실험그룹의 사료조성은 실크 피브로인을 하루에 각각 \( 2.5 \) 및 \( 5.0 \)\( \mathrm{g} / \mathrm{kg} \mathrm{BW} \) 섭취되도록 조제되었고, SFP를 첨가하는 대신 탄수화물을 각각 \( 2.5 \% \) 및 \( 5.0 \% \) 씩 제외하여 조제하였습니다. 간장의 분획은 Laganiere와 Burk의 방법을 따라 HEPES완충용액(\( 10 \mathrm{mM} \) HEPES, \( 10 \mathrm{mM} \) KCI, \( 280 \mathrm{mM} \) sucrose,pH 7.4)을 사용하여 mitochondria, microsome, cytosol로 분리하였습니다. 이때, carbonyl group의 양은 360 nm와 370 nm 사이의 흡광도 파장에서 분자홉광계수 (E = 22,000)를 사용하여 계산되었습니다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>동물실험 및 사료조성</h2> <p>한국화학연구소에서 구입한 Sprague Dawley계 랫트 (male, \( 160 \pm 10 \mathrm{~g} \) )를 구입하여 본 대학 동물사육실에서 2주동안 예비사육한 다음, 7마리씩 3군으로 나누어 실험용 기본사료(control group)로써 사욱하면서 농촌진흥청 잠사곤충부에서 가수분해하여 공급받은 실크 피브로인(silk fibroin : MW 500) 분말 (SFP)을 각각 \( 2.5 \) 및 \( 5.0 \mathrm{~g} / \mathrm{kg} \mathrm{BW}\)가 되도록 사료에 첨가한 실험그룹(SFP-2.5 및 SFP-5.0 groups)으로 하여 6주간 사육실험을 헹하여 간장중의 활성산소의 생성 및 그 제거효소의 활성에 미치는 실크 피브로인의 영향을 평가하였다. 동물사육실은 항온항습 \( \left(22 \pm 2^{\circ} \mathrm{C}, 65 \pm 2 \% \mathrm{RH}\right) \) 하에서 12시간 싸이클(06:00~18:00)로 명암이 자동 조절된다.</p> <h2>조제사료의 조성</h2> <p>본 실험에 사용한 사료조성은 전보와 같이 탄수화물 \( 57.8 \%(\alpha \)-corn starch: \( 44.5 \%+ \) sucrose \( 13.3 \%) \), 단백질 \( 16.0 \% \)(sodium-free casein), 지질 \( 18.0 \% \) (lard \(18.0\%\)), 비타민과 무기질(AIN-76 mixture) 각각 \( 1.0 \%, 3.5 \% \), 그리고 섬유질 \( 3.0 \% \), DL-methionine \( 0.3 \% \), choline chloride \( 0.2 \% \) 를 첨가하였으며, 여기에 cholesterol \(0.5\%\) 및 sodium chloride \( 0.2 \)\( \% \) 를 첨가하여 고콜레스테롤혈증을 유도하였다. 실험그룹의 사료조성은 실크 피브로인을 하루에 각각 \( 2.5 \) 및 \( 5.0 \)\( \mathrm{g} / \mathrm{kg} \mathrm{BW} \) 가 섭취되도록 \( 2.5 \% \) 및 \( 5.0 \% \) 의 SFP를 첨가하는 대신 탄수화물을 각각 \( 2.5 \% \) 및 \( 5.0 \% \) 씩 제외하고 조제하였다.</p> <h2>간장조직의 분획</h2> <p>간장의 분획은 Laganiere와 Burk의 방법에 따라 HEPES완충용액(\( 10 \mathrm{mM} \) HEPES, \( 10 \mathrm{mM} \) KCI, \( 280 \mathrm{mM} \) sucrose,pH 7.4)을 사용하어 mitochondria, microsome 및 cytosol획분으로 분획하여 사용하였다. 이들 획분의 단백질의 함량은 Lowry 등의 방법에 따라 측정하였다.</p> <h2>활성산소의 생성량 측정</h2> <p>히드록시 라디칼 \( (\cdot \mathrm{OH}) \) 의 함량은 deoxyribose의 파괴정도로서 hydroxyl radical 생성정도를 측정하는 방법으로서, 간장획분의 산소데사산물에 의해 deoxyribose가 파괴되어 aldehyde가 생성되며, 이 aldehyde는 산성용핵에서 thio-barbituric acid와 반응하여 발색되는 것을 이용한 Hal-liwell과 Gutteridge의 방법에 따라 측정하였다. 간장획분중의 수펴옥시드 라디칼 \( \left(\mathrm{O}_{2}^{-}\right) \)의 생성량은 McCord와 Fridoych과 Chan과 Bielski의 방법에 따라 super-oxide dismutase를 억제할 수 있는 ferricytochrome C의 환원속도를 측정하였다. \( 0.1 \mathrm{mM} \) EDTA를 함유한 인산완충용액 (pH 7.8) \( 420 \mu \mathrm{l}\) 에 cyanide의 농도가 \( 50 \mu \mathrm{M} \) 이 되도록 \( 20 \mathrm{mM} \) cyanide 용액을 가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 가온하였다. 이 용액에 cytosol \( 300 \mu \mathrm{l} \) 와 \( 0.1 \mathrm{mM} \) cytochrome C \( 50 \mu \mathrm{l} \) 를 넣어 분광광도계롤 사용 \( 550 \mathrm{~nm} \) 에서 홉광도를 시간에 따라 측정하였다. 이 때 cytochrome C의 양은 분자 흡광계수 \( 19,500 \mathrm{M}^{-1} \mathrm{~cm}^{-1} \) 로 계산하였다.</p> <h2>산화적 스트레스의 분석</h2> <p>간장획분중의 과산화지질의 함량은 Choi 등이 사용한 방법에 따라 분광광도계를 사용하여 TBA법으로 말론디알데히드(malondialdehyde : MDA)의 함량을 측정하여 과산화지질(lipid peroxide : LPO)의 함량으로 표시하였다. 간장획분으로서 mitochondria와 microsome의 산화된 단백질의 한량은 Levine 등의 방법에 따라 carbonyl group의 생성량을 측정하였다. \( 0.1 \mathrm{ml} \) 의 시료에 \( 30 \% \) TCA (trichlo-roacetic acid)를 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 혼합, \( 3,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심분리한 훅 상층액을 제거한 뒤 잔사에 \( 10 \mathrm{mM} \) DNPH(di-nitrophenyl hydrazine) \( 0.5 \mathrm{ml} \) 첨가, 15 분마다 흔합하며 1시간 동안 실온에 방치 후 \( 3,000 \mathrm{rpm} \) 에 서 10분간 원심분리하였다. 상흥액을 제거한 후 잔사에 ethanol/ethyl acetate \( (\mathrm{v} / \mathrm{v} ~1: 1) 3.0 \mathrm{ml} \) 를 첨가하여 실온에서 10분 방치한다. 다시 \( 3,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10분간 원십분리 후 잔사을 얻은 뒤, \(6 \mathrm{M} \) guanidine(\( 20 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer, pH 2.3) \( 1.0 \mathrm{ml} \) 첨가\(\cdot\)혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 항온 수조에서 15분간 가온한 후, \( 3,500 \mathrm{rpm} \) 에서 10분간 원심분리하여 상충액을 얻었다. 이때 carbonyl group의 양은 \( 360 \mathrm{~nm} \) 와 \( 370 \mathrm{~nm} \) 사이에 있는 흡광도의 파장에서 분자홉광계수 \( (E=22,000) \) 를 이용하여 계산하였다.</p> <h2>제거효소(scavenger enzymes)의 활성 측정</h2> <p>Oyanagui의 방법에 따라 수퍼옥시드 디스무타아제(superoxide dismutase : SOD)의 활성은 간장의 mitochon-dria 및 cytosol획분을 사용하여 측정하였고, 글루타치온 피옥시다아제(glutathione peroxidase : GSHPx)의 활성은 Lawrence와 Burk의 방법에 따라 \( 340 \mathrm{~nm} \) 에서 NADPH의 감소를 측정하기 위한 방법으로 간장의 cytosol획분에서 측정하였다.</p> <h2>분석결과의 통계처리</h2> <p>본 연구의 모든 실험결과는 통계 처리하여 평균치와 표준편차를 계산하였으며, 각 실험군간의 유의성 검정은 Student's t-test로 실시하였다.</p>