본 논문에서는 배양 시간에 따른 현탁 세포의 건조중량과 생체중량/건조중량을 측정하여 나타내었다. 실험을 통해 sucrose 농도가 \( 6 \% \) 이상의 농도에서는 세포의 성장이 계속해서 증가하는 경향을 보였으며, 이 농도가 GFP 생산에 미치는 영향을 측정하기 위해 \( 5 \mathrm{~g} \)의 세포를 \( 5 \mathrm{ml} \)의 측정용 버퍼에 처리하여 fluorescence를 측정하였다. 그 결과 sucrose 농도가 지나치게 극단적이면 세포생장에 좋지 않음을 알 수 있었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Sucrose 농도에 따른 식물세포의 성장</h2> <p>GFP 유전자가 도입된 형질전환 벼세포의 현탁 배양 세포를 \( 50 \mathrm{~mL} \)의 N6액체배지에서 20일 동안 현탁 배양하여 배양 시간에 따른 현탁 세포의 건조중량 (DCW)과 수분함유 정도를 나타내는 지표인 cell size index (생체중량/건조중량)를 측정하여 Fig. 2에 나타내었다. 세포 생산량은 sucrose 농도 \( 3 \% \)인 경우 10일째에 건조중량이 \( 2.78 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \)로 가장 높았고, sucrose 농도 \(6\%\)에서는 15일째가 \( 5.36 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \)로 가장 높았으며, 그 이후에는 건조 중량이 각각 감소하는 경향을 나타내었다. 다음으로 sucrose 농도가 \( 6 \% \) 이상의 \( (12 \%, 18 \% \) 및 \( 24 \%) \) 농도에서는 세포의 성장이 계속해서 증가하는 경향을 보이고 있으며, 20일 동안 현탁 배양한 결과에서 가장 높은 값은 20일째 sucrose농도 \( 12 \% \)에서 \( 7.06 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \)로 나타났다. 반면에 20일 이후부터는 sucrose 농도 \( 18 \% \)를 제외한 \( 12 \% \)와 \( 24 \% \)에서는 오히려 감소하는 경향을 보였다. 그리고 가장 높은 농도인 sucrose \( 24 \% \)에서는 너무 많은 sucrose의 양이 오히려 세포의 생장에 저해를 일으킨 것으로 생각되어진다. 위의 결과를 살펴보면 sucrose 농도에 따른 식물세포의 성장에 있어서 sucrose 농도가 \( 12 \% \)일 때 가장 큰 영향을 미친 것을 알 수 있으며, 너무 많은 sucrose의 양은 세포의 생장에 있어서 좋지 않은 영향을 미친다는 것을 알 수 있다. 또한, 당의 농도가 높아질수록 cell size index가 뚜렷하게 낮아지는 경향을 나타내었는데, 이러한 결과는 배지내의 당의 농도가 높아짐에 따른 삼투압의 증가와 삼투압 증가에 따른 생체중량의 감소에 의한 것으로 판단되며 삼투압의 증가에 따른 cell size index의 감소는 고농도의 식물세포배양을 가능하게 하여 생산성의 향상에 기여할 수 있다고 판단된다.</p> <h2>GFP 생산에 미치는 sucrose 농도의 영향</h2> <p>Sucrose 농도가 GFP 생산에 미치는 영향을 측정하기 위해 \( 5 \mathrm{~g} \)의 세포를 \( 5 \mathrm{ml} \)의 측정용 버퍼에 처리하여(재료 및 방법 참조) fluorescence를 측정하였다. 먼저 Fig. 3A를 살펴보면 sucrose의 농도가 \( 3 \% \)일 때 GFP 생산량은 세포의 사멸기로 접어드는 10일째 이 후부터 그 양이 차츰 증가하다가 15일째 이 후 부터는 급격하게 증가하여 sucrose 농도 \( 3 \% \)를 제외한 다른 농도와의 GFP 생산량을 비교하기 어려웠다. 또한, 배지내로 분비된 단백질을 측정하였을 경우에도 sucrose 농도 \( 3 \% \)일 때 가장 높은 값을 나타냈다. 이러한 결과로 미루어볼 때 GFP 생산량이 급격하게 증가한 것은 배지내의 sucrose가 에너지원 등으로 소모되어 15일 이 후로 사멸기에 접어든 세포의 파괴로 인해 세포내부의 단백질이 세포외로 분비된 결과에 의한 것으로 판단된다.</p> <p>반면에 세포내부의 GFP 측정 실험 에서는 sucrose 농도 \( 3 \% \)에서 뿐만 아니라 다른 농도에서의 GFP생산량 차이를 확인 할 수 있었다. Sucrose 농도 \( 6 \% \)에서는 15일째 이후부터 GFP량이 증가하는 경향을 보였다. 이러한 원인은 탄소원인 sucrose의 고갈에 따른 RAmy3E promoter의 발현으로 인한 현상으로 보인다. 또한, sucrose 농도 \( 3 \% \) 이상의 농도에서는 배지내의 탄소원의 고갈에 걸리는 시간이 sucrose 농도 \( 3 \% \)보다 지연되므로, 배지내로 분비된 GFP량은 sucrose 농도가 높아질수록 그 값이 작다는 것을 알 수 있다. 따라서 본 연구에서는 20일 동안의 실험에서 관찰된 GFP의 분비량이 sucrose 농도 \( 3 \% \)에서 가장 높게 나타났다. 앞의 결과를 확인하기 위하여 배지내로 분비된 GFP생산량의 차이를 낮은 sucrose 농도에서 보기 위하여 \( 1 \%\sim5 \% \)의 농도에서 실험한 결과 sucrose 농도가 \( 3 \% \) 이하에서는 확실히 보다 짧은 시간 내에 GFP가 생산되고 있는 것을 알 수 있다.</p> <p>위와 같은 결과를 토대로 세포가 생장하는데 있어서 sucrose 농도가 아주 적거나 혹은 지나치게 많으면 세포생장에 좋지 않은 영향을 끼치며, 식물세포배양을 이용하여 외래단백질을 생산하고자 할 때에는 sucrose의 적절한 농도가 매우 중요함을 알려주는 지표로 삼을 수 있는 것으로 생각 되어진다. 또한, RAmy3E promoter의 높은 발현율을 이용하여 상업적으로 유용한 재조합 단백질을 발현시킴으로서 보다 높은 생산율과 가치를 얻을 수 있을 것으로 판단된다.</p>