Rubisco의 활성을 측정하기 위해 Tris buffer, NADH, GSH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, 3-phosphoglycerate kinase, a-glycerophosphate dehydrogenase-triose phosphate isomerase, RuBP, ATP, MgCl2, KHCO3 등의 용액을 첨가하고, 흡광도와 산화율로부터 계산했고, Rubisco activase의 활성은 반응 혼합액에 rubisco activase 용액을 가한 다음, 흡광도를 측정하여 NADH 산화율로부터 ADP의 생성율을 계산했다. Rubisco와 rubisco activase의 함량은 단백질이나 효소의 함량 측정시 가장 감도가 높고 신속한 방법인 항체를 이용한 ELISA법으로 측정했다.
<h2>Rubisco와 rubisco activase의 활성 측정</h2> <p>Rubisco의 활성은 \( 1 \mathrm{~M} \) Tris buffer \( (\mathrm{pH} 7.8), 0.006 \mathrm{~M} \) NADH, \(0.1 \mathrm{~M}\) GSH, \(0.5 \% \) glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, \(0.025\) M \(3\)-phosphoglycerate kinase, \( 0.05 \% \) a -glycerophosphate dehydrogenase-triose phosphate isomerase, \( 0.025 \mathrm{~M} \) RuBP, \(0.2 \mathrm{~M}\) ATP, \(0.5 \mathrm{~M} \mathrm{~MgCl}_{2}, 0.5 \mathrm{~M} \mathrm{~KHCO}_{3} \)에 분리한 rubisco 용액을 첨가한 후, \( 340 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 NADH 산화율로부터 계산하였다. 1 unit는 분당 \( 1 \mu \mathrm{M} \)의 RuBP가 만들어지는 화소의 양으로 정의하였다. Rubisco activase의 활성은 반응 혼합액 \( (50 \mathrm{~mM} \) Tricine-\( \mathrm{KOH}\left(\mathrm{pH}\right. \) 8.0), \( 20 \mathrm{~mM} \mathrm{~KCl}, 10 \mathrm{~mM} \mathrm{~MgCl}_{2}, 1 \mathrm{~mM} \) ATP, \(1 \mathrm{~mM} \) phosphoenolpyruvate, \( 0.3 \mathrm{~mM} \) NADH, 40 units \( / \mathrm{mL} \) pyruvate kinase, \(40\) units/ \( \mathrm{mL} \) lactate dehydrogenase)에 rubisco activase 용액을 가한 다음, \( 340 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 NADH 산화율로부터 ADP의 생성율을 계산하였다 . 분당 \( 1 \mu \mathrm{M}\) ATP가 ADP로 분해되는 양을 1 unit로 정의하였다.</p> <h2>Rubisco와 rubisco activase의 함량 측정</h2> <p>Rubisco와 rubisco activase의 함량은 항체를 이용한 ELISA법에 의해 측정하였다. 이는 단백질이나 효소의 함량을 측정하는데 가장 감도가 높고 비교적 빠른 방법이다. Microplate의 wello에 \( 0.1 \mathrm{~M} \) sodium carbonate-bicarbonate buffer 용액(pH 9.5)으로 희석된 두 효소 용액을 각각 가한 다음, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하루 밤 동안 반응시키고, \( 0.05 \% \) Tween 20이 들어있는 \( 0.01 \mathrm{~M} \) PBS \( (\mathrm{pH} \) 7.4)용액으로 3번 세척하였다. Blocking을 위해 \( 0.01 \mathrm{~M}\) PBS (pH 7.4)로 만든 \( 0.1 \% \) BSA 용액을 사용하였다. 1차 항체로서 토끼 항 rubisco와 항 rubisco activase 항혈청을 각각 사용하였으며, 2차 항체로서는 \(0.1\%\) BSA가 함유된 \( 0.01 \mathrm{~M} \) PBS \( (\mathrm{pH} \) 7.4)로 1:20,000 희석시킨 peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG 용액을 사용하였다. Peroxidase의 기질\( \left[30 \% \mathrm{~H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right. \)가 함유된 \( 0.05 \mathrm{~M} \) citrate \( / 0.1 \mathrm{~M} \) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 5.0) \)로 만든 OPD tablet 용액]을 가하여 암상태의 실온에서 20분간 반응 시킨 후, \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{~HCl} \)로 반응을 정지시켰다. ELISA microplate reader (Bio-Rad model 3550-UV)를 사용하여 \( 492 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>