이 연구에서는 Xylanase 활성을 Somogyi와 Nelson의 환원당 정량방법을 변형하여 측정하였다. 단백질 함량은 Bradford 방법에 따라 측정하였으며, bovine serum albumin을 표준물질로 사용하였다. 또한, 특정 아미노산 잔기에 선택적으로 작용하는 다양한 화학수식제를 효소반응용액에 각각 \(20 \mathrm{mM}\) 첨가한 후 효소의 잔존활성을 측정하여 화학수식제에 의한 효소활성의 저해도를 알아보았다.
<h2>효소활성과 단백질 함량 측정</h2><p>Xylanase 활성은 Somogyi와 Nelson의 환원당 정량방법을 변형하여 측정하였다. 기질용액으로는 \( 1 \% \) oat-spelts xylan을 \( 50 \mathrm{mM} \) citrate-phosphate \(( \mathrm{pH} ~6.0 )\) 완충용액에 현탁한 후 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 가열하고 정치시켜 그 상등액을 이용하였다. 기질용액 \( 0.4 \mathrm{ml} \)에 \( 0.1 \mathrm{ml} \)의 조효소액을 첨가하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20 분간 반응시킨 후 alkaline copper reagent를 \( 0.4 \mathrm{ml} \) 첨가하고 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10 분간 가열하여 효소반응을 정지시켰다. 반응액을 수돗물로 냉각하여 \( 0.4 \mathrm{ml} \)의 Nelson's reagent를 가한 후 \( 2.6 \mathrm{ml} \)의 증류수를 첨가하여 희석한 다음 \( 520 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 D-xylose를 \( 0 \sim 1.0 \mu \mathrm{mol} \)의 농도로 사용하여 작성하였고, 효소 1 unit는 주어진 조건에서 분당 \( 1 \mu \mathrm{mol} \)의 D-xylose에 해당하는 환원당을 생성할 수 있는 효소의 양으로 정하였다. 단백질 함량은 Bradford의 방법에 따라 측정하였고 bovine serum albumin을 표준물질로 사용하였다.</p><h2>화학수식제의 처리</h2><p>화학수식제에 의한 효소활성의 저해도를 알아보기 위하여 특정 아미노산 잔기에 선택적으로 작용하는 여러 가지 화학수식제를 효소반응용액에 각각 \( 20 \mathrm{mM} \) 씩 첨가한 후 효소의 잔존활성을 측정하였다. 정제효소는 각 반응용액 당 0.05 unit를 사용하였고 반응용액의 최종부피는 \( 0.5 \mathrm{ml} \)로 하였다. Cysteine 잔기를 수식하기 위해서는 iodoacetic acid, \( 5,5^{\prime} \)-dithiobis (2-nitrobenzoic acid), N-ethylmaleimide, p-chloromercuribenzoic acid를, lysine 잔기를 수식하기 위해서는 pyridoxal-5'-phosphate, acetic anhydride, 2,4,6-trinitrobenzene-1-sulfonic acid를, histidine 잔기를 수식하기 위해서는 diethyl pyrocarbonate를, arginine 잔기를 수식하기 위해서는 phenylglyoxal과 2,3-butanedione을 사용하였으며, tryptophan 잔기를 수식하기 위해서는 N-bromosuccinimide를, glutamic acid 또는 aspartic acid를 수식하기 위해서는 carbodiimide를 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20분간 방치한 다음 \( 0.01 \mathrm{ml} \)를 채취하여 xylanase의 잔존활성을 측정하였고, 화학수식제의 작용은 화학수식제를 사용하지 않은 효소활성의 상대 \( \% \)로 나타내었다.</p><p>기질에 의한 효소의 보호효과를 알아보기 위해서는 \( 0.5 \% \) \((\mathrm{v}/\mathrm{v}\)) oat-spelts xylan (Sigma Co., USA)과 \( 1 \mathrm{mM} \) 의 N-bromosuccinimide 또는 \( 10 \mathrm{mM} \)의 carbodiimide를 0.05 unit의 효소가 존재하는 반응용액에 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 방치한 다음 \( 0.01 \mathrm{ml} \) 를 채취하여 xylanase의 잔존활성을 측정하였다.</p><p>효소저해의 반응차수를 계산하기 위해서는 N-bromosuccinimide 또는 carbodiimide를 여러 가지 농도로 반응용액에 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 일정시간 간격으로 \( 0.01 \mathrm{ml} \)를 채취하여 효소의 잔존활성을 측정하였다.</p>