세포 독성 측정 결과 보편적으로 사용되는 프로바이오틱스인 Lactobacillus casei보다 Lactobacillus rhamnosus 파쇄물이 fibroblast에 주는 자극이 현저하게 낮은 것을 확인 할 수 있는데 이는 상기 프로바이오틱스와 비교하여도 현저히 낮은 세포독성을 나타내는 Lactobacillus rhamnosus가 향장원료로서 사용될 수 있음을 알 수 있다. DPPH 자유라디칼 소거활성 측정 결과 활성산소의 감소는 직-간접적으로 멜라닌 세포 생성 경로 및 인자들에 영향을 미치게 되어 멜라닌 생성 작용들도 억제가 되는데 이는 항산화활성의 증가에 따른 추가적인 미백활성에도 영향을 미칠 것이라고 사료된다. 환원력 측정을 분석한 결과, Lactobacillus rhamnosus 파쇄물이 체내의 활성 산소를 감소시키므로 항산화 활성이 증가됨에 따라 활성산소에 영향을 받는 멜라닌 생성기작에도 영향을 미치게 되어 피부미백 효능이 동반될 것이라는 것을 알 수 있었다. 또한 Tyrosinase 억제 효과 실험 결과 멜라닌 생성을 방해해 미백효과를 보일 것으로 예측되며 미백 기능을 가지는 향장소재로써 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 사료된다. 마지막으로 Melanoma cell을 이용한 멜라닌 생성량 측정결과, 독성이 거의 없는 Lactobacillus rhamnosus가 피부 적합성이 높아 합성미백제 및 기타 천연물을 대체할 수 있는 긍정적인 향장소재로 다가갈 수 있으며 향장미백제로서 Lactobacillus rhamnosus의 활용 가능성이 높을 것으로 예측할 수 있다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>세포 독성 측정</h2> <p>Lactobacillus rhamnosus의 파쇄물의 human fibroblast cell인 CCD-986sk에 대한 세포독성을 알아보기 위하여 본 실험을 진행하였다. Lactobacillus rhamnosus가 장내 일반 유산균과 비교하여 피부세포에서 어떠한 차이를 나타내는지 비교 및 관찰하기 위하여 대조군으로써 Lactobacillus casei 파쇄물을 사용하였다. 각 sample은 \( 2.5 \%, 5.0 \%, 10.0 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 농도로 처리하였으며, 그 결과 농도 의존적으로 세포독성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. \( 10.0 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 농도의 Lactobacillus rhamnosus 파쇄물의 경우 \( 7.6 \% \) 의 세포독성을 나타내어, 같은 농도의 Lactobacillus casei 파쇄물의 세포독성인 \( 9.8 \% \) 보다 낮은 독성을 가진다는 것을 Fig. 1을 통해서 알 수 있다. 따라서 보편적으로 사용되는 프로바이오틱스인 Lactobacillus casei보다 Lactobacillus rhamnosus 파쇄물이 fibroblast에 주는 자극이 현저하게 낮은 것을 확인 할 수 있다. 상기 프로바이오틱스와 비교하여도 현저히 낮은 세포독성을 나타내는 Lactobacillus rhamnosus가 추후 식품이나 향장원료로서 큰 문제점 없이 사용될 수 있을 것이라고 사료된다.</p> <h2>DPPH 자유라디칼 소거활성 측정</h2> <p>DPPH는 안정된 자유라디칼로 \( 517 \mathrm{~nm} \) 근처에서 최대로 흡수하며, 수소 또는 전자를 받으면 \( 517 \mathrm{~nm} \) 근처에서 흡광도가 감소한다. 따라서, 항산화 활성을 판단할 수 있는 DPPH 자유라디칼 소거활성 측정을 통해 라디칼을 환원시키는 능력이 크면 항산화 활성이 크다고 기대할 수 있다. 이러한 원리로 측정된 DPPH 자유라디칼 소거 활성 결과를 Table 1에 나타내었다. 실험군으로 Lactobacillus rhamnosus와 Lactobacillus casei 각각의 파쇄물을 이용하였으며, postive control로써 ascorbic acid를 사용하였다.</p> <p>Lactobacillus rnamnosus와 Lactobacillus casei 모두 DPPH 자유라디칼 소거능이 농도의존적으로 증가하였으며, 각각 \( 10.0 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 농도에서 \( 14.9 \%, 13.2 \% \) 의 DPPH 자유라디칼 소거활성을 나타냈다. 본 실험의 결과는 postive control인 ascorbic acid과 증숙더덕 추출물 \( 1.25 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) 의 농도에서 \( 41.58 \% \) 의 항산화활성의 결과보다 작은 값이지만, 농도의 증가에 따른 DPPH 자유라디칼 소거활성 증가를 확인할 수 있다.</p> <p>활성산소가 감소할 경우 체내의 항산화물질을 고갈시키 것을 막는 동시에, 각질형성세포에 작용하여 사이토카인의 분비를 억제시킴으로써 멜라닌세포에 영향을 미치게 된다. 따라서 활성산소의 감소는 직-간접적으로 멜라닌 세포 생성 경로 및 인자들에 영향을 미치게 되어 멜라닌 생성 작용들도 억제가 된다. 결국 항산화활성의 증가에 따른 추가적인 미백활성에도 영향을 미칠 것이라고 사료된다.</p> <h2>환원력 측정 분석</h2> <p>환원력은 활성산소에 젖자를 제공할 수 있는 활성 수소의 수치를 측정한 것으로 흡광값이 높으면 활성산소 제거 능력이 높음을 나타낸다. Lactobacillus rhamnosusi가 Lactobacillus casei 파쇄물을 각각 \( 2.5 \%, 5.0 \%, 10.0 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 농도로 사용하였으며 ascorbic acid는 positive control로 사용하였다. 실험 결과를 보면 각 sample의 파쇄물 농도가 점차적으로 증가함에 따라 농도 의존적으로 환원력이 증가하는 경향을 볼 수 있었으며, positive control인 ascorbic acid의 O.D. 값이 \( 1.0635 \) 로 가장 강한 환원력을 나타내었고, Lactobacillus rhamnosus 가 \(0.7636\), Lactobacillus casei가 \(0.7391\)의 O.D. 값이 측정되었다(Fig. 2). 위의 결과로 Lactobacillus rhamnosus의 환원력은 초고압 공정을 거친 지치의 추출물보다 작은 값이지만, 일반적인 장내유산균인 Lactobacillus casei보다 높은 항산화 활성을 가짐을 확인할 수 있다. DPPH 자유라 디칼 소거활성 실험과 마찬가지로 항산화 활성의 증가는 멜라닌색소 형성의 신호전달 경로에 영향을 미침으로써 멜라닌 색소 형성억제에 효과적으로 알려져 있다. 따라서 Lactobacillus rhamnosus 파쇄물이 체내의 활성 산소를 감소시키므로 항산화 활성이 증가됨에 따라 활성산소에 영향을 받는 멜라닌 생성기작에도 영향을 미치게 되어 피부미백 효능이 동반될 것이라 사료되기에 다음과 같은 미백 효능 실험을 진행하였다.</p> <h2>Tyrosinase 억제 효과 탐색</h2> <p>Tyrosinase는 피부의 멜라닌 색소의 생성을 촉진하는 효소로 tyrosinase의 저해활성을 측정함으로써 각 시료들의 미백효과를 알아 볼 수 있다.</p> <p>Lactobacillus rhamnosus와 Lactobacillus casei 파쇄물을 각각 \( 2.5 \%, 5.0 \%, 10.0 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 농도로 처리하고, positive control로써 hydroquinon을 \( 25, 50, 100 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도로 투여 하여 tyrosinase 저해활성을 측정하였다(Fig. 3). Positive control인 hydroquinone의 경우 가장 높은 농도인 \( 100 ~\mu \mathrm{g} / \) \( \mathrm{ml} \) 에서 \( 40.65 \% \) 의 미백활성을 나타내었으며, Lactobacillus rhamnosus 가 \( 2.5 \%, 5.0 \%, 10.0 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 농도에서 각각 \( 20.6 \% \), \( 25.8 \%, 31.1 \% \) 의 tyrosinase 저해 활성을 나타내었으며, Lactobacilllus casei도 같은 농도에서 각각 \( 11.6 \%, 13.2 \% \), \( 17.7 \% \) 의 tyrosinase 저해 활성을 나타내었다. Lactobacillus rhamnosus가 Lactobacillus casei와 비교하여 약 2배에 가까운 높은 미백활성을 보였다. Kim의 연구에서는 \( 1 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) 농도의 녹차 추출물이 \( 38.64 \% \) 의 미백활성을 나타낸 것과 비교 하면 Lactobacillus rhamnosus 파쇄물 만으로도 천연 추출물만큼의 미백활성을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다. 위의 결과로 Lactobacillus rhamnosus 파쇄물이 Lactobacillus casei 파쇄물의 약 2배 이상의 tyrosinase 저해 활성을 나타냄에 따라, 멜라닌 생성에 간여하는 효소인 tyrosinase를 저해하여 멜라닌 생성을 방해해 미백효과를 나타낼 것으로 생각되며, 추후 미백 기능을 가지는 향장소재로써 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.</p> <h2>Melanoma cell을 이용한 멜라닌 생성량 측정</h2> <p>Melanoma 세포를 이용하여 시료 투여 시 멜라닌 생합성과 세포생존율에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 농도별로 처리하고 24시간 후, 멜라닌 생성량을 측정하였다(Fig. 4). 실험 결과, Lactobacillus rhamnosus의 경우 \( 2.5 \%, 5.0 \% \), \( 10.0 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 농도에서 각각 \( 66 \%, 59 \% 58.6 \% \) 의 생성률을 보였으며, Lactobacillus casei 파쇄물은 같은 농도에서 \( 96.2 \% \), \( 83.6 \%, 80.6 \% \) 의 생성률을 보였다. positive control인 hydroquinone의 경우 \( 25,50,100 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 농도에서 각각 \( 53.8 \%, 46.2 \%, 40.9 \% \) 의 낮은 생성률을 보였다. 위의 세포독 성결과에서 Lactobacillus casei가 가장 높은 세포독성을 가지는 데에도 불구하고 Lactobacillus rhamnosus 파쇄물의 멜라닌 생성량이 낮은 결과로 보아, 멜라닌의 생성을 억제하는 활성물질이 함유되어 있을 것이라 사료된다. 미백 효능이 뛰어나다고 알려진 고로쇠 수액의 경우 \( 100~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 농도에서 \( 35 \% \) 가량의 멜라닌 생성 저해율을 나타낸 것과 비교하여도 Lactobacillus rhamnosus 파쇄물의 미백활성이 월등히 우수한 것이 확인되었다. 또한 초고압 추출 공정에 의한 당귀 추출물의 미백 및 자외선 차단 효과 연구에서 보고된 초고압 처리된 당귀의 멜라닌 생성량이 \( 82.4 \% \) 인 것과 비교 하면 Lactobacillus rhamnosus 파쇄물의 미백활성이 높다는 것을 유추할 수 있다. Positive control인 hydroquinone의 미백활성이 Lactobacillus rhamnosus에 비해 약 \( 15 \% \) 정도 높지만, 대표적인 미백제로 알려진 hydroquinone은 높은 미백활성과 함께 독성을 가지고 있는 합성물질로 현재 많은 연구진들이 이러한 합성 미백제를 대체할 수 있는 천연물질들에 대해 연구 중에 있다. 위의 결과를 토대로 독성이 거의 없는 Lactobacillus rhamnosus가 합성미백제인 hydroquinone의 미백 활성보다 낮지만 피부 적합성이 높아 합성미백제 및 가타 천연물을 대체할 수 있는 긍정적인 향장소재로 다가갈 수 있으며, 멜라닌 생성은 줄이면서 세포독성은 낮아야 하는 향장미백제로서 Lactobacillus rhamnosus의 활용 가능성이 매우 높을 것으로 사료된다.</p>