Difco Gram 염색 키트로 Gram 염색 후 광학 현미경(Nikon Eclipse E200 모델)을 사용하여 세포 형태를 검사했습니다. 16S rDNA 영역은 16S-27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG\( \left.3^{\prime}\right) \) 및 16S-1492R 프라이머(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')로 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 증폭되었습니다. 200~800 염기쌍(bp) 범위의 주요 단편을 아가로스 겔에서 정제하고 T-블런트 플라스미드에 개별적으로 클로닝했습니다. 이어서 염기 클로닝을 위해 M13-F 및 M13-R 프라이머를 사용하여 10개의 콜로니에 대해 서열 분석을 수행하였으며 모든 PCR 유래 클론을 확인하기 위해 DNA염기서열을 분석하여 수행하고 확인하였습니다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>배지</h2> <p>호염성 세균을 분리하고 배양하기 위해 marine 한천배지 (KisanBiotech, Korea)를 사용하였다. 필요할 경우, \( 80 \mathrm{~g} / \mathrm{l}\)의 염화나트륨과 \( 10 \mathrm{~g} /\mathrm{l} \)의 전지분유 (skim milk)를 첨가하여 사용하였다.</p> <h2>세포성장 및 단백질분해효소 생산</h2> <p>세포성장과 단백질분해효소를 생산할 목적으로, 분리된 균을 \( 30 \mathrm{ml} \)의 marine 배지를 함유한 \( 250 \mathrm{ml} \) 플라스크에서 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \), 24시간 배양하였다. 이때, 염화나트륨을 각각 \(0, 4, 8, 12, 16, 20, 24 \%~(\mathrm{~w} / \mathrm{v}) \) 첨가하였다. 세포성장은 분광광도계(Shimadzu UV mini-1240)를 사용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 관찰하였다.</p> <h2>단백질분해효소를 분비하는 호염성 세균의 분리</h2> <p>\( 4 \mathrm{~kg} \)의 멸치와 \( 1 \mathrm{~kg} \)의 소금을 흔합하고 밀봉한 다음 \( 15 \sim 20 { }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하면서 3, 6, 12주 후에 각각 주기적으로 표본을 취하였다. 샘플은 \( 10 \% \) 식염수에 희석한 후 \( 10 \% \mathrm{~NaCl} \)과 \( 1 \% \) 전지분유를 함유한 marine 한천배지에 도말하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2~4일간 배양하였다. 흰 한천배지에서 콜로니 주변에 큰 환을 형성하는 균를 예비적으로 선별하였으며, 분리된 균주들은 2~3회 순수분리 후 \( 20 \% \) 글리세롤에 보관하면서 사용하였다.</p> <h2>호염성세균의 동정</h2> <p>세포의 형태는 그람염색(Difco Gram stain kit 사용) 후 광학현미경(Model Nikon Eclipse E200)으로 관찰하였다. 생화학적 실험은 API kit (20 NE, 50 CHB)를 사용하였다.</p> <h2>16S rDNA 증폭과 염기서열 분석</h2> <p>16S rDNA는 16S-27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG\( \left.3^{\prime}\right) \)와 16S-1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 증폭하였다. 증폭된 DNA 단편은 솔젠트(주)의 plasmid T-blunt와 접합(ligation)하여 대장균 TOP10에 형질전환하였다. 10개의 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 추출하여 M13-F (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'), M13-R (5'GGAAACAGCTATGACCATG-3'), 16S-785F (5'-GGATTAG ATACCCTGGTA-3'), 그리고 16S-805R (5'-GACTACCAGGG TATCTAATC-3') 프라이머를 이용하여 염기서열을 분석하였다.</p> <h2>16S-23S ribosomal RNA 유전자사이 공간(intergenic spacer, IGS)의 증폭과 염기서열분석</h2> <p>16S-23S IGS는 16/23S-1525F (5'-GCTGGATCACCTCCT TTCT-3')와 16/23S-40R (5'-CTGGTGCCAAGGCATCCA-3') 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 아가로즈 젤에서 200~800 염기쌍(base pair, bp) 사이의 주요 단편을 정제하여 T-blunt plasmid에 각각 클로닝하고, 그로부터 얻은 10개의 콜로니를 이용하여 M13-F 와 M13-R 프라이머를 사용하여 염기서열을 분석하였다.</p> <h2>염기서열의 분석</h2> <p>16S rDNA와 16S-23S IGS의 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI; http://www.ncbi.nlm. nih.gov/)의 BLAST server를 사용하여 분석하였다. 다중서열 배열 (multiple sequence alignment)은 CLUSTAL W 프로그램을 사용하여 분석하였다. 계통발생도(phylogenetic tree)는 MEGA5 프로그램을 이용하여, 통계적 방법은 neigh-bor-joining 법으로 계통발생론 평가는 Bootstrap법을 이용하여 구축하였다. 16S-23S IGS에 존재하는 tRNA의 분석은 transfer RNA database server (http://trnadb.bioinf.unileipzig.de/)를 사용하였다.</p> <h2>재조합 DNA 기술</h2> <p>모든 재조합 DNA 기술은 분자클로닝(molecular cloning)에 기술된 방법에 준하여 실시하였다. 세포내 염색체 DNA는 염색체 DNA 정제키트(Qiagen, Dutch)를 사용하여 분리하였다. DNA 증폭은 Pfu-X DNA polymerase (솔젠트, 한국)를 사용하였다. PCR 정제와 겔 추출키트는 Gene All Biotechnology (한국) 제품을 사용하였다. PCR로 얻은 모든 클론은 DNA염기서열을 분석하여 확인하였다.</p> <h2>염기서열 가입번호(accession number)</h2> <p>16S rDNA와 16S-23S IGS 부위 DNA 염기서열의 GenBank 가입번호는 JN381953 JN382964이다.</p> <h2>단백질분해효소 분석법</h2> <p>단백질분해효소의 효소활성도는 Chung 등이 기술한 방법을 변형하여 측정하였다. \( 2 \% \) 카제인을 함유한 \( 2.5 \mathrm{~ml} \)의 \(100\mathrm{~mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) buffer \( (\mathrm{pH} \) 8.0)와 \( 0.2 \mathrm{~ml} \)의 세포배양액을 혼합한 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응하였다. 반응은 \( 30 \% \) trichloroacetic acid를 \( 1 \mathrm{~ml} \) 첨가하여 정지한 다음, \( 13,000 \mathrm{~rpm} \)에서 10분간 원심분리 후, \( 280 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 단백질분해효소 활성도 1 Unit는 30분간 1 흡광도 증가를 촉매하는 효소의 양으로 정의하였다. 효소 활성도와 세포성장 흡광도는 5회 반복하여 측정하여 평균치를 표시하였다.</p>