본 논문에서는 폐와 기관지에서의 총미세분진에 의한 영향여부 확인을 위한 실험을 진행하였다. 실험에 사용된 총미세분진은 서울시내 전철역 약 30곳에서 채취하였다. 실험동물에 5일간 DEP와 PM을 inhalation chamber안에서 흡입 노출 시켜 천식을 유발시켰다. 폐 조직의 Masson's trichrome 염색 후에 섬유화 면적을 측정하여 폐 섬유화 진행여부와 Periodic acid-Schiff (PAS) 염색 후에 술잔세포의 평균 개수를 측정하여 변화를 확인하였다. 술잔세포 측정시에는 기저막 둘레 길이를 기준으로 원형모양을 띄고 비슷한 크기의 기관지 3 개에서 술잔세포를 세었고, 모든 측정은 computerized image analyzer 프로그램을 이용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>DEP 와 PM의 수집과 전처리</h2><p>DEP는 보건복지부 자동차공해연구소에서 확보하였고, PM 시료는 서울시내 지하전철역에 설치된 공기정화기의 membrane filter에 흡착된 것을 채취하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 총미세분진(total suspended particle; TSP)은 서울시내 전철역 약 30곳에서 모은 혼합 미세분진이다. 확보된 DEP 및 PM은 in vivo 흡입실험에 사용하기 전 membrane filter에 통과시켜 섬유성분을 제거하였고, 생물학적 요소(예: 바이러스, 세균, 곰팡이 동) 및 수분을 제거 하기 위하여 가열건조기속에서 가열처리 \( \left(200{ }^{\circ} \mathrm{C}\right. \)에서 3시간) 하였다.</p><h2>천식유발</h2><p>천식은 Balb/c 암컷마우스 및 동일한 품종과 조건의 IL-10 KO 마우스를 대상으로 유발시켰다. 본 연구를 위한 Balb/c 마우스는 (주)오리엔트바이오에서 구입하였으며, IL-10 KO 마우스는 한국생명공학연구원에서 제공받았다. 실험을 위한 대조군과 각 처치군에는 12마리를 배정하였고, 실험동물에서 천식을 유발시키기 위하여 실험 1일에 \( 20 \mu \mathrm{g} \) ovalbumin (Sigma, USA)과 \( 2 \mathrm{mg} \) aluminum hydroxide (Sigma)를 adjuvant로 하여 \( 100 \mu \mathrm{\ell} \) PBS에 녹여서 복강내로 투여하였다. 최초 감작 14일 후 동일한 방법으로 2차 감작을 실시하였다. 실험 28일, 29일, 30일에 \( 1 \% \) ovalbumin (Sigma)을 ultrasonic nebulizer (Sunrise medical, USA)를 사용하여 aerosol 상태로 만든 후 하루에 60분씩 chamber안에서 자연스런 호흡을 통하여 감작시켰다. 실험 30일째의 최후 감작 후 24시간이 경과한 다음 실험동물을 안락사 시켰고, 실험에 필요한 시료들을 채취하였다.</p><h2>DEP와 PM 노출</h2><p>천식이 유발된 실험동물에 5일간 (하루 4시간) DEP와 PM을 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{m}^{3} \)의 농도로 inhalation chamber안에서 흡입 노출 시켰다.</p><h2>폐 조직의 Masson's trichrome 염색과 섬유화 측정</h2><p>\( 0.5 \mathrm{ml} / 200 \mathrm{~g} \) B.W Ketamin과 Xylazine (Rumpun \( { }^{\circledR} \) )을 1:5로 혼합하여 마우스의 복강 내로 주사하여 마취하였다. 마취된 마우스에서 폐와 기관지를 절제해낸 후 \( 10 \% \) 포르말린 \( 3 \mathrm{ml} \)를 주입하여 고정한 후 파라핀 블록을 만들고 \( 5 \mu \mathrm{m} \)의 절편을 제작하였다. Masson's trichrome 염색은 Garvey의 실험 방법대로 \( 56^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에 30분 처리하여 파라핀을 녹인 후 xylene으로 제거하였다. 탈파라핀 한 조직, 절편을 Bouin (Junsei, JAPAN)용액에 \( 56^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 후 고정하였다. 수돗물에 수세한 후 weigert iron hematoxylin (Showa, JAPAN)용액에 5분 염색하고 Biebrich scarlet-acid fuchsin (Junsci)용액에 10분 반응시킨 후 phosphomolybdic-phos-photungstic acid (Junsei)용액으로 5분 처리하고 aniline blue (Junsei)용액에 5분 염색한 다음 탈수한 후 mounting하였다.</p><p>상피하부의 섬유화 정도를 보기 위하여 상피하부에 섬유화로 염색되는 부위의 면적을 측정하였다. 모든 기관지는 기저막 둘레의 길이를 기준으로 크기가 유사하고 비교적 원형모양을 띄는 3개를 정해 평균값을 계산하였으며, 기저막 둘레의 길이 \( 100 \mu \mathrm{m} \)당 섬유화염색부위의 면적을 계산하였고, 모든 측정은 computerized image analyzer(Image pro \(^{Ⓡ} \), USA)프로그램을 이용하였다.</p><h2>폐 조직의 Periodic acid-Schiff (PAS) 염색과 술잔세포의 측정</h2><p>PAS 염색은 McManus의 실험방법을 따랐다. 조직절편을 탈파라핀 후 \( 1 \% \) periodic acid (Showa)수용액에 5분간 산화시키고, Schiff (Tokyo, JAPAN)시약에 10분 반응시킨 다음 Harris's hematoxylin (Sigma)으로 대조염색을 한 후 탈수 처리하여 mounting하였다.</p><p>술잔세포의 증식 정도를 보기 위하여 기저막 둘레의 길이 \( 100 \mu \mathrm{m} \)에서 PAS 양성인 술잔세포의 수를 세어서 비교하였다. 기저막 둘레의 길이를 기준으로 크기가 유사하고 비교적 원형모양을 띄는 기관지 3 개에서 술잔세포를 세어, 기저막 둘레의 길이 \( 100 \mu \mathrm{m} \)당 술잔세포의 평균수를 계산하였으며, 모든 측정은 computerized image analyzer (Image pro \( { }^{Ⓡ} \), USA) 프로그램을 이용하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>통계 프로그램인 SPSS (Ver 10.0 for windows)를 사용하여 실험설계에 대한 분산분석은 ANOVA로, 각 처치군들간의 비교는 independent sample T-test를 실시하여 유의성을 검정하였다. 각 자료는 3번 이상의 반복된 실험을 통하여 얻어진 결과를 평균\(\pm\)표준오차로 표시하였고, \( P<0.05 \)인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.</p>