본 연구에서는 흑마늘 열수 추출물(ABG)이 인체 위암세포 AGS의 이동 및 침입을 억제하는 효과를 살펴보았다. 이 효과는 TER의 증가와 연결되어 있었으며, 이는 ABG가 암전이에 관여하는 유전자의 활성도에 영향을 미치는 것으로 보인다. 연구에서는 RT-PCR를 사용하여 matrix metalloproteinase (MMP)와 tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)의 발현 변화를 조사하였고, ABG가 TIMP 발현을 증가시켜 MMP의 발현을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, TJ 구성단백질들의 중요성을 확인한 후, ABG의 항전이 효과가 이 단백질들의 발현에 어떤 영향을 미치는지 조사하였다.
<h2>AGS 위암세포 MMPs 및 TIMPs의 발현에 미치는 흑마늘 열수 추출물의 영향</h2> <p>이상의 결과를 통하여 관찰된 ABG 처리에 의한 AGS 위암 세포 이동성 및 침윤성의 억제와 TER의 증가는 ABG가 강력한 항전이 효과를 가지고 있음을 보여주는 결과들이다. 따라서 ABG의 항전이에 관여하는 유전자들의 관련성 정도를 조사하기 위하여 먼저 matrix metalloproteinase (MMP) 및 tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP)의 발현 변화를 RT-PCR 로 조사하였다. 이를 위하여 다양한 시간 동안 \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) ABG가 처리된 AGS 위암세포의 RNA를 분리하여 해당 유전자들의 primer를 이용하여 RT-PCR를 실시하였다. Fig. 3A에 나타낸 바와 같이 ABG의 처리 시간이 증가할수록 \MMP-2 의 발현은 다소 감소되었으나, MMP-9의 발현은 큰 변화가 없었다. 그러나 TIMP의 경우, TIMP-1 및 TIMP-2의 발현 모두가 ABG 처리 시간이 증가에 따라 점차적으로 증가되었다. MMPs의 발현 증가에 따른 그들 효소의 활성 증가는 암세포의 전이에 필수적이지만, 이들의 발현은 TIMP에 의하여 억제될 수 있으므로, 이는 ABG가 TIMP의 발현 증가를 통하여 MMP의 발현이 부분적으로 억제될 수 있음을 보여 주는 결과이다.</p> <p>Fig. 3A에서 나타낸 ABG 처리에 의한 MMPs 및 TIMPs의 발현 변화가 MMPs 단백질 및 그들의 활성 감소와 직접적인 연관성을 가지는지의 여부를 조사하기 위하여 동일 조건에서 배양된 AGS 위암세포를 대상으로 Western blotting 및 zymography 분석을 실시한 결과는 Fig. 3B 및 C에 나타낸 바와 같다. 제시된 결과에서 알 수 있듯이 ABG 의 처리 시간이 증가 할수록 단백질 수준에서 MMP-2 및 MMP-9의 발현이 점차 감소하였으며, ABG 처리 농도가 증가할수록 그들의 효소적 활성도 다소 억제되었음을 알 수 있다. 이는 ABG 의 항전이 효능이 MMPs의 활성 감소와 연관되어 있음을 보여주는 결과이다.</p> <h2>AGS 위암세포의 TJ 조절 유전자의 발현에 미치는 ABG 의 영향</h2> <p>최근 연구에 의하면 TJ 구성단백질들(특히 claudin 단백질 군)이 암세포의 전이에 매우 중요한 역할을 하고 있음이 밝혀졌다. Claudin 단백질은 막단백질로 인접세포의 claudin 단백질군의 세포외 영역과 서로 인접되어있다고 알려져 있다. 21 종류의 transmembrane 단백질을 포함하는 claudin family는 TJ strand의 중요한 구성요소로 큰 범위에서 TJ의 투과도 특성(permeability characteristics)을 결정 한다. 또한 TJ 는 세포막의 apical과 bassolateral 사이에 지방과 단백질의 이동을 막는 연속적인 circumferential "fence"를 형성하므로 세포의 극성의 형성과 유지에도 claudin 이 중요하다. 따라서 이러한 TJ 단백질인 claudin의 부조로 인한 TJ의 파괴 는 암세포의 초기 침윤과 전이에 관련한 명백한 증거로 최근 연구되어지고 있다. 이와 같이 TJ 단백질은 아울러 TJ 관련 단백질(E-cadherin, Snail 등)들과의 상호 작용을 통하여 암세포의 전이를 조절할 수 있다. 따라서 ABG 의 항전이 효능이 이들 TJ 조절인자들의 발현에 영향을 줄 수 있을 것으 로 추정되어 몇 이들 인자들의 발현에 미치는 영향을 RT-PCR 및 Western blotting 방법으로 조사하였다. Fig. 4에 나타낸 바와 같이 ABG 의 처리 시간이 증가할수록 조사된 3 가지의 claudin 유전자들의 발현이 특히 번역 수준에서 감소되었는 데, 이는 AGS 위암세포에서 ABG 에 의한 claudins 발현 억제는 post-transcriptional 수준에서 이루어짐을 알 수 있었다. 아울러 세포-세포 연결(cell-cell adhesion) 역할과 전이/종양억제 단백질 기능을 가지는 E-cadherin의 발현은 전사 및 번역 수준에서 ABG 처리 시간이 증가에 따라 점차 감소되었다. 그리고 많은 암세포에서 E-cadherin의 발현 감소와 연계되면서 다양한 암세포 전이 조절 관련 유전자들의 전사활성에 중요한 역할을 할 것으로 기대되는 Snail의 발현은 점차 증가되었다.</p> <h1>초록 : 흑마늘 추출물이 인체위암세포의 tight junction 투과성 조절과 세포 침윤성 억제에 미치는 영향</h1> <p>본 연구에서는 흑마늘 열수 추출물(ABG)의 암세포 전이억제 효능을 검정하였다. AGS AGS 인체위암세포의이동성과 침윤성을 억제하였으며, 이는 TER의 증가와 연관성이 있었다. 또한 ABG에 의한 AGS 위암세포의 침윤성 억제는 TIMPs 발현 증가에 의한 MMPs의 발현 및 활성 저하에 의한 것임을 알 수 있었다. 아울러 AGS 위암세포에서 과발현을 나타내는 TJ 단백질인 claudins의 발현 저하 등이 ABG의 항전이 효과에 연관되어 있음을 알수 있었다. 이상의 결과는 흑마늘 열수 추출물이 단순한 암세포의 증식억제를 통한 암예방 및 항암활성 뿐만 아니라 암세포의 전이 또한 효과적으로 억제할 수 있음을 보여주며, 이와 연관된 보다 구체적인 분자세포생물학적접근 및 in vivo 연구의 필요성이 요구됨을 의미한다.</p>