SINGLE NUCLEOTIDE DETECTION METHODA method of sequencing a nucleic acid comprising the steps of (1) generating a stream of single nucleotides by progressive pyrophosphorolysis; (2) producing at least one substantially double-stranded oligonucleotide used probe comprising (a) a first single-stranded oligonucleotide labelled with first and second regions of detectable element types and (b) second and third single-stranded oligonucleotides capable of hybridising to complementary regions on the first oligonucleotide; (2a) either (i) treating the used probe with a restriction endonuclease to cut the first oligonucleotide strand at the recognition site or (ii) treating the used probe with restriction endonuclease to cut the first oligonucleotide strand at the recognition site; (3) digesting the first oligonucleotide strand of the used probe with an enzyme ide; (4) reacting the fourth oligonucleotide with another first oligonucleotide to produce a substantially double-stranded oligonucleotide product corresponding to the used probe; (5) repeating the above steps; and (6) detecting the detectable elements.A method of sequencing a nucleic acid comprising the steps of: (a) generating a stream of single nucleotides by progressive pyrophosphorolysis of the nucleic acid;(b) producing at least one substantially double-stranded oligonucleotide used probe by reacting, in the presence of a polymerase and a ligase, one of the single nucleotides with a corresponding probe system comprising: (i) a first single-stranded oligonucleotide labelled with first and second regions of a characteristic detectable element in an undetectable state located respectively on the X′ and Y′ sides of a third region comprising a restriction enzyme recognition site element including a capture site and an exonuclease-blocking site on the X′ side thereof wherein either X′ is 3′ and Y′ is 5′, or X′ is 5′ and Y′ is 3′; and(ii) second and third single-stranded oligonucleotides that hybridize to complementary regions on the first oligonucleotide flanking the capture site;(c) either (iii) treating the used probe with a conventional or nicking substitution-dependent restriction endonuclease to cut the first oligonucleotide strand at the recognition site if and only if the single nucleotide captured comprises a nucleobase which is substituted or(iv) treating the used probe with a conventional or nicking substitution-sensitive restriction endonuclease to cut the first oligonucleotide strand at the recognition site if and only if the single nucleotide captured comprises a nucleobase which is unsubstituted;(d) digesting the first oligonucleotide strand of the used probe with an enzyme having double-stranded exonucleolytic activity in the X′-Y′ direction corresponding to the first oligonucleotide to yield detectable elements derived from either the first region, the second region, or the first and second regions in a detectable state and a single-stranded fourth oligonucleotide which is at least in part the sequence complement of the first oligonucleotide;(e) reacting the fourth oligonucleotide with another first oligonucleotide to produce a substantially double-stranded oligonucleotide product corresponding to the used probe;(f) repeating steps (c), (d) and (e) in a cycle; and(g) detecting the detectable elements released in each iteration of step (d) wherein if the endonuclease employed is of the conventional type the second or third oligonucleotide includes an endonucleolysis-directing linkage at or close to its X′ or Y′ end respectively.
단일 뉴클레오티드 검출 방법본 실시예는, (1) 핵산의 점진적 가피로인산분해에 의해 단일 뉴클레오티드의 스트림을 생성하는 단계; (2) 중합효소 및 리가제의 존재하에 단일 뉴클레오티드 중 하나와 상응하는 프로브 시스템을 반응시키는 것에 의해 하나 이상의 실질적 이중-가닥 올리고뉴클레오티드 사용 프로브를 생산하는 단계로서, 상기 상응하는 프로브 시스템은 (a) 포획 부위를 포함하는 제한 효소 인식 부위 요소 및 그것의 X' 측 상의 엑소뉴클레아제-차단 부위를 포함하는 제3 영역의 X' 및 Y' 말단 측에 각각 위치된 검출 불가능한 상태에서 특징적 검출가능 요소 유형의 제1 및 제2 영역으로 표지된 제1 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 (상기 X'는 3'이고 Y'는 5' 또는 X'는 5'이고 Y'는 3') 및 (b) 포획 부위를 플랭킹하는 제1 올리고뉴클레오티드 상의 상보적 영역에 혼성화할 수 있는 제2 및 제3 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단계; (2a) (i) 상기 사용 프로브를 통상적 또는 니킹 치환-의존 제한 엔도뉴클레아제로 처리하여, 포획된 단일 뉴클레오티드가 치환된 뉴클레오염기를 포함하는 경우에만 인식 부위에서 제1 올리고뉴클레오티드 가닥을 절단하는 단계, 또는 (ii) 상기 사용 프로브를 통상적 또는 니킹 치환-민감 제한 엔도뉴클레아제로 처리하여 포획된 단일 뉴클레오티드가 비치환된 뉴클레오염기를 포함하는 경우에만 인식부위에서 제1 올리고뉴클레오티드 가닥을 절단하는 단계; (3) 상기 사용 프로브의 제1 올리고뉴클레오티드 가닥을 제1 올리고뉴클레오티드에 상응하는 X'-Y' 방향으로 이중-가닥 엑소뉴클레올리틱 활성을 갖는 효소로 분해하여, 검출 가능한 상태에서 제1 영역, 제2 영역, 또는 제1 및 제2 영역 유래의 검출가능 요소 및 적어도 부분적으로 제1 올리고뉴클레오티드의 서열 상보물인 단일-가닥화 제4 올리고뉴클레오티드를 생산하는 단계; (4) 상기 제4 올리고뉴클레오티드를 다른 제1 올리고뉴클레오티드와 반응시켜 상기 사용 프로브에 상응하는 실질적 이중-가닥 올리고뉴클레오티드 산물을 생산하는 단계; (5) 상기 (2a), (3) 및 (4) 단계를 주기적으로 반복하는 단계; 및 (6) 상기 (3) 단계의 각 반복에서 방출된 검출가능 요소를 검출하는 단계로서, 사용된 엔도뉴클레아제가 통상적 유형인 경우 제2 또는 제3 올리고뉴클레오티드는 그것의 X' 또는 Y' 말단에 또는 X' 또는 Y' 말단 근방에 각각 엔도뉴클레올리시스-지정 연결을 포함하는 단계를 특징으로 하는 핵산 염기서열분석 방법을 제공한다. 또한 상응하는 생물학적 프로브 시스템이 개시된다.(a) 핵산의 점진적인 열인산화에 의해 단일 뉴클레오티드 스트림을 생성하는 단계;(b) 폴리머라제 및 리가제, 상응하는 프로브 시스템을 갖는 단일 뉴클레오티드 중 하나: (i) X' 및 Y에 각각 위치한 검출 불가능한 상태의 특징적인 검출 가능한 요소의 제1 및 제2 영역으로 표지된 제1 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 포획 부위 및 엑소뉴클레아제 차단 부위를 포함하는 제한 효소 인식 부위 요소를 포함하는 제3 영역의 '면, 여기서 X'는 3'이고 Y'는 5'이거나 X'는 5'이고, Y'는 3'이고; 및(ii) 포획 부위에 인접하는 첫 번째 올리고뉴클레오티드 상의 상보적 영역에 혼성화하는 두 번째 및 세 번째 단일 가닥 올리고뉴클레오티드; 포획된 단일 뉴클레오티드가 치환된 핵염기를 포함하는 경우에만 인식 부위의 올리고뉴클레오티드 가닥 또는 (iv) 사용된 프로브를 통상적인 또는 닉킹 치환-민감성 제한 엔도뉴클레아제로 처리하여 인식 부위에서 첫 번째 올리고뉴클레오티드 가닥을 절단하는 경우 및 포획된 단일 뉴클레오타이드가 비치환된 핵염기를 포함하는 경우에만;(d) 사용된 프로브의 첫 번째 올리고뉴클레오타이드 가닥을 첫 번째 올리고뉴클레오타이드에 해당하는 X'-Y' 방향으로 이중 가닥 엑소뉴클레오타이드 분해 활성을 갖는 효소로 분해하여 검출 가능한 결과를 산출함 첫 번째 영역, 두 번째 영역 또는 첫 번째 및 두 번째 영역에서 파생된 요소 검출 가능한 상태의 단일 가닥 제4 올리고뉴클레오티드 및 적어도 부분적으로 제1 올리고뉴클레오티드의 서열 상보체인 단일 가닥 제4 올리고뉴클레오티드;(e) 제4 올리고뉴클레오티드를 또 다른 제1 올리고뉴클레오티드와 반응시켜 사용된 것에 상응하는 실질적으로 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 생성물을 생성하는 단계 프로브;(f) 사이클에서 단계 (c), (d) 및 (e)를 반복하는 단계; 및(g) 단계 (d)의 각 반복에서 방출된 검출 가능한 요소를 검출하는 단계로서, 사용된 엔도뉴클레아제가 통상적인 유형인 경우 제2 또는 제3 올리고뉴클레오티드는 각각 X' 또는 Y' 말단에 또는 이에 근접한 엔도뉴클레오시스-지시 연결을 포함하는 것.