Genomic library 제작에 필요한 chromosomal DNA를 만들기 위해 Bacillus sp. J105균주의 chromosomal DNA를 분리하여 Sau3AI으로 부분 분해한 후 원심관에 16시간 동안 슈크로즈 밀도 원심분리(sucrose density ultracentrifugation)를 행하였으며, E. coli의 형질전환은 Cohen과 Chang의 방법을 변형한 방법을 통해 LB배지 5ml에서 전배양한 배양액 0.2ml를 LB배지 20ml에 접종하고 진탕 배양했다.
<h2>Bacillus sp. J105균주의 genomic library의 제작</h2> <p>Genomic library 제작에 필요한 chromosomal DNA의 조제 방법은 Bacillus sp. J105균주의 chromosomal DNA를 분리하여 약 50 ~ 70 \( \mu \mathrm { g } \)의 DNA를 Sau3AI으로 부분 분해하여 su-crose용액으로 원심관에 5 ~ \(20 \% \)까지 밀도를 형성시켜 \( 50,000 \times g \)에서 16시간 동안 슈크로즈 밀도 원심분리(sucrose density ultracentrifugation)를 행하였다. 원심분리 후 크기별로 분리된 chromosome DNA 단편이 포함된 용액을 \( 0.5 \mathrm { ml } \)씩 분취하여 \( 0.5 \% \) agarose 전기영동을 통하여 DNA 크기를 측정하여, 20 ~ 30 \( \ kb \)크기의 DNA단편을 모아 TE buffer에 24시간 동안 투석하여 sucrose를 제거한 후 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)보관하였다. 준비된 cosmid vector arms \( 1 \mu \mathrm { g } \)과 \( 20 \sim 30 \mathrm { ~kb } \) chromosomal DNA단편 \( 3 \mu \mathrm { g } \)을 \( \mathrm { T } _ { 4 } \) ligase (Promega, USA)로 \( 18 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 6시간동안 ligation하였다. Ligation 후 in vitro packaging Kit (Stratagene Co., USA)를 사용하여 lambda phage 입자를 만들어 E. coli DH5에 형질도입한 후 LB agar배지(X-gal/IPTG, ampicillin 2 \( \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \)에 도말하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 18시간 배양하였다.</p> <h2>E. coli의 형질전환</h2> <p>E. coli의 형질전환은 Cohen과 Chang의 방법을 변형한 방법으로, \( 5 \mathrm { ml } \)의 LB배지에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 18 \)시간 전배양한 배양액 \( 0.2 \mathrm { ml } \)를 LB배지 \( 20 \mathrm { ml } \)에 접종하고 \( 660 \mathrm { ~nm } \)에서 O.D.값이 0.4가 될 때까지 진탕 배양하였다. 배양액을 \( 15,000 \times g \)에서 10분 간 원심분리하고 얻어진 균체를 \( 50 \mathrm { mM } \mathrm { CaCl } _ { 2 } ( \mathrm { pH } 8.0) \)용액 \( 2 \mathrm { ml } \)에 현탁하여 \( 0 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 15 분간 방치한 후, \( 15,000 \times g \)에서 10 분간 원심분리하고 \( 50 \mathrm { mM } \mathrm { CaCl } _ { 2 } ( \mathrm { pH } \) 8.0), \( 15 \% \) glycerol 혼합용액 \( 1.5 \mathrm { ml } \)에 다시 현탁하여 competent cell을 얻었다. Competent E. coli cells \( 0.2 \mathrm { ml } \)와 DNA \( 0.5 \sim 1.0 \mu \mathrm { g } \)을 혼합하고 \( 0 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30분간 정치한 다음 \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2분간 열처리하였다. 열처리 후 \( 0 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5 분간 정치한 다음 LB 배지 \( 1 \mathrm { ml } \)을 가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1시간동안 정치배양 후 배양액을 ampicillin ( \( 2 \mathrm { mg } \) \( / \mathrm { ml } \))이 포함된 LB agar배지에 도말하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 18시간 배양하여 \( \beta \)-lactamase 재조합 clone을 선별하였다.</p>