NGF와 PCNA에 대한 면역조직화학적인 염색은 DAKO LSABKit를 이용하였고, 파라핀 포매 조직에서 절편을 얻은 후 탈파라핀 하고 \(3\%\) hydrogen peroxide에 5분간 반응시킨 뒤 Tris 완충액에 5분간 둔 다음 생리식염 인산염 완충액(PBS)으로 5분 동안 반응시키고 NGF와 PCNA를 각각 \(1: 100\) 으로 희석하여 1 시간 반응시킨 후 Tris 완충액 bath에 5분간 두었다. 발색반응은 substrate-chromogen 용액으로 10 분간 반응시켰고, 조직은 이식 전 분리한 줄기세포와 동맥내에서 1 일간 배양한 신경줄기세포를 채취하였다.
<h2>면역조직화학적 염색</h2> <p>Nerve growth factor(NGF) 와 proliferating cell nuclear antigen (PCNA)에 대한 면역조직화학적인 염색은 DAKO LSABKit를 이용하였다. 파라핀 포매 조직에서 \( 6 \mu \mathrm { m } \) 의 절편을 얻은 후 탈파라핀 하고 \(3 \% \) hydrogen peroxide에 5분간 반응시킨 뒤 증류수로 수세하고 신선한 Tris 완충액에 5분간 둔 다음 생리식염 인산염 완충액(PBS)으로 5 분 동안 반응시키고 NGF(Santa Cruz Co., USA)와 PCNA(DAKO,Denmark)를 각각 \( 1: 100 \) 으로 희석하여 1 시간 반응시킨 후 Tris 완충액 bath에 5 분간 두었다. 반응시킨 절편은 생리식염 인산염 완충액으로 만든 biotinylated anti-rabbit와 anti-mouse immunoglobulin으로 10 분간 반응시킨 후 Tris 완충액으로 수세하고 \( 0.05 \mathrm { M } \) Tris 완충액 \( ( \mathrm { pH } \) 7.6)으로 제조한 streptoavidin peroxidase내에서 10 분간 둔 다음 다시 Tris 완충액으로 수세 후 Tris bath에 5분간 두었다. 발색반응은 \( 2 \mathrm { ml } \) 의 기질 완충액을 눈금 있는 시험관에 넣괴 각 완충액 \( 2 \mathrm { m } \) 마다 AEC chromogen액을 1 방울씩 첨가하고 즉시 혼합한 다음 완충액 \( 2 \mathrm { m } \) 마다 substrate-hydrogen peroxide 용액 1 방울씩 첨가하고 즉시 혼합하여 제조한 substrate-chromogen 용액으로 10 분간 반응시켰다.</p> <h2>전자현미경용 표본의 제작</h2> <p>조직은 이식된 신경줄기세포를 확인하기 위하여 이식 전 분리한 줄기세포와 동맥내에서 1 일간 배양한 신경줄기세포를 채취하였고, 이식 후 10 일, 20 일, 30 일, 40 일, 50 일군으로 구분하여 이식한 조직부위를 채취하였다. 조직의 고정은 \( 0.1 \) \( \mathrm { M } \) phosphate buffer( \( \mathrm { pH } \) 6.8)로 제조한 2.5 \% glutaraldehyde 고정액으로 1시간 동안, \( 1 \% \) osmium으로 1 시간 동안 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 후고정하였다. 조직의 탈수는 에탄을을 이용하고 수지 침투는 propylene oxide와 polyresin을 이용한 통상적인 방법으로 처리하였다. 침투 후 조직은 beem capsule에 포매하포 dry oven에서 \( 35-37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 8 \sim 18 \) 시간, \( 45 \sim 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 하룻밤, \( 55-60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1일, 실온에서 하룻밤 동안 두는 방법으로 중합시켜 블럭을 만들었다. 전자현미경 관찰을 위하여 금색이나 회색을 띠는 초박절편을 200 mesh의 구리 그리드에 얹어 uranyl acetate-lead citrate 이중 전자염색을 시행하였다. 전자염색한 그리드는 \( 100 \mathrm { kV } , 61 \mu \mathrm { A } \) 상태의 투과 전자현미경(JEOL \( 1200 \mathrm { EX } \) II, Japan)으로 5,000 배에서 주로 관찰하였다.</p>