본 연구에서는 U937/vector 및 U937/Bcl-2 세포를 배양하였으며, 이후 세포 증식율 측정 및 분석을 위해 도립 현미경과 Microsoft EXCEL program을 사용하였다. 다음으로 세포 생존도의 조사를 위해 ELISA reader를 이용한 흡광도를 조사하였으며, 세포주기 변화는 형광반응에 따른 histogram을 ModiFit LT program을 사용하여 분석하였다. 마지막으로 염색에 의한 핵의 형태 변화 관찰은 형광현미경을 \(400\)배의 배율로 해 암세포 핵을 관측하여 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>U937 세포의 배양 및 HDAC 저해제의 처리</h2><p>본 연구에 사용된 U937/vector 및 U937/Bcl-2 세포는 Moon et al.에 의하여 제시된 것과 같이, \( 90 \% \)의 RPMI-1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY)에 \(10\%\) fetal bovine serum (FBS), \(1\%\)의 penicillin 및 streptomycin (Biofluids, Rockville, MD)과 \( 0.7 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) geneticin (G418 sulfate, Sigma Chemical Co., St. Luis, MO)이 함유된 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건 하에서 배양하였다. TSA 및 Na-B는 Sigma에서 구입하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma)에 용해하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였고, 매회 처리 전 배지에 희석 후 사용하였다.</p><h2>Hemocytometer를 이용한 세포 증식율의 측정</h2><p>세포 배양용 6 well plate에 \( 2 \times 10^{4} \) 개\( / \mathrm{ml}\)의 개수로 well당 \( 2 \mathrm{ml} \) 씩 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 다음 TSA 80\(\mathrm{nM}\)을 처리하여 72시간까지 배양하였다. 그 후 배지를 제거하고 trypan blue (Gibco BRL)로 염색 후 도립 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 살아있는 세포를 계수하여 이에 따른 결과를 Microsoft EXCEL program을 사용하여 분석하였다.</p><h2>MTT assay에 의한 세포 생존도의 조사</h2><p>세포 배양용 6 well plate에 \( 2 \times 10^{4} \) 개 \( / \mathrm{ml} \) 정도로 세포를 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후 HDAC 저해제를 적정 농도로 처리하였다. 48시간 후 tetrazolium bromide salt (MTT, Amresco, Solon, OH)를 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도가 되게 배지로 희석하여 3시간 동안 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양시킨 다음 DMSO로 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 \( 540 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>세포주기 변화의 분석</h2><p>HDAC 저해제가 함유된 배지에서 적정시간 동안 배양시킨 세포들을 모아 고정시킨 후 핵산에 특이적으로 결합하는 형광물질인 propidium iodide(PI, concentration, \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \); Sigma)와 10 kunit의 RNase (Sigma)를 처리하여 암실, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 동안 염색하였다. 다시 PBS도 세척 과정을 거친 후 DNA flow cytometry (Becton Dickinson, San Jose, CA)에 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 ModiFit LT (Becton Dickinson) program을 사용하여 분석하였다.</p><h2>DAPI 염색에 의한 핵의 형태 변화 관찰</h2><p>준비된 세포를 \( 3.7 \% \) formaldehyde 용액으로 10분 동안 고정 후, cytospin으로 slide glass 위에 부착시켰다. PBS로 수세 후 \( 0.2 \% \)의 Triton X-100 (Amresco)을 첨가하여 상온에서 10분간 고정하였다. 그 후 다시 PBS로 수세하고 4',6-dia-midino-2-phenylindole (DAPI, Sigma) 용액으로 암하에서 15분 정도 염색시킨 후, PBS로 DAPI 용액을 충분하게 세척하고 absolute alcohol을 이용하여 탈수 및 slide glass 위에 mounting solution을 처리한 후 형광 현미경(Carl Zeiss)을 이용하여 400배의 배율로 각 농도에 따른 암세포 핵의 형태 변화를 관찰하였다.</p>