폐글리세롤을 고부가가치 유용물질로 전환하는 공정 개발은 바이오디젤 생산 활성화와 생산단가 절감에 도움이 될 것이다. 이를 위해 폐글리세롤 내 독성 물질에 대한 미생물의 저항성을 높여야 한다. 본 연구팀은 폐글리세롤에 포함된 퍼록사이드가 미생물 생장을 저해하는 주요 성분임 을 밝혔으며, 트레할로스 생합성 오페론 \( (o t s B A) \) 발현이 폐글리세롤에 대한 미생물의 저항성을 향상시키는지 여부를 확인하였다. 또한, 아미노레블린산(ALA) 생합성 유전자와 공동 발현을 통해 폐글리세롤을 탄소원으로 사용하여 ALA를 대량 생산하는 미생물 공정 개발이 본 연구의 주목표이다.
<h1>서론</h1> <p>지속 가능한 친환경 대체 연료인 바이오디젤은 국내·외적으로 생산량이 꾸준히 증가하고 있다. 바이오디젤 생산공정에서 부산물로 발생되는 폐글리세롤 용액에는 지방산염(약 20%), 반응 후 분리되지 않은 메탄올(약 11%) 및 염(나트륨 또는 칼륨) 등의 불순물들이 상당 양 존재한다. 최근 들어 폐글리세롤이 과잉으로 발생하여 이를 정제하여 판매하는 것이 가격 경쟁력을 상실하고 있을 뿐만 아니라 새로운 환경오염 유발원으로 대두되어 바이오디젤 생산이 위축되는 상황으로 변하고 있어 미국을 포함한 전 세계적으로이의 처리 방안을 고심하고 있다. 따라서 폐글리세롤을 고부가가치 유용물질로 전환하는 공정을 개발한다면 폐글리세롤의 새로운 활용방안 창출을 통한 생산단가 절감은물론 바이오디젤 생산의 활성화를 유도할 수 있다. 폐글리세롤을 미생물 발효용 기질로 사용하여 바이오 연료(케미컬)생산을 위한 많은 시도가 있었으나, 다른 탄소원을 사용하는 경우에 비하여 발효기간이 길고 생산성이 낮다. 이는 폐글리세롤에 존재하는 불순물들이 미생물들의 생장을 억제하기 때문이다: 폐글리세롤 용액 중에 존재하는 염 성분 들은 폐글리세롤 용액의 삼투압을 높이고, 지방산 염은 그 자체가 독성물질로 작용하여 미생물의생장을 저해한다. 고온의 바이오디젤 생산공정에 서 오일 또는 지방산 산화로 생성된 퍼록사이드가 폐글리세롤에 존재하는데, 퍼록사이드는 세포막의 지질과산화반응(lipid peroxidation)을 촉진하여 세포막의 붕괴, 막 단백질 응집 유도를 통한 비활성화, 호흡사슬 교란을 통한 세포 사멸을 촉진시킨다. 폐글리세롤을 멸균하는 과정에서불순물로 포함된 지방산 염의 산화로 퍼록사이드 생성이 더욱 촉진되기 때문에 멸균된 폐글리세롤에는 다량의 퍼록사이드가 존재한다. 간단한 열처리만으로도 폐글리세롤 중의 메탄올을 쉽게 제거할 수 있고 대장균을 포함한 많은 미생물들이 메탄올에 어느 정도 내성이 있기 때문에 미생물배양에 있어서 폐글리세롤에 존재하는 메탄올은 크게 문제되지 않는다. 결국 폐글리세롤에 포함된 염(나트륨 또는칼륨), 퍼록사이드, 지방산의 독성으로 인해 대장균을 비롯한 대부분의 미생물의 대사가 교란되어 세포생장이 심각하게 저해 받을 수 있다. 따라서 폐글리세롤을 미생물의 탄소원으로 사용하기 위해서는 이러한 독성 물질들에 대한 생산균주의 저항성을 높이는 것이 필수적이다</p> <p>트레할로스는 두 개의 글루코오스가 \( \alpha-\alpha \)-1,1-glycosidic linkage(글리코시딕 결합)로 연결되어 있는 비환원성 이당류이다. 일반적으로, 대장균(E. coli), 효모균(Saccharomyces cerevisiae), 코리네박테리움균(Corynebacterium sp.), 피로피온산 페르덴레이치균(Propionibacterium freudenreichii) 등의 미생물들이 열, 삼투압, 에탄올 등에 노출되어 극심한 스트레스 상황에 직면해 있을 때, 트레할로스가 세포 내에서 생합성/축적되어 이들 미생물들을 보호하는 것으로 알려져 있다. 본 연구팀은 베타-카로틴을 생합성하는 재조합 대장균 배양에서 퍼록사이드, 지방산, 및 폐글 리세롤을 고농도로 첨가한 배지에서 대장균 유래 트레할로 스 생합성 오페론 \( (o t s B A) \)을 발현시킨 균주가 대조군 균주에 비하여 생장저해 없이 고농도의 베타-카로틴을 생합성 하는 것을 확인하였고 폐글리세롤에 포함된 불순물들 중 퍼록사이드가 미생물 생장을 저해하는 주요 핵심 성분임을 규명하였다. 그러나 대조군으로 사용된 재조합 대장균이 생합성 하는 베타-카로틴이 활성산소를 포함한 과산화물을 제거하는 항산화 물질로 작용하기 때문에 폐글리세롤의 독성완화에 미치는 트레할로스의 영향을 정확히 평가하는 데 한계가 있었다.</p> <p>본 연구는 세포 내 트레할로스 생합성 오페론 \( (o t s B A) \) 발현이 폐글리세롤에 대한 미생물의 저항성을 향상시키는지여부를 조사하고 아미노레블린산(aminolevulinic acid, ALA)생합성에 관여하는 유전자와 공동발현을 통해 폐글리세롤을탄소원으로 사용하여 생장저해 없이 ALA를 대량생산하는미생물공정을 개발하는데 그 목적이 있다. ALA는 피부에 국소적으로 흡수시키면 비정상적인 세포에만 반응하여 광감각제인 프로토포피린(protoporphyrin)으로 변환/축적되고 여기에 특정파장의 빛을 조사하면 비정상세포의 궤사를 촉진시킨다. 이러한 특징 때문에 ALA는 광역동 치료요법(PDT,photodynamic Therapy)에 사용된다. 뿐만 아니라 ALA는제초제 또는 인체에 무해한 살충제로도 사용이 가능하다. 산업적 중요성으로 인하여 ALA를 대량생산하기 위한 생물공정개발 연구가 많이 이루어지고 있으나, 폐글리세롤을 기질로 사용하여 ALA를 생산하기 위한 미생물및 공정 개발에 대한 예는 전혀 보고된 바 없다.</p> <p>본 연구에서는 아미노레블린산(aminolevulinic acid, ALA)을 생합성하는 재조합 대장균에 \( (o t s B A) \)를 추가적으로 도입한 균주를 제작하고, 이를 폐글리세롤이 첨가된 배지에서 배양하며 세포생장 및 ALA 생산량을 측정하여 이를 대조군 균주의 배양결과와 비교하였다. 재조합 균주의 otsBA 발현을최적화 하기 위하여 IPTG의 적정 첨가량 및 첨가시기를 결정하였다.</p>