합성된 cDNA의 정량 분석을 위해 real time PCR 반응 용액을 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10초간 denaturation, \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20초간 annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20초간 extension을 40회 반복했다. Metalloprotease 활성을 측정하기 위해 \( 1 \% \) azocasein 기질용액 \( 400 \mu \mathrm { L } \)에 조효소액 \( 100 \mu \mathrm { L } \)을 섞어 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30분간 반응시켰다.
<h2>Real-time PCR을 이용한 vvp 유전자 발현도 분석</h2> <p>합성된 cDNA의 정량 분석을 위해 \( 12.5 \mu \mathrm { L } \)의 2X SYBR Premix Ex \( \mathrm { Taq } ^ {\mathrm { TM } } \) (Takara), 각 \( 0.5 \mu \mathrm { L } \)의 \( 10 \mu \mathrm { M } \) primer, \( 2 \mu \mathrm { L } \)의 \( \mathrm { cDNA } (20 \mathrm { ng } / \mu \mathrm { L } ) \)를 \( 9.5 \mu \mathrm { L } \)의 증류수와 혼합하여 real time PCR 반응 용액을 만들었다. Smart Cycler Ⅱ System(Cepheid)을 이용하여 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10초간 denaturation, \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20초간 annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20초간 extension 과정을 40회 반복하였다. SYBR Green의 형광 신호는 PCR cycle 중 신장반응이 끝난 후에 매번 측정하였다. PCR 산물의 정량 지표인 형광도가 직선적으로 증가하는 성질을 보이</p> <p>는 증폭 초기에 기본 형광도(horizontal line)를 넘어서는 PCR cycle의 횟수를 "Threshold cycle \( ( \mathrm { Ct } ) \) "이라고 한다. 본 실험에서도 \( \mathrm { Ct } \) 값을 이용하여 vvp 유전자의 발현 변화를 측정하였고 샘플양의 변이를 보정해 주는 reference 유전자로는 16s rRNA 를 사용하였다. PCR 반응 종료 후 증 폭된 PCR 산물이 목적한 DNA 단편인지 알아보고자 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 99 ^ {\circ } \mathrm { C } \)까지 초당 \( 0.2 ^ {\circ } \mathrm { C } \)씩 온도를 상승시키며 증폭된 PCR 산물의 융해 곡선을 측정하였다. PCR 반응, 데이터의 수집 및 분석은 Smart CyclerI System과 함께 제공되는 프로 그램을 사용하여 수행하였다.</p> <h2>Metalloprotease 활성 측정</h2> <p>LBS 액체배지 \( 100 \mathrm { ~mL } \)에 감마선 조사 또는 비 조사된 V. vulnificus 배양액 \( 1 \% \) 를 접종한 후 3시간 마다 배양액 \( 1 \mathrm { ~mL } \)을 취하여 원심 분리한 후 그 상등액을 조효소 액으로 사용하였다. 효성활성 측정은 \( 1 \% \)의 azocasein 기질용액 \( (0.1 \mathrm { M } \) 인산완충용액, \( \mathrm { pH } \) 7.5) \( 400 \mu \mathrm { L } \)에 조효소액 \( 100 \mu \mathrm { L } \)을 섞어준 후 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30분간 반응시켰다. \( 25 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) trichloroacetic acid 용액 \( 250 \mu \mathrm { L } \)을 가해 반응을 종료 시킨 후 15분 동안 반응액을 정치시키고 \( 10,000 \mathrm { rpm } \)에서 5분간 원심 분리하여, 그 상등액을 취하여 동일 양의 \( 1 \mathrm { ~N } \mathrm { NaOH } \)용액과 섞어주었다. 효소의 역가 1 unit은 상기 조건에서 1분당 \( 440 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도 0.01을 증가시키는데 필요한 효소 양으로 하였다.</p>