포도와 오이즙액에 동충하초 균사체 배양기간에 따른 멜라닌 생성 억제를 측정하기 위하여, B16BL6 mouse melanoma cell을 6 well plate에 \( 1 \times 10^{5} \mathrm{~cells/ ml}\)의 세포수로 각각 \( 5 \mathrm{~ml} \)씩 분주하여 배양하였다. 멜라닌 생성량은 시료를 처리하지 않은 melanoma cell을 대조구로 그 상대적인량을 측정하여, 가장 활성이 우수한 배양기간의 균사체 배양액을 본 실험에 이용하였다. 처리된 세포를 \( 5 \% \mathrm{~CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C} \)의 조건에서 5일간 배양 후 생성된 멜라닌 색소를 육안으로 1차 평가하였고, 배양 상등액 \( 1 \mathrm{~ml} \)을 취하여 원심분리 후 pellet을 제거한 상등액을 UV-Vis spectrophotometer를 사용하여 \( 475 \mathrm{~nm} \)파장에서 흡광도에 의해 멜라닌 생성량을 측정하였다. 염색된 세포로부터 crystal violet을 추출하기 위하여 \( 95 \% \)ethanol을 1시간동안 상온에서 처리하였으며, 추출액을 UV-Vis spectrophotometer를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \)파장에서 흡광도로 세포의 생존율을 측정하였다. 포도와 오이혼합액에 동충하초 균사체 배양액의 in vitro tyrosinase활성 억제율을 측정하기 위하여, 96 well plate (Falcon. USA)에 L-tyrosine \((10 \mathrm{~mM})\) \(25 ~\mu \mathrm{l}\)에 포도와 오이즙액에 동충하초 균사체 배양액을 각각 \( 0,5,10,20,30 \% \)씩 첨가하고, mushroom tyrosinase (\(2,500 \mathrm{~unit}\), Sigma Chemical Co., USA)를 \(3 ~\mu \mathrm{l}\)씩 넣은 다음 \( 50 \mathrm{~mM} \)인산완충용액으로 최종 \( 200 ~\mu \mathrm{l} \)가 될 수 있게 조절하였다.
<h2>포도와 오이즙액에 동충하초 균사체 배양기간에 따른 멜라닌 억제</h2> <p>포도와 오이즙액에 동충하초 균사체 배양기간에 따른 멜라닌 생성 억제를 측정하기 위하여, B16BL6 mouse melanoma cell을 6 well plate에 \( 1 \times 10^{5} \mathrm{~cells/ ml}\)의 세포수로 각각 \( 5 \mathrm{~ml} \)씩 분주하여 배양하였다. 24시간 배양후 \( 5 \% \) FBS가 첨가된 MEM 배지로 교환한 후 포도와 오이즙액에 동충하초 균사체를 5일 간격으로 25일간 배양한 배양 상등액을 각각 \( 5 \% \)의 농도로 처리하였다. 처리된 세포를 \( 5 \% \mathrm{~CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C} \) 조건에서 5일간 배양한 후 생성된 멜라닌 색소를 육안으로 1차 평가하였고, 배양 상등액 \( 1 \mathrm{~ml} \)을 취하여 원심분리 후 pellet을 제거한 상등액을 UV-Vis spectrophotometer를 사용하여 \( 475 \mathrm{~nm} \) 파장에서 흡광도를 통해 멜라닌 생성량을 측정하였다. 멜라닌 생성량은 시료를 처리하지 않은 melanoma cell을 대조구로 그 상대적인 량을 측정하여, 가장 활성이 우수한 배양기간의 균사체 배양액을 본 실험에 이용하였다.</p> <h2>균사체 배양액의 농도별 멜라닌 생성 억제</h2> <p>멜라닌 생성 억제 효능을 평가하기 위하여 B16BL6 mouse melanoma cell을 6 well plate에 \( 1 \times 10^{5} \mathrm{~cells/ml}\)의 세포를 각각 \( 5 \mathrm{~ml} \)씩 넣고 24시간 배양하였다. 배양 후 \( 5 \% \) FBS가 첨가된 MEM 배지로 교환한 후 포도와 오이즙액에 동충하초 균사체를 15일 배양한 배양 상등액을 \( 0,10,20,30,40,50 ~\mu \mathrm{l} / \mathrm{ml} \) 의 농도로 처리하였다. 처리된 세포를 \( 5 \% \mathrm{~CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C} \)의 조건에서 5일간 배양 후 생성된 멜라닌 색소를 육안으로 1차 평가하였고, 배양 상등액 \( 1 \mathrm{~ml} \)을 취하여 원심분리 후 pellet을 제거한 상등액을 UV-Vis spectrophotometer를 사용하여 \( 475 \mathrm{~nm} \) 파장에서 흡광도에 의해 멜라닌 생성량을 측정하였다.</p> <h2>포도와 오이즙액에 동충하초 균사체 배양액의 세포독성</h2> <p>포도, 오이즙액과 이 즙액에 동충하초 균사체 배양액의 세포 생존에 미치는 영향을 측정하기 위하여 crystal violet assay 방법을 응용하였다. 6 well plate에 \( 5 \times 10^{4} \mathrm{~cells/ml}\)의 세포를 각각 \( 5 \mathrm{~ml} \)씩 넣고 24시간 배양 후 \( 1 \%\) FBS가 첨가 된 MEM 배지로 교환하여 준 후, 포도, 오이즙액과 그 즙액에 동충하초 균사체를 15일 동안 배양한 배양 상등액을 각각 \( 0,1,3,5,7,9,10,20 \% \) 농도로 각각 처리하여 24시간동안 배양하여 배양 상등액을 제거하고, PBS \((\mathrm{pH} ~7.2)\)로 세척 한 후 \( 0.1 \% \) crystal violet (\( 10 \% \) ethanol)을 이용하여 5분 동안 상온에서 염색 하였다. 그 후 crystal violet을 완전히 제거 한 후 PBS \((\mathrm{pH} ~7.2)\)로 3회 세척하였다. 염색된 세포로부터 crystal violet을 추출하기 위하여 \( 95 \% \) ethanol을 1시간동안 상온에서 처리하였으며, 추출액을 UV-Vis spectrophotometer를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \) 파장에서 흡광도로 세포의 생존율을 측정하였다.</p> <h2>Tyrosinase 활성억제</h2> <p>포도와 오이혼합액에 동충하초 균사체 배양액의 in vitro tyrosinase 활성 억제율을 측정하기 위하여, 96 well plate (Falcon. USA)에 L-tyrosine \((10 \mathrm{~mM})\) \(25 ~\mu \mathrm{l}\)에 포도와 오이즙액에 동충하초 균사체 배양액을 각각 \( 0,5,10,20,30 \% \)씩 첨가하고, mushroom tyrosinase (\(2,500 \mathrm{~unit}\), Sigma Chemical Co., USA)를 \(3 ~\mu \mathrm{l}\)씩 넣은 후 \( 50 \mathrm{~mM} \) 인산완충용액으로 최종 \( 200 ~\mu \mathrm{l} \)가 되게 조절하였다. 그 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 ELISA reader 를 통해 멜라닌 생성량을 \( 490 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도로 측정하였다.</p>