GRP78은 ER 내의 선택적 단백질에 대한 보류에 관여하며, 그 과도 표현이 모든 재조합 단백질의 발현을 향상시키지는 않는다. 이는 Oligosaccharide 그룹이 단백질의 folding, sorting, 분비 효율에 영향을 주기 때문이다. 또한 다른 배양조건이나 배양 시스템은 배양세포의 대사와 재조합단백질에 영향을 미치는 ER stress로 작용할 수 있다. TCA 회로를 통해 aspartate 공급이 가능하므로, glycosylation 과정에서 nucleotide 유용성이 중요하다. 마지막으로, ER folding 능력은 숙주 세포와 배양조건에 크게 의존하며, 이들 두 요소는 ER folding의 최적화를 위한 잠재적인 사이트를 제공한다.
<h2>ER 내 비정상 단백질의 축적 저해</h2> <p>ER folding 능력은 숙주 세포와 배양조건에 의해서 크게 영향을 받는데, 이들 두 factor는 ER folding의 최적화를 위해서 potential site를 제공한다. 본래 효율적인 protein-processing machinery를 가지는 세포를 찾는 것이 합리적인데, 예를 들어, antibody-producing cell로부터 유래된 cell line은 높은 수준에서 단백질의 분비를 처리하도록 프로그램 되어 있다. 단백질 축적을 막는 또 다른 수단으로는 세포 분비 효율을 개선하기 위해서 ER folding machinery를 조작하는 것 이다. ER 기능에 관한 초기 세포공학은 재조합단백질 발현과 ER chaperone up-regulation 사이의 관계에 초점을 맞추 었다. 이들 연구들은 분비 단백질들이 processing을 위해서는 ER chaperone을 요구한다는 것을 제시하였다. 특히, 단백질 분비경로에 있어서 GRP78의 over-expression이 실험되어졌다. 재조합단백질 folding의 촉진자로서, GRP78이 ER 내 혼란을 개선을 위한 유망한 후보자로 대두되었다. 그러나 과 발현된 GRP78은 일시적으로 결합하는 분비단백질에 대하여 오히려 분비 효율을 감소시켰다. 따라서 GRP78은 ER 내 선택적인 단백질에 대한 보류에 관여하며, 그것의 overexpression이 모든 재조합단백질에 대하여 발현을 향상시키지는 않는다고 생각된다.</p> <p>단백질 glycosylation은 단백질 processing의 또 다른 중요 한 결정자인자이다. Oligosaccharide 그룹이 단백질의 folding과 sorting 및 분비 효율에 영향을 주기 때문이다. 부정확하게 glycosylation된 단백질은 집합체를 형성하고 ER lumen에서 보류된다. Glycosylation machinery의 engineering은 EOR이나 UPR 영향을 미치지 않고도 훨씬 많은 양의 생체활성을 나타내는 재조합 당단백질을 생산하기 위한 가능성 있는 대안을 제공한다. 단백질 processing은 saccharide 그룹의 부재나 당이 절단됨으로써 다양한 수준에서 손상될 수 있다. Glycosylation process의 효율성과 정확성은 enzymatic machinery의 활성과 lipid-linked oligosaccharide donor의 유효성에 의해서 결정된다. 결론적으로, glycosylation을 개선하기 위한 접근 방법은 ER glycan assembly apparatus 효소의 과발현과 dolichol이나 nucleotide-sugar precursor와 같은 glycan chain 형성을 위한 기질의 공급을 조절하는 것을 포함하고 있다. Nucleotide-sugar의 농도는 nucleotide와 amino-sugar pool에 의존하며, 이 nucleotide와 amino-sugar pool은 각각 glucose 와 glutamine의 유효성에 의해서 영향을 받는다. Glucose limitation 조건에서, carbon source가 에너지 생산성을 위해서 우선적으로 사용되고 nucleotide가 RNA 합성을 위해서 소비될 때 nucleotide는 고갈된다. 이러한 과정은 절단된 dolichol-linked sugar precursor를 합성함으로써, 단백질 folding에 역효과를 나타낸다. 결론적으로, nucleotide feeding은 매우 중요하며, 또한 glucose feeding보다는 좀 더 효과적일 수가 있다. Amino-sugar의 유효성은 암모니아의 1차 공여체가 되는 glutamine의 공급에 의해서 결정될 수 있으며, 또한 glucosamine 혹은 galactosamine의 직접적인 feeding에 의해서도 결정될 수 있다.</p> <p>위에서 언급된 media supplementation과는 별개로, 다른배양조건 (산소 농도, serum content, 암모니아 존재)이나 배양 시스템은 배양세포의 대사와 재조합단백질에 영향을 미치는 ER stress로 작용할 수도 있다. 따라서 각 세포주에 대한 적정 조건을 규정하고 배양 기간 동안 세포주를 homogenous distribution하는 것이 필수적이다. 배양세포의 대사 상태는 숙주 세포의 primary metabolism을 공정함으로써 조절될 수도 있다. 예로써 GRP78로부터 단백질의 해리와 같은 proses의 몇몇 단계들이 에너지 의존적이기 때문에, 재조합단백질의 높은 수준의 발현은 좀 더 밚은 ATP 생산을 요구를 한다. 그러나 대부분 포유동물세포에서 glucose는 pyruvate를 위하여 산화되어 최종적으로 lactate로 되어, tricarboxylic acid (TCA) cycle를 통한 완전한 산화 보다 횔씬 적은 ATP 생산하고 결국은 media가 산패된다. 심지어 높은 에너지 요구 조건 하에서도, 숙주세포는 \( \mathrm{CO}_{2} \)와 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)를 위하여 glucose의 산화 보다는 오히려 glutamine의 산화에 의해서 부가적으로 요구되는 에너지를 생산 할 수 있다. 이러한 관점에서, 새로운 유전자의 발현을 위해서 TCA 회로와 같은 high-ATP-yielding metabolic pathway를 사용하는 directing cell은 세포 분비 효율을 개선 하기 위한 중요한 요소가 될 수 있다. 숙주 세포 내 cytoplasmic pyruvate carboxylase (PYC)의 도입은 glycolysis와 TCA 회로 사이의 결실된 연결을 재구성 한다. 즉, PYC 를 발현하는 세포는 glucose와 glutamine으로부터 좀 더 효율적인 에너지를 생산한다. 결론적으로, 이들 carbon source의 소비가 좀 더 낮아짐으로써 lactate와 ammonia의 생산을 감소시킴으로서 배양수명과 생산성이 확장된다. 또한, ammonia가 단백질 glycosylation에 역효과를 나타내므로, medium 내에 ammonia 농도의 감소는 재조합단백질의 품질과 양을 향상시킨다. 게다가 TCA 회로는 nucleotide 합 성을 위한 aspartate를 공급할 수 있으므로, glycosylation process를 위해서는 nucleotide 유용성이 매우 중요하다는 결론에 도달하게 된다.</p>