신경 조직은 \(-20 ^ {\circ } \mathrm { C }\)에서 냉동한 후 20μm 두께로 절단하여 슬라이드에 부착하였다. 이후 이중 면역형광 염색법을 위해 PBS에 슬라이드를 45분간 담가 고정시켰다. 신경 상해 후 쥐의 기능적 평가는 sciatic functional index(SFI)를 이용해 발바닥 모양으로 평가하였다. 이때 SFI 값이 0이면 정상, -100 이상이면 신경 기능이 완전히 상실되었음을 의미한다. 연구 데이터 처리는 SPSS를 이용해 각 항목의 평균과 표준편차를 구하고, 일원변량 분산분석을 이용해 그룹 간 차이를 분석하였다.
<h2>면 역형광 염색법 (Immunofluorescence staining)</h2> <p>신경 조직은 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 냉동시킨 후 cyostat를 이용하여 \( 20 \mu \mathrm { m } \) 의 두께로 잘라 슬라이드에 붙인다. 이중 면역형광 염색법(double immunofluorescence staining)을 수행하기 위해, \( 4 \% \) paraformaldehyde, \( 4 \% \) sucrose가 혼합된 PBS [137 \( \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } , 2.7 \mathrm { mM } \mathrm { KCl } , 10 \mathrm { mM } \mathrm { Na } 2 \mathrm { PO } 4,2 \mathrm { mM } \mathrm { KH } 2 \mathrm { PO } 4 \) \( ( \mathrm { pH } 7.4)] \) 에 45 분 동안 슬라이드를 넣어 조직을 고정시킨다. 그 후 \( 0.5 \% \) nonidet \( \mathrm { P } -40 \) 이 함유된 \( \mathrm { PBS } \) 를 각 조직에 처리하여 세포에 투과성을 높여주고, Antibody 와의 비특이적 결합을 막기 위해 PBST에 \( 2.5 \% \) BSA, \( 2.5 \% \) horse serum을 함유하고 있는 blocking buffer에 4시간 동안 담그어 놓는다. 4시간 후 각 조직에 첫 번째 antibody를 처리하게 되는데, 좌골 신경(SN), 감각신경절(DRG), 척수(SC) 조직에 첫 번째 antibody로 anti-neurofilament 200 antibody (NF-200, N52, sigma), anti- \( \beta \) III-tubulin antibody (TUJ1, Covarice), anti-S100 \( \beta \) antibody (Dako), anti-NGF antibody, anti-BDNF antibody, anti-NT-3 antibody 그리고 anti-GAP-43 antibody를 처리한다. 이 때 antibody는 \( 2.5 \% \mathrm { BSA } , 2.5 \% \) horse serum을 함유하고 있는 blocking buffer에 1:200에 비율로 혼합하여 처리한 후 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 16 시간 동안 반응시킨다. 첫 번째 antibody의 반응이 끝난 후 PBST로 조직을 씻어내고, \( 2.5 \% \mathrm { BSA } , 2.5 \% \) horse serum을 함유하고 있는 blocking buffer에 Fluorescein-goat anti-mouse와 Rhodamin-goat anti-rabbit antibody (Molecular probes)를 1:100으로 혼합하여 암실에서 1시간 30분 동안 두 번째 antibody 처리를 수행한다. 두 번째 antibody는 빛에 민감하기 때문에 반응 시간동안 반드시 암실에서 수행되어져야만 한다. 마지막으로 gelatin mount medium을 이용하여 cover-slide를 붙인다. 본 연구에서는 두 번째 antibody만 처리한 control slide를 첨부하는데 이것은 antibody의 반응이 정확한지를 확인하기 위한 것이다. 모든 조직 sample은 형광현미경(Zeiss fluorescent microscope)을 통해 관찰되었고, images는 Axioskop camera를 이용하여 찍었다. 디지털 카메라로 찍은 모든 images는 Adobe Photoshop (version 5.5)을 이용하여 green과 red의 밝기와 강도를 같은 비율로 증폭시켜 관찰하였다. 그리고 Photoshop program의 Layer blending mode options를 이용 images를 중복시켜 관찰하여 각 단백질의 발현 위치를 관찰하였다.</p> <h2>Sciatic functional index (SFI)</h2> <p>기능적인 평가는 좌골 신경 상해 후 쥐의 발바닥에 검은색 잉크를 문힌 후 하얀 종이 위에 직선으로 걷게 하여 찍힌 발의 모양으로 계산하는 sciatic functional index (SFI)로 평가하였다. SFI는 4개 구성요소로 이루어졌다. 상해 받은쪽 발의 발가락 펴짐 정도(experimental toe spread, ETS), 정상인 발의 발가락 펴짐 정도(normal toe spread, NTS), 상해 받은 쪽 발의 프린트된 발의 길이(experimental paw length, EPL) 그리고 정상인 발의 프린트된 발의 길이(normal paw length, NPL) 이다. 실험에서 얻어진 값은 아래의 공식에 대입하여 SFI 값을 산출하게 된다. SFI의 값이 0 이 되면 정상으로 판정하고, -100이상이면 좌골신경에 기능이 완전히 상실했다는 것을 의미한다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>본 연구의 자료 처리는 SPSS 통계프로그램을 이용하여 각 항목별 평균과 표준편차를 구하였고, 항목별 그룹간의 차이를 알아보기 위해 일원변량 분산분석(one-way ANOVA)를 이용하였다. 유의차가 나타난 항목에 대한 사후검증은 Duncan의 방법을 이용하였다. 통계적 유의수준은 \( * \) \( \mathrm { p }<.05 \)와 \(** \) \( \mathrm { p }<.005 \)로 정하였다.</p>