고체상 유기 합성법을 사용하여 8개의 \(N\)-3-hydroxysulfonyl-L-HSL 유도체를 합성하였다. GC/MS 분석법과 H-NMR spectroscopy로 합성된 화합물의 화학구조를 확인하였다. QS 저해는 V. harveri strain BB88G을 report strain으로 하여 \(\mathrm{3-OH-C_4-HSL}\)에 대한 발광 정도를 측정하여 정량적으로 확인하였다. LasR 가 TraR의 신호 결합부위의 아미노산 서열은 LasR 가 부분적으로 TraR의 신호 결합부위와 잘 보존된 부분을 LuxN의 신호 결합부위로 가정하여 모델링 연구에 사용하였고 FlexX 결합 분석은 가능한 결합 형태들 중에서 LuxN의 신호 결합부위의 잘 맞는 형태를 선택하여 결합에너지를 계산하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>화합물 합성</h2> <p>고체상 유기 합성법(solid phase organic synthesis method)으로 8개의 \(N\)-3-hydroxysulfonyl-L-HSL 유도체를 합성하였다. 선행연구에서 사용된 방법에 따라, Fig. 1과 Table 1에 보여지는 방법과 순서로 합성하였다. 모든 합성물은 aminomethyl polystyrene(AM PS) resin으로부터 \( 63 \% \)에서 \( 73 \% \)의 수율로 추출하였다. \( [6 \mathrm{a}(70 \%), 6 \mathrm{b}(72 \%), 6 \mathrm{c}(64 \%), 6 \mathrm{d} (73 \%), \operatorname{6e}(71 \%), 6 \mathrm{f}(70 \%), 6 \mathrm{g}(63 \%)], 6 \mathrm{h}(67 \%), \mathrm{AI}(73 \%)] \) 합성된 화합물의 화학구조는 GC/MS 분석법(Micromass Autospec-Ultima OA TOF GC/MS, UK)과 H-NMR spectroscopy로 확인하였다. (Bruker Avance \( 400 \mathrm{WB} \), DSX-\( 400 \), Germany).</p> <h2>Bloassay를 통한 QS 저해 활성의 측정</h2> <p>\(\mathrm{3-OH-C_4-HSL}\)에 반응하여 발광을 하는 V. harveri strain BB88G을 report strain으로 하여, \(\mathrm{3-OH-C_4-HSL}\)에 대한 발광 정도를 측정함으로써 QS 저해를 정량적으로 측정하였다. 6 hanveri 세포를 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) LBS 배지 \( (10 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) tryptone, \( 5 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) yeast extract, \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \mathrm{NaCl} \) 에서 overnight 배합한 후, 이를 bioussay 배지 \( (300) \mathrm{mM} \mathrm{NaC.1,} 50 \mathrm{mM} \mathrm{MgSO}_{4}, 0.20(w / v) \) vitamin-free casamino acid, \( 10 \mathrm{mM} \) potassium phosphale, \( 1 \mathrm{mM} \) L-arginine, 15 glycerol \( (\mathrm{pH}  7.5)\)에 100 배 회석하였다. </p> <p> \( 1 \mu \mathrm{M} ~ \mathrm{3-OH-C_4-HSL}\)과 8개의 저해제 물질들을 그림에 표시된 농도로 첨가하고, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다. 반광과 세포밀도(optical densities; OD)를 각각 luminometer(Thermo Flectron Co.j와 spectrophotometer(HP8452A, Hewlett- Packard)로 \(600 \mathrm{nm}\)에서 확정한 후, 여러 다른 연구에서처럼 Iuminescence의 강도를 \( \mathrm{OD}_{600} \) 값으로 표준화한 lumines- cence/OD \( { }_{\text {onn }}(\mathrm{RLU} \), relative light unitsi로 표시하였다.</p> <h2>분자 결합의 모델링</h2> <p>각각 Pseudomonas aeruginosa와 Agrobacterium tumefa- ciens의 \( \mathrm{QS} \) 수용체 단백질들인 LasR 가 TraR의 신호 결합부위(signal binding domain)의 아미노산 서열은 LuxN 서열과 비교하여, LasR 가 TraR의 신호 결합부위와 부분적으로 잘 보존된 부분을 LuxN의 신호 결합부위로 가정하고 이를 모델링 연구에 사용하였다.(Fig. 2). 이 추정 신호 결합부위의 부분적 삼차구조를 ORCIIESTRA 프로그램으로 예측하여 [20]. 이를 기반으로 FlexX 프로그램을 통해 Fig. 1에 제시 된 보든 8 개의 저해제 물질들이 리간드로 한 결합 분석을 in silico에서 수행하였다.[12]. 우선 SYBYL의 sketch module을 사용하여 이들의 결합 형태를 초안한 후[26], RMS(root mean squarej gradient를 0.015 이하까지 Gasteiger-Hückel charge로 Tripos force field를 사용하여 최소화하였다.[5,18]. 이러한 FlexX 결합 분석은 run-multiple ligund option을 가지고 수행되었으며, 가능한 결합 형태들 중에서 LuxN의 신호 결합부위에 적절하게 잘 맞는 형태를 최상의 복합제 구조로 선택하여, 이 구조속에서 결합에너지(docking energy)를 계산하였다.</p>