Clitocybin A 화합물의 세포독성을 확인하기 위하여 HDF- N cells에서의 세포독성을 측정, 자외선에 의한 matrix metallo-proteinase-1 (MMP-1) 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 HDF-N 세포를 24 well plate에 \( 1 \times 10^{5} \) cells/well로 분주한 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \) 농도의 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 24시간 배양하였고 실험결과는 각 군의 Student tt-test를 이용하여 pp-value를 구하여 유의성을 검증하였다.
<h2>세포주의 배양 및 조제</h2> <p>본 시험에 사용된 시험재료는, cell proliferation reagent WST-1은 Roche 1644-807, DC protein assay kit는 bio-rad 500-0116, human total MMP-1 ELISA kit는 R\&D system DY901, oleanolic acid는 Sigma사(USA) 제품을 사용하였다. 사용한 세포주는 human neonatal foreskin에서 유래한 normal human primary dermal fibroblasts-neonatal (HDF-N)로서 배양접시 바닥에 접종한 후 \( 0.1 \% \) insulin, \( 0.1 \% \) rhFGF, \( 0.1 \% \) gentamicin, \( 2 \% \) FBS를 함유하는 fibroblast basal medium (FBM, lonza, CC-3131) 배지를 넣고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)를 유지하며 \( 5 \% \) 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다.</p> <h2>세포독성시험</h2> <p>Clitocybin A 화합물의 세포독성을 확인하기 위하여 HDF- N cells 에서의 세포독성을 측정하였다. 즉, HDF-N cells을 96 well plate에 각각 \( 5 \times 10^{3} \) cells/well로 분주한 다음 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 배양 후, 12시간의 기아 상태를 유지한 뒤, clitocybin A 및 새로운 배지(media supplement 제외)를 넣고, 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 세포의 생존율을 측정하기 위하여 WST-1 반응액을 supplement가 제외된 배지에 \( 1 / 10 \)로 희석하고 이를 각 well 당 \( 100 \mu 1 \)씩 처리하여 1시간동안 반응시킨 후 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>자외선에 의한 MMP-1 발현 억제시험</h2> <p>Clitocybin A 화합물이 자외선에 의한 matrix metallo-proteinase-1 (MMP-1) 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 HDF-N 세포를 24 well plate에 \( 1 \times 10^{5} \) cells/well로 분주한 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \) 농도의 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 24시간 배양하였다. 자외선 챔버를 이용하여 배양한 세포에 영향을 주지 않는 범위인 UV-A \( 5 \mathrm{~J} / \mathrm{cm}^{2}+\mathrm{UV}-\mathrm{B} 40 \mathrm{~mJ} / \mathrm{cm}^{2} \)를 조사한 후 시료가 첨가된 배지로 교환하여 48시간 배양하였다. 배양 후 배양액을 human total MMP-1 ELISA kit를 이용하여 MMP-1 발현 정도를 측정하였다. 이때 oleanolic acid를 비교군으로, 시료를 처리하지 않은 세포배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 설정하였으며 각각 3회씩 반복하여 평균값을 구하였다. 측정값은 아래의 수학식에 의해 MMP-1 발현 저해 정도를 나타내었다.</p> <p>MMP-1 발현저해율\((\%) = \frac{대조군의 반응흡광도-시료의 세포배양액 반응흡광도}{대조군의 반응 흡광도}\)\( \times 100 \)</p> <p></p> <h2>통계처리</h2> <p>실험결과는 각 군의 Student \( t \)-test를 이용하여 \( p \)-value를 구하여 유의성을 검증하였다.</p>