Rhodococcus sp EH831 균주를 사용하여 벤젠, 톨루엔 및 에틸벤젠의 호기적 생분해에 미치는 에탄올의 영향 규명을 위한 실험을 수행하였다. 벤젠과 톨루엔, 에틸벤젠과 에탄올을 실린지를 이용하여 주입하고 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 180 \mathrm{~rpm} \)에서 7일 동안 배양하였고 모든 실험은 2반복으로 수행되었으며, 균주를 접종하지 않는 조건을 대조군으로 하였다. 농도 분석을 위해서는 headspace 가스를 gas tight syringe를 이용하여 시간별로 채취하여 가스크로마토그래피로 분석하고 생분해속도를 비교하기 위해서는 각각의 혈청병에서 배양액 \( 1 \mathrm{~mL} \)을 채취하여 흡광도를 측정하였다.
<p>벤젠, 톨루엔 및 에틸벤젠의 호기적 생분해에 미치는 에탄올의 영향 규명을 위해 Rhodococcus sp. EH831 균주를 접종원으로 사용하였다. 벤젠 생분해에 미치는 에탄올 영향을 조사하는 실험을 위해 EH831 균주는 다음과 같이 벤젠을 유일 탄소원과 에너지원으로 첨가한 무기염배지(Bushnell-Hass, BH, 배지)에서 배양하였다. \( 1.2 \mathrm{~L} \)-혈청병에 BH 배지를 \( 50 \mathrm{~mL} \) 주입하고 EH831 균주를 접종한 후, 부틸마개로 밀폐하였다. 벤젠 \( 10 ~\mu \mathrm{L} \)를 실린지를 이용하여 주입 한 후(혈청병 중 벤젠 총량으로 \( 112.5 ~\mu \mathrm{mol} \)에 해당) \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 180 \mathrm{~rpm} \)에서 7일 동안 배양하였다. 이렇게 해서 얻은 EH831 배양액을 원심분리하여 \( (8,900 \times g) \) 에서 균체만을 회수 하여 멸균수로 2번 세척하였다. 세척된 EH831 균주에 새 BH 배지를 \( 20 \mathrm{~mL} \) 첨가하여 현탁한 후, 이 균주 현탁액 \( 20 \mathrm{~mL} \)을 \( 600 \mathrm{~mL} \)-혈청병에 주입하였다. 혈청병을 부틸마개로 밀폐한 후, 벤젠과 에탄올을 실린지를 이용하여 주입하였는데, 주입농도는 Table 1과 같다. 벤젠과 에탄올 첨가 후 혈청병을 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 180 \mathrm{~rpm} \)에서 배양하면서 주기적으로 혈청병 상부의 벤젠 농도를 가스크로마토그래피를 이용하여 분석하였다.</p> <p>톨루엔 및 에틸벤젠 호기적 생분해에 미치는 영향 규명 실험도 상기의 벤젠과 동일하게 진행하였는데, EH831 균주 전배양에서 톨루엔 혹은 에틸벤젠을 각각 \( 10 ~\mu \mathrm{L} \) 주입하였고 (혈청병 중 톨루엔 및 에틸벤젠의 총량은 각각 94.1 및 \( 81.7 ~\mu \mathrm{mol} \) 임), 본 실험에서 톨루엔-에탄올 혹은 에틸벤젠-에탄올 주입 농도는 Table 1과 같다. 모든 실험은 2반복으로 수행되었으며, 균주를 접종하지 않는 조건을 대조군으로 하였다.</p> <p>벤젠, 톨루엔 및 에틸벤젠의 농도 분석을 위해 headspace 가스를 gas tight syringe를 이용하여 시간별로 \( 0.3 \mathrm{~mL} \)씩 채취하였고, 채취된 가스를 불꽃 이온화 검출기가(Flame ion-ization detector) 장착된 가스크로마토그래피(Gas chromato-graphy, Agilent 6850N, USA)로 분석하였다. 분석 컬럼은 DB-wax\( (30 \mathrm{~m} \times 0.32 \mathrm{~mm} \times 0.25 ~\mu \mathrm{m} \), J&V Sientific column, USA)이었고, 분석 온도는 오븐이 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \), 주입부와 검출부가 \( 230^{\circ} \mathrm{C} \)이었다. 모든 측정은 3반복으로 수행하였다.</p> <p>에탄올이 첨가된 조건하에서 EH831 균주의 건조균체중량 당(dry cell weight, \( \mathrm{DCW} \)) 벤젠, 톨루엔 및 에틸벤젠의 생분해속도를 비교하기 위해, 각각의 실험 종료시 혈청병에서 배양액 \( 1 \mathrm{~mL} \)을 채취하여 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다(Agilent 8453, USA). 배양액의 흡광도값은 다음의 식에 의해 \( \mathrm{DCW} \) 값으로 환산하였다: \( \mathrm{g}-\mathrm{DCW} \cdot \mathrm{L}^{-1}=0.39 \times \mathrm{OD}_{600 \mathrm{nm}} \left(r^{2}=0.98\right) \).</p>