S epidermidis의 증식 단계에 따른 urease 활성을 측정한 결과 지수증식기 후반에서 효소의 활성이 최고조에 달하며, 배지 중 nickel 농도에 따른 urease 활성의 변화를 측정한 결과 \( 50 \mu \mathrm{M} \) 이상의 nickel 농도에서 최대로 비활성화 되었다. S epidermidis 조추출물은 DEAE-Sepharose, Phenyl-Sepharose, Mono-Q 및 Superdexcolumn에 순차적으로 적용하여 urease를 정제하였으며, 최종 정제된 S epidermidis urease의 비활성은 \( 993.8 \mathrm{U} / \mathrm{mg} \)으로 조추출물에 비해 1,127배 정제된 것으로 나타났다. 정제된 urease 시료에 대하여 native gel 전기영동을 실시하고 기질인 urea 및 cresol red를 사용하여 활성 염색을 실시한 결과, urease 활성에 기인한 2개의 진홍색 펩타이드 밴드가 나타났으며, 상대 이동성을 측정하고 천연분자량을 산출한 결과, Sepidermidis urease의 천연분자량은 약 255\( \mathrm{Kd} \) 인 것으로 나타났다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>증식단계 및 Nickel ion이 urease 활성에 미치는 영향</h2> <p>세균 유래의 urease는 보통 지수증식기 후반에서 정상증식기에 걸쳐 가장 많이 발현되는 것으로 알려져 있다. S. epidermidis의 증식 단계에 따른 urease 활성을 측정·비교하기 위하여, TSB 배양액을 시간 별로 분취하여 urease 효소의 비활성(specific activity)을 측정, 비교하여 본 결과, 역시 지수증식기 후반에서 효소의 활성이 최고조에 달하는 것으로 나타났다.</p> <p>Urease는 그 활성 부위에 전이 금속인 nickel을 함유하고 있다. LB나 TSB와 같은 고영양 액체 배지에는 금속 이온을 착화합물화시키는 성분이 있으므로 nickel 의존적인 효소의 활성을 위해서는 별도로 nickel을 첨가해줄 필요가 있다. 따라서 배지 중 nickel 농도에 따른 urease 활성의 변화를 측정해 본 결과, \( 50 \mu \mathrm{M} \) 이상의 nickel 농도에서 비활성이 최대가 됨을 관찰하였다.</p> <h2>Urease 단백질의 분리·정제 및 nickel 함량</h2> <p>앞에서 기술한 방법에 따라 제조한 S. epidermidis 조추출물은 DEAE-Sepharose, Phenyl-Sepharose, Mono-Q 및 Superdexcolumn에 순차적으로 적용하여 urease를 정제하였다. DEAE-Sepharose 수지에 흡착된 S. epidermidis urease는 \( 0.57 \mathrm{M} \)의 \( \mathrm{KCl} \)농도에서 용출되었으며, 보다 강한 음이온 교환 수지인 Mono-Q column의 경우에는 \( 0.45 \mathrm{M} \)의 \( \mathrm{KCl} \)농도에서 용출되었다. \( 2 \mathrm{M} \mathrm{KCl} \)농도에서 Phenyl-Sepharose column에 홉착되었던 urease는 \( 0 \mathrm{M} \mathrm{KCl} \) step gradient에서 용출되었으나, 정제 효과는 그리 크지 않은 것으로 나타났다. 각 단계별 정제 결과는 Table 1에 요약된 바와 같고, 최종 정제된 S. epidermidis urease의 비활성은 \( 993.8 \mathrm{U} / \mathrm{mg} \) 으로서 조추출물에 비하여 1,127배 정제된 것으로 나타났다. 정제 단계별 urease 시료에 대하여 \( 15 \% \) SDS-polyacrylamide gel 전기 영동을 시행한 결과, 최종 단계인 Superdex HR-200 크로마토그라표에서 얻은 urease 시료는 urease subunit로 추정되는 67, 16.1 및 \( 12.7 \mathrm{Kd} \) 크기의 펩타이드 외에도 44.5 및 \( 24 \mathrm{Kd} \) 크기의 펩타이드 밴드가 관찰되었다. 기 발표된 DNA 염기서열을 근거로 예상된 S. epidermidis urease의 3개 subunit 분자량은 각각 62,085 (UreC), 14,916 (UreB) 및 11,792 (UreA) dalton이므로 위의 \(44.5\) 및 \( 24 \mathrm{Kd} \) 펩타이드는 정제 과정 중의 불순물로 추정된다. 한편, ICP-mass spectrophotometer로 측정한 결과 정제된 S. epidermidis urease는 catalytic unit당 2.2개의 nickel 이온을 함유하고 있는 것으로 나타났으며 이는 기타 세균 유래의 효소의 특성과 일치하는 것이다.</p> <h2>Native gel 전기 영동, 활성 염색 및 효소 Subunit의 확인</h2> <p>정제된 urease 시료에 대하여 앞에서 기술한 방법에 따라 native gel 전기영동을 실시하고 기질인 urea 및 cresol red를 사용하여 활성 염색을 실시한 결과, urease 활성에 기인한 2개의 진홍색 펩타이드 밴드가 나타났다. 이 활성 밴드를 잘라내어 다시 \( 15 \% \) SDS-polyacrylamide gel에 적용하여 전가영동을 실시하고 silver 염색한 결과, 전항에서 관찰된 67, 16.1 및 \( 12.7 \mathrm{Kd} \) 크기의 펩타이드 밴드로 구별되어 이들이 각각 진정 urease subunit를 구성하는 UreC, UreB 및 UreA 펩타이드임을 확인할 수 있었다.</p> <h2>천연분자량 및 \( K_{\mathrm{m}} \) 의 측정</h2> <p>정제된 urease 시료를 표준분자량 물질과 함께 동일한 조건 하에 Superose 6 HR 10/30 gel filtration column에 적용하여 상대 이동성 \( \left(K_{\mathrm{av}}\right) \)을 측정하고, 이로부터 천연분자량을 산출한 결과, S. epidermidis urease의 천연분자량은 약 \(255 \mathrm{Kd} \) 인 것으로 나타났다. 이 결과는 S. epidermidis urease의 (UreA-UreB-UreC) catalytic unit의 예상분자량 88,793을 기준으로 판정할 때 약 3개의 catalytic unit로 구성된 3량체로 존재하는 것을 암시하며 기존의 타 세균 유래의 urease효소의 X-선 결정구조 분석의 결과들과도 일치하는 것이다. 한편, Lineweaver-Burk 법에 따라 산출한 S. epidermidis urease의 Michaelis 상수 값은 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{pH} \) 7.0에서 \( 8.5 \pm 0.7 \mathrm{mM} \)로 나타났고, 이는 같은 coagulase-음성 포도상구균이며 요로감염증 원인 병원균인 Staphylococcus saphrophyticus urease의 \( K_{\mathrm{m}} \) 값 \( 9.5 \mathrm{mM} \)과 비교되는 수치이다. 그러나, 이 세균이 보통으로 처하게 될 생리적인 환경에서의 이러한 \( K_{\mathrm{m}} \) 값이 가지는 의미는 분명치 않다.</p>