실험은 다양한 대조군 별로 항암 효과 확인을 위해 누드마우스의 등에 인슐린을 주입하였고, 특히 제 4군이 레이저 조사를 통한 광역학치료군에 해당한다. 항암 효과는 암종의 부피 측정을 통해 완전 치료율과 부피 변화를 관찰하여 판단하였다. 이 때 광역학 치료에 의한 항암 효과를 관찰하기 위해 세포사멸 기전 확인에 용이한 Hoechst 33342와 PI 염색법으로 세포를 염색하였다. 그 후 형광현미경을 통해 UV 영역에서 세포를 관찰하였다.
<h2>세포사멸 분석</h2><h3>괴사세포와 고사세포 염색</h3><p>광역학치료에 의한 세포사멸기전을 확인하기 위하기 Hoechst 33342 (Sigma, USA)와 Propidium iodide (PI: Sigma,USA) 염색법을 이용하였다. 6 well plate에 24시간 동안 배양한 세포에 광감작제(\(0.15 \mu \mathrm{g/ml}\)) 또는 \(0.29 \mu \mathrm{g/ml}\)) \(100 \mu \mathrm{l}\) 를 세포배양 배지로 희석하여 첨가하고 6시간 후 \(660 \mathrm{nm}\) diode laser (\(400 \mathrm{mW}\), \(30\mathrm{min}\))를 조사하였다. 레이저조사를 마치고 바로, 3시간, 6시간, 9시간, 12시간, 24시간 후 각각의 well에 Hoechst 33342용액(\(0.5\mathrm{mg/ml}\), Sigma)과 PI용액(\(0.5\mathrm{mg/ml}\), Sigma)으로 염색 후 형광현미경(Olympus, Japan)을 이용하여 \(330 \sim 385 \mathrm{nm}\)의 UV 영역에서 세포를 관찰하였다. 세포계수는 200배의 배율에서 5곳의 영역을 관찰한 평균값을 결과로 사용하였다.</p><h3>투과전자현미경</h3><p>광감작제 \( (0.15 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 또는 \( 0.29 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)와 \( 660 \mathrm{nm} \) diode laser \( (400 \mathrm{mW}, 30 \mathrm{min}) \)를 이용하여 광역학처치 6시간 후 cell scraper (Sarstedt, USA)를 이용하여 세포를 배양 flask에서 분리하여 \(2.5\%\) glutaraldehyde solution (Yakuri, Japan) \( 1\mathrm{ml} \) 를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 전고정 하였다. 후 고정을 \( 1 \% ~\mathrm{OsO}_{4} \) 실시하였다. 그리고 \( 2 \% \) agarose gel을 첨가하여 agarose block을 만들고 탈수과정과 침투, 포매, block trimming, semi-thin section, thin section, 전자염색을 통해 관찰하였다.</p><h2>이종이식된 종양의 광역학치료</h2><h3>세포주의 이종이식</h3><p>배양된 SNU-1041 세포주를 hemocytometer를 이용하여 세포의 수를 \( 10^{8} \) cells \( / \mathrm{ml} \) 만들었다. 그리고 30 gauge\( (\mathrm{G}) \)인 슐린 주사기로 \( 100 \mu \mathrm{l} \)씩 누드마우스의 등에 피하로 주입 후 종양의 형성유무를 관찰하고 1주 간격으로 종양의 부피를 측정하였다.</p><h3>종양의 광역학치료</h3><p>누드마우스에 이종이식된 종양의 크기가 약 \( 400 \sim 600 \mathrm{mm}^{3} \)에 도달하였을 때, 제 1군 \( (\mathrm{n}=4) \)은 정상 대조군으로 종양에 아무런 처치도 하지 않았고 제 2군 \( (\mathrm{n}=4) \)은 9-HpbD-a으로만 치료한 군으로서 \( 30 \mathrm{G} \) 인슐린 주사기를 먼저 종양 중심부에 넣고 주위조직으로 여러번 반복시켜 광감작제가 고루 퍼질 수 있는 경로를 확보한 후 DPBS용액으로 희석한 9-HpbD-a (\(9.38 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)를 \( 100 \mu \mathrm{l} \)씩 일정한 압력으로 서서히 종양내에 주입하였다(fanning technique). 제 3군 \( (\mathrm{n}=4) \)은 레이저 치료만을 시행한 군으로서 다이오드 레이저의 diffuser tip을 종양 중심부와 기저부에 삽입 후 각각 10분씩 평균 \( 0.96 \mathrm{J} / \mathrm{mm}^{3}(400 \mathrm{mW}) \)의 에너지를 조사하였다. 제 4군 \( (\mathrm{n}=16) \)은 상기한 방법으로 9-HpbD-a 를 종양 내 투여하고 6시간 후 레이저 조사를 시행한 광역학치료군이었다. 레이저 조사 시에는 온도센서를 이용하여 종양내의 온도변화를 기록하였다.</p><h3>종양부피의 측정</h3><p>각 군에서 치료 후 1주, 2주, 3주, 4주의 시점에서 종양의부피 (평균\(±\)표준편차)를 측정하여 항암효과를 판정하였다. 부피의 계산은 다음의 공식을 이용하였다.</p><p>\( \mathrm{V}=(4 / 3 \times \mathrm{A} \times \mathrm{B} \times \mathrm{C}) \times 1 / 2~(\mathrm{~V}= \) 부피, \( \mathrm{A}= \) 장축, \( \mathrm{B}= \) 단축, \( \mathrm{C}= \) 높이 \( ) \)</p><h3>항암효과의 판정</h3><p>항암효과는 각 군에서 이식된 암종의 부피의 변화를 4주까지 측정하여 완전 치료율과 종양부피의 변화를 비교하여 판정하였다.</p><h3>통계처리</h3><p>SAS 통계프로그램을 이용하여 9-HpbD-a의 농도변화 및 조사시기에 따른 항암효과의 차이를 two-way ANOVA test로 분석하였고 이종이식한 종양에서 항암효과의 차이는 repeated measure ANOVA test와 student t-test로 \(95\%\) 유의수준에서 검증하였다.</p>