단백질을 SDS-PAGE로 분리한 후 nitrocellulose membrane에 전기전이를 시행했다. 전이에는 Tris base, glycine, methanol로 이루어진 전기전달 버퍼를 사용하였고, 4°C에서 100V의 전압으로 60분 동안 전이를 진행했다. 전이된 막은 탈지분유와 Tween 20이 함유된 블로킹 버퍼로 처리한 후, 항체를 첨가하여 일차 항원-항체 결합을 시켰다. 세척 후, 알칼리인 졸로스포스페이트를 포함한 이차 항체를 반응시키고 발색을 진행했다. 마지막으로, 세척 후 알칼리인 졸로스포스페이트 버퍼에 BCIP와 NBT를 추가하여 발색하고 결과를 확인했다.
<p>SDS-PAGE에 의하여 분흭된 단백질을 nitrocellulose membrane (Biorad, USA)으로 전기적인 전이를 시행하였는데, 이 때 electrotransfer buffer \( (50 \mathrm { mM } \) Tris base, \( \mathrm { pH } \) 8.3; \( 384 \mathrm { mM } \) glycine; \( 20 \% \) methanol)를 사용하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 약 \( 100 \mathrm { ~V } \) 의 전압에서 60 분 동안 전이하였다. 이렇게 전이된 nitrocellulose membrane을 PBS \( \left (80 \mathrm { mM } \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } , 20 \right . \) \( \left . \mathrm { mM } \mathrm { NaH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } , 100 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } , \mathrm { pH } 7.4 \right ) \) 에 5 \% 탈지분유와 \( 0.1 \% \) Tween 20이 함유된 blocking buffer로 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 시간 처리한 후 일차 항원-항체결합에 사용하는 항체(n-NOS, Santa Cruz Biotechnology, USA)를 1:1000으로 희석하여 첨가시킨 blocking buffer에 nitrocellulose membrane을 담구어 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 시간 반응시켰다. \( \mathrm { PBS } \) 와 \( \mathrm { PBS } \) 에 \( 0.1 \% \) Tween 20이 함유된 PBS-T로 15분 간격으로 3회 세척한 후, 발색반응을 보기 위해서는 alkaline phosphatase가 결합된 이차 항체를 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. Nitro-cellulose membrane을 PBS와 PBS-T로 각각 5회 세척한 후, 3 \% 5-Bromo-4-chloro-3-indoylphosphate p-toluidine salt (BCIP)와 0.015 \% p-nitroblue tetrazolium chloride ( \( \mathrm { NBT } \) )가 포함된 alkaline phosphatase buffer \( (100 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } \), \( \mathrm { pH } \) 9.5; \( 100 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } ; 5 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } 2 \) )에 담구어 발색하여 관찰하였다.</p>