벼 식물체는 염처리를 위해 유리온실에서 4주 동안 생육하였으며, 수경액은 1/2 MS 배지를 사용하였다. 그리고 Trizol을 이용하여 염처리 된 벼와 여러 다른 벼 품종의 잎에서 RNA를 추출하였다. 또한, 유전자 발현량을 확인하기 위해 real-time PCR을 사용하였다.
<h2>Real-time PCR을 이용한 염처리시 벼멸구 저항성 유전자의 발현량 측정</h2> <p>본 실험은 자포니카와 인디카 품종간에 비교실험으로 수행하였다. 자포니카 품종으로는 일품벼와 상해향혈나를 사용하였고, 인디카 품종으로는 국제미작연구소(IRRI)에서 내염성 품종으로 선발한 Pokkali와 감수성 품종인 IR29를 사용하였다. 염처리를 위해 벼 식물체를 유리온실에서 4 주간 생육 하였으며, 수경액은 기본 영양 기준을 충족하는 \( 1 / 2 \mathrm { MS } \) 배지를 사용하였고 일주일에 2회씩 교환하였다. 염처리는 자 포니카와 인디카 품종간에 조성을 달리하여, 자포니카 품종은 \( 0,50,200 \mathrm { mM } \) 으로 인디카 품종은 \( 0,100 \mathrm { mM } \)로 24시간 처리하였다. 인디카 품종과 달리 자포니카 품종인 일품벼와 상해향혈나는 염 저항성 정도와 관련하여 농도기준에 대해 보고된 바가 없기에 기존에 보고를 참고하여 50과 200 \( \mathrm { mM } \)의 농도로 처리하였다. RNA는 염처리 된 일품벼, 상해향혈나, Pokkali와 IR29의 잎에서 Trizol (Invitrogen사, Carlsbad, CA, USA)을 사용해 추출하였다. 이렇게 얻어진 각 \( 5 \mu \mathrm { g } \) 의 RNA가 RevertAidTM H Minus Fist Strand cDNA Synthesis Kit (MBI Fermentas 사 Amherst, NY, USA)를 이용한 cDNA 합성에 사용되었다. 유전자 발현량은 수치화하여 확인하기 위해서 real-time PCR (Takara사 SC101, Shiga, Japan)을 사용하였다. Real-time PCR 반응은 \( 25 \mu \mathrm { L } \) 의 부피에 cDNA \( 1 \mu \mathrm { L } , 1 \mathrm { X } \) 의 Premix Taq, 3000배 희석된 SYBR Green I을 \( 2.5 \mu \mathrm { L } , 0.3 \mu \mathrm { M } \)의 Os-Bil forward primer(5'CTGCATCAACACATTCCAGAG 3')와 reverse primer (5' ACTGTTTTGTCAGATGGTAGAGTGA 3') 또는 Os-Act1의 forward primer(5'TCCATCTTGGCATC-TCTCAG 3')와 reverse primer (5' GTACCCTCATCAGG-CATCTG 3')을 넣어 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분간 predenaturation을 하고, denaturation은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20초, annealing은 \( 48 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20초, extension은 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초 과정을 반복하여 수행되었다. Os-Act1은 벼의 actin 유전자이며 내부 표준으로 사용되었다.</p>