본 논문의 실험에서는 생화학 분석기를 이용하여 분석한 혈청 포도당, enzyme im-munoassay ELISA 분석용 kit를 이용하여 분석한 혈청 인슐린 농도, BSA를 이용하여 Bradford (1976)의 방법으로 검출한 총단백질량, WBLR 용액에 membrane을 넣고 1분간 발색하고 얻은 membrane을 이미지 분석 시스템을 이용하여 스캔한 후 Quantity 1-D Analysis Soft ware를 이용하여 산출한 단백질량과 같은 모든 결과들을 SPSS/PC 11.0 통계 프로그램을 이용하여 기술 통계치를 산출하였다.
<h2>혈청 포도당 및 인슐린 농도 분석</h2> <p>모든 실험동물들은 pentobarbital sodium \( (50 \mathrm{mg} / \mathrm{kg}) \) 을 복강을 에 투여, 마취시킨 후 개복하여 좌심실에서 혈액 \( 8 \mathrm{ml} \) 를 채혈한 후 혈청 분리 튜브로 옮겨 30분 정도 실온에서 방치한 후 원심분리 (\( 3,000 \mathrm{rpm}\), 15분, \( \left.4^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 하여 혈청을 분리하였다. 혈청 포도당은 생화학 분석기(EKTACHEM DT 60II, USA)를 이용하여 분석하였으며, 혈청 인슐린 농도는 enzyme im-munoassay ELISA 분석용 kit (Mercodia AB, Uppsala, Sweden)을 이용하여 분석하였다.</p> <h2>조직 표본 준비</h2> <p>모든 실험처치를 끝낸 집단들의 심장을 액화질소로 동결시킨 후 분석 시까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 의 초저온 냉동기(Bio-Freezer, Forma Scientific)에 보관한 후 western blot 분석을 위해 protein \( \mathrm{ex}^{-} \) traction solution (Cat No. 17081-iNtRON, Korea) 1 ml에 심장의 좌심실 조직을 균질화(homogenizer, Pyrex Corning, USA)시킨 후 \( 14,000 \mathrm{rpm} \) 으로 10 분간 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 원심분리(Centrifuge 5417R- effendorf, Germany)하였다. 원심분리 후 펠렛(pellet)을 제외한 상층부분을 따로 분리하여 분석 시까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 초저온 냉동기에 보관하였다.</p> <h2>SDS-PAGE</h2> <p>총 단백 질량은 BSA (bovine serum albumin, \( 570 \mathrm{~nm} \) )를 이용하여 Bradford (1976)의 방법으로 겅량하였다. \(10\%\) separating gel (3DW, \(30\%\) acrylamide: bisacrylamide, \( 1.5 \mathrm{M} \) tris \( \mathrm{pH} \) \( 8.8,10 \% \) SDS, TEMED, \( 10 \% \) ammonium persulfate)과 \(5\%\) stacking gel (3DW, \(30\%\) acrylamide: bisacylamide, 1M tris\( \mathrm{pH} 6.8,10 \% \) SDS, TEMED, \(10\%\) ammonium persul fate)을 만들어 사용하였다. 원심분리 \( (14,000 \mathrm{rpm}, 10 \mathrm{~min}) \) 한 상층액과 5XSDS Sample loading buffer \( (60 \mathrm{mM} \) tris \( \mathrm{pH} 6.8,25 \% \) glycerol, \(2\%\) SDS, 14.4mM 2-mercaptothanol, \(0.1\%\) Bromophenol blue)를 잘 혼합한 후 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 끓여 단백질을 변성시킨 후 10분간 얼음에 방치한 후 다시 \(14,000 \mathrm{rpm} \) 으로 10분간 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 원심 분리하고 스탠다드 마커 (Pagerular Prestained Protein Ladder, #SM0671- Fermertas)여 함께 각 샘플을 Mini-Protein II dual-slab apparatus (Bio-Rad, CA, USA)에 준비된 stacking gel well에 총 단백질량이 \( 30 \mathrm{ug} \) 이 되도록 분주하고 \(80 \mathrm{volt}\)에서 2시간 정도 샘플이 바닥에 닿을 때까지 전기영동 하였다.</p> <h2>Westem blot</h2> <p>Methanol에 적신 PVDF membrane (Bio-rad, USA)과Transfer buffer \( (190 \mathrm{mM} \) glycine, \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-base, \( 0.05 \% \) SDS, \( 20 \% \) methanol)로 적신 3M paper (Whatman)를 차례로 겹쳐 Mini trans-blot cell (Bio-Rad, CA, USA)에 장치한 후 \(60 \mathrm{volt}\) 로 2시간을 전사하고 Membrane으로 증착이 끝나면 rocker platform 위에서 90분 등안 membrane을 \( 3 \% \) skim milk 용액 (in TBS-T: \( 10 \mathrm{mM} \) Tris-base, HCl-\(\mathrm{pH} 7.6 \), \( 0.5 \mathrm{M} \mathrm{NaCl}, 0.05 \% \) Tween-20)으로 Blocking시켰다. 이 후 1차 항체인 anti-AMPK a (#2532, Cell Signaling, USA), anti- Phospho- AMPK (#2531, Cell Signaling, USA), anti-PGC-1a (SC-13067, Santa Cruz, CA, USA), anti-GLUT-4 (#2299, Cell Signaling, USA), an-ti-HSP-60 (SC-13966, Santa Cruz, CA, USA), anti-GAPDH (SC-20357, Santa Cruz, CA, USA)를 \(1 : 1,000\)으로 bolcking (\(3\%\) skim milk)용액으로 각각 희석시켜 12시간 동안 흔들어 준다음 TBS-T 용액으로 10분씩 5차례 세척한 후 2차 항체(horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit 65- 6120, ZYMED, CA, USA; horseradish peroxidase-conjugated rab-bit anti-goat 81-1620, ZYMED, CA, USA)틀 Blocking 용액으로 15,000으로 희석시켜 90분 동안 흔들어 주고 난 후 TBS-T용액으로 10분씩 5차례 세척하였다. 마지막 단계로 WBLR 용액(Western Blotting Luminol Reagent SC-2048, Santa cruz Biotechnology, CA, USA)에 membrane을 넣고 1분간 발색하고 얻어진 membrane을 이미지 분석 시스템(Molecular Imager ChemiDoc XRS System, Bio-Rad, USA)을 이용하여 스캔한 후 Quantity 1-D Analysis Soft ware (Bio-Rad, USA)를 이용하여 단백질량을 산출하였다.</p> <h2>자료 처리 방법</h2> <p>이 연구에서 얻어진 모든 결과는 SPSS/PC 11.0 통계 프로그램을 이용하여, 각 변인에 대한 기술 틍계치 (mean \( \pm \mathrm{SD} \)) 를 산출하였다. 생리적 변인인 좌심실내압은 집단(3)×시간(9) 반복측정에 의한 이원변량분석(repeated two Way- ANOVA)을 실시하였으며 상호작용효과가 있을 경우 그 차이를 구체적으로 확인하기 위하여 SNK (Student Newman- Keuls)을 이용하여 사후검증을 하였다. 혈청 포도당, 혈청 인슐린 수준, 당대사 관련 표현형 단백질(AMPK, PGC-1\(\alpha\), GLUT-4)과 HSP-60 단백질의 집단 간 차이를 확인하기 위해 일원변량분석 (one way-ANOVA)을 실시하였다. 집단 간 유의한 차이가 있을 경우 LSD (least significant difference)를 이용하여 사후 검증을 실시하였다. 이때 가설 수락 기준은 \( \alpha-0.05 \) 수준으로 하였다.</p>