실험에 사용된 어성초는 대한민국 전라남도 보광 어성초 농장에서 구입한 것이다. 잎과 줄기를 통째로 구입하여 증류수로 세척하고 건조하여 폴리에틸렌 필름으로 밀봉하여 보관하였다. 실험 기간 동안 어성초는 -20°C의 냉장 온도를 유지하였다. 일반 성분의 분석은 표준 프로토콜에 따라 다양한 방법을 사용하였다. 수분함량 측정은 대기건조법, 조단백질 분석은 마이크로 킬달법, 조지방 정량은 속슬렛 추출법, 회분 측정은 직접 소각법, 조섬유 평가는 Henneberg-Stohmann 개선법을 사용하였다. 이러한 모든 측정은 AOAC 방법의 지침에 따라 수행되었습니다. 무기 원소를 정량화하기 위해 원자 흡광 광도계(Varian Model SpectrAA-300A)를 사용하였다. 또한 인 함량은 몰리브덴 블루 흡광도 방법을 사용하여 정량화되었습니다. 어성초 시료는 분석 전에 적절하게 가공 및 보관되었다. 수분, 조단백질, 조지방, 회분, 조섬유, 무기원소 등 다양한 성분을 측정하기 위해 AOAC 방법과 특수 장비를 사용했습니다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>실험에 사용된 어성초는 전남 보성군 벌교읍 대포리 보광 어성초농장에서 재배한 것으로 잎과 줄기가 온전한 것을 구입하여 증류수에 깨끗이 씻은 후 물기를 제거하고 poly-ethylene film으로 밀봉한 후 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 냉장보관하면서 실험에 사용하였다.</p><h2>일반성분 분석</h2><p>일반성분 분석은 AOAC법에 의해 수분은 상압가열 건조법, 조단백질은 micro kjeldahl법, 조지방은 soxhlet 추출법, 조회분은 직접 회화법, 조섬유는 Henneberg Stohmann 개량법으로 각각의 함량을 측정하였다.</p><h2>유리아미노산 분석</h2><p>유리아미노산 분석은 어성초 시료 \( 20 \mathrm{g} \)에 \( 75 \% \) ethanol \(200 \mathrm{ml} \)를 가하여 homogenizer로 균질화 시키고 이를 환류 냉각장치에 연결하여 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \)에서 40분간 가열한 뒤, 이를 Büchner funnel을 사용하여 여과하였고 남은 고형물은 \( 75 \% \) ethanol \( 50 \mathrm{ml} \)로 3회 세척하여 다시 여과하였다. 위의 여과액을 모두 합하여 vacuum evaporator로 감압건조하여 etha-nol을 완전 증발시킨 다음 ethyl ether \( 50 \mathrm{ml} \)로 3회에 걸쳐 재추출하였다. Ether 층을 회수하여 vacuum evaporator로 감압건조 시켜 잔류의 ether을 제거한 후 \( 0.2 \mathrm{M} \) citrate buf-fer \((\mathrm{pH} \mathrm{2.2}) \)을 가하여 일정량 되게 정용하여 시료용액으로 사용하였다. 아미노산의 형광 유도체화를 위해 Edman's Reagent인 PITC (phenylisothiocyanate)을 사용하였으며, 이들 유도체를 분려하기 위해 \( 3.9 \times 150 \mathrm{mm} \) Pico \( \cdot \mathrm{Tag}^{\circledR} \) column을 사용하여 Table 1과 같이 내부 표준법으로 정량하였다.</p><h2>지방산 분석</h2><p>지방산의 분석은 Bligh와 Dyer법에 따라 어성초 시료 \( 50 \mathrm{g} \)에 Folch용액(chloroform : methanol =\( 2: 1 \)) \( 150 \mathrm{ml} \)를 혼합하여 blender를 사용하여 2분 동안 균질화하고 chloro- form \( 50 \mathrm{ml} \)를 가하여 30초 동안 교반한 후 다시 증류수 \( 50\mathrm{ml} \)를 넣고 30초 동안 교반하여 균질화 하였다. 이 균질액을 Buchner 여과기로 여과한 후 chloroform층만을 취하여 감압 농축하여 지질을 얻었다. 상기의 지질 \( 100 \mathrm{mg} \)을 \( 0.5 \mathrm{N} \) \( \mathrm{NaOH}\) \(4\mathrm{ml} \)를 가하고 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)의 water bath에서 20분간 검화시켰다. \( 14 \%\) \(\mathrm{BF}_{3} / \mathrm{CH}_{3} \mathrm{OH} \)와 n-heptane를 각각 \( 5 \mathrm{ml} \)씩 차례로 넣어 추출하고 n-heptane층을 무수 \( \mathrm{NaSO}_{4} \)로 탈수한 다음 여과하여 GC 주입용 시료로 사용하였으며 methylester의 분석조건은 Table 2 와 같다.</p><h2>무기성분 분석</h2><p>무기성분의 분석은 어성초 시료를 습식분해법으로 분해하여 증류수로 정용하고 여과하여 검액으로 사용하였다. 각 무기성번의 정량은 원자흡광광도계(Varian Model SpectrAA-300A)를 사용하였으머 인의 정량은 molybde-num blue 흡광도법으로 비색정량 하였다.</p><h2>휘발성 향기성분의 추출</h2><p>휘발성 향기성분의 추출은 어성촌 마쇄한 시료 \( 500 \mathrm{g} \)을 증류수 \(1.5\mathrm{l} \)에 취하고 di-ethyl ether \( 100 \mathrm{ml} \)로 변형 제작된 Likens와 Nickerson형 SDE장치(Simultaneous Distillation-Extraction)를 이용하여 2시간 동안 추출하였다. 상기 조작은 전체 시료 \( 1.85 \mathrm{kg} \)을 모두 소모할 때까지 반복하고, 이때 추출된 휘발성 향기성분의 수율을 조사하기 위하여 내부표준 물질로서 \( 100 \mathrm{ppm} \) 4-decanol \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하였으며 추출물은 질소가스를 이용해 \( 25 \mathrm{ml} \)로 농축하였다.</p><h2>항균활성의 검색</h2><p>휘발성 향기성분에 대한 항균활성 조사에는 15종의 병원성 균주를 사용하였다. 실험에 사용된 배지로는 세균의 활성에는 tryptic soy broth (TSB)를 사용하였고, 항균활성 측정에는 Mueller-Hinton agar (Difco)를 사용하였는데 Vibrio para-haemolyticus와 Vibrio vulnificus와 같은 호염성 세균에는 \( 3 \% \mathrm{NaCl} \)가 첨가된 배지를 사용하였다.</p><p>항균활성은 Kirby-Baucr disk 확산법에 따라 측정하였다. 어성초의 휘발성 향기성분 추출물에 포화시킨 멸균된 여지 disk (\(8.0 \mathrm{mm} \) in diameter, \( 1.0 \mathrm{mm} \) in thickness, Toyo Roshi Kaisha, Ltd.)는 \( 1 \times 10^{8} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \)로 조정된 각 병원성 군주 배양액을 \( 0.1 \mathrm{ml} \)씩 균일하게 도포한 배지를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 18시간 배양하였다. 이때 ether에 포화시킨 disk를 대조구로 사용하였다. 배양 후 농축물의 각 병원성 균주에 대한 항균활성은 disk 주변 배지의 clear zone의 크기로 결정하였다.</p>