GMO 현미의 섭취가 대식세포의 면역증강 기능에 미치는 영향을 파악하기 위해, 대식세포가 생성하는 질산화물의 농도를 ELISA 방법을 통해 측정하였다. 대식세포를 다양한 조건으로 24시간 동안 활성화하였고, 그 후 Greiss 화학 시약을 사용하여 NO 생성도를 살펴보았다. 또한, GMO 현미 섭취 생쥐의 NK세포 활성도는 YAC-1 세포에 대한 세포독성을 통해 평가하였다. 추가로, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, INF- \( \gamma, \) TNF- \( \alpha, \) GM-CSF 등 다양한 사이토카인의 변화도 ELISA kit를 이용해 측정하였다.
<h2>면역 기능 조절 시험</h2> <p>대식세포가 면역증강효과를 나타내는 기전의 하나인 NO의 생성에 대한 GMO현미의 영향을 알아보기 위하여 배양 상등액 중의 NO 생성도를 Green 등의 방법에 따라 측정하였다. GMO 현미를 섭취한 생쥐의 대식세포 \( \left (1 \times 10 ^ { 5 } \right . \) cells/ well)를 LPS, LPS-r-IFN, Poly IC (polyriboinosinic: poly-ribocytidylic acid) 등으로 24시간 동안 활성화시킨 후 배양 상등액 \( 100 \mu \mathrm { l } \) 를 취하여 \( 100 \mu \mathrm { l } \) Griess reagent \( (0.1 \% \) naph-thylethyenediamine dihydrochlorides \( 1 \% \) sulfanilamide in \( 5 \% \) phosphoric acid)를 가하고 혼합한 후, ELISA reader (Quantikine Immunoassays from R \&D systems, USA)로 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다. NO의 농도는 \( \mathrm { NaNO } _ { 2 } \) 를 사용하여 작성된 표준곡선으로부터 환산하였다. GMO 현미를 섭취한 생쥐의 혈청을 채취하여 혈청내의 IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, INF- \( \gamma, \) TNF- \( \alpha, \) GM-CSF 등을 포함하는 다양한 cytokine들의 변화를 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. Goat anti-human IL-2, goat anti-human IL-4, goat anti-human IL-6, goat anti-human IL-8, goat anti-human INF- \( \gamma \), goat anti-human TNF- \( \alpha \), goat anti-human GM-CSF를 PBS (Phosphate buffered saline)로 희석하여 flat-bottomed 96 well plate에 분주 한 후 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) overnight 배양한 후 \( 1 \% \) skim milk로 30분 동안 상온에서 blocking한다. Plate를 PBS로 세척한 후 PBS로 희석된 혈청 시료를 plate에 가하여 1시간 동안 반응시키고 세척한 후 alkaline phosphatase-conjugated second antibody (AP-goat anti-human IgG)를 \(1:1,000 \)으로 희석하여 첨가하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2시간 반응시켰다. Substrate인 p-nitro-phenyl phosphate를 넣은 후 ELISA reader를 사용하여 \( 492 \mathrm { ~nm } \) 에서 OD를 측정하였다. Phagocytic activity 측정은 Okimura 등의 zymosan particle 도입방법을 이용하여 측정하였다. 96 well plate에 GMO 현미를 섭취한 생쥐의 대식세포를 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well의 농도로 넣고 zymosan을 \( 5 \times 10 ^ { 6 } \) particels \( / \mathrm { ml } \) 이 되도록 가한 후 \( 0.6 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \mathrm { NBT } \) 를 가하고 1시간 동안 배양한다. 냉각된 N-ethylmaleimide의 생리식염수 용액으로 2회 세척한 후 생성된 formazan을 DMSO (dimethyl sulfoxide)로 녹인 다음 ELISA reader로 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다. NK세포의 활성도 측정을 위해서는 NK세포에 대해 감수성을 지닌 YAC-1 세포를 사용하여 이에 대한 cytotoxicity로 조사하였다. GMO 현미를 섭취한 생쥐와 사료만 섭취한 생쥐의 비장을 각각 분리하여 96 well plate에 \( 5 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well의 농도로 넣은 후 YAC-1 세포를 target cell로 하여 \(25:1 \)의 비율로 넣고, 20시간 동안 배양하였다. 세포 증식을 알아보기 위해 \( 25 \mu ~ \mathrm { MTT } (2 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \)를 가하고 4시간 동안 더 배양한 후 측정하였다.</p>