모노레이어로 성장한 MCF-7 세포를 \( 0.25 \% \) trypsin-EDTA용 액으로 처리하여 싱글세포로 만들어 최종 세포농도 \( 5 \times 10^{6} \) cell \( / \mathrm{ml} \) 를 24시간 성장시키고 CJP와 PTP를 각각 \( 300 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 와 \( 500 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 로 처리하여 48 시간 또는 72 시간 동안 반응 시킨 후DNA를 분리했고 Monolayer로 자란 MCF-7 세포는 \( 0.25 \% \) trypsin-EDTA용액으로 처리해서 싱글세포로 만든 다음 최종 세포농도가 \( 5 \times 10^{5} \) cell \( / \mathrm{ml} \) 되도록 섞은 다음 각 \( 50 \mathrm{~mm} \) d한 접시 당 \( 2 \mathrm{ml} \) 씩 분주한 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24 시간 부착했다.
<h2>DNA 단편화</h2> <p>Monolayer로 자란 MCF-7 세포를 \( 0.25 \% \) trypsin-EDTA용 액으로 처리하여 single 세포로 만들어 최종 세포농도 \( 5 \times 10^{6} \) cell \( / \mathrm{ml} \) 를 24시간 배양하여 CJP와 PTP를 각각 \( 300 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 와 \( 500 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 로 처리하여 48 시간 또는 72 시간 동안 반응 시킨 다음 DNA를 분리하였다. 상층액을 회수한 후 PBS로 세척하고 trypsin EDTA를 처리하여 세포를 회수 후 원심분리 하여 다시 세포를 회수하였다. 이 세포에 \( 20 \%\) SDS \(125 \mathrm{ml} \) 를 첨가 하고 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4 시간 이상 반응 시켜 \( 6 \mathrm{~N} \mathrm{NaCl} 675 \mathrm{ml} \) 첨가하여 반응을 정지시킨 뒤 상층액에 phenol buffer \( 2.5 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 1 시간 동안 shaking하여 상층액을 모으고 phenol:chloroform:iso-amyalcohol (25:24:1)을 동량 처리하여 15 분 동안 shaking 후 원심 분리하여 상층액을 회수하였다. 여기에 chloroform:iso-amyalcohol (24:1)를 동량 처리하여 정제되도록 15 분 shaking하여 상층액을 회수한 다음 차가운 에탄올을 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12 시간 방치하여 DNA를 침전시 켰다. 상층액을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 9,000 \mathrm{rpm} \) 으로 20 분간 원심분리하여 침전물을 회수 후 건조시킨 뒤 TE buffer \( 20 \mathrm{ml} \) 로 녹여낸 다음 RNase \( 1 \mathrm{ml} \) 를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 1 \) 시간 방치 시킨 후 \( \times 6 \) dye을 \( 4 \mathrm{ml} \) 첨가하여 \( 1.5 \% \) agarose gel에서 \( 100 \mathrm{~V}, 2 \) 시간 loading하여 UV 상에서 촬영하였다.</p> <h2>세포주기 분석</h2> <p>Monolayer로 자란 MCF-7 세포를 \( 0.25 \% \) trypsin-EDTA용액으로 처리하여 single 세포로 만든 후 최종 세포농도가 \( 5 \times 10^{5} \) cell \( / \mathrm{ml} \) 되도록 희석하여 각 \( 50 \mathrm{~mm} \) dish 당 \( 2 \mathrm{ml} \) 씩 분주한 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24 시간 부착하였다. 부착된 세포는 배지를 제거 후 농도별로 희석한 CJP와 PTP를 각각 \( 500 \mathrm{ml} \) 씩 각 well에 첨가하여 총 볼륨 \( 5 \mathrm{ml} \) 이 되게 한 후 각각 48 시간 더 반응시켜 배지를 제거한 다음 PBS로 2회 세척하여 \( 0.25 \% \) trypsin-EDTA용액 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 와 배지 \( 1 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 세포를 회수했다. 회수된 세포는 cold ethyl alcohol을 최종 볼륨의 70\%가 되도록 하여 세포를 고정시키고 \( 1,000 \mathrm{rpm} \) 에서 5 분간 원심분리하여 상층액을 폐기하고 PBS \( 1 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 교반 후, 원심을 반복하여 세포를 회수 하였다. PI 용액 \( 40 \mathrm{ml} \) 와 RNase \( 2 \mathrm{ml} \) 를 PBS \( 1 \mathrm{ml} \) 에 희석하여 각 농도별로 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 암소에서 30 분간 반응하여 flow cytometer를 이용하여 세포의 주기를 분석하였다.</p> <h2>Caspase-3 활성 측정</h2> <p>세포사멸이 유도된 세포를 회수하여 cold cell lysis buffer \( 50 \mathrm{ml} \) 를 첨가하고 얼음에 10 분간 방치한 후 \( 1,000 \times g \) 에서 1 분간 원심분리하고 상층액을 회수하여 cold cell lysis buffer \( 50 \mathrm{ml} \) 로 희석하였다. \( 10 \mathrm{mM} \) DTT가 첨가된 reaction buffer \( 50 \mathrm{ml} \) 와 LEHD-pNA \( 5 \mathrm{ml} \) 를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 1 \sim 2 \) 시간 방치한 후 \( 405 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <p>Caspase- 3 activity \( =\frac{\text { OD of test sample-OD of blank }}{\text { OD of control-OD of blank }} \)</p> <h2>환경호르몬에 의해 유도된 암세포의 성장 억제 효과</h2> <p>Monolayer로 자란 MCF-7 세포를 \( 0.25 \% \) trypsin-EDTA용액으로 처리하여 single 세포로 만들고 \( 5 \times 10^{4} \mathrm{cell} / \mathrm{ml} \) 로 조절하여 48well plate에 분주하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24시간 배양하였다. CJP와 PTP를 처리하기 1 2시간 전에 배양한 세포의 배지를 흡입하고 \( 1 \% \) cFBS가 들어간 배지로 교환하였다. 여기에 미리 녹여 준비한 bisphenol A와 esreadiol 각 \( 25 \mathrm{ml} \) 와 CJP와 PTP를 각각 \( 25 \mathrm{ml} \) 씩 혼합하여 총 볼륨이 \( 250 \mathrm{ml} \)가 되게 분주 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 72 시간 배양하고 SRB assay를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p>