CLARITY is a method of making tissue transparent using acrylamide-based hydrogels built from within, and linked to, the tissue, and as defined in the initial paper, represents "transformation of intact biological tissue into a hybrid form in which specific components are replaced with exogenous elements that provide new accessibility or functionality". When accompanied with antibody or gene-based labeling, CLARITY enables highly detailed pictures of the protein and nucleic acid structure of organs, especially the brain. It was developed by Kwanghun Chung and Karl Deisseroth at the Stanford University School of Medicine.

Several published papers have applied the CLARITY method to a wide range of tissues and disease states such as immuno-oncology for human breast cancer, Alzheimer's disease human brains, mouse spinal cords, multiple sclerosis animal models, and plants. CLARITY has also been combined with other technologies to develop new microscopy methods including confocal expansion microscopy, SPIM light sheet microscopy, and CLARITY-optimized light sheet microscopy (COLM).

Procedure

The process of applying CLARITY imaging begins with a postmortem tissue sample. Depending on the tissue type pre-processing steps such as demineralization or decolorization may be necessary after sample fixation. Next a series of chemical treatments must be applied to achieve transparency, in which the lipid content of the sample is removed, while almost all of the original proteins and nucleic acids are left in place. The purpose of this is to make the tissue transparent and thus amenable to detailed microscopic investigation of its constituent functional parts (which are predominantly proteins and nucleic acids). To accomplish this, the preexisting protein structure has to be placed in a transparent scaffolding which preserves it, while the lipid components are removed. This 'scaffolding' is made up of hydrogel monomers such as acrylamide. The addition of molecules like formaldehyde, paraformaldehyde, or glutaraldehyde can facilitate attachment of the scaffolding to the proteins and nucleic acids that are to be preserved, and the addition of heat is necessary to establish the actual linkages between the cellular components and the acrylamide.

Once this step is complete, the protein and nucleic acid components of the target tissue's cells are held firmly in place, while the lipid components remain detached. Lipids are then removed over days to weeks for passive diffusion in detergent, or accelerated by electrophoretic methods to only hours to days. Efforts to accelerate by electrophoretic methods remain inconclusive on ability to not cause tissue damage. As they pass through, the detergent's lipophilic properties enable it to pick up and excise any lipids encountered along the way. Lipophilic dyes as DiI are removed, however there are CLARITY-compatible lipophilic dyes that can be fixated to neighbouring proteins. The large majority of non-lipid molecules, such as proteins and DNA, remain unaffected by this procedure, thanks to the acrylamide gel and chemical properties of the molecules involved.

As reported in the initial paper, the tissue expands during this process, but as needed can be restored to its initial dimensions with a final step of incubation in refractive index matching solution. Tissue expansion does occur in the uniquely lipid-rich brain; however, other tissue types have been noted to not experience as much tissue expansion throughout the process.

By this stage in the process, the sample has been fully prepared for imaging. The contrast for imaging can come from endogenous fluorescent molecules, from nucleic acid (DNA or RNA) labels, or from immunostaining, whereby antibodies that bind specifically to a certain target substance are used. In addition, these antibodies are labeled with Fluorescent tags that are the key to final imaging result. Standard confocal, two-photon, or light-sheet imaging methods are all suitable to then detect the fluorescence emitted down to the scale of protein localization, thus resulting in the final highly detailed and three-dimensional images that CLARITY produces.

After a sample has been immunostained for an image, it is possible to remove the antibodies and re-apply new ones, thus enabling a sample to be imaged multiple times and targeting multiple protein types.

Applications
In terms of brain imaging, the ability for CLARITY imaging to reveal specific structures in such unobstructed detail has led to promising avenues of future applications including local circuit wiring (especially as it relates to the Connectome Project), relationships between neural cells, roles of subcellular structures, better understanding of protein complexes, and imaging of nucleic acids and neurotransmitters. An example of a discovery made through CLARITY imaging is a peculiar 'ladder' pattern where neurons connected back to themselves and their neighbors, which has been observed in animals to be connected to autism-like behaviors.

The CLARITY technique has expanded to several applications beyond the brain. Numerous modifications have been published to build upon the initial publications and efforts have been made both academically and within the biotech industry to apply broad-scope applications to CLARITY. CLARITY continues to gain traction as an emergent technology that can provide powerful insights into clinical diagnostics in the future. CLARITY can be used with little or no modifications to clear most other organs such as liver, pancreas, spleen, testis, and ovaries and other species such as zebrafish. While bone requires a simple decalcification step, similarly, plant tissue requires an enzymatic degradation of the cell wall.

NIH director Francis Collins has already expressed his hopes for this emergent technology, saying:

Limitations
Although the CLARITY procedure has attained unprecedented levels of protein retention after lipid extraction, the technique still loses an estimated 8% of proteins per instance of detergent electrophoresis. Repeated imaging of a single sample would only amplify this loss, as antibody removal is commonly accomplished via the same detergent process that creates the original sample. However, those calculations appear to lack a consistent method for overall protein loss throughout the experiment. ClearLight Biotechnologies, a company founded by Karl Deisseroth, found that the detergent process originally published for antibody removal was not the ideal approach and have developed a destaining solution that was not as detrimental to the tissue integrity.

Other potential disadvantages of the technique are the length of time it takes to create and image a sample (the immunohistochemical staining alone takes up to six weeks to perform), and the fact that the acrylamide used is highly toxic and carcinogenic. Time has often been cited as a limiting factor and disadvantage to using the CLARITY technique; however, several academic and biotech companies (Logos Bioscience, ClearLight Biotechnologies) have continued to develop and optimize CLARITY reagents that significantly truncated the immunostaining time frame reducing the process from six weeks to as quickly as a week depending on sample type. All tissue clearings have their own safety issues. While acrylamide is considered to be toxic and carcinogenic, its components are similar to those found in gels used for western blots.

See also 
Brainbow
Diffusion Tensor Imaging
3DISCO

References 

Neuroimaging
Stanford University medicine
CLARITY는 뇌 조직을 투명하게 하는 실험 기법이다. 처음 논문에서 정의된 것처럼, "온전한 생체 조직을 특정 구성 요소는 새로운 접근성 또는 기능성을 제공하는 외래 요소로 대체된 하이브리드 형태로의 변화"를 나타낸다. 또는 유전자 기반의 라벨링을 동반하는 경우, CLARITY는 기관의 단백질과 핵산 구조, 특히 그것에 의해 개발되었다.

광 및 분자 접근성을 향상시키기 위해 조직 내에서 아크릴 아미드 기반의 조직 - 겔 하이브리드를 구축하는 CLARITY 방법을 사용한 후속 발표 논문은 알츠하이머 병에 걸린 인간의 뇌, 마우스 척수, 다발성 경화증 동물 모델, 식물,에 관한 연구 및 공초점 현미경(F. Chen 등. Science, 2015년 1월)과 CLARITY-강화된 광시트 현미경 또는 COLM에서 사용하기 위한 조직의 확장 또는 부풀어오름을 포함하는 현미경적 방법들을 포함했다.

절차 

CLARITY 영상을 적용하는 과정은 조직 샘플로 시작한다. 다음으로 거의 모든 원래의 과는 남아 있는 한편, 샘플의 성분은 제거되는 투명성 달성하기 위해 일련의 화학 처리가 적용되어야 한다. 이 과정의 목적은 조직을 투명하게 만듦으로써 구성요소의 기능을 나타내는 부분(주로 단백질 및 핵산이다)의 상세한 현미경 조사를 가능케하는 것이다. 이를 위해, 지질 성분은 제거되는 한편, 기존의 단백질 구조는 그것을 보존하는 투명한 골격에 배치되어 있어야 한다. 이 '골격'은 아크릴 아마이드와 같은 하이드로 겔의 단량체로 구성된다. 유사 와 같은 분자의 첨가는 보존되어야 하는 단백질과 핵산에 골격의 부착을 용이하게 할 수 있고, 열의 첨가는 세포 성분 및 아크릴 아마이드 사이의 실제 결합을 확립하는데 필요하다.
일단 이 단계가 완료되면, 지질 성분은 분리된 상태를 유지하는 한편, 상기 대상 조직 세포의 단백질 및 핵산 성분은 제자리에 견고하게 유지된다. 이후, 지질은 1 ~ 2 주 이상 동안 세제의 수동 확산으로 제거되거나 전기 영동 방법에 의해 가속된다. 세제가 통과할 때, 세제의 친유성이 그 과정 중 지질을 찾아내어 잘라낼 수 있게 한다. 대다수의 비지질 분자는 아크릴 아마이드 겔 및 관련된 분자의 화학적 특성 때문에 이 절차에 의해 영향을 받지 않는다.
최초 논문에 보고된 바와 같이, 조직이 이 과정에서 팽창하지만, 필요시 마지막 단계인 굴절율 정합 용액에 둠으로써 최초 사이즈로 복귀될 수 있다.
이 단계에 이르면, 샘플은 영상을 위해 완전히 준비된다. 영상을 위한 대비는 체내 형광 분자들, 핵산 (DNA 또는 RNA) 라벨, 또는 특정한 표적 물질에 특이적으로 결합하는 가 사용되는 면역염색을 사용할 수 있다. 또한, 이러한 항체들은 최종 영상 결과에 중요 요소인 태그로 표지된다. 표준 공 초점, 양 광자, 또는 광판 촬영 방법들은 모두 단백질 수준까지 방출되는 형광을 감지하기에 적합하고, 따라서 CLARITY가 만들어내는 최종 매우 상세한 3 차원 영상이 나오게 된다.
샘플이 영상을 위해 면역 염색된 후, 항체들을 제거하고 새로운 항체들을 다시 적용하는 것이 가능하고, 따라서 샘플을 여러 차례 촬영할 수 있고 복수 단백질 유형을 타겟팅할 수 있다.

응용 
뇌 영상의 측면에서, 막힘없이 상세하게 특정 구조를 보여주는 CLARITY 영상의 기능은 국부적 배선 (특히 에 관련하여), 신경 세포들 사이의 관계, 세포 내 구조물들의 역할, 단백질 복합체에 대한 더 나은 이해, 핵산 및 의 영상을 포함한 향후 응용을 전도유망하게 하였다. CLARITY 영상을 통한 발견의 한 예는, 과 유사한 행동을 보이는 동물들에서 관찰되었던, 신경 세포들이 자신과 자신의 이웃에 다시 연결되는 특유의 '사다리'패턴이다.

 책임자  이미 이 도래하는 기술에 대한 자신의 희망을 아래와 같이 표현했다.

한계 
CARITY 방법은 지질 추출 후 단백질 보존의 전례 없는 수준을 달성했지만, 이 기술은 여전히 세제 전기영동 때마다 단백질의 약 8 %를 잃는다. 항체 제거는 일반적으로 원래의 샘플을 만드는 것과 동일한 세제 과정을 통해 이루어지기 때문에, 단일 샘플의 반복된 영상은 이 손실을 증폭시킬 따름이다. 그 기술의 또 다른 단점은 샘플을 생성하고 영상화하는데 걸리는 시간과 (면역 조직 염색만 수행하는데 6주가 소요된다.) 사용되는 아크릴 아미드가 매우 독성이 높다는 것도 또 하나의 문제이다.

각주 

신경영상