3T3-L1 지방세포는 한국세포주은행(KCLB 10092)에서 구입하여, \(10 \% \)의 FBS와 \(1\%\)의 penicillin-streptomycin이 첨가된 DMEM 배지에서 \(37^{\circ} \mathrm{C}\)와 \(5 \% \mathrm{CO}_{2}\) 환경에서 2일 간격으로 배양액을 교체하며 배양하였다. 중국산 산사자 메탄올 추출물의 세포독성은 MTT 효소로 측정하였고, 배양된 세포와 염색된 지방의 흡광도는 각각 \(570 \mathrm{~nm}\)와 \(560 \mathrm{~nm}\)에서 측정하였다. 실험동물은 12시간 절식 후 ethyl ether로 마취하고, 심장에서 혈액을 채취하였으며, 혈청은 채혈 후 30분간 실온에서 방치한 후 \(3,000 \mathrm{rpm}\)에서 15분간 원심분리하여 분리하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>중국산 산사자 메탄올 추출물의 제조</h2> <p>중국산 산사자(Crataegus fructus)는 서울 경동시장 약재도 매상가에서 구입한 다음 분쇄하여 사용하였으며 식물표본은 식물학적 검정을 마친 후 경남과학기술대학교 생물신소재공학실험실 표본실(GNTC-001)에 보관하였다. 산사자 메탄올 추출물 \( (639 \mathrm{~g}) \)은 분쇄한 산사자 \( 2 \mathrm{~kg} \)을 메탄올 \(16 \mathrm{~l}\)에 넣고 상온에서 3회 반복 추출하여 얻은 추출액을 Watman filter paper(No. 2)로 여과한 다음 회전감압농축기(Eyela, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 감압농축하여 얻었으며 수득 율은 약 \( 32 \% \) 정도였다.</p> <h2>3T3-L1 세포 배양과 분화</h2> <p>미분화된 3T3-L1 지방세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB 10092)으로부터 분양받아 사용하였고 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS, GIBCO, Rockvile, MD, USA)과 \(1\%\)의 penicillin-streptomycin (Lonza Walkersville, Inc., Walkersville, MD, USA)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, GIBCO) 배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건으로 배양하였으며 2일마다 배양액을 교환하였다. 배양된 3T3-L1 지방세포의 \( 60 \% \)가 confluent 되었을 때 \( 0.05 \% \) trypsin과 \( 0.53 \mathrm{mM} \) ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, Sigma Co., St. Louis, MO, USA)를 처리하였고 \( 1,000 \mathrm{rpm} \)에서 5분 동안 원심 분리한 다음 \( 1 \times 10^{6} \) cell 씩 12-well plate에 분주하여 배양하였다. 3T3-L1 지방세포의 분화는 \( 10 \% \) FBS와 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), \( 0.5 \mathrm{uM} \) dexamethasone, 10 \( \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) insulin (Sigma Co., St. Louis, MO, USA)이 첨가된 DMEM 배지에서 유도하였으며 2일 후에 \( 10 \% \) FBS와 10 \( \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) insulin이 포함된 DMEM 배지로 교환하고 다시 \( 10 \% \) FBS를 포함한 DMEM 배지에서 3일 동안 배양하여 \( 80 \% \) 이상의 세포가 분화되었음을 확인하였다.</p> <h2>MTT assay</h2> <p>중국산 산사자 메탄올 추출물의 세포독성은 황색의 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma Co., St. Louis, MO, USA)가 mitochondria 효소 에 의해 불용성인 보라색의 formazan으로 변하는 반응을 이용하여 세포수의 변화를 추정하는 방법으로 확인하였다. 중국산 산사자 메탄올 추출물은 DMSO에 녹인 후 \( 200-2,000\mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) 농도로 희석한 다음 \( 0.2 \mathrm{um}\) membrane filter (Sartorius, USA)로 여과하여 사용하였다. 12-well plate에서 24시간 동안 배양된 3T3-L1 세포에 산사자 추출물을 0, 200, 400, 600, 800, 1,000, 2,000 \(\mathrm{ug} / \mathrm{ml} \)의 농도로 첨가한 후 24 간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건으로 배양한 다음 Hank's balanced salt solution에 용해시킨 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) MTT 용액을 첨가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4시간 동안 배양하였다. 배양된 3T3-L1 세포는 PBS로 세척한 다음 \( 1 \mathrm{ml}\) DMSO를 첨가한 후 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Oil-red O 염색</h2> <p>중국산 산사자 메탄올 추출물이 중성지방에 미치는 영향 은 분화된 3T3-L1 세포에 0, 200, 400, 600, 800, 1,000, 2,000 \( \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \)의 중국산 산사자 메탄올 추출물을 처리하여 48시간 동안 배양한 후 PBS로 세척한 다음 Cacodylate buffer ( \( 2 \% \) formaldehyde, \( 2.5 \% \) glutaraldehyde, \( 0.025 \% \) calcium chloride, \( 5 \% \) sucrose)로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 고정하여 조사하였다. 고정된 세포는 PBS로 세척한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 Oil-red O 염색시약 (Sigma Co., St. Louis, MO, USA)으로 염색하였다. 염색된 지방은 DMSO에 용해한 후 \( 560 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였으며 지방함량은 대조군의 흡광도 평균값에 대한 백분율로 나타내었다.</p> <h2>실험동물의 식이 및 사육</h2> <p>실험동물은 3주령의 수컷 ICR mouse를 효창사이언스 (Daegu, Korea)로부터 분양받아 2주일간 정상식이(AIN-93G)로 적응시킨 후 실험구별로 각각 6마리씩 4군으로 나누어 시험하였으며 실험식이의 조성은 Table 1과 같다. 산사자 메탄올 추출물은 \( 500 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \)과 \( 1,000 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \)의 농도로 물에 희석한 다음 \(100 \mathrm{ul}\)씩 실험구에 경구투여하였으며 대조구인 high fat \( 45 \% \mathrm{cal} \) 고지방식이군은 산사자 메탄올 추출물 대신 물을 \( 100 \mathrm{ul} \) 경구투여하였다. 각 처리구는 T0 (대조구, AIN-93G 정상식이), T1 (대조구, high fat \( 45 \% \mathrm{cal} \) 고지방식이와 물 \( 100 \mathrm{ul} \) ), T2 (실험구, high fat \( 45 \% \mathrm{cal} \) 고지방식이와 \( 500 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) 산사자 메탄올 추출물 \( 100 \mathrm{ul} \) ), T3 (실험구, high fat \( 45 \% \mathrm{cal} \) 고지방식이와 \( 1,000 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) 산사자 메탄올 추출물 \( 100 \mathrm{ul}) \)로 나누어 5주 동안 사육하였다. 식이사료와 물은 자유급식하였으며 사육실의 온도는 \( 23 \pm 2^{\circ} \mathrm{C} \), 습도는 \( 55 \pm 5 \% \)로 유지하였고 명암은 12시간 간격으로 조절하였다. 실험동물의 체중은 일주일에 한 번씩 일정한 시간에 측정하였고 식이 섭취량은 매일 일정한 시간에 식이 급여량과 식이 잔여량의 차이를 계산하여 구하였으며 음수량도 매일 일정한 시간에 식이섭취량과 동일한 방법으로 측정하였다.</p> <h2>시료채취 및 분석</h2> <p>실험동물은 12 시간 동안 절식시킨 다음 ethyl ether로 마취 하였고 채혈은 심장에서 하였으며 혈청은 채혈한 혈액을 실온에서 30분간 방치한 후 \( 3,000 \mathrm{rpm} \) 에서 15 분 동안 원심분리 하여 분리하였다. 분리한 혈청의 총 콜레스테롤과 중성지방 농도는 네오딘의학연구소(Seoul, Korea)에 의뢰하여 분석하 였다. 실험동물의 간과 신장은 채혈 후 즉시 적출하여 생리식 염수로 세척한 다음 여과지로 수분을 제거하고 무게를 측정 하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>실험동물의 증체량은 처리구별 개체 체중으로 비교하였으며 사료섭취량은 처리구별 개체 섭취량의 평균값으로 비교하였다. 실험결과의 평균값과 표준오차는 SAS (Statistical analysis system, USA) program을 사용하여 구하였고 Duncan's 다 중검정법으로 \( 5 \% \) 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.</p>