\( C_{a}=\frac{\left(12.3 D_{663}-0.86 D_{645}\right) \times V}{d \times 1000 \times W} \) \( C_{b}=\frac{\left(19.3 D_{645}-3.60 D_{663}\right) \times V}{d \times 1000 \times W} \)는 각각 엽록소 \(\mathrm{a}\)와 엽록소 \(\mathrm{b}\)의 함량을 말하며 \(\mathrm{D}\)는 광밀도 \(\mathrm{V}\)는 용액 부피 \(\mathrm{W}\)는 잎의 무게 \(\mathrm{d}\)는 빛의 경로이다. 또한 엽록소 분석과 같은 방식으로 Brassica oleracea var.italica 잎 잎을 채취하여 프롤린 함량을 분석했다.
<h2>잎의 엽록소 함량 분석</h2> <p>스트레스에 의한 엽록소 함량 변화를 평가하기 위해, 대조구, 저온 및 고온 처리 후에 Brassica oleracea var. italica 잎을 무작위로 채취하였다. 채취한 잎을 증류수로 세척한 다음 작은조각으로 분쇄하였다. 신선한 잎(FW) \( 0.5 \mathrm{~g} \) 을 \( 50 \mathrm{~mL} \) 코니컬 튜브에 넣고 \( 25 \mathrm{~mL} \)의 \( 80 \% \) 아세톤을 첨가하였다. 코니컬 튜브를 흔들어 24시간 동안 암조건에 두었다. \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) 실린지 필터로 여과한 후, UV/Vis 분광 광도계(Orion AquaMate 7000, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 \( 80 \% \) 아세톤을 blank로 하여 645 및 \( 665 \mathrm{~nm} \)에서의 흡광도를 측정하였다. 식물 잎의 엽록소 a 및 b 함량은 Maclachlan 및 Zalik의 방정식에 따라 계산하였다.</p> <p>\( C_{a}=\frac{\left(12.3 D_{663}-0.86 D_{645}\right) \times V}{d \times 1000 \times W} \)<caption>(2)</caption></p> <p>\( C_{b}=\frac{\left(19.3 D_{645}-3.60 D_{663}\right) \times V}{d \times 1000 \times W} \)<caption>(3</caption></p> <p>\( \mathrm{C}_{\mathrm{a}} \)는 엽록소 \( \mathrm{a} \) 함량 \( (\mathrm{mg} / \mathrm{g} \mathrm{FW}), \mathrm{C}_{\mathrm{b}} \) 는 엽록소 \( \mathrm{b} \) 함량 \( (\mathrm{mg} / \mathrm{g} \)\( \mathrm{FW}), \mathrm{D} \)는 표시된 파장에서의 광밀도, \( \mathrm{V} \)는 최종 용액 부피 \( (\mathrm{mL}) \), \( \mathrm{W} \)는 신선한 잎의 무게 \( (\mathrm{g}), \mathrm{d} \) 는 빛의 경로 \( (\mathrm{cm}) \)이다.</p> <h2>잎의 프롤린 함량 분석 및 식물 건조 중량 측정</h2> <p>엽록소 분석과 동일한 방식으로 Brassica oleracea var. italica 잎을 채취하였다. 잎을 증류수로 세척하고 작은 조각으로 분쇄했다. 프롤린 함량은 Bates et al. 이 제안한 acid-ninhydrin reagent ( \( 2.5 \mathrm{~g} \) ninhydrin, \( 60 \mathrm{~mL} \) glacial acetic acid 및 \( 40 \mathrm{~mL} \)\( 6 \mathrm{M} \) phosphoric acid)으로 추출한 후 비색법을 사용하여 분석하였다. \( 50 \mathrm{~mL} \) 코니컬 튜브에 \( 10 \mathrm{~mL} 3 \% \) sulfosalicylic acid와\( 0.5 \mathrm{~g} \) 의 신선한 잎 \( (\mathrm{FW}) \)을 혼합하고 초음파분산기에서 30분 동안 반응시켰다. 추출된 용액을 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분 동안 \( 4000 \mathrm{rpm} \)으로 원심 분리하고 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) 실린지 필터로 여과하였다. 여과액 \( 2 \mathrm{~mL} \)를 \( 2 \mathrm{~mL} \)의 acid-ninhydrin reagent 및 \( 2 \mathrm{~mL} \)의 glacial acetic acid와 혼합하고 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 가열하였다. 얼음물에서 샘플을 냉각시킨 후, \( 4 \mathrm{~mL} \)의 톨루엔을 용액에 첨가하고 20초 동안 교반하였다. 발색단을 함유하는 톨루엔을 수성상으로부터 분리하고 UV/Vis 분광 광도계를 사용하여 톨루엔을 blank로 하여 \( 520 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 프롤린 농도는 표준 곡선 \( (0-500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \)을 만든 후, 신선한 잎 중량을 기준으로 계산하였다.</p> <p>Brassica oleracea var. italica를 온도 스트레스 조건에 노출시키고 식물 반응과 환경 조건을 모니터링 한 후 잎, 줄기, 뿌리로 나누어 증류수로 세척한 다음 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 오븐에서 건조 후 중량을 측정하였다.</p>