담배세포의 형질 전환 및 세포 배양 방법을 알아보고, 세포농도측정에 대해서 알아본다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>담배세포의 형질전환 및 세포배양</h2> <p>식물에서 \(\beta\)-glucuronidase가 발현되도록 조작된 식물 형질전환용 vector pBI 121을 A. tumefaciens LBA 4404에 삽입한 후 담배식물체 절편과 공조배양 후 \( 50 \mathrm{~mg}\)/\(\mathrm{L}\) kanamycin와 \(30\mathrm{~g}\)/\(\mathrm{L}\)의 sucrose가 첨가된 MS 배지 (\(1.65 \mathrm{g}\)/\(\mathrm{L}\) \(\mathrm{NH}_{4} \mathrm{NO}_{3}\), \(1.0 \mathrm{g}\)/\(\mathrm{L}\) \(\mathrm{KNO}_{3}\), \(0.37 \mathrm{g}\)/\(\mathrm{L}\) \(\mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7\mathrm{H2}\mathrm{O}\), \(16.9 \mathrm{mg}\)/\(\mathrm{L} \) \( \mathrm{MnSO}_{4} \cdot \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(8.6 \mathrm{mg}\)/\(\mathrm{L}\) \(\mathrm{ZnSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(0.025 \mathrm{mg}\)/\(\mathrm{L}\) \(\mathrm{CuSO}_{4}\) ◦ \( 5 \mathrm{H2} \mathrm{O}\), \(0.44 \mathrm{g}\)/\(\mathrm{L}\) \(\mathrm{CaCl}_{2}\) ◦ \(2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(0.083 \mathrm{mg}\)/\(\mathrm{L}\) \(\mathrm{KI}\), \(0.025 \mathrm{mg}\)/\(\mathrm{L}\) \( \mathrm{CoCl}_{2} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(0.17 \mathrm{g}\)/\(\mathrm{L}\) \(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\), \(6.2 \mathrm{mg}\)/\(\mathrm{L}\) \(\mathrm{H}_{3} \mathrm{BO}_{3}\), \(0.25 \mathrm{mg}\)/\(\mathrm{L} \) \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{MoO}_{4} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(27.85 \mathrm{mg}\)/\(\mathrm{L}\) \(\mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(37.25 \mathrm{mg}\)/\(\mathrm{L} \) \(\mathrm{Na}\)-EDTA, \( 0.1 \mathrm{g}\)/\(\mathrm{L} \) myo-inositol, \(20 \mathrm{mg}\)/\(\mathrm{L} \) glycine, \( 0.5 \mathrm{mg}\)/\(\mathrm{L} \) pyridoxin-\(\mathrm{HCl}\), \(0.1 \mathrm{mg}\)/\(\mathrm{L} \) thiamine-\(\mathrm{HCl}\))에서 callus를 유도하고 이를 다시 \( 50 \mathrm{mg}\)/\(\mathrm{L} \)의 benzylaminopurine (BAP)가 첨가된 MS 배지에서 식물체로 재분화를 유도하였다. 이렇게 유도된 식물체를 부위별로 나누어 GUS activity를 측정한 후 가장 높은 부위에서 다시 \( 0.5 \mathrm{mg}\)/\(\mathrm{L} \) 2,4-dichloro phenoxy acetic acid가 첨가된 MS 배지에서 callus 유도 후 동일 배지하에서 현탁세포를 유도하였고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \), \( 120 \mathrm{rpm} \), 명조건으로 유지하면서 7일 간격으로 계대배양하면서 유지하고 실험 재료로 사용하였다.</p> <h2>세포농도측정</h2> <p>세포의 증식은 세포 생체중량(fresh cell weight, FCW), 세포 건조중량(dry cell weight, DCW)과 SCV (sedimented cell volume)의 측정을 통해 관찰하였다. 세포 생체중량은 Büchner funnel을 이용하여 배양액을 Whatman No.1 여과지로 거른 후 증류수로 수회 세척후 다시 여과하여 얻은 세포를 측정한 중량을 사용하였으며 이러한 생체중량 측정과정을 거친 세포를 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지된 dry oven에 넣어 시간에 따른 무게변화가 없을 때까지 건조시켜 측정한 중량은 세포 건조중량으로 사용하였다. SCV는 시료를 1시간 동안 매스실린더에서 세포를 가라앉힌 후 세포부피 : 총시료 부피로 나타내었다.</p> <h2>이온 및 당농도 분석</h2> <p>총당분석은 Waters사의 refractometry index detector와 carbohydrate column \( (4.6 \times 250 \mathrm{~mm}) \)로 이루워진 HPLC를 사용하였고 이때 유속은 \( 1.3 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \)이였다.</p> <p>이온분석은 ion chromatography를 이용하였는데 이때 음이온(\(\mathrm{PO}_{4}^{-}\), \(\mathrm{SO}_{4}^{-}\), \(\mathrm{NO}_{3}^{-}\), \(\mathrm{Cl}^{-}\)) 분석으로는 Ion Pac SDA4 column (Dionex, USA), 양이온( \( \mathrm{Na}^{+}\), \(\mathrm{K}^{+}\), \(\mathrm{Ca}^{2+}\), \(\mathrm{Mg}^{2+}\), \(\mathrm{NH}_{4}{ }^{+} \)) 분석으로는 Ion Pac CS124 column (Dionex, USA)을 사용하였고 이때 유속은 \( 1.0 \mathrm{ml}\)/\(\mathrm{min} \)이였다.</p> <h2>\( \beta \)-glucuronidase (GUS) assay</h2> <p>식물체의 경우 식물체 절편을 액체질소로 얼린 후 유봉으로 파쇄 후 extraction buffer (\( 0.1 \mathrm{M}\) \(\mathrm{NaHPO}_{4}\) \(\mathrm{pH} 7.0 \), \( 10 \mathrm{mM}\) \(\beta \)-mercaptoethanol, \( 0.5 \mathrm{M} \) EDTA, \(30\%\) sarcosyl, \(10\%\) triton, \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \))로 추출하였고 현탁세포의 경우는 extraction buffer를 첨가한 후 1시간 동안 sonication하였다.</p> <p>단백질 추출 후 10분간 \( 3000 \mathrm{rpm} \)으로 원심분리한 후 상등액을 취해 GUS 기질인 4-methylumbelliferyl \( \beta \)-D glucuronide (MUG)를 첨가하여 \( 36^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간동안 반응시킨 후 stop buffer (\(0.2 \mathrm{~M}\) \(\mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3}\))를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이때 MUG가 GUS에 의해 4-methylumbelliferone로 전환시 나타나는 fluorescence를 Höefer사의 TKO100 fluorometer를 이용하여 측정하였다.</p> <h2>Bubble-Column Bioreactor</h2> <p>Fig. 1에 나타난 bioreactor는 높이가 \( 60 \mathrm{~cm} \), glass vessel의 안쪽 지름이 \( 10 \mathrm{~cm} \)로 이루어져 있으며 vessel의 아래쪽에 위치한 \( 1.5 \mathrm{~cm} \)의 glass filter를 통해 \( 1.0 \mathrm{~vvm} \)의 공기를 불어넣어 세포를 교반시켰고 이때 working volume은 \( 2 \mathrm{~L} \)이었다.</p> <p>Bioreactor는 회분식 배양과 배양시작후 5, 11일째에 \( 30 \mathrm{g}\)/\(\mathrm{L} \)의 sucrose를 첨가한 유가식 배양을 수행하였고 거품의 형성을 막기 위해 antifoam A emulsion을 희석하여 배양시 간헐적으로 첨가하였다.</p>