다양한 글루타민 수준을 가진 RPMI-1640 배지(0, 0.1, 1, 10 mM)로 대체하여 적정 시간 동안 배양하였다. MTT assay를 이용하여 증식 억제 여부를 확인하였다. PC3 전립선암세포는 \(10\%\) FBS와 \(1\%\) penicillin 및 streptomycin이 포함된 RPMI-1640 배지로 \(37^{\circ}C, 5\%CO_2\) 조건에서 배양한 후 다양한 글루타민 수준을 가진 RPMI-1640 배지로 적정 시간 배양하여 증식 억제 여부를 MTT assay로 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포배양 및 MTT assay</h2> <p>본 연구에 사용된 PC3 전립선암세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)에서 분주 받았으며, \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS)에 \( 1 \% \) 의 penicillin 및 strepto-mycin이 포함된 RPMI-1640 배지(Gibco BRL, Grand Island NY, USA)를 이용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건에서 배양하였다. 글루타민 결핍에 따른 증식 억제 여부를 조사하기 위하여 세포 배양용 6 well plate에 \( \mathrm { PC } 3 \) 세포를 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) 개/ml로 분주하고 24 시간 동안 안정화시킨 다음 배지를 제거한 후, 글루타민이 결핍된 \( 90 \% \) 의 RPMI-1640 (Gibco BRL) 배지에 \( 10 \% \) FBS, \( 1 \% \)의 penicillin 및 streptomycin이 포함된 성장배지를 사용하여 각 well에 분주하였으며 배양하였다. 적정 시간 후 배지를 제거하고 tetrazolium bromide salt (MTT, Amresco, Solon, Ohio, USA)를 \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 농도가 되게 배지로 희석하여 3 시간 동안 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 배양시킨 다음 MTT 시약을 깨끗하게 제거 하고 dimethylsulfoxide (DMSO, Amresco)를 이용하여 생성된 formazin을 모두 녹인 후 96 well plate에 옮겨서 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>DAPI staining 및 flow cytometry 분석</h2> <p>글루타민 결핍에 의한 PC3 세포의 증식억제가 apoptosis 유도와 연관성이 있는지의 여부를 조사하기 위하여 \( 4 ^ {\prime } , 6 \)-dia-midino-2-phenylindole (DAPI) 염색을 이용한 핵의 형태적 변화를 관찰하였다. 이를 위하여 동일 조건에서 배양된 PC3 세포를 \( 37 \% \) formaldehyde 용액과 PBS를 \( 1: 9 \) 의 비율로 섞은 fixing solution을 이용하여 상온에서 10 분 동안 고정하였다. 이들 세포를 PBS로 2 3회 washing하고 \( 0.2 \% \) 의 triton X-100 (Amresco)을 첨가하여 상온에서 10 분간 고정한 후, DAPI (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 용액으로 염색시켰다. 15분 정도 염색시킨 후, mounting solution을 처리한 후 형광 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 400 배의 배율로 핵의 형태 변화를 관찰하였다. 아울러 세포주기 진행에 미치는 영향의 분석을 위해서는 글루타민이 결핍된 배지에서 적정시간 동안 배양시킨 PC3 세포들을 CycleTEST PLUS DNA REAGENT Kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 고정 및 염색을 하여 \( 4 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \), 암실에서 30 분 동안 반응을 시킨 다음 DNA flow cytometry (Becton Dickinson)에 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 분석하였다.</p>