Brcpi1 유전자는 기관별로 특이적으로 발현하는 것으로 관찰되었으며, 이 유전자를 조절하는 식물 발현 벡터를 구축하였다. 정상생장조건에서 변형 식물과 비교시 Brcpi1이 포함된 식물이 더 빠른 생장과 개화를 보였다. 또한, 염해 스트레스로 인한 세포 내 \( \mathrm { Ca_2 + } \) 이온 증가는 신호전달체계를 활성화하고, 세포내의 염해 스트레스 적응에 관여하는 \( \mathrm { K_ + } \) 이온의 유입과 \( \mathrm { K_ + } / \mathrm { Na_ + } \) 관계를 조절한다. 이를 통해 Brcpi1 유전자가 식물의 성장, 발육 및 스트레스 반응에 크게 기여하는 것을 확인하였다.
<p>Brcpi1 유전자의 계통수 작성은 6개의 유전자들을 이용하여 neighbor-joining 방법으로 구축한 결과 총 7개의 단백질에서 3개의 그룹으로 나눌 수 있었다. 각각의 group에 해당되는 유전자들의 생리적 기능에 대한 정보는 거의 없기 때문에 BrCPI1 단백질의 기능을 예측 할 수 없으나, 3개 그룹의 유전자간 기능적으로 분리되어 있을 가능성을 시사하고 있다. 따라서 본 실험에서 분리된 BrCPI1은 애기장대 및 양배추유래의 phytocystatin과 같은 cluster를 형성하고 있기 때문에 이들 유전자와 거의 유사한 기능을 가지고 있을 것으로 예측된다.</p> <h2>Brcpi1 유전자의 copy 수와 발현분석</h2> <p>소송체 게놈 상에서 Brcpi1 유전자의 copy 수를 알아보기 위해, 배추 잎으로부터 분리한 genomic DNA \( 20 \mu \mathrm { g } \)를 BamHI, EcoRI, HindⅢ와 Pst Ⅰ으로 각각 절단하였다. Southern blot 분석은 Brcpi1 유전자의 3' UTR 영역 특정 염기서열부위를 probe로 하였다. 그 결과 HindⅢ로 절단한 lane를 제외한 나머지 3개의 lane 에서 단일 밴드를 보였다 (Fig. 3). 이는 Brcpi1 유전자가 배추 게놈에 낮은 copy 수의 유전자임을 시사한다. 지금까지 Brassica 속에서 phy-tocystatin 유전자는 7-8개정도 알려져 있다. 이들 유전자간에 높은 상동성을 보였는데, Sou-thern blot 분석에서 낮은 copy를 보였다, 이는 Brcpi1 유전자의 3' UTR 영역 특정 염기서열부위를 probe사용하였기 때문에 배추 게놈 내에 Brcpi1 만이 특이적으로 hybridiza-tion 되었기 때문으로 생각된다. 또한 Brcpi1 유전자의 발현 분석은 뿌리, 줄기, 어린잎, 성숙한 잎, 주두, 꽃잎, 수술, 꽃받침, 화경 등 9개 조직을 이용하여 RT-PCR분석을 수행하였다. Brcpi1 유전자의 기관별 발현양은 수술이 가장 높게 나타났으며, 꽃받침, 주두 및 꽃잎 등의 기관에서 뿌리 및 잎보다 높은 경향을 보인 것으로 미루어 볼 때 기관 특이적으로 발현하고 있음을 시사한다.</p> <h2>형질전환 애기장대를 이용한 Brcpi1 유전자의 기능분석</h2> <p>Brcpi1 유전자의 기능을 분석하고자 사용한 식물 발현 벡터는 pBig vector로 Brcpi1는 35S promoter의 조절지배하에 발현하도록 구축하였다. 형질전환은 애기장대를 생장시킨 후, 개화전에 Agrobacterium 을 스프레이로 화아기관에 촉촉하게 감염시킨 후, 종자를 채취하였다. 얻어진 T1종자를 hygromycin이 포함된 MS배지에서 30개의 형질전환체 중 정상적으로 생육한 10개 식물체를 선발하여 T2세대를 육성하였다. 형질전환 식물체들에서 도입 유전자의 확인은 Brcpi1 및 HPT 유전자를 이용하여 PCR 분석으로 학인하였다. 그리고 유전자의 도입이 확인된 개체를 이용하여 RT-PCR 분석을 통해 Brcpi1 유전자의 발현을 확인하였다 (결과 미제시). 정상생장조건에서 WT과 transgenic plants 간의 phenotype을 비교한 결과 형 질전환체가 생장 속도 및 개화시기가 빠른 게 나타났다. 식물생장에 영향을 주는 생장조절물질 중 ABA 처리 후 Brcpi1 유전자의 발현 정도를 살펴본 결과 ABA 처리한 형질전환체에서 ABA를 처리하지 않은 형질전환체와 거의 유사한 발현량을 보였다. 또한 환경 스트레스stress 변화에 따른 Brcpi1유전자의 발현 양상을 알아보기 위해 250 \( \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } \) 및 저온 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)을 처리하여 지상부의 발현량을 분석한 결과 Brcpi1 유전자의 발현은 \( 250 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } \) 및 저온 \(4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)을 처리한 형질전환체에서 처리하지 않은 형질전환체에 비해 높게 나타났다. 또한 \( 250 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } \) 및 저온 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 및 ABA 처리에 따른 형질전환체의 생육은 형질전환하지 않은 대조구에 비해 뿌리 및 지상부의 생육이 양호하였다. 통상 염해 스트레스는 \( \mathrm { NaCl } \)에서 유래되어지는 \( \mathrm { Na_ + } \) 와 \( \mathrm { Cl_- } \) 이온 농도가 원인이 되어 세포 내에 \( \mathrm { Ca_2 + } \) 이온의 증가를 초래하게 되고, 순간적으로 변화된 세포질 내의 \( \mathrm { Ca_2 + } \) 이온농도는 second messager로서 작용하여, 세포의 스트레스에 대한 신호전달체계를 활성화하고 세포내의 염해 스트레스 적응에 관여하는 \( \mathrm { K_ + } \) 이온의 유입과 \( \mathrm { K_ + } / \mathrm { Na_ + } \) 관계를 조절된다. 이런 측면에서 Brcpi1 유전자는 세포내의 염해 스트레스를 적응하여 생육의 증가 및 유전자의 발현이 높게 나타난 것으로 사료된다. 따라서 Brcpi1 유전자는 비생물학적 스트레스 반응에 넓은 스펙트럼을 갖고 있는 식물 생장과 발육에 중요하게 관여하고 있음을 시사한다.</p>