SDS-PAGE를 통해 eye-specific LDH C \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소가 정제되었으며, 이의 하부단위체의 분자량은 \( 38. 7 \mathrm{kDa} \)이며, 전체 분자량은 \( 154. 8 \mathrm{kDa} \)로 측정되었다. 이 동위효소의 최적 \( \mathrm{pH} \)는 8. 5로, 중성보다는 약염기성 조건에서 효소활성이 높았다. 또한, 이 동위효소의 \( K_{\mathrm{m}}^{\mathrm{PYR}} \) 값은 \( 1. 88 \times 10^{-5} \mathrm{M} \)로, 쏘가리와 가물치의 \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소보다 피루브산에 대한 기질결합친화성이 높았다. 이를 바탕으로 다양한 조건의 서식지를 가진 어류에서의 이 동위효소에 대한 연구가 확대되면, eye-specific LDH C4 동위효소의 기능에 대한 이해도 높아질 것으로 예상되었다.
<h2>Eye-specific LDH C \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 분자량 및 최적 \( \mathrm{pH} \)</h2> <p>Eye-specific LDH C \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 정제도를 확인하고 분자량을 측정하기 위하여 SDS-PAGE를 실시한 결과, 하부단위체 \( \mathrm{C} \)가 단일밴드로 나타나 eye-specific LDH C \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소가 정제되었음을 확인하였고 정제된 eye-specific LDH C \( \mathrm{C}_{4} \)동위효소는 역학실험 및 항체생성을 위한 항원으로 사용하였다(Fig. 4). 하부단위체 \( \mathrm{C} \)는 분자량이 \( 38.7 \mathrm{kDa} \)으로 측정되어 eye-specific LDH C \( \mathrm{C}_{4} \)동위효소의 분자량은 \( 154.8 \mathrm{kDa} \)으로 나타났다(Fig.4). 이는 각각 풀망둑과 쏘가리 LDH C \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소의 분자량인\( 136.0 \) 및 \( 140.4 \mathrm{kDa} \) 보다는 크고 조피볼락의 eye-specific LDH\( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 분자량 \( 154.0 \mathrm{kDa} \)과는 유사하게 나타났다. Eye-specific LDH \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소에 대한 최적 \( \mathrm{pH} \)를 구한 결과 효소활성은 \( \mathrm{pH} 4.0 \)에서 \( \mathrm{pH} 5.5 \)까지 증가하다 \( \mathrm{pH} 6.5 \)까지 급격히 감소하였고 다시 증가하여 \( \mathrm{pH} 8.5 \)에서 최고 활성을 나타낸 후 급격히 감소하였다. 따라서 eye-specific LDH C \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 최적 \( \mathrm{pH} \)는 8.5로 중성보다는 약염기성 조건시 효소활성이 높은 것으로 나타났다(Fig. 5). 이는 LDH C \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 a-keto acid들에 대한 넓은 기질특이성에 기인하는 효소촉매부위의 이온화정도 차이 때문이라고 생각된다. 따라서 LDH 활성측정 시 일반적으로 사용하는 중성조건이 eye-specific LDH C \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 활성측정 시에는 최적 조건이 아니며 이는 앞으로 eye-specific LDH C \( \mathrm{C}_{4} \)동위효소의 활성측정 시 고려 할 부분이라고 생각된다.</p> <h2>Eye-specific LDH C \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 기질의존성 및 \( K_{m}^{\text {PYR }} \) 값</h2> <p>\( \mathrm{LDH} \) 동위효소들의 기질에 대한 촉매특성실험은 동위효소들의 구조적, 진화적 특성을 규명하는데 효과적이다. 일반적으로 \( 10 \mathrm{mM} \) 의 고농도 피루브산에서는 LDH C \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소가 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소보다 피루브산에 의한 저해정도가 낮으며eye-specific LDH C \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 경우 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소보다 조금더 저해되었다. 본 실험에서 eye-specific LDH C 4 동위효소의 피루브산에 대한 기질의존성을 측정한 결과, \( 10 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 \( 6.5 \% \) 의 효소활성이 남아(Fig. 6) 소 심장 및 고등어 망막의 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소보다 피루브산에 의한 저해정도가 더 높게 나타나 같은 결과를 보였다. 또한 eye-specific LDH C \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 \( K_{\mathrm{m}}^{\mathrm{PYR}} \) 값은 \( 1.88 \times 10^{-5} \mathrm{M} \) 로 나타났는데 (Fig. 7) 이는 쏘가리 LDH \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소의 \( K_{\mathrm{m}}^{\mathrm{PYR}} \) 값 \( 4.86 \times 10^{-5} \) \( \mathrm{M} \) 및 가물치 \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소의 \( K_{\mathrm{m}}^{\mathrm{PYR}} \) 값 \( 1.7 \times 10^{4} \mathrm{M} \)보다 낮은 값으로서 eye-specific LDH \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소가 \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소보다 피루브산에 대한 기질결합친화성이 큰 것으로 나타났다.</p> <h2>Eye-specific LDH \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 면역화학적 특성</h2> <p>쥐노래미 eye-specific LDH C 동위효소에 대한 항체 생성 여부 및 생성된 항체의 항원과의 반응특이성을 확인하기위하여 쥐노래미 눈 조직을 eye-specific LDH \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소에 대한 항체를 사용 Western blotting시켰다(Fig. 8). 그 결과 eye-spe-cific LDH \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소에 대한 항체가 쥐노래미 눈 조직의 eye-specific LDH C \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소 및 하부단위체 \( \mathrm{C} \)를 포함한 동위효소(C hybrid, \( \mathrm{CH}) \)와 반응하므로 반응특이성이 있는 항체가 생성되었음을 확인하였다. Native-PAGE 상에서 거의 나타나지 않은 \( \mathrm{CH} \) 밴드가 Western blot 상에서 나타난 이유는 효소염색보다 Western blot 상에서 이미지가 증폭되었기 때문으로 생각된다.</p> <p>본 연구 결과 쥐노래미 eye-specific LDH \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 정제과정에서의 특성이 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소보다 \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소와 유사하였고, 약염기성 조건에서 효소활성이 높게 나타난 점은 다른 LDH 동위효소들과 달리 효소활성 측정 시 약염기성에서의 측정도 필요함을 시사한다. 또한 생성된 eye-specific LDH \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소에 대한 항체는 면역조직화학, stern blotting 및 ELISA 등에 이용되어 eye-specific LDH \( \mathrm{C}_{4} \)동위효소 및 이와 유사한LDH \( \mathrm{C}_{4} \)동위효소를 보유하는 생물 종들의 병증진단, 진화 및 비교생리학적 연구에 폭넓게 사용 될 것이라고 생각된다. 앞으로 다른 동물에 비하여 상대적으로 다양한 조건의 서식지를 갖는 어류에서 eye-specific LDH \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소에 대한 정제 및 역학특성에 관한 연구가 더 많이 이루어진다면 eye-specific LDH C4 동위효소의 기능에 관한 이해의 폭이 넓혀질 것으로 사료된다.</p>