본 연구에서는 DGGE를 통해 미생물 군집다양성을 조사했다. 조사 결과 미생물 군집은 시간에 따라 변화하며, DGGE gel의 전자수용체에 따라서 서로 다른 미생물들의 다양성들을 관찰할 수 있었다. 더불어 군집분석 결과로 혼합균주를 구성하고 있는 균주들의 종을 파악할 수 있었다.
<h2>미생물 군집분석</h2><p>전국의 시료를 각각PCE와 TCE를 넣고 배양한 후, 탈염 소화율이 우수한 3개의 시료(광양, 하남, 여천)를 선발 하였으며, 4주간 집적배양한 배양액으로부터 전체 DNA를 획득하여 세균용 universal primer로 알려진 34fGC와 786r primer를 이용하여 PCR 증폭산물을 얻었으며, agarose gel 상에서 예상되는 486 bp의 밴드를 확인하였다. 미생물 군집다양성을 확인하는데 유용한 기법인 DGGE를 이용하여 미생물 군집의 다양성을 조사했다.</p><p>각 배양액의 DGGE profile에서 다양한 밴드들을 확인할 수 있었으며, 각 시료는 기질(PCE와 TCE)에 따라 다른 밴드 pattern을 나타내고 있다. 각 환경시료의 PCE 및 TCE의 집적배양 전과 집적배양 후의 DGGE profile은 매우 다르며, 집적배양 전 시료에 나타나는 밴드가 집적배양 후에는 대부분 보이지 않고, 새로운 밴드들이 나타남을 확인하였다. 이것은 오염물질에 따른 미생물 군집은 시간에 따라 변화됨을 의미한다.</p><p>Table 1과 같이 DGGE gel에서 다른 위치에 존재하는 56개의 밴드를 분리하였고, 분리된 밴드에서 DNA를 추출하여 염기서열을 분석하였으며, NCBI의 GeneBank를 이용하여 상동성을 비교 검색하였다. 각 군집의 주요 미생물은 DGGE gel에서 강한 intensity를 나타내는 밴드로 9번 밴드는 Tissierella praeacuta (X80833)로 분석되었다. 20번과 31번 밴드는 Sedimentbacter sp. (AY221992, AY766467)로 Y-TCE시료와 H-TCE 시료에서 공통적으로 나타났다. 30, 33번 밴드는 uncultured bacteria로 분석되었으며, 36, 46번, 55번 밴드는 Clostridium-like bacteria(U27711, CR933216)로 분석되었다.</p><p>G-TCE 시료 농화배양의 주요 미생물은 9번 밴드(Tissier-ella praeacuta, X80833)와, 19번 밴드(Clostridium sp. EBR, AB 186360)이다. 그러나 이 밴드들은 G-PCE 시료 농화배양에는 나타나지 않았다. G-PCE 시료 농화배양의 주요 미생물은 1번 밴드(Unidentified eubacterium, AJ229210)와 3번 밴드(Unidentified eubacterium, AJ229206)로 나타났다. H-PCE시료 농화배양와 H-PCE 시료 농화배양도 다른 pattern을 보이고 있다. H-TCE 시료 농화배양의 31번(Sedi-mentibacter sp., AY766467), 36번(Clostridium-like species, U27710), 37번(Desulfotomaculum ruminis, Y11572)이 주요 미생물이며, 이 밴드는 H-TCE 시료 농화배양에만 나타났다. 한편 Y-TCE 시료 농화배양와 Y-PCE 시료 농화배양는 38번(Clostridium hastiforme, X77848), 44번(Uncultured Clostridiaceae bacterium, AB218338), 45번(Desulfosporo-sinus youngii, DQ117470), 46번(Clostridium-like sp., U27711), 47번(Desulfotomaculum carboxydivorans, AY961415) 밴드가 같은 위치에서 관찰되었다. 그러나 주요미생물은 Y-TCE에서는 38번(Clostridium hastiforme, X77848), 49번(Un-cultured bacterium, CT574058)이고, Y-PCE 의 주요 미생물은 44, 45, 46, 47번으로 다르게 나타났다.</p><p>DGGE 분석결과, 탈염소화와 관련된 미생물들로는 황산염 환원 세균(sulphate-reducing bacteria, SRB)와 아세테이트 산화세균(acetate-oxidizing bacteria, AOB)가 우점하는것으로 분석되었다. SRB로 분석되어진 29, 37번 밴드는 각각 Desulfotomaculum nigrificans(AB026550)와 \( 100 \% \), Desul-fotomaculum sp. (Y11572)와 \( 94 \% \) 유사하였다. 밴드 37, 45, 47, 28, 29번 밴드는 각각 Desulfotomaculum sp. (Y11572)와 \( 100 \% \). Desulfosporosinus youngii (DQ117470)와 \( 99 \% \), Desulfotomaculum carboxydivorans (AY961415)와 \( 96 \% \), D. aeronauticum (X98407)와 \( 97 \% \), Desulfotomaculum nigrificans (AY742958)와 \( 94 \% \) 유사한 것으로 확인되었다. SRB균주는 탈염소화 효율을 증대시키는 것으로 알려져 있으며, 과거 PCE나 TCE에 오염된 지역의 토양에서 종종 발견되었으며, 탈염소화 미생물의 co-culture로서 인식되고 있다. 최근 몇몇 세균들은 염소계 알칸(chlorinated alkanes)의 탈염소화 과정을 통해 성장에 필요한 에너지를 얻는다고 알려져 있다.</p><p>아세테이트는 혐기성 조건에서 메탄을 생성하는 선구물질로 알려져 있으며, AOB에 의하여 \( \mathrm{H}_{2} \)와 \( \mathrm{CO}_{2} \)로 전환된다.\( \mathrm{H}_{2} \)는 PCE 및 TCE의 염소를 제거하는데 이용되며, 혐기성 배양에서 중요한 역할을 한다. Clostridium sp.는 AOB에 속하며, 혐기성 배양조건에서 아세테이트를 메탄, \( \mathrm{H}_{2}, \mathrm{CO}_{2} \)를 생성한다고 보고되어지고 있다. 농화배양된 시료의 군집분석을 통하여 Clostridium sp. (6, 19, 35, 36, 38, 40, 46, 53, 55번 밴드)이 모든 시료에 존재하는 것을 확인하였다.</p><p>DGGE gel에서 전자 수용체에 따라, 다른 미생물 다양성과 community profiles을 나타냄을 확인하였다. 또한, 농화 배양 시료 미생물의 DGGE를 통한 군집분석에서 혼합균주를 구성하고 있는 균주들은 대부분 uncultured 미생물, Clostridium sp.와 SRB등으로 조사되었다.</p>