RAW264.7 세포를 \( 1 \% \) penicillin/streptomycin, \( 10 \% \) fetal bovine serum 포함 DMEM에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건하에 24시간 배양한 후, 농도 별로 시료를 처리하여 alamarBlue Cell Viability Reagent로 2시간 배지하여 \( 570 \mathrm {nm } \)에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 확인하고, LPS를 처리하여 Griess reagent로 \( 540 \mathrm { nm } \)에서 흡광도를 측정하여 \(\mathrm {NO}\) 생성량을 측정하였다.
<h2>세포배양</h2> <p>본 연구에 사용된 RAW264.7 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 분양 받아 실험하였다. 세포는 \( 1 \% \) penicillin/streptomycin 및 \( 10 \% \) fetal bovine serum이 포함된 \( \mathrm { DMEM } \) 에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건하에 배양하였다.</p> <h2>세포 생존율</h2> <p>RAW264.7 세포를 24시간 배양한 후 농도 별로 시료를 처리하였다. 시료 처리 24 시간 후 alamarBlue \( { } ^ {\circledR } \) Cell Viability Reagent (Thermo Fisher Scientific, \( \mathrm { MA } , \mathrm { USA } \) )을 배지의 총량의 \( 10 \% \)씩 처리하여 2시간 배양하였다. 반응 후 \( \mathrm { UV } / \mathrm { Visible } \) spectro- photometer을 이용하여 \( 570 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하여 세포생존율을 확인하였다.</p> <h2>\( \mathrm { NO } \) 생성량 측정</h2> <p>RAW264.7 세포를 24시간 배양한 후 농도 별로 시료를 처리하였다. 시료 처리 1시간 후 \( \mathrm { LPS } \) 를 처리하여 24 시간 배양한 상등액을 \( \mathrm { NO } \) 생성량 측정에 사용하였다. 세포 상등액에 Griess reagent \( (1 \% \quad \) sulfanilamide, \( 0.1 \% \quad \mathrm { ~N } \)-1-naphthylenediamine dihydrochloride, and \( 5 \% \) phosphoric acid)를 처리하여 \( 540 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Immunoblotting</h2> <p>RAW264.7 세포를 24시간 배양한 후 농도 별로 시료 및 LPS를 처리하였다. 시료 처리 24시간 후 PBS로 두 번 세척한 후, protease inhibitor cocktail을 포함한 RIPA buffer로 용해한 후 얼음에서 30 분간 정치시켰다. 세포 용해액을 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 12,000 \mathrm { rpm } \)에서 20 분 간 원심분리하고, 상층액은 Bradford 시약(Bio-rad, California, CA, USA)을 이용하여 단백질 정량을 실시하였다. 세포 용해액은 \( 2 \times \) Lamilae buffer와 혼합하여 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분간 가열 후 각 \( 20 \mu \mathrm { g } \) 단백질량에 해당하는 시료를 \( 10 \% \mathrm { SDS } - \) PAGE에서 전기 영동하여 분리하였다. 전기 영동된 단백질은 polyvinylidene difluoride membrane 막에 옮겨 상온에서 1 시간 동안 blocking (5 \% skim milk in TBST) 하였다. 1차 항체를 \( 4 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 overnight 처리하였다. TBST로 세척하고, 2 차 항체를 1시간 동안 반응시켰다. TBST로 세척하고 enhanced chemiluminescence western blotting detection kit (Bio-rad)로 반응하였다. 단백질 밴드는 ChemiDoc (Bio-rad)로 촬영하여 확인하였다.</p>