Immunoblotting은 SDS-PAGE를 통해 단백질 시료를 분리하고, Towbin's Buffer로 polyacryamidegel 내의 단백질들을 nitrocellulose membrane으로 이동시키는 기술이다. Salmonella 세포 표면전하와 소수성은 zeta-potential 측정을 통해 결정되고 LB 액체배지에서 배양한 Salmonella 세포를 \(0.5\%\)의 SDS에 노출하여 생존비율을 측정해 SDS에 대한 내성을 분석했다. OmpW 단백질의 Salmonella 내에서의 역할과 유전자 발현 조절 연구를 위해 \( \mathrm { OmpW } \) 다클론성 항체를 생산한 결과,E. coli BL21을 IPTG가 들어간 배양조건에서 배양하였을 경우 전체 단백질의 \( 5 \% \)이상을 차지하는 \( \mathrm { His } _ { 6 \times } \times \mathrm { OmpW } \)단백질이 발현되는 것을 확인했다.
<h2>Immunoblotting</h2> <p>SDS-PAGE를 통해 단백질 시료를 분리한 후, transfer 장치(BioRad)와 Towbin's Buffer (TB)를 사용하여 polyacryamidegel 내의 단백질들을 nitrocellulose membrane (Schleicher & Schuell)으로 이동시켰다[13]. Towbin 등에 의해 기술된 바와 같이 \(5 \% \) skim milk를 함유하는 Towbin's Saline Buffer (TBS)에서 3 시간 동안 membrane을 blocking시킨 후, 적절히 희석된 OmpW 특이적인 다클론성 1 차 항체와 함께 2 시간 반응시켰다. TBS로 수 회 세척한 membrane에 2 차 항체인 horseradish peroxidase-conjugated donkey anti-rabbit Ig (Amersham)를 \( 5 \% \) skim milk/TBS에 1:1,000의 비율로 희석하여 2 시간 동안 반응시켰다. TBS로 수 회 세척한 membrane의 OmpW 단백질 밴드를 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) (Sigma)와 4-chloro-1-naphthol (Sigma)이 포함된 용액에서 자주색의 침착물이 생성되는 것으로 확인하였다. 반응은 다량의 증류수 세척을 통해 중지시켰다.</p> <h2>세포 표면 특성 분석</h2> <p>Salmonella 세포 표면전하와 소수성은 zeta-potential 측정을 통해 결정될 수 있다. Salmonella 배양액을 원심분리를 통해 얻어 \( 0.85 \% \mathrm { NaCl } \) 로 2회 세척하였다. 적절히 희석한 세포 현탁액의 zeta-potential을 ELS-8000 (Otsuka electronics) 로 측정하였다.</p> <h2>SDS에 대한 내성 분석</h2> <p>LB 액체배지에서 25 시간 배양한 Salmonella 세포를 수거하여 생리식염수로 세척한 후 \( 0.5 \% \) 의 SDS에 10 분간 노출하였다. 처리가 끝난 샘플 내에 살아남은 균은 생균수 측정법을 통해 확인하였다. 결과는 SDS를 처리하지 않은 세포에 대한 SDS-처리한 세포의 생존비율로 나타내었다.</p> <h2>결 과</h2> <h3>OmpW 단백질의 과발현, 정제 및 OmpW 특이적인 다클론성 항체의 생산</h3> <p>OmpW 단백질의 Salmonella내에서의 역할 규명 및 유전자 발현 조절에 대한 이후의 연구를 위하여 우선 OmpW 특이적인 다클론성 항체를 생산하기로 하였다. 항원의 대량생산 및 합성된 항원단백질의 수월한 정제를 위하여 대장균을 이용한 인위적인 단백질 과발현 체계를 이용하여 6개의 histi-dine \( \left ( \operatorname { His } _ { 6 \times } \right ) \) 잔기들로 표지되어진 OmpW 항원을 발현하는 체계를 활용하였다. 재료 및 방법에서 설명한 바와 같이 단백질 발현을 위한 완전한 ompW 유전자를 가지는 ompW과 발현 플라스미드 pBP22을 구축하였다 (Fig. 1A). pBP22을 가지는 E. coli BL21 (DE3)을 \( 1 \mathrm { mM } \) 의 IPTG가 들어있는 배양조건에서 배양하였을 경우 전체 단백질의 \( 5 \% \) 이상의 양을 차지하는 \( \mathrm { His } _ { 6 \times } \times \mathrm { OmpW } \) 단백질이 발현되는 것을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다(Fig. 1B). 과량 생성된 \( \mathrm { His } _ { 6 \times } - \mathrm { OmpW } \) 단백질이 세포질 부분에 일부 존재하고, 대부분의 OmpW 단백질은 불용성의 inclusion body를 형성하고 이들이 쉽게 가라앉는 것을 볼 수 있었다(data not shown). 항체 생성에는 변성된 형태의 단백질 사용이 무방하므로 변성조건인 \( 8 \mathrm { M } \) urea를 처리하여 불용성의 OmpW 단백질을 가용화하였으며, \( \mathrm { His } _ { 6 \times } \)-OmpW 단백질은 \( \mathrm { Ni } ^ { 2 + } \)-sepharose를 이용한 친화성 정제 크로마토그래피를 통해 총 \( 375 \mathrm { mg } \) 의 \( \mathrm { His } _ { 6 \times } - \mathrm { OmpW } ^ { 2 } \) 를 얻었다(Fig 1B).</p>