배추유묘를 측정하고 역체질소로 마쇄한 후, DEPC 처리된 멸균수에 녹여 RNA양을 정량하였다. RNase H-Reverse Transcriptase를 사용하여 total RNA를 처리하고, \( 5 \mu \mathrm { g } \)의 total RNA로부터 first strand cDNA를 합성하였다. PCR 산물은 \( 1. 5 \% \) agarose gel상에서 이동 및 염색 후에 band 확인과 pGEM T-Easy vector에 cloning하여 염기서열을 조사하였으며, 유전자간 상동성 비교는 BLAST 분석을 통해 실시하였다.
<h2>Total RNA 분리</h2> <p>배추유묘 \( 0.1 \mathrm { g } \) 을 측정하여 미리 차갑게 준비해 놓은 막자사발과 막대를 이용하여 역체질소로 마쇄하였다. 마쇄한 조직은 \( 1 \mathrm { ml } \) 의 TRIzol-reagent가 담긴 \( 1.5 \mathrm { ml } \) 원심분리용 튜브에 넣어 섞어주고, 핵단백질체가 완전히 분리되도록 상온에 15분간 두었다. \( 1 \mathrm { ml } \) TRIzol-reagent에 대해 \( 0.2 \mathrm { ml } \) chloroform을 넣어 15초 동안 vortex하고, 상온에서 5분간 방치한 후 \( 11,000 \mathrm { rpm } \) 으로 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 15분간 원심분리 하여 상등액을 새 튜브로 옮겼다. 상층은 \( 0.5 \mathrm { ml } \) 의 isopropanol과 \( 0.25 \mathrm { ml } \) 의 high salt precipitation solution \( (0.8 \mathrm { M } \) sodium citrate/ \( 1.2 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } ) \)을 넣어 잘 섞어주고 상온에서 10분간 방치하여 RNA를 침전시켰다. 이렇게 추출한 산물을 \( 11,000 \mathrm { rpm } \)으로 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분간 원심분리 하여 상등액을 버리고. RNA 침전물에 \( 1 \mathrm { ml } \)의 \( 75 \% \) ethanol을 넣고 \(11,000 \mathrm { rpm } \) 으로 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5분 동안 원심분리 했다. 그 다음 상등액을 제거하고 RNA 침전을 진공상태에서 5-10분간 건조시켰다. 마지막으로 \( ( 50-100 \mu \mathrm { l } \)의 DEPC 처리된 멸균수에 녹여 spectrophotometer로 RNA양을 정량하여 사용하였다.</p> <h2>Brcpi1 유전자 분리 및 염기서열 분석</h2> <p>Total RNA는 RNase H-Reverse Transcriptase (Gibco BRL, Rockville, MD, USA) protocol에 따라 수행하였으며, first strand cDNA는 \( 5 \mu \mathrm { g } \) total RNA로부터 합성하였다. 합성된 cDNA \( 2 \mu \mathrm { l } \)를 주형으로 \( 10 \times \mathrm { PCR } \) buffer ( \( 200 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } \mathrm { pH } 8.4, 500 \mathrm { mM } \mathrm { KCl } ) 5 \mu \mathrm { l } \)와 \( 50 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl_2 } 1.5 \mu \mathrm { l } , 10 \mathrm { mM } \) dNTP mix \( 1 \mu \mathrm { l } \), Taq DNA polymerase (5 units/ \( \mu \mathrm { l } \) ) \( 0.4 \mu \mathrm { l } \), for-ward primer \( (10 \mu \mathrm { M } ) \), reverse primer \( (10 \mu \mathrm { M } ) \)를 각각 \( 1 \mu \mathrm { l } \)씩 첨가하고 멸균수 \( 38.1 \mu \mathrm { l } \)로 최종 부피 \( 50 \mu \mathrm { l } \)를 만든 후 PCR을 실시하였다. 이때 사용한 primer는 NCBI database로부터 얻어진 정보로부터 (5'-GAACTTGGAAGGTACTG-3'), (5'-AGTTTTGCGCTTCAGGCA-3')를 합성하여 사용하였다. PCR 반응은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 4분간 pre-denaturation 시킨 후, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서1분간 denaturation, \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분간 annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2분간 extension과정을 35 cycles로 하였으며, 마지막으로 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서10 분간 extension을 실시하였다. PCR 산물은 \( 1.5 \% \) agarose gel상에 영동한 후, ethidium bromide로 염색하여 band를 확인하였다. 증폭산물은 pGEM T-Easy vector (Pro-mega)에 cloning하여 염기서열을 조사하였고, 유전자간 상동성 비교는 BLAST분석에 의하여 실시하였다. Full len-gth cDNA을 분리하기 위하여 얻어진 단편의 염기서열을 토대로 RACE용 primer를 합성하여 TAKARA사에서 시판하고 있는 5' RACE 및 3' RACE kit를 이용하여 미지의 영역을 증폭하였다. 각각의 RACE 방법으로 얻어진 산물을 염기서열을 조사였다. 또한 유전자간의 계통수 유연관계 는 MEGA version 3.0 프로그램 (Kumar et al. 2001)을 이용하였다.</p>