신규 인산 가용화균으로 여겨지는 Klebsiella sp. DA71-1를 균주로 선발하여 인산 가용화능을 측정하였다. 그 결과 Klebsiella sp. DA71-1은 초기 배양 \( \mathrm{pH} \)가 6.0일 때 그리고 glucose를 기질로 사용했을 때 인산 가용화능이 우수했다. 특히 glucose를 기질로 사용했을 때 높은 유리인산을 방출하기 때문에 농도에 따른 인산 가용화능을 측정하였는데, glucose의 함량이 \( 3 \% \) 일 때 높은 유리인산을 방출하였다.
<h1>결 과</h1> <h2>인산 가용화 균의 선별</h2> <p>경남 김해시의 하우스 지역 내 근권 토양을 샘플링 하여 혼합시킨 토양시료 \( 10 \mathrm{~g} \) 에서 희석 평판법으로 세균을 분리 한 결과, 건조 토양 \( 1 \mathrm{~g} \) 당 세균 수는 대략 \( 2 \sim 5 \times 10^{8} \mathrm{cfu} \mathrm{ml}^{-1} \) 였다. 콜로니의 모양, 색깔 등으로 보아 다른 균주로 생각되는 것을 난용성 인산염이 함유된 SM 고체배지상에 접종하여, 배양하였다. 3일후에 투명대를 관찰한 결과, tri-calcium phosphate가 함유된 배지에서는 \( 10 \% \) 이상의 균주가 분명한 투명대를 보였으나, hydroxyapatite가 함유된 배지에서는 투명대를 보이는 균주가 극소수였다. 그 중에서 비교적 투명대 영역이 분명하게 나타난 균주를 1차 선별하였다. 1차 선별된 균주는 hydroxyapatite 첨가 배지에서 유리 인산 생성량이 비교적 높은 수준의 세균을 선발하였으며, 그 중에서 인산가용화능이 가장 우수하며 신규의 인산 가용화균으로 생각되 는 DA71-1 균주를 확인하여 실험하였다.</p> <h2>분리균주의 동정</h2> <p>분리균주의 생리 생화학적인 특성을 Bergey's manual에 따라 조사한 결과, Klebsiella sp. Pseudomonas sp. 및 Burkho-lderia sp.의 가능성이 높았다. 또한, 전자현미경(SEM) 관찰하에서 분리된 균주는 전형적인 간균의 모양을 하고 있었으며, 크기는 \( 0.4 \sim 0.5 \times 1.7 \sim 2 \mu \mathrm{m} \) 정도였다. 동정의 정확성을 기하기 위해 균주를 API system으로 동정한 결과 그 중 DA71-1은 Klebsiella sp와의 유사성은 99\%로 Bergey's manual에 의한 동정의 결과와 일치하였다. 그리하여 지금까지 hy-droxyapatite 인산염을 가용화시키는 세균으로 알려지지 않은 Klebsiella sp. DA71-1 의 분리균주를 선별하였기에 가용화 특성 실험을 계속하여 수행하였다.</p> <h2>난용성 인산염 종류별에 따른 인산가용화 특성</h2> <p>Klebsiella sp. DA71-1 균주가 tri-calcium phosphate, hydroxyapatite, aluminium phosphate의 난용성 인산염 기질에 대한 인산 가용화능을 비교 조사 하였다. tri-calcium phosphate를 기질로 사용했을 때, \( \mathrm{pH} \) 4.6 정도로 저하되었고 최대 \( 148 \mathrm{ppm} \) 의 유리인산을 방출하였고, hydrox-yapatite를 기질로 사용했을 때, \( \mathrm{pH} \) 는 4.4까지의 저하와 최대 \( 214 \mathrm{ppm} \) 의 유리인산을 방출하였다. Aluminium phosphate의 경우는 \( \mathrm{pH} \) 가 4.18로 급격한 저하를 보였으나, 인산 가용화능은 \( 20 \mathrm{ppm} \) 정도로 약했다. 이런 결과는 본 연구실에서 난용성 인산염 우수균주로 분리한 Pseudomonas cepacia가 배양시간 72시간에 hydroxyapatite를 가용화한 인산 값보다 우수하였다. 초기배양 \( \mathrm{pH} \) 가 5.0일 때 배양 72시간에 4.55의 \( \mathrm{pH} \) 저하와 최대 \( 230 \mathrm{ppm} \) 의 유리인산을 방출하였다. 이 결과에 따라 Klebsiella sp. DA71-1은 배양 시 초기 \( \mathrm{pH} \) 에 관계없이 대체적으로 성장이 비슷하며, 특히 초기 배양 \( \mathrm{pH} \) 가 6.0일 때 인산 가용화능이 우수하였다.</p> <h2>탄소 원 종류별에 따른 인산가용화 특성</h2> <p>비교적 가격이 저렴한 탄소원을 이용하여 경제적인 배양단가로 대량배양을 위한 기초 실험으로서 탄소 원 종류에 따른 인산 가용화능을 측정하여 Fig. 5에 나타냈다. 그 결과 glucose를 기질로 사용하였을 때 84시간 경에 \( \mathrm{pH} \) 가 4.4로 저하되고 최대 \( 230 \mathrm{ppm} \) 의 유리인산을 방출하였다. sucrose를 기질로 사용하였을 때는 \( \mathrm{pH} \) 저하의 폭이 가장 낮았으며 최대 4.5 의 \( \mathrm{pH} \) 와 \( 120 \mathrm{ppm} \)의 유리인산을 방출하였다. maltose를 기질로 사용하였을 때는 60시간에 4.82의 \( \mathrm{pH} \) 저하와 \( 170\mathrm{ppm} \)의 유리인산을 방출하였으며, fructose를 기질로 사용하 였을 때는 최대 4.7의 \( \mathrm{pH} \) 저하와 \( 180 \mathrm{ppm} \)의 유리인산을 방출하였다. 이러한 결과에 따라 Klebsiella sp. DA71-1은 glucose를 기질로 사용하였을 때 인산 가용화능이 가장 우수하였다. 비교적 단가가 저렴한 폐당밀을 이용하여 측정 하였는데 동일한 탄소 농도에서의 균주 생육이 저조 하였으며, 따라서 가용화능은 낮은 편이었다.</p> <h2>glucose의 농도에 따론 인산 가용화 특성</h2> <p>Klebsiella sp. DA71-1는 glucose를 기질로 사용하였을 때 가장 높은 유리인산을 방출하기 때문에 glucose 최적농도에 따른 최대의 인산 가용화능을 측정하고자 유리인산의 방출양을 비교 조사 하였다. Glucose가 \( 1 \% \)일 때는 최대 4.43으로 \( \mathrm{pH} \) 가 저하되었으며 유리인산 방출량은 170ppm이었다. Glucose 함량이 \(3\%\) 일 때는 96시간까지 안정되게 \( \mathrm{pH} \) 가 저하되었으며 84시간에 \( \mathrm{pH} \) 는 3.93으로 저하되고 유리 인산의 방출량은 \( 280 \mathrm{ppm} \)으로 최대에 이르렀다. 이는 기질로 사용한 glucose가 시간이 지나도 glucose \( 1 \% \)에 비해 고갈되지 않은 것에 기인한 것인데 \( 3 \% \) 의 함량 이상일 때 는 높은 기질의 함량때문에 기질저하가 있는 듯 했다. 인산 값은 \( 3 \% \) 에 비해 낮게 나왔으며, 최대 3.82의 \( \mathrm{pH} \) 저하와 257 ppm의 유리인산을 방출하였다. 이 결과에 따라 Klebsiella sp. DA71-1는 glucose의 함량이 \( 3 \% \) 일때 높은 유리인산을 방출하였다.</p>