본 실험은 S. mutans JC-2를 분양 받아 4주마다 NA(Nutrient agar, Difco Co., USA)배지에 계대하여 HIB(Heart Infusion Broth, Difco Co., USA)를 배지로 이용해 항균 활성 측정을 하였고, 항균활성을 나타내는 천연물은 96 well microtiter plate assay, Disk paper method, \(MIC\) 측정의 3단계를 통해 최종 선정하였다.
<h1>실험 방법</h1><h2>실험 재료 및 시료 조제</h2><p>경북 및 강원도 일대에서 1995년에서 2004년 사이에 채집한 식용 및 약용 식물 309종을 대한식물도감에서 검증하여, 그늘에서 일주일 간 건조 한 후 잘게 썰어 메탄올로 추출하였으며, 추출액은 감압 농축하여 분말로 제조하여 사용 전까지 저온 밀봉 보관하였다. 사용시에는 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 농도로 DMSO(dimethylsulfoxide)에 녹인 후 항균 활성을 평가하였다. 사용한 식물 재료 및 추출 부위는 Table 에 나타내었다.</p><h2>사용 균주 및 배지</h2><p>본 실험에 사용한 균주는 원광대학교 치과대학 구강미생물 실험실에 보관중인 S. mutans JC-2를 분양 받아 4주마다 NA(Nutrient agar, Difco Co., USA)배지에 계대하여 사용하였다. 항균 활성 측정에 사용된 배지로는 HIB(Heart Infusion Broth, Difco Co., USA)를 사용하였다. 시료의 활성 평가를 위한 대조군으로는 ampicillin, erythromycin, streptomycin sulfate(Sigma Co., USA)를 DMSO에 적당한 농도로 녹여 사용하였다.</p><h2>항균활성의 평가</h2><p>항균활성을 나타내는 천연물은 96 well microtiter plate assay, Disk paper method, \(MIC\) 측정의 3단계를 통해 최종 선정하였다.</p><p>96 well microtiter plate assay에 의한 항균 활성의 측정: 96 well plate를 사용하여 각 well에 \( 180 \mathrm{\mu l}\) HIB 배지, \( 10 \mathrm{\mu l} \) 의 시료와 \( 10 \mathrm{\mu l} \) 의 S. mutans 균액을 혼합하여 최종 부피가 \(200 \mu \mathrm{l} \) 되도록 조정하였으며, 최종 시료농도는 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \), 접종 농도는 \( 10^{6} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 로 되도록 첨가하였다. 이후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 배양하고, UV-Visible spectrophotometer (Hitachi Co., JAPAN)로 \( 600 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하여 S. mutans에 대한 성장률을 측정하여 항균력을 평가하였다. 시료 처리시 용매 대조구는 DMSO를 \( 5 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)를 사용하였으며, 이 농도까지는 S. mutans의 성장저해는 나타나지 않았다. 성장 저해율은 아래와 같이 계산하였다.</p><p>Growth inhibition \( (\%)=\{1-(S-C2) /(C1-M)\} \times 100 \)</p><p>이때 \( S \)는 (배지 \( + \) S. mutans \( + \) 시료) 흡광도, \(C1\)은 (배지 \( + \)S. mutans) 흡광도, \( C2 \)는 (배지+시료) 흡광도, \(M\)은 배지 흡광도를 각각 나타낸다.</p><p>Disk paper method를 이용한 항균 활성의 측정: 96 well microtiter plate method에 의해 1차 선별된 시료의 항균 활성은 HIB 고체 배지에서 disk paper (지름 \( 6.5 \mathrm{mm} \), Whatman No. 2)를 이용한 생육저지환의 크기를 측정하여 재평가 하였다. 이때 시료의 농도는 disk당 \( 100 \mu \mathrm{g} \)을 사용하였으며, S. mutans 세포 농도는 \( 1 \sim 2 \times 10^{8} \mathrm{CFU} \) 되도록 도말한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양한 후 생육저지환의 크기\( (\mathrm{mm}) \)를 측정하여 2차 선별하였다. 대조군으로는 ampicillin, erythromycin, streptomycin sulfate의 시판 항세균제를 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도로 처리하였으며, 항세균 활성은 생육저지환의 크기로 나타내었다.</p><p>\(MIC\)의 측정: 2차 선별된 7종의 천연물 시료의 항균 활성은 microbroth dilution 법을 변형시켜 평가하였다. HIB 액체 배지 \( 980 \mu \mathrm{l}\)에 시료 \( 10 \mu \mathrm{l} \)(각각의 최종농도 \(0,10,15,25,30,50,75,100,150,200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)와 균액 \( 10 \mathrm{\mu l}\left(10^{6} \mathrm{CFU} /\right. \)\( \mathrm{ml}) \)를 첨가하여, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 배양한 후 생육이 나타나지 않는 최저농도를 \(MIC\)로 결정하였다. 이때 실험의 대조군으로는 ampicillin, erythromycin, streptomycin sulfate를 각각 최종농도 1, 2, 3, \( 4 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 되도록 처리하여 \(MIC\)를 결정하였다.</p>