유기용매 및 금속이온의 영향을 조사하기 위해 메탄올, 에탄올, DMSO, 아세토니트릴, 아세톤과 \(\mathrm{Mg}^{2+},\mathrm{Ca}^{2+},\mathrm{K}^{+},\mathrm{Li}^{+},\mathrm{Cu}^{2+}\)를 농도별로 반응액에 첨가하여 pNPB 기질에 대한 효소활성을 측정하였다. SDS, Sarcosy1, Tween 40, Tween 80, Triton X-100을 사용하여 inclusion body의 리폴딩을 수행하였으며, (R,S)-ECHB 가수분해 반응은 에스터라제 EM2L8을 이용하여 수행하였다.
<h2>유기용매 및 금속이온의 영향 조사</h2> <p>일반적으로 널리 사용되는 유기용매인 메탄올, 에탄올, DMSO, 아세토니트릴, 아세톤을 농도별로 반응액에 첨가한 후, pNPB 기질에 대한 효소활성을 측정하였다. 또한, 많이 사용되는 금속이온인 \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } , \mathrm { Ca } ^ { 2 + } , \mathrm { K } ^ { + } , \mathrm { Li } ^ { + } , \mathrm { Cu } ^ { 2 + } \) 를 여러 가지 농도 \( (0-100 \mathrm { mM } ) \) 로 반응액에 첨가한 후, pNPB 기질에 대한 효소활성을 측정하였다.</p> <h2>단백질 리폴딩 수행</h2> <p>SDS, Sarcosy1, Tween 40, Tween 80, Triton X-100을 사용하여 inclusion body의 리폴딩을 수행하였다. Inclusion body 현탁액 \( 90 \mu \mathrm { L } \) 에 여러 농도의 계면활성제 용액 \( 10 \mu \mathrm { L } \) 을 첨가하여 완전히 섞은 후에 \( 900 \mu \mathrm { L } \) 의 Tris- HCl 용액(50 \( \mathrm { mM } , \mathrm { pH } 8.0 \) )을 넣고 희석함으로써 리폴딩과정을 수행하였다.</p> <h2>(R,S)-ECHB 가수분해 반응 수행</h2> <p>에스터라제 EM2L8을 이용하여 (R,S)-ECHB 기질에 대한 가수분해 반응을 다음과 같이 수행하였다. 각 효소반응 시, 먼저 pNPB 표준측정법을 수행하고 그 결과에 따라서 \( 40 \mathrm { U } \)에 해당되는 세포추출액을 효소액으로 사용하였다. Tris- HCl용액 \( (100 \mathrm { mM } , \mathrm { pH } 9.0 \) )에 (R,S)-ECHB 기질을 \( 0.5 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 첨가한 후, \( 40 \mathrm { U } \) 의 효소액을 넣고 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 반응시켰다. 반응 액의 부피는 \( 1.2 \mathrm { ~mL } \) 이며 1시간 간격으로 \( 100 \mu \mathrm { L } \) 씩 샘플링하여 에칠아세테이트 \( 400 \mu \mathrm { L } \), 포화 탄산칼륩 용액 \( 50 \mu \mathrm { L } \) 와 함께 완전히 섞어주었다. 원심분리를 통해 에칠아세테이트 층을 취하고 원심건조농축기로 완전히 건조시켰다. 염화메칠렌 \( 8 \mathrm { ~mL } \) 과 decane \( 10 \mu \mathrm { L } \) 혼합액을 제조하고 이중에서 \( 400 \mu \mathrm { L } \) 를 넣어 재부유한 후, 피리딘 \( 20 \mu \mathrm { L } \) 와 염화아세틸 \( 10 \mu \mathrm { L } \) 을 첨가하여 상온에서 1시간 동안 방치하먼서 (R,S)-ECHB 기질의 아세털화반응을 수행하였다. 염산용액 (1M)을 \( 200 \mu \mathrm { L } \) 넣고 충분히 섞은 후 하층액 \( 200 \mu \mathrm { L } \) 를 취하고, 포화중탄산나트륨 \( 200 \mu \mathrm { L } \) 를 넣고 섞은 후 하층액 \( 100 \mu \mathrm { L } \) 를 취하였다. 그 중에서 \( 2 \mu \mathrm { L } \)를 사용하여 기체크로마토그래피 분석을 수행하였다.</p>