A1에 대한 forward primer로 5'-GCTGGTGTCCAGCATTTTCA-3', reverse primer로 5'-TGAAGCACACTGCCCATTGA-3'을 사용하였고, \( \beta \)-actin에 대한 forward primer로 5'-GCCATGTACGTTGACATCCA-3', reverse primer로 5'-CGCTCATTGCCACAGGATT-3'을 사용하였다. TRI Reagent를 이용한 Chomczynski의 방법으로 RNA를 분리하고, RT-PCR을 통해 HBV, TNF-a, CYP1A1, \( \beta \)-actin mRNA 발현을 측정하였다.
<h2>Quantitative competitive RT-PCR</h2> <p>전체 RNA는 TRI Reagent를 사용하여 Chomczynski의 방법으로 분리하였다. HBV, TNF-a, cytochrome P450 1A1 (CYP1A1), \( \beta \)-actin의 mRNA 발현은 reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)을 이용하여 측정하였다. 각 유전자들에 대한 특이적인 primer로는 HBV에 대한 forward primer 2 5'-CGATCCATACTGCGGAACTC-3', re-verse primer로 5'-GGAGGCTTGAACAGTAGGAC-3'를 사용하였고, TNF-a에 대한 forward primer로 5'-ACTAGTGG-TGCCAGCCGATGGGTTG-3', reverse primer 로 5'-GTGG-GGGCTGGGTAGAGAATGGATG-3'를 사용하였고, CYP1A1에 대한 forward primer로 5'-GCCAATGTCCAGCTGTCAGA-3', reverse primer로 5'-GATGGTGAAGGGGACGAAGG-3'를 사용하였고, b-actin에 대한 forward primer로 5'GTAT-CCTGACCCTGAAGTACCCCA-3', reverse primer로 5'-AGGATGGCGTGAGGGAGAGCAT-3'를 사용하였다. TNF-a mRNA를 정량하기 위하여 위의 TNF-a에 특이적인 primer 결합 부위들을 포함하는 재조합 DNA TNF-a internal standards (IS)를 만들어 quantitative/competitive RT-PCR을 수행하였다. 전체 RNA는 oligo \( ( \mathrm { dT } )_ { 15 } \)를 primer로 사용하여 cDNA로 만든 후, PCR 완충액, 4 \( \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } _ { 2 } , \) 2.5 U of Tag DNA polymerase, 재조합 DNA IS와 각각 6pmol의 primer들로 이루어진 PCR 종합혼합물을 가하였다. 시료들은 5분간 94 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 변성시킨 다음, 94 \( ^ {\circ } \mathrm { C } , 30 \)초 ; 59 \( ^ {\circ } \mathrm { C } , 30 \) 초; 72 \( ^ {\circ } \mathrm { C } , 30 \)초의 과정을 30회 반복하였고, 마지막으로 5분간 72 \( ^ {\circ } C \)에서 처리하였다. PCR 결과물은 \( 8 \% \)polyacrylamide 겔 전기영동과 ethidum bromide 염색으로 확인하였다. 시료의 RNA로부터 증폭된 PCR 산물은 370-bp 의 길이를 가졌으며, 재조합 IS로부터 증폭된 경우에는 324-bp 길이의 PCR 산물이 얻어졌다. TNF-a mRNA의 농도는 겔 상에서 각 PCR 산물들의 농도를 측정한 후 TNF-a와 IS에 대한 PCR 산물의 농도비율을 구하여 표준 곡선에 외삽하여 정량하였다.</p> <h2>Microparticle Enzyme Immunoassay (MEIA)</h2> <p>1.3-eq HBV genome을 세포내 도입시킨 경우와 HBV 혈청으로 감염시킨 Hepa-1c1c7 세포로부터 얻은 세포배양액에서 HBV의 표면항원인 HBsAg을 검출하기 위하여 Abbott IMx HBsAg assay system (Abbott Laboratories, IL, USA)을 이용하여 MEIA를 수행하였고, 신호 대 잡음비(S/N ratio)가 2.0이상인 경우를 HBV 양성으로서 반응성이 있다고 평가하였다.</p>