비색반응의 발색제로는 \( \mathrm{FeCl}_{3} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 또는 \( \mathrm{K}_{3} \mathrm{Fe}(\mathrm{CN})_{6} \) 용액 및 혼합액을 사용하였으며, 각 실험마다 \( \mathrm{pH} 6.5 \)의 증류수를 신선하게 조제하여 사용하였습니다. 비색정량법의 수계 적용 가능성을 평가하기 위해, 증류수, 상수도, 그리고 강물 (경북 안동시 낙동강 댐) 등 총 10가지의 시료를 준비하였습니다. 각 시료는 \( \mathrm{pH} \) 값을 6.5로 조정한 후, 비색반응에 사용되었습니다. 비색반응의 적용 가능성을 확인하기 위해 생활용품에서 다음과 같은 시료들을 사용하였습니다: 5개의 일회용 컵, 플라스틱 튜브(G사, Korea), 일회용 주사기(N사, Korea)의 열수 추출물 및 메탄올 추출물. 이 시료들은 발색반응에 활용되었습니다. 물 추출의 경우, 멸균된 증류수를 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 충분히 부어 상온에서 30분 동안 방치하여 물 추출물을 조제하였습니다. 메탄올 추출물은 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 동안 추출되었습니다.
<h1>재료 밎 방법</h1> <h2>시약</h2> <p>BPA, 4-hydroxyacetophenone (4-HAP), 4-hydroxybenzoic acid (4-HBA), 4-hydroxybenzaldehyde (4-HBAL), phenol, nonyl phenol, tannic acid, butyl hydroxytoluene, 2-acetox-ybenzoic acid 는 모두 Sigma Co. (USA)로부터 구입하여 사용하였으며, BPA 및 분해산물들의 구조는 Fig. 1에 나타내었다. 발색제인 \( \mathrm{FeCl}_{3} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 와 \( \mathrm{K}_{3} \mathrm{Fe}(\mathrm{CN})_{6} \) 는 Junsei Chemical Co. (Japan)로부터 구입하여 사용하였다.</p> <h2>비색정량반응의 최적화</h2> <p>비색반옹의 발색제로는 \( \mathrm{FeCl}_{3} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 또는 \( \mathrm{K}_{3} \mathrm{Fe}(\mathrm{CN})_{6} \) 용액 및 혼합액을 사용하였으며, 실험시마다 \( \mathrm{pH} 6.5 \) 의 증류수를 사용하여 신선하게 조제하였다. 최적 검출파장 선정 시에는 시료 및 혼합액을 UV-Vis spectrophotometer (Hitachi U-3010, Japan)를 사용하여 \( 200 \sim 800 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 분석하였으며, 다수의 시료 측정시에는 microplate reader (Expert-96, Asys Hitech Co., Austria)를 사용하였다. 발색반응 최적 \( \mathrm{pH} \) 선정 시에는 50\( \mathrm{mM} \) citrate-phosphate buffer solution \( (\mathrm{pH} 2, 4) \), \( 50 \mathrm{mM} \) di-phosphate-monophosphate buffer solution \( (\mathrm{pH}6, 7 )\), \( 50 \mathrm{mM} \) glycine-sodium hydroxide buffer solution \( (\mathrm{pH} 9,11) \) 을 사용하였다. 그 외 반응 온도, 반응 시간, 흔합액의 용량, 혼합액의 농도, 반응중지제로서의 \( \mathrm{NaOH} \) 및 \( \mathrm{HCl} \) 선정은 각각의 조건에서 반응 후, \( 750 \mathrm{~nm} \) 에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다.</p> <h2>BPA 발색반응에 따른 분광학적 분석 및 반응 특이성 검토</h2> <p>비색반웅에 대한 특이성을 확인하기 위해, BPA 및 이의 유도체, 분해산물 및 페놀성 화합물을 각각 메탄올에 적당량 녹이고, 각각의 시료용액 \( 160~ \mu \mathrm{l} \) 에 \( 1 \%~ \mathrm{FeCl}_{3} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 와 \( 1 \% ~\) \( \mathrm{K}_{3} \mathrm{Fe}(\mathrm{CN})_{6} \) 혼합액을 \( 40~ \mu \mathrm{l} \) 넣은 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 반응하고, \( 50 ~\mathrm{mM} ~\mathrm{HCl} ~10~ \mu \mathrm{l} \) 를 가하여 반응을 정지하였다. 이후 \( 750 \mathrm{~nm} \)에서의 흡광도를 측정, 비교하여 반응 특이성을 확인하였다.</p> <h2>수계, 토양, 생활용품으로부터 BPA 분석</h2> <p>비색정량법의 수계 적용가능성 검토를 위해 증류수, 상수도 및 강물 (경북 안동시 낙동강 댐) 각각 10종을 취한 후, 각각의 시료를 \( \mathrm{pH} \) 를 6.5로 조정하고 발색반응에 사용하였다. 또한 각각의 시료에 일정한 양의 BPA를 가하여 동일한 반응을 수행하여, 수계에서의 검출 신뢰성을 확인하였다. 토양시료는 경북 안동시 송천동 안동댐 주변 토양 시료를 사용하였으며, 토양 특성에 따른 변화요인을 최소화하기 위해서 각각 서로 다른 7개소의 토양을 일정량씩 혼합한 후, 토양시료 1 및 토양시료 2로 사용하였다. 시료 토양 \( 10 \mathrm{~g} \) 에 증류수 \( 25 ~\mathrm{ml} \)를 넣어 10시간 진탕 추출하고, 이를 \(3,000 \mathrm{rpm}\) (HA-1000-3, Hanil Science Industrial Co., Korea)에서 5 분간 원심분리 후 상등액을 회수하고, \( \mathrm{pH} \) 를 6.5로 조정한 후 발색반응에 사용하였다. 한편 토양 물 추출 상등액의 미세입자 제거를 위해 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) membrane filter (Millipore, Ireland)를 이용한 filtrate를 반응시켜 미세입자의 영향도 조사하였다. 생활용품에서 비색반응 적용가능성을 확인하기 위해서, 각각 5 개의 일회용 컵, 플라스틱 튜브(G사, Korea), 일회용 주사기(N사, Korea)의 열수 추출물 및 메탄올 추출물을 발색반응에 사용하였다. 물 추출의 경우, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 의 멸균 증류수를 충분히 부어 30 분간 상온에 방치하여 물 추출물을 조제하였으며, 메탄올 추출물은 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 시간 추출하였다.</p> <h2>BPA 의 HPLC 분석</h2> <p>비색 정량을 정확성 및 신뢰성을 확인하기 위해, 실험에 사용된 시료를 기기분석하였다. 사용된 HPLC는 SCL-10A controller, LC-10AD pump, SPD-10A detector (Shimadzu co., Japan)을 사용하였으며 컬럽은 Mightysil RP-18 (Kanto chemical Co. Japan), 용매는 \( 50~ \mathrm{mM} \) phosphate buffer와 Acetonitrile의 동량 흔합액(\( \mathrm{pH} ~2.5)\), 검출 파장 \( 280 \mathrm{~nm} \), 유속은 \( 0.7~ \mathrm{ml} / \mathrm{min} \)이며 이러한 조건에서 BPA의 검출시간은 \( 9.9 \)분이며, 검출한계는 \( 1~ \mu \mathrm{M} \) 이었다.</p>