Park과 Kim의 방법을 변형하여 Tyrosinase 저해 활성을 실험하였하였더니 \(\mathrm{Inhibitory~activity}\) \( (\%)= \) \( [1- \) \(\mathrm{(sample~absorbance / control~absorbance)}\) \( ] \times 100 \)와 같이 나타났고, Wunsch과 Heindrich의 방법에 따라Collagenase 저해활성을 측정하였더니 \(\mathrm{Inhibitory~activity}\) \( (\%)= \) \( [1- \) \(\mathrm{(sample~absorbance~/~control absorbance}\) \( )] \times 100 \)와 같이 나타났다.
<h2>금속봉쇄력</h2> <p>금속봉쇄력은 Shimada 등의 방법을 따라 측정하였다. \( 0.74 \mathrm{ml} \)의 증류수에 시료 \( 0.2 \mathrm{ml} \)를 가하고 \( 2 \mathrm{mM} \)의 iron(Ⅱ) chloride 용액 \( 20 \mu \mathrm{L}\)와 \( 5 \mathrm{mM} \)의 ferrozine 용액 \( 40 \mu \mathrm{L} \)를 첨가하여 실온에서 20분간 반응시킨 후 UV/VIS~spectrophotometer로 \( 562 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 시료 대신 용매를 가하여 같은 방법으로 측정하였고, 시료 자체의 색을 측정하기 위해 공시험은 \( 2 \mathrm{mM} \)의 iron(Ⅱ)~chloride 용액과 \( 5 \mathrm{mM} \)의 ferrozine 용액 대신 증류수를 가하여 측정하였다.</p> <h2>Tyrosinase 활성 억제</h2> <p>Tyrosinase 저해 활성은 Park과 Kim의 방법을 변형하여 실험하였다. 96 well plate에 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer (\( \mathrm{pH} 6.5\))를 분주한 후 시료 \( 10 \mu \mathrm{L}\)씩 넣는다. 그 후 potassium phosphate buffer (\( \mathrm{pH} 6.5\))에 녹인 \( 1500 \mathrm{unit} / \mathrm{mL} \)의 mushroom tyrosinase를 \( 10 \mu \mathrm{L}\)씩 넣어 준 후 \( 4 \mathrm{mM} \)의 L-tyrosine을 \( 20 \mu \mathrm{L} \)씩 넣은 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 반응시켰다. 그 후 얼음에서 5분간 방치하여 반응 중지 후 \( 490 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. Tyrosinase 활성 억제에는 다음과 같이 나타냈다.</p> <p>\(\mathrm{Inhibitory~activity}\) \( (\%)= \) \( [1- \) \(\mathrm{(sample~absorbance / control~absorbance)}\) \( ] \times 100 \)</p> <h2>Collagenase 활성 억제</h2> <p>Collagenase 저해활성 측정은 Wunsch과 Heindrich의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris-HCl buffer\( \left(\mathrm{pH}\right.\) \(7.5)\)에 \( 4 \mathrm{mM} ~\mathrm{CaCl} 2_{2} \)를 첨가한 4-phenylazobenzyl-oxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg\( (0.3 \mathrm{mg} / \mathrm{mL}) \)를 녹인 기질액 \( 0.25 \mathrm{mL} \) 및 시료용액 \( 0.1 \mathrm{mL} \)의 혼합액에 collagenase\( (0.2 \mathrm{mg} / \mathrm{mL})~ 0.15 \mathrm{mL} \)를 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 \( 6 \% \) citric acid \( 0.5 \mathrm{mL} \)을 넣어 반응을 정지시킨 후, ethyl acetate \( 1.5 \mathrm{mL} \)을 첨가하여 \( 320 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. Collagenase 저해활성은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <p>\(\mathrm{Inhibitory~activity}\) \( (\%)= \) \( [1- \) \(\mathrm{(sample~absorbance~/~control absorbance}\) \( )] \times 100 \)</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험에 대한 통계 처리는 SAS program(Statistical analytical system V 8.2, SAS Institue Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 one way ANOVA법으로 실시하였으며, 조사 항목들 간의 유의성 검정은 Duncan의 다중검정법으로 \( p<0.05 \) 수준에서 실시하였다.</p>