경북 포항의 호미곶 연안 해수를 시료액으로 사용하였고 시료액을 \( 2 \%\) \( \mathrm{NaCl} \)이 첨가된 멸균희석수를 이용하여 연속적으로 희석하였고 원액과 희석수 \(100\) \( \mu l \) 씩을 배지위에 도말하였다. 분해균주의 동정을 위하여 \( 16 \mathrm{S} \) rDNA 염기서열분석을 실시하였으며 생육 양상을 경시적으로 관찰하면서 한천분해 효소의 활성을측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>분리용 시료 및 한천분해 균주의 분리 배양</h2> <p>경북 포항의 호미곶 연안 해수를 시료액으로 사용하였다. 시료액을 \( 2 \%\) \( \mathrm{NaCl} \)이 첨가된 멸균희석수를 이용하여 연속적으로 희석하였고 원액과 희석수 \(100\) \( \mu l \) 씩을 배지위에 도말하였다. 시료액을 한천을 유일한 탄소원 및 에너지원으로 한 무기염 한천배지와, 일반적인 해양세균 분리 및 증균용 배지로 사용되는 배지로 Difco (Detroit, USA)에서 구입한 marine broth 2216 (Bacto peptone \( 5.00 \mathrm{~g} \), Bacto yeast extract \( 1.00 \mathrm{~g} \), \( \mathrm{Fe} \)(III) citrate \( 0.10 \mathrm{~g}, \mathrm{NaCl} \) \( 19.45 \mathrm{~g}, \mathrm{MgCl}_{2} \) (dried) \( 5.90 \mathrm{~g}\), \(\mathrm{NaSO}_{4}\) \( 3.24 \mathrm{~g}, \mathrm{CaCl}_{2}\) \( 1.80 \) \( \mathrm{~g}\), \(\mathrm{KCl}\) \( 0.55 \mathrm{~g}\), \(\mathrm{Na}_{2}\mathrm{CO}_{3}\) \(0.16 \mathrm{~g} \), \( \mathrm{KBr}\) \( 0.08 \mathrm{~g}\) \( \mathrm{SrCl}_{2}\) \( 34.00 \mathrm{~mg} \),\( \mathrm{H}_{3} \mathrm{BO}_{3}\) \( 22.00 \mathrm{~mg} \), \(\mathrm{Na}\)-silicate \( 4.00 \mathrm{~mg}\), \(\mathrm{NaF}\) \( 2.40 \mathrm{~mg} \), \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right) \mathrm{NO}_{3}\) \( 1.60 \mathrm{~mg}, \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\) \( 8.00 \mathrm{~mg} \), Distilled water \( 1.0 \)1) 고체배지에 도말한 후 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하면서 한천분해활성에 의한 한천분해로 한천 평판 배지를 함몰시키는 균주를 선별하였다.</p> <h2>한천분해 균주의 선정 및 동정</h2> <p>한천분해능을 가진 분리 균주들을 무기염 한천배지 및 marine broth 2216 한천배지에서 배양하면서 분해능이 가장 우수한 SL-5 균주를 선별하였다. 분해균주의 동정을 위하여 \( 16 \mathrm{S} \) rDNA 염기서열분석을 실시하였다. 분석된 염기서열은 Blast를 사용하여 공시균주와 유사도를 검토하였으며, 윈도우 버전의 Clustal 프로그램 (ClustalX ver. 1.8)을 이용하여 다중염기배열 (multiple alignment)을 수행한 후 neighbor-joining method와 bootstrap method \((\mathrm{n}=1000) \)로 분석하여 계통분류학적 위치를 파악하였다.</p> <h2>한천분해 균주의 생육 및 조효소액 제조</h2> <p>Marine broth 2216 배지 \( 50 \mathrm{~ml} \)가 들어있는 \( 250 \mathrm{~ml} \) 삼각플라스크에 순수분리한 SL-5 균주를 접종한 후 shaking in-cubator를 이용하여 \( 27^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{~rpm} \)에서 진탕 배양하였다. 생육 양상을 경시적으로 관찰하면서 한천분해 효소의 활성을측정하였다. 이후 3일 배양한 후 배양액을 원심분리하여 \( \left(12000 \times g, 4^{\circ} \mathrm{C}, 10 \mathrm{~min}\right) \) 균체를 제거한 후 얻어진 상층액을 조효소액으로 사용하였다.</p>