INSULINOTROPIC PEPTIDE SYNTHESIS USING SOLID AND SOLUTION PHASE COMBINATION TECHNIQUESThe present invention relates to the preparation of insulinotropic peptides that are synthesized using a solid and solution phase ("hybrid") approach. Generally, the approach includes synthesizing three different peptide intermediate fragments using solid phase chemistry. Solution phase chemistry is then used to add additional amino acid material to the third fragment which is then coupled to the second fragment and then the first fragment in solution. Alternatively, a different second fragment is coupled to the first fragment in the solid phase. Then, solution phase chemistry is then used to add additional amino acid material to a different third fragment. Subsequently, this different third fragment is coupled to the coupled first and different second fragment in the solution phase. The use of a pseudoproline in one of the fragments eases solid phase synthesis of that fragment and also eases subsequent solution phase coupling of this fragment to the other fragments. The present invention is very useful for forming insulinotropic peptides such as GLP- 1(7-36) and its natural and non-natural counterparts.A method of making an insulinotropic peptide, comprising the steps of: a) providing a first peptide fragment including the amino acid sequence of (SEQ ID NO. 5)Z-QAAKEFI AWL VKX35-B 'whereinX35 is an achiral, optionally sterically hindered amino acid residue;Z is an N-terminal protecting group;B' is -OH; andone or more residues of said sequence optionally includes side chain protection;b) coupling the first peptide fragment in solution to arginine amide in order to provide a second peptide fragment including the amino acid sequence of (SEQ ID NO. 6)Z-QAAKEFIAWLVKX35R-NH2 whereinZ is N-terminal protecting group Fmoc-;X35 is an achiral, optionally sterically hindered amino acid residue; andone or more residues of said sequence optionally includes side chain protection; c) removing the N-terminal protecting group to afford a third peptide fragment including the amino acid sequence of (SEQ ID NO. 6)Z- QAAKEFIAWLVKX35R-NH2 whereinZ is H-;X35 is an achiral, optionally sterically hindered amino acid residue; andone or more residues of said sequence optionally includes side chain protection; d) providing a fourth peptide fragment including the amino acid sequence of (SEQ ID NO. 7)Z-TFTSD VX17 18YLEG-B ' whereinX17'18 is a dipeptide residue of a pseudoproline; Z is an N-terminal protecting group;B' is -OH; andone or more residues of said sequence optionally includes side chain protection; e) coupling the fourth peptide fragment to the third peptide fragment in solution in order to provide a fifth peptide fragment including the amino acid sequence of (SEQ ID NO. 8)Z-TFTSDVX17 18YLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2 whereinZ is an N-terminal protecting group;X17'18 is a dipeptide residue of a pseudoproline;X35 is an achiral, optionally sterically hindered amino acid residue; andone or more residues of said sequence optionally includes side chain protection; f) removing the N-terminal protecting group to afford a sixth peptide fragment including the amino acid sequence of (SEQ ID NO. 14)Z-TFTSDVX17 18YLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2 whereinZ is H-;X17'18 is a dipeptide residue of a pseudoproline;X35 is an achiral, optionally sterically hindered amino acid residue; andone or more residues of said sequence optionally includes side chain protection; g) providing a seventh peptide fragment including the amino acid sequence of (SEQ ID NO. 9)Z-HX8EX10-B'whereinX8 and X10 are each independently achiral, optionally sterically hindered amino acid residues;Z is an N-terminal protecting group;B' is -OH; andeach of H and E optionally includes side chain protection; andh) coupling the seventh peptide fragment to the sixth peptide fragment in solution to provide an insulinotropic peptide including the amino acid sequence of (SEQ ID NO. 10)Z-HX8EX10TFTSDVX17 18YLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2 whereinZ is an N-terminal protecting group;X17'18 is a dipeptide residue of a pseudoproline; X8, X10 and X35 are each independently achiral, optionally sterically hindered amino acid residues; andone or more residues of said sequence optionally includes side chain protection.
고체- 및 용액-상 조합 기법을 사용한 인슐린친화성 펩타이드 합성본 발명은 고체-상 및 용액-상("혼성") 접근법을 이용하여 합성되는 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 이 접근법은 고체-상 화학을 이용하여 3가지 상이한 펩타이드 중간체 단편을 합성함을 포함한다. 이어, 용액-상 화학을 이용하여 추가적인 아미노산 물질을 제 3 단편에 부가하고, 이를 이어서 제 2 단편에 커플링 시키고, 이 후 용액 상태의 제 1 단편과 커플링시킨다. 다르게는, 상이한 제 2 단편을 용액-상인 제 1 단편과 커플링 시킨다. 이어, 용액-상 화학을 이용하여 추가적인 아미노산 물질을 상이한 제 3 단편에 부가한다. 이어서, 이러한 상이한 제 3 단편을 용액-상인 커플링된 제 1 및 상이한 제 2 단편에 커플링시킨다. 단편 중 하나에 슈도프롤린을 사용하면 그 단편의 고체-상 합성이 용이해지고, 또한 이 단편과 다른 단편의 후속 용액-상 커플링도 용이해진다. 본 발명은 GLP-1(7-36) 및 이들의 천연 및 비-천연 대응물과 같은 인슐린친화성 펩타이드를 생성시키는데 매우 유용하다.(a) 하기 서열 식별 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 펩타이드 단편을 제공하는 단계:서열 식별 번호: 5Z-QAAKEFIAWLVKX35-B'(여기에서, X35는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;Z는 N-말단 보호기이고;B'는 -OH이고;상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)(b) 용액 상태의 제 1 펩타이드 단편을 아르기닌 아마이드와 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 펩타이드 단편을 제공하는 단계:서열 식별 번호: 6Z-QAAKEFIAWLVKX35R-NH2(여기에서,Z는 N-말단 보호기 Fmoc-이고;X35는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)(c) N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 펩타이드 단편을 수득하는 단계:서열 식별 번호: 6Z-QAAKEFIAWLVKX35R-NH2(여기에서,Z는 H-이고;X35는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)(d) 하기 서열 식별 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 펩타이드 단편을 제공하는 단계:서열 식별 번호: 7Z-TFTSDVX17-18YLEG-B'(여기에서,X17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;Z는 N-말단 보호기이고;B'는 -OH이고;상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)(e) 제 4 펩타이드 단편을 용액 상태의 제 3 펩타이드 단편과 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 제 5 펩타이드 단편을 제공하는 단계:서열 식별 번호: 8Z-TFTSDVX17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2(여기에서,Z는 N-말단 보호기이고;X17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;X35는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)(f) N-말단 보호기를 제거하여 하기 서열 식별 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 제 6 펩타이드 단편을 수득하는 단계:서열 식별 번호: 14Z-TFTSDVX17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2(여기에서,Z는 H-이고;X17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;X35는 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)(g) 하기 서열 식별 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 제 7 펩타이드 단편을 제공하는 단계:서열 식별 번호: 9Z-HX8EX10-B'(여기에서,X8 및 X10은 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;Z는 N-말단 보호기이고;B'는 -OH이고;H 및 E 각각은 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다), 및(h) 제 7 펩타이드 단편을 용액 상태의 제 6 펩타이드 단편과 커플링시켜 하기 서열 식별 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 인슐린친화성 펩타이드를 제공하는 단계:서열 식별 번호: 10Z-HX8EX10TFTSDVX17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX35R-NH2(여기에서,Z는 N-말단 보호기이고;X17-18은 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고;X8, X10 및 X35는 각각 독립적으로 비키랄성의, 선택적으로 입체 장애된 아미노산 잔기이고;상기 서열 중 하나 이상의 잔기는 선택적으로 측쇄 보호를 포함한다)를 포함하는, 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법.