FS, FYA의 배양된 세포를 모아서 3,000 rpm으로 5분간 원심 분리하고 상층액을 버리고 세포들만 모운 후 PBS로 세척 후 CycleTEST Plus DNA Reagent Kit를 사용하여 PI 염색을 하여 암실에서 30분 동안 반응을 확인하였다. 상기 조건에서 AGS 세포를 TRIzol reagent에서 1시간 동안 처리하여 RNA를 분리하였다. 적당량이 lysis buffer를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 반응시키고, \( 14,000 \mathrm{rpm} \) 으로 30분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었다.
<h2>Flow cytometry 분석</h2> <p>FS 및 FYA를 농도별로 처리한 배지에서 배양된 세포를 모아서 3,000 rpm으로 5 분간 원심 분리하여 상층액을 버리고 세포들만 모은 후 PBS로 충분히 세척 후 CycleTEST Plus DNA Reagent Kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하여 고정 및 propidium iodide (PI) 염색을 하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), 암실에서 30 분 동안 반응을 시켰다. 염색된 세포를 \( 35-\mathrm{mm} \) mesh를 이용하여 단일세포로 분리한 후 FACSCalibur (Becton Dickinson)를 이용하여 형광반응에 따른 Cellular DNA content 및 histogram을 Cell Quest software 및 ModiFit LT (Becton Dickinson) 프로그램을 이용하여 분석하였다.</p> <h2>Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 분석</h2> <p>상기한 조건에서 배양된 AGS 세포를 회수하여 PBS로 세척하고, TRIzol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 동안 처리하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, 각각의 primer (Table 1), DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭하였다. 각 \( \mathrm{PCR} \) 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하여 \( 1 \mathrm{X} \) TAE buffer로 \( 1 \% \) agarose gel을 만들고 well 당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 loading 한 후 \( 50 \mathrm{~V} \) 에서 전기영동을 행하였다. 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 EtBr을 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하고 Picture works' photo enhancer를 이용하여 사진 촬영을 하였다. 이 때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH 유전자를 internal control로 사용하였다.</p> <h2>단백질의 분리, 전기영동 및 Western blotting</h2> <p>위와 동일한 조건으로 FS 및 FYA를 처리한 배지에서 자란 준비된 세포들을 모은 후 PBS로 씻어내고, 적당량의 lysis buffer\( [25 \mathrm{mM} \) Tris-Cl (pH 7.5), \( 250 \mathrm{mM} ~\mathrm{NaCl}, 5 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 1 \% \) NP-40, \( 1 \mathrm{mM} \) phenylmethylsulfonyfluoride (PMSF), 5 \( \mathrm{mM} \) dithiothreitol (DTT)]를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 반응시킨 후, \( 14,000 \mathrm{rpm} \) 으로 30 분간 원심분리하여 그 상충액을 취하였다. 상층액의 단백질 농도를 Bio-Rad 단백질 정량시약 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 사용방법에 따라 정량한 다음 동량의 Laemmli sample buffer (Bio-Rad)를 섞어서 sample을 만들었다. 이렇게 만든 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기 영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA 으로 전이시킨 후, 비특이적인 단백질과의 결합을 막기 위해 5\% skim milk를 함유한 PBS-T \( (0.1 \% \) Tween 20 in PBS)를 일정시간 처리하였다. 처리된 membrane에 1 차 항체를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 overnight 시킨 후 PBS-T로 세척하고 처리된 1 차 항체에 맞는 2 차 항체를 사용하여 상온에서 1 시간 정도 반응 시켰다. 다시 PBS-T로 세척하고 enhanced cheilumino-scence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp., Arlignton Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 암실에서 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다. 본 실험에 사용된 1 차 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc.에서 구입하였으며, PBS-T에 약 1:500으로 희석하여 사용하였다. 또한, immunoblotting을 위해 2 차 항체로 사용된 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulin 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulino Amersham Life Science Corp.에서 구입하였다.</p>