본 연구에서는 항체의 검출을 위해 ELISA 방법을 사용하였다. 우선, 항체와 수용액 상태의 thyroglobulin을 실온에서 농도별로 2시간 반응시킨 후, 이 반응액을 thyroglobulin \( (5 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)가 흡착된 96 well plate에 적용하였다. 이어서, \(3\%\) BSA-PBS를 이용해 2시간 동안 blocking 처리한 후, 동정된 3클론의 배양상층액을 \( 50 \mu \mathrm{\ell} \)씩 추가하였다. 그 후의 반응 과정은 초기에 적용한 ELISA 방법과 동일하게 진행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약</h2> <p>실험에 사용한 RPMI-1640, antibiotic/antimycotics, complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, phosphatidylcholine, phosphatidylserine 및 phosphatidyle-thanolamine, bovine serum albumin, thyroglobulin(bovine)은 Sigma사(St. Louis, MO. USA), fetal bovine serum은 제일생명공학서비스(대구, 한국)에서, biotinylated anti-mouse Igs 및 HRP-streptavidin는 ZYMED사(San Francisco, CA. USA), 그리고 기타 필요한 모든 시약은 특급제품을 사용하였다.</p> <h2>항체의 제작</h2> <p>대한실험동물센터(충북, 음성)에서 구입한 Balb/c 마우스 \( (6 \mathrm{wk} \cdot ♂) \)를 사용하였으며, 마우스 한 마리당 \( 20 ~\mu \mathrm{g} \)씩 thyroglobulin을 complete Freund's adjuvant와 충분히 혼합한 뒤 복강내로 주사하였다. 추가면역 \( (20 ~\mu \mathrm{g} / mouse) \)은 incomplete Freund's adjuvant로 2주 간격으로 2번 행한 뒤 세포융합 3일 전 마지막으로 추가 면역을 하였다 \( (10 ~\mu \mathrm{g} \) /mouse). 그 후, Balb/c 생쥐에서 비장을 적출 한 다음 Balb/c 마우스계의 myeloma cell line인 PAI세포와 융합하였다. 이하 자세한 방법은 Milstein 및 Kohler의 원법을 비표적 온화한 방법으로 변조한 Nam등의 방법에 따라 행하였다.</p> <h2>항체의 스크리닝</h2> <p>항체의 검출은 먼저 ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)법으로 행하였다. 항원(thyroglobulin, \( 5 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{m l} \))을 96 well plate (Nunc. Inter Med.사)에 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 밤새 흡착시키고 \(3\%\) BSA-PBS로 2시간 blocking하였다. Plate를 세척한 뒤 배양상층액을 넣어 2시간 실온에서 배양하고 다시 biotin화 된 anti-mouse Igs (ZYMED Lab.)로 2시간 및 HRP- streptavidin (ZYMED Lab.)으로 1시간 반응시킨 다음 o-phenylendiamine을 기질로 \( 492 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 세척 완충액으로는 PBS-Tween \( (0.05 \%) \)을 사용하였다.</p> <h2>ELISA 저해시험</h2> <p>기본적인 방법은 ELISA와 동일하나 미리 실온에서 항체와 수용액 상태의 thyroglobulin을 농도별로 2시간 반응시킨다. 반응 후 이 반응액을 thyroglobulin \( (5 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)를 흡착시켜 놓은 96 well plate에 넣어서 ELISA법과 동일한 방법으로 행한다. 이때 동일 농도로 희석시킨 항체만을 넣은 well의 홉광도를 \( 0 \% \)으로 하여 각 well의 홉광도를 % inhibition으로 계산하여 나타내었다.</p> <h2>인지질에 대한 교차반응성 측정</h2> <p>Phosphatidylcholine, phosphatidylserine 및 phospha-tidylethanolamine을 absolute \(\mathrm{EtOH}\)에 녹이고 \( (10 \mu \mathrm{M}) \) 각 \( 50 \mu \mathrm{\ell} \)씩 96 well microtiter plate에 넣은 다음 밤새 방치한다. 그 후 \(3\%\) BSA-PBS로 2시간 blocking시키고 위에서 동정한 3클론의 배양상층액을 \( 50 \mu \mathrm{\ell} \)씩 가한 다음 이하 반응은 위 ELISA법과 동일한 방법으로 진행하였다.</p>