1 N HCI를 사용하여 pH를 2.5로 조정한 0.05 M sodium phosphate buffer에서 유산균주를 접종하고, 생존율을 측정하여 내산성을 평가했다. 0.3% 농도의 oxgall 용액을 첨가한 MRS 배지에서도 유산균주를 접종하고, 생균수를 측정하였다. oxgall을 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 생균수 비율을 통해 담즙산 내성을 간주하였다.
<p>유산균 선발에 사용한 기본배지에 chlorogenic acid를 1 \( \mathrm { mM } \) 농도로 첨가하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24시간 배양한 다음, 원심 분리하여 얻어진 균체를 \( 50 \mathrm { mM } \) ammonium acetate buffer \( ( \mathrm { pH } 6.0) \) 로 2회 씻어내고 동일한 buffer에 현탁하였다. 현탁 액에 glass beads (150-212 \( \mu \mathrm { m } \), Sigma, USA)를 첨가하여 vortex mixer를 이용하여 균체를 파쉐한 다음, 원심분리하여 조효소액을 회수하였다. \( 50 \mathrm { mM } \) ammonium acetate buffer \( ( \mathrm { pH } \) 6.0)에 chlorogenic acid를 \( 1 \mathrm { mM } \) 농도로 녹인 기질용액과 동량의 조효소액을 혼합하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 반응시킨 다음, acetic acid를 최종 농도 \( 30 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 가 되도록 첨가하여 반응을 종결시켰다. 조효소액의 단백질 정량에는 Bio-Rad protein assay kit (Bio-Rad, USA)를 사용하였고, 표준물질로는 bovine gamma globulin을 사용하였다. Membrane filter \( (0.2 \mu \mathrm { m } ) \) 를 이용하여 여과한 반응 종결액은 HPLC를 이용하여 chlorogenic acid의 정량적 감소를 측정하 였고, 반응물 및 생성물의 검출에는 UV detector (Waters 410 , USA)을 사용하여 \( 325 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다. HPLC 분석에는 TSK-gel ODS 80TS column (4.6×150 mm, TOSHO, Japan)을 사용하였고, 전개용매 \( 0.5 \% \) acetic acid:acetonitrile \( (80: 20) \) 는 \( 1 \mathrm { ~mL } / \mathrm { min } \) 로 흘려주었다. 효소 활성 단위는 상기 조건에서 \( 1 \mu \mathrm { mol } \) 의 chlorogenic acid를 분해하는뎨 필요한 효소량을 1 unit로 정하였다.</p><h2>내산성 및 담즙산 내성 평가</h2> <p>내산성 평가는 Kobayashi 등의 방법을 변형하여 수행하였다. 1 N HCI을 이용하여 \( \mathrm { pH } \)를 2.5로 조정한 \( 0.05 \mathrm { M } \) sodium phosphate buffer ( \( \mathrm { pH } \) 7)에 분리한 유산균주 배양액을 초기 균수가 \( 10 ^ { 8 } \mathrm { CFU } / \mathrm { mL } \) 가 되게 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 3시간 정치 반응 후, 반응 전과 후의 생균수를 측정하여 계산 한 생존율을 내산성으로 간주하였다.</p><p>담즙산 내성은 Pennacchia 등의 방법을 변형하여 평가하였다. 여과 제균된 oxgall 용액(Difco)을 \( 0.3 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) 농도가 되도록 첨가한 MRS 배지에 분리한 유산균주 배양액을 초기 균수가 \( 10 ^ { 7 } \mathrm { CFU } / \mathrm { mL } \) 가 되게 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24시간 정치배양 후, 생균수를 측정하였다. 또한 oxgall을 첨가하지 않고 동일한 조건에서 배양한 대조군의 생균수를 측정하고, 대조군 대비 처리군의 생균수 비율을 답즙산 내성으로 간주하였다.</p><h2>실험동물 및 유산균 투여</h2>