우리 몸의 혈액은 생명을 유지해 나가는데 필수적인 역할을 하며, 이러한 순환계 질환으로 인한 사망률은 높다. 혈전이 원인이 되어 질병을 유발시키는 것을 혈전성 성인병이라고 하며, 1933년에 알려진 streptokinase는 1949년에 인체에 투여되었고 1980년대에 들어와 본격적으로 사용되기 시작했다. Sobel 등은 urokinase를 정제하여 사용하고, tissue plasminogen activator(t-PA)는 혈관 내피 세포와 같은 사람의 정상세포에서도 생산되며 혈전 용해 효소로서 현재 임상에 사용되고 있다. 이번 연구에서는 부작용이 없고 반감기가 길고 가격이 저렴한 혈전용해효소를 생산하는 미생물을 토양에서 탐색하고, 생산을 위한 최적 생산 조건을 조사하는 것이다.
<h1>서 론</h1> <p>우리몸의 혈액은 혈관을 통하여 각 조직에 영양물질이나 산소를 공급하므로서 생명을 유지해 나가는데 이러한 순환계의 질환으로 인한 사망률은 매우 높은 편이다. 순환계 질환은 모두 혈액 내에서 형성되는 혈전에 기인하는 경우가 대부분이며 이 혈전이 원인이 되어 질병을 유발시키는 것을 혈전성 성인병 혹은 혈전증이라고 한다. 인체내에서 혈전이 형성되는 기전은 혈액내에 존재하는 fibrinogen이 thrombin의 작용을 받아 섬유소 성분인 혈전으로 되어 응고되는 것이다. 이런 혈전 형성의 기전은 상처가 생겨 혈관의 일부가 파괴되었을 때 혈전 유출방지를 위한 정상기전으로 작용하고 있으나 그렇지 않은 평상시에 생성되는 혈전은 혈관벽에 부착하여 혈관을 좁게 만들어 혈압을 높일 뿐만 아니라 혈전을 헝성하는 섬유소 성분은 접착성이 강하여 혈구나 응고된 덩어리를 만들어 혈액내에 남게 된다. 이렇게 형성된 혈전은 혈액중에 존재하면서 혈류를 방해하거나 혈관을 따라 이동하면서 뇌혈관과 같은 미세혈관을 막아 각종 순환기계의 성인병을 유발하게 된다.</p> <p>세균으로부터 plasminogen을 활성화하는 혈전용해물질이 포도상구균(Staphylococcus sp.)의 배양액에서 발견되었으나 bovine plasminogen을 활성화시키지 못하였다. 그러나 용혈성 연쇄상구균(Streptococcus sp.)의 배양액 중에서 plasminogen을 활성화하여 혈전용해 작용을 나타내는 물질을 발견한 Fletcher 등은 이를 정제하여 streptokinase라 하였다. Streptokinase(SK)는 1933년에 알려진 후 1949년에 처음으로 인체에 투여되었고 1980년대에 들어와서 본격적으로 사용되기 시작하였다. 이 후 Sobel 등은 사람 또는 동물의 뇨 중에 plasminogen을 활성화하는 효소가 존재하는 것을 확인하고 이를 정제하여 urokinase(UK)라 하였다. 또한 UK와 비슷한 작용을 하는 물질중 사람의 악성 종양인 melanoma 유래의 tissue plasminogen activator(이 물질은 혈관 내피 세포와 같은 사람의 정상세포에서도 생산되며 t-PA라고 총칭함)가 혈전 용해 효소제로서 현재 임상에 사용되고 있다. 그러나 t-PA는 혈중에서 반감기가 짧고 가격이 고가이기 때문에 비경제적이라는 것이 큰 결점이라 할 수 있다. 따라서 본 연구는 손쉽게 대량 생산이 가능하고 부작용이 없고 혈중에서 반감기가 길며 가격이 저렴한 혈전용해효소를 생산하는 미생물을 토양에서 탐색하여, 혈전용해효소의 생산을 위한 최적 생산 조건을 조사하여 보고 하고자 한다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>혈전용해효소 생산을 위한 방선균 분리</h2> <p>부산 근교 각 지역에서 채집한 토양 시료 약 \( 1 \mathrm { g } \)을 멸균 수 \( 10 \mathrm { ml } \)에 현탁시켜 충분히 진탕하였다. 약 20분간 방치한 후 상등액을 방선균 분리용 배지(glucose \( 10 \mathrm { g } \), yeast extract \( 1 \mathrm { g } \), polypeptone \( 1 \mathrm { g } \), beef extract \( 1 \mathrm { g } \), agar \( 20 \mathrm { g } \), 증류수 \( 1 \mathrm { L } , \mathrm { pH } 7.5) \)에 도말하여 \( 28 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 4 일간 배양한 다음 생성된 colony를 순수 분리하였다. 순수 분리한 균을 fibrin plate에 이식하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 혈전용해 정도를 관찰하였다. 관찰결과 혈전을 용해하는 방선균을 선별해서 \( 28 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 방선균 분리용 배지 조성으로 된 액체배지 \( 8 \mathrm { ml } \)가 든 시험관 \( (1.8 \times 18 \mathrm { ~cm } ) \)에 각각 접종해서 \( 28 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 1 \sim 5 \)일간 진탕 배양하면서 날짜별로 약 \( 1 \mathrm { ml } \)씩 배양액을 취하여 원심분리 후 상등액으로 혈전용해 반응을 측정하였다.</p>