본 논문에서는 세포독성 측정을 위해 Park의 방법을 변형한 MTT assay를 사용하였다. 또한 \( 1 \times 10^{6} \mathrm{cells} / \mathrm{ml} \) 의 농도로 RAW \( 264.7 \) 세포를 96-well plate에 준비하고 20 시간 전 배양하여 농도별로 \( (0.1,1,10,50,100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \mathrm{COHEE} \) 를 첨가한 후 배양하였다. Nitric oxide 분비량 측정을 위해서는 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess 반응을 측정하였다. cytokine의 분비량을 측정을 위해서는 RAW \( 264.7 \) cell의 세포배양액 내의 TNF- \( \alpha \), IL-6 및 IL-1 \( \beta \)를 ELISA kit를 이용하여 실험하였다. 마지막으로는 세포질 내에서 만들어지는 COX-2 와 iNOS, \( \mathrm{NF}-\kappa B \) \( \mathrm{p} 65 \) 의 발현량에 COHEE가 미치는 영향을 알아보았다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>부산 청사포에서 2014년도에 채취한 진두발은 담수로 수 회 깨끗하게 수세한 후 자연건조 하였다. 그 후 동결 건조하여 분말화 하였으며 진공 포장상태로 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 저장하며 실험에 사용하였다.</p> <h2>진두발 에탄올 추출물 제조</h2> <p>분말상태의 진두발에 10 배양의 \( 95 \% \) ethanol을 가한 후 교반기(H-0820, Dongwon Science Co., Korea)를 이용하여 24 시간 실온에서 추출하였다. 원심분리기(UNION \( 32 \mathrm{R} \), Hanil Co., Korea)로 추출물로부터 상층액을 취하였다. 남은 잔사는 동일한 방법으로 2 회 반복하여 추출하였고 상층액은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 감압농축기(RE200, Yamoto Co., Japan)로 농축하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 건조시킨 후, \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하며 실험에 사용하였다. 에탄올 추출물의 총 폴리페놀, flavone 및 flavanone의 함량은 각각 \( 1.65 \pm 0.13 \%, 0.05 \pm 0.00 \%, 0.93 \pm 0.00 \% \) 이였다(data not shown).</p> <h2>세포배양</h2> <p>한국세포주은행(KCLB 40071, Korea)에서 cell line으로서 murine의 대식세포주인 RAW \( 264.7 \) 세포를 분양 받아 사용하였으며, Dulbecco's Modified Eagle Medium (GIBCO,USA)에 \( 10 \% \) inactivated fetal bovine serum (FBS)과 1\% penicillin-streptomycin을 첨가한 배지를 배양액으로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 배양하였다.</p> <h2>세포독성 측정</h2> <p>Park 등 [30]의 방법을 약간 변형해 MTT assay를 실시하여 시료의 세포독성을 평가하였다. \( 1 \times 10^{6} \mathrm{cells} / \mathrm{ml} \) 의 농도로 RAW \( 264.7 \) 세포를 96-well plate에 분주하고 20 시간 전 배양하여 농도별로 \( (0.1,1,10,50,100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \mathrm{COHEE} \) 를 첨가한 후 22 시간 본 배양하였다. \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) MTT (thiazolyl blue tetrazolium bromide, Sigma-Aldrich Chemical Co., USA) 용액을 첨가하고 2 시간 재 배양하였다. 이를 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 2,000 \) \( \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심분리하여 상층액을 걷어내고 dimethyl sulfoxide \( 100 \mu \mathrm{l} \) 분주하여 생성된 formazan을 녹여내 microplate reader (Model 550, Bio-Rad, USA)를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 세포 증식능은 다음 식에 의해 계산하였다.</p> <p>Proliferation index (\%) = Sample 흡광도 / Control 흡광도 \( \times 100 \)</p> <h2>Nitric oxide 분비량 측정</h2> <p>배양액 내의 nitrite 농도를 측정하기 위해 Griess 반응을 이용하였다. \( 2.5 \times 10^{5} \mathrm{cells} / \mathrm{ml} \) 로 조절한 RAW \( 264.7 \) cell을 24 well plate에 접종하고 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator (MCO-\( 15 \mathrm{AC} \), Sanyo, Japan)에서 20 시간 전 배양하였다. 그 후 \( \mathrm{COHEE} \) 를 \( 0.1,1,10,50,100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 처리하고 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 LPS로 자극하여 24 시간 본 배양하였다. 이를 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 2,000 \) \( \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심분리하여 상층액을 얻어 정량 실험에 사용하였다. 상층액은 Griess 시약( \( 1 \% \) sulfanilamide \( +0.1 \% \)naphthylendiamine dihydrochloride, \( 1: 1 \) 과 배양액을 \( 1: 1 \)로 상온에서 10 분간 반응시켜 microplate reader를 이용해 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양액 내 NO의 농도는 sodium nitrite \( \left(\mathrm{NaNO}_{2}\right) \) 의 농도별 표준곡선과 비교하여 산출하였다.</p> <h2>Pro-inflammatory cytokines 분비량 측정</h2> <p>ELISA kit (Mouse ELISA set, BD Bioscience, USA)를 이용하여 RAW \( 264.7 \) cell의 세포배양액 내의 TNF- \( \alpha \), IL-6 및 IL-1 \( \beta \) cytokine의 분비량을 측정하였다. 세포배양액을 얻기 위해 RAW \( 264.7 \) cell을 \( 2.5 \times 10^{5} \mathrm{cells} / \mathrm{ml} \) 로 조절하여 24 well plate에 접종하고 18 시간 전 배양하였다. 그 후 \( 0.1,1 \), \( 10,50,100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도별 COHEE와 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 LPS를 처리하고 12 시간의 본배양을 거쳐 원심분리를 통해 상층액을 얻었다. ELISA는 microplate에 capture antibody로 anti-mouse TNF- \( \alpha \), IL-6 및 IL-1 \( \beta \) 를 분주하여 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 하룻밤 동안 coating시켰다. 이후 \( 0.05 \% \) Tween 20 이 포함된 PBST로 세척한 후 \( 10 \% \) FBS 용액으로 blocking 하였고 PBST로 세척한 뒤 각 microplate well에 세포 배양 상층액을 분주하고 실온에서 2 시간 반응시켰다. 반응 후 PBST로 세척하고 희석한 biotinylated anti-mouse TNF- \( \alpha \), IL-6 detection antibody와 streptavidin-horseradish peroxydase conjugate undefined biotinylated anti-mouse IL-1 \( \beta \) detection antibody를 첨가하고 1 시간 반응 후, streptavidin-horseradish peroxidase conjugate를 첨가하여 30 분 반응시켰다. 반응 후 이를 다시 PBST로 세척하고 OPD 용액을 첨가하여 실온에서 30 분 농안 암반응시켰다. \( 2 \mathrm{~N} \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 로 반응을 종료시킨 후 microplate reader를 이용하여 \( 490 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정 하였다.</p> <h2>iNOS, COX-2 및 NF-KB p65 발현량 측정</h2> <p>COHEE가 세포질 내 생성되는 iNOS, COX-2 및 \( \mathrm{NF}-\kappa B \) \( \mathrm{p} 65 \) 의 발현량에 미치는 영향을 알아보기 위하여 RAW \( 264.7 \) 세포를 배양하였다. 배양이 끝난 세포를 수집하여 3 회 PBS (phosphate buffered saline)로 세척한 후, Sheeba와 Asha [34]의 방법에 따라 cytosol lysis buffer [50 mM HEPES (pH 7.4), \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 5 \mathrm{mM} \) EDTA, 1\% deoxycholate, \( 5 \mathrm{mM} \) phenylmethylsulfonyl fluoride, \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) aprotinin, \( 1 \% \) Triton \( \mathrm{X}-100,0.1 \% \mathrm{NP}-40 \) ]를 첨가하여 30 분간 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 lysis 시킨 후, \( 15,520 \times \mathrm{g} \) 에서 20 분간 원심분리 하여 세포막 성분 등을 제거하였다. BCA protein assay kit (Pierce, USA)를 사용하여 단백질을 정량하였으겨 \( 30 \mu \mathrm{l} \) 의 lysate를 Laemmli [20]의 방법을 사용하여 \( 10 \% \) SDS-PAGE로 분리하였다. 분리된 단백질은 Towbin 등 의 방법을 참고하여 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane (Bio-Rad)에 1 시간 동안 전사시켜 \( 5 \% \) skim milk가 포함된 TBSS (tris buffered saline, pH 7.5) 용액으로 상온에서 2 시간 동안 blocking 하였다. iNOS, COX-2 및 NF-кB의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS, COX-2 및 NF-кB p65 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., USA)를 사용하여 \( 1: 500 \) 으로 희석하고 상온에서 2 시간 반응시킨 후 TBSS로 3 회 세정하였다. 2 차 항체로 HRP (horseradish peroxydase)가 결합된 anti-mouse \( \operatorname{IgG} \) 및 anti-rabbit \( \operatorname{IgG} \) 를 1:2,000으로 희석하여 상온에서 1 시간 반응시킨 후, TBSS로 3회 세정하여 ECL 기질과 \( 1-3 \) 분간 반응 후 각각의 단백질 밴드는 Gene tool (GeneGnome5, Syngene, UK)을 이용하여 가시화 하였다.</p>