추출물의 전자공여능 측정은 DPPH에 대한 수소공여 효과로 측정하였으며, 이때, ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정을 수행하였다. 다음으로 SOD 유사활성 측정의 경우 추출물에서 과산화수소로 전환시키는 반응을 촉매 하는 pyrogallol의 생성량을 측정해 이뤄졌다. 마지막으로 NO assay 및 cell viability 측정은 각각 상등액에 축적되는 nitrite 양과 MTT assay에 의해 측정되었다.
<h2>전자공여능(Electron donation ability: EDA) 측정</h2><p>전자공여능 측정은 Blois의 방법에 따라 in vitro에서 각 추출물의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)에 대한 수소공여 효과로 측정하였다. 해조류 \( 1 \mathrm{~g} \)당 에탄올 \( 10 \mathrm{ml} \)의 비율로 추출한 시료를 DMSO에 녹여 각각 4, 20, 40 \( \mu \mathrm{l} \)와 \( 1.5 \times 10^{-4} \mathrm{M} \) DPPH용액 \( 160 \mu \mathrm{l} \)을 섞은 다음, 최종 volume이 \( 200 \mu \mathrm{l} \)이 되도록 증류수를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분 동안 반응시킨 다음 ELISA reader를 이용하여 \( 520 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능(Electron donation ability: EDA)은 EDA(\(\%\)) \(=\)대조구 흡광도\(-\)시료 첨가구 흡광도 \( / \) 대조구 흡광도\( \times 100\)으로 계산하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조그룹과 흡광도차를 비교하여 프리라디칼의 제거활성을 백분율로 계산하였다.</p><h2>SOD 유사활성(Superoxide dismutase-like activity: SODA) 측정</h2><p>추출물의 SOD 유사활성은 Marklund와 Marklund의 방법에 따라 과산화수소 \( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \)로 전환시키는 반응을 촉매 하는 pyrogallol의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성으로 나타내었다. 각 추출시료를 DMSO에 녹여 농도별로 희석하여, 시료 1, 5, \( 10 \mu \mathrm{l} \)에 Tris-\(\mathrm{HCl}\) buffer (\(50 \mathrm{mM} \) Tris [hydroxymethyl] aminomethane, \( 10 \mathrm{mM} \) EDTA, \( \mathrm{pH} 8.5\)) \( 150 \mu \ \mathrm{l} \) 와 \( 7.2 \mathrm{mM} \) pyrogallol을 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 첨가한 다음, 최종 volume \( 200 \mu \mathrm{l} \)이 되도록 증류수를 첨가하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응한 후 \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{~HCl} \) \( 50 \mu \mathrm{l} \)을 가하여 반응을 정지시켰다. 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양은 ELISA reader (VersaMax, Molecular Devices, USA)를 이용하여 \( 420 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. SOD 유사활성은 추출물 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도의 차이를 백분율 \( (\%) \)로 나타내었다. SODA \( (\%)=(1-\mathrm{A} / \mathrm{B}) \times 100 \), \(\mathrm{A}=\)추출물 첨가구의 흡광도, \(\mathrm{B}=\)추출물 무첨가구의 흡광도.</p><h2>NO assay 및 cell viability 측정</h2><p>NO의 생성은 비색법으로 세포 상등액에 축적되는 nitrite 양을 측정하였다. 대식세포를 24-well plate에 \( 5 \times 10^{5} \) \( \mathrm{cells} / \mathrm{well} \)의 세포가 되도록 재부유하여, 최종농도가 \( 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)가 되도록 추출물을 처리한 다음, \( 1 \mathrm{hr} \) 후에 LPS의 자극 하에 24시간 배양하고 그 배양 상등액 내의 \( \mathrm{NO} \)를 Griess 시약과 반응시켜 측정하였다. \( 100 \mu \mathrm{l} \)의 세포배양 상등액을 취하여 동량의 Griess 시약[\( 1 \% \) sulfanilamide ( \( 30 \% \) acetic acid)와 \( 0.1 \%\) N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride \( (60 \% \) acetic acid) 혼합액)]을 가하여 상온에서 20분간 반응시켰다. \( \mathrm{NO} \)의 활성정도는 ELISA reader (VersaMax, Molecular Devices, USA)를 사용하여 \( 800 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 범위에서 \( 540 \mathrm{~nm} \) 흡광도를 측정하였다.</p><p>세포활성은 MTT assay에 의하여 측정하였다. 24-well microtiter plate (Nunc, Vangaard, Neptune, NJ)에 RAW \( 264.7 \) macrophage를 \( 5 \times 10^{5} \) \( \mathrm{cells} / \mathrm{well} \)의 농도로 분주하였다. 분주 24시간 후, 추출물의 최종농도가 \( 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)가 되도록 각 추출물이 함유되어 있는 배지를 \( 100 \mu \mathrm{l} \)씩 넣어 48시간 동안 배양하였다. Plate에 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT, Sigma M2128)] \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)용액을 \( 20 \mu \mathrm{l} \)씩 첨가하여 4시간 동안 배양시키고 formazan을 형성시킨 후 조심스럽게 상등액을 제거하였다. DMSO \( 150 \mu \mathrm{l}\)를 첨가하여 formazan을 녹인 후 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>