본 연구는 APPsw 알츠하이머 질환 생쥐모델, 비교군 모델, 그리고 16주 실험처치 모델들 간의 인지능력 차이를 비교하기 위해 생쥐수영능력을 평가할 수 있는 행동실험을 수행하였다. 더 나아가서, SDS-PAGE 및 Western blot analysis를 이용하여 각 모델들의 알츠하이머 관련 단백질을 정량화하였다. 구체적으로 Bio-Rad ChemiDoc XRS 시스템을 통해 A\(\beta\)-42, BDNF, GLUT-1, HSP-70 단백질량을 정량화하였으며, SDS-PAGE에 각 단백질을 분주한 후 전기영동을 수행하였다. APPsw 알츠하이머 질환 모델생쥐와 non-Tg의 유영거리, 유영속도, 유영시간의 차이를 판단하기 위해 독립 t-검증을 수행하였으며, 16주간 인지능력 개선결과가 있었는지 확인하기 위해 일원 변량분석과 LSD 검증을 수행하였다. 추가적으로 이원변량분석을 통해 분자표현형 단백질 수준에서 운동집단 간 또는 운동수행여부 간의 차이를 확인하였다.
<h2>SDS-PAGE</h2><p>\( 10 \% \)와 \( 16.5 \% \) separating gel \( (30 \% \) acrylamide: bisacryla-mide, \( 1.5 \mathrm{M} \) tris \( \mathrm{pH} 8.8\), \(10 \% \) SDS, TEMED, \( 10 \% \) ammonium persulfate)과 \(5\%\) stacking gel ( \( 30 \% \) acryiamide: bisa-crylamide, \( 1 \mathrm{M} \) tris \( \mathrm{pH} 6.8\), \(10\%\) SDS, TEMED, \( 10 \% \) ammonium persulfate)을 만들어 사용하였다. 원심분리(\( 15,000\mathrm{rpm},\) 20분)한 상충액과 SDS loading buffer (\( 60\mathrm{mM} \) tris \( \mathrm{pH} 6.8\), \(25\%\) glycerol, \(2\%\) SDS, \( 14.4 \mathrm{mM} \) 2-mercapto ethanol, \( 0.1 \% \) Bromophenol Blue를 잘 혼합한 후 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10 분간 꿇여 단백질을 변성시킨 후 식혀서 다시 \( 15,000 \mathrm{rpm} \)으로 20분간, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 원심분리하였다. Standard marker (SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Bio-Rad)와 함께 각 샘플을 Mini-Protein Ⅱ dual-slab apparatus (Bio-Rad, USA)에 준비된 stacking gel well과 동일한 총 단백질량 \( (50 \mu \mathrm{g}) \)이 되도록 분주한 후 \(80 \mathrm{volt}\)에서 2시간 정도 샘플이 바닥에 닿을 때까지 전기 영동하였다.</p><h2>Western blot analysis</h2><p>Transfer buffer ( \( 190 \mathrm{mM} \) glycine, \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-base, \( 0.05 \% \) SDS, \(20\%\) methanol)에 적신 PVDF membrane (Immuno Blot PVDF membrane, Bio-Rad, CA, USA), Whatman \( 3 \mathrm{M} \) paper, 전기영동한 젤, PVDF membrane을 차례로 겁처 Mini trans-blot cell (Bio-Rad, CA, USA)에 장치한 후 \(40 \mathrm{volt}\)로 2시간 전사시켰다. Membrane으로 증착이 끝나면 shaker platform위에서 1시간 동안 membrane을 \(5\%\) skim milk 용액(in TNT: \( 10 \mathrm{mM} \) Tris-base \( \mathrm{pH} 8.0\), \(150 \mathrm{mM} \ \mathrm{NaCl}\), \(0.05 \% \) Tween-20)으로 blocking시켰다. 1차 항체인 anti-BDNF(Santa Cruz Biotechnology, sc-546, CA, USA), anti-GLUT-1(Santa Cruz Biotechnology, sc-7903, CA, USA), anti-HSP70(Santa Cruz Biotechnology, sc-24, CA, USA)와 anti-A\( \beta\)-42(Chemicon, MAB1561, MS, USA)는 \(1:1,000\)으로 blocking (\(5\%\) skim milk) 용액으로 각각 희석시켜 1시간 반 동안 흔들어 주고 난 다음 TNT 용액으로 10분씩 3차례 세척한 후 2차 항체(horseradish peroxidase -conjugated goat anti-rabbit ZYMED, 65-6120, CA, USA; horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse, Santa Cruz Biotechnology, sc-2005, CA,USA )를 Blocking 용액으로 \(1:3,000\)으로 희석시켜 1시간 동안 흔들어 주고 난 다음 TNT 용액으로 10분씩 3차례 세척하였다. 마지막 단계로 ECL substrate 용액(Santa Cruz, Biotechnology, USA)에 membrane을 넣고 5분간 발색시키고 얻어진 membrane을 Bio-Rad ChemiDoc XRS 시스템을 활용하여 A\(\beta\)-42, BDNF, GLUT-1 과 HSP-70 단백질량을 산출하였으며 총 단백질량은 BSA (bovine serum albumin, \( 570 \mathrm{~nm} \) )을 이용하여 정량하였다.</p><h2>자료 처리 방법</h2><p>이 연구에서 얻어진 모든 자료는 윈도우용 11.0 SPSS 통계 프로그램을 이용하여 기술 통계치 \( ( \) mean \( \pm \) SD)를 산출하였다. 실험처치 전 APPsw 알츠하이머 질환 모델생쥐와 non-Tg의 인지능력[유영거리(escape distance), 유영속도(escape velocity ), 유영시간(escape latency)]의 차이를 검증하기 위하여 독립 t-검증(independent t-test)을 실시하였으며 16주간 실험처치 후 인지능력의 개선 효과가 있는지를 검증하기 위해 일원 변량분석을 실시하였으며 분석결과 유의한 차이가 있을 경우 LSD (least significant difference) 검증을 실시하였다. 나머지 분자표현형 단백질의 경우 운동집단(non-Tg와 Tg)간 및 조건(운동수행여부)간에 따른 차이가 있는지를 검증하기 위해 이원변량분석(집단\(\times\)운동수행여부)을 실시하였으며 상호작용 효과가 있을 경우 그 차이를 구체적으로 확인하기 위하여 독립 t-검증을 실시하였다. 이때, 가설 수락기준은 \( a=0.05 \)로 설정하였다.</p>