2-Cys Prx 유전자(At3g11630)로부터 스트레스 유도성 SWPA2 프로모터 또는 CaMV 35S 프로모터에 연결한 2개의 벡터 pSP-K, pEP-K를 Agrobacterium tumefaciens EHA105에 도입하여 고구마 형질전환에 사용하고, MS1D 고체배지에 1주일 배양한 캘러스를 형질전환 재료로 사용하여 형질전환된 식물체들을 재분화하였다.
<h2>벡터 제작</h2> <p>2-Cys Prx 유전자 (At3g11630)의 식물발현벡터 제작을 위하여 경상대 이상렬 교수로부터 확보한 식물발현벡터에서 2-Cys Prx의 코딩부위만을 제한효소를 이용하여 분리한 후 스트레스 유도성 SWPA2 프로모터 또는 CaMV 35S 프로모터에 각각 연결하였다. 이것들을 kanamycin 저항성 선발표지를 갖는 pCAMBIA2300의 Hind III 자리에 삽입하여 pSP-K, pEP-K 벡터로 명명하였다 (Figure 1). 위 두 벡터를 Agrobacterium tumefaciens EHA105에 각각 도입하여 고구마 형질전환에 이용하였다.</p> <h2>Agrobacterium 매개에 의한 형질전환 및 식물체 재분화</h2> <p>MS1D 고체배지에 계대배양한지 1주일 된 배발생 캘러스를 형질전환 재료로 이용하였다. 1 일 동안 배양한 Agrobacteria 를 원심분리하여 모은 후, \( 10 \mathrm { ~mL } \) 의 MS1D 액체배자에 현탁하여 배발생 캘러스와 혼합하여 30 분 동안 방치한 후 멸균된 filter paper를 이용하여 캘러스에 묻은 Agrobacteria 와 배지를 제거하고 2일 동안 MS1D 배지에 공동 배양하였다 (Lim et al. 2004). \( 400 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) cefotaxime이 함유된 멸균수로 공동 배양한 캘러스를 3회 세척하여 Agrobacteria 를 제거한 후 \( 100 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) kanamycin과 \( 400 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) cefotaxime이 함유된 선발배지 (MS1DCK)에서 약 4개월 동안 3주 간격으로 계대배양하면서 kanamycin 저항성 캘러스를 선발하였다. 선발된 배발생 캘러스로부터 체세포배 및 식물체를 유도하기 위하여 2,4-D를 제거한 MS 기본배지 ( \( 100 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) kanamycin, \( 400 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) cefotaxime 함유: BMCK)에 읆겨 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 약 \( 40 \mu \mathrm { mol } \cdot \mathrm { m } ^ { -2 } \cdot \sec ^ { -1 } \) 의 cool-white 형광, 광주기 16 시간 조건에서 배양하였다.</p> <h2>형질전환 식물체 분석</h2> <p>Kanamycin 함유배지에 일차적으로 선발된 재분화 식물체를 PCR로 확인하였다. PCR에 사용된 primer는 Prx 및 \( n p t \mathrm { II } \) 유전자 특이염기서열 부분을 사용하였으며 Prx 프라이머는 5'-TCT AGA ATG GCG TCT GTT GCT-3' 5'-GAG CTC CTA AAT AGC TGA GAA-3'이고 \( n p t \) II 프라이머는 5'-GAG GCT ATT CGG CTA TGA CTG-3' 5'-ATC GGG AGC GGC GAT ACC GTA-3'이다. PCR로 Prx 유전자의 도입이 확인된 고구마 식물체를 대상으로 Southern 분석을 실시하였다. 배양기에서 생육중인 고구마 식물체의 잎으로부터 DNeasy Plant Maxi Kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 genomic DNA를 분 리하였다. 분리한 DNA \( (30 \mu \mathrm { g } ) \) 를 \( E c \circ R \) I으로 절단하여 \( 0.8 \% \) agarose gel에 전기영동한 훈, Zeta Probe membrane (Bio-Rad 제품)으로 전 이시켰다. 형질전환 식물체의 probe는 Prx 유전자 특이부분에서 제작된 primer를 이용하여 PCR로 합성하여 이용하였으며 (800 bp), 공벡터를 도입한 식물체는 npt II 유전자를 probe로 이용하였다. 이 DNA를 동위원소 \( \left [a- ^ { 32 } \mathrm { P } \right ] \mathrm { dCTP } \) 로 labelling 시켜 prehybridization용액 (Zeta Probe membrane 용)에 첨가하여 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 시간 동안 혼성 화시켰다. 반응을 마친 membrane을 세척하고 X-ray 필름에 노출시켜 밴드를 확인하였다.</p>