Hep3B 인체 간암세포는 American Type Culture Collection에서 분주 받아, \( 10 \% \) FBS와 \( 1 \% \)의 penicillin 및 streptomycin이 포함된 RPMI- 1640 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 배양했다. 연구에 필요한 다양한 화합물 및 항체는 Sigma, Santa Cruz Biotechnology, Invitrogen Corp., GIBCO-BRL 등 다양한 공급 업체에서 구매했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료 및 항체</h2> <p>본 연구에 사용된 propidium iodide (PI), 4,6-dia-midino-2-phenylindole (DAPI), 3-(4,5-Dimethyl-2-thia-zolyl)-2,5-diphnyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) 및 5,5 V, 6,6 V-tetrachloro-1,1 V,3,3 V-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide (JC-1)은 Sigma (St Louis, MO)에서 구입하였으며, RPMI1640 배지 및 fetal bovine serum (FBS)는 Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA)과 GIBCO-BRL (Gaithersburg, MD)에서각각 구입하였다. Bcl-2, Bax, Bid, cytochrome \( \mathcal{c} \), poly (ADP-ri-bose) polymerase (PARP), caspase-3,-8 및 -9 항체는 Santa Cruz Biotechnology (SantaCruz, CA)에서 구입하였고, \( \beta \) -actin은 Sigma에서, peroxidase-labeled donkey anti-rabbit 및 heepanti-mouse immunoglobulin은 Amersham Life Science Corp. (Arlington Heights, IL)에서 구입하였다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>Hep3B 인체 간암세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD)에서 분주 받아 \( 10 \% \) FBS, \( 1 \% \) 의 penicillin 및 streptomycin (Biofluids, Rockville, MD)이 포함 된 RPMI- 1640 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건 하에서 배양하였다. Genistein (Sigma)과 TRAIL (KOMA Biotech Inc, Seoul, Korea)은 각각 DMSO와 PBS에 적정 농도로 녹여 배지에 희석하여 처리하였다.</p> <h2>MTT assay</h2> <p>다양한 조건에서의 Нep3B 세포 증식 억제의 비교를 위하여 MTT assay를 실시하였다. 이를 위해 적정 조건에서 Hep3B 세포를 배양 후 배지를 제거하고 MTT를 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 희석하여 \( 200 \mu 11 \) 씩 분주하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3시간 동안 다시 배양하였다. 배양이 끝난 다음 MTT 시약을 제거하고 dimethylsulf-oxide (DMSO, Sigma)를 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 분주하여 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 후 96 well plate에 200\( \mu \mathrm{l} \)씩 옮겨서 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 세 번을 하였으며, 그에 대한 평균값과 표준 오차를 Microsoft EXCEL program을 사용하여 분석하였다.</p> <h2>DAPI staining에 의한 세포핵의 형태 관찰</h2> <p>Apoptosis가 유발되었을 경우 특이적으로 나타나는 핵의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 준비된 세포를 \( 3.7 \% \) formaldehyde 용액으로 고정 후, \( 2.5 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 의 DAPI 용액을 처리하여 상온에서 15분간 염색하였다. 염색이 끝난 후 DAPI 용액을 충분하게 세척하고 mounting solution을 처리한 후 형광 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 400 배의 배율로 핵의 형태 변화를 관찰하였다.</p> <h2>Flow cytometry 분석</h2> <p>Apoptosis 유도의 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 준비된 세포들을 CycleTEST PLUS DNA REAGENT Kit (Becton Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 고정 및 염색을 하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), 암실에서 30분 동안 반응을 시켰다. 반응시킨 세포를 \( 35-\mathrm{mm} \) mesh를 이용하여 단일세포로 분리한 후 FACSCalibur (Becton Dickinson)를 적용시켜 형광반응에 따른 Cellular DNA content 및 histogram을 CellQuest software 및 ModiFit LT (Becton Dickinson) 프로그램을 이용하여 분석하였다.</p>