HKSMM 시료가 Cell viability와 proliferation에 미치는 영향을 확인하기 위해 \(50 \%\) ethanol 수용액 추출물(HKSMM50)을 제조하였다. 세포배양은 10% FBS, RPMI 1640 배지에 항생제를 첨가하여 \(\left(37 \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2}\right) \) 환경에서 배양하고 3일 간격으로 계대배양하였다. Cell viability는 ELISA microreader로 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하는 것으로, Cell proliferation은 BrdU assay 후 마찬가지로 ELISA microreader를 이용하여 흡광도를 측정하는 것으로 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료 및 시약</h2><p>HKSMM은 (주)HK바이오텍(Jinju, Korea), AHCC는KCFKOREA (Seoul, Korea)로부터 구입하였다. Jurkat cells은 ATCC (Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. Fetal bo-vine serum (FBS), penicillin \( (100 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) \), streptomycin (100\( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ), bovine serum albumin (BSA), Roswell Park Memo-rial Institute (RPMI) 1640은 Gibco 사(Waltham, MA, USA) 및 concanavalin A (ConA)와 dimethylsulfoxide (DMSO)는Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.MTT [3-4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazoliumbromide] assay kit는 Enzo Life Sciences (Minneapolis, MN,USA)에서 구입하였다. Cell proliferation을 위한 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) BrdU assay kit, propi-dium iodide (PI), Western blotting detecting reagents, pierce bicinchoninic acid protein assay kit, NFAT primary antibody(anti-NFAT antibody), \( \beta \)-actin mouse polyclonal antibody 및 anti-goat IgG conjugated horseradish peroxidase (HRP) sec-ondary antibody는 Santa Cruz사(Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다. Human \(\mathrm{IL-2}\) ELISA kit (Invitrogen Co.Seoul, Korea), human (\mathrm{IFN-}\) \( \gamma \) ELISA kit (Bioscience Co.,Seongnam, Korea) 및 human cyclooxygenase-2 (COX-2) ELISA kit (Invitrogen사)를 사용하였다. NE-PER nuclear/cytoplasmic extraction reagent kit, lysis buffer \( (50 \mathrm{mM} \) HEPES, (\mathrm{pH} 7.4\); \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} ; 1 \% \) deoxycholate; \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA; \( 1 \mathrm{mM} \) methyl sulfoxide fluoride; \( 1 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) aprotinin), Tris-buffered saline (TBS; \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris/ \( 0.15 \mathrm{M} \mathrm{NaCl} \) buffer solution, \( 0.05 \% \) Tween-20는 Thermo Fisher Scientific 사 (Seoul, Korea) 및 enhanced chemiluminescence kit (ECL)는 Bio-Rad사(Hercules, CA, USA)로부터 구입하였다. 그 외 사용된 시약은 reagent grade 이상이었다.</p><h2>HKSMM 시료의 \(50 \%\) ethanol 수용액 추출물(HKSMM(50) )제조</h2><p>HKSMM \( (100 \mathrm{~g}) \)을 \( 50 \% \) ethanol 수용액 11에 첨가하고 충분히 혼합한 후 over night 방치하였다. 혼합기로 균질화 하고 원심분리 \( \left(7,000 \mathrm{rpm}, 4^{\circ} \mathrm{C}, 30 \mathrm{~min}\right) \)하여 얻은 상등액의 ethanol을 진공농축 \( \left(50^{\circ} \mathrm{C}\right) \)하여 제거하고 동결건조하여 HKSMM50 시료 갈색분말 \( (45.4 \mathrm{~g}) \)을 얻었다.</p><h2>세포배양</h2><p>Jurkat cells은 \(10 \%\) FBS, penicillin ( \(100\mathrm{U}/\mathrm{ml}\) ), streptomycin \((100\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml})\)을 함유한 RPMI \(1640\) 배지에서 배양(5\% \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) )하였다. Cells은 \( 75 \mathrm{~cm}^{2} \) Falcon flask (Glendale, \( \mathrm{AZ} \), USA)에서 충분히 증식한 후 3일 간격으로 incubator \( \left(37 \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2}\right) \)에서 계대배양하였다.</p><h2>Cell viability 측정</h2><p>배양된 Jurkat cells \( \left(2 \times 10^{3}\right. \) cells \( \left./ 100 \mu \mathrm{l}\right) \)을 96 well plate의 well에 분주하여 24시간 배양 \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2}\right) \)하고, HKSMM50 및 AHCC 시료 용액 \( (0,10,50,100,200,400,600,800 \), \( 1,000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) 100 \mu \mathrm{l} \)를 처리한 후 다시 24시간 배양하고 배양물을 제거하였다. 여기에 MTT시약(RPMI 1640 medium으로 5배 희석) \( 100 \mu \mathrm{l} \) 분주하고 1시간 반응시켰다(37 \( { }^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) ). 상등액을 제거한 후 DMSO \(100 \mu\mathrm{l} \ \)를 첨가하여 살아있는 세포에 의해 생성된 formazan을 용해하여 ELSA microreader (SpectraMax i3, Molecular devices: San Jose, CA, USA)로 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>Cell proliferation 측정</h2><p>BrdU assay에 의한 cell proliferation은 제조사(Santa Cruz 사)의 방법에 준하여 분석하였다. 즉, 배양된 세포 \( \left(2 \times 10^{3}\right. \) \(\mathrm{cells/}\)\(90\mu \mathrm{l}\))를 96 well plate의 well에 분주하고 24시간 배양 \( \left.37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2}\right) \)하였다. 여기에 HKSMM50시료 용액 \( (0 \), \( 250,500,1,000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) 100 \mu\mathrm{l} \) 및 AHCC시료 용액 \( (1,000 \) \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) 100 \mu\mathrm{l}\) 처리하고 3시간 또는 6시간 배양 \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \%\right. \) \( \left.\mathrm{CO}_{2}\right) \) 또한 24시간 배양된 cells에 ConA 용액(500 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) 50 \mu \mathrm{l} \) 처리 1시간 후에 HKSMM50 시료 용액 \( (0,500 \), \( 1,000,2,000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 및 AHCC 시료 용액 \( (2,000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) 50 \) \( \mu\mathrm{l}\)를 처리하고 3시간 또는 6시간 배양하였다.</p><p>이들 시료처리 배양물에 \( \mathrm{BrdU} \) 용액 \( 10 \mu\mathrm{l} \ \) 처리하여 3시간 배양 \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}\right. \), \( \left.5 \% \mathrm{CO}_{2}\right) \) 하였다. 원심분리 \( (300 \mathrm{~g}, 10 \mathrm{~min}) \)하여 상등액을 제거한 후, 1시간 건조 \( \left(60^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 하고, FixDent 시약 \( 200 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하고 실온에서 고정하였다. 고정액을 제거하고 anti-BrdU-POD working solution \( 100 \mu\mathrm{l}\) 첨가하고 실온에서 반응 \( (90 \mathrm{~min}) \)시켰다. 세척 후 substrate solution \( 100 \mu \mathrm{l} \) 첨가 하여 반응 시킨 후 \( 1 \mathrm{M}\) \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \)로 반응을 종결 시키고 ELISA microreader (SpectraMax i3, Molecular devices)로 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 cell proliferation을 측정하였다.</p>