혈관내피세포의 이동 능력은 modified 48-well Boyden 챔버를 이용하여 조사했고, 혈관 내피 세포 발아 능력 조사는 Kim 등의 방법에 따라 실시 했다. PPAECs 세포를 \( 10 \% \) FBS \( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 첨가 DMEM 배지에서 24시간 배양하였다. 유의성은 one-way ANPVA를 이용하였다.
<h2>혈관내피세포의 이동 능력 조사</h2> <p>혈관내피세포의 이동 능력은 modified 48-well Boyden 챔버(Neuroprobe, Cabin John, MD, USA)를 이용하여 조사하였다. 먼저 BSA가 들어있는 M199 배지에 지시된 만큼의 오디 추출물을 첨가한 다음 챔버의 아래 또는 위 홈에 놓고, polycarbonate 필터\( (8 ~\mu \mathrm{m} \) pores, Poretics, Livermore, CA, USA)를 \( 50 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 피브로넥틴과 \( 0.2 \% \)의 젤라틴으로 코팅한 다음, 위 챔버와 오디 추출물 용액 사이에 방치하였다. 세포를 트립신으로 처리한 후 M199 배지로 2회 세척한 다음, \( 1 \% \) BSA로 재현탁 하였다. 이후, 위 챔버의 각 홈에 \( 5 \times 10^{4} \) 세포를 접종한 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, ~5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 조건으로 12시간 동안 배양한 후 면봉으로 필터의 위쪽으로부터 이동하지 않은 세포를 제거하였다. 필터를 메탄올로 고정한 다음, 슬라이드 글라스 위에서 Diff-Quik 용액(HEMA-3 stain set; Biochemical Scicnces, Swedesbord, NJ, USA)으로 염색한 후 현미경을 이용하여(100x) 이동한 세포의 수를 세었다.</p> <h2>혈관내피세포의 발아 능력 조사</h2> <p>혈관내피세포의 발아 능력 조사는 Kim 등의 방법에 따라 행하였다. 즉, PPAECs 세포를 microcarrier beads(직경 \( 175 ~\mu \mathrm{m} \); Sigma) 상에서 융합 상태로 성장시킨 다음, \( 2 \% \)의 FBS와 지시된 만큼의 오디 추출물이 포함된 피브린 젤 \( (2.5 ~\mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)에 방치하였다. 피브린 젤을 DMEM 배지에서 24시간 마다 동량의 오디 추출물을 첨가하면서 배양한 다음, 3일째에 도립현미경을 이용하여(100x) 발아된 세포의 수를 세었다.</p> <h2>MMPs와 TIMPs의 enzyme immunoassay</h2> <p>PPAECs 세포를 24 well plate에 세포밀도가 \( 5 \times 10^{4} \) cells/ \( \mathrm{cm}^{2} \)이 되도록 접종한 다음, \( 10 \% \) FBS \( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 첨가 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양한 후 융합상태로 자란 PPAECs 세포를 무-혈청 및 무-phenol red 배지에서 12시간 동안 배양하였다. 세포를 새로운 배지로 세척한 다음 대조완충용액 또는 오디 추출물을 지정된 시간만큼 처리하였다. 분비된 MMPs와 TIMPs의 실제 양은 제조사의 지시에 따라 enzyme immunoassay kits (Fuji Chemical Industries, Toyama, Japan)로 측정하였다.</p> <h2>Western hybridization</h2> <p>PPAECs 세포를 \( 60 \mathrm{~mm} \) dish에 \( 3 \times 10^{6} \) cells/dish이 되도록 접종하여 \( 10 \% \) FBS \( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 첨가 DMEM 배지에서 24시간 배양하였다. 이후, PBS로 세척한 다음, \( 5\% \) FBS \( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 첨가 배지에서 21시간 동안 혈청-결핍 상태로 배양하였다. 그 후, 오디 추출물을 처리하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, ~5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 조건에서 24시간 배양하였다. PPAECs 세포로부터 단백질 추출은 10x RIPA 용해 완충용액(Upstate, Lake Placid, NY, USA)을 이용하였다. 단백질분해효소 억제제 \( (10 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) trypsin, \( 10 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) aprotinin, \( 10 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) leupeptin, \( 1 ~\mathrm{mM} \) phenylmethylsulfonyl fluoride, \( 200 ~\mathrm{mM} \mathrm{~Na}_{3} \mathrm{VO}_{4}, 100 ~\mathrm{mM} \mathrm{~NaF} \) )가 포함된 용해 완충용액(\( 50 \mathrm{~mM} \) HEPES, \( 150 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaCl}, 10 \% \) glycerol, \( 1\% \) Triton X-100, \( 1.5 \mathrm{~mM} \mathrm{~MgCl}_{2}, 1 ~\mathrm{mM} \) EGTA)으로 세포를 용해시킨 다음, 원심분리 \( (14,000 \times g) \)에 의해 상등액을 얻은 후, BCA 단백질 정량 시약(Pierce, Rockford, IL, USA)을 사용하여 단백질을 정량하였다. 단백질을 \( 10 \% \) SDS-polyacrylamide 젤 상에서 분리한 다음, nitrocellulose 막으로 옮긴 후, \( 2\% \) skim milk를 함유한 TBS 완충용액에 넣어 막의 비특이적 부위들을 차단하였다. 완충용액은 제거한 다음 1차 항체와 함께 배양한 후, horseradish peroxidase-conjugated 2차 항체를 처리한 다음 ECL (Amcrsham International, Buckingham, UK)로 발색시켰다.</p> <h2>통계 처리</h2> <p>자료든 평균\( \pm \mathrm{SD} \)로 나타냈으며, 유의성은 Student-Newman-Kculs test에 의한 one-way ANPVA를 이용하여 검사하였다. 통계적 유의성은 \( \mathrm{P}<0.05 \)를 기준으로 하였다.</p>