재조합단백질의 정제는 C-말단의 His-tag를 이용하여 수행되었고, 난황항체는 산란계의 면역을 통해 실시되었다. 채란한 알로부터 분리한 난황항체를 이용하여 리파아제 활성 및 임상시험을 실시하였다.
<h2>재조합 단백질의 정제 및 분석</h2> <p>재조합 단백질의 C-말단에 연결된 His-tag를 이용하여 효소 정제를 수행하였다. Ni-NTA 컬럼(QIAGEN Inc., Valencia, CA)를 \( 50 \mathrm{mM} \) 이미다졸(imidazole)이 포함된 염화나트륨(300 \( \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}) \), 인산나트륨 \( \left(50 \mathrm{mM}, \mathrm{pH} 8.0, \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\right) \) 완충용액으로 평형화한 후, 세포추출액을 주입하고 동일용액으로 씻어준다. 이후에 \( 200 \mathrm{mM} \) 이미다졸이 포함된 용액을 사용하여 컬럼에 결합되어 있는 재조합 단백질을 용출한다.</p> <p>단백질 농도는 소 혈청알부민을 표준단백질로 사용하여 Bradford protein assay kit(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 이용하여 측정하였다.</p> <p>SDS-PAGE 전기영동은 \( 12 \% \)의 아크릴아미드 겔과 트리스-글리신 용액(Tris-glycine buffer, \( 1.5 \mathrm{M}, \mathrm{pH} \) 8.8)을 사용하여 수행하였다. 세포추출액과 침전물현탁액을 각각 \( 20 \mu \mathrm{L} \)씩 사용하여 전기영동을 수행하였고 염색시약은 Coomassie Brilliant Blue를 사용하였다.</p> <h2>산란계 면역</h2> <p>난황항체를 생산하기 위해 28주령의 ISA-brown계통 산란계에 면역을 실시하였다. 대장균에서 생산된 리파아제 전체 단백질, 촉매활성도메인, 코리파아제 결합도메인을 각각 100\( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도가 되도록 PBS(phosphate buffered saline)로 희석한 후, Freund's complete adjuvant(Sigma-aldrich Inc. St. Louis, MO)와 동량으로 혼합/유화하여 면역원을 제조하였다. 유화액 \( 1 \mathrm{~mL} \)을 산란계의 흥근에 \( 0.25 \mathrm{~mL} \)씩 4곳에 근육주사 하였으며, 추가접종은 1차 접종 후, 2주 간격으로 Freund's incomplete adjuvant(Sigma-aldrich Inc. St. Louis, MO)로 유화하여 1차 접종과 동일한 방법으로 총 2회 실시 하였다. 3차 면역 후, 산란계의 익하정맥에서 채혈을 실시하여 혈청을 분리였으며, 면역란은 매일 채란하여 \( 8^{\circ} \mathrm{C} \) 저온실에 저장하였다.</p> <h2>난황항체 분리</h2> <p>면역한 산란계로부터 채란한 알로부터 수용성 난황항체(water soluble IgY fraction, WSF)를 분리하였다. 면역란의 난황을 분리하여 증류수로 10배 희석하여 \( \mathrm{pH} 5.0 \)으로 조절한 다음 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 동결 및 실온에서 해동시킨 후, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 분간 원심분리 \( (10,000 \times \mathrm{g}) \)하여 상층액을 회수하여 여과 및 동결건조하였다.</p> <h2>면역원성 시험 및 난황항체가 확인</h2> <p>재조합 단백질항원들을 면역하여 얻은 수용성 난황항체 분말에 대한 면역원성과 항체가를 측정하기 위해 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)를 실시하였다. MicrotestIII flexible assay plate(Falcon 3911, BD Biosciences)에 세 종류의 항원들과 각종 미생물의 항원(Salmonella typhymurium, Helicobacter pylori, E. coli K88, recombinant human rotavirus)을 탄산염-중탄산옆 용액(carbonate-bicar-bonate buffer, \( \mathrm{pH} \) 9.6)으로 \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)이 되도록 희석한 후, 각각 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 씩 분주하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 18시간 동안 코팅하였다. PBST 용액 \( \left(0.02 \mathrm{M} \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 0.13 \mathrm{M} \mathrm{NaCl}, 0.05 \%\right. \) Tween 20, \(\mathrm{pH} 7.2 \) )으로 세척한 후, \( 3 \%\) BSA 용액(bovine serum albumin, PBS, \(\mathrm{pH} 7.3 \) )을 각각 \( 175 \mu \mathrm{L} \)씩 분주하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 동안 블로킹하였다. \( 3 \%\) BSA/PBS 용액과 세척용액을 동량으로 섞은 희석용액을 이용하여 비면역 난황항체와 상기에서 획득한 수용성 난황항체를 단계별로 희석하여 각각 분주한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 동안 반응시켰다. 2차 항체로는 alkaline phosphatase conjugated rabbit anti-chicken IgG를 5,000배 희석하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 동안 반응시켰다. 각 반응 종로 시, 세척용액으로 플레이트를 5회 세척하였다. 기질용액으로는 p-니트로페닐인산(p-nitrophenyl phosphate)를 녹인 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 염화마그네숨이 포함된 \( 10 \% \) 디에칠아민 \( \left(\mathrm{pH} \mathrm{9.8)}\right. \) 용액을 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20분 동안 반응을 수행 하였다. 5\( \mathrm{M} \) 수산화나트륨을 사용하여 반응을 정지시킨 후, ELISA reader(EL-800, BIO-TEK Instrument Inc.)를 이 용하여 \( 405 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.</p> <h2>리파아제 활성 저해 시험</h2> <p>생산된 난황항체에 의한 리파아제의 활성 저해 효과를 알아보기 위해 합성기질인 p-nitrophenyl caproate \( \left(\mathrm{pNPC}, \mathrm{C}_{6}\right) \)을 이용한 리파아제의 활성을 측정하였다. 음성 대조군으로 비면역 수용성 난황항체와 돼지 췌장 리파아제에 대한 수용성 난황항체를 사용하였다. \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 농도로 희석한 각 난황항체와 \( 3 \mathrm{U} / \mathrm{mL} \)의 돼지췌장 리파제(Sigma-aldrich Inc. St. Louis, MO)를 동량 혼합한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응하여 반응액으로 사용하였다. 합성기질을 사용한 효소의 활성 측정을 다음과 같이 수행하였다, 기질 혼합액은 \( 10 \mathrm{mM}\) pNPC와 에탄올 및 \( 50 \mathrm{mM} \) 트리스-염산 용액(Tris-\( \mathrm{HCl}, \mathrm{pH} 8.0 \) )을 10:40:950의 부피 비율로 섞어 총 \( 1 \mathrm{~mL} \)을 사용하였다. 이 혼합액에 반응액 \( 5 \mu \mathrm{L} \)를 혼합하여 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 반응시키고 효소반응에 의해서 생성된 p-니트로페놀의 양을 분광광 도계로 \( 405 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 측정한 흡광도 값은 p-니트로페놀의 양과 시간으로 환산하여 \( \mathrm{U} / \mathrm{mL} \)로 단위 환산하였다.</p> <h2>임상시험</h2> <p>임상시험을 실시하기 위해 7주령의 수컷 Sprague-Dawley (SD) rat 14 마리를 공시하여 임상시험을 실시하였다. 케이지에 개체별로 분리하여 사육하였다. 리파아제 저해 활성 시험결과에 따라 선별된 코리파아제 결합도메인에 대한 수용성 난황항체 (처리군)와 비면역 수용성 난황항체(대조군)를 \( 0.5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 농도가 되도록 콘오일, 콜레스테롤올레산염, 콜산(cholic acid)에 용해시켜 지방용액을 제조하여 \( 1 \mathrm{~mL} \)씩 경구 투여하였다. 경구 투여 후, 2 시간 간격으로 안와정맥에서 채혈을 실시하여 혈청 분리 후, 중성지방산, 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤을 측정하여 지방의 장관흡수 억제효과를 측정하였다.</p>