\( \mathrm{EH} \)에 대한 활성 저해 효과가 가장 적은 유기용매를 선발하기 위해 다양한 시도를 하였고, 유기용매에서 라세믹 \( p \)-NSO에 대한 입체특이성 가수분해 반응에 대한 최적 온도를 결정하기 위하여 \( 20-40^{\circ} \mathrm{C} \)의 온도 구간에서 초기 30 분간의 가수분해 속도를 측정하고, 최적 water content를 결정하기 위하여 초기 가수분해 속도를 측정한 결과, 약 \( 2 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)에서 상대적으로 가장 높은 광학적 순도 및 수율을 얻을 수 있었으며, dodecane을 반응용매로 사용하여 라세믹 \( p \)-NSO에 대한 입체선택적 가수분해를 실시한 결과, 반응시간이 길어졌음에도 불구하고 수율이 증가하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>유기 용매의 선정</h2> <p>일반적으로 방향족 에폭사이드 기질은 소수성 분자구조로 인하여 수용액에서의 용해도가 낮은 편이다. 따라서, 수용액상에서의 \( p \) - \( \mathrm{NSO} \) 에 대한 입체선택적 가수분해반응은 초기농도 \( 4 \mathrm{mM} \) 에서 반응을 실시하였다. Fig. 1 과 같이 약 1 시간 정도의 반응을 통해 ee 값이 \( 100 \% \) 인 광학적으로 순수한 (S)-p-NSO를 \( 30 \% \) 정도(이론수율 \( =50 \%) \) 의 수율로 얻을 수 있었다. 생촉매를 이용한 회분식 생물전환공정의 생산성 향상을 위해서는 초기 기질 농도 증가가 필요한데, \( p \) - \( \mathrm{NSO} \) 의 경우 수용액에 대한 높은 용해도를 기대하기 어렵기 때문에 유기용매에서의 입체선택적 가수분해 반응을 고려해 볼 수가 있다. 또한, 일반적으로 삼각링 구조의 에폭사이드는 불안정한 구조로 인하여 수용액에서 자발적 분해가 일어날 수 있으므로 수율 저하 및 광학순도 저하가 일어날 수 있는데, 이러한 문제점도 유기용매 사용을 통해 해결할 수 있을 것으로 기대할 수 있다.</p> <p>친수성 유기용매를 cosolvent로 사용하여 수용액에서의 \( p-\mathrm{NSO} \) 의 용해도를 증가시켜 입체선택적 가수분해 반응을 수행한 연구결과는 있으나, 소수성 유기용매 자체를 반응용매로 사용한 연구 결과는 보고되지 않았다. 친수성 유기용매는 cosolvent로의 사용은 효과적이나, 단일 친수성 유기용매만을 사용하는 경우 급격한 \( \mathrm{EH} \) 활성 저하가 일어나 효율적인 입체선택적 가수분해 반응을 기대하기가 어렵다. 따라서, 본 논문에서는 소수성 유기용매를 대상으로 \( \mathrm{EH} \) 에 대한 활성 저해 효과가 가장 적은 유기용매를 선발하기 위하여 여러 종류의 유기용매에서 라세믹 \( p \)-NSO에 대한 가수분해 반응을 시도하였다(Table 1). 대조군으로 \( 50 \mathrm{mM} \) 인산완충용액에서의 반응을 고려하였으며, Table 1 에서와 같이 생촉매 활성은 decane, dodecane 등에서 비교적 높은 활성을 보임을 알 수 있었다. Dodecane의 경우 수용액 대비 약 \( 57 \% \) 수준의 활성을 보여주어 유기용매로 선택하였다.</p> <h2>온도 및 water content의 영향</h2> <p>유기용매에서 라세믹 \( p \)-NSO에 대한 입체특이성 가수분해 반응에 대한 최적 온도를 결정하기 위하여 \( 20-40^{\circ} \mathrm{C} \) 의 온도 구간에서 초기 30 분간의 가수분해 속도를 측정하였다. Fig. 2와 같이 최적 온도는 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 부근임을 알 수 있었고, 가장 낮은 가수분해 속도를 준 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 대비 약 \( 20 \% \) 정도 효율이 높음을 알 수 있었다. \( \mathrm{EH} \) 활성을 이용한 라세믹 에폭사이드에 대한 입체선택적 가수분해 반응에서는 물 자체가 반응물로 사용되기 때문에 적절한 양의 물을 첨가해 주어야 한다. 최적 water content를 결정하기 위하여, \( 0 \sim 10 \) \( \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 범위에서 \( \mathrm{DDW} \) 를 첨가한 후 초기 가수분해 속 도를 측정한 결과, 약 \( 2 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 에서 상대적으로 가장 높은 광학적 순도 및 수율을 얻을 수 있었다(data not shown).</p> <h2>입체선택적 가수분해 반응을 이용한 (S)-para-nitro-styrene oxide 생산</h2> <p>실험을 통해 결정한 최적조건인 반응온도 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{DDW} \) 첨가량 \( 2 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 에서 dodecane을 반응용매로 사용하여 라세믹 \( p \)-NSO에 대한 입체선택적 가수분해를 실시하였다. 수용액에서의 초기농도 \( 4 \mathrm{mM} \) 보다 높은 \( 20 \mathrm{mM} \) 의 라세믹 기질에 \( 100 \mathrm{mg} \) 의 A. niger 건조분말, \( 2 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 \( \mathrm{DDW} \) 를 첨가한 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm} \) 에서 교반하면서 반응을 진행하였다. Fig. 3에서와 같이 약 10 시간 정도의 반응을 통해 ee 값이 \( 100 \% \) 인 광학적으로 순수한 (S)-p-NSO를 \( 37 \% \) 정도(이론수율 \( =50 \%) \) 의 높은 수율로 얻을 수 있었다. 일반적으로 동력학적 분할반응에서 수율은 반응시간이 길어질수록 낮아지는데, 유기용매에서 반응을 진행하는 경우 수용액보 다 반응시간이 길어졌음에도 불구하고 수율이 오히려 증가한 결과를 얻을 수 있었다. 이는 유기용매에서의 기질 안 정성이 증가되었기 때문으로 판단된다. 따라서, 이러한 유기용매에서의 방향족 에폭사이드 기질에 대한 입체선택적 가수분해 반응은 미생물 유래의 \( \mathrm{EH} \) 활성을 이용한 고부가가치의 광학활성 에폭사이드 중간체 제조를 위한 반응 시스템으로 활용될 수 있을 것이다.</p>