식물 조직의 종류에 따라 단위 무게 또는 부피 당 세포의 수가 다르다는 것은 일반적 사실이며, 식물 원형질체 분리에 가장 큰 영향을 미치는 것은 효소의 종류, 농도 및 처리시간일 것이다. 본 연구에서는 Ogura CMS 서울배추 기내 실생의 하배축, 떡잎 및 본잎을 재료로 이용하여 2가지 효소액 처리 후 각 조직의 단위 무게당 분리되는 원형질체 수를 효소처리 20시간 까지 조사하였고, 연구에서 얻은 결과를 토대로 고수율 원형질체 분리를 위한 효소액 조성과 처리시간으로 설정하고 다음 실험에 활용하였다.
<h2>Callus colony 생장과 재분화 유도</h2> <p>원형질체 배양 시작 17일 후 노랑봄, 조생추석 및 서울배추의 micro-callus가 포함된 배양물 \( 3 \mathrm { ~mL } \) 를 균일하게 취하여 삼투압을 낮추고 다양한 첨가물이 포함된 11 종의 수정 MS배지 (MS배지, sucrose \( 37.5 \mathrm { mM } \), mannitol \( 112.5 \mathrm { mM } \), agarose type VII \( 12.5 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } , \mathrm { pH } 5.8 \))가 담긴 \( 87 \times 15 \mathrm { ~mm } \) petri-dish에 plating하였다. 배양물은 16시간 명 \( \left (50 \mu \mathrm { mol } \cdot \mathrm { m } ^ { -2 } \cdot \mathrm { s } ^ { -1 } \right ) / 8 \)시간 암의 일장 하에서 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 배양하였다. Micro-callus 를 plating한 2 주 후 callus colony의 생장을 조사하였으며 노랑봄배추 callus colony는 유래한 종류별로 구분하여 재분화 유도를 위한 재료로 사용하였다. PGR (BA, zeatin, NAA)이 혼용 첨가 되고 sucrose \( 30 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \)과 gelrite \( 2 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \)가 첨가된 \( \mathrm { pH } 5.8 \) MS배지를 재분화 유도를 위한 배지로 사용하였으며, petri-dish 당 6-10개의 callus colony를 이식하였괴 배양환경은 callus colony 유도 시와 동일하였다. 신초와 뿌리 분화는 배양 3주 후 조사하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>기내 파종 배추 실생으로부터 원형질체 분리를 위한 조직별 효소처리 시간</h2> <p>식물 원형질체 분리에 가장 큰 영향을 미치는 것은 사용되는 효소의 종류, 농도 및 처리시간일 것이며 (In et al. 2008; Jee and Chung 1989a), 식물 조직의 종류에 따라 단위 무게 또는 부피 당 세포의 수가 다르다는 것은 일반적 사실이다. 본 연구에서는 Ogura CMS 서울배추 기내 실생의 하배축, 떡잎 및 본잎을 재료로 이용하여 2가지 효소액 처리 후 각 조직의 단위 무게당 분리되는 원형질체 수를 효소처리 20시간 까지 조사하였다 (Figure 1). 본잎 조직의 경우 효소액 A (cellulose R-10 \( 1 \% \), macerozyme R-10 \( 0.5 \% \)) 처리 1시간 이후 급속하게 원형질체가 분리되고, 약 5시간 이후부터는 분리되는 원형질체의 수가 크게 증가하지 않았다. 떡잎 조직은 효소액 A 처리 이후 약 7 시간까지 분리되는 원형질체 (Figure 3Ba)의 수가 완만하게 증가되었고 그 이후 원형질체 수는 정체하였다. 한편, 하배축 조직은 효소액 A 처리 시 원형질체의 수율이 현저히 낮아, pectin질 분해 효소의 구성을 조절하였다. 조절한 효소액 (효소액 B; cellulose R-10 \( 1 \% \), macerozyme R-10 \( 0.4 \% \), pectolyase \( 0.1 \% \) )으로 하배축 절 편을 처리한 결과 떡잎 조직에 효소액 A를 사용했을 때와 유사한 정도로 원형질체가 분리되었다. 재분화 배양을 위한 식물 원형질체 분리 시 Jee와 Chung (1989a)의 경우 (2-3 시간)를 제외하고 대부분 약 10-16 시간 동안 또는 overnight하여 효소액을 처리하였다 (Sakai and Imamura 1990; Lian and Lim 2001; In et al. 2008). 본 실험의 결과 분리되는 원형질체의 수는 효소액 처리시간에 따라 정의 상관관계를 나타내지 않으므로 cellulase나 pectinase와 같은 효소에 의해 조기에 분리된 원형질체가 피해를 입는 것을 최소화 하기 위해서는 적정 시간 동안만 처리하는 것이 필수적이라고 판단된다. 이와 같은 결과를 토대로 배추 본잎의 경우 효소액 A로 5시간 처리, 떡잎의 경우 효소액 A로 7시간 처리, 하배축의 경우 효소액 B로 7시간 처리하는 것을 고수율 원형질체 분리를 위한 효소액 조성과 처리시간으로 설정하고 다음 실험에 활용하였다.</p>