본 실험에서의 소포자 배양에서는 고온처리가 끝난 소포자들과 약전처리 후 나출한 소포자들을 원심분리 후 전처리 배지를 제거한 후 배양배지에 현탁했으며, 배양배지로는 NLNS 배지, 2층배지, 하층 고체배지 등을 사용하였다. 전처리가 끝난 후 배지의 교환 여부가 배의 발생에 미치는 영향을 조사한 실험에서는 전처리 배지가 들어있는 배양접시에 배양배지를 첨가 및 전처리 배지를 제거 후 소포자 pellet을 배양 배지에 다시 현탁하는 등의 실험을 진행하였다. 배양 중 새 배지의 첨가가 배의 발생에 미치는 영향을 조사한 실험에서는 \(1, 2, 3\) 및 \(4\)일 후 새 배지를 동량 첨가하여 실험하였다. \(2\)층 배양 시 하층고체배지의 양이 배의 발생에 미치는 영향을 조사한 실험에서는 배양접시에 고체 배지를 분주한 후 소포자 현탁액을 분주하는 방법으로 진행하였다. 이후 결과조사는 해부 현미경을 통해 이뤄졌다.
<h2>소포자 배양</h2><p>고온처리가 끝난 소포자들과 약전처리 후 나출한 소포자들을 \( 1,000 \mathrm{rpm} \) 에서 5분간 원심분리하여 전처리 배지를 제거한 후 배양배지에 현탁하였다. 이때 소포자의 밀도는 \( 1 \mathrm{ml} \)에 약 \( 10 \times 10^{4} \)이 되도록 조정하였으며, \( 60 \times 15 \mathrm{mm} \)배양접시에 \( 1.5 \mathrm{ml} \)씩 분주하여 배양하였다. 소포자가 들어있는 배양접시들은 투명한 plastic box에 넣어 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)의 암 상태에서 4주간 배양하였다.</p><p>배양배지는 \( 10 \% \) sucrose가 첨가된 NLNS 배지를 사용하였으며, 2층배지 사용 시 하층 고체배지는 \( 2 \% \) sucrose와 \( 0.4 \% \) phytagel이 첨가된 1/2 NLNS를 사용하였다. 2층배지는 첨가하는 배지의 양이 배의 생산에 미치는 영향과 하층고체배지의 양이 배의 생산에 미치는 영향을 조사한 실험에서만 실시하였으며, 이외의 실험에서는 액체배지를 사용하였다. 배지의 \( \mathrm{pH} \)는 \( 5.8 \sim 6.0 \)이 되도록 조정하였다. 모든 액체배지는 pore size가 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \)와 \( 0.22 \mathrm{\mu \mathrm{m}} \)인 membrane을 사용하여 여과 멸균하였으며 2층배양 시 하층 고체배지는 고압 멸균하여 사용하였다.</p><p>전처리가 끝난 후 배지의 교환 여부가 배의 발생에 미치는 영향을 조사한 실험에서는 사용한 전처리 배지를 원심분리하여 제거한 후 소포자 pellet을 배양 배지에 다시 현탁시켜 배양하거나(이후 '교환' 이라 칭함) 또는 전처리 배지가 들어있는 배양접시에 배양배지를 첨가(이후 '첨가'라 칭함)하여 배양하였다. 첨가의 경우에는 소포자의 밀도가 \( 1 \mathrm{ml} \)에 약 \( 2 \times 10^{5} \)이 되도록 조정한 소포자 현탁액 \( 1.5 \mathrm{ml} \)이 들어있는 \( 60 \times 15 \mathrm{~mm} \) 배양접시에 배양 배지를 각각 \( 1.5 \mathrm{ml} \)씩 첨가하여 배양하였으며, 교환의 경우에는 전처리한 소포자들을 \( 1.000 \mathrm{rpm} \)에서 5분간 원심분리하여 전처리 배지를 제거 한 후 배양배지를 첨가하여 소포자 밀도를 \( 1 \mathrm{ml} \)에 약 \( 1 \times 10^{5} \)이 되도록 재조정하였으며 \( 60 \times 15 \mathrm{~mm} \) 배양접시에 \( 3 \mathrm{ml} \)씩 분주하여 배양하였다.</p><p>배양 중 새 배지의 첨가가 배의 발생에 미치는 영향을 조사한 실험에서는 \( 60 \times 15 \mathrm{~mm} \) 배양접시에 소포자 현탁액을 \( 1.5 \mathrm{ml} \)씩 분주하고 배양 1, 2, 3 및 4일 후 새 배지를 동량 첨가하였다. 또 새 배지 첨가 시 첨가 횟수가 배의 발생에 미치는 영향을 조사한 실험에서는 \( 60 \times 15 \mathrm{~mm} \) 배양접시에 소포자 현탁액을 \( 1.5 \mathrm{ml} \)씩 분주한 후 배양 1일 후부터 \( 1.5 \mathrm{ml} \)씩을 1일 간격으로 1, 2 및 3회 첨가하였다. 한편 2층배양에서 새 배지의 첨가 시 첨가하는 배지의 양이 배의 발생에 미치는 영향을 조사한 실험 에서는 하층고체 배지가 \( 7 \mathrm{ml} \) 들어있는 \( 60 \times 15 \mathrm{~mm} \) 배양 용기에 소포자 현탁액을 \( 1.5 \mathrm{ml} \)씩 치상하고 배양 1일 후 새 배지를 각각 1.5, 2 및 \( 3 \mathrm{ml} \)씩 첨가하였다.</p><p>2층 배양 시 하층고체배지의 양이 배의 발생에 미치는 영향을 조사한 실험에서는 \( 60 \times 15 \mathrm{~mm} \) 배양접시에 고체 배지를 각각 3, 5 및 \( 7 \mathrm{ml} \)씩 분주하여 미리 준비한 후 소포자 현탁액을 \( 1.5 \mathrm{ml} \)씩 분주하고 배양 1일 후 새 배지를 동량 첨가하였다.</p><h2>결과조사</h2><p>실험은 1개의 배양접시를 1반복으로 하여 한 처리에 \( 4 \sim 5 \) 반복씩 2회 이상 실시하였다. 배양 4주 후 해부 현미경 10배의 배율 하에서 1개의 배양접시에 들어있는 배의 수를 계수하여 평균과 표준오차를 구하였다.</p>