Balb/c 마우스 50마리를 10마리씩 나눠 일반사료, 표고버섯균사체 AHCC, HKSMM의 농도에 따라 제조된 사료와 미세여과기 및 자외선 유수살균장치를 통과시킨 물을 자유급이 하였다. 4주차 및 6주차에 혈액을 채취하여 NO(nitric oxide)의 함량을 Promega Griess Reagent system을 사용하여 분석하였고, 비장은 6주차에 채취하였다. Nitric oxide 함량은 제조사의 프로토콜에 따라 분석하였고 단백질 농도는 모든 시료를 같은 농도로 제조한 뒤 단백질 분식 키트 프로토콜에 따라 측정하였다.
<h2>실험동물</h2> <p>\( \mathrm { Balb } / \mathrm { c } \) 마우스 50 마리로 구성은 Table 1 과 같다. 일반사료 급이군 negative control (NC) 10마리, 표고버섯균사체 기성품 \( \mathrm { AHCC } \) 급이군 positive control (PC) 10마리, \( \mathrm { HKSMM } \) 급이군 \( \mathrm { T } 1(500 \mathrm { mg } / 100 \mathrm { ~g } ), \mathrm { T } 2(1,000 \mathrm { mg } / 100 \mathrm { ~g } ) \) 및 T3 \( (2,000 \mathrm { mg } / 100 \mathrm { ~g } ) \) 로 구성하였다. 농도에 맞게 제조된 사료와 미세여과기 및 자외선 유수살균장치를 통과한 물을 자유급이 하였다. 실험동물의 혈청은 4 주차 및 6 주차에 혈액을 채취하여 얼음에서 \( 20 \mathrm { ~min } \) 방치 후 원심분리를 통해 분리하였고, 비장은 6 주차에 채취하였다. 동물사육실은 항온항습한 환경에서 12 시간 주기의 조명으로 설정하여 사육하였다. 동물실험은 KIT 경남환경독성본부 IACUC의 승인을 받아 진행되었다(승인번호: 2108-0004).</p> <h2>Griess Assay를 통한 NO (nitric oxide) 측정</h2> <p>\( \mathrm { NO } \) 의 함량은 제조사의 프로토콜에 따라 Promega Griess Reagent system (Promega Corporation, Medison, USA)을 사용하여 분석하였다. 96 well plate에 Balb/c 마우스에서 채취한 혈청 \( 100 \mu 1 \) 와 sulfanilamide solution \( 50 \mu 1 \) 을 분주한 후 차광상태의 실온에서 10 분간 반응하였다. 그 후 NED solution \( 50 \mu 1 \) 를 추가로 분주한 후 차광상태의 실온에서 10 분간 반응하였다. 반응이 끝난 plate는 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 통해 아질산염농도를 측정하였다.</p> <h2>Western Blot 분석에 의한 단백질 발현 측정</h2> <p>단백질 농도는 Pierce bicinichoninic acid 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific, Inc.)의 프로토콜에 따라 측정하고 모든 시료를 같은 농도로 제조하였다. 동량의 단백질 샘플 \( (10 \mu \mathrm { g } ) \) 을 SDS-PAGE를 통해 분리하고 TE Semi-Dry Transfer Unit (GE Healthcare Life Sciences)를 이용하여 PVDF membrane으로 옮겼다. 그런 다음 실온에서 1시간 30분 동안 \( 5 \% \) 소 혈청 알부민(BSA, Thermo Fisher Scien-tific, Inc.)으로 blocking 하였다. Blocking이 끝난 membrane은 \( 4 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 하루밤 동안 1 차 항체(iNOS (cat. no. \( 13120 \mathrm { ~S } \) ); \( 1: 1,000 \), COX-2 (cat. no. 12282S); 1:1,000, \( \beta \)-Actin (cat. no. 4970S); 1:5,000, p-p65 (cat. no. 3033S); 1:1,000, p65 (cat. no. \( 8242 \mathrm { ~S } \) ); 1:1,000, p-IKB (cat. no. \( 2859 \mathrm { ~S } \) ); \( 1: 1,000 \), IKB (cat. no. \( 4812 \mathrm { ~S } \) ); \( 1: 1,000 \), p-ERK (cat. no. \( 4370 \mathrm { ~S } \) ); \( 1: 1,000 \), p-JNK (cat. no. \( 4671 \mathrm { ~S } \) ); \( 1: 1,000, \mathrm { p } 38 \) (cat. no. \( 8690 \mathrm { ~S } \) ); 1 : \( 1,000) \) 와 함께 반응시켰다. 1차 항체는 Cell Signaling Tech-nology, Inc. (Massachusetts, USA)에서 구입하였다. 반응이 끝난 membrane을 \( 1 \mathrm { X } \mathrm { TBST } \) 로 15 분 동안 5 회 세척하고 2차 항체(anti-rabbit (cat. no. A120-101P, Bethyl Laboratory, Inc.)와 함께 실온에서 3시간 동안 반응하였다. 한번 더 \( 1 \mathrm { X } \) TBST로 세척한 후 Chemiluminescence kit (Bio-Rad Laboratories, Inc., California, USA)로 발현정도를 시각화 하였다. 이미지는 Chemi-Doc 시스템(Version 6.0, Bio-Rad Laboratories, Inc., California, USA)에 의해 확인하였다. Total form과 \( \beta \)-actin은 로딩 대조군으로 사용되었다. Image J1.50i 소프트웨어(National Institutes of Health)를 사용하여 3회 수행한 Western blot 이미지를 정량화 하였다.</p>