유럽 실험동물 취급 면허교재에서 나타낸 과학적이고 윤리적인 규정으로 동물을 포함한 실험을 하였고 강원대학교 동물실험윤리위원회에서 실험수행을 위한 승인을 받아 브로일러의 성장에 맞춰 나눔별로 사료섭취량과 증체량 및 사료요구율을 측정하였다. 희생 후 장내 미생물 검사를 위해 혐기적 방법으로 채취된 맹장을 차갑게 지속시켰고 이 자료는 GLM procedure를 사용한 분산 분석으로 하였고 Duncan"s multiple range test의 자료에 대한 통계적인 유의차는 p<0.05 에서 검토하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험설계 및 사양관리</h2> <p>동물을 포함한 모든 실험절차는 유럽 실험동물취급 면허교재에서 제시된 과학적이고 윤리적인 규정을 준수하였으며, 실험수행을 위한 승인은 강원대학교 동물실험윤리위원회(IACUC Kangwon National University)로부터 얻었다. 로스계통의 1일령 브로일러 수컷 240 (Ross 308 , 미국) 마리를 상업용 부화장(한양부화장 경기도 이천시)으로부터 구입하였다. 병아리 체중(평균 \( 45 \pm 2.07 \mathrm{~g} \))을 측정하여 4 처리구, 각 처리구펜당 20 마리씩 3반복으로 완전임의 배치한 후 35일 동안 실험사료를 급여하였다. 실험처리구는 대조구, 항생제(avylamycin \(8 \mathrm{ppm}\)), 적송수피추출물(red pine bark extracts, RE) 2개의 첨가구(RE \(65 \mathrm{ppm}\), \(80 \mathrm{ppm}\)) 로 구분하였다. 적송수피추출물은 뉴트라팜 주식회사(경기도 남양주시)으로부터 제공받았으며 그 제조방법(대한민국 등록특허 10-09162285)을 간략히 기술하면 다음과 같다. 적송수피를 분쇄하여 주정용액과 혼합하고 \( 70^{\circ} \mathrm{C}\), 2시간 동안 반응시킨 후 여과해서 농축여액과 건조추출박을 각각 얻은 다음에 농축여액과 건조추출박을 혼합하여 적송수피추출물을 얻는다. 서로 다른 적송수피추출물의 첨가수준은 Kim 등의 보고에 기초하였으며 그들이 보고한 항생제 첨가구와 유사한 성장능력을 나타냈던 \(50 \mathrm{ppm}\)보다 \(15 \mathrm{ppm}\)씩 높은 수준으로 조절하였다. 항생제와 적송수피추출물은 옥수수의 량을 줄여서 첨가하였으며 조단백질과 대사에너지 함량을 비롯한 모든 영양소 수준은 동일하게 배합하였다. 실험사료는 미국의 NRC에서 제시한 동물사양표준 가운데서 브로일러의 영양소요구량을 충족 또는 초과할 수 있도록 하였다. 병아리는 물과 사료에 자유롭게 접근할 수 있는 표준상태(밀도 10 마리\( / \mathrm{m}^{2} \)) 하에서 유지하였다. 각 펜은 왕겨를 바닥 \( 10 \mathrm{~cm} \) 높이로 깔아주었다. 사육실의 온도는 입추당일에서 3 일까지는 \( 33^{\circ} \mathrm{C} \) 로 유지하였고, 그 다음부터 주당 \( 23^{\circ} \mathrm{C} \) 씩 낮췄으며 22일부터는 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 로 유지하였다. 상대습도는 \( 70 \% \) 로 유지하였고 24 시간 연속조명을 사용하였다.</p> <h2>희생과정 및 도체특성</h2> <p>브로일러의 성장에 따른 각 단계 별 사료섭취량, 증체량 및 사료요구율은 3주령과 5주령에 각각 측정하였다. 사료요구율은 일정한 기간 중의 사료섭취량을 증체량으로 나눈 값으로 나타냈다. 희생 12 시간 전에 사료와 물을 철회하였고 실험종료 시에 각 처리구에서 평균체중에 가까운 닭 15 마리(각 펜당 5 마리)를 선별하여 실험동물 안락사 권장내용에 따라서 경추탈골에 의해서 스트레스를 주지 않고 안정적으로 희생하였다. 닭의 스트레스를 최소화하기 위해 희생 2 시간 전에 희생할 닭을 선정하여 나머지 닭의 시야에서 보이지 않는 분리된 희생장소로 이동하였다. 경추탈골 후 즉시 경동맥을 절단하여 90 초 동안 방혈하였고 뜨거운 물 \( \left(58-60^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 에 4 분 정도 담근후 탈모기를 2분 동안 통과시켜 탈모하였다. 혈액, 깃털, 머리(첫 번째 목뼈에서 절단), 정강이, 내장적출을 한 다음에 도체중을 측정하였고 도체율은 생체중에 대한 도체중의 비율로써 계산하였다. 가슴살, 다리살의 무게는 도체중 비율로써 계산하였다. 복강지방, 간, 비장, F낭(bursa of Fabricius), 흉선의 상대적인 무게는 생체중 비율로써 계산하였다. 복강지방은 좌골(ischium) 내에 확장되거나 총배설강 주위 및 복강근육에 인접한 지방을 모두 취해서 측정하였다.</p> <h2>혈액지질과 면역물질</h2> <p>실험 종료 시에 희생할 닭의 날개정맥으로부터 주사기(Hamilton 22-gauge needle, \( 0.70 \mathrm{~mm} \) in diameter)를 이용해서 \( 1 \mathrm{ml} \) 혈액을 채취하여 실온에서 30분간 방치하였다. 혈청은 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\) 15분간 \(2,200\times \mathrm{g}\)에서 혈액을 원심분리에 의해서 분리하였다. 분리된 혈청은 액체질소가스를 이용하여 급속동결한 다음에 생화학적 분석 시까지 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동보관하였다. 중성지방, 총 콜레스테롤, 고밀도지단백콜레스테롤 그리고 저밀도지단백 콜레스테롤은 자동혈액분석기 (Autoanalyzer 7150, Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 상업용 효소킷(Sigma Co. Ltd., USA)에 의해서 분석하였다. 면역단백질은 상업용 킷(Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX, USA)를 사용하여 dou-ble-antibody sandwich ELISA에 의해서 측정하였다. IgG(chicken IgG ELISA quantitation set, E30-104), IgA (chicken IgA ELISA quantitation set, E30-103) 및 IgM (chicken IgM ELISA quantitation set, E30-102)를 이용하여 반응시킨 다음 precision microplate reader (Molecular Devices, Inc., New York, USA)에 의해서 \( 450 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 항체의 량을 계산하였다.</p> <h2>맹장 미생물</h2> <p>희생 후 곧바로 장내 미생물을 조사하기 위해서 혐기적인 방법으로 맹장을 채취한 후 얼음 위에서 유지하였다. 맹장은 분석 시까지 AnaeroGen sachets (Oxoid, Hampshire, UK)가 갖춰진 sealed anaerobic jars (Oxoid, Basingstoke, UK)에서 혐기상태로 유지하였다. 즉시, 맹장 내용물을 멸균된 혐기성 생리식염수(phosphorus buffered saline; PBS \(0.1 \mathrm{M}\), \(\mathrm{pH} 7.0\))로 혼합하여 10 배 희석 \( (1: 9, \mathrm{wt} / \mathrm{vol}) \) 하였다. 계수를 위하여 동일한 식염수에서 일련의 희석을 계속하였다. 모든 절차는 anaerobic chamber \( \left(5 \%\right. \) hydrogen, \( 5 \% \mathrm{~CO}_{2} \), balanced nitro-gen)에서 혐기상태로 이루어졌다. 배양은 희석된 \( 10^{-2} \sim 10^{-7} \) 에서 각각 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 씩을 분주하여 멸균된 평판 선택배지 즉 Lactobacillus SPP. (MRS agar, Oxoid, Basingstoke, UK); Bifidobacterium SPP. (bifidobacterium selective agar, BIM-25 medium); Salmonella (SS agar Difco, CM0099); Escherichia coli(McConkey Purple agar)에서 실행하였다. Salmonella와 Escherichia coli는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 호기배양하였고, Lactobacillus SPP.와 Bifidobacterium SPP.는 AnaeroGen sa-chets가 갖춰진 sealed anaerobic jars를 이용한 혐기상태 하에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), 48 시간 정치배양한 후, 각각의 평판배지에서 미생 카운터로써 총균수를 조사하였다. 모든 미생물 군락의 수는 맹장내용물 \( \mathrm{g} \) 당 균수(CFU, colony-forming unit/\(\mathrm{g}\) 맹장내용물)로써 상용로그를 취하여 제시하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>자료는 SAS software의 GLM procedure를 사용하여 분산 분석(ANOVA)에 의해서 분석하였고 Duncan"s multiple range test에 의해서 모든 자료에 대한 통계적인 유의차는 \( \mathrm{p}<0.05 \) 에서 검정하였다.</p>