PLC는 여러 조직에서 발현되고 \( \mathrm{PLC\gamma} \)는 세포 증식에 관해 관려한다. 본 연구에서는 특이 항체를 사용하여 단백질이 인산화되는가를 조사한다. 방법은 NO 에 의하여 PLCY가 활성화 정도를 분석한다. 추가로 \( \mathrm{NO} \) 에 의한 \( \mathrm{PLC\gamma}_{1} \) 의 인산화 정도도 분석하고, ERK 와 관련이 있는지 입증한다.
<h2>\( \mathrm{PLC\gamma}_{1} \) 의 tyrosine 인산화에 대한 \( \mathrm{NO} \) 의 영향</h2> <p>\( \mathrm{PLC} \) 는 \( \beta, \gamma \), 및 \( \delta 3 \) 가지가 여러 조직에서 발현되고 세포 활성화에 관여하는데 BeWo 세포에서 VEGF에 의한 세포의 증식에는 주로 \( \mathrm{PLC\gamma} \) 가 관여한다. \( \mathrm{PLC\gamma} \) 는 tyrosine 잔기의 인산화에 의하여 활성형으로 된다. 본 연구에서는 \( \mathrm{NO} \) 에 의하여 PLCY가 활성화되는가를 조사하였다. SNP를</p> <p>처리한 후 세포 추출액을 \( \mathrm{PLCV}_{1} \) 및 \( \mathrm{PLCr}_{2} \) 에 대한 특이 항체를 사용하여 면역침전을 시행한 후 phosphotyrosine 항체인 PY로 western blotting을 시행하여 이들 단백질이 인산화되는가를 조사하였다(Fig. 5). \( \mathrm{PLC\gamma}_{1} \) 및 \( \mathrm{PLC\gamma}_{2} \) 에 대한 항체로 면역침전한 단백질을 다시 이들 항체로 Western blotting을 하였을 때 검출되는 양은 동일하였다. 이들 면역침전된 시료를 PY항체를 사용하여 조사하였을 때 \( \mathrm{SNP} \)에 의하여 \( \mathrm{PLC\gamma}_{1} \) 은 tyrosine 잔기가 인산화되어 활성화되는 것으로 나타났으나 \( \mathrm{PLC\gamma}_{2} \) 의 인산화에는 아무런 변화가 없었다. 또한, \( \mathrm{SNP} \) 에 의한 \( \mathrm{PLC\gamma}_{1} \) 의 tyrosine 인산화는 tyrosine kinase의 억제제인 genistein에 의하여 억제되는 것으로 보아 이들의 활성화를 나타내는 인산화는 tyrosine kinase에 의하여 일어난다는 것을 알 수 있다.</p> <p>다음으로 \( \mathrm{NO} \) 에 의한 \( \mathrm{PLC\gamma}_{1} \) 의 인산화가 ERK 를 통하여 일어나는가를 조사하였다. PD98059를 전 처리한 후 SNP를 투여한 BeWo 세포로부터 얻은 추출액을 \( \mathrm{PLC\gamma}_{1} \) 으로 면역침전하고 PY에 대한 항체로 Western blotting을 하였을 때 SNP에 의한 tyrosine 잔기의 인산화는 크게 감소되는 것으로 나타났다(Fig. 6). 이 결과는 \( \mathrm{NO} \) 에 의한 \( \mathrm{PLC\gamma}_{1} \) 의 인산화는 ERK를 통하여 일어난다는 사실을 제시한다.</p> <p>다른 연구자의 보고에 의하면 peroxynitrite를 처리한 \( \mathrm{NIH} 3 \mathrm{~T} 3 \) 세포에서 \( \mathrm{PLC\gamma}_{1} \) 의 tyrosine 잔기가 인산화된다고 보고하였지만 그들은 인산화 효소를 거쳐서 일어나는가는 밝히지 못하였다. 또 다른 연구자들은 \( \mathrm{PLC}_{\beta 1} \) 이 ERK 에 의하여 직접적으로 인산화된다고 보고하기도 하였으나, 본 연구에서는 \( \mathrm{PLC\gamma}_{1} \) 이 ERK에 의하여 직접적으로 인산화되는지 혹은 다른 인자를 통하여 일어나는지는 밝히지 못 하였다. \( \mathrm{NO} \) 는 세포 내 cGMP의 양을 증가시키고 결국에는 CGMP-의존형 인산화 효소인 protein kinase G 의 활성화를 유도하는데 \( \mathrm{NO} \) 에 의한 단백질의 인산화가 PKG 에 의하여 일어날 수 있으나 이들은 serine이나 threonine기의 인산화 를 시키며 특히, \( PLC\gamma_{\beta} \) 가 PKG에 의하여 인산화되면 세포 자극에 의한 반응은 오히려 억제된다고 하였다. \( \mathrm{NO} \) 에 의하여 \( \mathrm{PLC}_{\beta} \) 나 \( \mathrm{PLC}_{8} \) 가 인산화될 가능성도 배제할 수 없으나 본 연구 결과에서는 \( \mathrm{PLC\gamma}_{1} \) 이 \( \mathrm{NO} \) 에 의한 ERK 의 활성화 경로를 통하여 tyrosine기의 인산화가 이루어지고 이들의 활성화에 의하여 세포의 증식이 일어날 것으로 추측된다.</p> <p>비록 \( \mathrm{PLC\gamma}_{1} \) 의 어느 아미노 잔기가 인산화되어 \( \mathrm{NO} \) 에 의한 세포 증식의 조절에 중요한 조절 인자로 작용하는가는 앞으로 연구되어야 하겠지만 본 연구 결과는 choriocar-cinoma 세포에서 ERK 나 \( \mathrm{PLC\gamma}_{1} \) 의 신호전달 인자를 조절함으로써 \( \mathrm{NO} \) 에 의한 세포 증식을 억제할 수 있다는 것을 제시하고 있다. 더욱 중요한 점으로는, 생리-병리학적으로 볼 때, BeWo 세포가 VEGF로 자극을 받으면 VEGF 수용체의 인산화를 통한 \( \mathrm{PLC\gamma} \) 의 활성화가 ERK 를 자극하여 세포의 증식이나 \( \mathrm{NO} \) 의 생성에 영향을 줄 뿐만 아니라 세포 내 증가된 \( \mathrm{NO} \) 에 의하여 자가적으로 \( \mathrm{PLC\gamma} \) 가 활성화되어 세포증식에 대한 증폭 작용을 할 것으로 추측된다.</p>