병 관련 유전자 분석을 위해 NCBI에서 유전자를 참조하고, primer3를 이용하여 primer를 설계하였다. 각 유전자의 발현 양을 quantitative RT-PCR을 이용하여 분석하였고, 정량을 위해 표준 유전자를 serial dilution하여 qRT-PCR을 진행하였다. 분석하고자 하는 DNA 농도는 NanoDrop ND-2000을 이용하여 측정하였다. 고추 세균점무늬병의 발병 양상을 확인하기 위해 X. euvesicatoria를 접종 후 14일 뒤에 이병엽률을 확인하였다.
<h2>Quantitative RT-PCR에 의한 병 관련 유전자 분석</h2> <p>병 관련 유전자 분석을 위한 primer는 NCBI에 등록되어 있는 유전자를 참조하였으며, primer3 (http: //primer3.ut.ee/)를 이용하여 설계하였다(Table 1). 각 유전자의 발현양은 quantitative RT-PCR (Real Time-PCR)을 수행하여 분석하였다. qRT-PCR 분석을 위한 standard clone은 설계된 primer를 이용하여 PCR한 후, 각각의 PCR 산물을 All-in-one vector (Biofact, Korea)에 cloning하였으며, plasmid DNA는 HiGene \( { }^{\text {TM }} \) Plasmid Mini Prep Kit (Biofact, Korea)를 이용하여 추출하였다. 염기서열 분석은 All-in-one Vector systems manual에 따라 M13-20F와 M13-20R primer를 이용하여 분석하였고, BLAST search를 통해 확인하였다. 염기서열이 확인 된 plasmid DNA는 real-time PCR (Bio-Rad, USA)을 이용하여 melting curve 분석 후 정량분석을 위한 표준 유전자(artificial standard clone)로 사용하였다. 정량 PCR은 CFX96 Touch \( { }^{\mathrm{TM}} \) Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA)과 QuantiFast\( { }^{\circledR} \) SYBR\( ^{\circledR} \) Green PCR Kit (Qiagen, Germany)을 이용하였다. 각 유전자의 정량 PCR은 앞에서 설계한 각각의 primer를 이용하였으며 (Table 1), 반응조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 15 \mathrm{~min} \) 동안 pre-denaturation 시켜, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 30 \mathrm{sec} \) denaturation, 각 유전자 별로 \( 30 \mathrm{sec} \) annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 30 \mathrm{sec} \) extension후 fluorescence를 측정하고 45 cycles을 수행하였다. CaLRR1, CaWRKY1, CaPIK1, CaPR10유전자의 annealing 값은 각각 \( 64.2^{\circ} \mathrm{C} \), \( 64.0^{\circ} \mathrm{C}, 62.6^{\circ} \mathrm{C} \) 및 \( 62.6^{\circ} \mathrm{C} \) 이다. Final extension은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 5 \mathrm{~min} \) 동안 수행하였다. Melting curve 분석은 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 부터 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 \( 0.2^{\circ} \mathrm{C} \)씩 증가시키면서 fluorescence를 측정하였다. 정량을 위한 표준 유전자를 \( 1~ \mathrm{ng} / \mu \mathrm{l} \) 부터 serial dilution하여 qRT-PCR을 수행하였으며, 분석하고자 하는 DNA 농도는 NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific, USA)을 이용하여 \( 1~ \mathrm{ng} / \mathrm{\mu l} \)를 분석에 이용하였다.</p> <h2>발병 조사</h2> <p>\( \mathrm{CO}_{2} \) 농도에 따른 고추 세균점무늬병의 발병 양상을 확인하기 위해 X. euvesicatoria를 접종 후 14일 뒤에 이병엽률을 확인하였으며, 이병엽률은 발병엽수와 전체 엽수를 조사하여 백분율로 산출하였다. 발병도 조사는 각 잎의 병반 부위를 세어 0-4 (0; 병반 부위 없음, 1; 1-20개, 2; 21-40개, 3; 41-60개, 4; 61개 이상)로 발병 정도를 구분하여, 구분된 수의 평균값을 발병도로 정의하였다.</p>