유연 미생물들의 16S rRNA 유전자 염기서열을 수집하고, 이를 CLUSTAL X 프로그램을 활용하여 multiple alignment를 시행하였다. 지방족 탄화수소인 hexane, hexadecane, chloroform을 유일한 탄소원으로 사용하여 배양 후 분해능을 판정하였으며, 방향족 화합물 역시 비슷한 방법으로 분해능을 판정하였다. 단, Phenanthrene의 경우 YEPG 평판배지에서 colony를 취한 후 이를 Phenanthrene과 함께 \( 20 \mathrm{~ml} \) MSM을 포함한 \( 125 \mathrm{~ml} \) 플라스크에 접종하여 대수 증식기에서 배양하였다.
<h2>16S rRNA을 이용한 균주의 동정</h2> <p>분리균으로부터 total DNA 를 추출하여 PCR로 16S rRNA 유전자를 증폭하는데 사용하였다. Primers로는 27f와 1492r를 사용하여 total DNA로부터 약 \( 1.5 \mathrm{~kb} \)의 16S rRNA 유전자를 증폭하였다. Primer 27f와 1492r의 염기서열(5'에서 3')은 각각 CGATCCCCTGCTTTTCTCC와 AGAGTTTGATCMTGGCTCAG이었다. 이 PCR 산물은 솔젠트(주)(대전, 대한민국)에 의뢰하여 Applied Biosystems 3730XL capillary DNA Sequencer (Foster City, CA, USA)를 사용하여 부분적으로 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 BLASTN (version 2.2 .10)을 이용하여 GenBank database에서 가장 비슷한 염기서열을 찾는데 사용하였다.</p> <p>검색 결과를 토대로 하여 유연 미생물들의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 수집한 후, CLUSTAL X 프로그램을 사용하여 multiple alignment를 수행하였다. Multiple alignment의 결과를 TreeVeiw 프로그램상에서 neighbor-joining법으로 계통수를 작성하였으며 Boot strap은 1,000번을 수행하였다.</p> <h2>지방족 탄화수소의 분해능 조사</h2> <p>본 연구에 사용된 지방족 탄화수소는 hexane, hexadecane, 그리고 chloroform이었다. 각 지방족 탄화수소의 분해능은 그 화합물을 유일 탄소원으로 공급하여 평판배지에서 14일 배양 후 집락 형성 유무에 따라 판단하였다. MSM agar 배지에 균주를 접종하고, Petri dish 뚜껑에 각 화합물을 두어 증기상태로 균주에 공급하였으며 각 Petri dish는 비닐 봉지로 봉하여 탄소원의 증기가 밖으로 세지 않게 하였다. 한편 hexadecane을 이용한 성장은 filter 여과한 hexadecane을 유일 탄소원(\(1\%\), \( \mathrm{v} / \mathrm{v})\)으로 포함하는 MSM agar 에 미생물을 도말 하여 집락 형성을 재 확인하였다. 대조군은 탄소원을 포함하지 않은 것 외는 실험군과 동일한 조건에서 배양되었다. 달리 언급하지 않는 미생물 배양은 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 실시하였다. 특정 석유계 탄화수소에서의 성장은 동일 실험을 2번 이상 실시하여 그 성장 여부를 결정하였다.</p> <h2>방향족 탄화수소 분해능 조사</h2> <p>본 연구에 사용된 방향족 탄화수소는 benzene, toluene, ethyl benzene, o-xylene, m-xylene, p-xylene, phenol, biphenyl, naphthalene, 그리고 phenanthrene이었다. Phenanthrene을 제외한 방향족 화합물의 분해능은 지방족 화합물의 분해능 조사방법과 같이 특정 방향족 화합물을 유일 탄소원으로 사용한 성장여부로서 판단하였다. 이 때 각 방향족 화합물은 증기상태로 공급해주었다.</p> <p>한편 휘발성이 없는 phenanthrene의 경우는 phenanthrene spray plate assay로 먼저 분해능을 조사하고 또한 phenan-threne을 유일 탄소원으로 포함하는 MSM배지에서의 성장은 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 OD증가로 측정하였다. Phenanthrene \( 10 \mathrm{~mg} \)을 \( 0.4 \mathrm{~ml} \) chloroform에 녹여 autoclave된 \( 250 \mathrm{~ml} \) Erlenmeyer 플라스크에 넣고 hood에서 filter 멸균된 질소를 주입하여 chloroform을 제거하였다. Phenanthrene이 남겨진 플라스크에 멸균된 MSM 배지 \( 40 \mathrm{~ml} \)을 넣어 \( 150 \mathrm{~rpm} \) 에서 12시간 진탕하여 phenanthrene이 포화된 MSM 배지를 만들었다. 여기에 phenanthrene을 포함하는 MSM배지에서 전배양된 균주를 취하여 접종하였다. 전배양은 YEPG 평판배지에서 colony를 한 백금이 취하여 phenanthrene과 \( 20 \mathrm{~ml} \) MSM이 포함된 \( 125 \mathrm{~ml} \) 플라스크에 접종하여 \( 150 \mathrm{~rpm} \)에서 배양한 후 대수 증식기 때 취하여 접종균으로 사용하였다.</p> <p>Aromatic ring dioxygenase는 indole로부터 indigo를 형성할 수 있는 것으로 보고되었으므로 indole을 사용하여 문헌에 기술된 것과 같이 분리균의 aromatic ring dioxygenase 활성을 조사하였다. 한편 benzene 환을 깨는 효소인 meta-cleav-age dioxygenase의 활성은 \(0.1\%\)\((\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) catechol 용액을 평판배지에 형성된 집락에 점적하여 형성된 노란색 산물(2-hydroxy-muconic semialdehyde으로 추정) 근거로 판단하였다.</p>