Method for large-scale production of lentiviruses by GMP-grade serum-free suspension cellsThe invention provides a method for large-scale production of lentiviruses by GMP-grade serum-free suspension cells. The method specifically comprises the steps that (a) seed liquid for packaging cells is provided; (b) the seed liquid is inoculated in first culture liquid; (c) subculture of the packaged cells is performed; (d) when a liquid change trigger condition is met, liquid exchange operation is initiated; (e) step (c) and step (d) are repeated n times; (f) when a transfection trigger condition is met, transfection operation is initiated; (g) liquid change after transfection is optionally performed; (h) the transfected packaged cells are cultured; (i) when a liquid change trigger condition is met, harvesting and liquid change operation are initiated; (j) step (h) and step (i) are repeated m times; (k) recovered liquid recovered in each time is mixed; (1) purifying treatment is carried out, wherein the culture liquid adopted in each step is serum-free cell culture liquid. The method can prepare the high-titer lentiviruses on a large scale efficiently. In addition, the method can meet the high requirements of GMP production for the production quality.A kind of method of serum free suspension cell production slow virus, which is characterized in that comprising steps of(a) provide a kind of for producing the seed liquor of the incasing cells of slow virus, the incasing cells is the packet of suspension growth fill cell；(b) seed liquor is inoculated in the first culture solution being placed in culture vessel, obtains the first culture, wherein institute the first culture solution stated is the cell culture fluid of serum-free, and inoculum density is 1 × 106-5×106cell/ml, and first the volume of culture solution is 3-100 liter (preferably 5-50 liter)；(c) secondary culture of incasing cells is carried out to first culture, wherein the condition of secondary culture is set as in temperature it is 30~38 deg c, dissolved oxygen is 35~55%, co2concentration is to carry out under 2~10% and ph 6.9-7.4, and train in the passage during supporting, the real-time ph value of first culture is monitored, and based on the real-time ph value to dissolved oxygen and/or co2concentration into row control, to maintain ph between 6.9-7.4；(d) when satisfaction changes liquid trigger condition, liquid operation is changed in starting,wherein, the liquid trigger condition of changing includes:(s1) real-time ph≤6.9, preferably≤7.0, preferably≤7.05；(s2) pass through regulation oxygen, air, nitrogen and/or co2downward trend is still presented in concentration, real-time ph value；with(s3) secondary culture time >=72 hour；wherein, it is described change liquid operation include: will be located at the culture cell-free clear liquid be discharged from the culture vessel, the volume of the culture is vq1 before middle discharge clear liquid, and the volume that the culture after clear liquid is discharged is vh1, then vq1/vh1 the ratio between be 3-15 (preferably 4-7, more preferably 5-6)；then, culture solution is added in xiang suoshu culture vessel, forms incasing cells culture；(e) repetition step (c) and (d) n times, n 1,2 or 3 time；(f) when meeting transfection trigger condition, start transfection procedure,wherein, the transfection trigger condition includes:(t1) cell total amount is 0.05~2 × 1011a cell；(t2) cell density is 0.5~5 × 106a cell/ml；(t3) cell viability >=90%；with(t4) total incubation time >=72 hour；wherein, the transfection procedure includes: after mixing the production of plasmid for being used to produce the slow virus with transfection reagent, to add enter the culture vessel, to import the incasing cells, forms the incasing cells through transfecting；(g) liquid is changed after optionally being transfected；(h) incasing cells through transfecting is cultivated, wherein the condition of culture is set as in temperature being 30~37 deg c, dissolved oxygen for 35~55%, co2concentration is to carry out under 2~10% and ph 6.9-7.4, and during the secondary culture, monitor institute the real-time ph value of the first culture is stated, and based on the real-time ph value to dissolved oxygen and/or co2concentration is controlled, to maintain ph is between 6.9-7.4；(i) when satisfaction changes liquid trigger condition, starting harvest is operated with liquid is changed,wherein, the liquid trigger condition of changing includes:(s1) real-time ph≤6.9, preferably≤7.0, preferably≤7.05；(s2) pass through regulation oxygen, air, nitrogen and/or co2concentration, real-time ph value still decline；with(s3) secondary culture time >=72 hour；wherein, it is described change liquid operation include: will be located at the culture it is cell-free containing virus feed liquid recycle, wherein the volume for recycling the culture before feed liquid is vq2, and the volume for recycling the culture after clear liquid is vh2, then vq2/vh2 it than for 3-15 (preferably 4-7, more preferably 5-6)；(j) step (h) and (i) is repeated m times, m 1,2 or 3 time, wherein before repeating, training is added in xiang suoshu culture vessel nutrient solution forms transfected cell culture；(k) recovered liquid that each time is recycled is merged, obtains the clear liquid containing virus through merging；with(l) purification process is carried out to the clear liquid containing virus through merging, to obtain purified slow virus carrier；wherein, the culture solution used in above-mentioned all steps is the cell culture fluid of serum-free.
GMP-수준 무혈청 현탁 세포 사용에 의한 렌티바이러스의 대규모 제조 방법GMP-수준 무혈청 현탁 세포 사용에 의한 렌티바이러스의 대규모 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계: (a) 패키징 세포의 시드 용액을 제공하는 단계; (b) 시드 용액을 제1 배양액에 접종하는 단계; (c) 패키징 세포의 계대배양을 수행하는 단계; (d) 액체 교환 유발 조건이 충족되었을 때, 액체 교환 작업을 개시하는 단계; (e) 단계 (c) 및 (d)를 1, 2 또는 3회 반복하는 단계; (f) 형질감염 유발 조건이 충족되었을 때, 형질감염 작업을 개시하는 단계; (g) 임의적으로, 형질감염 후, 액체 교환을 수행하는 단계; (h) 형질감염된 패키징 세포를 배양하는 단계; (i) 액체 교환 유발 조건이 충족되었을 때, 수거 및 액체 교환 작업을 개시하는 단계; (j) 단계 (h) 및 (i)를 1, 2 또는 3회 반복하는 단계; (k) 각 회수액을 조합하는 단계; 및 (l) 정제 처리를 수행하는 단계를 포함한다. 각 단계에서 사용된 배양액은 무혈청 세포 배양액이다.(a) 렌티바이러스의 제조를 위해, 현탁액 중에서 성장하는 패키징 세포인, 패키징 세포의 시드 용액을 제공하는 단계;(b) 시드 용액을 배양 용기 중 제1 배양액에 접종하여 제1 배양물을 수득하는 단계이며, 여기서 제1 배양액은 무혈청 세포 배양액이고, 접종 밀도는 1x106 내지 5x106개의 세포/ml이고, 제1 배양액의 부피는 3 내지 100 L인 단계;(c) 온도 30℃ 내지 38℃, 용존 산소 35% 내지 55%, CO2 농도 2% 내지 10% 및 pH 6.9 내지 7.4의 설정 조건하에서 제1 배양물에 대해 패키징 세포의 계대배양을 수행하고, 계대배양 공정에서 제1 배양물의 실시간 pH 값을 모니터링하고, 실시간 pH 값에 기초하여 용존 산소 및/또는 CO2의 농도를 제어함으로써 pH 값을 6.9 내지 7.4 범위로 유지시키는 단계;(d) 액체 교환 유발 조건이 충족되었을 때, 액체 교환 작업을 개시하는 단계이며,여기서 액체 교환 유발 조건은(s1) 실시간 pH ≤6.9, 바람직하게는 ≤7.0, 더욱 바람직하게는 ≤7.05;(s2) 산소, 대기, 질소 및/또는 CO2의 농도 조정에 의해, 실시간 pH 값이 여전히 하락 추세를 보임; 및(s3) 계대배양 시간 ≥72 h을 포함하고;여기서 액체 교환 작업은 배양물 중 무세포 상청액을 배양 용기로부터 배출하는 것 - 여기서 상청액 배출 이전의 배양물 부피는 Vq1이고, 상청액 배출 이후의 배양물 부피는 Vh1이고, Vq1/Vh1 비가 3 내지 15임; 및 이어서 배양액을 배양 용기에 보충하여 패키징 세포의 배양물을 형성하는 것을 포함하는 것인 단계;(e) 단계 (c) 및 (d)를 n회 반복하며, 여기서 n은 1, 2 또는 3인 단계;(f) 형질감염 유발 조건이 충족되었을 때, 형질감염 작업을 개시하는 단계이며, 여기서 형질감염 유발 조건은(t1) 세포 총량이 0.05~2x1011개의 세포임;(t2) 세포 밀도가 0.5~5x106개의 세포/ml임;(t3) 세포 생존율이 ≥90%임; 및(t4) 총 배양 시간이 ≥72 h임을 포함하고;여기서 형질감염 작업은 렌티바이러스 제조를 위해 제조 플라스미드 및 형질감염 시약을 혼합하는 것, 및 이를 배양 용기에 첨가하여 패키징 세포를 도입하고, 형질감염된 패키징 세포를 형성하는 것을 포함하는 것인 단계;(g) 임의적으로, 형질감염 후, 액체 교환을 수행하는 단계; (h) 온도 30℃ 내지 37℃, 용존 산소 35% 내지 55%, CO2 농도 2% 내지 10% 및 pH 6.9 내지 7.4의 설정 조건하에서 형질감염된 패키징 세포를 배양하고, 계대배양 공정에서 제1 배양물의 실시간 pH 값을 모니터링하고, 실시간 pH 값에 기초하여 용존 산소 및/또는 CO2의 농도를 제어함으로써 pH 값을 6.9 내지 7.4 범위로 유지시키는 단계;(i) 액체 교환 유발 조건이 충족되었을 때, 수거 및 액체 교환 작업을 개시하는 단계이며,여기서 액체 교환 유발 조건은(s1) 실시간 pH ≤6.9;(s2) 산소, 대기, 질소 및/또는 CO2의 농도 조정에 의해, 실시간 pH 값이 여전히 감소함; 및(s3) 계대배양 시간 ≥72 h을 포함하고;여기서 액체 교환 작업은 배양물 중 무세포 바이러스 함유 피드액을 회수하는 것을 포함하고, 여기서 피드액 회수 이전의 배양물 부피는 Vq2이고, 상청액 회수 이후의 배양물 부피는 Vh2이고, Vq2/Vh2 비가 3 내지 15인 단계;(j) 단계 (h) 및 (i)를 m회 반복하며, 여기서 m은 1, 2 또는 3인 단계이며, 여기서 반복 전에 배양액을 배양 용기에 보충하여 형질감염 세포 배양물을 형성하는 것인 단계;(k) 각 회수액을 조합하여 조합된 바이러스 함유 상청액을 수득하는 단계; 및(l) 조합된 바이러스 함유 상청액을 정제하여 정제된 렌티바이러스 벡터를 수득하는 단계를 포함하고;여기서 상기 각 단계에서 사용된 배양액은 무혈청 세포 배양액인, 무혈청 현탁 세포로부터 렌티바이러스를 제조하는 방법.