실험에 사용된 노랑어리연꽃은 국내산으로 (주)로터스그린에서 2015년 11월에 구매되었다. 이 식물은 국립생물자원관 생물자원연구부의 확증표본을 통해 종 판별 시스템에 의해 확인되었다. 실험에는 Spectrostar Nano(BGM LabTech, Ortenberg, Germany)라는 microplate reader 장비와 LAS4000(Fuji Film, Tokyo, Japan) 제품인 Chemi-Doc이 사용되었다. CCD-986sk 세포에 대한 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물의 유효농도 결정을 위해 MTT assay를 사용하여 세포 생존율을 측정하였다.
<h1>재료 밎 방법</h1> <h2>재료 및 추출</h2> <p>본 실험에 사용된 노랑어리연꽃은 국내산으로 광주광역시에 소재한 농업회사법인 (주)로터스그린에서 2015년 11월 구매하여 사용하였으며, 국립생물자원관 생물자원연구부 식물자원과의 확증표본(NIBRVP000012545)으로 생물 종 판별 시스템에 의해 확인되었다. 노랑어리연꽃의 전초는 음건한 후 건조 시료 \( 200 \mathrm { ~g } \)을 실온에서 methyl alcohol \( ( \mathrm { MeOH } ) \) 에 3일 동안 침지시키고 이 과정을 3회 반복하여 농축 후 동결 건조하여 추출물 \( 21.5 \mathrm { ~g } \)을 얻었다. 노랑어리연꽃 추출물(16.4 g)은 증류수로 용해하고 유기 용매의 극성에 따라 \( n \)-hexane (Hex), methylene chloride (MC), ethyl aceate (EA) 및 \( n \)-butyl alcohol ( \( \mathrm { BuOH } ) \)을 순차적으로 가하여 각 분획물 \( (0.8,0.7,1.1,2.4 \mathrm { ~g } ) \)을 얻었다.</p> <h2>시약 및 기기</h2> <p>세포 독성 실험 및 배양을 위한 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5diphenyl-tetrazolium bromide(MTT)는 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA), Dulbeco's modified Eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS) 및 Penecillin Streptomycin (100X)는 Hyclone (Logan, UT, USA) 제품을 사용하였다. 유효성 평가를 위한 MMP-1, Pro-COL1A1, \( \beta \)-actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하여 사용하였으며, ROS-Glo \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) Go Script \( ^ {\mathrm { TM } } \) Reverse Trans-criptase, GoTaq \( { } ^ { Ⓡ } \) Flexi DNA Polymerase는 Promega(Madison, WI, USA) 제품을 MMP-1, Pro-collagen kit는 각각 Abcam (Cambridge, MA, USA), TaKaRa (Shiga, Japan)에서 구입하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 microplate reader 장비는 Spectrostar Nano(BGM LabTech, Ortenberg, Germany)를 사용하였으며, Chemi-Doc은 LAS4000(Fuji Film, Tokyo, Japan) 제품을 사용하였다.</p> <h2>세포배양 및 세포 생존율 측정</h2> <p>\( \mathrm { ATCC } \)에서 구매한 CCD-986sk (Human fibroblast) 세포를 \( 10 \% \) FBS, \( 1 \% \) penicillin streptomycin을 첨가한 DMEM으로 배양기에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \)조건으로 배양하였다. 본 실험에서 CCD-986sk 세포에 대한 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물의 유효농도를 결정하기 위해 세포생존율 측정은 MTT assay로 진행하였다. 배양된 CCD-986sk 세포를 48 well plate에 각각 \( 5 \times 10 ^ { 3 } \) cells/well로 접종하고 24시간 배양하였다. 동일 배지로 교체한 후 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물을 농도별 \( (5,10,25,50,75,100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \)로 희석하여 처리한 후 48시간 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 배양하였다. \( 5 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) \( \mathrm { MTT } \) 용액을 배양된 세포에 \( 20 \mu \mathrm { L } \) 씩 처리한 후 4시간 반응시켰다. 그 후 demethyl sulfoxide \( 100 \mu \mathrm { L } \) 넣은 후, 10분간 교반한 후 microplate reader로 \( 540 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>