갑상선 세포에서는 서로 다른 농도의 sericin이 첨가되어 48시간 동안 배양된 후에, Tg-mRNA의 발현량과 Tg 단백질의 분비량이 조사되었다. 일정 수준 이상의 sericin 농도에서는 sericin 의존적으로 분비 Tg가 증가하였다. 또한, ER chaperone과 ER signal 관련 인자의 발현이 sericin에 의해 증가하였고, 이들의 증가된 발현이 연속적인 발현에 영향을 미치는지 확인하였다. ER stress는 신생 분비단백질의 생합성에 기여하는 것으로 파악되었다. 또한, ER molecular chaperone의 발현과 관련하여, sericin에 의한 Tg의 분비증가는 분비 당단백질의 생합성촉진과 분비능력향상에 크게 기여하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <p>갑상선세포의 정상적인 배양조건에서 각각 다른 농도의 sericin 첨가하여 다시 48시간 배양한 후 Tg-mRNA의 발현양과 세포 외로 분비되는 Tg 단백질 양을 조사하였다. ER stress유도물질인 tunicamycin을 처리하였을 때에는 Tg-mRNA의 발현감소가 크게 없지만 세포 외로 분비되는 Tg는 거의 관찰되지 않았다. Sericin을 처리한 세포에서도 현저한 Tg-mRNA의 발현양의 변화는 없었다. 그러나 세포 외로 분비된 Tg의 양은 sericin을 \( 0.5 \mathrm{\mu g} / \mathrm{\mu l} \)을 처리하였을 때에는 오히려 분비된 Tg 양이 감소하였지만, \( 1 \mathrm{\mu g} / \mathrm{\mu l} \)의 경우는 con-trol에서 보다 조금 많은 양의 Tg을 분비하였으며 \( 2.5 \mu \mathrm{g} / \mu \mathrm{l} \) 농도에서는 분비된 Tg가 현저하게 증가하였다. 이 결과는 일정 수준이상의 sericin 농도에서는 sericin 의존적으로 분비 Tg가 증가되는 것을 의미한다. 그러나 엄격하게 sericin이 ER내에서 Tg의 folding & assembly를 도와서 증가하였는지, 아니면 Tg의 분비기전을 activation하여 Tg의 분비가 증가하였는지는 알 수 없었다. 그래서 Tg가 ER내에서 folding & assem-bly할 때에 깊이 관여하는 ER molecular chaperone의 발현을 관찰하고자 하였다.</p> <p>일반적으로 분비단백질의 세포외분비가 현저한 상태에서는 ER chaperone의 활발한 작용이 알려져 있다. 위 실험결과 sericin에 의해서 Tg 분비가 촉진되었다. Fig. 2의 결과는 sericin에 의해서 변화하는 ER lumen의 ER molecular chaper-one과 ER membrane에 존재하며 ER signal pathway에 관여하는 단백질의 발현을 실험한 것이다. ER stress를 받지 않았을 때에는 ER lumen에서 IRE1, PERK 등과 결합하고 있다가 ER stress를 받으면 이들로부터 분리되어 malfolded (unfolded/misfolded) protein을 돕기 위하여 높은 발현을 보이는 Bip의 발현이 sericin에 의해서 증가하였다. 그리고 정상적이지 않은 당쇄가 존재하는 당단백질을 인식하는 calreticu-lin 역시 발현이 증가하였다. 그러나 Bip과 calreticulin의 발현 정도는 tunicamycin에 의한 적극적인 ER stress일 때보다는 상대적으로 약한 발현이다. 이는 ER lumen에 생긴 malfolded protein의 repairing을 위한 발현증가라기보다는 짧은 시간에 대량의 분비 Tg을 만들기 위하여 많은 양의 Bip과 calreticulin을 필요로 하는 것으로 볼 수 있다. 그리고 ER membrane에 존재하는 3종류(IRE1, PERK, ATF6)의 신호전달 단백질의 발현 역시도 control에 비하여 증가하였지만 tunicamycin을 처리하였을 때보다는 약하였다. 이런 이유로 Fig. 2에서 얻은 결과는 sericin에 의해서 ER stress를 유도하는 것보다는 대량으로 새로이 생합성 되는 Tg 생산을 위하여 요구되는 많은 양의 ER chaperone과 ER signal 관련인자로 볼 수 있다.</p> <p>위의 결과와 같이 ER chaperone과 ER signal 관련인자가 sericin에 의해서 발현이 증가하였다, 이들의 증가된 발현이 하부단계의 연속적인 발현으로 이어지는지를 확인하였다. ER stress에 의해서 IRE1의 발현이 증가하면 하부의 XBP-1의 mRNA splicing (Pst I 제한효소 site를 포함하는 중간의 \( 23 \mathrm{bp} \)가 제거)이 일어나 XBP-1 단백질이 생산되어 chaperone 생합성발현을 촉진하는 것이 알려져 있다. 각각 다른 농도의 sericin을 처리한 한 후에 XBP-1의 PCR 산물을 Pst I 처리하여 전기영동 하였다. 화살표가 가리키는 밴드가 ER stress의 강도를 나타낸다. Control에 비교하여 tunicamycin을 처리하면 ER stress를 받아서 화살표가 가리키는 밴드가 강하게 보인다. 그러나 sericin처리에 의해서는 control과 비교하여 현저한 발현증가는 없지만 일정한 정도의 ER stress를 받고 있는 것 같다. 그러나 Fig. 2의 결과와 연관하여 생각할 때에, sericin에 의한 ER stress는 신생 분비단백질의 생합성에 관여하는 정도의 상승된 발현을 보인다고 할 수 있다.</p> <p>ER stress에 의해서 PERK 발현이 증가하면 하부단계의 eIF2a의 인산화 eIF2a-P가 일어나 전체적인 단백질전사가 억제되는 것이 알려져 있다. Sericin 처리에 의한 eIF2a의 인산화 정도를 실험하였다. Sericin농도가 증가하면서 eIF2a의 발현이 control보다 증가하였지만 eIF2a-P의 인산화는 전혀 변화가 없다. eIF2a의 발현증가는 앞에서 ER chaperone의 발현 증가와 같이 신생 Tg의 대량생산에 따른 증가로 보인다. 그러나 sericin처리에도 eIF2a의 인산화 발현에는 변화가 없는 것은 sericin에 의해서 단백질생합성을 감소시키는 적극적인 ER stress로 작용하지 않는다는 것을 의미한다.</p> <p>Sericin은 murine hybridoma 2E3-O, human hepato-blastoma HepG2, human epithelial HeLa 그리고 human em-bryonal kidney 293 세포주의 증식을 촉진하는 것이 알려져 있다. 그리고 동물세포의 증식을 촉진하기 위한 세포배양배지의 좋은 공급원으로 사용되고, 다양한 세포배양용 배지에 FBS 대신 첨가하여도 냉동보존에도 이용되고 있다. Sericin 처리에 의한 세포증식 실험의 결과, Fig. 5에서 보는 것과 같이 sericin처리한 세포들은 negative control로 tunicamycin을 처리한 세포보다는 일정한 범위 내에서 세포생장이 촉진하는 것이 관찰되었다. 즉, sericin을 \( 0.5\mu \mathrm{g}/\mu \mathrm{l} \) 첨가 했을 때 세포증식이 가장 많이 되었고, 그 이상의 농도에서도 일정 수준 이상의 세포증식이 관찰되었다. 이는 세포 내 단백질합성이 활발하여져서 각종 대사기전의 활성으로 말미암아 세포증식도 촉진되는 것으로 생각된다.</p> <p>위와 같이 ER molecular chaperone의 발현이 연관되어 ser-icin에 의한 Tg의 분비증가는 분비 당단백질의 생합성촉진과 분비능력향상에 크게 기여할 것이다. 결국 이것은 sericin이 새로운 기능성 생체재료로 사용될 수 있는 것을 의미한다.</p>