B16F10 melanoma 세포를 \( 2 \times 10 ^ { 5 } \) cells \(/ \)well 농도로 6-well plate에 배양하여 24시간 동안 성장시켰다. 이후 fucoidan과 \( \alpha- \)MSH를 사용하여 외부 자극을 가했고, 과생성 멜라닌 및 tyrosinase 활성도를 측정하는 실험을 수행했다. 또한, BSA를 표준 단백질로 사용하여 polyacrylamide gel 전기영동을 통해 단백질을 정량하고 분석하였다.
<h2>B16F10 melanoma cell내의 tyrosinase 활성도 측정</h2> <p>6-well plate에 well 당 \( 2 \times 10 ^ { 5 } \) cells \(/ \)well 농도로 접종한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) incubator에서 24시간 동안 배양을 하였다. 배지를 제거하고 fucoidan이 1, 10, 20, 50 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도로 희석 된 배지로 교체한 후 48시간을 배양하였다. 그 후 배지를 제거한 세포를 PBS로 2번 세척하고, \( 1 \% ~( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) Triton X-100을 함유한 \( 100 \mathrm { mM } \) sodium phosphate ( \( \mathrm { pH } \) 6.8) 을 \( 100 ~ \mu \mathrm { l } \) 넣고 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30분 용해시킨 후, 12,000 \( \mathrm { rpm } \)에서 30분 동안 원심 분리하여 얻은 상등액을 tyrosinase 활성도 측정에 사용하였다. 상등액 \( 40 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)와 \( 100 \mathrm { ~mM } \) sodium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } \) 6.8)에 녹인 \( 2 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) L-DOPA \( 160 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 를 첨가하여 1시간 동안 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) incubator에서 배양하였다. 반응이 끝난 후 tyrosinase에 의해 DOPA로부터 형성되는 DOPA chrome의 양을 \( 490 \mathrm { ~nm } \)에서 측정하여 상대적 tyrosinase 활성으로 나타내었다.</p> <h2>\( \alpha- \)MSH 에 의한 과생성 멜라닌 생성량 및 tyrosinase 활성도 측정</h2> <p>외부 자극에 대한 B16F10 melanoma 세포 내 과생성 멜라닌과 tyrosinase의 활성도에 대하여 fucoidan이 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 외부 자극제로 \( \alpha- \)MSH를 사용하였으며 실험방법은 B16F10 melanoma 세포의 멜라닌 생성량 측정 및 tyrosinase 활성도 측정과 동일하게 시행하였다.</p> <h2>Polyacrylamide gel에서 tyrosinase 활성 측정</h2> <p>B16F10 melanoma 세포를 6-well에 \( 2 \times 10 ^ { 5 } \) cells \(/ \)well로 분주한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) incubator에서 배양하였다. 24시간 후에 \( \alpha- \)MSH가 포함된 배지에 fucoidan을 1, 10, 20 및 50 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도로 희석하여 교체한 다음 48시간 동안 배양하였다. 그 후 배지를 제거한 세포를 PBS로 세척하고, \( 1 \%~( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) Triton X-100을 함유한 \( 100 \mathrm { ~mM } \) sodium phosphate \( ( \mathrm { pH } \) 6.8)을 \( 100 \mu \mathrm { l } \) 넣고 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30분 동안 반응시킨 후 12,000 \( \mathrm { rpm } \)에서 30분 동안 원심 분리하여 얻은 상층액은 tyrosinase 효소원으로 사용하였다. BSA를 표준 단백질로 이용하여 단백질을 정량하고 SDS \(-10 \% \) polyacrylamide gel에서 일정량의 단백질과 sample loading buffer 혼합액을 전기영동 하였다. 얻어진 gel을 \( 200 \mathrm { ~ml } \) 의 \( 100 \mathrm { ~mM } \) sodium phosphate buffer에 넣고 상온에서 30분 동안 가볍게 흔들어준 후 새로운 용액으로 교환하고 한 번 더 세척하였다. 그리고 \( 10 \mathrm { mML } -DOPA 용액을 넣고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 2시간 이상 반응시켜 나타나는 갈색의 밴드를 확인하였다.</p>