사전에 준비된 \( 1 \mu \mathrm { g } \) 의 \(TAR vector \)와 \( 2 \mu \mathrm { g } \)의 \(genomic DNA \)를 포함하는 \(Falcon tube \)에 \(spheroplasts \) 현탁액과 \(PEG \)용액을 넣어 가볍게 섞은 후, 원심분리 및 \( \mathrm { SOS } \) 용액에 현탁시켰다. 그 후, \(30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(1 \)시간 동안 배양하여, \(SD-His plate \)에 형질전환체를 \(patch \)하는 과정을 거쳤다.
<p>균체를 다시 \( 2 \mathrm { ~m } \ell \)의 \(STC \)용액(1 M sorbitol, \( 10 \mathrm { mM } Tris. \) \( \mathrm { Cl } \mathrm { pH } 7.5 \) , \( 10 \mathrm { mM } \mathrm { CaC } \) )으로 현탁하였다. \(15 r \)의 \(Falcon tube \)에 직선상의 \( 1 \mu \mathrm { g } \) 의 \(TAR vector \)와 \( 2 \mu \mathrm { g } \)의 \(genomic DNA \)를 미리 준비하여, \(spheroplasts \) 현탁액 \( 450 ml \) 를 넣어 가볍게 섞은 후 실온에 \(10 \)분 방치한 후, \( 5 ml \) 의 \(PEG \)용액(20 \% PEG8000, 10 \( \mathrm { mM } Tris \) \( \cdot \mathrm { Cl } \mathrm { pH } 7.5,10 \mathrm { mM } \mathrm { CaCl } \) )을 넣고 \(tube inverting \)하여 가볍게 섞고 실온에서 \(10 \)분간 방치하였다. \( 1,500 \mathrm { rpm } \) 에서 \(5 \)분간 원심분리하여 집균한 후, 상충액을 조심스럽게 제거하고 \( 1 \mathrm { mt } \)의 \( \mathrm { SOS } (1 \mathrm { M } sorbitol \) , \( 6.5 \mathrm { mM } \mathrm { CaCl } , 0.25 \% \) \(Yeast extract \), \( 0.5 \% \) \(Bacto peptone) \) 용액에 현탁하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(1 \)시간 배양하였다. 이때 \(TOP agar Sor-His \)를 녹여 \(glass test tube \)에 \(8 ml \)씩 분주하여 \(50 C \)에 둔다. 위의 배양액을 \(Top Agar \)에 조심스럽게 섞어 넣은 후, \(Sor-His plate \)에 조심스럽게 붓고, \(plate \)가 굳게 되면 \( 30 \% \)에서 \( 3 \sim 4 \)일간 배양하였다.</p> <h2>\(Positive clone \)의 확인</h2> <p>\(SD-His plate \)에 나온 형질전환체를 이쑤시개를 이용하여 한 \(plate \) 당 \(30 \)개의 \(colony \)들 \(patch \)하였다. \( 2-3 \) 일 동안 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양 후 다시 \(SD-His plate \)에 \(replica \)하여 복제본을 만들어 이를 \(primary gene pool \)로서 \(30 C \)에서 \(2 \)일자 배양하였다. \(primary gene pool \)로 복제된 \(plate \)에서 자란 세포들을 \( 5 \mathrm { ~m } \ell \)의 물로 배지 표면을 씻어 \( 15 \mathrm { m \ell } \)의 \(Falcon tube \)에 넣은 후 집균하였다. 집균된 균주에서 \(zymolyase \)를 사용하여 산모의 \(DNA \)를 추출하였다, 추출된 \(DNA \)를 \( 400 ul \) 의 \(TE buffer \)에 녹인 후, 이 중 \( 1ul \)를 \( \mathrm { PCR } \) 반응에 사용하였다. \(positive \) 확인용 \( \mathrm { PCR } \)에 이용된 영역은 사용한 \(TAR vector \)에는 존재하지 않으나, 재조합에 의헤 \( \mathrm { HHPRT } \) 유전자의 양말단과 연결되어 분리된다면 그 내부에 존재할 \( h H P R T \) 유전사의 cxon9 부분에 해당한다(Table 2). /p> <p>이 \(primary gene pool \)을 이용하여 먼저 \(PCR \)로 콜른이 되었는지를 확인한 후, \(positive \) \( \mathrm { PCR } \) 밴드가 확인되면 이로부터 각각의 \(colony \)를 사용하여 두 번째 \(colony \) \( \mathrm { PCR } \)을 수행하여 확인하였다. 이러한 확인 후 가각결론의 \(DNA \)를 분리하여 \(HPRT gene \)의 나머지 모든 \(exon \) 영역에 대해 \( \mathrm { PCR } \)을 수행하였다. \( \mathrm { PCR } \) 반응은 \(9700 Thermocycler (Perkin-Elmer) \)열 사형하여 \( 944 ^ {\circ } \mathrm { C } , 2 \)분간 \(1 cycle \), 그리고 \( 94 { } ^ {\circ } \mathrm { C } , 30 \)초 \( \rightarrow 58 ^ {\circ } \mathrm { C } , 30 \)초 \( \rightarrow 68 ^ {\circ } \mathrm { C } , 1 \)분의 반응을 \(30 cycles \) 반응시킨 후, \( 72 \mathrm { C } \) 에서 \(10 분 1 cycle \)의 연장 반응을 수행하였다. \(PCR \) 산물은 \( 2 \% \)의 \(SeaKem GTG agarose gel \)을 사용하여 진기영동을 통하여 확인하였다.</p>