본 연구의 실험재료로 B16F10 mouse melanoma cell을 사용하였고 mitochondrial reductase에 의하여 보라색의 MTT formazan을 형성하는 원리를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 이후 회수한 세포는 buffer로 처리하고 lysis한 뒤 원심 분리과정을 거쳐 pellet을 회수하여 흡광도를 측정하여 멜라닌 함량을 조사하였다.
<h2>실험 재료 및 세포 배양</h2> <p>본 연구에 사용된 B16F10 mouse melanoma cell은 American type cell culture (ATCC, Manassas, VA, USA) 으로부터 분양받았으며 배양에는 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS, welgene, Gyeongsan, Korea)와 \( 100 ~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) penicillin, \( 100 ~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) streptomycin 이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Welgene)을 사용하였다. 세포는 \( 37{ }^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 3일을 주기로 계대 배양을 실시하여 안정화 한 뒤 실험에 사용하였으며 세포의 자극에 사용된 \( \alpha \)-MSH은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.</p> <h2>세포 독성 측정</h2> <p>Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT)는 살아있는 세포의 미토콘드리아에서 mitochondrial reductase에 의하여 보라색의 MTT formazan (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)을 형성하는 원리를 이용하여 세포의 생존율을 측정하는 방법이다. 본 연구에서는 Luteolin 및 Luteolin 유도체가 \( \alpha \)-MSH로 자극된 B16F10 mouse melanoma cell의 생존에 미치는 영향을 조사하고자 세포를 24-well plate에 \( 1.0 \times 10^{4} \mathrm{cells} / \mathrm{well} \) 농도로 분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24시간 동안 전 배양한 뒤 \( \alpha \)-MSH (\( 200 ~ \mathrm{nM} \))와 시료(\( 50, 100, 200 ~ \mu \mathrm{M} \))를 동시에 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 이후 각 well에 MTT 시약을 첨가한 뒤 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 3시간 동안 반응하여 formazan blue를 형성시킨 다음 ELISA reader (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Melanin contents 측정</h2> <p>\( \alpha \)-MSH로 자극된 B16F10 mouse melanoma cell에서 Luteolin 유도체가 melanin의 합성에 미치는 영향을 조사하고자 B16F10 mouse melanoma celle를 6-well plate에 \( 4.0 \times 10^{4} \mathrm{cells} / \mathrm{well} \) 농도로 분주하여 incubator (\(37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \))에서 24시간 동안 전 배양 한 후 \( \alpha \)-MSH (\( 200 ~ \mathrm{nM} \))와 시료(\( 50, 100, 200 ~ \mu \mathrm{M} \))를 동시 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 이후 회수한 세포는 radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA buffer, with \( 1 \% \) protease inhibitor, \( 1 ~ \mathrm{mM} \) PMSF, \( 1 ~ \mathrm{mM} \) \( \mathrm{NaVO}_{4} \))로 처리하여 lysis한 뒤 원심 분리(\( 13,000 ~ \mathrm{rpm} \), \( 30 \mathrm{~min} \), \( 4^{\circ} \mathrm{C} \))과정을 거쳐 pellet을 회수하였으며 회수한 pellet은 \( 1 \mathrm{~N} \) \( \mathrm{NaOH} \)를 \( 500 ~ \mu \mathrm{L} \) 첨가한 뒤 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \) heating block에서 1시간 동안 용해시킨 후 \( 405 ~ \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 함량을 조사하였다.</p>