본 논문에서 원형질체 유리의 중요 요인은 배양에 사용하는 식물조직의 세포벽을 효율적으로 녹일 수 있는 적절한 효소의 조합과 농도이며 또한 고장액을 이용한 전처리 역시 중요함을 확인했으며 원형질 분리에 사용되는 식물의 종류, 조직의 종류, 식물의 생육 조건, 원형질 분리 온도 및 시간, 진탕 속도와 시간도 원형질 분리에 영향을 미친다고 실험으로 검증되었다.
<h2>마커 분서</h2> <p>웅성불임인자를 전이를 확인하기 위해 양배추와 무와 융합체의 잎으로부터 Dellaporta 등 (1983)의 방법을 약간 변형하여 Genomic DNA를 추출하였다. Primer는 NWB 웅성불임 특이적인 조합과 (Nahm et al. 2005), 핵의 융합 여부를 확인을 위한 양배추와 무에서 서로 다른 특이적인 밴드를 보이는 ISSR primer 834: \( 5 ^ {\prime } \)-AGAGAGAGAGAGAGAG(CT)T-3',853: 5'-TCTCTCTCTCTCTCTC(AG)T-3'을 사용하였고, Ex-Taqpolymerase (Takara Co.)로 PCR 반응을 수행하였다. PCR 조건은 pre-denaturation은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5 분간, 이후 denaturation은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30 초, annealing 은 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } 1 \)분, extension은 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1 분간 45 cycle을 하였으며 last extension은 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5 분간 수행하였다. 합성된 DNA는 \( 1 \% \) agarose gel에서 전기영동 후, 밴드의 양상을 관찰하였다.</p> <h2>형태적 관찰</h2> <p>양배추와 무의 원형질체 융합을 통해 재분화된 개체 중 PCR 반응에서 NWB-CMS 계통의 미토콘드리아가 전이된 것으로 확인된 개체를 대상으로 2달간의 저온 춘화처리를 통하여 원형질융합체를 개화시켜 화기구조 및 형태적 특성을 조사하고 결실 및 종자발달 여부를 확인하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>원형질 분리</h2> <p>원형질 분리에 영향을 미치는 조건들로는 전처리의 유무와 원형질 분리 효소의 종류와 농도 등이 있다. 원형질 분리 효소를 처리하기 전에 CPW 13M, TVL 용액 등의 고장액으로 삼투작용이 일어나도록 처리하면 원형질 분리 효율이 높아지는데 (Lian and Lim 2001), 본 실험에서도 효소처리 전에 각각의 재료들을 TVL 용액에 1~2시간 동안 침지한 뒤에 원형질을 분리해본 결과 역시 원형질 분리 효율이 높은것을 확인할 수 있었다 (데이타 미제시). 또한 원형질 분리효율을 높이기 위하여 원형질 분리 효소의 종류와 농도가 중요하여 처리구 모두를 고장액인 TVL 용액으로 침지한 후 여러 효소 조합별 원형질 유리 정도를 확인하였다 (Table 1). 일반적으로 원형질체를 분리하기 위해 Cellulase와 Macerozyme의 조합을 사용하고 일부 효율을 높이기 위해 Pectolyase를 이용하기도 한다. 본 실험에서는 각각의 식물재료에 따른 최적화된 효소 조합을 조사하였다. 먼저 양배추의 하배축율 이용한 실험에서 Cellulase \( 1 \% \), Macerozyme \( 0.1 \% \)를 기준으로 Macerozyme의 농도를 2 배로 하여 원형질 분리를 수행해 본 결과 원형질체 유리율이 약 20 배 정도 높아졌으며 이 조건에서 다시 Cellulase의 농도를 2 배로 올렸을 때 원형질체의 유리가 다시 약 4.5배가 높아지는 것을 확인하였다. 이와는 독립적으로 Cellulase \( 1 \% \), Macerozyme \( 0.5 \% \) Pectolyase \( 0.1 \% \)를 첨가한 효소조합의 분리율은 Cellulase \( 2 \% \), Macerozyme \( 0.2 \% \)에 비하여서도 다시 3 배 정도 증가하였다. 이는 최초 Cellulase \( 1 \% \), Macerozyme \( 0.1 \% \) 의 효소조합에 비하여 약 93배 정도가 유리된 것으로 이 조합을 양배추의 원형질분리에 이용하였다. 일반적으로 양배추의 하배축에서 유래된 원형질체는 \( 30 \sim 120 ~ \mu \mathrm { m } \) 정도의 크기를 보였으며, 무의 잎으로부터 유리한 원형질체는 약 \( 20 \sim 40 ~ \mu \mathrm { m } \)의 크기로 상대적으로 작았으나 원형질체 수가 매우 많았다. 따라서 특별히 Pectolyase첨가 없이 Cellulase \( 2 \% \), Macerozyme \( 0.2 \% \)의 효소조합을 선택하여 사용하였다. 위의 결과를 통해 원형질체 유리를 위한 중요 요인은 배양에 사용하는 식물조직의 세포벽을 효율적으로 녹일 수 있는 적절한 효소의 조합과 농도이며 또한 고장액을 이용한 전처리 역시 중요함을 확인하였다. 이 밖에도 원형질 분리에 사용되는 식물의 종류, 조직의 종류, 식물의 생육 조건, 원형질 분리 온도 및 시간, 진탕 속도와 시간도 원형질 분리에 영향을 미치는 것으로 실험을 통해 알수 있었다 (데이타 미제시).</p>