톳 추출물로 처리한 3T3-L1 지방전구세포의 분화 및 droplet 생성 정도를 확인하기 위해 세포를 배양하여 분화를 유도했다. 세포내 droplet을 확인하기 위해 Oil Red O 염색후 세척하여 정량적 분석을 위해 대조군과의 흡광도 값을 백분율로 나타냈다. 톳 분획물을 처리하며 분화시킨 3T3-L1 지방전구세포에 첨가물을 넣어 반응시켰다.
<h2>MTT assay에 의한 3T3−L1 지방전구세포 성장억제 조사</h2> <p>세포 배양용 6 well plate에 3T3-L1 지방전구세포를 분주하여 confluent 상태까지 배양한 후 톳 추출물을 배지에 희석하여 각 well 당 적정농도로 처리하였다. 72 시간 후 희석된 \( 0.5 \) \( \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도의 tetrazolium bromide salt (MTT, Amresco, Solon, OH, USA) 를 \(200 \mu \mathrm{l} \)씩 분주하고 2시간 동안 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양시킨 다음 배지와 MTT 시약을 깨끗하게 제거하고 DMSO를 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 분주하여 well에 생성된 formazan을 모두 녹인 후 96 well plate에 \(200 \mu \mathrm{l} \)씩 옮겨서 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 각 세포에 대한 독성은 각각의 대조군의 평균 흡광도 값을 구하여 평균 흡광도 값에 대한 백분율로 나타내었다.</p> <h2>3T3-L1 지방전구세포 형태의 관찰</h2> <p>톳 추출물 처리에 의한 3T3-L1 지방전구세포의 분화 및 droplet 생성 정도를 확인하기 위하여 세포 배양용 6 well plate에 3T3-L1 지방전구세포를 분주하여 confluent 상태까지 배양한 후 톳 추출물을 적정농도로 희석 처리하면서 분화를 유도하였다. 분화가 끝난 후 톳 추출물 처리농도에 따른 분화 및 droplet 생성 정도를 도립 현미경을 이용하여 200배의 배율로 관찰하였다.</p> <h2>Oil Red O 염색 및 정량</h2> <p>세포 내 droplet 생성을 확인하기 위하여 Oil Red O 염색을 실시하였다. 준비된 3T3-L1 지방전구세포를 PBS로 세척한 후 \( 3.7 \% \) formalin으로 10 분간 고정하고 \( 60 \% \) isopropanol을 이용하여 세척한 다음 Oil Red O solution을 처리하여 실온에서 20 분 간 염색하였다. 염색 후 Oil Red O solution을 제거하고 증류수로 4회 세척한 다음 염색된 세포를 위상차 현미경을 이용하여 관찰하였다. 또한 정량적 분석을 위하여 \( 100 \% \) isopropanol을 이용하여 지방을 추출한 후 96 well plate에 200 \( \mu 1 \) 씩 옮겨서 ELISA reader로 \( 500 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였고 대조군의 흡광도 값에 대한 백분율로 나타내었다.</p> <h2>Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)에 의한 mRNA의 분석</h2> <p>톳 분획물을 처리하면서 분화시킨 3T3-L1 지방전구세포에 TRIzol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, Ca, USA) \( 1 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 동안 반응시킨 후 200 μl의 chloroform을 첨가하여 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분 동안 반응시켰다. \( 14,000 \mathrm{rpm} \), \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15 분간 원심분리시켜 \( 400 \mu 1 \) 의 상층액을 분리하고 동량의 isopropanol을 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분 동안 반응시킨 후 \( 14,000 \mathrm{rpm}, 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 원심분리시켜 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 DEPC water를 이용하여 녹이고 정량한 후, 각각의 primer, DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 역전사 및 증폭하였다. 각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하여 1X TAE buffer로 1\% agarose gel을 만들고 well 당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 loading 한 후 \( 100 \mathrm{~V} \) 에서 전기영동을 하였다. 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 ethidium bromide (EtBr, Sigma-Aldrich)을 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하였으며, housedeeping 유전자인 glyceraldegyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 internal control로 사용하였다.</p>