La biotina svolge il ruolo di cofattore di diverse carbossilasi ATP-dipendenti.
Essa è legata al sito attivo dell'enzima tramite un legame peptidico che si forma tra il gruppo carbossilico dell'acido valerianico ed un gruppo aminico di un residuo di lisina.
La reazione di carbossilazione, in cui interviene la biotina, prevede il trasferimento di una molecola di CO2 da un donatore ad un accettore, passando per un intermedio in cui la vitamina fissa la CO2 su uno degli atomi di azoto dell'anello imidazolico, formando così la carbossibiotina.
La formazione della carbossibiotina avviene tramite l'ausilio di bicarbonato, ioni magnesio ed ATP.