감껍질의 전처리조건을 최적화하기 위하여 반응표면분석법을 이용하였고 이를 통해 생성된 환원당의 정량은 DNS법을 활용하였다. S. cerevisiae \( \mathrm{NK} 28 \)은 \( 5 \mathrm{ml} \)의 YEPD (yeast extract \(1\%\) \( (\mathrm{w} / \mathrm{v}) \), peptone \( 2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \), glucose \( 2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v})) \)에 접종하여 상온에서 약 12시간 배양한 이후에, 효모의 성장에 영향을 미치는 점을 고려하여 전처리물에서 12시간 전배양하였는데, 호기적 배양은 교반속도를 \( 200 \mathrm{rpm} \)으로 유지, 혐기적 조건은 플라스크를 밀봉한 후 진탕배양기에서 배양하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>감껍질은 경상북도 청도의 감 고부가가치화 클러스터 사업단에서 제공받은 2012년산 감껍질을 실험실용 건조기(JSR, Korea)를 이용하여 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 동안 건조하여 분쇄기(HMF-3000S, Hanil, Korea)로 분쇄한 후 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다.</p> <h2>전처리 방법</h2> <p>분쇄한 감껍질은 농도별로 제조한 황산용액 \( (1.4,1.5,1.75 \), \( 2.0,2.1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v})) \)과 \( 10 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 비율로 혼합하여 실온에서 1시간 동안 침지한 후 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \)에서 열처리하였다. 전처리된 시료는 상온으로 냉각시킨 후, 원심분리 \( (16,000 \times g, 10 \mathrm{~min}) \)하여 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액은 \( \mathrm{CaCO}_{3} \)를 사용하여 \( \mathrm{pH} 5.5 \)로 중화시킨 후 원심분리 \( (16,000 \times g, 10 \mathrm{~min}) \) 하여 상등액을 회수한 후 멸균된 여과지 \( (0.45 \mu \mathrm{m} \), Advantec, USA)로 여과하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다.</p> <h2>실험설계</h2> <p>감껍질의 전처리조건을 최적화하기 위하여 반응표면분석법을 이용하였다. 전처리 조건은 중심합성계획법(Central Composite Design, CCD)을 이용하여 황산농도(0.5-\( 3.0 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v})) \) 와 열처리시간(15-30분)의 범위를 설정하였다. 독립변수로서 황산농도 \( \left(\mathrm{X}_{1}, \%\right) \) 및 가열처리 시간 \( \left(\mathrm{X}_{2}, \mathrm{~min}\right) \)을 설정하고 종속변수는 전처리 후 생성된 환원당의 농도 \( \left(\mathrm{Y}_{\mathrm{R}}\right. \), \( \mathrm{g} / 1) \)로 지정하여 실험을 설계하였으며 Table 1에 나타냈다. 실험 결과의 분석은 Design Expert 8.0 (stat-Ease, USA)를 사용하였다.</p> <h2>분석방법</h2> <p>본 연구에 사용된 효모는 키위로부터 분리한 S. cerevisiae NK28이며, 균체 성장속도는 흡광광도계(GE Healthcare, Sweden)를 사용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.</p> <p>전처리를 통하여 생성된 환원당의 정량은 DNS(3, 5-dinitrosalicylic acid)법을 사용하였다. 전처리 된 감껍질에 함유된 당류의 정성분석은 Bio-LC(HPAEC-PAD system, Dionex, USA)를 이용하여 분석하였다. CarboPac \( { }^{\mathrm{TM}}\) PA1 (Dionex) 컬럼을 사용하였으며, 이동상으로는 \( 18 \mathrm{mM} \mathrm{NaOH} \)를 \( 1.0 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 의 유속으로 사용하였다. 전처리 된 감껍질에 함유된 발효 저해제 중 furfural, 5-Hydroxymethylfurfural 및 acetic acid의 분석은 HPLC (Shimadzu, Japan)를 사용 하였으며 Rezex ROA-Organic Acid H+ (Phenomenex, USA) 컬럼 및 \( 0.6 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 유속의 \( 0.005 \mathrm{~N} \) 황산용액을 이동상으로 사용하였다.</p> <h2>발효조건</h2> <p>S. cerevisiae \( \mathrm{NK} 28 \)은 \( 5 \mathrm{ml} \)의 YEPD (yeast extract \(1\%\) \( (\mathrm{w} / \mathrm{v}) \), peptone \( 2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \), glucose \( 2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v})) \)에 접종하여 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 동안 배양한 후, 전처리 과정에서 생산되는 저해제들이 효모의 성장에 영향을 미치는 것을 고려하여 전처리물에서 12시간 동안 전배양하였다. \( 100 \mathrm{ml} \)의 감껍질 전처리물(총환원당 \( 63.23 \mathrm{~g} / \mathrm{l}, \mathrm{pH} \) 5.5, Table 3)이 포함된 \( 500 \mathrm{ml} \)의 플라스크에 초기 세포흡광도 \( \left(\mathrm{OD}_{600}\right) \)가 0.1이 되도록 접종하여 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)에서 96시간 동안 배양하였다. 호기적 배양은 진탕배양기의 교반속도를 \( 200 \mathrm{rpm} \)으로 유지하였으며, 혐기적 조건은 \( 100 \mathrm{ml} \) 배지에 oxyrase(Bioworld, USA) \( 1 \mathrm{ml} \)을 첨가하고 스크류 타입의 마개를 이용하여 플라스크를 밀봉한 후 진탕배양기에서 배양하였다.</p>