Kanamycin이 첨가된 선발배지에서 살아남은 식물체에 GalUR 유전자 도입 여부를 PCR로 확인하고, 증폭된 밴드의 유전자 판별 및 복사본 수를 Southern 분석으로 검증했다. 상추잎으로부터 분리한 genomic DNA를 절단하고 전기영동 후 멤브레인으로 전이시켰다. GalUR 유전자를 probe로 표지하고 hybridization을 실시했다. 비타민 C 함량 분석을 위해 형질전환체 종자를 파종하고, 채취된 시료를 한국식품연구소로 보내어 HPLC 방법으로 비타민 C 함량을 측정했다.
<h2>PCR 및 Southern 분석</h2> <p>Kanamycin이 첨가된 선발배지에서 살아남은 식물체에 GalUR 유전자가 도입되었는지를 확인하기 위하여 PCR 분석을 수행하였다. 형질전환 하여 얻어진 발근된 상추 개체를 자연광이 들어오는 순화실에서 \( \left (20 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \) 순화하였다. 본엽이 3~4장 나온 식물체의 어린 잎조직을 채취하여 genomic DNA를 추출하였다. PCR 반응조건은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5분간 pre-denaturation한 후, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분간 denaturation, \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분간 annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분간 extension 하는 과정올 35번 반복하고, 마지막으로 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5분간 신장반응 시키는 것으로 하였다. PCR 반응에 사용된 forward와 backward primer는 5-ATGAOGCACAATCOCACTAT-3'와 5-GIGGGATCCT CATAATTCTTCGTC-3'를 각각 이용하였다. PCR 산물은 \( 0.8 \% \) agarose gel에서 전기영동 하였으며, EtBr로 염색하여 UV lamp하에서 밴드롤 확인하였다. 또한, 증폭된 밴드가 GalUR 유전자인지, 몇 copy로 삽입되었는지 확인하기 위하여 Southern 분석울 실시하였나 (Southern 1975). 상추잎에서 분리한 genomic DNA \( (20 \mathrm { ug } ) \) 를 HindⅢ로 절단하여 \( 0.8 \% \) agarose gel 전기영동 한 후, agarose gel 상의 DNA 밴드를 ZetaR- Probe nylone membrane으로 전이시켰고, GalUR 유전자를 probe로서 \( { } ^ { 32 } \mathrm { P } - \mathrm { dCTP } \) 로 표지하여 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 시간 hybridization시켰다. 반응을 마친 membrane을 세척하고, \( -70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서X-ray 필름에 노출시켜 밴드를 확인하였다.</p> <h2>비타민 C 함량 분석</h2> <p>형질전환체 \( \left (T_ { 0 } \right ) 8 \) line돌을 각각 자가수분하여 \( \mathrm { T } _ { 1 } \) 송자를 채종하였다. 비타민 C 함량 분석을 위하여 \( \mathrm { T } _ { 1 } \) 형질선환체 종자를 105구 tray에 파종하였다. 8 linc 각각의 \( \mathrm { T } _ { 1 } \) 식물체내에 GalUR 유전자 삽입 유무를 확인하기위해 본엽이 3장 정도 나왔을 때 PCR 분석을 수행하였다. 유전자가 확인된 \( \mathrm { T } _ { 1 } \) 개체들 중에서 각각의 \( T_ { 1 } 12 \) 개체를 선발하여 큰 포트로 이식하였다. 이때 대조구로서 형질전환하지 않은 화홍적축면 상추도 같이 파종하여 다수 준비하였다. 하우스에서 약 2달간 재배한 형질전환 상추 8 line당 \( T_ { 1 } \) 12개체에서 생육이 불균일한 것을 제외하고 각각 10점을 모아서 bulk로 시료를 준비하였다. 이같이 준비된 시료에서 비타민 C 함량을 측정하고자 오래된 잎을 제외한 비슷한 크기의 어린잎을 약 200 \( \mathrm { g } \)씩 채취하였다. 대조구도 같은 방법으로 3개의 시료를 준비하였다. 비타민 C는 쉽게 파괴되는 영양소이므로, 채취된 시료들을 바로 얼음을 채운 상자에 넣어서 분석전문 기관인 한국식품연구소로 보내 HPLC 분석 방법으로 비타민 C 함량을 측정하였다. \( 5 \% \) metaphosphoric acid 용액에서 시료롤 추출하였고, column은 \( \mathrm { Cl } 8(4.6 \mathrm { ~mm } \times 250 \mathrm { ~mm } ) \), detector는 UV \( 254 \mathrm { ~nm } \)를 사용하였다. Standard curve 값은 Ascorbic acid 표준시약을 사용하여 측정하였다.</p>