균주분리 및 배양은 유뮤 분해 미생물을 분리하기 위해 탄소원이 결핍된 C-배지를 사용하였다. 선별된 단일 균주는 LB 액체배지 \( (\mathrm {NaCl} \) \( 10 \mathrm {~g} \), trypton \(10 \mathrm {~g} \), yeast extract \( 5 \mathrm { ~g } / \mathrm {L} ) \)에서 각각 전배양시킨 후, \( 1 \% \) 원유가 첨가된 C-배지에 \(1 \%\) 접종하여 \(37 ^ {\circ } \mathrm {C} \), 7일간 200rpm으로 배양한 뒤 유류 분해능이 가장 우수한 균주를 선별하였다.
<p>선별된 균주로부터 플라스미드 DNA의 분리는 Maniatis 등의 방법에 따라 행하였으며, 유전자 재조합 실험을 위한 플라스미드 DNA 분리는 Promega의 Wizard miniprep 정제 kit로 분리하여 준비하였다.</p> <h2>균주분리 및 배양방법</h2> <p>유뮤 분해 미생물을 분리하기 위하여 탄소원이 결핍된 C-배지(Carbon-minimal medium)를 사용하였으며, 배지의 조성은 \( \left ( \mathrm { NH } _ { 4 } \right )_ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } 5 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } , \mathrm { K } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } 2 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } , \mathrm { MgSO } _ { 4 } \cdot 7 ^ { 2 } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } 0.2 \mathrm { ~g } / \) \( \mathrm { L } , \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } \mathrm { gg } / \mathrm { L } , \mathrm { CaCl } _ { 2 } 10 \mathrm { mg } / \mathrm { L } , \mathrm { FeSO } _ { 4 } \cdot { } ^ { 7 } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } 10 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \), \( \mathrm { NaCl } 30 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \), yeast extract \( 0.2 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) 및 trace element 용액 \( 2 \mathrm { ~mL } \left ( \mathrm { MoO } _ { 3 } 1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } , \mathrm { ZnSO } _ { 4 } \cdot { } _ { 7 } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } 7 \mathrm { mg } / \mathrm { L } , \mathrm { CuSO } _ { 4 } \cdot 5 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \right . \) \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { L } _ { 1 } \mathrm { H } _ { 3 } \mathrm { BO } _ { 3 } 1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } , \mathrm { CoCl } _ { 2 } \cdot 6 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } 6 \mathrm { mg } / \mathrm { L } ^ { 2 } , \mathrm { NiSO } _ { 4 } \cdot \) \( \left .6 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \mathrm { lmg } / \mathrm { L } \right ) \) 룰 함유하고 있으며, pH 7.0으로 조정하여 사용하였다. 유류가 오염된 해양으로부터 유류 분해 미생물을 분리하기 위하여 유출이 빈번하다고 생각되는 부산의 자갈치 선착장과 인근 유류오염 지역으로부터 해수를 채취하였다. 탄소원으로 crude oil을 \( 1 \% \) 첨가한 C-배지에 채취한 해수를 \( 1 \% \) 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 200 \mathrm { rpm } \) 으로 7 일간 진탕 배양하여 균의 생육이 확인되면 새로운 C-배지에 균주 및 원유를 각각 \( 1 \% \) 로 첨가하여 다시 배양하였다. 이렇게 3 회 반복하여 생육한 균주를 LB-고체배지에 도말하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양하였다. 선별된 단일 균주를 LB 액체배지 \( ( \mathrm { NaCl } \) \( 10 \mathrm { ~g } \), trypton \( 10 \mathrm { ~g } \), yeast extract \( 5 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } ) \) 에서 각각 전배양시킨 후, \( 1 \% \) 원유가 첨가된 C-배지에 \( 1 \% \) 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 7 일간 200rpm으로 배양한 후 유류 분해능이 가장 우수한 균주를 선별하였다.</p>