본 실험에서는 THP-1 세포를 특정 화학물질로 처리하고, Prostaglandin(PG)를 더하여 IL-1\(\beta\)의 분비량을 측정하였다. ELISA 방법과 RT-PCR 방법을 사용하여 IL-1\(\beta\)의 양을 측정하고 유전자 전사체를 증폭시켰다. 또한, 배지 중 IL-1\(\beta\)의 양은 표준곡선을 이용하여 계산하였다. 실험 과정에서 세포는 특정 매체에 노출되었으며, PCR 결과는 agarose gel을 사용하여 분리하고, ethid ium bromide 염색 후 이미지를 촬영하였다. 이 실험은 특정 화학물질이 세포에 어떠한 영향을 미치는지를 파악하는 데 도움이 되었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포배양 및 시약</h2> <p>THP-1 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구매하고 제안한 대로 유지하였다. 황색포도상구균으로부터 분리한 PG인 polymyxin B와 oxi-dized 1-palmitoyl-2-arachidonosyl-sn-phosphatidylcholine (OxPAPC)는 InvivoGen (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. 내독소가 없는 bovine serum albumin (BSA), LY294002, diphenyleneiodonium chloride (DPI), N-acetylcysteine (NAC), rapamycin과 SP600125는 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. U0126, SB202190, Akt in-hibitor IV (Akti IV) 는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. 억제제 실험에서 THP-1세포를 앞의 화학물질들을 1 시간동안 처리하고 \( PG(1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 를 더해 9시간 동안 자극하였고, enzyme linked immunosorbent as-say (ELISA)로 배지에 분비된 IL-1\(\beta \)의 양을 측정하고 reverse transcription (RT)-polymerase chain reaction (PCR)로 IL-1\(\beta \)유전자 전사체를 증폭시켰다.</p> <h2>IL-1\(\beta \) ELISA</h2> <p>분비된 IL-1\(\beta \)의 양을 상용되는 ELISA kit를 제조업자의 지시에 따라 이용하여 측정하였다(BD Biosciences, San Diego, CA, USA). THP-1 세포는 \( 0.1 \%\) BSA가 들어있는 RPMI me-dium 1640에 하룻밤 동안 배양하고, PG에 노출시킨 후 세포배양배지를 모았다. 세포배양배지와 IL-1\(\beta \)의 표준을 IL-1\(\beta \)가 붙어있는 단일클론항체로 미리 코팅되어있는 microtiter plate에 넣어주었다. 2시간 배양 후, plate를 씻고 IL-1\(\beta \)에 특정한 효소-복합 다 클론성 항체를 배양하였다. Plate를 씻고 기질을 첨가하고 배양한 다음 색의 강도를 측정하였다. 배지에 존재 하는 IL-1\(\beta \)의 양을 표준곡선에 따라 계산하였다. ELISA 결과는 평균 \( \pm \) 표준편차로 나타내었다.</p> <h2>RT-PCR</h2> <p>THP-1 세포를 \( 0.1 \% \) BSA가 들어있는 RPMI medium 1640에 하룻밤 동안 배양하고 PG에 노출하였다. 전체 RNA를 세포로부터 추출하고 Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase를 이용하여 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 역전사하였다. Primer를 첨가하고 25 cycles \( \left(94^{\circ} \mathrm{C}\right. \) for \( 30 \mathrm{sec}, 55^{\circ} \mathrm{C} \) for 30\( \mathrm{sec}, 72^{\circ} \mathrm{C} \) for \( \left.30 \mathrm{sec}\right) \)을 PCR을 실행하여 IL-1\(\beta \) 전사체를 증폭시켰다. IL-1\(\beta \)의 primer로 5-GGACAAGGGAGGAAGATGC-3 (forward)와 5-TCTTTCAACACGCAGGACAG-3 (reverse)를 사용하고, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)의 primer로 5-AAGCTCTGCGTGACTGTCCT-3 (forward)와 5-GCTTGCTTCTTTTGGTTTGG-3 (reverse)를 사용하였다. PCR 결과를 \( 2 \% \) agarose gel에서 전기영동에 의해 분리하고 ethidium bromide 염색한 다음 이미지를 사진으로 찍었다. 각 band의 intensity를 IL-1\(\beta \)/GAPDH로 표시하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>통계적인 분석은 GraphPad PRISM, version 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 실행하였고, \( p<0.05 \) 를 통계적으로 의미있는 것으로 간주된다.</p>