본문은 실험동물과 투여할 실험물질의 조건과 측정 방법을 설명하고 있다. 마우스 유방암 세포주 4T1-luc을 계대배양한 후 AZA에 의한 세포 독성을 알아보고자 CCK-8 assay를 이용해 세포 생존율을 측정하고, Tumorsphere 형성에서 AZA의 영향력을 알아보고자 at-tachment plates에 4T1-luc cell을 seeding하고 AZA를 처리했다. BALB/c 암컷 마우스에 4T1-luc 종양세포를 수집해 유방지방체에 접종하고, 대조군을 3군으로 나누어 DMSO, AZA를 투여하는 실험을 진행했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포주 배양 및 시약</h2> <p>마우스 유방암 세포주 4T1-luc은 Caliper life science(Alameda, CA)로부터 분양 받아 \( 100 \mathrm{~mm} \) 세포배양접시에 배양하였으며 3일 내지 4일 간격으로 계대배양 하였다. 배양액으로는 \( 10 \% \) fetal bovine serum과 \( 1 \% \) penicillin/streptomycin (Invitrogen, Grand Island, NY)이 첨가된 DMEM (Invitrogen)을 이용 하였으며 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) incubator에서 배양 하였다. 5-aza-2'-deoxycytidine AZA는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입 하였고, DMSO에 녹여서 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)로 소분하여 냉동상태로 \( \left(-80^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 보존하였다. 사용 시 생리식염수에 희석하여 사용하였다.</p> <h2>CCK-8 assay</h2> <p>AZA에 의한 세포 독성을 알아보기 위하여 CCK-8 assay(Dojindo Molecular Technologies, Inc)를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 4T1-luc cell 각 \( 5 \times 10^{3} \)개를 96-well plate에 seeding하고 24시간 전배양(pre-incubation)을 하였다. 그 후 AZA를 여러 농도별로 처리하고 72시간 배양한 다음 CCK-8용액 \( (10 \mu \mathrm{l} / 100 \mu \mathrm{l} \) cell culture medium)을 각 well에 첨가 시켜 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 동안 배양하였다. 반응이 끝난 plate는 \(450 \mathrm{nm} \) 파장에서 흡광도를 측정하여 세포생존 능력의 변화를 측정 하였다.</p> <h2>Tumorsphere 배양</h2> <p>Tumorsphere 형성에서 AZA의 영향을 살펴보기 위해 at-tachment plates 에 4T1-luc cell을 seeding 하고 \( 1 \mu \mathrm{M} \)의 AZA를 처리하였다. 3일 후 Trypsin-EDTA를 처리해 single cell을 얻어 ultra-low attachment plates (Corning, NY, USA)에 \( 1 \times 10^{5} \)개를 seeding 한 후 \( 5 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) EGF, \( 5 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) bFGF (Peprotech, RockyHill, NJ), \( 4 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) heparin (Sigma, St. Louis, MO), B27 (1:50dilution, Invitrogen, Grand Island, NY)이 포함된 DMEM 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양하였다. 7일 후 tumorsphere 형성을 inverted microscope를 이용하여 50X배율로 촬영하였다. sphere의 수와 크기는 Image-Pro Plusprogram (MediaCybernetics, Silver Spring, MD)으로 측정하였다.</p> <h2>실험동물 및 시험물질 투여</h2> <p>5주령의 BALB/c 마우스 암컷은 (주)오리엔트에서 구입하였다. 모든 동물은 특정병원체부재(specific pathogen-free,SPF) 동물로 1주일간의 순화 기간을 거친 후 실험에 사용하였다. 마우스 30마리를 Fig. 1과 같이 3개 실험군으로 나누어 실험하였으며, 실험군은 그룹 당 10마리씩 설정하였다. 즉 모든 그룹의 BALB/c 암컷 마우스에 4T1-luc 종양세포를 \( 5 \times 10^{4} \) 수집하여 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 씩 유방지방체 (m.f.p.)에 접종하고, 대조군 1군에는 \( 0.2 \% \) DMSO를 일주일에 5회 3주간 복강투여 하였고, 투여군 2군과 3군에는 AZA (2군: \( 0.05 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) B.W., 3군: \( 0.1 \)\( \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) B.W.)를 투여 하였다. 본 연구에서의 모든 동물실험은 가천의과학대학교 이길여 암 – 당뇨 연구원 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 동물실험 표준작업지침서(Standard Operation Procedures, SOP)에 따라 수행되었다.</p>