본문에서는 횐쥐를 마취시킨 후 복와위 자세에서 왼쪽 비복근과 가자미근 조직을 적출하여 골격근 조직 채취 및 분석 방법을 진행하였다. 골격근 조직의 GLUT-4 protein 발현량을 측정하기 위해서 각각의 조직을 \( 137 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 2.7 \mathrm{mM} \mathrm{KCl}, 10 \mathrm{mM} \mathrm{Na}_{2} \mathrm{PO}_{4} \), \( 2 \mathrm{mM} \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}(\mathrm{pH} \) 7.4)가 함유된 PBS 로 씻은 후에 혼합용액에 담구고 초음파 분석하고 Membrane에 부착 된 단백질을 western blotting하였다.
<h2>골격근 조직 채취 및 분석 방법</h2> <h3>골격근 조직의 적출</h3> <p>골격근 조직은 횐쥐를 마취시킨 후 복와위 자세에서 왼쪽 비복근과 가자미근 조직을 적출하였다. 적출부위에 따른 오차를 줄이기 위해 실험 내내 한명의 검사 자가 동일한 부위를 설정하여 일정량을 적출하였다. 적출된 각각의 조직은 즉시 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 의 냉동고에 넣어 분석 전까지 보관하였다.</p> <h3>SDS-PAGE</h3> <p>골격근 조직의 GLUT-4 protein 발현량을 측정하기 위하여 각각의 조직을 \( 137 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 2.7 \mathrm{mM} \mathrm{KCl}, 10 \mathrm{mM} \mathrm{Na}_{2} \mathrm{PO}_{4} \), \( 2 \mathrm{mM} \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}(\mathrm{pH} \) 7.4)가 함유된 PBS 로 씻은 후 50-200 씨의 triton lysis buffer ( \( 20 \mathrm{mM} \) Tris, pH 7.4, \( 137 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 25 \) \( \mathrm{mM} \) 3-glycerolphosphate, \( \mathrm{pH} \) 7.14, \( 2 \mathrm{mM} \) sodium py-rophosphate, \( 2 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 1 \mathrm{mM} \mathrm{Na}_{3} \mathrm{PO}_{4}, 1 \% \) Triron \( X-100 \), \( 10 \% \) glycerol, \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) leupeptin, \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) aprotinin, \( 3 \mathrm{uM} \) benzamidine, \( 0.5 \mathrm{mM} \mathrm{DTT}, 1 \mathrm{mM} \) PMSF)에 담그어 초음파 분해하였다. 그 후 각 sample에 대한 단백질을 정량하였으며, 그 중 \( 10 \mu \mathrm{g} \) 의 단백질을 western blotting analysis에 사용하였다. 시료는 12\% SDS-PAGE (1.5 M Trizma base, 10\% Sodium Dodecyl Sulfate, 30\% Acrylamide, 10\% Ammonium Sulfate, TEMED) 상에서 전기영동 시킨 후 PVDF membrane (Pall Corporation, U.S.A)에 전기이동 시켰다.</p> <p>Western blotting</p> <p>전기이동 된 PVDF membrane을 TBS로 10 분씩 3회 wash-ing한 후 blocking buffer (TBS \( 34 \mathrm{ml} \), BSA \( 1.05 \mathrm{~g} \) )에서 1 시간동안 shaking시킨 후, 각각의 polyclonal antibody를 Blocking buffer에 1:1,000의 비율로 희석하여 상온에서 1 시간 30 분 동안 반응시켰다. 그 후 membrane을 씻어내고 anti-rabbit \( \operatorname{IgG} \) (Santa Cruz, U.S.A)가 결합되어 있는 horseradish peroxidase 를 1 대 1,000 의 비율로 희석하여 상온에서 30 분 동안 처리하고 다시 한 번 씻어내었다. 마지막으로 Membrane에 부착 된 단백질을 western blotting detection system을 이용하여 측정하였으며 density meter (Sharp jx-330)를 이용하여 스캔한 후, 단백질의 정량분석은 이미지 분석 프로그램(Image Master ver. 3.0, Biotech pharmacia)을 이용하여 산출하였다.</p> <h3>자료처리</h3> <p>본 실험에서 얻은 자료는 SPSS (Version 18.0) 통계 프로그램을 이용하여 각 항목별 평균과 표준편차 제시하였다. 각 조직별 집단 간 GLUT-4 protein 및 LDH 동위효소 발현량을 비교하기 위해 독립 t-test를 수행하였다. 또한 12 주간 체중 변화의 차이를 검증하기 위해 이원반복측정분산분석 (two-way Repeated Measure ANOVA)을 수행하였으며, 모든 통계적 유의 수준은 \( p \times 0.05 \) 수준으로 하였다.</p>