HeLa 세포를 Lipofectamin 2000 reagent로 형질전환한 후, NP-40 lysing buffer로 용해하고 \(\mathrm{12,000 rpm}\)으로 10분간 섞어 항상적인 용해액을 준비하여 SDS-PAGE 및 Western blot 방법을 사용하여 wild type MBL-A와 triple mutant MBL-A DNA의 단백질 발현을 분석하였다.
<h2>SDS-PAGE 및 Western blot 방법을 사용한 MBL 단백질 분석</h2> <p>MBL의 단백질 발현 관찰을 위해 HeLa 세포는 \( 100 \mathrm { ~mm } \) dish에 \( 2.5 \times 10 ^ { 6 } \) cells/dish 로 배양하였다. 배양 18시간 후, wild type MBL-A과 triple mutant MBL-A DNA을 Lipofectamin 2000 reagent (Invitrogen)을 사용하여 형질전환 하였으며, 형질전환 48시간 후, NP-40 lysing buffer(\(\mathrm{50 mM}\) Tris-\(\mathrm{HCl}\), \( \mathrm { pH } 7.5,~150 \mathrm { mM }~ \mathrm{NaCl}~ 0.5 \% \) DOC, and \( 0.5 \% \) NP-40)로 세포를 용해시키고, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 12,000 \mathrm { rpm } \)으로 10분간 원심분리하여 고형성분을 제거한 cell lysate를 회수하였다. Cell lysate에 존재하는 MBL 단백질 분석은 \( 12 \% \) polyacrylamide gel을 사용하여 SDS-PAGE와 western blot으로 하였다. SDS-PAGE 실시 후 Transfer electrophoresis unit (Amersham)을 이용하여 \(250 \mathrm { mA } \)에서 3시간 동안 nitrocellulose membrane으로 단백질을 전이시키고, gelatin buffer \( (0.1 \% \) Gelatin, \( 15 \mathrm { mM } \) Tris-\(\mathrm{HCI}\), \( \mathrm { pH } 7.5,1 \mathrm { mM } \) EDTA, \(0.1 \%\) Triton X-100, \( 130 \mathrm { mM } ~\mathrm {NaCl } \)를 사용하여 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 진탕수조에서 30분간 blocking 하였다. MBL 단백질은 mouse anti-HA monoclonal antibody(Roche, 1: 500)를 18시간 반응시킨 후, 항체를 제거하고 Tris-saline wash buffer ( \( 1 \mathrm { mM } \) Tris-\(\mathrm{HCl} ~\mathrm { pH } 7.5, ~0.9 \% \mathrm { NaCl } ) \) 및 Tris-saline-Triton X-100 wash buffer ( \( 1 \mathrm { mM } \) Tris-\(\mathrm{HCl}~ \mathrm { pH } 7.5,~0.9 \%~ \mathrm { NaCl } , 0.05 \% \) Triton X-100)를 사용하여 각각 30분간 nitro-cellulose membrane을 씻어 주었다. 그 후 goat anti-mouse IgG peroxidase (Sigma 1:1,000)를 사용하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 동일한 wash buffer를 사용하여 30분간 씻어준 다음 ECL Plus chemiluminescence reagent (Amersham Pharmacia Biotech)로 반응시키고 X-ray film에 감광하여 단백질을 확인하였다.</p>