각 식물체로부터 DNA를 추출하기 위하여 Plant DNA Zol Reagent (Life Technologies Inc., Grand Island, New York, USA)를 사용하였다. 추출된 DNA를 bluescript vec-tor로 클로닝한 후 ABI Prism 377 Sequencer (Applied Biosystem, USA)로 염기서열을 분석하였다. PAUP에서 분류군간 핵산 차이에 의한 유의성 검증, 염기 빈도, 서열쌍 거리, un-corrected "p"에 의한 측정된 거리 등을 산출하였다. 서열간 코돈의 중립성 검증은 갭과 결손 서열을 제외한 다음 1,000회 반복으로 MEGA4로 실시하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료와 genomic DNA 추출</h2> <p>본 분석에 사용한 식물 분류군은 자주족도리풀(A. siboldii Miquel for. koreanum Y. Lee), 금오족도리풀(A. patens Yamaki), 서울족도리풀 (Asarum heterotropoides var. seoulense(Nakai) Kitag.), 개족도리풀(A. maculatum Nakai), 민족도리풀(A. siboldii Miquel var. manshuricum Maximowicz), 민무늬족도리풀(A. vericolor (Yamaki) Y. Lee var. non-vericolor Y. Lee), 각시족도리풀(Asarum siboldii Miquel var. manshuricum Maximowicz for. misandrum Y. Lee), 족도리풀(A. sieboldii Miquel), 뿔도리풀(A. siboldii Miquel var. cornutum Y. Lee)로 자생지에서 직접 채집하여 사용하였다.</p> <p>각 식물체로부터 DNA를 추출하기 위하여 Plant DNA Zol Reagent (Life Technologies Inc., Grand Island, New York, USA)를 사용하였다. 추출방법은 사용자의 지침서에 의거하여 추출하였다. 추출된 DNA는 진공 흡입기로 5분간 건조시킨 후 TE \( 100 \mathrm{ul} \)에 용해하여 3일간 냉장 보관하였다. 용해된 시료는 DNA 정량을 체크하였고 TE로 DNA 농도가 균질하게 조정하여 본 분석을 위해 사용하거나 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동고에 보관하였다.</p> <h2>trrL and trnT 분석</h2> <p>엽록체의 trrL intron과 trrL-trrT spacer 부위는 Taberlet 등이 고안한 시발체(primer)로 PCR (polymerase chain reaction)을 이용하여 증폭시켰다.</p> <p>PCR 반응을 위하여 추출한 각 분류군의 게놈 DNA \( 50 \mathrm{ng} \), 각 dNTP \(100 \mathrm{uM} \), 시발체 각 \( 0.2 \mathrm{uM}\), 1x enzyme buffer, Taq polymerase 2 unit를 넣고 증류수로 전체 \( 50 \mathrm{ul}\) volume이 되도록 추가하였다. 증폭반응은 초기 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 90 sec간 변성한 후, 28 사이클로 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 sec, \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60 sec \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60 sec간 실시하였고, 추가로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 연장하였다.</p> <p>PCR 산물은 1.5 agarose gel에서 분리하였는데 이때 절편들의 상대적 크기를 비교하기 위해 \( 100 \mathrm{bp} \) ladder DNA mark-er를 같이 loading시켰다. 전기영동 후 젤은 ethidium bro-mide로 염색하여 밴드를 현상하였다. 현상된 젤은 Alpha Image TM (Alpha Innotech Co, USA)을 사용하여 밴드 양상을 조사하였다. 이후 젤 에서 DNA를 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)로 추출하였다. 추출된 DNA를 bluescript vec-tor로 클로닝한 후 ABI Prism 377 Sequencer (Applied Biosystem, USA)로 염기서열을 분석하였다.</p> <h2>통계 분석</h2> <p>분류군간 유전적 거리(I)와 유전적 동질성 (D)은 분류군간 염기쌍의 비교로 산출하였다. PAUP에서 분류군간 핵산 차이에 의한 유의성 검증, 염기 빈도, 서열쌍 거리, un-corrected "p"에 의한 측정된 거리 등을 산출하였다. 염기자리 당 서열 간 염기 조성 차이, 불일치 계수를 검증하였다.</p> <p>서열간 코돈의 중립성 검증은 갭과 결손 서열을 제외하고 1,000회 반복으로 MEGA4로 실시하였다. 타지마의 여러 통계치(M=number of sites, S=Number of segregating sites, ps=S/M, and \( \pi\)=nucleotide diversity. D=Tajima test statistic)를 산출하였다.</p> <h2>유연관계 분석</h2> <p>각 족도리풀 trnL-trnT에서 얻은 크로마토그램(chromato-gram)은 소프트웨어 Sequence Navigator 1.0.1 (Applied Biosystems Inc.)로 편집하였다. 족도리풀 trnL - trnT 서열에서 결손부위를 포함한 서열 배당은 MEGA4 version 4.1과 Clustal X program으로 분석하였다. 배당된 서열에서 gap의 부위는 missing data로 처리하였다. 그러나 계통학적으로 정보적인 인델은 이진법 처리로 data에 삽입하였다.</p> <p>최절약법에 의한 tree (maximum parsimonious tree, MP)는 heuristic search, branch-swapping options, tree bi-section-reconnection에 따랐다[20]. 최우법(maximum like-lihood tree, ML), N-J법(neighbor-joining tree, NJ)으로 tree 작성을 실시하여 비교하였다. 계통분석의 분지는 PHYLIP version 3.57의 NEIGHBOR, neighbor-joining (NJ) 방법에 의해 구성하였다. 분류군의 가지에 대한 Bootstrap 분석은 1000회 반복법으로 실시하였다.</p>