본 실험에서 Sprague-Dawley계 흰쥐를 성별 구별 없이 사용했으며 대조군은 정상 흰쥐 3마리, 실험군으로는 양 혀인두신경을 절단한 군, 양쪽 혀밑신경을 절단한 군으로 구획 지어 3일, 7일, 10일, 14일 및 2일 군마다 흰쥐 3마리씩 실험하였다. 대조군 및 실험군의 조직절편은 알코올과 자일렌을 사용해 탈수와 침투과정을 거쳐 파리핀에 포매한 후 박절기를 이용해 \( 5 \mu \mathrm{m} \)두께의 연속절편을 제작해 젤라틴 처리했으며, 슬라이드 글라스에 부착한 뒤 hematoxylin-eosin 염색하여 관찰했다. 렉틴조직화학은 대조군과 실험군의 성곽유두부위 조직절편을 사용했으며 특이적 저해당질 반응액을 이용해 렉틴반응의 특이성을 검정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험동물</h2><p>실험동물로는 Sprague-Dawley계의 흰쥐(체중 \(250 \sim 300 \mathrm{g} \))를 암수 구별 없이 사용하였다. 모든 동물은 항온 항습과 12시간의 밤-낮 주기가 일정하게 유지되는 사육실에서 물과 사료를 충분히 공급한 후 사용하였으며, 동물실험은 대구가톨릭대학교 동물실험 윤리규정에 따라 수행하였다.</p><h2>혀인두신경 또는 혀밑신경 절단</h2><p>흰쥐를 urethane \( (1 \mathrm{~g} / \mathrm{kg} \), i.p.)으로 마취시킨 후 목 앞쪽 피부의 정중부를 \( 1.5 \mathrm{~cm} \) 정도 절개하였다. 해부현미경으로 보면서 두힘살근(digastric muscle)의 뒤힘살 중간부분을 핀셋으로 저치고 아래의 붓목뿔근(stylohyoid muscle)을 가쪽으로 당겨 혀인두신경을 노출시켰다. 양쪽 혀인두신경을 가위로 절단하고 \( 2 \mathrm{~mm} \) 정도 잘라낸 후 피부를 봉합하였다. 또한 혀인두 신경보다 가쪽 아래에서 주행하는 혀밑신경을 동일한 방법으로 노출시킨 후 가위로 절단하고 \( 2 \mathrm{~mm} \) 정도를 잘라낸 후 피부를 봉합하였다. 대조군은 일정한 조건하에서 사육한 정상 흰쥐 3마리를 사용하였으며, 실험군은 양쪽 혀인두신경을 절단한 군과 양쪽 혀밑신경을 절단한 군으로 구분한 후 3일, 7일, 10일, 14일 및 2 일 군으로 나누어 각 군마다 흰쥐 3마리씩 실험에 사용하였다.</p><h2>조직절편 제작</h2><p>대조군 및 각 실험군의 흰쥐는 과량의 urethane을 배안으로 주사하여 마취시킨 뒤 가슴을 열고 \( 4 \% \) paraformaldehyde 용액 \( \left(4^{\circ} \mathrm{C}\right) \)으로 심장을 통해 관류고정 시킨 후 혀를 절취하였다. 떼어낸 혀를 해부현미경으로 보면서 성곽유두부위(circum-vallate papilla portion)를 구분하여 분리하였고, \( 4 \% \) paraformaldehyde 용액으로 후고정 하였다. 조직절편은 알코올과 자일렌을 이용한 탈수와 침투과정을 거쳐 파라핀(Paraplast; Oxford, USA)에 포매하였고, 박절기를 사용하여 \( 5 \mu \mathrm{m} \) 두께의 연속절편을 만든 후 젤라틴을 처리한 슬라이드 글라스에 부착시키고 hematoxylin-eosin (H-E) 염색하여 관찰하였다.</p><h2>렉틴조직화학</h2><p>대조군과 실험군의 성곽유두부위 조직절편을 사용하여 렉틴조직화학(lectin histochemistry)을 실시하였다. 본 연구에서는 9가지 렉틴을 사용하였으며, Table 1에 사용한 렉틴의 종류, 렉틴의 농도, 이들과 특이적으로 결합하는 당잔기 및 특이적 저해당질을 표시하였다. 대조군 및 각 실험군의 조직절편을 \( 0.01 \mathrm{~M} \) phosphate-buffered saline (PBS)에 20분간 처리한 후 \( 0.3 \% \mathrm{~H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 함유한 메탄올액으로 30분간 반응하여 내인성 peroxidase의 활성을 저해시키고, 비특이적인 반응을 억제하기 위하여 \( 5 \% \) 정상 토끼 혈청(Vector Laboratories, Burlin-game, CA, USA)으로 30분 동안 처리하였다. 렉틴반응은 비오틴화 렉틴(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)을 반응액인 \( 0.1 \mathrm{mM} \)의 \( \mathrm{CaCl}_{2}, \mathrm{MnCl}_{2} \) 및 \( \mathrm{MgCl}_{2} \)를 함유하는 \( 0.01 \mathrm{M} \) PBS에 일정농도로 희석하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 비오틴화 렉틴과 반응한 조직절편은 avidin-biotin-horseradish peroxidase 복합체(Vector Laboratories, Bur-lingame, CA, USA)로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 각 반응 사이에 조직절편은 PBS로 20분씩 3차례 씻어 주었다. 조직절편을 \( 0.01 \% \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 함유하는 \( 0.05 \% \) diaminobenzidine(DAB, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 용액으로 발색반응을 시켜 갈색의 반응산물을 얻었다. PBS로 세척하고 hematoxylin으로 대조 염색한 후 Axiophot Photomicroscope (Carl Zeiss, Halbergmoos, Germany)으로 관찰하였고, AxioCam MRc5 (Carl Zeiss, Halbergmoos, Germany)로 촬영하였다.</p><p>렉틴반응의 특이성은 각 렉틴과 특이적으로 반응하는 저해 당질을 섞은 후 48시간 실온에서 반응시킨 반응액을 이용하여 검정하였다. 렉틴반응의 강도는 -(음성), +(약한 양성), ++(중정도의 양성) 그리고 +++(강한 양성) 등으로 표시하였다.</p>