모든 동물 실험은 대한민국 전북대학교 동물윤리위원회의 승인을 받았서 공시재료는 일반농장과 동물복지농장 도계장에서 처리 후 생산되는 식육의 가슴육 부위를 채취한 후, 곧바로 액체질소에 냉동하고 잘게 분쇄하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>공시동물, 샘플수집</h2> <p>모든 동물 실험은 대한민국 전북대학교 동물윤리위원회(CBNU2018-097)의 승인을 받았다. 본 연구에 이용된 공시재료는 일반농장과 동물복지농장의 28일령 육계(cobb)이다. 육계의 feather \( (\mathrm{n}=27) \)는 도계 전의 28일령 육계의 닭의 날개(vane)와 목(pulp)에서 채취하였다. Serum \( (\mathrm{n}=20) \)은 날개정맥에서 혈액을 채취한 후, 원심분리(\(3,000 \times \mathrm{g} \), \( 15 ~ \mathrm{min} \), \( 4^{\circ} \mathrm{C} \))하여 serum을 분리하였다. Muscle tissue \( (\mathrm{n}=10) \)는 도계장에서 처리 후 생산되는 식육의 가슴육 부위를 채취한 후, 곧바로 액체질소에 냉동하고 잘게 분쇄하였다. 모든 sample은 분석 전까지 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하였다.</p> <h2>Serum corticosterone 분석</h2> <p>Serum CORT 분석은 Corticosterone ELISA kit (Enzo, New York, USA)를 사용하였다. Serum에 Steroid Displacement Reagent (SDR) solution을 넣고 vortexing 한 뒤 \( 5 \mathrm{~min} \) 동안 그대로 두었다. 그 후, ELISA assay buffer를 추가하여 sample을 준비하였다. 준비된 sample은 제조업체의 방법에 따라 분석을 진행하여 CORT 농도를 측정하였다.</p> <h2>Feather corticosterone 분석</h2> <p>Feather corticosterone은 메탄올 기반 추출 기술을 사용하여 추출하였다. Feather의 vane을 수집하고 Bead beating homogenizer (Benchmark Scientific, Sayreville, USA)로 균질화 후 HPLC 등급의 메탄올을 첨가하였다. Sample을 sonication water bath에서 \( 30 \mathrm{~min} \) 동안 처리 후 shaking water bath에서 overnight하였다. 그 다음 메탄올을 여과지를 이용하여 feather sample과 분리했으며, \( 3 ~ \mathrm{ml} \) 메탄올을 추가하여 feather 잔여물 및 원래 sample tube를 세척하였다. 메탄올 추출물을 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) water bath에서 증발시켰고, 잔여 pellet은 Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)로 용출하였다. 추출된 sample을 Corticosterone ELISA kit (Enzo, New York, USA)를 사용하여 제조업체 지침에 따라 feather sample의 corticosterone 농도를 측정하였다.</p> <h2>단백질 추출 및 Western blotting</h2> <p>Feather (pulp)과 muscle 내 단백질은 분쇄된 sample에 protease inhibitor가 포함된 Radio immune precipitation assay buffer (Biosesang, Sungnam, Korea)를 넣고 균질화 한 후 원심분리 (\(12,000 ~ \mathrm{rpm} \), \( 15 \mathrm{~min} \), \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)) 하였다. 원심분리하여 얻은 상등액을 DC kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 단백질 농도를 결정하였다. 단백질 정량 후 샘플은 \( 12 \% \) acrylamide gel에서 전기영동하였고, 분리된 단백질은 PVDF (polyvinylidene fluoride) membrane으로 옮겼다. Membrane을 Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST) (\( 20 ~ \mathrm{mM} \) Tris, \( 137 ~ \mathrm{mM} \) \( \mathrm{NaCl} \), \( 5 ~ \mathrm{mM} \) \( \mathrm{KCl} \), \( 0.05 \% \) Tween 20)에 \( 5 \% \)로 희석한 skim milk로 실온에서 \( 90 \mathrm{~min} \) 동안 blocking 한 뒤, 1차 항체를 \( 5 \% \) skim milk에 희석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 overnight 하였다. 1차 항체의 종류와 희석배율은 다음과 같다: HSP70 (\( 1 : 2,500 \), ADI-SPA-820, Enzo, San Diego, CA, USA), Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (\( 1 : 2,500 \), sc-47724, Santa Cruz, CA, USA). TBST로 membrane을 washing한 후, 2차 항체(goat antimouse IgG, Enzo, San Diego, CA, USA)를 \( 5 \% \) skim milk에 \( 1 : 5,000 \)으로 희석하여 실온에서 \( 1.5 ~ \mathrm{hr} \) 반응시킨 후, TBST로 washing 하였다. 마지막으로 membrane을 ECL kit (SuperSignal WestPico Plus, Thermo Fisher, USA)에 반응시키고 iBright CL100 Imaging System (Thermo Fisher Scientific, USA)을 사용하여 단백질 발현 수준을 시각화 하였다. 단백질 발현은 GAPDH로 표준화하였다.</p> <h2>근육 내 glycogen 및 L-lactate 분석</h2> <p>근육 내 glycogen 및 L-lactate는 각각 Glycogen Assay kit (ab65620, Abcam)과 L-lactate Assay kit (ab65330, Abcam)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 분석하였다.</p> <h2>통계 분석</h2> <p>통계 분석은 SAS 9.4 software (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 수행되었다. 일반농장과 동물복지농장 간 비교는 Student's t-test를 통해 유의성 검정을 하였다. 모든 결과 값은 평균과 표준오차(Mean \( \pm \) SE)로 나타내었으며, 유의 수준은 \( p<0.01 \)에서 분석하였다.</p>