NUCLEIC ACID AMPLIFICATION BY TWO-ENZYME, SELF-SUSTAINED SEQUENCE REPLICATIONNovel methods are provided for nucleic acid amplification by continuous, substantially isothermal, self-sustained sequence replication ("3SR") utilizing RNA-dependent DNA polymerase activity, DNA-dependent DNA polymerase activity, RNAse H activity and DNA-dependent RNA polymerase activity. In one of the methods, before enzymatic activities can be provided by only two enzymes, a reverse transcriptase and a DNA-dependent RNA polymerase. The methods may employ two or three enzymes to provide the necessary enzymatic activities. Thus, in certain of the methods, an exogenous source of RNAse H, such as E. coli RNAse H, is employed in combination with a reverse transcriptase and a DNA-dependent RNA polymerase. In other of the methods of the present invention, reaction media are employed in which the inherent RNAse H activity of retroviral reverse transcriptases is effective to provide high levels of amplification so that only two enzymes, reverse transcriptase and DNA-dependent RNA polymerase, are required. Novel compositions for carrying out the methods of the present invention are also provided.A method for 3SR amplification of a target RNA segment of a target RNA molecule which segment comprises a 5'-subsegment, which includes a 5'-terminal nucleotide and extends at least 9 nucleotides in the 3•-direction from the 5•-terminal nucleotide of the target segment, and a 3'-subsegment, which does not overlap the 5'-subsegment and which includes a 3•-terminal nucleotide and extends at least 9 nucleotides in the 5'-direction from the 3*-terminal nucleotide of the target segment, which method comprises incubating in a reaction medium:(a) (1) a first DNA primer which is a single stranded DNA which comprises at its 3'-end a first subsegment having a 3*-terminal nucleotide and extending at least 9 nucleotides in the 5'-direction, said first subsegment of said first primer being of the same length as the 3•-subsegment of the target segment and having a sequence sufficiently complementary to that of the 3 '-subsegment of the target segment to prime, in the reaction medium, a primer extension reaction in which a nucleic acid with the sequence of the target segment is the template, and (2) a second DNA primer, which is a single-stranded DNA which comprises at its 3'-end a first subsegment having a 3'-terminal nucleotide and extending at least 9 nucleotides in the 5'-direction, said first subsegment of said second primer being of the same length as the 5'-subsegment of the target segment and having a sequence sufficiently homologous to that of the 5'-subsegment of the target segment to prime, in the reaction medium, a primer extension reaction in which a nucleic acid with the sequence complementary to that of the target segment is the template, provided that at least one of said primers further comprises a promoter-providing subsegment, which comprises the sense strand of a first promoter, said sense strand being joined to the first subsegment of the primer, which comprises said promoter-providing segment, operably for transcription from said first promoter of a cDNA comprising the extension products of said two primers, and provided further that, where said first primer lacks such a promoter-providing subsegment, then the5'-terminal nucleotide of said 5'-subsegment of said target RNA segment is the 5'-terminal nucleotide of the target RNA molecule;(b) at least two enzymes which exhibit in said reaction medium DNA-dependent DNA polymerase activity, RNA-dependent DNA polymerase activity, RNAse H activity and a DNA-dependent RNA polymerase, said DNA-dependent RNA polymerase in said reaction medium, being capable of catalyzing transcription from said first promoter; and (c) nucleoside triphosphates required as substrates for the DNA-dependent DNA polymerase, RNA-dependent DNA polymerase, and DNA-dependent RNA polymerase activities; wherein said incubation occurs in a range of temperatures at which said enzymes in said reaction medium are active in providing said DNA-dependent DNA polymerase, RNA-dependent DNA polymerase, RNAse H, and DNA-dependent RNA polymerase activities.
2- 효소의, 자속성 서열 복제에 의한 핵산 증폭새로운 방법은 RNA-의존 DNA폴리머라제 활성, DNA-의존 DNA폴리머라제 활성, RNA아제 H활성 및 DNA-의존 RNA폴리머라제 활성을 사용하여 연속적인, 실질적으로 등온의 속성 서열 복제 (″35R″)에 의한 핵산 증폭을 제공한다. 방법중 하나에서, 앞서 효소 활성은 두개의 효소, 역전사효소 및 DNA-의존 RNA폴리머라제에 의해 제공될 수 있다. 상기 방법은 두개 또는 세개의 효소를 사용하여 필요한 효소 활성을 제공할 수 있다. 따라서, 특정 방법에서 E. 콜리 RNA아제 H같은 RNA아제 H의 외래 원천을 역전사효소 및 DNA-의존 RNA폴리머라제와 함께 사용한다. 본 발명의 다른 방법에서 레트로비루스의 역전사효소의 고유한 RNA아제 H활성이 높은 수준의 종폭을 제공하기에 효과적이어서 단지 두개의 효소들 역 전사효소 및 DNA-의존 RNA폴리머라제를 필요로하는 반응 매질을 사용한다. 또한 본 발명의 방법을 수행하기 위한 새로운 조성물이 제공된다.반응 매질내의 항기의 항온 처리로 구성되는 5′-말단 뉴클레오티드를 포함하고 표적 분말의 5′-말단 뉴클레오티드로부터 3′-방향으로 적어도 9개 뉴클레오티드를 연장하는 5′-부분절, 및 5′-부분절에 겹치지 않으며 3′-말단 뉴클레오티드를 포함하고 표적 분절의 3′-말단 뉴클레오티드로부터 5′-방향으로 적어도 9개 뉴클레오티드를 연장하는 3′-부분절을 포함하는 표적 RNA분자의 표적 RNA분절의 3SR증폭 방법: (a)(1)3′-말단 뉴클레오티드를 갖고 5′-방향으로 적어도 9개 뉴클레오티드를 연장하는 첫번째 부분절을 그의 3′-말단에 함유하는 한가닥 DNA인 첫번째 DNA프라이머로서, 상기 첫번째 프라이머의 상기 첫번째 부분절이 표적분절의 3′-부분절과 동일한 길이이고 반응 매질에서 표적 분절의 서열을 갖는 핵산이 주형인 프라이머 연장반응을 개시하는 표적 분절의 3′-부분절의 서열에 충분히 상보성인 서열을 갖고, 및 (2)3′-말단 뉴클레오티드를 갖고 5′-방향으로 적어도 9개 뉴클레오티드를 연장하는 첫번째 부분절을 그의 3′-말단에 함유하는 한가닥 DNA인 두번째 DNA프라이머로서, 상기 두번째 프라이머의 상기 첫번째 부분절이 표적 분절의 5′-부분절과 동일한 길이이고 반응 매질에서 표적 분절의 서열에 상보적인 서열을 갖는 핵산이 주형인 프라이머 연장 반응을 개시하는 표적 분절의 5′-부분절의 서열에 충분히 상보적인 서열을 갖고 단, 상기 프라이머들 중 적어도 하나는 첫번째 프로모터의 센서 가닥을 함유하는 프로모토-제공 부분절을 부가적으로 함유하며, 상기 센스 가닥은 상기 두개의 프라이머의 연장 생산물을 함유하는 cDNA의 상기 첫번째 프로모터로부터의 전사를 위해, 상기 프로모터-제공 분절을 함유하는 프라이머의 첫번째 부분절에 연결되고, 단, 부가적으로 상기 첫번째 프라이머가 프로모터-제공 부분절이 결핍된 경우에, 상기 표적 RNA 분절의 상기 5′-부분절의 5′-말단 뉴클레오티드는 표적 RNA분자의 5′-말단 뉴클레오티드임, (b)상기 반응 매질에서 DNA-의존 DNA폴리머라제 활성, RNA-의존 DNA폴리머라제 활성, RNA아제 H활성 및 DNA-의존 RNA폴리머라제를 나타내는 적어도 두개의 효소로서, 상기 반응 매질에서 상기 DNA-의존 RNA폴리머라제는 상기 첫번째 프로모터로부터의 전사를 촉매할수 있음; (c)DNA-의존 DNA폴리머라제, RNA-의존 DNA폴리머라제 및 DNA-의존 RNA폴리머라제 활성에 의한 기질로서 필요한 뉴클레오시드 삼인산염; 이때, 상기 항온처리는 상기 DNA-의존 DNA폴리머라제, RNA-의존 DNA폴리머라제, RNA아제 H 및 DNA-의존 RNA폴리머라제 활성 시공시에 상기 반응 매질에서 상기 효소들이 활성인 온도의 범위에서 수행한다.