본 절에서는 단백질 가수분해 조건, 가수분해물의 제조, 항산화활성 측정, 기질농도에 따른 항산화활성 측정, 상승효과 측정에 대한 방법을 설명한다. 가수분해물 제조는 계란노른자 단백질을 효소로 가수분해시켜 각 단계별로 분자량 크기에 따라 분획하였으며, 항상화활성 측정으로 Thiobarbituric acid (TBA)에 대해서는 Ohkawa 등의 방법을 사용했으며, Ferric thiocyanate에 대해서는 Mit-suda 등의 방법을 사용했다. 다음으로 기질농도에 따른 항산화활성 측정은 가수분해물을 linoleic acid에 첨가하면서 항온기 내에서 각 TBA와 ferric thiocyanate 방법에 따라 흡광도를 측정하였다. 마지막으로 상승효과는 \( \alpha\)-tocopherol을 linoleic acid에 첨가하고 항온기 내에서 TBA값 및 ferric thio-cyanate값을 측정하여 구했다.
<h2>단백질 가수분해 조건</h2><p>기질에 대한 최적의 효소비를 결정하기 위해서 \( 0.1 \mathrm{M} \) disodium hydrogen phosphate-sodium dihydrogen phos-phate buffer \( (\mathrm{pH} 7.0) \)를 사용하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 기질 대 효소비를 10에서 1,000까지 변화시켜 가수분해도를 검토하였다. 또한 최적의 기질농도를 결정하기 위하여 \( 0.2 \% \)부터 \( 5\% \)까지 기질농도를 변화시키면서 동일한 완충용액과 온도에서 가수분해하여 기질농도를 검토하였고, 기질에 대한 효소의 반응시간에 대한 조건은 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \), 기질농도 \( 1 \% \) 및 기질 대 효소비를 \(100:1\)로 하고 반응시간을 1, 2, 4, 8, 12, 18 및 24시간로 변화시키면서 가수분해도를 측정하였다.</p><h2>가수분해물의 제조</h2><p>가수분해물은 Kim 등의 방법에 따라 계란노른자 단백질을 효소로 가수분해시켜 각 단계별로 분자량 크기에 따라 분획하였다. 즉, 효소로 가수분해시킨 후 한외여과막장치를 사용하여 분자량 한계범위가 각각 \( 10 \mathrm{kDa}, 5 \mathrm{kDa} \) 및 \( 1 \mathrm{kDa} \)인 막에 차례로 통과시켜 분획한 후 동결건조하여 가수분해물을 제조하였다.</p><h2>항산화활성 측정</h2><p>단백질 가수분해물의 항산화활성은 linoleic acid emul-sion을 Osawa 등의 방법에 따라 linoleic acid \( 0.13 \mathrm{m} \ell \), ethanol \( 10 \mathrm{m}\ell\), \(50 \mathrm{mM} \) phosphate buffer (\(\mathrm{pH} 7.0\)) \( 10 \mathrm{m} \ell \)를 혼합하고, 이 혼합물에 가수분해물을 linoleic acid에 대해 각각 \(1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 의 농도로 3차 증류수에 용해시켜 첨가하여 전체 부피가 \( 25 \mathrm{m} \ell \)가 되게 하였다. 이때 \( \alpha \)-tocopherol은 ethanol에 용해시켰으며, 대조구는 가수분해물을 첨가하지 않고 만든 linoleic acid emulsion 그 자체를 사용하여 \( 40 \pm \)\( 1^{\circ} \mathrm{C} \)로 조설된 항온기내에서 저장하면서 자동산화롤 촉진시켰다. Thiobarbituric acid (TBA)에 의한 항산화활성의 측정은 Ohkawa 등의 방법에 따라 실시하였다. 즉, \( 40{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응시킨 linoleic acid emulsion \( 0.05\mathrm{m} \ell \)에 \( 8.1 \% \) sodium dodecyl sulfate (SDS) \( 0.2 \mathrm{m \ell}\), \(20 \% \) acetic acid \( 1.5 \)\( \mathrm{m \ell} \) 및 \( 0.8 \%\) \( \mathrm { TBA} \) 수용액 \( 1.5 \mathrm{m \ell} \)를 넣고 혼합한 다음, \( 5^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60분간 방치한 후 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60분간 발색시켜 분광광도계 (Hitachi, Japan)를 사용하여 \( 532 \mathrm{nm} \)에서 흡광도롤 측정하였다. Ferric thiocyanate에 의한 항산화활성 측정은 Mit-suda 등의 방법에 따라 실시하였다. 즉, 유지혼탁액 \( 0.1 \mathrm{m \ell} \)에 \( 75 \% \) ethanol \( 4.7 \mathrm{~m} \ell, 30 \% \) ammonium thiocynate \( 0.1 \)\( \mathrm{m} \ell \) 및 \( 3.5 \%\) \( \mathrm{HCl} \)이 포함된 \( 20 \mathrm{mM} \) ferrous chloride \( 0.1 \mathrm{m} \ell \)를 가한 후 3 분 후에 \( 500 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>기질농도에 따른 항산화활성 측정</h2><p>가수분해물의 농도에 따른 항산화활성의 측정은 가수분해물을 linoleic acid에 대해 \( 0.1 \% \)에서 \( 2 \% \)까지 첨가하여 \( 40\pm 1^{\circ} \mathrm{C} \)로 조절된 항온기 내에서 저장하면서 일차별로 TBA와 ferric thiocyanate 방법에 따라 흡광도를 측정하였다.</p><h2>상승효과 측정</h2><p>가수분해물의 상승효과는 TBA 및 ferric thiocyanate 방법에 의해 결정하였다. 즉, 유지혼탁액에 \( \alpha\)-tocopherol을 linoleic acid에 대해 \( 0.1 \% \)가 되게 첨가하고, 여기에 가수분해물을 linoleic acid에 대해 \( 1 \% \)가 되게 가한 후 \( 40 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \)로 조절된 항온기 내에 저장하면서 TBA값 및 ferric thio-cyanate값을 측정하였다.</p>