본 연구는 수용성 단백질의 비정상 응집 문제를 다루고 있으며, 대장균 트립토판 중합효소의 응집을 억제하기 위해 Y173F 돌연변이를 사용하는 방법을 탐구한다. 실험에서는 대장균 균주 RB797와 ptactrpA 플라스미드를 이용하여 단백질 발현을 수행하고 분리하는 과정을 진행했다. 단백질 발현 후 세포를 파쇄하여 SDS-PAGE로 분리하였으며, 응집된 단백질을 변성시킨 후 원심분리하여 정제하는 과정을 거쳤다. 정제된 단백질의 순도는 SDS-PAGE로 확인되었다. 이를 통해 야생형 및 Y173F 돌연변이의 응집 억제 효과를 알아보기 위해 실험을 진행하였다.
<h1>서 론</h1> <p>수용성 단백질이 비정상적인 불용성 응집(aggregate)으로 전환되면 생물에서나 바이오산업 분야에서 여러 문제를 야기한다. 단백질 응집은 단백질의 불안정한 3 차 구조나 3 차구조 형성과정(folding)이 관여하는 것으로 보이나 일반화된 이론은 아직 미홉하다. 대장균 트립토판 중합효소 \( \alpha \) 소단위체( \( \alpha \mathrm { TS } ) \) 는 가장 혼한 구조의 하나인 TIM 배럴 구조롤 가지고 있다. 대장균에서 유전공학적인 방법으로 과량 수용성인 상태로 발현되나, 많은 응집 형성 돌연변이가 알려져 있다. 이전의 연구에서 \( \mathrm { Y } 173 \mathrm { F } \) 잔기치환 \( \alpha \mathrm { TS } \) 이 단백질의 안정성과 도메인 협동성을 매우 높여 주었음으로, 여기서는 이러한 성질이 여러 자러의 돌연변이에 의해 유발된 응집 형성을 억제할 수 있는 지 살펴보고자 했다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약, 박테리아 균주 및 플라스미드, 클로닝</h2> <p>모든 시약은 Sigma Chemical Co (MO, USA), New England BioLab (MA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 대장균 균주 \( \mathrm { RB } 797 \) 와 플라스미드 ptactrpA는 단백질의 대량발현 과정에 사용하였다. 잔기 173자리에 Phe 코돈을 갖는 trp A BssHII-SalI 절편을 응집을 일으키는 돌연변이 코돈을 포함하는 tactrpA 플라스미드의 해당부위와 교체하였다.</p> <h2>단백질의 발현 및 분리</h2> <p>야생형 및 잔기치환 단백질들을 대량 발현시키고 분리한 방법은 이미 보고된 방법을 따랐다. 단백질을 젖당으로 발현 유도한 후, 세포를 파쇄한 후 원심분리기로 용해층과 침천층으로 구분한 후 SDS-PAGE을 시행하였다. 응집된 \( P28L \)로부터의 단백질 분리는 \( 6 \mathrm { M } \) 요소를 첨가한 후 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 시간 용해시켜 변성시킨 후, 원심분리시켜 상층액을 \( 5 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 0.2 \mathrm { mM } \) phenylmethylsulfonyl-fluoride (PMSF), and \( 10 \mathrm { mM } \beta \)-mercaptoethanol \( ( \beta- \mathrm { ME } ) \) 이 포함된 \( 10 \mathrm { mM } \mathrm { KPO } _ { 4 } ( \mathrm { pH } 7.8) \) 용액에 투석하여 재변성시켰다. 그 뒤 황산암모늄 \( \left ( \left ( \mathrm { NH } _ { 4 } \right )_ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \right ) \) 침전법과 이온크로마토그래픠 HPLC로 분리하였다. 정제된 단백질의 순도는 SDS-PAGE로 확인하였다. 순수 정제된 야생형의 \( \alpha \) 소단위체의 농도는 \( \mathrm { E } ^ { 1 \% } { } _ { 278 \mathrm { ~nm } } = 4.4 \) 롤 사용하여 결정하였다.</p>