HPLC를 이용하여 본 효소의 최적 \( \mathrm{pH} \) 와 온도를 연구하였다. 본 효소와 \( T \)caldophilus GK24 유래 trehalose synthase와의 서로 다른 아미노산 잔기는 구조적으로 본 효소의 내열성을 유지하는데 중요한 역할을 할 것으로 사료된다. 트레할로스 생산 전환율은 \( 42.1 \% \) 를 기점으로 생성된 트레할로스가 글루코오스로 다시 전환됨을 확인하였다. 또한, 오염 우려가 없는 고온 하에서 산업적으로 적용할 때 매우 유용할 것으로 예상되는데, 이것은 기존의 다른 효소들과는 달리 높은 내열성을 가지고 있기 때문이라고 말할 수 있다.
<h2>재조합 trehalose synthase의 특징</h2> <p>본 효소의 최적 \( \mathrm{pH} \) 와 온도는 HPLC를 사용하여 조사하였다. 효소반응의 최적 \( \mathrm{pH} \) 는 7.5이고, \( \mathrm{pH} \) 7.5 8.5 범위에서 \( 90 \% \) 이상의 안정된 활성을 유지하여 T. caldophilus GK24 유래 trehalose synthase의 \( \mathrm{pH} \) 범위(6.0 9.0)와 비슷한 양상을 나타내었다. 트레할로스 생산에 큰 영향을 미치는 본 효소의 최적온도는 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 이고 \( 70 \sim 80^{\circ} \mathrm{C} \) 범위에서 95\% 이상의 높은 활성을 유지하여 T. thermophilus \( \mathrm{HJ} 6 \) 의 생육온도 \( \left(80^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 와도 유사한 양상을 나타내었다. 또한, 본 효소는 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 동안의 열처리에는 안정하게 활성이 유지되지만, \( 90^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 40분 만에 \( 50 \% \) 로 활성이 감소하였고, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서는 10분 만에 활성이 \( 17 \% \) 까지 감소하였다. T. caldophilus GK24 유래 trehalose synthase는 본 효소와 아미노산 서열상의 상동성이 \( 99 \% \) 임에도 불구하고, 최적온도는 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 를 나타내어 본 효소의 최적온도외는 매우 상이함을 나타내었다. 따라서, 본 효소와 \( T \)caldophilus GK24 유래 trehalose synthase와의 서로 다른 아미노산 잔기(Phe84, Gly118, Glu589, Thy666, Val729, Thr800, Tyr908)는 구조적으로 본 효소의 내열성을 유지하는데 중요한 역할을 수행할 것으로 생각된다. 또한, 내열성 단백질을 대장균에서 발현시키면 native와는 다른 성질과 구 조를 가질 수 있고, 이런 단백질은 고온 환경 하에서 구조가 성숙하여 안정화 하는 것으로 보고되고 있으며, 열의존성 구조성숙은 내열성 단백질에서 주로 확인되고 있다. 이와 같은 이유로 본 연구에서 단백질 생산 시에 사용한 pJLA503 벡터 시스템은 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 유전자의 발현을 유도하기 때문에 기존의 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 유전자를 발현하는 시스템에 비해 내열성 단백질의 구조성숙에 있어 더욱 유리할 것으로 생각된다.</p> <h2>효소반응의 최적조건</h2> <p>트레할로스 대량생산을 위한 효소반응 조건의 최적화를 위해 본 효소의 반응시간 경과에 따른 트레할로스 생산 전환율을 조사하였다. \( 50 \mathrm{mM} \) 의 기질농도에서 트레할로스 생산 전환율은 30 분 만에 \( 42.1 \% \) 의 최고치를 나타냈고 1시간까지 유지하다가 그 이후, 시간이 경과 할수록 감소하여 24시간 후에는 \( 33.6 \% \) 로 줄어들고 상대적으로 글루코오스 생산량은 \( 40.9 \% \) 로 중가하였다(Fig. 6). 따라서 트레할로스 생산 전환율은 \( 42.1 \% \) 를 기점으로 생성된 트레할로스가 글루코오스로 다시 전환된다는 것을 알 수 있었다. 몇몇 연구자들은 trehalose synthase가 맥아당과, 트레할로스로부터 글루코오스를 생성한다고 보고 한바 있다. 또한, \(100,250,500 \mathrm{mM} \) 의 기질농도에서 트레할로스 전환율을 실험한 결과, Table 2에서와 같이 고농도의 기질에서 트레할로스 생산 전환율이 증가하였다. \( 500 \mathrm{mM} \) 의 기질농도에서 전환율은 \( 55.7 \% \) 로 가장 높았다. 이것은 Nishimoto 등이 Pimelobacter sp. 유래 trehalose synthase의 효소반응에 있어서 기질반응 농도는 트레할로스 전환율에 크게 영향을 주지 않는다고 보고한 것과 상이한 결과를 나타냈다. 본 효소의 트레할 로스 생산 전환율(55.7\%)은 T. caldophilus GK24 유래 trehalose synthase의 69.2\%와 비교하면 낮은 편이지만 고농도의 기질에서 트레할로스의 전환율이 높기 때문에 산업 적인 생산수율 측면에서 더욱 유리할 것으로 생각된다. 또한, 기존의 다른 효소들과는 달리 높은 내열성을 가지고 있기 때문에 오염 우려가 없는 고온 하에서 산업적으로 적용할 때 매우 유용할 것으로 생각된다.</p>