση με τη συνήθη δράση φωσφατάσης του. Κείμενο: Η φυματίωση (ΤΒ) παραμένει κύρια αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας στους κόσμο, ιδίως στις αναπτυσσόμενες χώρες [1] . Η ασθένεια προκαλείται από το Mycobacterium tuberculosis (MTB) και περίπου το ένα τρίτο του παγκόσμιου πληθυσμού έχει μολυνθεί από αυτό το παθογόνο. Σε μια πρόσφατη έκθεση, ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (ΠΟΥ) υπολόγισε ότι υπάρχουν 9,2 εκατομμύρια νέα περιστατικά φυματίωσης σε όλο τον κόσμο το 2006 [1] . Σε απάντηση στη μόλυνση από MTB, η επαγωγή κυτοκινών από τα κύτταρα του ανοσοποιητικού είναι ένας σημαντικός αμυντικός μηχανισμός. Τα μολυσμένα μακροφάγα εκκρίνουν μεσοκυτταρικούς σηματοδοτικούς παράγοντες, προφλεγμονώδεις κυτοκίνες, για να μεσολαβήσουν στη φλεγμονώδη απόκριση που οδηγεί στον σχηματισμό κοκκιώματος και στην επαγωγή ανοσίας που προκαλείται από Τ-κύτταρα [2] . Προκειμένου να κατανοηθεί η παθογένεση της φυματίωσης, οι οδοί σηματοδότησης που προκαλούνται από μυκοβακτήρια αποτελούν από καιρό αντικείμενο ενδιαφέροντος. Οι ενεργοποιημένες πρωτεϊνικές κινάσες με μιτογόνο (MAPKs) συμπεριλαμβανομένης της εξωκυτταρικής κινάσης 1 και 2 (ERK1/2), της p38 MAPK και της N-τερματικής κινάσης c-Jun (JNK) έχουν ενοχοποιηθεί ως σημαντικά μόρια κυτταρικής σηματοδότησης που ενεργοποιούνται από μυκοβακτήρια [3] . Προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι το p38 MAPK και το ERK1/2 απαιτούνται για την επαγωγή της έκφρασης του TNF-α σε ανθρώπινα μονοκύτταρα που έχουν μολυνθεί με M. tuberculosis H37Rv [4] . Αποκαλύψαμε περαιτέρω τον σημαντικό ρόλο των MAPK στα συμβάντα μεταγωγής σήματος της μυκοβακτηριακής ενεργοποίησης των πρωτογενών μονοκυττάρων του ανθρώπινου αίματος (PBMo) που οδηγεί σε εκφράσεις κυτοκίνης μέσω της αλληλεπίδρασης με το PKR [5] . Ωστόσο, τα επακόλουθα γεγονότα σχετικά με τον τρόπο ρύθμισης της MAPK και τον τρόπο με τον οποίο αυτή η ρύθμιση επηρεάζει την παραγωγή κυτοκίνης ως απόκριση στα μυκοβακτήρια παραμένουν προς αποσαφήνιση. Δεδομένου ότι τα MAPK ενεργοποιούνται με φωσφορυλίωση, η αποφωσφορυλίωση των MAPK φαίνεται να είναι μια αποτελεσματική διαδικασία για την αδρανοποίηση των δραστηριοτήτων τους. Μπορεί να επιτευχθεί με ειδικές φωσφατάσες πρωτεϊνικών κινασών που μπορούν να αφαιρέσουν τη φωσφορική ομάδα από τα MAPK. Παραδείγματα αυτών των φωσφατάσης περιλαμβάνουν φωσφατάσες τυροσίνης, φωσφατάσες σερίνης/θρεονίνης και φωσφατάσες διπλής ειδικότητας (DUSPs). Ορισμένα DUSP είναι επίσης γνωστά ως φωσφατάσες MAPK (MKP) [6] [7] [8] . Επί του παρόντος, έχουν εντοπιστεί τουλάχιστον 10 MKP, ενώ το MKP-1 είναι το πιο μελετημένο μέλος της οικογένειας. Ο ρυθμιστικός ρόλος του MKP-1 στην επαγωγή κυτοκίνης αποδεικνύεται καλύτερα από τα μακροφάγα MKP-1 knockout (KO) σε απόκριση στον λιποπολυσακχαρίτη (LPS), ένα συστατικό κυτταρικού τοιχώματος των Gram-αρνητικών βακτηρίων. Τα μακροφάγα MKP-1 KO έδειξαν παρατεταμένη φωσφορυλίωση της p38 MAPK και JNK καθώς και αυξημένη παραγωγή TNF-α ως απόκριση στη θεραπεία με LPS [9] . Σε συμφωνία με αυτά τα αποτελέσματα, μια άλλη ομάδα αποκάλυψε περαιτέρω ότι τα μακροφάγα που προέρχονται από μυελό των οστών MKP-1 KO που έλαβαν θεραπεία με LPS εμφανίζουν αυξημένη δραστηριότητα δέσμευσης DNA του AP-1 [10] . Επίσης, έδειξαν ότι η επαγόμενη από LPS έκφραση MKP-1 εξαρτάται από τον παράγοντα διαφοροποίησης μυελοειδούς 88 (MyD88) και τον προσαρμογέα που περιέχει την περιοχή TIR που επάγει την IFN-β (TRIF) [10], αποδεικνύοντας έτσι τον ρόλο του MKP-1 στη μεταγωγή σήματος Όχι μόνο το LPS, αλλά και άλλοι επαγωγείς TLR, συμπεριλαμβανομένων των CpG, πεπτιδογλυκάνης, πολυ IC και Pam 3 Cys μπορούν να ρυθμίσουν τις εκφράσεις κυτοκίνης συμπεριλαμβανομένων των TNF-α, IL-10 μέσω δραστηριοτήτων MKP-1 [10, 11] . Σε αυτές τις διεργασίες, το MKP-1 χρησιμεύει για τον μετριασμό των ανεπιθύμητων ενεργειών του σηπτικού σοκ και τη διατήρηση των λειτουργιών των οργάνων περιορίζοντας τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις μετά από βακτηριακή μόλυνση. Ένα άλλο παράδειγμα λειτουργίας MKP-1 είναι η ανοσολογική απόκριση στον Staphylococcus aureus (S. aureus), ένα Gram θετικό βακτήριο. Υπάρχουν υψηλότερα επίπεδα παραγωγής κυτοκίνης συμπεριλαμβανομένων των TNF-α, IL-6 και MIP-1α σε ποντίκια MKP-1 KO που έχουν μολυνθεί με S. aureus [12] . Επίσης, τα ποντίκια θα είχαν ταχεία ανάπτυξη πολυοργανικής δυσλειτουργίας καθώς και ταχύτερο ποσοστό θνησιμότητας κατά την πρόκληση με S. aureus που σκοτώθηκε από τη θερμότητα [12] . Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το MKP-1 προστατεύει τον ξενιστή από την υπερενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος ως απόκριση σε Gram αρνητικά ή Gram θετικά βακτήρια. Στο παρελθόν, πιστευόταν ότι διαφορετικά μέλη της οικογένειας MKP/DUSP έχουν επικαλυπτόμενες λειτουργίες. Ωστόσο, η εμφάνιση του DUSP2 ανέτρεψε την ιδέα προς τα κάτω [13] . Αποδείχθηκε ότι το DUSP2 συμπεριφέρεται διαφορετικά και είναι αντίθετο με τη λειτουργία όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Στα κύτταρα DUSP2 KO, παρήγαγαν λιγότερους φλεγμονώδεις μεσολαβητές, υπονοώντας ότι το DUSP2 μπορεί να παίζει ρόλο στη μεσολάβηση αντί να περιορίζει τη φλεγμονή. Για παράδειγμα, όταν τα μακροφάγα DUSP2 KO υποβλήθηκαν σε θεραπεία με LPS, υπήρχαν λιγότεροι TNF, IL-6, μονοξείδιο του αζώτου, κύτταρα που παράγουν IL-12 σε σύγκριση με εκείνα των ομολόγων του άγριου τύπου [13] . Όταν τα μαστοκύτταρα που προέρχονται από μυελό των οστών DUSP2 KO ευαισθητοποιήθηκαν αρχικά με υποδοχέα ανοσοσφαιρίνης Ε (IgE) (FcεRI) και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με σταθερό στη θερμότητα αντιγόνο δινιτροφαινόλης, παρήγαγαν χαμηλότερα επίπεδα mRNA του TNF, μείωσαν την παραγωγή IL-6, λιγότερη φωσφορυλίωση του ERK1 /2, p38 MAPK και λιγότερες μεταγραφικές δραστηριότητες από τα Elk1 και NFAT-AP-1 [13] . Αυτές οι απροσδόκητες θετικές ρυθμίσεις των λειτουργιών των ανοσοκυττάρων από το DUSP2 έχουν υποτεθεί ότι οφείλονται σε αλληλεπιδράσεις μεταξύ MAPK [13] . Η διέγερση των μαστοκυττάρων ΚΟ και των μακροφάγων έδειξε αυξήσεις στη φωσφορυλίωση της JNK. Επιπλέον, η αναστολή της JNK από αναστολείς μικρών μορίων έδειξε αυξήσεις στη φωσφορυλίωση του ERK [13] . Οι συγγραφείς έδειξαν επίσης ότι υπήρχαν φυσικές αλληλεπιδράσεις του DUSP2 με το ERK2, το DUSP2 με το JNK2, καθώς και το DUSP2 και το p38 MAPK μετά από διέγερση των κυττάρων με σταθερό στη θερμότητα αντιγόνο δινιτροφαινόλης. Ωστόσο, οι λεπτομέρειες των αλληλεπιδράσεων μεταξύ MAPK και φωσφατάσης χρειάζονται περαιτέρω διερεύνηση. Έτσι, η οικογένεια MKP διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση των ανοσολογικών αποκρίσεων. Η έμφυτη ανοσοαπόκριση προστατεύει τον ξενιστή από μόλυνση ΜΤΒ με έκκριση κυτοκινών συμπεριλαμβανομένου του TNF-α στα κύτταρα του ανοσοποιητικού. Εν τω μεταξύ, η MAPK είναι μια από τις κρίσιμες πρωτεΐνες στη ρύθμιση της ανοσίας και της έκφρασης κυτοκίνης. Δεδομένου ότι η MAPK ρυθμίζεται από το MKP-1 ως απόκριση στο LPS και η ενεργοποίηση του MAPK είναι σημαντική στην έκφραση κυτοκίνης που προκαλείται από BCG, υποθέτουμε ότι το MKP-1 παίζει κρίσιμο ρόλο στην ανοσολογική ρύθμιση του BCG στα ανθρώπινα μονοκύτταρα. Εξετάσαμε τη συμμετοχή του MKP-1 στην επαγόμενη από BCG ενεργοποίηση MAPK και την επακόλουθη έκφραση κυτοκίνης. Εδώ, παρουσιάζουμε αποδείξεις ότι το MKP-1 παίζει έναν απροσδόκητο ρόλο στη ρύθμιση της επαγωγής κυτοκίνης από το BCG μέσω του ελέγχου της φωσφορυλίωσης MAPK. Έχει αναφερθεί ότι πολλοί επαγωγείς συμπεριλαμβανομένων αυξητικών παραγόντων, LPS, πεπτιδογλυκάνης και δεξαμεθαζόνης μπορούν να διεγείρουν την έκφραση MKP-1 σε ανθρώπινα μακροφάγα, μικρογλοία, μαστοκύτταρα ή ινοβλάστες [6] . Για να διερευνηθεί ο ρόλος διαφορετικών επαγωγέων TLR στη διαδικασία επαγωγής MKP-1 σε μονοκύτταρα ανθρώπινου αίματος, το επίπεδο του mRNA του MKP-1 μετρήθηκε με τη μέθοδο ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (QPCR). Τα PBMo απομονώθηκαν από πρωτογενή μονοπύρηνα κύτταρα ανθρώπινου αίματος και διεγέρθηκαν με Pam 3 Cys (αγωνιστής TLR2), πολυ IC (αγωνιστής TLR3) ή LPS (αγωνιστής TLR4) για 1 και 3 ώρες. Μετά από έκθεση σε Pam 3 Cys ή LPS, υπήρξαν σημαντικές επαγωγές των επιπέδων mRNA MKP-1 εντός 1 ώρας από τη θεραπεία (Εικόνα 1Α). Αυτά τα αποτελέσματα στην επαγωγή ΜΚΡ-1 συνεχίστηκαν για 3 ώρες μετά τη θεραπεία με Pam 3 Cys (Εικόνα 1Α). Αντίθετα, το πολυ IC δεν επήγαγε ΜΚΡ-1 (Σχήμα 1Α). Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι διαφορετικοί επαγωγείς έδειξαν διαφορική ρύθμιση προς τα πάνω της έκφρασης MKP-1. Το LPS έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς για να καταδείξει τον ρόλο του MKP-1 στην ανοσολογική απόκριση τόσο in vivo όσο και in vitro [9, 12]. Για να δημιουργηθεί ένα θεμέλιο για την ερμηνεία των επόμενων πειραματικών αποτελεσμάτων, το LPS χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για την επαγωγή της έκφρασης MKP-1. Για τον προσδιορισμό των επιπέδων του MKP-1 σε απόκριση στο LPS, προσδιορίστηκε η κινητική της μεταγραφής του MKP-1 με QPCR. Υπήρξε μια σημαντική επαγωγή mRNA του MKP-1, το οποίο κορυφώθηκε ήδη από 1 ώρα μετά τη διέγερση του LPS και τα επίπεδα μειώθηκαν σταδιακά σε μια πορεία 6 ωρών. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το LPS προκάλεσε έκφραση ΜΚΡ-1 (Εικόνα 1Β). Στη συνέχεια, για να καταδειχθεί η επαγωγή ειδικών φωσφατάσης από BCG, μελετήθηκε η κινητική της έκφρασης ΜΚΡ-1 σε PBMo χρησιμοποιώντας QPCR κατά τη διάρκεια της θεραπείας με BCG. Παρόμοια με τα αποτελέσματα που παράγονται από το LPS, με την προσθήκη BCG (MOI = 1 CFU/κύτταρο), υπήρξε σημαντική επαγωγή mRNA του MKP-1 εντός 1 ώρας από τη θεραπεία με BCG όπως προσδιορίστηκε από τον ανιχνευτή Taqman ειδικό για το MKP-1 (Εικόνα 2Α). Τα αποτελέσματα διήρκεσαν για τουλάχιστον 6 ώρες (Σχήμα 2Α). Για να εξεταστεί εάν οι αλλαγές στην παραγωγή πρωτεΐνης ήταν παράλληλες με εκείνες των επιπέδων mRNA, τα επίπεδα πρωτεΐνης του ΜΚΡ-1 μετρήθηκαν με στύπωμα Western. Σε απόκριση στο BCG, το PBMo παρήγαγε την πρωτεΐνη MKP-1 ήδη 30 λεπτά μετά τη θεραπεία. Τα επίπεδα πρωτεΐνης διατηρήθηκαν για 2 ώρες και έπεσαν στα βασικά επίπεδα στις 3 ώρες (Εικόνα 2Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπήρχε επαγωγή MKP-1 ως απόκριση στην ενεργοποίηση BCG σε ανθρώπινα μονοκύτταρα. Έχει αποδειχθεί ότι η αναστολή της p38 MAPK είτε από ειδικό αναστολέα είτε από siRNA μείωσε την έκφραση του MKP-1 σε μακροφάγους που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με LPS ή πεπτιδογλυκάνη. 14] . Για τον προσδιορισμό των μηχανισμών που εμπλέκονται στην έκφραση του MKP-1 που προκαλείται από BCG, το PBMo υποβλήθηκε σε προεπεξεργασία με αρκετούς αναστολείς συμπεριλαμβανομένου του PD98059 (αναστολέας για κινάση MAP [MEK] ή ERK1/2), SB203580 (αναστολέας για p38 MAPK), SP600125in (ΝΚ) και CAPE (αναστολέας για NF-κB) για 1 ώρα. Χρησιμοποιήθηκε ένα εύρος συγκεντρώσεων κάθε αναστολέα για να ελεγχθούν οι βέλτιστες συγκεντρώσεις και τα αποτελέσματά τους στη βιωσιμότητα των κυττάρων και στις αναστολές κινάσης. Στη συνέχεια προστέθηκε BCG και συλλέχθηκε το συνολικό RNA. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, με την αναστολή των δραστηριοτήτων MAPK ERK1/2 και p38 από τους αντίστοιχους σχετικά ειδικούς αναστολείς τους, οι εκφράσεις ΜΚΡ-1 μειώθηκαν σημαντικά (Εικόνα 3). Επιπλέον, χρησιμοποιώντας υψηλότερη δόση SB203580, δείξαμε ότι η αναστολή αυξάνεται περαιτέρω (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Αντίθετα, η προεπεξεργασία των κυττάρων με CAPE και SP600125 δεν επηρέασε την επαγωγή του MKP-1 από το BCG (Εικόνα 3). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η επαγόμενη από BCG έκφραση MKP-1 εξαρτάται τόσο από το p38 MAPK όσο και από το ERK1/2. Σε όλα τα παραπάνω πειράματα, ο πρωταρχικός στόχος ήταν να εξεταστεί η επαγωγή του MKP-1 από το BCG σε ανθρώπινα μονοκύτταρα. Έτσι, για να εξεταστεί περαιτέρω ο ρόλος του MKP-1 στην επαγόμενη από BCG σηματοδότηση, χρησιμοποιήθηκε η επιμόλυνση του siRNA σε PBMo για να περιοριστεί η δραστηριότητα του MKP-1. Για να αποδειχθεί ότι το MKP-1 siRNA μπορεί πράγματι να καταστρέψει το γονίδιο στόχο, τα PBMo επιμολύνθηκαν πρώτα με τον έλεγχο ή το siRNA MKP-1 και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BCG για 3 ώρες. Τα επίπεδα του MKP-1 mRNA μετρήθηκαν με τη μέθοδο RT-PCR. Στο Σχήμα 4Α, το BCG διέγειρε την έκφραση ΜΚΡ-1 (λωρίδες 1 και 2). Σε μονοκύτταρα επιμολυσμένα με MKP-1 siRNA, η επαγωγή του MKP-1 από το BCG μειώθηκε σημαντικά (λωρίδες 2 και 4). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το siRNA καταργεί τα επίπεδα του mRNA MKP-1. Για να προσδιοριστεί περαιτέρω εάν το MKP-1 siRNA επηρεάζει το MKP-1 που προκαλείται από BCG σε επίπεδα πρωτεΐνης, το PBMo υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως παραπάνω και οι πρωτεΐνες MKP-1 μετρήθηκαν με στύπωμα Western. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το BCG θα μπορούσε να επάγει πρωτεΐνες MKP-1 ως συνήθως για κύτταρα διαμολυνθέντα με siRNA ελέγχου (Εικόνα 4Β, λωρίδες 1-3). Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης MKP-1 που επάγεται από το BCG μειώθηκαν σε κύτταρα επιμολυνθέντα με MKP-1 siRNA (Σχήμα 4Β, λωρίδες 4-6). Μαζί, τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το MKP-1 siRNA όχι μόνο μείωσε το mRNA του MKP-1 στη θεραπεία με BCG, αλλά επίσης ακύρωσε την πρωτεΐνη MKP-1 που προκλήθηκε από BCG. Όπως αναφέρεται στη βιβλιογραφία [9], τα ποντίκια MKP-1 KO παρουσίασαν αυξημένο TNF -α παραγωγή ως απάντηση στο LPS. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα siRNA του MKP-1, το LPS χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια ως έλεγχος για την επίδειξη των επιδράσεων αυτού του συστήματος siRNA MKP-1. έκφραση κυτοκίνης που προκαλείται από LPS σε MKP-1 επιμολυσμένα με siRNA κύτταρα υποδηλώνει ότι το σύστημα siRNA είναι αποτελεσματικό στην καταστροφή της έκφρασης MKP-1 και το MKP-1 δρα ως αρνητικός ρυθμιστής στην έκφραση του TNF-α που προκαλείται από LPS. Για να διερευνηθεί η επίδραση Το MKP-1 siRNA σε έκφραση κυτοκίνης που προκαλείται από BCG, τα επίπεδα των TNF-α, IL-6 και IL-10 mRNA μετρήθηκαν με τη μέθοδο QPCR. Τα PBMo επιμολύνθηκαν είτε με μάρτυρα είτε με siRNA MKP-1. Μετά από έκθεση σε BCG με siRNA ελέγχου, υπήρξαν σημαντικές επαγωγές των επιπέδων mRNA του TNF-α, IL-6 και IL-10 για 3 ώρες μετά τη θεραπεία όπως αναφέρθηκε προηγουμένως ( [5] και δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια, εξετάστηκαν τα αποτελέσματα του siRNA του MKP-1 στην έκφραση κυτοκίνης που προκαλείται από το BCG. Παραδόξως, υπήρξε μια σημαντική κατάργηση της έκφρασης του TNF-α που προκαλείται από BCG από το siRNA MKP-1 (Εικόνα 4D). Με την καταστροφή του MKP-1, το επίπεδο του επαγόμενου από BCG TNF-α ήταν μόνο 60% σε σύγκριση με αυτό των κυττάρων ελέγχου, ενώ η IL-6 και η IL-10 που προκλήθηκαν από BCG παρέμειναν αμετάβλητα στα επιμολυσμένα με MKP-1 κύτταρα siRNA. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι το MKP-1 παίζει ρόλο στην επαγωγή της έκφρασης του TNF-α κατά τη διέγερση του BCG, η οποία μπορεί να είναι διαφορετική από εκείνη των συμβατικών λειτουργιών του στις οποίες το MKP-1 δρα ως αρνητικός ρυθμιστής σε μονοπάτια σηματοδότησης που προκαλούνται από LPS [7. ] .Οι απροσδόκητες παρατηρήσεις στην έκφραση κυτοκίνης οδηγούν στη διερεύνηση των επιδράσεων του MKP-1 siRNA στην επαγόμενη από BCG ενεργοποίηση MAPK. Το MKP-1 βρέθηκε να έχει μια προτιμώμενη σύνδεση υποστρώματος με p38 MAPK και JNK από το ERK1/2 [7] . Η κατάσταση φωσφορυλίωσης των MAPK εκτιμήθηκε σε PBMo μάρτυρα ή με επιμολυσμένο με MKP-1 siRNA. Τα αποτελέσματα στυπώματος Western έδειξαν ότι το BCG προκάλεσε φωσφορυλίωση p38 MAPK και ERK1/2 σε 15 λεπτά (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και κορυφώθηκε στα 30 λεπτά και στη συνέχεια επέστρεψε στα βασικά επίπεδα σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το siRNA ελέγχου (Εικόνα 5). Παρόμοια με τα αποτελέσματα της έκφρασης κυτοκίνης, η φωσφορυλίωση τόσο της p38 MAPK όσο και της ERK1/2 σε απόκριση στο BCG μειώθηκε σε μονοκύτταρα που είχαν επιμολυνθεί με MKP-1 siRNA αντί της αναμενόμενης αύξησης στη φωσφορυλίωση (Εικόνα 5). Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η καταστροφή του MKP-1 θα είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη φωσφορυλίωση της MAPK από το BCG, υπονοώντας ότι το μειωμένο επίπεδο παραγωγής TNF-α σε διεγερμένα με BCG μονοκύτταρα οφείλεται σε μειωμένη φωσφορυλίωση των MAPK από το MKP-1 siRNA. Αυτή η έκθεση παρουσίασε στοιχεία ότι Η νέα λειτουργία του MKP-1 αποκαλύπτεται στη ρύθμιση των κυτοκινών ως απόκριση σε μυκοβακτηριακή μόλυνση. Το BCG επάγει το MKP-1 ως ταχεία απόκριση (Εικόνα 2). Ο μηχανισμός επαγωγής του MKP-1 από το BCG εξαρτάται τόσο από το ERK1/2 όσο και από το p38 MAPK (Εικόνα 3). Χρησιμοποιώντας την προσέγγιση siRNA, οι λειτουργίες του MKP-1 μπορούν να εξεταστούν σε πρωτογενή ανθρώπινα μονοκύτταρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επαγόμενη από BCG ενεργοποίηση MAPKs καθώς και η έκφραση κυτοκίνης είναι κατάντη του MKP-1 (Εικόνες 4D και 5). Έτσι, το MKP-1 είναι ένα κρίσιμο μόριο σηματοδότησης που εμπλέκεται στην επαγόμενη από BCG έκφραση κυτοκίνης. Προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι το MKP-1 που επάγεται από LPS ή πεπτιδογλυκάνη εξαρτάται από το p38 MAPK [14] . Αντίστοιχα, το MKP-1 που προκαλείται από BCG μπορεί να ανασταλεί τόσο από αναστολείς p38 MAPK όσο και από αναστολείς ERK1/2. Είναι ενδιαφέρον ότι έχει αποδειχθεί ότι η αποικοδόμηση του MKP-1 μειώνεται μετά από φωσφορυλίωση ERK1/2 [15] . Μπορεί να υποτεθεί ότι οι πρωτεΐνες MKP-1 που προκαλούνται από BCG μπορούν να σταθεροποιηθούν με ERK1/2 και οι λεπτομερείς μηχανισμοί που εμπλέκονται απαιτούν περισσότερη εξερεύνηση. Επίσης, δεδομένου ότι η αναστολή της έκφρασης MKP-1 και από τους δύο αναστολείς (για p38 MAPK και ERK1/2) δεν ήταν πλήρης, πιστεύεται ότι άλλες πρωτεΐνες μπορεί να εμπλέκονται στην έκφραση του MKP-1 που προκαλείται από BCG. Με βάση την αποτελέσματα της βιβλιογραφίας σχετικά με τα αποτελέσματα LPS (Εικόνα 6), η αρχική προσδοκία για αυτό το έργο είναι ότι το MKP-1 λειτουργεί ως αρνητικός ρυθμιστής. Τα διεγερμένα με LPS MKP-1 KO περιτοναϊκά μακροφάγα έδειξαν παρατεταμένη φωσφορυλίωση της p38 MAPK και JNK καθώς και αυξημένη παραγωγή TNF-α [9] . Με αυτόν τον τρόπο, η επαγόμενη από LPS MKP-1 θα μπορούσε η επαγόμενη από BCG φωσφορυλίωση MAPK να μειωθεί από το siRNA MKP-1 να αποτρέψει την παρατεταμένη παραγωγή TNF-α όπως στη σήψη, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε σοβαρή βλάβη στον ξενιστή. Αναμενόταν ότι το BCG επάγει το MKP-1 και η επαγωγή του θα συσχετίστηκε με την αποφωσφορυλίωση των MAPKs συμπεριλαμβανομένου του p38 MAPK. Αναστέλλοντας το MKP-1 χρησιμοποιώντας siRNA, αναμενόταν να είχε αυξημένη φωσφορυλίωση της ρ38 MAPK και παρατεταμένη παραγωγή TNF-α σε απόκριση στο BCG. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας που παρουσιάζονται εδώ είναι διαμετρικά αντίθετα. Μια πιθανότητα για τα απροσδόκητα αποτελέσματα μπορεί να οφείλεται σε μη ειδικές επιδράσεις της επιμόλυνσης ή του siRNA. Ωστόσο, αυτό δεν συνέβη αφού υπήρξε παρατεταμένη και αυξημένη έκφραση του TNF-α μετά την επεξεργασία των μονοκύτταρων που είχαν επιμολυνθεί με siRNA MKP-1 με LPS (Εικόνα 4C). Υπάρχει τώρα μια νέα υπόθεση που εξηγεί τέτοιες παράδοξες επιδράσεις του MKP- 1 στη ρύθμιση του TNF-α στην οποία η φωσφατάση παίζει ρόλο στη θετική ρύθμιση της παραγωγής TNF-α ως απόκριση στο BCG όπως στην περίπτωση του DUSP2 [13] . Οι δομές των MKP-1 και DUSP2 είναι παρόμοιες, με τις οποίες και οι δύο περιέχουν μια περιοχή που αλληλεπιδρά με MAPK και μια καταλυτική θέση φωσφατάσης. Αντίθετα, άλλα DUSP μπορεί να έχουν επιπλέον τομείς, π.χ., PEST [6] . Εδώ, υποθέτουμε ότι η λειτουργία του MKP-1 στην επαγόμενη από BCG σηματοδότηση είναι παρόμοια με αυτή του DUSP2/PAC1. Στην πραγματικότητα, η ανακάλυψη του DUSP2 δημιούργησε αρχικά κάποια παράδοξα ερωτήματα. Όπως περιγράφεται, το DUSP2 συμπεριφέρεται διαφορετικά από άλλα μέλη της οικογένειας MKP [13] . Σε μακροφάγους DUSP2 KO που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με LPS, παρήγαγαν λιγότερους φλεγμονώδεις μεσολαβητές, συμπεριλαμβανομένων λιγότερου TNF, IL-6, μονοξειδίου του αζώτου και κυττάρων που παράγουν IL-12, σε σύγκριση με αυτά των ομολόγων του άγριου τύπου [13] . Πράγματι, τα αποτελέσματα αυτών των δημοσιευμένων μελετών για τις μελέτες DUSP2 είναι αρκετά παρόμοια με εκείνα των αποτελεσμάτων που αναφέραμε εδώ. Είναι εύλογο ότι αυτές οι απροσδόκητες θετικές ρυθμίσεις των λειτουργιών των ανοσοκυττάρων από το DUSP2 οφείλονταν σε αλληλεπιδράσεις μεταξύ των MAPK [13] . Αποδείχθηκε ότι υπάρχουν αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μονοπατιών JNK και ERK1/2 [16] .Εδώ, δείξαμε ότι η παρατεταμένη ενεργοποίηση του JNK μπλοκάρει την ενεργοποίηση ERK (Εικόνα 6). Στην κατάσταση DUSP2, η διέγερση των μαστοκυττάρων και των μακροφάγων KO δείχνει αυξημένη φωσφορυλίωση της JNK και η αναστολή της JNK από τον δικό της ειδικό αναστολέα αποκαθιστά τη φωσφορυλίωση του ERK1/2 [13] . Στην κατάσταση BCG-MKP-1, υπάρχει μια πρώιμη φωσφορυλίωση της p38 MAPK και ERK1/2. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι το JNK μπορεί να διαδραματίσει κάποιο ρόλο στην αλληλεπίδραση συνομιλίας του MAPK. Ωστόσο, τα προκαταρκτικά μας δεδομένα υποδηλώνουν ότι το επίπεδο της φωσφορυλιωμένης JNK δεν αυξήθηκε στο PBMo Το MKP-1 παίζει κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης κυτοκίνης κατά τη μόλυνση από μυκοβακτηρίδιο. μόλυνση. Το μοντέλο LPS παρασχέθηκε σύμφωνα με τα ευρήματα της βιβλιογραφίας (Αριστερά). Σε αυτό το σενάριο, το LPS ενεργοποιεί το MKP-1, το οποίο με τη σειρά του αποφωσφορυλιώνει και απενεργοποιεί το phospho-p38 MAPK, με αποτέλεσμα λιγότερη επαγωγή TNF-α. Ωστόσο, η κατάσταση στην ενεργοποίηση του DUSP2 με DHP-HSA είναι πιο περίπλοκη (Μέση), καθώς η δράση της φωσφατάσης προκαλεί επακόλουθη αναστολή της φωσφο-JNK που οδηγεί στην αποκαταστάλωση της φωσφο-ρ38 MAPK. Κατά συνέπεια, τα συνδυασμένα αποτελέσματα αυτού του καταρράκτη έχουν ως αποτέλεσμα περισσότερη έκφραση του TNF-α. Ο απροσδόκητος αντιμυκοβακτηριακός ρόλος του MKP-1 (Δεξιά) μπορεί να εξηγηθεί από γεγονότα παρόμοια με τα αποτελέσματα DUSP2. Σε αυτή την περίπτωση (Δεξιά), υπήρξε αναστολή άγνωστων μονοπατιών ή κινασών κατάντη του MKP-1 και ο άγνωστος παράγοντας με τη σειρά του αναστέλλει την ενεργοποίηση των MAPK οδηγώντας σε περισσότερη επαγωγή TNF-α. Οι λεπτομέρειες και οι στόχοι κινάσης δεν έχουν ακόμη προσδιοριστεί. επιμολύνθηκε με MKP-1 siRNA (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Έτσι, οι λεπτομέρειες της διαφωνίας μεταξύ των MAPK χρειάζονται περαιτέρω διερεύνηση. Εδώ, παρουσιάζουμε ένα μοντέλο για να συνοψίσουμε τα αποτελέσματα και να υποθέσουμε την ύπαρξη ενός ακόμη άγνωστου ενδιάμεσου παράγοντα ή παραγόντων στις οδούς κατάντη των επιδράσεων MKP-1 στον καταρράκτη σηματοδότησης που προκαλείται από BCG. Ο απροσδόκητος αντιμυκοβακτηριακός ρόλος του MKP-1 (Εικόνα 6) μπορεί να εξηγηθεί από γεγονότα παρόμοια με τα αποτελέσματα DUSP2. Σε αυτή την περίπτωση, το BCG επάγει την έκφραση MKP-1 ενώ επίσης ενεργοποιεί τα MAPK συμπεριλαμβανομένων των p38 MAPK και ERK1/2. Κατάντη του MKP-1, υπάρχει αναστολή άγνωστων μονοπατιών ή κινασών. Ο άγνωστος παράγοντας με τη σειρά του αναστέλλει την ενεργοποίηση των MAPKs, η οποία τελικά οδηγεί σε περισσότερη επαγωγή TNF-α (Εικόνα 6). Συνοπτικά, το MKP-1 παίζει κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης κυτοκίνης κατά τη μόλυνση από μυκοβακτηρίδια. Η αναστολή άγνωστων μονοπατιών ή κινασών κατάντη του ΜΚΡ-1, η οποία με τη σειρά της αναστέλλει την ενεργοποίηση των MAPKs, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να εξηγήσει τη νέα λειτουργία της ΜΚΡ-1 στην ενίσχυση της δραστικότητας της ΜΑΡΚ και την επακόλουθη έκφραση του ΤΝΡ-α μετά από θεραπεία με BCG (Εικόνα 6). Συνολικά, ο ρόλος των συνομιλιών MAPK χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση. (3) TNF-α, 30 κύκλοι (TM = 56°C), ανάντη, 5'-GGCTCCAGGCGGTGCTTGTTC-3', κατάντη, 5'-AGACGGCGATGCGGCTGATG-3'. Τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1% με βρωμιούχο αιθίδιο και οπτικοποιήθηκαν υπό υπεριώδες φως. Προκειμένου να ελεγχθεί το μέγεθος των προϊόντων PCR, χρησιμοποιήθηκε 1 kb Plus DNA Lad-der™ (Invitrogen, ΗΠΑ) μαζί με τα προϊόντα PCR. Για την εκτέλεση QPCR, τα επίπεδα του MKP-1 και του TNF-α mRNA επίσης ως το γονίδιο αναφοράς GAPDH (ως εσωτερικός έλεγχος) προσδιορίστηκαν με τα ειδικά γονιδιακά κιτ αντιδραστηρίων Assays-on-Demand (Applied Biosystems, USA). Όλα τα δείγματα εκτελέστηκαν εις διπλούν ή εις τριπλούν και χωρίς ελέγχους προτύπου σε έναν ανιχνευτή ακολουθίας ABI Prism 7700. Η μέθοδος ανάλυσης του QPCR ήταν η συγκριτική μέθοδος αριθμού κύκλου με κατώφλι (CT) όπως περιγράφεται στο δελτίο χρήστη αρ. 2 του ABI Prism 7700 Sequence Detection System. Ο αριθμός CT των στοχευόμενων γονιδίων κανονικοποιήθηκε σε αυτόν της GAPDH σε κάθε δείγμα (ΔC Τ). Η τιμή CT των επεξεργασμένων κυττάρων συγκρίθηκε με αυτή των μη επεξεργασμένων ή ψευδοκατεργασμένων κυττάρων (ΔΔCT). Η σχετική γονιδιακή έκφραση των στοχευόμενων γονιδίων (διπλάσια επαγωγή) υπολογίστηκε ως 2-ΔΔCT. Οι συνολικές κυτταρικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν με λύση κυττάρων σε ρυθμιστικό λύσης που περιείχε 1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA (pH 8,0), 1% SDS, 0,2 mg/ml PMSF, 1 μg/ml απρωτινίνη, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 2 μg/ml πεπστατίνη, 2 μg/ ml λευπεπτίνης και 50 mM φθοριούχου νατρίου για 5 λεπτά. Το ομογενοποίημα στη συνέχεια βράστηκε για 10 λεπτά και αποθηκεύτηκε στους -70°C μέχρι να χρησιμοποιηθεί. Οι συγκεντρώσεις της ολικής πρωτεΐνης σε κυτταρικά εκχυλίσματα προσδιορίστηκαν με BCA™ Protein Assay Kit (Pierce, IL, USA). Το Western blot έγινε όπως περιγράφεται [20]. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE, ηλεκτροστυπώθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Schleicher & Schuell) και ακολούθησε ανίχνευση με ειδικά αντισώματα για Actin, MKP-1 (Santa Cruz Biotech., USA), phospho-p38 MAPK, phospho-ERK1/2 (Cell Signaling, ΗΠΑ). Μετά από τρεις πλύσεις, οι μεμβράνες επωάστηκαν με τα αντίστοιχα δευτερεύοντα αντισώματα. Οι ζώνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Amersham Pharmacia Biotech) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η μεταμόλυνση του siRNA σε ανθρώπινα μονοκύτταρα έγινε όπως περιγράφεται [21] . Το siRNA του MKP-1 περιελάμβανε (i) MKP1-HSS102982, AAACGCUUCGUAUCCUCCUUUGAGG; (ii) MKP1-HSS102983, UUAUGCCCAAGGCAUCCAG-CAUGUC; και (iii) MKP1-HSS102984, UGAUG-GAGUCUAUGAAGUCAAUGGC. Το knockdown MKP-1 στο PBMo διεξήχθη χρησιμοποιώντας μόνο το MKP1-HSS102983 ή μια ομάδα των παραπάνω τριών διαφορετικών MKP-1 Stealth™ Select RNAi (αναλογία = 1:1:1, 200 nM, Invitrogen, ΗΠΑ). Το Stealth™ RNAi Negative Control Duplex (200 nM) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για ανεξάρτητες αλληλουχίας επιδράσεις για τη διαμόλυνση siRNA. Η επιμόλυνση των μονοκυττάρων έγινε με τη χρήση αντιδραστηρίου μορφομετατροπής DNA jetPEI™ (Polyplus Transfection, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά τη διαμόλυνση των κυττάρων για 24 ώρες, τα μορφομετατραπέντα υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαφορετικούς επαγωγείς όπως περιγράφεται παραπάνω. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη δοκιμή Student's t. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν οι τιμές p ήταν μικρότερες από 0,05.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 2610, "text": "κυτοκίνες" } ], "id": 888, "question": "Τι είναι ο παράγοντας νέκρωσης όγκου-άλφα;" }, { "answers": [ { "answer_start": 998, "text": "MAPK φωσφατάση-1" } ], "id": 889, "question": "Τι ρυθμίζει τη δραστηριότητα της δραστηριότητας MAPK;" }, { "answers": [ { "answer_start": 330, "text": "Mycobacterium tuberculosis" } ], "id": 890, "question": "Τι προκαλεί τη φυματίωση;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2155, "text": "το ένα τρίτο του παγκόσμιου πληθυσμού" } ], "id": 891, "question": "Τι ποσοστό του κόσμου έχει μολυνθεί από φυματίωση;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2313, "text": "9,2 εκατ" } ], "id": 892, "question": "Πόσα νέα κρούσματα φυματίωσης υπάρχουν κάθε χρόνο παγκοσμίως;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4738, "text": "φωσφορυλίωση" } ], "id": 894, "question": "Πώς ενεργοποιείται το MAPK;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4192, "text": "φωσφατάσες τυροσίνης, φωσφατάσες σερίνης/θρεονίνης και φωσφατάσες διπλής ειδικότητας (DUSPs)" } ], "id": 895, "question": "Ποια ένζυμα εμπλέκονται στη φωσφορυλίωση;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4394, "text": "τουλάχιστον 10" } ], "id": 896, "question": "Πόσες MAPK φωσφατάσες υπάρχουν;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6425, "text": "Gram θετικά βακτήρια" } ], "id": 898, "question": "Τι είναι ο Staph aureus;" }, { "answers": [ { "answer_start": 8560, "text": "MAPK" } ], "id": 899, "question": "Ποια πρωτεΐνη βρίσκεται στην κρίσιμη διαδρομή της ανοσίας και της έκφρασης κυτοκίνης;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Εμβόλια κατά του ιού της γρίπης που μεταδίδονται με ιούςhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4147686/SHA: f6d2afb2ec44d8656972ea79f8a833143bbeb42bΣυγγραφείς: Tripp; Tompkins, S. MarkDate: 2014-08-07DOI: 10.3390/v6083055License: cc-byAbstract: Παρά τη διαθεσιμότητα ενός απενεργοποιημένου εμβολίου που έχει λάβει άδεια για >50 χρόνια, ο ιός της γρίπης συνεχίζει να προκαλεί νοσηρότητα και θνησιμότητα παγκοσμίως. Η συνεχής εξέλιξη των στελεχών του ιού της γρίπης που κυκλοφορούν και η εμφάνιση νέων στελεχών μειώνει την αποτελεσματικότητα των ετήσιων εμβολίων που βασίζονται στην αντιστοίχιση με τα κυκλοφορούντα στελέχη της γρίπης. Επομένως, υπάρχει μια συνεχής ανάγκη για νέα, αποτελεσματικά εμβόλια που παρέχουν διακλαδική προστασία για να αποφευχθεί η ανάγκη για εξαμηνιαία αναμόρφωση των εμβολίων εποχικής γρίπης. Τα εμβόλια με ανασυνδυασμένο ιό είναι μια ελκυστική εναλλακτική στα κλασικά αδρανοποιημένα εμβόλια επειδή οι φορείς ιών επιτρέπουν την φυσική έκφραση αντιγόνων γρίπης, ακόμη και από λοιμογόνους ιούς γρίπης, ενώ εκφράζονται στο πλαίσιο του φορέα που μπορεί να βελτιώσει την ανοσογονικότητα. Επιπλέον, ένα εμβόλιο με φορέα επιτρέπει συχνά τη χορήγηση του εμβολίου σε σημεία επαγωγικής ανοσίας όπως η αναπνευστική οδός που επιτρέπει την προστασία από τη μόλυνση από τον ιό της γρίπης. Επιπλέον, η ικανότητα εύκολου χειρισμού φορέων ιών για την παραγωγή νέων εμβολίων γρίπης μπορεί να παρέχει την ταχύτερη διαδρομή προς ένα καθολικό εμβόλιο που προστατεύει από όλους τους ιούς της γρίπης. Αυτή η ανασκόπηση θα συζητήσει τα πειραματικά εμβόλια που μεταδίδονται με ιούς για χρήση σε ανθρώπους, συγκρίνοντάς τα με τα εγκεκριμένα εμβόλια και τα εμπόδια που αντιμετωπίζουν για την αδειοδότηση αυτών των εμβολίων για τον ιό της γρίπης επόμενης γενιάς. Κείμενο: Η εποχική γρίπη είναι ένα παγκόσμιο πρόβλημα υγείας που προκαλεί υψηλή κινητικότητα και σημαντική θνησιμότητα. 1] [2] [3] [4] . Επιπλέον, η μόλυνση από γρίπη συχνά επιδεινώνει προϋπάρχουσες ιατρικές καταστάσεις [5] [6] [7] . Τα εμβόλια κατά των κυκλοφορούντων στελεχών της γρίπης είναι διαθέσιμα και ενημερώνονται ετησίως, αλλά πολλά ζητήματα εξακολουθούν να υπάρχουν, συμπεριλαμβανομένης της χαμηλής αποτελεσματικότητας στους πληθυσμούς που διατρέχουν μεγαλύτερο κίνδυνο επιπλοκών από τη μόλυνση από τον ιό της γρίπης, δηλαδή στους νέους και τους ηλικιωμένους [8, 9]. Παρά τα αυξανόμενα ποσοστά εμβολιασμού, οι νοσηλείες που σχετίζονται με τη γρίπη αυξάνονται [8, 10] και έχει αναπτυχθεί σημαντική αντοχή στα φάρμακα σε δύο από τα τέσσερα επί του παρόντος εγκεκριμένα αντι-ιικά φάρμακα [11, 12]. Ενώ τα ανοσοενισχυτικά έχουν τη δυνατότητα να βελτιώσουν την αποτελεσματικότητα και τη διαθεσιμότητα των σημερινών αδρανοποιημένων εμβολίων, τα ζωντανά εξασθενημένα εμβόλια και τα εμβόλια με ιό εξακολουθούν να θεωρούνται μία από τις καλύτερες επιλογές για την πρόκληση ευρείας και αποτελεσματικής ανοσίας στον ιό της γρίπης [13] . Οι γενικοί τύποι από τα εμβόλια γρίπης που είναι διαθέσιμα στις Ηνωμένες Πολιτείες είναι το τριδύναμο αδρανοποιημένο εμβόλιο γρίπης (TIV), το τετραδύναμο εμβόλιο γρίπης (QIV) και το ζωντανό εξασθενημένο εμβόλιο γρίπης (LAIV; σε τρισθενείς και τετρασθενείς μορφές). Υπάρχουν τρεις τύποι αδρανοποιημένων εμβολίων που περιλαμβάνουν αδρανοποιημένα εμβόλια ολόκληρου του ιού, αδρανοποιημένα με διαχωρισμό ιού και εμβόλια υπομονάδας. Στα εμβόλια split virus, ο ιός διασπάται από ένα απορρυπαντικό. Σε εμβόλια υπομονάδας, τα ΗΑ και ΝΑ έχουν περαιτέρω καθαριστεί με απομάκρυνση άλλων ιικών συστατικών. Το TIV χορηγείται ενδομυϊκά και περιέχει τρεις ή τέσσερις αδρανοποιημένους ιούς, δηλαδή δύο στελέχη τύπου Α (Η1 και Η3) και ένα ή δύο στελέχη τύπου Β. Η αποτελεσματικότητα του TIV μετράται με την επαγωγή χυμικών αποκρίσεων στην πρωτεΐνη αιμοσυγκολλητίνης (ΗΑ), την κύρια γλυκοπρωτεΐνη επιφάνειας και προσκόλλησης στη γρίπη. Οι αποκρίσεις αντισωμάτων ορού στην ΗΑ μετρώνται με τη δοκιμασία αναστολής αιμοσυγκόλλησης (HI) και ο ειδικός για το στέλεχος τίτλος HI θεωρείται ο χρυσός κανόνας συσχετισμός της ανοσίας στη γρίπη όπου τετραπλάσια αύξηση του τίτλου μετά τον εμβολιασμό ή HI τίτλος ≥1:40 θεωρείται προστατευτικός [4, 14]. Η προστασία έναντι της κλινικής νόσου παρέχεται κυρίως από τα αντισώματα ορού. Ωστόσο, τα αντισώματα IgA του βλεννογόνου μπορεί επίσης να συμβάλλουν στην αντίσταση έναντι της μόλυνσης. Τα εμβόλια αδρανοποιημένα με διάσπαση του ιού μπορούν να προκαλέσουν αποκρίσεις αντισωμάτων ειδικών για τη νευραμινιδάση (NA) [15] [16] [17] , και τα αντισώματα αντι-ΝΑ έχουν συσχετιστεί με προστασία από μόλυνση στον άνθρωπο [18] [19] [20] [21] [22] . Επί του παρόντος, οι ειδικές για το ΝΑ αποκρίσεις αντισωμάτων δεν θεωρούνται συσχετισμός προστασίας [14] . Το LAIV χορηγείται ως ρινικό εκνέφωμα και περιέχει τα ίδια τρία ή τέσσερα στελέχη του ιού της γρίπης με τα απενεργοποιημένα εμβόλια αλλά σε εξασθενημένο σκελετό εμβολίου [4] . Τα LAIV είναι ευαίσθητα στη θερμοκρασία και προσαρμοσμένα στο κρύο, επομένως δεν αναπαράγονται αποτελεσματικά στη θερμοκρασία του πυρήνα του σώματος, αλλά αναπαράγονται στον βλεννογόνο του ρινοφάρυγγα [23] . Η ανοσοποίηση LAIV επάγει αποκρίσεις αντισωμάτων ορού, αποκρίσεις αντισωμάτων βλεννογόνου (IgA) και αποκρίσεις Τ κυττάρων. Ενώ οι ισχυρές αποκρίσεις αντισώματος αντισώματος ορού και ρινικής πλύσης (βλεννογόνος) σχετίζονται με προστασία από λοίμωξη, άλλες ανοσολογικές αποκρίσεις, όπως αποκρίσεις CD8 + κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων (CTL) μπορεί να συμβάλλουν στην προστασία και δεν υπάρχει σαφής συσχέτιση της ανοσίας για το LAIV [4 , 14, 24] .Τα εμβόλια κατά του ιού της γρίπης που έχουν λάβει άδεια επί του παρόντος υποφέρουν από μια σειρά ζητημάτων. Τα αδρανοποιημένα εμβόλια βασίζονται σε ειδικές αποκρίσεις αντισωμάτων στο ΗΑ και σε μικρότερο βαθμό στις πρωτεΐνες ΝΑ για προστασία. Τα ανοσοκυρίαρχα τμήματα των μορίων HA και NA υφίστανται μια συνεχή διαδικασία αντιγονικής μετατόπισης, μια φυσική συσσώρευση μεταλλάξεων, που επιτρέπει την αποφυγή του ιού από την ανοσία [9, 25]. Έτσι, τα κυκλοφορούντα στελέχη γρίπης Α και Β επανεξετάζονται ετησίως για αντιγονική αντιστοίχιση με τα τρέχοντα εμβόλια, η αντικατάσταση των στελεχών του εμβολίου μπορεί να πραγματοποιείται τακτικά και συνιστάται ετήσιος εμβολιασμός για την εξασφάλιση προστασίας [4, 26, 27] . Για το βόρειο ημισφαίριο, η επιλογή του στελέχους του εμβολίου γίνεται τον Φεβρουάριο και στη συνέχεια οι κατασκευαστές ξεκινούν την παραγωγή, χρειάζονται τουλάχιστον έξι μήνες για να παραγάγουν τις εκατομμύρια δόσεις εμβολίου που απαιτούνται για το φθινόπωρο [27] . Εάν η πρόβλεψη είναι ατελής ή εάν οι κατασκευαστές έχουν προβλήματα με την παραγωγή εμβολίων, η αποτελεσματικότητα ή η διαθεσιμότητα του εμβολίου μπορεί να τεθεί σε κίνδυνο [28] . Το LAIV δεν συνιστάται για όλους τους πληθυσμούς. Ωστόσο, γενικά θεωρείται ότι είναι εξίσου αποτελεσματικό με τα αδρανοποιημένα εμβόλια και μπορεί να είναι πιο αποτελεσματικό στα παιδιά [4, 9, 24]. Ενώ το LAIV βασίζεται σε αντιγονικό ταίριασμα και τα αντιγόνα HA και NA αντικαθίστανται με το ίδιο πρόγραμμα με το TIV [4, 9], υπάρχει κάποια πρόταση ότι το LAIV μπορεί να προκαλέσει ευρύτερη προστασία από το TIV λόγω της ποικιλομορφίας της ανοσολογικής απόκρισης που συνάδει με την επαγωγή Αντισώματα ορού και βλεννογόνου που εξουδετερώνουν τον ιό, καθώς και ευρέως αντιδραστικές αποκρίσεις Τ κυττάρων [9, 23, 29]. Ενώ συνολικά τόσο το TIV όσο και το LAIV θεωρούνται ασφαλή και αποτελεσματικά, υπάρχει αναγνωρισμένη ανάγκη για βελτιωμένα εμβόλια εποχικής γρίπης [26] . Επιπλέον, η βελτιωμένη κατανόηση της ανοσίας στα διατηρημένα αντιγόνα του ιού της γρίπης έχει αυξήσει την πιθανότητα ενός καθολικού εμβολίου και αυτά τα καθολικά αντιγόνα πιθανότατα θα απαιτούν νέα εμβόλια για αποτελεσματική χορήγηση [30] [31] [32] .Τα εμβόλια με φορείς ιού μοιράζονται πολλά από τα πλεονεκτήματα του LAIV, καθώς και εκείνα που είναι μοναδικά για τους φορείς. Υπάρχουν συστήματα ανασυνδυασμένου DNA που επιτρέπουν έτοιμο χειρισμό και τροποποίηση του γονιδιώματος του φορέα. Αυτό με τη σειρά του επιτρέπει την τροποποίηση των φορέων για την εξασθένηση του ιού ή την ενίσχυση της ανοσογονικότητας, επιπλέον της προσθήκης και του χειρισμού των αντιγόνων του ιού της γρίπης. Πολλοί από αυτούς τους φορείς έχουν μελετηθεί εκτενώς ή έχουν χρησιμοποιηθεί ως εμβόλια κατά των μορφών άγριου τύπου του ιού. Τέλος, καθένας από αυτούς τους φορείς εμβολίου είτε είναι ελαττωματικός ως προς την αναπαραγωγή είτε προκαλεί μια αυτοπεριοριζόμενη μόλυνση, αν και όπως το LAIV, η ασφάλεια σε ανοσοκατεσταλμένα άτομα εξακολουθεί να αποτελεί ανησυχία [4, 13, [33] [34] [35] . Ο Πίνακας 1 συνοψίζει τα οφέλη και τις ανησυχίες καθενός από τα εμβόλια που μεταδίδονται με ιούς που συζητούνται εδώ. Υπάρχουν 53 ορότυποι αδενοϊού, πολλοί από τους οποίους έχουν διερευνηθεί ως φορείς εμβολίων. Ένα εμβόλιο ζωντανού αδενοϊού που περιέχει ορότυπους 4 και 7 χρησιμοποιείται από τον στρατό εδώ και δεκαετίες, υποδηλώνοντας ότι οι αδενοϊοί μπορεί να είναι ασφαλείς για ευρεία χρήση εμβολίων [36] . Ωστόσο, οι ανησυχίες για την ασφάλεια οδήγησαν στην πλειονότητα της ανάπτυξης εμβολίων με βάση τον αδενοϊό να επικεντρωθεί σε φορείς με ελαττωματικούς πολλαπλασιασμούς. Ο αδενοϊός 5 (Ad5) είναι ο πιο μελετημένος ορότυπος, που έχει δοκιμαστεί για γονιδιακή παράδοση και αντικαρκινικούς παράγοντες, καθώς και για εμβόλια μολυσματικών ασθενειών. Οι φορείς αδενοϊού είναι ελκυστικοί ως φορείς εμβολίων επειδή το γονιδίωμά τους είναι πολύ σταθερό και υπάρχει ποικιλία διαθέσιμων ανασυνδυασμένων συστημάτων που μπορούν να φιλοξενήσουν έως και 10 kb ανασυνδυασμένου γενετικού υλικού [37] . Ο αδενοϊός είναι ένας ιός χωρίς περίβλημα που είναι σχετικά σταθερός και μπορεί να διαμορφωθεί για μακροχρόνια αποθήκευση στους 4 °C ή ακόμη και αποθήκευση έως και έξι μήνες σε θερμοκρασία δωματίου [33] . Τα εμβόλια αδενοϊού μπορούν να αναπτυχθούν σε υψηλούς τίτλους, που υπερβαίνουν τις 10 μονάδες σχηματισμού πλάκας 1° ανά mL όταν καλλιεργούνται σε κύτταρα 293 ή PER.C6 [38] και ο ιός μπορεί να καθαριστεί με απλές μεθόδους [39] . Τα εμβόλια αδενοϊού μπορούν επίσης να χορηγηθούν μέσω πολλαπλών οδών, συμπεριλαμβανομένης της ενδομυϊκής ένεσης, της υποδόριας ένεσης, της ενδοδερμικής ένεσης, της από του στόματος χορήγησης με χρήση προστατευτικής κάψουλας και της ενδορρινικής χορήγησης. Είναι σημαντικό ότι οι δύο τελευταίες μέθοδοι χορήγησης επάγουν ισχυρές ανοσοαποκρίσεις του βλεννογόνου και μπορεί να παρακάμψουν την προϋπάρχουσα ανοσία φορέα [33] . Ακόμη και οι φορείς αδενοϊού με ελαττωματικούς αναδιπλασιασμούς είναι φυσικά ανοσοδιεγερτικά και αποτελεσματικά ανοσοενισχυτικά στο ανασυνδυασμένο αντιγόνο που χορηγείται. Ο αδενοϊός έχει μελετηθεί εκτενώς ως φορέας εμβολίου για ανθρώπινη ασθένεια. Η πρώτη αναφορά που χρησιμοποιεί αδενοϊό ως φορέα εμβολίου για τη γρίπη έδειξε ανοσογονικότητα του ανασυνδυασμένου αδενοϊού 5 (rAd5) που εκφράζει το ΗΑ ενός ιού γρίπης των χοίρων, A/Swine/Iowa/1999 (H3N2). Η ενδομυϊκή ανοσοποίηση ποντικών με αυτό το κατασκεύασμα προκάλεσε ισχυρές αποκρίσεις εξουδετερωτικών αντισωμάτων και προστάτευσε τα ποντίκια από πρόκληση με έναν ετερόλογο ιό, A/Hong Kong/1/1968 (H3N2) [40] . Τα ελαττωματικά εμβόλια rAd5 που εκφράζουν ΗΑ κατά της γρίπης έχουν επίσης δοκιμαστεί σε ανθρώπους. Ένα rAd5-HA που εκφράζει το ΗΑ από το A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1; PR8) χορηγήθηκε σε ανθρώπους επιδερμικά ή ενδορινικά και προσδιορίστηκε για ασφάλεια και ανοσογονικότητα. Το εμβόλιο ήταν καλά ανεκτό και η επαγόμενη ορομετατροπή με την ενδορρινική χορήγηση είχε υψηλότερο ρυθμό μετατροπής και υψηλότερους γεωμετρικούς τίτλους HI [41] . Ενώ οι κλινικές δοκιμές με φορείς rAd ήταν συνολικά επιτυχείς, επιδεικνύοντας ασφάλεια και κάποιο επίπεδο αποτελεσματικότητας, ο rAd5 ως φορέας έχει επισκιαστεί αρνητικά από δύο αποτυχίες κλινικών δοκιμών. Η πρώτη δοκιμή ήταν μια εξέταση γονιδιακής θεραπείας όπου η ενδοφλέβια χορήγηση υψηλής δόσης ενός φορέα Ad είχε ως αποτέλεσμα το θάνατο ενός 18χρονου άνδρα [42, 43]. Η δεύτερη κλινική αποτυχία ήταν η χρήση ενός εμβολίου HIV με φορέα Ad5 που δοκιμαζόταν ως μέρος μιας μελέτης σταδίου, μιας κλινικής δοκιμής φάσης 2Β. Σε αυτή τη μελέτη, τα άτομα εμβολιάστηκαν με τον φορέα εμβολίου Ad5 που εκφράζει γονίδια HIV-1 gag, pol και nef. Το εμβόλιο προκάλεσε ειδικές για τον HIV αποκρίσεις Τ κυττάρων. Ωστόσο, η μελέτη διακόπηκε αφού η ενδιάμεση ανάλυση έδειξε ότι το εμβόλιο δεν πέτυχε αποτελεσματικότητα και τα άτομα με υψηλούς προϋπάρχοντες τίτλους αντισωμάτων Ad5 ενδέχεται να έχουν αυξημένο κίνδυνο να αποκτήσουν HIV-1 [44] [45] [46] . Στη συνέχεια, επιβεβαιώθηκε ο κίνδυνος που σχετίζεται με το εμβόλιο rAd5 [47] . Αν και αυτές οι δύο περιπτώσεις δεν υποδεικνύουν ότι τα εμβόλια Ad-vector είναι επικίνδυνα ή αναποτελεσματικά, η ομπρέλα από τις σημειώσεις των κλινικών δοκιμών έχει επηρεάσει το ενδιαφέρον για όλα τα εμβόλια αδενοϊού, αλλά το ενδιαφέρον παραμένει. Η ανοσοποίηση με φορείς αδενοϊού προκαλεί ισχυρές κυτταρικές και χυμικές ανοσολογικές αποκρίσεις που ξεκινά μέσω εξαρτώμενων από τον υποδοχέα και ανεξάρτητων μονοπατιών που μοιάζουν με τα διόδια που επάγουν ισχυρές προφλεγμονώδεις αποκρίσεις κυτοκίνης. Τα ανασυνδυασμένα Ad εμβόλια που εκφράζουν αντιγόνα HA από πανδημικό H1N1 (pH1N1), H5 και H7 υψηλής παθογονικότητας ιού γρίπης των πτηνών (HPAI) (HPAIV) και ιούς γρίπης των πτηνών H9 έχουν δοκιμαστεί για αποτελεσματικότητα σε διάφορα ζωικά μοντέλα, συμπεριλαμβανομένων κοτόπουλων, ποντικών, και κουνάβια, και αποδείχθηκε ότι είναι αποτελεσματικά και παρέχουν προστασία από πρόκληση [48, 49] . Έχουν διερευνηθεί αρκετοί φορείς rAd5 για τη χορήγηση αντιγόνων μη-ΗΑ, νουκλεοπρωτεΐνης γρίπης (NP) και πρωτεΐνης μήτρας 2 (M2) [29, [50] [51] [52] . Η αποτελεσματικότητα των μη-ΗΑ αντιγόνων οδήγησε στη συμπερίληψή τους με εμβόλια που βασίζονται σε HA για τη βελτίωση της ανοσογονικότητας και τη διεύρυνση του εύρους τόσο της χυμικής όσο και της κυτταρικής ανοσίας [53, 54] . Ωστόσο, καθώς οι αποκρίσεις των κυττάρων CD8 + T και των εξουδετερωτικών αντισωμάτων δημιουργούνται από τον φορέα και τα αντιγόνα του εμβολίου, η ανοσολογική μνήμη σε αυτά τα συστατικά μπορεί να μειώσει την αποτελεσματικότητα και να περιορίσει την επαναλαμβανόμενη χρήση [48] .Ένα μειονέκτημα ενός φορέα Ad5 είναι η πιθανότητα προϋπάρχουσας ανοσίας. Έτσι, εναλλακτικοί ορότυποι αδενοϊού έχουν διερευνηθεί ως φορείς, ιδιαίτερα μη ανθρώπινοι και ασυνήθιστοι ανθρώπινοι ορότυποι. Οι φορείς μη ανθρώπινου αδενοϊού περιλαμβάνουν εκείνους από μη ανθρώπινα πρωτεύοντα (NHP), σκύλους, πρόβατα, χοίρους, αγελάδες, πτηνά και άλλους [48, 55]. Αυτοί οι φορείς μπορούν να μολύνουν μια ποικιλία τύπων κυττάρων, αλλά γενικά είναι εξασθενημένοι στους ανθρώπους αποφεύγοντας ανησυχίες για προϋπάρχουσα ανοσία. Οι αδενοϊοί των χοίρων, του NHP και των βοοειδών που εκφράζουν αντιγόνα Η5ΗΑ έχει αποδειχθεί ότι επάγουν ανοσία συγκρίσιμη με τα ανθρώπινα εμβόλια rAd5-H5 [33, 56]. Οι ανασυνδυασμένοι, ελαττωματικοί στην αναπαραγωγή αδενοϊοί από ορότυπους χαμηλού επιπολασμού έχουν επίσης αποδειχθεί ότι είναι αποτελεσματικοί. Ορότυποι χαμηλού επιπολασμού όπως οι τύποι αδενοϊού 3, 7, 11 και 35 μπορούν να αποφύγουν τις ανοσολογικές αποκρίσεις κατά του Ad5 διατηρώντας παράλληλα την αποτελεσματική παροχή αντιγόνου και την ανοσογονικότητα [48, 57]. Στρατηγικές αρχικής ενίσχυσης, χρησιμοποιώντας ανοσοποίηση DNA ή πρωτεΐνης σε συνδυασμό με ενισχυτική ανοσοποίηση εμβολίου αδενοϊού, έχουν επίσης διερευνηθεί ως μέσο για την αποφυγή προϋπάρχουσας ανοσίας [52] . Οι αδενο-συνδεόμενοι ιοί (AAV) εξερευνήθηκαν για πρώτη φορά ως φορείς γονιδιακής θεραπείας. Όπως οι φορείς rAd, ο rAAV έχει ευρύ τροπισμό που μολύνει μια ποικιλία ξενιστών, ιστών και πολλαπλασιαζόμενους και μη πολλαπλασιαζόμενους κυτταρικούς τύπους [58]. Οι AAVs γενικά δεν θεωρούνταν φορείς εμβολίων επειδή θεωρούνταν ευρέως ότι ήταν ανεπαρκώς ανοσογονικοί. Μια σπερματική μελέτη που χρησιμοποιούσε AAV-2 για να εκφράσει μια γλυκοπρωτεΐνη HSV-2 έδειξε ότι αυτός ο φορέας εμβολίου ιού επήγαγε αποτελεσματικά ισχυρές αποκρίσεις CD8 + Τ κυττάρων και αντισώματος ορού, ανοίγοντας έτσι την πόρτα σε άλλες μελέτες που σχετίζονται με το εμβόλιο rAAV [59, 60] .ΑAV φορέας τα συστήματα έχουν μια σειρά από ελκυστικές ιδιότητες. Οι ιοί άγριου τύπου είναι μη παθογόνοι και δεν μπορούν να αναπαραχθούν στον άνθρωπο και τα συστήματα ανασυνδυασμένων φορέων AAV εξασθενούν ακόμη περισσότερο [61] . Ως μέλη της οικογένειας των παρβοϊών, οι AAV είναι μικροί ιοί χωρίς περίβλημα που είναι σταθεροί και επιδέχονται μακροχρόνια αποθήκευση χωρίς ψυχρή αλυσίδα. Ενώ υπάρχει περιορισμένη προϋπάρχουσα ανοσία, η διαθεσιμότητα μη ανθρώπινων στελεχών ως υποψήφιων εμβολίων εξαλείφει αυτές τις ανησυχίες. Οι τροποποιήσεις στον φορέα έχουν επίσης αυξημένη ανοσογονικότητα [60] . Υπάρχουν περιορισμένες μελέτες που χρησιμοποιούν AAVs ως φορείς εμβολίου για τη γρίπη. Ένα AAV που εκφράζει ένα αντιγόνο HA αποδείχθηκε για πρώτη φορά ότι επάγει προστατευτικό το 2001 [62]. Αργότερα, ένα υβριδικό AAV που προέρχεται από δύο απομονώσεις πρωτευόντων πλην του ανθρώπου (AAVrh32.33) χρησιμοποιήθηκε για να εκφράσει το NP της γρίπης και να προστατεύσει από την πρόκληση PR8 σε ποντικούς [63] . Πιο πρόσφατα, μετά την πανδημία του ιού της γρίπης H1N1 του 2009, δημιουργήθηκαν φορείς rAAV που εκφράζουν τις πρωτεΐνες HA, NP και μήτρας 1 (M1) του A/Mexico/4603/2009 (pH1N1) και σε μελέτες ανοσοποίησης και πρόκλησης σε ποντίκια, το rAAV- Τα HA και rAAV-NP αποδείχθηκαν προστατευτικά. Ωστόσο, τα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με rAAV-HA + NP + M1 είχαν την πιο ισχυρή προστασία. Επίσης, τα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με rAAV-HA + rAAV-NP + rAAV-M1 προστατεύτηκαν επίσης εν μέρει από την ετερόλογη (PR8, H1N1) πρόκληση [63] . Πιο πρόσφατα, ένας φορέας AAV χρησιμοποιήθηκε για την παροχή παθητικής ανοσίας στη γρίπη [64, 65]. Σε αυτές τις μελέτες, ο AAV (AAV8 και AAV9) χρησιμοποιήθηκε για την παροχή ενός διαγονιδίου αντισώματος που κωδικοποιεί ένα ευρέως διασταυρούμενο προστατευτικό μονοκλωνικό αντίσωμα κατά της γρίπης για έκφραση in vivo. Τόσο η ενδομυϊκή όσο και η ενδορινική χορήγηση των AAV αποδείχθηκε ότι προστατεύει από μια σειρά από προκλήσεις του ιού της γρίπης σε ποντίκια και κουνάβια, συμπεριλαμβανομένων των ιών H1N1 και H5N1 [64, 65]. Αυτές οι μελέτες υποδηλώνουν ότι οι φορείς rAAV είναι πολλά υποσχόμενοι φορείς εμβολίου και ανοσοπροφύλαξης. Σε αυτό το σημείο, ενώ περίπου 80 κλινικές δοκιμές φάσης Ι, Ι/ΙΙ, ΙΙ ή ΙΙΙ rAAV είναι ανοιχτές, ολοκληρώθηκαν ή υπό εξέταση, αυτές έχουν επικεντρωθεί σε μελέτες μεταφοράς γονιδίων και έτσι υπάρχουν ακόμη περιορισμένα δεδομένα ασφάλειας για τη χρήση του rAAV ως εμβόλια [66] .Οι αλφαιοί είναι ιοί θετικής αίσθησης, μονόκλωνοι RNA της οικογένειας Togaviridae. Μια ποικιλία αλφαϊών έχουν αναπτυχθεί ως φορείς εμβολίων, συμπεριλαμβανομένου του ιού Semliki Forest (SFV), του ιού Sindbis (SIN), του ιού της εγκεφαλίτιδας των ίππων της Βενεζουέλας (VEE), καθώς και χιμαιρικών ιών που ενσωματώνουν τμήματα ιών SIN και VEE. Τα ελαττωματικά εμβόλια ή ρεπλικόνια με αντιγραφή δεν κωδικοποιούν ιικές δομικές πρωτεΐνες, έχοντας αυτά τα τμήματα του γονιδιώματος να αντικαθίστανται με διαγονιδιακό υλικό. Οι δομικές πρωτεΐνες παρέχονται σε συστήματα παραγωγής κυτταροκαλλιέργειας. Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό των συστημάτων αντιγραφής είναι η αυτο-αναπαραγόμενη φύση του RNA. Παρά το μερικό ιικό γονιδίωμα, τα RNA είναι αυτοαναπαραγόμενα και μπορούν να εκφράζουν διαγονίδια σε πολύ υψηλά επίπεδα [67] . Το SIN, το SFV και το VEE έχουν όλα ελεγχθεί για αποτελεσματικότητα ως φορείς εμβολίων για τον ιό της γρίπης [68] [69] [70 ] [71] . Ένα σύστημα αντιγραφής που βασίζεται σε VEE που κωδικοποιεί το HA από το PR8 αποδείχθηκε ότι επάγει ισχυρή ανοσοαπόκριση ειδική για HA και προστατεύεται από πρόκληση σε ένα μοντέλο ποντικού, παρά την επαναλαμβανόμενη ανοσοποίηση με τον φορέα που εκφράζει ένα αντιγόνο ελέγχου, γεγονός που υποδηλώνει ότι η προϋπάρχουσα ανοσία μπορεί να μην αποτελεί πρόβλημα για το εμβόλιο αντιγραφής [68] . Μια ξεχωριστή μελέτη ανέπτυξε ένα σύστημα αντιγραφής VEE που εκφράζει το HA από το A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) και έδειξε ποικίλη αποτελεσματικότητα μετά τον in ovo εμβολιασμό ή τον εμβολιασμό νεοσσών 1 ημέρας [70] . Ένας ανασυνδυασμένος ιός SIN χρησιμοποιήθηκε ως φορέας εμβολίου για να απελευθερώσει μόνο έναν επίτοπο κυττάρων CD8 + Τ. Ο καλά χαρακτηρισμένος επίτοπος NP εκφράστηκε διαγονιδιακά στο σύστημα SIN και αποδείχθηκε ότι είναι ανοσογονικός σε ποντίκια, ενεργοποιώντας μια ισχυρή απόκριση κυττάρων CD8 + Τ και μειώνοντας τον τίτλο του ιού της γρίπης μετά την πρόκληση [69] . Πιο πρόσφατα, ένα σύστημα αντιγραφής VEE που εκφράζει την πρωτεΐνη HA του PR8 αποδείχθηκε ότι προστατεύει νεαρά ενήλικα (ηλικίας 8 εβδομάδων) και ηλικιωμένων (12 μηνών) ποντίκια από θανατηφόρο ομόλογο πρόκληση [72] . Τα συστήματα αντιγραφής VEE είναι ιδιαίτερα ελκυστικό καθώς το VEE στοχεύει τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα στους λεμφικούς ιστούς, ενεργοποιώντας γρήγορες και ισχυρές ανοσολογικές αποκρίσεις [73] . Τα συστήματα αντιγραφής VEE μπορούν να προκαλέσουν ισχυρές ανοσολογικές αποκρίσεις του βλεννογόνου μέσω ενδορρινικής ή υποδόριας ανοσοποίησης [72] [73] [74] και υποδόριας ανοσοποίησης με σωματίδια αντιγράφου τύπου ιού (VRP) που εκφράζουν ειδικά αντιγόνα συστημικά IgG και αντισώματα κοπράνων [IgA] 74] . Τα VRP που προέρχονται από τον ιό VEE έχουν αναπτυχθεί ως υποψήφια εμβόλια για τον κυτταρομεγαλοϊό (CMV). Μια κλινική δοκιμή φάσης Ι με το CMV VRP έδειξε ότι το εμβόλιο ήταν ανοσογονικό, προκαλώντας αποκρίσεις αντισωμάτων που εξουδετερώνουν τον CMV και ισχυρές αποκρίσεις Τ κυττάρων. Επιπλέον, το εμβόλιο ήταν καλά ανεκτό και θεωρήθηκε ασφαλές [75] . Μια ξεχωριστή κλινική δοκιμή αξιολόγησε την αποτελεσματικότητα της επαναλαμβανόμενης ανοσοποίησης με ένα VRP που εκφράζει ένα αντιγόνο όγκου. Το εμβόλιο ήταν ασφαλές και παρά την υψηλή ειδική για τον φορέα ανοσία μετά την αρχική ανοσοποίηση, συνέχισε να ενισχύει τις ειδικές για τα διαγονίδια ανοσοαποκρίσεις κατά την ενίσχυση [76] . Αν και απαιτούνται πρόσθετα κλινικά δεδομένα, αυτές οι αναφορές υποδεικνύουν ότι τα συστήματα αντιγραφής αλφαϊού ή τα VRP μπορεί να είναι ασφαλή και αποτελεσματικά, ακόμη και εν όψει της προϋπάρχουσας ανοσίας. Ο βακουλοϊός έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς για την παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών. Πρόσφατα, ένα εμβόλιο ανασυνδυασμένου HA που προέρχεται από βακουλοϊό εγκρίθηκε για ανθρώπινη χρήση και ήταν για πρώτη φορά διαθέσιμο για χρήση στις Ηνωμένες Πολιτείες για την περίοδο γρίπης 2013-2014 [4] . Οι βακουλοϊοί έχουν επίσης διερευνηθεί ως φορείς εμβολίων. Οι βακουλοϊοί έχουν πολλά πλεονεκτήματα ως φορείς εμβολίων. Οι ιοί έχουν μελετηθεί εκτενώς για έκφραση πρωτεϊνών και χρήση φυτοφαρμάκων και έτσι υφίστανται χειρισμό εύκολα. Οι φορείς μπορούν να φιλοξενήσουν μεγάλες εισαγωγές γονιδίων, παρουσιάζουν περιορισμένη κυτταροπαθητική δράση σε κύτταρα θηλαστικών και έχει αποδειχθεί ότι μολύνουν και εκφράζουν γονίδια ενδιαφέροντος σε ένα φάσμα κυττάρων θηλαστικών [77]. Ενώ οι υποκινητές εντόμων δεν είναι αποτελεσματικοί για την έκφραση γονιδίων θηλαστικών, οι κατάλληλοι προαγωγείς μπορούν να κλωνοποιηθούν στους φορείς εμβολίου βακουλοϊού. Οι φορείς βακουλοϊού έχουν δοκιμαστεί ως εμβόλια γρίπης, με το πρώτο αναφερόμενο εμβόλιο χρησιμοποιώντας τον ιό πυρηνικής πολυέδρωσης Autographa californica (AcNPV) που εκφράζει την HA του Το PR8 υπό τον έλεγχο του προαγωγέα CAG (AcCAG-HA) [77] . Η ενδομυϊκή, η ενδορινική, η ενδοδερμική και η ενδοπεριτοναϊκή ανοσοποίηση ή τα ποντίκια με AcCAG-HA προκάλεσαν αποκρίσεις αντισωμάτων ειδικών για ΗΑ, ωστόσο μόνο η ενδορινική ανοσοποίηση παρείχε προστασία από θανατηφόρα πρόκληση. Είναι ενδιαφέρον ότι η ενδορινική ανοσοποίηση με τον άγριου τύπου AcNPV οδήγησε επίσης σε προστασία από την πρόκληση PR8. Η ισχυρή έμφυτη ανοσολογική απόκριση στον βακουλοϊό παρείχε μη ειδική προστασία από επακόλουθη μόλυνση από τον ιό της γρίπης [78] . Αν και αυτές οι μελέτες δεν έδειξαν ειδική προστασία, υπήρχαν αντιγονοειδικές ανοσοαποκρίσεις και πιθανές επικουρικές επιδράσεις από την έμφυτη απόκριση. Οι ιοί ψευδότυπου βακουλοϊού έχουν επίσης διερευνηθεί. Η πρωτεΐνη G του ιού της φυσαλιδώδους στοματίτιδας που ελέγχεται από τον προαγωγέα πολυεδρικών εντόμων και το HA του A/Chicken/Hubei/327/2004 (H5N1) HPAIV που ελέγχεται από έναν προαγωγέα CMV χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία του BV-G-HA. Η ενδομυϊκή ανοσοποίηση ποντικών ή κοτόπουλων με BV-G-HA προκάλεσε ισχυρές αποκρίσεις αντισωμάτων ορού HI και VN, αποκρίσεις IFN-γ και προστατεύτηκε από την πρόκληση H5N1 [79] . Μια ξεχωριστή μελέτη έδειξε αποτελεσματικότητα χρησιμοποιώντας έναν δισθενή ψευδοτυπικό φορέα βακουλοϊού [80] . Ο βακουλοϊός έχει επίσης χρησιμοποιηθεί για τη δημιουργία ενός εμβολίου αδρανοποιημένων σωματιδίων. Το HA του A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1) ενσωματώθηκε σε έναν εμπορικό φορέα βακουλοϊού που ελέγχεται από τον προαγωγέα e1 από τον ιό του συνδρόμου λευκής κηλίδας. Ο προκύπτων ανασυνδυασμένος ιός πολλαπλασιάστηκε σε κύτταρα εντόμων (Sf9) και αδρανοποιήθηκε ως εμβόλιο σωματιδίων [81, 82]. Η ενδορινική χορήγηση με την τοξίνη Β της χολέρας ως ανοσοενισχυτικό προκάλεσε ισχυρούς τίτλους HI και προστατεύτηκε από θανατηφόρο πρόκληση [81] . Η από του στόματος χορήγηση αυτού του ενθυλακωμένου εμβολίου προκάλεσε ισχυρούς τίτλους HI ορού και τίτλους IgA του βλεννογόνου σε ποντίκια και προστατεύτηκε από την πρόκληση H5N1 HPAIV. Πιο πρόσφατα, συν-σκευάσματα αδρανοποιημένων φορέων βακουλοϊού έχουν επίσης αποδειχθεί αποτελεσματικά σε ποντίκια [83]. Ενώ υπάρχουν αυξανόμενα δεδομένα σχετικά με την πιθανή χρήση του βακουλοϊού ή του ψευδοτυπικού βακουλοϊού ως φορέα εμβολίου, δεδομένα αποτελεσματικότητας σε μοντέλα ζώων θηλαστικών εκτός τα ποντίκια λείπουν. Δεν υπάρχουν επίσης δεδομένα για την ασφάλεια στους ανθρώπους, μειώνοντας τον ενθουσιασμό για τον βακουλοϊό ως φορέα εμβολίου για τη γρίπη αυτή τη στιγμή. Ο ιός της νόσου του Newcastle (NDV) είναι ένας μονόκλωνος ιός RNA αρνητικής αίσθησης που προκαλεί ασθένεια στα πουλερικά. Το NDV έχει μια σειρά από ελκυστικές ιδιότητες ως φορέας εμβολίου. Ως ιός των πτηνών, υπάρχει μικρή ή καθόλου προϋπάρχουσα ανοσία στον NDV στους ανθρώπους και ο NDV διαδίδεται σε υψηλούς τίτλους τόσο στα αυγά κοτόπουλου όσο και στην κυτταροκαλλιέργεια. Ως παραμυξοϊός, δεν υπάρχει φάση DNA στον κύκλο ζωής του ιού που μειώνει τις ανησυχίες για συμβάντα ολοκλήρωσης και τα επίπεδα έκφρασης γονιδίου καθοδηγούνται από την εγγύτητα στην αλληλουχία οδηγό στο 3' άκρο του ιικού γονιδιώματος. Αυτή η κλίση της γονιδιακής έκφρασης επιτρέπει την εξασθένηση μέσω αναδιάταξης του γονιδιώματος ή με εισαγωγή διαγονιδίων μέσα στο γονιδίωμα. Τέλος, η παθογένεια του NDV καθορίζεται σε μεγάλο βαθμό από χαρακτηριστικά της πρωτεΐνης σύντηξης που επιτρέπει την έτοιμη εξασθένηση του φορέα εμβολίου [84] . Η αντίστροφη γενετική, μια μέθοδος που επιτρέπει τη διάσωση του NDV από πλασμίδια που εκφράζουν την ιική πολυμεράση RNA και τις πρωτεΐνες νουκλεοκαψιδίου, αναφέρθηκε για πρώτη φορά το 1999 [85, 86]. Αυτή η διαδικασία επέτρεψε τον χειρισμό του γονιδιώματος του NDV καθώς και την ενσωμάτωση διαγονιδίων και την ανάπτυξη φορέων NDV. Η γρίπη ήταν η πρώτη μολυσματική ασθένεια που στοχεύτηκε με φορέα ανασυνδυασμένου NDV (rNDV). Η πρωτεΐνη ΗΑ του A/WSN/1933 (Η1Ν1) εισήχθη στο στέλεχος εμβολίου Hitchner Β1. Η πρωτεΐνη ΗΑ εκφράστηκε σε μολυσμένα κύτταρα και ενσωματώθηκε σε μολυσματικά ιοσωμάτια. Ενώ ο ιός ήταν εξασθενημένος σε σύγκριση με το στέλεχος του γονικού εμβολίου, προκάλεσε μια ισχυρή απόκριση αντισωμάτων στον ορό και προστατεύτηκε από την πρόκληση ομόλογου ιού της γρίπης σε ένα μοντέλο μόλυνσης από ποντικό [87] . Στη συνέχεια, ο rNDV δοκιμάστηκε ως φορέας εμβολίου για τον HPAIV με ποικίλη αποτελεσματικότητα έναντι λοιμώξεων από τον ιό της γρίπης H5 και H7 σε πουλερικά [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] . Αυτά τα εμβόλια έχουν το πρόσθετο πλεονέκτημα ότι παρέχουν δυνητικά προστασία τόσο από τον ιό της γρίπης όσο και από τη μόλυνση από NDV. Το NDV έχει επίσης διερευνηθεί ως φορέας εμβολίου για τον άνθρωπο. Δύο μελέτες NHP αξιολόγησαν την ανοσογονικότητα και την αποτελεσματικότητα ενός rNDV που εκφράζει το HA ή το NA του A/Vietnam/1203/2004 (H5N1; VN1203) [95, 96]. Η ενδορινική και ενδοτραχειακή παροχή των εμβολίων rNDV-HA ή rNDV-NA προκάλεσε αποκρίσεις αντισωμάτων τόσο στον ορό όσο και στον βλεννογόνο και προστατεύτηκε από την πρόκληση HPAIV [95, 96]. Το NDV έχει περιορισμένα κλινικά δεδομένα. Ωστόσο, κλινικές δοκιμές φάσης Ι και φάσης Ι/ΙΙ έχουν δείξει ότι ο φορέας NDV είναι καλά ανεκτός, ακόμη και σε υψηλές δόσεις που χορηγούνται ενδοφλεβίως [44, 97]. Ενώ αυτά τα αποτελέσματα είναι ελπιδοφόρα, απαιτούνται πρόσθετες μελέτες για την προώθηση του NDV ως φορέα ανθρώπινου εμβολίου για τη γρίπη. Ο ιός παραϊνφλουέντσας τύπου 5 (PIV5) είναι ένας φορέας εμβολίου παραμυξοϊού που διερευνάται για τη χορήγηση αντιγόνων εμβολίου κατά της γρίπης και άλλων μολυσματικών ασθενειών. Ο PIV5 μόλις πρόσφατα έχει περιγραφεί ως φορέας εμβολίου [98] . Παρόμοια με άλλους ιούς RNA, ο PIV5 έχει μια σειρά από χαρακτηριστικά που το καθιστούν ελκυστικό φορέα εμβολίου. Για παράδειγμα, το PIV5 έχει σταθερό γονιδίωμα RNA και καμία φάση DNA στον κύκλο αντιγραφής του ιού, μειώνοντας τις ανησυχίες για την ενσωμάτωση ή την τροποποίηση του γονιδιώματος του ξενιστή. Το PIV5 μπορεί να αναπτυχθεί σε πολύ υψηλούς τίτλους σε υποστρώματα κυτταροκαλλιέργειας εμβολίων θηλαστικών και δεν είναι κυτταροπαθητικό επιτρέποντας εκτεταμένη καλλιέργεια και συλλογή του ιού του εμβολίου [98, 99]. Όπως το NDV, το PIV5 έχει κλίση γονιδιακής έκφρασης από 3' έως 5' και η εισαγωγή διαγονιδίων σε διαφορετικές θέσεις στο γονιδίωμα μπορεί να εξασθενήσει ποικίλα τον ιό και να αλλάξει την έκφραση διαγονιδίων [100] . Το PIV5 έχει ευρύ τροπισμό, μολύνοντας πολλούς τύπους κυττάρων, ιστούς και είδη χωρίς να προκαλεί κλινική νόσο, αν και ο PIV5 έχει συσχετιστεί με βήχα σε ρείθρο σε σκύλους [99] . Ένα σύστημα αντίστροφης γενετικής για το PIV5 χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά για την εισαγωγή του γονιδίου HA από το A/Udorn/307/72 (H3N2) στο γονιδίωμα PIV5 μεταξύ του γονιδίου της αιμοσυγκολλητίνης-νευραμινιδάσης (HN) και του γονιδίου της μεγάλης (L) πολυμεράσης. Παρόμοια με τον NDV, το HA εκφράστηκε σε υψηλά επίπεδα σε μολυσμένα κύτταρα και αναδιπλασιάστηκε παρόμοια με τον ιό άγριου τύπου και, σημαντικότερο, δεν ήταν παθογόνο σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια [98] . Επιπρόσθετα, μια μεμονωμένη ενδορινική ανοσοποίηση σε μοντέλο ποντικού λοίμωξης από γρίπη αποδείχθηκε ότι επάγει αποκρίσεις εξουδετέρωσης αντισωμάτων και προστατεύει από έναν ιό που εκφράζει ομόλογη πρωτεΐνη ΗΑ [98] . Το PIV5 έχει επίσης διερευνηθεί ως εμβόλιο κατά του HPAIV. Ανασυνδυασμένα εμβόλια PIV5 που εκφράζουν το ΗΑ ή το ΝΡ από το VN1203 δοκιμάστηκαν για αποτελεσματικότητα σε ένα μοντέλο πρόκλησης ποντικού. Τα ποντίκια που εμβολιάστηκαν ενδορρινικά με μία μόνο δόση εμβολίου PIV5-H5 είχαν ισχυρές αποκρίσεις αντισωμάτων στον ορό και το βλεννογόνο και προστατεύτηκαν από θανατηφόρα πρόκληση. Συγκεκριμένα, αν και οι κυτταρικές ανοσοαποκρίσεις φάνηκε να συμβάλλουν στην προστασία, το αντίσωμα ορού ήταν αρκετό για προστασία από την πρόκληση [100, 101]. Η ενδομυϊκή ανοσοποίηση με PIV5-H5 αποδείχθηκε επίσης ότι είναι αποτελεσματική στην πρόκληση αποκρίσεων εξουδετέρωσης αντισωμάτων και στην προστασία από την πρόκληση θανατηφόρου ιού της γρίπης [101] . Το PIV5 που εκφράζει την πρωτεΐνη NP του HPAIV ήταν επίσης αποτελεσματικό στο μοντέλο ανοσοποίησης και πρόκλησης ποντικού, όπου μια μεμονωμένη ενδορρινική ανοσοποίηση προκάλεσε ισχυρές αποκρίσεις CD8 + Τ κυττάρων και προστατεύτηκε από πρόκληση ομόλογου (H5N1) και ετερουποτυπικού (H1N1) ιού [102] . δεν υπάρχουν κλινικά δεδομένα ασφάλειας για τη χρήση του PIV5 σε ανθρώπους. Ωστόσο, το ζωντανό PIV5 αποτελεί συστατικό των κτηνιατρικών εμβολίων για τον βήχα ρείθρων για >30 χρόνια και οι κτηνίατροι και οι ιδιοκτήτες σκύλων εκτίθενται σε ζωντανό PIV5 χωρίς αναφερόμενη ασθένεια [99] . Αυτό σε συνδυασμό με προκλινικά δεδομένα από μια ποικιλία ζωικών μοντέλων υποδηλώνει ότι ο PIV5 ως φορέας είναι πιθανό να είναι ασφαλής στους ανθρώπους. Δεδομένου ότι η προϋπάρχουσα ανοσία αποτελεί ανησυχία για όλα τα εμβόλια που έχουν φορείς ιού, θα πρέπει να σημειωθεί ότι δεν υπάρχουν δεδομένα για τα επίπεδα προϋπάρχουσας ανοσίας στον PIV5 στους ανθρώπους. Ωστόσο, μια μελέτη που αξιολόγησε την αποτελεσματικότητα ενός εμβολίου PIV5-H3 σε σκύλους που είχαν προηγουμένως εμβολιαστεί κατά του PIV5 (βήχας ρείθρων) έδειξε πρόκληση ισχυρών αποκρίσεων αντισωμάτων ορού αντι-Η3 καθώς και υψηλά επίπεδα αντισωμάτων ορού στο εμβόλιο PIV5, υποδηλώνοντας προϋπάρχουσα ανοσία στο Ο φορέας PIV5 μπορεί να μην επηρεάσει την ανοσογονικότητα των εμβολίων ακόμη και με επαναλαμβανόμενη χρήση [99] .Τα εμβόλια ιού ευλογιάς έχουν μακρά ιστορία και το αξιοσημείωτο χαρακτηριστικό ότι είναι υπεύθυνα για την εκρίζωση της ευλογιάς. Ο τερματισμός του προγράμματος εμβολιασμού για τον ιό της ευλογιάς είχε ως αποτέλεσμα έναν μεγάλο πληθυσμό ατόμων που δεν έχουν λάβει ιούς ευλογιάς που παρέχει την ευκαιρία για χρήση των ιών ευλογιάς ως φορείς χωρίς προϋπάρχουσες ανησυχίες για την ανοσία [103] . Τα εμβόλια με φορέα ευλογιάς προτάθηκαν για πρώτη φορά για χρήση το 1982 με δύο αναφορές ανασυνδυασμένων ιών δαμαλίτιδας που κωδικοποιούν και εκφράζουν λειτουργικό γονίδιο κινάσης θυμιδίνης από τον ιό του έρπητα [104, 105]. Μέσα σε ένα χρόνο, ένας ιός δαμαλίτιδας που κωδικοποιεί το HA ενός ιού H2N2 αποδείχθηκε ότι εκφράζει μια λειτουργική πρωτεΐνη HA (που διασπάται στις υπομονάδες HA1 και HA2) και ότι είναι ανοσογονικός σε κουνέλια και χάμστερ [106] . Στη συνέχεια, και οι δέκα από τις πρωτογενείς πρωτεΐνες της γρίπης έχουν εκφραστεί στον ιό του εμβολίου [107] . Η πρώιμη εργασία με άθικτους φορείς ιού δαμαλίτιδας προκάλεσε ανησυχίες για την ασφάλεια, καθώς υπήρχε σημαντική αντιδραστικότητα που εμπόδιζε την ανάπτυξη ανασυνδυασμένου εμβολίου [108] . Δύο φορείς δαμαλίτιδας αναπτύχθηκαν για την αντιμετώπιση αυτών των ανησυχιών για την ασφάλεια. Το στέλεχος του τροποποιημένου ιού δαμαλίτιδας Ankara (MVA) εξασθενήθηκε με διέλευση 530 φορές σε καλλιέργειες ινοβλαστών εμβρύου κοτόπουλου. Ο δεύτερος, ο ιός δαμαλίτιδας της Νέας Υόρκης (NYVAC) ήταν ένας καθαρισμένος με πλάκα κλώνος του στελέχους εμβολίου της Κοπεγχάγης που εξασθενήθηκε ορθολογικά με τη διαγραφή 18 ανοιχτών πλαισίων ανάγνωσης [109] [110] [111] . Ο τροποποιημένος ιός δαμαλίτιδας Ankara (MVA) αναπτύχθηκε πριν στην εκρίζωση της ευλογιάς για τη μείωση ή την πρόληψη των ανεπιθύμητων ενεργειών άλλων εμβολίων κατά της ευλογιάς [109] . Η σειριακή διέλευση ιστοκαλλιέργειας του MVA είχε ως αποτέλεσμα την απώλεια του 15% του γονιδιώματος και καθιέρωσε έναν περιορισμό ανάπτυξης για τα κύτταρα πτηνών. Τα ελαττώματα επηρέασαν τα τελευταία στάδια της συναρμολόγησης του ιού σε κύτταρα μη πτηνών, ένα χαρακτηριστικό που επιτρέπει τη χρήση του φορέα ως ενός στρογγυλού φορέα έκφρασης σε μη επιτρεπτούς ξενιστές. Είναι ενδιαφέρον ότι πάνω από δύο δεκαετίες πριν, ο ανασυνδυασμένος MVA που εκφράζει τα HA και NP του ιού της γρίπης αποδείχθηκε αποτελεσματικός έναντι της πρόκλησης θανατηφόρου ιού γρίπης σε ένα μοντέλο ποντικού [112] . Στη συνέχεια, MVA που εκφράζει διάφορα αντιγόνα από εποχιακούς, πανδημικούς ιούς (A/California/04/2009, pH1N1), ιπποειδών (A/Equine/Kentucky/1/81 H3N8) και HPAI (VN1203) έχει αποδειχθεί ότι είναι αποτελεσματικοί σε ποντικού , κουνάβι, NHP και μοντέλα πρόκλησης ιπποειδών [113] . Τα εμβόλια MVA είναι πολύ αποτελεσματικά διεγερτικά τόσο της κυτταρικής όσο και της χυμικής ανοσίας. Για παράδειγμα, η αποβολή λοίμωξης παρέχει φυσική έκφραση των αντιγόνων της γρίπης επιτρέποντας ισχυρές αποκρίσεις αντισωμάτων σε εγγενή επιφανειακά ιικά αντιγόνα. Ταυτόχρονα, τα ενδοκυτταρικά πεπτίδια γρίπης που εκφράζονται από τον φορέα ευλογιάς εισέρχονται στην οδό επεξεργασίας και παρουσίασης του αντιγόνου MHC κατηγορίας Ι επιτρέποντας την επαγωγή αντιιικών αποκρίσεων των CD8 + Τ κυττάρων. Το MVA επάγει επίσης αποκρίσεις CD4 + Τ κυττάρων συμβάλλοντας περαιτέρω στο μέγεθος των αντιγονοειδικών λειτουργιών τελεστή [107, [112] [113] [114] [115] . Το MVA είναι επίσης ένας ισχυρός ενεργοποιητής πρώιμων έμφυτων ανοσοαποκρίσεων ενισχύοντας περαιτέρω τις προσαρμοστικές ανοσολογικές αποκρίσεις [116]. Μεταξύ της πρώιμης ανάπτυξης του εμβολίου ευλογιάς και της πιο πρόσφατης ανάπτυξης φορέα εμβολίου, το MVA έχει υποβληθεί σε εκτεταμένες δοκιμές ασφάλειας και έχει αποδειχθεί ότι είναι εξασθενημένο σε σοβαρά ανοσοκατεσταλμένα ζώα και ασφαλές για χρήση σε παιδιά, ενήλικες, ηλικιωμένους και ανοσοκατεσταλμένα άτομα. Με εκτεταμένα προκλινικά δεδομένα, τα ανασυνδυασμένα εμβόλια MVA που εκφράζουν αντιγόνα γρίπης έχουν δοκιμαστεί σε κλινικές δοκιμές και έχουν αποδειχθεί ασφαλή και ανοσογόνα στους ανθρώπους [117] [118] [119] . Αυτά τα αποτελέσματα σε συνδυασμό με δεδομένα από άλλες (χωρίς γρίπη) κλινικές και προκλινικές μελέτες υποστηρίζουν το MVA ως κορυφαίο υποψήφιο εμβόλιο με ιικό φορέα. Ο φορέας NYVAC είναι ένα εξαιρετικά εξασθενημένο στέλεχος του ιού της δαμαλίτιδας. Το NYVAC έχει περιορισμό αναπαραγωγής. Ωστόσο, αναπτύσσεται σε ινοβλάστες εμβρύου κοτόπουλου και σε κύτταρα Vero επιτρέποντας την παραγωγή σε κλίμακα εμβολίου. Σε μη επιτρεπτά κύτταρα, οι κρίσιμες όψιμες δομικές πρωτεΐνες δεν παράγονται σταματώντας την αντιγραφή στο ανώριμο στάδιο του ιού [120] . Το NYVAC είναι πολύ εξασθενημένο και θεωρείται ασφαλές για χρήση σε ανθρώπους όλων των ηλικιών. Ωστόσο, προκαλεί κατά κύριο λόγο μια απόκριση CD4 + Τ κυττάρων η οποία είναι διαφορετική σε σύγκριση με το MVA [114] . Τόσο το MVA όσο και το NYVAC προκαλούν ισχυρές χυμικές αποκρίσεις και μπορούν να χορηγηθούν μέσω του βλεννογόνου για να προκαλέσουν αποκρίσεις αντισωμάτων του βλεννογόνου [121]. Υπήρξε μόνο περιορισμένη εξερεύνηση του NYVAC ως φορέα εμβολίου για τον ιό της γρίπης. Ωστόσο, ένα εμβόλιο που εκφράζει το HA από A/chicken/Indonesia/7/2003 (H5N1) αποδείχθηκε ότι επάγει ισχυρές αποκρίσεις εξουδετερωτικών αντισωμάτων και προστατεύει από πρόκληση σε χοίρους [122] . Ενώ υπάρχουν ισχυρά δεδομένα ασφάλειας και αποτελεσματικότητας για τη χρήση του NYVAC ή τα εμβόλια γρίπης που μεταδίδονται με MVA, η προϋπάρχουσα ανοσία παραμένει ανησυχητική. Αν και η εκστρατεία εμβολιασμού κατά της ευλογιάς είχε ως αποτέλεσμα έναν πληθυσμό ατόμων που δεν είχαν ιούς ευλογιάς, η έναρξη ενός προγράμματος εμβολιασμού MVA ή NYVAC για τον HIV, τη γρίπη ή άλλα παθογόνα θα μειώσει γρήγορα αυτόν τον ευαίσθητο πληθυσμό. Ενώ υπάρχει σημαντικό ενδιαφέρον για την ανάπτυξη εμβολίων για τον ιό της γρίπης με φορέα ευλογιάς, οι τρέχουσες στρατηγικές εμβολιασμού κατά της γρίπης βασίζονται στην τακτική ανοσοποίηση με εμβόλια που ταιριάζουν με κυκλοφορούντα στελέχη. Αυτό πιθανότατα θα περιόριζε τη χρήση ή/και την αποτελεσματικότητα των εμβολίων ιού γρίπης που μεταδίδονται από τον ιό ευλογιάς για τακτική και εποχιακή χρήση [13] . Περιέργως, το NYVAC μπορεί να έχει ένα πλεονέκτημα για χρήση ως φορέας εμβολίου γρίπης, επειδή η ανοσοποίηση με αυτόν τον φορέα προκαλεί ασθενέστερες ανοσοαποκρίσεις ειδικά για το εμβόλιο σε σύγκριση με άλλα εμβόλια ιού ευλογιάς, ένα χαρακτηριστικό που μπορεί να αντιμετωπίσει τις ανησυχίες σχετικά με την προϋπάρχουσα ανοσία [123] . Ενώ ο ιός ευλογιάς- τα εμβόλια με φορέα δεν έχουν ακόμη εγκριθεί για χρήση σε ανθρώπους, υπάρχει ένας αυξανόμενος κατάλογος εγκεκριμένων ιών ευλογιάς για κτηνιατρική χρήση που περιλαμβάνει εμβόλια με φορέα ευλογιάς και καναρινιού για τους ιούς της γρίπης των πτηνών και των ιπποειδών, αντίστοιχα [124, 125] . Το εμβόλιο με φορέα ευλογιάς ορνίθων που εκφράζει το αντιγόνο HA του ιού της γρίπης των πτηνών έχει το πρόσθετο πλεονέκτημα της παροχής προστασίας έναντι της μόλυνσης από ευλογιά των ορνίθων. Επί του παρόντος, τουλάχιστον δέκα εμβόλια με φορέα ευλογιάς έχουν λάβει άδεια για κτηνιατρική χρήση [126] . Αυτοί οι φορείς του ιού της ευλογιάς έχουν τη δυνατότητα να χρησιμοποιηθούν ως φορείς εμβολίων στον άνθρωπο, παρόμοια με την πρώτη χρήση της ευλογιάς των αγελάδων για εμβολιασμό κατά της ευλογιάς [127] . Η διαθεσιμότητα αυτών των φορέων μη ανθρώπινου ιού ευλογιάς με εκτενή δεδομένα ασφάλειας και αποτελεσματικότητας των ζώων μπορεί να αντιμετωπίσει τα προβλήματα με την προϋπάρχουσα ανοσία στα στελέχη του ανθρώπινου εμβολίου, αν και η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα που περιγράφηκε αρχικά με την ευλογιά αγελάδων θα μπορούσε επίσης να περιορίσει τη χρήση. VSV), ένας ραβδοϊός, ως φορέας εμβολίου έχει έναν αριθμό κοινών πλεονεκτημάτων με άλλους φορείς εμβολίου ιού RNA. Τόσο οι ζωντανοί όσο και οι ελαττωματικοί φορείς εμβολίου VSV έχουν αποδειχθεί ότι είναι ανοσογονικοί [128, 129] και όπως το Paramyxoviridae, το γονιδίωμα Rhabdoviridae έχει 3' έως 5' διαβάθμιση γονιδιακής έκφρασης που επιτρέπει την προσοχή μέσω επιλεκτικής εισαγωγής γονιδίου ή γονιδιώματος εμβολίου αναδιάταξη [130] . Το VSV έχει μια σειρά από άλλα πλεονεκτήματα, συμπεριλαμβανομένου του τροπισμού ευρέος ιστού και της δυνατότητας για ενδομυϊκή ή ενδορινική ανοσοποίηση. Η τελευταία μέθοδος χορήγησης επιτρέπει την επαγωγή της ανοσίας του βλεννογόνου και την εξάλειψη των βελόνων που απαιτούνται για τον εμβολιασμό. Επίσης, υπάρχουν ελάχιστα στοιχεία για την οροθετικότητα του VSV σε ανθρώπους που εξαλείφουν τις ανησυχίες για προϋπάρχουσα ανοσία, αν και η επαναλαμβανόμενη χρήση μπορεί να είναι ανησυχητική. Επίσης, το εμβόλιο VSV μπορεί να παραχθεί χρησιμοποιώντας υπάρχουσες κυτταρικές σειρές κατασκευής εμβολίων θηλαστικών. Τα αντιγόνα της γρίπης εκφράστηκαν για πρώτη φορά σε φορέα VSV το 1997. Τόσο το HA όσο και το NA αποδείχθηκε ότι εκφράζονται ως λειτουργικές πρωτεΐνες και ενσωματώνονται στα ανασυνδυασμένα σωματίδια VSV [131]. Στη συνέχεια, το VSV-HA, που εκφράζει την πρωτεΐνη HA από το A/WSN/1933 (H1N1) αποδείχθηκε ότι είναι ανοσογονικό και προστατεύει τα ποντίκια από την πρόκληση θανατηφόρου ιού της γρίπης [129] . Για να μειωθούν οι ανησυχίες για την ασφάλεια, αναπτύχθηκαν εξασθενημένοι φορείς VSV. Ένα υποψήφιο εμβόλιο είχε μια κολοβωμένη πρωτεΐνη G VSV, ενώ ένα δεύτερο υποψήφιο ήταν ανεπαρκές στην έκφραση της πρωτεΐνης G και βασιζόταν στην πρωτεΐνη G που εκφραζόταν από μια κυτταρική σειρά βοηθητικού εμβολίου για την παροχή του υποδοχέα του ιού. Και οι δύο φορείς βρέθηκαν να είναι εξασθενημένοι σε ποντίκια, αλλά διατήρησαν την ανοσογονικότητα [128] . Πιο πρόσφατα, εμβόλια VSV με αντιγραφή ενός κύκλου έχουν δοκιμαστεί για αποτελεσματικότητα έναντι του H5N1 HPAIV. Φορείς VSV που εκφράζουν το HA από A/Hong Kong/156/97 (H5N1) αποδείχθηκε ότι είναι ανοσογονικοί και επάγουν διασταυρούμενες αντιδράσεις αντισωμάτων και προστατεύουν από πρόκληση με ετερόλογη πρόκληση H5N1 σε μοντέλα ποντικού και NHP [132] [133] [134 ] .VSV διανύσματα δεν είναι χωρίς πιθανές ανησυχίες. Ο VSV μπορεί να προκαλέσει ασθένεια σε πολλά είδη, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων [135]. Ο ιός είναι επίσης δυνητικά νευροδιηθητικός σε ορισμένα είδη [136], αν και μελέτες NHP υποδηλώνουν ότι αυτό δεν αποτελεί ανησυχία στους ανθρώπους [137]. Επίσης, ενώ η ενσωμάτωση του αντιγόνου της γρίπης στο ιοσωμάτιο μπορεί να προσφέρει κάποιο όφελος στην ανοσογονικότητα, αλλαγές στον τροπισμό ή την εξασθένηση θα μπορούσαν να προκύψουν από την ενσωμάτωση διαφορετικών γλυκοπρωτεϊνών γρίπης. Ωστόσο, δεν υπάρχουν στοιχεία για αυτό [134] . Επί του παρόντος, δεν υπάρχουν δεδομένα για την ανθρώπινη ασφάλεια για εμβόλια με φορέα VSV. Ενώ τα πειραματικά δεδομένα είναι πολλά υποσχόμενα, απαιτείται πρόσθετη εργασία πριν από την εξέταση του εμβολιασμού κατά της ανθρώπινης γρίπης. Τα τρέχοντα εμβόλια γρίπης βασίζονται στην αντιστοίχιση του αντιγόνου ΗΑ του εμβολίου με τα κυκλοφορούντα στελέχη για να παρέχουν ειδικές για το στέλεχος αποκρίσεις εξουδετερωτικών αντισωμάτων [4, 14, 24]. Υπάρχει σημαντικό ενδιαφέρον για την ανάπτυξη καθολικών εμβολίων κατά της γρίπης που δεν θα απαιτούσαν ετήσια αναμόρφωση για να παρέχουν προστατευτική ισχυρή και ανθεκτική ανοσία. Αυτά τα εμβόλια βασίζονται στη δημιουργία εστιασμένων ανοσολογικών αποκρίσεων σε εξαιρετικά διατηρημένα τμήματα του ιού που είναι ανθεκτικά στη μετάλλαξη [30] [31] [32] . Τα παραδοσιακά εμβόλια μπορεί να μην είναι κατάλληλα για αυτές τις στρατηγικές εμβολιασμού. Ωστόσο, τα εμβόλια με φορέα που έχουν την ικανότητα να τροποποιούνται εύκολα και να εκφράζουν διαγονίδια είναι συμβατά για αυτές τις εφαρμογές. Οι πρωτεΐνες NP και M2 έχουν διερευνηθεί ως καθολικά αντιγόνα εμβολίου για δεκαετίες. Η πρώιμη εργασία με ανασυνδυασμένους ιικούς φορείς έδειξε ότι η ανοσοποίηση με εμβόλια που εκφράζουν αντιγόνα γρίπης προκάλεσε ισχυρές αποκρίσεις CD8 + Τ κυττάρων [107, [138] [139] [140] [141] . Αυτές οι αποκρίσεις, ακόμη και στο αντιγόνο HA, θα μπορούσαν να είναι διασταυρούμενες προστατευτικές [138]. Ένας αριθμός μελετών έχει δείξει ότι η ανοσοποίηση με NP που εκφράζεται από AAV, rAd5, φορείς άλφα ιού, MVA ή άλλα συστήματα φορέων επάγει ισχυρές αποκρίσεις CD8 + Τ κυττάρων και προστατεύει από την πρόκληση του ιού της γρίπης [52, 63, 69, 102, 139, 142 ] . Καθώς η πρωτεΐνη NP διατηρείται σε μεγάλο βαθμό στους ιούς της γρίπης Α, τα NP-ειδικά Τ κύτταρα μπορούν να προστατεύσουν από ετερόλογες και ακόμη και ετερουποτυπικές προκλήσεις ιών [30] . Η πρωτεΐνη Μ2 είναι επίσης εξαιρετικά διατηρημένη και εκφράζεται στην επιφάνεια των μολυσμένων κυττάρων, αν και σε μικρότερο βαθμό έκταση στην επιφάνεια των σωματιδίων του ιού [30] . Μεγάλο μέρος της εργασίας του εμβολίου σε αυτόν τον τομέα έχει επικεντρωθεί σε σωματίδια που μοιάζουν με ιούς ή υπομονάδες που εκφράζουν τον εξωτομέα M2. Ωστόσο, μελέτες που χρησιμοποιούν στρατηγικές DNA-prime, rAd-boost για τον εμβολιασμό έναντι ολόκληρης της πρωτεΐνης M2 έχουν δείξει ότι το αντιγόνο είναι ανοσογονικό και προστατευτικό [50] . Σε αυτές τις μελέτες, τα αντισώματα στην πρωτεΐνη Μ2 προστατεύονταν από ομόλογη και ετερουποτυπική πρόκληση, συμπεριλαμβανομένης μιας πρόκλησης H5N1 HPAIV. Πιο πρόσφατα, το NP και το M2 έχουν συνδυαστεί για να επάγουν ευρέως διασταυρούμενες αντιδράσεις CD8 + T κυττάρων και αντισωμάτων, και τα εμβόλια rAd5 που εκφράζουν αυτά τα αντιγόνα έχουν αποδειχθεί ότι προστατεύουν από τις προκλήσεις pH1N1 και H5N1 [29, 51] . Ιστορικά, το HA έχει δεν θεωρείται ευρέως ως γενικό αντιγόνο εμβολίου. Ωστόσο, η πρόσφατη ταυτοποίηση μονοκλωνικών αντισωμάτων εξουδετέρωσης του ιού που αντιδρούν διασταυρούμενα με πολλούς υποτύπους του ιού της γρίπης [143] έδωσε την ευκαιρία να σχεδιαστούν αντιγόνα εμβολίου για να ξεκινήσουν εστιασμένες αποκρίσεις αντισωμάτων στις εξαιρετικά διατηρημένες περιοχές που αναγνωρίζονται από αυτά τα μονοκλωνικά αντισώματα. Η πλειονότητα αυτών των ευρείας διασταυρούμενης αντίδρασης αντισωμάτων αναγνωρίζει περιοχές στο μίσχο της πρωτεΐνης ΗΑ [143]. Ο μίσχος ΗΑ είναι γενικά λιγότερο ανοσογόνος σε σύγκριση με τη σφαιρική κεφαλή της πρωτεΐνης ΗΑ, επομένως οι περισσότερες προσεγγίσεις έχουν χρησιμοποιήσει πρωτεΐνες ΗΑ χωρίς κεφάλι ως ανοσογόνα. Τα εμβόλια μίσχου ΗΑ έχουν σχεδιαστεί χρησιμοποιώντας DNA και σωματίδια που μοιάζουν με ιούς [144] και MVA [142]. Ωστόσο, αυτές οι προσεγγίσεις επιδέχονται έκφραση σε οποιονδήποτε από τους φορείς ιών που περιγράφονται εδώ. Ο στόχος οποιουδήποτε εμβολίου είναι να προστατεύει από λοιμώξεις και ασθένειες, ενώ προκαλεί ανοσία βάσει πληθυσμού για μείωση ή εξάλειψη της μετάδοσης του ιού εντός του πληθυσμού. Είναι σαφές ότι τα επί του παρόντος αδειοδοτημένα εμβόλια κατά της γρίπης δεν έχουν εκπληρώσει πλήρως αυτούς τους στόχους, ούτε αυτούς που είναι ειδικοί για την πρόκληση μακροπρόθεσμης, ισχυρής ανοσίας. Υπάρχει μια σειρά ζητημάτων που σχετίζονται με τα εμβόλια που πρέπει να αντιμετωπιστούν προτού βελτιστοποιηθούν οι στρατηγικές εμβολιασμού κατά της γρίπης βάσει πληθυσμού. Η έννοια του εμβολίου -ένα μέγεθος για όλους πρέπει να ενημερωθεί, δεδομένης της πρόσφατης ικανότητας ανίχνευσης της διεπαφής ιού-ξενιστή μέσω προσεγγίσεων παρεμβολής RNA που διευκολύνουν τον εντοπισμό γονιδίων ξενιστή που επηρεάζουν την αντιγραφή του ιού, την ανοσία και την ασθένεια. Υπάρχει επίσης ανάγκη για αναθεώρηση των τρεχουσών στρατηγικών εμβολίου κατά του ιού της γρίπης για τους πληθυσμούς σε κίνδυνο, ιδιαίτερα εκείνους που βρίσκονται σε κάθε άκρο του ηλικιακού φάσματος. Ένα παράδειγμα βελτιωμένου σχήματος εμβολίου μπορεί να περιλαμβάνει τη χρήση ενός εμβολίου ιού γρίπης που εκφράζει τις πρωτεΐνες HA, NA και M και/ή NP για τους δύο υποτύπους γρίπης Α που κυκλοφορούν επί του παρόντος και τα δύο στελέχη γρίπης Β, έτσι ώστε το εμβόλιο και το αντιγόνο του εμβολίου τα επίπεδα δεν αποτελούν πρόβλημα για την πρόκληση προστατευτικής ανοσίας. Οι ανασυνδυασμένοι ζωντανοί εξασθενημένοι ή ανεπαρκείς σε αναδιπλασιασμό ιοί γρίπης μπορεί να προσφέρουν ένα πλεονέκτημα για αυτήν και άλλες προσεγγίσεις. Τα εμβόλια μπορούν να κατασκευαστούν για να εκφράζουν πλήρους μήκους πρωτεΐνες του ιού της γρίπης, καθώς και να δημιουργούν διαμορφωτικά περιορισμένους επιτόπους, χαρακτηριστικά κρίσιμα για τη δημιουργία κατάλληλης χυμικής προστασίας. Η συμπερίληψη των εσωτερικών αντιγόνων της γρίπης σε ένα εμβόλιο με φορέα μπορεί επίσης να προκαλέσει υψηλά επίπεδα προστατευτικής κυτταρικής ανοσίας. Για τη δημιουργία παρατεταμένης ανοσίας, είναι πλεονέκτημα η πρόκληση ανοσίας σε σημεία επαγωγικής ανοσίας σε φυσική μόλυνση, στην περίπτωση αυτή στην αναπνευστική οδό. Αρκετά εμβόλια με φορέα στοχεύουν την αναπνευστική οδό. Τυπικά, τα εμβόλια με φορέα δημιουργούν αντιγόνο για εβδομάδες μετά την ανοσοποίηση, σε αντίθεση με τον εμβολιασμό υπομονάδας. Αυτή η αυξημένη παρουσία και επίπεδο αντιγόνου εμβολίου συμβάλλει και βοηθά στη διατήρηση μιας ανθεκτικής ανοσολογικής απόκρισης στη μνήμη, αυξάνοντας ακόμη και την επιλογή κυττάρων που εκκρίνουν αντισώματα υψηλότερης συγγένειας. Η ενισχυμένη απόκριση μνήμης συνδέεται εν μέρει με την εγγενή αύξηση της ανοσίας που προκαλείται από τον φορέα. Έτσι, για ασθενέστερα αντιγόνα τυπικά της ΗΑ, τα εμβόλια με φορέα έχουν την ικανότητα να ξεπερνούν πραγματικούς περιορισμούς για την επίτευξη ισχυρής και ανθεκτικής προστασίας. Η εκπλήρωση των εντολών της ανάπτυξης εμβολίου κατά της εποχικής γρίπης είναι δύσκολη και η απόκριση σε ένα στέλεχος πανδημίας είναι ακόμη πιο δύσκολη. Τα ζητήματα με την επιλογή του στελέχους του εμβολίου κατά της γρίπης με βάση τους ιούς που κυκλοφορούν πρόσφατα αντικατοπτρίζουν συχνά συστάσεις του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (ΠΟΥ) - μια διαδικασία που είναι επίπονη. Τα στελέχη των ιών της γρίπης Α που θα χρησιμοποιηθούν στην παρασκευή εμβολίων δεν είναι ιοί άγριου τύπου αλλά μάλλον ανασυνδυαστικοί ιοί που είναι υβριδικοί ιοί που περιέχουν τουλάχιστον τα γονιδιακά τμήματα HA και NA από τα στελέχη στόχους και άλλα τμήματα γονιδίων από το κύριο στέλεχος, PR8, τα οποία έχει ιδιότητες υψηλής ανάπτυξης σε γονιμοποιημένα αυγά κότας. Αυτή η πρόσθετη διαδικασία απαιτεί περισσότερο χρόνο και ποιοτικό έλεγχο, και συγκεκριμένα για τους ιούς HPAI, είναι μια διαδικασία που μπορεί να αποτύχει λόγω της φύσης αυτών των ιών. Αντίθετα, τα εμβόλια με ιούς είναι σχετικά εύκολο να χειριστούν και να παραχθούν και έχουν καλά εδραιωμένα προφίλ ασφάλειας. Υπάρχουν αρκετοί φορείς που βασίζονται σε ιούς που χρησιμοποιούνται επί του παρόντος ως συστήματα χορήγησης αντιγόνου, συμπεριλαμβανομένων των ιών ευλογιάς, των αδενοϊών βακουλοϊού, του παραμυξοϊού, του ραβδοϊού και άλλων. Ωστόσο, η πλειονότητα των ανθρώπινων κλινικών δοκιμών που αξιολογούν εμβόλια ιού γρίπης χρησιμοποιούν ιούς ευλογιάς και αδενοϊούς. Ενώ καθεμία από αυτές τις προσεγγίσεις φορέων έχει μοναδικά χαρακτηριστικά και βρίσκεται σε διαφορετικά στάδια ανάπτυξης, οι συνδυασμένες επιτυχίες αυτών των προσεγγίσεων υποστηρίζουν την προσέγγιση του εμβολίου με φορέα ιού στο σύνολό της. Θα πρέπει να ξεπεραστούν ζητήματα όπως η προϋπάρχουσα ανοσία και οι απαιτήσεις της ψυχρής αλυσίδας και οι συνεχείς ανησυχίες για την ασφάλεια. Ωστόσο, κάθε προσέγγιση σημειώνει πρόοδο στην αντιμετώπιση αυτών των ζητημάτων και όλες οι προσεγγίσεις εξακολουθούν να είναι βιώσιμες. Τα εμβόλια που φέρουν ιούς υπόσχονται ιδιαίτερα τον εμβολιασμό με καθολικά ή εστιασμένα αντιγόνα όπου οι παραδοσιακές μέθοδοι εμβολιασμού δεν είναι κατάλληλες για την αποτελεσματική χορήγηση αυτών των αντιγόνων. Οι πιο ελπιδοφόρες προσεγγίσεις που βρίσκονται επί του παρόντος σε ανάπτυξη είναι αναμφισβήτητα αυτές που στοχεύουν διατηρημένους επιτόπους περιοχής μίσχου ΗΑ. Δεδομένων των μέχρι σήμερα ευρημάτων, τα εμβόλια που μεταδίδονται με ιούς υπόσχονται πολλά και μπορεί να ξεπεράσουν τους τρέχοντες περιορισμούς των εμβολίων κατά της γρίπης.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 422, "text": "συνεχής εξέλιξη των στελεχών του ιού της γρίπης που κυκλοφορούν και η εμφάνιση νέων στελεχών" } ], "id": 1241, "question": "Τι μειώνει την αποτελεσματικότητα των ετήσιων εμβολιασμών κατά της γρίπης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 829, "text": "εμβόλια με ανασυνδυασμένο ιό" } ], "id": 1243, "question": "Ποιες εναλλακτικές λύσεις στα κλασικά εμβόλια με φορέα χρειάζονται;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3517, "text": "ενδομυϊκά" } ], "id": 1257, "question": "Πώς χορηγείται το TIV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3727, "text": "πρωτεΐνη αιμοσυγκολλητίνης (ΗΑ)," } ], "id": 1264, "question": "Ποια είναι η κύρια γλυκοπρωτεΐνη επιφάνειας και προσκόλλησης στον ιό της γρίπης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3925, "text": "ειδικός για το στέλεχος τίτλος HI" } ], "id": 1473, "question": "Ποιος είναι ο χρυσός κανόνας για τη συσχέτιση με την ανοσία στη γρίπη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7152, "text": "Αντισώματα ορού" } ], "id": 1475, "question": "Τι παρέχει προστασία από κλινικές ασθένειες;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4214, "text": "τα αντισώματα IgA του βλεννογόνου μπορεί επίσης να συμβάλλουν στην αντίσταση έναντι της μόλυνσης" } ], "id": 1476, "question": "Τι μπορεί να προσφέρει προστασία από την κλινική ασθένεια;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4924, "text": "δεν αναπαράγονται αποτελεσματικά στη θερμοκρασία του πυρήνα του σώματος" } ], "id": 1480, "question": "Αναπαράγεται το LAIV στη θερμοκρασία του σώματος;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4847, "text": "Τα LAIV είναι ευαίσθητα στη θερμοκρασία και προσαρμοσμένα στο κρύο" } ], "id": 1481, "question": "Ποιο είναι το χαρακτηριστικό του LAIV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5055, "text": "Η ανοσοποίηση LAIV επάγει αποκρίσεις αντισωμάτων ορού, αποκρίσεις αντισωμάτων βλεννογόνου (IgA) και αποκρίσεις Τ κυττάρων." } ], "id": 1483, "question": "Τι κάνει η ανοσοποίηση LAIV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5741, "text": "Τα ανοσοκυρίαρχα τμήματα των μορίων HA και NA υφίστανται μια συνεχή διαδικασία αντιγονικής μετατόπισης, μια φυσική συσσώρευση μεταλλάξεων" } ], "id": 1485, "question": "Τι επιτρέπει την εισβολή του ιού από την ανοσία;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6287, "text": "τον Φεβρουάριο" } ], "id": 1486, "question": "Πότε γίνεται η επιλογή του στελέχους του εμβολίου στο βόρειο ημισφαίριο;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6721, "text": "γενικά θεωρείται ότι είναι εξίσου αποτελεσματικό με τα αδρανοποιημένα εμβόλια και μπορεί να είναι πιο αποτελεσματικό στα παιδιά" } ], "id": 1487, "question": "Ποια είναι η αποτελεσματικότητα του LAIV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6886, "text": "αντιγονικό ταίριασμα" } ], "id": 1488, "question": "Σε τι βασίζεται το LAIV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7443, "text": "βελτιωμένη κατανόηση της ανοσίας στα διατηρημένα αντιγόνα του ιού της γρίπης" } ], "id": 1491, "question": "Τι έχει αυξήσει την πιθανότητα καθολικού εμβολίου κατά της γρίπης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7851, "text": "επιτρέπουν έτοιμο χειρισμό και τροποποίηση του γονιδιώματος του φορέα" } ], "id": 1492, "question": "Ποιο είναι το πλεονέκτημα των συστημάτων ανασυνδυασμένου DNA;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7943, "text": "επιτρέπει την τροποποίηση των φορέων για την εξασθένηση του ιού ή την ενίσχυση της ανοσογονικότητας" } ], "id": 1493, "question": "Ποιο είναι το πλεονέκτημα του συστήματος ανασυνδυασμένου DNA;" }, { "answers": [ { "answer_start": 13732, "text": "53" } ], "id": 1497, "question": "Πόσοι ορότυποι αδενοϊού υπάρχουν;" }, { "answers": [ { "answer_start": 8714, "text": "Ένα εμβόλιο ζωντανού αδενοϊού που περιέχει ορότυπους 4 και 7 χρησιμοποιείται από τον στρατό εδώ και δεκαετίες" } ], "id": 1498, "question": "Γιατί ο αδενοϊός μπορεί να είναι ο ασφαλέστερος φορέας εμβολίου;" }, { "answers": [ { "answer_start": 9084, "text": "αδενοϊός 5 (Ad5)" } ], "id": 1501, "question": "Ποιος είναι ο πιο μελετημένος ορότυπος;" }, { "answers": [ { "answer_start": 9877, "text": "ο ιός μπορεί να καθαριστεί με απλές μεθόδους" } ], "id": 1508, "question": "Ποιο είναι το πλεονέκτημα του αδενοϊού;" }, { "answers": [ { "answer_start": 9929, "text": "Τα εμβόλια αδενοϊού μπορούν επίσης να χορηγηθούν μέσω πολλαπλών οδών, συμπεριλαμβανομένης της ενδομυϊκής ένεσης, της υποδόριας ένεσης, της ενδοδερμικής ένεσης, της από του στόματος χορήγησης με χρήση προστατευτικής κάψουλας και της ενδορρινικής χορήγησης." } ], "id": 1509, "question": "Ποιο είναι το πλεονέκτημα των εμβολίων αδενοϊού;" }, { "answers": [ { "answer_start": 11289, "text": "Το εμβόλιο ήταν καλά ανεκτό και η επαγόμενη ορομετατροπή με την ενδορρινική χορήγηση είχε υψηλότερο ρυθμό μετατροπής και υψηλότερους γεωμετρικούς τίτλους HI" } ], "id": 1526, "question": "Ποιο ήταν το αποτέλεσμα της δοκιμής rAd5-HA;" }, { "answers": [ { "answer_start": 11679, "text": "μια εξέταση γονιδιακής θεραπείας όπου η ενδοφλέβια χορήγηση υψηλής δόσης ενός φορέα Ad είχε ως αποτέλεσμα το θάνατο ενός 18χρονου άνδρα" } ], "id": 1531, "question": "Ποιο είναι ένα παράδειγμα αποτυχίας του rAd5;" }, { "answers": [ { "answer_start": 16344, "text": "προϋπάρχουσα ανοσία," } ], "id": 1549, "question": "Ποιο είναι το μειονέκτημα του διανύσματος Ad5;" }, { "answers": [ { "answer_start": 14111, "text": "ορότυποι αδενοϊού έχουν διερευνηθεί ως φορείς, ιδιαίτερα μη ανθρώπινοι και ασυνήθιστοι ανθρώπινοι ορότυποι" } ], "id": 1550, "question": "Ποιες εναλλακτικές λύσεις για το διάνυσμα Ad5 έχουν διερευνηθεί;" }, { "answers": [ { "answer_start": 14845, "text": "Ορότυποι χαμηλού επιπολασμού όπως οι τύποι αδενοϊού 3, 7, 11 και 35" } ], "id": 1553, "question": "Τι μπορεί να αποφύγει την απόκριση anti-Ad5 και επίσης να προσφέρει αποτελεσματική παροχή αντιγόνου και ανοσογονικότητα;" }, { "answers": [ { "answer_start": 15067, "text": "Στρατηγικές αρχικής ενίσχυσης, χρησιμοποιώντας ανοσοποίηση DNA ή πρωτεΐνης σε συνδυασμό με ενισχυτική ανοσοποίηση εμβολίου αδενοϊού" } ], "id": 1557, "question": "Ποιες πρόσθετες στρατηγικές έχουν διερευνηθεί για να αποφευχθεί η προϋπάρχουσα ανοσία;" }, { "answers": [ { "answer_start": 15370, "text": "Όπως οι φορείς rAd, ο rAAV έχει ευρύ τροπισμό που μολύνει μια ποικιλία ξενιστών, ιστών και πολλαπλασιαζόμενους και μη πολλαπλασιαζόμενους κυτταρικούς τύπους" } ], "id": 1559, "question": "Ποιο είναι το πλεονέκτημα του φορέα AAV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 15998, "text": "Οι ιοί άγριου τύπου είναι μη παθογόνοι και δεν μπορούν να αναπαραχθούν στον άνθρωπο και τα συστήματα ανασυνδυασμένων φορέων AAV εξασθενούν ακόμη περισσότερο" } ], "id": 1560, "question": "Ποιο είναι το πλεονέκτημα του φορέα AAV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 16162, "text": "Ως μέλη της οικογένειας των παρβοϊών, οι AAV είναι μικροί ιοί χωρίς περίβλημα που είναι σταθεροί και επιδέχονται μακροχρόνια αποθήκευση χωρίς ψυχρή αλυσίδα." } ], "id": 1561, "question": "Ποιο είναι το πλεονέκτημα του φορέα AAV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 16319, "text": "Ενώ υπάρχει περιορισμένη προϋπάρχουσα ανοσία, η διαθεσιμότητα μη ανθρώπινων στελεχών ως υποψήφιων εμβολίων εξαλείφει αυτές τις ανησυχίες." } ], "id": 1562, "question": "Ποιο είναι το πλεονέκτημα του φορέα AAV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 16530, "text": "Υπάρχουν περιορισμένες μελέτες" } ], "id": 1563, "question": "Έχει μελετηθεί το AAV ως φορείς για τη γρίπη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 18884, "text": "Οι δομικές πρωτεΐνες παρέχονται σε συστήματα παραγωγής κυτταροκαλλιέργειας." } ], "id": 1567, "question": "Πώς λειτουργούν οι φορείς αλφαϊών;" }, { "answers": [ { "answer_start": 20569, "text": "το VEE στοχεύει τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα στους λεμφικούς ιστούς, ενεργοποιώντας γρήγορες και ισχυρές ανοσολογικές αποκρίσεις" } ], "id": 1570, "question": "Γιατί το σύστημα αντιγραφής VEE είναι ιδιαίτερα ελκυστικό;" }, { "answers": [ { "answer_start": 21068, "text": "ως υποψήφια εμβόλια για τον κυτταρομεγαλοϊό (CMV)" } ], "id": 1572, "question": "Για ποιο σκοπό αναπτύχθηκαν τα VRP που προέρχονται από το VEE;" }, { "answers": [ { "answer_start": 23505, "text": "μη ειδική προστασία από επακόλουθη μόλυνση από τον ιό της γρίπης" } ], "id": 1581, "question": "Ποιο ήταν το όφελος από την ισχυρή έμφυτη ανοσοαπόκριση στον φορέα βακουλοϊού;" }, { "answers": [ { "answer_start": 25564, "text": "ένας μονόκλωνος ιός RNA αρνητικής αίσθησης που προκαλεί ασθένεια στα πουλερικά" } ], "id": 1582, "question": "Τι είναι ο ιός της νόσου του Newcastle;" }, { "answers": [ { "answer_start": 25711, "text": "Ως ιός των πτηνών, υπάρχει μικρή ή καθόλου προϋπάρχουσα ανοσία στον NDV στους ανθρώπους και ο NDV διαδίδεται σε υψηλούς τίτλους τόσο στα αυγά κοτόπουλου όσο και στην κυτταροκαλλιέργεια" } ], "id": 1583, "question": "Ποιες είναι οι ελκυστικές ιδιότητες του φορέα NDV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 25897, "text": "Ως παραμυξοϊός, δεν υπάρχει φάση DNA στον κύκλο ζωής του ιού που μειώνει τις ανησυχίες για συμβάντα ολοκλήρωσης και τα επίπεδα έκφρασης γονιδίου καθοδηγούνται από την εγγύτητα στην αλληλουχία οδηγό στο 3' άκρο του ιικού γονιδιώματος. Αυτή η κλίση της γονιδιακής έκφρασης επιτρέπει την εξασθένηση μέσω αναδιάταξης του γονιδιώματος ή με εισαγωγή διαγονιδίων μέσα στο γονιδίωμα." } ], "id": 1584, "question": "Ποια είναι η ελκυστική ποιότητα του φορέα NDV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 28115, "text": "ο φορέας NDV είναι καλά ανεκτός, ακόμη και σε υψηλές δόσεις που χορηγούνται ενδοφλεβίως" } ], "id": 1588, "question": "Τι δείχνουν τα περιορισμένα ανθρώπινα ίχνη NDV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 35883, "text": "το MVA έχει υποβληθεί σε εκτεταμένες δοκιμές ασφάλειας και έχει αποδειχθεί ότι είναι εξασθενημένο σε σοβαρά ανοσοκατεσταλμένα ζώα και ασφαλές για χρήση σε παιδιά, ενήλικες, ηλικιωμένους και ανοσοκατεσταλμένα άτομα. Με εκτεταμένα προκλινικά δεδομένα, τα ανασυνδυασμένα εμβόλια MVA που εκφράζουν αντιγόνα γρίπης έχουν δοκιμαστεί σε κλινικές δοκιμές και έχουν αποδειχθεί ασφαλή και ανοσογόνα στους ανθρώπους" } ], "id": 1638, "question": "Πόσο ασφαλές είναι το MVA;" }, { "answers": [ { "answer_start": 36856, "text": "Το NYVAC είναι πολύ εξασθενημένο και θεωρείται ασφαλές για χρήση σε ανθρώπους όλων των ηλικιών" } ], "id": 1643, "question": "Πόσο ασφαλές είναι το NYVAC;" }, { "answers": [ { "answer_start": 38064, "text": "οι τρέχουσες στρατηγικές εμβολιασμού κατά της γρίπης βασίζονται στην τακτική ανοσοποίηση με εμβόλια που ταιριάζουν με κυκλοφορούντα στελέχη" } ], "id": 1644, "question": "Τι θα περιόριζε τη χρήση εμβολίων με φορέα ευλογιάς;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Διακίνηση πυρηνικών πρωτεϊνών ως απάντηση στο HIV-1 Tat: Επανασυνδέοντας τον πυρήναhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3499507/SHA: efa871aeaf22cbd0ce30e8bd1cb3d1affforou; Bidoia, Carlo; Woods, Elena; Roe, Barbara; Wynne, Kieran; Elia, Giuliano; Hall, William W.; Gautier, Virginie W.Date: 2012-11-15DOI: 10.1371/journal.pone.0048702 Άδεια χρήσης: cc-byAbstract: Η trans-activator πρωτεΐνη Tat είναι μια ιική ρυθμιστική πρωτεΐνη απαραίτητη για την αναπαραγωγή του HIV-1. Το Tat διακινεί στο νουκλεόπλασμα και στον πυρήνα. Ο πυρήνας, ένα εξαιρετικά δυναμικό και δομημένο υποπυρηνικό διαμέρισμα χωρίς μεμβράνη, είναι η θέση της βιογένεσης rRNA και ριβοσώματος και εμπλέκεται σε πολυάριθμες κυτταρικές λειτουργίες συμπεριλαμβανομένης της μεταγραφικής ρύθμισης, του ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και της ιογενούς μόλυνσης. Είναι σημαντικό ότι η παροδική πυρηνική διακίνηση των μεταγραφών του ιού Tat και HIV-1 είναι κρίσιμης σημασίας για την αντιγραφή του HIV-1, ωστόσο, ο ρόλος(οι) του πυρήνα στην αντιγραφή του HIV-1 παραμένει ασαφής. Για να κατανοήσουμε καλύτερα πώς η αλληλεπίδραση του Tat με τον πυρηνικό μηχανισμό συμβάλλει στην παθογένεση του HIV-1, διερευνήσαμε τις ποσοτικές αλλαγές στη σύνθεση του πυρηνικού πρωτεώματος των Τ-κυττάρων Jurkat που εκφράζουν σταθερά τον HIV-1 Tat συντηγμένο με μια ετικέτα TAP. Χρησιμοποιώντας μια οργανική πρωτεομική προσέγγιση βασισμένη στη φασματομετρία μάζας, σε συνδυασμό με σταθερή επισήμανση ισοτόπων σε κυτταρική καλλιέργεια (SILAC), ποσοτικοποιήσαμε 520 πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων 49 πρωτεϊνών που δείχνουν σημαντικές αλλαγές σε αφθονία στον πυρήνα των Τ-κυττάρων Jurkat κατά την έκφραση Tat. Πολυάριθμες πρωτεΐνες που εμφάνιζαν αλλαγή πτυχής ήταν καλά χαρακτηρισμένοι αλληλεπιδρώντες Tat και/ή γνωστό ότι είναι κρίσιμες για την αντιγραφή του HIV-1. Αυτό υποδηλώνει ότι ο χωρικός έλεγχος και ο υποκυτταρικός διαχωρισμός αυτών των κυτταρικών συμπαραγόντων από τον Tat παρέχουν ένα επιπλέον στρώμα ελέγχου για τη ρύθμιση των κυτταρικών μηχανημάτων που εμπλέκονται στην παθογένεση του HIV-1. Η ανάλυση μονοπατιού και η ανακατασκευή δικτύου αποκάλυψε ότι η έκφραση Tat είχε ειδικά ως αποτέλεσμα τον πυρηνικό εμπλουτισμό πρωτεϊνών που συμμετέχουν συλλογικά στη ριβοσωματική βιογένεση, την ομοιόσταση των πρωτεϊνών, τις μεταβολικές οδούς συμπεριλαμβανομένων των γλυκολυτικών, φωσφορικών πεντόζης, βιοσυνθετικών οδών νουκλεοτιδίων και αμινοξέων, μονοπατιών απόκρισης σήματος, Τ-κυττάρου ακεραιότητα του γονιδιώματος. Παρουσιάζουμε εδώ το πρώτο διαφορικό προφίλ του πυρηνικού πρωτεώματος των Τ-κυττάρων που εκφράζουν HIV-1 Tat. Συζητάμε πώς αυτές οι πρωτεΐνες συμμετέχουν συλλογικά σε διασυνδεδεμένα δίκτυα που συγκλίνουν για να προσαρμόσουν τις δυναμικές δραστηριότητες του πυρήνα, οι οποίες ευνοούν τις βιοσυνθετικές δραστηριότητες του ξενιστή και μπορούν να συμβάλουν στη δημιουργία ενός κυτταρικού περιβάλλοντος που υποστηρίζει την ισχυρή παραγωγή HIV-1. Κείμενο: Ο πυρήνας είναι ένα εξαιρετικά διατεταγμένο υποπυρηνικό διαμέρισμα οργανωμένο γύρω από γενετικοί τόποι που ονομάζονται περιοχές οργάνωσης πυρήνων (NORs) που σχηματίζονται από συστάδες εκατοντάδων επαναλήψεων γονιδίου rDNA οργανωμένες σε διαδοχικές επαναλήψεις από την κεφαλή στην ουρά [1, 2] . Ένα οργανίδιο χωρίς μεμβράνη που αρχικά περιγράφηκε ως «Εργοστάσιο Ριβοσώματος», ο πυρήνας είναι αφιερωμένος στη μεταγραφή rDNA που κατευθύνεται από την RNA-πολυμεράση-Ι, στην επεξεργασία του rRNA που μεσολαβείται από μικρές πυρηνικές ριβονουκλεοπρωτεΐνες (soRNPs) και τη συγκρότηση ριβοσώματος. Η βιογένεση του ριβοσώματος είναι απαραίτητη για τη σύνθεση πρωτεϊνών και τη βιωσιμότητα των κυττάρων [2] και τελικά καταλήγει στις ξεχωριστές μεγάλες (60S) και μικρές (40S) ριβοσωμικές υπομονάδες, οι οποίες στη συνέχεια εξάγονται στο κυτταρόπλασμα. Αυτή η θεμελιώδης κυτταρική διαδικασία, στην οποία το κύτταρο αφιερώνει τους περισσότερους ενεργειακούς πόρους του, είναι αυστηρά ρυθμισμένη ώστε να ταιριάζει με τις δυναμικές αλλαγές στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τον ρυθμό ανάπτυξης και τις μεταβολικές δραστηριότητες [3] . Ο πυρήνας είναι ο τόπος πρόσθετης επεξεργασίας RNA, συμπεριλαμβανομένης της εξαγωγής mRNA και αποικοδόμηση, η ωρίμανση των πλούσιων σε ουριδίνη μικρών πυρηνικών RNPs (U snRNPs), που αποτελούν τον πυρήνα του ματίσματος, βιογένεση του t-RNA και των microRNAs (miRNAs) [4] . Ο πυρήνας εμπλέκεται επίσης σε άλλες κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένου του ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, των ογκογόνων διεργασιών, των αποκρίσεων κυτταρικού στρες και της μετάφρασης [4]. και περιγράφει χιλιάδες πρωτεΐνες που διέρχονται μέσω του πυρήνα ως απόκριση σε διάφορες μεταβολικές συνθήκες, στρες και κυτταρικά περιβάλλοντα [5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]. Συλλογικά, οι προαναφερθείσες μελέτες αντιπροσωπεύουν ορόσημα στην κατανόηση της λειτουργικής πολυπλοκότητας του πυρήνα και έδειξαν ότι οι πυρηνικές πρωτεΐνες βρίσκονται σε συνεχή ανταλλαγή με άλλα πυρηνικά και κυτταρικά διαμερίσματα ως απόκριση σε συγκεκριμένες κυτταρικές συνθήκες. Είναι σημαντικό ότι ο πυρήνας είναι επίσης στόχος ιών συμπεριλαμβανομένων HIV-1, hCMV, HSV και KSHV, ως μέρος της στρατηγικής αντιγραφής τους [2, 17]. Οι μελέτες Proteomics που αναλύουν τους πυρήνες των κυττάρων που έχουν μολυνθεί με τον ανθρώπινο αναπνευστικό συγκυτιακό ιό (HRSV), τον ιό της γρίπης Α, τον ιό της λοιμώδους βρογχίτιδας κορωνοϊού των πτηνών (IBV) ή τον αδενοϊό τόνισαν πώς οι ιοί μπορούν να διαταράξουν την κατανομή των πυρηνικών πρωτεϊνών [2, 17, 18, , 20, 21, 22, 23, 24] . Είναι ενδιαφέρον ότι και οι δύο ρυθμιστικές πρωτεΐνες HIV-1 Tat και Rev εντοπίζονται στο πυρηνόπλασμα και τον πυρήνα. Και οι δύο αλληλουχίες τους περιλαμβάνουν ένα σήμα πυρηνικού εντοπισμού (NoLS) που επικαλύπτεται με το σήμα πυρηνικού εντοπισμού τους (NLS), το οποίο διέπει τον πυρηνικό εντοπισμό τους [25, 26, 27, 28, 29, 30, 31] . Επιπλέον, τα Tat και Rev αλληλεπιδρούν με το πυρηνικό αντιγόνο Β23, το οποίο είναι απαραίτητο για τον πυρηνικό εντοπισμό τους [25, 26, 27, 28, 29, 30]. Ωστόσο, μια πρόσφατη μελέτη περιέγραψε ότι σε αντίθεση με τα Τ-κύτταρα Jurkat και άλλες μετασχηματισμένες κυτταρικές σειρές όπου το Tat σχετίζεται με τον πυρήνα και τον πυρήνα, στα πρωτογενή Τ-κύτταρα το Tat συσσωρεύεται κυρίως στην πλασματική μεμβράνη, ενώ διακινείται μέσω του πυρήνα όπου λειτουργεί. [32] . Ενώ η ρύθμιση της ενεργού πυρηνικής τους εισαγωγής και/ή εξαγωγής, όπως μεσολαβείται από την οικογένεια καρυοφερίνης/ιμπορτίνης έχει περιγραφεί καλά, οι μηχανισμοί που κατανέμουν τα Tat και Rev μεταξύ του κυτταροπλάσματος, του πυρηνοπλάσματος και του πυρήνα παραμένουν αδιευκρίνιστοι [33, 34, 35, 36 , 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48] . Είναι σημαντικό, δύο σημαντικές μελέτες των Machienzi et al. έχουν αποκαλύψει σημαντικούς λειτουργικούς δεσμούς μεταξύ της αντιγραφής του HIV-1 και του πυρήνα [49, 50]. Πρώτον, θα μπορούσαν να αναστείλουν την αντιγραφή του HIV-1 και τη λειτουργία μετενεργοποίησης Tat χρησιμοποιώντας ένα δόλωμα TAR που κατευθύνεται ειδικά στον πυρήνα. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας μια παρόμοια προσέγγιση, με ένα αντι-HIV-1 σφυροκέφαλο ριβοένζυμο συντηγμένο με το μικρό πυρηνικό RNA U16 και ως εκ τούτου στοχευμένο στον πυρήνα, θα μπορούσαν να καταστείλουν δραματικά την αντιγραφή του HIV-1. Συλλογικά, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν έντονα ότι τα μεταγραφήματα HIV-1 και η διακίνηση πυρηνικών Tat είναι κρίσιμα για την αναπαραγωγή του HIV-1. Ωστόσο, η φύση αυτών των συνεισφορών μένει να διευκρινιστεί. Σε αυτήν την έκθεση, αναλύσαμε συστηματικά τις διαταραχές του πυρηνικού πρωτεώματος που συμβαίνουν σε κύτταρα Τ Jurkat που εκφράζουν συστατικά τον HIV-1 Tat, χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση ποσοτικής φασματομετρίας μάζας. Ακολουθώντας τον λεπτομερή σχολιασμό των ποσοτικών αλλαγών αφθονίας στη σύνθεση της πυρηνικής πρωτεΐνης κατά την έκφραση Tat, επικεντρωθήκαμε στα επηρεαζόμενα από Tat κυτταρικά σύμπλοκα και σηματοδοτικά μονοπάτια που σχετίζονται με τη βιογένεση ριβοσώματος, το μάτισμα, τους μοριακούς συνοδούς, την αντιγραφή και επιδιόρθωση του DNA και τον μεταβολισμό και συζητήσαμε τις δυνατότητές τους εμπλοκή στην παθογένεση του HIV-1. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τις ποσοτικές αλλαγές στο πυρηνικό πρωτεϊνό των Τ κυττάρων Jurkat που εκφράζουν συστατικά HIV-1 Tat (86aa) έναντι του αρνητικού σε Tat αντίστοιχου, χρησιμοποιώντας σταθερή σήμανση ισοτόπων με αμινοξέα σε κυτταρική καλλιέργεια Τεχνολογία (SILAC), ακολουθούμενη από φασματομετρία μάζας σε σειρά ESI και εφάρμοσε την πειραματική προσέγγιση που περιγράφεται στο Σχήμα 1Α. Πρώτον, χρησιμοποιώντας ρετροϊική παράδοση γονιδίου, μετατρέψαμε τον HIV-1 Tat συγχωνευμένο σε μια ετικέτα καθαρισμού διαδοχικής συγγένειας (TAP) (αποτελούμενη από δύο πρωτεΐνη G και ένα πεπτίδιο που δεσμεύει στρεπταβιδίνη) ή ετικέτα TAP μόνη της (φορέας ελέγχου) στον κλώνο Ε6 Τ κυττάρων λευχαιμίας Jurkat -1 και ταξινομήθηκαν τα μετατραπέντα κύτταρα (GFP θετικά) κατά FACS. Αυτό οδήγησε σε έναν εξαιρετικά εμπλουτισμένο πληθυσμό πολυκλωνικών μεταγωγισμένων κυττάρων που παρουσίαζαν διαφορετικά επίπεδα έκφρασης του διαγονιδίου (Εικόνα 1Β). Η λειτουργικότητα του TAP-Tat επιβεβαιώθηκε με τη διαμόλυνση των κυττάρων Jurkat TAP-Tat και TAP με έναν φορέα γονιδίου αναφοράς λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο του HIV-1 LTR (pGL3-LTR) [36] . Το TAP-Tat ρυθμίζει την έκφραση γονιδίου από το HIV-1 LTR έως και 28 φορές σε σύγκριση με τον έλεγχο (Εικόνα 1C). Για να αντιμετωπίσουμε περαιτέρω τη λειτουργικότητα του Tat συγχωνευμένου με τον TAP, συγκρίναμε το Jurkat TAP-Tat με το Jurkat-tat, μια κυτταρική σειρά που εκφράζει σταθερά χωρίς ετικέτα Tat [51] . Και οι δύο κυτταρικές σειρές εμφάνισαν συγκρίσιμη δράση HIV-1 LTR μετά από επιμόλυνση με pGL3-LTR (Σχήμα S1). Στη συνέχεια, η έκφραση Tat και ο υποκυτταρικός εντοπισμός επαληθεύτηκαν με υποκυτταρική κλασμάτωση που ακολουθείται από ανάλυση WB (Εικόνα 1 Ε). Το TAP-Tat εμφάνισε έναν εμφανή πυρηνικό/πυρηνικό εντοπισμό αλλά μπορούσε επίσης να ανιχνευθεί στο κυτταρόπλασμα. Αυτές οι παρατηρήσεις επικυρώθηκαν περαιτέρω με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού (Εικόνα 1Ε). Αξίζει να σημειωθεί ότι το Jurkat-tat παρουσίασε παρόμοια μοτίβα για την υποκυτταρική κατανομή Tat όπως φαίνεται από μικροσκοπία ανοσοφθορισμού και υποκυτταρική κλασμάτωση που ακολουθείται από ανάλυση WB (Εικόνα S2 και S3). Στη συνέχεια συγκρίναμε τον ρυθμό ανάπτυξης και τον πολλαπλασιασμό των κυτταρικών σειρών Jurkat TAP και TAP-Tat (Υλικά και Μέθοδοι S1), οι οποίες ήταν ισοδύναμες (Εικόνα S4A). Ομοίως, η ανάλυση FACS επιβεβαίωσε ότι οι σχετικοί πληθυσμοί στα G1, S και G2/M ήταν παρόμοιοι για τα κύτταρα Jurkat TAP-Tat και TAP (Εικόνα S4B). Επισημάναμε τα κύτταρα Jurkat TAP-Tat και Jurkat TAP με ελαφριά (R0K0) και βαριά (R6K6) ισότοπο που περιέχει αργινίνη και λυσίνη, αντίστοιχα. Μετά από πέντε περάσματα στο αντίστοιχο μέσο SILAC τους, 85 εκατομμύρια κύτταρα από κάθε καλλιέργεια συλλέχθηκαν, συνενώθηκαν και απομονώθηκαν οι πυρήνες τους όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Εικόνα 1Α) [52]. Κάθε βήμα της διαδικασίας παρακολουθήθηκε στενά με μικροσκοπική εξέταση. Για την αξιολόγηση της ποιότητας της διαδικασίας κλασματοποίησής μας, διερευνήθηκε ο ειδικός εμπλουτισμός γνωστών πυρηνικών αντιγόνων με ανάλυση Western Blot (Εικόνα 1D). Η νουκλεολίνη (110 kDa) και η φιμπριλλαρίνη (FBL) (34 kDa), δύο κύριες πυρηνικές πρωτεΐνες που είναι γνωστό ότι εντοπίζονται στο κοκκώδες συστατικό του πυρήνα, βρέθηκε ότι είναι πολύ εμπλουτισμένες στο μικτό πυρηνικό κλάσμα. Αξίζει να σημειωθεί ότι η νουκλεολίνη κατανεμήθηκε εξίσου μεταξύ του πυρηνικού και του κυτταροπλασματικού κλάσματος. Αυτό το πρότυπο κατανομής για τη νουκλεολίνη φαίνεται να είναι ειδικό για τα Τ-κύτταρα Jurkat όπως φαίνεται προηγουμένως [52, 53]. Η πυρηνική πρωτεΐνη PARP-1 (Poly ADPribose polymerase 1) (113 kDa) ήταν παρούσα στο πυρηνικό και το νουκλεοπλασματικό κλάσμα αλλά είχε εξαντληθεί στο πυρηνικό κλάσμα. Η άλφα-τουμπουλίνη (50 kDa) ήταν σε μεγάλη αφθονία στο κυτταροπλασματικό κλάσμα και ανιχνεύτηκε ασθενώς στα πυρηνικά κλάσματα. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι οι μέθοδοί μας παρήγαγαν ένα εξαιρετικά εμπλουτισμένο πυρηνικό κλάσμα χωρίς σημαντική διασταυρούμενη μόλυνση. Στη συνέχεια, το μίγμα πυρηνικών πρωτεϊνών υποβλήθηκε σε πέψη με τρυψίνη και τα προκύπτοντα πεπτίδια αναλύθηκαν με φασματομετρία μάζας. Πραγματοποιήθηκε συγκριτική ποσοτική πρωτεομική ανάλυση χρησιμοποιώντας MaxQuant για την ανάλυση των αναλογιών σε ισότοπα για κάθε πεπτίδιο που ταυτοποιήθηκε. Ποσοτικοποιήθηκαν συνολικά 2427 πεπτίδια, που αντιπροσωπεύουν 520 ποσοτικοποιημένες πυρηνικές πρωτεΐνες. Ο πλήρης σχολιασμένος κατάλογος των ποσοτικοποιημένων πυρηνικών πρωτεϊνών είναι διαθέσιμος στον Πίνακα S1 και τα ακατέργαστα δεδομένα από την ανάλυση φασματομετρίας μάζας κατατέθηκαν στη βάση δεδομένων αποθετηρίου Tranche (https:// proteomecommons.org/tranche/), στην οποία μπορείτε να προσπελάσετε χρησιμοποιώντας τον κατακερματισμό κλειδιά που περιγράφονται στα υλικά και τις μεθόδους. Σημειώσαμε τις ποσοτικοποιημένες πρωτεΐνες χρησιμοποιώντας τα εργαλεία ToppGene Suite [54] και εξάγαμε τους σχολιασμούς Gene Ontology (GO) και InterPro [55] . Η ανάλυση των βιολογικών διεργασιών GO (Εικόνα 1ΣΤ) αποκάλυψε ότι οι βιολογικές διεργασίες που αντιπροσωπεύονται καλύτερα περιελάμβαναν τη μεταγραφή (24%), την επεξεργασία RNA (23%), τη διαδικασία του κυτταρικού κύκλου (13%) και την οργάνωση των χρωμοσωμάτων (15%), η οποία αντανακλά την πυρηνική σχετίζεται με λειτουργίες και είναι συγκρίσιμος με τον προηγούμενο χαρακτηρισμό του πυρηνικού πρωτεώματος των Τ-κυττάρων Jurkat [52]. Η ανάλυση υποκυτταρικής κατανομής (Εικόνα 1ΣΤ) αποκάλυψε ότι το σύνολο δεδομένων μας περιείχε πρωτεΐνες που είναι γνωστό ότι εντοπίζονται στον πυρήνα (49%), στον πυρήνα (24%), ενώ το 15% των πρωτεϊνών είχε περιγραφεί προηγουμένως ότι κατοικούν αποκλειστικά στο κυτταρόπλασμα. Η υποκυτταρική κατανομή ήταν παρόμοια με την προηγούμενη ανάλυσή μας του πυρηνικού πρωτεώματος των Τ-κυττάρων Jurkat [52]. Πίνακας S1. Η κατανομή των αναλογιών πρωτεΐνης παριστάνεται στο Σχήμα 1G ως log 2 (αλλαγή αφθονίας). Οι αναλογίες SILAC υποδεικνύουν αλλαγές στην αφθονία πρωτεΐνης στο πυρηνικό κλάσμα των κυττάρων Jurkat TAP-Tat σε σύγκριση με τα κύτταρα Jurkat TAP. Η κατανομή των ποσοτικοποιημένων πρωτεϊνών ακολούθησε μια κατανομή Gauss (Εικόνα 1G). Συνολικά 49 πυρηνικές πρωτεΐνες εμφάνισαν 1,5 φορές ή μεγαλύτερη σημαντική αλλαγή (ρ, 0,05) κατά την έκφραση Tat (Πίνακας 1). Από αυτές, 30 πρωτεΐνες εμπλουτίστηκαν, ενώ 19 πρωτεΐνες εξαντλήθηκαν. Τα κύτταρα δεν εμφάνισαν αλλαγές στην περιεκτικότητα σε σταθερή κατάσταση ορισμένων από τα κύρια και άφθονα συστατικά του πυρήνα, συμπεριλαμβανομένης της νουκλεοφωσμίνης (NPM1/B23), C23, FBL, της πυρηνικής πρωτεΐνης P120 (NOL1) και της πυρηνικής πρωτεΐνης 5A (NOL5A). Οι διακριτές αναλογίες των αλλαγών πρωτεΐνης κατά την έκφραση Tat θα μπορούσαν να αντικατοπτρίζουν συγκεκριμένη πυρηνική αναδιοργάνωση και αλλοιωμένες δραστηριότητες του πυρήνα. Πραγματοποιήσαμε ανάλυση WB για να επικυρώσουμε τα αποτελέσματα που βασίζονται στο SILAC που ελήφθησαν από την ποσοτική πρωτεομική μας προσέγγιση (Εικόνα 2). 15 επιλεγμένες πρωτεΐνες εμφάνισαν διαφορική ένταση στα πυρηνικά κλάσματα κατά την έκφραση Tat, συμπεριλαμβανομένων 9 εμπλουτισμένων πρωτεϊνών (HSP90b, STAT3, pRb, CK2a, CK2a', HSP90a, Transportin, ZAP70, DDX3) και 3 εξαντλημένων πρωτεϊνών (ILF3, BOPSS RP1, και . . Επιπλέον, δοκιμάσαμε επίσης με ανάλυση WB, η αφθονία πρωτεΐνης δεν επηρεάστηκε από την έκφραση Tat (Importin beta, FBL, B23, C23). Αυτά τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν τη συμφωνία στην τάση των αντίστοιχων αναλογιών SILAC, παρά ορισμένες διαφορές στα ποσοτικά εύρη. Αξίζει να σημειωθεί ότι χρησιμοποιώντας το WB, θα μπορούσαμε να παρατηρήσουμε μια αλλαγή της έντασης για την πρωτεΐνη με μια αλλαγή πτυχής SILAC τόσο χαμηλή όσο 1,25 φορές. Σημειωτέον, το ερώτημα παραμένει ως προς το μέγεθος της αλλαγής πτυχής μπορεί να αποτελεί βιολογικά σχετική συνέπεια. Από τη μία πλευρά, το όριο των αλλαγών αφθονίας πρωτεΐνης μπορεί να προσδιοριστεί στατιστικά και στη συνέχεια θα υπογραμμίσει τις μεγαλύτερες αλλαγές αφθονίας όπως απεικονίζεται στον Πίνακα 1. Εναλλακτικά, ο συντονισμένος εμπλουτισμός ή η εξάντληση της πλειονότητας των πρωτεϊνών που ανήκουν σε ένα ξεχωριστό κυτταρικό σύμπλεγμα ή μονοπάτι θα επέτρεπε τον ορισμό μιας ομάδας πρωτεϊνών ενδιαφέροντος και πιθανής σημασίας. Επομένως, στη συνέχεια επικεντρωθήκαμε τόσο σε εμπλουτισμένες ή εξαντλημένες μεμονωμένες πρωτεΐνες με δραστηριότητες που σχετίζονται με τη μοριακή παθογένεση του HIV-1 ή Tat, όσο και σε ομαδοποιημένες τροποποιήσεις που επηρεάζουν ολόκληρα μονοπάτια κυτταρικής σηματοδότησης και μακρομοριακά σύμπλοκα. Αρχικά επικεντρωθήκαμε σε πρωτεΐνες σηματοδότησης που αλληλεπιδρούν με το Tat ή/και σχετίζονται Η μοριακή παθογένεση του HIV-1 και του οποίου η αφθονία στον πυρήνα ρυθμίστηκε από την έκφραση Tat. Φωσφο-πρωτεϊνικές φωσφατάσες. Η φωσφο-πρωτεϊνική φωσφατάση PP1 και PP2A είναι βασικές φωσφατάσες σερίνης/θρεονίνης [56, 57]. Είναι σημαντικό ότι η ΡΡ1 αντιπροσωπεύει το 80% της δραστηριότητας φωσφατάσης Ser/Thr εντός του πυρήνα. Στη μελέτη μας, η PP1 βρέθηκε να είναι δυνητικά εμπλουτισμένη κατά 1,52 φορές στον πυρήνα των κυττάρων Jurkat που εκφράζουν Tat, κάτι που υποστηρίζει προηγούμενες μελέτες που περιγράφουν την πυρηνική και πυρηνική στόχευση της PP1a από τον HIV-1 Tat και πώς η PP1 ρυθμίζει προς τα πάνω τη μεταγραφή του HIV-1. 58, 59, 60, 61, 62]. Το PP1 c ταυτοποιήθηκε επίσης ως μέρος της in vitro πυρηνικής αλληλεπίδρασης [63] . Παρομοίως, η PPP2CA, η καταλυτική υπομονάδα PP2A (1,29 φορές) και η ρυθμιστική υπομονάδα της PP2R1A (1,27 φορές) εμπλουτίστηκαν παρόμοια με την έκφραση Tat. Είναι ενδιαφέρον ότι η συσχέτιση Tat με τους προαγωγείς της υπομονάδας PP2A έχει ως αποτέλεσμα την υπερέκφραση και τη ρύθμιση της δραστηριότητας της PP2A στα λεμφοκύτταρα [64, 65]. Επιπλέον, το PP2A συμβάλλει στη ρύθμιση της μεταγραφής και αντιγραφής του HIV-1 [61, 66] .Πρωτεΐνη Ρετινοβλαστώματος. Η πρωτεΐνη pRb του ογκοκατασταλτικού γονιδίου εμφάνισε μια αλλαγή 1,4 φορές στον πυρήνα κατά την έκφραση Tat [67] . Περαιτέρω, η ανάλυση WB επιβεβαίωσε τη διακριτή μετατόπιση του pRb από το νουκλεόπλασμα στον πυρήνα από το Tat (Εικόνα 2). Ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο, το pRb μπορεί να υπερφωσφορυλιωθεί ή να υποφωσφορυλιωθεί κατά την έκφραση Tat και μπορεί αρνητικά ή θετικά να ρυθμίσει τη μεταγραφή που προκαλείται από Tat αντίστοιχα [68, 69, 70]. Είναι ενδιαφέρον ότι η υπερφωσφορυλίωση του pRB πυροδοτεί τη μετατόπισή του στον πυρήνα [71] . Η φωσφορυλίωση του pRB σχετίζεται επίσης με αύξηση της ριβοσωματικής βιογένεσης και της κυτταρικής ανάπτυξης [72] .STAT3. Ο μετατροπέας σήματος του παράγοντα μεταγραφής και ο ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (STAT3) εμπλουτίστηκε σημαντικά (1,86 φορές) στο πυρηνικό κλάσμα με τη συστατική έκφραση Tat. Επιπλέον, η ανάλυση WB έδειξε ότι η έκφραση Tat θα μπορούσε να προάγει την επανατοποθέτηση του STAT3 από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, με έναν διακριτό εμπλουτισμό στον πυρήνα (Εικόνα 2). Είναι ενδιαφέρον ότι προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει την ενεργοποίηση της σηματοδότησης STAT3 με τη μεσολάβηση Tat, όπως φαίνεται από την κατάσταση φωσφορυλίωσης [73] . Είναι ενδιαφέρον ότι η φωσφορυλίωση STAT3 προκάλεσε διμερισμό της πρωτεΐνης μετά τη μετατόπισή της στον πυρήνα [74] .YBX1. Η ΥΒΧ1, η πολυλειτουργική πρωτεΐνη που δεσμεύει DNA/RNA εμπλουτίστηκε κατά 1,38 φορές στον πυρήνα των κυττάρων Jurkat κατά την έκφραση Tat. Είναι ενδιαφέρον ότι το YBX1 αλληλεπιδρά με τα Tat και TAR και ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου HIV-1 [63, 75] .ZAP70. Η πρωτεϊνική κινάση τυροσίνης ZAP70 (συνδυασμένη με Ζέτα αλυσιδωτή πρωτεϊνική κινάση 70) εμπλουτίστηκε κατά 1,24 φορές στον πυρήνα των κυττάρων Jurkat που εκφράζουν Tat [76] . Επιπλέον, η ανάλυση WB αποκάλυψε ότι η έκφραση Tat θα μπορούσε να προάγει την επανατοποθέτηση του ZAP70 από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, με έναν διακριτό εμπλουτισμό στον πυρήνα (Εικόνα 2). Αξίζει να σημειωθεί ότι το ZAP70 είναι μέρος της in vitro πυρηνικής αλληλεπίδρασης Tat [63] .Matrin 3. Η πρωτεΐνη εσωτερικής πυρηνικής μήτρας, Matrin 3 (MATR3), παρουσίασε μια αλλαγή 1,39 φορές στον πυρήνα των κυττάρων Jurkat που εκφράζουν Tat. Εντοπίζεται στον νουκλεολασμό με διάχυτο μοτίβο που αποκλείεται από τους πυρήνες [77] . Το Matrin 3 έχει αναγνωριστεί ως μέρος της in vitro πυρηνικής αλληλεπίδρασης του HIV-1 Tat [63] . Δύο πρόσφατες μελέτες περιέγραψαν τη Matrin 3 ως μέρος συμπλεγμάτων ριβονουκλεοπρωτεϊνών που περιλαμβάνουν επίσης το HIV-1 Rev και (Rev Response Element) RNA HIV-1 που περιέχει RRE και προάγει τον HIV-1 μετα-μεταγραφική ρύθμιση [78, 79, 80] .CASP10 . Το προ-αποτωτικό μόριο σηματοδότησης, η Κασπάση 10 (CASP10), εξαντλήθηκε σημαντικά από τον πυρήνα των κυττάρων Jurkat-Tat (0,82 φορές) [81] . Είναι σημαντικό ότι η έκφραση Tat ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση και τη δραστηριότητα του CASP10 στα κύτταρα Jurkat [82] .ADAR1. Η δεαμινάση αδενοσίνης που δρα στο RNA (ADAR1), η οποία μετατρέπει τις αδενοσίνες σε ινοσίνες σε δίκλωνο RNA, εξαντλήθηκε σημαντικά από τον πυρήνα των κυττάρων Jurkat-Tat (0,78 φορές). Είναι ενδιαφέρον ότι η υπερέκφραση του ADAR1 ρυθμίζει προς τα πάνω την αντιγραφή του HIV-1 μέσω ενός μηχανισμού επεξεργασίας RNA [83, 84, 85, 86, 87, 88]. Επιπλέον, το ADAR1 ανήκει στην in vitro πυρηνική αλληλεπίδραση HIV-1 Tat [63] . Για να υπογραμμίσουμε τις δομικές και λειτουργικές σχέσεις των πυρηνικών πρωτεϊνών που επηρεάζονται από τον HIV-1 Tat, κατασκευάσαμε μια αναπαράσταση δικτύου του δεδομένων μας. Χρησιμοποιήσαμε το Cytoscape έκδοση 2.6.3 [89] και χρησιμοποιήσαμε το πρόσθετο MiMI [90] για να χαρτογραφήσουμε προηγουμένως χαρακτηρισμένες αλληλεπιδράσεις, εξαγόμενες από βάσεις δεδομένων αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών (BIND, DIP, HPRD, CCSB, Reactome, IntAct και MINT). Αυτό είχε ως αποτέλεσμα ένα εξαιρετικά πυκνό και συνδεδεμένο δίκτυο που περιλαμβάνει 416 πρωτεΐνες (κόμβους) από τις 536 πρωτεΐνες, συνδεδεμένες με 5060 μη κατευθυνόμενες αλληλεπιδράσεις (άκρες) (Εικόνα 3Α). Η ανάλυση κεντρικότητας αποκάλυψε ένα όριο 23,7 αλληλεπιδράσεων ανά πρωτεΐνη. Η ανάλυση τοπολογίας χρησιμοποιώντας το πρόσθετο CentiScaPe [91] έδειξε ότι η κατανομή βαθμών κόμβου ακολουθεί έναν νόμο ισχύος (Εικόνα S5), χαρακτηριστικό ενός δικτύου χωρίς κλίμακα. Είναι σημαντικό, όταν αναλύσαμε την κατανομή του συντελεστή ομαδοποίησης (Σχήμα S6) διαπιστώσαμε ότι το δίκτυο είναι οργανωμένο σε μια ιεραρχική αρχιτεκτονική [92], όπου οι συνδεδεμένοι κόμβοι είναι μέρος υψηλά ομαδοποιημένων περιοχών που διατηρούνται από λίγους κόμβους οργανωμένους γύρω από τον HIV-1 Tat. Επιπλέον, η ανάλυση βαθμού σύνδεσης κόμβου του δικτύου μας εντόπισε τον HIV-1 Tat ως την πιο συνδεδεμένη πρωτεΐνη (Εικόνα S6). Συγκεκριμένα, η ανάλυση τοπολογίας έδειξε ότι οι τιμές για τις κεντρικότητες Tat ήταν οι υψηλότερες (βαθμός κόμβου, τάση, ακτινοβολία, εγγύτητα, ενδιάμεση και κεντροειδής), χαρακτηρίζοντας την Tat ως την κύρια πρωτεΐνη κόμβου του πυρηνικού δικτύου. Πράγματι, συνολικά 146 πρωτεΐνες έχουν περιγραφεί προηγουμένως ότι αλληλεπιδρούν με Tat (Εικόνα 3Β, Πίνακας S2). Αυτές οι πρωτεΐνες εμπλέκονται σε ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένης της χρωμοσωμικής οργάνωσης, της επεξεργασίας DNA και RNA και του ελέγχου του κυτταρικού κύκλου. Είναι σημαντικό ότι κατά την τρίτη από αυτές τις πρωτεΐνες παρουσιάζεται μια αύξηση στην αλλαγή αναλογίας αναλογίας (59 πρωτεΐνες με αναλογία 0,1,2 φορές). Παράλληλα, χαρακτηρίσαμε το μέγεθος των σχετικών αλλαγών αφθονίας πρωτεϊνών που παρατηρήθηκαν σε διακριτές κυτταρικές οδούς (Εικόνα 4). βιογένεση. Αρχικά επικεντρωθήκαμε στη βιογένεση του ριβοσώματος, την κύρια λειτουργία του πυρήνα. Θα μπορούσαμε να παρατηρήσουμε μια γενική και συντονισμένη αύξηση στην αφθονία των ριβοσωμικών πρωτεϊνών στον πυρήνα με την έκφραση Tat (Εικόνα 4). Ενώ ορισμένες ριβοσωμικές πρωτεΐνες παρέμειναν ανεπηρέαστες, η Tat προκάλεσε την πυρηνική συσσώρευση αρκετών ξεχωριστών μεγάλων και μικρών ριβοσωμικών πρωτεϊνών, εκτός από την RPL35A, για την οποία η έκφραση Tat προκάλεσε σημαντική μείωση στο πυρηνικό επίπεδο (0,29 φορές). Ομοίως, αρκετές πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην επεξεργασία του rRNA εμφάνισαν συνολική αύξηση στην πυρηνική συσσώρευση κατά την έκφραση Tat. Αυτά περιλαμβάνουν ανθρώπινα κανονικά μέλη της οικογένειας L7ae μαζί με μέλη που συμμετέχουν στα Box C/D, H/ACA και U3 snoRNPs (Εικόνα 4). Αντίθετα, το BOP1, ένα συστατικό του συμπλέγματος PeBoW (Pescadillo Bop1 WDR12) που είναι απαραίτητο για την ωρίμανση της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας, εξαντλήθηκε σημαντικά από τον πυρήνα των κυττάρων Jurkat TAP-Tat (0,81 φορές) και αυτό επιβεβαιώθηκε με ανάλυση WB (Εικόνα 2 ) [93] . Ωστόσο, τα άλλα συστατικά του συμπλέγματος PeBoW, Pes1 (0,94 φορές) και WDR12 (1,1 φορές), δεν επηρεάστηκαν από την έκφραση Tat. Αξίζει να σημειωθεί ότι δεν εντοπίσαμε αλλαγή στην αφθονία της πρωτεΐνης που συμμετέχει στη μεταγραφή του rDNA όπως το RNAPOLI, το UBF.Spliceosome. Προσδιορίσαμε και ποσοτικοποιήσαμε στο σύνολο δεδομένων μας 55 πρωτεΐνες από τις 108 γνωστές ματοσωμικές πρωτεΐνες [94]. Αυτές οι πρωτεΐνες περιλαμβάνουν τις μικρές πυρηνικές ριβονουκλεοπρωτεΐνες U1, U2 και U5, Sm D1, D2, D3, F και B, και τις ετερογενείς πυρηνικές ριβονουκλεοπρωτεΐνες. Τα δεδομένα μας υποδεικνύουν μια ευδιάκριτη αύξηση στην αφθονία των ειδικών πρωτεϊνών συμπλόκου ματίσματος κατά την έκφραση του HIV-1 Tat σε Τ-κύτταρα Jurkat (Εικόνα 3 και 4). Οι μόνες τρεις πρωτεΐνες που εξαντλήθηκαν σημαντικά από τον πυρήνα κατά την έκφραση του HIV-1 Tat ήταν η RBMX (0,89 φορές), η HNRNPA2B1 (0,84 φορές) και η SNRPA (0,81 φορές). Αρκετές έρευνες έδειξαν μεταβολή της έκφρασης στους κυτταρικούς παράγοντες ματίσματος σε κύτταρα μολυσμένα με HIV-1 [95, 96]. Μοριακές συνοδούς. Έχουμε εντοπίσει αρκετούς μοριακούς συνοδούς, συνοδηγούς και άλλους παράγοντες που εμπλέκονται στην πρωτεόσταση που εμπλουτίζονται σε μεγάλο βαθμό στον πυρήνα των Τ-κυττάρων κατά την έκφραση Tat (Εικόνα 3 και 4), πολλοί από τους οποίους είχαν προηγουμένως χαρακτηριστεί ως μέρος της πυρηνικής αλληλεπίδρασης Tat [63] . Αρκετές πρωτεΐνες θερμικού σοκ, συμπεριλαμβανομένων των DNAJs, ειδικών ισομορφών HSP90, HSP70 και HSP40 και οι συμπαράγοντες τους εμπλουτίστηκαν διακριτικά στο πυρηνικό κλάσμα των κυττάρων Jurkat που εκφράζουν Tat (Εικόνα 4). Όπως φαίνεται από το WB, ενώ τα HSP90a και b είναι ως επί το πλείστον κυτταροπλασματικά, η έκφραση Tat πυροδοτεί την επανατοποθέτησή τους στον πυρήνα και τον πυρήνα, επιβεβαιώνοντας την πρωτεωμική ποσοτική μας προσέγγιση (Εικόνα 2). Ομοίως, η θερμοπληξία μπορεί να προκαλέσει την επανατοποθέτηση των HSP90 και HSP70 στον πυρήνα [97, 98, 99, 100, 101]. Σε μια πρόσφατη μελέτη, η ομάδα του Fassati έδειξε ότι το HSP90 υπάρχει στον προαγωγέα HIV-1 και μπορεί να ρυθμίζει άμεσα την έκφραση του γονιδίου του ιού [102] . Παρατηρήσαμε επίσης τη συντονισμένη αυξημένη αφθονία μορίων σαπερονίνης κατηγορίας I (GroEL και GroES) και κατηγορίας II (σαπερονίνη που περιέχει TCP-1 (CTT)) (Εικόνα 3 και 4) κατά την έκφραση Tat. Ουμπικιτίνη-πρωτεάσωμα μονοπατιού. Η οδός ουβικιτίνης-πρωτεασώματος είναι το κύριο πρωτεολυτικό σύστημα των ευκαρυωτικών κυττάρων [103] . Είναι σημαντικό ότι η πυρηνική οδός ουβικιτίνης-πρωτεασώματος ελέγχει την παροχή ριβοσωμικών πρωτεϊνών και είναι σημαντική για τη βιογένεση του ριβοσώματος [104, 105]. Το πρωτεάσωμα 26S αποτελείται από το σωματίδιο πυρήνα 20S (CP) και το ρυθμιστικό σωματίδιο 19S (RP). Εναλλακτικά, το CP μπορεί να συσχετιστεί με το 11S RP για να σχηματίσει το ανοσοπρωτεάσωμα. Όλες οι ποσοτικοποιημένες πρωτεΐνες στη μελέτη μας αποτελούν μέρος του ρυθμιστικού συμπλέγματος 19S και περιλαμβάνουν PSMD2 (1,5 φορές), PSMD3 (1,32 φορές), PSMD11 (1,25 φορές) και PSMD13 (0,72 φορές), το μόνο συστατικό πρωτεασώματος που έχει μειωθεί σημαντικά από τον πυρήνα παρουσία Tat (Εικόνα 4) . Είναι ενδιαφέρον ότι το Tat αλληλεπιδρά με διακριτές υπομονάδες του συστήματος πρωτεασώματος, συμπεριλαμβανομένων των υπομονάδων 19S, 20S και 11S. Οι συνέπειες αυτών των αλληλεπιδράσεων περιλαμβάνουν τον ανταγωνισμό του Tat με το 11S RP ή το 19S RP για δέσμευση στο 20S CP, το οποίο είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της δραστηριότητας της πεπτιδάσης 20S [106, 107, 108, 109, 110, 111]. Επιπλέον, το Tat αποδείχθηκε ότι τροποποιεί τη σύνθεση και τη δραστηριότητα του πρωτεασώματος, η οποία επηρεάζει τη δημιουργία πεπτιδικών αντιγόνων που αναγνωρίζονται από τα κυτταροτοξικά Τ-λεμφοκύτταρα [112]. Είναι σημαντικό ότι μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι απουσία Tat, τα συστατικά πρωτεασώματος σχετίζονται με τον προαγωγέα HIV-1 και η δραστηριότητα πρωτεασώματος περιορίζει τη μεταγραφή [113] . Η προσθήκη Tat προώθησε τον διαχωρισμό της υπομονάδας 19S από το πρωτεάσωμα 20S, ακολουθούμενο από τον διακριτό εμπλουτισμό του συμπλόκου τύπου 19S σε πυρηνικά εκχυλίσματα μαζί με τη μεσολάβηση Tat στρατολόγηση των υπομονάδων 19S στον προαγωγέα HIV-1, που διευκόλυνε την μεταγραφική επιμήκυνση [113] . Επίσης ποσοτικοποιήσαμε την UBA1 (1,36 φορές), την E3 ουβικιτίνη-πρωτεϊνική λιγάση UHRF1 (1,13 φορές), την UBC (1 φορές) και δύο ειδικές πεπτιδάσες Ubiquitin, USP30 (1,28 φορές) και USP20 (0,06 φορές) (Εικόνα 4) .Αντιγραφή και επιδιόρθωση DNA. Κατά την έκφραση του HIV-1 Tat, παρατηρήσαμε τον συντονισμένο πυρηνικό εμπλουτισμό αρκετών κυτταρικών παραγόντων που σχετίζονται με τις οδούς αντιγραφής και επιδιόρθωσης του DNA (Εικόνα 4). , αντίστοιχα) [114] . Τα MCM7, 6 και 3 ταυτοποιήθηκαν ως μέρος της in vitro πυρηνικής αλληλεπίδρασης του HIV-1 Tat [63] . Η δομική διατήρηση των χρωμοσωμάτων 2, SMC2, εμπλουτίστηκε (1,35 φορές) στο πυρηνικό κλάσμα με έκφραση Tat. Το SMC2 αναγνωρίστηκε ως μέρος της in vitro πυρηνικής αλληλεπίδρασης του HIV-1 Tat [63]. Ενώ ο παράγοντας αντιγραφής C1 (RFC1) και RFC2 (1,31 και 1,28 φορές αντίστοιχα) εμφάνισαν αυξημένη αλλαγή πτυχής και το RFC5/3 δεν επηρεάστηκε, το RFC4 εξαντλήθηκε σοβαρά (0,69 φορές) από το πυρηνικό κλάσμα κατά την έκφραση Tat [115] . Τα RFC1 και RFC2 ταυτοποιήθηκαν ως μέρος της in vitro πυρηνικής αλληλεπίδρασης του HIV-1 Tat [63]. Το Tat προκάλεσε τον εμπλουτισμό του XRCC6 (1,27 φορές) και του XRCC5 (1,36 φορές) στον πυρήνα, οι οποίοι εμπλέκονται στην επιδιόρθωση της μη ομόλογης σύνδεσης άκρου DNA (NHEJ) [116] . Το XRCC6 συνδέεται με σύμπλοκα ιικής προενσωμάτωσης που περιέχουν HIV-1 Integrase και επίσης αλληλεπιδρά με Tat και TAR [117, 118, 119]. Επιπλέον, σε μια οθόνη που βασίζεται σε ριβοένζυμα, το knockdown του XRCC5 (Ku80) μείωσε τόσο την ολοκλήρωση των ρετροϊών όσο και τη μεταγραφή Tatmediated [120] . Ως μέρος της επιδιόρθωσης βασικής εκτομής (BER), έχουμε εντοπίσει μια κύρια απουρινική/απυριμιδινική ενδονουκλεάση 1 (APEX1) (1,29 φορές). Είναι σημαντικό ότι σε μια οθόνη siRNA που στοχεύει παράγοντες επιδιόρθωσης DNA, το knockdown APEX1 βρέθηκε ότι αναστέλλει τη μόλυνση από τον HIV-1 κατά περισσότερο από 60% [121] . Η πρωτεΐνη της ομάδας υψηλής κινητικότητας (HMG), HMGA1 (1,30 φορές), εμπλουτίστηκε στον πυρήνα μετά την έκφραση Tat [122]. Το HMGA1 αλληλεπιδρά με την HIV-1 Integrase και αποτελεί μέρος του συμπλέγματος προ-ενσωμάτωσης HIV-1 [123, 124]. Είναι σημαντικό ότι το HMGA1 έχει αναγνωριστεί σε μια πρωτεομική εξέταση, ως κυτταρικός συμπαράγοντας που αλληλεπιδρά με τον οδηγό HIV-1 59 [125] .Μεταβολισμός. Τα πρωτεομικά μας δεδομένα υποδηλώνουν ότι το Tat προκαλεί διαταραχές στη γλυκόλυση, στην οδό φωσφορικής πεντόζης και στη βιοσύνθεση νουκλεοτιδίων και αμινοξέων (Εικόνα 4 και Σχήμα S7). Συγκεκριμένα, σε Τ κύτταρα που εκφράζουν Tat, εντοπίσαμε συντονισμένες αλλαγές στην αφθονία πρωτεϊνών που δεν ήταν προηγουμένως γνωστό ότι σχετίζονται με την παθογένεση Tat, η οποία αποκάλυψε απροσδόκητες συνδέσεις με τη γλυκόλυση και την οδό φωσφορικής πεντόζης, συμπεριλαμβανομένων των ακόλουθων γλυκολιτικών ενζύμων, γαλακτικής αφυδρογονάσης Β (LDHB) (1,37 φορές), 3-φωσφορική αφυδρογονάση γλυκεραλδεΰδης (GAPDH) (1,17 φορές) και μουτάση φωσφογλυκερικού οξέος (PGAM1) (0,89 φορές) (Εικόνα 4 και Σχήμα S7). Εν συντομία, το GPI καταλύει τον αναστρέψιμο ισομερισμό της 6-φωσφορικής γλυκόζης σε 6-φωσφορική φρουκτόζη. Στη συνέχεια, το PFKP καταλύει τη μη αναστρέψιμη μετατροπή της 6-φωσφορικής φρουκτόζης σε 1,6-διφωσφορική φρουκτόζη και είναι ένα βασικό ρυθμιστικό ένζυμο στη γλυκόλυση. Στο τέλος της γλυκολυτικής οδού, το PKM2, στην τετραμερή του μορφή, είναι γνωστό ότι παράγει ATP και πυροσταφυλικό, ενώ το LDHB εκτρέπει την πλειονότητα του πυροσταφυλικού στην παραγωγή γαλακτικού και την αναγέννηση του NAD+ για υποστήριξη της συνεχιζόμενης γλυκόλυσης, ένα φαινόμενο που περιγράφεται για πολλαπλασιαστικά Τ κύτταρα [126] . Αξίζει να σημειωθεί ότι σε υψηλά πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα, το PKM2 μπορεί να βρεθεί στη διμερή του μορφή και η δραστηριότητά του μεταβάλλεται. Αυτό ρυθμίζει προς τα πάνω τη διαθεσιμότητα των ενδιαμέσων γλυκόζης, τα οποία αναδρομολογούνται στις οδούς βιοσύνθεσης φωσφορικής πεντόζης και σερίνης για την παραγωγή βιοσυνθετικών προδρόμων νουκλεοτιδίων, φωσφολιπιδίων και αμινοξέων. Ως μέρος της οδού της φωσφορικής πεντόζης, έχουμε χαρακτηρίσει τον σημαντικό εμπλουτισμό της αφυδρογονάσης της 6-φωσφορικής γλυκόζης (G6PD) (2,11 φορές), η οποία διακλαδίζεται της οδού γλυκόλυσης για να δημιουργήσει NADPH, η ριβόζη-5 φωσφορική ουσία σημαντική πρόδρομη ουσία για τη σύνθεση νουκλεοτίδια. Σύμφωνα με αυτό, εντοπίσαμε τη συντονισμένη αύξηση της αφθονίας των ενζύμων που παίζει κεντρικό ρόλο στη σύνθεση πουρινών και πυριμιδινών. Πιο συγκεκριμένα, το IMPDH2 (1,66 φορές), ένα ένζυμο περιορισμού του ρυθμού στο σημείο διακλάδωσης της βιοσύνθεσης νουκλεοτιδίων πουρίνης, που οδηγεί στη δημιουργία νουκλεοτιδίων γουανίνης, συνθετάσης πυροφωσφορικής φωσφοριβοσυλίου 2 (PRPS2) (1,41 φορές), κυτιδίνης-5- τριφωσφορική συνθετάση (CTPS) (1,74 φορές) που καταλύει τη μετατροπή της UTP σε CTP και τη μεγάλη υπομονάδα της ριβονουκλεοτιδικής αναγωγάσης (RRM1) (1,56 φορές). Παράλληλα, παρατηρήσαμε την αυξημένη αφθονία της αμινοτρανσφεράσης φωσφοσερίνης PSAT1 (1,90 φορές), ενός ενζύμου που εμπλέκεται στη βιοσύνθεση σερίνης, το οποίο έχει συνδεθεί με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων in vitro. Η διεπαφή ιού-ξενιστή είναι μια θεμελιώδης πτυχή στον καθορισμό της μοριακής παθογένεσης του HIV-1 [127, 128, 129, 130, 131, 132, 133]. Πράγματι, με το περιορισμένο ρεπερτόριο ιικών πρωτεϊνών του, ο HIV-1 βασίζεται σε μεγάλο βαθμό στον μηχανισμό του κυττάρου ξενιστή για την αντιγραφή του. Αρκετές πρόσφατες μελέτες έχουν αξιοποιήσει τις πρόσφατες προόδους στις τεχνολογίες ''OMICS'' και έχουν αποκαλύψει σημαντικές γνώσεις σε αυτόν τον πολύ συντονισμένο μοριακό διάλογο [132, 134]. Το HIV-1 Tat είναι απαραίτητο για την αντιγραφή του ιού και ενορχηστρώνει την έκφραση του γονιδίου HIV-1. Η ιική ρυθμιστική πρωτεΐνη είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρά με μια εκτεταμένη σειρά κυτταρικών πρωτεϊνών και ρυθμίζει την έκφραση κυτταρικών γονιδίων και τη οδό σηματοδότησης [135, 136]. Εμείς και άλλοι έχουμε χρησιμοποιήσει προσεγγίσεις σε επίπεδο συστήματος για τη διερεύνηση της αλληλεπίδρασης Tat με τον μηχανισμό του κυττάρου ξενιστή, οι οποίοι έχουν χαρακτηρίσει το HIV-1 Tat ως κρίσιμο μεσολαβητή της διεπαφής ξενιστή-ιού [137, 138, 139, 140, 141, 142, 143 , 144, 145, 146, 147, 148, 149]. Εδώ, έχουμε διερευνήσει τη διακίνηση πυρηνικών πρωτεϊνών ως απόκριση στην έκφραση του HIV-1 Tat σε Τ-κύτταρα, με σκοπό να παρέχουμε μοναδικές και νέες γνώσεις σχετικά με το ρόλο της συγκρότησης πρωτεϊνών από το Tat στη λεπτομερή ρύθμιση της διαθεσιμότητας και της λειτουργίας πρωτεΐνης. Έχουμε αναπτύξει για αυτή τη μελέτη, ένα κυτταρικό μοντέλο που χρησιμοποιεί Τ-κύτταρα Jurkat που εκφράζουν σταθερά Tat συντηγμένα στο Ν-τερματικό του άκρο με την ετικέτα TAP. Τα Τ-κύτταρα Jurkat είναι ισχυρά και παρουσιάζουν το πλεονέκτημα να αναπτύσσονται χωρίς ερεθίσματα και μετατρέπονται εύκολα χρησιμοποιώντας γονίδιο ρετροϊού διανομή. Είναι σημαντικό ότι έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για την αξιολόγηση της παθογένεσης με τη μεσολάβηση Tat χρησιμοποιώντας προσεγγίσεις σε όλο το σύστημα και για την ανάλυση των οδών και των λειτουργιών κυτταρικής σηματοδότησης κλειδιών Τ-κυττάρων [144, 150, 151, 152]. Πράγματι, τα βρήκαμε ιδιαίτερα κατάλληλα για παρατεταμένη in vitro καλλιέργεια σε μέσο SILAC και επακόλουθη απομόνωση του πυρήνα τους που ακολουθείται από ανάλυση MS, η οποία απαιτεί έως και 85 εκατομμύρια κύτταρα. Συνδυάσαμε το Tat με την ετικέτα TAP για να ενεργοποιήσουμε μελλοντικές μεταγενέστερες εφαρμογές όπως ο καθαρισμός συγγένειας σε συνδυασμό ή η ανάλυση IP Chromatin. Είναι σημαντικό ότι έχουμε επιβεβαιώσει ότι η N-τερματική ετικέτα TAP δεν παρενέβη στη λειτουργία Tat ούτε στον εντοπισμό της στα κελιά Jurkat, σε σύγκριση με την ετικέτα χωρίς ετικέτα. Αξίζει να σημειωθεί ότι η υποκυτταρική κατανομή Tat μπορεί να ποικίλλει ανάλογα με τον τύπο κυττάρου που χρησιμοποιείται. Ενώ το Tat είναι γνωστό ότι συσσωρεύεται στον πυρήνα και τον πυρήνα σε κύτταρα Jurkat και άλλες μετασχηματισμένες κυτταρικές σειρές, στα πρωτογενή Τ-κύτταρα, το Tat περιγράφηκε ότι συσσωρεύεται κυρίως στη μεμβράνη πλάσματος, ενώ διακινείται μέσω του πυρήνα όπου λειτουργεί [32] . Αυτές οι διαφορές παραμένουν προς χαρακτηρισμό, αλλά θα μπορούσαν να σχετίζονται με διαφορετικά επίπεδα έκφρασης παραγόντων μεταφοράς σε μετασχηματισμένες κυτταρικές σειρές έναντι πρωτογενών κυττάρων, όπως περιγράφεται πρόσφατα από τον Kuusisto et al. [39] . Επιπλέον, οι Stauber και Pavlakis έχουν προτείνει ότι ο πυρηνικός εντοπισμός Tat θα μπορούσε να είναι τα αποτελέσματα της υπερέκφρασης Tat [31] . Εδώ, επιλέξαμε και χρησιμοποιήσαμε έναν πολυκλωνικό πληθυσμό Jurkat Τ-κυττάρων που εκφράζουν Tat σε διαφορετικά επίπεδα. Προτείνουμε ότι αυτή η ετερογένεια στα επίπεδα έκφρασης Tat μπορεί να αντικατοπτρίζει τη στοχαστική έκφραση Tat που περιγράφεται κατά τη διάρκεια της ιικής αντιγραφής [153]. Χρησιμοποιώντας μια ποσοτική πρωτεομική στρατηγική που βασίζεται σε μια οργανική προσέγγιση, ποσοτικοποιήσαμε περισσότερες από 520 πυρηνικές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων 49 πρωτεϊνών που παρουσιάζουν σημαντική αλλαγή πτυχής. Ο βαθμός στον οποίο οι επαγόμενες παραλλαγές στην αφθονία των πυρηνικών πρωτεϊνών είναι βιολογικά σχετικές και μπορούν να επηρεάσουν τις κυτταρικές και/ή ιικές διεργασίες παραμένει να προσδιοριστεί. Ωστόσο, η βιολογική φύση των μονοπατιών και των μακρομοριακών συμπλεγμάτων που επηρεάζονται μας επιτρέπει να συζητήσουμε τις πιθανές συσχετίσεις τους με την παθογένεση του HIV-1. Το HIV-1 Tat εκφράζεται νωρίς μετά την ενσωμάτωση του γονιδιώματος του HIV-1 και μεσολαβεί στη μετάβαση στη φάση παραγωγής του ιού, που σχετίζεται με ισχυρή έκφραση προϊικού γονιδίου, συγκρότηση ιικών πρωτεϊνών και, τελικά, εκβλάστηση και απελευθέρωση ιοσωμάτων. Σε αυτό το πλαίσιο και με βάση τα αποτελέσματά μας, προτείνουμε ότι το Tat θα μπορούσε να συμμετάσχει στη διαμόρφωση του ενδοκυτταρικού περιβάλλοντος και του μεταβολικού προφίλ των Τ κυττάρων για να ευνοήσει τις βιοσυνθετικές δραστηριότητες του ξενιστή που υποστηρίζουν την παραγωγή ισχυρών βιριόντων. Πράγματι, παρατηρήσαμε τον διακριτό πυρηνικό εμπλουτισμό ριβοσωμικών πρωτεϊνών και ενζύμων που σχετίζονται με τη ριβοσωματική βιογένεση, κάτι που θα μπορούσε να είναι ενδεικτικό μιας αύξησης της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Με την αξιοσημείωτη εξαίρεση της πυρηνικής εξάντλησης του RPL35A, οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες και τα ένζυμα που σχετίζονται με τη ριβοσωματική βιογένεση ήταν στις 20 πιο εμπλουτισμένες πυρηνικές πρωτεΐνες (NHP2L1, RLP14, RPL17, RPL27, RPS2, RPL13). Επιπλέον, αυτό το αποτέλεσμα φαίνεται να είναι ειδικό για τον HIV-1 Tat αφού η αναστολή της μεταγραφής από την ακτινομυκίνη D είχε ως αποτέλεσμα τη συνολική εξάντληση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών στον πυρήνα [9] . Επιπλέον, η ποσοτική πρωτεομική ανάλυση του πυρήνα σε κύτταρα μολυσμένα με αδενοϊό έδειξε μια ήπια μείωση στις ριβοσωμικές πρωτεΐνες [24] . Το εάν αυτό αντικατοπτρίζει μια μετατόπιση στη βιογένεση του ριβοσώματος και/ή μια αλλαγή στη σύνθεση των ριβοσωμικών υπομονάδων παραμένει να προσδιοριστεί. Ωστόσο, η προσαρμοσμένη ανάγκη για αυξημένη παραγωγή ριβοσώματος είναι διαισθητική για ένα σύστημα που πρέπει να υποστηρίξει την αυξημένη ζήτηση για σύνθεση νέων ιικών πρωτεϊνών. Παράλληλα, παρατηρήσαμε την αντίστοιχη διαμόρφωση των μονοπατιών που ρυθμίζουν την ομοιόσταση των πρωτεϊνών. Παρατηρήσαμε τη σημαντική πυρηνική συσσώρευση πολλαπλών μοριακών συνοδών συμπεριλαμβανομένων των HSPs, του συμπλέγματος TCP-1 και των μορίων CANX/CALR και τη διαταραγμένη πυρηνική αφθονία πρωτεϊνών που ανήκουν στην οδό ουβικιτίνης-πρωτεασώματος, η οποία ελέγχει την παροχή ριβοσωμικών πρωτεϊνών [104, 105] . Αυτές οι παρατηρήσεις υποστηρίζουν περαιτέρω προηγούμενες μελέτες που περιγράφουν τη ρύθμιση της πρωτεασωμικής δραστηριότητας από το Tat, οι οποίες επηρεάζουν την έκφραση, τη συναρμολόγηση και τον εντοπισμό συγκεκριμένων υπομονάδων των πρωτεασωμικών συμπλεγμάτων [106, 107, 108, 109, 110, 111, 113]. Παρατηρήσαμε επίσης την ταυτόχρονη μείωση του CASP10 στον πυρήνα του Jurkat TAP-Tat. Έχει προταθεί ότι το CASP10 θα μπορούσε να στοχευτεί στον πυρήνα για να αναστείλει την πρωτεϊνοσύνθεση [154]. Είναι ενδιαφέρον ότι η παρουσία και οι πιθανοί ρόλοι των μοριακών συνοδών στον πυρήνα έχουν τονιστεί από τους Banski et al, οι οποίοι επεξεργάζονται πώς το δίκτυο συνοδών θα μπορούσε να ρυθμίσει τη βιογένεση του ριβοσώματος, τη σηματοδότηση των κυττάρων και την απόκριση στρες [97, 155]. Καθώς η παραγωγή του ιού προχωρά στην όψιμη φάση και το κυτταρικό στρες αυξάνεται, ο πυρηνικός εμπλουτισμός των μοριακών συνοδών από το Tat θα μπορούσε όχι μόνο να επιτρέψει την επαρκή αναδίπλωση των νεοσυντιθεμένων ιικών πρωτεϊνών αλλά θα μπορούσε επίσης να προωθήσει την ανοχή των μολυσμένων κυττάρων στο στρες και να διατηρήσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Συμπτωματικά, παρατηρήσαμε ο έντονος πυρηνικός εμπλουτισμός των ενζύμων που ανήκουν σε μεταβολικές οδούς συμπεριλαμβανομένης της γλυκόλυσης, της φωσφορικής πεντόζης, των βιοσυνθετικών οδών νουκλεοτιδίων και αμινοξέων. Ομοίως, αυτές οι οδοί είναι αυξημένες σε πολλαπλασιαστικά Τ-κύτταρα ή σε καρκινικά κύτταρα μετά από μια μεταβολική στροφή προς αερόβια γλυκόλυση, γνωστή και ως φαινόμενο Warburg [156, 157, 158, 159]. Εκεί, τα ενδιάμεσα γλυκόζης από το μονοπάτι της γλυκόλυσης όχι μόνο δεσμεύονται στην παραγωγή ενέργειας και διασπώνται σε πυροσταφυλικό για τον κύκλο TCA, αλλά ανακατευθύνονται σε εναλλακτικές οδούς, συμπεριλαμβανομένης της οδού φωσφορικής πεντόζης, και χρησιμοποιούνται ως μεταβολικοί πρόδρομοι για την παραγωγή νουκλεοτιδίων, αμινοξέων , ακετυλ CoA και NADPH για ομοιόσταση οξειδοαναγωγής. Με συνέπεια, σημειώσαμε επίσης τον ταυτόχρονο πυρηνικό εμπλουτισμό ενζύμων που ανήκουν στην οδό σύνθεσης νουκλεοτιδίων, συμπεριλαμβανομένου του IMPH2, ενός ενζύμου περιορισμού του ρυθμού που είναι γνωστό ότι ελέγχει τη δεξαμενή GTP. Ομοίως, παρατηρήσαμε τον πυρηνικό εμπλουτισμό του PSAT1, ενός ενζύμου που εμπλέκεται στο μεταβολισμό της σερίνης και της θρεονίνης, το οποίο σχετίζεται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό [160] . Συλλογικά, προτείνουμε ότι με τον έλεγχο της ομοιόστασης των πρωτεϊνών και των μεταβολικών οδών, το Tat θα μπορούσε να καλύψει τόσο την ενεργειακή όσο και τη βιοσυνθετική ζήτηση της παραγωγικής λοίμωξης HIV-1. Σημείωση, ενώ τα ένζυμα μεταβολισμού νουκλεοτιδίων συνδέονται με τον πυρήνα, η γλυκόλυση λαμβάνει χώρα στο κυτταρόπλασμα. Παρόλα αυτά, γλυκολυτικά ένζυμα έχουν ανιχνευθεί τόσο στο πυρηνικό όσο και στο πυρηνικό κλάσμα με πρωτεομικές αναλύσεις [8, 161]. Επιπλέον, γλυκολυτικά ένζυμα, όπως PKM2, LDH, φωσφογλυκερική κινάση, GAPDH και αλδολάση, έχουν επίσης αναφερθεί ότι εμφανίζουν πυρηνικό εντοπισμό και συνδέονται με το DNA [162] . Πιο συγκεκριμένα, το PKM2 είναι γνωστό ότι συνδέεται με τον προαγωγέα και συμμετέχει στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης ως μεταγραφικός συνενεργοποιητής [163]. Το HIV-1 Tat έχει προηγουμένως περιγραφεί ως ανοσορυθμιστής και πιο συγκεκριμένα, έχει αναφερθεί ότι αναστέλλει ή προάγει Σηματοδότηση TCR [164] . Παρατηρήσαμε τον πυρηνικό εμπλουτισμό από το Tat βασικών εγγύς ή κατάντη συστατικών των μονοπατιών σηματοδότησης Τ-κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των ZAP70, ILF3 και STAT3, που παίζουν κρίσιμους ρόλους στην ανάπτυξη και ενεργοποίηση των Τ-κυττάρων. Τα είχαμε προσδιορίσει προηγουμένως ως συστατικά ειδικά για τα Τ-κύτταρα του πυρήνα και οι μελέτες IF πρότειναν ότι η συσχέτισή τους με τον πυρήνα θα μπορούσε να ρυθμιστεί από συγκεκριμένες συνθήκες [165] . Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν περαιτέρω ότι το Tat θα μπορούσε να συμβάλει στη δυσρύθμιση των σημάτων που προέρχονται από TCR και ότι ο πυρήνας θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει έναν σημαντικό χωρικό σύνδεσμο για τα μόρια σηματοδότησης TCR. Παρατηρήσαμε τον συντονισμένο πυρηνικό εμπλουτισμό των βασικών συστατικών των οδών αντιγραφής, ανασυνδυασμού και επιδιόρθωσης του DNA από Πλέκω δαντέλαν. Αυτά περιλαμβάνουν τα XRCC5 και XRCC6, HMGA1, APEX1, MCM2-7, SMC2, RFC1 και RFC2, ενώ το RFC4 βρέθηκε να έχει εξαντληθεί σημαντικά. Είναι ενδιαφέρον ότι αυτοί οι συμπαράγοντες έχουν συσχετιστεί με την αποτελεσματικότητα της ενσωμάτωσης του DNA του ρετροϊού στο DNA του ξενιστή ή με την ακεραιότητα του ενσωματωμένου προϊού [166] . Απομένει να καθοριστεί εάν η αυξημένη αφθονία αυτών των παραγόντων εντός του πυρήνα θα μπορούσε να συσχετιστεί με την πιθανή συμμετοχή τους στην ενσωμάτωση και διατήρηση της ακεραιότητας του γονιδίου του προϊού. εξαρτώνται από τους παράγοντες που είναι εγγενείς για κάθε πρωτεΐνη και τη φύση της σχέσης τους με το Tat, καθώς η υποκυτταρική κλασμάτωση σε συνδυασμό με την ανάλυση WB έδειξε ότι το πρότυπο και η έκταση της υποκυτταρικής ανακατανομής μεταξύ των πρωτεϊνών διέφεραν. Θα μπορούσαμε να παρατηρήσουμε περιπτώσεις όπου το Tat ρύθμισε προς τα πάνω την έκφραση των πρωτεϊνών που είχε ως αποτέλεσμα μια γενική αύξηση αυτών των πρωτεϊνών σε όλα τα κυτταρικά διαμερίσματα συμπεριλαμβανομένου του πυρήνα (DDX3, TNPO1). Εναλλακτικά, το Tat θα μπορούσε να προκαλέσει την πυρηνική μετατόπιση πρωτεϊνών απευθείας από το κυτταρόπλασμα ή το νουκλεόπλασμα (pRb). Επιπλέον, παρατηρήσαμε κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες ανακατανεμημένες τόσο στο νουκλεόπλασμα όσο και στον πυρήνα κατά την έκφραση Tat (STAT3, ZAP70 και HSP90). Τέλος, παρατηρήσαμε επίσης μείωση πρωτεϊνών στο πυρηνικό κλάσμα που συνοδεύεται από αύξηση στο πυρηνόπλασμα (SSRP1). Παραμένει δύσκολο σε αυτό το στάδιο να εκτιμηθεί εάν η συσσώρευση συγκεκριμένων πρωτεϊνών θα είχε ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση ή την αναστολή τους απομονώνοντάς τες μακριά από τη θέση δράσης τους. Αντίθετα, η εξάντληση μιας πρωτεΐνης από τον πυρήνα θα μπορούσε είτε να έχει ως αποτέλεσμα την προς τα κάτω ρύθμιση της δραστηριότητάς της σε αυτή τη θέση είτε θα μπορούσε να είναι αποτέλεσμα της κινητοποίησής της από τη θέση αποθήκευσης, τον πυρήνα, στο πυρηνόπλασμα ή στο κυτταρόπλασμα όπου μπορεί να εκτελέσει λειτουργία. Αξιοσημείωτα, εντοπίσαμε αρκετούς γνωστούς συνεργάτες HIV-1 Tat που εμπλέκονται στην παθογένεση του HIV-1, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο Tat θα μπορούσε να ρυθμίσει φυσικά την πυρηνική στόχευση ή τη στρατολόγησή τους σε συγκεκριμένη θέση στο νουκλεόπλασμα ή στο κυτταρόπλασμα. Το Tat θα μπορούσε επίσης να προωθήσει μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, οι οποίες θα μπορούσαν να μεσολαβήσουν στη στόχευση συγκεκριμένων πρωτεϊνών στον πυρήνα. Αυτό εξηγείται από τις ακόλουθες εμπλουτισμένες πρωτεΐνες, pRb, PP1 και STAT3, για τις οποίες η φωσφορυλίωση προκαλείται από Tat. Είναι σημαντικό ότι η κατάσταση φωσφορυλίωσης τους καθορίζει την υποκυτταρική κατανομή τους, παρέχοντας έτσι έναν πιθανό μηχανισμό για την ανακατανομή τους από το Tat. Επιπλέον, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι οι κινάσες σερίνης/θρεονίνης (CK2 a') και οι φωσφατάσες (PP1) εμπλουτίστηκαν σημαντικά στα πυρηνικά κλάσματα του Jurkat TAP-Tat. Αυτά τα ένζυμα ευθύνονται για το μεγαλύτερο μέρος της δραστηριότητας φωσφορυλίωσης/αποφωσφορυλίωσης στον πυρήνα και μπορούν να λειτουργήσουν ως ρυθμιστές της διακίνησης πυρηνικών πρωτεϊνών. Επιπλέον, το Tat μείωσε σημαντικά τα επίπεδα του SUMO-2 στον πυρήνα. Ομοίως, οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που προκαλούνται από το SUMO είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν τον εντοπισμό της πυρηνικής πρωτεΐνης [104]. Δεδομένης της πιθανής σημασίας των μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων, συμπεριλαμβανομένης της φωσφορυλίωσης στην αλλαγή της αφθονίας των πυρηνικών πρωτεϊνών που προκαλείται από Tat, μια πιο στοχευμένη πρωτεομική προσέγγιση, όπως ο εμπλουτισμός για φωσφοπετίδια, θα επεκτείνει την ανάλυση της προσέγγισής μας διαλογής. είναι επίσης ένα σημαντικό μέσο για τη ρύθμιση της αφθονίας των πυρηνικών πρωτεϊνών. Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες αποικοδομούνται από την οδό Ubiquitin-Proteasome για να διασφαλιστεί ότι η αφθονία τους ταιριάζει με τα επίπεδα μεταγραφής rRNA. Αντίθετα, οι πρωτεΐνες θερμικού σοκ HSP90 τις προστατεύουν από την αποικοδόμηση. Είναι ενδιαφέρον ότι τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η Tat διαμορφώνει την αφθονία των πρωτεϊνών που σχετίζονται με το μονοπάτι Ubiquitin-proteasome και θερμικό σοκ. Αυτό θα μπορούσε να συμβάλει στον παρατηρούμενο εμπλουτισμό ριβοσωμικών πρωτεϊνών από την Tat. Ωστόσο, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ότι η αυξημένη αφθονία ριβοσωμικών πρωτεϊνών στον πυρήνα θα μπορούσε να είναι το αποτέλεσμα της παρεμπόδισης της εξαγωγής τους στο κυτταρόπλασμα με τη μεσολάβηση Tat. Είναι ενδιαφέρον ότι χρησιμοποιώντας ένα διαφορετικό κυτταρικό σύστημα, ένα διαγονιδιακό στέλεχος drosophila melanogaster Tat, οι Ponti et al, ανέλυσαν τις επιδράσεις του Tat στη βιογένεση του ριβοσώματος, μετά από 3 ημέρες επεξεργασίας θερμικού σοκ για να προκληθεί έκφραση Tat υπό τον έλεγχο του προαγωγέα hsp70 [167]. Μετά την έκφραση Tat, παρατήρησαν ένα ελάττωμα στην προ-rRNA επεξεργασία που σχετίζεται με μείωση του επιπέδου των ριβοσωμάτων 80S [167]. Ωστόσο, το διαφορετικό κυτταρικό σύστημα που χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με την επαγωγή θερμοπληξίας 3 ημερών καθιστούν τα αποτελέσματά τους δύσκολο να συγκριθούν με τα δικά μας. Ενώ προηγούμενες μελέτες σε επίπεδο συστήματος έχουν παρακολουθήσει τις επιδράσεις της έκφρασης του HIV-1 Tat στα Τ κύτταρα, από όσο γνωρίζουμε, έχουμε παρουσιάσει Εδώ η πρώτη πρωτεομική ανάλυση της δυναμικής σύνθεσης του πυρήνα σε απόκριση στην έκφραση HIV-1 Tat. Χρησιμοποιώντας ποσοτική πρωτεϊνική, έχουμε υπογραμμίσει τις αλλαγές στην αφθονία συγκεκριμένων πυρηνικών πρωτεϊνών και έχουμε επισημάνει την εκτεταμένη και συντονισμένη πυρηνική αναδιοργάνωση ως απόκριση στη συστατική έκφραση Tat. Τα ευρήματά μας υπογραμμίζουν ότι τα Τ-κύτταρα που εκφράζουν Tat επιδεικνύουν ένα μοναδικό πυρηνικό πρωτεομικό προφίλ, το οποίο μπορεί να αντανακλά μια ιογενή στρατηγική για τη διευκόλυνση της εξέλιξης σε ισχυρή παραγωγή ιών. Είναι σημαντικό ότι σημειώσαμε τη λειτουργική σχέση των πυρηνικών πρωτεϊνών του συνόλου δεδομένων μας με την παθογένεση του HIV-1 και ειδικότερα του HIV-1 Tat. Αυτό αυξάνει περαιτέρω την εμπιστοσύνη μας στην πειραματική στρατηγική μας και υποδηλώνει έναν ρόλο για το Tat στον χωρικό έλεγχο και τον υποκυτταρικό διαχωρισμό αυτών των κυτταρικών συμπαραγόντων. Τελικά, η μελέτη μας παρέχει νέες γνώσεις σχετικά με τη σημασία του Tat στη διασταυρούμενη συζήτηση μεταξύ των πυρηνικών λειτουργιών και της παθογένεσης του ιού. Είναι σημαντικό ότι έχουμε επίσης εντοπίσει αλλαγές στην αφθονία των πυρηνικών πρωτεϊνών που δεν σχετίζονταν προηγουμένως με την παθογένεση του HIV-1, συμπεριλαμβανομένων πρωτεϊνών που σχετίζονται με μεταβολικές οδούς, οι οποίες παρέχουν νέους πιθανούς στόχους και κυτταρικές οδούς για θεραπευτική παρέμβαση.Τ-κύτταρα Jurkat, κλώνος Ε6.1 (ATCC), Jurkat NTAP-Tat και Jurkat NTAP διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% (v/v) εμβρυϊκό βόειο ορό (Gibco, εγκεκριμένο από την ΕΕ) και αντιβιοτικά. Κύτταρα Phoenix-GP (G.P. Nolan; www.stanford.edu/ group/nolan/), διατηρήθηκαν σε μέσο DMEM συμπληρωμένο με 10% (v/v) εμβρυϊκό βόειο ορό (GIBCO, εγκεκριμένο από την ΕΕ). Τα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας μετρητή κυττάρων Scepter TM 2.0 (Millipore). Η αλληλουχία του HIV-1 Tat (HIV-1 HXB2, 86 αμινοξέα) υποκλωνοποιήθηκε σε φορέα pENTR 2B (Invitrogen, Α10463). Χρησιμοποιώντας την τεχνολογία Gateway (Invitrogen), εισαγάγαμε την αλληλουχία HIV-1 Tat στο πλασμίδιο pCeMM-NTAP(GS)-Gw [168]. Κύτταρα Phoenix (G.P. Nolan; www.stanford.edu/group/nolan/), επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Fugene 6 (Roche) με 5 mg του πλασμιδίου NTAP-Tat ή NTAP και 3 mg του pMDG-VSVG. Τα ιικά υπερκείμενα συλλέχθηκαν μετά από 48 ώρες, διηθήθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για τη μεταγωγή των κυτταρικών σειρών Jurkat. Το κατασκεύασμα ονομάζεται NTAP-Tat, το κενό διάνυσμα ονομάστηκε NTAP. Χρησιμοποιώντας ρετροϊική γονιδιακή παράδοση, μεταβιβάσαμε σταθερά κύτταρα Jurkat (κλώνος E6.1 (ATCC)). Οι θετικοί κλώνοι που ονομάζονται Jurkat NTAP-Tat και Jurkat NTAP ταξινομήθηκαν για να εμπλουτίσουν τον πληθυσμό κυττάρων που εκφράζουν GFP χρησιμοποιώντας τον BC MoFlo XDP cell sorter (Beckman Coulter). Τα υποκυτταρικά κλάσματα (10 mg) διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε Μεμβράνες PVDF BioTrace (Pall corporation). Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: a-Tubulin (Sc 5286), C23 (Sc 6013) και Fibrillarin (Sc 25397) ήταν από τη Santa Cruz Biotechnology και PARP (AM30) από την Calbiochem, ποντίκι anti-ZAP 70 (05-253 , Millipore), κουνελιού anti-STAT3 (06-596, Millipore), κουνελιού αντι-ILF3 (ab92355, Abcam), κουνελιού anti-HSP90 beta (ab32568, Abcam), ποντικιού anti-ADAR1 (ab88574, Abcam), κουνελιού αντι- HDAC1 (ab19845, Abcam), κουνελιού anti-SSRP1 (ab21584, Abcam) κουνελιού αντι-BOP1 (ab86982, Abcam), ποντικιού anti-KpNB1 (ab10303, Abcam), κουνελιού anti-HIV-1 Tat (ab43014, Abcam), ραβδί anti-CK2A (ab10466, Abcam), κουνελιού anti-DDX3X (ab37160, Abcam), ποντικιού anti-TNPO1 (ab2811, Abcam), ποντικιού anti-HSP90A (CA1023, MERCK) και rabbit-anti RB1 (sc-102, Santa Cruz). Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα δευτερεύοντα αντισώματα ECL: Anti-mouse IgG και ECL Anti-rabbit IgG (GE Healthcare) και Donkey anti-goat IgG (Sc 2020) (Santa Cruz Biotechnology). Για ανάλυση SILAC SILAC-RPMI R0K0 και Χρησιμοποιήθηκαν μέσα SILAC-RPMI R6K6 (κύτταρα Dundee) συμπληρωμένα με 10% διαπιδυμένο FBS (GIBCO, 26400-036). Τα κύτταρα Jurkat που εκφράζουν NTAP-Tat και NTAP ανακαλύφθηκαν σειριακά και αναπτύχθηκαν για πέντε διπλασιασμούς για να εξασφαλιστεί η πλήρης ενσωμάτωση των σημασμένων αμινοξέων. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ελέγχθηκε με Trypan Blue (διάλυμα 0,4%, SIGMA) και επιβεβαιώθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας χρώση PI και ανάλυση FACS. Τα κύτταρα αναμίχθηκαν σε αναλογία 1:1 για να ληφθούν 140610 6 κύτταρα. Πυρήνες απομονώθηκαν από τον μικτό κυτταρικό πληθυσμό όπως περιγράφηκε προηγουμένως στους Jarboui et al., [165]. Πυρηνικά εκχυλίσματα (100 mg) επαναιωρήθηκαν σε 50 mM διττανθρακικό αμμώνιο και σε διάλυμα θρυψίνης χωνεύτηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως στους Jarboui et al. [165] . Το δείγμα εκτελέστηκε σε ένα φασματόμετρο μάζας Thermo Scientific LTQ ORBITRAP XL συνδεδεμένο με ένα σύστημα χρωματογραφίας Eksigent NANO LC.1DPLUS που ενσωματώνει έναν αυτόματο δειγματολήπτη. Το δείγμα φορτώθηκε σε στήλη Biobasic C18 PicofritTM (μήκος 100 mm, 75 mm ID) και διαχωρίστηκε με αυξανόμενη βαθμίδα ακετονιτριλίου, χρησιμοποιώντας βαθμίδα ανάστροφης φάσης 142 λεπτών (0-40% ακετονιτρίλιο για 110 λεπτά) με ρυθμό ροής 300 nL min-1. Το φασματόμετρο μάζας λειτούργησε σε λειτουργία θετικού ιόντος με τριχοειδική θερμοκρασία 200uC, τριχοειδική τάση 46V, τάση φακού σωλήνα 140V και με δυναμικό 1800 V εφαρμοσμένο στο φριτ. Όλα τα δεδομένα αποκτήθηκαν με το φασματόμετρο μάζας που λειτουργεί σε λειτουργία αυτόματης μεταγωγής εξαρτώμενη από δεδομένα. Πραγματοποιήθηκε σάρωση MS υψηλής ανάλυσης χρησιμοποιώντας το Orbitrap για την επιλογή των 5 πιο έντονων ιόντων πριν από την ανάλυση MS/MS χρησιμοποιώντας την παγίδα ιόντων. Η αποτελεσματικότητα ενσωμάτωσης των επισημασμένων αμινοξέων προσδιορίστηκε με ανάλυση των πεπτιδίων που ταυτοποιήθηκαν σε απομονωμένους πυρήνες από κυτταρικό πληθυσμό που διατηρήθηκε σε μέσο ''Heavy'' όπως περιγράφεται στο [169] . Η ανάλυσή μας έδειξε ότι είχαμε αποτελεσματικότητα ενσωμάτωσης 0,95% (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα φάσματα MS/MS αναζητήθηκαν για ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση πεπτιδίων χρησιμοποιώντας το λογισμικό MaxQuant [170] (έκδοση 1.1.1.36), τη βάση δεδομένων ανθρώπινης IPI (έκδοση 3.83) και η μηχανή αναζήτησης Andromeda που σχετίζεται με το MaxQuant [171] . Χρησιμοποιήθηκαν τυπικές ρυθμίσεις για το MaxQuant με το Acetyl (Protein N-term) ως μεταβλητή τροποποίηση και το Carbamidomethyl (Cys) ως σταθερή τροποποίηση, επιτρέπονται 2 χαμένες διασπάσεις, εκτός από το ότι απαγορεύτηκε το φιλτράρισμα των επισημασμένων αμινοξέων. Η αρχική απόκλιση μάζας των ιόντων πρόδρομων ιόντων και θραυσμάτων ήταν 7 ppm και 0,5 Da, αντίστοιχα. Κάθε αναλογία πρωτεΐνης υπολογίστηκε ως ο σταθμισμένος μέσος όρος των επιμέρους αναλογιών πεπτιδίων. Οι πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν με το ελάχιστο ένα πεπτίδιο με ποσοστό ψευδούς ανακάλυψης μικρότερο από 1%. Η οντολογία γονιδίων, η οδός KEGG και οι όροι Pfam εξήχθησαν από καταχωρήσεις UNIPROT χρησιμοποιώντας το Perseus, ένα λογισμικό από το πακέτο ανάλυσης MaxQuant Data (http://www. maxquant.org ), και τα εργαλεία σουίτας ToppGene [54] . Τα Jurkat NTAP-Tat και Jurkat NTAP επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ηλεκτροδιάτρησης Amaxa (Amaxa biosystem) με το pGL3 (pGL3-LTR) (Promega) όπως συνιστάται από την Amaxa Biosystem. Οι δοκιμές διπλής λουσιφεράσης (Promega) πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η δραστηριότητα της λουσιφεράσης μετρήθηκε και κανονικοποιήθηκε έναντι της συνολικής ποσότητας πρωτεϊνών όπως ποσοτικοποιήθηκε από το κιτ ποσοτικοποίησης πρωτεΐνης BCA (Pierce, Thermo Scientific). Για να διατηρήσουμε το αρχικό τους σχήμα, πραγματοποιήσαμε ανοσοχρώση των κυττάρων Jurkat σε εναιώρημα. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε 2% PFA για 10 λεπτά σε RT, διαπερατήθηκαν σε 0,5% Triton X-100 για 15 λεπτά σε RT και μπλοκαρίστηκαν με 5% FCS. Τα κύτταρα επωάστηκαν με το αντίσωμα HIV-1 Tat κουνελιού (ab43014, Abcam) ακολουθούμενο από το δευτερεύον αντίσωμα αντι-Κουνελιού alexa fluor 647 (Α-21246, Invitrogen). Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν σε επικαλυμμένα με Cell-Tak (BD) Silanised Slides (DaoCytomation) και χρωματίστηκαν με DAPI. Οι εικόνες καταγράφηκαν με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο Carl Zeiss εξοπλισμένο με αντικειμενικό DIC λαδιού Plan-Apochromat 63X/1.4. Το αρχείο δεδομένων RAW της πρωτεωμικής από την ανάλυση φασματομετρίας μάζας κατατέθηκε στο αποθετήριο Tranche (https:// proteomecommons.org/tranche/) [172] . Μπορείτε να αποκτήσετε πρόσβαση και να λάβετε το αρχείο χρησιμοποιώντας το ακόλουθο κλειδί κατακερματισμού:(R3O5SV5Z6HvWqrBNDhp21tXFetluDWYxvwMIfU-h6e1kMgarauCSq4dlNcxeUvFOHDEzLeDcg4X5Y8reSb6-MUA6wM1kIAAA = MUA6wM1kIAAA = MUA6wM1kIAAA). Υλικά και Μέθοδοι S1 Περιγραφή των μεθόδων που χρησιμοποιούνται για την εξέταση του κυτταρικού κύκλου, της βιωσιμότητας των κυττάρων και της ανάλυσης κυτταρικού πολλαπλασιασμού. (DOCX)", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 2921, "text": "πυρήνας" } ], "id": 5131, "question": "Πού δημιουργούνται το rRNA και τα ριβοσώματα;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6781, "text": "49" } ], "id": 5132, "question": "Πόσες πρωτεΐνες αποδείχθηκε ότι αλλάζουν σημαντικά την ποσότητα του πυρήνα των Τ-κυττάρων Jurkat;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5054, "text": "HIV-1, hCMV, HSV και KSHV" } ], "id": 5134, "question": "Ποιοι ιοί στοχεύουν τον πυρήνα ως μέρος της στρατηγικής αντιγραφής τους;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5870, "text": "Β23" } ], "id": 5135, "question": "Ποιο πυρηνικό αντιγόνο είναι απαραίτητο για τον εντοπισμό των πρωτεϊνών Tat και Rev;" }, { "answers": [ { "answer_start": 35837, "text": "85 εκατ" } ], "id": 5140, "question": "Πόσα κύτταρα συλλέχθηκαν από κάθε καλλιέργεια;" }, { "answers": [ { "answer_start": 11622, "text": "113 kDa" } ], "id": 5141, "question": "Πόσο διαρκεί η πυρηνική πρωτεΐνη PARP-1;" }, { "answers": [ { "answer_start": 11751, "text": "50 kDa" } ], "id": 5142, "question": "Πόσο διαρκεί η πρωτεΐνη Άλφα-τουμπουλίνη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 36929, "text": "πυρηνικός" } ], "id": 5144, "question": "Πού βρέθηκε λιγότερο άφθονη η άλφα τουμπουλίνη στο κύτταρο;" }, { "answers": [ { "answer_start": 12417, "text": "Ο πλήρης σχολιασμένος κατάλογος των ποσοτικοποιημένων πυρηνικών πρωτεϊνών" } ], "id": 5145, "question": "Τι φαίνεται στον Πίνακα S1;" }, { "answers": [ { "answer_start": 129, "text": "49" } ], "id": 5147, "question": "Πόσες πρωτεΐνες εμφάνισαν σημαντική αλλαγή πτυχής;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Ανάλυση αλληλεπίδρασης της νουκλεοπρωτεΐνης του ιού της λεμφοκυτταρικής χοριομηνιγγίτιδας σε μολυσμένα κύτταρα αποκαλύπτει την υπομονάδα μεταφοράς ATPase Na(+)/K(+) και την απαγορευτική ουσία ως παράγοντες του κυττάρου ξενιστή που εμπλέκονται στον κύκλο ζωής των ιών θηλαστικών https://www.ncbi.nlm.nih .gov/pmc/articles/PMC5834214/SHA: efbd0dfc426da5dd25ce29411d6fa37571623773Συγγραφείς: Iwasaki, Masaharu; Minder, Petra; Caì, Yíngyún; Kuhn, Jens Η.; Yates, John R.; Torbett, Bruce E.; de la Torre, Juan C. Ημερομηνία: 2018-02-20DOI: 10.1371/journal.ppat.1006892 Άδεια: cc0Abstract: Αρκετοί αρενοϊοί θηλαστικών (mammarenaviruses) προκαλούν αιμορραγικούς πυρετούς στους ανθρώπους και δημιουργούν σοβαρές ενδημικές ανησυχίες για τη δημόσια υγεία τους. Επιπλέον, αυξανόμενα στοιχεία υποδεικνύουν ότι ο παγκοσμίως κατανεμημένος, πρωτότυπος ιός θηλαστικών, ο ιός της λεμφοκυτταρικής χοριομηνιγγίτιδας (LCMV), είναι ένα παραμελημένο ανθρώπινο παθογόνο κλινικής σημασίας. Οι ανησυχίες για τους ανθρωποπαθογόνους ιούς θηλαστικών επιδεινώνονται λόγω της έλλειψης αδειοδοτημένων εμβολίων και η τρέχουσα θεραπεία κατά του ιού των θηλαστικών περιορίζεται στη χρήση ριμπαβιρίνης εκτός σήμανσης που είναι μόνο μερικώς αποτελεσματική. Η λεπτομερής κατανόηση των αλληλεπιδράσεων ιού/κυττάρου ξενιστή μπορεί να διευκολύνει την ανάπτυξη νέων στρατηγικών κατά του θηλαστικού ιού στοχεύοντας συστατικά του μηχανισμού κυττάρου ξενιστή που απαιτούνται για τον αποτελεσματικό πολλαπλασιασμό του ιού. Εδώ τεκμηριώνουμε τη δημιουργία ενός ανασυνδυασμένου LCMV που κωδικοποιεί μια νουκλεοπρωτεΐνη (NP) που περιέχει μια ετικέτα συγγένειας (rLCMV/Strep-NP) και τη χρήση του για τη σύλληψη της αλληλεπίδρασης NP σε μολυσμένα κύτταρα. Η πρωτεομική μας προσέγγιση σε συνδυασμό με δοκιμές γενετικής και φαρμακολογικής επικύρωσης προσδιόρισε την ΑΤΡάση Na(+)/K(+) που μεταφέρει την υπομονάδα άλφα 1 (ATP1A1) και την απαγορευτική (PHB) ως προ-ιικούς παράγοντες. Οι κυτταρικές δοκιμασίες αποκάλυψαν ότι το ATP1A1 και το PHB εμπλέκονται σε διαφορετικά στάδια του κύκλου ζωής του ιού. Αντίστοιχα, παρατηρήσαμε μια συνεργική ανασταλτική επίδραση στον πολλαπλασιασμό του LCMV με έναν συνδυασμό αναστολέων ATP1A1 και PHB. Δείχνουμε ότι οι αναστολείς ATP1A1 καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό του ιού Lassa και του Candid#1, ενός ζωντανού εξασθενημένου στελέχους εμβολίου του ιού Junín, υποδηλώνοντας ότι η απαίτηση του ATP1A1 στον πολλαπλασιασμό του ιού διατηρείται μεταξύ των γενετικά απομακρυσμένων ιών θηλαστικών. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι οι κλινικά εγκεκριμένοι αναστολείς του ATP1A1, όπως η διγοξίνη, θα μπορούσαν να επαναχρησιμοποιηθούν για τη θεραπεία λοιμώξεων από ιούς θηλαστικών παθογόνων για τον άνθρωπο. Η εισβολή σε ανθρώπινες κατοικίες από μολυσμένα τρωκτικά μπορεί να οδηγήσει σε ανθρώπινες λοιμώξεις μέσω έκθεσης του βλεννογόνου σε αερολύματα ή με άμεση επαφή του γδαρμένου δέρματος με μολυσματικό υλικό. Αρκετοί ιοί θηλαστικών προκαλούν ιογενείς αιμορραγικούς πυρετούς (VHF) στους ανθρώπους και θέτουν σημαντικά προβλήματα δημόσιας υγείας στις ενδημικές περιοχές τους [2] [3] [4] [5] [6] . Οι Mammarenaviruses ταξινομούνται σε δύο κύριες ομάδες, τον Παλαιό Κόσμο (OW) και τον Νέο Κόσμο (NW) [1] . Ο ιός OW Lassa (LASV), αιτιολογικός παράγοντας του πυρετού Lassa (LF), είναι το πιο σημαντικό παθογόνο θηλαστικού ιού OW. Ο LASV υπολογίζεται ότι μολύνει αρκετές εκατοντάδες χιλιάδες άτομα ετησίως στη Δυτική Αφρική, με αποτέλεσμα μεγάλο αριθμό περιπτώσεων LF που σχετίζονται με υψηλή νοσηρότητα και θνησιμότητα. Επιπλέον, οι ενδημικές περιοχές του LASV επεκτείνονται [7] και η συσχέτιση του πρόσφατα ταυτοποιημένου ιού θηλαστικού ιού Lujo με ξέσπασμα VHF στη Νότια Αφρική [8, 9] έχει εγείρει ανησυχίες σχετικά με την εμφάνιση νέων θηλαστικών ιών που προκαλούν VHF. Ο πιο σημαντικός ιός θηλαστικών ΒΔ είναι ο ιός Junín (JUNV), ο οποίος προκαλεί τον αργεντίνικο αιμορραγικό πυρετό [10] . Ο παγκοσμίως κατανεμημένος ιός λεμφοκυτταρικής χοριομηνιγγίτιδας του θηλαστικού OW (LCMV) είναι ένα παραμελημένο ανθρώπινο παθογόνο κλινικής σημασίας ειδικά σε συγγενείς λοιμώξεις [11] [12] [13] [14] [15] . Επιπλέον, ο LCMV αποτελεί ιδιαίτερη απειλή για τα ανοσοκατεσταλμένα άτομα, όπως έχει καταδειχθεί από θανατηφόρες περιπτώσεις μόλυνσης από LCMV που σχετίζονται με μεταμοσχεύσεις οργάνων [16, 17] . Ωστόσο, η έρευνα LCMV μπορεί να πραγματοποιηθεί με ασφάλεια σε περιορισμό BSL-2, αντί για περιορισμό BSL-4 που είναι απαραίτητος για ζωντανή έρευνα LASV ή JUNV [18] . Δεν διατίθενται εμβόλια εγκεκριμένα από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων των ΗΠΑ (FDA) για τη θεραπεία οι λοιμώξεις από αρεναϊό, αν και ένα ζωντανό εξασθενημένο στέλεχος εμβολίου του JUNV, Candid#1, έχει άδεια στην Αργεντινή. Ομοίως, η τρέχουσα θεραπεία κατά του μαμαρεναϊού περιορίζεται σε μια εκτός ετικέτας χρήση του νουκλεοσιδικού αναλόγου ριμπαβιρίνης που είναι μόνο μερικώς αποτελεσματική και μπορεί να προκαλέσει σημαντικές παρενέργειες [19] [20] [21] . Η ανάπτυξη αποτελεσματικών φαρμάκων κατά του θηλαστικού ιού έχει παρεμποδιστεί από την έλλειψη λεπτομερούς κατανόησης των αλληλεπιδράσεων ιού/κυττάρου-ξενιστή που απαιτούνται για τον πολλαπλασιασμό του ιού θηλαστικού που θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν επιδεκτικούς στόχους για αντιική θεραπεία. το πιθανό πρόβλημα ότι η υπερέκφραση ενός προϊόντος μεμονωμένου ιικού γονιδίου μπορεί να ενισχύσει τις αλληλεπιδράσεις PPI που δεν είναι σχετικές κατά τη διάρκεια μιας φυσικής μόλυνσης από ιό. Για να ξεπεραστεί αυτό το ζήτημα, σχεδιάσαμε ένα ανασυνδυασμένο LCMV (rLCMV) που κωδικοποιεί μια σειρά στρεπτόκοκκου [WSHPQFEK (GGGS) 3 WSHPQFEK] συντηγμένη με το αμινοτελικό άκρο του NP (rLCMV/Strep-NP) (Εικ. 1A και 1B) . Για να διευκολυνθεί η αναγνώριση ειδικών PPI μεταξύ των πρωτεϊνών του NP και των πρωτεϊνών του κυττάρου ξενιστή, χρησιμοποιήσαμε την πλατφόρμα τριών τμημάτων του ιού θηλαστικού (r3) [30] για να σχεδιάσουμε μια r3LCMV που εκφράζει μια έκδοση C-τελικού Strep-tag ενισχυμένης πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (r3LCMV/eGFP -Strep) που χρησιμοποιήσαμε ως αρνητικό μάρτυρα (Εικ. 1Α και 1Β) . Διασώσαμε τα rLCMV/Strep-NP και r3LCMV/eGFP-Strep και επιβεβαιώσαμε την έκφραση των NP και eGFP με επισήμανση strep σε κύτταρα μολυσμένα με rLCMV/Strep-NP και r3LCMV/eGFP-Strep, αντίστοιχα (Εικόνα 1C). Στη συνέχεια, εξετάσαμε τις ιδιότητες ανάπτυξης των rLCMV/Strep-NP και r3LCMV/eGFP-Strep σε τρεις διαφορετικές κυτταρικές σειρές από χάμστερ, ανθρώπους και πρωτεύοντα μη ανθρώπινα (κύτταρα BHK-21, A549 και Vero E6, αντίστοιχα) (Εικόνα 1D) . Η καταλληλότητα των rLCMV/Strep-NP και r3LCMV/eGFP-Strep ήταν μέτρια μειωμένη σε σύγκριση με αυτή που παρατηρήθηκε με στελέχη LCMV άγριου τύπου (WT) Armstrong (rLCMV ARM) και κλώνου 13 (rLCMV Cl-13). Ωστόσο, τόσο το rLCMV/Strep-NP όσο και το r3LCMV/eGFP-Strep είχαν κινητικές ανάπτυξης τύπου WT και έφτασαν σε υψηλούς τίτλους. Όπως και με το WT LCMV, η μόλυνση με rLCMV/Strep-NP εμπόδισε την παραγωγή βιοδραστικής IFN-I από κύτταρα ως απόκριση στη μόλυνση από τον ιό Sendai (SeV), όπως προσδιορίστηκε με τη χρήση βιοπροσδιορισμού IFN που βασίζεται στην προστασία έναντι του κυτταροπαθητικού αποτελέσματος (CPE) που προκαλείται από μόλυνση με ιός φυσαλιδώδους στοματίτιδας (VSV) (Εικ. 1Ε) . Κύτταρα Vero που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 16 ώρες με υπερκείμενα ιστοκαλλιεργημένα (TCS) από κύτταρα A549 που μολύνθηκαν πρώτα με WT LCMV ή rLCMV/Strep, ακολουθούμενα από μόλυνση 24 ωρών με SeV, παρέμειναν πλήρως ευαίσθητα σε CPE που προκαλείται από VSV. Αντίθετα, κύτταρα Vero που υποβλήθηκαν σε αγωγή με TCS από κύτταρα A549 μολυσμένα με rLCMV/NP(D382A), ένα μετάλλαγμα που δεν μπορεί να αποτρέψει την επαγωγή της IFN-I [30], και στη συνέχεια με SeV, προστατεύτηκαν έναντι CPE που προκαλείται από VSV. Επιλέξαμε τον άνθρωπο Κυτταρική σειρά A549 επειδή τα επιθηλιακά κύτταρα του πνεύμονα είναι ένας από τους αρχικούς κυτταρικούς στόχους του ανθρώπου μετά από εισπνοή θηλαστικών ιόντων. Μολύναμε κύτταρα A549 (πολλαπλότητα μόλυνσης [MOI] = 0,1) είτε με rLCMV/Strep-NP είτε με r3LCMV/eGFP-Strep (Εικ. 2Α). Στις 48 ώρες μετά τον εμβολιασμό (pi), παρασκευάσαμε ολικά κυτταρολύματα για αναλύσεις pull-down (PD) χρησιμοποιώντας ρητίνη σεφαρόζης επικαλυμμένη με στρεπ-τακτίνη. Δείγματα των πρωτεϊνικών συμπλοκών που υπάρχουν στα δείγματα PD κλασματοποιήθηκαν με ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) (Σχήμα 2Β) και ακολούθησε χρώση με πηκτή πρωτεΐνης SYPRO Ruby. Συγκρίναμε το μοτίβο των ζωνών χρωματισμένων πρωτεϊνών που ανιχνεύθηκαν μεταξύ δειγμάτων μολυσμένων με rLCMV/Strep-NP-και r3LCMV/eGFP και επιβεβαιώσαμε την παρουσία Strep-NP και eGFP-Strep σε σχετικά δείγματα (Σχήμα 2Β) . Τα πρωτεϊνικά σύμπλοκα στα υπόλοιπα εκλούσματα από τα δείγματα PD συμπυκνώθηκαν με καθίζηση με τριχλωροξικό οξύ (TCA) και υποβλήθηκαν σε πέψη με θρυψίνη (Σχήμα 2Α). Τα πεπτίδια που είχαν υποστεί πέψη υποβλήθηκαν σε ανάλυση υγρής χρωματογραφίας-διαδοχικής φασματομετρίας μάζας (LC-MS/MS) χρησιμοποιώντας ένα υβριδικό φασματόμετρο μάζας που αποτελείται από γραμμική τετραπολική παγίδα διπλών κυττάρων ιόντων (LTQ) Velos και έναν αναλυτή Orbitrap. Ταξινομήσαμε πρωτεΐνες κυττάρου ξενιστή που ταυτοποιήθηκαν με LC -Ανάλυση MS/MS από δύο ανεξάρτητα βιολογικά αντίγραφα σε δύο ομάδες: 1) πρωτεΐνες που βρέθηκαν μόνο σε δείγματα Strep-NP PD με τουλάχιστον πέντε φασματικές μετρήσεις (Πίνακας 1) και 2) πρωτεΐνες που βρέθηκαν τόσο σε Strep-NP όσο και σε eGFP-Strep Δείγματα PD με πέντε ή υψηλότερες φασματικές μετρήσεις σε δείγματα Strep-NP και τουλάχιστον 2 φορές υψηλότερες φασματικές μετρήσεις σε Strep-NP PD σε σύγκριση με δείγματα PD eGFP (Πίνακας 2). Το φιλτράρισμα των δεδομένων χρησιμοποιώντας αυτά τα κριτήρια οδήγησε στην ταυτοποίηση 139 υποψήφιων πρωτεϊνών κυττάρου ξενιστή ως συνεργατών που αλληλεπιδρούν με NP. Μεταξύ 53 πρωτεϊνών που βρέθηκαν σε δείγματα NP-και eGFP-PD, 36 είχαν φασματικές μετρήσεις στο δείγμα NP-PD που ήταν λιγότερο από δύο φορές υψηλότερες από τις αντίστοιχες φασματικές μετρήσεις τους στο δείγμα eGFP-PD (Σχήμα 2C και Πίνακας S1 ) . Με βάση τα κριτήρια που περιγράψαμε παραπάνω, θεωρήσαμε αυτές τις πρωτεΐνες ως εξαιρετικά απίθανους ειδικούς NPinteractors με εμπλοκή στον κύκλο ζωής του LCMV και επομένως δεν λάβαμε υπόψη αυτές τις επιτυχίες για περαιτέρω ανάλυση. Ωστόσο, αναγνωρίζουμε ότι δεν μπορούμε επισήμως να αποκλείσουμε ότι ορισμένες από αυτές τις επιτυχίες θα μπορούσαν να διαδραματίσουν ακόμα ρόλο στον κύκλο ζωής του LCMV. Ο σχολιασμός πρωτεΐνης μέσω της ταξινόμησης οικογένειας πρωτεϊνών της εξελικτικής σχέσης (PANTHER) (Βιολογική διαδικασία) των υποψηφίων πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με NP αποκάλυψε ότι ένας μεγάλος αριθμός πρωτεϊνών εμπλέκεται σε μεταβολικές και κυτταρικές διεργασίες (Εικόνα 2D). Αναλύσαμε επίσης τις μοριακές λειτουργίες των υποψήφιων πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με NP σύμφωνα με την ταξινόμηση προφίλ πρωτεΐνης PAN-THER (Εικόνα 2Ε), η οποία αποκάλυψε διαφοροποιημένες βιοχημικές λειτουργίες εμπλουτισμένες για πρωτεΐνες και συνοδούς που δεσμεύουν νουκλεϊκό οξύ. ιικοί ρόλοι πρωτεϊνών κυττάρου-ξενιστή που αλληλεπιδρούν με NP που ταυτοποιήθηκαν με LC-MS/MS, εξετάσαμε την επίδραση της μικρής παρεμβολής από RNA (siRNA) εξουδετέρωσης (kd) καθενός από τα αντίστοιχα γονίδια στον πολλαπλασιασμό του γονιδίου αναφοράς που εκφράζει rLCMV ZsGreen ( ZsG) σε κύτταρα Α549 (Σχήμα 3Α). Τα siRNA που χρησιμοποιήσαμε ήταν από τη βιβλιοθήκη ανθρώπινου siRNA ON TARGET-Plus (OTP) σε όλο το γονιδίωμα (18.301 γονίδια, 4 siRNA/γονίδιο). Τα OTP είναι τελευταίας γενιάς siRNA και προσφέρουν σημαντικά πλεονεκτήματα σε σχέση με τις προηγούμενες γενιές. Οι επιδράσεις εκτός στόχου οφείλονται κυρίως στη δραστηριότητα σπόρων που μοιάζει με αντιπληροφοριακό κλώνο microRNA (miR). Στα OTP, η νοηματική έλικα τροποποιείται για να ευνοήσει την πρόσληψη αντιπληροφοριακού κλώνου ενώ η αντιπληροφοριακή περιοχή σπόρων κλώνου τροποποιείται για να μειώσει δραστικά τη μη στόχευση που σχετίζεται με τους σπόρους [33] . Επιπλέον, τα OTP έχουν σχεδιαστεί με βάση τον αλγόριθμο SMARTselection (Dharmacon), που θεωρείται ευρέως ως ο καλύτερος αλγόριθμος για ορθολογική στρατηγική σχεδίασης siRNA. Πολυάριθμοι παράγοντες του κυττάρου ξενιστή έδειξαν δράση κατά του LCMV (αύξηση της έκφρασης ZsG κατά kd των γονιδίων), συμπεριλαμβανομένης της πρωτεΐνης 1B (MAP1B) που σχετίζεται με μικροσωληνίσκους [38], του ιού του δάγγειου πυρετού 2 (DENV-2) [39] και του chikungunya ιός (CHIKV) [40] .Για να ξεκινήσουμε την αξιολόγηση των πιθανών βιολογικών επιπτώσεων των αναγνωρισμένων αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης κυττάρου ξενιστή NP, επιλέξαμε τα ATP1A1 και PHB δεδομένης της διαθεσιμότητας αντιδραστηρίων, της υπάρχουσας γνώσης σχετικά με τους ρόλους τους στην κυτταρική φυσιολογία και των στοιχείων συμμετοχής σε πολλαπλασιασμό άλλων ιών. Επιβεβαιώσαμε ότι κύτταρα που διαμολύνθηκαν με siRNA ειδικά για ATP1A1 και PHB εμφάνισαν τα προβλεπόμενα μειωμένα επίπεδα στην έκφραση της πρωτεΐνης ATP1A1 και PHB (Εικόνα 3Β). Ομοίως, εξετάσαμε εάν τα μειωμένα επίπεδα έκφρασης του ZsGreen με τη μεσολάβηση siRNA συσχετίστηκαν με μειωμένους τίτλους απογόνων LCMV. Για αυτό, επιμολύναμε κύτταρα Α549 με στόχευση siRNA Έκφραση πρωτεϊνών με επισήμανση Strep. Κύτταρα Α549 που σπάρθηκαν (5,0 χ 105 κύτταρα/φρεάτιο) σε ένα τρυβλίο 6 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύχτα, μολύνθηκαν (ΜΟΙ = 0,1) με τα υποδεικνυόμενα rLCMVs. Στις 48 ώρες pi, παρασκευάστηκαν ολικά κυτταρολύματα και η έκφραση πρωτεΐνης αναλύθηκε με στύπωμα western. (Δ) Αυξητικές ιδιότητες πρωτεϊνών με επισήμανση Strep που εκφράζουν rLCMV. Μολύνθηκαν κύτταρα BHK-21 (1,75 x 105 κύτταρα/φρεάτιο), A549 (1,25 x 105 κύτταρα/φρεάτιο) ή Vero E6 (1,25 x 105 κύτταρα/φρεάτιο) σε πλάκες 24 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν (ΜΟΙ = 0,01) με τα υποδεικνυόμενα rLCMV. Στους υποδεικνυόμενους χρόνους pi, συλλέχθηκαν TCS και προσδιορίστηκαν οι τίτλοι του ιού με IFFA. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο ± SD των αποτελεσμάτων τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Ε) Έλλειψη επαγωγής IFN-I σε κύτταρα μολυσμένα με rLCMV/Strep-NP. Τα κύτταρα Α549 μολύνθηκαν (MOI = 0,1) με το υποδεικνυόμενο rLCMV ή μολύνθηκαν ψευδώς και 36 ώρες αργότερα μολύνθηκαν με SeV (MOI = 1). Στις 24 ώρες pi με SeV, συλλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν TCS, μετά την απενεργοποίηση του ιού με U.V., για τη θεραπεία των κυττάρων Vero E6 για 16 ώρες, ακολουθούμενη από μόλυνση με rVSV (MOI = 0,1) [rVSV(+)] ή ψευδή μόλυνση [rVSV (- ) ]. Στις 24 ώρες pi με rVSV, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% PFA και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες για να εκτιμηθεί το επαγόμενο από rVSV κυτταροπαθητικό αποτέλεσμα. Χρησιμοποιήσαμε ως έλεγχο το rLCMV/NP(D382A) που περιέχει τη μετάλλαξη D382A εντός του NP, η οποία έχει αποδειχθεί ότι καταργεί την ικανότητα του NP να εξουδετερώνει την επαγωγή παραγωγής IFN-I.https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 1006892.g001 ATP1A1 ή με NC siRNA 72 ώρες πριν από τη μόλυνση με rLCMV/ZsG. Βρήκαμε ότι η μεσολαβούμενη από siRNA kd του ATP1A1 ανέστειλε δραματικά την έκφραση ZsGreen (Εικ 3Ci), η οποία συσχετίστηκε με σημαντική μείωση των μολυσματικών απογόνων LCMV (Εικ. 3Cii). Οι προσπάθειές μας να δούμε την αλληλεπίδραση μεταξύ NP και ATP1A1 ή NP και PHB με συν-ανοσοκαθίζηση ήταν ανεπιτυχείς. Πολλές πιθανότητες θα μπορούσαν να εξηγήσουν αυτό, συμπεριλαμβανομένων των αλληλεπιδράσεων χαμηλής συγγένειας ή υψηλού ρυθμού ενεργοποίησης/απενεργοποίησης ή και των δύο. Μια άλλη θεώρηση είναι ότι μόνο ένα μικρό κλάσμα NP μπορεί να εμπλέκεται στην αλληλεπίδραση με μια δεδομένη πρωτεΐνη κυττάρου ξενιστή, και επομένως, η ανίχνευση αυτών των αλληλεπιδράσεων θα απαιτούσε πολύ ευαίσθητες μεθόδους όπως LC-MS/MS. Για να ξεπεράσουμε αυτό το πρόβλημα χρησιμοποιήσαμε συνεστιακή μικροσκοπία για να εξετάσουμε τον συνεντοπισμό της NP με ATP1A1 και PHB σε κύτταρα μολυσμένα με LCMV. Οι σταθμισμένοι συντελεστές συνεντοπισμού (CC), που προσδιορίστηκαν λαμβάνοντας υπόψη τη φωτεινότητα του σήματος κάθε καναλιού, ήταν σημαντικά υψηλότεροι από το μη σταθμισμένο CC, υποδεικνύοντας την παρουσία φωτεινότερων pixel στις συνεντοπισμένες περιοχές σε σύγκριση με τις μη συνεντοπισμένες περιοχές περιοχές (Εικόνα 4) .Η καρδιακή γλυκοσίδη ouabain είναι ένας αναστολέας του ATP1A1 που έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία της συμφορητικής καρδιακής ανεπάρκειας στις ευρωπαϊκές χώρες [41] . Ο αναστολέας PHB rocaglamide είναι μια φλαβαγλίνη από ένα δέντρο Aglaia που χρησιμοποιείται στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική [42] που έχει ισχυρή αντικαρκινική δράση [43] . Για να εξετάσουμε εάν η φαρμακολογική αναστολή του ATP1A1 ή του PHB ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό του LCMV, προηγουμένως προηγηθήκαμε σε ανθρώπινα (A549 και HEK 293T), μη ανθρώπινα πρωτεύοντα (Vero E6) και τρωκτικών (ποντικού L929 και χάμστερ BHK-21) με ουαμπαϊνη ή ροκαλαμίδη και τα μολύναμε με rLCMV/eGFP (S1 Σχήμα). Η θεραπεία με ουαμπαϊνη είχε ως αποτέλεσμα μια ισχυρή δοσοεξαρτώμενη αναστολή της έκφρασης eGFP σε μολυσμένα κύτταρα πρωτευόντων ανθρώπου και μη, αλλά δεν επηρέασε την ένταση έκφρασης eGFP σε μολυσμένα κύτταρα τρωκτικών (Σχήμα S1A). Αυτό το εύρημα είναι σύμφωνο με τα τρωκτικά που εκφράζουν ένα αλληλόμορφο ATP1A1 που είναι ανθεκτικό στην αναστολή της ουαμπαϊνης [44] . Ομοίως, παρατηρήσαμε μια δοσοεξαρτώμενη αναστολή της ροκαγλαμίδης της έκφρασης eGFP σε όλες τις κυτταρικές σειρές που έχουν μολυνθεί με rLCMV/eGFP (Σχήμα S1B). Σύμφωνα με αυτά τα ευρήματα, η παραγωγή μολυσματικών απογόνων LCMV μειώθηκε με θεραπεία είτε με ουαμπαϊνη είτε με ροκαγλαμίδη (Εικ. 5Α) εντός ενός εύρους συγκεντρώσεων που είχε ελάχιστη επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων (Εικ. 5Β). Για να εξετάσουμε τη συσχέτιση μεταξύ αποτελεσματικότητας και κυτταροτοξικότητας αυτών των ενώσεων, προσδιορίσαμε τον θεραπευτικό τους δείκτη (TI = CC 50 /IC 50 (Εικ. 5Bi). ενώ η ροκαγλαμίδη είχε TI >105 (CC 50 > 1000 nM, IC 50 = 9,51 nM) και 10,3 (CC 50 = 100 nM, IC 50 = 9,75 nM) στα κύτταρα A549 και Vero E6, αντίστοιχα) (Εικ. Επιπλέον, ο αναστολέας ανταγωνιστής ATP1A1, η βουφαλίνη, εμφάνισε επίσης ισχυρή αντι-LCMV δράση με TIs 8,92 (CC 50 Heat shock protein HSP 90-alpha HSP90AA1 P07900 8 10 9Endoplasmin HSP90B1 Saminoge ουδέτερο 650L 650L. 12 9Κερατίνη, τύπος II επιδερμιδική Hb1 KRT81 Q14533 10 8 9Εικαζόμενη ελικάση MOV-10 MOV10 Q9HCE1 8 10 9Πρωτεΐνη σχετιζόμενη με μικροσωληνίσκους 1B MAP1B P46821 6 11 8,5M ειδική υποστήριξη (σχέδιο 8,5M) Δραστηριότητα LCMV της ουαμπαϊνης και της ροκαγλαμίδης που δεν οφειλόταν σε μειωμένη κυτταρική βιωσιμότητα. Για να αποκτήσουμε γνώσεις σχετικά με τους μηχανισμούς με τους οποίους η ουαμπαϊνη και η ροκαγλαμίδη ασκούν την αντι-LCMV δράση τους, εξετάσαμε τις επιδράσεις αυτών των ενώσεων σε διαφορετικά στάδια του κύκλου ζωής του LCMV. Αρχικά, ρωτήσαμε εάν η ουαμπαϊνη και η ροκαγλαμίδη επηρέασαν την κυτταρική είσοδο του LCMV. Διεξάγαμε πειράματα χρόνου προσθήκης στα οποία θεραπεύσαμε κύτταρα με ουαμπαϊνη ή ροκαγλαμίδη πριν από τον εμβολιασμό του ιού (-1,5 ώρα), τη στιγμή του εμβολιασμού (0 ώρα) ή 1,5 ώρα pi (+1,5 ώρα) (Εικ. 6Α) Σε ορισμένα δείγματα, χρησιμοποιήσαμε χλωριούχο αμμώνιο ξεκινώντας από 4 ώρες pi για να αποκλείσουμε πολλαπλούς γύρους μόλυνσης από τον ιό. Ο χρονισμός της προσθήκης ένωσης δεν άλλαξε σημαντικά τον αριθμό των θετικών σε eGFP κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι ούτε η ουαμπαϊνη ούτε η ροκαγλαμίδη ανέστειλαν την κυτταρική είσοδο του LCMV. Ο αριθμός των κυττάρων eGFP + σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ouabain μειώθηκε σε όλα τα σημεία του χρόνου προσθήκης σε σύγκριση με τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), αλλά ήταν παρόμοιος με αυτόν που παρατηρήθηκε σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με χλωριούχο αμμώνιο. Έτσι, η ouabain δεν ανέστειλε την αντιγραφή LCMV RNA και την έκφραση γονιδίου, αλλά μάλλον ένα καθυστερημένο στάδιο του κύκλου ζωής του LCMV. Αντίθετα, η θεραπεία με ροκαγλαμίδη είχε ως αποτέλεσμα έναν αμελητέο αριθμό κυττάρων eGFP +, υποδεικνύοντας ότι η ροκαγλαμίδη ανέστειλε την αντιγραφή του RNA του ιού και τη γονιδιακή μεταγραφή. μολυσματικό LCMV που εκφράζει eGFP (rLCMVΔGPC/eGFP) και κύτταρα που έχουν υποστεί αγωγή είτε με ουαμπαϊνη είτε με ροκαγλαμίδη. Εβδομήντα δύο ώρες αργότερα, προσδιορίσαμε το ποσοστό κανονικοποιημένης έκφρασης eGFP σε μολυσμένα κύτταρα (Εικ. 6Β). Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας από το πείραμα χρόνου προσθήκης, το ouabain δεν επηρέασε την έκφραση eGFP του ανταποκριτή. Ωστόσο, η ροκαγλαμίδη μείωσε την έκφραση του eGFP, επιβεβαιώνοντας την ανασταλτική δράση της ροκαγλαμίδης στη σύνθεση RNA του ιού. Εξετάσαμε επίσης την επίδραση της ουαμπαϊνης και της ροκαγλαμίδης στο τελευταίο στάδιο του κύκλου ζωής του αρεναϊού, με τη μεσολάβηση Ζ. Για αυτό το πείραμα, επιμολύναμε κύτταρα με πλασμίδια που εκφράζουν Z-Strep-και Z-FLAG (DYKDDDDK επίτοπος) από LCMV και LASV, αντίστοιχα. Στις 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση, αφαιρέσαμε το υπερκείμενο υγρό της ιστοκαλλιέργειας (TCS) και πλύναμε εκτενώς τα επιμολυσμένα κύτταρα για να εξαλείψουμε το ήδη εκβλαστήματο Ζ. Καλλιεργήσαμε τα επιμολυσμένα κύτταρα παρουσία ή απουσία ουαμπαϊνης ή ροκαγλαμίδης. Στις 24 ώρες, προσδιορίσαμε από τα επίπεδα WB της πρωτεΐνης Ζ και στα προϊόντα λύσης ολόκληρων κυττάρων και που σχετίζονται με σωματίδια που μοιάζουν με ιούς (VLPs) που συλλέχθηκαν από TCS. Η θεραπεία με ροκαγλαμίδη, αλλά όχι με ουαμπαϊνη, προκάλεσε μείωση της αποτελεσματικότητας εκβλάστησης τόσο του LCMV όσο και του LASV Z (Εικ. 6C και 6D). Η επαναληψιμότητα αυτών των ευρημάτων επιβεβαιώθηκε με βάση τα αποτελέσματα από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα (Εικόνα 6Ε). Εξετάσαμε επίσης εάν η ouabain θα μπορούσε να παρέμβει σε ένα στάδιο συναρμολόγησης μολυσματικών απογόνων που δεν καταγράφηκε από τον προσδιορισμό εκβλάστησης Z μέσω δύο επιπλέον πειραμάτων. Το πρώτο πείραμα περιελάμβανε τη χρήση ενός πρόσφατα παραγόμενου μολυσματικού ανασυνδυασμένου LCMV ενός κύκλου που εκφράζει το γονίδιο αναφοράς ZsGreen (scrLCMV/ZsG-P2A-NP) για να μολύνει (MOI = 0,1) κύτταρα A549 (1η μόλυνση). Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με ένα πλασμίδιο που εκφράζει LCMV GPC. Μετά από 24 ώρες, χρησιμοποιήσαμε TCS για να μολύνουμε μια νέα κυτταρική μονοστιβάδα (2η μόλυνση) και ταυτοποιήσαμε τα μολυσμένα κύτταρα με βάση την έκφραση ZsGreen. Για να αξιολογήσουμε την επίδραση της ouabain στην de novo συναρμολόγηση μολυσματικών απογόνων προσδιορίσαμε κανονικοποιημένες αναλογίες (2η/1η μόλυνση) των κυττάρων ZsGreen + (Εικ. 6F). Το δεύτερο πείραμα περιελάμβανε μόλυνση (MOI = 0,1) κυττάρων με WT LCMV και 48 ώρες αργότερα πλύναμε τα μολυσμένα κύτταρα τρεις φορές για να αφαιρέσουμε τους εξωκυτταρικούς μολυσματικούς απογόνους που παρήχθησαν κατά τις πρώτες 48 ώρες της μόλυνσης. Στη συνέχεια, προστέθηκαν φρέσκα μέσα που περιέχουν ουαμπαϊνη ή μάρτυρας φορέα DMSO και 24 ώρες αργότερα προσδιορίσαμε τους τίτλους του ιού σε TCS (Εικ. 6G). Τα αποτελέσματα και από τα δύο πειράματα έδειξαν σταθερά ότι η ouabain δεν ανέστειλε την de novo συναρμολόγηση του εξωκυτταρικού μολυσματικού ιού. Η συνδυαστική θεραπεία μπορεί να ανακουφίσει σημαντικά το πρόβλημα που δημιουργείται από την ταχεία εμφάνιση ανθεκτικών στα φάρμακα παραλλαγών που παρατηρούνται συνήθως κατά τη διάρκεια στρατηγικών μονοθεραπείας για τον έλεγχο των λοιμώξεων από ιούς RNA. Δεδομένου ότι η ουαμπαϊνη και η ροκαγλαμίδη ανέστειλαν διαφορετικά στάδια του κύκλου ζωής του LCMV, εξετάσαμε εάν η χρήση τους σε συνδυασμό οδηγεί σε συνεργιστική δράση κατά του LCMV. Για αυτό το πείραμα, μολύναμε κύτταρα A549 με rLCMV/eGFP και τα επεξεργάσαμε με ουαμπαϊνη και ροκαγλαμίδη χρησιμοποιώντας διαφορετικές συγκεντρώσεις και συνδυασμούς. Στις 48 ώρες pi, προσδιορίσαμε το ποσοστό έκφρασης eGFP (Εικ. 7). Ο συνδυασμός θεραπείας με ουαμπαϊνη και ροκαγλαμίδη οδήγησε σε συνεργική αντι-LCMV δράση που ενισχύθηκε υπό συνθήκες χρησιμοποιώντας υψηλότερες συγκεντρώσεις ουαμπαϊνης και χαμηλότερες συγκεντρώσεις ροκαγλαμίδης. Στη συνέχεια ρωτήσαμε εάν οι παράγοντες ATP1A1 και PHB-κυττάρου-ξενιστή συνέβαλαν επίσης στον πολλαπλασιασμό του ιικού αιμορραγικού πυρετού- που προκαλεί LASV. Επεξεργαστήκαμε τα κύτταρα Α549 με ουαμπαϊνη, βουφαλίνη ή ροκαγλαμίδη και εμβολιάσαμε τα επεξεργασμένα κύτταρα με ανασυνδυασμένο LASV που εκφράζει eGFP (rLASV/eGFP). Η έκφραση eGFP εξετάστηκε 48 ώρες αργότερα. Παρόμοια με τη μόλυνση rLCMV, ο πολλαπλασιασμός LASV περιορίστηκε σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ουαμπαϊνη, βουφαλίνη ή ροκαγλαμίδη σε συγκεντρώσεις που επηρεάζουν ελάχιστα τη βιωσιμότητα των κυττάρων, αν και οι τιμές IC 50 τους ήταν ελαφρώς υψηλότερες από αυτές που βρέθηκαν με το σύστημα μόλυνσης LCMV (Εικ. 5B και S2 Σχήμα ) καθώς η ουαμπαϊνη είχε IC50 9,34 ηΜ, η βουφαλίνη είχε IC50 1,66 ηΜ και η ροκαγλαμίδη είχε IC50 37,0 ηΜ (Σχήμα 8). Δοκιμάσαμε επίσης την επίδραση των ενώσεων που στοχεύουν τα ATP1A1 και PHB στον πολλαπλασιασμό του JUNV. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματά μας που ελήφθησαν με LCMV και LASV, η ουαμπαϊνη, η βουφαλίνη και η ροκαγλαμίδη κατέστειλαν έντονα τον πολλαπλασιασμό JUNV (Σχήμα S3). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι το ATP1A1 και το PHB λειτουργούν ως προ-ιικοί παράγοντες μιας σειράς θηλαστικών ιών. Ταυτοποιήσαμε τα ATP1A1 και PHB ως νέες πρωτεΐνες κυττάρων-ξενιστών που συμβάλλουν στον αποτελεσματικό πολλαπλασιασμό των ιών θηλαστικών. Η προσέγγισή μας χρησιμοποιώντας ένα ανασυνδυασμένο LCMV που εκφράζει NP με μια ετικέτα συγγένειας διευκόλυνε τον καθορισμό της αλληλεπίδρασης NP στο πλαίσιο της μόλυνσης από LCMV. Πρόσφατα, χρησιμοποιώντας ένα NP-ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα (mAb) για την κατακρήμνιση NP και σχετιζόμενων συνεργατών κυτταρικής πρωτεΐνης σε αλληλεπίδραση NP ιού θηλαστικού, ο King et al. αναγνώρισε 348 πρωτεΐνες-ξενιστές που συσχετίστηκαν με το LCMV NP [45]. Βρήκαμε 99 κοινές πρωτεΐνες μεταξύ της φιλτραρισμένης αλληλεπίδρασης LCMV NP των 171 πρωτεϊνών και της αλληλεπίδρασης LCMV NP που τεκμηριώνεται από τους King et al. Διαφορές τόσο στις πειραματικές συνθήκες όσο και στις μεθοδολογίες ανάλυσης που χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία της αλληλεπίδρασης LCMV NP που τεκμηριώνεται από τους King et al. και τα δικά μας πιθανόν h μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα πλύθηκαν με φρέσκο ​​μέσο για να εξαλειφθεί η προκαλούμενη από Ζ παραγωγή VLPs απουσία θεραπείας με ένωση και καλλιεργήθηκαν για άλλες 24 ώρες σε φρέσκα μέσα παρουσία ouabain ή Roc-A στην ενδεικνυόμενη συγκεντρώσεις. Τα VLP που υπάρχουν σε TCS συλλέχθηκαν με υπερφυγοκέντρηση και παρασκευάστηκαν προϊόντα λύσης κυττάρων. Η έκφραση της πρωτεΐνης Ζ σε VLP και κυτταρολύματα προσδιορίστηκε με στυπώματα western χρησιμοποιώντας αντισώματα κατά της επισήμανσης Strep (C) και της επισήμανσης FLAG (D). Η απόδοση εκβλάστησης για κάθε δείγμα υπολογίστηκε διαιρώντας την ένταση του σήματος της πρωτεΐνης Ζ που σχετίζεται με τα VLPs με εκείνη του Ζ που ανιχνεύθηκε στο κυτταρόλυμα. Οι αριθμοί στο κάτω μέρος του πίνακα C αντιστοιχούν στις αποδόσεις εκβλάστησης LCMV Z που προσδιορίζονται σε ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα. Τα αποτελέσματα που φαίνονται στο πλαίσιο Ε αντιστοιχούν στον μέσο όρο και την SD από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα συμπεριλαμβανομένου αυτού που παρουσιάζεται στο πλαίσιο D. Η μέση απόδοση εκβλάστησης των δειγμάτων που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ορίστηκε στο 100%. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο ± SD τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων. (ΣΤ) Επίδραση της ουαμπαϊνης στην ενσωμάτωση ιικής γλυκοπρωτεΐνης σε ιοσωμάτια. 293Τ κύτταρα που σπάρθηκαν (4,0 x 105 κύτταρα/φρεάτιο) σε πλάκα 12 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύχτα, μολύνθηκαν (MOI = 0,1) με scrLCMV/ZsG (1η μόλυνση) για 2 ώρες και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με 0,5 μg pC-GPC . Στις 24 ώρες pi, τα κύτταρα πλύθηκαν με φρέσκο ​​μέσο για την εξάλειψη του μολυσματικού σωματιδίου του ιού που παρήχθη απουσία επεξεργασίας με ένωση, και καλλιεργήθηκαν για άλλες 24 ώρες σε φρέσκο ​​μέσο παρουσία ουαμπαϊνης στα 40 ηΜ (OUA). Στις 48 ώρες pi, το TCS συλλέχθηκε και χρησιμοποιήθηκε για τη μόλυνση φρέσκιας μονοστιβάδας κυττάρων BHK-21 (2η μόλυνση) σπαρμένα (4,0 x 105 κύτταρα/φρεάτιο) σε πλάκα 12 φρεατίων 1 ημέρα πριν από τη μόλυνση και κυτταρόλυμα 293Τ ετοιμάστηκε. 24 ώρες αργότερα, παρασκευάστηκε κυτταρόλυμα ΒΗΚ-21. Η ένταση του σήματος ZsGreen μετρήθηκε με έναν αναγνώστη φθορίζουσας πλάκας. Η αποτελεσματικότητα ενσωμάτωσης GP υπολογίστηκε διαιρώντας την ένταση του σήματος ZsGreen στο κυτταρόλυμα BHK-21 (2η) με εκείνη στο κυτταρόλυμα 293Τ (1η). Η μέση αποτελεσματικότητα ενσωμάτωσης GP των δειγμάτων που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ορίστηκε στο 100%. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο όρο ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. συνέβαλε στις παρατηρούμενες διαφορές μεταξύ των συνόλων δεδομένων. Παρά την πρόοδο στην εφαρμογή παγκόσμιων οθονών που βασίζονται σε πρωτεϊνική για τον εντοπισμό αλληλεπιδράσεων ιού-πρωτεΐνης-ξενιστή-πρωτεΐνης, η επικάλυψη μεταξύ συνόλων δεδομένων για το ίδιο ιικό σύστημα είναι συνήθως περιορισμένη. Ωστόσο, η ουσιαστική επικάλυψη 99 από τις 171 πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με NP και από τις δύο μελέτες υποστηρίζει τη συνολική αξιοπιστία και των δύο συστημάτων. Χρησιμοποιήσαμε τα αποτελέσματα της αλληλεπίδρασης eGFP-Strep, που προσδιορίστηκε σε κύτταρα μολυσμένα με r3LCMV/eGFP-Strep, ως έλεγχο για το φιλτράρισμα των μη ειδικών αλληλεπιδράσεων NP, οι οποίες μπορεί να είχαν οδηγήσει σε υψηλότερο βαθμό αυστηρότητας από ό,τι στη μελέτη των King et. al για την επιλογή υποψηφίων που αλληλεπιδρούν με NP. Οι συνδυασμένες πληροφορίες που παρέχονται από το NP interactome που αναφέρεται από τους King et al. και αυτό που παρουσιάζουμε σε αυτή την εργασία, θα διευκολύνει μελλοντικές μελέτες για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό των λειτουργικών και βιολογικών επιπτώσεων των πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με το κύτταρο-ξενιστή. Όλα τα δοκιμασμένα NP του ιού θηλαστικού, με εξαίρεση το NP από το TCRV, μπλοκάρουν την εξαρτώμενη από IRF-3 IFN- I επαγωγή [25, 46] . Η αντι-IFN δραστηριότητα του NP χαρτογραφήθηκε στο C-τερματικό του τμήμα και συνδέθηκε με την περιοχή 3'-5' εξωνουκλεάσης που υπάρχει με το C-τερματικό τμήμα NP [30] . Ο αναστολέας-Β κινάσης ε (IKKε) ταυτοποιήθηκε ως πρωτεΐνη που δεσμεύει το NP χρησιμοποιώντας υπερέκφραση που προκαλείται από πλασμίδιο σε επιμολυσμένα κύτταρα [47] και η συγγένεια δέσμευσης NP-IKKε συσχετίστηκε με την ικανότητα του NP να αναστέλλει την επαγωγή IFN-I [47]. Εμείς, καθώς και το έργο των King et al. [45] , δεν ανίχνευσε αυτή την αλληλεπίδραση NP-IKKε. Αυτή η απόκλιση μπορεί να έχει προκληθεί από πολύ χαμηλή έκφραση του IKKε σε κύτταρα μολυσμένα με LCMV, γεγονός που εμπόδισε την ανίχνευση του IKKε από το LC-MS/MS. Εναλλακτικά, η αλληλεπίδραση NP-IKKε θα μπορούσε ενδεχομένως να ρυθμιστεί προσωρινά και να λάβει χώρα σε πρώιμους χρόνους pi, αλλά θα μπορούσε να απουσιάζει κυρίως στις 48 h pi, τη στιγμή κατά την οποία προετοιμάσαμε τα κυτταρολύματα για τις πρωτεϊνομικές μελέτες μας. Μελλοντικές μελέτες που θα συγκρίνουν την αλληλεπίδραση του NP σε διαφορετικούς χρόνους κατά τη διάρκεια της μόλυνσης θα συμβάλουν στην καλύτερη κατανόηση της δυναμικής των αλληλεπιδράσεων ΝΡ/πρωτεϊνών ξενιστή. α και β) και μία ρυθμιστική γ υπομονάδα [48] . Το ATP1A1 αντιπροσωπεύει μία από τις τέσσερις α υπομονάδες [49, 50]. Πρόσφατα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η Na + /K + -ATPase εμπλέκεται σε πολλαπλές οδούς σηματοδότησης κυττάρων που είναι ανεξάρτητες από τη λειτουργία άντλησης ιόντων [51] . Αναστολείς καρδιακών γλυκοσιδών της Na + /K + -ATPase (NKA), τα λεγόμενα καρδιοτονικά στεροειδή (CST; π.χ., ouabain, bufalin), έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό διαφορετικών ιών, συμπεριλαμβανομένου του ιού Έμπολα [35], των κοροναϊών [36], του ιού του απλού έρπητα 1 [52, 53] , του CHIKV [54] , του ιού της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας 1 (HIV- 1) [55] , αδενοϊός [56] και ιός του αναπαραγωγικού και αναπνευστικού συνδρόμου χοίρων 1 [57] . Διαφορετικοί μηχανισμοί είναι πιθανό να συμβάλλουν στην αντιϊκή δράση των CST, συμπεριλαμβανομένων των αλλοιωμένων κυτταρικών λειτουργιών που διαμορφώνονται από τη σηματοδοτική δραστηριότητα του Na + /K + -ATPase [58] . Έτσι, μια χαμηλή συγκέντρωση ουαμπαϊνης προκαλεί μια διαμορφωτική αλλαγή στο ATP1A1 που έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση και την απελευθέρωση της πρωτο-ογκογονικής κινάσης πρωτεΐνης τυροσίνης, Src, από το ATP1A1, που ακολουθείται από ενεργοποίηση ακόμη άγνωστης κατάντη σηματοδότησης που αναστέλλει, για παράδειγμα, την είσοδο των κυττάρων ιός ηπατίτιδας ποντικού (MHV) [59] . Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η ouabain δεν παρενέβη στην είσοδο των κυττάρων LCMV. Επιπλέον, η θεραπεία με τον αναστολέα Src 4-αμινο-5-(4-μεθυλφαινυλ)-7-(t-βουτυλ)πυραζολο [3,4-d] πυριμιδίνη (PP1) δεν εξουδετέρωσε την αντι-LCMV δράση της ουαμπαϊνης ( S4 Εικ). Ωστόσο, η σηματοδότηση Src με τη μεσολάβηση ATP1A1 θα μπορούσε εύλογα να συμβάλει στην ανασταλτική επίδραση της ouabain στον πολλαπλασιασμό του JUNV, όπως παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε με το MHV. Επιπλέον, η κυτταρική είσοδος του JUNV συμβαίνει επίσης με ενδοκυττάρωση που προκαλείται από κλαθρίνη [60] , μια διαδικασία που επηρεάζεται από τη σηματοδότηση Src. Το Ouabain έχει χρησιμοποιηθεί κλινικά σε αρκετές ευρωπαϊκές χώρες για τη διαχείριση της συμφορητικής καρδιακής ανεπάρκειας, ενώ η βουφαλίνη έχει δοκιμαστεί σε κλινικές δοκιμές για θεραπείες καρκίνου [61] και η διγοξίνη CST έχει εγκριθεί από τον FDA από το 1997 για τη θεραπεία της καρδιακής ανεπάρκειας και της κολπικής μαρμαρυγής . Ως εκ τούτου, οι ευκαιρίες για τα επαναχρησιμοποιούμενα CST έχουν τη δυνατότητα ως θεραπευτικά για τη θεραπεία λοιμώξεων που προκαλούνται από αρένα ιούς που προκαλούν ιικό αιμορραγικό πυρετό. Ο αναστολέας PHB, η ροκαγλαμίδη, φάνηκε να παρεμβαίνει στη σύνθεση και την εκβλάστηση του LCMV RNA, αλλά δεν επηρέασε την είσοδο των κυττάρων LCMV. Αντίθετα, το PHB αναφέρθηκε ότι είναι ένας υποδοχέας εισόδου κυττάρων για το DENV-2 [39] και το CHIKV [40] . Από την άλλη πλευρά, το PHB δεν δρούσε ως υποδοχέας εισόδου κυττάρων ιού για τον HCV. Αντίθετα, το PHB συνέβαλε στην είσοδο των κυττάρων του HCV μέσω της δέσμευσης σε κυτταρικό RAF (c-Raf; πρωτο-ογκογονιδιακή σερίνη/θρεονίνη-πρωτεϊνική κινάση) και επακόλουθη ενεργοποίηση πρωτο-ογκογονιδίου σαρκώματος αρουραίου Harvey (HRas) που επάγει μια οδό μεταγωγής σήματος που απαιτείται για την είσοδο σε κύτταρα HCV με τη μεσολάβηση του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) [37]. Επιπλέον, το kd PHB με τη μεσολάβηση siRNA μείωσε την παραγωγή του H5N1 FLUAV [38] . Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι το PHB εμπλέκεται σε διαφορετικά στάδια του κύκλου ζωής μιας ποικιλίας ιών και ως εκ τούτου ένας ελκυστικός στόχος για την ανάπτυξη ευρέως φάσματος αντιιικών φαρμάκων. Το Rocaglate είναι μια ομάδα φυσικών ενώσεων, η οποία περιλαμβάνει τη ροκαγλαμίδη, η οποία αναστέλλει την πρωτεΐνη σύνθεσης στοχεύοντας τον ευκαρυωτικό παράγοντα έναρξης 4Α ελικάσης RNA εξαρτώμενου από ATP DEAD-box (eIF4A) και ασκεί αντικαρκινική δράση [62, 63] . Η ένωση rocaglate, η σιλβεστρόλη, αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό του ιού Έμπολα πιθανώς παρεμβαίνοντας στο ρόλο του eIF4A στη μετάφραση ιικών πρωτεϊνών [64] . Ενώ επικεντρωθήκαμε σε δύο πρωτεΐνες ξενιστές, την ATP1A1 και την PHB, σε αυτή τη μελέτη, η προσέγγισή μας πρωτεϊνικής εντόπισε επίσης αρκετές NP- αλληλεπιδρώντες πρωτεΐνες κυττάρου ξενιστή των οποίων η έκφραση kd μέσω siRNA είχε ως αποτέλεσμα αυξημένο πολλαπλασιασμό του LCMV. Αυτές οι πρωτεΐνες, οι οποίες περιελάμβαναν MAP1B, μπορεί να έχουν αντι-LCMV δράση. Το MAP1B έχει αποδειχθεί ότι συνδέεται με τις μη δομικές πρωτεΐνες 1 (NS1) και 2 (NS2) του ανθρώπινου αναπνευστικού συγκυτιακού ιού (HRSV) [34] . Τα NS1 και NS2 του HRSV ανταγωνίζονται την απόκριση της IFN-I του ξενιστή μειώνοντας τα επίπεδα του παράγοντα που σχετίζεται με τον υποδοχέα TNF (TRAF3), του IKKε (NS1) και του STAT2 (NS2) [65] . Η αλληλεπίδραση NS2-MAP1B παρενέβη στην ικανότητα του HRSV NS2 να μειώνει τα επίπεδα STAT2, ενώ ο ρόλος της αλληλεπίδρασης NS1-MAP1B μένει να προσδιοριστεί [34] . Η εξέταση του ρόλου της αλληλεπίδρασης NP-MAP1B στη ρύθμιση της ικανότητας του NP να αναστέλλει την επαγωγή της IFN τύπου Ι είναι ενδιαφέρουσα. Εντοπίσαμε μεταξύ των πρωτεϊνών του κυττάρου ξενιστή που αλληλεπιδρούν με NP τον ιό λευχαιμίας Moloney RNA ελικάσης 10 (MOV10), ο οποίος έχει αναφερθεί ότι είναι ένας αντιϊκός παράγοντας για το FLUAV [66] , τους ρετροϊούς [67] [68] [69] [70] [71] και τον DENV-2 [72] . Δεν παρατηρήσαμε αυξημένο πολλαπλασιασμό LCMV σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε kd του MOV10 με τη μεσολάβηση siRNA, εύρημα που θα αμφισβητούσε την αντι-LCMV δράση του MOV10. Ωστόσο, θεωρούμε ότι το LCMV έχει ήδη βέλτιστο πολλαπλασιασμό στα κύτταρα A549 και περαιτέρω αυξήσεις μπορεί να συμβούν μόνο κάτω από μάλλον μοναδικές συνθήκες. Το MOV10 αποδείχθηκε ότι ενισχύει την επαγωγή IFN-I με τη μεσολάβηση IRF-3 μετά από μόλυνση με SeV μέσω ενός ανεξάρτητου και εξαρτώμενου από ΙΚΚε τρόπου που δεσμεύει τη δεξαμενή κινάση 1 (TBK1). Αυτό το εύρημα υποστηρίχθηκε περαιτέρω με την επίδειξη αλληλεπίδρασης MOV10-IKKε από μελέτες συν-ανοσοκαθίζησης [73] . Τεκμηριώσαμε ότι η δράση κατά της IFN του ιού mammarena NP συσχετίστηκε με την ικανότητά του να αλληλεπιδρά με το IKKε [47] . Το εάν η αλληλεπίδραση NP-MOV10 εμποδίζει το MOV10 να ενισχύσει την επαγωγή IFN-I με τη μεσολάβηση IRF-3 παραμένει να καθοριστεί. Αρκετά μέλη του συμπλέγματος Τ που περιέχει σαπερονίνη θηλαστικών (CCT) αναγνωρίστηκαν ως εξέχοντα χτυπήματα στην αλληλεπίδρασή μας NP. Το CCT θηλαστικών είναι κρίσιμο για την αναδίπλωση πολλών πρωτεϊνών με σημαντικές λειτουργίες σε διάφορες κυτταρικές διεργασίες [74] και μπορεί να προστατεύσει σύνθετες τοπολογίες πρωτεϊνών εντός της κεντρικής κοιλότητάς του κατά τη βιοσύνθεση και την αναδίπλωση [75] . Η συμβολή των μελών CCT στη συναρμολόγηση NP σε μια δομή νουκλεοκαψιδίου θα μπορούσε να εξηγήσει την παρουσία τους στο αλληλεπιδράτωμα NP, αλλά όχι στο eGFP. Είναι ενδιαφέρον ότι τα μέλη του CCT έχουν εμπλακεί στον πολλαπλασιασμό διαφορετικών ιών συμπεριλαμβανομένου του ιού της λύσσας [76, 77] , του HCV [78] και του FLUAV [79] . Ωστόσο, ο ρόλος αυτών των πρωτεϊνών CCT στον πολλαπλασιασμό του ιού παραμένει άγνωστος και μπορεί να περιλαμβάνει λειτουργίες άλλες από το να δρουν ως μοριακές συνοδούς. Προηγούμενες μελέτες τεκμηρίωσαν την παρουσία αρκετών συστατικών του eIF4F, συμπεριλαμβανομένου του 4Α, εντός συμπλεγμάτων αντιγραφής-μεταγραφής ιών (RTC) σε κύτταρα μολυσμένα με LCMV [80] και TCRV [81] . Αυτά τα ευρήματα, μαζί με την ανίχνευση ενός αριθμού ριβοσωμικών πρωτεϊνών στην αλληλεπίδραση NP, υποδηλώνουν ότι η μετάφραση των ιικών mRNAs μπορεί να λάβει χώρα εντός του RTC. Ωστόσο, η παρεμβολή της ροκαγλαμίδης στη δραστηριότητα του eIF4A εντός του ιικού RTC μπορεί να συμβάλει στην αντι-LCMV δραστηριότητά του. Σε αυτή την εργασία, τεκμηριώσαμε τη δημιουργία rLCMV/Strep-NP και τη χρήση του για τον ορισμό της αλληλεπίδρασης NP σε μολυσμένα κύτταρα. Παρουσιάσαμε στοιχεία ότι το ATP1A1 και το PHB συμβάλλουν στον αποτελεσματικό πολλαπλασιασμό των θηλαστικών ιών χρησιμοποιώντας γενετική και φαρμακολογική αναστολή των γονιδίων. Σε συμφωνία με τα ευρήματά μας, η βιοπληροφορική ανάλυση αποκάλυψε ότι το πρωτεϊνικό δίκτυο που σχετίζεται με το ATP1A1 και το PHB περιλαμβάνει πρωτεΐνες κυττάρου ξενιστή με λειτουργίες σε βιολογικές διεργασίες που έχουν εμπλακεί στον πολλαπλασιασμό του ιού (Σχήμα S5). Η συνολική πειραματική προσέγγιση που περιγράφεται εδώ μπορεί να διευκολύνει την ταυτοποίηση βιολογικά σχετικών πρωτεϊνών κυττάρου ξενιστή που αλληλεπιδρούν με ΝΡ. Μελλοντικές μελέτες που διευκρινίζουν τους ρόλους των προ- και αντιικών παραγόντων κυττάρου-ξενιστή που προσδιορίζονται σε αυτή τη μελέτη στον πολλαπλασιασμό του ιού θηλαστικού θα προωθήσουν την κατανόησή μας για τις πολλαπλές λειτουργίες του NP και θα αποκαλύψουν νέους κυτταρικούς στόχους για την ανάπτυξη φαρμάκων κατά των θηλαστικών. Επιπλέον, με τον εντοπισμό προϊικών παραγόντων κυττάρων-ξενιστών, φάρμακα που έχουν ήδη εγκριθεί μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν ως θεραπευτικά για την καταπολέμηση των λοιμώξεων από ανθρώπινους παθογόνους ιούς θηλαστικών. (ATCC CCL-1), grivet Vero E6 (ATCC CRL-1586), ανθρώπινα A549 (ATCC CCL-185) και ανθρώπινα HEK 293T (ATCC CRL-3216) κύτταρα αναπτύχθηκαν στο τροποποιημένο μέσο Eagle's Dulbecco (Thermo Fisher Scientific, Waltham , MA) που περιέχει 10% εμβρυϊκό βόειο εμβρυϊκό ορό απενεργοποιημένο με θερμότητα, 2 mM L-γλουταμίνη, 100 mg/ml στρεπτομυκίνης και 100 U/ml πενικιλίνης στους 37˚C και 5% CO 2 .WT ανασυνδυασμένους LCMVs, Armstrong ( rLCMV ARM) και στελέχη κλώνου-13 (rLCMV Cl-13), δημιουργήθηκαν όπως περιγράφεται [30, 82, 83]. Η δημιουργία rLCMV/NP(D382A) και SeV, στέλεχος Cantell, περιγράφηκε [30, 82, 83]. Ένα rLCMV χωρίς GPC και που εκφράζει eGFP (rLCMVΔGPC/eGFP) δημιουργήθηκε από την αντίστροφη γενετική χρησιμοποιώντας διαδικασίες που περιγράφηκαν προηγουμένως [84]. Τα rLCMV/Strep-NP και r3LCMV/eGFP-Strep δημιουργήθηκαν με αντίστροφη γενετική χρησιμοποιώντας παρόμοιες διαδικασίες για τη δημιουργία WT rLCMV και τριτμηματικού LCMV (r3LCMV) που εκφράζει eGFP [30] . Για τη δημιουργία αυτών των νέων rLCMVs, δημιουργήσαμε πλασμίδια pol1S Cl-13 που κατευθύνουν την ενδοκυτταρική σύνθεση με τη μεσολάβηση Pol1 ανασυνδυασμένων ειδών RNA γονιδιώματος LCMV S που κωδικοποιούν NP ή eGFP με σήμανση Strep, αντίστοιχα (Εικ. 1Α και 1Β). Το eGFP που εκφράζει rLCMV (rLCMV/eGFP) δημιουργήθηκε όπως περιγράφεται [85] και το rLCMV που εκφράζει το ZsGreen (rLCMV/ZsG) αντί του eGFP δημιουργήθηκε με αντίστροφη γενετική χρησιμοποιώντας παρόμοιες διαδικασίες για τη δημιουργία rLCMV/eGFP. Η δημιουργία του rLASV που εκφράζει eGFP (rLASV/eGFP) θα περιγραφεί αλλού. Ένα τρι-τμηματοποιημένο ανασυνδυασμένο ζωντανά εξασθενημένο στέλεχος Candid #1 του JUNV που εκφράζει eGFP (r3JUNV/eGFP) δημιουργήθηκε όπως περιγράφεται [86] . Για τη δημιουργία ενός νέου μονού κύκλου rLCMV που εκφράζει ZsGreen (scrLCMV/ZsG-P2A-NP), δημιουργήθηκε ένα πλασμίδιο pol1S παραλείποντας το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης GPC (ORF) από το πλασμίδιο pol1S που χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία του rLCMV/ZsG. Το scrLCMV/ZsG-P2A-NP διασώθηκε με αντίστροφη γενετική χρησιμοποιώντας παρόμοιες διαδικασίες για τη δημιουργία rLCMVΔGPC/eGFP [84] Οι τίτλοι .LCMV προσδιορίστηκαν με προσδιορισμό σχηματισμού ανοσοεστίας (IFFA) όπως περιγράφεται [87] . Εν συντομία, δεκαπλάσιες σειριακές αραιώσεις ιού χρησιμοποιήθηκαν για να μολύνουν μονοστιβάδες κυττάρων Vero Ε6 σε πλάκα 96 φρεατίων και σε 20 ώρες pi, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη (PFA) σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS). Μετά από κυτταρική διαπερατότητα με επεξεργασία με ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης (DB) (0,3% Triton X-100 σε PBS που περιέχει 3% αλβουμίνη ορού βοοειδών [BSA]), τα κύτταρα χρωματίστηκαν με mAb αρουραίου σε NP (VL-4, Bio X Cell, West Lebanon, NH) συζευγμένο με Alexa Fluor 488 (VL-4-AF488, Protein Labeling Kit, Life Technologies, Carlsbad, CA). Οι τίτλοι VSV προσδιορίστηκαν με μια δοκιμασία πλάκας. Συνολικά κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης PD (+) (250 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl [ρΗ = 7,5], 0,5% TritonX-100, 10% γλυκερόλη, 1 mM MgCl 2 , 1 μM CaCl 2 , 1 μM ZnCl 2 ) και διαυγάστηκε με φυγοκέντρηση στα 21.130 x g στους 4˚C για 10 λεπτά. Τα διαυγασμένα λύματα αναμίχθηκαν σε αναλογία 1:1 με ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης (100 mM Tris [ρΗ 6,8], 20% 2-μερκαπτοαιθανόλη, 4% SDS, 0,2% μπλε βρωμοφαινόλης, 20% γλυκερόλη) και έβρασαν για 5 λεπτά. Τα δείγματα πρωτεϊνών κλασματοποιήθηκαν με SDS-PAGE χρησιμοποιώντας πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 4-20% βαθμίδωσης (γέλες Mini-PROTEAN TGX 4-20%, Bio-Rad, Hercules, CA) και οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν με ηλεκτροστύπωμα σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Immobilin Transfer , Millipore, Billerica, MA). Για την ανίχνευση πρωτεϊνών με επισήμανση Strep, οι μεμβράνες αντέδρασαν με μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού στο Strep (QIAGEN, Germantown, MD), eGFP (Takara Bio USA, Mountain View, CA), GP 2 (We33/ 36), ATP1A1 (TehrmoFisher Scientific, Rockford , IL), PHB (Abcam, Cambridge, MA) ή πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού στην α-τουμπουλίνη (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA) ή την αφυδρογονάση της 3-φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης (GAPDH, Millipore), αντίστοιχα, ακολουθούμενη από επώαση με κατάλληλο χρένο Αντισώματα ανοσοσφαιρίνης G (IgG) συζευγμένα με υπεροξειδάση (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, ΡΑ). Το υπόστρωμα χημειοφωταύγειας SuperSignal West Pico ή Femto (Thermo Fisher Scientific) χρησιμοποιήθηκε για την εξαγωγή σημάτων χημειοφωταύγειας που οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ImageQuant LAS 4000 Imager (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA). Τραβήξτε προς τα κάτω πρωτεΐνες με επισήμανση στρεπτόκοκκου από μολυσμένες Κύτταρα Α549 που παρασκευάστηκαν σε έξι δίσκους των 15 cm (περίπου 1,0 χ 108 κύτταρα συνολικά) μολύνθηκαν είτε με rLCMV/Strep-NP είτε με r3LCMV/eGFP σε ΜΟΙ 0,1. Στις 48 ώρες pi, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με παγωμένο PBS, ξύστηκαν σε φρέσκο ​​παγωμένο PBS και φυγοκεντρήθηκαν στα 400 x g στους 4°C για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο αφαιρέθηκε και τα κύτταρα λύθηκαν με 12 ml ρυθμιστικού διαλύματος λύσης PD (+) συμπληρωμένο με κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης και φωσφατάσης (Thermo Fisher Scientific) και 5 μg/ml δεοξυριβονουκλεάσης Ι (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ). Το προϊόν λύσης διαυγάστηκε με φυγοκέντρηση στα 3.900 x g στους 4°C για 30 λεπτά για να αφαιρεθούν τα κυτταρικά υπολείμματα. Το διαυγασμένο κυτταρόλυμα στη συνέχεια επωάστηκε με ρητίνη strep-tactin sepharose (QIAGEN) στους 4°C. Μετά από 2 ώρες επώασης, η ρητίνη πλύθηκε τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης PD (+) και μία φορά με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης PD χωρίς TritonX-100 (ρυθμιστικό διάλυμα λύσης PD [-]). Μετά τη φυγοκέντρηση στα 1.600 x g και στους 4˚C για 5 λεπτά, το τελευταίο ρυθμιστικό έκπλυσης αφαιρέθηκε και τα πρωτεϊνικά σύμπλοκα που σχετίζονται με τη ρητίνη εκλούστηκαν σε 2 ml ρυθμιστικού διαλύματος λύσης PD (-) που περιείχε 2,5 mM αποθειοβιοτίνης. Το έκλουσμα στη συνέχεια υποβλήθηκε σε κατακρήμνιση TCA που ακολουθήθηκε από πέψη με θρυψίνη. Μικροστήλη τεχνολογίας πολυδιάστατης ταυτοποίησης πρωτεΐνης. Παρασκευάστηκε μια μικροστήλη MudPIT δημιουργώντας πρώτα ένα τήγμα Kasil στο ένα άκρο ενός μη απενεργοποιημένου τριχοειδούς σωλήνα εξωτερικής διαμέτρου 250 μm (OD) (εσωτερική διάμετρος 360 μm) (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). Το φριτ Kasil παρασκευάστηκε με σύντομη εμβάπτιση ενός τριχοειδούς σωλήνα 20-30 cm σε 300 μl καλά αναμεμειγμένου διαλύματος πυριτικού καλίου Kasil 1624 (PQ Corporation, Malvern, PA) και 100 μl φορμαμιδίου, ωρίμανση στους 100˚C για 4 ώρες. , και κόβουμε τη φριτέζα σε μήκος %2 mm. Ισχυρά σωματίδια ανταλλαγής κατιόντων (SCX Luna, διάμετρος 5 μm, πόροι 125 Å, Phenomenex, Torrance, CA) συσκευάστηκαν εσωτερικά από πολτούς σωματιδίων σε μεθανόλη σε 2,5 cm. Σωματίδια αντίστροφης φάσης (2 cm, C18 Aqua, διάμετρος 3 μm, πόροι 125 Å, Phenomenex) στη συνέχεια συσκευάστηκαν διαδοχικά στον τριχοειδή σωλήνα χρησιμοποιώντας την ίδια μέθοδο με τη φόρτωση SCX. Ανάλυση MudPIT. Μια αναλυτική στήλη υγρής χρωματογραφίας αντίστροφης φάσης δημιουργήθηκε με το τράβηγμα ενός τριχοειδούς σωλήνα OD 100 μm (εσωτερική διάμετρος (ID) 360 μm) (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ) σε άκρο ID 5 μm. Σωματίδια ανάστροφης φάσης (Luna C18, διάμετρος 3 μm, πόροι 125 Å, Phenomenex) συσκευάστηκαν απευθείας στην τραβηγμένη στήλη στα 5,5 mPa έως μήκους 15 cm. Η στήλη γεμίστηκε περαιτέρω, πλύθηκε και εξισορροπήθηκε στα 10 mPa με ρυθμιστικό διάλυμα Β (80% ακετονιτρίλιο, 0,1% μυρμηκικό οξύ) ακολουθούμενο από ρυθμιστικό διάλυμα Α (5% ακετονιτρίλιο και 0,1% μυρμηκικό οξύ). Το MudPIT και οι αναλυτικές στήλες συναρμολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μια ένωση μηδενικού νεκρού όγκου (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA). Η ανάλυση LC-MS/MS διεξήχθη με αντλία LC υψηλής πίεσης Agilent (Agilent) και γραμμική τετραπολική παγίδα ιόντων διπλής κυψέλης Orbitrap Velos (Thermo) χρησιμοποιώντας ένα εσωτερικά κατασκευασμένο στάδιο ηλεκτροψεκασμού. Ο ηλεκτροψεκασμός διεξήχθη απευθείας από την αναλυτική στήλη με την εφαρμογή της τάσης ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (ESI) σε ένα tee (150 μm ID, Upchurch Scientific) ακριβώς κατάντη ροής διαχωρισμού 1:1.000 για να μειωθεί ο ρυθμός ροής στα 300 nl/min μέσω των στηλών . Πραγματοποιήθηκαν πειράματα MudPIT (10 σταδίων) στα οποία κάθε στάδιο αντιστοιχεί σε 0, 10, 20, 40, 50, 60, 70, 80, 90 και 100% ρυθμιστικό διάλυμα C (500 mM οξικό αμμώνιο, 0,1% μυρμηκικό οξύ, και 5% ακετονιτρίλιο) και εκτελέστηκε για 3 λεπτά στην αρχή μιας βαθμίδωσης 110 λεπτών. Ανάλυση δεδομένων. Πραγματοποιήθηκε ταυτοποίηση πρωτεΐνης και πεπτιδίου με Integrated Proteomics Pipeline-IP2 (Integrated Proteomics Applications, San Diego, CA. http://www. integratedproteomics.com/) χρησιμοποιώντας αλγόριθμους ProLuCID και DTASelect2. DTASelect παράμετροι ήταν-p 2 -y 1-trypstat-pfp .01 -extra-pI-DB-dm-in. Τα ακατέργαστα αρχεία φάσματος εξήχθησαν σε αρχεία ms2 από ακατέργαστα αρχεία χρησιμοποιώντας ανοιχτού κώδικα RawExtract 1.9.9 (Scripps Research Institute, La Jolla, CA; http://fields.scripps.edu/downloads.php) και τα διαδοχικά φάσματα μάζας αναζητήθηκαν σε βάση δεδομένων ανθρώπινης πρωτεΐνης (UniprotKB). Για να εκτιμήσουμε με ακρίβεια τις πιθανότητες πεπτιδίων και τα ποσοστά ψευδούς ανακάλυψης, χρησιμοποιήσαμε μια βάση δεδομένων δόλωμα που περιέχει τις αντίστροφες αλληλουχίες όλων των πρωτεϊνών που προσαρτώνται στη βάση δεδομένων στόχου. Τα διαδοχικά φάσματα μάζας αντιστοιχίστηκαν σε αλληλουχίες χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο ProLuCID με ανοχή μάζας πεπτιδίου 600 ppm. Οι αναζητήσεις ProLuCID έγιναν σε έναν επεξεργαστή συμπλέγματος Intel Xeon που εκτελείται υπό το λειτουργικό σύστημα Linux. Ο χώρος αναζήτησης περιελάμβανε υποψήφια μισά και πλήρως θρυπτικά πεπτίδια που εμπίπτουν στο παράθυρο ανοχής μάζας χωρίς περιορισμό λανθασμένης διάσπασης. Η καρβαμιδομεθυλίωση (+57,02146 Da) της κυστεΐνης θεωρήθηκε ως στατική τροποποίηση. Έλεγχος siRNA Κύτταρα A549 (1.000 κύτταρα/φρεάτιο) σε πλάκα 384 φρεατίων επιμολύνθηκαν αντίστροφα με 0,5 pmol δεξαμενής siRNA (Πίνακας S2) στοχεύοντας κάθε γονίδιο χρησιμοποιώντας 0,1 μl Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) (τελική συγκέντρωση siRNAM ήταν 10 n ), ακολουθούμενη από επώαση στους 37˚C και 5% CO 2 . Στις 72 ώρες μετά τη διαμόλυνση, τα κύτταρα μολύνθηκαν (ΜΟΙ = 0,05) με rLCMV/ZsG. Οι πρωτεΐνες κυττάρου-ξενιστή στόχου siRNA επιλέχθηκαν με βάση τη διαθεσιμότητα επικυρωμένων αλληλουχιών siRNA. Τα siRNA που χρησιμοποιήσαμε για να εξετάσουμε τις επιδράσεις στον πολλαπλασιασμό LCMV της έκφρασης knockdown των υποψήφιων επιτυχιών πρωτεΐνης κυττάρου ξενιστή που αλληλεπιδρούν με NP αντιστοιχούσαν στη βιβλιοθήκη ανθρώπινου siRNA ON TAR-GET-Plus (OTP) σε όλο το γονιδίωμα (18.301 γονίδια, 4 siRNA/γονίδιο). Dharmacon, Lafayette, CO). Κύτταρα A549 (3,0 x 10 4 κύτταρα/φρεάτιο) επιμολύνθηκαν αντίστροφα σε μια πλάκα 24 φρεατίων με 6 pmol δεξαμενές siRNA που στοχεύουν κάθε γονίδιο χρησιμοποιώντας 1 μl Lipofectamine RNAiMAX (τελική συγκέντρωση siRNA είναι 10 nM) . Στις 72 ώρες μετά τη διαμόλυνση, το συνολικό κυτταρόλυμα παρασκευάστηκε σε τροποποιημένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης Α (25 mM Tris-HCl [ρΗ = 8,0], 50 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1,25% δεοξυχολικό νάτριο) και διαυγάστηκε με φυγοκέντρηση σε 21.130 x g στους 4˚C για 10 λεπτά. Η ολική συγκέντρωση πρωτεΐνης του διαυγασμένου προϊόντος λύσης κυττάρων μετρήθηκε με Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). Η ίδια ποσότητα πρωτεΐνης από κάθε δείγμα υποβλήθηκε σε SDS-PAGE και η έκφραση πρωτεΐνης γονιδίων που στοχεύουν siRNA αναλύθηκε με στυπώματα western. Κύτταρα μολυσμένα με rLCMV που εκφράζει eGFP-ή ZsGreen σταθεροποιήθηκαν με 4% PFA σε PBS. Μετά τη διαπερατότητα των κυττάρων με επεξεργασία με DB, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 4',6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI). Ο πράσινος φθορισμός (eGFP ή ZsGreen) και τα σήματα DAPI μετρήθηκαν με συσκευή ανάγνωσης φθορίζουσας πλάκας (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, Bio-Tek, Winooski, VT). Κύτταρα μολυσμένα με ψευδή και ιό σταθεροποιήθηκαν με 4% PFA. Μετά τη διαπερατότητα των κυττάρων και τον αποκλεισμό με επεξεργασία με DB που περιείχε 1% φυσιολογικό ορό κατσίκας, τα κύτταρα επωάστηκαν με πρωτεύον αντίσωμα ποντικού anti ATP1A1 ή PHB ακολουθούμενο από δευτερεύον αντίσωμα κατά IgG ποντικού συζευγμένο με Alexa Fluore 568 (αντι-ποντικού IgG-AF568). Στη συνέχεια, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με VL-4-AF488. Σε ορισμένα δείγματα, το πρωτογενές αντίσωμα έναντι του ATP1A1 ή του PHB παραλείφθηκε για τον προσδιορισμό του φθορισμού υποβάθρου. Για την οπτικοποίηση των πυρήνων, το DAPI Fluoromount-G (SouthernBiotech, Birmingham, AL) χρησιμοποιήθηκε για την τοποθέτηση καλυπτρίδων σε γυαλί ολίσθησης. Τα χρωματισμένα κύτταρα παρατηρήθηκαν υπό ομοεστιακό μικροσκόπιο (LSM 710, Zeiss) και τα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό ΖΕΝ (Zeiss). Η ανάλυση συνεντοπισμού διεξήχθη σε βάση εικονοστοιχείου με εικονοστοιχείο χρησιμοποιώντας λογισμικό Zen (Zeiss). Οκτώ πράσινα (ΝΡ-θετικά) κελιά επισημάνθηκαν και κάθε εικονοστοιχείο στην επισημασμένη περιοχή σχεδιάστηκε στο διάγραμμα διασποράς με βάση το επίπεδο έντασής του από κάθε κανάλι. Τα κατώφλια για τα πράσινα και τα κόκκινα κανάλια προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ψευδο-μολυσμένα κύτταρα βαμμένα με VL-4-AF488 (αντι-ΝΡ) και αντίσωμα IgG ποντικού συζευγμένο με Alexa Fluor 568, χωρίς τη χρήση αντισωμάτων αντι-ATP1A1 ή -PHB. Σε κάθε pixel εκχωρήθηκε η τιμή 1. Οι συντελεστές συνεντοπισμού (CC) (ή μη σταθμισμένοι συντελεστές CC) προσδιορίστηκαν διαιρώντας το άθροισμα των θετικών πράσινων και κόκκινων εικονοστοιχείων με το άθροισμα των πράσινων θετικών εικονοστοιχείων. Αυτός ο υπολογισμός επαναλήφθηκε για οκτώ μεμονωμένα κύτταρα. Για να αξιολογήσουμε την ειδικότητα του συνεντοπισμού, προσδιορίσαμε το σταθμισμένο CC λαμβάνοντας υπόψη τη φωτεινότητα κάθε σήματος καναλιού. Η σύγκριση των μη σταθμισμένων και σταθμισμένων CC μας επέτρεψε να προσδιορίσουμε εάν υπήρχαν φωτεινότερα pixel στις συντοποθετημένες περιοχές σε σύγκριση με τις μη συνεντοπισμένες περιοχές. Οι τιμές p προσδιορίστηκαν με ένα τεστ t δύο ουρών χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism. Κύτταρα Α549 ή Vero Ε6 σπάρθηκαν (2,0 x 104 κύτταρα/φρεάτιο) σε πλάκα 96 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύχτα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3πλάσιες σειριακές αραιώσεις ένωσης στους 37˚C και 5% CO 2 για 2 ώρες, ακολουθούμενη από μόλυνση με rLCMV/eGFP (MOI = 0,01). Οι ενώσεις ήταν παρούσες στο τελικό σημείο μελέτης. Στις 48 h pi, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% PFA σε PBS και η έκφραση eGFP εξετάστηκε με συσκευή ανάγνωσης φθορίζοντος πλακιδίου (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, BioTek). Οι μέσες τιμές που λήφθηκαν με κύτταρα που είχαν υποστεί επεξεργασία με DMSO και μολυσμένα με rLCMV/eGFP ρυθμίστηκαν στο 100%. Οι συγκεντρώσεις IC50 προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism.A549 ή Vero E6 κύτταρα που σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων (2,0 x 104 κύτταρα/φρεάτιο) και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύχτα, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3πλάσιες σειριακές αραιώσεις ένωσης και καλλιεργήθηκαν στους 37˚C και 5% CO 2 για 48 ώρες. Στη συνέχεια, προστέθηκε αντιδραστήριο ενός διαλύματος CellTiter 96 AQ (Promega, Madison, WI). Στη συνέχεια, ο προσδιορισμός διεξήχθη σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή και η απορρόφηση (490 nm) ελήφθη χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη ανοσοπροσροφητικού προσδιορισμού (ELISA) συνδεδεμένου με ένζυμο (SPECTRA max συν 384; Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Οι μέσες τιμές που ελήφθησαν με κύτταρα επεξεργασμένα με DMSO ορίστηκαν στο 100%. Οι συγκεντρώσεις CC50 προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism. Ένα πλασμίδιο που εκφράζει C-τελική πρωτεΐνη Z σημασμένη με Strep (pC-LCMV-Z-Strep) δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας παρόμοια διαδικασία για να δημιουργηθεί ένα πλασμίδιο που εκφράζει C-τελική επισήμανση πρωτεΐνη LASV Z (pC-LASV-Z-FLAG) και ο προσδιορισμός εκβλάστησης πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [88] . Κύτταρα (HEK 293T) σε πλάκα 12 φρεατίων επιμολύνθηκαν με 0,5 μg κενού φορέα pCAGGS ή pC-LCMV-Z-Strep ή pC-LASV-Z-FLAG χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000. Στις 5 ώρες μετά τη διαμόλυνση, τα μέσα αντικαταστάθηκαν με φρέσκα μέσα και επωάστηκαν στους 37˚C και 5% CO 2 για 19 ώρες. Στη συνέχεια τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με φρέσκο ​​μέσο. Μετά την απομάκρυνση του τελευταίου μέσου πλύσης, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο που περιείχε ουαμπαϊνη (30 ή 40 nM) ή ροκαγλαμίδη (50 ή 100 nM) ή ισοδύναμη συγκέντρωση DMSO και 24 ώρες αργότερα, σωματίδιο που μοιάζει με ιό (VLP)- που περιείχε TCS και συλλέχθηκαν κύτταρα. Το ολικό κυτταρόλυμα παρασκευάστηκε με λύση των κυττάρων με ρυθμιστικό λύσης (1% ΝΡ-40, 50 mM Tris-HCl [ρΗ 8,0], 62,5 mM NaCl, 0,4% δεοξυχολικό νάτριο). Μετά τη διαύγαση του TCS από τα κυτταρικά υπολείμματα με φυγοκέντρηση στα 400 x g και στους 4˚C για 10 λεπτά, τα VLP συλλέχθηκαν με υπερφυγοκέντρηση στα 100.000 x g και στους 4˚C για 30 λεπτά μέσω ενός μαξιλαριού σακχαρόζης 20%. Τα VLP επαναιωρήθηκαν σε PBS και η έκφραση του Ζ στο ολικό κυτταρόλυμα και το TCS (που περιέχει VLPs) αναλύθηκαν με στυπώματα western. Κύτταρα Α549 μολυσμένα με rLCMV/eGFP συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας διάλυμα αποκόλλησης κυττάρων Accutase (Innovative Cell Technologies, San Diego) και . σταθεροποιήθηκε με 4% PFA σε PBS. Η έκφραση eGFP εξετάστηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας BD LSR II (Becton Dickson) και τα δεδομένα αναλύθηκαν με FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR). Τα 293Τ κύτταρα σπάρθηκαν (4,0 x 105 κύτταρα/πηγάδι) σε 12 - τρυβλίο φρεατίου και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύχτα μολύνθηκαν με scrLCMV/ZsG-P2A-NP για 2 ώρες και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με 0,5 μg pC-GPC. Στις 24 ώρες pi, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με φρέσκο ​​μέσο για την εξάλειψη του μολυσματικού σωματιδίου του ιού που παρήχθη απουσία αγωγής με ένωση, και καλλιεργήθηκαν για άλλες 24 ώρες σε φρέσκο ​​μέσο παρουσία 40 ηΜ ουαμπαϊνης ή φορέα ελέγχου (DMSO). Στις 48 ώρες pi, το TCS συλλέχθηκε και χρησιμοποιήθηκε για να μολύνει φρέσκες μονοστοιβάδες κυττάρων ΒΗΚ-21 που σπάρθηκαν (4,0 χ 105 κύτταρα/φρεάτιο) σε πλάκα 12 φρεατίων 1 ημέρα πριν από τη μόλυνση, και παρασκευάστηκε κυτταρόλυμα 293Τ. 24 ώρες αργότερα, παρασκευάστηκε κυτταρόλυμα ΒΗΚ-21. Το ολικό κυτταρόλυμα παρασκευάστηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρικής λύσης (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl [pH = 7,5], 0,5% [NP-40], 1 mM EDTA] και διαυγάστηκε με φυγοκέντρηση στα 21.130 x g στους 4˚ C για 10 λεπτά. Η ένταση σήματος ZsGreen σε διαυγασμένο κυτταρόλυμα μετρήθηκε με συσκευή ανάγνωσης φθορισμού πλακών (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, BioTek). Τα κύτταρα A549 σπάρθηκαν (2 x 105 κύτταρα/φρεάτιο) σε ένα τρυβλίο 96 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύχτα. με συνδυασμούς διαφορετικών συγκεντρώσεων ουαμπαϊνης και ροκαγλαμίδης για 2 ώρες και στη συνέχεια μολύνθηκαν (MOI = 0,01) με rLCMV/eGFP. Οι ενώσεις ήταν παρούσες στο μέσο καλλιέργειας καθ' όλη τη διάρκεια του πειράματος. Στις 48 ώρες pi, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν, διαπερατήθηκαν με επεξεργασία με DB και χρωματίστηκαν με DAPI. Τα σήματα eGFP και DAPI μετρήθηκαν με συσκευή ανάγνωσης φθορισμού πλακών (Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader, BioTek). Οι αναγνώσεις του eGFP κανονικοποιήθηκαν με ενδείξεις DAPI και χρησιμοποιήθηκαν κανονικοποιημένα δεδομένα για την ανάλυση της συνεργιστικής επίδρασης των δύο ενώσεων με το πρόγραμμα MacSynergy II [89]. Τα δεδομένα αναλύθηκαν για τιμές p με μια δοκιμή μη ζευγαρωμένης t δύο ουρών χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 3181, "text": "ιός OW Lassa (LASV)" } ], "id": 5151, "question": "Ποια είναι η αιτία του πυρετού Lassa;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7688, "text": "τα επιθηλιακά κύτταρα του πνεύμονα είναι ένας από τους αρχικούς κυτταρικούς στόχους του ανθρώπου μετά από εισπνοή θηλαστικών ιόντων" } ], "id": 5153, "question": "Γιατί επιλέχθηκε η ανθρώπινη κυτταρική σειρά A549 για αυτήν τη μελέτη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 30214, "text": "48 h" } ], "id": 5154, "question": "Για πόσο καιρό μολύνθηκαν τα κύτταρα πριν από την ανάλυση;" }, { "answers": [ { "answer_start": 19098, "text": "ouabain" } ], "id": 5155, "question": "Ποιο φάρμακο χρησιμοποιείται για τη θεραπεία της συμφορητικής καρδιακής ανεπάρκειας;" }, { "answers": [ { "answer_start": 16283, "text": "ATP1A1" } ], "id": 5156, "question": "Τι αναστέλλει το ouabain;" }, { "answers": [ { "answer_start": 22599, "text": "συνδυαστική θεραπεία" } ], "id": 5157, "question": "Ποια μέθοδος μπορεί να ανακουφίσει σημαντικά την εμφάνιση ανθεκτικών στα φάρμακα παραλλαγών στις ιικές λοιμώξεις RNA;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2167, "text": "ATP1A1 και PHB" } ], "id": 5158, "question": "Ποιους παράγοντες απέδωσε αυτή η μελέτη στον αποτελεσματικό πολλαπλασιασμό των θηλαστικών ιών;" }, { "answers": [ { "answer_start": 38342, "text": "χρησιμοποιώντας γενετική και φαρμακολογική αναστολή των γονιδίων" } ], "id": 5159, "question": "Πώς προτείνουν οι συγγραφείς ότι το ATP1A1 και το PHB συμβάλλουν στον αποτελεσματικό πολλαπλασιασμό των θηλαστικών ιών;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Ιοί και εξέλιξη – Πρώτα οι ιοί; A Personal Perspectivehttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6433886/SHA: f3b9fc0f8e0a431366196d3e835e1ec368b379d1Συγγραφείς: Moelling, Karin; Broecker, FelixΗμερομηνία: 2019-03-19DOI: 10.3389/fmicb.2019.00523Άδεια: cc-byAbstract: Η ανακάλυψη εξωπλανητών σε υποτιθέμενες κατοικήσιμες ζώνες έφερε επανάσταση στην αστροβιολογία τα τελευταία χρόνια. Κέντρισε το ενδιαφέρον για το ερώτημα σχετικά με την προέλευση της ζωής και την εξέλιξή της. Εδώ, συζητάμε ποιος μπορεί να ήταν ο ρόλος των ιών στην αρχή της ζωής και κατά τη διάρκεια της εξέλιξης. Οι ιοί είναι οι πιο άφθονες βιολογικές οντότητες στη Γη. Είναι παρόντες παντού, στο περιβάλλον μας, στους ωκεανούς, στο έδαφος και σε κάθε ζωντανό ον. Οι ρετροϊοί συνέβαλαν στις μισές περίπου γονιδιωματικές αλληλουχίες μας και στην εξέλιξη του πλακούντα των θηλαστικών. Οι σύγχρονοι ιοί αντικατοπτρίζουν την εξέλιξη που κυμαίνεται από τον κόσμο του RNA έως τον κόσμο της πρωτεΐνης DNA. Πόσο πίσω μπορούμε να εντοπίσουμε τη συμβολή τους; Οι πρώτες αναπαραγόμενες και εξελισσόμενες οντότητες είναι τα ριβοένζυμα ή τα ιοειδή που πληρούν διάφορα κριτήρια ζωής. Το RNA μπορεί να εκτελέσει πολλές πτυχές της ζωής και επηρεάζει την έκφραση των γονιδίων μας μέχρι σήμερα. Οι απλούστερες δομές με πληροφορίες που δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες μπορεί να αντιπροσωπεύουν μοντέλα ζωής που βασίζονται σε δομικές και όχι γενετικές πληροφορίες. Οι ιοί σήμερα είναι υποχρεωτικά παράσιτα ανάλογα με τα κύτταρα-ξενιστές. Παραδείγματα για το πώς μπορεί να είχε χαθεί ένας ανεξάρτητος τρόπος ζωής περιλαμβάνουν τα μιτοχόνδρια, τους χλωροπλάστες, τη Rickettsia και άλλα, τα οποία ήταν αυτόνομα βακτήρια και έγιναν ενδοκυτταρικά παράσιτα ή ενδοσύμβιοι, χάνοντας έτσι τα περισσότερα γονίδιά τους. Ακόμη και in vitro η απώλεια γονιδίων μπορεί να ανακεφαλαιωθεί σε όλη τη διαδρομή από το κωδικοποιητικό έως το μη κωδικοποιητικό RNA. Επιπλέον, οι γιγάντιοι ιοί μπορεί να υποδεικνύουν ότι δεν υπάρχει αιχμηρό σύνορο μεταξύ ζώντων και μη ζωντανών οντοτήτων αλλά μια εξελικτική συνέχεια. Εδώ, συζητείται πώς οι ιοί μπορούν να χάσουν και να αποκτήσουν γονίδια και ότι είναι βασικοί οδηγοί της εξέλιξης. Αυτή η συζήτηση μπορεί να διεγείρει τη σκέψη για τους ιούς ως πρώιμες δυνατές μορφές ζωής. Εκτός από την άποψή μας «πρώτα οι ιοί», υπάρχουν και άλλοι όπως «πρώτα οι πρωτεΐνες» και «πρώτα ο μεταβολισμός». ) . Μπορεί κανείς να εξετάσει απλούστερες ζωντανές οντότητες; Υπάρχουν στοιχεία με μηδενικά γονίδια που πληρούν πολλά κριτήρια για την πρώιμη ζωή: ριβοένζυμα, καταλυτικά RNA που σχετίζονται στενά με τα ιοειδή. Ανακτήθηκαν in vitro από 10 15 μόρια (απταμερή), 220 νουκλεοτίδια σε μήκος, με 10 γύρους επιλογής. Μεταξύ των πολλών ειδών RNA που υπάρχουν σε αυτή τη συλλογή οιονεί ειδών, τα RNAs ήταν καταλυτικά ενεργά μέλη, ενζυμικά ενεργά ριβοένζυμα. Ο χώρος αλληλουχίας για RNA 220-μερών είναι περίπου 3 × 10 132 (Eigen, 1971; Wilson και Szostak, 1999; Brackett και Dieckmann, 2006). Τα επιλεγμένα ριβοένζυμα ήταν σε θέση να αναπαραχθούν, να διασπάσουν, να ενωθούν και να σχηματίσουν πεπτιδικούς δεσμούς. Μπορούν να πολυμερίσουν τους απογόνους χημικά, να επιτρέψουν την εμφάνιση μεταλλάξεων και να εξελιχθούν. Το ένα μόριο χρησιμεύει ως καταλύτης και το άλλο ως υπόστρωμα. Ο αναδιπλασιασμός των ριβοζύμων καταδείχθηκε στον δοκιμαστικό σωλήνα (Lincoln and Joyce, 2009). Τα ριβοένζυμα μπορούν να σχηματίσουν πεπτιδικούς δεσμούς μεταξύ αμινοξέων (Zhang and Cech, 1997). Έτσι, μικρά πεπτίδια ήταν διαθέσιμα μέσω ριβοζυμικής δραστηριότητας. Κατά συνέπεια, μια τροποποίηση RNA έχει προταθεί ως πεπτιδικό νουκλεϊκό οξύ (PNA), με πιο σταθερούς πεπτιδικούς δεσμούς αντί για φωσφοδιεστερικούς δεσμούς (Zhang and Cech, 1997; Joyce, 2002). Η αντιγραφή των μορίων RNA μπορεί να πραγματοποιηθεί χημικά από RNA χωρίς ένζυμα πολυμεράσης. Επιπλέον, δεοξυριβόζυμα μπορούν να σχηματιστούν από ριβονουκλεοτίδια (Wilson and Szostak, 1999). Έτσι, το DNA μπορεί να προκύψει από το RNA χημικά, χωρίς το βασικό πρωτεϊνικό ένζυμο, την αντίστροφη μεταγραφάση. Ένας ολόκληρος ζωντανός κόσμος είναι δυνατός από το μη κωδικοποιητικό RNA (ncRNA) πριν από την εξέλιξη του γενετικού κώδικα και των πρωτεϊνικών ενζύμων. Τα ριβοένζυμα αποτελούνται φυσικά από κυκλικά μονόκλωνα RNA (Orgel, 2004). Δεν έχουν τον γενετικό κώδικα τριπλής και δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Αντίθετα, παρουσιάζουν δομικές πληροφορίες από βρόχους φουρκέτας που σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου μεταξύ ημιτελών διπλών κλώνων και βρόχους ελεύθερους να αλληλεπιδρούν με άλλα μόρια. Αντιπροσωπεύουν ένα οιονεί είδος στο οποίο μπορεί να σχηματιστούν πολλά είδη RNA, όπως ριβοένζυμα, μόρια που μοιάζουν με tRNA και άλλα ncRNA. Τα RNA μέσα σε μια τέτοια δεξαμενή μπορούν να δεσμεύσουν αμινοξέα. Ενενήντα διαφορετικά αμινοξέα έχουν εντοπιστεί στον μετεωρίτη Murchison που βρέθηκε στην Αυστραλία, ενώ στη Γη μόνο περίπου 20 από αυτά χρησιμοποιούνται για τη σύνθεση πρωτεϊνών (Meierhenrich, 2008). Το πού συνέβη ο σχηματισμός ριβοζύμων στην πρώιμη Γη είναι θέμα εικασίας. Οι υδροθερμικές οπές, όπως οι μαύροι καπνιστές στα βαθιά του ωκεανού, είναι πιθανότητες όπου μπορεί να έχει ξεκινήσει η ζωή (Martin et al., 2008). Εκεί διατίθενται βαθμίδες θερμοκρασίας και άργιλος που περιέχει μέταλλα όπως μαγνήσιο ή μαγγάνιο. Οι πόροι ή οι κόγχες προσφέρουν δυνατότητες συγκέντρωσης δομικών στοιχείων, που απαιτούνται για να συμβούν χημικές αντιδράσεις. Είναι ενδιαφέρον ότι επίσης ο πάγος είναι υποψήφιος για σχηματισμό ριβοζύμων και χημικές αντιδράσεις. Οι κρύσταλλοι πάγου μετατοπίζουν τα βιομόρια στην υγρή φάση, η οποία οδηγεί σε συγκέντρωση, δημιουργώντας μια οιονείκυτταρική διαμερισματοποίηση όπου προωθείται η de novo σύνθεση προδρόμων νουκλεοτιδίων. Εκεί, μπορούν να προκύψουν RNA και ριβοένζυμα, τα οποία είναι ικανά για αυτο-αντιγραφή (Attwater et al., 2010) Τα σύμπλοκα .tRNA-αμινοξέων μπορούν να βρουν RNA ως «mRNAs». Τέτοιες αλληλεπιδράσεις θα μπορούσαν να έχουν συμβάλει στην εξέλιξη του γενετικού κώδικα. Αυτή η αλληλουχία γεγονότων μπορεί να οδηγήσει σε πρωτόγονους πρόδρομους ριβοσώματος. Τα ριβόζυμα είναι τα βασικά καταλυτικά στοιχεία στα ριβοσώματα: \"Το ριβόσωμα είναι ριβόζυμο\" (Cech, 2000) , συμπληρωμένο με περίπου εκατό πρωτεΐνες ικριώματος αργότερα κατά την εξέλιξη. Οι πρωτεΐνες έχουν δομικές λειτουργίες και συμβάλλουν έμμεσα στην ενζυματική δραστηριότητα. Είναι αυτά τα ριβοσωμάτια δεσμευμένα ριβοένζυμα απολιθώματα από την πρώιμη Γη; Μικρά πεπτίδια μπορούν να σχηματιστούν από τα ριβοένζυμα πριν από την εξέλιξη των ριβοσωμάτων, όπου τα μεμονωμένα ή διμερή αμινοξέα μπορεί να προέρχονται από το σύμπαν (Meierhenrich, 2008). , 1994). Τέτοιες πρωτεΐνες είναι γνωστές ως πρωτεΐνες δέσμευσης RNA από ιούς RNA που προστατεύουν το γονιδίωμα RNA, με μοτίβα όπως το RAPRKKG του νουκλεοκαψιδίου NCp7 του HIV (Schmalzbauer et al., 1996). Τα πεπτίδια μπορούν να ενισχύσουν την καταλυτική δράση των ριβοζύμων έως και 100 φορές (Müller et al., 1994). Τέτοια πεπτίδια ιών RNA χρησιμεύουν ως συνοδοί που αφαιρούν δομές RNA υψηλότερης τάξης, επιτρέποντας πιο αποτελεσματική αλληλεπίδραση των μορίων RNA και αυξάνοντας τους ρυθμούς μεταγραφής των πολυμερασών RNA (Müller et al., 1994). Οι ριβονουκλεοπρωτεΐνες μπορεί επίσης να ήταν λειτουργικά σημαντικές κατά την εξέλιξη των ριβοσωμάτων (Harish and Caetano-Anolles, 2012). Αυτές οι προριβοσωμικές δομές είναι επίσης παρόμοιες με τις πρόδρομες δομές των ρετροϊών. Η αντίστροφη μεταγραφή μπορεί να πραγματοποιηθεί από ριβοένζυμα χημικά. Αυτή η δράση δεν απαιτεί απαραίτητα μια πρωτεϊνική πολυμεράση όπως η αντίστροφη μεταγραφάση. Ομοίως, τα δεοξυριβονουκλεοτίδια μπορούν να προκύψουν με την αφαίρεση ενός οξυγόνου χωρίς την ανάγκη ενός πρωτεϊνικού ενζύμου (μια αναγωγάση) όπως σήμερα, και να επιτρέπουν τον πολυμερισμό του DNA (Wilson and Szostak, 1999; Joyce, 2002). Τα ίδια στοιχεία των προδρόμων για τα ριβοσώματα είναι επίσης δομικά στοιχεία των ρετροϊών, οι οποίοι μπορεί να έχουν παρόμοια εξελικτική προέλευση (Moelling, 2012 (Moelling, 2013. Τα tRNA χρησιμεύουν ως εκκινητές για την αντίστροφη μεταγραφάση και η αλληλουχία των προαγωγών των μετατιθέμενων στοιχείων είναι που προέρχονται από tRNA (Lander et al., 2001). Τα ριβοένζυμα αναπτύχθηκαν σε πιο πολύπλοκα εσώνια της ομάδας ΙΙ που αυτοδιασπώνται με την εισαγωγή γονιδίων που κωδικοποιούν μια αντίστροφη μεταγραφάση και πρόσθετες πρωτεΐνες (Moelling and Broecker, 2015; Moelling et al., 2017) (Εικόνα 1) .Ήταν έκπληξη το γεγονός ότι τα γονιδιώματα σχεδόν όλων των ειδών είναι πλούσια σε ncDNA, που μεταγράφονται σε ncRNA αλλά δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες, όπως αποδεικνύεται, για παράδειγμα, από την «Εγκυκλοπαίδεια Στοιχείων DNA \" (ENCODE) έργο. Το ncDNA αντιστοιχεί σε περισσότερο από το 98% του γονιδιώματος του ανθρώπινου DNA (Deveson et al., 2017). Οι ανώτεροι οργανισμοί τείνουν να έχουν περισσότερες μη κωδικοποιητικές πληροφορίες, γεγονός που επιτρέπει πιο πολύπλοκους τρόπους γονιδιακής ρύθμισης. Τα ncRNA είναι ρυθμιστές των αλληλουχιών που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Οι εξαιρετικά πολύπλοκοι οργανισμοί όπως οι άνθρωποι έχουν συνήθως μεγάλο αριθμό ncRNA και ρυθμιστικούς μηχανισμούς. Το ncRNA μπορεί να κυμαίνεται από κοντά στο μηδέν στα μικρότερα βακτήρια όπως το Pelagibacter ubique έως περίπου 98% στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Οι ιοί RNA όπως ο ρετροϊός HIV φιλοξενούν ncRNAs για γονιδιακή ρύθμιση όπως το trans-ενεργοποιητικό στοιχείο απόκρισης (TAR), τη σύνδεση θέση για την πρωτεΐνη Tat για την πρώιμη ιική γονιδιακή έκφραση. Το Tat έχει μια εξαιρετικά βασική περιοχή που περιλαμβάνει κυρίως υπολείμματα Lys και Arg, που μοιάζουν με άλλες πρωτεΐνες δέσμευσης RNA. Το ncRNA χρησιμεύει επίσης σε γονιδιώματα ιικού RNA ως θέσεις εισόδου ριβοσωμάτων, θέσεις δέσμευσης εκκινητών ή σήματα συσκευασίας. Η σύνθεση του DNA εξαρτάται από τη σύνθεση RNA ως αρχικό γεγονός, με εκκινητές RNA ως εκκινητές για την αντιγραφή του DNA, στο εσωτερικό των κυττάρων όπως ΕΙΚΟΝΑ 1 | Εμφανίζεται ένα διαμέρισμα με βασικά στοιχεία της ζωής, όπως συζητείται στο κείμενο. Το μη κωδικοποιητικό RNA (ncRNA), τα ριβοένζυμα ή τα ιοειδή, μπορούν να εκτελέσουν πολλά βήματα για τη ζωή χωρίς γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, αλλά μόνο με δομικές πληροφορίες. Τα μεμονωμένα αμινοξέα υποδεικνύονται ως μαύρες κουκκίδες και μπορεί να είναι διαθέσιμα στη Γη από το σύμπαν. Το DNA μπορεί να υπήρχε πριν από τους ρετροϊούς. Το διαμέρισμα μπορεί να ερμηνευθεί ως προ-ιός ή προ-κύτταρο. Viroid, πράσινο; RNA, κόκκινο; DNA, μαύρο. καθώς και κατά τη διάρκεια της ρετροϊικής αντιγραφής, που αποδεικνύει την απαίτηση RNA (Flint, 2015). Ο αριθμός των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες θηλαστικών είναι περίπου 20.000. Παραδόξως, αυτό είναι μόνο το ένα πέμπτο του αριθμού των γονιδίων του σιταριού ψωμιού (Appels et al., 2018) . Οι τουλίπες, ο καλαμπόκι και άλλα φυτά έχουν επίσης μεγαλύτερα γονιδιώματα, γεγονός που δείχνει ότι ο αριθμός των γονιδίων δεν αντικατοπτρίζει απαραίτητα την πολυπλοκότητα ενός οργανισμού. Τι κάνει αυτά τα φυτικά γονιδιώματα τόσο μεγάλα, παραμένει ένα ανοιχτό ερώτημα. Θα μπορούσαν τα γιγάντια γονιδιώματα να είναι αποτέλεσμα αναπαραγωγής φυτών από αγρότες ή κηπουρούς;Σύμφωνα με τον Szostak υπάρχουν μόρια που φαίνονται σαν λείψανα από τον κόσμο του RNA, όπως το ακετυλο-CoA ή η βιταμίνη Β12, και τα δύο είναι συνδεδεμένα με ένα ριβονουκλεοτίδιο για κανένα προφανής λόγος - «ξεχάστηκε» να αφαιρεθεί; (Roberts and Szostak, 1997; Szostak et al., 2001; Szostak, 2011). Ίσως το συνδεδεμένο RNA να χρησιμεύει ως δομικός σταθεροποιητής. Τα λιπιδικά κυστίδια θα μπορούσαν να έχουν σχηματίσει τα πρώτα διαμερίσματα και να περικλείουν ριβοένζυμα, tRNA με επιλεγμένα αμινοξέα και RNA που έγινε mRNA. Είναι προ-κυτταρικός ή προ-ιός (Εικόνα 1); Patel et al. (2015) απέδειξε ότι τα δομικά στοιχεία της ζωής, τα ριβονουκλεοτίδια, τα λιπίδια και τα αμινοξέα, μπορούν να σχηματιστούν από τα C, H, O, P, N, S σε μια σύνθεση \"one pot\". Αυτή η μελέτη μπορεί να θεωρηθεί ως μια μελέτη παρακολούθησης της κλασικής σύνθεσης βιομορίων in vitro Urey-Miller (Miller, 1953; Miller και Urey, 1959). Η μετάβαση από το RNA στον κόσμο του DNA προωθήθηκε με το σχηματισμό της αντίστροφης μεταγραφάσης. Το ένζυμο περιγράφηκε για πρώτη φορά σε ρετροϊούς, αλλά είναι σχεδόν πανταχού παρόν και βρίσκεται σε πολλά κυτταρικά είδη, πολλά από τα οποία με άγνωστες λειτουργίες (Simon and Zimmerly, 2008; Lescot et al., 2016). Είναι ένας σημαντικός σύνδεσμος μεταξύ του RNA και του κόσμου του DNA. Η ονομασία ανάστροφη μεταγραφάση είναι ιστορική και ερεθιστική γιατί είναι η «πραγματική» μεταγραφάση κατά τη μετάβαση από το RNA στον κόσμο του DNA. Παρομοίως, η ριβονουκλεάση Η (RNase Η) είναι ένα βασικό ένζυμο των ρετροϊών (Mölling et al., 1971). Η RNase H αποδείχθηκε ότι είναι μία από τις πέντε πιο συχνές και αρχαίες πρωτεΐνες (Ma et al., 2008) που ανήκει σε μια υπεροικογένεια περισσότερων από εξήντα διαφορετικών μοναδικών εκπροσώπων και 152 οικογενειών με πολυάριθμες λειτουργίες (Majorek et al., 2014) .Μερικά από τα πολλά tRNA μπορούν να φορτωθούν με αμινοξέα. Υπάρχουν ιοί που περιέχουν δομές που μοιάζουν με tRNA (TLS), που μοιάζουν με αυτά τα πρώιμα RNA (Dreher, 2009). Το TLS αυτών των ιών συνήθως συνδέεται με ένα μόνο αμινοξύ. Οι ιοί TLS περιλαμβάνουν φυτικούς ιούς, όπως τον ιό του κίτρινου μωσαϊκού του γογγύλι, τον ιό του μωσαϊκού του φυστικιού, τον ιό του μωσαϊκού καπνού (TMV) και τον ιό του μωσαϊκού Brome. Μόνο το μισό tRNA βρίσκεται στους Narnaviruses των μυκήτων. Τα αμινοξέα που είναι γνωστό ότι αποτελούν συστατικά ιών που μοιάζουν με tRNA είναι η βαλίνη, η ιστιδίνη και η τυροσίνη. Οι δομές χαρακτηρίστηκαν επίσης ως «μίμηση», ενισχύοντας τη μετάφραση (Dreher, 2009 (Dreher, , 2010 . Μοιάζουν με «κατεψυγμένα» στοιχεία που μοιάζουν με πρόδρομα για την πρωτεϊνοσύνθεση. Αυτός ο συνδυασμός ενός μερικού tRNA που συνδέεται με ένα αμινοξύ μπορεί να ερμηνευθεί ως ένα πρώιμο εξελικτικό βήμα προς την πρωτεϊνοσύνθεση, παγιδευμένο σε ένα ιικό στοιχείο. Τα ριβοένζυμα σχετίζονται με τα ελεύθερα πρωτεϊνών ιοειδή. Τα ιοειδή είναι στοιχεία που μοιάζουν με ιούς που ανήκουν στην ιοσφαίρα, τον κόσμο των ιών (Chela-Flores, 1994). Τα ιοειδή στερούνται πρωτεϊνικής επικάλυψης και επομένως αρχικά δεν χαρακτηρίστηκαν ως ιοί αλλά ως ιοειδή ιοειδή όταν ανακαλύφθηκαν το 1971 από τον Theodor Diener. Περιέγραψε τα ιοειδή ως «ζωντανά απολιθώματα» (Diener, 2016) (Εικόνα 2) . Από μολυσμένες πατάτες, ο Diener απομόνωσε το Potato Spindle Tuber Viroid (PSTVd) του οποίου το γονιδίωμα ήταν περίπου 100 φορές μικρότερο από εκείνο των ιών που ήταν γνωστοί εκείνη την εποχή. Τα γνωστά σήμερα ιοειδή κυμαίνονται από 246 έως 467 νουκλεοτίδια. Περιέχουν κυκλικό μονόκλωνο RNA, είναι απαλλαγμένα από πρωτεΐνες και αυτοαναπαραγόμενα χωρίς γενετικές πληροφορίες, αλλά μόνο δομικά ΣΧΗΜΑ 2 | Τα ιοειδή είναι δομές βρόχου φουρκέτας και εμφανίζονται σχηματικά και ως ηλεκτρονική μικρογραφία. Τα ιοειδή είναι, όπως τα ριβοένζυμα, χωρίς γενετικές πληροφορίες και παίζουν σημαντικό βιολογικό ρόλο σήμερα στις ασθένειες των φυτών, στα άνθη γαρύφαλλου, στον καρκίνο του ήπατος, ως καταλύτης της πρωτεϊνικής σύνθεσης στα ριβοσώματα και ως κυκλικά ρυθμιστικά RNA, ως «σφουγγάρια» για άλλα ρυθμιστικά RNA.πληροφορίες με τη μορφή φουρκέτας (Riesner et al., 1979). Μπορούν να δημιουργήσουν αντίγραφα του εαυτού τους στο κατάλληλο περιβάλλον. Χαρακτηρίστηκαν ως τα «σύνορα της ζωής» (Flores et al., 2014). Η γνώση της σύνθεσης του ιού βασίστηκε στο TMV και την κρυστάλλωσή του από τον Wendell Stanley το 1935 (Pennazio and Roggero, 2000). Το γονιδίωμα του TMV είναι μονόκλωνο RNA που κωδικοποιεί πρωτεΐνη περίπου 6.400 νουκλεοτιδίων που περικλείεται από μια πρωτεϊνική επικάλυψη που μοιάζει με ράβδο. Τα ιοειδή, αντίθετα, δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες και στερούνται επικαλύψεων, αλλά σχετίζονται στενά με τους ιούς. Τα ιοειδή μπορεί να χάσουν την αυτονομία τους και να βασίζονται σε πολυμεράσες RNA του ξενιστή για να αναπαραχθούν, είναι ικανά να μολύνουν φυτά και πολλά είναι οικονομικά σημαντικά παθογόνα. Υπάρχουν δύο οικογένειες, οι Pospiviroidae που αναπαράγονται με πυρήνα, όπως το PSTVd ​​και οι Avsunviroidae που αναπαράγονται με χλωροπλάστες, όπως το ιοειδές ηλιακής κηλίδας του Avocado (ASBVd). Η αντιγραφή τους απαιτεί ένζυμα ξενιστή. Έτσι, η αυτονομία αντικαθίσταται από την εξάρτηση από τα ένζυμα του ξενιστή και έναν ενδοκυτταρικό τρόπο ζωής. Τα περισσότερα ιοειδή είναι συχνά ενζυμικά ενεργά ριβοένζυμα - ωστόσο είναι παραδείγματα ότι αυτό το χαρακτηριστικό μπορεί να χαθεί ως αποτέλεσμα της αλλαγής των περιβαλλοντικών συνθηκών. Η απώλεια της ριβοζυμικής δραστηριότητας είναι λειτουργική και όχι γενετική απώλεια. Μόνο οι πυρηνικές παραλλαγές, οι Pospiviroidae, μπορούν να χάσουν τη ριβοενζυμική τους δραστηριότητα και να χρησιμοποιήσουν το κυτταρικό ένζυμο RNase III για την αντιγραφή τους. Αντίθετα, τα Avsunviroidae εξακολουθούν να είναι ενεργά ριβοένζυμα σφυροκέφαλου. Έτσι, μέσα στον πυρήνα ενός κυττάρου ξενιστή, η ενζυμική λειτουργία RNA μπορεί να καταστεί περιττή. Όχι γονίδια, αλλά μια λειτουργία, η καταλυτική δραστηριότητα, χάνεται. Τα ιοειδή προφανώς δεν κέρδισαν γονίδια, αλλά συνεργάστηκαν για έναν πιο περίπλοκο τρόπο ζωής. Για παράδειγμα, το RNA που μοιάζει με μικρό ιοειδή γαρύφαλλο (CarSV RNA) συνεργάζεται με έναν ρετροϊό και συνοδεύεται από ένα ομόλογο DNA που δημιουργείται από μια αντίστροφη μεταγραφάση. Αυτό το ένζυμο προέρχεται πιθανώς από έναν παραρετροϊό φυτών. Οι παραρετροϊοί συσκευάζουν τα σωματίδια του ιού σε διαφορετικό στάδιο κατά τη διάρκεια της αντιγραφής από τους ρετροϊούς, το DNA, όχι το RNA. Αυτός ο μοναδικός συνδυασμός μεταξύ δύο ιικών στοιχείων έχει μέχρι στιγμής ανιχνευθεί μόνο με το CarSV σε άνθη γαρύφαλλου (Flores et al., 2005 (Flores et al., 2014. Γιατί εξελίχθηκε μια τέτοια συνεργασία -ίσως εκτρέφοντας κηπουρούς; Το RNA είναι ευαίσθητο στην αποικοδόμηση. Επομένως, η γενετική αύξηση και ανάπτυξη του γονιδιώματος μπορεί να μην είναι ευνοϊκή ενεργειακά - τουλάχιστον όχι στα φυτά. Το κέρδος λειτουργίας είναι, σε αυτή την περίπτωση, συνεργασία. Το κυκλικό RNA (circRNA) σχετίζεται με τα ριβοένζυμα/ιοειδή ως κύριος ρυθμιστής άλλων ρυθμιστικών RNA, ένα «σφουγγάρι» που απορροφά μικρά RNA. Τα Micro RNA (miRNAs) είναι μετα-μεταγραφικοί ρυθμιστές που επηρεάζονται από την παρουσία circRNA. Τα circRNA ανιχνεύθηκαν σε εγκεφάλους και όρχεις ανθρώπου και ποντικού καθώς και σε φυτά. Μπορούν να δεσμεύσουν 70 διατηρημένα miRNA σε ένα κύτταρο και ανέρχονται σε 25.000 μόρια (Hansen et al., 2013). Η δομή τους θυμίζει καταλυτικά ενεργά ριβοένζυμα. Υπάρχει ένα εξαιρετικό ιοειδές που απέκτησε κωδικοποιητικές πληροφορίες και εισήλθε στο ανθρώπινο ήπαρ (Taylor, 2009). Το ιοειδές είναι γνωστό ως ιός δέλτα ηπατίτιδας (HDV). Έχει το μικρότερο γονιδίωμα από οποιονδήποτε γνωστό ζωικό ιό με περίπου 1.680 νουκλεοτίδια. Έχει ιδιότητες χαρακτηριστικές των ιοειδών, καθώς περιέχει circRNA, σχηματίζει παρόμοιες φουρκέτες και αντιγράφεται στον πυρήνα χρησιμοποιώντας ένζυμα ξενιστή. Δύο πολυμεράσες πρέπει να ανακατευθύνουν την ειδικότητά τους από το DNA στο RNA για να δημιουργήσουν το γονιδίωμα και το αντιγονιδίωμα HDV. Και τα δύο έχουν ριβοζυμική δράση. Σε αντίθεση με άλλα ριβοένζυμα, το HDV κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη, το αντιγόνο δέλτα της ηπατίτιδας (HDVAg) που εμφανίζεται σε δύο μορφές, το μικρό-HDVAg (24 kDa) που υποστηρίζει την αντιγραφή και το μεγάλο-HDVAg (27 kDa) που βοηθά στη συναρμολόγηση του ιού. Το γονίδιο πιθανώς ελήφθη από το κύτταρο ξενιστή με ανασυνδυασμό του ενδιάμεσου mRNA του HDV με ένα mRNA ξενιστή. Η μετάδοση εξαρτάται από έναν βοηθητικό ιό, τον ιό της ηπατίτιδας Β (HBV), ο οποίος παρέχει το τρίχωμα (Taylor, 2009) Η συσκευασία από έναν βοηθητικό ιό προστατεύει το γονιδίωμα και έτσι επιτρέπει την ύπαρξη ενός μεγαλύτερου ιού; Στα φυτά, τα ιοειδή μπορεί να μην είναι ικανά να γίνουν μεγαλύτερα πιθανώς λόγω της ευαισθησίας τους στην υποβάθμιση -αλλά δεν μπορούν να γίνουν και πολύ μικρότερα. Είναι γνωστό μόνο ένα μεμονωμένο ιοειδές που αποτελείται πλήρως από RNA που κωδικοποιεί πρωτεΐνες με τρίδυμα (AbouHaidar et al., 2014). Τα ιοειδή και τα σχετικά αναδιπλασιαζόμενα RNA είναι επιρρεπείς σε σφάλματα αναδιπλασιαζόμενες μονάδες και η συχνότητα σφάλματος επιβάλλει ένα ορισμένο ελάχιστο μέγεθος σε αυτά, καθώς διαφορετικά θα εξαφανίζονταν. Αυτός ο μηχανισμός έχει περιγραφεί ως «καταστροφή σφάλματος», που εμποδίζει την επιβίωση (Eigen, 1971 (Eigen, , 2013). Τα ιοειδή και τα σχετικά RNA είναι τα μικρότερα γνωστά αντίγραφα. Τα μικρότερα θα εξαφανίζονταν απουσία συστημάτων επιδιόρθωσης. Συνοπτικά, το RNA μπορεί να καταλύσει πολλές αντιδράσεις. Τα πρωτεϊνικά ένζυμα που μπορεί να έχουν εξελιχθεί αργότερα έχουν υψηλότερη καταλυτική δράση. Τα ριβοένζυμα είναι φορείς πληροφοριών, αλλά δεν απαιτούν κωδικοποιητικά γονίδια. Οι πληροφορίες αποθηκεύονται με τη σειρά και τη δομή τους. Έτσι, η αντιγραφή ενός αρχικού RNA ακολουθείται από ροή πληροφοριών, από DNA σε RNA σε πρωτεΐνη, όπως περιγράφεται στο Central Dogma (Crick, 1968). Ακόμη και μια ροή πληροφοριών από την πρωτεΐνη στο DNA έχει περιγραφεί για ορισμένες αρχαϊκές πρωτεΐνες (Béguin et al., 2015). Ο κόσμος της πρωτεΐνης DNA περιέχει πολλά ncRNA με βασικές λειτουργίες. Το ncRNA μπορεί να χρησιμεύσει ως πρότυπο ένωση για την προέλευση της ζωής σε άλλους πλανήτες. Ως εκ τούτου, δεν έχει πρωταρχική σημασία η χημική σύνθεση αυτού του μορίου, αλλά η απλότητα και η πολυλειτουργικότητά του. Επιπλέον, το RNA είναι λογισμικό και υλικό σε ένα μόνο μόριο, γεγονός που το καθιστά μοναδικό στον κόσμο μας. Υπάρχουν και άλλα σενάρια εκτός από τα σενάρια που συζητήθηκαν εδώ «πρώτα ο ιός», όπως «πρώτα πρωτεΐνες», «μεταβολισμός-γροθιά» ή «ο κόσμος των λιπιδίων» (Segré et al., 2001; Andras and Andras, 2005; Vasas et al., 2010; Moelling, 2012). Μερικές από αυτές τις εναλλακτικές έννοιες χτίστηκαν στη φυλογονιδιωματική, την ανακατασκευή του δέντρου της ζωής με αλληλούχιση γονιδιώματος (Delsuc et al., 2005). Παραδόξως, ήταν ο Sir Francis Crick, ένας από τους ανακαλυπτές της διπλής έλικας του DNA, που δήλωσε ότι δεν θα εκπλαγεί για έναν κόσμο πλήρως κατασκευασμένο από RNA. Μια παρόμοια πρόβλεψη έγινε από τον Walter Gilbert (Crick, 1968; Gilbert, 1986). Τι όραμα! Ο κόσμος μας σχεδόν 50 χρόνια αργότερα ορίστηκε ως κόσμος «RNAprotein» (Altman, 2013). Κάποιος μπορεί να υποθέσει ότι ο κόσμος μας χτίστηκε από ριβοένζυμα ή ιοειδή, που σημαίνει «πρώτα οι ιοί. «Τα ncRNA εμφανίζονται ως λείψανα από τον κόσμο του παρελθόντος RNA, πριν από την εξέλιξη του DNA, του γενετικού κώδικα και των πρωτεϊνών. Ωστόσο, το ncRNA είναι απαραίτητο στον κόσμο του βιολογικού DNA μας σήμερα. Είναι δυνατό να παραχθεί τέτοιο ncRNA σήμερα στον δοκιμαστικό σωλήνα με απώλεια γονιδιακής πληροφορίας από RNA που κωδικοποιεί πρωτεΐνη. Αυτή η αναγωγή σε ncRNA αποδείχθηκε in vitro με RNA φάγου. Το γονιδιωματικό RNA του φάγου Qβ, μήκους 4.217 νουκλεοτιδίων, επωάστηκε παρουσία ρεπλικάσης Qβ, ελεύθερων νουκλεοτιδίων και αλάτων, ένα πλούσιο περιβάλλον στον δοκιμαστικό σωλήνα. Το RNA αφέθηκε να αντιγραφεί μέσω της αντιγραφής Qβ. Η σειριακή μεταφορά κλασμάτων σε φρέσκο ​​μέσο οδήγησε σε όλο και ταχύτερους ρυθμούς αντιγραφής και μείωση του γονιδιωματικού μεγέθους, σε 218 νουκλεοτίδια ncRNA σε 74 γενιές. Αυτή η μελέτη έδειξε ότι, ανάλογα με τις περιβαλλοντικές συνθήκες, μπορεί να λάβει χώρα μια ακραία γονιδιακή μείωση. Αυτό το πείραμα που πραγματοποιήθηκε το 1965 χαρακτηρίστηκε ως «Τέρας του Spiegelman». Το κωδικοποιητικό RNA έγινε αντιγραφικό ncRNA (Spiegelman et al., 1965; Kacian et al., 1972)! Ο Manfred Eigen επέκτεινε αυτό το πείραμα και έδειξε περαιτέρω ότι ένα μείγμα που δεν περιέχει RNA για αρχή αλλά μόνο ριβονουκλεοτίδια και η ρεπλικάση Qβ μπορεί κάτω από τις κατάλληλες συνθήκες σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα να δημιουργήσει αυθόρμητα αυτοαντιγραφόμενο ncRNA. Αυτό εξελίχθηκε σε μια μορφή παρόμοια με το Monster του Spiegelman. Η παρουσία του ενζύμου ρεπλικάση ήταν ακόμη απαραίτητη σε αυτές τις μελέτες. Επιπλέον, μια αλλαγή στη συγκέντρωση του ενζύμου και η προσθήκη βραχέων RNA ή ενός παρεμβολέα RNA επηρέασε τον προκύπτοντα πληθυσμό RNA (Sumper and Luce, 1975; Eigen, 2013). Έτσι, η πολυπλοκότητα των γονιδιωμάτων εξαρτάται από το περιβάλλον: οι κακές συνθήκες οδηγούν σε αυξημένη πολυπλοκότητα και τα πλούσια περιβάλλοντα σε μειωμένη πολυπλοκότητα. Η διαδικασία που αποδείχθηκε σε αυτό το πείραμα με ιικά συστατικά δείχνει ότι η επαναφορά στην απλότητα, η μείωση του μεγέθους, η απώλεια γενετικών πληροφοριών και η ταχύτητα Η αναπαραγωγή μπορεί να είναι σημαντικές δυνάμεις της ζωής, παρόλο που αυτό φαίνεται να είναι σαν μια αναστροφή της εξέλιξης. Το πείραμα μπορεί ίσως να γενικευτεί από τον δοκιμαστικό σωλήνα σε μια αρχή, ότι οι πιο επιτυχημένοι επιζώντες στον πλανήτη μας είναι οι ιοί και οι μικροοργανισμοί, που έγιναν οι πιο άφθονες οντότητες. Ίσως η ζωή μπορεί να ξεκινήσει ξανά από εκεί. Αυτές οι μελέτες θέτουν το ερώτημα πώς τα μόρια RNA μπορούν να γίνουν μακρύτερα, εάν τα μικρά πολυμερή γίνονται όλο και μικρότερα, αναπαράγονται ταχύτερα και ανταγωνίζονται μεγαλύτερα. Αυτό μπορεί να ξεπεραστεί με τη ροή θερμότητας σε έναν ανοιχτό πόρο σε βυθισμένα πετρώματα, τα οποία συγκεντρώνουν τα αναδιπλασιαζόμενα ολιγονουκλεοτίδια από μια σταθερή ροή τροφοδοσίας και την επιλογή για μακρύτερους κλώνους. Αυτό έχει περιγραφεί για αύξηση από 100 σε 1.000 νουκλεοτίδια in vitro. Μόρια RNA μικρότερα από 75 νουκλεοτίδια θα εξαφανιστούν (Kreysing et al., 2015). Θα μπορούσε ένα φτωχό περιβάλλον να οδηγήσει σε αύξηση της πολυπλοκότητας; Αυτό θα μπορούσε να δοκιμαστεί. Τα ριβοένζυμα φάνηκε να αυξάνονται σε μέγεθος με την πρόσληψη γονιδίων, όπως αποδεικνύεται για το HDV (Taylor, 2009). Ένα ενδιαφέρον πρόσφατο απροσδόκητο παράδειγμα που υποστηρίζει την ιδέα ότι οι περιβαλλοντικές συνθήκες επηρεάζουν τη γενετική πολυπλοκότητα, είναι το μικροβίωμα του ανθρώπινου εντέρου. Η πολυπλοκότητά του αυξάνεται με τα διάφορα τρόφιμα, ενώ η ομοιόμορφη πλούσια τροφή μειώνει την ποικιλομορφία του και μπορεί να οδηγήσει σε ασθένειες όπως η παχυσαρκία. Ο αποικισμός του ανθρώπινου εντερικού σωλήνα ξεκινά από τη γέννηση. Μερικές δεκάδες είδη βακτηρίων και ιών/φάγων διατηρούνται μεταξύ ατόμων (πυρηνικές αλληλουχίες) ως σταθερή σύνθεση (Broecker et al., 2016c. Δυσβίωση έχει παρατηρηθεί σε αρκετές χρόνιες ασθένειες και στην παχυσαρκία, απώλεια βακτηριακού πλούτου και ποικιλότητας. Η διατροφή σε πλούσιες συνθήκες με τρόφιμα πλούσια σε ζάχαρη συμβάλλει στην παχυσαρκία, η οποία έχει ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση της πολυπλοκότητας του μικροβιώματος. Αυτή η μείωση είναι δύσκολο να αναστραφεί (Cotillard et al., 2013; Le Chatelier et al., 2013). Το μικροβίωμα του εντέρου σε ανθρώπους με παχυσαρκία θυμίζει τη γονιδιακή μείωση που περιγράφεται στο πείραμα του Spiegelman's Monster: μείωση των γονιδίων σε ένα πλούσιο περιβάλλον. Η μείωση της πολυπλοκότητας του μικροβιώματος αποδίδεται εν μέρει στη δράση των φάγων, οι οποίοι υπό τέτοια συνθήκες, που ορίζονται ως στρες, λύουν τα βακτήρια. Η μεταμόσχευση μικροχλωρίδας κοπράνων μπορεί ακόμη και να αντικατασταθεί από διαλυτά κλάσματα που περιέχουν φάγους ή μεταβολίτες από τον δότη χωρίς βακτήρια (Ott et al., 2017). Αντίστοιχα, τα πιο πολύπλοκα μικροβιώματα βρίσκονται σε αυτόχθονες ανθρώπινες φυλές στην Αφρική, οι οποίες ζουν με μια ευρεία ποικιλία διαφορετικών θρεπτικών συστατικών. Ωστόσο, είναι μια αργή διαδικασία για να αυξηθεί η πολυπλοκότητα της μικροχλωρίδας του εντέρου με ποικίλη διατροφή. Τα μικροχλωρίδια που σχετίζονται με την παχυσαρκία που επιβιώνουν είναι πιο κατάλληλα και πιο δύσκολο να αντιμετωπιστούν. Η αστικοποίηση και η εκδυτικοποίηση της διατροφής σχετίζεται με απώλεια μικροβιακής βιοποικιλότητας, απώλεια μικροβιακών οργανισμών και γονιδίων (Segata, 2015). Γονιδίωμα Salmonella enterica. Η απώλεια του γονιδίου δείκτη παρακολουθήθηκε με σειριακή διέλευση σε πλούσιο μέσο. Μετά από 1.000 γενιές περίπου το 25% των διαγραφών προκάλεσε αυξημένη βακτηριακή ικανότητα. Οι διαγραφές οδήγησαν σε μικρότερα γονιδιώματα με μειωμένα ή απουσία γονιδίων επιδιόρθωσης DNA (Koskiniemi et al., 2012). Η απώλεια γονιδίου προσέφερε υψηλότερη ικανότητα στα βακτήρια κάτω από αυτές τις πειραματικές συνθήκες. Οι μιμιοί που ανακαλύφθηκαν πρόσφατα και άλλοι γιγάντιοι ιοί αξίζει να εξεταστούν για την κατανόηση της εξέλιξης της ζωής σε σχέση με τη συμβολή των ιών. Οι οικοδεσπότες τους είναι, για παράδειγμα, τα φύκια Acanthamoeba, Chlorella και Coccolithus (Emiliania huxleyi), αλλά και κοράλλια ή σφουγγάρια όπως συζητήθηκε πιο πρόσφατα. Οι μιμιοί ανακαλύφθηκαν για πρώτη φορά σε πύργους ψύξης νερού στο Μπράντφορντ του Ηνωμένου Βασιλείου το 2003 με περίπου 1.000 γονίδια, τα περισσότερα από τα οποία δεν σχετίζονται με παλαιότερα γνωστά γονίδια. Οι μιμιοί έχουν τραβήξει την προσοχή επειδή περιέχουν στοιχεία που θεωρήθηκαν χαρακτηριστικά των ζωντανών κυττάρων και όχι των ιών, όπως στοιχεία που απαιτούνται για τη σύνθεση πρωτεϊνών, tRNA και τρανσφεράσες αμινοξέων. Οι μιμιοί φιλοξενούν αυτά τα δομικά στοιχεία ως ελλιπή σύνολα που δεν επαρκούν για την ανεξάρτητη πρωτεϊνοσύνθεση καθώς μπορούν να εκτελέσουν τα βακτήρια ή τα αρχαία, εμποδίζοντάς τα να ζήσουν μια αυτόνομη ζωή (La Scola et al., 2003 Scola et al., 2008. Είναι μεγαλύτερα από ορισμένα βακτήρια. Οι γιγάντιοι ιοί μπορούν να θεωρηθούν ότι βρίσκονται σε μια εξελικτική πορεία προς έναν κυτταρικό οργανισμό. Εναλλακτικά, μπορεί να έχουν εξελιχθεί από έναν κυτταρικό οργανισμό λόγω απώλειας γενετικών πληροφοριών (Nasir and Caetano-Anolles, 2015). Οι γιγάντιοι ιοί έχουν συχνά προσλάβει γονίδια από τους ξενιστές τους με οριζόντια μεταφορά γονιδίων (HGT) (La Scola et al., 2008; Nasir και Caetano-Anolles, 2015; Colson et al., 2018). Ένα γράφημα για τα μεγέθη του γονιδιώματος δείχνει ότι οι μιμιοί και τα βακτήρια αλληλοεπικαλύπτονται σε μέγεθος, υποδεικνύοντας μια συνεχή μετάβαση μεταξύ ιών και βακτηρίων και μεταξύ ζωντανών και μη ζωντανών κόσμων (βάσει Holmes, 2011) (Εικόνα 3) . Άλλοι γιγάντιοι ιοί, όπως οι μεγαιοί, ανακαλύφθηκαν στον ωκεανό της Χιλής με 1.120 γονίδια. Πιο πρόσφατα, ο Klosneuvirus εντοπίστηκε στα λύματα του μοναστηριού Klosterneuburg στην Αυστρία το 2017 με 1,57 εκατομμύρια (εκατομμύρια) ζεύγη βάσεων (Mitch, 2017). Ο Pithovirus sibericum είναι ο μεγαλύτερος μεταξύ των γιγάντιων ιών που έχει ανακαλυφθεί μέχρι σήμερα με διάμετρο 1,5 microns, γονιδίωμα 470.000 bp με 467 υποτιθέμενα γονίδια, μήκους 1,6 micron και πιθανώς είναι 30.000 ετών καθώς ανακτήθηκε από μόνιμο πάγο στη Σιβηρία (Legendre et al., 2014). Οι μικρότεροι πανδοραιοί με μήκος 1 micron έχουν πέντε φορές μεγαλύτερα γονιδιώματα, 2.500.000 bp (Philippe et al., 2013) (Εικόνα 3). βακτήρια. Αυτοί οι ιοφάγοι όπως ο Sputnik έχουν μέγεθος μόνο 50 nm με 18.343 bp κυκλικού dsDNA και 21 προβλεπόμενα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Αναπαράγονται σε εργοστάσια ιών και καταναλώνουν τους πόρους του mimivirus, καταστρέφοντάς τον έτσι. Μερικοί ιοφάγοι μπορούν ακόμη και να ενσωματωθούν στο γονιδίωμα του κυτταρικού ξενιστή και μπορούν να επανενεργοποιηθούν όταν ο ξενιστής μολυνθεί από γιγάντιους ιούς. Έτσι, οι γιγάντιοι ιοί υποδηλώνουν ότι οι ιοί είναι κοντά σε ζωντανές οντότητες ή μπορεί να ήταν ζωντανοί (La Scola et al., 2008; Fischer και Hackl, 2016). Στη βιολογία είναι σύνηθες να γίνεται διάκριση μεταξύ ζωντανής και νεκρής ύλης από την ικανότητα σύνθεσης πρωτεϊνών και αυτόνομης αναπαραγωγής. Οι γιγάντιοι ιοί μπορεί να θεωρηθούν ως ελλείποντα κρίκος μεταξύ των δύο, επειδή φιλοξενούν «σχεδόν» τη συσκευή πρωτεϊνοσύνθεσης. Η μετάβαση από τον ζωντανό στον μη ζωντανό κόσμο είναι συνεχής, δεν χωρίζεται από ένα αιχμηρό όριο (Εικόνα 3). Οι ιοί δεν θεωρούνται ζωντανοί από την πλειονότητα της επιστημονικής κοινότητας και όπως γράφονται στα σχολικά βιβλία, επειδή δεν μπορούν να αναπαραχθούν αυτόνομα. Ωστόσο, ορισμένοι από τους γιγάντιους ιούς είναι εξοπλισμένοι με σχεδόν όλα τα συστατικά του μηχανισμού πρωτεϊνοσύνθεσης κοντά σε βακτήρια, γεγονός που υποδηλώνει ότι ανήκουν στη ζωντανή ύλη (Schulz et al., 2017). Τα ριβοένζυμα μπορεί να ήταν η πιο πρώιμη αναπαραγόμενη οντότητα. Ίσως επίσης άλλοι ιοί ήταν αρχικά πιο ανεξάρτητοι από την πρώιμη Γη από ό,τι είναι σήμερα. Όπως περιγράφεται στο Σχήμα 1 μπορεί αρχικά να μην υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ ενός πρώιμου ιού ή ενός πρώιμου κυττάρου. Μόνο αργότερα οι ιοί μπορεί να έχουν εγκαταλείψει την αυτόνομη αντιγραφή τους και να έχουν γίνει παράσιτα -όπως έχει περιγραφεί για ορισμένα βακτήρια (βλ. παρακάτω). Έχουν γίνει προσπάθειες για τον εντοπισμό του μικρότερου ζωντανού κυττάρου που εξακολουθεί να αναπαράγεται αυτόνομα. Μεταξύ των πιθανώς μικρότερων φυσικών βακτηρίων είναι το Pelagibacter ubique του κλάδου βακτηρίων SAR11 (Giovannoni, 2017), το οποίο ανακαλύφθηκε το 1990. Είναι ένα άλφα-πρωτεοβακτήριο με 1.389 γονίδια που υπάρχουν παντού σε όλους τους ωκεανούς. Μπορεί να φτάσει έως και 10 28 ελεύθερα ζωντανά κύτταρα συνολικά και αντιπροσωπεύει περίπου το 25% των μικροβιακών κυττάρων πλαγκτού. Πολύ λίγο από το DNA του δεν είναι κωδικοποιητικό. Φέρει φάγους τύπου ποδοφάγου, που ονομάζονται «πελαγοφάγοι» (Zhao et al., 2013). Αυτό το μικρό βακτήριο χαρακτηρίστηκε ως ο πιο κοινός οργανισμός στον πλανήτη. Γιατί είναι τόσο επιτυχημένο; Αυτό το αυτόνομο βακτήριο είναι μικρότερο από ορισμένους παρασιτικούς γιγάντιους ιούς. Ο Craig Venter, ο οποίος πέτυχε πρώτος τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του ανθρώπινου γονιδιώματος, προσπάθησε να ελαχιστοποιήσει το υποτιθέμενο μικρότερο γονιδίωμα ενός ζωντανού είδους, από το Mycoplasma mycoides, ένα παρασιτικό βακτήριο που ζει στα μηρυκαστικά (Gibson et al., 2008 (Gibson et al., 2010 . Η ομάδα του συνέθεσε ένα γονιδίωμα 531.000 bp με 473 γονίδια, 149 από αυτά (32%) με άγνωστες λειτουργίες (Hutchison et al., 2016). Μεταξύ των μικρότερων παρασιτικών ζωντανών οργανισμών είναι οι Nanoarchaeum equitans. Είναι ένα θερμόφιλο αρχαίο που ζει στους 80 • C και σε pH 6 με 2% αλάτι (Huber et al., 2003) . Το γονιδίωμά του έχει μέγεθος 490.000 bp και κωδικοποιεί 540 γονίδια. Το N. equitans είναι ένα υποχρεωτικό συμβίωση ενός μεγαλύτερου αρχαίου, ο Ignicoccus που ιππεύει πάνω του σαν σε άλογο, εξ ου και το όνομα (Huber et al., 2003). Ο κόσμος των ιών καλύπτει μια σειρά τριών κορμών σε μέγεθος των γονιδιωμάτων τους: μηδενικά γονίδια σε περίπου 2.500 γονίδια που ανέρχονται σε περίπου 2.500.000 bp DNA. Τα ιοειδή μηδενικού γονιδίου έχουν μήκος περίπου 300 βάσεις (Εικόνα 3). Η ιοσφαίρα είναι η πιο επιτυχημένη δεξαμενή βιολογικών οντοτήτων στον πλανήτη μας όσον αφορά τον αριθμό των σωματιδίων, την ταχύτητα αντιγραφής, τους ρυθμούς ανάπτυξης και τον χώρο αλληλουχίας. Υπάρχουν περίπου 10 33 ιοί στον πλανήτη μας και είναι παρόντες σε κάθε υπάρχον είδος (Suttle, 2005). Δεν υπάρχει ζωντανό είδος χωρίς ιούς! Οι ιοί εμφανίζονται επίσης ελεύθερα στους ωκεανούς, στο έδαφος, στα σύννεφα μέχρι τη στρατόσφαιρα και ψηλότερα, σε υψόμετρο τουλάχιστον 300 km. Πληθαίνουν το ανθρώπινο έντερο, το κανάλι γέννησης και το εξωτερικό μέρος του σώματος ως προστατευτικό στρώμα ενάντια στους μικροβιακούς πληθυσμούς. Τα μικρόβια περιέχουν φάγους που ενεργοποιούνται σε συνθήκες στρες, όπως έλλειψη θρεπτικών ουσιών, αλλαγή θερμοκρασίας, έλλειψη χώρου και άλλες αλλαγές των περιβαλλοντικών συνθηκών. Ένα από τα πιο συγκλονιστικά έγγραφα αυτού του αιώνα ήταν η δημοσίευση της αλληλουχίας του ανθρώπινου γονιδιώματος (Lander et al., 2001). Περίπου οι μισοί, πιθανώς ακόμη και τα δύο τρίτα της αλληλουχίας αποτελούνται από περισσότερο ή λιγότερο ολοκληρωμένους ενδογενείς ρετροϊούς (ERVs) και σχετικά ρετροστοιχεία (REs) (de Koning et al., 2011). Οι RE ενισχύονται μέσω μηχανισμών αντιγραφής και επικόλλησης που περιλαμβάνουν ένα βήμα ανάστροφης μεταγραφάσης από ένα ενδιάμεσο RNA στο DNA. Επιπλέον, τα μετατιθέμενα στοιχεία DNA (TEs) κινούνται με μηχανισμό cutand-paste. Η προέλευση των RE συζητείται ως υπολείμματα αρχαίων ρετροϊικών βλαστικών λοιμώξεων που σταθεροποιήθηκαν εξελικτικά στο γονιδίωμα. Περίπου 450.000 ανθρώπινα στοιχεία ERV (HERV) αποτελούν περίπου το 8% του ανθρώπινου γονιδιώματος που αποτελείται από ρετροϊικά στοιχεία χαρακτηριστικών όπως τα γονίδια gag, pol, env και πλευρικές μακριές τερματικές επαναλήψεις (LTR) που δρουν ως προαγωγείς (Lander et al., 2001). Ο Howard Temin, ένας από τους ανακαλυπτές της αντίστροφης μεταγραφάσης, το 1985 περιέγραψε ήδη ενδογενή στοιχεία που μοιάζουν με ρετροϊούς, τα οποία υπολόγισε σε περίπου 10% της αλληλουχίας του γονιδιώματος του ανθρώπου και του ποντικού (Temin, 1985). Ο πραγματικός αριθμός είναι περίπου 45% όπως υπολογίζεται σήμερα (Lander et al., 2001). Σε ορισμένα γονίδια όπως το γονίδιο αναστολέα πρωτεϊνικής κινάσης Β (PKIB) προσδιορίσαμε περίπου 70% αλληλουχίες που σχετίζονται με ρετροϊούς (Moelling and Broecker, 2015). Υπάρχει όριο; Θα μπορούσε να ήταν 100%; Οι ρετροϊοί εκτιμάται ότι έχουν εισέλθει στη γενεαλογία του γονιδιώματος των θηλαστικών πριν από 550 εκατομμύρια χρόνια (MYA) (Hayward, 2017). Παλαιότερες αλληλουχίες ERV μπορεί να υπάρχουν αλλά δεν είναι αναγνωρίσιμες σήμερα λόγω της συσσώρευσης μεταλλάξεων. Τα ERV υφίστανται μεταλλάξεις, διαγραφές ή ομόλογα συμβάντα ανασυνδυασμού με μεγάλες διαγραφές και μπορούν να γίνουν τόσο σύντομες όσο τα στοιχεία LTR μεμονωμένα, τα οποία έχουν μήκος μερικές εκατοντάδες bp -αριστερά- υπερβάσεις από πλήρους μήκους ρετροϊικά γονιδιώματα περίπου 10.000 bp. Οι προαγωγείς LTR μπορούν να απορυθμίσουν γειτονικά γονίδια. Συμβάντα ομόλογου ανασυνδυασμού μπορεί να θεωρηθούν ως συμβάντα απώλειας γονιδίου ή γονιδιακής μείωσης. Είναι η υπόθεση ότι τα ERV, τα οποία δεν χρειάζονταν πλέον για την άμυνα του κυττάρου ξενιστή, δεν επιλέχθηκαν πλέον για την εξέλιξη και κατά συνέπεια διαγράφηκαν ως περιττοί καταναλωτές ενέργειας. Ο Eugene Koonin επισημαίνει ότι η μόλυνση και η ενσωμάτωση είναι μοναδικά γεγονότα που συμβαίνουν με γρήγορο ρυθμό , ενώ η απώλεια και η μείωση των γονιδίων μπορεί να διαρκέσουν πολύ μεγαλύτερα χρονικά πλαίσια (Wolf and Koonin, 2013). Μια συχνή γονιδιακή μείωση των ευκαρυωτικών γονιδιωμάτων είναι η απώλεια της πρωτεΐνης του περιβλήματος του ιού που κωδικοποιείται από το γονίδιο env. Χωρίς επίστρωση, οι ρετροϊοί δεν μπορούν πλέον να φύγουν από το κύτταρο και να μολύνουν άλλα κύτταρα. Χάνουν την κινητικότητα και γίνονται υποχρεωτικά ενδοκυτταρικά στοιχεία. Οι βοηθητικοί ιοί μπορούν να παρέχουν πρωτεΐνες φακέλου σε trans και να κινητοποιούν τους ιούς. Τα TE ή RE μπορούν να θεωρηθούν ως παραδείγματα λειψάνων ενδοκυτταρικών ιών χωρίς περιβλήματα -ή θα μπορούσε να ήταν το αντίθετο, ίσως πρόδρομοι ρετροϊών πλήρους μήκους; Αυτά τα στοιχεία μπορούν να ενισχυθούν ενδοκυτταρικά και να τροποποιήσουν τα γονιδιώματα του ξενιστή ενσωματώνοντας το δυναμικό κίνδυνος γονιδιακής διαταραχής και γενετικών αλλαγών. Οι RE μπορούν να οδηγήσουν σε διπλασιασμούς γονιδίων και ανάπτυξη ψευδογονιδίων, με το ένα αντίγραφο για σταθερή διατήρηση των επίκτητων λειτουργιών και το άλλο για καινοτομίες (Cotton and Page, 2005). Τέτοιοι διπλασιασμοί αποτελούν μεγάλες ποσότητες γονιδιωμάτων θηλαστικών (Zhang, 2003). Οι ρετροϊοί έχουν διπλασιασμό του τμήματος RNase H, ένας από τους οποίους χρησιμεύει ως καταλυτικά ανενεργός συνδέτης μεταξύ της πολυμεράσης RT και της ενζυμικά ενεργής RNase H (Xiong and Eickbush, 1990; Malik και Eickbush, 2001; Moelling και Broecker, 2015; Moelling et al., 2017). Αυτός ο διπλασιασμός γονιδίων χρονολογείται από 500 εκατομμύρια χρόνια (Cotton και Page, 2005). Οι διπλασιασμοί γονιδίων είναι μια κοινή αιτία καρκίνου, που συχνά εμφανίζεται μόνο στο γονιδίωμα του ίδιου του καρκινικού κυττάρου, επηρεάζοντας λιγότερο τους απογόνους. Τα Myc, Myb, ErbB2, Ras και Raf είναι ογκογονίδια που ενισχύονται σε διάφορους τύπους ανθρώπινων καρκίνων (Vogelstein και Kinzler, 2002). Η ικανότητα των ρετροϊών να ενσωματώνονται τους κάνει να διακρίνονται από τους ενδοσυμβιωτικούς που παραμένουν ξεχωριστοί. Ωστόσο, το καθαρό αποτέλεσμα είναι πολύ παρόμοιο, απόκτηση νέας γενετικής πληροφορίας, η οποία μεταδίδεται στην επόμενη γενιά, εάν η βλαστική σειρά μολυνθεί και συμβεί ενδογενοποίηση του ιού. Η ολοκλήρωση του ιού δεν περιορίζεται στα ευκαρυωτικά κύτταρα, αλλά και ένας μηχανισμός στα προκαρυωτικά για συντήρηση της λυσογονικής κατάστασης των φάγων μέσα στα βακτήρια.Επίσης, για άλλους ευκαρυωτικούς ιούς όπως ο HBV, το αντιγόνο της επιφάνειας του φακέλου BHsAg μπορεί να διαγραφεί, γεγονός που οδηγεί σε έναν υποχρεωτικό ενδοκυτταρικό τρόπο ζωής για τον ιό, ο οποίος ειδικά με την παρουσία HCV προάγει τον καρκίνο ( Yang et al., 2016) .Ο HIV έχει αποδειχθεί ότι χάνει γρήγορα ένα από τα βοηθητικά του γονίδια, το nef, αρχικά για αρνητικό παράγοντα. Το γονίδιο χάθηκε εντός ενός μάλλον μικρού αριθμού διελεύσεων του ιού που αναπτύχθηκε υπό συνθήκες καλλιέργειας ιστού με επιλογή για κύτταρα που παράγουν υψηλό τίτλο ιού. Η διαγραφή του nef είχε ως αποτέλεσμα σημαντική αύξηση του τίτλου του ιού στην καλλιέργεια -εξ ου και το όνομα. Το προϊόν του γονιδίου nef δεν χρειαζόταν μέσα στα κύτταρα ιστοκαλλιέργειας, μάλλον ήταν ανασταλτικό για αντιγραφή. Ωστόσο, είναι απαραίτητο για την παθογένεια στα ζώα και στη συνέχεια το nef ερμηνεύτηκε εκ νέου ως \"απαραίτητος παράγοντας\" (Flint, 2015). Επίσης, οι ανθρώπινοι ξενιστές του HIV μπορούν να χάσουν ένα σημαντικό τερματικό τμήμα ενός επτά διαμεμβρανικού υποδοχέα στα λεμφοκύτταρα, τον πρωταρχικό στόχο κύτταρο για είσοδο HIV και για πρόσληψη ιού. Αυτό το μόριο, ο υποδοχέας της κυτοκίνης CCR5 περικόπτεται από 32 καρβοξυτελικά αμινοξέα (CCR5-32), απενεργοποιώντας τον υποδοχέα λειτουργικά. Η συχνότητα αλληλόμορφων του μεταλλαγμένου μεταλλάγματος CCR5-32 είναι περίπου 10% στον ευρωπαϊκό πληθυσμό, καθιστώντας αυτά τα άτομα ανθεκτικά στις λοιμώξεις από τον ιό HIV (Solloch et al., 2017). Αυτή η απώλεια γονιδίου στους Ευρωπαίους έχει αποδειχθεί ότι κάνει τα άτομα ανθεκτικά όχι μόνο στη μόλυνση από τον ιό HIV αλλά και στην ελονοσία. Αυτή μπορεί να ήταν η επιλεκτική πίεση στο παρελθόν πριν από την εμφάνιση του HIV/AIDS. Δεν έχει περιγραφεί καμία παρενέργεια για τους ανθρώπους που δεν έχουν αυτό το γονίδιο (Galvani and Slatkin, 2003). Οι ιοί έχουν αποδειχθεί ότι είναι οδηγοί της εξέλιξης (Villarreal and Witzany, 2010), συμπεριλαμβανομένου του ανθρώπινου γονιδιώματος, το οποίο κατά τουλάχιστον 45% αποτελείται από αλληλουχίες που σχετίζονται με ρετροϊούς. Επιπλέον, οι ενδογενοποιημένοι ρετροϊοί παρείχαν τα γονίδια συγκυτίνης που είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη του πλακούντα των θηλαστικών και επέτρεψαν την ανάπτυξη εμβρύων χωρίς την απόρριψή τους από το μητρικό ανοσοποιητικό σύστημα (Dupressoir et al., 2012). Έτσι, η ίδια ιδιότητα που προκαλεί ανοσοανεπάρκεια σε ασθενείς μολυσμένους με HIV και οδηγεί σε AIDS προκαλεί σχηματισμό συγκυτίων, σύντηξη κυττάρων μετά τη μόλυνση από έναν ρετροϊό. Οι ιοί έχουν επίσης προταθεί ότι είναι στην αρχή της εξέλιξης της προσαρμοστικής ανοσίας (Villarreal, 2009). Έτσι, οι ιοί διαμόρφωσαν τα γονιδιώματα παρέχοντας βασικά γονίδια και μηχανισμούς. Η ενδογενοποίηση των ρετροϊών έχει συμβεί στα γονιδιώματα των θηλαστικών για τουλάχιστον 550 εκατομμύρια χρόνια (Hayward, 2017). Εάν τα ενσωματωμένα ERV δεν παρείχαν κανένα επιλεκτικό πλεονέκτημα, επιδεινώθηκαν και συσσώρευαν μεταλλάξεις με απώλεια λειτουργίας. Αυτό αποδείχθηκε άμεσα με την ανακατασκευή ενός μολυσματικού ρετροϊού από τη συναινετική αλληλουχία 9 ελαττωματικών ενδογενών αλληλουχιών ιών, που ορίζονται ως Phoenix. Ο ιός εκφράστηκε από έναν κατασκευασμένο συνθετικό κλώνο DNA σε κυτταρική καλλιέργεια και σχημάτισε σωματίδια ιού που ταυτοποιήθηκαν με μικροσκοπική ανάλυση υψηλής ανάλυσης (Dewannieux and Heidmann, 2013). σε πραγματικό χρόνο» και να καταδείξουν πιθανές συνέπειες για την ανοσία. Στις αρχές του 1900, ορισμένα άτομα μεταφέρθηκαν σε νησιά, συμπεριλαμβανομένου του νησιού καγκουρό, κοντά στην ηπειρωτική χώρα της Αυστραλίας για λόγους επαναπληθυσμού, καθώς τα κοάλα απειλούνταν να εξαφανιστούν. Σήμερα, η πλειοψηφία του πληθυσμού των κοάλα έχει μολυνθεί από τον KoRV, ο οποίος σχετίζεται στενά με τον ιό της λευχαιμίας των πιθήκων Gibbon (GALV). Ωστόσο, τα κοάλα που απομονώνονται στο νησί καγκουρό είναι αρνητικά KoRV, γεγονός που επιτρέπει τη χρονολόγηση της εισαγωγής του KoRV στον πληθυσμό των κοάλα πριν από περίπου εκατό χρόνια. Πολλά από τα μολυσμένα κοάλα αρρώστησαν και πέθαναν, ωστόσο ορισμένοι πληθυσμοί έγιναν ανθεκτικοί μέσα σε περίπου 100 χρόνια, που αντιστοιχεί σε περίπου 10 γενιές. Τα κοάλα πιθανότατα ανέπτυξαν αντίσταση λόγω των ενσωματωμένων προϊών DNA. Ο ρετροϊός μεταδίδεται ως εξωγενής καθώς και ως ενδογενής ιός, παρόμοιος με τον ρετροϊό προβάτων Jaagsiekte (JSRV), όπου οι ενδογενοποιημένοι ιοί προστατεύουν με ένα προϊόν ιϊκού γονιδίου, όπως το Env, από de novo λοιμώξεις με «εξαίρεση υπερμόλυνσης» (Tarlinton, 2012 ) . Η συμβολή των ρετροϊών στην αντιϊκή άμυνα είναι εντυπωσιακή, καθώς όλα τα γονίδια των ρετροϊών έχουν ανάλογα γονίδια στον αμυντικό μηχανισμό siRNA/RNAi των ευκαρυωτικών κυττάρων (Moelling et al., 2006). εκφράζοντας πρωτεΐνες Env που μπλοκάρουν τους υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας (Villarreal, 2011). Ένας συγκρίσιμος μηχανισμός προστατεύει τα βακτηριακά κύτταρα από φάγους DNA, με ενσωματωμένα θραύσματα DNA φάγου που μεταγράφονται σε mRNA και υβριδοποιούνται στους εισερχόμενους νέους φάγους DNA και έτσι οδηγούν στην καταστροφή τους από ειδικές για το υβρίδιο νουκλεάσες, ανοσία CRISPR/Cas (Charpentier and Doudna, 2013). . Συχνά δεν γίνεται αντιληπτό ότι η απόκτηση ανοσίας σε βακτήρια και κύτταρα θηλαστικών ακολουθεί ανάλογους μηχανισμούς (Εικόνα 4). Η ενσωμάτωση των ρετροϊών συνήθως συμβαίνει σε σωματικά κύτταρα μετά τη μόλυνση ως υποχρεωτικό βήμα κατά τη διάρκεια του ιικού κύκλου ζωής. Η μόλυνση των βλαστικών κυττάρων μπορεί να οδηγήσει σε μετάδοση στην επόμενη γενιά και τελικά να οδηγήσει σε κληρονομική αντίσταση. Οι ενδογενοποιημένοι ρετροϊοί πιθανότατα προκάλεσαν αντίσταση ΕΙΚΟΝΑ 4 | Οι ιοί προστατεύουν από ιούς: οι ρετροϊοί προστατεύουν ένα κύτταρο από μια νέα λοίμωξη από έναν παρόμοιο ιό που χαρακτηρίζεται ως \"αποκλεισμός υπερμόλυνσης\" ή ιική παρεμβολή. Αυτό διαμεσολαβείται από προϊόντα ιικών γονιδίων όπως πρωτεΐνες ή νουκλεϊκά οξέα. Ομοίως, οι φάγοι προστατεύουν από τους φάγους: η υπερμόλυνση των βακτηρίων αποτρέπεται από το CRISPR/Cas RNA που προέρχεται από προηγούμενες λοιμώξεις. Ανάλογοι είναι και οι μηχανισμοί άμυνας έναντι των ιών και των φάγων. Η προστασία από ιούς ή φάγους έναντι υπερλοιμώξεων αντιπροσωπεύει την κυτταρική άμυνα και την επίκτητη ανοσία. Τα τέσσερα παραδείγματα συζητούνται στο κείμενο.στα εξωγενή αντίστοιχα. Ομοίως, η αντοχή στον ιό της ανοσολογικής ανεπάρκειας του πιθήκου (SIV) σε ορισμένα είδη πιθήκων μπορεί να εξηγηθεί με ενδογενοποίηση (Li et al., 2017 (Li et al., 2018). Στην περίπτωση των φάγων και των προκαρυωτικών ξενιστών τους, ο μηχανισμός περιγράφεται ως CRISPR/Cas, οι οποίοι ακολουθούν ανάλογες αρχές \"ενδογενοποίησης\" του εισερχόμενου γενετικού υλικού για μετέπειτα αποκλεισμό. Κάποιος μπορεί να εικάσει ότι ο HIV μπορεί επίσης να ενδογενοποιηθεί τελικά στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Υπάρχουν κάποιες ενδείξεις ότι ο HIV μπορεί να μολύνει ανθρώπινα βλαστικά κύτταρα και μπορεί να μεταδοθεί στο εμβρυϊκό γονιδίωμα (Wang et al., 2011). Πόσος χρόνος μπορεί να διαρκέσει δεν είναι γνωστό -10 γενιές; Η απώλεια της λειτουργίας των ERV μπορεί να συμβεί από μεταλλάξεις, διαγραφές του env ή άλλων γονιδίων και τελικά όλων των κωδικοποιητικών γονιδίων με ομόλογο ανασυνδυασμό, αφήνοντας πίσω μόνο ένα LTR. Ο αριθμός των στοιχείων που μοιάζουν με ρετροϊό ανέρχεται σε περίπου 450.000, που αντιστοιχεί στο 8% του ανθρώπινου γονιδιώματος (Lander et al., 2001; Cordaux και Batzer, 2009). Οι περιοχές προαγωγέα αναλύθηκαν για τη συμβολή τους στον καρκίνο με την ενεργοποίηση γειτονικών γονιδίων - ως συνέπεια μιας πρώην μόλυνσης από ρετροϊό. Πράγματι, τα ενεργοποιημένα κυτταρικά γονίδια με «προαγωγή προς τα κάτω» εντοπίστηκαν σε μελέτες σε ζώα με την ενεργοποίηση του γονιδίου myc ως ένα από τα πολλά παραδείγματα, που οδηγεί σε χρόνια, όχι οξεία ανάπτυξη καρκίνου (Ott et al., 2013). Ωστόσο, ως γενικός μηχανισμός για τον ανθρώπινο καρκίνο σήμερα, οι LTRs δεν αναγνωρίζονται ως κύριοι ένοχοι. Τα περισσότερα από τα ERV που βρίσκουμε σήμερα έχουν ενσωματωθεί κατά την εξέλιξη σε ιντρόνια ή άλλες περιοχές όπου η παρουσία τους είναι σχετικά αβλαβής. Τα άλλα είχαν ως αποτέλεσμα τον θάνατο των μεταφορέων που εξαφανίστηκαν; Οι επιδράσεις των LTRs στα επίπεδα έκφρασης των γειτονικών γονιδίων ξενιστών μελετήθηκαν με τον ενδογενή ανθρώπινο ιό, HERV-K, ως πιθανή αιτία καρκίνου, αλλά αυτό δεν φαίνεται να είναι ένα γενικό φαινόμενο (Broecker et al., 2016b). Όπως φαίνεται για τα κοάλα, τα ERV μπορούν να προσδώσουν ανοσία σε ιογενείς λοιμώξεις (Feschotte and Gilbert, 2012) .Ένα σχετικό ERV, HERV-H, αποδείχθηκε ότι παράγει ένα RNA που διατηρεί τα πρώιμα εμβρυϊκά κύτταρα πολυδύναμα και ακόμη και επαναφέρει τα ενήλικα κύτταρα να ανακτήσουν την πολυδύναμη. Grow et al., 2015). Έτσι, ο ρόλος των ERVs μπορεί να είναι πιο περίπλοκος από ό,τι γνωρίζουμε επί του παρόντος. Τα μεταφερόμενα στοιχεία και οι RE που έχασαν την ικανότητα κυτταρικής μετάδοσης με τη διαγραφή της πρωτεΐνης του περιβλήματος συμβάλλουν σε μεγάλο βαθμό στη γενετική πολυπλοκότητα των κυττάρων-ξενιστών. Είναι «κλειδωμένα» μέσα στα κύτταρα και αποτελούν βασικούς μοχλούς της αύξησης της γενετικής πολυπλοκότητας (Cordaux and Batzer, 2009). Κάποιος θα μπορούσε να υποθέσει ότι αυτά τα ενδοκυτταρικά στοιχεία είναι ρετροϊοί που δεν μπορούν να αναπαραχθούν χωρίς επικάλυψη (Lander et al., 2001). Οι νυχτερίδες μεταδίδουν ιούς όπως ο Έμπολα και ο κορωνοϊός SARS χωρίς να υποφέρουν από ασθένεια (Beltz, 2018). Ακόμη και οι ιοί RNA όπως οι Bornaviruses έχει αποδειχθεί ότι ενσωματώνονται με αθέμιτη αντίστροφη μεταγραφή, παρέχοντας επίσης ανοσία έναντι της υπερμόλυνσης (Katzourakis and Gifford, 2010). Υπάρχουν δύο εξέχοντα γεγονότα που συνέβαλαν σημαντικά στην επιτυχία της ζωής και στο σχηματισμό κυττάρων. Και τα δύο σχετίζονται με τη γονιδιακή μείωση. Αυτό το φαινόμενο μπορεί να παίξει ρόλο στην εξέλιξη των ιών από τον αυτόνομο σε παρασιτικό τρόπο ζωής. Στη δεκαετία του 1960 ο Lynn Margulis πρότεινε μια εξωκυτταρική προέλευση για τα μιτοχόνδρια (Margulis, 1970 (Margulis, , 1993). Ένα προγονικό κύτταρο, ίσως ένας αρχαίος, μολύνθηκε από ένα αναερόβιο βακτήριο, το οποίο προκάλεσε μιτοχόνδρια. Ομοίως, τα κυανοβακτήρια σχημάτισαν τους χλωροπλάστες στα σύγχρονα φυτικά κύτταρα. Τα μιτοχόνδρια εμφανίστηκαν πριν από περίπου 1,45 δισεκατομμύρια χρόνια (BYA) (Embley and Martin, 2006). Τα μιτοχόνδρια και οι χλωροπλάστες είναι τα πιο εντυπωσιακά παραδείγματα αλλαγής του τρόπου ζωής από αυτόνομα βακτήρια σε ενδοσυμβίωσης. Αυτή η μετάβαση θεωρείται συχνά ως εξαιρετικά σπάνια και χαρακτηριστικό της εξέλιξης της ζωής στον πλανήτη μας. Ωστόσο, υπάρχουν πολλά άλλα υποχρεωτικά ενδοκυτταρικά παράσιτα όπως Rickettsia, Chlamydia trachomatis, Coxiella burnetii (ο αιτιολογικός παράγοντας του πυρετού Q), Mycobacterium leprae, M. tuberculosis και M. mycoides (Beare et al., 2006). Ο τρόπος ζωής των ενδοσυμβίων στις δύο περιπτώσεις των μιτοχονδρίων και των χλωροπλαστών είναι εντυπωσιακός. Και οι δύο μείωσαν δραστικά τη γενετική τους σύνθεση. Τα μιτοχόνδρια περιέχουν λιγότερα από 37 γονίδια, από τα αρχικά περίπου 3.000 γονίδια. Σχετίζεται η ενδογενοποίηση των ρετροϊών, των ERV, που ενσωματώνονται σε κύτταρα βλαστικής σειράς με την ενδοσυμβίωση; Είναι αυτά τα ενδοσυμβιοτικά μοντέλα για τη μετάβαση από τον αυτόνομο τρόπο ζωής σε μια παρασιτική ζωή-που μπορεί να συνέβη με ιούς; Ένα πιο πρόσφατο χαρακτηριστικό παράδειγμα για μια αναγωγική εξέλιξη είναι η Rickettsia. Αυτά τα βακτήρια θεωρούνταν για κάποιο χρονικό διάστημα ως ιοί λόγω της υποχρεωτικής ενδοκυτταρικής παρασιτικής ύπαρξής τους. Τα Rickettsia έχουν εξελιχθεί από αυτόνομα αναδιπλασιαζόμενα βακτήρια. Η αναγωγική εξέλιξη των ενδοσυμβίων μπορεί να δώσει βακτήρια με μικροσκοπικά γονιδιώματα σε βάρος της αυτόνομης εξωκυττάριας ζωής. Τα γονιδιώματά τους έχουν μήκος 1,11 mio bp με περίπου 834 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες και απώλεια 24% από αναγωγική εξέλιξη (Ogata et al., 2001). Η Rickettsia μπορεί να έχει κάποια σχέση με τα κυανοβακτήρια, τα οποία θεωρούνται ως τα κύρια συμβίωση. Μπορεί κανείς να υποθέσει ότι οι ιοί μπορεί να ήταν αρχικά αυτόνομες οντότητες; Τα ιοειδή μπορεί να έχουν υποστεί μετάβαση από την αυτονομία σε παράσιτα, όπως ακριβώς φαίνεται για τα μιτοχόνδρια, τους χλωροπλάστες ή τη Ρικέτσια; Σε ποιο βαθμό οι ιοί ήταν αρχικά αυτόνομοι και ανεξάρτητοι από τους κυτταρικούς μεταβολισμούς -και συνέβαλαν στην προέλευση των κυττάρων; Θα μπορούσαν μόνο αργότερα να έχουν χάσει την αυτονομία τους και να γίνουν παρασιτικοί; Οι ιοί είναι μινιμαλιστικοί στη σύνθεσή τους και πρέπει να έχουν υποστεί αυστηρές γονιδιακές μειώσεις (Flint, 2015). Πόσο μικρό μπορεί να γίνει το γονιδίωμά τους; Οι περισσότεροι κωδικοποιούντες ιοί RNA εξακολουθούν να περιέχουν ρυθμιστικά στοιχεία, ncRNA στις 3 και 5 τερματικές περιοχές για είσοδο ριβοσωμάτων, πρωτεϊνική σύνθεση, μεταγραφική ρύθμιση και άλλα. Μια υποομάδα ρετροϊών είναι ένα ενδιαφέρον παράδειγμα σε σχέση με την ταυτόχρονη απώλεια και απόκτηση γενετικών πληροφοριών. Οι ογκογόνοι ρετροϊοί ή ογκοιοί μπορούν να ανασυνδυαστούν με κυτταρικά γονίδια τα οποία υπό τους προαγωγείς των ρετροϊών μπορούν να γίνουν ογκογονίδια και οδηγοί καρκίνου. Περίπου εκατό ογκογονίδια έχουν επιλεγεί στα εργαστήρια και έχουν μελετηθεί επί δεκαετίες για την κατανόηση των μοριακών μηχανισμών του καρκίνου. Η επιλογή για αναπτυξιακά πλεονεκτήματα των κυττάρων-ξενιστών οδήγησε στην ανακάλυψη των ταχύτερων ογκογονιδίων που προάγουν την ανάπτυξη που γνωρίζουμε σήμερα, όπως τα Ras, Raf, ErbB ή Myc, τα οποία είναι εν μέρει επιτυχημένοι στόχοι για αντικαρκινικά φάρμακα (Moelling et al., 1984). Αυτά τα ογκογονίδια προσελήφθησαν στις περισσότερες περιπτώσεις από τους ρετροϊούς σε βάρος των δομικών (gag), αναδιπλασιαζόμενων (pol) ή περιβλήματος (env) γονιδίων και συχνά εκφράζονται ως πρωτεΐνες σύντηξης με Gag. Έτσι, οι ογκογόνοι ρετροϊοί είναι υποχρεωτικοί ενδοκυτταρικοί ελαττωματικοί ιοί και επιλέχθηκαν εργαστηριακά από ερευνητές για τα ογκογονίδια με την πιο ισχυρή ικανότητα προαγωγής της ανάπτυξης. Χρειάζονται την παροχή αντιγραφικών γονιδίων σε trans από βοηθητικούς ιούς που μολύνουν ταυτόχρονα για να μολύνουν άλλα κύτταρα (Flint, 2015). Οι ρετροϊοί είναι σε θέση να συλλάβουν κυτταρικά γονίδια, να τα μεταφέρουν και να τα ενσωματώσουν σε γειτονικά κύτταρα. Ορισμένα στελέχη του ιού σαρκώματος Rous διατηρούν ικανή την αναπαραγωγή όταν φέρουν το ογκογονίδιο src (για σάρκωμα) που προέρχεται από κύτταρα που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 536 αμινοξέων που προφανώς μπορεί να χωρέσει στο ρετροϊικό σωματίδιο μαζί με το ιικό γονιδίωμα πλήρους μεγέθους (Broecker et al., 2016α). Χωρικοί λόγοι μπορεί να επηρέασαν τον σχηματισμό ογκογόνων ρετροϊών και να περιόρισαν το μέγεθός τους και έτσι να οδήγησαν σε ελαττωματικούς φαινοτύπους τους. Υπάρχουν ενδείξεις ότι η ανεξέλεγκτη δραστηριότητα των (ρετρό) τρανσποζονίων στα βλαστικά κύτταρα μπορεί να οδηγήσει σε ασθένειες όπως η ανδρική στειρότητα - πιθανώς από \"λάθος καταστροφή, \" που προκαλείται από πάρα πολλά γεγονότα μεταφοράς. Στα θηλαστικά, τα piRNAs εξημερώνουν τη δραστηριότητα των τρανσποζονίων μέσω της δραστηριότητας RNase H των πρωτεϊνών PIWI κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης (Girard et al., 2006). Μόνο μια μειοψηφία ιών είναι παθογόνα. τα περισσότερα από αυτά δεν προκαλούν ασθένειες. Αντιθέτως, είναι πιο σημαντικοί ως μοχλοί της εξέλιξης, ως διαβιβαστές γενετικού υλικού, ως καινοτόμοι παράγοντες. Ειδικότερα, οι ιοί RNA είναι οι πιο καινοτόμοι. Μερικά από αυτά είναι παθογόνα και επικίνδυνα, όπως ο ιός HIV ή η γρίπη, ή ιοειδή στα φυτά. Οι ιοί RNA είναι σε θέση να αλλάζουν τόσο γρήγορα που το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή δεν είναι σε θέση να αντιμετωπίσει τη μόλυνση. Η παθογένεια προκύπτει όταν αλλάζουν οι περιβαλλοντικές συνθήκες, για παράδειγμα, όταν ένας ιός εισέρχεται σε έναν νέο οργανισμό ή είδος. Η αύξηση της κυτταρικής πολυπλοκότητας από τους ιούς είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό της εξέλιξης. Τέτοιες μεγάλες εξελικτικές αλλαγές λαμβάνονται πρόσφατα ως επιχειρήματα κατά της εξελικτικής θεωρίας από τον Κάρολο Δαρβίνο, ο οποίος θεώρησε τις βαθμιαίες αλλαγές, μικρές αυξήσεις από μεταλλάξεις ως την κύρια βάση για την επιλογή και την εξέλιξη. Νέα κριτική αντιμετωπίζει αυτή τη σκέψη, θεωρώντας τις μεγαλύτερες αλλαγές ως εξελικτικούς οδηγούς. Τέτοιες αλλαγές προκύπτουν από πολλά σύνθετα φαινόμενα όπως η ενδοσυμβίωση, η μόλυνση από προκαρυώτες, οι ιοί και οι μύκητες, ο ανασυνδυασμός γονιδίων, η HGT, οι λοιμώξεις, το φύλο. Δραματικές αλλαγές όπως η ενδοσυμβίωση ή οι λοιμώξεις από παθογόνους παράγοντες επεκτείνουν την έννοια της εξέλιξης του Δαρβίνου. Υπάρχουν πολυάριθμα παραδείγματα για τη συμβολή των ιών στην εξέλιξη της ζωής από τουλάχιστον 550 MYA (Hayward, 2017). Όμως ο γενετικός θόρυβος μέσω τυχαίων μεταλλάξεων δεν μας επιτρέπει να επιστρέψουμε στην αρχή της ζωής. Μπορεί να μην είναι αδύνατο ότι το παλαιότερο διαμέρισμα ήταν δυσδιάκριτο, είτε προ-κύτταρο είτε προ-ιός. Κατ' αναλογία μπορεί κανείς να υποθέσει ότι σε κάποιο σημείο οι αυτόνομοι ιοί εγκατέλειψαν την ανεξαρτησία τους για μια υποχρεωτική ενδοκυτταρική ζωή -όπως έχει περιγραφεί για τα μιτοχόνδρια και τους χλωροπλάστες αλλά και τα ενδοκυτταρικά βακτήρια όπως η Rickettsia. Αυτή η εικασία βασίζεται στην ιδέα ότι η πρώιμη ζωή πρέπει να ξεκίνησε απλά και με υψηλή γενετική μεταβλητότητα και στη συνέχεια να έγινε πιο περίπλοκη. Αλλά η πολυπλοκότητα μπορεί να εγκαταλειφθεί για έναν τρόπο ζωής που καταναλώνει λιγότερο ενέργεια με μικρά γονιδιώματα και υψηλή ταχύτητα αντιγραφής (Moelling, 2012 (Moelling, , 2013). Επομένως, μπορεί να επαναληφθεί το ερώτημα: \"Είναι οι ιοί οι παλαιότεροι πρόγονοί μας;\" Κάποια απολιθώματα μπορεί να αναπαραχθούν εν μέρει in vitro από τα πειράματα του Spiegelman's Monster και του Eigen, εξηγώντας τις μεγάλες δυνατότητες επιβίωσης του απλού ncRNA. Οι ιοί μπορεί να είναι παθογόνοι μικροοργανισμοί, αλλά η αναγνώρισή τους ως κύρια αιτία ασθενειών είναι λάθος. Αυτή η έννοια βασίζεται στην ιστορία των ιών στην ιατρική, όπως εξηγείται σε ένα βιβλίο με τίτλο «Ιοί: Περισσότεροι φίλοι παρά εχθροί» (Moelling, 2017) . Το σενάριο που περιγράφεται εδώ εστιάζει στους ιούς ως οδηγούς της εξέλιξης. Ο πρώιμος κόσμος του RNA κέρδισε ενδιαφέρον πριν από 20-30 χρόνια, όπως αποδεικνύεται από τις αναφορές που παρέχονται παραπάνω. Παραδόξως, υπάρχουν επιστήμονες που εξακολουθούν να πιστεύουν στην «υπόθεση του πανσπερμίου» και πιστεύουν ότι οι ρετροϊοί είναι εξωγήινης προέλευσης (Steele et al., 2018). Το πρόσφατο ενδιαφέρον για την προέλευση της ζωής προέκυψε από τους πρόσφατα ανακαλυφθέντες εξωπλανήτες των οποίων ο αριθμός αυξάνεται καθημερινά -και οι οποίοι μπορεί να είναι τόσο πολλοί όσο 10 25 . Έτσι, οι καθαρές στατιστικές κάνουν μερικούς ανθρώπους να πιστεύουν ότι υπάρχει εξωγήινη ζωή. Η εξωγήινη ζωή μιμείται στα εργαστήρια στη Γη με πολλές υποθέσεις -ίσως αυτή η επισκόπηση διεγείρει κάποιους προβληματισμούς. Η συζήτηση που παρουσιάζεται εδώ θα πρέπει να ληφθεί ως έννοια για απλές αναπαραγόμενες και εξελισσόμενες οντότητες που πιθανώς προκύπτουν από διαφορετικά δομικά στοιχεία σε άλλα περιβάλλοντα, με τη δομή να είναι πιο σχετική από την ακολουθία.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 2207, "text": "ιούς" } ], "id": 1175, "question": "Ποιες είναι οι πιο άφθονες βιολογικές οντότητες στη Γη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 17144, "text": "ρετροϊοί" } ], "id": 1176, "question": "Τι συνέβαλε σε ένα μεγάλο μέρος της γονιδιωματικής αλληλουχίας των θηλαστικών;" }, { "answers": [ { "answer_start": 21976, "text": "ριβοένζυμα ή ιοειδή" } ], "id": 1177, "question": "Ποιες ήταν οι πρώτες αναπαραγόμενες οντότητες που πληρούσαν διάφορα κριτήρια για τη ζωή;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2504, "text": "ριβοένζυμα, καταλυτικά RNA που σχετίζονται στενά με τα ιοειδή" } ], "id": 1179, "question": "Ποιες οντότητες χωρίς γονίδια ικανοποιούν τα κριτήρια για τη ζωή;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3060, "text": "Μπορούν να πολυμερίσουν τους απογόνους χημικά, να επιτρέψουν την εμφάνιση μεταλλάξεων και να εξελιχθούν. Το ένα μόριο χρησιμεύει ως καταλύτης και το άλλο ως υπόστρωμα. Ο αναδιπλασιασμός των ριβοζύμων καταδείχθηκε στον δοκιμαστικό σωλήνα (Lincoln and Joyce, 2009). Τα ριβοένζυμα μπορούν να σχηματίσουν πεπτιδικούς δεσμούς μεταξύ αμινοξέων (Zhang and Cech, 1997). Έτσι, μικρά πεπτίδια ήταν διαθέσιμα μέσω ριβοζυμικής δραστηριότητας" } ], "id": 1181, "question": "Πώς μπορούν τα ριβοένζυμα να αντιγραφούν, να ενωθούν και να δημιουργήσουν πεπτιδικούς δεσμούς;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3683, "text": "Η αντιγραφή των μορίων RNA μπορεί να πραγματοποιηθεί χημικά από RNA χωρίς ένζυμα πολυμεράσης." } ], "id": 1182, "question": "Η αντιγραφή του RNA χρειάζεται ένζυμα πολυμεράσης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4179, "text": "κυκλικά μονόκλωνα RNA" } ], "id": 1184, "question": "Από τι αποτελούνται τα ριβοένζυμα;" }, { "answers": [ { "answer_start": 4309, "text": "δομικές πληροφορίες από βρόχους φουρκέτας που σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου μεταξύ ημιτελών διπλών κλώνων και βρόχους ελεύθερους να αλληλεπιδρούν με άλλα μόρια." } ], "id": 1186, "question": "Τι παρουσιάζουν τα ριβοένζυμα;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Chikungunya: Μια δυνητικά αναδυόμενη επιδημία;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860491/SHA: f7c3160bef4169d29e2a8bdd79dd6e9056d4774cAuthor; Kannan, Senthil; Kawalekar, Omkar U.; Shedlock, Devon J.; Khan, Amir S.; Sarangan, Gopalsamy; Srikanth, Padma; Weiner, David B.; Muthumani, KaruppiahΗμερομηνία: 2010-04-27DOI: 10.1371/journal.pntd.0000623Άδεια: cc-byAbstract: Ο ιός Chikungunya είναι ένα αναδυόμενο παθογόνο που μεταδίδεται από τα κουνούπια και έχει σημαντικό αντίκτυπο στην υγεία στον άνθρωπο και προκαλεί πονοκέφαλο, κεφαλαλγία, πυρετό, έμετος, μυαλγία και αρθραλγία. Αυτόχθονες στην τροπική Αφρική, πρόσφατα μεγάλα κρούσματα έχουν αναφερθεί σε μέρη της Νοτιοανατολικής Ασίας και σε αρκετά από τα γειτονικά της νησιά το 2005–07 και στην Ευρώπη το 2007. Επιπλέον, θετικά κρούσματα έχουν επιβεβαιωθεί στις Ηνωμένες Πολιτείες σε ταξιδιώτες που επέστρεψαν από γνωστές περιοχές εστίας. Επί του παρόντος, δεν υπάρχει εμβόλιο ή αντιική θεραπεία. Με την απειλή μιας αναδυόμενης παγκόσμιας πανδημίας, τα περίεργα προβλήματα που σχετίζονται με τις πιο άμεσες και εποχιακές επιδημίες δικαιολογούν την ανάπτυξη ενός αποτελεσματικού εμβολίου. Σε αυτήν την ανασκόπηση, συνοψίζουμε τα στοιχεία που υποστηρίζουν αυτές τις έννοιες. Κείμενο: Ιός Chikungunya (CHIKV), ένα παθογόνο που μεταδίδεται από τα κουνούπια που καταγράφεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Αλλεργιών και Λοιμωδών Νοσημάτων (NIAID) ως Παθογόνο Προτεραιότητας Κατηγορίας Γ που προκαλεί πυρετό Chikungunya (CHIKF) , εξαπλώνεται σε όλη την Ασία, την Αφρική και μέρη της Ευρώπης τα τελευταία χρόνια [1, 2, 3] . Ο CHIKV είναι ένας ιός που μεταδίδεται από τα αρθρόποδα (αρβοϊός) και μεταδίδεται στον άνθρωπο κυρίως από τον Aedes aegypti, τον διαβόητο πολλαπλασιαστή του κίτρινου πυρετού [4, 5] . Η λοίμωξη από CHIKV χαρακτηρίζεται από έντονο πόνο στις αρθρώσεις, που παρασύρει τα θύματά της σε ασυνήθιστες στάσεις [6] . Η ασθένεια πήρε το όνομά της από τη δημοτική γλώσσα Kimakonde της Τανζανίας και της Μοζαμβίκης, και η λέξη chikungunya σημαίνει «αυτό που παραμορφώνεται ή λυγίζει» και μεταφράζεται στα Σουαχίλι σε «η ασθένεια του λυγισμένου περιπατητή» [7, ​​8, 9] . Στην Αφρική, το CHIKV διατηρείται σε έναν συλβατικό κύκλο μεταξύ των Aedes spp που κατοικούν στο δάσος. κουνούπια, άγρια ​​πρωτεύοντα, σκίουροι, πουλιά και τρωκτικά (Εικόνα 1) [10] . Στην Ασία, η ασθένεια μεταδίδεται από το Ae. aegypti και Ae. albopictus [11] . Η μετάδοση στην Ασία συμβαίνει σε έναν αστικό κύκλο όπου το κουνούπι μεταδίδει την ασθένεια από έναν μολυσμένο άνθρωπο σε έναν μη μολυσμένο άνθρωπο, ακολουθώντας ένα επιδημιολογικό πρότυπο παρόμοιο με τον δάγγειο πυρετό [12] . Η επιδημία του CHIKV 2005-2006 στα νησιά La Reunion στον Ινδικό Ωκεανό , ώθησε την ανακάλυψη ενός νέου είδους φορέα, του Ae. albopictus [5] . Καταστρέφοντας πάνω από το ένα τρίτο του πληθυσμού του νησιού, αυτή η επιδημία κορυφώθηκε την καταστροφή της μεταξύ Ιανουαρίου και Φεβρουαρίου 2006, όταν πάνω από 46.000 κρούσματα ήρθαν στο φως κάθε εβδομάδα, συμπεριλαμβανομένων 284 θανάτων [5, 13] . Ae. Το albopictus είναι κοινό στις αστικές περιοχές των Ηνωμένων Πολιτειών και ήδη ανθίζει σε 36 πολιτείες, προκαλώντας σοβαρές ανησυχίες στον ανοσολογικά αφελή πληθυσμό των Ηνωμένων Πολιτειών [14] . Κατά συνέπεια, αυτή η ανασκόπηση περιγράφει λεπτομερώς την επιδημιολογία και την παγκόσμια επέκταση του CHIKV, κλινικά χαρακτηριστικά και παθογένεια και τα συμπτώματα και τις επιπλοκές του, και τέλος προτείνει μια πιθανή προσέγγιση εμβολίου κατά της λοίμωξης CHIKV. Το CHIKV έχει απομονωθεί σε τρεις γονότυπους με βάση φυλογενετικές μελέτες. Αυτοί οι γονότυποι, βασισμένοι στις γονιδιακές αλληλουχίες μιας πρωτεΐνης φακέλου (Ε1), είναι ασιατικοί, ανατολικοί/κεντρικοί/νοτιοαφρικανικοί και δυτικοί αφρικανικοί [4, 11, 15]. Χρησιμοποιώντας φυλογενετικά μοντέλα, οι Cherian et al. εκτιμούν ότι ο ασιατικός γονότυπος του CHIKV εμφανίστηκε μεταξύ 50 και 310 ετών και οι γονότυποι της Δυτικής και Ανατολικής Αφρικής διέφεραν μεταξύ 100 και 840 ετών [15]. Από τότε, το CHIKV έχει προχωρήσει πολύ, με πολλές μεταλλάξεις ενσωματωμένες, και συνέχισε να προκαλεί επιδημίες σε αρκετές περιοχές. Οι πρόσφατες δραστηριότητες του CHIKV περιλαμβάνουν την ινδική επιδημία το 2005-2006, την οποία ακολούθησε μια ξαφνική έκρηξη κρουσμάτων το 2007. Υπολογίζεται ότι 1,3 εκατομμύρια άνθρωποι σε 13 πολιτείες αναφέρθηκαν ότι μολύνθηκαν στην Ινδία [12, 16] και το CHIKV ήταν επίσης ευρέως διαδεδομένο στη Μαλαισία, τη Σρι Λάνκα και την Ινδονησία [17] . Τον Ιούλιο-Αύγουστο του 2007, αναφέρθηκε το CHIKV στην Ιταλία, το οποίο πιθανώς εισήχθη από ταξιδιώτες από περιοχές επιρρεπείς στο CHIKV της Ινδίας, της Αφρικής και των νησιών του Ινδικού Ωκεανού, όπως ο Μαυρίκιος, η Μαδαγασκάρη και οι Σεϋχέλλες. Λίγα από τα ιταλικά απομονωμένα στελέχη βρέθηκαν να έχουν εξελιχθεί από την απομόνωση Κεράλα, η οποία συσχετίστηκε με μια μετατόπιση A226V στο γονίδιο Ε1 που αντιπροσωπεύει μια επιτυχημένη εξελικτική προσαρμογή στον φορέα των κουνουπιών παρόμοια με αυτές που παρατηρήθηκαν στο νησί Reunion [2, 18, 19] .Τα τελευταία χρόνια, με την αύξηση των παγκόσμιων ταξιδιών, ο κίνδυνος εξάπλωσης του CHIKV σε μη ενδημικές περιοχές έχει αυξηθεί [1] . Αρκετοί ταξιδιώτες έχουν φέρει μαζί τους το CHIKV στο σπίτι αφού επισκέφτηκαν περιοχές με ενεργά μολυσμένους πληθυσμούς [12, 20] . Τέτοιες περιπτώσεις έχουν τεκμηριωθεί σε ευρωπαϊκές χώρες, την Αυστραλία, την Ασία και τις Ηνωμένες Πολιτείες [8, 21] . Οι Ηνωμένες Πολιτείες έχουν ήδη αναφέρει τουλάχιστον δώδεκα περιπτώσεις CHIKV που σχετίζονται με ταξίδια, ενώ η Γαλλία έχει αναφέρει 850 περιπτώσεις και το Ηνωμένο Βασίλειο 93 [8, 14] . Πέρα από αυτό, ταξιδιώτες με CHIKV έχουν επίσης διαγνωστεί στην Αυστραλία, το Βέλγιο, τον Καναδά, την Τσεχία, τη Γαλλική Γουιάνα, τη Γερμανία, το Χονγκ Κονγκ, την Ιταλία, την Ιαπωνία, την Κένυα, τη Μαλαισία, τη Μαρτινίκα, τη Νορβηγία, την Ελβετία και τη Σρι Λάνκα [21]. Μερικοί ταξιδιώτες ήταν ιαιμικοί, ανησυχώντας τους αξιωματούχους δημόσιας υγείας σχετικά με την εξάπλωση του CHIKV σε νέες περιοχές [1, 8] . Ο χρόνος επώασης για το CHIKV είναι σχετικά σύντομος, απαιτεί μόνο 2-6 ημέρες με συμπτώματα που συνήθως εμφανίζονται 4-7 ημέρες μετά τη μόλυνση [ 22] . Vazeille et al. ανίχνευσε CHIKV στους σιελογόνους αδένες του Ae. albopictus μόνο 2 ημέρες μετά τη μόλυνση [5] . Κατά τη μόλυνση, το CHIKF τείνει να εμφανίζεται σε δύο φάσεις. Το πρώτο στάδιο είναι οξύ, ενώ το δεύτερο στάδιο, που βιώνουν οι περισσότεροι αλλά όχι όλοι, είναι επίμονο, προκαλώντας αναπηρική πολυαρθρίτιδα. Τα χαρακτηριστικά της οξείας φάσης περιλαμβάνουν απότομη έναρξη πυρετού, αρθραλγία και σε ορισμένες περιπτώσεις κηλιδοβλατιδώδες εξάνθημα [6, 23]. Η οξεία φάση προκαλεί τόσο έντονο πόνο στις αρθρώσεις και τους μυς που δυσκολεύει πολύ την κίνηση και προσβάλλει τα θύματά της [6, 20] . Ενενήντα πέντε τοις εκατό των μολυσμένων ενηλίκων είναι συμπτώματα μετά τη μόλυνση και από αυτούς, οι περισσότεροι γίνονται ανάπηροι για εβδομάδες έως μήνες ως αποτέλεσμα μειωμένης επιδεξιότητας, απώλειας κινητικότητας και καθυστερημένης αντίδρασης. Δεκαοκτώ μήνες μετά την έναρξη της νόσου, το 40% των ασθενών διαπιστώθηκε ότι εξακολουθούν να έχουν αντι-CHIKV IgM [6, 18, 23, 24]. Το χρόνιο στάδιο του CHIKF χαρακτηρίζεται από πολυαρθραλγία που μπορεί να διαρκέσει από εβδομάδες έως χρόνια πέρα ​​από το οξύ στάδιο [6] . Το CHIKV έχει αποδειχθεί ότι επιτίθεται στους ινοβλάστες, εξηγώντας τη συμμετοχή των μυών, των αρθρώσεων και των συνδετικών ιστών του δέρματος. Ο υψηλός αριθμός νευρικών απολήξεων που εντοπίζονται στις αρθρώσεις και στους μυϊκούς συνδετικούς ιστούς μπορεί να εξηγήσει τον πόνο που σχετίζεται με το CHIKF [25, 26] . Περισσότερο από το 50% των ασθενών που πάσχουν από σοβαρή CHIKF είναι άνω των 65 ετών και περισσότερο από το 33% πεθαίνουν. Οι περισσότεροι ενήλικες που πάσχουν από σοβαρή CHIKF έχουν υποκείμενες ιατρικές παθήσεις [6, 24, 27]. Η άλλη ομάδα που επηρεάζεται δυσανάλογα από το σοβαρό CHIKV είναι τα παιδιά. Άλλες επιπλοκές που σχετίζονται με το CHIKV, από τις πιο συχνές έως τις λιγότερο συχνές, περιλαμβάνουν αναπνευστική ανεπάρκεια, καρδιαγγειακή αντιρρόπηση, μηνιγγοεγκεφαλίτιδα, σοβαρή οξεία ηπατίτιδα, σοβαρές δερματικές επιδράσεις, άλλα προβλήματα του κεντρικού νευρικού συστήματος και νεφρική ανεπάρκεια [6, 18, 20, 23, 24, 26, 27] .CHIKV αναλαμβάνει έναν περίπλοκο κύκλο αντιγραφής μετά τη μόλυνση του ξενιστή (Εικόνα 2), που καθιστά το γονιδίωμά του ευαίσθητο σε μεταλλάξεις [28, 29]. Για παράδειγμα, ο Αε. Ο aegypti, υπεύθυνος για επιδημίες στην Κένυα, τις Κομόρες και τις Σεϋχέλλες, έφερε το CHIKV με μια αλανίνη στη θέση 226 του γονιδίου Ε1 (E1-A226) [4, 18] . Ωστόσο, όταν ο ιός έπληξε τα νησιά La Reunion, μια μείωση του πληθυσμού των Ae. aegypti, λόγω της μαζικής χρήσης διχλωροδιφαινυλοτριχλωροαιθανίου και της έλλειψης Ae. Ο πληθυσμός του είδους albopictus www.plosntds.org, οδήγησε σε οικολογική πίεση, ευνοώντας την αντικατάσταση της αλανίνης στη θέση 226 με βαλίνη (E1-A226V) [5] . Αυτή η μετάλλαξη επέτρεψε στο δευτερεύον είδος φορέα του CHIKV, Ae. albopictus, για να συμπληρώσει Ae. aegypti ως κύριος φορέας του [5] .Μέσα σε ένα χρόνο, η μετάλλαξη E1-A226V ήταν παρούσα στο νησί La Reunion και το Ae. Το albopictus προφανώς έφερε τη μεγάλη επιδημία που μολύνει το 34% του πληθυσμού του νησιού La Reunion [5] . Όλα τα στελέχη CHIKV που απομονώθηκαν από το Mayotte έφεραν τη μετάλλαξη E1-A226V και η μετάλλαξη βρέθηκε επίσης στη Μαδαγασκάρη το 2007 [5] . Η μετάλλαξη E1-A226V δεν υπήρχε στην αρχή της επιδημίας των νησιών του Ινδικού Ωκεανού (πριν από τον Σεπτέμβριο του 2005). Ωστόσο, περισσότερο από το 90% των μεταγενέστερων ιικών στελεχών που βρέθηκαν εκεί είχαν ενσωματώσει τη μετάλλαξη (Δεκέμβριος-Μάρτιος 2006), υποδεικνύοντας μια αλλαγή γονότυπου κατά τη χειμερινή περίοδο [5, 18, 20] . Η μετάλλαξη E1-A226V επέτρεψε επίσης μια αύξηση της μολυσματικότητας της Αε. albopictus σε σύγκριση με τη μολυσματικότητα του Ae. aegypti [4, 11, 18, 30] , και με αρκετούς παράγοντες μαζί, Ae. Το albopictus έχει γίνει ο νέος προτιμώμενος και πιο θανατηφόρος φορέας για το CHIKV [4, 5, 11]. Μάλιστα, οι Tsetsarkin et al. διαπίστωσε ότι ένας ιός E1-A226V με σήμανση Green Fluorescent Protein ήταν 100 φορές πιο μολυσματικός στο Ae. albopictus από ό,τι ήταν στον Αε. αίγυπτος [4] . Σε όλα τα νησιά του Ινδικού Ωκεανού, η Ae. Το albopictus έγινε ο κύριος φορέας για το CHIKV μέσα σε 1-2 χρόνια μετά την εισαγωγή του CHIKV στην περιοχή [31] . Αξίζει να σημειωθεί ότι ο Ae. Το aegypti έχει εγκατασταθεί πιθανότατα στη Βόρεια Αμερική για περισσότερα από 300 χρόνια, ενώ το Ae. Το albopictus βρίσκεται σε πολλές περιοχές των ΗΠΑ, από το 1985, κυρίως στη Φλόριντα [32] και από τότε έχει επεκτείνει τη γκάμα του στη χώρα. Οι Reiskind et al. βάλθηκε να προσδιορίσει αν ο Αε. aegypti και Ae. Τα κουνούπια albopictus που αιχμαλωτίστηκαν στη Φλόριντα ήταν ευαίσθητα στη μόλυνση από CHIKV από ένα προϊόν απομόνωσης La Reunion [32] . Κάθε κουνούπι που δοκιμάστηκε ήταν πολύ ευαίσθητο στη μόλυνση από έναν πλήρους μήκους μολυσματικό κλώνο της απομόνωσης του νησιού La Réunion, το στέλεχος CHIKV LR2006 OPY1. Αν και η Αε. Τα στελέχη albopictus ήταν πιο ευαίσθητα στη μόλυνση, η συνολική οικολογία και οι διαφορές στα πρότυπα δαγκώματος του ανθρώπου πρέπει να μελετηθούν περαιτέρω Χαρακτηριστικά, υπάρχουν δύο γύροι μετάφρασης: (+) το αισθητικό γονιδιωματικό RNA (49S9 = 11,7 kb) δρα απευθείας ως mRNA και μεταφράζεται μερικώς (59 τέλος) για την παραγωγή μη δομικών πρωτεϊνών (nsp's). Αυτές οι πρωτεΐνες είναι υπεύθυνες για την αντιγραφή και το σχηματισμό ενός συμπληρωματικού (2) κλώνου, του εκμαγείου για περαιτέρω (+) σύνθεση κλώνου. Η αντιγραφή του υπογονιδιωματικού mRNA (26 S = 4,1 kb) λαμβάνει χώρα μέσω της σύνθεσης πλήρους μήκους (2) ενδιάμεσου RNA, το οποίο ρυθμίζεται από τον πρόδρομο nsp4 και p123 στην πρώιμη μόλυνση και αργότερα από ώριμα nsp. Η μετάφραση του προσφάτως συντεθέντος υπογονιδιωματικού RNA έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή δομικών πρωτεϊνών όπως το Capsid και η πρωτεΐνη E2-6k-E1 (από το 39 άκρο του γονιδιώματος). Η συναρμολόγηση πραγματοποιείται στην επιφάνεια του κυττάρου και το περίβλημα αποκτάται καθώς οι οφθαλμοί του ιού αναβλύζουν από το κύτταρο και η απελευθέρωση και η ωρίμανση συνέβη σχεδόν ταυτόχρονα. Ο αναδιπλασιασμός συμβαίνει στο κυτταρόπλασμα και είναι πολύ γρήγορος (,4 ώρες) [28, 29] . doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g002 www.plosntds.org για να αποκτήσετε μια ακριβέστερη κατανόηση μιας πιθανής επιδημίας CHIKV στις ΗΠΑ [32] .Κατά τη διάρκεια της 7ης ημέρας πριν από τη γέννηση, καμία ανθρώπινη μητέρα δεν έχει αναφερθεί να μεταδίδει το ασθένεια κάθετα. Ωστόσο, περίπου το 50% των νεογνών που γεννήθηκαν ενώ η μητέρα είχε προσβληθεί από CHIKV προσβλήθηκε από τη μητέρα τους, παρά τη μέθοδο τοκετού. Επιπλέον, υπήρξαν περιπτώσεις μετάδοσης του CHIKV από τη μητέρα στο έμβρυο που προκαλεί συγγενή ασθένεια και εμβρυϊκό θάνατο [33] . ανακάλυψαν ότι οι μητέρες μπορούσαν να μεταδώσουν το CHIKV στους απογόνους τους κατά τη διάρκεια της περιγεννητικής περιόδου (Ημέρα 24 έως Ημέρα +1) [33, 34] και σχετίζεται με υψηλό βαθμό νοσηρότητας. Κατά τη μέση Ημέρα 4 της ζωής, όλα τα νεογνά ήταν συμπτωματικά για CHIKV, παρουσιάζοντας κοινά συμπτώματα CHIKF. Έξι νεογνά επιβεβαιώθηκε ότι προσβλήθηκαν από CHIKV και ανέπτυξαν μηνγοεγκεφαλίτιδα. Από εκείνες τις μητέρες που, κατά τη διάρκεια της επιδημίας του νησιού La Reunion, μολύνθηκαν πολύ πριν τον τοκετό, αναφέρθηκαν μόνο τρεις θάνατοι εμβρύων [12, 33]. Ramful et al. θεώρησε ότι η μετάδοση από τη μητέρα στο παιδί πιθανότατα συμβαίνει διαπλακουντιακά λίγο πριν τον τοκετό [33]. Μια παρόμοια μελέτη των Gerardin et al. ανέφεραν δεκαεννέα περιπτώσεις νεογνικής λοίμωξης που σχετίζονται με μητρική ιαιμία εντός του τοκετού που εξελίχθηκε σε εγκεφαλίτιδα λόγω κάθετης μετάδοσης από μολυσμένες μητέρες [34] .Οι κλινικές και επιδημιολογικές ομοιότητες με τον δάγγειο πυρετό καθιστούν δύσκολη τη διάγνωση του CHIKV, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει τους γιατρούς να διαγνώσουν εσφαλμένα το CHIKV ως δάγγειο πυρετό. Συνεπώς, η συχνότητα εμφάνισης του CHIKV μπορεί στην πραγματικότητα να είναι υψηλότερη από ό,τι πιστεύεται σήμερα (Πίνακας 1) [6, 12, 35]. Ο χρόνος που έχει περάσει από την έναρξη της νόσου είναι η πιο κρίσιμη παράμετρος κατά την επιλογή μιας διαγνωστικής εξέτασης. Το CHIKV μπορεί να ανιχνευθεί και να απομονωθεί με καλλιέργεια με κύτταρα κουνουπιών (C6/36), κύτταρα Vero (θηλαστικά) ή σε ποντίκια [26] . Ωστόσο, αυτή η μέθοδος μπορεί να διαρκέσει τουλάχιστον μία εβδομάδα και επιτυγχάνει υψηλή ευαισθησία μόνο κατά τη διάρκεια της ιαιμικής φάσης, η οποία συνήθως διαρκεί μόνο έως και 48 ώρες μετά το δάγκωμα. Πέντε ημέρες μετά τη μόλυνση, η προσέγγιση απομόνωσης του ιού έχει χαμηλή ευαισθησία αλλά εξακολουθεί να είναι η προτιμώμενη μέθοδος για την ανίχνευση του στελέχους CHIKV [12, 26, 31, 35]. Η RT-PCR από την άλλη πλευρά είναι μια ταχύτερη και πιο ευαίσθητη μέθοδος που μπορεί να χρησιμοποιηθεί εντός της πρώτης εβδομάδας από την έναρξη της νόσου [26], και αυτή τη στιγμή είναι η πιο ευαίσθητη μέθοδος για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό του mRNA του ιού [4, 36] .Classic Η ορολογική ανίχνευση, με προσδιορισμούς όπως η ELISA [37] , ο ανοσοφθορισμός [5, 38] , η δέσμευση του συμπληρώματος και η αναστολή της αιμοσυγκόλλησης [39] , αποτελεί το δεύτερο διαγνωστικό εργαλείο που χρησιμοποιείται για τη βιολογική διάγνωση της λοίμωξης CHIKV. Αυτές οι αποδεδειγμένες τεχνικές είναι χρήσιμες για την ανίχνευση του Αντιγόνου στα κουνούπια κατά τη διάρκεια επιδημιολογικών μελετών. Αυτές οι αναλύσεις ανιχνεύουν IgM και IgG ειδικά για τον ιό, ωστόσο η ευαισθησία και η ειδικότητα αυτών των αναλύσεων δεν έχουν χαρακτηριστεί ελάχιστα. Η ιική ικανότητα, ή η πιθανότητα ιογενούς μόλυνσης και μετάδοσης, είναι μια σημαντική παράμετρος που μπορεί να ποσοτικοποιηθεί με ELISA, ιική καλλιέργεια και PCR.A μελέτη από τους Ng et al. έδειξε βιοδείκτες ενδεικτικούς σοβαρής λοίμωξης CHIKV [40] . Βρήκαν μειωμένα επίπεδα RANTES και αυξημένα επίπεδα Ιντερλευκίνης-6 (IL-6) και Ιντερλευκίνης-1b (IL-1b) που θα μπορούσαν να μηνυθούν για ανίχνευση CHIKV σε ασθενείς ως δείκτες καταιγίδας κυτοκινών που προκαλείται από το CHIKV. Οι Couderc et al. επιδεικνύουν μια άλλη κυτοκίνη, την IFN τύπου Ι, ως βασικό παράγοντα στην εξέλιξη της λοίμωξης CHIKV [26] . Χρησιμοποιώντας ένα μηδενικό μοντέλο ποντικιού IFN-a/b, κατέδειξαν στοιχεία μυών, αρθρώσεων και δέρματος ως προνομιούχων στόχων CHIKV, κάτι που συνάδει με την ανθρώπινη παθολογία. Αν και οι Ng et al. κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι τα επίπεδα RANTES καταστέλλονταν σημαντικά σε ασθενείς με σοβαρή CHIKF [40] , είναι ενδιαφέρον ότι μια αύξηση στα επίπεδα του RANTES έχει παρατηρηθεί στη μόλυνση από τον δάγκειο πυρετό [41] . Δεδομένου ότι τα συμπτώματα του CHIKF μιμούνται εκείνα του δάγγειου πυρετού, τα αποτελέσματα που προέκυψαν από αυτήν τη μελέτη υποδηλώνουν έντονα ότι το RANTES θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός διακριτικός βιοδείκτης που διαφοροποιεί αυτές τις δύο κλινικά παρόμοιες ασθένειες. Δεν υπάρχουν επί του παρόντος διαθέσιμες εγκεκριμένες αντιικές θεραπείες για το CHIKV [1, 3, 12, 42]. Επί του παρόντος, το CHIKF αντιμετωπίζεται συμπτωματικά, συνήθως με μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα ή στεροειδή, ανάπαυση στο κρεβάτι και υγρά. Η κίνηση και η ήπια άσκηση πιστεύεται ότι μειώνουν τη δυσκαμψία και την πρωινή αρθραλγία, αλλά η βαριά άσκηση μπορεί να επιδεινώσει τα ρευματικά συμπτώματα. Τα κορτικοστεροειδή μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε περιπτώσεις εξουθενωτικής χρόνιας λοίμωξης CHIKV. Υπάρχει μια συζήτηση σχετικά με την καταλληλότητα της χλωροκίνης ως θεραπείας για ανεπίλυτη, μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη αρθρίτιδα [43] . Μια μελέτη έδειξε ότι η παραγωγή του ιού www.plosntds.org μειώθηκε δραστικά στις 16 ώρες μετά τη μόλυνση μετά από θεραπεία με 100 mM dec-RVKR-cmk (Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-χλωρομεθυλκετόνη), έναν αναστολέα της φουρίνης [42, 44] . Η χλωροκίνη έδρασε αυξάνοντας το pH, εμποδίζοντας την είσοδο του ιού στο κύτταρο που εξαρτάται από το χαμηλό pH. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι το dec-RVKR-cmk ή η χλωροκίνη ανέστειλε μόνο την εξάπλωση του ιού από κύτταρο σε κύτταρο, όχι τον αναδιπλασιασμό του CHIKV από τη στιγμή που είχε εισέλθει στο κύτταρο [43] . Ωστόσο, οι περισσότεροι θα συμφωνούσαν ότι το καλύτερο όπλο ενάντια στο CHIKV είναι η πρόληψη. Ένα ζωντανό εμβόλιο CHIKV που αναπτύχθηκε από τις Ηνωμένες Πολιτείες έφτασε στη φάση ΙΙ κλινική δοκιμή που περιελάμβανε 59 υγιείς εθελοντές [45] . Το 8% των εθελοντών εμφάνισε παροδική αρθραλγία, ενώ το 98% των εθελοντών είχε ορομετατροπή [45]. Ωστόσο, τα ζωντανά εμβόλια CHIKV εξακολουθούν να αμφισβητούνται. Δεν μπορεί κανείς να αποκλείσει τον κίνδυνο ενός ζωντανού εμβολίου που ενδεχομένως να προκαλέσει χρόνιους ρευματισμούς. Επίσης, υπάρχει το ερώτημα εάν η ευρεία χρήση στο κοινό θα μπορούσε να προκαλέσει μετάδοση από κουνούπια ή να οδηγήσει σε χρόνια μόλυνση ή ιική αναστροφή [1] . Μια εναλλακτική προσέγγιση θα ήταν η παραγωγή ενός χιμαιρικού εμβολίου κατά του CHIKV. Οι Wang et al. ανέπτυξε ένα εμβόλιο χιμαιρικού αλφαϊού που είναι ομοιόμορφα εξασθενημένο και δεν προκαλεί αντιδραστικότητα σε ποντίκια [3] . Τρεις διαφορετικές εκδόσεις αυτού του εμβολίου κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τρεις διαφορετικούς φορείς ραχοκοκαλιάς: εξασθενημένο στέλεχος εμβολίου Τ-83 από τον ιό της εγκεφαλίτιδας των ίππων της Βενεζουέλας (VEEV), τον ιό της ανατολικής εγκεφαλίτιδας των ίππων (EEEV) και τον εξασθενημένο ιό Sindbis (SINV). Εν ολίγοις, οι δομικές πρωτεΐνες CHIKV κατασκευάστηκαν στη ραχοκοκαλιά των προαναφερθέντων εμβολίων για την παραγωγή των χίμαιρων [3] . Αυτές οι χίμαιρες βρέθηκαν να διεγείρουν μια ισχυρή χυμική ανοσία και ακόμη και σε δόσεις 5,3-5,8 log 10 PFU, δεν προκάλεσαν αντιδραστικότητα. Όταν τα εμβολιασμένα ποντίκια προσβλήθηκαν με CHIKV, ούτε τα ενήλικα ούτε τα νεογνά ποντίκια κέρδισαν βάρος, είχαν πυρετό ή εμφάνισαν σημεία νευρολογικής ασθένειας. Κατά τη σύγκριση των χίμαιρων με το εμβόλιο Army181/25, το εμβόλιο του Στρατού οδήγησε σε υψηλότερα επίπεδα ιαιμίας και αναπαραγωγής στις αρθρώσεις νεογνών ποντικών. Επειδή οι αρθρώσεις είναι γνωστοί στόχοι του CHIKV, οι Wang et al. σημείωσε ότι το εμβόλιο τους μπορεί να αποφύγει τις αρνητικές αντιδραστικές παρενέργειες του εμβολίου του Στρατού. Αφού εμβολιάστηκαν υποδορίως με 5,3-5,8 log 10 PFU των χιμαιρικών εμβολίων, τα ποντίκια παρήγαγαν ισχυρούς τίτλους εξουδετερωτικών αντισωμάτων. Οι χίμαιρες VEEV και EEEV απέδωσαν υψηλότερους τίτλους εξουδετερωτικών αντισωμάτων από τη χίμαιρα SINV χωρίς να είναι πιο λοιμώδεις. Επιπλέον, οι χίμαιρες VEEV και EEEV CHIKV φάνηκαν να είναι πιο ανοσογονικές από το εμβόλιο του Στρατού, παρά τη χαμηλότερη ιαιμία και την αναπαραγωγή των χίμαιρων στις αρθρώσεις νεογνών ποντικών [3] .Tiwari et al. [46] υιοθέτησε μια διαφορετική στρατηγική χρησιμοποιώντας αδρανοποιημένο με φορμαλίνη CHIKV σε συνδυασμό με αλυδρογέλη (υδροξείδιο του αργιλίου) ως ανοσοενισχυτικό. Αυτή η μελέτη υποδηλώνει ξεκάθαρα ότι αυτό το εμβόλιο προκαλεί τόσο χυμικές όσο και μεσολαβούμενες από κύτταρα ανοσοαποκρίσεις σε ποντίκια, παρέχοντας το ανοσογονικό του δυναμικό. Μια πρόσφατη μελέτη των Couderc et al. [47] έδειξε παθητική ανοσοποίηση ως πιθανή θεραπεία για τη λοίμωξη CHIKV. Χρησιμοποιώντας καθαρισμένη ανοσοσφαιρίνη που εκχυλίστηκε από ασθενείς με CHIKV που αναρρώνουν, επέδειξαν αποτελεσματική εξουδετερωτική δράση έναντι της λοίμωξης CHIKV τόσο in vitro όσο και in vivo. Αυτό δημιουργεί μια πιθανή προληπτική και θεραπευτική προσέγγιση για την καταπολέμηση της λοίμωξης CHIKV. Μελέτες παθογένειας που διεξήχθησαν με σχετικό άλφα ιό, όπως ο RRV, έδειξαν το ρόλο των μακροφάγων στην επιμονή στη μόλυνση [48] . Έδειξαν επίσης το ρόλο των ειδικών για τον RRV CD8 Τ-λεμφοκυττάρων στην εκκαθάριση του ιικού φορτίου σε μολυσμένους ασθενείς, δικαιολογώντας έτσι παρόμοιες έρευνες με το CHIKV και τη σημασία της διερεύνησης ενός εμβολίου που βασίζεται στην κυτταρική ανοσοαπόκριση κατά του CHIKV [49] . Υπάρχουν πάντα ορισμένα κινδύνους που σχετίζονται με ζωντανά εξασθενημένα ή αδρανοποιημένα εμβόλια ιών [50] . Ένας τρόπος για να αποφευχθούν αυτά τα πιθανά προβλήματα είναι η κατασκευή ενός εμβολίου DNA με βάση τη συναίνεση. Τα εμβόλια που βασίζονται στο DNA έχουν βελτιωμένο προφίλ ασφάλειας σε σύγκριση με τα ζωντανά ή εξασθενημένα εμβόλια [51, 52]. Συνέπεια της ταχείας εξέλιξης του CHIKV είναι η δυσκολία στην κατασκευή ενός εμβολίου που θα είναι σε θέση να Σχήμα 3 . Επίπεδα ειδικής για το CHIKV IgG σε ποντικούς ανοσοποιημένους με εμβόλια CHIKV. Κάθε ομάδα ποντικών C57BL/6 (n = 5) ανοσοποιήθηκε με 12,5 mg φορέα ελέγχου pVax1 ή πλασμίδια εμβολίου CHIKV όπως υποδεικνύεται στις 0 και 2 εβδομάδες. Τα ποντίκια αιμορραγήθηκαν 2 εβδομάδες μετά από κάθε ανοσοποίηση και η δεξαμενή ορού κάθε ομάδας αραιώθηκε σε 1:100 και 1:500 για αντίδραση με συγκεκριμένα κατασκευάσματα εμβολίου. Ο ορός επωάστηκε για 1 ώρα στους 37 uC σε πλάκες 96 φρεατίων επικαλυμμένες με 2 mg/ml αντίστοιχων πεπτιδίων CHIKV, και το αντίσωμα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας IgG-HRP αντι-ποντικού και η OD μετρήθηκε στα 405 nm. Το doi:10.1371/journal.pntd.0000623.g003 www.plosntds.org προστατεύει αποτελεσματικά μεγάλους πληθυσμούς από πολλαπλά στελέχη του ιού. Ένα από τα δυνατά πλεονεκτήματα των συναινετικών εμβολίων DNA είναι η ικανότητά τους να προκαλούν διασταυρούμενες αντιδραστικές ανοσολογικές αποκρίσεις έναντι των τριών διακριτών φυλογενετικών ομάδων του CHIKV. Επίσης, τα εμβόλια με βάση το DNA μπορούν να παραχθούν πιο γρήγορα από τα εμβόλια με βάση τις πρωτεΐνες. Πρόσφατα, οι Muthumani et al. κατασκεύασε ένα εμβόλιο που αποδείχθηκε ότι επάγει τόσο χυμική όσο και κυτταρική ανοσία in vivo σε θηλυκά ποντίκια C57/BL6 ηλικίας 3-4 εβδομάδων [49] . Αυτά τα ποντίκια ανοσοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μια μέθοδο ηλεκτροδιάτρησης in vivo για να χορηγήσουν το εμβόλιο στον τετρακέφαλο μυ. Το συναινετικό κατασκεύασμα σχεδιάστηκε έναντι των Ε1, Ε2 και του καψιδίου της πρωτεΐνης πυρήνα. Για να σχεδιάσουν το κατασκεύασμα, ευθυγράμμισαν 21 αλληλουχίες CHIKV που απομονώθηκαν μεταξύ 1952 και 2006, χρησιμοποιώντας στελέχη από διαφορετικές χώρες, συμπεριλαμβανομένου του νησιού La Reunion. Το πιο κοινό νουκλεοτίδιο μεταξύ των αλληλουχιών επιλέχθηκε σε κάθε θέση που θα χρησιμοποιηθεί στη συναινετική κατασκευή, προσέχοντας να μην αλλοιωθεί το πλαίσιο ανάγνωσης. Διεξήγαγαν βελτιστοποίηση κωδικονίων και RNA, πρόσθεσαν μια ισχυρή αλληλουχία Kozak και αντικατέστησαν το πεπτίδιο σήματος με μια αλληλουχία οδηγό ανοσοσφαιρίνης Ε για να βελτιώσουν την αποτελεσματικότητα του εμβολίου. Μετά την ανοσοποίηση των ποντικών, συλλέχθηκαν σπλήνες μαζί με ορό και δοκιμάστηκαν για τον προσδιορισμό του τίτλου αντισωμάτων. Μετά από τρεις ανοσοποιήσεις, τα συναινετικά εμβόλια Ε1, Ε2 και C φάνηκε ότι επάγουν ανοσοαποκρίσεις των Τ-κυττάρων που οδηγούν σε ισχυρές αποκρίσεις IFN-c και πολλαπλασιασμό σε ποντικούς C57/BL6. Επιπλέον, σε σύγκριση με ποντίκια ελέγχου, τα ανοσοποιημένα ποντίκια είχαν υψηλότερα επίπεδα ολικής IgG καθώς και υψηλότερα αντι-Ε1 ειδικά, αντι-Ε2 και αντι-C ειδικά αντισώματα IgG, υποδηλώνοντας ισχυρή χυμική ανοσολογική απόκριση (Εικόνα 3) και επίσης ειδικότητα για τα αντιγόνα που κωδικοποιούνται στα κατασκευάσματα εμβολίου (Εικόνα 4). Λόγω των υποσχόμενων αποτελεσμάτων του και της ανάγκης για ένα ασφαλέστερο εμβόλιο, αυτό το συναινετικό εμβόλιο DNA αξίζει περαιτέρω έρευνα. Ο προσδιορισμός της μακροζωίας των προστατευτικών επιδράσεων του εμβολίου και της επιμονής των αποκρίσεων αντισώματος και IFN-c θα μπορούσε να είναι το επόμενο βήμα της έρευνας. Πρέπει επίσης να διεξαχθούν αμφισβητούμενες μελέτες σε ανοσοποιημένα ποντίκια. Η ασθένεια που μεταδίδεται από τα κουνούπια CHIKV έχει προκαλέσει μαζικά ξεσπάσματα για τουλάχιστον μισό αιώνα, αλλά δεν περιορίζεται πλέον στις αναπτυσσόμενες χώρες www.plosntds.org. Άρχισε να εισχωρεί στα όρια του αναπτυσσόμενου κόσμου. Ως αποτέλεσμα, το NIAID έχει χαρακτηρίσει το CHIKV ως παθογόνο της κατηγορίας C παράλληλα με τους ιούς της γρίπης και του SARS-CoV [3] . Η συνειδητοποίηση της πιθανής σοβαρότητας αυτής της ασθένειας είναι επιτακτική. Για παράδειγμα, εάν χρησιμοποιηθεί ως βιολογικό όπλο, η παγκόσμια οικονομία θα μπορούσε να ακρωτηριαστεί σοβαρά. Εάν αρκετά μέλη των ενόπλων δυνάμεων μολυνθούν κατά τη διάρκεια μιας στρατιωτικής ανάπτυξης, οι στρατιωτικές επιχειρήσεις θα μπορούσαν να επηρεαστούν σημαντικά. Οι προσπάθειες παρακολούθησης της νόσου θα παρέχουν ελάχιστη μόνο προειδοποίηση σε μια παγκόσμια κοινωνία και τα μέτρα για την πρόληψη της νοσηρότητας και της θνησιμότητας που συνδέονται με την πανδημία είναι επιτακτική ανάγκη [21, 31]. Παρά τη σοβαρότητα της μολυσματικής του ισχύς και τον φόβο ότι είναι πιθανό βιολογικό όπλο, δεν υπάρχει επί του παρόντος εμβόλιο για τις λοιμώξεις από το CHIKV. Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές ζωντανών εξασθενημένων εμβολίων το 2000, αλλά η χρηματοδότηση του έργου διακόπηκε. Νεότερες προσεγγίσεις όπως τα εμβόλια DNA φαίνονται πολλά υποσχόμενες σε σχέση με τις συμβατικές στρατηγικές όπως ο ζωντανός εξασθενημένος ή απενεργοποιημένος ιός και επομένως απαιτούν περαιτέρω έρευνα. Οι πρόσφατες εξελίξεις όπως η παροχή ηλεκτροδιάτρησης και η ενσωμάτωση ανοσοενισχυτικών ενίσχυσαν την αποτελεσματικότητα του εμβολίου DNA [51, 53]. Παρά τη χαμηλή απόκριση αντισωμάτων στα εμβόλια DNA, άλλα πολυάριθμα πλεονεκτήματα έχουν επισκιάσει αυτά τα δευτερεύοντα μειονεκτήματα (Πίνακας 2), το πιο σημαντικό είναι η ικανότητα να επάγει τόσο χυμικές όσο και κυτταρικές ανοσοαποκρίσεις [51, 54]. Κρίνοντας από την πρόσφατη επιτυχία, όπως π.χ. το ανοσογονικό κατασκεύασμα που αναπτύχθηκε από τους Muthumani et al., τα εμβόλια DNA θα μπορούσαν να παίξουν σημαντικό ρόλο στην καταπολέμηση του CHIKV [49] . Τα εμβόλια είναι κυριολεκτικά ένα κρίσιμο συστατικό του ελέγχου της νόσου CHIKV και επομένως η έρευνα σε αυτόν τον τομέα ενθαρρύνεται ιδιαίτερα. Η δραματική εξάπλωση των ιών του δάγκειου πυρετού (DENV) σε όλη την τροπική Αμερική από το 1980 μέσω των ίδιων φορέων και των ίδιων ανθρώπινων ξενιστών υπογραμμίζει τον κίνδυνο για τη δημόσια υγεία στην Αμερική. Οι ανεπιθύμητες ενέργειες που σχετίζονται με το τρέχον ζωντανό εμβόλιο είναι καλά τεκμηριωμένες [55] . Έχοντας συνειδητοποιήσει αυτά τα μειονεκτήματα, θα πρέπει να καταβληθούν σοβαρές προσπάθειες για την ανάπτυξη νέων στρατηγικών για την πρόληψη περαιτέρω εξάπλωσης και επιπλοκών.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 402, "text": "ένα αναδυόμενο παθογόνο που μεταδίδεται από τα κουνούπια" } ], "id": 2470, "question": "Τι είναι ο ιός Chikungunya;" }, { "answers": [ { "answer_start": 901, "text": "Επί του παρόντος, δεν υπάρχει εμβόλιο ή αντιική θεραπεία" } ], "id": 2472, "question": "Υπάρχει θεραπεία;" }, { "answers": [ { "answer_start": 959, "text": "Με την απειλή μιας αναδυόμενης παγκόσμιας πανδημίας, τα περίεργα προβλήματα που σχετίζονται με τις πιο άμεσες και εποχιακές επιδημίες δικαιολογούν την ανάπτυξη ενός αποτελεσματικού εμβολίου." } ], "id": 2473, "question": "Ποιο συμπέρασμα εξάγεται σε αυτή την έκθεση;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1269, "text": "ένα παθογόνο που μεταδίδεται από τα κουνούπια που καταγράφεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Αλλεργιών και Λοιμωδών Νοσημάτων (NIAID) ως Παθογόνο Προτεραιότητας Κατηγορίας Γ που προκαλεί πυρετό Chikungunya (CHIKF)" } ], "id": 2474, "question": "Τι είναι ο ιός Chikungunya;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1587, "text": "ένας ιός που μεταδίδεται από τα αρθρόποδα (αρβοϊός" } ], "id": 2475, "question": "Τι είναι το CHIKV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1914, "text": "η δημοτική γλώσσα Kimakonde της Τανζανίας και της Μοζαμβίκης" } ], "id": 2478, "question": "Από ποια γλώσσα πήρε το όνομά της η ασθένεια;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2354, "text": "Ae. aegypti και Ae. albopictus" } ], "id": 2482, "question": "Από τι διανύσεται στην Ασία;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2423, "text": "σε έναν αστικό κύκλο όπου το κουνούπι μεταδίδει την ασθένεια από έναν μολυσμένο άνθρωπο σε έναν μη μολυσμένο άνθρωπο, ακολουθώντας ένα επιδημιολογικό πρότυπο παρόμοιο με τον δάγγειο πυρετό" } ], "id": 2483, "question": "Πώς συμβαίνει η μετάδοση στην Ασία;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2924, "text": "46.000" } ], "id": 2485, "question": "Στην κορύφωση της επιδημίας πόσα κρούσματα την εβδομάδα υπήρχαν στο νησί;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3931, "text": "μεταξύ 100 και 840 ετών" } ], "id": 2491, "question": "Πότε ο ασιατικός γονότυπος απέκλινε από τον αφρικανικό γονότυπο;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3980, "text": "έχει προχωρήσει πολύ, με πολλές μεταλλάξεις ενσωματωμένες, και συνέχισε να προκαλεί επιδημίες σε αρκετές περιοχές" } ], "id": 2492, "question": "Ποια είναι η κατάσταση του ασιατικού CHIKV από την εμφάνισή του;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6092, "text": "4-7" } ], "id": 2496, "question": "Σε πόσες ημέρες εμφανίζονται τα συμπτώματα;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7113, "text": "Το χρόνιο στάδιο του CHIKF χαρακτηρίζεται από" } ], "id": 2499, "question": "Τι ποσοστό των ασθενών εξακολουθεί να έχει το CHIKV IgM μετά από δεκαοκτώ μήνες;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7155, "text": "από πολυαρθραλγία που μπορεί να διαρκέσει από εβδομάδες έως χρόνια πέρα ​​από το οξύ στάδιο" } ], "id": 2500, "question": "Από τι χαρακτηρίζεται το χρόνιο στάδιο;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7299, "text": "ινοβλάστες" } ], "id": 2501, "question": "Τι επηρεάζει το CHIKV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 12484, "text": "50%" } ], "id": 2503, "question": "Τι ποσοστό των ατόμων που πάσχουν από CHIKF είναι άνω των 65 ετών;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7677, "text": "33%" } ], "id": 2504, "question": "Τι ποσοστό πεθαίνει;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7864, "text": "παιδιά" } ], "id": 2505, "question": "Ποια άλλη ομάδα επηρεάζεται δυσανάλογα;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7917, "text": "από τις πιο συχνές έως τις λιγότερο συχνές, περιλαμβάνουν αναπνευστική ανεπάρκεια, καρδιαγγειακή αντιρρόπηση, μηνιγγοεγκεφαλίτιδα, σοβαρή οξεία ηπατίτιδα, σοβαρές δερματικές επιδράσεις, άλλα προβλήματα του κεντρικού νευρικού συστήματος και νεφρική ανεπάρκεια" } ], "id": 2506, "question": "Ποιες επιπλοκές συνδέονται με το CHIKV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 8765, "text": "σε οικολογική πίεση, ευνοώντας την αντικατάσταση της αλανίνης στη θέση 226 με βαλίνη (E1-A226V)" } ], "id": 2509, "question": "ποιο ήταν το αποτέλεσμα της μείωσης του πληθυσμού των Αε. Αίγυπτος όταν ο ιός έπληξε τα νησιά Reunion, λόγω μαζικής χρήσης διχλωροδιφαινυλοτριχλωροαιθανίου;" }, { "answers": [ { "answer_start": 10106, "text": "Ae. albopictus" } ], "id": 2511, "question": "Τι προκάλεσε τη μεγάλη επιδημία στα νησιά Λα Ρεϋνιόν;" }, { "answers": [ { "answer_start": 9151, "text": "34%" } ], "id": 2512, "question": "Τι ποσοστό του πληθυσμού επηρεάστηκε;" }, { "answers": [ { "answer_start": 9197, "text": "Όλα τα στελέχη CHIKV που απομονώθηκαν από το Mayotte έφεραν τη μετάλλαξη E1-A226V και η μετάλλαξη βρέθηκε επίσης στη Μαδαγασκάρη το 2007 [" } ], "id": 2513, "question": "Πού βρέθηκε το στέλεχος CHIKV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 10106, "text": "Ae. albopictus" } ], "id": 2516, "question": "Ποιος έχει γίνει ο προτιμώμενος και θανατηφόρος φορέας;" }, { "answers": [ { "answer_start": 2370, "text": "Ae. albopictus" } ], "id": 2518, "question": "Ποιος έγινε ο κύριος φορέας στον Ινδικό Ωκεανό μέσα σε 1-2 χρόνια μετά την εισαγωγή του CHIKV;" }, { "answers": [ { "answer_start": 7587, "text": "50%" } ], "id": 2521, "question": "Τι ποσοστό των νεογνών μολύνθηκαν από τη μητέρα τους;" }, { "answers": [ { "answer_start": 13332, "text": "η μετάδοση από τη μητέρα στο παιδί πιθανότατα συμβαίνει διαπλακουντιακά λίγο πριν τον τοκετό" } ], "id": 2524, "question": "Τι είναι η θεωρία σχετικά με τη μετάδοση;" }, { "answers": [ { "answer_start": 27352, "text": "Τα εμβόλια είναι κυριολεκτικά ένα κρίσιμο συστατικό του ελέγχου της νόσου CHIKV και επομένως η έρευνα σε αυτόν τον τομέα ενθαρρύνεται ιδιαίτερα" } ], "id": 2527, "question": "Ποιο είναι το συμπέρασμα αυτής της έκθεσης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 25596, "text": "ως παθογόνο της κατηγορίας C παράλληλα με τους ιούς της γρίπης και του SARS-CoV" } ], "id": 2528, "question": "Ποια είναι η ονομασία NIAID του CHIKV;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Οι εργαζόμενοι στον τομέα της υγειονομικής περίθαλψης υποδεικνύουν κακή ετοιμότητα για ξέσπασμα της νόσου του ιού Έμπολα στην περιοχή Ashanti της Γκάνα https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5461762/SHA: f8efe7295a7cf875c8a695df3e85utinas Angelinas Yar, Denis Dekugmen; Owusu, Michael; Biney, Eno Akua; Forson, Paa Kobina; Okyere, Portia Boakye; Gyimah, Akosua Adumea; Owusu-Dabo, EllisΗμερομηνία: 2017-06-06DOI: 10.1186/s12889-017-4474-6Άδεια: cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Η πρόσφατη επιδημία του ιού Έμπολα (EVD) χρειάζεται την Αφρική για να εκπαιδεύσει ορισμένες χώρες στη Δύση ευθυγραμμίστε τους εργαζόμενους στον τομέα της υγείας υψηλού κινδύνου για δεξιότητες πρόληψης ασθενειών. Παρόλο που η Γκάνα δεν κατέγραψε (και δεν έχει ακόμη καταγράψει) κανένα κρούσμα, και αρκετοί εργαζόμενοι στον τομέα της υγείας έχουν λάβει πολυάριθμα προγράμματα κατάρτισης, δεν υπάρχει αρχείο οποιασδήποτε μελέτης που να αξιολογεί την ετοιμότητα των εργαζομένων στον τομέα της υγειονομικής περίθαλψης (HCWS) σχετικά με την EVD και οποιαδήποτε επιρρεπή σε έκτακτη ανάγκη ασθένεια στην Γκάνα. Ως εκ τούτου, πραγματοποιήσαμε μια συγχρονική μελέτη βασισμένη στο νοσοκομείο στην οποία συμμετείχαν 101 HCW από δύο εγκαταστάσεις στο Kumasi της Γκάνα για να αξιολογήσουμε το επίπεδο ετοιμότητας των HCW να ανταποκριθούν σε οποιαδήποτε πιθανή EVD. ΜΕΘΟΔΟΙ: Χορηγήσαμε ένα ερωτηματολόγιο πρόσωπο με πρόσωπο χρησιμοποιώντας μια προσαρμοσμένη λίστα ελέγχου WHO (2015) και CDC (2014) για την ετοιμότητα Έμπολα και αξιολογήσαμε τα συνολικά κενά γνώσης και την ετοιμότητα των HCW της Γκάνας σε επιλεγμένες εγκαταστάσεις υγείας της περιοχής Ashanti της Γκάνα από Οκτώβριος έως Δεκέμβριος 2015. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Συνολικά 92 (91,09%) HCW δήλωσαν ότι δεν ήταν επαρκώς εκπαιδευμένοι για να χειριστούν ένα ύποπτο περιστατικό EVD. Μόνο το 25,74% (n = 26) θεώρησε ότι οι εγκαταστάσεις τους ήταν επαρκώς εξοπλισμένες για να χειρίζονται και να διαχειρίζονται ασθενείς με EVD. Όταν ρωτήθηκε ποιο απολυμαντικό να χρησιμοποιήσετε μετά την περίθαλψη και τη φροντίδα ενός ύποπτου ασθενούς με EVD, μόνο το 8,91% (n = 9) μπορούσε να αναγνωρίσει σωστά το σωστό απολυμαντικό (χ(2) = 28,52, p = 0,001). ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Η μελέτη μας καταδεικνύει χαμηλή γνώση και κακή ετοιμότητα και απροθυμία πολλών υγειονομικών υπηρεσιών υγείας να παρακολουθήσουν την EVD. Πέρα από την απόκτηση γνώσεων, υπάρχει η ανάγκη για περισσότερη εκπαίδευση κατά καιρούς για την πλήρη προετοιμασία των HCW για να χειριστούν οποιαδήποτε πιθανή περίπτωση EVD. Κείμενο: Κατά την τελευταία έξαρση της νόσου του ιού Έμπολα (EVD) και τη συνακόλουθη μαζική επιδημία της με πολύ υψηλή θνησιμότητα [1 ] , πολλά συστήματα και υπηρεσίες υγείας στη Δυτική Αφρική κατακλύστηκαν και διαταράχθηκαν. Αυτό οφειλόταν εν μέρει στα φτωχά και αδύναμα συστήματα υγείας σε συνδυασμό με τους απροετοίμαστους και ανειδίκευτους εργαζομένους στον τομέα της υγειονομικής περίθαλψης (HCWs) σε συνδυασμό με την κακή κατανόηση της δυναμικής της νόσου που συνδέεται με την έλλειψη των απαραίτητων πόρων. Στις αρχές του 2014, η εμφάνιση του EVD [1] στη Γουινέα, συντάραξε τα συστήματα υγειονομικής περίθαλψης της υποπεριοχής της Δυτικής Αφρικής, στοιχίζοντας πάνω από 9800 ζωές [2] συμπεριλαμβανομένων περισσότερων από 491 (58,7%) θανάτων HCW από 839 μολύνσεις [2]. 2] . Επομένως, αυτή η επιδημία ενίσχυσε το γεγονός ότι οι HCW διατρέχουν υψηλό κίνδυνο να μολυνθούν από τη νόσο, σύμφωνα με τα βασικά τους καθήκοντα. Τα εμπειρικά δεδομένα που δημιουργήθηκαν κατά τη διάρκεια και μετά την επιδημία έδειξαν πόσο απροετοίμαστοι ήταν οι περισσότεροι υγειονομικοί ασθενείς μπροστά στην κρίση. Μελέτες στη Νιγηρία, τη Γουινέα και την Ινδία υποδεικνύουν το χαμηλό επίπεδο γνώσεων, την αρνητική στάση και τις κατώτερες πρακτικές που μπορούν να εξαλειφθούν μέσω της συνεχούς εκπαίδευσης των HCW καθώς και της παροχής των απαραίτητων και επαρκών πόρων στο πλαίσιο των καθηκόντων τους [3] [4] [5] [6] .Οι χώρες που επλήγησαν περισσότερο ήταν η Λιβερία, η Σιέρα Λεόνε, η Γουινέα και αρκετές άλλες χώρες με εισαγόμενα κρούσματα [7] . Όπως τα περισσότερα κράτη της Δυτικής Αφρικής, η Γκάνα ήταν σε κατάσταση υψηλού συναγερμού και ήταν η νούμερο ένα στον κατάλογο των χωρών που θεωρούνταν ότι διατρέχουν υψηλό κίνδυνο για EVD. Έτσι, η χώρα προσπάθησε να κάνει κάποιες προετοιμασίες στον απόηχο της επιδημίας [8] . Η κυβέρνηση, με την υποστήριξη οργανώσεων δωρητών, όπως ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (ΠΟΥ), οι Γιατροί Χωρίς Σύνορα (ΓΧΣ) δημιούργησε πόρους για την εκπαίδευση των επαγγελματιών υγείας και κάποιο επίπεδο αναπροσαρμογής εξοπλισμού των νοσοκομείων και ετοιμότητας των εργαζομένων στον τομέα της υγείας για κάθε πιθανή σενάρια έκτακτης ανάγκης. Διάφορα HCW έλαβαν τόσο θεωρητική όσο και πρακτική εκπαίδευση σχετικά με τον τρόπο διαχείρισης των μολυσμένων και προσβεβλημένων ατόμων. Αυτές οι εκπαιδευτικές συνεδρίες έλαβαν τη μορφή επιτόπιας και εκτός τοποθεσίας καθοδήγησης καθώς και εργαστηρίων. Πραγματοποιήθηκαν επίσης ασκήσεις προσομοίωσης για να γίνει αντιληπτό πώς θα αντιδρούσαν τα HCW κατά τη διάρκεια σεναρίων έκτακτης ανάγκης EVD. Για παράδειγμα, η γερμανική κυβέρνηση μέσω του Κέντρου Συνεργατικής Έρευνας στην Τροπική Ιατρική Kumasi οργάνωσε πρακτική εκπαίδευση για αρκετούς υπηκόους της Δυτικής Αφρικής σχετικά με τη λήψη δειγμάτων, τη δειγματοληψία και τη χρήση και αφαίρεση ατομικού προστατευτικού εξοπλισμού (http://kccr.org). Το πιο σημαντικό, υπήρξε η κατασκευή τριών κέντρων θεραπείας και επίσης, μια υπηρεσία αναμονής ασθενοφόρων για τη μεταφορά των επιβεβαιωμένων περιστατικών στα κέντρα θεραπείας. Παρεμπιπτόντως, η Γκάνα δεν κατέγραψε κανένα κρούσμα στον απόηχο της επιδημίας και μέχρι στιγμής δεν έχει καταγράψει κανένα κρούσμα EVD. Ωστόσο, η ανταπόκριση των HCW στα σενάρια εντόπισε αρκετά κενά. Μετά από μια σειρά εκπαίδευσης για HCW, θα μπορούσε κανείς εύκολα να υποθέσει ότι οι εργαζόμενοι στον τομέα της υγειονομικής περίθαλψης είναι επαρκώς προετοιμασμένοι και εξοπλισμένοι με τις απαραίτητες γνώσεις και δεξιότητες για να αντιμετωπίσουν οποιαδήποτε πιθανή εστία EVD. Δεν είναι σαφές, για παράδειγμα, σε ποιο βαθμό αυτές οι ασκήσεις εξασκήθηκαν και για πόσο καιρό εντάχθηκαν σε συνήθεις νοσοκομειακές δραστηριότητες. Ως εκ τούτου, αναρωτιέται κανείς πόσο καλά προετοιμασμένοι είναι οι HCW στην Γκάνα για να ανταποκριθούν όχι μόνο στην EVD αλλά και σε άλλες επιδημικές επιρρεπείς ασθένειες (EPDs) που απαιτούν συντονισμένη προσέγγιση όσον αφορά την ετοιμότητα και τη διαχείριση. Παρόλο που έχουν επενδυθεί ορισμένοι πόροι για την αντιμετώπιση του φόβου EVD στην Γκάνα, δεν έχει γίνει καμία αξιολόγηση για την ετοιμότητα των εργαζομένων στον τομέα της υγείας απέναντι σε τυχόν σενάρια έκτακτης ανάγκης. Η απλή παροχή εργαλείων όπως φάρμακα, προστατευτικός εξοπλισμός προσωπικού (ΜΑΠ) και άλλα logistics δεν αποτελεί πανάκεια για την επαρκή και κατάλληλη ανταπόκριση στα EPD. Κατά συνέπεια, εάν το προσωπικό υγειονομικής περίθαλψης δεν έχει τις βασικές γνώσεις, τις πρακτικές και οργανωτικές δεξιότητες για να σχεδιάσει και να ανταποκριθεί σε τέτοιες καταστάσεις έκτακτης ανάγκης, δεν θα σήμαινε καταδίκη μόνο για το ίδιο αλλά και για τον γενικό πληθυσμό, όπως στην περίπτωση της πρόσφατης επιδημίας στη Δυτική Αφρική. Είναι σημαντικό, για παράδειγμα, να κατανοήσουμε τη δυναμική του τι θα ωθήσει έναν HCW να είναι πρόθυμος να βάλει τη ζωή του/της στην γραμμή του καθήκοντος για μια περίπτωση EVD. Είναι επομένως κρίσιμο να κατανοήσουμε την τρέχουσα ετοιμότητα του εργαζομένου στον τομέα της υγειονομικής περίθαλψης στην Γκάνα προκειμένου να γίνουν συστάσεις για μελλοντική εκπαίδευση και σχεδιασμό για οποιαδήποτε κατάσταση επιδημίας. Επομένως, η ανάγκη για τη Γκάνα να έχει εμπειρικά δεδομένα σχετικά με τη γενική ετοιμότητα έκτακτης ανάγκης για τον προσδιορισμό και την κατανόηση των κενών γνώσης και την αξιολόγηση της γνώσης έναντι της πρακτικής σε μια προσπάθεια να παράσχει κατεύθυνση για την πολιτική δεν μπορεί να υπερτονιστεί. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε το επίπεδο ετοιμότητας, ετοιμότητας και γνώσης για την απόκριση έκτακτης ανάγκης EVD μεταξύ ενός πληθυσμού εργαζομένων στον τομέα της υγειονομικής περίθαλψης (HCWs) στη Μητρόπολη Kumasi της Περιφέρειας Ashanti, Γκάνα. Πραγματοποιήσαμε μια εγκάρσια τομή μελέτη σε νοσοκομείο μεταξύ των υπηρεσιών υγείας εργαζόμενοι στα Κυβερνητικά Νοσοκομεία Kumasi South και Suntreso που έχουν χαρακτηριστεί ως «προηγμένη μονάδα συγκράτησης του Έμπολα» και «μόνιμη ομάδα Έμπολα» αντίστοιχα, στη Μητρόπολη Κουμάσι. Τα νοσοκομεία Kumasi South και Suntreso έχουν μέση μηνιαία παρακολούθηση από το Τμήμα Εξωτερικών Ασθενών (OPD) περίπου 20.603 και 11.712 ασθενών αντίστοιχα και υγειονομικό προσωπικό περίπου 450 το καθένα. Παρόμοια με τις περισσότερες εγκαταστάσεις, υπάρχουν περισσότερες γυναίκες νοσοκόμες παρά άνδρες. Οργανώσαμε μια ημερήσια εκπαίδευση για τους βοηθούς ερευνητές μας σχετικά με τον τρόπο χρήσης της συσκευής Personal Digital Assistant (PDA) Samsung Galaxy note 8 GT-N5100 (Samsung Electronics Co. Ltd., Σεούλ, Κορέα) στη συλλογή δεδομένων. Η αρχική έκδοση του ερωτηματολογίου δοκιμάστηκε εκ των προτέρων, με πέντε εργαζόμενους στον τομέα της υγειονομικής περίθαλψης που ήταν παρόμοιοι ως προς τα χαρακτηριστικά τους με τα μέλη του πληθυσμού της μελέτης αλλά εκτός της περιοχής δικαιοδοσίας και μελέτης για να διασφαλιστεί η εγκυρότητα και η μεροληψία μέτρησης. Το ερωτηματολόγιο αναθεωρήθηκε με βάση τις προτάσεις και τα σχόλια (κυρίως για τον τρόπο κατασκευής των ερωτήσεων) που ελήφθησαν από τον πιλότο. Αυτό ήταν το τελικό και επικυρωμένο εργαλείο συλλογής δεδομένων που χρησιμοποιήθηκε κατά τη διάρκεια της μελέτης. Και στις δύο εγκαταστάσεις, επικοινωνήσαμε με τους ιατρικούς επιθεωρητές για να λάβουμε άδεια να παρακολουθήσουμε τις πρωινές συνεδριάσεις τους για να εξηγήσουμε τους στόχους και τους στόχους της εργασίας στους HCW. Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου, δόθηκε η ευκαιρία στα HCW να κάνουν ερωτήσεις. Δύο βοηθοί πεδίου τοποθετήθηκαν σε καθεμία από τις τοποθεσίες μελέτης για τη συλλογή δεδομένων. Μερικές από τις ερωτήσεις που τέθηκαν περιελάμβαναν τον οργανισμό που είναι υπεύθυνος για την EVD, τον τρόπο μετάδοσης της νόσου, την ετοιμότητα του HCW να χειριστεί οποιοδήποτε περιστατικό EVD και, μεταξύ άλλων, τα πρώιμα κλινικά χαρακτηριστικά της λοίμωξης. Κατά την εκτίμηση του μεγέθους του δείγματος για αυτήν τη μελέτη, προηγούμενα δεδομένα από το νοσοκομείο αναφέρει ότι υπάρχουν περίπου 900 HCW στις δύο εγκαταστάσεις. Υποθέτοντας ένα διάστημα εμπιστοσύνης 95% και εάν το 70% αυτών των HCW ερχόταν σε επαφή με ένα ύποπτο κρούσμα EVD, επιτρέποντας ποσοστό σφάλματος 10%, περίπου 87 HCW θα παρείχαν προεπιλεγμένη ισχύ μελέτης 80% και άλφα 5%. Με ένα ποσοστό μη ανταπόκρισης περίπου 15% που μας επιτρέπει να δειγματίσουμε 101 HCW από τις δύο εγκαταστάσεις που παρέχουν υπηρεσίες έκτακτης ανάγκης στην περιοχή Ashanti της Γκάνα. Επομένως, οποιοσδήποτε εργαζόμενος υγειονομικής περίθαλψης παρακολουθεί απευθείας ασθενείς σε κατάσταση έκτακτης ανάγκης ήταν επιλέξιμος για συμπερίληψη στη μελέτη. Το πλαίσιο δειγματοληψίας μας αποτελείται από μια λίστα με συνολικά 200. Από αυτή τη λίστα, πήραμε στη συνέχεια ένα συστηματικό τυχαίο δείγμα όλων των επιλέξιμων εργαζομένων στον τομέα της υγείας για να αντιπροσωπεύσουμε το μέγεθος του δείγματος. Αφού λάβαμε γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση που υποδεικνύεται από την υπογραφή και ή το αποτύπωμα των συμμετεχόντων, στη συνέχεια χορηγήσαμε τα ερωτηματολόγια εντός των δύο εγκαταστάσεων. Χρησιμοποιήσαμε τη λίστα ελέγχου WHO (2015) και CDC (2014) για την ετοιμότητα για τον Έμπολα που παρέχει πρακτικές και συγκεκριμένες προτάσεις για να διασφαλίσουμε ότι η υγεία Οι εγκαταστάσεις μπορούν να βοηθήσουν το προσωπικό τους να ανιχνεύσει πιθανά κρούσματα Έμπολα, να προστατεύσουν το προσωπικό και να ανταποκριθούν κατάλληλα [9, 10] . Αυτή η λίστα ελέγχου περιλάμβανε την αξιολόγηση των εγκαταστάσεων, τη γνώση και την ετοιμότητα των HCW. Με βάση αυτές τις λίστες ελέγχου, αναπτύξαμε ένα ερωτηματολόγιο για να εξακριβώσουμε τη συνολική γνώση και ετοιμότητα των HCW της Γκάνας σχετικά με το ξέσπασμα της EVD. Το ερωτηματολόγιο μας χορηγήθηκε από ένα PDA και κατέγραψε τα δημογραφικά στοιχεία, την ετοιμότητα, τη μορφή αποζημίωσης που πιστεύουν οι HCW ότι θα ήταν κατάλληλη για τη φροντίδα του περιστατικού EVD και τη γνώση του EVD κατά την περίοδο Οκτωβρίου έως Δεκεμβρίου 2015. Απαιτήθηκαν απαντήσεις σε αυτές τις ερωτήσεις από τους HCW για τον προσδιορισμό της πρόσβασης σε πληροφορίες σχετικά με την EVD μεταξύ των HCW, τις γνώσεις τους σχετικά με την EVD και τη μορφή αποζημίωσης που οι HCW πιστεύουν ότι θα ήταν κατάλληλη κατά τη φροντίδα της υπόθεσης EVD μεταξύ άλλων. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν ηλεκτρονικά χρησιμοποιώντας tablet για αποθήκευση στο cloud μέσω CommCare ODK έκδοση 2.27.2, συγκεντρώθηκε σε αρχείο Microsoft Excel, εξήχθη στην έκδοση 14 STATA και αναλύθηκε. Χρησιμοποιήθηκαν περιγραφικές στατιστικές για να συνοψιστεί η κατανομή των διαφόρων μεταβλητών σε πίνακες και σχήματα. Οι κατηγορικές μεταβλητές αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τεστ chisquare και λογιστική παλινδρόμηση για συσχετίσεις. Ιστορικό των συμμετεχόντων στη μελέτη Ο Πίνακας 1 δείχνει τα χαρακτηριστικά υποβάθρου των συμμετεχόντων στη μελέτη. Συνολικά ερωτήθηκαν 101 συμμετέχοντες στη μελέτη, εκ των οποίων οι 85 (84,16%) ήταν γυναίκες. Οι ερωτηθέντες κατηγοριοποιήθηκαν σε τρεις κύριες ομάδες ανά επάγγελμα: Νοσηλευτές (76,24%), Ιατροί (19,80%) και Βοηθοί Ιατρών (ΒΑ) (3,96%). Η πλειοψηφία (54,46%) των ερωτηθέντων ήταν παντρεμένοι. Συνολικά το 52,48% (53) ασκούσε το επάγγελμά του για λιγότερο από 5 χρόνια (SD = 9,22 ± 10,52 έτη). Και στις δύο εγκαταστάσεις, το 75,25% (76) των ερωτηθέντων εργαζόταν στην εγκατάσταση για λιγότερο από 5 χρόνια (SD = 4,04 ± 4,07 έτη). Ο Πίνακας 2 δείχνει τη γνώση και την επίγνωση των συμμετεχόντων για την EVD. Από τους 101 HCW που ερωτήθηκαν, το 83,17% (n = 84) προσδιόρισε σωστά την αιτία της EVD, το 13,86% (n = 14) δεν γνώριζε την αιτία, ενώ το 2,97% (n = 3) επισήμανε εσφαλμένα ότι η αιτία είναι βακτήριο. Παρόλο που ένας (0,99%) γιατρός και 16 (15,84%) νοσηλευτές δεν μπόρεσαν να προσδιορίσουν σωστά την αιτία. καμία ομάδα δεν ήταν σημαντικά πιθανό να επισημάνει λανθασμένα την αιτία της EVD (χ 2 = 5,41, p = 0,247). Συνολικά 72 (71,29%) HCW ανέφεραν τα μέσα ενημέρωσης, ιδίως το ραδιόφωνο ως κύρια πηγή πληροφοριών όταν ρωτήθηκαν πού άκουσαν για πρώτη φορά για την EVD . Αυτό ήταν σημαντικά μεγαλύτερο από άλλες πηγές (χ 2 = 45,44, p < 0,05). Όταν ρωτήθηκε ποιο εργαστήριο επιπέδου βιοασφάλειας (BSL) απαιτείται για τη δοκιμή δείγματος από ύποπτο ασθενή με EVD, συνολικά 19 (18,81%) ανέφεραν BSL-3 εκ των οποίων 11 (10,89%) ήταν Ιατροί, ενώ 8 (7,92) και 1 ( Το 0,99%) ήταν Νοσηλευτές και Βοηθοί Ιατρών, αντίστοιχα. Άλλοι 76 (75,25%), εκ των οποίων οι 9 (8,91%) ήταν γιατροί, 62 (61,39%) Νοσηλευτές Όταν ρωτήθηκαν ποιο απολυμαντικό να χρησιμοποιήσουν μετά την παρακολούθηση και τη φροντίδα ενός ύποπτου ασθενούς με EVD, μόνο το 8,91% (n = 9) μπορούσε να προσδιορίσει σωστά το λευκαντικό (0,5% υποχλωριώδες νάτριο) ποιο απολυμαντικό πρέπει να χρησιμοποιηθεί (χ 2 = 28,52, p = 0,001). Ετοιμότητα για ξέσπασμα EVD ανά κατηγορία HCW Ο Πίνακας 3 δείχνει τα επίπεδα ετοιμότητας των HCW να χειριστούν και να διαχειριστούν την εστία EVD. Όταν οι HCW ρωτήθηκαν εάν θεωρούν ότι οι εγκαταστάσεις τους είναι επαρκώς εξοπλισμένες για να χειρίζονται και να διαχειρίζονται ασθενείς με EVD, το 25,74% (n = 26) απάντησε θετικά, ενώ το 54,46% (55) ανέφερε διαφορετικά. Από αυτούς, οι 14 (13,86%) ήταν Ιατροί, οι 39 (38,61%) Νοσηλευτές και οι 2 (1,98%) ήταν ΠΑ (χ 2 = 2,66, p = 0,62). Εάν μολύνθηκαν κατά λάθος με EVD μετά από παρακολούθηση ασθενή με EVD, 98 (97,03%) από τους ερωτηθέντες δήλωσαν ότι θα δεχόντουσαν να απομονωθούν (χ 2 = 4,69, p = 0,321). Εν τω μεταξύ, το 44,55% (n = 45) των HCWs θα παρακολουθούσε πρόθυμα έναν ύποπτο για EVD ασθενή (χ 2 = 8,03, p = 0,09). Συνολικά 92 (91,09%) HCW που ερωτήθηκαν ανέφεραν ότι δεν ήταν επαρκώς εκπαιδευμένοι για να χειριστούν μια EVD ύποπτη περίπτωση. Όταν τους ζητήθηκε να βαθμολογήσουν την ικανότητά τους στο χειρισμό ενός ύποπτου ασθενούς για EVD, το 18,81% (n = 19) δήλωσε ότι είχε μικρή εμπιστοσύνη και ικανότητα, ενώ το 6,93% (n = 7) δήλωσε ότι ήταν εξαιρετικά σίγουρο να χειριστεί ένα ύποπτο περιστατικό EVD (χ 2 = 13,09, p = 0,11). Πέρα από την EVD, ζητήσαμε από τον πληθυσμό της έρευνάς μας να ονομάσει άλλες ασθένειες επιρρεπείς σε επιδημίες. Από το σύνολο των ιατρών υγείας που συμμετείχαν σε συνέντευξη, το 56,43% (57/101) ανέφερε επιδημικές ασθένειες βακτηριακής προέλευσης όπως η φυματίωση και η χολέρα. Ένα επιπλέον 33,70% (34/101) ανέφερε ασθένειες ιογενούς προέλευσης όπως SARS, γρίπη, HIV, πυρετός Lassa και δάγγειος πυρετός, ενώ το 9,90% (10) ανέφερε άλλες αναφερόμενες στην ελονοσία. Όταν ρωτήθηκαν για τη μορφή αποζημίωσης που οι HCW θεωρούσαν ότι θα ήταν κατάλληλη όταν φροντίζουν έναν ύποπτο ασθενή για Έμπολα, οι απαντήσεις που δόθηκαν περιελάμβαναν προσωπική ασφάλιση (32/101), οικογενειακή αποζημίωση σε περίπτωση θανάτου (31/101), χρήματα (30/101) και βραβεία (8/101) ενώ άλλοι πρότειναν επίσης προαγωγή εργασίας (7/101) και άλλοι (18/101). Ο πληθυσμός της έρευνάς μας συνέστησε την παροχή logistics και εκπαίδευσης ως δύο βασικά ζητήματα για την κατάλληλη προετοιμασία των HCW προς οποιαδήποτε ασθένειες επιρρεπείς σε επιδημίες.Πολλά ζητήματα σχετικά με την ετοιμότητα των HCW έχουν συζητηθεί εκτενώς παγκοσμίως, ειδικά μετά την επιδημία του Σοβαρού Οξέος Αναπνευστικού Συνδρόμου Coronavirus (SARS-CoV) και του αναπνευστικού συνδρόμου της Μέσης Ανατολής (MERS)-CoV. Ενώ είναι καταγεγραμμένο ότι το πρόσφατο ξέσπασμα EVD κατέγραψε πολύ υψηλή θνησιμότητα μεταξύ των HCW, εξ όσων γνωρίζουμε, μόνο λίγες μελέτες έχουν αντιμετωπίσει αυτά τα ζητήματα εν όψει μιας επιδημίας EVD, ιδίως σε χώρες που δεν έχουν πληγεί από την επιδημία EVD και ιδιαίτερα σε υπο Σαχάρας Αφρική, μια τέτοια μελέτη είναι σχεδόν ανύπαρκτη. Συνεπώς, η μελέτη μας αξιολόγησε πόσο προετοιμασμένοι είναι οι HCW απέναντι σε μια πιθανή επιδημία EVD. Τα αποτελέσματα αυτής της έρευνας έδειξαν ότι περισσότεροι από τους μισούς (54,46%) HCW έδειξαν ότι οι εγκαταστάσεις τους δεν ήταν έτοιμες να χειριστούν περιπτώσεις EVD. Σχεδόν το 92% ανέφερε ότι δεν ήταν επαρκώς εκπαιδευμένο για να χειριστεί ένα ύποπτο περιστατικό EVD και δεν προκαλεί έκπληξη το γεγονός ότι λιγότερο από το 50% δήλωσε ότι θα παρακολουθούσε πρόθυμα έναν ύποπτο ασθενή. Επιπλέον, σχεδόν το ένα τρίτο των HCW θα ήθελε επίσης ασφάλιση για τους εαυτούς τους και τις οικογένειές τους σε περίπτωση που μολυνθούν από EVD. Αυτά τα αποτελέσματα είναι ξεκάθαρα ενδεικτικά του πόσο κακώς προετοιμασμένοι είναι οι HCW που συμμετείχαν στην έρευνα απέναντι σε μια δυνητικά απειλητική για τη ζωή επιδημική ασθένεια, όπως π. ως EVD στην Γκάνα. Σε αυτή τη μελέτη, μόνο το 25,7% των HCW είπε ότι οι εγκαταστάσεις τους ήταν επαρκώς εξοπλισμένες για να χειριστούν ένα ξέσπασμα EVD. Τέτοιες χαμηλές βαθμολογίες των νοσοκομείων από την πλειονότητα των HCW είναι ένδειξη έλλειψης εμπιστοσύνης στην ετοιμότητα των εγκαταστάσεων τους και αυτό μπορεί στην πραγματικότητα να υποδηλώνει πραγματική έλλειψη ετοιμότητας και ετοιμότητας των νοσοκομείων να χειριστούν όχι μόνο περιπτώσεις EVD αλλά και άλλες δυνητικά επιρρεπείς σε επιδημίες ασθένειες. Εναλλακτικά, θα μπορούσε επίσης να σημαίνει ότι οι HCW πιθανότατα αγνοούσαν τις προπαρασκευαστικές εργασίες και τον εξοπλισμό των εγκαταστάσεων τους για να χειριστούν την κατάσταση επιδημίας EVD. Η προθυμία για εργασία κατά τη διάρκεια επιδημιών και έκτακτων περιστατικών θεωρείται ως αίσθηση καθήκοντος ακόμη και εν όψει κινδύνου. Σε αυτή τη μελέτη, λιγότερο από το 50% των HCW εξέφρασαν την προθυμία τους να εργαστούν σε περίπτωση εμφάνισης επιδημίας EVD. Επιπλέον, πάνω από το ένα τρίτο υπέδειξε διάφορες μορφές αποζημίωσης για τον εαυτό τους ή τις οικογένειές τους σε περίπτωση θανάτου ή κατά τη φροντίδα ενός περιστατικού EVD. Αυτό σημαίνει ότι εάν οι HCW έχουν διαβεβαιωθεί ή εγγυηθεί ότι αυτοί και οι οικογένειές τους θα λάβουν φροντίδα σε περίπτωση θανάτου ή κατά τη φροντίδα ενός περιστατικού EVD, θα εργαστούν πρόθυμα μπροστά σε οποιοδήποτε σενάριο έκτακτης ανάγκης. Η υπόθεση είναι ότι οι HCW θα εργάζονται πρόθυμα σε περίπτωση έκτακτης ανάγκης μολυσματικών ασθενειών και θα ανταποκρίνονται κατάλληλα. Ωστόσο, υπάρχουν ενδείξεις ότι οι HCW αποφεύγουν αυτό το «ιερό καθήκον» στη φροντίδα των ασθενών και θα άφηναν τους ασθενείς ευάλωτους σε περιόδους κρίσης [11] . Προκειμένου να αποφευχθεί η μόλυνση των HCW ενώ είναι υποχρεωμένοι να εργάζονται ακόμη και ενόψει προσωπικού κινδύνου, όπως απαιτείται από τους κώδικες δεοντολογίας και επαγγελματισμού τους, είναι επιτακτική ανάγκη να διασφαλιστεί ότι πληρούνται τα κατάλληλα συμβατικά πρότυπα, εγγυήσεις και αποτελεσματικές πρακτικές δημόσιας υγείας που επιτρέπουν στους HCW ανταποκρίνονται σε τέτοιες εστίες, ώστε να μην μολυνθούν και ή επηρεαστούν παρά τους κινδύνους που ενδέχεται να αντιμετωπίζουν και συνεχίζουν να αντιμετωπίζουν [12] . Έτσι, η κατάλληλη εκπαίδευση των HCW, όπως υποδεικνύεται από τους ερωτηθέντες κατά τη διάρκεια της μελέτης, σε συνδυασμό με τον εξοπλισμό προετοιμασίας ορισμένων εγκαταστάσεων υγείας είναι πολύ σημαντική για τη διασφάλιση ότι είναι εξοπλισμένοι με τις απαραίτητες γνώσεις και τα εργαλεία που απαιτούνται για να εργαστούν σε περίπτωση επιδημίας. Γενικά Η γνώση της EVD είναι ζωτικής σημασίας για την επαρκή ανταπόκριση και φροντίδα των ασθενών. Σχεδόν το 17% του πληθυσμού της μελέτης μας δεν μπόρεσε να αναγνωρίσει ότι η EVD προκαλείται από έναν ιό. Αναμφισβήτητα, τα μέτρα ελέγχου των λοιμώξεων θα ήταν δύσκολα και προβληματικά για τέτοιους HCW. Λιγότερο από 10% θα μπορούσε να αναγνωρίσει σωστά το 0,5% υποχλωριώδες νάτριο ως το καλύτερο απολυμαντικό από τις πολλές επιλογές που παρέχονται. Αυτό έρχεται σε πλήρη αντίθεση με παρόμοια μελέτη στο Conakry που διεξήχθη κατά τη διάρκεια της κορύφωσης της επιδημίας, όπου το 68% των HCW γνώριζαν τη σωστή συγκέντρωση του απολυμαντικού [5] . Αν και δεν προσπαθούμε να συγκρίνουμε αυτά τα δύο σενάρια, αυτές οι πληροφορίες μπορεί να είναι ζωτικής σημασίας για τη συνειδητοποίηση ότι η γνώση των HCW στα μέτρα πρόληψης και ελέγχου των λοιμώξεων είναι κρίσιμης σημασίας για την εκτέλεση των καθηκόντων τους. Αυτή η μελέτη έδειξε ότι οι περισσότεροι HCW άκουσαν για πρώτη φορά για την EVD μέσω των μέσων ενημέρωσης, ιδίως μέσω του ραδιοφώνου . Αυτό καθιερώνει τον κρίσιμο ρόλο που διαδραματίζουν τα μέσα ενημέρωσης στην ενημέρωση του γενικού πληθυσμού σε τέτοιες εστίες ασθενειών. Στην Γκάνα, υπάρχουν πάνω από 350 μέσα ενημέρωσης (ραδιόφωνο και τηλεόραση μαζί) και τα περισσότερα νοικοκυριά είτε διαθέτουν ραδιόφωνο, τηλεόραση είτε έχουν πρόσβαση στο διαδίκτυο. Παρά τον πλουραλισμό των μέσων ενημέρωσης, εξακολουθεί να εναπόκειται στα ιδρύματα και τις εγκαταστάσεις υγείας να οργανώνουν ειδική εκπαίδευση για κάθε αναδυόμενη μολυσματική ασθένεια που εμφανίζεται παγκοσμίως για την ενημέρωση της γνώσης των HCWs. Η απομόνωση είναι ένα βασικό μέτρο δημόσιας υγείας για την πρόληψη της εξάπλωσης μολυσματικών ασθενειών. Σε αυτή τη μελέτη, πάνω από το 97% των HCW εξέφρασαν την προθυμία τους να συμμορφωθούν και να αποδεχτούν να απομονωθούν σε περίπτωση που μολυνθούν μετά από παρακολούθηση ύποπτου ασθενή με EVD. Ωστόσο, ένα μικρό ποσοστό των HCW που ερωτήθηκαν δήλωσαν ότι θα ήταν πολύ δυσαρεστημένοι και αυτό θα μπορούσε τελικά να επηρεάσει τη συμμόρφωση. Η απομόνωση είναι μια από τις παλαιότερες μεθόδους ελέγχου των εστιών μεταδοτικών ασθενειών για τους ασθενείς [13] . Ωστόσο, αξίζει να σημειωθεί ότι λιγότερο από το 50% δήλωσε ότι θα ήταν πρόθυμο να παρακολουθήσει έναν ύποπτο για EVD ασθενή και υποψιαστήκαμε ότι αυτό θα μπορούσε να σχετίζεται με τον φόβο της προσωπικής ασφάλειας [14] . Η επείγουσα ανταπόκριση από μια επιδημική ασθένεια από έναν εξωτικό μολυσματικό ιό ή παθογόνο θα προκαλέσει φυσικά κάποιο επίπεδο φόβου και σκεπτικισμού μεταξύ οποιασδήποτε ομάδας ατόμων, ειδικά όταν οι γνώσεις τους σχετικά με τη δυναμική της επιδημίας της νόσου είναι χαμηλή. Υπάρχουν ιστορίες HCW που απέφυγαν την ευθύνη της θεραπείας ασθενών [15] και αυτό φάνηκε στο HIV/AIDS και στο Σοβαρό Οξύ Αναπνευστικό Σύνδρομο-Κοροναϊό (SARS-CoV) κατά τη δεκαετία του 1980 και του 2003, αντίστοιχα, όπου ο φόβος της επαφής με ύποπτοι και μολυσμένοι ασθενείς έπιασαν μερικούς HCW [16, 17] . Μακροπρόθεσμα, αυτός ο φόβος πιθανότατα θα επηρεάσει την εμπιστοσύνη και τη δέσμευσή τους στον επαγγελματισμό. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης υποδεικνύουν το γεγονός ότι η γνώση και η παροχή εργαλείων όπως ο προστατευτικός εξοπλισμός προσωπικού (ΜΑΠ) και άλλα logistics από μόνα τους δεν είναι αρκετά καλή στρατηγική . Ενδέχεται να υπάρχει η ανάγκη να αντιμετωπιστούν και ζητήματα που σχετίζονται με τον μύθο και τον πολιτισμό, καθώς και διαβεβαιώσεις συντήρησης σε περίπτωση που κάποιος μολυνθεί. Η γενική άποψη ότι η αφοσίωση της χώρας στο υγειονομικό προσωπικό μπορεί να είναι ένας παράγοντας που συμβάλλει σε όλα αυτά και δεν μπορεί να αγνοηθεί. Ωστόσο, είναι κρίσιμης σημασίας να εμπνευστούν οι HCW και να αισθάνονται ασφαλείς στη φροντίδα τέτοιων εστιών υψηλής μολυσματικής νόσου. Κατά τη διάρκεια της μελέτης μας, οι HCW υπέδειξαν διάφορες μορφές αποζημίωσης που έπρεπε να τους καταβληθούν σε περίπτωση που επηρεαστούν στην περίπτωση της επίθεσης EVD. Αυτή η μελέτη είχε κάποιους εγγενείς περιορισμούς. Αυτή ήταν μια διερευνητική μελέτη και το μέγεθος του δείγματός μας ήταν περιορισμένο. Επομένως, ενώ δεν προσπαθούμε να γενικεύσουμε τα αποτελέσματα, πιστεύουμε ότι αυτό μπορεί να είναι μια αντανάκλαση των HCW γενικά. Επιπλέον, δεδομένου ότι η μελέτη μας επικεντρώθηκε κυρίως σε δύο εγκαταστάσεις υγείας, είμαστε και πάλι προσεκτικοί στην παρέκτασή τους σε άλλες ώστε να αντικατοπτρίζονται άλλες εγκαταστάσεις. Επιπλέον, δεδομένου ότι αυτή δεν ήταν μια πραγματική εμπειρία και μια έρευνα που βασίζεται σε ερωτηματολόγια, οι απαντήσεις μπορεί να μην αντικατοπτρίζουν με ακρίβεια εμπειρίες από την πραγματική ζωή σε περίπτωση επιδημίας EVD. Παρά τους περιορισμούς αυτούς, η ανάγκη για εκπαίδευση ήταν έντονη μεταξύ των HCW. Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν περαιτέρω την κακή ετοιμότητα των υγειονομικών εγκαταστάσεων και το μεγάλο ποσοστό των HCW που δεν επιθυμούν να παρακολουθήσουν ένα ύποπτο κρούσμα EVD. Αυτό απαιτεί συντονισμένες προσπάθειες των ιδρυμάτων και των εγκαταστάσεων υγείας για τον πλήρη εξοπλισμό και προετοιμασία των HCW με τα απαιτούμενα εργαλεία και γνώσεις και τη διασφάλιση της ικανότητας χειρισμού οποιασδήποτε επιδημικής ασθένειας.", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 9503, "text": "δύο" } ], "id": 4250, "question": "Πόσες εγκαταστάσεις παρακολουθήθηκαν σε αυτή τη μελέτη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 1802, "text": "25,74%" } ], "id": 4251, "question": "Τι ποσοστό των εγκαταστάσεων πίστευε ότι ήταν επαρκώς εξοπλισμένες για να χειριστούν τη νόσο του ιού Έμπολα;" }, { "answers": [ { "answer_start": 15240, "text": "26" } ], "id": 4252, "question": "Πόσες εγκαταστάσεις πίστευαν ότι ήταν επαρκώς εξοπλισμένες για να χειριστούν τη νόσο του ιού Έμπλα;" }, { "answers": [ { "answer_start": 19711, "text": "εάν οι HCW έχουν διαβεβαιωθεί ή εγγυηθεί ότι αυτοί και οι οικογένειές τους θα λάβουν φροντίδα σε περίπτωση θανάτου ή κατά τη φροντίδα ενός περιστατικού EVD," } ], "id": 4254, "question": "Τι προτείνει η μελέτη ότι θα έκανε τους εργαζόμενους στον τομέα της υγειονομικής περίθαλψης πιο πρόθυμους να φροντίσουν τους ασθενείς κατά τη διάρκεια μιας επιδημίας του ιού Έμπολα;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Ανάλυση με βάση την αλληλουχία RNA του μεταγραφώματος της σπλήνας μετά από μόλυνση από ιό λοιμώδους βρογχίτιδας κοτόπουλων που επιλέχθηκαν για διαφορετικές συγκεντρώσεις λεκτίνης στον ορό που δεσμεύει τη μαννόζηhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4729133/SHA: f5f1cd436f2040b Edin; Kjærup, Rikke Brødsgaard; Mach, Núria; Minozzi, Guilietta; Strozzi, Francesco; Gualdi, Valentina; Williams, John L.; Chen, Jun; Wattrang, Eva; Buitenhuis, Bart; Juul-Madsen, Helle Risdahl; Dalgaard, Tina Sørensen Ημερομηνία: 2016-01-27DOI: 10.1186/s12864-016-2403-1 Άδεια χρήσης: cc-byAbstract: ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Η λοιμώδης βρογχίτιδα των πτηνών είναι μια εξαιρετικά μεταδοτική νόσος της άνω λοιμώδους βρογχίτιδας ΙΒ. Η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση μεταξύ της έμφυτης και της προσαρμοστικής ανοσολογικής απόκρισης στη λοίμωξη από IBV είναι ένα κρίσιμο στοιχείο για περαιτέρω βελτιώσεις στις στρατηγικές ελέγχου του IBV. Για το σκοπό αυτό, μελετήθηκαν δύο σειρές κοτόπουλου, που επιλέχθηκαν για υψηλή (γραμμή L10H) και χαμηλή (γραμμή L10L) συγκέντρωση ορού λεκτίνης που δεσμεύει τη μαννόζη (MBL). Συνολικά χρησιμοποιήθηκαν 32 πουλιά από κάθε γραμμή. Δεκαέξι πουλιά από κάθε σειρά μολύνθηκαν με IBV και δεκαέξι έμειναν μη μολυσμένα. Οκτώ μη μολυσμένα και μολυσμένα πουλιά από κάθε σειρά υποβλήθηκαν σε ευθανασία 1 και 3 εβδομάδες μετά τη μόλυνση. Ο προσδιορισμός αλληλουχίας RNA πραγματοποιήθηκε σε δείγματα σπλήνας και από τα 64 πουλιά και πραγματοποιήθηκε ανάλυση διαφορικής γονιδιακής έκφρασης για τέσσερις συγκρίσεις: γραμμή L10L έναντι γραμμής L10H για μη μολυσμένα πτηνά στις εβδομάδες 1 και 3, αντίστοιχα, και με τον ίδιο τρόπο για μολυσμένα πτηνά. Η λειτουργική ανάλυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας όρους διαδικασίας ανοσολογικού συστήματος γονιδιακής οντολογίας (GO) που είναι ειδικοί για το Gallus gallus. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Συγκρίνοντας μη μολυσμένα πουλιά L10H και L10L, εντοπίσαμε 1698 και 1424 διαφορικά εκφρασμένα γονίδια (DE) στις εβδομάδες 1 και 3, αντίστοιχα. Για τα μολυσμένα με IBV πτηνά, τα γονίδια 1934 και 866 DE αναγνωρίστηκαν μεταξύ των δύο γραμμών στις εβδομάδες 1 και 3, αντίστοιχα. Οι δύο πιο εμπλουτισμένοι όροι GO που προέκυψαν από τη σύγκριση μη μολυσμένων πτηνών μεταξύ των δύο γραμμών ήταν «Ενεργοποίηση λεμφοκυττάρων που εμπλέκεται στην ανοσοαπόκριση» και «Σωματικός ανασυνδυασμός γονιδίων ανοσοσφαιρίνης που εμπλέκονται στην ανοσοαπόκριση» στις εβδομάδες 1 και 3, αντίστοιχα. Κατά τη σύγκριση των μολυσμένων με IBV πτηνών μεταξύ των δύο γραμμών, οι πιο εμπλουτισμένοι όροι GO ήταν «ενεργοποίηση άλφα-βήτα Τ κυττάρων» και «Θετική ρύθμιση της ενεργοποίησης λευκοκυττάρων» στις εβδομάδες 1 και 3, αντίστοιχα. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Τα υγιή πτηνά από τις δύο σειρές εμφάνισαν σημαντικές διαφορές στα προφίλ έκφρασης για υποσύνολα προσαρμοστικών και γονιδίων που σχετίζονται με την έμφυτη ανοσία, ενώ η σύγκριση των πουλιών που είχαν μολυνθεί με IBV από τις δύο σειρές έδειξε διαφορές στην έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με την ανοσία που εμπλέκονται στα Τ κύτταρα ενεργοποίηση και πολλαπλασιασμό. Οι παρατηρούμενες διαφορές μεταγραφής μεταξύ των δύο γραμμών δείχνουν ότι η επιλογή για MBL είχε επηρεάσει την έμφυτη καθώς και την προσαρμοστική ανοσία. ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ: Η ηλεκτρονική έκδοση αυτού του άρθρου (doi:10.1186/s12864-016-2403-1) περιέχει συμπληρωματικό υλικό, το οποίο είναι διαθέσιμο σε εξουσιοδοτημένους χρήστες. Κείμενο: Συμπεράσματα: Τα υγιή πτηνά από τις δύο γραμμές παρουσίασαν σημαντικές διαφορές στα προφίλ έκφρασης για υποσύνολα προσαρμοστικών και εγγενών γονιδίων που σχετίζονται με την ανοσία, ενώ η σύγκριση των μολυσμένων με IBV πτηνών από τις δύο σειρές έδειξε διαφορές στην έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με την ανοσία που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση και τον πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων. Οι παρατηρούμενες διαφορές μεταγραφής μεταξύ των δύο γραμμών υποδεικνύουν ότι η επιλογή για MBL είχε επηρεάσει την έμφυτη καθώς και την προσαρμοστική ανοσία. Λέξεις-κλειδιά: IBV, Coronavirus, Λοιμώδης βρογχίτιδα, Κοτόπουλο, αλληλουχία RNA, Transcriptome, Spleen, Mannose-δεσμευτική λεκτίνη, Ανοσολογική απόκριση Υπόβαθρο Λοιμώξεις πτηνών Η βρογχίτιδα (IB) είναι μια οξεία και εξαιρετικά μεταδοτική ασθένεια της ανώτερης αναπνευστικής οδού που προκαλείται από τον ιό της λοιμώδους βρογχίτιδας (IBV). Ο ιός είναι μέλος της οικογένειας Coronaviridae και έχει πολλούς ορότυπους και στελέχη. Η ταχεία αντιγραφή σε συνδυασμό με τον υψηλό ρυθμό μετάλλαξης και τον ανασυνδυασμό είναι οι κύριες αιτίες της παρατηρούμενης υψηλής ποικιλομορφίας [1] . Η αναπνευστική οδός είναι το κύριο όργανο-στόχος και το σημείο εισόδου για τον ιό, πριν εξαπλωθεί περαιτέρω στους νεφρούς και τις γονάδες. Τα πιο κοινά συμπτώματα της IB σχετίζονται με την αναπνευστική οδό και περιλαμβάνουν λαχανιάσματα, βήχα, φτέρνισμα, τραχειακές ραγάδες και ρινικές εκκρίσεις [2] . Η μετατροπή της τροφής και το μέσο ημερήσιο κέρδος επηρεάζονται στα κοτόπουλα κρεατοπαραγωγής και η μόλυνση συχνά ακολουθείται από δευτερογενείς βακτηριακές λοιμώξεις. Στα στρώματα, ο IBV προκαλεί μείωση της παραγωγής και της ποιότητας των αυγών. Σήμερα, η ΙΒ είναι μια από τις πιο σημαντικές οικονομικά ασθένειες στον κλάδο των πουλερικών [2] . Οι εστίες μόλυνσης ελέγχονται με έναν συνδυασμό αυστηρών πρακτικών διαχείρισης και εμβολιασμού. Οι αυστηρές πρακτικές διαχείρισης, οι οποίες περιλαμβάνουν τη διατήρηση της θερμοκρασίας του περιβλήματος και τον αερισμό, είναι απαραίτητες, επειδή ο IBV είναι εξαιρετικά μεταδοτικός και εξαπλώνεται πολύ γρήγορα. Τα ζωντανά εξασθενημένα και αδρανοποιημένα εμβόλια χρησιμοποιούνται ευρέως για τον έλεγχο και την πρόληψη της λοίμωξης από IBV [3, 4]. Καθώς υπάρχει μικρή ή καθόλου διασταυρούμενη προστασία μεταξύ διαφορετικών ορότυπων/παραλλαγών του ιού, ως εκ τούτου τα εμβόλια θα πρέπει να περιέχουν ορότυπους που υπάρχουν σε μια συγκεκριμένη περιοχή προκειμένου να προκληθεί επαρκής προστασία [1] . Επομένως, απαιτούνται νέα εμβόλια πολλαπλών στελεχών με τον βέλτιστο συνδυασμό αντιγόνων και βέλτιστα ανοσοενισχυτικά για τον μελλοντικό έλεγχο του IBV. Η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση μεταξύ της έμφυτης και της προσαρμοστικής ανοσολογικής απόκρισης στη λοίμωξη από IBV είναι ένα κρίσιμο στοιχείο για περαιτέρω βελτιώσεις των εμβολίων. Η μόλυνση με IBV προκαλεί ένα ευρύ φάσμα ανοσολογικών αποκρίσεων στα κοτόπουλα. Μια έμφυτη ανοσολογική απόκριση ενεργοποιείται κατά τα αρχικά στάδια της μόλυνσης στη βλεννογόνο επένδυση της τραχείας μετά τη δέσμευση των ιοσωμάτων του IBV σε υποδοχείς στα επιθηλιακά κύτταρα [5] . Η ενεργοποίηση αυτής της έμφυτης ανοσοαπόκρισης μπορεί να ξεκινήσει με σηματοδότηση υποδοχέα τύπου Toll (TLR) κατά την αναγνώριση του IBV [6, 7] . Επιπλέον, έχει παρατηρηθεί ταχεία ενεργοποίηση των φυσικών φονικών κυττάρων (NK) μία ημέρα μετά τη μόλυνση από IBV [8] καθώς και αυξημένος αριθμός μακροφάγων στους πνεύμονες και την τραχεία μετά από πρωτογενή λοίμωξη από IBV [9] . Στην περίπτωση των προσαρμοστικών ανοσολογικών αποκρίσεων, οι υποπληθυσμοί Τ λεμφοκυττάρων εμπλέκονται ενεργά στα πρώιμα στάδια της κάθαρσης του IBV [7, 10] παρουσιάζοντας ταχεία ενεργοποίηση κατά τη μόλυνση από IBV [6] . Επιπλέον, μελέτες έχουν δείξει ότι τα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (CTL) παίζουν σημαντικό ρόλο στην απόκριση σε πρωτογενείς λοιμώξεις με IBV [10, 11] . Εκτός από τις αποκρίσεις των Τ κυττάρων, έχουν αναφερθεί ειδικά αντισώματα για τον IBV, και των τριών κατηγοριών αντισωμάτων που υπάρχουν στα κοτόπουλα [12] [13] [14] . Μια ειδική τοπική απόκριση αντισωμάτων στη λοιμώδη βρογχίτιδα των πτηνών είναι χαρακτηριστική για την απόκριση σε μια δευτερογενή μόλυνση [15] . Το έμφυτο και το προσαρμοστικό ανοσοποιητικό σύστημα είναι έντονα διασυνδεδεμένα, κάτι που φαίνεται επίσης στην απόκριση στη λοίμωξη από IBV, και η σύνδεση πιθανώς περιλαμβάνει τη συλλεκτίνη ορού, τη λεκτίνη που δεσμεύει τη μαννόζη (MBL) ως βασικό παράγοντα [16] . Δύο σειρές κοτόπουλου που ήταν που επιλέχθηκαν για υψηλές και χαμηλές συγκεντρώσεις MBL ορού (που ορίζονται L10H και L10L, αντίστοιχα), χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη. Η εκλεκτική αναπαραγωγή έχει πραγματοποιηθεί για 14 γενιές χρησιμοποιώντας τον συνδυασμό δύο στελεχών (67,5 % κοτόπουλα UM-B19 και 33,5 % White Cornish) ως αρχικό πληθυσμό, όπως περιγράφεται από τους Juul-Madsen et al. [17] . Το τελικό αποτέλεσμα ήταν δύο αποκλίνουσες γραμμές, με μέσες συγκεντρώσεις MBL στον ορό 33,4 μg/ml για τη γραμμή L10H και 7,6 μg/ml για τη γραμμή L10L, αντίστοιχα [18, 19] . Η μέση συγκέντρωση ορού MBL για 14 διαφορετικές σειρές κοτόπουλου που αντιπροσωπεύουν τόσο τα κοτόπουλα κρεατοπαραγωγής όσο και τα στρώματα είναι περίπου 6 μg/ml, αλλά κυμαίνεται από 0,4 έως 37,8 μg/ml σε φυσιολογικά υγιή κοτόπουλα με πρωτεΐνη που παράγεται στο ήπαρ ως την κύρια πηγή κυκλοφορίας του MBL [17. ] . Στα κοτόπουλα, έχει παρατηρηθεί θετική συσχέτιση μεταξύ των συγκεντρώσεων του MBL στον ορό και της σοβαρότητας αρκετών λοιμώξεων, όπως οι λοιμώξεις που προκαλούνται από IBV [19] , Escherichia coli [20] και Pasteurella multocida [21] . Το MBL κοτόπουλου συνδέεται με τον IBV [16, 22], επομένως είναι πιθανό το MBL να διευκολύνει τις έμφυτες αποκρίσεις όπως η οψωνοφαγοκυττάρωση, η ενεργοποίηση του συμπληρώματος ή η εξουδετέρωση του ιού, στα πρώιμα στάδια της μόλυνσης από IBV. Στα θηλαστικά η MBL έχει επίσης αποδειχθεί ότι επηρεάζει την επαγωγή προσαρμοστικής ανοσίας [23] . Προς υποστήριξη του ρόλου του MBL ως απάντηση στο IBV, οι Kjaerup et al. [18] παρατήρησε σημαντικές διαφορές στις κυτταρικές προσαρμοστικές ανοσολογικές παραμέτρους σε απόκριση σε μόλυνση από IBV μεταξύ των γραμμών L10L και L10H. Επιπλέον, τα πουλιά από τη σειρά L10H εμφάνισαν χαμηλότερα ιικά φορτία και λιγότερο σοβαρή βλάβη των βλεφαρίδων της τραχείας μετά τη μόλυνση από IBV σε σύγκριση με τα πουλιά από τη σειρά L10L. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να χαρακτηρίσει το μεταγραφικό σπλήνα υγιών πτηνών από τις δύο σειρές που επιλέχθηκαν για MBL ορού και για τη διερεύνηση διαφορών στους μοριακούς μηχανισμούς πίσω από την ανάπτυξη συστημικής προσαρμοστικής ανοσίας μεταξύ των γραμμών L10L και L10H που έχουν μολυνθεί με IBV. Το πειραματικό χρονοδιάγραμμα και τα χρονικά σημεία δειγματοληψίας είναι όπως απεικονίζονται στο Σχήμα. 1 και μια πλήρης περιγραφή της πειραματικής μόλυνσης αναφέρεται από τους Kjaerup et al. [18] . Τα πτηνά μολύνθηκαν σε ηλικία 3 εβδομάδων και από τη 2η ημέρα μετά τη μόλυνση (p.i. ), παρουσίασε κλινικά σημεία χαρακτηριστικά της λοίμωξης από IBV, συμπεριλαμβανομένου του φτερνίσματος και της κοπιαστικής αναπνοής. Τα ιικά φορτία σε επιχρίσματα τραχείας αξιολογήθηκαν για όλα τα πτηνά όπως αναφέρθηκε στην προηγούμενη εργασία που δημοσιεύτηκε στην πειραματική μελέτη μόλυνσης [18] . Δεν ανιχνεύθηκε ιός στα μη μολυσμένα πτηνά σε οποιαδήποτε χρονική στιγμή καθ' όλη τη διάρκεια του πειράματος. Τα ιικά γονιδιώματα ανιχνεύθηκαν σε επιχρίσματα από μολυσμένα πτηνά από την ημέρα 1 έως την 8η p.i. Αξιοσημείωτα, σημαντικά χαμηλότερα ιικά φορτία (p < 0,03) παρατηρήθηκαν σε πτηνά από τη γραμμή L10H σε σύγκριση με μολυσμένα πτηνά από τη γραμμή L10L [18] . Η ανίχνευση και η ποσοτικοποίηση της έκφρασης σπληνικού γονιδίου δεδομένων αλληλουχίας RNA παρήχθησαν από οκτώ μολυσμένα και οκτώ μη μολυσμένα πουλιά από καθεμία από τις δύο γραμμές σε δύο περιπτώσεις δειγματοληψίας, όπως περιγράφεται στην ενότητα υλικά και μέθοδοι. Όλα τα δείγματα πέρασαν μέτρα ποιοτικού ελέγχου για ακατέργαστες και κομμένες αναγνώσεις αλληλουχίας εκτός από το μεμονωμένο αρ. 46, το οποίο αφαιρέθηκε λόγω πολύ μικρού αριθμού αναγνώσεων με αλληλουχία. Για τα υπόλοιπα πτηνά, λήφθηκαν κατά μέσο όρο πάνω από 37 εκατομμύρια αναγνώσεις ανά δείγμα για τα 63 δείγματα που αναλύθηκαν, με το 81 % των αναγνώσεων να αντιστοιχίζονται στην αλληλουχία αναφοράς του γονιδιώματος του κοτόπουλου, όπως περιγράφεται στην ενότητα υλικά και μέθοδοι (Βλ. συνοπτικά στατιστικά στοιχεία με το Ο αριθμός των αντιστοιχισμένων και των συνολικών αναγνώσεων παρουσιάζεται στο Πρόσθετο αρχείο 1: Πίνακας S1 ). Συνολικά, ταυτοποιήθηκαν 17.113 εκφρασμένα γονίδια. Μετά από φιλτράρισμα γονιδίων με λιγότερες από μία ανάγνωση ανά εκατομμύριο σε οκτώ δείγματα [24] (γονίδια που δεν θα μπορούσαν να επιτύχουν στατιστική σημασία για διαφορική έκφραση), η τελική λίστα περιείχε 11.292 εκφρασμένα γονίδια. Πριν από τη διεξαγωγή της ανάλυσης διαφορικής γονιδιακής έκφρασης, διεξήχθη περαιτέρω πολυπαραγοντική ανάλυση στα ακατέργαστα και κανονικοποιημένα δεδομένα γονιδιακού αριθμού για τον εντοπισμό τυχόν αποκλίσεων. Η γραφική παράσταση πολυδιάστατης κλίμακας (MDS) στα εκφρασμένα γονίδια μεταξύ των δύο γραμμών, L10H και L10L, έδειξε ότι διαφέρουν σημαντικά στα προφίλ μεταγραφής τους τόσο για μη μολυσμένα όσο και για μολυσμένα με IBV πτηνά [Βλ. Πρόσθετο αρχείο 2: Εικόνα S1 ]. Επιπλέον, η διακύμανση μεταξύ των ατόμων στη γονιδιακή έκφραση την εβδομάδα 1 ήταν σημαντικά υψηλότερη από αυτή που παρατηρήθηκε την εβδομάδα 3 τόσο για τα μη μολυσμένα όσο και για τα μολυσμένα με IBV πτηνά [Βλ. Πρόσθετο αρχείο 2: Εικόνα S1 ]. Τα πουλιά 22 και 47 διαχωρίστηκαν από τα υπόλοιπα στο Διάγραμμα MDS [Βλ. Πρόσθετο αρχείο 2: Εικόνα S1 ]. Ωστόσο, η επιθεώρηση των ακατέργαστων δεδομένων αλληλουχίας και των παραμέτρων χαρτογράφησης δεν εντόπισε κανένα τεχνικό πρόβλημα που θα μπορούσε να εξηγήσει την παρατηρούμενη εξωομαδοποίηση αυτών των πτηνών. Επιπροσθέτως, διεξήχθη μια διακλαδική ανάλυση κύριου συστατικού (PCA) χρησιμοποιώντας ακατέργαστες και κανονικοποιημένες μετρήσεις γονιδίων. Το interclass PCA αποκάλυψε ότι τα πουλιά 22 και 47 τοποθετήθηκαν εκτός των διαστημάτων εμπιστοσύνης 95 % των αντίστοιχων θεραπειών τους [Βλ. Πρόσθετο αρχείο 3: Εικόνα S2 ]. Ωστόσο, το PCA δεν εντόπισε κανένα γονίδιο με προφίλ ακραίων μετρήσεων που μπορεί να συνέβαλαν στη διασπορά μεταγραφών των πτηνών 22 και 47 σε σχέση με τις ομάδες θεραπείας τους. Αν και δεν υπήρχε σαφής τεχνική ή βιολογική εξήγηση για την εξωομαδοποίησή τους, αυτά τα δείγματα αφαιρέθηκαν από περαιτέρω ανάλυση. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση διαφορικής γονιδιακής έκφρασης για να συγκριθούν οι δύο σειρές κοτόπουλων (L10L και L10H) σε δύο χρονικά σημεία για μη μολυσμένα (C1 και C2 , βλέπε Εικ. 1 ) και πτηνά μολυσμένα με IBV (C3 και C4, βλέπε Εικ. 1). Ένας μεγάλος αριθμός γονιδίων εκφράστηκε διαφορικά (DE) μεταξύ των γραμμών L10L και L10H τις εβδομάδες 1 και 3, τόσο για μη μολυσμένα όσο και για μολυσμένα με IBV πτηνά (βλ. Πίνακα 1, βλ. Ταυτοποιήσαμε 1.698 και 1.424 γονίδια DE για τα μη μολυσμένα πουλιά μεταξύ των γραμμών L10L και L10H τις εβδομάδες 1 και 3, αντίστοιχα (βλ. Πίνακα 1). Συνολικά 692 γονίδια είχαν υψηλότερη έκφραση στη σειρά L10H και 1.006 είχαν υψηλότερη έκφραση στη σειρά L10L για τα μη μολυσμένα πουλιά την εβδομάδα 1 [Βλ. Πρόσθετο αρχείο 4: Πίνακας S2 ] και 774 γονίδια είχαν υψηλότερη έκφραση στη σειρά L10H και 650 γονίδια είχαν υψηλότερη έκφραση σε Γραμμή L10L για μη μολυσμένα πτηνά την εβδομάδα 3 [Βλ. Πρόσθετο αρχείο 5: Πίνακας S3 ]. Συγκρίνοντας τα πουλιά L10H και L10L μολυσμένα με IBV, εντοπίσαμε 1.934 και 866 γονίδια DE στις εβδομάδες 1 και 3, αντίστοιχα (βλ. Πίνακα 1 ). Συνολικά 931 γονίδια είχαν υψηλότερη έκφραση στη γραμμή L10H και 1.003 είχαν υψηλότερη έκφραση στη γραμμή L10L την εβδομάδα 1 και την εβδομάδα 3, 508 είχαν υψηλότερη έκφραση στη γραμμή L10H και 358 είχαν υψηλότερη έκφραση στη γραμμή L10L (Πίνακας 1, Πρόσθετο αρχείο 6: Πίνακας S4 και πρόσθετο αρχείο 7: Πίνακας S5). Υπήρχαν επίσης αλλαγές που σχετίζονται με την κατάσταση στη γονιδιακή έκφραση όπως φαίνεται στο διάγραμμα Venn (Εικ. 2) . Την εβδομάδα 1, ο συνολικός αριθμός των γονιδίων DE σε μη μολυσμένα πτηνά Εικ. 2). Από τα 3.011 (1077 + 621 + 1313) γονίδια DE τόσο για μη μολυσμένα όσο και για μολυσμένα πτηνά μεταξύ των δύο σειρών μόνο 621 (~20 %) ήταν κοινά για δύο συγκρίσεις (Εικ. 2). Την εβδομάδα 3, ο συνολικός αριθμός των γονιδίων DE σε μη μολυσμένα πτηνά μεταξύ των δύο σειρών ήταν 1424 (883 + 541) (Πίνακας 1, Εικ. 2) που ήταν υψηλότερο σε σύγκριση με 866 (541 + 325) σε μολυσμένα πτηνά μεταξύ των δύο γραμμών (Πίνακας 1, Εικ. 2). Κατά τη σύγκριση των μη μολυσμένων και των μολυσμένων πτηνών μεταξύ των δύο γραμμών, 541 (~30 %) γονίδια ήταν κοινά από τα συνολικά 1749 (883 + 541+ 325) γονίδια DE και για τις δύο συγκρίσεις (Εικ. 2) .Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε επίσης ανάλυση διαφορικής γονιδιακής έκφρασης για να συγκρίνουμε δύο χρονικά σημεία (εβδομάδα 1 και εβδομάδα 3) στις δύο σειρές κοτόπουλου (L10L και L10H) για μη μολυσμένα (C5 και C6, βλέπε Εικ. 1 ) και πτηνά μολυσμένα με IBV (C7 και C8, βλέπε Εικ. 1). Τέλος, διεξήχθη επίσης ανάλυση διαφορικής γονιδιακής έκφρασης για να συγκριθούν οι δύο καταστάσεις μόλυνσης (μη μολυσμένες και μολυσμένες με IBV) σε δύο χρονικά σημεία για τη σειρά κοτόπουλου L10L (C9 και C10, βλ. Πίνακα S6, Πρόσθετο αρχείο 9: Πίνακας S7, Πρόσθετο αρχείο 10 : Πίνακας S8 , Πρόσθετο αρχείο 11: Πίνακας S9 , Πρόσθετο αρχείο 12: Πίνακας S10 , Πρόσθετο αρχείο 13: Πίνακας S11 , Πρόσθετο αρχείο 14: Πίνακας S12 και Πρόσθετο αρχείο 15: Πίνακας S13 ]. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση συνόλου γονιδίων εμπλουτισμού για τον προσδιορισμό υπερεκπροσωπούμενοι όροι \"Διαδικασία του ανοσοποιητικού συστήματος\" Γονιδιακής Οντολογίας (GO) χρησιμοποιώντας τις λίστες γονιδίων DE από συγκρίσεις μεταξύ μη μολυσμένων και μολυσμένων πτηνών από τις δύο σειρές στις 1 και 3 εβδομάδες p.i. Οι πιο εμπλουτισμένοι όροι του ανοσοποιητικού συστήματος GO μεταξύ των δύο γραμμών κατά τη σύγκριση μη μολυσμένων πτηνών από τις δύο γραμμές και στη συνέχεια μολυσμένων από τις δύο γραμμές φαίνονται στο Σχήμα. 3 Όροι του ανοσοποιητικού συστήματος .GO που σχετίζονται με γονίδια που εκφράστηκαν διαφορετικά μεταξύ των δύο γραμμών για μη μολυσμένα πτηνά την εβδομάδα 1 ήταν \"Ενεργοποίηση λεμφοκυττάρων που εμπλέκεται στην ανοσοαπόκριση\" (GO:0002285), \"Ενεργοποίηση έμφυτης ανοσολογικής απόκρισης\" (GO:0002218) , \"Λυμφοκυτταρική ανοσία\" (GO:0002449) και \"Σύγκριση λευκοκυττάρων μεταξύ των δύο γραμμών, L10H και L10L, μη μολυσμένα και μολυσμένα πτηνά σε δύο χρονικά σημεία (εβδομάδες 1 και 3). Οι συγκρίσεις C1-C4 αντιστοιχούν σε συγκρίσεις διαφορικής γονιδιακής έκφρασης που παρουσιάζονται στο Σχήμα. 1 Για τα μη μολυσμένα πτηνά την εβδομάδα 3, οι πιο εμπλουτισμένοι όροι του ανοσοποιητικού συστήματος GO ήταν \"Σωματικός ανασυνδυασμός γονιδίων ανοσοσφαιρίνης που εμπλέκονται στην ανοσολογική απόκριση\" (GO:0002204) και \"Προσαρμοστική ανοσοαπόκριση βασισμένη σε σωματικό ανασυνδυασμό ανοσοϋποδοχέων κατασκευασμένων από υπερφαμιλυβουλίνη\" (GO:0002460) [Βλέπε Εικ. 3 , Βλ. Πρόσθετο αρχείο 17: Εικόνα S4 ]. Συνολικά, 47 γονίδια DE χαρτογραφήθηκαν με όρους GO ανοσοποιητικού συστήματος σε αυτή τη σύγκριση (Εικ. 4) . Μεταξύ των γονιδίων DE που είχαν υψηλότερη έκφραση στη γραμμή L10H την εβδομάδα 3, στη μη μολυσμένη ομάδα, ήταν τα IL7, FKBP1B, FAS και PTPN22, τα οποία επίσης φάνηκαν να εκφράζονται διαφορετικά μεταξύ των γραμμών την εβδομάδα 1 [Βλ. 4 , Πρόσθετο αρχείο 17: Εικόνα S4 ].Σύγκριση μολυσμένων πτηνών από τις δύο σειρές, την εβδομάδα 1, \"Alpha-beta T cell activation\" (GO:0046631), \"Activation of intente immune response\" (GO:0002218) και \" Οι λειτουργίες διαφοροποίησης λευκοκυττάρων» (GO:0002521) ήταν οι τρεις πιο εμπλουτισμένοι όροι του ανοσοποιητικού συστήματος GO (Εικ. 3) . Το CXCR4 (υποδοχέας χημειοκίνης 4), το PTPN22 και το FAS ήταν από τα πιο εκφρασμένα γονίδια στο L10H [Βλ. 4 , Πρόσθετο αρχείο 18: Εικόνα S5 ]. Ο κύριος όρος του ανοσοποιητικού συστήματος GO που εμπλουτίστηκε έντονα στα μολυσμένα πτηνά την εβδομάδα 3 ήταν \"Θετική ρύθμιση της ενεργοποίησης λευκοκυττάρων\" (GO:0002696) [Βλ. Εικόνα S6 ]. Η παρούσα μελέτη χρησιμοποίησε δύο σειρές, τις L10L και L10H, οι οποίες έχουν επιλεγεί με διαφορετικό τρόπο για υψηλή και χαμηλή συγκέντρωση ορού MBL για 14 γενιές, Εικ. 3 Λειτουργικός χάρτης γονιδίων διαφορικά εκφρασμένων εμπλουτισμένων για όρους GO ανοσοποιητικού συστήματος. Οι κορυφαίες κατηγορίες των όρων του ανοσοποιητικού συστήματος GO που σχετίζονται με γονίδια διαφορικής έκφρασης (DE). Όλες οι κατηγορίες ήταν στατιστικά σημαντικές (προσαρμοσμένη τιμή p < 0,001). Τα θραύσματα γραφήματος αντιπροσωπεύουν τον αριθμό των γονιδίων που σχετίζονται με τους όρους ως αναλογία του συνολικού αριθμού γονιδίων στον αντίστοιχο όρο GO. Οι όροι που δεν έχουν ομαδοποιηθεί εμφανίζονται με γκρι αντίστοιχα. Αυτές οι δύο γραμμές έχουν χρησιμοποιηθεί εκτενώς νωρίτερα για ανοσολογικές μελέτες και παρουσιάζουν διαφορές στις ανοσολογικές παραμέτρους μετά από πρόκληση με πολλά παθογόνα [18, 22, 25]. Επιπλέον, η σπλήνα των πτηνών θεωρείται ότι παίζει πολύ σημαντικό ανοσολογικό ρόλο επειδή τα λεμφικά αγγεία και οι λεμφαδένες των πτηνών δεν έχουν αναπτυχθεί ελάχιστα [26] . Διερευνήθηκαν οι διαφορές μεταγραφής στη σπλήνα μεταξύ των δύο γραμμών, L10L και L10H, για μη μολυσμένα (υγιή) και μολυσμένα με IBV πτηνά, εστιάζοντας στη διαφορική έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό μέσα σε σημαντικά εμπλουτισμένους όρους GO που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό. Μεγάλες διαφορές στα προφίλ μεταγραφής παρατηρήθηκαν μεταξύ των πτηνών από τις δύο σειρές, αμφότερα μη μολυσμένα (υγιή) και μετά την πειραματική πρόκληση IBV [Βλ. Πρόσθετο αρχείο 2: Εικόνα S1 ]. Αυτό προτείνει το Σχ. 4 Διαφορικά εκφρασμένα γονίδια που σχετίζονται με τον όρο GO ανοσοποιητικό σύστημα. Αναπαράσταση χάρτη θερμότητας των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων (DE) που σχετίζονται με τους όρους του ανοσοποιητικού συστήματος GO για τις τέσσερις συγκρίσεις μεταξύ των δύο γραμμών, L10H και L10L, μη μολυσμένων και μολυσμένων ομάδων σε δύο χρονικά σημεία, εβδομάδες 1 και 3. Ο χάρτης θερμότητας κατασκευάζεται χρησιμοποιώντας τις μέσες τιμές μετρήσεων ανά εκατομμύριο για κάθε ομάδα ότι η επιλογή για τα επίπεδα ορού MBL στις δύο γραμμές είχε πολύ ευρύτερο αποτέλεσμα που υπερβαίνει την έκφραση του γονιδίου MBL [27] . Οι παρατηρούμενες διαφορές μεταγραφής μπορούν πιθανώς να αποδοθούν σε συσχετισμένη απόκριση στην επιλογή [28] ή τυχαία γενετική μετατόπιση [29] . Η συσχετισμένη επιλογή συμβαίνει όταν ένα χαρακτηριστικό επηρεάζεται από την επιλογή ενός άλλου χαρακτηριστικού και εξαρτάται από μια γενετική συσχέτιση μεταξύ των δύο χαρακτηριστικών, η οποία είναι πολύ γνωστή στην εκτροφή ζώων [30] . Εναλλακτικά, η τυχαία γενετική μετατόπιση θα μπορούσε να συμβάλει στις παρατηρούμενες διαφορές, λαμβάνοντας υπόψη ότι ο ιδρυτικός πληθυσμός των δύο γραμμών ήταν μικρός [17] . Εστιάζοντας στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό: την εβδομάδα 1, τα μη μολυσμένα πουλιά παρουσίασαν διαφορές στην έκφραση γονίδια που εμπλέκονται τόσο στην προσαρμοστική ανοσία όσο και στα μονοπάτια που σχετίζονται με την έμφυτη ανοσία [Βλ. Πρόσθετο αρχείο 16: Εικόνα S3 ]. Επιπλέον, η γραμμή L10H είχε χαμηλότερη έκφραση για το υποσύνολο των εγγενών γονιδίων του ανοσοποιητικού, TYRO3, TRAF3 και TLR7 την εβδομάδα 1 [Βλ. Πρόσθετο αρχείο 16: Εικόνα S3 και Σχήμα. 4]. Το TYRO3 κωδικοποιεί τον υποδοχέα τυροσινοπρωτεϊνικής κινάσης 3 (TYRO3) που εμπλέκεται στην αναστολή των μονοπατιών σηματοδότησης TLR και των οδών σηματοδότησης κυτοκινών που προκαλούνται από TLR. Αυτά τα δύο μονοπάτια επηρεάζουν τις διαδικασίες που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό, συμπεριλαμβανομένου του κυτταρικού πολλαπλασιασμού/επιβίωσης, της κυτταρικής προσκόλλησης και της μετανάστευσης και αναστέλλουν την έμφυτη φλεγμονώδη απόκριση στα παθογόνα [31] . Το TRAF3 κωδικοποιεί μια κυτταροπλασματική πρωτεΐνη σηματοδότησης, η οποία παίζει κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της αντιϊκής απόκρισης και της ιικής διαφυγής [32] [33] [34] . Το TLR7 ήταν επίσης μεταξύ των γονιδίων που σχετίζονται με την έμφυτη ανοσία DE με υψηλότερη έκφραση στη σειρά L10H. Το TLR7 κοτόπουλου έχει αποδειχθεί ότι παίζει ρόλο στην ανταπόκριση στις λοιμώξεις από IBV [9, 35]. Εκτός από τις διαφορές στα προφίλ έκφρασης για ένα υποσύνολο εγγενών ανοσογονιδίων, οι δύο σειρές διέφεραν επίσης ως προς την έκφρασή τους σε προσαρμοστικά ανοσογονίδια . Τα μη μολυσμένα πουλιά από το L10H είχαν υψηλότερη γονιδιακή έκφραση σε σύγκριση με τη σειρά L10L, για TGFB3, IL7, FKBP1B, FAS και PTPN22. Αυτά τα γονίδια είναι γνωστό ότι εμπλέκονται σε ένα ευρύ φάσμα προσαρμοστικών ανοσολογικών διεργασιών. Στους ανθρώπους, η μείωση της σηματοδότησης TGF-β στα Τ κύτταρα έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει τη λειτουργία των CD8 Τ κυττάρων με έμμεσο τρόπο που έχει ως αποτέλεσμα την ταχεία εξάλειψη των ιών, επιτρέποντας τη δημιουργία μιας αποτελεσματικής απόκρισης μνήμης [36] . Ομοίως, η ανθρώπινη IL-7 διαδραματίζει βασικό ρόλο στην επιβίωση τόσο των αρχέγονων [37] και της μνήμης [38, 39] CD4 και CD8 Τ κυττάρων. Επιπλέον, μια in vitro μελέτη έδειξε ότι η αναστολή του FKBP1B και άλλων κυκλοφιλινών εμπόδισε την αναπαραγωγή διαφορετικών Coronaviruses, συμπεριλαμβανομένου του IBV [40] . Κατ' αναλογία, τα μη μολυσμένα πουλιά από τη σειρά L10H είχαν υψηλότερη έκφραση IL7, FKBP1B, FAS και PTPN22. Γενικά τα μη μολυσμένα (υγιή) πτηνά από τις δύο σειρές εμφανίζουν διαφορετικά προφίλ έκφρασης για αυτό το υποσύνολο εγγενών και προσαρμοστικών ανοσογονιδίων που πιθανώς προκύπτουν από αποκλίνουσα επιλογή για τη συγκέντρωση MBL στον ορό. Η επιλογή στην εκτροφή ζώων έχει αποδειχθεί ότι έχει εκτεταμένη επίδραση σε μια ποικιλία χαρακτηριστικών συμπεριλαμβανομένων των ανοσολογικών [30] . Επιπλέον, συσχετισμένη απόκριση στην επιλογή έχει παρατηρηθεί στην περίπτωση που η επιλογή πραγματοποιήθηκε σε λιγότερο σύνθετα χαρακτηριστικά όπως τα επίπεδα τεστοστερόνης [41] . Τέλος, διαφορετικά προφίλ έκφρασης για το υποσύνολο της έμφυτης και προσαρμοστικής ανοσίας στα μη μολυσμένα πτηνά από τις δύο γραμμές μπορεί να οφείλονται στην ισορροπία στην επίδραση των επιπέδων MBL στον ορό. Υψηλά επίπεδα ανθρώπινης MBL έχουν ως επί το πλείστον αναφερθεί ως ωφέλιμα ενώ σε περίπτωση ενδοκυτταρικής παρασιτικής νόσου η επίδραση του επιπέδου MBL στον ορό μπορεί να είναι αντίθετη [42] . Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η επιλογή για τα επίπεδα MBL στον ορό μπορεί να οδηγήσει σε ευνοϊκές μεθόδους ανοσολογικών αποκρίσεων ανάλογα με τη λειτουργία MBL. Μεγάλες διαφορές στα πρότυπα έκφρασης παρατηρήθηκαν μεταξύ των δύο γραμμών μετά τη μόλυνση με IBV και αυτές οι διαφορές αφορούσαν προσαρμοστικές οδούς που σχετίζονται με την ανοσία που σχετίζονται με την \"ενεργοποίηση των άλφα-βήτα Τ κυττάρων\" (GO:0046631) και την \"Ενεργοποίηση της έμφυτης ανοσολογικής απόκρισης\" (GO:0002218) [Βλ. Πρόσθετο αρχείο 18: Εικόνα S5 ]. Ο παρατηρούμενος εμπλουτισμός για τους όρους GO που σχετίζονται με την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων είναι σύμφωνος με μια προηγούμενη μελέτη αυτών των γραμμών που έδειξε ότι τα ειδικά για τον IBV Τ κύτταρα είναι παρόντα σε μεγάλους αριθμούς στον σπλήνα μετά από μόλυνση από IBV [43] . Την εβδομάδα 1 μετά τη μόλυνση CXCR4, FAS και PTPN22 έδειξαν υψηλότερη έκφραση στη σειρά L10H. Οι υποδοχείς χημειοκίνης CXC εκφράζονται τόσο σε τελεστικά όσο και σε Τ κύτταρα μνήμης και παίζουν βασικό ρόλο στην ομοιόσταση των Τ κυττάρων μνήμης [44] . Το FAS έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζεται προς τα πάνω στους νεφρούς των κοτόπουλων που έχουν προσβληθεί από IBV [45] . Η οδός Fas/FasL είναι μια σημαντική οδός θανάτωσης των κυτταροτοξικών Τ κυττάρων [46] . Ομοίως, το PTPN22 έχει αποδειχθεί ότι εκφράζεται διαφορικά σε κοτόπουλα μετά από πρόκληση παθογόνου, και συγκεκριμένα μετά από μόλυνση με Escherichia coli [47] .Επιπλέον, το VCAM1 και το JMJD6 ήταν μεταξύ των προσαρμοστικών γονιδίων που σχετίζονται με την ανοσία DE μεταξύ των γραμμών την εβδομάδα 3 [Βλ. 4 , Πρόσθετο αρχείο 19: Εικόνα S6 ]. Το γονίδιο VCAM1 είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στην ενεργοποίηση των Τ κυττάρων [48] . Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι το JMJD6 ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των Τ-λεμφοκυττάρων μνήμης κατά τη διάρκεια μιας ιογενούς λοίμωξης [49], κάτι που παρουσιάζει μεγάλο ενδιαφέρον δεδομένου ότι είχε υψηλότερη έκφραση στα πουλιά που είχαν μολυνθεί με IBV από τη σειρά L10H την εβδομάδα 3. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι δύο γραμμές διαφέρουν σε μεγάλο βαθμό στην έκφραση προσαρμοστικών γονιδίων που σχετίζονται με την ανοσία μετά από μόλυνση, που μπορεί να συνεπάγεται την παρουσία διαφορετικών τρόπων γονιδιακής ρύθμισης. Οι χρόνοι δειγματοληψίας επιλέχθηκαν για την πρόσβαση στις αποκρίσεις τόσο στη φάση τελεστή (εβδομάδα 1) όσο και στη φάση μνήμης (εβδομάδα 3) της προσαρμοστικής ανοσοαπόκρισης στον IBV. Σύμφωνα με την 1 εβδομάδα, υποσύνολα γονιδίων μετά τη μόλυνση που εμπλέκονται ενεργά στον πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων εμφανίζουν διαφορές μεταξύ των γραμμών. Επίσης, την εβδομάδα 3 τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό σε απόκριση στη μόλυνση από IBV που διαφέρουν μεταξύ των γραμμών σχετίζονται περισσότερο με τη διατήρηση της μνήμης των Τ κυττάρων. Το MBL είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στη ρύθμιση της ωρίμανσης των δενδριτικών κυττάρων καθώς και στην παραγωγή κυτοκίνης [50] . Τα δενδριτικά κύτταρα, τα οποία είναι τα κύρια αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και συμμετέχουν ενεργά στη ρύθμιση των προσαρμοστικών ανοσολογικών αποκρίσεων, διαθέτουν τους υποδοχείς για το MBL στα θηλαστικά [23] . Επομένως, οι δύο γραμμές που επιλέχθηκαν για διαφορετική συγκέντρωση MBL στον ορό μπορεί να εμφανίζουν διαφορές στις προσαρμοστικές ανοσοαποκρίσεις και στην ανάπτυξη προσαρμοστικής ανοσίας ως αποτέλεσμα διαφορών στην απόκριση στη σηματοδότηση κυτοκίνης από τα δενδριτικά κύτταρα. Άλλες μελέτες των δύο γραμμών, L10L και L10H, έχουν δείξει ότι διαφέρουν στις παραμέτρους απόκρισης της νόσου μετά την πρόκληση με διαφορετικά παθογόνα. Η σειρά L10L έχει συσχετιστεί με αυξημένο πολλαπλασιασμό του ιού στον αεραγωγό μετά από λοίμωξη από ιό λοιμώδους βρογχίτιδας (IBV) [18] , μειωμένο ρυθμό ανάπτυξης μετά από λοίμωξη από Escherichia coli [20] και μεγαλύτερο εντερικό αποικισμό μετά από λοίμωξη από Salmonella Infantis [51] . Στο παρόν πείραμα, σημαντικά χαμηλότερα ιικά φορτία (p < 0,03) παρατηρήθηκαν σε πτηνά από τη γραμμή L10H σε σύγκριση με μολυσμένα πουλιά από τη γραμμή L10L [18] . Επιπλέον, τα πουλιά L10H στην παρούσα μελέτη εμφάνισαν λιγότερο σοβαρή βλάβη των βλεφαρίδων της τραχείας μετά τη μόλυνση από IBV σε σύγκριση με τη σειρά L10L (μη δημοσιευμένα δεδομένα). Στο τρέχον πείραμα παρατηρήθηκαν φαινοτυπικές διαφορές σε πρόσθετα χαρακτηριστικά που συνδέονται με την προσαρμοστική ανοσία, συμπεριλαμβανομένων των αριθμών των κυκλοφορούντων Β κυττάρων και των κυτταροτοξικών Τ κυττάρων [18] . Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις φαίνεται ότι η επιλογή για υψηλή συγκέντρωση MBL στον ορό επιτρέπει στα πτηνά να αντεπεξέλθουν καλύτερα μετά τη μόλυνση με μια σειρά παθογόνων. Ως εκ τούτου, οι παρατηρούμενες διαφορές στα προφίλ έκφρασης για τα προσαρμοστικά και έμφυτα γονίδια που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό είναι μια αντανάκλαση των διαφορών στην αντοχή στη νόσο και στις ανοσολογικές αποκρίσεις μεταξύ των γραμμών L10L και L10H. Συμπερασματικά, μεγάλες διαφορές στο μεταγραφικό του σπλήνα μεταξύ των δύο σειρών κοτόπουλου , L10L και L10H, παρατηρήθηκαν τόσο σε μη μολυσμένα (υγιή) όσο και σε μολυσμένα με IBV πτηνά. Τα μη μολυσμένα πουλιά από τις δύο σειρές εμφάνισαν διαφορές στα προφίλ έκφρασης για ένα υποσύνολο προσαρμοστικών και γονιδίων που σχετίζονται με την έμφυτη ανοσία, τα οποία μπορεί να αντιπροσωπεύουν διαφορές στην ετοιμότητα να ανταποκριθούν σε μια μόλυνση. Μετά τη μόλυνση με IBV, οι δύο σειρές έδειξαν μεγάλες διαφορές στην έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην προσαρμοστική κυτταρική ανοσολογική απόκριση, όπως τα μονοπάτια ενεργοποίησης και πολλαπλασιασμού των Τ κυττάρων και ως εκ τούτου την ικανότητά τους να ανταποκρίνονται στη μόλυνση, η οποία αντανακλάται στη διαφορά στο φορτίο παθογόνου που παρατηρείται μεταξύ των δύο γραμμών. Αυτή η μελέτη αποτελεί συνέχεια του πειράματος που πραγματοποιήθηκε από τους Kjaerup et al. [18] που χαρακτήρισε την κυτταρική και χυμική ανοσολογική απόκριση των δύο σειρών κοτόπουλων, L10H και L10L, που επιλέχθηκαν με διαφορετικό τρόπο για τις συγκεντρώσεις MBL στον ορό μετά από μόλυνση από IBV. Συνολικά, 96 πτηνά χρησιμοποιήθηκαν στην πειραματική μελέτη που προέρχονται από τις δύο αμιγείς γραμμές του Πανεπιστημίου Aarhus, L10H και L10L [19] . Και τα 96 πουλιά εκτράφηκαν μαζί σε ένα βιοασφαλές περιβάλλον χωρίς IBV μέχρι την ηλικία των 3 εβδομάδων και στη συνέχεια κατανεμήθηκαν σε δύο διαφορετικές ομάδες με 24 πουλιά από κάθε σειρά σε κάθε ομάδα (μη μολυσμένα και μολυσμένα). Τα πτηνά μεταφέρθηκαν σε εγκατάσταση επιπέδου βιοασφάλειας 2 και τοποθετήθηκαν σε απομονωτές. Δύο απομονωτές περιείχαν μη μολυσμένα κοτόπουλα και δύο απομονωτές περιείχαν μολυσμένα κοτόπουλα. Κάθε απομονωτήρας έχει ένα ίσο μείγμα των δύο γραμμών όπως περιγράφεται από τους Kjaerup et al. [18] .Το λοιμογόνο στέλεχος IBV-M41 χρησιμοποιήθηκε για τη μόλυνση (ένα ευγενικό δώρο από τον Dr. med. κτηνίατρος. Hans C. Philipp στο Lohmann Animal Health GmbH, Cuxhaven, Γερμανία). Ο ιός είχε περάσει δύο φορές σε συγκεκριμένα εμβρυονικά αυγά χωρίς παθογόνα. Τα εμβόλια IBV παρασκευάστηκαν σε αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) αμέσως πριν από τη χρήση και περιείχαν 2 × 10 5,2 EID 50 /200 μl ιού IBV-M41. Η πρώτη και η δεύτερη ομάδα (οι μη μολυσμένες ομάδες) μολύνθηκαν ψευδώς με 200 μl PBS ανά πουλί. Η τρίτη και η τέταρτη ομάδα (οι μολυσμένες ομάδες) έλαβαν 200 μL IBV-M41. Τα εμβόλια χορηγήθηκαν μισά ρινικά και μισά από το στόμα για να μιμηθούν τις φυσικές οδούς μόλυνσης του IBV στο κοτόπουλο. Τα κοτόπουλα τρέφονταν με δίαιτες που πληρούσαν ή υπερέβαιναν τις απαιτήσεις του Εθνικού Συμβουλίου Έρευνας. Τροφοδοσία και νερό παρέχονταν κατά βούληση. Τα πτηνά παρακολουθούνταν καθημερινά για κλινικά σημεία ασθένειας και οι παράμετροι της νόσου μετρήθηκαν όπως αναφέρθηκε από τους Kjaerup et al. [18] . Κανένα από τα άτομα δεν έλαβε αντιβιοτική θεραπεία κατά την πειραματική περίοδο. Η μελέτη διεξήχθη υπό αυστηρή δεοντολογική έγκριση και παρακολούθηση (βλ. τη δήλωση στο τέλος της ενότητας Υλικά και Μέθοδοι). Για αυτήν τη μελέτη συλλέχθηκαν 64 δείγματα σπλήνας και χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας RNA. Τα πουλιά θυσιάστηκαν 1 και 3 εβδομάδες μετά τη μόλυνση με εξάρθρωση του τραχήλου της μήτρας και συλλέχθηκαν δείγματα σπλήνας. Και στα δύο χρονικά σημεία, συλλέχθηκαν οκτώ δείγματα από τις δύο γραμμές, L10H και γραμμή L10L, από κάθε ομάδα (μη μολυσμένα και μολυσμένα) όπως απεικονίζεται στο Σχήμα. 1 . Μετά τη συλλογή, οι σπλήνες τεμαχίστηκαν (τριγωνική φέτα διατομής από το πάνω μέρος) και πανομοιότυπα δείγματα από κάθε κοτόπουλο τοποθετήθηκαν αμέσως σε διάλυμα σταθεροποίησης RNAlater® (Ambion Inc., Austin, Texas) που επωάστηκαν στους 4°C όλη τη νύχτα και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν στους -20°C την επόμενη ημέρα. Δείγματα ιστού ομογενοποιήθηκαν σε TissueLyzer LT (Qiagen, Hilden, Γερμανία). Το συνολικό RNA εξήχθη με το κιτ Qiagen RNAeasy (Κωδ. Καταλόγου 74104, Qiagen, Venlo, Ολλανδία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ποιότητα των 64 συνολικών δειγμάτων RNA επαληθεύτηκε χρησιμοποιώντας μια συσκευή 2200 TapeStation RNA Screen Tape (Agilent, Santa Clara, CA, USA) και η συγκέντρωση εξακριβώθηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο ND-1000 (Nano-Drop, Wilmington, DE). Οι βιβλιοθήκες ήταν παρασκευάστηκε με το κιτ προετοιμασίας δειγμάτων Illumina TruseqRNA (Catalog ID FC-122-1001, Illumina, San Diego, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και αξιολογήθηκε με το Agilent Tape Station 2200. Οι βιβλιοθήκες ποσοτικοποιήθηκαν από το Picogreen και στη συνέχεια κανονικοποιήθηκαν στα 10 nM όπως συνιστάται από την Illumina για δημιουργία συμπλέγματος στο Hiseq2000. Ισογραμμομοριακές ποσότητες κάθε βιβλιοθήκης αναμίχθηκαν πριν από τη μετουσίωση του NaOH. Το κιτ συστάδων PE Illumina Truseq v3 (Catalog ID PE-401-3001) χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία συστάδων στο εμβολιασμένο κύτταρο Illumina Flowcell και οι υβριδισμένες βιβλιοθήκες αναλύθηκαν σε έξι γραμμές σε ένα Flow. το Hiseq2000 με 100 κύκλους μιας μονάδας αλληλούχισης ζευγαρωμένου άκρου χρησιμοποιώντας το κιτ Truseq SBS v3 (Catalog ID FC-401-3001). Ποιοτικός έλεγχος, χαρτογράφηση αναγνώσεων αλληλουχίας RNA και μέτρηση χαρτογραφημένων αναγνώσεων Η αρχική ποιότητα ελέγχου αξιολογήθηκε από την έκδοση λογισμικού FastQC 0.11.3 [52] . Οι ακατέργαστες αναγνώσεις περικόπηκαν για βάσεις χαμηλής ποιότητας χρησιμοποιώντας το εργαλείο Trimmomatic έκδοση 0.32 [53] εφαρμόζοντας την ελάχιστη βαθμολογία ποιότητας Phred >10 κατά μέσο όρο στο συρόμενο παράθυρο των πέντε βάσεων. Επιπλέον, αφαιρέθηκαν όλες οι αναγνώσεις με μήκος κάτω από 40 bp. Οι κομμένες αναγνώσεις χαρτογραφήθηκαν στο γονιδίωμα αναφοράς Gallus gallus (Gallus_gallus-4.0, έκδοση 80 [54] ) χρησιμοποιώντας έναν ματισμένο ευθυγραμμιστή TopHat2 έκδοση 2.014 [55] . Ο σχολιασμός του γονιδίου Gallus gallus που χρησιμοποιήθηκε για τη χαρτογράφηση ανακτήθηκε από τη βάση δεδομένων Ensembl έκδοση 80 (www.ensembl.org). Η ποιότητα της χαρτογράφησης αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύνολο σεναρίων Python εντός του κιτ εργαλείων RSeQC [56] . Η αξιολόγηση ποιοτικού ελέγχου περιλάμβανε επιθεώρηση της κάλυψης ανάγνωσης σε ολόκληρο το σώμα του γονιδίου, προκειμένου να εκτιμηθεί εάν η κάλυψη αναγνώσεων ήταν ομοιόμορφη και εάν υπήρχε κάποια προκατάληψη 5' ή 3', καθώς και πώς κατανεμήθηκαν οι χαρτογραφημένες αναγνώσεις στα χαρακτηριστικά του γονιδιώματος. Αριθμός γονιδίων Η εκτίμηση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το εργαλείο HTSeq-count σε λειτουργία «ένωσης». Το HTSeq-count είναι μια δέσμη ενεργειών Python εντός του πλαισίου HTSeq, έκδοση 0.7.1, η οποία είναι μια εργαλειοθήκη ανοιχτού κώδικα που επιτρέπει την εισαγωγή ακατέργαστων αριθμών από ευθυγραμμισμένες αναγνώσεις να σχολιάζονται με ονόματα γονιδίων που βασίζονται σε γονιδιωματικά χαρακτηριστικά [57] . Οι μετρήσεις που ελήφθησαν χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση της γονιδιακής έκφρασης και τον εντοπισμό γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά (DE). Αυτό επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας το πακέτο Bioconductor edgeR έκδοση 3.10.0 [58] και limma έκδοση 3.24.5 [59] σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που περιγράφηκε προηγουμένως [24] . Πριν από τη διεξαγωγή στατιστικής ανάλυσης, γονίδια με χαμηλά επίπεδα έκφρασης φιλτραρίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα όριο τουλάχιστον μίας ανάγνωσης ανά εκατομμύριο σε n από τα δείγματα, όπου n είναι το μέγεθος της μικρότερης ομάδας αντιγράφων, που σε αυτή την περίπτωση ήταν οκτώ. για να ληφθούν υπόψη οι τεχνικές και βιολογικές επιπτώσεις, οι μετρήσεις αναγνώσεων κανονικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη συνάρτηση \"calc-NormFactors\" που υλοποιήθηκε στο πακέτο edgeR. Αυτή η συνάρτηση κανονικοποιεί τα δεδομένα βρίσκοντας ένα σύνολο παραγόντων κλιμάκωσης για τα μεγέθη της βιβλιοθήκης που ελαχιστοποιεί τις αλλαγές στο ημερολόγιο μεταξύ των δειγμάτων. Οι συντελεστές κλίμακας υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον περιορισμένο μέσο όρο των τιμών M (TMM) μεταξύ των δειγμάτων [58] . Οι κοινές και ετικέτες εκτιμήσεις διασποράς υπολογίστηκαν με τη μέθοδο πιθανότητας προσαρμοσμένης στο προφίλ Cox-Reid προκειμένου να διορθωθεί η τεχνική και βιολογική απόκλιση κατά την προσαρμογή του πολυμεταβλητού αρνητικού διωνυμικού μοντέλου [60] . Η πολυδιάστατη κλίμακα (MDS) εφαρμόστηκε στο πακέτο edgeR , για να αξιολογηθεί οπτικά η ομοιότητα των δειγμάτων. Η γραφική παράσταση MDS δημιουργήθηκε για να απεικονίσει τη σχέση μεταξύ των δειγμάτων και να εντοπίσει πιθανές ακραίες τιμές [58] . Το MDS βασίζεται στη σύγκριση της σχέσης μεταξύ όλων των ζευγών δειγμάτων εφαρμόζοντας ένα μέτρο απόστασης κατά ζεύγη μέτρησης [58] . Πιθανές ακραίες τιμές διερευνήθηκαν περαιτέρω χρησιμοποιώντας την ανάλυση κύριου συστατικού (PCA) για την αφαίρεση δειγμάτων που ήταν εκτός έλλειψης εμπιστοσύνης 95%. Δημιουργήθηκε ένας πίνακας σχεδιασμού προκειμένου να προσδιοριστούν οι παράγοντες που αναμενόταν να επηρεάσουν το επίπεδο έκφρασης. Η μήτρα κατασκευάστηκε για να ταιριάζει στο κορεσμένο μοντέλο όπου κάθε συνδυασμός θεραπείας εξετάστηκε ξεχωριστά. Οκτώ συνδυασμοί θεραπείας θεωρήθηκαν όπως φαίνεται στο Σχ. 1 : μη μολυσμένα πτηνά από τη γραμμή L10H την εβδομάδα 1, μη μολυσμένα πουλιά από τη γραμμή L10L την εβδομάδα 1, μολυσμένα πουλιά από τη γραμμή L10H την εβδομάδα 1, μολυσμένα πτηνά από τη γραμμή L10L την εβδομάδα 1, μη μολυσμένα πτηνά από τη γραμμή L10H την εβδομάδα 3, μη μολυσμένα πτηνά από τη γραμμή L10L την εβδομάδα 3, μολυσμένα πουλιά από τη γραμμή L10H την εβδομάδα 3, μολυσμένα πουλιά από τη γραμμή L10L την εβδομάδα 3. Χρησιμοποιήθηκε μια γενικευμένη γραμμική δοκιμή αναλογίας πιθανότητας μοντέλου, που προσδιορίζει τη διαφορά ενδιαφέροντος για διαφορική έκφραση μεταξύ αυτών των συνδυασμών θεραπείας. Η ανάλυση διαφορικής έκφρασης πραγματοποιήθηκε συγκρίνοντας τις λογαριθμικές διαφορές στον αριθμό των γονιδίων μεταξύ δύο γραμμών (L10H και L10L) σε διαφορετικά χρονικά σημεία (εβδομάδες 1 και 3) και για διαφορετική κατάσταση (μη μολυσμένη και μολυσμένη) ξεχωριστά (Εικ. 1). Τα ποσοστά ψευδούς ανακάλυψης Benjamini Hochberg (FDR) για ένα πείραμα σε όλο το μεταγραφικό υπολογίστηκαν για να διορθωθούν για πολλαπλές δοκιμές [61] . Όλα τα γονίδια με τιμή p προσαρμοσμένη σε FDR <0,05 θεωρήθηκαν μεμονωμένα γονίδια ενδιαφέροντος και διατηρήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Η λειτουργική ανάλυση των γονιδίων DE πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την έκδοση Cytoscape 3.2.1 [62, 63] με την έκδοση ClueGo 2.1 .7 plug-in [64] για τον εμπλουτισμό του σχολιασμού και του εμπλουτισμού των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων (DE) για τέσσερις συγκρίσεις (C1-C4, βλ. Εικ. 1). Το ClueGO καθορίζει την κατανομή των γονιδίων-στόχων στους όρους και τις οδούς GO (Gene Ontology): αυτή η μελέτη επικεντρώθηκε. Η τιμή p υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας υπεργεωμετρικές δοκιμές δεξιάς πλευράς και η προσαρμογή Benjamini-Hochberg χρησιμοποιήθηκε για διόρθωση πολλαπλών δοκιμών. Μια προσαρμοσμένη τιμή p 0,001 έδειξε μια στατιστικά σημαντική απόκλιση από την αναμενόμενη κατανομή και ότι οι αντίστοιχοι όροι και μονοπάτια GO εμπλουτίστηκαν για τα γονίδια-στόχους. Η ισχύς συσχέτισης μεταξύ των όρων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας μια διορθωμένη στατιστική κάπα 0,4. Το δίκτυο που δημιουργήθηκε αντιπροσώπευε τους όρους ως κόμβους που συνδέονταν με βάση ένα επίπεδο βαθμολογίας κάπα 0,4. Το μέγεθος των κόμβων αντανακλούσε τη σημασία εμπλουτισμού των όρων. Το δίκτυο σχεδιάστηκε αυτόματα χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο Organic layout που υποστηρίζεται από το Cytoscape. Οι λειτουργικές ομάδες δημιουργήθηκαν με επαναληπτική συγχώνευση αρχικά καθορισμένων ομάδων με βάση το προκαθορισμένο όριο βαθμολογίας κάπα. Μόνο λειτουργικές ομάδες που αντιπροσωπεύονται από τον πιο σημαντικό όρο τους οπτικοποιήθηκαν στο δίκτυο παρέχοντας μια διορατική άποψη των αλληλεπιδράσεων τους [64] .Οι πειραματικές διαδικασίες διεξήχθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που εγκρίθηκαν από τη Δανική Επιθεώρηση Πειραμάτων σε Ζώα και συμμορφώθηκαν με τον Νόμο του Υπουργείου Δικαιοσύνης της Δανίας αριθ. . 382 (10 Ιουνίου 1987) και Πράξεις 739 (6 Δεκεμβρίου 1988) και 333 (19 Μαΐου 1990) σχετικά με τα πειράματα σε ζώα και τη φροντίδα των πειραματόζωων. Την άδεια διεξαγωγής του πειράματος σε ζώα έλαβε η Helle R. Juul-Madsen. σύγκριση μεταξύ μη μολυσμένων πτηνών την εβδομάδα 1. Οι όροι του ανοσοποιητικού συστήματος GO προσδιορίστηκαν ως κόμβοι και συνδέθηκαν με βάση το επίπεδο βαθμολογίας κάπα (> = 0,4) και την τιμή p < 0,001. Λειτουργικά σχετιζόμενες ομάδες επικαλύπτονταν εν μέρει. Οι όροι GO επισημαίνονται με χρώματα σύμφωνα με την ιεραρχική ομαδοποίηση των όρων GO. Οι όροι που δεν έχουν ομαδοποιηθεί εμφανίζονται με γκρι χρώμα. Τα έγχρωμα γραφήματα πίτας των κόμβων του ανοσοποιητικού συστήματος GO δείχνουν την αναλογία γονιδίου που σχετίζεται με τον αντίστοιχο όρο. (PDF 60 kb)Επιπρόσθετο αρχείο 17: Εικόνα S4 . Αναπαράσταση δικτύου εμπλουτισμένων όρων του ανοσοποιητικού συστήματος GO γονιδίων διαφορικά εκφρασμένων (DE) για σύγκριση μεταξύ μη μολυσμένων πτηνών την εβδομάδα 3. Οι όροι του ανοσοποιητικού συστήματος GO προσδιορίστηκαν ως κόμβοι και συνδέθηκαν με βάση το επίπεδο βαθμολογίας κάπα (> = 0,4) και την τιμή p < 0,001. Λειτουργικά σχετιζόμενες ομάδες επικαλύπτονταν εν μέρει. Οι όροι GO επισημαίνονται με χρώματα σύμφωνα με την ιεραρχική ομαδοποίηση των όρων GO. Οι όροι που δεν έχουν ομαδοποιηθεί εμφανίζονται με γκρι χρώμα. Τα έγχρωμα γραφήματα πίτας των κόμβων του ανοσοποιητικού συστήματος GO δείχνουν την αναλογία γονιδίου που σχετίζεται με τον αντίστοιχο όρο. (PDF 55 kb) Πρόσθετο αρχείο 18: Εικόνα S5 . Αναπαράσταση δικτύου εμπλουτισμένων όρων του ανοσοποιητικού συστήματος GO γονιδίων διαφορικά εκφρασμένων (DE) για σύγκριση μεταξύ μολυσμένων πτηνών την εβδομάδα 1. Οι όροι του ανοσοποιητικού συστήματος GO προσδιορίστηκαν ως κόμβοι και συνδέθηκαν με βάση το επίπεδο βαθμολογίας κάπα (> = 0,4) και την τιμή p < 0,001. Λειτουργικά σχετιζόμενες ομάδες επικαλύπτονταν εν μέρει. Οι όροι GO επισημαίνονται με χρώματα σύμφωνα με την ιεραρχική ομαδοποίηση των όρων GO. Οι όροι που δεν έχουν ομαδοποιηθεί εμφανίζονται με γκρι χρώμα. Τα έγχρωμα γραφήματα πίτας των κόμβων του ανοσοποιητικού συστήματος GO δείχνουν την αναλογία γονιδίου που σχετίζεται με τον αντίστοιχο όρο. (PDF 70 kb) Πρόσθετο αρχείο 19: Εικόνα S6 . Αναπαράσταση δικτύου εμπλουτισμένων όρων του ανοσοποιητικού συστήματος GO γονιδίων διαφορικά εκφρασμένων (DE) για σύγκριση μεταξύ μολυσμένων πτηνών την εβδομάδα 3. Οι όροι του ανοσοποιητικού συστήματος GO προσδιορίστηκαν ως κόμβοι και συνδέθηκαν με βάση το επίπεδο βαθμολογίας κάπα (> = 0,4) και την τιμή p < 0,001. Λειτουργικά σχετιζόμενες ομάδες επικαλύπτονταν εν μέρει. Οι όροι GO επισημαίνονται με χρώματα σύμφωνα με την ιεραρχική ομαδοποίηση των όρων GO. Οι όροι που δεν έχουν ομαδοποιηθεί εμφανίζονται με γκρι χρώμα. Τα έγχρωμα γραφήματα πίτας των κόμβων του ανοσοποιητικού συστήματος GO δείχνουν την αναλογία γονιδίου που σχετίζεται με τον αντίστοιχο όρο. (PDF 30 kb)", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 1062, "text": "συγκέντρωση ορού λεκτίνης που δεσμεύει τη μαννόζη (MBL)" } ], "id": 5161, "question": "Τι διαφοροποίησε τις δύο σειρές κοτόπουλου που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη;" }, { "answers": [ { "answer_start": 9800, "text": "σπλήνα" } ], "id": 5162, "question": "Ποιο όργανο χρησιμοποιήθηκε για τα δείγματα αλληλουχίας RNA;" } ] } ] }

{ "paragraphs": [ { "context": "Επιταχυνόμενη ιική δυναμική σε κυτταρικές σειρές νυχτερίδας, με συνέπειες για την εμφάνιση ζωονοσογόνων Μπότες, Mike; Chandran, Kartik; Dobson, Andrew P; Drosten, Christian; Graham, Andrea L; Grenfell, Bryan T; Müller, Marcel A; Ng, Melinda; Wang, Lin-Fa; van Leeuwen, AniekeΗμερομηνία: 2020-02-03DOI: 10.7554/elife.48401Άδεια: cc-byAbstract: Οι νυχτερίδες φιλοξενούν λοιμογόνους ζωονοσογόνους ιούς χωρίς να εμφανίσουν ασθένεια. Απαιτείται μια μηχανιστική κατανόηση του αντίκτυπου της ικανότητας φιλοξενίας του ιού των νυχτερίδων, συμπεριλαμβανομένων των μοναδικών συστατικών ανοσολογικών οδών, στη δυναμική του ιού σε κυτταρική κλίμακα για να διαλευκανθεί η εμφάνιση ζωονοσογόνων. Πραγματοποιήσαμε δοκιμές μολυσματικότητας ιού σε κυτταρικές σειρές νυχτερίδας που εκφράζουν επαγόμενους και ιδιοσυστατικούς ανοσολογικούς φαινοτύπους και στη συνέχεια αναπτύξαμε ένα θεωρητικό μοντέλο του in vitro συστήματός μας, το οποίο προσαρμόζουμε σε εμπειρικά δεδομένα. Τα μοντέλα Best fit ανακεφαλαίωσαν τους αναμενόμενους ανοσοποιητικούς φαινοτύπους για αντιπροσωπευτικές κυτταρικές σειρές, υποστηρίζοντας ισχυρές αντιικές άμυνες σε κύτταρα νυχτερίδας που συσχετίστηκαν με υψηλότερες εκτιμήσεις για τα ποσοστά διάδοσης του ιού εντός του ξενιστή. Γενικά, οι αυξημένες ανοσολογικές αποκρίσεις περιορίζουν την επαγόμενη από παθογόνο κυτταρική νοσηρότητα, η οποία μπορεί να διευκολύνει την εγκαθίδρυση ταχέως πολλαπλασιαζόμενων επίμονων λοιμώξεων εντός του ξενιστή. Οι ταχέως μεταδιδόμενοι ιοί που έχουν εξελιχθεί με τα ανοσοποιητικά συστήματα της νυχτερίδας πιθανότατα θα προκαλέσουν ενισχυμένη λοιμογόνο δύναμη μετά την εμφάνισή τους σε δευτερεύοντες ξενιστές με ανοσοποιητικά συστήματα που αποκλίνουν από αυτά που είναι μοναδικά για τις νυχτερίδες. Κείμενο: Οι νυχτερίδες έχουν λάβει μεγάλη προσοχή τα τελευταία χρόνια για το ρόλο τους ως ξενιστές δεξαμενής ιογενείς ζωονόσοι, συμπεριλαμβανομένης της λύσσας και των σχετικών ιών λυσσαρίου, των ιών henipah Hendra και Nipah, των φιλοϊών Έμπολα και Marburg και του κορωνοϊού SARS (Calisher et al., 2006; Wang και Anderson, 2019). Στα περισσότερα θηλαστικά που δεν είναι χειρόπτερα, οι henipaviruses, οι filoviruses και οι κοροναϊοί προκαλούν σημαντική νοσηρότητα και θνησιμότητα, εμφανίζουν σύντομες διάρκειες μόλυνσης και προκαλούν ισχυρή, μακροπρόθεσμη ανοσία σε ξενιστές που επιβιώνουν από μόλυνση (Nicholls et al., 2003; Hooper et al., 2001; Mahanty και Bray, 2004). Οι νυχτερίδες, αντίθετα, δεν εμφανίζουν εμφανή συμπτώματα ασθένειας κατά τη μόλυνση με παθογόνα που είναι εξαιρετικά λοιμώδη σε μη εκούσια θηλαστικά (Schountz et al., 2017) αλλά μπορεί, αντίθετα, να υποστηρίξουν τους ιούς ως μακροχρόνιες επίμονες λοιμώξεις, παρά ως παροδικές, ανοσοποιητικές παθολογίες. Plowright et al., 2016). Οι πρόσφατες ερευνητικές εξελίξεις έχουν αρχίσει να ρίχνουν φως στους μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους οι νυχτερίδες αποφεύγουν την παθολογία από αυτά τα κατά τα άλλα λοιμώδη παθογόνα (Brook and Dobson, 2015). Οι νυχτερίδες αξιοποιούν μια σειρά μηχανισμών ειδικών για τα είδη για τον περιορισμό του ιικού φορτίου, οι οποίοι περιλαμβάνουν ασυμβατότητες αλληλουχίας υποδοχέα ξενιστή για ορισμένους συνδυασμούς ιού νυχτερίδας (Ng et al., 2015; Takadate et al., 2020) και συστατική έκφραση της αντιϊκής κυτοκίνης, IFN-a, για άλλους (Zhou et al., 2016). Τυπικά, η παρουσία ιικού RNA ή DNA στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων θηλαστικών θα προκαλέσει έκκριση πρωτεϊνών ιντερφερόνης τύπου Ι (IFN-a και IFN-b), οι οποίες προάγουν την έκφραση και τη μετάφραση διεγερμένων από ιντερφερόνη γονιδίων (ISGs) σε γειτονικά κύτταρα και τα καθιστούν αποτελεσματικά αντιικά (Stetson and Medzhitov, 2006). Σε ορισμένα κύτταρα νυχτερίδας, τα μεταγραφικά σχέδια για αυτήν την απόκριση IFN εκφράζονται ιδιοσυστατικά, ακόμη και απουσία διέγερσης από ιικό RNA ή DNA (Zhou et al., 2016). Σε μη ιπτάμενα θηλαστικά, η ιδιοσυστατική έκφραση της IFN πιθανότατα θα προκαλούσε εκτεταμένη φλεγμονή και συνοδό ανοσοπαθολογία μετά από ιογενή μόλυνση, αλλά οι νυχτερίδες υποστηρίζουν μοναδικές προσαρμογές για την καταπολέμηση της φλεγμονής (Zhang et al., 2013; Ahn et al., 2019; Xie et al., 2018; Pavlovich et al., 2018) που μπορεί να έχει εξελιχθεί για να μετριάσει τη μεταβολική βλάβη που προκαλείται κατά τη διάρκεια της πτήσης (Kacprzyk et al., 2017). Ο βαθμός στον οποίο η συστατική έκφραση IFN-a σημαίνει συστατική αντιϊκή άμυνα με τη μορφή λειτουργικής πρωτεΐνης IFN-a παραμένει άλυτη. Σε κύτταρα νυχτερίδας που εκφράζουν συστατικά IFN-a, ορισμένα διεγερμένα από πρωτεΐνη, κατάντη ISGs φαίνεται να εκφράζονται επίσης συστατικά, αλλά είναι παρόλα αυτά δυνατή η πρόσθετη επαγωγή ISG μετά από ιική πρόκληση και διέγερση της IFN-b (Zhou et al., 2016; Xie et al., 2018). Παρά τις πρόσφατες προόδους στη μοριακή κατανόηση της ιικής ανοχής της νυχτερίδας, οι συνέπειες αυτής της μοναδικής ανοσίας της νυχτερίδας στη δυναμική του ιού εντός του ξενιστή -και οι επιπτώσεις της στην κατανόηση της εμφάνισης ζωονοσογόνων- δεν έχουν ακόμη διευκρινιστεί. Το πεδίο της «δυναμικής του ιού» αναπτύχθηκε για πρώτη φορά για να Περιγράψτε τα μηχανιστικά υπόβαθρα των μακροπρόθεσμων προτύπων ιικού φορτίου σταθερής κατάστασης που παρουσιάζουν ασθενείς σε λοιμώξεις χρόνιας φάσης με HIV, οι οποίοι φαινόταν να παράγουν και να καθαρίζουν τον ιό με ισοδύναμους ρυθμούς (Nowak and May, 2000; Ho et al., 1995). Μοντέλα απλής εξάντλησης των κυττάρων-στόχων, στα οποία το ιικό φορτίο υπαγορεύεται από μια πέψη στο κάτω μέρος του eLife Οι νυχτερίδες μπορούν να μεταφέρουν ιούς που είναι θανατηφόροι για άλλα θηλαστικά χωρίς οι ίδιες να παρουσιάζουν σοβαρά συμπτώματα. Στην πραγματικότητα, οι νυχτερίδες είναι φυσικές δεξαμενές για ιούς που έχουν μερικά από τα υψηλότερα ποσοστά θνησιμότητας από οποιουσδήποτε ιούς που αποκτούν οι άνθρωποι από άγρια ​​ζώα -συμπεριλαμβανομένης της λύσσας, του Έμπολα και του κορωνοϊού SARS. Οι νυχτερίδες διαθέτουν μια σειρά αντιικών άμυνες που κρατούν την ποσότητα του ιού έλεγχος. Για παράδειγμα, μερικές νυχτερίδες έχουν μια αντιική ανοσολογική απόκριση που ονομάζεται μονοπάτι ιντερφερόνης μόνιμα ενεργοποιημένη. Στα περισσότερα άλλα θηλαστικά, η ύπαρξη μιας τέτοιας υπερ-επαγρύπνησης ανοσολογικής απόκρισης θα προκαλούσε επιβλαβή φλεγμονή. Οι νυχτερίδες, ωστόσο, έχουν προσαρμοσμένα αντιφλεγμονώδη χαρακτηριστικά που τις προστατεύουν από τέτοια βλάβη, όπως η απώλεια ορισμένων γονιδίων που κανονικά προάγουν τη φλεγμονή. Ωστόσο, κανείς δεν έχει διερευνήσει προηγουμένως πώς αυτές οι μοναδικές αντιικές άμυνες των νυχτερίδων επηρεάζουν τους ίδιους τους ιούς. Τώρα, οι Brook et al. έχουν μελετήσει αυτήν ακριβώς την ερώτηση χρησιμοποιώντας κύτταρα νυχτερίδων που αναπτύχθηκαν στο εργαστήριο. Τα πειράματα χρησιμοποίησαν κύτταρα από ένα είδος νυχτερίδας -τη μαύρη ιπτάμενη αλεπού-στην οποία η οδός της ιντερφερόνης είναι πάντα ανοιχτή, και ένα άλλο -την αιγυπτιακή νυχτερίδα φρούτων-στην οποία αυτή η οδός ενεργοποιείται μόνο κατά τη διάρκεια μιας μόλυνσης. Τα κύτταρα νυχτερίδας μολύνθηκαν με τρεις διαφορετικούς ιούς και στη συνέχεια οι Brook et al. παρατήρησε πώς η οδός της ιντερφερόνης βοήθησε να κρατηθούν υπό έλεγχο οι λοιμώξεις, πριν δημιουργήσει ένα μοντέλο υπολογιστή αυτής της απόκρισης. Τα πειράματα και το μοντέλο βοήθησαν να αποκαλυφθεί ότι η άμυνα των νυχτερίδων μπορεί να έχει ένα πιθανό μειονέκτημα για άλλα ζώα, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων. Και στα δύο είδη νυχτερίδων, οι ισχυρότερες αντιϊκές αποκρίσεις αντιμετωπίστηκαν από τον ιό που εξαπλώθηκε ταχύτερα από κύτταρο σε κύτταρο. Αυτό υποδηλώνει ότι η άμυνα του ανοσοποιητικού συστήματος των νυχτερίδων μπορεί να οδηγήσει στην εξέλιξη ιών που μεταδίδουν ταχύτερα και ενώ οι νυχτερίδες προστατεύονται καλά από τις βλαβερές συνέπειες των δικών τους παραγωγικών ιών, άλλα πλάσματα όπως οι άνθρωποι δεν είναι. Τα ευρήματα μπορεί να βοηθήσουν στο να εξηγηθεί γιατί οι νυχτερίδες είναι συχνά η πηγή για ιούς που είναι θανατηφόροι για τον άνθρωπο. Η μάθηση περισσότερων για την αντιική άμυνα των νυχτερίδων και τον τρόπο με τον οποίο οδηγούν την εξέλιξη του ιού μπορεί να βοηθήσει τους επιστήμονες να αναπτύξουν καλύτερους τρόπους πρόβλεψης, πρόληψης ή περιορισμού της εξάπλωσης των ιών από τις νυχτερίδες στον άνθρωπο. Απαιτούνται περισσότερες μελέτες σε νυχτερίδες για να βοηθηθούν αυτές οι προσπάθειες. Εν τω μεταξύ, τα πειράματα υπογραμμίζουν τη σημασία της προειδοποίησης των ανθρώπων να αποφεύγουν την άμεση επαφή με άγριες νυχτερίδες. αύξηση της παροχής πόρων των ευαίσθητων στη μόλυνση κυττάρων ξενιστών, αναπτύχθηκαν για πρώτη φορά για τον HIV (Perelson, 2002) αλλά έκτοτε έχουν εφαρμοστεί σε άλλες χρόνιες λοιμώξεις, συμπεριλαμβανομένου του ιού της ηπατίτιδας-C (Neumann et al., 1998), του ιού της ηπατίτιδας-Β (Nowak et al., 1996) και κυτταρομεγαλοϊό (Emery et al., 1999). Πρόσφατες εργασίες έχουν υιοθετήσει παρόμοιες τεχνικές για τη μοντελοποίηση της δυναμικής εντός του ξενιστή των οξειών λοιμώξεων, όπως η γρίπη Α και η ιλαρά, εμπνέοντας συζήτηση σχετικά με τον βαθμό στον οποίο η ρητή μοντελοποίηση του ανοσοποιητικού ελέγχου από πάνω προς τα κάτω μπορεί να βελτιώσει τα συμπεράσματα πέρα ​​από τις βασικές υποθέσεις περιορισμού των πόρων. μοντέλο κυττάρου στόχου (Baccam et al., 2006; Pawelek et al., 2012; Saenz et al., 2010; Morris et al., 2018). Για να διερευνήσουμε τον αντίκτυπο των μοναδικών ανοσολογικών διεργασιών της νυχτερίδας στην in vitro ιική κινητική, αναλάβαμε πρώτα μια σειρά πειραμάτων μόλυνσης από ιούς σε κυτταρικές σειρές νυχτερίδας που εκφράζουν αποκλίνοντες φαινοτύπους ιντερφερόνης και στη συνέχεια αναπτύξαμε ένα θεωρητικό μοντέλο που διευκρινίζει τη δυναμική της ιική εξάπλωση εντός του ξενιστή. Αξιολογήσαμε το θεωρητικό μας μοντέλο αναλυτικά ανεξάρτητο από τα δεδομένα και, στη συνέχεια, προσαρμόσαμε το μοντέλο σε δεδομένα που ανακτήθηκαν από πειραματικές δοκιμές in vitro, προκειμένου να εκτιμήσουμε τα ποσοστά μετάδοσης του ιού εντός του ξενιστή και την κυτταρική εξέλιξη σε κατάσταση κατά του ιού υπό διάφορες υποθέσεις απουσίας, επαγόμενης και συστατικής ασυλία, ανοσία. Τέλος, επιβεβαιώσαμε τα ευρήματά μας σε χωρικά σαφείς στοχαστικές προσομοιώσεις προσαρμοσμένων χρονοσειρών από το μοντέλο μέσου πεδίου μας. Υποθέσαμε ότι οι ανοσολογικές διεργασίες από πάνω προς τα κάτω θα υπερέβαιναν τον κλασικό περιορισμό των πόρων σε κυτταρικές σειρές νυχτερίδων που περιγράφονται ως ιδιοσυστατικά αντιιικές στη βιβλιογραφία, προσφέροντας μια ελεγχόμενη πρόβλεψη για μοντέλα που ταιριάζουν σε εμπειρικά δεδομένα. Προβλέπαμε περαιτέρω ότι οι πιο ισχυρές αντιικές αποκρίσεις θα συσχετίζονται με τους ταχύτερους ρυθμούς διάδοσης του ιού εντός του ξενιστή, αλλά επίσης θα προστατεύουν τα κύτταρα από τη θνησιμότητα που προκαλείται από ιούς για να υποστηρίξουμε τις μακροχρόνιες λοιμώξεις στην καλλιέργεια ιστών. Εξερευνήσαμε πρώτα την επίδραση του έμφυτου φαινοτύπου του ανοσοποιητικού σχετικά με τη διάδοση του ιού εντός του ξενιστή σε μια σειρά πειραμάτων μόλυνσης σε κυτταρική καλλιέργεια. Πραγματοποιήσαμε δοκιμές πλάκας σε μονοστοιβάδες πλακών έξι φρεατίων τριών απαθανατισμένων κυτταρικών σειρών νεφρού θηλαστικών: [1] Κύτταρα Vero (πράσινος πίθηκος Αφρικής), τα οποία είναι ελαττωματικά στην IFN και επομένως περιορισμένη σε αντιική ικανότητα (Desmyter et al., 1968). [2] Κύτταρα RoNi/7.1 (Rousettus aegyptiacus) που επιδεικνύουν ιδιοσυγκρασιακές επαγόμενες αποκρίσεις ιντερφερόνης κατά την πρόκληση ιού (Kuzmin et al., 2017; Arnold et al., 2018; Biesold et al., 2011; Pavlovich et al., 2018); και [3] Κύτταρα PaKiT01 (Pteropus alecto) που εκφράζουν συστατικά IFN-a (Zhou et al., 2016; Crameri et al., 2009). Για να εντείνουμε τις ειδικές για την κυτταρική σειρά διαφορές στην ιδιοσυστατική ανοσία, πραγματοποιήσαμε δοκιμές μολυσματικότητας με ιούς φυσαλιδώδους στοματίτιδας Indiana με επισήμανση GFP, ικανούς για αναπαραγωγή: rVSV-G, rVSV-EBOV και rVSV-MARV, που έχουν περιγραφεί προηγουμένως (Miller et al., 2012; Wong et al., 2010). Δύο από αυτούς τους ιούς, ο rVSV-EBOV και ο rVSV-MARV, είναι ανασυνδυασμένοι για τους οποίους η κυτταρική είσοδος μεσολαβείται από τη γλυκοπρωτεΐνη των φιλοϊών που αναπτύχθηκαν από νυχτερίδες, του Έμπολα (EBOV) και του Marburg (MARV), επιτρέποντάς μας έτσι να ρυθμίσουμε την έκταση της δομικής , καθώς και ανοσολογική, αντιική άμυνα σε κάθε λοίμωξη. Προηγούμενη εργασία σε αυτό το εργαστήριο έχει καταδείξει ασυμβατότητες στον υποδοχέα φιλοϊού NPC1 που καθιστούν τα κύτταρα PaKiT01 ανθεκτικά στη μόλυνση με rVSV-MARV (Ng and Chandrab, 2018, Αδημοσίευτα αποτελέσματα), καθιστώντας τα δομικά αντιιικά, πέρα ​​από τη συστατική τους έκφραση του IFN . Και οι τρεις κυτταρικές σειρές προκλήθηκαν με και τους τρεις ιούς σε δύο πολλαπλότητες μόλυνσης (ΜΟΙ): 0,001 και 0,0001. Διεξήχθησαν μεταξύ 18 και 39 δοκιμές σε κάθε συνδυασμό κυττάρου-ιού-MOI, με εξαίρεση τις μολύνσεις rVSV-MARV σε κύτταρα PaKiT01 στο MOI = 0,001, για τις οποίες πραγματοποιήθηκαν μόνο οκτώ δοκιμές (βλ. Υλικά και μέθοδοι· Εικόνα 1 -συμπληρώματα εικόνας 1-3, Συμπληρωματικό αρχείο 1).Επειδή οι δοκιμές πλάκας περιορίζουν τη μετάδοση του ιού από γείτονα σε γείτονα σε δισδιάστατο κυτταρικό χώρο (Howat et al., 2006) , μπορέσαμε να παρακολουθήσουμε την εξάπλωση του GFP- εκφράζοντας κύτταρα μολυσμένα από ιό σε μονοστοιβάδες ιστών μέσω μικροσκοπίας ανεστραμμένου φθορισμού. Για κάθε δοκιμή λοίμωξης, παρακολουθήσαμε και επαναλάβαμε την απεικόνιση των πλακών για έως και 200 ​​ώρες παρατηρήσεων ή μέχρι την ολική καταστροφή της μονοστοιβάδας, επεξεργαστήκαμε τις προκύπτουσες εικόνες και δημιουργήσαμε μια χρονοσειρά της αναλογίας του χώρου πλάκας που καταλαμβάνουν τα μολυσματικά κύτταρα κατά τη διάρκεια κάθε δοκιμής (βλ. Υλικά και μέθοδοι). Χρησιμοποιήσαμε γενικευμένα μοντέλα πρόσθετων για να συμπεράνουμε τη χρονική πορεία όλων των αντιγράφων κυτταροκαλλιέργειας και να κατασκευάσουμε το σύνολο δεδομένων πολλαπλών δοκιμών στο οποίο τελικά προσαρμόζουμε το μηχανιστικό μοντέλο μετάδοσης για κάθε συνδυασμό κυτταρικής γραμμής που σχετίζεται με ιούς (Εικόνα 1. Εικόνα 1 - συμπληρώματα εικόνας 1-5). Και οι τρεις ανασυνδυασμένοι ιοί φυσαλιδώδους στοματίτιδας (rVSV-G, rVSV-EBOV και rVSV-MARV) μόλυναν ιστοκαλλιέργειες Vero, RoNi/7.1 και PaKiT01 και στα δύο εστιακά MOI. Μετά την εισβολή, ο ιός εξαπλώθηκε γρήγορα στις περισσότερες κυτταρικές μονοστιβάδες, με αποτέλεσμα την εξαφάνιση της επιδημίας που προκαλείται από τον ιό. Οι επιδημίες ήταν λιγότερο σοβαρές σε καλλιέργειες κυττάρων νυχτερίδας, ειδικά όταν είχαν μολυνθεί με τους ανασυνδυασμένους φιλοϊούς, rVSV-EBOV και rVSV-MARV. Η καταστροφή της μονοστοιβάδας αποφεύχθηκε στην περίπτωση των μολύνσεων rVSV-EBOV και rVSV-MARV στα κύτταρα PaKiT01: στα πρώτα, η επίμονη ιογενής λοίμωξη διατηρήθηκε καθ' όλη τη διάρκεια των 200 ωρών κάθε πειράματος, ενώ, στο δεύτερο, η μόλυνση εξαλείφθηκε νωρίς στο χρονοσειρές, διατηρώντας ένα μεγάλο ποσοστό ζωντανών, μη μολυσματικών κυττάρων καθ' όλη τη διάρκεια του πειράματος. Υποθέσαμε ότι αυτό το μοτίβο είναι το αποτέλεσμα της εξαφάνισης επιδημίας που προκαλείται από το ανοσοποιητικό (Εικόνα 1) . Τα μοτίβα από MOI = 0,001 ανακεφαλαιώθηκαν σε μεγάλο βαθμό στο MOI = 0,0001, αν και σε κάπως μειωμένες συνολικές αναλογίες (Σχήμα 1-σχήμα συμπλήρωμα 5 ). μοντέλο για να ταιριάζει σε αυτά τα δεδομένα για να διαλευκανθούν τα αποτελέσματα της επαγόμενης και συστατικής ανοσίας στη δυναμική της εξάπλωσης του ιού στον ιστό ξενιστή (Εικόνα 1). Το διαμερισματικό σύστημα εντός του ξενιστή μιμήθηκε τη δισδιάστατη μονοστιβάδα κυτταροκαλλιέργειας μας, με τα κύτταρα να καταλαμβάνουν πέντε διακριτές καταστάσεις μόλυνσης: ευαίσθητα (S), αντιιικά (Α), εκτεθειμένα (Ε), μολυσματικά (I) και νεκρά (D). Μοντελοποιήσαμε τα εκτεθειμένα κύτταρα ως μολυσμένα αλλά όχι ακόμη μολυσματικά, συλλαμβάνοντας τη «φάση έκλειψης» της ενσωμάτωσης του ιού σε ένα κύτταρο ξενιστή που προηγείται της ιικής αντιγραφής. Τα αντιιικά κύτταρα ήταν άνοσα σε ιογενή λοίμωξη, σύμφωνα με την «κατάσταση κατά του ιού» που προκαλείται από τη διέγερση με ιντερφερόνη των ISG σε ιστούς που γειτνιάζουν με τη μόλυνση (Stetson and Medzhitov, 2006). Επειδή στοχεύαμε να μεταφράσουμε τα διαθέσιμα δεδομένα σε μοντελοποιημένες διαδικασίες, δεν μοντελοποιήσαμε ρητά τη δυναμική της ιντερφερόνης, αλλά αντ' αυτού κλιμακώσαμε τον ρυθμό εξέλιξης των κυττάρων από ευαίσθητα σε αντιιικά (r) με βάση την αναλογία των εκτεθειμένων κυττάρων (σε παγκόσμιο επίπεδο) στο σύστημα. Σε συστήματα που επιτρέπουν την ιδιοσυστατική ανοσία, ένας δεύτερος ρυθμός κυτταρικής απόκτησης αντιιικής κατάστασης (\") κλιμακώθηκε επιπλέον με την παγκόσμια αναλογία των ευαίσθητων κυττάρων στο μοντέλο. Σε σύγκριση με τον ιό, τα σωματίδια IFN είναι μικρά και εξαιρετικά διαχυτικά, δικαιολογώντας αυτή την υπόθεση σφαιρικής σηματοδότησης στην περιορισμένη χωρική έκταση μιας πλάκας έξι φρεατίων και διατηρώντας τη συνέπεια με προηγούμενες προσεγγίσεις μοντελοποίησης της σηματοδότησης IFN στην ανάλυση πλάκας (Howat et al., 2006). Για να αντιπροσωπεύσουμε καλύτερα το εμπειρικό μας σύστημα μονοστρωματικών, εκφράσαμε τις μεταβλητές κατάστασης ως αναλογίες (P S , P A , P E , P I , και P D ), υπό τις υποθέσεις της μετάδοσης που εξαρτάται από τη συχνότητα σε έναν καλά αναμεμειγμένο πληθυσμό (Keeling and Rohani, 2008) , αν και σημειώστε ότι η συμπερίληψη του P D (που αντιπροσωπεύει την αναλογία του νεκρού χώρου στον ιστό που έχει διαμορφωθεί) είχε το λειτουργικό αποτέλεσμα της ποικίλης μετάδοσης με την πυκνότητα των μολυσματικών κυττάρων. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα το ακόλουθο σύστημα συνηθισμένων διαφορικών εξισώσεων: Ορίσαμε την «επαγόμενη ανοσία» ως πλήρη, μοντελοποιώντας όλα τα κύτταρα ως επιρρεπή σε ιική εισβολή σε ισορροπία απαλλαγμένη από νόσο, με άμυνες που προκαλούνται μετά από έκθεση στον ιό μέσω του όρου r. Αντίθετα, επιτρέψαμε στην έκταση της συστατικής ανοσίας να ποικίλλει στο εύρος παραμέτρων \" > 0, ορίζοντας ένα \"συστατικό\" σύστημα ως αυτό που περιέχει οποιαδήποτε αντιιικά κύτταρα σε ισορροπία χωρίς νόσο. Κατά την προσαρμογή αυτού του μοντέλου σε δεδομένα καλλιέργειας ιστών, υπολογίσαμε ανεξάρτητα τόσο το r όσο και το \"; καθώς και ο ρυθμός μετάδοσης από κύτταρο σε κύτταρο, b, για κάθε συνδυασμό κυττάρου-ιού. Δεδομένου ότι ο βαθμός στον οποίο η ιδιοσυστατικά εκφραζόμενη IFN-a μεταφράζεται συστατικά σε λειτουργική πρωτεΐνη δεν είναι ακόμη γνωστός για τους ξενιστές νυχτερίδων (Zhou et al., 2016), αυτή η προσέγγιση επέτρεψε στα δεδομένα μας ιστοκαλλιέργειας να οδηγήσουν σε συμπέρασμα μοντελοποίησης: ακόμη και σε κυτταρικές σειρές PaKiT01 γνωστό ότι εκφράζει συστατικά την IFN-a, την πραγματική συστατική έκταση του συστήματος (δηλ. η ποσότητα των αντιιικών κυττάρων που υπάρχουν σε ισορροπία χωρίς νόσο) αφέθηκε να ποικίλλει μέσω της εκτίμησης \": Για τους σκοπούς της προσαρμογής του μοντέλου, καθορίσαμε την τιμή του c, τον ρυθμό επιστροφής των αντιιικών κυττάρων σε κατάσταση ευαισθησίας, στο 0. Η μικρή χωρική κλίμακα και η σύντομη χρονική πορεία (μέγιστο 200 ώρες) των πειραμάτων μας πιθανότατα απαγόρευσαν οποιαδήποτε επιστροφή των αντιιικών κυττάρων σε ευαίσθητη κατάσταση στο εμπειρικό μας σύστημα. Ωστόσο, διατηρήσαμε τον όρο c σε αναλυτικές αξιολογήσεις του μοντέλου μας, επειδή η παλινδρόμηση από την κατάσταση κατά του ιού στην ευαισθησία είναι δυνατή σε μεγάλες χρονικές περιόδους in vitro και στην κλίμακα ενός πλήρους οργανισμού (Radke et al., 1974; Rasmussen and Farley, 1975; Samuel και Knutson, 1982). Από το σύστημα μοντέλου εντός του ξενιστή (Εξίσωση 1-5), αντλήσαμε την ακόλουθη έκφραση για το R 0 , τον βασικό αριθμό αναπαραγωγής του παθογόνου (Συμπληρωματικό αρχείο 2): Τα παθογόνα μπορούν να εισβάλουν σε μια καλλιέργεια ιστού ξενιστή όταν R 0 >1. Οι ταχείς ρυθμοί απόκτησης συστατικού αντιικού (\") θα οδηγήσουν το R 0 <1: οι καλλιέργειες ιστών με εξαιρετικά ιδιοσυστατική αντιική ανοσία θα είναι επομένως ανθεκτικές στην εισβολή του ιού από την αρχή. Εφόσον, εξ ορισμού, η επαγόμενη ανοσία διεγείρεται μετά την αρχική εισβολή του ιού, ο ρυθμός της επαγόμενης αντιιικής απόκτησης (r) δεν ενσωματώνεται στην εξίσωση για το R0. Ενώ οι επαγόμενες ανοσολογικές διεργασίες μπορούν να ελέγξουν τον ιό μετά την αρχική εισβολή, δεν μπορούν να τον αποτρέψουν από την εμφάνισή του. Σε περιπτώσεις πλήρως επαγόμενης ή απουσίας ανοσίας (\" ¼ 0), η εξίσωση R 0 μειώνεται έτσι σε μια τυπική μορφή του κλασικού μοντέλου SEIR: Σε ισορροπία, το θεωρητικό μοντέλο μέσου πεδίου δείχνει μία από τις τρεις καταστάσεις μόλυνσης: ενδημική ισορροπία, σταθερή οριακοί κύκλοι ή καμία μόλυνση (Εικόνα 2) . Αντίστοιχα, αυτές οι καταστάσεις προσεγγίζουν τους φαινοτύπους της επίμονης μόλυνσης, της επαγόμενης από τον ιό εξαφάνισης επιδημίας και της ανοσοδιαμεσολαβούμενης επιδημικής εξαφάνισης που παρατηρήθηκαν προηγουμένως σε πειράματα καλλιέργειας ιστών (Εικόνα 1). Θεωρητικά, η ενδημική ισορροπία διατηρείται όταν δημιουργούνται νέες λοιμώξεις με τον ίδιο ρυθμό με τον οποίο χάνονται οι λοιμώξεις, ενώ οι οριακές κύκλοι αντιπροσωπεύουν το χώρο παραμέτρων κάτω από τον οποίο οι μολυσματικοί και ευαίσθητοι πληθυσμοί είναι κλειδωμένοι σε προβλέψιμες ταλαντώσεις. Ενδημικές ισορροπίες που προκύπτουν από την κυτταρική αναγέννηση (δηλ. γεννήσεις) έχουν περιγραφεί in vivo για τον HIV (Coffin, 1995) και in vitro για αναλύσεις πλάκας ιού έρπητα (Howat et al., 2006), αλλά, επειδή πλησιάζουν τόσο πολύ το μηδέν, οι πραγματικοί οριακές κύκλοι πιθανότατα συμβαίνουν μόνο θεωρητικά, αντί να αποδίδουν στοχαστικά εξαφανίσεις σε εμπειρικές χρονοσειρές. Η ανάλυση διχασμού του μέσου μοντέλου πεδίου αποκάλυψε ότι περιοχές χωρίς μόλυνση (εξάλειψη παθογόνου) οριοθετήθηκαν σε τιμές κατώτερου ορίου (σημείο διακλάδωσης) για το b, κάτω από τις οποίες το παθογόνο δεν μπορούσε να εισβάλει. Δεν βρήκαμε ανώτατο όριο εισβολής για το b σε καμία περίπτωση (δηλ. b αρκετά υψηλό για να οδηγήσει σε εξαφάνιση που προκαλείται από παθογόνο), αλλά οι υψηλές τιμές b οδήγησαν σε διακλαδώσεις Hopf, οι οποίες οριοθετούν περιοχές του χώρου παραμέτρων που χαρακτηρίζονται από οριακούς κύκλους. Δεδομένου ότι οι οριακές κύκλοι πλησιάζουν τόσο κοντά στο μηδέν, τα υψηλά bs που ανακτώνται σε αυτό το εύρος πιθανότατα θα προκαλούσαν εξαφανίσεις επιδημιών που προκαλούνται από ιούς υπό πειραματικές συνθήκες. Κάτω από πιο ισχυρές αναπαραστάσεις ανοσίας, με υψηλότερες τιμές για το ένα ή και για τα δύο επαγόμενα (r) και τα συστατικά (\") ποσοστά απόκτησης αντιικών, οι διακλαδώσεις του Hopf εμφανίστηκαν σε ολοένα και υψηλότερες τιμές για το b, που σημαίνει ότι οι επίμονες λοιμώξεις θα μπορούσαν να δημιουργηθούν σε υψηλότερους ρυθμούς μετάδοσης του ιού. Σχήμα 2 ). Σύμφωνα με την προέλευσή μας για το R 0 , βρήκαμε ότι το κατώφλι σημείου διακλάδωσης για ιική εισβολή ήταν ανεξάρτητο από αλλαγές στην επαγόμενη παράμετρο του ανοσοποιητικού (r) αλλά κορεσμένο σε υψηλές τιμές \" που χαρακτηρίζουν την άκρως ιδιοσυστατική ανοσία (Εικόνα 3). το θεωρητικό μας μοντέλο με τα ελάχιστα τετράγωνα σε κάθε συνδυασμό κυτταρικής σειράς-ιού, υπό απούσες, επαγόμενες και συστατικές υποθέσεις ανοσίας. Γενικά, τα μοντέλα βέλτιστης προσαρμογής ανακεφαλαίωσαν τα αναμενόμενα αποτελέσματα με βάση τον ανοσοποιητικό φαινότυπο της εν λόγω κυτταρικής σειράς, όπως περιγράφεται στη γενική βιβλιογραφία (Πίνακας 1 Κατά ειρωνικό τρόπο, το επαγόμενο ανοσοποιητικό μοντέλο προσέφερε ελαφρώς καλύτερη προσαρμογή από το συστατικό σε λοιμώξεις rVSV-MARV σε την κυτταρική σειρά PaKiT01 (ο συνδυασμός μιας κυτταρικής γραμμής-ιού για τον οποίο γνωρίζουμε ότι υπάρχει μια συστατικά αντιϊκή ασυμβατότητα κυττάρου-υποδοχέα). Επειδή οι ιδιοσυστατικές παραδοχές του ανοσοποιητικού μπορούν να απαγορεύσουν την εισβολή παθογόνου (R 0 <1), οι προσαρμογές μοντέλων σε αυτήν τη χρονοσειρά κάτω από θεσμικές παραδοχές παρεμποδίστηκαν από υπερεκτιμήσεις του \", οι οποίες απαγόρευαν την εισβολή παθογόνου. Μόνο με την ενσωμάτωση ενός εξαιρετικά γρήγορου ρυθμού επαγόμενης απόκτησης αντιικών θα μπορούσε το μοντέλο να εγγυηθεί ότι η αρχική μόλυνση θα επιτρεπόταν και στη συνέχεια θα ελεγχόταν γρήγορα. Σε όλες τις γραφικές παραστάσεις του πάνελ (Α), ο ρυθμός επαγόμενης ανοσολογικής απόκτησης αντιικών (r) καθορίστηκε στο 0,01. Το πλαίσιο (Β) απεικονίζει τη δυναμική υπό μεταβλητά επαγόμενη ανοσία, που κυμαίνεται από απουσία (αριστερά: r=0) έως υψηλή (δεξιά: r=1). Σε όλα τα διαγράμματα του πλαισίου (Β), ο ρυθμός ιδιοσυστατικής λήψης αντιικών (\") καθορίστηκε σε 0,0001 Οι καμπύλες σημείου διακλάδωσης αντιπροσωπεύονται ως συμπαγείς γραμμές και οι καμπύλες Hopf ως διακεκομμένες γραμμές. Το λευκό διάστημα υποδηλώνει ενδημική ισορροπία (επιμονή), το γκρίζο διάστημα υποδεικνύει οριακούς κύκλους και το μαύρο διάστημα υποδηλώνει ότι δεν υπάρχει μόλυνση (εξάλειψη). Άλλες τιμές παραμέτρων για ανάλυση ισορροπίας καθορίστηκαν σε: b = 0,025, m = ,001, s = 1/6, c = 0. Ειδικά σημεία από αναλύσεις διακλαδώσεων παρατίθενται στο Συμπληρωματικό αρχείο 3. Για την προσαρμογή του θεωρητικού μας μοντέλου σε δεδομένα in vitro, υπολογίσαμε τον ρυθμό μετάδοσης του ιού εντός του ξενιστή (b) και τον ρυθμό(-ους) της κυτταρικής απόκτησης σε κατάσταση κατά του ιού (r ή r + \") ( Πίνακας 1; Συμπληρωματικό αρχείο 4). Υπό απουσίες ανοσιακών παραδοχών, τα r και \" σταθεροποιήθηκαν στο 0 ενώ το b εκτιμήθηκε. κάτω από επαγόμενες ανοσολογικές υποθέσεις, το \" σταθεροποιήθηκε στο 0 ενώ τα r και b εκτιμήθηκαν. και κάτω από ιδιοσυστατικές ανοσιακές παραδοχές, και οι τρεις παράμετροι (r, \", και b) εκτιμήθηκαν ταυτόχρονα για κάθε συνδυασμό κυττάρου-ιού. Οι εκτιμήσεις παραμέτρων βέλτιστης προσαρμογής για δεδομένα MOI=0,001 οπτικοποιούνται σε συνδυασμό με διακλαδώσεις br και b-\" στα (r) και (B) το ποσοστό συστατικής ανοσίας της απόκτησης αντιικών (\"). Τα πάνελ δείχνουν διακύμανση στην έκταση της ανοσίας, από απουσία (αριστερά) έως υψηλή (δεξιά). Οι καμπύλες σημείων διακλάδωσης αντιπροσωπεύονται ως συμπαγείς γραμμές και οι καμπύλες Hopf ως διακεκομμένες γραμμές. Το λευκό διάστημα υποδηλώνει ενδημική ισορροπία (επιμονή), το γκρίζο διάστημα υποδηλώνει οριακό κύκλο και το μαύρο διάστημα υποδηλώνει ότι δεν υπάρχει μόλυνση (εξάλειψη). Άλλες τιμές παραμέτρων για ανάλυση ισορροπίας καθορίστηκαν σε: b = 0,025, m = ,001, s = 1/6, a = 1/6, c = 0. Ειδικά σημεία από αναλύσεις διακλαδώσεων παρατίθενται στο Συμπληρωματικό αρχείο 3. χώρος που αντιστοιχεί σε θεωρητικούς οριακούς κύκλους, σύμφωνα με παρατηρούμενες εξαφανίσεις επιδημιών που προκαλούνται από ιούς σε καλλιέργειες στοχαστικού ιστού. Σε αντίθεση με τα κύτταρα Vero, το μοντέλο επαγόμενης ανοσίας προσέφερε την καλύτερη εφαρμογή σε όλα τα RoNi/ 7.1 δεδομένα, σύμφωνα με τα αναφερόμενα πρότυπα στη βιβλιογραφία και τη δική μας επικύρωση με qPCR ( Πίνακας 1; Arnold et al., 2018; Kuzmin et al., 2017; Biesold et al., 2011; Pavlovich et al., 2018). Όπως και στις δοκιμές κυττάρων Vero, υπολογίσαμε τις υψηλότερες τιμές b για μολύνσεις rVSV-G σε κυτταρικές σειρές RoNi/7.1, αλλά εδώ ανακτήσαμε υψηλότερες εκτιμήσεις b για rVSV-MARV από ό,τι για rVSV-EBOV. Αυτή η αναστροφή εξισορροπήθηκε από ένα υψηλότερο εκτιμώμενο ποσοστό απόκτησης σε κατάσταση κατά του ιού (r) για το rVSV-EBOV έναντι του rVSV-MARV. Γενικά, παρατηρήσαμε ότι οι ταχύτεροι ρυθμοί λήψης αντιικών (είτε επαγόμενοι, r, συστατικοί, \", είτε και τα δύο) συσχετίστηκαν με υψηλότερους ρυθμούς μετάδοσης (b). Όταν αντισταθμίστηκαν από τις τιμές r, b που εκτιμήθηκαν για λοιμώξεις RoNi/7.1 διατήρησαν το ίδιο πλάτος με εκείνες που εκτιμήθηκαν για κυτταρικές σειρές Vero που απουσίαζαν ανοσοποιητικά, αλλά προκάλεσαν πιο ήπιες επιδημίες και μειωμένη κυτταρική θνησιμότητα (Εικόνα 1) . Οι εκτιμήσεις παραμέτρων RoNi/7.1 εντοπίστηκαν στην περιοχή που αντιστοιχεί στην ενδημική ισορροπία για το ντετερμινιστικό, θεωρητικό μοντέλο (Εικόνα 4) , αποδίδοντας λιγότερο οξείες επιδημίες οι οποίες παρ' όλα αυτά εξαφανίστηκαν σε στοχαστικά πειράματα. ταιριάζει καλύτερα από μοντέλα που υποθέτουν ιδιοσυστατική ανοσία, ενώ οι λοιμώξεις rVSV-MARV στο PaKiT01 αντιστοιχίστηκαν ισοδύναμα με μοντέλα που υποθέτουν είτε επαγόμενη είτε ιδιοσυστατική ανοσία-με τα επαγόμενα μοντέλα να προτιμώνται έναντι των συστατικών στις συγκρίσεις AIC επειδή υπολογίστηκε μια λιγότερη παράμετρος (Σχήμα 1-συμπληρώματα εικόνας 4 5; Συμπληρωματικό αρχείο 4). Για όλες τις λοιμώξεις από ιούς, οι κυτταρικές σειρές PaKiT01 που απέδωσαν b υπολογίζουν μια πλήρη τάξη μεγέθους υψηλότερη από τα κύτταρα Vero ή RoNi/7,1, με κάθε b ισορροπημένο από μια ανοσοαπόκριση (είτε r είτε r σε συνδυασμό με \") επίσης τάξη μεγέθους υψηλότερη από που ανακτήθηκε για τις άλλες κυτταρικές σειρές (Εικόνα 4; Τραπέζι 1 ). Όπως και στα κύτταρα RoNi/7.1, η παράμετρος PaKiT01 εντοπίζεται στην περιοχή που αντιστοιχεί στην ενδημική ισορροπία για το ντετερμινιστικό θεωρητικό μοντέλο. Επειδή οι ιδιοσυστατικές ανοσολογικές διεργασίες μπορούν στην πραγματικότητα να απαγορεύσουν την αρχική εισβολή παθογόνου, η ιδιοσυστατική ανοσοπροσαρμογή σε λοιμώξεις rVSV-MARV σε κυτταρικές σειρές PaKiT01 εντοπίζεται σταθερά στο ή κάτω από το κατώφλι του σημείου διακλάδωσης για εισβολή ιού (R 0 ¼ 1). Κατά την προσαρμογή του μοντέλου για βελτιστοποίηση του \", τυχόν δοκιμές παραμέτρων των τιμών \" που παρήγαγαν R 0 <1 δεν οδήγησαν σε μόλυνση και, κατά συνέπεια, παρήγαγαν εξαιρετικά κακή προσαρμογή σε δεδομένα μολυσματικών χρονοσειρών. Σε όλα τα μοντέλα που ταιριάζουν, υποθέτοντας συστατική ανοσία, σε όλες τις κυτταρικές σειρές, οι αντιικές συνεισφορές από \"απαγορευμένο ιό να εισβάλει καθόλου. Το επαγόμενο ανοσοποιητικό μοντέλο παρήγαγε έτσι μια πιο λιτή ανακεφαλαίωση αυτών των δεδομένων, επειδή η εισβολή του ιού ήταν πάντα επιτρεπτή και στη συνέχεια ελεγχόταν γρήγορα. για να υπολογιστεί ο αρχικός «αντιϊκός ρυθμός» - ο αρχικός ρυθμός συσσώρευσης αντιικών κυττάρων κατά την εισβολή ιού για κάθε συνδυασμό κυττάρου-ιού-ΜΟΙ- με βάση την ακόλουθη εξίσωση: όπου το P E υπολογίστηκε από την αρχική μολυσματική δόση (MOI) κάθε πειράματος μόλυνσης και το P S υπολογίστηκε σε ισορροπία χωρίς νόσο: Επειδή και \" και τα δύο συμβάλλουν σε αυτόν τον αρχικό αντιιικό ρυθμό, οι επαγόμενες και οι συστατικές υποθέσεις του ανοσοποιητικού είναι ικανές να αποδώσουν εξίσου γρήγορους ρυθμούς, ανάλογα με τις προσαρμογές παραμέτρων. Πράγματι, υπό πλήρως επαγόμενες ανοσολογικές υποθέσεις, ο επαγόμενος ρυθμός απόκτησης αντιικών (r) που εκτιμήθηκε για τη μόλυνση rVSV-MARV στα κύτταρα PaKiT01 ήταν τόσο υψηλός που ο αρχικός αντιϊκός ρυθμός υπερέβαινε ακόμη και αυτόν που εκτιμήθηκε σύμφωνα με τις βασικές υποθέσεις για αυτόν τον συνδυασμό κυττάρου-ιού (Συμπληρωματικό αρχείο 4 ) . Στην πραγματικότητα, γνωρίζουμε ότι οι ασυμβατότητες του υποδοχέα NPC1 καθιστούν τις κυτταρικές σειρές PaKiT01 ιδιοσυστατικά ανθεκτικές στη μόλυνση rVSV-MARV (Ng and Chandrab, 2018, Μη δημοσιευμένα αποτελέσματα) και ότι τα κύτταρα PaKiT01 εκφράζουν επίσης συστατικά την αντιική κυτοκίνη, IFN-a. Τα αποτελέσματα προσαρμογής του μοντέλου υποδηλώνουν ότι αυτή η συστατική έκφραση της IFN-a μπορεί να δρα περισσότερο ως μια ταχέως επαγόμενη ανοσοαπόκριση μετά την εισβολή του ιού παρά ως μια συστατική έκκριση της λειτουργικής πρωτεΐνης IFN-a. Ωστόσο, όπως υποτέθηκε, οι κυτταρικές σειρές PaKiT01 ήταν μακράν οι πιο αντιικές από οποιεσδήποτε στη μελέτη μας-με τα αρχικά αντιιικά ποσοστά να εκτιμώνται αρκετές τάξεις μεγέθους υψηλότερα από οποιεσδήποτε άλλες στη μελέτη μας, είτε με επαγόμενες είτε με συστατικές υποθέσεις (Πίνακας 1. Συμπληρωματικό αρχείο 4). Τα κύτταρα RoNi/7.1 εμφάνισαν τη δεύτερη πιο έντονη υπογραφή ανοσίας, ακολουθούμενα από τα κύτταρα Vero, για τα οποία ο αρχικός αντιϊκός ρυθμός ήταν ουσιαστικά μηδενικός ακόμη και υπό αναγκαστικές υποθέσεις επαγόμενης ή ιδιοσυστατικής ανοσίας (Πίνακας 1; Συμπληρωματικό αρχείο 4). Χρησιμοποιώντας προσαρμοσμένες παραμέτρους για τα b και \", υπολογίσαμε επιπλέον το R 0 , τον βασικό αριθμό αναπαραγωγής για τον ιό, για κάθε συνδυασμό κυτταρικής γραμμής-ιού-MOI (Πίνακας 1; Συμπληρωματικό αρχείο 4). Βρήκαμε ότι το R 0 ήταν ουσιαστικά αμετάβλητο σε διαφορετικές παραδοχές του ανοσοποιητικού για τα κύτταρα RoNi/7.1 και Vero, για τα οποία ο αρχικός αντιιικός ρυθμός ήταν χαμηλός. Στην περίπτωση των κυττάρων PaKiT01, ένας υψηλός αρχικός αντιϊκός ρυθμός είτε με επαγόμενη είτε με ιδιοσυστατική ανοσία είχε ως αποτέλεσμα μια αντίστοιχα υψηλή εκτίμηση του b (και, κατά συνέπεια, του R 0 ) που παρήγαγε ακόμα την ίδια καμπύλη επιδημίας που προέκυψε από τις πολύ χαμηλότερες εκτιμήσεις για το b και R0 σε συνδυασμό με απουσία ανοσίας. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι οι αντιικές ανοσοαποκρίσεις προστατεύουν τους ιστούς του ξενιστή έναντι της κυτταρικής θνησιμότητας που προκαλείται από τον ιό και μπορεί να διευκολύνουν την καθιέρωση ταχύτερων ρυθμών μετάδοσης εντός του ξενιστή. Συνολική καταστροφή μονοστιβάδων συνέβη σε όλους τους συνδυασμούς κυττάρου-ιού εκτός από τις μολύνσεις rVSV-EBOV στα κύτταρα RoNi/7.1 και μολύνσεις rVSV-EBOV και rVSV-MARV σε κύτταρα PaKiT01. Η καταστροφή της μονοστοιβάδας αντιστοιχούσε σε ευπαθή κυτταρική εξάντληση και επιδημική ανανέωση όπου το R-effective (το προϊόν του R0 και η αναλογία ευαίσθητη) μειώθηκε κάτω από το ένα (Εικόνα 5). Για λοιμώξεις rVSV-EBOV στο RoNi/7.1, τα επαγόμενα αντιιικά κύτταρα διασφάλισαν υπολειμματικά ζωντανά κύτταρα, τα οποία γέννησαν νέα ευαίσθητα κύτταρα αργά στη χρονοσειρά. Σε λοιμώξεις rVSV-EBOV και rVSV-MARV σε κύτταρα PaKiT01, αυτή η αντιική προστασία σταμάτησε την επιδημία (Εικόνα 5; R-effective <1) πριν από την πλήρη μείωση των ευπαθών. Στην περίπτωση του rVSV-EBOV στο PaKiT01, η γέννηση νέων ευπαθών ατόμων από εναπομείναντα ζωντανά κύτταρα που προστατεύονται από την κατάσταση κατά του ιού διατήρησε τη μετάδοση σε όψιμο στάδιο για να διευκολύνει τη μακροχρόνια επιμονή της επιδημίας. Είναι σημαντικό ότι κάτω από σταθερές τιμές παραμέτρων για το ρυθμό επώασης μόλυνσης και το ποσοστό θνησιμότητας που προκαλείται από μόλυνση (α), τα μοντέλα δεν μπόρεσαν να αναπαράγουν τις μακροπρόθεσμες μολυσματικές χρονοσειρές που καταγράφηκαν σε δεδομένα από μολύνσεις rVSV-EBOV σε κυτταρικές σειρές PaKiT01 χωρίς ενσωμάτωση κυτταρικών γεννήσεις, μια υπόθεση που υιοθετήθηκε σε προηγούμενες αναπαραστάσεις μοντελοποίησης της ιικής δυναμικής που προκαλείται από IFN σε καλλιέργεια ιστών (Howat et al., 2006). Στα πειράματά μας, παρατηρήσαμε ότι η κυτταρική αναπαραγωγή έλαβε χώρα καθώς οι δοκιμασίες πλάκας πέτυχαν συρροή. Τέλος, επειδή η προστατευτική επίδραση των αντιιικών κυττάρων είναι πιο ξεκάθαρα παρατηρήσιμη χωρικά, επιβεβαιώσαμε τα αποτελέσματά μας προσομοιώνοντας προσαρμοσμένες χρονικές σειρές σε μια χωρικά σαφή, στοχαστική ανακατασκευή του μοντέλου μέσου πεδίου μας. Σε χωρικές προσομοιώσεις, οι ρυθμοί απόκτησης αντιιών καθορίστηκαν σε προσαρμοσμένες τιμές για το r και το \" που προέκυψαν από τις μέσες εκτιμήσεις πεδίου, ενώ οι ρυθμοί μετάδοσης (β) καθορίστηκαν σε τιμές δέκα φορές μεγαλύτερες από αυτές που εκτιμήθηκαν υπό τις μέσες συνθήκες πεδίου, λαμβάνοντας υπόψη την εντατικοποίηση της παραμέτρου κατώφλια που επιτρέπουν την εισβολή παθογόνων σε τοπικές χωρικές αλληλεπιδράσεις (βλ. Υλικά και μέθοδοι· Βίντεο 1-3; Εικόνα 5-σχήμα συμπλήρωμα 3; Συμπληρωματικό αρχείο 5; Webb et al., 2007). Σε χρονοσειρές με δυνατότητα ανοσοποιητικού, τα χωρικά αντιιικά κύτταρα λειτουργούσαν ως «καταφύγια» που προστάτευαν τα ζωντανά κύτταρα από μόλυνση καθώς κάθε αρχικό επιδημικό κύμα «ξεπλύθηκε» σε μια κυτταρική μονοστιβάδα. Η ενδεχόμενη γέννηση νέων ευπαθών ατόμων από αυτά τα ζωντανά καταφύγια επέτρεψε τη διαρκή μετάδοση επιδημίας σε περιπτώσεις όπου ορισμένα μολυσματικά κύτταρα παρέμειναν σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία της προσομοίωσης (Βίντεο 1-3· Σχήμα 5-σχήμα συμπλήρωμα 3). Οι νυχτερίδες είναι δεξαμενές για αρκετές σημαντικές αναδυόμενες ζωονόσους, αλλά φαίνεται ότι δεν παρουσιάζουν ασθένεια από λοιμώδη ιικά παθογόνα. Αν και η βιβλιογραφία της μοριακής βιολογίας έχει σημειώσει μεγάλη πρόοδο στην αποσαφήνιση των μηχανισμών με τους οποίους οι νυχτερίδες ανέχονται τις ιογενείς λοιμώξεις (Zhou et al., 2016; Ahn et al., 2019; Xie et al., 2018; Pavlovich et al., 2018; Zhang et al., 2013), η επίδραση της μοναδικής ανοσίας της νυχτερίδας στη δυναμική του ιού εντός του ξενιστή δεν έχει αποσαφηνιστεί επαρκώς. Χρησιμοποιήσαμε έναν καινοτόμο συνδυασμό πειραματισμού in vitro και μοντελοποίησης εντός του κεντρικού υπολογιστή για να διερευνήσουμε τον αντίκτυπο της μοναδικής ανοσίας της νυχτερίδας στη δυναμική του ιού. Κρίσιμα, βρήκαμε ότι οι κυτταρικές σειρές νυχτερίδας έδειξαν μια υπογραφή ενισχυμένης ανοσοαπόκρισης με τη μεσολάβηση ιντερφερόνης, είτε συστατικής είτε επαγόμενης μορφής, η οποία επέτρεψε την καθιέρωση ταχέων ρυθμών μετάδοσης ιού εντός του ξενιστή, κύτταρο σε κύτταρο (β). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίχθηκαν τόσο από την ανεξάρτητη από δεδομένα ανάλυση διακλάδωσης του μέσου όρου του θεωρητικού μοντέλου πεδίου, όσο και από την προσαρμογή αυτού του μοντέλου σε χρονικές σειρές ιογενών λοιμώξεων που καθιερώθηκαν σε καλλιέργεια κυττάρων νυχτερίδας. Επιπλέον, δείξαμε ότι η αντιική κατάσταση που προκαλείται από το μονοπάτι της ιντερφερόνης προστατεύει τα ζωντανά κύτταρα από θνησιμότητα σε καλλιέργεια ιστών, με αποτέλεσμα in vitro επιδημίες παρατεταμένης διάρκειας που ενισχύουν την πιθανότητα εγκαθίδρυσης μιας μακροχρόνιας επίμονης λοίμωξης. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι οι ιοί που εξελίχθηκαν σε δεξαμενές νυχτερίδων που διαθέτουν βελτιωμένες δυνατότητες IFN θα μπορούσαν να επιτύχουν ταχύτερους ρυθμούς μετάδοσης εντός του ξενιστή χωρίς να προκαλούν παθολογία στους ξενιστές τους. Τέτοιοι ταχέως αναπαραγόμενοι ιοί πιθανότατα θα προκαλούσαν ακραία λοιμογόνο δράση κατά τη διάχυση σε ξενιστές που δεν έχουν παρόμοιες ανοσοποιητικές ικανότητες με τις νυχτερίδες. Για να επιτύχουμε αυτά τα αποτελέσματα, αναπτύξαμε αρχικά ένα νέο, εντός του ξενιστή, θεωρητικό μοντέλο που διευκρινίζει τα αποτελέσματα της μοναδικής ανοσίας της νυχτερίδας και, στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε ανάλυση διχασμού των ιδιοτήτων ισορροπίας του μοντέλου υπό ανοσοαπούσες, επαγόμενες και συστατικές υποθέσεις. Θεωρήσαμε ότι μια κυτταρική σειρά είναι ιδιοσυστατικά ανοσία εάν διαθέτει οποιονδήποτε αριθμό αντιιικών κυττάρων σε ισορροπία απαλλαγμένη από νόσο, αλλά επιτρέψαμε στην έκταση της συστατικής ανοσίας να ποικίλλει στο εύρος των παραμέτρων για \", το συστατικό ποσοστό απόκτησης αντιικών. Κατά την εξαγωγή της εξίσωσης για το R0, τον βασικό αριθμό αναπαραγωγής, ο οποίος ορίζει τις συνθήκες κατωφλίου για την εισβολή του ιού σε έναν ιστό (R 0 >1), δείξαμε πώς το κατώφλι εισβολής αυξάνεται σε υψηλές τιμές της συστατικής απόκτησης αντιικών. Οι ιδιοσυστατικές ανοσολογικές διεργασίες μπορούν επομένως να απαγορεύσουν την εισβολή παθογόνου, ενώ οι επαγόμενες αποκρίσεις, εξ ορισμού, μπορούν να ελέγξουν μόνο εκ των υστέρων λοιμώξεις. Μόλις εκπληρωθούν τα όρια για εισβολή παθογόνου, οι παραδοχές της ιδιοσυστατικής ανοσίας θα περιορίσουν την κυτταρική θνησιμότητα (μολυσματικότητα) που προκύπτει σε υψηλά ποσοστά μετάδοσης. Ανεξάρτητα από τον μηχανισμό (επαγόμενο ή συστατικό), τα διεγερμένα από ιντερφερόνη αντιιικά κύτταρα φαίνεται να διαδραματίζουν βασικό ρόλο στη διατήρηση μακροπρόθεσμων ή επίμονων λοιμώξεων προστατεύοντας τα ευαίσθητα κύτταρα από ταχεία μόλυνση και ταυτόχρονο κυτταρικό θάνατο. Η προσαρμογή του μοντέλου μας σε δεδομένα in vitro υποστήριξε αναμενόμενους ανοσολογικούς φαινοτύπους για διαφορετικές κυτταρικές σειρές νυχτερίδων όπως περιγράφεται στη βιβλιογραφία. Τα απλά μοντέλα κυττάρων-στόχων που αγνοούν τα αποτελέσματα της ανοσίας ανακεφαλαιώνουν καλύτερα τις μολυσματικές χρονοσειρές που προέρχονται από κύτταρα Vero με ανεπάρκεια IFN, ενώ τα μοντέλα που υποθέτουν επαγόμενες ανοσολογικές διεργασίες αναπαρήγαγαν με μεγαλύτερη ακρίβεια τις δοκιμές που προέρχονται από κύτταρα RoNi/7.1 (Rousettus aegyptiacus), τα οποία διαθέτουν ένα τυπικό επαγόμενο από ιό IFN -απάντηση. Στις περισσότερες περιπτώσεις, τα μοντέλα που υποθέτουν συστατικές ανοσολογικές διεργασίες αναδημιουργούσαν καλύτερα επιδημίες ιών που παράγονται σε κύτταρα PaKiT01 (Pteropus alecto), τα οποία είναι γνωστό ότι εκφράζουν συστατικά την αντιική κυτοκίνη, IFN-a (Zhou et al., 2016). Υποστήριξη μοντέλου για επαγόμενες ανοσολογικές υποθέσεις σε προσαρμογές σε λοιμώξεις rVSV-MARV σε κύτταρα PaKiT01 υποδηλώνει ότι η ιδιοσυστατική IFN-α χαρακτηριστική έκφρασης των κυττάρων P. alecto μπορεί να αντιπροσωπεύει περισσότερο μια ιδιοσυστατική ανοσολογική διαδικασία εκκίνησης παρά μια αέναη, λειτουργική, αντιική άμυνα. Τα αποτελέσματα από τη μέση προσαρμογή του μοντέλου πεδίου επιβεβαιώθηκαν επιπλέον σε χωρικά σαφείς στοχαστικές προσομοιώσεις κάθε χρονοσειράς. Όπως αποδείχθηκε προηγουμένως σε μοντέλα εντός του ξενιστή για τον HIV (Coffin, 1995; Perelson et al., 1996; Nowak et al., 1995; Bonhoeffer et al., 1997; Ho et al., 1995), οι υποθέσεις απλής εξάντλησης κυττάρου στόχου μπορούν συχνά να παρέχουν ικανοποιητικές προσεγγίσεις της δυναμικής του ιού, ειδικά εκείνων που αναπαράγονται σε απλά συστήματα in vitro. Ουσιαστικά, η προσαρμογή του μοντέλου μας τονίζει την ανάγκη ενσωμάτωσης των επιδράσεων του ανοσοποιητικού ελέγχου από πάνω προς τα κάτω προκειμένου να αναπαραχθούν με ακρίβεια μολυσματικές χρονοσειρές που προέρχονται από καλλιέργειες ιστού κυττάρων νυχτερίδας, ειδικά εκείνες που προκύπτουν από την ισχυρά αντιική κυτταρική σειρά PaKiT01 P. alecto. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι τα ενισχυμένα ανοσοποιητικά μονοπάτια με τη μεσολάβηση IFN σε δεξαμενές νυχτερίδων μπορεί να προάγουν αυξημένα ποσοστά αντιγραφής του ιού εντός του ξενιστή πριν από την εμφάνιση μεταξύ των ειδών. Ωστόσο, αναγνωρίζουμε τους περιορισμούς που επιβάλλονται από τα πειράματα in vitro στην καλλιέργεια ιστών, ιδίως όσον αφορά τους ανασυνδυασμένους ιούς και τις απαθανατισμένες κυτταρικές σειρές. Μελλοντικές εργασίες θα πρέπει να επεκτείνουν αυτές τις μελέτες κυτταροκαλλιέργειας ώστε να περιλαμβάνουν μετρήσεις πολλαπλών μεταβλητών καταστάσεων (δηλ. αντιιικά κύτταρα) για την ενίσχυση των επιδημιολογικών συμπερασμάτων. Η συνεχιζόμενη επανεμφάνιση των επιδημιών Έμπολα σε ολόκληρη την κεντρική Αφρική υπογραμμίζει τη σημασία της κατανόησης του ρόλου των νυχτερίδων ως δεξαμενών για λοιμώδη ζωονόσο. Η τελευταία δεκαετία είναι μάρτυρας της αναδυόμενης συναίνεσης σχετικά με τις μοναδικές οδούς με τις οποίες οι νυχτερίδες αντιστέκονται και ανέχονται τις εξαιρετικά λοιμώξεις (Brook and Dobson, 2015; Xie et al., 2018; Zhang et al., 2013; Ahn et al., 2019; Zhou et al., 2016; Ng et al., 2015; Pavlovich et al., 2018). Ωστόσο, η κατανόηση των μηχανισμών με τους οποίους οι νυχτερίδες υποστηρίζουν ενδημικά παθογόνα σε επίπεδο πληθυσμού ή προάγουν την εξέλιξη μολυσματικών παθογόνων σε ατομικό επίπεδο, παραμένει άγνωστη. Η ενδημική διατήρηση της λοίμωξης είναι ένα καθοριστικό χαρακτηριστικό μιας δεξαμενής παθογόνου (Haydon et al., 2002) και οι νυχτερίδες φαίνεται να αξίζουν έναν τέτοιο τίτλο, υποστηρίζοντας τη μακροχρόνια επιμονή των εξαιρετικά μεταδοτικών ιογενών λοιμώξεων σε πληθυσμούς απομονωμένων νησιών πολύ κάτω από τα αναμενόμενα κρίσιμα μεγέθη κοινότητας (Peel et al., 2012) . Οι ερευνητές συζητούν τη σχετική επιρροή των μηχανισμών σε επίπεδο πληθυσμού και εντός του ξενιστή που μπορεί να εξηγήσουν αυτές τις τάσεις (Plowright et al., 2016), αλλά όλο και περισσότερο, τα δεδομένα πεδίου είναι δύσκολο να συνδυαστούν χωρίς αναγνώριση του ρόλου των επίμονων λοιμώξεων (Peel et al. , 2018; Brook et al., 2019). Παρουσιάζουμε γενικές μεθόδους για τη μελέτη της δυναμικής του ιού σε διασταυρούμενη κλίμακα, οι οποίες υποδηλώνουν ότι η επιμονή εντός του ξενιστή υποστηρίζεται από ισχυρές αντιικές αποκρίσεις χαρακτηριστικές των ανοσολογικών διεργασιών της νυχτερίδας. Οι ιοί που αναπτύσσουν ταχείς ρυθμούς αντιγραφής κάτω από αυτές τις ισχυρές αντιικές άμυνες μπορεί να αποτελούν τον μεγαλύτερο κίνδυνο για την εμφάνιση παθογόνων μεταξύ ειδών σε ξενιστές διάχυσης με ανοσοποιητικά συστήματα που διαφέρουν από αυτά που είναι μοναδικά για τις νυχτερίδες. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε τρεις απαθανατισμένες κυτταρικές σειρές νεφρού θηλαστικών: Vero (πράσινος πίθηκος Αφρικής), RoNi/7.1 (Rousettus aegyptiacus) (Kühl et al., 2011; Biesold et al., 2011) και PaKiT01 (Pteropus alecto) (Crameri et al., 2009). Οι ταυτοποιήσεις ειδών όλων των κυτταρικών γραμμών νυχτερίδας επιβεβαιώθηκαν μορφολογικά και γενετικά στις δημοσιεύσεις στις οποίες περιγράφηκαν αρχικά (Kühl et al., 2011; Biesold et al., 2011; Crameri et al., 2009). Κύτταρα Vero ελήφθησαν από ATCC. Μονοστοιβάδες κάθε κυτταρικής σειράς αναπτύχθηκαν σε συρροή 90% (~9Α105 κύτταρα) σε πλάκες 6 φρεατίων. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε επωαστήρα υγροποιημένου 37˚C, 5% CO 2 και καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle της Dulbecco (DMEM) (Life Technologies, Grand Island, Νέα Υόρκη), συμπληρωμένο με 2% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) (Gemini Bio Products, West Sacramento, CA) και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Life Technologies). Τα κύτταρα ελέγχονταν κάθε μήνα για μόλυνση από μυκόπλασμα ενώ πραγματοποιούνταν πειράματα. όλα τα κύτταρα προσδιορίστηκαν αρνητικά για μόλυνση σε κάθε δοκιμή. Προηγούμενη εργασία έχει δείξει ότι όλες οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν είναι ικανές να δημιουργήσουν μια απόκριση IFN τύπου Ι κατά την πρόκληση ιού, με εξαίρεση τα κύτταρα Vero, τα οποία έχουν ανεπάρκεια IFN-b (Desmyter et al. ., 1968; Rhim et al., 1969; Emeny και Morgan, 1979). Τα κύτταρα RoNi/7.1 έχουν αποδειχθεί ότι ενισχύουν ιδιοσυγκρασιακές επαγόμενες άμυνες IFN κατά τη μόλυνση από ιούς (Pavlovich et al., 2018; Kuzmin et al., 2017; Arnold et al., 2018; Kühl et al., 2011; Biesold et al., 2011), ενώ τα κύτταρα PaKiT01 είναι γνωστό ότι εκφράζουν συστατικά την αντιϊκή κυτοκίνη, IFN-a (Zhou et al., 2016). Αυτή η εργασία είναι η πρώτη τεκμηρίωση της σηματοδότησης IFN που προκαλείται κατά την πρόκληση με τα συγκεκριμένα ανασυνδυασμένα VSV που περιγράφονται παρακάτω. Επαληθεύσαμε γνωστούς αντιϊκούς ανοσοποιητικούς φαινοτύπους μέσω qPCR. Τα αποτελέσματα ήταν συνεπή με τη βιβλιογραφία, υποδεικνύοντας έναν λιγότερο έντονο ρόλο για την άμυνα της ιντερφερόνης έναντι της ιογενούς λοίμωξης στα κύτταρα RoNi/7.1 έναντι των κυττάρων PaKiT01. Ιοί ανασυνδυασμένης φυσαλιδώδους στοματίτιδας Indiana με δυνατότητα αναπαραγωγής, που εκφράζουν γλυκοπρωτεΐνες φιλοϊού στη θέση του άγριου τύπου G (rVSV-G, rVSV -EBOV, και rVSV-MARV) έχουν περιγραφεί προηγουμένως (Wong et al., 2010; Miller et al., 2012). Οι ιοί επιλέχθηκαν για να αντιπροσωπεύουν ένα ευρύ φάσμα αναμενόμενων αντιιικών αποκρίσεων από κύτταρα ξενιστές, με βάση ένα εύρος προηγούμενων εξελικτικών ιστοριών μεταξύ της γλυκοπρωτεΐνης του ιού που μεσολαβεί στην είσοδο του κυττάρου και του υποδοχέα εισόδου του κυττάρου ξενιστή. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις κυμαίνονταν από την πλήρη απουσία εξελικτικού ιστορικού στην περίπτωση λοιμώξεων rVSV-G σε όλες τις κυτταρικές σειρές έως μια γνωστή ασυμβατότητα εισόδου σε επίπεδο υποδοχέα στην περίπτωση λοιμώξεων rVSV-MARV σε κυτταρικές σειρές PaKiT01. Για τη μέτρηση της μολυσματικότητας των rVSVs καθεμία από τις κυτταρικές σειρές που περιγράφονται παραπάνω, έτσι ώστε να υπολογιστεί η σωστή ιική δόση για κάθε ΜΟΙ, προστέθηκε NH 4 Cl (20 mM) σε μολυσμένες κυτταρικές καλλιέργειες 1-2 ώρες μετά τη μόλυνση για να αποκλειστεί η εξάπλωση του ιού και μεμονωμένα κύτταρα θετικά για eGFP μετρήθηκαν χειροκίνητα στις 12-14 ώρες μετά τη μόλυνση. Προηγούμενες δημοσιευμένες εργασίες υποδεικνύουν ότι οι απαθανατισμένες κυτταρικές σειρές νεφρού Rousettus aegyptiacus (RoNi/7.1) και Pteropus alecto (PaKiT01) παρουσιάζουν διαφορετικούς έμφυτους αντιικούς ανοσοποιητικούς φαινοτύπους, προκαλούμενοι, αντίστοιχα ., 2011; Pavlovich et al., 2018; Kühl et al., 2011; Arnold et al., 2018) και συστατική (Zhou et al., 2016) έκφραση γονιδίων ιντερφερόνης τύπου Ι. Επαληθεύσαμε αυτούς τους δημοσιευμένους φαινοτύπους στις δικές μας κυτταρικές σειρές μολυσμένες με rVSV-G, rVSV-EBOV και rVSV-MARV μέσω qPCR των γονιδίων IFN-a και IFN-b σε μια διαχρονική χρονική σειρά μόλυνσης. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήσαμε πολλές φορές σειρά μόλυνσης κάθε κυτταρικής σειράς με καθέναν από τους ιούς που περιγράφονται παραπάνω, υπό συνθήκες ψευδούς μόλυνσης και σε MOI 0,0001 και 0,001-με εξαίρεση το rVSV-MARV στις κυτταρικές σειρές PaKiT01, για τις οποίες η μόλυνση πραγματοποιήθηκε μόνο σε MOI = 0,0001 λόγω στα περιορισμένα αποθέματα ιών και στην εξαιρετικά χαμηλή μολυσματικότητα αυτού του ιού σε αυτήν την κυτταρική σειρά (που απαιτούνται επομένως υψηλά ιικά φορτία για αρχική μόλυνση). Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις διπλούν σε πλάκες 6 φρεατίων, έτσι ώστε μια τυπική πλάκα για οποιονδήποτε από τους τρεις ιούς είχε δύο φρεάτια ελέγχου (ψευδές), δύο φρεάτια MOI = 0,0001 και δύο φρεάτια MOI = 0,001, με εξαίρεση τις πλάκες PaKiT01, που είχαν δύο μάρτυρες και τέσσερα MOI = 0,0001 φρεάτια σε μια δεδομένη στιγμή. Δικαιολογούμε αυτήν την εξαίρεση PaKiT01 μέσω της προσδοκίας ότι η έκφραση IFN-a είναι συστατική για αυτά τα κύτταρα και με την υπόθεση ότι οποιαδήποτε έκφραση εμφανίζεται στο χαμηλότερο MOI θα πρέπει επίσης να υπάρχει και στο υψηλότερο MOI. Για αυτές τις χρονοσειρές γονιδιακής έκφρασης, τέσσερις 6- Οι πλάκες φρεατίων για κάθε συνδυασμό κυτταρικής σειράς-ιού επωάστηκαν με ιό για μία ώρα στους 37°C. Μετά την επώαση, ο ιός αφαιρέθηκε με αναρρόφηση και οι μονοστοιβάδες κυττάρων πλύθηκαν σε PBS, στη συνέχεια καλύφθηκαν με μια επικάλυψη ανάλυσης πλάκας άγαρ για να μιμηθούν συνθήκες υπό τις οποίες διεξήχθησαν δοκιμές μόλυνσης. Στη συνέχεια, οι πλάκες συλλέχθηκαν διαδοχικά σε χρονικά σημεία περίπου 5, 10, 15 και 20 ωρών μετά τη μόλυνση (ο ακριβής χρόνος διέφερε καθώς εκτελούνταν πολλαπλές δοκιμές ταυτόχρονα). Μετά τη συλλογή κάθε πλάκας, η επικάλυψη άγαρ αφαιρέθηκε και ο ιός λύθηκε και το RNA εκχυλίστηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας το κιτ Zymo Quick RNA Mini Prep, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και συμπεριλαμβανομένου του βήματος για την πέψη του κυτταρικού DNA. Μετά την εκχύλιση, η ποιότητα του RNA επαληθεύτηκε μέσω nanodrop και το RNA μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας το κιτ σύνθεσης cDNA Invitrogen Superscript III, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στη συνέχεια, το cDNA αποθηκεύτηκε στους 4˚C και ως κατεψυγμένο απόθεμα στους À20˚C για να περιμένει το qPCR. Αναλάβαμε την qPCR του cDNA για να αξιολογήσουμε την έκφραση των γονιδίων ιντερφερόνης τύπου Ι, IFN-a και IFNb, και του γονιδίου housekeeping, b-Actin , χρησιμοποιώντας εκκινητές που αναφέρθηκαν προηγουμένως στη βιβλιογραφία (Συμπληρωματικό αρχείο 6) . Για qPCR, 2 ml από κάθε δείγμα cDNA επωάστηκαν με 7 ml απιονισμένου νερού, 1 ml μίγματος εκκινητών 5 UM προς τα εμπρός/αντίστροφα και 10 ml iTaq Universal SYBR Green, και στη συνέχεια ανακυκλώθηκαν σε μηχανή QuantStudio3 Real-Time PCR σύμφωνα με τα ακόλουθα συνθήκες: αρχική μετουσίωση στους 94 C για 2 λεπτά ακολουθούμενη από 40 κύκλους: μετουσίωση στους 95˚C (5 s), ανόπτηση στους 58˚C (15 s) και επέκταση στους 72˚C (10 s). Αναφέρουμε απλή Τιμές d-Ct για κάθε δοκιμή, με ακατέργαστη Ct του γονιδίου στόχου που ενδιαφέρει (IFN-a ή IFN-b) αφαιρούμενη από την ακατέργαστη Ct του γονιδίου b-Actin housekeeping στο Σχήμα 1 - Σχήμα 6. Ο υπολογισμός της αλλαγής πτυχής κατά την ιογενή μόλυνση σε σύγκριση με την ψευδή χρησιμοποιώντας τη μέθοδο d-d-Ct (Livak and Schmittgen, 2001) ήταν ακατάλληλος σε αυτή την περίπτωση, καθώς θέλαμε να αποδείξουμε τη συστατική έκφραση της IFN-a σε κύτταρα PaKiT01, όπου δεδομένα από ψευδή κύτταρα ήταν πανομοιότυπο με αυτό που παρήχθη από μολυσμένα κύτταρα. Αφού αναπτύχθηκαν σε συρροή~90%, τα κύτταρα επωάστηκαν με σφαιροποιημένα rVSV που εκφράζουν eGFP (rVSV-G, rVSV-EBOV, rVSV-MARV). Οι κυτταρικές σειρές προκλήθηκαν τόσο με χαμηλή (0,0001) όσο και υψηλή (0,001) πολλαπλότητα μόλυνσης (MOI) για κάθε ιό. Σε μια κυτταρική μονοστιβάδα που έχει μολυνθεί σε ένα δεδομένο MOI (m), η αναλογία των κυττάρων (P), που έχουν μολυνθεί από k ιικά σωματίδια μπορεί να περιγραφεί με την κατανομή Poisson: P k ð Þ ¼ e Àm m k k! , έτσι ώστε ο αριθμός των αρχικά μολυσμένων κυττάρων σε ένα πείραμα να ισούται με: 1 À e Àm . Υποθέσαμε ότι μια περίπου 90% συρρέουσα καλλιέργεια στην αρχή κάθε δοκιμής αποτελούνταν από ~9x10 5 κύτταρα και πραγματοποιήσαμε όλα τα πειράματα σε MOI 0,0001 και 0,001, που σημαίνει ότι ξεκινήσαμε κάθε δοκιμή εισάγοντας ιό, αντίστοιχα, σε ~81 ή 810 κύτταρα, που αντιπροσωπεύει τη μεταβλητή κατάστασης 'E' στο θεωρητικό μας μοντέλο. Τα χαμηλά MOI επιλέχθηκαν για να προσεγγίσουν καλύτερα τη δυναμική της μέσης μόλυνσης πεδίου και να περιορίσουν τα τεχνουργήματα της χωρικής δομής, όπως η πρόωρη επιδημική εξαφάνιση όταν οι αναπτυσσόμενες πλάκες συγκρούονται με τα τοιχώματα των πλακών σε κυτταρική καλλιέργεια. έτσι ώστε ένα φρεάτιο ελέγχου (χωρίς ιό) και 2-3 φρεάτια το καθένα στα ΜΟΙ 0,001 και 0,0001 επωάστηκαν ταυτόχρονα στην ίδια πλάκα. Συνολικά, πραγματοποιήσαμε μεταξύ 18 και 39 δοκιμές σε κάθε συνδυασμό κυττάρου-ιού-MOI, με εξαίρεση τις μολύνσεις r-VSV-MARV σε κύτταρα PaKiT01 στο MOI = 0,001, για τις οποίες πραγματοποιήσαμε μόνο οκτώ δοκιμές λόγω της χαμηλής μολυσματικότητας αυτού του ιού σε αυτή η κυτταρική σειρά, η οποία απαιτούσε υψηλά ιικά φορτία για την αρχική μόλυνση. Τα κύτταρα επωάστηκαν με ιό για μία ώρα στους 37°C. Μετά την επώαση, ο ιός αφαιρέθηκε με αναρρόφηση και οι μονοστοιβάδες κυττάρων πλύθηκαν σε PBS, στη συνέχεια καλύφθηκαν με τετηγμένη παχύρρευστη επικάλυψη (50% 2Χ ΜΕΜ/Λγλουταμίνη. 5% FBS; 3% HEPES; 42% αγαρόζη), ψύχθηκε για 20 λεπτά και επωάστηκε ξανά στο αρχικό τους υγροποιημένο περιβάλλον στους 37˚C, 5% CO 2. Μετά την εφαρμογή της επικάλυψης, οι πλάκες παρακολουθούνταν περιοδικά χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο ανεστραμμένου φθορισμού μέχρι τα πρώτα σημάδια έκφρασης GFP ήταν μάρτυρες (~6-9,5 ώρες μετά τη μόλυνση, ανάλογα με την κυτταρική σειρά και τον ιό υπό διερεύνηση). Από εκείνη τη στιγμή και μετά, ένα τετράγωνο υποσύνολο του κέντρου κάθε φρεατίου (αποτελούμενο από 64 ή 36 υποπλαίσια και που αντιστοιχεί περίπου στο 60% και 40% ολόκληρου του χώρου του φρεατίου) απεικονιζόταν περιοδικά, χρησιμοποιώντας μια διαλογή υψηλού περιεχομένου CellInsight CX5 (HCS) Πλατφόρμα με στόχο αέρα 4Χ (ThermoFisher, Inc, Waltham, MA). Οι ρυθμίσεις μικροσκοπίου διατηρήθηκαν στάνταρ σε όλες τις δοκιμές, με τον χρόνο έκθεσης να ορίζεται στα 0,0006 s για κάθε εικόνα. Απεικονίστηκε ένα έγχρωμο κανάλι, έτσι ώστε οι εικόνες που παράγονται δείχνουν κύτταρα που εκφράζουν GFP σε λευκό και κελιά που δεν εκφράζουν GFP σε μαύρο (Εικόνα 1-σχήμα συμπλήρωμα 1). Τα φρεάτια φωτογραφήθηκαν σε περιστροφή, όσο το δυνατόν συχνότερα, από την έναρξη Έκφραση GFP μέχρι τη στιγμή που η πλειονότητα των κυττάρων στο φρεάτιο θεωρήθηκε ότι ήταν νεκρά, η έκφραση GFP δεν μπορούσε πλέον να ανιχνευθεί ή ο πρώιμος τερματισμός ήταν επιθυμητός για να επιτραπεί η χρώση Hoechst. Στην περίπτωση των κυττάρων PaKiT01 μολυσμένων με rVSV-EBOV, όπου διαπιστώθηκε μια φαινομενικά επίμονη λοίμωξη, ο προσδιορισμός τερματίστηκε μετά από 200+ ώρες (8+ ημέρες) συνεχούς παρατήρησης. Μετά τον τερματισμό όλων των δοκιμών, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε φορμαλδεΰδη (4% για 15 λεπτά), επωάστηκαν με χρώση Hoechst (0,0005% για 15 λεπτά) (ThermoFisher, Inc, Waltham, MA), και στη συνέχεια απεικονίστηκαν σε 4Χ στο CellInsight CX5 High Content Πλατφόρμα Screening (HCS). Το μηχάνημα επιτράπηκε να βρει τη βέλτιστη εστίαση για κάθε εικόνα λεκέδων Hoechst. Επιτρεπόταν ένα έγχρωμο κανάλι έτσι ώστε οι εικόνες που παράγονται έδειχναν ζωντανούς πυρήνες σε λευκά και νεκρά κύτταρα σε μαύρο. Ο Hoechst χρωματίζει το κυτταρικό DNA και η ιογενής λοίμωξη πιστεύεται ότι παρεμβαίνει στη διαύγεια του λεκέ (Dembowski και DeLuca, 2015). Ως εκ τούτου, ο τερματισμός της μόλυνσης, η στερέωση των κυττάρων και η χρώση Hoechst καθιστούν δυνατή τη δημιουργία μιας πρόχειρης χρονικής σειράς μη μολυσματικών ζωντανών κυττάρων (δηλ. ευαίσθητα + αντιιικά κύτταρα) για να συμπληρώσουν τις εικόνες που παρήγαγαν χρονοσειρές αναλογιών μολυσματικές. Λόγω της αβεβαιότητας σχετικά με την ακριβή επιδημική κατάσταση των κυττάρων που έχουν χρωματιστεί με Hoechst (δηλ. τα εκτεθειμένα αλλά όχι ακόμη μολυσματικά κύτταρα ενδέχεται να εξακολουθούν να χρωματίζονται), επιλέξαμε να προσαρμόσουμε τα μοντέλα μας μόνο στη μολυσματική χρονολογική σειρά που προέρχεται από εικόνες GFPexpressing και χρησιμοποιήσαμε εικόνες χρώσης Hoechst ως post hoc οπτικό έλεγχο μόνο για την εφαρμογή μας (Εικόνα 5. Εικόνα 5 -συμπληρώματα εικόνας 1-2).Οι εικόνες που ανακτήθηκαν από τις παραπάνω χρονοσειρές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε δυαδική μορφή (\"μολυσματικές\" έναντι \"μη μολυσματικές\" ή, για εικόνες χρωματισμένες με Hoechst, \"ζωντανές\" έναντι \"νεκρές\") μορφή χρησιμοποιώντας το πακέτο EBImage (Pau et al., 2010) στην έκδοση R 3.6 για MacIntosh, μετά από μεθόδους που περιγράφονται περαιτέρω στο Συμπληρωματικό αρχείο 7. Οι δυαδικές εικόνες στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε περαιτέρω επεξεργασία σε χρονοσειρές μολυσματικών ή, για εικόνες χρωματισμένες με Hoechst, ζωντανών κυττάρων χρησιμοποιώντας μια σειρά σεναρίων μέτρησης κελιών. Λόγω υλικοτεχνικών περιορισμών (δηλ. πολλές πλάκες δοκιμών λοιμώξεων που εκτελούνται ταυτόχρονα και μόνο ένα διαθέσιμο μικροσκόπιο απεικόνισης), η χρονική πορεία της απεικόνισης σε όλη τη διάρκεια κάθε δοκιμής ήταν αρκετά μεταβλητή. Ως εκ τούτου, προσαρμόσαμε μια σειρά στατιστικών μοντέλων στα επεξεργασμένα δεδομένα εικόνας για να ανακατασκευάσουμε αξιόπιστες τιμές της μολυσματικής αναλογίας κάθε πηγαδιού ανά ώρα για κάθε ξεχωριστή δοκιμή σε όλους τους συνδυασμούς κυτταρικής γραμμής-ιού-MOI (Εικόνα 1 Για να εξαχθεί η έκφραση για R 0, ο βασικός αναπαραγωγικός αριθμός παθογόνων in vitro, χρησιμοποιήσαμε τεχνικές Next Generation Matrix (NGM) (Diekmann et al., 1990; Heffernan et al., 2005), χρησιμοποιώντας το Wolfram Mathematica (έκδοση 11.2) ως αναλυτικό εργαλείο. Το R0 περιγράφει τον αριθμό των νέων λοιμώξεων που δημιουργούνται από μια υπάρχουσα μόλυνση σε έναν πλήρως ευαίσθητο πληθυσμό ξενιστή. ένα παθογόνο θα εισβάλει σε έναν πληθυσμό όταν R 0 >1 (Συμπληρωματικό αρχείο 2). Στη συνέχεια αναλύσαμε τις ιδιότητες σταθερότητας του συστήματος, εξερευνώντας τη δυναμική σε μια σειρά χώρων παραμέτρων, χρησιμοποιώντας MatCont (έκδοση 2.2) (Dhooge et al., 2008) για το Matlab (έκδοση R2018a) (Συμπληρωματικό αρχείο 3). Ο ρυθμός γεννήσεων, β, και το φυσικό ποσοστό θνησιμότητας, m, το υπόλοιπο για να αποφέρει έναν ρυθμό αύξησης σε επίπεδο πληθυσμού, τέτοιος ώστε να είναι αδύνατο να εκτιμηθούν ταυτόχρονα τόσο το b όσο και το m από τα δεδομένα συνολικού μεγέθους πληθυσμού μόνο. Ως εκ τούτου, καθορίσαμε το b στο. 025 και υπολογίστηκε m προσαρμόζοντας μια έκδοση απουσίας μόλυνσης του μοντέλου μας μέσου πεδίου στην ευαίσθητη χρονοσειρά που προέκυψε μέσω της χρώσης Hoechst των φρεατίων ελέγχου για καθεμία από τις τρεις κυτταρικές σειρές (Εικόνα 1-σχήμα συμπλήρωμα 7). Αυτό απέδωσε ένα φυσικό ποσοστό θνησιμότητας, m, που αντιστοιχεί σε διάρκεια ζωής περίπου 121, 191 και 84 ωρών, αντίστοιχα, για τις κυτταρικές σειρές Vero, RoNi/7.1 και PaKiT01 (Εικόνα 1-σχήμα συμπλήρωμα 7) . Στη συνέχεια καθορίσαμε τον ρυθμό επώασης του ιού, s, ως το αντίστροφο της συντομότερης παρατηρούμενης χρονικής διάρκειας από την αρχική μόλυνση έως την παρατήρηση των πρώτων μολυσματικών κυττάρων μέσω μικροσκοπίου φθορισμού και για τους εννέα συνδυασμούς κυτταρικής σειράς-ιού (που κυμαίνεται από 6 έως 9,5 ώρες). Καθορίσαμε το α, το ποσοστό θνησιμότητας που προκαλείται από λοίμωξη, στο 1/6, ένα αποδεκτό πρότυπο για τη γενική ιική κινητική (Howat et al., 2006) και κρατήσαμε το c, το ποσοστό υποχώρησης των αντιικών κυττάρων στην ευπαθή κατάσταση, στο 0 για την χρονικό διάστημα (<200 ώρες) των πειραματικών δοκιμών μόλυνσης κυτταρικής γραμμής. Υπολογίσαμε τις ειδικές τιμές κυτταρικής γραμμής-ιού-MOI για b, r και \"προσαρμόζοντας την ντετερμινιστική έξοδο των μολυσματικών αναλογιών στο μοντέλο μέσου πεδίου μας στην πλήρη σειρά στατιστικά αποτελέσματα όλων των δοκιμών για κάθε χρονοσειρά μολυσμένων κυτταροκαλλιεργειών (Σχήμα 1-σχήμα συμπληρώματα 2-3). Η προσαρμογή πραγματοποιήθηκε ελαχιστοποιώντας το άθροισμα των τετραγωνικών διαφορών μεταξύ της εξόδου του ντετερμινιστικού μοντέλου και της ειδικής μολυσματικής αναλογίας του ιού κυτταρικής γραμμής-MOI των δεδομένων σε κάθε χρονικό βήμα. Βελτιστοποιήσαμε τις παραμέτρους για MOI = 0,001 και 0,0001 ταυτόχρονα για να αξιοποιήσουμε τη στατιστική ισχύ στα δύο σύνολα δεδομένων, εκτιμώντας διαφορετικό ρυθμό μετάδοσης, b, για δοκιμές που εκτελούνται σε κάθε μολυσματική δόση, αλλά, όπου ισχύει, υπολογίζοντας τους ίδιους ρυθμούς r και \" στα δύο χρονική σειρά. Χρησιμοποιήσαμε τον επιλύτη διαφορικής εξίσωσης lsoda() στο πακέτο R deSolve (Soetaert et al., 2010) για να λάβουμε αριθμητικές λύσεις για το μοντέλο μέσου πεδίου και πραγματοποιήσαμε ελαχιστοποίηση χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο «Nelder-Mead» της συνάρτησης optim() στο βάση R. Όλες οι προσαρμογές μοντέλων διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας συνεπείς αρχικές εικασίες για τις παραμέτρους, b (b = 3) και όπου ισχύει, r (r = 0,001) και \" (\" = 0,001). Στην περίπτωση αποτυχημένων προσαρμογών ή ακαθόριστων hessians, δημιουργήσαμε μια σειρά από τυχαίες εικασίες γύρω από τις συνθήκες εκκίνησης και συνεχίσαμε την εκτίμηση μέχρι να επιτευχθούν επιτυχείς προσαρμογές. Και οι δεκαοκτώ συνδυασμοί δεδομένων κυτταρικής γραμμής-ιού-MOI ταιριάστηκαν από ανοσία (\" = r = 0) έκδοση του θεωρητικού μοντέλου και, στη συνέχεια, μια επαγόμενη ανοσία (\" = 0; r >0) και συστατική ανοσία (\" >0; r >0) έκδοση του μοντέλου. Τέλος, συγκρίναμε τις προσαρμογές σε κάθε συνδυασμό κυτταρικής γραμμής-ιού-MOI μέσω AIC. Κατά τον υπολογισμό του AIC, ο αριθμός των προσαρμοσμένων παραμέτρων σε κάθε μοντέλο (k) διέφερε μεταξύ των φαινοτύπων του ανοσοποιητικού, με μία παράμετρο (b) να υπολογίζεται για απουσίες ανοσολογικών υποθέσεων, δύο (b και r) για υποθέσεις επαγόμενης ανοσίας και τρεις (b, r , και \") για συστατικές ανοσιακές παραδοχές. Το μέγεθος του δείγματος (n) αντιστοιχούσε στον αριθμό των διακριτών χρονικών βημάτων σε όλες τις εμπειρικές μολυσματικές δοκιμές στις οποίες προσαρμόστηκε το μοντέλο για κάθε συνδυασμό ιών κυτταρικής γραμμής. Όλα τα σενάρια προσαρμογής και σύγκρισης μοντέλων διατίθενται ελεύθερα για λήψη στο ακόλουθο αποθετήριο FigShare: DOI: 10.6084/m9.figshare.8312807. Τέλος, επαληθεύσαμε ότι όλα τα μέσα πεδία ταιριάζουν σε ένα χωρικό πλαίσιο, προκειμένου να διευκρινιστεί πιο διεξοδικά ο ρόλος των αντιικών κελιά σε κάθε χρονοσειρά. Κατασκευάσαμε το χωρικό μας μοντέλο σε C++ που υλοποιήθηκε στο R χρησιμοποιώντας τα πακέτα Rcpp και RcppArmadillo (Eddelbuettel and Francois, 2011; Eddelbuettel και Sanderson, 2017). Ακολουθώντας τους Nagai and Honda (2001) και Howat et al. (2006), διαμορφώσαμε αυτό το σύστημα σε ένα δισδιάστατο εξαγωνικό πλέγμα, χρησιμοποιώντας ένα χρονικό βήμα επιδημίας δέκα λεπτών για τις μεταβάσεις κατάστασης κυττάρου. Κατά την εκκίνηση κάθε προσομοίωσης, τυχαία εκχωρήσαμε μια διάρκεια φυσικής διάρκειας ζωής, περίοδο επώασης, περίοδο μολυσματικότητας και χρόνο από την κατάσταση κατά του ιού έως την ευαισθησία σε όλα τα κύτταρα σε μια θεωρητική μονοστιβάδα. Οι διάρκειες των παραμέτρων αντλήθηκαν από μια κανονική κατανομή με επίκεντρο το αντίστροφο των αντίστοιχων σταθερών ρυθμών των m, s, a και c, όπως αναφέρθηκε με το μοντέλο μέσου πεδίου μας. Οι μεταβάσεις που περιλαμβάνουν τα επαγόμενα (r) και τα συστατικά (\") ποσοστά απόκτησης αντιικών ρυθμίστηκαν πιθανολογικά και προσαρμόστηκαν δυναμικά σε κάθε χρονικό βήμα με βάση το παγκόσμιο περιβάλλον. Ως εκ τούτου, καθορίσαμε αυτές τις παραμέτρους στις ίδιες τιμές που εκτιμήθηκαν στο μοντέλο μέσου πεδίου και πολλαπλασιάσαμε τόσο το r όσο και το \" με την παγκόσμια αναλογία, αντίστοιχα, εκτεθειμένων και ευαίσθητων κυττάρων σε ένα δεδομένο χρονικό βήμα. Σε αντίθεση με τα ποσοστά απόκτησης αντιιών, οι μεταβάσεις περιλαμβάνουν ο ρυθμός γεννήσεων (β) και ο ρυθμός μετάδοσης (β) συνέβησαν πιθανολογικά με βάση το τοπικό περιβάλλον κάθε κυττάρου. Ο ρυθμός γεννήσεων, b, πολλαπλασιάστηκε με την αναλογία των ευαίσθητων κυττάρων σε μια περιφέρεια έξι γειτόνων ενός εστιακού νεκρού κυττάρου, ενώ το b πολλαπλασιάστηκε με την αναλογία μολυσματικών κυττάρων εντός τριάντα έξι γειτονικών κυττάρων κοντά σε ένα εστιακό ευαίσθητο κύτταρο. επιτρέποντας τη μετάδοση του ιού να επεκταθεί πέρα ​​από τα άμεσα πλησιέστερα γειτονικά όρια ενός μολυσματικού κυττάρου. Για να αντισταθμίσουμε τα υψηλότερα όρια στην κυτταρική εμμονή και την εισβολή του ιού που συμβαίνουν κάτω από τοπικές χωρικές συνθήκες (Webb et al., 2007), αυξήσαμε το ποσοστό γεννήσεων, b και το ποσοστό μετάδοσης από κύτταρο σε κύτταρο, b, αντίστοιχα, σε έξι και δέκα φορές τις τιμές που χρησιμοποιούνται στο μοντέλο μέσου πεδίου (Συμπληρωματικό αρχείο 4) . Εξάγαμε αυτές τις αυξήσεις με βάση την υπόθεση ότι οι γεννήσεις πραγματοποιήθηκαν αποκλειστικά με βάση τις αλληλεπιδράσεις του πλησιέστερου γείτονα κατά ζεύγη (τα έξι άμεσα γειτονικά κύτταρα σε ένα εστιακό νεκρό κύτταρο), ενώ η μετάδοση του ιού ήταν τοπικά συγκεντρωμένη αλλά περιλάμβανε μια μικρή (7,5%) παγκόσμια συνεισφορά. που αντιπροσωπεύει τα τριάντα έξι κύτταρα που περιβάλλουν την περιοχή ενός εστιακού ευαίσθητου. Δικαιολογούμε αυτές τις αυξήσεις και εξάγουμε την προέλευσή τους περαιτέρω στο Συμπληρωματικό αρχείο 5. Προσομοιώσαμε δέκα στοχαστικές χωρικές χρονικές σειρές για όλους τους συνδυασμούς κυττάρου-ιού και με τις τρεις παραδοχές ανοσίας σε μέγεθος πληθυσμού 10.000 κυττάρων και συγκρίναμε την έξοδο του μοντέλου με δεδομένα στο . Διαφανής φόρμα αναφοράς Διαθεσιμότητα δεδομένων Όλα τα δεδομένα που δημιουργήθηκαν ή αναλύθηκαν κατά τη διάρκεια αυτής της μελέτης περιλαμβάνονται στο χειρόγραφο και στα υποστηρικτικά αρχεία. Όλες οι εικόνες και ο κώδικας που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη έχουν γίνει διαθέσιμα για λήψη στο ακόλουθο Figshare", "qas": [ { "answers": [ { "answer_start": 1243, "text": "οι αυξημένες ανοσολογικές αποκρίσεις περιορίζουν την επαγόμενη από παθογόνο κυτταρική νοσηρότητα, η οποία μπορεί να διευκολύνει την εγκαθίδρυση ταχέως πολλαπλασιαζόμενων επίμονων λοιμώξεων εντός του ξενιστή. Οι ταχέως μεταδιδόμενοι ιοί που έχουν εξελιχθεί με τα ανοσοποιητικά συστήματα της νυχτερίδας πιθανότατα θα προκαλέσουν ενισχυμένη λοιμογόνο δύναμη μετά την εμφάνισή τους σε δευτερεύοντες ξενιστές με ανοσοποιητικά συστήματα που αποκλίνουν από αυτά που είναι μοναδικά για τις νυχτερίδες." } ], "id": 2720, "question": "Ποιο είναι το συμπέρασμα αυτής της έκθεσης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3079, "text": "ασυμβατότητες αλληλουχίας υποδοχέα ξενιστή για ορισμένους συνδυασμούς ιού νυχτερίδας (Ng et al., 2015; Takadate et al., 2020) και συστατική έκφραση της αντιϊκής κυτοκίνης" } ], "id": 2723, "question": "Ποια σειρά μηχανισμών για συγκεκριμένο είδος έχουν οι νυχτερίδες για να περιορίσουν το ιικό φορτίο;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3298, "text": "η παρουσία ιικού RNA ή DNA στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων θηλαστικών θα προκαλέσει έκκριση πρωτεϊνών ιντερφερόνης τύπου Ι (IFN-a και IFN-b), οι οποίες προάγουν την έκφραση και τη μετάφραση διεγερμένων από ιντερφερόνη γονιδίων (ISGs) σε γειτονικά κύτταρα" } ], "id": 2724, "question": "Πώς καθίστανται συνήθως αντιιικά τα κύτταρα των θηλαστικών;" }, { "answers": [ { "answer_start": 3958, "text": "οι νυχτερίδες υποστηρίζουν μοναδικές προσαρμογές για την καταπολέμηση της φλεγμονής" } ], "id": 2726, "question": "Τι κάνουν οι νυχτερίδες αντ' αυτού;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5569, "text": "οι νυχτερίδες είναι φυσικές δεξαμενές για ιούς που έχουν μερικά από τα υψηλότερα ποσοστά θνησιμότητας από οποιουσδήποτε ιούς που αποκτούν οι άνθρωποι από άγρια ​​ζώα -συμπεριλαμβανομένης της λύσσας, του Έμπολα και του κορωνοϊού SARS." } ], "id": 2729, "question": "Πώς συνδέονται οι νυχτερίδες με θανατηφόρες ιογενείς ασθένειες;" }, { "answers": [ { "answer_start": 5911, "text": "μερικές νυχτερίδες έχουν μια αντιική ανοσολογική απόκριση που ονομάζεται μονοπάτι ιντερφερόνης μόνιμα ενεργοποιημένη" } ], "id": 2730, "question": "Ποιο είναι ένα παράδειγμα αντι-ιικής άμυνας στις νυχτερίδες;" }, { "answers": [ { "answer_start": 6157, "text": "Οι νυχτερίδες, ωστόσο, έχουν προσαρμοσμένα αντιφλεγμονώδη χαρακτηριστικά που τις προστατεύουν από τέτοια βλάβη, όπως η απώλεια ορισμένων γονιδίων που κανονικά προάγουν τη φλεγμονή." } ], "id": 2732, "question": "Σε τι διαφέρουν οι νυχτερίδες;" }, { "answers": [ { "answer_start": 37853, "text": "Οι ιδιοσυστατικές ανοσολογικές διεργασίες μπορούν επομένως να απαγορεύσουν την εισβολή παθογόνου, ενώ οι επαγόμενες αποκρίσεις, εξ ορισμού, μπορούν να ελέγξουν μόνο εκ των υστέρων λοιμώξεις." } ], "id": 2748, "question": "Ποιο είναι το συμπέρασμα του μοντελισμού;" }, { "answers": [ { "answer_start": 38234, "text": "Ανεξάρτητα από τον μηχανισμό (επαγόμενο ή συστατικό), τα διεγερμένα από ιντερφερόνη αντιιικά κύτταρα φαίνεται να διαδραματίζουν βασικό ρόλο στη διατήρηση μακροπρόθεσμων ή επίμονων λοιμώξεων προστατεύοντας τα ευαίσθητα κύτταρα από ταχεία μόλυνση και ταυτόχρονο κυτταρικό θάνατο" } ], "id": 2749, "question": "Ποιο είναι το συμπέρασμα της μελέτης;" }, { "answers": [ { "answer_start": 42872, "text": "Οι ιοί που αναπτύσσουν ταχείς ρυθμούς αντιγραφής κάτω από αυτές τις ισχυρές αντιικές άμυνες μπορεί να αποτελούν τον μεγαλύτερο κίνδυνο για την εμφάνιση παθογόνων μεταξύ ειδών σε ξενιστές διάχυσης με ανοσοποιητικά συστήματα που διαφέρουν από αυτά που είναι μοναδικά για τις νυχτερίδες" } ], "id": 2753, "question": "Ποιο είναι το συμπέρασμα αυτής της μελέτης;" } ] } ] }