Tod polymerase는 PCR 과정에서 주형인 λ-phage와 primer 1, 2를 사용해 DNA 중합 활성을 측정하였으며, 그 온도 의존성은 50-90°C 범위에서 측정하였다. 최적 온도는 75-80°C로 파악되었으며, 85°C 이상에서는 활성을 보이지 않았다. 또한, 이 효소의 DNA 합성 반응은 2가 양이온이 필수적으로 요구되는 것으로 드러났다. 따라서 Tod polymerase에 대한 PCR 반응의 최적 buffer 조성은 50mM Tris/HCl (pH 9.0), 2.5mM MgCl2, 0.01% tween-20로 확인되었다.
<h2>Tod DNA polymerase의 생화학적 특징</h2> <p>Tod polymerase룰 PCR에 적용하기 위하여 재료 및 방법에서 언급한 바와 같이 주형인 \( \lambda \)-phage 및 primer 1 과 2를 사용하여 DNA 중합 활성을 측정하였다. Tod polymerase의 \( \mathrm { pH } \) 의존성은 \( \mathrm { pH } \) 7.5 10.0의 범위에서 측정하였다. Buffer로는 \( 50 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } ( \mathrm { pH } 7.5 \sim 9.0) \) 과 \( 50 \mathrm { mM } \) Glycine- \( \mathrm { NaOH } \) (pH 9.0 10.5)을 사용하여 활성을 측정한 결과, 본 효소의 최적 \( \mathrm { pH } \) 는 \( 9.0 \) 을 나타내었다(Fig. \( 3 \mathrm { ~A } ) \). 이것은 다른 \( \mathrm { PCR } \) 상업용 효소인 Taq polymerase, Vent polymerase, pfu poly-merase의 최적 \( \mathrm { pH } ( \mathrm { pH } \) 8.5 9.0)와 비슷한 양상을 나타내었다. Tod polymerase의 온도 의존성은 \( 50 \sim 90 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 범위에서 측정한 결과, 최적 온도는 \( 75 \sim 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 를 나타내었고(Fig. 3B) \( 85 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 이상에서는 활성을 보이지 않았다.</p> <p>Tod polymerase의 2 가 양이온에 대한 영항을 검토하기 위해 \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } , \mathrm { MnCl } _ { 2 } \) 를 사용하였다. \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \) 과 \( \mathrm { Mn } ^ { 2 + } \) 에 대한 최적 농도는 각각 \( 2.5 \mathrm { mM } \) 과 \( 1 \mathrm { mM } \) 로 나타났다. 또한 2 가 양이온이 없는 조건에서는 활성을 나타내지 않아서 본 효소의 DNA 합성 반응에는 2가 양이온을 반드시 요구하는 것으로 나타났다. \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \) 에 의한 Tod polymerase의 활성은 다른 DNA polymerase의 \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \) 이온에 대한 효과와 일치하였다. \( \mathrm { Mn } ^ { 2 + } \) 에 대한 Tod polymerase의 최대 활성은 \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \) 에 대한 최대 활성과 비숫하여 대부분의 DNA polymerase가 \( \mathrm { Mn } ^ { 2 + } \)에 대햔 낮은 활성을 나타내는 것과 비교하여 상이한 결과를 나타냈다(Fig. 3C) \( [3,4] \). Tod polymerase의 \( \mathrm { KCl } \) 농도에 대한 영향도 검토되었다. KCl에 대헤서는 낮은 농도에서는 효소활성에 큰 영향을 미치지 않았지만 \( 10 \mathrm { mM } \) 이상의 농도 에서 점차 활성이 감소하여 \( 80 \mathrm { mM } \) 이상에서는 효소 활성이 완전히 저해되었다(Fig. 3D), 이것은 PCR 반응에 KCl의 첨가가 필수적인 Taq 및 Tea DNA polymerase과는 대조적인 반면, Tfi DNA polymerase과는 비슷한 결과를 나타냈다. 이상의 결과에서 PCR 반응을 위한 Tod polymerase의 최적 buffer 조성은 \( 50 \mathrm { mM } \) Tris \( / \mathrm { HCl } ( \mathrm { pH } 9.0), 2.5 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } , 0.01 \) \% tween-20(반응 촉진제)로 확인되었다.</p>