배지에서 \(37^{\circ}C\)에서 24시간 진탕 배양한 후 원심분리와 여과를 거쳐 조효소액을 얻었다. Lipase 활성은 p-nitrophenyl palmitate (\(pNPP\))를 사용하여 측정하였다. 조효소액의 온도 안정성을 평가하기 위해, 조효소액과 기질, 완충액을 섞은 후 여러 온도에서 1시간 반응시킨 후 잔존 효소 활성을 측정하였다. 또한, 고정화 리파아제인 novozyme 435를 사용하여 효소의 안정성을 비교하였다.
<h2>조효소액 조제</h2> <p>\( \mathrm { NB } \) 배지에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 시간 진탕 배양하여 얻은 배양액을 원심분리 \( (10,000 \times g, 15 \mathrm { ~min } ) \) 한 후, 배양 상등액을 mem-brane filter \( (0.22 \mu \mathrm { m } ) \) 로 여과 한 후 조효소액으로 사용하였다.</p> <h2>Lipase 활성도 측정</h2> <p>Lipase의 활성은 기질인 p nitrophenyl palmitate ( \( p \mathrm { NPP } ) \) 를사용하여 측정하였다[25]. 즉, 조효.소액에 \( 50 \mathrm { mM } \) pNPP 10μll과 \( 0.1 \mathrm { M } \) Tris- \( \mathrm { HCl } \) 완충액 \( \left ( \mathrm { pH } \right . \) 8) \( 0.9 \mathrm { ml } \) 을 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분간 반응시킨 후 spectrophotometer를 이용하여 \( 410 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 이때 조효소액을 첨가하지 않은 용액을 대조구로 사용하였다.</p> <p>효소활성은 \( p \mathrm { NPP } \) 로부터 1분 동안 1 μmol의 pnitrophenol \( ( \mathrm { NPP } ) \) 을 생산하는데 관여하는 효소의 양을 1 unit로 정의하였다.</p> <h2>효소의 온도와 \( \mathrm { pH } \) 안정성 조사</h2> <p>조효.소액의 온도 안정성을 조사하기 위하여 조효.소액과 기질, 완충액을 혼합한 효소혼합액을 \( 30,40,50,60,70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 시간 반응시킨 후 \( 410 \mathrm { ~nm } \) 에서 잔존 혀소 활성을 측정하였다. 또한 조효소액의 \( \mathrm { pH } \) 안정성을 조사하기 위하여 \( 0.1 \mathrm { M } \) sodiumacetate \( ( \mathrm { pH } 4-5), 0.1 \mathrm { M } \) potassium phosphate \( ( \mathrm { pH } \) 6-7), 그리고 \( 0.1 \mathrm { M } \) Tris- \( \mathrm { HCl } ( \mathrm { pH } 8-10) \) 완충액을 사용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24시간 반응한 후 효소의 잔존 활성을 측정하였다. 양성대조구로 고정화 리파아제인 novozyme 435 (Novozyme, Denmark)를 사용하여 효소의 안정성을 비교하였다.</p>