B. amyloliquefaciens EMD17과 B. amyloliquefaciens MJ1-4는 37℃에서 Luria Bertani(LB) 배지를 이용하여 진탕 배양하였다. 반면에, farinosa SY80, R. oryzae, 그리고 Aspergillus oryzae는 30℃에서 Yeast Mold (YM) 배지로 배양하였다. 이들 Bacillus와 효모 균수를 구하기 위해서는 배양액을 0.1% 펩톤수로 10배씩 단계적으로 희석하여, 희석액 100µl를 각각 LB 한천배지와 YM 한천배지(chloramphenicol 150µg 첨가)에 도말하여 각각 37℃와 30℃에서 배양하여야 한다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>종균 배양</h2> <p>B. amyloliquefaciens EMD17과 B. amyloliquefaciens MJ1-4는 Luria Bertani (LB, MB Cell, CA, USA) 배지에 접종하여 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) 진탕 배양하였다. P. farinosa SY80, R. oryzae 그리고 Aspergillus oryzae 는 Yeast Mold (YM, Neogen, MI, USA) 배지에 접종하여 30 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다. Bacillus와 효모 균수는 배양액을 0.1 \( \% \) 펩톤수를 이용하여 10배씩 단계 희석한 희석액 100 \( \mu \mathrm { l } \)씩을 각각 LB 한천배지와 YM 한천배지(chloramphenicol 150 \( \mu \mathrm { g } \) 첨가)에 도말하여 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)와 30 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 각각 배양하여 구하였다. 곰팡이들은 YM 한천배지에 접종하여 30 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배지 전면이 충분히 균사로 덮힐 때까지 배양한 후 멸균 젓가락을 사용하여 균사를 회수하여 멸균수에 현탁하였다. 거즈로 여과하여 얻은 여액 중의 포자들은 haemacytometer (Marienfeld, Germany)를 사용하여 계수하였다.</p> <h2>메주 제조</h2> <p>함양농협에서 구입한 국산콩(2012년산) 9 \( \mathrm { kg } \)을 세척하고 15시간 증류수에 담가 불린 후 물을 따라낸 다음 121 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 50분간 증자한 후 냉각하였다. 콩 1.5 \( \mathrm { kg } \)에 미리 배양한 B. amyloliquefaciens EMD17과 B. amyloliquefaciens MJ1-4 균주를 대두 중량비로 각각 0.5 \( \%( \mathrm { v } / \mathrm { w } ) \) 첨가하였다. P. farinosa SY80은 1 \( \%( \mathrm { v } / \mathrm { w } ) \) 접종하였고 R. oryzae의 경우 0.5 \( \%( \mathrm { v } / \mathrm { w } ) \)를 먼저 증자대두에 접종하고 메주를 성형한 후 메주 표면에 0.5 \( \%( \mathrm { v } / \mathrm { w } ) \)를 추가로 접종하였다. 메주 1개당 (1.5 \( \mathrm { kg } \)) 접종된 B. amyloliquefaciens 균수는 \( 4 \times 10 ^ { 9 } \mathrm { ~CFU } \) (MJ1-4와 EMD17 각각 \( 2 \times 10 ^ { 9 } \mathrm { ~CFU } \), P. farinosa SY80는 \( 4 \times 10 ^ { 9 } \mathrm { ~CFU } \)이고 R. oryzae 는 \( 4 \times 10 ^ { 8 } \) spores이다. 균주들을 접종 후 대두를 파쇄하여 골고루 혼합한 후, \( 15 \times 10 \times \) 20 \( \mathrm { cm } \) 크기로 성형하였다. 이런 방식으로 Bacillus 2종과 효모와 곰팡이 각 1종 도합 4종을 접종한 메주(메주 1) 2개를 제조하였다. 대조구로는 B. subtilis KACC16450 (natto 균주)와 A. oryzae KCCM 60166 을 각각 \( 4 \times 10 ^ { 9 } \mathrm { ~CFU } \), \( 4 \times 10 ^ { 8 } \) spore 접종한 메주(메주 2) 2개를 제조하였다. 또 다른 대조구로는 증자대두 표면을 잘게 자른 볏짚으로 둘러싸는 방식으로(볏짚을 균원 시료로 사용한) 제조한 메주(메주 3)가 있다. 3종류의 메주들은 3일간 자연건조한 뒤 온도 25 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \), 습도 80 \( \% \) 배양기에서 7일간 두어 일차 발효를 시킨 후 실외 (12, 1월)에서 약 두 달간 공중에 매달아 두는 방식으로 2차 발효를 수행하였다.</p>