주요 실험 내용은 6주령 BALB/c 마우스를 대한바이오링크에서 분양 받아, 조절된 온도와 습도의 사육실에서 명암 주기를 적용하여 사육하였다. HBBS 버퍼에 FBS를 첨가해 세포 농도를 \(1 \times 10 ^ { 6 } \) \( \mathrm { cells/ ml } \)로 조정한 후, 96-well microplate에 세포현탁액을 분주하였다. 특정 조건에서 배양 후 비부착성세포를 제거하였고, 다 당체와 LPS를 첨가한 후 다시 배양하였다. 분리된 대식세포에서 Lysosomal enzyme의 활성을 측정하였다.
<p>\( \mathrm { ITCH } _ { 50 } ( \%) = \frac {\mathrm { TCH } _ { 50 } \text { of control } - \mathrm { TCH } _ { 50 } \text { treated with sample } } {\mathrm { TCH } _ { 50 } \text { of control } } \times 100 \)</p> <h2>실험 동물</h2> <p>BALB/c 마우스(6주령, male)를 (주)대한바이오링크로부터 분양 받아 사용하였으며, 사육실 환경은 온도 \( 22 \pm 2 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 습도 \( 55 \pm 5 \% \) 정도를 유지하고 12시간 간격으로 명암을 구분하였다. 사육기간 동안 사료((주)삼양)와 음료(1차 증류수)는 충분히 공급하였다.</p> <h2>대식세포의 분리</h2> <p>대식세포(macrophage)는 5-8주령 우성 BALB/c 마우스의 복강내에 \( 10 \% \) thioglycollate medium \( 3 \mathrm { ml } \) 을 복강에 주입한 후 3일 이내에 회수하였다. 세포 농도는 \( 10 \% \) FBS (fetal bovine serum)가 첨가된 HBBS (Hank's balanced salt solution) buffer를 이용하여 \( 1 \times 10 ^ { 6 } \) \( \mathrm { cells/ ml } \) 로 조정하였고, 그 후, 96-well microplate의 각 well에 세포현탁액 \( \left (2 \times 10 ^ { 5 } \right . \) \( \mathrm { cells/ well } ) \) \( 200 \mathrm {\mu \mathrm { l } } \) 씩 분주하였다. 상기 세포를 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건에서 2시간동안 배양한 후 plate를 강하게 털어서 비부착성세포를 제거하고 부착성 대식세포를 분리하였다. 세포내, 외 다 당체와 LPS를 10,50 및 \( 100 \mathrm {\mu } \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도로 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건 하에서 48시간 동안 배양하였다.</p> <h2>대식세포의 lysosomal enzyme 활성 측정</h2> <p>Lysosomal enzyme 활성은 96-well flat-bottomed tissue culture plates를 이용하여 분석하였다. \(0.1 \% \) Triton X-100 \( 25 \mathrm {\mu \mathrm { l } } \) 를 첨가하여 microplate \( \left (2 \times 10 ^ { 5 } \right . \mathrm { cells/ well } \) ) 내에서 대식세포 단층을 용해시켰다. \( 10 \mathrm { mM } \) PNPP (p-nitrophenyl phosphate) 용액 \( 150 \mathrm {\mu \mathrm { l } } \)를 대식세포의 lysosomal enzyme (acid phosphatase)의 반응기질로서 첨가하였다. 그 후, \( 50 \mathrm {\mu \mathrm { l } } \) citrate buffer을 각 well에 첨가한 후, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1시간 동안 배양한 다음, \( 0.2 \mathrm { M } \) borate buffer ( \( \mathrm { pH } \) 9.8) \( 25 \mathrm \mathrm {\mu \mathrm { l } } \)를 반응 혼합물에 첨가하고, \( 405 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>