총 RNA 분리를 위해 CTAB 완충액을 사용하여 작업하였으며, Primer3 프로그램을 이용해 프라이머를 제작하였다. 이를 바탕으로 PCR 작업을 수행하였다. DNA 단편을 증폭시키고, 이를 random primer DNA 표지 프로토콜을 사용하여 표지한 후, Northern blot 분석을 수행하였다. 또한, 4℃의 저온에 24시간 노출된 상추 잎에서 MDHA 환원효소(MDHAR)의 활성도를 엽록체분획과 세포질분획에서 추출하여 측정하였다.
<h2>총 RNA 추출 및 Northern Blot</h2> <p>총 RNA의 분리는 Chang 등의 방법을 약간 수정한 CTAB 완충액(2% CTAB, \( 100 \mathrm { mM } \) Tris, \( \mathrm { pH } \) 8.0, \( 20 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 1.4 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } ) \) 을 사용하여 분리하였다. 총 RNA(11.4 μg)는 1.5% (w/v) agarose 젤[1×MOPS (20 mM \( N \)-morpholino) propanesulfonic acid, pH 7.0), \( 2 \mathrm { mM } \mathrm { Na } \)-acetate, \( 1 \mathrm { mM } \) EDTA, 3.7 \% (v/v) formaldehyde)에서 전기영동한 후 Sambrook 등의 방법을 약간 수정하여 20배의 SSC 용액에서 membrane에 전이시켰다.</p> <p>Monodehydroascorbate 환원효소의 \( \mathrm { cDNA } \)는 시금치의 cDNA (accession. No. AB063289)로부터 프라이머 제작 프로그램 (Primer3, Whitehead Institute, USA)을 사용하여 프라이머[MDHAR: 5'-CAT TTT GTC CAA TTC TCC AT-3' (F), 5'- TCC TCA TTT TCT CTT TCC AA-3' (R)]를 제작하여 전보와 동일한 조건에서 \( \mathrm { PCR } \)을 수행하였다. 증폭시킨 DNA단편을 주형으로 하여 random primer DNA 표지 프로토콜을 사용하여 \( \left [ \mathrm { a } ^ { 32 } \mathrm { P } \right ] \mathrm { dCTP } (50 \mu \mathrm { Ci } / \mathrm { ml } ) \) 로 표지하였으며 Northern blot분석은 전보와 동일한 방법으로 수행하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>MDHA 환원효소의 활성도변화</h2> <p>\( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 저온에 24시간 노출시킨 상추의 잎 내에서 아스코스산의 재생과 관련된 MDHA 환원효소(MDHAR)의 활성도는 엽록체분획과 세포질분획에서 추출하여 측정하였으며 그 활성도 변화는 Fig. 1과 같다.</p> <p>Fig. 1에 나타난 바와 같이 MDHA 환원효소의 활성도 변화는 저온에 노출되는 시간이 길어질수록 활성도가 증가하였으며, 특히 저온에 노출된 시간이 6시간이 지나면서 급격하게 증가하는 경향을 보였다. 엽록체분획과 세포질분획에서 동일한 경향을 보이며 실온으로 회복시켰을 때 MDHA 환원효소의 활성도가 감소하는 경향을 보였다. 전보에서 식물이 저온과 같은 스트레스에 노출되면 산화적 스트레스가 증가하게 되고 이때 생성되는 과산화수소를 제거하기 위한 메카니즘을 가지고 있다. 아스코브산을 전자공여체로 사용하는 아스코브산 과산화효소(APX)와 DHA 환원효소(DHAR)의 활성이 급격하게 증가하는 것으로 나타났다. 이와 이는 오이의 잎에서 저온 처리를 함으로써 과산화수소의 함량이 증가하고, 수퍼옥사이드 전이효소(SOD)의 활성도도 증가한다고 보고하였다. 그러나 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 회복시키면 수퍼옥사이드 전이효소의 활성도는 회복되지만 과산화수소의 함량은 상당히 증가한다고 하였다. 이 결과는 저온스트레스가 오이식물에 대한 산화적스트레스로 작용하고 있음을 확인할 수 있으며, 아스코브산 과산화효소와 글루타사이온 환원효소(GR)가 작용하여 과산화수소를 제거하기 위한 메카니즘이 발현된다고 하였다. 저온에 노출된 식물에서 저온에 적응하는 메카니즘은 카탈레이스나 수퍼옥사이드 전이효소뿐 만 아니라 아스코브산과 관련된 몇 가지 효소가 작용하는 것으로 생각할 수 있다.</p>