선발 미생물을 배양하고 원심분리, 용해, 투석 작업을 거쳐 정제하였으며 향균활성이 존재하는 분획만 취합하여 동결견조하였다. Lowry 방법을 변형하여 향균물질 단백질 함량을 측정해 흡광도를 측정하였고 bovine serum albumin의 표준 곡선으로 나타내었다. 향균물질의 분자량을 측정하기 위해 Tricine-sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis를 수행하여 투명환의 유무를 확인하였다.
<h2>항균물질의 분리 및 정제</h2><p>선발 미생물을 glucose minimal medium \( 500 \mathrm{ml} \) 에 \(1\% (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 접종하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일 동안 배양하였다. 선발 미생물의 배양 상등액에 황산암모늄을 \( 80 \% \)의 포화도까지 첨가하고, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간동안 방치한 후 원심분리 \( (20,000 \times \mathrm{g} \), \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), 30분)하여 얻은 침전물을 \( 10 \mathrm{mM} \) Tris \( \cdot \mathrm{HCl} \) 완충용액 \( (\mathrm{pH} 8.0)\) 에 용해시켰다. 그리고 투석막(MWCO \(6-8 \mathrm{kDa}\) cut-off, Spectrum Laboratories, Inc.)으로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 동안 투석을 한 후 DEAE-sepharose fast flow (Pharmacia, Biotech. AB Uppsala, Sweden) column \( (25 \times 400 \mathrm{mm}) \)과 Sephacryl S-200HR (Pharmacia) column \( (15 \times 960 \mathrm{mm}) \)을 이용하여 정제하였다. 각 분획의 단백질 함량은 \( 280 \mathrm{nm} \)로 측정하였고, 각각 항균활성을 측정하여 활성이 존재하는 분획만 취합하여 동결건조하였다. 모든 정제과정은 단백질성 항균물질의 변성을 최소화하기 위해서 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 수행하였다.</p><h2>단백질 함량 측정</h2><p>항균물질 단백질 정량은 Lowry 방법을 변형하여 실시하였다. 항균물질 시료 \(50 \mu \mathrm{l}\)에 biuret reagent \( (0.75 \mathrm{mmol} / \mathrm{h} \) cupric sulfate, \( 94 \mathrm{mmol} / \mathrm{l} \) sodium hydroxide) \( 550 \mu \mathrm{l} \)를 혼합하고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시킨 후, Folin and Ciocalteu's phenol reagent (Sigma Co., St. Louis, MO, USA) \( 25 \mu \mathrm{l} \)를 넣고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분 동안 반응시켰다. 그리고 spectro-photometer로 \( 725 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하여 나타내었고, 표준곡선은 bovine serum albumin (BSA; Sigma Co.)를 사용하였다.</p><h2>항균물질 분자량 측정</h2><p>항균물질의 분자량을 측정하기 위해 Tricine-sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (Tricine-SDS-PAGE)를 수행하였다. \( 20 \% \) polyacrylamide gel를 사용하여 \( 100 \mathrm{V} \)로 5시간 동안 전기영동 한 후 silver staining kit (Amersham Biosciences AB Inc., Sweden)로 염색했다. 분자량 marker는 ultra-low range molecular weight marker (\(1,060-26,600 \mathrm{Da}\), Sigma)을 사용했다. Tricine SDS-PAGE를 수행한 후 밴드가 항균물질인지 확인하기 위해 direct detection을 하였다. Tricine SDS-PAGE한 polyacrylamide gel을 \( 25 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) isopropanol과 \( 10 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) glacial acetic acid의 혼합물에 2시간동안 고정을 하고 멸균 증류수로 6시간동안 wash 한 후 B. cereus KCCM 12667 가 중층된 배지에 올리고 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 6시간 배양하여 투명환의 유무를 확인하였다.</p>