본 연구에서는 정상세포와 유방암세포주인 MDA MB-231에서 Dab2 유전자의 발현을 조사하기 위하여 RT-PCR을 수행하였으며 정상세포로는 자궁내막조직 세포를 사용하였다. 또한 luciferase 활성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 부위의 CpG methylation 상태를 분석하기 위하여 sodium bisulfite의 처리에 의한 염기서열 결정법을 이용하였으며 Dab2 유전자의 발현억제와는 관련이 없는 것으로 보였다. 그리고 TATA box의 주변의 CpG가 methylation이 되어 있는 것으로 나타났으며 5-azacytidine의 처리에 의하여 demethylation된 것으로 추정할 수 있다. 따라서, MDA MB-231세포는 5-azacytidine처리에 의해서 Dab2 유전자의 발현이 회복되는 것을 알 수 있다.
<h1>결 과</h1> <h2>자궁 내막세포와 MDA MB-231 세포에서의 Dab2 유전자의 발현</h2> <p>정상세포인 자궁내막조직 세포와 유방암세포주인 MDA MB-231에서 Dab2 유전자의 발현을 조사하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. Genomic DNA의 오염에 의한 비특이적 band의 출현을 방지하기 위하여 + strand의 primer는 exon 10 에서 - strand의 primer는 exon 11에서 각각 제작하였다. 이 primers를 이용하면 \( 366 \mathrm{bp} \) 크기의 \( \mathrm{PCR} \) 산물이 얻어진다. 그림 2에서 보는바와 같이 정상조직인 인간 자궁내막조직 세포에서는 \( 366 \mathrm{bp} \) 의 band가 검출되지만 암 세포인 MDA MB-231에서는 검출되지 않는 것으로 보아 Dab2 유전자의 발현이 일어나지 않는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1).</p> <h2>Bisulfite-assisted genomic sequencing</h2> <p>본 연구에서는 CpG methylation의 상태를 분석하기 위하여 Hajkova 등에 의해서 수정된 sodium bisulfite의 처리에 의한 염기서열 결정법을 이용하였다. Sodium bisulfite의 처리에 의하여 DNA상의 모든 cytosines은 deamination이 되어 uracil로 변하게 되지만, 5'-methyl cytosine은 cytosine으로 남아 있게된다. 이렇게 수식된 DNA가닥에 특이적인 primer를 이용하여 증폭시켜 염기서열을 결정하게되면 methylation이 되지 않은 cytosine은 adenine으로 변하여 methylation 상태를 확인할 수 있다. Dab2 promoter 영역 내에는 모두 41개 의 CpG가 존재한다. 5' 상류 쪽에서부터 118 198번째의 80개의 염기가 결손된 promoter가 luciferase assay에서 그 활성이 급격하게 저하되는 것으로 확인되어 먼저 이 부위의 CpG의 methylation pattern을 bisulfite 반응을 이용하여 분 석하였다. 이 부위에는 CpG가 5개(9 13번)가 존재한다. PCR 을 위한 primers는 이 5개의 CpG와 그 하류의 8개의 CpG를 포함하도록 제작하여 bisulfite 반응을 하고 PCR로 증폭하여 총 13개의 CpG의 methylation상태를 분석한 결과 MDA MB231 세포로부터 추출된 genomic DNA의 methylation상태는 정상조직의 자궁내막조직 세포의 methylation상태와 마찬가 치로 한군데도 methylation이 되어있지 않는 것으로 확인되었다(data not shown). 따라서 luciferase 활성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 부위의 CpG의 methylation은 Dab2 유전자의 발현억제와는 관련이 없는 것으로 보인다.</p> <h2>Methylation-specific PCR (MSP)</h2> <p>Interferon ४ (INF-४)의 경우에는 TATA box 주변의 CpG가 methylation이 되면 그 promoter의 활성이 억제되는 것이 보고되어 있다. MDA MB-231 세포에서 luciferase 활성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 부위의CpG가 전혀 methylation되어 있지 않았기 때문에 TATA box 부근의 CpG 의 methylation이 Dab2 gene의 발현억제와 관련이 되어있을 가능성이 시사되었다. Dab2 유전자의 TATA box 부위(420 426번째의 nucleotides)에는 methylation에 민감하지 않은 효 소(unsensitive enzyme)인 Msp I과 민감한 효소(sensitive enzyme)인 Hap II에 의해서 인식되어지는 부위인 CCGG서 열이 TATA box 상류 쪽에 2군데(379번째와 412번째의 nucleotide, 23번째와 28번째의 (pG)와 TATA box의 하류 쪽에 2군데(467번째와 512번째의 nucleotide, 35번째와 40번째의 CpG가 각각 존재한다. 이들 각 부위의 methylation의 상태를 분석하기 위하여 PCR용 primers를 Table 1 과 같이 제작하였고, 각각의 primer는 23,28,35 그리고 40번째의 CpG의 methylation 상태를 분석할 수 있가 때문에 그 이름을 각각 CpG23. CpG28, CpG35 그리고 CpG40으로 명명하였다.</p> <p>Genomic DNA를 Hap II와 Msp I으로 각각 처리한 다음 각각의 primer를 이용하여 DNA를 증폭한 결과 MDA MB-231세포에서 추출한 DNA를 methylation에 민감하지 않은 효소인 Msp I으로 처리하였을 때에는 CpG28, CpG35 그리고 CpG40에 상응하는 PCR 산물은 나타나지 않았고, CpG23에 상응하는 PCR 산물은 대조군에 비교하여 약 10 배정도 약하게 증폭되었다(Fig. 2A). 그러나 이 CpG23의 PCR 산물은 정상조직인 자궁내막세포에서도 대략 같은 정도로 나타나는 것으로 보아 제한효소에 의한 genomic DNA의 부분적인 절단인 것으로 보인다(Fig. 2B). 한편, methylation에 민감한 효소인 Hap II로 처리를 하였을 때에는 4개의 PCR 산물이 대조군과 동일하게 검출되었다. 그러나 이들 4개의 PCR 산물은 정상 자궁내막세포에서는 검출되지 않았다(Fig. 2). 따라서, TATA box의 주변의 상류부위인 23번째와 28번째, 그리고 하류 부위인 35번째와 40번째의 4개의 CpG는 MDA MB-231세포에서 methylation이 되어 있는 것으로 나타났다.</p> <h2>5-azacytidine처리에 의한 demethylation 분석</h2> <p>MDA MB-231세포에서 Dab2 유전자의 hypermethylation을 보다 확실하게 알아보기 위해서 MDA MB-231세포는 DNA methyltransferase (DNMT)의 저해제인 5-azacytidine을 4일 동안 처리하였다. 처리한 세포에서 추출한 genomic DNA를 Hap II로 처리하여 4개의 primers; CpG23, CpG28, CpG35 그리고 CpG40, 로 MSP를 한 결과 4개 모두 효소를 처리한 DNA주형에서는 각각의 primer에 상응하는 PCR 산물이 검출되지 않았다. 따라서 5-azacytidine의 처리에 의하여 methyla-tion되어 있었던 4곳의 CpG가 demethylation된 것으로 추정된다(Fig. 3).</p> <h2>5-azacytidine처리에 의한 Dab2 유전자의 발현</h2> <p>Dab2 유전자는 정상조직인 자궁내막세포에서는 발현되지만 유방암세포주인 MDA MB-231 세포에서는 발현되지 않았다(Fig. 1). 이와 같이 암세포에서 Dab2 유전자의 발현이 promoter의 TATA box부근의 CpG의 methylation과 직접적으로 연관되어 있는지를 알아보기 위하여 5-azacytidine처리를 한 MDA MB-231 세포로부터 전체 RNA를 분리하여 RT\PCR을 수행하였다. 5-azacytidine처리를 한 MDA MB-231세포는 대조군으로 이용한 자궁내막세포에서 나타난 것과 동일하게 \( 366 \mathrm{bp} \) 의 RT-PCR의 산물이 검출되었다(Fig. 4). 따라서, MDA MB-231세포는 5-azacytidine처리에 의해서 Dab2 유전자의 발현이 회복되는 것으로 나타났다.</p>