인체 간암세포, 직장암세포, 인체 백혈병 세포는 생명공학연구소에서 분양받아 마늘 열수 추출물에 농도별로 배양처리하여 PBS로 수회 수세 후 PI염색을 실시하였으며 염색후 DNA 대조군 및 WEAS 처리군을 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 ModiFit LT 프로그램을 사용하여 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포배양 및 마늘 열수 추출물의 처리</h2> <p>본 실험에 사용된 인체 간암세포(Hep3B 및 HepG2), 직장 암세포(HT 29 및 HCT 116) 및 인체 백혈병 세포(U937 및 HL60)는 생명공학연구소(KRIBB, Taejeon, Korea)에서 분양 받았으며, 세포의 배양을 위해 RPMI-1640 배지(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)와 \(10 \)%의 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Gibco BRL)과 \( 1 \% \) 의 penicillin-streptomycin (Gibco BRL) 등이 포함된 배지를 사용하여 \( 37 ^\circ \mathrm{C}\), \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건하에서 배양하였다. 본 실험에 사용된 마늘은 남해지역에서 생산된 것으로서 열수 추출(water extract of A. sat-ivum, WEAS)은 고온 열수농축으로 분리하여 휘발성 및 액체 성분을 모두 제거하여 3차 증류수에 \( 50 \% \)의 stock solution으로 만든 후 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \)의 여과지를 이용하여 걸러낸 후 해당 암세포에 적정 농도별로 처리하였다.</p> <h2>MTT assay를 이용한 세포 중식률의 측정</h2> <p>세포 배양용 \( 6 \) well plate에 \( 3 \times 10^{5} \)개/\(\mathrm{ml}\)로 암세포를 분주하고 WEAS를 배지에 희석하여 각 well 당 적정 농도로 처리하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 tetrazolium bromide salt (MTT, Amresco, Solon, Ohio, USA)를 \(0.5 \mathrm{mg}/\mathrm{ml}\) 농도가 되게 배지로 희석하여 반응시킨 후 MTT 시약을 제거 dimethylsulfoxide (DMSO, Amresco)로 각 well에 생성된 formazan을 녹인 후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvalc, CA, USA)로 \( 540 \mathrm{nM}\)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Agarose gel 전기영동에 의한 DNA fragmentation의 분석</h2> <p>정상 및 WEAS가 처리된 배지에서 \( 24\)시간 동안 배양된 포의 DNA를 추출하여 bovine pancreatic ribonuclease(RNase A)를 처리하였다. 얻어진 DNA를 \( 1.5 \)% agarose gel 전기영동으로 분리하여 ethidiumbromide (EtBr,Sigma, St. Louis, MO, USA)로 염색한 후 UV 하에서 관찰하였다.</p> <h2>DNA flow cytometer에 의한 세포 주기의 분석</h2> <p>정상 및 WEAS가 처리된 배지에서 배양된 세포를 모아서 PBS로 수회 수세 후 CycleTEST Plus DNA Reagent Kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하여 고정 및 propidium iodide (PI) 염색을 실시하였다. 염색 후 DNA flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 대조군 및 WEAS 처리군을 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 ModiFit LT (Becton Dickinson) program을 사용하여 분석하였다.</p>