전남 진도군 연안에서 옥덩굴을 채취하고, \( 100 \% \) EtOH을 첨가하여 추출하는 과정을 반복하여 실험에 필요한 옥덩굴 에탄올 추출물을 제조하였다. 이를 이용하여 DPP-IV 효소와 PTP1B 효소의 효소 활성 억제능을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약</h2> <p>Insulin, 4-nitrophenyl phosphate bis(cyclohexyl-ammonium) salt (NPP), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), bovine serum albumin, Oil Red O, 2-mercaptoethanol, anti- \( \beta \)-actin antibody, insulin, dexamethasone (DEX), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) 는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), newborn calf serum (FCS), fetal bovine serum (FBS), phosphate buffered saline (PBS), trypsin-EDTA, penicillin-streptomycin은 Hyclone (Longan, UT, USA)에서 구입하였다. 2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino]-2-deoxyglucose (2-NBDG) 는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)로부터 구입하였고, Gly-Pro-AMC은 Ana Spec, Inc. (San Jose, CA, USA)로부터 구입하였고, interleukin (IL)-1 \( \beta \) 와 interferon (IFN)- \( \gamma \)은 R\( \& \)D (Minneapolis, MN, USA), rat insulin kit는 Mercodia Developing Diagnostics (Mercodia, Uppsala, Sweden)로부터 구입하였다. Glucose Transporter Type 4 (GLUT4) primary antibody와 secondary antibody (anti-rabbit, anti-mouse)는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였고, p-IRS1 (insulin receptor substrate 1), IRS1, p-IRS1 (ser 307), p-AKT (protein kinase B, PKB), AKT, p-AMPK (5' AMP-activated protein kinase), AMPK primary antibody는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. Nitrocellulose membrane은 Bio-rad사(서울, 한국)에서 구입하였고, 시약 및 용매는 특급 또는 1 급 시약을 사용하였다.</p> <h2>추출물 제조</h2> <p>전남 진도군 연안에서 채취한 옥덩굴(C. okamurae)은 목포대학교 해양수산자원학과 박찬선교수에 의헤 동정 또는 확인되었다. 수집된 옥덩굴은 \( 15^{\circ} \mathrm{C} \) 정도의 정수기 물로 약 1~2시간 담그어 놓았다가 염분을 제거시키는 과정을 반복하여 염분을 완전히 제거시켰다. 그런 다음에 \( 100 \% \) EtOH을 첨가하여 추출하는 과정을 반복한 후 추출액을 여과하고 진공하에서 회전감압농축기로 농축시켰다. 그 후에 동결건조기를 이용해 동결건조시킨 파우더를 밀폐용기에 보관하면서 실험에 이용하였다. 옥덩굴 에탄올 추출물의 수율은 \( 1.16 \% \) 이고, COE로 표기하였다.</p> <h2>Dipeptidyl peptidase-Ⅳ (DPP-Ⅳ) 및 protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) 효소 활성</h2> <p>DPP-Ⅳ 효소 활성 억제능은 다음과 같은 조건에서 측정되었다. Black 96-well plate의 각 well에 mouse serum \( 10 \mu \mathrm{L} \) COE 추출물 \( 25 \mu \mathrm{L}, 50 \mu \mathrm{M} \) Gly-Pro-AMC \( 25 \mu \mathrm{L} \)를 넣고 60분 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응시킨다. 1시간 후 반응 정지 시약인 \( 3 \mathrm{M} \) acetic acid를 \( 70 \mu \mathrm{L} \)씩 첨가하고 \( VICTOR^{TM} \) Multilabel Plate Reader(PerkinElmer, MA, USA)의 excitation \( 370 \mathrm{~nm} \), emission \( 440 \mathrm{nm} \)에서 형광을 측정하였다.</p> <p>PTP1B 효소 활성 억제능은 p-NPP를 기질로 이용하여 탈인산화 정도를 측정하여 판단하였다. PTP1B \( (0.05 \mu \mathrm{g} / \mu \mathrm{L}) \) 용액, \( 20 \mathrm{mM} \) p-NPP (\( 0.1 \mathrm{M} \) \( NaCl \), \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 50 \mathrm{mM} \) citrate, \( \mathrm{pH} 6.0 \), \( 1 \mathrm{mM} \) DTT) 용액 및 COE 추출물을 첨가시키고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시킨 후, \( 10 N~ NaOH~10 \mu \mathrm{L} \)를 첨가하여 반응을 종결시킨 다음에 \( 410 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>