2007년 4월부터 10월까지 부산에 거주하며 성병 건강검진이 필요한 직업에 종사하는 개인(주로 유흥업소 여성근로자)에게 참여 동의서를 제공하였다. 보건소 및 대체성병진료소 방문 시 접촉하여 검사를 받고 자궁경부도말 검체를 채취하였으며 면봉을 사용하여 총 660개의 검체를 채취하여 실험 내내 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)의 온도를 유지하면서 바이러스 수송 매체(VTM)에 즉시 넣었습니다. 유전자 증폭 후, PCR 산물을 2.5% 아가로스 겔에서 전기영동하여 샘플 품질을 평가했습니다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>연구 재료</h2> <p>2007년 4월부터 10월까지 부산시내 거주하면서 성병에 관한 건강진단을 받아야 할 직업에 종사하는 자(주로 유흥업소 여성종사자)를 대상으로 이들이 보건소 및 대용성병진료소에 성병 검진차 내원하였을 때 협조 동의 후 자궁경부 도찰물을 시료로 사용하였다. 총 660건의 검체 채취는 면봉으로 하였으며, 채취 즉시 VTM (viral transport medium)에 넣어 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 유지하여 실험에 사용하였다.</p> <h2>DNA 추출</h2> <p>채취한 검체는 진탕 후 \( 500 \sim 1,000 \mu \mathrm{l} \)정오도를 effendorf tube (\( 1.5 \mathrm{ml} \))에 넣고 \( 9,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리 후 상층액을 제거하고 세척용 완충액으로 2회 세척하였다. DNA 정제는 DNA 추출용 버퍼 \( 200 \mu \mathrm{l} \) 를 넣고 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 항온수조에서 3시간 방치 후 90- \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20분간 가열하였다. 추출된 HPV DNA는 \( 14,000 \mathrm{rpm} / 10 \mathrm{~min} \) 원심분리 후 상층액을 취하여 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다.</p> <h2>PCR에 의한 증폭</h2> <p>추출된 DNA의 PCR시험은 MyHPV Chip Kit \( { }^{\circledR} \) 에서 제공하는 시험법에 의하였다. 먼저 1st PCR은 추출된 template DNA \( 5 \mu \mathrm{l}, 10 \times \) buffer \( 2.5 \mu \mathrm{l}, 2.5 \mathrm{mM} \) dNTP \( 2.0 \mu \mathrm{l} \), Taq polymerase (\( 5 IU/ \mu 1 \) , Takara Co., Japan) \( 0.5 \mu 1 \), \( \beta \)-globin primer [\( \beta \)-globin F (5'-GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG-3'), \( \beta \)-globin R (5'-T GGTCTCCT TAAACCTGTCTTG-3')] 각 \( 1.0 \mu \mathrm{l} \), MY09/ MY11 primer [MY09-C (5'-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3'), MY11-N (5'-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3')] 각 \( 1.0 \mu 1 \) 를 넣고 증류수로 총 \( 25.0 \mu 1 \) 되게 하였다. PCR 수행은 PTC-200 (MJ Research, Inc)을 이용하여 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 초기 변성 후, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초의 조건에서 30회 반복 수행 후 최종적으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4분간 신장 후 종결하였다. 유전자 증폭이 끝난 후 \( 2.5 \% \) 아가로스 겔에서 전기영동하여 검체의 적합성 유무 판정을 위한 대조군인 \( 250 \mathrm{bp} \) 크기의 \( \beta \)-globin과 \( 451 \mathrm{bp} \) 크기의 PCR 산물을 확인하였다.</p>