본 논문에서는 Folin과 Denis의 방법을 활용해 섬괴불나무 잎 추출물 \( 1 \mathrm{~mL} \), 동량의 \( 95 \% \) 에탄올 \( 1 \mathrm{~mL} \)와 \( 5 \mathrm{~mL} \)의 증류수를 첨가한 후 \( 2 \mathrm{~N} \) 농도의 Folin-ciocalteu reagent를 \( 1 \mathrm{~N} \)농도로 희석해 \( 0.5 \mathrm{~mL} \)를 넣어 추출물에 들어있는 TPC를 측정했다. Blois의 방법을 활용해 라디칼의 생성 여부에 따라 보라색으로 변하는 라디칼 변화 활성 중 DPPH radical 소거능과 Cushman과 Cheung의 방법을 활용해 ACE 저해 효과를 측정했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료 및 추출물 제조</h2> <p>섬괴불나무의 잎은 울릉도에서 자생하는 것을 채취하여 원기재문과 참고문헌을 이용하여 동정하였으며, 잎을 제외한 이물질을 제거한 후, \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) dry oven에서 건조하였다. 건조한 시료는 분쇄기를 이용하여 \(40\) mesh로 분쇄하여 사용하였다. 열수 추출물의 제조는 시료 \( 1 \mathrm{~g} \) 에 증류수 \( 200 \mathrm{~mL} \)를 넣고 가열하여 액이 \( 100 \mathrm{~mL} \)이 되었을 때 냉각하였으며, 용매 추출에서는 \( 1 \mathrm{~g} \)의 시료에 \(10\)-\(100\%\) 에탄올 용액, 메탄올, 아세톤, 부탄올을 각각 \( 100 \mathrm{~mL} \) 씩 가하여 homogeniger로 \( 20,000 \)rpm 에서 \(1\)분간 균질화하였다. 추출물 모두 \(12\)시간 이상 교반 추출하고 추출액은 whatman No. \(1\) filter paper로 여과한 후 섬괴불나무 잎 추출물의 total phenolic contents (TPC)를 측정하였으며, TPC를 조절하기 위해 rotary vacuum evaporator (Eyela NE, Tokyo, Japan)로 농축하여 항산화, 생리활성 효소 억제 효과, 항균효과 측정에 사용하였다.</p> <h2>TPC 측정</h2> <p>추출물에 함유된 TPC를 측정하기 위해 Folin과 Denis의 방법에 준하여 섬괴불나무 잎 추출물 \( 1 \mathrm{~mL} \), 동량의 \( 95 \% \) 에탄올 \( 1 \mathrm{~mL} \) 와 \( 5 \mathrm{~mL} \) 의 증류수를 첨가한 후 \( 2 \mathrm{~N} \) 농도의 Folin-ciocalteu reagent를 \( 1 \mathrm{~N} \) 농도로 희석하여 \( 0.5 \mathrm{~mL} \)를 첨가하였다. 발색시약인 \( \mathrm{Na}_{2}{CO}_{3} \) \( 1 \mathrm{~mL} \) 를 섞어주고 암실에서 \(1\)시간 이내로 반응시켰다. TPC는 \(725 \mathrm{~nm} \) 의 흡광도를 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선으로 계산하였다.</p> <h2>\(1\),\(1\)-diphenyl-\(2\)-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거능과 anti-oxidant protection factor (PF) 측정</h2> <p>Blois의 방법에 준하여 라디칼의 생성 여부에 따라 보라색으로 변하는 라디칼 변화 활성 중 DPPH radical 소거능을 측정하였다. 섬괴불나무 잎 추출물 \( 1 \mathrm{~mL} \)에 \( 60 \mu \mathrm{M}\) \(DPPH\) \( 3 \mathrm{~mL} \)를 첨가하고 mixing 한 후 실온에서 \(15\)분 동안 시약 반응을 시켰다. 측정은 흡광도를 사용하여 \( 517 \mathrm{~nm} \)의 파장에서 측정하였으며, 추출물의 흡광도와 대조구의 흡광도 차이를 이용하여 계산하였다. Jo와 Cho의 방법에 준하여 \( \beta \)-carotene의 산화 억제력에 따라 지용성 항산화 활성을 나타내는 PF는 evaporator용 수기에 \( \beta \)-carotene과 chloroform을 각각 \( 1 \mathrm{mg} \) 당 \( 5 \mathrm{~mL} \) 비율로 제조하여 \( 1 \mathrm{~mL} \) 를 넣고 \( 40\)-\(50^{\circ} \mathrm{C} \) water bath를 통해 용액을 증류시킨 다음, 각각의 linoleic acid와 tween \(40\) 을 \( 20\), \(184 \mu \mathrm{L} \)씩 분주하여 \( \beta \)-carotene을 재용해한다. Emulsion 용액을 제조하기 위해 \( 50 \mathrm{~mL} \)의 \(\mathrm{H}_{2}{O}_{2} \)를 넣어주고, 섬괴불나무 잎 추출물 \( 100 \mu \mathrm{L} \)와 emulsion \( 5 \mathrm{~mL} \) 을 혼합하여 vortex한 후 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 의 water bath에서 \(30\)분간 반응시켜 \( 470 \mathrm{~nm} \) 의 파장에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>XOase 저해 효과 측정</h2> <p>Cushman과 Cheung의 방법에 준하여 ACE 저해 효과를 측정하였다. 샘플군은 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} 8.3 \))에 \( 0.3 \mathrm{M}\) \(\mathrm{NaCl}\)를 첨가하여 제조한 용액에 \( 2.5 \mathrm{mM} \) hippuryl-L-histidyl-L-leucine (HHL, Sigma-Aldrich Co, Louis, MO, USA)를 녹인 기질용액 \( 0.15 \mathrm{~mL} \)와 ACE \(0.25 \mathrm{unit} / \mathrm{mL}\), Sigma-Aldrich Co.) \( 0.1 \mathrm{~mL} \), 섬괴불나무 잎 추출물 \( 0.1 \mathrm{~mL} \) 를 혼합하였으며, 대조군은 추출물 대신 증류수 \( 0.1 \mathrm{~mL} \)를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(30\)분간 시약 반응시킨 후 \( 1 \mathrm{~N} \) HCl \(0.25 \mathrm{~mL} \) 를 첨가하여 시약 반응을 정지시킨 뒤 \( 3 \mathrm{~mL} \) 의 ethyl acetate를 첨가하였다. Ethyl acetate 층으로부터 용매를 증류시킨 잔사에 \( 2 \mathrm{~mL} \)의 증류수를 첨가하여 추출된 hippuric acid를 흡광도 \( 280 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하여 표준곡선을 통해 계산하였다.</p>