부탄올을 이용하여 Bacillus subtilis BK-17의 배양액을 감압 evaporator로 농축한 후, 이를 투석하여 DEAE Sephadex A-50 column에 흡착시킨 다음 동일 buffer로 용출하였다. 이 과정에서 혈전용해 활성을 갖는 부분만을 선별하여 사용하였다. 또한 Bergey's manual of systematic bacteriology를 이용해 형태학적, 생화학적 특성 조사를 통해 Bacillus subtilis로 최종 동정하였다.
<h2>미생물의 동정</h2> <p>선발된 균주 BK-17의 분류학적 동정을 위해 전자현미경 촬영 및 Bergey's manual of systematic bacteriology 방법에 따라 형태학적, 생화학적 특성을 조사하여 최종적으로 Bacillus subtilis로 동정하였다.</p> <h2>혈전용해효소의 분리 및 정제</h2> <h3>에탄을 침전</h3> <p>부탄올을 사용하여 Bacillus subtilis BK-17의 배양액을 감압 evaporator로 농축하였다. 농축한 배양액을 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris-HCl buffer \( ( \mathrm { pH } \) 7.5)로 투석한 후 에 탄올로 먼저 55%가 되게 농축한 배양액과 혼합하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 4 시간 방치한 후 원심분리 \( \left (12,000 \mathrm { rpm } , 20 \mathrm { ~min } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \) 하여 침 전물을 제거하고 다시 동일한 방법으로 \( 75 \% \) 가 되게 농축한 배양액과 혼합하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24 시간 방치한 후 원심분리 \( \left (12,000 \mathrm { rpm } , 20 \mathrm { ~min } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \) 하여 수거한 침전물을 수거하여 상기 buffer에 녹인 다음 투석하여 활성을 검정하고, 다음 정제단세의 시료로 사용하였다.</p> <h3>DEAE-A50 chromatography</h3> <p>투석한 조효소액을 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris-HCl buffer ( \( \mathrm { pH } 7.5 \) ) 에 평형화된 DEAE Sephadex A-50 column \( (4 \times 15 \mathrm { ~cm } ) \) 에 흡착시키고 동일buffer로 용출하면서 비 흡착된 부분의 분획 중 혈전용해 활성이 있는 부분만을 다음 정제단계에 사용하였다.</p> <h3>Sephadex G-75 gel filtration</h3> <p>전 단계에서 얻은 효소액을 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } ( \mathrm { pH } 7.5 \) ) buffer로 투석 후 동결 건조하여 Sephadex G-75로 gel filtra-tion을 행하였다. Sephadex G-75은 \( 100 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } \) 이 함유된 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris- HCl \( \mathrm { pH } \) 8.0) buffer로 평형화 시킨 것을 col- \( \mathrm { umn } (1 \times 120 \mathrm { ~cm } ) \) 에 충전하여 사용하였다. 시간당 \( 4.0 \mathrm { ~m } \ell \) 정도의 유속으로 1 fraction에 \( 1 \mathrm { m \ell } \) 씩 분취하여 혈전용해 활성과 단백질을 측정하여 활성 분획을 취하였다.</p>