Collagenase를 생산하는 균주를 분리하기 위해 20~40대의 남녀 40명을 대상으로 피부 트러블을 가진 부위에서 면봉으로 채취한 후, 멸균 처리된 면봉을 사용하여 멸균된 생리 식염수 \( (0.85 \% \mathrm{NaCl}) \)에 현탁하여 실험에 사용하였습니다. 일차적으로 수집된 여러 시료를 멸균된 생리 식염수로 \( 10^{2} \sim 10^{7} \)배율로 희석한 후, 분리용 평판 배지에 \( 100 \mu l \)씩 도말하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 배양하였습니다. 이를 바탕으로 GPI (Gram Positive Identification) Card를 활용하여 균주를 분류하였으며, 16SrDNA의 염기 서열을 분석하여 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Gene bank database와 비교했습니다. 이를 통해 균주의 분류학적 위치를 파악하였습니다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 분리용 시료 및 사용배지</h2> <p>Collagenase를 생산하는 균주를 분리할 목적으로 피부 트러블을 가진 20~40대의 남녀 40명을 대상으로 피부를 멸균한 면봉으로 긁어 멸균 생리 식염수 \( (0.85 \% \mathrm{NaCl}) \)에 현탁하여 사용하였다. Collagenase 생산 균주의 분리용 평판 배지는 \(0.3\% \) collagen (Insoluble Type I, Sigma Co., USA),\( 0.1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) yeast extract, \( 0.7 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\), \(0.2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) \( \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\), \(0.01 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(0.05 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) citrate \(\cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \), 그리고 \( 1.5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) agar로 구성된 것과 \( 2.0 \% \) gelatin을 포함하는 LB평판 배지 \( \left(5.0 \% \mathrm{HgCl}_{2}\right. \)를 뿌려 gelatin이 분해된 것을 halo로써 확인)를 사용하였다. 효소 생산용 액체 배지는 \( 0.3 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) gelatin, \( 0.1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) yeast extract, \( 0.7 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \quad \mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}, 0.2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \quad \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 0.01 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) \( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot \mathrm{7H}_{2} \mathrm{O} \)와 \( 0.05 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) citrate \( \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)를 사용하였다.</p> <h2>Collagenase 생산 균주의 분리 및 효소 활성 측정법</h2> <p>일차적으로 수집된 여러 시료를 멸균 생리 식염수로\( 10^{2} \sim 10^{7} \)으로 희석한 후 분리용 평판 배지에 \( 100 \mu l \)씩 도말하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 halo를 형성하는 colony를 분리하고 1차 선별된 colony를 효소 생산용 액체배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 200 \mathrm{rpm} \)에서 24시간 동안 배양시킨후 collagenase 활성을 측정하여 활성이 가장 높은 균주를 이차 분리하였다.</p> <p>Collagenase 활성 측정을 위한 조효소액은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \(200 \mathrm{rpm} \) 으로 24시간 동안 진탕 배양한 후에 \( 4 ^{\circ} \mathrm{C} \), \(12,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심 분리한 것을 사용하였다. 효소 반응 기질인 collagen \( (0.03 \mathrm{~g} / \mathrm{ml}) \)을 \( 4 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{CaCl}_{2} \)를 포함한 Tris- \( \mathrm{HCl} \) buffer \( (\mathrm{pH} 7.4)\) \(0.4 \mathrm{ml} \)를 넣어 반응 기질액을 만들어 조효소액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(110 \mathrm{rpm} \)으로 30분 동안 효소 반응을 시켰다. 반응의 정지는 \( 0.1 \mathrm{mM} \) cold acetic acid \( 0.5 \mathrm{~ml} \)를 가하여 행하였다. \( 10,000 \mathrm{rpm} \)에서 15분간 원심 분리하여 얻은 상등액 \( 0.1 \mathrm{~ml} \)에 \( 0.05 \% \) \(\mathrm{SnCl}_{2} \cdot \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)을 포함한 methylcellosolve용액에 ninhydrin을 \(2\% \)첨가하여 만든 ninhydrin solution \(1 \mathrm{ml} \)과 \( 4 \mathrm{mM} \mathrm{CaCl} \)를 포함한 Tris-\( \mathrm{HCl} \) buffer ( \( \mathrm{pH} 7.4\)) \( 1.4 \mathrm{~ml} \)을 가하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C}\), 15분 가열한 후 냉각시키고, \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 O.D를 측정하여 유리된 free \(\alpha\)-amino group을 Ninhydrin법으로 정량하였다. 효소 \(1 \mathrm{unit}\)는 1분 동안 \( 1 \mu \mathrm{M} \)의 leucine을 생산하는 효소의 양으로 정의하고, 단백질량은 bovine serum albumin을 표준 단백질로 하여 Bradford assay 및 \( 280 \mathrm{~nm} \)에서의 흡광도를 측정하여 정량하였다.</p> <h2>분리 균주의 분류 및 동정</h2> <p>이차로 분리된 collagenase 생산 균주 중에서 가장 collagenase 활성이 높은 균의 분류학적인 위치를 검토하기 위하여 형태학적, 배양학적, 생화학적인 제반 특성을 조사하고, 이를 바탕으로 GPI (Gram Positive Identification) Card (Biomerieux, France)를 사용하여 균주를 검토한 후, 16SrDNA의 염기 서열을 결정하고 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Gene bank database와 비교 분석하였다.</p>