16 S rDNA 염기서열 분석에 의한 10 균주 동정을 실행한 결과 95%에서 100%사이의 상동성과 일부 균에서의 histamin 분해능이 확인되었다.효소법을 바탕으로 histamine을 분해하고 탁도측정법으로 시험균주의 생육곡선을 관찰하여 둘 사이의 관계를 분석한 결과 저온상태인 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 최적의 상태를 가지는 균주가 histamine분해에서의 활용성이 높았다.병원성이 의심되는 Shewanella massilia의 경우 균주의 이용성 향상을 위해 최적활성 범위의 측정에 대한 검토가 요구된다.
<h2>\( 16 \mathrm { ~S } \) rDNA 염기서열 분석에 의한 동정</h2> <p>제한배지에서 분리한 10 균주를 동정하기 위해 API Kit와 세균자동동정기 시스템(MicroLog TMsystem, release 4.0, Biolog Inc., U.S.A.) 등을 사용하여 동정을 시도하였으나 생화학 시험용 인공배지에서 증식이 원활하지 못하였고 기존에 구축된 데이터 베이스의 정보 부족으로 상호유사성이 떨어지는 등의 문제점이 발생하였다. 그래서 \( 16 \mathrm { ~S } \) rDNA 염기서열 분석에 의한 동정을 시도하였다 그 결과 분리된 10 균주 모두 동정이 가능하였으며, Pseudomonas putida strain RA2, Halomonas marina, Uncultured Arctic sea ice bacterium clone ARKXV1/ 2-136, Halomonas venusta, Psychrobacter sp. HS5323, Pseudomonas putida KT2440, Rhodococcus erythropolis, Klebsiella terrigena (Raoultella terrigena), Alteromonadaceae bacterium T1, Shewanella massilia로 동정되었다(Table 3). 그리고 각각 \( 100 \%, 100 \%, 99 \% \), \( 99 \%, 99 \%, 99 \%, 100 \%, 95 \%, 99 \%, 100 \% \) 의 상동성을 보였다. 한편 Arnold and Brown[2]은 Pseudomonas, Proteus, Escherichia, Vibrio, Klebsiella, Clostridium 속의 그리고 Alin과 Satake and Fugita은 Salmonella와 Achromobacter 속의 균이 histamin 분해능이 있었다고 보고한 바 있어 동정된 균주와 일치성이 보여진다.</p> <h2>Histamine 분해능 시험</h2> <p>효소법은 2단계의 연속적인 효소시스템을 이용하여 histamine을 측정하는 방법으로 먼저, diamine oxidase가 hista mine의 분해를 촉매하여 imidazole acetaldehyde, ammonia와 hydrogen perxide 등의 반응생성물을 형성시킨다. 두 번째 첨가되는 효소인 peroxidase는 LCV (Leuco crystal violet)를 환원형에서 산화형으로 변화시키는데 \( \mathrm { LCV } \) 는 환원형에서는 색을 띠지 않다가 peroxidase에 의하여 산화형이 되면 보라색을 띠는 성질을 갖고 있다. 이러한 메커니즘으로 histamine 분해를 확인하였으며, 탁도측정법으로 시험균주의 생육곡선을 관찰하였다. 이와 같은 방법으로 미생물의 생육곡 선과 histamine의 분해와의 관계를 관찰한 결과는 Fig. 1과 2에 나타내었다.</p> <p>시험균주의 histamine 분해능을 관찰한 결과, Shewanella massilia가 빠른 시간에 분해가 이루어지는 것을 확인 할 수 있었고, 제한배지에서 분리한 10 균주 모두, 대수증식기가 시작되는 지점에서 급속한 분해가 관찰 되었다. 이것은 histamine의 분해가 효소 활성이 대량으로 이루어지는 대수증식기에 활발히 시작되고 있다는 것으로 증식과 더불어 세포외에 배출되는 균체 외 효소에 의한 것으로 추정할 수 있다.</p> <p>이상의 결과로 자반고등어에서 분리 동정한 균주 중 histamine을 분해하는데 활용 가능성이 높은 균주는 10 균주 중 비교적 저온상태인 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 최적의 상태를 보이고, \( \mathrm { NaCl } \) 농도 \( 0 \% \sim 9 \% \) 의 폭넓은 범위에서 성장 가능한 \( P_ { s e u d o m o n a s } \)putida KT2440로 사료되며, Shewanella massilia도 \( \mathrm { NaCl } \) 농도 \( 0 \% \sim 5 \% \) 에서 성장이 가능하고 시험균주 중 최고의 분해능을 보여 활용 가능성이 높을 것이라 사료된다. 하지만, Shewanella massilia의 경우 병원성이 의심되고 모든 균주의 최적활성실험 등이 부족하기 때문에 분리한 균주의 이용성을 더 높이기 위해서는 병원성 실험이나 최적활성 범위 축정 등의 대한 검토가 더 필요하다고 사료된다.</p>