이 연구에서는 American Type Culture Collection에서 구매한 T-47D 유방암 세포를 사용하였다. 이 세포들은 Dulbeccco's Modified Eagles' Medium(DMEM)에 페니실린 G와 streptomycin sulfate를 함유한 상태에서 \(37^{\circ} \mathrm{C}(5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) )의 온도 조건 하에서 배양하였다. 연구 과정에서는 T-47D 유방암 세포에서의 methylation 상태 변화를 관찰하기 위해 메틸화 특이적 PCR(MSP)를 실행하였다. DNA 추출은 DNeasy tissue kit를 사용하여 수행하였다. 그리고 Stage I primer는 sodium bisulfite로 변형된 염기서열만을 인식하며, methylation의 여부를 구분하는 기능은 포함되어 있지 않다. 이러한 방법론을 통해 유방암 세포에서의 methylation 상태 변화에 대한 깊은 이해를 도모하고자 하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포 배양</h2> <p>본 연구에 사용한 T-47D 유방암 세포는 American Type Culture Collection(Manassas, VA)사로 부터 구입하였다. T-47D 세포는 \( 10 \% \mathrm{FBS}, 100 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) 의 페니실린 G, \( 100 \mu \mathrm{g} / \) \( \mathrm{ml} \) streptomycin sulfate를 함유하고 있는 Dulbeccco's Modified Eagles' Medium(DMEM)을 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}(5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) )의 incubator에서 배양하였다. 세포는 6 wells plate에서 배양하였으며, 세포를 분주하고 난 뒤 24 시간 후 caffeic acid, chlorogenic acid, EGCG를 처리하였다. \( 20 \mu \mathrm{M} \) 의 caffeic acid와 chlorogenic acid로 6일간 처리한 세포에서는 배지를 3 일 후 교환해 주었으며, 배지 교환을 할 때 caffeic acid와 chlorogenic acid를 재처리하였다. EGCG는 세포롤 분주하고 난 뒤 24 시간 후 \( 5,20,50 \mu \mathrm{M} \) 을 세포배양액에 혼합한 후 2 일간 배양하여 처리하였다.</p> <h2>Methylation-specific polymerase chain reaction (MSP)</h2> <p>T-47D 유방암 세포에서의 methylation 상태 변화를 알아보기 위하여 MSP를 실시하였다. DNA는 DNeasy tissue kit(Qiagen, Valencia, CA)로 추출하였다. p16 유전자의 methylation 상태는 2-stage nested PCR 방법으로 축정하였다. 우선 \( 1 \mu \mathrm{g} \) 의 추출한 DNA를 EZ DNA methylation kit(Zymo Research, Orange, CA)를 이용-하여 변형시켰다. Methylation이 일어나지 않은 cytosine은 sodium bisulfite의 처리에 의해 urasil로 변형어 일어나는 반면, methylation이 일어나 있는 cytosine은 메틸 그룹 \( \left(\mathrm{CH}_{3}\right) \) 의 차단으로 인해 urasil로 변형되지 않고 그대로 cytosine으로 남아있게 된다. 이렇게 sodium bisulfite로 변형된 DNA의 sequence는 methylation이 일어난 DNA와 methylation이 일어나지 않은 DNA 간에 더 이상 동일하지 않온 염기서열을 가지게 된다. 따라서 본 연구에서는 각각의 DNA sequence에 맞는 primer롤 제작하여 PCR을 실행하였다. Stage I PCR 에서는 p16 유전 자중 \( \mathrm{CpG} \) 가 풍부한 promoter 지역(size \( 208 \mathrm{bp} \) )을 증폭시켰다. Stage I primer는 sodium bisulfite로 변형된 염기서열을 인식할 뿐 methylation 여부를 구분할 수는 없도록 되어있다. Stage I PCR에 의해 증폭된 product는 50-1000배로 dilution을 실시한 후 \( 2.5 \mu \) l의 Stage I PCR product를 이용하여 Stage II PCR을 실시하였다. 이 단계에서 사용된 primer들은 methylation과 unmethylation을 구분하여 증폭시키는 PCR이다. Primer의 sequence, annealing 온도, 고리고 product 크기는 표 1 에 나타난 바와 같다. PCR 반옹의 특이성을 높이기 위하여 HotStarTaq DNA polymerase(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하였으며, PCR 반응 튜브의 최종 volume은 \( 20 \mu 1 \)로 하였다. Stage I PCR의 조전은 denaturing 온도는 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45초, anealing 온도는 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분, extension 온도는 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서, 1 분으로 구성되었으며, 이러한 세 단계를 \( 40 \mathrm{cy-} \) cycles 반복하였다. 그 후 마지막 extension을 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 실시하였다. Stage II PCR 조전은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45 초간 denaturing 시켰으며, \( 62^{\circ} \mathrm{C} \) (unmethylation-specific and methylation-specific)에서 45초간 실시하였으며, 마지막 extension 단계는 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45 초간 실시하였다. Stage II PCR 에서도 이러한 단계를 반복적으로 40 cycles 실행하였다. PCR cycle 수와 조건은 증폭된 신호가 증폭 curve에서 직선적으로 증가하는 부분에 해당되는지를 살펴본 후 최적의 cycle 수를 결정하였다. 또한 control은 DNA가 없는 상태에서 모든 효소나 첨가물을 포함한 채 \( \mathrm{PCR} \) 을 실시하였다. 모든 증폭된 PCR product는 \( 2 \% \) agarose gel을 이용하여 15 분간 전기영동을 한 후, ethidium bromide로서 5 분간 염색을 하였다. 그 후 gel은 ultraviolet transillumination을 통해 사진으로 기록되었다. 이러한 gel 사진들은 densitometry를 이용하여 integrated optical density(IOD)롤 측정하였다. 이렇게 측정된 methylation과 unmethylation \( \mathrm{PCR} \) product의 \( \mathrm{IOD} \) 는 internal control로서 증폭된 \( \mathrm{PCR} \) product(표 1)로서 보정하여 PCR 반응을 위해 쓰인 DNA의 copy수를 보정하였다. Internal control primer 역시 methylation과 unmethylation 상태를 구분하지 못하고 유전자를 증폭시킬 수 있도록 설계되었다. 모든 PCR 반응은 똑같은 조건의 세포를 3 set로 구성하여 각 set를 최소 2회이상 반복 측정하였으며, PTC- 100 thermal cycler(MJ research, Waltham, MA)를 이용하여 증폭하였다.</p>