플라스미드 pCXI40-glmS의 SDS-PAGE 분석 결과는 재조합 균주 KG343 제작에 가장 적합하다고 판단되었다. 그러나, 이 플라스미드를 함유한 KG343에서는 예상과 달리 GlcN 생산이 이루어지지 않았다. 반면, glmS가 발현된 재조합 E. coli를 이용하여 배양했을 때는 GlcNAC과 GlcN의 생산량이 높았다. 특히 KG440이 가장 높은 총 GlcNAC과 GlcN 생산량을 보였다. 개발된 Corynebacterium은 GlcNAC 생산 농도가 낮았지만, 이는 GRAS 미생물에서 GlcN과 GlcNAC를 처음으로 생산할 수 있음을 입증했다는 점에서 중요하다.
<h3>재조합 \( C \). glutamicum에서 \( \mathrm { GlcN } \)과 \( \mathrm { GlcNAc } \) 생산</h3> <p>SDS-PAGE 분석결과에서 \( GlmS \) 효소합성이 가장 우수한 것으로 판단된 플라스미드 pCXI40- \( glmS \)를 기반균주인 KG208에 형질전환하여 재조합균주 KG343을 제작하였다. 한편, 유전자 \( glmS \)와 \( gna1 \)은 모두 동일한 복제원점을 함유한 발현벡터에 클로닝되어 있기 때문에 두 플라스미드를 \( C \). glutamicum에 동시에 도입할 수 없어 또 다른 \( E \). coli/ \( C \). glutamicum 셔틀벡터(shuttle vector)인 pCES208 벡터에 \( gna1 \) 유전자를 서브클로닝하여 4가지 종류의 pCES208- \( gna1 \) 시리즈 벡터를 제작하였다. KG343 균주에 이들 플라스미드를 각각 도입한 후 삼각플라스크에서 48시간 발효하여 \( \mathrm { GlcN } \)과 \( \mathrm { GlcNAC } \)의 생산농도를 측정하였다. 플라스미드 pCXI 40-glmS을 함유한 KG343의 경우, 기대와는 달리 \( \mathrm { GlcN } \)이 생산되지 않았다. \( glmS \)가 발현되는 재조합 \( E \). coli를 이용하여 배양한 결과, 일반적으로 glucosamine-6-phosphate synthase는 반응 생산물인glucosamine-6-phosphate에 의해서 효소 활성이 강하게 저해(inhibition) 받는 것으로 알려져 있다. 아마도, \( C \). glutamicum 유래의 \( GlmS \)도 glucosamine-6-phosphate에 의해서 효소 활성이 강하게 저해를 받아 \( \mathrm { GlcN } \)이 거의 생산되지 않는 것으로 판단된다. 한편, \( \mathrm { glmS } \)가 발현되는 균주에 프로모터 \( sod \)에 의해 \( gna1 \) 유전자가 동시에 발현되는 균주인 KG430에서는 \( \mathrm { GlcN } \)과 \( \mathrm { GlcNAC } \)이 전혀 생산되지 않았다. \( gna1 \) 유전자가 각각 \( i l v C, i l v C- \mathrm { M } 1 \), ilvC-M2 프로모터에서 발현되는 균주인 KG440, KG443, KG445에서는 \( \mathrm { GlcNAC } \)가 약 \( 0.8-1.8 \mathrm { ~g } / \) 생산되었으며, KG440과 KG443은 \( \mathrm { GlcN } \)도 함께 생산되었다. 특히, KG440은 총 \( \mathrm { GlcNAC } \)와 \( \mathrm { GlcN } \) 생산량 측면에서 가장 우수한 결과를 나타내었다. 한편, \( \mathrm { GlcN } \)-6- \( \mathrm { P } \)와 \( \mathrm { GlcN } \)-6- \( \mathrm { P } \)의 탈 인산화와 세포 외 배출에 관한 기작은 알려져 있지 않지만, alkaline phosphatase와 sugar phosphatases의 촉매에 의해 탈 인산화되어 배출되는 것으로 추정된다. 지금까지 재조합 \( E \). coli에서 \( 110 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \)의 \( \mathrm { GlcNAc } \)이 생산된 보고가 있으며, Bacillus의 경우, \( 31.65 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \) 생산되는 결과가 알려져 있다. 그러나, 세포외막 성분의 독성문제로 인해 \( E \). coli를 생산 숙주로 사용하여 건강기능성 식품용도로 \( \mathrm { GlcNAc } \)를 생산하는 것은 부적절한 것으로 사료된다. 또한, Bacillus는 아직 그 생산농도가 낮은 수준으로 추가적인 생산연구가 더 요구된다. 본 연구에서 개발된 Corynebacterium은 \( \mathrm { GlcNAC } \) 생산농도는 매우 낮은 수준이지만, GRAS(generally regarded as safe) 미생물에서 \( \mathrm { GlcN } \)과 \( \mathrm { GlcNAC } \)를 처음으로 생산할 수 있음을 증명한 것에 그 의미를 부여할수 있다. 한편, 생산농도가 매우 낮은 원인은 본 연구에 도입된 \( C \). glutamicum 유래의 glucosamine-6-phosphate synthase가 그 생산물인 glucosamine-6-phosphate에 의해 효소활성이 강하게 저해를 받기 때문인 것으로 추정되므로, 향후 효소 개량을 통해 생산물 저해를 받지 않는 glucosamine-6-phosphate synthase를 개발하거나 이미 개발된 다른 미생물 유래의 이종의 \( glmS \)를 도입하면 이 문제를 해결할 수 있을 것으로 판단된다. 또한, 본 연구에서 개발된 균주를 사용하여 향후 \( \mathrm { GlcNAc } \)의 유입 차단, 배출 강화와 같은 추가적인 대사공학과 배지 및 배양공정 최적화를 통해 고농도의 \( \mathrm { GlcNAc } \)를 생산하는 기술을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.</p> <h1>요 약</h1> <p>대사공학을 이용하여 \( N \)-아세틸글루코사민 \( \mathrm { (GlcNAc) } \)을 생산하는 재조합 Corynebacterium glutamicum 을 개발하였다. 먼저 \( \mathrm { GlcNAc } \)를 생산하는 기반균주를 제작하기 위하여, \( N \)-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase와 glucosamine-6-phosphate deaminase를 암호화하는 \( \operatorname { nagAB } \)와 \( N \) -acetylmannosamine-6-phosphate epimerase를 암호화하는 \( \operatorname { nagE } \)를 \( C \). glutamicum ATCC 13032에서 순차적으로 결손하여, 최종적으로 KG208 균주를 제작하였다. 또한, glucosamine-6-phosphate synthase를 암호화하는 \( C \).glutamicum 유래의 \( glmS \)와 glucosamine-6-phosphate \( N \) -acetyltransferase를 암호화하는 Saccharomyces cerevisiae 유래의 gna1을 각각 여러 발현벡터에 클로닝하였다. 여러 발현 조합의 플라스미드들 중에서 pCXI40- \( glmS \)와 pCEI40- \( gna1 \)을 함유한 제조합균주 KG440은 삼각플라스크 발효에서 \( 1.77 \mathrm { ~g } / 1 \)의 \( \mathrm { GlcNAc } \)와 \( 0.63 \mathrm { ~g } / 1 \)의 글루코사민을 생산하였다.</p>