프로테아제 활성은 skim milk agar를 이용하여 측정되었다. 녹농균 생물막은 서로 다른 두 방법을 통해 측정되었는데, 정지 생물막 측정(static biofilm assay)은 \(96 \)-well plate에서 M \(63 \) 최소배지를 이용해 수행되었고, 적하 유동 생물막 측정(drip-flow biofilm assay)은 녹색 형광 단백질(GFP; green fluorescence protein)을 발현하는 플라스미드 pAB \(1 \)를 도입한 녹농균을 drip flow-cell 내에서 흘리면서 배양함에 의해 수행되었다.
<h2>프로테아제 활성 측정</h2> <p>프로테아제 활성은 skim milk agar(0.5 \% skim milk, \( 0.5 \% \) peptone, \( 0.1 \% \) glucose, \( 1.5 \% \) agar)를 이용하여 측정되었다. Skim milk agar plate위에 지름 \( 0.5 \mathrm { cm } \)의 여과지를 놓고 그 위에 그림에 표시된 농도의 저해제 물질을 포함하는 LB에서 OD \( { } _ { 600 } \) \( = 4.0 \) 까지 배양된 녹농균을 \( 5 \mu l \)씩 접종하였다. 이를 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(18 \)- \(24 \)시간 배양하면서 여과지 주위에 skim milk의 단백질이 분해되어 생기는 투명환의 직경을 통해 프로테아제 활성을 측정하였다.</p> <h2>생물막 형성 측정</h2> <p>녹농균 생물막은 서로 다른 두 방법을 통해 측정되었다. 정지 생물막 측정(static biofilm assay)은 \(96 \)-well plate에서 M \(63 \) 최소배지[ \( \left [ \mathrm { M } 63 \operatorname { salt } \left (12 \mathrm { g } / \mathrm { L } \mathrm { ~KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } , 28 \mathrm { g } / \mathrm { L } \mathrm { ~K } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } \right . \right . \), \( \left .8 \mathrm { g } / \mathrm { L } \left ( \mathrm { NH } _ { 4 } \right ) \mathrm { SO } _ { 4 } \right ), 1 \mathrm { mM } \mathrm { ~MgSO } { } _ { 4 } , 0.5 \% \) casamine acid, \( 0.2 \% \) citratej를 이용해 수행되었다. 두 개의 \(96 \)-well plate에 그림에 표시된 농도의 저해제를 넣고 M \(63 \) 최소배지를 \( 150 \mu l \)씩 분주하였다. 여기에 \(16 \)시간 이상 충분히 배양된 PAO \(1 \)세포를 \( 2 \% \) 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \(48 \)시간 배양하였다. 두 plate중 하나로는 OD \( { } _ { 600 } \) 값을 측정하고 또 다른 하나는 crystal violet을 염색을 통해 생물막 형성 정도를 측정하였다. Plate에 있는 배양액을 모두 버리고 물에 2회 가볍게 씻어 well 표면에 붙어 자란 생물막 만을 남긴 후, \( 0.1 \% \) crystal violet 용액을 \( 180 \mu l \) 씩 분주하여 \(7 \)분 동안 흔들면서 염색하였다. 남은 과량의 crystal violet 용액을 모두 버리고 absolute ethanol \( 200 \mu l \)로 \(30 \)분 동안 흔들어 생물막 속에 염색된 crystal violet을 녹여낸 후 \( 600 \mathrm { nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 A \( { } _ { 600 } \) 값을 미리 측정한 OD \( { } _ { 600 } \) 값으로 표준화 하였다. 적하 유동 생물막 측정(drip-flow biofilm assay)은 녹색 형광 단백질(GFP; green fluorescence protein)을 발현하는 플라스미드 pAB \(1 \)를 도입한 녹농균을 drip flow-cell 내에서 흘리면서 배양함에 의해 수행되었다. 우선 형광 발현용 플라스미드인 pAB \(1 \)을 녹농균 PAO \(1 \)에 형질전환을 통해 도입한 후, 이를 \(16 \)시간 이상 충분히 배양하였다. Drip flow-cell내에서 생물막을 형성하기 위하여 M \(63 \) 최소배지에 표시된 농도의 저해제를 넣고, 앞서 배양된 형광 발현 녹농균을 \( 1 \% \) 접종하여 OD \( { } _ { 600 } \) \(=0.5 \) 정도로 맞춘 다음, slide glass를 넣어둔 drip flow-cell속으로 \( 1 \mathrm { mL } / \mathrm { min } \)의 유속으로 흘려 주었다. 초기 부착이나 생물막의 성숙 등 관찰하고자 하는 단계에 도달할 정도의 시간동안 흘려준 후 slide glass를 꺼내어 형광 현미경(Leica MZ \(16 \)F)으로 생물막이 형성된 정도를 관찰하였다.</p>