세포의 증식, 성장, 물질대사 등 여러 중요한 역할을 하는 mTOR는 다양한 암세포에서 PI3K/Akt/mTOR 신호경로를 통해 암세포를 조절한다. APO-Direct assay를 통한 apoptosis 측정에서 레스베라트롤의 농도가 증가함에 따라 apoptosis가 유도되었고, Bcl-2를 저해시킴으로써 apoptosis를 촉진한다. Western blotting은 apoptosis 유도 효과가 mTOR 및 COX-2 발현에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 을 실시하였다. Rapamycin은 mTOR의 특이적인 저해제이며, FK506 bind-ing protein (FKB12)와 복합체를 형성하여 mTORdml FKBP12-Rapamycin binging (FRB) 도메인에 직접 바인딩하여 mTOR의 작용을 저해한다. 본 연구를 통하여 레스베라트롤은 MCF-7 세포의 증식을 억제하고 이는 apoptosis 의 유도에 의한 것임을 확인하였다. 또 mTOR의 신호경로 저해를 통하여 COX-2의 발현을 감소시킴을 알 수 있다.
<h1>고 찰</h1><p>항암제를 이용한 화학적 치료는 암세포가 항암제에 약제내성을 갖게 되어 치료 후 찾아오는 2차 발병에서 그 효과를 보기 힘들고, 암세포 뿐만 아니라 정상 세포에도 독성이 나타나 이에 대한 여러 방안이 연구되고 있다. 따라서 최근에는 파이토케미컬을 이용하여 암세포의 성장과 분열을 억제하는 연구들이 진행되고 있는 바, 녹차 성분인 Epigallocatechin-3-gallate EGCG은 암세포에서 여러 신호경로를 통해 암세포의 증식 억제는 물론 암 예방 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 커큐민(curcumin)은 강황에서 추출된 폴리페놀류의 파이토케미컬로 암세포에서 apoptosis를 유도하는 것으로 알려져 있다.</p><p>mTOR는 세포의 증식, 성장, 물질대사 등 여러 가지 중요한 역할을 하며, 다양한 암세포에서 PI3K/Akt/mTOR 신호경로를 통해 암세포의 성장과 증식을 조절하는 것으로 알려져 있다. COX-2는 염증반응을 조절하는 중요 인자로 암세포에서 과발현되는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 레스베라트롤에 의한 MCF-7 세포에서의 암세포 증식 억제 및 apoptosis 유도 효과와, 이에 따른 mTOR 및 COX-2의 발현 양상을 알아보고자 하였다. 이를 위하여 MCF-7 세포에 레스베라트롤을 농도별로 처리하여 암세포의 생존율을 알아본 결과, 대조군과 비교했을 때 농도가 높아짐에 따라 암세포의 생존율이 감소하는 것을 알 수 있었다(Fig. 1A). 동일한 방법으로 시간별 암세포의 생존율을 알아본 결과, 대조군에 비해 시간이 경과함에 따라 암세포 생존율이 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 1B). 이와 같은 암세포의 생존율 감소가 apoptosis에 의해 일어나는 것인지 알아보기 위해 Hoechst 33342 염색을 통해 apoptosis에서 나타나는 염색체 응축 현상을 확인한 결과, Fig.2A 에서와 같이 레스베라트롤의 농도가 증가함에 따라 농도의존적으로 염색체 응축 현상인 apoptotic body 가 더 많이 발생된 것을 알 수 있었고, Annexin V-propodium iodide staning을 통한 apoptosis 측정에서도 레스베라트롤의 농도가 증가함에 따라 apoptosis 유도 효과가 큰 것을 확인 하였다(Fig. 2B). 이같은 결과는 전립선암 세포주 LNCaP에 레스베라트롤을 농도별로 처리 했을 때, APO-Direct assay를 통한 apoptosis 측정에서 레스베라트롤의 농도가 증가함에 따라 apoptosis가 유도되었고, 레스베라트롤의 처리 농도 증가는Bax, Bad, Bid 등을 활성화 시키고 Bcl-2를 저해시킴으로써 apoptosis를 촉진한다는 결과와 유사한 것으로 보인다.</p><p>한편 레스베라트롤을 처리했을 때 나타나는 apoptosis 유도 효과가 mTOR 및 COX-2 발현에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 Western blotting을 실시하였다. MCF-7 세포에 레스베라트롤을 농도별로 \( 6 \mathrm{hr} \) 처리했을 때, 농도가 증가함에 따라 mTOR 및 COX-2의 발현이 감소하는 것을 확인하였고 (Fig. 3A), 레스베라트롤 \( 100 \mu \mathrm{M} \) 을 시간 별로 처리했을 때에도 마찬가지로 시간이 지남에 따라 mTOR와 COX-2의 발현이 감소하였다(Fig. 3B). 레스베라트롤은 HeLa, Hec-1A, KLE등의 여러 자궁암 세포주에서 EIA assay를 통한 prostaglandin E2 (PGE2) 생성실험에서 레스베라트롤의 농도가 높아짐에 따라 COX-2 대사산물인 PGE2 생성이 감소됨이 밝혀졌다. 이러한 결과는 레스베라트롤에 의한 COX-2의 발현감소와 PGE2 생성의 유의성을 보여준다. mTORC1은 암성장의 중요 인자로 알려져 있으며 암세포에서 과발현되어 있는데[10], 최근 연구 에서 mTORC1은 4E-binding protein 1 (4E-BP1)의 인산화를 조절하여 hyposia-inducible factor 1 (HIF-1)을 활성화 시켜 저산소 상태에서 암세포가 적응하고 살아남는데 필요한 유전자를 발현시키는데 도움이 되는 것으로 알려졌다. COX-2 또한 저산소상태의 암세포에서 혈관신생 유도와 관련이 있는 것으로 밝혀져 있고, COX-2에 의해 생성된 산물인 PGE2가 혈관신생을 자극하며, COX-2가 과발현 되면 혈관신생 표적유 전자인 VEGF의 발현이 유도되는 것으로 알려졌다.</p><p>Rapamycin은 mTOR의 특이적인 저해제이며, FK506 bind-ing protein (FKB12)와 복합체를 형성하여 mTORdml FKBP12-Rapamycin binging (FRB) 도메인에 직접 바인딩하여 mTOR의 작용을 저해한다. 또한 세포분열 G1기를 정지시켜 암세포의 증식을 억제하는 효과를 가지고 있다. Celecoxib는 COX-2의 특이적인 저해제로 암세포에서 apopto-sis를 일으키는 것으로 알려져 있다. Rapamycin과 cele-coxib가 MCF-7 세포에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 Rapamycin과 레스베라트롤을 각각 또는 병행처리 하고 celecoxib와 레스베라트롤을 각각 또는 병행처리하여 세포생존율을 측정해 보았다. 그 결과 rapamycin와 celecoxib을 처리했을 때 무처리한 것에 비하여 암세포의 생존율이 감소하였으며 병행처리시에는 암세포의 생존율이 더욱 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 4). 동일한 조건에서 mTOR와 COX-2 신호분자 조절에 미치는 영향을 알아보기 위해 Western blotting을 실시한 결과, rapamycin을 단독으로 처리했을 때 COX-2의 발현이 저해되었으며 레스베라트롤과 병행처리 했을 때에 단독으로 처리했을 때 보다 COX-2의 발현이 더 강하게 저해되는 것을 관찰하였다. 또한 celecoxib를 단독으로 처리했을 때 에는 mTOR의 활성에 변화가 없었으며 레스베라트롤과 병행 처리 했을 때에는 mTOR의 활성이 감소하는 것으로 나타났다 (Fig. 5).</p><p>결론적으로, 본 연구를 통하여 레스베라트롤은 MCF-7 세포의 증식을 억제하는 것으로 밝혀졌으며 이러한 증식억제가 apoptosis 의 유도에 의한 것임을 확인하였는데, 이와 같은 결과는 mTOR의 신호경로 저해를 통하여 COX-2의 발현을 감소시킴으로써 나타나는 것으로 보인다.</p>