본문은 Total genomic DNA 분리와 정제과정으로 가장 먼저 LB배지에 균주를 접종하고 원심분리하여 세포를 수확한 후 TES buffer로 재현탁하고 lysozyme, SDS와 Proteinase K, phenol 첨가하여 반응시켰다. 상징액을 취한후 3M sodium acetate, ethanol 처리 후 실험에 사용하였다. 특정 유전자의 증폭 또는 클로닝을 위한 시료 사용을 위해 total DNA를 정제하였다.
<h2>Total genomic DNA 분리와 정제</h2> <p>각 균주를 \( 50 \mathrm { ml } \)의 LB배지에 접종하고 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 180 \mathrm { rpm } \)으로 24시간 동안 배양한 후 원심분리(6,300× \( \left .g, 10 \mathrm { ~min } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \)하여 세포를 수확하였다. 회수된 배양세포를 \( 5 \mathrm { ml } \) TES buffer[0.1 M Tris-HCl (pH 7.0), \( 0.01 \mathrm { M } \) EDTA, \( 1 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } ] \)로 재현탁하고, lysozyme \( (10 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \)을 \( 200 \mu \mathrm { l } \) 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 15분간 반응시켰다. \( 10 \% \) SDS를 \( 100 \mu \) 첨가하고, 물리적인 DNA 절단을 방지하기 위하여 천천히 섞어준 후 \( 50 \mu \mathrm { l } \) proteinase \( \mathrm { K } (20 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \) 와 \( 5 \mu \mathrm { l } \) RNase를 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30 분간 반응시켰다. \( 5 \mathrm { ml } \) TES buffer를 더 첨가하여 \( 10 \mathrm { ml } \)의 phenol을 첨가하여 잘 섞어주었다. 원심분리를 통하여 얻어진 상징액을 취하여 새로운 tube로 옮긴 후 동량의 phenol/choroform/isoamyl alcohol로 2회, chlorofrom으로 1회 처리하였다. 상징액을 취하여 새로운 tube로 옮긴 후 \( 1 / 10 \) volume의 3M sodium acetate (pH 5.4)와 2-3 fold volume의 \( 100 \% \) ethanol을 첨가하여 30 분간 실온에서 방치하였다. 원심 분리 후 상징액을 버리고 \( 70 \% \) ethanol을 처리하여 염류를 씻어낸 후 다시 한 번 원심분리하였다. 상징액을 버리고 공기중에서 ethanol을 제거한 후 침전물 \( 500 \mu 1 \) 의 멸균수에 녹여 다음 실험에 사용하였다. \( 0.8 \% \) agarose gel에 전기영동을 실시하여 DNA band를 확인한 후 UV-spectrophotometer (DU 800, Beckman Coulter, Fullerton, USA)를 이용하여 정량하였다. Total DNA의 정제를 위해 crude DNA를 \( 10 \mathrm { ml } \) cesium chloride용액에서 녹인 후 ethidium bromide를 첨가하고 \( 0.2 \mu \mathrm { m } \) membrane filter를 이용하여 30분간 투석하여 DNA 용액을 회수하여 농축한 후 특정 유전자의 증폭 또는 클로닝을 위한 시료를 사용하였다. 기타 언급하지 않은 여러 가지 분자 생물학적 방법은 이미 잘 알려진 방법에 따라 수행하였다.</p>