RAW \( 264.7 \) 세포를 분주하여 24시간 동안 배양한 뒤, LPS \( (1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \) 와 시료를 농도별로 동시 치리하여 24시간 동안 배양했다. RAW \( 264.7 \) 세포를 24-well plate에 분주하여 24시간 동안 배양한 뒤, LPS \( (1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \) 와 시료를 농도별로 동시 처리하여 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2}\right) \) 에서 24시간 동안 배양했다. 모든 실험은 3회 반복 측정하고, 결과 값은 평균값 \( \pm \) 표준편차로 나타냈다.
<h3>Prostaglandin \( \mathrm{E}_{2}\left(\mathrm{PCE}_{2}\right) \) 생성 억제 활성 측정</h3> <p>RAW \( 264.7 \) 세포에서 \( \mathrm{CH} \) 와 \( \mathrm{CHB} \) 의 Prostaglandin \( \mathrm{E}_{2} \) 생성 억제 활성을 측정하기 위해서 24-well plate에 \( 8.0 \times 10^{4} \mathrm{cells} / \mathrm{well} \) 로 분주하여 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2}\right) \) 에서 24 시간 동안 전 배양 한 뒤. LPS \( (1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \) 와 시료를 농도별로 동시 처리하여 24시간 반응하였다. 이후 배양 배지를 회수하여 10,000 \( \mathrm{rmm} \) 에서 3분 동안 원심 분리 침전물을 제거하였으며, 상등액에 존재하는 \( \mathrm{PGE}_{2} \) 의 셍성량은 Mouse enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (R\&D Systems Inc., Minneapolis, MN, \( \mathrm{USA}) \) 를 이용하여 \( \mathrm{PGE}_{2} \) 를 측정하였다.</p> <h3>전염증성 cytokine (TNF-a, IL-6, IL-1β) 생성 억제 활성 측정</h3> <p>RAW \( 264.7 \) 세포를 24-well plate에 \( 8.0 \times 10^{4} \mathrm{cells} / \) well로 분주하여 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2}\right) \) 에서 24시간 동안 배양한 뒤, LPS \( (1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \) 와 시료를 농도별로 동시 치리하여 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2}\right) \) 에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 세포 배양액을 \( 10,000 \mathrm{rpm} \) 에서 3 분 동안 원심 분리하여 침전물을 제거한 상등액을 취한 뒤, Mouse TNF-a ELISA Kit (BD Biosciencse, Califomia, USA), Mouse IL-6 ELISA Kit (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), Mouse IL-1β ELISA Kit(R&D Systems Inc.)를 이용하여 전 염증성 cytokine (IL-6, IL-1β, TNF-a)의 생성량은 측정하였다.<h3>Western blot analysis</h3> <p>RAW \( 264.7 \) 세포를 6-well plate에 \( 4 \times 10^{5} \mathrm{cells} / \) well로 분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24 시간 동안 배양한 후 LPS \( (1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \) 와 시료를 동시 치리하여 24시간 반응하였다. 배양액을 제거하고 phosphate buffered saline (Biosesang, Seongnam, Korea)로 2회 세척한 후, radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA buffer, Biosesang)를 치리하여 단백질을 lysis하였다. 추출한 단백질을 \( 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 30 분 동안 원심 분리하여 상등액을 분리하고 분리된 상등액의 단백질은 BCA kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 단백질을 정량 하였다. 이후 정량 된 단백질 \( 20 \mu \mathrm{g} \) 을 \( 10 \% \) polyacrylamide gel에 loading해 전기영동하고 polyvinylidene difluoride membrane (Milipore, Burlington, MA, USA)에 전이 시킨 뒤, \( 1 \mathrm{X} \) TBST (Tris-buffered saline, 0.1\% Tween 20)로 녹인 \( 5 \% \) skim milk에 membrane을 넣어 상온에서 2 시간 동안 blocking 하였다. 이후 TBST를 사용해 10 분 간격으로 3회 세척하였다. 1차 항체 반응 은 (iNOS antibody (1:1,000, Bio-Rad), COX-2 antibody (1:1,000, Rockland Immunochemicals, Inc., Pottstown, PA, USA), \( \beta \)-actin antibody clone \( \mathrm{AC}-74 \) (1:10,000, Sigma-Aldrich)를 이용하여 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 18시간 동안 반응시켰으며, 이후 TBST를 사용하여 10 분 간격으로 3회 세척하고, 1:10,000으로 희석한 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, \( \mathrm{USA} \)) 와 상온에서 90 분 동안 반응시킨 후 TBST를 사용하여 10 분 간격으로 3회 세척하였다. 이후 membrane을 ECL kit (Bio-\( \mathrm{Rad} \) 를 사용하여 imaging densitometer (model GS-700, Bio-\( \mathrm{Rad}) \) 을 통해 현상하였으며. Image J program \( (\mathrm{NIH} \), Bethesda, \( \mathrm{MD}, \mathrm{USA} \)) 을 이용하여 \( \beta \)-actin 대비 iNOS와 \( \mathrm{COX}-2 \) 단백질 발현량의 면직을 수치화하여 그래프로 나타내었다.</p> <h3>통계처리</h3> <p>모든 실험은 3회 반복하여 측정하였으며, 결과 값은 평균값 \( \pm \) 표준면차로 나타내었다. 각 치리군 간의 유의성을 검정하기 위하여 One-way analysis of variance (ANOVA)를 시행한 후, \( p<0.05 \) 수준에서 student's t-test로 통계치리의 유의성을 검정하였다.</p>