전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 ethidium bromide를 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하였으며 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate de-hydrogenase 유전자를 internal control로 사용, \( \mathrm{PGE}_{2} \) 생성양의 변화 측정을 위한 \( \mathrm{PGE}_{2} \) EIA kit는 Cayman Chemicals에서 구입, \( \mathrm{PGE}_{2} \)의 양의 측정을 위해 정상 및 다양한 농도의 ENIL 및 ENS를 1시간 선 처리 후 PMA \( (40 \mathrm{~nM} \) )를 처리한 배지에서 6시간 동안 U937 세포를 배양시킨 후 상층액만 이용하여 제시된 방법에 따라 처리한 다음 ELISA reader를 이용하여 \( 420 \mathrm{~nm} \)의 흡광도를 이용하여 반응의 정도를 측정하였다.
<h2>세포의 형태 변화 관찰</h2> <p>다양한 실험 조건에서 세포의 전체적 형태 변화 여부를 조사하기 위하여 도립 현미경(inverted microscope, Carl Zeiss)을 이용하여 200배의 배율로 관찰하였다. 또한 동일한 조건에서의 핵의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 \( 37 \% \) formaldehyde용액과 PBS를 1:9의 비율로 섞은 fixing solution을 모아진 세포에 첨가하여 상온에서 10분 동안 고정하였다. 고정된 세포를 PBS에 부유시킨 후 cytospin을 이용하여 slide glass 위에 세포를 부착시키고 \( 4^{\prime} \),6-diamidino-2-phenylindole (DAPI,Sigma) 용액을 처리하여 염색하였다. 형광 현미경을 이용하여 400배의 배율로 세포의 핵의 형태 변화를 관찰하였다.</p> <h2>Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석</h2> <p>다양한 조건에서 준비된 세포들을 모은 다음 적당량의 lysis buffer [25 mM Tris-Cl ( \( \mathrm{pH~7.5} \)), \( 250 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 5 \mathrm{mM} \) EDTA,\( 1 \% \) NP-40, \( 1 \mathrm{mM} \) phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), 5\( \mathrm{mM} \) dithiothreitol (DTT)]를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 반응시킨 후, \( 14,000 \mathrm{rpm} \)으로 30분간 원심분리하여 그 상층액을 취하였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 사용방법에 따라 정량 한 다음 동량의 Laemmli sample buffer (Bio-Rad)를 섞어서 sample을 만들었다. 이렇게 만든 동량의 단백질을 sodium dodecyl sul-phate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리한 다음 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell,Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 전이시켰다. 전이가 끝난 membrane에 1차 항체를 처리하여 상온에서 2시간 이상 또는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 over night 시킨 다음 2차 항체를 사용하여 상온에서 1시간 정도 반응시켰다. 반응이 끝난 후 PBS-T \( 0.1 \% \) Tween in PBS)로 충분히 세척하고 Enhanced Chemiluminoesence(ECL) 용액(Amersham Life Science Corp.)을 적용시킨 다음 암실에서 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다.</p> <h2>Rverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)에 의한 mRNA의 분석</h2> <p>준비된 세포를 대상으로 TRIzol reagent (Invitrogen Co.,Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 total RNA를 분리하고 정량한 다음 primer, DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 넣고 Mastercycler gradient(Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭한 다음 \( 1 \% \) agarose gel을 이용하여 \( 100 \mathrm{~V} \)에서 전기영동을 하였다.전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 ethidium bromide (EtBr)를 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하였다. 이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate de-hydrogenase (GAPDH) 유전자를 internal control로 사용하였다.</p> <h2>\( \mathrm{PGE}_{2} \)의 측정</h2> <p>\( \mathrm{PGE}_{2} \) 생성양의 변화 측정을 위한 \( \mathrm{PGE}_{2} \) EIA kit는 Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였으며, \( \mathrm{PGE}_{2} \)의 양을 측정하기 위하여 정상 및 다양한 농도의 ENIL 및 ENS를 1시간 선 처리 후 PMA \( (40 \mathrm{~nM} \) )를 처리한 배지에서 6시간 동안 U937 세포를 배양시킨 다음 상층액만 이용하여 제시된 방법에 따라 처리한 다음 ELISA reader를 이용하여 \( 420 \mathrm{~nm} \)의 흡광도를 이용하여 반응의 정도를 측정하였다.</p>