인천 영흥도에서 해수 채취 후 Marine agar 배지에 도말하여 한천분해 균주 Agarivornas sp. HY-1을 선발하였다. 16S rRNA 유전자 분석 결과 \(95\%\)의 유사성을 나타냈다. 시간에 따른 한천분해 균주의 효소활성과 생장을 측정한 결과, 2일째가 가장 높았고, 온도에 따른 한천분해 효소의 활성은 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 최대 활성을 보였다. Agarivorans 속 세균들의 한천분해효소의 최적 온도는 균주마다 다르게 나타났다. \( \mathrm{pH}\)별 한천분해효소의 활성을 살펴보면 Agarivorans gilvus WH0801는 \(\mathrm{pH} 6.0\)을 보였으며, Simiduia sp. TM-2은 \(\mathrm{pH}8.0 \)을 보였다. 한천가수분해산물의 TLC분석 결과 \( \beta- \)agarase가 아닌 \( \alpha \)-agarase로 나타났다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>한천분해균주의 분리 및 동정</h2> <p>인천 영흥도의 해수를 채취한 후 Marine agar 배지에 도말하여 한천분해 활성에 의해 배지를 함몰시키는 균주를 선발하였다. 선발된 균주는 백금이를 이용하여 3차례 이상 순수분리하고 추출된 Genomic DNA의 16S rRNA 유전자를 분석하니 Agarivorans litoreus 그리고 Agarivorans albus와 \( 95 \% \)의 가장 높은 유사성을 나타내었다. 이에 분리 균주를 Agarivornas sp. HY-1으로 명명하였고 이 균주의 계통분류학적 위치를 Fig.1 에 나타냈다. Agarase를 생산하여 한천을 분해하는 Agarivor-ans 속 세균은 보고가 되어있다.</p> <h2>시간에 따른 한천분해 균주의 효소활성과 생장 측정</h2> <p>\( 0.2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 agar를 첨가한 Marine broth 2216 배지 50 \( \mathrm{ml} \)에 순수분리한 Agarivornas sp. HY-1 균주를 접종하여 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \), \( 250 \mathrm{rpm} \) 에 4일 동안 진탕배양하였다. 배양 시간에 따른 한천 분해 균주의 생장과 효소활성을 Fig. 2에 나타냈다. 접종 후 1일까지 균의 수가 크게 증가하였으며, 이후 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 효소활성은 2일째가 가장 높았지만 오차범위내에서 1일째와 3일째와 차이가 없었고 4일째는 오차범위를 벗어나서 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 최대활성은 591.91 units/1였다. 이후 연구에서는 1일 동안 진탕배양한 후 생성된 효소액을 이용하였다.</p> <h2>온도에 따른 한천분해효소의 활성</h2> <p>각 온도별 한천분해 효소의 활성은 Fig. 3에 나타냈다. 실험에 사용된 효소의 한천분해활성은 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 최대 활성을 보였고, \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서의 활성을 \( 100 \% \)로 보았을 때, \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 약 \( 64 \% \)를 나타내었고, \(30\)과 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 \( 90 \% \) 이상, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 약 \( 89 \%, 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 약 \( 59 \% \)를 나타내었다. 다른 균주들의 한천분해효소의 최적 온도는 Agarivorans gilvus WH0801, Simiduia sp. TM-2, Agarivorans albus에서 각각 \( 30, 35, 40^{\circ} \mathrm{C} \)의 최적의 온도를 나타내었다. 본 연구와 동일한 Agarivorans 속 세균들이 생산하는 agarase의 최적온도가 균주마다 달랐다.</p> <h2>최적온도에서의 \( \mathrm{pH} \) 별 한천분해효소의 활성</h2> <p>최적온도에서의 \( \mathrm{pH} \) 별 한천분해효소의 활성은 Fig. 4 에 나타냈다. \( \mathrm{pH} \)6-7의 \( 20 \mathrm{mM} \) Tris- HCl 완충용액에서 높은 활성을 보였으며, 효소활성이 가장 높은 \( \mathrm{pH} 7 \)에서의 활성을 \( 100 \% \)로 보았을 때, \( \mathrm{pH} 5 \) 와 6 에서 \( 90 \% \) 이상의 활성을 보였다. \( \mathrm{pH} 5 \) 에서는 \( 20 \mathrm{mM} \) sodium acetate 완충용액과 \( 20 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) 완충용액 중에 \( 20 \mathrm{mM} \) sodium acetate 완충용액에서 더 높은 활성을 나타냈으며, \( \mathrm{pH} \) 에서는 \( 20 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) 완충용액과 \( 20 \mathrm{mM} \) GTA 완충용액 중에 \( 20 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) 완충용액에서 더 높은 활성을 나타냈다. 다른 균주들의 한천분해효소 최적 \( \mathrm{pH} \)는 Agarivorans gilvus WH0801는 \( \mathrm{pH} \) 6.0을 보였으며, Simiduia sp. TM-2은 \( \mathrm{pH} \) 8.0을 보였다. Agarivorans albus에선 \( \mathrm{pH} 7.0 \)을 보여, 다양한 최적 \( \mathrm{pH} \)를 보이는 것을 알 수 있다. 본 연구와 동일한 Agarivorans 속 세균이 생성하는 agarase의 최적 \( \mathrm{pH} \)가 온도처럼 서로 다른 것을 알 수 있었다.</p> <h2>한천분해효소의 열안정성</h2> <p>한천분해효소의 열안정성은 Fig. 5에 나타냈다. \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 열처리없이 반응시킨 것을 \( 100 \% \)로 보았을 때, \( 20,30,40^{\circ} \mathrm{C} \)에 서는 해당 온도에 2시간 노출되었을 때 \( 86 \% \) 이상의 활성을 보였다. \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 시간에 따라 활성이 계속 떨어지는 것을 볼 수 있었으며, 2시간 노출되었을 때 \( 44 \% \) 의 잔존활성을 보였다. \(60, 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 활성이 급격히 떨어져 \( 0.5 \)시간부터 잔존활성을 보이지 않았다. 따라서 Agarivorans sp. HY-1가 생산하는 한천분해효소는 내열성을 가지고 있지 않다는 것을 확인할 수 있다.</p> <h2>한천가수분해산물의 TLC분석</h2> <p>\(Agarivorans\) sp. HY-1 균주를 2일 동안 배양하여 제조된 조효소액에 \( 0.2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 agarose가 첨가된 \( 20 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) \( (\mathrm{pH} 7.0) \) 완충용액을 첨가하여 시간별로 반응시킨 후 TLC로 분석한 결과를 Fig. 6 에 나타냈다. 현재 한천분해효소에는 \( a \)-agarase와 \( \beta \)-agarase 두 가지가 존재한다고 알려져 있기 때문에 \( \beta \)-agarase의 산물인 neoagarooligosaccharides를 이용하여 한천분해효소의 산물을 추정한 후에 이 한천분해효소가 \( a\)- agarase와 \( \beta \)-agarase 중 어디에 속하는지 파악하였다. Fig. 6 에서 NA4와 NA6 사이는 agarotriose로, NA6 아래는 agar-opentaose로 판단되었다. Agarivorans sp. HY-1 균주가 생산한 한천분해효소의 산물을 TLC로 분석한 결과를 보면 \( \beta- \)agarase가 아닌 \( a \)-agarase인 것을 알 수 있었다. \( a \)-Agarase의 분해산물은 항암 및 항산화 효과가 보고되어 있어, Agari-vorans sp. HY-1 균주와 해당 균주가 생산하는 agarase는 유용하게 이용될 수 있을 것이다.</p>