U937 세포에서 platycodin D가 유발하는 apoptosis 정도를 정량적으로 분석하기 위해, \(\mathrm{2,000 rpm}\)으로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 PBS로 세척한 세포들을 CycleTEST PLUS DNA REAGENT Kit과 \(4^\circ\mathrm{C}\)에서 30분 동안 반응시켰다. 또한 TRIzol reagent를 이용하여 RNA를 분리하고 증폭하여 \(1.5\%\) agarose gel에 DNA gel loading solution을 섞어서 loading하여 \(50V\)에서 전기영동하고 EtBr로 염색하여 UV 하에서 GAPDH를 internal control로 사용하여 양적 차이를 확인하였다.
<h2>Flow cytometry 분석</h2> <p>U937 세포에서 platycodin D가 유발하는 apoptosis 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 정상 및 platycodin D가 48시간 동안 처리된 세포들을 모은 다음 \( 2,000 \mathrm { rpm } \)로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 PBS를 이용하여 2~3회 정도 세척하였다. 준비된 세포는 CycleTEST PLUS DNA REAGENT Kit(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 고정 및 염색을 하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 암실에서 30분 동안 반응을 시켰다. 반응시킨 세포를 \(\mathrm{35-mm}\) mesh를 이용하여 단일세포로 분리한 후 FACSCalibur (Becton Dickinson)를 적용시켜 형광반응에 따른 Cellular DNA content 및 histogram을 CellQuest software 및 odiFit LT (Becton Dickinson) 프로그램을 이용하여 분석하였다.</p> <h2>Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 분석</h2> <p>동일한 조건에서 배양된 U937 세포들에 TRIzol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, 각각의 primer, DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 넣고 Mastercycler radient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭하였다. 각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인 하기 위하여 \( 1 X \) TAE buffer로 \( 1.5 \% \) agarose gel을 만들고 well 당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 loading 한 후 \( 50 \mathrm { ~V } \) 에서 전기영동을 행하였다. 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 EtBr로 염색한 후 UV 하에서 관찰하였으며, glyceraldehyde-3-phosphate de-hydrogenase(GAPDH)를 internal control로 사용하였다.</p> <h2>Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석</h2> <p>준비된 세포에 적당량의 lysis buffer [\(\mathrm{25 mM}\) Tris-\(\mathrm{Cl}\) \( ( \mathrm { pH } 7.5\)), \( 250 \mathrm { mM } ~\mathrm { NaCl } , 5 \mathrm { mM } \) EDTA, \(1 \%\) NP-40, \( 1 \mathrm { mM } \) phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), \( 5 \mathrm { mM } \) dithiothreitol(DTT)]를 첨가하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1시간 동안 반응시킨 후, 총 단백질을 분리하였다. 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 사용방법에 준하여 정량 후 다음 동량의 Laemmli sample buffer(Bio-Rad)를 섞어서 sample을 만들었 다. 동량의 sample을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-poly-acrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리한 후, nitro-cellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 전이시켰다. 분리된 단백질 이 전이된 nitrocellulose membrane을 \(5 \%\) skim milk를 처리하여 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하고 1차 antibody를 처리하여 상온에서 2시간 이상 또는 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 overnight시킨 다음 PBS-T로 세척하고 처리된 1차 antibody에 맞는 2차 antibody 를 사용하여 상온에서 1시간 정도 반응시켰다. 반응이 끝난 후 암실에서 Enhanced Chemiluminoesence(ECL) solution (Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 발현 양을 분석하였다.</p>