MDCK 세포주를 MEM에 Penicillin/Streptomycin, Vitamin Solution, Glucose Solution, Trypsin이 첨가된 바이러스 분리용 배지로 배양했다. 바이러스의 배양을 위해 인플루엔자 환자로부터 받은 면봉을 바이러스수송용 배지에 담아 원심 분리한 후, 배양용기에 MDCK 세포를 24시간 배양했다. 10일간 배양하여 매일 현미경으로 세포병변효과를 관찰하고, CPE가 나타난 세포 배양액에서 바이러스 유전자 확인 검사를 실시하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포주 및 배양</h2> <p>Mardin-Darby canine kidney (MDCK) 세포주는 질병관리본부 국립보건연구원 인플루엔자바이러스팀에서 분양받아 사용했고 세포배양용 배지는 penicillin ( \( 0.05 \) units \( / \mathrm { ml } ) / \mathrm { strep } - \) tomycin \( (0.05 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 과 \( 10 \% \) FBS가 첨가된 Minimum essential medium (MEM) (Invitrogen, USA) 사용하였으며 바이러스 분리용 배지는 MEM에 Vitamin Solution (INVITROGEN, USA), Glucose Solution (SIGMA, UK), Trypsin (SIGMA, UK), Penicillin/Streptomycin (SIGMA, UK)을 첨가하여 사용하였다. 세포배양은 \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } , 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 조정된 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에서 배양되었다.</p> <h2>검체처리 및 바이러스 배양</h2> <p>부산시내 10개 병원에 내원한 인플루엔자 의사환자에게서 인후도찰 또는 비인후도찰한 면봉을 바이러스수송용배지에 담아 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 를 유지하여 실험실로 수송하였다. 바이러스수송용 배지 \( 1 \mathrm { ml } \) 에 penicillin (5 units/ml)/streptomycin \( (5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 및 nystatin \( (1,000 \) units \( / \mathrm { ml } ) \) 을 첨가하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1시간 방치 한 후, \( 990 \times g \) 로 20분간 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 원심 분리하여 상층액을 접종액으로 사용하였다. 바이러스의 배양을 위해 24-well 배양용</p> <p>기에 MDCK세포를 24시간 배양했다. 이렇게 준비된 well에 바이러스 분리용 배지 \( 0.5 \mathrm { ml } \) 를 넣은 후 전처리된 가검물 \( 0.2 \) \( \mathrm { ml } \) 씩 접종하고 \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } , 34 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 wh정된 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에서 10일간 배양하면서 매일 현미경하에서 세포병변효과(cytopathic effect, CPE)를 관찰하였다. CPE가 나타난 세포 배양액에서 바이러스 유전자 확인 검사를 실시하였다.</p>