본문은 TARvector 및 hookhook 제작과 Yeast spheroplasttrans formation에 대하여 다루고 있다. 본 실험에 사용된 TAR vector 4종류는 모두 radial vector이며, Universalhook으로는 인간게놈에서 사용될 때는 AluAlu 반복서열을 사용하였고, 마우스 게놈을 사용할 경우에는 B1 반복서열을 사용하여 Apal-Xhol 자리에 삽입하였다. 이어 Spheroplastcompetentcell을 제작하기 위해 50ml YPD 액체배지에 효모 균주를 접증한 후 30도 에서 하룻밤 배양하여, 20ml의 1M sorbitol로 혼탁하여 4도에서 30분간 방치하였다.
<h2>\(TAR vector \) 및 \(hook \) 제작</h2> <p>\(TAR cloning \)에 사용되는 기본 \(TAR vector \)는 \(pVC604 vector \)에 제한 효소 인식자리인 \(Multi-cloning site \)에 \(3'-unique hook \)으로 사용될 \(DNA \) 단편을 \(PCR \)로 증폭하여 \(BamH1-Xbal \) 자리에 삽입하였다. 본 실험에 사용된 \(TAR vector 4 \) 종류는 모두 radial vector로서 인간의 \( h H P R T \) 유전자 흑은 마우스의 \( m H P R T \) 의 \( 3 ^ {\prime } \) 염기서열을 지닌 \( 3 ^ {\prime } \) \(-hook \)으로 삽입되었다. 또한 \(5'-Universal hook \)으로는 인간게놈에서 사용될 때는 \(Alu \) 반복서열을 사용하였고, 마우스 게놈을 사용할 경우에는 \(B1 \) 반복서열을 사용하여 \(Apal-Xhol \) 자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 \(TAR vector \)를 \(TAR cloning \)에 사용할 때는 이들 \(vector \)를 제한효소 \( Eco \mathrm { RI } \) 으로 처리하여 직선상의 \(vector \)로 만들어 사용하였다.</p> <h2>\(Yeast spheroplast transformation \)</h2> <p>\(Spheroplast competent cell \)을 제작하기 위해 \( 50 \mathrm { ml } \) 의 \( \mathrm { YPD } \) 액체배지에 효모 균주를 접증한 후 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 하룻밤 배양하여, O.D \( \mathrm { D } _ { 60 } = 1.3 \sim 1.4 \) 에서 균주를 집균하고, \( 20 \mathrm { ml } \) 의 \( 1 \mathrm { M } \) sorbitol로 혼탁하여 \( 4 \mathrm { C } \) 에 \(30 \)분간 방치하였다. 현탁액을 \( 3000 \mathrm { rpm } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(5 \)분간 원심 분리하여 집균한 후, \( 20 \mathrm { ml } \)의 \(SPEM \)용액(1 M sorbitol, \( 10 \mathrm { mM } \) sodium-phosphate \( \mathrm { pH } 7.5 \) , \( 10 \mathrm { mM } \) disodium-phosphate \( \mathrm { pH } 7.5 \) , \( 0.5 \mathrm { M } \) \(EDTA) \)에 다시 현탁하였다. 현 탁핵에 \( 20 \mu l \)의 \(zymolyase \) \( (10 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \) (ICN Biomedicals, Inc. 20T)와 \( 40 \mu \) 의 \( 14 \mathrm { M } \) \(--mercaptoethanol \)을 넣고 잘 섞은 후, \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 약 \(20 \) 분간 \( 50 \mathrm { rpm } \)이하로 매우 느리게 진탕 배양하였다. 세포의 \(spheroplasts \) 정도를 조사하기 위해 현탁액을 \( 1 \mathrm { M } \) sorbitol과 \( 2 \% \) \(SDS \)에 \( 1 / 10 \) 로 넣어 \(O.D \) \( \mathrm { D } _ { 600 } \) 값을 측정 하여 \( 1 \mathrm { M } \) sorbitol/2 \% SDS 값이 \( 3 \sim 5 \) 배가 되도록 하였다. \(Zymolyase \) 처리가 끝난 세포를 \( 1500 \mathrm { rpm } \), \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(5 \) 분간 원심 분리하여 집균한 뒤 \( \beta \) \(-mercaptoethanol \)의 제거를 위해 \( 1 \mathrm { M } sorbitol \) 로 두 번 씻어주었다.</p>