EPEE의 lipase 효소 활성 저해능 보유 유무를 측정하고 EPEE에 의한 항비만 활성을 분석하였다. 세포 독성을 유발하지 않는 시료의 처리 농도를 위해 water soluble tetrazolium(WST) assay를 수행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>E. pleiosperma 에탄올 추출물의 준비</h2><p>본 연구에서 사용한 E. pleiosperma \( 95 \% \) 에탄올 추출물(EPEE)은 한국생명공학연구원, 해외생물소재허브센터에서 구입(분양번호 FBM123-004)하였다. 건조 및 분쇄한 시료를 \( 95 \% \) 에탄올을 용매로 하여 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일간 초음파 추출을 수행하고 추출이 끝난 시료를 filter로 여과하여 고형물을 없앤 후 감압농축(N-1000SW, EYELA, Japan) 및 동결 건조 (FDU2100, EYELA, Japan)한 시료를 구입하여 사용 전까지 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다.</p><h2>EPEE의 췌장 lipase 효소 활성 저해능 분석</h2><p>EPEE의 항비만 활성을 세포 실험계에서 분석하기에 앞서 EPEE의 lipase 효소 활성 저해능 보유 유무를 다음과 같이 측정하였다. 먼저 \( 1.5 \mathrm{ml} \) tube에 \( 0.25 \mathrm{M} \) Tris ( \(\mathrm{pH} \ 7.7)\), \(250\mathrm{mM} \) \( \mathrm{CaCl}_{2}\), \(5 \mathrm{mM} \) 4-nitrophenyl dodecanoate(PNPD)로 구성된 효소액과 기질을 넣고 잘 섞어준 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 예열하고, \( 0.25 \mathrm{M} \) Tris( \(\mathrm{pH} \ 7.7\))에 녹인 lipase와 시료를 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시킨 후 \( 20 \% \) sodium dodecyl sulfate(SDS)를 첨가하여 반응을 종료하였다. 반응액을 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(15,000\mathrm{rpm} \)에서 20분간 원심분리하여, 분리한 상층액을 96-well tissue culture plate에 분주하고 multi-plate reader를 이용하여 \( 412 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정한 후, 10분간 반응시킨 시료의 흡광도로부터 0분 반응 시료의 흡광도를 뺀 값을 control 대비 백분율로 나타내었다. 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.</p><h2>세포 배양 및 시료 처리</h2><p>EPEE의 항비만 활성을 세포실험계에서 분석하기 위헤 항비만 활성 분석에 사용되는 대표적인 cell model system인 3T3-L1 지방전구세포를 American Type Culture Collection (ATCC, VA, USA)으로부터 구입하여 \( 10 \% \) fetal bovine serum(FBS) 및 penicillin/streptomycin이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. \( 0.5 \mu \mathrm{M} \) IBMX, \( 1 \mu \mathrm{M} \) DEX, \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 insulin(이하 MDI)를 처리하여 adipogenesis를 유도하고 EPEE에 의한 지방세포 분화 및 세포 내 지방 축적 저해능, 지방세포 분화 관련 인자의 유전자 및 단백질 발현 조절 등의 항비만 활성을 분석하였다.</p><h2>세포 독성 유무 분석</h2><p>항비만 활성 분석 수행 전 시료가 세포생존율에 미치는 영향을 확인함과 동시에 세포 독성을 유발하지 않는 시료의 처리 농도를 결정하기 위해 water soluble tetrazolium(WST) assay를 수행하였다. \( 1 \times 10^{5} \) cell을 24-well tissue culture plate에 분주하여 24시간 동안 부착시킨 후 시료를 농도 별로 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 시료 처리 후 WST 시약이 든 배지로 교체하여 한 시간 동안 반응시킨 후 multi-plate reader를 이용하여 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.</p>