식물은 세포 내 다양한 소기관에 칼슘을 조절하는 단백질이 있는데, 그 중하나가 ACA11 유전자이다. 형질 전환을 통해 ACA11 유전자의 기능을 알아보고자 실험을 수행하였다. 애기장대를 형질전환한 후, 식물이 자랄 때까지 관찰하였다. 그 결과 hypersensitive response (HR)와 같은 표현형을 보이는 것이 흥미로웠다. 이 HR이 발생하는 이유를 분석하기 위해 Western blot 분석을 진행하였으며, 그 결과 ACA11 때문이 아니고 형질전환된 식물에서 유전자 침묵을 발생하기 때문으로 판단되었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>애기장대에서 ACA11의 형질전환체 선발</h2> <p>칼슘은 신호전달 과정에 있어서 중요한 이차 매개체로시의 역할을 한다고 잘 알려져 있다(Berridge et al. 2000; Sanders et al. 1999). 식물은 동물과 달리 칼슘을 조절하는 단백질들이 세포 내 다양한 소기관에 분포하고 있는 것으로 알려겨 있다 (Sanders et al 1999). 이러한 칼슘을 조절하는 단백질 중 특히 칼슘의 주요저장소인 액포막 (vacuole membrane)에 존재하는 \( \mathrm{Ca}^{2+} \)-ATPase를 암호화하는 ACA11 유전자의 생물학적인 기능을 알아보고자 애기장대에ACA11 단백질을 과발현하기 위해서 다음과 같이 애기장대에 형질 전환시켰다. 애기장대에서 ACA11 유전자를 분리하여 식물의 binary vector인 35S-GFP vector에 Xho I/Spe I의 제한 효소률 이용하여 재조합하였다. 이렇게 재조합한 35S-ACAl1-GFP와 35S-GFP vector를 각각 애기장대에 형질전환하였다. 이렇게 형질 전환된 식물을 선별하기 위해서 \( \mathrm{T}_{0} \) 씨앗을 kanamycin과 \( 3 \% \) sucrose가 함유된 MS배지에 뿌려 저항성을 가지는 식물을 형질전환 식물로 선별하고 실험을 수행하였다.</p> <h2>\( \mathrm{ACA} 11 \) 이 형질전환된 애기장대의 표현형</h2> <p>앞서 만들어진 ACA11-GFP 유전자가 형질전환된 식물의 \( \mathrm{T}_{2} \) 세대를 이용하여 그 표현형을 관찰하였다. 35S-ACA11-GFP 유전자와 35S-GFP가 형질전환된 애기장대를 훍에 심어 식물이 씨앗을 맺을 때까지 그들의 표현형을 관찰하였다. 이러한 ACA11-GFP 유전자가 형질전환된 식물은 꽃이 피기 전 발달단계까지는 표현형을 관찰 할 수 없었다. 흥미롭게도, 형질전환된 식물들 중 일부에서 꽃이 피기 시작하면서 성숙된 잎들에서 pathogen을 처리한 후 나타나는 것과 유사한 hypersensitive response (HR)와 같은 표현형을 보였다. 이러한 표현형은 같은 형질전환 식물에서 받은 씨앗에서 자란 식물들 중에서도 잎에서 HR을 보이는 식물이 있는 반면 야생형과 같은 표현형을 유지하는 식물들로 나뉘어져 나타났다. 또한 표현형을 보이는 식물과 보이지 않는 식물에서 씨앗을 받아 다음 세대에서 표현형을 관찰해 보았을 때도 두 종류의 식물에서도 동일하게 HR 을 보이는 식물과 보이지 않는 식물로 나뉘어 졌다. 이러한 표현형은 형질전환된 식물의 잎이 성숙하면서 조금씩 나타나기 시작하였고 잎 이외에서는 세포사멸 외의 다른 특별한 표현형을 관찰할 수 없었다.</p> <h2>형질전환된 식물의 ACA11 단백질 발현 분석</h2> <p>ACA11-GFP 유전자가 형질전환된 식물 잎에서 보여지는 HR의 표현형이 ACA11-GFP 단백질의 과발현에 의한 것인지 확인하기 위해서 형질전환된 식물에서 막 단백질을 분리하여 Western blot 분석을 수행하였다. ACA11-GFP가 형질전환된 식물을 흙에서 4주간 키운 후 HR이 발생하는 식물과 발생하지 않는 식물을 각각 구분하여, 식물 전체로부터 막 단백질만을 분리하여 실험을 수행하였다. Western blot을 수행한 결과 표현형이 발생하지 않는 ACA11-GFP OX 1-2과 2-2 식물체에서는 약 \( 130 \mathrm{kDa} \) 에서 ACA11-GFP 의 단백질 발현을 확인 할 수 있었고, HR 이 일어나는 형질전환체인 ACA11-GFP OX 1-1과 2-1 식물체에서는 ACA11-GFP의 발현을 관찰할 수 없었다. 이러한 결과는 실제로 ACA11-GFP 유전자가 형질전환된 식물의 HR 표현형의 원인이 ACA11 유전자의 과 발현 때문이 아니라 오히려 형질전환된 식물에서 ACA11 유전자의 유전자 침묵 (gene silencing)을 발생하여 표현형을 유발할 가능성을 시사하였다. 세포사멸 표현형을 보이는 형질전환체와 표현형을 보이지 않는 형질전환체를 이용하여 수 차례의 단백질 발현여부에 대한 반복실험 결과 ACA11-GFP 유전자가 발현이 되지 않는 형질전환체가 표현형이 나타남을 확인함으로써 \( A C A 11 \) 유전자의 유전자 침묵에 의하여 세포사멸이 유발됨을 추정할 수 있었다. 하지만 앞으로 ACA11-GFP 유전자가 형질전환된 식물에서 본래 식물체가 발현하고 있던 \( A C A 11 \) 유전자의 RNA 발현이 이루어지지 않음을 확인을 해야 할 것이며 돌연변이를 이용하여 본 가설을 증명해야 할 것으로 판단된다.</p> <h2>형질전환된 식물 잎의 DAB 염색 분석</h2> <p>지금까지 보고된 바에 따르면 식물에 병원균이 칩입하게 되면 가장 먼저 세포 내 칼슘의 능도가 변화되고 다음으로 활성산소가 증가하게 된다. 이러한 신호전달 과정을 거쳐 식물은 방어 메커니즘이 작동하게 되고 병원균으로부터 식물을 보호하기 위해서 잎에 침입한 병원균을 격리하기 위해서 국부적으로 HR와 같은 세포사멸을 발생시키게 된다. 이러한 세포사멸 현상은 식물자체에서 병원균에 감염된 부분을 격리함으로써 더 이상의 감염을 피하기 위한 하나의 전략이다 (Nümberger and Scheel 2001). 이러한 보고들을 근거로 ACA11-GFP 유전자가 형질전환되어 HR을 보이는 식물은 ACA11 유전자가 파괴됨으로써 세포질의 칼슘을 액포 내로 격리하지 못해 세포질에 칼슘농도가 증가되게 되고 증가된 칼슘을 신호로 세포 내 활성산소 (ROS)가 과다 축적되어 잎에서 HR인 세포사멸을 유발할 것으로 예상하고 실험을 진행하였다. 실제로 ACA11 유전자가 형질전환되어 HR을 보이는 식물의 잎을 이용하여 활성산소가 과도하게 축적되는지 활성산소를 염색하는 DAB 염색 시약을 이용하여 실험을 수행하였다. 그림에서 보는 바와 같이 free GFP vector가 형질전환된 잎에서는 활성산소가 관찰되지 않는데 반해 ACA11-GFP 유전자가 형질전환된 식물의 잎에서는 갈색의 염색 부분을 확인함으로써 활성산소가 상당한 량으로 축적되는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 ACA11-GFP 유전자가 형질전환된 식물에서 보여지는 HR인 세포사멸은 액포막 존재 칼슘 펌프의 유전자 침묵에 의하여 액포에서 유래한 칼슘이 액포로 다시 수송하지 못하고 세포질에 머물게 됨으로써 세포질에 고농도로 칼슘 증가되고 이는 세포질 등에서 활성산소가 축적되게 유도함으로 발생된다는 것을 확인할 수 있었다.</p>