METHOD FOR MEASURING DNA METHYLATIONThe present invention relates to a method of measuring the content of methylated DNA in a DNA region of interest in a genomic DNA contained in a biological specimen, and so on.A method of measuring the content of methylated DNA in an objective DNA region in a genomic DNA contained in a biological specimen, comprising: either one of the following combined steps: (i) combined step (i) comprising: (1) First step having: First (A) step of mixing single-stranded DNA (plus strand) containing an objective DNA region with a masking oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of a recognition site of a methylation sensitive restriction enzyme, thereby generating from a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological specimen single-stranded DNA in which the recognition site of the methylation sensitive restriction enzyme is protected, and First (B) step of causing base-pairing between the single-stranded DNA (plus strand) containing the objective DNA region protected and generated in First (A) step and a single-stranded immobilized oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to a part (provided that, not containing the objective DNA region) of the 3′-end of the single-stranded DNA, thereby selecting the protected and generated single-stranded DNA, and (2) Second step of digesting the single-stranded DNA selected in First step with one or more kinds of methylation-sensitive restriction enzyme, and then removing a generated free digest (single-stranded DNA containing one or more unmethylated CpGs in the recognition site of the methylation sensitive restriction enzyme, the site being protected by the masking oligonucleotide); or, (ii) combined step (ii) comprising: (1) First step of causing base-pairing between a single-stranded DNA (plus strand) containing an objective DNA region and a single-stranded immobilized oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to a part (provided that, not containing the objective DNA region) of the 3′-end of the single-stranded DNA, thereby selecting the single-stranded DNA from a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological specimen, and (2) Second step having: Second (A) step of mixing the single-stranded DNA selected in First step, with a masking oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of a recognition site of a methylation-sensitive restriction enzyme, thereby generating a single-stranded DNA in which the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme is protected, and Second (B) step of digesting the single-stranded DNA protected and generated in Second (A) step with one or more kinds of methylation-sensitive restriction enzyme, and removing a generated free digest (single-stranded DNA containing one or more unmethylated CpGs in the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme, the site being protected by the masking oligonucleotide); and (3) Third step comprising as a pre step of each of the following regular steps: a step (First pre step) of temporarily separating a single-stranded DNA which is an undigested substance obtained in Second step (single-stranded DNA not containing unmethylated CpG in the recognition site of the methylation sensitive restriction enzyme, the site being protected by the masking oligonucleotide) from both of the single-stranded immobilized oligonucleotide and the masking oligonucleotide, and a step (Second pre step) having a step (Second (A) pre step) of causing base-pairing between the generated single-stranded DNA (plus strand) and a single-stranded oligonucleotide, thereby selecting the generated single-stranded DNA and forming DNA in which the selected single-stranded DNA and the single-stranded oligonucleotide are base-paired, and a step (Second (B) pre step) of making the DNA formed in the step (Second (A) pre step) into double-stranded DNA in which the selected single-stranded DNA has been extended by allowing one extension of a primer by using the selected single-stranded DNA as a template and the single-stranded oligonucleotide as a primer, and a step (Third pre step) of temporarily separating the double-stranded DNA extensionally-formed in Second pre step (extensionally-formed double-stranded DNA not containing an unmethylated CpG pair in the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme, the site being protected by the masking oligonucleotide) into a single-stranded DNA (plus strand) and a single-stranded DNA (minus strand), and as regular steps: (a) Regular step A having Step A1 of selecting the single-stranded DNA by causing base-pairing between the generated single-stranded DNA (plus strand) and the single-stranded immobilized oligonucleotide (minus strand), and Step A2 of extensionally-forming double-stranded DNA from the single-stranded DNA by causing one extension of a primer by using single-stranded DNA selected in Step A1 as a template and the single-stranded immobilized oligonucleotide as the primer, and (b) Regular step B of extensionally-forming double-stranded DNA from the single-stranded DNA by caus...
ＤＮＡ 메틸화 측정 방법본 발명은 생체 시료 등에 포함된 게놈 DNA에서 관심 DNA 영역의 메틸화된 DNA의 함량을 측정하는 방법 등에 관한 것이다.생물학적 표본에 포함된 게놈 DNA의 목적 DNA 영역에서 메틸화된 DNA의 함량을 측정하는 방법으로서, 하기 결합 단계 중 하나를 포함하는 방법: (i) 결합 단계 (i) : 첫 번째 (A) 목적 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA(plus 가닥)와 메틸화 민감성 제한효소 인식 부위의 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 마스킹 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 DNA로부터 생성하는 단계 생체 시료에 포함된 genomic DNA 유래 시료 메틸화 민감성 제한효소의 인식부위가 보호된 single-stranded DNA, 및 상기 (B) 상기 single-stranded DNA(plus strand)를 포함하는 염기쌍 사이에 염기쌍을 형성하는 단계 첫 번째 (A) 단계에서 보호 및 생성된 목적 DNA 영역 및 부분에 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 고정화된 올리고뉴클레오티드(단, (2) 단일가닥 DNA의 3'-말단의 목적 DNA 영역을 포함하지 않는 단일가닥 DNA를 선택하여 보호 및 생성된 단일가닥 DNA를 선별하는 단계, 및 (2) 제1단계에서 선별된 단일가닥 DNA를 소화시키는 2단계 1종 이상의 메틸화 민감성 제한 효소로 생성된 자유 분해효소(메틸화 민감성 제한 효소의 인식 부위에 하나 이상의 메틸화되지 않은 CpG를 포함하는 단일 가닥 DNA, 마스킹 올리고뉴클레오티드에 의해 보호되는 부위)를 제거 ; 또는 (ii) (ii) 다음을 포함하는 결합 단계: (1) 목적 DNA 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA(플러스 가닥)와 뉴클레오티드 서열에 상보적인 단일 가닥 고정화 올리고뉴클레오티드 사이에 염기쌍을 형성하는 첫 번째 단계 단일 가닥 DNA의 3' 말단 부분(단, 목적하는 DNA 영역을 포함하지 않음)을 이용하여 생물학적 시료에 포함된 게놈 DNA로부터 유래된 DNA 시료에서 단일 가닥 DNA를 선별하고, (2) ) 두 번째 단계는: 두 번째 (A) 첫 번째 단계에서 선택된 단일 가닥 DNA와 메틸화 민감성 제한 효소의 인식 부위의 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 마스킹 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 메틸화 감수성 제한효소의 인식부위가 보호된 단일가닥 DNA, 및 상기 2차 (A) 단계에서 보호 및 생성된 단일가닥 DNA를 1 또는 2차로 소화하는 2차 (B) 단계 메틸화-민감성 제한효소의 종류 및 생성된 자유 분해효소(메틸화-민감성 제한효소의 인식 부위에 하나 이상의 메틸화되지 않은 CpG를 포함하는 단일 가닥 DNA, 마스킹 올리고뉴클레오티드에 의해 보호되는 부위)를 제거하는 단계; 및 (3) 다음 각 단계의 전단계로 포함하는 제3단계: 제2단계에서 얻어진 미소화 물질인 단일 가닥 DNA(함유되지 않은 단일 가닥 DNA)를 일시적으로 분리하는 단계(제1 예비 단계) 단일 가닥 고정화 올리고뉴클레오티드 및 마스킹 올리고뉴클레오티드 모두로부터 메틸화 민감성 제한 효소의 인식 부위에 메틸화되지 않은 CpG, 마스킹 올리고뉴클레오티드에 의해 보호되는 부위, 및 단계(제2 전단계)를 갖는 단계(제2( A) 전단계) 생성된 단일가닥 DNA(플러스 가닥)와 단일가닥 올리고뉴클레오티드 사이에 염기쌍을 형성하여 생성된 단일가닥 DNA를 선별하여 선별된 단일가닥 DNA와 단일가닥 DNA가 결합된 DNA를 형성하는 단계 -가닥 올리고뉴클레오티드가 염기쌍을 이루고, 상기 단계(두 번째(A) 전단계)에서 형성된 DNA를 선별된 단일가닥 DNA가 결합된 이중나선 DNA로 만드는 단계(두 번째(B) 전단계) 선택된 single-stranded DNA를 template로, single-stranded oligonucleotide를 프라이머로 하여 primer를 1번 연장하여 확장된 DNA를 일시적으로 분리하는 단계(3차 pre step) 두 번째 사전 단계(메틸화 민감성 제한 효소의 인식 부위에 메틸화되지 않은 CpG 쌍을 포함하지 않는 확장적으로 형성된 이중 가닥 DNA, 마스킹 올리고뉴클레오티드에 의해 보호되는 부위)를 단일 가닥 DNA(플러스 가닥) 및 단일 가닥 DNA(마이너스 가닥) 및 일반 단계: (a) 생성된 단일 가닥 DNA(플러스 가닥)와 단일 가닥 DNA 사이에 염기쌍을 일으켜 단일 가닥 DNA를 선택하는 단계 A1을 갖는 일반 단계 A -가닥 고정화 올리고뉴클레오타이드(마이너스 스트랜드) 및 A2 단계에서 선택된 단일 가닥 DNA를 임시로 프라이머를 연장하여 단일 가닥 DNA로부터 이중 가닥 DNA를 연장 형성하는 단계 A2 late 및 단일 가닥 고정화 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하고 (b) 원인에 의해 단일 가닥 DNA로부터 이중 가닥 DNA를 신장적으로 형성하는 정규 단계 B인 것을 특징으로 하는 DNA 메틸화 측정방법.