녹농균은 쿼럼 센싱이 매우 중요하게 관여하는 기회감염성 병원균으로 본 연구는 사전 연구에서 합성해낸 쿼럼 센싱 억제물질 \(5 \)b와 \(5 \)f가 실제 녹농균에서 쿼럼 센싱과 병독성을 억제할 수 있는지 분석한다. 대장균을 이용한 리포터 분석에서와는 달리, \(5 \)b와 \(5 \)f 모두 녹농균에서 직접 처리하였을 때는 LasR의 활성에 영향을 주지 못하였으나, 대신 이 물질들은 녹농균의 또다른 쿼럼 센싱 수용체 단백질인 QscR의 활성에 선택적으로 영향을 주었다. 두 물질 모두 중요한 병독인자인 프로테아제 활성에는 영향을 주지 않으면서도, 만성감염을 매개하는뎨 중요한 생물막의 형성은 의미있게 감소시켰다.
<h2>녹농균에서 저해제들의 프로테아제 생성에 미치는 영향</h2> <p>\(5 \)b와 \(5 \)f가 LasR과 QscR을 구별하여 농도 의존적으로 작용하였기 때문에 이들이 QS과 관련된 중요한 표현형에 어떻게 작용할지 판단하기 어려웠으므로, 이를 알아보기 위해 QS와 관련된 중요한 생리적 특징인 병독인자(virulence factor)의 생산에 이들이 미치는 영향을 조사하였다. \(5 \)b와 \(5 \)f를 녹농균에 다양한 농도로 처리한 후, 대표적 병독인자인 프로테아제 활성을 skim milk 배지법을 이용하여 측정해 보았을 때, \(5 \)b와 \(5 \)f 모두 측정한 모든 농도 범위에서 프로테아제 활성에 의미있는 영향을 미치지 못하였다. 지금까지 알려진 많은 병독인자들이 LasR의 직, 간접적인 조절을 받는다는 점에서, 이는 앞서 \(5 \)b와 \(5 \)f가 LasR의 활성을 저해하지 못했다는 결과와 부합되는 결과라 할 수 있다. QscR의 경우는 직접 조절하는 유전자중에 병독인자로 알려진 유전자는 아직 없으나, LasR이나 RhIR등 다른 QS 수용체 단백질들에 의해 조절되는 유전자들 중 일부의 발현을 억제한다는 것이 보고된 바 있다. 본 실험과 앞서의 실험 결과들을 종합할 때 \(5 \)b와 \(5 \)f에 의하여 변화된 QscR의 활성 정도로는 LasR의 활성이나 녹농균의 병독성에 영향을 주지 못함을 알 수 있다.</p> <h2>저해제들이 녹농균의 생물막 형성에 미치는 영향</h2> <p>저해제들이 녹농균의 생물막 형성에 미치는 영향을 알아 보기 위해 생물막 형성 정도를 조사하였다. 여러 농도로 \(5 \)b와 \(5 \)f를 처리한 후, 정지 생물막 측정법(static biofilm assay)을 이용하여 측정하였을 때, 두 저해제 모두 의미있게 녹농균의 생물막 형성을 저해하였다. 특히 \(5 \)f를 \( 10 \mu \mathrm { M } \) 처리한 경우 처리하지 않은 것에 비해 \( 50 \% \) 이하로 생물막 형성이 감소하였다. 흥미롭게도 이들이 QS에 영향을 줄 때와는 달리, 생물막 억제 효과는 낮은 농도 범위에서도 나타났다. 이는 이 두 물질들이 생물막 억제제로 쓰일 수 있음을 의미하는 동시에, 이들에 의한 생물막 형성의 저해가 QS 저해의 결과로 나타난 것이 아닐 수도 있음을 시사하는 것이었다. 이를 보다 정확히 살펴보기 위해 생물막 형성 과정 동안 시간에 따른 생물막의 성숙 정도를 현미경을 통해 관찰해 보았다. 이를 위해 녹색 형광 단백질(GFP; green fluorescence protein)을 발현하는 플라스미드(pAB \(1 \))를 도입한 녹농균을 drip flow-cell 내의 유동 배지 속에서 흘리면서 생물막을 형성시키는 적하 유동 생물막 형성 방법(drip-flow biofilm formation)과 이를 형광 형미경으로 관찰하는 방법을 통해 이 물질들이 어느 단계에서 생물막 형성을 저해하는지 조사해 보았다. \(5 \)b의 경우 생물막 형성을 특이적으로 억제하는 특정 단계가 뚜렷이 관찰되지 않았으나, 흥미롭게도 \(5 \)f의 경우는 녹농균의 초기 부착단계를 저해하였으며, 일단 부착이 일어난 다음 성숙하는 단계에서는 의미있는 영향을 미치지 않았다(data not shown). 오랫동안 녹농균에서 QS과 생물막 형성이 밀접한 관계가 있다는 것이 많이 보고되어 왔음에도 불구하고, 최근에는 생물막 형성에 QS 이외의 다른 조절인자들도 영향을 미친다는 보고들도 많아서, 생물막 형성은 QS와 독립적으로도 여러 주변 인자에 의해 다양하게 조절 받을 수 있다고 생각된다. 특히 생물막의 성숙은 QS에 의해 영향을 많이 받을 수 있으나, 초기 부착과 같은 단계에서는 cyclic di-GMP와 같은 세포내 신호전달 물질들의 영향을 많이 받는다는 것이 알려져 있다. 본 실험에서 \(5 \)b와 \(5 \)f가 QS에 영향을 주는 농도보다 훨씬 낮은 농도에서 생물막 형성을 억제한 것이나, \(5 \)f의 경우 생물막의 성숙이 아닌 초기 부착을 억제하였다는 점에서 이들이 QS와는 독립적인 경로로 생물막 형성을 억제하였을 가능성이 매우 높다고 생각된다. 본 연구는 세균 QS 저해제 개발을 위한 지속적 연구의 일환으로 이전 연구에서 in silico 모델링을 이용한 스크리닝을 통해 QS 저해제로 발굴된 두 가지 물질에 대한 보다 심층적인 평가를 위한 것이었다. 결론적으로 이들 화합물들이 대장균 리포터 균주에서는 \(3 \)OC \(12 \)-HSL 수용체중 LasR의 활성을 억제한 것과는 달리, 녹농균에서는 LasR보다는 녹농균의 또 다른 \(3 \)OC \(12 \)-HSL 수용체인 QscR의 활성에 주된 영향을 주며, 그 영향도 단순한 활성 억제라기 보다는 \(5 \)b의 경우 활성 증가이거나, 혹은 \(5 \)b의 경우처럼 농도에 따른 활성 억제였음을 알 수 있었다. 이러한 차이는 대장균과 녹농균 두 균주간에 단백질의 접힘이 다르게 나타나거나, 혹은 \(5 \)b나 \(5 \)f의 대사 과정이 달라 서로 다른 물질로 변환되기 때문일 수 있다. 이에 대한 보다 자세한 기전 연구가 필요하다고 생각된다. 또한 이들 물질이 녹농균의 생물막 억제 효과가 있음을 새로이 발견하였는뎨, 이들 물질들이 QS에 영향을 주더라도 대표적 병독소인 프로테아제의 발현에 영향을 주지는 못하였으므로, 녹농균의 병독성을 증가시키지 않으면서 생물막을 억제 할 수 있는 물질로 이들을 개발할 수 있을 가능성이 있다고 생각된다.</p> <h1>요 약</h1> <p>그람음성 간균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 비뇨기, 각막, 호흡기, 화상부위 등에 광범위하게 감염하는 기회감염성 병원균으로, 병원성의 발현에 세균의 세포밀도 인식 기전인 쿼럼 센싱(quorum sensing)이 매우 중요하게 관여한다. 사전 연구에서 녹농균 감염력을 제어하기 위한 방법으로 쿼럼 센싱의 주 신호물질인 \(N \)- \(3 \)-oxododecanoyl-HSL( \(3 \)OC \(12 \)-HSL)의 분자 구조가 변형된 물질들을 합성하여 쿼럼 센싱 억제물질로 사용하고자 하였으며, 그 중 두 개의 물질들 ( \(5 \)b, \(5 \)f)이 대장균을 이용한 스크리닝을 통해 녹농균의 주요 쿼럼 센싱 수용체 단백질인 LasR의 활성을 억제할 수 있음을 확인하였었다. 본 연구에서는 이 물질들의 효과를 보다 면밀히 분석하기 위하여 실제 녹농균에서 이 물질들이 쿼럼 센싱과 병독성을 억제할 수 있는지 분석해 보았다. 대장균을 이용한 리포터 분석에서와는 달리, \(5 \)b와 \(5 \)f 모두 녹농균에서 직접 처리하였을 때는 LasR의 활성에 영향을 주지 못하였다. 대신 이 물질들은 녹농균의 또다른 쿼럼 센싱 수용체 단백질인 QscR의 활성에 선택적으로 영향을 주었다. 흥미롭게도 이 물질들의 효과는 대장균에서 얻어진 결과와는 달랐으며 다소 복잡하였다. 두 물질 모두 낮은 농도 범위 \( (<10 \mu \mathrm { M } ) \)에서 QscR의 활성을 증가시켰으며, 높은 농도의 \(5 \)f( \( \approx 1 \mathrm { mM } ) \)는 QscR을 강하게 억제하였다. 두 물질 모두 중요한 병독인자인 프로테아제 활성에는 영향을 주지 않으면서도, 만성감염을 매개하는뎨 중요한 생물막의 형성은 의미있게 감소시켰다. 특히 \(5 \)f는 생물막의 성숙단계 보다는 녹농균 세포의 초기 부착을 억제하였다. 이러한 결과들을 바탕으로, \(5 \)f의 경우 독성의 증가 없이 생물막 형성을 억제할 수 있는 물질로 응용이 가능하다고 제안한다.</p>