녹용 시료로부터 genomic DNA의 분리 및 정제는 Matsunaga 등의 방법을 변형하여 실시하였다. 총 13개의 시료 중 10개는 D-loop 영역의 염기서열을 위해 사용되었고, 나머지 3개는 원산지 동정을 위해 사용되었다. 분리 및 정제한 DNA의 농도는 UV 흡광도 측정을 통해 결정되었으며, TE buffer를 사용하여 희석 후 보관하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>녹용 시료</h2> <p>본 연구에 사용된 녹용은 서울의 경동시장에 위치한 녹용 수입회사로부터 수입면장을 확인한 러시아산 원용(Cervus ela-phus sibericus, 마록), 중국산 깔깔이(Cervus elaphus bac-trianus, 마록), 뉴질랜드산 뉴자(Cervus elaphus, 적록)등 각 13 개씩을 구입하여 공시재료로 사용하였다. 또한, 북미산 녹용(Cervus elaphus canadensis)은 실제 국내 유통이 금지되었으나 북미에서 수입되어 중국산으로 판매되는 제품을 녹용 수입 회사를 통해서 13점을 구매하여 사용하였다. 이중에서 각 10개의 시료는 D-loop 영역의 염기서열을 위한 시료로 나머지 3개의 시료들은 원산지 동정을 위한 검정용으로 사용하였다.</p> <h2>Total genomic DNA의 분리, 추출</h2> <p>녹용 시료로부터 genomic DNA의 분리 및 정제는 Matsunaga 등의 방법을 일부 변형하여 다음과 같이 실시하였다. 녹용 \( 1 \mathrm{~g} \)에 3 배 분량의 lysis buffer \( \left(155 \mathrm{mM} \mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl}\right. \), \( 10 \mathrm{mM} {KHCO} 3,1 \mathrm{mM} {EDTA}) \)를 첨가한 다음, homogenizer를사용하여 균질화시킨 후 \( 3,000 \times g \)로 15 분간 원심분리 하였다. 침전된 pellet에 lysis buffer II \( (100 \mathrm{mM} \) Tris- \({HCl}, \mathrm{pH} \) 8.0, \( 10 \mathrm{mM} {EDTA}\), \(10 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}\), \(0.5 \% \) SDS를 \( 3 \mathrm{ml} \)넣고 protei-nase \( \mathrm{K}(50 \mathrm{ug} / \mathrm{ml}) \)를 첨가한 후에 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)의 항온기에서 1시간동안 방치하였다. 이후 RNase \( (50 \mathrm{ug} / \mathrm{ml}) \)을 첨가한 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 처리하였다. 이들 혼합액에 \( 6 \mathrm{M} \mathrm{NaCl} 1.5 \)\( \mathrm{ml} \)과 chloroform \( 3 \mathrm{ml} \)을 첨가하고 잘 혼합한 후에 \( 12,000 \times \) \( g \)에서 15분간 원심분리 하였다. 이후 상층액을 버리고 DNA 침전물을 TE buffer \( (10 \mathrm{mM} \) TrisHCl \( \mathrm{pH} \) 8.0, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA)에 용해하여 분광광도계를 사용하여 \( 260\mathrm{~nm} \) 에서 UV 흡광도를 측정하여 분리한 녹용 DNA의 농도를 결정한 후 TE buffer (10 mM TrisHCl pH 8.0, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA)를 사용하여 최종 농도가 \( 50 \mathrm{ng} / \mathrm{ul} \)이 되도록 희석한 후 냉동 보관하였다. 또한 일부 genomic DNA 추출이 잘 되지 않는 녹용은 Genomic DNA isolation kit (Qiagen, Germany)를 사용하여 분리, 추출하였다.</p>