사람 유래 G-CSF cDNA를 누에 유래 prophenoloxidase activating enzyme의 endoplasmic signal sequence DNA 부분으로 치환하고 융합하였다. 이를 zeocin selection marker가 포함된 pIZTv5/His 벡터에 삽입하여 안정적인 세포주를 만들었으며, 이를 위해 누에 유래 Bm5 세포를 서열한 여러 성분을 함유한 배지에서 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다. 이때 Bm5-12, Bm5-D1, Bm5-D2, Bm5-D3 세포는 세포 수가 \( 4 \times 10^{6} \mathrm{~cells/ml} \)가 되도록 한 상태에서 동일한 조건으로 배양하였다.
<h1>Materials and Methods</h1> <h2>세포배양 및 형질전환</h2> <p>누에 유래 Bm5 세포는 \( 5\% \) fetal calf serum (Gibco)과 penicillin, streptomycin, and amphotericin B (Gibco Anti-Anti, Invitrogen Corporation)을 함유한 GRACE 배지 (Welgene)를 사용하여 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다. Bm5세포는 \( 25 \mathrm{~cm}^{2} \) tissue culture plate 당 \( 2 \times 10^{6} \) 세포를 분주하여 하루 배양한 뒤 형질전환 하였다. 각 벡터는 FuGENEⓇ HD Transfection Reagent (Roche)를 사용하여 Bm5 세포를 형질전환 하였다. 형질전환 \( 24 \mathrm{hr} \) 후에 배지는 새 것으로 교환하였다.</p> <h2>Wild type 및 돌연변이 G-CSF 발현 벡터 제작</h2> <p>사람 유래 G-CSF cDNA는 누에 유래 prophenoloxidase activating enzyme (PPAE)의 endoplasmic signal sequence에 해당하는 DNA 부분과 치환 및 융합하여 제작하였다. Two-step PCR 방법으로 제작된 누에의 endoplasmic signal sequence를 가진 G-CSF를 ppaeG-CSF라고 명명하였다. ppaeG-CSF를 주형으로 하고 GeneArtⓇ Site-Directed Mutagenesis kit (Invitrogen, USA)를 사용하여 site-directed mutagenesis 방법으로 성숙한 G-CSF 단백질의 N-말단에 glycine-proline-alanine 세 아미노산이 결여된 돌연변이(ppaeG-CSFd1)를 생산하였다. Primer는 JAd1 (GTTGCAACCCCCCTGAGCTCCCTGCCCCA)와 JB21 (CAGGGGGGTTGCAACACTTTTGGT)를 사용하였다. Alanine-serine-serine 결여 돌연변이와 serine-leucine-proline 결여 돌연변이는 ppaeG-CSFd1과는 달리 합성 DNA를 사용하였다(Bioneer, 대전). 즉, 각 세아미노산의 codon이 결여된 전체 ppaeG-CSF DNA의 양쪽에 제한효소 SacI과 AgeI 인식 DNA를 5'과 3'에 연결하여 합성한 후 SacI과 AgeI으로 절단하여 곤충발현 벡터인 pIZTv5/His 벡터에 삽입하여 각 돌연변이 유전자 발현 벡터를 구축하였다 (ppaeG-CSFd2와 ppaeG-CSFd3). 각 세 종류의 돌연변이 G-CSF 유전자는 DNA sequence를 확인하여 다른 돌연변이가 없음을 확인하였다.</p> <h2>Stable Cell line 구축</h2> <p>Wild type 및 돌연변이 G-CSF가 삽입된 pIZTv5/His 벡터에는 zeocin selection marker가 존재하여 이를 이용하여 stable cell line을 구축하였다. 각각의 발현 벡터를 Bm5 세포에 전술한 방법으로 형질전환하고, \( 400 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도의 zeocin을 첨가하여 형질전환 된 세포만을 유지 및 선별하였다. 형질전환 된 세포만을 획득한 후에는 zeocine의 농도를 \( 100 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)로 낮추어 stable cell line 배양하며 유지하였다. 획득한 각 stable cell line을 Bm5-12, Bm5-D1, Bm5-D2, and Bm5-D3라고 명명하고 액체질소에 보관하였다.</p> <h2>G-CSF 단백질 합성 분석</h2> <p>Bm5-12, Bm5-D1, Bm5-D2과 Bm5-D3 세포를 세포 수가 \( 4 \times 10^{6} \mathrm{~cells/ml} \)로 되게 하여 동일한 조건에서 배양하였다. 4일 동안 배양한 후 \( 2 \mathrm{~ml} \) 배지를 회수하여 배지로 분비된 G-CSF 양을 비교하였다. \( 2 \mathrm{~ml} \) 배지는 \( 0.2 \mathrm{~ml} ~10 \times \) binding buffer \( (100 \mathrm{~mM} \) sodium phosphate buffer, \( 500 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaCl} \), \( 100 \mathrm{~mM} \) imidazole, \( \mathrm{pH} ~7.4) \)와 섞은 후 \( 60 ~\mu \) \( 150 \% \) nickel sepharose beads (Pharmacia)를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 한 시간 동안 G-CSF 단백질을 결합시켰다. \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), \( 3,000 \mathrm{~rpm} \)에서 원심분리하여 nickel sepharose beads를 회수하고, \( 1 \times \) binding buffer로 3회 세척을 한 후 \( 30 ~\mu l \) SDS-PAGE loading buffer를 첨가하였다. \( 12 \% \) polyacrylamide gel을 사용하여 전기영동한 후 PROTRAN nitrocellulose membrane (Whatman)으로 단백질을 전이시켰다. Membrane은 gelatin wash buffer \( (0.1 \% \) gelatin, \( 15 \mathrm{~mM} \) Tris-HCl, \( \mathrm{pH} ~7.5 \), \( 2 \mathrm{~mM} \) EDTA, and \( 0.1 \% \) Tritonx-100)로 block을 하였고, anti-his 항체(Cell Signaling, \( 1:500 \) dilution)와 peroxidase-labeled goat anti-rabbit IgG (Sigma A0545, \( 1:1,000 \) dilution)를 사용하여 ECL로서 G-CSF의 존재 여부와 상대적인 생산량을 비교하였다. 각 밴드는 Image analyzer (Alpha Innotech FluorChem FC2 MultiImage II)를 사용 하여 얻었다.</p>