클론된 유전자의 염기서열로부터 유추된 Xyn1401과 Xyn1402의 아미노산 배열은 127번째의 Asn과 Lys을 제외하고는 모두 동일하였으며, Xyn1401과 Xyn1402를 포함하여 이와 비교된 다른 xylanases에서 이들 주요 잔기가 모두 동일하게 배열된 것으로 나타났고, pUC19의 HincⅡ 위치에 클로닝된 xyn1401과 xyn1402 유전자는 lac promoter와 동일한 방향으로 삽입되어 있었으며, 재조합 대장균을 ampicillin이 첨가된 LB 배지에서 12시간 동안 진탕 배양한 후 배양상등액과 균체파쇄상등액에 존재하는 Xyn1401과 Xyn1402의 활성을 측정한 결과 \( 94.1 \% \)와 \( 91.0 \% \)가 균체외로 분비됨이 확인되었다.
<p>클론된 유전자의 염기서열로부터 유추된 Xyn1401과 Xyn1402의 아미노산 배열은 127번째의 Asn과 Lys을 제외하고는 모두 동일하였다. SignalP4.1 프로그램으로 분석한 결과 두 효소의 signal peptide는 아미노 말단의 28개 아미노산으로 동일하게 구성된 것으로 예측되었다. 재조합 대장균의 배양상등액으로부터 정제된 Bacillus sp. YJ6의 xylanase는 아미노 말단 배열이 ASTDYWQN로 보고되었으며, 이 배열은 Xyn1401과 Xyn1402의 signal peptide 바로 다음에 배열된 AGTDYWQN에 해당하였다. 그러므로 SignalP4.1 프로그램으로 예측된 Xyn1401과 Xyn1402의 signal peptide는 타당한 것으로 판단된다. Xyn1401과 Xyn1402의 아미노산 배열을 NCBI database에서 다른 단백질의 아미노산 배열과 비교한 결과 GH11에 속하는 xylanase와 매우 높은 상동성을 보였으며, 동일한 배열을 갖는 xylanase도 확인되었다. 상동성이 높은 xylanase는 대부분이 유전체 서열로부터 유추된 것으로 효소 특성에 대해서는 보고되지 않은 실정이다. 그러므로 아미노산 배열의 차이와 효소 반응특성 사이의 관계를 비교하기 위해 효소에 대한 연구가 진행된 xylanase의 아미노산 배열을 Xyn1401과 Xyn1402와 비교하였다. Signal peptide 부분을 제외하고 mature 단백질 부분만을 기준으로 하였을 때 Xyn1401과 Xyn1402의 아미노산 배열은 B. amyloliquefaciens CH51 (1/0 잔기), B. subtilis cho40 (3/2 잔기), B. subtilis AMX-4 (3/4 잔기), Bacillus sp. YA-14 (5/4 잔기), B. subtilis (6/5 잔기), B. subtilis ABGx (6/5 잔기), Bacillus sp. BP-7 (9/9 잔기), Bacillus sp. YJ6 (11/10 잔기)과 B. licheniformis MS5-14 (16/16 잔기)의 xylanase와 차이가 있었다. 한편 GH11에 속하는 xylanase의 활성잔기가 B. circulans의 xylanase에서 106Glu와 200Glu로 보고되었으며, B. subtilis의 xylanase는 Q7H/N8F/S179C 변이 또는 Q7H/G13R/S22P/S179C 변이에 의해 열안정성이 크게 향상되어 이들 아미노산 잔기 지점이 효소의 열안정성과 관련성이 있는 것으로 확인되었다. Xyn1401과 Xyn1402를 포함하여 이와 비교된 다른 xylanases에서 이들 주요 잔기가 모두 동일하게 배열된 것으로 나타났다.</p> <p>pUC19의 HincⅡ 위치에 클로닝된 xyn1401과 xyn1402 유전자는 lac promoter와 동일한 방향으로 삽입되어 있었으며, 이들 재조합 플라스미드를 함유한 E. coli DH5a 형질전환주를 배양하여 xylanase를 생산하였다. 재조합 대장균을 ampicillin이 첨가된 LB 배지에서 12시간 동안 진탕 배양한 후 배양상등액과 균체파쇄상등액에 존재하는 Xyn1401과 Xyn1402의 활성을 측정한 결과 \( 94.1 \% \)와 \( 91.0 \% \)가 균체외로 분비됨이 확인되었다. 이러한 결과는 재조합 대장균에서 생산되는 YB-1401과 YB-1402의 mannanase가 대부분 균체내에 존재하는 것과는 크게 달랐다. Xyn1401과 Xyn1402의 특성을 조사하기 위해 재조합 대장균의 배양상등액을 ammonium sulfate \((30-70 \%) \)로 처리한 후 침전된 단백질을 \( 10 \mathrm { mM } \) sodium phosphate \( ( \mathrm { pH } ~6.0) \) 완충액으로 투석하여 조효소액을 제조하였다. Xylanase 활성을 측정하기 위해서 OSX \((0.5 \%) \)와 \( 50 \mathrm { mM } \) sodium phosphate 완충액 \( ( \mathrm { pH } ~6.0 \) 또는 6.5)를 포함한 반응액에 조효소액을 첨가하고 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 15분 동안 반응을 수행한 후 생성된 환원당을 DNS 방법으로 결정하였다. 반응 \( \mathrm { pH } \)에 따른 xylanase 활성을 조사하기 위해서는 반응온도를 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 고정하고 반응액 \( \mathrm { pH } \)를 달리하여 반응을 수행한 후 생성된 환원당을 정량하였으며 완충액으로는 \( 50 \mathrm { mM } \) sodium citrate \( ( \mathrm { pH } 4.0-6.0) \), \( 50 \mathrm { mM } \) sodium phosphate \( ( \mathrm { pH } 6.0-8.0) \)와 Tris \( ( \mathrm { pH } 8.0-9.0) \)가 사용되었다. Xyn1401은 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)와 \( \mathrm { pH } 6.0 \), Xyn1402는 \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \)와 \( \mathrm { pH } 6.5 \)에서 각각 최대 활성을 보여 두 효소간에 최적 반응 조건이 차이를 보였다. 카르복실 말단에 hexahistidine이 융합된 형태로 재조합 대장균으로부터 생산된 B. amyloliquefaciens CH51의 xylanase는 Xyn1402와 동일한 배열을 갖는 효소이지만 \( \mathrm { pH } 4.0 \)과 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 최대활성을 갖는 것으로 보고되어 Xyn1402와 매우 큰 차이를 보였다. 이는 hexahistidyl 잔기가 융합된 때문일 수 있으나 다른 효소들의 경우 이와 같이 큰 변화를 일으킨 예가 보고된 바 없었다. Paenibacillus sp. DG-22의 xylanase는 카르복실 말단에 hexahistidine이 융합되어도 유사한 아미노산 배열을 갖는 xylanase와 비교하였을 때 최적 반응온도와 \( \mathrm { pH } \)가 거의 동일한 것으로 보고되었다. Xyn1401이나 Xyn1402와 아미노산 배열이 유사한 B. subtilis CXJZ ( \( \left . \mathrm { pH } 5.8,60 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ), \) B. subtilis cho40 ( \( \left . \mathrm { pH } 6,60 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \), Bacillus sp. YJ6 ( \( \mathrm { pH } 5.0 \), \( \left .50 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \), B. subtilis AMX-4 ( \( \left . \mathrm { pH } 6-7,50-55 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \), B. licheniformis MS5-14 \( \left ( \mathrm { pH } 6,40-45 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \)와 Bacillus sp .BP-7 \( \left ( \mathrm { pH } 6,60 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \)의 xylanase는 최적 반응조건이 약간씩 차이를 보였다.</p>