cDNA 합성을 위한 total RNA는 TRI Reagent를 이용하여 칠면초 유식물로부터 추출하였rh, Semi-quantitative RT-PCR의 대조구로 사용하기 위하여 GenBank 데이터베이스로부터 나문재 및 해홍나물의 공통염기서열을 파악하였으며, 이를 토대로 cDNA를 합성하기 위해 5'-GATCTTGCTGGTCGTGATCT-3, 5'-CTCCAATCCAGACACTGTAT-3'을 각각 forward와 reverse primer로 제작하였으며, TAKARA EX Taq \( ^ \mathrm { TM } \) DNA 중합효소를 사용하여 칠면초 actin cDNA를 증폭한 후 완성된 plasmid를 대장균 \(DH5a \)에 도입, 항생제 screening을 거쳐 배양 후 plasmid를 추출하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물재료</h2> <p>본 실험에서는 명아주과 나문재속의 칠면초(Suaeda japon-ica Makino)를 사용하였다. Expansin cDNA 합성을 위한 RNA 분리용 식물 재료로는 전북 군산시 옥서면 선연리 염습지에서 채취한 평균 초장 \( 10 \mathrm { ~cm } \)인 칠면초 유식물을 사용하였으며, 발아 및 스트레스 처리 실험을 위한 재료로는 농어촌공사 김제지사에서 분양받은 칠면초 종자(2010년 채집)를 사용하였다.</p> <h2>\( \mathrm { NaCl } \) 농도 별 배양</h2> <p>칠면초 종자를 \( 70 \% \) 에탄올과 \( 2 \% \mathrm { NaOCl } \)로 표면 소독한 후 각각 \( 0, 1, 2, 5, 10, 20 \mathrm { ppt } \) (part per thousand)의 \( \mathrm { NaCl } \)을 함유한 1/2 MS 배지에서 2주간 발아 및 배양하여 염분농도별로 칠면초 유식물의 생장을 관찰하고 total RNA 분리에 사용하였다.</p> <h2>RNA 추출 및 Full-length cDNA 합성</h2> <p>cDNA 합성을 위한 total RNA는 TRI Reagent (Sigma, USA)를 이용하여 칠면초 유식물로부터 추출하였다. 칠면초 total RNA에서 expansin 유전자의 cDNA를 합성하기 위해 CapFishing full-length cDNA premix kit (Seegene, Korea)를 사용하였다. Expansin 유전자의 기관별 발현과 스트레스 조건에서의 발현양상 분석을 위해 필요한 1st strand cDNA는 PrimeScript \( ^ { TM } \) 1st strand cDNA synthesis kit (TAKARA, Japan)를 사용하여 합성하였다. cDNA 합성의 주형으로는 \(2 \mu \mathrm { g } \)의 total RNA를 사용하였으며, oligo dT primer를 사용하여 1st strand cDNA를 합성하였다. Expansin 유전자 cDNA의 PCR 증폭을 위하여 Rose et al. (1997)과 Kim et al. (2000)이 사용한 expansin의 보존적 공통염기서열을 분석하여 만든 de-generate primer \-GSNCAYGCNACNTTYTAYGGNG-3, 5'-YTGCCARTTYTGNCCCCARTT-3'을 각각 forward와 re-erse primer로 사용하였고, PCR 효소로는 TAKARA EX Taq \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) DNA 중합효소(TAKARA, Japan)를 사용하였다. 이 결과 확보한 partial cDNA를 토대로 full-length cDNA를 합성하기 위해 5' RACE PCR과 3' RACE PCR을 수행하였다. 5' RACE PCR에 사용한 주형은 CapFishing Full-length cDNA Premix kit를 이용해 합성한 cDNA를 사용하였다. Full-length cDNA를 합성하기 위한 다른 방법으로 5'-Full RACE Core set (TAKARA, Japan)을 이용한 inverse PCR을 수행하였다. Primer는 제조사의 제작방법을 이용하여 제작하였다.</p> <p>Semi-quantitative RT-PCR의 대조구(internal control)로 사용하기 위하여 GenBank 데이터베이스로부터 나문재 및 해홍나물의 actin 유전자의 염기서열을 확인하고 이들의 공통염기서열을 파악하였다. 공통염기서열을 토대로 칠면초 actin 유전자의 cDNA를 합성하기 위해 5'-GATCTTGCTGGTCGTGATCT-3, 5'-CTCCAATCCAGACACTGTAT-3'을 각각 forward와 reverse primer로 제작하였으며 TAKARA EX Taq \( ^ \mathrm { TM } \) DNA 중합효소를 사용하여 칠면초 actin cDNA를 증폭하였다.</p> <h2>cDNA 클로닝과 염기서열분석</h2> <p>PCR을 통하여 합성된 expansin 및 actin 유전자의 cDNA는 pGEM T-easy vector system (Promega, USA)을 이용하여plasmid에 삽입하였다. 완성된 plasmid를 열충격 방법으로 대장균 \(DH5a \)에 도입한 후, 항생제 screening을 거쳐 배양한 다음 Axyprep plamid miniprep kit (Axygen, USA)를 사용하여 plasmid를 추출하였다. 추출한 plasmid는 전기영동으로 분리하고 염기서열을 확인하였다.</p> <h2>Expansin 유전자의 발현양상 분석을 위한 semi-quantitative RT-PCR</h2> <p>칠면초의 expansin 유전자의 발현양상 분석을 위한 주형으로 PrimeScript \( ^ {\mathrm { TM } } \) 1st strand cDNA synthesis kit를 사용하여 합성한 cDNA를 사용하였으며, semi-quantitative RT-PCR 반응을 위하여 Table 2의 primer를 사용하였다. TAKARA EX Taq \( ^ \mathrm { TM } \)DNA 중합효소를 사용하여 \( 98 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 10초, \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 30초 그리고 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 30초의 25, 30 또는 35 cycle로 PCR을 수행하였다. 각 유전자의 발현량 비교에 적절한 PCR cycle 수는 반복 실험을 통하여 결정하였다.</p> <p>기관별 및 염분 농도별 expansin 유전자 발현양상 분석을 위한 semi- quantitative RT-PCR 에 동일한 양의 1st strand cDNA } 를 사용하였다는 것을 보여주기 위한 대조구 유전자로는 칠면초 actin 유전자 염기서열을 사용하였다.</p>