플라스미드 pSJE6c가 포함된 균주를 배양할 때, E. coli는 200µg/mL, L. brevis는 5µg/mL의 erythromycin을 첨가하였다. 형질전환은 Gene PulserII 장치로 진행하였고, 특정한 한 쌍의 oligonucleotides를 합성하였다. L. brevis 균주는 1%의 탄소원이 포함된 MRS 배지에서 배양하여 세포를 회수하고, 이후 Trizolbead법을 이용하여 RNA를 추출하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 플라스미드, 배양조건</h2> <p>본 연구에 사용한 균주 및 plasmid들을 Table \(1\)에 나타내었다. Lactobacillus brevis \( 2.14 \) 균주는 MRS 배지 (Difco Lab, Detroit, MI, USA)에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 정치배양하였고, 탄소원 으로 glucose, galactose, melibiose, raffinose, sucrose, fructose, lactose(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 각 \( 1 \% \) (w/v) 되게 MRS 배지에 첨가하였다. E. coli \( \mathrm{DH} 5 \alpha \) 균주는 Luria-Bertani (LB) 배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 진탕 배양하였다. 플라스 미드 pSJE6c 혹은 \( \mathrm{pSJE} \)를 포함한 균주들의 배양시 erythromycin(Em)을 E. coli는 \(200\mu\mathrm{g}/\mathrm{mL}\) 그리고 \(L\).brevis는 \(5\mu \mathrm{g} /\mathrm{mL}\)되게 첨가하였다.<h2>DNA 추출 및 형질전환</h2> <p>E. coli와 L. brevis 균주의 plasmid DNA 추출은 Qiagenprep spin miniprep kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하였고, DNA 농도는 spectrophotometer를 이용하여 측정하였다. 형질전환은 electroporation으로 Gene PulserII (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 장치를 사용하였다. E. coli competent cell 제조는 Dower 방법을 사용하였으며, \( L \). brevis competent cell은 Berthier 방법을 일부 변경하여 사용하였다. L. brevis 형질전환을 위한 electroporation 조건 은 \(1.5\mathrm{kV}, 200 \mathrm{WWW},25\mu\mathrm{F}\)이며, 충격후 \(1\mathrm{~mL} \)의 MRS 배지를 첨가하여 2 시간 회복 배양한 다음 \(\operatorname{Em}(5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \) 첨 가 MRS 한천배지에 도말하였다. \(37^{\circ}\mathrm{C} \)에서 \(2\)일간 배양후 분리된 균락들을 얻어서 MRS 액체배지 \(5 \mathrm{~mL} \) 에 접종, 배양한 후 plasmid를 추출하였다. 제한효소로 절단한 plasmid DNA 들은 agarose gel 전기영동으로 그 크기를 확인하였다.</p> <h2>발현벡터 구축 및 외래 유전자 재조합</h2> <p>발현벡터 구축에 사용한 promoter는 Jeong 등(\(2006\))이 Lactococcus lactis LM\(0230\) chromosomal DNA에서 분리한 P6C로서 연구를 통해 강력한 promoter임이 보고되었다. 알려진 염기서열을 바탕으로 상보적인 한 쌍의 oligonucleo-tides(\(54\)-mers, Table \(2\) 참조)를 합성하였다(Embiotech, Seoul, Korea). Oligomer들은 STE 완충용액( \( 10 \mathrm{mM} \) Tris, \( \mathrm{pH} \) 8.0,\( 50 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 1 \mathrm{mM} \) EDTA)에 \( 50 \mathrm{pmol} / \mu \mathrm{L} \) 농도로 녹였다.각 oligomer를 \( 2 \mu \mathrm{mol} \)씩 섞은 후에 MJ Mini PCR 기기(Bio-Rad)를 이용하여 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(5\)분 가열후 서서히 냉각하는 방법으로 annealing 시켰다. Pst과 Bam HL으로 절단한 후 본 연구실에서 개발한 유산균용 셔틀벡터인 pSJE에 도입하였다. \( \alpha \)-galactosidase유전자 \( (\mathrm{aga}) \)와 \( \beta \)-galactosidase 유전자 (lacZ)는 각각 Leuconostoc mesenteroides SY\(1\)과 Lactococcus lactis ssp. lactis ATCC\(7962\)에서 얻은 chromosomal DNA를 주형으로 그리고 Table \(2\)에 나타낸 primer들 을 사용하여 PCR로 증폭하였다. 증폭후 \( \mathrm{BamHI} \)과 NotI으로 절단하여 pSJE6c에 도입하였다.</p> <h3>\( \alpha \)-galactosidase \( (\alpha \)-Gal) assays</h3> <p>균주들을 \(6\)가지 다른 탄소원(glucose, galactose, melibiose, raffinose, fructose, sucrose)이 각각 \( 1 \% \)씩 포함된 MRS 배 지에서 배양하면서 흡광도 \( \left(\mathrm{OD}_{600}\right) \)를 측정하여 생육곡선을 작성하였다. \(6,12,24,36\), 및 \(48\)시간대 시료들의 효소역가를 측정하였다. \( \alpha \)-Gal 효소역가는 Church 방법을 사용하였다. 기질은 p-nitrophenyl- \( \alpha \)-galactopyranoside(PNPG)를 사용하였으며, 생성되는 p-nitrophenol(PNP)은 흡광도 \( \mathrm{OD}_{400} \) 에서 측정하였다. 효소 \(1\) unit는 \(1\)분당 기질인 PNPG를 분해하여 \( 1 \mathrm{nmol} \mathrm{PNP} \) 을 생성하는뎨 필요한 효소의 양으로 정의하였다.<h3>\( \beta \)-galactosidase \( (\beta \)-Gal) assays</h3> <p>균주들을 다른 탄소원(glucose, galactose, lactose, raffinose, sucrose)이 각각 \( 1 \% \) 씩 포함된 MRS 배지에서 배양한 후 \( \beta \) \( \mathrm{Gal} \) 효소역가를 Miller의 방법에 준해 측정하였다. 각각 의 시간대별 \( (6,12,24,36,48 \) 시간 \( ) \) 배양액 \( 1 \mathrm{~mL} \) 을 원심분 리하여 균체를 회수하여 \(3\)차 증류수로 \(1\)회 세척한 후, \( 1 \mathrm{~mL} \) Z-buffer \( \left(\mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 7_{2} \mathrm{O} 1.61 \mathrm{~g}, \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.55 \mathrm{~g}, \mathrm{KCl}\right. \) \( 0.075 \mathrm{~g}, \mathrm{MgSO}_{4} 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.0246 \mathrm{~g}, \beta \)-mercaptoethanol \( 0.27 \mathrm{~mL} \), \( \mathrm{pH} 7.0,100 \mathrm{~mL} \) 최종부피)에 현탁하였다. \( 0.01 \mathrm{~mm} \) zirconiasilaca bead를 \(1/5\)정도 넣고, Mini-bead beater-\(8\) (Biospec products, Bartlesville, OK, USA)를 이용하여 세포벽을 파쇄 \( \left(1\right. \) 분씩 \(2\)회)한 후, 원심분리하여 상등액을 회수하였다. \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(5\)분 방치 후, 기질인 \( O \)-nitrophenyl- \( \beta \)-D-galactopyranoside(ONPG) 용액 \( 200 \mu \mathrm{L}\left(\mathrm{ONPG} 4 \mathrm{mg} / \mathrm{mL}, \mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\right. \) \( 1.05 \mathrm{~g}, \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} 0.45 \mathrm{~g},\left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} 0.1 \mathrm{~g}, \mathrm{Na}_{3} \) Citrate \( 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) \( 0.05 \mathrm{~g}, 100 \mathrm{~mL} \) 의 최종부피)넣고 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \)에서 노란색이 나타 날 때까지 반응하였다. 그리고 \( 500 \mu \mathrm{L} 1 \mathrm{M} \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \)로 반응 을 중지시킨 후, 원심분리하였다. 흡광도 \( \mathrm{OD}_{420} \)과 \( \mathrm{OD}_{550}\)에서 측정하여 \( \beta \)-Gal unit를 다음의 식에 따라 계산하였다.</p> <p>\[\beta \text {-Gal unit }=1,000 \times\left(\mathrm{OD}_{420}-1.75 \times \mathrm{OD}_{550}\right) / \mathrm{T} \times \mathrm{OD}_{600}\]</p> <p>\( \mathrm{t} \) : 노란색으로 변할 때까지의 시간(min)</p> <h3>Slot blot hybridization</h3> <p>L. brevis 균주를 각각의 탄소원이 \( 1 \% \) 포함된 MRS 배지 에서 \( \mathrm{OD}_{600} 0.8 ~ 1.0 \)까지 배양한 후 세포를 회수하여 Trizolbead법으로 RNA를 추출하였다. RNA는 \(260\)과 \( 280 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 농도를 구하였다. RNA \( 10 \mu \mathrm{g} \)씩을 slot blot 장치 SE\(646\)(Amersham Phamarcia Biotech Inc., Uppsala Sweden)를 이용하여 hybond-XL nylon membrane 에 고정화시켰다. 유전자 발현에 사용한 \( a g a \)와 lacZ PCR 증 폭산물을 probe로 사용하였으며, Amersham Alkphos Direct Labeling and Detection System(Amershamn Bioscience)을 이용하여 labeling과 detection을 실시하였다. Hybridization 과정은 ULTRaHYB(Ambion, Austin, TX, USA)를 이용하 여 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(1\)시간의 prehybridization과 \(12\) 시간의 hybridization을 실시하였다.</p>