\( \mathrm { CapR } \) 단백질의 발현과 순수분리를 위해 \( \mathrm { pET } 21 \mathrm { a } ( + ) \) 벡터를 활용하여 유전자를 삽입하고 IPTG로 발현을 유도하였다. SPR-based DNA 칩을 이용하여 \( \mathrm { CapR } \) 단백질과 촉진유전자들과의 반응을 연구하였다. biotin이 부착된 DNA oligomer로 \( \mathrm { PCR } \) 에서 합성한 \( \mathrm { PO } _ { 0 } \) 촉진유전자를 정제하여 streptoavidin이 연결된 칩에 결합시킬 수 있었고, 촉진유전자들과의 반응을 확인하였으며, 본 실험에서 분리정제된 \( \mathrm { CapR } \) 단백질이 가능성 있는 구조를 가지고 있음을 나타낸다.
<h2>결과 및 고찰</h2> <h3>조절 단백질 \( \mathrm { CapR } \) 의 발현과 순수분리</h3> <p>CapR 단백질과 촉진유전자와의 상호작용을 SPR-basedDNA 칩을 이용하여 연구하기 위해서는 정제된 CapR 단백질이 필요하다. 이를 위해 본 연구에서는 단백질 발현벡타인 \( \mathrm { pET } 21 \mathrm { a } ( + ) \) 를 활용하였다 (Fig. 1). \( \mathrm { T7 } \) 촉진유전자하에 CapR이 발현될 수 있도록 capR 유전자 \( (1,692 \mathrm { bp } ) \) 를 삽입하여 \( \mathrm { pET } 21 \mathrm { a } ( + ) \mathrm { CapR } \) 을 만늘었다. 이 끌라스미드가 형질전환된 세포를 IPTG로 처리하여 발현을 유도하였다 (Fig.2). \( \mathrm { IPTG } ^ { 2 } \) 을 넣어 밝현시켰을 때는 넣지 않았을 때에 비해약 \( 60 \mathrm { kDa } \) 에 해당하는 위치에 수용성단백질이 증가한 것을 보여준다. CapR 단백질은 563 개의 아미노산으로 구성 되어 있음으로 이 단백질이 발현된 것으로 판단된다. pET21a( + ) 벡터에서 발현된 단백질은 \( N \) 말단부위에 T7 Tag을 가지고 있도록 되어 있음으로 T7. Tag 훕착찰럽을 이용하여 CapR 단백질을 순수 분리하였다 (Fig. 2). SDS-PAGE상에서 CapR 단백질은 높은 순수로 분리 정제되었음을 보여준다.</p> <h3>\( \mathrm { SPR } \) 근거 DNA 칩을 이용한 CapR 단백질과 촉진유전자들과의 반응</h3> <p>SPR-based DNA 칩을 이용하여 CapR 단백질과 촉진유전자가 서로 어떻게 작용하는지를 Biacore 3000 을 이용하 여 실헙하였다. CapR 단백질에 대한 고유의 \( \mathrm { Po } _ { 0 } \) 촉진유전자를 biotin이 부착된 DNA oligomer로 \( \mathrm { PCR } \) 에서 합성한후 정제하였다. 따라서, 함성된 \( \mathrm { PO } _ { 0 } \) 촉진유전자는 한쪽 끝에biotin를 가지고 있게 되어 streptoavidin이 연결된 칩에 결합시킬 수 있었다.</p> <p>\( \mathrm { NtrC } \) 계에 속하는 활성인자들은 리간드와 결합하여 촉진유전자에 결합하는 것으로 알려져 있다. CapR 단백질도 페놀이 있는 조건하에서 기능을 수행할 수 있는 것으로 보고된 바 있다. 따라서, 페놀의 존재여부가 미치는 영향도 함께 조사하였다. Negative control로 진핵 세포의 촉진 유전자인 \( P_ { C M v } \) 를 사용하였다. 계놀 유무에 관계없이 예상대 도 CapR 단백질은 \( \mathrm { Pcmv } \) 칩에 결합하지 않는 경향으로 나타났다 (Fig. 3). 다음으로 positive control로 salicylate에 의해 반응하는 \( \mathrm { NahR } \) 단백질의 조절 유전자인 \( \mathrm { P } _ { s a l } \) 촉진유전자를 이용한 DNA 칩을 사용하였다. Psal의 경우 촉진유전자의 특성상 조절 단백질만으로도 슁게 반응하는 경향을 가지뗘, 다른 조절 단백질과도 cross-activation도 한다고 알려져 있다. Psal 촉진유전자의 경우는 페놀존재유무에 상관없이 CapR 조절단백질과 반응함을 보여주었다 (Fig. 4). 이는 본 실험에서 분리정제된 \( \mathrm { CapR } \) 단백질이 가능성 있는 구조를 가지고 있음을 나타낸다.</p>