인삼사포닌 분해를 위해 R2A 고체배지에 도말하고 esculin agar에 streaking하여 \( \beta \)-Glucosidase 활성을 가진 균주를 분리하였으며, ginsenoside \( \mathrm { Rb } _ { 1 } \)로 반응시켜 변환시킬 수 있는 균주를 선발하였다. 16S rRNA sequencing을 통해 미생물의 유연관계를 분석하고, 분리된 균주와 type strain의 유사도(%) 를 확인하기 위하여 NCBI database를 이용하였다. Optical Density 값은 선발 균수의 colony에 멸균된 LB 액체배지에서 24시간 동안 배양하여 측정하였고, 각 4시간에서 48시간 동안 6번 각각의 Optical Density 값을 측정하여 균주의 생장 속도를 확인하였다. \(\beta\)-glucosidase활성은 Peralta 등의 방법으로 측정하였다. Glucosidase 활성은 24시간 동안 Gsoil 235 를 배양한 LB, TSB, NB 배양액을 원심 분리한 후, 균체를 제거하였고 상층액을 조효소액으로 사용하여 측정하였다.
<h2>균주 분리</h2> <p>인삼사포닌을 분해하는 미생물을 선발하기 위하여 인삼밭과 주변토양으로부터 시료를 채취하여 R2A 고체배지에 도말한 후 colony를 취하여 esculin agar에 streaking하여 \( \beta \)-Glucosidase 활성을 가진 균주를 분리하였으며, 분리된 균주는 액체배양하여 \( 1 \mathrm { mM } \) 의 ginsenoside \( \mathrm { Rb } _ { 1 } \) 과 반응시켜 ginsenoside를 전환시킬 수 있는 균주를 Fig. 1 과 같이 선발하였다.</p> <h2>Ginsenoside 변환 미생물의 유연관계 분석</h2> <p>미생물의 유연관계를 분석하기 위하여 16S rRNA sequencing을 제노텍(대전)에 의뢰하여 분석하였으며, NCBI database를 이용하여 분리된 균주와 type strain의 유사도(%)를 확인하였다. 균주들의 16S rRNA 염기서열을 Clustal X program을 이용하여 일정하게 정렬하고 gap는 BioEdit program으로 편집하였다. 균주들의 진화과정을 추적하는 작업은 Kimura two-parameter model[10]을 이용하였고, MEGA 3 Program의 neighbor-joining 방법으로 계통분류학적 위치를 결정하였다.</p> <h2>배지에 따른 선발균주의 생장곡선 확인</h2> <p>선발 균주의 colony를 취하여 멸균된 LB 액체배지에 24시간 동안 배양하여 \( 600 \mathrm { ~nm } \) 에서 O.D(Optical Density)값을 측정하고, LB, TSB, NB \(50 \mathrm { ~mL } \) 에 이를 각각 \( 500 \mu \mathrm { L } (1 \% \), \( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 씩 접종한 후 \( 160 \mathrm { rpm } , 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) incubator에서 \( 4,8,12 \), \( 16,24,48 \) 시간마다 각각의 O.D.값을 측정하여 균주의 생장 속도를 확인하였다.</p> <h2>\( \beta \)-Glucosidase활성 측정</h2> <p>\( \beta \)-glucosidase활성은 Peralta 등의 방법을 사용하여 측정하였다. 24 시간 동안 Gsoil 235 를 배양한 LB, TSB, NB 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 후 상층액을 조효소액으로 하여 \( \beta \)-Glucosidase 활성을 측정하였다. 효소액은 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 항온수조에서 5 분간 활성화시켰다. \( 5 \mathrm { mM } \) p-nitrophenyl- \( \beta \)-D-glucopyranoside를 함유한 \( 25 \mathrm { mM } \) 인산완충용액 \( ( \mathrm { pH } \) 7.0) \( 50 \mu \mathrm { L } \) 에 효소액 \( 50 \mu \mathrm { L } \) 을 가하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분간 반응 시킨 후 \( 100 \mu \mathrm { L } \) 의 \( 0.5 \mathrm { M } \) sodium phosphate solution으로 반응을 중지시켜 유리되는 \( p \)-nitrophenol의 양을 \( 405 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 효소활성 1 단위(unit)는 반응시간 분당 생성되는 \( p \)-nitrophenol \( 1 \mathrm { nmole } \) 을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.</p>