독도 연안의 바닷물을 채취하고, 희석한 artificial sea water로 희석하여 standard dilution plating technique을 이용하여 Marine agar 2216(MA) 배지에 도말하여 5일간 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하여 세균의 순수 분리를 시도하였다. 16S rRNA 유전자를 사용하여 PCR을 수행하고, DNA prep mate를 사용하여 염기서열을 결정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시료 채취 및 배양가능한 세균의 분리</h2> <p>독도를 구성하고 있는 2 개의 큰 섬인 동도와 서도 연안에서, 먼저 접근하기 쉬운 동도 계단 주위 연안을 중심으로 바닷물을 채취하고, 선착장 주변에서 고여 있거나 흐르는 바닷물과, 서도에서는 어민 숙소 앞과 물골 주위의 바닷물을 각각 채취하였다. 2007년 9월, 2008년 4월과 6월 등 3회에 걸쳐 채취하였다. 채취한 시료는 멀균된 cornical tube에 담았고, 실험실에 옮겨서는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다.</p> <p>채취한 시료는 단계별로 멸균된 artificial sea water로 희석하여 standard dilution plating technique을 이용하여 Marine agar 2216(MA; Difco, USA) 배지에 도말하였다. 1/10 MA, 1/2 MA, MA 배지 등에 희석한 시료를 각각 \( 100 \mathrm{~\mu} \mathrm{L} \) 도말한 후, \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5일간 배양하였다. 세균의 순수 분리를 위하여, 배지 상에 나타난 군락을 형태적으로 분류, 선별하여 각각의 한천 배지에 획선 도말하였다.</p> <h2>16S rRNA 유전자의 염기배열 결정</h2> <p>육안으로 관찰했을 때 콜로니의 모양, 크기, 색깔 등에 따라 세균을 순수 분리하였다. 분리한 세균을 Marine broth(MB; Difco, USA)에 배양한 후 원심분리하여 세균을 모았다 \( (10,000 \times \mathrm{g}, 5 \mathrm{~min}) \). QIAamp DNA mini kit(QIAGEN; USA)을 사용하여 total genomic DNA를 추출하였다. 분리한 total DNA에서 16S rRNA를 증폭시키기 위하여 5'-GAGTTTGATCATGGCTCAG-3'(Escherichia coli nucleotides 9에서 27)를 forward primer로 5-ACGGTTACCTTG-TTACGACTT-3'(E. coli nucleotides 1492에서 1512)를 reverse primer로 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 denaturation (\(94^{\circ} \mathrm{C},\) 5분) 시킨 후, denaturation (\(94^{\circ} \mathrm{C},\) 30초), annealing (\(60^{\circ} \mathrm{C},\) 30초), elongation (\(72^{\circ} \mathrm{C},\) 45초) 단계를 35회 반복하고, 마지막으로 elongation (\(72^{\circ} \mathrm{C},\) 10분) 하는 조건으로 반응시켰다. PCR 산물을 DNA prep mate \( { }^{\mathrm{TM}} \) (Bioneer, Korea)를 사용하여 회수하고, 염기서열을 결정하였다.</p> <h2>16S rRNA 유전자의 염기서열에 대한 계통분석</h2> <p>분리된 세균을 동정하기 위해서 16S rRNA 유전자의 염기서열 간 유사도를 확인하기 위하여 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) search를 이용하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 EzTaxon server(http://www.eztaxon.org)의 데이터베이스에서 유사한 염기서열을 비교하였다. 분리균 DNA로부터 결정된 염기서열과 데이터베이스에서 얻어진 염기서열은 PHYDIT program(http://plaza.snu.ac.kr/~jchun/phydit)을 이용하여 Clustal W multiple alignment로 정렬하여 계통수 제작에 이용하였다. 염기서열 간의 유전적 거리는 Jukes & Cantor distance model을 사용하여 추정하였다. Neighbour-joining data의 Bootstrap 분석 시 1,000회의 resampling을 적용하여 tree topology의 평가 기준으로 사용하였고, 이를 토대로 하여 phylogenetic tree를 결정하였다.</p>