본 연구에서는 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현을 검증하기 위해 PCR 실험을 실시하였다. 모든 실험은 3회 반복으로 진행되며, 결과는 평균값과 표준편차로 표현하였다. 결과의 통계처리는 SPSS 10.0 소프트웨어를 활용하였으며, 유의차 검증은 분산분석(ANOVA) 후에 Turkey's HSD test를 이용하여 유의성을 분석하였다. 추가적으로, 대식세포(Raw264.7)의 생존율도 확인하였다.
<h2>Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)</h2> <p>iNOS, COX-2의 mRNA 발현을 알아보기 위하여 polymerase chain reaction (PCR)을 실시하였다. 실험에 사용한 primer sequences는 Table 1과 같다. PCR tube에 5X green GoTaq flexi buffer, \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \), PCR nucleotide mix ( \(10 \mathrm { mM } \)), primer, GoTaq DNA polymerase, nuclease free water, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다. GAPDH, iNOS는 \( 96 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 2분, \( 96 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10초, \( 64 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분(40 cycles), COX-2는 \( 96 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 2분, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10초, \( 51 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분(40 cycles)을 실행하였다. PCR로 합성시킨 후 \( 0.002 \% \) ethidium bromide를 첨가한 \( 1.5 \% \) agarose gel을 \( 100 \mathrm { ~V } \)에서 40분간 전기영동한 후 LAS 4,000 을 이용하여 밴드를 확인하여 분석 정량하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험은 3회 반복으로 행하여 평균치와 표준편차로 나타내었고, 결과 통계처리는 SPSS10.0 (Evanston, USA) software를 사용하였으며, 유의차 검증은 분산분석(analysis of variance ANOVA)을 한 후 \( \alpha=0.05 \) 수준에서 Turkey's HSD test에 의해 유의성을 분석하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>대식세포(Raw264.7)의 생존율 확인</h2> <p>섬바디나물 추출물에 의한 대식세포(Raw264.7)의 세포 생존율을 MTT assay에 의해 확인한 결과 Fig. 1과 같이 나타내었다. 섬바디나물 추출물이 LPS로 유도된 macrophage cell의 세포 독성을 측정한 결과 \( 1,000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 농도에서 \( 100 \% \) 이상의 높은 세포 생존율을 나타낸 반면에 대조군인 Vit. C는 같은 농도인 \( 1,000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 농도에서 \( 60 \% \)의 세포 생존율을 나타내었다.</p>