pCTcon에 cft 유전자를 subcloning한 pCTECFTN에 E. coli DH5\(\alpha\)와 S. cerevisiae EBY100로 형질전환하여CFs의 생성능과 균체증식이 높은 재조합균주를 선별하고 Immunofluorescence microscopy로 표층발현유무를 확인했다. 표층 발현은 기질과의 반응 공간 확보가 어려워 episomal 발현보다 효소활성이 낮다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>재조합 plasmid의 구축 및 효모형질전환체 선별</h2><p>Galactose로 유도되는 표층발현 vector인 pCTcon (GAL1 promoter)에 cft 유전자를 subcloning 하여 pCTECFTN ( \(9.1 \mathrm{kb}) \)를 구축하였다. 구축된 plasmid는 우선 E. coli DH5\(\alpha\)에 형질전환하여 증폭, 추출한 후 S. cerevisiae EBY100에 형질전환시켜 uracil 결핍 최소배지 (SD)에서 형질전환체를 1차 선별하고, 1차 선별된 균주는 test tube culture 후 cell lysates를 \( \ 5\%\) inulin과 반응시켜 반응산물을 TLC와 HPLC로 분석하여 그 중 CFs의 생성능과 균체증식이 높은 재조합균주를 선별하였다. 최종 선별된 재조합균주에서 CFTase는 유도적 promoter인 GAL1 promoter의 조절 하에서 안정적으로 표층발현되었다.</p><h2>Immunofluorescence microscopy</h2><p>Anti-c-myc (1차 항체)와 FITC (2차 항체)로 labeling 후 immunofluorescence microscopy로 관찰한 결과, EBY100/ pCTENIU은 형광을 나타내었고, EBY100 (control)은 그렇지 않았다. 이 결과로 표층발현유무를 확인하였다(data not shown)</p><h2>재조합 CFTase 발현과 분비국재성</h2><p>YPDG 배지에서 48시간 배양 후 분획한 균체는 \( 5.52 \mathrm{unit}/\mathrm{l}\)의 활성을 보였다. 대조구에서는 \( 0.7 \mathrm{unit}/\mathrm{l}\), 배양 상등액에서는 활성이 나타나지 않았다. 표층 발현은 episomal 발현 \( (18.73 \mathrm{unit}/\mathrm{l}\)) 보다는 활성이 낮았다. 표층 발현의 활성이 떨어지는 이유로 효모세포 표면에 발현되는 \(\alpha\)-agglutinin의 수가 약 \( 10^{4}-10^{5} \) 개로 한정되어 있기 때문에 발현시킬 수 있는 효소의 양이 일정하다. 그리고 목적 단백질이 세포 밖으로 완전히 분비되지 못하게 잡아주는 역할을 하는 세포벽 부착 매개 단백질이 요구된다. 매개 단백질로는 자연적으로 효모 세포벽에 존재하는 다양한 세포벽 mannoprotein을 이용할 수 있는데, 일부 mannoprotein은 세포벽에 약하게 결합하는 단백질과 일부 plasma membrane 유래이며, 주로 분자량이 작은 단백질들이다. 이들은 세포벽과의 결합력이 약하거나 세포의 표면과의 거리가 먼 위치에 존재하기 때문에 이들을 매개로 하여 외래 단백질을 표면발현 하였을 때 결합력이 약하거나 외래단백질이 충분히 표면에 노출되지 못하며 세포벽으로 흡수되지 못하는 기질과의 접촉할 수 없는 단점이 있다. 따라서, 일반적인 episomal 발현에 비해 상대적으로 효소활성이 낮은 것으로 사료되었다. 또한, Washida 등의 연구결과에서 따르면, Rhizopus orygae lipase를 \(\alpha\)-agglutinin의 C 말단 하류에 유전적으로 융합하여 표면 발현시켰을 때와 \(\alpha\)-agglutinin과 lipase 사이에 linker peptides를 삽입하여 표면 발현시켰을 때의 기질 친화성이 linker peptides의 수가 늘어감에 따라 증가하였다. 이는 표면 발현된 효소가 기질과 반응하기 위한 공간적인 확보가 일반 episomal 발현에 비해 어려워 기질과의 친화력이 감소하는 것으로 사료된다. 따라서, 일반적인 episomal 발현에 비해 상대적으로 효소활성이 낮은 것으로 사료되었다.</p>