본 논문은 실험 결과 가장 효과적인 PEG 기반 polymeric humectant를 사용하여 성장인자 안정화 제형을 구성하였고, 선정된 제형에 맞춘 피부 투과 펩타이드로 phage의 population이 가장 높은 VPRSMAATHSTF 서열의 펩타이드를 선별하였다. PBS을 대조군으로 선별된 피부 투과 촉진 펩타이드의 활성을 검증한 결과, Polymeric humectant 기반의 제형을 이용한 경우는 P3-1 펩타이드가 PBS 기반의 S3-2 펩타이드 보다 약 5배 높은 피부 투과성을 보였다. 그러나 PBS 조건에서 실험한 결과 반대의 결과가 나타났다. 이에 본 연구는 Porcine skin 내에서의 분포를 통해 두가지 펩타이드의 특성을 비교하였고, P3-1 펩타이드가 피부 내의 투과 및 잔류량이 많다는 결과를 확인하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>성장인자 안정화 제형 선정</h2> <p>교원세포의 성장을 촉진을 위하여 EGF, hGH, bFGF를 각각 \( 100 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \)의 농도로 처리하였다. 그 결과 bFGF를 처리한 경우 교원세포의 성장이 촉진되며 spindle의 형태를 이루는 것을 확인할 수 있었다. 기존의 성장인자 보다 주름의 개선 측면에서 우수한 성장인자로 기대된다. 이런 bFGF이 경우 열에 의한 안정성이 낮다. 이 정도를 확인 하기 위해 우선 성장인자의 농도에 대한 교원세포의 성장촉진 활성을 비교하였다. \( 100 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \)에서의 활성이 \( 0.1 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \)에서는 나타나지 않았다. \( 10-1 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \)의 범위에서는 농도에 의존적으로 교원세포의 성장이 증가함을 확인할 수 있었다. 이를 환산하여 bFGF의 열에 대한 안정성을 파악할 수 있었다.</p> <p>그 결과 증류수에 bFGF를 넣고 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 1 \mathrm{~h} \) 가열한 결과 활성이 1/1000 수준으로 감소한 것을 알 수 있었다. 이 때 성장인자의 열 안정성을 개선하기 위해서 보습제 성분을 추가하였다. 이는 기존의 보습제의 \( \mathrm{OH} \) 그룹등이 물과 단백질 분자 사이의 수소결합력을 줄여주는 것으로 설명하고 있다. 기존의 단분자 보습제인 glycerol, 과 PEG가 결합된 PEG의 길이가 긴 polymeric humectant를 사용하였다. 각각 \( 90 \% \)의 농도가 되게 하고 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 1 \mathrm{~h} \) 동안 배양하였다. 그 결과 PEG의 길이가 100 이상이 되는 Glycereth 26의 경우나 PEG400의 경우는 \( 70^{\circ} \mathrm{C}\) \(1 \mathrm{~h} \) 배양 이후에도 \( 90 \% \) 이상의 활성이 유지되었다. 그러나 PEG의 길이가 1개인 Glucam E20의 경우는 약 \( 30 \% \)의 활성이 유지되었다. 이를 통해서 PEG의 길이가 긴 성분을 사용할 때 성장인자의 고온 안정성을 향상시키는 것을 알 수 있었다. 또한 이들은 glycerin 류의 단분자 성분이 1-8\( \% \) 수준의 활성을 유지시키는 것에 비해서도 안정화 능력이 큰 것으로 이해할 수 있다. 이를 바탕으로 PEG 기반의 polymeric humectant를 적용한 성장인자 안정화 제형을 구성하였다.</p> <h2>성장인자 안정화 맞춤형 피부 투과 펩타이드의 선별</h2> <p>Franz cell- Porcine skin 시스템과 Phage library를 활용하여 피부투과 촉진 펩타이드를 발굴하는 것은 이론적인 계산이나 화학적인 modification 없이도 투과 촉진 펩타이드를 발굴할 수 있는 방법으로 다양한 연구자에 의해서 알려져 왔다. 그러나 이때 library를 다르게 (길이 및 disulfide bond의 유무)하는 정도의 차이가 있었으나 그 방법은 유사했다. 대부분 donor chamber에 PBS를 사용하는 형태이다. 그러나 특정 성분이 피부로 투과가 잘되기 위해서는 피부 구조 속에서의 diffusion 뿐만 아니라 제형에서 피부로 partition되는 정도도 큰 영향을 미친다. 본 연구에서는 이점을 주목하여 screening 단계에서부터 최종 제형을 기반으로 스크리닝하여 투과 효율을 더욱 향상시키고자 하였다. 이 경우 PBS에서 선별된 투과 촉진 펩타이드보다 최종 제형에서 더 우수한 투과효율을 나타낼 것으로 기대하였다.</p> <p>우선 polymeric humectant 기반의 제형과 phage library를 혼합한 mixture를 Franz cell의 donor chamber에 incubation을 하는 방식으로 screening을 수행하였다. 먼저 polymeric humectant 기반의 제형에서는 Phage의 생존에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다(data not shown). 동일한 양의 phage를 donor chamber에 incubation 하였을 때 스크리닝 round 별 receiver chamber에 투과한 phage의 수가 점증적으로 증가한 것으로 스크리닝을 통한 우수 phage의 들의 population이 증가한다는 것을 유추 할 수 있다. 3 round와 4 round의 phage의 서열을 확인한 결과 가장 population이 높은 VPRSMAATHSTF 서열의 펩타이드를 확인할 수 있었다. 약 \( 50 \% \) 정도의 분포를 가지는 것을 확인하였고 4 round 이상의 선별은 더 이상 진행하지 않았다.</p> <h2>피부 투과 촉진 펩타이드의 활성 검증</h2> <p>본 연구로 선별된 펩타이드의 투과 정도를 비교하기 위해서 FITC를 펩타이드 C 말단에 연결하여 제작하였고, 기존의 PBS기반으로 선별된 NGSLNTHLAPIL 서열 및 콜라겐을 이루는 기본 구조가 되는 GHK 서열이 반복된 구조의 펩타이드를 대조군으로 사용하였다. 투과 실험은 Polymeric humectant 기반의 제형을 활용하였다. PBS를 기반으로 선별된 S3-2 펩타이드 보다도 Polymeric humectant 기반의 제형을 이용한 경우는 P3-1 펩타이드가 S3-2 펩타이드 보다 5배 가량 많이 피부를 투과한 것을 알 수 있었다. 그러나 이들을 PBS 조건에서 실험한 경우는 이 경향이 역전되는 것을 확인할 수 있었다(data not shown). 제형에서 피부구조로 효능성분이 partition되어 나오는 것이 피부 투과에 영향을 미치는 중요 요소라고 판단되고 제형 맞춤형 파지디스플레이를 수행 함으로써 특정 기능을 위해 선정된 제형에서의 투과효율을 높일 수 있었다. PBS 기반의 선별 방식은 다양한 제형에 일반적으로 적용시키기에 적절한 방식이라고 생각된다. 그러나 특정 목적으로 정해진 한가지 제형에 대해서 스크리닝을 수행하게 되면 제형 맞춤형 투과 촉진 펩타이드를 쉽게 선별할 수 있음을 알 수 있었다.</p> <p>두가지 펩타이드의 특성을 비교하기 위해서 Porcine skin 내에서의 분포를 확인하였다. PBS 기반의 S3-2 peptide와 P3-1 peptide에 FITC를 표지하고 Polymeric humectant 기반의 제형 조건에서 porcine skin에 도포한 뒤 투과 정도를 two-photon confocal을 이용하여 관찰하였다. 가장 시그날이 강한 표피에서부터 \( 5 \mu \mathrm{m} \)씩 침투하며 영상을 확인하였고, 표피 층을 지나 진피층의 영역이 되는 \( 60 \mu \mathrm{m} \) 깊이까지 투과를 검증하였다. 그 결과 P3-1 펩타이드가 피부내의 투과 및 잔류량이 많다는 것을 알 수 있다. 본 연구에 의해서 발굴된 투과촉진 펩타이드들은 차후 성장 인자와의 fusion 상태의 생산을 통하여 각각의 투과촉진 활성이 증대된 새로운 성장인자의 개발에 적용되어 피부 외용제 분야에 적용될 수 있다. 이는 화학적인 투과촉진제를 사용하여 피부 장벽기능에 교란을 가져올 수 있는 방식에[19] 비해 안전할 것으로 예상된다. 또한 세포막의 지질성분은 피부 각질 세포간 지질층과는 그 구성이 다르기 때문에 피부 투과 측면에서는 세포막 투과 방식의 PTD (protein transduction domain)보다 우수한 것으로 예상된다.</p>