본 연구에서는 gch1, ptps, ndk, gmk, guaA-guaB 유전자를 동시에 발현하여 세피아프테린의 생산량을 비교하였다. 결과로는 guaA-guaB 유전자를 추가적으로 발현하는 경우 세피아프테린의 생산량이 대조구보다 약 43% 증가하였고, 이는 IMP로부터 GMP가 생성되는 효소반응의 속도가 GMP가 IMP로 전환되는 효소반응 속도보다 빨라진 것으로 추정된다.
<h2>목적 유전자 동시발현이 세피아프테린 생산에 미치는 영향</h2> <p>세피아프테린 생합성에 필수적인 gch1과 ptps 유전자가 도입된 대장균 BL21(DE3)에 gmk, ndk, guaA-guaB 유전자를 동시에 발현할 수 있는 벡터를 형질전환하고 세피아프테린의 생산량을 비교하였다(Fig. 4A). 세피아프테린을 생산할 수 있는 BL21(DE3) 균주에 대조구 벡터(pACYCDuet-1)를 추가적으로 형질전환한 균주를 \( 0.1 \mathrm { mM } \) IPTG로 단백질 발현을 유도하고 24시간 배양한 경우 약 \( 87.7 \pm 9.8 \mathrm { mg } / \mathrm { l } \)의 세피아프테린이 생산되었다. 이 결과는 선행연구결과와 매우 유사한 것으로서 gch1과 ptps 유전자가 도입된 균주에 대조구 벡터를 추가로 형질전환 하여도 세피아프테린 생산에는 영향을 미치지 않는 것으로 판단되었다.</p> <p>세피아프테린 생산은 GTP를 생합성 회로의 전구물질로 사용하기 때문에 퓨린(purine)계 핵산대사 회로에서 GTP 생합성을 증가시키기 위하여 ndk, gmk 및 guaA-guaB 유전자를 순차적으로 동시 발현하여 세피아프테린의 생산량을 비교하였다. Fig. 4A에서 나타났듯이, ndk 유전자를 단독으로 발현하거나 ndk-gmk를 조합하여 발현한 경우는 세피아프테린의 생산량이 대조구보다 유의적으로 감소하였다. 유전자 guaA-guaB의 경우는 단독으로 발현하거나 ndk와 동시에 발현하는 경우 세피아프테린의 생산량이 현격히 감소하였다. 유전자 ndk와 gmk를 동시에 발현한 경우는 대조구와 유사한 수준의 세피아프테린의 생산성을 나타내었다. 그러나 ndk-gmk 유전자 발현조합에서 guaA-guaB유전자를 추가적으로 발현하는 경우 \( 126.1 \pm 9.3 \mathrm { mg } / \mathrm { l } \)의 세피아프테린이 생산되었는데 이 값은 대조구에 비하여 약 \( 43 \% \) 증가한 값이다.</p> <p>퓨린계 핵산의 대사회로에서 IMP는 XMP 및 GMP 경로를 통해 다시 회귀가 가능하다(Fig. 1). 본 연구에서 guaA-guaB의 추가적인 발현을 통해 IMP로부터 GMP가 생성되는 효소반응의 속도가 GMP가 IMP로 전환되는 효소반응 속도보다 빨라졌기 때문에 세피아프테린의 생산량이 guaA-guaB-gmk-ndk의 동시 발현조건에서 대조구보다 유의적으로 향상된 것으로 추정된다. 그러나 이러한 결과의 보다 체계적인 해석을 위하여 유전자 동시발현에 의한 대사흐름 등의 변화를 보다 면밀하게 분석할 필요가 있을 것으로 사료된다.</p> <p>GTP 생합성에 관여하는 유전자의 동시발현이 세포 내 GTP 농도에 미치는 영향을 조사하였다(Fig. 4B). 세피아프테린 생산에 필요한 gch1과 ptps 유전자만 발현된 균주의 세포 내 GTP 농도는 \( 0.21 \pm 0.04 \)( \( \mathrm { mg } / \mathrm { g } \) cell) 수준이었다. GTP 생합성에 관여하는 guaA-guaB, gmk 및 ndk 유전자를 동시에 발현한 실험구의 세포 내 GTP의 농도는 \( 0.44 \pm 0.01 \)( \( \mathrm { mg } / \mathrm { g } \) cell)로서 대조구와 비교하여 약 2배 높은 GTP 함량을 나타 내었다. 세피아프테린 생산 양상과 완벽하게 부합되지는 않았지만 ndk, gmk 및 guaA-guaB를 순차적으로 추가발현하는 경우 세포 내 GTP 농도가 증가하는 양상을 확인할 수 있었다.</p>