분리균주는 \(16\mathrm{~s}\) rRNA 염기서열 분석과, PGA 생산을 위해 탄소원 \(glucose, fructose, gal-actose, sucrose, maltose, glycerol; xylose, citric acid \) 농도 \(5\%\)와 질소원 \(L-glutamate, L-glutamine\), \( \mathrm{NaNO}_{3} , \mathrm{NH}_{4} \mathrm{NO}_{3} , \mathrm{NH}_{4}\mathrm{Cl}\), \(\left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm {SO}_{4}\),\(casamino acid, peptone\) 농도 \(1 \%\)로 첨가하였다. 그 후 분리 및 정제 과정을 거쳐 \(L-glutamate \)으로 표준곡선을 작성하였다.
<h2>균주의 동정</h2> <p>분리균주는 \( 16 \mathrm { ~s } \) rRNA 염기서열을 분석하였고 \( \mathrm { API } 50 \mathrm { CH } \)동정 kit (Biomerieux, France)를 이용하여 생리 및 생화학적 특성을 조사한 뒤, 그 결과물을 \(Bergy's Manual of Systematic Bacteriology \)에 준하여 동정하였다.</p> <h2>PGA 생산조건 검토</h2> <p>\( \mathrm { PGA } \) 생산을 위한 최적조건을 검토하기 위하여 탄소원, 질소원을 결정하였다. 먼저, 탄소원은 \(glucose, fructose, gal-actose, sucrose, maltose, glycerol; xylose, citric acid \)는 최종농도 \( 5 \% \)가 되도록 \( \mathrm { PGA } \) 생산배지에 첨가하였다. 각각 탄소원이 첨가된 배지로 Bacillus subtilis \( \mathrm { CH } -10 \)을 배양하고 생성된 \( P G A \)의 양은 \(ninhydrin \) 반응을 둥하여 결정하였다. 질소원은 \(L-glutamate, L-glutamine \), \( \mathrm { NaNO } _ { 3 } , \mathrm { NH } _ { 4 } \mathrm { NO } _ { 3 } , \mathrm { NH } _ { 4 } \mathrm { Cl } \), \( \left ( \mathrm { NH } _ { 4 } \right )_ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \), \(casamino acid, peptone \)을 \( 1 \% \) 가 되도록 \( \mathrm { PGA } \) 상산배지에 첨가하여 \( \mathrm { PGA } \)의 생산량을 검토하였다.</p> <h2>\( \mathrm { PGA } \) 의 분리 및 정제</h2> <p>\( 50 \mathrm { ml } \) 의 균체 배양액은 원심분리 \( (12,000 \times g, 30 \) 분 )하여 균체를 제거하고 상등액을 회수하였다. 상등액에는 \(4 \)배량의 메탄올을 침가하고 생긴 침전을 회수하여 \( 10 \mathrm { ml } \) 의 \( 10 \mathrm { mM } \)Tris-HCl buffer \( ( \mathrm { pH } 8.0) \) 에 녹인 후, 2 liter의 동 buffer로 3번 투석하였다. 투석액은 동결건조한 후, \( 1 \mathrm { ml } \) 의 \( 10 \mathrm { mM } \)Tris- \( \mathrm { HCl } \) buffer \( ( \mathrm { pH } 8.0) \)에 용해하고 \(a-polypeptide \)의 제거를 위해 proteinase \( \mathrm { K } (100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 를 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 12 \) 시간 처리하였다. 처리액은 \( 10 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } \) buffer ( \( \mathrm { pH } \mathrm { 8.0)로 } \mathrm { 투석한 } \mathrm { 후- } \) 동결 건조하여 사용하였다. \( \mathrm { PGA } \) 의 정량을 위해 동일한 앙의 \( 6 \mathrm { M } \mathrm { HCl } \) 과 함께 \( 105 ^ {\circ } \mathrm { C } , 24 \) 시간 가수분해하였고, \( 6 \mathrm { M } \mathrm { NaOH } \) 로 중화한 후에 용액중의 glutamate의 양을 측정하였다. 중화한 glutamate 용액은 에탄올에 녹인 \( 0.35 \% \) ninhydrin \( ( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) 용 액과 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 10 \) 분간 반응하고, \( \mathrm { A } _ { 570 } \) 에서 흡광도를 측정하였고 \(L-glutamate \)로 표준곡선을 작성하여 정량하였다.</p>