EBV에 감염된 B 세포에서 EBV miRNA 발현 양상을 조사하기 위해 Northern blot을 수행하였다. B95-8에서 보고된 5종의 EBV miRNA인 BHRF1-1, BHRF1-2, BHRF1-3, BART1, BART2가 확인되었으며, EBV 음성인 BJAB 세포에서는 EBV miRNA 발현이 전혀 관찰되지 않았다. 또한, 예측된 EBV pri-miRNA와 pre-miRNA에 대해 RT-PCR을 통해 검증하였으며, 일부 pre-miRNA는 예측보다 미미한 검출 결과를 보였다.
<h2>Northern blot</h2> <p>추출한 RNA \( 30 ~ \mu \mathrm { g } \)을 \( 15 \% \) polyacrylamide-urea gel에 전기영동한 후 Zeta-Probe Blotting Membrane (BIO-RAD La-boratories, Hercules, CA)으로 이동시켰다. 각각의 EBV miRNA와 상보적인 oligo-nucleotide 5 ' 말단을 \( \mathrm { P } ^ { 32 } \)-ATP와 T4 kinase를 이용하여 표식하였다. Pre-hybridization과 hy-bridization은 ExpressHyb Hybridization Solution (BD Bio-sciences Clontech, Palo Alto, CA)을 이용하여 수행하였다. Hybridization 후, membrane은 실온에서 \( 2 \times \mathrm { SSC } (0.05 \% \) SDS)로 15 분간 2 번 세척해 준 후 \( 0.1 \times \operatorname { SSC } (0.1 \% \) SDS)로 역시 상온에서 15 분 간 2 번 세척해 주었다. 동량의 RNA가 겔에 loading 되었는지 확인하기 위해 ethidium bromide(EtBr)로 염색하여 5s rRNA 밴드를 비교하였다.</p> <h1>결 과</h1> <h2>EBV 감염 B 세포에서 EBV miRNA 발현 확인</h2> <p>EBV가 감염된 B 세포에서의 EBV miRNA 발현 양상을 살펴보기 위해 Northern blot을 실시하였다. 기대되는 바와 같이 B95-8에서 보고된 5 종의 EBV miRNA 들인 BHRF1-1, BHRF1-2, BHRF1-3, BART1, BART2가 모두 확인되었다. 상대적으로 BART1이 짧은 노출시간(16 시간)에서도 발현이 확인된 반면, BART2의 경우 오랜 시간 동안(7 일 이상) 노출 시에만 확인되었다. EBV 음성 세포주인 BJAB의 경우 EBV miRNA 발현은 전혀 검출되지 않았다. 하지만 인간세포의 miRNA인 miR16의 경우 B95-8과 BJAB에서 모두 발현되는 것을 확인하였다. 겔 상의 5s rRNA를 EtBr로 염색하고 정량하여 동량의 RNA를 loading 하였음을 확인하였다.</p> <h2>EBV miRNA에 대한 pri-miRNA 및 pre-miRNA 발현 확인</h2> <p>동물세포의 miRNA들은 전구체인 pri-miRNA와 pre-miRNA가 단계적인 절단 과정을 거치며 형성된다. EBV miRNA들도 이와 같은 생성 과정을 거치는지 확인하고자 Fig. 1에 제시된 primer들을 사용하여 예측되는 EBV pri-miRNA와 pre-miRNA들에 대한 RT-PCR을 실시하였다. 예측되는 EBV miRNA들이 EBV 게놈의 UTR 또는 인트론 부위에 존재하기 때문에, B95-8에서 추출한 total RNA에 random primer와 oligo \( \mathrm { dT } \)를 1:1로 섞어 reverse transcription하여 얻어진 cDNA를 사용한 결과 보고된 5 종의 EBV miRNA에 대한 예측되는 pri-miRNA들이 모두 증폭되었다. B95-8에서 추출한 RNA를 DNase I으로 처리한 다음 역 전사효소를 첨가하지 않고 반응시켜 PCR한 산물을 음성대조구로 사용하였다. Pre-miRNA의 증폭을 위헤서는 \( 60 \sim 80 \) 뉴클레오타이드 크기의 EBV pre-miRNA 만을 선택적으로 증폭하기 위해서 작은 RNA \( (<200 \mathrm { nt } ) \) 를 분리할 수 있는 \( \operatorname { mirVana } ^ {\mathrm { TM } } \) miRNA isolation kit (Ambion)를 이용하여 RNA를 추출하여 실험하였다. cDNA합성을 위해 random primer를 사용한 결과 BART1, BHRF1-2 및 BHRF1-3에 대해 예측되는 EBV pre-miRNA들은 잘 검출되었으나, BHRF1-1과 BART2에 대해 예측되는 pre-miRNA들은 검출이 미미하였다 (data now shown). 이는 random primer를 사용하는 경우 존재하는 많은 RNA들에 대해 모두 cDNA가 합성되므로 비교적 적은 빈도로 존재할 가능성이 있는 EBV pre-miRNA들의 경우 RT-PCR로 검출이 어려울 수 있기 때문으로 해석할 수 있다. 예상과 같이 random primer를 사용하여 비교적 검출이 어려웠던 pre-BHRF1-1과 pre-BART2의 경우 각 miRNA 특이 reverse primer를 사용해 합성한 cDNA를 PCR에 사용한 결과 숩게 증폭산물을 얻을 수 있었다. 실험에 사용된 RNA가 200 뉴클레오타이드 이하의 작은 크기의 RNA 만을 포함한다는 것을 확인하기 위해, pri-miRNA 중의 하나인 pri-BHRF1-2 특이 primer와 서로 인접하여 위치하는 BHRF1-2와 BHRF1-3을 포함하는 \(223 \mathrm { ~bp } \)의 전사체를 증폭할 수 있는 primer도 함께 사용하여 실험하였다. \( 200 \mathrm { ~bp } \) 이하인 작은 크기의 RNA 만 선별하여 사용한 경우 pri-BHRF1-2 나 BHRF1-2~1-3 전사체돌은 negative control에서와 마찬가지로 증폭되지 않았다.</p>