Giemsa 시약은 Fluka사(Bushes, Switzerland), 덱스트란은 Amersham Pharmacia Biotech사 (Uppsala, Sweden) 제품을 사용하였고, fluorescein isothiocyanate (FTTC)와 phycoerythrin (PE) 형광이 표지된 CD80, CD83, MHC class II, 대조군 항체들(IgG1헝)과 apoptosis detection kit, \( \mathrm{T} \)-세포 분리에 사용한 CD3 MACS magnetic bead, AEBSF, zVal-Ala-Asp-fmk는 BD Pharmingen사(Flanklin Lakes, NJ), Miltenyi biotec사(Auburn, CA), Roche Diagnostics사 (Indianapolis, IN), Calbiochem사 (San Diego, CA) 에서 구입하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약</h2> <p>Giemsa 시약은 Fluka사(Bushes, Switzerland) 제품을 사용하였으며, 덱스트란은 Amersham Pharmacia Biotech사 (Uppsala, Sweden) 제품을 사용하였다. 세표 표면 마커 발현 촉정 실험에 사용한 fluorescein isothiocyanate (FTTC)와 phycoerythrin (PE) 형광이 표지된 CD80, CD83, MHC class II, 대조군 항체들(IgG1헝)과 apoptosis detection kit은 BD Pharmingen사(Flanklin Lakes, NJ), \( \mathrm{T} \)-세포 분리에 사용한 CD3 MACS magnetic bead는 Miltenyi biotec사(Auburn, CA) 로 부터 구입하였다. AEBSF는 Roche Diagnostics사 (Indianapolis, IN), zVal-Ala-Asp-fluoromethylketone (zVAD-fmk)은 Calbiochem사(La Jolla, CA) 로 부터 구입하였고 사람 재조합 GM-CSF는 R\&D Systems 사(Minneapolis, MN) 로부터 구입하여 사용하였다. RPMI-1640 배양엑은 Gibco-BRL사(Rockville, MD, USA) 로 부터 구입하였으며 Staphylococcal enterotoxin B (SEB), Histopaque와 다른 기초 시약은 Sigma사(St. Louis, MO, USA) 로 부터 구입하였다.</p> <h2>호중구의 분리 및 배양</h2> <p>만초 혈액으로 부터 호중구의 분리는 Son 등과 같은 방법을 사용하였다. 혈액 \( (100 \mathrm{ml}) \) 은 \( 0.1 \mathrm{M} \) EDTA, \( \mathrm{pH} 7.4 \) 와 \( 0.9 \% \mathrm{NaCl} \) 이 들어있는 수혈용 퐥에 채혈한 후 이 혈액에 덱스트란을 넣고 조심스럽게 섞은 다음 풀라스틱 실린더에 1시간 동안 침전시켰다. 호중구를 포함하는 혈장 성분 충을 분리하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 850 \times \mathrm{g} \) 로 15 분 동안 원심분리하고 침전된 세포를 \( 20 \mathrm{ml} \) 의 완충액 \( \mathrm{A}\left(8.0 \mathrm{mM} \mathrm{Na}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 1.5 \mathrm{mM} \mathrm{KH} \mathrm{KO}_{4}\right. \), \( 136 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 2.6 \mathrm{mM} \mathrm{KCl}, 0.5 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}, 0.6 \mathrm{mM} \mathrm{CaCl}_{2} \), \( \mathrm{pH} \) 7.4)에 부유시킨 다음 증류수를 넣어 혼재된 적혈구를 제거하였다. 임퐈구 분리 용액을 세포층 아래쪽에 조심스립게 넣고 \( 850 \times \mathrm{g} \) 에서 30 춘간 원심분리하여 종간 충에 존재하는 임파구는 버리고 침전된 과랍구 층은 \( 11 \mathrm{mM} \) 글루코오즈와 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 소 혈칭 알부민을 첨가한 완충액 \( \mathrm{B}(25 \mathrm{mM} \) Hepes \( \mathrm{pH} \) 7.4, \( 125 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 0.7 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2}, 0.5 \mathrm{mM} \) EDTA)에 부유시커 사용하였다.</p> <h2>세포사멸의 형태적 관찰</h2> <p>호중구는 여러 가지 형태의 핵을 가진 세포로서 세포사멸이 일어날 경우 핵 모양의 변화가 일어난 세포의 수로서 그 정도를 측정하였다[14]. Cytospin에서 \( 500 \times \mathrm{rpm} \) 으로 1 분간 원심 분리한 다음 메탄올로 고정시키고 May-Grunwald Giemsa 염색액으로 염색하였다. 호중구의 세포사멸 정도는 400 배 현미경 시야에서 최소한 300 개의 세포 중에서 특이적인 변화가 나타난 세포를 확인하여 \%로 표시하였다.</p>