NOVEL METHOD FOR CHARACTERIZING AND MULTI-DIMENSIONALLY REPRESENTING THE FOLDING PROCESS OF PROTEINSThe invention relates to a novel method for characterizing and multi-dimensionally representing the folding process of proteins (FIG. 9). Said method comprises, in a methodically novel combination, kinetically arranging the hydrodynamic size of the refolding and thus modified protein, associating the proteolytically fragmented intermediates on the basis of the bioinformatic detection patterns, classifying the folding pathway association of the intermediates, characterizing the folding sequences, and multi-dimensionally visualizing the characterized folding process in a computer-aided manner. Said method is characterized in that all intermediates modified during the refolding and thus structurally blocked are identified and digitalized according to the four individual characteristics of said intermediates, namely the hydrodynamic size, the formation time, the folding pathway association, and amount. Said novel method has many applications in the field of research of protein folding and proteopathy, protein engineering, antibody engineering, molecular biology, therapeutic medicine, biotechnology, biotechnological production of protein pharmaceuticals, protein taxonomy, and nanotechnology for developing and producing novel functional protein materials. According to the invention, many and varied products in the form of different assay kits, devices, software, and machines can be produced and used to carry out said method.A method for the characterization and multidimensional visualization of the folding procedure of proteins, wherein all intermediates trapped by chemical modification at various time intervals during the refolding process are identified and digitized by at least 4 individual characteristics, namely its hydrodynamic size, the time of formation, the folding pathway identity, and the quantifiable amount, wherein a folding pathway consists of 4 phases, wherein the method is applicable for the characterization of the folding pathway of all proteins, and wherein the method comprises the following steps: 1) analysis of the protein to be characterized, on the basis of its primary, secondary and possibly three dimensional structure, its biological and physicochemical properties and its purpose, wherein a theoretical fragment mass identification pattern is created and the corresponding procedure and implementation are determined,2) separation of the optimally unfolded fraction of the protein with maximized hydrodynamic size, wherein the protein is subjected to denaturing, if applicable reduction and removal of reducing agents, chromatographic separation and spectrometric identification,3) dynamic modification of the protein intermediates during backfolding and if applicable reoxidation process, wherein portions of the refolding batch are separated at certain time intervals and the occurring intermediates are modified in different degree with appropriate reagents depending on the reactivity of the amino acids with according side chains reagents and are thereby converted to structurally relatively stable intermediates with its own individual characteristics, namely the hydrodynamic size, the time of formation, amount and the membership to a particular folding pathway,4) separation and quantification of the intermediates and the depiction of their hydrodynamic sizes and, where applicable, their amount as a function of time of formation, where the intermediates, which were modified during the refolding process, are studied with electrophoresis or chromatography in conjunction with other spectroscopic methods, preferentially with dynamic light scattering (DLS) to analyze and quantify the individual characteristics of the intermediates, wherein a fingerprint profile of the refolding process is created, and the resulting modified intermediates are used for the next step,5) fragmentation of the intermediates, wherein the modified intermediates are separated according to their hydrodynamic size and are proteolytically cleaved preferentially with Trypsin and optionally with the Endoproteases Lys-C, Glu-C and Asp-N and other Exoproteases or if necessary chemically in order to support differentiation of the fragments,6) detection of the fragmented intermediates, wherein the molecular mass of all fragments and the larger fragments bound by disulfide bridges and/or crosslinkers are measured with mass spectrometry, and are documented in a database and classified in a fragment mass identification table for the purpose of identification, thereby MALDI-TOF-MS/MS (tandem mass spectroscopy) and/or MALDI-TOF_MS_PSD (post-source-delay) are used for the accurate differentiation of similar fragments,7) determination of the intermediates folding pathway identity, where the type, the number and the position of the modifications serve as unique individual traits for every intermediate determined through the comparison of the mass spectrometrically documented number and mass of the fragments with the theoretical fragment mass identification pattern, and where the intermediates with the same traits are assigned into groups, and where the grouped intermediates point to further folding pathways, where this conclusion is compensated and complemented with criteria based on protein folding kinetics and protein evolution,8) identification and classification of the intermediates, where every intermediate is identified by its individual characteristics, namely the hydrodynamic size, time of formation, folding pathway identity and the amount, and wherein these identified intermediates, which are sorted into groups are assigned to certain folding pathways, where these intermediates can meet three further criteria: namely the same modification characteristics, the reduction of their hydrodynamic size within their group and their course of formation and depletion over time within the distinct folding pathway,9) characterization of the folding process with the help of the simultaneous multidimensional graphical depiction of all intermediates assigned to distinct folding pathways according to their identified characteristic, wherein the following characteristics of the folding process are determined: the dominant folding pathway to the native structure, the fastest and slowest folding pathway, pathways leading to misfolding, the folding kinetics in all pathways, the order of disulfide bond formation and/or crosslinking reaction, formation of knots and their...
단백질의 폴딩 과정을 특성규명하고 다차원적으로 나타내기 위한 신규한 방법본 발명은 단백질의 폴딩 과정을 특성규명하고 다차원적으로 표시하기 위한 신규한 방법에 관한 것이다(도 9). 상기 방법은, 리폴딩되어서 변형된 단백질의 유체역학적 크기를 동력학적으로 배열하는 단계, 생물 정보 검출 패턴에 기초하여 단백질 분해방식으로 단편화된 중간체를 연관시키는 단계, 중간체의 폴딩 경로 연관성을 분류하는 단계, 폴딩 수순을 특성규명하는 단계, 및 컴퓨터-보조 방식으로 상기 특성규명된 폴딩 과정을 다차원적으로 가시화하는 단계를, 방법론적으로 신규한 조합으로, 포함한다. 상기 방법은 리폴딩 동안 변형되고 이에 따라서 구조적으로 차단된 모든 중간체가 확인되고 상기 중간체의 4가지 개별적인 특징, 즉, 유체역학적 크기, 형성 시간, 폴딩 경로 연관성 및 양에 따라서 수치화되는 것을 특징으로 한다. 상기 신규한 방법은, 신규한 기능성 단백질 재료를 개발하여 생산하기 위하여, 단백질 폴딩 및 단백질에 기인한 질병, 단백질 공학, 항체 공학, 분자 생물학, 치료 약제, 생명공학, 단백질 약제의 생명공학적 생산, 단백질 분류, 및 나노기술의 연구 분야에서 많은 응용을 지닌다. 본 발명에 따르면, 상이한 분석평가 키트, 장치, 소프트웨어 및 기계의 형태로 많은 다양한 제품이 제조되어, 상기 방법을 수행하는데 이용된다.단백질의 폴딩 과정을 특성규명하고 다차원적 가시화하기 위한 방법으로서, 리폴딩 과정 동안 각종 시간 간격에서 화학적 변형에 의해 포획된 모든 중간체가 적어도 4가지 개별적 특징, 즉, 유체역학적 크기, 형성 시간, 폴딩 경로 동일성 및 정량화 가능한 양에 의해 확인되고 수치화되며, 추가로 폴딩 경로가 4상으로 이루어지고, 상기 방법은 모든 단백질의 폴딩 경로의 특성규명을 위하여 적용가능하며, 상기 방법은 이하의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 폴딩 과정의 특성규명 및 다차원적 가시화 방법:1) 1차원, 2차원 및 가능하게는 3차원 구조, 생물학적 특성 및 물리화학적 특성, 그리고 목적에 의거해서, 특성규명될 단백질을 분석하는 단계로서, 이론적 단편 질량 확인 패턴이 작성되고, 대응하는 절차 및 실행이 결정되는 것인, 상기 분석하는 단계;2) 최대화된 유체역학적 크기를 지니는 단백질의 최적으로 언폴딩된 분획을 분리하는 단계로서, 상기 단백질은, 환원제의 환원 및 제거, 크로마토그래피 분리 및 분광분석적 확인을 적용가능하다면, 변성되는 것인, 상기 분리하는 단계;3) 백폴딩 동안에 그리고 재산화 과정을 적용가능하다면, 단백질 중간체를 동적 변형시키는 단계로서, 리폴딩 배취의 부분들이 소정 시간 간격에서 분리되고, 발생하는 중간체는 측쇄 시약에 따라서 아미노산의 재활성에 따라서 적절한 시약으로 상이한 정도로 변형되고, 이에 따라, 자체의 개별적인 특징, 즉, 유체역학적 크기, 형성 시간, 양 및 특정 폴딩 경로에 대한 멤버쉽면 형성 시간의 함수로서의 중간체의 양을 묘사하는 단계로서, 리폴딩 과정 동안 변형된 중간체들이 해당 중간체들의 개별적인 특징을 분석하고 정량화하기 위하여 기타 분광분석 방법, 바람직하게는 동적 광 산란과 함께 전기영동 혹은 크로마토그래피에 의해 연구되고, 리폴딩 과정의 핑거프린트 프로파일이 작성되며, 얻어진 변형된 중간체들은 다음 단계에서 이용되는 것인, 상기 묘사하는 단계;5) 중간체를 단편화하는 단계로서, 변형된 중간체들은 그들의 유체학적 크기에 따라서 분리되고, 단편의 분화를 뒷받침하기 위하여, 우선적으로 트립신으로 그리고 임의선택적으로 엔도프로테아제 Lys-C, Glu-C 및 Asp-N 및 기타 엑소프로테아제로 단백질분해 방식으로 또는 필요한 경우 화학적으로 분할되는 것인, 상기 단편화하는 단계;6) 단편화된 중간체들을 검출하는 단계로서, 이황화 브리지 및/또는 가교제에 의해 결합된 보다 큰 단편 및 모든 단편의 분자 질량이 질량 분광법에 의해 측정되고, 데이터베이스에 문서화되며, 확인의 목적을 위하여 단편 질량 확인표에 분류되고, 이에 따라서, MALDI-TOF-MS/MS(탄뎀 질량 분광법) 및/또는 MALDI-TOF_MS_PSD(포스트-소스-디케이)가 유사한 단편들의 정확한 구별을 위하여 이용되는 것인, 상기 검출하는 단계;7) 중간체 폴딩 경로 동일성을 판정하는 단계로서, 상기 변형의 유형, 수 및 위치가 단편의 질량 분광학적 문서화된 수 및 질량을 이론적 단편 질량 확인 패턴과의 비교를 통해 결정된 모든 중간체에 대한 독특한 개별적인 특색으로서 제공되고, 동일한 특색을 지니는 중간체들이 그룹으로 할당되며, 그룹화된 중간체들이 추가의 폴딩 경로에 지정되고, 이 결론이 단백질 폴딩 동역학 및 단백질 진화에 의거한 기준으로 보상되고 보완되는 것인, 상기 판정하는 단계;8) 상기 중간체들을 확인 및 분류하는 단계로서, 모든 중간체가 개별적인 특징, 즉, 유체역학적 크기, 형성 시간, 폴딩 경로 동일성 및 양에 의해 확인되고, 그룹으로 분류된 이들 확인된 중간체는 특정 폴딩 경로에 할당되며, 이들 중간체는 추가의 3가지 기준: 즉, 동일 변형 특징, 그들 그룹 내 그들의 유체역학적 크기의 저감 및 상기 별개의 폴딩 경로 내에서 시간 경과에 따른 그들의 형성 및 결실 과정을 충족시킬 수 있는 것인, 상기 확인 및 분류하는 단계;9) 확인된 특징에 따라서 개별의 폴딩 경로에 할당된 모든 중간체의 동시 다차원적 그래픽 묘사의 도움으로 상기 폴딩 과정을 특성규명하는 단계로서, 해당 폴딩 과정의 이하의 특징들: 천연 구조에 대한 우세한 폴딩 경로, 가장 신속한 폴딩 경로와 가장 저속 폴딩 경로, 미스폴딩을 초래하는 경로, 모든 경로 내 폴딩 동역학, 이황화 결합 형성 및/또는 가교 반응의 순서, 단백질 폴딩 과정에 대한 결절의 형성 및 그들의 영향, 이황화물 재배열을 포함하는 분자내 재배열, 폴딩 경로 분지화, 중간체 형태의 확대, 교차 및 동시발생이 결정되는 것인, 상기 특성규명하는 단계; 및10) 단백질 폴딩 과정을 다차원 가시화하는 단계로서, 상기 폴딩 과정은 다차원 좌표계 내에, 상기 4가지 특징에 의해 규정된, 세로좌표들을 플로팅하는 컴퓨터 그래픽을 이용해서 가시화되어 애니메이션화되며, 가시화의 다양화는 이들 4가지 특징의 조합 및 변형에 의해 더욱 확대될 수 있는 것인, 상기 다차원 가시화하는 단계.