Psudomonas sp. G314 균주로부터 추출한 시료를 원심분리하여 균체를 제거한 후, Surface Tensiometer를 사용하여 25℃에서 표면장력을 측정하였다. 이를 통해 선별 균주가 생산하는 생물학적 계면활성제를 대량 확보할 수 있는지를 확인하기 위해 5 l 발효기에 2 l의 배지를 첨가하여 배양하였다. 배양 후 30℃에서 진탕 배양한 결과, 부분 정제된 생물 계면활성제를 얻어 냉장 보관하였으며, 이는 다음 실험에 사용되었다.
<h2>표면장력 측정</h2> <p>LB 영양배지에서 \( \mathrm { OD } _ { 600 } = 1.0 \) 까지 전 배양한 균주 5 \( \mathrm { ml } \) 을 500 \( \mathrm { ml } \)LB 배지에 접종한 후 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 200 \mathrm { rpm } \) 으로 진탕 배양하며 배양시간에 따라 시료를 일정량 채취하였다. 채취한 시료는 원심분리기(supra22K, Hanil Science, Korea)로 원심분리 \( (13,000 \times g, 10 \) 분)하여 균체를 제거한 후, Surface Tensiometer (CBVP-A3, FACE, Japan)를 사용하여 plate 방법으로 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 3회 반복하여 표면장력을 측정하였다.</p> <h2>자동 발효기를 이용한 계면활성제 생산</h2> <p>선별 균주가 생산하는 생물학적 계면활성제를 추후 대량으로 확보할 수 있는지를 확인하기 위한 예비실험으로 5 l 의 발효기 \( ( \mathrm { KF } -5 \mathrm { ~L } \), 한국발효기, Korea)에 2 1의 배지를 첨가하여 배양하였다. 이때 배지는 LB broth를 이용하였으며 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } , 400 \) \( \mathrm { rpm } , 1: 1 \mathrm { vVm } (2 \mathrm { NV } / \mathrm { min } ) \)의 조건에서 실험하였다.</p> <h2>생물 계면활성제 정제</h2> <p>Psudomonas sp. G314의 전 배양 용액을 11 영양배지에 접종하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 진탕 배양한 후 Fig. 1 에 표기한 순서에 따라 정제하였다. 배양 용액은 원심분리(13,000× \( g \), 10 분)를 통하여 균체를 제거한 상등액에 \( 1 \mathrm { ~N } \mathrm { HCl } \) 용액을 서서히 가하면서 \( \mathrm { pH } \) 2.0이 되도록 조정하였다. \( \mathrm { pH } \) 를 조정한 상등액을 동량의 chloroform:methanol (2:1)을 가하여 저어주면서 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 하룻밤 방치하여 추출하였다. 그 후 분액깔대기를 통하여 유기 용매층 만을 회수하여 Rotary Vacuum Evaporator (N-N series, Eyela, Japan)로 농축하고, 이를 \( 0.2 \) \( \mathrm { M } \) phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } \) 7.0)에 용해시킨 후 동결건조기 (Freezone 4.5, Labconco, USA)를 이용하여 분말 상태로 만들었다. 이와 같이 부분 정제된 생물 계면활성제는 냉장 보관하며 다음 실험에 사용하였다.</p>