도토리 화분 추출물 및 분획물의 혈소판 응집저해 활성 평가를 위해 Whole Blood Aggregometer를 사용한 impedance 법으로 평가하였다. 이 때 collagen을 응집 유도체로, aspirin을 활성 대조구로 사용하였다. 또한 인간 적혈구 용혈 활성은 기존 보고된 방법으로 측정하였고, flavonoids와 phenolic acids는 UPLC/MS/MS를 이용하여 분석하였다. 추가적으로 total polyphenol, total flavonoid 함량을 측정하였고, 각 분석결과는 ANOVA로 유의성 분석을 하였다.
<h2>도토리 화분 추출물 및 분획물의 혈소판 응집 저해 활성</h2><p>도토리 화분 추출물 및 분획물의 혈소판 응집저해 활성은 Whole Blood Aggregometer (Chronolog, Havertown, PA,USA)를 사용하여 impedance 법으로 평가하였다. 먼저 인간 농축 혈소판(platelet rich plasma: PRP)을 전처리 및 수세한 후 최종 혈소판 농도가 \(5\times10^{8}/\mathrm{ml}\)이 되도록 조정하여 사용하였으며 응집 유도제로 collagen (\(1 \mathrm{mg/ml}\))을 사용하였다. 혈소판 응집 반응은 collagen 첨가 후 12분간 측정하였으며, Aggrolink program (Aggrolink 5.2.3, Chrono-log, Havertown, PA, USA)을 사용하여 amplitude, slope, Area Under the Curve (AUC)를 측정하여 평가하였다. 이때 amplitude (ohm)는 혈소판에 응집 유도제를 첨가하였을 때 일어나는 최대 응집 정도를 나타내며, slope는 응집 유도제를 첨가한 직후부터 1분 동안의 응집 곡선의 기울기를 나타내며, AUC는 전체적인 혈소판 응집 정도를 표시하는 것으로 전기저항 증가에 따른 slope 곡선의 하강 면적을 의미한다. 혈소판 응집 저해 활성은 시료 첨가 시의 AUC 값과 DMSO를 첨가한 용매 대조구의 AUC 값의 비로 나타내었다. 활성 대조구로는 aspirin (Sigma Co.,St.Louis, MO, USA)을 사용하였다.</p><h2>도토리 화분 추출물 및 분외물의 적혈구 용혈 활성</h2><p>도토리 화분 추출물 및 분획물의 인간 적혈구 용혈 활성은 기존 보고된 방법으로 측정하여 평가하였다. 용혈 활성은 다음의 수식을 이용하여 계산하였다.</p><p>(\(\%) \text{Hemolysis} =[\text{(Abs. S-Abs. C)/(Abs. T-Abs. C)}] \times 100 \)</p><p>\(Abs. S\): 시료 첨가구의 흡광도, \(Abs. C\): DMSO 첨가구의 흡광도, \(Abs. T\): Triton X-100 첨가구의 흡광도.</p><h2>도토리 화분의 에틸아세테이트 분획물의 flavonoids 밎 phenolic acids 분석</h2><p>도토라 화분 추출물의 에틸아세 테이트 분획물의 flavonoids 및 phenolic acids를 UPLC/MS/MS를 이용하여 분석하였다. UPLC 분석 조건은 ACQUITY UPLC\( { }^{\circledR} \) BEH 18 \(1.7 \mu \mathrm{m} \) 컬럼, 컬럼온도 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \), 유량 \( 350 \mu \mathrm{l} / \mathrm{min} \), 주입량 \( 2 \mu \mathrm{l} \), 이동상 용매는 \( 0.1 \% \) formic acid가 포함된 증류수와 \( 0.1 \% \) formic acid가 포함된 acetonitrile 기울기 용리를 수행하였다(Table 1). MS/MS 분석은 TSQ Quantum ULTRA (Thermo Fisher, Waltham, USA)를 이용하였으며 분석조건은 multiple reaction monitoring (MRM) 방식으로, negative ionization mode로 수소화된 분자이온((M-H)-)을 만들어 각 성분별 precursor ion을 선정하여 tune 작업을 통해 최적의 collision energy 및 product ion을 선택하여 spray voltage \( 2.0 \mathrm{kV} \), desolvation gas flow rate \( 800 \mathrm{l} / \mathrm{hr} \)와 cone gas flow rate \( 1 \mathrm{l} / \mathrm{hr} \), desolvation temperature \( 450^{\circ} \mathrm{C} \) 로 분석하였다. 분석 표품은 상업적으로 판매하고 있는 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA)의 caffeic acid, cinnamic acid, \( \rho \)-coumaric acid, m-coumaric acid, ferulic acid, gallic acid, gentisic acid, 4-hydroxybenzoic acid, protocatechuic acid, salicylic acid, sinapic acid, syringic acid, vanillic acid의 13종의 페놀산과 apiin, astragalin, cosmosiin, fisetin, hyperoside, isoquercitrin, kaempferol, luteolin, myricetin, orientin, quercetin, quercitrin, rutin, vitexin의 총 14종의 플라보노이드 성분을 사용하였다.</p><h2>기타 분석 및 통계처리</h2><p>Total polyphenol 및 Total flavonoid 함량 측정은 기존 보고된 방법에 따라 측정하였으며, 각각 rutin과 tannic acid를 표준시약으로 사용하였다. 총당 정량은 phenol-sulfuric acid법을 사용하였으며, 표준 시약은 sucrose를 사용하였다. 각각의 분석결과는 3회 반복한 실험의 평균과 편차로 나타내었다. 실험 결과는 SPSS 23.0 버전을 사용하여 mean \(\pm\) SD로 나타내었으며, 각 군 간의 차이는 ANOVA로 분석하였으며 유의수준은 \( p<0.05 \)로 하였다.</p>