잎의 가장자리는 왕성한 체세포분열로 유사분열조직으로 분화되는 것을 확인하였다. Differentially expressed gene (DEG)의 검출과 real-time PCR을 이용한 DEG clone의 발현 양상 분석을 통해 소식물체의 발생 초기에 높아진 유전자의 발현이 꾸준히 유지되고 있음을 확인할 수 있었다.
<h1>결 과</h1> <h2>잎 가장자리 유사분열조직의 관찰</h2> <p>관찰된 잎의 가장자리는 budding이 준비되는 단계에 따라 왕성한 체세포분열의 양상을 보이며, 이후 세포의 분열이 집중되는 유사분열조직(meristemoid)의 형태로 분화되는 것을 확인하였다. 이후 유사분열조직의 왕성한 세포분열을 통하여 budding이 일어나 발생단계인 heart stage의 embryo 형태의 소식물체를 관찰할 수 있었다.</p> <h2>Differentially expressed gene (DEG)의 검출</h2> <p>총 120조합의 ACP primer를 이용한 DEG PCR을 통하여 채취 조직에 따라 서로 다른 유전자 발현 양상을 보이는 66 개의 DEG 후보 군을 확인하였다(대표 예, Fig. 2A). 선발된 DEG 후보 군의 염기서열을 확보하였다. 유전자 염기서열을 바탕으로 BlastN program을 이용한 분석에서 유전자 서열 database와 유의성을 보이는 clone은 23개였으며 나머지 43개의 clone의 염기서열은 유의성을 보이는 정보를 얻지 못하였다. 동일한 DEG 염기서열을 BlastX program을 통해 번역된 염기서열과 단백질 database와의 유의성 검색하였다. 이 결과에서는 nucleotide database 검색과는 달리 총 35개의 유의성 있는 clone이 선발되었다. 이것은 염기서열에서는 유의성을 보이지 않으나 단백질 서열로 번역하였을 때 확인되는 단백질 아미노산 서열이 유의성을 보인다는 것으로서 12개의 clone에서 이와 같은 결과가 도출되었다. 유의성 분석으로 선발된 유전자는 신호체계에서의 위치를 파악할 수 있는 선행 논문을 기초로 분석되었다.</p> <h2>Real-time PCR을 이용한 DEG clone의 발현 양상 분석</h2> <p>기능이 알려져 있는 유전자인 NAC-domain 단백질, Cytochrome p450, Metallothionein, rpL2, rpL32유전자를 대표적으로 선발하여, 모체 식물의 crenate margin 부위에서 발생하는 소식물체의 발생단계에 따라 각각의 유전자의 발현양상의 변화를 quantitative real-time PCR을 이용하여 분석하였다. 18S ribosomal RNA를 기준으로 delta-delta CT 분석법으로 각 유전자의 발현양을 분석한 결과 Fig.2B에 나타난 바와 같이 소식물체가 발생하지 않은 비유도성 단계의 조직을 기준으로 발생의 초기 단계에 높은 수준으로 발현 양이 증가함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 유전자를 cloning할때 사용한 DEG의 결과와 동일하거나 유사하였다. 특히 NAC domain 단백질의 경우에는 초기 발현이 급격히 증가하였고, 이후 소식물체가 성숙된 이후에도 비유도성 단계보다 발현을 높게 유지함을 확인할 수 있었다. 이러한 발현의 양상은 cyto-chrom p450에서도 확인되었다. Metallothionein와 rpL32의 경우, 소식물체의 발생 초기에 높아진 유전자의 발현이 이후 꾸준히 유지되고 있음을 확인할 수 있었다. 특이 할만한 것은 rpL2의 경우는 소식물체의 발생 초기단계에는 그 발현 양이 증가되는 것으로 확인되었으나, 이후 소식물체의 발생이 완료된 성숙 단계에서는 오히려 발현 양이 비유도성 단계보다 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.</p>