본 연구에서는 사람 췌장 리파아제 유전자와 재료 및 방법에 기술한 3가지 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써, 뉴클레오티드로 구성된 DNA 조각을 제조하였다. 대량으로 생산된 코리파아제 결합도메인은 Ni-NTA 컬럼을 이용하여 수용성분획으로부터 순수하게 분리했다. 따라서 같은 양의 항원을 면역하였을 때 항체 생성율이 가장 높은 코리파아제 결합도메인의 면역원성이 가장 높은데 이러한 결과는 양성대조군인 돼지 췌장 리파아제에 대한 수용성 난황항체보다 코리파아제 결합도메인에 대한 수용성 난황항체가 리파아제 활성을 효과적으로 저해한다는 사실을 알려준다. 재조합 코리파아제 결합도메인을 항원단백질로 사용하여 면역화시킨 산란계에서 생산된 난황항체에 항원단백질의 특이 항체가 포함되어 있으며 생체 외부의 췌장리파아제 활성을 저해한다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>사람 췌장 리파아제 도메인 유전자 클로닝</h2> <p>사람의 췌장 리파아제 효소는 음식물속에 포함된 지방의 가수분해를 수행하는 촉매활성 도메인과 담즙산염 (bile salt)의 저해작용을 억제하는 코리파아제 (colipase) 결합도메인으로 구성되어 있음이 보고되었다. 본 연구에서는 췌장 리파아제에 대한 항체 생산용 항원단백질로써 전체 리파아제 단백질뿐만 아니라 촉매활성 도메인과 코리파아제 결합도메인을 사용하기로 결정하였다.</p> <p>사람의 췌장 리파아제 유전자의 염기서열을 조사 분석한 결과, 전체 유전자는 1398 개의 뉴클레오티드로 구성되어 있으며, 전반부 1059 개의 뉴클레오티드가 촉매활성도메인을 코딩하고 후반부 336 개의 뉴클레오티드가 코리파아제 결합도메인을 코딩하는 것으로 밝혀졌다. 본 연구에서는 사람 췌장 리파아제 유전자와 재료 및 방법에 기술한 3가지 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써, 각각 1395, 1059, 336개의 뉴클레오티드로 구성된 DNA 조각을 제조하였다. 제조된 DNA 조각을 각각 pGEM T 벡터에 먼저 클로닝하고 이후에 발현벡터인 pET22 벡터에 서브클로닝하였다.</p> <h2>사람 췌장 리파아제 도메인 단백질의 생산과 분리</h2> <p>앞서 제조된 3가지 재조합 플라스미드를 사용하여 E. coli BL21 (DE3)를 형질전환하고 \( 18^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하면서 IPTG를 사용하여 재조합단백질의 발현을 유도하였다. SDS-PAGE를 통해서 세포 내 단백질의 양상을 분석한 결과, 리파아제 전체단백질 \( ( \) 약 \( 51.2 \mathrm{kDa}) \), 촉매활성도메인 (약 \( 38.8 \mathrm{kDa}) \), 코리 파아제 결합도메인(약 \( 12.3 \mathrm{kDa} \) )에 해당되는 재조합 단백질을 확인할 수 있었다. 3가지 재조합단백질은 수용성분흭(S)과 불용성분획(P)에서 모두 관찰되었으며, 특히, 코리 파아제 결합도메인이 다른 2가지 단백질에 비해서 대량으로 생산된 것을 확인하였다.</p> <p>대량 생산된 코리파아제 결합도메인의 경우, Ni-NTA 컬럼을 이용하여 수용성분획으로부터 순수하게 분리할 수 있었다. 리파아제 전체단백질과 촉매활성도메인의 경우에는 불용성 분획의 단백질을 정량한 후에 항원단백질로 직접 사용하였다.</p> <h2>난황항체 생산</h2> <p>지방분해 효소인 리파아제에 대한 리파아제 전체단백질, 촉매활성도메인, 코리파아제 결합도메인을 면역원으로 사용하여 생산된 수용성 난황분말(WSF)의 항체가를 측정하고자 하였다. 항체의 특이성을 조사하기 위해 준비된 세 종류의 항원 및 각종 미생물의 항원(Salmonella typhymurium, Heli-cobacter pylori, E. coli K88, recombinant human rotavirus)을 코팅한 후 상기에서 획득한 각 수용성 난황항체와 비면역 난황항체에 대한 ELISA를 실시하였다. 비면역 항체의 경우에는 사용한 모든 항원단백질에 대해 항원-항체 반응을 나타내지 않았으며(GMT 50,000 이하), 세가지 수용성 난황항체도 각종 미생물 항원에 대해서 반응을 보이지 않았다(GMT 50,000 이하). 반면에 세가지 난황항체는 면역유도실험에 사용한 3종류의 항원단백질에 대해서 특이적인 항원-항체반응을 나타내었다(GMT 100,000 이상). 이중에서도 그림 4에 나타난 것과 같이 코리파아제 결합도메인(C)에 대한 IgY가 코리파아제 결합도메인에 대해서 가장 높은 항체가 (7,140,000)을 나타냈다. 반면에 전체단백질 (H)과 촉매활성도메인(A)에 대한 IgY는 해당 항원단백질에 대해서 각각 3,000,000 과 4,700,000의 항체가를 나타내었다. 따라서 동일한 양의 항원을 면역하였을 때 항체 생성율이 가장 높은 코리파아제 결합도메인의 면역원성이 가장 높은 것으로 확인 되었다.</p> <h2>리파아제 활성 저해 시험</h2> <p>생산된 난황항체의 리파아제 활성 저해 효과를 알아보기 위해 리파아제의 pNPC 분해활성을 측정하였다. 리파아제 활성 억제율을 측정한 결과, Fig. 5와 같이 음성 대조군인 비면역 수용성 난황항체는 \( 12 \% \), 양성대조군인 돼지췌장 리파아제에 대한 수용성 난황항체는 \( 58 \% \)까지 리파아제 활성을 억제하였다. 반면에 코리파아제 결합도메인과 전체단백질 및 촉매활성도메인에 대한 난황항체는 각각 \( 62 \%, 44 \%, 23 \% \) 까지 리파아제 활성을 억제하였다. 이러한 결과는 양성대조군인 돼지 췌장 리파아제에 대한 수용성 난황항체보다 코리파아제 결합도메인에 대한 수용성 난황항체가 리파아제 활성을 효과적으로 저해함을 보여준다.</p> <h2>임상시험</h2> <p>리파아제 활성을 저해시키는 난황항체가 포함된 지방용액을 경구 투여하여 최종적으로 지방의 장관흡수 억제 효과를 검증하였다. 혈중 중성지방산을 측정한 결과 Fig. 6 A과 같이 지방용액 투여 후 중성지방산의 수치는 1시간 후까지 급속히 증가하였으며 그 이후부터는 감소하는 경향을 보였다. 대조군의 경우 4시간 이후부터는 7주령 rat의 일반적인 중성지방산 수치 범위 \( (85.6 \pm 18.6) \)안에서 일정하게 유지되었다. 그러나 처리군의 경우 4 시간 이후부터는 대조군에 비해 유의적으로 감소하였다 \( (\mathrm{P}<0.005) \). 혈중 총 콜레스테롤은 7주령 rat의 일반적인 총 콜레스테롤 범위 \( (97.00 \pm 7.71) \)안에서 수치가 변화하였다. 처리군은 총 콜레스테롤 변화가 거의 없는 반면 대조군은 경구 투여 2시간 후부터 총 콜레스테롤이 증가하는 경향을 보였다. 또한 혈중 HDL-콜레스테롤은 지방용액 투여 1 시간 이후부터 감소하였으며 대조군보다 처리군의 수치가 높은 경향을 나타내었다. 혈중 LDL 콜레스테롤은 대조군과 처리군에서 비슷한 양상을 보이며 변화하였다.</p> <p>본 연구에서는 재조합 코리파아제 결합도메인을 항원단백질로 사용하여 면역화시킨 산란계로부터 생산된 난황항체에 해당 항원단백질에 대한 특이적 항체가 포함되어 있으며 생체외 (in vitro)에서 췌장리파아제의 활성을 저해할 수 있음을 밝힐 수 있었다. 그뿐만 아니라 코리파아제 결합도메인에 대한 난황항체를 먹이와 함께 섭취한 쥐의 혈중 중성지방 수치가 대조군에 비해 상대적으로 감소하는 것으로부터 난황 항체가 생체내 (in vivo)에서도 췌장 리파아제의 활성을 저해하는 것으로 추정할 수 있게 되었다. 이러한 연구결과는 코리파아제 결합도메인을 사용하여 생산된 난황황체가 비만억제제로의 개발가능성이 있음을 보여준다.</p>