그람 양성균인 간균 형태의 균주는 분리용 배지에서 아이보리색의 불투명한 colony를 형성하고, 불특정하게 퍼져 자란다. 16S rDNA 부위를 PCR로 증폭하여 염기서열을 확인한 결과, Bacillus subtilis strain ATCC 9799와 100% 상동성을 보였다. 이 균주의 효소는 metalloprotease inhibitor인 EDTA와 O-phenanthroline에 의해 저해되는 metalloproteinase의 특성을 보였으며, ammonium persulfate, N-ethylmaleimide, L-cysteine, NaF, PMSF에서도 저해되었다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>Collagenase 생산 균주 분리 및 동정</h2><p>Collagenase 생산능을 가지는 균주를 분리하기 위하여 가정으로부터 채취한 김치를 미생물 분리원으로 사용하였다. Collagenase 생산 균주의 분리용 평판 배지에 \(3 \sim 4\)일간 배양한 결과 collagen을 분해한 결과로 고체배지 상에 halo가 형성되는 것을 관찰할 수 있었다.</p><p>분리된 균주는 간균 형태의 그람 양성균으로 내생 포자를 형성하였고, 분리용 배지에서 아이보리색의 불투명한 colony를 형성하고 불특정하게 퍼져 자랐다. 생화학적 특성으로 Table 1에서 보는 바와 같이 대부분의 특성이 Bacillus subtilis와 거의 흡사한 결과를 보였다.</p><p>분리 균주 세포로부터 genomic DNA를 분리하여 AccuPower PCR PreMix kit (Bioneer)를 이용해 16S rDNA 부위를 PCR로 증폭시킨 후 auto-sequence를 이용해 염기서열을 확인하여 결정된 573개의 염기 서열을 Gene bank database와 비교한 결과 Bacillus subtilis strain ATCC 9799 와 \( 100 \% \)의 상동성을 보였다. 이상의 결과로부터 본 균주를 Bacillus subtilis JS-17로 명명하였다.</p><h2>Collagenase의 정제 및 효소의 특성</h2><p>Bacillus subtilis JS-17로부터 생산된 collagenase 특성을 평가하기 위해 효소를 정제하였다. 조효소액은 배양액을 원심 분리하여 상층액을 취해 ultrafiltration으로 농축하여 얻어졌다. 조효소액을 Amberlite IRA-900 column에 \( \mathrm{NaCl} \)을 이용하여 \( 0 \sim 1.5 \mathrm{M} \) 까지 농도 구배를 주면서 단백질을 용출시켰다. 용출액은 \( 10 \mathrm{ml} / \) tube로 분획하였으며, 활성이 있는 분획을 회수하여 ultrafilteration을 이용하여 농축시켰다. 이때의 효소의 비활성은 \( 164.4 \mathrm{~units}\)/ \( \mathrm{mg} \)으로 증가하였고, 회수율은 \(6.9\%\)였다. 두 번째 단계로 Sephacryl S-300 HR column을 이용하여 단백질을 용출시킨 결과, 효소의 비활성은 \( 189.5 \mathrm{~units}\)/ \( \mathrm{mg} \)로 증가하였고, 회수율은 \( 3.1 \% \) 였다. Gel fiteration chromatography의 활성분획을 회수하여 ultrafilteration을 이용하여 농축시킨 다음 DEAE-Sephadex A-50 column으로 단백질을 정제하였다. 이 때 효소의 비활성은 \( 192.1 \mathrm{~units}\)/ \( \mathrm{mg} \) 이며, \( 1.1 \% \)로 회수되었다. 이러한 회분액을 투석 및 농축한 후 SDS-PAGE를 실시하였다. 염색, 탈색을 한 후 분자량을 측정한 결과 분자량은 약 \( 28 \mathrm{kDa} \)이었다. Clostridium histolyticum 유래의 collagenase는 \(68\sim 130\mathrm{~kDa}\) 범위로 보고되었고 Cytophaga sp. 유래의 collagenase는 \( 120 \mathrm{kDa} \)으로 보고되어 이들 효소와는 다른 collagenase 효소임을 추정할 수 있었다.</p><p>정제된 효소의 온도에 따른 안정성을 측정한 결과, \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)까지 \( 60 \% \) 정도의 활성이 남아 고온에서도 비교적 안정하였다. 일반적으로 collagenase는 대개 \( 30 \sim 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 최적 활성을 나타내는 것으로 보고되어 있으며, 해양 미생물인 Vibrio sp. B-30의 경우 \( 23^{\circ} \mathrm{C} \)에서 최적 활성을 가지는 것으로 보고되고 있다. \( \mathrm{pH} \)에 대한 측정 결과는 \( \mathrm{pH} ~6.0 \sim 9.8\)까지 안정함을 보였고, \(\mathrm{pH ~7}\)에서 최대 활성을 나타내었다. 금속 이온에 대한 효소의 특성을 검토한 결과, 금속 이온 농도 \( 1 \mathrm{mM} \)을 가한 경우에는 대부분의 금속 이온이 존재할 때 활성이 증가하여 전형적인 metalloproteinase의 성질을 지녔다. \( \mathrm{Na}^{+}\), \(\mathrm{Fe}^{2+}\), \(\mathrm{Ni}^{2+} \) 존재 하에서는 약 \( 40 \% \) 정도의 활성 증가를 보였고, 특히 \( \mathrm{Sn}^{2+} \) 존재 하에서는 \( 60 \% \) 까지의 활성 증가를 보였다. 하지만, \( 5 \mathrm{mM} \)의 높은 농도에서는 효소의 활성이 감소되었고, \( \mathrm{Mn}^{2+}\),\( \mathrm{Ca}^{2+}\), \(\mathrm{Co}^{2+}\), \(\mathrm{Ni}^{2+}\), \(\mathrm{Hg}^{2+} \)에 대해서는 농도를 높였을 때 \( 30 \% \) 정도 저해 효과를 보였다. 효소의 저해제에 대한 특성 검토는 metalloprotease inhibitor인 EDTA와 O-phenanthroline에 의해 활성이 저해되는 metalloproteinase의 특성을 나타냈으며, ammonium persulfate, N-ethylmaleimide, L-cysteine, NaF, PMSF에서도 저해되었다. 또한, 정제된 효소의 기질 특이성을 실험한 결과 정제된 collagenase는 insoluble collagen (Type I)에 대해 기질 특이성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.</p>