본 연구에서는 고정화 기술을 이용하여 리파아제 K80 효소를 고체 상태의 담체에 흡착시킨다. 이 효소는 수용성 형태일 때 정확한 활성을 측정할 수 있지만, 고정화된 상태에서는 활성이 낮게 측정될 수 있다. 그러나 이 기술은 CalB와 비교할 때, 더 빠른 시간 내에 높은 전환율을 보여주어 산업적 공정의 시간 및 비용을 절감하는 데 기여할 수 있다. K80 효소는 메탄올에 대해 높은 안정성을 보여, 바이오디젤 생산에 활용 가능함을 확인하였다. 이러한 고정화된 리파아제 K80는 바이오디젤 외에도 다른 산업 공정에서도 이용 가능성을 가진다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>리파아제 K80의 유기용매에 대한 특성</h2> <p>P. vulgaris 리파아제 K80의 경우, 가수분해반응의 비활성도(specific activity)가 2,000 U/mg으로 높은 활성을 가지는효소로 보고되었으며, 본 연구에서도 재조합 E. coli BL21(DE3)/pKLE 균체의 세포 추출액 중의 리파아제 활성이 평균 600 U/mL로 매우 높은 활성을 가지는 것으로 나타났다. 따라서 세포 추출액 중의 리파아제 K80의 농도는 300 mg/L이며, 배양액 1.8리터에 해당되는 균체를 1/50 부피인 36 mL에 현탁하고 세포추출액을 제조했기 때문에 리파아제의 생산량은 배양액 기준으로 6 mg/L인 것으로 밝혀졌다.</p> <p>높은 활성을 가지고 있는 리파아제 K80을 산업적 공정과정에 적용하기 위해 알코올류(메탄올, 에탄올, 1-프로판올, n-부탄올)에 대한 리파아제 K80의 안정성을 확인하였다(Fig.1). 다양한 농도의 알코올용액에 리파아제 K80을 넣고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 방치한 후, 원심분리를 통해 얻은 상등액의 리파아제 활성을 pNPC assay방법으로 측정하였다. 메탄올의 경우, 50%의 농도에서도 높은 활성을 유지하였으며, 60%이상의 농도에서 효소활성이 감소하였다. 에탄올의 경우, 40% 농도에서 높은 활성을 유지하였고 1-프로판올과 n-부탄올의 경우, 50%의 농도에서도 높은 활성을 유지하였다. 상업적으로 판매되는 Candida antarctica에서 유래한 리파아제인 CalB의 경우, 20% 메탄올의 농도에서 잔존활성이 50%이하로 떨어졌으며, 메탄올의 농도가 증가함에 따라 그 활성이 점차적으로 감소되는 것을 확인할 수 있다[23]. 따라서, P.vulgaris에서 유래한 리파아제 K80의 경우 알코올류에 대해 상대적으로 높은 안정성을 가지고 있음을 확인하였다.</p> <h2>다양한 알코올을 이용한 바이오디젤 합성반응</h2> <p>오일과 알코올의 몰비가 1:1이 되도록 올리브오일과 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, n-부탄올을 각각 섞고 리파아제 K80을 이용하여 바이오디젤 합성반응을 24시간 동안 진행하였다. 박층 크로마토그래피를 통해 반응 산물을 확인한 결과 (Fig. 2), 메탄올, 에탄올, 부탄올의 경우, 올리브유로부터 바이오디젤이 생성되었고, 1-프로판올의 경우, 바이오디젤이 거의 생성되지 않았다. n-부탄올을 사용하였을 때, 가장 많은 양의 바이오디젤이 생성되었으나, 메탄올이 다른 알코올류에 비해 가장 저렴하며, 바이오디젤 합성 반응에서 가장 많이 쓰이기 때문에 메탄올을 추가적인 연구에 사용하였다.</p> <h2>리파아제 K80을 이용한 바이오디젤 합성반응</h2> <p>현재 CalB는 바이오디젤 합성반응에 가장 많이 쓰이고 있는 상업용 효소로써 효과적으로 바이오디젤을 생산할 수 있으나 메탄올에 불안정한 특성을 가지고 있어 3 step-wise반응으로 바이오디젤 합성반응을 진행하고 있다.</p> <p>리파아제 K80을 이용하여 올리브오일과 메탄올을 바이오디젤로 전환시키는 반응을 수행하였다. CalB의 바이오디젤 합성반응과 동일하게 3-stepwise 반응을 진행하였다. 초기에 올리브오일과 메탄올의 몰비가 1:1로 혼합된 용액을 반응기질로 사용하였으며, 3시간, 6시간 후에 오일과 알코올의 최종 몰비가 1:2, 1:3으로 되도록 메탄올을 첨가(3step-wise)하고 총 9시간 동안 반응하였다(Fig. 3).</p> <p>TLC결과를 통해 반응시간이 진행될수록 올리브오일의 양이 감소하는 것과 바이오디젤의 양이 증가하는 것을 관찰할 수 있으며, 기체 크로마토그래피 분석을 통하여 바이오디젤 생성량이 최대 71%임을 확인했다(Fig. 3B). 분석 결과, 7시 간대에 71%의 바이오디젤이 생성되었으나 9시간대에 43%로 감소하였다. 이처럼, 6시간대에 메탄올을 첨가한 후 1시간 동안 바이오디젤의 생성량이 크게 증가하지만 그 뒤로 감소하는 것을 확인하였다. 이것은 리파아제 K80에 의해 생성된 바이오디젤이 효소의 가수분해반응에 의해 다시 지방산으로 전환되기 때문이라고 해석된다. 따라서 메탄올 첨가 후, 1시간 동안 반응을 진행하고 바이오디젤을 회수하는 것이 가장 효과적이라고 판단된다.</p> <h2>담체를 이용한 고정화 K80 제조</h2> <p>이번 연구에서 사용된 고정화 기술은 소수성 작용을 이용하여 고체 상태의 담체에 효소를 흡착시키는 방법이다. 본 연구실에 확보하고 있는 여러 미생물에서 유래한 리파아제에 대한 고정화 효율을 확인한 결과, 리파아제 K80이 가장 효과적으로 고정화되는 것을 확인하였다(Fig. 4). 리파아제 K80 효소액(단백질 100 mg, 0.5 M 황산암모늄용액)을 담체와 섞고 4시간 동안 진탕배양기에서 반응한다. 즉, 반응시간 0, 2, 4시간에 반응상등액의 리파아제 잔존활성을 pH stat방법으로 확인한 결과, 2시간 만에 고정화 효율은 91.8%에 도달했으며, 4시간 만에 고정화 효율이 98.2%로 나타났다(Table 1). 담체에 고정화된 K80을 건조시킨 뒤, 최종적으로 제조된 고정화 K80의 활성을 pH stat으로 측정한 결과, 246 U/g이었다. 이것을 기준으로 활성 유지율을 계산한 결과 4.17%를 나타내었다. 고정화 K80의 활성 유지율이 이처럼 낮은 이유는 효소가 담체에 고정되어있기 때문이다. 즉, 수용성 리파아제 K80의 경우, pH STAT 방법으로 정확한 효소의 활성을 측정할 수 있지만, 고정화 K80의 경우, 담체에 고정된 형태이기 때문에 올리브유 에멀젼과 균일상을 형성할 수 없어서 효소 활성이 실제보다 매우 낮게 나오는 것으로 해석된다.</p> <h2>고정화 K80을 이용한 바이오디젤 합성반응</h2> <p>고정화 K80을 이용하여 올리브오일과 메탄올을 바이오디젤로 전환시키는 반응을 수행하였다. 고정화 K80의 경우에도 앞서 기술한 리파아제 K80 효소액과 동일한 방법으로 실험을 진행하였다. 올리브오일과 메탄올의 몰비가 1:1로 혼합된 용액을 초기 반응기질로 사용하였다. 3시간, 6시간 후에 메탄올의 최종 몰비가 1:2, 1:3으로 되도록 첨가하였으며, 총 9시간을 반응하여 얻은 결과는 다음과 같다(Fig. 5).</p> <p>리파아제 K80과 동일하게 반응이 진행될수록 올리브오일의 양이 감소하는 것과 바이오디젤의 양이 증가하는 것을 TLC결과를 통해 확인할 수 있으며, 기체 크로마토그래피 분석을 통하여 최대 생성수율이 97%임을 알 수 있다. 고정화K80의 경우, 수용성 K80과 달리 반응 조건에서 수분함량이 매우 낮기 때문에 가수분해 반응보다 에스테르 교환반응 또는 에스테르화 반응이 빠르게 진행되어 바이오디젤 생성 수율이 높게 나타난 것으로 해석된다.</p> <p>CalB를 이용하여 바이오디젤 합성반응에서 동일한 3-stepwise반응을 수행한 선행연구에서 90%이상의 바이오디젤 전환율을 확인할 수 있다. 그러나 90%이상의 높은 바이오디젤 생성 수율을 얻기 위해 긴 반응시간을 필요로 하는 CalB와는 달리 고정화 K80의 경우, CalB를 이용한 바이오디젤 합성반응보다 빠른 시간 내에 높은 전환율을 보여줌으로써 산업 공정에서 반응시간을 단축시켜 비용을 절감할 수 있을 것으로 기대된다.</p> <h2>고정화 K80을 이용한 반응기질의 변화에 따른 바이오디젤 합성 반응</h2> <p>고정화 K80을 이용하여 올리브유, 팜유, 해바라기씨유, 콩기름, 청어유, 폐콩기름유, 폐식용유를 메탄올과 최종 몰비가 1:3이 되도록 각각 섞은 3-stepwise 반응을 진행시켰다. 9시간 동안 반응을 수행한 후 기체 크로마토그래피로 반응산물을 분석한 결과, 청어유를 제외한 나머지 오일에서 높은 바이오디젤 생성량을 확인 할 수 있었다(Fig. 6). 고정화 K80이 다양한 식물성 오일을 바이오디젤로 전환할 수 있음을 확인하였다. 다양한 오일의 성분표(Table 2)를 통해 팔미트산, 올레인산, 스테아린산, 리놀렌산을 다량 포함하고 있는 대부분의 식물성 오일을 바이오디젤 생산원료로 이용할 수 있음을 알 수 있다. 한편, 청어유에는 일반 식물성 오일에는 함유되지 않은 polyunsaturated fatty acid(PUFA, 오메가-3 지방산)이 다량 포함되어 있고 리파아제 K80의 경우에는 PUFA를 바이오디젤로 전환시키지 못하는 것으로 해석된다.</p> <p>결론적으로, 리파아제 K80은 다른 상업적 리파아제인 CalB 효소보다 메탄올에 대해 훨씬 높은 안정성을 가지고 있었으며, 이러한 특성을 이용하여 바이오디젤을 생산할 수 있음을 확인하였다. 또한 담체에 소수성 결합으로 흡착된 고정화된 K80을 이용하였을 때 바이오디젤을 효과적으로 생산할 수 있었다. 고정화 K80을 이용하여 다양한 종류의 오일을 바이오디젤로 전환할 수 있었다. 고정화된 리파아제 K80는 바이오디젤 생산뿐만 아니라 다른 산업적 공정에서도 활용할 수 있을 것으로 기대한다.</p>