Terminal amine isotopic labeling of substrates
டெர்மினல் அமீன் ஐசோடோபிக் லேபிளிங் ஆஃப் சப்ஸ்ட்ரேட்ஸ் (டி. ஏ. ஐ. எல். எஸ்) என்பது அளவு புரோட்டியோமிக்ஸில் ஒரு முறையாகும், இது ஒவ்வொரு புரதத்தின் (என்-டெர்மினல் பெப்டைடுகள்) என்-டெர்மினல் துண்டுகளின் அடிப்படையில் மாதிரிகளின் புரத உள்ளடக்கத்தை அடையாளம் கண்டு, மாதிரிகளுக்கிடையே புரத மிகுதியில் உள்ள வேறுபாடுகளைக் கண்டறிகிறது. என்-முனைய பெப்டைடுகளை அடிப்படையாகக் கொண்ட பிற முறைகளைப் போலவே, இந்த மதிப்பீடும் புரதங்களை துண்டுகளாக உடைக்க டிரிப்சினைப் பயன்படுத்துகிறது மற்றும் என்-முனைய பெப்டைடுகளை (அசல் புரதங்களின் என்-முனையைக் கொண்ட துண்டுகள்) மற்ற துண்டுகளிலிருந்து (உள் டிரிப்டிக் பெப்டைடுகள்) பிரிக்கிறது. TALS உள் டிரிப்டிக் பெப்டைடுகளை அடையாளம் கண்டு அகற்றுவதன் மூலம் N-முனைய பெப்டைடுகளை தனிமைப்படுத்துகிறது. இந்த எதிர்மறை தேர்வு கொடுக்கப்பட்ட மாதிரிகளில் உள்ள அனைத்து N-முனைகளையும் கண்டறிய TALS முறையை அனுமதிக்கிறது. N-முனைய பெப்டைடுகளை அடையாளம் காண N-முனையத்தின் இலவச அமினோ குழுவை நம்பியிருக்கும் மாற்று முறைகள் சில N-முனைகளைக் கண்டறிய முடியாது, ஏனெனில் அவை "இயற்கையாகவே தடுக்கப்பட்டுள்ளன" (அதாவது. இயற்கையான புரதத்திற்கு இலவச அமினோ குழு இல்லை). புதிய அடி மூலக்கூறுகள் மற்றும் புரோட்டியேஸ்களை அடையாளம் காண்பது (அறியப்படாத மற்றும் பரந்த தனித்துவத்தைக் கொண்டவை உட்பட) மற்றும் புரதக் குறிப்பை செயல்படுத்தும் புரதங்களின் முனையை வரையறுக்கும் ஒரு வழியாக டைல்ஸ் முறை பல பயன்பாடுகளைக் கொண்டுள்ளது. நோய் நிலையில் உள்ள அடி மூலக்கூறுகள் மற்றும் புரோட்டியேஸ்களைப் பற்றிய தெளிவான புரிதலைப் பெறுவதற்காக, புற்றுநோய் போன்ற நோய்களில் பல்வேறு வரையறுக்கப்பட்ட உயிரியல் பாதைகளுடன் புரோட்டியேஸ்களை இணைக்கவும் டேல்ஸ் பயன்படுத்தப்படலாம். முறை TALS என்பது பிரிட்டிஷ் கொலம்பியா பல்கலைக்கழகத்தில் ஒரு குழுவால் உருவாக்கப்பட்ட N-முனைய பெப்டைடுகளின் லேபிளிங் மற்றும் தனிமைப்படுத்தலுக்கான 2D அல்லது 3D புரோட்டியோமிக்ஸ் அடிப்படையிலான மதிப்பீடாகும். பல புரோட்டீஸ் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட செல்களை ஒப்பிடுவதற்கும் புரோட்டியோம் செல்களைக் கட்டுப்படுத்துவதற்கும் டேல்ஸ் முறை வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளது. திசு, ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள், புற்றுநோய் செல்கள் மற்றும் திரவ வெளியேற்றங்கள் உள்ளிட்ட பல்வேறு மூலங்களிலிருந்து மாதிரிகள் பெறப்படலாம். இந்த மதிப்பீடு அல்ட்ராஃபில்ட்ரேஷன் மூலம் உள் டிரிப்டிக் பெப்டைடுகளை அகற்றுவதன் மூலம் என்-டெர்மினல் பெப்டைடுகளை தனிமைப்படுத்துகிறது, இது பெயரிடப்பட்ட முதிர்ந்த என்-டெர்மினல் மற்றும் நியோ-என்-டெர்மினல் பெப்டைடுகளை டாண்டம் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (எம்எஸ்/எம்எஸ்) மூலம் பகுப்பாய்வு செய்ய விடுகிறது. இந்த எதிர்மறை தேர்வு கொடுக்கப்பட்ட மாதிரிகளில் உள்ள அனைத்து N-முனைகளையும் கண்டறிய TALS முறையை அனுமதிக்கிறது. N-முனைய பெப்டைடுகளை தனிமைப்படுத்த N-முனையத்தின் இலவச அமினோ குழுவை நம்பியிருக்கும் மாற்று முறைகள் இயற்கையாகவே தடுக்கப்பட்ட N-முனையத்தைக் கண்டறிய முடியாது, ஏனெனில் அவை ஒரு இலவச அமினோ குழுவைக் கொண்டிருக்கவில்லை. TALS க்கு பரிசோதனைக்கு பெப்டைட்டின் சிறிய மாதிரி மட்டுமே தேவைப்படுகிறது (100-300 ug), அறியப்படாத அல்லது பரந்த தனித்துவத்தைக் கொண்ட புரோட்டியேஸ்களுடன் பயன்படுத்தப்படலாம் மற்றும் மாதிரி லேபிளிங்கிற்கான பல்வேறு முறைகளை ஆதரிக்கிறது. இருப்பினும், இது ~ 50 சதவீத புரதங்களை இரண்டு அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட வெவ்வேறு மற்றும் தனித்துவமான பெப்டைடுகளால் (அசல் முதிர்ந்த என்-முனையங்களில் ஒன்று மற்றும்/அல்லது பிளவு தளத்தின் வழியாக ஒன்று அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட நியோ-என்-முனைய பெப்டைட்) அடையாளம் காட்டுகிறது, அவை சுயாதீனமான உயிரியல் நிகழ்வுகளைக் குறிக்கவில்லை, எனவே அளவீட்டிற்கு சராசரியாக இருக்க முடியாது. ஒற்றை பெப்டைட்-பேஸ் என்-டெர்மினோம் பகுப்பாய்விற்கான முடிவுகளை சரிபார்ப்பதிலும் இது சிரமம் உள்ளது. டைமெத்திலேஷன்-டெயில்ஸ் மதிப்பீட்டிற்கான பின்வரும் படிகள், ஒரு கட்டுப்பாட்டு மாதிரி (சாதாரண புரோட்டியோலிடிக் செயல்பாட்டை வெளிப்படுத்துகிறது) மற்றும் ஒரு சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மாதிரி (இந்த எடுத்துக்காட்டில் கூடுதல் புரோட்டியோலிடிக் செயல்பாட்டை வெளிப்படுத்துகிறது) ஆகியவற்றை ஒப்பிடுகின்றன. சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மாதிரியில் கூடுதல் புரோட்டியோலிடிக் செயல்பாட்டுடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மற்றும் கட்டுப்பாட்டு மாதிரிகள் இரண்டிலும் புரோட்டியோம்-வைட் புரோட்டியோலிசிஸ் ஏற்படுகிறது. புரோட்டியேஸ்களை செயலிழக்கச் செய்தல் மற்றும் புரதத்தின் சிதைவு மற்றும் குறைப்பு. நிலையான ஐசோடோப்புகளுடன் பெயரிடுதல். இது கட்டுப்பாட்டு மாதிரியில் தோன்றிய பெப்டைடுகளை சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மாதிரியில் தோன்றியவற்றிலிருந்து வேறுபடுத்த அனுமதிக்கிறது, எனவே அவற்றின் ஒப்பீட்டு மிகுதியை ஒப்பிடலாம். இந்த எடுத்துக்காட்டில், சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மாதிரிகளுக்கு கனமான அல்லது கட்டுப்பாடுகளுக்கு ஒளியைப் பயன்படுத்தி முதன்மை அமீன்களின் குறைப்பு டைமெத்திலேஷன் மூலம் லேபிளிங் பயன்படுத்தப்படுகிறது. இந்த எதிர்வினை சோடியம் சயனோபோரோஹைட்ரைடு மூலம் ஊக்குவிக்கப்படுகிறது மற்றும் பெயரிடப்பட்ட மெத்தில் குழுக்களை லைசின்-அமின்கள் மற்றும் புரதங்கள் மற்றும் புரோட்டீஸ் பிளவு தயாரிப்புகளின் என்-முனையில் உள்ள ஃப்ரீ (ஜி. ஏ)-அமினோ குழுக்களுடன் இணைக்கிறது. எதிர்வினை அமினோ குழுக்களைத் தடுப்பது. இது உள் டிரிப்டிக் பெப்டைடுகளை பின்னர் செயல்பாட்டில் அடையாளம் காண அனுமதிக்கிறது, ஏனெனில் அவை மட்டுமே எதிர்வினை அமினோ குழுக்களுடன் கூடிய பெப்டைட்களாக இருக்கும். இந்த எடுத்துக்காட்டில் பெயரிடுதல் எதிர்வினை (குறைப்பு டைமெத்திலேஷன்) எதிர்வினை அமினோ குழுக்களையும் தடுக்கிறது. பூலிங். பெயரிடப்பட்ட இரண்டு புரோட்டியோம்களும் இப்போது கலக்கப்பட்டுள்ளன. இரண்டு மாதிரிகளிலும் உள்ள புரதங்களின் ஒப்பீட்டு அளவை இன்னும் துல்லியமாக அளவிட அனுமதிக்கும் அனைத்து அடுத்தடுத்த படிகளிலும் மாதிரிகள் ஒரே மாதிரியாக நடத்தப்படுவதை இது உறுதி செய்கிறது. டிரிப்ஸினைசேஷன். இது ஒவ்வொரு புரதத்தையும் துண்டுகளாக உடைக்கிறது. அசல் புரதங்களின் பெயரிடப்பட்ட N-முனையம் தடுக்கப்பட்டுள்ளது, அதே நேரத்தில் புதிய உள் டிரிப்டிக் பெப்டைடுகள் ஒரு இலவச N-முனையத்தைக் கொண்டுள்ளன. எதிர்மறை தேர்வு. டிரிப்டிக் பெப்டைட் பிணைப்புக்கான குறிப்பிட்ட ஹைப்பர் ப்ராஞ்ச்டு பாலிக்ளிசரால் மற்றும் ஆல்டிஹைட் (எச். பி. ஜி) பாலிமர் மாதிரியில் சேர்க்கப்பட்டு, புதிதாக உருவாக்கப்பட்ட டிரிப்டிக் பெப்டைடுகளுடன் அவற்றின் இலவச என்-டெர்மினி மூலம் வினைபுரிகிறது. மேலே உள்ள படி 3 ஐப் போலவே, இந்த எதிர்வினை சோடியம் சயனோபோரோஹைட்ரைடு மூலம் வினையூக்கப்படுகிறது. டைமெத்திலேட்டட் லைசினின் அசிட்டிலேட்டட் மற்றும் ஐசோடோபிக் பெயரிடப்பட்ட புரத பெப்டைடுகள் மற்றும் நியோ (புதிய)-என்-டெர்மினல் பெப்டைடுகள் செயல்படுவதில்லை மற்றும் வரம்பற்றவை மற்றும் அல்ட்ராஃபில்ட்ரேஷனைப் பயன்படுத்தி பாலி-இன்டெர்னல் டிரிப்டிக் பெப்டைட் வளாகங்களிலிருந்து பிரிக்கப்படலாம். விலக்கப்பட்ட வரம்பற்ற புரதங்கள் என்-முனைய பெப்டைடுகள் மற்றும் நியோ-என்-முனைய பெப்டைடுகளுடன் அதிக அளவில் குவிந்துள்ளன. இந்த உட்செலுத்தப்பட்ட மாதிரி பின்னர் அளவிடப்பட்டு பகுப்பாய்வு MS/MS ஆல் முடிக்கப்படுகிறது. TALS இன் இறுதி கட்டம் உயிர் தகவலியல் உள்ளடக்கியது. ஒரு பெப்டைட் ஐசோடோப்பு அளவீடு மற்றும் சில உயிர் தகவலியல் தேடல் அளவுகோல்களால் பின்னணி புரோட்டியோலிசிஸ் தயாரிப்புகள் மற்றும் அகற்றப்படாத புரதங்களிலிருந்து வேறுபடும் ஒரு படிநிலை அடி மூலக்கூறு வின்னோவிங் செயல்முறையைப் பயன்படுத்துதல். புரதங்கள் மற்றும் புரோட்டீஸ் பிளவு தயாரிப்புகளின் அமினோ குழுக்களைத் தடுக்கவும் பெயரிடவும் பயன்படுத்தப்படும் முறைகளில் டேல்ஸின் வகைகள் வேறுபடுகின்றன. இந்த அமினோ குழுக்களில் லைசின்-அமின்கள் மற்றும் புரதங்களின் N-முனையத்தின் இலவச (காஂ)-அமினோ குழுக்கள் அடங்கும். டைமெத்திலேஷன்-டெயில்ஸ் செயல்முறை என்பது ஒரு இரசாயன லேபிளிங் அடிப்படையிலான செயல்முறையாகும், இது அமீன்-எதிர்வினை ஐசோடோபிக் உலைகளைப் பயன்படுத்தி ஒரு கட்டத்தில் செய்யப்படுகிறது. இரண்டு மாதிரிகளின் லேபிளிங் 12CH2-ஃபார்மால்டிஹைடு (ஒளி) அல்லது 13CD2-ஃபார்மால்டிஹைடு (கனமானது) ஐப் பயன்படுத்துகிறது மற்றும் சோடியம் சயனோபோரோஹைட்ரைடை வினையூக்கியாகப் பயன்படுத்துகிறது. இந்த முறையின் நன்மை என்னவென்றால், இது வலுவானது, திறமையானது மற்றும் செலவு குறைந்ததாகும். கட்டுப்பாடுகள் மற்றும் புரோட்டீஸ் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட மாதிரிகளுக்கான லேபிளிங் செயல்முறை அவை சேகரிக்கப்படுவதற்கு முன்பு தனித்தனியாக மேற்கொள்ளப்பட வேண்டும், மேலும் இது ஒரு பரிசோதனைக்கு இரண்டு மாதிரிகளுக்கு மட்டுப்படுத்தப்பட்டுள்ளது, இது ஒரே நேரத்தில் பல மாதிரிகளை ஆய்வு செய்ய வேண்டியிருந்தால் ஒரு பாதகமாக இருக்கலாம். செல் கலாச்சாரத்தில் அமினோ அமிலங்களுடன் நிலையான ஐசோடோப்பு லேபிளிங் (எஸ். ஐ. எல். ஏ. சி) என்பது விவோவில் செய்யக்கூடிய ஒரு செயல்முறையாகும். இந்த செயல்முறை அனைத்து செல் கலாச்சார ஆய்வகங்களிலும் பயன்படுத்தப்படலாம் மற்றும் வழக்கமாக பயன்படுத்தப்படும் லேபிளிங் நுட்பமாகும். இந்த வளர்சிதை மாற்ற லேபிளிங் உயிரியல் மாதிரிகளில் கொடுக்கப்பட்ட புரோட்டீஸைத் தடுக்கவும், எக்ஸ் விவோ செயலாக்கத்தின் பகுப்பாய்வு செய்யவும் உதவுகிறது. இரசாயன லேபிளிங்கை விட இந்த வளர்சிதை மாற்ற லேபிளிங் முறையைப் பயன்படுத்துவதன் ஒரு நன்மை என்னவென்றால், சீரம் புரதங்கள் போன்ற அசுத்தங்களிலிருந்து ஆராயப்படும் உண்மையான செல்லுலார் பெறப்பட்ட புரதங்களுக்கு இடையில் நம்பகமான, வேகமான மற்றும் திறமையான பாகுபாட்டை இது அனுமதிக்கிறது. ஐந்து மல்டிபிளெக்ஸ் மாதிரிகள் வரை பகுப்பாய்வு செய்ய SILAC TALS ஐப் பயன்படுத்தலாம். வளர்சிதை மாற்றத்தால் பெயரிட முடியாத மருத்துவ ரீதியாக பொருத்தமான மனித மாதிரிகளுக்கு எஸ். ஐ. எல். ஏ. சி பொருத்தமானது அல்ல. எஸ். ஐ. எல். ஏ. சி ஒரு விலையுயர்ந்த முறையாகும், மேலும் பெரும்பாலான ஆய்வகங்களுக்கு இது ஒரு சாத்தியமான விருப்பமாக இருக்காது. உறவினர் மற்றும் முழுமையான அளவீட்டு (iTRAQ) முறை அல்லது iTRAQ-TALS க்கான ஐசோபாரிக் குறிச்சொல் ஒரே நேரத்தில் பல மாதிரிகளை அளவிட உதவுகிறது. இந்த முறை நான்கு மற்றும் எட்டு பிளக்ஸ் ஐட்ராக் வினைப்பொருள்களைப் பயன்படுத்தி மல்டிபிளெக்ஸ் சோதனைகளில் 4 முதல் 8 மாதிரிகளிலிருந்து ஒரே நேரத்தில் பகுப்பாய்வு செய்யும் திறனைக் கொண்டுள்ளது. இந்த முறை மாதிரிகளின் உயர் துல்லியமான அடையாளம் மற்றும் அளவீட்டை வழங்குகிறது மற்றும் மாதிரி நகல்களின் மேலும் இனப்பெருக்கம் செய்யக்கூடிய பகுப்பாய்வு அனுமதிக்கிறது. மற்ற ஐட்ராக் முறைகளைப் போலவே, ஐட்ராக்-டெயில்களுக்கும் ஒரு மால்டி மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டர் மற்றும் விலையுயர்ந்த ஐட்ராக் வினையூக்கிகள் தேவைப்படுகின்றன. மாற்று முறைகள் என் டெர்மினி மற்றும் புரோட்டியோலிசிஸ் தயாரிப்புகளைப் படிப்பதற்கு பல மாற்று அணுகுமுறைகள் உள்ளன. அமின்களின் அசிட்டிலேஷன், அதைத் தொடர்ந்து டிரிப்டிக் செரிமானம் மற்றும் இலவச என்-டெர்மினல் பெப்டைடுகளின் பயோடினைலேஷன் ஆகியவை ஃப்ரீ லைசின்கள் மற்றும் என்-டெர்மினியை முத்திரை குத்த இரசாயனத்தைப் (அசிட்டிலேஷன்) பயன்படுத்துகின்றன. தடுக்கப்பட்ட N-முனையம் பின்னர் எதிர்மறையாக தேர்ந்தெடுக்கப்படுகிறது. இருப்பினும், இயற்கையாகவே இலவச உள் என்-டெர்மினி மற்றும் தடுக்கப்பட்ட என்-டெர்மினியை அசிட்டிலேஷனுக்குப் பிறகு வேறுபடுத்த முடியாது. இந்த முறை ஐசோடோபிக் லேபிளிங்கைப் பயன்படுத்தாது, எனவே கண்டுபிடிப்புகளை அளவிடுவது கடினம். மேலும், சோதனை மற்றும் பின்னணி புரோட்டியோலிசிஸ் தயாரிப்புகளை வேறுபடுத்துவது கடினம். லைசின் குவானிடினேஷனைத் தொடர்ந்து என்-டெர்மினியின் பயோடினைலேஷன் லைசின் எச்சங்களைத் தடுக்க ஒரு இரசாயனத்தைப் பயன்படுத்துகிறது மற்றும் இலவச என்-டெர்மினியைக் குறிக்கிறது. குறிக்கப்பட்ட இலவச N-முனையம் பின்னர் தேர்ந்தெடுக்கப்படுகிறது. இந்த முறையின் எதிர்மறையான அம்சம் என்னவென்றால், இயற்கையாகத் தடுக்கப்பட்ட N-முனையைப் பிடிக்க முடியாததால், பிளவுபடுத்தப்படாத பெப்டைடுகளைப் பயன்படுத்தி ஒரு புள்ளிவிவர மாதிரியைப் பயன்படுத்த முடியாது. இது ஐசோடோபிக் லேபிளிங்கை உள்ளடக்காததால், முடிவுகளை அளவிட முடியாது. பிளவு தளமும் ஏற்கனவே லேபிளிங் செய்ய அறியப்பட வேண்டும். என்-டெர்மினியின் சப்டிலிகேஸ் பயோடினைலேஷன் என்-டெர்மினல் பெப்டைடுகளின் நொதி லேபிளிங்கைப் பயன்படுத்துகிறது, ஆனால் லைசின் தடுப்பு இரசாயனங்களைப் பயன்படுத்துவதில்லை. லைசின் தடுப்பு இல்லாமல், பிளவுபட்ட என்-முனைய பெப்டைட் பல அடையாளம் காண மிகவும் குறுகியதாக இருக்கும். முடிவுகள் சப்டிலிகேஸின் பண்புகளை மிகவும் சார்ந்திருக்கலாம், எனவே பக்கச்சார்பானதாக இருக்கலாம். இந்த முறை இயற்கையாகவே தடுக்கப்பட்ட N-முனையத்தைப் பிடிக்காது, மேலும் ஐசோடோபிக் லேபிளிங்கைப் பயன்படுத்தாது, எனவே கண்டுபிடிப்புகளை அளவிடுவது கடினம். N-முனையத்தின் ITRAQ-பெயரிடுதல், N-முனையத்தை பெயரிடுவதற்கு iTRAQ ஐப் பயன்படுத்துகிறது. நியோ-என்-டெர்மினி பெப்டைடுகள் சிலிகோ மூலம் தேர்ந்தெடுக்கப்படுகின்றன. இந்த நுட்பத்தின் எதிர்மறையான அம்சம் என்னவென்றால், மால்டி மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டர் தேவைப்படுகிறது மற்றும் தேவையான ஐட்ராக் வினையூக்கிகள் விலை உயர்ந்தவை. இந்த முறை இயற்கையாகவே தடுக்கப்பட்ட N-முனையைப் பிடிக்காது. முழு செயல்முறைக்கும் 50-100 mg பெப்டைட் மாதிரிகள் தேவைப்படும். ஒருங்கிணைந்த பின்ன மூலைவிட்ட குரோமடோகிராஃபி (COFRADIC) இயற்கையாகவே தடுக்கப்பட்ட N-முனையம் மற்றும் புரோட்டீஸ் உருவாக்கப்பட்ட நியோ-N-முனையத்திற்கு வெவ்வேறு லேபிளிங்கை அனுமதிக்கிறது. தடுக்கப்பட்ட அனைத்து N-முனைகளும் எதிர்மறையாக தேர்ந்தெடுக்கப்படுகின்றன. இருப்பினும் இந்த செயல்முறைக்கு பல இரசாயன செயலாக்கம், குரோமடோகிராஃபி மற்றும் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி தேவைப்படுகிறது. சிறந்த பிரிப்பு முடிவுகள் கையாளும் போது நிகழாத மெத்தியோனின் ஆக்சிஜனேற்றம் போன்ற அமினோ அமில மாற்றத்தைப் பொறுத்தது. இந்த முறைக்கு ஒரு மாதிரிக்கு 150 எம்எஸ்/எம்எஸ் பகுப்பாய்வுகள் தேவைப்படுகின்றன, ஆனால் வெகுஜன நிறமாலை அளவீட்டிற்காக மாதிரிகள் தொகுக்கப்படலாம் (மேலும் பகுப்பாய்வுகளின் எண்ணிக்கையைக் குறைக்கலாம்). இந்த நுட்பம் அறியப்படாத அல்லது பரந்த குறிப்பிட்ட தன்மை கொண்ட புரோட்டியேஸ்களுக்கு பயன்படுத்த ஏற்றது. மேலும் காண்கஃ SILAC iTRAQ குறிப்புகள் புரோட்டியோமிக்ஸ் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி