의약품 분야에서 광학 이성질체의 생리활성 차이로 인해 순수한 의약품 소재 합성기술에 대한 연구가 진행되고 있으며, 이를 위해 광학활성 중간체 제조기술의 개발이 중요시되고 있다. EH를 이용한 광학활성 epoxide 제조방법은 광학분할 가수분해 방법으로, 라세믹 epoxide를 기질로 사용하여 입체선택적 가수분해를 일으킨다. 이전 연구들에서는 EH 유전자를 박테리아나 효모에 발현시켜 광학활성 epoxide를 제조한 보고가 있었으며, 발현 vector와 숙주세포에 따라 단백질 발현량과 효소 활성이 다를 수 있다. P. pastoris는 methanol을 대사할 수 있는 효모로서 alcohol oxidase (AOX) promoter를 가지고 있어 methanol 유도 시 외래 단백질을 발현할 수 있다. 따라서, Kozak 염기서열을 포함한 RgEH 유전자를 P. pastoris에 발현시키기 위해 재조합 균주를 제작하였다.
<h1>서 론</h1> <p>광학적으로 순수한 epichlorohydrin (ECH) 또는 styrene oxide (SO)와 같은 광학활성 에폭사이드들은 의약품 산업, 농약산업 및 정밀화학 산업에서 아주 중요한 중간체로 사용되고 있다. 특히, 의약품에 있어서 광학이성질체들의 생리활성 차이가 존재함에 따라 광학적으로 순수한 의약품 소재 합성기술 개발연구가 활발히 진행되고 있으며, 이들의 효율적인 제조를 위해 사용되는 광학활성 중간체 제조기술의 개발이 중요시 되고 있다. 광학활성 styrene oxide를 제조하는데 있어 주로 화학촉매 합성법이 사용되고 있지만 최근에 들어 epoxide hydrolase (EH) 및 monooxygenase (MO) 등 생촉매를 이용한 합성방법에 대하여도 많은 연구들이 진행되고 있다. EH(EC 3.3.2.3) 를 이용한 광학활성 epoxide 제조방법은 라세믹 epoxide를 기질로 사용하여 입체선택적 가수분해를 일으키는 광학분할 가수분해 (hydrolytic kinetic resolution) 방법이다. 다시 말하면, 라세믹 epoxide 흔합물 중 (R)- 또는 (S)-이성질체 중 한쪽만을 선택적으로 가수분해하여 diol로 만들어 제거함으로서 광학적으로 순수한 epoxide만을 제조하는 방법이다. EH의 장점은 NAD 또는 FAD와 같은 보조인자를 펼요로 하지 않으며 광범위한 기질에 대하여 입체특이성을 가지며, 비교적 안정된 구조를 가지고 있어 상업적으로 유용한 효소로 평가되고 있다. EH 를 이용한 광학활성 에폭사이드 제조에 대한 연구로는 Aspergillus niger, Agrobacterium radiobacter 등을 생촉매로 하여 광학활성 epoxide 등을 제조한 연구가 있으며, 효모의 일종인 R. glutinis, 담수어류인 Danio rerio 및 해양어류인 Mugil cephalus의 EH 유전자를 재조합한 균주를 생촉매로 하여 광학활성 epoxide를 제조한 연구들이 있다.</p> <p>이제까지의 연구들을 보면 미생물, 곰팡이, 식물 및 동물 유래의 EH 유전자를 박테리아나 효모에 발현시켜 광학활성 epoxide롤 제조한 여러 보고들이 있었으며 발현 vector나 숙주세포에 따라 단백질 발현량과 효소활성이 차이가 있었음을 알 수 있다. 발현 vector나 숙주세포의 종류에 따라 여러 장단점이 있으나 물에는 잘 녹지 않고 유기용매에 잘 녹는 기질을 사용하는 EH나 lipase들을 발현시키는 숙주로는 유기용매에 강한 Pseudomonas sp. 또는 효모의 일종인 Pichia pastoris 등을 쓰는 것이 고농도 반응에서 이점이 있다. P. pastoris는 methanol을 대사할 수 있는 효모 중 하나로 강럭 하면서 발현조절이 잘 되는 alcohol oxidase (AOX) pro-moter를 가지고 있어 methanol로 유도하면 \( 30 \% \) 아상의 외래단백질을 발현시킬 수 있다고 하였다. 또한 P. pastoris는 E. coli의 경우와 같은 장점들(저가, 많은 발현량 및 용이한 scale-up)과 함께 단백질 가공, 단백질 folding 및 번역 후 수식 등이 필요한 진핵세포의 유전자들을 활성형으로 얻을 수 있는 좋은 발현 system으로 알려겨 있다. P. pastoris에 사용하는 vector들은 숙주세포의 염색체에 상동성으로 재조합되기 때문에 재조합단백질의 발현량을 높이기 위한 방법으로 발현 vector를 multiple expression cassette로 제작하는 방법도 있으며 Belousova 등은 Herpes simplex virus의 thymidine kinase 유전자를 adenoviral vector에 double ex-pression cassette 방식으로 삽입시켜 효율적인 발현을 유도하는데 성공하였다고 보고하였다.</p> <p>본 연구자들은 전보에 보고한 바와 같이, 효모인 R. glutinis의 EH 유전자를 발현벡터인 pPICZ 벡터에 single ex-pression cassette로 재조합하여 P. pastoris GS115 균주에 발현시켰으며, P. pastoris 재조합균주를 이용하여 광학순도 \( 99 \% \) 이상의 (S)-styrene oxide를 높은 수율로 언은 바 있다. 본 실험에서는 보다 많은 단백질을 P. pastoris에 발현시키고자 RgEH 유전자의 시작 codon 앞에 Kozak 염기서열을 넣었으며 R. glutinis의 EH 유전자가 두 배로 전사될 수 있도록 pPICZ 벡터에 double expression cassette로 삽입시킨 재조합균주를 제작하였다. P. pastoris에 이중발현시킨 RgEH 재조합한 균주를 이용하여 라세미 styrene oxide 기질에 대한 동력학적 가수분해 활성을 측정하였으며 반응온도의 영향분석 및 detergent 첨가 등을 통해 가수분해능 및 광학활성 에폭사이드의 최종 수율을 향상시키고자 하였다.</p>