L-threonine 대량생산을 위해 제작된 plasmid들의 안정성 문제를 해결하기 위해 thr operon을 함유한 plasmid의 안정성을 높이기 위한 방법들이 보고되었고, 그 일환으로 본 연구에서는 새로운 기질로 soidum cirate를 선정하여 그 배지 중 적정농도 및 이를 이용한 배양조건과 L-theronine의 생산량을 연구하였다. 새로운 기질로 sodium cirate를 사용하여 연구하기도 하였다. 배양을 위핸 배지와 L-Thereonine 생산을 위한 배지는 각각 다른 특성을 가지고 있으며, 특히 L-Threonine 생산을 위한 플라스크용 배지는 포도당, yeast extract 등이 첨가된 배지가 사용되었고 발효조 배양을 위한 종균 배지에도 포도당, tryptone, 등의 조성으로 이루어진 배지를 사용하였다. 배양조건으로는 LB 한전 배지에서 진탕 배양이 이루어졌고, 균체 농도는 배양액 희석으로 사용되었아.
<p>Threonine은 인간이나 가축의 성장에 부족하기 쉬운 아미노산의 하나로서 가축의 사료, 식품 및 의약품 원료로도 널리 사용되어지는 필수 아미노산이다. 화학적 합성에 의해 생산된 threonine은 4개의 이성질체가 존재하기 때문에 순수한 L-형만을 선택적으로 분리하기가 쉽지 않다. 그러나 미생물의 발효법에 의해 생산된 threonine은 모두 L-형으로 화학적 합성에 의해 생산된 threonine보다 효과적이다. 또한 특정아미노산을 값싼 원료로부터 단순한 공정에 의해서 높은 수율로 생산할 수 있으므로 공업적인 아미노산 생산에 널리 이용되고 있다.</p> <p>아미노산 생합성 경로의 조절은 일반적으로 아미노산 analog 물질들에 의해 연구되었다. \( \alpha \)-Amino- \( \beta \)-hydroxyvaleric acid AHV는 세균의 성장을 억제하는 L-threonine analog 물질이며, 과잉 축적된 L-threonine에 의해 feedback inhibition을 받는 효소들은 AHV에 의해서도 활성이 저해된다. AHV에 대한 내성 변이주는 Escherichia coli, Brevibacterium sp., 그리고 Corynebacterium sp. 같은 미생물들로부터 분리되어졌으며 이들 미생물의 특징은 L-threonine의 축적에 의한 feedback inhibition이 해제되는 점에 있다. 따라서 AHV 내성 변이주의 분리는 L-threonine 대량 생산을 위한 방법으로 이용되고 있으며 이와 더불어 유전자 재조합법을 이용한 L-threonine 생산성 향상에 대한 연구는 주로 생합성에 직접 관여하는 효소군의 구조유전자(thr operon)를 대량으로 발현시켜 L-threonine의 생산을 유도하고 있다. 하지만 이러한 방법들은 L-threonine의 대량생산을 위하여 제작된 plasmid들의 배양 중 안정성이 문제점으로 지적된다. 이를 해결하기 위하여 thr operon을 함유한 plasmid의 안정성을 높이기 위해 여러 방법이 보고되어 있다.</p> <p>따라서 본 연구에서는 L-threonine 생산량을 증가시키기 위해 같은 aspartate 계열의 아미노산인 L-lysine에서 생산량 증가를 위해 시도된 바 있는 pyruvate carboxylase 유전자를 plasmid 형태 pPYC로 L-threonine 생산균주인 E. coli MT201에 도입하여 재조합 균주인 E. coli MT/pPYC를 획득하였다. 그렇지만 재조합 균주인 E. coli MT/pPYC는 포도당을 첨가한 배지에서 모균주인 E. coli MT201보다 더 낮은 성장과 L-threonine 생산량을 보였다. 이를 해결하기 위해 새로운 기질로 sodium citrate를 선정하여 sodium citrate의 배지 중 적정농도 및 이를 이용한 배양 조건과 L-threonine 생산량에 관하여 연구하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 plasmid</h2> <p>L-Threonine 생산을 위한 실험에 사용된 균주 및 plasmid는 Table 1과 같다.</p> <h2>배지</h2> <p>E. coli 배양을 위한 일반배지는 Luria-Bertani 배지를 약간 변형한 배지 ( \(1 \% \) tryptone, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 0.5 \% \mathrm{NaCl}) \)와 M9 최소배지 ( \( 6 \mathrm{~g} / \mathrm{l} ~ \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \), \( 3 \mathrm{~g} / \mathrm{l} ~ \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \), \( 0.5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} ~ \mathrm{NaCl} \), \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{l} ~ \mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl}, 0.002 \mathrm{~M~} \mathrm{MgSO}_{4}, 0.4 \% \) 포도당, \( 0.0001 \mathrm{~M~} \mathrm{CaCl}_{2} \) )를 사용하였으며, 필요에 따라 ampicillin을 \( 50 \mathrm{mg / l} \) 첨가하여 사용하였다. 형질전환용 배지는 SOC 배지( \( 2 \% \) tryptone, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 10 \mathrm{~mM~} \mathrm{NaCl} \), \( 2.5 \mathrm{~mM~} \mathrm{KCl} \), \( 10 \mathrm{~mM~} \) \( \mathrm{MgCl}_{2} \), \( 20 \mathrm{~mM} \) 포도당)를 사용하였다.</p> <p>L-Threonine의 생산을 위한 플라스크용 배지는 liter당 \( 70\mathrm{~g} \) 포도당, \( 2 \mathrm{~g~} \) yeast extract, \( 20 \mathrm{~g}\left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \), \( \mathrm{SO}_{4}, 1 \mathrm{~g~} \mathrm{MgSO}_{4} \), \( 1.5 \mathrm{~g~} \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\) , \( 10 \mathrm{~mg~} \mathrm{FeSO} 4\), \( 30 \mathrm{~g~} \mathrm{CaCO}_{3} \) , \( 10 \mathrm{~mg~} \mathrm{MnSO} 4 \)를 첨가한 배지를 사용하였고, 발효조 배양을 위한 종균 배지는 liter당 \( 10 \mathrm{~g~} \) 포도당, \( 10 \mathrm{~g~} \) tryptone, \( 7 \mathrm{~g} \) yeast extract, \( 1 \mathrm{~g} \) \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4}\) , \( 10 \mathrm{~g~} \mathrm{NaCl} \), \( 2 \mathrm{~g~} \mathrm{KH}{ }_{2} \mathrm{PO}_{4} \)의 조성으로 된 배지를 사용하였다. 발효조에서 L-threonine 생산에 사용된 배지는 liter당 \( 50 \mathrm{~g~} \) 포도당, \( 2.5 \mathrm{~g~} \) yeast extract, \( 10 \mathrm{~g~}\left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4}, \) \( 1 \mathrm{~g~} \mathrm{MgSO}_{4} \), \( 2 \mathrm{~g~} \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \), \( 10 \mathrm{~mg~} \mathrm{FeSO} 4\), \( 5 \mathrm{~mg~} \mathrm{MnSO}_{4} \)를 첨가한 배지를 사용하였고 유가식 배양을 위한 첨가배지의 조성은 liter 당 \( 40 \mathrm{~g~} \) 포도당, \( 0.2 \mathrm{~g~} \) methionine, \( 0.25 \mathrm{~g~} \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \)이었다. 필요에 따라 ampicillin은 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \)의 농도로 첨가하였다.</p> <h2>배양 조건</h2> <p>LB 한천 배지에서 18시간동안 배양한 균주를 \( 50 \mathrm{ml} \) 최소 배지를 함유한 \( 500 \mathrm{ml} \) baffle 플라스크에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 진탕 배양기(KSI-200L, Korea Science Co., Ltd.)에서 \( 160 \mathrm{rpm} \)의 조건으로 진탕 배양하였다. 24시간 배양 후 \( 20 \mathrm{ml} \)의 배양액을 \( 200 \mathrm{ml} \)의 종균배지가 들어있는 1 liter baffle 플라스크에 접종하여 최소배지의 배양 조건과 동일하게 유지하였다. 18시간 배양 후 \( 200 \mathrm{ml} \)의 배양액은 \( 1.8 \) liter의 발효배지가 들어있는 5 liter 발효조(KFC LA-150, Kobiotech Co., Ltd.)에 첨가하였다. 배양 온도는 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), pH는 \( 25 \%\) \( \mathrm{NH}_{4} \mathrm{OH} \)를 사용하여 6.0으로 일정하게 조절하였고 교반속도와 통기속도는 용존 산소의 농도가 \( 20 \% \) 이상 유지되도록 적절하게 조절하였다.</p> <h2>분석방법</h2> <p>균체 농도는 배양액을 증류수로 적당히 희석한 후 spec-trophotometer (JASCO V-530, JASCO Corporation, Japan)를 사용하여 \( 660 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 포도당 농도는 YSI Glucose & Lactate Analyzer (YSI 2700 SELECT, Yellow Springs Instruments Co., USA)를 사용하여 분석하였으며, L-threonine 농도는 Kase의 ninhydrin 방법[3]을 변형하여 사용하였다.</p>