본 논문에서는 순천만의 염생식물 근권에서 사는 세균을 분리하기 위해 순천만에서 우점하는 자생식물인 칠면초 군락 3개 지점을 정해 샘플링을 진행하였으며, marine broth, tryptic soy broth 한천배지를 사용해 시료를 제작하였다. 분리주의 \( 16 \mathrm { S } \) rDNA를 분석하여 총 92개의 균주를 동정하고 유연관계 확인을 위한 계통수를 작성한 결과 각 수치가 firmicutes \((56.5 \%\)), gamma-proteobacteria \((29.3 \%\)), alpha-proteobacteria \((5.4 \%\)), actinobacteria \((5.4 \%\)), bacteroidetes \((3.3 \%\))로 나타났다. Shannon's Diversity index를 산출한 결과 \(1.675, 1.924, 2.04\)로 채취 지점 별로 종 다양성 간에 차이를 보임을 확인하였다.
<p>우선 순천만 자생 S. japonica 근권 3개 site에서 총 92개의 세균이 순수분리 되었는데, MB 고체배지에서는 73개의 균주가, TSB 고체배지에서 19개의 균주가 분리되었다. MB 배지에서만 분리된 균주로는 주로 해양세균으로 보고된 Shewanella, Marinobacterium, Marinobacter, Microbulbifer, Halomonas, Vibrio 속이 분리되었으며, 이들은 TSB 배지에서는 분리되지 않는 경향을 보였다. 한편, TSB 배지에서는 Bacillus, Paenibacillus, Arthrobacter, Sporosarcina, Microbacterium 속이 주로 분리되었으며, 이들 중 특히 Bacillus 속의 종들은 MB 배지에서도 분리되는 경향을 보였다. 일반적으로 Bacillus 및 연관속의 다양한 종들은 토양 정주균(Soil microflora)으로 물질 순환에 직접 관여하며, 스트레스가 극심한 환경에서 생존하면서 진화해 온 것으로 알려져 있다. 또한 식물과 상호작용하여 식물 생장 촉진(Plant growth promotion), 식물병원체 방어유도(Induction of systemic resistance) 등 다양한 역할을 수행하는 것으로 보고되었다. MB 배지가 해양세균 분리를 위해 최척화된 배지임을 감안할 때, 이들 Bacillus속의 종들은 해양환경에 적응하면서 조수간만의 차이 및 이에 의한 태양광, 자외선, 온도 변화 등 스트레스가 상존하는 갯벌환경에서 생존하며 염생식물과 어떠한 상호작용을 수행할 것으로 예상되어 분리된 Bacillus 속 균주들에 대해 후행 연구가 필요하다. 본 연구에서 92종이 분리되었으나 일반적으로 배양 가능한 미생물은 전체 중 \( 1-2 \% \)에 해당하며, 실제 순천만 식물근권에 존재하는 미생물 종류나 수는 훨씬 많을 것으로 추측된다. 또한 분리균들 중 Ez-Taxondatabase 상의 유사염기서열과 \( 98.5 \% \) 미만의 유사도를 보이는 분리주는 총 11개 균주로, 모두 신종세균으로의 가능성을 보였다. 순천만 갯벌은 일반적인 육지, 해양과 다른 독특한 환경을 가지고 있으며, 지리·역사적 특성으로 미생물상에 대한 연구사례가 거의 없음을 볼 때 보고되지 않은 신종세균이 다양하게 분포할 것으로 된다.</p> <p>시료채취 지점별로는 각각 33개, 35개, 24개 균주가 순수 분리 되었으나 부분동정 결과 각각 29종, 25종, 16개 종이 분리되어 샘플링 지점별로 상이한 수준의 종 다양성을 보이는 것으로 생각된다(Table 1). 따라서 이들의 계통분석 및 종 다양성 확인을 위해 \( 16 \mathrm { S } \) rDNA sequence를 Clustal X program으로 다중정렬 후, BioEdit Sequence Alignment Editor를 사용해 염기서열을 정렬하였으며, Mega 6.0 program을 활용하여 Neighbor-Joining Tree method, Tamura nei model에 따라 분석하였다. 또한 Shannon's diversity index \( \left (H ^ {\prime } \right . \))를 적용하여 시료채취 지점별로 다양성 지수를 분석하였다. 그 결과 분리균들은 크게 4개 문(Phylum), 10개 목(Order), 26개 속(Genus), 51개 종(Species)에 속하는 것으로 나타났다. gamma-proteobacteria 그룹에 속하는 Oceanospirillales 목의 Halomonas (H.) 속이, Alteromonadales 목에 속하는 Marinobacter (M.) 속, Marinobacterium (M.) 속의 종들이, Microbulbifer (M.) 속, Shewanella (S.) 속이, Vibrionales 목에 속하는 Vibrio (V.) 속의 종들이 분리되었다. alpha-proteobacteria 그룹에 속하는 Rhodobacterales 목에서는 Labrenzia (L.) 속, Roseivivax (R.) 속, Sulfitobacter (S.) 속 및 Yangia 속 (Ya.)의 종들이 분리되었다. Firmicutes 문에는 Actinomycetales 목에 속하는 Brevibacterium (B.) 속이, Bacilli 목에 속하는 Halobacillus (H.)속이, Bacillales목에 속하는 Bacillus (B.) 속의 종들이 분리되었다. Bacteroidetes 문에는 Sphingobacteriales 목에 속하는 Algoriphagus (A.) 속이, Flavobacteriales 목에는 Tenacibaculum (T.) 속의 종들이 분리되었으며, Actinobacteria 문에는 Actinomycetales 목에 속하는 Arthrobacter (A.) 속, Micrococcus (M.) 속, Agromyces (A.) 속, Kocuria (K.) 속, Microbacterium (M.) 속의 종들이 분리되었다. 이들의 비율을 정리해보면 92개 전체 분리균 중 52개 분리균이 gram positive, low G + C contents 특성을 가진 firmicutes (56.5 \%)로, 27개 분리균이 gamma-proteobacteria (29.3 \%)로, 5개 분리균이 alpha-proteobacteria (5.4 \%)로, 5개 분리균이 gram positive, high G + C contents 특성을 가진 actinobacteria (5.4 \%)에 속하였으며, 3개 분리균이 Bacteroidetes (3.3 \%)에 속하였다(Table 3). 선행연구에 따르면, 자연환경 특성 및 그들의 고유한 기능에 의해 특징적 미생물상을 보이며, 일반적으로 해수에서는 해양동물에 대한 pathogen이나 marine bacteria 및 alpha-, gamma proteobacteria 위주로 순수분리되는 것으로 보고되었다. 담수에서는 물질순환의 역할을 담당하는 beta-proteobacteia 가, 해양 침적지에서는 다양한 산소조건에서 물질순환의 역할을 수행하는 delta-proteobacteria 가 주로 순수분리되는 것으로 보고되고 있다. 그러나 본 연구에서는 이와 달리 low G + C contents, gram positive bacteria의 특징을 보이는 firmicutes가 집중 분리되었으며, 그 다음으로 gamma-proteobacteria가 분리되었으며, 이는 샘플링 장소와 관계없이 공통적이었다. 우선 채취지점과는 상관없이 종 분포를 살펴보면, 가장 높은 비율을 차지한 firmicutes 문에서는 그에 속하는 Bacillus 속에서 가장 다양한 종의 분포를 보였는데, 특히 다음과 같은 다양한 종들과 높은 유사도를 보였다. Bacillus altitudinis, Bacillus aryabhattai의 경우 식물생장 촉진하는 gibberellins, abscisic acid, indole butyric acid와 같은 물질 분비에 관여하며, 특히 B. aryabhattai의 경우 연안의 염 스트레스 환경하에서 생존하며 식물 뿌리신장(root elongation) 및 생장촉진(growth promotion) 효과가 보고되었다. 또한 Paenibacillus peoriae 는 광범위한 식물 역병균에 대해 길항성을 부여하는 것으로 보고되었다. 일반적으로 Bacillus 속의 세균들은 환경적 스트레스에 강하다고 알려진 점, 특히 그들 중 주로 식물면역성 및 생장촉진과 관련된 Bacillus 속의 주요 균주들과 유전적 상동성이 높은 균주들이 본 연구에서 분리되었음을 볼 때, 본 연구에서 분리균들이 해안환경에 적응하면서 염생식물의 생장에 어떠한 역할을 할 것으로 사료되어 추가적 연구가 필요하다. 한편 Bacillus methylotrophicus 등은 식물 생장을 촉진하며 탈질화 과정, 유기물 산화에 관여한다. 또한 이들은 Bacillus selenatarsenatis와 함께 수계의 침적환경에서 크롬, 비소, 산화성이 강한 중금속을 환원· 응집시켜 무독화하는 것으로 알려져 있다. 산화성이 강한 중금속은 환경에 축적될 경우 오염된 토양의 식물생장을 저해하며, 강력한 독성을 보인다. 일반적으로 세균들은 유· 무기물의 세포내 산화 및 및 광반응을 통해 환원력(reducing power)를 얻으며, 이를 생명유지 및 분열생장에 이용한다. 중금속 이온 환원균의 경우 그들의 세포 외측에서 reducing power 일부를 중금속이온 환원에 사용하며 응집· 침윤시켜 무독화한다. 때문에 이러한 균주들은 식물근권의 오염된 토양, 담수 저서에 생존하며 bio-remediation의 역할을 수행하는 것으로 잘 알려져 있다. 또한 이러한 역할 수행을 위해 유사한 환경적 스트레스에 대한 내성이 필요하며, 따라서 식물생장 촉진 및 면역성 유도 등의 역할을 수행하면서도 토양에 축적된 유독성 물질에 대한 무독화 및 물질순환에 관련된 Bacillus 속 균주들과 상동성이 높은 본 분리균들은 염해 농경지, 오염된 토양 등에서 작물 및 식물의 생존을 가능하게 하는 등 유용 미생물자원으로의 가능성이 있을 것으로 사료된다. 또한 갯벌 미생물상에 관한 선행연구가 드물었다는 점, 해양환경에서 일반적으로 우점한다고 알려진 marine bacteria 이외에 본 연구에서 중금속 환원균주가 분리된 점은 미생물상에 대한 연구뿐만 아니라, 순천만 갯벌토양 및 염생식물이 생장하는 환경 자체에 대한 전반적인 연구도 필요한 것으로 사료된다. 한편 분리균주들과 상동성이 높은 Bacillus taeanensis 등 다양한 Bacillus 속의 종들이 염전 등 특수한 고호염성 해양환경에서 신종 세균으로 보고되고 있다. 식물생장, 유· 무기물 순환, 중금속 환원의 역할 및 염분환경에 적응된 세균들과 유사도가 높은 균주들이 분리된 것은 firmicutes 문의 다양한 세균들이 해양환경에 적응하며 순천만 갯벌에 고유기능을 부여하면서 염생식물과 상호작용하는 것으로 추정된다. Firmicutes 문의 균주들에 이어 높은 비율을 보인 gamma-proteobacteria group 중 다빈도로 분리된 Marinobacterium 속은 국내 다른 갯벌 S. japonica 근권에서도 분리되었으며, Halomonas 속은 일반적으로 해수에서 분리되는 세균으로 알려져 있다. 일반적으로 해양세균과 염생식물 혹은 해안식물과의 상호관계에 대한 연구는 부족한 실정으로, 이들이 본 연구에서도 분리되었음을 볼 때 식물과 어떠한 상호 작용을 할 가능성이 있는 균주로 추가적인 연구가 필요하다. 이외 Shewanella marisflavi는 해양 병원균으로 알려져 있다. 결론적으로, 본 연구결과와 선행연구들을 종합해 볼 때 같은 해양환경에 속한다고 하더라도 갯벌의 고유한 기능에 따라 일반 해수와는 상이한 미생물 상이 형성된 것으로 볼 수 있으며, 이렇게 형성된 미생물상은 순천만 갯벌 고유의 기능을 가능하게 하는 것으로 생각된다. 이에 더하여 시료채취 지점별 근권세균의 유전학적 다양성을 분석한 결과 다양성 지수는 1.675, 1.924, 2.04로 나타나, 칠면초 군락위치에 따라 firmicutes, gamma-proteobacteira 순으로 각 phyla의 우점순은 유사하지만 유전적 다양성은 상이한 것으로 판단된다. 이는 같은 갯벌, 동일한 종의 근권 일지라도 채취지점에 따른 주변환경 변화가 종 우점도에 영향을 미치는 것으로 풀이된다. 본 연구에서는 순천만에서 자생하는 염생식물 S. japonica 근권에서 세균을 분리·동정하였으며 그들의 분포 및 종 다양성을 확인하였고 계통학적 분석을 실시하여 갯벌 특이적 세균 군집의 역할에 대해 확인하였다. 본 연구 결과로서 해양환경에서 적응하면서, 간접적으로는 근권토양에서 물질순환의 역할을 수행하며, 직접적으로는 염생식물 생존 및 생장에 긍정적 영향을 미치는 식물 상호작용 유용 미생물 자원확보의 기초자료로 활용될 수 있다.</p> <h1>요 약</h1> <p>순천만의 염생식물 근권에서 정주하는 세균의 분리를 위해 순천만에서 우점하는 자생식물인 칠면초 군락 3개 지점을 선발하여 샘플링 하였다. 시료는 marine broth, tryptic soy broth 한천배지를 통해 분리되었으며, 형태학적인 구분을 통해 순수분리되었다. 분리주의 \( 16 \mathrm { S } \) rDNA를 분석하여 총 92 균주가 동정되었다. 이들의 유연관계 확인을 위한 계통수 작성 결과, 각각 firmicutes \( (56.5 \%) \), gamma-proteobacteria \((29.3 \%\)), alpha-proteobacteria \((5.4 \%\)), actinobacteria \((5.4 \%\)), bacteroidetes \((3.3 \%\))에 속하였다. Shannon's Diversity index \( \left (H ^ {\prime } \right . \))를 산출하였을 때 각각 1.675, 1.924, 2.04로, 채취 지점 별로 종 다양성의 차이를 보였다.</p>
