이 연구에서는 전통 누룩에서 열과 산, 알칼리에 대하여 내성이 우수한 효모를 선발하여 바이오에탄올 생산에 적합한 균주를 확보하고자 한다. 이를 위해 12종의 누룩을 구매하여 멸균수로 희석하고 chloramphenicol이 함유된 YEPD 배지에 도말하여 44\(^\circ \mathrm{C}\)에서 48시간 배양하여 단일집락을 분리하고 30\(^\circ \mathrm{C}\)에서 24시간 배양하여 Internal transcribed spacer 영역을 증폭하고 BLAST 프로그램을 사용하여 균주를 동정하였다. 분석한 결과를 한국 미생물자원센터의 대조구와 비교하여 실험하였다.
<p>본 연구에서는 우리나라 전통 누룩으로부터 고온에서 성장속도가 빠르고 산, 알칼리에 대하여 내성이 우수한 효모를 선발하여 바이오에탄올을 생산하는데 적합한 균주를 확보하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주분리</h2> <p>경상북도 상주시를 비롯하여 전국의 재래시장에서 판매되고 있는 누룩 12점을 구매하였다. 분쇄한 누룩 \( 1 \mathrm { ~g } \)을 멸균수 \( 9 \mathrm { ml } \)에 현탁한 후 \( 10 ^ { 1 } -10 ^ { 5 } \) 희석배수까지 단계적으로 희석하고, chloramphenicol (100 mg/l, Sigma-Aldrich, USA)이 함유된 YEPD (yeast extract \( 10 \mathrm { ~g } / \), peptone \( 20 \mathrm { ~g } / \), glucose \( 20 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } , \mathrm { pH } \) 6.8, BD Diagnostic, USA) 평판배지에 도말한 후 \( 44 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 48시간 동안 배양하여 단일집락을 분리하였다.</p> <h2>균주동정</h2> <p>분리한 효모 균주는 YEPD 배지를 사용하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 동안 진탕배양한 후 \( \mathrm { GenEx } ^ {\mathrm { TM } } \) genomic Sx (GeneAll, Korea)를 사용하여 염색체 DNA를 추출하였다. 염색체의 Internal transcribed spacer 영역을 증폭하기 위하여 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3')와 ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') 프라이머를 사용하였다. PCR 산물은 (주)마크로젠(Korea)에 의뢰하여 염기서열을 해석하였으며, National Center for Biotechnology Information (NCBI, RP, MD, USA)의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 프로그램을 사용하여 기존에 보고된 균주의 염기서열과 상동성을 비교하여 균주를 동정하였다.</p> <h2>균주의 생육특성</h2> <p>단일집락을 \( 5 \mathrm { ml } \) YEPD 배지에 접종하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 12시간 배양한 후, 세포흡광도 \( \left ( \mathrm { OD } _ { 600 } \right ) = 1 \)에 해당하는 균체를 회수하였다. 회수한 균체는 멸균수로 5회 세척하고 \( 10 ^ { 0 } \)부터 \( 10 ^ { 4 } \)까지 단계적으로 멸균수를 사용하여 희석한 후 \( 5 \mathrm { ~N } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \) (Korea) 용액과 \( 5 \mathrm { ~N } \mathrm { NaOH } \) (Samchun, Korea) 용액을 사용하여 \( \mathrm { pH } \)를 조정한 YEPD 평판배지에 \( 15 \mu \mathrm {\mu } \)씩 점적한 후 25, \( 30,44 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 48시간 동안 배양하였다. 대조구로서 Pichia farinosa (Millerozyma farinosa) KCTC27412 균주를 한국 미생물자원센터(KCTC, Korea)로부터 분양 받아 사용하였다.</p>