곤충시료를 distilled water와 dimethyl sulfoxide, ethanol 및 methanol로 각각 증류수와 용매를 가하여 추출하였다.혈장은 채혈 후 원심분리하여 혈장을 분리하고 냉동한 상태로 보관하였으며 항혈전 활성과 트롬빈 저해 활성을 \( \mathrm{~CaCl}_{2} \)를 첨가하여 혈액의 응고시간을 측정하였다. 또한 항트롬빈 활성을 보인 곤충 추출물들은 항산화 활성을 측정 평가하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험재료 및 시료의 조제</h2><p>실험에 사용한 곤충시료는 2004년에서 2007년에 걸쳐 대전대학교 생명과학과에서 준비하였으며, 이미 보고한 곤충시료 library 42종과 추가적으로 확보한 34종을 포함하여 모두 76종을 사용하였다. 확보된 곤충시료는 distilled water, dimethyl sulfoxide (DMSO), ethanol 및 methanol로 기존의 사용된 방법과 동일하게 추출하였다. Distilled water로 추출하는 경우, 시료 \( 10 \mathrm{~g} \)당 \( 100 \mathrm{ml} \)의 증류수를 가하여 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 추출하였으며, DMSO, ethanol 및 methanol로 추출하는 경우에는 시료 \( 10 \mathrm{~g} \)당 \( 100 \mathrm{ml} \)의 용매를 가하여 상온에서 24시간 추출하여, 추출물 304종을 준비하였다. 추출물은 감압 건조하여 분말화한 후, DMSO에 녹인 후 적당한 농도로 희석하여 thrombin time (TT) 및 activated partial thromboplastin time (aPTT) 측정, 열 및 산 안정성 평가에 사용하였다. 혈장은 최근 1개월 동안 약물투여를 받지 않은 지원자의 전혈로부터 조제하였으며, 채혈 후 즉시 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 5,000 \times g \)로 5분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하고 냉동한 상태로 보관하였으며(신선동결혈장), 필요시 상온에서 해동하여 사용하였다.</p><h2>항혈전 활성</h2><p>항혈전 활성은 시료의 TT (thrombin time) 및 aPTT (activated partial thromboplastin time)를 측정하여 평가하였다. 트롬빈 저해 활성은 기존의 보고한 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)를 이용하여 혈액 응고시간을 측정하여 평가하였다. \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 0.5 \mathrm{U} \) 트롬빈(Sigma Co., USA) \( 50 \mu \mathrm{l} \) 와 20 \( \mathrm{mM} \mathrm{CaCl}_{2} 50 \mu \mathrm{l} \), 다양한 농도의 시료 추출액 \( 10 \mu \mathrm{l}\)를 coagulometer의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였으며, 시료 대조군으로는 아스피린(Sigma Co.)을, 용매 대조군으로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 평균 33.1초의 응고시간을 나타내었으며, 트롬빈 저해 활성은 3회 이상 반복한 실험의 평균치를 용매 대조구인 DMSO의 평균치의 비로 나타내었다. TT 측정결과 항혈전 활성이 인정되는 추출물의 경우 aPTT를 측정하였다. aPTT측정의 경우에는, 혈장 \( 100 \mu \mathrm{l} \)와 다양한 농도의 시료 추출액 \( 10 \mu \mathrm{l}\)를 Amelung coagul-ometer KC-1A (Japan)의 튜브에 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 가온한 후, \( 50 \mu l \)의 aPTT reagent (Sigma, ALEXIN\(^{\mathrm{TM}} \) )를 첨가하고 다시 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 반응하였다. 이후 \( 50 \mu \mathrm{l} \mathrm{~CaCl}_{2} \) (\( 35 \mathrm{mM}) \)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조군으로는 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 55.2초의 응고시간을 나타내었다. aPTT의 결과는 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다.</p><h2>곤충 추출물의 항산화 활성</h2><p>항트롬빈 활성이 인정되는 곤충 추출물들의 항산화 활성은 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) radical에 전자를 공여하여 자유기를 소거하는 활성을 측정하여 평가하였다. 먼저, 다양한 농도로 희석한 시료 \( 20 \mu \mathrm{l}\)에 \( 99.5 \% \) 에탄올에 용해시킨 \( 2 \times 10^{4} \mathrm{M} \) DPPH 용액 \( 380 \mu \mathrm{l} \)를 넣고 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 분 동안 반응시킨 후, \( 516 \mathrm{~nm} \)에서 microplate reader (Asys Hitech, Expert96, Asys Co., Austria)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 대조구로는 butyl hydroxytoluene, vitamin C 및 vitamin E (Sigma Co., USA)를 사용하였다. DPPH free radical 소거능은 시료첨가구와 비첨가구의 백분율로 표시하였으며, \( \mathrm{IC}_{50} \)는 \( 50 \% \) 소거능을 나타내는 농도로 계산하였다.</p><p>DPPH scavenging activity (\( \% \))</p><p>\( =\{1-( \) Sample O.D. \( ) /( \) Control O.D. \( )\} \times 100 \)</p>