본 실험에서 회분반응의 시료는 반응기로부터 주기적으로 채취하여 \( \mathrm{ClO}_{4}^{-} \)농도 감소와 더불어 생성된 \( \mathrm{Cl}^{-} \)의 농도와 \( \mathrm{pH} \)를 분석하였다. 입자상 황과 활성 슬러지를 이용한 독립영양방식의 \( \mathrm{ClO}_{4}^{-} \) 제거공정에 사용된 황 입자의 표면을 관찰려고 SEM 을 이용했다. 또한, 황을 이용한 독립영양방식의 \( \mathrm{ClO}_{4}^{-} \)제거공정에 존재하는 미생물 군집을 조사하려고 DGGE기법을 이용했다.
<h1>재료 및 방법</h2> <h2>화학분석</h2> <p>회분반응의 시료는 반응기로부터 주기적으로 채취하여 \( \mathrm{ClO}_{4}^{-} \)농도 감소와 더불어 생성된 \( \mathrm{Cl}^{-} \)의 농도와 \( \mathrm{pH} \)를 분석하였다. 시료는 1회용 주사기로 채취하여 syringe filter (pore size, \( 0.22 \mu \mathrm{m}) \)로 여과 후 필요에 따라서는 적당히 희석하여 ion chromatograph (IC, Dionex ICS-3000; Dionex, Sunnyvale, CA)로 분석하는데 사용하였다. IC 분석은 한국기초과학연구원에서 실시하였으며 \( \mathrm{ClO}_{4}^{-} \)와 \( \mathrm{Cl}^{-} \)의 분석은 EPA METHOD 314.0을 수정한 방법(Table 2)을 사용하였다. Analytical column AS16과 guard column AG16이 장착된 IC (Dionex ICS-3000)을 사용하여 \( \mathrm{ClO}_{4}^{-} \)과 \( \mathrm{Cl}^{-} \) 농도를 분석하였다. 한편 \( \mathrm{SO}_{4}{ }^{2-} \)의 분석은 EPA METHOD 300.0을 수정한 방법을 사용하였다. \( \mathrm{ClO}_{4}^{-}, \mathrm{Cl}^{-} \), 그리고 \( \mathrm{SO}_{4}^{2-} \)의 검출한계는 각각 \( 0.5 \mathrm{\mu g} / 1.5 \) \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{l} \), 그리고 \( 0.2 \mathrm{~mg} / \mathrm{l} \)이었다. IC 분석에 사용한 표준시약은 AccuStandard Inc. (New Haven, CT, USA)에서 구매하였다. 한편 시료의 \( \mathrm{pH} \)는 \( \mathrm{pH} \) meter (Isteck, 한국)로 측정하였다.</p> <h2>주사전자현미경(scanning electron microscope, SEM)을 이용한 황입자 표면 관찰</h2> <p>입자상 황과 활성 슬러지를 이용한 독립영양방식의 \( \mathrm{ClO}_{4}^{-} \) 제거공정에 사용된 황 입자의 표면을 관찰하기 위해 SEM (model JSM-6700F, JEOL, Japan)을 사용하였다. SEM 관찰에 사용된 시료는 농화 배양 반응기에서 채취한 황 입자이었다. 대조군으로는 사용하지 않은 황 입자를 사용하였다. 황 입자 시료는 1년 이상 농화 배양된 반응기에서 채취하였다.</p> <p>황 입자는 SEM으로 관찰하기 전에 전처리를 하였다. 전처리 과정은 다음과 같이 실사하였다. 황 입자를 phosphate buf-fer \( (\mathrm{pH} 7.2) \)로 3번 세척 한 후 ethanol 50,60,70,95, 그리고 \( 100 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)에 순차적으로 넣어 탈수시켰다. 그 후 ethanol \( 100 \% \)를 2번 더 반복 처리하여 탈수시키고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 의 온도에서 1시간 동안 풍건 시켰다. 그리고 대조군으로 사용된 황 입자도 동일한 전처리를 실시하였다. 전처리가 끝난 황 입자는 동아대학교 공동기기센터에서 sputter coater (model Cressington 108 AUTO; Ted Pella Inc., CA, USA)를 이용하여 Au/Pd 타깃으로 코팅 처리하여 SEM을 사용하여 관찰하였다.</p> <h2>PCR (Polymerase Chain Reaction) - DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) 분석</h2> <p>황을 이용한 독립영양방식의 \( \mathrm{ClO}_{4}^{-} \)제거공정에 존재하는 미생물 군집을 조사하기 위해 DGGE기법을 사용하였다. 사용한 시료는 2달 농화배양된 반응기에서 채취한 황입자의 생물막 미생물이었다. 접종균으로 사용된 활성 슬러지도 동일한 실험과정을 거쳐 미생물군집을 비교하였다.</p> <p>채취한 황 입자 시료에 phosphate buffered saline (PBS; \( 0.13 \mathrm{M} \mathrm{NaCl}, 10 \mathrm{mM} \) sodium phosphate buffer, \( \mathrm{pH} \) 7.2)을 넣어 강하게 5분간 vortex하여 생물막 미생물을 황 입자로부터 유리시켰다. 유리된 미생물은 회수하여 Mobio (Carlsbad, CA USA)사의 Ultraclean \( { }^{\mathrm{TM}} \)을 사용하여 total genomic DNA를 추출하는데 사용하였다. 추출된 DNA는 \( 0.8 \% \) agarose gel을 이용하여 \( 0.5 \% \)TAE buffer에서 전기영동하여 확인하였으며 UV spectrophotometer를 사용하여 농도를 측정하였다.</p> <p>추출된 DNA를 주형으로 사용하여 문헌에 기술된 것과 같이 PCR로 16S rRNA 유전자의 일부(Escherichia coli num-bering 기준으로 341 에서 534에 해당)를 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물(약 \( 200 \mathrm{bp}) \)은 agarose gel 전기영동으로 확인한 후 문헌에 기술된 것과 같이 DGGE분석에 사용하였다. DGGE는 DCode System (Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 200\( \mathrm{V}, 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4.5시간 진행하였다. 시료로 사용된 \( \mathrm{PCR} \)산물은 \( 10 \% \) (w/v) polyacrylamide gel (acrylamide: N,N0-methyl-enebisacrylamide, 37.5:1, Bio-Rad)에서 1x TAE buffer (2 M Tris base, \( 1 \mathrm{M} \) glacial acetic acid, \( 50 \mathrm{mM} \) EDTA, pH 8.0)를 사용하여 분리하였다. Gel에 denaturing gradient를 형성하기 위해 \( 40 \% \)와 \( 60 \% \) denaturant를 각각 포함하는 \( 10 \% \) poly-acrylamide의 2 stock solutions을 혼합 하였으며, denaturing gradient는 전기영동방향으로 증가하였다. \( 100 \% \) denaturant는 7 M urea와 \( 40 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) formamide로 구성된 것을 말한다.</p>