감귤박 균주 3처리구, COenzyme Q10 3처리구, 토양 미생물 균주 3처리구, 무항생제 1처리구 등 10수 이상의 처리구를 중심으로한 사료첨가제가 포함된 사료를 4주간 인공수정을 통하여 얻은 병아리에게 급여를 실시하였다. 이 후, 부화 4주 후에 해당 병아리에게 희석된 살모넬라균 주입을 실시하여 실험을 진행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험대상의 준비</h2><p>본 실험에서는 병아리를 사용하였으며, 병아리를 얻기 위해서 제주대학교 부속 실습센터에서 사육중인 이사브라운 계통의 건강한 산란계 암탉을 이용하여 인공수정을 통하여 수정란을 확보하였다. 인공수정 방법은 수탉 마사지 방법을 이용하여 5마리의 수탉에서 정액을 받아냈다. 희석하지 않은 정액을 \( 1 \mathrm{ml} \)멸균 주사기를 이용 40마리의 암탉에 \( 0.05 \mathrm{ml} \)씩 정액을 주입 하였고. 똑같은 방법으로 정액을 받아 인공수정을 3일 간격으로 2회 주입을 실시 하였다. 수정란 수집은 처음 정액주입 3일 후부터 5일간 실시하였다. 모은 수정란은 빛이 들지 않는 서늘한 곳에 모아 두었다가 수정란 표면에 이물질을 제거한 후 한꺼번에 부화기에 넣어 부화를 시켰다. 부화기의 온도는 \( 38^{\circ} \mathrm{C} \) 습도는 \(50\%\) 이상이 되도록 유지하였다. 부화된 병아리는 부화 후 5일령부터 실헙에 사용되었으며 평균체중을 \( 40 \mathrm{~g} \)으로 조정하여 수행하였다. 사용된 사료첨가제로는 감귤박 발효균주를 중심으로 실험에 이용하였다. 감귤박 발효균주는 본 연구에서 사용된 미생물 균주군인 광합성균, 토양 미생물균, 유산균 등을 이용하여 감귤박 발효실험을 통하여 생존율과 항균물질 생성 여부에 따라 동정한 균주를 선발하였으며 이는 이를 개발한 회사에 의하여 제공되었고 본 연구는 이를 제공받아 실험에 이용하였다. 그 외 토양 미생물균주는 해남 지역에서 생산되는 김치와 해안가의 미생물 균총에서 특이 분류한 미생물을 사용하였으며 Coenzyme Q10은 상업적으로 이용되는 것을 구매 후 사용하였다. 이러한 첨가제를 처리구에 따라 감귤박 균주 3처리구, COenzyme Q10 3처리구, 토양 미생물 균주 3처리구, 무항생제 1처리구로 나누어 10수 이상이 되도록 나누어 케이지에 넣어 실험을 실시하였다. 실험은 동절기인 1월에서 3월 사이에 실시하여 타 질병 감염에 의한 외부 요인을 차단하였다. 가로 \(30\mathrm{cm}\), 세로 \(30\mathrm{cm}\), 높이 \(30\mathrm{cm}\) 종이 박스를 이용하여 만든 케이지에 보온등을 설치하여 실험을 실시하였다.</p><h2>사료 및 첨가제 급여</h2><p>일주일 단위로 사료 급여량을 계산하여 첨가제를 혼합하여 급여하였고, 흔합 방법은 EM 원일 농장에서 사용하고 있는 병아리용 항생제 무첨가 상업용 사료를 공급 받아 첨가제 혼합비율에 따라 혼합을 실시하였다. 급여 방법은 일일 급여량을 반으로 나누어 아침 9시에 한번 저녁 6시에 급여를 실시하였고, 4주간 사료급여를 실시하였다.</p><h2>살모넬라균 배양 및 주입</h2><p>사람에게 유해하지 않은 살모넬라균 Salmonella gallinarium (주식회사 CT\&D에서 공급)를 배양하기 위해 우선 XLD agar (Difco \( { }^{\mathrm{TM}} \) XLD Agar Base) 배지를 삼각 플라스크와 HOT Plate를 이용하여 3차 증류수 \(1\mathrm{l}\)에 agar \(59\mathrm{g}\)을 녹이고 패트리디쉬에 \( 20 \mathrm{ml} \)씩 부어 배지를 만들었다. 배지를 만들때 넘치는 것을 방지하기 위해 플라스크는 용량의 절반만 만들어 사용하였고, 입자가 잘 녹은 선명한 붉은 색으로 될 때가지 가열하였다. XLD agar 배지에 백금봉을 이용 S. gallinarium균을 접종 48시간 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 인큐베이터에 배양 하였고, 여기서 자란 검회색 콜로니를 패트리디쉬에 만들어 놓은 혈액배지에 백금봉을 이용조밀하게 균 접종하였고, 24시간 이상 자라지 않게 한 후 멸균면봉을 이용 균을 \( 5 \mathrm{ml} \) 1X PBS (Phosphate Buffered Saline)에 수집하여, McFarland 세균수 측정법을 이용하여 균수가 \( 10^{8} \)\( \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \)되도록 희석하였다. 이 균을 병아리 한 마리에 \( 1 \mathrm{ml} \)씩 구강을 통해 주입하였다. 병아리의 머리 부분을 잠시 동안 잡아 뱉어내지 않도록 주입을 실시하였다. 살모넬라균 주입시기는 부화 4주 후에 살모넬라균 주입을 실시하였다.</p>