강원도에서 수확된 머루, 복분자, 오미자를 사용하였으며, 주국순당에서 제공받은 효모 균주 Saccharomyces cerevisiae KWN으로 알코올 발효를 진행하였다. 이는 YEPD 배지에서 초기 세포흡광도를 OD600=1 수준으로 접종한 후 30°C에서 24시간 동안 진탕배양기를 사용하여 배양하였다. 또한, 에탄올 5%가 함유된 GY 배지를 사용하여 죽국순당에서 제공한 Acetobacter pasteurianus KSD5 균주를 30°C, 150 rpm 조건으로 18시간 배양한 후 식초 제조에 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료 및 균주</h2> <p>머루는 강원도 영월군, 복분자는 강원도 원주시, 오미자는 강원도 횡성군에서 2016년에 수확된 것을 사용하였다. 알코올 발효를 위한 효모 균주는 (주국순당에서 제공한 Saccharomyces cerevisiae \( \mathrm{KWN} \) 을 사용하였으며[20], YEPD ( \( 2 \% \) glucose, \( 1 \% \) yeast extract, \( 2 \% \) peptone) 액체 배지에 세포흡광도 \( \left(\mathrm{OD}_{600}\right) \) 기준으로 초기 농도 \( \mathrm{OD}_{600}=1 \) 수준으로 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 진탕배양기를 사용하여 배양하였다. 에탄올 \( (5 \%, \mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 이 함유된 \( \mathrm{GY} \) ( \( 2 \% \) glucose, \( 1 \% \) yeast extract) 배지를 사용하여 (죽국순당에서 제공한 Acetobacter pasteurianus KSD5 균주를 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 150 \mathrm{rpm} \) 조건으로 진탕배양기(JSR, Japan)를 사용하여 18 시간 배양한 후 식초 제조를 위한 종초로 사용하였다.</p> <h2>식초 제조</h2> <p>수확된 머루를 분쇄하여 \( 21^{\circ} \mathrm{Brix} \) 의 착즙액을 제조한 후 S. cerevisiae \( \mathrm{KWN} \) 을 초기 세포 농도 \( \mathrm{OD}_{600}=5 \) 수준으로 접종하여, \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 7 일 동안 정치 배양을 통해 알코올 발효를 진행하여 에탄올 농도 \( 10 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 머루주를 제조하였다. 머루·복분자 과실주 제작을 위하여 복분자를 분쇄하여 얻은 착즙액 \( \left(10^{\circ} \mathrm{Brix}\right) \) 을 머루주와 \( 50 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 비율로 혼합하였다. 오미자 착즙액은 총산도가 약 \( 6 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 수준으로 나타나 알코올 발효가 어려울 것으로 판단되어 쌀막걸리(주)국순당, Korea) 원주를 혼합하여 사용하였다. 쌀막걸리(10 L)에 오미자 착즙액을 초산 발효 중 단계적으로 추가하였으며, 초산 발효 개시일에 \( 20 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}), 10 \) 일 후 \( 30 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \), 발효 말기 \( 40 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 비율로 첨가하였다. 각각의 과실주에 \( A \). pasteurianus KSD5 균주를 초기 농도 \( \mathrm{OD}_{600}=5 \) 로 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 항온배양기에서 20 일 동안 정치 배양하여 초산 발효를 진행하였다.</p> <h2>시료 전처리 및 유도체화</h2> <p>발효가 완료된 식초는 원심분리 \( (5,867 \times g, 20 \) 분)한 후 상등액을 회수하여 초저온 냉동고 \( \left(-70^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 에서 24 시간 동안 보관한 후 동결건조(일신바이오베이스, Korea) 하였다. 동결건조물은 \( 70 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 의 에탄올(덕산과학, Korea)을 사용하여 1 시간 동안 추출한 후, 상등액을 회수하여 감압건조기(Eppendorf, Germany) 를 사용하여 건조하였다. Pyridine (Sigma-Aldrich, USA)을 \( 20 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 농도로 녹인 methoxyamine hydrochloride (Sigma-Aldrich)를 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 첨가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 90 분 동안 반응시키고, \( N \)-methyl- \( N \)-trimethylsilyl trifluoroacetamine (MSTFA, Sigma-Aldrich, USA) \( 50 \mu \) 를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응한 후 여과지(polytetrafluoroethylene, \( 0.45 \mu \mathrm{m} \), Sigma-Aldrich)를 사용하여 여과하였다.</p>