A.niger LK 건조분말을 생촉매로 사용하여 \( \mathrm{EH} \) 활성을 이용한 입체선택적 가수분해 반응을 진행했다. 여러 유기용매에 \( 4 \mathrm{mM} \mathrm{p} \)-NSO, A. niger LK 건조분말, \( \mathrm{DDW} \) 를 이용해 A. niger \( \mathrm{LK} \) 의 \( \mathrm{EH} \) 활성 저하가 최소인 유기용매를 선택했다. 반응 온도와 water content의 영향을 측정했으며 \( p-\mathrm{NSO} \) 정량분석으로 Gas chromatography를 확인했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>미생물 배양 조건</h2> <p>A. niger LK 포자를 액체배지(glucose \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \), corn-steep liquor \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) )에 접종하여 \( 27^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm} \) 에서 3일간 배양하였다. 균체를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3 일간 건조시켜 얻은 A. niger LK 건조분말을 생촉매로 사용하였다.</p> <h2>\( \mathrm{EH} \) 활성을 이용한 입체선택적 가수분해 반응</h2> <p>본 연구에서 사용한 \( p \)-NSO는 \( \omega \)-bromo-para-nitro-acetophenone으로부터 문헌에 제시되어 있는 방법을 이용하여 합성하였다. 수용액에서의 입체선택적 가수분해 반응은 A. niger \( \mathrm{LK} \) 건조분말 \( 50 \mathrm{mg} \) 과 \( 4 \mathrm{mM} \) 의 라세믹 \( p \)-NSO 기질을 \( 1 \mathrm{ml} \) 의 \( 50 \mathrm{mM} \) 인산완충액( \( (\mathrm{pH} \mathrm{8.0)} \) 에 현탁시킨 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm} \) 에서 교반하면서 반응을 진행하였다. 반응 후 에폭사이드를 cyclohexane으로 추출한 후, 유기용매 층을 \( \mathrm{GC} \) 로 분석하여 enantiomeric excess (ee = \( \left.\frac{(S-R)}{(S+R)} \times 100(\%)\right) \) 값과 수율을 결정하였다. 유기용매상에서의 반응은 \( 20 \mathrm{mM} p \)-NSO, \( 100 \mathrm{mg} \) 의 A. niger LK 건조분말 및 적절한 양의 물을 첨가한 후 같은 조건에서 반응을 진행하였다.</p> <h2>유기용매 선정</h2> <p>A. niger \( \mathrm{LK} \) 의 \( \mathrm{EH} \) 활성 저하가 가장 적은 유기용매를 선정하기 위하여 여러종류의 유기용매에 \( 4 \mathrm{mM} \mathrm{p} \)-NSO과 \( 50 \mathrm{mg} \) 의 A. niger LK 건조분말 및 \( 2 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 \( \mathrm{DDW} \) (distilled \& deionized water)을 넣은 후 초기 30 분간의 분 해속도를 측정하여 가장 높은 활성을 주는 유기용매를 선 정하였다.</p> <h2>온도 및 water content의 영향</h2> <p>유기용매상의 반응에 있어서 water content 영향은 위와 같은 조건에서 \( 0,1,2,3,5,10 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 \( \mathrm{DDW} \) 를 각각 공급한 후 초기 30 분간의 분해속도를 측정하여 평가하였고, 반응온도는 같은 조건에서 \( 20,25,30,35,40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 각각 초기 30 분간의 분해속도를 측정하여 평가하였다.</p> <h2>Gas chromatography 분석</h2> <p>\( p-\mathrm{NSO} \) 정량분석을 위하여 (R)-이성질체와 (S)-이성질체에 대한 분리능이 있는 \( \beta \)-Dex 120 (Supelco Co., USA; \( 0.25 \mathrm{~mm} \) ID, \( 30 \mathrm{~m} \) length, \( 25 \mu \mathrm{m} \) film thickness) 컬럼을 사용하였으며, \( \mathrm{GC} \) 조건은 문헌치를 이용하였다.</p>