CGL의 특이적 저해제인 DL-propargylglycine과 PLP 결합 보효소의 활성을 억제하는 hydroxylamine이 첨가된 시료를 사용해 CGL에 의한 반응물 생성을 확인하였다. Human CGL에서 \( \alpha, \gamma \)-elimination 반응에 의해 생성되는 methylselenol \( \left(\mathrm{CH}_{3} \mathrm{SeH}\right) \)은 \( \mathrm{GC} / \mathrm{MS} \)를 이용해 분석하였다. 또한, L-methionine과 L-SeMet의 \( \alpha, \gamma \)-elimination에서 발생하는 \( \alpha \) -etobutyrate는 MBTH 측정방법을 이용해 확인하였다.
<h2>Human CGL 효소 반응시료 준비</h2> <p>효소반응은 \( 10 \mathrm{mM} \) L-SeMet가 포함된 활성측정 buffer (0.1 M KPB, \( 20 \mathrm{uM} \) PLP, pH 7.9) \( 300 \mathrm{ul} \) 에 \( 150 \mathrm{ug} \) 의 human CGL을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 반응시킨 후 \( \mathrm{HCl} \) \( 150 \mathrm{ul}(12 \mathrm{~N}) \) 을 첨가하고 argon gas를 10 분간 bubbling 하면서 표준 시료와 동일한 방법으로 효소반응에 의해 생성된 methylselenol을 포집하였다. 생성된 methylselenol이 효소반응에 의한 것인지를 확인하기 위하여 반응액에 효소를 첨가하지 않은 시료와 효소를 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 열처리한 후의 효소를 사용하였다. 또한 반응액에 기질을 첨가하지 않은 시료도 이용하였는데 이는 생성물이 기질로부터 생성되었는지를 확인하기 위함이었다. 그리고 CGL의 보효소인 PLP와 결합하여 활성을 특이적으로 억제하는 hydroxylamine을 첨가한 시료와 CGL의 특이적 저해제인 DL-propargylglycine를 전처리한 시료도 대조군으로 사용하여, 반응물을 생성하는 효소가 CGL에 의함을 확인하고자 했다.</p> <h2>\( \mathrm{L}-\mathrm{SeMet} \) 을 기질로 이용한 human CGL 효소 반응액의 \( \mathrm{GC} / \mathrm{MS} \) 분석</h2> <p>Human CGL의 \( \alpha, \gamma \)-elimination 반응에 의해 L-SeMet로부터 생성되는 되는 methylselenol \( \left(\mathrm{CH}_{3} \mathrm{SeH}\right) \) 은 \( \mathrm{GC} / \mathrm{MS} \) 를 이용하여 분석하였다. 기준 methylselenol 시료의 준비는 보고된 방법을 사용하였다[20]. 간단히 설명하면 dimethyl-diselenide를 sodium tetrahydroborate로 환원하여 제조하였다. \( 100 \mathrm{ul} \) ethanol에 \( 10 \mathrm{ul}(50 \mathrm{umol}) \) 의 dimethyldiselenide가 녹아 있는 vial에 ethanol \( 100 \mathrm{ul} \) 에 녹인 \( 0.18 \mathrm{~g} \) 의 sodium tetrahydroborate를 천천히 첨가하여 5 분간 반응시키고, argon gas로 충분히 bubbling 시킨 효소활성 측정 buffer \( 200 \mathrm{ul} \) 에 신속하게 첨가하였다. 이어 \( 200 \mathrm{ul}(12 \mathrm{~N}) \) 의 \( \mathrm{HCl} \) 을 첨가한 후 10 분간 argon gas로 bubbling 하면서 생성된 gas를 methylselenol 포집 혼합용액 (50 mM 1-fluoro-2, 4-dinitrobenzene, \( 83 \mathrm{mM} \mathrm{NaHCO}_{3} \) in \( 63 \% \) dimetylfomamid:\( 34 \% \) water)으로 이동시켰다. 포집 혼합용액에 생성된 안정한 dinitrophenyl selenoether를 benzene으로 추출하여 기준 시료로 사용하였다. Human CGL 반응물의 조제 부분에서 언급한대로 전 처리를 거친 대조군 시료들과 실험군 시료를 이용하여 동일한 조건에서 실험을 하였다. \( \mathrm{GC} / \mathrm{MS} \) 의 분석 조건은 injector의 온도를 \( 260^{\circ} \mathrm{C} \) 로 하였고, oven 온도는 최초 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 분간 유지, \( 15^{\circ} \mathrm{C} / \mathrm{min} \) 으로 \( 300^{\circ} \mathrm{C} \) 로 상승시킨 후 11분간 유지하였다. Detector는 EI mode에서 \( 70 \mathrm{eV} \) 의 에너지로 이온화 하였고 \( \mathrm{TIC} \) 의 SCAN mode에서 검출이온 질량범위를 50-300으로 설정하여 각 질량스펙트럼을 확인하였다.</p> <h2>\( \mathrm{L}- \) Methionine과 L-SeMet의 \( \alpha, \gamma \)-elimination 활성측정</h2> <p>L-methionine과 L-SeMet의 \( \alpha, \gamma \)-elimination 등은 기존의 방법을 사용하였다[12]. 즉 두 기질로부터 생성되는 \( \alpha \) -etobutyrate를 MBTH (3-methyl-2-benzothiazolone-hydrazone) 측정방법을 통해 확인하였다. 효소반응은 \( 0.1 \mathrm{M} \mathrm{KPB}(\mathrm{pH} \) 8.0)에 \( 20 \mu \mathrm{M} \) PLP와 기질인 L-methionine과 L-SeMet의 농도 \( (0,0.1,0.5,1,1.5,2,2.5 \mathrm{mM}) \) 를 변화시켜 첨가한 혼합액에 각각 \( 7 \mu \mathrm{g} \) 의 효소를 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 반응시켰고, \( 5 \% \mathrm{TCA} \) 를 첨가하여 반응을 종결시키고, \( 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심분리 하여 상층액을 취하였다. 반응액을 \( \mathrm{MBTH} \) 용액과 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 40 분간 반응시킨 후 시료의 안정화를 위하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 방치하였다. MBTH 반응액은 UV-visible 흡수 스펙트럼을 이용하여 \( 324 \mathrm{~nm} \) 에서의 흡광도로 생성된 \( \alpha \)-ketobutyrate의 농도를 측정하여 기질 농도에 따른 최고 반응속도 \( \left(V_{\max }\right) \) 와 \( K_{m} \) 값을 측정하였다. 모든 실험은 3회 이상 반복 시행되었으며, 효소반응의 fitting과 회귀 분석은 컴퓨터 소프트웨어인 KaleidaGraph를 이용하였다.</p>