정제된 플라스미드 DNA를 대장균 BL21(DE3)starcompetent cell에 형질전환하여 kanamycin이 첨가된 배지에 접종 후 배양하였으며, 정제된 단백질에 TEV protease를 \(\beta\)-mercaptoethanol과 함께 처리하여 아미노 말단의 polyhistidine tag을 제거하였다. TEV protease 처리 후 원심분리를 하여 상층액을 모은 후,투석막을 사용하여 B-완충용액에서 투석 처리한 후 B-완충용액으로 안정화시킨 Ni-sepharose 컬럼에 다시 통과하여 제거한 후 컬럼에 붙지 않고 나온 SA FtsZ 단백질을 모아 Dialysis와 Bradford 방법을 이용한 FtsZ 단백질 농도를 측정하였다. FtsZ 단백질의 효소 활성을 관찰하기 위해서는 FS-II 형광계를 이용하였으며, 폴리머의 형성에 따른 빛의 산란 현상을 이용해 emission을 관찰하였다.
<h2>재조합 단백질의 발현과 정제</h2> <p>정제된 플라스미드 DNA \( 1 \mu \mathrm{L} \)를 대장균 BL21(DE3)starcompetent cell에 형질전환하여 kanamycin (\( \ 50 \mathrm{ng} / \mu \mathrm{L} \))이 첨가된 1 L LB 배지에 접종 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 시 세포 밀도는 Scinco社의 S-3100 UV 분광광도계를 이용하여 측정하였고, 탁도가 0.7~0.8에 이르렀을 때 \( 0.5 \mathrm{mM} \)isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)를 처리한 후, \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12시간 동안 배양하였다. 배양물은 \( 5000 \mathrm{rpm} \)으로 30분간 원심분리를 하고 세포 pellet만 취하였다. 세포 pellet에 \( 20 \mathrm{mM} \) Tris-HCl (\( (\mathrm{pH} 7.9) \)), \( 500 \mathrm{mM} \)\( \mathrm{NaCl} \), \( 5 \mathrm{mM} \) Imidazole \( 50 \mathrm{mL} \) (A-완충용액)와 \( 1 \mathrm{mM} \) phenyl-methylsulphonylfluoride(PMSF)를 넣어서 섞어준 후에, 초음파 파쇄기로 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포를 \( 12000 \mathrm{rpm} \) 1시간 동안 원심분리를 하여 pellet을 버리고 상층액을 따로모았다. 상층액을 A-완충용액으로 안정화시킨 Ni-sepharose컬럼에 흘렸다. Ni-sepharose 흘린 후, \( 20 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{Tris-HCI} \)(pH 7.9), \( 500 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{NaCl} \), \( 20 \mathrm{mM} \) imidazole 용액으로 씻어서, imidazole 농도가 \( 100 \mathrm{mM} \)에서 \( 500 \mathrm{mM} \)이 되도록 농도구배로 하여 용출을 하였다. 정제된 단백질은 \(12\%\) sodiumdodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 확인하였다. 정제된 단백질에 TEV protease를 \( 5 \mathrm{mM} \) β-mercaptoethanol과 함께 처리하여 (\( \sim 0.3 \mathrm{ng} / \mu \mathrm{L} \))\( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 동안 처리하여 아미노 말단의 polyhistidine tag을 제거하였다.</p> <h2>Dialysis와 Bradford 방법을 이용한 FtsZ 단백질 농도 측정</h2> <p>TEV protease 처리 후 원심분리를 하여 상층액을 모은 후,투석막 (SnakeSkinR Pleated Dialysis Tubing, 10000 MWCO,Pierce社)을 사용하여 B-완충용액 ( \( 50 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{MES-NaOH} \)\( (\mathrm{pH} 7.9) \), \( 50 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{KCI} \), \( 10 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{MgCl}_{2} \)) ( \( 2 \mathrm{L} \)에 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 동안 투석 처리를 하였다. 투석 처리가 끝난 용액에 남아있는TEV protease와 절단이 안된 SA FtzZ 단백질을 분리하기 위하여 B-완충용액으로 안정화시킨 Ni-sepharose 컬럼에 다시 통과하여 제거한 후 컬럼에 붙지 않고 나온 SA FtsZ 단백질을모았다. 단백질의 농도 측정은 Bradford 방법을 이용하였으며, Bio-Rad社의 protein assay kit (500-0002)의 bovine serumalbumin 을 표준시료로 \( 620 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>FtsZ 단백질의 효소 활성</h2> <p>기 위하여 Scinco社의 FS-II 형광계를 이용하여 폴리머의 형성에 따라 excitation 방향과 \( 90^{\circ} \) 방향으로 빛이 산란되는 현상을 이용하였다. Excitation 파장은 \( 320 \mathrm{nm} \), emission 파장은 \( 330 \sim 370\mathrm{nm} \)로 설정하였다. Excitation과 emission의 슬릿간격은 둘 다 \( 2.5 \mathrm{nm} \)로 고정하였고 PMT voltage는 \( 500 \mathrm{volt} \)로 설정하였다. 형광 측정용 cuvette (path length: \( 1 \mathrm{cm} \))에 B-완충용액에 \( 1 \mathrm{mM} \) GTP를 넣고 \( 330 \sim 370\mathrm{nm} \)에서의 emission을 관찰하고, \( 2 \mu \mathrm{L} \) SA FtsZ 단백질에 B-완충용액과 \( 1 \mathrm{mM} \) GTP를 첨가한 후에 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양을 하면서 매 30초마다 emission을 관찰하였다.</p> <p></p>