Human Dermal Fibroblast를 96 well에 serum free DMEM 배지로 \( 60 \% \) confluent로 배양 후 다음날 Serum Free media에 각각의 성장인자를 농도 별로 처리 후 \( 24 \mathrm{~h} \)를 추가 배양하였으며 MTT assay를 통해서 성장인자에 의한 HDF의 성장 촉진 효과를 수치화하였다. 피부 투과성 peptide를 선별하기 위해서 경피 제제의 용출 실 험 방법을 응용하였고 Franz glass cell (Standard 직경 \( 9 \mathrm{~mm} \), Receiver \( 5 \mathrm{ml} \), Permegear)을 이용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약 및 기기</h2> <p>Phage library는 Ph.D -12 phage library kit를 New England Biolab에서 구입하여 사용하였다. Franz glass cell(Standard 직경 \( 9 \mathrm{~mm} \), Receiver \( 5 \mathrm{~ml} \), Permegear), 돼지 피부(\(1 \mathrm{~mm}\) 두께, Medikinetics), M-13 phage spin kit(Qiagen), P3-1, S3-2 peptide와 control peptide (FTIC fusion 형태, Peptron), PEG400, Glycerin, 1,3 Butylene glycol(Sigma), GlucmE20 (Lubrizol) glycereth26 (Lipochemical), EGF, hGH, FGFb (차메디텍) 등의 시약은 표기된 업체에서 구매 혹은 제작하였다. Two-photon confocal은 IVIM Technology (Korea)를 이용하였다.</p> <h2>성장인자의 열 안정성 분석</h2> <p>Human Dermal Fibroblast를 96 well에 serum free DMEM 배지로 \( 60 \% \) confluent로 배양 후 다음날 Serum Free media에 각각의 성장인자를 농도 별로 처리 후 \( 24 \mathrm{~h} \)를 추가 배양하였다. 이후 MTT assay를 통해서 성장인자에 의한 HDF의 성장 촉진 효과를 수치화하였다. 성장인자의 열 안정성을 확인하기 위해 최종 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도가 되게 \( 90 \% \)의 보습제에 배합하였다. 이후 PCR 기기를 이용하여 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 1 \mathrm{~h} \) 동안 incubation한 뒤 HDF 세포에 처리하였다. 이를 종합하여 성자인자 안정화 제형은 단분자 보습제와 PEG 기반 고분자 보습제를 \( 40 \% \)의 농도가 되는 제형을 선정하였다.</p> <h2>Phage display를 이용한 각질투과 phage 선별</h2> <p>피부 투과성 peptide를 선별하기 위해서 경피 제제의 용출 실 험 방법을 응용하였다. 이를 위해 Franz glass cell (Standard 직경 \( 9 \mathrm{~mm} \), Receiver \( 5 \mathrm{ml} \), Permegear)을 이용하였다. Glass cell의 상단과 하단 사이에 돼지 피부 (0.7 mm 두께, Medikinetics) 를 장착하고 상단의 donor chamber에 phage를 처리한 뒤, 돼지 피부를 투과하여 하단의 Receiver chamber에 잔류하는 Phage를 증폭하였다. 이 과정을 1회 진행하는 것을 1 Round 선별한 것으로 정의하였다. 1 Round에서 증폭된 Phage를 가지고 다시 2 Round를 진행하는 방식으로 피부 투과력이 좋은 phage를 경쟁하는 방식으로 선별하였고 총 4 Round를 수행하였다. Receiver chamber에는 각각 \( 500 \mu \mathrm{l} \)와 \( 5 \mathrm{ml} \)의 TBS (\(50 \mathrm{mM} \) Tris \( \mathrm{pH} \) 7.5, \( 150 \mathrm{mM}~ \mathrm{NaCl} \)) 용액에 \(1\%\) BSA (Sigma)와 \( 0.01 \% \) Tween 20을 녹여서 사용하였다. Donor chamber에는 성장인자 안정화 제형을 사용하였다. Random 한 peptide 서열을 가지는 phage를 가지고 시작하기 위해서, Ph.D -12 phage library kit (New England Biolab)를 사용하였다. \( 500 \mu \mathrm{l} \)의 donor chamber 액에 \( 10^{10} \)개의 phage를 처리하였다. 이후 \( 16 \mathrm{~h} \) 동안 배양하였고, Receiver chamber의 TBS \( 5 \mathrm{ml} \)를 모두 사용하여 phage를 증폭하였다. Phage를 증폭하기 위해서 Host cell로 E. coli ER2738 (New England Biolab)를 이용하였다. \( 25 \mathrm{ml} \)의 LB 배지에 진탕 배양된 ER2738를 접종하고 O.D. (\(550 \mathrm{nm} \)) 0.5에서 투과한 Phage가 있는 TBS \( 5 \mathrm{ml} \)를 모두 처리하고 \( 4 \mathrm{~h} \) 배양하였다. 이후 \( 8000 \mathrm{G} \)로 원심 분리하여 E. coli와 phage를 분리하였다. Phage가 있는 상층액에 \( 6 \mathrm{ml} \)의 침전액 (\( 20 \% \) PEG6000, \( 2.5 \mathrm{M}\) \(\mathrm{NaCl} \))을 처리하여 Phage를 침전시켰다. \( 8000 \mathrm{G} \)로 원심 분리 후 침전된 Phage에 TBS 용액을 처리하여 Phage른 분리 후 보관하였다. 최종적으로 피부 투과성 Phage가 가지는 peptide를 확인하기 위해서 phage를 single colony에서 증폭하였다. Phage를 가지는 ER2738 E. coli는 LB/X-gal/IPTG plate에서 파란색을 띄는 성질을 이용하였다. ER2738 배양액에 \( 300 \mu \mathrm{l} \)에 phage를 TBS로 적정량 희석하여 처리한 뒤, 이를 TOP agar \( 4 \mathrm{ml} \)에 섞은 후 LB/X-gal/IPTG plate 상단에 처리하고 \( 16 \mathrm{~h} \) 추가 배양한 뒤 blue colony를 선별하였다. 각각의 colony를 \( 5 \mathrm{ml} \)의 ER2738 배양액에 \( 6 \mathrm{~h} \) 추가 배양한 뒤 M13 phage spin kit (Qiagen)을 이용하여 DNA를 분리 후 염기서열을 분석하였다. 이를 통해 피부투과 peptide를 선별하였다.</p>