저산소증을 유도하기 위해 Culture plate를 저산소 처리한 후 배양세포를 정상 산소 환경 배양조에 옮겨서 배양하였다. RNA 추출을 위해 저산소증 유발하기 위한 배양 후 세포 용해 처리와 균질화, 원심분리하여 RNA를 침전시키고 용액 D로 녹이는 과정을 거쳤다. Microarray는 대조군과 실험군의 저산소증 유발 세포에서 분리한 total RNA로부터 first cDNA strand를 만들고 표지한 후 세척하여 디지털 형광이미지를 얻었다.
<h2>저산소증 유발</h2><p>Culture plate를 \( \mathrm{CO}_{2} \) Water Jacketed Incubator(Forma Scientific Inc.)를 이용하여 \( 2 \% \mathrm{O}_{2} / 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 환경에서 3시간 처리하여 저산소증을 유도하였다. 저산소 처리가 끝나면 배양세포를 정상산소 환경 배양조에 옮기고 계속 배양하였다.</p><h2>RNA 추출</h2><p>RNA 추출을 위한 배양은 \( 60 \mathrm{~mm} \) dish를 사용하였다. DIV12에 AGR \( 10 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) 를 처리하고 DIV14에 저산소증을 유발하였다. 저산소 처리가 끝나고 24 시간 후에 배양액을 제거하고 5 10 ml의 ice-cold PBS로 수세하였다. PBS를 제거하고 용액D[4M guanidinium thiocyanate, \( 25 \mathrm{mM} \) sodium citrate- \( 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) sodium lauryl sarcosinate, \( 0.1 \mathrm{M} \) \( \beta \)-mercaptoethanol] \( 1 \mathrm{ml} \) 를 각 culture dish에 넣어 세포를 용해시켰다. 용해된 lysate-를 microfuge tube에 옮기고 tissue homogenizer로 15 30초간 균질화하였다. 여기에 용액D 1 \( \mathrm{ml} \) 당 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 의 \( 2 \mathrm{M} \) sodium acetate \( (\mathrm{pH} 4.0), 1 \mathrm{ml} \) 의 phe-\( \mathrm{nol}\left(4^{\circ} \mathrm{C}\right), 0.2 \mathrm{ml} \)의 chloroform-isoamyl alcohol을 넣고 잘 섞어주었다. 튜브를 얼음에 15분간 넣어둔 후 원심분리(10,000 \( x \mathrm{~g}, 20 \)분, \( \left.4^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 하여 상등액을 취하고 동일부피의 iso-propanol을 넣어 잘 섞어주었다. 이를 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2시간 처리한 후 원심분리하여 \( \left(10,000 \times \mathrm{g}, 30\right. \) 분, \( \left.4^{\circ} \mathrm{C}\right) \mathrm{RNA} \)를 침전시키고 용액D로 녹였다. 이를 isopropanol로 한 번 더 침전시킨 후 75\% alcohol로 2회 수세한 후 diethyl pyrocarbonate로 처리한 물에 녹이고 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다.</p><h2>Microarray</h2><p>Microarray는 Digital Genomics(서울)에 의뢰하여 분석하였다. 대조군과 실험군의 저산소증 유발 세포에서 각각 분리한 20 50 ug의 total RNA로부터 oligo(dT) primer와 역전사효소를 이용하여 first cDNA strand를 만들고, 대조군은 Cy3 dye(green)로, 실험군은 Cy5 dye(red)로 표지하였다. 두 probe를 1:1 흔합하여 TwinChip \( { }^{\mathrm{TM}} \) Rat-5K(Digital Genomics)을 hy-bridization ( \( 3 X \) SSC, \( 42^{\circ} \mathrm{C}, 16 \) 시간)하고 최종적으로 \( 0.1 \times \mathrm{SSC} \)로 상온에서 1 분씩 4 회 세척하였다. 디지털형광이미지는 ScanArray Lite microarray analysis system(Perkin Elmer Life Sciences, Inc., Boston, MA, USA)을 이용하여 얻었다.</p>