생굴을 기수분해하려고 원재료인 굴을 해동한 후, 같은 양의 증류수를 가하고 균질화기위해 원료 굴의 \( 1 \% \)에 해당하는 양의 Protamex를 더하고, 1시간 동안 온도 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)와 \(6.0,7.0 \mathrm{pH} \)로 유지된 shaking incubator에서 1단 가수분해했다. paper disc 법을 이용해 제조된 굴 효소 가수분해물의 기능성을 측정했고 triptic soy agar \(15\sim20\mathrm{ml}\)를 분주, 건조해 실험용 평판 배지를 고체 배지로 만들었다. 사용한 균주는 gram 양성 3종, gram 음성 3종을 배양액과 함께 각 \( 100 \mu \mathrm{l} \)씩 분주해 고체 배지에 도말했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>굴은 경남 통영에서 재배한 양식산 참굴(Crassostrea gigas, 각장 \( 4.6 \pm 2.3 \mathrm{~cm} \), 각중 \( 9.9 \pm 3.2 \mathrm{~g} \) ) 중 생굴 시판을 목적으로 채취한 것을 냉동 상태로 30분 이내에 운반 후 \( -25^{\circ} \mathrm{C} \)에 저장하여 이용하였다. 생굴의 가수분해를 위해 이용한 효소는 Bacillus sp.에서 유래한 Protamex (Novonordisk Bioindystrials, Inc., Denmark)와 Bacillus amyloliiensquefaciens에서 유래한 Neutrase (Novonordisk Bioindystrials, Inc., Denmark)를 사용하였다. 캡슐의 외벽물질로는 알긴산염(Kanto Chemical Co., Inc., Tokyo, Japan)과 염화칼슘(Daejung Chemicals \(\&\) Materials Co., Siheung, Korea)을 이용하였고, 가소제는 SPAN 80 (Duksan Pure Chemical Co., LTD. Ansan, Korea)을 이용하였다.</p> <h2>굴 효소 가수분해물의 제조</h2> <p>생굴을 가수분해하기 위해 원료 굴을 해동한 다음, 해동된 굴에 동량의 중류수를 가하고 균질화 하였다. 여기에 원료 굴의 \( 1 \% \)에 해당하는 양의 Protamex를 첨가하고, 온도 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)와 6.0 7.0의 \( \mathrm{pH} \)로 유지된 shaking incubator (Orbital shak-er, Forma Scientific, USA)에서 1시간 동안 1단 가수분해하였다. 뒤이어 첨가한 효소의 불활성화를 위해 열탕에서 10분간 처리한 후 방냉하고, 20분간 원심분리 \( (1,000 \times g \), Mega 17R, Hanil Science Industrial Co., Ltd, Inchun, Korea) 후 그 상층액을 여과하였다. 이것을 Neutrase로 \( 45 \sim 55^{\circ} \mathrm{C} \)와 \( \mathrm{pH} 6.0 \) 인 상태에서 1시간 동안 재 가수분해 한 뒤 첨가 효소의 불활성화를 위해 열탕에서 10분간 방치하였다. 효소 불활성화 된 용액은 방냉 후 다시 20분간 원심분리 \( (1,000 \times g) \)하고 여과하였다. 부유물 및 미분해 단백질을 제거하기 위해 \(3 \mathrm{kDa} \) membrane을 장착한 한외여과기(8200, Amicon, Massachusetts, USA)로 여과하여 이용하였다. 이것을 기능성 농축 및 저장의 편리성을 위해 동결 건조(FD5508, Ilshin Lab Co., LTD, Yangju, Korea)하여 이용하였다.</p> <h2>항균성 측정</h2> <p>제조된 굴 효소 가수분해물의 기능성 측정을 위해 paper disc 법을 이용하였고, 실험용 평판 배지는 triptic soy agar 15-20 \(\mathrm{ml}\)를 분주, 건조하여 고체 배지로 제조하였고, 사용된 균주는 gram 양성 3종(Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus)과 gram 음성 3종(Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus)으로, 각 균주를 배양액과 함께 \( 100 \mu \mathrm{l} \)씩 분주하여 고체 배지에 도말하였다. 굴 효소 가수 분해물은 paper disc(\(8 \mathrm{mm}\), Tokyo Seisakusho Co., Japan)에 \( 40 \mu \mathrm{l} \)를 흡수시켜 균주를 도말한 고체 배지 위에 두고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24-48시간 동안 배양하였다. 굴 효소 가수분해물의 항균성은 paper disc 주변의 clear zone의 직경을 통해 측정하였다.</p>