DEAE 분획 수거 시료를 pH 7.5 HEB 완충액으로 미리 평형화 시킨 epoxy-urea column에 적용한 후, 100 mM urea를 함유하는 HEB(pH 7.5)완충액으로 용출한 단백질 시료를 4\(^\circ \mathrm{C}\)에서 투석하여 Urease 활성을 phenol-hypochloride와 반응하여 생성된 indophenol을 625 nm에서 측정하여 결정하였다. 단백질 순도는 SDS-Polyacrylamide 전기영동을 이용하여 확인하였다.
<p>한편으로, 동일한 DEAE 분획 수거 시료를 역시 전 항에서 제조하여 \( \mathrm { pH } ~7.5 \) HEB 완충액으로 미리 평형화 시킨 epoxy-urea column \( (1 \times 6.4 \mathrm { ~cm } ) \)에 적용한 후, \( 100 \mathrm { ~mM } \) urea를 함유하는 HEB \( ( \mathrm { pH } ~7.5) \)완충액으로 용출시켰다. 용출된 단백질 시료는 적용 시 사용한 완충액 (PEB 및 HEB)에 대하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 각각 투석하여 다음 단계의 분석에 사용하였다.</p> <h2>Urease 활성 측정</h2> <p>Urease 활성은 urea로부터 ammonia가 방출되는 양을 측정 함으로써 결정하였다. 즉, ammonia가 phenol-hypochloride와 반응하여 생성된 indophenol을 \( 625 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하는 fixed-time point assay를 시행하였다. Assay buffer ( \( 50 \mathrm { ~mM } \) urea, \( 25 \mathrm { ~mM } \) HEPES, \( 0.5 \mathrm { ~mM } \) EDTA ( \( \mathrm { pH } ~7.5 \))에 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 효소를 첨가함으로써 반응을 시작하였으며, 방출되는 ammonia 농도는 Microsoft Excel 2000 프로그램 상에서 직선형 상관 회귀 분석에 의해 결정되었다. Urease 활성의 1 unit는 urea를 기질로 하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 표준 assay buffer에서 매 분당 \( 1 ~ \mu \mathrm { mol } \)의 urea를 가수 분해하는데 필요한 효소의 양으로서 정의하였다.</p> <h2>SDS-Polyacrylamide 전기영동</h2> <p>각 정제단계에서의 단백질 순도는 Laemmli 법에 의한 SDS-polyacrylamide gel 전기영동을 시행하여 확인하였다. 각각의 시료는 \(3 \% \) SDS, \( 10 \% \) glycerol, \(5 \% \) 2-mercaptoethanol을 함유하는 \( 0.0625 \mathrm { ~M } \) Tris buffer \( ( \mathrm { pH } ~6.8) \)에 가하여 \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 denature시킨 후 사용하였다. 이 시료를 두께 \( 1.5 \mathrm { ~mm } \)의 \( 4.5 \% \) stacking gel과 \( 12 \% \) polyacrylamide resolving gel에 적용하여 \( 39 \mathrm { ~mA } \)로 4 시간 동안 전기영동한 다음 \( 0.1 \% \) Coomassie brilliant blue R-250으로 염색한 후 탈색하였다. 시료 중 단백질의 농도는 bovine serum albumin을 표준품으로 하여 Lowry법 또는 MicroBCA Protein Assay Kit (Pierce, USA) 를 이용하여 측정하였다.</p>