Huh7-replicon cell을 사용하여 NS5B 유전자를 추출하였으며, 이를 위해 해당 세포를 \( 35 \mathrm { ~mm } \) dish에 95% 비율로 배양하였다. 이후 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 12,000 \times \mathrm { g } \)에서 15분간 원심 분리 후 상등액을 채취하고, isoprophanol \( 500 \mu \mathrm { L } \)을 사용하여 total RNA를 추출하였다. 마지막으로, 추출된 PCR 제품을 pcDNA3의 BamHI와 EcoRV 사이트에 클로닝하였다.
<p>NS5B gene을 Huh7-replicon cell로부터 얻기 위하여 Huh7-replicon cell을 \( 35 \mathrm { ~mm } \) dish에 95 \%가 되게 키웠다. Cell을 1X PBS로 washing 한 후에, Trizol reagent \( { } ^ {\circ } \left ( \right . \) Invi- \( ^ { - } \) trogen) \( 1 \mathrm { ~mL } \)을 넣고 상온에서 5분간 방치하여 cell을 깨고, chloroform \( 200 \mu \mathrm { L } \)를 넣고 섞어준 후 상온에서 3 분간 방치하였다. \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 12,000 \times \mathrm { g } \)로 15분간 원심 분리하여 상등액 만을 취해 isoprophanol \( 500 \mu \mathrm { L } \) 로 precipitation하여 total RNA를 언었다. 여기에 RQ1 DNase॰(Promega) 처리를 한 후에 다시 phenol extraction을 하여 sample을 얻어 \( 1 \mathrm { mg } \)의 RNA를 RT reaction에 사용하였다. RNA \( 1 \mu \mathrm { g } , 2 \mathrm { mM } \)의 primer \( 1 \mu \mathrm { L } , 10 \mathrm { mM } \) dNIP \( 1 \mu \mathrm { L } \), DEPC DW로 final volume \( 8 \mu \mathrm { L } \)가 되도록 넣고 섞어서 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 동안 incubation 하였다. 곤바로 ice에 2 분간 둔 후 master mixture(5X RT buffer, \( 25 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } _ { 2 } , 0.1 \mathrm { M } \) DTT, RNase inhibitor \( \left ( \right . \) Promega))를 넣고 \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 2분 동안 Pre-incubation한 후에 superscript \( { } ^ {\text { MII } } \) RTase (Invitrogen)를 넣고 \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } 50 \)분, \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } 15 \)분 동안 incubation 하여 \( \mathrm { RT } \)를 수행하였다. 여기서 나온 RT product를 template로 하여 Taq polymerase(Pro-mega)를 이용, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } 2 \) 분 \( -94 ^ {\circ } \mathrm { C } 30 \)초 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } 45 \) 초 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } 1 \) 분 \(30 \) 초로 \(30 \) cycle \( -72 ^ {\circ } \mathrm { C } 10 \)분으로 PCR을 수행하였다. RT- \( \mathrm { PCR } \)에 사용한 primer들은 Table 2 에 나와있다. 이렇게 얻어진 PCR product를 pcDNA3의 BamHI, EcoRV site에 cloning 하였다. 다시 이 pcDNA-NS5B construct를 temp-late로 하여 동일 조건으로 PCR을 수행하여 \( \mathrm { pcDNA } 4 \)의 BamHI, XhoI site에 cloning하여 pcDNA4-NS5B라 명명하였다.</p>