Digital transcriptome subtraction
ডিজিটাল ট্রান্সক্রিপ্টোম বিয়োগ (ডি. টি. এস) হল একটি বায়োইনফরমেটিক্স পদ্ধতি যা হোস্ট সিকোয়েন্সের গণনামূলক অপসারণের মাধ্যমে নতুন প্যাথোজেন ট্রান্সক্রিপ্টের উপস্থিতি সনাক্ত করে। ডিটিএস হল ওয়েট-ল্যাব পদ্ধতির প্রতিনিধিত্বমূলক পার্থক্য বিশ্লেষণের (আরডিএ) সরাসরি সিলিকো অ্যানালগ, এবং নিরপেক্ষ উচ্চ-থ্রুপুট সিকোয়েন্সিং এবং হোস্টের একটি উচ্চ-মানের, টীকাযুক্ত রেফারেন্স জিনোমের প্রাপ্যতা দ্বারা সম্ভব হয়েছে। পদ্ধতিটি বিশেষভাবে সংক্রামক রোগের এটিওলজিক্যাল এজেন্ট পরীক্ষা করে এবং ম্যার্কেল সেল পলিওমাভাইরাস আবিষ্কারের জন্য সবচেয়ে বেশি পরিচিত, যা ম্যার্কেল-সেল কার্সিনোমার সন্দেহজনক কার্যকারক এজেন্ট। নতুন রোগজীবাণু আবিষ্কারের জন্য গণনামূলক বিয়োগের ব্যবহার 2002 সালে মায়ারসন ও অন্যান্যরা প্রথম প্রস্তাব করেছিলেন। হিউম্যান এক্সপ্রেসড সিকোয়েন্স ট্যাগ (ই. এস. টি) ডেটাসেট ব্যবহার করে। নীতিগত পরীক্ষার প্রমাণ হিসাবে, মায়ারসন এবং অন্যান্যরা। এটি পোস্ট-ট্রান্সপ্ল্যান্ট লিম্ফোপ্রোলিফারেটিভ ডিসঅর্ডারে (পিটিএলডি) এপস্টাইন-বার ভাইরাস-সংক্রামিত লিম্ফোসাইট ব্যবহার করে একটি সম্ভাব্য পদ্ধতি ছিল। 2007 সালে, "ডিজিটাল ট্রান্সক্রিপ্টোম বিয়োগ" শব্দটি চ্যাং-মুর গ্রুপ দ্বারা উদ্ভাবিত হয়েছিল এবং ম্যার্কেল-সেল কার্সিনোমাতে ম্যার্কেল সেল পলিমাভাইরাস আবিষ্কার করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। এম. সি. ভি আবিষ্কারের সাথে সাথে, এই পদ্ধতিটি এমন একটি ক্ষেত্রে মৃত্যুর কারণ হিসাবে একটি নতুন অ্যারেনাভাইরাসকে জড়িত করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল যেখানে একক দাতার কাছ থেকে অঙ্গ প্রতিস্থাপনের পরপরই তিনজন রোগী একই ধরনের অসুস্থতায় মারা গিয়েছিলেন। পদ্ধতি সি. ডি. এন. এ গ্রন্থাগারের নির্মাণ মানব জিনোমিক ডি. এন. এ নির্মূল করার জন্য ডি. এন. এ. এস-1-এর সাথে চিকিত্সার পরে, প্রাথমিক সংক্রামিত টিস্যু থেকে মোট আর. এন. এ বের করা হয়। মেসেঞ্জার আরএনএ তারপর একটি অলিগো-ডিটি কলাম ব্যবহার করে শুদ্ধ করা হয় যা পলি-এ লেজের সাথে আবদ্ধ হয়, যা বিশেষভাবে প্রতিলিপি করা জিনের উপর পাওয়া একটি সংকেত। র্যান্ডম হেক্সামার প্রাইমিং ব্যবহার করে, রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেস (আরটি) সমস্ত এমআরএনএ-কে সিডিএনএ-তে রূপান্তরিত করে এবং ব্যাকটেরিয়াল ভেক্টরগুলিতে ক্লোন করে। ব্যাকটেরিয়া, সাধারণত ই. কোলাই, তারপর সিডিএনএ ভেক্টর ব্যবহার করে রূপান্তরিত হয় এবং একটি চিহ্নিতকারী ব্যবহার করে নির্বাচন করা হয়, রূপান্তরিত ক্লোনগুলির সংগ্রহ হল সিডিএনএ লাইব্রেরি। এটি টিস্যু এমআরএনএর একটি স্ন্যাপ-শট তৈরি করে যা স্থিতিশীল এবং পরবর্তী পর্যায়ে ক্রমবদ্ধ করা যেতে পারে। ক্রমবিন্যাস এবং গুণমান নিয়ন্ত্রণ সিডিএনএ গ্রন্থাগারকে অবশ্যই গভীরতার সাথে ক্রমবিন্যাস করতে হবে (অর্থাৎ। একটি তাত্ত্বিক বিরল প্যাথোজেন সিকোয়েন্স (টেবিল 1) সনাক্ত করার জন্য, বিশেষত যদি বিদেশী সিকোয়েন্সটি অভিনব হয়। চ্যাং-মুর একাধিক সিকোয়েন্সিং প্ল্যাটফর্ম ব্যবহার করে 200,000 প্রতিলিপি বা তার বেশি গভীরতার সিকোয়েন্সিং সুপারিশ করেন। তারপরে মিথ্যা-ইতিবাচক ফলাফলগুলি হ্রাস করার জন্য কাঁচা ক্রমগুলিতে কঠোর মান নিয়ন্ত্রণ প্রয়োগ করা হয়। প্রাথমিক মানের স্ক্রিনটি উচ্চ-বিশ্বস্ততার (হাই-ফাই) পাঠের একটি ডেটাসেট রেখে দ্ব্যর্থহীন ক্রমগুলি বাদ দেওয়ার জন্য বেশ কয়েকটি সাধারণ পরামিতি ব্যবহার করে। নিম্ন-মানের শেষ ক্রমগুলি অপসারণ করতে নিম্ন ফ্রেড স্কোর কাটঅফ ব্যবহার করা হয়। সাধারণত, প্রতিটি বেস-কলিং-এ 99%-99.9% নির্ভুলতা নিশ্চিত করতে 20 বা 30-এর একটি ফ্রেড স্কোর কাটঅফ ব্যবহার করা হয়। ভেক্টর এবং অ্যাডাপ্টার অপসারণ। কম জটিলতা-একটি ক্রমের জটিলতা স্কোর পলি-ডিটি বা পলি-ডিএ-এর মতো একটি সিরিজের (হোমো-পলিমার) অভিন্ন ঘাঁটির সংখ্যা প্রতিফলিত করে। মানুষের পুনরাবৃত্তিমূলক ডিএনএ। দৈর্ঘ্য-পরামিতিটি ব্যবহৃত সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তির জন্য নির্দিষ্ট অপ্টিমাইজড রিড দৈর্ঘ্যের উপর নির্ভরশীল। বিস্ফোরণ ঘটান এবং ই. কোলাই জিনোম ক্রম বাদ দিন। মেগাব্লাস্ট ব্যবহার করে জিনোম হোস্ট করার জন্য ব্লাস্ট, হাই-ফাই রিডগুলি তারপর অ্যানোটেটেড ডেটাবেসের ক্রমের সাথে মিলিত হয় এবং যে কোনও ইতিবাচক মিলগুলি ডেটাসেট থেকে বাদ দেওয়া হয়। মানব অনুক্রমের একটি ধনাত্মক মিলনের জন্য সর্বনিম্ন হিট দৈর্ঘ্য সাধারণত 30 টি ধারাবাহিক অভিন্ন ঘাঁটি, যা 60 এর একটি ব্লাস্ট স্কোরের সমান; সাধারণত, অবশিষ্ট ক্রমটি সামান্য অসামঞ্জস্যের (20 নিউক্লিওটাইডের মধ্যে 1) অনুমতি দেওয়ার জন্য কম কঠোর পরামিতি সহ আবার ব্লাস্ট হয়। এই পর্যায়ে বেশিরভাগ ক্রম (> 99 শতাংশ) ডেটাসেট থেকে সরিয়ে ফেলা উচিত। বিয়োগ ক্রমগুলির মধ্যে সাধারণত অন্তর্ভুক্ত থাকেঃ রেফারেন্স হিউম্যান ট্রান্সক্রিপ্টোম-এক্সপ্রেশন লাইব্রেরি সেট থেকে যে কোনও পরিচিত হিউম্যান ট্রান্সক্রিপ্টকে বাদ দেয়। রেফারেন্স হিউম্যান জিনোম-সিডিএনএ লাইব্রেরি নির্মাণের সময় টীকা প্রক্রিয়া এবং যে কোনও দূষিত জিনোমিক সিকোয়েন্স দ্বারা মিস হওয়া জিনগুলিকে সরিয়ে দেয়। মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ-মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ দ্রুত পরিবর্তনের হারের কারণে প্রচুর পরিমাণে এবং পলিমরফিক। ইমিউনোগ্লোবুলিন অঞ্চল-ইমিউনোগ্লোবুলিন লোকাই অত্যন্ত পলিমরফিক এবং অন্যথায় রেফারেন্স জিনোমের সাথে দুর্বল সারিবদ্ধতার কারণে মিথ্যা-ইতিবাচক ফল দেয়। অন্যান্য মেরুদণ্ডী সিকোয়েন্স "নন-হোস্ট" প্রার্থীদের অনির্দিষ্ট সিকোয়েন্স বিশ্লেষণ প্যাথোজেন ডেটাবেসের সাথে সারিবদ্ধকরণ বিয়োগের কঠোর রাউন্ডের পরে, অবশিষ্ট সিকোয়েন্সগুলি নন-রিডান্ড্যান্ট কনটিগগুলিতে গুচ্ছবদ্ধ করা হয় এবং কম-স্ট্রিংসি পরামিতি ব্যবহার করে পরিচিত প্যাথোজেন সিকোয়েন্সের সাথে সারিবদ্ধ করা হয়। যেহেতু প্যাথোজেন জিনোমগুলি দ্রুত পরিবর্তিত হয়, নিউক্লিওটাইড-নিউক্লিওটাইড সারিবদ্ধকরণ বা ব্লাস্টন সাধারণত তথ্যহীন কারণ কোডন অবক্ষয়ের কারণে অ্যামিনো অ্যাসিডের অবশিষ্টাংশ পরিবর্তন না করে নির্দিষ্ট ঘাঁটিতে মিউটেশন হওয়া সম্ভব। অ্যামিনো অ্যাসিড সিকোয়েন্সের সাথে সমস্ত 6টি ওপেন রিডিং ফ্রেমের ইন সিলিকো অনুবাদিত প্রোটিন সিকোয়েন্সকে অ্যানোটেটেড প্রোটিন বা ব্লাস্টএক্সের সাথে মেলানো হল পছন্দের সারিবদ্ধকরণ পদ্ধতি কারণ এটি একটি সম্পর্কিত স্ট্রেন/প্রজাতির সাথে মিলে একটি নতুন প্যাথোজেন সনাক্ত করার সম্ভাবনা বাড়ায়। ইতিবাচক মিলনের সম্ভাবনা সর্বাধিক করার জন্য এই পর্যায়ে প্রার্থী অনুক্রমের পরীক্ষামূলক সম্প্রসারণও ব্যবহার করা যেতে পারে। ডি নোভো অ্যাসেম্বলি এমন ক্ষেত্রে যেখানে পরিচিত প্যাথোজেনগুলির সাথে সারিবদ্ধকরণ তথ্যহীন বা অস্পষ্ট, সম্পূর্ণ প্যাথোজেন জিনোম সিকোয়েন্স তৈরি করতে প্রাথমিক সংক্রামিত টিস্যুতে প্রাইমার হাঁটার জন্য প্রার্থী সিকোয়েন্সের কনটিগগুলি টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহার করা যেতে পারে। যেহেতু ভাইরাল প্রতিলিপিগুলি অত্যন্ত বিরল অনুপাতের টিস্যু এমআরএনএ (1 মিলিয়নে 10 টি প্রতিলিপি), তাই কম কভারেজের কারণে শুধুমাত্র মূল প্রার্থী অনুক্রমের উপর ভিত্তি করে একটি প্রতিলিপি তৈরি করার সম্ভাবনা নেই। প্যাথোজেনের বৈধতা একবার উচ্চ-থ্রুপুট সিকোয়েন্সিং ডেটাতে একটি অনুমানমূলক প্যাথোজেন চিহ্নিত হয়ে গেলে, আরও সংবেদনশীল কৌশল ব্যবহার করে সংক্রামিত রোগীদের মধ্যে প্যাথোজেনের উপস্থিতি যাচাই করা আবশ্যক, যেমনঃ আরটি-পিসিআর এবং 3 '-এবং 5'-রেস সহ ডেরিভেটিভ পদ্ধতিগুলি প্যাথোজেন এমআরএনএর অস্তিত্ব নিশ্চিত করতে। ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি টিস্যুতে প্যাথোজেনের অস্তিত্ব নির্ধারণ করতে সম্পর্কিত প্যাথোজেনের অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে। প্যাথোজেন-নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি টাইটার পরিমাপ করার জন্য সেরোলজিকাল পরীক্ষা। ব্যাকটেরিয়াল কালচার/ভাইরাল কালচার, যা পরীক্ষাগার নির্ণয়ের ক্ষেত্রে স্বর্ণমান হিসাবে বিবেচিত হয়। প্রয়োগ ডি. টি. এস-এর প্রাথমিক প্রয়োগটি ক্যান্সারে প্যাথোজেনিক ভাইরাস সনাক্তকরণে রয়েছে। এটি অ-ক্যান্সার সম্পর্কিত রোগে ভাইরাল প্যাথোজেন সনাক্ত করতেও ব্যবহার করা যেতে পারে। ভবিষ্যতের ক্লিনিকাল প্রয়োগগুলিতে ব্যক্তিদের মধ্যে নিয়মিত ভিত্তিতে ডি. টি. এস-এর ব্যবহার অন্তর্ভুক্ত থাকতে পারে। ডি. টি. এস কৃষিতেও প্রয়োগ করা যেতে পারে, উৎপাদনের উপর প্রভাব ফেলে এমন প্যাথোজেনগুলি চিহ্নিত করে। গণনা বিয়োগ ইতিমধ্যে একটি মেটাজেনমিক্স গবেষণায় ব্যবহৃত হয়েছিল যা আইএপিভি দ্বারা ভাইরাল সংক্রমণকে মৌমাছির উপনিবেশ পতনের ব্যাধিটির সাথে যুক্ত করেছিল। উপকারিতা প্যাথোজেন ক্রম সম্পর্কে কোনও পূর্ব জ্ঞানের প্রয়োজন হয় না। পূর্বে অসংলগ্ন, সম্ভাব্য নিরাময়যোগ্য প্যাথোজেনগুলি সনাক্ত করতে পারে। ইতিমধ্যেই উপলব্ধ আণবিক পদ্ধতি এবং সম্পদ ব্যবহার করে। অসুবিধাগুলি প্যাথোজেনের উপস্থিতি সনাক্ত করে তবে রোগের সাথে কার্যকারণ সংযোগ স্থাপন করে না। কোচের স্বীকার্য এবং ব্র্যাডফোর্ড হিলের মানদণ্ড দেখুন। অধ্যয়ন করা জীবের জন্য একটি অত্যন্ত নির্ভরযোগ্য, সম্পূর্ণ রেফারেন্স ট্রান্সক্রিপ্টোম থাকতে হবে। ফরেন সিকোয়েন্স সনাক্তকরণের অভাব একটি প্যাথোজেনিক ফরেন বডি সম্পূর্ণরূপে বাদ দিতে পারে না। তথ্যসূত্র বায়োইনফরমেটিক্স