DNA 추출을 위해서 나도송이풀, 외풀, 주름잎 및 물칭개나물의 genomic DNA는 막자사발을 사용하여 건조된 식물체를 분쇄하고 DNeasy Plant Mini Kit를 사용하였다. 꽃며느리밥풀의 genomic DNA는 Cota-Sanchez et al.의 방법을 이용하여 분리했다. 또한 PCR 반응을 위해 DNA template \( 100 \mathrm { ng } \), forward pri-mer \( 2.5 \) pmol, reverse primer \( 2.5 \) pmol, dNTPs mixture \( 2 \mu l \)( \( 10 \mathrm { nM } \) each) 그리고 Pfu DNA polymerase \( 1 \mu l \) ( \( 3 U \))를 함유한 \( 100 \mu l \)의 반응액을 활용했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물재료</h2> <p>식물들은 충북 제천의 山野에서 채집하였다. 정확한 분류를 위하여 식물도감을 참고하고, 또한 전문가들의 조언도 받았다. 乾地黃은 국내의 한의원에 한약재를 납 품하는 제약사를 통해서 구입하였다.</p> <h2>DNA 추출</h2> <p>나도송이풀, 물칭개나물, 외풀 및 주름잎의 genomic DNA는 막자사발을 이용하여 건조된 식물체를 분쇄한 후, Qiagen 의 DNeasy Plant Mini Kit를 사용하여 분리하였다. 꽃며느리밥풀의 genomic DNA는 Cota-Sanchez et al.의 방법을 사용하여 분리하였다[6]. 간단히 설명하면, 막자사발을 이용하여 건조된 식물체를 미세하게 분쇄하고, 분말 \( 0.5 \mathrm { ~g } \) 을 \( 15 \mathrm { ml } \) 용량의 polypropylene tube에 넣고, 여기에 2 CTAB buffer \( 4 \mathrm { ml } \) 를 첨가하여 잘 섞은 후, \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 4 시간 동안 유지시켰다. 여기에 chloroform ◦ isoamyl alcohol (24:1) 혼합물 \( 4 \mathrm { ml } \) 를 첨가하여 vortex한 후, tabletop centrifuge를 사용하여 3,500 rpm으로 15 분간 원심분리하였다. 상등액에 isopropanol을 첨가하여 DNA를 침전시킨 후에, TE buffer \( (10 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } , \mathrm { pH } \) 8.0, \( 1 \mathrm { mM } \) EDTA)에 녹이고, RNase A를 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 overnight 동안 유지시켰다. 이것을 Promega의 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System으로 정제하였다.</p> <h2>PCR Amplification</h2> <p>PCR 반응을 위해서는 DNA template \( 100 \mathrm { ng } \), forward pri-mer \( 2.5 \) pmol, reverse primer \( 2.5 \) pmol, dNTPs mixture \( 2 \mu l \)( \( 10 \mathrm { nM } \) each) 그리고 Pfu DNA polymerase \( 1 \mu l \) ( \( 3 U \))를 포함하는 \( 100 \mu l \) 의 반응액에서 반응을 진행하였다. PCR 반응에 사용된 forward primer(5'-TTTAGATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3')및 reverse primer (5'-TTTAAGCTTCCAAGTATCGCATTTCGCT-3')의 위치는 Fig. 1A에 표시하였다. 반응 조건은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2 분간 한 cycle, 그리고 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 분, \( 58 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 분, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 3 분씩 30 cycle을 진행시킨 후, 최종적으로 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분간 유지시켰다. 이때에 사용된 forward primer 는 18S rRNA gene들의 5'-ends의 conserved region을 target으로 하여 제조되었다[14]. 이때에 현삼과 식물들의 18S rRNA genes에서 존재하지 않는 제한효소 \( BglⅡ 의 인식부위를 forward primer의 5'-말단에 첨가하여서 cloning시에 사용할 수 있도록 하였다. Reverse primer는 5.8S rRNA의 중간부위를 target으로 하여 제조하는데, 역시 cloning시에 사용하기 위하여 현삼과 식물들의18S rRNA gene, 5.8S rRNA gene 그리고 사이의 intergenic transcribed spacer에 존재하지 않는 HindⅢ의 인식부위를 첨가하였다. PCR에는 error가 많이 발생하는Taq DNA polymerase 대.신에 error가 횔씬 적게 발생하는 Pfu DNA polymerase를 사용함으로써 반응 중에 DNA sequence 가 변경되는 것을 최소화하였다[5].</p>