본 연구는 Bacillus sp. 균주에 대한 유기용매 내성조사를 실시하여 균주의 산업적인 이용 가능성에 대해 조사하였다. 유기용매 내성세균은 울산공단 일대의 폐수 및 토양을 채취하여 nutrient broth 등의 분리배지에 농화배양을 실시하여 분리하였다. 해당 균주의 염기서열을 계통수 분석법인 neighbor joining법과 bootstrap 분석에 의거해 작성하여 유사도를 조사하였고, 분해능 여부는 Duharm tube를 이용하여 다양한 유기용매 및 난분해성 물질을 유일한 탄소원으로 사용해 48-96시간 동안 정치배양하여 생존유무를 통해 확인하였다.
<p>따라서 본 연구에서는 울산공단 일대의 폐수 및 토양에서 유기용매 내성을 나타내는 균주를 분리하였고, 아직 보고가 미흡한 유기용매 내성 세균인 Bacillus sp. 균주에 대해 다양한 유기용매에 대한 내성 등 기본적인 조사를 실시하였다. 그리고 그 유용성을 검증하기 위하여 온도, \(\mathrm{pH}\), 금속이온, 유기용매 등 여러 환경인자들이 lipase에 미치는 영향과 각종 물질의 분해능력을 조사함으로써 Bacillus sp. BCNU 5005 균주의 산업적인 이용 가능성에 대해 조사하여 보고하고자 한다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>유기용매 내성 세균의 분리 및 lipase 생성 균주 선별</h2> <p>유기용매 내성 세균을 분리하기 위해 울산공단 일대의 폐수 및 토양을 채취하여 nutrient broth (NB) 등의 분리배지에 \( 10 \% \) \( ( \mathrm { v } / \mathrm { v } )\) n-hexane을 첨가한 후 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 농화배양을 실시하였다. n-Hexane에 대해 내성이 있는 균을 1차 선별하였고, \( 10 \% \) toluene을 첨가하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 48시간 동안 배양하여 toluene에 내성이 뛰어난 균주를 2차 선별하였다. 유기용매 내성 균주의 lipase 생산여부를 확인하기 위해서 기질인 \( 1 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) tribuyrin이 첨가된 nutrient agar(NA) 배지 등 분리배지에 균을 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24-48시간 배양 후 투명환의 생성여부를 관찰하였다.</p> <h3>생리, 생화학적 특성 및 형태학적 특성 조사</h3> <p>유기용매 내성이 뛰어난 균주에 대해 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology [18]에 준하여 생리, 생화학적 특성을 조사하였고, 정확한 동정을 위하여 forward primer(5'AGT TTG ATC CTG GCT CAG 3')와 reverse primer(5' ACGGCT ACC TTG TTA CGA CTT 3')를 사용하여 16S 리보좀 DNA를 증폭하였으며 그 염기서열을 분석하였다. 나아가 염기서열의 유사도를 조사하였고 계통수는 neighbor joining법과 bootstrap 분석에 의거하여 작성하였다.</p> <h2>유기용매 내성 및 분해능 조사</h2> <p>유기용매에 대한 내성 조사를 위해 균이 접종된 NA 평판배지에 11종의 다양한 유기용매를 overlay하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 48-96시간 동안 정치배양하였고, 유기용매에 대한 분해능 조사는 최소배지인 minimum salts medium(MSM; \( 0.715 \mathrm { ~g } \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } \)- \( 2 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } , 0.365 \mathrm { ~g } \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } , 0.5 \mathrm { ~g } \left ( \mathrm { NH } _ { 4 } \right )_ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } , 0.1 \mathrm { ~g } \mathrm { MgSO } _ { 4 }  \cdot  7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \), and \( 0.5 \% \) trace elements solution \( \left (0.88 \mathrm { ~g } \mathrm { Ca } \left ( \mathrm { NO } _ { 3 } \right )_ { 2 } \right .\cdot 4 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } , 0.2 \mathrm { ~g } \mathrm { FeSO } \mathrm { F } _ { 4 } \cdot 7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } , 0.01 \mathrm { ~g } \mathrm { ZnSO } _ { 4 } \cdot 7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } , 0.01 \mathrm { ~g } \) \( \mathrm { H } _ { 3 } \mathrm { BO } _ { 3 } , 0.01 \mathrm { ~g } \mathrm { CoSO } \mathrm { C } _ { 4 } \cdot 7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } , 0.01 \mathrm { ~g } \mathrm { CuSO_ { 4 } } \cdot 5 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } , 0.004 \mathrm { ~g } \) \( \mathrm { MnSO } _ { 4 } \cdot \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } , 0.004 \mathrm { ~g } \mathrm { Ni } \left ( \mathrm { NO } _ { 3 } \right )_ { 2 } 6 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } , 0.003 \mathrm { ~g } \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { MoO } _ { 4 } \cdot \) \( \left .2 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } , 0.002 \mathrm { ~g } \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { WO } _ { 4 } \cdot 2 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } , 0.05 \mathrm { ~N } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \right ) \) )를 사용하였다. Duharm tube를 이용하여 다양한 유기용매 및 난분해성 물질을 유일한 탄소원으로 첨가하였고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 48-96시간 동안 정치배양한 뒤 생존유무로 분해능 여부를 확인하였다.</p>