복합 한약재를 이용한 발효 방법은 cerevisiae STV89를 애엽과 음양곽 혼합액에 4\( \% \) 씩 접종한 후, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4 일간 배양하고 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 분 간 열처리를 해주었다. 그리고 황기, 맥문동,금은화, 백련초, 길경, 어성초, 단삼 등에서 추출한 파우더형의 한약재에 12 시간 동안 미리 혐기적인 배지에서 배양한 L. case를 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12 시간 동안 \( 180 \mathrm{rpm} \) 의 속도로 진탕하여 발효하였다. 복합적인 발효 한약 추출물을 만드는 또 다른 방법으로는, 인진호, 금은화, 지구자로 구성된 숙취 해소용 한방 제제에 뽕잎, 호박, 도라지, 은행잎, 당근, 메주,찹쌀, 맥아, 포도당, 토마토, 감자 등으로 이루어진 일반 식품류를 일정 비율로 혼합하여 제조하는 것이다. 전탕된 한약재를 이용한 발효방법은 전탕 추출법에 의해 추출된 오적산을 \( 1 \mathrm{M} \) 의 \( \mathrm{NaOH} \) 로 \( \mathrm{pH} \)를 8.0으로 조정한 후 가압 멸균하였다. 상온에서 냉각하여 L. fermentum을 1\(\%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 접종한 뒤, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 항온실에서 통기성으로 배양한 후 48시간 동안 액체로 발효시켰다.
<p>애엽의 발효에는 조효소제인 a-Herbzyme \( 3 \mathrm{~g} \) 에 증류수 \( 100 \mathrm{ml} \) 를 가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 침출하여 여과시킨 후 그여액을 조효소액으로 사용하였다. 열수 추출하여 건조한 애엽 (3.0 g, pH 5.44)을 tube에 \( 0.95 \mathrm{~g} \) 을 넣고 미리 추출된 조효소액을 \( 2.2 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 시간 반응하였다. 멸균 후,S. cerevisiae STV89를 애엽에 \( 4 \% \) 씩 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4 일간 배양하고, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 분간 열처리하였다[7]. 녹용을 발효한경우, 녹용을 분쇄하여 중량의 \( 5 ~ 10 \) 배 양의 물을 넣고 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2 시간 추출하고 추출액을 \( 1 \mu \mathrm{m} \) 여과지로 여과한 후Bacillus sp.를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 시간 동안 발효하였다. 발효 종료 후 \( 0.25 \mu \mathrm{m} \) 여과지로 여과한 다음 여과액이 30 Brix가 되도록 감압 농축하여 녹용 발효추출물을 제조하였다[23].</p> <h3>복합 한약재를 이용한 발효</h3> <p>애엽과 음양곽 혼합 발효에서는 애엽과 음양곽 추출물을 이용하여 각각 다음과 같은 방법을 통하여 발효 애엽과 발효 음양곽을 얻었다. 열수 추출하여 건조한 애엽 \( (3.0 \mathrm{~g}, \mathrm{pH} 5.44) \)과 음양곽 \( (3.0 \mathrm{~g}, \mathrm{pH} 4.82) \) 을 tube에 각각 \( 0.95 \mathrm{~g} \) 을 넣고 미리 추출된 조효소액을 \( 2.2 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 시간 반응 후 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 살균하였다. S. cerevisiae STV89를 애엽과 음양곽 혼합액에 \( 4 \% \) 씩 접종한 후, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4 일간 배양하고 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 분 간 열처리하였다[33]. 또한 황기, 맥문동,금은화, 백련초, 길경, 어성초, 단삼 등에서 추출한 파우더형의 한약재에 12 시간 동안 미리 혐기적인 배지에서 배양한 L. case를 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12 시간 동안 \( 180 \mathrm{rpm} \) 의 속도로 진탕하여 발효하였다[34]. 복합적인 발효 한약 추출물을 만드는 또 다른 방법으로는, 인진호, 금은화, 지구자로 구성된 숙취 해소용 한방 제제에 뽕잎, 호박, 도라지, 은행잎, 당근, 메주,찹쌀, 맥아, 포도당, 토마토, 감자 등으로 이루어진 일반 식품류를 일정 비율로 혼합하여 제조하는 것이다. 먼저 일반 식품 원료 혼합물을 35 일간 발효하고 여기에 숙취 해소용 한방 제제를 첨가하여 다시 15 일을 발효시킴으로써 총 60 일간의 숙성과정을 거쳐 발효물을 제조하였다[11]. 상지, 상백피, 상엽 약침액의 발효 방법은 \( 50 \mathrm{~g} \) 의 약재에 \( 94 \% \) 에탄올을 100\( \mathrm{ml} \) 넣고 72 시간 추출하였다. 추출물을 여과하고 회전식evaporator를 사용하여 농축한 뒤, A. oryzae를 이용하여 48시간 동안 발효하였다[30].</p> <h3>전탕된 한약재를 이용한 발효</h3> <p>전탕 추출법에 의해 추출된 오적산을 \( 1 \mathrm{M} \) 의 \( \mathrm{NaOH} \) 로 \( \mathrm{pH} \)를 \( 8.0 \) 으로 조정한 후 가압 멸균하였다. 상온에서 냉각시켜 L. fermentum을 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 로 접종하고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 항온실에서 48시간 동안 통기성으로 배양하여 액체상으로 발효하였다[39].발효 육미지황탕의 경우, L. gasseri를 발효 뉸주로 접종하였고 그 외 발효 방법은 앞의 내용과 동일하였다[29]. 쌍화탕의 발효시에는 접종 균주인 영지버섯을 평판배지에서 배양하고\( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하면서 30 일 간격으로 계대 배양하였다. 균사체의 성장을 위하여 항온 배양기에서 평판배지를 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 의 온도에서 20 일간 배양한 후, 액체 배지에 접종하고 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 120 \)\( \mathrm{rpm} \) 에서 7 일간 배양하여 액체 종균을 생산하였다. 최종적으로 쌍화탕에 \( 10 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 수준으로 접종하여 생육 온도 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \), 상대 습도 \( 80 \% \) 를 유지하면서 30 일간 배양하여 발효물을 제조하였다[40].</p>