pmGL3-PRC1는 pGL3-Basic에 PRC1 프로모터의 일부분을 삽입하고, 아데노부속바이러스 벡터 pAAV-PRC1-GFP는 pAAV-CMV-GFP의 CMV를 동일한 PRC1 프로모터 부분으로 대체, 삽입하여 제작하였다. 생체이미징을 하기 위한 벡터, pAAV-PRC1-luciferase는 pAAV-PRC1-GFP plas-mid 벡터의 GFP cDNA를 luciferase cDNA로 대체하여 제작하였다. 형질전환한 세포는 2일간 배양한 후에 dual lucifer-ase assay kit로 측정하였다. Ad-CMV-GFP, Ad-PRC1-GFP는 이미 보고된 방법에 따라 생산 및 분리하여 flow cytometry로 측정하였다. Xenograft mouse 모델에서의 PRC1 활성은 IVIS 시스템이 LivingImage \( { }^{\text{TM}} \) 프로그램을 포함된 것을 활용하여 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>플라스미드 제작</h2> <p>pmGL3-PRC1는 PRC1 프로모터(Genebank accession number AC068831의 85000-83254)의 일부분을 pGL3-Basic(Promega, Madison, WI)에 삽입하여, 아데노부속바이러스 벡터 pAAV-PRC1-GFP는 pAAV-CMV-GFP의 CMV를 동일한 PRC1 프로모터 부분으로 대체, 삽입하여 제작하였다. 같은 방법으로 survivin (BIRC5) 프로모터(Genebank accession number U75285의 844-2813)로 pmGL3-BIRC5, pAAV-BIRC5-GFP를 제작하였다. 아데노바이러스 벡터를 제작하기 위해서는, pAAV-PRC1-GFP에서 PRC1 프로모터-GFP-SV40 polyadenylation 부분을 포함한 DNA 조각을 아데노바이러스 벡터인 pShuttle 벡터(Quantum Biotechnologies, Carlsbad, CA)에 삽입하여 Ad-PRC1-GFP를 완성하였다. Ad-CMV-GFP는 이미 보고된 벡터를 사용하였다. 생체이미징을 하기 위한 벡터, pAAV-PRC1-luciferase는 pAAV-PRC1-GFP plas-mid 벡터의 GFP cDNA를 luciferase cDNA로 대체하여 제작하였다.</p> <h2>세포주 배양, 형질전환, 루시퍼라제 assay</h2> <p>인간 유래 정상 폐세포주인 MRC-5 (ATCC, CCL-171)와 폐암세포주인 A549 (ATCC, CCL-185)는 \( 10\% \) fetal bovine serum, penicillin \( (100 \mathrm{~U} / \mathrm{ml}) \) 및 streptomycin \( (100 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 배양하였다.</p> <p>MRC5, A549의 세포주를 \( 5 \times 10^{4} \) cells/ well의 조건으로 각각 24 well plate에서 배양하였다. 하루 뒤에 명기한 플라스미드 \( 350 \mathrm{~ng} \)을 각 well에 lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 형질전환하였다. 이 때, 각 시료의 형질전환 효율을 보정하기 위하여 pRL-TK (Promega, Madsion, WI) \( 50 \mathrm{~ng} \)을 동시에 사용하였다. 형질전환한 세포는 2일간 배양한 후 발현된 Luciferase 활성을 dual lucifer-ase assay kit (Promega)로 측정하였다.</p> <h2>AAV, AV 제작 및 그 프로모터 활성 측정</h2> <p>각 재조합 아데노부속 바이러스(recombinant Adeno-asso-ciated virus, rAAV) 벡터를 생산하기 위해서 GFP cDNA 혹은 luciferase cDNA를 함유하고 있는 pAAV plasmid DNA, AAV serotype 2 (AAV2)rep-cap plasmid DNA, adenoviral helper plasmid DNA의 세 가지 plasmid DNA를 1:1:1 분자 수 비율로 HEK293 세포를 이용하여 calcium-phosphate pre-cipitation 방법으로 triple co-transfection 하여 rAAV를 생산하여 정량하였다. 준비된 rAAV-PRC1의 활성을 측정하기 위하여, 12-well plate에 well당 \( 1 \times 10^{4} \) 개의 세포를 배양한 폐암세포주인 A549와 정상 폐세포주인 MRC-5에 각 rAAV 벡터를 200,000 multiplicity of infection (MOI)로 72시간 동안 처리하였다. rAAV에 감염된 세포에서의 GFP발현은 형광현미경(CKX41, OLYMPUS, Tokyo, Japan) 과 flow cytometry (FACS Calibur, Becton Dickinson, CA)를 이용하여 분석하였다.</p> <p>Ad-CMV-GFP, Ad-PRC1-GFP는 이미 보고된 방법을 따라 생산, 분리하여 6 well 당 \( 4 \times 10^{5}, 1 \times 10^{6} \) 개의 세포를 각각 배양한 A549와 MRC-5에 MOI 100으로 감염시켜 2일 배양 후 그 GFP 활성을 flow cytometry (BD FACSCaliburTM system, BD)로 측정하였다.</p> <h2>Xenograft mouse 모델에서의 in vivo 프로모터 활성 측정</h2> <p>Xenograft mouse 모델에서의 PRC1, CMV 프로모터의 생체내 활성은 LivingImage \( { }^{\text{TM}} \) 프로그램을 포함한 IVIS 시스템(Xenogen Corp., CA)을 이용하여 측정하였다. A549 폐암 세포주를 이식하고 7일이 경과한 누드마우스에 각 rAAV 벡터 \( \left(3 \times 10^{11}\right. \) virus particles/mouse)를 미정맥 투여하였고, 투여 후 일정기간 동안 xenograft 누드마우스에 발현되는 in vivo luciferase 활성을 다음과 같이 측정하였다. 마우스를 \( 2 \% \) iso-fluorane/air 혼합물로 마취시키고, D-luciferin potassium salt \( (150 \mathrm{~mg} / \mathrm{kg} \), MIPS, USA)를 복강 투여한 후 마우스 각 부위에서 발생하는 총 photon counts를 획득하여 정량적으로 분석하였다.</p>