VppC를 무효화하려고, kanamycin에 내성을 가진 nptII 유전자를 vppC 유전자 안에 삽입했다. 이는 nptII를 포함한 pBSL86을 SmaI 효소로 분리하고 얻은 kanamycin 내성 유전자를 vppC의 EcoRV site에 삽입하여 이뤄졌다. 재조합 DNA를 만들기 위해 사용된 벡터는 Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP)를 사용하여, 일정한 온도에서 인산기를 제거하며, 이를 통해 벡터의 self-ligation이 막혔다.
<h2>재조합 \( v p p C:: n p t \| l D \) D 제작</h2> <p>\( \mathrm { VppC } \) 를 불활성화 시키기 위해 \( v p p C \) 유전자의 내부에 kanamycin에 저항성을 갖는 neomycin phosphotransferaseII 를 코딩하는 nptII 유전자를 삽입하였다[18,23]. nptII를 포함하고 있는 pBSL86를 SmaI 효소로 절단하여 얻어진 \( 1.2 \mathrm { ~kb } \) kanamycin 내성 유전자를 vppC 유전자 내부에 존재하는 EcoRV site에 삽입하여 재조합 DNA를 제작하였다. 클로닝에 사용된 벡터는 self-ligation을 막기위해 Calf Intestinal Alkaline Phosphatase \( ( \mathrm { CIAP } ) \) 를 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 와 \( 56 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 각각 30 분 처리하여 벡터의 인산기를 제거하여 사용되었다. Genereplacement를 위한 suicide vector는 pDMS197이었으며, \( \mathrm { pDMS197 } \) 을 \( \mathrm { Sac } \) 과 \( \mathrm { Kpn } \) I으로 처리한 후 \( 3.8 \mathrm { ~kb } \) 의 재조합 vppC::nptII SacI-KpnI DNA 단편과 ligation시켜 allelicexchange를 위한 재조합 suicide plasmid를 구축하였다.</p> <h2>Homologous recombination에 의한 콜라겐 분해효소 불할성화 돌연변이체의 선발</h2> <p>E. coli 7213은 재조합 suicide plasmid의 공여체로, 원 균주인 V. parahaemolyticus 04 는 수용체로 각각 사용하였다. 공여체와 수용체를 각각 배양한 후 \( \left ( \mathrm { OD } _ { 660 \mathrm { ~nm } } = 0.8 \right ) \) 원심분라하여(12,000 rpm, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \) 분 \( ) \) cell pellet을 얻었다. 각 pellet에 \( 1.5 \% \mathrm { NaCl } \) 이 첨가된 \( \mathrm { TSB } \) 배지 \( 1 \mathrm { ml } \) 을 첨가하여 균을 현탁하고, 각 현탁액의 \( 30 \mu \mathrm { l } \) 를 잘 섞어서 diaminopimelic acid (DAP)가 첨가된 \( \mathrm { LB } \) 고체배지의 중심에 접종 후, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 18 시간 배양하였다. 혼합 배양된 균은 \( 1.5 \% \mathrm { NaCl } \) 이 첨가된 TSB배지 \( 1 \mathrm { ml } \) 에 집균한 뒤 선별 배지에 \( 100 \mu \mathrm { l } \) 씩 도말하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 18 시간 배양시켰다. Single crossover 돌 연변이체는 kanamycin과 tetracycline이 첨가된 선택배지를 사용하여 선발하였으며, double crossover 돌연변이체는 suicide plas-mid에 포함되어 있는 \( \operatorname { SacBR } \) counter-selection system을 적용하여 분리하였다. Kanamycin과 \( 10 \% \) sucrose가 첨가된 \( \mathrm { TCBS } \) 배지에 도말하여 성장한 colony들은 kanamycin이 들어있는 LB배지와 tetracycline이 들어있는 LB배지에 접종하여 항생제 감수성 여부로서 1차 screening을 하였고, PCR방법으로 DNA를 증폭하여 증폭된 DNA 단편의 크기 비교로서 allele exchange를 확인하였다.</p>