일반적인 유전자조작은 \( E \). coli Top10을 사용하였으며 \( C \). glutamicum 염색체에 존재하는 유전자를 결손하기 위한 목적으로 고순도 시약은 Sigma-Aldrich에서 구입하였으며, 일반 시약은 Junsei와 Duksan의 제품으로 전기천공법은 이전 논문에 기술된 방법에 준하여 실시하고 한천배지에서 1일간 배양된 균을 백금으로 직접 접종하고 진탕 배양기에서 \( 32 ^ {\circ } \mathrm { C } , 2 \)일간 \( 240 \mathrm { rpm } \)으로 배양하였다.
<h2>재료 및 방법</h2> <h3>균주, 플라스미드 및 유전자 조작</h3> <p>연구에 사용한 균주와 플라스미드는 Table 1에 표시하였다. 일반적인 유전자조작은 \( E \). coli Top10 (Invitrogen,USA)을 사용하였으며, \( \mathrm { GlcNc } \)을 생산하기 위한 모균주는 \( C \). glutamicum ATCC 13032를 사용하였다. 유전자 클로닝과 발현을 위한 플라스미드는 \( \mathrm { pCX } \) 시리즈 발현벡터 pCXT20,pCXS30, pCXS35, pCSI 40, pCXI43, pCXI45)와 pCES208을 사용하였다. \( C \). glutamicum 염색체에 존재하는 유전자를 결손하기 위한 목적으로 \( \mathrm { pK } 19 \mathrm { mobsacB } \) 벡터를 사용하였다. 특정한 \( \mathrm { DNA } \) 단편은 \( Pfu \)-X DNA polymerase (SolGent, Korea)를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 얻었으며, 클로닝 후 염기서열을 분석하여 DNA 염기서열을 확인하였다. \( C \). glutamicum의 형질전환용 세포(competent cell)의 제조와 전기천공법(electroporation)은 이전 논문에 기술된 방법에 준하여 실시하였다.</p> <h3>\( \mathrm { DNA } \) 조작용 제품 및 시약</h3> <p>\( \mathrm { DNA } \) 제한효소는 New England Biolabs (USA)와 Enzynomics (Korea) 회사 제품을 사용하였다. \( \mathrm { DNA } \) plasmid prep kit, Gel extraction kit, PCR premix kit, \( Pfu \)-X DNA polymerase kit는 Intron (Korea), GeneAll (Korea), Enzynomics (Korea), SolGent (Korea)에서 각각 구입하였다. \( N \)-Acetylglucosamine, glucosamine 등의 고순도 시약은 Sigma-Aldrich (USA)에서 구입하였으며, 일반 시약은 Junsei (Japan)와 Duksan (Korea) 제품을 사용하였다. Tryptone과 yeast extract는 Difco (USA) 제품을 사용하였다.</p> <h3>배지조성과 배양조건</h3> <p>\( E \). coli와 \( C \). glutamicum은 \( \mathrm { LB } \) (Luria Bertani; tryptone \( 10 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \) yeast extract \( 5 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } , \mathrm { NaCl } 10 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \) 배지를 사용하여 각각 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 32 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다. 필요시 항생제를 첨가할경우, \( E \). coli의 경우 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) ampicillin, \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) kanamycin, \( 25 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) chloramphenicol을 첨가하였으며, \( C \). glutamicum의 경우 \( 25 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) kanamycin, \( 4.5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) chloramphenicolo 을 첨가하였다. \( \mathrm { GlcNc } \)과 \( \mathrm { GlcN } \)생산을 위한 플라스크 발효배지는 이전 논문에 기술된 첨가량에 준하여 실시하였으며, 이때 아미노산은 첨가하지 않았다. \( 30 \mathrm { ml } \)의 발효배지를 함유한 \( 250 \mathrm { ml } \) 삼각플라스크에 \( \mathrm { LB } \) 한천배지에서 1일간 배양된 균을 백금이로 직접 접종하고 진탕 배양기에서 \( 32 ^ {\circ } \mathrm { C } , 2 \)일간 \( 240 \mathrm { rpm } \)으로 배양하였다. 모든 실험은 3회 반복 수행하여 그 평균치를 계산하여 표시하였다.</p>