가랑잎애기버섯, 밀버섯, 솔버섯, 황토볏짚버섯, 및 민자주방망이버섯은 경상북도 경산시 하양읍의 야산등 7곳과 제주도에서 채집한 민자주방망이버섯과 광릉에서 채집한 자주방망이버섯아재비를 각각 1종을 채집하였다. Genomic DNA 분리에 사용한 균사는 PDA배지에서 25일 간 배양한 균사를 사용하였고 PCR에 사용한 primer들의 code name과 sequence는 Table 1에 나타내었다. OTU 자료형렬 작성과 parsimony analysis, Heu-restic search방법을 이용하여 계통수를 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>채집 및 배양</h2> <p>가랑잎애기버섯, 밀버섯, 솔버섯, 황토볏짚버섯, 및 민자주방망이버섯은 경상북도 경산시 하양읍의 야산등 7곳과 제주도에서 채집한 민자주방망이버섯과 광릉에서 채집한 자주방망이버섯아재비를 각각 1종을 채집하였다. 민자주방망이버섯과 자주방망이버섯아재비 외에 가랑잎애기버섯, 밀버섯, 솔버섯, 졸각버섯, 만가닥버섯 등을 비교 분석 재료로 하였다. 채집한 버섯의 주름살 일부분 떼어 potato dextrose agar (PDA) 배지에서 접종하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 배양하였다. 배양된 균사는 감자연결, 모양, 색깔 등을 보고 기존의 문헌에서 서술된 내용과 일치되는 균사를 분리하여 계대배양 하였고, 그중 같은 시기에 계대한 균주를 분리하여 실험에 사용하였다.</p> <p>일반적으로 버섯균사의 배양실험에 많이 사용하는 PDA 배지를 선정하였다. PDA배지는 PDA \( 39.0 \mathrm{~g} / \mathrm{L}\), \(\mathrm{pH} 5.4 \)로 조제하여 \( 121^{\circ} \mathrm{C}\), 1.5 기압에서 30분간 멸균하고, clean bench 하에서 멸균된 직경 \( 87 \mathrm{~mm} \)의 petri dish에 \( 50 \mathrm{ml} \) 씩 분주하여 완전히 식힌 후, 직경 \( 5 \mathrm{~mm} \)의 Cork borer로 자른 후 접종하였다. 접종 후 \( 25 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \)의 incubator에서 25일간 배양하였다.</p> <h2>Genomic DNA의 분리</h2> <p>Genomic DNA 분리에 사용한 균사는 PDA배지에서 25일 간 배양한 균사를 사용하였다. DNA분리 방법은 Yoon 등의 방법을 약간 변형시켜, 배양한 균사체의 약 \( 0.5 \mathrm{~g} \)을 액체질소로 동결시켜 유발로 갈아서, 마쇄한 분말을 \( 1.5 \mathrm{ml} \) eppendorf tube에 옮기고, lysis buffer [ \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-HCl \((\mathrm{pH} 7.2)\), \( 50 \mathrm{mM} \) EDTA \( (\mathrm{pH} 8.0)\), \(3\%\) sodium dodecyl sulfate (SDS), \(1 \% \) 2-mercatoethanol] \( 500 \mu \mathrm{l} \)를 넣어서 잘 섞고, \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) water bath에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 중에는 10분마다 두 세번씩 뒤집어서 섞어주었다. 다음에는 \( 15,000 \mathrm{rpm} \)에서 15분간 원심분리하고 상층액을 micropipet으로 채취하여 다른 \( 1.5 \mathrm{ml} \) tube에 옮겼다. 채취한 양과 동량의 phenol-chloroform-isoamylalcohol (25: 24: 1)을 넣어 잘 섞은 뒤, \( 15,000 \mathrm{rpm} \)에서 5분간 원심 분리하였다. 상층액을 채취하여 새 tube에 옮긴 후 채취액의 2배의 냉장보관한 \( 70 \% \) ethanol을 넣고 \( 15,000 \mathrm{rpm} \)에서 3분간 원심 분리하여 DNA를 침전시켰다. pellet을 확인한 후, 상층액을 제거하고 실온에 20분 정도 건조시킨 다음, TE buffer \( [10 \mathrm{mM} \) Tris-HCl \((\mathrm{pH} 8.0)\), \( 1 \mathrm{mM}\) EDTA \((\mathrm{pH} 8.0)]\) \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 넣어서 DNA를 용해시킨 후 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하여 PCR 반응용액의 주형 DNA로 사용하였다.</p> <h2>PCR 반응액의 조성과 PCR 조건</h2> <p>PCR에 사용한 primer들의 code name과 sequence는 Table 1에 나타내었다. 대체로 \( \mathrm{G}-\mathrm{C} \)의 함량이 \( 60 \sim 70 \% \)이었다. PCR을 위한 반응 혼합액의 조성은 Taq polymerase \( 1 \mathrm{U} \), Tris-HCl \((\mathrm{pH} 9.0)\) \( 10 \mathrm{mM} \), dNTPs mixture \( 250 \mu \mathrm{M}\), \(\mathrm{KCl} ~40 \mathrm{mM}\), \(\mathrm{MgCl}_{2} ~1.5 \mathrm{mM} \)였고 여기에 genomic DNA \( 1.0 \mu \mathrm{l} \) primer \( 2.0 \mu \mathrm{l} \) (Genotech)를 넣고 3차 증류수를 \( 20 \mu \mathrm{l} \)까지 채웠다. PCR에 사용한 thermal cycler는 영국 Techne사의 Progene였으며, PCR 조건은 박등의 방법을 약간 변형하여 따라 주형 DNA를 변성(denaturation)시키기 위해 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분간 처리 후, 증폭을 위해 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초간 변성(denaturation), \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 분간 부착(annealing), \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5 분간 중합 반응을 확실하게 완성하였다. PCR한 product들은 ethdium bromide를 첨가한 \( 1.0 \% \) agarose gel에서 \( 1 \times \mathrm{TAE} \) buffer (Tris base, glacial acetic acid, \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{EDTA} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \))를 사용하여 \(70 \mathrm{volt}\)로 전기영동한 후 UV상에서 나타나는 band들을 관찰하였다.</p> <h2>계통수 분석</h2> <p>RAPD결과는 각 밴드를 하나의 형질로 취급하여 유무에 따라 '1'과 '0'으로 표시하고 전체 OTU 에 대한 자료형렬을 작성하였으며, PAUP (4.02b version, Swfford, 2001)을 사용하여 parsimony analysis를 하였으며, 분석방법으로는 Heu-restic search를 이용하였다. 또한 Nei의 유전적 거리지수를 다소 변한 Nei-Li의 거리지수를 이용하여 상사도 행렬을 도출하였다. 도출된 자료행렬에 따라 유전적 유사도를 기초로 한 neighbor-joining (NJ) tree를 산출하였다. 또한 각 분계도의 지지정도를 알아보기 위하여 jacknifing, bootstrap을 이용하였다. 이러한 분석방법은 1000회 반복하였으며 이를 통한 계통수를 찾아내었다.</p>