느티나무 가닥버섯 H. marmoreus 3-10은 덕유산, H. marmoreus 1-1은 일본 후쿠오카에서 채집되었다. 각각 PDA와 PDB 배지에서 특정 조건에서 배양하였다. 이들 균주의 Genomic DNA는 Moller 등의 방법을 통해 추출되었으며, PCR을 이용하여 rDNA cluster를 증폭하였다. 또한, ITS 1과 ITS 4를 사용하여 TS region을 증폭하였고, SSU rRNA gene, 5.8S rRNA gene, LSU rRNA gene, IGS 1 region, 5S rRNA gene, IGS 2 region 증폭에 사용된 primer는 총 23개로, 이는 Table 2에 명시되어 있다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>느티만가닥 균주 배양</h2> <p>본 연구에서 사용된 느티만가닥버섯 H. marmoreus 3-10의 기원은 전북 덕유산이며, H. marmareus 1-1은 일본 후쿠오카에서 채집되었다. 두 균주는 그린 합명회사에서 보존하고 있는 균사체를 분양 받아 실험에 사용하였으며, Potato dextrose agar (PDA; potato peptone \( 4.0 \mathrm{~g} \), glucose \( 20.0 \mathrm{~g} \) and agar powder \( 15.0 \mathrm{~g} \), 11 distilled water, Scharlau Chemie S.A,Spain) 배지로 \( 24^{\circ} \mathrm{C}, \) 13일간 배양하고, Potato dextrose broth (PDB; Potato peptone \( 4.0 \mathrm{~g} \), Glucose \( 20.0 \mathrm{~g} \) were dissolved 11 of distilled water pH \( 5.6 \) and sterilized by autoclaving at \( 121^{\circ} \mathrm{C} \) for \( 15 \mathrm{~min} \) ) 액체배지에서 15일간 \( 24^{\circ} \mathrm{C}, 80 \mathrm{rpm} \)으로 배양하였다. DNA manipulation에 사용된 Eschericia coli strain은 DH5 \(a\) (Donginbiotech Co.)로 pGEM-T plasmid vec-tor는 cloning과 sequencing에 사용되었다.</p> <h2>느티만가닥버섯의 DNA extraction과 PCR amplification</h2> <p>MOller등의 방법을 이용하여, H. marmoreus 3-10 균주와 H. marmoreus 1-1 균주의 Genomic DNA를 추출하였다. 약 \( 4.0 \mathrm{~g} \)의 자실체를 막자 사발을 이용하여 액체질소 첨가 후, 10분 동안 물리적으로 파쇄하였다. \( 15 \mathrm{ml} \)의 lysis buffer (20\( \mathrm{mM} \) Tris-HCl (pH 8.0), \( 10 \mathrm{mM} \) EDTA, \(1\%\) SDS) 처리 후 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 반응시킨다. \( 5 \mathrm{M} \mathrm{~NaCl} \)은 \( 10 \%\) CTAB buffer에 처리하여 총 부피의 \( 1 / 10 \)이 되게 한다. 그 후 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에 \(1\sim2\)시간 처리하였다. PCR을 이용하여 rDNA cluster를 증폭하였으며,TS region을 증폭하기 위하여 White et al에 보고된 방법을 이용하여 100 pmole의 ITS 1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')과 ITS 4 (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3')를 사용하였다. SSU rRNA gene, 5.8S rRNA gene, LSU rRNA gene, IGS 1 region, 5S rRNA gene, IGS 2 region을 증폭하기 위하여 사용한 primer는 23개로 Table 2에 명시되어있다. 50ul의 부피로 10x Ex Taq buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 100mM KCl, \( 0.1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 1 \mathrm{mM} \) DTT), \( 2.5 \mathrm{mM} \) dNTP mixture, 100 pmol primer, sterilized distilled water, Ex Taq polymer-ase (TaKaRa Co.)를 첨가하여 PCR로 증폭하였다. SSU rRNA gene, LSU rRNA gene과 IGS region은 사이즈가 크기 때문에 직접 디자인한 primer를 이용하여 증폭하였다(Table 2). PCR 반응 조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C}, \) 2분간 predenaturation한 후, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에 1분간 denaturation, annealing 온도는 각 primer의 조건에 맞게 설정한 후, \( 72^{\circ}\mathrm{C} \)에서 3분 extension한 후, 25 cycle 증폭하고, 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 extension시켰다.</p>