본 논문에서 인산가용화 관련 gdh 유전자의 클로닝 및 구조 확인결과 E. coli K-12 W3110의 chromosomal DNA은 E. coli의 gdh 유전자와 일치하며, pGGT가 도입된 대장균에서 이 효소 유전자가 대량 발현됨을 알 수 있었다. A.hydrophila DA\(33\)으로 gdh 유전자의 도입 및 발현 실험에서는 A. hydrophila DA33을 처리한 실험구를 이용하였으며, 실험 결과 가용화 관련 유전자를 도입한 형질전환 균주는 높은 효소활성이 보이나 발현양은 크게 증가되지 않은 것이 확인되었다. 다음으로 A. hydrophila pGHS/DA33의 유기산 생성에서는 분리 균주 A. hydrophila DA33는 난용성 인산염잉 첨가된 배지에서 gluconic acid의 생성이 증가함을 보였다. 마지막으로 형질전환 균주 A. hydrophila pGHS/DA33의 가용화 효과를 분석한 결과 gdh 유전자의 발현효율은 다소 미흡하나 연속적인 효소의 생성 증가는 인산염 가용화 능력을 향상 시킬 것으로 사료됐다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>인산가용화 관련 gdh 유전자의 클로닝 및 구조 확인</h2><p>E. coli K-12 W3110의 chromosomal DNA를 주형으로 GDH1 과 GDH2 primer를 이용하여 PCR product \( 2.4 \mathrm{kb} \) 의 증폭된 단편을 획득하였다. 구조해석을 통한 gdh 유전자를 확인하기 위하여, 증폭된 단편을 pGEM-T Easy vector에 cloning하여 재조합 plasmid인 pGGT를 획득하였다. 유전자의 구조해석 결과, E. coli의 gdh 유전자와 일치함을 확인 하였으며, 재조합 plasmid인 pGGT가 도입된 대장균에서 이 효소 유전자가 대량 발현됨을 확인하였다(data not shown). 송 등이 분리한 인산가용화능이 우수한 세균인 A. hydrophila DA33으로의 도입을 위해 이 균주의 항생제 감수성을 조사한 결과 chloramphenicol에는 내성이 없었다. 재조합 plasmid, pGGT를 EcoRI으로 처리하여 insert 영역 \( 2.4 \mathrm{kb} \) 를 정제한 다음, chloramphenicol에 내성을 가진 vector인 pHSG398을 EcoRI으로 처리하여 subcloning하였으며, 그 결과 얻어진 재조합체를 pGHS로 명명하였다.</p><h2>A. hydrophila DA33으로 gdh 유전자의 도입 및 발현</h2><p>본 연구그룹이 분리한 다수의 인산가용화 균주를 대두의 pot 실험으로 인산의 이용성 증대 시험을 한 결과, A. hydrophila DA33을 처리한 실험구의 생육이 가장 우수하여, 이 균주를 분자육종하기로 하였다. pHSG398에 subcloning하여 획득된 재조합 plasmid인 pGHS를 A. hydrophila DA33에 eletroporation으로 도입하였다. Chloramphe-nicol 함유 배지에서 형질 전환된 콜로니를 선별한 뒤, plas-mid의 도입여부를 확인하였다. 수세대의 계대배양을 거친 뒤에 플라스미드의 안정성을 확인하였다. 형질전환 균주인 pGHS/DA33은 tri-calcium phosphate의 인산염 배지에서 확인한 결과, wild type이나 vector인 pHSG가 도입된 균주보다 투명대가 선명하게 나타났다. Methyl red가 \( 0.01 \% \) 함유된 고체배지 상에서도 확연하게 붉은 색을 나타내었다. Fig. 3은 야생형 균주 DA33과 가용화 관련 유전자를 도입한 A. hydrophila pGHS/DA33의 GDH 효소활성을 측정 비교한 결과이다. 가용화 관련 유전자를 도입한 형질전환 균주는 배양 2 일째에 가장 증가된 GDH 효소활성을 보였으며, wild type보다 \( 40 \% \) 이상의 높은 효소활성을 나타내었으나, 발현양은 크게 증가되지 않은 것으로 보아, 대량발현 조건의 확립을 위한 계속적 연구가 필요한 것으로 생각된다.</p><h2>A. hydrophila pGHS/DA33의 유기산 생성</h2><p>지금까지 난용성 인산염의 가용화 기작은 정확하게 알려져 있지 않다. periplasm에서 pyrroloquinoline quinone(PQQ) 을 생성하는 family에 의하여 유기산 생성이 증가된다는 것이 보고되어져 있으며, 이것이 난용성 인산염의 가용화에 관여한다는 것이 알려져 있다. PMS의 생육이 증대됨에 따라 유리인산의 방출량이 증가함에 따라 \( \mathrm{pH} \) 저하가 나타나는데, 이는 유기산 생성에 의한 결과라고 알려져 있다. 이미 밝혀진 유기산에는 gluconic acid, citric acid 등이 있으며, 분리 균주 A. hydrophila DA33은 \(0.5\%\) 난용성 인산염이 첨가된 배지에서 배양한 배양액 내에 gluconic acid의 생성이 증가 되었다. Gluconic acid의 생성이 glucose dehydrogen-ase (GDH) 에 의해 생산되어 난용성 인산염의 가용화와 밀접한 관계를 가지고 있다고 밝혀졌으므로, GDH활성을 증대시키는 A. hydrophila pGHS/DA33에서의 유기산 생성을 경시적으로 측정한 결과를 Fig. 4에 나타내었다.</p><p>Glucose dehydrogenase 유전자를 도입한 A. hydrophila pGHS/DA33 균주는 glucose가 첨가된 최소 배지에서 배양 2일째에 최대의 생성량을 보이다가 3 일째 경과 시에는 약간 감소하는 경향을 보였으며, 평균 \( 5.6 \mathrm{mM} \) 의 gluconic acid를 생성하여 wild type 균주보다 약 1.4배의 생산 증가 현상을 보였다. 이 결과는 E. herbicola EH010의 균주에서의 gluconic acid 생성량과 비슷한 결과이나, 생육 조건 등이 일치하지 않으므로 정확한 효율을 비교하기에는 어려움이 있다. 따라서 효과 증대를 위해서는 인산염의 첨가에 따른 배양조건을 달리하는 추가적인 확인이 필요할 것으로 사료된다.</p><h2>형질전환 균주 A. hydrophila pGHS/DA33의 가용화 효과</h2><p>E. coli의 gdh 유전자를 도입한 균주의 GDH활성을 실험한 결과 wild type 균주에 비해 약 \( 40 \% \) 정도 높았다. 이는 도입한 gdh 유전자의 발현효율은 다소 미흡한 것이나 연속적인 효소의 생성 증가는 인산염 가용화 능력을 향상 시킬것으로 사료된다. 분자 육종한 A. hydrophila DA33의 난용성 인산염 가용화 특성은 배양학적 특성 실험에서 최적의 가용화 효과를 보여준 glucose \(3\%\) 농도로 첨가된 배지에서 조사하였다. 배양에 따른 인산염에서 가용화된 유리인산의 생산양은 wild type인 A. hydrophila DA33이 배양 4일째에 약 \( 960 \mathrm{ppm} \) 인 반면에 gdh 유전자가 도입된 A. hydrophila pGHS/DA33는 \( 1,380 \mathrm{ppm} \) 을 가용화 시켰다. 인산염 가용화가 일어날 경우에 동반되는 \( \mathrm{pH} \) 의 감소현상은 wild type이나 형질전환 균주에 있어서 커다란 차이점을 볼 수는 없었다. 이는 4일 정도의 배양시간에 약 1.4배 이상의 인산 가용화 효과를 보여준 것이므로, 실질적인 식물재배 및 토양환경에서는 보다 장기적인 이용이 이루어지므로 더 높은 효과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다.</p>