연구에서 SDS-PAGE는 Laemmli 방법을 수행하였으며 Fibrin zymography 활성 확인은 다른 연구자의 방법을 따랐다. 혈전용해효소의 기질 특이성을 알기 위해 다양한 기질을 이용하였으며 단백질의 N-말단 염기서열은 Edman-degradation 방법에 의해 분석하였다.
<h2>SDS-PAGE 및 fibrin zymography</h2> <p>본 연구에서 SDS-PAGE는 Laemmli 방법에 의해 수행하였다. 단백질 분석을 위한 시료 제조는 배양 상층액에 함유되어 있는 단백질 \( (40 \mathrm{~g}) \) 을 \( 10 \% \) TCA를 이용하여 변성 침전시킨 후 침전 된 단백질을 sample buffer (0.5 M Tris, \( \mathrm{pH} \) 6.8, \( 10 \% \) SDS, \( 20 \% \) glycerol 그리고 \( 0.03 \% \) bromphenol blue)로 5 배 희석한 후SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 본 연구에서 단백질 농도는 bovine serum albumin (BSA)를 표준시료로 이용하여 Bradford 방법으로 측정하였다.</p> <p>Fibrin zymography 활성 확인법은 다른 연구자의 방법에 따라 fibrinogen의 농도가 \( 0.12 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 가 되게 poly-acrylamide 용액에 혼합한 후 곧바로 thrombin (1.0 NIH \(\mathrm{unit/ml} \)) 을 첨가하여 제조한 fibrin-polyacrylamide 을 제조하였다. 각 lane에 배양 상층액 \( 100 \mathrm{ng} \) 의 단백질을 loading 한 후 \( 10 \mathrm{~mA} \) 의 일정한 전류를 걸어 전기영동을 실시한 다음, SDS에 의해 불활성화 된 효소를 재활성화 시키기 위해 gel을 \( 2.5 \% \) Triton X-100를 포함한 Tris 완충용액(\( 50\mathrm{mM}\), \( \mathrm{pH} \) 7.4)에 30 분간 침적하여 SDS를 제거하였다. 그리고 증류수로 여러번 세척하여 gel로부터 Triton X-100을 제거하였다. Fibrin 분해능을 지닌 단백질은 활성염색법에 의해 gel 상의 fibrin을 분해하여 Coomassie blue 염색 결과 투명대를 형성하기에 분획된 단백질의 혈전용해 활성은 활성반응 완충용액( \( 200 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{NaCl} \), \( 10\mathrm{mM}\) \( \mathrm{CaCl}_{2}, 0.02 \% \mathrm{NaN}_{3} \) 가 포함된 \( 30 \mathrm{mM} \) Tris 완충용액, \( \mathrm{pH} \) 7.4)에 gel을 침적하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 12 시간 반응을 시킨 후 투명대 형성 유무를 확인함으로서 확인하였다.</p> <h2>합성 기질을 이용한 기질 특이성 연구</h2> <p>혈전용해효소의 기질 특이성을 알기 위하여 Table 2 에 나열되어있는 다양한 기질을 이용하여 기질에 대한 효소의 특이성을 알아보았다. \( 0.5 \mathrm{mM} \) 기질용액 \( 0.2 \mathrm{ml} \) (20 mM Tris- \( \mathrm{HCl} \) 완충용액, \( \mathrm{pH} \) 9.0)과 조효소 \( (3.0 \mathrm{ug} / 0.2 \mathrm{ml}) \) 을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) water bath에 넣고 1 분간 반응시킨 후 \( 50 \% \) 초산용액 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 반응을 멈추게 하였다. 시료를 \( 405 \mathrm{~nm} \) 에서 반응 상층액의 흡광도를 측정하였다. 본 연구에서 효소 활성의 \( 1 \mathrm{unit} \)은 1 분간에 \( 1 \mu \mathrm{mol} \) 의 pritroanline의 생산하는 효소량으로 정의하였다.</p> <h2>N-말단 염기서열 분석</h2> <p>본 연구에서는 단백질의 N-말단 염기서열 분석을 위하여 SDS-PAGE 후에 겔상의 단백질을 electroblotting에 의해 polyvinylidene difluoride membrane로 이동시킨 후 Coomassie blue에 의해 membrane을 염색하였다. 염색된 단백질 시료 중 특정 부분의 단백질들을 단리하여 gas-phase protein sequencer (model Procise 491, ABI, U.S.A.)를 이용하여 Edman-degradation 방법에 의해 단백질의 N-말단 염기서열 분석을 분석하였다.</p>