통해 도입된 유전자의 확장과 homoplasmy를 확인하였다. Northern blot 분석을 통해 목표 유전자의 발현을 확인하였다. Bombarding된 담배 잎을 RMOP 배지에서 2일간 배양한 후, spectinomycin 저항성 shoot을 유도하고 동일한 선발배지에서 재분화를 반복하여 도입된 목표 유전자의 homoplasmy를 유도하였다. 그리고 PCR, Southern blot, northern blot 분석을 통해 도입된 유전자의 확장과 homoplasmy, 목표 유전자의 발현을 확인하였다.
<h2>형질전환체의 선발</h2> <p>Bombarding된 담배 잎을 RMOP 배지에서 2 일간 배양 후 \( 5 \times 5 \mathrm { ~mm } \)크기로 절단하여 RMOP sp (RMOP, \( 500 \mathrm { ~mg } / \mathrm { L } \) specti-nomycin) 선발배지에서 6-7주 배양하여 spectinomycin 저항성 shoot을 유도한 후, 다시 \( 3 \times 3 \mathrm { ~mm } \) 크기로 절단하여 동일한 선발배지에서 재분화를 통하여 spectinomycin 저항성 shoot를 유도하였다. 이와 같이 선발 배지에서 재분화를 반복하여 도입된 목표 유전자의 homoplasmy를 유도하였다.</p> <h2>형질전환체 검정</h2> <p>형질전환체 검정을 위하여 PCR 분석과 Southern blot 분석, northern blot 분석을 수행하였다. PCR과 Southern blot 분석을 위해서 배양중인 식물체의 잎에서 genomic DNA를 추출 (G-spinTMIIp Gnomic DNA Extraction Kit for Plant, Intron)하였고, northern blot 분석을 위해서 total RNA를 추출(RNeasy Plant Mini kit, QIAGEN)하였다. PCR 분석은 P1 primer (chloroplast genome sequence: 5'-AATCGCTAGTAATCGCCGG-3')와 P2 primer (aadA sequence: 5'-AATCAATATCACTGTGTGGC-3')를 이용하여 유전자가 엽록체 genome으로 도입되었는지를 확인하였고, P3 primer (laccase 5' sequence)와 P4 primer (laccase3' sequence)를 이용하여 유전자 도입여부를 확인하였다.</p> <p>Southern blot 분석은 \( 2 ~ \mu \mathrm { g } \)의 genomic DNA를 BglⅡ 제한효소로 digestion하여 수행하였고, 분석에 사용된 probe는 담배 엽록체 genome의 trnl 유전자와 trnA유전자 sequence를 이용, 담배엽록체 genome DNA를 주형으로하여 증폭한 PCR product를 gel elution (Gel Elution Kit, QIAGEN)한 후 방사성동위원소로 labeling ( \( { } ^ { 32 } \mathrm { P } - \mathrm { dCTP } \) Probe Labeler Kit, Intron)하여 사용하였다. Northern blot 분석은 \( 5 ~ \mu \mathrm { g } \)의 total RNA를 이용하여 수행하였고, 분석에 사용된 probe는 laccase 유전자의 5' sequence와 3' sequence로 제작된 primer를 이용하여 형질전환에 사용된 재조합 plasmid DNA를 주형으로하여 증폭한 PCR product를 gel elution (Gel Elution Kit, QIAGEN)한 후, 방사성동위원소로 labeling \( \left ( { } ^ { 32 } \mathrm { P } - \mathrm { dCTP } \right . \) Probe Labeler Kit, INTRON)하여 사용하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>형질전환체 선발</h2> <p>엽록체 형질전환을 위해서 제작한 벡터 CTVL은 Figure 1에 나타낸 바와 같고, 이 형질전환 벡터를 gold particle에 coating</p>