베타-카로틴과 mevalonate 생합성 유전자를 삽입한 E. coli를 3.4L 발효기에 배양하였다. 세포현포액을 동결건조기로 처리하여 추출용 세포를 얻었으며, 필요한 경우에는 세포파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하고 원심분리로 세포잔사물을 추출하였다. 다양한 조건(추출용매의 양, 온도, 종류 등)에서 베타-카로틴의 추출 수율을 조사하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재조합 대장균 배양 및 세포 전처리</h2> <p>\( 3.4 \mathrm{~L} \) 상단구동 발효기 (코바이오텍, 인천, 한국)에 ampicillin \( (100 \mathrm{mg} / \mathrm{L}) \), chloramphenicol \( (50 \mathrm{mg} / \mathrm{L}) \), 글리세 롤( 20 \( \mathrm{g} / \mathrm{L} \) )을 첨가한 \( 2 \mathrm{YT} \) 배지 \( 1.8 \mathrm{~L} \) 를 넣고 베타-카로틴과 mevalonate 생합성 외래 유전자들을 삽입한 E.coli \( \mathrm{DH} 5 \alpha \) 를 접종한 후 회분식 모드로 배양을 시작하였다. 글라이세롤이 거의 고갈될 시점에 \( \mathrm{pH} \)-stat으로 기질용액 (글리세롤:yeast extract=10:1)을 공급하며 유가식 배양을 수행하였다. 배양 종료 후 배양액을 취하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 8,000 \mathrm{rpm} \) 에서 원심 분리하여 상등액을 제거한 후 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 증류수로 2 차례 세척하여 세포표면에 존재하는 잔류 배지성분들을 제거한 후, \( 1 \mathrm{~g} \) wet cell 당 \( 85 \% \) 2-프로판올 용액 \( 3 \mathrm{~mL} \) 를 첨가하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 교반하며 세포에 존재하는 수분들을 제거하였다. 정량적인 실험을 위하여 탈수 세포를 동결건조기(PVTFD 50A, Cilsin, Korea)에 넣고 건조시킨 후 이를 추출용 세포로 사용하였다.</p> <p>세포파쇄가 필요한 경우, 세포현탁액을 포함하는 튜브를 얼음통에 넣고 세포파쇄기(Ultrasonic homogenizer, Sonics \& Materials, Inc., Danbury, USA)의 tip을 세포현탁액에 담그고 반복적인 sonication에 의해 세포를 파쇄한 후 원심분리에 의해 세포잔사물(cell debris)을 회수하였고 이를 베타-카로틴 추출에 사용하였다. 시료 전처리와 베타-카로틴 추출에 일제 특급 시약을 사용하였다. 오일은 해표 압착올리브유(주식회사 사조 \( \mathrm{O \& F} \), 인천, 한국)를 사용하였다.</p> <h2>베타-카로틴 추출조건 최적화</h2> <p>동결건조 세포 또는 동결건조 후 파쇄된 세포잔사물에 추출 용매를 첨가한 후 물중탕으로 30 분간 교반하였다. 추출용매의 양, 추출온도 및 추출용매의 종류, 용매의 혼합에 따른 추출 수율을 조사하였다. 조사된 추출용매는 아이소부틸 아세테이트(IBA), 아세톤, \( \mathrm{n} \)-헵탄, 올리브유, 및 이들의 혼합 용액이다.</p> <h2>베타-카로틴 결정 세척</h2> <p>정제된 베타-카로틴의 순도를 향상시키기 위하여 불순물을 제거해야 하는데, 에탄올 또는 아세톤을 세척용매로 사용하였다. 베타-카로틴 결정 약 \( 280 \mathrm{mg} \) 에 이들 용매 \( 50 \mathrm{~mL} \) 를 넣고 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 교반한 후, 여과에 의해 세척된 결정을 회수하였다.</p>