에폭사이드는 반응성이 우수하고, 광학활성을 가지는 키랄 에폭사이드는 고부가가치 광학활성 의약품 합성용 핵심중간체로써의 중요성이 증대되고 있다. Rhodotorula sp 균체를 생촉매로 이용하여 (R, S)-styrene oxide로부터 (R)-styrene oxide만을 입체선텍적으로 가수분해하여 광학순도 99% 이상의 (S)-styrene oxide를 제조하기 위해 주요 반응 조건인 pH, 온도 및 기질 용해도 향상을 위한 유기용매 첨가량 등의 영향을 분석하고 반응 표면 분석법을 이용하여 생산조건을 최적화하고자 한다.
<h1>서 론</h1> <p>에폭사이드(epoxide)는 반응성이 우수한 oxirane 링구조로 인하여 친전자성반응, 친핵성반응 등 다양한 반응을 유도할 수 있어 유기합성용 중간체로 널리 사용되고 있다. 특히, 광학활성을 가지는 키랄 에폭사이드는 고부가가치 광학활성 의약품 합성용 핵심중간체로써의 중요성이 증대 되고 있다.</p> <p>생촉매를 이용하여 키랄 에폭사이드를 제조하는 방법으로는 monooxygenase 등의 산화환원효소를 이용하여 이중결합에 직접 oxirane 링을 도입하는 방법과 라세믹 에폭사이드 기질의 각 광학이성질체에 대한 생촉매의 선택적 가수분해능을 이용하여 단일 광학이성질체만을 분리하는 기술이 있다. (R), (S)-이성질체로 혼합되어 있는 라세믹에폭사이드 기질로부터 특정 광학이성질체만을 선택적으로 diol로 가수분해시켜줌으로써 궁극적으로 한 종류의 에폭사이드만을 제조할 수 있는 효소가 에폭사이드 가수분해 효소(epoxide hydrolase, EH)이다. EH는 monooxygenase에 비해 cofactor 재순환이 요구되지 않으며, 비교적 안정된 구조를 가지고 있다는 장점이 있다.</p> <p>본 논문에서는 EH 활성이 우수한 Rhodotorula sp. 균체를 생촉매로 이용하여 라세믹 (R, S)-styrene oxide로부터 (R)-styrene oxide만을 입체선텍적으로 가수분해시켜 제거 함으로써 광학순도 \( 99 \% \) 이상의 (S)-styrene oxide를 제조함에 있어 주요 반응 조건인 \( \mathrm { pH } \), 온도 및 기질 용해도 향상을 위한 유기용매 첨가량 등이 미치는 영향을 분석하고 반응 표면 분석법을 이용하여 생산조건을 최적화하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포 배양</h2> <p>Rhodotorula sp. CL-82를 배양하기 위한 배지로는 \( 1 \% \) \( ( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) yeast, \( 1 \% \) \(( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) glucose를 포함하는 최소배지 (Peptone \( 10 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \), \( \mathrm { NaCl } 2 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \), \( \mathrm { MgSO } _ { 4 } \cdot 7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } 0.147 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \), \( \mathrm { NaH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } 1.3 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \), \( \mathrm { ~K } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } 4.4 \mathrm { ~g } / 1 \)를 사용하였으며, 배양 온도 \( 27 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(250 \mathrm { rpm } \) 에서 48시간 진탕 배양하였다. 배양된 세포는 원심분리 후 \( 100 \mathrm { mM } \) phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } 8.0 \))로 두 번 세척한 다음 생촉매로 사용하였다.</p> <h2>입체선택성 가수분해반응</h2> <p>세포 \( 300 \mathrm { mg } \) (건조중량기준)을 \( 10 \mathrm { ml } \)의 \( 100 \mathrm { mM } \) phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } 8.0 \))에 현탁시킨 다음 \( 20-80 \mathrm { mM } \) 라세믹 styrene oxide를 주입하였다. 반응기로는 screw-cap vessel을 사용하였으며, \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(250 \mathrm { rpm } \) 의 진탕배양기에서 30분 동안 가수분해 반응을 실시하여 초기 가수분해속도를 결정하였다. 반응 종료 후 반응액을 cyclohexane으로 추출한 후, 유기용매 층을 chiral GC로 분석하여 초기 가수분해속도와 광학순도(enantiomeric excess, ee \( = [S-R] /[S + R] \times 100 \%) \)를 결정하였다.</p> <h2>\( \mathrm { pH } \), 온도 및 cosolvent의 영향</h2> <p>반응표면 분석법을 이용한 입체선택적 가수분해효소 반응조건 최적화를 위하여반응용액의 \( \mathrm { pH } \)를 6.5-8.5, 온도를 \( 27.5-37.5 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 그리고 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 \( 1-5 \% \) \( ( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \)까지 변화시키면서 광학분할 실험을 수행하였다.</p>