균체농도의 탁도를 측정하는 것은 분광광도계(Shimadzu UV- \(160 \)A, Japan)를 이용하였는데, 일정시간마다 채취한 배양액을 적당한 비율로 희석하여 사용하였다. 균체 분획에서 endoxylanase 활성을 측정하는 실험에서는, 균체 침전물 Zymolyase 100100T (Seikagaku Kogyo, Japan)과 glass beads ( 0.40.4- 0.50.5 mm), lysozyme (Sigma, USA) 두 가지를 사용하여 cell lysate 분획을 얻은 후 배양상등액을 함께 사용하였다. 조효소액의 조액은 LBM 배지에 재조합된 Bacillus 균주를 사용하였는데, 21발효조에서 24시간 회분 배양한 배양 상등액을 염석한 후 반백질을 10분 원심분리하여 얻은 침전을 phos-phate buffer에 녹였고, 원심분리 후 용액에 녹이는 과정을 한 번 더 진행하고 24시간 투석을 하였다.
<h2>균체농도, 잔존환원당 및 plasmid 안정성</h2> <p>균체농도는 일정시간마다 채취한 배양액을 적당한 비율로 희석하여 분광광도계(Shimadzu UV- \(160 \)A, Japan)를 사용하여 \( 600 \mathrm { ~nm } \) 에서 탁도 (OD \(_ { 600 } \))로 측정하였다. 배양액을 \(3,000 \)x \( g \) 에서 \(5 \) 분 동안 원심분리한 후 배양 상등액을 얻고, dini-trosalicylic acid 방법을 사용하여 잔존환원당 농도를 측정하였다. Plasmid 안정성은 배양애을 LB 평판배지에 도말한 후 자란 colony를 kanamycin \( (10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 이 함유된 \( \mathrm { LB } \) 배지에서 toothpicking한 다음 형성된 colony수의 비(백분율)로 측정하였다.</p> <h2>균체 분획 및 endoxylanase 활성 측정</h2> <p>균체 침전물을 Zymolyase \(100 \)T (Seikagaku Kogyo, Japan)과 glass beads ( \(0.4 \)- \(0.5 \) mm), lysozyme (Sigma, USA)을 사용하여 cell lysate 분획을 얻어, 이들 분획과 배양상등액을 사용하여 각 분획에서의 endoxylanase 활성을 측정하였다. Endoxylanase의 활성은 DNS법을 이용하여 \( 1 \% \) oat spelts xylan을 기질로 사용하여 pH \( 6.5(0.1 \mathrm { M } \) 인산 완충액), \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 분당 \( 1 \mu \mathrm { mol } \) 의 환원당(xylose equivalent)을 생성하는 혀소의 양을 \(1 \) unit로 정의하였다. 각 효소들의 분비효율(secretion efficiency)은 전체 효소활성에 대한 균체 외 효소 활성비를 백분율로 나타내었다. 단백실 정량은 Bradford법으로 정량하였다.</p> <h2>조효소액의 조제</h2> <p>재조합 Bacillus 균주를 LBM 배지를 사용하여 \(21 \) 발효조 에 \(24 \)시간 동안 회분배양하여 배양 상등액을 \( 70 \% \) ammo-nium sulfate로 염석하여 단백질을 \( 10,000 \mathrm { rpm } \) 에서 \(10 \) 분간 원심분리하여 침전시킨 후 침전을 직당량의 \( 20 \mathrm { mM } \) phos-phate buffer ( \( \mathrm { pH } 6.0 \))에 녹이고 \( 12,000 \mathrm { rpm } \) 에서 \(10 \)분간 원심분리하여 불용성 침전을 제거한 다음 \( 20 \mathrm { mM } \) phosphate buffer ( \( \mathrm { pH } 6.0 \))로 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(24 \)시간 투석하였다. 투석액을 ul-trafiltration membrane (MW cut-off \( = 10,000 \), Millipore, Bedford, MA, U.S.A.)을 이용하여 농축시켰다.</p>