사용 균주는 해양 환경에서 분리한 VP KH410을 사용하였고, 배지는 LB배지에 \( 3 \% \mathrm{NaCl}, 0.5 \% \) glucose, \( 0.2 \% \) 효소 첨가, 초기 \( \mathrm{pH} \) 5.5, 배양온도 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에 7시간 진탕 배양하였다. 세포 파쇄액으로는 배양액을 원심분리 후 침전물을 생리 식염수로 2회, 인산 완충액으로 1회 세척하고 동일 완충액에 재현탁 후,균체를 얼음에 채워 초음파 파쇄기로 파쇄시켰다. 마지막으로 원심분리 후 상등액을 효소활성측정에 사용하였다. 사용 저해제는 acetohydroxamic acid (AHA), thal-lium acetate, boric acid, \( \mathrm{Pb}\left(\mathrm{NO}_{3}\right)_{2}, \mathrm{HgCl}_{2}, \mathrm{AgNO}_{3} \), 그리고\( p \)-hydroxymercuric benzoate를 사용하였다. 생육도는 분광광도계 \( 600 \mathrm{~nm} \) 흡광도로 측정하였다. 효소활성의 측정은 Weatherburn 방법을 변형하여 hypochlorite 존재하에서 암모니아를 phenol과 반응시켜 indo-phenol로 전환시켜서 나온 발색정도를 분광광도계로 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 요소분해효소의 정제로는 대량 배양 후 DEAE-cellulose ion exchange chromatography, Sepharose CL-6B gel filtration 및 Oxirane-activated urea affinity column 방법을 변형하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용 균주 및 배지</h2> <p>해양 환경에서 분리한 VP KH410을 사용하였다. 기본배지로는 LB배지에 \( 3 \% ~\mathrm{NaCl}, 0.5 \% \) glucose, \( 0.2 \% \) 효소를 첨가하고 초기 \( \mathrm{pH} \) 를 5.5로 조정하여 배양을 유도하였으며 배양온도 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에 7시간 진탕 배양하였다.</p> <h2>세포 파쇄액</h2> <p>균체 파쇄액의 준비를 위하여 배양액을 원심분리하고 \( \left(3,000 \mathrm{X} g, 10 \mathrm{~min}, 4^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 그 침전물을 생리 식염수로 2회 세척하였다. 이를 인산 완충액 \( (20 \mathrm{mM}, \mathrm{pH} 7.0) \) 으로 한번 더 세척 한 후, 같은 완충액에 재 현탁 시키고 균체롤 얼음에 채운후 초음파 파쇄기 (Sonifer 250, Branson, USA)를 이용 하여 파쇄시켰다 (50 duty cycles, output 4.0, 4 periods of 30s). 피쇄액은 원심분리한 후 \( \left(10,000 \mathrm{X} \mathrm{g}, 20 \mathrm{~min}, 4^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 그 상등액 만을 효소활성 측정용 및 정제 과정에 사용하였다.</p> <h2>사용 저해제</h2> <p>사용 저해제로는 acetohydroxamic acid (AHA), thal-lium acetate, boric acid, \( \mathrm{Pb}\left(\mathrm{NO}_{3}\right)_{2}, \mathrm{HgCl}_{2}, \mathrm{AgNO}_{3} \), 그리고 \( p \)-hydroxymercuric benzoate를 사용하였다. 각각의 농도는 균 배양액의 경우에는 \( 0.02 \% \) 를 첨가하고 효소활성이 최대에 이로는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 7시간의 배양을 유도 한 후에 균체를 회수하여 사용하였다. 정제효소의 경우에는 각 저해제에 대하여 30 unit를 사용하고 각각의 저해제를 \( 0.01 \mathrm{mM} \), \( 1 \mathrm{mM}, 10 \mathrm{mM} \) 과 \( 20 \mathrm{mM} \) 의 농도별로 첨가하였다. 호소와의 반응은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 반응시킨 후 기질인 요소를 첨가하여 활성의 정도를 비교하였으며, 표준 요소분해호소로는 식물 유래 jack bean urease (Sigma, Type c-3, 1200\( \mathrm{IU} / \mathrm{mg} \) )를 사용하였다.</p> <h2>생육도 및 효소활성의 측정</h2> <p>균의 생육도는 분광광도계를 이용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서의 흡광도로써 측정하였고, 단백질의 정량은 \( 280 \mathrm{~nm} \) 에서 행하였다. 요소분해효소 활성의 측정은 Weatherburn의 방법을 변형하여 기질인 요소가 분해되어 생성되는 암모니아를 hypochlorite 존재하에서 phenol과 반응시켜 indo-phenol로 전환시킨 후 나타나는 발색정도를 분광광도계로 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하여 정량하였다. 이때 표준곡선은 am-monia chloride로 측정하였으며 1분 동안에 \( 1 \mu \mathrm{M} \) 을 유리시키는데 필요한 요소분해효소의 양을 1 unit로 정하였다.</p> <h2>요소분해효소의 정제</h2> <p>요소분해효소는 대량 배양을 행한 후 DEAE-cellulose ion exchange chromatography, Sepharose CL-6B gel filtration 및 Oxirane-activated urea affinity column의 방법을 변형하여 정제하였다. 전체 정제과정은 Fig. 1에 요약하였다. 정제 요소분해효소의 순도 검정을 위하여 SDS-PAGE를 Laemmli와 Osborn 의 방법에 따라 \( 12 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) poly-acryl amide와 \( 0.1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) SDS 가 함유된 separating gel과 \( 4 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) polyacryl amide 와 \( 0.1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \mathrm{SDS} \) 가 함유된 stacking gel을 만들어 사용하였다. 시료의 조제는 \( 2 \% \) SDS와 \( \beta \)-mercaptoethanol을 함유하는 sample buffer와 정제 과정을 거친 효소를 섞어 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 끓인 후 15 \( \mathrm{mA} \) 에서 약 3시간 동안 전기영동한 후 gel을 coomassie 염색액으로 염색하고 단백질 밴드를 확인하였다. 이때 정제된 요소분해효소의 분자량을 측정하기 위하여 Bio-rad사의 middle molecular weight standard를 사용하였다.</p>