발현벡터를 Agrobacterium을 활용해 형질전환 하고 스크리닝 한 결과 얻어진 15 개의 독립된 형질전환체 중 BrMT3 유전자 발현이 높은 7 번과 12 번 라인을 본 실험에 활용했다. 애기장대 실험은 형질전환체를 1/2 MS에서 약 2 주간 키운 유묘를 액체질소 하에서 막자사발로 마쇄 하고 추출 버퍼를 사용하여 total RNA를 분리했으며 이를 RT-PCR 분석에 사용하였다. B. rapa 를 사용한 실험에서는 3 주간 수경재배한 식물체를 \( 50 \mu \mathrm{M}\) \(\mathrm{CdCl}_{2} \) 을 2, 5, 24 시간 동안 처리 후 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하였다.
<h2>발현 벡터 제작 및 애기장대로의 형질전환</h2><p>BrMT3 유전자를 식물체에 형질전환하기 위하여 BASTA 유전자가 선발 마커로 들어간 식물 형질전환용 벡터 pCAMBIA를 이용하였다. 엽록체에 BrMT3를 targeting 하기 위해 chloroplast transit peptide로 알려진 Rubisco small subunit (RbcS) (Lee et al. 2002) 의 signal peptide를 포함하는 벡터와 35 s promoter를 이용하여 식물체 전체에서 발현을 유도하는 벡터를 제작한 후 엽록체에 BrMT3이 정확히 targeting하는지를 알아 보기 위한 GFp (Green Fluorescence Protein)를 추가하였다. 이를 위해, Rubisco small subunit (RbcS) chloroplast transit peptide를 제한효소 EcoR I 과 BamH I 을 포함하는 primer를 이용하여 PCR을 통해 증폭 한 뒤 EcoRI 과 BamH I 으로 자른 pCAMBIA에 ligation 한 뒤 cloning을 거쳐 GFP tag를 추가한 pCAM-RbcS-GFP 를 제작하였다. 이렇게 완성된 벡터에 BamHI 과 XbaI 을 처리한 뒤 BrMT3를 같은 제한효소를 이용하여 자른 다음 각각 ligation 하여 본 실험에서 완성하고자 하는 BrMT3의 엽록체 targeting vector인 pCAM-RbcS-BrMT3-GFP 를 완성하였다. 완성된 발현벡터를 Agrobacterium을 이용하여 형질전환 하여 스크리닝 한 결과 15 개의 독립된 형질전환체를 얻었으며 이중 BrMT3 유전자의 발현이 높은 7 번과 12 번 라인이 본 실험에 사용되었다.</p><h2>RNA 추출 및 RT-PCR</h2><p>애기장대 실험은 형질전환체를 1/2 MS (1/2 Murashige and Skoog salts including vitamin, \( 0.8 \% \) plant agar, and \( 1.5 \% \) sucrose) 에서 약 2 주간 키운 유묘 \( 0.5 \mathrm{~g} \) 을 액체질소 하에서 막자사발을 이용해 마쇄 한 후 추출 버퍼 (p-Aminosalicylic acid \( 13.5 \mathrm{~g} \), Tri-isopropyl Naphthal Sulfonic acid \( 2.25 \mathrm{~g}\), \(0.25 \mathrm{M} \) Tris-\( \mathrm{HCl} \) \( \mathrm{pH} 9.0 \), \( 0.25 \mathrm{M}\) \(\mathrm{NaCl}\), \(0.05 \mathrm{M} \) EDTA, 2-mercaptoethanol \( 5 \mathrm{ml} \), Phenol \( 6 \mathrm{ml} \), Distilled Water/DEPC) 를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 이렇게 분리한 total RNA를 RT-PCR 분석에 이용하였다. B. rapa 를 이용한 실험에서는 1/2 MS 액체배지에 3 주간 수경재배한 식물체를 \( 50 \mu \mathrm{M}\) \(\mathrm{CdCl}_{2} \) 을 2, 5, 24 시간 동안 처리한 뒤 뿌리와 줄기로부터 RNA (Spectrum plant total RNA kit, Sigma) 를 추출하고 cDNA (Superscript III First-Strand Synthesis System, Invitrogen) 를 합성하였다. PCR에 사용된 primer 는 다음과 같다. BrMT3 primer (BrMT3 sense: GGAAACTGCGACT GTTCTGA, BrMT3 antisense: TAGAGCCACACTTGCATTGG), BrActin primer (BrActin sense: TGTGTGATGTCGGAGATGGT, BrActin antisense: AACCCTGTGGGTGCTAAGTG). PCR은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 초 변성, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45 초의 조건에서 29 와 32 cycles을 수행하였다.</p>