DNA 단편의 정확성을 위해서 Pyrobest DNA polymerase를 이용하였고, 증폭이 끝난 반응액은 전기영동을을 행하여 목적 DNA 단편을 확인할 수 있다. Enterococcus faecalis 균체로부터 genomic DNA를 Genomic DNA isolation kit을 사용하여 분리하고, forward primer EF_ADC02-F와 reverse primer EF_ADC02-R을 이용하여 ADC 유전자 단편의 중폭을 행하였으며, Pyrobest DNA polymerase를 이용하여 95\(^\circ \mathrm{C}\) 5분간 반응한 후 30 cycle의 95\(^\circ \mathrm{C}\) 30초, 55\(^\circ \mathrm{C}\) 30초 및 72\(^\circ \mathrm{C}\) 1분간 진행하여 증폭하였다.
<h2>ADC 유전자의 증폭, cloning 및 발현플라스미드의 제작</h2> <p>Genomic DNA isolation kit (Promega)를 사용하여 확보 된 Enterococcus faecalis 균체로부터 genomic DNA를 분리하였다. 분리된 Enterococcus faecalis의 genomic DNA를 주형으로 하여 forward primer EF_ADC02-F와 reverse primer EF_ADC02-R을 이용하여 ADC 유전자 단편의 중폭(PerkinElmer model 2400 thermal cycle, USA)을 행하였다. DNA 단편의 증폭은 정확성을 기하기 위하여 Pyrobest DNA polymerase (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)를 이용하였다. 증폭 조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 반응한 후 30 cycle의 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 1분을 반복 수행하였고 마지막 extension을 위하여 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시켰다. 증폭이 끝난 반응액은 \( 0.8 \% \) agarose gel에서 전기영동을 행하여 목적 DNA 단편을 확인하였다. 목적 DNA 단편을 pGEM-T easy vector (Promega)에 연결하고 대장균(E. coli DH5a)으로 도입하여 형질전환시켰다. 유전자의 cloning과 형질전환에는 Sambrook et al.의 방법을 이용하였다. 클로닝된 재조합체 plasmid를 갖는 E. coli DH5a를 LB (ampicillin, \( 100~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ) broth 배지 \( 4~ \mathrm{ml} \)를 이용하여 배양하고 원심분리 \( (12000 \times g, \) 5분 \( ) \)하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체로부터 Plasmid mini kit (Quiagen, USA)를 이용하여 플라스미드를 분리하고 제한효소 EcoRI으로 절단하여 목적 DNA 단편을 확인하였다. 이렇게 제작된 재조합 플라스미드를 pGEMTe-EF_ADC022라고 명명하였다. 삽입된 DNA 단편에 대한 염기서열 결정은 (주) 바이오 넥스(Seoul, Korea)에 의뢰하여 행하였다.</p> <p>클로닝된 재조합체로부터 Plasmid mini kit (Quiagen,USA)를 이용하여 pGEMTe-EF_ADC022를 분리하고 이를 주형으로 하여 발현 plasmid 제작을 위하여 적절한 위치에서 제한효소를 작용시킬 수 있는 primer set인 EF_ADC_E2-F와 EF_ADC_E2-R를 이용하여 발현 plasmid 제작용 ADC 유전자 단편의 증폭(Perkin-Elmer model 2400 thermal cycle,USA)을 행하였다. DNA 단편의 중폭은 정확성을 기하기 위하여 Pyrobest DNA polymerase (Takara Bio Inc., Shiga,Japan)를 이용하였다. 증폭 조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 반응한 후 30 cycle의 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 1분을 반복 수행하였고 마지막 extension을 위하여 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시켰다. 증폭이 끝난 반응액은 \( 0.8 \% \) agarose gel에서 전기영동을 행 하여 목적 DNA 단편을 확인하였다. 목적 DNA 단편을 pGEM-T easy vector (Promega)에 연결하고 대장균 \( ( \) E. coli \( \mathrm{DH} 5 \mathrm{a}) \)에 도입하여 형질전환시켰다. 클로닝된 재조합체 plasmid를 갖는 E. coli DH5a를 LB (ampicillin, \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ) broth 배지 \( 4~ \mathrm{ml} \)를 이용하여 배양하고 원심분리(12000×g, 5 분)하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체로부터 Plasmid mini kit (Quiagen, USA)를 이용하여 플라스미드를 분리하고 제한효소 EcoRI으로 절단하여 목적 DNA 단편을 확인하였다. 이렇게 제작된 재조합 플라스미드를 pGEMTe-EF_ADCE22 라고 명명하였다. 삽입된 DNA 단편에 대한 염기서열 결정 은 (주) 바이오넥스(Seoul, Korea)에 의뢰하여 행하였다. pGEMTe-EF_ADCE22를 제한효소 NdeI과 Xhol으로 절단 하여 agarose gel에서 전기영동을 행하고 \( 1611~ \mathrm{bp} \) DNA 단 편을 gel extraction kit (Quiagen)를 이용하여 agarose gel로 부터 회수하였다. 회수된 DNA 단편을 대장균용 고발현 플 라스미드인 pTXB의 같은 제한효소 부위에 연결하여 ADC 유전자의 발현 플라스미드를 구축하고 이를 pTXB1-EF_ADCE22로 명명하였다.</p>