Rubisco와 rubisco activase의 함량은 ELISA법에 의해 측정, Microplate의 well에 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium carbonate-bicarbonate buffer 용액으로 희석된 두 효소 용액을 3번 세척한후 Blocking을 위해 \( 0.1 \% \mathrm{BSA} \) 용액을 사용, 1차 항체로서 토끼 항 rubisco와 항 rubisco activase 항혈청을 사용하였으며, 2차 항체로서는 peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG 용액을 사용하였고 Peroxidase의 기질인 OPD tablet 용액을 가하여 실온 20분 반응시킨 후, \( 1 \mathrm{~N}\ \mathrm{HCl} \)로 반응을 정지시켰고 ELISA microplate reader (Bio-Rad modcl 3550-UV)를 사용하여 \( 492 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.
<h2>Rubisco activity 측정</h2> <p>Racker의 방법으로 Rubisco의 activity를 측정하였다. \(1\) \(\mathrm{M} \) Tris \( (\mathrm{pH} 7.8)\), \( 0.006 \) \(\mathrm{M}\ \mathrm{NADH} \) , \( 0.1 \ \mathrm{M}\ \mathrm{GSH} \), \( 0.5 \) \(\mathrm{M}\ \mathrm{KHCO}_{3} \), \( 0.5 \% \) glyceraldehyde 3 -phosphate dehydrogenase, \( 0.025 \% \) 3-phosphateglycerate kinase, \( 0.05 \% \) a-glycerophosphate dehydrogenase-triose phosphate isomerase, \( 0.025 \mathrm{M} \) ribulose bisphosphate, \( 0.2 \mathrm{M} \) ATP 및 \( 0.5 \mathrm{M} \mathrm{MgC}_{2} \)로 조제한 측정용액에 fraction된 rubisco 용액을 가하였다. 주입 즉시 UV-VIS spectrophotometer를 이용하여 RuBP가 PGA를 형성하고 이것이 GAP을 형성할 때 산화하는 \( \mathrm{NADH} \) 양을 \( 340 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. 1분에 \( 1 \mu \mathrm{M} \) 의 ribulose bisphosphate의 분해를 촉매시키는 양을 \(1\ \mathrm{unit} \)로 나타내었다.</p> <h2>Rubisco activase activity 측정</h2> <p>Robinson과 Portis 방법으로 rubisco activase의 activity를 측정하였다. Reaction mixture \( (50 \mathrm{mM} \) Tricine \( (\mathrm{pH}8.0) \), \( 20 \mathrm{mM} \mathrm{KCl}, 5 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2}, 25 \mathrm{mM} \mathrm{ATP}, 1 \mathrm{mM} \) PEP, \( 0.3 \mathrm{mM} \mathrm{NADH}, 40 \mathrm{units} \) / \(\mathrm{ml} \) pyruvate kinase, \(40 \mathrm{units/ml}\) lactic dehydrogenase)에 rubisco activase용액을 첨가하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분간 반응시킨 후, UV-VIS spectrophotometer를 이용하여 \( 340 \mathrm{~nm} \) 에서 측정된 NADH oxidation 율로부터 ADP의 생성율, 즉 ATP 가수분해열을 계산하여 rubisco activase의 activity를 측정하였다.</p> <h2>Rubisco와 rubisco activase의 함량 측정</h2> <p>Rubisco와 rubisco activase의 함량은 항체를 이용한 ELISA법에 의해 측정하였다. Microplate의 well에 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium carbonate-bicarbonate buffer 용액\( (\mathrm{pH} 9.5)\)으로 희석된 두 효소 용액을 각각 가한 다음, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 하루 밤 동안 반응시키고, \( 0.05 \% \) Tween 20 이 들어있는 \( 0.01 \mathrm{M} \mathrm{PBS} \) \( (\mathrm{pH} 7.4)\)용액으로 3번 세척하였다. Blocking을 위해 \( 0.01 \) M PBS \( (\mathrm{pH} 7.4)\)로 만든 \( 0.1 \% \mathrm{BSA} \) 용액을 사용하였다. 1차 항체로서 토끼 항 rubisco와 항 rubisco activase 항혈청을 각각 사용하였으며, 2차 항체로서는 \( 0.1 \% \mathrm{BSA} \) 가 항유된 \( 0.01 \mathrm{MPBS}(\mathrm{pH}7.4) \)로 1:20,000 회석시킨 peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG 용액을 사용하였다. Peroxidase의 기질인 OPD tablet 용액을 가하여 압상태의 실온에서 20분간 반응시킨 후, \( 1 \mathrm{~N}\ \mathrm{HCl} \)로 반응을 정지시켰다. ELISA microplate reader (Bio-Rad modcl 3550-UV)를 사용하여 \( 492 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>SDS-PAGE</h2> <p>Laemmli의 방법에 따라, \( 20 \% \) polyacrylamide gel을 사용하여 실온에서 \( 110 \mathrm{~V}, 11 \)시간 30분의 전기영동이 끝난 후, comassie blue R-250 용액으로 염색하고, \( 7.5 \% \) acetic acid를 사용하여 탈색하였다.</p>