MTT assay분석을 통해 3T3-L1 지방전구 세포의 시료 독성을 파악한다. MTT assay분석은 미토콘드리아의 탈수작용으로 수용성 기질인 MTT가 노란색에서 불용성의 보라색의 포마잔으로 환원되는 원리를 이용한다. 분양 받은 3T3-L1 지방전구 세포의 배양 및 분화를 위해 DMEM에 \(10 \%\) calf serum과 anti-biotics를 첨가해 배양하고 원심분리한 세포를 모아 시료처리 한 후 \( 10 \% \) FBS DMEM 배지에 insulin이 첨가된 배지를 교체해 주었다.
<h2>MTT assay</h2> <p>3T3-L1 지방전구세포의 시료 독성은 MTT assay로 분석하였다. MTT 3-(3,4-dimethyl-thiazolyl-2)-2,5-diphenyl tetra-zolium bromide (MTT) assay는 미토콘드리아의 탈수소효소 작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT가 불용성의 보라색 formazan으로 환원되는 원리를 이용한 방법이다. 세포를 \( 5 \times 10 ^ { 4 } \) cells/well으로 96 well plate에 분주하고 24 시간 배양 후 배지를 교체하고 샘플 처리하여 24시간 후 MTT (Sigma Aldrich) 시약을 \( 5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 농도로 \( 10 \mu 1 \) 를 각 well에 가하고 4시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후 상층액을 제거하고 각 well에 100 ul의 DMSO (Sigma Aldrich) 를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 ELISA reader (Spectra MAX M2, Molecular Device)로 \( 550 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였으며, 세포독성은 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.</p> <h2>3T3-L1 지방전구세포의 배양 및 분화 유도 및 샘플처리</h2> <p>실험에 사용된 3T3-L1 세포는 한국 세포주 은행(KCLB)에서 분양 받아 사용하였다. 배양 및 분화 배지는 Dulbecco's modified Eagle's medium high glucose (DMEM, Gibco RBL, Grand Island, NY, USA)에 10 \% calf serum (Gibco RBL), anti-biotics를 첨가하여 \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } , 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 인큐베이터에서 배양하여 세포가 confluent 상태가 되면 trypsin/EDTA를 처리하여 세포를 원심분리 하여 세포를 모아서 \( 3 \times 10 ^ { 6 } \) cells/well의 밀도로 6 well에 분주한 후 \( 100 \% \) confluency 상태에서 48 시간 방치 후 DMEM에 10 \% FBS (Gibco RBL)와 \( 23 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 3-isobutyl-1-methyl-xanthin (IBMX, Sigma Aldrich Co, St Louis, Mo, USA), \( 5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) insulin (Sigma Aldrich), \( 1 \mathrm { mM } \) dex-amethazone (Sigma Aldrich)이 첨가된 배지(MDI)와 시료를 처리하여 48 시간 동안 유도하고 배지를 제거하고 시료와 \( 10 \% \) FBS DMEM 배지에 \( 5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 의 insulin이 첨가된 배지를 교체해 주었다. 10 \% FBS DMEM, insulin 배지는 2일 마다 지속적으로 시료와 같이 처리하였다.</p>