자동 박피한 마늘을 3회 세척 후 건조시킨 후, 숙성기에서 15일간 \( 50 \sim 90 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 범위에서 숙성시켜 검은 마늘을 제작했다. 제작된 흑마늘은 진공동결건조기를 이용하여 분말화시켰다. 이후, Brand-Williams의 방법을 변형하여 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical에 대한 ABGE의 소거능력을, Chung 등의 방법과 Choi 등의 방법을 변형하여 hydroxyl radical과 Hydrogen peroxide에 대한 소거활성을 각각 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료 및 시료의 제조</h2> <p>실험에 사용된 마늘은 뿌리 부분을 제거하고 자동 박피한 깐 마늘을 흐르는 물에 3회 세척한 다음 자연 건조하였고, 그 다음 마늘을 숙성기에서 \( 50 \sim 90 ^ {\circ } \mathrm { C } \)까지 온도를 변화시키면서 약 15 일 숙성시켜 검은색의 흑마늘을 제조하였다. 흑마늘 시료는 진공동결건조기(EYELA FREE2E DRYER FDV-810)를 이용하여 동결건조시킨 다음 분쇄기로 분말화시켰다. 메탄올 추출물 제조를 위해 동결건조 시료 \( 100 \mathrm { ~g } \)에 메탄올 \(1 \mathrm { l } \)를 가하여 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 3회 반복하여 추출한 다음 여과한 여액을 회전식 진공농축기를 이용하여 완전 휘발시킨 후dimethyl sulfoxide를 이용하여 일정한 농도로 희석하여 사용하였다. 세포배양을 위한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin/streptomycin/amphotericin (각각 \( 10,000 \mathrm { U } / \mathrm { ml } , 10,000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 및 \( 2,500 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) ), fetal bovine se-rum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (USA)으로부터 구입하였다. HT1080 세포는American Type of Culture Collection (Manassas, VA, USA)로부터 구입하였다. MTT 시약, gelatin, agarose, PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) 및 기타 시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.</p> <h3>DPPH radical assay</h3> <p>Brand-Williams의 실험방법을 변형하여 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical에 대한 ABGE의 소거능력을 측정하였다. 시험농도의 ABGE를 DPPH 용액에 가하여 \( 10 \mathrm { sec } \) 동안 잘 혼합한 다음 실온에서 \( 20 \mathrm { ~min } \) 동안 반응시킨 후 \( 525 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 \( 0.1 \% \) vi-tamin C를 사용하였고, DPPH radical 함량은 시료 첨가군과 대조군의 흡광도 비를 \( \% \) 값으로 환산하여 나타내었다.</p> <h2>Hydroxyl radical assay</h2> <p>Chung 등의 실험방법을 변형하여 hydroxyl radical을 측정하였다. \( 50 \mu \mathrm { l } \)의 \( 10 \mathrm { mM~ } \mathrm { FeSO } _ { 4 } \)와 \( 50 \mu \mathrm { l } \) 의 \( 10 \mathrm { mM~ } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)를 이용한 Fenton반응으로 hydroxyl radical를 발생시켰다. 발생된 radical을 \( 25 \mu 1 \) 의 \( 10 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 25 \mu 1 \) 의 \( 10 \mathrm { mM } \) 2-deoxy-ribose, \( 150 \mu \mathrm { l } \)의 \( 0.1 \mathrm { M } \) phosphate buffer ( \( \mathrm { pH } 7.4 \))의 존재 하에서 시험농도의 ABGE와 반응시킨 다음 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 4 \mathrm { hr } \) 동안 반응시켰다. 여기에 \( 250 \mu \mathrm { l } \)의 \( 2.8 \% \) TCA (trichloroacetic acid) 및 \( 250 \mu \mathrm { l } \)의 \( 1 \% \) TBA (thiobabituric acid)를 첨가하여 \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 가열한 후 상온에서 식힌 다음 \( 1,000 \times \mathrm { g } \)에서 \( 5 \mathrm { ~min } \) 동안 원심분리하였다. 회수한 상등액의 흡광도를 \( 532 \mathrm { ~nm } \)에서 측정하여 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 \( \% \) 값으로 환산하여 항산화 활성을 나타내었다.</p> <h2>Hydrogen Peroxide Scavenging Assay</h2> <p>Choi 등의 실험방법을 변형하여 Hydrogen peroxide에 대한 소거활성을 측정하였다. \( 80 \mu \mathrm { l } \)의 ABGE, \( 20 \mu \mathrm { l } \)의 \( 10 \mathrm { mM } \) Hydrogen peroxide 및 \( 100 \mu \mathrm { l } \)의 \( 0.01 \mathrm { M } \) 인산완충용액 \( ( \mathrm { pH } 5.0) \)을 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 5 \mathrm { ~min } \) 동안 유지시킨 후에 \( 15 \mu \mathrm { l } \)의 \( 1.25 \mathrm { mM } \) ABTS 및 \( 30 \mu \mathrm { l } \)의 peroxidase \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 10 \mathrm { ~min } \) 동안 반응시킨 후 \( 405 \mathrm { nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 \( 0.1 \% \) vita-min C를 사용하였다. 항산화 활성은 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 \( \% \) 값으로 환산하였다.</p>