미라큘린 단백질을 발현하기 위해 E. coli에 pET42 벡터를 클로닝하고 이를 BL21 균주에 형질전환시켰다. IPTG 첨가 후 37°C에서 약 3시간 동안 배양하여 단백질 발현을 유도하였으며, 이를 Anti-DYKDDDDK Affinity Resin Column을 이용해 정제하였다. 또한, Bradford 방법을 응용하여 추출한 단백질의 정량을 위한 표준곡선을 작성하였다.
<h2>E. coli로부터 재조합 miraculin 단백질유도</h2> <p>E. coli를 이용하여 miraculin 단백질 발현을 위해 pET42 벡터의 EcoRV 및 BamH Ⅰ 제한효소 부위에 클로닝하여 E.coli 균주 BL21에 형질전환 하였다(Fig. 6A). 형질 전환 된 균주는 \(50 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) kanamycin이 들어간 LB 고체배지에 도말하고, 선발된 colony를 \( 50 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) kanamycin이 들어간 LB 액체배지에 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 16시간 배양하였다. 이후, 배양액은 \( 1 / 20 \) 로 scale-up 하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 약 3시간 배양하여 \( \mathrm { OD } _ { 600 } \)가 0.5-1.0에 도달하도록 하였다. 이후 균 배양액에 IPTG를 최종 농도 \(1 \mathrm { mM } \) 이 되도록 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 약 3시간 배양함으로써 단백질 발현을 유도하였다. 발현 유도된 균 배양액은 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 12,000 \mathrm { rpm } \)으로 5분간 원심 분리하고 PBS buffer를 넣고 1초 간격으로 60회 sonication 하였다. 용해된 세포를 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 12,000 \mathrm { rpm } \)으로 5분간 원심 분리하고 상층액을 수집하여 발현 분석 및 단백질 정량을 위한 표준곡선 구축에 이용하였다.</p> <h2>Miraculin 단백질 정제</h2> <p>E. coli로부터 추출한 재조합 단백질의 정제는 Anti-DYKDDDDK Affinity Resin Column (Sino Biological Inc., China)을 이용하여 진행하였다. PBS buffer ( \( \mathrm { pH } \) 7.4)를 column에 3회 흘려 column을 평형화 시킨 뒤 \( 0.45 \mu \mathrm { M } \) filter로 필터링 한 전체 가용성 단백질을 Anti-DYKDDDDK Affinity Resin에 몇 차례 결합시켰다. 그 다음 PBS buffer ( \( \mathrm { pH } \) 7.4)를 이용하여 결합되지 않은 단백질을 washing 후 \( \mathrm { pH } 3.0 \) 의 elution buffer ( \( 100 \mathrm { mM } \) glycine, \(10 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } \) )를 5회 이상 흘려 column에 결합된 재조합 단백질을 용출하였다.</p> <h2>Miraculin 단백질 정량화를 위한 표준곡선 구축</h2> <p>정제된 miraculin 단백질 \( 100 \mathrm { ng } , 200 \mathrm { ng } , 400 \mathrm { ng } , 600 \mathrm { ng } , 800 \mathrm { ng } , 1000 \mathrm { ng } / \mathrm { lane } \)을 \( 12 \% \) SDS polyacrylamide gels에서 분리하고, 상기에 기재된 바와 동일하게 Western blot 분석을 실시하여 검출하였다. 농도별로 검출된 면적의 intensity를 측정하여 Bradford (1976)가 보고한 방법을 응용하여 단백질 정량을 위한 표준곡선으로 나타냈다.</p>