유기용매의 도입은 입체선택적 가수분해 반응의 효율을 향상시킬 수 있을 것으로 기대할 수 있으나, 생촉매 활성을 저하시킬 수 있는 문제가 있다. 특히 유기용매 시스템에서는 효소 주위의 필수 물분자층(essential water shell)이 촉매활성 유지에 필수적인 것으로 보고되고 있기에 본 논문에서는 소수성 계열의 유기용매를 중심으로 유기용매를 선정하였다. 다음으로 본 논문에서는 유기용매로 \(2\)성분계에서 비대칭 분할반응을 위해, 가장 효율적인 phenyl oxirane 물질전달을 기대할 수 있는 hollow-fiber membrane을 이용한 비대칭 분할 시스템을 개발하였는데, 고농도 반응의 경우 반응산물인 pheny-1,2-ethanediol 생성에 따른 EH 반응속도 저해 현상을 극복할 수 없는 단점이 있었으며, 이를 통해 이 문제를 극복할 수 있는 반응기 시스템이 요구됨을 알 수 있다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>유기용매의 선정</h2><p>유기용매의 도입으로 기질인 라세믹 phenyl oxirane의 용해도 증가 및 화학적 안정성증가로 입체선택적 가수분해 반응의 효율을 향상시킬 수 있을 것으로 기대할 수 있으나, 유기용매 사용이 생촉매 활성을 저하시킬 수 있으므로 이러한 문제점을 극복할 수 있는 생물반응기 시스템 개발이 요구된다. 일반적으로 친수성 유기용매를 사용하는 경우 세포의 효소 활성에 악영향을 주는 경우가 많이 보고되고 있다. 유기용매 시스템에서는 효소 주위의 필수 물분자층(essential water shell)이 단백질의 3차 구조를 유지시켜 주는 것이 촉매활성 유지에 필수적인 것으로 보고되고 있다. 친수성 유기용매를 사용하는 경우 이러한 필수 물분자 층이 쉽게 용해되어 제거될 가능성이 높으므로 본 과제에서는 소수성 계열의 유기용매를 중심으로 유기용매를 선정하였다. 실험 방법으로는 유기용매 \( 2 \mathrm{ml} \)에 세포 농축액 \( (230 \mathrm{mg} \mathrm{DCW} / 10 \mathrm{ml})\)이 들어 있는 \( 100 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 8.0) \)로 전체 용량을 \( 10 \mathrm{ml} \)로 만들고 \( 20 \mathrm{mM} \) phenyl oxirane을 첨가한 후, \( 35^{\circ} \mathrm{C}\), \(200 \mathrm{rpm} \) 조건의 진탕배양기에서 30분 동안 반응을 수행하였다. 반응종료 후 \( 10 \mathrm{ml} \)의 ethyl acetate와 혼합시킨 후 유기용매층을 chiral GC로 분석하였다. 유기용매 및 수용액상에서의 라세믹 phenyl oxirane 분배계수는 같은 양의 두 용매층에 존재하는 기질의 양을 측정하여 결정하였다.</p><p>Table 1 에서와 같이 일반적으로 EH 생촉매 활성은 사용한 유기용매의 구조와 극성에 따라 많은 차이를 보여주었는데, 유기용매 및 수용액 2성분 시스템에서의 EH 활성은 dodecane, hexadecane 등의 소수성 유기용매에서의 활성이 ethylacetate, diethyl ether 등과 같은 극성용매에 비해 높은 활성을 보여주었다. 유기용매 중 가장 높은 EH 활성을 보여준 dodecane의 경우 수용액 대비 약 \( 60 \% \) 수준 이상의 활성을 유지시킬 수 있이 이상계 수용액/유기용매 반응 시스템 개발에 사용할 유기용매로 선택하였다.</p><h2>1단계 Hollow-fiber 반응기 시스템을 이용한 고농도 Phenyl Oxirane의 광학분할</h2><p>유기용매 및 수용액으로 구성된 2성분계에서 생촉매를 이용한 비대칭 분할반응을 수행하는 경우, 유기용매 사용에 따른 기질 농도 증가 및 기질 안정성 향상이라는 장점 이외에 유기용매 사용으로 인한 생촉매활성 감소가 동시에 존재함으로 이러한 상반된 문제점을 동시에 극복하기 위하여 EH 활성을 가진 미생물 생촉매가 있는 수용역층과 phenyl oxirane 기질이 녹아있는 유기용매층을 막으로 분리한 상태에서 가장 효율적인 phenyl oxirane 물질전달을 기대할 수 있는 hollow-fiber membrane을 이용한 비대칭 분할 시스템을 개발하기로 하였다 (Fig. 1). 무극성의 유기용매가 생촉매가 있는 수용상으로 확산되어 들어와 EH 활성을 저하시키는 현상을 예방하고, 또한, 유기용매 결손으로 인한 입체선택적 분할반응의 수율 저하를 방지하기 위하여 hollow-fiber membrane의 재질은 친수성 성질을 가진 regenerated cellulose를 사용하였다.</p><p>생촉매로 사용한 R. toruloides SJ-4 세포 \( (10 \mathrm{~g} \) DCW)는 \( 100 \mathrm{mM} \) phosphate 완충용액 \( (\mathrm{pH} 8.0) \)에 현탁시켜 반응기 시스템의 첫 번째 hollow-fiber의 shell 부위를 통해 \( 60 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 이동시키면서 입체선택적 가수분해 반응을 실시하였다. 기질이 녹아 있는 유기용매층은 hollow-fiber 반응기의 lumen 부위를 \( 30 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 통과하면서 막의 표면적을 통해 생촉매와 접촉하게 되면서 입체선택적 가수분해 반응이 일어나게 된다. 고농도의 라세믹 에폭사이드에 대한 광학분할을 위해 구성한 1단계 hollow-fiber 반응기 시스템을 이용하여 \( 200 \mathrm{mM} \)의 phenyl oxirane 기질에 대하여 EH 활성기반의 입체선택적 가수분해 반응을 수행하였다. 10시간 정도의 반응을 통해 광확적으로 순수한(\(\ >98\%\) ee) (S)-phenyl oxirane (yield \( =35 \% \), 이론 수율 대비)을 얻을 수 있었다.</p><p>1단계 hollow-fiber 반응기 시스템을 사용하여 \( 300 \mathrm{mM} \) phenyl oxirane에 대한 입체 선택적 가수분해반응을 실시하였다. 반응기 운전 시작 18시간 후에도 ee 값이 69.2에서 향상되지 못하고 계속적으로 비슷한 속도로 (S)-phenyl oxirane와 (R)-phenyl oxirane이 분해됨을 볼 수 있었다. 이는 EH 생촉매의 활성 감소나 초기기질의 저해보다는 가수분해 반응에서 필연적으로 수반되는 고농도의 diol 산물 생성에 따른 반응속도 저해 현상이 가장 큰 원인으로 판단된다. 따라서, 1단계 hollow-fiber 반응기 시스템은 phenyl oxirane 기질의 수용액상에서의 화학가수분해로 인해 수율이 낮아지는 문제점과 기질의 낮은 용해도로 인한 낮은 단위 부피당 생산성 문제점을 해결할 수 있는 시스템으로 평가 할 수 있으나, 고농도 반응의 경우 반응산물인 pheny-1,2-ethanediol 생성에 따른 EH 반응속도 저해 현상을 극복할 수 있는 반응기 시스템이 요구됨을 알 수 있다.</p>