Method for indexing and determining relative concentration of expressed messenger RNAsAn improved method for the simultaneous sequence-specific identification of mRNAs in a mRNA population allows the visualization of nearly every mRNA expressed by a tissue as a distinct band on a gel whose intensity corresponds roughly to the concentration of the mRNA. In general, the method comprises the formation of cDNA using anchor primers to fix a 3'-endpoint, preparing cRNA, transcribing cDNA from the cRNA and performing two sequence specific PCR amplifications of the cDNA. In preferred embodiments, the method comprises comparing the length and at least part of the nucleotide sequence of the PCR products to expected values determined from a database of nucleotide sequences. The method can identify changes in expression of mRNA associated with the administration of drugs or with physiological or pathological conditions. Also provided are vectors and primers useful for the practice of the improved method.Improving one's methods of the special evaluation of a synchronizing sequence that carries out mrnas in a mrna storehouse, it comprises the steps:(a) prepare a double-stranded cdna storehouse with a blended anchor primer from a mrna storehouse, each anchor primer contains one 5 ' terminal and one 3 ' end, and it comprises one section sequence of (i) 7-40t residue; (ii) discern the site of first restriction enzyme cutting of 6 above bases, this cleavage site is relevant with the sequence of t residue towards 5 ' terminal location; (iii) first stuffer of from 4 to 40 nucleotide, this first stuffer be positioned toward with by 5 ' relevant-end of first restriction enzyme cleavage site; (iv) second stuffer, it inserts 6 above bases of identification by between the sequence of first restriction enzyme cleavage site and t residue; (v) from by-v ,-v-n and-each anchor primer phase transformation residue of selecting the group that v-n-n forms is positioned in 3 '-end, wherein v is from forming the deoxyribonucleotide that screens the group by a, c and g; n is the deoxyribonucleotide that screens from the group that is made up of a, c, g and t, and the mixture that includes anchor primer contains the possibility of all v and n;(b) downcut double-stranded cdna storehouse with first sex-limited restriction endonuclease and second restriction enzyme, 4-nucleotide sequence of this second restriction enzyme identification has formed a double-stranded cdna library of molecules that first and second ends are arranged respectively;(c) each the double-stranded cdna molecule that derives from step (b) is inserted into into carrier in a direction, it is anti-meaning for the special promotor of phage, in carrier, formed and contained the structure storehouse of inserting the cdna molecule, therefore determine respectively in abutting connection with the sequence of 5 ', 3 ' flanking vector of 3 ' end of 5 ' the terminal and sense strand that inserts the cdna sense strand, and the described structure that one 3 ' flanking vector sequence arranged has 15 length of nucleotides in described first restriction endonuclease sites and qualification at least between transcription initiation site in described promotor;(d) insert the carrier transformed host cells with the cdna that is cut, contain the carrier that the clone inserts with generation;(e) with at least a cdna molecule that maybe can not discern insertion, maybe can not discern the special promoter sequence of phage, but the structure storehouse that the digestion with restriction enzyme of sequence produces in step (c) on the energy identification carrier, so just produced the linear segment of the cdna molecule that contains insertion, the linear fragment of chan shenging has one at least in 5 ' the flanking vector sequence of carrier 5 ' to 15 nucleotide of second end of double-stranded cdna molecule like this;(f) by incubation linear fragment and the special rna polymerase of phage that has initial from the special promoter transcription ability of phage, produced the preparation of the crna that antisense crna transcribes;(g) with a thermoscript ii and 15-30 nucleotide long and comprise by with 5 ' reverse transcription primer of 5 ' flank body sequence complementary nucleotide sequence, produce the first chain cdna by transcribing crna;(h) form the first serial inferior storehouse and carry out the polymerase chain reaction generation first time first cover pcr product as template by separating the first chain cdna with the first chain cdna, the polymerase chain reaction is that 15-30 nucleotide is long with first 3 ' pcr primer for the first time, it and cutting the enzyme site and determining 3 ' flanking vector sequence complementation between the transcription initiation site by the special promotor of phage in first is restricted, first 5 ' pcr primer has been defined-n 13 '-end of forming, wherein ' n ' is among four kinds of deoxyribonucleotide a, c, g or t one, first 5 ' pcr primer is that 15-30 nucleotide is long, and and the carrier preface complementation of 5 ' flank, simultaneously, the complementation of first 5 ' pcr primer extends into a nucleotide in the special insertion nucleotide of crna, in different primers of this first 5 ' pcr primer are used in four inferior storehouses of difference each; (i) become the inferior storehouse of second series by the further separation first serial inferior storehouse cover of first in each pcr product and carry out polymerase chain reaction generation second time second with the first cover pcr product as template and overlap the pcr product, second 3 ' the pcr primer that the polymerase chain reaction is used in the second time is that 15-30 nucleotide is long, it and determine 3 ' flanking vector sequence complementation between the transcription initiation site at first restriction endonuclease sites with by the special promotor of phage, second 5 ' pcr primer has been defined one by-n 13 '-end that-nx forms...
발현된 메신저 RNA의 상대적인 농도를 산출하고 결정하는 방법본 발명은 mRNA 군에서 mRNA를 동시 서열 특이적으로 동정하기 위한 향상된 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 조직에 의해 발현된 거의 모든 mRNA를 겔상에 mRNA의 농도에 대략적으로 상응하는 강도를 가진 명백한 밴드로서 가시화시켜준다. 일반적으로, 상기 방법은 앵커 프라이머를 사용하여 cDNA를 형성시켜 3'-말단지점에 고정시키고, 후속하는 RNA 합성을 위한 박테리오파지 특이적인 프로모터를 포함하는 벡터내의 cDNA로부터 클로닝된 삽입물을 생성시키고, 클로닝된 삽입물의 선형화된 단편을 생성시키고, cRNA로부터 cDNA를 전사시키고 cDNA의 두 가지 서열 특이적인 PCR 증폭을 수행하는 것을 포함한다. 바람직한 양태에서, 상기 방법은 PCR 생성물의 누클레오티드 서열의 길이 및 적어도 일부분을 비교하여 누클레오티드 서열의 데이터베이스로부터 결정된 값을 예상하는 것을 포함한다. 상기 방법은 약물의 투여 또는 생리학적 또는 병리학적 상태와 관련된 mRNA의 발현에 있어서의 변화를 동정할 수 있다. 또한 본 발명은 상기 향상된 방법을 실행하기 위해 유용한 벡터 및 프라이머를 제공한다.(a) 앵커 프라이머의 혼합물을 사용하여 mRNA 집단으로부터 이중 가닥 cDNA 집단을 준비하는 단계로서, 각각의 앵커 프라이머가 5' 말단과 3' 말단을 지니며, (ⅰ) 7개 내지 40개의 T 잔기의 트랙(tract); (ⅱ) 6개가 넘는 염기를 인식하는 제 1 제한 엔도누클레아제에 의해 절단되는 부위로서, 절단 부위가 T 잔기의 트랙에 대해 5'-말단쪽에 위치한 절단 부위; (ⅲ) 제 1 제한 엔도누클레아제에 의해 절단되는 부위에 대해 5'-말단쪽에 위치한 4개 내지 40개 누클레오티드의 제 1 스터퍼(stuffer) 절편; (ⅳ) 6개가 넘는 염기를 인식하는 제 1 제한 엔도누클레아제에 의해 절단되는 부위와 T 잔기의 트랙 사이에 개재된 제 2 스터퍼 절편; 및 (ⅴ) -V, -V-N, 및 -V-N-N (여기서, V는 A, C 및 G로 구성된 군으로부터 선택된 데옥시리보누클레오티드이고, N은 A, C, G 및 T로 구성된 군으로부터 선택된 데옥시리보누클레오티드이다), 및 V와 N에 대한 모든 가능성을 함유하는 앵커 프라이머를 포함하는 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 각각의 앵커 프라이머의 3' 말단에 위치한 페이싱(phasing) 잔기를 포함하는 단계; (b) 이중 가닥 cDNA 집단을 제 1 제한 엔도누클레아제와 제 2 제한 엔도누클레아제로 절단하는 단계로서, 제 2 제한 엔도누클레아제가 4-누클레오티드 서열을 인식하여 각각 제 1 말단과 제 2 말단을 지니는 이중 가닥 cDNA 분자의 집단을 형성시키는 단계; (c) 벡터내의 박테리오파지 특이적 프로모터에 대해 안티센스인 배향으로 단계(b)로부터의 각각의 이중 가닥 cDNA 분자를 벡터내로 삽입시켜서 삽입된 cDNA 분자를 함유하는 구성물의 집단을 형성시킴으로써, 각각 삽입된 cDNA의 센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 3' 말단에 인접해 있는 5' 및 3' 플랭킹 벡터 서열을 규정하게 하고, 상기 구성물이 제 1 제한 엔도누클레아제 부위와 상기 프로모터에서 전사 개시를 규정하는 부위 사이에 길이가 15개 이상의 누클레오티드인 3' 플랭킹 벡터 서열을 지니게 하는 단계; (d) 절단된 cDNA가 삽입되어 클로닝된 삽입체를 함유하도록 생성된 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계; (e) 생성된 선형화된 단편이 이중 가닥 cDNA 분자의 제 2 말단의 5'에서 벡터내로 삽입된 15개 이상의 누클레오티드의 5' 플랭킹 벡터 서열을 지니게 되도록, 삽입된 cDNA 분자 또는 박테리오파지 특이적 프로모터내의 서열은 인식하지 못하지만 벡터내의 서열은 인식하는 하나 이상의 제한 엔도누클레아제로 단계(c)에서 생성된 구성물을 분해시킴으로써 삽입된 cDNA 분자를 함유하는 선형화된 단편을 생성시키는 단계; (f) 선형화된 단편을 박테리오파지 특이적 프로모터로부터 전사를 개시시킬 수 있는 박테리오파지 특이적 RNA 중합효소와 인큐베이션시킴으로써 안티센스 cRNA 전사체의 cRNA 프레퍼레이션(preparation)을 생성시키는 단계; (g) 역전사효소와, 길이가 15개 내지 30개 누클레오티드이고 5' 플랭킹 벡터 서열에 대해 상보적인 누클레오티드 서열을 포함하는 5' RT 프라이머를 사용하여 cRNA를 전사시킴으로써 제 1 가닥 cDNA를 생성시키는 단계; (h) 제 1 가닥 cDNA를 제 1 시리즈(series)의 서브푸울로 분할시키고, 제 1 제한 엔도누클레아제 부위와 박테리오파지 특이적 프로모터에 의한 전사 개시를 규정하는 부위 사이에 있는 3' 플랭킹 벡터 서열에 대해 상보적인 길이가 15개 내지 30개 누클레오티드인 제 1의 3' PCR 프라이머와 -N1(여기서, "N"은 4개의 데옥시누클레오티드 A, C, G 또는 T 중 어느 하나이다)로 구성된 3' 말단을 지니는 것으로 규정된 제 1의 5' PCR 프라이머를 사용하는 제 1 중합효소 연쇄 반응을 위해 주형으로서 제 1 가닥 cDNA를 사용함으로써 PCR 생성물의 제 1 세트를 생성시키는 단계로서, 제 1의 5' PCR 프라이머가 길이가 15개 내지 30개 누클레오티드이고, 5' PCR 프라이머의 상보성이 cRNA의 삽입체 특이적 누클레오티드 중의 하나의 누클레오티드로 신장되는 방식으로 5' 플랭킹 벡터 서열에 대해 상보적인 단계; (i) 각각의 제 1 시리즈의 서브푸울내의 PCR 생성물의 제 1 세트를 서브푸울의 제 2 세트로 추가로 분할시키고, 제 1 제한 엔도누클레아제 부위와 박테리오파지 특이적 프로모터에 의한 전사 개시를 규정하는 부위 사이에 있는 3' 플랭킹 벡터 서열에 대해 상보적인 길이가 15개 내지 30개 누클레오티드인 제 2의 3' PCR 프라이머와 -N1-Nx (여기서, N1은 이러한 서브푸울에 대한 제 1 중합효소 연쇄 반응에서 사용된 N1과 동일하고, "N"은 단계(h)에서와 같고, "x"는 1 내지 5의 정수이다)로 구성된 3' 말단을 지니는 것으로 규정된 제 2의 5' PCR 프라이머를 사용하는 제 2 중합효소 연쇄 반응을 위해 주형으로서 PCR 생성물의 제 1 세트를 사용함으로써 PCR 생성물의 제 2 세트를 생성시키는 단계로서, 제 2의 5' PCR 프라이머가 길이가 15개 내지 30개 누클레오티드이고, 프라이머의 상보성이 "x"+1과 동등한 누클레오티드의 수로 cRNA의 삽입체 특이적 누클레오티드로 교차 신장되는 방식으로 5' 플랭킹 벡터 서열에 대해 상보적이고, 제 2의 5' PCR 프라이머 중 또 다른 하나가 제 2 시리즈의 서브푸울의 상이한 서브푸울에서 사용되고, 서브푸울의 제 1 세트내의 각각의 서브푸울에 대해 제 2 시리즈의 서브푸울에 4X 서브푸울이 존재하는 단계; 및 (j) PCR 생성물의 제 2 세트를 분석하여 mRNA 집단에 존재하는 mRNA의 3' 단부를 나타내는 서열 특이적 생성물의 디스플레이를 생성시키는 단계를 포함하여 mRNA 집단에서 mRNA를 동시 서열 특이적으로 확인하기 위한 방법.