무궁화의 대량증식의 한계점을 극복하기 위하여 무궁화 우량품종 '난파'의 잎을 이용하여 효율적인 조직배양 방법을 확립하기 위해, 첫째 영양분의 농도가 변형된 MS 배지에 NAA와 BAP을 조합한 배지를 사용하여 캘러스 유도 및 증식을 수행하였다. 둘째 유도된 캘러스를 BAP이 첨가된 재분화배지에 치상하고 배양한다. 셋째 우수한 신초들은 IAA 가 첨가된 배지에 옮겨 발근을 유도한다.
<p>본 연구에서는 무궁화의 대량증식의 한계점을 극복하기 위하여 제주대학교의 온실에서 재배하고 있는 무궁화 우량 품종 '난파'의 성숙한 잎을 이용한 효율적인 조직배양 방법을 확립하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물재료</h2> <p>본 실험에서는 제주대학교 아열대원예산업연구소의 온실에서 재배중인 무궁화 품종 ‘난파'의 잎을 식물재료로 사용하였다. 포장에서 재배한 무궁화를 2017년 겨울 온실로 옮겨 심은 후 개엽은 2018년 3월 초에 시작되었다. 개엽 후 3개월 이상 생장한 잎을 실험에 사용하였고, 온실에서는 시기에 관계 없이 식물재료의 안정적인 확보가 가능하였다. 채취한 잎은 멸균수로 3 회 세척 후 \( 75 \% \) 에탄올에서 1 분 처리한 후 멸균수로 3회 세척하였다. 1차 소독 후 \( 0.03 \% \) Tween 20 을 첨가한 차아염소산나트륨( \( \mathrm { NaOCl } ) 1.5 \% \) 에서 20분 소독 후 멸균수로 3회 세척하였다. 잎은 가운데 엽맥을 중심으로 약 \( 0.5 \mathrm { ~cm } \times 0.5 \mathrm { ~cm } \) 크기로 잘라 실험에 사용하였다.</p> <h2>기본 배지</h2> <p>무궁화‘난파'의 잎으로부터 캘러스 및 신초 재분화를 유도하기 위한 배지로는 MS배지에서 철, 염화칼슘 및 비타민의 농도가 변형된 MS배지를 기본으로 사용하였다.</p> <h2>캘러스 유도 및 증식</h2> <p>캘러스의 유도에는 변형된 MS 배지에 식물생장조절호르몬 NAA (Naphthalene acetic acid, Duchefa, Haarlem, The Netherlands)와 BAP (6- benzylaminopurine, Duchefa, Haarlem, The Netherlands)를 각각 다른 농도로 조합한 4종류의 배지를 사용하였다. 약 \( 0.5 \mathrm { ~cm } \times 0.5 \mathrm { ~cm } \) 크기로 절단한 잎 절편을 각 캘러스 유도 배지가 포함된 페트리디쉬(SPL, Korea)에 10개씩 치상하고 6주간 배양하였다. 배양 6 주 후에 캘러스 유도율과 색깔 및 성장 정도 등을 조사하였다. 캘러스 유도를 위한 기내 배양은 \( 24 \pm 1 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 암조건 하에서 수행하였다. 각 실험은 3 반복으로 수행하였다.</p> <h2>신초 재분화 및 발근</h2> <p>각 캘러스 유도배지에서 유도된 캘러스를 변형된 MS배지에 BAP \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) 를 첨가한 재분화배지에 치상하고 3주간 배양하였다. 배양 3주 후에 신초 형성율을 조사하였고, 캘러스에 신초가 1 개 이상인 것을 조사하였으며 하나의 캘러스에 복수의 신초가 형성된 것도 하나로 간주하였다. 또한 신초 형성 과정, 신초의 변이 여부 등을 관찰하였다. 형성된 신초는 생장을 촉진하기 위해 신초 부분을 캘러스에서 잘라내어 \( \mathrm { GA } _ { 3 } \) 를 \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) 로 첨가한 변형된 \( \mathrm { MS } \) 배지에 옮겨 배양하였다. 그 후 신초 생육이 우수한 개체들은 변형된 MS 배지에 IAA (Indole amino acetic acid, Duchefa, Haarlem, The Netherlands) \( 0 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) 또는 \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) 를 첨가한 배지에 옮겨 발근을 유도하였다. 재분화를 위한 모든 실험은 \( 23 \pm 1 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 16시간 광주기에서 수행하였다.</p>