비만세포는 다양한 약제나 보체 활성화 과정에서 생기는 분해산물에 의해 활성화되었다. 비만세포의 히스타민 분비를 억제하는 효과가 항산화물질과 관련이 있다는 보고도 있으며, HemoHIM에도 항산화 효과가 있어서 이러한 히스타민 분비 억제 효과가 HemoHIM에 함유된 항산화물질에 의한 것일 가능성이 있다. 또한, 염증성 사이토카인의 분비 억제 효과가 사이토카인의 유전자 전사과정을 억제한 결과인지를 확인하기 위해 사이토카인의 mRNA 발현 정도를 비교하는 RT-PCR법을 사용했다. 이전 연구에서는 오미자 추출물과 북강활 에틸아세테이트 분획물이 세포질 내의 IkB 분해를 억제하고, NF-kB가 핵 내로 이동하는 것을 억제하는 효과가 있다는 보고가 있었다. 따라서 HemoHIM의 NF-kB에 대한 작용을 밝히는 것이 필요한 것으로 판단된다. 히스타민 분비 억제 실험에서도 HemoHIM의 \(1\mathrm{\mu g/ml}\) 농도에서 최대 억제 효과가 나타나며, 고농도에서는 억제 효과가 감소하는 현상이 관찰되었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>히스타민 측정</h2> <p>비만세포는 항원 자극이나 calcium ionophore A23187, compound 48/80 등과 같은 다양한 약제들, 또는 보체 활성화 과정에서 생기는 분해산물인 C3a, C5a와 같은 anaphylatoxin에 의해 활성화된다. 활성화된 비만세포 내로 칼슘유입이 증가하면, 비만세포 내 히스타민, 세로토닌, 가수분해효소 등의 염증성 매개물질이 세포 밖으로 분비된다. 또한 활성화된 비만세포의 phospholipase A2에 의해 세포막의 phosphatidyl choline이 arachidonic acid로 전환되고, arachidonic acid는 cyclooxygenase와 5-lipoxygenase pathway를 통해 prosta-glandin D2, leukotrien C4, leukotrien D4, leukotrien E4 등의 매개물질들을 분비하여 알레르기를 유발한다. 비만세포를 활성화시키는 compound 48/80은 phenethylamine의 혼합 다당체로서 세포 외 칼슘이 세포 내로 유입되는 것을 유발한다. 세포 내 칼슘이온의 농도가 증가하면 다양한 2차 신호 전달물질에 세포 내부로 신호가 전달되어 비만세포의 탈과립이 일어나 히스타민이 분비된다. 따라서 사람 비만세포주 HMC-1에 HemoHIM을 농도별로 처리한 후에 compound 48/80으로 히스타민 분비를 유도하여 HemoHIM의 히스타민 분비 억제 효과를 관찰하였다. 그 결과, 대조군 \(7.42\pm0.91\mathrm{ng/ml}\)에 비해 compound 48/80을 처리한 실험군은 \(26.49\pm0.55\mathrm{ng/ml}\) 로 히스타민 분비량이 증가하였다(Table 1). 여기에 HemoHIM 0.1, 1, \(10\mathrm{\mu g/ml}\)을 처리한 실험군에서는 약 \(25\%, 38 \%, 12 \% \)정도 히스타민 분비가 억제되는 것을 관찰하였으며, 특히 HemoHIM \(1\mathrm{\mu g/ml}\)에서 가장 억제 효과가 큰 것으로 나타났다. 그러나 고농도인 \(100\mathrm{\mu g/ml}\) 을 처리하였을 때는 히스타민 분비량이 약간 증가하는 것으로 나타났다. 이는 HemoHIM이 다양한 종류의 생리활성 성분을 포함한 복합조성물이기 때문에 농도에 따라 히스타민 분비를 억제하는 성분과 촉진하는 성분의 균형이 달라지기 때문으로 생각되며, 복합 조성물에서 억제성분만을 분리 정제할 필요성이 있다고 판단된다. 천연 식물인 복분자, 상백피, 조각자나무, 연명초 등의 추출물도 동일하게 비만세포의 히스타민 분비를 억제한다는 보고도 있다. 또한 항산화물질이 비만세포의 히스타민 분비를 억제한다는 보고가 있으며, HemoHIM의 항산화 효과도 증명되었기 때문에, 이러한 비만세포의 히스타민 분비 억제 효과는 HemoHIM에 함유된 항산화물질에 의한 것일 가능성도 있다고 생각된다. 알레르기 억제제는 비만세포 내로 칼슘 유입을 억제하거나 비만세포 내 칼슘저장소에서 세포질 내로의 칼슘 유출을 억제하여, 세포 내 칼슘의 양을 감소시켜서 히스타민 분비를 억제하는 것으로 알려져 있다. 따라서 HemoHIM의 세포 외 칼슘 유입 또는 세포질 내 칼슘유출 억제 효과에 대한 연구도 필요하다고 생각된다.</p> <h2>사이토카인 분비량 측정</h2> <p>알레르기 반응에는 비만세포를 포함하는 다양한 면역세포가 관여하는데, 이들 세포는 IL-6, TNF-\(\alpha\), GM-CSF 등과 같은 염증성 사이토카인을 분비한다. TNF-\(\alpha\)는 비만세포가 활성되면 분비하는 다기능성 사이토카인으로 면역반응과 염증반응에 관여하며, IL-18, IL-6, IL-8, GM-CSF와 같은 다른 염증성 사이토카인의 분비를 촉진한다. IL-6 역시 강력한 염증반응을 매개하는 강력한 사이토카인이며, GM-CSF는 골수계 세포의 분화와 증식을 촉진하는 작용을 한다. 그리고 IL-8 은 호중구, 림프구, 호산구의 동원을 촉진하는 화학주성인자로서, 호중구를 활성화시켜 리소좀 효소를 방출하고 활성산소 생산을 유발하며, 관절염이나 패혈증 등과 같은 염증성질환에 관여한다. 따라서 히스타민 분비를 억제하는 효과가 있는 HemoHIM이 염증성 사이토카인의 분비도 효과적으로 억제 하는지 확인하였다. HemoHIM을 농도별로 HMC-1에 처리한 후에 PMA와 A23187로 사이토카인의 분비를 유도하였다. 그 결과 GM-CSF의 분비량은 HemoHIM을 처리하였을 때, 대조군 \(2.95\pm0.41\mathrm{ng/ml}\)에 비하여 약 \(27-45\%\) 정도 분비량이 농도의존적으로 억제되었다(Table 2). 하지만 염증성 케모카인 IL-8의 분비량은 저농도에서는 억제효과가 나타나지 않았지만, HemoHIM \(100\mathrm{\mu g/ml}\)에서만 약 \(18\%\)정도 억제되었다. TNF-\(\alpha\)의 경우에 대조군 \(789.4\pm31.4\mathrm{pg/ml}\)에 비해 HemoHIM을 농도별로 처리하였을 때, 약 \(43-55\%\) 정도 분비량이 억제되었고, IL-6의 경우에도 대조군 \(1,830.0\pm 106.1\mathrm{pg/ml}\) 과 비 표하였을 때, HemoHIM의 각 농도에서 약 \(32-42\%\) 정도 분비량이억제되는 것을 확인하였다. IL-6와 TNF-\(\alpha\)의 분비량은 실험한 모든 농도에서 비슷한 억제효과를 나타내었는데, 이는 HemoHIM이 두 종류의 사이토카인 생산에 더 민감한 작용을 나타내는 것으로 GM-CSF 분비량과는 다른 신호전달 과정에 관여할 가능성이 있는 것으로 생각된다. 이와는 달리 북강활 에틸아세테이트 분획이 TNF-\(\alpha\)와 IL-8의 분비량을 동시에 억제한다는 보고와 오미자 물추출물이 HMC-1의 IL-6, TNF-\(\alpha\), GM-CSF의 분비량을 억제한다는 보고도 있었다. 따라서 이들 추출물과 HemoHIM의 활성성분이 다를 가능성이 있다고 판단된다.</p> <h2>사이토카인 mRNA 발현량 분석</h2> <p>HemoHIM에 의한 염증성 사이토카인의 분비 억제 효과가 각 사이토카인의 유전자 전사과정을 억제한 결과인지 알아보기 위하여 사이토카인의 mRNA 발현 정도를 RT-PCR법을 이용하여 비교하였다. IL-6와 GM-CSF의 mRNA 발현량은 사이토카인의 분비량과 같이 HemoHIM 처리에 의해 그 정도가 억제되는 것으로 나타났다(Fig. 1). 그러나 저농도의 HemoHIM처리로 분비량이 억제되었던 TNF-\(\alpha\)의 경우에는 저농도에서 mRNA 발현량이 거의 억제되지 않았다. 이러한 결과는 HemoHIM이 비만세포 내에 이미 합성되어 축적된 TNF-\(\alpha\)의 분비를 억제하지만, 활성화된 비만세포가 TNF-\(\alpha\)를 새로 합성하는 것은 억제하지 못할 가능성을 시사하는 것으로 생각된다. 그리고 저농도의 HemoHIM에 의해 분비량이 억제되지 않았던 IL-8의 mRNA 발현량이 많이 억제되었다. 즉 분비는 억제하지 못하였지만 IL-8 mRNA 합성은 억제하는 것으로 생각된다. 알레르기성 염증반응의 중요한 전사 인자인 NF-kB가 IL-6, TNF-\(\alpha\), GM-CSF 유전자의 전사를 조절한다고 알려져 있다. 오미자 물추출과 북강활 에틸아세테이트 분획이 세포질 내의 IkB 분해를 억제하고, NF-kB가 핵 내로 들어가는 것을 억제한다는 보고가 있기 때문에 NF-kB에 대한 HemoHIM의 작용을 밝히는 것이 필요하다고 생각된다.</p> <h2>비만세포 특이 유전자의 mRNA 발현량 분석</h2> <p>알레르기 유발 항원의 침입에 대해 T세포가 IL-4를 분비하면 IL-4는 B세포가 IgE를 생성하도록 유도한다. IgE는 비만세포의 Fc\(\varepsilon\)RI이라고 불리는 고친화성 IgE 수용체에 강하게 결합한다. 이때 항원이 비만세포의 Fc\(\varepsilon\)RI에 결합한 IgE에 결합하면, Fc\(\varepsilon\)RI의 교차결합에 의해 비만세포의 화학적 매개물질이 분비되어 알레르기 반응이 일어난다. 단백분해효소 (trytase)는 비만세포 가 활성화되면 빠른 시간에 분비되는 화학적 매개물질로서 최근에는 과민성 쇼크발생시 농도를 측정하여 전신 비만세포 활성화의 진단에 사용하고 있다. 비만세포 막에 있는 Tyrosine kinase인 c-kit는 SCF (stem cell factor)와 결합하여 비만세포의 증식과 분화를 유도하는 수용체이다. 따라서 HemoHIM이 비만세포의 활성화시 분비되는 단백분해효소, IgE에 대한 수용체인 Fc\(\varepsilon\)RI, 그리고 분화 증식에 필요한 c-kit의 발현량을 억제하는 효과가 있는지 알아보기 위하여, 각 유전자의 mRNA 발현량을 RT-PCR법으로 확인하였다. 그 결과 c-kit의 mRNA 발현량은 모든 농도에서 약 \(33-65\%\) 억제되었고, Fc\(\varepsilon\)RI의 mRNA 발현량은 HemoHIM 농도에 의존적으로 억제율이 증가하여 최대 약 \(82\%\)까지 억제 되었다(Fig. 2). 그러나 Tryptase mRNA 발현량은 HemoHIM \(1\mathrm{\mu g/ml}\)에서 최대 약 \(64\%\) 까지 억제되었으나, \(10, 100\mathrm{\mu g/ml}\)에서는 억제효과가 나타나지 않았다. 히스타민 분비 억제 실험에서도 HemoHIM \(1\mathrm{\mu g/ml}\)에서 최대 억제 효과가 나타나고 고농도에서는 억제 효과가 감소하는 현상이 나타났다. 이것은 다당체가 주성분인 HemoHIM이 고농도에서 서로 결합하여 오히려 억제 효과가 감소하여 나타나는 결과일 가능성이 있다고 생각된다.</p>