in vitro transcription과 translation을 통해 분리한 유전자의 발현을 증명하기 위해 protein의 생성 여부를 알아보았고, 안개초에서 분리한 DFR 유전자가 얼마나 존재하는지 확인하기 위해 Southern blot 분석을 했다. 'Red Sea' 꽃잎에서 DNA를 분리하고 cDNA 상에 두 개의 제한효소를 처리해 hybridization 해보니 각각의 lane에 같은 강도의 두개의 band가 보임으로써 안개초의 DFR 유전자는 genome에 오직 한개만 존재함을 알 수 있다. 몇몇을 제외한 대부분 식물의 genome에는 단 하나의 DFR 유전자가 있다.
<h2>유전자의 기내 발현</h2> <p>분리한 유전자의 발현을 증명하기 위하여 in vitro tran-scription과 translation을 통하여 protein의 생성 여부를 알아보았다. 먼저 유전자를 Bluescript \( \mathrm { KS } ^ { + } \)vector에 cloning 한 후 T7-RNA-Polymerase 와 T3-RNA-Polymerase를 이용하여 transcription 시키고 생성된 mRNA를 다시 reticulocyte system 과 \( \left [ { } ^ { 35 } \mathrm { ~S } \right ] \)-Methionin labelling을 이용하여 translation을 유도한 후 생성된 protein을 SDS-PAGE를 통해 확인해 본 결과 분리한 DFR유전자와 같은 \( 40 \mathrm { ~kDa } \) 크기의 protein을 확인하였다.</p> <h2>분리유전자의 Southern blot 분석</h2> <p>분리한 안개초의 DFR 유전자가 genome에 얼마나 존재하는지 확인하기 위하여 Southern blot 분석을 수행하였다. cDNA-library 제작에 사용하였으며 핑크색의 색소발현체계를 가진 'Red Sea'의 꽃잎으로부터 DNA를 분리한 후 cDNA상에 1개의 cutting site를 가진 제한효소인 EcoRV과 XhoI으로 처리하고 DFR cDNA를 probe로 hybridization을 해 본 결과 각각의 lane에 동일한 강도를 가진 두개의 band를 보였다. Fig. 6에서 보는 바와 같이 제한효소 EcoRV로 처리한 경우 각각 \( 6.5 \mathrm { ~kb } , 3.2 \mathrm { ~kb } \) 크기의 band가, XhoI으로 처리한 경 우 각각 \( 5.8 \mathrm { ~kb } , 4.4 \mathrm { ~kb } \) 크기의 band를 나타냄으로써 안개초의 DFR 유전자는 genome 내에 오직 한개가 존재한다는 것을 알 수 있다. 이러한 결과는 이미 보고된 금어초 (Martin et al. 1985), 페튜니아 (Beld et al. 1989), 카네이션 (Lee et al. 2004), 과꽃 (Min 2006), stock (Min et al. 1998), 옥수수 (O' Reilly et al. 1985), 오렌지 (Lo Piero et al. 2006) 등과 일치하며 페튜니아의 DFR 유전자는 3개의 copy를 보였으나 실제로 오직 하나의 유전자 \( D F R-A \)만이 DFR 기능을 가지고 있음을 증명하였고, 장미 (Tanaka et al. 1995)의 경우 많은 copy 수를 확인하였으나 식물재료가 inbred line이 아니며 tetraploid 식물이기 때문에 정확한 copy 수를 단정하기 힘들다는 어려움이 있고 거베라 (Helariutta et al. 1993)의 genome에는 다양한 수의 DFR 유전자가 존재하고 있는 것으로 알려졌으며. 다른 flavonoid 생합성 관련 유전자의 경우 Beld 등 (1989)의 보고에 의하면 페튜니아는 적어도 8 개의 CHS 유전자와 2개의 CHI 유전자가 존재하며 Ipomoea batatas (Shiokawa et al. 1999)의 경우는 3 개의 서로 다른 염기서열을 가진 FHT 유전자를 분리했다는 보고가 있다. 그 외 대부분 식물의 genome 에는 단지 하나의 DFR 유전자가 있음이 보고되었다.</p>