Sinorhizobium meliloti 1021 균주로부터 MDH로 추정되는 유전자 SmMDH를 이용하여 E.coli 균주를 형질전환한 후 효소 유전자를 발현시켰다. SmMDH는 494개의 아미노산으로 구성되며, LDR 계열에 속하는 Rhodobacter sphaeroides 유래 MDH와 가장 높은 아미노산 서열 상동성을 나타내었으며 이 외에도 LDR 계열의 P/MDH, ScMDH, AfMDH 및 StMDH와 \( 35.0-42.7 \% \) 의 아미노산 서열 상동성을 나타내었다. 결과적으로 smMDH는 LDF 계열의 MDH일것으로 예상한다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>SmMDH 유전자의 클로닝 및 대장균 내 발현</h2> <p>National Center for Biotechnology Information (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 데이터베이스 검색을 통해 다양한 미생물 유전체 내의 MDH 유전자 분포를 확인하였다. 그 중 Sinorhizobium meliloti 1021 균주로부터 MDH로 추정되는 유전자(SmMDH; GenBank accession No. NP386546)를 발견하였으며, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 검색 결과, 이 유전자가 다른 미생물 유래 MDH 유전자들과 상동성을 가짐을 알 수 있었다.</p> <p>PCR을 통해 선택적으로 증폭한 약 \( 1.5 \mathrm { ~kb } \)의 SmMDH유전자 단편을 pET-21a 발현벡터에 삽입하여 pETSmMDH로 명명하였다. 이 유전자는 494개의 아미노산 잔기(약 \( 54 \mathrm { ~kDa } \))을 암호화하는 \( 1,485 \mathrm { ~bp } \)의 염기로 구성 되었으며, 서열분석 결과 데이터베이스 상의 염기서열과 일치함을 확인하였다.</p> <p>E. coli BL21 (DE3) 균주에 pETSmMDH를 형질전환하여 재조합 대장균을 얻은 후, 배양하면서 효소유전자의 발현을 유도하였다. 효소유전자의 발현도 및 효소 정제도를 SDS-PAGE로 확인한 결과, 유전자 서열로부터 예상한 바와 같이 약 \( 54 \mathrm { ~kDa } \) 의 재조합 SmMDH 단백질이 대장균 내에서 대량 발현되고 쉽게 정제됨을 확인하였다.</p> <h2>SmMDH의 상동성 비교</h2> <p>SmMDH 유전자로부터 추정한 아미노산 서열을 다른 미생물 유래 MDH들과 비교하여 분석한 결과, dehydrogenase/ reductase (DR) family 계열의 효소들과 진화적으로 유사한 것으로 나타났다. 또한 SmMDH는 494개의 아미노산으로 구성되며, LDR 계열에 속하는 Rhodobacter sphaeroides 유래 MDH (RsMDH)와 \( 55.2 \% \)로 가장 높은 아미노산 서열 상동성을 나타내었다. 이 외에도 LDR 계열의 Pseudomonas fluorescens MDH (P/MDH), Saccharomyces cerevisiae MDH (ScMDH), Aspergillus fumigatus MDH (AfMDH) 및 Salmonella typhimurium MDH (StMDH)와 \( 35.0-42.7 \% \) 의 아미노산 서열 상동성을 나타내었다. 반면에 SDR 또는 MDR 계열의 효소들과는 \( 10 \% \) 이하의 매우 낮은 서열 상동성을 보였다.</p> <p>또한 SmMDH의 N-말단 domain 부위에서 발견된 Rossmann fold 형태의 조효소 결합부위(Phe39, Asp71, Ile131, Glu133)와 C-말단 domain 부위에 존재하는 \( \alpha \)-helix 형태의 기질 결합 부위(Asp230, Arg231, His303, Arg373), 그리고 효소의 활성부위(Asn191, Lys295, Asn300) 서열은 Kavanagh 등의 연구결과와 유사하게 보존되어 있음을 확인하였으며, 이상의 결과를 종합할 때, SmMDH는 LDR 계열의 MDH일 것으로 예상하였다.</p>