B35, PC12 세포를 사용하여 맥문동이 신경세포에 미치는 영향을 평가하였다. 한편, MTT는 살아있는 세포 내 미토콘드리아 내막에 존재하는 oxido-reductase의 효소 작용으로 환원되어 보라색의 formazan을 형성하는데, 이 발색정도를 흡광도로 측정하여 세포 생존률을 예측한다. 다음으로 배양액을 이용한 세포분화를 측정하여 B35 세포주에서 분비되는 NGF가 신경세포의 분화에 미치는 영향을 평가하였다. NGF ELISA kit를 이용하여 권장법에 따라 맥문동 추출물에 의한 세포와 실험동물에서 나오는 NGF 분비량을 측정하였다.
<h2>세포배양(Cell culture)</h2> <p>맥문동이 신경세포에 미치는 영향을 평가하기 위하여 B35, PC12 세포를 사용하였다. Neuroblastoma인 B35 cells은 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS), L-glutamine, penicillin 및 strepto-mycin을 함유한 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)에 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건의 incubator에서 배양하였다. Pheochromocytoma인 PC12 세포는 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS), L-glutamine, penicillin 및 streptomycin을 함유한 RPMI 1640 배지에 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건의 incubator에서 배양하였다.</p> <h2>세포독성시험</h2> <p>MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diohenyl tetrazo-lium bromide, Sigma, USA)는 살아있는 세포 내 미토콘드리아 내막에 존재하는 oxido-reductase의 효소 작용에 의해 환원되어 보라색의 formazan을 형성하게 되는데, 용해액 내 보라색 formazan의 발색정도를 흡광도로 측정함으로써 세포 생존률을 예측하는 실험방법으로 이용되고 있다. 먼저, B35 세포를 96 well \( \left(3 \times 10^{4}\right. \) 세포/well)에 분주하여 24 시간 배양한 뒤, Vehicle (DMSO)과 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 맥문동의 추출물을 처리하고, 24시간 동안을 배양하였다. 배양용 배지를 제거하고, MTT용액을 \( 50 \mathrm{\mu l} \) 첨가한 뒤, 4 시간 동안 배양한 후 세포 내에 보라색 결정이 생성되면 DMSO 용액을 이용하여 formazan을 용해시켰다. 각 well에 나타난 색깔의 변화를 ELISA-reader (VERSA max, micro-reader, MDS. Co, USA)를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다.</p> <h2>PC 12 세포주에서 신경돌기 성장관찰</h2> <p>B35 세포주에서 분비되는 NGF가 신경세포의 분화에 미치는 영향을 평가하기 위하여 배양액을 이용한 세포분화를 측정하였다. 이를 위해 먼저 B35 세포에 맥문동 추출물을 처리한뒤 24 시간 배양을 하여, NGF가 분비된 세포 배양액을 확보하였다. 분비된 배양액을 PC12 세포주에 처리하여 24시간의 경과 후 세포주의 변화를 위상차 도립현미경(Nikon, Japan)을 이용하여 분화정도를 관찰하였고, dendrite의 길이는 Leica Application Suite (Leica Microsystems, Switzerland)를 이용하여 측정하였다.</p> <h2>Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)</h2> <p>맥문동 추출물에 의한 세포와 실험동물에서 NGF 분비량은 NGF ELISA kit (Chemicon, USA \& Canada)를 이용하여 권장법에 따라 측정하였다. 신경세포인 B35세포를 96 well plate에 \( 3 \times 10^{4} \) 세포/well가 되도록 분주한 후, \( 70 \sim 80 \% \) 자랄때까지 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{CO}_{2} \) incubator에 배양하였다. 그리고 각 well에 vehicle과 \( 10 \mathrm{\mu l} / \mathrm{ml} \) 의 맥문동 추출물을 처리하고, 24 시간 동안 배양한 후, 배양액을 채취하여 5,000 rpm에서 2 분 동안 세포를 침전시켜 상층액을 준비하였다. ELISA kit의 각 well에 \( 100 \mathrm{\mu l} \)의 배양액을 첨가하여 밤새 배양하여 NGF를 항체에 결합시켰다. 미부착된 용액을 세척하고, anti-mouse NGF monoclonal antibody를 \( 100 \mathrm{\mu l} \) 첨가하여 실온에서 2 시간 동안 shaking 배양하였다. 미부착된 항체를 제거하고, 2 차 항체인 peroxidase conjugated donkey anti-mouse IgG poly-clonal antibody \( 100 \mathrm{\mu l} \)를 첨가하여 실온에서 shaking 배양하였다. 여기에 100 pl의 substrate (TMB)을 첨가하여 실온에서 15 분 동안 효소반응을 유도한 뒤, stop solution을 첨가하여 반응을 종결하였다. 반응종결에 따라 나타난 변화는 ELISA-reader (VERSA max, micro-reader, MDS Co., USA)를 이용하여 \( 450 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다.</p>