계통발생학적 분석을 하기 위하여 엽록체 전장 유전체 염기열을 NCBI로부터 획득하여 비교한 뒤 계통수를 작성했다. Sbrevicaule을 포함하여 총 8개의 종류에 엽록체 전장 유전체 염기서열을 중심으로 한 다중 정렬의 결과를 구명 된 S. brevicaule 특징적 SNP으로 S. brevicaule 특이성 검사가 진행 되었다. PCR의 결과로 핵산 염색용액인 RedSafe를 활용하여 1% agarose gel에서 확인되었으며, PCR 결과물을 상대로 제한효소를 처리하여 같은 방법으로 agarose gel에서 확인한 후 PCR기반의 S.brevicaule 특징적 분자마커 개발했다.
<h2>엽록체 전장유전체의 비교</h2> <p>S. brevicaule 의 계통발생학적 분석을 위해 S. brevicaule 엽록체 전장 유전체 염기서열을 NCBI (the National Center for Biotechnology Information)로부터 얻은 Capsicum anmuam (JX270811), S. berthaultii (KY419708), S. bulbocastamum (DQ347958), S. chacoense (MF471371), S. commersonii (KM489054), S. demissum (MK036508), S. hougasii (MF471372), S. lycopersicum (NC007898), S. nigrum (KM489055), S. stoloniferum (MF471373), S. tuberosum 과 비교하여 계통수를 작성하였다. 엽록체 코딩 서열을 기반으로 Kimura 2-parameter 모델을 적용한 Maximum likelihood 방법이 이용되었으며, 1,000 번의 Bootstrap 옵션으로 MEGA 6.0 프로그램을 이용하여 분석이 진행되었다(Tamura et al. 2013).</p> <p>S. brevicaule 특이적 분자마커 개발을 위해 S. brevicaule 엽록체 전장 유전체 염기서열은 NCBI로부터 얻은 S. acaule (MK036506), S. bulbocastamum (DQ347958), S. chacoense(MF471371), S. commersonii (KM489054), S. demissum (MK036508), S. stolonioferum (MF471373), S. tuberosum (KM489056)의 엽록체 전장 유전체 염기서열과 EMBL (http://www.ebi.ac.uk/Tools/ msa /clustalw2)의 ClustalW2에 의해 다중 정렬하여 염기서열을 비교 분석하여 S. brevicaule 특이적 영역대를 구명하였다.</p> <h2>PCR 기반의 분자마커 개발</h2> <p>S. brevicaule을 포함한 총 8 종의 엽록체 전장 유전체 염기서열을 대상으로 한 다중 정렬의 결과로 구명 된 S. brevicaule 특이적 SNP를 대상으로 S. brevicaule 특이성 검증이 수행 되었다. 우선, 8종의 다중 정렬 결과로 구명된 SNP를 대상으로 dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)을 이용하여 S. brevicaule 특이적으로 작용하거나 S. brevicaule 를 제외한 다른 Solamum 종들에 특이적으로 작용하는 제한효소를 확인한 후, 각각의 SNP 영역을 포함하는 프라이머를 제작하였고, S. brevicaule와 S. tuberosum을 포함하여 총 21 개의 유전자 계통, S. brevicaule (SB2-1 및 SB2-17), S. tuberosum (감자품종 '서홍(Seohong)', '하령(Haryeong)', '대지(Daeji)', 및 감자품종 육성계통 PT56), S. acaule SA, S . berthaultii (SB1), S. candolleamum (SC4), S. cardiophyllum SC1, S . commersonii (SC2), S. demissum (SD), S. iopetalum (SI), S. kurtziamum (SK), S. jamesii (SJ), S. microdontum (SM2), S. mochiquense (SM1), S . pinnatisectum (SP), S. stoloniferum (SS), S. vernei (SV2) and S. verrucosum (SV1)을 대상으로 총 \( 25 \mathrm { ul } \) 볼륨(약 \( 20 \mathrm { ng } \) genomic DNA, \( 0.5 \mathrm { mM } \) dNTPs, \( 10 \mathrm { pMol } \) each primer, \( 1 \mathrm { U } \) Taq polymerase (Genetbio, Daejeon, South Korea))으로 Thermocycler (Biometra, Göttingen, Germany)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR의 결과는 핵산 염색용액인 RedSafe (Intron Biotechnology, Seongnam, South Korea)를 이용하여 \( 1 \% \) agarose gel에서 확인하였으며, PCR 결과물을 대상으로 제한효소를 처리한 후, 동일한 방법으로 agarose gel에서 확인하여 PCR기반의 S. brevicaule 특이적 분자마커 개발을 진행하였다.</p>