HCT 116 세포주 배양은 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 streptomycin에 37도의 \(5\% \) \( \mathrm{CO} 2 \) humidified incubator에서 진행한다. Cell lysate에는 RIPA buffer를 이용하고 lysate protein를 정량할 때는 BCA protein assay kit를 이용한다. Trans-LT1 transfection reagent를 사용하여 프로토콜대로 transfection을 세포에 시행한다. 96-well plate에서 세포주 처리를 진행하고, \( 50 \mathrm{ml} \) MTS를 각각 넣어 2시간 이후에 배지를 버리고 DMSO를 넣어 20분 반응시킨 후 흡광도를 측정한다. 데이타는 SigmaStat for windows로 분석을 진행한다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포배양, 유전자 및 시약</h2><p>HCT 116 세포주는 미국 유형 배양 콜랙션 (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD)에서 구매하여 McCoy's 5A media (\(10\%\) FBS, 50 unit/ml penicillin (Sigma, St. Louis, MO), \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) streptomycin (Sigma, St. Louis, MO)에 \(5\% \) \( \mathrm{CO} 2 \) humidified incubator at 37도에서 배양하였다. 세포수와 생존활성(viability)은 trypan blue (Sigma) dye exclusion을 이용해서 hemacytometer상에서 측정하였다. 화합물 노출 실험 중에는 혈청이 없는 배지를 이용하였다. 저해제 등은 Calbiochem (EMD biosciences, Inc. La Jolla, CA)에서 구매하였다.</p><h2>Western Immunoblot Analysis</h2><p>Cell lysate는 RIPA buffer (1x PBS, \( 1 \% \) NP-40, \( 0.5 \% \) sodium deoxycholate, \( 0.1 \%\) SDS, \(100 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) PMSF, \( 1 \mathrm{mM} \) sodium orthovanadate, and Protease Inhibitor Cocktail (Sigma))로 준비하고 2-3초 정도의 sonication 후 lysate protein은 BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL)를 이용해서 정량하였다. 각각 \( 50 \mathrm{mg} \) 단백질을 소형 전기영동기를 이용해서 분리한 후 단백질을 PVDF membrane (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)에 이동하였다. 블롯은 1시간동안 \(5\%\) skim milk Tris-buffered saline plus Tween \( 0.05 \% \) (TBST) 로 blocking 후 각각의 일차항체로 2시간 상온에서 반응 후 3회 TBST로 세척 후 horseradish-conjugated secondary antibody로 1시간 상온 반응후 3회 세척 후 ECL Chemiluminescent substrate (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)로 발색 현상하였다. 각 일차항체는 rabbit polyclonal anti-human Actin antibody (Santacruz Biotech-nology, Santa Cruz, CA), 토끼 polyclonal anti-p-MAPKs, anti-Egr-1 항체 (Cell signaling technology, Beverly, MA)를 사용하였다.</p><h2>Transient / stable transfection</h2><p>세포는 Trans-LT1 transfection reagent (Mirus, Madison, WI)를 이용해서 제조자 프로토콜에 따라 transfection을 수행하였다. Luciferase reporter gene의 transfection을 위해서 각 well 당 \( 1.5 \mathrm{mg} \) firefly luciferase reporter plasmid와 \( 0.15 \mathrm{mg} \) renilla luciferase, pRL-null vector (Promega, Madison, WI)를 \( 4.5 \mathrm{ml} \) Trans-LT1 reagent에 혼합하여 6 well culture plate에 처리하였다. Transfection후 24시간 뒤 세포는 화합물에 24시간 노출하였다. Firefly 와 대조구인 renilla luciferase를 동시에 transfection 하는 Dual-luciferase reporter assay system (Promega)을 이용해서 정량하였다. 모든 tranfection 효율은 50 내지 \(60\%\)정도를 유지하였고 이 효율은 pMX enhanced GFP vector를 이용해서 transfection 후 동시에 확인하였다. Stable cell lines을 추가로 만들기 위하여 48시간 뒤 \( 1000 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) G418 (Invitrogen, Carlsbad.CA) 로서 선별을 가하였다. 선별은 monolayer colonies 가 형성될때까지 하며 안정된 transfectants 는 \( 500 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\) G418의 일반배양액에서 유지한다.</p><h2>Luciferase Assay</h2><p>세포는 차가운 PBS로 세척후 수동 분해 버퍼 (Promega)로 분해물을 준비하였다. \( 12,000 \mathrm{~g} \) 에서 4분간 원심분리후 상층 효소액을 assay에 이용하였다. 상층액은 이후 실험을 위해서 \( -80{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다. Luciferase activity는 dual-mode luminometer (Model TD-20/20, Turner Designs Co., Sunnyvale, CA)를 이용해서 측정하였다. Firefly luciferase activity은 renilla luciferase activity에 대해서 일반화 하였고 활성은 다음의 상대치로 표시하였다 (firefly luciferase activity / renilla luciferase activity).</p><h2>세포활성측정</h2><p>3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS)을 이용하여 발색반응을 분석 하였다. 세포주 \( \left(2 \times 10^{4}\right. \) /well)를 96-well plate에서 화합물을 처리 하였고 처리 시간이 경과한 후 각 well당 \( 50 \mathrm{ml} \) MTS를 투입하여 2시간 반응 시킨 후 배지를 버려내고 각 well에 DMSO \( 100 \mathrm{ml} \) 을 넣고 20분간 반응 시킨 후 \( 490 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>Small interference RNA (siRNA) 처리</h2><p>세포는 EGR-1 (Dharmacon, Lafayette, CO)의 siRNA를 lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad.CA)으로 처리하여 manufacturer's protocol (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 따라 transfection 하였다. 모든 처리반응 시간은 72시간이었다.</p><h2>통계처리</h2><p>데이타는 SigmaStat for windows (Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA)를 이용해서 분석하였다. 두그룹의 데이터 비교는 Student's \( t \) test를 하였고, multiple groups 비교는 ANOVA를 실시한다.</p>