효소의 활성을 피팅하는 최적 온도를 찾기 위해 다양한 온도에서 효소활성을 측정하였다. 결과적으로 exo-1,3-b-glucanase의 최적 온도는 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)로 확인되었으며, \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 이상에서는 효소활성이 크게 감소하였다. 또한, 이 효소는 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)까지 80% 이상의 활성을 유지하였다. 추가로, 이 효소의 기질특이성을 확인하기 위해 합성기질 및 천연기질에 대한 특이성도 조사하였다.
<h2>exo-1,3- \( \beta \)-glucanase의활성과안전성에 미치는 온도의 영향</h2> <p>효소활성에 미치는 온도의 영향을 조사하기 위해서 효소의 최적 \( \mathrm{pH} 4.5 \) 및 \( 30-60^{\circ} \mathrm{C} \) 의 온도 범위에서 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \) 간격으로 각 온도에서 30 분간 처리시킨 효소의 활성을 측정하였다. 그 결과, Fig.4A와 같이 정제된 exo-1,3-b-glucanase의 최적온도는 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 였으며, \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 이상에서는 효소활성이 급격히 떨어졌다. 효소의 열 안정성을 조사하기 위해서 정제된 효소를 최적 \( \mathrm{pH} 4.5 \) 및 \( 30-60^{\circ} \mathrm{C} \) 온도 범위에서 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \) 간격으로 각 온도 변화를 주면서 30 분간 방치한 후 최적온도인 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응시켜 효소의 잔존 활성을 측정하였다. 그 결과, Fig. \( 4 \mathrm{~B} \) 와 같이 exo- \( 1,3-\beta \)-glucanase는 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 까지는 \( 80 \% \) 이상의 효소 활성을 유지하였고, 그 이후에는 효소 활성이 급격하게 떨어졌다.</p> <h2>효소의 기질특이성</h2> <p>정제된 효소의 기질특이성을 확인하기 위하여 합성기질 및 천연기질에 대하여 효소의 기질 특이성을 조사하였다. 그 결과 합성기질의 경우 \( \rho \)-Nitrophenyl- \( \beta \)-D-glucopyranoside에 대해서 \( 1.12 \mathrm{U}(100 \%) \) 로 가장 높은 활성을 나타내었으며, 천연 기질의 경우 laminarin에 대하여 \( 5.40 \mathrm{U}(100 \%) \) 로서 가장 높은 활성을 나타내었고 amygdalin, esculin 및 cellobiose에 대해서 각각 \( 3.40 \mathrm{U}(63 \%), 0.16 \mathrm{U}(3 \%), 0.11 \mathrm{U} \) (2\%)의 활성을 나타내었다. 하지만 salicin에 대해서는 거의 활성을 나타내지 않았다(Table 1).</p> <h2>효소반응속도</h2> <p>정제된 재조합 exo- \( \beta \)-1,3-glucanase의 isoflavone 배당체에 대한 효소반응속도를 알아보기 위해 여러 가지 농도의 daidzin과 genistin을 각 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 와 정제된 효소 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 를 \( 440 \mu \mathrm{l} \) 의 \( 100 \mathrm{mM} \) citrate phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 4.5) \) 에 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응 후 \( 500 \mu \mathrm{l} \) 의 ethyl acetate를 첨가하여 isoflavone을 추출한 뒤 ethyl acetate층을 회수하여 methanol을 적당량 섞은 후 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 를 HPLC 분석에 이용하였다. 그 결과 정제된 재조합 exo- \( \beta \)-1,3-glucanase Daidzin 에 대한 \( K_{\mathrm{m}} \) 값은 \( 0.12 \mathrm{mM}, V_{\max } \) 는 \( 945.03 \mathrm{U} / \mathrm{mg} \) protein이었으며, genistin에 대한 \( K_{\mathrm{m}} \) 값은 \( 0.14 \mathrm{mM}, V_{\max \text { 는 }} \) \( 835.92 \mathrm{U} / \mathrm{mg} \) protein으로 나타났다(Fig. 5). 이는 기존에 보고된 Thermotoga maritima, soybean, almod emulsion 유래의 \( \beta \)-glucosidase 등에 비하여 낮은 \( K_{\mathrm{m}} \) 값과 높은 \( V_{\max } \) 를 나타낸 것으로, 재조합 exo- \( \beta \)-1,3-glucanase는 발효공학을 통한 isoflavone 배당체의 분해에 이용할 수 있는 우수한 효소라고 생각된다.</p>