PCR
To make primers of the correct sequence that will bind to the template DNA, it is necessary to know a little bit of the template sequence, on either side of the region of DNA you wish to amplify. DNA polymerase and dNTPs are commercially available from biotechnology supply companies. The template is the DNA that contains the target you want to amplify. The primers are synthetic DNA molecules whose sequence matches a region flanking the target you are trying to amplify. It is possible nowadays, to chemically synthesize DNA molecules of any given base sequence, to use as primers. Primer sequences are determined from known sequence since there must be a match to the region of DNA to be amplified. PCR amplification requires 2 primers that determine the region of sequence amplified in the forward and reverse direction. Likewise, the reverse primer is designed from the complimentary strand. PCR is exponential amplification in which the newly generated PCR fragment from one cycle also acts as a template for the next cycle (Figure 1A). Amplification of DNA for Sanger sequencing differs from PCR in that a single primer is used. Amplification is the reproduction of one strand using the compliment from the original strand The important design considerations described below are a key to specific amplification with high yield. The preferred values indicated are built into all our products by default. 1. Primer Length: It is generally accepted that the optimal length of PCR primers is 18-22 bp. This length is long enough for adequate specificity and short enough for primers to bind easily to the template at the annealing temperature. 2. Primer Melting Temperature: Primer Melting Temperature (T m) by definition is the temperature at which one half of the DNA duplex will dissociate to become single stranded and indicates the duplex stability. Primers with melting temperatures in the range of 52-58 o C generally produce the best results. The PCR process was originally developed to amplify short segments of a longer DNA molecule (Saiki et al. 1985). A typical amplification reaction includes target DNA, a thermostable DNA polymerase, two oligonucleotide primers, deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), reaction buffer and magnesium. If an amplification reaction fails and you suspect the DNA template is contaminated with an inhibitor, add the suspect DNA preparation to a control reaction with a DNA template and primer pair that has amplified well in the past. Since PCR is, basically, replication of DNA in a test-tube, all the usual ingredients needed for DNA replication are required: A template (the DNA that is being copied) Primers (to initiate the synthesis of the new DNA strands) DNA polymerase (to carry out the synthesis) dNTPs (nucleotide precursors). The template is the DNA that contains the target you want to amplify. The primers are synthetic DNA molecules whose sequence matches a region flanking the target you are trying to amplify. It is possible nowadays, to chemically synthesize DNA molecules of any given base sequence, to use as primers. PCR stands for Polymerase Chain Reaction, a method for amplifying DNA in vitro. Where, in cloning DNA into a plasmid, the DNA is amplified by the bacterial cell when it replicates the plasmid, PCR amplifies DNA in a test-tube. The template is the DNA that contains the target you want to amplify. The primers are synthetic DNA molecules whose sequence matches a region flanking the target you are trying to amplify. It is possible nowadays, to chemically synthesize DNA molecules of any given base sequence, to use as primers. The polymerase chain reaction (PCR) is a powerful core molecular biology technique. It is an efficient and rapid in vitro method for enzymatic amplification of specific DNA or RNA sequences from nucleic acids of various sources. A simple PCR reaction consists of a set of synthetic oligonucleotide primers that flank the target DNA sequence, target DNA, a thermostable DNA polymerase and dNTPs.  After completing this exercise, you should be able to: Design PCR primers to amplify given target regions from a DNA template. Identify the direction in which a given primer would be extended by polymerase on a given template. Design a pair of primers to amplify the entire length of the following 45 base pair sequence. Make each primer 14 bases long. Write the sequences of the primers in 5' to 3' order. PCR works by repeated cycles of strand separation, annealing of primers, and extension of the primed strands. Simply put, the target DNA is replicated in vitro, many, many times, to obtain a large amount of the DNA that lies between the two primer regions. To make primers of the correct sequence that will bind to the template DNA, it is necessary to know a little bit of the template sequence, on either side of the region of DNA you wish to amplify.
http://oregonstate.edu/dept/biochem/hhmi/hhmiclasses/bb494/pcrohtwo.html https://agctsequencing.wordpress.com/2012/05/14/primer-selection-guidelines-good-primers-important-for-pcr-and-automated-sequencing/ http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/pcr-amplification/ http://oregonstate.edu/dept/biochem/hhmi/hhmiclasses/bb494/pcrohtwo.html http://oregonstate.edu/dept/biochem/hhmi/hhmiclasses/bb494/pcrohtwo.html http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/pcr/pcr-products.html http://www.cybertory.org/exercises/primerDesign/index.html http://oregonstate.edu/instruct/bb494/pcr.html
what makes a good primer for amplification
प्रवर्धन के लिए एक अच्छा प्राइमर क्या बनाता है
पीसीआर
सही अनुक्रम के प्राइमर बनाने के लिए जो टेम्पलेट डीएनए से बंधेंगे, डीएनए के क्षेत्र के दोनों ओर टेम्पलेट अनुक्रम को थोड़ा जानना आवश्यक है, जिसे आप बढ़ाना चाहते हैं। डीएनए पोलीमरेज़ और डीएनटीपी जैव प्रौद्योगिकी आपूर्ति कंपनियों से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। टेम्प्लेट वह डीएनए है जिसमें वह लक्ष्य होता है जिसे आप बढ़ाना चाहते हैं। प्राइमर सिंथेटिक डीएनए अणु होते हैं जिनका अनुक्रम उस क्षेत्र से मेल खाता है जिसे आप बढ़ाने की कोशिश कर रहे हैं। आजकल किसी भी आधार अनुक्रम के डीएनए अणुओं को रासायनिक रूप से संश्लेषित करना, प्राइमर के रूप में उपयोग करना संभव है। प्राइमर अनुक्रम ज्ञात अनुक्रम से निर्धारित होते हैं क्योंकि प्रवर्धित होने के लिए डीएनए के क्षेत्र में एक मैच होना चाहिए। पीसीआर प्रवर्धन के लिए 2 प्राइमरों की आवश्यकता होती है जो आगे और पीछे की दिशा में प्रवर्धित अनुक्रम के क्षेत्र को निर्धारित करते हैं। इसी तरह, रिवर्स प्राइमर को मानार्थ स्ट्रैंड से डिज़ाइन किया गया है। पीसीआर घातीय प्रवर्धन है जिसमें एक चक्र से नव उत्पन्न पीसीआर टुकड़ा अगले चक्र(चित्रा 1ए)के लिए एक टेम्पलेट के रूप में भी कार्य करता है। सेंगर अनुक्रमण के लिए डीएनए का प्रवर्धन पीसीआर से भिन्न होता है जिसमें एक एकल प्राइमर का उपयोग किया जाता है। प्रवर्धन मूल स्ट्रैंड से तारीफ का उपयोग करके एक स्ट्रैंड का प्रजनन है नीचे वर्णित महत्वपूर्ण डिजाइन विचार उच्च उपज के साथ विशिष्ट प्रवर्धन की कुंजी हैं। बताए गए पसंदीदा मान डिफ़ॉल्ट रूप से हमारे सभी उत्पादों में अंतर्निहित होते हैं। 1. प्राइमर लंबाई: यह आमतौर पर स्वीकार किया जाता है कि पीसीआर प्राइमरों की इष्टतम लंबाई 18-22 बीपी है। यह लंबाई पर्याप्त विशिष्टता के लिए काफी लंबी है और प्राइमरों के लिए एनीलिंग तापमान पर टेम्पलेट को आसानी से बांधने के लिए पर्याप्त है। 2. प्राइमर पिघलने का तापमान: परिभाषा के अनुसार प्राइमर पिघलने का तापमान (T m) वह तापमान है जिस पर डीएनए डुप्लेक्स का आधा हिस्सा एकल असहाय होने के लिए अलग हो जाएगा और द्वैध स्थिरता को इंगित करता है। 52-58 o C की सीमा में पिघलने वाले तापमान वाले प्राइमर आमतौर पर सर्वोत्तम परिणाम देते हैं। पीसीआर प्रक्रिया मूल रूप से एक लंबे डीएनए अणु (सैकी एट अल 1985) के छोटे खंडों को बढ़ाने के लिए विकसित की गई थी। एक विशिष्ट प्रवर्धन प्रतिक्रिया में लक्ष्य डीएनए, एक थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़, दो ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर, डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट (डीएनटीपी), प्रतिक्रिया बफर और मैग्नीशियम शामिल हैं। यदि एक प्रवर्धन प्रतिक्रिया विफल हो जाती है और आपको संदेह है कि डीएनए टेम्पलेट एक अवरोधक से दूषित है, तो डीएनए टेम्पलेट और प्राइमर जोड़ी के साथ नियंत्रण प्रतिक्रिया में संदिग्ध डीएनए तैयारी जोड़ें जो अतीत में अच्छी तरह से प्रवर्धित हुई है। चूंकि पीसीआर, मूल रूप से, एक टेस्ट-ट्यूब में डीएनए की प्रतिकृति है, इसलिए डीएनए प्रतिकृति के लिए आवश्यक सभी सामान्य अवयवों की आवश्यकता होती है: एक टेम्पलेट (डीएनए जिसे कॉपी किया जा रहा है) प्राइमर (नए डीएनए स्ट्रैंड के संश्लेषण को शुरू करने के लिए) डीएनए पोलीमरेज़ (संश्लेषण करने के लिए) डीएनटीपी (न्यूक्लियोटाइड अग्रदूत)। टेम्प्लेट वह डीएनए है जिसमें वह लक्ष्य होता है जिसे आप बढ़ाना चाहते हैं। प्राइमर सिंथेटिक डीएनए अणु होते हैं जिनका अनुक्रम उस क्षेत्र से मेल खाता है जिसे आप बढ़ाने की कोशिश कर रहे हैं। आजकल किसी भी आधार अनुक्रम के डीएनए अणुओं को रासायनिक रूप से संश्लेषित करना, प्राइमर के रूप में उपयोग करना संभव है। पीसीआर पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के लिए खड़ा है, जो इन विट्रो में डीएनए को बढ़ाने के लिए एक विधि है। जहां, डीएनए को प्लास्मिड में क्लोन करने में, डीएनए को बैक्टीरिया कोशिका द्वारा प्रवर्धित किया जाता है जब यह प्लास्मिड की प्रतिकृति बनाता है, पीसीआर एक टेस्ट-ट्यूब में डीएनए को बढ़ाता है। टेम्प्लेट वह डीएनए है जिसमें वह लक्ष्य होता है जिसे आप बढ़ाना चाहते हैं। प्राइमर सिंथेटिक डीएनए अणु होते हैं जिनका अनुक्रम उस क्षेत्र से मेल खाता है जिसे आप बढ़ाने की कोशिश कर रहे हैं। आजकल किसी भी आधार अनुक्रम के डीएनए अणुओं को रासायनिक रूप से संश्लेषित करना, प्राइमर के रूप में उपयोग करना संभव है। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) एक शक्तिशाली कोर आणविक जीव विज्ञान तकनीक है। यह विभिन्न स्रोतों के न्यूक्लिक एसिड से विशिष्ट डीएनए या आरएनए अनुक्रमों के एंजाइमी प्रवर्धन के लिए इन विट्रो विधि में एक कुशल और तेजी से है। एक साधारण पीसीआर प्रतिक्रिया में सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमरों का एक सेट होता है जो लक्ष्य डीएनए अनुक्रम, लक्ष्य डीएनए, एक थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ और डीएनटीपी को फ्लैंक करता है।  इस अभ्यास को पूरा करने के बाद, आपको निम्न में सक्षम होना चाहिए: पीसीआर प्राइमरों को डीएनए टेम्पलेट से दिए गए लक्ष्य क्षेत्रों को बढ़ाने के लिए डिज़ाइन करें। उस दिशा की पहचान कीजिये जिसमें दिए गए प्राइमर को किसी दिए गए टेम्पलेट पर पोलीमरेज़ द्वारा बढ़ाया जाएगा। निम्नलिखित 45 बेस जोड़ी अनुक्रम की पूरी लंबाई को बढ़ाने के लिए प्राइमरों की एक जोड़ी डिज़ाइन करें। प्रत्येक प्राइमर को 14 बेस लंबा बनाएं। प्राइमरों के अनुक्रमों को 5 'से 3' के क्रम में लिखें। पीसीआर स्ट्रैंड पृथक्करण के बार-बार चक्रों, प्राइमरों की एनीलिंग और प्राइमेड स्ट्रैंड्स के विस्तार द्वारा काम करता है। सीधे शब्दों में कहें, लक्ष्य डीएनए को इन विट्रो में दोहराया जाता है, कई, कई बार, डीएनए की एक बड़ी मात्रा प्राप्त करने के लिए जो दो प्राइमर क्षेत्रों के बीच स्थित है। सही अनुक्रम के प्राइमर बनाने के लिए जो टेम्पलेट डीएनए से बंधेंगे, डीएनए के क्षेत्र के दोनों ओर टेम्पलेट अनुक्रम को थोड़ा जानना आवश्यक है, जिसे आप बढ़ाना चाहते हैं।
प्रवर्धनासाठी एक चांगला प्राइमर काय बनवतो
टेम्पलेट डीएनएला बांधणार्या योग्य अनुक्रमाचे प्राइमर तयार करण्यासाठी, आपण वाढवू इच्छित असलेल्या डीएनएच्या प्रदेशाच्या दोन्ही बाजूंना टेम्पलेट अनुक्रमाची थोडीशी माहिती असणे आवश्यक आहे. बायोटेक्नॉलॉजी पुरवठा कंपन्यांकडून डीएनए पॉलिमरेज आणि डीएनटीपी व्यावसायिकरित्या उपलब्ध आहेत. टेम्पलेट हा डीएनए आहे ज्यामध्ये आपण वाढवू इच्छित लक्ष्य असते. प्राइमर सिंथेटिक डीएनए रेणू आहेत ज्यांचा अनुक्रम आपण वाढविण्याचा प्रयत्न करीत असलेल्या लक्ष्याच्या बाजूच्या प्रदेशाशी जुळतो. आजकाल कोणत्याही आधार अनुक्रमातील डीएनए रेणूंचे रासायनिक संश्लेषण करणे, प्राइमर म्हणून वापरणे शक्य आहे. प्रवर्धित होण्यासाठी डीएनएच्या क्षेत्राशी जुळवाजुळव होणे आवश्यक असल्याने ज्ञात अनुक्रमावरून प्राइमर अनुक्रम निश्चित केले जातात. पीसीआर प्रवर्धनासाठी 2 प्राइमर आवश्यक आहेत जे पुढील आणि उलट दिशेने वाढलेल्या अनुक्रमाचे क्षेत्र निर्धारित करतात. त्याचप्रमाणे, रिव्हर्स प्राइमर कॉम्प्लिमेंटरी स्ट्रँडपासून डिझाइन केलेले आहे. पीसीआर एक्सपोनेन्शियल एम्प्लीफिकेशन आहे ज्यामध्ये एका चक्रातून नव्याने तयार होणारा पीसीआर तुकडा पुढील चक्रासाठी टेम्पलेट म्हणून देखील कार्य करतो (आकृती 1 ए). सेंगर सिक्वेंसिंगसाठी डीएनएचे प्रवर्धन पीसीआरपेक्षा वेगळे आहे कारण एकच प्राइमर वापरला जातो. प्रवर्धन म्हणजे मूळ स्ट्रँडमधील कौतुकाचा वापर करून एका स्ट्रँडचे पुनरुत्पादन होय खाली वर्णन केलेले महत्त्वपूर्ण डिझाइन विचार उच्च उत्पादनासह विशिष्ट प्रवर्धनाची गुरुकिल्ली आहेत. सूचित केलेली पसंतीची मूल्ये डिफॉल्टनुसार आमच्या सर्व उत्पादनांमध्ये तयार केली जातात. 1. प्राइमर लांबी: सामान्यत: हे मान्य केले जाते की पीसीआर प्राइमरची इष्टतम लांबी 18-22 बीपी आहे. ही लांबी पुरेशा विशिष्टतेसाठी पुरेशी लांब आहे आणि प्राइमर एनीलिंग तापमानावर टेम्पलेटशी सहजपणे बांधू शकेल इतकी लहान आहे. 2. प्राइमर वितळण्याचे तापमान: व्याख्येनुसार प्राइमर मेल्टिंग टेम्परेचर (टी मीटर) हे असे तापमान आहे ज्यावर डीएनए डुप्लेक्सचा अर्धा भाग विभक्त होऊन एकल होईल आणि डुप्लेक्स स्थिरता दर्शवितो. 52-58 डिग्री सेल्सिअस च्या दरम्यान वितळणारे तापमान असलेले प्राइमर सामान्यत: सर्वोत्तम परिणाम देतात. पीसीआर प्रक्रिया मुळात दीर्घ डीएनए रेणूचे लहान विभाग वाढविण्यासाठी विकसित केली गेली होती (सैकी एट अल. 1985). विशिष्ट प्रवर्धन प्रतिक्रियेमध्ये लक्ष्य डीएनए, एक थर्मोस्टेबल डीएनए पॉलिमरेज, दोन ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर, डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड ट्रायफॉस्फेट्स (डीएनटीपी), प्रतिक्रिया बफर आणि मॅग्नेशियम यांचा समावेश आहे. जर प्रवर्धन प्रतिक्रिया अयशस्वी झाली आणि आपल्याला डीएनए टेम्पलेट इनहिबिटरने दूषित झाल्याचा संशय आला असेल तर संशयित डीएनए तयारी डीएनए टेम्पलेट आणि प्राइमर जोडीसह नियंत्रण प्रतिक्रियेत जोडा जी पूर्वी चांगली वाढली आहे. पीसीआर ही मुळात टेस्ट-ट्यूबमधील डीएनएची प्रतिकृती असल्याने, डीएनए प्रतिकृतीसाठी आवश्यक असलेले सर्व सामान्य घटक आवश्यक आहेत: एक टेम्पलेट (कॉपी केला जाणारा डीएनए) प्राइमर (नवीन डीएनए स्ट्रँड्सचे संश्लेषण सुरू करण्यासाठी) डीएनए पॉलिमरेज (संश्लेषण करण्यासाठी) डीएनटीपी (न्यूक्लियोटाइड अग्रदूत). टेम्पलेट हा डीएनए आहे ज्यामध्ये आपण वाढवू इच्छित लक्ष्य असते. प्राइमर सिंथेटिक डीएनए रेणू आहेत ज्यांचा अनुक्रम आपण वाढविण्याचा प्रयत्न करीत असलेल्या लक्ष्याच्या बाजूच्या प्रदेशाशी जुळतो. आजकाल कोणत्याही आधार अनुक्रमातील डीएनए रेणूंचे रासायनिक संश्लेषण करणे, प्राइमर म्हणून वापरणे शक्य आहे. पीसीआर म्हणजे पॉलिमरेज चेन रिअॅक्शन, विट्रोमध्ये डीएनए वाढविण्याची एक पद्धत. जेथे, डीएनएला प्लास्मिडमध्ये क्लोन करताना, प्लास्मिडची प्रतिकृती बनविताना बॅक्टेरियाच्या पेशीद्वारे डीएनए वाढविला जातो, पीसीआर चाचणी-ट्यूबमध्ये डीएनए वाढवते. टेम्पलेट हा डीएनए आहे ज्यामध्ये आपण वाढवू इच्छित लक्ष्य असते. प्राइमर सिंथेटिक डीएनए रेणू आहेत ज्यांचा अनुक्रम आपण वाढविण्याचा प्रयत्न करीत असलेल्या लक्ष्याच्या बाजूच्या प्रदेशाशी जुळतो. आजकाल कोणत्याही आधार अनुक्रमातील डीएनए रेणूंचे रासायनिक संश्लेषण करणे, प्राइमर म्हणून वापरणे शक्य आहे. पॉलिमरेज चेन रिअॅक्शन (पीसीआर) हे एक शक्तिशाली कोर मॉलिक्युलर बायोलॉजी तंत्र आहे. विविध स्त्रोतांच्या न्यूक्लिक आम्लांपासून विशिष्ट डीएनए किंवा आरएनए अनुक्रमांच्या एंजाइमेटिक प्रवर्धनासाठी ही एक कार्यक्षम आणि जलद इन विट्रो पद्धत आहे. साध्या पीसीआर प्रतिक्रियेमध्ये सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमरचा एक संच असतो जो लक्ष्य डीएनए अनुक्रम, लक्ष्य डीएनए, थर्मोस्टेबल डीएनए पॉलिमरेज आणि डीएनटीपीला घेरतो.  हा व्यायाम पूर्ण केल्यानंतर, आपण हे करण्यास सक्षम असावे: डीएनए टेम्पलेटमधून दिलेल्या लक्ष्य क्षेत्रांना वाढविण्यासाठी पीसीआर प्राइमर डिझाइन करा. दिलेल्या टेम्पलेटवर पॉलिमरेझद्वारे दिलेल्या प्राइमरचा विस्तार कोणत्या दिशेने केला जाईल हे ओळखा. खालील 45 बेस जोडी अनुक्रमाची संपूर्ण लांबी वाढविण्यासाठी प्राइमरची एक जोडी डिझाइन करा. प्रत्येक प्राईमर 14 बेस लांब करा. प्राईमर्सचे अनुक्रम ५' ते ३' क्रमाने लिहा. पीसीआर स्ट्रॅंड पृथक्करण, प्राइमरचे अॅनिलिंग आणि प्राइमेड स्ट्रँड्सच्या विस्ताराच्या वारंवार चक्रांद्वारे कार्य करते. सोप्या भाषेत सांगायचे तर, लक्ष्य ित डीएनएची विट्रोमध्ये पुनरावृत्ती केली जाते, बर्याच वेळा, दोन प्राइमर प्रदेशांमध्ये असलेल्या डीएनएची मोठ्या प्रमाणात प्राप्ती करण्यासाठी. टेम्पलेट डीएनएला बांधणार्या योग्य अनुक्रमाचे प्राइमर तयार करण्यासाठी, आपण वाढवू इच्छित असलेल्या डीएनएच्या प्रदेशाच्या दोन्ही बाजूंना टेम्पलेट अनुक्रमाची थोडीशी माहिती असणे आवश्यक आहे.
पीसीआर