본 연구에서는 Roberts와 Selitrennikoff의 방법을 변형하여 Colloidal chitin을 제조하고, Astrup와 Hullertz의 방법을 바탕으로 혈전분해 활성을 확인하였다. Skim milk 배지로 분리된 균주의 protease 활성을 조사하고, tributyrin을 이용해 lipase 활성을 측정하였다. 또한, colloidal chitin agar plate를 사용하여 chitinase 활성을 조사하였다. 조효소액을 활용하여 온도와 \( \mathrm { pH } \)에 따른 효소의 안정성을 테스트하였으며, 효소 활성의 세기는 plasmin에 의해 분해된 면적을 비교하여 측정하였다.
<h2>Colloidal chitin 제조</h2> <p>Colloidal chitin은 Roberts와 Selitrennikoff의 방법을 변형하여 조제하였다. Chitin (C9213, Sigma-Aldrich Co., USA) \( 20 \mathrm { ~g } \)에 진한 염산 \( 350 \mathrm { ml } \)을 천천히 가하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간동안 격렬하게 stirring한다. 다시 키틴 혼합물에 \( 95 \% \) 차가운 에탄을 \(2 \mathrm { l } \)을 가한 다음 \( -35 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 동안 방치한 후 \( 5,000 \times g \), 20분, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 원심분리하여 colloidal chitin을 침전시킨다. Colloidal chitin 침전물은 다시 증류수로 colloidal chitin이 중성 \( ( \mathrm { pH } \) 7.0)이 될 때까지 세척한 후 사용하였다.</p> <h2>균주의 기질특이성 조사</h2> <p>혈전분해 활성은 Astrup와 Hullertz의 방법을 변형하여 사용하였다. \( 0.4 \% \) fibrinogen (Sigma)을 sodium borate buffer( \(10 \mathrm { mM } \) sodium borate, \( 160 \mathrm { mM } \) boric acid, \( 40 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } \) Merck)에 녹인 후 직경 \( 87 \times 15 \mathrm { ~mm } \) petridish에 \( 10 \mathrm { ml } \) 넣은 후 thrombin ( \( 1,000 \mathrm { unit } / \mathrm { ml } \) \( \mathrm { Sigma } \) ) \(20 \mathrm { unit } \)를 첨가하여 실온에 30분간 방치하여 응고시켰다. 응고된 fibrin plate에 각 시료를 적당량 점적하여 3시간 동안 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 반응시켰다. 분리된 균주의 protease 활성은 skim milk 배지를 이용하였으며, li-pase 활성은 tributyrin을 기질로 하여 확인하였고, chitinase 활성은 colloidal chitin agar plate에서 조사하였다.</p>( \( 1,000 \mathrm { unit } / \mathrm { ml } \) \( \mathrm { Sigma } \) ) \(20 \mathrm { unit } \)<h2>반응온도 및 \( \mathrm { pH } \)에 따른 혈전분해효소의 활성 분석</h2> <p>조효소액을 이용하여 온도 및 \( \mathrm { pH } \) 에 따른 효소의 안정성을 실시하였다. 우선, 반응온도에 따른 혈전분해효소의 활성은 응고된 fibrin plate에 동량의 조효소액과 plasmin을 점적하여 \( 25,30,35,40,45,50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1시간 또는 3시간동안 반응시켜 용해된 분해면적 측정으로 분석하였다. \( \mathrm { pH } \)에 따른 혈전분해 효소의 활성 분석은 \( \mathrm { pH } 6.0 \sim9.0 \) 에서 1시간 또는 3시간 동안 반응시커 용해된 분해면적을 측정함으로써 이루어졌다. 효소 활성의 세기는 혈전분해효소로 알려져 있는 plasmin에 의해 분해된 면적과 비교하여 결정되었다.</p>