본문의 실험에서 연구재료는 암컷 BALB/c 마우스를 사용하였고 복수암세포는 Sarcoma 180, 시약은 수용성 고분자 키토산과 mitomycin C, cis-platinum (II) diamine dichloride, 5-fluorouracil를 사용하였다. 암세포에 대한 세포독성효과 연구는 생명연장효과를 알아보기 위하여 본문에 제시된 방법으로 진행되었ek. 실험성적은 평균 또는 평균 pm 표준편차로 표현했고 각 군간의 통계학적 검정에는 스튜던트티이검정을 사용하였으며 P값이 0.05 미만일 때 의미있는 차로 간주하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>연구재료</h2> <h3>1) 실험동물</h3> <p>암컷 BALB/c 마우스로서 생후 8 주 내외, 체중 \( 25 \mathrm{~g} \) 내외의 것을 한국 효창 사이언스로부터 구입하여 실험에 사용하였다.</p> <h3>2) 복수암세포</h3> <p>Sarcoma 180 세포는 한국생명공학센터에서 구입하여 \( \mathrm{BALB} / \mathrm{c} \) 마우스의 복강 내에 일주일 간격으로 암세포 부유액 \( \left(1 \times 10^{6}\right. \) cells/ml) \( 1 \mathrm{ml} \) 씩을 접종하여 계대 배양하면서 수거한 암세포를 사용하였다.</p> <h3>3) 시약</h3> <p>수용성 고분자 키토산(탈아세틸화한 N-acetyl-D-gluco-samine polymer, 평균분자량 200,000-1,000,000)은 우리바이오텍사의 제품을 사용하였고, mitomycin \( \mathrm{C} \) 는 Kyowa Hakko Kogyo Co. , cis-platinum (II) diamine dichloride (cisplatin)은 보령제약, 5-fluorouracil은 Sigma Co. 의 제품을 사용하였다.</p> <h1>연구방법</h1> <h2>1) 암세포에 대한 세포독성효과</h2> <p>사람 erythroleukemia 유래의 세포주인 K562세포와 마우스 T lymphoma 세포인 Yac-1세포를 각 각 \( 25 \mathrm{~cm}^{2} \) 프라스틱 플라스크(Falcon, Oxnard, U.S.A.)에서. \( 10 \% \) 우태아혈청(fetal calf serum, FCS, Boehringer Mannheim, Mannheim, Ger-many), \( 2 \mathrm{mM} \) L-glutamine (Gibco, Grand Island, U.S.A.), \( 100 \mathrm{IU} / \mathrm{ml} \) penicillin, \( 100 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) streptomycin, \( 0.25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \amphotericin B (Gibco, Grand Island, USA)를 포함시킨 RPMI 1640 배지(complete RPMI 1640)로 부유 배양시켜 유지시켰다. 상기의 세포들을 96 wells plate에 well당 10,000 개\( (0.2 \mathrm{ml}) \) 씩 분주하고 키토산 단독처리의 경우 \( 3,10,30 \mu \mathrm{g} \) 만을 투여하였으며 여기에 기존항암제인 mitomycin C 0.1, cisplatin 0.2,5-fluorouracil \( 1.0 \mu \mathrm{g} \) 을 추가하여 복합작용의 효과를 보았다. 약제를 작용시킨 후 plate는 5\% \( \mathrm{CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C} \) 그리고 충분한 습도가 유지되고 있는 배양기에 3 일 동안 배양하였다. 배양 후에 plate의 각 well에 MTT(PBS \( 1 \mathrm{ml} \) 당 5\( \mathrm{mg} \) 의 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl- tetrazolium bromide)액 \( 10 \mu \mathrm{L} \) 씩을 적하하고 \( 4.5 \) 시간 추가 배양하였다. 시간이 경과된 후 \( 10 \% \mathrm{SDS}-0.02 \mathrm{M} \mathrm{HCl} \) 액 \( 25 \mu \mathrm{L} \) 씩을 well에 적하하여 실온과 암실조건에서 하룻밤 방치하였다. Optical density \( (\mathrm{OD}) \) 는 microplate reader (Model 550 microplate reader, Bio-Rad, Richımond, USA)를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다.</p> <h2>2) 생명연장효과</h2> <p>Sarcoma 180 세포를 PBS에 부유시킨 세포 부유액(1× \( \left.10^{6} / \mathrm{ml}\right) 1 \mathrm{ml} \) 씩을 마우스 복강 내에 주사하고 24 시간 경과시킨 후 키토산 \( 250 \mu \mathrm{g} \) 과 mitomycin C 250, 125, \( 25 \mu \mathrm{g} \) 을 복강내로 복합투여하고 일주일이 경과 후 상기의 약제를 2차 투여하였다. 마우스의 생사는 매일 관찰하였으며 100 일 동안 관찰하였다.</p> <h2>3) 통계학적 분석</h2> <p>실험성적은 평균 또는 평균 \( \pm \) 표준편차로 나타냈으며 각 군간의 통계학적 검정에는 Student's t-test를 사용하고 P값이 \( 0.05 \) 미만일 때 의의 있는 차로 간주하였다</p>