산업적 유용성이 높을 것으로 사료되는 Nocardiopsis sp. MMBL010 균주에 대한 방선균의 일반적인 형질전환에는 PEG-based protoplast transformation이나 electroporation 방법들이 우수한 배지로써, ISP4 배지에 (Dmannitol, yeast extract)를 첨가한 배지이며 과발현 된 균주에서는 포자의 생성이 활발히 일어나는 것이 확인되었다.
<h2>Genetic modification system via E. coli-driven conju-gation</h2> <p>산업적 유용성이 높을 것으로 사료되는 Nocardiopsis sp. MMBL010 균주에 대한 형질전환 시스템이 가능하도록 접합(conjugation) 기반의 유전자 전달 기법 구축을 시도하였다. 방선균의 일반적인 형질전환에는 PEG-based protoplast transformation이나 electroporation 방법들이 주로 활용되고 있으나, 불행히도 희소방선균에서는 기존의 방선균 플라스미드를 이용한 protoplast 법과 electroporation 법은 매우 낮은 효율을 보이는 것으로 보고되고 있다. 따라서 E. coli-Streptomyces shuttle integration plasmid(pSET152)를 이용하여 E. coli로부터 플라스미드 DNA 를 전달하는 접합 기반의 시스템을 구축하였다. 기존의 Streptomyces 계열의 방선균에서 사용되는 접합기법은 NSRA Nocardiopsis sp. MMBL010 균주 내에서는 작동하지 않음을 확인하였기에(data not shown), 본 연구실에서 접합을 통한 형질전환 방법이 검증된 NSRA 균주인 P. autotrophica 와 S. benihana 방법을 개량하여 Nocardiopsis sp. MMBL010 균주에 접합 시스템을 구축하였다. 공여세포인 대장균에 대한 준비는 기존의 방법으로 진행하였으며, 수용세포인 Nocardiopsis sp.MMBL010은 균사체(mycelia)로부터 준비하였다. Nocardiopsis sp. MMBL010 균주로부터 생성되는 agarase로 인하여 포자를 충분히 확보하기 어렵기 때문에, 액체배지에서 배양한 후 sonication을 사용하여 균사체를 풀어주었다. 준비된 두 균주 를 섞어준 후 modified ISP4 배지에서 22~24시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다. Modified ISP4 배지는 대장균의 성장이 MS 배지에서 보다 우수한 배지로써, ISP4 배지에 (Dmannitol, yeast extract)를 첨가한 배지이다. 추가적으로 수용세포인 Nocardiopsis sp. MMBL010이 공여세포인 대장균에 항생효과를 나타내기에, 두 균주를 섞어준 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 flooding 하기 전까지 배양 시킨 뒤 항생제를 이용한 선별작업을 수행하였다. 공여세포인 대장균의 성장이 우세한 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서의 전배양을 통해, 항생제에 대한 대장균의 성장이 억제되는 것을 보완함으로 효율적인 접합시스템을 구축할 수 있었다(Fig. 3).</p> <p>구축된 시스템은 방선균 이차대사산물의 생산에 putatively positive regulatory gene인 SCO5147의 발현을 통해 검증하 였다. SCO5147의 과발현은 방선균 integration vector인 ermE*pSET152를 사용하였으며(Fig. 4A, B), 이것은 primer 1 , 2 (Primer 1: 5'-TGCAGCTGGCACGACAGG-3' and Primer 2: 5'-CTGCGCCGATGGTTTCTACA-3')를 사용하여 확인하였다. SCO5147이 과발현 된 균주에서 검은색 색소의 생산이 증가되었고, empty vector만 과발현 된 균주에서는 포자의 생성이 활발히 일어나는 것이 확인되었다(Fig. 3). 비록 ECF-sigma factor인 SCO5147의 과발현에 따른 표현형의 변화에 대해서는 정확히 규명되지 않았지만, 형질전환 된 Nocardiopsis sp. MMBL010 유래 생리활성물질의 생산성 변화를 비교할 수 있었다. C. albicans와 E. coli에 대한 antimicrobial activity를 보았을 때, wild-type과 vector만이 과발현 된 균주에서 생성 된 저해환의 크기 변화는 미미하였지만, SCO5147이 과발현 된 균주에서는 더 큰 저해환이 생성함을 확인할 수 있었다 (Fig. 4C). 궁극적으로, 조절유전자인 SCO5147의 발현을 통해 Nocardiopsis sp. MMBL010의 성공적인 형질전환 시스템 구 축 및 외래 유전자의 발현을 검증할 수 있었다.</p>