에탄올이나 글리세롤과 같이 발효를 통해 활용할 수 없는 탄소원이 배지에 유일한 탄소원으로 도입되면 정상적인 호흡과 발효를 통한 ATP 생산이 불가능해진다. 결과적으로 coq 유전자가 결여된 돌연변이 균주는 제한된 성장을 보였으며 coenzyme Q의 주요 기능은 전자 전달 시스템에서 coenzyme 역할을 하는 것이지만 체내 항산화제로서의 역할에 대한 연구 관심이 높아지고 있습니다. PUFA(다불포화 지방산)는 자동 산화를 겪어 지질 과산화물 및 지방 과산화 라디칼을 생성하는 것으로 알려져 있습니다. 리놀렌산 자가산화의 경우 히드록시산, 옥소산, 에폭시산, 알데히드 등 다양한 화합물을 생성하는 것으로 보고되었다. 연구 결과에 따르면 리놀렌산을 처리한 S. cerevisiae coq7 변이주의 생존율은 약 \( 10 \% \)로 동일한 지방산을 처리한 야생형 균주의 생존율과 유사한 것으로 나타났다.
<h2>N. crassa coq-7 유전자에 의한 돌연변이의 회복</h2> <p>S. cerevisiae의 coq 돌연변이는 여러 종류의 표현형을 나타내지만, 가장 분명한 것은 성장 속도가 매우 늦고, 콜로니가 매우 작은 'petite' 표현형이다. 즉 coenzyme Q는 미토콘드리아 내막에 존재하는 전자 전달계에서 NADH-coenzyme Q reductase (complex I), succinate coenzyme Q reductase (complex Ⅱ) 및 cytochrome bc1 복합체의 조효소로 참여하는데, coenzyme Q가 결핍됨에 따라서 호흡,즉 호흡에 의한 ATP의 생산이 중지되고 단지 발효에 의한 성장만이 가능하기 때문이다. 따라서 에탄올 혹은 글리세롤 등과 같이 발효 과정을 통하여 이용이 불가능한 탄소원을 유일한 탄소원으로 배지에 첨가하여 주면, 정상적인 호흡과 발효에 의한 ATP의 생산이 불가능해짐으로 coq 유전자가 결여된 돌연변이 균주는 거의 성장을 못하는 것 으로 관찰된다. 좀더 고등한 진핵생명체인 C. elegans나 포유류인 mouse의 경우에는 coenzyme Q가 결핍된 경우에는 초기 발생 과정이 중지되는 등, 특히 발생 초기에는 필수적으로 요구되지만, 이후에 미토콘드리아의 호흡에는 영향을 미치지 않는 것으로 보고가 된 경우가 있었으나, 이는 외부에서 먹이 등으로 공급된 coenzyme Q가 미토콘드리아 내로 이동하여서 그 기능을 수행하가 때문으로 밝혀졌다. 최근 S. cerevisiae의 경우에도 외부에서 coenzyme Q6를 섭취하면 호흡이 회복되며, 발효로 이용이 불가능한 탄소원에서의 성장이 가능하게 되는데, 이때는 cytochrome bc1 복합체도 안정적인 구조로 회복되는 것으로 보고가 되었다.</p> <p>본 실험에서는 N. crassa의 coq-7 cDNA를 S. cerevisiae의 GAP 프로모터의 조절을 받도록 삽입하여 pEJ-YQ7을 조립하였다. 이 플라스미드를 S. cerevisiae CEN\(\triangle\)COQ7 균주에 형질전환한 후에 글리세롤 \( 2 \%\)(\(\mathrm{w} / \mathrm{v}\))가 첨가된 액체 배지에서 성장속도를 조사하여 균 성장 밀도를 측정함과 동시에 글리세롤을 유일한 탄소원으로 첨가한 고체 배지에서의 성장도 관찰한 결과를 보면 coq7 돌연변이체는 거의 성장을 보이지 않음 반면에, N. crassa coq-7 유전자가 도입된 경우에는 야생형 S. cerevisiae 균주와 비슷한 성정 속도를 보였다. 글리세롤만을 유일 탄소원으로 첨가한 고체 배지 상에서도 뚜렷한 성장을 관찰할 수가 있었다.</p> <p>cog7 돌연변이체는 탄소원을 글리세롤이 아닌 발효가 가능한 글루코스로 한 경우에도 매우 낮은 성장 속도를 보였다. N. crassa coq-7 유전자가 도입된 균주의 경우에 글루코스 배지에서도 성장 속도가 완전히 회복되는 것으로 나타났는데, 이는 GAP 프로모터가 지속적으로 발현되는 프로모터임으로 충분한 양의 COQ7 단백질을 생산하는데 기인한 것으로 생각된다.</p> <p>다른 종의 coenzyme Q 생합성 관련 유전자에 의한 기능적 상보성에 관한 보고는, 최근 C. elegans의 clk-1 유전자에 의한 E. coli ubiF 돌연변이체에 대한 상보성 연구를 비롯하여 다수가 존재하는데 이 연구에서의 홍미로운 점은 각 종마다 이용하는 coenzyme Q 곁가지의 길이가 다양함에도 불구하고 상보성이 일어나는 경우가 많고, 진핵과 원핵생명체 간의 교환도 가능하기 때문이다. 대부분의 진균류와 같이 coenzyme Q10을 이용하는 것으로 조사된(B.-U. Lee, unpublished data) N. crassa의 coq-7 유전자도 coenzyme Q6을 이용하는 S. cerevisiae의 coq7을 대체하는 것은 물론이며, 기존의 예로 C. elegans는 본래 coenzyme Q9을 이용하지만 clk-1은 coenzyme Q8을 이용하는 E. coli를 보완하거나, E. coli의 ubiG 유전자가 발현하는 효소가 coenzyme Q6를 이용하는 S. cerevisiae의 미토콘드리아로 targeting 되었을 경우에는 완전하게 보완하는 등 여러 보고가 있었다. Coenzyme Q 곁가지의 길이는 생합 성 첫 효소인 coq1에 기인하는 것으로 보고가 되었다.</p> <p>N. crassa의 coq-7 돌연변이체를 조립하는 것이 가능한 지를 알아보기 위해서 RIP (repeat-induced point muta-tion)을 이용하여 돌연변이를 유도한 결과, 정상적인 자낭 및 검은색의 숙성된 자낭포자 (ascospore)의 형성은 관찰되었으나, 자낭 포자를 발아시킨 결과 매우 낮은 발아율을 보였으며, 발아된 경우에는 모두 정상적인 성장 및 포자 형성을 보임으로 coq-7 돌연변이체는 아닌 것으로 판단되었다. 이는 생장을 위해서 산소가 절대적으로 필요한 호기성 생명체이고 발효가 불가능한 N. crassa의 경우에, coq-7 유전자에 돌연변이가 도입되면 전자 전달계의 불활성화에 기인하여 성장하지 못하호 치사(lethal)하기 때문으로 생각된다. 외부에서 공급되는 coenzyme \( \mathrm{Q} 10 \)이 발아율에 변화를 주는지의 여부를 조사하기 위하여 배지에 coenzyme Q10을 다량으로 첨가한 경우에도 역시 매우 낮은 발아율을 보였다.</p> <h2>불포화지방산에 대한 감수성 연구</h2> <p>생명체에서 산소 라디칼의 발생에 의한 산화는 암과 같은 치명적 질병의 주된 원인 중의 하나가 된다. 전자 전달계에서 조효소로 작용하는 것이 가장 중요한 coenzyme Q의 역할이지만 최근에는 생체 내에 존재하는 항산화제로서의 역할에 대한 연구도 활발하게 수행 중이다. 항산화 기작에 대해서는 아직 완전하게 밝혀지지 않았지만, 환원형의 coenzyme Q(\(\mathrm{QH}_{2}\))는 특히 지용성 항산화제의 기능을 감당하는 것으로 알려지고 있으며, 지방성 과산화 라디칼을 제거하거나 혹은 vitamin E와 유사한 기능을 할 것으로 생각되고 있다. \( \mathrm{QH}_{2} \)는 강력한 항산화제로서 인지질 및 lipoprotein들을 지질과산화 현상으로부터 보호하고, 산소 라디칼의 공격으로부터 막단백질 및 DNA를 보호하는 기능을 보유한 것으로 보고가 되었다.</p> <p>S. cerevisiae coq 돌연변이는 linolenic acid와 같은 polyunsaturated fatty acid (PUFA)를 처리하면 매우 높은 감수성을 나타내며 치사하는 것으로 보고되었다. PUFA는 자가산화 (autoxidation) 기작에 의해서 지방성 과산화물(lipid peroxide) 및 지방성 과산화 라디칼을 생산하는 알려졌는데, 특히 linolenic acid가 자가산화 되면, 세포에 독성을 갖는 다양한 종류의 hydroxy acid류, oxo acid류, epoxy acid류 및 알데하이드를 생산하는 것으로 보고가 되었다.</p> <p>S. cerevisiae coq7 돌연변이 균주를 linolenic acid를 처리하여 생존율을 조사한 결과에 따르면 동일한 지방산으로 처리한 야생형의 약\( 10 \% \) 정도인 것으로 나타났다. 이는 coq7 돌연변이 균주는 지용성 항산화제로서의 역할을 하는 \( \mathrm{QH}_{2} \)를 생성하지 못하여 자가산화 기작에 의한 linolenic acid의 산물에 대해서는 민감하여 치사가 빠르게 일어나지만 야생형 균주는 저항을 나타내는 것울 의미한다. coq7 돌연변이 균주에 N. crassa의 coq-7 유전자가 도입될 경우에는 야생형 S. cerevisiae 수준의 생존율을 보였다. 자가산화가 쉽게 일어나지 않는 포화지방산인 oleic acid로 처리된 경우에는 치사를 나타내지 않았다.</p>