활성산소에 의한 세포 손상을 모델로 한 적혈구 광용혈 실험은 사람 적혈구를 대상으로 하여 세포 보호 효과를 측정할수 있다. 실험균주는 피부상재균으로서, Gram (+) 균주 3종, Gram (-) 균주 2종 및 효모균 1종으로 총 6종의 균주이며, acnes의 배양 배지는 RC 배지를 사용하였으며 P. acne는 \(4^{\circ} \mathrm{C}\)에서 보관하면서 실험 72시간 전에 활성화 시켰으며, 균을 배양 배지에 접종한 후 anaerobic jar에서 Gaspack system을 사용하여 밀봉하여 \(37^{\circ} \mathrm{C}\)에서 72시간 동안 혐기성 배양하였다. 추출물의 항균활성은 각 균주를 대상으로 disc diffusion assay로 측정하였으며, paper disc 실험을 통해서 강력한 항균력을 니타낸 사자발쑥의 에틸아세테이트 분획물에 대하여 agar-dilution method를 사용함으로써 최소저해농도를 정확히 확인할수 있다.
<h2>Photohemolysis법을 이용한 세포 보호 효과 측정</h2> <p>사람 적혈구를 대상으로 활성산소 \( ( \)특히 \( \left.{ }^{1} \mathrm{O}_{2}\right) \) 에 의한 세포 손상(또는 파괴)을 모델로 한 적혈구 광용혈 실험을 통해서 세포 보호 효과를 측정하는 실험이다. 빛과 광증감제인 rose-bengal에 의해 유도된 적혈구의 용혈 정도를 측정하여 추출물이 자외선에 의한 피부 보호 물질로서 적합한 지에 대한 가능성을 판단할 수 있다고 사료된다.</p> <p>적혈구 현탁액 제조: 적혈구는 건강한 성인 남녀로부터 얻었다. 채혈 즉시 항응고제인 heparin이 첨가된 시험관에 넣은 후, \( 3,000 \mathrm{~rpm} \) 으로 \( 5 \mathrm{~min} \) 동안 원심 분리하여 적혈구와 혈장을 분리하고, 분리한 적혈구는 \( 0.9 \% \) saline phosphate buffered saline \( \left(\mathrm{pH} 7.4, \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot 12 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ~9.6 \mathrm{mM}, \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \cdot\right. \) \( \left.2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ~1.6 \mathrm{mM}\right) \) 으로 세척하여 원심분리하고 백혈구 층을 제거하였다. 3회 반복하여 세척, 분리한 적혈구는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 의 냉장고에 보관하면서 사용하였고, 모든 실험은 채혈 후 12 h 이내에 행하였다. 광용혈 실험은 이미 확립된 방법에 따라 수행하였다. 실험에 사용된 적혈구 현탁액은 \( 700 \mathrm{~nm} \) 에서 O.D. 는 0.6이었으며 이때 적혈구 수는 \( 1.5 \times 10^{7} \mathrm{cells} / \mathrm{mL} \) 이었다.<p> <p>사자발쑥 추출물의 광용혈 억제 효과: 적혈구 현탁액 \( 3.5 \mathrm{~mL} \) 를 파이렉스 시험관(No. 9820)에 넣은 후, 추출물을 농도별 로 각각 \( 50 \mu \mathrm{L} \) 씩 첨가하였다. 암소에서 30 분 동안 사전반응 (pre-incubation)시킨 후, 광증감제 rose-bengal \( (12 \mu \mathrm{M}) 0.5 \mathrm{~mL} \)를 가하고 15 분 동안 광조사를 하였다.</p> <p>광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 \( 50 \times 20 \times 25 \) \( \mathrm{cm} \) 크기의 상자 안에 \( 20 \mathrm{~W} \) 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 \( 5 \mathrm{~cm} \) 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15 분 동안 광조사를 하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 용혈정도를 15 분 간격으로 \( 700 \mathrm{~nm} \) 에서 투광도 (transmittance, \( \%) \)를 측정하여 구하였다. 이 \( 700 \mathrm{~nm} \) 의 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도의 증가는 적혈구의 용혈정도에 비례한다. 모든 실험은 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 항온실에서 행하였다. 사자발쑥 추출물의 광용혈에 미치는 효과는 후암반응(post-incubation) 시간과 용혈정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 \( 50 \% \) 가 용혈되는 시간인 \( \tau_{50} \) 을 구하여 비교하였다.</p> <p>대조군(control)은 \( \tau_{50} \) 이 31 분으로 오차범위 \( \pm 1 \mathrm{~min} \) 이내로 모든 경우의 실험에서 재현성이 양호하게 나타냈다. Rose-bengal을 첨가하고 광조사를 안 했을 경우와 rose-bengal을 첨가하지 않고 광조사만 했을 경우는 모두 암반응 120 분까지는 용혈이 거의 일어나지 않았다. 모든 실험은 3 회 반복하여 평균하였다.</p> <h2>타이로세네이즈 저해활성 측정</h2> <p>멜라닌 함량을 감소시키거나 표피로 전달되는 과정을 차단하기 위한 미백 효능 평가의 방법으로 타이로시네이즈 저해활성 평가법을 이용하였다. L-타이로신의 기질로부터 멜라닌 생성과정에서 타이로시네이즈가 핵심효소로 작용하여 생성되기 때문에 타이로시네이즈의 저해활성은 미백활성을 측정하는데 중요하다. 실험방법은 L-타이로신 \( (0.3 \mathrm{mg} / \mathrm{mL}) \) 을 potassium phosphate buffer \( (0.1 \mathrm{~M}, \mathrm{pH} 6.8) \) 에 용해시킨 용액 \( 1.9 \mathrm{~mL} \) 에 추출물 \( 0.1 \mathrm{~mL} \) 과 타이로시네이즈 \( (1,250 \mathrm{~units} / \mathrm{mL}) ~0.1 \mathrm{~mL} \) 를 가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분 동안 항온 배양시킨다. 반응혼합물을 얼음 수조에 넣어 반응을 종결시키고, \( 475 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 타이로시네이즈 저해활성은 타이로시네이즈의 활성을 \( 50 \% \) 감소시키는뎨 필요한 시료의 농도(inhibition concentration, \( \mathrm{IC}_{50}, \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) )로 표기하였다.</p> <h2>사자발쑥 추출물의 항균활성 측정</h2> <p>사용균주: 본 실험에 사용된 균주는 피부상재균으로서, Gram (+) 균주 3종, Gram (-) 균주 2종 및 효모균 1종으로 총 6종의 균주이며, 여드름의 원인균인 P. acnes ATCC6919 와 바듬균인 P. ovale ATCC12078, 호기성 Gram (+) 균주인 S. aureus ATCC6538, B. subtilis ATCC19659, 호기성 Gram (-) 균주인 E. coli ATCC23736, P. aeruginosa ATCC29336 를 한국 미생물 보존센터 KCCM에서 분양받아 사용하였다.</p> <p>배지 및 배양조건: P. acnes의 배양 배지는 Reinforced clostridial(RC) 배지(Merck, Germany)를 사용하였으며 P. acne는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하면서 실험 72 시간 전에 활성화 시켰으며, 균을 배양 배지에 접종한 후 anaerobic jar에서 Gaspack system(Merck Anaerocult\(^{Ⓡ} \) Gaspack system, Germany) 을 사용하여 밀봉하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 72 시간 동안 혐기성 배양하였다. 호기성 Gram (+) 균주인 S. aureus, B. subtilis와 Gram (-) 균주인 E. coli, P. aeruginosa 는 Mueller-Hinton 배지 (Merck, Germany)를 사용하였으며 균을 접종한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 24 시간 배양하였다. 또한 비듬균인 P. ovale는 Pityrosporum 배지(Malt extract agar \( 6\% \), ox-bile \( 2 \% \), tween \( 401 \% \), glycerol mono-oleate \( 0.25 \% \) )를 사용하였으며 균을 접종한 뒤 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 동안 배양하여 사용하였다.</p> <p>Disc diffusion assay에 의한 항균활성 측정: 각 추출물의 항균활성은 각 균주를 대상으로 disc diffusion assay로 측정하였다. 배양된 균주는 \( 1 \times 10^{7} \mathrm{~CFU} / \mathrm{mL} \) 으로 조절한 후 본 실험에 사용하였다. 평판배지에 배양된 각 균주를 멸균 면봉을 이용하여 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 씩 도말하여 준비하였고, 시료를 disc 당 \( 0.5,2.5 \mathrm{~mg} \) 이 되도록 paper disc (diamerter \( 8 \mathrm{~mm} \), Roshikaisha. Ltd., Tokyo, Japan)에 천천히 흡수시킨 뒤, 건조과정을 거쳐 용매를 휘발시켰다. 각각의 시료가 흡수된 paper disc를 도말한 평판배지 위에 밀착시킨 상태로 배양한 후 disc 주변에 생성된 저해환(clear zone, \( \mathrm{mm} \) )을 측정하여 항균활성을 비교하였다.</p> <p>최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 측정: paper disc 실험을 통해서 강력한 항균력을 니타낸 사자발쑥의 에틸아세테이트 분획물에 대한 정확한 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 조사하기 위하여 agar-dilution method를 사용하여 수행되었다. 각각의 균주는 농도를 \( 1 \times 10^{7} \mathrm{~CFU} / \mathrm{mL} \) 로 조절한 후 본 실험에 사용하였다. 에틸아세테이트 분확물과 대조군으로써 화장품에 방부제로 사용되는 methyl paraben을 DMSO를 사용하여 2 배 희석법을 이용하여 농도를 희석하였다. 그 후에 샘플을 2 \( \mathrm{mL} \) 씩 함유한 배지 \( 20 \mathrm{~mL} \) 를 Petri dish에 주입하였고, 시험균을 평판배지 위에 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 씩 도말하여 배양하였다. 육안으로 관찰하였을 때, 각각의 균들이 증식되지 않는 농도를 MIC로 결정하였다.</p>