야생형 P. stipitis의 셀로비오스 대사가 느리다는 문제를 해결하기 위해 셀로비오스 조건에서 적응 진화를 통해 셀로비오스 대사 효율이 향상된 YN14 균주를 확보하였다. 이는 해당 균주가 생육이 어려운 환경에서 돌연변이나 발현 수준 변화 없이 스스로 유전적 변이를 일으키고 YN14 균주로 진화하였음을 보여준다. 실험 결과는 YN14 균주가 유전적으로 안정적이며, 스트레스를 유발하지 않는 환경에서도 진화에 필요했던 유전적 변이를 상실하지 않는다는 것을 확인하였다. 그러나, 야생형 P. stiptis는 셀로비오스 대사에 관련된 유전자를 다수 보유하고 있음에도 셀로비오스 대사 속도가 느려서 이에 대한 개선 방안이 제시되었다.
<h2>진화된 P. stipitis의 유전적 변이의 안정성 확인</h2> <p>본 연구에서는 cellobiose의 대사가 현저히 느린 야생형 \( P \). stipitis를 이용하여 cellobiose 조건에서 적응진화를 진행하여 cellobiose 대사 효율이 상승한 YN14 균주를 확보할 수 있었으며, 이는 P. stipitis 모균주가 cellobiose 대사와 관련된 유전자들의 돌연변이 혹은 발현 수준의 변화 없이는 생육이 어려운 환경에서 스스로 유전적 변이를 일으켜 YN14 균주로 진화하였다는 것을 나타낸다. 아울러 이러한 결과는 YN14 균주를 cellobiose 대사에 관련된 스트레스를 유발하지 않는 환경에서 계대배양을 진행하는 경우 cellobiose 대사와 관련된 각종 인자들이 다시 변화하여 모균주와 비슷한 수준으로 회귀할 수도 있음을 시사한다. 따라서 YN14 균주가 유전적으로 안정한지 확인하기 위하여 glucose를 단일 탄소원으로 하는 조건에서 총 10 회에 걸쳐 계대배양을 진행하였으며, 각 배양 단계의 종료 시점에서 회수한 세포를 cellobiose를 단일 탄소원으로 하는 조건에서 회분식 배양을 진행하여 YN14 균주의 cellobiose 대사 양상을 비교하였다.</p> <p>Fig. 4는 glucose 조건의 계대배양 단계에서 첫 번째 배양, 네 번째 배양, 일곱 번째 배양 및 열 번째 배양 후 회수한 YN 14 균주들의 \( 20 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \) cellobiose 조건에서의 회분식 발효 양상을 나타내고 있다. Glucose 조건에서 1 회 배양한 후 회수한 YN14 균주는 cellobiose 대사 속도의 저하 없이 24 시간 안에 모든 cellobiose를 소모하였으며 \( 0.4 \mathrm { ~g } \) ethanol \( / \mathrm { g } \) cellobiose의 수율로 약 \( 7.6 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \) 의 ethanol을 생산하였다. Glucose 조건에서 4 회, 7 회 및 10 회 계대배양한 후 회수한 YN14 균주들 역시 거의 변하지 않은 cellobiose 대사 속도를 보였으며, glucose 조건에서 1회 배양한 YN14 균주와 거의 비슷한 ethanol 생산량 및 생산수율을 나타내었다(ethanol 생산 \(8.0-8.2 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \), ethanol 생산수율 \(0.39-0.40 g \ ethanol/g \) cellobiose). 이러한 결과로부터 cellobiose 환경에서 적응진화한 YN14는 유전적으로 안정하기 때문에 스트레스를 유발하지 않는 환경에서 배양하더라도 진화에 필요했던 유전적 변이를 상실하지 않는다는 것을 확인하였다.</p> <h1>고 찰</h1> <p>P. stipitis는 섬유소계 바이오매스로부터 ethanol과 같은 바이오연료를 생산하는 미생물로 널리 활용되어 왔으며, xylose의 대사가 매우 원활할 뿐만 아니라 다양한 당류(예, glucose, mannose, galactose, cellobiose 등)를 대사할 수 있는 유용한 호모로 알려져 있다. P. stipitis의 유전체 및 전사체를 분석한 선행연구 결과에 따르면, P. stipitis에는 약 11개의 sugar transporter(SUT1-4, HXT2.1-2.6 및 HXT4)와 약 7 개의 intracellular \( \beta \)-glucosidase(BGL1-7) 들이 cellobiose의 대사에 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히 HXT2.4와 BGL5, HXT2.5와 BLG3 및 HXT2.6과 BGL 1 등은 유전체에서 각각 클러스터를 이루며 cellobiose 환경에서 상당히 높은 수준으로 발현되는 것이 확인되어 P.stipitis의 cellobiose 대사에 주요한 역할을 할 것으로 보고된 바 있다. 그러나 본 연구에서 야생형의 P. stiptis는 cellobiose 대사에 관련된 유전자를 다수 보유하고 있음에도 cellobiose의 대사속도가 매우 느린 것이 확인되었는데, 이는 세포 내의 cellobiose transporter들이나 intracellular \( \beta \) glucosidase들의 활성이 매우 낮기 때문이거나 cellobiose를 빠르게 대사할 수 있을 정도로 충분히 발현되지는 않기 때문인 것으로 사료된다. 선행연구에서 P.stipitis 유래의 HXT2.4와 BGL5 를 도입한 재조합 S. cerevisiae 또는 P.stipitis 유래의 HXT2.4와 Neurospora crassa 유래의 GH1-1 (intracellular \( \beta \)-glucosidase)을 도입한 재조합 S. cerevisiae 균주의 cellobiose 대사 효율이 좋지 않았음이 보고된 바 있는데, 이러한 선행연구 결과 역시 야생형 P. stipitis의 cellobiose 대사와 관련된 효소 및 단백질들의 활성은 그다지 높지 않음을 나타낸다.</p>