톱밥과 옥수수심으로부터 xylan을 추출하기 위해, 15N NaOH 수용액과 20g 톱밥을 80\(^\circ \mathrm{C}\)에서 8시간 반웅시킨 후 원심분리하고, 80\(^\circ \mathrm{C}\) 온수로 3회 세척한 후 35% HCl로 pH 4.5까지 조정하고, 2배의 에탄올을 첨가하여 10분간 교반한 후 여과포로 여과하고 100ml HCl로 pH 2.0까지 조정하여 xylan을 추출하였다. 이를 정성 반응은 TLC를 이용하고 정량 반응은 HPLC를 이용하여 분석하였다.
<h2>톱밥과 옥수수심으로부터 xylan 추출</h2> <p>효소의 기질이 되는 xylan를 추출하기 위해 쉽게 구할 수 있는 톱밥 \( 20 \mathrm { ~g } \) 을 \( 15 \mathrm { ~N } \mathrm { NaOH } \) 수용액 \( 200 \mathrm { ml } \) 에 각각 흔합하여 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(8 \) 시간 동안 반웅시킨 후 이를 원심분리 하여 잔류물을 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 온수 \( 100 \mathrm { ml } \) 로 \(3 \)회 세척한 후 여액을 \( 35 \% \mathrm { HCl } \) 로 \( \mathrm { pH } 4.5 \) 가 되도록 조정하였다. 이 여액에 \(2 \) 배의 에탄올을 첨가하여 \(10 \) 분간 교반한 후 여과포로 여과하여 잔류물을 \(100 \) \( \mathrm { ml } \) 온수로 세척하고 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) drying oven에서 \(12 \) 시간 건조하여 중량을 측정하였다. 옥수수심 \( (20 \mathrm { ~g } ) \) 의 경우도 톱밥과 같은 조건으로 처리하여 여액을 모았다. 이 여과액을 \( 35 \% \mathrm { HCl } \) 로 \( \mathrm { pH } 6.0 \) 으로 중화시킨 후 에탄올을 \(11 \) 첨가하여 \(10 \) 분간 교반 한 후 거름종이에 여과하여, 여과된 잔류물을 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(12 \) 시간 건조시켜 중량을 측정하였다.</p> <h2>TLC 및 HPLC 분석</h2> <p>Endoxylanase에 의해 가수분해된 xylan을 thin layer chromatography (TLC)와 high performance liquid chroma-tography (HPLC)를 이용하여 분석하였다. 효소반응 생성물의 정성분석은 TLC를 이용하여 분석하였다. 효소반응은 \(250 \) \( \mathrm { ml } \) 플라스크에 \( 30 \mathrm { ml } 2 \sim 8 \% \) oat spelts xylan, birchwood xylan, corncob xylan과 \( 20 \mathrm { mM } \) phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } \) \(6.0 \)), enzyme solution \( (2.5 \sim 25 \mathrm { unit } / \mathrm { ml } ) \) 을 total \( 60 \mathrm { ml } \) 이 되도록 첨가한 후 \( 40 \sim 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 반응 시켰다. 반응액은 \(5 \) 분간 열처리 후 각각의 반응액을 \( 5 \mu \) 씩을 TLC plate (Merck KGaA, Darmstadt, Germany)에 점적한 후 chloroform-acetic acid-water ( \(6:7:1 \))을 전개용매로 \(3 \)회 전개하였다. 생성물은 ethanol-sulfuric acid ( \(95:5 \)) spray로 \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5분간 발색하였다. Xylan 가수분해 후 생성된 xylooligosaccharide의 정량 분석은 carbohydrate analysis column (Waters)이 장착된 HPLC (Alliance \(2690 \), Waters, Milford, MA, U.S.A.)를 이용하여 측정하였다. \( 1 \mathrm { ml } \) 의 효소 반응액을 membrane filter (ADVANTEC MFS, Inc., Japan)을 이용하여 여과하여 불용성 물질을 제거하였다. 효소 반응액은 \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(5 \) 분간 가열하여 정지시킨 후 evaporator (Bioneer, Taejon, Korea)를 이용하여 농축시켜 pellet을 증류수 \( 100 \mu \) 에 현탁시켰다. 이동상으로는 \( 75 \% \) acetonitrile을 사용하였고, column의 온도는 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 유속은 분당 \( 1.2 \mathrm { ml } \) 로 하여 주입량은 \( 10 \mu \mathrm { l } \) 로 하였다. Standard로는 xylose (Sigma, St. Louis, U.S.A.), xylobiose와 xylotriose (Megazyme, Ireland)를 사용하였다.</p>