약간 수정된 Kolar을 이용해 콜라겐 함량을 구하고 Food code I의 방법에 약간의 변화를 주어 흡광도를 측정함으로써 콘드로이친황산 함량을 구할 수 있다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료 및 시약</h2><p>실험재료로 사용한 캥거루 꼬리는 호주의 식품무역회사에서 수입한 야생의 캥거루 유래의 꼬리를 사용하였으며, 소꼬리는 동대축산 유통 및 무역 회사에서 수입한 호주산 제품을 사용하였다. Hydroxyproline 등의 분석 실험에 사용한 모든 시약은 특급을 사용하였다.</p><h2>콜라겐 함량 측정 및 콘드로이친황산 축정</h2><p>콜라겐 함량은 Kolar의 방법을 약간 수정하여 시료를 가수분해한 후 희석하지 않고 total hydroxyproline을 정량한 후 다음과 같이 계산하였다.</p><p>콜라겐 함량 \( (\mathrm{mg} / 100 \mathrm{ml})=(\mathrm{h} \times 2.5) /(\mathrm{m} \times \mathrm{V}) \)\( \mathrm{h}=\mathrm{hydroxyproline,} \mathrm{m}= \) 시료 중량, \( \mathrm{V}= \) 용량</p><p>콘드로이친황산 함량은 Food code I의 방법을 약간 수정하여 시료를 희석하지 않고 여과한 시료에 글루쿠론산 표준용액으로 기준 값을 설정한 후 붕산나트륨 황산시약과 카비졸시약을 처리한 시료를 \( 530 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>단백질 정량</h2><p>Bradford 방법을 사용하여 정량 하였으며, 검량선은 bovine serum albumin을 표준으로 작성하여 단백질을 정량하였다.</p><h2>무기물 함량</h2><p>A.O.A.C 방법에 의해 원자홉광 분석기를 이용하여 분석하였다.</p><h2>총 지질 함량</h2><p>A.O.A.C. 방법에 의해 분석하였다.</p><h2>CLA 측정</h2><p>지질 추출은 Folch 등의 방법으로 chloroform과 methanol로 추출하였다. 시료 \( 25 \mathrm{~g} \)에 Folch 용액( \( \mathrm{CHCl}_{3}: \mathrm{CH}_{3} \mathrm{OH}= 2:1\)) \( 180 \mathrm{ml} \)와 BHA \( 500 \mu \mathrm{l} \)를 넣고 균질기( \(2,500 \mathrm{rpm}\) )로 1분간 균질화시킨 다음 \( 0.08 \% ~\mathrm{NaCl} ~50 \mathrm{ml} \)을 첨가하여 30초간 흔들어 혼합한 후 \(3,000 \mathrm{rpm}\)에서 10분간 원심분리 시켰다. 상층은 aspiration을 통하여 제거하고 하층은 funnel filter paper에 sodium anhydrous sulfate를 첨가하여 여과하였다. 추출물은 감압농축기에서 농축시키고 \( \mathrm{N}_{2} \) 하에서 남은 용매를 제거하였다. 메칠레이션(Methylation)은 Folch 방법으로 추출한 지질 \( 80 \mathrm{mg} \)과 \( 0.4 \mathrm{mg} \)의 tricosanoic acid methyl esters\( (0.4 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) hexane, internal standard \( ) \)를 screw-capped test tube에 넣고 질소충전 하에서 용매를 제거한 후 메탄올에 녹인 \( 0.5 \mathrm{N} ~\mathrm{NaOH} ~1 \mathrm{ml} \)을 넣고 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \)에서 7분 동안 가수분해시킨 다음 실온에서 5분 동안 냉각시켰다. 유리 지방산은 메탄올에 녹인 \( 14 \% \) boron trifluoride \( 1 \mathrm{ml} \)을 첨가하여 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 메칠레이션 시킨 후 30분간 실온에서 냉각시켰다. 헥산 \( 2 \mathrm{ml} \)과 증류수 \( 2 \mathrm{ml} \)을 넣고 GLC 분석을 위하여 상층에서 \( 1 \mathrm{ml} \)을 회수하였으며, GLC로 분석 전까지는 냉동고에 보관하였다.</p><h2>Gas chromatograpy analysis</h2><p>conjugated linoleic acid methyl esters 8 total fatty acid의 함량을 구하기 위해 회수한 sample \( 0.5 \mu \mathrm{L} \)를 split injection port에 주입하여 이때의 GLC 조건은 다음의 Table1과 같다.</p>