Haverkata-Trass의 fibrin plate법에 따라 gelatin, fibrinogen, borate 완충 용액과 thrombin이 포함된 petri-dish에 paper disc에 훕입시킨 효소용액을 놓고 \(\mathrm{37^{\circ} C}\)에서 18시간 방치하여 fibrin막의 용해면적을 측정하여 상대적인 활성을 측정하였다. 분리된 단백질의 분자량은 전기영동하여 결정하고, 효소의 활성에 미치는 pH의 영향을 알아보기 위해 농축한 효소를 다양한 pH로 조정하여 24시간 방치한 후 잔존활성을 측정하였다.
<h3>혈전용해 활성의 측정(fibrin plate assay)</h3> <p>Haverkata-Trass의 fibrin plate법에 따라 \( 2 \% \) gelatin 용액에 녹인 \( 0.2 \% \) fibrinogen 용액 \( 10 \mathrm { ml } \) 에 \( 0.2 \mathrm { M } \) borate 완충 용-액 \( ( \mathrm { pH } 7.8 \) )에 녹인 thrombin 20 unit를 적하하여 잘 섞은 후 이를 petri-dish에 부어 fibrin막을 만들었다. 효소용액을 \( 100 \mu 1 \) 씩 paper disc 에 훕입시켜 plate에 놓고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 18시간 방치 하였다. 효소에 의해 fibrin막이 용해되면 용해면적을 측정하여 상대적인 활성을 측정하였다. Fibrin plate는 plasminogen이 제거된 fibrinogen과 plasminogen이 포함된 fibrinogen을 이용하여 두 가지 방법으로 준비하였다.</p> <h3>분자량 측정</h3> <p>분리된 단백질의 분자량은 전기영동을 실시하여 결정 하였으며 전기영동은 \( 4 \% \) stacking gel 과 \( 12.5 \% \) separating gel로 이루어진 SDS-PAGE를 사용하여 \( 100 \mathrm { ~V } \) 에서 2시간 동안 전기영동한 후 gel을 coomassie로 염색하였다. 분자량 측정을 위해 low molecular weight standard (Bio-rad)를 사용하였다.</p> <h3>효소활성에 대한 pH의 영향</h3> <p>효소의 활성에 미치는 \( \mathrm { pH } \) 의 영향을 알아보기 위해 농축한 효소를 \( 20 \mathrm { mM } \) sodium citrate buffer \( ( \mathrm { pH } 3.0,4.0,5.0) \), \( 20 \mathrm { mM } \) potassium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } 6.0,7.0), 20 \mathrm { mM } \)Tris- \( \mathrm { HCl } \) buffer ( \( \mathrm { pH } 8.0 \) ), \( 20 \mathrm { mM } \) sodium carbonate buffer \( ( \mathrm { pH } 9.0,10.0) \) 로 희석하여 \( \mathrm { pH } \) 별로 조정한 다음, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24시간 방치한 후 잔존활성을 측정하였고, 최적 반응 \( \mathrm { pH } \) 는 각 \( \mathrm { pH } \) 별로 조정된 효소액을 사용하여 효소활성의 \( \mathrm { pH } \) 의존성을 검토하였다.</p>