L-Threonine 생산균주인 E. coli MT201의 생육 및 L-threonine 생산량을 확인하기 위해 발효배지에서 유가식 배양을 실시하였고 coli MT/pPYC는 glucose하에서 E. coli MT201보다 균체 증식 및 L-threonine 생산량 모두가 감소, pyruvate carboxylase에 의해서 oxaloacetate로의 공급은 원활하였으나 TCA 회로의 중간 대사산물의 공급이 원활하지 않아 균체의 생육이 억제 되어 L-threonine 생산량이 감소한 것으로 사료되며 coli MT / pPYC에서의 플라스크 배양 결과도 E. coli MT201을 이용한 배양의 경우와 유사한 결과를 보였으며 L-threonine 생산량 증대를 목적으로 형질전환된 E. coli MT / pPYC 균주에 대해서 sodium citrate의 첨가가 L-threonine 생산량뿐만 아니라 균체 증식(OD660)에 대해서도 포도당만을 탄소원으로 사용한 경우에 비해 더 좋은 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>E. coli MT201과 재조합 균주인 E. coli MT/pPYC의 L-threonine 생산량 비교</h2> <p>L-Threonine 생산균주인 E. coli MT201의 생육 및 L-threonine 생산량을 확인하기 위해 탄소원이 포도당으로 구성된 발효배지에서 유가식 배양을 실시하였다. 5 liter 발효조를 이용하여 유가식 배양을 실시한 결과 E. coli MT201의 경우에 총 배양 112 시간 동안에 균체량은 흡광도(OD660)을 기준으로 약 52까지 증가하였고, 배양 중 L-threonine은 최고 \( 57 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 가 생산되었다.</p> <p>L-Threonine의 대량생산을 위해서는 전구물질인 oxalo-acetate의 과량생성이 필요하다. 이를 위하여 해당과정의 py-ruvate로부터 직접 oxaloacetate를 생성하는 pyruvate car-boxylase의 과량생산을 위한 발현용 plasmid, pPYC를 제작하였다. Koffas 등과 Peters-Wendisch 등의 논문을 참조하여 양 말단에 HindIII 제한효소부위를 지니는 primer를 각각 제작하였다. 이들 primer로 Corynebacterium glutamicum으로부터 정제·회수된 염색체 DNA로부터 Takara LA Taq kit (Takara, Japan)를 이용하여 Delta Cycler II system (Ericomp, USA)으로 Takara사의 실험법에 따라 실시하여 pyc 유전자를 포함하며 HindIII의 제한효소부위를 양 말단에 지니는 약 \( 3.4 \mathrm{~kb} \) 의 DNA단편을 획득하였다. 이들 PCR 산물의 확인은 plasmid pUC19의 HindIII부위에 cloning하여 DNA sequencing을 통하여 pyc 유전자의 ORF 임를 확인하였다(결과 미제시). 한편 \( 4.2 \mathrm{~kb} \)의 E. coli에서 발현하는 plasmid \(\mathrm{pTrc} 99 \mathrm{~A} \)를 먼저 제한효소 NcoI 으로 절단하여 평활화시킨 후에 reading frame을 맞추기 위하여 HindIII 링커(Takara, Japan)를 부착하여 최종적으로 제한효소 HindIII로 절단한 후에 이 부위에 상기의 pyruvate carboxylase 유전자를 포함하는 \( 3.4 \mathrm{~kb} \)의 DNA 단편을 연결하여 \( 7.5 \mathrm{~kb} \)의 expression plasmid pPYC를 제작하여 agarose gel상에서 확인하였다(결과 미제시)</p> <p>상기의 방법으로 제작된 plasmid를 E. coli MT201에 도입하여 형질전환된 균주인 E. coli MT / pPYC를 획득하였다. E. coli MT / pPYC의 L-threonine 생산성을 확인하기 위해 모균주인 E. coli MT201의 배양 조건과 동일한 조건으로 유가식 배양을 실시하였다. 유가식 배양 결과 균체의 증식(OD660)은 총 배양 122시간에 약 41까지 증가하였고 L-threonine은 최고 \( 36.5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 까지 생산되었다</p> <p>형질전환균주 E. coli MT/pPYC는 glucose하에서 E. coli MT201보다 균체 증식 및 L-threonine 생산량 모두가 감소되었다. 이는 포도당이 해당과정을 거쳐 TCA 회로를 회전하면서 생육에 필요한 전구체인 중간대사 산물을 공급해 주어야 하는데 pyruvate carboxylase에 의해서 oxaloacetate로의 공급은 원활하였으나 상대적으로 TCA 회로의 중간 대사산물의 공급이 원활하지 않아 균체의 생육이 억제 받았으며 이로 인하여 일차대사산물인 L-threonine 생산량이 감소한 것으로 추측된다.</p> <h2>플라스크 배양에서 균체 생육 및 L-threonine 생산에 대한 sodium citrate의 영향</h2> <p>TCA 회로 상의 중간대사 산물을 공급함으로써 E. coli MT / pPYC의 생육 및 L-threonine 생산에 대한 영향을 조사하기 위하여 citric acid를 포도당과 함께 공급하였다. 배양액 중의 pH를 고려하여 sodium citrate와 ammonium citrate의 영향을 각각 조사한 결과로부터 sodium 염이 ammonium 염보다 균체 증식 및 생산에 효율적임을 알 수 있었다(결과 미제시).</p> <p>E. coli MT201과 E. coli MT / pPYC 의 생육 및 L-threonine 생산에 필요한 탄소원으로 포도당만을 첨가한 경우와 포도당과 sodium citrate를 함께 첨가한 경우를 각각 플라스크 상에서 비교하였다. 플라스크 배양에 사용된 탄소원은 각각 포도당\((5\%)\), 그리고 포도당 \( (3 \%)\) + sodium citrate \( (2 \%) \) 으로 하였다.</p> <p>플라스크 배양 결과 모균주인 E. coli MT201에서 탄소원으로 포도당만을 사용한 배양에서는 \( 0.99 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 L-threonine이 생산된 반면 \( 2 \% \)의 sodium citrate를 같이 첨가한 배양에서는 탄소원으로 포도당만을 첨가한 경우보다 훨씬 높은 \( 4.18 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 L-threonine이 생산되었다. L-Threonine 생산량의 증가뿐만 아니라 균체의 증식(OD 660) 역시 3.02에서 8.76으로 증가하였다(Table 2).</p> <p>재조합 균주인 E. coli MT / pPYC에서의 플라스크 배양 결과도 E. coli MT201을 이용한 배양의 경우와 유사한 결과를 보였다. 따라서 L-threonine 생산량 증대를 목적으로 형질전환된 E. coli MT / pPYC 균주에 대해서 sodium citrate의 첨가가 L-threonine 생산량뿐만 아니라 균체 증식(OD660)에 대해서도 포도당만을 탄소원으로 사용한 경우에 비해 더 좋은 효과가 있음을 확인할 수 있었다.</p> <h2>L-Threonine 생산을 위한 포도당 및 sodium citrate의 최적 농도</h2> <p>플라스크 배양에서 E. coli MT / pPYC 에 대한 탄소원으로 포도당과 sodium citrate를 혼합한 배양이 균주의 생육 및 L-threonine 생산에 있어 효과적임을 확인하였다. 균주의 생육 및 L-threonine 생산에 영향을 주는 탄소원의 최적 농도를 결정하기 위해 포도당과 sodium citrate를 \( 5 \% \) 이내에서 다양한 농도비로 첨가하였다.</p> <p>플라스크 상에서 포도당과 sodium citrate의 농도비 (4:1, 3.5: 1.5,3: 2,2.5: 2.5,2: 3)를 다르게 하여 배양을 실시한 결과 균주의 생육은 배양 전반에 걸쳐 유사한 증식형태를 보였다. L-Threonine 생산성을 검토하면 sodium citrate의 농도가 높을수록 초기 L-threonine 생산량은 증가되었으나 특히 포도당과 sodium citrate의 농도비가 3.5:1.5의 비율로 첨가되었을 때 가장 높은 생산량\( (5.14 \mathrm{~g} / \mathrm{l}) \) 을 보였다(Table 3).</p> <p>L-Threonine 생산량과 마찬가지로 균체의 생육 역시 포도당과 sodium citrate의 농도비 3.5:1.5의 비율로 첨가되었을 때 L-threonine 생산 균주의 생육이 가장 좋았다(Table 4). 그렇지만 포도당과 sodium citrate의 농도비가 2:3의 비율로 첨가되었을 때에는 배양 32시간 이후부터 생육이 감소하는 경향을 보였는데 이는 포도당의 고갈에 의한 것으로 추측된다(Table 4).</p> <h2>유가식 배양에서 E. coli MT/pPYC의 L-threonine 생산</h2> <p>상기 실험에서 확인된 최적의 포도당과 sodium citrate의 첨가비(3.5:1.5)를 이용하여 5 liter 발효조에서 유가식 배양에 의한 재조합 균주 E. coli MT/pPYC의 L-threonine 생산량을 확인하였다. 첨가배지는 탄소원인 포도당의 농도가 발효조 내에서 \( 5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 이하로 되었을 때 간헐적으로 공급하였다.</p> <p>유가식 배양의 결과 Fig. 3에서 보는바와 같이 배양 21시간부터 첨가배지를 공급하였다. L-Threonine 생산 균주의 생육은 배양 60시간동안에 홉광도(OD660)를 기준으로 약 48까지 증가하였다. 또, L-threonine 생산은 배양 75시간동안 약 \( 76 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 까지 증가되어 최고의 생산량을 보였다. 이때 L-threonine 생산성은 \( 1.25 \mathrm{~g} / \mathrm{l} / \mathrm{h} \) 로 최고의 값을 나타내었다.</p>