제주조릿대(Sasa quelpaertensis Nakai) 잎 열수추출물이 미백소재로서의 활용 가능성을 평가한 결과, Trp-1 (DHICA oxidase)의 발현과 \( \alpha \)-MSH에 의해 유도되는 지속적인 ERK (extracellular signal-regulated kinase)의 활성화를 농도 의존적으로 저해 하는 등 tyrosinase와 TRP-1의 발현을 저해하는 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다. 이는 제주조릿대 열추출물이 식물성 미백 소재로서의 활용 가능성을 보여준다.
<h1>서 론</h1><p>피부색은 기저층에 존재하는 멜라닌 세포가 만들어내는 멜라닌의 함량에 의해 결정된다. 멜라닌은 태양 광선으로부터 들어오는 자외선을 차단하는 색소로서 과도하게 합성되거나, 노화 등에 의해 피부의 생리기능이 떨어지면 피부 표면에 침착되어 기미, 주근깨 및 다양한 색소로 나타난다. 멜라닌은 멜라닌 생성세포내의 멜라닌 소체에서 티로시나제 (tyrosinase), 티로시나제 관련 단백질 1(tyrosinase related protein 1; TRP-1), TRP-2 등과 같은 멜라닌 생합성 효소의 작용으로 합성된다. 멜라닌 생합성에서 티로시나제는 티로신(tyrosine)이 도파퀴논(dopaquinone)으로 전환되는 중요한 속도조절 단계를 매개하기 때문에 피부 색소조절 과정을 연구하는데 중요한 표지 유전자이다. 또한 티로시나제는 유멜라닌(eumelanin)의 중간대사산물인 5,6-dihydroxyindole (DHI)을 indole-5,6-quinone으로 전환하는 과정에도 관여한다고 알려져 있다. TRP-1의 기능은 아직 확실하게 밝혀져 있지는 않지만, 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA) 산화효소의 역할을 할 것이라는 보고와 더불어 티로시나제를 안정화시키는 작용을 할 것이라는 보고도 있다. 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (DOPA) chrome tautomerase라고 불리는 TRP-2는 중간대사 산물인 DOPA chrome을 DHICA로 이성질화시키는데 관여하며 멜라닌 생중합체 내에 carboxylated subunits의 구성을 조절하는 스위치 역할을 한다고 알려져 있다. 그러나 B16 흑색종 세포에서 \( \alpha \)-MSH 등의 멜라닌 생성 활성화 인자들에 의해 Trp-2의 발현이 오히려 억제된다는 보고도 있다.</p><p>피부가 자외선 자극을 받으면 각질형성세포(keratinocyte)에서 endothelin-1 (ET-1), \( \alpha \)-MSH, 부신피질 자극 호르몬, 일산화질소(\(\mathrm{NO}\)) 등이 분비되어 피부색소가 증가된다. \( \alpha \)-MSH는 멜라닌 생성세포에 있는 melanocortin-1 수용체에 결합하여 cyclic adenosine monophosphate (cAMP) 농도를 증가시켜 멜라닌 생성을 증가시키고, 일산화질소는 cyclic guanidine monophosphate (cGMP) 경로를 통해 멜라닌 생성을 증가시킨다. ET-1의 경우 멜라닌 세포의 protein kinase C 경로와 cAMP 경로를 통해 피부 색소형성을 촉진시킨다. 이밖에도 각질형성세포에서 분비되는 멜라닌 생성 촉진인자는 basic fibroblast growth factor, stem cell factor 등이 있다.</p><p>본 연구는 제주도 한라산에 광범위하게 자생하는 제주조릿대(Sasa quelpaertensis Nakai) 잎 열수추출물이 미백소재로서의 활용 가능성을 평가하기 위하여 수행하였다. 제주조릿대 잎은 2005년 4월에 제주도 교래리 지역에서 채집하여 음건한 다음 미세말로 만든 후 증류수에 침적하고 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 추출하여 동결 건조 분말로 만들었다. 우선 제주조릿대 잎 열수추출물의 버섯 티로시나제 억제활성을 분석한 결과, 미백소재로 사용되는 arbutin과는 달리 버섯 티로시나제 활성에 직접적인 영향을 나타내지는 않았다(Data not shown). 다음은 제주조릿대 잎 열수추출물이 세포내 티로시나제 활성과 멜라닌 생성에 미치는 영향을 조사하였다. B16/F10 흑색종 세포를 6 well plate에 \( 5 \times 10^{4} \) cells/\( \mathrm{mL} \) 농도로 24시간 동안 배양한 후 \( 50 \mathrm{nM}\) \(\alpha \)-MSH와 제주조릿대 잎 열수추출물 (31, 63, 125, 250, 500 \(\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \) 시료를 처리하였다. 세포배양 36시간이 지난 후 똑같은 조건으로 배지를 교환하여 총 72시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 세포를 수획하여 \( 0.2\mathrm{mM} \) phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)와 \( 1 \% \) Triton- X 100을 함유한 \( 67 \mathrm{mM} \) 인산 나트륨 완충용액( \( (\mathrm{pH} 6.8\)) \( 500 \mu \mathrm{L} \)를 첨가하여 초음퐈 분쇄기로 세포를 분쇄하였다. 세포 분쇄액을 1시간 동안 얼음에 보관한 후 \( 15,000 \mathrm{rpm} \)으로 20분간 원심분리하여 상층액을 얻고, 이 상층액을 티로시나제 활성 분석에 사용하였다. \( 33 \mathrm{mM} \) 인산 나트륨 완충용액( \( \mathrm{pH} 6.8\)), \( 9 \mu \mathrm{M} \) L-tyrosine, \( 4 \mathrm{mM} \) L-DOPA를 혼합한 후 상층액 \( 100 \mu \) \( \mathrm{L} \)를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 항온기에서 2시간 반응시켜 생성된 DOPA chrome을 \( 475 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 제주조릿대 잎 열수추출물을 \( \alpha \)-MSH와 동시에 처리한 실험군에서는 \( \alpha \)-MSH만 처리한 대조군에 비해 세포내 티로시나제 활성과 멜라닌 생합성(Fig. 1B)이 농도 의존적으로 저해됨을 관찰 할 수 있었다. 이는 제주조릿대 잎 열수추출물이 직접적으로 티로시나제의 활성을 저해하지 않고, \(\alpha\)-MSH에 의해 유도된 멜라닌 생합성 신호전달 경로에 작용하고 있음을 말해주는 결과이다. 따라서 제주조릿대 잎 열수추출물에 의한 멜라닌 생합성 관련 단백질의 발현양상을 분석하였다. 제주조릿대 잎 열수추출물은 티로시나제와 Trp-1 (DHICA oxidase)의 발현과 \( \alpha \)-MSH에 의해 유도되어지는 지속적인 ERK (extracellular signal-regulated kinase)의 활성화를 농도 의존적으로 저해 하는 결과를 보여 주었다.</p><p>피부 미백에 도움을 주는 소재로 활용되는 물질들은 멜라닌이 합성되기 전 단계, 합성 중, 혹은 합성 이후 단계에 각각 작용하여 멜라닌 생성을 저해한다. hydroquinone과 arbutin은 티로시나제 저해제이며, linoleic acid와 \(\alpha\)-linolenic acid는 티로시나제를 분해하는 물질로 알려져 있다. 또한, 멜라노좀의 이동을 억제할 수 있는 물질, 피부박리를 촉진시키는 물질, 티로시나제의 글리코실화(glycosylation)를 저해하여 멜라노좀의 성숙을 억제하거나, 티로시나제의 전사(transcription)를 억제하는 물질들에 대한 다양한 연구들이 진행되고 있다. 최근에는 부작용이 없는 식물추출물들을 대상으로 미백소재를 찾기 위한 연구들이 활기를 띠고 있다.</p><p>자외선 자극에 의해 피부 각질형성세포는 \( \alpha \)-MSH를 분비하여 멜라닌 생성세포의 멜라닌 생합성을 촉진한다. 본 연구에서 제주조릿대 잎 열수추출물은 \( \alpha \)-MSH에 의한 세포신호 전달 경로 중 지속적인 ERK 활성화를 저해함으로써 tyrosinase와 TRP-1의 발현을 저해하는 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다. 이는 제주조릿대 잎 열수추출물이 멜라닌 생합성 신호전달 경로를 저해하는 기전을 가진 식물성 미백 소재로서 활용 가능성이 있음을 보여준다.</p>