본문은 B16F10 cell line을 \(1\times10^{6}\)cells/dish로 seeding하고 하루 동안 배양한 후 trizol lysis buffer dish에 \(1\mathrm{ml}\)씩 분주해 세포를 lysis하고 chloroform을 \(200\mu\mathrm{l}\)씩 분주해 위아래로 흔들어 반응시켰다. 이후 isopropanol과 DEPC water로 total RNA를 분리하고 oligo(dT) 15 primer, reverse transcriptase로 cDNA를 합성하였다.
<h2>Total RNA 분리 및 cDNA 합성</h2> <p>실험에 사용된 cell line B16F10을 \( 100 \mathrm { mm } \) culture dish에 \( 1 \times 10 ^ { 6 } \) cells/dish로 cell을 seeding한 후 24 시간 동안 배양하여 추출물을 농도별로 처리 후 24 시간 동안 배양하여 안정화시켰다. 배지의 상등액을 제거한 후 trizol lysis buffer dish에 \( 1 \mathrm { ml } \) 씩 분주하여 세포를 lysis 하였고 chloroform을 \( 200 \mu \mathrm { l } \) 씩 분주하여 20 초 동안 위아래로 흔들어 반응시켜주었다. 그 후 \( 13,200 \mathrm { rpm } \) 에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 isopropanol \( 500 \mu l \) 와 1:1로 튜브에 옮겨 섞었다. 다시 이전과 동일한 조건으로 원심분리 하였고, 상층액 제거 후 \( 75 \% \) EtOH-diethylpyrocarbonate (DEPC) water를 각 e-tube에 \( 1 \mathrm { ml } \) 씩 분주한 뒤 \( 13,200 \mathrm { rpm } \) 에서 5 분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 실온에서 건조시켰다. DEPC water를 \( 50 \mu l \) 씩 분주하여 녹인 뒤 96-well plate에 멸균수 195 \( \mu \mathrm { l } \) 와 RNA \( 5 \mu \mathrm { l } \) 를 총 양이 \( 200 \mu \mathrm { l } \) 가 되도록 첨가하여 260 \( \mathrm { nm } , 280 \mathrm { nm } \) 에서 각각 total RNA양을 측정하였다. Oligo(dT) 15 primer \( (500 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) 1 \mu \mathrm { l } \), 추출한 RNA \( 2 \mu \mathrm { l } \) 와 nuclease free water로 \( 10 \mu \mathrm { l } \) 를 맞추고 \( 75 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분간 반응시킨 뒤 \( 5 \mathrm { X } \) reaction buffer, \( \mathrm { RNasin } \) inhibitor, \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } , PCR nucleotide mix, nuclease free water, reverse transcriptase를 첨가 후 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 5분, \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 60분, \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 15 분간 반응을 시켜 cDNA를 합성하였다.</p>