실험 집단에게는 1주일 동안 사전적응 운동을 하게 한 뒤, 주 5일 동안 6주간 트레드밀을 이용한 지구성 운동을 시행하였다. pentobarbital로 마취한 후 개복하여 혈액을 채취하고, 혈액을 분석하기 위해 30분 동안 방치 후 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 또한, 6주간 운동 후 마취시킨 후 뇌 조직을 적출하고 분석까지 -80도에서 냉동 보관하였다. 미토콘드리아는 Mitochondria Extraction Kit를 사용하여 분리하였다.
<h2>훈련방법</h2> <p>Rodent 트레드밀(8 Lanes, Dae-myung Scientific Co, Ltd, Korea)을 이용하여 지구성 운동을 시키기 위해 1주일 정도 사전적응 훈련 10분 동안 \( 10 \mathrm { ~m } / \mathrm { min } \), 주 5일) 을 실시하였으며, 본 훈련은 실온 \( \left (22 ^ {\sim } 24 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \) 에서 주 5일 총 6 주간 실시하였다. 훈련 프로토콜은 Table 1과 같다.</p> <h2>혈중 생화학 성분 분석</h2> <p>(NON STZ-CON) 집단, STZ-CON 집단, STZ-EXE 집단을 대상으로 혈액을 채혈하기 위해 pentobarbital sodium (50 \( \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \) )으로 마취 시켜 개복하여 심장에서 \( 8 \mathrm { ml } \) 의 혈액을 채혈한 후 혈청 글루코스와 인슐린 수준을 분석하기 위해 혈청 분리 튜브를 이용하여 혈액을 약 30분 동안 방치한 후 15분간 원심분리 \( (3,000 \mathrm { rpm } ) \) 하여 혈청을 분리하고, 혈중 생화학적 검사를 실시하였다. 글루코스와 인슐린 수준은 각각 Glucose Hexokinase kit (Bayer, Pittsburg, USA)와 enzyme immuno-assay ELISA 분석용 kit (Mercodia AB, Uppsala, Sweden)를 이용하여 분석하였으며 인슐린 저항성의 지표로 사용되고 있는 HOMA-IR (Homeostasis model assessment of insulin re-sistance \( =[ \) Fasting Insulin \( ( \mu \mathrm { U } / \mathrm { ml } ) \times \) Fasting Plasma Glucose \( ( \mathrm { mmol } / \mathrm { 1 } ) / 22.5]) \) 를 산출하였다.</p> <h2>뇌 적출</h2> <p>6주간 트레드밀 지구성 운동을 수행한 후, pentobarbital (50 \( \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \) )을 복강 내 주입시켜 마취 시킨 후, 뇌 조직을 적출하 여 분석 때까지 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 냉동 보관하였다.</p> <h2>미토콘드리아 분리방법</h2> <p>미토콘드리아의 분리는 Mitochondria Extraction Kit(IMGENEX Corporation, San Diego, CA)을 이용하여 분리하였다. 분석방법은 조직 \( 1 \mathrm { ~g } \) 당 \( 5 \mathrm { ml } \) 의 homogenizing buffer를 넣어 잘게 균질화 시킨 후, 균질화된 샘플은 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분간 \( 3,000 \mathrm { rpm } \) 으로 원심 분리하였다. 분리된 상층액을 다시 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 분간 \( 12,000 \mathrm { rpm } \) 으로 원심 분리한 후, 상층액을 제거하고 남은 pellet을 \( 5 \mathrm { ml } \) 의 Suspension buffer를 넣어 잘 섞어 준 다음 다시 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분간 \( 12,000 \mathrm { rpm } \) 으로 원심 분리하였다. 이후 상층액을 제거 후 1 회 더 Suspension buffer \( 5 \mathrm { ml } \) 를 넣고 잘 섞어 준 후 다시 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분간 \( 12,000 \mathrm { rpm } \) 으로 원심 분리하였다. 상층액을 제거한 후 남은 pellet은 \( 1 \mathrm { ml } \) 의 Complete Mitochondrial lysis buffer를 넣어 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30분간 녹인 후 분리된 mitochondrial extract를 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분간 \( 12,000 \mathrm { rpm } \) 으로 원심 분리하여 획득한 상층액(mitochondria fraction)을 얻었다. 총 단백질량은 BSA (Bovine Serum Albumin, \( 570 \mathrm { ~nm } \) )를 이용하여 Bradford의 방법으로 정량화하였다.</p>