10g의 꽃봉오리를 사용해 guanidium chloride 방법으로 total RNA를 얻어내고, 1차 oligo-dt-cellulose column을 통하여 mRNA를 얻었으며 2차 column을 통과한 후 순수한 mRNA를 분석하였다. cDNA-library로부터 카네이션의 DFR-cDNA를 probe로 하여 screening하여 5개의 positive clone을 분리하고 phage-DNATM를 생성하여 DFR-gene의 염기서열을 얻었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>안개초로부터 DFR 유전자의 분리 및 염기서열 분석</h2> <p>\( 10 \mathrm { ~g } \)의 꽃봉오리로 부터 guanidium chloride방법을 사용하여 total RNA를 분리한 결과 \( 4.841 \mathrm { mg } \)을 얻었고 1차 oligo-dt-cellulose column을 통하여 \( 38 \mu \mathrm { g } \)의 mRNA를 얻었으며 2차 column을 통과한 후 \( 15 \mu \mathrm { g } \)의 순수한 mRNA를 분석하였다. 이 중 \( 5 \mu \mathrm { g } \)의 \( \mathrm { mRNA } \)를 cDNA-library의 합성에 사용하였다. 합성된 cDNA-library로부터 카네이션의 DFR-cDNA를 probe로 하여 screening하여 본 결과 5개의 positive clone을 분리하였고 이것으로부터 phage-DNA를 분리하여 EcoRI으로 처리해 본 결과 5 개 clone 모두 \( 1.2 \) \( \mathrm { kb } -1.5 \mathrm { ~kb } \) 크기의 insert를 가지고있었다. 이 clone들을 페튜니아의 DFR유전자를 probe로 Southern blot 분석을 통해 검정해 본 결과 모두 DFR 유전자임을 확인하였다. 분리한 5개의 서로 다른 크기의 DFR 유전자를 각각 G1-G5로 명명하였고, 벡터 \( \mathrm { pUC19 } \)에 cloning 하여 염기서열분석을 수행한 결과 \( 1.5 \mathrm { ~kb } \) 크기의 clone G3만이 full size clone임을 확인하였다. 염기서열 분석 결과를 보면 안개초의 DFR 유전자는 \( 1471 \mathrm { ~bp } \) 이며 이 중 coding region은 \( 1047 \mathrm { ~bp } \) 였고 349 amino acid를 인지하였다. 또 이 유전자는 \( 190 \mathrm { ~bp } \)의 leader sequence와 \( 288 \mathrm { ~bp } \)의 trailer sequence 및 \( 18 \mathrm { ~bp } \)의 poly(A) tail을 가지고 있었다. Start codon과 stop codon을 살펴보면 start codon은 AAAATGG로 Joshi (1987a)가 발표한 식물체의 고유의 codon과 일치하며 ATG의 -3 위치에 purin 염기가 나타났다. 유전자의 \( 3 ^ {\prime } \) 말단에 나타나는 polyadenylation signal AATAAA 는 TAA translation stop codon으로부터 \( 41 \mathrm { ~bp } \) downstream 위치에 있으며 polyadeny-lation site에서 \( 172 \mathrm { ~bp } \) upstream 위치에 존재하였다 (Joshi 1987b). 이들 유전자의 염기서열의 유사성을 Dianthus gratianopolitanus (Yagishita et al. 2000), Dianthus_caryophyllus (Lee et al., 2004), Brassica_oleracea (Min et al. 2002), Forsythia intermedia (Rosati et al. 1997), Petunia_hybrida (Beld et al. 1989), Nierembergia_sp (Ueyama et al. 2006), Rosa_hybrid (Tanaka et al. 1995), Callistephus_chinensis (Min 2006), Gerbera hybrid (Helariutta et al. 1993) 등의 DFR 유전자와 비교해 보면 nucleotide level 에서는 각각 \( 89,89,66,66,66,66,68 \), \( 63,62 \% \)를 나타내었고 amino acid level에서도 역시 같은 수치의 유사성을 나타내었다. 이러한 수치에서 보듯 안개초의 DFR 유전자는 같은 Caryophyllaceae과에 속하는 카네이션 (Dianthus caryophyllus)과 nucleotide level 에서 \( 89 \% \), amino acid level에서 \( 89 \% \)로 가장 높은 일치성을 보였다. 또한 같은 Solanaceae과에 속하는 Petunia hybrid와 Nierembergia sp의 경우도 \( 88 \% \) 의 높은 일치성을 나타내었다. 유사한 결과는 다른 색소유전자인 CHS (Niesbach-Klösgen et al. 1987)와 DFR (Lee et al. 2004)의 염기서열분석에서도 보고된 바 있으며 식물분류학이나 진화학적 측면에 큰 의미가 있다고 사료된다.</p>