Total RNA \( 5 \mu \mathrm { g } \)을 이용해 \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 50분 동안 역전사 반응을 수행한 후, 만들어진 cDNA를 주형으로 PCR을 실행한다. cDNA \( 2 \mu \mathrm { L } \), forward primer, reverse primer, PCR master mix, 그리고 증류수를 사용해 PCR mixture를 제조한다. PCR 반응은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분, 후에 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분, \( 58 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분, 그리고 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분씩 총 25 cycle에 걸쳐 진행한 후, 마지막으로 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분간 extension 반응을 실행한다.
<h2>Reverse transcription-PCR</h2> <p>Total RNA \( 5 \mu \mathrm { g } \) 을 이용하여 \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 50 분간 역전사 반응을 수행하였다. 만들어진 cDNA(최종부피 \( 60 \mu \mathrm { L } \)를 주형으로 하여, 유진자 득이적인 primer를 이용하여 PCR을 수행하였다. 즉, cDNA \( 2 \mu \mathrm { L } \), forward primer와 reverse primer 를 각각 \( 1 \mu \mathrm { L } , \mathrm { PCR } \) master mix(SecGene Inc. Korea) 10 \( \mu \mathrm { L } \), 증류수 \( 6 \mu \mathrm { L } \) 로 PCR mixturc를 제조하고, PCR의 조건은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분 후 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 분, \( 58 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 분씩 25 cycle 증폭 후 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10분간 extension반응을 시행하였다. PCR product는 진기영동을 수행한 후 UV 하에서 사진 촬영 하였다.</p> <h2>Western blot analysis</h2> <p>인간 대장암 세포주 HCT116 세포주와 p53-null HCT116를 60 mm dish에 각각 접종 후, 약 24시간 뒤에 allicin을농도 별로 처리한 다음, 다시 24시간 뒤에 세포를 수확하였다. 수확한 세포는 RIPA buffer(20 mM Tris-Cl[pH 7.5], 150 \( \mathrm { mM } \) \( \mathrm { NaCl } , 1 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { NaCL } , 1 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { EDTA } , 1 \mathrm { mM } \) EGTA, \( 1 \% \) NP40, 1 \% sodium deoxycholate, \( 2.5 \mathrm { mM } \) sodium pyrophosphate, \( 1 \mathrm { mM } \beta \)-glycerophosphate, \( 1 \mathrm { mM } \mathrm { Na } _ { 3 } \mathrm { VO } _ { 4 } , 1 \) \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) leupeptin)용액을 \( 200 \mu \mathrm { L } \) 처리하여 가볍게 tapping한 후 얼음 위에서 15 분간 lysis 시킨 다음 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) centrifuge에서 \( 14,000 \mathrm { rpm } \) 으로 10 분간 원심분리하여 단백질을 추출하였다. 전기영동은 NuPage 4-12 \% acrylamide gel(Invitrogen, USA) 을 이용하였으며, transfer를 마친 membrane은 5 \% non-fat skim milk(Bio-Rad, USA)가 함유된 IX TBS-T(0.1 \% Tween \( 20, 100 \mathrm { mM } \) Tris-Cl[pH 7.5], \( 0.9 \% \mathrm { NaCl } \) 에서 1시간 blocking 하였다. 1차 antibody 처리는 5 \% skim milk가 함 유된 IX TBS-T 용액을 사용하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 12시간 이상 수행하고 TBS-T 용액으로 15 분간 3회 세척하였고, 2차 antibody의 겅우에는 같은 조성으로 실온에서 1시간 수행한 후 일련의 세척과정을 마쳤다. 세척 후 Western LightingPlus-ECL(Perkin Elmer, USA)을 사용하여 발광시켜 X-rayfilm에 expose한 후 확인하였다. 본 실험에서 사용된 1차antibody로는 anti-NAG-1, anti-p53, anti-ACTIN이 사용되었다. NAG-1 antibody를 제외한 모든 항체는 Santa Cruz사(USA)와 Cell Signaling사(USA)로부터 구입하였고 NAG-1antibody는 미국 NIEHS(National Institute of EnvironmentalHealth Sciences)의 Dr. Eling group으로부터 제공 받았다.</p>