건조된 황금의 뿌리를 구매하여 추출물을 얻었다. 이후 albicans 균주를 YM 액체배지에서 계대배양하여 사용하였다. 최소억제농도 측정 시 3회 중 2회일치하거나 가장 높은 값을 채택하였다. 다음으로 바이오필름 형성 및 S.baicalensis의 항바이오필름 활성을 측정하고, C. albicans의 폴리스티렌 표면 부착에 대한 이의 영향을 분석하였다. microsomal membrane을 준비하여 (1,3)−\(\beta\)-D-glucan synthase의 활성을 측정하였다. FUN-1과 Calcofluor White를 사용한 이중 염색과 Neutral red 염색에 의한 분석을 하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물추출물</h2> <p>건조된 황금(S. baicalensis)의 뿌리를 jchanbang.com에서 구매하였다. \( 30 \mathrm{~g} \)의 황금을 \( 600 \mathrm{ml} \)의 증류수에 넣어 1시간동안 불린 후 2시간 동안 끓였다. \( 2,000 \mathrm{~g} \)로 20분간 원심분리한 후 상등액을 진공농축기로 농축시키고 동결건조하여 황금의 수용성 추출물 \( 14.1 \mathrm{~g} \)을 얻었다. 수용성 추출물(이하 S. baicalensis) 은 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 증류수에 녹인 후 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) filter (Avantec, Japan)로 여과하여 사용 전까지 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다.</p> <h2>균주 및 배양</h2> <p>Candida albicans (KCCM 50235, ATCC 18804), C. glabrata (KCCM 50044, ATCC 2001), C. tropicalis (KCCM 50075, ATCC 750), C. krusei (KCCM 11426, ATCC 32196)는 한국미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에서 분양 받아 사용하였다. 바이오필름 실험에 사용된 10 C. albicans 균주는 캔디다증 환자로부터 분리하였으며 분리균주는 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였고 필요시 YM agar (Becton Dickinson, USA) 또는 YM 액체배지에서 계대배양 후 사용하였다.</p> <h2>최소 억제농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)</h2> <p>MIC는 CLSI M27-A3 미량희석법에 준하여 resazurin을 포함시킨 색변화 측정법을 병행하여 사용하였다.</p> <p>모든 분석은 3회 반복하였고 MIC는 두 가지 기준에 따라 결정하였다: MIC는 3회의 분석 중 최소한 2회 일치하거나 3회 중 가장 높은 값으로 결정하였다. 양성 대조군으로 amphotericin B (Sigma, USA)를 포함시켰다.</p> <h2>바이오필름 형성과 S. baicalensis의 항바이오필름 활성 측정</h2> <p>캔디다증 환자에서 분리한 10 C. albicans 균주에 대한 대수기의 배양액을 \( 5 \% \) glucose가 첨가된 Yeast Nitrogen Base (YNB/Glc, Becton Dickinson, USA)에 최종 농도 \( 1 \times 10^{7} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 로 희석하였다. Flat-bottomed 96 well plate (Becton Dickinson, USA)에 희석액을 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 씩 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 배양하여 C. albicans 가 바이오필름을 형성하게 하였다. 부유상태의 효모를 제거하고 YNB/Glc로 헹군 후 음성 대조군을 포함하여 S. baicalensis가 포함된 \( 0.2 \mathrm{ml} \)의 YNB/Glc를 각 well에 넣어 초기단계의 바이오 필름에 대한 S. baicalensis 추출물의 저해효과를 조사하였다. 습도가 유지되는 조건에서 24 시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응시킨 후 바이오필름의 생존력을 XTT 환원분석법에 따라 측정하였다. 모든 실험은 4개씩 3회 시행하였다. 데이터는 3회 실험 중의 하나를 나타낸다.</p> <h2>C. albicans의 폴리스티렌 표면 부착에 대한 S. bai-calensis의 영향</h2> <p>대수기의 C. albicans ATCC 18804 배양액을 YNB/Glc에 최종 농도 \( 1 \times 10^{7} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 로 희석하였다. Flat-bottomed 96 well plate에 배양액 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 을 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3시간 배양하여 C. albicans 가 바이오필름을 형성하게 하였다. 부유상태의 효모를 조심스럽게 제거하고 YNB/Glc로 헹군 후 음성 대조군을 포함하여 S. baicalensis가 포함된 \( 0.2 \mathrm{ml} \) 의 YNB/Glc를 각 well에 넣어 3시간과 24시간 후에 폴리스티렌 바닥에 부착된 C. albicans를 위상차 현미경(Olympus, Japan)을 통해 분석하였다.</p> <h2>Microsomal membrane의 준비</h2> <p>\( (1,3)-\beta \)-D-glucan synthase의 활성 측정을 위한 효모의 microsomal membrane은 Shedlefzky와 Kurtz의 방법을 변형하였으며 원심분리 이후의 과정은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 행하였다: \( 1 \mathrm{~L} \) 의 YM에 C. albicans ATCC 18804 를 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 16시간 동안 진탕 배양하였다. 배양액을 \( 1,900 \mathrm{~g} \)로 원심분리하여 캔디다를 회수한 후 \( 10 \mathrm{ml} \)의 breakage buffer [\( 50 \mathrm{mM} \) Tris Cl (\( \mathrm{pH} 7.4 \)), \( 1 \mathrm{mM} \) EGTA, \( 4 \mathrm{mM} \) DTT, \( 5 \mu \mathrm{M} \) leupeptin, \( 20 \mu \mathrm{M} \)PMSF에 현탁시킨 후 \( 3 \mathrm{ml} \) 의 \( 0.5 \mathrm{~mm} \) glass bead를 넣어 70초씩 12회 Bead beater (BioSpec, USA)를 작동시켜 세포를 파쇄시켰다. 세포의 파쇄 정도는 위상차 현미경으로 관찰하였다. \( 3,000 \mathrm{~g} \)로 10분간 원심분리한 후 상등액을 \( 100,000 \mathrm{~g} \) 로 1시간 원심분리하여 membrane 침전물을 얻었다. Membrane 침전물은 \( 33 \% \)의 glycerol이 포함된 breakage buffer에 녹인 후 \( -27^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다. Membrane 침전물의 단백질 정량은 제조사의 방법에 따라 Bradford 분석법(Bio Rad, USA)으로 측정하였다.</p> <h2>\( (1,3)-\beta-\mathrm{D}- \) glucan synthase 활성</h2> <p>\( (1,3)-\beta \)-D-glucan synthase 활성측정을 위한 반응은 Kurtz의 방법을 약간 변형하였다: 최종 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 의 부피로 reaction buffer [\( 50 \mathrm{mM} \) Tris Cl (\( \mathrm{pH} 7.4 \)), \( 4 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 20 \mu \mathrm{M} \) GTP, \( 0.5 \% \) Brij \( 35,6.6 \% \) glycerol, \( 2 \mathrm{mM} \) UDP-glucose], \( 100 \mu \mathrm{g} \) 의 캔디다 membrane protein과 \( S \). baicalensis를 혼합하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시켰다. \( 6 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} \)를 \( 10 \mu \mathrm{l} \)넣어 반응을 정지시킨 후 생성된 glucan을 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \)로 30분간 용해시켰다. \( 210 \mu \) 의 aniline blue mix [40:21:59의 \( 0.1 \% \) aniline blue, \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{HCl}, 1 \mathrm{M} \) glycine/ \( \mathrm{NaOH} \) buffer (\( \mathrm{pH} 9.5 \))]를 넣은 후 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시킨 다음 fluorescence reader(Bio-Tek, USA)를 사용하여 excitation \( 400 \mathrm{~nm} \), emission \( 460 \mathrm{~nm} \)에서 50의 감도로 형광의 양을 측정하였다. reaction buffer, stop solution, aniline blue mix의 형광값을 background 로 하여 \( (1,3)-\beta \)-D-glucan synthase 활성을 다음의 식에 따라 계산하였다.</p> <p>\( (1,3)-\beta \)-D-glucan synthase activity \( (\%) \)\( = \) (fluorescence \( { }_{400 / 460} \) of \( S \). baicalensis-treated sample-fluorescence \( { }_{400 / 460} \) of background)/(fluorescence \( 400 / 460 \) of non-treated sample-fluorescence \( 400 / 460 \) of background)\( \times 100 \)</p> <h2>FUN-1과 Calcofluor White를 사용한 이중 염색</h2> <p>대수기의 C. albicans ATCC 18804 를 YNB/Glc에 최종 농도 \( 2 \times 10^{6} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 로 희석하였다. 음성 대조군을 포함하여 MIC의 S. baicalensis 를 처리한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rpm} \) 에서 3시간 동안 진탕 배양하였다. \( 1 \mathrm{ml} \) 의 배양액을 \( 5,000 \mathrm{~g} \) 로 1분간 원심분리하여 회수하고 Phosphate buffered saline (PBS)으로 헹군 후 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 의 PBS로 균질하게 녹였다. \( 20 \mu \mathrm{M} \) 의 FUN-1 (Invitrogen, USA)과 \( 25 \mu \mathrm{M} \) 의 Calcofluor white (Sigma, USA)를 넣어 상온의 암소에서 1시간 이상 염색한 후 triple pass filter가 장착된 형광현미경(Olympus, Japan)으로 관찰하였다.</p> <h2>Neutral red 염색에 의한 분석</h2> <p>대수기의 C. albicans ATCC 18804 배양액 \( \left(2 \times 10^{6} \mathrm{CFU} /\right. \)\( \mathrm{ml} \)에 MIC의 S. baicalensis를 처리한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rpm} \)에서 진탕 배양하였다. 4시간 후 \( 5,000 \mathrm{~g} \) 로 1분간 원심분리하여 회수한 후 PBS로 혱구었다. 같은 양의 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) neutral red로 혼합한 후 위상차현미경으로 관찰하였다.</p>