PTGV의 배양과 정량을 위해 ST 세포를 사용하고, PTGV 유전자를 증폭하기 위해 사용한 올리고핵산 primer 염기서열과 TaqMan probe를 디자인하였다. PCR 민감도 실험을 시행하여 annealing 온도와 \( \mathrm{MgCl}_{2} \) 농도에 따라 달라지는지 알아보고, 정량을 위한 표준곡선을 작성하여 TaqMan probe real-time PCR 시험법의 최적조건을 확립하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>PTGV의 배양 및 정량</h2> <p>PTGV (ATCC VR-1740)의 배양과 정량을 위해 ST 세포(ATCC CRL-1746)를 사용하였다. ST 세포를 \( 10 \% \) Fetal Bovine Serum (FBS: Hyclone, USA)을 첨가한 Dulbecco's Minimun Eagle's Medium (DMEM: Hyclone, USA) 배지에 배양하였다. T-150 flask에 배양된 단층세포에 PTGV를 감염시킨 후 주기적으로 세포병변효과(cytopathic effect: CPE 를 관찰하였다. CPE가 명백하게 관찰될 때 동결과 해빙과정을 3회 반복하여 파쇄한 후 \( 2,000 \mathrm{rpm} \)에서 3분간 원심분리하여 상층액을 얻은 후 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) filter로 여과한 다음 소분하여 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 이하에서 보관하였다.</p> <p>PTGV의 정량을 위해 감염성 있는 바이러스의 titer를 \( 50 \% \) tissue culture infectious dose \( \left(\mathrm{TCID}_{50}\right) \)로 나타내었다. PTGV를 \( 2 \% \) FBS을 첨가한 DMEM 배지로 7배수로 희석하여 24 well plate에 배양된 세포에 \( 0.25 \mathrm{ml} \)씩 접종하였다. 음성대조군으로 세포배양배지를 \( 0.25 \mathrm{ml} \)씩 접종하였다. 그 후 \( 35^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 배양하면서 주기적으로 현미경으로 CPE를 관찰하였다.</p> <h2>Primer와 TaqMan probe의 디자인</h2> <p>PTGV 유전자를 증폭하기 위해 사용한 올리고핵산 primer 염기서열은 NCBI data base에 보고된 PTGV complete genome의 ORF 7 (Genbank no.: AJ271965.2)을 기초로 Primer Express \( 3.0 \) software (Applied biosystems)를 이용하여 디자인하였다. TaqMan probe는 primer보다 Tm (melting 온도) 값이 \( 8-10^{\circ} \mathrm{C} \) 정도 높게 디자인하였다. TaqMan probe sequence \( 5^{\prime} \) 말단에는 fluorescent reporter dye인 6-carboxy-fluorescein (FAM)을 3' 말단에는 quencher인 Blak Hole Quencher 1 (BHQ-1)이 오도록 하였다.</p> <h2>TaqMan probe real-time PCR 시험법 최적화</h2> <p>\( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관한 바이러스 배양액을 얼음에서 녹인 후, RNA를 분리하였다. RNA 분리는 NucleoSpin \( { }^{\circledR} \) RNA Virus (MACHEREY-NAGEL, Germany)를 사용하여 제조사에서 제공한 방법에 따라 실시하였다. 바이러스 배양액 \( 150 \mu \mathrm{l} \)로부터 총 \( 50 \mu 1 \) 의 RNA를 용출하였다. 분리한 RNA를 주형으로 TOPscript \( { }^{\mathrm{TM}} \) cDNA Synthesis kit (Enzynomics, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 추출한 PTGV RNA \( 10 \mu \mathrm{l} \)와 specific revers primer (\(10 \mathrm{pmol}) 2 \mu \mathrm{l} \)를 혼합하였다. 혼합물을 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 처리한 후, \( 10 \times \mathrm{TOPscript}^{\mathrm{TM}} \) RT buffer \( 2 \mu \), TOPscript \( { }^{\text {TM }} \) Reverse Transcriptase (200 units/ul) \( 1 \mu \mathrm{l} \), dNTP mixture ( \( 2 \mathrm{mM}) 2 \mu \mathrm{l} \), RNase Inhibitor (40 units/ \( / \mu \) l) \( 0.5 \mu \), RNase-free water \( 2.5 \mu \)를 첨가하여 최종 부피를 \( 20 \mu \mathrm{l} \)로 맞추었다. \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 반응시켜 cDNA를 합성한 후 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 반응시켰다. PTGV의 cDNA를 주형으로 Applied biosystems사 (USA)의 StepOnePlus Real-Time PCR sysyem을 사용하여 real-time PCR을 실행하였다.</p> <p>TaqMan probe real-time PCR 시험법의 최적 조건을 확립하기 위해 annealing 온도와 \( \mathrm{MgCl}_{2} \) 농도에 따른 PCR 민감도 실험을 실시하였다. Real-time PCR 반응액은 TOPreal \( { }^{\mathrm{TM}} \) qPCR \( 2 \times \) PreMIX (TaqMan probe, Enzynomics, Korea) \( 10 \mu \mathrm{l}, 10 \mathrm{pmol} \) forward primer \( 0.5 \mu \mathrm{l}, 10 \mathrm{pmol} \) reverse primer \( 0.5 \mu \mathrm{l}, 10 \mathrm{pmol} \) probe \( 1 \mu \mathrm{l} \), PTGV cDNA \( 2 \mu \mathrm{l} \)에 멸균된 3차 증류수 \( 6 \mu \mathrm{l} \)를 넣어 총 \( 20 \mu \mathrm{l} \)가 되게 하였다. 핵산증폭은 pre-incubation은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분, denaturation은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5초, annealing은 30초(annealing 온도 최적화를 위해 \( 54^{\circ} \mathrm{C}, 56^{\circ} \mathrm{C}, 58^{\circ} \mathrm{C}, 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 real-time PCR 수행)로 하여 45 cycle을 수행하였다. 최적 \( \mathrm{MgCl}_{2} \) 농도를 결정하기 위해 최적화된 annealing 온도 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( \mathrm{MgCl}_{2} \)를 \( 3 \mathrm{mM} \)에서 \( 5 \mathrm{mM} \)까지 변화시켜 첨가해준 PTGV cDNA 농도에 따른 threshold cycle 값을 비교하였다.</p> <p>Titer를 측정하고자 하는 시료들과 함께 titer가 \( 1.10 \times 10^{4} \) \( \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \)인 PTGV를 순차적으로 \( 1.10 \times 10^{1} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \)까지 10배씩 희석한 후 real-time RT-PCR을 수행하여 정량을 위한 표준곡선을 작성하였다. 시료 속에 들어있는 PTGV RNA의 양을 표준곡선에 대입하여 정량하였다. 표준곡선은 PTGV의 농도에 따라 real-time PCR에 의해 검출되는 threshold cycle \( (\mathrm{Ct}) \) 값을 \( \mathrm{TCID}_{50} \) equivalent \( / \mathrm{ml} \) 로 전환하여 작성하였다. Threshold cycle은 PCR cycle이 exponential phase로 들어가는 cycle 수를 나타낸다.</p>