본 실험에 사용되는 환경개선제의 종류는 A, B, C, D, E, F사의 제품을 이용하였으며, 연속희석법을 이용하여 각 제품의 생균수 측정 실험을 진행하였다. 다음으로 제품의 항생제 내성 시험을 위해 본 연구는 aminiglycosides 계열, Lincosimides 계열, Macrolides 계열, Cephalosporins 계열, Quinolones 계열, Penicillins 계열 그리고 Tetracyclines 계열의 항생제를 사용했으며, 각 항생제의 위해도 등급은 Streptomycin(\(3\)등급)을 제외하고 모두 \(4\)등급이다. 항생제 시험은 disk diffusion 법을 통해 진행되었다.
<h1>실험 재료 및 방법</h1> <h2>제품선정</h2> <p>환경개선제의 종류는 '\(07\)년 단미사료 협회에서 제공하는 판매별 순위를 고려하여 점유율 기준으로 상위 제품 \( \mathrm{A}, \mathrm{B} \)사 (상위 \( 30 \% \) 이내)의 제품과 하위 제품으로 \( \mathrm{E}, \mathrm{F} \)사의 제품을 선정 하였으며, 현재 개발완료 되어진 \( \mathrm{C}, \mathrm{D} \)사의 제제를 획득하여 생균수 측정과 항생제 내성 시험을 하였다(Table \(2\)).</p> <h2>생균수 측정</h2> <p>연속희석법을 이용하여, A, B, C, D, E, F사의 생균수 측정 실험을 행하였다. 희석배수가 \( 10^{4} \) 에서 \( 10^{7} \) 의 희석액 \( 0.1 \) \( \mathrm{mL} \)를 살균된 유리봉을 이용하여 배지 표면에 골고루 도말 한 후 집락이 형성될 때까지 \(48\)시간동안 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하여 형성된 콜로니를 세어 측정하였다. 형성된 콜로니는 통계학적으로 가장 믿을 수 있는 \(30\)에서 \(300\)집락이 형성된 배지의 콜로니를 세어 평균을 내었다. 시료의 희석액으로는 멸균수를 사용하였으며, 생균수 측정 결과는 총 \(2\)번의 실험 을 통해 산출 되었다. 측정에 이용된 배지의 종류는 일반 세균용으로 NA(Nutrient Agar), 유산균류용 배지 MRSA (Lactobacilli MRS agar), 효모 및 곰팡이류용으로 PDA (Potato Dextrose Agar) 배지를 이용하였다.</p> <h2>항생제 종류 선정</h2> <p>항생제는 현재 \(2009\)년 \(1\)월 \(1\)일 사료첨가용 항생제 품목이 제한되기 전까지 계열별로 tetracycline계, penicillin계 및 sulfa계가 가장 많이 사용되었으며, 그 다음으로는 aminoglycoside계, quinolone계, macrolide계가 많이 사용된다고 보고 되었다. 또한 축종별로는 돼지에 가장 많은 항생제가 사용 된다고 보고되어진다. 실험에 이용된 항생제 disc는 aminiglycosides 계열의 Gentamycin, Neomycin, Streptomycin과 Lincosimides 계열의 Clindamycin, Lincomycin, Macrolides 계열의 Erythromycin, Cephalosporins 계열의 Cephalothin, Quinolones 계열의 Norploxacin, Penicillins 계열의 Penicillin, Amoxicillin, Ampicillin 그리고 Tetracyclines 계열의 Oxytetracyclin의 총 \(12\)가지의 항생제가 사용 되었으며 Table \(3\)에 나열하였다. 독성, 내성 유발성, 규제적 중요도 등과 노출 등을 고려한 위해도 분석 결과에 의하면 Streptomycin은 위해도 \(5\)-\(10\)의 \(3\)등급이며, 나머지 항생제는 \(10\)-\(15\)의 조금 더 위해도가 높은 \(4\)등급에 해당한다. 위해도 등급은 총 \(5\)등급으로 분류되며 \(1\)등급에서 \(5\)등으로 갈수록 위해도가 높은 것으로 선정되어 있다. \(12\)가지 항생제는 보두 현재 사용 금지된 종류이며 Penicillin은 \(2008\)년까지 허용되었던 인수공용 항생제 품목이다.</p> <h2>항생제 내성 시험 방법</h2> <p>항생제 시험은 disk diffusion법을 이용하였으며 MRSA, PDA, NA 배지에 각 미생물제제를 \( 0.1 \mathrm{~mL} \)씩 분주한 후, 멸균된 유리 도말봉을 이용하여 골고루 도말한 뒤 \(10\)분 이내 에 dispenser를 이용하여 항생제 디스크를 배지 위에 접종하였다. 항생제 내성여부는 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(48\)시간 배양한 후에 클리어 존의 형성 여부와 크기에 따라 내성의 정도를 확인 하 였으며, 실험은 총 \(3\)번에 걸쳐 실험하여 표준편차와 함께 클리어 존의 크기를 나타내었다.</p>