First strand cDNA synthesis kit를 이용해 A. niger #33의 분리 정제한 total RNA로부터 cDNA를 합성하였고 PCR로 EH 유전자를 증폭한 후 universal primer을 이용해 유전자서열을 확인, 단백질서열을 결정하였다. S. cerevisiae에 재조합 EH를 발현시켜 형질전환체를 얻고 단백질의 발현정도를 SDS-PAGE 전기영동으로 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>배지 및 미생물 배양조건</h2> <p>A. niger #33는 액체배지(glucose \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \), corn-steep liquor \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) )에서 \( 27^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm} \) 조건에서 3 일간 배양하였다. 배양액을 원심 분리하여 상등액을 제거한 후 \( 100 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer( \( \mathrm{pH} \) 8.0)로 두 번 세척한 균체를 실험재료로 사용하였다.</p> <h2>Total RNA 분리 및 cDNA 합성</h2> <p>A. niger #33로부터 total RNA의 분리는 Chomczynski과 Sacchi의 방법을 이용하였다. 분리 정제한 total RNA로부터 cDNA를 합성하기 위하여 Gibco사의 first strand cDNA synthesis kit를 사용하였다.</p> <h2>PCR을 이용한 A. niger #33 EH 유전자의 증폭 및 클로닝</h2> <p>A. niger #33의 cDNA library로부터 EH 유전자를 증폭하기 위하여 PCR을 사용하였다. PCR에 사용한 primer들은 Gene Bank 등에 보고된 EH의 mRNA sequence를 참조하여 제작하였다. 효모인 S. cerevisiae에 발현시키기 위한 primer로는 KpnI과 NotI의 restriction site가 들어있는 5AnEHF(Kpnl): 5'-cgggtaccatgtccgctccgttcgccaagt-3'와 3AnEHR(NotI): 5'-gcggccgcctacttctgccacacctgctcg- 3'를 사용하였다. PCR 산물을 먼저 pEZ-T vector(RNA사, Korea)에 삽입시킨 다음 pEZ-T/AnEH plasmid DNA로부터 S. cerevisiae 용 vector인 pYES2 vector에 A. niger EH 유전자를 삽입하기 위하여 pEZ-T/AnEH plasmid DNA를 KpnI 및 NotI으로 가수분해하고 전기영동한 후 \( 1200 \mathrm{bp} \) DNA조각을 gel로부터 추출하였다. 같은 효소로 가수분해한 pYES2 vector에 EH 유전자를 삽입시킨 다음 여러 종류의 제한효소로 가수분해하여 EH 유전자가 올바른 방향으로 cloning 되었는지를 확인하였다. 확인 된 plasmid들은 T7 및 SP6 등과 같은 universal primer들을 이용하여 유전자서열을 확인하고 단백질서열을 결정하였다.</p> <h2>S. cerevisiae에 재조합 EH의 발현 및 분석</h2> <p>Invitrogen사의 S.C. EasyCompTM Transformation Kit를 이용하여 만든 S. cerevisiae competent cell \( 50 \mu l \) 에 \( 1 \mu \mathrm{g} \) recombinant DNA를 섞은 다음 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) water bath에서 1 시간동안 water bath에서 반응을 통해 형질전환체를 얻었다. EH 유전자의 발현은 galactose 첨가를 통해 유도하였다. 즉, \( 5 \mathrm{m \ell} \) YNBCAD 배지에 형질전환체를 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간동안 전배양을 행하고 전배양액을 YPD배지 ( \( 1 \% \) glucose, \( 1 \% \) yeast extract, \( 2 \% \) peptone)로 \( \mathrm{OD} 600=0.25 \) 가 되도록 희석한 후 6시간 정도 배양하였다. Galactose가 \( 2 \% \) 되도록 첨가하고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48시간 및 60시간 배양하여 얻은 배양액을 원심분리하여 S. cerevisiae pellet을 얻어 EH 활성 분석을 위한 생촉매로 사용하였다. 배양하는 동안 glucose 양은 DNS 또는 enzyme kit를 사용하여 측정하였고, 단백질의 발현정도는 SDS-PAGE 전기영동으로 확인하였으며 대조군은 pYES2 vector만 들어있는 S. cerevisiae 형질전환체를 사용하였다.</p> <h2>입체선택적 가수분해 반응 및 가스크로마토그라피 (GC) 분석</h2> <p>재조합 S. cerevisiae \( 200 \mathrm{mg} \) 을 \( 10 \mathrm{ml} \) 의 \( 100 \mathrm{mM} \) 인산완충액 \( (\mathrm{pH} \) 8.0)에 현탁시킨 후 \( 10 \sim 20 \mathrm{mM} \) 농도로 라세믹 phenyl oxirane 기질을 주입하였다. \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm} \) 에서 교반시키면서 반응을 진행시킨후, 반응용액을 pentane 또는 cyclohexane으로 추출하고 유기용매 층을 GC로 분석하여 enantiomeric excess 값 및 EH 활성을 평가하였다.</p>