대구의 간 부위를 동결된 상태로 구입해 마쇄한 다음 동결고에 저장하여 두고 실험을 진행했다. 대구 간부분의 가수분해도는 여러 가지 효소를 이용해 측정했다. 각 시료 0.5g을 완충용액에 분산시켜 1%의 기질용액을 만들었고 각 효소별 최적온도에서 반응시키면서 일정 반응시간에 따라 반응혼합액에서 2ml를 빼 TCA 시험관에 넣어 원심분리를 했다. 원심분리한 상층액에서 가용성 단백질량을 검사한 후 가수분해도를 계산했다. 기질에 대한 최적의 효소비 결정을 위해 기질대 효소비를 변화시켜 가수분해도를 검토하였고 최적의 기질농도 결정을 위해 기질농도를 변화시키며 가수분해해 기질농도를 검토했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>본 실험에 사용한 대구의 간부위는 부산광역시 남천동 소재 활어센터에서 동결된 상태로 구입하여 마쇄한 다음, \(-30 \pm 2^{\circ} \mathrm{C} \)의 동결고에 저장하여 두고 실험에 사용하였다.</p> <p>가수분해시 사용한 효소인 papain, \( \alpha \)-chymotrypsin, trypsin 및 pronase E는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA), Alcalase와 Neutrase는 Novo Co. (Denmark)으로부터 구입하였고, ACE 저해활성 측정에 사용된 안지오텐신전환효소와 Hippuryl-Histidyl-Leucine (Hip-His-Leu)은 Sigma Chemical Co.에서 구입하였다. 그 외의 모든 시약은 분석용 특급시약을 사용하였다.</p> <p>대구의 간 단백질을 가수분해시켜 분자량별로 분획하기 위한 한외여과막 장치 (ultrafiltration membrane system)는 Millipore Co. (Bedford, USA)으로부터 구입하였고, 사용된 막의 분자량 한계범위 (molecular weight cut-off : MWCO)는 각각 \( 10 \mathrm{~kDa}, 5 \mathrm{~kDa} \) 및 \( 1 \mathrm{~kDa} \)을 사용하였다. 분리◦정제시 사용된 수지는 Sigma Chemical Co.에서 구입한 SP-Sephadex C-25와 Sephadex G-15이며, HPLC는 Tosoh Co.(Tokyo, Japan)의 ODS reverse-phase column \( (\phi 10.0 \times 250 \)\( \mathrm{mm} \) )이 장착된 Spectra Physics Co. (Riviera Beach, USA)의 P 2000을 사용하였으며, 최종 순도 결정은 Bio-Rad Co.(BioFocus, USA)의 capillary electrophoresis (CE) system을 사용하였다.</p> <h2>단백질의 가수분해도 측정</h2> <p>여러 가지 효소를 이용한 대구의 간부분의 가수분해도 (degree of hydrolysis) 측정은 각 시료 \( 0.5\mathrm{g} \) 을 Table 1 에 나타낸 완충용액 \( 50 \mathrm{m} \ell \)에 분산시켜 \( 1 \%\) (w/v) 기질용액으로 만든 다음, 각 효소별 최적온도에서 반응시키면서 일정 반응시간의 경과에 따라 반응흔합액에서 \( 2 \mathrm{m} \ell \)를 취하여 \( 20 \% \) (w/v) trichloroacetic acid (TCA) \( 2 \mathrm{m} \ell \)가 들어있는 시험관에 넣은 다음 원심분리 \( (3,000 \times \mathrm{g}, 10 \mathrm{min})\) 하였으며, 이때 사용한 기질 대 효소비는 100:1이 되도록 하였다. 원심분리한 상층액을 일정량 취하여 Lowry 법으로 \( 10 \% \mathrm{~TCA} \) 가용성 단백질량을 측정한 후, 다음 식으로부터 가수분해도를 계산하였다.</p> <p>가수분해도\( (\%)=\frac{10\% \mathrm{~TCA} \text { 가용성 단백질량 }}{\text { 총단백질량 }} \times 100 \)</p> <h2>단백질의 가수분해 조건</h2> <p>기질에 대한 최적의 효소비를 결정하기 위해서 \( 0.1 \mathrm{M} \) disodium hydrogen phosphate-sodium dihydrogen phosphate buffer \( \left(\mathrm{pH}\right. \) 7.0)를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 기질의 농도가 \( 1 \% \) \( (\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)가 되게 한 후, 기질 대 효소비를 10에서 1,000까지 변화시켜 가수분해도를 검토하였다. 또한 최적의 기질농도를 결정하기 위하여 효소 대 기질비가 \( 1: 100 \)으로 한 후, \( 0.2 \% \)부터 \( 5.0 \% \)까지 기질농도를 변화시키면서 동일한 완충용액과 온도에서 2시간 가수분해하여 기질농도를 검토하였다.</p>