실험용 생쥐를 구입하여 일반식이를 먹이며 2주 동안 적응기간으로 사육하였다. 당뇨 유발을 위해 11주령과 21주령의 일반식이그룹 생쥐와 고지방식이그룹 생쥐를 5~6시간 동안 금식시킨 후 STZ을 복강에 주입하였고 희생시킨 실험 생쥐로부터 추출한 혈액을 \(2,400 \times g \) 에서 15분간 원심분리한 후 상층액을 다시 \( 12,500 \times g \) 에서 15분간 2차 원심분리하여 상층액을 혈장시료로 사용하였다. 각 total RNA시료 \( 500 \mathrm{ng} \) 을 High Capacity cDNAundefined 9700을 사용하여 cDNA를 합성하였으며 TNF-a, MCP-1과 normalizing gene의 RNA transcript 발현량을 측정하기 위해 quantitative real-time PCR을 기존의 표준곡선 방식대로 수행하여 실험쥐의 실험 데이터는 SD 또는 SEM로 결과를 나타냈고, student t-test로 유의성을 검정하였으며, 선형회귀분석으로 사이토카인 유전자 발현량과 혈장 인슐린량의 상관관계를 평가했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험동물</h2> <p>실험용 생쥐(C57BL/6, 4주령)를 구입하여(Hyochang Science, Daegu, Korea) 일반식이(normal diet, ND; fat \(4 \mathrm{kcal} \% \), Rodent NIH-31 Open Formula Auto, Zeigler Bros, inc, Gardners, PA, USA)를 먹이며 2주 동안 적응기간으로 사육하였다. 6주령 때부터 일반식이그룹(ND)과 고지방식이 (high-fat diet, HFD; fat \( 45 \mathrm{kcal} \% \), Feedlab Korea Co, Ltd, Korea)로 비만화를 유도하는 고지방식이그룹으로 나누어 사육하였다. 물과 식이를 자유로이 먹이면서 온도는 \( 23 \pm 3^{\circ} \mathrm{C} \), 습도는 \(55\sim 65\%\)이며 12시간 light-dark cycle로 조정된 동물실험실에서 사육하였다.</p> <h2>Streptozotocin 주사에 의한 당뇨 유발</h2> <p>당뇨 유발을 위해 11주령과 21주령의 일반식이그룹 생쥐와 고지방식이그룹 생쥐를 5~6시간 동안 금식시킨 후 STZ을 복강에 주입하였다. Low-dose STZ protocol에 따라서 \( 0.1 \mathrm{M} \) so-dium citrate buffer ( \( \mathrm{pH~} 4.5\))에 \( 0.75 \% \) 의 농도로 녹인 STZ을 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) mouse body weight의 용량으로 연속 5 일간 생쥐의 복강에 주사하였다. STZ 주사 후에도 주사 전과 같은 식이 를 자유급식하였다. STZ 주사 4주 후에 혈당량을 조사하여 과혈당증 유도를 확인한 후, STZ 주사 5주 후에 생쥐의 주령이 각각 16주령과 26주령이 되었을때 안락사 시키고 혈액과 실험 조직을 적출하였다.</p> <h2>혈장 포도당 농도와 인슐린 농도</h2> <p>희생시킨 실험 생쥐로부터 추출한 혈액을 \(2,400 \times g \) 에서 15분간 원심분리한 후 상층액을 다시 \( 12,500 \times g \) 에서 15분간 2차 원심분리하여 상층액을 혈장시료로 사용하였다. 분리한 혈장에서의 포도당 농도는 glucometer를 사용하여 측정하였으며, 인슐린 농도는 ELISA kit (ALPCO Diagnostics, Salem, NH, USA)를 사용하여 측정하였다.</p> <h2>cDNA 합성</h2> <p>STZ을 주사하여 당뇨를 유발시킨 ND와 HFD의 16주령과 26주령의 네 종류 생쥐의 실험군(16w-ND, 16w-HFD), ( 26w-ND, 26w-HFD)과 당뇨를 유발하지 않은 네 종류의 대조군 생쥐들을 sodium pentobarbital로 마취시키고 심장채혈 후 희생시키고 복부피하지방조직(subcutaneous abdominal adi-pose tissue)등 실험 조직을 적출하였다. 적출한 각 생쥐의 지방조직 약 \( 300 \mathrm{mg} \) 을 RNeasy Lipid Tissue Mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. RNA추출 과정 중에 DNase I (RNase-free DNase set, Qiagen)를 처리하여 genomic DNA의 오염이 없는 순수 RNA만을 추출하였다. 각 total RNA시료 \( 500 \mathrm{ng} \) 을 High Capacity cDNAundefined 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 cDNA를 합성하였다.</p> <h2>Real-time PCR</h2> <p>TNF-a, MCP-1과 normalizing gene의 RNA transcript 발현량을 측정하기 위해 quantitative real-time PCR을 기존의 표준곡선 방식대로 수행하였다. 이를 위해 Mouse TaqMan Gene Expression Assays (assay ID: TNF-a Mm00443258_m1, MCP-1 Mm00441242_m1, Applied Biosystems)와 Real-Time PCR System 7500 (Applied Biosystems)을 사용하여 real-time PCR을 수행하였다. Normalizing gene으로 Mouse GAPDH Endogenous Control (Applied Biosystems, part # 4352932E)을 구입하여 사용하였다. 각각의 well에 \( 10 \mathrm{ng} \) 의 total RNA에 해당하는 cDNA를 포함하는 반응용액 \( 20 \mu l \) 에서 측정하였다. Real-time PCR 조건으로 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2분, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분 반응 후 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15초와 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분을 40회 반복하는 cycle로 수행하였다. 각각의 사이토카인 mRNA 발현량은 GAPDH mRNA 발현량으로 나눈 값을 임의적인 상대값(arbitrary val-ues)으로 표현하였다.</p> <h2>통계 분석</h2> <p>실험생쥐의 몸무게와 혈장 포도당 및 인슐린 농도와 사이토카인 유전자 발현량에 대한 실험 데이터는 평균과 표준편차(standard deviation, SD) 또는 평균과 표준오차(standard er-ror of means, SEM)로 결과를 나타내었고, student t-test로 유의성을 검정하였으며, 선형회귀분석(linear regression anal-ysis)을 통해 사이토카인 유전자 발현량과 혈장 인슐린량의 상관관계를 평가하였다. \( p<0.05 \) 인 것을 유의한 결과라 판단하였다.</p>