본 연구에서는 단백질 가수분해 효소인 alcalase 이용하여 해마 단백질을 가수분해하고 이를 원심분리한 후 상층액을 취하여 해마 단백질 유래 효소 가수분해물(ALC)를 얻었다. 그리고 MTT assay를 이용하여 ALC의 에탄올 독성 억제효과를 측정하여 에탄올에 의해 생긴 간 손상에 대한 보호 효과를 확인하고자 하였다.
<p>따라서 본 연구에서는 해마를 효소를 이용하여 해마 단백질 을 가수분해하고 그렇게 얻은 해마 단백질 유래 효소 가수분해 물의 에탄올에 의해 유도된 간 손상 보호 효과를 확인하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>해마 단백질 유래 효소가수분해물(ALC) 제조</h2> <p>해마 원료에 단백질 가수분해 효소인 alcalase (Novozymes, Denmark)를 이용하여 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) \( \mathrm { pH } \) \(8.0 \) 조건 하에 24 시간 동안 가수분해를 진행하였다. 가수분해 후 \( 3,000 \times \mathrm { g } \) 에서 20 분간 원심분리 한 후 잔사를 제거한 상층액을 취하여 이를 해마 단백 질 유래 효소가수분해물 \( ( \mathrm { ALC } ) \) 로 사용하였다.</p> <h2>세포주 배양</h2> <p>본 실험에서 사용한 normal liver cell line인 Chang 세포는 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS)와 \( 1 \% \) penicillin/streptomycin \( ( \mathrm { P } / \mathrm { S } ) \) 이 첨가된 Roswell Park Memorial Institute medium을 이 용하여 배양하였고, 간암세포주 Huh7은 \( 10 \% \mathrm { FBS } \) 와 \( 1 \% \mathrm { P } / \mathrm { S } \) 이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium을 사용하였으 며 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에 배양하였다.</p> <h2>세포 독성 측정</h2> <p>\( \mathrm { ALC } \) 의 세포 독성은 MTT assay를 이용하여 측정하였다. Chang 세포를 \( 2.5 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { cell } / \mathrm { mL } \) 의 농도로 \( 200 \mu \mathrm { L } \) 씩 96 well plate에 분주하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 배양하였다. 분주 16 시간 후에 \( \mathrm { ALC } \) 를 농도별로 처리하여 24시간 후 MTT assay를 이용하여 세포생존율을 측정하였다. 배양액 제거 후 MTT 용액 을 4 시간 동안 처리한 다음 \( 150 \mu \mathrm { L } \mathrm { DMS } \) 에 30 분간 녹여 분 광광도계를 이용하여 \( 570 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 에탄올 독성 억제효과는 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 세포를 96 well plate에 \( 2.5 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { cell } / \mathrm { mL } \) 로 \( 200 \mu \mathrm { L } \) 씩 분주하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 16시간 배양하였다. ALC를 농도별로 1시간 전처리한 후 \( 800 \mathrm { mM } \) 의 에탄올을 첨가하고 24 시간 배양하였 다. 배양액 제거 후 MTT 용액을 4시간 동안 처리한 다음 150 \( \mu \mathrm { L } \mathrm { DMSO } \) 에 30 분간 녹여 분광광도계를 이용하여 \( 570 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p>