Disc diffusion assay에 의한 항균활성: 사자발쑥 추출물에 대하 항균활성은 S. aureus, B subtilic과 같은 2종의 Gmm (+) 세균과 E. coli, P. aeruginosa와 같은 2종의 Gram (-) 세균으로 구성된 4종의 세균과 피부질환을 일으키는 대표적인 피부상재균인 P. ovale, P acnes를 포함한 총 6 종의 세균을 disc 확산법으로 실시한 결과는 Table 1 과 같이 나타갔다. 에틸아세테이트 분획은 현재 화징품에 사용되고 있는 방부제나 항진균제보다 뛰어난 천연방부제, 항진균제로서의 역할이 충분히 기대된다. 분리된 TLC 띠 성분을 확인하기 위하여 UV-visible 스펙트럼, HPLC에 의한 분리, LC/ESI-MS 등에 의한 분자량 등의 분광학적 데이터를 이용하였다. HPLC 및 LC/ESI-MS/MS를 이용한 사자발쑥 추출물의 플라보노이드 분석: UV-visible 스펙트럼을 이용하여 22 차 분리한 TLC 크로마토그램의 7개 peak에 대한 UV 스캔 결과, 7개 peak의 최대 흡수 파장 \( \left(\lambda_{\max }\right) \) 중에서 2 개의 peak(AP 1-1, AP 1-3)에서 플라보노이드 성분의 최대흡수 파장과 유사함을 보였다. 사자발쑥의 에틸아세테이트 분획에서 2 차 분리한 단일 성분인 AP 1-1과 AP 1-3의 성분 및 구조를 확인하기 위해서 LC/ESI-MS/MS를 통해 어떤 장치를 사용하여 쟀다.
<h2>피부상재균의 항균할성</h2> <p>Disc diffusion assay에 의한 항균활성: 사자발쑥 추출물에 대하 항균활성은 S. aureus, B subtilic과 같은 2종의 Gram (+) 세균과 E. coli, P. aeruginosa와 같은 2종의 Gram (\(-\)) 세균으로 구성된 4종의 세균과 피부질환을 일으키는 대표적인 피부상재균인 P. ovale, P. acnes를 포함한 총 6 종의 세균을 disc 확산법으로 실시한 결과는 Table 1 과 같이 나타났다. 사자발쑥 분획의 경우, Gram (\(+\)) 세균인 S. aureus, B. subtilis에서 높은 항균활성이 나타났고, 특히 에틸아세테이트 분획과 아글리콘 분획에서는 화장품에 방부제로 사용되고 있는 methyl paraben보다 높은 항균활성이 니타닜다. 반면에 Gram (\(-\)) 세균의 경우에 methyl paraben은 높은 항균 활성을 나타냈지만, 사자발쑥 분획의 경우에는 항균활성이 없는 것으로 나타났다. 이로써 사자발쑥 추출물의 분획은 \( \mathrm{Gram}(+) \) 세균에서만 높은 항균활성을 니타내는 것을 알았다. 또한, 비듬균인 P. ovale와 여드름균인 P. acnes의 항균 활성은 P. ovale의 경우는 전혀 항균활성이 없는 반면에, P. acnes에서는 강력한 항균활성을 보였다. 이를통해, 사자발쑥 추출물의 분획은 Gram (\(+\)) 세균에서만 항균활성을 나타내기 때문에 피부상재균 중에 Gram (\(+\)) 세균인 여드름균에 높은 항균활성을 나타났고, 효모균인 비듬균에서는 항균활성이 나타나지 않은 것으로 예상된다.</p> <p>사자발쑥 Ethyl acetate 분획물의 최소저해농도(MIC): Disc diffusion assay의 결과를 바탕으로 사자발쑥 추출물의 에틸아세테이트 분흭과 아글리콘에 높은 항균활성을 니타내었던 Gram (\(+\)) 세균인 S. aureus, B. subtilis 및 P. acnes 총 3 가지 균주를 바탕으로 최소저해농도를 측정하였다. Table 2 에 나타난 바와 같이, Gram (\(+\)) 세균에서 사지발쑥 추출물의 에틸아세테이트 분획의 최소저해농도는 모두 \( 625 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 로 나타났고, 아글리콘에서의 최소저해농도는 S. aureus \( (625 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \), B. subtilis \( (325 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \) 및 P. acnes \( (2,500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \) 을 나타났다. 반면, methyl paraben의 경우에는 S. aureus \( (1,250 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \), B. subtilis \( (2,500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \) 및 P. acnes \( (2,500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) )을 나타닜다. 따라서, 에틸아세테이트 분획은 아글리콘보다 뛰어난 항균활성을 니타냈다. 또한 비교물질인 methyl paraben과 비교 시, Gram (\(-\)) 세균의 경우는 비교물질로 사용된 methyl paraben보다 항균활성이 떨어지지만, Gram (\(+\)) 세균의 경우에서는 에틸아세테이트 분획이 methyl paraben 보다 항균활성이 약 2\(-\)3배 높게 나타났다. 그러므로 여드름균인 P. acnes 와 습진을 유발하는 S. aureus 등의 Gram (\(+\)) 세균의 피부 감염에 의한 예방으로 사용될 수 있을 것이다. 또한 현재 화징품에 사용되고 있는 방부제나 항진균제보다 뛰어난 천연방부제, 항진균제로서의 역할이 충분히 기대된다.</p> <h3>TLC 및 HPLC 분석를 이용한 사자발쑥 추출물의 eupatilin 및 jaceosidin 확인</h3> <p>사자발쑥 추출물의 TLC 분석: 사자발쑥 추출물의 TLC 크로마토그램은 Fig. 6에 니타냈다. \( 50 \% \) 에탄올로 추출한 사자발쑥 추출물의 에틸아세테이트 분흭으로 8 개의 때(AP\(-\)1, AP\(-\)2, AP\(-\)3, AP\(-\)4, AP\(-\)5, AP\(-\)6, AP\(-\)7, AP\(-\)8) 로 분리됨을 나타났다. 그 중 AP\(-\)1 \( (\mathrm{R}_{\mathrm{f}} ~0.92) \), AP\(-\)3 \( (\mathrm{R}_{\mathrm{f}} ~0.81) \), AP\(-\)4 \( (\mathrm{R}_{\mathrm{f}} ~0.73) \), AP\(-\)5 \( (\mathrm{R}_{\mathrm{f}} ~0.49) \) 는 자외선 흡수 및 NP\(-\)PEG 발색법으로 확인한 결과 추출물 중 주요 성분임을 확인할 수 있었다. 이 4 개의 띠를 TLC 크로마토그램에서 각각 긁어서 추출 여과하고 여액을 감압◦건조시켜 얻은 띠들의 파우더를 성분 분석에 사용하였다. 분리된 TLC 띠 성분 확인에는 자외선 흡수 및 NP\(-\)PEG 발색법, UV\(-\)visible 스펙트럼, HPLC에 의한 분리 및 확인 등의 분광학적 데이터를 이용하였다. TLC 크로마토그램에서 분리된 띠들을 HPLC를 통해서 분석한 결과, 여러 성분이 혼합된 peak를 니타냈으며, 그 중에 Ryu 등에 제시되었던 eupatilin과 jaceosidin의 peak이 AP\(-\)1에서 나타났으며 나머지 두 가지 띠에 대해서는 밝혀지지 않았다. eupatilin과 jaceosidin 단일성분으로 분리하기 위해서 1 차 분리한 성분 중 AP-1 \( (\mathrm{R}_{\mathrm{f}} ~0.92) \) 띠를 다시 2 차 분리를 하여 7개의 띠(AP\(-\)1\(-\)1, AP\(-\)1\(-\)2, AP\(-\)1\(-\)3, AP\(-\)1\(-\)4, AP\(-\)1\(-\)5, AP\(-\)1\(-\)6, AP\(-\)1\(-\)7)로 분리되었고 확인하였다(Fig. 6). 이 분리된 TLC 띠 성분을 확인하기 위하여 UV\(-\)visible 스펙트럼, HPLC에 의한 분리, LC/ESI-MS 등에 의한 분자량 등의 분광학적 데이터를 이용하였다.</p> <p>HPLC 및 LC/ESI-MS/MS를 이용한 사자발쑥 추출물의 플라보노이드 분석: UV\(-\)visible 스펙트럼을 이용하여 22 차 분리한 TLC 크로마토그램의 7개 peak에 대한 UV 스캔 결과, 7개 peak의 최대 흡수 파장 \( \left(\lambda_{\max }\right) \) 중에서 2 개의 peak(AP 1\(-\)1, AP 1\(-\)3)에서 플라보노이드 성분의 최대흡수 파장과 유사함을 보였다. AP 1\(-\)1의 경우는 \( 246, 273, 342 \mathrm{~nm} \) 를 니타냈으며, AP 1\(-\)3의 경우는 \( 237, 272, 346 \mathrm{~nm} \) 를 나타내었다(Fig. 7).</p> <p>사자발쑥 추출물의 에틸아세테이트 분획을 위에 제시된 조건으로 HPLC를 실시하였다. \( \lambda=340 \mathrm{~nm} \) 에서 HPLC는 5 개의 분리된 peak이 나타났으며, 각각의 peak은 Fig. 6 에 나타난 2차 분리를 한 TLC 크로마토그램에서 분리된 따를 긁어서 \( 50 \% \) 에탄올로 추출◦여과하여 용매를 감압◦건조시킨 후 얻은 파우더를 에탄올 용액으로 녹여 HPLC로 분석하여 확인하였다. 그 결과, TLC를 통해 분리된 7개의 peak이 단일물질임을 HPLC를 통해서 확인하였으며 Ryu 등이 기술한 바와 같이 Fig. 6의 TLC AP 1\(-\)1 \( \left(\mathrm{R}_{\mathrm{f}} 0.91\right) \) 는 eupatilin (17.42 min)의 peak과 일치하였고, TLC AP 1\(-\)3 \( \left(\mathrm{R}_{\mathrm{f}} 0.78\right) \) 는 jaceosidin(14.72 min)과 일치함을 확인하였다(data not shown).</p> <p>사자발쑥의 에틸아세테이트 분획에서 2 차 분리한 단일 성분인 AP 1\(-\)1과 AP 1\(-\)3의 성분 및 구조를 확인하기 위하여 LC/ESI\(-\)MS/MS를 통해 측정하였다. 그 결과, AP 1\(-\)1은 negative ion mode에서 분자 이온 \( [\mathrm{M}-\mathrm{H}]^{-} \)는 \( \mathrm{m} / \mathrm{z} \) 343.3에서 나타났으며, LC/ESI-MS/MS에서는 분자이온에서 \( -\mathrm{CH}_{3} -\)단위의 소실에 의한 결과로 ion peak는 \( (\mathrm{m} / \mathrm{z}~ 343.1 \rightarrow \mathrm{m} / \mathrm{z} ~328.2) \)로 나타닜다(Fig. 8). 이는 Ryu 등 이 보고한 논문에서 확인할 수 있으며 사자발쑥 추출물의 에틸아세테이트 분획의 성분 중에 TLC 상의 AP 1-1는 eupatilin으로 확인하였다. 또한, AP 1-3의 경우에는 negative ion mode에서 분자 이온 \( [\mathrm{M}-\mathrm{H}]^{-} \)는 \( \mathrm{m} / \mathrm{z} ~329.3\) 에서 나타났으며, LC/ESI-MS/MS 에서 분자이온에서 \( -\mathrm{CH}_{3} \)-단위의 소실에 의한 결과로 ion peak \( (\mathrm{m} / \mathrm{z} ~329.1 \rightarrow \mathrm{m} / \mathrm{z} ~314.2 ) \)가 나타났다(Fig. 9). 이는 Ryu 등이 UV \( \lambda_{\max } \), HPLC, LC/ESI\(-\)MS/MS에 의해 가술된 바와도 일치하며, 사자발쑥 추출물의 에틸아세테이트 분획의 성분 중에 jaceosidin이 있음을 획인하였다.</p>