본 실험에서는 (주)덕산비엔에프에서 제공받은 생마늘 및 흑마늘과 비교군으로서 일본의 아오모리산 흑마늘(WEABG-A)을 이용하여 항비만 효과 여부를 조사하였다. 3T3-L1 지방전구세포를 confluent 상태까지 배양한 후 분화배지로 교환하여 분화를 유도하여 mRNA 발현양 분석, 단백질 분석에 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시료준비</h2> <p>본 실험에 사용된 생마늘 및 흑마늘은 (주)덕산비엔에프에서 제공 받았으며, 열수 추출물을 얻기 위하여 흐르는 물로 충분히 세척하고 건조시킨 후 잘게 분쇄하였다. 건조된 생마늘 및 흑마늘 \( 100 \mathrm{~g} \) 당 증류수 11를 첨가하여 환류 냉각장치가 장착된 가열기에서 \( 180-200^{\circ} \mathrm{C} \)의 온도로 3시간 동안 끓인 후 이를 \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 20분간 원심분리하여 찌꺼기를 제거하고 상층액만 분리하였다. 분리된 상층액을 Whatman 필터 (No.2)로 걸러내고 감압 농축과정을 통하여 고형성분을 얻어내어 막자사발로 잘게 마쇄하고 밀봉시켜 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 초저온 냉동고에 보관하였으며, 실험 시에는 3차 증류수를 이용하여 100 \( \mathrm{mg} / \mathrm {ml} \)의 농도로 만든 다음 이를 적정 농도로 배지에 희석하여 처리하였다. 아울러 비교군으로서 일본의 아오모리산 흑마늘(WEABG-A)을 동일 조건에서 처리하여 항비만 효과 여부를 조사하였다.</p> <h2>실험재료</h2> <p>본 실험에서 mRNA 발현양 분석을 위하여 Bioneer (Taejeon, Korea)에서 구입한 primer 염기서열은 Table 1에 나타내었으며, 단백질 분석을 위하여 사용된 PPAR \( \gamma, \mathrm{C} / \mathrm{EBP}\alpha, \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \) 및 actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 및 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. Immunoblotting을 위해 2차 항체로 사용된 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Life Science Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다. 또한 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 위하여 사용된 insulin, dexamethasone 및 IBMX와 지방세포 내 triglyceride 생성을 확인하기 위하여 사용된 Oil Red O는 Sigma-Aldrich (St. Luis, MO, USA)에서 구입하였다.</p> <h2>3T3-L1 지방전구세포의 배양</h2> <p>실험에 사용된 3T3-L1 지방전구세포는 \( 90 \% \)의 Dulbecco's Modified EaDCRT Media (DMEM, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), \(10\%\) 의 bovine calf serum (BCS, Gibco BRL) 및 \( 1 \% \)의 penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL)이 포함된 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{ CO }_{2} \) 조건 하에서 배양하였다. 세포수의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 성장배지의 교환을 매 48시간마다 실시하여 적정수의 세포를 유지하였다.</p> <h2>3T3-L1 지방전구세포의 분화유도</h2> <p>3T3-L1 지방전구세포를 세포 배양용 6 well plate에서 confluent 상태까지 배양한 후 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) insulin, \( 0.1 \mu \mathrm{M} \) dexamethasone 및 \( 0.5 \mu \mathrm{M} \mathrm{IBMX} \) 가 포함된 분화배지로 교환하여 2일간 배양하였으며, 그 후 매 2일마다 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) insulin이 포함된 배지로 교환하였으며, 10일간 분화를 유도한 3T3-L1 지방전구세포를 다양한 실험적 분석을 위하여 사용하였다.</p>