홍어회의 염기서열 분석 결과 4가지 클론(2, 28, 40, 49)이 동일한 염기서열을 갖고 있으며, 9가지 클론은 각각 다른 uncultured bacterium clone들로 동정되었다. 2가지 클론를 제외한 나머지 클론들은 배양되지 않은 박테리아들로 추정되며, 특히 054E11.b, 13/4/10H, PDTRI1OCT054가 우점균으로 존재하고 있다고 추정된다. 이는 \( \mathrm { pH } ~8.9-9.4 \) 범위에 있는 숙성된 흥어회의 환경이 자라기 어려워 식중독 미생물 등이 검출되지 않았기 때문이다.
<p>그 뒤를 이어 4종류의 클론(클론 2, 28, 40, 49)이 동일한 염기서열을 갖고 있음이 염기서열분석 결과 밝혀졌고, 이들 클론은 라이브러리에서 \( 4 / 63=6.3 \% \)를 차지하고 있으며, BLAST로 분석한 결과 \( 100 \% \)의 유사성으로 uncultured bacterium clone PDTRI1OCT054로 동정되었다. 이밖에 9종류의 클론들은 1회씩만 나타났으며, 이들은 각각 uncultured bacterium clone nbt229e07, Adelie penguin guano bacterium 97, uncultured bacterium clone 004F02.b, uncultured bacterium 005F01.b, uncultured bacterium clone R2B18H, uncultured bacterium clone 043F04.g, uncultured bacterium clone 001H10.g, Serpens flexibilis strain ATCC 29606, Psychrobacter sp. J466로 동정되었다(Table 1).</p> <p>이 결과로부터 Serpens flexibilis strain ATCC 29606, Psychrobacter sp. J466를 제외하고는 대부분 실험실에서 배양되지 않았던 박테리아들이 홍어회에 서식하고 있는 것으로 추정할 수 있다. 특히 uncultured bacterium clone 054E11.b가 \( 57.1 \% \), uncultured bacterium clone 13/4/10H가 \(9.5 \% \) 그리고 uncultured bacterium clone PDTRI1OCT054가 \( 6.3 \% \)의 비율로 나타남으로써 이들이 홍어회에서 우점균으로 존재하고 있다고 추정할 수 있다. 대장균, Vibrio 등 중성 식품에서 자라는 식중독 미생물 등이 본 실험에서 검출되지 않았는데, 이는 숙성된 흥어회는 \( \mathrm { pH } ~8.9-9.4 \) 범위에 있어서 자라기 어려운 환경을 이루고 있기 때문인 것으로 판단된다.</p> <h2>DGGE에 의한 16S rDNA 분석</h2> <p>발효홍어(홍어회)를 PBS 완충용액으로 현탁시킨 현탁액으로부터 분리한 DNA를 주형으로 사용하여 \(40 \mathrm { -bp } \)의 GC 클램프를 갖고 있는 338FGC와 518R 프라이머 세트를 사용하여, 16S rDNA 조각을 증폭하기 위한 PCR 반응을 수행하였다. 또한 12가지의 서로 다른 삽입체를 갖고 있는 클론들(클론 2, 3, 9, 7, 12, 18, 23, 26, 35, 52, 55, 67)에 대해서도 338FGC와 518R 프라이머 세트를 사용하여 각각 PCR을 수행하였다. 이들 PCR 산물을 포름아마이드와 요소 변성제가 들어있는 변성구배 아크릴아마이드 젤(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)을 이용하여 전기영동을 수행하였다. DGGE로 DNA 조각을 분석하면 동일한 길이의 염기조각이라 하더라도 염기서열 차이에 따른 Tm 값의 차이에 의해 이중가닥이 녹아 단일가닥을 만들면서 서로 다른 위치에 DNA 띠를 형성하게 된다.</p> <p>홍어회 현탁액으로부터 분리한 DNA를 주형으로 사용하여 얻은 PCR 산물과 12종류의 클론들로부터 증폭된 \(221 \mathrm { -bp } \) DNA 조각들을 함께 전기영동하여 상대적인 위치를 비교하였다(data not shown). 흥미 있게도 염기서열의 차이에도 불구하고 서로 다른 5종류의 클론인 3번, 7번, 9번, 18번, 52번은 동일한 위치에서 띠를 형성하였다. 또한 서로 다른 2종류의 클론인 17번과 55번도 동일한 위치에서 띠를 형성하 였다. 동일한 박테리아에서 유래한 16S rDNA 조각도 rRNA 유전자의 중복성 때문에 다른 위치에서 DNA 띠를 형성하 는 것이 보고된바 있다. 서열이 다른 경우에도 16S rDNA 조작들이 동일한 녹는점을 가짐으로써, 동일한 위치에서 DNA 띠를 형성할 수 도 있다. 이 결과로부터 배양 비의존적 방법으로 미생물 다양성을 분석할 경우 16S rDNA 조각을 클로닝하여 라이브러리를 만드는 것이 DGGE보다 더 민감하게 미생물 집단에 대한 정보를 얻을 수 있다는 것을 알 수 있다.</p>