6-well plate에 세포 분주, 매실 추출물 처리, 멜라닌 생성 자극 후 세포를 배양하고 멜라닌 양을 산출했다. B16F 세포에 처리과정을 거쳐 Western blot의 band를 관찰하였고 각 시료농도군에 대한 유의차 검정은 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하는 값을 도출했다.
<h2>B16F1에서 Melanin 생성 측정</h2> <p>6-well plate에 \( 3 \times 10^{5} \) \( \mathrm{cells} / \mathrm{well} \)로 세포를 분주하였고, 매실 추출물을 처리하고 1시간후에 L-dopa로 melanin 생성을 자극 후 48시간 동안 세포를 배양 하였다. 세포를 수집하여 \( 1,200 \mathrm{rpm} \)에서 5분간 원심 분리하여 침전한 후, \( 1 \mathrm{ml} \) homoge-nization buffer (\( 50 \mathrm{mM} \) Sodium phosphate \( \mathrm{pH} 6.5 \), \( 1 \% \) Triton X-100, \( 2 \mathrm{mM} \) PMSF로 용해시켰다. 여기서 얻은 pellet에 \( 1 \mathrm{N} ~\mathrm{NaOH} \) \(10 \% \) DMSO \( 200 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하고 vortex 후 \( 405 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정 하였다. melanin 표준품(Sigma, USA)으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 각 well에서 생성된 멜라닌 양을 산출하였다. 멜라닌은 단위세포(10 \( { }^{4} \) \( \mathrm{cells} \))에서의 멜라닌 생성량을 비교하였다.</p> <h2>Western blot analysis</h2> <p>B16F 세포에 용출 완충용액 \( (50 \mathrm{mM} \) Tris - \( \mathrm{HCl} \), \( \mathrm{pH} 7.5 \), \( 0.4 \% \) Nonidet P-40, \( 120 \mathrm{mM~} \mathrm{NaCl}, 1.5 \mathrm{mM} ~\mathrm{MgCl}_{2},2 \mathrm{mM} \) phenylmethylsulfonyl fluoride, \( 80 \mathrm{lg} / \mathrm{ml} \) leupeptin, \( 3 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{NaF} \) and \( 1 \mathrm{mM} \) DTT을 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 30 \mathrm{~min} \) 동안 처리하였다. \( 10 \mu \mathrm{g} \)의 세포용출액을 \( 10 \% \) Tris - \( \mathrm{HCl} \) gel에서 전기영동 후 단백질을 전기적으로 nitrocellulose membrane으로 전이시켰다. 그 다음 \( 10 \% \) skim milk를 nitrocellulose membrane에 전처리하고 목적 단백질에 대한 1차 항체 (anti-Nrf2, anti-SOD-1, anti-SOD-2, anti-beta-actin)를 처리한 다음 2차 항체를 처리 후, chemiluminescent ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 목적단백질을 검출하였다. Western blot의 band는 LAS3000 \( { }^{\circledR} \) image analyzer (Fuiifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>각 실험은 3회 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각각의 시료농도에 대해 평균\( \pm \)표준편차로 나타내었다. 각 시료농도군에 대한 유의차 검정은 대조군과 비교하여 Student's test 한 후 \( p < 0.05 \) 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.</p>