섬바디의 잎, 줄기, 뿌리를 나눠, 시료 각각을 \(70\%\) ethanol로 10배 가하고 상온에서 추출한 액을 모아 여과해 감압 농축 동결건조하여 분말로 만들었다. 추출물들은 DMSO에 녹여, 최종농도 \( 2.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)를 넣어 항혈전 활성을 관측했다. 또한, 최종농도가 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)가 될 수 있게 해서 적혈구 용혈활성을 관측하였다. 섬바디 부위별 추줄물의 항응고 활성은 thrombin time, prothrombin time, activated partial thromboplastin time으로 관측했다. 섬바디 부위별 추출물의 혈소판 응집저해 활성은 수세한 농축 혈소판에 섬바디 시료와 collagen을 넣어 혈소판 응집을 이끌어내 미세전극에 혈소판이 부착 응집되며 생긴 전기 저항값 변화를 관측했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료 및 시약</h2> <p>본 실험에 사용된 2019년 울릉도에서 수확한 섬바디를 구입하여 에탄올 추출물 제조에 사용하였다. 구체적으로는, 섬바디의 잎(DT-L), 줄기(DT-S), 뿌리(DT-R)를 구분하여, 각각의 시료에 대해 10 배의 \( 70 \% \) ethanol (Daejung Chemicals \& Metals Co., Ltd. Korea)을 가하고, 상온에서 2회 반복 추출하고, 추출액을 모아 filter paper (Whatsman No. 2, GE healthcare UK limited, UK)로 여과한 후 감압 농축(Eyela Rotary evaporator N-1110S, Tokyo Rikakikai Co., Ltd. Japan)하고 동결건조(FD5508, Ilshin Lab Co. Ltd, Korea)하여 분말로 제조하였다. 확증표본은 안동대학교 식품영양학과에 보관하고 있다. 추출물들은 DMSO에 \( 100 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 녹인 후, 항혈전 활성 평가시 최종농도가 \( 2.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 되도록 첨가하였으며, 적혈구 용혈활성 평가시에는 최종농도가 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 되도록 첨가하였다. 항혈전 활성평가에 사용한 혈장은 시판 control plasma (MD Pacific Technology Co., Ltd, Huayuan Industrial Area, China)를 사용하였으며, PT reagent와 aPTT reagent는 MD Pacific Hemostasis (MD Pacific Technology Co., Ltd, Huayuan Industrial Area, China)의 분석시약을 사용하여 측정하였다. 기타 시약은 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)의 시약급 이상의 제품을 구입하여 사용하였다.</p> <h2>섬바디 부위별 추출물의 혈액응고 저해 활성</h2> <p>섬바디 부위별 추줄물의 항응고 활성은 각각 thrombin time (TT), prothrombin time (PT) 및 activated partial thromboplastin time (aPTT)을 측정하여 평가하였다. 모든 실험은 3회 반복하여 평균치로 나타내었으며, 각각의 항응고 활성은 시료 첨가시의 응고 시간의 평균치를 무첨가시의 응고 시간의 평균치의 비로 나타내었다.</p> <h2>섬바디 부위별 추출물의 혈소판 응집 저해 활성</h2> <p>섬바디 부위별 추출물의 혈소판 응집저해 활성은 수세된 농축 혈소판에 섬바디 시료를 첨가한 후 collagen을 첨가하여 혈소판 응집을 유도한 후 Whole Blood Aggregometer (Chronolog, PA, U.S.A)의 미세전극에 혈소판이 부착, 응집됨에 따라 발생하는 전기 저항값의 변화를 측정하여 평가하였다(IRB-Andong National Univ-1312: 1040191-202002-BR-001-01). 보다 자세하게는 \( 10 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{CaCl} \) \(20 \mu l \), suspending buffer \( 147.5 \mu \mathrm{l} \), 섬바디 시료 5씨가 포함된 반응 cuvette에 \( 50 \mu \)의 인간 유래 혈 소판 \( \left(5 \times 10^{8}\right. \) cells \( \left./ \mathrm{ml}\right) \)을 첨가하고 3분 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)로 가온 후, 응집유도제로 collagen \( (1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 을 \( 2.5 \mu 1 \)를 넣고 혈소판 응집을 측정하였다. 응집반응은 Whole Blood Aggregometer의 교반장치를 이용하여 반응액을 \( 500 \mathrm{rpm} \)으로 교반시키면서 collagen 첨가 후 12분간 측정하였다. 이후 얻어진 응집곡선으로부터 Aggrolink program (Aggrolink 5.2.3, Chrono- log, PA, USA)을 이용하여 amplitude, slope, area under 를 측정하여 혈소판 응집을 평가하였다. 이때, amplitude \( (\Omega) \)는 응집유도제를 첨가하였을 때 일어나는 혈소판의 최대 응집도를 나타내며, slope는 응집유도제를 첨가한 직후부터 1분 동안의 응집곡선의 기울기를 나타내며, area under는 전체적인 혈소판 응집 정도를 표시하는 것으로 전기저항 증가에 따른 slope 곡선의 하강면적을 나타낸다.</p>