효소에 대한 \( \mathrm{pH} \) 의 영향을 알아보기 위해 \( \mathrm{pH} \)2.0부터 \( \mathrm{pH} \)11.0까지 \( \mathrm{pH} \)에 적합한 buffer를 이용하였다. 효소에 대한 온도의 영향은 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) 부터 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) 간격으로 측정하였다. \( \rho \) - nitrophenyl- \( \alpha \)-D-galacto-pyranoside(PNPG) 와 \( \rho \)-nitrophenyl - \( \beta \)-D-gluco-pyranoside(PNPG)를 사용해서 잔존효소 활성을 측정함으로써 금속이온에 대한 영향, 온도 안정성 등을 알아보았다. 효소의 \( \mathrm{Km} \) 및 \( \mathrm{Vmax} \)를 Lineweaver-Burk plot을 통해 계산하여 구했다.
<h2>\( \mathrm{pH} \) 및 온도에 대한 안정성</h2> <p>효소에 대한 \( \mathrm{pH} \) 의 영향을 알아보기 위해 \( \mathrm{pH} \) 별로 적합한 buffer를 이용하였는데 pH 2.0은 \( 0.1 \mathrm{M} \) citrateHCl buffer, \( \mathrm{pH} 3.0 \) 은 \( 0.1 \mathrm{M} \) glycineHCl buffer, \( \mathrm{pH} \) 4.0-5.0은 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium acetate buffer, \( \mathrm{pH} \) 6.0-10.0은 \( 0.1 \mathrm{M} \) TrisHCl buffer, \( \mathrm{pH} 11.0 \) 은 \( 0.1 \mathrm{M} \) glycineNaOH buffer를 이용하였다. \( \mathrm{pH} \) 안정성은 조효소액과 정제된 효소액 각각 \( 10 \mu \mathrm{L} \) 에 \( \mathrm{pH} \) 2.0-11.0의 buffer를 각각 \( 190 \mu \mathrm{L} \) 씩 가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12 시간 방치한 후 잔존효소 활성을 \( 50 \mathrm{mM} \) sodium phosphate buffer \( \left(\mathrm{pH}\right. \) 6.5)를 사용하여 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 반응하여 측정하였다. 효소에 대한 온도의 영향은 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) 부터 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) 간격으로 측정하였다. 최적반응 온도는 효소액과 기질 용액을 10 분간 반응시킨 후, 활성을 측정하였고, 온도 안정성은 효소액을 각 온도에서 30 분간 처리한 후 잔존효소 활성을 \( \rho \)-nitrophenyl- \( \alpha \)-D-galacto-pyranoside(PNPG)와 \( \rho- \) nitrophenyl- \( \beta \)-D-gluco-pyranoside(PNPG)를 사용하여 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10 분간 반응하여 측정하였다.</p> <h2>효소의 금속이온에 대한 영향</h2> <p>효소의 금속이온에 대한 영향을 알아보기 위해 \( \rho \) - nitrophenyl- \( \alpha \)-D-galacto-pyranoside(PNPG) 와 \( \rho \)-nitrophenyl - \( \beta \)-D-gluco-pyranoside(PNPG)에 \( \mathrm{Zn}^{2+}, \mathrm{Ca}^{2+}, \mathrm{Cu}^{2+}, \mathrm{Mn}^{2+} \), \( \mathrm{Mg}^{2+}, \mathrm{Co}^{2+}, \mathrm{Fe}^{2+} \) 금속이온들을 최종농도가 \( 2 \mathrm{mM} \) 이 되도록 첨가한 후 잔존효소 활성을 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 반응하여 측정하였다.</p> <h2>효소의 \( \mathrm{Km} \) 및 Vmax 측정</h2> <p>효소의 \( \mathrm{Km} \) 및 \( \mathrm{Vmax} \) 를 촉정하기 위해 농도별 기질 용액 \( [\mathrm{s}] \) 의 반응정도[v]를 측정한 후 \( 1 /[\mathrm{s}] \) 에 대해 \( 1 / \mathrm{v} \) 를 plot하는 방법인 Lineweaver-Burk plot을 그렸고 이를 통하여 \( \mathrm{Km} \) 값과 \( \mathrm{Vmax} \) 값을 계산하였다. 이때, 각 기질 농도에서의 효소 활성을 \( 50 \mathrm{mM} \) sodium phosphate buffer( \( \mathrm{pH} \) 6.5)를 사용하여 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 반응하여 측정하였다.</p> <h2>이소플라본 및 탄수화물의 함량변화</h2> <p>Soy broth medium에서 선발미생물을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48 시간동</p> <p>안 배양한 후, 배양액을 취하여 원심분리 \( (10,000 \times \mathrm{g} / 15 \mathrm{~min}) \) 하고 상등액을 취하여 동결건조하였다. 이소플라본 분석은 동결건조 시료 \( 0.5 \mathrm{~g} \) 에 \( 70 \% \) 메탄올을 \( 20 \mathrm{~mL} \) 가하여 10 분간 sonication 시키고 20 분간 진탕하였다. 그리고 \( 10,000 \mathrm{rpm} \) 에서 5 분간 원심분리하여 상등액을 취한 후 \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) membrane filter(Advantec, Japan)로. 여과하여 HPLC(Agilent 1100 series, USA) 분석을 수행하였다. Column은 Eclipse XDB-\( \mathrm{C} 18(4.6 \times 150 \mathrm{~mm}) \), mobile phase \( \mathrm{A} \) 는 \( 0.1 \% \) phosphoric acid, mobile phase \( \mathrm{B} \) 는 acetonitrile을 linear gradient하게 \( 0.8 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \) 의 flow rate으로. 용출하였으며, UV detector \( (255 \mathrm{~nm}) \) 으로 검출하였다. 탄수화물 분석은 동결건조 시료 \( 0.5 \mathrm{~g} \) 에 증류수 \( 4 \mathrm{~mL} \) 을 첨가하고 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 항온수조에서 2 시간 진탕한 후 에탄올 \( 10 \mathrm{~mL} \) 을 첨가하여 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 항온수조에서 30 분간 시료내의 당을 추출하였다. 그리고 \( 10,000 \times \mathrm{g} \) 에서 5 분간 원심분리하여 상등액을 취한 후 \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) membrane filter로 여과하여 HPLC 분석을 수행하였다. Column은 Sugar-Pak TM1 \( (6.5 \times 300 \mathrm{~mm}) \) 을 사용하여 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 로 유지하였으며, mobile phase는 water를 \( 0.5 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \) 의 flow rate 0 르로 용출하였으며, refractive index detector(Waters, USA)으로 검출하였다.</p>