기능 유전체 연구에 필요한 재료는 애기장대와 벼에서 성공을 거둔 전이인자 (trans-posable element)를 이용한 삽입돌연변이 집단의 대량 유기 방법을 배추에 적용하여 확보 하였으며, T-DNA가 배추 게놈 내에 삽입됨으로써 형질변화를 관찰하고 이러한 돌연변이체를 분석하여 관련 유전자를 동정 할 수 있다. 돌연변이 현상이 실제 T-DNA 삽입에 따른 유전자의 기능 억제 및 파괴에 의해 이루어졌음을 명확히 하기 위해서는 돌연변이 현상을 배제하고 유전자 수준에서의 변화인지를 분석하여야 하고, T-DNA 배추 게놈 내 삽입으로 인한 유전자 기능 파괴로 나타나는 형질변화의 역추적은 flanking DNA를 B. rapa BAC clone sequences database (www.brassica-rapa.org)와 비교하여 배추 염색체내에서 유전자좌를 표시하여 기능유전체학 연구의 중요한 초석이 된다.
<h2>기능유전체 연구 재료</h2><p>우장춘 박사의 U's triangle에 의해 밝혀졌듯이 B. rapa L. ssp. pekinensis 아종은 AA형 게놈을 가지며 유전체 크기 또한 약 \( 530 \mathrm{Mb} \)로 작아 기능유전체 연구에 있어 이점을 가진다. 이는 농촌진흥청 BioGreen 21 사업의 일환으로 Brassica rapa Genome Project (BrGP)의 재료로 이용되었으며 Multination Brassica Genome Project (MBGP)와 Brassica rapa Genome Sequencing Project (BrGSP)로 이어졌다. 또한 MBGP와 BrGSP의 유전체 연구 결과는 www.brassica-rapa.org를 통해 공개되어 있다.</p><h2>배추 돌연변이체 유기</h2><p>다양한 돌연변이체 유기 방법들이 존재하지만, 분석의 용이함을 위한 적은 수의 T-DNA가 삽입될 가능성이 높 은 Agrobacterium을 이용한 간접 형질전환방법이 배추를 비롯한 식물체 돌연변이 유기에 많이 이용되고 있다. 그러나 배추는 고추, 무와 함께 형질전환이 어려운 작물 중에 하나로써 그 성공률이 약 \( 2-3 \% \) 정도이다. 일반적으로 배추는 종자 파종 후 7일 정도 지난 어린 식물체에서 자엽을 이용한 형질전환 방법과 하배축을 이용한 형질전환 방법으로 구분되지만 재료의 종류만 다를 뿐 전체적인 방법은 비슷하다.</p><p>또한 애기장대와 벼에서 성공을 거둔 전이인자 (trans-posable element)를 이용한 삽입돌연변이 집단의 대량 유기 방법을 배추에 적용한다면 기능유전체 연구에 필요한 재료를 확보하는데 크게 기여할 수 있을 것이다. 이와 관련하여 배추에서 \( A c / D s \) 전이인자 시스템 (Activation/Dissociation transposon system) 적용에 대한 연구가 본 연구팀(www.pmglab.com)에 의해 진행되고 있다.</p><h2>배추 돌연변이체 표현형 분석</h2><p>T-DNA가 배추 게놈 내에 무작위로 삽입됨으로써 유전자의 일부 혹은 전부를 파괴하여 유전자가 가지고 있는 고유의 기능이 사라지게 되어 나타나는 형질변화를 관찰 하고 이러한 돌연변이체를 분석하여 관련 유전자를 동정 할 수 있다. T-DNA의 삽입이 확인된 \( \mathrm{T}_{0} \) 돌연변이체를 순화시키고 저온 처리는 최소 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \) 이하의 온도를 유지해 약 \( 45 \sim 50 \)일 정도로 처리한 뒤 배추의 자가불화합성을 고려하여 뇌수분 (bud pollination)을 이용해 교배하고 각각의 특성을 파악한다. \( \mathrm{T}_{0} \) 돌연변이체로부터의 돌연변이체 관찰은 주요 목표 형질 (웅성불임 등)을 목표로 그 특성에 맞추어 선발 되며 그 외의 형질들은 일반적으로 농촌진흥청 종자관리소에서 발행한 작물별 특성 조사 요령 (식물체 크기, 외엽의 크기 및 모양, 잎면의 요철 등 총 30가지 특성)에 맞추어 조사된다. 이러한 방법으로 조사된 \( \mathrm{T}_{0} \) 돌연변이체들은 고유의 형질이 다음 세대에 계속 전해지는 지를 확인하기 위해 최소 \( \mathrm{T}_{2} \) 세대까지 온실 및 노지에서 진전시켜 그 표현형을 관찰하게 된다. T-DNA의 삽입 위치가 정해져 있지 않음은 다양한 형태의 돌연변이체가 생산됨을 통해서도 확인할 수 있다. 육종학적 측면에서는 배추가 자가불화합성임에도 불구하고 자가화합 및 웅성불임 현상을 보이는 개체들, 작물 생육 측면에서 철, 망간 등의 결핍으로 엽록소가 감소하여 카로티노이드계 색이 나타나는 황백화 현상으로 생장이 억제된 개체, 다른 배추에 비해 추대시기가 빠른 개체 등이 관찰되었다. 그리고 작물 형태 측면에서는 외엽이 완전히 땅에 달라붙어 생장하는 로제트 (rosette)형 개체, 잎표면에 털이 없는 무모 개체, 결구외엽의 결각이 마치 무처럼 자라는 개체, 식물체의 본엽이 좁아지고 (세엽현상) 액아들이 많이 붙어 마치 판엽계 열무형태의 잎이 많은 개체, 화기의 크기가 크거나 작은 개체, 꽃잎이 주름진 개체 등 다양한 돌연변이체가 관찰되었다.</p><p>한편, 돌연변이 현상이 실제 T-DNA 삽입에 따른 유전자의 기능 억제 및 파괴에 의해 이루어졌음을 명확히 하기 위해서는 돌연변이체의 염색체 배수성 분석 (polyploidy analysis)을 통해 조직배양이나 형질전환과정에서 발생한 돌연변이 현상을 배제하고 유전자 수준에서의 변화인지를 분석하여야 한다.</p><h2>Flanking DNA 분석</h2><p>T-DNA 삽입으로 유전자의 기능을 파괴함으로써 그 기능을 역추적하기 위해서 우선 T-DNA 삽입 위치 즉, 기능이 피괴된 유전자가 무엇인지 알아야 한다. 표현형이 비형질전환체와 뚜렷한 차이를 보이며 Southern blot 분석 결과 적은 수의 T-DNA가 삽입되었고 염색체 수가 \( 2 \mathrm{n}=20 \) (Lagerctantz and Lydiate 1996)인 돌연 변이체가 분석에 용이하며 그 방법으로는 plasmid rescue, inverse PCR 및 tail-PCR 등이 있다. 염기서열 확인은 T-DNA 내의 sequencing primer들을 이용하고, 획득한 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information) database 의 BLASTN, BLSATX 분석과 배추 EST (Expressed Sequence Tags) data-base (www.brassica-rapa.org)와 상동성 비교를 통해 동정한다. 또한 flanking DNA는 B. rapa BAC clone sequences database (www.brassica-rapa.org)와 비교하여 배추 염색체내에서 유전자좌를 표시하고 이는 기능유전체학 연구에 중요한 초석이 될 수 있다.</p><p>실제로 3000개 이상의 삽입돌연변이체를 보유한 본 연구팀에서는 pCambia 1301 vector와 pBluescript Ⅱ KS (+) vector를 결합한 형태로, plasmid rescue와 inverse PCR이 모두 가능한 pRCV2 vector를 제작하여 배추 기능유전체 연구를 진행하고 있다. 확보된 flanking DNA는 B. napus, B. juncea, B. oleracea, Arabidopsis thaliana, Oryza sativa 등에서 다양한 유전자와 높은 상동성을 보였다.</p>