RLE는 3T3-L1 지방전구세포 분화에 영향을 미치고, 600-1000 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 triglyceride 축적 억제 효과가 뚜렷하게 나타났다. 또한 RLE에 의한 세포 독성 효과는 없었다. RLE가 지방세포 분화에 영향을 미치는지 알아보기 위하여 3T3-L1 지방전구세포가 confluent 상태가 된 이후 전체 분화에 앞서 확인한 RLE에 의한 triglyceride 축적 억제 효능이 세포 독성에 의한 효능인지 확인하기 위하여 PreMix WST-1 Cell Proliferation Assay System을 사용하여 세포생존율을 확인하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>RLE의 지방세포 내 triglyceride 축적억제 효과 확인</h2> <p>RLE가 지방세포 분화에 영향을 미치는지 알아보기 위하여 3T3-L1 지방전구세포가 confluent 상태가 된 이후 전체 분화 과정 동안 \( 100-1000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도의 RLE를 함께 처리하여 지방세포 내 triglyceride 축적 정도를 확인하였다. 그 결과 RLE를 처리하지 않고 \( 0.5 \% \mathrm{DMSO} \)를 처리한 대조군의 분화 정도를 \( 100 \% \)로 하였을 때, RLE를 농도별로 처리한 실험군들의 triglyceride의 축적율이 RLE의 농도가 증가할수록 감소하였다(Fig. 2). 그러나, RLE의 농도 100-500 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서는 효과가 미미하였고, \( 600 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)부터 triglyceride 축적억제 효과가 뚜렷하게 나타나, 최고 농도인 \( 1000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서는 대조군에 비해 약 \( 84 \% \)의 triglyceride 축적억제 효능을 나타내었다. 따라서 RLE는 지방전구세포에서 지방세로로의 분화를 억제하는 효능이 높은 것으로 사료되며, 이후 실험은 triglyceride 축적 억제 효능이 뚜렷하게 나타나는 600-1000 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도의 RLE를 사용하였다.</p> <h2>RLE의 3T3-L1 세포에서의 독성확인</h2> <p>앞서 확인한 RLE에 의한 triglyceride 축적 억제 효능이 세포 독성에 의한 효능인지 확인하기 위하여 PreMix WST-1 Cell Proliferation Assay System을 사용하여 세포생존율을 확인하였다. Triglyceride 축적억제 효과가 있는 600-1000 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 RLE 농도로 세포 생존율을 확인한 결과, RLE 농도 \( 600,700,800,900 \) 그리고 \( 1000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서 각각 \( 99.5 \pm \)\( 4.74,95.6 \pm 4.64,90.35 \pm 6.63,94.06 \pm 2.97,85.59 \pm 4.03 \% \)로 측정되었다(Fig. 3). 따라서 RLE에 의한 triglyceride 축적 억제 효과는 3T3-L1에 대한 독성 효과는 아닌 것으로 사료된다.</p> <h2>RLE에 의한 지방세포 분화관련 전사인자의 발현 변화</h2> <p>지방세포의 분화는 peroxisome proliferation activated receptor gamma(\( \mathrm{PPAR} \gamma \)), CCAAT enhancer binding protein \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \) family라고 불리는 전사인자들이 중추적인 역할을 담당하며 다양한 상호작용을 통해 조절된다. 지방세포 유도 복합체인 MDI(insulin, dexamethasone, 3-isobutyl-1-methylxanthine)는 이러한 전사인자의 발현을 촉진함으로써 지방전구세포를 지방세포로 분화시킨다. 바꾸어 말하면 지방세포 분화 관련 전사인자들의 발현 저해를 통하여 지방 세포로의 분화를 억제하고 지방 축적 감소 등을 야기시킬 수 있으므로, 이는 항 비만 물질 탐색의 기작 연구에 가장 많이 쓰이는 방법 중 하나이다. 따라서, RLE에 의한 지방축적 억제 효과가 지방세포의 분화를 조절하는 전사인자들의 발현 변화와 관련되는지 알아보았다.</p> <p>\( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \)는 지방세포의 분화초기에 MDI에 의해 발현되는 단백질로 지방전구세포에 MDI와 RLE를 2일간 복합처리 한 후(Day 2) 세포를 회수하여 단백질 발현 양상을 확인한 결과 RLE를 처리한 실험군의 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \)의 발현량이 대조군 보다 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4A). 또한 \( \mathrm{PPAR} \gamma \)와 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha \)는 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \)의 자극을 받아 발현하는 단백질들로, adipogenesis에서 중요한 transcription factor로 널리 알려져 있고, 지방세포 완전분화의 지표로 사용된다. RLE에 의한 \( \mathrm{PPAR} \gamma \)와 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha \)의 발현량의 변화를 확인하기 위해, MDI와 RLE를 복합 처리하여 2일간 반응시키고, insulin과 RLE를 4일간 복합처리 한 후 단백질 발현 양상을 확인한 결과(Day 6), RLE의 농도 의존적으로 \( \mathrm{PPAR} \gamma \)와 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha \)의 발현이 감소하였다(Fig. 4B). 따라서, RLE는 지방세포의 분화 초기에 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \)의 발현을 저해시킬 뿐 아니라, 이후 분화 전체 단계에서 중요한 역할을 하는 \( \mathrm{PPAR} \gamma \) 및 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha \)의 발현 또한 저해시켜 지방세포의 분화를 억제시키는 것으로 사료된다. 즉, RLE는 지방세포의 분화를 유도하는 핵심 전사인자들의 발현을 저해하여 지방세포의 분화를 억제하는 것으로 사료된다.</p>