B. subtilis 168을 LB 배지에 \( 1 \% \) 접종한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 60시간 동안 진탕 배양하면 균 증식과 항균력이 꾸준히 이루어졌고, 20-24시간에 최대 항균력 400 \( \mathrm{AU} / \mathrm{mg} \) 단백질이 관찰되었다. 10종의 Gram 양성균과 음성균에 대한 저해 효과는 L. monocytogenes ATCC 19111와 B. cereus ATCC14579에 대한 저해 효과가 가장 컸으며, class IIa군 특성과 유사하다. B. subtilis 168은 청국장 제조에 사용하면 B. cereus 증식을 억제할 수 있으며, 2-3일 발효하면 타 균들과 차이가 없는 양질의 청국장을 얻을 수 있다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>B. subtilis 168 생육중 항균력 변화</h2> <p>B. subtilis 168을 LB 배지에 \( 1 \% \) 접종한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 60시간 동안 진탕 배양하면서 균 증식과 항균력을 측정하였다. 균 증식은 계속 꾸준히 이루어짐을 흡광도 측정 결과에서 알 수있고 배양 60 시간에 \( 1.6 \) 부근에 도달하였다. 항균력은 배양 16 시간부터 20 시간째 급격히 증가하다가 24 시간 이후 급격히 감소됨을 알수 있었다. 27 시간 이후로는 항균력이 \( 100 \mathrm{AU} / \mathrm{mg} \) 단백질로 일정하게 유지됨을 확인 할 수 있었다. 최대 항균력은 배양 20-24시간에 관찰되었고 400 \( \mathrm{AU} / \mathrm{mg} \) 단백질이었다.</p> <h2>저해 스펙트럼</h2> <p>10종의 Gram 양성균과 음성균을 대상으로 B. subtilis 168에 의한 저해 여부를 조사하였다(Table 2). S. aureus subspaureus ATCC 25923를 제외한 모든 Gram 양성균들은 저해되었으나 음성균들은 저해를 보이지 않았다.</p> <p>L. monocytogenes ATCC 19111와 B. cereus ATCC14579에 대한 저해 효과가 가장 컸으며, 이는 B. subtilis168의 항세균 활성이 Gram 양성균들에 한정되는 것으로 여겨진다. L. monocytogenes ATCC 19113에 강한 저해 활성을 보이므로 박테리오신 그룹들 중에서 Listeria에 강한 항균 활성을 나타내는 특징을 가진 class IIa군 특성과 유사하다. B. cereus는 설사형 혹은 구토형 독소를 생산하는 유해균으로 쌀이나 쌀 가공품 그리고 볏짚등에 분포한다. 볏짚에 분포하는 B, cereus 포자는 쉽게 청국장으로 옮겨갈수 있다. B. subtilis 168을 청국장 제조시 종균으로 사용한다면 B. cereus 증식은 억제될 수도 있을 것이다. 청국장에서 분리한, 혈전용해능이 우수한 B. subtilis 및 B.amyloliquefaciens 균주들과 168을 청국장 제조에 사용한 결과들을 보면 비록 168의 α-amylase, α-galactosidase, β-glucosidase, 그리고 단백질 가수분해효소들(산성, 중성, 및알칼리성) 역가는 타 균주들 보다 현저히 낮지만 168을 콩에 접종하여 청국장 발효를 2-3일 진행한 후에는 타 균들과 차이가 없는 양질의 청국장을 얻을 수 있었다. 이상 결과들로 볼 때 B. subtilis 168은 청국장 종균으로 사용 가능하며 특히 B. cereus 저해효과가 예상되어 발효식품 안전성 측면에서 유리할 것이 예상된다.</p> <h2>효소처리가 항균 활성에 미치는 영향</h2> <p>B. subtilis 168 의 항균 물질의 효소 처리에 따른 반응을 조사하였다. 지시균주로는 B. cereus ATCC 14579를 \( 1 \times 10^{5} \) cell을 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 관찰한 결과 protease나 proteinase K 처리 후 저해 환이 사라졌다. 이 두 효소는 비특이적 단백질 가수분해 효소임을 고려할 때 B. subtilis 168 이 만드는 항균 물질은 단백질 혹은 펩타이드 박테리오신으로 여겨진다.</p> <h2>박테리오신 분자량 추정</h2> <p>Tricine-SDS PAGE을 통하여 L. monocytogenes ATCC 19111와 E. faecalis ATCC 29212에 대한 항균력을 측정한 결과 gel 상에서 약 \( 5 \mathrm{kDa} \) 부위에서 두 균 공히 저해하는, 항균력을 지닌 밴드를 관찰 할 수 있었다(Fig. 3). Coomassie로 염색된 SDS gel 해당 위치에서도 동일 크기의 펩타이드가 확인되었다. 이 결과로부터 B. subtilis 168이 생산하는 5kDa 크기 펩타이드는 항균력을 지닌 박테리오신임을 확인할 수 있었다.</p> <h2>저해 기작</h2> <p>B. subtilis 168 박테리오신에 노출된 B. cereus ATCC 14579의 생균수 변화를 측정하였다. 박테리오신에 노출되지 않은 대조구의 경우 초기균수 \( 1 \times 10^{8} \mathrm{cell} / \mathrm{mL} \) 는 6 시간째 \( 1 \times 10^{5} \mathrm{cells} / \mathrm{mL} \) 까지 감소하였으나 6 시간 이후 차츰 균수가 증가하여 배양 24 시간에는 \( 5 \times 10^{7} \) cells \( / \mathrm{mL} \) 까지 다시 증가하였다. 반면 B. subtilis 168 박테리오신에 노출된 B. cereus세포들의 경우에는 박테리오신 첨가 시점으로부터 3 시간 이후부터(Fig. 4 그래프 상에서 6시간 이후) 생균수가 감소하였으며, 배양 24 시간에는 \( 1 \times 10^{2} \) cells \( / \mathrm{mL} \) 까지 감소하였다. 이상 결과는 B. subtils 168 박테리오신에 의한 저해는 민감한 세균을 죽이는, 즉 살균(bactericidal) 기작임을 보여주는 것이다. 청국장과 같은 전통발효식품들의 단점인 안전성 문제를 보완하는 가장 좋은 방법은 발효균들 중에서 유해균을 억제하는 균주들을 찾아서 종균으로 사용하는 것이다. 이런 측면에서 B. subtilis 168은 청국장 종균으로 가능성이 있는 것으로 생각된다. 앞으로 168 보다 효소활성이 우수한 GRAS간균들 중에서 유해균 억제능이 우수한 균들을 찾는 노력이 필요할 것으로 생각된다.</p>