스테비아는 남미가 원산지인 국화과 감미식물이여, 스테비아추출물 발효액으로부터 세균 23균주와 효모 10균주를 분리하여 일반적인 분류학적 방법과 분자유전학적 방법으로 동정을 실시하였다. 분리된 균주들은 5속 10종의 세균과 1종의 효모균에 속하는 것으로 나타났으며 16S와 18S rDNA 염기서열 분석에 근거하여 계통수 작성 및 분리균들의 항미생물 활성을 여러 세균과 식물병원성 진균들에 대해 조사하였다. 분리균들 중에서는 \(Lactobacillus paracasei\) SB13이 광범위한 세균들에 대해서 강한 항균활성을 나타냈다. 이를 토대로 친환경적 미생물 제제를 개발하는데 도움을 줄 것으로 사료된다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>유효 미생물의 분리 및 1 차 동정</h2> <p>스테비아추출물 발효액에서 분리된 균주들의 콜로니 형태를 바탕으로 한 육안 판정으로 세균 23균주와 효모 10균주를 1차 선별하였다. 선별된 분리세균 23균주를 대상으로 형태학적, 배양학적, 생화학적 특성을 조사하였다. 그 결과 SB08을 제외하고는 모두 그람 양성균이었으며 주로 바실러스와 젖산균 계통의 세균이 많이 존재하는 것으로 나타났다. 대부분이 간균이었고 SB05와 SB17만이 구균이었다. 최적 성장온도는 대부분이 \( 30 \sim 35^{\circ} \mathrm{C} \) 이었고 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 이상에서 자라는 고온균은 발견되지 않았다. 스테비아추출물 발효액에서 분리된 효모들은 API 20C AUX kit를 사용하여 1차 동정을 실시하였다. 그 결과 모두 거의 유사한 결과를 나타내었고 kit에 포함된 동정표에 나타나있는 효모들과 일치하는 균주는 없었다.</p> <h2>rDNA 염기서열 분석에 의한 동정 및 계통분류</h2> <p>분자생물학적 기술은 균주를 동정하는데 큰 도움이 되고 있다. 특히 진화적 상관관계를 알아내기 위해 PCR로 증폭된 rDNA 유전자의 염기서열을 분석하는 것은 미생물 분류의 중요한 도구가 되었다. 종 (species) 수준까지의 정확한 동정을 위하여 분리세균들은 16S rDNA의 염기서열을, 효모들은 18S rDNA의 염기서열을 결정하여 BLAST (version 2.2.14) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 그 결과 스테비아추출물 발효액에서 분리된 세균 23균주에는 \(Bacillus\)속 6종, \(Lactobacillus, Micrococcus, Moraxella, Staphylococcus\)속 각 1종씩 모두 5속 10종의 세균이 존재하는 것으로 확인되었다. 분리된 효모 10균주는 모두 동일한 \(Pichia\) \(membranifaciens\)인 것으로 나타났다. 일반 분류학상으로 \( 97 \% \) 이상의 rDNA 염기서열 상동성을 나타내는 균주들의 경우 하나의 종으로 정의할 수 있다. 스테비아추출물 발효액으로부터 분리된 유효 미생물들의 분석 결과 모두 \( 98 \% \) 이상의 상동성을 나타내었다. 스테비아추출물 발효액에서 분리된 세균들 중에서는 \(Lactobacillus\) \(paracasei\)가 우점종인 것으로 나타났다.</p> <p>스테비아추출물 발효액으로부터 순수 배양된 10종의 분리균들의 계통발생학적 연관관계를 측정하기 위해 16S rDNA 유전자 조각의 염기서열을 결정하여 알려진 서열들과 CLUSTAL W 프로그램을 이용하여 비교하였고 그 결과를 계통수로 나타내었다. 분리된 효모의 18S rDNA 유전자 조각의 염기서열을 동일한 방법으로 분석하여 \(Pichia\)속에 속하는 효모들과의 계통발생학적 연관관계를 조사하였다.</p> <h2>유효 미생물들의 항균 및 항진균 활성</h2> <p>스테비아추출물 발효액으로부터 분리되어 순수 배양된 유효 미생물 11종의 항균 및 항진균 활성을 측정한 결과 젖산균인 \(L.\) \(paracasei\) SB13이 가장 높은 항균 활성을 나타내었다. 이 균주는 8종의 그람양성균과 8종의 그람음성균에 대한 광범위한 항균 활성을 나타내었고 진균인 \(Rhizoctonia\) \(solani\)에 대해서도 항진균 활성을 나타내었다. 젖산균인 \(L.\) \(paracasei\)는 nisin과 같은 천연 항균물질인 박테리오신(bacteriocin)을 생산하는 것으로 알려져 있다. 박테리오신은 작은 분자량의 펩티드로 인체에 무해하며 특정 미생물들을 선택적 저해한다. 스테비아추출물 발효액에서 분리된 젖산균인 \(L.\) \(paracasei\) SB13의 항균활성도 이 박테리오신에 의한 것으로 사료된다.</p> <p>\(Bacillus\) \(pumilus\)로 동정된 SB21은 \(Listeria\) \(ivanovii\)에 항균활성을 나타냈으며 SB21과 \(B.\) \(subtilis\) SB22 두 균주는 작물병원성 진균인 \(Collectotricum\) \(coccodes\)와 \(Ophiostoma\) \(ulmi\)에 대한 항진균 활성을 나타내었다. \(Bacillus\)속이 생산하는 항진균물질들은 종에 따라 다양한데 \(B.\) \(subtilis\)가 생산하는 것에는 bacillomycin, fungistatin, iturin, mycosubtilin 등이 있으며, \(B. pumilus\)도 비단백질 성분의 항진균물질을 생산한다. \(Moraxella\) \(osloensis\)는 grey garden slug를 죽이는 내독소를 생산하는 것으로 알려져 있으나 스테비아추출물 발효액에서 분리된 \(M. osloensis\) SB08이 이러한 활성을 가지고 있는지는 조사하지 못하였다. 그 밖의 분리균들 중에는 \(B.\) \(megaterium\) SB01과 \(B.\) \(aquimaris\) SB07이 그람양성균인 \(Corynebacterium\) \(xerosis\)에 대한 항균활성을 나타내었고 \(B.\) \(vietnamensis\) SB19가 \(C. coccodes\)에 대한 항진균 활성을 나타내었다. 분리균들 중 \(B. fusiformis\) SB23, \(M. luteus\) SB05, \(S.pasteuri\) SB17은 길항작용을 나타내지 않았다.</p> <p>효모의 일종인 \(Pichia\) \(membranifaciens\)는 음식과 관련된 환경에서 흔히 발견되는 효모로 발효 중인 올리브 연분에서 높은 비율로 발생한다. 이런 환경에서 발견된 분리균주 중 하나인 \(P.\) \(membranifaciens\) CYC1106는 내염성 효모로 \(Botrytis cinerea\)와 같은 작물병원성 진균에 대한 길항작용을 나타내는 killer toxin을 생산한다. 스테비아추출물 발효액에서 유일하게 분리된 효모인 \(P.\) \(membranifaciens\) SY05는 세균류에는 항균활성을 나타내지 않았고 작물병원성 진균들 중에서도 고추탄저병의 원인균인 \(C. coccodes\)에만 항진균 활성을 나타내었다.</p> <h1>요약</h1> <p>스테비아(\(Stevia\) \(rebaudiana\) Bertoni)는 남미가 원산지인 국화과의 감미식물이다. 스테비아추출물 발효액으로부터 세균 23균주와 효모 10균주를 분리하여 일반적인 분류학적 방법과 분자유전학적 방법으로 동정하였다. 스테비아추출물 발효액에서 분리된 균주들은 5속 10종의 세균과 1종의 효모균에 속하는 것으로 나타났다. 16S와 18S rDNA 염기서열 분석에 근거하여 계통수를 작성하였다. 분리균들의 항미생물 활성을 여러 세균과 식물병원성 진균들에 대해 조사하였다. 분리균들 중에서는 \(Lactobacillus paracasei\) SB13이 광범위한 세균들에 대해서 강한 항균활성을 나타내었다. 이들 결과는 토양개량을 위한 친환경적 미생물 제제를 개발하는데 도움을 줄 것이다.</p>