형질전환 식물세포배양을 이용한 바이오의약 단백질은 생산수준을 높이기 위해 고생산 세포주의 선별과정 이후 세포에 적합한 bio-reactor를 선정하는 것이 필요하다. 본 논문에서는 bioreactor 종류와 식물세포배양 시 주로 고려해야 하는 점을 소개한다. 특히 spin filter를 포함하여 공중사막 배양기, \(2\)단계 고정화 배양기, stirred tank bioreactor, 공기부양식 배양기, rotation drum, 광배양기 등을 소개한다. 한편, 배지 및 공정변수의 최적화를 수행하거나 공정의 검증을 위한 방법으로 miniature bioreactor나 microtiter plate를 소개한다.
<h1>형질전환 식물세포배양을 위한 bioreactor 공학</h1><p>형질전환 식물세포배양을 이용한 바이오의약 단백질의 상업화를 위해서는 생산 수준의 증진이 필수적이다. 고생산 세포주의 선별과정 이후에는, 세포에 적합한 bio-reactor를 선정하고, 생산 공정의 개발 및 최적화에 의해서 생산성 증대가 가능하다. 이 장에서는 bioreactor 공정 측면에서 bioreactor 종류와 식물세포배양 시 주로 고려해야하는 사항에 대해 언급하고자 한다.</p><h2>Bioreactor 종류</h2><p>식물세포 배양을 위해서는 이미 다양한 종류의 bio-reactor가 개발되었으며, spin filter를 포함하여 공중사막 (hollow fiber) 배양기, 2단계 고정화 배양기, stirred tank bioreactor, 공기부양식 (air-lift) 배양기, rotation drum, 광배양기 등이 식물세포배양에 사용된 보고들이 있다 (Zhong et al. 1999). 일반적으로 동물세포배양이나 식물세포배양에 널리 사용되는 두 종류의 bioreactor는 stirred tank bio-reactor와 pneumatic bioreactor이다. 최근에는 공장설립 시간 및 비용절감을 위해 disposable bioreactor를 이용해 목적단백질을 생산하는 연구가 진행되고 있으며, 간편하게 배지 및 공정변수의 최적화를 수행하기 위한 HTS (high-throughput screening)용 bioreactor도 사용되고 있다 (Huang and McDonald 2009).</p><p>Stirred tank bioreactor의 경우 산업적 이용에 적합할 뿐만 아니라 bioreactor 운전에 대해 잘 알려져 있으며 다른 bioreactor에 비해 산소 및 물질전달에 용이하며, 재현성 있는 결과를 얻을 수 있다. 게다가 온도, \(\mathrm{pH}\), 용존산소량 등 공정변수를 항상 일정하게 유지하기 쉬운 편이기 때문에 이를 바탕으로 조건 변화에 따른 세포의 상태변화의 관찰 및 조절이 용이하다 (Zhong et al. 1995; Roberts and Shuler 1997). 또한 바이오의약품을 생산하기 위해 필수적인 cGMP (current Good Manufacturing Practice) 조건하에서 작업하기 용이하므로, 물리적 교반에 의한 높은 에너지 비용에도 불구하고 현재까지 바이오의약 산업에서 널리 사용되고 있다. Stirred tank bioreactor에서의 교반과 기포분산은 기계적 교반에 의해 이루어진다. 교반기 종류 및 크기에 따라 bioreactor 내부에서 다양한 흐름형태를 얻을 수 있으며 Rushton turbine, marine, paddle, centrifugal cell-lift 교반기 등이 주로 사용되고 있다. 식물 세포는 전단응력에 민감하기 때문에, 낮은 전단응력을 주는 교반기의 적용과 함께, 세포에 손상을 주지 않는 범위에서 교반속도를 최적화해야 한다 (Doran 1999).</p><p>Pneumatic bioreactor에는 공기부양식 bioreactor와 bubble column 방식이 있으며, 세포의 혼합, 물질 및 산소전달은 공급된 공기에 의해 이루어진다. 공기부양식 bioreactor의 장점으로는 식물세포 배양에 적합하고, 간단한 구조로 인해 scale-up에 유리하다. 또한 기계적 교반이 없으므로 에너지 및 bioreactor 운영비용이 적게 들고, 전단응력이 낮은 장점이 있다. 전단응력에 민감한 식물세포의 경우, 공기부양식 bioreactor가 많이 적용되고 있다. 공기부양식 bioreactor 내·외부에 loop를 만들 수 있으며, 기포에 의한 세포손상을 줄일 수 있고, 외부 loop내부에 구획을 만들어 세포와 배양액을 분리하여 연속적으로 생산된 재조합 단백질을 분리할 수 있다 (Wang et al. 2002). 반면에 bioreactor 내부에 불균일한 세포분포나 낮은 산소 및 물질전달 능력이 문제가 되고 있다. 과도한 기포가 형성되어 세포에 손상을 미칠 수 있기 때문에 산소를 주입공기에 혼합하는 방법도 사용되고 있다.</p><p>상업적으로 세포배양을 통해 목적 단백질을 생산하기 위해서는 대량배양이 필수적이며 주로 pilot 형태의 stirred tank bioreactor가 사용되지만, 세포에 강한 전단응력을 줄 수 있고 통기에 의한 기포도 세포에 물리적인 충격을 줄 수 있다. 뿐만 아니라 공장설립에 비용이 많이 들고 시간이 오래 걸리는 단점을 극복하기 위해서 disposable bio-reactor에 대한 연구가 시작되었다. Disposable bioreactor는 가격이 저렴하고 \(1,000 \mathrm{L} \) 까지 대량배양이 가능하며, 작동 및 유지가 간편하다. 바이오의약품 생산 측면에서는 배양 각 배치사이에 세척과정 및 멸균과정이 없기 때문에 연간 배치수를 늘릴 수 있고, 완벽히 밀폐된 시스템이기 때문에 GMP 시설로 허가받는 데에도 유리하다 (Eibl and Eibl 2008). Disposable bioreactor에는 Wave 방식이 가장 널리 사용되고 있으며, 지금까지 식물세포 배양에 적용한 사례는 주로 이차대사 산물이나 산업용 단백질의 생산이었으며 (Ritala et al. 2008), 바이오의약 단백질 생산에도 형질전환 벼 세포와 담배 세포에 적용 한 보고가 있다 (Trexler et al. 2005; Girard et al. 2006). Wave 방식의 경우 보다 큰 scale로의 적용이 어렵고 물질이나 열 및 산소전달능이 낮은 단점을 극복하기 위해서, stirred tank bioreactor 타입의 single-use bioreactor (SUB)를 식물세포 배양에서 연구 중에 있다. 최근에는 이스라엘의 Protalix 사에서 bubble column 형태의 disposable bioreactor를 개발하여 당근 세포배양을 통한 재조합 glucocerebrosidase (GCD;상품명 Cerezyme)를 생산 중이며, 현재 임상 3상이 진행 중에 있다 (Aviezer et al. 2009).</p><p>바이오의약품 개발시 배지 및 공정변수의 최적화를 수행하거나 공정의 검증을 위해 validation에서 scale-down 시험을 수행하는 경우에 miniature bioreactor나 microtiter plate가 사용되고 있다 (Betts and Baganz 2006; Gill et al. 2008). HTS bioreactor는 다수의 bioreactor를 이용하여 짧은 시간에 많은 정보를 얻을 수 있는 장점이 있다. 반면에 보다 큰 규모의 bioreactor 적용시 공정변수의 경우에는 변동사항이 많고 식물세포가 주로 응집되어있기 때문에, 아직 적용에는 어려움이 있을 것으로 사료된다.</p>