E. coli에서 재조합 단백질 생산에 있어 미접힌 단백질의 내포체 형성은 주요 문제점으로 지적되어 왔다. 본 연구에서는 이러한 현상을 Pseudoalteromonas elyakovii 유래의 alginate lyase 단백질을 이용하여 관찰하였고, 이 단백질은 E. coli에서 비가용성 내포체 형태로 발현되었다. 더불어, cyclodextrin glucanotransferase와 GroEL/ES의 공발현이 단백질의 가용성 형태 발현을 증진시키는 것으로 알려져 있으며, human granulocyte-colony stimulating factor의 경우에는 DnaK/DnaJ/GrpE와의 공발현이 활성형 발현을 이끌어냈다는 이전 연구 결과도 참조하였다.
<h1>서 론</h1><p>E. coli에서 재조합 단백질 생산 시 native 상태로 접히지 못한 단백질들이 축적되어 내포체(inclusion body)를 형성하는 문제점이 있다. 그러나 이러한 문제점들의 해결책으로 GroEL/ES나 DnaK/DnaJ/GrpE 같은 molecular chaperone을 이용하여 재조합 단백질의 접힘(folding)을 촉진시키는 방법이 제시되어져 왔다. DnaK/DnaJ/GrpE는 nascent polypeptide와 반응하여 비가역적인 응집을 막고, 부분적으로 접힘을 촉진시키는 기능을 하는 것으로 알려졌으며 GroEL/ES는 이미 접혀진 단백질과 부분적으로 반응하여 접힘을 보다 완벽하게 할 수 있도록 도와주는 역할을 한다.이와 같은 molecular chaperone 들과의 공발현은 단백질 접힘을 도와 활성형 형태의 단백질 생산 증대에 큰 영향을 미친다. 그리고 접힘 이외에도 chaperone은 단백질의 응집, 안정성, heat response의 조절, 단백질의 분비 등에도 영향을 미친다.</p><p>본 실험에서 사용한 모델 단백질은 Pseudoalteromonas elya-kovii 유래의 alginate lyase (aly)이며 약 \( 51 \, \mathrm{kDa} \)의 분자량으로 E. coli에서 비가용성 내포체 형태로 발현됨을 확인하였다. 이러한 내포체 형성의 주요단계는 peptide translation 그리고 부분적으로 접혀진 단백질들의 응집체 형성이 그 원인일 것으로 보고 있으며, 전체 단계는 번역 속도, peptide 농도, 및 확산에 의존하고, 그리고 이러한 변수들 역시 chaperone처럼 \( \mathrm{pH} \), 염농도, 온도 같은 환경적 요인에 영향을 받는다. Alginate는 높은 점착성 용액을 형성하며 금속이온을 킬레이팅하는 능력을 갖기 때문에 넓게는 식품과 제약 산업에 유용하다. 이러한 alginate를 분해하는 alginate lyase는 hydrolase보다 일정하게 분해할 수 있으며, polysaccharide의 D-mannuronate 나 L-gluronate rich region을 특이적으로 분해한다. 또한 반응 산물의 비환원성 말단 부분에 4-de-oxy-L-erythro-hex-4-enopyranosyluronate의 구성을 이루게 하는 \( \beta \)-elimination 촉매작용에 의해 alginate의 분해를 촉매 하기도 한다. 최근, alginate lyase는 Pseudomonas aeruginosa의 균주에 의해 방출되는 점액상의 alginate를 액화시킬 수 있으며, 이것은 낭포성 섬유증 환자의 치료제로서 좋은 후보 효소로 알려지고 있다.</p><p>이전 연구에서 cyclodextrin glucanotransferase와 GroEL/ES를 공발현시켰을 때 가용성 형태로 생산됨을 보고한 바 있으며, 다른 연구에서는 human granulocyte-colony stimulating factor를 DnaK/DnaJ/GrpE와 공발현시켜 활성형 으로 발현시켰다. 또한 배양 온도와 내포체 형성간의 관계가 가용성 단백질의 생산 증대의 또 다른 방안으로 제시되가도 했는데, 그 중 B-glucosidase는 GroEL/ES 발현 생산과 함께 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 저온 배양했을 때, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 단독 발현시킨 것에 비해 20 배나 향상된 단백질 활성도를 보였다.</p><p>따라서, 본 연구에서는 E. coli에서 비가용성 내포체 형태로 발현되는 alginate lyase를 GroEL/ES 또는 DnaK/DnaJ/GrpE와 같은 molecular chaperone과 공발현시켜 수용성 및 활성형으로 발현\(\cdot\)생산하고자 하였다.</>