RAW 264.7 cell을 2.5 x 10^5 cells/ml로 조절하고 20시간 배양한 후 SMYEE와 LPS를 처리하여 Nitric Oxide 분비량을 Griess 반응을 이용하여 측정하였다. 그 결과 SMYEE는 nitrite 농도를 증가시키며 LPS 자극에 대해 상승하는 경향을 보였고, Proliferation index ( \( \% \) of control) = Sample 흡광도 / Control 흡광도 \( \times 100 \)를 이용하여 cell proliferation을 측정하였다. RAW 264.7 cell의 세포배양액 내의 TNF- \( \alpha \), IL- 6 및 IL- \( 1 \beta \) cytokine의 분비량을 ELISA kit를 이용하여 측정하고 \( 490 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 분석하였다.
<p>Proliferation index ( \( \% \) of control) = Sample 흡광도 / Control 흡광도 \( \times 100 \)</p> <h2>Nitric oxide 분비량 측정</h2> <p>Griess 반응을 이용하여 배양액 내의 nitrite 농도를 측정하였다. RAW 264.7 cell을 \( 2.5 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { cells } / \mathrm { ml } \) 로 조절해 24-well plate에 접종하고 \( 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) incubator (MCO-15AC, Sanyo, Japan)에서 20 시간 전 배양하였다. 그 후 SMYEE를 \( 0.1,1,10,50,100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 처리하고 \( 1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 LPS로 자극하여 24 시간 본 배양하였다. 배양 상층액은 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 879 \times g \) 에서 10 분간 원심분리하여 정량 실험에 사용하였다. Griess 시약( \( 1 \% \) sulfanilamide \( + 0.1 \% \) naphthylendiamine dihydrochloride, \( 1: 1 \) )과 배양 상층액은 \( 1: 1 \) 로 상온에서 10 분간 반응시켜 microplate reader를 이용해 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양액 내 \( \mathrm { NO } \) 의 농도는 sodium nitrite ( \( \mathrm { NaNO } _ { 2 } \)) 의 농도별 표준곡선과 비교하여 산출하였다.</p> <h2>Pro-inflammatory cytokines 분비량 측정</h2> <p>RAW 264.7 cell의 세포배양액 내의 TNF- \( \alpha \), IL- 6 및 IL- \( 1 \beta \) cytokine의 분비량을 ELISA kit (Mouse ELISA set, BD Bioscience, USA)를 이용해 측정하였다. RAW 264.7 cell을 \( 2.5 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { cells } / \mathrm { ml } \) 로 조절하여 24 -well plate에 접종하고 18 시간 전 배양하였다. 그 후 \( 0.1,1,10,50,100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도별 SMYEE 와 \( 1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 LPS 를 처리하고 12 시간의 본배양을 거쳐 원심분리를 통해 세포배양 상층액을 얻었다. ELISA는 microplate에 anti-mouse TNF- \( \alpha \), IL- 6 및 IL- \( 1 \beta \) 의 capture antibody를 coating buffer에 희석 후 분주하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 하룻밤 동안 coating시켰다. 이후 \( 0.05 \% \) Tween 20 이 포함된 PBST로 세척한 후 \( 10 \% \) FBS 용액으로 blocking 하였고 PBST 로 세척한 뒤 각 microplate well에 세포 배양 상층액을 분주하고 실온에서 2 시간 반응시켰다. 반응 후 PBST로 세척하고 희석한 biotinylated anti-mouse TNF- \( \alpha \), IL-6 detection antibody와 streptavidin-horseradish peroxydase conjuagate를 분주하여 실온에서 1시간 반응시켯다. IL- \( 1 \beta \)의 경우, biotinylated anti-mouse IL- \( 1 \beta \) detection antibody를 첨가하고 1 시간 반응 후, streptavidin horseradish peroxidase conjugate를 첨가하여 30 분 반응시켰다. 반응 후 이를 다시 PBST 로 세척하고 OPD 용액을 첨가하여 실온에서 30 분 동안 암반응시켰다. \( 2 \mathrm { ~N } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \) 로 반응을 종료시킨 후 microplate reader를 이용하여 \( 490 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p>