홍어회를 중성의 PBS 완충용액으로 균질화하여 제노믹 DNA 분리 키트를 이용하여 DNA를 추출하하였다. 16S rDNA를 nested PCR로 증폭하였다. 1차 PCR 반응에는 27F와 1492R을 프라이머로 사용하고, 2차 PCR 반응에는 희석한 DNA \( 1 \mu \mathrm { L } \)를 사용했다.HincII를 처리한시료를 혼합하여 5분 간 상온에서 DNA가 연결되도록 반응하게 했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시료 및 DNA 추출</h2> <p>홍어 전문 식당에서 구입한 홍어회 \( (20 \mathrm { ~g } ) \)를 \( 30 \mathrm { ~mL } \)의 PBS 완충용액( \( \mathrm { pH } 7.0 \))으로 균질화 시켰다. 홍어회 현탁액을 제노믹 DNA 분리 키트(Solgent, Daejeon, Korea)를 이용하여 DNA를 추출했다. 추출한 DNA는 16S rDNA를 증폭하기 위한 중합효소 연쇄반응(PCR)의 주형으로 사용하였다.</p> <h2>PCR</h2> <p>홍어회 현탁액으로부터 추출한 DNA를 주형으로 사용하여, 16S rRNA 유전자의 V2 지역을 nested PCR로 증폭하였다. 1차 PCR 반응에는 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)와 1492R(5'-GGCTACCTTGTTACGACT)을 프라이머로 사용하였다. 증폭된 DNA를 증류수로 100 배 희석한 후, 희석한 DNA \( 1 \mu \mathrm { L } \)를 2차 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. 16S rDNA 라이브러리 구축을 위해서 338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)와 518R(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG) 프라이머 세트를, 그리고 DGGE 분석을 위해서는 338FGC(5'-CGCCCGCCGCGCGCGGGGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG)와 518R 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초 간 변성, \( 45 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초 간 어닐링, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분간의 신장반응을 1주기로 하여 30회 반복하였다.</p> <h2>16S rDNA 라이브러리 제작 및 염기서열 분석</h2> <p>HincII를 처리한 pUC18 \( 1.0 \mu \mathrm { L } \), 16S rDNA \( 1.0 \mu \mathrm { L } , 5X DNA 연결효소 완충용액 \( 2 \mu \mathrm { L } \), 증류수 \( 5 \mu \mathrm { L } \) 그리고 DNA Quick ligase(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) \( 1 \mu \mathrm { L } \)를 혼합하여 \( 10 \mu \mathrm { L } \)가 되도록 한 후, 5분 간 상온에서 DNA가 연결되도록 반응시켰다. DH5 \( \alpha \)(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) competent cell \( 50 \mu \mathrm { L } \)에 ligation sample \( 1 \mu \mathrm { L } \)를 혼합하여 얼음에서 30분간 정치시켰다가 \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초 간 열 충격을 주어 형질전환을 시켰다. 앰피실린 \( (50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \), X-Gal \((40 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 그리고 IPTG \(1 \mathrm { mM } \))이 들어 있는 LB 한천배지에 도말하여 집락이 형성되도록 하였다. 흰색 집락을 선별하여 \( 3 \mathrm { ml } \)의 TB 액체 배지에 접종하여 배양시켰다. 플라스미드 정제 키트(Solgent, Daejeon, Korea)를 사용하여 플라스미드를 분리한 후 DNA 염기서열결정을 하였다.</p>