본 연구를 통해 클로닝된 S natalensis 유래 metK 유전자가 방선균에서 이차대사산물생산 유도 기능을 포함하고 있는지 확인하기 위해 재료 및 방법에서 설명된 것과 같이 ermE 프로모터를 가진 pSET152ET 벡터를 이용하여 metK 고발현용 플라스미드(pCD1)를 구축하였으며 S lividans TK24 는 S coelicolor \( \mathrm { A } 3(2) \)와 유전적으로 매우 유사하여 색소계 항생물질인 actinorhodin을 생산할 수 있는 정상적인 생합성 유전자군을 가지고 있지만 경로특이적 촉진인자(pathway-specific activator)의 받현을 유도할 수 있는 조절인자의 기능부족으로 인하여 읻반적인 조건에서는 S coeli-color A3(2)와 달리 actinorhodin을 전혀 생산하지 못하는 특징을 가진 방선균이다.
<h2>metK 고발현용 플라스미드 및 형질전환체의 구축</h2> <p>본 연구를 통해 클로닝된 S. natalensis 유래 metK 유전자가 방선균에서 이차대사산물생산 유도 기능을 포함하고 있는지 확인하기 위해 재료 및 방법에서 설명된 것과 같이 ermE 프로모터를 가진 pSET152ET 벡터를 이용하여 metK 고발현용 플라스미드(pCD1)를 구축하였다. 구축된 pCD1은 접합전달법을 이용하여 방선균의 분자생물학적인 연구와 이차대사 산물생산 제어 유전자 연구에 사용되고 있는 S. lividans TK24의 genomic DNA로 도입되었으며 Southern blot analysis을 통해 삽입된 pCD1이 여러 세대 동안 S. lividans TK24의 genomic DNA에 안정하게 유지되고 있는지 확인되었다. Fig.3 에서 보는 바와 같이 PCR로 얻어진 \( 0.5- \mathrm { kb } \) metK 유전자 단편을 probe로 사용한 Southern blot analysis에서 S. lividansTK24의 wild-type (lane 1)과 pSET152ET벡터만이 도입된 형질전환체(lane 2)에서는 어떠한 signal도 보이지 않았지만 pCD1 이 도입된 뒤 5번 이상의 계대배양을 거친 형질전환체 (lane 3)에서는 재조합 플라스미드 pCD1 (lane 4)과 같이 metK유전자에 대한 positive signal이 명확하게 확인되었다. 따라서S. lividans TK24의 genomic DNA에 도입된 재조합 플라스미드 pCD 1이 여러 세대 동안 안정하게 유지되고 있음을 확인할 수 있었다.</p> <h2>metK 고발현을 이용한 S. lividans TK24의 actinorhodin생산 유도</h2> <p>S. lividans TK24 는 S. coelicolor \( \mathrm { A } 3(2) \) 와 유전적으로 매우 유사하여 색소계 항생물질인 actinorhodin을 생산할 수 있는 정상적인 생합성 유전자군을 가지고 있지만 경로특이적 촉진인자(pathway-specific activator)의 받현을 유도할 수 있는 조절인자의 기능부족으로 인하여 읻반적인 조건에서는 S. coeli-color A3(2)와 달리 actinorhodin을 전혀 생산하지 못하는 특징을 가진 방선균이다. 따라서 S. natalensis 유래 metK의 이차 대사산물생산 유도 기능을 확인하기 위해 S. lividans TK24를 이용하여 metK의 고발현이 S. lividans TK24 로부터 actino-rhodin의 생산을 유도할 수 있는지 확인해 보았다. 그 결과 Fig. 4A에서 보는 바와 같이 R5 고체배지에 배양한 S. lividans TK24의 wild-type과 pSET152ET벡터만이 도입된 균주에서는 어떠한 색소의 생산도 확인되지 않은 반면에 재조합 플라스미드 pCD1이 도입된 형질전환체의 주변에는 파란색 항생물질인 actinorhodin의 생산이 강하게 유도된 것을 확인할 수 있었다. 또한 R4 액체배지에서도 actinorhodin의 생산량 차이를 명확히 확인할 수 있었는데 S. lividans TK24의 wild-type과 \( \mathrm { pSET152 \textrm { ET } } \) 벡터, 그리고 재조합 플라스미드 pCD1이 도입된 균주들의 액체베양에서 균체량의 차이는 없었던(자료 미제시) 반면에 pCD1이 도입된 형질전환체의 actinorhodin 생산량은 다른 두 균주들에 비해 월등히 높았다. 또한 Fig. 4B에서 보는 바와 같이 S. lividans TK24의 wild-type과 pSET152ET벡터만이 도입된 형질전환체는 배양기간 120 시간 동안 actinorhodin의 뚜렷한 증가를 확인할 수 없었지만 \( \mathrm { pCD } 1 \) 이 도입된 형질전 환체에서는 배양 48시간부터 actinorhodin 생산이 시작되어 배양 108 시간 만에 최고 생산량에 도달하였으며 wild-type에 비해 actinorhodin 생산량이 10 배 증가되었다. 이러한 결과는 metK 유전자의 고발현과 SAM 의 외부적인 첨가를 통해 acti-norhodin의 생산량을 증가시킨 다른 연구결과들에 비해 생산량 증가치가 가장 큰 것이다. 또한 본 연구를 통해 확인된 actinorhodin 생산의 증가는 S. codicolor \( \mathrm { A3 } (2) \) 의 연구결과에서 보고된 것과 같이 S. natalensis 유래 metK가 \( S \). lividans TK24로부터 actinorhodin의 생합성 유전자군의 발현 을 직접 유도하는 경로특이적 촉진인자 ActII-ORF4의 발현을 직접 또는 간접적으로 증가시킨 것이 그. 원인이 된 것으로 판단된다. 따라서 본 연구를 통해 클로닝된 S. natalensis 유래 \( m e t K \) 유전자는 방선균에서 이차대사산물생산을 유도할 수 있는 우수한 기능을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.</p>