본 연구에서 녹차의 항산화능을 보기우해 플라보노이드, 페놀, Catechin, SOD 유사활성, Hydroxyl radical 소거능, \(\beta\)-carotene-linoleate 실험을 진행하였다. 녹차는 볶음차, 후발효차에 증류수를 가해 여과 후 사용했으며 플라보노이드의 정량은 Davis 변법, 페놀의 경우 Folin-Denis 방법을 이용하였다. Catechin은 HPLC로, SOD는 pyrogallol의 자동산화에 의한 발색원리를 이용해 흡광도를 측정하였다. Hydroxyl radical 소거능은 Halliwell과 Gutteridge의 방법을, 마지막으로 항산화력을 \(\beta\)-carotene-linoleate이용한 항산화 효과를 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료</h2> <p>본 실험에 사용된 녹차는 볶음차이며, 후발효차는 자연 유래의 미생물 발효차로서 경남 사천시 곤명면 영봉다원에서 생산되는 친환경 유기농 차엽(6월 초순)으로 제조되는 수제품으로 차광성과 밀폐성이 강한 필름에 포장되어 1년간 실온에서 저장된 실험용 시료를 각각 사용하였다.</p> <h2>시료제조</h2> <p>상기 녹차(\(100\mathrm{g}\))와 후발효차(\(100\mathrm{g}\))에 각각 20배의 증류수를 가하여 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 8시간 환류냉각하여 3회 추출 한 후 여과하였으며, 이것을 회전증발기에서 농축하였다. 농축물은 다시 동결건조한 후 포장하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하면서 시료로 사용하였다. 이후의 분석결과는 각 시료 당 3회 반복 실시하여 평균값으로 나타내었다.</p> <h2>시약 및 기기</h2> <p>본 실험에 사용한 주요 시약으로 (+)-catechin, (-)-gallocatechin gallate, (-)-gallocatechin, (-)-epigallocatechin, (-)-epigallocatechin gallate, catechol, quercetin, caffeic acid, L-ascorbic acid, pyrogallol, butylated hydroxytoluene, potassium ferricyanide, 2-thiobarbituric acid, \( \beta \)-carotene 등은 Sigma사(USA)제품을 이용하였으며, 용매 및 기타 시약은 특급 또는 1급을 사용하였다.</p> <h2>총 플라보노이드 측정</h2> <p>총 플라보노이드의 정량은 Davis 변법을 이용하였으며, 녹차와 후발효차 추출물의 분말 \( 0.01 \mathrm{~g} \)에 증류수 \( 60 \mathrm{ml} \)를 가한 후 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 추출한 다음, 다시 여과하여 \(100\mathrm{ml} \)로 정용하였다. 그리고 여과액을 일정량 취하여 시험관에 옮긴 후 \( 90 \% \) diethylene glycol과 \( 1 \mathrm{N}\) \(\mathrm{NaOH}\) \(0.75 \mathrm{ml} \) 를 혼합하여 \( 420 \mathrm{~nM} \)에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준곡선은 quercetin (Sigma Co., USA)의 농도를 \(0 \sim 0.5 \mathrm{mg}\) 범위가 되도록 제조하였으며, 검량선으로부터 시료 추출물의 풀라보노이드 함량을 계산하였다.</p> <h2>총 페놀 측정</h2> <p>총 페놀의 정량은 Folin-Denis방법에 따라 시험관에 시료 \( 0.01 \mathrm{~g} \)에 Folin-Denis 시약 \( 5 \mathrm{ml} \)를 넣어 혼합한 후, 증류수로 \( 100 \mathrm{ml} \) 정용한 다음 실온에서 30분간 방치하여 \( 760 \mathrm{~nM} \)에서 흡광도를 측정하였다. 이때 quercetin (Sigma Co., USA)의 농도를 \( 0 \sim 0.5 \mathrm{mg} \)범위가 되도록 제조하여 검량선으로부터 시료 추출물의 페놀 함량을 계산하였다.</p> <h2>Catechin 분석</h2> <p>Catechin 분석은 Wang 등의 방법에 준하여 HPLC로 분석하였다. 즉, 시료 \( 0.05 \mathrm{~g} \)을 각각 시험관에 넣고 1분 동안 sonication 시킨 증류수를 \( 30 \mathrm{ml} \) 가하여 혼합시킨 다음 10분간 원심분리한 후 상징액을 취하였다. 이 상징액에 증류수를 가하여 \( 50 \mathrm{ml} \)로 정용하였다. 그리고 Sep-pak \( \mathrm{C}_{18} \) cartridge에 통과시켜 HPLC로 분석하였다. 용매는 \( 1 \% \) phosphoric acid로 \( 25 \% \) tetrahydrofuran (THF)을 분당 \( 1 \mathrm{ml} \)로 용출하였으며 UV detector로 \( 210 \mathrm{nM} \)에서 측정하였다.</p> <h2>Superoxide dismutase (SOD) 유사활성 측정</h2> <p>SOD 유사활성은 알칼리 상태에서 pyrogallol의 자동산화에 의한 발색원리를 이용한 Marklund와 Marklund의 방법에 따라 측정하였다. 각 시료 \( 0.2 \mathrm{ml} \)에 \( \mathrm{pH} 8.5\)로 보정한 tris \(\mathrm{HCl}\) buffer \( 3 \mathrm{ml} \)와 \( 7.2 \mathrm{mM} \) pyrogallol \( 0.2 \mathrm{ml} \)를 가하고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 정확히 10분간 방치한 후 \( 1 \mathrm{~N}\) \(\mathrm{HCl}\) \(1 \mathrm{ml} \)를 가하여 반응을 정지시켜 산화된 pyrogallol의 흡광도를 \( 420 \mathrm{~nM}\)에서 측정하여, \(100 -\) [(시료첨가구의 흡광도/ 무첨가구의 흡광도)\( \times 100] \)으로 나타내었다.</p> <h2>Hydroxyl radical 소거 효과 측정</h2> <p>Hydroxyl radical (OH \(\cdot\)) 소거 효과의 측정은 Halliwell과 Gutteridge 등의 방법에 따라 ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)가 포함된 Fenton 반응계에서 분석하였다. \( 1 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{FeCl}_{3}\),\(1 \mathrm{mM}\) EDTA, \( 20 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\), \(1 \mathrm{mM}\) ascorbic acid, \( 30 \mathrm{mM} \) 2-deoxy-2-ribose를 \( 28 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} - \mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \) buffer (\( \mathrm{pH} 7.4\))에 녹인 후 각각 \( 0.3 \mathrm{ml} \)씩 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응시킨 후 60분간 incubation시켰다. 다시 thiobarbituric acid (TBA)와 trichloroacetaic acid (TCA)를 첨가하여 끓는 물에서 20분간 반응한 다음 신속하게 냉각시켜 \( 532 \mathrm{nM} \)에서 spectrophotometer (Shimadzu UV-1601, Japan)를 이용하여 흡광도를 측정하였으며 대조구는 butylated hydroxyanisole (BHA)를 사용하였다.</p> <h2>\( \beta \)-Carotene-linoleate system을 이용한 항산화 효과 측정</h2> <p>시료의 항산화력은 \( \beta \)-carotene-linoleate model system으로 측정하였다. 즉 chloroform과 \( \beta \)-carotene용액에 linoleic acid \( 0.375 \mathrm{ml} \)과 tween 40을 첨가한 후 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)의 회전증발기에서 chloroform을 제거하였다. 잔류 emulsion에 3차 증류수 \( 750 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 강하게 진탕한 다음 용기에 넣어 둔다. 시험관에 emulsion용액 \( 2.5 \mathrm{ml} \)에 추출물 \( 0.3 \mathrm{ml} \)에 동일한 것을 두 개 만들어 하나는 그대로 사용하고, 다른 하나는 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 105분 동안 암실에서 incubation시킨 다음 \( 492 \mathrm{nM} \) 에서 spectrophotometer (Shimadzu UV-1601, Japan)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 이때 대조구는 L-ascorbic acid를 사용하였다.</p> <p>Antioxidant activity effect \( (\%)=\frac{\text { Sample }_{0}-\text { Blank }_{105}}{\text { Blank }_{0}-\text { Blank }_{105}} \times 100 \)</p>