SDS-PAGE를 활용해 LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소의 정제 상태와 분자량을 측정했다. 전기영동은 Laemmli의 방법에 따라 이루어졌고, 이를 위해 다양한 조건의 acrylamide gel로 이루어진 slab gel을 준비했다. 전기영동 과정은 \(0.1 \% \mathrm { SDS } \)가 포함된 \( 0.025 \mathrm { M } \) Tris-glycine buffer를 사용하여 진행하였으며, 온도와 전압을 정해진 조건에서 2시간 동안 유지하였다. 마지막으로 IEF를 실시하여 정제된 LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소들의 등전점 값을 추정하였다.
<h2>SDS-polyacrylamide gel 전기영동(SDS-PAGE) 및 분자량 측정</h2> <p>LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소의 정제정도와 분자량의 측정은 SDS-PAGE로 이루어졌다. 전기영동은 Laemmli의 방법에 따라 \( 12.5 \% \mathrm { ~T } , 2.67 \% \mathrm { C } \) acrylamide separation gel과 \( 5 \% \mathrm { ~T } \), \( 2.67 \% \mathrm { C } \) acrylamide stacking gel이 되도록 slab gel을 만들었다. 시료와 \( 0.06 \) M Tris- \( \mathrm { HCl } ( \mathrm { pH } \) 6.8), \(25 \% \) glycerol, \(2 \% \) SDS, \( 5 \% \) 2-mercaptoethanol, \(0.1 \% \) bromophenol blue 용액을 \( 4: 1( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 로 섞어 \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분간 가열한 후 1초정도 원심 분리 한 다음 상등액을 전기영동 시료로 사용하였다. 전기영동은 \( 0.1 \% \mathrm { SDS } \) 를 포함하는 \( 0.025 \mathrm { M } \) Tris-glycine buffer \( ( \mathrm { pH } \) 8.3)를 사용하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 100 \mathrm { ~V } \) 에서 2시간 동안 실시하였다. 단백질 염색은 \( 45 \% \) 메탄올과 \( 10 \% \) 초산에 녹인 \( 0.1 \% \) Coomassie brilliant blue R-250에서 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 10분간 염색한 후 \( 10 \% \) 메탄올, \( 10 \% \) 초산용액에서 탈색시켰다. 분자량 측정 시 표준 단백질로는 bovine serum albumin (MW 66,000), ovalbumin (MW 45,000), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (MW 36,000), cabonic anhydrase (MW 29,000), trypsinogen (MW 24,000), trypsin inhibitor (MW 20,000) 및 a-lactalbumin (MW 14,200)을 사용하였다.</p> <h2>Isoelectric focusing(IEF)</h2> <p>정제된 LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소들의 \( \mathrm { pI } \) 값을 구하기 위해 IEF를 실시하였다. Vertical polyacrylamide slab gel isoelectric focusing은 \(2.39 \% \) ampholine 용액( \(40 \% \), pH 3-10), \(0.17 \% \) TEMED, \(0.05 \% \) ammonium persulfate를 포함하는 \( 7.5 \% \mathrm { ~T } \), \( 2.67 \% \mathrm { C } \) 의 acrylamide slab gel을 만들었다. 음극에는 \( 0.02 \mathrm { M } \) NaOH 용액을 넣고 양극에는 \( 0.01 \mathrm { M } \mathrm { H } _ { 3 } \mathrm { PO } _ { 4 } \) 용액을 넣은 후 \( 60 \% \) glycerol을 함유한 \( 4 \% \) ampholine 용액을 시료와 \(1:1 \)로 섞어 gel위에 가하였다. \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } , 200 \mathrm { ~V } \) 에서 2시간, \( 400 \mathrm { ~V } \) 에서 2시간 동안 전기영동 한 다음 Coomassie brilliant blue R-250으로 단백질 염색을 실시하여 이동거리에 대한 표준곡선을 작성한 후 \( \mathrm { pI } \) 값을 정하였다. 등전점 측정을 위한 표준단백질로는carbonic anhydrase Ⅱ ( \( \mathrm { pI } 5.9 \)), myoglobin \(( \mathrm { pI } 6.8, 7.2) \), lentil lectin \(( \mathrm { pI } 8.2, 8.6, 8.8) \)을 사용하였다.</p>