Sigma사에서 제공하는 다양한 시약을 사용하여 tyrosinase의 활성에 따른 멜라닌 고분자 변화 과정을 실험하였다. 본 실험은 L-tyrosine을 기질로 하여 DOPA chrome의 생성여부를 측정하였다. 특정 농도로 희석한 fucoidan과 함께 L-tyrosine과 mushroom tyrosinase를 혼합 후 30분 동안 배양하여 흡광도를 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약 및 실험 기기</h2> <p>실험에 사용된 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylte-trazolium bromide (MTT) 과 fucoidan, tyrosine, Triton X-100, mushroom tyrosinase, \( a \)-MSH, DOPA는 Sigma사(St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다. 그 외 시약은 일급 또는 특급 시약을 사용하였으며 세포 배양을 위한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지와 fetal bovine serum (FBS), 항생제 penicillin-streptomycin은 GIBCO사(Grand Island, NY, USA)의 제품을 사용하였다.</p> <p>실험에 사용된 기기는 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator (Forma Scientific 3111, Marietta, OH, USA), clean bench (Hanback Co, Ltd. HB-402SM, Seoul, Korea), microscope (Nikon TS 100, Japan), multi-detection microplate (Bio-TEK Synergy HT, Winooski, VT, USA) 등이었다.</p> <h2>실험 방법</h2> <p>Mushroom tyrosinase inhibition assay</p> <p>자외선 또는 주변 환경에 의해 tyrosinase가 활성을 갖게 되면 tyrosine (또는 DOPA)이 중간생성 단계인 DOPA chrome의 생성경로를 거쳐 자동 산화반응에 의해 멜라닌 고분자로 변화한다. 본 실험은 L-tyrosine을 기질로 하여 중간 단계인 DOPA chrome의 생성여부를 측정하였다. 즉, 다양한 농도별로 희석한 fucoidan \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 와 \( 50 \mathrm { ~mM } \) sodium phosphate buffer ( \( \mathrm { pH } \) 6.5)에 녹인 \(1 \mathrm { mM } \) L-tyrosine \( 170 \mu \mathrm { l } \)를 96-well plate에 넣고 mushroom tyrosinase \( (1,000 \mathrm { ~unit } / \mathrm { ml } ) \) \( 20 \mu \mathrm { l } \\)를 혼합한 후 상온에서 30분 배양한 후 \( 490 \mathrm { ~nm } \)에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 구하였다.</p> <p>\( \begin {array} { l } \text { 상대적 tyrosinase } \\ \text { 활성도( \%) } \end {array} = \frac {\text { 시료 첨가군의 O.D at } 490 \mathrm { ~nm } } {\text { 시료 무첨가군의 O.D at } 490 \mathrm { ~nm } } \times 100 \)</p> <h2>세포주 및 세포 배양</h2> <p>한국 세포주은행에서 분양받은 B16F10 멜라닌 세포주는 \( 10 \% \) FBS와 \( 1 \% \) penicillin-streptomycin이 첨가된 DMEM을 사용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) incubator에서 배양하였다.</p>