HEK293, K562, A549 세포는 배양기에서 배양했으며, Pfu DNA polymerase을 이용해 분리한 promoter 영역을 PCR로 증폭하여 증폭된 산물에서 염기서열을 확인했다. K562, HEK293, A549 세포주는 각각의 promoter를 포함하는 pGL3-baseic vector와 Lipofectamine2000을 함께 co-transfection한 후 활성을 측정하였다. Mutant plasmid는 QuikChange site-directed mutagenesis kit와 mutant oligonucleotides을 이용해 합성하였고, 각 세포로부터 핵단백질 추출에는 Nuclear extraction kit를, Probe와 핵단백질 결합에는 Gel shift Assay kit를 사용했다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포 배양</h2><p>Human embryonic kidney (HEK)293 (ATCC CRK-1573), K562 chronic myelogenous leukemia (ATCC CCL-243), A549 lung cancer (ATCC CCL-185) 세포주는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. HEK293는 DMEM (Gibco, Grand Island, NY, USA)을 K562와 A549세포는 RPMI에 각각 \( 10 \% \) FBS와 \( 1 \% \) penstrep (Gibco)를 추가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 배양하였다.</p><h2>Promoter 합성 및 분리</h2><p>Pfu DNA polymerase (MBI Fermentas, MD, USA)를 이용하여 4개의 다른 HCCR promoter 영역을 합성하였다. 분리한 promoter 영역을 주형으로 Table 1에 제시한 primer를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 증폭된 산물은 pGL3-Basic vector의 XhoI과 KpnI 사이에 cloning하여 sequencing (GenoTech, Daejeon, Korea)을 통해 염기서열을 확인하였다.</p><h2>Luciferase (LUC) 정량</h2><p>K562, HEK293, A549 세포주는 각각의 promoter를 포함하는 \( 200 \mathrm{ng} \)의 pGL3-baseic vector와 internal standard로 \( 40 \mathrm{ng} \)의 pCMV-RL 혼합하여 \( 3 \mu \)의 Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 함께 co-transfection하였다. \( 30 \mathrm{hr} \)이 지난 후에 Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 각 promoter의 활성을 측정하였다.</p><h2>돌연변이생성(Mutagenesis)</h2><p>Mutant plasmid는 pGL3-406~+30을 주형으로 QuikChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA)와 mutant oligonucleotides (GenoTech, Table 1)을 이용하여 제공된 매뉴얼에 따라 합성하였다.</p><h2>핵단백질 추출(Nuclear protein extraction)</h2><p>Nuclear extraction kit (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 매뉴얼에 따라 각 세포로부터 핵단백질을 추출하였다. 먼저, \( 1 \times 10^{7} \)세포를 수거하여 \( 500 \mu l \)의 hypotonic lysis buffer에서 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 15 \mathrm{~min} \) 반응하여 세포를 파쇄하였다. 이를 \(10,000\times 8\)에서 \( 20 \mathrm{~min} 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 원심 분리하여 침전물을 extraction buffer \( (60 \mathrm{mM} \) HEPES \([pH 7.9]\), \( 1.5 \) \( \mathrm{mM}\) \( \mathrm{MgCl} 2\), \(420 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{NaCl}\), \(0.2 \mathrm{mM} \) EDTA, \(25\%\) glycerol, \( 1 \mathrm{mM} \) dithiothreitol, and protease inhibitor cocktail)를 이용하여 추출하였다.</p><h2>Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)</h2><p>\( 3 \mu \mathrm{g} \)의 K562에서 추출한 nuclear extracts를 이용하였고, Double-strand oligonucleotide probes (G36, TG, mTG, Table 1)를 [r-32P]ATP \( (3,000 \mathrm{Ci}\ / \mathrm{mmol}[10 \mathrm{mCi} / \mathrm{ml}] ; \) NEN Life Science products)와 T4 polynucleotide kinase (Invitrogen)로 표지하였다. Probe와 핵단백질 결합은 Gel shift Assay kit (Promega)를 제작사의 매뉴얼에 따라 진행하였다.</p>