유전자의 발헌을 위해 각각의 sense primer 내에 Kozak translation initiation sequence롤 삽입하고, 생성된 단편을 유전자 발현에 사용되는 효모 발현 벡터인 pYES2의 EcoRI/XbaI 부위에 클로닝하였으며 제작된 재조합 플라스미드를 ABI3700 시스템을 이용하여 시퀀싱한 결과 pYexkA1(lecA 함유)과 pYexkB1(lecB 함유)이 ORF 및 염기서열에 이상이 없는 재조합 plasmid을 확인하였다. 또한 이 연구에서는 한국산 겨우살이의 렉틴 유전자를 형질전환하여 효모 내 각 렉틴 사슬의 발현을 확인하였다. RNA 수준에서 각 사슬의 발현이 유도시간에 의해 조절되는 것을 관찰하였고, 최적의 발현시간은 36시간으로 판단하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Recombinant yeast 용 Plasmid구축</h2> <p>KM Lectin A, B 유전자를 증폭하기 위하여 두 쌍의 sense primer (KoLA1f/KoLB1f)와 antisense primer (KoLA1r/KoLB1r)를 제작한 후 한국산 겨우살이로부터 추출한 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 통해 약 \( 0.8 \mathrm{~kb} \) 크기의 lectin A, B 유전자를 증폭하였다. 유전자의 발헌을 위해 각각의 sense primer 내에 Kozak translation initiation sequence롤 삽입하였으며, 효모용 발현 벡터 pYES2의 EcoRI/ XbaI site에 pYES2에 클로닝하였다.</p> <p>이를 통해 구축된 재조합 plasmid는 ABI3700 system을 통해 염기서열 분석을 함으로서 ORF 및 염기서열상 이상이 없는 재조합 plasmid인 pYexkA1 (lecA 포함)과 pYexkB1 (lecB 포함)을 확인할 수 있었다.</p> <p>각각의 재조합 plasmid 내에 존재하는 lectin A, B는 pYES2 system 이 가지고 있는 GAL1 promotor를 이용하여 galactose에 의한 유도발현이 이루어진다.</p> <h2>lecA 및 lecB 유전자의 단백질 발현</h2> <p>위에서 언급한 plasmid를 uracil이 제한된 SC-minimal (합성배지) 률 이용하여 효모에 형 질 전환 후 균체 단쌕실(72시간 배양 후)을 SDS-PAGE하여 본 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 그림에서와 같이 SDS-PAGE (A) 상에서는 발현 단백질의 차이가 나타나지 않으나 western blot (B)에서는 galactose로 유도된 균체(B의 No. 3, 6)에서 약 \( 29 \mathrm{kDa} \) 가량의 크기를 갖는 예상 단백질을 검출할 수가 있었다.</p> <p>재조합 효모 내 lectin 발현을 정량적으로 분석하기 위해 한국산 겨우살이 lectin에 대한 monoclonal antibody를 이용한 ELISA 분석의 결과, 재조합 lectin의 발현을 확인하였고 이를 rKM lectin A1 (recombinant Korean mistletoe lectin A1) 및 rKM lectin B1 으로 명명하였다. 하지만 발현되는 양은 기대와 달리 소량으로서 각각 48시간 유도배양된 효모의 가용성 단백질 \( 1 \mathrm{mg} \) 당 rKM lectin A1의 경우 \( 1.24 \mu \mathrm{g} \) rKM lectin B1의 경우 \( 1.75 \mu \mathrm{g} \) 으로 낮게 검출되었다.</p> <h2>RT-PCR에 의한 lecA, B 발현의 전사 단계에서 확인</h2> <p>상기의 결과에 의해 lecA 및 B 의 효모 내 고발현은 어려운 것으로 예측되어 그 원인에 대해 고찰한 결과 세포내 고발현은 translation 단계에서 제어가 될 가능성이 제기된다. 이는 lectin 이 진핵세포상의 28S rRNA 의 특정 adenine을 분해하여 ribosome 상에서 단백질의 합성을 불활성화시키는 type2의 RIP로 분류되고 있음에서 유추할 수 있었다. 이의 확인을 위해 시간별로 galactose 유도시킨 균체로 부터 RNA를 추출한 후 이를 RT-PCR 하였으며 그 결과를 Fig. 5에 나타내었다.</p> <p>Fig. 5에서 보듯이 A, B 모두 36시간 배 양까지는 전사 산물이 보이나 lecA gene의 경우 그 이후 시간에는 산물이 나타나지 않았으며 lecB gene 또한 60시간 배양 이후 전사산물이 관찰 되지 않았다. 위의 결과를 바탕ㅇ․로 lecA 유전자의 경우 초기 전사된 mRNA 로부터 발현된 lectin A chain에 의해 rRNA가 제어를 받은 것으로 추측할 수 있으며, 이는 Pulse-Field 실험 등에 의한 보다 세밀한 실험결과가 요구 된다. 위의 RT-PCR의 전사 단계상 결과는 다음 dot-hybridization(Fig. 6)의 결과와도 일치함을 알 수 있다.</p> <p>즉 lecA 유선자의 전사 산물은 36시간 뒤에는 나타나지 않으므로 재조합 효모 내에서의 lectin A chain lecA의 발현은 RNA 단계에서 유도시간에 따라 제어됨을 고찰 할 수가 있었다.</p> <p>이상의 결과로부터 본 논문은 식물 유래 이종 단백질인 겨우살이 lectin의 효모 내 발현을 기대하며 실헙 하였다. 효모를 이용한 식물유래 이종단백질의 발현의 예로서 합성 thaumatin 유전자가 이미 보고 되었으나 이들의 활성은 확인 되지 않았다. 또한 곰팡이를 이용한 식물 protein의 발현에서는 곰팡이의 N-terminal site에 식물 유전자를 fusion시켜 activity를 확인 하였다.</p> <p>본 연구는 식물(한국산 겨우살이)의 lectin유전자를 각기 효모에 형질 전환 함으로서 lectin의 각 chain이 효모 내에서 발현됨을 확인 하였으나 각각 chain의 발현은 유도 시간에 의해 제어됨을 RNA단계에서 확인 할 수 있었으며 최적 발현 시간은 36시간임을 확인하였다.</p> <p>Lectin이 cytotoxicity를 가진 RIP II로 분류됨에 따라 lectin의 활성 부분인 A 유전자의 변형을 가하여 A, B chain의 fusion에 의한 효모 내 발현을 유도하여 산업적 이용을 모색할 예정이다.</p>