METHOD AND KIT FOR DETECTION/QUANTIFICATION OF TARGET RNA[Object] It is to provide a method and a kit capable of detecting or quantifying a target RNA simply and rapidly from trace amounts of RNA in a sample, in a case such as when one or more kinds of pathogenic microorganisms are to be detected or quantified.[Solving means] The method comprises the steps of 1) synthesizing cDNA from a sample containing the target RNA using a liquid-phase primer having a promoter sequence and a reverse transcriptase to obtain a cDNA-RNA complex, 2) degrading the RNA of the complex, 3) synthesizing a double-stranded DNA via the cDNA obtained in the step 2) and the solid-phase primer, 4) synthesizing RNA from the double-stranded DNA, 5) synthesizing cDNA via the RNA obtained in the step 4) and the solid-phase primer to obtain a cDNA-RNA complex, 6) degrading the RNA of the complex obtained in step 5), 7) synthesizing a double-stranded DNA via the cDNA obtained in the step 6) and the liquid-phase primer, and 8) quantifying the double-stranded DNAs obtained in the steps 3) and 7). These steps can be performed in a single reaction solution.A method for detecting or quantifying a target RNA, comprising the following steps (a) to (j): (a) a step of fixing a 5' end of a primer comprising a DNA sequence corresponding to a 5'-side target specific sequence of the target RNA on a surface of a substrate to prepare a solid-phase DNA (+) primer; (b) a step of adding an RNA-polymerase promoter sequence to a 5'-end side of a primer comprising a cDNA sequence which is complementary to a 3'-side sequence of the target RNA to prepare a liquid-phase cDNA (-) primer; (b') a step of preparing as needed a liquid-phase universal primer wherein an RNA-polymerase promoter sequence is added to a 5' end of a tag sequence; (c) a step of preparing a sample RNA comprising a 3'-side sequence and 5'-side target specific sequence of the target RNA; (d) a step of allowing the liquid-phase cDNA (-) primer prepared in step (b) to contact with the sample RNA strand prepared in step (c) in a liquid phase to hybridize the liquid-phase cDNA (-) primer and the sample RNA, and then extending a DNA (-) strand by a reverse transcriptase to prepare a cDNA strand-RNA strand complex; (e) a step of allowing an RNase that specifically degrades an RNA strand in a DNA strand-RNA strand complex, to act on the cDNA strand-RNA strand complex prepared in step (d) to prepare a single-stranded DNA (-); (f) a step of allowing the single-stranded DNA (-) prepared in step (e) to contact with the solid-phase DNA (+) primer prepared in step (a) in a liquid phase to hybridize the single-stranded DNA (-) and the solid-phase DNA (+) primer, and then extending a DNA (+) strand by an enzyme having a DNA-dependent DNA-polymerase activating capacity to prepare a double-stranded DNA; (g) a step of allowing an RNA polymerase to act on the double-stranded DNA prepared in step (f) to amplify a single-stranded RNA (-) utilizing an RNA-polymerase promoter sequence derived form the DNA (-) strand, hybridizing an amplified single-stranded RNA (-) and a solid-phase DNA (+) primer, and then extending a DNA (+) strand by a reverse transcriptase to prepare a cDNA strand-RNA strand complex; (h) a step of allowing an RNase that specifically degrades an RNA strand in a DNA strand-RNA strand complex, to act on the cDNA strand-RNA strand complex prepared in step (g) to prepare a solid-phase single-stranded DNA (+); (i) a step of allowing the solid-phase single-stranded DNA (+) prepared in step (h) to contact with the liquid-phase cDNA (-) primer prepared in step (b) or with the liquid-phase universal primer prepared in step (b') in a liquid phase to hybridize the single-stranded DNA (+) and the liquid-phase cDNA (-) primer or the liquid-phase universal primer, and then extending a DNA (-) strand by an enzyme having a DNA-dependent DNA-polymerase activating capacity to prepare a double-stranded DNA; and (j) a step of quantifying the double-stranded DNAs prepared in step (f) and step (i).
표적 ＲＮＡ의 검출·정량방법 및 키트1 또는 복수 종류의 병원미생물을 검출·정량하는 경우 등, 시료 중의 미량인 RNA로부터 간편하고 신속하게 표적 RNA를 검출·정량할 수 있는 방법과 키트를 제공한다. 1) 표적 RNA를 포함하는 시료로부터 프로모터 서열을 갖는 액상 프라이머와 역전사 효소를 사용하여 cDNA를 합성하고, cDNA-RNA 복합체를 얻어서, 2) 상기 복합체의 RNA를 분해하고, 3) 상기 2)에서 얻은 cDNA와 상기 고상 프라이머를 통하여 이중사슬 DNA를 합성하고, 4) 상기 이중사슬 DNA로부터 RNA를 합성하고, 5) 상기 4)에서 얻은 RNA와 상기 고상 프라이머를 통하여 cDNA를 합성하고, cDNA-RNA 복합체를 얻어서, 6) 상기 5)에서 얻은 복합체의 RNA를 분해하고, 7) 상기 6)에서 얻은 cDNA와 상기 액상 프라이머를 통하여 이중사슬 DNA를 합성하고, 8) 상기 3) 및 7)에서 얻은 이중사슬 DNA를 정량한다. 이들은 하나의 반응액 중에서 실시될 수 있다.이하 (a)~(j)의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 RNA의 검출·정량방법.(a) 표적 RNA의 5'측 표적 특이적 서열에 상당하는 DNA 서열을 포함하는 프라이머의 5' 말단을 기판 표면에 고정시켜서 고상(固相) DNA(+) 프라이머를 조제하는 공정;(b) 표적 RNA의 3'측 서열과 상보적인 cDNA 서열을 포함하는 프라이머의 5' 말단 측에 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 부가하여 액상 cDNA(-) 프라이머를 조제하는 공정;(b') 필요에 따라서, 태그 서열의 5' 말단에 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 부가한 액상 유니버설 프라이머를 조제하는 공정;(c) 표적 RNA의 3'측 서열과 5'측 표적 특이적 서열을 포함하는 시료 RNA를 조제하는 공정;(d) 공정 (b)에서 조제된 액상 cDNA(-) 프라이머와, 공정 (c)에서 조제된 시료 RNA사슬을 액상으로 접촉시켜서 액상 cDNA(-) 프라이머와 시료 RNA를 혼성화시킨 다음, 역전사 효소에 의해 DNA(-)사슬을 신장시켜서 cDNA사슬-RNA사슬 복합체를 조제하는 공정;(e) 공정 (d)에서 조제된 cDNA사슬-RNA사슬 복합체에 DNA사슬-RNA사슬 복합체에 있어서의 RNA사슬을 특이적으로 분해하는 RNA 분해효소를 작용시켜서 단일사슬 DNA(-)를 조제하는 공정;(f) 공정 (e)에서 조제된 단일사슬 DNA(-)와 공정 (a)에서 조제된 고상 DNA(+) 프라이머를 액상으로 접촉시켜서 단일사슬 DNA(-)와 고상 DNA(+) 프라이머를 혼성화시킨 다음, DNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성능을 갖는 효소에 의해 DNA(+)사슬을 신장시켜서 이중사슬 DNA를 조제하는 공정;(g) 공정 (f)에서 조제된 이중사슬 DNA에 RNA 폴리머라제를 작용시키고, DNA(-)사슬 유래의 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 이용하여 단일사슬 RNA(-)를 증폭시키고, 증폭한 단일사슬 RNA(-)와 고상 DNA(+) 프라이머를 혼성화시킨 다음, 역전사 효소에 의해 DNA(+)사슬을 신장시켜서 cDNA사슬-RNA사슬 복합체를 조제하는 공정;(h) 공정 (g)에서 조제된 cDNA사슬-RNA사슬 복합체에 DNA사슬-RNA사슬 복합체에 있어서의 RNA사슬을 특이적으로 분해하는 RNA 분해효소를 작용시켜서 고상 단일사슬 DNA(+)를 조제하는 공정;(i) 공정 (h)에서 조제된 고상 단일사슬 DNA(+)와 공정 (b)에서 조제된 액상 cDNA(-) 프라이머, 또는 공정 (b')에서 조제된 액상 유니버설 프라이머를 액상으로 접촉시켜서 단일사슬 DNA(+)와 액상 cDNA(-) 프라이머 또는 액상 유니버설 프라이머를 혼성화시킨 다음, DNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성능을 갖는 효소에 의해 DNA(-)사슬을 신장시켜서 이중사슬 DNA를 조제하는 공정;(j) 공정 (f) 및 공정 (i)에서 조제된 이중사슬 DNA를 정량하는 공정;