본 논문에서는 Apoptosis 유발에 대해 EAHF 처리에 의한 apoptosis 유발이 어느 경로에 의하여 일어나는지를 조사하였으며, caspase 활성에 대해 Western blot analysis 결과와 유사성을 토대로 EAHF 처리에 따른 apoptosis 유발이 extrinsic pathway 보다는 intrinsic pathway를 통하여 이루어짐을 알 수 있었다. 한편, EAHF 처리에 의한 apoptosis 유발에는 pro-apoptotic Bax의 증가에 따른 anti-apoptotic 인자들의 발현 저하가 중요한 역할을 하고 있음을 파악했다.
<h2>Death receptor 관련 인자 및 Bcl-2 family의 발현에 미치는 EAHF의 영향</h2><p>Apoptosis 유발은 크게 mitochondrial pathway라고 알려진 intrinsic pathway 및 death receptor pathway로 알려진 extrinsic pathway로 나누어 질 수 있는데, EAHF 처리에 의한 apoptosis 유발이 어느 경로에 의하여 일어나는지를 조사하기 위하여 먼저 death receptor에 속하는 유전자들의 발현 변화를 RT-PCR 및 Western blot analysis 방법으로 조사하였다. Fig.4의 결과에서 알 수 있듯이 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포 모두에서 조사된 5가지의 대표적인 death receptor 관련 유전자들의 발현은 EAHF 처리에 의하여 아무런 변화가 나타나지 않았으며, 이는 EAHF의 처리에 의한 apoptosis 유발에 있어서 death receptor pathway가 관여하지 않을 가능성을 보여주는 결과이다. 다음은 mitochondrial pathway를 포함한 apoptosis 유발 조절에 있어서 가장 대표적인 조절인자로 알려진 Bcl-2 family에 속하는 유전자들이 EAHF의 처리에 의하여 어떠한 변화가 나타나는지를 조사한 결과, anti-apoptotic 인자인 Bcl-2 및 Bcl-\(\mathrm{X}_{\mathrm{L}} \)의 발현에는 EAHF 처리에 따라 큰 변화가 나타나지 않았지만 세포의 죽음에 관여하는 pro-apoptotic 인자인 Bax의 경우는 두 세포주 모두에서 EAHF 처리 농도가 높아질수록 전사 및 번역 수준에서 발현의 정도가 증가하는 것으로 나타났다. 특히 EAHF에 의하여 apoptosis가 강하게 나타났던 MDA-MB-231 세포에서 Bax의 발현 증가가 더욱 더 강하게 나타났다. 이상의 결과는 EAHF 처리에 의한 apoptosis 유발에는 pro-apoptotic Bax의 증가에 따른 상대적인 anti-apoptotic 인자들의 발현 저하가 중요한 역할을 하고 있음을 의미하는 것이다.</p><h2>Caspases의 발현 및 활성에 미치는 EAHF의 영향</h2><p>다음은 extrinsic 및 intrinsic pathway를 포함하는 apoptosis 유발의 전반적인 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 몇 가지 caspases의 활성에 미치는 EAHF의 영향을 조사하였다. 조사된 caspases 중 caspase-8 은 death receptor와 연관된 extrinsic pathway의 과정에서, caspase-9는 미토콘드리아와 연관된 intrinsic pathway에서 initiation caspase로 작용한다. 그리고 caspase-3은 caspase-9의 활성에 의하여 활성화되거나 자가 활성에 의하여 apoptosis의 최종적인 과정에서 관여한다. 먼저 Western blot analysis에 의한 3가지 종류의 caspase 단백질 발현의 정도를 비교한 결과는, Fig. 6에 나타낸 바와 같이 caspase-3이 결손된 MCF-7 세포의 경우 caspase-8 및 -9의 발현에 EAHF는 큰 영향을 미치지 못하였지만, MDA-MB-231 세포에서는 EAHF의 처리에 의하여 intrinsic pathway의 개시 단계에 관여하는 caspase-9의 비활성형 단백질의 발현이 다소 감소되었고, caspase-3의 경우 활성형의 증가가 뚜렷하게 관찰되었다. 그러나 caspase-8의 경우 EAHF 처리에 따라 큰 변화가 관찰되지 않았다. 따라서 EAHF에 의한 caspase의 활성 여부를 재확인하기 위하여 in vitro caspase 활성을 정량적으로 조사한 결과는 Fig. 7에 나타낸 바와 같다. Fig. 7의 결과에서 알 수 있듯이 caspase-8의 활성은 두 유방암세포 모두에서 관찰되지 않았으며, caspase-9 및 caspase-3은 특히 MDA-MB-231 세포에서 매우 높게 나타나 Western blot analysis 결과와 유사한 경향성을 보여주었다. 이상의 결과는 EAHF 처리에 따른 apoptosis 유발이 extrinsic pathway 보다는 intrinsic pathway를 통하여 이루어지고 있음을 보여주는 것이다.</p><p>한편 활성화된 caspase-3는 세포의 정상적인 생존에 필수적인 세포 내 주요단백질들을 분해할 수 있으며, 종종 단편화가 일어난 이들 단백질들은 apoptosis가 유발되었다는 표지자로서 활용이 된다. 본 연구에서도 EAHF에 의해 caspase-3이 활성화되었다면 특정 기질 단백질의 분해가 일어날 것이므로 이를 확인하기 위하여 동일 조건에서 배양된 암세포를 대상으로 Western blot analysis를 통하여 분석한 결과, poly(ADP-ribose) polymerase(PARP) 및 \( \beta \)-catenin 단백질의 발현이 MDA-MB-231 세포에서 매우 감소되었으나, phospholipase(PLC)-\( \gamma \)1 및 DNA fragmentation factor(DFF) 40/DFF45의 경우는 큰 변화가 없었다. 또한 caspase와의 직간접적인 결합을 통하여 그들의 활성을 억제하는 것으로 알려진 IAP family에 속하는 주요 인자들의 발현에 미치는 EAHF의 영향을 조사한 결과, 두 유방암세포 모두에서 큰 변화를 관찰할 수 없었다.</p>