창자파래 시료를 여수시 돌산읍에서 수집 후, 진공동결건조기를 이용하여 건조하고 분쇄한 후, 입자크기를 100 mesh 이하로 맞추고, -40°C에서 보관하여 사용했다. DMPT 추출은 Fig.1에 따른 방법으로 진행했다. 4가지 종류의 실험사료를 제작하여, 원료 100g당 물 40%를 첨가하고, 실험사료 2, 3, 4에는 DMPT를 각각 10mg, 20mg, 30mg을 첨가했다. 실험에 사용한 조피볼락은 전라남도 수산시험연구소에서 생산되었으며, 사육개시 전과 4주, 8주 후에 체장과 체중을 측정했다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>DMPT의 추출</h2><h3>1. 실험재료</h3><p>시료로 사용한 창자파래(Enteromorpha intestinalis)는 전라남도 여수시 돌산읍 인근 연안에서 채취하여 흐르는 수도수로 충분히 세척한 후 진공동결건조기(Dura-Dry&trade; &mu;P, FTS SYSTEM. Inc. Livonia, MI, USA)를 이용하여 수분함량을 \( 2 \% \) 정도 되도록 건조하여 waring blender로 분쇄하고 표준체로 입자크기를 \(100 \mathrm{~mesh}\) 이하로 하여 \( -40^{\circ} \mathrm{C} \) 동결고에 보관하면서 실혐에 사용하였다.</p><h3>2. DMPT 추출물 조제</h3><p>시료로부터 DMPT 추출은 Fig. 1과 같은 방법으로 하였다. 즉 \(100 \mathrm{~mesh}\)이하로 분쇄한 창자파래 분말 \( 5 \mathrm{~g} \)에 물과 acetone (2:1, \( \mathrm{v/v}\))의 혼합 용액을 15배량 첨가하여 soni-cator(Sonics & Materials Inc., Model VC 375, Newtown, CT, USA)를 이용하여 먼저 초음파 처리를 행하였다. 초음파 처리 조건은 5분간 처리 후 정지시간을 20초로 하였으며, 초음파 강도는 \( 200 \mathrm{W/cm^2}\)로 하였다. 초음파 처리된 창자파래로부터 DMPT는 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \)의 멸균기에서 45분간 추출하여 냉각시켰다. 계속하여 원심분리 (\(3,000 \times g\), 30분)시켜 상층액만을 농축하였으며, 여기에 \( 10 \mathrm{~m\ell} \)의 methanol을 가하여 3회 반복 추출한 액을 다시 농축하였다. 농축물은 ether로 세척한 후 다시 냉각된 methanol을 가하여 결정화시키고 methanol을 제거한 것을 DMPT의 추출물로 하였다.</p><h3>3. DMPT 정량</h3><p>먼저 \( 10 \mathrm{~m\ell} \) vial에 DMS(東京化成, M0431. \( 99 \% \))를 \(10~200 \mathrm{~\mu \ell} \)를 넣고 gas tight syringe를 이용하여 시료병내의 headspace gas를 gas chromatography(GC, Shimadzu GC-17A, Tokyo, Japan)에 주입하여 DMS농도에 대한 피크 면적과의 관계식을 구하였다. 그리고 다시 \( 10 \mathrm{~m \ell} \) 시료병에 DMPT 표준품(恵京化成, C1240. Lot FIE01)을 농도별로 넣고 포화 \( \mathrm{NaOH} \)용액 \( 5 \mathrm{~m\ell} \)를 첨가하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 가온시켜 발생한 headspace gas를 gas tight syringe로 GC에 주입하여 분석하였다. 이때 DMPT가 알칼리 조건하에서 분해되어 발생한 DMS를 retention time으로 확인하였으며, 발생한 DMS의 양은 DMS농도에 대한 피그 면적과의 관계식을 이용하여 검량선을 구하고, 이것에 2.1을 곱하여 DMPT 양으로 산출하였다. 이때의 GC 분석조건은 Table 1 과 같다. 또한 시료로부터 추출하여 결정화시킨 crude DMPT의 정량도 이와 같은 방법을 이용하여 추출물 일정량을 vial에 넣고 포화 \( \mathrm{NaOH} \)용액을 첨가하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 가온시켜 발생한 DMS 양을 GC로 측정하여 검량선으로 부터 DMPT 함랑을 측정하였다.</p><h2>실험사료 제조</h2><p>실험사료 1은 단백질원으로서 어분을, 지질원으로는 오징어간유를, 탄수화물원으로는 덱스트린을 사용하여 Table 1에 나타낸 조성에 따라 원로들을 잘 혼합한 후 원료 \( 100 \mathrm{~g} \) 당 물 \( 40 \% \)를 첨가하여 제조하였고(대조구), 실험사료 2,3 및 4는 대조구에 DMPT를 각각 \( 10 \mathrm{~mg}\), \(20 \mathrm{~mg} \) 및 \( 30 \mathrm{~mg} \)을 각각 첨가하여 제조하였으며, 제조된 실험 사료는 \( -30^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하면서 사용하였다. 제조된 총 5가지 실험 사료의 조단백질 함량은 \( 50.7 \% \), 조지방은 \( 6.6 \% \) 및 조회분은 \( 13.2 \% \) 였다.</p><h2>실험어 및 사육관리</h2><p>실험에 사용한 조피볼락은 전라남도 수산시험연구소 종묘배양장에서 생산된 것을 시판배합사료로 4주간 예비사육을 시킨 다음, 사육 실험전 실험사료의 적응을 위해 2주간 실험사료를 공급하였다. 실험사료의 적응이 끝난 후 사육 실험을 위해 전일 절식시킨 후 어체를 측정하고 \( 100 \mathrm{~\ell} \) 수조에 30마리씩 2반복으로 5개 수조에 수용하여 8주간 사육 실험을 하였다.</p><p>실험어는 평균체중 \( 6.0 \mathrm{~g} \) 내외로 먹이는 1일 2회(오전 9시, 오후 5시)에 만복에 가깝게 공급하였고, 사육수는 여과 해수를 사용하여 유수량은 \( 5 \mathrm{~\ell/min} \)로 조절하였으며 적절한 산소 공급을 위해 각 실험수조에 에어스톤을 설치하였다. 사육기간 중의 수온은 \( 19.5^{\circ} \mathrm{C}\) ~ \( 24.5^{\circ} \mathrm{C}\)였으며, 비중은 1.022 ~ 1.024범위였다.</p><p>어체 성분분석에 사용한 실험어 선정은 먼저 사육 개시 시점에 무작위로 30마리를 추출하여 사용하였고, 그리고 사육 개시 4주후 및 8주후에는 각 실험구별로 10마리씩 무작위로 추출하여 사용하였으며, 분석과정 중 모든 시료는 냉동 보관 (\(-30^{\circ} \mathrm{C}\))하였다.</p><h2>실험어 성장 측정</h2><p>실험어의 체장과 체중은 사육개시전과 사육 4주 및 8주 후에 미리 24시간 절식시킨 후 무작위적으로 10마리를 취하여 MS-222 \( 100 \mathrm{ppm} \)으로 마취시켜 스트레스를 최소화하여 측정하였다.</p><h2>일반성분의 분석</h2><p>실험어체의 일반 성분은 상법에 따라 수분은 상압가열건조법, 단백질은 semi-micro Kjeldahl법, 지방은 Soxhlet법, 회분은 건식회화법으로 분석하였다.</p><h2>구성 아미노산 분석</h2><p>시료 \( 0.5 \mathrm{~g} \)을 취하여 유리 ampoule에 넣고 \( 6 \mathrm{N} \) \( \mathrm{HCl}\) \(3 \mathrm{~m\ell}\)를 가하여 질소가스로 충진한 뒤 \( 110^{\circ} \mathrm{C} \)의 sand bath에서 24시간 가수분해하였다. 분해액을 glass filter로 여과하고 감압 건조하여 \( \mathrm{HCl} \)을 완전히 제거한 다음 증류수 \( 10 \mathrm{~m\ell} \)를 가하여 다시 감압 건조하였다. 이어서 \( \mathrm{pH} \) 2.2의 구연산 완충액으로 \( 100 \mathrm{~m\ell} \)로 정용한 다음 아미노산 자동분석기(Bio-chrom 20, Pharmacia Inc., Cambridge, England)로 분석하였다.</p><h2>지방산 분석</h2><p>지방산 분석을 위하여 Bligh & Dyer법에 따라 총지질을 추출하여 혼합지방산을 제조하였고, \( 3 \%\) \(\mathrm{{BF}_{3}/methanol}\)로써 지방산 methylester로 조제하여 GC(Shimadzu GC-17A, Tokyo, Japan)로 분석하였으며, 분석조건으로는 ca-pillary column(\(0.25 \mathrm{~\mu m}\) DB-wax fused silica, \( 0.32 \mathrm{~mn}\) I.D., \( 30 \mathrm{~m}\))을 사용하여 \( 180^{\circ} \mathrm{C} \)로 승온한 후 8분간 유지한 다음 \( 3^{\circ} \mathrm{C/min} \) 속도로 \( 230^{\circ} \mathrm{C} \)까지 승온하였고, 이동상은 \( \mathrm{He} \)을 1 \( \mathrm{m\ell/min} \)로 흘렸으며 FID detector를 사용하였다. 그리고 각 지방산 정량을 위하여 외부표준품으로 14:0, 16:0, 18:0, 20:0, 22:0, 24:0, 14:1, 16:1n-7, 18:1n-7, 18:1n-9, 20:1n-9, 22:1n-9, 18:2n-6, 20:2n-6, 18:3n-3, 20:3n-6, 20:3n-3, 18:4n-3, 20:4n-6, 20:4n-3, 22:4n-6, 20:5n-3, 22:5n-6, 22:5n-3 및 22:6n-3(순도 \(99\%\) 이상, Sigma, St. Louis, USA)을 사용하였고, 정량은 data system CLASS-GC10(Shimadzu Sei-sakusha Co. Ltd. Tokyo, Japan)을 이용하여 시료 건조물에 대한 각 지방산의 \( \mathrm{mg}\)/\(100 \mathrm{g} \)으로 나타내었다.</p><h2>통계처리</h2><p>모든 실험결과는 SPSS professional statistics Ver. 7.5(SPSS Inc.)를 사용하여 분산분석(ANOVA test)을 수행하였으며, 각 평균간의 유의성 검정은 Duncan's multiple range test로 \( p<0.05\) 수준에서 행하였다.</p>