NO와 PGE2, TNF-α, IL-1β, IL-6의 농도는 각각 griess reagent와 ELISA kit를 이용하여 배양액에서 측정하였다. 배양 후 세포는 PBS로 세척하고, lysis buffer를 첨가하여 30분간 lysis 진행 후 원심 분리를 통해 세포막 성분을 제거하였다. TBST로 세척 후 secondary antibody 반응과 ECL kit를 이용한 반응을 통해 세포 내의 특정 성분을 LAS 4000 chem-iluinescence detection system으로 현상 및 정량하였다.
<h2>Nitric Oxide 생성량 측정</h2> <p>\( \mathrm { NO } \)의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 griess reagent를 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 cell은 DMEM배지를 이용하여 \( 5 \times 10 ^ { 4 } \) cells/ml로 조절한 후 12 well plate에 접종하고, \( 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 24시간 전 배양하였다. 세포에 \( 1 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)의 LPS를 처리하고 1시간 뒤에 1, 10, 100 \( \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)의 울릉도 자생추출물을 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액의 상층액을 얻은 후 griess 시약과 반응 시킨 후 ELISA reader로 \( 540 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하여 NO 생성율을 백분율로 표시하였다</p> <h2>Prostaglandin \(E_ { 2 } \), TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \), IL-6 생성량 측정</h2> <p>세포배양액 내의 \( PGE_ { 2 } \), TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \), IL-6 생성량은 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 cell은 DMEM배지를 이용하여 \( 5 \times 10 ^ { 4 } \) cells/ml로 조절한 후 12 well plate에 접종하고, \( 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 24시간 배양하였다. 세포에 \( 1 \mathrm {\mu } \) \( \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 LPS를 처리 한 뒤 1시간 후에 0, 1, 10, 100 \( \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)의 울릉도 자생식물 추출물을 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 배지를 취하여 \( PGE_ { 2 } \)를 측정하였다.</p> <h2>Immunoblotting</h2> <p>배양이 끝난 세포를 수집하여 PBS (phosphate buffer sal-ine)로 세척한 후 \( 100 \mu \mathrm { L } \)의 lysis buffer을 첨가하여 30분간 lysis 시킨 후 \( 13,000 \mathrm { rpm } \)에서 20분간 원심 분리하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 총 \( 30 \mu \mathrm { g } \) protein을 \( 10 \% \) SDS-PAGE로 분리하여 이를 PVDF (polyvinylidenedifluoride) membrane에 \( 55 \mathrm { ~V } \)로 90분간 transfer하였다. 그리고 PVDF membrane을 \( 5 \% \) skim milk에서 1 시간 방치한 뒤 primary antibody에서 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 overnight하여 준다. 다시 TBST로 세 번 세척한 뒤 secondary antibody를 상온에서 1시간 반응 시킨 뒤 TBST로 세 번 세척한 뒤 ECL kit와 반응시켜 LAS 4000 chem-iluinescence detection system (Fuii, Tokyo, Japan)을 이용하여 현상 및 정량을 하였다.</p>