토양 미생물은 계대 배양법을 통하여 미생물이 자란 배지상에서 형태나 색깔이 다른 colony를 순수 분리하였으며, ACC deaminase 활성은 Barnawal 등의 방법을 통해 평가하였다. 또한 표준물질로 IAA를 이용하여, 감량선을 작성하고 시료의 농도를 환산하였다. 다양한 온도 및 염농도에서 균체의 생육능을 확인함으로써 분리주들에 대한 기후 및 토양 환경에 대한 적용성과 적응능을 알아보았으며, 질소 고정화능 조사에서는 Test를 통해 배지색이 푸른색으로 변할 경우 양성으로 판단하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>토양 미생물의 분리</h2> <p>본 연구에서 사용한 근권 토양과 뿌리는 부산 일대의 신라대학교 인근 야산, 대저 토마토 밭, 기장군 배 밭, 창원 인근 야산 및 텃밭, 제주시 노리매 공원 및 인근 해변을 포함한 7곳으로부터 채취하였다. 채집된 토양과 뿌리를 음지에서 2일간 풍건하였으며, 각 시료 1 g을 9 ml의 멸균된 생리식염수에 현탁하였다. Serial dilution으로 희석한 용액을 6가지 평판 배지인 Bennet agar (BA, \( 1 \% \) glucose, \( 0.2 \% \) peptone, \( 0.1 \% \) beef extract, \( 0.1 \% \) yeast extract), glucose minimal salts agar (GMSA, \( 0.2 \% \) glucose, \( 1 \% \) yeast extract, \( 0.2 \% \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 0.3 \% \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}, 0.01 \% \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.0002 \% \) \( \mathrm{MnSO}_{4} \) ), potato dextrose agar (PDA, Difco \( { }^{\mathrm{TM}} \) ), tryptic soy agar (TSA, Difco \( { }^{\mathrm{TM}} \) ) plate, actinomycetes isolation agar (AIA, \(0.2\%\) sodium caseinate, \(0.01\%\) L-asparagine, \( 0.4 \% \mathrm{C}_{3} \mathrm{H}_{5} \mathrm{O}_{2} \mathrm{Na}, 0.05 \% \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}, 0.01 \% \mathrm{MgSO}_{4}, 0.0001 \% \)\( \mathrm{FeSO}_{4}, 1.5 \% \) agar), humic-vitamin agar (HV, \(0.1\%\) humic acid, \( 0.05 \% \mathrm{KCl}, 0.05 \% \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4}, 0.05 \% \mathrm{MgSO}_{4} \), \( 0.002 \% \mathrm{CaCO}_{3}, 0.002 \% \mathrm{FeSO}_{4}, 0.1 \% \mathrm{~V}_{\mathrm{B}} \) stock solution, \( 1.5 \% \) agar)에 도말한 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 일간 배양하였다. 또한 채집한 식물 뿌리로부터 내생진균류의 분리를 위해 계면활성제(Tween 80)와 표백제 (\(1.0\%\) perchloric acid)로 살균 처리하여 멸균수로 세척한 후 sonication 하였다. Sonication 처리된 뿌리를 각 6가지 평판 배지에 올려서 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 일간 배양하였다. 미생물이 자란 배지상에서 형태나 색깔이 다른 colony를 계대 배양법을 통하여 순수 분리하였다.</p> <h2>저항성 물질 ACC deaminase 생성능 조사</h2> <p>건조, 염, 온도 등 환경스트레스에 대한 저항성 기작의 주요지표인 ACC deaminase 활성은 Barnawal 등[11]의 방법을 통해 평가하였다. Test tube에 TSB를 넣고 선별된 분리주를 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2일간 배양한 뒤 원심 분리하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체는 DF salt 배지 \( (0.4 \% \) \( \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 0.6 \% \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4}, 0.02 \% \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.0001 \% \) \( \mathrm{FeSO}_{4}, \quad 0.000001 \% \quad \mathrm{H}_{3} \mathrm{BO}_{3}, \quad 0.00001 \% \quad \mathrm{MnSO}_{4} \cdot \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \), \( 0.000007 \% \mathrm{ZnSO}_{4}, 0.000005 \% \mathrm{CuSO}_{4}, 0.000001 \% \mathrm{MoO}_{3} \),\( 0.2 \% \) glucose, \( 0.2 \% \mathrm{C}_{6} \mathrm{H}_{12} \mathrm{O}_{7}, 0.2 \% \mathrm{C}_{6} \mathrm{H}_{8} \mathrm{O}_{7}, \mathrm{pH} \) 7.3)로 두 차례 세척하고 질소원으로 \( 3 \mathrm{mM} \mathrm{ACC} \) 가 첨가된 \( \mathrm{DF} \) salt 배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2일간 배양하였다. 대조구로는 질소원으로 아무것도 첨가하지 않은 배지를 이용하였으며, \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 \( \mathrm{ACC} \) 의 이용에 따른 균체의 증가를 통해 ACC deaminase의 생성을 확인하였다.</p> <h2>Indole-3-acetic acid (IAA) 생성능 조사</h2> <p>식물성 호르몬인 IAA 생성능을 평가하기 위해 \( 0.1 \% \) tryptophane이 첨가된 King’s B (\(2\%\) proteose peptone, \( 0.25 \% \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}, 0.6 \% \mathrm{MgSO}_{4}, 1.5 \% \) glycerol) 배지에 분리 주를 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2일간 배양하였다. 원심분리( \(10,000 \mathrm{rpm}\),15분)후 상층액을 분리하여, Salkowski’s rent \(35\%\) \( \left.\mathrm{HClO}_{4} 50 \mathrm{ml}, 0.5 \mathrm{M} \mathrm{FeCl}_{3} 1 \mathrm{ml}\right) \) 과 1:2 (v/v)의 비율로 혼합한 다음, 분홍색이 발색되는 동안 상온에서 30분간 정치하였다. 발색되는 정도를 분광광도계(Spectrophotometer, Multiskan GO, Thermo Scientific, Vantaa, Finland)를 이용하여 \(530 \mathrm{nm} \)에서 측정하였다. 표준물질로 IAA를 이용하여, 위와 같은 동일한 방법으로 검량선을 작성하여 시료의 농도를 환산하였다.</p> <h2>분리주의 다양한 환경조건에 대한 생육특성</h2> <p>분리주들에 대한 기후 및 토양 환경에 대한 적용성과 적응능을 알아보기 위하여 다양한 온도 \( \left(10-50^{\circ} \mathrm{C}\right), \mathrm{pH}(\mathrm{pH} \) 4-12) 및 염농도 \( (\mathrm{NaCl}\ 0-10 \%) \) 에서 균체의 생육능을 확인하였다. 배양된 분리주의 생장은 분광광도계를 이용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>질소 고정화능 조사</h2> <p>질소 고정세균 분리용 nitrogen free bromothymol blue \( \left(\mathrm{NFB}, 0.5 \%\left(\mathrm{HO}_{2} \mathrm{CCH}_{2} \mathrm{CH}(\mathrm{OH}) \mathrm{CO}_{2} \mathrm{H}, \quad 0.05 \% \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\right.\right. \), \( 0.001 \% \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.002 \% \mathrm{NaCl}, 0.005 \% \mathrm{FeSO}_{4} \cdot \) \( 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.0002 \% \mathrm{Na}_{2} \mathrm{MoO}_{4}, 0.001 \% \mathrm{MnSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.001 \% \) \( \mathrm{CaCl}_{2}, 0.4 \% \mathrm{KOH}, 0.2 \% \) bromothymol blue (in \( 0.5 \% \) alcohol),\( 0.175\%\) agar, pH 6.8) 배지를 이용하였다. 분리용 NFB 배지는 무기염과 탄소원만 들어 있고 질소원이 결핍된 배지로서 대기 중의 질소를 고정할 능력이 있는 분리주만이 생장할 수 있는 선택배지를 이용하였다. Test tube에 NFB 배지를 넣고 전배양된 분리주를 loop로 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4일간 배양하면서 배지 색이 푸른색으로 변할 경우 양성으로 판단하였다.</p>