배양액 중의 효소 활성을 확인하기 위하여 Native-PAGE 수행 후 보고한 것과 유사하였으나, 결과와는 상이하였다. 이후에는 효소활성이 급격히 감소하였다. T. Harzianum 중의 laccase가 배양 4일 뒤 효소 활성이 가장 크다는 결과와 비교시 배양시간이 비교적 길다는 것 을 알 수 있다. 효소는 40 \(^\circ \mathrm{C}\) 이하에서 활성도가 50 \%50% 이하, 80 \(^\circ \mathrm{C}\) 에서 최대 활성을 나타냈다.
<h2>Activity staining</h2> <p>F. pinicola 배양액 중의 효소 활성을 확인하기 위하여 Native-PAGE 수행 후 기질인 ABTS로- activity staining 한 결과 laccase 활성을 나타내는 band가 43 55 \( \mathrm{kDa} \) 사이에서 확인되었다(Fig. 2). 이 결과는 F. faxinea 중의 laccase 및 Cambria 등이 보고한 laccase와 유사하였으나, Yoon 등이 보고한 F. pinicola 중의 laccase 분자량이 \( 32 \mathrm{kDa} \)인 결과와는 상이하였다.</p> <h2>배양시간에 따른 효소 생산</h2> <p>이상의 실험결과에 따라 F. pinicola로부터 laccase를 생산하기 위한 최적배지 조건을 \( 2 \% \) glucose, \( 0.4 \% \) peptone, \( 0.05 \% \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \cdot \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.05 \% \mathrm{CaCl}_{2} \) 로 결정하여 이를 포함하는 배지에 균사체를 시간 별로 배양한 결과, 배양 7 일째 효소활성이 종가하여 배양 8 일째 효소활성이 \( 200 \mathrm{mU} / \mathrm{mL} \)로서 가장 우수한 것으로 나타났으며, 이후에는 효소활성이 급격히 감소하였다(Fig. 3), 균사체를 MCM에서 배양했을 때 효소활성이 \( 114 \mathrm{mU} / \mathrm{mL} \) 인 결과(Fig. 1)와 비교할 때, 최적배지조건으로 배양하였을 때 효소활성이 \( 175 \% \) 증가함을 알 수 있었다. P. cinnabartinus 및 Monotospora \( \mathrm{sp} \). 중의 laccase가 각각 7일 및 8 일 배양 후 최대 활성을 나타낸 결과와 유사하였으며, Sadhasivam 등이 보고한 \( T \). Harzianum 중의 laccase가 배양 4 일 후 효소 활성이 가장 크다는 결과와 비교하였을 때는 배양시간이 비교적 긴 것을 알 수 있었다. 그러나 Cyathus bulleri 중의 laccase는 배양 후 21 일, Phlebia floridensis 중의 laccase는 배양 후 20 일에 최대활성이 나타난 것으로 보아 본 균주의 laccase 생산을 위한 배양기간은 버섯류로부터 laccase 생산을 위한 일반적인 배양기간 범주에 속하는 것으로 사료된다.</p> <h2>기질특이성</h2> <p>F. pinicola 균사체로부터 생성된 배양액 중의 laccase에 대한 기질톡이성을 조사하기 위하여 비페놀계 기질인 ABTS와 페놀성 기질인 2, 6-dimethoxyphenol, syringaldazine, guaiacol 및 \( o \)-tolidine을 기질로 사용하여 활성을 측정한 결과, ABTS에 대하여 활성이 가장 우수하였다(Table 5). 이는 F. fraxinea 중의 laccase가 \( \mathrm{ABTS} \) 에 대하여 가장 높은 효소활성을 나타낸 결과와 일치하였다.</p> <h2>최적 \( \mathrm{pH} \) 와 최적 온도</h2> <p>F. pinicola 균사체로부터 생산된 laccase의 배양액 중의 효소활성을 위한 \( \mathrm{pH} \) 및 온도의 영향을 Fig. 4와 Fig. 5 에 나타내었다. 효소는 \( \mathrm{pH} \) 3에서 최대 활성을 나타내었으며 \( \mathrm{pH} \) 4 에서는 활성도가 \( 30 \% \) 이하로 급격히 감소하여 \( \mathrm{pH} 5 \) 이상에서는 활성을 나타네지 않았다. 한편 효소는 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 이하에서 활성도가 \( 50 \% \) 이하로 나타났으며 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 최대 활성을 나타내었다. 이는 Park 등이 보고한 P. cinnabarinum laccase의 최적 \( \mathrm{pH} 3.0 \) 과 일치하였으며, Xiao 등이 보고한 Trametes sp. laccase 및 F. fraxinea laccase가 각각 \( \mathrm{pH} 4.5, \mathrm{pH} 5.0 \) 에서 최대 활성을 나타내는 결과와 상이함을 알 수 있었다. 한편, Trametes \( s p \).로부터 생산된 laccase 의 최적 온도는 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \), F. fraxinea laccase의 최적 온도는 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 이며, Nagai 등이 보고한 L edodes로부터 생산된 laccase의 최적 온도는 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 로, 균류로부터 생산되는 laccase의 최적온도가 매우 다양함을 알 수 있었다.</p>