GLP 규정을 준수하여 C57BL/6 수컷 쥐를 SPF 시설에서 사육하였다. EG7 세포주와 EL4 세포주 를 한 대학교에서 입수하였다. C57BL/6 마우스 뒷다리의 경골과 대퇴골에서 골수세포를 추출하고 ACK lysis buffer를 사용하여 적혈구를 제거하였으며 분화된 수지상세포로 OVA, GM-CSF, IL-4, LPS를 통하여 성숙시켰다. 수지상세포의 성숙과 분화단계에 따라 활성정도를 확인하기 위하여 IL-12의 분비량을 sandwich ELISA 방법으로 조사하였다. 2\(\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml}\) 농도로 Coating 항체를 희석하여, 96-well 50\(\mu\mathrm{l}\) 씩을 ELISA plate에 넣고 실온에서 하룻밤동안 정치하였다. 수지상세포에 의하여 종양의 치료하고 예방하는 효과를 OVA 종양모델을 적용하여 조사하였다. 예방효과의 측정을 위하여 수지상세포를 일주일 간격으로 3회 투여하고, 3차 투여 일주일일 후 EG7 종양세포를 주사하여 수컷 쥐의 생존기간과 종양형성 억제를 연구하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>마우스 및 종양세포주</h2> <p>실험동물은 6-8주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 샘타코(주)에서 구입하였으며, specific-pathogen free (SPF) 시설에서 good laboratory practice (GLP) 규정을 준수하여 사육하였다. T-cell lymphoma 유래의 EL4 세포주와 EL4 세포에 oval-bumin (OVA) cDNA를 transfection한 EG7 세포주는 부산대학교 의과대학 생화학교실로부터 입수하였으며, \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL), penicillin (100 units/ \( \mathrm{ml}) / \) streptomycin \( (100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) (Gibco BRL) 그리고 \( 2 \mathrm{mM} \) L-glutamate (Sigma)가 포함된 RPMI 1640 (Gibco BRL) 배양배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2} \)가 공급되는 조건에서 배양하였다.</p> <h2>마우스 골수세포로부터 수지상세포의 분화와 성숙</h2> <p>C57BL/6 마우스 뒷다리의 대퇴골과 경골에서 골수세포를 적출하고 ACK lysis buffer \( (0.15 \mathrm{M} \mathrm{~NH}_{4} \mathrm{Cl}\), \(1.0 \mathrm{mM} \mathrm{~KHCO}_{3} \), \( 0.1 \mathrm{mM} \mathrm{~Na} _{2} \)-EDTA)를 이용하여 적혈구를 제거하였다. 수지상세포는 \(10\%\) FBS, \( 2 \mathrm{mM} \) L-glutaminc, \( 50 \mu \mathrm{M} \) 2-mercaptoe-thanol이 포함된 Opti-MEM (Gibco BRL) 배지에 \( 20 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF, PeProtech) 와 \( 10 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \mathrm{~IL}-4 \) (PeProtech) 를 첨가한 배양액에 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 분화를 유도하였다. 수지상세포의 분화정도는 CD11c, CD86, CD40, MHC class Ⅱ의 표면발현을 flow cytometer 분석으로 확인하였다. 수지상세포의 성숙을 위한 자극인자로는 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) lipopolysaccharide (LPS, Sigma)를 사용하였으며, 종양항원으로는 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) OVA(Sigma)를 사용하였다.</p> <h2>수지상세포의 표면분자 발현 분석</h2> <p>수지상세포를 회수하여 \( 2 \% \) FBS가 첨가된 phosphate buffered solution (PBS)에 부유하고 fluorescein isothiocyanate (FITC) 또는 Phycoerythin (PE)으로 표지된 anti-mouse CD11c, CD86 (B7-2), CD40 및 MHC class II (I-A/I-E) 항체(BD PharMingen)로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), 암실에서 30분간 염색하였다. 세포의 생존율을 동시에 측정하기 위하여 염색한 시료에 propidium iodide (PI) 용액 (50 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) PI, \( 0.1 \% \) v/v sodium citrate)을 첨가한 다음, Epics XL flow cytometer (Beckman Coulter)를 이용하여 분석하였다.</p> <h2>사이토카인 측정</h2> <p>수지상세포의 분화와 성숙단계에 따른 활성정도를 확인하기 위하여 IL-12 분비량을 sandwich ELISA 방법으로 측정하였다. Coating 항체 (PharMingen)를 \( 2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도로 희석하여, 96-well ELISA plate (Nunc)에 \( 50 \mu\mathrm{l} \) 씩 넣고 실온에서 하룻밤 정치시켰다. PBST \( (0.05 \% \) 로 tween 20이 첨가된 PBS)로 세척하고, \(3\%\) bovine serum albumin (BSA Fraction V, Sigma)을 함유한 PBS를 \( 200 \mu\mathrm{l} \)씩 첨가하여 실온에 2시간 정치하여 blocking하였다. PBST로 세척한 다음 표준용액과 세포처리 후 일정시간 배양한 상등액 시료를 각각 \( 100 \mu \mathrm{l} \)씩 첨가하여 실온에 3시간동안 정치하였다. PBST로 세척하고 biotinylated 항체 (PharMingen)를 \( 0.5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)로 희석하여 \( 100 \mu \mathrm{l} \)씩 첨가하고 실온에서 1시간 반응시켰다. PBST로 세척한 다음 HRP-conjugated streptavidin \( (0.125 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \), Endogen) \( 100 \mu\mathrm{l} \)를 첨가하여 실온에서 30분간 정치하고 PBST로 세척하였다. 발색반응은 tetramethylbenzidine (TMB) 기질용액 (InnoGenex) \( 50 \mu\mathrm{l} \)를 이용하였으며, Bio-Tek EL312e micro plate ELISA reader에서 \( 630 \mathrm{~nm} \)에서의 O.D 값을 측정하였다. 반응정지를 위하여 \( 0.18 \;\mathrm{M} \mathrm{~H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 용액을 \( 50 \mu \mathrm{l} \)씩 첨가하고 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서의 O.D 값을 재측정하였다.</p> <h2>수지상세포의 ex vivo 활성 측정</h2> <p>수지상세포 \( 1 \times 10^{6} \) cells/50 \( \mu \mathrm{l} \)를 7일 간격으로 3회 피하주사하여 면역한 C57BL/6 마우스의 비장세포를 배양배지에서 \( 4 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) OVA항원으로 5일 동안 재자극한 다음, 세포내 IFN-\(\gamma\)을 생성하는 CD8+ T세포와 항원특이적인 세포독성 활성을 조사하였다. 세포내 IFN-\(\gamma\)을 생성하는 CD8+ T세포 측정을 위하여 비장세포를 고정액으로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 처리하고 permeabilization 용액을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 반응 시킨 다음, FITC-conjugated anti-mouse IFN-\(\gamma\) 항체(BD PharMingen)과 PE-conjugated anti-mouse CD8 (BD PharMingen) 항체로 염색하여 Epics XL flow cytometer로 분석하였다. CD8+ T세포의 세포독성 활성은 비장세포(effector cell)과 \( 100 \mu \mathrm{Ci} \) 의 \( \mathrm{Na}_{2}{ }^{51} \mathrm{CrO}_{4} \) 을 표지한 EL4 세포와 EG7 세포(target cell)을 적절한 비율로 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 조건의 배양기에서 4시간 동안 공조배양한 후 배양 상등액으로 방출된 \( { }^{51} \mathrm{Cr} \) 의 radioactivity를 gamma-counter (Beckman, Milan, Italy)로 측정하였다. 세포독성 활성은 다음 식에 따라 환산하여 표시하였다.</p> <p>Cytotoxic activity \( (\%\))=[(sample release - spontaneous release) / (total release - spontaneous release)] \(\times\) 100</p> <p>(sample release: 시료 처리 후 방출량; spontaneous release: 자연적인 target cell의 방출량; total release: \( 1 \% \) triton X-100에 의한 target cell의 방출량)</p> <h2>수지상세포의 in vivo 활성 측정</h2> <p>수지상세포에 의한 종양의 치료 및 예방효과를 OVA 종양모델을 이용하여 조사하였다. 종양은 C57BL/6 마우스에 \( 1 \times 10^{6} \)개의 EG7 세포를 왼쪽 대퇴부에 피하주사하여 형성하였다. 치료효과를 측정하기 위하여 EG7 세포 투여 3일 후부터 수지상세포를 오른쪽 대퇴부에 7일 간격으로 3회 투여하면서 종양형성 억제와 마우스 생존기간을 관찰하였다. 예방효과를 측정하기 위하여 수지상세포를 7일 간격으로 3회 투여하고, 3차 투여 7일 후 EG7 종양세포를 주사하여 종양형성 억제와 마우스 생존기간을 관찰하였다. 종양의 형성은 마지막 투여 후 6주간 동안 관찰하였다. 종양크기는 calipers를 사용하여 측정하였고, 다음과 같은 공식으로 계산하였다.</p> <p>Tumor cell volume (\(\mathrm{mm}^{3}\)) = (Width,\(\mathrm{mm})^{2}\) \(\times \) Length\( (\mathrm{mm}) \times 0.52 \)</p>