본 연구에서는 Matsumoto등과는 다른 다양한 탄소농도를 이용, polypeptone이 함유된 배지를 사용한 점과 군주의 차이에 의해 증식속도에 차이가 난 것으로 사료되었다. 총 분비 단백질량은 sucrose에서 배양하는 경우가 가장 높았고 fructose에 배양하는 경우 가장 낮게 확인되었다. Fig. 2B는 leucocin A 형질 전환체의 탄소원에 따른 단백질분해효소 분비율을 나타낸 것으로 sucrose를 사용한 경우 배양 초기부터 완만하게 감소하여 15시간에 가장 낮은 단백질 분해효소 분비율을 보였고 15시간 이후 전체적으로 완만하게 상승 하였다. 따라서 이 결과는 leucocin A 형질 전환체의 다양한. 따라서 이 결과는 leucocin A 형질 전환체의 다양한 탄소원 사용 시 총 분비 단백질이 증가하고 동시에 단벅질분해효소 분비의 감소를 의미했다. 또한 sucrose과 glucose에서 각각 2시간씩 배양하게될 때 \(29.6\%\)와 \(29\%\)의 성장저해로 항균 활성이 관찰 되었으며 15시간 경과시에는 각각 \(72.6 \%\)와 \(65.5 \%\)의 성장저해로 항균 활성이 관찰이 되어 sucrose를 탄소원으로 사용했을 때 항균 활성이 가장 높은 것을 알 수 있다.
<h1>결과 및 토의</h1> <h2>형질 전환체의 시간에 따른 성장속도</h2> <p>Fig. 1은 탄소원에 따른 재조합 효모의 성장 속도를 비교한 결과이다. 광학밀도는 4 가지 탄소원을 유지하는 배지의 모두에서 15 시간까지 증가하였는데 이는 15 시간까지 대수적으로 증식한 후, 서서히 정체기와 사멸기로 접어든 것으로 샤료 된다. Fig. 1은 탄소원에 따른 세포증식을 확인한 것으로 sucrose>glycerol>glucose>fructose 순으로 세포 증식이 높을 것으로 확인되었다. 특히 sucrose가 포함된 배지에서 배양 15 시간 경과 시 세포밀도는 glucose를 유지하는 배지에서 배양한 경우에 비해 \( 18 \% \) 높게 측정되었다. Lipase 유전자가 포함된 pWI3proROL 벡터로 형질전환된 S. cer-evisiae의 경우 24 시간 이후에 정지기에 접어 든 결과와 비교하면, 본 연구에서는 일찍 정지기에 접어드는 것을 알 수 있었고 최대 광학밀도 \( (OD600 \mathrm{~nm}) \) 도 본 연구가 더 높았다. 본 연구에서는 Matsumoto 등과는 다른 다양한 탄소농도를 이용, polypeptone이 함유된 배지를 사용한 점과 군주의 차이에 의해 증식속도에 차이가 난 것으로 사료되었다.</p> <h2>탄소원에 따른 형질 전환쳬의 총 분비 단백질 및 단백질분해효소 분비율 측정</h2> <p>Fig. 2A는 leucocin A 형질 전환체를 탄소원에 따른 총 분비 단백질량을 나타낸 것으로, glycerol을 제외한 탄소원에서 배양하는 경우 배양 15 시간에 총 분비 단백질량(total secreted protein)이 최대로 측정되었다. 총 분비 단백질량은 sucrose에서 배양하는 경우가 가장 높았고 fructose에 배양하는 경우 가장 낮게 확인되었다. Sucrose에서 배양한 경우 glucose에 배양한 경우에 비하여 총 분비 단백 질량이 약 \( 7.9 \% \) 증가하였다.</p> <p>Fig. 2B는 leucocin A 형질 전환체의 탄소원에 따른 단백질분해효소 분비율을 나타낸 것으로 sucrose를 사용한 경우 배양 초기부터 완만하게 감소하여 15 시간에 가장 낮은 단백질 분해효소 분비율을 보였고 15 시간 이후 전체적으로 완만하게 상승 하였다. Fructose와 glycerol, 그리고 glucose를 사용한 경우는 0 시간부터 12 시간 까지 비슷하게 진행되었고 15 시간을 기점으로 이들 모두가 급격히 감소했지만 특히 glycerol을 사용한 경우는 단백질 분해 효소 분비율이 급감하였으며, 18 시간 이후부터 glycerol과 fructose를 사용한 경우에 비슷하게 진행 되었다. 그러나 glucose를 사용한 경우 15 시간 까지 계속적으로 감소되다 15 시간 이후 급격히 상승 하는 것을 볼 수 있었다. 탄소원으로써 glucose를 사용한 경우 단백질 분해 효소 분비율의 급격한 상승은 Lee 등의 논문과 같은 결과를 가졌다. 따라서 이 결과는 leucocin A 형질 전환체의 다양한. 탄소원 사용 시 총 분비 단백질이 증가하고 동시에 단벅질분해효소 분비의 감소를 의미했다. Lee 등의 결과에서도 총 분비 단백질의 증가와 동시에 단백질 분해 효소 분비율의 감소와 같이 유사한 형태가 나타났다. 이는 균체의 성장이 최고조에 이른 15 시간까지는 배지의 영양분을 이용하였고, 이후 영양분 고갈에 따른 세포파괴와 살이있는 세포에서의 단벡질 분해효소 분비의 양이 증가하는 것으로 사료된다.</p> <h2>항균 활성 측정</h2> <p>Leucocin A 형질전환체를 다양한 탄소원에서(fructose, glycerol, glucose, sucrose) 배양한 후 배양시간 별로 수집된 배양액의 항균 활성(antibacterial activity)을 측정하기 위하여 B. subtilis를 대상으로 성장정도를 광학밀도로 측정하였다 \( \left(30^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{~rpm}, 12 \mathrm{~h}\right) \). Fig. 3은 leucocin A 형질전환체와 대조긴의 배양 시간 별로 수집된 배양액의 상등액이 포함된 배지에서의 B. sub-tilis 성장 저해를 나타낸 것이다. Leucocin A 형질 전환체가 대조군에 비하여 성장이 현저히 억제 되었다는 것을 알수 있었고, 탄소원 모두 15 시간에 가장 높은 항균 활성을 나타내었다. 또한 sucrose과 glucose에서 각각 2 시간 배양 하였을 때 \( 29.6 \% \) 와 \( 29 \% \) 의 성장저해로 항균 활성이 관찰 되었고 15 시간 경과 시에는 각각 \( 72.6 \% \) 와 \( 65.5 \% \) 의 성장저해로 항균 활성이 관찰 되어 sucrose를 탄소원으로 시용하였을 경우 항균 활성이 가장 높은 것을 알 수 있었다.</p>