Brewer 등의 방법에 따라 배양조에서 4일간 유지한 흰쥐 E 18 대뇌피질 신경세포 plate에 ice-cold D-PBS를 넣고 4\(^\circ \mathrm{C}\) methanol로 세척하였다. 그 후 용액을 -20\(^\circ \mathrm{C}\) methanol로 교체하고 20분간 방치하였다. ice-cold D-PBS로 15분간 세척 후 3시간에 걸쳐 용액과 1차 항체로 방치시켰다. 상온에서 preblock solution으로 20분씩 3회 세척, 이차항체로 1시간 처리를 진행하였다.
<h2>면역세포화학법(Immunocytochemistry)</h2> <p>흰쥐 E \(18 \) 대뇌피질 신경세포는 Brewer 등의 방법에 따라 poly-D-lysine-coated culture plate에서 배양하였다. 배양조에서 4일간(4 DIV) 유지한 신경세포 plate에 ice-cold D-PBS \( \left (0.1 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \mathrm { CaCl } _ { 2 } , 0.2 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \mathrm { KCl } , 0.2 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } , 0.1 \right . \) \( \left . \mathrm { g } / \mathrm { L } \mathrm { MgCl } _ { 2 } -6 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } , 8.0 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \mathrm { NaCl } , 2.16 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } -7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \right ) \)를 넣고 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) methanol로 잠시 세척하였다. 용액을 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) methanol로 교체하고 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 20분간 방치하였다. ice-cold D-PBS로 15분간 세적한 후 preblock solution [0.05 \% triton, 5 \( \% \) normal goat serum in h-PBS \( \left (20 \mathrm { mM } \mathrm { NaPO } _ { 4 } , \mathrm { pH } 7.4 \right . \), \( 450 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } \) 으로 at \( 4 ^ { 0 } \mathrm { C } \) 에서 1시간 처리하고, 1차 항체 (1: 5,000)를 넣고 2시간 더 방치하였다. 세포를 상온에서 preblock solution으로 20분씩 3번 세척하고 alkaline- phosphatase-conjugated 이차항체(Bohringer Mannheim)를 넣고 1시간 처리한 후, preblock solution으로 15분, h-PBS 로 10분씩 3회 세척하였다. NBT와 BClP를 이용하여 발색하고 h-PBS 로 세척하여 반응을 중지시켰다.</p>