다제내성 Pseudomonas aeruginosa에 항균 효과가 있는 구기자, 금은화, 길경, 단삼, 오미자, 붉나무, 정향, 치자, 황금, 황련 등 10가지 약재를 발효에 사용했으며, GRAS 미생물인 유산균을 유용미생물로 선정해 계대배양했다. 사용 한약재에 유산균을 배양하여 만든 발효 한약재의 ethyl acetate 추출물은 감압 농축한 후, 발효에 의한 한약재의 성분 변화를 관찰하기 위해 TLC pattern 분석을 실시했다. 그 결과 발효한 붉나무 추출물에서는 발효 전보다 강한 spot이 나타났다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>한약재의 선정과 유용미생물의 선정 및 배양</h2><p>발효에 사용한 한약재는 선행연구를 통하여 다제내성 Pseudomonas aeruginosa에 항균효과가 있는 한약재를 선정하였으며, 구기자, 금은화, 길경, 단삼, 오미자, 붉나무, 정향, 치자, 황금, 황련등 10가지 약재는 대구광역시 약전골목 내 한약방에서 구입하여 사용하였다. 유용미생물은 GRAS 미생물로서 유산균을 선정하였으며, Table 1에서 보는 바와 같이 한국생명공학연구원 유전자원센터 유전자은행(KCTC)에서 분양을 받아 lactobacilli MRS배지(proteose peptone NO.3. \( 10 \mathrm{g} / \mathrm{l} \), beef extract \( 10 \mathrm{g} / \mathrm{l} \), yeast extract \( 5 \mathrm{g} / \mathrm{l} \), dextrose \( 20 \mathrm{g} / \mathrm{l} \), polyoxyethylene sorbitan monooleate \( 1 \mathrm{g} / \mathrm{l} \), ammo-nium citrate \( 2 \mathrm{g} / \mathrm{l} \), magnesium sulfate \( 0.1 \mathrm{g} / \mathrm{l} \), manganese sulfate \( 0.05 \mathrm{g} / \mathrm{l} \), dipotassium phosphate \( 2 \mathrm{g} / \mathrm{l} \), sodium ace-tate \( 5 \mathrm{g} / \mathrm{l}, \mathrm{pH}6.5 \), Difco Co.)에 계대배양한 후 균체를 \( 20 \% \) glycerol이 포함된 저장액에 넣어 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였으며, 실험에 사용하기 전 계대배양을 실시하였다.</p><h2>한약재 발효를 통한 Ethyl acetate 추출물 제조 및 TLC pattern 분석</h2><p>한약재의 발효는 사용 한약재의 methanol 추출 농축액을 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 MRS배지에 첨가하여 멸균하였다. 유산균 배양시 사용한 균주는 Table 1에 나타내었으며, 접종양은 \( 1 \times 10^{8} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \)로 stock액을 제조한 후 유산균을 \( 0.2 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)가 되도록 농축액을 첨가하여 멸균된 MRS 배지에 접종하였다. 배양 시 조건은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 7 일간 배양하였다. 배양액은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), \( 1,000 \times g \)에서 10분간 원심분리 후 상등액을 분리하였다. 발효 한약재의 추출은 발효 후 얻은 상등액 \( 50 \mathrm{ml} \) 에 ethyl acetate \( 100 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 수행하였으며, 2회 반복하여 실시하였다. 발효 전 methanol 추출물도 역시 같은 방법으로 ethyl acetate \( 100 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 2회 반복하였다. 발효 전 methanol 추출의 ethyl acetate 분획물과 발효 한약재의 ethyl acetate 추출물은 소량의 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{SO}_{4} \)을 첨가하여 수분을 제거하고 filter paper로 여과한 후 rotary vacuum evaporator (EYELA, Tokyo Rikakikai Co. A-3-S. Japan)를 이용하여 감압 농축하였다. 발효에 의한 한약재의 성분변화를 관찰하기 위해 TLC pattern 분석을 수행 하였다. 6균주로 발효한 붉나무의 ethyl acetate 추출물 중에서 HO-1 발현에 활성을 보인 KCTC 3498으로 발효한 붉나무 ethyl acetate 추출물과 메탄올 추출물과의 TLC를 통한 발효 전과 후의 생성물의 pattern을 확인하였다. 붉나무의 methanol 추출의 ethyl acetate 분획물 \( (10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)과 각각 발효한 ethyl acetate 추출물 \( (10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)은 TLC plate (Silica gel 60 F254, Merck Co.)에 각각 \( 10 \mu \mathrm{l} \)를 점적하고 건조시킨 후 전개용매 (Hexane:Acetone=1:1)가 들어 있는 TLC chamber에서 전개시켰다. 전개시킨 TLC plate는 U.V. lamp \( 254 \mathrm{nm}, 365 \mathrm{nm} \)과 \( 10 \% \) 황산에 발색하여 확인하였다. 그 결과 발효 전에 비해 발효한 붉나무 ethyl acetate 추출물에서 \( \mathrm{R}_{\mathrm{f}}=0.35,0.45,0.72 \) 등에서 발효 전보다 강한 spot으로 나타남을 확인하였다.</p>