알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질의 신호서열과 합성 t-PA 유전자들을 발현벡터들에 클로닝하였고, 이들 벡터를 사용하여 알팔파의 잎 절편을 형질전환하였다. 형질전환된 조직은 체세포 배발생을 통해 정상적인 식물체로 재분화하였고, 이들 형질전환체들은 온실에서 증식하여 생화학적 분석이 가능하도록 하였다. 형질전환체에서 기대되는 1.6 kb의 크기의 band를 확인할 수 있었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <p>알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질의 신호서열과 합성 t-PA 유전자 (1,728 bp), t-PAER 유전자 \( (1,746 \mathrm { bp } ) \) 와 t-PAHis 유전자 \( (1,749 \mathrm { bp } ) \) 를 발현벡터들 (p221a와 p221a-rbc)에 클로닝 하였다 (Fig. 1). 합성 t-PA 유전자, t-PAER 유전자와 t-PAHis6 유전자들을 각각 35S 프로모터와 Rbcsk-1A 프로모터, 35S 터미네이터에 의해서 발현 및 mRNA의 안정성을 유도하였다. 알팔파 형질전환체내에서 발현양을 증가시키기 위해서 TEV leader sequence를 \( 35 \mathrm { ~S } \) 프로모터 아래에 삽입하였다 (Fig. 1). 알팔파의 잎 절편은 p221a-t-PA,p221a-st-PA, p221a-t-PAHis6, p221a-t-PAER, p221a-rbc-t-PA, p221a-rbc-st-PA 발현벡터들로 형질전환된 A. tumefaciens 를 이용하여 형질전환을 실시하였다 (Fig. \( 2 \mathrm { ~A } \) ). 제초제에 저항성을 나타내는 조직을 선별하기 위해서, 형질전환된 잎 절편을 PPT \( (4 \mathrm { mg } / \mathrm { L } ) \) 가 들어 있는 배지위에서 배양하였다. 대조군으로 야생종 알팔파 잎 절편들을 같은 배지위에서 배양하였다. 형질전환된 조직은 체세포 배발생 (Fig. \( 2 \mathrm { ~B } \) )을 통하여 정상적인 잎과 뿌리를 갖는 식물체로 재분화하였다 (Fig. \( 2 \mathrm { C } \) ). 어린 식물체는 뿌리 증식 후, 순화 단계를 거쳐 온실에서 증식하였다 (Fig. 2 D, E). 그런 후 PPT에 대한 저항성을 검정하기 위해서 \( 0.3 \% \) Basta 용액으로 분사 후, 생존 여부 및 PAT 유전자 발현을 검정하였다 (Fig. \( 2 \mathrm { ~F } \) ). 일주일 후 정상적인 성장을 나타내는 잠정적인 형질전환체를 선별할 수 있었다. 대조적으로 사용된 야생종 알팔파 및 비형질전환체는 말라 죽었다. 추가적으로 두 번의 Basta처리 후에, 각각 유전자별로 16-32개의 잠정 적인 형질전환체를 생화학적 및 분자생물학적 특성 규명을 하기 위해서 선발하였다. 모든 식물체는 대조군으로 사용된 야생종과 동등한 성장속도와 종자생성에 차이가 없었다. 또한 영양번식을 통한 세대 진전 후 제초제 저항성과 t-PA의 특성이 전달되는 것을 확인 할 수 있었다.</p> <h1>형질전환체 분자생물학적 분석</h1> <h2>t-PA 및 파생 유전자 삽입 및 전사 확인</h2> <p>알팔파 형질전환체의 genomic DNA내에 t-PA 유전자들의 삽입 유무를 확인하기 위해서 PCR 증폭을 실시하였다. 실험방법에 명시된 t-PA 유전자 전반을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 이용하였다. 잠정적인 형질전환체에서 기대했던 \( 1.6 \mathrm { ~kb } \) 의 크기의 band를 확인 할 수 있었고 (Fig. 3A-3F, lanes 4-9), 형질전환에 사용된 발현벡터들 (p221a-t-PA, p221a-t-PAER, p221a-t-PAHis 6 , p221a-st-PA, p221a-rbc-t-PA, p22la-rbc-st-PA)을 주형으로 사용한 결과 혈질전환체에서 확인된 것과 같은 크기의 \( 1.6 \mathrm { ~kb } \) 의 band를 확인할 수 있었다 (Fig. 3A-3F, lane 2). 이러한 실험은 t-PA 유전자 삽입을 확인하기 위해서 2 번의 반복 실험을 실행하였다. 음성 대조군으로 아생종 알팔파를 사용하여 RCR 증폭을 실시한 결과 t-PA 유전자에 상응하는 band를 확인할 수 없었다 (Fig. 3A-3F, lane 3). 확인된 알팔파 형질전환체들은 생화학적 분석을 위해서 온실에서 증식하였다.</p>