참당귀 분말 시료에 Aspergillus oryzae KCCM 11372, Aspergillus kawachii KCCM 32819, Monascus purpureus KCCM 12002 세 종류의 곰팡이 균주를 배양한 후 Decursin 및 decursinol angelate, Polyphenolic compounds, Flavonoid의 함량과 DPPH를 이용한 항산화 활성을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료 및 발효 조건</h2> <p>본 실험에 사용한 참당귀(Angelica gigas Nakai)는 2009년 9월에 경상남도 산청군 지리산 일대에서 재배되고 있는 것을 농가로부터 직접 구입하여 뿌리를 깨끗하게 물로 씻은 후 흙과 이물질을 제거하고 건조시켜 분쇄 후 시료로 사용하였다. 참당귀 분말 시료에 3종류의 곰팡이 균주 Aspergillus oryzae KCCM 11372, Aspergillus kawachii KCCM 32819 및 Monascus purpureus KCCM 12002를 한국미생물보존센터로부터 분양 받아 참당귀 발효에 사용하였다. 세 균주의 seed culture는 glucose \( 10 \% \), peptone \( 5 \%, \mathrm{KNO}_{3} 2 \%, \mathrm{NH}_{4} \mathrm{H}_{2} \mathrm{PO}_{4} 2 \% \), \( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.5 \% \) 및 \( \mathrm{CaCl}_{2} 0.1 \% \) 함유 배지에서 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 150 \) \( \mathrm{rpm} \) 으로 72 시간 배양한 후 참당귀 분말에 각각 \( 5 \%(\mathrm{v} / \mathrm{w}) \) 수준으로 첨가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12 일간 고체배양 시켰다.</p> <h2>Decursin 및 decursinol angelate 함량 측정</h2> <p>원료 참당귀 및 발효 참당귀 분말의 20 배에 해당하는 메탄올로 2시간씩 5회 환류 추출 한 다음 Sartorius Minisart \( 0.45  \Perp \mathrm{m} \) filter (Sartorius Stedim, Goettingen, Germany)로 여과 한 후 진공농축기(Buchi Rotavapor R\(-\)215)로 농축하였다. 농축된 시료를 메탄올로 녹인 다음 Sartorius Minisart \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) filter (Sartorius Stedim, Goettingen, Germany)로 여과시킨 후 분석시료로 사용하였다. 메탄올에 녹인 시료는 HPLC\(-\)DAD(Agilent 1200, Agilent Techologies, USA)를 사용하였으며, 컬럼은 Waters symmetry C18 column \( (4.5 \times 250 \mathrm{~mm}, 5 \mu \mathrm{m}) \), 용매 A는 HPLC용 water, 용매 B acetonitrile을 사용하여 gradient 조건으로 분석하였다. 분석 조건은 Table 1 과 같이 column oven 온도 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \), 이동상의 속도 \( 1 \mathrm{ml} / \mathrm{min}, \mathrm{DAD} \) 분석파장은 \( 328 \mathrm{~nm} \) 로 용매 gradient 조건으로 분석하였다.</p> <h2>Polyphenolic compounds 함량 측정</h2> <p>Polyphenolic compounds의 함량은 Folin\(-\)Denis법으로 측정하였다. 발효. 당귀 분말의 \( 0.1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 시료 용액 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 에 Folin\(-\)ciocalteu's phenol reagent \( 2.5 \mathrm{ml} \) 를 첨가하여 잘 혼합하고, 실온에서 정확히 5 분 반응시킨 후 \( 7.5 \% \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} 2 \mathrm{ml} \) 를 가하여 혼합하고, \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 발색시킨 다음 Spectrophotometer(HITACHI U\(-\)2900, Hitachi High\(-\)Technologies Co., Kyoto, Japan) \( 760 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 이때 polyphenolic compounds의 함량은 tannic acid를 \( 0-500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도로 하여 시료와 동일한 방법으로 측정한 표준곡선으로부터 계산하였다.</p> <h2>Flavonoid 함량 측정</h2> <p>Flavonoid 함량은 Jia 등의 방법에 따라 측정하였다. 발효. 당귀 분말의 \( 0.1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 시료 용액 \( 0.25 \mathrm{ml} \)에 \( 1.25 \mathrm{ml} \) 의 정제수와 \( 5 \% \mathrm{NaNO}_{2} \) 용액 \( 5 \mathrm{ml} \) 을 가하고, 5분 후 \( 10 \% \mathrm{AlCl}_{3} \) •\( 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.15 \mathrm{ml} \) 를 잘 혼합한 후 Spectrophotometer (HITACHI U\(-\)2900, Kyoto, Japan)의 \( 510 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 플라보노이드 함량은 표준 물질로서 (\(+\))\(-\)catechin hydrate을 20 200 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도로 시료와 동일한 방법으로 측정하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였다.</p> <h2>DPPH에 의한 항산화 활성 측정</h2> <p>항산화 활성 측정은 Abe 등의 방법에 따라 측정하였다. DPPH (a, a'\(-\)diphenyl\(- \beta-\)picrylhydrazyl) \( 16 \mathrm{mg} \) 을 에탄올 100 \( \mathrm{ml} \) 에 녹인 후 동량의 증류수를 혼합하여 Whatman filter paper NO. 2 에 여과시켜 반응 용액을 제조하였다. 발효 당귀 분말의 \( 0.05 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 시료 용액 \( 1 \mathrm{ml} \) 을 취하고, 여기에 \( \mathrm{DPPH} \) 반응 용액 \( 5 \mathrm{ml} \) 을 넣어 잘 혼합한 후 암소에서 30 분간 반응시킨 후 Spectrophotometer (HITACHI U\(-\)2900, Kyoto, Japan)의 \( 528 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 이때 활성 비교를 위하여 기존에 항산화제로 많이 사용되고 있는 합성 항산화제 BHT를 \( 0.05 \% \) 농도로 첨가하여 시료와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였다. DPPH를 이용한 항산화 활성은 시료 첨가구와 무첨가구의 흡광도차를 백분율%로 표시하였다.</p> <p>DPPH radical scavenging activity \( (\%)=[1 \)\(-\)(sample absorbance \( { }_{528 \mathrm{~nm}} \) )/control absorbance \( \left.{ }_{528 \mathrm{~nm}}\right] \times 100 \)</p>