Rhodobacter capsulatus 유래의 hemA 유전자를 항시발현벡터에 클로닝한 다음 과발현시킨 균주를 통해 ALA를 고농도로 생산하기 위한 최적의 배양조건을 연구하였다. 세포생장에 Glycine 농도가 큰 영향을 미쳤고, 이때 세포성장을 저해하지 않는 선에서 최적의 농도는 \(5-10\mathrm{g/L}\)이었다. Succinic acid의 최적 농도는 \(10-20\mathrm{g/L}\)이었고 일부를 glutamate를 대체하면 ALA의 생산량이 더욱 향상되었다. 이렇게 jar-fermentor 발효 실험으로부터 최적화 배양조건을 찾음으로써 최종적으로 \(8.2\mathrm{g/L}\)의 고농도 ALA 생산이 가능했다.
<h2>Jar fermentor 배양실험</h2> <p>이상과 같은 flask 배양시험들을 통하여 얻은 배양 조건 및 배지 조성을 토대로 하여, \( 2.5 \mathrm { ~L } \) jar fermentor에서 ALA 생산시험을 수행하였다(Fig. \( 5 \)). 배양 중의 \( \mathrm { pH } \) 상승을 막기 위해 \( 5 \mathrm { ~N } \) 황산용액을 첨가하여 \( \mathrm { pH } 6.3 \) 으로 유지하였다. 세포 생장과 동반하여 succinic acid 량이 지속적으로 감소하면서 ALA생산량이 증가하기 시작하였으며, 배양 24 시간 후 에는 \( 6.8 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) 수준에 도달하였다. 또한 이 시점에 기질인 succinic acid가 거의 고갈되었기 때문에 succinic acid와 glycine을 각각 \( 5 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) 씩 공급한 결과, ALA 생산량은 지속적 으로 증가하여 배양 28 시간 후에는 \( 8.2 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) 수준에 이르렀다. 한편, 항시발현벡터를 사용하였음에도 불구하고 세포 생장보다 약간 늦은 싯점부터 ALA 생산이 시작되었는데, ALA 생합성 효소는 세포 생장과 비례하여 발현되는 것으로 추정되지만 ALA가 생합성되는 시간 및 생합성된 ALA가 세포 막을 통과하여 세포 밖으로 나오는데 시간이 소요되기 때문으로 추정된다.</p> <p>본 연구에서 유전자재조합 대장균으로부터 ALA를 고농도로 생산할 수 있는 공정을 개발하기 위해 배양온도, 기질의 농도, 탄소원 및 glutamate의 영향, 유가배양의 효과 등을 조사하였다. Lee 등은 Bradyrhizobium japonicum hemA 유전자를 발현시킨 대장균으로부터 \( 3.9 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) 수준의 ALA 를 얻었으며, Choi 등은 Rhodopseudomonas palustris hemA 유전자를 발현시킨 대장균의 배양 최적화를 통해 \( 5.15 \mathrm { g } / \mathrm { L } \) 수준의 ALA를 얻었다고 보고하였다. 또한, 최근 들어 재조합 대장균의 유가식 배양 최적화를 통하여 \( 6.6 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) 수준의 고농도 ALA를 얻을 수 있었다고 보고된 바 있다.</p> <h1>요 약</h1> <p>Rhodobacter capsulatus 유래의 hemA 유전자를 항시발현벡터(pHCEIIB vector)에 클로닝한 후 과발현시킨 Escherichia coli BLR(DE3) 균주를 사용하여, 5-aminolevulinic acid (ALA) 생산을 위한 적정 배양조건을 조사하였다. ALA 생산을 위한 배양온도는 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 보다는 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 더 나은 결과를 나타내었다. Glycine 농도가 세포생장에 미치는 영향이 컸으며, 세포생장을 저해하지 않고 ALA를 고농도로 생산하기 위한 적정 glycine 농도는 \( 5-10 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) 수준이었다. Succinic acid의 적정 첨가수준은 \( 10-20 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) 이었으며, succinic acid의 일부를 glutamate로 대체할 경우에 ALA의 생산량을 향상시키는 효과가 있었다. 한편, 배지 중의 glucose 첨가는 ALA 생산성을 저하시키는 결과를 초래하였다. 이상과 같은 배양 조건 최적화를 통한 jar-fermentor 발효실험을 통하여, 고가의 유도제(IPTG)나 ALA dehydratase inhibitor를 첨가하지 않고도 \( 8.2 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) 수준의 고농도 ALA를 얻을 수 있었다.</p>