수확한 균사체를 \( 1.5 \mathrm{~mL} \) microtube에 넣고 동결 건조하여 마쉐한 뒤 DNeasy Plant Mini Kit를 사용하여 genomic DNA를 추출하고, ITS1F-ITS4 primer를 사용하여 Nuclear rDNA 상에 존재하는 ITS1-5.8S-ITS2 rDNA의 PCR을 증폭하였으며, 해독한 염기서열은 DNASTAR pro software를 이용하여 NJ 방법으로 ITS 영역의 계통수를 작성하였고, 액화력 측정은 \( 8,000 \mathrm{rpm} \)에서 10 분간 원심분리한 상등액을 조효소액으로 사용하였다.
<h2>게놈 DNA 분리</h2> <p>순수 분리된 균주들을 MEB 배지에 균을 접종한 후 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 일간 진탕배양하여 균사체를 수확하였다. \( 1.5 \mathrm{~mL} \) microtube에 수확한 균사체를 넣고 동결 건조하여 마쉐한 뒤 DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN, Hilden, Germany; 69106)를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다.</p> <h2>PCR 증폭과 ITS rDNA 염기서열 분석</h2> <p>Nuclear rDNA 상에 존재하는 ITS1-5.8S-ITS2 rDNA의 PCR 증폭을 위해, univeral primer pairs는 ITS1F-ITS4 primer[14]를 사용하였다. PCR 조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 predenaturation 4 분 후에 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 denaturation 1 분, \( 58^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 annealing 1 분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 extension 2분을 설정하여 35 회 반복하고 최종 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 7 분간 extension하여 약 530 640 bp의 밴드를 증폭시켰다. PCR 산물의 염기서열 분석은 Solutions for Generic Technologies (Solgent) Co. Ltd.에 의뢰하였다.</p> <h2>계통도 분석</h2> <p>해독한 염기서열은 Lasergene사의 DNASTAR pro software (SeqMan Pro v7.0)를 이용하여 NJ 방법(MEGA v4.0)으로 ITS 영역의 계통수를 작성하였으며 1,000 회의 bootstrap 분석을 통해 신뢰도를 평가하였다. 충청지역 누룩에서 분리한 균주의 분류적 위치를 검토하기 위해, NCBI GenBank(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/의 염기서열을 획득한 후, 분리균과의 similarity를 분석하였다.</p> <h2>조효소액 조제</h2> <p>액화력(Dextrinogenic activity units, DU)측정은 배양체 2 \( \mathrm{g} \) 을 \( 40 \mathrm{mM} \mathrm{Na} \) acetate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 5.0) \( 10 \mathrm{~mL} \) 에 현탁하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 진탕시킨 후, \( 8,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심분리한 상등액을 조효소액으로 사용하였다. 당화력(Saccharogenic power, SP) 측정은 배양체 \( 1 \mathrm{~g} \) 을 \( 1 \% \mathrm{NaCl} \) 용액 20 \( \mathrm{mL} \) 에 현탁하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3 시간 추출한 상등액을 사용하였다.</p> <h2>효소활성 측정</h2> <p>액화력(DU)은 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 예열한 \( 1 \% \) 가용성 전분용액(0.4 M Na acetate buffer, pH 5.0) \( 2 \mathrm{~mL} \) 를 기질용액으로 희석 효소액 \( 0.1 \mathrm{~mL} \) 를 넣고 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응시킨 후, 효소 반응액 \( 0.1 \mathrm{~mL} \) 에 \( 0.00025 \mathrm{~N} \) 요오드 용액(0.0025 \( \mathrm{N} \mathrm{KI}) 10 \mathrm{~mL} \) 를 가하여 \( 670 \mathrm{~nm} \) 에서 투과도(T\%)를 측정하여 Wohlgemuth value으로 산출하였다.</p> <p>당화력은 \( 2 \% \) 가용성 전분용액을 기질로 하여 국세청 주류 분석규정 및 일본 국세청 주류 분석규정에 따른 glucoamylase 활성을 측정하여 비교하였다. 당화력은 기질용액을 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 효소반응시킨 후, 생성된 환원당의 양을 Lane-Eynone법으로 측정하여 기질의 당화율이 \( 15 \% \) 되는 범위에서 당화율에 희석배수를 곱하여 산출하였다.</p> <p>액화력 및 당화력의 단위는 누룩 혹은 배양체 \( 1 \mathrm{~g} \) 의 활성으로 표시하였으며, 각 sample은 3회 측정한 평균값으로 표기하였다.</p> <h2>산 생성능 분석</h2> <p>배양체 \( 1 \mathrm{~g} \) 을 \( 1 \% \mathrm{NaCl} 20 \mathrm{~mL} \) 에 현탁한 후, 그 상등액을 \( \mathrm{pH} \) meter로 측정하였고, 총산의 측정은 현탁액 \( 10 \mathrm{~mL} \) 에 대해 \( 0.1 \% \) phenolphthalein 용액 2 3방울을 떨어뜨려 \( 0.1 \mathrm{~N} \) \( \mathrm{NaOH} \) 로 선흥색이 될 때까지 적정하였다.</p>