검정콩과 노란콩 메주를 표준화된 방법으로 제조하고 여기에 소금과 물을 첨가하여 혼합하여 \( 32^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 2개월과 7개월 발효·숙성시켜 된장을 제조했다. 비장세포배양 상층액의 경우 미리 준비한 비장세포 \( 10 \% \) 부유액을 \( \mathrm{ml} \) 당 \( 2 \times 10^{6} \) 세포가 되도록 하여, 24 wells tissue culture plate에 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 분주한 후 시료 \( 10 \mu \mathrm{g} \)를 각각 작용시켜 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에 배양했다. 이번 실험에는 체중이 \( 25 \mathrm{g} \) 전후이고 표준사료로 사육한 마우스를 사용하였다. 대조군과 각 시료에서 얻은 실험 자료로부터 ANOVA를 구했으며 통계 분석은 Tukey honest significant difference test를 이용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료 및 시약</h2> <p>노란콩(황금콩.대립종)을 대조구로 하였고, 검정콩은 대립종(서리태◦속 파란콩)을 충남 괴산군자농협에서 시판중인것을 구입하여 사용하였다. 사이토카인 생성을 위한 실험동물은 암컷 Balb/c 마우스로서 생후 8주 내외, 체중 \( 25 \mathrm{~g} \) 내외의 것을 대한바이오링크(음성군, 충청북도)로부터 구입하여 실험에 사용하였다. Lipopolysaccharide (LPS)는 Escherichia coli (serotype 026:B6)에서 분리 정제된 표품(Sigma Cat.L8274, USA)을 사용하였다. IL-2, IL-6, TNF-\( \alpha \)를 측정하기 위한 시약은 Mouse IL-2, IL-6, TNF- \( \alpha \) ELISA kit (eBioscience, USA)을 이용하였다.</p> <h2>용매 추출 및 분획</h2> <p>표준화된 방법으로 검정콩 및 노란콩 메주를 제조한 후 소금 및 물을 첨가하여 혼합한 후 \( 32^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 2개월과 7개월 발효 및 숙성시켜 된장을 제조하였다. 각각의 된장을 동결 건조한 후 마쇄하여 시료에 20배(\(\mathrm{v} / \mathrm{w}\))의 메탄올을 첨가하여 12시간 교반을 3회 반복한 후 여과하여 회전식 진공 농축기(EYELA, Tokyo Rikakikai Co. Japan)로 농축하여 메탄올 추출물(methanol extract)을 얻었다. 이들 추출물을 dimethylsulfuroxide (DMSO)에 희석하여 실험에 사용하였다.</p> <h2>비장세포배양 상층액</h2> <p>비장세포배양 상층액 준비는 미리 준비된 비장세포 부유액을 \( 10 \% \)가 되게 소 태아혈청을 가한 RPMI 1640 (Gibco, USA) 배지로 \( \mathrm{ml} \) 당 \( 2 \times 10^{6} \) 세포가 되도록 조절하여, 24 wells tissue culture plate (Costar, USA)에 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 분주한 후 시료 \( 10 \mu \mathrm{g} \)를 각각 작용시켜 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에 배양하였다. 또한 시료 \( 10 \mu \mathrm{g} \) 및 LPS \( 1 \mu \mathrm{g} \)와의 복합작용도 함께 시험하였다. 대조군은 DMSO액을 사용하였으며 배양시간은 상기의 조건에 72시간으로 하였다. 배양이 끝난 후 전량 배양액을 수거한 다음 \( 300 \times g \)에서 10분간, \( 10,000 \times g \)에서 30분간 원침 시킨 후 그 상층액을 수거하여 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다.</p> <h2>IL-2, IL-6, TNF-\(\alpha \) 측정</h2> <p>미리 96 wells microplate에 mouse IL-2, IL-6, TNF-\( \alpha \)에 대한 capture 항체를 coating buffer에 희석하여 \( 100 \mu \mathrm{g} \) 씩을 분주한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤 방치하였다. 다음날 plate를 세척용 완충액으로 5번 세척한 후 assay diluent \( 250 \mu \mathrm{l} \)을 분주한 후 실온에서 1시간동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 5번 세척한 후 plate의 각 well에 시료 \( 100 \mu \mathrm{l} \)을 적하하여 실온에서 2시간 동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 5번 세척한 후 detection 항체 \( 100 \mu \mathrm{l} \)을 분주한 후 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 5번 세척한 후 avidin-horse-radish peroxidase액 \( 100 \mu \mathrm{l} \)을 적하하여 다시 실온에서 30분 동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 7번 세척한 후 tetrame-thylbenzidine이 포함된 기질 액 \( 100 \mu \)을 적하하여 실온에서 15분 동안 방치한 후 stop액 \( 50 \mu \)을 가하였다. Stop액 \( 50 \mu \mathrm{l}\)을 가하여 반응을 정지시켰다. Optical density는 microplate reader (Bio-Rad, Model 550, USA)를 이용하여 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다.</p> <h2>마우스를 이용한 종양전이 억제 실험</h2> <p>본 실험에 사용한 동물은 웅성 Balb/c 마우스(한국 화학연구소, 대전)로, 체중이 \( 25 \mathrm{~g} \) 전후의 것을 사용하였으며, 사료는 표준사료로 사육하였다. 사육 시 물과 사료는 충분한 양을 공급하였고, 동물 실험실은 온도 \( 22 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 55 \pm 5 \% \)를 유지하였으며, 12시간 간격으로 light-dark cycle을 유지하였다. 종양전이 억제효과를 살펴보기 위하여 폐(lung)에 대하여 전이력을 획득한 고전이성 종양세포주인 colon 26-M3.1 carcinoma cell을 \( 100 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \)의 penicillin- streptomycin과 \( 7.5 \% \)의 fetal bovine serum (FBS)이 함유된 Dulbecco's modified Eaggle's medium (DEME) 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양하였다. 배양된 각각의 암세포는 일주일에 \(2 \sim 3\)회 refeeding하고 \(6 \sim7\)일 만에 \( 0.05 \% \) trypsin EDTA로 부착된 세포를 분리하여 원심분리한 후 집적된 암세포에 phosphate buffered saline (PBS)를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 \( 100 \mu \mathrm{l}\left(2.5 \times 10^{4} \mathrm{ml}\right) \)를 Balb/c 마우스의 꼬리에 정맥 주사하였다. 각 군은 5마리로 하였으며, 시료는 종양세포접종 2일전에 피하 주사하였다. 전이된 종양의 판정은 종양접종 14일 후에 마우스를 희생시켜 종양의 표적기관인 폐를 적출한 다음, Bouin's 용액 (saturated picric acid : formalin : acetic acid = \( 15: 5: 1 \),\( \mathrm{v} / \mathrm{v} / \mathrm{v} \) )에서 전이된 종양을 고정시킨 후 종양의 군집수를 계수하였고, 시료에 의한 종양전이억제 효과는 종양만 접종한 대조군과 비교하여 측정하였다.</p> <h2>통계 분석</h2> <p>대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 자료로부터 ANOVA를 구한 후 Tukey honest significant difference test를 이용하여 통계 분석하였다.</p>