조골 세포의 ALP 효소 활성 측정을 위해 포화 배양 시킨후 시료 처리를 한 후 p-NPP로부터 생성된 p-nitrophenol (p-NP)를 측정하여 (p-NP)에 대한 표준그래프를 작성한 후 활성도를 대조군과의 비교하였다. 더불어 alkaline phosphatase kit를 사용하여 염색법에 의한 조골세포 활성도를 측정하였다. 더불어 Alizarine red solution을 이용하여 석회화 정도를, RT-PCR을 이용해 골기질 유전자 발현을 조사하였다. 모든 실험결과는 Duncan's multiple range test를 통해 유의적 차이를 검정하였다.
<h3>Alkaline phosphatase 효소활성 측정</h3> <p>포화 배양된 MC3T3-E1 세포를 \( 1 \times 10^{4} \mathrm{~cell/well} \)로 조정하여 96well plate에 분주하고 24시간 후 분화유도배지로 교환하여 24시간 배양 후 시료처리를 하였다. ENA-A 이온수를 각 농도별 (1, 2, 4, 8 \(\%) \)로 넣어 세포를 배양한 후 3일 뒤 PBS로 세척한 다음 \( 0.1 \% \) Triton X-100을 \( 20 \mu \mathrm{L} \)씩 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 lysis하였다. Lysis된 cell의 상등액 \( 5 \mu \mathrm{L} \)는 단백질 정량에 사용하였고, 나머지 상등액에 \( 20 \mu \mathrm{L} \)의 \( 0.1 \mathrm{N} \) glycine과 \( 10 \mu \mathrm{L} \)의 \( 100 \mathrm{~mM} \) p-nitrophenylphosphate (p-NPP)를 첨가한 후 다시 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 \( 200 \mu \mathrm{L} \)의 \( 0.1 \mathrm{~N} \mathrm{~NaOH} \) 로 반응을 중지하고 \( 405 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. ALP activity는 p-NPP로부터 생성된 p-nitrophenol (p-NP)를 측정하여 (p-NP)에 대한 표준그래프를 작성한 후 활성도를 대조군과의 상대비교를 통해 도출하였다.</p> <h3>ALP 염색법에 의한 조골세포 활성검색</h3> <p>ALP 효소의 염색 정도를 측정하기 위해 24 well에 \( 1 \times 10^{5} \mathrm{cells/mL}\)로 처리하고 이온수를 적정농도로 희석 처리한 후 시간경과에 따른 효소활성을 측정하였다. 염색은 alkaline phosphatase(AP) kit (Sigma)를 사용하여 측정하였다. 먼저, 배지를 제거하고 고정액(citrate-acetone-formaldehyde)을 첨가하여 약 30초간 실온에 보관하였다가 45초간 증류수로 세척하였다. 준비된 diazonium solution (sodium nitrite : FRV-alakline: naphthol AS-BI alkaline solution \(= 1:1:1\))을 첨가하여 약 15분간 실온에서 방치한 뒤 2분간 증류수로 세척하고 hematox-ylin solution으로 2분간 다시 염색한 뒤 흐르는 물로 염색액을 제거한 다음 현미경으로 관찰하였다.</p> <h3>Alizarin-Red 염색법에 의한 석회화 형성도 검사</h3> <p>ALP 염색법과 동일하게 24 well에 조골세포를 \( 1 \times 10^{5} \mathrm{cells/mL} \)로 분주한 뒤, 배지를 제거하고, PBS로 세척한 뒤, \( 70 \% \) \( \mathrm{EtOH} \) 로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간동안 고정시켰다. Alizarine red(AR)solution은 \( 10 \mathrm{~mL} \)의 증류수에 \( 40 \mathrm{mM} \)이 되게 농도를 맞춘 뒤 \( \mathrm{pH} \)를 4.2로 조정하였다. 준비한 AR solution으로 10분간 염색하고, 증류수로 2번 세척한 뒤 염색되지 않은 부분은 PBS로 씻어주면서 제거해주고 표면이 너무 마르지 않게 PBS로 조금 적셔주면서 현미경으로 nodule 형성 정도를 관찰히였다.</p> <h3>RT-PCR법에 의한 조골세포 분화 관련 골기질 유전자 발현 조사</h3> <p>Total RNA는 조골세포를 \( 100 \phi \) dish에 \( 1 \times 10^{6} \mathrm{~cells/mL}\)로 9일간 배양한 뒤 TRI reagent (Molecular Research Center, Inc.)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 분리하였다. 간단히 설명하면 배양된 세포에서 배지를 제거하고 phosphate buffered saline (PBS,\(\mathrm{~pH7.4}\)) \( 10 \mathrm{~mL} \)로 두 번 세 척 한 후 TRI reagent를 처리하였다. 이것을 \( 1.5 \mathrm{~mL} \) tube에 \( 1 \mathrm{~mL} \)씩 담고 1-bromo-3-chloropropane을 \( 200 \mu \mathrm{L} \) 첨가하여 30초간 vortex하여 원심분리 \((3,000 \mathrm{rpm} \), 15분, \( \left.4^{\circ} \mathrm{C}\right) \)하여 상등액을 취해 새로운 tube에 옮겼다. 여기에 동량의 isopropanol을 첨가하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2 시간 이상 방치하고 나서 원심분리 \( (13,000 \mathrm{rpm} \), 15 분, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) )한 후 상등액을 제거하였다. 침전물에 \( 75 \% \) 에탄올을 첨가하여 제거한 후 diethyl pyrocarbonate (DEPC) 처리된 증류수를 첨가하여 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 수조에서 10분간 반응시켜 침전물을 녹였다. 분리된 RNA는 spectrophotometer와 \( 1 \% \) formaldehyde agarose gel 전기영동을 이용하여 정량하고 확인하였다. 분리된 total RNA \( 2 \mu \mathrm{g} \)에 superscript Ⅱ RT200 U, \( 0.5 \mu \mathrm{g} \) Oligo dT, \( 0.5 \mathrm{mM} \) dNTP를 첨가하여 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 90분간 반응시킨 후 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응을 종결시켜 cDNA를 제조하였다. cDNA는 Table 1의 primer들을 이용한 PCR 방법으로 증폭되었다. PCR의 반응에는 \(2.5\mathrm{U}\) Taq polymerase (Takara Ex), \( 2 \mathrm{~mM} \mathrm{~MgCl} _2\), \(0.2 \mathrm{~mM} \) dNTP를 첨가하여 각각의 primer에 맞는 조건으로 실시하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>실험결과의 통계분석은 SAS program을 이용한 분산분석법을 실시하여 Duncan's multiple range test에 의해 시료간의 유의적 차이를 검정하였다.</p>