확립된 real-time PCR 방법은 PTGV에 특이적인 실험법임을 확인하기 위해, 해당 시험법에 대하여 생물의약품 제조공정에서 PTGV 제거 검증을 위한 시험법의 특이성, 검출한계, 완건성, 재현성을 실시하였다. 이때 특이성은 시험 대상물에서 특정 핵산을 정확하게 검출할 수 있는 능력을 의미한다. 그리고 완건성은 일부조건이 조금이라도 의도적 변경이 발생했을 때 측정값이 받는 영향의 척도를 나타내는 검사법의 신뢰도를 표시하는 지표이다.
<h2>TaqMan probe real-time PCR의 신뢰성 검증</h2> <p>확립된 real-time PCR 시험법을 세포주, 원료물질, 제조 공정, 완제품에서 PTGV 검출시험법으로 사용하기 위해 시험법의 특이성(specificity), 검출한계(detection limit), 완건성(robustness)을 검증하였다.</p> <p>핵산증폭검사법의 특이성은 시험 대상물에서 특정 핵산을 정확하게 검출할 수 있는 능력이다. 특이성 검증을 위해 다른 RNA 바이러스(BVDV, BPIV-3, HAV, PEDV, Reo-3, PRoV)와 DNA 바이러스(BHV, MVM, PPV PRV)를 대상으로 cross-activity를 확인한 결과 PTGV에서만 fluorescence 값의 증가를 관찰할 수 있었고, 다른 바이러스에서는 음성대조군과 같이 fluorescence 값의 증가를 관찰할 수 없었다. 이와 같은 결과에서 확립된 real-time PCR 방법은 PTGV에 특이적인 실험법임을 확인하였다.</p> <p>검출한계 검증을 위해 Titer가 \( 1.10 \times 10^{4} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \)인 PTGV를 10배씩 순차적으로 \( 1.10 \times 10^{0} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \)까지 희석한 샘플을 독립적으로 준비하여 각 희석 배수 당 8회에 걸쳐 총 24회 검출시험을 실시하였다. 검출한계 값은 총 시험 건수 중 \( 95 \% \)가 양성으로 검출될 수 있는 검체량 당 PTGV titer를 의미하기 때문에 24회 시험 중 23회 이상 양성 값이 나온 농도인 \( 1.10 \times 10^{0} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \)을 검출한계로 결정하였다(자료 미제시).</p> <p>완건성은 시험방법 중 일부 조건이 소규모라도 의도적으로 변경되었을 때 측정값이 얼마나 영향을 받는지에 대한 척도를 나타내는 것으로 통상적으로 검사법의 신뢰도에 대한 지표이다. 제조회사를 달리한 primer에 따른 real-time PCR 방법의 완건성을 검증하기 위해 3곳의 primer 제조회사가 제조한 primer를 준비하였다. Titer가 \( 1.10 \times 10^{4} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \)인 PTGV를 10배씩 순차적으로 \( 1.10 \times 10^{\circ} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \)까지 희석한 후 primer 별로 3회의 real-time PCR을 실시한 후 평균 Ct 값을 비교하였다. Ct 값에 대한 \( \mathrm{CV}(\%) \) 값은 \( 0.82,1.61,0.58,0.71,1.58 \)로 확인되었다. Real-time PCR의 완건성 검증에서 \( \mathrm{CV}(\%) \)가 \( 3 \% \) 이하이면 완건성이 있다고 판단한. 서로 다른 제조회사의 primer에서 Ct 값의 \( \mathrm{CV}(\%) \)가 \( 3 \% \) 이하로 나타나 완건성이 있음을 확인하였다.</p> <p>\( \mathrm{MgCl}_{2} \) 농도 변화에 따른 완건성을 검증하기 위해 Titer가 \( 1.10 \times 10^{4} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \)인 PTGV를 10배씩 순차적으로 \( 1.10 \times 10^{0} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \)까지 희석한 후 \( \mathrm{MgCl}_{2} \) 농도를 \( 3 \mathrm{mM} \), \( 4 \mathrm{mM}, 5 \mathrm{mM} \)로 변화시켜 real-time PCR을 실시한 후 평균 Ct 값을 비교하였다. Ct 값에 대한 \( \mathrm{CV}(\%) \) 값은 \( 0.63,0.41 \), \( 0.64,0.59,1.62 \)로 확인되었다. 실험조건의 농도에서 Ct 값의 변화가 거의 없고, \( \mathrm{CV}(\%) \)가 \( 3 \% \) 이하로 나타나 \( \mathrm{MgCl}_{2} \) 농도의 변화에 대한 완건성이 있음을 확인하였다.</p> <p>확립된 real-time PCR 시험법을 생물의약품 제조공정에서 PTGV 제거 검증을 위한 정량시험법으로 활용이 가능한지 확인하기 위해 PTGV 정량 검출시험법의 재현성 검증을 실시하였다. 서로 다른 날에 PTGV 표준시료에서 RNA를 추출하고 real-time RT-PCR을 수행한 후 Ct 값을 비교하였다. PTGV log titer \( \left(\log _{10} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml}\right. \); \( \left.\mathrm{x}\right) \) 에 대한 Ct 값(y) 간의 표준 회귀식은 첫째 날의 경우 \( \mathrm{y}=-3.551 \mathrm{x}+ \) \( 40.385 \) (결정계수 \( \mathrm{R}^{2}=0.994 \) ), 둘째 날의 경우 \( \mathrm{y}=-3.425 \mathrm{x}+ \) \( 39.540\left(\mathrm{R}^{2}=0.999\right) \), 셋째 날의 경우 \( \mathrm{y}=-3.214 \mathrm{x}+38.760 \) \( \left(\mathrm{R}^{2}=0.995\right) \), 넷째 날의 경우 \( \mathrm{y}=-3.511 \mathrm{x}+40.540\left(\mathrm{R}^{2}=0.999\right) \), 다섯째 날의 경우 \( \mathrm{y}=-3.497 \mathrm{x}+41.470\left(\mathrm{R}^{2}=0.999\right) \), 여섯째 날의 경우 \( \mathrm{y}=-3.377 \mathrm{x}+39.410\left(\mathrm{R}^{2}=0.999\right) \), 일곱째 날의 경우 \( \mathrm{y}=-3.214 \mathrm{x}+38.760\left(\mathrm{R}^{2}=0.995\right) \), 여덟째 날의 경우 \( \mathrm{y}= \) \( -3.257 \mathrm{x}+39.115\left(\mathrm{R}^{2}=0.998\right) \)로 표준 회귀식의 결정계수 \( \left(\mathrm{r}^{2}\right) \)는 모두 \( 0.99 \) 이상으로 나타나 재현성뿐만 아니라 회귀성이 매우 높음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과에서 PTGV 정량 검출시험법으로 활용이 가능함을 확인할 수 있었다.</p>