4T1-luc 유방암세포를 이용하여 유방암 세포 생존율에 AZA가 어떻게 영향을 미치는지 알아보았다. 암줄기세포 배양 특성 중 하나인 tumorsphere 형성에 대한 AZA의 영향을 살펴보았고 메칠화 억제현상이 암줄기세포의 유지와 생성을 억제할 수 있음을 알 수 있었다. 발광물질이 표지된 유방암 종양세포를 수집해 BALB/c female mice의 유방지방체에 접종 한 후 IVIS를 이용해 실험동물에서 영상을 획득하여 AZA가 종양세포의 성장을 억제한다는 것 또한 알 수 있었다.
<h1>결 과</h1> <h2>유방암 세포 생존율에서 AZA가 미치는 영향</h2> <p>\( 0.1 \mu \mathrm{M} \sim 50 \mu \mathrm{M} \) 농도의 AZA를 4T1-luc 세포에 처리한 후 72시간 후에 4T1-luc 생존율을 CCK-8 assay로 측정한 결과 처리하지 않은 대조군과 비교하여 실험군의 세포가 농도 의존적으로 세포 생존율이 감소하는 것을 관찰하였다. 세포 생존율 실험을 통해 AZA가 4T1-luc 유방암세포의 \(\mathrm{IC}_{50}\) (The half maximal inhibitory concentration)는 \( 1 \mu \mathrm{M} \) 내외라는 것을 알 수 있었고, 이 농도를 이용하여 암줄기세포 배양 특성 중 하나인 tumorsphere 형성에서 AZA의 영향을 살펴보았다.</p> <h2>유방암 세포주에서 AZA에 의한 Tumorsphere 형성 감소</h2> <p>정상 줄기세포를 혈청이 제거된 배양액에 EGF와 bFGF와 같은 성장인자를 첨가하여 unattached 조건에서 키우면 분화된 세포는 제거되고, 줄기세포들은 자라서 sphere를 형성한다. 같은 배양 조건에서 암세포를 키우게 되면, 분화된 암세포는 제거되고 암줄기세포들만 살아남아서 tumorsphere를 형성하게 된다. 이런 암줄기세포 배양특성 중 하나인 tumorsphere 형성에서 AZA의 영향을 살펴보기 위해 tumor-sphere 배양실험을 수행하였다. Attachment plates에 4T1-luccell을 seeding 하고 \( 1 \mu \mathrm{M} \)의 AZA를 처리하고, 3일 후 Trypsin-EDTA를 처리해 single cell을 얻어 ultra-low attach-ment plates (Corning)에 배양하였다. 7일 후 tumorsphere 형성을 inverted microscope를 이용하여 촬영한 결과 실험 대조군에 비해 약물 처리군의 tumorsphere의 크기와 수가 현저하게 감소하였다. 이러한 결과로 AZA에 의한 메칠화 억제현상이 암줄기세포의 유지와 생성을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.</p> <h2>In vivo 상에서 AZA의 종양세포 억제 효과</h2> <p>발광물질이 표지된 4T1-luc 유방암 종양세포를 수집해 BALB/c female mice의 유방지방체(m.f.p.)에 접종 한 후 IVIS를 이용해 실험동물에서 영상을 획득하였다. 영상분석 결과에서, 종양세포 주입 일주일 후 모든 그룹에서 종양이 형성되었다. 그러나 시간이 지날수록 종양 발광 신호가 시험물질을 처리한 군(Group 2, AZA: \( 0.05 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) B.W., Group 3, AZA: \( 0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) B.W.)이 용매 대조군(Group 1: \(0.2\%\) DMSO)보다 낮은 것을 확인할 수 있었다. 이를 수치화한 데이터를 보면 전체적으로 실험군의 photon 평균값이 대조군보다 2주차부터 4배 감소하였다. 이는 시험물질을 처리 한 뒤, 3주 후에 측정한 BLI (bioluminescent imaging) 결과에서도 실험군의 종양 덩어리가 유의적으로 감소한 것을 관찰 할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 AZA가 종양세포의 성장을 억제한다는 것을 알 수 있었다.</p> <h2>AZA에 의한 stem regulator gene 발현 감소</h2> <p>AZA에 의한 DNA 메칠화 억제 현상이 줄기세포 조절 전사 인자들의 발현에 어떠한 영향을 주는지 살펴보았다. BALB/c 마우스에 유방암 세포주를 주입하고 3주간 시험물질(AZA: \( 0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) B.W.)을 처리한 후 종양조직을 얻어 RTQ-PCR을 수행하였다. 그 결과 AZA를 처리한 군에서 Oct-4, Nanog, Sox2의 mRNA 발현이 대조군 보다 1.5배 이상 감소하였지만 c-Myc, Klf4의 발현에는 변화가 없었다.</p>