SDS-PAGE를 이용하여 단백질의 분자량과 농도를 측정하고, Tris-HCl buffer를 사용하여 활성 측정을 하였다. SmMDH의 활성 단위인 1 unit는 1분 간격으로 측정된 1분당 mannitol 산화반응 또는 fructose 환원반응하는 효소량으로 정의하였다.
<h2>단백질 정량 및 분자량 분석</h2> <p>정제된 SmMDH의 대략적인 분자량은 SDS-PAGE를 이용하여 측정하였다. Mini-protean II (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 전기영동 기구를 이용하여 \( 12 \% \) gel 상에서 분리하였으며, Coomassie brilliant blue R-250 (Sigma-Aldrich)으로 염색한 후, 다시 destaining solution ( \( 20 \% \) methanol, \( 10 \% \) acetic acid)을 처리하여 효소 단백질을 확인하였다. 분자량 비교를 위해 molecular weight markers (Sigma-Aldrich; 분자량 30,000-200,000)를 표준물질로 사용하였고, 효소 단백질의 농도는 BCA \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) protein assay kit (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA)를 이용하여 측정하였다.</p> <h2>효소 활성 측정</h2> <p>SmMDH의 산화활성을 측정하기 위해 \( 200 \mathrm { ~mM } \) 의 D-mannitol 기질과 \( 0.5 \mathrm { ~mM } \mathrm { ~NAD } ( \mathrm { P } ) ^ { + } \)를 조효소로 함유한 \( 50 \mathrm { ~mM } \) Tris-HCl buffer ( \( \mathrm { pH~ } 9.0 \))를 사용하였고, 환원활성 측정에는 \( 200 \mathrm { ~mM } \) 의 D-fructose 기질과 \( 0.5 \mathrm { ~mM } \mathrm { ~NAD } ( \mathrm { P } ) \mathrm { H } \)를 첨가한 \( 50 \mathrm { ~mM } \) Tris-HCl ( \( \mathrm { pH~ } 7.0 \))의 조건에서 적당량의 정제된 효소를 첨가하여 최종 \( 300 \mu \mathrm { l } \) 로 반응하였다. \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10분 동안 효소반응을 진행하면서 PowerWave \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) microplate spectrophotometer (Biotek Instrument Inc., Highland, USA)를 이용하여 \( 340 \mathrm { ~nm } \)에서 반응액의 흡광도 변화를 1분 간격으로 측정하였다. SmMDH의 활성 1 unit는 1분당 \( 1 \mu \mathrm { mol } \) 의 \( \mathrm { NAD } ^ { + } \)를 \( \mathrm { NADH } \) 로 전환(mannitol 산화반응) 또는 \( \mathrm { NADH } \) 를 \( \mathrm { NAD } ^ { + } \)로 전환(fructose 환원반응)하는 효소량으로 정의하였다.</p>