5종의 어류로부터 A. simplex 제 3기 유충과 Contracaecum, Goezia 유충을 분리하여 실험에 사용하였으며, 유충의 DNA는 QIAamp(r) DNA Mini kit를 이용하여 분리하였다. 또한 18S rDNA 증폭을 위해 두 개의 시발체를 사용하였고, 증폭된 18S rDNA 단편들은 제한효소들로 처리하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>A. simplex 제 3 기 유충, Contracaecum, Goezia 충체 확보 및 종 동정</h2> <p>숭어, 도다리, 고등어, 아나고, 참돔 등 5종의 어류의 복강, 위벽, 장벽, 간 등에서 A. simplex 제 3기 유충, Contracaecum 및 Goezia 유충을 분리하여 \( 0.9 \% \) 생리식염수에 세척한 후 실험에 사용하였다. A. simplex는 5종의 어류 모두에서 발견되었으며, Contracecum type A는 두 종(고등어, 도다리)에서, Contracaecum type \( \mathrm { C } ^ {\prime } \)은 참돔 한 종에서만 볼 수 있었다. 종동정을 위해서는 \( 10 \% \) 포르말린으로 고정한 다음 증류수로 여러 번 세척하고 알코올-글리세린 용액에서 투명화 한 후 글리세린-젤리로 봉입하여 표본을 제작하여 현미경하에서 동정하였다.</p> <h2>DNA 분리 및 증폭</h2> <p>유충의 Genomic DNA는 QIAamp(r) DNA Mini kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 분리하였다. 18S rDNA를 증폭하기 위하여 두 개의 시발체(conserved primers, forward): \( 5 ^ {\prime } \)-GCGAACGGCTCATTACAACA-3' 및 (reverse):5'-GGTTC AAGCCACTGCGATTA-3'를 사용하였으며(PreMix ver.2.0, TaKaRa, Japan), PCR 조건은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } 5 \)분(1 cycle), \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 30초, \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } 30 \)초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } 1 \)분(30 cycle), \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } 10 \) 분( 1 cycle)으로 시행하였다(Mastercycler Personal, Eppendorf, Germany).</p> <h2>Restriction fragment length polymorphism (RFLP) 분석</h2> <p>증폭된 \( 18 \mathrm { ~S } \) rDNA 단편들은 제한효소 \( \mathrm { Taq } \mathrm { I } \), Hinf \( \mathrm { I } \), Hha \( \mathrm { I } , \mathrm { Alu } \mathrm { I } , \mathrm { Dde } \mathrm { I } , \mathrm { Hae } \mathrm { III } , \mathrm { Sau } 96 \mathrm { I } \) 및 Sau3A I 로 처리하였다. 증폭된 DNA \( (1 \mu \mathrm { g } ) \) 을 각각의 제한효소로 처리하였다. 제한효소 사용은 제조사(Promega, Madison, WI, USA)의 지시에 따랐으며, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } 4 \)시간 동안 처리 한 후 \( 1 \% \mathrm { TBE } \) gel에 전개하여 ethidium bromide로 염색하였다.</p>