유전자 일부분이 결실된 MSMEG_2660을 cloning하여 돌연변이 균주용 vector를 구축하고, colony를 돌연변이 후보군으로 선정, 돌연변이 후보군을 각각 \(20 \mathrm { ml } \) \( 7 \mathrm { H } 9 \) 액체배지에서 3일간 배양한 다음 chromosomal DNA를 추출하여 MSMEG_2660_F와 MSMEG_2660_R의 primer를 이용하여 PCR로 돌연변이를 확인하였다. pMV306lacZ는 E coli에서 복제가 가능하여 조작이 쉽고, single copy로 존재하므로, \( \beta \)-galactosidase 활성을 측정하거나 \( \beta \)-galactosidase의 antibody를 이용하여 Western blot을 통해 특정 유전자의 발현 조절을 연구하는데 용이하고, myco-bacteria의 vector와 호환성이 높으며, multi-cloning site를 가지므로 cloning이 쉬운 장점이 있다.
<h2>pKOTs를 이용한 M. smegmatis MSMEG_2660 결실 돌연변이 제작</h2> <p>pKOTs vector가 돌연변이 제작에 사용이 가능한지 알아보기 위하여 유전자 일부분이 결실된 MSMEG_2660을 cloning하여 돌연변이 균주용 vector를 구축하였다(pKOTs \( \Delta \)MS2660). 돌연변이 제작과정은 위의 재료 및 방법에 서술하였다. Vector의 복제를 위한 균주 배양은 \(30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서, single-crossover 형질전환체를 획득하기 위한 조건은 \(42 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 수행되었다.</p> <p>Hygromycin이 존재하지 않는 배지에서 성장하지만 hygrom-ycin이 존재하는 배지에서는 성장하지 못하는 colony를 돌연변이 후보군으로 선정하여, 돌연변이 후보군을 각각 \(20 \mathrm { ml } \) \( 7 \mathrm { H } 9 \) 액체배지에서 3일간 배양한 다음 chromosomal DNA를 추출하여 MSMEG_2660_F와 MSMEG_2660_R의 primer를 이용하여 PCR로 돌연변이를 확인하였다. Wild type의 경우에는 \(1,110 \mathrm { ~bp } \)의 크기를 가지는 DNA band를 확인할 수 있었고, MSMEG_2660 돌연변이는 MSMEG_2660 내의 \(270 \mathrm { ~bp } \)가 결실된 \(840 \mathrm { ~bp } \)의 DNA band를 확인할 수 있었다. 이 실험결과는 pKOTs가 mycobacteria의 유전자를 knockout 시키는데 성공적으로 작용하는 vector임을 보여주었다.</p> <h2>pMV306lacZ 구축</h2> <p>lacZ 유전자는 \( \beta \)-galactosidase (EC. 3.2.1.23)를 암호화하며, 유전자 특성을 조사하기 위한 reporter 유전자로서 주로 사용된다. Mycobacteria에는 lacZ 유전자가 존재하지 않기 때문에 promoter가 없는 lacZ 유전자 앞부분에 조사하고자 하는 유전자의 promoter를 cloning하여 transcriptional fusion을 구축한 다음, \( \beta \)-galactosidase의 효소 활성을 측정함으로써 유전자의 발현 정도를 알 수 있다. Mycobacteriophage L5는 M. tuber-culosis, M. smegmatis와 BCG 균주들에 감염하여 chromoso-mal DNA로 삽입되어 lysogenic 상태로 존재하게 되는데, 이는 mycobacteria의 chromosomal DNA내의 tRAN \( { } ^ {\text { Gly } } \) 유전자 부분과 겹쳐 존재하는 attB site와 mycobacteriophage L5의 attP site간의 site-specific recombination의 결과이다.</p> <p>Mycobacteria의 삽입 vector인 pMV306은 mycobacterophage L5의 attP site와 integrase를 암호화하는 유전자인 int를 가지며 selectable marker로 Tn903 유래의 kanamycin 저항성 유전자를 포함하고 있다. 이러한 점들을 기반으로 pNC vector를 주형으로 pMV306lacZ_F (5'-AATTGCGGCCGCAAAAAACCCCTCAAGACC-3') 와 pMV306lacZ_R (5'-CCGGTCTAGACAGGAGGATTCACCATGG-3')을 primer로 사용하여 promoter가 존재하지 않는 acZ 유전자를 포함하는 \(3,193- \mathrm { bp } \) DNA 단편을 PCR을 통해 얻은 다음, PCR 산물을 NoA과 Xbal으로 자른 후 동일한 제한효소를 처리한 pMV306에 cloning 하여 pMV306lacZ vector ( \(7,149 \mathrm { ~bp } \))를 구축하였다. pMV306lacZ는 pMV306의 특성을 그대로 보존하고 있기 때문에, E. coli에서 복제가 가능하여 조작이 쉽고, attB site로 site-specific recombination이 일어나 mycobacteria의 chromosomal DNA에 삽입되어 single copy로 존재하므로, \( \beta \)-galactosidase 활성을 측정하거나 \( \beta \)-galactosidase의 antibody를 이용하여 Western blot을 통해 특정 유전자의 발현 조절을 연구하는데 용이하다. 또한 Kanamycin 저항성 유전자를 가지고 있기 때문에 다른 항생제 저항성 유전자를 가지는 myco-bacteria의 vector와 호환성이 높으며, pMV306 유래의 multi-cloning site (MCS)를 가지므로 cloning이 쉬운 장점이 있다.</p>