1차 순수 분리된 colony중에서 갈변 반응을 일으키는 균주를 선별하여 chitinase 활성 및 항산화력 측정을 위한 균주로 사용하여 DNA 추출하였다. 추출한 16S rDNA를 증폭하여 염기서열을 분석하여 균주의 최적 생육조건을 조사하였다. 조효소액을 조제하고 Chitinase 활성 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>Chitinase 생산균주의 분리</h2> <p>전통발효식품으로부터 chitinase를 생산하는 균주를 분리하기 위하여 간장과 된장을 시료로 사용하였다. 생리식염수에 적당히 희석한 시료를 분리용 고체배지(LB medium \( +1 \% \) colloidal chintin)에 plating한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2~3일간 배양한 다음 colloidal chitin을 분해하여 clear zone을 형성하는 colony를 순수 분리하였다. 1차 순수 분리된 colony중에서 갈변 반응을 일으키는 균주를 선별하여 chitinase 활성 및 항산화력 측정을 위한 균주로 사용하였다. Colloidal chitin은 Roberts와 Selitrennikoff의 방법에 따라 조제하였다.</p> <h2>DNA 추출</h2> <p>분리된 균주로부터 chromosomal DNA 분리는 G-spin \( { }^{\mathrm{TM}} \) genomic DNA extraction kit (iNtRON Biotechnol.)를 사용하여 분리하였으며 분리된 genomic DNA는 16 S rDNA cloning을 위한 template로 사용하였다.</p> <h2>16S rDNA 증폭 및 염기서열 분석</h2> <p>Bacillus 속 균종의 분류가 가능한 부위 2곳을 대장균 염기서열 기준 forward primer로 5'-GAGTTTGATCCTGGCTCA-3'(대장균 기준 9 27 bp), reverse primer로 5'-AGGAAAG-GAGGTGATCCAGCC-3'(대장균 기준 1542 1525 bp)를 사용하여 16 S rDNA 절편을 증폭하였다. PCR 반응은 5U의 Taq polymerase, \( 10 \mathrm{mM} \) dNTP, \( 10 \mathrm{mM} \) Tris-HCl(pH 8.3), \( 1.5 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl} 2_{2} \) 를 포함하는 PCR혼합물을 이용하였다. PCR은 first denature \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 로 5분, 30 cycle 로 denaturation \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 60 초, annealing \( 55^{\circ} \mathrm{C}\) 45초, extension \( 72^{\circ} \mathrm{C}\) 5분으로 수행하였다(Model 9600 thermocycler, PE Applied Biosystems,Warrington, United Kingdom). 증폭된 PCR 산물은 \( 0.6 \% \) agarose gel에 전기영동한 후 DNA 단편을 회수하여 pGEM-T easy vector (Promega 사)에 cloning하여 DNA 염기서열 분석에 사용하였다. 염기서열분석은 자동염기서열 분석장치 Applied Biosystems 373A (PE Applied Biosystems)를 이용하여 분석하였다. 결정된 16S rDNA의 염기서열은 Genebank 의 Blast program을 이용하여 이미 Genebank에 등록된 16 S rDNA 염기서열과의 상동성을 비교하여 균주를 동정하였다.</p> <h2>균주의 생육조건 조사</h2> <p>균주의 최적 생육조건을 조사하기 위하여 배양온도, pH 및 염 농도에 대한 균주의 성장률을 \( 420 \mathrm{~nm} \) 에서 spectrophotometer로 측정하였다.</p> <h2>조효소액의 조제 및 Chitinase 할성 측정</h2> <p>Chitinase 활성 측정을 위해서 효소생산배지 \( 1 \% \) colloidalchtin, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 0.5 \% \) peptone, \( 0.2 \% \) beef extract, \( 0.1 \% \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}, 0.1 \% \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 0.05 \% \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7_{2} mathrm{O} \) )에서 \( 37{ }^{\circ} \mathrm{C} \), \( 200 \mathrm{rpm}\), 48시간동안 진탕배양한 후에 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심분리하여 상등액을 조효소액으로 사용하였다. 효소반응은 colloidal chitin \((1\%)\)을 \( 100 \mathrm{mM} \) phosphate buffer(pH 7.0)에 현탁한 다음 조효소액 \( 1 \mathrm{ml} \) 을 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간동안 \( 150 \mathrm{rpm} \) 으로 진탕하면서 효소반응을 시켰다. 반응이 끝난 다음 5 분간 boiling하여 반응을 정시시킨 후 남아있는 colloidal chitin을 제거하기 위하여 원심분리(\( 12,000\mathrm{rpm}, 10 \mathrm{~min} \) )를 하였다. 효소의 활성은 DNS (dinitrosalicylic acid)법으로 유리된 환원당을 정량하였다. 효소 1 unit는 1 시간 동안 \( 1 \mu \mathrm{M} \) 의 N-acetyl-D-glucosamine을 생산하는 효소의 양으로 정하였다. 단백질 정량은 Bradford의 방법에 따라 측정하였으며, 이때 표준단백질로 bovine serum albumin 을 사용하였으며 \( 595 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p>