실험을 위해 눈꽃 동충하초 균사체를 분양 받고 야산에서 야생 뽕잎을 채취하였다. 세포주는 B16BL6 mouse melanoma cell을 분양 받고, 우태아 혈청과 배양용 배지를 준비하였다. 뽕잎 추출물에 동충하초 균사체를 배양해 배양액을 제조하였다. potato dextrose 배지에서 \(7\)일간 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양한 눈꽃 동충하초 균사체를 사용하였다. 배양액은 원심분리 후 상등액을 여과하여 얻고 각종 활성실험에 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료 및 기기</h2> <p>본 실험에 사용된 버섯 균사체는 경남농업기술원으로부터 분양받은 눈꽃 동충하초(Paecilomyces japonica) 균사체를 사용하였으며, 뽕잎은 경남 함양군 안의면 일대의 야산에서 서식하는 야생 뼝 잎을 채취하여 사용하였다. 세포주인 B16BL6 mouse melanoma cell (No. 80006)은 한국 세포주 은행으로부터 분양받아 사용하였으며, 우태아 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)은 Gibco 사의 것을, 배양용 배지(Minimum Essential Medium. MEM)는 Sigma 사의 것을 사용하였다.</p> <p>UV-Vis spectrophotometer는 Ultrospec 2000 (Pharmacia Biotec, Swiss)을 사용하였고, melanin 생합성 측정은 ELISA reader (Synergy \( { }^{\text {TM }} \) HT. Bio-tek, USA)를 사용하여 \( 490 \mathrm{~nm} \) 파장에서 흡광도로 측정하였다. 기타 활성 측정 및 분석에 사용된 시약은 특급시약을 사용하였다.</p> <h2>뽕잎 추출물에 동충하초 균사체 배양액 제조</h2> <p>뽕잎 추출물에 동충하초 균사체 배양을 위하여, potato dextrose agar (PDA. Difco, USA) 배지에서 7일간 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 정치 배양한 눈꽃 동충하초 균사체를 사용하였다. 뽕잎 추출액은 천연재료인 야생뽕잎을 흐르는 물에 3 번 수세한 후, 다시 증류수에 최종 수세하여 착즙기(3-8-3626. Green power, Korea) 로 추출 하였다. 이 추출물을 멸균증류수와 \( 1: 1 \) (v/v) 로 혼합하고, 약 \( 0.5 \mathrm{~cm} \) 크기의 정사면체 감자 조각을 \( 2 \% \) 되게 첨가하여 동충하초 균사체 액체 배양용 배지를 제조하였다. 그 후 전 배양한 동충하초 균사체 \( 1 / 2 \) plate를 \( 1 \mathrm{~L} \) 액체배지에 접종하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 120 \mathrm{rpm} \) 의 조건으로 15 일간 진탕배양 하였다. 배양이 완료된 동충하초 균사체 배양액을 회수하여 \( 13,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심분리 후 상등액을 \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) syringe filter (Sartorius, Germany)로 여과하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하며 각종 활성실험에 사용하였다.</p> <h2>세포 배양 및 수확</h2> <p>B16BL6 mouse melanoma cell (No. 80006)은 \( \mathrm{CO}_{2} \) 세포배양기 \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2}\right) \) 에서 \( 10 \% \) fetal bovine serum (Gibco. Co.)이 포함된 MEM 배지를 사용하여 배양하였다. 여기에 penicillin-streptomycin (Sigma Chemical Co., USA) 100 I.U.-100 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 를 첨가하였으며, 약 24 시간 주기로 MEM 배지를 표체하였다. 세포 수확에 있어서는 trypsin-EDTA(Gibco. Co.)를 cell이 부착되어 있는 dish에 5분간 처리한 후 trypsin-EDTA를 완전히 제거하고, MEM 배지를 이용하여 수확하는 방법을 사용하였다.</p>