대황 에탄올 추출물을 이용해 활성물질을 분리하였고, 이를 통해 22개의 sub-fraction 중 EA1, 2 에탄올-fraction이 lipase 저해활성을 높게 나타냄을 확인하였다. 특히, EA1 sub-fraction은 \(2.5 \mathrm{mg}/\mathrm{ml}\)에서 \(82.55\%\)로, \(0.54 \mathrm{mg}/\mathrm{ml}\)의 \( \mathrm{IC}_{50} \) 값을 가지며 가장 높은 lipase 저해활성을 보였다. 이로 인해, EA1 sub-fraction은 잠재적인 lipase 저해 물질을 포함하며, 이는 갈조류 유래의 phlorotannin derivatives 또는 ethyl acetate에 용출이 잘되는 소수성 물질로 사료된다. Polyphenol 화합물의 hydroxyl group과 효소의 결합부위가 수소 및 이온결합을 통해 강한 복합체를 형성, 이로써 효소의 활성을 저해한다는 사실도 함께 확인하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>E. bicyclis 에탄올 추출물의 lipase 저해 활성</h2> <p>활성물질을 분리하기 위하여 대황 에탄올 추출물을 \( \mathrm{n} \) -hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol 및 water의 극성차를 이용하여 순차적 분획하였다. 그 중 ethyl acetate 층이 \( 1,2.5 \) 및 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도에서 각각 \( 38.35 \%, 58.54 \% \) 및 \( 65.91 \% \) 로 \( 1.31 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 \( \mathrm{IC}_{50} \) 값을 보여 높은 lipase 저해활성을 보였다(Table 2). Ethyl acetate 분획을 silica-gel column chromatography를 이용하여 분리하여 22 개의 subfraction을 얻었다. 22 개 sub-fraction의 lipase 저해활성을 측정한 결과, EA1, 2 에탄올-fraction 이 높은 lipase 저해활성을 나타내었으며 그 중 EA1 sub-fraction이 \( 2.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 에 서 \( 82.55 \% \) 로 \( 0.54 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 \( \mathrm{IC}_{50} \) 값을 보여 가장 높은 lipase 저해활성을 나타냈다. 갈조류인 Ascophyllum nodosum 와 Ecklonia cava 의 에탄올 추출물로부터 분리한 ethyl acetate 분획 역시 에탄올보다 높은 lipase 저해활성을 나타내었고 이를 silica-gel column chromatography를 실시한 결과, crude ethyl acetate 분획보다 활성이 높음을 확인하여 본 연구와 유사한 결과를 나타내었다. 따라서 ethyl acetate 분획의 EA1 sub-fraction이 잠재적인 lipase 저해 물질을 포함하고 있을 것으로 사료되어진다. Bitou 등은 해조류의 ethyl acetate 분획은 tannin과 같은 polyphenol의 함량이 높다고 하였으며 이는 효소단백질과 강하게 결합하여 효소의 활성을 저해한다고 보고하였다. Moon 등은 대황 ethyl acetate 분획이 높은 protein tyrosine phosphatase \( 1 \mathrm{~B} \) 저해활성을 가지며 \( \alpha \)-glucosidase 저해활성도 나타낸다고 하였으며 이는 대황이 가지는 phlorotannin 유래 물질인 것으로 밝혀겼다. 이를 통해 대황의 EA1 sub-fraction이 나타내는 lipase 저해활성은 갈조류 유래의 phlorotannin derivatives 또는 ethyl acetate에 용출이 잘되는 소수성 물질일 것으로 사료된다.</p> <h2>Lipase inhibitor의 분리</h2> <p>높은 lipase 저해활성을 보인 EA1 sub-fraction으로부터 유효물질을 분리하기 위하여 HPLC를 실시하였다. 분석을 통해 8 개의 주요 peak를 분리하였으며 각 peak의 lipase 저해활성을 측정한 결과는 Table 3 과 같다. 5,7 및 8 fraction이 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 에서 각각 \( 66.85 \%, 62.77 \% \) 및 \( 61.93 \% \) 의 높은 lipase 저해활성을 보였으며 그 중 fraction 5 의 \( \mathrm{IC}_{50} \) 값이 \( 0.37 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 으로 \( \mathrm{EA} 1 \) 분획보다 높은 lipase 저해활성을 보였다(Table 4). 그러나 positive control인 orlistat( \( \mathrm{IC}_{50}= \) \( 0.1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) )보다는 낮은 저해활성을 나타내었다. 높은 저해활성을 보인 fraction 5 에 대해 LC/ESI-MS와 NMR를 실시하여 구조를 구명하였다. LC/ESI-MS(negative mode, \( [\mathrm{M}-\mathrm{H}]^{+} \) at \( \mathrm{m} / \mathrm{z} 741.1 \) )에 의한 분자 조성은 \( \mathrm{C}_{36} \mathrm{H}_{22} \mathrm{O}_{18} \) 로 나타났다. \( { }^{1} \mathrm{H} \)-NMR spectrum은 \( \delta 6.14(1 \mathrm{H}, \mathrm{s}), 6.12(1 \mathrm{H}, \mathrm{s}), 6.07 \) \( (2 \mathrm{H}, \mathrm{s}), 6.06(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}), 6.03(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}), 5.97(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}), 5.94 \) \( (1 \mathrm{H}, \mathrm{d}), 5.91 \) (3H, m)의 signal을 나타내었고 반면 \( { }^{13} \mathrm{C}- \) NMR은 \( \delta 162.03,160.30,157.96,156.15,154.68,152.55 \), 147.50, 147.45, 147.28, 147.06, 144.45, 144.29, 143.56, \( 143.46 \), 138.79, 138.62, 126.61, 126.34, 125.80, 125.74,\( 125.02,124.78,124.72,100.01,99.89,99.63,99.53 \),\( 97.80,96.36,95.98,95.90,95.50 \) signal을 나타내었다. 이러한 결과를 통해 fraction 5 의 구조는 dieckol로 확인하였다 (Fig. 2). Dieckol은 대표적인 phlorotannin 화합물로서 phloroglucinol을 기본구성단위로 하는 폴리페놀 화합물이며 자연계에서 해양식물, 특히 갈조류에서 발견되고 있다. 해조류 유래 phlorotannin은 항산화, 심혈관 질환 보호, 항바이러스 및 tyrosinase 저해활성 등 다양한 기능성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. Polyphenol 화합물은 단백질과 착물을 이루는 친화력이 뛰어난 것으로 알려져 있어 이 물질의 hydroxyl group과 효소의 결합부위가 수소 및 이온결합을 통해 효소와 강한 복합체를 형성함으로써 효소들과 비선택적 침전반응을 통하여 효소의 활성을 저해한 것으로 사료되어진다.</p>