METHOD FOR DESIGNING DNA-BINDING PROTEINS OF THE ZINC-FINGER CLASSThe invention is directed to the design of DNA-binding proteins (DBP's) with capabilities of binding to any predetermined target double-stranded DNA sequence. Disclosed are the rules for design of the proteins; an algorithm for screening for the optimal DBP's; a computer system employing the rules and the algorithm; general formulae encompassing the proteins; and methods of use of the proteins.A method for designing a DBP, with multiple ZF domains connected by linker sequences, that binds selectively to a target DNA sequence within a given gene, each of said ZF domains having the formulaA-XCX2.4CA2A3XFXZ3XXZ2LXZ-HX3.5Hand each of said linkers having the formulawherein(i) X is any amino acid; (ii) X . is a peptide from 2 to 4 amino acids in length; (iii) X3.5 is a peptide from 3 to 5 amino acids in length; (iv) X0-2 is a peptide from 0 to 2 amino acids in length; (iv) Ai is selected from the group consisting of phenylalanine and tyrosine; (v) A2 is selected from the group consisting of glycine and aspartic acid; (vi) A3 is selected from the group consisting of lysine and arginine; (vii) A* is selected from the group consisting of threonine and serine; (viii) A5 is selected from the group consisting glycine and glutamic acid; (ix) A; is selected from the group consisting of lysine and arginine; (x) C is cysteine; (xi) F is phenylalanine; (xii) L is leucine; (xiii) H is histidine; (xiv) E is glutamic acid; (xv) P is proline; and (xvi) Zi, Z2 and Z3 are the base-contacting amino acids, which method comprises an algorithm comprising the steps of:(a) setting a genome to be screened;(b) selecting the target DNA sequence in the genome for binding;(c) setting the number of ZF domains to n<*;(d) dividing the target DNA sequence into nucleotide blocks wherein each block contains nz nucleotides using a first routine where nz is determined using the following relationship: nz = 3na;(e) assigning base-contacting amino acids at Zi, Z2 and Z3 to each ZF domain, according to the A Rules and/or B Rules set forth in Tables 1-3 of the specification, of a DBP which binds to the first nucleotide block from step (d) as numbered from the first 5 ' nucleotide of the target gene sequence to generate a block- specific DBP and calculating the binding energy, Binding Energy block , of each ZF domain of each such block-specific DBP as the product of the binding energies, Binding Energy doman, of all ZF domains of the DBP, each determined using the formula:Binding Energy dom in = (5 x the number of hydrogen bonds) + (2 x the number of H2O contacts) + (the number of hydrophobic contacts);(f) subdividing the DBP from step (d) into blocks using a second routine to generate a subdivided DBP having three ZF domains;(g) screening the subdivided DBP from step (f) against the genome using a third routine to determine the number of binding sites in the genome for each subdivided DBP in the genome and assigning a binding energy for each such site using the following formula:Binding Energy site n = (5 x the number of hydrogen bonds) + (2 x the number of H2O contacts) + (the number of hydrophobic contacts); (h) calculating a ratio of binding energy, Rb, using a fourth routine for each nucleotide block-specific DBP from step (e) using the following formula:Rb = Binding Energy block /the sum of all Binding Energysite n 's for all subdivided DBP's from step (g);(i) repeating steps (f) through (h) for each subdivided DBP wherein nd > 4; (j) repeating steps (d) through (i) for each nucleotide block in the target DNA sequence containing nz nucleotides;(k) rank-ordering Rb numerical values obtained from step (h); and(1) selecting a DBP with an acceptable R value.
아연-핑거 클래스의 ＤＮＡ-결합 단백질의 디자인 방법본 발명은 어떤 예정된 타겟 이중-가닥 DNA 서열에 결합할 수 있는 DNA-결합 단백질(DBP)의 디자인에 관한 것이다. 단백질을 디자인하기 위한 규칙; 최적 DBP를 스크리닝하기 위한 알고리즘; 규칙과 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 시스템; 단백질을 포함하는 일반식; 및 단백질 사용 방법을 개시한다. 링커 서열에 의해 연결된 다중 ZF 도메인을 가지며, 주어진 유전자 내에서 표적 DNA 서열과 선택적으로 결합하는 DBP 디자인 방법으로서, 상기 각 ZF 도메인 은 하기 식을 가지고, A1XCX2-4CA2A3XFXZ3XXZ2LXZ1HX3-5H 상기 각 링커는 하기 식을 가지며, A4A5X0-2EA6P (상기 식에서, (i) X는 아미노산이고; (ii) X2-4는 길이가 2 내지 4 아미노산인 펩티드이고; (iii)X3-5는 길이가 3 내지 5 아미노산인 펩티드이고; (iv) X0-2는 길이가 0 내지 2 아미노산인 펩티드이고; (iv) A1은 페닐알라닌 및 티로신으로 구성된 그룹으로부터 선택되고; (v) A2는 글리신 및 아스파르트산으로 구성된 그룹에서 선택되고, (vi) A3은 리신 및 아르기닌으로 구성된 그룹에서 선택되고, (vii) A4는 트레오닌 및 세린으로 구성된 그룹에서 선택되고, (viii) A5는 글리신 및 글루탐산으로 구성된 그룹에서 선택되고, (ix) A6은 리신 및 아르기닌으로 구성된 그룹에서 선택되고, (x) C는 시스테인이고; (xi) F는 페닐알라닌이고; (xii) L은 류신이고; (xiii) H는 히스티딘이고; (xiv) E는 글루탐산이고; (xv) P는 프롤린이고; 및 (xvi) Z1, Z2 및 Z3는 염기-접촉 아미노산이다.): (a) 스크린될 게놈을 설정하는 단계; (b) 게놈 안에서 결합할 표적 DNA 서열을 선택하는 단계; (c) ZF 도메인의 수를 nd로 설정하는 단계; (d) 표적 DNA 서열을 첫번째 루틴을 이용하여 각 블록이 nz 뉴클레오티드를 함유하도록 뉴클레오티드 블록들로 나누는 단계(여기서, nz는 nz = 3nd 라는 관계식으로 결정됨); (e) 본 명세서의 표 1-3에서 설정된 A 규칙 및/또는 B 규칙에 따라, Z1, Z2 및 Z3에서 염기-접촉 아미노산을, 표적 유전자 서열의 첫번째 5' 뉴클레오티드로부터 계산된 단계 (d)로부터 첫번째 뉴클레오티드 블록에 결합하는 DBP의 각 ZF 도메인으로 할당하여 블록-특이적 DBP를 생성하고, 하기 식으로 각각 결정된 DBP의 모든 ZF 도메인의 결합에너지(결합에너지도메인)의 결과물으로서, 이러한 각 블록-특이적 DBP 각각의 ZF 도메인의 결합에너지(결합에너지블록)를 계산하는 단계: 결합에너지도메인 = (5 x 수소결합의 수) + (2 x H2O 접촉수) + (소수 접촉수) (f) 두번째 루틴을 이용하여 단계(d)로부터의 DBP를 블록으로 세분하여, 세 개의 ZF 도메인을 갖는 세분된 DBP를 생성하는 단계; (g) 세번째 루틴을 이용하여 단계(f)에서 세분된 DBP를 게놈에 대해 스크리닝하여, 게놈 내의 각각의 세분된 DBP에 대하여 게놈 내의 결합 부위의 수를 결정하고, 하기식을 사용하여 이러한 각각의 부위에 대한 결합에너지를 할당하는 단계: 결합에너지부위n = (5 x 수소결합의 수) + (2 x H2O 접촉수) + (소수 접촉수) (h) 네번째 루틴을 이용하여 단계(e)로부터의 각각의 뉴클레오티드 블록-특이적 DBP에 대하여 하기 식에 의해 결합에너지 비(Rb)를 계산하는 단계: Rb = 결합에너지블록/단계(g)로부터 모든 세분된 DBP에 대한 모든 결합에너지부위n의 합; (i) 각각의 세분된 DBP에 대하여 단계(f)에서 (h)를 반복하는 단계(여기서, nd ≥ 4); (j) nz 뉴클레오티드를 함유한 표적 DNA 서열 내의 각각의 뉴클레오티드 블록에 대하여 단계(d)에서 (i)를 반복하는 단계; (k) 단계(h)에서 얻어진 Rb 수치를 순위-정렬하는 단계; (l) 허용가능한 Rb 값을 갖는 DBP를 선택하는 단계 를 포함하여 이루어지는 알고리즘을 포함하여 이루어지는 방법.