Рекомбінантна ДНК (рДНК) - штучно створені молекули ДНК за допомогою методів генетичної рекомбінації, які поєднують генетичний матеріал різного походження - фрагмент ДНК, який потрібно клонувати, та кільцеву молекулу ДНК. На відміну від природньої рекомбінації генетичного матеріалу, рДНК створюється за допомогою низки лабораторних методів.

Клонування послідовностей полягає у збільшенні їхньої кількості за посередництва бактерій (клітина-господар) чи інших клітин, у яких вектор може ампліфікуватися. У клітині-господарі утворюються ідентичні копії вектора зі вставленим у нього геном. Під час поділу клітин рекомбінантні молекули ДНК передаються до нащадків цієї клітини. З часом утворюються колонії бактерій, які містять ідентичних клонів вихідної клітини, кожен з яких має одну або більшу кількість копій рДНК. Тобто ген у складі молекули рДНК є клонованим. В результаті експресії рДНК, синтезуються рекомбінантні білки, проте утворення білка необов'язкове.

Поєднання молекул ДНК з різних організмів можливе через їх однакову хімічну природу, хоча такі молекули різняться за нуклеотидними послідовностями, через що рДНК також називають химерною, подібно до міфічної істоти .

Перші молекули рДНК були створені у 1973 році Полом Бергом, Гербертом Боєром, Енні Чанг і Стенлі Коеном зі Стенфордського університету та Каліфорнійського університету в Сан-Франциско. У1975 році на "The Asilomar Conference” обговорювалося регулювання та безпечне використання технології рДНК, доцільність використання цієї технології. Однак з середини 80-х років минулого століття поступово зростає кількість продуктів, створених за допомогою рДНК .

Інструменти та етапи створення рекомбінантної ДНК
Для утворення рДНК потрібні ферменти - ендонуклеази рестрикції, лігази.

Ендонуклеази - це ферменти, які розщеплюють молекулу ДНК у специфічних послідовностях або поблизу них, котрі складаються з чотирьох-восьми пар основ. Ендонуклеази у організмах бактерій є природним явищем (для захисту від проникнення чужинної ДНК, наприклад вірусу), яке використовують у лабораторній техніці . Багато нуклеаз непридатні для використання у біотехнології, оскільки розщеплюють молекули ДНК випадковим чином, як результат – утворюється набір фрагментів різного розміру. Тому послуговуються ферментами, які зв’язуються з відомими сайтами на ДНК, бажано щоб вони були унікальними, що сприятиме утворенню меншої кількості фрагментів .

Багато рестрикційних ендонуклеаз роблять простий дволанцюговий розріз в середині послідовності розпізнавання, що призводить до утворення тупого кінця або липкого (когезивного), який містить короткі одноланцюгові виступи на кожному кінці молекули. У останньому випадку за рахунок комплементарності, кінці розрізаної молекули ДНК можуть об'єднуватись між собою. Ендонуклеази рестрикції з різними послідовностями розпізнавання можуть утворювати однакові липкі кінці. Наприклад, BamHI (послідовність розпізнавання GGATCC) і BglII (AGATCT) створюють липкі кінці GATC . 

Результат дії рестриктаз на молекули ДНК можна перевірити, провівши електрофорез у агарозному гелі. Для визначення розміру фрагментів використовують маркер мас.

Лігазами для генетичної інженерії послуговуються, щоб відновити розриви, які виникли в одному з ланцюгів дволанцюгової молекули та з'єднати разом окремі молекули ДНК або кінці однієї молекули шляхом створення двох фосфодиефірних зв'язків (по одному на кожен ланцюг) .

Етапи створення рДНК
1. Відбір цільової послідовності, плазміди, ферментів.

2. Розщеплення відібраної молекули ДНК та плазміди ендонуклеазами рестрикції.

3. Лігування фрагменту ДНК та плазміди ДНК-лігазами, як наслідок утворюється векторна молекула. Крім послідовності інтересу вектор має містити гени, які б забезпечували відбір клітин, які містять вектор зі вставленою цільовою послідовністю.

4. Введення вектора у бактеріальну клітину, в якій відбуватиметься ампліфікація послідовності у складі вектора сумісно з поділами клітин.

5. Відбір мікроорганізмів з рекомбінантними вектором з геном інтересу .

Експресія ДНК
У бактеріях чи інших організмах, в яких відбувалася ампліфікація вектора з послідовністю інтересу, експерсія рДНК може відбуватися або ні. У випадку експресії можна отримувати транскрипти з цієї послідовності та рекомбінантні білки. До складу плазмід експерсії входять реплікони, промотори, селективні маркери, множинні сайти клонування, послідовності видалення злитого (рекомбінантного білка). Реплікон складається з одного сайту початку реплікації та пов’язаних з ним cis-діючих елементів. Слід підбирати копійність плазміди, оскільки збільшення кількості плазмід сприятиме зростанню концентрації білка в клітині, що може викликати метаболічне навантаження, яке зменшуватиме швидкість росту бактерій, збільшуватиме нестабільність плазмід. Найбільш поширеними промоторами є lac промотор, промотор фагу Т7. Промотори підбирають залежно від сили та його регулювання. Селективними маркерами є переважно гени антибіотиків (ампіциліну, канаміцину, тетрацикліну та ін.), які використовують для відбору трансформованих клітин. Крім того, додають послідовності, які забезпечували б: 

1) виявлення гена за його експресією з подальшим очищенням; 

2) досягненням розчинності; 

3) очищення від компонентів клітини-господаря та культурального середовища. 

Ці три пункти можна забезпечити шляхом наявності амінокислотної послідовності (пептидної мітки) або великого поліпептиду (партнера злиття) у тандемі з білком-інтересу, у такому випадку утворюється химерний білок . Можуть додаватися послідовності, які спрямовуватимуть білок у певне місце (клітинний компартмент або позаклітинне середовище), сприятимуть (для уникнення деградації ферментними системами клітини-господаря) .

Відбір організмів, які містять рекомбінантну ДНК
Переважно організми, які містять рДНК мають нормальний фенотип, тобто їх морфологія, метаболізм не змінилися, порівняно з організмами без такої ДНК. Щоб визначити наявність рекомбінантних послідовностей зазвичай використовують метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Якщо ген інтересу експресується у складі вектору, то можна виявити РНК та/або білки за допомогою реакції зворотньої транскрипції (Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) або шляхом вестерн-гібридизації . У деяких випадках можуть спостерігатися значні зміни фенотипу, що не є нормою. Однак якщо обраний ген, продукт якого здатний генерувати біологічну активність в організмі господаря, то це можлива ситуація. Прикладами є токсичність рекомбінантного білка для організму господаря, особливо якщо він надмірно експресується або експресується в невідповідних клітинах або тканинах у випадку багатоклітинних організмів-господарів.

У деяких випадках рекомбінантна ДНК може мати шкідливий вплив, навіть якщо вона не експресується. Одним із механізмів, за допомогою якого це відбувається, є інсерційна інактивація, за якої рДНК вставляється в ген клітини-господаря. У деяких випадках дослідники використовують це явище, щоб "нокаутувати" гени ("knock out") та визначити їхню біологічну функцію. Інший механізм, за допомогою якого вставка рДНК у хромосому може впливати на експресію генів – активація раніше мовчазних генів клітини-господаря. Це може статися, наприклад, коли фрагмент рДНК з активним промотором розташовується поруч із раніше неактивним геном клітини-господаря, або коли хазяйський ген, функціональність якого пригнічує експресію іншого гена, піддається інсерційній інактивації рекомбінантною ДНК.

Застосування технології рекомбінантної ДНК
рДНК широко використовується у дослідженнях, біотехнології та медицині, ветеринарії, сільському господарстві, біоінженерії, для отримання комерційних продуктів для людини та тварин, отримання самих тварин. Наприклад, GloFish є зарестрованим торговим брендом, який продає генетично модифікованих акваріумних рибок, які здатні до флуоресценції . Рекомбінантна ДНК використовується для ідентифікації, картування та секвенування генів, а також для визначення їхньої функції. рДНК використовують як зонди для вивчення експресії генів в окремих клітинах, тканинах цілих організмів. Рекомбінантні білки широко використовуються у експериментах, для створення антитіл, які слугуватимуть зондами у дослідженнях синтезу білка в клітинах і організмах .


Рекомбінантний білок

Характеристика


Хімозин



- потрібен  для виробництва сирів;

- перший  генетично модифікований білок, який використовують у комерційних цілях;

- у біотехнологічному виробництві для продукування хімозину  використовують непатогенний штам К-21 E. coli. Синтезований  рекомбінантний білок структурно подібний природному ферменту. Такий спосіб  дозволяє здешевити виробництво та отримувати у значно більших кількостях  білок;

- близько 60% твердого сиру в США виготовляють з використанням  генно-інженерного хімозину;

- у 1990 році FDA присвоїло хімозину статус «визнаного загалом  безпечним» (GRAS) на основі даних, які показують, що фермент безпечний .


Інсулін людини



- використовують для лікування інсулінозалежного діабету;

- рекомбінантний -  синтезують шляхом введення гена людського інсуліну в E. coli або дріжджі (Saccharomyces  cerevisiae) .


Гормон росту людини (соматотропін)



- до створення технології рекомбінантного білка, гормон отримували з  гіпофізів трупів, що провокувало у пацієнтів розвиток хвороби  Кройтцфельда-Якоба;

- препарат використовують у терапевтичних цілях, однак, можливе  зловживання .


Фактор згортання крові VIII

;

- традиційна техніка вироблення – використання людської крові від донорів. Недолік такого підходу  – ризик передачі інфекційних захворювань, які передаються через кров (ВІЛ,  гепатит В).   DrugBank entry.


Вакцина проти гепатиту В



- розробка рекомбінантної субодиничної вакцини є важливою, оскільки  вірус не можна культивувати in vitro. .


Діагностика ВІЛ-інфекції

1. Тест на антитіла (ELISA або вестерн-блот) – використовується  рекомбінантний білок ВІЛ для визначення наявності антитіл, які організм  виробляє у відповідь на ВІЛ-інфекцію.

2. ДНК-тест – послуговуються  полімеразною ланцюговою реакцією зі зворотньою  транскрипцією. Розробка такого тесту стала можливою завдяки аналізу  послідовностей геномів ВІЛ та молекулярне клонування.

Сторінка тестування на ВІЛ від Центру контролю захворювань США (CDC) .


Золотий рис



- перспективний через можливе зменшення випадків дефіциту вітаміну А  у світі;

- наразі не використовується через вирішення питань регулювання інтелектуальної  власності .


Стійкі до гербіцидів культури

 - розроблено комерційні сорти важливих сільськогосподарських культур  (сої, кукурудзи, сорго, ріпаку, люцерни та бавовнику) з рекомбінантним геном,  який забезпечує стійкість до гербіциду гліфосату (торгова назва Раундап), які  використовуються у комерційних цілях;

- спрощення боротьби з бур’янами за допомогою гліфосату .


Культури, стійкі до комах

Bacillus thuringeiensis, які виробляють (Bt-токсин) з  інсектицидними властивостями ;

- така технологія широко використовується у сільському господарстві  та садівництві;

- проблеми з впливом (чи його відсутністю) на навколишнє середовище  остаточно не вирішені .


