Oil Red O staining을 통한 지방세포 분화 및 TG 생성 저해능 분석 실험에서는 MDI를 이용해 3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화하였으며, 이후 위상차 현미경과 Oil Red O staining을 지방세포 분화 억제능 및 TG 생성 저해능을 분석하였다. 다음으로 Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)을 통한 지방세포 분화 관련 유전자 발현 조절능 분석 실험에서는 EPEE가 유전자의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 6-well tissue culture plate 세포를 분주하고 RNA를 분리하여 각 유전자의 발현을 RT-PCR로 분석하였다. 다음으로 지방세포 분화 관련 단백질 발현 조절능 분석 실험에서는 시료 처리가 끝난 세포에서 단백질을 분리하여 지방 생성 관련 단백질의 발현 변화를 Western blot hybridization으로 분석하였으며, 지방세포내 중성지방 제거량 측정 실험은 phosphateoxidase(GPO)-TRINDER kit를 이용해 진행하였다.
<h2>Oil Red O staining을 통한 지방세포 분화 및 TG 생성 저해능 분석</h2><p>3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화는 상기의 MDI를 처리하여 유도하였다. 12-well tissue culture plate에 well 당 \( 2 \times 10^{5} \)개의 세포를 분주하고 2일 후 \( 10 \% \) FBS가 든 배지로 교체하였다. 2일 경과 후 MDI가 든 배지로 교체하면서 시료를 농도별로 처리하고 2일 간격으로 총 4회 insulin과 시료를 치리하였다. 마지막 시료를 처리하고 2일 경과 후 위상차 현미경을 이용하여 지방세포 분화 정도 및 시료에 의한 분화 억제 정도를 200배 배율로 관찰하여 촬영한 후, 지방세포 분화 억제능 및 TG 생성 저해능을 Oil Red O staining을 통해 분석하였다. 지방세포 분화 및 시료 처리가 완료된 세포를 \( 1 \times \) phosphate buffered saline(PBS)로 씻어 준 다음 \( 10 \% \) formalin으로 고정하고 Oil Red O staining solution을 처리한 후 30분간 염색하였다. 염색 완료 후 \( 100 \% \) isopropanol을 사용하여 염색된 지방을 추출하고 multi-plate reader를 이용하여 \( 500 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)을 통한 지방세포 분화 관련 유전자 발현 조절능 분석</h2><p>EPEE가 지방세포 분화에 중요한 역할을 담당하는 유전자의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 6-well tissue culture plate에 \( 3 \times 10^{5} \)개의 세포를 분주하고 지방 생성 억제능 분석과 동일한 방법으로 시료를 처리한 후 RNA를 분리하여 각 유전자의 발현을 RT-PCR로 분석하였다. 먼저 시료 처리가 완료된 배양 세포의 total RNA를 TRIzol (Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 추출한 후 NanoVue plus spectrophotometer(GE healthcare, WI, USA)를 이용하여 정량하고 SuperScript \( { }^{\mathrm{TM}} \) First-Strand Synthesis System (Invitrogen)을 이용하여 cDNA를 합성한 후 PCR을 수행하였다. 유전자 발현 분석의 internal control로는 housekeeping gene인 glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 사용하였으며 실험에 사용한 대상 유전자의 염기서열은 Table 1에 제시한 바와 같다.</p><h2>Western blot hybridization을 통한 지방세포 분화 관련 단백질 발현 조절능 분석</h2><p>상기의 RT-PCR 분석에서와 같은 방법으로 실험을 수행한 후 시료 처리가 끝난 세포에서 단백질을 분리하여 지방 생성 관련 단백질의 발현 변화를 Western blot hybridization으로 분석하였다. 먼저 시료 처리가 끝난 배양 세포에서 cell lysate를 추출하여 Bradford assay로 단백질 농도를 결정한 후 \( 50 \mu \mathrm{g} \)의 단백질을 \( 10 \% \) SDS-polyacrylamide gel electrophoresis로 전기영동하고 nitrocellulose membrane에 blotting한 후 대상 단백질의 일차 항체와 hybridization하였다. 실험에 사용한 C/EBP\(\alpha \)와 C/EBP\(\beta \)의 일차 항체는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)로 부터 구입하였고, PPAR \( \gamma \) 및 actin의 일차 항체와 horse radish peroxidase가 부착된 anti-goat, anti-rabbit, anti-mouse등의 이차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. Membrane 수세 후 이차 항체로 한 시간 동안 반응시키고 chemiluminescence detection system(FuoChem \( { }^{\circledR} \) FC2, AlphaInnotech, USA)을 이용하여 각 단백질의 발현을 분석하였다.</p><h2>지방세포내 중성지방 제거량 측정(lipolysis assay)</h2><p>EPEE가 보유한 지방세포 내 중성지방 제거능(lipolysis activity)은 아래와 같이 분석하였다. Confluence 상태의 3T3-L1 지방전구세포를 2일간 배양한 다음 MDI를 첨가한 DMEM 배지로 2일간 배양하고 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)이 든 DMEM 배지에 4일간 추가 배양하였다. 이러한 과정을 통해 지방세포 분화가 완료된 3T3-L1 cell에서 시료를 농도별로 처리한 다음 48시간 후 중성지방 분해에 의해 배지에 방출된 glycerol 양을 glycerol-3-phosphateoxidase(GPO)-TRINDER kit(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 \(540\mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.</p><h2>데이터 처리 및 통계 분석</h2><p>모든 실험 결과는 최소 3회 이상의 반복 실험을 통하여 얻은 데이터를 평균(mean) \( \pm \) 표준편차(standard deviation, SD)로 나타내었고, 필요 시 대표적인 그림이나 데이터를 제시하였다. 각 데이터의 통계 분석은 SPSS 20.0 software를 이용한 unpaired Student's t-test를 통해 \( p \) 값이 0.05 미만 \( (p<0.05) \)인 경우 유의성이 있는 것으로 판단하였다.</p>