야생형 Akt/PKB kinase 유전자를 활용하여 실험을 진행하였다. 대장균에서 추출한 plasmid DNA와 형질전환 방법은 Maniatis 등의 방법을 따르며, 각종 제한효소 및 T4 DNA ligase 등은 제조 회사의 권장 방법에 따라 사용하였다. pUSEamp-Akt1 cDNA 재조합 벡터와 pET28a 벡터를 결합하여 길이 7.1-kb의 pET28-Akt1 재조합 벡터를 제작하였다. 각 배양 조건에서 성장한 균체의 단백질 양은 Bradford 분석법을 이용해 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>DNA 추출 및 조작</h2> <p>야생형 Akt/PKB kinase 유전자는 pUSEamp-Akt1 cDNA (catalog \# 21-153, Upstate Biotechnology사, USA)를 구입하여 사용하였다. 대장균에서의 형질전환 및 plasmid DNA 재조합 조작은 Maniatis 등의 방법에 따라 추출하였다. 각종 제한효소 및 T4 DNA ligase(Takara, Korea) 등은 구입하여 사용하였으며, 반응조건은 제조 회사의 권장 방법에 따라 실시하였다.</p> <h2>발현벡터의 제작</h2> <p>구입한 pUSEamp-Akt1 cDNA 재조합 벡터를 EcoRI \( \mathrm{BamHI} \) 으로 자르고 얻은 \( 1.75-\mathrm{kb} \) 의 단편을 같은 제한효소를 이용하여 자른 pET28a \( (+) \) (Novagene, USA) 벡터에 삽입하여 길이 7.1-kb의 pET28-Akt1 재조합 벡터를 제작하였다.</p> <h2>대장균에서 유전자의 대량 발현</h2> <p>각각의 배양 조건에서 성장한 균체의 단백질의 양을 측정하기 위해서 Bradford 분석법을 이용하였다. 배양한 균체에 각각 \( 300 \mu \mathrm{L} \) 의 완충액을 넣어 현탁시키고, 초음파분쇄기로 분쇄한 후 \( 10,000 \times g \) 에서 30 분간 원심분리하여 얻어진 침전물과 supernatant를 이용하여 각각의 protein의 양을 측정하였는뎨, 이때 BSA(bovine serum albumin)를 표준품으로 이용하여 표준검량곡선을 작성한 후 측정하였다.</p> <h2>Akt/PKB kinase의 정제</h2> <p>Akt kinase를 정제하기 위하여, IPTG \( 0.5 \mathrm{mM} \) 로 발현을 유도시킨 대장균을 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 배양 후 원심분리하고, 세포만을 disruption buffer [ \( 25 \mathrm{mM} \mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} / \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}(\mathrm{pH} \) 7.5) + \( 300 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 20 \mathrm{mM} \) imidazole, \( 0.2 \mathrm{mM} \mathrm{CoCl}_{2} \), AEBSF]에 현탁하여 초음파로 분쇄하였다. 원심분리로 세포 침전물을 제거한 cell lysate를 nickel-nitrotriacetic acid \( \left(\mathrm{Ni}^{2+}\right. \)-NTA) resin(Qiagen, Germany)과 섞어 1 시간 방치하였다. \( \mathrm{Ni}^{2+} \)-NTA agarose 컬럼을 동일한 완충액으로 3 회 세척하고, \( 250 \mathrm{mM} \) imidazole 함유 elution buffer로 His \( _{6^{-}} \) tagged protein을 용출하였다. 용출한 단백질은 dialysis buffer [ \( \left.25 \mathrm{mM} \mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} / \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, \mathrm{pH} 7.5,0.2 \mathrm{mM} \mathrm{CoCl}_{2}\right] \)로 충분히 투석하여 사용하였다.</p> <h2>Western blot analysis</h2> <p>분리한 단백질이 목적하는 Akt kinase 임을 명확히 밝히기 위해서 SDS-PAGE 후 젤에 전개된 단백질을 Pharmacia사의 multiphore electrophoresis kit를 이용하여 electrotransfer 방법에 의해 nitrocellulose membrane에 옮겼다. Ponceau Staining으로 transfer된 protein band를 확인한 후 \( 1 \mathrm{x} \) TBS (Tris-buffered saline: \( 20 \mathrm{mM} \) Tris, \( 500 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl,} \mathrm{pH} \) 7.5)으로 washing한 후 blocking buffer(5\% dried milk in PBS, 0.05\% Tween-20) \( 100 \mathrm{~mL} \) 를 넣어 실온에서 3시간 동안 반응시켰다. 이후, anti-Akt antibody와 1 차 반응을 시키고, Supersignal West Femto Chemiluminescence western blotting detection system(Pierce Biotech, USA)을 이용하여 band의 형성을 확인한 후 건조시켜 보관하였다.</p> <h2>Akt/PKB kinase 활성화</h2> <p>정제한 Akt 단백질은 293 cell lysate를 이용하여 활성화시켰다. 간단하게, Akt protein kinase(10 unit \( / \mu \mathrm{L}) 20 \mu \mathrm{L} \), \( 10 \times \) kinase buffer(200 mM HEPES [pH 7.4], \( 143 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{MgCl}_{2}, 10 \mathrm{mM} \) EDTA) \( 3 \mu \mathrm{L}, 20 \mathrm{mM} \) DTT \( 3 \mu \mathrm{L} \), cell lysate \( (1 \mathrm{mg} / \mathrm{mL}) 1 \mu \mathrm{L}, 2 \mathrm{mM} \) ATP \( 3 \mu \mathrm{L} \) 를 섞어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응 시켰다. 활성화된 \( \mathrm{Akt} / \mathrm{PKB} \) kinase는 필요 시 \( \mathrm{Ni}^{2+} \) -NTA column으로 정제하여 사용하였다.</p> <h2>비방사성 protein kinase assay</h2> <p>Protein kinase assay는 형광 물질인 FITC 가 부착된 기질 (FITC-TRRSRTESIT)을 이용하여 실험하였다. 반응액은 FITC-peptide \( 5 \mu \mathrm{g}, 2 \times \) reaction buffer(40 mM HEPES \( \left[\begin{array}{ll}\mathrm{pH} & 7.2\end{array}\right], 20 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2}, 20 \mathrm{mM} \mathrm{MnCl}_{2}, 2 \mathrm{mM} \) DTT, \( 40 \mathrm{mM} \) ATP, \( 2 \mu \mathrm{g} \) phosphatidyl serine) \( 10 \mu \mathrm{L} \) 에 증류수를 혼합하여 총 부피를 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 로 조정하고, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분 반응한 후 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 열처리로 반응을 정지시킨 sample을 \( 0.8 \% \) agarose gel에서 전개하여 활성을 확인하였다.</p>