품종 및 집단간의 유연관계 분석을 위해 DISPAN 프로그램과 Neighbor-Joining(NJ) 메소드를 사용하였다. 이를 통해 유전적 거리를 추정하고 phylogenetic tree를 작성하였다. 또한, 집단간 누적 식별력(Cumulative power of discrimination; CPD)을 산출하는 방법을 제시하였으며, 이를 통해 분석 대상 집단별로 MS 마커의 평균 이형질성을 나타냈다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>공시재료 및 microsatellite (MS) markers</h2> <p>본 연구에서는 토종닭 순계집단(적갈계통(R) 61수, 황갈계통(Y) 93 수), 토종닭 실용계집단(C) 75수, 오골계(OC) 70 수, 외래 품종인 Hy-Line Brown (H) 60 수 그리고 백색 레그혼(L) 36 수 총 395수의 혈액에서 DNA를 분리하여 공시재료로 이용하였고 품종별 다형성이 확인된 13종의 MS marker를 선발하여 활용하였다. 선발된 13종의 MS marker는 닭의 염색체상에 존재하고 있으며 Table 1에 제시하였다.</p> <h2>유전자 증폭</h2> <p>PCR 반응은 MS marker를 증폭하기 위한 primer에 형광염색된 Dye 색상과 대립 유전자의 크기 별 분포 등을 고려하여 \(2\sim3\) marker 씩 multiplex PCR을 수행하였다. PCR 반응액은 Template DNA \( 50 \sim 100 \mathrm{ng} \), \( 10 \times \)PCR Buffer \((10\mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\), \(\mathrm{pH}~ 8.3\), \( 50 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{KCl}\), \(1.5\mathrm{mM}\) \(\mathrm{MgCl}_{2} \)), \(10 \mathrm{pmole}\) of each primer, dNTPs (\(2.5 \mathrm{mM}\)) and \( 0.5 \) unit Taq DNA poly-merase (Takara, Japan) 및 \( \mathrm{ddH}_{2} \mathrm{O} \)를 첨가하여 총량을 \(10 \mu\mathrm{l}\)로 맞춰 사용하였다. PCR 반응은 GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 열변성 후 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 40 초, marker 별로 적정한 annealing 온도 (\( 50 \sim 60^{\circ} \mathrm{C} \))에서 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분간 35 회 반응시킨 후 신장반응은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 수행하여 증폭된 PCR-Products는 Ethdium Bromide를 첨가한 \(2\%\) agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다.</p> <h2>MS marker의 유전자형 분석</h2> <p>PCR product \(1 \mu\mathrm{l}\)를 적정 희석 배율에 따라 \( \mathrm{ddH}_{2} \mathrm{O} \)로 희석하고, 다시 Formamide와 Genescan \( { }^{\mathrm{TM}}-500\) \(\mathrm{LIZ}^{\mathrm{TM}} \) Size Standard를 잘 혼합하여 희석된 PCR product와 \(1:9\)의 비율로 혼합하였다. 이 혼합물을 Capillary arrary가 장착된 ABI 3130 Auto Seqeuncer (Appiled Biosystems, USA)을 이용하여 유전자형 분석을 실시하였다. 분석된 유전자형은 Genmapper (Applied Biosystems, version 4.0) 프로그램을 이용하여 MS marker별 대립유전자들의 정확한 크기를 결정하였다.</p> <h2>통계분석</h2> <p>Genotyper Software에 의해 결정되어진 MS marker별 대립유전자들은 microsatellite Toolkit software를 이용하여 분석 집단별 및 개체별로 정리한 후 관측 이형질성(observed heterozygosity), 대립유전자 빈도(allele frequency), 각 locus 별 대립유전자의 수 및 집단별 대립유전자 수를 산출하였다. 각각의 분석 MS marker 좌위별 동형질성(homozygosity; \( \mathrm{H}_{\mathrm{o}} \) ), 이형 질성(heterzygosity; \( \left.\mathrm{h}_{\mathrm{i}}\right) \)는 다음과 같이 표시된다.</p> <p>\( \mathrm{H}_{\mathrm{o}}=\sum \mathrm{P}_{\mathrm{i}}^{2}, \mathrm{~h}_{\mathrm{i}}=1-\mathrm{Ho} \)</p> <p>여기서 \( \mathrm{P}_{\mathrm{i}} \)는 MS marker의 각각의 대립유전자 빈도이다. 또한 분석된 모든 MS marker들의 평균이형질성(\(\mathrm{H}\))는 다음과 같이 산출하였다.</p> <p>\( \mathrm{H}=\sum \mathrm{H}_{\mathrm{j} / \mathrm{r}} \)</p> <p>여기서 \( \mathrm{H}_{\mathrm{j}} \) 는 \( \mathrm{j} \) 번째 MS marker의 이형질성이며 \( \mathrm{r} \)은 분석대상 MS marker수이다. 각각의 집단에 다형성 정보량 (polymorphic information content; PIC)는 다음과 같다.</p> <p>\( \mathrm{PIC}=1-\left(\sum_{i=1}^{k} p_{i}^{2}\right)-\sum_{i=1}^{k-1} \sum_{j=i+1}^{k} 2 p_{1}^{2} p_{j}^{2} \)</p> <p>여기서 \( \mathrm{P}_{\mathrm{i}}\), \(\mathrm{P}_{\mathrm{j}} \)는 각각 \( \mathrm{i} \)번째 \( \mathrm{j} \)번째 대립유전자의 빈도이며, \( \mathrm{n} \)은 대립유전자의 개수이다. 품종 및 집단간의 유연관계 분석을 위해 sample number의 보정을 통한 Nei 등의 방법을 이용한 DISPAN program을 사용하였으며, Neighbor-Joining(NJ) method를 이용하여 genetic distances를 추정하여 이를 근거로 한 phylogenetic tree를 작성하였다. 또한 집단간 누적 식별력(Cumulative power of discrimination; CPD)는 Fan 등이 제시한 바에 따라 다음과 같이 산출하였다.</p> <p>\( \mathrm{CPD}=\left(1-\left[\left(1-\mathrm{H}_{\mathrm{a}}\right)\left(1-\mathrm{H}_{\mathrm{b}}\right)\left(1-\mathrm{H}_{\mathrm{c}}\right)\left(1-\mathrm{H}_{\mathrm{d}}\right)\left(1-\mathrm{H}_{\mathrm{e}}\right)\left(1-\mathrm{H}_{\mathrm{f}}\right)\right]\right) \times 100 \% \)</p> <p>여기서 \( \mathrm{H}_{\mathrm{a}} \sim \mathrm{H}_{\mathrm{f}} \)는 각각 분석대상 집단 별 전체 분석된 MS marker의 평균 이형질성이다.</p>