본 실험에 사용된 도토리 화분은 마쇄기를 통한 1차 마쇄 후 에탄올 침지를 이용하여 추출하였다. 추출액은 여과, 농축 후 분말로 조제하였고 이를 순차적 극성 용매와 물 잔류물로 회수하였다. 각 분획물은 분말화한 뒤 활성 및 성분 분석 평가에 사용하였다. 항산화 활성은 DPPH, ABTS, 환원력 측정으로 평가하였으며, 혈액응고 저해 활성은 시판 control plasma를 이용하여 TT, PT, aPTT를 측정하여 평가하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>도토리 화분 및 시약</h2><p>본 실험에 사용된 도토리 화분은 2019년 봄에 강원도지역에서 채취 한 화분을 구입하여 \(-20^{\circ}\mathrm{C}\)에서 냉동 보관하면서 사용하였다. 도토리 화분은 마쇄기(FoodMix-150W, Angel Electric Co., Bucheon, Korea)로 1분간 1차 미쇄한 후 \(95\%\) ethanol (Daejung Chemicals \(&\) Metals Co., Ltd. Korea)에 침지하여 추출하였다(Fig. 1). Dimethyl sulfoxide (DMSO)와 Triton X-100은 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA)의 시약급 이상의 제품을 구입하여 사용하였다.</p><h2>도토리 화분의 추출물 및 극성별 유기용매 분획물 조제</h2><p>도토리 화분의 추출물은 \(95\%\) ethanol (Daejung Chemicals \(\&\) Metals Co., Ltd. Korea)을 시료의 20배를 가하고 상온에서 8시간씩 5회 추출하여 조제하였다. 추출액은 filterpaper (Whatsman No. 2, GE healthcare UK limited, UK)로 거른 후 감압 농축(Eyela Rotary evaporator N-1000, TokyoRikakikai Co., Ltd., Tokyo, Japan)하여 분말로 조제하였으며, 이후 추출물을 물에 현탁한 후 n-hexane, ethylacetate 및 butanol을 이용하여 순차적으로 극성별 용매 분획하고, 물 잔류물을 회수하였다. 각각의 분획물들은 감압 농축하여 분말화하였으며, 이후 분말 시료들은 \(99.9\%\) DMSO 용액에 적당한 농도로 녹여, 항산화 활성, 항혈전 활성, 적혈구 용혈 활성 및 성분 분석 평가에 사용하였다.</p><h2>도토리 화분 추출물 및 분획물의 항산화 활성</h2><p>도토리 화분 추출물 및 분획물의 항산화 활성은 DPPH(1,1-diphenyl2-picryl hydrazyl) 음이온 소거능, ABTS[2,2-azobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)] 양이온 소거능, nitrite 소거능] 및 환원력 측정으로 평가하였다. DPPH 음이온 소거능, ABTS 양이온 소거능 및 환원력의 비교 평가 시 추출물 및 분획물의 최종 농도는 \(0.5 \mathrm{mg/ml}\)로 조정하였으며, nitrite 소거능의 경우 \(0.2 \mathrm{mg/ml}\)로 조정하였다. 활성 평가는 기존보고와 동일한 방법으로 측정하였으며, 각각 3회 반복한 실험의 평균과 편차로 표시하였다.</p><h2>도토리 화분 추출물 및 분획물의 혈액응고 저해 활성</h2><p>도토리 화분 추출물 및 분획물의 혈액응고 저해 활성은 thrombin time (TT), prothrombin time (PT) 및 activated partial thromboplastin time (aPTT)을 측정하여 평가하였다. 모든 실험은 3회 반복하여 평균치로 나타내었으며, 각각의 항응고 활성은 시료 첨가 시의 응고 시간의 평균치를 대조구 DMSO 응고시간의 평균치의 비로 나타내었다. 활성 평가에 사용한 혈장은 시판 control plasma(MD Pacific Technology Co., Ltd, Huayuan Industrial Area,China)를 사용하였으며, PT reagent와 aPTT reagent는 MDPacific Hemostasis (MD Pacific Technology Co., Ltd, Huayuan Industrial Area, China)의 분석시약을 사용하여 측정하였다. 기타 시약은 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA)의 시약급 이상의 제품을 구입하여 사용하였다.</p>