본 연구에서는 조직에서 total RNA를 추출하는 방법에 대해 설명하였다. 조직은 cold PBS로 충분히 세척된 후 RNA isolation re-agent를 사용하여 초음파 분쇄기를 이용해 분쇄하였다. 이어 PCR 반응액에 Forward와 Reverse primer를 넣어 27회 반복하는 과정을 통해 확인하였다. cDNA 증폭을 위한 PCR 수행 및 DEPC 처리 증류수에 녹여 UV spectrophotometer로 정량하는 방법을 포함하였으며, 마지막으로 RT-PCR은 RNA를 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 3분 가열하여 denaturation 시킨 후 얼음에 보관하는 방법을 설명하였다.
<h2>RT-PCR</h2> <p>조직으로부터 total RNA를 얻기 위하여 cold PBS로 충분히 세척한 후에 사용하였다. \( 1.5 \mathrm { ml } \) tube에 RNA isolation re-agent (TRI-REAGENT) \( 500 \mu \)와 작은 조각의 조직을 넣고 초음파분쇄기로 2~3분간 갈아준다. 여기에 \( 100 \mu \mathrm { l } \)의 chloroform을 첨가하여 충분히 섞어준 다음 \( 13,000 \mathrm { rpm } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 15분 동안 원심 분리하였다. 약 \( 200 \mu \)의 상등액을 취하여 새로운 tube로 옮기고 동량의 isopropanol 넣고 상온에서 10분 정도 처리한 후 \( 13,000 \mathrm { rpm } \) 으로 10 분 동안 원심분리하고 tube의 바닥에 얻어진 pellet에 \( 75 \% \) ethanol을 초기 RNA isolation reagent 양과 동일한 \( 500 \mu \mathrm { l } \) 넣고 \( 12,000 \mathrm { rpm } \)으로 5분 동안 원심 분리하여 최종적으로 total RNA를 얻었다. DEPC가 처리된 증류수에 녹여 UV spectrophotometer로 정량하였다. 그 다음으로 수행한 RT-PCR은 RNA \( (3 \mu \mathrm { g } ) \)를 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 3분 가열 하여 denaturation 시킨 후 바로 얼음에 담가둔다. 10X buffer \( 3 \mu \mathrm { l } \), dNTP \( 4 \mu \mathrm { l } , 1 \mu \)의 oligo-dT (300 ng), 10,000 U의 역전사효소와 RNase inhibitor를 첨가하고 총 \( 30 \mu \)가 되게 한 후 \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 90 분 간 반응시켜 cDNA를 합성한다. 반응이 끝난 후 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 2분 반응시켜 역전사효소를 inactivation시킨 다음 최종 \( 100 \mu \mathrm { l } \) 로 맞춘다. 그 다음 단계로 cDNA를 증폭하기 위해서 PCR을 수행하였다. PCR 반응액 \( 20 \mu 1 \)에 각각의 Forward와 Reverse primer를 넣어서 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } 5 \)분, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } 30 \)분, \( 57 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 40초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 40초로 27회 반복하여 전기영동으로 확인하였다. 사용된 Forward와 Reverse primer는 아래와 같다. BiP-F (5'-AGTG-GTGGCCACTAATGGAG), BiP-R (5'-TCTTTTGTCAGGGG-TCGTTC); Cnax-F (5'-GCATCATGCCATCTCTGCTA), Canx-R (5'-GGCATCTTCATCCCAGTCAT); ERp29-F (5'-AGTGG-TGGCCACTAATGGAG), ERp29-R (5'-TCTTTTGTCAGGG-GTCGTTC); ATF6-F \( \quad \) (5'-CTAGGCCTGGAGGCCAGGTT), ATF6-R (5'-ACCCTGGAGTATGCGGGTTT), IRE1-R (5'-CCACCCTGGACGGAAGTTTG); PERK-F (5'-GGTCTGGTT-CCTTGGTTTCA), PERK-R (5'-TTCGCTGGCTGTGTAACTTG); ß-actin-F (5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC), ß-actin-R (5'- CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA)</p>