본 연구에서는 동물세포 배양 유래 생물의약품에서 MVM 안전성 확보를 위해, real-time PCR 시험법을 확립하고 CHO 세포에서 MVM을 정량적으로 검출하여 바이러스 안전성 검증 시험법으로의 활용 가능성을 평가하고, 단백질 의약품 제조공정에서 바이러스 필터를 이용한 바이러스 제거 공정의 효율을 감염역가 시험법과 비교 검증하여 바이러스 제거 검증 시험법으로의 활용 가능성을 평가하였다.
<p>본 연구에서는 동물세포 배양 유래 생물의약품에서 MVM 안전성을 확보하기 위해, 세포주, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 MVM을 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 MVM 제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 민감도와 특이도가 우수한 real-time PCR 시험법을 확립하고자 하였다. 확립된 real-time PCR 시험법을 활용하여 인위적으로 MVM을 감염시킨 CHO 세포에서 MVM을 정량적으로 검출하여 바이러스 안전성 검증 시험법으로의 활용 가능성을 평가하였다. 또한 단백질 의약품 제조공정에서 바이러스 필터를 이용한 바이러스 제거 공정의 효율을 감염역가 시험법과 비교 검증하여 바이러스 제거 검증 시험법으로의 활용 가능성을 평가하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>MVM의 배양 및 정량</h2> <p>MVM(ATCC VR 1346)의 배양과 정량을 위해 A9 세포(ATCC CRL 6319)를 사용하였다. A9 세포를 \( 10 \% \) 우혈청(Gibco BRL, USA)을 첨가한 Dulbecco's Minimun Essential Medium(DMEM: Gibco BRL, USA) 배지에 배양하였다. T-150 flask에 배양된 단층 세포에 바이러스를 감염시킨 후 주기적으로 세포병변효과(cytopathic effect: CPE)를 관찰하였다. CPE가 명백하게 관찰 될 때 배양액과 세포를 수거한 다음, \( 400 \times \mathrm { g } \)에서 5분간 원심 분리하여 상층액은 따로 모으고 pellet은 재현탁하였다. Pellet을 동결과 해빙과정을 2회 반복하여 파쇄한 후 \( 400 \times \mathrm { g } \)에서 5분간 원심 분리하여 상등액을 얻었다. 원심 상등액을 혼합한 후 \( 0.45 ~ \mu \mathrm { m } \) filter로 여과한 다음 소분하여 \( -70 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 보관하였다.</p> <p>MVM의 정량을 위해 감염성 있는 바이러스의 titer를 \( 50 \% \) tissue culture infectious dose( \( \mathrm { TCID } _ { 50 } \))로 나타내었다. MVM을 \( 2 \% \) 우혈청을 첨가한 DMEM 배지로 7배수로 희석하여 24 well plate에 배양된 세포에 \( 0.25 \mathrm { ~mL } \)씩 접종하였다. 음성 대조군으로 세포배양배지를 \( 0.25 \mathrm { ~mL } \)씩 접종하였다. 그 후 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에서 \( 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \), \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 배양하면서 계속적으로 현미경으로 CPE를 관찰하였다.</p>