Peniophora sp. JS17 균주를 최적의 laccase 생산 배지에서 7일 동안 배양한 후, ammonium sulfate 침전과 Hitrap Q sepharose column을 이용하여 효소를 정제하였다. 정제된 laccase를 합성 멜라닌과 반응시키고, mediator로서 HBT 또는 syringaldehyde를 첨가하여 멜라닌의 탈색율을 조사하였다. 효소 단독으로 멜라닌과 반응한 경우, 48시간 만에 약 \( 9 \% \)의 탈색율을 보였다.
<h2>멜라닌 탈색 효소의 정제</h2> <p>Peniophora sp. JS17 균주를 앞의 실험에서 밝혀낸 laccase 최적 생산 배지( \( 2 \% \) xylose, \( 0.2 \% \) malt extract, \( 0.4 \% \) tryptone, \( 0.1 \% \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 0.4 \% \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) )에서 7일동안 배양한 후, 배양 상등액의 효소를 ammonium sulfate 침전 및 Hitrap Q sepharose column을 이용하여 정제하였다. 정제된 효소를 SDS-PAGE로 확인한 결과 약 \( 70 \mathrm{kDa} \) 부근에서 2개의 밴드가 확인되었다(Fig. \( 4 \mathrm{~A} \) ). 이 밴드의 laccase 활성을 확인하기 위하여 정제된 효소를 Native-PAGE로 전기영동 한 후 기질인 ABTS를 사용하여 활성염색을 수행하였다. 그 결과 SDS-PAGE의 결과와 비슷한 위치에서 폭넓게 밴드가 확인되었다(Fig. 4B). Peniophora cinerea가 생산하는 laccase의 경우에는 26.2-72.6 kDa의 분자량 범위에서 8종류의 isozyme이 존재하고, 그 중에서 3종류의 laccase가 약 72 kDa의 분자량을 나타내는 것으로 보고된 바 있다.</p> <h2>효소의 멜라닌 탈색 활성</h2> <p>일반적으로 곰팡이 유래 laccase는 분자량(약 kDa)이 크기 때문에 기질의 phenolic 부분만 산화할 수 있어 lignin 및 melanin과 같은 난분해성 물질을 단독으로 분해하기에는 효율이 떨어진다. 따라서, 분자량이 작은 mediator의 존재 시 laccase는 nonphenolic compound까지 산화할 수 있어 난분해성 물질의 분해 효율이 상승할 수 있다. 대표적인 mediator로서 1-hydroxybenzotriazole (HBT) 및 syringaldehyde는 laccase의 기질이면서 쉽게 양이온 radical을 형성하여 melanin과 재반응 함으로써 melanin을 탈색할 수 있게 된다. Peniophora sp. JS17 균주의 배양상등액으로 부터 정제된 laccase에 대하여 멜라닌 탈색 활성을 조사하기 위해 정제된 효소와 합성 멜라닌을 함께 반응하고, 여기에 mediator로서 HBT 또는 syringaldehyde를 첨가하여 멜라닌 탈색율을 조사하였다. 그 결과 효소 단독으로 멜라닌과 반응한 경우에는 반응시간이 경과함에 따라 멜라닌 탈색율이 아주 조금씩 증가하여 48시간 만에 약 \( 9 \% \)의 탈색율을 나타내었다 (Fig. 5). 반면 mediator로서 HBT를 첨가한 경우의 멜라닌 탈색율은 48시간 만에 \( 77 \% \)를 나타내었고, syringaldehyde를 첨가한 경우에는 \( 55 \% \)의 멜라닌 탈색 효능을 보이는 것으로 확인되었다(Fig. 5). 이와 같이, melanin 탈색은 효소 단독으로는 효율이 낮기 때문에 mediator의 종류 및 농도에 따라 melanin 탈색 효능이 크게 달라질 수 있다. 그러나, HBT 및 syringaldehyde는 피부 독성이 있어 화장품 원료로 적합하지 않기 때문에 현재, 새로운 mediator의 탐색 및 개발을 진행 중에 있다.</p>