PCR 방법으로 특정 바이러스의 존재를 확인하고 분석하기 위해 유전적인 변이가 심하지 않은 conserved sequence를 가진 부위를 선택해야 하며, 이 조건을 만족시키기 위해 Primer3 Softerware를 사용하여 MVM 특이적인 primer를 5쌍 디자인 하였다. 이 산물들을 sequencing 한 후 searching한 결과 PCR 산물이 MVM유전자임을 확인할 수 있었다. PCR 조건을 확립하기 위해 일반 PCR을 통해 확립된 조건을 기반으로 한 TaKaRa를 사용했고, MVM-F5와 MVM-R5를 사용하여 annealing temperature를 최적화하였다.
<h1>결 과</h1> <h2>Primer의 선별</h2> <p>PCR 방법을 사용하여 특정 바이러스 존재를 확인하고, 정량분석하기 위해서는 바이러스 내에서 유전적인 변이가 심하지 않은 conserved sequence를 가진 부위를 선택하여야 한다. 선택된 sequence는 특정 바이러스에만 존재하여 특이성이 높아야 한다. 생물의약품의 원료물질, 공정 중간물질, 최종제품 등에 미량으로 오염될 수 있는 바이러스 검출을 위한 정량 PCR의 경우 높은 민감도가 요구된다. 위와 같은 조건을 만족하는 PCR을 확립하기 위해 Primer3 Software를 이용하여 MVM 특이적인 primer 5쌍을 디자인하였다(Table 1). 일반 PCR을 실행하여 각각의 primer쌍들의 민감도를 확인하였다. Titer가 \( 6 \times 10 ^ { 3 } \mathrm { ~TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \)과 \( 6 \times 10 ^ { 1 } \mathrm { ~TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \)인 MVM을 시료로 PCR을 수행한 결과 primer 쌍 MVM-F5, MVM-R5가 가장 민감도가 우수하였다(자료 미제시). PCR 조건을 최적화 한 결과 annealing temperature와 \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \) 농도는 각각 \( 52 ^ {\circ } \mathrm { C } \)와 \( 4 \mathrm { ~mM } \)이었다. 최적 조건에서 PCR의 민감도를 측정하였다. Titer가 \( 6 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { ~TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \)인 MVM을 순차적으로 희석하여 PCR 한 결과 \( 6 \times 10 ^ { -2 } \mathrm { ~TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \)까지 PCR 산물을 확인할 수 있었다(Fig. 1). PCR 산물을 sequencing한 후 blast searching(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 한 결과 PCR 산물이 MVM 유전자임을 확인할 수 있었다(자료 미제시).</p> <h2>MVM DNA 정량을 위한 real-time PCR 최적화</h2> <p>일반 PCR을 통해 확립된 PCR 조건을 기초로 SYBR \( ^ {\circledR } \)Premix Ex Taq \( ^ {\mathrm { TM } } \)(TaKaRa)을 사용하여 real-time PCR 조건을 확립하였다. Forward primer로 MVM-F5를 reverse primer로 MVM-R5를 사용하여 PCR 반응의 annealing tem-perature를 최적화하였다(Fig. 2). Titer가 \( 6 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { ~TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \), \( 6 \times 10 ^ { 2 } \mathrm { ~TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \), \( 6 \times 10 ^ { 0 } \mathrm { ~TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \)인 MVM을 시료로 annealing temperature를 \( 48 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) , \( 52 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 54 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 56 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 58 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 변화시키며 real-time PCR을 수행하였을 때 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 crossing point가 가장 낮게 나타나 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)가 최적 온도임을 알 수 있었다.</p>