Trehalase 반응 후의 당정량과 Trehalase 반응 이전의 당정량의 차이로 trehalose의 양을 계산하였다. Trehalase 활성은 상등액내의 일정한 단백질 농도를 기준으로 trehalase 반응 후의 glucose양과 반응 전의 glucose양의 차이로 정하였다. 측정된 흡광도 값은 ATPase 환성으로 선환하기 위해 standard curve를 이용하였다. phos-phate buffer 를 Fluorescence Spectrophotometer 로 측정하여 standard curve 를 구한 후에 이것을 비교하여 \( \mathrm{pH} \)를 결과값으로 계산하였다.
<h2>Trehalose 정량</h2> <p>증류수로 세척한 일성한 농도의 세포 \( \left(10^{9}\right. \) cells \( \left./ \mathrm{ml}\right) \) 를 1시간동안 끓는 물에 중탕시켜 세포를 용해시키기 원심분리를 통해 그 상등액을 보았나. 상둥액 \( 500 \mu \ell \) 를 2 배 희석한뒤, Somogi-Nelson법을 이용해 환워당을 정량하여 대조구로 사용하였다. 그리고 다른 \( 500 \mu \ell \) 의 상등액에 \( 400 \mu \ell \) 의\( 50 \mathrm{mM} \) phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 5.7)를 넣은 후, trehalase(Sigma, Steinheim, Germany)를 \( 1.5 \mu \ell \) 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 반응시킨 후 Somogi-Nelson법으로 비환원성 말단을 가진 trehalose로부터 해리된 환원당을 정량하였다. Trehalase반응후의 당정량과 이전의 당정량의 차이로 trehalose의 양( \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mg} \) protein)을 계산하였다.</p> <h2>Trehalase 활성 측정</h2> <p>준비된 균체시료에 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-Cl (pH 7.0)과 glass bead를 넣고 micromixer로 퐈쇄하였다. 원심분리하여 상등액을모은 후 \( 100 \mu \) 의 상등액은 D-Glucose assay Kit (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) 을 이용하여 반응시키고 \( 340 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 세포내 glucose를 정량하였다. 또한 \( 50 \mu \ell \) 의 상등액을 trehalase의 시료로 사용하여 \( 0.5 \mathrm{M} \) trehalose 용액을 넣고 20 분간 반응시킨 후 끓는물에 5 분간 꿇여 반응을 중지시켰다. 이후 D-glucose assay\( \mathrm{Kit} \) 를 이용하여 반응시킨 다음 \( 340 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. 흡광도값은 standard curve를 통해 glucose량으로 환산하였으며, 상등액내의 일정한 단백질 농도 \( (\mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 를 기준으로 trehalase 반응후의 glucose양과 반응 전의 glucose양의 차이로 trehalase 활성( \( \mu \mathrm{M} / \mathrm{min}, \mathrm{mg} \) protein)을 정하였다. 단백질 정량은 Bradford 법을 이용하였다.</p> <h2>ATPase 활성 측정</h2> <p>세포내 \( \mathrm{H}^{+}{ }^{+} \)ATPase의 활성측정은 Eilis의 방법을 이용하였다. \( 25\mathrm{ml} \) 의 MRS 액체배지에서 배양한 균을 모아 세척한 후 \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{MgSO} \) 가 포함된 \( 75 \mathrm{mM} \) Tris-Cl buffer\( (\mathrm{pH} \) 6.5) \( 2.5 \mathrm{ml} \) 에 현탁하여 ATPase 활성측정을 위한 균체시료로서 사용하였다. 균체시료에 \( 250 \mu \) toluene을 넣고혼합한 뒤, \( 35 \mathrm{C} \) 에서 5 분간 방치하였다. Ethanol을 넣은 드라이아이스와 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에 번갈아 넣으며 냉가과 녹임을 2 번 반복한 후 균체를 모으고 세척하였다. 다시 위의 buffer \( 1 \mathrm{ml} \)에 현타한 후 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하고 이를 활성측정을 위한 샘플로 사용하였다. 샘플 \( 10 \mu l \) 에 \( 990 \mu t \) 의 buffer (50mMTris-Cl, \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{MgSO} \mathrm{M}_{4}, \mathrm{pH} \) 6.5)를 넣고. \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간방치하고, 미리 준비한 \( 0.1 \mathrm{mM} \mathrm{ATP} \) 블 \( 125 \mu \ell \) 첨가하여 37' \( \mathrm{C} \) 에서 반응시킨다. 반응후 malachite green reagent [5.7\%\( (\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) ammonium molybdate in \( 6.0 \mathrm{~N} \mathrm{HCl}: 2.3 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)polyvinyl alcohol : \( 0.08 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) malachite green : water\( =1: 1: 2: 2] \) 늘 \( 1 \mathrm{ml} \) 넣고 5 분간 실온에 둠으로써 반응을 중지 시키고 \( 630 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도 값은 standard curve를 이용해 ATPase 환성으로 선환하였다. 단위는 \( \mu \mathrm{M} / \mathrm{min}, \mathrm{mg} \) protein 이고 standard는\( \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \) 로 측정하였다.</p> <h2>세포내 \( \mathrm{pH} \) 측정</h2> <p>준비된 균체시료를 세척하고 \( 2 \mathrm{ml} \) 의 증류수에 현탁하였다. \( 10 \mu \mathrm{M} \) 의 5-(and-6)-carboxy SNARF \( \mathrm{Ⓡ} \) - 1 , acetoxymethylester, acetate (Molecular Probes, Leiden, Netherlands)를첨가한 뒤 한 시간 동안 실온에 두었다. 그 후 균체를 모아세척하고 \( 4 \mathrm{ml} \) 증류수에 현탁한 다음 Fluorescence Spec-trophotometer (L20B, 미국 PERKIN ELMER, USA)로 측정하였다. 측정조건은 다음과 같다. Ex: 534nm, Em : 580/610,Slit width : \( 5 \mathrm{~mm}(\mathrm{Ex}, \mathrm{Em}) \) 측정한 값은 \( \mathrm{pH} \) 늘 조정한 phos-phate buffer를 Fluorescence Spectrophotometer로 측정하여 standard curve를 구한 뒤, 비교하여 \( \mathrm{pH} \) 를 산출하였다.</p>