비장세포를 배양하여 배양상층액에서 IL-2, IL-4를 얻었다. 이들을 모노클론항체와 기질 액 등을 사용하여 \( 450 \mathrm{~nm} \)의 Optical density에서 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험동물</h2><p>암컷 Balb/C 마우스로서 생후 8주 내외, 체중 \( 25\mathrm{~g} \) 내외의 것을 한국 효창 사이언스(대구, 경북)로부터 구입하여 실험에 사용하였다.</p><h2>시약</h2><p>실험에 사용한 에센셜 오일, eucalytus와 geranium 에센셜 오일은 Razzmatazz Ltd.(England)의 제품으로서 Eucalyptus (Code No. AD01)과 Geranium (Code No. AD08)을 사용하였다.</p><h2>비장세포배양 상층액 준비</h2><p>비장세포배양 상층액 준비는 미리 준비된 비장세포 부유액을 \( 10 \% \)가 되게 소 태아혈청을 가한 RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지 (complete \( 10\% \) FCS RPMI 1640)로 \( \mathrm{ml} \) 당 \( 2 \times 10^{6} \) 세포가 되도록 조절하여, 24 wells tis-sue culture plate (Costar, Cambridge, MA, USA)에 \( 1 \mathrm{~ml} \)씩 분주한 후 eucalyptue \( 10 ~\mu \mathrm{g}\), \(100 ~\mu \mathrm{g}\), \(1 \mathrm{~mg} \)을 각각 작용시키거나 geranium \( 0.1,1,10 ~\mu \mathrm{g} \)을 각각 작용시켜 \( 37 \mathrm{C}\), \(5 \% ~\mathrm{CO}_{2} \) 배양기에 배양하였다. 배양시간은 상기의 조건에서 2, 4, 24, 48, 72시간으로 하였다. 각각 일정시간 배양이 끝난 후 전량 배양액을 수거한 다음 \( 300 \times \mathrm{g} \)에서 10분간, \(10,000\times \mathrm{g} \)에서 30분간 원침 시킨 후 그 상층액을 수거하여 배양상층액에서 IL-2, IL-4 생성을 정량 하였다. IL-2 정량은 24, 48, 72시간 째, IL-4 정량은 2, 4, 24시간 째의 배양 상층액을 사용하였다.</p><h2>IL-2 측정</h2><p>IL-2 측정은 Quantikine \( { }^{\mathrm{TM}} \) Mouse IL-2 ELISA kit (R \( \& \) D Systems Inc., Minneapolis, USA)을 이용하였다. 간략하면 미리 IL-2에 대한 모노클론항체가 부착된 96 wells micro-plate의 각 well에 시료 희석 액 \( 50 ~\mu \mathrm{l} \) 씩을 분주하고 시료 \( 50 ~\mu \mathrm{l} \) 씩 을 적하하여 실온에서 2시간 동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 5번 세척한 후 horseradish peroxidase가 함유된 항체액 \( 100 ~\mu \mathrm{l} \) 씩을 적하하여 다시 실온에서 2시간 동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 5 번 세척한 후 hy-drogen peroxide와 tetramethylbenzidine이 포함된 기질 액 \( 100 ~\mu \mathrm{l} \) 씩을 적하하여 실온에서 30분 동안 방치한 후 stop 액 \( 100 ~\mu \mathrm{l} \) 씩을 가하였다. Optical density는 microplate reader (Model 550 microplate reader, Bio-Rad, Richmond, USA)를 이용하여 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다.</p><h2>IL-4 측정</h2><p>IL-4 측정은 Quantikine \( { }^{\mathrm{TM}} \) Mouse IL-4 ELISA kit (R \( \& \) D Systems Inc., Minneapolis, USA)을 이용하였다. 간략하면 미리 IL-4에 대한 모노클론항체가 부착된 96 wells micro-plate의 각 well에 시료 희석액 \( 50 ~\mu \mathrm{l} \) 씩을 분주하고 시료 \( 50 ~\mu \mathrm{l} \) 씩을 적하 하여 실온에서 2시간 동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 5번 세척한 후 horseradish peroxidase가 함유된 항체 액 \( 100 ~\mu \mathrm{l} \) 씩을 적하 하여 다시 실온에서 2시간 동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 5 번 세척한 후 hydrogen peroxide와 tetramethylbenzidine이 포함된 기질액 \( 100 ~\mu \mathrm{l} \) 씩 을 적하하여 실온에서 30분 동안 방치한 후 stop액 \( 100 ~\mu \mathrm{l} \) 씩을 가하였다. Optical density는 microplate reader (Model 550 microplate reader, Bio-Rad, Richmond, USA)를 이용하여 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다.</p><h2>통계학적 분석</h2><p>실험성적은 평균 또는 평균\( \pm \)표준편차로 나타냈으며 각 군 간의 통계학적 검정에는 Student's t-test를 사용하고 P값이 0.05 미만일 때 의의 있는 차로 간주하였다.</p>