중성지방을 염색하는 Oil red O 염색 방법으로 지방 세포 내 중성지방 축적 정도를 시각화하고 지방 세포의 분화억제 활성을 알아볼 수 있다. 지방세포 분화가 완료된 세포를 이용하여 TRI reagent처리와 원심분리 등의 과정을 거쳐 추출된 RNA로 지방세포 분화 발현을 확인하고, 지방의 저장, 합성에 관련된 인자를 이용하여 real-time PCR을 실시하였다.
<h2>Oil red \( \mathrm { O } \) 염색법</h2> <p>시료의 지방세포 분화억제 활성을 검토하기 위하여 Oil red O 염색을 시행하였다. Oil red O 염색은 중성지방을 염색하는 방법으로 지방 세포 내 중성지방 축적 정도를 시각화할 수 있다. 3T3-L1 전구지방세포를 9일 동안 분화시킨 후 배지를 제거하고 phosphate buffered saline (PBS)로 세척하고 \( 10 \% \) formaldehyde 용액으로 세포를 고정시켰다. 다시 PBS로 세척 후, Oil red O 용액을 첨가하여 30 분간 실온에서 염색하고, Oil red O 용액을 제거한 후 증류수로 세척하여 건조시킨 다음 위상차 현미경을 이용하여 관찰하고 흡광도 측정을 위하여 \( 100 \% \) isopropyl alcohol로 염색된 지방구를 용출시켜 spec-trophotometer를 이용하여 \( 510 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Real-time PCR을 이용한 mRNA 분석</h2> <p>지방세포 분화가 완료된 cell을 pH 7.4 phosphate buffered saline (PBS, Gibco RBL)로 세척하여 배양된 세포에서 배지를 제거하고 PBS \( 10 \mathrm { ml } \) 로 두 번 세척한 후 TRI reagent를 처리하고, \( 1.5 \mathrm { ml } \) tube에 \( 1 \mathrm { ml } \) 씩 담고 1-bromo-3-chloropropane (Sigma Aldrich)을 \( 200 \mu 1 \) 첨가하고 vortex 하여 원심분리 \( \left (3,000 \mathrm { rpm } , 15 \right . \) 분, \( \left .4 ^ {\circ } mathrm { C } \right ) \) 하고, 상등액을 새로운 tube에 옮겼다. 여기에 동량의 isopropanol (Sigma Aldrich)을 첨가하여 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2 시간 이상 방치하고 나서 원심분리(13,000 rpm, 15분, \( \left .4 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \) 한 후 상등액을 제거하였다. 침전물에 \( 75 \% \) ethanol을 첨가하여 제거한 후 diethyl pyrocarbonate (DEPC, Sigma Aldrich) 처리된 증류수를 첨가하여 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 수조에서 10분간 반 응시켜 침전물을 녹였다.</p> <p>추출된 RNA를 CDNA로 합성 후 SYBER Green과 지방세포 분화 발현 인자인 PPAR-gamma, C/EBP-alpha, SREBP-1c를 확인하고, 지방 축적, 합성, 저장에 관련된 ACS, FAS, FATP1, FABP4, Perilipin의 primer를 이용하여 real-time PCR을 실시하였다. Primer 염기서열은 Table 1과 같다.</p>