분변시료는 당뇨나 암, 간질환과 같은 기저질환을 갖고 있지 않은, 채취 시점으로부터 3개월 이내에 장내미생물에 영향을 줄 수 있는 항생제, 술, 약품 등의 섭취를 하지 않은 건강한 성인 남성으로부터 기증받았으며 FF과정은 이전에 연구되어 보고된 방법으로 수행되었고, 이에 따라 BCM을 제조했다. 장내미생물생태 분석을 위한 dsDNA는 반응된 FF 산물로부터 추출되었고 시퀀스데이터는 Miseq SOP 에 따라 Mothur software를 사용하여 분석했다.
<h2>Fecal fermentation (FF)</h2> <p>사용한 분변시료는 제주대학교 생명윤리위원회(IRB)의 승인을 받아 채취하였다(JJNU-IRB- \( 2018 \)- \( 040 \)- \( 002 \)). 분변시료는 당뇨나 암, 간질환과 같은 기저질환을 갖고 있지 않은 건강한 성인 남성으로부터 기증받았으며, 실험에 참여한 피험자들은 채취 시점으로부터 \( 3 \)개월 이내에 장내미생물에 영향을 줄 수 있는 항생제, 술, 약품 등의 섭취를 하지 않은 사람으로 구성되었다. FF과정은 이전에 연구되어 보고된 방법으로 수행되었고, 이에 따라 Basal Culturing medium (BCM)을 제조했다. 분변은 채취하여 산소를 치환시킨 Phosphate buffered saline \( (10 \% \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \)에 균질화 시킨 후 채로 걸러 anaerobic chamber (Bactron Ⅱ, SHEL LAB, Cornelus, OR, USA)로 옮겨 혐기상태를 유지하였다. 준비된 BCM에 \( 10 \% \mathrm { w } / \mathrm { v } \)로 분변시료를 분주한 뒤 동결 건조된 GID 소화산물( \( 10 \% \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) 첨가하였다. Fecal fermentation은 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 2 \)시간 동안 진행하였고, triplicate로 실험을 진행하였다. FF반응 직후 액체질소에 넣어 동결시켜 장내미생물 반응 및 변화를 중지시켰다. 그 후 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 보관하며, 장내미생 물생태 분석에 이용하였다.</p> <h2>DNA extraction and \( 16 \)S rRNA gene sequencing</h2> <p>장내미생물생태 분석을 위한 dsDNA는 반응된 FF 산물로부터 추출되었다. 동결된 샘플은 얼음위에서 녹이고, 그 중 \( 1 \mathrm { ~mL } \)을 \( 10,000 \mathrm { rpm } \)에서 \( 10 \) 분간 원심분리하였다. 샘플 상층액은 버리고, 남은 pellet으로부터 QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit (QIagen, Hilden, Germany)을 이용하여 DNA를 추출하였으며, Qubit dsDNA HS assay kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 \( 5 \mathrm { ng } / \mu \mathrm { L } \)로 농도를 표준화 하였다. \( 16 \)S rRNA 유전자 내 가변부위(Variable region) 중 V \( 3 \)-V \( 4 \)을 \( 5 ' \)-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG; forward primer, \( 5' \) GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC; reverse primer로 polymerase chain reaction (PCR)를 이용하여 증폭시켰다. 이후의 MiSeq library 제작과정은 Illumina (San Diego, CA, USA)에서 제공하는 16S Metagenomic sequencing library preparation protocol을 참고하여 수행되었다. 제작한 MiSeq Library는 마크로젠(Seoul, South Korea)에 시퀀싱을 의뢰하였으며, raw data를 받아 분석하였다.</p> <p>시퀀스데이터는 Miseq SOP (https://mothur.org/wiki/miseq_sop/)에 따라 Mothur software를 사용하여 분석했다. 간단하게 설명하자면 paired-end 형태로 얻어진 raw reads를 assemble하고, SILVA database version \( 138 \)에 align하였고, rare sequence들은 'pre.cluster'을 사용하여 수정하였다. Operational taxonomic units (OTUs)는 opti.clust algorithm을 이용하여 \( 97 \% \) 유사성으로 계산되었으며, Bray-curtis index를 기반으로 dissimilarity를 계산하여 \( 2 \)차원적 그래프인 Non-metric multidimensional scaling (NMDS)로 나타냈고 유의적인 차이를 나타내는 OTUs는 Linear discriminant analysis Effect Size (LEfse)를 이용하여 분석하였다. Heatmap은 R software에서 heatmap. \( 2 \) package를 사용하여 시각화 하였다.</p>