whole feather의 분해정도가 큰 실험구로부터 일정량의 배양액을 채취하여 배양하면서 균체 생육속도가 빠르고 직경이 큰 투명환을 생성하는 콜로니들을 일차적으로 우모 분해미생물로 선정하였다. 분리균주의 형태학적, 배양적 및 생화학적 특성을 Manual of methods for general bacteriology 및 Biochemical tests for identification of medical bacteria에 준하여 검토하고 동정하였다. Genomic DNA의 분리는 Ausubel 등의 방법에 준하여 추출하였다. Genomic DNA의 분리는 Ausubel 등의 방법에 준하여 추출하였는데 분리균주를 Luria-Bertani broth에서 20시간 동안 배양한 후, cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB) 방법을 이용하였다. 분리균주에 의한 chicken feather의 분해정도는 우모의 건조무게 감소량을 축정함으로서 정량하였다. Protease 활성 측정을 위하여 배양액을 원심 분리하고 그 상등액을 조효소액으로 사용하였다.
<h1>재료 밎 방법</h1> <h2>우모 분해미생물의 분리 및 배지</h2> <p>경남 일원의 닭 가공공장과 대규모 양계장 주변의 토양, 양계분뇨 및 분뇨 속에 떨어진 우모 그리고 퇴비화 중인 볏짚 등으로부터 일정량의 시료를 채취하였다. 시료 각 \( 1 \mathrm{~g} \)씩을 native whole chicken feather (약 \( 0.1 \mathrm{~g} \))가 첨가된 무기염 배지에 각각 접종한 후, \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rpm} \)에서 회전진탕배양하였다. 정기적으로 whole feather의 분해유무를 육안으로 관찰한 후, 분해정도가 큰 실험구로부터 일정량의 배양액을 채취하여 skim milk agar plate에 접종 및 배양하면서 균체 생육속도가 빠르고, 직경이 큰 투명환을 생성하는 콜로니들을 일차적으로 우모 분해미생물로 선정하였다. 선정균주들을 각각 native whole chicken feather가 첨가된 무기염 배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rpm}\), 5일간 회전진탕배양하였다. 원심분리에 의하여 균체를 제거한 배양 상등액의 protease 활성을 측정한 후, 활성이 가장 높은 균주를 실험균주로 최종 선정하였다. 이때 사용한 무기염 배지의 조성은 \( \mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl~} 0.05 \% \), \( \mathrm{NaCI~} 0.05 \%, \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 0.01 \%, \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} 0.02 \%, \mathrm{MgCl}_{2} 0.01 \% \) 및 yeast extract \( 0.01 \% \) (\(\mathrm{pH} 7.5\))이었으며, 케라틴 공급원으로 native whole feather를 첨가하였다. Skim milk agar plate의 조성은 tryptone \( 1 \% \), yeast extract \( 0.5 \% \), skim milk \( 5 \%, \mathrm{NaCl} \mathrm{0.5 \%} \) 및 agar \( 2 \%(\mathrm{pH} 7.5) \)이었다.</p> <h2>분리균주의 일차 동정</h2> <p>분리균주의 형태학적, 배양적 및 생화학적 특성을 Manual of methods for general bacteriology 및 Biochemical tests for identification of medical bacteria에 준하여 검토하였으며, 도출된 결과를 Bergey's manual of determinative bacteriology 및 Cowan and Steel's Manual for the identification of medical bacteria를 참조하여 동정하였다. 또한 Biolog사의 MicroLog \( { }^{\mathrm{TM}} \) system (USA)을 이용하여 분리균주를 4시간 및 24시간 동안 배양한 후, 발색반응을 측정하였다. 측정 결과를 MicroLog \( { }^{\mathrm{TM}} \) release 4.0 software를 이용하여 95개 탄소원 이용 패턴에 따라 균주를 동정하였다.</p> <h2>DNA 추출 및 16S rDNA의 PCR 증폭</h2> <p>Genomic DNA의 분리는 Ausubel 등의 방법에 준하여 추출하였다. 즉, 분리균주를 Luria-Bertani broth에서 20시간 동안 배양한 후, cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB) 방법을 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 주형으로 polymerase chain reaction (PCR)을 수행하였다. PCR을 위해서 Bioneer사의 AccuPower \( { }^{\circledR} \) PCR PreMix tube에 DNA 주형 \( 1 \mu \mathrm{L} \) (약 \( 40 \mathrm{ng}) \), 각각 \( 1 \mu \mathrm{L} \) 의 primers, \(17\mu l \) 의 멸균된 3차 증류수를 첨가하여 잘 섞었다. PCR은 initial denaturation \( 94^{\circ} \mathrm{C}\), 3분; denaturation \( 94^{\circ} \mathrm{C} \), 1분; annealing \( 55^{\circ} \mathrm{C}\), 1분; extension \( 72^{\circ} \mathrm{C}\), 3분의 조건으로 30 cycle을 실시한 후, final extension을 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 유지하여 증폭을 종결하였다. 16S rDNA를 증폭하기 위하여 사용된 primers는 E.coli 16S rDNA 부분의 conserved sequence를 기초로 하여 합성된 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') primer와 1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3') primer이었다.</p> <p>16S rDNA의 PCR 증폭산물의 정제는 \( 1 \% \) agarose gel에 PCR 증폭산물을 \( 100 \mathrm{~V} \) 의 전압으로 25분 동안 전기영동한 후, EtBr로 염색하이 원하는 band를 잘라 Qiagen PCR pu-rification kit (Qiagen)를 이용하여 정제하였다.</p> <h2>16S rDNA 염기서열 분석 및 계통분류</h2> <p>정제된 PCR 증폭산물의 염기서열 결정은ABI 377기종의 auto-sequencer를 사용하여 dye terminator sequencing method로 protocol에 따라 실시하였다. 염기서열 분석을 통하여 얻어진 분리주주의 부분 염기서열은 Blast network service를 이용하여 GenBank, EMBL, DDBJ에 등록된 다른 세균의 염기서열과 비교함으로써 계통분류학적 유연관계를 분석하였다. 각 염끼서열의 alignment는 Clustal X (version 1.81) program package 를 이용하여 정렬하였고, Neigh-bor-joining method에 의거하여 각 세균들의 계통분류학적 위치를 결정하였다.</p> <h2>분석방법</h2> <p>분리균주에 의한 chicken feather의 분해정도는 우모의 건조무게 감소량을 축정함으로서 정량하였다. Protease 활성 측정을 위하여 배양액을 \( 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 15분 동안 원심 분리한 후, 그 상등액을 조효소액으로 사용하였다. 효소 활성 측정을 위하여 \( 0.5 \% \) Hammersten casein 기질용액(0.1 M 인산완충용액, \( \mathrm{pH} 7.5 \) ) \( 450 \mu \mathrm{L} \) 에 적당하게 희석된 조효소액 50 \( \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액에 \( 10 \% \) trichloroacetic acid 용액 \( 250 \mu \mathrm{L} \) 를 첨가하여 반응을 종료시키고, 30분 동안 정치한 후, \( 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였으며, 상등액의 흡광도를 \(280 \mathrm{nm} \)에서 측정하였다. 효소의 1 unit는 상기 조건에서 1분당 흡광도 0.01을 증가시키는데 필요한 효소양으로 하였다.</p>