피조개 mtDNA 샘플은 득량(St. 1), 가막(St. 2), 남해(St. 3), 진해(St. 4), 태안(St. 5) 및 중국 산둥반도(St. 6)에서 수집되었습니다. 피조개 mt16S ribosomal DNA 유전자를 증폭하기 위해, forward primer로는 GenBank AF305058의 1-14번 영역을 선택하고, reverse primer로는 751-764번 영역을 선택하여 primer design program (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi/primer)을 활용하였습니다. PCR product를 2.5-3.0 nL에 각각의 제한효소 5-10 unit와 reaction buffer와 함께 첨가하여 최종 체적이 5μL이 되도록 조절하였습니다. 그 후, 24시간 동안 37°C에서 배양하였습니다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>피조개</h2> <p>피조개 mtDNA sample은 득량만(St. 1), 가막만(St. 2), 남해(St. 3), 진해(St. 4), 태안(St. 5) 및 중국 산둥반도(St. 6)에서 채집한 것을 대상으로 하였다. Sample 구입은 가막만, 태안, 남해는 2004년 12월에, 득량만과 중국산은 2005년 1월, 진해는 2005년 3월에 각각 양식 현장에서 직접 구입하였다.</p> <h2>Genomic DNA 분리 및 정제</h2> <p>피조개의 total DNA의 분리 및 정제는 Asahida et al.의 방법을 따랐다. 피조개 혈액 \( 100 \mathrm{ml} \) 에 TNES-Urea buffer (\( 8 \mathrm{M} \) urea, \( 10 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}\) \(\mathrm{pH} 7.5, 125 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 10 \mathrm{mM} \) EDTA, \(1\%\) SDS)에 완전히 용해시켜 proteinase \( \mathrm{K}\left(20 \mathrm{mg} \mathrm{l}^{-1}\right) \) \( 3 \mu 1 \) 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 overnight incubation 시켰다. phenol: chloroform-isoamyl alchol \( (25: 24: 1) \) 추출방 법으로 DNA를 정제하였다. 에탄올 처리 후 DNA pellet를 멸균 처리된 증류수에 녹여 PCR에 이용하였다.</p> <h2>PCR에 의한 mtDNA 증폭</h2> <p>피조개 mt16S ribosomal DNA gene 증폭을 위하여 forward로는 GenBank AF305058의 1-14번 부위와 reverse로는 751-764번 부위를 선택하여 primer design program (http:// www-genome.wi.mit.edu.cgi/primer)과 같이 이용하였다. 그 염기서열은 다음과 같다.</p> <p>Forward primer (ArkF-3): 5'-CGCCTGTTTATCAAA-3' Reverse primer (ArkR-3): 5'-CTGGGGCTGAAGTCG-3' PCR 반응액은 \(20-60 \mathrm{ng}\)의 template DNA, primer 각 \(20 \mathrm{pmol}\), dNTPs \( 0.5 \mathrm{mM}, 1.25 \) unit Taq DNA polymerase (FastStar Taq DNA polymerase, Rhoche Co.)와 \( 10 \times \) PCR reaction buffer (Rhoche Co.)를 혼합하여 최종 \( 25 \mu \) 가 되도록 하여 Thermal cycler (iCycler, Bio-Rad)에서 반응시켰다. PCR 은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 denaturation을 실시하고, \( 95^{\circ} \mathrm{C} 1 \) 분, \( 55^{\circ} \mathrm{C}\) 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C}\) 2 분씩 35 cycles를 수행하였고 그 후 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 7 분간 extension을 실시한 후 종료하였다.</p> <h2>RFLP 분석</h2> <p>8 종류의 제한효소(PvuII, BamHI, HinfI, HaeIII, EcoRI, RsaI, K s p 22, B s t X 21가 16 S rRNA RFLP 분석에 이용되었다. PCR product 2.5-3.0 씨에 각각의 제한효소 5-10 unit와 reaction buffer를 첨가하여 최종 volume이 \( 5 \mu l \) 되도록 하여 24 시간 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하였다. 제한효소로 절단된 DNA 단편을 \( 2.0 \% \) agarose gel에 전기영동하여 분리한 후 pattern을 분석하였다.</p> <h2>Similarity 분석</h2> <p>PCR-RFLP 분석 data를 이용하여 우리나라산과 중국산 피조개간의 유전적 관계를 SPSS ver.10.0 program을 사용하여 Euclidean distance method로 분석하였다.</p>