이전 연구에서 HCCR 유전자의 promoter 영역을 분리하고 전사시작부위를 확인하였으며, computational analysis를 통해 이 영역이 TATA box, CAAT box 및 다양한 전사인자와 결합 가능한 위치를 가지고 있음을 확인하였다. 각 promoter fragment의 활성은 K562에서 가장 높았으나, HEK293에서는 상대적으로 낮았고, A549에서는 거의 없었다. Gene2Promoter를 활용한 분석을 통해 36bp 범위 내에 TG-interacting factor (TGIF)를 위한 전사합의 서열이 존재함을 확인하였다. 이어서, pGL3-406~+30 내에 포함된 TGIF 전사합의 서열 위치에서 TGA를 GTC로 치환한 돌연변이 (pGL3-mTGIF)를 제작하였다. 이를 통해 우리는 두 가지 주요한 결과를 얻을 수 있었다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>암세포주에서 HCCR promoter의 활성분석</h2><p>앞선 연구에서 HCCR유전자에 대한 promoter 영역을 분리하여 전사시작부위를 확인하였고, computational analysis를 이용하여 이 promoter가 TATA box, CAAT box와 다양한 전사인자(transcriptional factor)들이 결합 가능한 자리가 있음을 관찰하였다. 본 연구에서는 HCCR발현에 중요한 역할을 담당하는 부위를 검색하기 위하여 promoter 영역의 단백질 합성 시작점 +30에서 5' 쪽 -147, -370, -406, -980까지 각각 합성하여 Firefly luciferase (LUC)를 reporter gene으로 포함하는 pGL3-basic vector에 cloning하였고, 이를 K562, HEK293, A549 세포주에 각각 transfection하여 각각의 reporter의 활성을 측정하였다. Renilla luciferase (RL)를 포함하는 pCMV-RL은 internal standard로 함께 co-transfection하여 LUC값을 RL값으로 normalization하여 결과값을 환산하였다. 측정한 모든 promoter fragment의 활성은 K562에서 가장 높은 활성을 보였지만, HEK293에서는 낮은 활성을, A549에서는 거의 활성이 없음을 관찰하였다. 실제로, 이들 세포주를 이용한 northern blot결과에서도 일치하는 결과를 얻었다. 또한, pGL3-406~+30과 pGL3-370~+ 30의 활성을 비교해보면, 단지 \( 36 \mathrm{bp} \)의 추가로 의미 있는 활성의 감소를 관찰하였다.</p><p>여기서 두 가지 결과를 얻을 수 있었다. 첫 번째, 동일한 promoter가 세포주에 따라 전사활성이 크게 차이를 보인다. 이것은 특정 전사인자가 세포에 따라 다르게 발현하거나, 각각의 세포에서 각기 다른 전사인자가 작용하여 전사활성을 조절할 수 있음을 의미한다. 두 번째, promoter 내의 –370~-406사이에 어떤 중요한 전사억제인자를 위한 부위가 존재 할 수 있다. 실제로 전사인자가 결합하는지 확인하기 위하여, 합성한 \( 36 \mathrm{bp} \)의 double strand oligo를 probe (P36)로 K562 핵단백질을 이용한 EMSA 분석을 하였다. Fig. 2에 나타낸 것처럼, 핵단백질이 결합함을 관찰하였다. 반면, 표기하지 않은 10배 농도의 probe P36를 첨가하면 핵단백질 결합이 방해되고, TGIF에 대한 특이적이 없는 probe Ery (erythroid krueppel like factor; -294 -272)을 첨가한 경우 그 결합이 정상적으로 일어남을 관하였다.</p><h2>TIGF site에 핵단백질의 결합</h2><p>Gene2Promoter (Genomatix)를 이용한 분석에서 \( 36 \mathrm{bp} \) 내에 TG-interacting factor (TGIF)를 위한 transcription consensus motif가 존재함을 확인하였다. 이를 근거로 TGIF에 대한 consensus sequence를 포함하는 oligo probe (TG)를 합성하여 K562 핵단백질을 대상으로 EMSA를 수행하였다. Fig. 3A에서 나타난 것처럼 TG probe에 핵단백질이 결합함을 관찰하였다. 반면, 표지하지 않은 10배 농도의 TG probe (TG)와 함께 반응한 EMSA에서는 관찰되지 않았고, 미표지의 2배의 TG probe (2TG)에서는 일부 결합이 방해됨을 관찰하였다.</p><p>TGIF 핵단백질의 결합을 확인하기 위해 TG probe의 TGIF에 대한 consensus sequence를 치환한(TGA를 GTC로 치환함) mutant TG probe (mTG)를 제작하여 TGIF와의 결합여부를 관찰하였다. Fig. 3B에서 보여지는 것처럼 정상 서열을 포함하는 probe에서는 정상적인 결합이 일어나지만, 돌연변이를 유도한 mTG에서는 핵단백질의 결합이 일어나지 않음을 관찰하였다. 이 결과는 TGIF site에 그것의 consensus sequence를 인식하는 한 개의 단백질이 결합하고, 그 서열의 치환은 TGIF와 같은 전사인자의 결합을 방해함을 의미한다.</p><h2>TGIF 단백질의 결합과 HCCR promoter의 활성 억제.</h2><p>앞선 reporter assay에서 TGIF자리가 그 promoter 활성을 억제함을 관찰하였다. 여기서는, 반대로 TGIF 자리에 핵단백질 결합의 방해가 promoter 활성을 회복 시킬 수 있는지 그 연관성을 확인하였다. 이를 위해, pGL3-406~+30 내에 포함된 TGIF에 대한 consensus sequence자리를 치환한(TGA를 GTC로 치환함) mutant돌연변이(pGL3-mTGIF)를 제작하였다. 이들 promoter 영역을 포함하는 reporter 벡터를 이용하여 K562 세포에서 luciferase reporter assay를 수행하였다. pGL3-mTGIF에서 의미 있는 전사활성의 회복을 관찰하였다. 이 결과를 종합해 보면, HCCR의 promoter에 TGIF전사인자가 결합하여 그 유전자 발현을 부분적으로 억제하고, TGIF의 결합을 방해하면 그 활성이 의미 있게 회복됨을 알 수 있다. 하지만, Fig. 1과 4의 결과에서 TIGF자리를 존재 유무에 따라 의미 있게 활성이 변화 하지만 그 차이가 크지 않음을 고려한다면 HCCR 발현 조절에서 TGIF의 역할이 TGIF 단독의 효과라기보다는 또 다른 전사인자가 존재할 수 있으며, 이 자리가 특정 환경에서 이 proto-oncogene을 발현을 조절하는데 관여할 수 있음을 암시한다.</p><p>본 연구에서는 HCCR promoter의 특성을 분석하였다. 이 과정에서 -390에서 -366 사이에 TGIF 전사인자 결합하여 전사 활성을 조절함을 관찰하였다.</p>