\( \alpha \)-galactosidase의 \( \quad \rho \)-nitrophenyl- \( \alpha \)-D-glucopyranoside(PNPG)에 대한 기질 친화력을 측정하기 위한 농도별 기질 용액의 반응 정도를 측정하고 Lineweaver-Burk plot에 의하여 \( K \mathrm{~m} \) 과 Vmax를 계산하면 PNPG를 기질로 사용했을때 Choi 등이 보고한 것보다 강한 친화력을 가짐을 알 수 있고, Chun과 Lee는 Aspergillus niger가 생산한 \( \beta \)-glucosidase에서 PNPG를 기질로 사용하였을때에 비하면 기질 친화도가 낮은 것으로 판단되나 효소의 정제도 및 실험조건에 따라 다를 수 있어 일률적으로 비교하긴 어려울 것으로 판단된다. \( \alpha \)-Galactosidase와 \( \beta \)-glucosidase 활성을 가지고 있는 Weissella cibaria K-M1-4를 soy broth medium에 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양한 후, 12 시간 간격으로 배지 중 당의 종류별 함량 변화를 HPLC로 분석하였고 sucrose를 모두 소비한 후에 \( \alpha \)-galactosidase의 작용으로 stachyose와 raffinose를 분해하여 최종산물인 sucrose를 생산하고 이용할 것으로 사료된다. Soy broth medium의 이소플라본을 분석한 결과, glucoside 형태인 daidzin, glycitin, genistin이 주종을 이루며 함유되어 있음을 나타내었고, 특히 이소플라본 중에서 genistin에서 genistein으로의 전환율이 우수한 것으로 나타났다.
<h2>효소의 \( \mathrm{Km} \) 및 \( \mathrm{V} / \mathrm{max} \) 측정</h2> <p>\( \alpha \)-galactosidase의 \( \quad \rho \)-nitrophenyl- \( \alpha \)-D-galacto-pyranoside(PNPG)에 대한 기질 친화력을 측정하기 위해 농도별 기질 용액의 반응 정도를 측정한 후 Lineweaver-Burk plot에 의하여 \( K \mathrm{~m} \) 과 Vmax를 계산하였다. 이 plot으로부터 산출된 \( \alpha- \) galactosidase의 \( K \mathrm{~m} \) 값은 \( 0.98 \mathrm{mM} \) 이었고, \( \mathrm{Vmax} \) 값은 \( 1.81 \) \( \mu \) mole/min이었다. \( \beta \)-glucosidase의 \( \rho \)-nitrophenyl- \( \beta \)-D-gluco-pyranoside(PNPG)에 대한 기질 친화력을 측정한 결과, \( \mathrm{Km} \) 값은 \( 1.24 \mathrm{mM} \) 이었고, \( \mathrm{Vmax} \) 는 \( 6.81 \mu \mathrm{mole} / \mathrm{min} \) 이었다(Data not shown). Choi 등은 Scopulariopsis brevicaulis가 생산하는 \( \alpha \)-galactosidase에서 PNPG를 기질로 사용하였을때 \( \mathrm{Km} \) 값이 \( 1.9 \mathrm{mM} \), Vmax값은 \( 9.66 \times 10^{2} \mu \mathrm{mole} / \mathrm{min} \) 임을 보였다. 본 \( \alpha \)-galactosidase는 PNPG에 대해 Choi 등이 보고한 것보다 강한 친화력을 가짐을 알 수 있었다. Chun과 Lee는 Aspergillus niger가 생산한 \( \beta \)-glucosidase에서 PNPG를 기질로 사용하였을때 \( K \mathrm{~m} \) 값이 \( 0.42 \mathrm{mM}, V \max \) 값은 \( 152 \mu \mathrm{mole} / \mathrm{min} \) 인 것에 비하면 기질 친화도가 낮은 것으로 판단되나 효소의 정제도 및 실험조건에 따라 다를 수 있으므로 일률적으로 비교하기는 어려운 것으로 판단된다.</p> <h2>Weissella cibaria K-M1-4 배양 중 탄수화물 및 이소플라본의 함량변화</h2> <p>\( \alpha \)-Galactosidase와 \( \beta \)-glucosidase 활성을 가지고 있는 Weissella cibaria K-M1-4를 soy broth medium에 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양한 후, 12 시간 간격으로 배지 중 당의 종류별 함량 변화를 HPLC로 분석하였다. Soy broth medium에는 sucrose(1.92%), stachyose(0.93%), fructose(0.41%), raffinose(0.19%), 미량의 glucose와 galactose 순서로 구성되어 있다. 미생물 배양 48 시간 이후에는 sucrose가 0.21%, fructose가 0.01% 로 감소한 반면에 stachyose와 raffinose는 0.01-0.03% 밖에 감소하지 않았다. 감소하지 않은 이유는 Weissella cibaria K-M1-4가 탄소원으로 sucrose와 fructose를 이용한다는 것을 나타내고, sucrose를 모두 소비한 후에 \( \alpha \)-galactosidase의 작용으로 stachyose와 raffinose를 분해하여 최종산물인 sucrose를 생산하고 이용할 것으로 사료된다. Soy broth medium의 이소플라본을 분석한 결과, glucoside 형태인 daidzin \( (66.7 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \), glycitin (28.1 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \), genistin \( (65.8 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \) 이 주종을 이루며 함유되어 있음을 나타내었다. 미생물 배양 48 시간 이후에는 \( \beta- \) glucosidase의 활성으로 daidzin \( (53.9 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \), glycitin( \( 25.4 \) \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \), genistin( \( 25.6 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \) 이 감소하였고 aglycone 형태의 daidzein \( (8.4 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \), glycitein \( (1.3 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \), genistein \( (18.8 \) \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \) 의 이소플라본으로 전환됨이 확인되었다. 특히 이소플라본 중에서 genistin에서 genistein으로의 전환율이 우수한 것으로 나타났다.</p>