토양에서 성장한 식물을 분석해 토양 내의 균 community를 분석했다. 특히, 질소고정 능력을 가진 균을 찾기 위해, 질소원이 없는 배지에서 시리얼 희석된 토양 시료를 배양하였다. 이 과정을 통해 ARA를 사용하여 아세틸렌을 에틸렌으로 환원시키는 8개의 균주를 확인했다.
<p>식물의 성장을 확인한 토양을 사용하여 토양 내 균 community를 분석했다. 토양내 미생물의 DNA는 PowerSoil \( { } ^ {\circledR } \) DNA Isolation Kit (카탈로그 번호 12888, MO BIO)을 이용하여 제조업체의 안내서에 따라 추출했다. 각 sequencing sample은 Illumina 16S Metagenomic Sequencing Library 프로토콜에 따라 준비했다. DNA의 정량과 농도는 PicoGreen과 Nanodrop을 이용해 측정했다. 16S rRNA 유전자는 16S V3-V4 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 프라이머 서열은 다음과 같다; 16S V3-V4 프라이머(Forward Primer, 5' TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG, Reverse Primer 5' GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C). Input \( \mathrm { gDNA } ~(12.5 \mathrm { ~ng } ) \)는 16S V3-V4 primer로 증폭되고 이후의 limit-cycle 증폭 단계는 multiplex sequencing adapters를 이용해 PicoGreen을 사용하여 표준화되고 풀링되며, 라이브러리의 크기는 LabChip GX HT DNA High Sensitivity kit (PerkinElmer, Massachusetts, USA)를 사용하여 검증했다. 그 후 MiSeq \( ^ {\mathrm { TM } } \) 플랫폼 (Illumina, San Diego, USA)을 사용하여 seqeuncing 했다.<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Isolation of nitrogen fixation bacteria</h2> <p>질소고정 능력을 가진 균을 분리하기 위해 serial dilution된 토양 시료를 질소원이 없는 배지에서 배양했다. 그 배지에서 높은 성장을 보인 58개의 후보 균주를 분리했다. 순수 분리된 균주들은 대부분 점액질로 이루어진 colony를 형성했다. 따라서 이후의 정량적 실험을 위해 각 균주는 nutrient medial은 KEMB에 기탁했다. KEMB에서 분양받은 질소고정 후보균주는 nutrient media에서 배양시켰다.</p> <h2>Acetylene Reduction Assay (ARA)</h2> <p>ARA를 통해 acetylene을 ethylene으로 환원시킨 8개의 균주(토양에서 분리된 균주 7, KEMB를 통해 분양받은 균주 1)를 확인했다(Fig. 1). 토양에서 분리한 균주 중 acetylene을 대부분 ethylene으로 환원시킨 strain MK7과 Y4, Y8에 대하여 재현성 실험을 실시했다. 재현성 실험에서 strain MK7 과 Y8에서 지속적인 nitrogenase 활성을 확인했다 (Table 1). 따라서 질소고정 균주로 strain MK7과 Y8을 선별하여 이후 실험을 실시했다. Strain MK7은 gas chromatography를 이용한 검출에서 초기의 기상층의 acetylene 농도는 \( 9.3 \% \)였지만, 5 일차에는 acetylene은 검출되지 않았고, ethylene은 \( 3.9 \% \)로 검출되었다. Strain Y8은 초기의 기상부의 \( 10.6 \% \)에서 \( 1.7 \% \)로 감소하였으며, ethylene은 \( 3.8 \% \)로 검출되었다. Acetylene이 약 \( 9 \% \) 감소한 것에 비해 ethylene 생성은 약 \( 3.8 \% \)로 낮게 검출되었다. 이는 닫힌계에서 균의 작용에 의해 용기 내부의 압력이 증가한 결과로 보인다. 하지만 acetylene은 검출되지 않았으므로 내부의 acetylene을 약 \( 100 \% \) 환원시킨 것으로 볼 수 있다.</p>