뇌의 mRNA를 분석하여 neurogranin 발현 수준을 살펴본 결과, 1월령, 3월령, 6월령의 WT와 EBD KO 쥐에서 다른 패턴을 발견하였다. WT 쥐에서는 시간 경과에 따른 neurogranin 발현량 변화가 없었으나, EBD KO 쥐에서는 노화가 진행될수록 neurogranin 발현이 감소하였다. 또한, neurogranin의 인산화 정도는 산화스트레스에 의해 변화하는 것으로 파악되었으며, 인산화된 neurogranin의 양은 노화가 진행됨에 따라 증가하였다. 특히 6월령 EBD KO 쥐의 뇌에서는 감소된 neurogranin 발현량에 비해 인산화된 neurogranin의 양이 증가하는 현상이 관찰되었다.
<h1>결 과</h1><p>본 논문에서는 1월령, 3월령, 6월령으로 분리되는 WT 및 EBD KO 쥐의 뇌에서 neurogranin의 상대적인 발현 수준을 알아보기 위해 mRNA를 이용한 real-time PCR 및 추출된 단백질을 이용한 western blot 을 수행하였고, neurogranin의 인산화정도, 배양된 신경세포인 neurospheres를 이용한 neu-rogranin 및 인산화 된 neurogranin의 수준을 확인하였다. 나아가 산화스트레스와 항산화제가 neurogranin의 인산화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 neurogranin에 산화스트레스 유발 물질인 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 처리하였고, 24시간 경과 후 일부 대조군에는 항산화제인 N-acetyl-L-cysteine (NAC)을 처리하여 그 결과를 확인하였다.<h2>Real-time PCR을 통한 WT 및 EBD KO 쥐 뇌의 neurogranin 상대적 발현수준</h2><p>1월령, 3월령, 6월령 WT, EBD KO 쥐에서 적출한 뇌의 mRNA를 이용하여 neurogranin 발현 수준을 real-time PCR을 수행하여 확인하였다. WT 쥐에서는 1월령, 3월령, 6월령 등 노화가 진행되는 상황에서도 neurogranin mRNA의 생성 수준에는 차이가 없었으나, EBD KO 쥐에서는 1월령, 3월령, 6월령과 같이 노화가 진행됨에 따라 neurogranin mRNA의 생성 수준은 감소되었다. 이 결과를 통해, 1월령 EBD KO 쥐에서는 neurogranin mRNA가 WT 쥐와 동일하게 정상적으로 생성되지만 노화가 진행됨에 따라 neurogranin mRNA의 생성 수준이 현격히 감소한다는 것을 발견하여, PPT1 결핍이 정상적인 neurogranin의 발현에 영향을 주는 것을 확인 하였다.</p><h2>WT 및 EBD KO 쥐의 뇌를 이용한 western blot 분석</h2><p>1월령, 3월령, 6월령의 WT과 EBD KO 쥐에서 적출한 뇌의 단백질을 이용하여 western blot 분석을 수행 하였다. 그 결과 real-time PCR의 결과와 유사하게 1월령, 3월령, 6월령으로 구분된 WT 쥐의 뇌에서는 neurogranin의 발현량에 차이가 없었으나, 1월령, 3월령, 6월령으로 구분된 EBD KO 쥐의 뇌에서는 노화가 진행될수록 neurogranin의 발현이 점차 감소하는 것을 확인 하였다.</p><p>또한, 인산화된 neurogranin은 1월령, 3월령, 6월령으로 구성된 WT 및 EBD KO 쥐에서 노화가 진행될수록 그 수준이 어느정도 증가하는 형태를 확인하였으며, 흥미롭게도 6월령의 EBD KO 쥐의 뇌에서는 감소된 neurogranin의 양에 비교하여 볼 때 인산화된 neurogranin의 양이 증가해 있음이 확인되었다.</p><h2>배양 신경세포인 neurospheres의 western blot 분석</h2><p>WT 과 EBD KO 쥐의 태아에서 추출한 neurospheres를 배양하여 neurogranin의 양을 확인한 결과, WT 및 EBD KO neurospheres 내의 neurogranin 수준은 앞서 실험 결과와 동일하게 EBD KO 쥐에서 감소하는 형태를 확인하였으며, 인산화된 neurogranin의 수준은 WT 쥐 보다 EBD KO 쥐에서 현격하게 수준이 증가한 형태를 확인하였다. 이렇듯 neural stem cell인 neurospheres에서도 감소하는 neurogranin의 발현수준에 비해 인산화된 neurogranin의 양이 증가하는 것이 확인 되었다. 이전의 다양한 연구를 통해 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 및 nitric oxide (NO)와 같은 활성산소들에 의해 산화스트레스가 활성화 되고, 노화와 관련이 있는 신경 퇴행 질환에 영향을 미친다는 결과가 보고된 바 있다. 또한 영아형 바텐병에서도 신경세포 내 산화스트레스 정도가 상승되어있음이 이전 연구를 통해 밝혀진 바, 산화스트레스의 정도 변화가 neurogranin의 인산화정도를 변화시키는지의 여부를 확인 할 필요성이 대두되었다.</p><h2>Neurospheres에 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 및 N-acetyl-L-cysteine (NAC)의 처리</h2><p>이전의 연구결과를 통해 밝혀진 바와 같이 영아형 바텐병에서 소포체 스트레스에 의해 활성산소가 발생하고 \( \mathrm{Ca}^{2+} \) 항상성에 붕괴가 발생하여 최종적으로 세포사멸이 발생한다면, neurogranin 또한 calmodulin 결합 단백질로서 \( \mathrm{Ca}^{2+} \) 항상성 붕괴에 의한 영향을 받을 것으로 사료되어, 활성산소가 neurogranin의 인산화에 미치는 영향을 조사하기 위해, 다량의 활성산소를 지닌 EBD KO 쥐의 neurospheres에 산화스트레스 유발물질인 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 처리하고, 24시간 경과 후 항산화제인 NAC 을 처리하여 western blot 분석을 수행하였다. Mock treat를 실시한 control의 인산화된 neurogranin 수준과 비교하여 산화스트레스 유발물질인 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 처리하자 그 수준이 현격히 상승하는 것을 확인하였으며, \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 처리 후 항산화제인 NAC을 투여한 샘플에서는 neurogranin의 인산화 수준이 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 처리하였을 당시보다 감소된 결과를 확인하였다. 따라서 이 결과를 통해 neurogranin의 인산화 정도는 세포가 가진 산화스트레스 정도에 의해 변화함을 확인 할 수 있었다.</p>