실험에 이용된 whole cell 항원과 urease 항원은 액체 배양한 H. pylori 균주로부터 분리하였다. 시험동물은 정상군, 대조군, 양성대조군, 시험물질 투여군으로 설정하여 각 군당 5마리씩 나누었고, 양성대조군과 시험물질 투여군은 저용량군과 고용량군으로 나누어 감작시켰다. 그리고 1차 및 2차 야기항원 투여 이후 30분간 전신의 증상을 관찰한 다음 판정기준에 따라 anaphylaxis 쇼크반응을 판정하여 기록하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>H. pylori 균주 배양</h2> <p>H. pylori 균주는 한국유전자은행으로부터 KCTC 12083 을 분양 받아 사용하였다. 분양 받은 균주는 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(\mathrm{CO}_{2} \) 농도 \( 10 \% \) 환경에서 \( 5 \% \) fetal bovine serum (FBS)과 항생제(H. pylori selective supplement (Oxoid, SROM4E, England))가 포함된 Brucella agar plate에서 2~3일 간격으로 계대배양 하였다. 계대배양으로 활성화된 균주는 Brucella broth에서 48~72시간 동안 액체배양 하였다.</p> <h2>Whole cell 항원 분리</h2> <p>Whole cell (WC) 항원은 액체 배양된 균주를 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(4,000 \times \mathrm{g} \) 로 30분간 원심분리 하여 회수하였다. 회수된 균주는 \(10 \mathrm{mM} \) Tris \( \mathrm{HCl}\) \((\mathrm{pH} 8.5)\) - \( 2 \mathrm{mM} \) EDTA로 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(4,000 \times \mathrm{g} \)로 30분간 원심분리 하여 1회 세척 후 멸균된 증류수에 현탁 시켰다. 세척된 균은 얼음물에서 30 초간 4 회 sonicate (pulse 20, duty cycle 50)한 다음 syringe filter \( (0.45 \mu \mathrm{m}) \)로 여과하였다. 여과된 WC의 농도는 Lowry법을 이용한 단백질정량 kit로 측정하여 사용 전까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 냉동 보관하였다.</p> <h2>Urease 항원 분리</h2> <p>액체 배양된 균주를 \( 10 \mathrm{mM} \) Tris \( \mathrm{HCl}\) \((\mathrm{pH} 8.5)\) - \( 2 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{EDTA} \)로 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(4,000 \times \mathrm{g} \)로 30분간 원심분리로 1회 세척한 후 차가운 증류수에 현탁하였다. 강하게 vortex \( (2,500 \mathrm{rpm}\), \(1 \mathrm{min}) \) 한 후 원심분리 \( (25,000 \times \mathrm{g}\), \(15 \mathrm{~min}\), \(4^{\circ}\mathrm{C} \) 된 상층액을 crude urease항원으로 사용하였다. 분리된 crude urease는 SDS-PAGE \( (12 \%) \)로 분자량을 확인하였고, 항원 농도는 Lowry법을 이용한 단백질정량 kit로 정량하여 사용 전 까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 냉동보관 하였다.</p> <h2>Anaphylaxis 쇼크 반응</h2> <h3>실험동물</h3> <p>실험동물은 한림실험동물(주)(경기도 화성, 한국)에서 Hartley계 guinea pig 6주령 \( (250 \sim 350 \mathrm{~g} \),♂ )을 구입하여 1주일간 순화시킨 후 시험에 사용하였다. 사육실은 실험동물 환경조건인 온도 \( 22 \pm 3^{\circ} \mathrm{C} \), 상대습도 \( 55 \pm 5 \% \), 환기횟수 10~12회\( / \mathrm{hr} \), 명암주기 12시간으로 유지하였다. 순화시기 및 시험기간 중 실험동물은 고형사료와 비타민의 공급을 위해 양배추를 사료와 동시에 자유 급여하였고, 음수도 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.</p> <h3>감작투여</h3> <p>감작투여는 항원성을 지니는가를 알아보기 위해 실시하는 anaphylaxis 쇼크반응시험, 수동 피부 anaphylaxis 반응시험 및 간접 적혈구 응집 반응시험을 실시할 때 시험동물의 면역계를 활성화시키기 위하여 사용하는 방법이다.</p> <p>본 시험에서는 시험 동물을 각 군당 5마리씩 나누어 Table 1 과 같이 정상군, 대조군, 양성대조군, 시험물질 투여군으로 설정하였으며, 양성대조군 및 시험물질 투여군은 저용량군과 고용량군으로 나누어 감작시켰다. 감작항원량은 \( 20 \mu \mathrm{g} / 100 \mu \mathrm{l} \) 의 농도로 adjuvant (FCA, Sigma.F5506)와 동량으로 emulsion하여 등쪽 피하에 1차 감작투여 하였다. 추가감작 투여는 1차감작 투여 후 2주 간격으로 총 3회 실시하였다.</p> <h3>시험물질 야기 투여</h3> <p>최종감작투여 1주와 2주후 야기항원을 귀정맥 내 투여하여 anaphylaxis 쇼크증상의 발현유무를 알아보았다. 감작에 이용한 용량은 투여용량 중 고용량을 적용하였다. 1차와 2차 야기항원 투여 후 30 분간 전신의 증상을 관찰하고, anaphylaxis 쇼크반응을 판정기준에 따라 판정하여 기록하였다.</p> <h3>관찰 자료의 해석 및 평가</h3> <p>Anaphylaxis는 종합적으로 쇼크정도에 따라 음성[-]은 아무런 임상증상이 관찰되지 않을 때, 경증 \( [\pm] \) 은 불안 (Restlessness), 기모(Piloerection), 진전(Tremor), 코를 문지르거나 핥음(Rubbing or licking nose)의 증상이 나타날 때, 중등도[+]는 재채기(Sneezing), 기침(Coughing), 호흡촉진(Hyperpnea), 배뇨(Urination), 배변(Evacuation), 유루(Lacrimation)의 증상이 보일 때, 중증[++]은 호흡곤란(Dyspnea), 찍찍거리는 소리(Rhonchus), 청색증(Cyanosis), 보행불안(Staggering gait), 도약(Jumping), 헐떡거리고 몸부림침(Gasping and writhing), 경련(Convulsion), 횡와(Sideposition), Cheyne-Stokes 호흡의 증상이 나타날 때, 그리고 사망 시(Death)[+++]로 판정하였다.</p>