Protein folding
پروٹین فولڈنگ وہ جسمانی عمل ہے جہاں ایک پروٹین چین کو اس کے مقامی تین جہتی ڈھانچے میں ترجمہ کیا جاتا ہے، عام طور پر ایک "فولڈڈ" تشکیل، جس کے ذریعے پروٹین حیاتیاتی طور پر فعال ہو جاتا ہے۔ ایک تیز رفتار اور دوبارہ پیدا کرنے کے قابل عمل کے ذریعے، ایک پولی پیپٹائڈ بے ترتیب کنڈلی سے اپنی خصوصیت کے تین جہتی ڈھانچے میں جوڑ جاتا ہے۔ ہر پروٹین ایم آر این اے کی ترتیب سے امینو ایسڈ کی لکیری زنجیر میں ترجمہ ہونے کے بعد پہلے ایک بے نقاب پولی پیپٹائڈ یا بے ترتیب کنڈلی کے طور پر موجود ہوتا ہے۔ اس مرحلے پر، پولی پیپٹائڈ میں کوئی مستحکم (یعنی دیرپا) تین جہتی ساخت کا فقدان ہے (پہلی شکل کے بائیں طرف دیکھیں)۔ جیسے ہی پولی پیپٹائڈ سلسلہ کو رائبوسوم کے ذریعے ترکیب کیا جا رہا ہے، لکیری سلسلہ اپنی تین جہتی ساخت میں جوڑنا شروع کر دیتا ہے۔ بہت سے پروٹینوں کا فولڈنگ پولی پیپٹائڈ چین کے ترجمہ کے دوران بھی شروع ہوتا ہے۔ امینو ایسڈ ایک دوسرے کے ساتھ تعامل کرتے ہوئے ایک اچھی طرح سے متعین تین جہتی ڈھانچہ، فولڈڈ پروٹین (شکل کا دایاں رخ دیکھیں) تیار کرتے ہیں، جسے مقامی حالت کہا جاتا ہے۔ نتیجے میں بننے والی تین جہتی ساخت کا تعین امینو ایسڈ کی ترتیب یا بنیادی ساخت سے ہوتا ہے (مثال کے طور پر، انفنسن کا نظریہ)۔ صحیح تین جہتی ڈھانچہ کام کرنے کے لیے ضروری ہے، حالانکہ فعال پروٹین کے کچھ حصے کھلے رہ سکتے ہیں، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ پروٹین کی حرکیات اہم ہیں۔ مقامی ساخت میں جوڑنے میں ناکامی عام طور پر غیر فعال پروٹین پیدا کرتی ہے، لیکن بعض صورتوں میں، غلط فولڈ شدہ پروٹین میں ترمیم شدہ یا زہریلی فعالیت ہوتی ہے۔ خیال کیا جاتا ہے کہ متعدد نیوروڈیجینریٹو اور دیگر بیماریاں غلط فولڈ شدہ پروٹین سے بننے والے امیلوئڈ فائبرلز کے جمع ہونے کے نتیجے میں ہوتی ہیں، جن کی متعدی اقسام کو پریون کہا جاتا ہے۔ بہت سی الرجی کچھ پروٹین کے غلط فولڈنگ کی وجہ سے ہوتی ہیں کیونکہ مدافعتی نظام بعض پروٹین ڈھانچوں کے لیے اینٹی باڈیز تیار نہیں کرتا ہے۔ پروٹین کی انحطاط ایک فولڈڈ سے بے نقاب حالت میں منتقلی کا عمل ہے۔ یہ کھانا پکانے، جلنے، پروٹینوپیتھی اور دیگر سیاق و سباق میں ہوتا ہے۔ فولڈنگ کے عمل کی مدت دلچسپی کے پروٹین کے لحاظ سے ڈرامائی طور پر مختلف ہوتی ہے۔ جب خلیے سے باہر مطالعہ کیا جاتا ہے، تو سب سے سست فولڈنگ پروٹین کو جوڑنے کے لیے کئی منٹ یا گھنٹے درکار ہوتے ہیں، بنیادی طور پر پرولین آئسومیرائزیشن کی وجہ سے، اور عمل مکمل ہونے سے پہلے چیک پوائنٹس جیسی متعدد درمیانی حالتوں سے گزرنا پڑتا ہے۔ دوسری طرف، سو امینو ایسڈ تک کی لمبائی والے بہت چھوٹے سنگل ڈومین پروٹین عام طور پر ایک ہی مرحلے میں جوڑ جاتے ہیں۔ ملی سیکنڈ کے وقت کے پیمانے معمول ہیں، اور سب سے تیز معروف پروٹین فولڈنگ رد عمل چند مائیکرو سیکنڈ کے اندر مکمل ہو جاتے ہیں۔ پروٹین کے فولڈنگ ٹائم اسکیل کا انحصار اس کے سائز، کانٹیکٹ آرڈر اور سرکٹ ٹوپولوجی پر ہوتا ہے۔ پروٹین فولڈنگ کے عمل کو سمجھنا اور اس کی تقلید کرنا 1960 کی دہائی کے آخر سے کمپیوٹیشنل بائیولوجی کے لیے ایک اہم چیلنج رہا ہے۔ پروٹین کو جوڑنے کا عمل بنیادی ڈھانچہ پروٹین کی بنیادی ساخت، اس کی لکیری امینو ایسڈ کی ترتیب، اس کی مقامی تشکیل کا تعین کرتی ہے۔ پولی پیپٹائڈ سلسلہ میں مخصوص امینو ایسڈ کے باقیات اور ان کی پوزیشن تعین کرنے والے عوامل ہیں جن کے لیے پروٹین کے کون سے حصے قریب سے ایک دوسرے کو جوڑتے ہیں اور اس کی سہ جہتی تشکیل بناتے ہیں۔ امینو ایسڈ کی ساخت اتنی اہم نہیں ہے جتنی کہ ترتیب۔ تاہم، فولڈنگ کی لازمی حقیقت یہ ہے کہ ہر پروٹین کی امینو ایسڈ کی ترتیب میں وہ معلومات ہوتی ہے جو مقامی ساخت اور اس حالت کو حاصل کرنے کے راستے دونوں کی وضاحت کرتی ہے۔ یہ کہنا نہیں ہے کہ تقریبا ایک جیسی امینو ایسڈ کی ترتیب ہمیشہ اسی طرح فولڈ ہوتی ہے۔ ماحولیاتی عوامل کی بنیاد پر بھی تشکیلات مختلف ہوتی ہیں ؛ اسی طرح کے پروٹین اس بنیاد پر مختلف طریقے سے فولڈ ہوتے ہیں کہ وہ کہاں پائے جاتے ہیں۔ ثانوی ساخت کی تشکیل فولڈنگ کے عمل کا پہلا قدم ہے جو ایک پروٹین اپنی مقامی ساخت کو سنبھالنے کے لیے لیتا ہے۔ ثانوی ڈھانچے کی خصوصیت وہ ڈھانچے ہیں جنہیں الفا ہیلیکس اور بیٹا شیٹس کے نام سے جانا جاتا ہے جو تیزی سے فولڈ ہوتے ہیں کیونکہ وہ انٹرا مالیکیولر ہائیڈروجن بانڈز کے ذریعے مستحکم ہوتے ہیں، جیسا کہ سب سے پہلے لینس پالنگ نے نمایاں کیا تھا۔ انٹرا مالیکیولر ہائیڈروجن بانڈز کی تشکیل پروٹین کے استحکام میں ایک اور اہم تعاون فراہم کرتی ہے۔ α-ہیلسیس ریڑھ کی ہڈی کے ہائیڈروجن بندھن سے ایک سرپل شکل بنانے کے لیے بنتے ہیں (دائیں طرف کی شکل کا حوالہ دیں)۔ β پلیٹیڈ شیٹ ایک ایسا ڈھانچہ ہے جو ریڑھ کی ہڈی کو ہائیڈروجن بانڈ بنانے کے لیے اپنے اوپر موڑ کر بناتا ہے (جیسا کہ بائیں طرف کے اعداد و شمار میں دکھایا گیا ہے)۔ ہائیڈروجن بانڈ پیپٹائڈ بانڈ کے امیڈ ہائیڈروجن اور کاربونل آکسیجن کے درمیان ہوتے ہیں۔ مخالف متوازی β پلیٹیڈ شیٹس اور متوازی β پلیٹیڈ شیٹس موجود ہیں جہاں مخالف متوازی β شیٹ میں ہائیڈروجن بانڈز کا استحکام زیادہ مضبوط ہوتا ہے کیونکہ یہ متوازی شیٹس کے ذریعے بنائے گئے جھکی ہوئی ہائیڈروجن بانڈز کے مقابلے میں مثالی 180 ڈگری کے زاویے کے ساتھ ہائیڈروجن بانڈز بناتا ہے۔ ترتیری ڈھانچہ α-ہیلسیس اور β-شیٹس عام طور پر ایمفیپیتھک ہوتے ہیں، یعنی ان میں ہائیڈروفیلک اور ہائیڈروفوبک حصہ ہوتا ہے۔ یہ صلاحیت پروٹین کی ترتیری ساخت کی تشکیل میں مدد کرتی ہے جس میں فولڈنگ ہوتی ہے تاکہ ہائیڈروفیلک اطراف پروٹین کے ارد گرد آبی ماحول کا سامنا کر رہے ہوں اور ہائیڈروفوبک اطراف پروٹین کے ہائیڈروفوبک کور کا سامنا کر رہے ہوں۔ ثانوی ڈھانچہ درجہ بندی کے لحاظ سے ترتیری ڈھانچے کی تشکیل کو راستہ فراہم کرتا ہے۔ ایک بار جب پروٹین کی ترتیری ساخت بن جاتی ہے اور ہائیڈروفوبک تعاملات کے ذریعے مستحکم ہو جاتی ہے، تو دو سسٹین کے باقیات کے درمیان ڈائیسلفائیڈ پلوں کی شکل میں کوولینٹ بانڈنگ بھی ہو سکتی ہے۔ یہ غیر ہم آہنگ اور ہم آہنگ رابطے پروٹین کی مقامی ساخت میں ایک مخصوص ٹپوولوجیکل انتظام کرتے ہیں۔ پروٹین کی ترتیری ساخت میں ایک واحد پولی پیپٹائڈ سلسلہ شامل ہوتا ہے ؛ تاہم، فولڈڈ پولی پیپٹائڈ زنجیروں کے اضافی تعاملات چوتھائی ساخت کی تشکیل کو جنم دیتے ہیں۔ کواٹرنیری ڈھانچہ ترتیری ڈھانچہ کچھ پروٹینوں میں کواٹرنیری ڈھانچے کی تشکیل کو راستہ دے سکتا ہے، جس میں عام طور پر ذیلی اکائیوں کی "اسمبلی" یا "کواسمبلی" شامل ہوتی ہے جو پہلے ہی جوڑ چکے ہوتے ہیں ؛ دوسرے لفظوں میں، متعدد پولی پیپٹائڈ زنجیریں ایک مکمل طور پر فعال کواٹرنیری پروٹین بنانے کے لیے تعامل کر سکتی ہیں۔ پروٹین فولڈنگ کی محرک قوتیں فولڈنگ ایک بے ساختہ عمل ہے جو بنیادی طور پر ہائیڈروفوبک تعاملات، انٹرا مالیکیولر ہائیڈروجن بانڈز کی تشکیل، وین ڈیر والز قوتوں کی طرف سے رہنمائی کرتا ہے، اور اس کی مخالفت کنفارمیشنل اینٹروپی کرتی ہے۔ فولڈنگ کا عمل اکثر مشترکہ طور پر شروع ہوتا ہے، تاکہ پروٹین کا این-ٹرمینس فولڈ ہونا شروع ہو جائے جب کہ پروٹین کا سی-ٹرمینل حصہ اب بھی رائبوسوم کے ذریعے ترکیب کیا جا رہا ہو ؛ تاہم، ایک پروٹین انو حیاتیاتی ترکیب کے دوران یا اس کے بعد خود بخود فولڈ ہو سکتا ہے۔ اگرچہ ان میکرو مالیکیولز کو "خود کو جوڑنا" سمجھا جا سکتا ہے، لیکن اس عمل کا انحصار سالوینٹ (پانی یا لپڈ بائی لیئر)، نمکیات کے ارتکاز، پی ایچ، درجہ حرارت، کوفیکٹرز اور مالیکیولر چیپرونز کی ممکنہ موجودگی پر بھی ہوتا ہے۔ پروٹینوں کو ان کی فولڈنگ کی صلاحیتوں پر محدود موڑنے والے زاویوں یا تشکیل کے ذریعے حدود ہوں گی جو ممکن ہیں۔ پروٹین فولڈنگ کے ان قابل اجازت زاویوں کو دو جہتی پلاٹ کے ساتھ بیان کیا گیا ہے جسے رامچندرن پلاٹ کے نام سے جانا جاتا ہے، جسے قابل اجازت گردش کے سائی اور فائی زاویوں کے ساتھ دکھایا گیا ہے۔ ہائیڈروفوبک اثر پروٹین فولڈنگ کو سیل کے اندر تھرموڈینامک طور پر سازگار ہونا چاہیے تاکہ یہ ایک بے ساختہ رد عمل ہو۔ چونکہ یہ معلوم ہے کہ پروٹین کو جوڑنا ایک بے ساختہ رد عمل ہے، اس لیے اسے منفی گبز فری انرجی ویلیو فرض کرنی چاہیے۔ پروٹین فولڈنگ میں گبز فری انرجی کا براہ راست تعلق اینتھالپی اور اینٹروپی سے ہے۔ منفی ڈیلٹا G کے پیدا ہونے اور پروٹین فولڈنگ کے تھرموڈینامک طور پر سازگار ہونے کے لیے، یا تو اینتھالپی، اینٹروپی، یا دونوں اصطلاحات سازگار ہونی چاہئیں۔ پانی کے سامنے ہائیڈروفوبک سائیڈ چینز کی تعداد کو کم کرنا فولڈنگ کے عمل کے پیچھے ایک اہم محرک قوت ہے۔ ہائیڈروفوبک اثر وہ رجحان ہے جس میں پروٹین کی ہائیڈروفوبک زنجیر پروٹین کے مرکز (ہائیڈروفیلک ماحول سے دور) میں گر جاتی ہے۔ آبی ماحول میں، پانی کے مالیکیول ہائیڈروفوبک علاقوں یا پروٹین کی سائیڈ چینز کے ارد گرد جمع ہوتے ہیں، جس سے پانی کے مالیکیولز کے پانی کے خول بنتے ہیں۔ ہائیڈروفوبک خطے کے ارد گرد پانی کے مالیکیولز کی ترتیب نظام میں ترتیب میں اضافہ کرتی ہے اور اس وجہ سے اینٹروپی (نظام میں کم اینٹروپی) میں منفی تبدیلی میں حصہ ڈالتی ہے۔ پانی کے مالیکیول ان پانی کے پنجروں میں جڑے ہوتے ہیں جو ہائیڈروفوبک گرنے، یا ہائیڈروفوبک گروپوں کے اندرونی فولڈنگ کو چلاتے ہیں۔ ہائیڈروفوبک کا خاتمہ پانی کے پنجروں کو توڑنے کے ذریعے نظام میں اینٹروپی کو واپس متعارف کراتا ہے جو پانی کے ترتیب شدہ مالیکیولز کو آزاد کرتا ہے۔ گلوبولر فولڈڈ پروٹین کے مرکز کے اندر تعامل کرنے والے ہائیڈروفوبک گروپوں کی بھیڑ فولڈنگ کے بعد پروٹین کے استحکام میں ایک اہم مقدار میں حصہ ڈالتی ہے، کیونکہ وین ڈیر والز کی بہت زیادہ جمع ہونے والی قوتیں (خاص طور پر لندن ڈسپریشن قوتیں)۔ ہائیڈروفوبک اثر تھرموڈینامکس میں ایک محرک قوت کے طور پر صرف اس صورت میں موجود ہوتا ہے جب ایک بڑے ہائیڈروفوبک خطے پر مشتمل ایمفیفیلک مالیکیول کے ساتھ آبی میڈیم کی موجودگی ہو۔ ہائیڈروجن بانڈز کی طاقت ان کے ماحول پر منحصر ہوتی ہے ؛ اس طرح، ہائیڈروفوبک کور میں ڈھکے ہوئے H-بانڈز مقامی ریاست کے استحکام کے لیے آبی ماحول کے سامنے H-بانڈز سے زیادہ حصہ ڈالتے ہیں۔ گلوبولر فولڈز والے پروٹینوں میں، ہائڈروفوبک امینو ایسڈ تصادفی طور پر تقسیم یا ایک ساتھ جمع ہونے کے بجائے بنیادی ترتیب کے ساتھ بکھرے ہوتے ہیں۔ تاہم، وہ پروٹین جو حال ہی میں ڈی نووو پیدا ہوئے ہیں، جو اندرونی طور پر بے ترتیب ہوتے ہیں، بنیادی ترتیب کے ساتھ ہائیڈروفوبک امینو ایسڈ کلسٹرنگ کا مخالف نمونہ دکھاتے ہیں۔ مالیکیولر چیپرونز پروٹین کی ایک کلاس ہیں جو ویو میں موجود دیگر پروٹینز کو درست طریقے سے جوڑنے میں مدد کرتی ہیں۔ چیپرون تمام سیلولر کمپارٹمنٹس میں موجود ہوتے ہیں اور پولی پیپٹائڈ چین کے ساتھ تعامل کرتے ہیں تاکہ پروٹین کی مقامی تین جہتی تشکیل کی اجازت دی جا سکے۔ تاہم، چیپرون خود اس پروٹین کی حتمی ساخت میں شامل نہیں ہوتے ہیں جس میں وہ مدد کر رہے ہیں۔ چیپرونز فولڈنگ میں اس وقت بھی مدد کر سکتے ہیں جب نیسنٹ پولی پیپٹائڈ کو رائبوسوم کے ذریعے ترکیب کیا جا رہا ہو۔ مالیکیولر چیپرونز اس کے فولڈنگ راستے میں پروٹین کی بصورت دیگر غیر مستحکم ساخت کو مستحکم کرنے کے لیے بائنڈنگ کے ذریعے کام کرتے ہیں، لیکن چیپرونز میں اس پروٹین کی صحیح مقامی ساخت کو جاننے کے لیے ضروری معلومات نہیں ہوتی ہیں جس کی وہ مدد کر رہے ہیں۔ بلکہ، چیپرونز غلط فولڈنگ کنفارمیشنز کو روک کر کام کرتے ہیں۔ اس طرح، چیپرون اصل میں مقامی ڈھانچے کی طرف فولڈنگ کے راستے میں شامل انفرادی مراحل کی شرح میں اضافہ نہیں کرتے ہیں۔ اس کے بجائے، وہ پولی پیپٹائڈ چین کے ممکنہ ناپسندیدہ مجموعوں کو کم کرکے کام کرتے ہیں جو بصورت دیگر مناسب انٹرمیڈیٹ کی تلاش کو سست کر سکتے ہیں اور وہ پولی پیپٹائڈ چین کو صحیح تشکیل کو فرض کرنے کے لیے ایک زیادہ موثر راستہ فراہم کرتے ہیں۔ چیپرونز کو فولڈنگ کیٹیلسٹ پروٹینز کے ساتھ الجھن میں نہیں ڈالنا چاہیے، جو فولڈنگ کے راستوں میں سست مراحل کے لیے ذمہ دار کیمیائی رد عمل کو متحرک کرتے ہیں۔ فولڈنگ اتپریرک کی مثالیں پروٹین ڈائیسلفائڈ آئسومیرس اور پیپٹائڈائل-پرولیل آئسومیرس ہیں جو ڈائیسلفائڈ بانڈز کی تشکیل یا پیپٹائڈ گروپ کے سی آئی ایس اور ٹرانس سٹیریو آئسومرز کے درمیان باہمی تبدیلی میں شامل ہو سکتے ہیں۔ ویو میں پروٹین کو جوڑنے کے عمل میں چیپرونز کو اہم دکھایا گیا ہے کیونکہ وہ پروٹین کو اس کی مناسب صف بندی اور موافقت کو مؤثر طریقے سے "حیاتیاتی طور پر متعلقہ" بننے کے لیے درکار مدد فراہم کرتے ہیں۔ اس کا مطلب یہ ہے کہ پولی پیپٹائڈ سلسلہ نظریاتی طور پر چیپرونز کی مدد کے بغیر اپنے آبائی ڈھانچے میں جوڑ سکتا ہے، جیسا کہ وٹرو میں کیے گئے پروٹین فولڈنگ تجربات سے ظاہر ہوتا ہے ؛ تاہم، یہ عمل حیاتیاتی نظاموں میں موجود ہونے کے لیے بہت غیر موثر یا بہت سست ثابت ہوتا ہے۔ لہذا، ویو میں پروٹین فولڈنگ کے لیے چیپرونز ضروری ہیں۔ مقامی ساخت کی تشکیل میں مدد کرنے میں اس کے کردار کے ساتھ ساتھ، چیپرونز کو پروٹین کی نقل و حمل، انحطاط جیسے مختلف کرداروں میں شامل دکھایا گیا ہے، اور یہاں تک کہ بعض بیرونی غیر متناسب عوامل کے سامنے بے ساختہ پروٹین کو اپنے صحیح مقامی ڈھانچے میں دوبارہ جوڑنے کا موقع فراہم کرتا ہے۔ ایک مکمل طور پر غیر فطری پروٹین میں ترتیری اور ثانوی ڈھانچہ دونوں کا فقدان ہوتا ہے، اور یہ ایک نام نہاد بے ترتیب کنڈلی کے طور پر موجود ہوتا ہے۔ بعض حالات میں کچھ پروٹین دوبارہ فولڈ ہو سکتے ہیں ؛ تاہم، بہت سے معاملات میں، ڈی نیچوریشن ناقابل واپسی ہے۔ خلیے بعض اوقات اپنے پروٹین کو گرمی کے منفی اثر سے انزائموں کے ساتھ بچاتے ہیں جنہیں ہیٹ شاک پروٹین (ایک قسم کا چیپرون) کہا جاتا ہے، جو دوسرے پروٹین کو فولڈنگ اور فولڈنگ دونوں میں مدد کرتے ہیں۔ ہیٹ شاک پروٹین بیکٹیریا سے لے کر انسانوں تک جانچ کی گئی تمام انواع میں پائے گئے ہیں، جس سے پتہ چلتا ہے کہ وہ بہت جلد تیار ہوئے اور ان کا ایک اہم کام ہے۔ کچھ پروٹین خلیوں میں کبھی بھی فولڈ نہیں ہوتے ہیں سوائے چیپرونز کی مدد کے جو یا تو انفرادی پروٹین کو الگ کرتے ہیں تاکہ ان کی فولڈنگ میں دوسرے پروٹین کے ساتھ تعامل سے خلل نہ پڑے یا غلط فولڈ شدہ پروٹین کو پھیلانے میں مدد ملے، جس سے وہ صحیح مقامی ساخت میں دوبارہ فولڈ ہو سکیں۔ یہ فنکشن اگھلنشیل بے ساختہ مجموعوں میں بارش کے خطرے کو روکنے کے لیے اہم ہے۔ پروٹین کی انحطاط یا مقامی حالت میں خلل ڈالنے میں شامل بیرونی عوامل میں درجہ حرارت، بیرونی فیلڈز (برقی، مقناطیسی)، سالماتی ہجوم، اور یہاں تک کہ جگہ کی حد (یعنی۔ قید)، جو پروٹین کی تہہ پر بڑا اثر ڈال سکتا ہے۔ سالیوٹس کی اعلی ارتکاز، پی ایچ کی انتہا، مکینیکل قوتیں، اور کیمیائی ڈی نیچرانٹس کی موجودگی بھی پروٹین کی انحطاط میں حصہ ڈال سکتی ہے۔ ان انفرادی عوامل کو ایک ساتھ تناؤ کے طور پر درجہ بند کیا گیا ہے۔ چیپرونز کو سیلولر تناؤ کے اوقات میں بڑھتے ہوئے ارتکاز میں موجود دکھایا گیا ہے اور ابھرتے ہوئے پروٹین کے ساتھ ساتھ غیر فطری یا غلط فولڈ ہونے والے پروٹین کی مناسب فولڈنگ میں مدد کرتا ہے۔ کچھ حالات میں پروٹین اپنی حیاتیاتی کیمیائی طور پر فعال شکلوں میں فولڈ نہیں ہوں گے۔ خلیات جس حد میں رہتے ہیں اس سے اوپر یا نیچے کا درجہ حرارت تھرمل طور پر غیر مستحکم پروٹین کو پھیلانے یا خراب کرنے کا سبب بنتا ہے (یہی وجہ ہے کہ ابالنے سے انڈے کا سفید حصہ غیر شفاف ہو جاتا ہے)۔ پروٹین کا تھرمل استحکام مستقل نہیں ہے، تاہم ؛ مثال کے طور پر، ہائپر تھرموفیلک بیکٹیریا پائے گئے ہیں جو 122 ڈگری سیلسیس تک کے درجہ حرارت پر بڑھتے ہیں، جس کے لیے یقینا ضروری ہے کہ ان کے اہم پروٹین اور پروٹین اسمبلیوں کی مکمل تکمیل اس درجہ حرارت پر یا اس سے اوپر مستحکم ہو۔ بیکٹیریم ای کولی بیکٹیریوفیج ٹی 4 کا میزبان ہے، اور فیج انکوڈ شدہ جی پی 31 پروٹین () ساختی اور فعال طور پر ای کولی چیپرون پروٹین گرو ای ایس کے لیے یکساں معلوم ہوتا ہے اور انفیکشن کے دوران بیکٹیریوفیج ٹی 4 وائرس کے ذرات کی اسمبلی میں اس کا متبادل بننے کے قابل ہوتا ہے۔ GroES کی طرح، Gp31 GroEL چیپرونن کے ساتھ ایک مستحکم کمپلیکس بناتا ہے جو بیکٹیریوفیج T4 میجر کیپسیڈ پروٹین Gp23 کے ویو میں فولڈنگ اور اسمبلی کے لیے بالکل ضروری ہے۔ فولڈ سوئچنگ کچھ پروٹینوں میں متعدد مقامی ڈھانچے ہوتے ہیں، اور کچھ بیرونی عوامل کی بنیاد پر ان کی فولڈ کو تبدیل کرتے ہیں۔ مثال کے طور پر، کائی بی پروٹین دن بھر فولڈ ہوتا ہے، جو سائانوبیکٹیریا کے لیے ایک گھڑی کے طور پر کام کرتا ہے۔ یہ اندازہ لگایا گیا ہے کہ تقریبا 0.5-4% PDB (پروٹین ڈیٹا بینک) پروٹین فولڈ بدل جاتے ہیں۔ پروٹین کو غلط طریقے سے جوڑنا اور نیوروڈیجینریٹو بیماری ایک پروٹین کو غلط طریقے سے جوڑنا سمجھا جاتا ہے اگر وہ اپنی معمول کی مقامی حالت کو حاصل نہیں کر پاتا ہے۔ یہ امینو ایسڈ کی ترتیب میں تغیرات یا بیرونی عوامل کے ذریعہ عام فولڈنگ کے عمل میں خلل کی وجہ سے ہو سکتا ہے۔ غلط فولڈ شدہ پروٹین میں عام طور پر β-شیٹ ہوتے ہیں جو ایک سپرمولیکولر ترتیب میں منظم ہوتے ہیں جسے کراس-β ڈھانچہ کہا جاتا ہے۔ یہ β-شیٹ سے بھرپور اسمبلیاں بہت مستحکم، بہت اگھلنشیل، اور عام طور پر پروٹیولیسس کے خلاف مزاحم ہوتی ہیں۔ ان فائبرلر اسمبلیوں کا ساختی استحکام پروٹین مونومرز کے درمیان وسیع تعاملات کی وجہ سے ہوتا ہے، جو ان کے β-اسٹرینڈز کے درمیان ریڑھ کی ہڈی کے ہائیڈروجن بانڈز سے بنتا ہے۔ پروٹین کی غلط فولڈنگ دوسرے پروٹین کی مزید غلط فولڈنگ اور جمع کو ایگریگیٹس یا اولیگومرز میں متحرک کر سکتی ہے۔ خلیے میں مجموعی پروٹین کی بڑھتی ہوئی سطح امیلائڈ جیسے ڈھانچوں کی تشکیل کا باعث بنتی ہے جو انحطاطی عوارض اور خلیوں کی موت کا سبب بن سکتی ہے۔ امیلائڈز ریشے دار ڈھانچے ہوتے ہیں جن میں بین سالماتی ہائیڈروجن بند ہوتے ہیں جو انتہائی اگھلنشیل ہوتے ہیں اور تبدیل شدہ پروٹین کے مجموعوں سے بنائے جاتے ہیں۔ لہذا، پروٹیسوم کا راستہ اتنا موثر نہیں ہو سکتا کہ جمع ہونے سے پہلے غلط فولڈ شدہ پروٹین کو خراب کر سکے۔ غلط فولڈ شدہ پروٹین ایک دوسرے کے ساتھ تعامل کر سکتے ہیں اور منظم مجموعے تشکیل دے سکتے ہیں اور بین سالماتی تعاملات کے ذریعے زہریلا پن حاصل کر سکتے ہیں۔ مجموعی پروٹین پریئن سے متعلق بیماریوں جیسے کریٹزفیلڈ-جیکب بیماری، مویشیوں کے سپنجفارم انسیفالوپیتھی (پاگل گائے کی بیماری)، امیلوئڈ سے متعلق بیماریوں جیسے الزائمر کی بیماری اور فیملیئل امیلوئڈ کارڈیومیوپیتھی یا پولی نیوروپیتھی کے ساتھ ساتھ انٹرا سیلولر ایگریگیشن کی بیماریوں جیسے ہنٹنگٹن اور پارکنسنز کی بیماری سے وابستہ ہیں۔ عمر کے آغاز سے ہونے والی یہ انحطاطی بیماریاں غلط فولڈ شدہ پروٹین کو اگھلنشیل، ایکسٹرا سیلولر ایگریگیٹس اور/یا کراس-β امیلوئڈ فائبرلز سمیت انٹرا سیلولر شمولیت میں جمع کرنے سے وابستہ ہیں۔ یہ مکمل طور پر واضح نہیں ہے کہ آیا مجموعے پروٹین ہومیوسٹاسس کے نقصان، ترکیب، فولڈنگ، جمع اور پروٹین کے کاروبار کے درمیان توازن کی وجہ ہیں یا محض عکاسی کرتے ہیں۔ حال ہی میں یورپی میڈیسن ایجنسی نے ٹرانستھیریٹن امیلوئڈ بیماریوں کے علاج کے لیے ٹافامیڈس یا وینڈاکیل (ٹیٹرامیرک ٹرانستھیریٹن کا ایک حرکی استحکام) کے استعمال کی منظوری دی۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ امیلوئڈ فائبرل کی تشکیل کا عمل (اور خود فائبرلز نہیں) انسانی امیلوئڈ بیماریوں میں پوسٹ مائٹوٹک ٹشو کے انحطاط کا سبب بنتا ہے۔ فولڈنگ اور فنکشن کے بجائے غلط فولڈنگ اور ضرورت سے زیادہ انحطاط پروٹیوپیتھی کی متعدد بیماریوں جیسے اینٹی ٹریپسن سے وابستہ ایمفیسیما، سسٹک فائبروسس اور لائسوسومل اسٹوریج کی بیماریوں کا باعث بنتا ہے، جہاں فنکشن کا نقصان اس عارضے کی ابتدا ہے۔ اگرچہ پروٹین ریپلیسمنٹ تھراپی کو تاریخی طور پر مؤخر الذکر عوارض کو درست کرنے کے لیے استعمال کیا گیا ہے، لیکن ایک ابھرتا ہوا طریقہ یہ ہے کہ میوٹیٹڈ پروٹین کو جوڑنے کے لیے فارماسیوٹیکل چیپرونز کا استعمال کیا جائے تاکہ انہیں فعال بنایا جا سکے۔ پروٹین فولڈنگ کا مطالعہ کرنے کے لیے تجرباتی تکنیکیں جبکہ پروٹین فولڈنگ کے بارے میں نتائج اتپریورتن مطالعات کے ذریعے بنائے جا سکتے ہیں، عام طور پر، پروٹین فولڈنگ کا مطالعہ کرنے کے لیے تجرباتی تکنیکیں پروٹین کے بتدریج سامنے آنے یا فولڈنگ اور معیاری غیر کرسٹلگرافک تکنیکوں کا استعمال کرتے ہوئے تشخیصی تبدیلیوں کے مشاہدے پر انحصار کرتی ہیں۔ ایکس رے کرسٹلگرافی فولڈڈ پروٹین کی تین جہتی ترتیب کو سمجھنے کی کوشش کے لیے ایک زیادہ موثر اور اہم طریقہ ہے۔ ایکس رے کرسٹلگرافی کرنے کے قابل ہونے کے لیے، زیر تفتیش پروٹین کو کرسٹل جالی کے اندر واقع ہونا چاہیے۔ کرسٹل لیٹس کے اندر پروٹین رکھنے کے لیے، کسی کے پاس کرسٹلائزیشن کے لیے موزوں سالوینٹ ہونا چاہیے، حل میں سپرسیچوریٹڈ سطح پر خالص پروٹین حاصل کرنا چاہیے، اور حل میں کرسٹل کو تیز کرنا چاہیے۔ ایک بار جب کسی پروٹین کو کرسٹلائز کیا جاتا ہے، تو ایکس رے بیم کو کرسٹل لیٹس کے ذریعے مرتکز کیا جا سکتا ہے جو بیم کو منتشر کرے گا یا انہیں مختلف سمتوں میں باہر کی طرف گولی مار دے گا۔ یہ باہر نکلنے والی بیم اندر سے منسلک پروٹین کی مخصوص تین جہتی ترتیب سے متعلق ہیں۔ ایکس رے خاص طور پر پروٹین کرسٹل لیٹس کے اندر انفرادی ایٹموں کے ارد گرد الیکٹران بادلوں کے ساتھ تعامل کرتے ہیں اور ایک قابل فہم ڈفریکشن پیٹرن تیار کرتے ہیں۔ صرف الیکٹران کثافت کے بادلوں کو ایکس رے کے طول و عرض سے جوڑ کر ہی اس نمونے کو پڑھا جا سکتا ہے اور اس میں شامل مراحل یا مرحلے کے زاویوں کے مفروضوں کی طرف لے جا سکتا ہے جو اس طریقہ کو پیچیدہ بناتے ہیں۔ ریاضیاتی بنیاد کے ذریعے قائم کردہ تعلق کے بغیر جسے فورئیر ٹرانسفارم کہا جاتا ہے، "فیز مسئلہ" تفریق کے نمونوں کی پیش گوئی کو بہت مشکل بنا دے گا۔ متعدد آئسومورفس متبادل جیسے ابھرتے ہوئے طریقے ایک بھاری دھات آئن کی موجودگی کا استعمال کرتے ہیں تاکہ ایکس رے کو زیادہ پیش گوئی کے انداز میں پھیلایا جا سکے، اس میں شامل متغیرات کی تعداد کو کم کیا جا سکے اور مرحلے کے مسئلے کو حل کیا جا سکے۔ فلوروسینس سپیکٹروسکوپی پروٹین کی فولڈنگ حالت کا مطالعہ کرنے کے لیے ایک انتہائی حساس طریقہ ہے۔ تین امینو ایسڈ، فینائلالینائن (فی)، ٹائروسین (ٹائر) اور ٹرپٹوفین (ٹی آر پی)، اندرونی فلوروسینس کی خصوصیات رکھتے ہیں، لیکن صرف ٹائر اور ٹی آر پی کو تجرباتی طور پر استعمال کیا جاتا ہے کیونکہ ان کی کوانٹم پیداوار اچھی فلوروسینس سگنل دینے کے لیے کافی زیادہ ہوتی ہے۔ ٹی آر پی اور ٹائر دونوں 280 این ایم کی طول موج سے پرجوش ہیں، جبکہ صرف ٹی آر پی 295 این ایم کی طول موج سے پرجوش ہے۔ ان کے خوشبودار کردار کی وجہ سے، ٹرپ اور ٹائر کے باقیات اکثر پروٹین کے ہائیڈروفوبک کور میں، دو پروٹین ڈومینز کے درمیان انٹرفیس پر، یا اولیگومیرک پروٹین کی ذیلی اکائیوں کے درمیان انٹرفیس پر مکمل یا جزوی طور پر دفن پائے جاتے ہیں۔ اس غیر قطبی ماحول میں، ان کی کوانٹم پیداوار زیادہ ہوتی ہے اور اس وجہ سے فلوروسینس کی شدت زیادہ ہوتی ہے۔ پروٹین کی ترتیری یا چوتھائی ساخت میں خلل پڑنے پر، یہ سائیڈ چین سالوینٹ کے ہائیڈروفیلک ماحول کے زیادہ سامنے آ جاتے ہیں، اور ان کی کوانٹم پیداوار کم ہو جاتی ہے، جس کی وجہ سے فلوروسینس کی شدت کم ہو جاتی ہے۔ ٹی آر پی کے باقیات کے لیے، ان کے زیادہ سے زیادہ فلوروسینس کے اخراج کی طول موج بھی ان کے ماحول پر منحصر ہوتی ہے۔ فلوروسینس سپیکٹروسکوپی کا استعمال فلوروسینس کے اخراج کی شدت میں یا زیادہ سے زیادہ اخراج کی طول موج میں تغیر کی پیمائش کرکے پروٹین کے توازن کو ظاہر کرنے کی خصوصیت کے لیے کیا جا سکتا ہے۔ ڈی نیچرانٹ ایک کیمیائی مالیکیول (یوریا، گوانیڈینیم ہائیڈروکلورائڈ)، درجہ حرارت، پی ایچ، دباؤ وغیرہ ہو سکتا ہے۔ مختلف لیکن مجرد پروٹین ریاستوں کے درمیان توازن، یعنی۔ مقامی حالت، انٹرمیڈیٹ اسٹیٹس، انفلڈ اسٹیٹ، ڈی نیچرانٹ ویلیو پر منحصر ہے ؛ لہذا، ان کے توازن کے مرکب کا گلوبل فلوروسینس سگنل بھی اس ویلیو پر منحصر ہے۔ اس طرح ایک پروفائل حاصل ہوتا ہے جو عالمی پروٹین سگنل سے ڈی نیچورینٹ ویلیو سے متعلق ہوتا ہے۔ توازن بے نقاب ہونے کا خاکہ کسی کو بے نقاب ہونے کے انٹرمیڈیٹس کا پتہ لگانے اور ان کی شناخت کرنے کے قابل بنا سکتا ہے۔ عام مساوات کو ہیوگس بیڈویل نے تھرموڈینامک پیرامیٹرز حاصل کرنے کے لیے تیار کیا ہے جو ہومومیرک یا ہیٹرومیرک پروٹین کے لیے بے نقاب توازن کی خصوصیت رکھتے ہیں، اس طرح کے پروفائلز سے ٹرائمرز اور ممکنہ طور پر ٹیٹریمرز تک۔ فلوروسینس سپیکٹروسکوپی کو تیزی سے اختلاط کرنے والے آلات جیسے کہ رکے ہوئے بہاؤ کے ساتھ جوڑا جا سکتا ہے، تاکہ پروٹین فولڈنگ کینیٹکس کی پیمائش کی جا سکے، شیورون پلاٹ تیار کیا جا سکے اور فائی ویلیو تجزیہ حاصل کیا جا سکے۔ سرکلر ڈائکروزم پروٹین فولڈنگ کا مطالعہ کرنے کے لیے سب سے عام اور بنیادی ٹولز میں سے ایک ہے۔ سرکلر ڈائکروزم سپیکٹروسکوپی سرکلر پولرائزڈ روشنی کے جذب کی پیمائش کرتی ہے۔ پروٹین میں، ڈھانچے جیسے الفا ہیلیکس اور بیٹا شیٹس چیرل ہوتے ہیں، اور اس طرح اس طرح کی روشنی کو جذب کرتے ہیں۔ اس روشنی کا جذب پروٹین کے مجموعے کے جوڑنے کی ڈگری کے نشان کے طور پر کام کرتا ہے۔ اس تکنیک کا استعمال پروٹین کے توازن کو ظاہر کرنے کی پیمائش کرنے کے لیے اس جذب میں تبدیلی کی پیمائش ڈی نیچرانٹ ارتکاز یا درجہ حرارت کے فنکشن کے طور پر کی گئی ہے۔ ایک ڈی نیچرانٹ پگھلنے سے بے نقاب ہونے کی آزاد توانائی کے ساتھ ساتھ پروٹین کی ایم ویلیو، یا ڈی نیچرانٹ انحصار کی پیمائش ہوتی ہے۔ درجہ حرارت کا پگھلنا پروٹین کے ڈی نیچوریشن درجہ حرارت (ٹی ایم) کی پیمائش کرتا ہے۔ جہاں تک فلوروسینس سپیکٹروسکوپی کا تعلق ہے، سرکلر ڈائکروزم سپیکٹروسکوپی کو تیزی سے اختلاط کرنے والے آلات کے ساتھ جوڑا جا سکتا ہے جیسے کہ پروٹین فولڈنگ کینیٹکس کی پیمائش کرنے اور شیورون پلاٹ تیار کرنے کے لیے اسٹاپ فلو۔ پروٹین کا وائبریشنل سرکلر ڈائکروزم پروٹین کے لیے وائبریشنل سرکلر ڈائکروزم (وی سی ڈی) تکنیک کی حالیہ پیش رفت، جس میں فی الحال فورئیر ٹرانسفارم (ایف ٹی) آلات شامل ہیں، حل میں پروٹین کی تشکیل کا تعین کرنے کے لیے طاقتور ذرائع فراہم کرتے ہیں یہاں تک کہ بہت بڑے پروٹین مالیکیولز کے لیے بھی۔ پروٹین کے اس طرح کے وی سی ڈی مطالعات کو پروٹین کرسٹل کے لیے ایکس رے ڈفریکشن ڈیٹا، بھاری پانی میں پروٹین کے حل کے لیے ایف ٹی-آئی آر ڈیٹا (ڈی 2 او)، یا کوانٹم کمپیوٹیشن کے ساتھ جوڑا جا سکتا ہے۔ پروٹین نیوکلیئر مقناطیسی گونج سپیکٹروسکوپی پروٹین نیوکلیئر مقناطیسی گونج (این ایم آر) متمرکز پروٹین کے نمونوں کے ذریعے مقناطیسی میدان کو متاثر کرکے پروٹین ساختی ڈیٹا اکٹھا کرنے کے قابل ہے۔ این ایم آر میں، کیمیائی ماحول کے لحاظ سے، بعض مرکزے مخصوص ریڈیو تعدد کو جذب کریں گے۔ چونکہ پروٹین کی ساختی تبدیلیاں این ایس سے ایم ایس تک کے ٹائم اسکیل پر کام کرتی ہیں، این ایم آر خاص طور پر پی ایس سے ایس تک کے ٹائم اسکیل میں انٹرمیڈیٹ ڈھانچوں کا مطالعہ کرنے کے لیے لیس ہے۔ پروٹین کی ساخت اور غیر فولڈنگ پروٹین ساختی تبدیلیوں کا مطالعہ کرنے کے لیے کچھ اہم تکنیکوں میں سی او ایس وائی، ٹی او سی ایس وائی، ایچ ایس کیو سی، ٹائم ریلیشن (ٹی 1 اور ٹی 2)، اور این او ای شامل ہیں۔ این او ای خاص طور پر مفید ہے کیونکہ مقامی طور پر پراکسیمل ہائیڈروجن کے درمیان مقناطیسی منتقلی کا مشاہدہ کیا جا سکتا ہے۔ مختلف این ایم آر تجربات میں ٹائم اسکیل حساسیت کی مختلف ڈگریاں ہوتی ہیں جو مختلف پروٹین ساختی تبدیلیوں کے لیے موزوں ہیں۔ این او ای بانڈ کمپن یا سائیڈ چین گردش کو اٹھا سکتا ہے، تاہم، این او ای پروٹین فولڈنگ کو اٹھانے کے لیے بہت حساس ہے کیونکہ یہ بڑے ٹائم اسکیل پر ہوتا ہے۔ کیونکہ پروٹین فولڈنگ تقریبا 50 سے 3000 سیکنڈ −1 سی پی ایم جی میں ہوتی ہے۔ آرام دہ منتشر اور کیمیائی تبادلے کی سنترپتی کی منتقلی فولڈنگ کے این ایم آر تجزیہ کے لیے کچھ بنیادی تکنیکیں بن گئی ہیں۔ اس کے علاوہ، دونوں تکنیکوں کو پروٹین فولڈنگ زمین کی تزئین میں پرجوش درمیانی حالتوں کو بے نقاب کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ ایسا کرنے کے لیے، سی پی ایم جی ریلیکسشن ڈسپریشن اسپن ایکو رجحان سے فائدہ اٹھاتا ہے۔ یہ تکنیک ہدف کے مرکزے کو 90 پلس کے بعد ایک یا زیادہ 180 پلس کے سامنے لاتی ہے۔ نیوکلئی ری فوکس کے طور پر، ایک وسیع تقسیم اس بات کی نشاندہی کرتی ہے کہ ہدف نیوکلئی انٹرمیڈیٹ پرجوش حالت میں شامل ہے۔ ریلیکسشن ڈسپریشن پلاٹس کو دیکھ کر ڈیٹا تھرموڈینامکس اور متحرک اور زمین کے درمیان حرکیات کے بارے میں معلومات اکٹھا کرتا ہے۔ سیچوریشن ٹرانسفر زمینی حالت سے سگنل میں تبدیلیوں کی پیمائش کرتا ہے کیونکہ پرجوش ریاستیں پریشان ہو جاتی ہیں۔ یہ کسی خاص مرکزے کی پرجوش حالت کو مکمل کرنے کے لیے کمزور ریڈیو فریکوئنسی تابکاری کا استعمال کرتا ہے جو اس کی سنترپتی کو زمینی حالت میں منتقل کرتا ہے۔ اس سگنل کو زمینی حالت کی مقناطیسیت (اور سگنل) کو کم کرکے بڑھایا جاتا ہے۔ این ایم آر میں اہم حدود یہ ہیں کہ اس کی ریزولوشن 25 کے ڈی اے سے بڑے پروٹین کے ساتھ کم ہوتی ہے اور ایکس رے کرسٹلگرافی کی طرح تفصیلی نہیں ہوتی ہے۔ مزید برآں، پروٹین این ایم آر تجزیہ کافی مشکل ہے اور ایک ہی این ایم آر سپیکٹرم سے متعدد حل پیش کر سکتا ہے۔ پروٹین ایس او ڈی 1 میں شامل ایک امییوٹروفک لیٹرل سکلیروسیس کے فولڈنگ پر مرکوز ایک مطالعہ میں، پرجوش انٹرمیڈیٹس کا مطالعہ نرمی کے پھیلاؤ اور سیچوریشن ٹرانسفر کے ساتھ کیا گیا۔ ایس او ڈی 1 کو پہلے بہت سی بیماریوں کا سبب بننے والے میوٹینٹس سے جوڑا گیا تھا جن کے بارے میں خیال کیا جاتا تھا کہ وہ پروٹین جمع کرنے میں ملوث ہیں، تاہم طریقہ کار ابھی تک نامعلوم تھا۔ ریلیکسشن ڈسپریشن اور سیچوریشن ٹرانسفر کے تجربات کا استعمال کرتے ہوئے بہت سی پرجوش انٹرمیڈیٹ ریاستوں کو ایس او ڈی 1 میوٹینٹس میں غلط فولڈنگ کا پتہ چلا۔ ڈوئل پولرائزیشن انٹرفیرومیٹری سالماتی تہوں کی نظری خصوصیات کی پیمائش کے لیے سطح پر مبنی ایک تکنیک ہے۔ جب پروٹین فولڈنگ کی خصوصیت کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، تو یہ ذیلی اینگسٹروم ریزولوشن پر حقیقی وقت میں پروٹین کی یک پرت کے مجموعی سائز اور اس کی کثافت کا تعین کرکے تشکیل کی پیمائش کرتا ہے، حالانکہ پروٹین فولڈنگ کی حرکیات کی حقیقی وقت کی پیمائش ان عملوں تک محدود ہوتی ہے جو ~ 10 ہرٹز سے سست ہوتی ہیں۔ سرکلر ڈائکروزم کی طرح، فولڈنگ کے لیے محرک ایک ڈی نیچرانٹ یا درجہ حرارت ہو سکتا ہے۔ ہائی ٹائم ریزولوشن کے ساتھ فولڈنگ کا مطالعہ حالیہ برسوں میں تیز، وقت سے حل شدہ تکنیکوں کی ترقی کے ذریعے پروٹین فولڈنگ کا مطالعہ بہت آگے بڑھا ہے۔ تجربہ کار تیزی سے بے نقاب پروٹین کے نمونے کی تہہ کو متحرک کرتے ہیں اور اس کے نتیجے میں پیدا ہونے والی حرکیات کا مشاہدہ کرتے ہیں۔ استعمال میں آنے والی تیز رفتار تکنیکوں میں نیوٹران بکھرنا، حلوں کا الٹرا فاسٹ اختلاط، فوٹو کیمیکل طریقے، اور لیزر ٹمپریچر جمپ سپیکٹروسکوپی شامل ہیں۔ ان تکنیکوں کی ترقی میں تعاون کرنے والے بہت سے سائنسدانوں میں جیریمی کک، ہینرک روڈر، ہیری گرے، مارٹن گروبیلے، برائن ڈائر، ولیم ایٹن، شینا ریڈ فورڈ، کرس ڈوبسن، ایلن فرشٹ، بینگٹ نولٹنگ اور لارز کونرمین شامل ہیں۔ پروٹیولیسس کا استعمال باقاعدگی سے حل کے حالات کی ایک وسیع رینج کے تحت سامنے آنے والے حصے کی تحقیقات کے لیے کیا جاتا ہے (مثال کے طور پر۔ تیز متوازی پروٹیولیسس (ایف اے ایس ٹی پی پی)۔ سنگل مالیکیول فورس سپیکٹروسکوپی سنگل مالیکیول تکنیک جیسے آپٹیکل ٹوئیزر اور اے ایف ایم کا استعمال الگ تھلگ پروٹین کے پروٹین فولڈنگ میکانزم کے ساتھ ساتھ چیپرونز کے ساتھ پروٹین کو سمجھنے کے لیے کیا گیا ہے۔ آپٹیکل ٹوئیزر کا استعمال ان کے سی-اور این-ٹرمینی سے واحد پروٹین مالیکیولز کو پھیلانے اور انہیں پھیلانے کے لیے کیا گیا ہے تاکہ بعد میں دوبارہ فولڈنگ کا مطالعہ کیا جا سکے۔ یہ تکنیک کسی کو واحد سالمے کی سطح پر فولڈنگ کی شرح کی پیمائش کرنے کی اجازت دیتی ہے۔ مثال کے طور پر، خون کے جمنے میں شامل پروٹین کی فولڈنگ اور انفلڈنگ کا مطالعہ کرنے کے لیے حال ہی میں آپٹیکل ٹوئیزر کا استعمال کیا گیا ہے۔ وان ولی برانڈ فیکٹر (وی ڈبلیو ایف) ایک پروٹین ہے جس کا خون کے جمنے کی تشکیل کے عمل میں لازمی کردار ہے۔ اس نے دریافت کیا-سنگل مالیکیول آپٹیکل ٹوئیزر کی پیمائش کا استعمال کرتے ہوئے-کہ کیلشیم سے منسلک وی ڈبلیو ایف خون میں شیر فورس سینسر کے طور پر کام کرتا ہے۔ شیر فورس وی ڈبلیو ایف کے اے 2 ڈومین کو بے نقاب کرنے کا باعث بنتی ہے، جس کی ریفولڈنگ کی شرح کیلشیم کی موجودگی میں ڈرامائی طور پر بڑھ جاتی ہے۔ حال ہی میں، یہ بھی دکھایا گیا ہے کہ سادہ ایس آر سی ایس ایچ 3 ڈومین طاقت کے تحت متعدد بے نقاب راستوں تک رسائی حاصل کرتا ہے۔ بائیوٹن پینٹنگ بائیوٹن پینٹنگ (غیر) فولڈڈ پروٹین کی حالت سے متعلق مخصوص سیلولر سنیپ شاٹس کو قابل بناتی ہے۔ بائیوٹن 'پینٹنگ' پیش گوئی شدہ اندرونی طور پر بے ترتیب پروٹین کی طرف تعصب ظاہر کرتی ہے۔ پروٹین فولڈنگ کے کمپیوٹیشنل مطالعات میں پروٹین استحکام، حرکیات اور ساخت کی پیش گوئی سے متعلق تین اہم پہلو شامل ہیں۔ 2013 کا ایک جائزہ پروٹین فولڈنگ کے لیے دستیاب کمپیوٹیشنل طریقوں کا خلاصہ پیش کرتا ہے۔ لیونتھال کا تضاد 1969 میں، خورس لیونتھال نے نوٹ کیا کہ، ایک بے نقاب پولی پیپٹائڈ سلسلہ میں ڈگری آف فریڈم کی بہت بڑی تعداد کی وجہ سے، اس سالمے میں ممکنہ تشکیلات کی فلکیاتی تعداد ہوتی ہے۔ ان کے ایک مقالے میں 3300 یا 10143 کا تخمینہ لگایا گیا تھا۔ لیونتھلز پیراڈوکس ایک نظریاتی تجربہ ہے جو اس مشاہدے پر مبنی ہے کہ اگر کسی پروٹین کو تمام ممکنہ تشکیلات کے ترتیب وار نمونے لے کر جوڑ دیا جائے تو ایسا کرنے میں فلکیاتی وقت لگے گا، چاہے تشکیلات کا نمونہ تیز رفتار سے لیا جائے (نینو سیکنڈ یا پیکو سیکنڈ پیمانے پر)۔ اس مشاہدے کی بنیاد پر کہ پروٹین اس سے کہیں زیادہ تیزی سے فولڈ ہوتے ہیں، لیونتھال نے پھر تجویز پیش کی کہ بے ترتیب تشکیلی تلاش نہیں ہوتی ہے، اور اس لیے پروٹین کو میٹا مستحکم انٹرمیڈیٹ اسٹیٹس کی ایک سیریز کے ذریعے فولڈ ہونا چاہیے۔ پروٹین فولڈنگ کا توانائی کا منظر فولڈنگ کے دوران پروٹین کی ترتیب کی جگہ کو توانائی کے منظر نامے کے طور پر دیکھا جا سکتا ہے۔ جوزف برینجلسن اور پیٹر وولینس کے مطابق، پروٹین کم سے کم مایوسی کے اصول پر عمل کرتے ہیں، جس کا مطلب ہے کہ قدرتی طور پر تیار شدہ پروٹینوں نے اپنے فولڈنگ توانائی کے مناظر کو بہتر بنایا ہے، اور اس فطرت نے امینو ایسڈ کے سلسلے کا انتخاب کیا ہے تاکہ پروٹین کی فولڈنگ حالت کافی مستحکم ہو۔ اس کے علاوہ، فولڈڈ اسٹیٹ کے حصول کو کافی تیز رفتار عمل بننا پڑا۔ اگرچہ فطرت نے پروٹین میں مایوسی کی سطح کو کم کر دیا ہے، لیکن اس کا کچھ حصہ اب تک باقی ہے جیسا کہ پروٹین کے توانائی کے منظر نامے میں مقامی منیما کی موجودگی میں دیکھا جا سکتا ہے۔ ان ارتقائی طور پر منتخب کردہ ترتیبات کا نتیجہ یہ ہے کہ پروٹینوں کے بارے میں عام طور پر یہ خیال کیا جاتا ہے کہ وہ عالمی سطح پر "توانائی کے مناظر" (ایک اصطلاح جو جوس اونوچک نے وضع کی ہے) رکھتے ہیں جو بڑی حد تک مقامی ریاست کی طرف ہوتے ہیں۔ یہ "فولڈنگ فنل" زمین کی تزئین پروٹین کو کسی ایک میکانزم تک محدود رہنے کے بجائے کسی بھی بڑی تعداد میں راستوں اور انٹرمیڈیٹس کے ذریعے مقامی ریاست میں جوڑنے کی اجازت دیتی ہے۔ اس نظریہ کو ماڈل پروٹین کے کمپیوٹیشنل تخروپن اور تجرباتی مطالعات دونوں کی حمایت حاصل ہے، اور اسے پروٹین کی ساخت کی پیش گوئی اور ڈیزائن کے طریقوں کو بہتر بنانے کے لیے استعمال کیا گیا ہے۔ فری انرجی زمین کی تزئین کی طرف سے پروٹین فولڈنگ کی تفصیل بھی تھرموڈینامکس کے دوسرے قانون کے مطابق ہے۔ جسمانی طور پر، جغرافیائی مناظر کی بجائے محض میکسیما، سیڈل پوائنٹس، منیما، اور فنلز کے ساتھ بصری صلاحیت یا کل توانائی کی سطحوں کے لحاظ سے مناظر کے بارے میں سوچنا شاید تھوڑا گمراہ کن ہے۔ متعلقہ تفصیل واقعی ایک اعلی جہتی مرحلے کی جگہ ہے جس میں کئی گنا زیادہ پیچیدہ ٹپوولوجیکل شکلیں لے سکتے ہیں۔ بے نقاب پولی پیپٹائڈ سلسلہ فنل کے اوپری حصے سے شروع ہوتا ہے جہاں یہ بے نقاب تغیرات کی سب سے بڑی تعداد کو فرض کر سکتا ہے اور اپنی اعلی ترین توانائی کی حالت میں ہوتا ہے۔ اس طرح کے توانائی کے مناظر اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ ابتدائی امکانات کی ایک بڑی تعداد موجود ہے، لیکن صرف ایک مقامی ریاست ممکن ہے ؛ تاہم، یہ متعدد فولڈنگ راستوں کو ظاہر نہیں کرتا ہے جو ممکن ہیں۔ ایک ہی عین مطابق پروٹین کا ایک مختلف مالیکیول معمولی طور پر مختلف فولڈنگ راستوں پر عمل کرنے کے قابل ہو سکتا ہے، مختلف کم توانائی کے انٹرمیڈیٹس کی تلاش میں، جب تک کہ ایک ہی مقامی ساخت تک پہنچ جائے۔ مختلف راستوں میں استعمال کی مختلف تعدد ہو سکتی ہیں جو ہر راستے کی تھرموڈینامک موافقیت پر منحصر ہوتی ہیں۔ اس کا مطلب یہ ہے کہ اگر ایک راستہ دوسرے کے مقابلے میں تھرموڈینامک طور پر زیادہ سازگار پایا جاتا ہے، تو اس کے مقامی ڈھانچے کے تعاقب میں زیادہ کثرت سے استعمال ہونے کا امکان ہے۔ جیسے جیسے پروٹین فولڈ ہونا شروع ہوتا ہے اور اپنی مختلف شکلیں اختیار کرتا ہے، یہ ہمیشہ پہلے سے زیادہ تھرموڈینامک طور پر سازگار ڈھانچہ تلاش کرتا ہے اور اس طرح انرجی فنل کے ذریعے جاری رہتا ہے۔ ثانوی ڈھانچوں کی تشکیل پروٹین کے اندر استحکام میں اضافے کا ایک مضبوط اشارہ ہے، اور پولی پیپٹائڈ ریڑھ کی ہڈی کے ذریعہ فرض کردہ ثانوی ڈھانچوں کے صرف ایک مجموعہ میں سب سے کم توانائی ہوگی اور اس وجہ سے پروٹین کی مقامی حالت میں موجود ہوگی۔ پولی پیپٹائڈ کے فولڈ ہونے کے بعد بننے والے پہلے ڈھانچوں میں الفا ہیلیکس اور بیٹا موڑ شامل ہیں، جہاں الفا ہیلیکس 100 نینو سیکنڈ میں بن سکتے ہیں اور بیٹا 1 مائیکرو سیکنڈ میں بدل سکتا ہے۔ انرجی فنل زمین کی تزئین میں ایک سیڈل پوائنٹ موجود ہے جہاں کسی خاص پروٹین کی منتقلی کی حالت پائی جاتی ہے۔ انرجی فنل ڈایگرام میں منتقلی کی حالت وہ تشکیل ہے جسے اس پروٹین کے ہر مالیکیول کے ذریعہ فرض کیا جانا چاہیے اگر پروٹین آخر کار مقامی ساخت کو قبول کرنا چاہتا ہے۔ کوئی بھی پروٹین پہلے منتقلی کی حالت سے گزرے بغیر مقامی ساخت کو قبول نہیں کر سکتا ہے۔ منتقلی کی حالت کو صرف ایک اور درمیانی قدم کے بجائے مقامی ریاست کی متغیر یا قبل از وقت شکل کہا جا سکتا ہے۔ منتقلی کی حالت کی تہہ کو شرح کا تعین کرنے والا دکھایا گیا ہے، اور اگرچہ یہ مقامی تہہ سے زیادہ توانائی کی حالت میں موجود ہے، یہ مقامی ساخت سے بہت ملتا جلتا ہے۔ منتقلی کی حالت کے اندر، ایک نیوکلئس موجود ہوتا ہے جس کے ارد گرد پروٹین جوڑنے کے قابل ہوتا ہے، جو ایک ایسے عمل سے بنتا ہے جسے "نیوکلیئشن کنڈینسیشن" کہا جاتا ہے جہاں ساخت نیوکلئس پر گرنے لگتی ہے۔ کمپیوٹیشنل پروٹین ڈھانچے کی پیش گوئی کے لیے پروٹین فولڈنگ ڈی نووو یا اے بی انیٹیو تکنیک کی ماڈلنگ کو پروٹین فولڈنگ کے مختلف پہلوؤں کی تقلید کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ سالماتی حرکیات (ایم ڈی) کا استعمال سلیکو میں پروٹین فولڈنگ اور حرکیات کے تخروپن میں کیا گیا تھا۔ پہلا توازن فولڈنگ سیمولیشن امپلیسیٹ سالوینٹ ماڈل اور امبریلا سیمپلنگ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ کمپیوٹیشنل لاگت کی وجہ سے، واضح پانی کے ساتھ ایم ڈی فولڈنگ سمیلیشن پیپٹائڈز اور بہت چھوٹے پروٹین تک محدود ہیں۔ بڑے پروٹین کے ایم ڈی سمیلیشن تجرباتی ڈھانچے کی حرکیات یا اس کے اعلی درجہ حرارت کے سامنے آنے تک محدود رہتے ہیں۔ طویل مدتی فولڈنگ کے عمل (تقریبا 1 ملی سیکنڈ سے آگے)، جیسے چھوٹے سائز کے پروٹین (تقریبا 50 باقیات) یا اس سے بڑے کے فولڈنگ، تک موٹے دانے والے ماڈلز کا استعمال کرتے ہوئے رسائی حاصل کی جا سکتی ہے۔ کئی بڑے پیمانے کے کمپیوٹیشنل پروجیکٹس، جیسے کہ Rosetta@home، Folding@home اور فولڈٹ، پروٹین فولڈنگ کو ہدف بناتے ہیں۔ انٹون پر طویل مسلسل-ٹریجیکٹوری سمیلیشنز انجام دی گئی ہیں، جو ایک بڑے پیمانے پر متوازی سپر کمپیوٹر ہے جسے ڈی ای شا ریسرچ نے اپنی مرضی کے مطابق اے ایس آئی سی اور انٹر کنیکٹس کے ارد گرد ڈیزائن اور بنایا ہے۔ اینٹون کا استعمال کرتے ہوئے انجام دی گئی تخروپن کا سب سے طویل شائع شدہ نتیجہ 355 K پر این ٹی ایل 9 کا 2.936 ملی سیکنڈ تخروپن ہے۔ تخروپن فی الحال چھوٹے (<150 امینو ایسڈ کے باقیات) پروٹین کو بے نقاب کرنے اور دوبارہ جوڑنے کے قابل ہیں اور پیش گوئی کرتے ہیں کہ تغیرات فولڈنگ حرکیات اور استحکام کو کس طرح متاثر کرتے ہیں۔ 2020 میں محققین کی ایک ٹیم جس نے ڈیپ مائنڈ کے تیار کردہ مصنوعی ذہانت (اے آئی) پروگرام الفا فولڈ کا استعمال کیا، نے سی اے ایس پی میں پہلا مقام حاصل کیا۔ ٹیم نے کسی بھی دوسرے گروپ کے مقابلے میں بہت زیادہ درستگی حاصل کی۔ اس نے سی اے ایس پی کے گلوبل ڈسٹنس ٹیسٹ (جی ڈی ٹی) میں تقریبا دو تہائی پروٹین کے لیے 90 سے اوپر اسکور کیا، یہ ایک ایسا ٹیسٹ ہے جو اس ڈگری کی پیمائش کرتا ہے جس تک ایک کمپیوٹیشنل پروگرام کی پیش گوئی کی گئی ساخت لیب کے تجربے کے طے شدہ ڈھانچے سے ملتی جلتی ہے، جس میں 100 ایک مکمل میچ ہے، جی ڈی ٹی کا حساب لگانے کے لیے استعمال ہونے والے فاصلے کے کٹ آف کے اندر۔ سی اے ایس پی میں الفا فولڈ کے پروٹین ڈھانچے کی پیش گوئی کے نتائج کو "تبدیلی" اور "حیران کن" کے طور پر بیان کیا گیا۔ کچھ محققین نے نوٹ کیا کہ اس کی پیش گوئیوں کے ایک تہائی حصے کے لیے درستگی اتنی زیادہ نہیں ہے، اور یہ کہ یہ پروٹین فولڈنگ کے مسئلے کو حل کرنے کے لیے پروٹین فولڈنگ کے طریقہ کار یا اصولوں کو ظاہر نہیں کرتا ہے۔ اس کے باوجود، اسے کمپیوٹیشنل حیاتیات میں ایک اہم کامیابی اور حیاتیات کے کئی دہائیوں پرانے عظیم چیلنج کی طرف بڑی پیش رفت سمجھا جاتا ہے۔ شیورون پلاٹ ڈینیچوریشن مڈپوائنٹ ڈاؤن ہیل فولڈنگ (کیمسٹری) فائی ویلیو تجزیہ پروٹین کی ممکنہ توانائی پروٹین ڈائنامکس پروٹین غلط فولڈنگ سائیکلک ایمپلیفکیشن پروٹین ڈھانچہ پیشن گوئی سافٹ ویئر پروٹیوپیتھی ٹائم ریزولیوڈ ماس سپیکٹرومیٹری حوالہ جات بیرونی روابط ہیومن پروٹیوم فولڈنگ پروجیکٹ پروٹین ڈھانچہ