항진균 감수성 검사는 CLSI M27-A3 미량희석법에 따라 배지의 혼탁도와 resazurin의 색 변화로 MIC를 결정하고, albicans 임상균주가 형성한 바이오필름 양은 XTT 환원분석법으로 측정한다. 초기 단계 바이오필름을 폴리스티렌 표면에 부착된 C. albicans로 형성하고, Calcofluor-White용액과 광학 현미경을 이용해 관찰한다. 또한, 단삼 에탄올추출물이 C. albicans의 germ tube 형성에 어떤 영향을 미치는지 광학 현미경으로 관찰한다. 마지막으로, 바이오필름 형성에 관여하는 유전자들의 mRNA 발현에 단삼의 영향을 qPCR 분석을 통해 파악한다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 배양조건</h2> <p>바이오필름 연구에 사용된 10개 C. albicans 균주는 캔디다증 환자로부터 분리한 것을 연세대학교 원주의과대학에서기증받았다. C. albicans SC5314 (ATCC MYA-2876TM)는 미국 American Type Culture Collection에서 구입하였다. C. albicans는 통상적으로 YM 배지(yeast extract 0.3%,malt extract 0.3%, peptone 0.5% and dextrose 1%)를 이용하여 37°C에서 배양하였다.</p> <h2>식물 추출물</h2> <p>단삼의 마른 뿌리를 70% 에탄올로 침출한 후 동결건조한추출물을 최종 농도 100 mg/ml로 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹인 후 -20°C의 암소에 보관하였고, 이를 단삼에탄올추출물이라고 표현하였다[12]. Positive control인amphotericin B (250 μg/ml)는 Sigma (USA)에서 구입하였으며, 실험 직전에 배지로 희석하여 사용하였다. 모든 실험의 대조군에는 실험군에 사용된 단삼 에탄올추출물의 양과동일한 양의 DMSO를 넣었다. 반응에 사용된 DMSO의 양은 최대 1% (v/v)로 1%까지는 DMSO가 C. albicans의 생존에 영향을 미치지 않았다.</p> <h2>항진균 감수성 검사</h2> <p>항진균 감수성 검사는 기본적으로 CLSI M27-A3 미량희석법에 따라 배지의 혼탁도를 기준으로 MIC를 결정하였고, 동시에 배지에 살아있는 세포 활동의 지표인 resazurin(Sigma)을 포함시켜 24시간 후 resazurin의 청색이 붉은 색으로 변하지 않는 최저농도를 MIC로 판단하여 데이터의 결과를 이중으로 검증하였다.</p> <h2>바이오필름의 정량</h2> <p>10개 C. albicans 임상균주가 형성한 바이오필름의 양은XTT (Sigma) 환원분석법으로 측정하였고[16], 바이오필름은 3시간 동안 형성된 초기 단계의 바이오필름(early stageof preformed biofilms)을 대상으로 실험을 진행하였다[17].YNB/glucose (yeast nitrogen base with 50 mM glucose)배지를 사용하여 각 C. albicans 임상균주를 1 × 10 7 cells/ml로 희석한 후, 0.2 ml의 cell suspension을 flat-bottom96-well polystyrene plate에 넣어 3시간 동안 37°C에서 배양하였다. 부유세포를 포함한 배지를 제거한 후 PBS(phosphate buffered saline, Invitrogen)로 2회 헹구어 초기단계 바이오필름을 준비하였다. 여기에 단삼 에탄올추출물(0, 39 μg/ml and 78 μg/ml)이 들어 있는 YNB/glucose(0.2 ml)를 넣고 37°C에서 16시간 동안 추가로 배양하여 단삼이 바이오필름 성장에 미치는 영향을 보고자 하였다. 부유세포를 제거하고 PBS로 헹군 후 발달된 바이오필름의 양을XTT 환원분석법을 시행하여 정량하였다. 실험은 각 샘플당5배수로 진행하였고 각 실험당 단삼 에탄올추출물을 넣지 않은 대조군을 100으로 하여 바이오필름 활성의 억제율을 %로 표현하였다.</p> <h2>단삼이 C. albicans의 폴리스티렌 표면부착(adhesion)에 미치는 영향</h2> <p>C. albicans SC5314 배양액을 YNB/glucose 액체배지를사용하여 5 × 106 cells/ml로 희석한 cell suspension을 flat-bottom 96-well polystyrene plate에 넣고, 최종 농도 0,39 μg/ml 또는 78 μg/ml의 단삼 에탄올추출물을 첨가한 후37°C에서 3시간 배양하여 캔디다 바이오필름이 발달하도록하였다. 바닥에 부착되지 않은 부유세포와 배지를 제거하고PBS로 헹군 후 40 μl PBS를 넣어 inverted microscope로관찰하였다. 폴리스티렌 표면에 부착된 C. albicans의 입체적인 형태를 관찰하기 위해 5 μl의 0.05% Calcofluor-White용액(Sigma)을 추가적으로 well에 넣은 후 invertedepifluorescence microscope를 이용하여 자외선하에서 400배로 관찰하였다.</p> <h2>단삼이 C. albicans의 germ tube 형성에 미치는 효과</h2> <p>C. albicans SC5314 배양액을 10% FBS (fetal bovineserum)를 포함하는 RPMI 1640 배지를 이용하여 5 × 106cells/ml로 희석한 cell suspension을 flat-bottom 96-wellpolystyrene plate에 넣었다. 각 well에 최종 농도 0, 39 μg/μl 또는 195 μg/ml 단삼 에탄올추출물을 넣은 후 3시간 동안 37°C에서 배양하여, C. albicans가 germ tube를 형성하는 데 단삼 에탄올추출물이 어떤 영향을 미치는지 invertedmicroscope을 이용하여 200배로 관찰하였다.</p> <h2>C. albicans의 바이오필름 관련 유전자에 대한 qPCR(Quantitative real-time PCR) 분석</h2> <p>단삼이 바이오필름 형성에 관여하는 유전자들의 mRNA발현에 미치는 영향을 분석하기 위해 qPCR 분석을 하였고,Lee and Kim의 논문에 기술한 것과 동일한 PCR primer와방법을 사용하였다[17]. 간단하게 기술하면, 6 well plate에서 RPMI 1640 배지내의 C. albicans SC5314가 37°C에서4시간 동안 바이오필름을 형성하게 한 후, 부유세포를 제거하고 PBS wash를 통해 초기단계 바이오필름을 준비하였다. 그 후 바이오필름에 0 또는 39 μg/ml 단삼 에탄올추출물을 처리하여 37°C에서 90분간 배양하였다. 다음으로 각 바이오필름에서 total RNA를 분리한 후 cDNA를 합성하였고, 바이오필름과 관련된 EAP1, HWP1, ALS1, ALS3, ECE1 유전자에 대한 forward and reverse primers를 넣어 DNA를증폭시켰다. 각 유전자의 fold regulation은 ACT1 Ct를 기준으로 comparative Ct method를 사용하여 계산하였고,DMSO를 처리한 solvent control을 Ct 값을 결정하는reference 값으로 데이터를 분석하였다. 각 유전자 발현에 대한 표준편차(standard deviation, SD)와 그룹간의 차이는Sigma plot 13.0 의 Student's t-test를 사용하였고, 결과는 p< 0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.</p>