키틴 분해요소 생산 미생물을 선발하기 위해 영양 최소배지인 DAVIS broth에 접종하여 키틴 분해활성이 가장 우수한 GA9 균주를 최종 선발하였다. 선발 미생물의 유전학적 동정을 위해 유전자 염기서열을 하고 분석한 결과를 종합하여, 선발 미생물을 Bacillus licheniformis GA9으로 명명하였다. 키틴 분해효소를 정제하기 위하여 황산암모늄을 포화시켜 비교한 결과 황산암모늄 침전물에서 키틴 분해효소의 활성이 존재함을 확인하였다. 황산암모늄 활성분획을 농축하고 용액에 용출시켜 측정한 결과, 배양상등액에 비해 45.2배 농축되었으며 회수율은 20.0% 로 확인하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>키틴 분해효소 생산미생물 분리 및 선발</h2> <p>지렁이의 장 내용물을 \( 0.85 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \mathrm{NaCl} \) 용액에 십진 희석하여 \( 2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) colloidal chitin을 함유한 고체배지에 도말·배양하여 콜로니 주위로 투명하게 분해환 (clear zone)을 생성하는 미생물 총 1,520 주를 1 차 선발하였다. 1차 선발미생물은 \( 2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) colloidal chitin을 함유한 액체배지에 배양한 후, 조효소액을 이용하여 키틴 분해활성이 우수한 균주를 2차 선발하였으며, 키틴 분해효소를 정제하기 위한 영양 최소배지인 DAVIS broth에 접종하여 키틴 분해활성이 가장 우수한 GA9 균주를 최종 선발하였다(data not shown).</p> <h2>선발미생물의 동정</h2> <p>선발 미생물을 Gram 염색과 아포염색을 하여 현미경으로 관찰한 결과, 그람 양성 간균으로 관찰되었고 내생포자를 생성하는 것으로 확인되었다(data not shown). 생화학적 동정을 위하여 API \( 50 \mathrm{CHB} \) kit test를 실시한 결과, Bacillus licheniformis와 \( 99.9 \% \) 상동성을 나타내었다(data not shown). 유전학적 동정을 위하여 \( 16 \mathrm{~S} \) ribosomal RNA 유전자 염기서열을 CLUSTAL X로 Multiple sequence alignment 한 후, MEGA 4.0을 사용하여 Phylogenetic tree 분석한 결과, Bacillus licheniformis와 가장 가까운 유연관계를 보였다. 따라서, 형태적 특징, 생화학적 특성과 \( 16 \mathrm{~S} \) rRNA 염기서열 분석결과를 종합하여, 선발 미생물을 Bacillus licheniformis GA9으로 명명하였다(Fig. 1).</p> <h2>키틴 분해효소의 분리 및 정제</h2> <p>키틴 분해효소를 정제하기 위하여 \( 2 \% \) (w/v) colloidal chitin이 함유된 DAVIS 액체배지에서 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 48 \) 시간동안 배양한 B. licheniformis GA9의 배양상등액에 황산암모늄을 \( 0-20 \%, 20-40 \%, 40-60 \%, 60-80 \% \) 농도로 포화시켰으며, 생성된 침전물을 각각 키틴 분해활성을 비교한 결과, 40-60\% 황산암모늄 침전물에서 키틴 분해효소의 활성이 존재함을 확인하였다(data not shown).</p> <p>황산암모늄 활성분획을 \( 10 \mathrm{mM} \) Tris \( \cdot \mathrm{HCl} \) buffer \( (\mathrm{pH} 7.5) \) 에 용해시킨 후, 동일한 완충용액으로 투석하여 황산암모늄을 제거한 시료를 음이온 교환수지 DEAE-sepharose fast flow에 흡착시키고 0-1 M NaCl 용액을 linear gradient하게 용출시켜서 분획마다 키틴 분해활성을 측정한 결과, 총 240 개의 분획 중 \( 149-186 \) 번 분획에서 키틴 분해활성을 확인하였으며, 활성분획은 투석을 실시한 후, 동결건조하여 농축하였다. 농축한 키틴 분해활성 분획을 겔 크로마토그래피로 정제한 결과, 총 160 개의 분획 중 키틴 분해활성을 나타낸 55-71번 분획을 모아 동결건조하여 농축하였다(data not shown). 키틴 분해효소를 최종 정제한 결과, 배양상등액에 비해 \( 45.2 \) 배 농축되었으며 회수율은 \( 20.0 \% \) 로 확인하였다 (Table 1).</p>