3T3-L1 전지방세포 분화에 영향을 미치는 PRF은 지방 분화를 촉진하는 핵심 전사인자인 PPAR\(\Upsilon\)와 C/EBP\(\alpha\) 발현을 저해함으로써 지방형성를 억제시키고, 성숙한 지방 세포에서 또한 분화된 지방세포에서 지방분해를 촉진한다는 것이 밝혀졌다. 또 성숙한 3T3-L1 지방세포에서 지방분해 및 산화 관련 단백질 발현에 미치는 PRF의 영향은 대조군에 비해 IBMX 또는 PRF 처리군에서 지방분해에 관여하는 PKA 및 HSL 단백질의 인산화가 높게 관찰됨으로서 PRF가 cAMP 경로를통해 지방분해 작용을 촉진하는 것을 알려주었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>3T3-L1 전지방세포 분화에 미치는 PRF의 영향</h2> <p>PRF가 3T3-L1 전지방세포의 세포 생존율 및 독성에 대한 영향을 우선적으로 분석하였다. MTT 그리고LDH 분석 결과, PRF는 50 μg/ml 이상 농도에서 세포성장을 유의적으로 억제하였다. 이러한 세포 생장 저해 효과가 세포 독성에 의한 것인지 분석하기 위해 배지의 LHD함량을 측정하였다. PRF는 50 μg/ml 농도에서부터 세포독성을 보여 주었다. 따라서 본 연구에서는 PRF 처리농도를 최대 40 μg/ml 농도로 설정하여 실험을 수행하였다.PRF가 3T3-L1 전지방세포 분화에 미치는 영향을 분석하기 위하여 PRF 처리하여 8일간 배양한 후 세포에 축적된 중성지방 함량을 측정하였다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 PRF는 농도 의존적으로 지방축적을 억제하였다. 염색된 지방 소적을 정량한 결과, PRF 고농도(40 μg/ml) 처리군에서는 MDI를 처리한 양성대조군에 비해 40% 정도의지방축적이 감소됨을 확인할 수 있었다. 지방축적을 감소시키는 PRF의 분자적 기전을 이해하기 위하여지방세포의 분화를 조절하는 핵심 전사인자인 PPARγ와C/EBPα, 그리고 이들의 표적 유전자인 FAS 및 aP2의 발현양상을 분석하였다. 음성 대조군에 비해 분화유도물질을 처리한 양성 대조군(MDI)에서는 PPARγ와 C/EBPα 발현 및 하위 유전자인 FAS와 aP2의 발현 수준이높았다. PRF를 처리한 실험군에서는 농도 의존적으로PPARγ와 C/EBPα, 그리고 이들의 하위 유전자인 FAS와aP2 발현이 농도 의존적으로 감소하였다. 이결과는 PRF가 지방 분화를 촉진하는 핵심 전사인자인PPARγ와 C/EBPα 발현을 저해함으로써 지방형성(lipogen-esis)를 억제한다는 것을 시사하였다.</p> <p>감귤류 과피에서 분리한 PMFs의 일종인 nobiletin과tangeretin 또는 수종의 PMFs 화합물로 구성된 복합물은3T3-L1 지방세포의 분화를 억제한다고 알려져 있다. 진귤 잎 유래 PRF의 화합물 조성 또한 nobiletin과 tan-geretin 함량이 높기 때문에 지방세포 분화 억제 활성을보이는 것으로 사료된다. 지방세포 분화 및 지방형성에주요한 인자로 작용하는 PPARγ은 PPARγ1과 PPARγ2의두 종류가 있는데 PPARγ1 보다 30개 아미노산이 더 많은PPARγ2가 지방세포 분화에 중요하다고 알려져 있다. PRF는 지방세포 분화의 필수 인자인 PPARγ2의 발현을 억제하고 아울러 C/EBPα의 발현 및 FAS와 aP2의 지방합성인자를 억제하여 지방세포 분화를 억제한다고 사료된다.</p> <h2>성숙한 3T3-L1 지방세포에서 지방분해에 미치는 PRF의 영향</h2> <p>진귤 잎에서 분리한 PRF가 지방분해에 미치는 영향을분석하기 위하여 완전히 분화된 지방세포에 PRF를 처리한 후 지방구의 크기 및 중성지방 함량을 비교하였다. 대조군은 지방구 크기가 크고 밀집되어 있는 반면에IBMX를 처리한 양성대조군에서는 지방구의 크기 및 수가 감소하였다. PRF를 처리한 실험군에서는 농도 의존적으로 지방구의 크기 및 수가 감소되는 것을 확인할 수있었다. 이와 마찬가지로 중성지방의 함량을 분석한 결과 IBMX를 처리한 군 및 PRF 고농도(40 μg/ml)처리군에서 대조군에 비해 약 10% 정도의 지방함량이 감소를 확인하였다. 지방세포에서 지방구가 감소한다는 것은 중성지방이 글리세롤과 FFA로 분해되는 지방분해가 촉진되기 때문이다. 이를 확인하기 위하여 각 실험군의 배지에서 글리세롤 함량을 측정하였다. IBMX 처리군에서 분비된 글리세롤 함량은 대조군에서유의적으로 높았으며, PRF 처리군에서도 농도 의존적으로 배지로 분비된 글리세롤 함량이 증가됨을 확인할 수있었다. 이 결과는 PRF가 분화된 지방세포에서 지방분해를 촉진하는 작용을 한다는 것을 암시해준다.3T3-L1 지방세포에서 sinensetin, nobiletin, tangeretin은PKA 경로를 통해 지방분해를 촉진한다고 알려져 있지만, 본 연구에서 사용한 PMFs 복합물에 대한시너지 효과에 관한 연구는 보고된 바 없다. Phosphodies-terase inhibitor인 IBMX는 세포 내 cAMP의 농도를 증가시켜 PKA/HSL 경로를 통한 지방분해를 촉진시킨다고 알려져 있다. PMFs 복합물인 PRF도 IBMX와 유사하게 cAMP 의존적 PKA/HSL 경로를 통해 성숙한 지방세포에서 지방분해를 촉진하는 활성을 나타낸다고 사료된다.</p> <h2>성숙한 3T3-L1 지방세포에서 지방분해 및 산화 관련 단백질 발현에 미치는 PRF의 영향</h2> <p>PRF에 의한 지방분해 기전을 확인하기 위하여 각 실험군에서 지방분해와 관련된 단백질들의 발현을 분석하였다. 대조군에 비해 IBMX를 처리한 양성대조군에서는 지방분해에 관여하는 PKA 및 HSL 단백질의 인산화가 매우높게 관찰되었다. 마찬가지로, PRF 처리군에서도 농도 의존적으로 PKA 및 HSL의 인산화가 증가하는것을 확인할 수 있었다. 세포 내 cAMP 농도를 증가시키는것으로 알려진 IBMX는 PKA 및 HSL 인산화가 대조군보다 6배 이상 증가하였다. 그리고 고농도 PRF군(40 μg/ml)의 PKA 및 HSL 인산화는 대조군에 비해 3배 이상의 증가하였다. 이 결과는 PRF가 cAMP 경로를통해 지방분해 작용을 촉진하는 것을 시사해주었다. 그리고 PRF가 성숙한 지방세포에서 지방산화 경로를 활성화하는지를 확인하기 위하여 각 실험군에서 AMPK와 ACC인산화 강도를 비교하였다. IBMX 처리군과 PRF 처리군에서는 AMPK 및 ACC 단백질의 인산화가 대조군에 비해매우 높게 검출되었다. PRF 처리군인 경우, 저농도 PRF (10 μg/ml) 처리군에서부터 AMPK 활성화가 대조군에 비해 4배 정도 높았고, 고농도 PRF (10 μg/m;) 처리군에서는 양성대조군인 IBMX 처리군과 비슷한 활성을 나타내었다. 이러한 결과들은 진귤 잎 유래PRF는 PKA/HSL 경로를 통한 지방분해는 물론 AMPK/ACC 경로를 통해 지방산화를 촉진하는 활성을 가지고있다는 것을 암시한다.</p> <p>공복으로 에너지를 공급받지 못하거나 운동 등 많은에너지가 필요할 때 지방조직은 PKA 경로를 통해 중성지방을 분해하여 지방산화를 통해 ATP를 생성하는데, 이는AMPK 경로를 통해 조절된다. AMPKα Thr172 부위의 인산화로 활성화된 AMPK는 HSL Ser565 부위를 인산화 시켜 HSL Ser660과 Ser563 부위의 인산화를 저해함으로써 지방생성을 억제한다[38]. 분화된 지방세포에서PRF는 AMPKα Thr172의 인산화 및 하위인자인 ACCSer79 부위의 인산화를 촉진하여 AMPK/ACC 경로를 통해 지방산화를 촉진한다고 판단되지만, AMPK 활성화로인한 HSL의 활성 억제와 PMFs의 작용 기전에 관한 추가적인 연구가 필요하다고 사료된다. 본 연구결과는 진귤유래 PRF는 3T3-L1 지방세포에서 PKA/HSL 경로를 통한지방 분해와 AMPK/ACC 경로를 통한 지방산화를 촉진하는 활성을 나타내고 있어 항비만 소재로 활용 가능성을제시해 준다.</p>