딸기를 공시품종으로 사용해 BA의 농도에 따라 기내 유식물체를 얻은 후 SSR마커를 이용해 유전적 변이 검정을 실시하였다. 변성시킨 PCR 산물을 토대로 변이 연속성 검정을 실시하였다. 공시 품종 및 BA 처리는 포복경의 선단으로부터 적출한 배지를 사용하고 이를 6주간 배양해서 유식물체를 얻는다. 또한 3회 계대배양한 조직를 조직배양묘에서 생산하는데 이때 농도는 0.0, 0.5, 1.0, 2.0 mg으로 각각의 배지를 무기염에 넣어 고압멸균기에서 멸균하여 사용한다. 온실 순화 및 변이 검정에서 딸기전용상토를 충진한 뒤에 상대습도를 80%유지한 뒤에 1일 4~5일 관수재배한다. 이 때 PCR반응물은 DNA의 역뱡향 프라이머를 사용하고 증폭조건은 일정한 온도에서 변성시킨 유전체를 수회초 반복한다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>공시 품종 및 BA 처리</h2> <p>본 연구는 사계성(ever-bearing) 딸기 '고하'를 공시품종으로 사용하였다. '고하'의 포복경의 선단으로부터 생장점을 적출하여 배지(\(1/3\)MS 무기염, \( 30 \mathrm{~g} \cdot \mathrm{L}^{-1} \) sucrose, \( 8 \mathrm{~g} \cdot \mathrm{L}^{-1} \) plant agar, \( \mathrm{pH} 5.6 \sim 5.8\))에 치상하여 6 주간 배양하여 기내 유식물체를 얻었다. 기내 유식물체의 뿌리와 잎을 제거한 후 BA가 첨가된 배지에 치상하여 6주간 배양 후, 기본 배지(MS 무기염 (Murashige and Skoog 1962), \( 30 \mathrm{~g} \cdot \mathrm{L}^{-1} \) sucrose, \( 8 \mathrm{~g} \cdot \mathrm{L}^{-1} \) plant agar, \( \mathrm{pH} 5.6 \sim 5.8\)에 4주 간격으로 3회 계대배양하여 하나의 온전한 조직배양묘(whole plant)를 생산하였다.</p> <p>본 실험에서 사용한 BA의 농도는 0.0, 0.5, 1.0, 2.0 \(\mathrm{mg} \cdot \mathrm{L}^{-1} \) 로 4수준으로 처리하였으며, 각 처리 별로 indole-3-butyric acid (IBA)를 \( 0.1 \mathrm{mg} \cdot \mathrm{L}^{-1} \)의 농도로 혼합 처리하였다. BA처리 배지는 MS 무기염에 \( 30 \mathrm{~g} \cdot \mathrm{L}^{-1} \)의 sucrose를 넣어 완전히 녹인 후 BA를 농도 별로 첨가하였으며, 배지 \( \mathrm{pH} \)를 \( 5.6 \sim 5.8\)로 조정한 후 \( 8 \mathrm{~g} \cdot \mathrm{L}^{-1} \)의 plant agar를 넣어 만들었다. 본 실험에 사용한 모든 배지는 \( 121^{\circ} \mathrm{C}\), 1.5기압의 고압멸균기에서 15분간 멸균하여 사용하였다.</p> <h2>온실 순화 및 변이 검정</h2> <p>BA의 농도 별 처리 후 증식된 유식물체는 온실에서 딸기전용상토 '푸르미'(서울바이오(주))를 충진한 흑색비닐포트(3치, 접은 윗 지름 \( 13 \mathrm{~cm} \times \) 높이 \( 6.8 \mathrm{~cm} \times \) 펼친 윗 직경 \( 9 \mathrm{~cm}) \)에 순화하였다. 순화 후 일주일동안 \( 50 \% \) 차광막으로 차광하고, 상대습도를 \( 80 \% \) 이상으로 유지한 후 서서히 제거하고, 6주간 육묘 후 본포에 정식하였다. 본포에 정식 후 딸기전용양액인 PBG액(Proefstation voor Bloemisterij en Glasgroente, Netherlands) (Sonneveld and Straver 1994)을 전기전도도(EC, electrical conductivity) \( 0.8 \mathrm{dS} \cdot \mathrm{m}^{-1} \)로 맞추어 1일 \( 4 \sim 5 \) 회 관수하며 재배하였다.</p> <p>BA 처리묘는 전 재배기간동안 형태적, 유전적 변이 검정을 실시하였으며, 형태적 변이 검정은 화방 출뢰성(불연속 출뢰 또는 불출뢰), 비정상 과일 출현, 초세 등을 기준으로 선발하였고, 선발된 변이체를 simple sequence repeat (SSR) 마커를 이용하여 유전적 변이 검정을 실시하였다.</p> <p>유전적 변이 검정을 위한 genomic DNA는 형태적 변이체의 어린 잎을 채취하여 NucleoSpin\( { }^{\circledR} \)Plant Ⅱ Kit (Macherey-Nagel, Germany)를 사용하여 추출하였다. 추출한 DNA는 분광 광도계(DS-11+ Spectrophotometer, DeNovix, USA)로 DNA양을 측정하여 \( 10 \mathrm{ng} \cdot \mu \mathrm{L}^{-1} \)로 정량한 후 분석에 이용하였다. 유전적 변이 검정에 이용한 SSR 마커는 Table 1과 같으며, 4개의 마커 정보를 수집하여 정방향에 5-FAM (Bioneer, Korea)으로 형광 표지한 프라이머를 제작하여 사용하였다.</p> <p>PCR 반응물은 \( 20 \mathrm{ng} \)의 genomic DNA, \( 10 \mu \mathrm{L} \)의 2 XTOPsimple\(^{\mathrm{TM}} \) PreMix-nTaq (Enzynomics, Korea), 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 \( 1 \mu \mathrm{L}\) \(\left(10 \mathrm{pM} \cdot \mu \mathrm{L}^{-1}\right) \)씩 넣고 증류수를 첨가하여 전체 부피를 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 로 조절하였다. PCR (Veriti \( { }^{\mathrm{TM}} \) 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, USA) 증폭 조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분동안 변성시킨 후, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초(반복 당 \( 1^{\circ} \mathrm{C} \)씩 감소), \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초간 25회 반복한 후, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초간 30회 반복한 후 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 처리하였다.</p> <p>PCR이 완료된 후 \( 5 \mu \mathrm{L} \) 의 증폭산물을 \( 1.5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) agarose gel에서 전기영동하여 증폭 여부를 확인한 후 PCR 증폭 산물 \( 0.5 \mu \mathrm{L}\left(50 \mathrm{ng} \cdot \mu \mathrm{L}^{-1}\right. \) ), GeneScan 500 LIZ dye Size Standard (Applied biosystems, USA) \( 0.5 \mu \mathrm{L} \)와 Hi-Di Formamide (Applied biosystems, USA) \( 9 \mu \mathrm{L} \)를 혼합하여 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 변성시킨 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분간 안정화 시켰다. 변성시킨 PCR 산물은 자동염기서열분석기(DNA Analyzer 3730xl, Applied Biosystems, USA)를 활용하여 전기영동한 다음 Gene Mapper 프로그램(Applied Biosystems, USA)을 사용하여 마커 별로 분석하여 유전적 변이 검정을 실시하였다.</p> <h2>변이 연속성 검정</h2> <p>변이 연속성 검정은 총 3년에 걸쳐 실시하였으며, 재배 1년차에 BA 처리묘에서 형태적, 유전적 변이체를 선발한 후, 선발된 개체를 관행육묘법을 통해 자묘를 증식하여 삽목육묘 한 후, 당해년도 11월 중순에 저장고에서 휴면타파 후 차년도 4월에 정식하며 후대에 변이가 연속되어 나타나는지에 대해 유전적 변이 검정을 실시하였다. 모든 형태적, 유전적 변이 검정은 위에 기술한 바와 동일하게 진행하였다.</p>