본 실험에서는 알래스카에서 채취된 낙엽진흙 버섯 자실체를 사용했다. 숙주세포인 HeLa는 penicillin 과 strepto-mycin을 첨가한 RPMI 1640 배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양했으며, 바이러스는 coxsackievirus B3(CVB3) H3 strain(AAB02228)을 \( \mathrm{HeLa} \) 배양을 통해 얻은 stock을 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하며 사용하였다. 버섯 열수추출물과 에탄올 침전물의 세포독성을 조사하기 위해 HeLa 세포에서 세포단층을 얻은 후 2%FBS를 함유한 유지용 배지를 이용해 여러 농도의 시료 용액을 제조하여 well당 \( 100 \mu \mathrm{L} \)씩 분주하고 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \), \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 배양하였다. CVB3에 대한 항바이러스 활성은 플라크 환원 분석으로 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료 및 시약</h2> <p>낙엽진흙 버섯[Porodaedalea pini (Brot.) Murrill] (syn. Phellinus pini)의 자실체는 알래스카에서 채취되어 (주)회주 커뮤니케이션스(Seoul, Korea)로 부터 제공 받았으며, 고려대학교 진균분류생태연구실로부터 동정 받아 실험에 사용하였다. Roswell Park Memorial Institute medium(RPMI) 1640, trypsin-EDTA, penicillin, streptomycin은 Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하고, 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT), neuraminidase(from Clostridium perfringens)와 표준 기질 인 2-(4-methylumbelliferyl)-\( \alpha-\mathrm{D}-\mathrm{N} \)-acetylneuraminic acid(MUNANA), 표준 단당류(fucose, mannose, glucose, galactose, xylose) 등은 모두 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.</p> <h2>세포주 및 바이러스</h2> <p>숙주세 포인 \( \mathrm{HeLa} \) 세 포는 \( 10 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) heat inactivated \( (56 \) \( { }^{\circ} \mathrm{C}, 30 \mathrm{~min} \) ) fetal bovine serum(FBS), penicillin 과 strepto-mycin을 첨가한 RPMI 1640 배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양하였다. 바이러스는 coxsackievirus B3(CVB3) H3 strain(AAB02228)을 가톨릭대학교 생명공학과 분자바이러스 연구실로부터 제공받아 \( \mathrm{HeLa} \) 배양을 통해 얻은 stock을 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하며 사용하였다. CVB3 바이러스 titer는 plaque reduction assay로 결정하였다.</p> <h2>버섯 열수추출 및 에탄올 침전물의 제조</h2> <p>버섯 자실체를 작은 절편으로 절단한 후 분쇄기로 파쇄한 조분쇄물 \( 200 \mathrm{~g} \)에 \( 3 \mathrm{~L} \)의 증류수를 가하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4시간 교반하면서 추출하고 Filter paper(Whatman \#2)로 여과한 여액을 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에서 동결 건조하여 얻어진 건조 분말 상태의 열수추출물을 얻었다. 건조 열수추출물 \( 0.6 \mathrm{~g} \)을 \( 50 \mathrm{~mL} \)의 증류수에 녹인 후 3배 용량의 \( 95 \% \) 에탄올을 가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24 시간 정치시킨 후, 원심분리 \( (8,000 \mathrm{rpm}, 30 \mathrm{~min} \), \( \left.4^{\circ} \mathrm{C}\right) \)하였다. 침전물은 증류수에 녹여 투석(MWCO 14,000) 후 동결 건조하여 건조분말형태(EP)로 보관하여 실험에 사용하였으며 상등액은 감압 농축(Rotary evaporator, Eyela, USA)하여 에탄올을 제거한 뒤 중류수에 녹여 동결 건조하여 건조분말형태 ES로 실험에 사용하였다.</p> <h2>세포독성시험</h2> <p>열수추출물과 에탄올 침전물(EP)의 세포독성을 조사하기 위해, HeLa 세포를 96-well plate에 \( 1.0 \times 10^{5} \) cells/well의 농도로 분주하고 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24 시간 배양하여 세포단층을 얻은 후, 배지를 제거하고 \( 2 \% \mathrm{FBS} \)를 함유한 유지용 배지 (maintenance medium, \( M M \) )를 이용해 다양한 농도의 시료 용액을 제조하여 well당 \( 100 \mu \mathrm{L} \)씩 분주하고 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \), \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양액을 제거하고 MTT assay로 세포독성을 측정하였다. 세포독성은 세포의 성장을 50% 까지 저해하는데 필요한 시료의 농도인 \( 50 \% \) cytotoxic concentration \( \left(\mathrm{CC}_{50}\right) \)로 나타내었다.</p> <h2>CVB3에 대한 항바이러스 시험</h2> <p>항바이러스 활성은 plaque reduction assay로 측정 하였다. 6-Well culture plates에 숙주세포인 HeLa cell의 세포 단층 \( \left(1 \times 10^{5}\right. \) cells/well)이 형성된 후 농도별 \( (0.1,0.5,1 \mathrm{mg} / \mathrm{mL}) \)로 열수추출물, 에탄올 침전 후 얻어진 상등액 시료(ES)와 침전물 시료(EP)를 각각 첨가하고, \( 150 \mathrm{PFU} / \mathrm{well} \)의 \( \mathrm{CVB} \)를 동시에 접종시켰다. \( 5 \% \mathrm{CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 90분간 바이러스를 세포에 흡착시킨 뒤 agar overlay medium(2% FBS, 0.5% agarose 함유된 RPMI 1640)을 세포 단층에 \(3 \mathrm{mL} / \) well로 가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \)에서 48 시간 배양 후 agar overlay medium을 때어내고 5% formalin-PBS로 세포를 고정시킨 후 crystal violet으로 염색하여 plaque의 수를 세었다. 항바이러스 활성은 viral plaque의 수를 50% 감소시키는데 필요한 시료의 농도률 50% effective concentration \( \left(\mathrm{EC}_{50}\right) \)으로 나타냈다.</p> <p>열수추출물의 항바이러스 작용 양식을 조사하기 위한 전배양 시험의 경우는 Katz 등의 방법에 따라, HeLa cell을 6-well plate에 먼저 분주하고 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양하여 세포단층을 얻은 후 배지를 제거하고 농도별 \( (0.1,0.5,1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{mL}) \) 열수추출물과 \( 2 \% \mathrm{FBS} \)를 함유한 RPMI 1640 배지를 well에 넣고 24시간 동안 전배양 하였다. 대조군으로는 배지만을 첨가하였다. 전배양이 끝난 후 시료를 함유한 배지를 제거한 후 잔여 배지를 PBS로 세척하여 완전히 제거한 다음, \( 150 \mathrm{PFU} / \) well의 CVB3 용액을 접종하고 90 분 간 세포에 흡착시킨 후 상기와 같이 배양하고 viral plaque의 수를 비교하였다.</p>