혈액한천배지에 S. aureus 시험균을 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 배양하고 \( 0.85 \% \mathrm { ~NaCl } \)용액에 MacFarland 탁도 13정도로 균 농도를 조절하여 실험을 진행했으며, \( 10 \% \) SDS 및 Proteinase K \( (1 \mathrm { ~mg } / \mathrm { ml } ) \)를 \( 1 \% \) 농도로 가한 EET buffer \( 2 \mathrm { ~ml } \)을 시험관에 넣고 plug가 완전히 잠기게 하여 \( 54 ^ {\circ } \mathrm { C } \)수조에서 하룻밤 반응시켰다.
<h2>Pulsed field gel electrophoresis (PFGE)</h2> <p>차 등의 방법을 토대로, S. aureus 시험균을 혈액한천배지에 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 배양하여, \( 0.85 \% \mathrm { ~NaCl } \)용액 \( 2 \mathrm { ~ml } \)에 MacFarland 탁도 13정도로 균 농도를 조절한다. \(1.5 \mathrm { ~ml } \) centrifuge tube에 균 현탁액 \( 200 ~ \mu \mathrm { l } \)와 \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 보관 중인 \(1.6 \% \) SeaKem Gold agarose (Cambrex, Rockland, ME, USA) \( 200 ~ \mu \mathrm { l } \)를 넣고 부드럽게 혼합한 후, plug mold (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)에 넣어 냉장고에서 30분 동안 방치하였다. EET buffer [0.5 M EDTA, 0.1 M EGTA, 1 M Tris \( ( \mathrm { pH } \ 8.0) \)]에 lysozyme \( (50 ~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \)과 lysostaphin ( \( 25 \mathrm { ~units } / \mathrm { ml } \))을 가하여 lysis solution을 만들고, plug가 굳으면 투명한 \( 1.5 \mathrm { ~ml } \) 시험관에 각각의 plug를 옮겨 넣었다. lysis solution을 \( 2 \mathrm { ~ml } \)씩 분주하고 plug가 완전히 잠기게 하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 수조에서 하룻밤 반응시킨 후, lysis solution을 제거하고 TE buffer로 1회 세척하였다. Proteinase K \( (1 \mathrm { ~mg } / \mathrm { ml } ) \) 및 \( 10 \% \) SDS를 \( 1 \% \) 농도로 가한 EET buffer \( 2 \mathrm { ~ml } \)을 plug가 들어있는 시험관에 넣고 plug가 완전히 잠기게 하여 \( 54 ^ {\circ } \mathrm { C } \)수조에서 하룻밤 반응시켰다. 시험관에서 buffer를 제거하고 멸균 증류수로 상온에서 30분씩 2회 세척하고 TE buffer로 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 30분씩 3회 세척하였다. Plug를 \( 2.5 \sim3 \mathrm { ~mm } \) 크기로 잘라 새로운 \( 1.5 \mathrm { ~ml } \) tube에 닣고 Sma I (New England Biolabs, Beverlu, MA, USA)이 첨가된 제한효소요액 \( 200 ~ \mu \mathrm { l } \)씩을 가한 후, \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)배양기에서 6시간 반응시킨 후 TE buffer로 plug를 1회 세척한다. Comb에 순서대로 plug를 붙이고, marker로는 Lambda Ladder ( \(48.5 \sim970 \mathrm { kbp } \), Bio-Rad, USA)을 사용하였다. 30 분간 실온에서 방치한 후 0.5x TBE buffer (Bioneer, Korea)로 제작한 \(1 \% \) SeaKem Gold agarose를 부어 굳힌 다음 CHEF mapper (Bio-Rad, USA)로 전기영동을 시행하였다. 조건은 initial pulse 5초, final pulse 40 초, \(6 \mathrm { V } / \mathrm { cm } , \) 20시간이고 온도는 \( 14 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 실시하였다. 겔은 ethi-dium bromide ( \( 0.5 ~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) : Bioneer, Korea)으로 30분간 염색 후 증류수로 30분간 탈색하였으며, UV illumination (AlphaInnotech, USA)상에 결과 파일(TIFF)을 저장하여 데이터 분석에 사용하였다.</p>