본 연구에서는 누에(Bombyx mori: Silkworm) 난소(ovary) 조직에서 수립된 Bm5 세포주를 tunicamycin을 \(5\(\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml}\)로 처리하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5시간 배양하여 N-glycosylation 억제, Promega RNAgents Total RNA Isolation System을 사용하여 total RNA 분리, Stratagene Poly(A) Quik mRNA Purification Kit를 이용하여 poly(A)+RNA 정제, Uni-ZAP XR Vector Kit와 Gigapack Packaging Extract를 사용하여 제작하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>공시 배양세포주 및 N-glycosylation 억제</h2> <p>본 연구에 사용된 곤충 배양세포주는 누에(Bombyx mori: Silkworm) 난소(ovary) 조직에서 수립된 Bm5 세포주이었다. N-glycosylation 억제를 위해 배양세포에 tunicamy-cin 를 \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 처리하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 시간 배양하였다.</p> <h2>Total RNA 및 \( \operatorname{poly}(\mathrm{A})+\mathrm{RNA} \) 분리</h2> <p>Tunicamycin이 처리된 배양세포를 5시간 후에 PBS(phosphate buffered saline)로 2회 세척한 다음 이로부터 total RNA 분리는 Promega (Madison, WI, USA)의 RNAgents Total RNA Isolation System을 사용하여 분리하였다. 분리한 total RNA는 전기영동으로 양상을 확인하고, 파장 \( 260 \mathrm{~nm} \) 에서 UV분광광도계로 정량하여 poly(A)+RNA분리에 사용하였다. poly(A)+RNA의 정제는 Stratagene (La Jolla, CA, USA)의 Poly(A) Quik mRNA Purification Kit를 사용하여 정제한 후 cDNA 유전자은행을 제작하는데 이용하였다.</p> <h2>cDNA 유전자은행 제작</h2> <p>N-glycosylation이 억제된 곤충 배양세포주의 cDNA 유전자은행의 제작은 Stratagene사(CA. USA)의 Uni-ZAP XR Vector Kit와 Gigapack Packaging Extract를 사용하여 제작하였다. 즉, poly(A)+RNA로부터 XhoI linker primer와 역전사효소를 이용하여 cDNA 말단을 평활말단으로 만들었다. 그리고 EcoRI adapter를 부착시킨 후, 제한효소인 XhoI으로 절단하고 size fractionation을 거쳐 \( 500 \mathrm{bp} \) 이상크기의 단편만을 취하였다. 이러한 CDNA를 Uni ZAP XR 벡터에 결합시켜 삽입한 후 완전한 bacteriophage 상태가 되도록 coat protein으로 packaging하여 cDNA 유전자 은행을 제작하고 기주세포(XL1-Blue MRF' strain)내에 감염시킨 후 cDNA농도를 적정하고 이를 적당한 농도로 증폭하여 시험에 사용하였다.</p> <h2>정상 및 N-glycosylation이 억제된 곤충 배양세포주의차별화 선별</h2> <p>Tunicamycin을 처리하여 제작된 cDNA 유전자은행으로부터 in vivo excision에 의해 무작위로 768개의 클론을 선발하여 플라스미드를 분리하였다. 분리한 플라스미드를 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 가온하여 변성시킨 후 두 장의 나일론 막에 각각 동일한 \( 0.5 \mu \mathrm{g} \) 의 플라스미드 DNA를 blotting 하였다. 두 장의 막을 각각 정상세포에서 분리한 poly(A)+RNA 와 N-glycosylation이 억제된 곤충 배양세포에서 분리한 poly(A)+RNA를 M-MLV 역전사효소로 합성한 1st-strand cDNA를 탐침으로 사용하였다.</p> <P>cDNA 탐침제조는 \( 1.5 \mathrm{m \ell} \) 튜브에 \( 1 \mu \mathrm{g} \) poly(A)+RNA, \( 1 \mu \mathrm{g} \) oligo(dT) primer \( (1 \mu \mathrm{g} / \mu \ell), 20 \) units RNase inhibitor, \( 5 \mu 2 \times \) reverse transciptase buffer, dGTP, dCPT, dTTP \( (20 \mathrm{mM} / \) each \( ) \), \( 120 \mu \mathrm{M} \mathrm{dATP}, 10 \mu \ell\left[\alpha-{ }^{32} \mathrm{P}\right] \) dATP \( (3000 \) \( \mathrm{Ci} / \mathrm{mmol}) \) 와 20 units M-MLV 역전사효소를 넣고 1 시간 동안 역전사하였다. 여기에 2 units RNaseH를 첨가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15 분간 반응하여 poly(A)+RNA만을 선택적으로 제거시킨 후 동위원소가 표지된 단선 cDNA를 G-50 Sephadex 칼럼을 이용하여 회수하였다.</p>