1993년 microprojectile bombardment 방법으로 크리핑 벤트그라스의 형질전환이 처음 보고되었으며, protoplast를 분리하여 polyethylene glycol 또는 electroporation을 이용하여 유전자를 주입하는 방법도 보고되었다. 이러한 방법들은 bar 유전자를 도입하기 위해 사용되었으나, 도입 유전자 수가 많고 gene silencing 문제, 낮은 발현률 등의 문제가 있어 최근 다른 방법들이 개발되고 있다.
<h1>본 론</h1> <h2>벤트그라스 형질전환 시스템</h2> <p>크리핑 벤트그라스 (Agrostis stolonifera L.)의 안정적인 형질전환은 1993년에 microprojectile bombardment 방법으로 처음 보고되었다 (Zhong et al. 1993). 이후 또다른 그룹들도 동일한 방법으로 형질전환을 보고하였으며 (Hartman et al. 1994; Xiao and Ha 1997), 또한 protoplast를 분리하여 polyethylene glycol 또는 electroporation을 이용하여 유전자를 직접 주입시키는 방법의 형질전환 방법도 보고되었다(Lee et al. 1996; Asano et al. 1997; 1998). 이들 대부분은 제초제 저항성 유전자인 bar를 도입시키기 위해 이루어졌다. 하지만 이들 방법들은 도입 유전자 수가 많은 점, 후세대에서 도입된 유전자가 발현되지 않는 gene silencing 문제와 낮은 성공 확률 등으로 최근에는 많이 사용되지 않고 있으며, 이러한 문제점들이 적은 Agrobacterium 매개 형질전환 방법이 주로 이용되고 있다 (Dai et al. 2001).</p> <p>크리핑 벤트그라스의 Agrobacterium 매개 형질전환은 2000년에 최초로 보고되었다 (Yu et al. 2000). 이때에는 형질전환 과정에서 reporter gene으로 GFP(Green fluorescent protein) 유전자가 이용되었고, 단 두 개의 독립 라인이 확인되어 보고되었다. 이후 Agrobacterium 매개 형질전환 효율을 증대시키기 위하여 여러 연구 그룹에서 보고가 잇따랐는데, 대체적인 형질전환 과정은 비슷하나 사용하는 벤트그라스 종이나 selection marker 또는 조직배양 조건 등에서 약간씩의 차이가 있었다 (Chai et al. 2003; 2004; Luo et al. 2004; Han et al. 2005; Aswath et al. 2005; Fu et al. 2005a; 2005b; 2007; Kim et al. 2007; Han et al. 2009). 예를 들면, 크리핑 벤트그라스가 아니라 콜로니얼 벤트그라스를 대상으로 한 보고가 있었으며 (Chai et al. 2003; 2004), selection marker 유전자로 bar가 아니라 hygromycin 저항성 유전자를 사용한 보고도 있었다 (Chai 2004; Han et al. 2005). 또한 제초제 저항성이나 hygromycin 저항성을 사용하지 않고, GFP와 manA (phosphomannose isomerase) 유전자를 사용하는 보고도 있었다 (Fu et al. 2005a). 나머지 보고들은 대부분 bar 유전자를 이용하여 형질전환을 수행하였고, 일부 embryogenic callus 유도 조건이나 Agrobacterium 형질전환 과정에서 효율을 증진시키기 위한 방법의 차이들이 있었다. 또한 최근에는 성숙종자에서 유래된 embryogenic callus가 아니라 stolon을 이용한 Agrobacterium 매개 형질전환 방법도 보고되었다 (Wang and Ge 2006b; Xu et al. 2009).</p> <p>현재까지 보고된 크리핑 벤트그라스의 Agrobacterium 매개 형질전환 과정을 종합하여 최적화된 과정을 살펴보면 Fig. 1과 같다. 간단히 살펴보면, 소독된 성숙 종자로부터 호르몬을 첨가한 callus 유도 배지에서 embryogenic callus를 유도하고 (callus induction), 계대 배양을 통하여 좋은 embryogenic callus를 선발한다 (embryogenic callus subculture). 그리고 Agrobacterium 접종 1주일 전에 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) kinetin이 포함된 배지에서 배양한 후 (pre-culture), Agrobacterium 용액에 10분 정도 접종하여 약 3일간 공동 배양시킨다 (co-cultivation). 이후 bialaphos 또는 PPT (phosphinotricin)가 함유된 배지에서 약 4-10주일간 배양하면서 살아있는 callus들만 골라낸 후 (selection), 호르몬이 없는 shooting 유도 배지로 옮겨 재분화를 유도한다 (shoot induction & root induction). 이후 토양으로 옮겨 심어 약 2주일간 순화시키고, 제초제 저항성 실험을 통하여 형질 전환체를 선발하게 된다. 보고된 논문마다 단계별 약간의 기간 차이가 있긴 하지만, 대략 callus induction은 8주 9주, transformation 후 co-culture는 약 3일, selection은 4~10주, shoot induction은 4-6주, root induction은 약 4주 정도로 형질전환체를 얻는 데는 약 6-7개월 정도 걸리는 것으로 파악되었다. 만약 충분한 embryogenic callus가 확보된 상태라면 callus induction 기간이 생략되므로 형질전환체를 약 4-5개월 내에 얻을 수 있다.</p>