본 논문에서는 B.coagulans는 lignocellulose를 함유한 식물성 소재로부터 L형-유산을 만들기 위해 많이 분리되었으며, 높은 확률의 B. coagulans 분리가 예상되는 볏짚을 분리원으로 정해 농가에서 수집해 최적 및 한계 생산 조건을 확보하고자 다양한 실험을 수행했다. Bacillus안의 bacteria 생장을 최소화 하기 위해 집적배양 단계에서는 유산균의 배양에 주로 쓰는 MRS broth를 사용하고 많은 종류의 bacteria를 검출하기 위해 생균수 측정 단계에서는 일반세균 검출에 사용하는 \( \mathrm { PCA } \)를 사용했다.
<p>토양미생물로 분류되는 B. coagulans는 육탄당뿐만 아니라 xylose와 같은 오탄당을 탄소원으로 이용하는 능력을 가지고 있어 lignocellulose를 함유하고 있는 식물성 소재로부터 L형-유산을 생산하기 위하여 많이 분리되었으며, 쌀겨의 우점종으로 분리된 바 있다. 본 연구에서는 우리나라 도처에서 쉽게 구할 수 있으며, 높은 확률의 B. coagulans 분리가 예상되는 볏짚을 분리원으로 선택하였고, 볏짚은 경기도 일대의 안성, 여주, 의정부, 포천의 농가에서 수집하였다. 약 \( 2 \mathrm { ~cm } \) 크기로 자른 볏짚 \( 10 \mathrm { ~g } \) 을 항진균제 cycloheximide(Sigma, USA)를 \( 100 \mathrm { mg/l } \)의 농도로 첨가한 멸균 MRS broth (Difco, USA) \( 100 \mathrm { ml } \)에 접종한 다음, B. coagulans의 최적 및 한계 생육온도로 알려진 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 및 \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 3일간 배양하면서 24시간 단위로 생균수를 측정하였다(Fig. 1). 생균수 측정에는 plate count agar(PCA; Difco)를 사용하였고, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다. 다양한 환경에서 높은 생장을 보이는 Bacillus 속 bacteria의 생장을 최소화 하기 위하여 집적배양 단계에서는 유산균의 배양에 주로 사용하는 MRS broth를 사용하였고, 가능한 많은 종류의 bacteria의 검출을 위하여 생균수 측정 단계에서는 일반세균 검출에 사용하는 \( \mathrm { PCA } \)를 사용하였다. \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 배양에서는 24시간 후에 평균 \( 10 ^ { 6 } \) \( \mathrm { ~CFU } / \mathrm { ml } \) 수준의 생균수가 검출되었고, 3일 후에는 모든 시료의 생균수가 평균 \( 10 ^ { 4 } \mathrm { ~CFU } / \mathrm { ml } \) 수준으로 감소하였다. \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 배양에서는 24시간 후에 \( 10 ^ { 4 } \mathrm { ~CFU } / \mathrm { ml } \) 수준의 생균수가 검출되었고, 2일차에 약간 증가하였다가 3일 후에는 \( 10 ^ { 3 } \mathrm { ~CFU } / \mathrm { ml } \) 수준까지 감소하는 것으로 나타났다. 본 연구에서는 \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 집적배양을 통하여 \( 10 ^ { 4 } \mathrm { ~CFU } / \mathrm { ml } \) 정도의 균수 확보가 가능한 것으로 나타났지만, 가능한 충분한 균수의 확보를 위하여 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 3일간 집적배양한 배양액을 십진희석하여 PCA에 도말하고, \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 72시간 배양하였다. PCA에서 생장한 콜로니의 다양성을 고려하여 각 시료당 30 균주를 순수분리하여 보존하였고, 각 시료로부터 순수분리한 균주들 중, 3 균주씩을 \( 16 \mathrm { S } \mathrm { ~rRNA } \) 유전자 염기서열 분석에 의해 계통발생학적으로 동정하였다. 분리된 균주의 \( 16 \mathrm { S } \mathrm { ~rRNA } \) 유전자 증폭은 colony PCR을 이용하여 수행하였고 primer는 eubacterial universal primer 27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 1492R(5'-GGT TAC CTT GTT AGG ACT T-3')을 사용하였다. PCR은 T professional TRIO thermocycler(Biometra, Germany)를 사용하였고, \( 50 \mu \mathrm { l } \) 반응계에는 소량의 colony, \( 100 \mathrm { ~mM } \) dNTP, \( 1 \mathrm { ~U } \) Taq polymerase(Inclone biotech, Korea), \( 20 \mathrm { ~pmol } \)의 primer를 첨가하였다. PCR은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 예비가열 후, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분간 변성, \( 52 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 45초간 annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분간 중합반응의 과정을 30회 반복하였다. 증폭된 PCR 산물은 PCR product purification kit(RBC Biosciece, Taiwan)을 사용하여 정제한 후, 수탁업체(Genotech, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 결정하였고, 염기서열 결정을 위한 primer는 \( 16 \mathrm { ~S } \mathrm { ~rRNA } \) 유전자 증폭에 사용하였던 27F와 1492R을 사용하였다. 결정된 염기서열은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 염기서열 정보를 대상으로 nucleotide BLAST를 통해 상동성을 분석하였고, 결정된 \( 16 \mathrm { ~S } \mathrm { ~rRNA } \) 유전자 염기서열과 가장 높은 상동성을 나타내는 표준균주(type strain)를 포함하는 분류학적 단위를 해당 균주의 종(species)으로 결정하였다. 4개 시료로부터 순수분리한 총 12 균주의 동정 결과, B. coagulans는 5 균주가 분리되었고, Enterococcus faecalis 2 균주, Enterococcus faecium 2 균주, B. licheniformis, Bacillus thuringiensis, B. subtilis가 각각 1 균주씩 분리되었다.</p>