BFA는 세포사멸을 억제하는 다른 약물들에 대해 각각 다른 작용을 가진다는 것을 알 수 있는데, 이것이 호중구의 세포사멸 억제기작이 다른 것을 알려준다. 최근 보고에 의하면, 세포사멸이 일어나는 동안 PKC-\( \delta \)는 caspase-3에 의해 분해되어 활성형으로 전환된다고 한다. 따라서 본 연구는 PKC-\( \delta \)에 대한 특이 억제제인 rottlerin과 caspase-3의 억제제인 zDEVD-fmk가 BFA에 의한 세포사멸에 어떤 영향을 미치는지 조사한 결과 세포 사멸을 억제시키는 Mcl-1의 나타난 단백질 양에 의하여 BFA의 효과가 나타난 것을 알 수 있다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>BFA에 의한 호중구 세포사멸의 유도</h2><p>호중구는 배양 상태에서 자연 세포사멸이 빠르게 일어 난다. 세포사멸의 특징인 핵의 농축이나 세포질 내 낭포가 쉽게 관찰되었다. 이들 변화는 DNA조각의 증가와 일치하여 증가하였으며 PS의 세포 외막으로의 노출 정도와도 일치하였다. 20 시간 배양 후 약 \( 50 \% \)가 세포사멸이 유도되었다. \( 1 \mu \mathrm{M} \)의 BFA를 첨가 하였을 때 호중구의 세포사멸은 \( 75 \pm 8 \% \)로 증가하였다. BFA를 처리하지 않은 세포들에서는 DNA의 조각이나 PS의 측정이 약하게 나왔으나 BFA를 처리한 호중구들은 DNA 조각이나 annexin-V염색이 강하게 나타남으로써 BFA에 의하여 세포사멸이 증가함을 보였다. BFA에 의한 세포사멸을 \( 0.01 \mu \mathrm{M} \) 로부터 \( 10 \mu \mathrm{M} \)까지 농도별로 측정하였을 때 \( 0.5 \mu \mathrm{M} \)의 낮은 농도에서부터 세포사멸이 일어났으며 \( 10 \mu \mathrm{M} \)에서 최대의 반응을 보였다. 따라서 본 연구에서는 \( 10 \mu \mathrm{M} \) 농도의 BFA를 실험에 사용하였다.</p><h2>호중구의 세포사멸 지연에 대한 BFA의 영향</h2><p>호중구의 세포사멸을 지연시킨다고 알려진 LPS나 GM-CSF로 호중구를 20시간 처리하였을 때 세포사멸되는 세포의 수가 현저히 감소하였다. 이들 약물을 처리하기 1시간 전에 BFA를 투여하고 20시간 배양 후 세포사멸을 측정하였다. BFA를 처리한 세포에서는 LPS나 GM-CSF가 들어 있더라도 세포사멸되는 정도가 증가함으로써 BFA는 세포사멸의 지연을 억제한다는 것을 알 수 있다. LPS를 처리한 세포에서 DNA 조각이 감소하는 현상도 BFA의 전처리 시에는 억제되었다. 한편, dibutyryl-cyclic AMP (db-cAMP), dexamethasone 및 interleukine-8 (IL-8)으로 처리하여 세포사멸이 지연된 경우, BFA의 효과는 부분적으로 나타났다. 이들 결과들은 BFA가 세포사멸을 억제하는 서로 다른 약물들에 대하여 각각 다른 작용을 가진다는 것을 보여주고 있으며 그들에 의한 호중구의 세포사멸 억제기작이 다를 것이라는 것을 암시하고 있다.</p><h2>BFA에 의한 세포사멸 유도에서 caspase-3 억제제와 protein kinase C-\( \delta \)(PKC-\( \delta \))억제제의 영향</h2><p>최근 다른 연구자들의 보고에 의하면, 세포사멸이 일어나는 동안 PKC-\( \delta \)는 caspase-3에 의하여 분해되면서 활성형으로 전환된다고 하였다. 따라서, 본 연구에서는 PKC-\( \delta \)에 대한 특이적인 억제제인 rottlerin과 caspase-3의 억제제인 zDEVD-fmk가 BFA에 의한 세포사멸에 어떠한 영향을 미치는가를 조사하였다. Rottlerin을 단독으로 첨가였을 때 호중구의 세포사멸은 현저히 감소하였다. 그러나 BFA를 농도별로 증가시켜 유도된 세포사멸은 \( 10\mu \mathrm{M} \)의 rottlerin에 의하여 영향을 받지 않았다. 또한, zDEVD-fmk를 \( 200 \mu \mathrm{M} \)의 농도로 BFA와 처리하여 PI 염색으로 세포사멸 정도를 관찰하였을 때도 BFA에 의한 세포사멸은 억제되지 않았다. 이들 두 결과는 BFA에 의한 세포사멸은 caspase-3를 통한 PKC-\( \delta \)의 활성에 의한 세포사멸과는 관계가 없다는 것을 제시하고 있다.</p><h2>Mcl-1의 발현에 대한 BFA의 영향</h2><p>호중구에서 발현되는 세포사멸 억제단백질인 Mcl-1의 발현이 BFA에 의하여 영향을 받는가를 보기 위하여 \( 10\mu \mathrm{M} \)의 BFA가 들어 있는 배양액에서 세포를 20시간 처리한 다음 Mcl-1에 대한 항체를 이용하여 western blot을 시행하였다. Mcl-1의 단백질 양은 배양 20시간에서 현저히 감소하였으나 LPS나 db-cAMP를 처리하였을 때 감소되는 양이 줄었다. Mcl-1의 단백질 양은 BFA의 단독 처리에 의하여 감소되었을 뿐만 아니라 LPS나 db-cAMP에 의하여 증가되는 것도 억제되었다. 이들 결과는 세포 사멸을 억제시키는 Mcl-1의 발현되는 단백질 양의 변화에 의하여 BFA의 효과가 나타난다는 것을 제시하고 있다.</p>