Leucocin A 유전자를 클로닝하기 위한 숙주 세포로는 대장균 세포\( ( \) E.coli DH5 \(\alpha\))가 이용되었다. Leucocin A 유전자가 포함된 재조합 DNA를 대장균에 형질전환시킨 다음에 발현 플라스미드 pAUR-LeucoA를 효모세포에 다시 형질전환시켰다. 형질전환이 완료된 효모세포는 aureobacidin A가 포함된 YPD 배지에서 3일 동안 배양하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>시약 및 배지</h2><p>제한효소, T4 polynucleotide kinase, DNA ligation kit ver. 2, Taq DNA polymerase는 Takara Korea (Seoul, Korea)에서 구입하였다.</p><p>유전자 클로닝을 위한 숙주로는 대장균 세포 \( ( \) E. coli DH5 \(\alpha\))를 사용하였다. 대장균은 LB 배지 ( \( 1 \% \) bacto tryptone, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 0.5 \% \mathrm{NaCl} \) )를 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다. 대장균 형질전환체의 선별을 위해서는 LB 배지에 ampicillin이 최종농도가 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 가 되게 첨가하여 사용하였다. 고체배지는 LB 배지에 한천 (agar)을 \( 1.5 \% \)가 되도록 첨가하여 제작하였다.</p><p>효모의 배양에는 YPD 배지 (\(1\%\) yeast extract, \( 2 \% \) polypeptone, \( 2 \% \) D-glucose)를 사용하였다. 효모의 발현 플라스미드는 alcohol dehydrogenase promoter(ADH)에 의해 발현이 유도되는 pAUR123 (Takara Korea, Seoul Korea)을 사용하였다. 효모의 형질전환에는 yeast transformation system (Clontech, USA)을 이용한 lithium acetate 법을 사용하였다. 형질전환된 효모의 선별에는 YPD 배지에 aureobacidin A (Takara Korea, Seoul Korea)를 최종농도가 \( 0.2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)가 되게 첨가한 배지를 사용하였다.</p><h2>박테리오신 유전자의 합성 및 효모발현 플라스미드의 제작</h2><p>개시코돈과 종지코돈을 포함하는 \( 117 \mathrm{bp} \) 길이의 leucocin A유전자를 효모발현 벡터에 삽입하기 위해 leucocin A 유전자의 상류부위와 하류부위에 해당하는 oligo DNA를 각각 합성하였다. Leucocin A 유전자의 용이한 클로닝을 위하여 leucocin A 유전자의 5' 부위에 해당하는 합성 oligo DNA에는 개시코돈인 ATG와 제한효소 XhoI 부위를, 3' 부위에 해당하는 합성 oligo DNA에는 종지코돈인 TAA와 제한효소 XbaI부위를 도입하여 제작하였다. 합성된 두 가닥의 oligo DNA들을 서로 annealing하여 이중쇄 DNA를 만들고 이를 인산화시킨다. 각각 절반씩 제작된 leucocin A를 코드하는 이중쇄 유전자 단편들을 효모 발현 벡터인 pAUR123의 XhoI 부위와 XbaI 부위에 연결한다. 이렇게 제작된 재조합 DNA를 대장균 (DH5\(\alpha\))에 형질전환시킨 후, 이로부터 플라스미드 DNA를 분리하고 제한효소를 이용하여 재조합 DNA를 확인하였다. 이렇게 제작된 leucocin A를 발현하는 효모용 플라스미드는 pAUR-LeucoA (7,099 bp)라고 명명하였다.</p><h2>Leucocin A 유전자를 도입시킨 효모세포의 제조</h2><p>발현 플라스미드 pAUR-LeucoA를 yeast transformation system (Clontech, USA)을 이용한 lithium acetate 법에 의해 효모세포 (Sacchromyces cerevisiae, ATCC 9763)에 형질전환시켰다. 형질전환이 이루어진 효모세포는 YPD 배지에 aureobacidin A (최종농도 \( 0.2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) )가 첨가된 선별배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일간 배양하였다.</p>