The MTT assay is a colorimetric assay for assessing cell metabolic activity. NAD(P)H-dependent cellular oxidoreductase enzymes may, under defined conditions, reflect the number of viable cells present. These enzymes are capable of reducing the tetrazolium dye MTT, which is chemically 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, to its insoluble formazan, which has a purple color. Other closely related tetrazolium dyes including XTT, MTS and the WSTs, are used in conjunction with the intermediate electron acceptor, 1-methoxy phenazine methosulfate (PMS). With WST-1, which is cell-impermeable, reduction occurs outside the cell via plasma membrane electron transport. However, this traditionally assumed explanation is currently contended as proof has also been found of MTT reduction to formazan in lipidic cellular structures without apparent involvement of oxidoreductases.

Tetrazolium dye assays can also be used to measure cytotoxicity (loss of viable cells) or cytostatic activity (shift from proliferation to quiescence) of potential medicinal agents and toxic materials. MTT assays are usually done in the dark since the MTT reagent is sensitive to light.

MTT and related tetrazolium salts
MTT, a yellow tetrazole, is reduced to purple formazan in living cells. A solubilization solution (usually either dimethyl sulfoxide, an acidified ethanol solution, or a solution of the  detergent sodium dodecyl sulfate in diluted hydrochloric acid) is added to dissolve the insoluble purple formazan product into a colored solution. The absorbance of this colored solution can be quantified by measuring at a certain wavelength (usually between 500 and 600 nm) by a spectrophotometer. The degree of light absorption is dependent on the degree of formazan concentration accumulated inside the cell and on the cell surface. The greater the formazan concentration, the deeper the purple colour and thus the higher the absorbance.

XTT (2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide) has been proposed to replace MTT, yielding higher sensitivity and a higher dynamic range. The formed formazan dye is water-soluble, avoiding a final solubilization step.

Water-soluble tetrazolium salts are more recent alternatives to MTT: they were developed by introducing positive or negative charges and hydroxy groups to the phenyl ring of the tetrazolium salt, or better with sulfonate groups added directly or indirectly to the phenyl ring.
 
MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium), in the presence of phenazine methosulfate (PMS), produces a formazan product that has an absorbance maximum at 490 nm in phosphate-buffered saline. The MTS assay is often described as a 'one-step' MTT assay, which offers the convenience of adding the reagent straight to the cell culture without the intermittent steps required in the MTT assay. However this convenience makes the MTS assay susceptible to colormetric interference as the intermittent steps in the MTT assay remove traces of coloured compounds, whilst these remain in the microtitre plate in the one-step MTS assay. Precautions are needed to ensure accuracy when using this assay and there are strong arguments for confirming MTS results using qualitative observations under a microscope. (This, however, is prudent for all colormetric assays.)

WSTs (water-soluble tetrazolium salts) are a series of other water-soluble dyes for MTT assays, developed to give different absorption spectra of the formed formazans. WST-1 and in particular WST-8 (2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium), are advantageous over MTT in that they are reduced outside cells, combined with PMS electron mediator, and yield a water-soluble formazan. Finally, WST assays (1) can be read directly (unlike MTT that needs a solubilization step), (2) give a more effective signal than MTT, and (3) decrease toxicity to cells (unlike cell-permeable MTT, and its insoluble formazan that accumulate inside cells).

Significance
Tetrazolium dye reduction is generally assumed to be dependent on NAD(P)H-dependent oxidoreductase enzymes largely in the cytosolic compartment of the cell.  Therefore, reduction of MTT and other tetrazolium dyes depends on the cellular metabolic activity due to NAD(P)H flux.  Cells with a low metabolism such as thymocytes and splenocytes reduce very little MTT.  In contrast, rapidly dividing cells exhibit high rates of MTT reduction.  It is important to keep in mind that assay conditions can alter metabolic activity and thus tetrazolium dye reduction without affecting cell viability. In addition, the mechanism of reduction of tetrazolium dyes, i.e. intracellular (MTT, MTS) vs. extracellular (WST-1), will also determine the amount of product. Additionally, proof has been provided as to the spontaneous MTT reduction in lipidic cellular compartments/structures, without enzymatic catalysis involved. Nevertheless, even under this alternative paradigm, MTT assay still assesses the reduction potential of a cell (i.e. availability of reducing compounds to drive cellular energetics). As such, the final cell viability interpretation remains unchanged.

In studying the viability of cells seeded on 3D fibrous scaffolds, the thickness of the scaffolds may influence the MTT assay results.

Methodology 
1. Inoculate cells into 96-well plate at 2,500-5,000 cells/well in 100 µL volume. Incubate overnight at 37 °C with 5%  to allow cell adhesion.

2. Add MTT [3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5 diphenyltetrazolium bromide] solution (10 µL, 5 mg/mL) to each well and incubate for 3 h at 37 °C with 5% .

3. Remove the culture medium and MTT formazan crystals from each well using 100 µL of acidified isopropanol (0.04 N HCl in 70% isopropanol). Gently shake the plate for 1 min and aspirate the contents completely using a multichannel pipettor.

4. Transfer the plate to a new 96-well plate containing 100 µL of 0.1 N NaOH per well and gently shake for 15 min on an orbital shaker platform set at low speed (<100 rpm).

5. Aspirate the contents of each well completely and transfer 50 µL of the solution from each well to a new 96 well plates.

6. Read the absorbance at 550 nm.

7. The amount of formazan produced is directly proportional to the number of living cells present in the culture and can be used to calculate cell viability. This assay has several advantages over other methods of measuring cell viability including its simplicity, speed, and sensitivity. Additionally, the MTT assay can be easily adapted for high-throughput screening applications.

Observation 
The Optical Density (OD) at 550 nm will be used to calculate the percentage of viability results using the following equation:

Viability % = 100 x OD550e/OD 550b

            Where, OD550e – Mean value of the measured optical density of the test item.

            OD550b – Mean value of the measured optical density of the negative control.

See also 
Tetrazolium chloride
Formazan

References

Further reading

External links 
 MTT assay Protocol

Biochemistry detection reactions
MTT 어세이(MTT assay)는 세포 대사 활동을 평가하기 위한 비색 분석이다.

NAD(P)H 의존성 세포 산화 환원 효소는 정의된 조건에서 존재하는 생존 세포의 수를 반영할 수 있다. 이 효소는 테트라졸륨 염료 MTT 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드를 보라색을 갖는 불용성 포르마잔으로 환원시킬 수 있다. XTT, MTS, WST를 포함한 기타 밀접하게 관련된 테트라졸륨 염료는 중간 전자 수용체인 1-메톡시 페나진 메토설페이트(PMS)와 함께 사용된다. 세포 불투과성인 WST-1을 사용하면 원형질막 전자 전달을 통해 세포 외부에서 환원된다. 이러한 기존 설명은 현재 MTT가 산화환원효소의 명백한 관여 없이 지질 세포 구조에서 포르마잔으로 환원된다는 증거가 발견되었기 때문에 나온다.

Tetrazolium 염료 분석은 또한 잠재적인 약제 및 독성 물질의 세포독성(생존 세포 손실) 또는 세포 증식 억제 활성(증식에서 정지로의 이동)을 측정하는 데 사용할 수 있다. MTT 시약은 빛에 민감하기 때문에 MTT 분석은 일반적으로 어두운 곳에서 수행된다.

정의

Tetrazolium 염료 
노란색 테트라졸인 MTT는 살아있는 세포에서 보라색 포르마잔으로 환원된다.

XTT(2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide)가 MTT를 대체하여 더 높은 감도와 더 높은 동적 범위를 제공하는 것으로 제안되었다. 형성된 포르마잔 염료는 수용성이므로 최종 가용화 단계를 피할 수 있다.

수용성 테트라졸륨 염은 MTT에 대한 보다 최근의 대안이다. 이들은 테트라졸륨 염의 페닐 고리에 양전하 또는 음전하 및 히드록시기를 도입하거나 페닐 고리에 직접 또는 간접적으로 추가된 설포네이트 기를 사용하여 개발되었다.

MTS(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨)는 페나진 메토설페이트(PMS)의 존재 하에 포르마잔을 생성한다. 인산완충식염수에서 최대 흡광도가 490 nm인 제품. MTS 분석은 종종 '원스텝' MTT 분석으로 설명되며, MTT 분석에 필요한 간헐적 단계 없이 시약을 세포 배양에 바로 추가할 수 있는 편리함을 제공한다. 그러나 MTT 분석의 간헐적 단계가 미량의 유색 화합물을 제거하기 때문에 이러한 편리성으로 인해 MTS 분석이 비색 간섭에 취약한 반면, 이들은 1단계 MTS 분석에서 미세역가 플레이트에 남아 있다. 이 분석법을 사용할 때 정확성을 보장하기 위해 예방 조치가 필요하며 현미경으로 정성적 관찰을 사용하여 MTS 결과를 확인해야 한다는 강력한 주장이 있다.

WST(수용성 테트라졸륨 염)는 형성된 포르마잔의 다른 흡수 스펙트럼을 제공하기 위해 개발된 MTT 분석을 위한 일련의 기타 수용성 염료이다. WST-1 및 특히 WST-8(2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨)은 MTT보다 유리하다. PMS 전자 매개체와 결합하여 세포 외부에서 환원되어 수용성 포르마잔을 생성한다. 이 분석의 특징은 다음과 같다.

 (가용화 단계가 필요한 MTT와 달리) 직접 읽을 수 있다.
 MTT보다 더 효과적인 신호를 제공한다.
 세포에 대한 독성을 감소시킬 수 있다(세포 투과성 MTT 및 불용성 세포 내부에 축적되는 포르마잔).

측정

방법 
MTT assay는 위에서 언급된 MTT 염료를 이용한다. 가용화 용액(보통 디메틸 설폭사이드, 산성화된 에탄올 용액 또는 묽은 염산에 세제 나트륨 도데실 설페이트 용액)을 첨가하여 불용성 보라색 포르마잔 생성물을 착색 용액에 용해시킨다. 이 착색 용액의 흡광도는 분광 광도계로 특정 파장(보통 500~600nm)에서 측정하여 정량화할 수 있다. 빛의 흡수 정도는 세포 내부와 세포 표면에 축적된 포르마잔 농도의 정도에 따라 다르다. 포르마잔 농도가 높을수록 보라색이 짙어지며 흡광도가 높아진다.

해석 
위에서 이야기한 것처럼 테트라졸륨 염료 환원은 일반적으로 세포의 세포질 구획에서 주로 NAD(P)H 의존성 산화환원효소에 의존하는 것으로 가정된다. 따라서 MTT 및 기타 테트라졸륨 염료의 감소는 NAD(P)H 플럭스로 인한 세포 대사 활성에 따라 달라진다. 흉선 세포 및 비장 세포와 같이 대사가 낮은 세포는 MTT를 거의 감소시키지 않는다.

대조적으로, 빠르게 분열하는 세포는 높은 MTT 감소율을 나타낸다. 분석 조건은 세포 생존에 영향을 미치지 않으면서 대사 활동을 할 수 있어야 한다. 따라서 테트라졸륨 염료 감소를 변경할 수 있음을 명심하는 것이 중요하다. 

또한, 테트라졸륨 염료의 환원 메커니즘, 즉 세포내(MTT, MTS) 대 세포외(WST-1)도 생성물의 양을 결정한다. 또한, 효소 촉매 작용 없이 지질 세포 구획/구조에서 자발적인 MTT 감소에 대한 증거가 제공되었다. 그럼에도 불구하고, 이러한 대안적 패러다임에서도 MTT 분석은 여전히 세포의 환원 가능성(즉, 세포 에너지를 구동하기 위한 환원 화합물의 가용성)을 평가하는데 중요한 지표가 된다. 따라서 최종 세포 생존력 해석은 변한다.

3D 섬유 스캐폴드에 시드된 세포의 생존 가능성을 연구할 때 스캐폴드의 두께가 MTT 분석 결과에 영향을 미칠 수 있다.

각주 

생화학 기법
생물학 실험
생화학 검출 반응