본 실험에서 사용한 발효하지 않은 흰목이버섯 추출물과 L. hamnosus BHN-LAB 76 유산균 발효 흰목이버섯 추출물은 \( 100 \mathrm{g} \)의 흰목이버섯을 사용했으며, 발효 전후의 흰목이버섯에서 추출 수율을 확인했다. 각 흰목이버섯 \( 100 \mathrm{g} \)에서 에탄올을 추출한 후, 동결 건조한 결과 약 \( 16.45 \mathrm{g} \)과 \( 21.65 \mathrm{g} \)의 추출 분말을 확보하였으며, 추출 수율은 \( 16.45 \% \)와 \( 21.65 \% \)로 확인되어, 유산균을 통한 발효 흰목이버섯의 추출 효율은 발효하지 않은 흰목이버섯 추출 수율 대비 약 \( 31.6 \% \) 증가한다는 사실을 알 수 있었다. 이러한 결과로 미루어 보아, 유산균으로 발효한 흰목이버섯 추출물은 \( \alpha \)-glucosidase 저해 활성을 증가시켜 당뇨 억제 활성을 촉진하는 것으로 보이며, 추가 연구를 통해 유산균 발효 흰목이버섯 추출물의 항당뇨 활성을 확인할 필요가 있다. FTF는 NFTF보다 지방세포로의 분화 억제 활성이 탁월한 것으로 보이며 FTF를 처리한 군에서 감소된 지방구 형성은 세포 내 p-AMPK, p-JNK, p-Akt 유전자 발현을 억제하여 지방 세포로의 분화 및 세포 분화 유도에 관여하는 것으로 보인다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>유산 발효에 따른 발효 흰목이버섯 추출물(FTF)의 제조</h2> <p>본 실험에서 사용한 발효하지 않은 흰목이버섯 추출물(Not fermented Tremella fuciformis; NFTF) 및 L. hamnosus BHN-LAB 76 유산균 발효 흰목이버섯 추출물 (Fermented Tremella fuciformis; FTF)은 \( 100 \mathrm{~g} \)의 흰목이버섯을 이용하였으며, 발효 전과 발효 후의 흰목이버섯으로부터 추출 수율을 확인하였다. 각 흰목이버섯 \( 100 \mathrm{~g} \)으로부터 에탄올 추출 후, 동결 건조한 결과 약 \( 16.45 \mathrm{~g} \)과 \( 21.65 \mathrm{~g} \)의 추출 분말을 확보하였으며, 추출 수율은 \( 16.45 \% \)와 \( 21.65 \% \)로 확인되어, 유산균을 통한 발효 흰목이버섯의 추출 효율은 발효하지 않은 흰목이버섯 추출 수율 대비 약 \( 31.6 \% \) 증가하는 것을 확인하였다(Table 1). 일반적으로 유산균을 통한 발효 시 다양한 유기산 및 아미노산 등의 대사산물이 생성되며 이러한 대사산물에 의해 \( \mathrm{pH} \)의 감소에 따라 추출 효율이 증가한다고 보고되었으며, 본 연구에서도 유산균 발효흰목이버섯 추출 효율이 \( 30 \% \) 넘게 증가하였다.</p> <h2>유산 발효에 의한 흰목이버섯 추출물(FTF)의 \( \alpha \)-glucosidase 저해 활성</h2> <p>\( \alpha \)-Glucosidase는 이당류를 단당류로의 분해를 촉매하는 가수 분해 효소이며, 이러한 \( \alpha \)-glucosidase를 저해시키는 물질은 항당뇨 활성을 증진시킨다고 보고되고 있다. 본 연구에서는 유산 발효에 의한 흰목이버섯 추출물의 당뇨 억제 활성을 \( \alpha \)-glucosidase assay를 통해 비교 분석하였다. 그 결과, 양성대조구로서 사용된 acarbose \( (1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)는 \( 42.21 \pm \) \( 1.03 \% \)의 \( \alpha \)-glucosidase 억제 활성이 나타났으며, 동일한 농도 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)로 처리한 발효하지 않은 흰목이버섯 추출물 (NFTF)과 L. rhamnosus BHN-LAB 76 유산균으로 발효한 흰목이버섯 추출물(FTF)의 \( \alpha \)-glucosidase 억제 활성은 \( 64.83 \pm 1.55 \%, 89.74 \pm 1.16 \% \)로 유산 발효한 흰목이버섯 추출물은 발효하지 않은 흰목이버섯 추출물 대비 약 \( 138 \% \)배 증가하는 것으로 나타났다. 또한, 모든 흰목이버섯 추출물은</p> <p>양성대조구에 비해 현저히 증가된 \( \alpha \)-glucosidase 억제 활성을 확인하였다(Fig. 2). 1990년 초부터 \( \alpha \)-glucosidase의 활성 저해에 의한 항당뇨 활성은 당대사를 지연시켜 혈당 증가를 막는 방법이 연구되기 시작하였다. 유산균 발효에 의한 대마씨 추출물의 \( \alpha \)-glucosidase 저해 활성은 발효하지 않은 대마씨 추출물보다 약 \( 15 \% \) 이상 증가시킨다고 보고되었으며, 유산균 발효를 통한 생물전환은 천연물의 효능을 증가시키는 유용한 기술로 이용되고 있다. 이러한 결과로 미루어 볼 때, 유산균으로 발효한 흰목이버섯 추출물은 \( \alpha \)-glucosidase 저해 활성을 증가시켜 당뇨 억제 활성을 촉진 하는 것으로 판단되며, 추가 연구를 통해 유산균 발효 흰목이버섯 추출물의 항당뇨 활성을 확인해 볼 필요성이 있다고 판단된다.</p> <h2>흰목이버섯 추출물(FTF)의 세포 독성 평가 및 지방분화유도 억제 효과</h2> <p>NFTF와 FTF가 세포에 미치는 독성을 평가하기 위하여 3T3-L1 전지방세포에 각 추출물을 \( 0.1,0.25,0.5,1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 처리한 후 MTT assay를 통해 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과 NFTF와 FTF를 처리한 모든 농도에서 세포 생존율에 영향을 미치지 않아, 모든 실험은 \( 0.1,0.25,0.5 \), \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도에서 진행하였다.</p> <p>흰목이버섯 추출물이 3T3-L1 전지방세포에서 지방분화유도를 통한 지방구 형성에 미치는 영향을 조사하기 위해 8일 간 분화 유도 배지에 NFTF와 FTF를 \( 0.25,0.5,1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 처리하였다. MDI 처리를 통한 전지방세포의 지방 분화 유도는 지질 성분에 특이적으로 반응하여 지방구만을 염색하는 Oil red O 시약을 사용하여 염색한 후 현미경 관찰을 통해 확인하였다. 그 결과, 미분화된 3T3-L1 전지방세포(normal)는 지방구의 형성이 거의 나타나지 않은 반면, 8 일간 분화시킨 MDI 양성 대조군에서는 염색된 지방구의 수가 현저하게 증가되었음을 확인하였다. 양성 대조군에 비해, NFTF를 처리한 군에서는 미미하게 감소된 지방구가 나타났으나, FTF를 처리한 군에서는 현저히 감소된 지방구를 확인하였고, 용해시킨 지방 축적도는 농도 의존적으로 \( p<0.05, p<0.01 \) 수준에서 감소하는 것을 확인하였다. 특히 FTF \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 처리한 군에서는 분화배지만을 처리한 군에 비해 현저히 감소된 지방구 형성을 확인 하였으며(Fig. 5A), Oil-Red-O 염색약으로 염색된 지방구를 \( 100 \% \) isopropyl alcohol로 용해시켜 지방 축적도를 확인해본 결과, \( p<0.01 \) 수준에서 약 \( 25 \% \) 지방 축적 감소를 확인하였다(Fig. 5B). 유산균을 통한 발효는 지방 분화 억제 효과를 가진 삼정환의 지방구 생성 억제효과를 더욱 증대시킨다고 보고하였다. 이러한 결과로 미루어 볼 때, FTF는 NFTF보다 지방세포로의 분화 억제 활성이 탁월한 것으로 판단된다.</p> <h2>유산 발효에 의한 흰목이버섯 추출물(FTF)의 p-AMPK, p-JNK, p-Akt의 유전자 발현 억제 효과</h2> <p>FTF에 의한 지방구 형성의 감소가 유전자 발현에 미치는</p> <p>영향을 알아보기 위해 3T3-L1 전지방세포에서 세포 내 에너지 항상성 조절 인자인 p-AMPK 인산화와 지방 세포 분화에 관여한다고 알려진 insulin을 통해 활성화되는 Akt 단백질의 발현을 확인해보았다. 또한, 세포 분화에 관여한다고 알려진 JNK의 활성을 western blot을 통해 확인해 보았다. 그 결과, 미분화된 3T3-L1 전지방세포의 인산화된 AMPK 유전자 발현은 현저히 감소됨을 확인하였고 이에비해 FTF을 \( 0.1,0.25,0.5,1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 처리한 경우 증가함을 확인하였다. 특히 \( \mathrm{FTF} 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 처리한 군에서는 확연하게 증가한 AMPK의 발현을 확인하였다. 또한 Akt 유전자 발현에서 FTF를 처리하지 않은 군에 비해 저 농도 \( (0.1,0.25,0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)에서는 유의적인 차이를 보이지는 않았지만, 고 농도 \( (1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)로 처리한 군에서는 현저하게 증가된 결과를 확인하였다. 추가적으로 \( \mathrm{JNK} \) 유전자 발현을 통해 세포 분화에 미치는 영향을 확인해 본 결과, 미 분화된 3T3-L1 전 지방세포에서는 어떠한 발현이 나타나지 않았지만, 분화 유도한 세포에서는 확연하게 증가된 양상을 확인하였으며, 발효 흰목이버섯 추출물을 처리한 군에서는 농도 의존적이지는 않았지만, 감소된 유전자 발현을 확인하였다. 본 연구에서는 인산화 되기 전 total form을 확인하지 못했으나, \( \beta \)-actin 대비 p-AMPK, p-JNK, p-Akt 수치 정량화를 통해 분석해 본 결과, FTF 처리 전 시료에 비해 각 인자들이 변화하는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 FTF를 처리한 군에서의 감소된 지방구 형성은 세포 내 p-AMPK, p-JNK, p-Akt 유전자 발현을 억제함으로써, 지방 세포로의 분화 및 세포 분화 유도에 관여하는 것으로 생각 되어진다. Adipogenesis 억제는 AMPK의 활성화를 통한 adipogenic transcription factors의 발현 감소가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, Aspergillus oryzae로 발효한 울금 주정 추출물에서의 지방 형성 억제 효과는 AMPK의 mRNA 발현이 증대되는 것을 통해 나타난다고 보고하였다. 따라서, 유산균으로 발효한 흰목이버섯 추출물은 항비만 및 항당뇨 효과가 있을 것으로 판단되며, 건강 기능식품으로 활용 및 발전 가능성을 확인하였다.</p>