본 연구에서는 일반경작지토양에서 B. subtilis AH18을 확인하기위해 토양에서 DNA를 각각 분리하여 PCR 및 multiplex PCR을 진행하였다. 진행 결과 B. subtilis AH18을 투여한 토양에서만 B. subtilis AH18의 각각의 특정 고유유전자 band를 확인할 수 있었고, 이는 B. subtilis AH18에 대한 primers들을 이용해 PCR 및 multiplex PCR을 하면 타 유사 토양미생물과 구분하여 B. subtilis AH18의 존재를 확인할 수 있음을 의미한다. 한편, subtilis AH18의 민감성 또한 분석했는데, \( 1.8 \pm 0.3 \times 10^{5} \mathrm{cfu} / \mathrm{g} \) 이상 존재시 monitoring이 가능함을 알 수 있었다. 다음으로 B. subtilis AH18 우점기간 확인 결과 \(3\)주 간격으로 미생물제제의 처리 시 식물성장촉진능과 생물방제능 유지가 가능할 것으로 추측하였다.
<h2>미 살균 일반경작지 토양에서의 B. subtilis AH18의 확인 및 민감성 확인</h2><p>일반경작지토양에는 많은 종류의 미생물들이 존재하며 그 중에서 특정 유전자를 소유하고 있는 B. subtilis AH18을 확인하기위해 토양에서 DNA를 각각 분리하여 PCR 및 multiplex PCR을 수행하였다. 그 결과 B. subtilis AH18을 투여한 토양에서만 B. subtilis AH18의 각각의 특정 고유유전자 band만 확인할 수 있었다(data not shown). 그리하여 multiplex PCR 실시결과 B. subtilis AH18을 투여한 토양에서는 3종의 특정 고유유전자의 triple band가 확인되었고, 균주를 투여하지 않은 토양에서는 primer dimer만 관찰되었다. 이는 B. subtilis AH18을 투여 후 7일이 지난 후에도 토양내에서 사멸되지 않고 존재함을 의미하여, 3종의 primers들을 이용해 PCR 및 multiplex PCR을 하면 타 유사 토양미생물과 구분하여 B. subtilis AH18의 존재를 확인할 수 있었다. 이 방법은 향후 경작지 토양내에서 생물방제를 위해 처리된 미생물제제의 존재유무와 토양내 우점능력을 확인하는데 널리 활용될 것으로 사료된다.</p><p>또한 토양내에서 B. subtilis AH18의 민감성 확인을 위하여 PCR 및 multiplex PCR 수행 결과, 두 PCR 모두 동일하게 B. subtilis AH18가 토양내 \( 1.8 \pm 0.3 \times 10^{5} \mathrm{cfu} / \mathrm{g} \) 이상 존재시 monitoring이 가능하였다. 이는 지금까지 보고된 토양내 rhizobacteria의 \( 10^{5} \mathrm{cfu} / \mathrm{g} \) of root 농도 이상이 존재시 유도저항성 및 방제능을 나타낸다는 보고처럼, 본 균주의 PCR 및 multiplex PCR을 통한 monitoring 농도가 \( 10^{5} \mathrm{cfu} / \mathrm{g} \) 임을 생각할 때, 위의 primers를 이용한 monitoring 방법을 이용하면 경작지 토양내에서 유효농도의 미생물제제를 monitoring 할 수 있는 새로운 방법이라고 생각한다.</p><h2>고추가 이식된 토양 내에서 B. subtilis AH18의 분포확인 및 우점기간 확인</h2><p>고추 식물체의 endophytic과 rhizosphere, 그리고 nonrhizosphere에서 DNA를 분리하여 PCR 및 multiplex-PCR를 수행하였다. 그 결과 rhizosphere와 non-rhizosphere에서 우점한 B. subtilis AH18의 triple band는 뚜렷이 확인할 수 있었지만, non-rhizosphere에서는 triple band 이외에 여러 다른 band도 확인할 수 있었다. 이는 토양 내 수많은 미생물들의 존재를 나타내고 있으며 non-rhizosphere에서는 B. subtilis AH18이 우점을 하지 못하고 있는 것으로 사료된다. 즉, B. subtilis AH18은 식물체의 rhizosphere와 non-rhizosphere에서 모두 triple band를 확인할 수 있으며, 이는 B. subtilis 종들의 토양내에 널리 분포한다는 보고와 동일하였다. 또한 B. subtilis AH18의 처리 기간별 monitoring을 위해 PCR 및 multiplex PCR 결과, 3주동안은 토양내에서 유효미생물제제 농도인 \( 10^{5} \mathrm{cfu} / \mathrm{g} \) 이상이 확인됨으로 영양형 세포 이외에 포자형으로 변형된 세포수까지 감안한다면 충분한 밀도 이상으로 3주 이상 토양내 우점할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 균주를 이용해서 미생물제제를 개발 사용한다면 영양형 세포의 기준으로 3주 간격으로 미생물제제의 처리 시 식물성장촉진능과 생물방제능을 유지 할 수 있을 것으로 사료된다.</p>