항진균물질의 성분 분석하기 위해 TLC plates에 점적한 후 ethyl acetate-methanol-water \( (50: 18: 5, \mathrm { v } / \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 로 전개시켜 발색처리를 하고, 분자량은 FAB mass spectrum을 이용해 FAB ion화 방법으로 측정하며, 아미노선 조성 분석을 위해 항진균물질의 아미노산 조성을 분석하기 위하여 6N HCl에 녹여 \( 110 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 반응시켜 가수분해하고 NMR spectroscopy에 의한 분자구조 분석을 위해 항진균물질을 \( \mathrm { MeOH } \)에 용해시켰다.
<h2>항진균물질의 성분 분석</h2> <h3>TLC를 이용한 항진균물질 성분 확인</h3> <p>항진균물질의 성분을 확인하기 위하여 methanol로 용해한 다음 TLC plates에 점적한 후 ethyl acetate-methanol-water \( (50: 18: 5, \mathrm { v } / \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 로 전개시킨 다음 ninhydrin solution, aniline으로 분무하여 \( 110 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분 동안 처리한 후 발색 정도를 확인하였다.</p> <h3>UV spectroscopy</h3> <p>항진균물질을 methanol로 용해시켜 \( 200 \mathrm { ~nm } \)에서 \( 800 \mathrm { ~nm } \)까지 UV spectroscopy를 이용하여 흡광도를 측정하였다(Specord S10, Zeiss, Germany).</p></h3> <h3>FAB-mass spectrum</h3> <p>항진균물질의 분자량은 FAB(JEOL JMS-AX505WA) mass spectrum을 이용하여 FAB ion화 방법으로 측정하였다.</p> <h3>아미노산 조성 분석</h3> <p>항진균물질의 아미노산 조성을 분석하기 위하여 6N HCl에 녹여 \( 110 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 반응시켜 가수분해하고, 증류수로 희석한 다음 완전히 건조시켜 methanol, \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \), triethylamine, phe-nylisotiocynate가 7:1:1:1로 혼합된 PITC (phenylisothiocyanate)로 유도체를 시약 \( 20 \mu \mathrm { l } \)를 넣고 실온에서 20분 동안 방치한 다음 완전히 건조시켰다. 이 PITC유도체를 \( \mathrm { CH } _ { 3 } \mathrm { CN } \) 인산완충 용액에 녹여 PICO-TAG column을 이용한 HPLC (Hewlett Packard 1100 Series)를 통하여 분석하였다.</p> <h3>NMR spectroscopy에 의한 분자구조 분석</h3> <p>항진균물질을 \( \mathrm { MeOH } \)에 용해시켜 \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \)-NMR spectrum, \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \)-COSY, HMQC을 600 NMR (Bruker, Avance-600)로 분석하였으며, 내부 표준물질로는 tetramethylsilane (TMS)를 사용하였으며 chemical shift는 \( \delta \) value로 ppm 단위로 나타내었다.</p> <h2>항진균물질의 독성 실험</h2> <h3>세포독성 실험</h3> <p>항진균물질의 세포독성을 알아보기 위해서 MTT \( \{ 3-(4,5- \) dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide } 방법을 사용하였다. 서울대학교에서 분양 받은 NIH3T3(마우스 섬유아 정상 세포)을 \( 2 \times 10 ^ { 5 } \) cells/ \( \mathrm { ml } \) 로 희석하여 96 well plate (Corning Co., USA)에 \( 100 \mu 1 \)씩 주입하여 배양한 다음 세포의 상층액을 제거한 후 항진균물질을 \( 0,10,50,100 \), \( 500,1,000,2,000 \mu \mathrm { l } / \mathrm { ml } \)의 농도로 \( 100 \mu \mathrm { l } \)씩 처리하여 배양하였다. 암 조건에서 well 당 \( 5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도의 MTT solution을 10 \( \mu 1 \)씩 첨가 한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에서 4시간 동안 암상태로 배양하였다. 푸른색의 MTT formazan이 생성되면 DMSO로 용해시켜 ELISA plate reader (Wavepower 340, Bio-Tek Co., USA)를 이용하여 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 실험군의 흡광도를 대조군의 흡광도와 비교하여 생존율을 구하였으며, \( 50 \% \) inhibition concentration \( \left ( \mathrm { IC } _ { 50 } \right ) \)은 생존율에 의거하여 구하였다.</p>Viability \( ( \%) = (T-B) /(C-B) \times 100 \)<ul> <li>\( \mathrm { T } \) : 실험군의 평균 흡광도</li> <li>\( \mathrm { C } \) : 대조군의 평균 흡광도</li> <li>\( \mathrm { B } : \) 기준 흡광도</li></ul>