松波基宗之子？、正室為明智光秀的叔母．小見の方、側室為深芳野ほか；幼名峰丸，初名松波庄五郎，繼承長井氏，名為長井規秀；後繼承齋藤氏，名為齋藤利政，號道三，渾名美濃の蝮。
約明應三年（1494年），道三出生於山城國乙訓郡西岡，其父松波基宗是負責天皇皇宮的護衛的北面武士。從小長相美貌而且聰明伶俐。由於爆發應仁之亂而使松波基宗失去俸祿，道三於11歲被迫在京都妙覺寺出家，法名法蓮坊。後還俗稱松波庄五郎（庄九郎），又娶賣油商人奈良屋又兵衛的女兒，改名為山崎屋庄五郎（庄九郎）。據記載道三賣油手法純熟，能將油通過一文錢的方孔注入容器中不使用漏斗而使油不灑出。長井長弘的家臣矢野五左衛門買油時驚異於道三嫻熟的技巧，向道三指出雖然賣油的技術純熟，但終究是商人的技能，如果能將這種技能注入到武藝上，那道三就會成為出色的武士。道三於是棄商從武，熟練的掌握槍的使用。
道三的師弟南陽坊是鷲林山常在寺的主持，他是土岐氏重臣長井利隆的弟弟。經南陽坊的推薦，道三出仕於長井長弘。在長井長弘的推薦下，大永三年（1523年），道三出仕於鷺山城的土岐賴藝。長井氏家老西村正元去世後，道三繼承西村氏，改名為西村（勘九郎）正利。大永五年（1525年），道三得到輕海西城為居城。
當時的美濃國陷入長期的戰亂狀態。前任美濃守護土岐政房的嫡子土岐賴武是家督的繼承者，得到守護代齋藤利良的支持。而晚年土岐政房寵愛次子土岐賴藝，他得到小守護代長井利隆的支持。土岐政房死後，二兄弟因為家督之位展開混戰。第一次衝突發生於永正十四年（1517年），土岐賴武取得勝利，戰敗的土岐賴藝被驅逐至尾張國。次年，聯絡齋藤彥四郎作為內應的土岐賴藝將土岐賴武驅逐至越前國。但土岐賴武是朝倉貞景的女婿，永正十六年（1519年），得到貞景之子朝倉孝景支持的賴武重新返回美濃。經過一段時間的穩定，直到大永五年（1525年），雙方再次開戰，長井長弘和道三奪取美濃守護所福光館和新任守護代齋藤利茂的居城稻葉山城。戰爭持續到大永七年（1527年），土岐賴藝接受道三的建議，派兵奇襲賴武的革手城，賴武戰敗。享祿三年（1530年），在美濃難以立足的土岐賴武再次流亡至越前國，土岐賴藝正式成為美濃守護，長井長弘成為守護代並掌握實權。享祿五年（1532年），道三娶明智光繼之女小見之方為正室。而在享祿三年（1530年）或天文二年（1533年），長井長弘突然被刺客暗殺，事件的主謀就是道三。隨後道三以同門重臣的身份繼承長井氏，改名為長井（新九郎）規秀，成為稻葉山城城主。
戰敗的土岐賴武與其子土岐賴純不甘心失敗，伺機準備反攻。天文四年（1535年），土岐賴藝與得到朝倉氏、六角氏援助的土岐賴武、賴純父子發生大規模衝突，戰火遍及美濃國全境。
天文七年（1538年），原守護代齋藤利良病死，無子嗣位，土岐賴藝命道三入繼，改名為齋藤（新九郎）利政，成為新守護代。次年，道三對稻葉山城進行大規模的擴建。
1960年代在編纂《岐阜縣史》的過程中發現《六角承禎條書》，此書是近江國守護六角義賢寫給平井氏、蒲生氏等家臣的文書，其中記載部分齋藤氏的事跡：
齋藤治部（齋藤義龍）的祖父新左衛門尉是京都妙覺寺的僧侶。
新左衛門尉姓西村，來到美濃仕於長井彌二郎（長井長弘）。
自文書發現以來，過去被視為道三個人事蹟的竊國行為，極有可能是長井新左衛門尉和道三父子兩代所為。
土岐賴武死後，土岐賴純於天文八年（1539年）與土岐賴藝達成和解。但在天文十一年（1542年），在道三的策劃下，土岐賴純的居城大桑城的兩個支城祐向山城和別府城相繼陷落，接著大桑城也落入土岐賴藝之手，土岐賴純再次逃往越前國。土岐賴藝隨後將居城從鷺山城遷往大桑城。
土岐賴藝一度視道三為心腹，甚至在大永六年（1526年）將愛妾深芳野賞賜給道三。但道三為實現自己的竊國大業，於天文十年（1541年）毒殺賴藝之弟土岐賴滿，導致兩人之間直接對抗。在逐漸肅清土岐賴藝的宗族後，天文十一年（1542年），道三出兵襲擊土岐賴藝的居城大桑城，土岐賴藝與其次子土岐賴次被迫流亡至尾張投靠織田信秀，美濃落入道三之手。
道三的竊國行為震驚周邊大名，道三被冠以「美濃的蝮蛇」的綽號。朝倉孝景和織田信秀則分別擁立土岐賴純和土岐賴藝進攻美濃，土岐賴純占據北方城，土岐賴藝占據革手城。道三一方面展開防御，一方面使用外交手腕。天文十五年（1546年），土岐賴純與道三在六角定賴的調解下，雙方以土岐賴藝隱居，土岐賴純接任美濃守護並迎娶道三的女兒為條件達成和解。天文十六年（1547年），織田信秀和朝倉宗滴結盟對付道三，並且聯手攻陷大垣城，之後率軍包圍稻葉山城，但是慘遭到道三的反擊。在加納口之戰時，織田軍慘遭大敗，包括織田信秀的弟弟織田信康在內5000人戰死。同年，土岐賴純突然死亡，幕後黑手為道三，使朝倉孝景失去扶植的對象。天文十七年（1548年），道三將女兒濃姬嫁給織田信秀的嫡子信長，雙方停戰結盟，使土岐賴藝失去後盾。天文二十一年（1552年），土岐賴藝再次被道三流放，被迫流亡於各國，道三徹底完成竊國大業。
天文十七年（1548年），道三希望與織田信秀的關係得到緩和，加上其子是被稱為「尾張大傻瓜」的織田信長，道三便策劃與織田信秀聯姻達成和睦。道三將女兒濃姬嫁給織田信秀的嫡子織田信長，雙方停戰結盟。
天文二十二年（1553年），道三突然決定與新任家督的織田信長於富田正德寺會面，並暗自計劃設下鴻門宴，準備斬殺織田信長奪取尾張。道三命重臣率兵800在寺前列隊，自己卻躲在織田軍必經之路的民宅中窺視信長。織田信長身穿一貫的奇裝異服，梳著茶筅似的頭髮，半開著浴衣似的袖子，大小佩刀用稻草繩卷在腰間，腰上掛著許多小袋子與七八個葫蘆，下身則穿著由半張虎皮與豹皮組合成的短褲裙，率領著700人的足輕、槍、弓和鐵炮部隊前來赴會。但在正德寺會面時，織田信長變裝為端庄的禮服出現在道三面前，令道三大為吃驚。宴會過後道三親自送行織田信長二十町，並對豬子兵助說將來自己的孩子必定會系馬在這個「傻瓜」的門前，成為他的屬下。
天文二十三年（1554年），道三將家督和稻葉山城讓給長子齋藤義龍後在常在寺剃髮出家，號「道三」，自己隱居於鷺山城。但義龍和道三之間關係險惡，傳聞深芳野在土岐賴藝賜給道三之前已經懷有身孕，義龍一直懷疑自己是否為土岐氏一脈，正德寺會面後道三的話更加深二人的矛盾。道三晚年偏愛次子孫四郎和三子喜平次，厭惡「愚蠢」的義龍。義龍決定先下手為強，發動兵變奪取家督。天文二十四年（1555年），義龍以病重為由派叔叔長井道利召弟弟孫四郎、喜平次到稻葉山城，趁二人酒醉時派日根野弘就將他們殺害。義龍又集結17，500人的大軍，以土岐氏正嫡的名義向道三宣戰，而道三則在城下町放火，渡過長良川後在大桑城集結2500人與義龍對峙。
雙方對峙一年後，弘治二年（1556年），道三寫下遺書，將美濃一國讓與女婿織田信長，並要求織田信長出兵救援。5月28日，道三率兵與齋藤義龍決戰於長良川，織田信長得訊後立即出兵營救。道三雖然擊潰義龍先鋒竹腰道塵的進攻，但由於雙方兵力相差懸殊，道三方迅速潰敗。道三被義龍方小真木源太砍傷小腿後討取首級，而怒於被小真木源太搶走功勞的長井忠左衛門則將道三的鼻子削去帶走。後義龍出家法名飯賀，飯賀就是從唐朝傳入日本的故事中弒父並砍下父親首級的人物。