apoptosis 유발에 중요한 조절인자로 작용하는 Caspase protease 효소는 핵이나 mitochondria의 외막에 불활성 상태로 존재한다.Western blot analysis결과, MDA-MB-231 세포에서 EAHF의 농도가 증가할 수록 caspase-8의 활성은 변화가 없는 반면 caspase-3, 및 caspase-9의 활성은 더 강해진다는 것을 통해 apoptosis 유발이 extrinsic way와 intrinsic pathway 중 intrinsic pathway를 이용한 caspase의 활성화와 강한 관련이 있음을 알 수 있다. 반면, MCF-7 세포에서는 Western blot analysis결과 EAHF가 caspase-3,-8 및 -9에 영향을 주지 않았음을 알 수 있었으나 이는 세포주기억제와 관련되며 세부적인 연관성은 추가실험을 통해 밝혀야한다.
<p>Caspase protease라는 효소 역시 apoptosis 유발에 중요한 조절인자로서 작용하는 것으로 알려져 있으며 이 단백질들은 세포에서 핵과 mitochondria의 외막에 불활성 상태인 pro-enzyme 형태로 존재한다. 많은 caspase 중 initiator caspase인 caspase-8은 활성화된 death receptor에 의해 형성된 DISC에 의해 활성화되어 effector caspase인 caspase-3을 활성화시킨다. 이렇게 활성화된 caspase-3은 많은 표적 단백질들을 분해하여 apoptosis를 유발하며, caspase에 의해서 분해가 유발되어 apoptosis에 관여하는 표적 단백질 중 하나인 PARP 단백질은 eukaryotic nuclear enzyme family로서 DNA repair, gene transcription, cell cycle progression, chromatin function, genomic stability 및 cell death를 조절하는 것으로 알려져 있다. Effector caspase인 caspase-3 및 -7이 활성화되면 \( 116 \mathrm{kDa} \)의 분자량을 가진 PARP 단백질의 Asp214와 Gly215 사이에서 분해가 일어나서 \(85\) 및 \( 24 \mathrm{kDa} \)의 단편으로 잘리게 된다. 한편 cell-cell adhesion 및 Wnt signaling에 관여하는 E-cadherin-associated 단백질로서 세포 내 골격 유지, 다양한 부착성 세포의 전사 조절 및 세포 유착에 관여하는 \( \beta \)-catenin도 caspase의 표적 단백질로서 apoptosis 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한 최근 연구에 의하면 다양한 성장인자나 cytokine 등과 같은 세포 성장을 촉진하는 인자들이 apoptosis를 억제할 수 있는 것으로 보고되어지고 있다. 이러한 세포의 성장에 있어서 PLC signaling pathway는 매우 중요하다고 보고되어지고 있는데, apoptosis가 유발될 경우 활성화된 caspase 효소에 의하여 분해될 수 있기 때문에 apoptosis 유발의 생화학적 표식자로 사용이 되고 있다. 또 다른 caspase인 caspase-9의 활성화는 mitochondria에서 유리된 cytochrome c에 의해서 형성된 apoptosome에 의하여 유발되며 이렇게 활성화된 caspase-9은 caspase-3를 활성화시켜 apoptosis를 일으키는 것으로 알려져 있으며, 많은 선행연구에서 알 수 있듯이 caspases의 활성화가 apoptosis의 유발에 대한 증거가 될 수 있다. 따라서 extrinsic 및 intrinsic pathway를 포함하는 apoptosis 유발에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 caspase-3,-8 및 -9의 발현 및 활성에 미치는 EAHF의 영향을 Western blot analysis로 조사한 결과 MCF-7 세포에서는 관찰된 모든 caspases의 발현에 EAHF이 아무런 영향을 미치지 못하였지만 MDA-MB-231 세포에서는 EAHF의 처리에 의하여 intrinsic pathway에 관여하는 것으로 알려진 caspase-3 및 caspase-9의 활성형 단백질의 발현의 증가 또는 비활형성 단백질의 발현 감소가 관찰되었으며, PARP, \( \beta- \)catenin 및 PLC-\( \gamma1 \) 등과 같은 단백질의 발현 감소 및 단편화 현상이 EAHF 처리 농도 의존적으로 증가되었다. 하지만 extrinsic pathway에 관여하는 것으로 알려진 caspase-8의 경우는 EAHF 처리에 따른 변화가 관찰되지 않았다. 이상의 Western blot analysis에 의한 결과를 재확인하기 위하여 caspases의 활성 정도를 직접 분석한 결과 MCF-7 세포에서는 EAHF 처리에 따른 caspase-3 및 caspase-9의 활성 증가가 약하게 나타났지만 MDA-MB-231 세포에서는 EAHF 처리 농도 증가에 따라 caspase-3 및 caspase-9의 활성이 매우 강하게 증가되었다. 즉 EAHF 처리에 따른 유방암세포의 apoptosis 유발은 intrinsic pathway를 통한 caspases의 활성화와 직접 관련이 있음을 의미하는 결과이다.</p><p>이상의 결과에서 EAHF를 인체 유방암세포주인 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포에 처리하였을 경우 세포의 증식을 강하게 억제하는 것으로 나타났고 세포의 형태적 변화도 초래하였다. 이러한 증식억제 및 형태변화는 MDA-MB-231에서는 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났지만 MCF-7 세포에서는 apoptosis 유발보다는 G1기에서의 세포주기 억제와 관련이 있는 것으로 나타났다. MDA-MB-231에서의 apoptosis 유발은 pro-apoptotic 유전자인 Bax의 발현 증가와 그에 따른 caspase-9의 활성화와 같은 intrinsic pathway를 거쳐 caspase-3의 활성화 및 기질 단백질들의 분해로 apoptosis가 유발되는 것으로 나타났다. 그러나 MCF-7 세포에서의 세포주기억제 유발은 추가 실험을 통하여 관련 유전자들 간의 발현 변화 및 상호 연관성에 대해서 밝혀야 할 것으로 생각된다. 이러한 연구 결과는 톳 추출물의 생화학적 항암기전 해석을 이해하고 향후 수행될 추가적인 연구를 위한 기초 자료로 중요하게 사용될 것으로 생각된다.</p>