본 실험에는 경상남도와 경상북도 지역에서 채취한 도꼬마리를 사용했고 경북농업기술원으로부터 분양받은 Phytophthora capsici(고추 역병균), Sclerotinia sclerotiorum (수박 균핵병균), Fusarium sp. (콩 시들음병균), Phythium sp. (강낭콩 마름병), Botryosphaeria clothidea (배 겹무늬병균), Fusarium oxysporium(고구마 밑썩음병균), Cercospora sp. (고추 갈색점무늬병균), Colletotrichum liliacearum (액운동탄저병균), Glomerella cingulata (포도 탄저병 및 부패병균), Aspergillus niger (사과 부패 병균)와 Glomerella sp. (고추 탄저병균)을 식물 병원성 진균으로써 사용했다. 식물 병원성 진균에 대한 항 진균활성은 agar diffusion법을 통해 측정했고 Lyu의 방법으로 항진균 활성의 정도를 측정했다. 그리고 Thin-layer chromatography를 통해 항 진균물질을 분리했다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>시료의 조제</h2><p>본 실험에 사용한 도꼬마리 (Xanthium strumarium L)는 경상남도와 경상북도 지역에서 자생하는 식물을 채취하여 음건하여 사용했다. 도꼬마리의 추출물의 조제는 \( 1 \mathrm{~kg} \)의 잎과 열매를 조분쇄하여 \( 10 \mathrm{~L} \)의 물에 넣어 끓여 필요한 량으로 농축하면서 열수 추출을 3회 반복했다. 열수 추출물을 evaporator(EYELA Co. Japan)로 농축한 추출물을 유기용매인 ether와 ethyl acetate로 각각 분별 추출했다.</p><h3>시험병원성 진균 및 사용배지</h3><p>본 실험에 사용한 식물 병원성 진균은 Phytophthora capsici(고추 역병균), Sclerotinia sclerotiorum (수박 균핵병균), Fusarium sp. (콩 시들음병균), Phythium sp. (강낭콩 마름병), Botryosphaeria clothidea (배 겹무늬병균), Fusarium oxysporium(고구마 밑썩음병균), Cercospora sp. (고추 갈색점무늬병균), Colletotrichum liliacearum (액운동탄저병균), Glomerella cingulata (포도 탄저병 및 부패병균), Aspergillus niger (사과 부패 병균)와 Glomerella sp. (고추 탄저병균)을 경북농업기술원으로부터 분양 받아 사용했다.</p><p>시험균주의 생육배지는 potato dextrose (PD) 배지 (\(20\%\) infusion from potato, \( 2 \% \) Bacto dextrose, \( \mathrm{pH}=5.6 \pm 0.2 \), Difco. Co., USA)와 potato dextrose agar (PDA) 배지 (\(20\%\) infusion from potato, \( 2 \% \) Bacto dextrose, \( 1.5 \% \) Bacto agar, \( \mathrm{pH}=5.6 \pm 0.2 \), Difco. Co., USA)를 구입하여 사용했다.</p><h3>항진균 활성 측정</h3><p>식물병원성 진균에 대한 ether와 ethyl acetate 추출물의 항 진균활성은 agar diffusion법으로 측정했다. 즉, petri dish에 배양된 시험균주를 \( 0.5 \mathrm{~mm} \)의 4각형으로 배지와 함께 취하여 PDA 평판배지위에 disc 접종하여 24시간 배양한 후, 시험균주의 주위에 도꼬마리의 ether와 ethyl acetate 추출물을 각각 \( 300 \mu \mathrm{g} / 20 \mu \mathrm{l} \)가 첨가된 건조한 paper disc \( (\Phi ; 6 \mathrm{~mm} \), Whatman Co.)를 각 시험균주 위에 올려놓고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 정치 배양했다. 항 진균활성의 측정은 paper disc주위의 clear zone의 생성 유무와 inhibitory zone (clear zone)의 크기\( (\mathrm{mm}) \)를 측정하여 항 진균활성으로 나타냈다.</p><h1>\( \mathrm{IC}_{50} \) 측정</h1><p>항진균 활성의 정도는 \( \mathrm{IC}_{50} \) (Inhibitory concentration values, i.e. drug concentration required to inhibit viability by \( 50 \% \) )으로 나타냈으며, 그 측정법은 Lyu의 방법에 준했다. 즉, \( \mathrm{IC}_{50} \)은 S. sclerotiorum의 생육을 \( 50 \% \) 저해시키는 도꼬마리의 ether 추출물의 농도로 표시된다. PDA 배지에서 충분히 배양된 S. sclerotiorum의 \( 0.5 \mathrm{~mm} \)의 4각형으로 배지와 함께 취하여 PD 액체배지 \( 100 \mathrm{ml} \) 와 ethyl acetate에 무균적으로 접종하고, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5일간 진탕 배양시켰다. 액체배지에서 배양된 진균을 원심분리로 취하여 \( 105^{\circ} \mathrm{C} \)에서 항량이 될 때 까지 건조시켜 중량 \( (\mathrm{mg}) \)을 측정했다.</p><p>PD 액체배지에 도조마리의 ether 추출물의 농도를 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), \(200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), \(300 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), \(400 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\) \(500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\) \(800 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)로 첨가하여 시험균주의 생육을 측정했다.</p><h2>TLC에 의한 항진균 물질 분리</h2><p>항 진균물질의 분리는 Thin-layer chromatography (TLC)를 이용하여 분리했다. 즉, TLC (Silica gel \( 60 \mathrm{~F}_{254} \), Merck) plate상에 ethyl acetate 추출물 \( (50 \mu \mathrm{l} / \mu \mathrm{g})\) \(1 \mu \mathrm{l} \)를 spot하여 실온에서 상승법으로 전개하여 건조한 후, \( 254 \mathrm{~nm} \)의 자외선 파장에서 조사하여 분석하였다. 전개용매로 methylene chloride와 methanol을 각각 \( 94: 6 \)으로 혼합하여 사용하였다.</p>