종양 조직을 PBS 완충용액으로 여러 차례 세척한 후, 일차 항체와 이차 항체로 반응시키고 LSM 510 현미경을 사용하여 이미지를 취득하였다. 종양 크기가 \( 60 \sim 100 \mathrm{~mm}^{3} \)이 되었을 때, 대조군과 실험군에 각각 PBS 완충용액과 STC, STD를 주입하였다. 일정 시간 후에 종양을 제거하여 무게를 측정하고, 이를 면역조직화학 염색하였다. 종양 조직을 슬라이드에 고정시키고 염색한 후, PBS 완충용액으로 세척하고, ScanScope를 사용하여 이미지를 취득하였다. 모든 데이터는 평균과 표준편차로 표현하였다.
<h2>면역형광염색(Immunofluorescence staining)</h2> <p>\( 0.1 \% \) MSO와 \( 0.5 \mu \mathrm{M} \) STC 및 \( 1.0 \mu \mathrm{M} \) STD를 첨가하여 반응시킨 세포를 수확하여 PBS 완충용액으로 세척한 후, 슬라이드 유리 위에 도말하고 PBS에 녹인 \( 2 \% \) paraformaldehyde를 사용하여 고정하고, PBS 완충용액으로 3회 세척한 후, PBS에 녹인 \( 0.1 \% \) Triton X-100을 사용하여 permeabilization한다. 다시 PBS 완충용액으로 3회 세척한 후, 일차 항체를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤 동안 반응시키고, PBS 완충용액으로 3회 세척한 후, FITC 또는 PE-conjugated anti-rabbit IgG나 anti-mouse IgG로 1시간 동안 상온에서 반응시키고, PBS 완충용액으로 3회 세척하여 mount 용액을 떨어뜨린 후, 커버 유리로 덮어 Zeiss LSM 510 confocal microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)를 사용하여 이미지를 얻었다.</p> <h2>면역결핍 생쥐에서 HL-60 세포의 종양 이종이식 (xenograft)</h2> <p>In vivo 상에서 STC 및 STD의 항암 효과를 알아보기 위해 \( 2 \times 10^{7} \)개의 HL-60 세포를 \(100 \mu \mathrm{l} \)의 PBS에 부유시켜 6~7주령의 면역결핍 생쥐의 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 종양의 크기가 \( 60 \sim 100 \mathrm{~mm}^{3} \) 정도 되었을 때, 대조군에는 PBS 완충용액을, 실험군에는 \( 7.19 \mu \mathrm{g} / \mathrm{kg} \)의 STC와 \( 21.795 \mu \mathrm{g} / \mathrm{kg} \)의 STD를 생쥐의 꼬리에 3일에 1번씩 주사하였으며, 종양의 크기는 측경 양각기(Caliper)를 사용하여 측정하였다. 일정 시간이 지난 후에 마우스의 종양을 떼어 무게를 측정하고, 구획을 나눠 냉동시키거나 파라핀으로 고정시켜 면역조직화학염색 (Immunohistochemistry)을 시행하였다.</p> <h2>면역조직화학염색</h2> <p>파라핀으로 고정시킨 종양 조직을 얇게 썰어 슬라이드 유리 위에 고정시키고 탈 파라핀 과정을 거친 후, 종양 조직을 헤마톡실린과 에오신을 사용하여 염색하고 일차 항체인 anti-ceramide antibody (1:10)를 상온에서 1시간 반응시킨 다음 이차 항체를 반응시키고 PBS 완충용액으로 세척한 다음 mount 용액을 떨어뜨려 커버 유리로 덮어 ScanScope (Aperio Technologies Inc., Park Center Dr. Vista, CA, USA)를 사용하여 이미지를 얻었다.</p> <h2>통계적 분석</h2> <p>데이터는 평균 \( \pm \) 표준편차로 나타내었다. 대조군 세포와 여러 가지 농도의 STC 및 STD를 처리한 세포 사이의 생존율에 차이가 있는지를 알아보기 위하여 일원 배치 분산분석 (ANOVA test)과 Student's t-test를 사용하여 분석하였다. \( P<0.05 \)일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.</p>