Total RNA를 이용하여 RT-PCR을 실시하여 \( \mathrm { Cu } / \mathrm { Zn } \) SOD 및 \( \beta \)-actin probe을 생성했다. 그 결과 \( 446 \mathrm { ~bp } , \beta \)-actin은 \( 1 \mathrm { ~kb } \)의 밴드로 확인되었고, TOPO vector에 삽입하여 transformation 시킨 후 EcoRI로 digestion하여 \( \mathrm { Cu } / \mathrm { Zn } \) SOD 및 \( \beta \)-actin probe이 생성되었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>\( \mathrm { Cu } / \mathrm { Zn } \) SOD 및 \( \beta \)-actin probe의 제작</h2> <p>배양한 세포에서 추출한 total RNA \( 15 \mu \mathrm { g } \)을 이용하여 합성한 first cDNA를 template로 하여 RS-1, RS-2 primers를 이용하여 RT-PCR을 수행하고 \( 1 \% \) agarose gel에서 전기 영동하였다. 그 결과 \( \mathrm { Cu } / \mathrm { Zn } \) SOD은 \( 446 \mathrm { ~bp } , \beta \)-actin은 \( 1 \mathrm { ~kb } \)의 밴드로 확인되었다. 이러한 PCR product를 TOPO vector에 삽입하여 transformation 시킨 후, 플라스미드를 추출하여 EcoRI으로 digestion하여 \( 1 \% \) agarose gel에 전기 영동하였다. 그 결과 \( 3.9 \mathrm { ~kb } \)의 TOPO vector에 \( 446 \mathrm { ~bp } \)의 \( \mathrm { Cu } / \mathrm { Zn } \) SOD in-sert DNA가 transformation 되었음을 확인하였다.</p> <h2>Northern blot analysis</h2> <p>유전자의 발현 정도를 비교하기 위하여 housekeeping 유전자인 \( \beta \)-actin을 선택하여 동일한 조건으로 Northern blot 분석을 수행하였다. \( \mathrm { Cu } / \mathrm { Zn } \) SOD는 \( 600 \mathrm { ~bp } \)의 위치에서 밴드가 확인되었다. 강력한 산화력을 지니는 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)를 30 분 처리했을 경우, 5 passage에서는 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)의 농도를 증가시켜도 비슷한 양상을 보였다. 15 passage의 경우 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)를 \( 500 ~ \mu \mathrm { M } , 1 \) \( \mathrm { mM } , 5 \mathrm { ~mM } \)로 각각 처리했을 때, \( \mathrm { Cu } / \mathrm { Zn } \) SOD의 발현양이 점차 증가하였다. 25 passage에서 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)를 \( 1 \mathrm { ~mM } \)과 \( 5 \mathrm { ~mM } \)로 각각 처리 했을 때, \( \mathrm { Cu } / \mathrm { Zn } \) SOD의 발현양이 가장 많은 것으로 나타났으며, 노화가 충분히 진행된 35 passage에서는 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)의 농도를 증가시켜도 \( \mathrm { Cu } / \mathrm { Zn } \) SOD의 발현에서는 큰 차이를 보이지 않았다.</p>