EH는 다양한 원핵/진핵 세포에서 발견되는 효소로, 에폭사이드 기질을 diol로 가수분해하여 광학활성 에폭사이드를 제조하는 공정에 이용될 수 있다. 광학활성 에폭사이드는 분자구조에 있는 epoxide ring의 반응성이 우수하여 고부가가치 중간체로 널리 사용되고 있으며, EH를 이용한 광학활성 에폭사이드 제조공정에서는 whole cell 자체를 생촉매로 사용하는 경우 기화학적 방법과 비교하여 생산량이 향상되고, 입증기술의 개발이 용이하다는 장점이 있다.
<h1>서 론</h1> <p>Epoxide hydrolase (EH, EC3.3.2.3)는 에폭사이드 기질을 diol로 가수분해시키는 효소로써 박테리아, 호모, 곰팡이, 동 물, 식물 등의 원핵세포나 진핵세포에서 다양하게 발견되고 있다. 미생물 유래의 EH 는 라세믹 에폭사이드 기실로 부터 (R)- 또는 (S)-이성질체 중 한 가지 광학이성질체를 입체선택적으로 가수분해시켜 제거시킴으로서 광학적으로 순수한 에폭사이드를 제조하는 공정에 이용할 수 있는 효소로 평가되고 있어 최근 많은 연구의 대상이 되고 있다.</p> <p>광학활성 에폭사이드(enantiopure epoxide)는 분자구조에 있는 epoxide ring의 반응성이 우수하여 고부가가치 광학활성 중간체로서 광학활성 의약품, 농약 및 기능성 식품 합성용 중간체로 널리 사용되고 있다. EH를 이용한 광학활성에폭사이드 제조공정에 있어서, EH활성이 우수한 whole cell 자체를 생촉매로 사용하는 경우 전체 단백질 대비 EH발현양이 적어 생산성 향상에 제한이 있으며, 효소를 분리하여 사용하는 경우 대량배양으로 인한 단백질 분리에 어려운점이 많고, 시간적으로나 비용적인 면에서 많은 불편이 따른다. 이러한 점들을 고려할 때 고효율로 EH를 발현할 수 있는재조합 생촉매(recombinant biocatalyst)를 개발하므로서 광학활성 에폭사이드 생산 공정에서 경제성 향상에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대할 수 있다. 이미 보고 된 연구개발 결과를 분석해보면, wild type Rhodotorula glutinis 대비 R. glutinis EH를 Pichia pastoris에 overexpression 시켰을 경우, activity가 \( 7 \sim \ 10 \)배가량 상승했으며, (R)-형, (S)-형이 혼합되어 있는 라세믹 styrene oxide \( 500 \mathrm { mM } \) 의 높은 초기농도에서 전체대비 \( 40 \% \) 이상(이론수율 \( 50 \% \)) 의 순수한 (S)-styrene oxide \( (99 \%>\) ee \( ) \) 를 얻을 수 있었다. 그러나 P. pastoris의 경우 염색체 DNA에 EH 단백질이 상동성 재조합되어 재조합 유전자의 안정성과 숙주세포의 유기용매 저항성 등이 좋았으나 외래유전자를 1개 또는 몇 개밖에 재조합시키지 못하므로 발현시킨 단백질의 양은 SDS-PAGE 상에서 확인이 곤란할 정도였다. Visser 등은 R . glutinis의 epoxide hydrolase를 pKK223-3 vector에 cloning하여, 재조합 단백질 발현용 숙주로 널리 사용되는 Escherichia coli BL21(DE3)에 발현시킨 결과, wild type 대비 1.7배의 활성을 보였으며, SDS-PAGE 상에서 발현을 확인할 수 없을 정도였다고 보고하였다. 또한 저자들이 E. coli BL21(DE3)을 이용하여 Aspergillus niger EH 유전자를 발현하였을 때, EH 단백질 발현 효율이 매우 낮았으나, codon usage를 고려한 E. coli 숙주세포를 사용하여 발현시켰을 경우 라세믹 styrene oxide \( 20 \mathrm { mM } \) 에 대하여 생촉매량 \( 10 \mathrm { mg } \mathrm { dcw } / \mathrm { ml } \) 에서 약 14 분 정도의 반응을 통해 \( 30 \% \) 정도(이론수율 \( = 50 \% \)) 의 높은 수율로 광학순도 \( 99 \% \) 이상인 (S)-styrene oxide을 얻을 수 있었다. R. glutinis의 경우에도 발현효율이 낮은 이유로 고려할 수 있는 것 중 효모 인 R. glutinis와 박테리아인 E. coli의 codon usage 선호도의 차이를 들 수 있다. R. glutinis의 EH 유전자에서는 많이 사용 되나 E. coli에서는 거의 사용되지 않는 codon들로는, CGG (Arg), CGA(Arg), GGA(Gly), CCC(Pro), CCT(Pro) 등이 있 으며 이 codon들은 E. coli에서는 \(0.3 \sim \ 0.8 \ % \) 정도밖에 사용되지 않는다. 따라서 위의 codon들에 대한 tRNA 유전자 plasmid를 가지는 숙주세포를 사용하므로서 목적 단백질의 발현을 고효율로 유도할 수 있을 것이다.</p>