YMPD 고체배지에서 pIJ486 vector를 삽입한 S.griseus/pIJ486 형질전환체는 배양 2일째 기균사를 형성하고, dasA가 과발현된 S.griseus/pES1 형질전환체는 주름진 기저균사의 형태를 간직하고 있었다. DNA microarray에서 dasA의 mRNA 비율은 pES1 형질전환체에서 12.1배 증가한 걸로 보였고, 나머지 RNA 발현량도 low resolution S1 nuclease mapping법으로 분석하면 증가한 것으로 보였다. 또한 GTP-binding protein은 aerial mycelium 형성에 관여하는 GTP-binding protein들과 높은 아미노산서열의 상동성을 보였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <p>pIJ486 vector가 삽입된 S. griseus/pIJ486 형질전환체는 YMPD 고체배지에서 배양 2일째 기균사를 형성하여 흰색을 띄지만, dasA가 과발현된 S. griseus/pES1 형질전환체는 주름이 많은 기저균사의 형태를 간직하고 있었다(Fig. 1A). 이러한 특이적 형태분화는 주사전자현미경(SEM)으로 표면을 관찰하면 일반적인 기저균사보다 짧고 거친 균사체를 갖고 있는 것을 알 수 있다.</p> <p>pES1에 의해서 유도되는 특이적 형태분화에 관련하는 유전자를 분석하기 탐색하기 위해서, pES1이 형질전환된 S. griseus/pES1의 RNA 샘플로부터 준비된 전사체를 pI486 벡터만 형질 전환된 S. griseus/pIJ486으로부터의 전사체와 각각 비교하였다. 형질 전환체는 YMPD 액체 배지에서 배양하여 균체를 회수하였으며, 이들로부터 RNA를 회수하여 DNA microarray를 수행하였다. t-검정법으로 분석하여 발현량이 2배 이상 증가(2-fold change)하고 p-value가 0.05 미만 \( (p \)-value \(<0.05) \)인 유전자를 선별하였다. 또한 오페론(또는 polycistronic unit)에서 일부 유전자만 증폭이 된 경우에는 "false positive"로 간주하였으며, 그 기능이 추정 불가능 한 유전자의 경우에도 다음 단계의 실험에는 제외시켰다.</p> <p>예상대로 DNA microarray에서 SGR2281(dasA)의 mRNA 비율은 pES1 형질전환체에서 12.1배 증가한 걸로 관찰되었다. 이는 형질전환체에서 dasA 유전자의 전사가 이뤄지고 있으며, microarray가 적절히 수행된 것을 의미한다. DNA microarray 결과로부터, dasA 유전자 외에 4개의 유전자 (SGR794, SGR2469, SGR3656, SGR3657)와 3개의 cluster (SGR795-797, SGR2377-2378, SGR6997-6998)가 선별되었다. 선별된 유전자들에 대한 정보는 Table 2 에 나타냈다. 각각의 cluster를 구성하는 유전자들은 RT-PCR 분석을 통하여 cluster 내 모든 유전자들이 하나의 전사체를 형성하며 전사되는 것을 확인하였다.</p> <p>발현량이 증가된 7종(dasA 제외)에 대한 RNA 발현량을 low resolution S1 nuclease mapping 법으로 분석하였으며, 분석된 모든 유전자들은 DNA microarray 결과와 마찬가지로 pES1 형질전환체에서 발현량이 증가된 것으로 확인되었다. 특히, SGR794와 SGR795의 경우에는 배양기간에 상관없이 pES1 형질전환체에서만 발현이 증가되었는데, 이들 유전자들은 pES1에 의해서 유도되는 특이적 형태분화에 중요한 역할을 담당하고 있을 것으로 추정된다.</p> <p>SGR2469가 코드하는 GTP-binding protein은 S. virido-chromogenes Tue57과 S. coelicolor A3(2)와 S. avermetilis MA4680 등의 GTP-binding protein들과 \( 84-88 \% \)의 높은 아 미노산 서열의 상동성을 보였다. S. coelicolor A3(2)의 GTP-binding protein은 aerial mycelium 형성에 밀접하게 관여하는 것으로 알려져 있다.</p> <p>SGR3656이 코드하는 SsfR (IclR family transcriptional regulator)은 Jiang 등에 의해 S. griseus에서 포자형성단계에 관여하는 조절인자로 보고되었다.</p>