28일 동안 약물을 투여하여 실험에 사용할 조직샘플을 수집하였다. 황산화효소 활성도 측정을 위해 몇 차례에 걸쳐 조직샘플을 용액에 넣고 마쇄한후 조직균직액을 원심분리하여 상측액을 수거하여, SOD assay kit를 이용하여 측정하였다. catalase의 활성도 측정은 catalase assay kit를 이용하여 측정하였다. Malondialdehyde (MDA) 농도는 TBARS assay\( \mathrm{kit} \)를 이용하여 측정하였고, Glutathione (GSH)의 농도도 측정하였다. 실험결과는 평균, 표준오차로 나타내고, 통계학적 분석결과는 GraphPad Prism program을 사용한다.
<h2>조직샘플 수집</h2> <p>28일 동안 약물을 투여한 후 최종 부검 일에 모든 동물들을 Rompun (xylazine hydro chlroride) \( 0.2 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 을 복강에 주사하여 진정시키고 Ketalar (ketamine hydrochlroride) 1\( \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 을 복강 투여하여 마취시킨 후 개복하여 실험에 사용할 간, 신장 및 췌장 조직을 수집하였다.</p> <h2>항산화효소 활성도 측정</h2> <p>SOD 활성도 측정을 위해 간, 신장, 훼장 조직 각 \( 1 \mathrm{~g} \)을 \( 0.25 \)M sucrose, \( 0.5 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 5 \mathrm{mM} \) HEPES 용액으로 마쇄한 후 조직 균질액을 \( 10,000 \mathrm{rpm} \)에서 20 분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 상층액 \( 2 \mathrm{ml} \) 을 다시 \( 12,000 \mathrm{rpm} \)에서 30 분간원심분리하여 그 상층액 \( 1 \mathrm{ml} \)에 ethanol \( 0.25 \mathrm{ml} \), chloroform \( 0.15 \mathrm{ml} \)을 넣고 1 분간 혼합한 후 다시 \( 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 30 분간원심분리하여 상층액을 수거하였다. 상층액 \( 1 \mathrm{ml} \)을 이용하여 SOD 의 활성도를 SOD assay kit를 이용하여 측정하였다.한편, catalase의 활성도 측정을 위해 각 조직 \( 1 \mathrm{~g} \)에 \( 1.15 \% \)\( \mathrm{KCl} \) 용액에 넣고 마쇄한 후 조직 균질액을 \( 15,000 \mathrm{rpm} \)에서 5 분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. \( 1.5 \mathrm{ml} \) 상층액에 \( 1 \mathrm{ml} ~0.01 \mathrm{M} \) phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 7.0), 0.4 \mathrm{ml} ~2 \mathrm{M} \mathrm{~H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 넣고 재빨리 섞은 후 catalase assay kit를 이용하여 측정하였다.<h2>Malondialdehyde (MDA) 측정</h2> <p>조직 내 지질 과산화 산물인 MDA 농도는 TBARS assay\( \mathrm{kit} \)를 이용하여 측정하였다. 즉, 각 조직 \( 1 \mathrm{~g} \)에 \( 1.15 \% \mathrm{KCl} \) 용액에 넣어 조직 균질액을 만든 후 \( 15,000 \mathrm{rpm} \)에서 5 분간 원심분리한 후 상층액을 분리하였다. 상층액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)에 \( 0.2 \mathrm{ml} ~8.1 \% \) SDS, \( 1.5 \mathrm{ml} ~20 \% \) glacial acetic acid, \( 1.5 \mathrm{ml} ~0.8 \% \) TBA를 넣고시험관 혼합기로 섞은 후 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 시간 동안 반응시켰다.이를 실온으로 식힌 다음 혼합액에 \( 1 \mathrm{ml} \) 증류수, \( \mathrm{n} \)-buta-\( \mathrm{nol} / \) pyridine (15:1, v/v) \( 5 \mathrm{ml} \)을 넣고 잘 흔들어 준 다음 5,000\( \mathrm{rpm} \)에서 10 분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 상층액의 흡광도를 spectrophoromter의 \( 532 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다.</p> <h2>Glutathione (GSH) 측정</h2> <p>조직 내 항산화물질인 GSH 농도를 측정하기 위해서 각 조직 \( 1 \mathrm{~g} \)에 \( 1.15 \% \mathrm{KCl} \) 용액에 넣어 조직 균질액을 만든 후 15,000 \( \mathrm{rpm} \)에서 5 분간 원심분리한 후 상층액을 분리하였다. 상층액 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 에 \( 1 \mathrm{ml}~ 0.2 \mathrm{M} \) Tris buffer \( (\mathrm{pH} 8.0), 0.1 \mathrm{ml}~0.01 \mathrm{M} \) DTNB,\( 4 \mathrm{ml} \) methanol을 넣고 실온에서 15 분간 반응시킨 후 \(15,000\mathrm{rpm}\)에서 5 분간 원심분리였으며 상층액의 흡광도를 spec-trophoromter의 \( 412 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험결과는 3회 반복실험에 대한 평균(mean)표준오차(standard deviation; SD)로 나타내었으며, 통계학적 분석은 GraphPad Prism program의 LSD-test를 수행하여 \( p \) 값이 \( 0.05 \) 이하인 경우를 유의성이 있는 것으로 판정하였다.</p>