바이러스 검출을 위한 primer는 poliovirus genome를 특이하게 추출할 수 있는 \(5'\)NCR부분의 염기서열을 사용했다. PCR를 \( 56 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 45초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 45초, \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초동안 40회씩를 반복해 산물을 얻었고 그 반응 결과로 생겨난 산물을 agarose gel에 전기 영동 해서 \( 394 \mathrm { ~bp } \)의 PCR 산물의 형성되었는 지 확인했다.
<h2>ICC-PCR (Integrated Cell Culture - Polymerase Chain Reaction)</h2> <p>바이러스 검출을 위한 primer는 poliovirus genome를 특이적으로 검출할 수 있는 5' NCR(Non Coding Region) 부분의 염기서열을 사용하였다. 1, 2차 세포배양액 \( 200 \mathrm { ul } \)를 \( 500 \mathrm { ul } \)의 GT\( (5 \mathrm { M } \) guanidium thiocyanate, \( 50 \mathrm { ~mM } \) Tris-\( \mathrm { HCl } \), \( 25 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 8 \% \) 2-mercaptoethanol)와 섞은 후, phenol/chloroform법으로 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 3분간 가열하여 변성시키고, 미리 준비한 cDNA 합성 혼합물(5x 반응 완충액, \( 3 \mathrm { ~mM }\) dNTP, \(150 \mathrm { ~pmol } \) reverse primer(PEV-R), \( 250 \mathrm { U }\) M-MLV 역전사효소(Promega사)를 넣어 \(37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1시간 동안 합성하였다. \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 열을 가하여 반응을 종결시킨 다음 PCR을 위한 주형으로 사용하였다. PCR 반응액은 총 \( 100 \mathrm { ul }\)[cDNA, 10x 반응 완충액, \( 1.5 \mathrm { ~mM } \mathrm { ~MgCl } _ { 2 } \),PEV-F, PEV-R 각각 \( 50 \mathrm { ~pmol } / \mathrm { ul } , 5 \mathrm { U } / \mathrm { ul } \) Taq polymerase(Takara사), adjusted to final \(\mathrm{100 ~ul}\) with \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \)]이 되도록 하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초, \( 56 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 45초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 45초 동안 40회를 반복시켜 PCR 산물을 얻었다. PCR 반응 결과 생겨난 산물을 \( 1.2 \% \) agarose gel에 전기 영동하여 \( 394 \mathrm { ~bp } \)의 PCR 산물의 형성 유무를 확인하였다.</p>