염습지에서 채취한 식물시료의 뿌리에서 내생진균을 온도 및 기간, 환경 등의 적합한 조건 하에서 진탕배양하고 여과 후 동결건조하여 사용하였다. 그 상태의 내생진균에서 genomic DNA 추출을 하였으며, 프로그램들을 사용해 다중 정렬 수행 및 내성진균의 염기서열을 확인하고, 동정된 진균류의 속을 확인하여 내생진균의 다양성을 분석 및 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>내생진균 및 식물시료</h2> <p>본 연구에서 사용된 식물시료는 전라남도 무안의 염습지에서 채취하였다. 식물시료는 염습지 자생식물인 해홍나물(Suaeda maritima), 갯질경(Limonium tetragonum), 칠면초(Suaccha japonica), 갯잔디(Zoysia sinica), 갈대(Phragmites australis)이며, 무안 염습지의 다양한 지역에서 염생식물을 채취하였다. 그리고 각 염생식물들은 채취지역에 따라 식물코드(plant code)로 분류하여 사용하였다.</p> <h2>배양조건 및 내생진균의 분리</h2> <p>해안 염습지에서 채취한 염생식물 시료의 토양을 제거하고, 계면활성제(Tween 80)를 10 분간 처리한 후에 멸균증류수로 세척하였다. 그리고 과염소산(Perchloric acid) \( 1 \% \)로 10분간 2 회 처리한 후에 멸균증류수로 세척하였으며 \( 3 \sim 4 \mathrm{~cm} \) 길이로 절단하여 수분을 제거하였다. 내생 진균의 분리와 배양을 위하여 스트렙토마이신(streptomycin) \( 80 \mathrm{~ppm} \)이 함유된 hagem minimal medium을 사용하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 조건에서 배양하였다. 그리고 potato dextrose agar(PDA)에 계대배양하여 순수 분리하였다.</p> <p>염생식물의 뿌리에서 순수 분리한 내생진균들을 배양하기위하여 Czapek's liquid medium에서 7일 동안 \( 180 \mathrm{~rpm} \)으로 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)조건하에서 진탕배양(shake culture) 하였으며, 여과 후에, 내생진균의 균체(mycobiont)를 균류의 동정을 위하여 7일 동안 동결건조를 수행하여 사용하였다.</p> <h2>Genomic DNA추출과 PCR 조건</h2> <p>동결건조 상태의 내생진균들은 DNeasy Plant mini kit(QIAgen)를 사용하여 genomic DNA의 추출을 수행하였다. Genomic DNA는 universal primer인 ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')과 ITS4 (5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3')를 사용하여 rDNA-ITS영역을 중폭하여 수행하였다. 그리고polymerase chain reaction(PCR) 조건은 최종농도 \( 10 \mathrm{~mM} \) Tris-HCl \( (\mathrm{pH} ~8.5) \), \( 1.5 \mathrm{~mM} \) \( \mathrm{MgCl}_{2}, 200 \mathrm{~nM} \mathrm{~dNTPs} \), \( 40 \mathrm{~mM} \) KCl이고, \( 10 \mathrm{~pmol} \)의 primer와 \( 0.1 \mathrm{~unit} \)의 Ex-Taq DNA polymerase (Takara, Japan)를 사용하였다. PCR 조건은 \( \left(95^{\circ} \mathrm{C}, 2 \mathrm{min}\right) \) predenaturation, \( \left(95^{\circ} \mathrm{C}, 30\right. \mathrm{sec})\) denaturation, \( \left(54.5^{\circ} \mathrm{C}, 1 \mathrm{~min}\right)\) annealing, \( \left(72^{\circ} \mathrm{C}, 1 \mathrm{~min}\right) \) extension, (35 cycles) total cycles, \( \left(72^{\circ} \mathrm{C}, 7 \mathrm{~min}\right.\)) final extension 으로 수행하였고, 증폭된 PCR 산물은 \( 1.5 \% \) agarose gel에서 전기영동 후, ethidium bromide (EtBr)을 사용하여 15분 염색한 후, UV transilluminator로 전기영동밴드를 확인하였다. 전기영동 단편들은 QIAquick PCR purification kit(Qiagen Inc., Germany)를 사용하여 정제하였으며, ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (PEBiosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하였다. 그리고 DNA 단편들은 ABI 310 DNA sequencer (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.</p> <h2>내생진균의 계통학적 분석 및 다양성 분석</h2> <p>내생진균의 염기서열을 ClustalX 프로그램으로 다중정렬을 수행한 후, Lasergene 7과 BioEdit 프로그램을 사용하여 염기서열을 확인하였다. 그리고 분석된 내생진균의 계통학적 분석은 MEGA 4.1프로그램 Neighbor-Joining (NJ: 1000 bootstrap replicates) 방법을 이용하여 분석하였다. 그리고 내생진균들의 유전적인 동정을 위하여 rDNA-ITS 영역의 염기서열을 blastn (NCBI) 프로그램으로 분석하였다.</p> <p>내생진균의 다양성 분석을 위하여 동정된 진균류의 속(Genus)을 확인하여 Shannon's diversity index (H')를 적용하였고, 각 식물에 대한 내생진균의 다양성을 분석 및 확인하였다.</p>