상추는 소비량은 많지만 비타민 C 함량은 낮으므로 비타민 C 생합성 유전자가 도입된 상추를 만들어 선발하였다. 시판 종인 상추 종자의 표면을 살균하여 사용하였고 딸기 유래 유전자와 선발마커인 npt Ⅱ 유전자가 함께 들어간 벡터를 가진 A.tumefaciens EHA105를 균주로 사용하였다. Agrobacterium를 제거하기 위해 선발배지에 Lilacillin을 넣었으며, Kanamycin을 첨가하여서 선발마커인 Kanamycin 저항성을 가진 형질전환체만을 선발하였다.
<p>따라서 본 실험은 소비량은 많지만, 비교적 비타민 C 함량이 낮은 상추에 비타민 C 생합성 유전자인 GalUR 유전자를 도입하여 비타민 C 함량이 높은 상추를 선발하고자 실시하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>(주)농우바이오 시판종인 화홍적축면 상추 종자를 \( 70 \% \) EtOH에 1분, \( 25 \% \) 락스에 15분간 침지하여 표면 살균하였다. 4회 멸균수로 수세한 다음 1/2MS 배지 (Murashige and Skoog 1962)에 sucrose \( 1 \% \)가 첨가된 고체배지에 파종 후, 광조건\((25 \pm 1 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 16h day/8h dark)에서 발아시켰다. 발아 후 3일 정도 된 자엽 절편체(엽병을 약간 포함)를 Kim과 Kwon(1999)이 상추 재분화에 효과적이라고 보고한 전처리 배지(MS, sucrose \(3\%,0.5 \mathrm{mg/L}\) BAP, \( 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) NAA, agar \( 0.8 \% \), \( \mathrm { pH }~5.7 \))에서 2일간 전 배양한 후, Agrobacterium과의 공동배양에 하였다.</p> <h2>형질전환용 균주</h2> <p>본 실험에 사용한 균주는 딸기 유래 유전자 D-galacturinic acid reductase (GalUR)와 선발마커인 npt Ⅱ 유전자가 재조합되어진 vector (pGALUR2300, (주)농우바이오)를 포함한 A. tumefaciens EHA105였다(Fig. 2). 균주를 YEP (peptone \( 10 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \), yeat-extract \( 10 \mathrm { mg } / \mathrm { L } , \mathrm { NaCl } ~5 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \), Kanamycin \(50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \), rifampicin \( 30 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } , \mathrm { pH }~ 5.6 \)) 액체배지에 \( 0 . \mathrm { D } _ { 600 } = 0.8 \) 정도까지 배양하여 한 번 원심분리한 후 동일 양의 전처리 액체배지로 Agrobacterium pellet을 희석한 다음 절편체와 공동배양에 사용하였다.</p> <h2>상추 형질전환</h2> <p>공동배양을 위해 미리 춘비한 Agrobacterium 현탁액에 2일간 전 배양한 자엽 절편체를 넣고 20분간 교반하였다. 그리고 멸균 여과지로 절편체에 붙은 현탁액을 제거한 후 공동배양배지 (MS, sucrose \(3\%\), \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) BAP, \( 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { L }\) NAA, acetosyringon \( 50 \mathrm { uM } , \mathrm { pH } ~5.2\))에 치상하고, 압 상태에서 2일간 배양하였다. 선발배지는 전처리 배지에 Agrobacterium의 제거를 위하여 \( 200 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \)의 Lilacillin(penicillin-sulfate sodium, Takeda Medicine Co., Japan)이 첨가되었다. 또한 본 실험에 사용된 균주의 선발마커는 Kanamycin 저항성을 가졌기 때문에 형질전환체 선발을 위하여 \( 100 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) Kanamycin이 첨가되었다. 선발배지에서 살아남은 신초들을 더 확실하게 선발을 하고자 MS배지에 \( 100 \mathrm { mg } / \mathrm { L }\) Kanamycin과 \( 200 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) Lilacillin만 첨가된 배지에서 신초의 신장과 발근을 유도하였다.</p>