내피세포는 Jaffee 등이 제안한 방법을 수정하여 분리하였고 RNA는 각기 다른 조건에서 배양하여 수확한 HUVEC으로부터 Trizol 용액을 이용하여 분리하였으며, 가톨릭대학교 미세유전체 질환 연구센터에서 제작한 \( 19 \mathrm{~K} \) 인간 올리고 칩을 사용하여 스텐포드 대학에서 제공하는 hierarchical clustering 알고리즘을 사용하여 clustering을 실시하였고, Treeview 프로그램을 이용하여 데이터를 이미지로 얻었다. 그리고 활성화시키지 않은 HUVEC의 유전자 발현을 기준으로 하여 활성화시킨 HUVEC의 유전자 발현 변화량을 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>인간 제대로부터 제대정맥 내피세포(HUVEC)의 분리 및배양</h2><p>내피세포는 Jaffee 등이 제안한 방법을 수정하여 다음과 같이 분리하였다. 길이가 \( 15 \mathrm{~cm} \) 이상 되는 제대 정맥에 제작된 바늘을 꽂고 등장액(phosphate buffered saline; PBS)으로 제대 정맥 내부를 2 차례 세척하여 주고, \( 0.2 \%\) collagenase를 정맥 내에 주입하여 주었다. \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 25 분간 반응시키고 난 후, 분리된 세포들을 튜브에 담고 \( 1,000 \times \mathrm{g} \)에서 7분간 원심분리 하였다. 분리된 세포들은 \( 20 \% \) 우태아 혈청(Fetal Bovine Serum; FBS, Life Technologies, Grand Island, NY, 내피세포 성장 시약(endothelial cell growth supplement; ECGS, \( 30 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \); Sigma, St Louis, MO), 헤파린(\( 90\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \); Sigma, St Louis, MO)이 함유된 M199 배지를 사용하여 gelatin이 피복되어 있는 배양 접시에서 배양하였다. 배지는 3 일 마다 교체해 준 후 세포를 수확한 HUVEC과 3일 후 배양 배지를 교체하고 13 시간 후에 세포를 수확한 것을 array 실험에 사용하였다. 이 때 HUVEC의 계대수가 \( 2 \sim 4 \)인 것을 사용하였다.</p><h2>HUVEC으로부터 total RNA의 분리</h2><p>각기 다른 조건에서 배양하여 수확한 HUVEC으로부터 Trizol (Invitrogen, Grand Island, NY) 용액을 이용하여 분리하였다. 수확한 세포에 Trizol \( 1 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 세포를 파괴시킨 후 클로로포름을 첨가하여 주고 \( 12,000 \times \mathrm{g}, 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15 분간 원심분리 하였다. 상등액을 새로운 튜브에 옮긴 후에 이소프로판올을 가하고 다시 \( 12,000 \times \mathrm{g}\), \(4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10 분간 원심분리 하였다. 얻은 RNA pellet을 공기 중에 말린 후 DEPC-처리한 물로 잘 녹여 준 후, 전기영동 gel에서 18S, 28S의 band가 뚜렷하고, \( 260 / 280 \) 비율이 1.8 이상인 시료만을 array 분석용으로 보관하였다.</p><h2>Oligonucleotide microarray의 hybridization</h2><p>올리고 칩은 가톨릭대학교 미세유전체 질환 연구센터에서 제작한 \( 19 \mathrm{~K} \) 인간 올리고 칩을 사용하였다. 칩의 질과 실험방법의 재현성은 NIH3T3 세포로부터 유래한 total RNA를 가지고 dye swap 실험에 의해 검증하였다. HUVEC의 total RNA \( 30 \mu \mathrm{g} \), 또는 reference RNA UHR (Universal Human Reference RNA; Stratagene, La Jolla, CA) \( 20 \mu \mathrm{g} \) 을 사용하여, Superscript Ⅱ 역전사 효소(Invitrogen, Grand Island, NY)를 반응시켜서 각각의 cDNA를 제작 하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 UHR cDNA는 Cy3 (NEN Life Science, Boston, MA)로 표지하였고 HUVEC cDNA는 Cy5 (NENLife Science, Boston, MA)로 표지하였다. 이렇게 제작된 프로브는 Microcon YM-30 column (Amicon, Stonehouse, Gloucester, UK)으로 정제를 하였고, 올리고 칩과 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서16 시간 이상 hybridization시켰다. 반응이 종료된 후 칩을 세척하여 준 후 Gene Pix 4000B scanner (Molecular Devices Comporation, Union, (A, USA)를 이용하여 이미지를 얻었고 일차적인 데이터 정리 후, BASE 프로그램으로 데이터의 normalization 및 filtering을 실시하였고 Cluster 프로그램을 통하여 clustering을 실시하였다.</p><h2>Hierarchical clustering</h2><p>스텐포드 대학에서 제공하는 hierarchical clustering 알고리즘을 사용하여 clustering을 실시하였고, clustering한 데이터는 스텐포드 대학에서 제공하는 Treeview 프로그램을 이용하여 이미지로 얻었다. Clustering시 각 lane 위에 가지들은 유전자 발현이 비슷한 것들끼리 연결시킨 것을 의미한다. 붉은색은 reference RNA UHR 보다 유전자 발현이 증대된 것을 의미하고, 초록색은 UHR 보다 유전자의 발현이 감소된 것을 의미한다.</p><h2>데이터 분석</h2><p>활성화시키지 않은 HUVEC (RHUVEC)의 유전자 발현을 기준으로 하여 활성화시킨 HUVEC(AHUVEC)의 유전자 발현 변화량을 분석하였다. BASE 프로그램을 통하여 내려받은 자료를 엑셀 프로그램(Microsoft Excel)을 이용하여 정리한후, RHUVEC 보다 AHUVEC의 유전자 발현차이가 2배 이상 되는 유전자만을 선별하여 분석, 정리 하였다.</p>