본 연구에서는 유전공학적으로 개발되어 제약 산업에서 사용하는 균주 중의 하나인 penicillin G amidase(PGA, benzylpenicillinami-dohydrolase, EC 3.5.1.11)를 대량으로 생산하기 위하여 E. coli ATCC 11105 에서 PCR(polymerase chain reaction) 을 통해 증폭한 pga gene을 pET-24a(+) expression vector에 넣어 pET-pga plasmid를 제작하였고, 이것을 형질전환한 E. coli BL21(DE3)/pET-pga 균주에서 PGA 의 과발현을 위한 배양 온도변화 전략을 모색하여 재조합 대장균의 유가배양시에 세포생육과 PGA생산을 극대화하는 것을 밝혀냈다.
<h1>서 론</h1><p>대량의 penicillin G amidase(PGA, benzylpenicillinami-dohydrolase, EC 3.5.1.11)를 생산하는 재조합 균주는, 유전공학적으로 개발되어 제약 산업에서 사용하는 균주 중의 하나이다. PGA는 penicillin G 를 phenylacetic acid(PAA)와 6-aminopenicillanic acid(6 APA)로 분해하고, 6 APA는 beta-lactam계 항생물질 합성을 위한 전구체로 사용된다. 산업적으로 PGA를 사용하여 반 합성 penicillin을 생산하고 있고, 대부분의 산업 공정에서는 부분적으로 정제한 PGA를 immobilized form으로 만들어서 사용한다. PGA는 주로 Escherichia coil(E. coli) 에서 생산되며, 재조합 E. coli ATCC 31052, 11105, 21285, 그리고 14945 가 사용된다. E.coil ATCC 11105의 PGA 는 periplasmic enzyme이고, \(24 \mathrm{kDa}\)의 small subunit과 \(65 \mathrm{kDa}\)의 large subunit으로 구성되어 있다. Precursor polypeptide (signal peptide- smallsubunit- spacer peptide- large subunit) 형태로 발현된 PGA가 활성을 가진 heterodimer가 되기 위해서는 signal peptide (26 아미노산)와 spacer peptide(54 아미노산)가 절단되는 다단계의 단백질 후 처리 과정이 필요하다. E. coil ATCC 11105의 pga gene이 cloning 되어 5'-과 3'-flanking region 을 포함한 완전한 염기서열이 밝혀져 있으며, 이 유전자가 재조합 plasmid에 삽입되고 E. coil에 형질전환되어 과발현된 PGA의 특성이 연구되어왔다. 최근에 Bacillusmegaterium 을 숙주로 사용하여 \(2 \mathrm{L}\)의 배양기에서 PGA의 분비 발현이 보고되었고, 6개의 히스티딘 잔기가 달린 PGA를 E. coil에서 발현시켰으며 고정화한 금속이온친화성 크로마토그래피 (immobilized metal-ion affinity chroma-tography: IMAC 방법으로 간단히 정제하는 방법이 연구된 바 있다. 또한 Alcaligenes faecalis의 PGA 유전자를 E. coil에서 고농도로 발현시키려는 노력도 시도되고 있다.</p><p>재조합 단백질의 생산성을 향상시키기 위하여 고농도 배양과 고효율 발현은 매우 중요하다. 이를 실현하기 위한 노력 가운데 \( 50 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 이상의 고농도의 균체에서 재조합 단백질의 고효율 발현은 실현한 보고가 있다. 재조합 단백질의 고효율 발현을 위해서는 영양분의 적절한 공급이 필요하며 acctate 축적을 줄이는 노력이 필요하다. 재조합 균주를 중온에서 대량으로 배양할 때에는 단백질이 불완전한 형태인 불용성 상태(inclusion body)로 발견되는 예가 많다. 그러나 저온에서 배양하면 재조합 단백질이 활성을 지닌 가용성 형태로 존재한다. 따라서 재조합 단백질을 생산하기 위하여 대량 배양과 함께 저온에서 재조합 균주를 생육시키는 것이 중요하다. 그러나 온도를 저하시키는 과정에서 미생물의 생육이 저하 되거나 사멸하는 경우가 발생하기도 한다. 배양과정에서 온도 변화에 따른 생리적 변화를 관찰한 많은 연구가 있었는데, 높은 온도에서의 영향뿐만 아니라 낮은 온도에서의 영향 등을 조사한 바, 환경의 변화에 의하여 미생물들은 세포 내 구조적, 생리적 변화가 일어나며 항스트레스성 단백질을 생성하는 것으로 알려져 있다. 미생물이 저온 상태에서는 cold shock protein(CSPs), AFGs(antifreeze proteins)와 DNA 구조와 기능에 관계되는 단백질 등을 생산하는 것으로 알려져 있다. 미생물이 저온 상태에서 배양하면 세포막 구조와 성분의 차이가 보이는데, 미생물의 세포막은 중온 상태로 생육시킬 때에 비하여 저온에서 생육시키면 불포화 지방산의 함량이 증가하는 것을 볼 수 있다. 특히 저온 조건에서는 linoleic acid 와 palmitoleic acid의 함량이 증가되고 이중결합의 수가 증가된다는 보고가 있다. 이러한 불포화 지방산의 변화에 의하여 세포막의 유동성이 증가된다.</p><p>본 연구에서는 E. coli ATCC 11105 에서 PCR(polymerase chain reaction) 을 통해 증폭한 pga gene을 pET-24a(+) expression vector에 넣어 pET-pga plasmid를 제작하였고, 이것을 형질전환한 E. coli BL21(DE3)/pET-pga 균주에서 PGA 의 과발현을 위한 배양 온도변화 전략을 모색하여 재조합 대장균의 유가배양시에 세포생육과 PGA생산을 극대화하여 얻은 결과를 보고한다.</p>