쥐노래미 각 조직의 LDH 활성 및 단백질 정량을 측정한 결과, 골격근 조직이 가장 높게 나타났고 눈, 뇌 및 신장 조직이 비교적 유사하게 나타났다. native-PAGE를 통해 eye-specific LDH \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소 및 하부단위체 \( \mathrm{C} \)를 포함하는 LDH 동위효소가 눈 조직에서 양극쪽으로 나타났고 뇌 조직에서는 하부단위체 C를 포함하는 동위효소가 나타났다. 피루브산 유사물인 oxamate를 이용한 affinity chromatography를 통해 eye-specific LDH \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소를 정제할 수 있었다. LDH 동위효소들은 \( \mathrm{NAD}^{+} \)및 oxamate와 복합체를 형성하는 정도가 서로 상이하여 동위효소들이 GEL에 결합하는 힘이 다르기에 동위효소들의 용출 순서에 차이에 따라 동위효소를 분리한다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>쥐노래미 조직의 LDH 활성 및 단백질 정량</h2> <p>쥐노래미 각 조직에서 LDH 활성을 측정한 결과 골격근, 심장, 뇌, 눈, 신장 및 간 조직의 순서로 높게 나타났다. 조직 내 단백질량은 골격근 및 간 조직이 각각 41.26 및 \( 41.16 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) 으로 유사하게 나타났고 심장 조직은 \( 35.12 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \)으로 나타났으며 눈, 뇌 및 신장 조직이 각각 19.87, 22.31 및 \( 24.89 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \)으로 비교적 유사하게 나타났다. LDH 활성이 골격근 조직에서 가장 높게 나타나고 간 조직에서 가장 낮게 나타난 점은 쏘가리 및 가물치의 결과와 같았다. 이는 젖산대사 시 다른 조직보다 골격근 조직에서 LDH가 중 요한 역할을 한다는 결과들과 일치하였다.</p> <h2>LDH 동위효소들의 전기영동 상</h2> <p>쥐노래미 골격근, 심장, 신장, 간, 눈 및 뇌 조직의 LDH를 native-PAGE한 결과 eye-specific LDH \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소 및 하부단위체 \( \mathrm{C} \)를 포함하는LDH 동위효소가 눈 조직에서 양극쪽으로 나타났고 뇌 조직에서는 하부단위체 \( \mathrm{C} \)를 포함하는 동위효소가 나타났다(Fig. 1). 눈 조직에서 eye-specific LDH C \( C_{4} \) 동위효소가 양극쪽으로 나타나는 것은 꺽지, 쏘가리, 얼룩동사리 및 가물치 등의 육식성 농어목 어류와 같았다. 골격근, 심장 및 신장 조직에서는 LDH \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소가 나타나서 조직특이성을 보이지 않았는데 역학적 및 면역화학적 추가실험이 필요하다고 사료된다(Fig. 1).</p> <h2>Eye-specific LDH \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 정제</h2> <p>피루브산 유사물인 oxamate를 이용한 oxamate-linked Sepharose gel로 조직추출액을 affinity chromatography 할 때 \( \mathrm{NADH} \)를 함유한 buffer를 가하면 LDH는 단계적 역학기전에 따라 NADH와 먼저 결합한 후 피루브산 유사물인 oxamate가 고정된 gel에 결합하고 나머지 단백질들은 용출된다. 이때 LDH 동위효소들은 \( \mathrm{NAD}^{+} \)및 oxamate와 복합체를 형성하는 정도에 차이가 있어 각 동위효소들이 gel에 결합하는 힘이 다르고, 이에 따라 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 함유한 buffer 및 buffer를차례로 유입 시 동위효소들의 용출 순서에 차이가 나타나서 동위효소들을 분리 할 수 있다.</p> <p>본 실험에서 쥐노래미 눈 조직 추출액을 oxamate-agarose gel로 affinity chromatography한 결과 NADH를 함유한 buf-fer 유입 시 LDH를 제외한 대부분의 단백질이 용출되었다(Fig. 2). LDH는 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 함유한 buffer 유입 후 19 번째 분획부터 용출되기 시작하여 buffer 유입 후 24 번째 분획까지 용출되었다(Fig. 2). 특히, 본 연구에서는 native-PAGE 상에서 골격근과 심장 조직 사이에 동위효소의 발현양상이 차이를 보이지 않았다(Fig. 1). 따라서 LDH \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소와 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소의 구별을 위해서 affinity chromatography 상에서의 모델이 되는 정제양상을 참고 하여 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 함유한 buffer 유입 후 용출되는 동위효소를 \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소로 보았고 buffer에서 용출되는 동위효소를 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소로 보았다(Fig. 2). LDH \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소는 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 함유한 buffer 유입 후 19-27번 분획에서 용출되었고 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소는 buffer 유입 후 \( 15-24 \)번 분획에서 용출되었다(Fig. 2). 이러한 결과는 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 함유한 buffer 및 buffer를 차례로 유입할 때 LDH \( \mathrm{A}_{4} \)) 동위효소가 용출된 후 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소가 용출되는 고등어, 생쥐 및 쏘가리의 경우와 같았다. Eye-specific LDH \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소를 포함한LDH 분획은 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 함유한 buffer 유입 후 23 번째 분획부터 용출되기 시작하여 buffer 유입 후 7 번째 분획까지 용출되었다(Fig. 2). LDH \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소에 이어서 eye-specific LDH \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소가 용출되는 점은 eye-specific LDH \( mathrm{C}_{4} \) 동위효소가 \( \mathrm{B}_{4} \)보다 \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소와 유사하다는 점을 시사하며 이는 풀망둑과 같은 결과이고 buffer 유입 시 eye-specific LDH \( \mathrm{C}_{4} \)가 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소와 같이 용출되는 고등어와는 다른 결과이다. 이러한 결과는 결국 쥐노래미 눈에서 eye-specific LDH \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소가 관여하는 대사가 고등어 보다는 풀망둑 눈 조직과 유사함을 나타낸다. Eye-specific LDH \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소를 포함한 LDH 분획은 농축하여 continuous-elution 전기영동 시료로 사용하였다. Continuous-elution 전기영동을 실시한 결과 eye-specific LDH \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소만 용출된 분획은 track marker가 용출된 후 10-12번째 분획까지였다(Fig. 3). 본 정제과정에서는 최종 \( 2.4 \% \)의 LDH 수율을 얻었고 \( 45.4 \)배로 정제된 eye-specific LDH \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소를 얻을 수 있었다(Table 2).</p>