상황버섯을 사용하여 추출한 열수 추출물, 에탄올 추출물과 pH 6.5로 보정한 0.1 \mathrm{M}0.1M maleic acid buf-fer 8 \mathrm{ml}8ml를 넣은 다음 0.05 \mathrm{ml}0.05ml의 유화제인 tween- 20.05 \mathrm{ml}20.05ml와 0.25 \mathrm{ml}0.25ml의 fish oil을 넣고 15분간 교반하여 실험직전에 만든 oil emulsion이 실험의 시료로 사용되었으며, 산화 촉진제인 \( \mathrm{Fe}^{2+} \) 또는 \( \mathrm{Cu}^{2+} \)의 첨가에 따른 지방산패 억제능, Elastase 저해 활성 측정, Collagenase 저해 활성 측정은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료</h2> <p>본 실험에 사용된 상황버섯은 캄보디아산으로 (주)바이오 길드로부터 구입하여 사용하였다.</p> <h2>시료 추출</h2> <p>시료의 추출은 다음과 같이 추출하였다. 즉, 열수 추출물의 경우, 상황버섯에 10배 양의 증류수를 첨가하여 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 환류 냉각 추출하였으며, 에탄올 추출물의 경우 \( 70 \% \) 에탄올에 침지하여 상온에서 24시간 방치하여 추출하였다. 각 추출물을 원십 분리하여 상층액을 취하는 과정을 3회 반복하였으며, 상층액을 감압 농축하여 동걸 건조 후 본 실험의 시료로 사용하였다.</p> <h2>Fish oil emulsion 조제</h2> <p>지방산패 억제능 실험에 사용하는 oil emulsion은 실험직전에 만들었으며, 미리 pH 6.5로 보정한 \( 0.1 \mathrm{M} \) maleic acid buf-fer \( 8 \mathrm{ml} \)를 넣은 다음 \( 0.05 \mathrm{ml} \)의 유화제인 tween- \( 20.05 \mathrm{ml} \)와 \( 0.25 \mathrm{ml} \)의 fish oil을 넣고 15분간 교반하였다. 이 후 \( \mathrm{KOH} 2 \) \( \mathrm{g} \)을 넣고 \( 150 \mathrm{ml} \)까지 정제수를 가한 후 교반하면서 \( 2 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} \)로 pH 6.5가 되도록 조제하여 사용하였다.</p> <h2>\( \mathrm{Fe}^{2+} \)또는 \( \mathrm{Cu}^{2+} \)의 첨가에 따른 지방산패 억제능 측정</h2> <p>산화 촉진제인 \( \mathrm{Fe}^{2+} \) 또는 \( \mathrm{Cu}^{2+} \)의 첨가에 따른 지방산패 억제능 측정은 Buege와 Aust의 방법에 따라 측정하였다. Oil emulsion \( 0.5 \mathrm{ml} \)와 시료 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 및 \( 50 \mathrm{ppm} \)의 \( \mathrm{Fe}^{2+} \) 또는 \( \mathrm{Cu}^{2+} \) 이온용액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)가 포함된 혼합물이 채워진 시험관을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 반응시킨 후 \( 2 \mathrm{ml} \)의 TCA/TBA 시약을 가하고 다시 혼합 후 끊는 물에서 15분간 끊인 다음 \( 5,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리 시켜 상층액을 흡광도 \( 531 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. \( \mathrm{Fe}^{2+} \) 또는 \( \mathrm{Cu}^{2+} \)의 첨가에 따른 지방산패 억제능은 시료용 액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <h2>Elastase 저해 활성 측정</h2> <p>Porcine pancreas elastase 저해 활성 측정은 기질로서 L\(-\)succinyl\(-\)(L\(-Ala_{3}-p-\)nitoanilide를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 \( p- \)nitoanilide의 생성량을 측정하였다. 즉, 각 시험용액을 일정 농도가 되도록 조제하여 \( 0.1 \mathrm{ml} \)씩 시험관에 취하고 50 \( \mathrm{mM} \) Tris\(-\mathrm{HCl} \) buffer pH 8.6에 녹인 elastase, pancreatic sol-ution, Type I : From Porcine Pancreas \( (0.6 \)nits/ml) 용액 \( 0.05 \) \( \mathrm{ml} \)을 가한 후 기질로 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris\(-\mathrm{HCl} \) buffer pH 8.6에 녹인 \( N -\)succinyl\(-\)(L\(-Ala_{3}-p- \)nitoanilide \( (1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)을 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 첨가하여 30분간 반응시켜 \( 410 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. Elastase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무침가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <h2>Collagenase 저해활성 측정</h2> <p>Collagenase 저해활성 측정은 Wûnsh 등의 방법에 따라 측정하였다. 즉 반응구는 \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris\(-\mathrm{HCl} \) buffer pH 7.5에 \( 4 \mathrm{mM} \mathrm{CaCl}_{2} \)를 첨가하여, 4\(-\)phenylazobenzyloxycarbonyl\(-\)Pro\(-\)Leu\(-\)Gly\(-\)Pro\(-\)Arg \( (0.3 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)를 녹인 기질액 \( 0.25 \mathrm{ml} \) 및 시료용액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)의 혼합액에 collagenase \( (0.2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) 0.15 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 \( 6 \% \) citric acid \( 0.5  \mathrm{ml} \)을 넣어 반응을 정지시킨 후, ethyl acetate \( 1.5 \mathrm{ml} \)을 첨가하여 상등액을 \( 320 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.<p>Collagenase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <h2>통계 처리</h2> <p>본 연구는 독립적으로 3회 이상 반복 실시하여 실험한 결과로 통계처리는 SPSS 10.0 for windows program을 사용하였으며, 유의차 검증은 분산분석(ANOVA: analysis of variance)을 한 후 \( p<0.05 \) 수준에서 Duncan의 다중 검증법(DMRT:Duncan's multiple range test)에 따라 분석하였다.</p>