Bacillus subtilis와 형태와 크기가 비슷하고 agar 분해 효소를 생산하며 Paenibacillus의 전형적인 swarming 운동 형태를 나타낸 CK214 균주의 편모를 관찰한 결과, LB agar 평판배지에서 배양한 경우 단일 세포 주위로 여러 개의 주모성의 편모가 나타났지만 LB 액체배지에서 배양한 경우는 agar 고체표면 조건에서 나타났던 주모성 편모가 관찰되지 않았다. CK214 균주의 agar 분해 활성이 운동성에 어떠한 영향을 끼치는지 연구하기 위해 agar 분해 효소를 암호화 하는 유전자를 찾는 작업과 동시에 random mutagenesis를 통한ADM 균주의 구축 작업을 진행하였고 최종적으로 4개의 ADM 균주를 선별하였다. 이 ADM 균주들과 CK214 야생형 균주의 운동성을 LB agar 평판배지에서 비교한 결과, CK214 야생형 균주는 높은 운동성을 나타내었지만 4개의 ADM 균주는 모두 운동성이 급격히 감소하여 agar 이용성이 CK214의 운동성에 직/간접적으로 관여하고 있다는 것을 보여줬다.
<p>내생포자를 형성하는 그람양성의 호기성 박테리아인 Paenibacillus는 환경에서 여러 분해 효소를 생산하며 몇몇 종에서는 소용돌이, 가지, 키랄 형태 같은 특유의 swarming 운동형태를 나타낸다. 그람양성의 \( \mathrm { CK } 214 \) 균주는 Bacillus subtilis와 그 형태와 크기가 비슷하고 agar 분해 효소를 생산하며 소용돌이, 가지형태의 Paenibacillus 전형적인 swarming 운동 형태를 나타내었다. 이는 알려진 Paenibacillus의 특징과도 일치하였으며, CK214 균주가 Paenibacillus 속에 포함된다는 또 하나의 증거가 되며, 우리는 \( \mathrm { CK } 214 \) 균주를 Paenibacillus sp. CK214라 명명하였다.</p> <h2>환경 중 agar 유무에 따른 Paenibacillus sp. CK214 균주의 편모 형성</h2> <p>일반적으로 Salmonella, Pseudomanas, Proteus와 같은 swarming 운동을 하는 대부분의 박테리아들은 주모성 편모를 가지며, 고체표면에서의 표면마찰과 점성을 극복하기 위해서는 활발한 편모 활성을 필요로 한다. agar 고체표면에서 뛰어난 swarming 운동 능력을 보이는 Paenibacillus sp. CK214 균주에서도 편모 활성이 매우 중요하게 작용할 것이라 생각하고 투과 전자 현미경(TEM)을 이용하여 CK214 균주의 편모를 관찰하였다(Fig. 4). LB agar \( (1.5 \% \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) 평판배지에서 배양한 CK214 균주의 경우 단일 세포 주위로 여러 개의 주모성의 편모가 나타난 것을 관찰하였다. LB 액체배지에서 배양한 CK214 균주의 경우 agar 고체표면 조건에서는 나타났던 주모성 편모가 관찰되지 않았다. Swarming 운동성 박테리아로 잘 알려진 Proteus mirabilis는 여러 환경적 요인에 의해 세포와 편모 길이의 증가, 편모 수의 증가 등의 swarmer cell로의 분화가 일어난다. 고체 표면 조건은 swarmer cell로의 분화에 관여하는 환경적 요인 중 하나이다. CK214 균주의 agar 고체표면 조건에서의 flagellation 또한 효과적인 swarming 운동에 필요한 세포 분화의 한 종류라 생각할 수 있다.</p> <h2>Agarase 결손 돌연변이주의 구축</h2> <p>당 이용성은 박테리아의 운동성과 관련한 유전자의 발현조절에 관여하는 중요한 요소 중 하나이다. Paenibacillus sp. CK214 균주는 agar를 분해 활성을 이용하여 agar를 탄소원, 에너지원으로 이용한다. 지금까지 박테리아의 agar 분해 활성 에 대한 연구를 살펴보면, agar를 분해하는 균주들은 agarase 효소를 생산하여 agar 분해 활성 가졌으며, CK214 균주 역시 agarase 효소를 생산할 것이라 예상할 수 있었다. CK214 균주의 agar 분해 활성이 운동성에 어떠한 영향을 끼치는지 앞으로의 연구를 위하여 분자생물학적인 접근법으로 agar 분해 효소를 암호화 하는 유전자를 찾는 작업과 동시에, random mutagenesis를 통한 agar 분해활성 결손 돌연변이주의 구축 작업을 함께 진행하였다. 재료 및 방법에 자세히 언급한 바와 같이 Kanamycin \( ( \mathrm { Km } ) \) 내성 유전자를 선별 marker로 가지는 \( \operatorname { Tn } p h o A \) transposon을 분자생물학적인 도구를 이용하여 random mutagenesis 과정을 수행하여 선별을 시작하였다. 집락 주위로 움푹한 투명환의 형성 정도가 저하된 8 개의 집락을 선별한 후 Kanmycin 항생제 배지에 다시 접종하여 최종적으로 4 개의 agar 분해활성 결손 돌연변이주를 선별하였다(Data not shown). Transposon의 삽입에 의한 agar 분해 활성의 감소가 agarase 유전자 자체의 불활성화에 의한것인지, 관련 유전자의 불활성화에 의한 간접적 영향인지를 알기 위한 분자 생물학적 접근에 의한 추가 연구가 필요한 상태이다.</p> <h2>Agarase 결손 돌연변이주의 운동성 감소</h2> <p>선별한 agar 분해활성 결손 돌연변이주(Agar degrading activity defective mutant \( \mathrm { ADM } \) ) 들과 \( \mathrm { CK } 214 \) 야생형 균주의 운동성을 \( 0.5,1.0 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \mathrm { LB } \) agar 평판배지에서 비교하였다 (Fig. 5). 앞서 CK214 야생형 균주는 \( 0.5,1.0 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) agar 조건에서 높은 운동성을 나타내었지만 4 개의 \( \mathrm { ADM } \) 균주는 모두 \( 0.5,1.0 \% \) agar 조건에서 야생형 균주에 비해 운동성이 급격히 감소하였다. 이는 agar 분해 활성에 의한 agar 이용성이 \( \mathrm { CK } 214 \)의 운동성에 직/간접적으로 관여하고 있다는 것을 보여준다. 여러 환경적 요인에 의해 편모 유전자의 발현이 조절 된다는 것이 이전 연구들에서 보고되었으며, Paenibacillus sp. \( \mathrm { CK } 214 \) 균주의 agar 분해 활성과 운동성 및 편모 발현간의 상관관계를 알기 위한 추가 연구가 필요하다.</p>