다양한 유/무기 질소원을 대상으로 하여 균주와 protease 생산성을 향상시키는 질소원을 선정하기 위하여 실험 진행 및 protease 의 정제를 실시하였다. 부분 정제된 효소 용액을 이용하여 MS gel에 옮기고 탈색 후 단백질 분해활성을 나타내는 band를 확인하여 Zymography 분석을 수행하였다. 또한 protease가 선택적으로 분해하는 기질을 조사하여 효소의 기질 특이성을 탐색하고 반응 실험을 통해 최적 \( \mathrm{pH} \)와 최적 온도를 확인하였으며 효소 안정성의 확인을 위해 잔존 효소 활성을 확인하여 \( \mathrm{pH} \) 및 온도 안정성을 측정했다. 또한 \( \mathrm{Ca}^{2+}, \mathrm{Cu}^{2+}, \mathrm{Fe}^{2+}\) 등의 metal ion과 EDTA 및 DTT와 같은 chemical reagent 그리고 SDS를 사용하여 각각에 대한 protease 활성을 조사하였다.
<h2>효소생산을 위한 질소원의 영향</h2> <p>분리된 균주의 성장과 protease 생산을 촉진하는 질소원을 선정하기 위하여 다양한 유기/무기 질소원을 대상으로 조사하였다. Ammonium chloride, ammonium sulfate, casamino acid, gelatin, malt extract, peptone, skim milk, soytone, soybean meal, tryptone, yeast extract를 LB broth에 각각 \( 1 \% \) \( (\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 씩 첨가하고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(48 \) 시간 동안 배양하여 균주의 성장과 protease 생산에 미치는 효과를 조사하였다.</p> <h2>Protease의 부분 정제</h2> <p>배양상등액을 molecular weight cut-off (MWCO)가 \( 300\mathrm{kDa}, 50 \mathrm{kDa}, 10 \mathrm{kDa} \) 의 membrane을 사용하여 ultrafiltration (UF, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)으로 분획하였다. 효소활성을 나타내는 \( 10 \mathrm{kDa} \) 이하의 단백질 fraction을 차가운 acetone으로 \( 40 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 로 포화시켜 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에 \( 4\) 시간 동안 보관한 뒤, \( 10,000 \mathrm{rpm} \) 에서\( 20 \) 분간 원심분리하여 침전물을 얻었다. \( 40 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 포화상등에 acetone을 추가적으로 넣어 \( 60 \) , \( 80 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 로 포화시켜 같은 방법으로 침전물을 얻었다. 각각 의 침전물을 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}\) \(\mathrm{pH} 9.0 \) 완충액에 녹여 protease 활성 분획을 조사하고, 각 시료를 MWCO가 \( 15 \mathrm{kDa} \) 인 Spectra/por Ⓡ Dialysis tube (Spectrum Laboratories, Inc., Chisholm, Minnesota, USA)에 채워 밀봉한 후, \( 4^{\circ} \mathrm{C}\) 에서 \(50 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}\) \(\mathrm{pH} 9.0 \) 완충액으로 dialysis시켜 정제하였다.</p> <h2>효소의 Zymography 분석</h2> <p>부분 정제된 효소용액을 \( 2 \)-mercaptoethanol 이 제외된 5X zymography sample buffer \( (60 \mathrm{mM} \) Tris- \(\mathrm{HCl}\), \( 25 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) glycerol,\( 12 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) SDS, \( 0.1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) bromophenol blue, \( \mathrm{pH} \)\( 6.8) \) 에 섞어 \( 12 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) polyacrylamide gel에 loading 하여 \( 80 \mathrm{~V} \) 로 전기영동 하고, Coomassie brilliant blue로 염색하여 단백질 band들을 확인하였다. Zymography는 mixed substrate (MS) gel을 만들어 TRANS-BLOT 법으로 측정하였다. Gel에 포함된 SDS는 효소반응을 저해할 수 있기 때문에, 이를 제거하기 위해 \(3 \)차 증류수로 \( 10 \) 분 간격으로 \( 3 \)번 washing하고, \( 2.5 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) Triton X-\( 100 \)으로 \( 30 \) 분간 washing하였다. Washing 된 gel은 MS gel 에 overlay하여 \( 20 \mathrm{~V} \) 에서 \(25 \) 분간 transfer하고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 예열된 zymogram reaction buffer \( (30 \)\( \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}, 200 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 0.02 \% \) \((\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) sodium azide, \( \mathrm{pH} 9.0 \) ) 에 \(30 \) 분간 반응 시킨 후, Coomassie brilliant blue로 염색하고, destaining solution \( 40 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) methanol, \( 10 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) acetic acid, \( 50 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) D.W)로 탈색하여 단백질 분해활성을 나타내는 clear band를 확인하였다.</p> <h2>효소의 기질 특이성</h2> <p>Casein, gelatin, bovine serum albumin (BSA)를 이용하여 protease가 선택적으로 분해하는 기질을 조사하였다. \( 50 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) 완충액 (\(\mathrm{pH} 9 \))에 \( 6 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 의 기질을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에 \( 1 \) 시간 동안 반응시킨 후, TCA로 반응을 정지시켜 protease 조사하였다.</p> <h2>효소 활성과 효소 안정성</h2> <p>Protease의 최적 \( \mathrm{pH} \) 를 조사하기 위해 \( 50 \mathrm{mM} \) sodium acetate \( (\mathrm{pH} 3.0 \sim 6.0) \), \( 50 \mathrm{mM} \) sodium phosphate \( (\mathrm{pH} \ 6.0~8.0\)), \( 50 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) \( (\mathrm{pH} \ 6.0~8.0\), \( 50 \mathrm{mM} \) Glycine \( \mathrm{NaOH}(\mathrm{pH} \ 9.0, 12.0\)) 완충액을 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(1\) 시간 동안 반응한 후, 효소활성을 측정하였다. 최적 온도를 측정하기 위하여 \( 25, 30, 37, 45, 50, 60, 70^{\circ} \mathrm{C} \) 의 반응온도에서 조효소액을 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) 완충액 (\(\mathrm{pH} 9.0 \))에서 \(1 \) 시간 동안 반응시켜 효소활성을 비교하였다. Protease의 \( \mathrm{pH} \) 안정성을 확인하기 위해, 각 환충액에 조효소액을 \(30\) 분 동안 실온에서 반응 시키고, 이후 \( \mathrm{pH} 9.0 \) 로 적정하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(1 \) 시간 동안 추가로 반응한 후, 잔존 효소활성을 측정하였다. 온도에 대한 효소의 안정성을 조사하기 위하여 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-\( \mathrm{HCl} \) 완충액 (\(\mathrm{pH} 9.0 \))에 조효소액을 섞고 각 온도에서 \(30 \)분 동안 반응시킨 후, 최적 온도인 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(1 \) 시간 동안 추가로 반응하며 잔존 효소활성을 측정하였다.</p> <h2>Metal ion, chemical reagent, SDS의 효소활성에 대한 영향</h2> <p>사용된 metal ion은 \( \mathrm{Ca}^{2+}, \mathrm{Cu}^{2+}, \mathrm{Fe}^{2+}, \mathrm{K}^{2+}, \mathrm{Mg}^{2+}, \mathrm{Zn}^{2+} \) 으로서 최종 농도가 \( 1,5,10 \mathrm{mM} \) 이 되도록 첨가하여 protense 활성을 조사하였다. Chemical reagent는 ethylenediaminetetra-acetic acid (EDTA), ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), dithiothreitol (DTT), phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)를 위의 조건과 같이 처리하여 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) 완충액 \( (\mathrm{pH} 9.0\))에서 \( 1 \) 시간 동안 \( 37 \mathrm{C} \) 에서 반응시켜 protease 활성을 조사하였다. 계면활성제에 따른 효소반응의 저해를 확인하기 위해 SDS를 사용하여\( 1, 2, 4, 5, 6 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) SDS로 처리하고, 위의 조건과 같이 \(30 \)분간 실온에서 반응하고, \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-\( \mathrm{HCl} \) 완충액 \( (\mathrm{pH} 9.0\))에서 \( 1 \) 시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 추가로 반응하여 protease 활성을 조사하였다.</p>