신장암세포주로 Caki, 뇌종양세포로 T98G, 유방암세포인 MDA231와 TRAIL과 cyclohexamide 약재를 사용하여 실험하였다. FACScan flow cytometer을 이용해 염색된 세포를 Flow cytometry analysis 하였으며, Western blotting으로 단백질의 발현을 알아보았다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포 배양 및 시약</h2> <p>본 연구에 사용한 신장암세포주인 Caki, 뇌종양세포인 T98G, 유방암세포인 MDA231세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. 세포주 배양을 위한 배지는 \( 10 \% \) 태아우혈청(fetal bo-vine serum, Hyclone laboratories, Lagan, Utah, USA)과 \( 1\%\) Antibiotics, \( 0.2 \% \) Gentamycin을 첨가한 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco BRL, Grand Island, NY)을 사용하였으며 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지되는 \( 5 \% ~\mathrm{CO}_{2} \) 배양기를 이용하여 배양하였다. 실험에 사용된 약제인 TRAIL과 cyclohexamide는 Sigma (St. Louis, MO, USA), anti-FAS는 Millipore (Bedford, MA), TNF-\(\alpha\) 는 R&D Systems (Minneapolis, MN)에서 구입하였다.</p> <h2>Flow cytometry analysis</h2> <p>\( 1 \times 10^{6} \)개의 세포를 \( 100 \mu \mathrm{l} \)의 PBS를 넣어 잘 풀어준 후, \( 200 \mu\mathrm{l} \)의 \(95\%\) ethanol 을 vortex하면서 조심스럽게 넣어준다. 세포를 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 고정한 후, PBS로 씻어준다. 세포에 \( 250 \mu \mathrm{l} \)의 \( 1.12 \% \) sodium citrate buffer \( (\mathrm{pH} \) 8.4)에 \( 12.5 \mu \mathrm{g} \) RNase가 녹아있는 용액을 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 배양하였다. 30분이 지난 후 그 용액에 \( 250 \mu \mathrm{l} \) propidium iodide \( (50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)을 넣어 30분간 RT에서 DNA를 염색하였다. 염색된 세포를 FACScan flow cytometer (E5464, Becton Dickinson, USA)를 이용하여 측정하였다.</p> <h2>Western Blotting</h2> <p>단백질의 발현을 알아보기 위해서 Western blotting을 실시하였다. 세포를 \( 0.4 \times 10^{6} \) cells/well로 12시간 배양 후에, FBS를 첨가하지 않은 무혈청 배지로 교체하여 시약을 처리하여 배양 후, 세포를 모아 \( 32 \mu \mathrm{l}\) lysis buffer \( 137 \mathrm{mM} ~ \mathrm{NaCl}\), \( 15 \mathrm{mM} \) EGTA, \( 0.1 \mathrm{mM} \) sodium orthovanadate, \( 15 \mathrm{mM} ~\mathrm{MgCl}_{2}\), \(0.1 \% \) Triton X-100, \( 25 \mathrm{mM} \) MOPS, \( 100 \mathrm{mM} \) phenylmethylsulfonyl fluoride, and \( 20 \mathrm{mM} \) leupeptin, \( \mathrm{pH} \) 7.2)를 첨가하고 5분 간격으로 15초 동안 3번 vortex하여 세포를 파쇄한 후 \( 13,000 \mathrm{rpm} \), \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C},\) 15분간 원심 분리하여 시료를 준비하였다. 시료는 \(562 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하여 단백질을 정량하였으며, \( 10 \% \) sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)에서 단백질을 분리한 후, immobilon membrane(Milipore, Bedford, MA)으로 transfer하였다. Membrane은 \( 5 \% \) milk/TBST (\( 20 \mathrm{mM} \) Tris-HCL, \( 137 \mathrm{mM}~ \mathrm{NaCl}\), \(0.1 \% \) Tween 20, \(\mathrm{pH} \) 7.4)로 실온에서 1시간 유지한 후, PARP (Santa Cruz, CA, USA)와 actin (Sigma, Louis, MO)을 희석한 \(5\%\) milk/TBST로 실온에서 12시간 유지하였다. Anti-mouse 또는 rabbit Ig horseradish peroxidase/TBST (Amersham Buckinghamshire, England)로 1시간 반응 후 Enhanced Chemiluminoscence (ECL, Pierce, IL, USA)용액을 가하여 발색시켜서 단백질을 확인하였다.</p>