본 연구에서 사용된 quercetin hydrate: Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, dimethyl sulfoxide에 10 \( \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 농도로 용해한 뒤 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관했다. 배양접시에 세포가 70-\( 80 \% \) 로 증식하면 Trypsin-EDTA Solution, 1X (Welgene)을 이용하여 배양 접시에 부착된 세포를 분리해 계대 배양했다. Cell counting kit- 8 (CCK-8 assay, DogenBio, Seoul, Korea) 방법으로 세포독성을 평가했다. HaCaT세포주를 6-well plate에 \( 4.0 \times 10^{5} \) cells/well로 분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{CO}_{2} 5 \% \) 배양기에서 24시간 동안 안정화시켰다. HaCaT 세포주를 6-well plate에 \( 8.0 \times 10^{5} \mathrm{cells} / \mathrm{well} \)로 분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{CO}_{2} 5 \% \) 배양기에 24시간 동안 안정화하고, serum-free 배지조건에서 TNF-\( \alpha(20 \mathrm{ng} / \mathrm{mL}) \)와 quercetin을 농도별로 처리했다.
<h2>재료 및 방법</h2> <h3>시약</h3> <p>본 연구에서 사용된 quercetin hydrate: Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, dimethyl sulfoxide에 10 \( \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 농노로 용해한 뒤 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다. \( \mathrm{TNF}-\alpha \)는 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, IL-17A는 R&D systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였으며, 모두 PBS (Welgene, Gyeongbuk, Korea) buffer에 녹여 사용하였다.</p> <h3>세포배양</h3> <p>\( \mathrm{HaCaT} \) 세포주(Human keratinocyte cell lines)는 고려대학교 (Seoul, Republic of Korea)에서 분양 받았으며, Dulbecco's modified Eagle's medium (Welgene, Gyeongbuk, Korea)에 \( 10 \% \) Fetal bovine serum (Welgene)과 1\% Penicillin-Streptomycin (Gibco, Grand Island, NY, USA)을 혼합한 배지를 이용해 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{CO}_{2} 5 \% \) 조건에서 배양하였다. 배양 접시에 세포가 70-\( 80 \% \) 로 증식하면 Trypsin-EDTA Solution, 1X (Welgene)을 이용하여 배양 접시에 부착된 세포를 분리시켜 계대 배양 하였다.</p> <h3>세포독성 실혐</h3> <p>Cell counting kit- 8 (CCK-8 assay, DogenBio, Seoul, Korea) 방법으로 세포독성을 평가하였다. \( \mathrm{HaCaT} \) 세포를 24-well plate 에 \( 5.0 \times 10^{4} \mathrm{cells} / \mathrm{well} \) 로 분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{CO}_{2} 5 \% \) 배양기에서 24시간 동안 안정화시켰다. 이때 serum-free 배지를 이용하여 quercetin을 농노별로 희석하여 분주한 뒤 최대 72 시간 동안 배양하였다. 기존 배지를 제기한 후 phenol red-free 배지와 \( \mathrm{CCK}-8 \) 용액을 각각 \( 10: 1 \) 로 혀석하여 well에 \( 500 \mu \mathrm{L} \) 씩 분주하였고 30 분간 반응시킨 후 상등액만 별도로 채취하여 \( 450 \mathrm{~nm} \)조건에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 아래 수식에 따라 측정되었다.</p> <p>Cell viabilit\( \mathrm{y}(\%)=\left(\frac{O D_{\text {sample }}^{a}-O D_{\text {blank }}{ }^{b}}{O D_{\text {sample }}^{c}-O D_{\text {blank }}}\right) \times 100 \)</p> <ol type=a start=1><li>Quercetin 처리군의 흡광도</li> <li>CCK-8 solution의 흡광도</li> <li>대조군의 흡광도</li></ol> <h3>RNA 추출 분리 및 real time RT-PCR</h3> <p>\( \mathrm{HaCaT} \) 세포주를 6-well plate에 \( 4.0 \times 10^{5} \) cells/well로 분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{CO}_{2} 5 \% \) 배양기에서 24 시간 동안 안정화시컸다. 이때 건선 유발을 위해 TNF- \( \alpha \) (Sigma aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 IL-17A (R\&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 각각의 농도 조건에서 치리한 후 serum-free 배지 조건에서 quercetin을 각 농도별로 동시 치리하였다. TRIzol reagent (Ambion, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 total RNA를 추출하고, Revertra ACE kit (Toyobo, Osaka, Japan)를 사용하여 cDNA로 역전사하였다. PCR 반응은 tepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 장비를 이용하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} 2 \) 분, \( 95^{\circ} \mathrm{C} 10 \) 분 holding stage, \( 95^{\circ} \mathrm{C} 15 \) 초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} 1 \) 분 cycling stage로 총 45 회 실시하였다. 위 실험에서 사용한 probe들은 Table 1에 별도로 표기하였다.</p> <h3>Western blot을 활용한 단백질 발현의 분석</h3> <p>\( \mathrm{HaCaT} \) 세포주를 6-well plate에 \( 8.0 \times 10^{5} \mathrm{cells} / \mathrm{well} \) 로 분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{CO}_{2} 5 \% \) 배양기에서 24 시간 동안 안정화하고, serum-free 배지 조건에서 TNF- \( \alpha(20 \mathrm{ng} / \mathrm{mL}) \) 와 quercetin을 농도별로 처리<p>하였다. 기존 배지를 제기한 뒤 차가운 DPBS (Welgene)로 3회 washing 하였다. RIPA Buffer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), Protease and Phosphatase Inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific) 혼합액을 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 를 분주한 뒤 단백질을 추출하고 전기영동을 실시하였다. PVDF membrane에 transfer시킨 뒤 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 primary antibody (1:1000)를 치리하였다. 그 후 secondary antibody (1:10000)를 1시간 동안 처리한 뒤 ECL 용액(Bio-rad, Hercules, CA, USA)을 PVDF membrane 위에 분주하고, 이미지 처리 장치(MicroChemi 4.2, DNR, Neve Wamin, Israel)를 이용하여 단백질 발현을 관찰하였다. 이후 Image J 프로그렘(N.I.H, Bethesda, MD, USA)을 통해 단백질의 발현량을 정량화 하였다. 실험에서 사용된 모든 항체는 Table 2에 별도로 표기하였다.</p> <h3>통계처리</h3> <p>모든 실험은 3회 반복 측정을 실시하여 각 군별로 평균과 표준 편차를 사용해 표기 하였으며, Student's t-test를 활용하여 \( p \) 값이 \( 0.05 \) 미만일 때 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였다.</p>