대장암 세포주의 생존에 미치는 영향을 파악하지 위해 cell viability assay를 수행하며 chromatin condensation 여부 확인을 위해 Hoechst 33342을 사용해 조사한다. total RNA를 통해 역전사 반응을 이끌어 냈는데 만들어진 probe는 정제 후 하나의 tube에 모은 후 16시간 동안 hybridization한다. 이 후 원심 분리를 통해 DNA microarray를 건조 시킨다.
<h2>Cell viability assay(MTT assay)</h2> <p>Allicin의 처리에 따른 대장암 세포주의 생존에 미치는 영향을 확인하기 위하여, cell viability assay를 수행하였다. 즉, 96 well plate에 well당 \( 3 \times 10 ^ { 3 } \)개의 HCT116 세포를 분주한 다음, allicin을 다양한 시간 동안 처리하였다. 즉, allicin의 최종 처리농도가 \( 25 \mu \mathrm { M } , 50 \mu \mathrm { M } , 100 \mu \mathrm { M } \) 가 되도록 처리하 고, 대조군으로는 \( \mathrm { DMSO } (0.1 \%) \) 를 \( 3,6,12 \), 그리고 24 시간 동안 처리하였다. 처리 후 각 well의 media를 제거하고 MTT(3-[4.5-Dimethylthiazol-2-yl]-2.5 diphenyltetrazolium bromide) 용액(Sigma, USA) \( 5 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) 을 각 well당 \( 10 \mu \mathrm { L } \) 씩 넣고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에서 4 시간 동안 반응 시킨 다음, 상층액을 제거 후 DMSO \( 15 \mu \mathrm { L } \) 씩 주입하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 방치한 뒤, NanoQuant Plate \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) (Tecan Trading AG,Switzerland)를 이용하여 580 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 결과 수치는 4개의 독립적인 well에서 수행한 값을 mean \( \pm \)SD 값으로 나타내었다.</p> <h2>Hoechst 33342 염색</h2> <p>Apoptosis 의 형태학적 특징 중 chromatin condensation여부를 확인하기 위하여 Hoechst 33342염색으로 조사하였다. allicin \( 100 \mu \mathrm { M } \) 을 24시간 처리한 후, \( 3.7 \% \) formalde-hyde로 30분간 고정하였다. 고정된 세포에 Hoechst 33342로 세포의 핵을 염색한 후 형광 현미경으로 chromatin cond-ensation의 여부를 조사하였다.</p> <h2>Total RNA 추출</h2> <p>Total RNA의 분리는 Qiagen RNeasy mini kit(Qiagen,USA)를 이용하여 제조사의 manual에 따라 수행하였다. 정제한 total RNA는 정량한 후, oligo DNA microarray 실험, RT-PCR 등에 사용되었다.</p> <h2>Oligo DNA Microarray 실험</h2> <p>DNA microarray는 Genomictree사에 위탁하여 수행하였으며, 미국 Microarrays사의 48.5 K Human Array-IlluminaHEEBO oligo microarray를 사용하였다. 세포주로부터 분리한 total RNA를 주형으로 하여, 역전사 반응을 수행하였다. 역전사 과정 동안 대조군 세포(DMSO 처리)에서 분리한 total RNA는 Cy3-dUTP를 이용하고, 실험군 세포(allicin 처리)에서 분리한 total RNA는 Cy5-dUTP를 이용하여 각각 labeling하였다. 만들어진 probe는 QIAquick PCR purifica-tion kit(Qiagen, USA)를 이용하여 정제 하고 난 후, 하나의 tube에 모은 다음 Microcon 30(Millipore, USA)을 이용하여 농축하였다. 최종 만들어진 probe를 pre-hybridization을 마친 DNA microarray에 적용한 다음, \( 65 ^ {\circ } \)C water bath에서 16시간 hybridization하였다. 일련의 세척과정 후, 원심분리를 하여 DNA microarray를 건조시켰다. 반응을 마친 DNAmicroarray는 Axon사의 Genepix4000B scanner(USA)를 이용하여 scan한 다음, 미국 Agilent사의 Gene Spring 7.3 프로그램을 이용하여 분석하였다. Normalization 방법은 intensity indepedent(LOWESS) normalization을 사용하였고, 유전자의 filtering은 median의 값의 합이 1,000 이상이 되는 유전자 중 2배 이상 up-regulation 되거나 down-regulation되는 유전자를 중심으로 실시하였다.</p>