Alkaline phosphatase 효소활성 측정을 위하여 포화배양된 MC3T3-E1 세포를 \( 1 \times 10^{5} \) cell/well로 조정하여 96 well plate에 분주하고 24시간 후 분화유도배지로 교환하여 24시간 배양 후 시료처리를 하고, p-NPP로부터 생성된 p-nitrophenol (p-NP)를 측정하여 p-NP에 대한 표준그래프를 작성한 후 ALP activity 활성도를 도출하였고, 단백질량으로 나누어 단위단백질함량당 효소활성도를 산출하였으며, ALP 효소의 염색 정도를 측정하기 위해 24 well에 \( 1 \times 10^{5} \) cells/mL로 처리하고 추출물을 적정농도로 희석처리한 후 시간경과에 따른 효소 활성을 측정하였다. Alizarin-Red 염색법에 의한 석회화 형성도 검사를 위해 Nodule 형성 확인 후 \( 10 \mathrm{mM} \) sodium phosphate( \( \mathrm{pH} \) 7.0)에 \( 10 \% \) cetylpyridinium chloride를 첨가하여 15분간 녹이고 염색된 정도는 \( 562 \mathrm{nM} \) 에서 흡광도로 측정하였으며 실험결과의 통계분석은 SAS program을 이용한 분산분석법을 실시하여 Duncan's multiple range test에 의해 시료간의 유의적 차이를 검정하였다.
<h3>Alkaline phosphatase 효소활성 측정</h3> <p>포화배양된 MC3T3-E1 세포를 \( 1 \times 10^{5} \) cell/well로 조정하여 96 well plate에 분주하고 24시간 후 분화유도배지로 교환하여 24시간 배양 후 시료처리를 하였다. 복분자 추출물과 양성대조군을 넣어 각각 3, 9, 18, 27일로 세포를 배양한 후 PBS로 3회 세척한 다음 \( 0.1 \% \) Triton X-100을 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 씩 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분간 lysis하였다. Lysis된 cell의 상등액 \( 5 \mu \mathrm{L} \)는 단백질 정량에 사용하였고, 나머지 상등액에 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 의 0.1 N glycine과 \( 10 \mu \mathrm{L} \) 의 \( 100 \mathrm{mM} \) p-nitrophenylphosphate p-NPP 를 첨가한 후 다시 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 \( 200 \mu \mathrm{L} \) 의 0.1 N \( \mathrm{NaOH} \) 로 반응을 중지하고 \( 405 \mathrm{nM} \) 에서 흡광도를 측정하였다. ALP activity는 p-NPP로부터 생성된 p-nitrophenol (p-NP)를 측정하여 p-NP에 대한 표준그래프를 작성한 후 활성도를 도출하였고, 단백질량으로 나누어 단위단백질함량당 효소활성도를 산출하였다.</p> <h3>ALP 염색법에 의한 조골세포 활성검색</h3> <p>ALP 효소의 염색 정도를 측정하기 위해 24 well에 \( 1 \times 10^{5} \) cells/mL로 처리하고 추출물을 적정농도로 희석처리한 후 시간경과에 따른 효소 활성을 측정하였다. 염색은 alkaline phosphatase (AP) kit (Sigma)를 사용하여 측정하였다. 그 방법은 다음과 같다. 민저, 배지를 제거하고 고정액(citrate-acetone- formaldehyde)을 첨가하여 약 30초간 실온에 보관하였다가 45초간 증류수로 행구었다. 준비된 diazonium solution (sodium nitrite : FRV-alakline : naphthol AS-BI alkaline solution = 1:1:1)을 첨가하여 약 15분간 실온에서 방치한 뒤 2분간 증류수로 세척하고 hematoxylin solution으로 2분간 다시 염색한 뒤 흐르는 물로 염색액을 제거한 다음 현미경으로 관찰하였다.</p> <h3>Alizarin-Red 염색법에 의한 석회화 형성도 검사</h3> <p>ALP 염색법과 동일하게 24 well에 조골세포를 \( 1 \times 10^{5} \) cells/mL로 처리한 뒤, 배지를 제거하고, PBS로 세척한 뒤, \( 70 \% \) EtOH 로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간동안 고정시켰다. Alizarine red (AR) solution은 \( 10 \mathrm{~mL} \) 의 증류수에 \( 40 \mathrm{mM} \) 이 되게 농도를 맞춘 뒤 \( \mathrm{pH} \) 를 4.2로 조정하였다. 준비한 AR solution으로 10분간 염색하고, 증류수로 2번 washing한 뒤 염색되지 않은 부분은 PBS로 씻어주면서 제거해주고 표면이 너무 마르지않게 PBS로 조금 적셔주면서 현미경으로 nodule형성 정도를 관찰하였다. Nodule 형성 확인 후 \( 10 \mathrm{mM} \) sodium phosphate( \( \mathrm{pH} \) 7.0)에 \( 10 \% \) cetylpyridinium chloride를 첨가하여 15분간 녹이고 염색된 정도는 \( 562 \mathrm{nM} \) 에서 흡광도로 측정하였다.</p> <h3>RT-PCR법에 의한 조골세포 분화 관련 골기질 유전자 발현 조사</h3> <p>Total RNA는 조골세포를 \( 100 \phi \) dish에 \( 1 \times 10^{6} \) cells/mL로 9일간 배양하여 분리하였다. TRI reagent를 사용하여 제조사의 지침에 따라 분리하였다. 배양된 세포에서 배지를 제거하고 phosphate buffered saline (PBS, \( 7.4 \mathrm{pH} \)) \( 10 \mathrm{~mL} \) 로 두번 세척한 후 TRI reagent를 처리하였다. 이것을 \( 1.5 \mathrm{~mL} \) tube에 \( 1 \mathrm{~mL} \) 씩 담고 1-bromo-3-chloropropane을 \( 200 \mu \mathrm{L} \) 첨가하여 30초간 vortex 하여 원심분리( \( 3,000 \mathrm{rpm} \), 15분, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) ) 하여 상등액은 취해 새로운 tube에 옮겼다. 여기에 동량의 isopropanol을 첨가하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2시간 이상 방치하고 나서 원심분리( \( 13,000 \mathrm{rpm} \) , 15분, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) )한 후 상등역을 제거하였다. 침전물에 \( 75 \% \) 에탄올을 첨가하여 제거한 후 diethyl pyrocarbonate (DEPC) 처리된 증류수를 첨가하여 \( 65^{\circ} \)수조에서 10분간 반응시켜 침전물을 녹였다. 분리된 RNA는 spectrophotometer와 \( 1 \% \) formaldehyde agarose gel 전기영동을 이용하여 정량하고 확인하였다.</p> <p>분리된 total RNA \( 2 \mu \mathrm{g} \), superscript II RT200 U, \( 0.5 \mu \mathrm{g} \) Oligo dT, \(0.5 \mathrm{mM} \mathrm{dNTP} \) 를 첨가하여 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 90분간 반응시킨 후 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 반응을 종결시켰다.</p> <p>Total RNA는 역전사되고 결과물인 cDNA는 Table 1 의 primer들을 이용한 PCR방법으로 증폭되었다. PCR의 반응에는 2.5 UTakara Ex. Taq polymerase, \( 2 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2}, 0.2 \) \( \mathrm{mM} \mathrm{dNTP} \) 를 첨가하여 각각의 primer에 맞는 조건으로 실시하였다.</p> <h3>통계처리</h3> <p>실험결과의 통계분석은 SAS program을 이용한 분산분석법을 실시하여 Duncan's multiple range test에 의해 시료간 의 유의적 차이를 검정하였다.</p>