본 논문은 염증과정에서 nitric oxide와 prostaglandin E2가 생성되며, NO는 체내 방어기능, 신호전달기능, 신경독성, 혈관 확장 등 다양한 생리기능을 가지고 있음을 설명한다. 카카오 분획물의 nitric oxide 저해활성을 확인하기 위해 RAW 264.7 cell의 NO생성억제 활성을 평가하였다. 카카오 분획물의 iNOS, COX-2 단백질의 발현을 실험한 결과 카카오 에틸아세테이트 분획물 \( 100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)농도로 처리시 LPS에 의해 증가된 iNOS, COX-2 protein 발현을 감소시켰고, 전반적으로 에틸아세테아트 분획물의 활성이 우수함을 확인하였다.
<h2>카카오 분획물의 nitric oxide 저해활성 확인</h2> <p>체내 염증과정에서는 과량의 nitric oxide (NO)및 prostaglandin \( \mathrm{E}_{2}\quad\left(\mathrm{PGE}_{2}\right) \)등의 염증인자가 유도형 \( \mathrm{NO} \) synthase (iNOS) 및 cyclooxygenase (COX)-2에 의해 형성된다. 이 중 \( \mathrm{NO} \)는 체내 방어기능, 신호전달기능, 신경독성, 혈관 확장 등 의 다양한 생리기능을 가지고 있다. 일반적으로 \( \mathrm{NO} \)의 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만 병리학적인 원인에 의한 과도한 \( \mathrm{NO} \)의 형성은 염증을 유발시키게 되며, 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경 손상 등을 유발 한다. RAW 264.7 cell의 \( \mathrm{NO} \)생성억제 정도를 측정하기 위하여 카카오 분획물을 농도별로 세포에 처리하여 생성되는\( \mathrm{NO} \)량을 측정한 결과 Fig. 8과 같이 나타내었다. LPS를 첨가하지 않은 군에서는 \( 16 \sim 18 \% \)의 \( \mathrm{NO} \)를 생성하였고,LPS와 카카오 분획물을 첨가한 군에서는 에틸아세테이트 분획물이 \( \mathrm{NO} \)의 생성량을 가장 많이 억제하였다. 즉, 에틸아세테이트 분획물은 농도 의존적으로 \( \mathrm{NO} \)의 생성을 억제함을 확인할 수 있었으며 \( 1,000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서 \( \mathrm{NO} \)의 생성을 \( 78.34 \% \)를 억제하였다. 이는 Byun 등의 현삼 메탄올 추출물과 Kim 등의 상황 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)추출물의 LPS로 유도된 Raw cell의 \( \mathrm{NO} \)생성억제능에 미치는 결과와 비교하여 보면 카카오 분획물 중 에틸아세테이트 분흭물이 NO생성억제능이 가장 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.</p> <h2>카카오 분획물의 iNOS, COX-2 단백질의 발현 측정 결과</h2> <p>flammatory cytokines), nitric oxide \( \mathrm{NO} \) 그리고 prostaglandin E2 (PGE2)가 inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 (COX-2)에 의해 생성된다. 특히, 자극에 유도된 iNOS인 경우 오랜 기간 동안 다량의 \( \mathrm{NO} \)를 생성하게 되고, 생성된 \( \mathrm{NO} \)는 guanylyl cyclase의 활성과 동시에 주위 조직에 세포독성을 나타내는 것이 특징이다. 즉 LPS로 유도 되어진 RAW 264.7 cell에서 iNOS의 protein level의 감소에 의해 항염증 효과를 기대할 수 있다. 카카오 에틸아세테이트 분획물이 iNOS, COX-2 protein 발현 저해효과가 있는지 알아보기 위하여 RAW 264.7 cell에 LPS \( (10 \mu \mathrm{g} / \mu \mathrm{l}) \)을 처리 하고 1시간 뒤, 카카오 에틸아세테이트 분획물을 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)로 처리 한 후 24시간 배양한 후 iNOS, COX-2 protein의 발현 변화를 western blotting으로 확인하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였으며, Fig. 9, 10과 같이 LPS를 처리 하지 않은 normal군에서는 iNOS, COX-2 protein 발현이 거의 나타나지 않았지만, LPS를 처리한 군에서는 산화적 스트레스가 유발되어 염증 반응을 매개하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 iNOS protein 발현이 \( 130 \mathrm{kDa} \)에서 상당 수준으로 나타났다. 대조적으로 카카오 에틸아세테이트 분획물 \( 100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)농도로 처리시 LPS에 의해 증가된 iNOS, COX-2 protein 발현을 감소시켰다. 따라서 카카오 에틸아세테이트 분획물이 LPS로 유발된 \( \mathrm{NO} \)생성과 iNOS, COX-2 protein 발현을 억제함으로서 항염증반응에 관여할 것으로 사료된다.</p> <p>이상의 결과로부터 카카오 분획물의 항산화 및 항염증 효과를 효소 및 세포에서 측정하여 활성을 확인할 수 있었으며, 전반적으로 에틸아세테아트 분획물의 활성이 우수하였다. 특히 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)이상의 농도에서 활성이 우수함을 확인할 수 있었다. 화장품에 첨가되는 소재는 제형의 안정성이 유지되는 한 독성이 없는 범위에서는 가능한 많은 양을 첨가하면 화장품의 효능을 높인다. 카카오 분획물의 경우 화장품에 첨가 시 \( 0.01 \%\)\((100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)서 \( 0.1 \%\)\((1,000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)정도의 양으로 활성이 나타났으므로 적은 양으로도 화장품 소재로서의 가능성이 있을 것으로 판단된다.</p>