염기서열 분석을 위해 PCR로 증폭시킨 후 유전형을 분석하였다. 교차접합시험을 위해서는 분리된 ESBL 생성 Klebsiella pneumoniae 균주를 전달균주로 하고 E. coli RG176\( { }^{\mathrm{Na} ⓡ } \)를 피전달균주로 지정하였다. 형질전환실험은 대상균주의 유전자 형별을 분석하여 TEM-1, SHV-12, CTX-M-15 유전자를 모두 가지고 있는 것을 확인한 후 진행하였다.
<h2>염기서열 분석( DNA sequence analysis)</h2><p>PCR에 의하여 증폭된 산물의 염기서열을 분석하여 유전형을 규명하였다. PCR 산물을 gel에서 분리하여 template로 이용하여 sequencing용 PCR을 실시하였다. Sequencing용 PCR시 primer는 forward와 reverse를 각각의 tube에 \( 1 \mu \mathrm{l} \) (5 \( \mathrm{pmol} / \mu \mathrm{l} \)) 넣고 Big dye terminator Ⅱ \( 4 \mu \mathrm{l} \), template \( 5 \mu \mathrm{l} \)를 넣어 총량이 \( 10 \mu \mathrm{l} \)가 되도록 하였다. PCR 조건은 \( 96^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 predenaturation을 실시하고, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10초간 de-naturation, annealing은 PCR annealing 온도에서 4초간 실시하였으며, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4분간 extension을 실시하여 \( 25 \mathrm{cycle} \) 동안 반응하였다. 최종 incubation은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 실시하였다. Sequencing용 PCR이 끝나면 결과물 \( 10 \mu \mathrm{l} \)에 \( 3 \mathrm{M} \) sodium acetate \( (\mathrm{pH} 4.6 )\) \(1 \mu \mathrm{l} \)와 \( 100 \% \) ethanol \( 25 \mu \mathrm{l}\)를 첨가하여 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 이상 침전시킨 다음 원심분리 \((22,000 \times \mathrm{g}\), \(15 \mathrm{min}\), \(4^{\circ} \mathrm{C})\)하여 상등액을 제거하고 \( 70 \% \) ethanol \( 100 \mu \mathrm{l} \)로 씻어 준 다음 원심분리 \( (22,000 \times \mathrm{g}\), \(20 \mathrm{min}\) \(4^{\circ} \mathrm{C})\)하였다. 모아진 pellet을 10분간 vacuum dry 하고 TSR (Template Suppression Reagent) \( 25 \mu \mathrm{l} \)에 녹여 \( 96^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분 30초간 방치한 후 ice에 정치 후 ABI Prism 310 (Applied Biosystems)을 이용하여 염기서열을 결정하였다.</p><h2>교차접합시험(Transconjugation Experiment)</h2><p>분리된 ESBL 생성 Klebsiella pneumoniae 균주를 전달균주로 하고 E. coli RG176\( { }^{\mathrm{Na} ⓡ } \)를 피전달균주로 하여 교차접합시험을 실시하였다. 시험균주들은 모두 TSB (tryptic soy broth)에서 배양된 대수 증식기 중반의 신선한 균주를 선정하였다. 전달균주와 피전달균주의 균체 수 비율을 1:1이 되게 하여 새로운 TSB에 혼합한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 18시간 배양하였다. 이 배양액을 멸균된 면봉에 적셔 ceftazidime \( (30 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml})\)+nali-dixic acid \( (16 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)가 첨가된 MacConkey agar에 고르게 도말하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 18시간 배양하여 균 집락 생성 유무를 조사하였다. MacConkey agar에 자란 균 집락을 재동정하여 생화학검사와 항균제 감수성검사를 실시하여 피전달균주인 E. coli로 내성이 전달되었는지를 확인하였다.</p><h2>형질전환시험(Transformation)</h2><p>대상균주가 가지고 있는 유전자의 형별을 분석하여 TEM-1과 SHV-12 그리고 CTX-M-15 의 세 가지 유전자를 모두 가지고 있는 것을 확인 한 후 형질전환 실험을 하였다. 먼저 시험균주를 TSB (tryptic soy broth) 배지에 접종하고 \(37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 18시간 배양하였으며, \( 10,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리한 후 침전물을 \( \operatorname{AccPrep}^{\circledR} \) plasmid extraction kit (Bioneer. Korea)를 이용하여 plasmid DNA를 추출하였다. Competent cell (E. coliDH5\(\alpha\)) \( 100 \mu \mathrm{l}\)에 대상균주 plasmid DNA \( 10 \mu \mathrm{l} \)를 첨가한 후 혼합하였다. 얼음 위에 10분 동안 방치한 후 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) water bath에 90초 동안 tube를 넣어두었다. Heat shock 직후 2분 동안 얼음에 tube를 보관 한 뒤 LB 액체배지 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 씩 첨가하고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) shaking incubator에 약 1시간 동안 배양시켰다. Ampicillin 항생제 \( (100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)가 함유되어 있는 LB 평판배지에 X-Gal \( (50 \mathrm{mg} / \mathrm{ml})\) \(20 \mu \mathrm{l} \)를 도말한 후 형질전환 시킨 배양액 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 씩 분주하여 도말 하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 18시간 이상 배양하였다.<p>LB 평판배지에서 자란 백색집락을 선택하여 다시 항생제가 포함된 LB 액체배지에 배양시켜서 plasmid DNA를 추출하여 PCR을 통해 형질전환 되었는지를 확인하였다. 또한 항생제 감수성 검사와 생화학 검사를 실시하여 균의 특성을 확인하였으며, 특히 double disk synergy test로 ESBL gene의 발현이 되었는지를 확인하였다.</p>