주박의 생물학적 특성에 대한 3가지 중요한 실험 결과를 확인하였다. 첫째로, 주박의 세포 증식 효과는 'Ez-cytox enhanced cell viability kit'을 이용하여 확인하였으며, 둘째로, 탄력섬유 분해효소에 대한 주박의 억제효과는 'elastase'를 이용한 실험을 통해 측정하였다. 마지막으로, HS27 세포에 주박을 처리했을 때 'collagen type I'의 합성량을 측정하기 위해 'Procollagen Type-I C-Peptide (PIP) EIA kit'를 사용하였다. 이 모든 실험은 주박의 다양한 농도에서 이루어졌다.
<h2>세포증식 측정</h2> <p>주박의 세포 증식 효.과는 Ez-cytox enhanced cell viability kit (Daeil Lab, Seoul, Korea)을 이용하여 측정하였다. 96-well plate에 각 well당 2,500 세포가 되도록 심어준 후, 24 시간을 배양하였다. 이 후, 배지를 제거하고 주박을 농도별로 처리한후 23시간을 배양한 후, Ez-cytox enhanced cell viability kit를 total volume의 \( 10 \% \) 의 양으로 첨가한 후 1 시간 동안 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 배양기에서 반응하였고, microplate reader를 이용하여 \( 450 \mathrm { ~nm } \) 의 흡광도에서 측정하였다.</p> <h2>Elastase 저해활성 측정</h2> <p>주박의 탄력섬유 분해효소의 억제효과를 알아보기 위해 elastase를 이용하여 측정하였다. 96-well plate에 \( 100 \mathrm { mM } \) Tris-HCl buffer \( ( \mathrm { pH } \) 8.0)를 넣은 후 농도별로 준비된 주박을 첨가하였다. 2 mM N-Succinyl-(Ala)-3-p-nitroanilide (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 각 well에 분주하고 \( 0.2 \) unit로 조제한 elastase 효소액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, \( \mathrm { USA } \) )을 첨가하여 섞어주었다. 이 후, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 배양기에서 30 분간 반응을 시킨 후 얼음에서 5 분간 방치하여 반응을 중지시켰다. Microplate reader를 이용하여 \( 410 \mathrm { ~nm } \) 의 파장에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Collagen 생합성 측정</h2> <p>HS27세포에 주박을 농도별로 처리했을 때 collagen typeI의 합성양을 측정하기 위해 Procollagen Type-I C-Peptide(PIP) EIA kit를 이용하였다. 96-well plate에 각 well당 10,000세포가 되도록 심어준 후 24 시간을 배양하였다. 이 후, 배양된 배지를 제거하고 주박을 농도별로 처리한 후 24 시간을 배양하였다. 각 well로부터 상층액을 회수하여 Procollagen Type-IC-Peptide (PIP) EIA kit의 각 well에 첨가한 후, 제조사의 방법에 따라 procollagen type \( \mathrm { I } \) 의 총 양을 측정하였다.</p> <h2>Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)</h2> <p>HS27세포는 \( 100 \mathrm { ~mm } \)-culture dish에 \( 70 \% \) 가 될 때까지 배양하였다. 배지를 제거하고, phosphate-buffered saline (PBS)로 두 번 헹구어준 뒤, 주박읕 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. Total RNA는 TRI Reagent (Sigma-aldrich, St. Louis, \( \mathrm { MO } , \mathrm { USA } \) )을 이용하여 제조사의 방법으로 추출하였다. 추출된 total RNA는 spectrophotometer를 이용하여 정량하여, 1 \( \mu \mathrm { g } \) 의 RNA를 이용하였고, cDNA 합성 및 PCR은 Accupower RT/PCR premix kit (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. PCR 조건은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } 1 \) 분, \( 48 ^ {\circ } \mathrm { C } 1 \) 분, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)</p>