단백질 전기영동 (Western blot) 신경 조직을 PBS로 씻은 후 triton lysis buffer 담그어 초음파 분해하고, 단백질을 정량한 후에 일부를 western analysis에 사용하였다. 실험을 통해 얻어진 Membrane을 이미지 분석 프로그램을 통해 NGF, BDNF, NT-3 그리고 GAP-43 단백질량을 산출하였다.
<h2>측정방법</h2> <h3>단백질 전기영동 (Western blot)</h3> <p>신경 조직을 \( 137 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } , 2.7 \mathrm { mM } \mathrm { KCl } , 10 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { Na } 2 \mathrm { PO } 4,2 \mathrm { mM } \mathrm { KH } 2 \mathrm { PO } 4( \mathrm { pH } \) 7.4)가 함유된 PBS로 씻은 후 50-200 \( \mu \ell \) 의 triton lysis buffer (20 mM Tris, pH 7.4, 137 \( \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } , 25 \mathrm { mM } \) B-blycerophosphate, \( \mathrm { pH } 7.14,2 \mathrm { mM } \) sodium pyrophosphate, \( 2 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 1 \mathrm { mM } \mathrm { Na3VO4,1 \% } \) Triron X-100, 10 \( \% \) glycerol, \( 5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) leupeptin, \( 5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) aprotinin, 3 uM benzamidine, \( 0.5 \mathrm { mM } \) DTT, \( 1 \mathrm { mM } \) PMSF에 담그어 초음파 분해하였다. 그 후 각 sample에 대한 단백질을 정량하였으며, 그 중 \( 10 \mu \mathrm { g } \)의 단백질을 western analysis에 사용하였다. 단백질의 발현은 anti-Nerve growth Factor (NGF, sc-549, Santa Cruz) antibody, anti-Brain-derived neurotropin factor (BDNF, sc-546, Santa Cruz) antibody, anti-Neurotrophin 3 (NT-3, sc-547, Santa Cruz) antibody 그리고 anti-Growth-associated protein 43(GAP-43, sc-7457, Santa Cruz) antibody를 이용하여 확인하였다. 정량을 수행한 proteins는 12 \( \% \) SDS-PAGE (1.5 M Trizma base, \( 10 \% \) Sodium Dodecyl Sulfate, 30 \( \% \) Acrylamide, 10 \( \% \) Ammonium Sulfate, TEMED) 상에서 \( 79 \mathrm { ~V } / 280 \mathrm { ~mA } \) 의 전압으로 전기영동 시킨 후 PVDF membrane (Pall Corporation, U.S.A)에 전기이동 시켰다. Antibody 와의 비특이적 결합을 막기 위해 \( 3 \% \mathrm { BSA } , 0.1 \% \) Tween 20 을 함유하고 있는 TBS buffer에서 membrane을 1시간 동안 상온 반응 시키고 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응을 끝낸 membrane을 TBST buffer에 washing한 후 rat NGF, BDNF, NT-3 그리고 GAP-43의 C-terminal에 특이적인 polyclonal antibody를 Blocking buffer (1X TBS buffer, 3 \( \% \) BSA, 0.1 \( \% \) Tween 20)에 \( 1: 1000 \) 의 비율로 희석하여 상온에서 1 시간 30 분 동안 반응시켰다. 그런 후 membrane을 TBST buffer로 씻어내고 anti-rabbit IgG (Santa Cruz, U.S.A)가 결합되어 있는 horseradish peroxidase를 skim milk buffer (1X TBST buffer, 10 \( \% \) Skim milk)에 1:1000의 비율로 희석하여 상온에서 1시간 30분 동안 처리 하고 다시 한 번 씻어내었다. 마지막으로 Membrane에 부착된 단백질을 Western blotting detection system을 이용하여 측정할 수 있었으며 Kodak scientific imaging film (Esteman Kodak Co., U.S.A)에 감광 하였다. Membrane을 densitymeter (Sharp jx-330)를 이용하여 스캔한 후 이미지 분석 프로그램(Image Master ver. 3.0, Biotech pharmacia)을 통해 NGF, BDNF, NT-3 그리고 GAP-43 단백질량을 산출하였다.</p>