본 연구에서는 Bacillus .sp.J105 균주를 사용하여 \( \beta \)-lactamase 단백질 분리와 유전자 클로닝을 수행하였다. 클로닝에 대한 배양을 위해 LB에 X-gal, IPTG, ampicillin 또는 tetracycline이 포함된 배지를 사용하였다. 균주에서 chromosomal DNA 분리하기 위해 Murray와 Thompson의 방법을 변형했고, Ampicillin을 함유한 LB배지에 균주를 접종하고 원심분리 등의 과정을 거쳐 생긴 침전물에 TE buffer와 CsCl, EtBr을 넣어 UV로 chromosomal DNA band를 회수한다.
<h2>사용 균주 및 plasmid</h2> <p>본 연구에 사용된 균주와 plasmid는 Table 1에 나타내었다. Bacillus. sp. J105균주는 부산 일대의 토양에서 분리하였으며 \( \beta \)-lactamase의 단백질 분리 및 유전자의 클로닝에 이용하였다. E. coli DH 5 \( \alpha \)는 \( \beta \)-lactamase유전자의 cloning에, E. coli HB101 균주는 \( \beta \)-lactamase유전자의 subcloning에 각각 사용하였다. Plasmid pLAFR3은 tetracycline 내성유전자 \( \left ( \mathrm { Tc } ^ {\mathrm { r } } \right ) \)와 multi cloning site (MCS)를 가지고 있는 \( 22 \mathrm { ~kb } \)의 cosmid vector이며 Bacillus sp. J105균주의 genomic library의 제작에 사용하였다. Plasmid pACYC184는 \( 4.2 \mathrm { ~kb } \)의 크기를 가지며 cloning한 \( \beta \)-lactamase 유전자의 subcloning vector로 사용하였다.</p> <h2>배양 배지</h2> <p>\( \beta \)-Lactamase 유전자 cloning을 위한 E. coli DH5a균주는 \( X \)-gal (5-bromo-4-chloro-3-indoly- \( \beta \)-D-galactopyranoside), IPTG (Isopropyl-thiogalactoside), 그리고 ampicillin \((2 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \)이 포함된 LB ( \(1 \% \)bacto trypton, \(0.5 \% \) yeast extract, \( 0.5 \% \) NaC agar 배지를 사용하였다. Bacillus sp. J105 균주와 E. coli HB101 (pKB89/pKL11/pKL11- \( \Delta \) B/pKL11- \( 4.6) \)의 배양에는 LB배지에 ampicillin \( (2 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \)을 첨가하여 배양하였고 E. coli HB101 (pACYC184)의 배양에는 LB배지에 tetracycline \( (30 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \)을 첨가하여 배양하였다.</p> <h2>Chromosomal DNA 분리</h2> <p>Bacillus sp. J105균주의 chromosomal DNA 분리는 Murray와 Thompson의 방법을 변형하여 다음과 같은 방법으로 분리하였다. Ampicillin \( (2 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \)을 함유한 LB배지 \( 100 \mathrm { ml } \)에 Bacillus sp. J105균주를 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 18시간 진탕 배양하여 배양액을 \( 50 \mathrm { ml } \)원심관에 옮겨 원심분리 \( (15,000 \times g \), \( 5 \mathrm { ~min } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) )로 균체를 회수하였다. 얻어진 균체에 TE buffer \( 9.5 \mathrm { ml } \) 와 \( 10 \% \) SDS \( 0.5 \mathrm { ml } \), 그리고 proteinase \( \mathrm { K } 50 \mathrm { ml } \)를 넣은 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 \( 5 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } \) \( 1.8 \mathrm { ml } \)와 CTAB / NaCl \( \ 1.5 \mathrm { ml } \)를 넣고 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20분간 반응시킨 후 동량의 chloroform/iso-amylalcohol \( ( \mathrm { v } / \mathrm { v } , 24: 1) \)을 첨가하여 조심스럽게 섞은 다음 원심분리(15,000× g, \( 10 \mathrm { ~min } \), room temp.)하여 상층액을 새 원심관에 회수하였다. 이 과정을 2회 반복하여 이행 하였다. Phenol추출 후 용액에 0.6배 용량의 isopropanol을 잘 섞은 다음 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20분간 방치 후 원심분리 \( \left (20,000 \times g, 15 \mathrm { ~min } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \) 하여 DNA를 침 전시킨 후, \( 70 \% \) ethanol로 침전물을 세척한 후 진공 건조하였다. 침전물에 TE buffer \( 4.0 \mathrm { ml } \) 와 CsCl \( \4.3 \mathrm { ~g } \) 을 넣은 후 잘 녹이고 ethidium bromide (EtBr) \( 0.1 \mathrm { ml } \) 를 첨가하여 \( 150,000 \times g \) 로 \( 15 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 4시간 초원심분리하여 UV 하에서 chromosomal DNA band를 회수하였다. 회수한 DNA용액을 water-saturated buthanol로 EtBr 을 제거한 후 TE buffer로 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 동안 투석하여 CsCl을 제거하였다. DNA농도는 \( 260 \mathrm { ~nm } \)에서의 흡광도로 측정하였다. 분리한 chromosomal DNA는 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 보관하여 \( \beta \)-lactamase 유전자 클로닝에 이용하였다.</p>