Cell lysate를 buffer로 준비한 후 SDS-PAGE로 protein을 분리하고, Immunoblot analysis로 분리된 protein의 양과 상태를 분석하는 Immunoblot analysis를 사용한다. Inducible nitric oxide synthase (iNOS)발현은 anti-iNOS antibody를 사용하여 면역화학적 방법으로 분석하였고, anti-NF- \( \kappa \)B p65 monoclonal antibody를 사용하여 NF- \( \kappa \)B를 측정하였다. 원심분리를 여러 번 거치며 상등액을 제거하고, 10분간 \( 15,800 \times \mathrm { g } \) 로 원심분리하여 핵분획이 포함된 상등액을 얻어 실험에 이용하였다.
<h2>Immunoblot analysis</h2> <p>\( 1 \% \) Triton X-100, \( 137 \mathrm { mM } \) sodium chloride, \( 10 \% \) glycerol, \( 2 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 1 \mathrm { mM } \) sodium orthovanadate, \( 25 \mathrm { mM } \) b-glycer-ophosphate, \( 2 \mathrm { mM } \) sodium pyrophosphate, \( 1 \mathrm { mM } \) phenyl-methylsulfonylfluoride, \( 20 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } ( \mathrm { pH } \) 7.5)와 1 \( \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) leupeptin을 포함하는 buffer를 이용하여 cell을 lysis하였고, cell lysates를 \( 10,000 \times \mathrm { g } \) 로 10분간 원심분리하여 de-bris를 제거하였다. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) 발현은 anti-iNOS antibody를 사용하여 면역화학적 방법으로 분석하였으며, anti-NF- \( \kappa \)B p65 monoclonal antibody를 사용하여 NF- \( \kappa \)B를 측정하였다. 2차 antibody로는 goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase (HRP)를 사용하였으며, iNOS와 NF- \( \kappa \)B의 band는 ECL immuno blotting detection reagents(Amersham)를 이용하여 발색하였다.</p> <h2>핵 분획제조</h2> <p>세포를 냉각시킨 PBS로 2회 세척하고, 이것을 PBS와 함께 microtube에 넣어 \(2,000 \times \mathrm { g } \) 로 5분간 원심분리한 후, PBS를 제거하고, \( 10 \mathrm { mM } \) HEPES ( \( \mathrm { pH } 7.9) \), \( 10 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { KCl } \), \(0.1 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 0.5 \% \) Nonidet P-40, \( 1 \mathrm { mM } \) DTT, \( 0.5 \mathrm { mM } \) phenyl-methylsulfonylfluoride를 함유하는 hypotonic buffer를 넣어 10분간 얼음위에 놓은 후, \( 7,200 \times \mathrm { g } \) 로 5분간 원심분리하였다. 그 후, 상등액을 제거하고 crude nuclei가 함유된 pellet에 \(20 \mathrm { mM } \) HEPES \( \mathrm { pH } 7.9 \), \( 400 \mathrm { mM } \mathrm { NaCI } \), \(1 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 10 \mathrm { mM } \) DTT, \( 1 \mathrm { mM } \) PMSF를 함유하는 추출용 buffer \( 50 \mu \mathrm { l } \) 를 넣어 30분간 얼음 위에 방치한 후, 10분간 \( 15,800 \times \mathrm { g } \) 로 원심분리하여 핵분획이 포함된 상등액을 얻어 실험에 이용하였다.</p>