시약으로는 유전자 클로닝을 위한 대장균 세포를 사용하였으며, LB배지를 이용하여 배양하였고 효모 배양에는 YPD 배지를 이용하였다. Subpeptin JM4-A와 Subpeptin JM4-B의 유전자는 외부에 의뢰하여 합성햐였고, 그 후 클로닝 및 효모세포의 형질전환을 진행 및 측정하여 생육 억제환을 비교 및 관찰하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약 및 배지</h2> <p>제한효소, T4 polynucleotide kinase, DNA ligation kit ver. 2, Taq DNA polymerase는 Takara Korea (Seoul, Korea)에서 구입하였다.</p> <p>유전자 클로닝을 위한 숙주로는 대장균 세포(E. coli DH5a)롤 사용하였다. 대장균은 LB 배지(1\% bacto tryptone, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 0.5 \% \mathrm{NaCl}) \) 를 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하였다. 대장균 형질전환체의 선별을 위해서는 LB 배지에 ampicillin을 최종농도가 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 가 되게 첨가하여 사용하였다. 고체배지는 LB 배지에 한천(agar)을 \( 1.5 \% \) 가 되도록 첨가하여 제작하였다.</p> <p>효모의 배양에는 YPD 배지(1\% yeast extract, \( 2 \% \) polypeptone, \( 2 \% \) D-glucose)를 사용하였다. 효모의 발현 플라스미드는 alcohol dehydrogenase promoter (ADH)에 의해 발현이 유도되는 pAUR123 (Takara Korea, Seoul Korea)을 사용하였다.</p> <h2>Subpeptin JM4-A 및 Subpeptin JM4-B 유전자의 클로닝 및 효모세포의 형질전환</h2> <p>박테리오신 Subpeptin JM4-A와 Subpeptin JM4-B의 유전자는 문헌고찰을 통해 확보된 DNA 염기서열을 토대로 (주)바이오니아(Seoul, Korea)에 의뢰하여 합성하였다. Subpeptin JM4-A와 Subpeptin JM4-B 유전자의 용이한 클로닝 및 발현을 위하여 유전자의 5' 말단에 제한효소 XbaI 인식부위와 개시코돈 ATG를, 그리고 3' 말단에 종지코돈 TAA와 제한효소 XhoI 인식부위를 도입하여 oligonucleotide들을 화학합성하였다. 제작된 oligonucleotide들을 annealing하여 이중가닥 DNA로 만든 후, 효모발현 벡터 pAUR123의 XhoI과 XbaI 부위에 연결하였다. 유전자 클로닝을 위한 숙주로는 대장균 세포(E. coli \( \mathrm{DH} 5 \) a )를 사용하였다. 대장균(E. coli \( \mathrm{DH} 5 \) a )에서 플라스미드 DNA를 분리하고 제한효소 Xhol과 XbaI으로 삽입된 \( 48 \mathrm{bp} \) 의 Subpeptin JM4-A와 Subpeptin JM4-B 유전자 단편을 확인하였다. 구축된 발현 플라스미드를 각각 pAUR-SubpA과 pAUR-SubpB로 명명하고 효모(S. cerevisiae KCTC 7913)의 형질전환은 electroporation (Cell-Porator, Life technologies, MD, USA)법으로 행하였다. 형질전환된 효모의 선별은 YPD 배지( \( 1 \% \) yeast extract, \( 2 \% \) polypeptone, \( 2 \% \) D-glucose)에 aureobacidin A (Takara Korea, Seoul Korea)를 최종농도가 \( 0.2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 가 되게 첨가한 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3 일간 배양하여 행하였다.</p> <h2>Subpeptin JM4-A 및 Subpeptin JM4-B를 생산하는 형질전환 효모의 항균활성 측정</h2> <p>그람양성 대표세균인 고초균(B. subtilis ATCC 6633)과 그람음성 장내세균인 대장균(E. coli KCTC 2223), 그람음성 녹농균(P. aeruginosa KCTC 2004)을 LB 배지를 이용하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤 배양하고, 사용직전에 이를 100 배로 희석하였다. 균 희석액을 YPD 고체배지에 도말하였고, 여기에 pAUR-SubpA 및 pAUR-SubpB가 도입된 형질전환 효모와 대조군으로 효모의 발현벡터(pAUR123)가 도입된 형질전환 효모의 배양액을 각각 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 씩 일정부위에 접종하였다. 이를 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 하룻밤 동안 배양한 후 항균작용에 의해 형성된 생육 억제환(clear zone)을 비교 - 관찰하였다.</p>