난황 단백질을 효소 가수분해하여 sialic acid를 회수하는데 한외여과(ultrafiltration)와 투석을 사용하여 원료에 포함된 에탄올의 농도가 가수분해 효율과 sialic acid의 회수에 어떤 영향을 주는지 조사하고 최적의 가수분해 조건을 구하며 한외여과막을 사용하여 sialic acid을 포함한 올리고당의 함량을 높이는 것이 목적이다. 액체 난황을 분무건조한 후 여기서 얻어진 난황 분말에 에탄을로 교반하면서 지질을 제거하고 alkaline protease인 Orientase를 이용해 가수분해 하였다.
<p>난황에 존재하는 sialic acid를 회수하기 위해서는 난황 단백질을 protease에 의해 가수분해시키는 것이 효율적인데 난황 단백질을 효소 가수분해에 의해 peptide화시킴으로써 sialic acid함유 올리고당을 얻을 수 있다. 일반적으로 sialic acid함유 올리고당으로 회수한 것이 기능성 식품소재로서 유용하다고 보고되었다. 효소 가수분해물에서 sialic acid가 합유된 올리고당을 선택적으로 회수하기 위해서 한외여과(ultrafiltration)와 투석을 실시하였다. 한외여과막을 사용하 면 역삼투막보다 큰 분자들을 회수할 수 있는데, 대개 크기가 \( 1 \mathrm { ~nm } \) 에서 50 100 \( \mathrm { nm } \) 까지의 지름을 가진 눈자를 회수하는데 유용하게 사용된다. 일반적으로 제품의 농축(용매의 제거) 이나 정제(낮은 분자량의 불순물의 제거)에 한외여과는 유용하게 사용되고 있고 툭히 단백질이나 고분자의 회수에 널리 사용된다.</p> <p>본 연구의 목적은 난황 단백질을 효소 가수분해할 때 원 료에 포함된 에탄올의 농도가 가수분해 효율과 sialic acid의 회수에 어떤 영향을 주는지 조사하여 최적의 가수분해 조건을 구하고 단백질 가수분해물을 얻은 후 한외여과를 실시하여 가수분해물 중에 있는 sialic acid를 포함한 올리고당의 함량을 높이는 것이다. 또한 여러 종류의 한외여과막 모듈에 대한 평가를 실시하여 sialic acid의 대량생산을 위한 공정 개발을 하는데 그 목적이 있다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>난황 단백질의 제조</h2> <p>원료로 사용된 난황 단백질은 다음과 간이 제조하였다. 액체 난황을 분무전조한 후 여기서 얻어진 난황 분말 \( 1.0 \mathrm { ~kg } \) 에 \( 4.0 \mathrm { ~L } \) 의 \( 95 \% \) 에탄을로 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 시간 고반하면서 난황 분말 중에 함유된 지질을 제거하였다. 추출된 액을 여과한 후 다시 \( 3.0 \mathrm { ~L } \) 의 에탄을율 투입하고 교반하면서 지질을 제거하 였다. 추출여과에 의해 지질이 제거된 난황 단백질을 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 오븐에서 건조하였다. 이 때 얻어진 난황단백실의 주요 성분 의 함량은 대략적으로 단백질 \( 40 \sim 50 \% \), 지질 \( 20 \sim 30 \% \), 물 5 \( 10 \% \), 그리고 ethanol 20 30 \%의 조성을 가지고 있다.</p> <h2>Protease에 의한 난황 단백질의 가수분해</h2> <p>난황 단백질의 가수분해는 다음과 같이 실시하였다. 난황 단백질 \( 800 \mathrm { ~g } \) 에 물 \( 3.2 \mathrm { ~L } \) 을 넣고 \( 5 \mathrm { M } \mathrm { NaOH } \) 로 \( \mathrm { pH } \) 를 \( 10.0 \) 으로 조정하였고, 반응온도를 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 유지시켰다. 그리고 alkaline protease인 Orientase (Hanku, Japan)를 난황 단백질의 중량 에 대해 \( 0.05 \% \) 를 첨가하였다. 1 시간 정도 교반을 하였고 그 이후에는 교반을 중지하였다. 8 시간 후에 다시 \( \mathrm { NaOH } \) 로 \( \mathrm { pH } \) 를 \( 10.0 \) 으로 조정하였고 Orientase를 다시 \( 0.05 \% \) 를 침가하였다. 8 시간 반응이 끝난 후 \( 5 \mathrm { M } \mathrm { HCl } \) 로 \( \mathrm { pH } \) 를 \( 6.5 \) 로 조정하였다. 그리고 exo-protease인 Flavorzyme (Novo, Denmark)을 \( 0.1 \% \) 로 투입하여 16 시간 반응시키고 반웅을 멈추었다. 효소가수분해가 끝난 후에 반응물에 남아있는 효소를 실활시키 기 위해 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20 분간 가열하였다. 반응이 끝난 후 전체 액을 진공여과하였고 이 때 여과면적 및 여과효율을 증가시 키기 위해 셀라이트를 코팅한 후 여과시켰다. 얻어진 난황 단백질 가수분해물의 용액을 한외여과의 원료로 사용하였다.</p>