본 연구에서는 청국장에서 분리한 B. amyloliquefaciens HC188가 생산하는 혈전분해 효소가 기존에 연구 보고된 혈전분해 효소들에 비해서 분자량이 적었으며, 본 연구에서 분리 \( \cdot \) 정제한 효소가 B. subtilis가 생산하는 혈전분해 효소인 subtilisin BPN과 subtilisin A26과는 다른 혈전분해 효소인 것으로 보였다. 청국장으로부터 분리한 미생물이 생산하는 혈전분해 효소도는 발효한 청국장이 나타내는 \( \mathrm{pH} 6.0-8.0\)에서 효소의 최대활성과 안정성을 나타내는 것으로 확인된다.
<h2>효소단백질의 분자량 측정과 fibrin zymography</h2><p>정제한 혈전분해 효소의 단일성을 확인하고 분자량을 측정하기 위하여 SDS-polyacrylamide gel과 zymography 전기영동을 수행한 결과는 Fig. 5에 나타내었다. SDS-PAGE와 zymography를 비교하여 혈전분해 효소활성이 나타난 band를 확인한 결과, 정제한 혈전분해 효소단백질의 분자량은 약 \( 22.3 \mathrm{kDa} \)으로 추정되었다. Kim 등이 정제한 혈전분해 효소의 분자량은 \( 27 \mathrm{kDa} \)으로 확인하였고, Jo 등은 메주로부터 분리한 B. amyloliquefaciens MJ5-41이 생산하는 혈전분해 효소의 분자량은 \( 27 \mathrm{kDa} \)이었다. Lee 등은 된장에서 분리한 Bacillus sp. KDO-13이 생산한 혈전분해 효소는 \( 44 \mathrm{kDa} \)이었고, Wang 등은 Douchi에서 분리정제한 혈전분해 효소는 \( 30 \mathrm{kDa} \)이었으며, Jaouadi 등은 Bacillus pumilus CBS가 생산하는 혈전분해 효소는 약 \( 34 \mathrm{kDa} \)으로 보고하였다. 이는 본 연구에서 청국장에서 분리한 B. amyloliquefaciens HC188가 생산하는 혈전분해 효소는 기존에 연구 보고된 혈전분해 효소들에 비해서 분자량이 적은 것으로 확인하였다.</p><h2>N-terminal 아미노산 서열분석</h2><p>정제한 혈전분해 효소단백질의 N-terminal 아미노산 서열은 Ala-Gln-Ser-Val-Pro-Tyr-Gly-Val-Ser-Gln-Ile-Lys-Ala-Pro-Ala로 분석되었다. Bacillus sp.가 생산하는 혈전분해 효소의 N-terminal 아미노산 서열과 비교한 결과(Table 2), 혈전분해 효소인 KA38과 B. amyloliquefaciens가 생산하는 혈전분해 효소인 NPR68의 N-terminal 아미노산 서열과는 일치하지 않은 것을 확인하였으며, B. subtilis가 생산하는 혈전분해 효소인 nattokinase의 아미노산 서열과도 일치하지 않은 것을 확인하였다. B. subtilis가 생산하는 혈전분해 효소인 subtilisin BPN과 subtilisin A26의 아미노산 서열을 비교하였을 때 각각 13개 아미노산과 10개 아미노산이 동일하여 높은 유사성(sequence homology)을 가지고 있는 것으로 나타났으나 subtilisin BPN와 subtilisin A26은 B. subtilis가 생산한 혈전분해 효소인 반면에 본 연구에서 분리 \( \cdot \) 정제한 효소는 B. amyloliquefaciens가 생산하였으며, 분자량 및 protease type 등과 비교해 볼 때 상이한 결과로 다른 혈전분해 효소인 것으로 사료되었다.</p><h2>최적반응 \( \mathrm{pH} \) 및 \( \mathrm{pH} \) 안정성</h2><p>조효소액과 정제한 효소액에 대한 \( \mathrm{pH} \)의 영향을 알아보기 위해 \( \mathrm{pH} 4.0-6.0\)은 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium acetate buffer, \( \mathrm{pH} 6.0-8.0\)은 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer, \( \mathrm{pH} 8.0-10.0\)은 \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris-HCl buffer를 사용하였다. 조효소액과 정제한 효소액 모두 \( \mathrm{pH} 8.0\)에서 최대활성을 나타내었으며(Fig. 6A), \( \mathrm{pH} 6.0-8.0 \) 사이에서 안정함을 나타내었다. 정제한 효소액은 \( \mathrm{pH} 9.0 \)에서는 활성이 \( 65 \% \) 로 급격히 감소하였다(Fig. 6B). 조효소액과 정제한 효소액의 혈전분해 활성은 산성 조건에서보다 알칼리 조건에서 비교적 높게 나타내었다. Choi 등이 분리한 Bacillus sp. DJ-2가 생산한 혈전분해 효소는 \( \mathrm{pH} 9.0 \) 에서 최대 활성을 나타낸다고 보고하였으며, Lee 등은 된장으로부터 분리한 Bacillus sp.가 생산한 혈전분해 효소는 \( \mathrm{pH} 6.0 \) 부터 효소활성이 \( 60 \% \) 이상 증가하여 \( \mathrm{pH} 8.0 \) 에서 최대활성을 나타냈으며 \( \mathrm{pH} 10.0 \) 에서는 \( 80 \% \) 이상의 효소활성이 유지되었다고 보고하였다. Yang 등은 \( \mathrm{pH} \) 가 증가할수록 혈전분해 효소활성도 증가하여 \( \mathrm{pH} 8.0\)에서 최대활성을 나타내었으며 \( \mathrm{pH} 10.0 \)에서는 \( 90 \% \) 이상 효소활성이 유지된다고 보고하였고, Kim 등이 분리한 Bacillus sp. CK 11-4 가 생산한 혈전분해 효소는 \( \mathrm{pH} 6.0 \) 이하에서는 효소활성이 낮으나 \( \mathrm{pH} 8.0\)에서 최대활성을 나타낸다고 보고하였다. 발효한 청국장의 \( \mathrm{pH} \) 가 6.0-8.0 사이를 나타내기 때문에 청국장으로부터 분리한 미생물이 생산하는 혈전분해 효소도 \( \mathrm{pH} 6.0-8.0\)에서 효소의 최대활성과 안정성을 나타내는 것으로 사료된다.</p>