BS분말을 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 비율과 \(0.9\%, \mathrm{w} / \mathrm{v}\) 용량으로 증류수를 첨가하여, 압력추출기를 사용하여 \(1.2-1.5 \mathrm{kgf} / \mathrm{cm}^{2}\)의 압력을 유지하며 \(100^{\circ} \mathrm{C}\)에서 3시간 추출한 후, 여과지(Whatman, No. 2)로 여과하고 로터리 증발기를 이용해 감압농축하였다. 세포 배양은 \(37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5\% \mathrm{CO}_{2}\) 조건에서 진행하였다. MTT를 이용한 실험법에서는 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 \(1 \times 10^{4}\) cells/well의 밀도로 분주하고, BS 추출물을 농도별로 \(0,50,100,200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\)처리하여 18시간 동안 배양한 후 MTT가 formazan으로 전환되는 것을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>Bulnesia sarmienti (BS) 열수추출물의 준비</h2> <p>본 실험에 사용된 BS는 (주)베타존코리아(Daegu, korea)에서 건조분말형태로 공급받아 사용하였다. BS분말 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) \( (0.9 \%, \mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 비율로 증류수를 가하여 압력추출기(HD07043-1001B, 경서기계산업, 인천)로 \( 1.2-1.5 \mathrm{kgf} / \mathrm{cm}^{2} \)의 자동조절상태를 유지하면서 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 동안 추출후 여과지(Whatman, No.2)로 여과하여 Rotary evaporator로 감압농축 하였다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>마우스의 대식세포주인 RAW 264.7세포는 한국세포주은행 (KCLB)에서 분양받았으며, 세포배양을 위해 \( 10 \% \) FBS과 \( 1 \% \) penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)배지를 사용하였다. 세포는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 배양하였다.</p> <h2>MTT assay</h2> <p>BS추출물의 세포에 대한 독성 측정은 MTT (3-(4,5-dime-thylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) (Sigma, MO, USA) 측정으로 분석하였다. 이 방법은 MTT가 formazan 으로 전환되는 것을 측정하는 것으로, 96 well plate에 \( 1 \times 10^{4} \)cells/well의 RAW 264.7 세포를 분주하고 BS 추출물을 농도별 \( (0,50,100,200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)로 18시간 동안 처리하였다. Well 당 \( 100 \mu 1 \)의 MTT용액을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 4시간 동안 반응시킨 후, microplate reader (VERSAmax, Molecular Devices, USA)를 이용하여 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다. BS추출물의 각 농도별 흡광도는 세포를 뺀 배지를 같이 배양하여 대조군과 실험군의 흡광도를 비교해서 보정하였다.</p> <h2>Nitric Oxide 생성량 측정</h2> <p>NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 Nitric Oxide de-tection kit (Assay Designs, Michigan, USA)를 이용하여 측정하였다. RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 \( 1.5 \times 10^{5} \) cells/ml로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 항온기에서 18시간 전배양하였다. 세포에 \( 0,50,100,200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 BS 추출물을 전처리하고 1시간 후 \( 100 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \)의 LPS를 처리하여 18시간 배양하였다. 배양액을 원심분리(\(12,000 \mathrm{rpm}\), 3분)하여 상층액을 얻은 후 반응 시킨 후 ELISA reader로 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 sodium nitrite의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액 내의 NO를 정량하였다.</p> <h2>Prostaglandin \( \mathrm{E}_{2} \) 생성량 측정</h2> <p>세포배양액 내의 \( \mathrm{PGE}_{2} \) 및 총 COX의 생성량은 \( \mathrm{PGE}_{2} \)와 COX 각각의 ELISA kit (Assay Designs, Michigan, USA)를 이용하여 측정하였다. RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 \( 1.5 \times 10^{5} \) \(\mathrm{cells/ml} \)로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, \( 5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2} \) 항온기에서 18시간 전배양하였다. 세포에 \( 0, 50, 100, 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 BS 추출물을 전처리하고 1시간 후 \( 100 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \)의 LPS를 처리하여 18시간 배양하였다. 배양배지를 원심분리하여 상층액에서 \(\mathrm{PGE}_{2} \) 및 COX를 분석하였다.</p> <h2>염증성 사이토카인 \( (\mathrm{IL}-1 \beta, \mathrm{IL}-6, \mathrm{TNF}-\alpha) \) 측정</h2> <p>세포배양액 내의 \(\mathrm{IL}-1 \beta\), TNF-\(\alpha\) 활성도 특정은 Assay Desings (Michigan, USA)사의 \(\mathrm{IL}-6\)의 측정은 BD Biosciences(San Jose, USA)사의 ESLISA kit를 사용하였다. 세포에 \(0, 50, 100, 200 \mathrm{ug/ml}\)의 BS추출물을 처리하고 1시간 후 \( 100 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \)의 LPS를 처리하였다. 18시간 후 세포 배양액을 원심분리하여 상층액에서 \(\mathrm{IL}-1 \beta\), \(\mathrm{IL}-6\), TNF-\(\alpha\)을 측정하였다.</p> <h2>통계학적 분석</h2> <p>모든 결과는 평균 \( \pm \) 표준편차로 표시하였으며, 실험군간 분산의 동질성을 비교하기 위한 Levene's test를 실시하고 one-way analysis of variance (ANOVA)를 통해 \(95\%\) 수준 \( (P<0.05) \)에서 통계적 유의성을 검정하였다.</p>