S. cerevisiae(바이오매스에서 에탄올 생산에 주로 사용하는 효모)를 이용하여 [EMIM][Ac]에 내성을 가진 돌연변이 효모 균주 선별 실험을 진행하였다. \( 5 \% \) [EMIM][Ac]가 첨가된 \( YPD_{80} \)배지에 8차례에 걸쳐 유도적 돌연변이 유발 방법을 수행하였다. 결과적으로 glucose 소비속도, 균체의 성장 속도, 에탄올 생산 속도 등이 각각 9.71배, 15.86배, 11.2배 증가한 것을 확인하였다. 유도적 돌연변이 유발 실험 이후 [EMIM][Ac]에 대한 내성이 증가된 돌연변이 균주를 선별하기 위해 다음과 같이 실시하였다. \( 5 \% \) [EMIM][Ac]와 \( 20 \mathrm{g} / \mathrm{l} \)의 glucose가 포함된 \( YPD_{20} \) 고체배지에 도말하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 약 10일간 배양 후 실험하여, glucose 소비 속도가 가장 빠르고, ethanol 생산량이 가장 높은 B2 균주와 S3 균주를 최종 선별하고 각각 D452-B2와 D452-S3로 명명하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>S. cerevisiae D452-2 균주의 유도적 돌연변이 유발 실험</h2> <p>바이오매스로부터 에탄올을 생산하기 위해 주로 사용되는 효모인 S. cerevisiae 를 이용하여 [EMIM][Ac]에 내성을 가진 돌연변이 효모 균주를 선별하기 위한 실험을 진행하였다. S. cerevisiae D452-2를 \( YPD_{20} \) 배지에 전배양한 후 \( 5 \% \) [EMIM][Ac]이 첨가된 \( YPD_{80} \) 배지에 초기 OD \( \left( A_{600} \mathrm{~nm}\right) \)가 1.0이 되도록 접종한 후 유도적 돌연변이 유발 방법을 수행하 였다. 배양 중에 glucose 농도가 초기 \( 80 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)에서 \( 0-1 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 정도로 낮아지면 \( 5 \% \) [EMIM][Ac]가 포함된 새로운 \( YPD_{80} \) 배지에 배양액의 \( 1 \% \)를 다시 접종하였다. 유도적 돌연변이 유발 실험의 제 1차 배양과 2차 배양에서는 \( 80 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 glucose를 10일 동안 소비하였으며 균체의 성장이 매우 저조하여 최종 OD \(\left( A_{600} \mathrm{~nm}\right) \)가 0.9 또는 0.96 정도였으나 3차 배양부터 균체의 성장이 증가하여 10일 동안 OD \(\left( A_{600} \mathrm{~nm}\right) \)가 2.98까지 증가하였다. 4차 배양부터는 glucose 소비 속도와 균체의 성장 속도가 함께 증가하기 시작하여 7차 배양 결과 4일 동안 \( 80 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 glucose를 모두 소비하였으며, OD \( \left( A_{600} \mathrm{~nm}\right) \)는 6.07까지 증가하였고, \( 36.34 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 에탄올이 생산되었다. 8차례에 걸쳐 \( 5 \% \) [EMIM][Ac]가 첨가된 \( YPD_{80} \) 배지에 유도적 돌연변이 유발 방법을 수행한 결과 glucose 소비속도, 균체의 성장 속도, 에탄올 생산 속도 등이 각각 9.71배, 15.86배, 11.2배 증가되었음을 확인하였다.</p> <h2>[EMIM][Ac]에 대한 내성이 증가된 돌연변이 균주 선별</h2> <p>유도적 돌연변이 유발 실험 이후 [EMIM][Ac]에 대한 내성이 증가된 돌연변이 균주를 선별하기 위해 \( 5 \% \) [EMIM][Ac]와 \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 glucose가 포함된 \( YPD_{20} \) 고체배지에 도말하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 약 10일간 배양하였다. 고체배지에 배양한 결과 colony의 크기가 균일하지 않고 다양하게 분포되어 있는 것을 확인하였으며 각각의 크기별로 크기가 큰 colony와 작은 colony로 구분하여 선별하였다. 선별된 균주들의 [EMIM][Ac]에 대한 내성을 확인하기 위해 크기가 큰 colony 4 종류(B1, B2, B3, and B4)와 크기가 작은 colony 4 종류(S1, S2, S3, and S4)를 \( 5 \% \)[EMIM][Ac]가 포함된 \( YPD_{80} \) 배지에 접종하여 각각의 균주들의 균체성장과 ethanol의 생산 수율 그리고 생산성을 비교하였다. 배양 결과 크기가 큰 colony 4 종류 모두 속도의 차이가 있기는 하지만 \( 5 \% \) [EMIM][Ac]에 크게 저해를 받지 않고 균체 성장을 이루었으며, glucose를 효과적으로 ethanol로 전환시켰다. 그 중 B2 균주의 경우엔 배양 28시간 이내에 \( 80 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 glucose를 모두 소비하여 \( 2.6 \mathrm{~g} \cdot \mathrm{l}^{-1} \cdot \mathrm{h}^{-1} \)의 가장 높은 glucose 소비속도를 보였으며, 이때 \( 32.5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 ethanol를 생산하였고 균체의 성장은 OD \(\left( A_{600} \mathrm{~nm}\right) \)가 7.1이였다. 크기가 작은 colony 4 종류 역시 속도의 차이가 있기는 하지만 배양 결과 모두 \( 5 \% \) [EMIM][Ac]에 크게 저해를 받지 않았다. 배양 28시간 동안 S3 균주의 경우 glucose 소비 속도는 \( 2.6 \mathrm{~g} \cdot \mathrm{l}^{-1} \cdot \mathrm{h}^{-1} \)로 가장 높았으며, \( 31.7 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 ethanol을 생산하였고, 균체의 성장은 OD \( \left( A_{600} \mathrm{~nm}\right) \)가 6.6이였다. 고체배지에서의 크기가 큰 colony와 작은 colony의 크기에 따른 glucose 소비 속도와 ethanol 생산량에는 모두 뚜렷한 경향을 나타내지 않았다. 따라서 glucose 소비 속도가 가장 빠르고, ethanol 생산량이 가장 높은 B2 균주와 S3 균주를 각각 최종적으로 선별하고 각각 D452-B2와 D452-S3로 명명하였으며 이후 추가 실험을 진행하였다.</p>