본 연구에서는 cyclosporin A 고생산 변이주인 YHC-004를, 균주의 계대배양 및 종균배양에는 MY 배지를 사용한다. 건조 균체량은 \( 10 \mathrm{~mL} \)의 배양액을 측정한다. 시료는 HPLC를 활용하여 Kreuzig 방법을 변형하여 분석하였으며, 컬럼은 Nucleosil 5 C 8 ( 4 m m × 250 m m ) 5 C 8 ​ (4 mm×250 mm)을 사용하였고, 이동상은 acetonitrile : water = 57 : 43 =57:43을 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주</h2> <p>본 연구에서는 \(T. inflatum\) ATCC 34921 로부터 유래된 cyclosporin A 고생산 변이주인 YHC-004를 사용하였다. 고생산성 변이주 YHC-004는 모균주 \(T. inflatum\) ATCC 34921의 포자 현탁액을 약 \( 10^{4} ~\mathrm{cfu} / \mathrm{mL} \)의 농도가 되도록 희석한 후, MY배지에 도말하고, 2시간 preincubation 시킨 후 UV를 38초간 조사하여 얻었다. UV 조사 시간은 \(T. inflatum\) ATCC 34921의 포자를 이용하여 미리 구한 UV 치사곡선에서 치사율 \( 99 \% \)에 해당되는 것이었다. UV 조사 후 얻어진 변이주들 가운데, \(Aspergilus~niger\)를 피검균주로 한 한천 확산법으로 생물학적 항균활성이 가장 높은 것을 1차로 선별하였고, 다시 액체 배양하여 얻어진 배양액을 HPLC로 분석하여 cyclosporin A 역가가 가장 높은 것들을 2차선별한 결과, 고생산성 변이주 YHC-004를 얻을 수 있었다. 이렇게 얻어진 변이주 YHC-004는 MY배지에서 배양하여 얻어진 포자 및 균사체를 멸균된 \( 20 \% \) glycerol 용액에 현탁시켜 \( -25^{\circ} \mathrm{C} \) 또는 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동실에 보존하면서 종균으로 사용하였다.</p> <h2>배지 및 배양 조건</h2> <p>균주의 계대배양 및 종균배양에는 MY 배지(malt extract \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \), yeast extract \( 4 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \), agar \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \))를 사용하였다. Cyclosporin A 생산을 위해 사용된 변형된 SSM 배지는 maltose \( 80 \mathrm{~g} \), Bacto-peptone \( 20 \mathrm{~g}, \mathrm{KCl}~ 2.5 \mathrm{~g}, \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}~ 5 \)\( \mathrm{g}, \mathrm{ZnSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ~30 \mathrm{mg},\left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4}~5 \mathrm{~g} \), trace elements 용액 \( 4 \mathrm{~mL} \)를 증류수에 녹여 \( \mathrm{pH} 5.7 \)로 맞춘 후 \( 1 \mathrm{~L} \)가 되도록 하였다. Trace element 용액은 \( \mathrm{MnCl}_2 \cdot 4 \mathrm{H}_2 \mathrm{O} \)\( 180~\mathrm{mg},\left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{6} \mathrm{Mo}_{7} \mathrm{O}_{24} \cdot 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}~20 \mathrm{mg}, \mathrm{CuSO}_{4} \cdot 5 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ~80 \mathrm{mg} \),\( ~\mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ~5000 \mathrm{mg} \)을 \( 1 \mathrm{~L} \)의 증류수에 용해하여 제조하였다. 플라스크 배양은 NBS-4330 rotary shaker(New Brunswick Scientific, NJ, USA)를 사용하였고, \( 100 \mathrm{~mL} \)의 배양액을 포함한 \( 500 \mathrm{~mL} \) baffled flask에서 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rpm} \)의 조건으로 실시하였다.</p> <h2>건조 균체량의 측정</h2> <p>건조 균체량은 \( 10 \mathrm{~mL} \)의 배양액을 미리 무게를 측정해 놓은 여과지(Whatman GF/C)에 감압 여과한 후 증류수로 세척한 다음 \( 105^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4시간 동안 건조시켜 측정하였다.</p> <h2>배양액으로부터 cyclosporin \( \mathrm{A} \)의 추출</h2> <p>\( 50 \mathrm{~mL} \) Falcon tube에 배양액 \( 10 \mathrm{~mL} \)를 취한 후 \( 10 \mathrm{N} ~\mathrm{NaOH} \)\(~ 1 \mathrm{~mL} \)를 첨가하고 진탕한 후 \( 10 \mathrm{~mL} \)의 \( \mathrm{n} \)-butyl acetate를 첨가하여 \( 27^{\circ} \mathrm{C}, 180 \mathrm{~rpm} \)으로 18시간 추출하였다. 추출이 완료되면 원심분리( \( 3,000 \times \mathrm{g}, 10 \)분)하여 n-butyl acetate 층과 배양액층을 분리하였다. 분리된 \( 0.5 \mathrm{~mL} \) n-butyl acetate를 drying vial에 옮긴 후 heating block\( \left(60^{\circ} \mathrm{C}\right) \)에 넣고 multinozzle manifold를 통하여 blowing air를 공급하여 건조하였다. 건조 후 \( 1 \mathrm{~mL} \) ethyl alcohol를 최초 농도의 2배 희석이 되도록 첨가한 후 격렬하게 흔들어 남은 cyclosporin A를 용해하였다. 용해된 시료는 \( 0.2 ~\mu \mathrm{m} \) filter(Minisart, Sartorius사)로 불순물을 제거한 후 분석을 위한 시료로 사용하였다.</p> <h2>HPLC 분석</h2> <p>Cyclosporin A 추출법에 따라 준비된 시료는 HPLC(Jasco, Japan)를 사용하여 Kreuzig 방법을 변형하여 분석하였다. 컬럼은 Nucleosil \( 5 ~\mathrm{C}_{8}(4 \mathrm{~mm} \times 250 \mathrm{~mm}) \)을 사용하였고, 이동상은 acetonitrile : water \( =57: 43 \)을 사용하였다. 시료주입량 \( 5 \mu \mathrm{L} \)였고, 유속은 \( 1 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \), 컬럼온도는 \( 75^{\circ} \mathrm{C} \)였으며, 검출기의 파장은 UV \( 210 \mathrm{~nm} \)로 하여 분리하였다. 표준 물질로 cyclosporin \( \mathrm{A}, \mathrm{B}, \mathrm{C}, \mathrm{D}, \mathrm{G}, \mathrm{U} \)를 사용하여 정량적으로 비교 분석하였다. Cyclosporin 각 유도체들의 HPLC분석시 체류시간은 용출 순서대로 cyclosporin C가 10.93분, cyclosporin B가 12.05분 cyclosporin U가 13.76분 cyclosporin A가 15.06분 cyclosporin G가 17.56분, cyclosporin D가 19.75분이었다(Fig. 2).</p> <p>Ratio of cyclosporin A (\(\%\)) \[=\frac{\text { Cyclosporin } \mathrm{A}(\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL})}{\text { Cyclosporin }(\mathrm{A}+\mathrm{B}+\mathrm{C}+\mathrm{D}+\mathrm{G}+\mathrm{U})(\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL})} \times 100\]</p>