본 연구는 hepatoma 세포를 4단계 cell passage로 구분하고, 항산화 효소 \( \mathrm { Cu } / \mathrm { Zn } \) SOD mRNA level을 규명하고자 하였다. \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)를 인위적으로 처리하여 각 단계의 passage에서 얼마만큼의 산화제를 수용하고 조절할 수 있는지를 규명하고자 하였다.
<p>본 연구에서는 간암 세포인 hepatoma를 배양하여 어린 세포와 노화된 세포를 4단계의 cell passage로 구분하였고, 항산화 효소인 \( \mathrm { Cu } / \mathrm { Zn } \) SOD를 mRNA level에서 규명하고자 하였다. 또한 세포에 강력한 독성을 지니는 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)를 처리 농도와 시간을 달리하여 hepatoma에 인위적으로 처리함으로써 각각 다른 단계의 passage에서 얼마만큼의 산화제를 수용하고 조절할 수 있는지에 대한 능력을 규명하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포 배양</h2> <p>Hepa-1c1c7 cell은 Mus musculus (mouse)의 hepatoma cell로서 American Type Tissue Culture (ATCC)에서 분양받았다. 이 세포주에 streptomycin과 penicilin을 각각 \(100 \mathrm { ~unit } / \mathrm { ml } \)의 농도로 첨가하고, FBS는 \( 10 \% \)가 되도록 첨가하여 사용 전까지 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 보관하였다. 세포주는 사용 전 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 녹인 후, FBS와 antibiotic을 포함하는 MEM-a로 washing하여 \( 6,500 \mathrm { ~rpm } \)에서 5분 동안 원심 분리하여 T-flask에 분주하였다. 계대 배양은 배양 중인 T-flask에서 배양액을 버리고 PBS \( 10 \mathrm { ~ml } \)로 두 번 세척 하고, trypsin \( 3 \mathrm { ~ml } \)을 넣은 후, 4 분 동안 incubator에서 배양 하였다. 새로운 T-flask에 배양액 25 \( \mathrm { ml } \)을 넣고, 세포수가 \( 4 \times 10 ^ { 6 } \) 개/ \( \mathrm { ml } \)이 되도록 새로운 flask에 분주한 후, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) incubator에서 배양하였다.</p> <h2>\( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 의 처리 조건</h2> <p>\(80 \sim 90 \% \)로 confluent 하게 자란 hepatoma cell에 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)를 대조군과 실험군에 각각 \( 100 ~ \mu \mathrm { M } , 500 ~ \mu \mathrm { M } , 1 \mathrm { ~mM } \), 그리고 5 \( \mathrm { mM } \)이 되게 처리하여, 30 분, 1 시간 동안 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) in-cubator에서 배양하였다. 또한 cell passage에 따른 양상을 보기 위해서 5, 15, 25, 35 cell passage에 대해서도 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)를 위와 같은 시간과 양에 따라 각각 처리하였다.</p>