면역세포인 대식세포는 사이토카인, 미토겐, 세균의 지질다당류 등에 의해 활성화되며, ROS, 활성질 소종, pro-inflammatory cytokines 등의 염증매개 물질 생성을 통하여 염증반응을 일으킨다. 이들 중 inducible nitric oxide synthase 활성화로부터 합성되는 \(\mathrm{NO}\)는 대표적인 염증인자로써 과잉생산 시 급성 및 만성 염증반응을 일으킬 수 있다. 본 연구에서는 만성적으로 노출 시 대식세포에서 염증반응을 일으키는 것으로 알려진 PM 10의 RAW 264.7 대식세포에서의 염증반응 유발 여부 확인을 위해 조건을 달리하여 \( \mathrm{NO} \) 생성량을 측정하였다. 실험 결과, LPS 또는 PM10으로 처리된 세포의 생존율이 감소한 것을 통해 두 물질 모두 대식세포에서 독성을 있었으며, 미세먼지 입자 단독 처리군과 비슷한 세포 생존율을 보였다. 해당화 추출물 처리군에서는 줄기에서 NO 생성을 \( 49.4 \% \) 억제, 잎에서는 \( 47.2 \% \) 억제 효과를 보였으며, 해당화 줄기 및 잎 추출물의 PM10 유도 염증반응 억제 효과는 이들 추출물의 세포 독성에 의한 것이 아니라는 것까지 알 수 있다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>미세먼지 PM\(10\)에 의한 RAW\(264.7\) 대식세포에서의 염증반응 측정</h2> <p>사이토카인, 미토겐, 세균의 지질다당류(LPS) 등에 의해 활성화되는 주요한 면역세포인 대식세포에서는 ROS, 활성질 소종, pro-inflammatory cytokines 등의 염증매개 물질 생성을 통하여 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 이들 중 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 활성화로부터 합성되는 \(\mathrm{NO}\)는 대표적인 염증인자로써 과잉생산 시 급성 및 만성 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있다(Gasparrini et al. \(2018\); Sharma et al. \(2007\)). 이에 본 연구에서는 만성적으로 노출 시 대식세포에서 염증반응을 일으키는 것으로 알려진 PM\(10\)의 RAW\(264.7\) 대식세포에서의 염증반응 유발 여부를 확인하기 위하여 \(100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도로 PM\(10\)을 RAW\(264.7\) 대식 세포에 처리 후 \( \mathrm{NO} \) 생성량을 측정하였다. Figure \( 1 \mathrm{~A} \)에서 보여지는 바와 같이 염증 유도제인 LPS 또는 PM\(10\)으로 자극 된 RAW\(264.7\) 세포에서 NO가 증가되었다. LPS로 유도된 NO 생성량은 미세먼지 입자에 의해 유도된 값보다 높았지만, PM\(10\)이 처리된 세포에서 무처리군(Mock)보다 약 \(2.6\)배 증가된 NO생성을 보였다(Fig. \(1\)A). 또한 LPS와 PM\(10\)으로 처리 된 대식세포의 세포 생존율을 MTT 분석을 통해 확인하였다</p> <p>그 결과 LPS 또는 PM\(10\)으로 처리된 세포의 생존율이 감소한 것을 통해 두 물질 모두 대식세포에서 독성을 나타냄을 확인 할 수 있었다(Fig. \(1\)B). 이러한 결과는 LPS 처리와 유사하게 대식세포에서 PM\(10\)으로 인하여 염증반응이 유도되고 세포 독성을 나타냄을 확인하였다.</p> <h2>해당화의 대식세포 내 염증발현 억제 효과 확인</h2> <p>서론에도 언급한 바와 같이 항염증 효과가 우수하다고 알려 진 해당화 추출물의 PM\(10\)유도 염증 반응 억제 활성을 조사 하기 위하여 PM\(10\) \( (100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)와 해당화 조직 별 추출물 (100 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) )를 RAW\(264.7\) 세포에 동시 처리 후 \( \mathrm{NO} \) 생성량을 측정 하였다. Figure \( 2 \mathrm{~A} \)에서 보이는 바와 같이 해당화 추출물을 처리한 RAW\(264.7\) 세포에서 PM\(10\)으로 인해 유도된 NO 생성이 억제되는 것을 조사되었다. 해당화 줄기 추출물에 의하여 PM\(10\)유도 NO 생성을 \( 49.4 \% \) 억제하였으며, 잎 추출물의 경우 \( 47.2 \% \) 억제 효과를 보였다. 이상의 \( \mathrm{NO} \) 생성 억제 효과 가 해당화 추출물의 세포 독성에 의한 것인지를 확인하기 위해 MTT assay를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 모든 해당화 추출물 처리군에서 미세먼지 입자 단독 처리군과 비교하여 유사한 세포 생존율을 보였으며, 이를 통하여 해당 화 추출물들은 RAW\(264.7\) 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다(Fig. \(2\)B). 이상의 연구 결과는 해당 화 줄기 및 잎 추출물의 PM\(10\) 유도 염증반응 억제 효과는 이들 추출물의 세포 독성에 의한 것이 아님을 시사한다. 줄기 추출물과 잎 추출물 간에 통계상 유의미한 차이는 보이지 않았으나, 줄기 추출물에서 가장 높은 NO 생성 억제 효능을 나타냄에 따라 후속 연구는 줄기 추출물을 이용하여 진행하였다.</p> <p>염증유발인자인 \(\mathrm{NO}\)와 prostaglandin \(\mathrm{E} 2\)의 생성은 각각 iNOS와 cyclooxygenase-\(2\) (COX-\(2\))에 의해 주로 이루어진다 inflammatory cytokines은 염증반응을 촉진함으로써 세포 노화 및 질병 유발에 관여하는 것으로 보고되어 있다(Kany et al. \(2019\); Toriyabe et al. \(2004\)). 이에 본 연구에서는 PM\(10\) 자극으로 유도된 pro-inflammatory cytokines 발현에 해당화 줄기 추출물이 미치는 영향을 real-time PCR을 이용하여 분석하였다. 그 결과 해당화 줄기 추출물을 처리한 RAW\(264.7\) 세포에서 \( i N O S, COX-\(2\), I L-\(1\) \beta \) 그리고 IL-\(6\)의 발현이 유의미하게 감소하였다. 결론적으로, 해당화 줄기 추출물의 PM\(10\)유도 염증반응 억제 활성은 iNOS, \( COX-\(2\) \) 및 pro-inflammatory cytokines의 발현 억제 기작에 의하여 나타남을 확인하였다. 또한 이상의 연구 결과를 통하여 해당화 줄기는 미세먼지로 유도되는 염증반응 억제 및 개선을 위한 천연소재로써 활용 될 수 있을 것으로 판단된다.</p>