일반 PCR용 특이 프라이머는 크기가 큰 PCR 산물을 생성하므로, 실시간 PCR에서 DNA 정량에 오차를 유발할 수 있음을 인지하였다. 따라서, 타겟 DNA 이외의 비특이적인 띠를 확인하기 위해 PCR 산물의 크기가 작은 프라이머를 사용하였다. LbLMA-1과 R16-1 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 DNA 단편은 \(210 \, \text{bp}\)였으며, pGEM-T vector system을 이용하여 형질전환을 시행하였다. 플라스미드 DNA를 \(10^{10}\) 복제수에서 \(10^{2}\) 복제수까지 점차 희석한 후, SYBR Green1 염료를 이용한 RT-PCR을 실행하여 plasmid DNA 복제 수에 따른 Ct값의 표준 곡선을 얻었다. 이때의 기울기는 -3.346, Y절편은 33.18, 결정계수 \(R^{2}\)는 0.993으로 계산되었다. SYBR Green1 염료와 Probe 방법을 이용한 플라스미드 DNA 복제 수의 차이는 없었으며, 이를 통한 표준곡선 생성도 가능하다는 것을 확인하였다. 본 연구의 RT-PCR 방법은 기존의 3-4일이 소요되는 배지법에 비해 24시간 이내에 빠르게 검출 가능하며, 염료와 프라이머의 사용에 따라 결과값에 차이가 나타나며, Probe 방법은 더욱 민감한 결과를 보였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Lactobacillus genus primer를 이용한 based-PCR</h2> <p>일반적인 PCR에 사용되는 특이 primer는 real-time PCR을 수행하기에는 PCR 산물크기가 커서 PCR efficency를 떨어뜨리기 때문에 DNA정량에 오류로 작용할 가능성이 있으며, 따라서 PCR 산물의 크기가 작은 primer를 사용하였으며, tar-get DNA 이외의 비특이적인 band가 나타나는지를 확인하였다. Lactobacillus genus specific primer인 LbLMA- 1 (reverse)과 R16-1 (forward), Lactobacillus genus RT PCR prime인 all-lact-F (forward)와 allact-R (reverse)의 PCR 산물을 \( 2.0\% \) agarose gel에서 \( 100 \mathrm{~V} \)에서 40분간 전기 영동하여 확인한 결과 Lactobacillus genus specific primer의 Amplification size는 \(210 \mathrm{bp} \), Lactobacillus genus Real-time PCR primer의 Amplification size는 \( 92 \mathrm{bp} \)임을 확인 할 수 있었으며, 비특이적인 band는 나타나지 않았다.</p> <h2>Lactobacillus reuteri 16S-23S rRNA intergenic species region의 cloning</h2> <p>LbLMA-1과 R16-1 primer set을 이용하여 증폭시킨 DNA fragment가 \( 210 \mathrm{bp} \)임을 확인하고 pGEM - T vector system(promega, USA)을 이용하여 형질 전환 하였다. plasmid DNA(vector size \( 3,015 \mathrm{bp} \) )의 크기가 약 \( 3.2 \mathrm{~kb} \)정도임을 확인하고, plasmid를 추출 및 정제하여, Macrogen에 DNA sequence를 의뢰하였다. sequence된 염기서열을 가지고 plasmid DNA가 insert 되었는지 확인하기 위해서 Finch TV program과 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)search program을 이용하여 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 Genebank에서 염기서열을 비교한 결과 \( 99 \% \) 일치함을 알 수 있었다. alllact-F와 alllact-Rprimer set을 이용하여 증폭시킨 DNA fragment가 \( 92 \mathrm{bp} \)임을 확인하고 T&A Cloning vector (RBC Bioscience, Korea)을 이용하여 형질 전환 하였다. plasmid DNA (vector size \( 2728 \mathrm{bp} \))의 크기가 약 \( 2.8 \mathrm{~kb} \)정도임을 확인하고, plasmid DNA를 추출 및 정제하였다.</p> <h2>Gene cloning 된 plasmid DNA copy number에 따른 검출한계</h2> <p>plasmid DNA를 \( 10^{10} \) copy number로부터 \( 10^{2} \) copy num-ber에 이르기 까지 단계적으로 희석하여 SYBR Green1 dye를 이용하여 RT PCR을 실행한 결과 Ct값에 따른 plasmid DNA copy number의 표준곡선을 얻었으며 이때의 Slope는 -3.346이었고, Y절편은 33.18, \( \mathrm{R}^{2} \) 값은 0.993으로 나타났다. Probe 방법을 이용하여 Real-time PCR을 실행한 결과 Slope는 -3.321이었고, Y절편은 39.10, \( \mathrm{R}^{2} \)값은 0.995로 나타났다. 두 가지 방법 모두 \( 10^{10} \) copy number 이상에서는 초기 DNA양이 많아 PCR inhibitor로 작용하여 검출곡선을 나타낼 수 없었다. SYBR Green1 dye를 이용한 방법과 Probe 방법을 이용한 plasmid DNA copy nember에 대한 차이는 없는 것으로 사료되며, 이를 이용한 표준곡선 제작 또한 가능함을 알 수 있었다.</p> <h2>RT PCR system을 이용한 Lactobacilli 정성◦정량 분석</h2> <p>RT PCR의 정량에서 가장 중요한 개념은 crossing point 혹은 Ct (Threshold Cycle) Value 이라는 수치이다. Fluorescence값이 base line값을 지나는 시점을 의미하므로 그 절대값이 낮을수록 sample내 존재하는 미생물 균총의 수가 많음을 의미하게 된다. SYBR Green1 방법을 이용한 생균제의 Lactobacilli 정성◦정량 분석결과 16개의 제품에서 모두 증폭이 일어났으며, 이때 Real-time PCR값은 4.46 ~ \( 6.56 log \) copies로 나타났고, 생균수 측정 결과 값은 5.63 ~ \( 7.59 log \) \( \mathrm{CFU} / \mathrm{g} \)로 나타나 차이를 보였다. Probe 방법을 이용한 생균제의 Lactobacilli 정성◦정량 분석결과에서는 Real-time PCR값은 5.51 ~ \( 7.00 log \) cop-ies로 나타났으며, 생균수 측정 결과 값은 5.63 ~ \( 7.59 log \) \( \mathrm{CFU} / \mathrm{g} \)로 나타나 차이를 보였다.PCR inhibitor와 primer의 dimer형성에 의한 conventional method와 차이가 있음을 확인 할 수 있었다. 하지만 SYBR Green1 방법과 Probe 방법을 이용한 Lactobacilli 정성◦정량 분석결과 표준 곡선 도출에는 차이가 없었으나, 혼합 미생물이 포함되어 있는 시료분석에서 Probe 방법을 이용한 분석방법이 생균수 측정 결과값과 근사함을 알 수 있었다. 또한 생균수 측정결과 값이 RT PCR 기법을 이용하여 측정한 미생물 수 보다 높음을 알 수 있었다. 이는 RT PCR기법은 미생물의 특이적인 primer를 이용하여 특이적 strain을 분석해내는 반면에 생균수 측정방법은 특이적 genus에 대한 전체적인 미생물을 측정하기 때문으로 사료된다. 이러한 결과를 종합해 볼 때 본 연구에서 실시한 RT PCR법은 3 ~ 4일이 소요되는 기존의 배지법과 비교하여 24시간 이내에 신속하게 검출이 가능하다고 여겨지며, 또한 RT PCR을 이용한 분석방법에서도 dye 사용과 primer 사용에 따라 결과 값이 차이가 나타났음을 확인 할 수 있었으며, Probe 방법을 이용하여 실험 한 결과가 민감한 결과를 나타내었음을 확인할 수 있었다.</p>