GM10 세포의 배양액이 포함된 반응 혼합액에 효소의 성질을 검토하기 위해 여러 저해제를 처리하고 IGFBP-5를 첨가한 후 분리해 western blot으로 IGFBP-5의 분해 정도와 각 저해제별 IGFBP-5의 저해정도를 확인했다. glucose 배지에서 처리한 배양액을 회수하고 gelatin이 함유된 SDS-PAGE로 분리한 후 gel을 세척했다. 그 후 fix solution으로 고정하고, staining solution으로 염색한 뒤 destaining solution으로 탈색시켰다.
<h2>IGFBP-5 proteolysis</h2> <p>GM10 세포를 \( 25 \mathrm{~mM} \) glucose 배지에서 배양하여 무혈청배지로 교환하고 IGF-I \( (100 \mathrm{~ng} / \mathrm{ml}) \), insulin( \( 100 \mathrm{~ng} / \mathrm{ml}) \) 을 처리한 배양액 \( 50 \mu \) l와 \( 5 \mathrm{~mM} \) glucose와 \( 25 \mathrm{~mM} \) glucose 배지에서 배양한 세포배양액 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 에 \( 0.5 \mathrm{~M} \) tris \( 10 \mu \mathrm{l}, 100 \mathrm{~mM} \) \( \mathrm{CaCl}_{2} \) 를 \( 2 \mu \mathrm{l} \) 첨가한 반응 혼합액에 효소의 성질을 검토하기 위해 저해제(50 mM EDTA, \( 2 \mathrm{mM} \) PMSF, \( 1 \mathrm{~mM} \) 1,10-phena-throline, \( 5 \mathrm{~mM} \) aprotinin, \( 0.2 \mathrm{~mM} \) E64, \( 3 \mathrm{~mM} \) Benzamide, \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) heparin)를 처리하여 실온에서 30분 반응시킨 후에 intact IGFBP-5를 \( 100 \mathrm{~ng} \) 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) water bath에서 하룻밤 반응시켰다. Sample buffer로 반응을 중지시킨 후 \(12.5\%\) SDS-PAGE로 분리하여 membrane에 이동시킨 membrane을 western blot으로 IGFBP-5의 분해 정도를 확인하였으며, 또한 각각의 inhibitor에 의한 IGFBP-5의 저해정도를 확인하였다.</p> <h2>Gelatin zymography</h2> <p>GM10 세포를 \( 5 \mathrm{~mM} \) glucose와 \( 25 \mathrm{~mM} \) glucose 배지에서 배양한 후 무혈청 배지로 교환하고 \( 25 \mathrm{~mM} \) glucose 배지에 각각 IGF-I(\(100 \mathrm{~ng} / \mathrm{ml}) \), insulin \( (100 \mathrm{~ng} / \mathrm{ml}) \)을 첨가하여 하룻밤 배양하였다. 또한 \( 25 \mathrm{~mM}, 5 \mathrm{~mM} \) glucose 배지에서 시간별로 처리한 배양액을 회수하여 \( 10 \% \) gelatin이 함유된 \( 10 \% \) SDS-PAGE로 분리하였다. 그런 다음 gel을 \(2.5\%\) Triton X-100으로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 세척하고 탈이온수로 세척한 다음, \(4 \mathrm{~mM} \mathrm{CaCl} \)를 함유한 \( 50 \mathrm{~mM} \) Tris buffer \( (\mathrm{pH} 7.4) \)에 하룻밤 방치하였다. 여기에 fix solution \(7\%\) acetic acid, \( 40 \% \) methanol)으로 고정하고 staining solution(\(0.1\%\) coomassie brilliant blue G-250, \(10\%\) acetic acid)로 염색한 후 destaining solution(\(7\%\) acetic acid, \( 20 \% \) methanol)로 탈색시켜 확인하였다.</p> <h2>실험결과의 통계처리</h2> <p>본 연구의 모든 분석수치는 각 실험군의 평균 \( \pm \) 표준편차로 나타내었고, 결과는 SPSS PC 프로그램을 이용하여 통계 분석하였다. 각 실험군간의 유의성은 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test로 분석하였다.</p>