ATCC회사에서 구입한 H4IIE 세포들을 5% FBS를 함유한 Dulbecco's modified Eagle's 배지에 배양하여 70% confluence되었을 때 무혈청 배지에서 2일 동안 배양하여 성장을 동기화하였다. 그리고 1x10^5 cells/ml의 농도로 96-well plate에 100\(\mu\mathrm{l}\)씩 분주하여 24시간 37\(^\circ \mathrm{C}\), 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 간세포를 배지를 제거한 후 PBS로 2회씩 세척하고 균질화를 시켰다.
<h2>간세포 배양</h2> <p>H4IIE 세포는 랫트의 간세포주로 ATCC회사에서 구입하였다. 이들 세포들은 5 \% FBS를 함유한 Dulbecco's modified Eagle's 배지(Life Technologies, Grand Island, NY)에 배양하였다. 이들 세포들이 \( 70 \% \) confluence되었을 때 세포성장을 정지시키기 위해 무혈청 배지에서 이틀을 배양하여 세포의 성장을 동기화 시켜서 실험에 이용하였다.</p> <h2>MTT 측정</h2> <p>간세포를 96-well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cells/ml의 농도로 \( 100 \mu \) l씩 분주하여 24 시간 동안 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에서 배양하였다. 길항제를 이용한 실험의 경우 먼저 길항제들을 처리하였다. 그리고 30 분 후에 palmitic acid를 처리하여 24시간 배양하였다. 반응 후 well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 \( \mathrm { DMSO } 100 \mu \mathrm { l } \) 첨가하여 ELISA reader(Model 680, BioRad, Hercules, CA, USA)로 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 에 서 흡광도를 측정하였다. 대조구 세포수를 \( 100 \% \) 로 하여 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.</p> <h2>Western immunoblotting</h2> <p>배지를 제거한 간세포를 PBS로 2번씩 세척한 후, 각기 150 \( \mu \) l의 lysis buffer (10× PBS, \( 1 \% \) NP-40, 20 \% SDS, \( 0.5 \mathrm { M } \)EDTA, \( 0.01 \mathrm { M } \) PMSF, \( 10 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) Leupeptin, \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) pepstatin A)를 처리하여 균질화를 시켰다. 균질화된 세포를 tube에 옮긴 후, \( 15,000 \mathrm { rpm } \)에서 10분간 원심분리하여 상충액을 새로운 tube에 저장하였다. Bradford 단백질 정량법을 이용하여 각각 \( 60 \mu \mathrm { g } \)의 sample들을 \( 8 \% \) SDS-PAGE 전기영동을 시킨 후, polyvinylidine difluoride membrane에 transfer하였다. Membrane은 5 \% skim milk에 1시간 동안 차단을 시켰고, 각각의 항체(Bcl-2, Bax, p38 MAPK, phospho-JNK, beta actin)를 \( 1 \% \) skim milk에 1,000배 희석하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 18시간 이상 배양하였다. 그 후, membrane을 0.1 \% Tween-20/1× TBS에 10분 간격으로 3번 세척 하였고, membrane을 \( 1 \% \) skimmilk에 5,000배 희석된 horseradish-peroxidase labeled 2차항체에 1시간 동안 배양한 후, 3번 세척을 거쳐서 Enhanced Chemiluminoscent(ECL) 시약을 1분간 처리한 다음 \( X \)-ray 필름에 30초간 노출시켜 현상하였다.</p>