본 연구는 생막걸리, 누룩, 김치, 젖산균 발효유 등에서 분리한 젖산균주를 활용하여 알코올 내성 젖산균을 탐색하였다. 이를 위해, 알코올(에탄올)이 \( 0 \%, 10 \%, 15 \% \) 가 함유된 MRS 액체 배지에서 성장한 균주 5 종을 선별하였고, 그 중
 
 알코올 내성이 확인된 2 종의 균주를 최종 선별하였다. 이들 균주는 표준 균주인 Pediococcus acidilactici DSM 20284와 비교 실험을 진행하였다. 또한, 선별된 젖산균주를 살균막걸리에 접종하여 냉장 및 상온에서 보존한 후 젖산균 수를 측정하였다. 이런 과정을 통해 젖산균의 알코올 내성 및 젖산균주의 효과를 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>알코올 내성 젖산균주의 1차 스크리닝</h2> <p>알코올 내성 젖산균을 탐색하기 위하여 현재 판매중인 생막걸리, 누룩, 김치, 및 젖산균 발효유 등에서 젖산균의 분리를 실시하였다. 젖산균의 분리 및 확인은 식품공전상의 젖산균 분리 배지인 bromocresol purple (BCP)배지를 사용하였으며, 각 샘플을 연속희석법으로 희석하여 도말 한 후 이틀간 배양하여 황색을 띄는 젖산균을 분리하였다.</p> <h2>알코올 함유 배지에서의 생장 실험</h2> <p>분리해낸 젖산균주를 알코올(에탄올)이 \( 0 \%, 10 \%, 15 \% \) 가 함유된 MRS 액체 배지에 접종하여 배양하였다. MRS배지는 알코올 농도에 따라 들어가는 알코올 부피를 제외한 만큼 만들어 가압멸균 후 냉각하고 알코올을 첨가하여 혼합한 후 제조하였다. 이렇게 제조한 알코올을 포함한 MRS 배지 \( 10 \mathrm{ml} \) 에 seed culture를 \( 1 \% \) 접종하여 배양하였다. 배양조건은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 150 \mathrm{rpm} \) 으로 24 시간 진탕 배양한 후 \( \mathrm{OD}_{600} \) 값이 증가하는 균주를 탐색하였다. \( \mathrm{O.D}_{600} \) 값은 24 시간 배양한 후 spectrophotometer를 이용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \) 파장에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>선별 균주의 분자생물학 및 생화학적 동정</h2> <p>\( 10 \% \) 와 \( 15 \% \) 알코올이 함유된 배지에서 \( \mathrm{O.D}_{600} \) 값이 증가한 균주 5 종을 선별하여 MRS broth에 다시 접종하여 배양한 후 RBC Genomic DNA Extraction Kit (RBC Bioscience Co., Taiwan)을 이용하여 Genomic DNA를 추출한 후 이를 template로 균주 동정을 위한 PCR을 수행하였다. PCR은 세균의 27F primer와 1492R primer를 이용하여 16S rRNA 유전자를 증폭하였고 증폭된 DNA의 염기서열은 (주)코스모진텍(Daejeon, Korea)에 의뢰하며 수행하였고 그 결과를 BLAST 프로그램을 이용하여 분석하였다. 또한 선별된 균주의 생화학적 동정을 위하여 젖산균 동정용 Kit인 API 50 CHL Medium (bioMerieux, France)을 사용하여 탄수화물의 발효 여부 및 대사를 비교 분석하였다.</p> <h2>알코올 내성 비교</h2> <p>최종 선별한 알코올 내성 젖산균 2 종의 알코올 내성 정도를 표준 균주인 Pediococcus acidilactici DSM 20284 균주와 비교 실험을 진행하였다. 에탄올이 \( 0 \%, 6 \%, 12 \% \) 함유된 MRS 액체 배지에서 각각의 균주를 일주일간 배양하며 24 시간에 한번씩 시료 채취한 후, 연속희석법으로 희석하고 도말하여 균주수를 측정하였다.</p> <h2>Bacteriocin Assay</h2> <p>Bacteriocin 생산능력을 확인 하기 위해 well diffusion assay를 수행하였다. Nutrient agar 배지에 식중독균의 하나인 Staphylococcus aureus 를 \( 1 \% \) 접종하여 굳힌 다음, 멸균한 tip으로 구멍을 낸 후 본 실험을 통해 선별한 알코올 내성 젖산균 2종과 Pediococcus acidilactici DSM 20284 배양 상등액을 주입하고, 대조군으로는 MRS 배지를 주입한 후 상온에서 2 시간 정도 방치하여 상등액이 확산되게 한 후 배양하여 저해 환의 크기를 측정하였다.</p> <h2>막걸리의 저장 기간 중 젖산균의 안정성</h2> <p>시중에서 구입한 살균막걸리에 선별된 젖산균주 P . acidilactici K3와 S1을 정균 작용이 가능한 수준인 \( 5 \times 10^{6} \) \( \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 로 접종한 후에 냉장고 저장 온도 \( \left(4^{\circ} \mathrm{C}\right) \), 법적 냉장 유통 온도 \( \left(10^{\circ} \mathrm{C}\right) \), 그리고 상온 \( \left(25^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 에 30 일간 보존하면서 샘플링을 한 후 연속희석 후 \( BCP 배지에서 황색 콜로니를 나타내는 젖산균 수를 측정하였다.</p>