균주 보관소에 등록이된 AB균주의 배양물을 이용하여 효소 저해 활성을 가지는 물질을 추출하기 위한 실험을 설계하였다. 균주를 키우기 위한 배양물질을 만들기 위해서 대두박을 이용하여 만든 액체배지를 사용하였다. 이후 액체배지에 AB 버섯균을 접종하여 배양시키고, 얻어낸 균사체 배양물의 a-glucosidase 활성 저해능을 측정하였다. 저해능 측정에는 TLC 분석, UV/Vis spectrophotometeric 분석, HPLC분석을 이용하였다. 이후, 각각의 분석 결과를 사용하여 배양물 가운데 높은 저해활성을 가지는 물질을 분리하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>AB균주는 균주보관소에 등록이 된 균주를 (주)HK 바이오텍 (Jinju, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. 대두박은 태평양 (Seoul, Korea), 황백당은 제일제당(Seoul, Korea), proline, xylose, \( \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\), \(\mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)는 Shinyo사(Osaka, Japan)에서 구입하였다. p-Nitrophenyl-a-D-glucopyranoside, a-glucosidase, daidzin, genistein, genistin은 Sigma사(St. Louis, MO. U.S.A)에서, ethanol, methanol, hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol, acetonitrile은 J.T.Baker사(Phillipsurg. NJ, U.S.A)에서 HPLC grade를 구입하였다. Silica gel 60 (\(230 \sim 400\) mesh ASTM)과 TLC plate (Silica 60 F-254) plate, \( 20 \times 20 \mathrm{~cm} \), \( 0.25 \mathrm{~mm} \), glass)는 Merck사(Germany)로부터 구입하였다. 그 외 사용된 시약은 reagent grade 이상이었다.</p><h2>AB 액체 배양</h2><p>Protease로 분해한 대두박 \( (100 \mathrm{~ml} / \mathrm{l}) \)에 황백당 \( 20 \mathrm{~g} \), proline \( 10 \mathrm{~g} \), xylose \( 10 \mathrm{~g}\), \(\mathrm{~MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ~0.5 \mathrm{~g} \), \( \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} ~0.5 \mathrm{~g} \)을 첨가하여 삼각플라스크에 \( 300 \mathrm{~ml} \) 분주하고 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 고압멸균한 후 액체배지로 사용하였다. AB 버섯균을 접종하고 shaking incubator \( 120 \mathrm{~rpm}\), \(25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 7일간 배양한 후 \(50 \mathrm{~l}\) fermenter (KoBioTech, Incheon, Korea)로 3일간 배양(\( 120 \mathrm{~rpm}\), \(25^{\circ} \mathrm{C}\), \(1 \mathrm{v} / \mathrm{v} / \mathrm{m}) \)하였다.</p><h2>Sample 조제</h2><p>배양된 AB 균사체 배양물을 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60분간 열수추출한 시료(HEAB) 50 \(\mathrm{l}\)를 ultra-membrane filter로 여과한 여액을 농축기(BUCHI, Swiss)를 이용하여 \( 75^{\circ} \mathrm{C} \)에서 Brix 50으로 감압농축하고 동결건조(Ilshin, Gyeonggi-do, Korea)하였다. 동결건조물 시료 \( 50 \mathrm{~g} \)에 증류수 \( (150 \mathrm{~ml}) \)와 \(95\%\) ethanol \( (800 \mathrm{~ml}) \)을 첨가하고 혼합하여 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 냉장고에서 하루 방치한 후 원심분리 \( (10,000 \mathrm{rpm}\), \(30 \mathrm{~min}) \)하여 상등액과 침전물을 분리하였다(3번 반복). 농축한 상등액(\(\beta\)-glucan-free HEAB)을 극성에 따라 hexane, chloroform, ethyl acetate (EA), butanol 순으로 용매분획 하였다. 분획에 사용한 용매는 각각 1.0 \(\mathrm{l}\)였고, 3회 반복추출하였다.</p><h2>\( a \)-Glucosidase 활성 측정</h2><p>시료의 a-glucosidase 활성 저해능은 Watanabe 등의 방법에 따라 측정하였다. 즉, 시료와 대조물질로 사용한 acarbose는 증류수에 일정 농도가 되게 용해한 후 여과 \( (0.2 ~\mu \mathrm{m} \) filter, Millipore)하여 사용하였다. \(\alpha\)-Glucosidase \( (0.7 \mathrm{~U} / \mathrm{ml}) \) \( 50 ~\mu \mathrm{l} \)와 acarbose 용액 또는 시료용액 \( 10 ~\mu \mathrm{l} \)를 96-well plate에 가한 후, microplate reader (Model 550, Biorad, USA)를 사용하여 \( \mathrm{OD}_{405} \)를 측정하였다. 5분 후에 기질용액(\(5 \mathrm{~mM}\) p-nitro-phenyl-\(\alpha\)-D-glucopyranoside/ \( 0.1 \mathrm{~M} \) phosphate buffer, \( \mathrm{pH} ~7.0\)) \( 50 ~\mu \mathrm{l} \)를 첨가하고 실온에서 5분간 반응시킨 후, 다시 \( \mathrm{OD}_{405} \)를 측정하여 흡광도 변화로부터 효소저해활성을 계산하였다.</p><h2>\( a \)-Glucosidase 저해제 분리</h2><h3>Open-column chromatographic analysis</h3><p>시료 \( 3 \mathrm{~g} \)을 silica gel \( (50 \mathrm{~g}) \)로 충진 한 open glass column \( (5 \mathrm{~cm} \), I.D)에 chloroform\(:\)methanol을 gradient로 \( (1: 0 \rightarrow 0: 1\), \(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 1차 분리하였다. \(\alpha\)-Glucosidase 저해활성이 강하게 나타난 Fr.Ⅳ (chloroform\(:\)methanol, \(8:1\), \(\mathrm{v} / \mathrm{v}\)), Fr. Ⅴ (chloroform\(:\)methanol, \( 5: 1, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \)를 합쳐서 다시 open column \( (2 \mathrm{~cm} \), I.D)에 silica gel \( (50 \mathrm{~g}) \)을 충진 한 후 acetonitrile: \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) (\(12: 1\),\(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)을 사용하여 분리하였다. 용출속도는 \( 1 \mathrm{~drop} / \mathrm{sec} \)로 300 drops 씩 collection하였다.</p><h3>TLC analysis</h3><p>시료를 silica gel plate를 사용하여 분리하였다. 전개용매는 butanol\(:\)ethanol\(:\) \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) (\(5: 3: 3\), \(\mathrm{v} / \mathrm{v} / \mathrm{v}\))를 사용하거나 acetoni-trile: \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) (\(12: 1\), \(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)를 사용하였다. 화합물의 확인은 diphenylamine aridine phosphate (DAP) 또는 \( 10 \% \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \)으로 발색시켰으며, UV 흡광을 확인하기 위해서는 UV lamp (short wave)로 조사하였다.</p><h3>UV/Vis spectrophotometeric analysis</h3><p>시료의 UV 흡광도는 시료를 methanol에 용해시켜 UV/Vis 흡수 pattern을 Beckman DU-650 model UV/Vis spectrophotometer (Brea, California, U.S.A.)를 이용하여 \(220 \sim 400 \mathrm{nm}\) scan하였다.</p><h3>HPLC analysis</h3><p>시료는 Dionex HPLC system (Sunnyvale, California, U.S.A.)을 이용하여 분석하였다. Column은 \( 3.9 \times 300 \mathrm{~mm} \) \(\mu\)-Bondapak \( \mathrm{C}_{18} \) column (Waters, Milford, MA)을 사용하였고, mobile phase는 methanol\(:\) \( 1 \mathrm{~mM} \) ammonium acetate (\(1: 3\), \(\mathrm{v} / \mathrm{v} \))을 isocratic으로 사용하였다. Flow rate는 \( 1 \mathrm{~ml} / \mathrm{min} \), peak의 detection은 UV/VIS wavelength \( 254 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다.</p>