탄소원 이용성 및 효소 활성 특성 조사에 API 50 CHB/E, API 20 E, API ZYM kit를 사용했고, 개중 API 50 CHB/E는 Bacillus 동정에 사용했으며 API 50 CHB/E의 결과를 보완하기 위해 사용했다. Bacillus 균들의 고분자 분해능을 알아보기 위해 DNA를 제외하고 기본배지를 MA로 하고 carboxymethylcellulose, soluble starch, skim milk를 각각 1%씩 첨가해 배지를 만든 후 각각의 배지에 균을 접종하고 30\(^\circ \mathrm{C}\)에서 배양해 분해능을 확인했다. 또한 Bacillus 균이 DNA를 분해할 수 있는 효소인 DNase를 생산할 수 있는지 알아보기 위해 DNA가 함유된 배지에 균을 배양한 후 1N HCl을 부어 투명대가 형성되는지 확인했다.
<h2>갯지렁이 유래 Bacillus 균주의 탄소원 이용능 및 주요 효소 활성 분석</h2> <p>탄소원 이용성 및 효소 활성 특성 조사는 API 50 CHB/E, API 20 E, API ZYM kit를 사용하였다. API 50 CHB/E는 Bacillus 동정에 사용되며 API 20 E는 API 50 CHB/E의 결과를 보완하기 위해 사용하였다. 모든 시험은 incubation box를 준비하고 증류수 \( 5 \mathrm { ml } \) 을 tray에 부어서 수분을 유지하도록 하였다. API 50 CHB/E Test는 API 50 CHB/E medium의 뚜껑을 열고 배지에서 집락을 여러 개 취해서 2 McFarland로 탁도를 맞추었다. 탁도를 맞춘 API 50 CHB/E medium을 스트립의 튜브에 분주하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24-48시간 배양하여 결과를 판독하였다. API 20 E Test는 suspension medium ( \( 5 \mathrm { ml } \))의 앰플을 열고 배지에서 하나의 colony를 취한 후 골고루 부유하도록 하는데, 본 연구의 대상 균주들은 해양 생물로 API kit를 이용하기 위하여 Sea Salts (SS) \( 3-4 \% \)용액에 부유시켰다. \( \llcorner \mathrm { CIT } \lrcorner \), \( \llcorner \mathrm { VP } \lrcorner, \llcorner \mathrm { GEL } \lrcorner \) 은 큐플까지 균액으로 가득 채우고 나머지는 큐플을 제외하고 튜브만 채웠다. ADH, LDC, ODC, H2S, URE는 혐기적인 조건을 만들어주기 위해 광유(mineral oil)로 큐플을 채웠다. Incubation box를 호기적인 상태에서 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \), API 50 CHB/E와 같은 시간 배양하고 결과를 판독하였다. API ZYM Test는 suspension medium ( \( 2 \mathrm { ml } ) \)에 균을 풀어 탁도를 5-6 McFarland로 맞추고 피펫을 이용하여 각 큐플에 \(65 \mu \mathrm { l } \)씩 분주하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 4시간동안 배양하였다. 4 시간 뒤 스트립을 꺼내어 ZYM A와 ZYM B 시약을 각각의 큐플에 한 방울씩 떨어뜨리고, 5 분 후 결과를 판독하였다. 색의 변화정도에따라 0 - 5까지의 값으로 표시하여 3이상인 반응을 양성으로 판정하였다.</p> <h2>고분자 물질 분해 효소 활성 시험</h2> <p>Bacillus 균들의 고분자 분해능을 알아보기 위해 DNA를 제외하고는 기본배지를 MA로 하고 carboxymethylcellulose (CM/cellulose, Sigma), soluble starch (Sigma-Aldrich), 그리고 skim milk (Difco)를 각각 \( 1 \% \) 씩 첨가해 목적한 배지를 만든 후 각각의 배지에 균을 접종한 후 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양해 분해능을 확인하였다. 그리고 고분자 지질 분해 가능성을 알아보기 위해 Tween 20 (Sigma), Tween 40 (Sigma), Tween 60 (Sigma), Tween 80 (Sigma)를 각각 \( 1 \% \)씩 첨가해 목적한 배지를 만든 후 각각의 배지에 균을 접종한 후 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양해 분해능을 확인하였다. DNA를 분해할 수 있는 효소인 DNase를 생산할 수 있는지 확인하고자 DNA가 함유된 배지에 균을 배양한 후 1N HCl을 부어 투명대가 형성되는지 확인하였다. Cellulose 분해 여부 관찰시 congo-red ( \( 0.1 \% \) )를 떨어뜨리고 30분이 지난 뒤 1M NaCl로 세척하였다. 균이 cellulose를 분해할 경우 균체 주변에 희미한 노란색이 나타나는 것으로 cellulase 활성 여부를 확인하였다. Starch의 분해 여부는 균을 배양한 후 Lugol's iodine을 부은 후 색변화를 관찰하였다. starch가 존재하는 부분은 진한 청색으로 변하고 starch 분해능이 있는 균체 주변은 투명대가 나타나는 것으로 amylase 효소활성을 조사하였고, Casein 분해능은 균 배양 후 투명대 생성여부를 확인하였다. Tween을 분해하는 균은 Tween을 포함하는 배지에서 배양된 균체 주변이 뿌옇게 변하는 것으로 확인하였다.</p>