본 장에서는 3T3-L1 세포가 Adipogenesis가 진행될 때 shikonin이 주는 영향을 확인하기 위해서 실험 재료 및 방법에 대해 서술하였다. 3T3-L1 세포 배양을 위해 DMEM에 calf serum, streptomycin, penicillin과 함께 세포 배양기에서 배양하였다. 3T3-L1 세포가 Adipogenesis 될 때 분화 유도 배지와 분화 유지 배지에 shikonin을 함께 처리하였다. 배양된 세포의 Total RNA는 acid-phenol 추출법을 이용한 RNeasy kit를 사용하여 분리 정제되었다. Total RNA는 역전사 하여 Real-time PCR 장비를 사용하여 진행되었다. Shikonin이 첨가된 군과 첨가되지 않은 군 사이의 비교에 대한 통계의 유의성은 unpaired t-test에 의해 검증되었다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포 배양 및 시약</h2><p>실험에 사용된 3T3-L1 세포(preadipocyte)는 ATCC(American type culture collection, Manassas, VA, USA)에서 구입하여 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에 \( 10 \% \) calf serum, \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) streptomycin, and 100units/\(\mathrm{ml} \) penicillin과 함께 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 세포 배양기에서 배양하였다. Shikonin은 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서 구입하였고 다른 시약들은 Sigma Chemical Co. (St.Louis, MO)에서 구입하였다.</p><h2>Adipogenesis 유도</h2><p>3T3-L1 세포는 phosphate buffered saline (PBS) 용액으로 씻어준 후, \( 1 \sim 2\times 105 \)cells\( / \mathrm{ml} \)을 6 well-plate에 세포밀도가 \( 100 \% \)가 될 때까지 배양하였다. 2일 후(day 0), \( 10 \% \) fetal bo-vine serum (FBS)이 첨가된 DMEM에 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) insulin, \( 0.25 \) \( \mu \mathrm{M} \) dexamethasone 그리고 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 3-isobutyl-1-meth-ylxanthine이 처리된 differentiation-induction medium (분화 유도 배지)로 교체하여 48시간 처리하였다. 그 후 2일 간격으로 \( 10 \% \mathrm{FBS} \)가 첨가된 새 배지에 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) insulin이 처리된 differentiation-maintenance medium (분화 유지 배지)로 교체되었다. Adipogenesis가 진행될 때, shikonin이 주는 영향을 확인하기 위해, 분화 유도 배지와 분화 유지 배지를 첨가할 때 shikonin을 함께 처리하였다.</p><h2>Total RNA 추출</h2><p>Total RNA는 acid-phenol 추출법을 이용한 RNeasy kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 제시된 편람에 따라 분리 정제되었다. 추출된 total RNA는 분광광도계를 이용하여 optical density (OD)값을 측정하고 역전사(reverse tran-scription) 반응을 진행할 때까지 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다.</p><h2>Real-Time polymerase chain reaction (PCR)</h2><p>\( 1 \mu \mathrm{g} \)의 total RNA는 cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA)를 이용하여 역전사 하였다. Real-time PCR은 7000 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) 장비를 사용하여 진행되었다. PCR은 다음의 조성으로 최종 반응 부피를 \( 20 \mu 1 \)로 준비하여 3반복 하였다: TaqMan gene expression master mix, \( 250 \mathrm{nM} \) TaqMan Probe, \( 2 \mu \mathrm{M} \)의 각 primer 그리고 \( 2 \mu \mathrm{l} \)의 cDNA. 적정 조성으로 흔합된 반응물질은 효소를 활성화시키기 위해 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시킨 후 다음의 과정으로 40 싸이클을 진행하였다: \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분. Real-Time PCR에 사용된 primer는 Applied Biosystems 사의 assay on demand gene expression 제품을 구매하여 사용하였다. Endogenous control는 Gustafson과 Smith를 참고로 18S rRNA를 사용하였다. 각 샘플에 대한 표적유전자의 mRNA 수준은 충분히 발현된 18S rRNA에 의해 표준화되었고, 표준화 된 샘플들의 값은 전지방세포(day 0)의 값을 기준으로 Ct method에 의해 비교되었다.</p><h2>Statistical analysis</h2><p>모든 실험결과는 SPSS ver. \( 14.0 \) 프로그램(SPSS, Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균(mean) \( \pm \) 표준오차(S.E.)로 나타냈다. Shikonin이 첨가된 군과 첨가되지 않은 군, 두 군 사이의 비교에 대한 통계의 유의성은 unpaired t-test에 의해 검증되었다.</p>