분산분석 결과, 발효일자별로는 유의미한 차이를 보였지만 균주별로는 유의미한 차이가 없었다. 그림 1에는 막걸리 시료의 미생물 다양성을 확인하기 위해 16S rDNA의 V3 부위와 28S rDNA의 D1-D2 부위를 증폭하여 DGGE 방법으로 분석한 결과가 나타나있다. 이 두 균주들은 막걸리의 산도증가에 기여하고 생리활성 및 기능성 부가에 참여할 것으로 판단되며, 이 연구에서는 다른 연구에 비해 더 적은 종류의 세균이 검출되었는데, 이는 막걸리 제조방법의 차이와 PCR primer의 차이 등이 원인으로 추측된다. 권 등은 A. idahoensis가 전분의 당화에 중요한 역할을 하고 S. cerevisiae가 알코올 발효를 주도한다고 보고하였다.
<h2>막걸리 발효기간 중의 알코올 함량의 변화</h2> <p>Table 5 는 접종된 균주별로 각 막걸리에서 나타나는 알코올 함량의 변화를 일자 별로 측정한 결과이다. 모든 효모균주에서 발효 2일째 급격한 증가를 보였으며 그 이후에 큰 차이가 없었다. 분산분석 (two-way ANOVA) 결과 발효일자별 \( (p \times 0.0001) \) 로는 유의미한 차이를 보였지만 균주별로는 유의미한 차이는 없는 것으로 나타났다 \( (p=0.1464) \). 발효일자별의 유의미한 차이도 0일째의 자료를 제외하면 \( p=0.7328 \) 로 차이가 없는 것으로 나타났다. 본 연구에서는 발효 2일째 알코올 함량이 \( 10 \% \) 내외인 반면에 양과 은은 \( 4 \% \) 였다. 발효 6일째 알코을 함량은 김 등은 \( 16 \% \), 전과 이는 \( 10\sim 13\% \), 양과 은은 \( 8 \% \) 인 반면 본 연구는 \( 10 \sim 11 \% \) 사이였다.</p> <h2>DGGE 분석</h2> <p>막걸리 시료의 미생물 다양성을 확인하기 위해 원핵생물의 16S rDNA의 V3 부위와 진핵생물의 28S rDNA의 D1-D2 부위를 degenerative primer로 증폭한 후 DGGE 방법을 이용하여 분석한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 막걸리 발효과정 중의 세균 변화는 접종된 효모균주에 상관없이 각각의 막걸리 시료에서 유사한 패턴을 나타내었다. 특히 F, S, K, R 효모로 발효된 막걸리들에서 밴드의 수는 발효 0일과 2일째에 가장 많았고 4일 이후에는 4번과 5번 밴드가 관찰되지 않았으며 이후 동일한 패턴을 보였다. 2번과 3번 밴드는 주로 발효 0일 부터 8일까지 관찰되었고 F, U, S, K 효모로 발효된 막걸리에서는 계속 관찰되었다. 빵효모(C) 막걸리의 경우는 다른 막걸리들에 비해 밴드의 패턴이 단순하였으며, 발효 2일째부터 3번 밴드가 출현하였으나, 다른 막걸리들은 0일째부터 이 밴드가 출현하였다. 1번 밴드는 U 효모를 이용한 막걸리를 제외하고는 발효 4일째부터는 관찰되지 않았다.</p> <p>Table 6은 Fig. 1에 나타난 각 밴드들을 염기서열 결정법을 통하여 동정한 결과이다. 가장 많이 검출된 2번 밴드의 16S rDNA 염기서열과 가장 유사한 서열을 나타내는 세균은 Pediococcus pentosaceus이었다. 이 세균은 그람 양성의 운동성이 없고 포자를 형성하지 않는 혐기성 세균으로, 당을 이용하여 lactic acid를 생성하는 lactic acid bacteria에 속하며 \( \mathrm{pH} 4.5\sim8.0 \) 범위에서 생장한다. 또한, 치즈, 식물, 고기 등의 발효균주로 사용되며 항균물질을 분비한다고 보고되어 있다. 한편, 발효기간 동안 꾸준히 검출된 3번 밴드의 16S rDNA 염기서열과 가장 유사한 서열을 나타내는 세균은 Lactobacillus fermentum이었다. 이 세균은 발효식품에서 관찰되는 그람 양성세균으로, 위산과 담즙에서도 생존이 가능하고 일부는 probiotic으로 작용하며 cholesterol 저해효과가 있다고 보고되었다. 가장 많이 검출된 이 두 균주들은 막걸리의 산도증가에 기여함과 동시에 생리활성 등의 기능성 부가에 참여할 수 있을 것으로 판단된다. 발효 4일 이후에는 관찰되지않았던 1번 밴드의 16S rDNA 염기서열과 가장 유사한 서열을 나타내는 세균은 Enterobacter gergoviae이었다. 이 세균은 장내세균이다. 이는 원료인 쌀이나 종국에 존재했던 것이 검출되었을 가능성도 있지만 발효. 4일 이후에는 관찰되지 않아 막걸리의 안전성에는 문제가 없는 것으로 판단되었다. 이 세균이 알코올에 의해 사멸한 것인지 산도 혹은 probiotics의 효과에 의해 사멸한 것인지는 확인할 수 없지만 막걸리 제조 시에 유의해야 할 세균이다. 한편, 이 실험에서는 세균의 16S rDNA 를 증폭하였는데도 불구하고 5 번 밴드에 해당하는 생물이 Oryzae sativa와 가장 높은 유사성을 나타내었는데, 이는 막걸리의 원료인 쌀에 해당하는 진핵생물이다. 하지만 이들 사이의 상동성이 \( 86 \% \) 이었으므로 높은 신뢰성을 나타내지는 않았다. 권 등은 누룩을 이용한 막걸리 제조과정에서 원핵생물로서 Lactobacillus속 세균이 우점을 이루는 것을 확인하였으며, Pediococcus pentosaceus와 Pantoea agglomerans 등의 세균도 검출하였다. 본 연구에서 보다 권 등의 연구에서 더 많은 종류의 세균들이 검출된 것은 막걸리 제조방법의 차이와 PCR primer의 차이 등이 원인인 것으로 판단된다.</p> <p>진핵생물의 검출을 위한 28S rDNA 의 분석 결과에서는 모든 막걸리 시료에서 하나 혹은 두 개의 밴드만이 검출되었다. 이를 모두 회수하고 PCR 반응을 수행한 후 염기서열을 결정한 결과, 이 두 밴드의 염기서열과 가장 유사한 서열을 나타내는 생물은 Saccharomyces cerevisiae로 알코올발효에 관여하는 효모균이다. S. crevisiae 이외의 다른 진균들은 검출되지 않았는데, 이는 막걸리 제조과정에서 순수 배양된 S. cerevisiae를 첨가한 후 발효를 진행하여 이 균이 우점을 이루었기 때문인 것으로 추측된다. 권 등은 누룩을 이용한 막걸리 제조과정에서 진헥생물로 Pichia kudriavzevii, S. cerevisiae, Asidia idahoensis, Khuyveromyces marxianus, Saccharomycopsis fibuligera, Torulaspora delbrueck 등을 검출하였고, 발효 2일째까지 P. kudtiavzevii가 우점을 이루었지만 3일 이후에는 S. cerevisiae가 우점을 이룬 다는 것을 보고하였다. 본 연구에서는 순수 배양된 S. cercvisiae를 첨가하여 막걸리를 제조하였기 때문에 발효초기부터 S. cerevisiae가 주로 검출되었지만, 권 등은 다양한 진균들이 존재하는 누룩을 이용하여 막걸리를 제조하였기 때문에 발효초기에는 S. cerevisiae가 우점을 이루지 않았다. 따라서 막걸리 제조과정에서 배양된 S. cerevisiacel 첨가 여부에 따라 검출되는 진핵생물에 차이가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 권 등은 A. idahoensis 등이 전분의 당화에 주된 역할을 하고 S. cerevisiae 가 알코올 발효를 주도한다고 보고하였다.</p>