유산균 시료 투여 시작 전날의 생쥐 분변시료에서는 다수의 작은 T-RF peak와 5개 정도의 주요 T-RF peak가 검출되었고, 5마리 생쥐 모두의 분변에서 같은 T-RFLP profile이 관찰되어 동일한 사료를 섭취하면서 동일한 환경에서 성장한 개체들의 장내 세균상은 큰 차이가 없음을 예상할 수 있지만 database 상에 다수가 존재하는 bacteria에 대한 정보가 없는 상태에서 각 T-RF에 해당하는 OTU를 결정하기에는 한계가 있다. 배양 비의존적 미생물 군집분석법의 하나인 T-RFLP 분석과 실험동물을 이용한 생균제의 장관 정착 평가를 시도한 결과, 생쥐의 장관에 L. plantarum KK3 균주가 정착되었음을 확인되었다.
<p>L. plantarum KK3 유산균 시료 투여 시작 하루 전의 생쥐 분변시료에서는 다수의 작은 T-RF peak와 5개 정도의 주요 T-RF peak가 검출되었다(Fig. 2). \(62, 243, 265, 323, 331 \mathrm { bp } \) 의 크기를 가지고 있는 5개 주요 T-RF peak는 실험에 사용한 5마리 생쥐 모두의 분변으로부터 검출되었고, 개체들 간의 T-RFLP profile은 큰 차이를 나타내지 않은 것으로 보아 동일한 사료를 섭취하면서 동일한 환경에서 성장한 개체들의 장내 세균상은 큰 차이가 없는 것으로 예상된다. 주요 T-RF의 크기에 해당하는 bacteria는 database 상에 다수가 존재하고, T-RFLP 분석의 결과로 나타나는 T-RF의 실험치가 예상치와 약간의 차이가 발생하기 때문에 생쥐의 분변에 존재하는 미생물상에 대한 정보가 없는 상태에서 각 T-RF에 해당하는 OTU를 결정하기에는 한계를 가지고 있다 (Fig. 2).</p><p>생쥐 투여를 위해 L. plantarum KK3 배양액을 냉동건조 한 다음, MRS agar를 이용하여 생균수를 측정한 결과 \( 4.4 \times 10 ^ { 9 } \mathrm { CFU } / \mathrm { g } \) 수준으로 나타났고, 냉동건조한 생균제의 섭취 과정에서 발생할 수 있는 손실의 감소를 위하여 탈지분유를 생균제 무게 대비 4배 첨가한 혼합분말을 \( 1 \mathrm { ~g } / \mathrm { day } \) 투여하였다. 투여를 시작하여 3일차 분변을 분석한 결과, 대부분의 주요 T-RF는 줄어들거나 사라지고 L. plantarum의 T-RF 이론치에 해당하는 \( 327 \mathrm { bp } \) 크기의 T-RF peak가 검출되었다. 6일차 분변에서는 \( L \). plantarum peak 대비 거의 대부분 peak의 높이가 상대적으로 감소한 것을 확인하였다. 7일차의 투여를 끝으로 이틀이 지난 9일차의 분변시료로부터는 줄어들었던 peak의 높이가 증가하였고, 시간의 경과에 따라 투여 시작 전의 분변에서 검출되었던 1,5번 peak가 상대적으로 높아지는 양상을 나타내었다. 유산균 시료의 투여 중지 이후, 분변에 존재하는 L. plantarum의 비중이 계속적으로 감소하였지만 중지 후 24일까지도 유지되고 있음을 확인 하였고, 이러한 현상은 실험개체들 간에 큰 차이를 나타내지 않았다(Fig. 2).</p><h2>L. plantarum KK3 균주의 장관 정착 및 T-RFLP 분석법의 유용성</h2> <p>투여 전의 분변에서 검출된 \( 323,331 \mathrm { bp } \) 크기의 4, 5번 TRF는 L. plantarum의 T-RF와 거의 같은 위치에서 검출되고 있어, 투여 전 생쥐 분변의 L. plantarum 존재 가능성을 배제할 수 없다(Fig. 2). 따라서 투여 전 분변시료를 멸균식염수로 희석하여 cinnamoyl esterase 활성 보유 유산균 선발을 위한 배지에 도말한 결과, 활성 보유 bacteria의 존재가 확인되지 않아, 4, 5 번 T-RF는 L. plantarum과 무관한 것으로 추정된다. 31일간 진행한 모니터링에서 L. plantarum T-RF 의 지속적 검출을 확인하였지만, 배양 비의존적 방법을 통한 미생물 군집 분석에서는 생균과 사균의 DNA가 동시에 증폭되기 때문에 분변에서 검출되는 L. plantarum의 생존 여부를 확인할 수 없다. 따라서 31일차 분변으로부터 cinnamoyl esterase 활성 보유 유산균 검출을 시도한 결과, 다수의 활성 보유 colony를 확인할 수 있었고, 이들 분리균주의 \( 16 \mathrm { ~S } \) rDNA 염기서열 분석 결과, L. plantarum으로 확인되었다 (data not shown). 분변에서 분리된 L. plantarum이 투여한 생균제와 동일하다는 유전적 근거를 제시하지는 못하였지만, 투여 전 분변시료로부터 검출되지 않았던 cinnamoyl esterase 활성 보유 bacteria가 투여 후에는 검출되었고, 이들이 L. plantarum으로 동정되었다는 점에서 동일 균주가 분변에서 검출되었을 가능성은 매우 높다. 또한 동물의 대장은 계속적으로 미생물이 증식할 수 있는 환경을 제공하면서 배설을 계속하고 있다는 점을 고려하면 T-RFLP 분석으로 검출된 L. plantarum의 peak는 실험동물의 장내에 존재하는 L. plantarum의 역동성을 반영하고 있는 것으로 사료된다. 따라서 L. plantarum KK3는 투여 중지 후, 생쥐의 장관에서 24일 이상 정착 가능한 것으로 추정된다.</p><p>T-RFLP 분석법을 이용한 생쥐 분변의 L. plantarum 검출 결과, 본 실험에서 사용한 primer 및 실험 조건이 생균제로 투여한 L. plantarum의 검출에 유용한 것으로 나타났다. 분변의 16S rDNA 증폭과정에서 동일량의 DNA를 사용하였 다는 점을 제외하고는 정량성을 주장할 근거를 갖추고 있지 못하지만, T-RFLP profile 중 L. plantarum peak의 상대적 비중을 고려한다면, 생균제 투여 효과 확인은 가능한 것으로 판단된다.</p><h1>요약</h1> <p>배양 비의존적 미생물 군집분석법의 하나로 활발하게 이용되고 있는 T-RFLP (terminal restriction fragment length polymorphism) 분석과 실험동물을 이용한 생균제의 장관 정착 평가를 시도해 보았다. 장관 정착 평가를 위한 생균제는 cinnamoyl esterase 활성 보유 유산균을 발효 침채류로부터 분리하였고, 16S ribosomal RNA 유전자 염기서열 분석을 통해 동정하였다. 분리 균주 중, cinnamoyl esterase에 의한 chlorogenic acid 분해활성이 높고, 내산성 및 담즙산 내성의 평가 결과가 우수한 Lactobacillus plantarum KK3 균주를 생균제로 선정하였다. 배양 후, 냉동건조하여 제조한 생균제를 생쥐에게 투여한 다음, T-RFLP 분석을 이용하여 생쥐 분변의 미생물상을 모니터링하였다. 생균제 투여에 따라 검출 되기 시작한 L. plantarum의 T-RF가 투여 중지 후 24일까지 지속됨을 확인하여 T-RFLP 분석법이 생균제로 사용한 L. plantarum의 장관 정착 평가에 유용한 것으로 나타났다. 생균제 투여 전 생쥐의 분변에서 검출되지 않았던 cinnamoyl esterase 활성 보유 L. plantarum이 투여 중지 후 24일차 분변에서 배양법으로 검출되어 L. plantarum KK3 균주의 생쥐 장관 정착이 확인되었다.</p>