황산암모늄을 이용한 침전법으로 농축한 시료를 양이온 교환수지인 SP-Sepharose를 이용한 이온교환 크로마토그래피를 수행하였으며 황산암모늄 분획물을 컬럼에 통과시킨 후 수지를 컬럼 부피의 5배인 \( 50 \mathrm{mM} \) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 6.0) \)으로 1차 세척하여 흡착되지 않은 물질을 제거하였다. 이 단계를 통해 항균 활성을 나타내는 피크를 완전히 분리할 수 있었습니다. 따라서 N말단의 아미노산 서열을 규명하는 등 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
<h2>박테리오신의 정제</h2> <p>분리균주를 MRS 액체배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, \) 36시간 배양한 후 원심분리하여 얻은 배양상등액의 박테리오신 활성은 \( 66 \mathrm{AU} / \mathrm{ml} \)이었고, 황산암모늄 침전법으로 부분 정제한 박테리오신 활성은 \( 528 \mathrm{AU} / \mathrm{ml} \) 으로 나타나 배양 상등액에 비해 약 8배 증가되었고 회수율은 약 \( 83 \% \) 였다. 분리균주가 생산하는 박테리오신을 정제하기 위하여 배양 상등액 중의 단백질을 황산암모늄 침전법으로 농축시킨 후 이온교환 크로마토그래피와 역상 HPLC를 순차적으로 실시하여 정제를 시도한 결과는 Table5와 같다.</p> <p>황산암모늄 침전법으로 농축한 시료를 양이온 교환수지인 SP-Sepharose를 사용하여 이온교환크로마토그래피를 실시하였다. 황산암모늄 분획을 칼럼에 통과시킨 후 칼럼의 5배의 부피에 해당하는 \( 50 \mathrm{mM} \) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 6.0) \) 를 흘려주어 수지에 흡착되지 않는 물질들의 세척을 먼저 실시하였는데 이들은 항균활성을 가진 봉우리와는 완전히 분리되었다. 이후에 \( \mathrm{NaCl} \) 농도구배(0에서 \( 1.0 \mathrm{M}) \) 에 의해 칼럼으로부터 결합된 단백질을 용출시켰다. 용출된 분획들에 대해 M. luteus에 대한 생육저해 여부를 조사한 결과, 최대 활성을 나타내는 분획은 99, 100번 이었으며, 용출된 분획 중 93~102번째 분획에서 항균활성이 나타났다. 박테리오신의 활성을 보이는 분획들만 모아 투석 및 동결 건조하여 이후 실험에 사용하였다.</p> <p>이온교환크로마토그래피에서 얻은 항균활성 분획을 투석 및 동결건조시킨 후 3차 증류수에 용해시켜 역상 HPLC를 통해 박테리오신을 정제하였다. C18 column에서 박테리오신의 분리는 한번 행해졌고 이때의 크로마토그램은 Fig. 4A와 같다. Retention time (RT)이 서로 다른 7개의 주요한 peak가 나타났다. 각 peak 별로 분획을 회수하여 M. luteus에 대한 생육저해 여부를 조사하였다. 회수한 7개의 분획 중 RT가 약 18.5분인 6번 분획에서만 항균활성이 나타났다. 위 실험결과의 재현성 확인을 위하여 2차, 3차 실험을 실시하여 동일한 결과를 얻었다. 이렇게 정제된 박테리오신의 최종 상대비활성(specific activity)은 배양상등액보다 약 75배 증가하였고, 회수율은 \( 13.5 \% \) 였다.</p> <h2>Tricine SDS-PAGE 전기영동</h2> <p>역상 HPLC를 통해 최종적으로 정제된 박테리오신의 분자량을 추정하기 위하여 전기영동을 실시하였다. Fig. 5에서 보는 바와 같이 정제된 박테리오신은 단일밴드를 나타내어 순수한 형태로 정제되었음을 알 수 있었다. 분자량 표준시료와 비교한 결과 약 \( 2.5 \mathrm{kDa} \) 인 분자량을 가지는 것으로 추정할 수 있었다. 또한 전기 영동한 겔을 중류수로 30분간 5회 세척한 후 M. luteus가 접종된 NB soft agar를 중층하여 박테리오신의 활성을 조사한 결과 위의 염색한 겔의 band와 일치하는 곳에 강한 억제환이 생겨 박테리오신임을 확인할 수 있었다. 기존의 보고된 B. licheniformis로부터의 항균물질인 박테리오신의 분자량이 subunit 별로 \( 240, 335, 380 \mathrm{kDa} \) 인데 비하여 그 단위 분자량이 \( 2.5 \mathrm{kDa} \) 으로 휠씬 작음을 알 수 있었으며 구조적인 분석은 하지 않아 알 수 없으나 기존의 박테리오신과는 다른 구조일 것으로 생각된다. 따라서 아미노말단의 아미노산서열과 같은 추가적인 연구의 수행이 필요할 것으로 판단된다.</p>