전국의 성인 20명의 소변 시료를 대상으로 ELISA 방법을 통해 요중의 AFM1 농도를 측정하고 HPLC-FLD에 의한 결과와 비교 분석하였다. 소변은 원심분리한 후 원심진공농축기로 농축시킨 후, \( 450 \mathrm { ~nm } \) (reference wave-length \( 620 \mathrm { ~nm } \) ) 파장에서의 흡광도를 측정한 뒤 측정된 흡광도를 환산하여 요중 AFM1 농도를 산출하였다.
<p>본 연구에서는 competitive ELISA가 요중 AFM1 농도 측정에 적합한 방법인지를 판단하기 위하여 HPLC-FLD 방법과의 특성을 비교, 평가해 보고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>대상자</h2> <p>2011년 실시한 식약청의 유해물질 안전관리 통합노출평가 기반 연구사업의 일환으로 전국의 성인을 대상으로 확률표본 추출하여 수집한 시료 중 HPLC 방법으로 요중 AFM1이 검출된 20명의 소변 시료를 대상으로 ELISA 방법을 이용하여 요중 AFM1의 농도를 측정하였으며 이를 HPLC-FLD 방법에 의한 결과와 비교 평가하였다.</p> <h2>소변시료 농축</h2> <p>competitive ELISA 분석을 위한 소변은 원심분리기(Hanil, Union 32R Plus)를 이용하여 \( 3,000 \mathrm { ~g } \) 로 15 분간 원심분리 하였다. 상층액 \( 2 \mathrm { ml } \) 를 원심진공농축기(Hanil, Modul 4080C)로 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 약 500 \( \mu \mathrm { l } \) 될 때까지 농축시켰다. 남은 용액을 \( 10,000 \mathrm { rpm } \) 으로 10 분 동안 원심분리한 후 상층액 270 \( \mu \mathrm { l } \)에 10 \( \times \\) PBS 를 가하여 총 300 \( \mu \mathrm { l } \)를 만들었다. 농축배율은 농축 전후에 소변의 무게를 측정하여 산출하였다. 한편, HPLC-FLD 분석 방법으로 요중 AFM1의 농도를 측정하기 위하여 소변 시료</p> <p>\( 3 \mathrm { ml } \) 를 면역친화컬럼(VICAM, USA)에 통과시킨 후 \( 10 \mathrm { ml } \) 의 PBS로 세척하였다. 세척이 끝나면 methanol과 acetonitrile이 2:3의 비율로 혼합된 용매 \( 0.5 \mathrm { ml } \) 로 먼저 추출한 후 동량의 물로 다시 한번 추출하여 최종 \( 1 \mathrm { ml } \) 의 용액을 만든 후 HPLC로 분석하였다(Fig. 1).</p> <h2>경쟁적 효소면역측정법(Competitive ELISA)</h2> <p>경쟁적 효소면역측정법으로 요중 AFM1의 농도를 산출하기 위하여 이미 상품화 되어있는 AFM1용 kit (Immunolab \( \mathrm { GMBH } \), Kassel, Germany)를 사용하였다. 간략히 방법을 기술하면, 항원이 부착되어 있는 well에 농축한 소변시료와 표준시료 \( 0 \mathrm { pg } / \mathrm { ml } , 10 \mathrm { pg } / \mathrm { ml } , 50 \mathrm { pg } / \mathrm { ml } , 100 \mathrm { pg } / \mathrm { ml } \) 를 100 \( \mu \mathrm { l } \)씩 넣고 곧바로 1 차 항체를 50 씨씩 넣었다. 잘 혼합하여 실온에서 60 분간 방치한 후 well 내의 혼합물을 버리고 세척용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 conjugate solution을 well 당 100 \( \mu \mathrm { l } \)씩 넣고 실온에서 다시 60 분간 반응 시켰다. 반응이 끝난 후 well 내의 혼합물을 버리고 세척용액으로 3회 세척하였으며 세척이 끝난 plate에 기질용액을 well 당 100 \( \mu \mathrm { l } \)씩 넣고 빛을 차단한 실온 상태에서 5 분간 방치하였다. 반응 후 stop solution을 100 \( \mu \mathrm { l } \)씩 넣어주어 반응을 종료하고, \( 450 \mathrm { ~nm } \) (reference wave-length \( 620 \mathrm { ~nm } \) ) 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 환산하여 요중 AFM1 농도를 산출하였다. 측정된 시료의 흡광도가 표준시료 \( 0 \mathrm { pg } / \mathrm { ml } \) 의 흡광도보다 높은 경우는 불검출 시료로 판정하였다.</p>