본 연구는 protein kinase가 AQP4 water channel의 활성을 어떻게 조절하는지를 규명하려고 한다. 이를 위해 DNA를 competent cell에 삽입하고, 이 DNA의 band를 확인하여 이를 template로 사용한다. AQP4 cRNA는 T3 RNA polymerase를 이용하여 in vitro에서 합성되며, 이 cRNA의 OD값을 측정하여 정량화한다.
<p>따라서 본 연구는 protein kinase가 AQP4 water channel의 활성을 조절할 수 있는지, 조절한다면 실제로 어떤 protein kinase에 의해 조절되는지를 밝히고자 시행하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>1. Xenopus Oocyte에서 AQP4 cDNA의 발현</h2> <h3>가. In vitro에서 AQP4 cDNA합성</h3> <p>Expression vector 에 삽입된 DNA를 competent cell (E.coli DH-5a)에 transformation시켜 ampicllin \( 50 \mu \mathrm { s } / \mathrm { ml } \) 이든 LB agar에 plating하였다. Transform된 single colony를 LB broth \( (10 \% \mathrm { NaCl } , 10 \% \) Bacto tryptone, \( 5 \% \) yeast extract, \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { m } \ell \) ampicillin)에, inoculation 하여 overnight 배양하였다. 배양한 cell에서 miniprep protocol에 따라 plasmid DNA를 분리하였다. 이 DNA를 Bam H I 효소로 1시간 처리하여 자르고 잘린 product는 \( 1 \% \) agarose gel에 전기영동하여 200 base pair (bp), \( 1.2 \mathrm { ~kb } , 4 \mathrm { ~kb } \) 의 band로 확인하였다. 확인된 DNA는 phenol extraction하여 purity를 높였다. AQP4 cDNA \(1 \mu \mathrm { g } \) 을 Xba I으로 \(37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 90분간 자르고 proteinase K ( \( 500 \mu \mathrm { s } / \mathrm { ml } \))를 \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 30분간 처리한 뒤 phenol: chloroform : isoamylalcohol (PCI)과 chloroform으로 extract하여 3 M sodium acetate와 ethanol로 침전시켜 pellet을 diethylpyrocarbonate (DEPC)로 처리한 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 에 녹였다. 이 DNA를 \( 1 \% \) agarose gel electro-phoresis하여 \( 4.5 \mathrm { ~kb } \)의 band를 확인하고, 이것을 template로 하여 T3 RNA polymerase롤 이용하여 in virro에서 AQP4 cRNA를 합성하였다. 합성시 cRNA는 그 안정성을 높이고 Xenopus oocyte에서 protein으로 translation되는 효율을 높이기 위해 \( 5 ^ {\prime } \) end에 m7G( \(5 ^ {\prime } \))ppp } ( \(5 ^ {\prime } \))G 를 capping 시켰다. 합성된 cRNA에 RNAse free DNAse I을 처리하여 남아있는 DNA를 완전히 제거하고 위 방법과 같이 PCl와 chloroform으로 extract하여 sodium acetate와 ehtanol로 침전시켜 pellet을 DEPC로 처리한 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \)에 녹였다. 이 cRNA는 spectrophotometer에서 \( 260 \mathrm { ~mm } \)와 \( 280 \mathrm { ~nm } \)의 wave-length에서 optical density (OD)를 측정하였고 formal-dehyde agarose RNA gel에 전기영동하여 획인하고, OD값과 비교하여 정랑하였다.</p>