상추를 공시작물로 해 특정 생육 조건 하에 생육시켰다. 생육한 공시작물은 저온 처리 후 최적 생육온도에서 회복시켰고 회복 처리 시간별로 분석용 잎을 채취 후 액체질소에 동결하고 저온냉동고에 보관해 실험에 사용했다. 조효소액은 Hossaine과 Jimenez등의 방법을 혼용해 조제했고 이는 MDHA 환원효소의 활성도 측정에 이용한다. 이 조효소액의 일정량과 반응용액을 최종 부피\( 1 \mathrm { ml } \)되도록 혼합했다. 이 용액에 0.5unit의 ascorbate oxidase를 넣어 반응 개시 후 NADH의 감소된 흡광도를 MDHA 환원효소의 활성도로 계산해 나타냈다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>공시작물의 생육 및 저온 처리</h2> <p>상추(Lactuca Sativa L. cv. Baronet, Journey Co. USA)를 공시작물로 하여 전보와 같은 생육조건 하에서 생육시켰다. 4주간 생육시킨 공시작물을 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 조절된 암상태의 생장상에서 24시간 동안 저온처리 하였으며, 분석용 잎 시료는 처리 시간별 (0,3,6,12,24시간째)로 채취하였다. 저온 처리 한 후 공시작물을 최적 생육온도 \( \left (20 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \)에서 회복시켰으며, 회복 처리 시간별(24, 48시간)로 각각 분석용 잎 시료를 채취하고 즉시 액체질소에 담가 동결한 후 저온냉동고 \( \left (-70 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \)에 보관하면서 실험에 사용하였다.</p> <h2>조효소액의 조제 및 MDHAR 활성도 측정</h2> <p>MDHA 환원효소의 활성도 측정을 위한 조효소액은 Hossaine 등과 Jimenez 등의 방법을 혼용하여 조제하였다. 시료 \( (1 \mathrm { ~g } ) \)를 액체질소를 넣고 마쇄한 후 10배 부피의 추출액 \( (100 \mathrm { mM } \) 인산완충액, \( \mathrm { pH } \) 7.5, 1 \( \mathrm { mM } \) EDTA, \(0.33 \mathrm { M } \) Mannitol, \( 1.0 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \mathrm { PVP } -40,1 \mathrm { mM } \) PMSF)을 첨가하여 현탁하였다. 현탁액을 두겹의 miracloth로 거른 다음 2,200 × \( \mathrm { g } \)에서 5분간 원심분리하여 수집한 침전물을 엽록체분획(Chloroplastic fraction)으로 하였다. 상징액은 \( 15,000 \times g \)로 원심분리하여 침전물을 제거하고 수집한 상징액을 세포질분획 (Cytosolic fraction)으로 하였다. 각 분획 조효소액의 단백질 함량은 Bradford의 방법으로 측정하였다. MDHA 환원효소의 활성도 측정은 Hossain 등의 방법을 약간 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 일정량 \( (50 \mu l ) \)의 조효소액과 반응용액 [50 \( \mathrm { mM } \) 인산완충액 \( ( \mathrm { pH } 7.6), 0.3 \mathrm { mM } NADH, 2.5 \mathrm { mM } \) ascorbate]을 최종부피가 \( 1 \mathrm { ml } \)가 되도록 혼합하였다. 이 반응 용액에 0.5unit의 ascorbate oxidase (Sigma사)를 넣어 반응을 개시하였으며, NADH의 산화정도 \( \left ( \varepsilon = 6,200 \mu \mathrm { M } ^ { -1 } \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \)를 340 \( \mathrm { nm } \)에서 1분 동안 흡광도 변화를 측정하고 감소된 흡광도를 효소의 활성도로 계산하여 나타내었다.</p>