I senesi aprirono le porte della città ad un esercito franco-senese, che assediò gli spagnoli nella fortezza fino alla loro cacciata dopo una mediazione dei Medici.
Nel febbraio 1553 gli spagnoli ripresero le ostilità al comando di García Álvarez de Toledo y Osorio, Viceré di Napoli, che dovette ritirarsi a causa dell'invasione degli Ottomani, alleati di senesi e francesi.
L'anno successivo Carlo V offrì il comando a Cosimo de' Medici, fornendogli un possente esercito formato da vari contingenti imperiali di spagnoli, tedeschi ed ungheresi, con il quale il comandante Gian Giacomo Medici di Marignano assediò Siena e saccheggiò il contado.
I senesi, comandati da Piero Strozzi e Biagio di Monluc, resistettero a lungo riuscendo anche ad infliggere dure sconfitte alla coalizione imperiale, come l'annientamento dell'esercito di Ridolfo Baglioni nella Battaglia di Chiusi, le scorrerie nel viareggino e l'invasione del Val d'Arno, ma alla fine vennero sopraffatti dalla preponderante superiorità numerica avversaria per cedere nella Battaglia di Scannagallo .