미생물 균주를 배양 배지에서 배양 후, 주사전자현미경으로 크기 및 길이를 조사하고, 현적법으로 균주의 운동성을 관찰하였으며, 우레아제 활성은 Lanyi 방법으로 측정하였다. 또한 미생물 균주의 게노믹 DNA 염기 조성은 Tamaoka 등의 방법에 따라 결정하였고, 계통수 분석은 CLUSTAL W 프로그램, bootstrap analysis, TREEVIEW 프로그램으로 조사하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세균 분리 및 배양 배지</h1> <p>세균 분리 및 배양 배지부산 해운대 해안에서 채취기 통에 미역 고형물을 바닷물 속에 정치 후 채취한 샘플을 1 / 1000 으로 희석한 후, 1 차 선별 배지(Alginate- \( \mathrm{Na} 1.00 \% \), Yeast extract \( 0.20 \%, \mathrm{NaCl} \) \( 0.20 \%, \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 0.20 \%, \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.10 \% \), KCI \( 0.10 \% \), \( \mathrm{CaCl}_{2} 0.05 \% \) )로 분리한 후, 2 차 선별 배지(상층 배지-Alginate-Na \( 1.00 \% \), Bacto-Agar \( 2.00 \%, \mathrm{pH} \) 7.5; 하층 배지 \( -\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} 0.05 \%, \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 0.05 \%, \mathrm{NaCl} 2.00 \%, \mathrm{FeSO}_{4} \) \( 0.01 \%, \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.05 \% \), KCI \( 0.05 \% \), Bacto-Agar \( 2.00 \% \) \( \mathrm{pH} \) 7.5)에 도말하여, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3일간 배양하여 알긴산 분해 미생물을 분리하였다</p> <h2>표현형적 특성(phenotypic characteristics) 조사</h2> <p>미생물 균주를 배양 배지에서 \( 30^{\circ} \mathrm{C},\) 2 일 동안 배양한 후, 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope)을 통해 크기와 길이를 조사하였다. 현적법(hanging-drop technique)으로 광학 현미경 하에서 균주의 운동성(motility)을 조사하였다. 영양 배지(Difco, U.S.A.)에서 각 온도별(4, 15, 23, 25,28,30,37,42 및 \( 48^{\circ} \mathrm{C} \) )로 3일간 배양하여 생장 온도 범위를 조사하였다. \( \mathrm{NaCl} \) 농도에 따른 성장 효과를 조사하기 위해 \( 0-10 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 의 \( \mathrm{NaCl} \) 을 포함하는 trypticase soy broth(Difco, U.S.A.)에서 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 로 3일간 배양하였다. 또한 각 \( \mathrm{pH}(4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0) \)의 배양 배지에서 3일간 배양하여 생장 \( \mathrm{pH} \) 범위를 조사하였다. 탄소원의 이용 능력 테스트는 Table 1 에 기재된 총 17개의 기질을 포함하는 API 50CH 시스템을 이용하여 수행하였다. 우레아제(urease) 활성은 Lanyi의 방법에 따라 측정하였다.</p> <h2>DNA 염기 조성 및 16S rDNA 서열 결정 및 계통수 분석</h2> <p>미생물 균주의 게노믹 DNA의 염기 조성은 Tamaoka 등의 방법에 따라 결정하였다. 16S rDNA 염기 서열 분석은 균주로부터 게노믹 DNA를 추출한 후, 16S rDNA sequencing을 통하여 균주를 동정하였다. 계통수(phylogentic tree) 분석은 CLUSTAL W 프로그램을 이용하여 각 16S rDNA 염기서열을 배열하고, bootstrap analysis를 통해 분석 한 후, TREEVIEW 프로그램으로 계통수를 조사하였다.</p> <h2>균주로부터 알긴산 분해효소 활성 측정</h2> <p>균주의 알긴산 분해능을 확인하기 위한 고체배지(Alginate-Na \( 0.50 \% \), Yeast extract \( 0.50 \%, \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 0.20 \%, \mathrm{MgSO}_{4} \). \( 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.10 \%, \mathrm{KCl} 0.10 \%, \mathrm{CaCl}_{2} 0.05 \% \), Agar \( 1.50 \% \) )에서 대조군으로 E. coli를 \( \mathrm{CPC} \) (cetylpyridinium chloride) \( 10 \% \) 로 알긴산 분해능을 확인하였다. 세포성장은 흡광도가 0.5 이하가 되도록 배양액을 희석한 후 분광광도계를 이용하여 \( 660 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 3일간 배양한 배양액으로부터 한외여과(ultrafiltration; \( \mathrm{MWCO}=30 \mathrm{kDa} \) )을 통해 부분 정제하여 알긴산 분해효소 활성을 측정하였다. 알긴산 분해효소 활성은 기질로써 \( 0.25 \% \) alginate- \( \mathrm{Na} 0.9 \mathrm{~mL} \)에 배양 상등액 \( 0.1 \mathrm{~mL} \) 를 첨가하여, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 반응시킨 후 DNS법에 의해 흡광도 \( (550 \mathrm{~nm}) \) 를 측정하여 우론산으로 D-글루코론산 생성량을 측정하였다. 효소 1 unit는 1 분에 1 \( \mu \mathrm{mole} \) 의 환원당을 생산하는 효소량으로 정의하였다.</p>