PEDV 스파크 단백질 유전자로부터 4개의 단편을 PCR로 합성하여 벡터를 제작하고, MYC tag 3개를 붙여 CaMV 35S 프로모터 조절을 받도록 pCAMBIA2300 벡터에 삽입하여 벡터를 완성하였다. 또한 Kanamycin 첨가 선발배지에서 각 벡터 당 50에서 70개 정도의 라인을 얻었고 외래 유전자 도입을 확인하기 위하여 PCR를 수행하였고 PCR로 도입유전자가 확인된 형질전환 담배 배양세포주를 대상으로 PEDV 스파크단백질 고생산 라인을 선발하고 자 C-Myc 항체를 사용하여 dot blot를 실시하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>형질전환 벡터 제작</h2> <p>약 \( 4.2 \mathrm{~kb} \)PEDV 스파크 단백질 유전자로부터 4종류의 단편을 PCR로 합성하여 벡터를 제작하였다. SP1 \( (0.44 \mathrm{~kb} \), 염기서열 \( 1,487-1,930 \mathrm{bp}) \), SP2 \( (1.69 \mathrm{~kb}, 2,300-3,987 \mathrm{bp}) \), SP3\( (1.39 \mathrm{~kb}, 1,559-2,950 \mathrm{bp}) \) 및 SP4 \((2.63 \mathrm{~kb}, 9-2,643\mathrm{bp})\) 각각을 PCR로 합성한 후 각 단편들 뒤에 MYC tag 3개를 붙여 \((100 \mathrm{bp}) \) 연결시킨 카세트를 완성한 후 염기서열을 확인하였다. 각각의 카세트를 CaMV \( 35 \mathrm{~S} \) 프로모터 조절을 받도록 제작한 다음 pCAMBIA2300 벡터에 삽입하여 벡터를 완성한 후 35S::SP1-M, 35S::SP2-M, 35S::SP3-M 및 35S::SP4-M으로 각각 명명하였다. 각각의 벡터를 Agrobacterium tumefaciens EHA105에 도입하여 담배 배양세포 형질전환에 이용하였다.</p> <h2>Agrobacterium 매개에 의한 형질전환 및 배양세포주 선발</h2> <p>앞서 제작된 35S::SP1-M, 35S::SP2-M, 35S::SP3-M 및 35S::SP4M 벡터를 각각 함유하고 있는 아그로박테리아와 담배 BY-2 배양세포를 공동배양하여 형질전환 하였다. 계대배양 4일된 BY-2 현탁배양세포를 아그로박테리아와 2일 동안 공동배양한 후 선발배지에 배양한 후 형성된 kanamycin 저항성 cluster를 선발하여 계속하여 동일배지에서 증식시켰다. 선발배지에서 4주 배양 후부터 cluster가 형성되기 시작하였으며 3주 간격으로 새로운 선발배지로 계대배양하여 형성된 세포괴를 선발하였다.</p> <p>Kanamycin 천가 선발배지에서 각 벡터 당 50개에서 70개 정도의 라인을 얻었으며 외래 유전자 도입을 확인하기 위하여 PCR를 수행하였다. 캘러스로부터 genomic DNA를 분리하고 nptII 유전자 특이 primer 혹은 PEDV 단편들 각각의 특이 primer를 이용하여 PCR를 수행하였다. 그 결과 각 벡터별 형질전환 효율은 \( 75 \% \)에서 \( 85 \% \)이었으며, 39개에서 60개의 형질전환 세포주를 확보하였다.</p> <h2>형질전환 담배 배양세포 분석</h2> <p>PCR로 도입유전자가 확인된 형질전환 담배 배양세포주를 대상으로 PEDV 스파크단백질 고생산 라인을 선발하고 자 C-Myc 항체를 사용하여 dot blot를 실시하였다. 그 결과 세포주별로 다양한 수준으로 PEDV 스파크 단백질이 발현되었으나 비형질전환 담배 배양세포주의 경우 아무런 spot도 관찰되지 않았다. 형질전환 배양세포주의 특성분석을 위해 벡터별로 6개의 PEDV 스파크단백질 고생산 세포주를 선발하였다. 즉, 35S::SP1-M 세포주의 경우는 2, 3, 9, 44, 45 및 46번을, 35S::SP2-M 세포주에서는 27, 57, 60, 63, 68 및 74번을, 35S::SP3-M 세포주는 36, 47, 52, 60, 61 및 62번을, 35S::SP4-M 세포주에서는 40,46,54,56,57 및 61번을 각각 선발하였다.</p> <p>Dot blot으로 PEDV 스파크 단백질 고생산 세포주를 각 벡터당 2 라인씩 선발하여 nptII 유전자를 탐침으로 이용하여 Southern blot 분석을 실시하였다. 그 결과 1-3 copy씩 외래 유전자가 도입되었음을 확인하였다. 이러한 결과로부터 도입유전자의 카피수와 유전자 발현 정도와는 직접적인 관련이 없음을 알 수 있었다.</p> <p>Dot blot 방법으로 선발된 6개씩의 고생산 세포주의 PEDV유전자 발현을 조사하기 위하여 northern blot 분석을 실시하였다. 고 결과 35S::SPl-M 세포주의 경우 3번과 9번 라인이, 35S::SP2-M 세포주의 경우 57번과 74번이, 35 S::SP3-M세포주는 52번, 61번, 35S::SP4M 세포주에서는 56번과 57번 라인에서 PEDV 스파크단백질 유전자가 강하게 발현하였다. 형질전환 담배 배양세포에서 PEDV 스파크 단백질 유전자의 발현은 RNA 수준과 단백진 수준에서 정확하게 일치하지 않았다. 즉, PEDV 스파크 단백질 유전자는 전사후 수준에서 조절됨을 알 수 있었다.</p>