혈액응고 저해활성은 Thrombin time(TT), Prothrombin time(PT), 그리고 activated partial thromboplastin time(aPTT) 측정을 통해 평가하였다. Thrombin 저해 활성과 aPTT 연장 활성은 각각 3회 반복 측정 후의 평균치를 DMSO의 평균치와 비교하였다. 그리고 이 과정에서 \(65 \mu \mathrm{l}\)의 \( \mathrm{CaCl}_{2}\) \((35 \mathrm{mM})\)를 첨가하여 혈장이 응고되는 시간을 측정하였다.
<h2>혈액응고 저해활성</h2> <p>혈액응고 저해활성은 시료의 thrombin time (TT), prothrombin time (PT) 및 activated partial thromboplastin time (aPTT)을 측정하여 평가하였다. 혈액 응고에서 중추적 역할을 수행하는 thrombin의 활성을 평가하는 TT는 \( 37^{ \circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 0.5 \mathrm {U} \) thrombin (Sigma, MO, USA) \( 50 \mathrm{\mu l}\)와 \( 20 \mathrm {mM} ~\mathrm{CaCl}_{2} \) \( 50 \mu \mathrm{l} \), 다양한 농도의 시료 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 를 Amelungcoagulometer KC-1A (Amelung. Lemgo, Germany)의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 표준혈장(MD Pacific Technology, China) \( 100 \mathrm { \mu l}\)를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였으며, 시료 대조군으로는 아스피린(Sigma, MO, USA)을, 용매 대조군으로는 DMSO를 사용하였다. Thrombin 저해 활성은 3회 이상 반복한 시료 TT 실험의 평균치를 용매 대조구인 DMSO 의 TT 평균치의 비로 나타내었다. 한편 PT는 외인성 응고계(Ⅱ,Ⅴ,Ⅶ, 및 Ⅹ 인자)의 응고 활성을 종합적으로 측정하는 방법으로, 혈장 \( 70 \mu \mathrm {l} \)와 다양한 농도의 시료 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 를 coagulometer의 튜브에 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm {C} \) 에서 3분간 가온 후, \( 130 \mu \mathrm {l} \) 의 PT reagent (MD Pacific Technology, China)를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, prothrombin 저해 활성은 3회 이상 반복한 시료 PT 실험의 평균치를 DMSO의 PT 평균치의 비로 나타내었다. 내인성 경로에 의한 혈액응고활성을 평가하는 aPTT 측정의 경우에는, 표준혈장 \( 70 \mu \mathrm {l} \) 와 다양한 농도의 시료 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 를 coagulometer 튜브에 첨가하여 \( 37^{ \circ} \mathrm {C} \) 에서 3분간 가온 후, \( 65 \mu \mathrm {l} \) 의 aPTT reagent (MD Pacific Technology, China)를 첨가하고 다시 \( 37^{ \circ} \mathrm {C} \) 에서 3분간 반응하였다. 이후 \( 65 \mu \mathrm {l} \) \( \mathrm {CaCl}_{2} \) \( (35 \mathrm {mM}) \)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, \( \mathrm {aPTT} \) 연장 활성은 3회 이상 반복한 시료 aPTT 실험의 평균치를 DMSO의 aPTT 평균치의 비로 나타내었다.</p>