분해 활성 염색 SDS-PAGE로 단백질을 분리한 후 isopropanol과 phosphate 완충액으로 세척하고 LBG, agar를 녹여 gel을 중층하고 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 4시간 반응시킨 후 congo red로 염색하여 mannan 분해 활성을 관찰하고 Coomassie brilliant blue 용액으로 polyacrylamide gel을 염색하여 단백질을 관찰하였다.
<h2>활성염색</h2> <p>조효소액을 SDS-PAGE한 후 polyacrylamide gel에서 SDS를 제거하기 위하여 \( 25 \% \) isopropanol를 포함한 \( 50 \mathrm { ~mM } \) phosphate 완충액(pH \( 6.0 \))으로 세척한 후 동일완충액에 \( 15-30 \)분간 방치하였다. Polyacrylamide gel을 꺼내어 동일한 완충용액에 \( 0.2 \% \) LBG와 \( 1.5 \% \) agar를 녹여 제조한 gel을 중층하여 비닐로 봉입하고 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 4 \)시간 반응시킨 후 중층한 gel을 congo red로 염색하여 분해된 부분을 관찰하였으며 polyacrylamide gel은 Coomassie brilliant blue 용액으로 염색하여 단백질을 관찰하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>증균 배양을 이용한 mannanase 생산균의 탐색과 분리균의 특성</h2> <p>된장으로부터 mannanase를 생산하는 내산성 Bacillus속 균주를 분리하기 위하여 \( \mathrm { pH } \)를 \( 4.5 \)로 조절한 LB 액체배지에 충청도 지역의 가정에서 각각 제조된 \( 25 \)점의 된장 시료를 각각 접종하여 진탕 배양한 후 추가로 \( 3 \)회 계대 배양을 실시하였다. 그 결과 마지막 계대 배양액 중에서 오직 \( 1 \)점의 시료에서만 균의 성장을 나타냈다. 이를 LB 평판배지 \( ( \mathrm { pH~ } 4.5) \)에 도말하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 2 \)일간 배양함으로써 \( 2 \)종류의 콜로니가 분리되었는뎨, 이로 보아 된장에 존재하는 내산성 세균의 종류가 적은 것으로 판단되었으며 이로 인하여 된장 시료 \( 25 \)점 중 오직 \( 1 \)점 시료의 접종액에서만 균의 성장을 보였던 것으로 추측된다. 한편 분리된 \( 2 \)개의 균주 중 YB- \( 1401 \)로 명명한 한 개의 균주가 \( \mathrm { LBG } \)를 분해하는 균주로 판명되어 이를 mannanase 생산균으로 선발하였다.</p> <p>분리균 YB- \( 1401 \)의 형태적 특성을 조사한 결과 포자를 형성하는 그람 양성 간균으로 확인되어 API \( 50 \mathrm { ~CHB } \)와 \( 20 \mathrm { E } \) kit를 사용하여 생화학적 특성을 조사하였다. Table \( 1 \)에 보인 바와 같은 YB- \( 1401 \)의 생화학적 특성을 Biomériux의 API web (https://apiweb.biomerieux.com/jsp/login.jsp)에서 다른 균 주와 비교한 결과 Brevibacillus laterosporus와 유사도( \( 61.1 \% \))가 가장 높았으며, Bacillus subtilis 및 B. amyloliquefaciens와는 \( 26.9 \% \), B. pumilus와는 \( 11 \% \)의 유사도를 보였다.</p>