2003년도에 토양에서 시료를 채취하여 CTAB을 이용해 humic acid와 같은 화합물을 제거하는 방법, PEG, NaCl 및 potassium acetate 침전방법, 그리고 또 다른 방법 III을 사용했을 때 마지막 방법이 정제도에 있어 제일 효과적이어서 그 방법으로 토양 시료를 처리해주는 것이 가장 효과적이라고 판단된다. 위의 실험 결과를 토대로 토양 DNA를 분자생물학적 기술에 적용하기 위해서는 반드시 올바른 정제과정을 통해 humic acid와 작은 bp의 RNA들과 같은 저해물질의 제거가 필요할 것으로 사료된다.
<h1>결 과</h1> <h2>토양시료의 채취</h2> <p>채취한 토양시료의 \( \mathrm{pH} \)를 확인하기 위해 토양 \( 5 \mathrm{~g} \)을 증류수 \( 10 \mathrm{~ml} \)에 현탁하여 원심분리하고 그 상등액의 \( \mathrm{pH} \)를 측정하였다. 토양의 표층으로부터 \( 30 \sim 50 \mathrm{~cm} \) 깊이의 토양을 채취했음에도 불구하고 채취한 토양의 \( \mathrm{pH} \)가 3.75 ~ 4.71로서 산성 토양임을 보여 주고 있다.</p> <h2>토양 DNA 분리법의 비교</h2> <p>2003년도에 채집한 토양 시료 1과 2를 대상으로 각각의 분리 방법을 적용한 결과, DNA 회수율과 정제도는 큰 차이를 나타내었다. 방법 I은 CTAB를 첨가하여 humic acid와 같은 화합물 제거를 시도한 방법으로서 DNA 회수율은 토양 \( 5 \mathrm{~g} \)당 \( 5080 \mu \mathrm{g} \)과 \( 5875 \mathrm{\mu g} \)으로서 상당히 높은 편이었으나 정제도 \( \left(\mathrm{A}_{260} / \mathrm{A}_{280}\right) \)는 1.214 와 1.218로 대체로 낮은 편이었다. 방법 Ⅱ는 PEG와 \( \mathrm{NaCl} \) 및 potassium acetate 침전을 실시하여 정제도의 향상을 기대했으나, 예상과 달리 방법 I에 비해 DNA 회수율도 \( 278 \mu \mathrm{g} \)과 \( 532 \mu \mathrm{g} \)으로 낮으면서 정제 도도 1.173과 1.197로서 더 낮았다. 그리고 방법 III의 경우, DNA 회수율은 \( 521 \mu \mathrm{g} \)과 \( 1028 \mu \mathrm{g} \)으로서 방법 I에 비해 \( 10 \sim \) \( 20 \% \) 정도로 낮은 편이었으나 정제도는 1.359와 1.375로 3가지 방법 중 가장 높게 나타났다. 한편 agarose gel 전기영동을 통해 각 시료를 비교한 결과, 분리방법에 따른 DNA 간의 농도 차이는 보이지 않았는데, 이는 가장 높은 회수율을 보인 방법 I로 분리한 DNA의 경우, 저분자 부분에 다량 존재하는 RNA나 humic acid로 추정되는 이물질이 흡광도에 영향을 주었기 때문이다. 이상의 결과를 토대로 본 연구진에 서 확립한 방법 III이 기존의 방법들에 비해 더 효율적인 것으로 판단하였다.</p> <h2>변형된 방법에 의한 토양 DNA의 분리</h2> <p>클로닝이 가능한 genomic DNA를 토양으로부터 분리하기 위하여 상기의 결과에서 선정된 방법 Ⅲ 을 이용하여 2004년도에 채집한 토양 시료 3 ~ 6을 대상으로 genomic DNA 분리를 실시하였다. 분리된 DNA의 회수율은 토양 \( 5 \mathrm{~g} \)당 \(463 \sim 785 \mu \mathrm{g} \)이었고, 정제도는 1.528 ~ 1.655 정도로 각각 확인되었는데, 이는 전 단계 실험에 비해서 회수율은 유사하였지만, 정제도가 월등히 높게 나타난 것으로서 2003년도 시료는 거즈로 단순히 거르기만 한 것에 비해 2004년도 시료는 그늘지고 통풍이 잘 되는 곳에서 하루 건조시킨 후, 거즈로 작은 돌과 나무뿌리, 나뭇잎 등의 이물질을 제거하는 등 전처리를 충분히 해 준 것도 일부 요인으로 작용했을 것으로 판단되었다.</p> <h2>분리된 토양 DNA의 분자생물학적 검정</h2> <p>우선 각 시료에 대한 PCR 적용 여부를 확인한 결과, Fig. 2 에서와 같이 방법 III으로 분리한 genomic DNA를 \( 10^{-3} \sim 10^{-6} \)의 농도로 희석했을 때에만 약 \( 350 \mathrm{bp} \) 크기의 product를 확인할 수 있었는데 이는 DNA 시료의 희석과정을 통해 humic acid와 같은 저해물질들 역시 충분히 희석되어 PCR 반응을 저해시키지 못한 것으로 판단되었다. 그러나 토양 DNA를 클로닝 하는데 필요한 \( 6 \mathrm{bp} \)를 인식하는 BamHI, EcoRI, HindIII, KpnI, SacI, SalI, XhoI 등의 제한효소와 \( 4 \mathrm{bp} \)를 인식하는 Sau3AI 등의 제한효소를 처리한 결과, 각 분리방법에 의해 분리된 토양 DNA는 본 연구에서 사용된 모든 제한효 소에 의해 절단되지 않았다.</p> <p>상기의 결과들을 통해 토양에 미량 존재하는 humic acid와 같은 물질들이 상당한 저해 작용을 하는 것으로 확인되었으므로 토양 DNA를 분자생물학적 기술에 적용하기 위해서는 반드시 정제과정을 통해 저해물질의 제거가 필요할 것으로 사료된다.</p>