인체 락토페린 유전자는 particle bombardment방법을 이용해 고구마의 배발생 캘러스에 도입되고, 락토페린 생산 형질전환 고구마가 된다. PCR, Southern 분석을 재분화된 식물체에 실시하여 고구마 염색체 게놈에 인체 락토페린 유전자가 도입되었음을 확인하였다. 락토페린 유전자의 발현을 northern blot 분석을 통해 확인하고, immunoblot 분석을 사용하여 고구마 괴근에서 \( 80 \mathrm { kDa } \) 크기의 락토페린 단백질이 생산됨을 확인하였다. 연구 결과 고구마가 치료용 인체 단백질을 생산하는 숙주로서 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Particle bombardment에 의한 형질전환 및 식물체 재분화</h2> <p>pLSM1 벡터가 도입된 배발생 캘러스는 일주일간 MS1D 배지에서 배양한 후 \( 100 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) kanamycin이 첨가된 MS1DK 선발배지에서 4주 간격으로 계대배양하였다. 계대배양이 진행되면서 대부분의 캘러스는 점액질화 되거나 비배발생캘러스로 전환되었으나 극히 일부 캘러스만 배발생능을 유지하면서 증식되었다 (Fig. 2A). 증식된 배발생 캘러스를 2,4-D가 제거된 MSBMK 배지로 옮겼을 때 여러 발달 단계를 보이는 체세포배 (Fig. 2B-D)가 유도되었으며 정상적인 식물체로 발달하였다 (Fig. 2E-F). 이들 식물체는 순화과정을 거쳐 생육상에서 재배하였고 (Fig. 2G) 정상적으로 괴근 형성이 이루어졌음을 알 수 있었다 (Fig. 3). 또한, 형질전환 되지 않은 대조구 고구마보다 형질전환 락토페린 고구마의 표피가 약간 진한 색을 띠었는데 (Fig. 4) 이는 고구마 표피 세포내의 락토페린 단백질이 대조구보다 더 많은 철을 흡수해서 나타나는 현상인지 좀 더 연구해 볼 필요가 있다. 또한, 형질전환된 락토페린 고구마가 형질전환되지 않은 대조구에 비해 횔씬 건전한 괴근을 생산하였는데 (Fig. 4) 이는 락토페린 유전자가 도입된 고구마 괴근에서 특정 pathogen에 대해 저항성을 가지고 있음을 추측할 수 있으므로 보다 구체적인 실험이 요구된다.</p> <h2>형질전환체의 특성 분석</h2> <p>선발배지에서 재분화된 고구마 기내 식물체의 잎으로부터 genomic DNA 분리하여 락토페린 프라이머를 이용하여 \( \mathrm { PCR } \) 을 수행한 결과, 형질전환 되지 않은 개체와는 달리 형질전환된 모든 개체에서 약 \( 700 \mathrm { bp } \) 크기의 락토페린 밴드가 합성됨을 확인 할 수 있었다 (데이터 미제시). PCR 분석으로 외래 유전자 도입이 확인된 식물체에서 락토페린 probe를 이용하여 Southern 분석을 실시한 결과 형질전환 식물체에서는 약 \( 8 \mathrm { ~kb } \) 크기의 인체 락토페린 유전자가 고구마 염색체 안에 1 copy로 삽입되었음을 확인할 수 있었다 (Fig. 5). Particle bombardment를 이용하여 본 연구자들이 개발한 락토페린 함유 고구마 배양세포 (Min et al. 2006)에서는 1 개 혹은 다수의 밴드를 가지는 형질전환 배양세포를 생산하였는데 본 연구에서 분석된 형질전환 식물체에서는 단일 밴드를 보여줌으로써 이는 동일한 배발생 캘러스에서 유래된 식물체임을 짐작 할 수 있었다. 락토페린 유전자의 발현을 확인하기 위해 total RNA를 분리하여 northern 분석을 수행한 결과 모든 형질전환체에서 \( 2.3 \mathrm { ~kb } \) 크기의 락토페린 transcripts가 발현됨을 확인하였다 (Fig. 6). 한편, 형질전환 고구마 괴근 절편체로부터 총 soluble 단백질을 분리하여 western blot 분석을 수행한 결과 형질전환되지 않은 고구마 괴근에서는 전혀 anti-lactoferrin 항체와 반응하지 않았으나 형질전환 괴근에서 약 \( 80 \mathrm { kDa } \) 크기의 락토페린 단백질이 생산됨을 확인하였다 (Fig. 7). 이와 같은 결과는 락토페린 유전자가 도입된 감자 (Chong and Langridge 2000)나 약용식물인 가시오갈피 (Jo et al. 2005)에서와 같은 결과로 \( 80 \mathrm { kDa } \) full-size 크기의 인체 락토페린 단백질이 생성되었으나 담배 (Mitra and Zhang 1994; Liu et al. 1999)나 인삼 배양세포 (Kwon et al. 2003)에 도입된 락토페린 단백질에서는 \( 80 \mathrm { kDa } \) 이외에 약 \( 40 \mathrm { kDa } \) 에 해당하는 truncated된 락토페린이 생산되었다고 보고하였다. Northern 분석 결과에서처럼 락토페린 transcripts의 발현량이 높았던 \#1, \#4, \#6 식물체는 이들로부터 형성된 괴근의 immunoblot 분석 결과에서도 마찬가지로 락토페린 단백질이 다른 라인에 비 해 더 많이 생산됨을 보여주었다 (Fig. 6, 7).</p> <p>본 연구에서는 인체 락토페린 유전자를 고구마의 배발생 캘러스에 particle bombardment 방법으로 도입하여 락토페린 생산 형질전환 고구마를 개발하였다. "Bio-factories"로써 식물에서 유용 단백질을 생산하기 위해 많은 연구가 진행되고 있는 시점에서 antimicrobial 락토페린 발현되는 형질전환 식물체는 경제적으로 중요한 특정 질병에 저항성을 증대시킴으로써 작물의 질적 향상을 꾀할 수 있으므로 신품종으로 개발될 수 있을 것이다.</p> <h1>적 요</h1> <p>면역강화와 같은 생리활성 기능을 가지는 인체 락토페린 cDNA가 들어있는 pLSM1 벡터를 이용하여 고구마 배발생 캘러스에 particle bombardment 방법으로 형질전환을 수행하여 인체 락토페린 생산 고구마를 개발하였다. 선발배지에서 형성된 배발생 캘러스로부터 체세포배발생 과정을 거쳐 식물체로 재분화되었고 토양에서 정상적으로 생장하여 괴근을 형성하였다. 재분화된 식물체를 대상으로 PCR과 Southern 분석을 실시한 결과 고구마의 염색체 게놈에 인체 락토페린 유전자가 도입되었음을 확인하였다. 또한, northern blot 분석을 통해 락토페린 유전자의 발현을 확인하였으며 immunoblot 분석을 통해 고구마 괴근에서도 \( 80 \mathrm { kDa } \) 크기의 락토페린 단백질이 생산됨을 확인할 수 있었다. 본 연구결과 고구마는 치료용 인체 단백질을 생산하는 숙주로서 매우 우수하다는 것을 입증하였다.</p>