미역 가수분해 산물을 발효할 때는 종 배양 배지를 사용하는데, 이는 고농도의 당에서 순치한 균은 당 흡수율을 증가시켜 아세톤, 부탄올, 에탄올의 생산을 증가시킨다고 보고되어 있기 때문이다. 발효 후 발생하는 단당과 저해물질의 양은 HPLC와 RID를 이용하고, 아세톤, 부탄올, acetic acid, butyric acid 의 측정은 gas chromatography를 이용하여 측정할 수 있다. 각 그룹 간의 유의적인 차이를 분석할 때에는 일원분산분석법을 이용할 수 있다.
<h2>아세톤, 부탄올, 에탄올 발효</h2> <p>미역 가수분해 산물을 사용하여 \( 120 \mathrm{ml} \) serum bottle에 working volume \( 70 \mathrm{ml} \) 로 하여 \( \mathrm{N}_{2} \) incubator에서 \( 120 \mathrm{rpm} \),\( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 로 8일 동안 발효를 진행하였다. 종배양 배지는 \( 120 \mathrm{ml} \) serum bottle에 working volume \( 70 \mathrm{ml} \) 으로 PGY medium \( (3 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) peptone, \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) glucose, \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) yeast extract 그리고 cysteine \( 0.15 \mathrm{~g} /) \) 을 사용하여 24시간 동안 \( C \). acetobutylicum KCTC 1724, C. beijerinckii KCTC 1785, C. tyrobutyricum KCTC 5387 균을 배양한다. 고농도의 당에서 순치한 균은 당 흡수율을 증가시켜 아세톤, 부탄올, 에탄올의 생산을 증가시킨다고 보고되어 있다. 따라서 1 차 종 배양된 C. acetobutylicum KCTC 1724, C. beijerinckii KCTC 1785, C. tyrobutyricum KCTC 5387 균을 고농도의 mannitol을 첨가한 PMY medium (3 g/l peptone, \( 60 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) mannitol, \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) yeast extract 그리고 cysteine \( 0.15 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 에 24 시간 동안 2차 종배양을 한다. 2차 종배양된 C. acetobutylicum KCTC 1724, C. beijerinckii KCTC 1785, C. tyrobutyricum KCTC 5387 균을 발효영양분을 첨가한 미역 가수분해 산물에 \( 7 \mathrm{ml} \)를 접종하여 발효를 진행하였다. 발효 첨가 영양분으로 YPC \( (84 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) yeast extract, \( 140 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) peptone, cysteine \( 4.2 \mathrm{~g} / \mathrm{l}) \) \( 2.4 \mathrm{ml}, 140 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) ammonium acetate \( 1 \mathrm{ml}, 140 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \mathrm{\textrm {MSO } _ { 4 }} \) \( 0.5 \mathrm{ml}, 140 \mathrm{~g} / \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} 0.5 \mathrm{ml}, 140 \mathrm{~g} / \mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 0.5 \mathrm{ml} \) 를 미역 가수분해 산물에 첨가하였다. 발효 도중 \( \mathrm{pH} \) 를 일정하게 유지하기 위해 HCl 과 NaOH 를 첨가하였다.</p> <p>\( \mathrm{Y}_{\mathrm{ABE}}(\mathrm{g} / \mathrm{g})=\frac{[\mathrm{ABE}]}{[\text { monosaccharide }]} \)<caption>(2)</caption></p> <p>여기서 [ABE]는 발효로 생산되는 아세톤, 부탄올, 에탄올의 최대 농도(g/l)이며, [monosaccharide]는 발효 초기 단당(glucose + mannitol)의 농도(g/l)이다.</p> <h2>분석방법</h2> <p>단당인 glucose와 mannitol, 저해물질인 5-hydroxymethyl-furfural (HMF), levulinic acid 그리고 formic acid의 양 측정은 HPLC (Agilent 1100 Series, Agilent, USA)와 RID (refractive index detector)를 이용하였다. 컬럼은 Biorad Aminex HPX-87H column \( (300.0 \times 7.8 \mathrm{~mm}) \) 를 사용하여 온도 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \), 이동상 \( 5 \mathrm{mM} \) 황산, 유속 \( 0.6 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 로 하여 각 시료를 35분간 분석하였다. 아세톤, 부탄올, 에탄올, acetic acid, butyric acid는 gas chromatography (YL 6100, YoungLin, Korea)와 FID (flame ionization detector)를 이용하였다. 컬럼은 silica capillary column HP-INNOWAX\( (30 \mathrm{~m} \times 0.32 \mathrm{~mm} \times 0.5 \mu \mathrm{m} \), Agilent Technologies, USA)를 이용하여 분석하였다. 통계학적인 분석방법 (SPSS, USA)으로 일원분산분석(one way analysis of variance, ANOVA)의 post-processing인 Duncan's multiple range test를 이용하여 각 group간의 유의적인 차이를 분석하였다 \( (p<0.05) \).</p>