실험에서 사용한 동물은 수컷 생쥐였으며, 그룹 당 8마리씩 고지방 식이 그룹과 일반 식이 그룹으로 나누었으며, 고지방 식이 그룹의 비만 유도는 고지방 식이 사료(\(45\%\) fat, rodent diet with high fat, # D12451)를 이용하여 5주간 진행하였다. 이 후 생쥐로부터 주사기로 복강세포를 수확하였으며, 대식세포의 식균 작용 측정을 위해 유세포 분석기(FACS Caliber Flow Cytometry; Becton dickinson, San Jose, USA)를 이용하였다. 실험에서 고지방 식이군과 일반 식이군의 체중, 대식세포의 식균작용, 산화질소와 사이토카인 생성량에 대한 분석은 독립 t 검증법으로 진행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험동물</h2> <p>실험동물은 4 주령의 C57BL/6 종으로 수컷 생쥐 총 16 마리를 (주)오리엔트바이오에서 분양 받아 그룹당 8 마리씩 고지방 식이 그룹과 일반 식이 그룹으로 배치하였다. 실험 동물의 사육 환경은 평균 온도 \( 22 \pm 2^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 50 \pm 5 \% \) 의 조건으로, 주◦야 순환은 12 시간(06:00-18:00 주간시간) 주기로 유지하였으며, 한 케이지 당 4 마리씩 사육하였고 사료와 물은 충분히 공급하였다. 실험동물의 취급은 실험동물윤리위원회에 계획서를 제출하고 승인받았으며(승인번호 CNU-00202), 위원회의 동물 실험 취급 규정에 따라 사육하고 실험하였다.</p> <h2>비만유도 및 식이 처치</h2> <p>비만의 유도는 선행연구(Shapiro 등)에 따라 고지방 식이 사료(\(45\%\) fat, rodent diet with high fat, # D12451)를 이용하여 5 주간 고지방 식이를 자유섭취토록 하였다. 일반식이집단은 일반사료(\(15\%\) fat)를 제공하였고, 섭취한 사료의 양은 매일 기록하였으며, 생쥐별 1 일 섭취량은 제한하지 않았다.</p> <h2>복강 대식세포 분리 및 배양</h2> <p>희생 3일전 마우스 복강에 \(3\%\) thioglycollate (DIFCO, Detroit, USA) \( 2 \mathrm{ml} \) 를 복강에 주사하여 대식세포를 유도하였다. 마우스를 경추탈골법에 의해 희생시키고 \( 5 \mathrm{ml} \) 주사기 (Greenject-5, Doo Won Co., Korea)를 이용하여 복강에 \( 5 \mathrm{ml} \) 의 RPMI 1640 (GIBCO, USA) 배지를 주입하고 2 3분간 부드럽게 마사지한 후 \( 5 \mathrm{ml} \) 주사기로 복강세포를 수확하는 것을 3회 반복하여 약 10-15 ml의 복강세포를 추출하였다. 회수한 복강 세포는 tryphan blue dye를 이용하여 세포수를 확인한 후, \( 1 \times 10^{6} \) cells \( / \mathrm{ml} \) 농도로 희석하여, 세포액 \( 1 \mathrm{ml} \) 을 24 well plate (NUNC, Denmark)에 분주하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 세포 배양기에서 2 시간 배양 후 항생제와 FBS가 함유된 배지를 교환하면서 비부착 세포를 제거하였다.</p> <p>복강에서 수집된 세포에서 대식세포의 비율을 확인하기 위해 수집된 복강 세포를 \( 1 \times 10^{6} \) cells을 두 개의 \( 15 \mathrm{ml} \) tube에 \( 5 \times 10^{5} \) cells로 나누어 대식세포의 특이적 세포 표면 단백질인 CD11b antibody (BD Biosciences, San Diego, CA) 1 μ1l를 한 개의 튜브에만 섞어 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 배양 후 유세포 분석기 (FACS Caliber Flow Cytometry; Becton dickinson, San Jose, USA) 를 이용하여 측정하였다.</p> <h2>식균작용 측정</h2> <p>대식세포의 식균 작용을 측정하기 위하여 \( 1 \times 10^{6} \) cells \( / 150 \) \( \mu 1 \) 농도로 \( 1 \mathrm{ml} \) 튜브에 두 개를 만들어 dextran (MW 70,000, Sigma, USA) 를 처치한 후 통제군은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서, 처치군은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 2 시간 배양 후 남아있는 FITC(fluorescein isothiocyanate)를 씻어내고 유세포 분석기(FACS Caliber Flow Cytometry; Becton dickinson, San Jose, USA)로 측정하였다. 식균지수(phagocytosis index)는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 로 배양한 결과로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 로 배양한 평균값을 나누어 수치화하였다.</p> <h2>산화질소(nitric oxide)와 사이토카인(cytokine) 측정</h2> <p>분주한 대식세포 \( \left(1 \times 10^{6}\right. \) cells/well)에 대식세포 자극제인 lipopolysaccharide (LPS, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)를 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도로 처치한 후 24 시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) in-cubator에서 배양한 후 상등액을 이용하여 측정하였다. 산화질소는 Griess assay를 이용하였고, 사이토카인(IL-13, IL-12, IFN- \( \gamma, \mathrm{TNF}-\mathrm{a}) \) 은 ELISA assay kit (eBioscience, USA)를 이용하여 측정하였다.</p> <h2>자료처리</h2> <p>모든 자료는 SPSS의 통계 package를 이용하여 각 그룹별 측정항목에 대한 평균 및 표준오차를 산출하였다. 고지방식이군과 일반식이군의 체중과 대식세포의 식균작용 그리고 산화질소와 사이토카인 생성량에 대한 항목별 유의차 분석은 독립 t 검증법(independent t-test)으로 검증하였으며, 모든 통계적 유의수준은 \( a=0.05 \) 를 기준으로 하였다.</p>