고초균과 대장균을 LB배지로 배양하고, 프로모터를 가진 박테리오신 생산 플라스미드 DNA를 도입한 효모를 사용하여 항균활성을 측정하였고, S. cerevisiae의 염색체 DNA로부터 GPD 프로모터 유전자의 단편을 PCR법에 의해 증폭하고, pBT-1.1 vector에 연결하여 pBT-GPDp를 제작하였으며, 구축된 박테리오신 생산 재조합 플라스미드 DNA로 효모를 형질전환시켜 항균활성 효모를 제작하였고, 이를 통해 \( 748 \mathrm { ~bp } \)의 GPD 프로모터 유전자의 단편을 확인할 수 있었다. 그리고 항균활성을 측정하여 형성된 생육억제환(clear zone)을 비교◦관찰하였다.
<h2>항균활성 측정</h2> <p>그람양성 대표세균인 고초균(B. subtilis ATCC 6633)과 그람 음성 장내세균인 대장균(E. coli KCTC 2223)을 LB 배지를 이용하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 하룻밤 동안 진탕배양(250 rpm)하고, 사용하기전에 이를 100배로 희석하였다. 균 희석액을 YPD 고체배지에 도말하였고, 여기에 프로모터를 가진 박테리오신 생산 플라스미드 DNA가 도입된 형질전환 효모와 대조군으로 효모의 발현벡터 pAUR123에 GPD 프로모터만 삽입한 플라스미드 DNA가 도입된 형질전환 효모, 기존에 개발한 ADH 프로모터만을 가진 박테리오신 생산 플라스미드 DNA가 도입된 형질 전환 효모 배양액을 각각 \( 20 \mu \mathrm { l } \) 씩 일정부위에 접종하고 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 하룻밤 동안 배양한 후 항균작용에 의해 형성된 생육억제환(clear zone)을 비교◦관찰하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>GPD 프로모터 유전자의 클로닝 및 확인</h2> <p>S. cerevisiae의 염색체 DNA로부터 PCR법에 의해 \( 748 \mathrm { ~bp } \)의 GPD 프로모터 유전자의 단편을 증폭하였고, 이를 pBT-1.1 vector에 연결하여 pBT-GPDp를 제작하였다. 삽입된 유전자 단편의 염기서열을 분석한 결과, 5' 및 3'말단에서 제한효소 KpnⅠ 부위를 확인할 수 있었으며, S. cerevisiae의 GPD 프로모터 유전자임을 확인할 수 있었다.</p> <h2>GPD 프로모터 유전자의 단편이 삽입된 박테리오신 생산 재조합 플라스미드 DNA의 구축 및 항균활성 효모의 제작</h2> <p>pBT-GPDp를 제한효소 KpnⅠ으로 절단하여 \( 748 \mathrm { ~bp } \)의 GPD 프로모터 유전자의 단편을 획득하였고, 이를 pAUR123과 선행연구에서 개발한 박테리오신 발현 플라스미드 DNA들의 제한효소 KpnⅠ 부위에 삽입하여 이를 각각 pAURG, pAURG-SubpA, pAURG-SubpB 및 pAURG-OR-7이라 명명하였다. 구축된 박테리오신 생산 재조합 플라스미드 DNA로 효모 세포(S. cerevisiae)를 형질전환시켜 항균활성 효모를 제작하였으며, 이로부터 분리된 플라스미드 DNA를 제한효소 KpnⅠ으로 절단하여 확인한 결과, \( 748 \mathrm { ~bp } \)의 GPD 프로모터 유전자의 단편을 확인할 수 있었다.</p> <h2>형질전환 효모의 항균활성 비교</h2> <p>재조합 플라스미드 DNA인 pAURG, pAURG-SubpA, pAURG-SubpB 및 pAURG-OR-7이 도입된 형질전환 효모들을 이용한 항균활성을 선행연구에서 보고한 pAUR123, pAUR-SubpA, pAUR-SubpB 및 pAUR-OR-7이 도입된 형질전환 효모들과의 항균활성을 비교한 결과, ADH 프로모터에 의해 박테리오신 유전자를 발현시키는 기존의 형질전환 효모들에 비해 본 연구를 통해 개발된 GPD 프로모터에 의해 박테리오신 유전자를 발현시키는 형질전환 효모들에서 전반적으로 세균에 대한 높은 생육억제능을 나타내는 것을 확인하였다. 박테리오신 유전자를 가지지 않는 효모발현 vector 인 pAUR123과 pAURG를 도입시킨 형질전환 효모들의 경우는 세균에 대한 생육억제를 나타내지 않았다. GPD프로모터에 의해 박테리오신 유전자의 발현이 유도되는 pAURG-OR-7 플라스미드 DNA가 도입된 형질전환 효모의 세균생육 억제환의 크기를 기존의 ADH 프로모터에 의해 박테리오신 유전자의 발현이 유도되는 pAUR-OR-7 플라스미드 DNA가 도입된 항균활성 효모의 세균생육 억제환과 비교한 결과, 그람양성 고초균에 대한 생육 억제환은 \( 3.2 \mathrm { ~mm } \) 정도 더 증가되었으며, 그람음성 대장균에 대한 생육 억제환은 \( 4.1 \mathrm { mm } \) 정도 더 증가된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 역시 GPD 프로모터에 의해 박테리오신 유전자의 발현이 유도되는 pAURG-SubpA 및 pAURG-SubpB 플라스미드 DNA가 도입된 형질전환 효모들의 세균생육 억제환의 크기를 기존의 ADH 프로모터에 의해 박테리오신 유전자의 발현이 유도되는 pAUR-SubpA 및 pAUR-SubpB 플라스미드 DNA가 도입된 형질전환 효모들의 세균생육 억제환과 비교한 결과, 그람양성 고초균에 대한 생육 억제환은 각각 \( 7.3 \mathrm { ~mm } \) 및 \( 2.8 \mathrm { ~mm } \) 정도 더 증가하였으며, 그람음성 대장균에 대한 생육 억제환도 각 각 \( 4.4 \mathrm { ~mm } \) 및 \( 1.9 \mathrm { ~mm } \) 정도 더 증가한 것을 확인할 수 있었다.</p>