NADPH oxidase는 막부착 단백질과 세포질 인자로 구성되어 있으며, p47 \( { } ^ {\text { phox } } \)를 silencing한 세포에 CoPP 처리를 하여 시 Nrf2 및 HO-1 발현을 녹다운 시키는 방법으로 활성을 억제시킬 수 있다. GSHmee가 처리된 세포에서는 CoPP나 hemin이 Nrf2의 활성을 증가시키지 못하여 HO-1의 발현이 되지 않는데, ROS는 CoPP나 hemin 때문에 발현되는 HO-1 유전자에게 중요한 역할이다.
<h2>HO-1 발현에서 p47 \( \mathrm { } ^ {\text { phox } } \) silencing의 효과</h2> <p>HO-1 발현 과정에 NADPH oxidase의 관련성을 확증하기 위하여 siRNA를 이용하였다. NADPH oxidase는 막부착 단백질인 p91 \( \mathrm { } ^ {\text { phox } } \), p22 \( \mathrm { } ^ {\text { phox } } \) 와 세포질 인자인 GTPase Rac1, p67 \( ^ {\text { phox } } \), p47 \( \mathrm { } ^ {\text { phox } } \) 로 구성되어 있으며, p47 \( { } ^ {\text { phox } } \) 의 발현을 knockdown 시켜서 NADPH oxidase의 활성을 억제시킬 수 있다. 본 연구에서 p47 \( \mathrm { } ^ {\text { phox } } \)의 발현을 억제하기 위하여 p47 \( \mathrm { } ^ {\text { phox } } \)mRNA와 간섭하는 oligonucleotides 즉, siRNA를 사용하여NADPH oxidase의 활성을 억제시켰다. p47 \( \mathrm { } ^ {\text { phox } } \) 에 대한 siRNA는 효과적으로p47 \( \mathrm { } ^ {\text { phox } } \) 유전자 발현을 막아 세포 내 p47 \( \mathrm { } ^ {\text { phox } } \) 의 양을 완전히 감소시켰다. 그 결과, p47 \( \mathrm { } ^ {\text { phox } } \) silencing한 세포에 CoPP를 처리한 경우는 control siRNA를 처리한 세포와 비교할 때 전사인자 Nrf2 및 HO-1 발현을 현저히 감소시키는 것으로 나타났다.</p> <h2>HO-1 발현에서 GSHmee의 효과</h2> <p>DPI 혹은 p47 \( \mathrm { } ^ {\text { phox } } \) silencing에 의한 NADPH oxidase 활성의 억제는 적당한 자극에 의해 NADPH oxidase에 의한 세포내 ROS의 생성을 저해시키게 된다. 본 연구에서 사용한 이들 NADPH oxidase의 억제 효과는 CoPP의 자극에 의한 HO-1의 발현을 억제시켰고, 이는 CoPP에 의한 HO-1 발현의 신호전달 과정에서 NADPH oxidase 및 그 효소에 의해 생성되는 ROS가 필요하다는 것을 시사한다. 그래서, 세포 내 ROS를 감소시키는 것으로 알려진 항산화 인자 GSH의 효과를 알아보았다. GSH는 세포 내로 들어갈 수 없기 때문에 본 실험을 위해서 세포막을 투과할 수 있는 GSH의 ester form인 GSHmee를 사용하였다. GSHmee는 세포 내 esterase에 의해 분해되어 세포내 GSH의 양을 증가시키는 것으로 사용될 수 있다. 흥미롭게도, GSHmee가 처리된 세포에서는 CoPP나 hemin이 Nrf2의 활성을 증가시키지 못하였고, 그 결과 HO-1의 발현을 유도하지 못하는 것을 알 수 있었다. 이 결과는 세포 내 ROS가 CoPP나 hemin에 의한 HO-1 유전자 발현 과정에 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.</p>