본 실험은 복합당질의 조직화학적 성상을 연구하기 위해 경골어류인 조피볼락, 용치놀래기, 송곳니베도라치, 졸복을 사용하였다. 장관 복합당질의 당잔기를 검색하기 위해 조직을 9가지의 biotinylated lectin을 Hepes buffer, \( \mathrm{Mn}^{2+} \), phosphate 등 용액에 희석하여 반응시켰다. PBS로 세척한 후 Mayer's hematoxylin으로 대조 염색하고, Lectin의 반응 정도를 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료 및 조직 표본 제작</h2> <p>본 실험에 사용한 경골어류는 점액 질의 조직화학적 연구는 되어 있으나 아직까지 복합당질의 조직화학적 성상에 관한 연구가 되어 있지 않은 횟대목(Scorpaeniformes) 양볼락과(Scorpaenidae)의 조피볼락 Sebastes schlegeli (Hilgendorf), 농어목(Percida) 놀래기과(Labridae)의 용치놀래기 Halichoeres poecilopterus (Temminck et Schlegel), 장갱이과(Stichaeidae)의 송곳니베도라치 Bryzoichthys lysimus (Jordan et Snyder) 및 복어목(Tetraodontiformes) 참복과(Tetraodontidae)의 졸복 Takifugu pardalis (Temminck et Schlegel)을 사용하였다.</p> <p>실험 동물을 희생시킨 후 흉복강을 절개하고 장이 시작되는 부위부터 장이 끝나는 부위까지 장 전체를 4 부위(근위장, 중간장, 원위장 및 직장)로 나누어 장을 \( 3 \sim 4 \mathrm{~mm} \) 두께로 절취한 뒤 \( 10 \% \) 중성 포르말린용액에 24시간동안 고정한 다음 수세과정을 거친 후 각급 알콜에서 탈수과정, 투명화과정을 거쳐 paraplast (융점 \( 56 \sim 58^{\circ} \mathrm{C} \) )에 포매하여 \( 6 \mu \mathrm{m} \) 두께의 연속절편을 만들었다. 장관의 조직학적 구조를 관찰하기 위하여 hematoxylin-eosin (H-E) 염색을 실시하였다.</p> <h2>Lectin histochemistry</h2> <p>장관 복합당질의 당잔기를 검색하기 위해 탈 파라핀한 조직을 \( 3 \% \) methanolic hydrogen peroxide에 실온에서 30분간 처리하고, phosphate buffer saline (PBS, \( 0.01 \mathrm{M} \), \( \mathrm{pH} 7.4 \))으로 10분간 3회 세척한 후 비특이성 반응을 없애기 위하여 \( 1 \% \) bovine serum albumin 용액에 실온에서 30분간 두었다가 여분의 용액을 제거시킨 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 습도를 유지하면서 9가지의 biotinylated lectin (Vector Lab., Burlingame, C.A., USA) 중 DBA, PNA, BSL- Ⅰ, sWGA 및 UEA- Ⅰ 은 Hepes buffer(\( 10 \mathrm{mM} \) Hepes 용액, \( \mathrm{pH} 7.5\), \( 0.15 \mathrm{M} \mathrm{NaCl} \), \( 0.1 \mathrm{mM} \mathrm{Ca}^{2+} \), \( 0.045 \% \) sodium azide)에, LCA와 Con A는 상기 Hepes buffer에 \( 0.01 \mathrm{mM} \)의 \( \mathrm{Mn}^{2+} \)이 포함된 용액에, RCA- Ⅰ 은 phosphate 용액(\( 10 \mathrm{mM} \) phosphate buffer, \( \mathrm{pH} 7.5 \), \( 0.15 \mathrm{M} \mathrm{NaCl} \), \( 0.085 \% \) sodium azide)에 Table 1 과 같은 농도로 희석하여 24시간 동안 반응시켰다.</p> <p>PBS로 세척한 후 ABC kit (avidin-biotin-peroxidase complex, Vector Lab.) 시약에 실온에서 60분간 반응시켰다. 다시 PBS로 세척한 후 Tris buffer (TB, \( 0.05 \mathrm{M} , \mathrm{pH} 7.6 \))에 \( 0.02 \% \) 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (Sigma, USA)와 \( 0.01 \% \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 혼합한 용액에 실온에서 약 10 분간 발색시켰다. 그 후 증류수로 세척하여 Mayer's hematoxylin으로 대조 염색한 후 polymount (Polyscience, USA)로 봉입하였다.</p> <p>Lectin의 반응정도는 음성은 0, 흔적적인 반응은 \( \pm \), 약한 반응은 +, 중등도의 반응은 ++, 강한 반응은 +++, 매우 강한 반응은 ++++ 등으로 표시하였다.</p>