질소원의 경우 탄소원을 최적 농도로 넣어 준 후 10종의 무기 및 유기 질소원을 \(0.5\%\)씩 첨가하고 \( 0.1 \sim 0.5 \% \) 농도에서 길항력을 조사하였다. 선발길항균의 담즙산에 대한 안정성을 알아보기 위하여 1일간 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양 후 길항력을 조사하였다. 배양상등액의 길항물질의 특성을 알아보기 위하여 \( 20^{\circ} \mathrm{C}\), \(25^{\circ} \mathrm{C}\), \(30{ }^{\circ} \mathrm{C}\), \(37^{\circ} \mathrm{C}\), \(45^{\circ} \mathrm{C}\), \(50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 선발 균주를 2일간 배양 후 길항력을 조사하였다.
<h2>선발 길항균주의 동정</h2> <p>선발균주 strain Y3의 분류학적 동정을 위해 Bergey's manual of systematic bacteriology의 세균 분류동정 지침서의 시험항목을 기준으로 하여 각 항목을 실험하였고, 최종적으로 Biolog사의 동정시스템(MicroLog \( \left.{ }^{\mathrm{TM}} 4.0\right) \)을 사용하여 검정실험 하였다. 각 실험에 사용한 배지조성과 실험방법은 Bergey's manual of systematic bacteriology을 참조하였다.</p> <h2>길항물질 생산을 위한 배지조건</h2> <p>Davis minimal medium\([\mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\) \(0.7 \%\), \(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\) \(0.2 \%\), Glucose \( 0.5 \% \), \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \) \(0.1 \%\), \(\mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \(0.01 \% \), glu-cose \( 0.1 \%] \)에 glucose를 제외시키고 10종의 탄소원을 \(1.0\%\)씩 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2일간 균을 배양한 후, 그 원심분리하여, 상등액을 균체량 측정법(cell mass test)에 따라 길항력을 조사하였다. 또한 견정된 최적의 탄소원에 대하여 \(0.1 \sim 1.0 \% \)까지 농도별로 길항력을 확인하였다.</p> <p>질소원 경우 Davis minimal medium에 질소원인 am-monium sulfate를 제외시키고 앞의 결과에서 선택된 탄소원을 최적 농도로 넣어 준 후 10종의 무기 및 유기 질소원을 \(0.5\%\)씩 첨가하고 길항물질 생산에 미치는 영향을 조사 후 \( 0.1 \sim 0.5 \% \) 농도에서 길항력을 조사하였다.</p> <h2>선발 길항균의 담즙산에 대한 안정성 및 길항력</h2> <p>선발길항균의 담즙산에 대한 안정성을 알아보기 위하여 LB평판배지에 전배양시킨 선발균주를 \(0.5\%\)까지 단계별로 담즙산이 첨가된 LB broth에 접종한 후 2일간 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다. LB broth에 가금티프스 원인균 Salmonella gal-linarum을 \( 50 \mu \ell \)씩 접종한 후 여과한 배양액 \( 1 \mathrm{ml} \)씩을 첨가하여 1일간 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양 후 길항력을 조사하였다.</p> <h2>선발 길항균의 \( \mathrm{pH} \) 및 온도에 따른 길항력</h2> <p>선발 길항균의 \( \mathrm{pH} \)에 대한 생육도와 안정성을 알아보기 위하여 LB평판배지에 전배양시킨 선발균주를 \( \mathrm{pH}\) \(3.0\sim 10.0 \)으로 조정된 LB broth에 접종하고 2일간 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양된 상등액을 이용하여 길항력을 조사하였다. 길항물질 생산에 대한 온도의 영향을 조사하기 위해 \( 20^{\circ} \mathrm{C}\), \(25^{\circ} \mathrm{C}\), \(30{ }^{\circ} \mathrm{C}\), \(37^{\circ} \mathrm{C}\), \(45^{\circ} \mathrm{C}\), \(50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 선발 균주를 2일간 배양 후 길항력을 조사하였다.</p> <h2>배양 상등액의 길항물질 특성 확인</h2> <p>배양상등액의 길항물질의 특성을 알아보기 위하여 LB액체배지 \( 1 \mathrm{~L} \) 에 선발균주를 배양한 후 \( 8000 \mathrm{rpm}\), 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액으로부터 고분자, 저분자를 분리하기 위하여 Amicon centriprep T10K를 이용, \( 3000 \times g \)에서 45분간 원심분리 하였고, 내열성을 알아보기 위하여 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 중탕으로 가열하였다.</p> <p>선별균주가 생산하는 길항물질을 n-butanol로 추출하여 조정제 후 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 감압 농축하고 증류수, methanol에 각각 용해하여 길항물질의 활성을 여지 디스크법(filter pa-per disk test)으로 조사하였다.</p>