해산물로부터 TCBS 상의 집락 색깔에 의해 비브리오균 분리 및 동정을 실시하였고, 분리된 비브리오균을 대상으로 식중독을 유발하는 enterotoxin의 유전자 검출을 PCR을 통해 검증하였다. 이 후, PCR 산물에서 독소 유전자를 정제하여 chitosan의 독소 유전자 검출을 위해 다시 PCR을 실시하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>비브리오균의 분리를 위한 배지</h2> <p>해산물로부터 Ju 등의 방법과 TCBS상의 집락의 색깔에 의하여 비브리오속 균의 동정을 실시하였다. 분리 및 동정을 위해 사용한 배지는 Difco Laboratories Detroit Michigan USA의 제품으로 alkaline peptone수, thio-citrate-bile-salt(TCBS) agar 및 tri-sugar-iron(TSI), lysine-indole-motility(LIM) agar 등이며, hemolysin 생성능을 알아보기 위해서는 \( 0.5 \% \mathrm{NaCl} \) 을 첨가한 Brain Heart Infusion(BHI, Sigma Co. St., Louis, USA) 액체배지와 \( 5 \% \) 면양 적혈구를 가한 헐액한천배지를 사용하였다.</p> <h2>Enterotoxin 유전자의 검출</h2> <p>분리된 비브리오 균속을 대상으로 식중독을 유발하는 enterotoxin으로써 heat-labile entertotoxin (trh), thermosta-ble direct hemolysin-like hemolysin (tdh) 및 choleratoxin (ctx) 의 유전자 검출은 Table 1의 primer를 이용하여 Delta Cycler I TM system, Easy Cycler Series(Ericomp, Inc., San Diego, CA, USA)의 PCR로 검증하였다.</p> <h2>Polymerase Chain Reaction(PCR)</h2> <p>PCR에 사용할 시료는 lysostaphin처리에 의한 검체의 조정법인 Sambrook 등의 방법으로 조제하였다. \( 0.5 \mathrm{~m} \)용 microtube에 buffer \( 100 \mu \ell(50 \mathrm{mM} \) glucose, \( 10 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 25 \mathrm{mM} \) Tris, \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, \mathrm{pH} 8.0 \) )를 분주하고 여기에 균을 부유시켰다. 그리고 \( 10 \mu l(1 \mathrm{mg} / \mathrm{m} \) )의 lysostaphin (Sig-ma Chemical Co., St. Louis, USA)를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 각각 5분, 10분, 15분, 30분 및 1시간씩 incubation하고 PCR을 실시한 결과 incubation시간에 관계없이 반응이 같았으므로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분씩, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 incubation하고 \( 10,000 \mathrm{rpm} \)에서 5분간 원심한 후 상층핵을 PCR 하였다. 이때의 PCR은 Stirai 등의 방법을 변형하여 사용하였다. 대상균주를 LB broth에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 18시간 진탕 배양(120 Rev. \( \times 6 \mathrm{~cm} \) stroke, Vision Scientific Co., Ltd. Korea)하였고 단계별로 희석하여 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 끓인 후, \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 이상 방치하였다. 이것울 약 10초간 원심분리하여 그 상층액을 template DNA로 사용하였다. PCR에 사용한 primer는 Table 1의 gene들과 상보결합하는 primer se-quence를 한국싱공(Korea Biotech, Taejeon, Korea)에서 주문하여 사용하였다. Purification은 Sep-Pak Catridge로 하였다. 이들 primer가 표적으로 하는 DNA의 크기는 Table 1과 같았다. 반응혼합액은 \( 5 \mu \) 의 \( 10 \times \operatorname{buffer}(0.1 \mathrm{M} \) Tris-HCl, \( \mathrm{pH~} 8.0 \), \( 0.5 \mathrm{M~} \mathrm{KCl.} \) \(0 .015 \mathrm{M~} \mathrm{MgCl} 2), 4 \mu \)의 \( 2.5 \) \( \mathrm{mM} \) dNTP, \( 10 \mathrm{pmol} / \mu \ell \) 의 sense primer \( 2 \mu \), antisense primer \( 2 \mu \ell \) 및 \( 0.25 \mu \) 의 \( 2.5 \mathrm{U} \) Taq polymerase로 구성하였으며, 여기에 검체를 \( 3 \times 103 \) 주가 되게 넣어 촣 \( 50 \mu \ell \) 가 되게하였다. PCR 조건은 gene에 따라 Table 2와 같이 실시하였다. 최종 PCR 증폭산물 \( 10 \mu \ell \)와 molecular weight marker로 phage \( \varnothing \) X174 Haell digested(TaKaRa Shuzu Kyoto, Japan)와 phage \( \lambda \) DNA HindiII digested(TaKaRa Shuzo Kyoto, Japan)를 사용하여 \( 2 \% \) agarose gel에서 전기영동(BioRad Mini-protein II)하였고, DNA 단편은 UV하에서 EtBr 로 염색하여 확인하였다. 독소 검출균주의 PCR산물의 정제는 QIA quick PCR Purification Kit(Qiagen Ca 28014, Germany)를 이용하여 정제하였다.</p> <h2>Chitosan의 독소 유전자 검출에 관한 영향</h2> <p>상기의 PCR법으로 독소 유전자 검출이 확인된 17주중에서 균의 발육이 양호하였던 V. vulnificlis-2, V. damsela-1와 V. porahemolyticus-7를 선정하여 재차 PCR하였다. 이들의 PCR 산물은 QIA quick PCR purification kit(Qiagen Ca 28014, Germany)로 독소 유전자를 정제한 훅, chitosan올 0, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 및 \( 600 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m} \ell \)까지 농도별로 각각 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응한 후, 상기와 동일한 조건으로 PCR을 실시하여 비교하였다.</p>