본 논문에서 P. carageenovora 유래의 arylsulfatase 유전자를 표면 발현 vector인 pCTcon에 subcloning하여 pCTAST 구축하고, 구축된 plasid를 E. coli DH5에 형질전환하여 증폭, 추출하였다. 이후 LiCl 법을 통해 S. cerevisiae EBY100에 형질전환시켜 1차 선별하였다. 1차 선별된 균주들에 대해 MUFS가 함유된 YPDG 고체배지 상에서 arylsulfatase의 활성을 확인하였다. 면역항체 염색한 균체의 형광 분석을 한 결과, EBY100/pCTAST는 뚜렷한 형광을 나타내며 표층발현이 확인되었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>재조합 plasmid 구축 및 효모형질전환체 선별</h2> <p>P. carrageenovora 유래의 arylsulfatase 유전자(astA)를galactose로 유도되는 표면발현 vector인 pCTcon(GAL1 promoter)에 subcloning하여 pCTAST(7.1kb)를 구축하였다. 구축된 plasmid는 우선 E. coli DH5에 형질전환하여 증폭, 추출한 후 \( \mathrm{LiCl} \) 법을 사용하여 S. cerevisiae EBY100에 형질전환시켜 uracil 결핍 최소배지(SD)에서 1차 선별하였다. 1차 선별된 균주는 \( 50 \mathrm{mM} \) 의 4-methylumbelliferyl sulfate(MUFS)가 함유된 YPDG 고체배지 상에서 arylsulfatase의 활성을 확인하였다. 확인 결과 host에서는 형광을 띄지 않는 반면, EBY100/pCTAST는 기질인 MUFS의 sulfate를 가수분해하여 형광을 띄는 4-methylumbelliferone을 생산하였다. 이는 형질전환체 EBY100/pCTAST 가 desulfatase 활성을 보임을 의미하였고, 이는 효모에서 P. carageenovora arylsulfatase가 활성형으로 생산됨을 시사하였다.</p> <h2>Immunofluorescence Microscopy</h2> <p>면역항체 염색한 균체의 형광 분석은 confocal laser scanning microscope(Carl Zeiss, LSM 510 META, Germany)를 이용하였다. Anti-c-myc(1차항체)와 FITC(2차항체)로 labeling 후 Immunofluorescence microscopy로 관찰한 결과, EBY100/pCTAST는 뚜렷한 형광을 나타낸 반면, EBY100(control)은 그렇지 않았다. 이러한 결과를 통하여 표층발현유무를 확인하였다.</p> <h2>균체증식 및 arylsulfatase의 발현</h2> <p>재조합 균주 S. cerevisiae EBY100/pCTAST를 YPDG 배지(1% yeast extract, 2% polypeptone, 1% dextrose, 1% galactose)에서 flask 배양하여 균체증식과 arylsulfatase 발현 양상을 조사하였다. 그 결과 배양 30 시간까지 균체증식은 활발하였으며, galactose가 완전히 소모되어지는 배양 42 시간에 정지기에 들어갔다. Arylsulfatase 활성은 galactose가 소모되는 배양 6시간부터 증가하기 시작하여 galactose가 완전히 소모된 직후인 배양 48 시간째에 최대 활성에 도달하였다. 또한 plasmid 안정성은 배양말기에서도 90% 이상 안정하게 유지되었다. Arylsulfatase의 최대 활성은 \( 1.2 \mathrm{unit} / \mathrm{mL} \)로 나타났으며, 배양 상등액에서는 활성이 나타나지 않았다. 이러한 결과를 통하여 발현된 arylsulfatase는 대부분 효모 표면발현됨을 확인할 수 있었다.</p> <p>Arylsulfatase를 진핵세포인 효모 S. cerevisiae의 세포표면에 발현하는 전세포 생물촉매(whole cell biocatalyst) 시스템의 경우 다양한 장점을 가지고 있기 때문에 그 이용성이 매우 다양하다 . 이러한 단백질의 효모 표면발현 시스템은 전통적 전세포 촉매제의 사용에서 기질과 생산물의 세포막 수송의 장벽을 제거하기 위하여 사용해야 했던 세포투과공정이 필요 없고, 이에 의하여 야기되었던 효소의 불활성화를 방지할 수 있을 뿐만 아니라 전세포 촉매제의 경우 cytoplasm 내에서 반응하므로 발생되었던 경쟁적 부반응에 의한 생산성 저하의 문제를 피할 수 있다. 또한 세포외에서의 반응으로 반응물과 생산물의 세포막 통과의 물질수송 문제를 피할 수 있으며 세포표면에 고정으로 반응 후 반응액으로부터 사용한 생체촉매제의 재사용이 가능하다.</p> <h2>탈황 조건에 따른 agarose 제조 및 DNA 전기영동</h2> <p>효모 S. cerevisiae의 세포표면에서 발현된 재조합 arylsul-fatase 효소를 이용하여 저렴한 agar로부터 고순도 친환경적인 agarose 생산에 적용 가능성을 확인하기 위하여 재조합 arylsulfatase로 제조된 agarose를 agar와 시판용 agarose와 함께 \( \lambda \mathrm{DNA} \) HindIII marker를 사용하여 DNA 전기영동 성능을 비교 실험하였다. 실험 결과 agar와 비교하여 효모 S. cerevisiae의 세포표면에서 발현된 재조합 arylsulfatase 처리로 제조한 agarose가 이동성이나 분리능에서 우수하였다. 또한 재조합 arylsulfatase 처리로 제조한 agarose는 시판용 agarose와 비교하였을 때 이동성이나 분리능이 유사한 결과를 확인할 수 있었다. 최근 연구 결과에 따르면  E. coli에서 과발현 - 생산된 재조합 arylsulfatase 효소로 제조된 agarose의 경우 품질을 평가한 결과 황산기 함량은 0.94% 에서 0.3% 정도로 감소하였고, gel 강도도 \( 250 \mathrm{~g} / \mathrm{cm}^{2} \)에서 \( 800 \mathrm{~g} / \mathrm{cm}^{2} \) 로 상업적 agarose의 강도 수치 ( \( 900 \sim 1,000 \) \( \mathrm{g} / \mathrm{cm}^{2} \) )와 비슷한 결과를 보이는 것으로 보고된 바 있다. 뿐만 아니라 polyethlene glycol(PEG) 또는 cetylpyridium chloride(CPC) 를 이용한 다양한 agarose의 고순도 정제 방법들이 연구 -보고되었다. 본 연구에서 효모 세포표면에서 발현된 재조합 arylsulfatase 처리로 제조한 agarose 역시 황산기 함량과 gel 강도에 있어서 상업적 agarose와 비슷한 수치를 보일 것으로 예상이 된다. 이상의 결과를 바탕으로 본 연구에서 효모 S. cerevisiae의 세포표면에서 발현된 재조합 arylsulfatase는 한천으로부터 고순도. 친환경적인 agarose를 직접 생산하는 생물 생산 공정에 효율적으로 적용가능하며, 기존 agarose의 정제 공정에 비교하여 유기용매와 계면활성제의 사용을 획기적으로 감소시킴으로써 공정비용 절감에도 크게 기여할 수 있음을 확인하였다.</p>