각 곰팡이 균주로 발효시킨 동결 및 열풍건조 발효 누에분말을 SDS-PAGE 전기영동 실행 후 염색액을 첨가하여 염색하고 이후 탈색과정을 거쳐 단백질 패턴을 분석하였다. 동결 및 열풍건조 발효 누에분말의 혈전용해 효소 활성은 피브린판에서 용해 지역을 보고 측정하였다. 이들의 항산화 활성은 DPPH법을 통해 흡광도의 감소를 관찰하여 측정하였다.
<h2>Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에 의한 단백질 패턴비교</h2><p>각 곰팡이 균주로 발효시킨 동결 및 열풍건조 발효 누에분말의 단백질패턴은 Weber 및 Osbom 방법에 준하였다. SDS-polyacrylamide gel의 조성은 \( 10 \% \) acrylamide, \( 1.5 \mathrm{M} \) Tris-HCl buffer (\(\mathrm{pH} 8.8)\), \(0.4\%\) SDS (Sodium dodecyl sulfate), \( 10 \% \) 과산화암모늄 및 \( 0.05 \% \) TEMED로 만들어 사용하였다. 농축 gel의 조성은 \(5\%\) acrylamide, \( 0.5 \mathrm{M} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) buffer \( (\mathrm{pH} 6.8) \), \(0.4\%\) SDS, \(0.05\%\) TEMED 였다. 시료단백질의 SDS 처리는 최종농도 \(2\%\) SDS, \( 14.4 \mathrm{mM}\) \(\beta \)-mercaptoethanol, \( 60 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) buffer ( \( \mathrm{pH} 6.8) \), \( 25 \% \) glycerol 및 \( 0.1 \% \mathrm{BPB} \) 혼합액에서 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)로 5 분간 열처리 하였다. 전기영동은 Tris-glycine 완충액 (\(25 \mathrm{mM}\) Tris, \( 192 \mathrm{mM} \) glycine, \( \mathrm{pH} 8.3) \) 하에서 \( 130-150 \mathrm{mA} / \mathrm{gel}(\mathrm{cm}) \)의 정전류를 통하여 1 시간 30 분간 하였다. 전기영동 후 gel은 고정액 (Methanol: Acetic acid : Water = 10:10:80)에 \( 1 \% \) coomassie brilliant blue R-250을 첨가하고 10시간 염색한 후 탈색액(Methanol : Acetic acid : Water =10:10:80)으로 충분히 탈색시켜 건조 및 사진촬영을 하였다.</p><h2>혈전용해 효소 활성 측정</h2><p>각 곰팡이 균주로 발효시킨 동결 및 열풍건조 발효 누에분말의 혈전용해 효소 활성은 fibrin plate 법을 변형하여 lysed zone으로 측정하였다. Fibrin plate는 \( 0.06 \% \) fibrinogen(Singma, St. Louis MO, USA)을 \( 0.2 \mathrm{M} \) borate buffer \( (\mathrm{pH} 7.5) \)에 용해시킨 후 petri dish에 \( 10 \mathrm{ml} \) 씩 분주하고 thrombin(5,000 unit, Sigma, St. Louis, MO, USA) 40 unit를 균일하게 섞이도록 가하면서 균일한 두께의 fibrin clot를 형성시킨 후 실온에서 30 분간 방치한 후 사용하였다. 시료를 증류수에 \( 1 \% \) 농도로 용출시킨 후 여과(Whatman No. 2) 하여 fibrin plate상에 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 씩 점적하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 동안 반응시킨 후 생성된 투명환 부위의 직경을 측정하였다. 직경은 서로 수직인 두 개의 지름을 측정하여 투명대의 면적을 구하였다.</p><h2>DPPH법에 의한 항산화 활성 측정</h2><p>각 곰팡이 균주로 발효시킨 동결 및 열풍건조 발효 누에분말의 항산화 활성은 Blois의 방법에 따라 측정하였다. 즉 DPPH (a, \( \alpha^{\prime} \)-diphenyl- \( \beta \)-picrylhydrazyl) 용액은 \( 100 \mathrm{ml} \) 에탄올에 DPPH \( 16 \mathrm{mg} \) 을 녹인 후 증류수 \( 100 \mathrm{ml} \)를 혼합하여 여과지(Whatman filter paper NO. 2)로 여과시켜 만들었다. DPPH 용액 \( 5 \mathrm{ml} \) 에 일정 농도 \( (0.5 \%) \)의 시료용액 \( 1 \mathrm{ml} \) 을 혼합하여 실온에서 30 분간 반응시킨 후 \( 528 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도의 감소를 측정하였다. 대조구인 시판 항산화 \( \mathrm{BHT} \)는 \( 0.05 \% \)로 첨가하여 상기와 동일한 방법으로 흡광도 감소를 측정하였다. DPPH free radical scavenging activity는 시료 첨가구와 무첨가구의 흡광도차를 백분율\((\%)\)로 표시하였다.</p><p>DPPH free radical scavenging activity\((\%) \\ =\{1-(\mathrm{Abs} / \mathrm{Abc})\} \times 100\)</p><p>Abc: Absorbance of control treatment at \( 528 \mathrm{~nm} \)</p><p>Abs: Absorbance of sample treatment at \( 528 \mathrm{~nm} \)</p>