\( \mathrm{Fe}^{3+}-\mathrm{EDTA} / \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)계에서는 \( \mathrm{Fe}^{3+} \)-EDTA의 촉매 작용으로 대부분의 \( \operatorname{ROS}\left(\mathrm{O}_{2}^{{ }^{--}}, \cdot \mathrm{OH}, \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \)가 생성된다. ROS 소거 활성 \( \left(\mathrm{OSC}_{50}\right) \)은 ROS의 \( 50 \% \)가 소거되는데 필요한 시료의 농도로 정의된다. 적혈구 현탁액 제조: 사람으로부터 얻은 피는 채혈 즉시 heparin이 첨가된 시험관에 넣은 후, \( 3,000 \mathrm{rpm} \)으로 5 min 동안 원심 분리하여 적혈구와 혈장을 분리하였다. 실험에 사용된 적혈구 현탁액은 \( 700 \mathrm{~nm} \)에서 O.D.가 0.6이었으며 이때 적혈구 수는 \( 1.5 \times 10^{7} \mathrm{cells} / \mathrm{ml} \)이었다. 마디풀 추출물의 광용혈에 끼치는 효과는 post-incubation시간과 용혈정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 \( 50 \% \)가 용혈되는 시간인 \( \tau_{50} \)을 구하여 비교하였다.
<h2>루미놀 발광법을 이용한 \( \mathrm{Fe}^{3+}-EDTA \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 계에 있어서 활성산소 소거 활성(총항산화능)</h2> <p>\( \mathrm{Fe}^{3+}-\mathrm{EDTA} / \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 계에서는 \( \mathrm{Fe}^{3+} \)-EDTA의 촉매 작용으로 대부분의 \( \operatorname{ROS}\left(\mathrm{O}_{2}^{{ }^{--}}, \cdot \mathrm{OH}, \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \) 가 생성된다. 이렇게 생성 된 ROS의 검출은 루미놀을 첨가하여 ROS와 루미놀이 반응할 때 방출되는 화학발광으로 측정할 수 있다. ROS 소거 활성은 루미놀-의존성 화학발광법을 이용한 \( \mathrm{Fe}^{3+}-\mathrm{EDTA} \) \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 계에서 측정하였다. 화학발광 측정용 튜브에 증류수 \( 1.78 \mathrm{ml} \) 를 넣고 다양한 농도의 추출물을 넣었다. 여기에 \( 2.5 \mathrm{mM} \mathrm{EDTA} 40 \mu \mathrm{l} \) 및 \( 5 \mathrm{mM} \mathrm{FeCl}{ }_{3} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 10 \mu \mathrm{l} \) 을 가한 후 \( 35 \mathrm{mM} \) 루미놀 \( 80 \mu \mathrm{l} \) 를 넣고 흔들어 섞어 주었다. 이어서 화학발광기의 cell holder에 튜브를 넣고 5min 동안 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 로 항온시킨 후 \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{H} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} 40 \mu \mathrm{l} \) 를 넣고 화학발광을 25min 동안 측정하였다. ROS 소거 활성 \( \left(\mathrm{OSC}_{50}\right) \) 은 ROS 의 \( 50 \% \) 가 소거되는데 필요한 시료의 농도로 정의된다.</p> <h2>Photohemolysis 법을 이용한 세포보호 효과 측정</h2> <p>적혈구 현탁액 제조: 사람으로부터 얻은 피는 채혈 즉시 heparin이 첨가된 시험관에 넣은 후, \( 3,000 \mathrm{rpm} \) 으로 5 min 동안 원심 분리하여 적혈구와 혈장을 분리하였다. 분리한 적혈구는 \( 0.9 \% \) saline phosphate buffer 적혈구 현탁액(15.0 million cells \( / \mathrm{ml} \) )을 준비하기 위해서 \( \mathrm{pH} \) 7.4, \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \). \( 12 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 9.6 \mathrm{mM}, \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 1.6 \mathrm{mM} \) 로 세척하여 원심분리하고 흰색의 백혈구 층은 제거하였다. 모든 실험은 채혈 후 12 h 이내에 행하였다. 실험에 사용된 적혈구 현탁액은 \( 700 \mathrm{~nm} \) 에서 O.D.가 0.6 이었으며 이때 적혈구 수는 \( 1.5 \times 10^{7} \mathrm{cells} / \mathrm{ml} \) 이었다.</p> <p>마디풀 추출물의 광용혈 억제 효과: 적혈구 현탁액 \( 3.5 \mathrm{ml} \) 를 파이렉스 시험관(No. 9820)에 넣은 후, 추출물을 농도별로 각각 \( 50 \mu 1 \) 씩 첨가하였다. 암소에서 30 min 동안 pre-incubation 시킨 후, 광증감제 rose-bengal \( (12 \mu \mathrm{M}) 0.5 \mathrm{ml} \)를 가하고 파라필름(Whatman laboratory sealing film, UK)으로 입구를 막은 후 \( 15 \mathrm{~min} \) 동안 광조사 하였다. 광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 \( 50 \mathrm{~cm} \times 20 \mathrm{~cm} \times \) \( 25 \mathrm{~cm} \) 크기의 상자 안에 \( 20 \mathrm{~W} \) 형광등을 장치하고, 형광등 으로부터 \( 5 \mathrm{~cm} \) 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험 관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 \( 15 \mathrm{~min} \) 동안 광조사 하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 파괴정도를 \( 15 \mathrm{~min} \) 간격으로 \( 700 \mathrm{~nm} \) 에서 투광도(transmittance, \%)로부터 구하였다. 이 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도의 증가는 적혈구의 용혈정도에 비 례한다. 모든 실험은 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 항온실에서 행하였다. 마디풀 추출물의 광용혈에 미치는 효과는 post-incubation 시간과 용혈정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 \( 50 \% \) 가 용혈되는 시 간인 \( \tau_{50} \) 을 구하여 비교하였다.</p>