DNase I은 동식물의 세포조직을 단세포로 해리시켜 세포생물학에서 활용도가 매우 높다. 본 연구에서는 Saccharomyces cerevisiae와 Pichia pastoris 두 종의 효모를 이용해 DNase I의 생산균을 개발하고자 하였다. 전자는 단백질의 분비능이 뛰어나고 glycosylation이 가능하지만 발현벡터의 불안정성, 과도한 당화, 낮은 생선성 등의 문제가 있었다. 후자는 외래유전자를 DNA에 삽입 가능하여 안정성이 높아지고, 대량생산과 활성형 단백질을 생산 및 분비할 수 있어 이상적인 숙주시스템으로 각광을 받고 있다.
<h1>서 론</h1><p>Deoxyribonuclease I (DNase I, EC 3.1.21.1)은 첫 번째로 발견된 DNA 가수분해 효소로 포유동물의 췌장 또는 귀밑샘과 같은 외분비선에서 분비되기 때문에 소화관에서 소화에 중요한 역할을 담당한다. 이미 사람을 비롯하여 소, 돼지, 닭의 췌장 및 쥐의 DNase I cDNA 유전자가 클로닝 되었고 그 염기서열이 밝혀졌다. DNase I은 활성의 조직 분포를 기준으로 포유동물의 DNase I은 췌장성, 이하성, 췌장-이하성 효소의 3개 유형으로 분류하고 있다. 췌장성 효소는 다른 유형보다 낮은 \( \mathrm{pH} \) 에 더 민감하며 사람, 소 및 돼지의 DNase I은 췌장성 효소 형태로 분류된다.</p><p>소 췌장에서 유래된 DNase I은 응용범위가 넓은 효소로 RNA를 취급하는 혈액검사 및 감염성질환과 암 질환검사와 같은 임상진단뿐만 아니라 가축검역 및 질환진단에 활용되며 유전자 발현량 조사, 무작위로 분해된 DNA단편의 제조 및 Real time PCR을 위한 시료제조, 동식물세포 해리 등의 분자생물학적 연구용 효소로도 널리 사용되고 있다. 동식물 세포조직을 해리하고 단세포로 분리시키는 과정에서 일부 세포가 파괴되고 이로부터 누출된 DNA는 해리된 세포를 엉키게 하여 의도하지 않는 세포 덩어리를 형성하게 되는데 이때 DNase I을 첨가함으로써 세포간 응집현상을 방지할 수 있으며, 동식물 세포의 조직배양에 collagenase 또는 trypsin과 함께 사용되고 있어 세포생물학에서 활용도가 매우 높다. 최근 인축에 각종 질병을 야기하는 RNA virus 질환을 효과적으로 진단하기 위해 검체로부터 RNA를 분리하는 과정에 혼재되어 있는 DNA물질을 제거해야만 하는데 이 때 RNA를 분해하지 않고 DNA만을 가수분해하는 RNase-free DNase I이 필요하며 이 효소는 실제 RNA 분리용 정제 kit의 가격경쟁력을 결정하는 중요한 요소이다.</p><p>DNase I을 소 췌장 유래 조직으로부터 분리하여 정제할 때 원료물질에 혼재되어 있는 다량의 RNase와 protease를 제거하기 위해서는 정제단계가 매우 복잡하며, 정제과정 중 protease에 의해 파괴되어 활성을 잃는 경우가 대부분이다. 따라서 국외에서는 재조합 세포를 사용하여 DNase I을 생산하기 위한 연구로 재조합 대장균과 재조합 동물세포주 COS-1을 제조하고 이들이 생산한 효소의 특성을 분석한 바 있다. 재조합 대장균을 이용할 경우 균체 내에 생산된 DNase I에 의한 숙주세균의 사멸을 막기 위해 유도성 T7 promoter로 과발현 하였지만 유도과정 중 사멸된 균체에서 유출된 DNase I이 배양 상등액에 존재하게 되고 사멸되지 않은 균체는 내부에 존재하여 정제에 어려움과 정제된 효소의 비활성이 \( 1,000 \mathrm{unit} / \mathrm{mg} \) protein 이하로 낮은 문제점이 있는 것으로 확인되었다. 특히 대장균의 경우 glycosylation이 되지 않아 효소적 기능이 소 췌장조직에서 정제된 천연의 효소와는 차이가 있는 것으로 나타났다. 동물세포인 COS- 1세포에 DNase I의 유전자를 도입하여 얻은 재조합 세포로 생산된 DNase I은 glycosylation은 되지만 생산성과 활성이 낮은 것으로 보고되었다. 이에 본 연구에서는 재조합 숙주균으로 효모 Saccharomyces cerevisiae와 Pichia pastoris를 사용하여 DNase I의 생산균을 개발하고자 하였다.</p><p>본 연구에서 사용한 효모 S. cerevisiae는 발현된 단백질을 세포 밖으로 분비할 수 있는 능력이 뛰어나며 glycosylation과 같은 post translational modification이 가능한 장점이 있다. 하지만 S. cerevisiae 숙주의 장기간 발효시 발현 벡터의 불안정성, 당단백질의 과당화(hyperglycosylation), 박테리아 발현 시스템에 비해 낮은 생산성 등의 문제점들을 보안하기 위하여 여러 다른 효모 시스템이 대체숙주로서 개발되고 있다. 특히 메탄올 자화 효모 Pichia pastoris는 여러 독특한 특징으로 인해 재조합 단백질 대량생산을 위한 이상적인 숙주시스템으로 각광을 받고 있다. 즉 외래유전자를 숙주세포 발현계의 염색체 DNA에 삽입시킬 수 있어 발현계의 안정성이 높아지며, 고농도 세포 배양시 발생되었던 단백질 발현율 저하를 막을 수 있다. 또한 메탄올 자화 효모는 강력한 메탄올 유도성인 alcohol oxidase 1 (AOXI) promoter를 이용하여 외래단백질의 대량생산에 유리할 뿐만 아니라 진핵세포로서 고등생물 유래의 유전자와 전사 및 번역 시스템이 유사하여 splicing을 통한 intron의 제거와 고등동물의 골지체와 유사한 분비기관을 갖추고 있어, post translational modification을 통해 활성형 단백질을 생산분비 할 수 있다.</p><p>본 연구에서는 재조합 숙주균으로 S. cerevisiae와 P. pastoris를 사용하여 DNase I의 생산균을 개발하고자 하였으며, 이를 위해 DNase I의 생산성이 높고 균체 외로 분비할 수 있도록 재조합 효모균을 제조하고, 이를 이용하여 DNA 분해와 같은 DNase I의 특성을 조사하였다.</p>