GUS 유전자를 함유한 pCAMBIA 1302 벡터를 Agrobacterium EHA105에 도입해 준비한 후 dipping 처리해 치상하여 5일 간 암배양하였다. 이 접종 개체는 제균 및 치상했으며 이후 염색용액에 넣어 배양기에서 overnight 처리했다. 이어서 이를 탈색해 PLB와 식물체의 GUS 발현 여부를 관찰했다.
<h2>호접란 PLB 증식을 위한 배지 첨가물의 조건</h2> <p>활성탄소 분말의 첨가가 페놀성 화합물의 제거에 미치는영향을 조사하기 위하여 활성탄소 분말을 PLB 증식배지에각각 \( 0.5 \mathrm { ~g } / 1 \)과 \( 1 \mathrm { ~g } / 1 \)을 첨가하였다. 또 식물호르몬(thiamine)의 첨가가 PLB 증식에 얼마나 효과가 있는지 알아보기 위하여 thiamine을 \( 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { l } \)의 농도로 배지에 첨가하여 thiamine을 첨가하지 않은 배지와 PLB 생육을 비교하였다. PLB 증식배지 내 sucrose 농도 차이가 PLB 증식율에 미치는 영향을알아보기 위하여 기본 Hyponex 배지에 sucrose를 10, 20 및 \( 30 \mathrm { ~g } / 1 \)의 농도로 첨가하여 증식율을 조사하였다.</p> <h2>Agrobacterium 준비 및 감염</h2> <p>호접란 형질전환을 위해 GUS 유전자를 함유하고 있는 pCAMBIA 1302 벡터를 Agrobacterium EHA105에 도입하였다. Agrobacterium은 형질전환 실험 2일 전에 hygromycin 50 \( \mathrm { mg } / 1 \)와 kanamycin \( 75 \mathrm { mg } / 1 \)이 함유된 YEP배지에서 진탕배양되었다. 배양된 Agrobacterium을 acetosyringone이 함유된 AM 배지에 OD값 0.8이 되도록 현탁하였다. PLB는 접종하기 3일 전에 새 PLB 배지에 계대하여 pre-culture 하였다. 이 PLB를 filter paper 위에 올려 핀셋으로 고정시킨 뒤 철제침에 준비된 현탁액을 묻혀 PLB를 전체적으로 3-4번 찔러 상처 내는 dipping 처리를 하였다. 그 후 Agrobacterium을 현탁한 AAM 배지에 dipping 처리된 PLB 절편을 담가 다시 20분 간 접종한 후 \( 100 \mathrm { uM } \) acetosyringone이 함유된 AAM 배지에 치상하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5일간 암배양하였다.</p> <h2>제균 및 치상</h2> <p>5일 동안 공배양한 접종 개체는 carbenicillin이 \( 200 \mathrm { mg } / \mathrm { l } \)함유된 멸균수에 3회 세척한 뒤 멸균된 filter paper에 올려 건조시켰다. 그리고 dipping 처리되지 않은 PLB의 절단면부분이 배지에 닿도록 치상하였다. 이후 hygromycin이 함유된 배지에서 광조건을 주어 PLB를 선발한 뒤 형질전환 식물체를 만들었다.</p> <h2>GUS expression assay</h2> <p>형질 전환체의 GUS activity 측정을 위하여 접종한 PLB조직을 \( 50 \mathrm { mM } \mathrm { NaH } \mathrm { N } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } \cdot \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } , 10 \mathrm { mM } \) EDTA와 \( 0.3 \mathrm { M } \) Mannitol이 함유된 5-bromo-4-chloro-indolyl glucuronie(X-Gluc) 염색용액에 넣어 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 배양기에서 overnight 처리하였다. 처리 후 \( 99.5 \% \)의 ethanol을 탈색용액으로 사용하여 chlorophyl이 제거될 때까지 반복적으로 탈색시킨 뒤 PLB와식물체의 GUS 발현 여부를 관찰하였다.</p>