본 논문에서는 Hydroxyl 라디칼 소거능을 \( \mathrm { FeSO } _ { 4 } \), \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)의 Fenton 반응으로 생긴 Hydroxyl 라디칼에 의해 sodium salicylate가 가수분해 되는 정도를 통해 구했음을 보여준다. ATCC에서 전지방세포를 구입해 배양했으며 대두부산물 처리에 의한 농도 의존적 세포생존율을 MTT assay로 측정했다. 상등액을 제거하고 DMSO를 각 \( \mathrm { well } \)에 분주하여 30분 교반한 뒤 흡광도, 즉 MTT가 세포에 의해서 환원된 양을 측정했으며 이는 각 \( \mathrm { well } \)에 생존한 세포수와 비례했다.
<p>소거능( \( \%\)) = [1-(추출물 첨가구의 흡광도/추출물 무 첨가구의 흡광도) ] \(\times 100 \)</p> <p>Hydroxyl 라디칼 소거능은 \( \mathrm { FeSO } _ { 4 } \)와 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)의 Fenton 반응에 의해 생성된 Hydroxyl 라디칼에 의해 sodium salicylate가 가수분해되는 정도를 통해 측정되었다. \( 1.5 \mathrm { ~mM } \mathrm { ~FeSO } _ { 4 } \)와 \( 6 \mathrm { ~mM } \mathrm { ~H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } (3.5:5)\)의 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 Fenton 반응에 의해 생성된 hydroxyl 라디칼 \( 760 ~ \mu \matherm{l} \)와 농도별 시료 \( 40 \mu \mathrm{l} \)를 혼합한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 약 30분간 반응시켰다. 반응 후 \( 200 \mathrm { ~mM } \) sodium salicylate \( 200 ~ \mu \mathrm{l} \)를 첨가 한 후 UV/Visible spectrophotometer (Berkman, USA)을 이용하여 \( 562 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였으며 위의 식을 이용하여 공정 별 hydroxyl radical 소거능을 계산하였다.</p> <h2>세포 배양</h2> <p>실험에 사용한 3T3-L1 pre-adipocyte cell (전지방세포)은 American Type Culture Collection (ATCC)로부터 구입하여 사용하였으며, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco Inc., USA) 배지에 \( 10 \% \) fetal bovine serum과 \( 1 \% \) antibiotics-antimycotic을 첨가하여 \( 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \)가 존재하는 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 세포 배양기에서 2~3일에 한 번씩 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.</p> <h2>세포생존율 측정</h2> <p>대두부산물 처리에 의한 농도 의존적 세포생존율은 MTT assay로 측정되었다. 배양된 3T3-L1 전지방세포를 96 well plate에 \( 5 \times 10 ^ { 3 } \) \( \mathrm { cells/well } \) 가 되도록 분주하였다. 24시간 배양 후 상등액을 제거하고 배지와 함께 대두부산물 추출시료를 \( 10 \mathrm { ~ppm } , 25 \mathrm { ~ppm } , 100 \mathrm { ~ppm } \) 농도로 처리하였다. 대두부산물을 농도별로 처리하고 24 시간을 배양한 후 MTT 시약 \( (5 \mathrm { ~mg } / \mathrm { ml } ) \)을 \( \mathrm { well } \) 당 \( 10 ~ \mu \mathrm { l } \) 첨가하고 3시간 동안 추가 배양하였다. 그후 상등액을 제거하고 DMSO \( 150 \mu \mathrm{l}\) 를 각 \( \mathrm { well } \)에 분주하여 30분 교반한 뒤 microplate reader (Infinite \( { } ^ {\circledR } \) 200, Tecan Trading AG, Switzerland)를 이용하여 \( 570 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 이 흡광도는 MTT가 세포에 의해서 환원된 양을 나타내며, 각 well에 생존한 세포수와 비례한다.</p>