Isotopic labeling
آاسوٹوپک لیبلنگ (یا آاسوٹوپک لیبلنگ) ایک ایسی تکنیک ہے جو کسی رد عمل، میٹابولک راستے، یا خلیے کے ذریعے آاسوٹوپ (نیوٹرون گنتی میں قابل شناخت تغیر کے ساتھ ایک ایٹم) کے گزرنے کو ٹریک کرنے کے لیے استعمال ہوتی ہے۔ رد عمل کو مخصوص ایٹموں کو ان کے آاسوٹوپ سے بدل کر 'لیبل' کیا جاتا ہے۔ اس کے بعد رد عمل کو رد عمل سے گزرنے دیا جاتا ہے۔ مصنوعات میں آاسوٹوپس کی پوزیشن کو اس ترتیب کا تعین کرنے کے لیے ماپا جاتا ہے جس کے بعد آاسوٹوپک ایٹم رد عمل یا سیل کے میٹابولک راستے میں آتا ہے۔ آئسوٹوپک لیبلنگ میں استعمال ہونے والے نیوکلائڈز مستحکم نیوکلائڈز یا ریڈیو نیوکلائڈز ہو سکتے ہیں۔ مؤخر الذکر صورت میں، لیبلنگ کو ریڈیو لیبلنگ کہا جاتا ہے۔ آاسوٹوپک لیبلنگ میں، لیبلنگ آاسوٹوپس کی موجودگی کا پتہ لگانے کے متعدد طریقے ہیں۔ ان کے بڑے پیمانے پر، کمپن موڈ، یا تابکار انحطاط کے ذریعے۔ ماس سپیکٹرومیٹری آاسوٹوپ کی کمیت میں فرق کا پتہ لگاتا ہے، جبکہ انفراریڈ سپیکٹروسکوپی آاسوٹوپ کے کمپن کے طریقوں میں فرق کا پتہ لگاتا ہے۔ نیوکلیئر مقناطیسی گونج مختلف گیرومیگنیٹک تناسب والے ایٹموں کا پتہ لگاتا ہے۔ تابکار انحطاط کا پتہ آئنائزیشن چیمبر یا جیل کے آٹوڈیگراف کے ذریعے لگایا جا سکتا ہے۔ آئسوٹوپک لیبلنگ کے استعمال کی ایک مثال پانی میں فینول (C6H5OH) کا مطالعہ ہے جس میں عام ہائیڈروجن (پروٹیم) کو ڈیوٹیریم (ڈیوٹیریم لیبلنگ) سے تبدیل کیا جاتا ہے۔ ڈیوٹیریٹڈ پانی میں فینول شامل کرنے پر (معمول کے H2O کے علاوہ D2O پر مشتمل پانی)، ہائیڈروجن کے لیے ڈیوٹیریم کا متبادل فینول کے ہائیڈروکسیل گروپ میں دیکھا جاتا ہے (جس کے نتیجے میں C6H5OD ہوتا ہے)، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ فینول آسانی سے پانی کے ساتھ ہائیڈروجن کے تبادلے کے رد عمل سے گزرتا ہے۔ صرف ہائیڈروکسیل گروپ متاثر ہوتا ہے، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ دیگر 5 ہائیڈروجن ایٹم تبادلے کے رد عمل میں حصہ نہیں لیتے ہیں۔ آاسوٹوپک ٹریسر ایک آاسوٹوپک ٹریسر، ("آاسوٹوپک مارکر" یا "آاسوٹوپک لیبل" بھی)، کیمسٹری اور بائیو کیمسٹری میں کیمیائی رد عمل اور تعاملات کو سمجھنے میں مدد کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ اس تکنیک میں، دلچسپی کے مالیکیول کے ایک یا زیادہ ایٹموں کو ایک ہی کیمیائی عنصر کے ایٹم کے لیے تبدیل کیا جاتا ہے، لیکن ایک مختلف آاسوٹوپ کے (جیسے تابکار سراغ لگانے میں استعمال ہونے والا تابکار آاسوٹوپ)۔ چونکہ لیبل والے ایٹم میں پروٹانوں کی تعداد یکساں ہوتی ہے، اس لیے یہ تقریبا بالکل اسی طرح برتاؤ کرے گا جس طرح اس کے غیر لیبل والے ہم منصب کرتے ہیں اور چند مستثنیات کے ساتھ، زیر تفتیش رد عمل میں مداخلت نہیں کرے گا۔ تاہم، نیوٹرانوں کی تعداد میں فرق کا مطلب یہ ہے کہ اس کا پتہ اسی عنصر کے دوسرے ایٹموں سے الگ لگایا جا سکتا ہے۔ کیمیائی تعاملات کے طریقہ کار کی تحقیقات کے لیے نیوکلیئر مقناطیسی گونج (این ایم آر) اور ماس سپیکٹرومیٹری (ایم ایس) کا استعمال کیا جاتا ہے۔ این ایم آر اور ایم ایس آاسوٹوپک اختلافات کا پتہ لگاتے ہیں، جو مصنوعات کی ساخت میں لیبل والے ایٹموں کی پوزیشن کے بارے میں معلومات کا تعین کرنے کی اجازت دیتا ہے۔ مصنوعات میں آاسوٹوپک ایٹموں کی پوزیشننگ کے بارے میں معلومات کے ساتھ، ابتدائی میٹابولائٹس کو مصنوعات میں تبدیل کرنے کے لیے استعمال ہونے والے رد عمل کے راستے کا تعین کیا جا سکتا ہے۔ تابکار آاسوٹوپس کی جانچ جیل الیکٹروفورسس میں جیل کے آٹوڈیگرافس کا استعمال کرتے ہوئے کی جا سکتی ہے۔ تابکار آاسوٹوپس پر مشتمل مرکبات سے خارج ہونے والی تابکاری فوٹو گرافی کی فلم کے ایک ٹکڑے کو تاریک کر دیتی ہے، جس سے جیل میں ایک دوسرے کے مقابلے میں لیبل والے مرکبات کی پوزیشن ریکارڈ ہوتی ہے۔ آاسوٹوپ ٹریسروں کو عام طور پر آاسوٹوپ تناسب کی شکل میں استعمال کیا جاتا ہے۔ ایک ہی عنصر کے دو آاسوٹوپس کے درمیان تناسب کا مطالعہ کرنے سے، ہم عنصر کی مجموعی کثرت سے متعلق اثرات سے بچتے ہیں، جو عام طور پر آاسوٹوپک کثرت میں بہت کم تغیرات کو زیر کرتے ہیں۔ آاسوٹوپک ٹریسرز ارضیات کے کچھ سب سے اہم اوزار ہیں کیونکہ انہیں زمین کے نظاموں میں پیچیدہ اختلاط کے عمل کو سمجھنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ارضیات میں آاسوٹوپک ٹریسروں کے اطلاق کے بارے میں مزید بحث آاسوٹوپ جیو کیمسٹری کے عنوان کے تحت کی گئی ہے۔ آاسوٹوپک ٹریسروں کو عام طور پر دو زمروں میں تقسیم کیا جاتا ہے: مستحکم آاسوٹوپ ٹریسروں اور ریڈیوجینک آاسوٹوپ ٹریسروں۔ مستحکم آاسوٹوپ ٹریسروں میں صرف غیر ریڈیجینک آاسوٹوپ شامل ہوتے ہیں اور عام طور پر بڑے پیمانے پر منحصر ہوتے ہیں۔ نظریہ طور پر، دو مستحکم آاسوٹوپ والے کسی بھی عنصر کو آاسوٹوپک ٹریسر کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔ تاہم، سب سے زیادہ استعمال ہونے والے مستحکم آاسوٹوپ ٹریسروں میں نسبتا ہلکے آاسوٹوپ شامل ہوتے ہیں، جو قدرتی نظاموں میں آسانی سے فریکشن سے گزرتے ہیں۔ آئسوٹوپک دستخط بھی دیکھیں۔ ایک ریڈیوجینک آاسوٹوپ ٹریسر میں تابکار انحطاط سے پیدا ہونے والا ایک آاسوٹوپ شامل ہوتا ہے، جو عام طور پر غیر ریڈیوجینک آاسوٹوپ کے تناسب میں ہوتا ہے (جس کی کثرت تابکار انحطاط کی وجہ سے زمین میں مختلف نہیں ہوتی ہے)۔ مستحکم آاسوٹوپ لیبلنگ میں غیر تابکار آاسوٹوپس کا استعمال شامل ہوتا ہے جو کئی کیمیائی اور حیاتیاتی کیمیائی نظاموں کو ماڈل کرنے کے لیے استعمال ہونے والے ٹریسروں کے طور پر کام کر سکتے ہیں۔ منتخب کردہ آاسوٹوپ اس مرکب پر ایک لیبل کے طور پر کام کر سکتا ہے جس کی شناخت نیوکلیئر مقناطیسی گونج (این ایم آر) اور ماس سپیکٹرومیٹری (ایم ایس) کے ذریعے کی جا سکتی ہے۔ کچھ سب سے عام مستحکم آاسوٹوپ 2H، 13C، اور 15N ہیں، جنہیں مزید این ایم آر سالوینٹس، امینو ایسڈ، نیوکلک ایسڈ، لپڈز، عام میٹابولائٹس اور سیل گروتھ میڈیا میں تیار کیا جا سکتا ہے۔ مستحکم آاسوٹوپس کا استعمال کرتے ہوئے پیدا ہونے والے مرکبات یا تو لیبل شدہ آاسوٹوپس کے فیصد سے متعین ہوتے ہیں (یعنی۔ 30 ٪ یکساں طور پر لیبل شدہ 13C گلوکوز ایک مرکب پر مشتمل ہوتا ہے جس پر 30 ٪ 13 کاربن آاسوٹوپ اور 70 ٪ قدرتی طور پر لیبل شدہ کاربن کے ساتھ لیبل کیا جاتا ہے) یا کمپاؤنڈ پر خاص طور پر لیبل شدہ کاربن پوزیشنوں کے ذریعہ (یعنی۔ 1-13 C گلوکوز جو گلوکوز کی پہلی کاربن پوزیشن پر لیبل کیا جاتا ہے)۔ گلائکولیسس راستے اور پینٹوز فاسفیٹ راستے سے اپنائے گئے رد عمل کا ایک نیٹ ورک دکھایا گیا ہے جس میں لیبل شدہ کاربن آاسوٹوپ رد عمل کے پورے نیٹ ورک میں مختلف کاربن پوزیشنوں پر دوبارہ ترتیب دیتا ہے۔ نیٹ ورک فرکٹوز 6-فاسفیٹ (ایف 6 پی) سے شروع ہوتا ہے، جس میں کاربن پوزیشن 1 اور 2 پر لیبل 13 سی کے ساتھ 6 کاربن ایٹم ہوتے ہیں۔ 1,2-13 C F6P دو گلیسرالڈیہائیڈ 3-فاسفیٹ (G3P)، ایک 2,3-13 C T3P اور ایک غیر لیبل شدہ T3P بن جاتا ہے۔ 2,3-13 C T3P کو اب سیڈوہیپٹولوز 7-فاسفیٹ (S7P) کے ساتھ رد عمل کیا جا سکتا ہے تاکہ ایک غیر لیبل شدہ erythrose 4-فاسفیٹ (E4P) اور ایک 5,6-13 C F6P تشکیل پائے۔ غیر لیبل شدہ T3P غیر لیبل شدہ مصنوعات کی ترکیب کے لیے S7P کے ساتھ رد عمل ظاہر کرے گا۔ یہ اعداد و شمار پوزیشن مخصوص لیبل والے مرکبات کا استعمال کرتے ہوئے رد عمل کے ذریعے کاربن ایٹم کی دوبارہ ترتیب کو دریافت کرنے کے لیے مستحکم آاسوٹوپ لیبلنگ کے استعمال کو ظاہر کرتے ہیں۔ مستحکم آاسوٹوپ لیبلنگ کا استعمال کرتے ہوئے میٹابولک فلکس تجزیہ (ایم ایف اے) مستحکم آاسوٹوپ لیبلنگ کا استعمال کرتے ہوئے خلیات کے اندر میٹابولک راستوں اور رد عمل کے ذریعے بعض عناصر کے بہاؤ کی وضاحت کے لیے ایک اہم ذریعہ ہے۔ خلیے کو ایک آئسوٹوپک لیبل کھلایا جاتا ہے، پھر لیبل شدہ فیڈ کا استعمال کرتے ہوئے خلیے کو بڑھنے دیا جاتا ہے۔ مستحکم میٹابولک بہاؤ کے تجزیے کے لیے خلیے کو ایک مستحکم حالت (خلیے میں داخل ہونے اور چھوڑنے والے آاسوٹوپس وقت کے ساتھ مستقل رہتے ہیں) یا ایک نیم مستحکم حالت (ایک مقررہ مدت کے لیے مستحکم حالت تک پہنچ جاتا ہے) تک پہنچنا چاہیے۔ آؤٹ پٹ میٹابولائٹ کا آاسوٹوپ پیٹرن طے کیا جاتا ہے۔ آؤٹ پٹ آاسوٹوپ پیٹرن قیمتی معلومات فراہم کرتا ہے، جسے ہر رد عمل کے ذریعے بہاؤ کی شدت، رد عمل سے مصنوعات میں تبدیلی کی شرح کو تلاش کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ یہ شکل ایک مخصوص رد عمل کے ذریعے بہاؤ کا تعین کرنے کے لیے مختلف لیبل استعمال کرنے کی صلاحیت کو ظاہر کرتی ہے۔ فرض کریں کہ اصل میٹابولائٹ، ایک تین کاربن مرکب، یا تو ایک رد عمل میں دو کاربن میٹابولائٹ اور ایک کاربن میٹابولائٹ میں تقسیم ہونے کی صلاحیت رکھتا ہے پھر دوبارہ جوڑتا ہے یا تین کاربن میٹابولائٹ رہتا ہے۔ اگر تعامل کو مساوی تناسب میں میٹابولائٹ کے دو آاسوٹوپس کے ساتھ فراہم کیا جاتا ہے، تو ایک مکمل طور پر لیبل شدہ (نیلے حلقے)، جسے عام طور پر یکساں طور پر لیبل شدہ کہا جاتا ہے، اور ایک مکمل طور پر غیر لیبل شدہ (سفید حلقے)۔ خاکہ کے بائیں جانب نیچے کا راستہ میٹابولائٹس میں کوئی تبدیلی ظاہر نہیں کرتا ہے، جبکہ دائیں جانب تقسیم اور دوبارہ ملاپ ظاہر ہوتا ہے۔ جیسا کہ دکھایا گیا ہے، اگر میٹابولائٹ صرف بائیں طرف نیچے کا راستہ اختیار کرتا ہے، تو یہ یکساں طور پر لیبل شدہ غیر لیبل شدہ میٹابولائٹ کے 50-50 تناسب میں رہتا ہے۔ اگر میٹابولائٹ صرف دائیں طرف لے جاتا ہے تو لیبلنگ کے نئے نمونے سامنے آسکتے ہیں، سب برابر تناسب میں۔ دوسرے تناسب اس بات پر منحصر ہو سکتے ہیں کہ اصل میٹابولائٹ کا کتنا حصہ راستے کے بائیں جانب بمقابلہ راستے کے دائیں جانب چلتا ہے۔ یہاں تناسب ایک ایسی صورتحال کے لیے دکھایا گیا ہے جس میں نصف میٹابولائٹس بائیں طرف اور نصف دائیں طرف لے جاتے ہیں، لیکن دیگر تناسب ہو سکتے ہیں۔ ایک مرکب میں لیبل والے ایٹموں اور غیر لیبل والے ایٹموں کے یہ نمونے آئسوٹوپمرز کی نمائندگی کرتے ہیں۔ مختلف لیبل والے میٹابولائٹس کی آئسوٹوپومر تقسیم کی پیمائش کرکے، ہر رد عمل کے ذریعے بہاؤ کا تعین کیا جا سکتا ہے۔ ایم ایف اے آئسوٹوپ لیبلنگ سے حاصل کردہ ڈیٹا کو ہر رد عمل، رکاوٹوں کے اسٹوچیومیٹری کے ساتھ جوڑتا ہے، اور ایک اصلاح کا طریقہ کار بہاؤ کے نقشے کو حل کرتا ہے۔ ناقابل واپسی تعاملات بہاؤ کو تلاش کرنے کے لیے درکار تھرموڈینامک رکاوٹیں فراہم کرتے ہیں۔ ایک میٹرکس بنایا جاتا ہے جس میں رد عمل کی اسٹوچیومیٹری ہوتی ہے۔ انٹرا سیلولر فلکس کا تخمینہ ایک تکراری طریقہ استعمال کرکے لگایا جاتا ہے جس میں مصنوعی فلکس کو اسٹوچیومیٹرک ماڈل میں پلگ کیا جاتا ہے۔ مصنوعی بہاؤ کو بہاؤ کے نقشے میں دکھایا جاتا ہے، جو ہر رد عمل کے لیے رد عمل کو مصنوعات میں تبدیل کرنے کی شرح کو ظاہر کرتا ہے۔ زیادہ تر بہاؤ کے نقشوں میں، تیر جتنا موٹا ہوتا ہے، رد عمل کی بہاؤ کی قدر اتنی ہی بڑی ہوتی ہے۔ آاسوٹوپ لیبلنگ پیمائش کی تکنیکیں آاسوٹوپمرز کے درمیان فرق کی پیمائش کرنے کی کوئی بھی تکنیک استعمال کی جا سکتی ہے۔ دو بنیادی طریقے، نیوکلیئر مقناطیسی گونج (این ایم آر) اور ماس سپیکٹرومیٹری (ایم ایس)، مستحکم آاسوٹوپ لیبلنگ میں بڑے پیمانے پر آاسوٹوپمرز کی پیمائش کے لیے تیار کیے گئے ہیں۔ پروٹون این ایم آر 13 سی لیبلنگ تجربات کے لیے استعمال ہونے والی پہلی تکنیک تھی۔ اس طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے، ایک مخصوص میٹابولائٹ پول کے اندر ہر ایک پروٹونیٹڈ کاربن پوزیشن کو دیگر پوزیشنوں سے الگ سے دیکھا جا سکتا ہے۔ یہ اس مخصوص پوزیشن پر لیبل کیے گئے آئسوٹوپمرز کے فیصد کو جاننے کی اجازت دیتا ہے۔ پروٹون این ایم آر کی حد یہ ہے کہ اگر میٹابولائٹ میں این کاربن ایٹم موجود ہیں، تو زیادہ سے زیادہ صرف این مختلف پوزیشن کی افزودگی کی اقدار ہو سکتی ہیں، جو کہ کل آئسوٹوپومر معلومات کا صرف ایک چھوٹا سا حصہ ہے۔ اگرچہ پروٹون این ایم آر لیبلنگ کا استعمال محدود ہے، لیکن خالص پروٹون این ایم آر تجربات کا اندازہ لگانا زیادہ آئسوٹوپومر معلومات والے تجربات کے مقابلے میں بہت آسان ہے۔ پروٹون این ایم آر کے علاوہ، 13 سی این ایم آر تکنیکوں کا استعمال آئسوٹوپمرز کی تقسیم کے بارے میں مزید تفصیلی نظریہ پیش کرے گا۔ ایک لیبل شدہ کاربن ایٹم انو میں اپنے براہ راست پڑوسیوں کی لیبلنگ کی حالت کے لحاظ سے مختلف ہائپر فائن تقسیم کے اشارے پیدا کرے گا۔ اگر پڑوسی کاربن ایٹموں کو لیبل نہیں کیا جاتا ہے تو ایک سنگل چوٹی ابھرتی ہے۔ اگر صرف ایک پڑوسی کاربن ایٹم کو لیبل کیا جائے تو ڈبلٹ چوٹی ابھرتی ہے۔ ڈبلٹ تقسیم کا سائز پڑوسی کاربن ایٹم کے فعال گروپ پر منحصر ہے۔ اگر دو پڑوسی کاربن ایٹموں کو لیبل کیا جاتا ہے، تو ڈبلٹ کا ایک ڈبلٹ ٹرپلٹ میں تبدیل ہو سکتا ہے اگر ڈبلٹ تقسیم برابر ہوں۔ میٹابولک فلکس تجزیہ کے مقاصد کے لیے این ایم آر تکنیک کے استعمال میں خامیاں یہ ہیں کہ یہ دیگر این ایم آر ایپلی کیشنز سے مختلف ہے کیونکہ یہ ایک خاص شعبہ ہے۔ این ایم آر سپیکٹرومیٹر تمام تحقیقی ٹیموں کے لیے براہ راست دستیاب نہیں ہو سکتا۔ این ایم آر پیمائش کے پیرامیٹرز کی اصلاح اور چوٹی کے ڈھانچوں کے مناسب تجزیے کے لیے ایک ہنر مند این ایم آر ماہر کی ضرورت ہوتی ہے۔ بعض میٹابولائٹس کو اضافی آئسوٹوپومر ڈیٹا حاصل کرنے کے لیے پیمائش کے خصوصی طریقہ کار کی بھی ضرورت پڑ سکتی ہے۔ اس کے علاوہ، چوٹی کے علاقوں کی درست مقدار کا تعین کرنے کے ساتھ ساتھ الجھے ہوئے سنگلٹ، ڈبلٹ اور ٹرپلٹ چوٹیوں کے سڑنے کی نشاندہی کرنے کے لیے خاص طور پر ڈھالنے والے سافٹ ویئر ٹولز کی ضرورت ہوتی ہے۔ نیوکلیئر مقناطیسی گونج کے برعکس، ماس سپیکٹرومیٹری (ایم ایس) ایک اور طریقہ ہے جو میٹابولک فلکس تجزیہ تجربات کے لیے زیادہ قابل اطلاق اور حساس ہے۔ ایم ایس آلات مختلف اقسام میں دستیاب ہیں۔ دو جہتی جوہری مقناطیسی گونج (2 ڈی-این ایم آر) سے مختلف، ایم ایس آلات براہ راست ہائیڈرولائسیٹ کے ساتھ کام کرتے ہیں۔ گیس کرومیٹوگرافی ماس سپیکٹرومیٹری (جی سی-ایم ایس) میں، ہائیڈرولائسیٹ کے مرکبات کو الگ کرنے کے لیے ایم ایس کو گیس کرومیٹوگراف کے ساتھ جوڑا جاتا ہے۔ جی سی کالم سے نکلنے والے مرکبات کو پھر آئنائز کیا جاتا ہے اور بیک وقت ٹکڑے ٹکڑے کیا جاتا ہے۔ جی سی-ایم ایس کے استعمال میں فائدہ یہ ہے کہ نہ صرف سالماتی آئن کے بڑے پیمانے پر آئسوٹوپمرز کی پیمائش کی جاتی ہے بلکہ کئی ٹکڑوں کے بڑے پیمانے پر آئسوٹوپمر سپیکٹرم کی بھی پیمائش کی جاتی ہے، جس سے ناپی گئی معلومات میں نمایاں اضافہ ہوتا ہے۔ مائع کرومیٹوگرافی-ماس سپیکٹرومیٹری (ایل سی-ایم ایس) میں، جی سی کو مائع کرومیٹوگراف سے تبدیل کیا جاتا ہے۔ اہم فرق یہ ہے کہ کیمیائی مشتق ضروری نہیں ہے۔ تاہم، ایم ایف اے میں ایل سی-ایم ایس کے استعمال شاذ و نادر ہی ہوتے ہیں۔ ہر معاملے میں، ایم ایس آلات ایک مخصوص آئسوٹوپومر کی تقسیم کو اس کے سالماتی وزن سے تقسیم کرتے ہیں۔ کسی خاص میٹابولائٹ کے تمام آئسوٹوپمرز جن میں لیبل والے کاربن ایٹموں کی ایک ہی تعداد ہوتی ہے، ایک چوٹی سگنل میں جمع کیے جاتے ہیں۔ چونکہ ہر آئسوٹوپومر ایم ایس سپیکٹرم میں بالکل ایک چوٹی میں حصہ ڈالتا ہے، اس کے بعد ہر چوٹی کے لیے فیصد کی قیمت کا حساب لگایا جا سکتا ہے، جس سے بڑے پیمانے پر آئسوٹوپومر کا حصہ حاصل ہوتا ہے۔ n کاربن ایٹموں والے میٹابولائٹ کے لیے، n + 1 پیمائش تیار کی جاتی ہے۔ معمول کے بعد، بالکل n معلوماتی ماس آئسوٹوپومر کی مقدار باقی رہتی ہے۔ ایم ایس تکنیک کے استعمال میں خرابی یہ ہے کہ گیس کرومیٹوگرافی کے لیے، نمونے کو کیمیائی مشتق کے ذریعے تیار کیا جانا چاہیے تاکہ چارج والے مالیکیول حاصل کیے جا سکیں۔ نمونوں کو مشتق کرنے کے لیے متعدد مرکبات استعمال ہوتے ہیں۔ این، این-ڈائیمیتھائلفارمائڈ ڈائیمیتھائل ایسیٹل (ڈی ایم ایف ڈی ایم اے) اور این-(ٹیرٹ-بیوٹیلڈیمیتھائلسیل)-این-میتھائلٹریفلوورواسیٹامائڈ (ایم ٹی بی ایس ٹی ایف اے) ان مرکبات کی دو مثالیں ہیں جو امینو ایسڈ کو مشتق کرنے کے لیے استعمال کیے گئے ہیں۔ اس کے علاوہ، مشاہدہ کردہ مضبوط آاسوٹوپ اثرات جی سی کالم میں مختلف لیبل والے آاسوٹوپمرز کے برقرار رکھنے کے وقت کو متاثر کرتے ہیں۔ جی سی کالم کی اوور لوڈنگ کو بھی روکا جانا چاہیے۔ آخر میں، کاربن کے علاوہ دیگر ایٹموں کی قدرتی کثرت بھی بڑے پیمانے پر آئسوٹوپومر سپیکٹرم میں خلل کا باعث بنتی ہے۔ مثال کے طور پر، سالمے میں موجود ہر آکسیجن ایٹم 17O آاسوٹوپ اور 18O آاسوٹوپ کے طور پر بھی موجود ہو سکتا ہے۔ آاسوٹوپس کی قدرتی کثرت کا ایک زیادہ اہم اثر آاسوٹوپس 29Si اور 30Si کی قدرتی کثرت کے ساتھ سلکان کا اثر ہے۔ ایس ایس تکنیک کے لیے مشتق ایجنٹوں میں سی کا استعمال کیا جاتا ہے۔ انسانی معدنی غذائیت کی تحقیق میں استعمال انسانوں میں معدنی غذائیت اور میٹابولزم کا مطالعہ کرنے کے لیے مستحکم آاسوٹوپ ٹریسروں کا استعمال پہلی بار 1960 کی دہائی میں رپورٹ کیا گیا تھا۔ اگرچہ ریڈیوآئیسوٹوپس کا استعمال انسانی غذائیت کی تحقیق میں کئی دہائیوں پہلے سے کیا جا رہا تھا، لیکن مستحکم آٮٔیسوٹوپس نے ایک محفوظ آپشن پیش کیا، خاص طور پر ان مضامین میں جن کے لیے تابکاری کی نمائش کے بارے میں تشویش بڑھ گئی ہے، جیسے۔ حاملہ اور دودھ پلانے والی خواتین اور بچے۔ مستحکم آاسوٹوپس کے ذریعہ پیش کردہ دیگر فوائد میں ایسے عناصر کا مطالعہ کرنے کی صلاحیت شامل ہے جن میں کوئی مناسب ریڈیو آاسوٹوپس نہیں ہیں اور طویل مدتی ٹریس کے رویے کا مطالعہ کرنا ہے۔ اس طرح مستحکم آاسوٹوپس کا استعمال آاسوٹوپک طور پر افزودہ مواد اور غیر نامیاتی ماس سپیکٹرومیٹرز کی بڑھتی ہوئی دستیابی کے ساتھ عام ہو گیا۔ ریڈیوآئیسوٹوپس کے بجائے مستحکم آاسوٹوپس کے استعمال میں کئی خامیاں ہیں: بڑی مقدار میں ٹریسر کی ضرورت ہوتی ہے، جس میں قدرتی طور پر موجود معدنیات کو پریشان کرنے کی صلاحیت ہوتی ہے۔ تجزیاتی نمونے کی تیاری زیادہ پیچیدہ ہوتی ہے اور ماس سپیکٹرومیٹری کے آلات زیادہ مہنگے ہوتے ہیں۔ پورے جسم یا مخصوص بافتوں میں ٹریسر کی موجودگی کو بیرونی طور پر نہیں ماپا جا سکتا۔ بہر حال، مستحکم آاسوٹوپس کو انسانی مطالعات میں معیار بنانے کے فوائد غالب رہے ہیں۔ زیادہ تر معدنیات جو انسانی صحت کے لیے ضروری ہیں اور غذائیت کے محققین کے لیے خاص دلچسپی کے حامل ہیں، ان میں مستحکم آاسوٹوپ ہوتے ہیں، جن میں سے کچھ قدرتی کثرت کم ہونے کی وجہ سے حیاتیاتی ٹریسروں کے طور پر اچھی طرح سے موزوں ہوتے ہیں۔ آئرن، زنک، کیلشیم، تانبے، میگنیشیم، سیلینیم اور مولیبڈینم ان ضروری معدنیات میں شامل ہیں جن میں مستحکم آاسوٹوپ ہوتے ہیں جن پر آاسوٹوپ ٹریسر کے طریقے لاگو کیے گئے ہیں۔ خاص طور پر آئرن، زنک اور کیلشیم کا بڑے پیمانے پر مطالعہ کیا گیا ہے۔ معدنی غذائیت/میٹابولزم کے جن پہلوؤں کا مطالعہ کیا جاتا ہے ان میں جذب (معدے کی نالی سے جسم میں)، تقسیم، ذخیرہ، اخراج اور ان عملوں کی حرکیات شامل ہیں۔ آئسوٹوپ ٹریسروں کو زبانی طور پر (کھانے کے ساتھ یا اس کے بغیر، یا معدنی ضمیمہ کے ساتھ) اور/یا نس کے ذریعے زیر انتظام کیا جاتا ہے۔ اس کے بعد آئسوٹوپ کی افزودگی کو خون کے پلازما، اریتھروسائٹس، پیشاب اور/یا پاخانہ میں ماپا جاتا ہے۔ ماں کے دودھ اور آنتوں کے مواد میں بھی افزودگی کی پیمائش کی گئی ہے۔ ٹریسر تجرباتی ڈیزائن بعض اوقات معدنیات کے درمیان ان کے میٹابولزم میں فرق کی وجہ سے مختلف ہوتا ہے۔ مثال کے طور پر، آئرن کے جذب کا تعین عام طور پر اریتھروسائٹس میں ٹریسر کو شامل کرنے سے کیا جاتا ہے جبکہ زنک یا کیلشیم کے جذب کو پلازما، پیشاب یا پاخانہ میں ٹریسر کی ظاہری شکل سے ماپا جاتا ہے۔ ایک ہی مطالعہ میں متعدد آاسوٹوپ ٹریسروں کا انتظام عام ہے، جس سے پیمائش کے زیادہ قابل اعتماد طریقوں کے استعمال اور میٹابولزم کے متعدد پہلوؤں کی بیک وقت تحقیقات کی اجازت ملتی ہے۔ غذا سے معدنی جذب کی پیمائش، جسے اکثر حیاتیاتی دستیابی کے طور پر تصور کیا جاتا ہے، غذائیت کی تحقیق کے لیے آئسوٹوپ ٹریسر طریقوں کا سب سے عام اطلاق ہے۔ اس طرح کے مطالعات کے مقاصد میں یہ تحقیقات شامل ہیں کہ کس طرح جذب کھانے کی قسم سے متاثر ہوتا ہے (جیسے۔ پودے بمقابلہ جانوروں کا ذریعہ، ماں کا دودھ بمقابلہ فارمولا)، غذا کے دیگر اجزاء (مثال کے طور پر۔ فائٹیٹ)، بیماری اور میٹابولک عوارض (جیسے۔ ماحولیاتی آنتوں کی خرابی)، تولیدی چکر، غذا میں معدنیات کی مقدار، معدنیات کی دائمی کمی، موضوع کی عمر اور ہومیوسٹیٹک میکانزم۔ جب اس طرح کے مطالعات کے نتائج کسی معدنیات کے لیے دستیاب ہوتے ہیں، تو وہ معدنیات کی انسانی جسمانی اور غذائی ضروریات کے تخمینے کے لیے ایک بنیاد کے طور پر کام کر سکتے ہیں۔ جب معدنی جذب اور میٹابولزم کا مشاہدہ کرنے کے مقصد سے کھانے کے ساتھ ٹریس کا انتظام کیا جاتا ہے، تو یہ ایک اندرونی یا بیرونی لیبل کی شکل میں ہو سکتا ہے۔ ایک اندرونی لیبل آئسوٹوپ ہے جو کھانے میں اس کی پیداوار کے دوران متعارف کرایا گیا ہے، اس طرح کھانے کے قدرتی معدنی مواد کو تقویت ملتی ہے، جبکہ بیرونی لیبلنگ سے مراد مطالعہ کے دوران کھانے میں ٹریسر آئسوٹوپ کا اضافہ ہوتا ہے۔ چونکہ یہ ایک بہت وقت طلب اور مہنگا طریقہ ہے، اس لیے اندرونی لیبلنگ معمول کے مطابق استعمال نہیں کی جاتی ہے۔ مختلف کھانوں کی اندرونی اور بیرونی لیبلنگ کا استعمال کرتے ہوئے جذب کی پیمائش کا موازنہ کرنے والے مطالعات نے عام طور پر لیبلنگ کے دو طریقوں کے درمیان اچھے معاہدے کا مظاہرہ کیا ہے، اس مفروضے کی حمایت کرتے ہوئے کہ بیرونی اور قدرتی معدنیات کو انسانی معدے کی نالی میں اسی طرح سنبھالا جاتا ہے۔ افزودگی کی مقدار آاسوٹوپ کے تناسب کی پیمائش، ایک حوالہ آاسوٹوپ کے لیے ٹریسر آاسوٹوپ کا تناسب، ماس سپیکٹرومیٹری کے ذریعے طے کی جاتی ہے۔ افزودگی کی متعدد تعریفیں اور حسابات مختلف محققین نے اپنائے ہیں۔ افزودگی کے حسابات زیادہ پیچیدہ ہو جاتے ہیں جب بیک وقت متعدد ٹریسروں کا استعمال کیا جاتا ہے۔ کیونکہ افزودہ آاسوٹوپ کی تیاری کبھی بھی آاسوٹوپک طور پر خالص نہیں ہوتی، یعنی۔ ان میں عنصر کے تمام آاسوٹو غیر فطری کثرت میں ہوتے ہیں، متعدد آاسوٹوپ ٹریسروں کی افزودگی کے حساب سے دوسرے ٹریسروں کی موجودگی سے ہر آاسوٹوپ کے تناسب میں خلل پیدا ہوتا ہے۔ معدنیات کی کمی کے پھیلاؤ اور وسائل سے محروم ممالک میں انسانی صحت اور فلاح و بہبود پر ان کے اہم اثرات کی وجہ سے، بین الاقوامی جوہری توانائی ایجنسی نے حال ہی میں مستحکم آاسوٹوپ طریقوں کی تفصیلی اور جامع وضاحت شائع کی ہے تاکہ اس علم کو مغربی تعلیمی مراکز سے باہر کے محققین تک پہنچایا جا سکے۔ ریڈیوآئیسوٹوپک لیبلنگ ریڈیوآئیسوٹوپک لیبلنگ ایک نظام کے ذریعے مادے کے نمونے کے گزرنے کا سراغ لگانے کی ایک تکنیک ہے۔ مادہ کو اس کی کیمیائی ساخت میں ریڈیو نیوکلائڈز کو شامل کرکے "لیبل" کیا جاتا ہے۔ جب یہ سڑ جاتے ہیں، تو ان کی موجودگی کا تعین ان کے ذریعے خارج ہونے والی تابکاری کا پتہ لگا کر کیا جا سکتا ہے۔ ریڈیوآئیسوٹوپک لیبلنگ آئسوٹوپک لیبلنگ کا ایک خاص معاملہ ہے۔ ان مقاصد کے لیے، تابکار انحطاط کی ایک خاص طور پر مفید قسم پوزیٹرون کا اخراج ہے۔ جب ایک پوزیٹرون کسی الیکٹران سے ٹکرا جاتا ہے، تو یہ دو اعلی توانائی والے فوٹون جاری کرتا ہے جو بالکل مخالف سمتوں میں سفر کرتے ہیں۔ اگر پوزیٹرون کسی ٹھوس شے کے اندر پیدا ہوتا ہے، تو اس کے ایک ملی میٹر سے زیادہ سفر کرنے سے پہلے ایسا کرنے کا امکان ہے۔ اگر ان دونوں فوٹونوں کا پتہ لگایا جا سکتا ہے، تو سڑنے کے واقعے کے مقام کا بہت واضح طور پر تعین کیا جا سکتا ہے۔ سختی سے بات کرتے ہوئے، ریڈیوآئیسوٹوپک لیبلنگ میں صرف ایسے معاملات شامل ہوتے ہیں جہاں تابکاری کو تجرباتی طور پر مصنوعی طور پر متعارف کرایا جاتا ہے، لیکن کچھ قدرتی مظاہر اسی طرح کے تجزیے کو انجام دینے کی اجازت دیتے ہیں۔ خاص طور پر، ریڈیو میٹرک ڈیٹنگ قریب سے متعلق اصول کا استعمال کرتی ہے۔ پروٹومکس میں ایپلی کیشنز پروٹومکس میں، جینوم کے ذریعے ظاہر کردہ پروٹین کے مکمل سیٹ کا مطالعہ، بیماریوں کی شناخت کرنے والے بائیو مارکروں میں سیل کلچر (ایس آئی ایل اے سی) میں امینو ایسڈ کے ذریعے مستحکم آئسوٹوپ لیبلنگ کا استعمال شامل ہو سکتا ہے، جو پروٹین کی سطح کا اندازہ لگانے کے لیے استعمال ہونے والے امینو ایسڈ کی آئسوٹوپک لیبل شدہ شکلیں فراہم کرتا ہے۔ پروٹین ریکومبیننٹ میں، ہیرا پھیری والے پروٹین بڑی مقدار میں تیار کیے جاتے ہیں اور آئسوٹوپ لیبلنگ متعلقہ پروٹین کی جانچ کرنے کا ایک ذریعہ ہے۔ یہ طریقہ 13C یا 15N کے ساتھ منتخب طور پر مرکزوں کو افزودہ کرنے یا ان میں سے 1H کو ختم کرنے کے بارے میں ہوتا تھا۔ ریکومبیننٹ کا اظہار نائٹروجن کے ذریعہ کے طور پر 15N-امونیم کلورائد پر مشتمل میڈیا کے ساتھ E.coli میں کیا جائے گا۔ اس کے نتیجے میں 15 این لیبل والے پروٹین کو پھر غیر متحرک دھاتی وابستگی اور ان کے فیصد کا تخمینہ لگا کر صاف کیا جاتا ہے۔ لیبل والے پروٹین کی پیداوار کو بڑھانے اور آئسوٹوپ لیبل والے میڈیا کی لاگت کو کم کرنے کے لیے، ایک متبادل طریقہ کار بنیادی طور پر غیر لیبل والے میڈیا کا استعمال کرتے ہوئے سیل ماس کو کم سے کم لیبل والے میڈیا میں متعارف کرانے سے پہلے بڑھاتا ہے۔ آاسوٹوپ لیبلنگ کا ایک اور استعمال ڈی این اے کی ترکیب کی پیمائش میں ہوگا، یعنی وٹرو میں خلیوں کا پھیلاؤ۔ خلیوں میں ترکیب (یا ترتیب) کے نمونے کا موازنہ کرنے کے لیے H3-تھائمیڈائن لیبلنگ کا استعمال کرتا ہے۔ ماحولیاتی نظام کے عمل کے تجزیے کے لیے ایپلی کیشنز آئسوٹوپک ٹریسروں کا استعمال قدرتی نظاموں، خاص طور پر زمینی اور آبی ماحول میں عمل کی جانچ کے لیے کیا جاتا ہے۔ مٹی کی سائنس میں 15 این ٹریسرز کا استعمال نائٹروجن سائیکلنگ کا مطالعہ کرنے کے لیے بڑے پیمانے پر کیا جاتا ہے، جبکہ 13 سی اور 14 سی، کاربن کے مستحکم اور ریڈیوآئیسوٹوپس، نامیاتی مرکبات کے کاروبار اور آٹوٹروفس کے ذریعے ان کے فکسشن کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال ہوتے ہیں۔ مثال کے طور پر، مارش اور دیگر۔ (2005) توانائی کے ذریعہ (امونیا آکسیکرن) اور کاربن کے ذریعہ (کیموآٹوٹروفک کاربن فکسشن) دونوں کے طور پر امونیا آکسیڈائزرز کے ذریعہ مرکب کے استعمال کو ظاہر کرنے کے لیے دوہری لیبل (15 این-اور 14 سی) یوریا کا استعمال کیا۔ ڈیوٹیریٹڈ پانی کا استعمال کسی درخت یا ماحولیاتی نظام میں پانی کی قسمت اور عمر کا پتہ لگانے کے لیے بھی کیا جاتا ہے۔ سمندروں کے ٹریسروں کے لیے ایپلی کیشنز کو سمندروں میں وسیع پیمانے پر استعمال کیا جاتا ہے تاکہ عمل کی ایک وسیع صف کا مطالعہ کیا جا سکے۔ استعمال شدہ آاسوٹوپس عام طور پر قدرتی طور پر اچھی طرح سے قائم ذرائع اور تشکیل اور سڑنے کی شرحوں کے ساتھ پائے جاتے ہیں۔ تاہم، اینتھروپوجینک آاسوٹوپس کو بھی بڑی کامیابی کے ساتھ استعمال کیا جا سکتا ہے۔ محققین سمندر کے جسمانی عمل کے بارے میں معلومات حاصل کرنے کے لیے مختلف مقامات اور اوقات پر آاسوٹوپک تناسب کی پیمائش کرتے ہیں۔ ذرات کی نقل و حمل سمندر ذرہ نقل و حمل کا ایک وسیع نیٹ ورک ہے۔ تھوریم آاسوٹوپس محققین کو مادے کی عمودی اور افقی حرکت کو سمجھنے میں مدد کر سکتے ہیں۔ 234th کی سمندر میں مستقل، اچھی طرح سے متعین پیداوار کی شرح اور 24 دن کی نصف زندگی ہے۔ قدرتی طور پر پائے جانے والے اس آاسوٹوپ کو گہرائی کے ساتھ لکیری طور پر مختلف دکھایا گیا ہے۔ لہذا، اس لکیری نمونے میں کسی بھی تبدیلی کو ذرات پر 234 ویں کی نقل و حمل سے منسوب کیا جا سکتا ہے۔ مثال کے طور پر، سطح کے پانی میں چند میٹر نیچے بہت زیادہ اقدار کے ساتھ کم آاسوٹوپک تناسب نیچے کی سمت میں عمودی بہاؤ کی نشاندہی کرے گا۔ مزید برآں، ذرات کی پس منظر کی نقل و حمل کو سمجھنے کے لیے ایک مخصوص گہرائی کے اندر تھوریم آاسوٹوپ کا پتہ لگایا جا سکتا ہے۔ مقامی نظاموں کے اندر گردش کی گردش، جیسے خلیج، صحن اور زیر زمین پانی، کی جانچ ریڈیم آاسوٹوپس سے کی جا سکتی ہے۔ 223Ra کی نصف زندگی 11 دن کی ہوتی ہے اور یہ قدرتی طور پر دریاؤں اور زیر زمین پانی کے ذرائع میں مخصوص مقامات پر پائی جا سکتی ہے۔ اس کے بعد ریڈیم کا آاسوٹوپک تناسب کم ہو جائے گا کیونکہ منبع دریا کا پانی خلیج یا صحن میں داخل ہوتا ہے۔ متعدد مختلف مقامات پر 223Ra کی مقدار کی پیمائش کرکے، گردش کے نمونے کو سمجھا جا سکتا ہے۔ اسی عین مطابق عمل کو زیر زمین پانی کی نقل و حرکت اور اخراج کا مطالعہ کرنے کے لیے بھی استعمال کیا جا سکتا ہے۔ لیڈ کے مختلف آاسوٹوپس کو عالمی سطح پر گردش کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ مختلف سمندر (یعنی۔ بحر اوقیانوس، بحر الکاہل، ہندوستانی، وغیرہ) مختلف آاسوٹوپک دستخط ہوتے ہیں۔ یہ مختلف سمندروں کے اندر تلچھٹ اور چٹانوں کے آاسوٹوپک تناسب میں فرق کا نتیجہ ہے۔ چونکہ لیڈ کے مختلف آاسوٹوپس کی نصف زندگی 50-200 سال ہوتی ہے، اس لیے پورے سمندر میں آاسوٹوپک تناسب کو یکساں بنانے کے لیے کافی وقت نہیں ہوتا ہے۔ لہذا، پی بی آاسوٹوپک تناسب کا درست تجزیہ مختلف سمندروں کی گردش کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ ٹیکٹونک عمل اور آب و ہوا کی تبدیلی انتہائی لمبی نصف زندگی والے آاسوٹوپس اور ان کی سڑنے والی مصنوعات کو ملٹی ملین سال کے عمل، جیسے ٹیکٹونکس اور انتہائی آب و ہوا کی تبدیلی کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ مثال کے طور پر، روبیڈیم-اسٹرونشیم ڈیٹنگ میں، اسٹرونشیم (87Sr/86Sr) کے آاسوٹوپک تناسب کا تجزیہ برف کے کور کے اندر کیا جا سکتا ہے تاکہ زمین کی زندگی میں ہونے والی تبدیلیوں کا جائزہ لیا جا سکے۔ آئس کور کے اندر اس تناسب میں فرق زمین کی جیو کیمسٹری میں اہم تبدیلیوں کی نشاندہی کرے گا۔ جوہری ہتھیاروں سے متعلق آاسوٹوپس مذکورہ بالا عمل کو قدرتی طور پر پائے جانے والے آاسوٹوپس کا استعمال کرتے ہوئے ماپا جا سکتا ہے۔ اس کے باوجود، اینتھروپوجینک آاسوٹوپس سمندری پیمائش کے لیے بھی انتہائی مفید ہیں۔ جوہری ہتھیاروں کے تجربات نے دنیا کے سمندروں میں غیر معمولی آاسوٹوپس کی کثرت جاری کی۔ 3H، 129I، اور 137Cs سمندری پانی میں تحلیل پائے جا سکتے ہیں، جبکہ 241Am اور 238Pu ذرات سے منسلک ہوتے ہیں۔ پانی میں تحلیل ہونے والے آاسوٹوپس عالمی گردش کے مطالعہ میں خاص طور پر مفید ہیں۔ مثال کے طور پر، سمندر کے اندر لیٹرل آئسوٹوپک تناسب میں فرق پانی کے مضبوط محاذوں یا گیروں کی نشاندہی کر سکتا ہے۔ اس کے برعکس، ذرات سے منسلک آاسوٹوپس کو پانی کے کالموں کے اندر بڑے پیمانے پر نقل و حمل کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ مثال کے طور پر، ایم یا پیو کی اعلی سطح بہت گہرائی میں مشاہدہ کرنے پر نیچے کی طرف اشارہ کر سکتی ہے، یا سطح پر مشاہدہ کرنے پر اوپر کی طرف اشارہ کر سکتی ہے۔ آئسوٹوپک لیبلنگ کے طریقے کیمیائی ترکیب انزیم-ثالثی تبادلے آئسوٹوپک لیبل میڈیا میں ریکومبیننٹ پروٹین کا اظہار۔ یہ بھی دیکھیں حیاتیات میں تابکاری ٹریسر آئسوٹوپومر آئسوٹوپولوگ آئسوبارک لیبلنگ آئسوٹوپ ڈائلیوشن دھاتی کاربونیلز کا انفراریڈ سپیکٹروسکوپی کے استعمال حوالہ جات بیرونی روابط ریڈیولیبلڈ مرکبات کی ترکیب لیبلنگ لیبارٹری تکنیک جسمانی کیمسٹری بائیو کیمسٹری کے طریقے ماس سپیکٹرومیٹری سپیکٹروسکوپی نیوکلیئر فزکس