Nitric oxide (NO) 분석법을 통해 생쥐 대식세포 RAW 264.7의 면역활성을 측정하기 위해, total NO assay는 Total NO/Nitrite/NitrateAssay Kit을 사용하여 Synergy HTMulti-detection microplate reader를 이용하여 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 의 파장에서 \( \mathrm { OD } \) 값을 측정하였다. 갈파래의 에탄올 추출 및 각 용매별 분획물의 제조하고 살아있는 세포내 미토콘드리아의 dehydrogenase에 의해서 MTT가 formazan으로 변화하는 MTT 분석법을 이용하여 생성된 formazan의 농도를 spectrophotometer로 측정함으로써 갈파래분획물의 암세포에 대한 세포독성을 관찰하였다.
<h2>Nitric oxide (NO) 분석법을 통한 면역활성 측정</h2> <p>생쥐 대식세포주 RAW 264.7을 96-well plate (Roche Inc.)에 분주하고 24 시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 배양세포를 PBS로 세정한 후 갈파래 분획물들을 PBS에 희석하여 20 \( \mu \ell \) 씩 첨가하였다 (최종농도: \( 0.5,0.1,0.01 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \). 대조군은 갈파래 분획물 대신 동량의 \( \mathrm { PBS } \) 를 가하였다. \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 에서 24시간 배양한 후 배양액 \( 100 \mu \mathrm { l } \)에 reaction diluent \( 400 \mu \mathrm { l } \)를 첨가하여 희석을 행하였다. Total NO assay는 Total NO/Nitrite/NitrateAssay Kit (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 제조사의 manual을 토대로 행하였으며, Synergy HTMulti-detection microplate reader (Biotek Instruments, Inc.)를 이용하여 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 의 파장에서 \( \mathrm { OD } \) 값을 측정하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>갈파래의 에탄올 추출 및 각 용매별 분획물의 제조</h2> <p>갈파래 시료 \( 800 \mathrm { ~g } \) 에 대한 에탄올 추출을 행하고 이를 Rotary evaporator (EYELA Inc., Tokyo, Japan)로 농축을 행하여 최종적으로 \( 3 \mathrm { ~L } \) 의 에탄올 추출시료를 얻었다. 이를 butanol, ethyl ether, hexane, methanol, \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 등을 이용하여 분획을 행하고, 얻어진 분획물을 Centrifugal evaporator (Sovall RC 5C + , Ashevrlle, NC, USA)를 이용하여 용매 제 거 및 농축을 행한 결과 각각의 갈파래 분획물 시료들을 10 \( \mathrm { mg } \) 전후의 비슷한 양으로 얻을 수 있었다.</p> <h2>갈파래분획물의 암세포에 대한 세포독성</h2> <p>MTT 분석법은 살아있는 세포내 미토콘드리아의 dehydrogenase에 의해서 MTT가 formazan으로 변화하는 것을 이용하며, 생성된 formazan의 농도를 spectrophotometer로 측정함으로써 세포에 대한 독성을 조사하는 방법으로서, 각종 항암제에 대한 in vivo 세포독성에 관한 연구에 사용되어 온 dye exclusion test나 \( \left [ { } ^ { 3 } \mathrm { H } \right ] \)-thymidine uptake assay와 비교 시 실험 조작이 매우 간편하고 재현성이 우수하여 세포독성여부 대량검색이나 초기 검색단계에 적당한 방법으로 많이 이용되고 있다. 이 방법은 방사선 동위원소를 사용하지 않고 세포의 증식 및 생존율을 정확히 측정할 수 있는 방법으로서, 육안으로도 발색정도를 관찰할 수 있다.</p>