BAs는 신체 대사활동에 필수적이지만 과량으로 발생하면 증상을 일으키는 물질로 발효식품에서 많이 생성된다. BAs의 함량을 줄이기 위해 된장에서 Bacillus 속 균주를 분리하여 분석하였다.
<p>Biogenic amines (BAs)이란 Bacillus 속, Escherichia 속 등 기타 식인성 병원 미생물들, Lactobacillus 속 및 Enterococcus 속 등 주요 식품 미생물의 amino acid decarboxylase의 선택적인 작용에 의해 carboxyl기의 제거와 함께 생성되는 저분자량의 질소화합물로, monoamine류인 histamine과 tyramine, diamine류인 putrescine과 cadaverine 등이 보고되어 있다. BAs는 신체 기관의 성장, 대사과정 및 면역 시스템 등의 대사활동을 하는 과정에 필수적이며 보통 장 점막에서 생성되는 mono 또는 diamine oxidase에 의해 해독이 가능하지만 과량으로 섭취할 시에는 발한, 메스꺼움, 구토 및 설사 등의 증상을 일으킨다. 특히 histamine은 홍조, 가려움증 및 두드러기 등의 증상을 일으키고 tyramine은 편두통, 심박수 증가, 혈관 수축 등의 증상을 나타낸다. 미국에서는 가다랑어 및 참치와 같은 histamine 함량이 높은 생선의 경우 \( 500 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \) 이하로 기준이 정해져 있지만, 우리나라는 아직 정확한 기준이 설정되지 않은 실정이므로 최근에는 BAs 함량을 최소화하려는 방향으로 제품을 개발하려는 추세이다. BAs는 다양한 발효식품에서 생성되며, 특히 단백질 함량이 높은 식품에서 발효과정이나 부패과정에 의해 다량 생성될 수 있다. 그 중 한국인이 많이 섭취하는 된장은 콩에 세균, 곰팡이 및 효모가 함께 작용하여 만들어진 전통 발효식품으로, 주요 미생물은 Bacillus 속이다. 된장은 특히 단백질이 풍부하기 때문에 발효과정 동안 BAs을 생성하는 데 이용될 수 있는 유리 아미노산의 증가로 과량의 BAs 생성으로 인해 안전성에 대한 우려가 제기되고 있다. Cho 등의 연구에 따르면, 재래식 된장에서 putrescine, cadaverine, histamine, tyramine, spermidine과 spermine이 234.1- \( 1453.7 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \) 이 검출되었고, 개량식 된장에서는 \( 180-295.5 \) \( \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \) 이 검출되었다. 최근에는 BAs를 분해하는 Pediococcus pentosaceus가 된장에서 분리되었으며, Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, P. acidophilus, Streptomyces thermophile 및 Lactobacillus plantarum 을 이용한 putrescine, tyramine 및 histamine 생성 억제에 관한 연구도 보고되었다. Bacillus 속 세균은 50년 이상의 오랜 기간 동안 산업적으로 사용되어온 생물자원으로서 여러 나라에서 프로바이오틱스 제품으로 판매되고 있으며, 특히 효소를 이용한 생물산업에 유용하게 이용되고 있다. 전통 장류에서 Bacillus 속 세균은 발효에 관여하는 많은 세균 중에서 우점종에 해당되어 starter로 개발될 가능성이 높으며, 일부 균주들은 항생물질을 분비하여 항진균 및 항세균 작용을 나타낸다고 보고되어 왔다. 이러한 Bacillus 속의 특성을 이용하여 최근에는 B. subtilis, B. amyloliquefaciens 및 B. licheniformis 등의 균주를 이용하여 BAs 함량의 감소를 확인한 바 있다. 따라서 이 연구에서는 전통발효식품의 starter로 개발하기 위한 목적으로 BAs 함량을 감소시키는 다른 Bacillus 속 균주를 된장으로부터 분리하여 보고하고자 한다. 실험에 사용할 Bacillus 속 균주는 재래시장 또는 일반 가정에서 된장을 수집하여 분리하였다. \( 1 \mathrm { ml } \) 의 된장 시료를 \( 0.9 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) saline에 10배 희석하여 nutrient agar (NA) 배지에 \( 100 \mu 1 \) 씩 도말하고 \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24-48 시간 배양하여 순수분리하였다. 분리된 균주의 계통학적 위치 확인을 위해 \( 16 \mathrm { ~S } \) 리보솜 RNA 염기서열을 분석하였고 Bioedit (ver. 7.2.6, USA)과 Mega program (Molecular Evolutionary Genetics Analysis ver. 7.0)을 이용하여 phylogenetic tree를 작성하였다. BAs의 분해능 확인을 위한 방법은 Ozogul의 방법을 참고하였고, 아민 생성 세균으로 식중독 원인균인 Escherichia coli ATCC 10798, Listeria monocytogenes ATCC 15313, Staphylococcus aureus ATCC 6538 및 Salmonella typhimurium enterica serova Typhimurium ATCC 14028을 사용하였으며, 된장에 풍부하게 존재하는 histamine 생성을 확인하기 위한 배지로 histidine decarboxylase broth(HDB, 2 g peptone, \( 1 \mathrm { ~g } \) beef extract, \( 5 \mathrm { ~g } \mathrm { NaCl } , 2.5 \mathrm { mg } \) pyridoxal HCl 및 \( 0.1 \% \) histidine/l)를 제조하여 사용하였다. 된장에서 분리한 균주를 \( 10 \mathrm { ml } \) nutrient broth (NB) 배지에 접종한 후 \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24시간 동안 배양하였다. Cell-free solutions (CFS)을 얻기 위해 원심분리 \( (8,800 \times g, 20 \mathrm { ~min } \), \( \left .4 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \) 하고 \( 0.22 \mu \mathrm { m } \) 필터로 여과한 후, CFS의 농도는 \( 10 \% \) (1 ml CFS \( + 9 \mathrm { ml } \mathrm { HDB } ), 25 \%(2.5 \mathrm { ml } \mathrm { CFS } + 7.5 \mathrm { ml } \mathrm { HDB } ) \), \( 50 \%(5 \mathrm { ml } \mathrm { CFS } + 5 \mathrm { ml } \mathrm { HDB } ) \) 및 \( 75 \%(7.5 \mathrm { ml } \mathrm { CFS } + 2.5 \mathrm { ml } \) HDB의 네 가지로 준비하고 대조군으로는 CFS을 첨가하지 않은 \( 10 \mathrm { ml } \mathrm { HDB } \) 를 사용하였다. 식중독균은 Luria-bertani broth (LB) 배지에 전배양하여 농도가 다른 시험관에 각각 \( 0.5 \mathrm { ml } \) 씩 접종한 후 \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 72시간 배양하였다. \( 5 \mathrm { ml } \) 배양액에 \( 6 \% \) trichloroacetic acid를 \( 2 \mathrm { ml } \) 첨가하고 원심분리 \( (3,000 \times g, 10 \mathrm { ~min } ) \) 한 후, 필터하여 HPLC 분석에 시료로 이용하였다.</p>