야생형 M. 야생형 M. xanthus 균주에 DK1622를, CsgA 돌연변이 균주는 LS523, CsgA, socD500 균주는 LS500, socD500 균주로는 LS637를 사용하였다. 야생형 균주의 정상 포자는 TPM agar 배지 위에 DK1622 균주를 \( 32^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 일간 배양해서 준비하였다. CsgA 특이성 유전자들은 보고 유전자인 lacZ 유전자에 연결이 되어있어, 특정 배양조건에서 발현율을 측정할 수 있도록 설계했다. M. xanthus의 \( \beta \)-galactosidase 활성은 Kroos 등의 방법을 활용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>균주 및 박테리오파아지</h2><p>야생형 M. xanthus 균주로는 DK1622을 사용하였으며, CsgA 돌연변이 균주는 LS523, CsgA, socD500 균주로는 LS500, socD500 균주로는 LS637를 사용하였다. 기타 사용균주는 Table 1에 요약하였다. M. xanthus 세포는 CTT 배지 [\(1\%\) Casitone (Difco Laboratories)], \( 10 \mathrm{mM} \) Tris-HCl, \( 1 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}-\mathrm{KHPO}_{4}\), \(8 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{MgSO}_{4}\) \((\mathrm{pH} 8.0)] \) 필요시에 \(1.5\%\) agar (Difco Laboratories)에서 배양되었다. 발생을 유발하기 위해서는 \( 5 \times 10^{8} \) 세포들이 TPM agar \( [10 \mathrm{mM} \) Tris-HCl, \( 1 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}-\mathrm{KHPO}_{4}\), \(8 \mathrm{mM} \mathrm{~MgSO}_{4} \) \((\mathrm{pH} 7.6)\) plus \(1.5\%\) agar] 혹은 CF agar [\(10 \mathrm{mM}\) Tris-HCl, \( 1 \mathrm{mM} \mathrm{~KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}-\mathrm{KHPO}_{4}\), \(8 \mathrm{mM} \mathrm{~MgSO}_{4}\), \(0.2 \mathrm{mg} \) of \( \left[\mathrm{NH}_{4}\right]_{2} \mathrm{SO}_{4} / \mathrm{ml}\), \(150 \mu \mathrm{g} \) of Casitone/\(\mathrm{ml}\). \( 1 \mathrm{mg} \) sodium pyruvate/ \( \mathrm{ml}\), \(2 \mathrm{mg} \) sodium citrate/ \( \mathrm{ml}\) \((\mathrm{pH} 6) \) plus \(1.5\%\) agar]에 도말되었다. 자실체는 해부 현미경으로 관찰되었으며, 포자는 phase contrast 현미경으로 관찰되었다. 일반 형질도입을 위한 박테리오파이지는 CTT 배지의 액체 lysate로 준비되었다.</p><h2>전자현미경에 의한 포자 관찰</h2><p>야생형 균주의 정상 포자는 TPM agar 배지 위에 DK1622 균주를 \( 32^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 일간 배양하는 방법에 의해서 준비되었다. socD500 포자를 준비하기 위해서는 LS637 균주를 CTT agar 배지 상에 \( 32^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5일간 배양한 후에 \( 15^{\circ} \mathrm{C} \) 로 온도를 내려 2 일 동안 더 배양하였다. 모든 포자들은 sucrose 밀도 구배법에 의해서 수집되었으며 glutaraldehyde가 최종 농도 \(2\%\) 로 첨가되어 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 시간 동안 처리되었다. 포자들은 \( 0.1 \mathrm{M} \) cacodylate 완충액 \( (\mathrm{pH} 7.25) \) 으로 3 차례 세척되었으며, \( 2 \% \mathrm{~OsO}_{4} \) 가 함유된 \( 0.1 \mathrm{M} \) cacodylate 완충액에서 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), 1시간 배양되었다. 포자들은 다시 \( 0.1 \mathrm{M} \) cacody-late 완충액 ( \( \mathrm{pH} 7.25) \) 으로 3 차례 세척되었으며, \( 2 \% \) uranyl acetate에 의해서 염색되었다. 시료들은 \(30\% 50\%, 70\%, 85\%, 95\%\) 두 번의 \(100\%\)\((\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 에탄올을 각각 15 분씩 순차적으로 처리하여 탈수하였다. 포자들은 propylene ox-ide에 의해서 각각 20 분씩 두 번 세척되었으며, Spurr 레진:propylene의 비율이 1:3, 1:2, 1:1, 2:1 및 3:1인 되도록 싸여졌다. 마지막으로 \(100\%\) Spurr 레진에 시료가 싸여진 후에 진공 상태에서 72 시간 처리하고, \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 6 시간동안 처리하여 polymerization이 수행되도록 하였다. 포자는 JOEL 100CXII 주사 전자현미경으로 관찰되었다.</p><h2>낮은 온도에 의한 CsgA 신호에 특이적인 유전자의 발현 유발</h2><p>CsgA 특이성 유전자들은 보고 유전자인 lacZ 유전자에 연결이 되어있음으로, 특정 배양조건에서 발현율을 측정할 수가 있도록 설계되었다. \( 5 \times 10^{6} \) 세포들이 CTT 배지에 도말되고 \( 32^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간동안 배양된 후에, \( 15^{\circ} \mathrm{C} \) 로 배양 온도를 낮추었다. \( 15^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48 시간을 더 배양한 후에 세포들은 멸균된 면도날을 사용하여 agar 표면으로부터 수거되고 \( \beta \)-galactosidase 활성이 측정되었다. 본 실험에 이용된 균주들은 Table 1에 표시되었다.</p><h2>\( \beta \)-galactosidase 활성 측정</h2><p>M. xanthus로부터의 \( \beta \)-galactosidase 활성은 Kroos 등의 방법을 이용하였다. 세포 시료는 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium phos-phate \( (\mathrm{pH}7.6)\), \(10 \mathrm{mM} \mathrm{~KCl}\), \(1 \mathrm{mM} \mathrm{~MgSO} \mathrm{S}_{4} \) 이 포함된 완충액에 현탁된 후에 얼음 위에서 초음파에 의해서 15 초 처리되고 45초 냉각시키는 과정을 3회 반복함으로 파쇄되었다. 시료는 \( 12,000 \mathrm{~g} \) 에서 1 분간 원심분리하여, 세포 debris를 제거한 후에, 상층액만을 \( \beta \)-galactosidase 활성 측정에 이용하였다. 기질로는 o-nitrophenyl- \( \beta \)-D-galactoside (ONPG)를 사용하였으며, 단백질 농도는 BCA 시약을 사용하여 소의 혈장 알부민 (BSA)을 기준으로 분석하였다. B-galactosidase의 특정 활성은 1 분당 단백질 1 milligram이 생성하는 0 -nitrophenol의 생성이 nanomole을 단위로 계산되었다.</p>