E. coli DH5 \alpha\(\alpha\)(F' supE44 hsdS20 recA13 ara-14 proA2 lacY1 galK2 rpsL20 xyl-5 mtl-1 leuB6 thi-1)를 cloning의 숙주로 사용하였다. 플라스미드 DNA 추출을 비롯한 일련의 분자생물학적 기법은 Sambrook 등의 방법을 따랐다. SDS-PAGE는 11 \%11% polyacrylamide gel을 이용하여 Laemmli의 방법으로 행하였다. 효소용액을 5분간 끓인 후 gel에 주입하였고 coomassie brilliant blue R-250 (Bio-Rad, USA)으로 염색한 후 관찰하였다. 한천분해 효소의 반응산물인 환원당의 측정은 Somogy-Nelson법으로 실시하였다. 한천 \( 35 \mathrm{~g} \) 을 \( 50 \mathrm{mM} \) TAPS 완충용액 \( (\mathrm{pH} \) 7.8, \( 1 \mathrm{mM} \) \( \left.\mathrm{NaCl}, 1 \mathrm{mM} \mathrm{CaCl}_{2}\right) 665 \mathrm{ml} \) 에 넣고 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 가열한후 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 냉각시키고, 한천 \( 1 \mathrm{~g} \) 당 재조합 효소 \( 0.3 \mathrm{U} \) 를 첨가하여 24시간 반응시켰다. \( \beta \)-agarase에 의한 한천분해산물은 thin-layer chromatog-raphy (TLC)로 확인하였다. B. subtilis와 E. coli를 각각 \( 50 \mathrm{ml} \) LB 액체 배지에 접종하여 잘 섞은 후 \( 10 \mathrm{ml} \) 씩 분주하고 한천분해산물을 \( 0,0.75 \), \( 1.5 \% \) 비율로 각각 첨가하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 배양조건</h2> <p>E. coli DH5 \(\alpha\)(F' supE44 hsdS20 recA13 ara-14 proA2 lacY1 galK2 rpsL20 xyl-5 mtl-1 leuB6 thi-1)를 cloning의 숙주로 사용하였다. B. subtilis DB104 (his, nprR2, nprE18, aprE A3) 및 B. subtilis ISW1214 (hsrM, leuA8, metB5; Tets)는 (주)바이오리더스(BioLeaders, Daejeon, Korea)에서 분양받았으며, B. subtilis 168 (ATCC 33234, KCTC 2217)과 함께 발현숙주로 사용하였다. 균주들의 배양은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) \((250 \mathrm{rpm})\)에서 Luria - Bertani (LB) broth (Difco, USA)를 이용하였고, 필요에 따라 배지 \( 1 \mathrm{ml} \) 당 \( 100 \mu \mathrm{g} \) ampicillin 혹은 \( 10 \mu \mathrm{g} \) kanamycin을 첨가하였다.</p> <h2>\( \beta \)-Agarase 유전자의 B. subtilis에서의 분비발현</h2> <p>플라스미드 DNA 추출을 비롯한 일련의 분자생물학적 기법은 Sambrook 등의 방법을 따랐다. Agarivorans sp. JA-1의 \( \beta \)-agarase 유전자 증폭을 위한 template DNA는 앞서 보고한 pGEMTe-A_sp_b-agaE11 플라스미드 DNA를 이용하였다. A_sp_b-agaE8-F (5'-GAATTCCATATGGCTGCTACCTTAGTCACCTC-3', EcoRI-Nde I sites underlined)와 A_sp_b-agaE7-R (5'-GGATCCTACTCGAGCACTTTACGACGTCTTAG-3', BamHI-XhoI sites underlined)를 primer로 사용하여 Pyrobest DNA polymerase (Takara Bio Inc., Otsu, Japan)로 증폭한 후 pGEM-T Easy vector (Promega, WI, USA)에 ligation시켜 pGEMTe-A_sp_b-agaE87를 제작하였고, 이를 제한효소 EcoRI 과 BamHI로 처리하여 생성된 2.9-kb 의 B-agarase 유전자 단편을 B. subtilis 발현벡터인 pLip (BioLeaders, Daejeon, Korea)에 삽입시켜 pLip-A_sp_b-aga E87 를 제작하였다. 제작된 재조합 DNA들은 제한효소 처리에 의한 단편 및 염기서열 분석을 통하여 확인하였다. 3 가지 종류의 B. subtilis strain들을 pLip-A_sp_b-agaE87로 형질전환시켰고 이들을 kanamycin \( (10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 이 첨가된 \( 4 \mathrm{ml}\) LB에서 진탕배양 \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm}\right) \) 하였다. 배양시작으로부터 각 각 5, 7, 9, 11시간이 지난 후 배양액을 채취하여 원심분리 \( (5,000 \times \mathrm{g}, 5 \mathrm{~min}) \) 를 행하였으며, 상등액을 취하여 발현시료로 사용하였다.</p> <p>pLip-A_sp_b-agaE87를 가지는 B. subtilis ISW1214를 ka-namycin \( (10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 이 첨가된 LB1 Ⅰ에서 9시간동안 진탕배양 \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm}\right) \) 하였고, 배양액을 채취하여 원심분리 \( (5,000 \mathrm{xg}, 5 \mathrm{~min} \) )를 행하였다. 상등액에 함유된 \( \beta \)-agarase는 Centriprep Ultracel YM-10 (Millipore, Billerica, MA, USA)을 이용하여 농축하였고 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris \( / \mathrm{HCl} \) ( \( \mathrm{pH} 7.4 \)) 완충용액을 이용하여 투석을 행한 후 대량발현 효소시료로 사용하였다. 단백질의 정량은 BCA protein assay reagent (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 이용하여 행하였고, bovine serum albumin을 표준물질로 이용하였다.</p> <h2>SDS-PAGE</h2> <p>SDS-PAGE는 \( 11 \% \) polyacrylamide gel을 이용하여 Laemmli의 방법으로 행하였다. 효소용액을 5분간 끓인 후 gel에 주입하였고 coomassie brilliant blue R-250 (Bio-Rad, USA)으로 염색한 후 관찰하였다.</p> <h2>\( \beta \)-agarase 활성 측정</h2> <p>한천분해 효소의 반응산물인 환원당의 측정은 Somogy-Nelson법으로 실시하였다. 한천을 \( 50 \mathrm{mM} \) TAPS 완충용액 \( (\mathrm{pH} 7.8,1 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}, 1 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{CaCl} \) )에 \( 0.2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 비율로 녹인 후에 재조합된 \( \beta \)-agarase를 첨가하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응시켰다. 효소반응액 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 에 \( 2.0 \mathrm{ml} \) 의 Somogy 시약 \( \left(10 \% \mathrm{CuSO}_{4} 80 \mathrm{ml}, 1 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} 100 \mathrm{ml}, \mathrm{Na}_{2} \mathrm{SO}_{4} 180 \mathrm{~g}\right. \), \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot 12 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 71 \mathrm{~g}, \mathrm{C}_{4} \mathrm{H}_{4} \mathrm{O}_{6} \mathrm{KNa} \cdot 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 40 \mathrm{~g} \) per \( \mathrm{dH}_{2} \mathrm{O} \) 1 \(\mathrm{l})\)을 첨가하여 반응을 중지시키고 10분간 끓였다. 실온으로 냉각된 용액에 arseno-molybdate 시약을 첨가하고 \( 14,000 \mathrm{xg} \)에서 5분간 원심분리한 상층액의 홉광도를 \( 510 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. 한천분해 효소의 활성은 1분당 \( 1 \mu \mathrm{mole} \) 의 galactose를 생산해 내는 효소의 양을 1 unit로 정의하였고 galactose(Sigma, MO, USA)를 이용하여 표준적정곡선을 작성하였다.</p> <h2>한천분해산물의 생산</h2> <p>한천 \( 35 \mathrm{~g} \) 을 \( 50 \mathrm{mM} \) TAPS 완충용액 \( (\mathrm{pH} \) 7.8, \( 1 \mathrm{mM} \) \( \left.\mathrm{NaCl}, 1 \mathrm{mM} \mathrm{CaCl}_{2}\right) 665 \mathrm{ml} \) 에 넣고 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 가열한후 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 냉각시키고, 한천 \( 1 \mathrm{~g} \) 당 재조합 효소 \( 0.3 \mathrm{U} \) 를 첨가하여 24시간 반응시켰다. 이후 한천 \( 1 \mathrm{~g} \) 당 재조합효소 \( 2.0 \mathrm{U} \) 를 추가하고 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 추가 반응시켰다</p> <h2>한천분해산물의 TLC 분석</h2> <p>\( \beta \)-agarase에 의한 한천분해산물은 thin-layer chromatog-raphy (TLC)로 확인하였다. 효소분해산물을 silica gel 60 TLC plates (Merck, Darmstadt, Germany)에서 n-buta-nol/acetic acid/ \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}(2: 1: 1, \mathrm{v} / \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 를 전개용액으로 사용하 여 전개시켰고, \( 10 \% \) 황산용액을 뿌리고 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 가열하여 가시화하였다 표준물질로 neoagarohexaose(Sigma), neoagarotetraose (V-Labs Inc., St. Covington, LA, USA), D-galactose (Sigma)를 사용하였다.</p> <h2>항균효과 측정</h2> <p>B. subtilis와 E. coli를 각각 \( 50 \mathrm{ml} \) LB 액체 배지에 접종하여 잘 섞은 후 \( 10 \mathrm{ml} \) 씩 분주하고 한천분해산물을 \( 0,0.75 \), \( 1.5 \% \) 비율로 각각 첨가하였다. 이후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm} \) 으로 배양하면서 2, 4, 6시간째 시료를 채취하여 분광광도계로 600 \( \mathrm{nm} \) 에서 광학밀도를 측정하여 성장양상을 비교하였다.</p>