본 연구에서는 안전성이 확인된 된장 풍미를 재현 가능한 곰팡이(A. oryzae MJS14), bacilli(Bacillus subtilis D119C), 젖산균, 효모 종균들을 개발하였다. 이들 종균은 메주와 된장에서 시험공장 수준에서 성공적으로 된장 발효에 사용되었다. A. oryzae MJS14는 곰팡이독소를 생산하지 않는 전통메주에서 분리한 균주이며, B. subtilis D119C는 아미노산 탈탄산 효소 능이 낮고 Bacillus cereus 억제능이 높은 전통된장에서 분리된 균주이다. 이들 종균은 \(4^{\circ}C\), \( -20^{\circ}C\), 그리고 상온에서 24주 동안 저장된 후, 그 생존율과 안정성을 4주마다 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주</h2> <p>본 연구 그룹은 선행 연구에서 안전성이 검증되고 전통된장 풍미를 재현할 수 있는 곰팡이, bacilli, 젖산균, 효모 종균을 개발하였고, 이들 종균은 시험공장 수준에서 된장 발효에 성공적으로 적용한 바 있다. 본 연구에서는 된장 발효용 바로 사용 종균 형태로 개발하기 위해 선행연구에서 검증된 동일한 종균을 사용하였다. Aspergillus oryzae MJS14은 전통메주로부터 분리한 곰팡이로 곰팡이독소를 생산하지 않는 균주로서, 일반적인 배양을 위해서는 potato dextrose agar (PDA) (Acumedia, Neogen, USA) 배지를 사용하였다. 메주 및 된장에서 콩알메주 및 된장에서의 A. oryzae 수 분석을 위해서는 Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol (DRBC) (Acumedia) 배지를 사용하였다. Bacillus subtilis D119C는 전통된장으로부터 분리된 균주로서 단백질 및 전분 분해효소능이 높고 아미노산 탈탄산 효소 능이 낮으며 Bacillus cereus 억제능이 높은 균주로 nutrient agar (NA) (Acumedia) 배지에 배양하였다. 유산균 종균인 Tetragenococcus halophilus 7BDE22 또한 된장으로부터 분리된 균주로 \( 3 \% \mathrm { NaCl } \) 과 \( 0.1 \% \) biotin을 함유한 MRS broth (Acumedia) 배지에 배양하였다. 호염성 Zygosaccharomyces rouxii SMY045는 알코올 생산능이 높고 생물막을 형성하지 않는 효모로 \( 10 \% \mathrm { NaCl } \) 을 포함한 YPD ( \( 1 \% \) yeast extract, \( 2 \% \) peptone, \( 2 \% \) glucose)에 배양하였다.</p> <h2>건조 종균의 제조</h2> <p>각 종균은 건조 분말형태로 개발하였다. 곰팡이 종균을 위해 A. oryzae MJS14를 \( 1 \times 10 ^ { 6 } \) spore/g 수준으로 콩, 쌀 및 보리에 접종 후 2 일 동안 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양한 후 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24시간 동안 열 건조하거나 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 동결 후 3일간 동결건조한 후 믹서기를 이용 분말화하였다. 각 시료의 포자는 hemocytomer를 이용하여 계수하였다. Bacillus 건조 종균을 위해서 B. subtilis D \( 119 \mathrm { C } \) 를 \( 1 \times 10 ^ { 7 } \mathrm { CFU } / \mathrm { g } \) 수준으로 콩에 접종 후 1 일간 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양 후 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 동안 열 건조 및 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 동결 후 3일간 동결건조한 후 믹서기를 이용 분말화하였다. 유산균 종균인 T. halophilus 7BDE22는 MRS (3% NaCl, 0.1% biotin 함유) 배지에 접종 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 3일간 배양하였고 효모 종균인 Z. rouxii SMY045는 \( \mathrm { YPD } \left (10 \% \mathrm { NaCl } \right . \) 함유)에 접종 후 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 3일간 배양 후, 각각 \( 30 \mathrm { ml } \)의 배양액을 \( 2,000 \times \mathrm { g } , 10 \)분간 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 회수된 종균에 \( 30 \mathrm { ml } \)의 동결보호제를 첨가 후 동결건조하였으며 사용된 동결보호제는 각각 Table 3, 4와 같다. 세균, 유산균, 효모의 계수는 평판배지를 이용 집락수로 계수하였다. 모든 종균은 상온, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 및 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24주 동안 저장하면서 처음 4주간은 매주 생존율을 측정하였으며 4주차 이후부터는 4주 단위로 생존율을 측정하여 안정성을 평가하였다.</p>