LPS는 보통 macrophage에 작용해 TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \), IL-6의 생성을 촉진시키는데, CopA3는 이들 cytokine을 유의미하게 억제함으로써 염증 반응을 유도한다. 특히 CopA3는 농도에 따라 \( 50 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)에서 \(35 \% \) 이상, \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)에서는 \( 80 \% \) 이상의 NO 생성을 저해하며, iNOS와 COX-2 생성도 저해하는 것을 확인하였다. 이 결과로부터 CopA3는 염증 예방과 치료에 효과적임을 확인하였다.
<p>NO생성에 대한 CopA3의 효과를 알아보았다. 생성된 NO양을 griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 \( \mathrm { NO } _ { 2 } ^ { - } \)의 형태로 측정하였다. 그 결과 Raw 264.7 cell에 LPS를 처리한 후 CopA3를 처리한 NO 생성량의 변화는 Fig. 2에 나타내었다. LPS 처리 후 NO 생성량은 정상세포에 비하여 약 4배 이상 증가되었다. CopA3는 \( 50 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)의 \(35 \% \) 이상의 감소율을 나타내었으며, \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 농도에서는 \( 80 \% \) 이상의 NO 생성 저해를 일으키는 것을 확인할 수 있었다.</p> <h2>TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \), IL-6 생성 억제 효과</h2> <p>대식세포는 동물 체내 모든 조직에서 분포하는 면역세포로서 세균이나 이물질을 탐식 제거하며, IL-1 \( \beta \), IL-6, TNF- \( \alpha \) 등의 염증 매개 물질들을 분비하여 초기 염증 반응에 주요 역할을 담당 한다. 특히, TNF- \( \alpha \)는 염증반응에 있어서 중요한 역할을 하며 macrophage와 mast cell 등에서 분비되며, LPS반응의 주요 매개체로서 내재면역에 있어서도 중요한 역할을 하며 만성 염증 반응과도 관련되어 있다. IL-1 \( \beta \)는 T-cell의 활성화, B-cell의 성숙, NK cell의 activity를 활성화 하며, IL-6는 림프구를 활성화시켜 항체생산을 증가시키는 것으로, IL-6의 level은 염증성 병변에서 항상 증가하는 것으로 보고되고 있다. 본 실험에서 LPS는 TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \), IL-6의 생성을 증가시켰지만 CopA3 처리한 결과 TNF- \( \alpha \)는 \( 60 \% \) 생성 억제를 IL-1 \( \beta \), IL-6는 각각 \( 50 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)의 농도에서 \( 50 \%, 55 \% \)의 생성 억제 효과를 나타내었다. 일반적으로 LPS는 macrophage에 작용하여 TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \), IL-6의 생성 준비를 촉진시켜 염증반응을 유도하지만 CopA3는 이 세 가지의 cytokine을 유의성있게 억제하였다.</p> <h2>iNOS, COX-2 의 단백질 발현 저해 효과</h2> <p>iNOS는 평소에는 세포 내에 존재하지 않으나 일단 유도되면 장시간 동안 다량의 NO를 생성하며, 생성된 NO는 혈관 투과성, 부종 등의 염증 반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다. NO의 생성에는 NO synthase (NOS)가 작용하게 되는데, constitutive NO synthase (cNOS)와 iNOS 중 자극에 유도된 iNOS의 경우 오랜 기간 동안 다량의 NO를 생성하고, 생성된 NO는 guanyl cyclase의 활성과 동시에 세포독성을 나타내게 된다. 따라서 NO로 유도 되어진 RAW 264.7 cell에서 iNOS의 protein level의 감소를 확인으로서 항염증 효과를 기대할 수 있으며, 또한 세포와 같은 macrophage 따른 monocyte에서 TNF- \( \alpha \), IL-6와 같은 proinflammatory cytokine을 증가시키는 요인 중 하나인 COX-2의 protein level의 감소를 이끌어냄으로서 항염증 효과를 기대할 수 있다. CopA3에 의한 NO 생성 저해 기전을 확인하기 위해 western blot을 실시하여 iNOS의 단백질 발현을 측정 하였으며, western blot을 이용하여 COX-2의 발현을 측정하였다. 그 결과 LPS에 의해 증가된 iNOS와 COX-2의 단백질 발현량이 농도 의존적으로 유의성 있게 감소되었다. \( \beta \)-actin의 band density 비율에 따라 iNOS 단백질 생성을 \( 41 \% \)와 COX-2의 단백질 발현을 \( 56 \% \) 저해함을 확인 하였다. 이를 통해 CopA3는 iNOS, COX-2 의 생성을 저해하는 것을 확인할 수 있었다.</p> <h1>초록</h1> <p>CopA3를 이용하여 피부 염증에 대하여 연구를 하였다. 산화질소와 cytokine의 생산은 면역세포의 대표적인 염증인자이다. 세포는 LPS 처리 후 한 시간 뒤에 CopA3를 처리하였다. 세포 독성이 나타나지 않는 농도인 \(5, 25, 50, 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)를 사용하였다. CopA3는 NO, TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \), IL-6, iNOS, COX-2의 생성을 저해 시켰다. iNOS와 COX-2 역시 \( 100 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)의 농도에서 각각 \( 54 \%, 65 \% \)가 저해가 되었다. 게다가 CopA3는 염증성 사이토 카인인 TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \), IL-6의 생성을 감소 시켰다. 이러한 결과로 CopA3는 염증 예방과 치료에 효과적임을 확인 할 수 있었다.</p>