Opuntia속 선인장 중 손바닥 선인장에서 추출 분획한 물질 중 항균 활성이 높은 MBT-01108 물질을 시중에서 시판되는 일반 소독제 7종, 항생제 7종과 비교해 항균 활성을 측정했다. 항균 활성을 검토하기 위해 wild type Salmonella enteritidis ATCC 13076, Streptococcus faecalis ATCC 10541, Pseudomonas aeruginosa KCTC 1636, Staphylococcus aureus KCTC 1621, Escherichia coli KCTC 1039 다섯 균주를 시험 균주로 선택해서 배양 후 시험균들의 내성 획득 여부를 MIC test와 paper disc 방법을 사용해 확인했다. 각 항생제 및 MBT-0110801108 물질의 항균 실험은 먼저 공시 균주를 이용하여 paper disc 방법으로 관찰한 후 inhibitory zone이 생기는 최소 농도의 항생제 및 MBT-0110801108 물질의 양을 결정해서 내성 균주들에 대해 위와 동일한 방법으로 항균 활성을 시험하고 inhibitory zone을 관찰했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료</h2> <p>시중에서 시판되는 일반 소독제를 분류에 따라서 과산화제, 염소제, glutaraldehyde, diguanide 유도체, 4급 암모늄 계면 활성제, 양성 계면 활성제, 요오드제 각 한 가지씩 사용하였고, penicillin, aminoglycoside, chloramphenicol, rifampin, tetracycline 계 항생제를 선별해서 사용하였다.</p> <p>본 연구실에서는 Opuntia속 선인장 중에 손바닥 선인장 (Opuntia ficus-indica var. Saboten Makino, 원산지 : 멕시코)을 사용해서 추출 분획하였고, 획득한 물질 중에서 항균 활성이 높은 MBT-01108 물질을 본 실험에 사용하였다.</p> <h2>균주 및 배지</h2> <p>소독제와 항생제 내성 시험에 사용된 균주 및 배지는 Table 1과 같다. 손바닥 선인장 추출물의 항균 활성을 시험하기 위하여 임상 분리 균주인 MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus), Resistant Pseudomonas aeruginosa, VRE (Vancomycin Resistant Enterococcus), Esherichia coli O157은 환자로부터 분리된 균주를 사용하였다.</p> <h2>실험 방법</h2> <h3>일반 소독제에 대한 내성 균주 선별</h3> <p>항균 활성을 검토하기 위하여 wild type Salmonella enteritidis ATCC 13076, Streptococcus faecalis ATCC 10541, Pseudomonas aeruginosa KCTC 1636, Staphylococcus aureus KCTC 1621, Escherichia coli KCTC 1039 다섯 균주를 시험 균주로 선택해서 Luria-Bertani (LB, Ventech bio, Korea) broth 에 접종해 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{~rpm} \)으로 16시간 배양하였다. \( \mathrm{OD}_{660} \)에서 흡광도를 측정 후 \( 1 \times 10^{6} \mathrm{~CFU} / \mathrm{ml} \)이 되도록 희석을 하여 스코테린 \( { }^{\circledR} \), 푸드세프, 와이덱스액 \( { }^{\circledR} \), 헥시덱스액, 동인염화벤잘코뇸액, 동인테고, Iodo 175 등의 소독제 별로 최소 생육 억제 농도 (Minimal Inhibitory Concentration, MIC) test를 하였다. 각 소독제에 대한 최소 억제 농도를 기준으로 하여 wild type의 균주들을 먼저 LB broth에 소독제와 같이 접종을 하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{~rpm} \) 으로 16시간 배양하였다. 이후에 소독제가 첨가된 평판 배지에 도말하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20시간 배양 하였다. 평판 배지에 자란 colony중에 단일 colony를 picking 하여 소독제가 첨가된 LB broth에 접종하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{~rpm} \) 으로 16시간 배양한 후 MIC test를 시행하였으며, 이와 동일한 방법으로 반복 실행한 결과에 의해 이 농도를 넘어선 균주들을 내성균으로 간주하고 그 빈도를 측정하였다.</p> <h3>항생제에 대한 내성 균주 선별</h3> <p>각 소독제에 대한 기준 MIC 값을 넘어선 균주들을 사용하여 ampicillin, chloramphenicol, gentamycin, kanamycin, rifampicin, streptomycin, tetracycine 일곱 가지의 항생제를 사용해 각 항생제에 대한 내성 균주를 선별하였고 빈도를 측정하였다. 먼저 각 항생제에 대해 소독제와 동일한 방법으로 wild type의 다섯 균주들을 MIC test하였고 최소 억제 농도를 기준 값으로 정하였다. 각 소독제에 대해 내성균으로 간주된 균들을 사용하여 LB broth에 최소 억제 농도의 소독제를 첨가해서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{~rpm} \)으로 16시간 배양하였다. 이후에 소독제가 첨가된 평판 배지에 도말하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20시간 배양하였다. 평판 배지에 자란 colony 중에 단일 colony를 picking하여 소독제가 첨가된 LB broth에 접종하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 200 \mathrm{~rpm} \)으로 16 시간 배양한 후 \( \mathrm{OD}_{660} \)에서 흡광도를 측정 후 \( 1 \times 10^{6} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \)이 되도록 희석하여 각 항생제별로 MIC test를 실시하였다. 또한 소독제에 대한 내성 균주들을 paper disc법에 의하여 평판 배지에 \( 100 \mu l\)에 도말한 후 각각의 항생제를 사용하여 paper disc \( (\Phi 8 \mathrm{~mm}) \) 에 흡수시킨 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 20시간 배양하여 항균 활성을 검토하였다.</p> <h3>손바닥 선인장 추출 · 분획 물질의 항균 활성 검토</h3> <p>제주도 손바닥 선인장을 추출 · 분획한 물질 중에서 가장 항균 활성이 높은 물질인 MBT-01108 물질을 이용하였다. 일곱 가지 소독제와 일곱 가지 항생제에서 선별된 내성균과 환자로부터 분리한 균주인 MRSA, R-Pseudomonas aeruginosa, VRE, E. coli O157을 사용하여 MBT-01108 물질의 항균 활성을 검토하였고, 시험균들의 내성 획득 여부를 MIC test와 paper disc 방법을 사용해서 확인하였다. Paper disc 방법에 사용하기 위하여 MBT-01108 물질의 농도를 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)로 동일하게 하여 시험 균주에 사용하였다. 또한 MIC test에 사용 하기 위하여 MBT-01108 물질을 농도가 \( 200 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)이 되도록 멸균된 \(12.5\)% DMSO (Dimethylsulfoxide, Sigma, USA)에 녹인 후에 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) filter (Sartorius, Germany)로 여과 제균시켰다. 그 다음 각각의 배지가 들어 있는 96-well plate에 MBT-01108 물질의 최고 농도가 \( 25 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)이 되도록 첨가한 후에 두 배 연속 희석법 (two-fold serial dilution method)으로 \( 0.05 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도까지 희석하여 사용하였다.</p> <h3>항균 활성 측정</h3> <p>각 항생제 및 MBT-\(01108\) 물질의 항균 실험은 먼저 공시 균주를 이용하여 paper disc 방법으로 관찰하였다. 평판 배지에 각 균주의 단일 colony를 한 백금이 취해 각각의 액체 배지에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(16\) 시간 동안 전배양하여 활성화 시킨 후 고체 배지에 배양액 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 를 떨어뜨려 균일하게 도말한다. 멸균된 paper disc를 넣고, 항생제 및 MBT-\(01108\) 물질의 각각의 농도별로 \( 100 \mu \mathrm{l} / \mathrm{disc} \) (농도 ; \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) )가 되도록 흡수시킨 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(24\) 시간 동안 배양한 후 disc 주위의 inhibitory zone을 관찰하였다. 이후에 inhibitory zone이 생기는 최소 농도의 항생제 및 MBT-\(01108\) 물질의 양을 결정한 후 내성 균주들에 대해 위와 동일한 방법으로 항균 활성을 시험하고 inhibitory zone을 관찰하였다.</p>