유산균의 내산성과 내담즙성은 Eppendorf tube로 원심분리한 후 modified MRS 배지(pH 7.0)에 2회 세척한 cell pellet에 0.3% HCl이나 bile salt를 1.2 ml씩 넣고 37\(^\circ \mathrm{C}\) 6시간 동안 방치한 후 RB agar plate에 도말하여 혐기적으로 배양하여 생균수를 측정하여 생존율을 계산해 내산성과 내담즙성을 판단한다. 유산균의 돼지소장 상피세포 부착성을 실험하기 위해서 돼지 소장 상부의 중간부를 절개하고 절개된 부위에 압력을 가하여 실험했다.
<h2>유산균의 내산성과 내담즙성</h2> <p>각 유산균의 배양액 1 ml를 Eppendorf tube에 넣고 원심분리하여 상등액을 버리고 모은 pellet에 modified MRS 배지(pH 7.0) (sodium acetate, ammonium citrate 불포함)를1 ml씩 처리하여 균체를 2회 세척한 후에 다시 원심분리 후남은 cell pellet에 0.3% HCl을 함유한 MRS (pH 2.2) 또는 0.3% (w/v) bile salt (Difco, USA)를 1.2 ml씩 넣고 잘 섞은후 세포현탁액을 준비하였다. \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 6시간 동안 방치한후 RB agar plate에 도말하여 혐기적으로 배양한 후 생균수를 측정하였고, 다음 식에 의해 내산성 또는 내담즙성을 나타내기 위한 생존율(%)을 계산하였다. 생존율( \%) = (cell number in MRS containing \( 0.3 \% \mathrm { HCl } \) or bile salt \( \div \) cell number in MRS) \( \times 100 \)</p> <h2>유산균의 돼지소장 상피세포 부착성</h2> <p>돼지 소장 상부의 중간부를 절개하고 절개된 부위에 압력을 가해 내용물을 제거하였다. 점액질 표면을 \( 0.01 \mathrm { M } \mathrm { PBS } \) (potassium buffered saline, pH 7.4)로 세척하고 조심스럽게 긁어서 mucus 부분을 제거하고 HEPES-Hank's (HH) buffer (25 mM HEPES, \( 0.137 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } , 5.4 \mathrm { mM } \mathrm { KCl } , 0.25 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } , 0.44 \mathrm { mM } \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } , 1.3 \mathrm { mM } \mathrm { CaCl } , 1.0 \mathrm { mM } \mathrm { MgSO } _ { 4 } \), \( 4.2 \mathrm { mM } \mathrm { NaHCO } _ { 3 } \) )로 세척하였다. 분리된 표피세포와 장관막을 mucus로부터 분리하기 위하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 12,000 \times g \) 에서 15 분간 2 번 원심분리하고, 다시 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 27,000 \times g \) 에서 15 분간 원심 분리하였다. Mucus를 제거한 후에 \( 20 \mathrm { ml } \) hyaluronidase (Sigma No. H-3506; \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \mathrm { HH } \) buffer)로 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 분간 반응시키고 표피세포를 멸균된 스푼으로 조심스럽게 긁어서 분리하였고, 이 분리된 표피세포 용액에서 거즈로 덩어리와 부스러기 들을 여과하여 제거시켰다. 표피세포 현탁액을 1 분간 \( 100 \times g \) 로 2 번 원심분리하였고 pellet을 \( 5 \mathrm { ml } \mathrm { HH } \) buffer로 \( 120 \times g 10 \) 분간 2 번 세척하고 \( 15 \mathrm { ml } \mathrm { HH } \) buffer로 한번 원심분리하여 세척하였다. 표피세포와 유산균을 최종 \( 1 \mathrm { ml } \) 로 섞고 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 40 분간 반응시켰다. 현탁액을 \( 200 \times g \)에서 15 분간 원심분리하고 \( \mathrm { HH } \) buffer로 3 번 세척하였다. 침전물을 초기부피의 반부피로 현탁하고 slide glass에 도말하였다. 세포와 균을 methanol로 고정시키고 Gram staining을 한 후 광학현미경으로 관찰하면서 균수를 측정하였다. 약 10개의 표피세포에 부착한 유산균수를 계수하여 평균을 내어 결과를 나타내었다.</p>