애기장대에서 찾은 AOX 합성 관련 유전자의 염기서열을 가지고 EST 데이터베이스를 통한 검색으로 Brassica rapa가 아닌 건 제거해 얻은 ESTs을 비교해서 같은 염기서열을 보이는 ESTs는 제거하고 총 15개의 ESTs를 얻었다. 고온을 기준으로 스트레스에 약한 '지부' 품종과 상대적으로 강한 '권심'의 배추종자를 한국배추게놈소재은행에서 분양받아 발아 후 어린 잎을 수확해 CTAB method를 이용해 DNA를 추출하였다. 증폭된 DNA는 DNA 조각의 크기를 확인하기 위해 \( 2 \% \)아가로스 gel에서 전기영동으로 확인하고 얻어진 염기서열분석 결과는 staden package라는 프로그램으로 '지부'와 '권심' 배추 사이의 염기서열을 비교했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>배추의 AOX 합성 관련 유전자 검색</h2> <p>애기장대의 AOX 합성 관련 유전자를 NCBI 데이터베이스를 이용하여 찾았다. 애기장대에서 찾은 AOX 합성 관련 유전자의 염기서열을 이용하여 EST 데이터베이스를 이용해 검색을 하였으며, Brassica rapa로 제한을 두고, Brassica rapa가 아닌 것은 모두 제거를 하였다. 그 결과 얻은 ESTs를 서로 비교를 하였으며, 동일염기서열을 보이는 ESTs들은 제거하여 총 15개의 ESTs를 얻을 수 있었다. '지부(Chiifu)'와 '권심(Kenshin)'의 염기서열을 비교하기 위해 각 EST에 그 양 끝 염기서열을 이용하여 포워드 프라이머와 리버스 프라이머를 각각 제작하였다.</p> <h2>식물 DNA 정제</h2> <p>한국배추게놈소재은행으로부터 분양받은 고온 스트레스에 약한 품종 '지부'와 비교적 강하다고 알려진 '권심'의 배추 종자를 발아시켜 키운 후 어린잎을 수확하고 CTAB method를 이용해 DNA를 추출하였다. 곱게 마쇄된 시료에 CTAB buffer를 \( 750 ~\mu \mathrm{l} \)을 가하고 30초 vortexing 하여 추가로 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 배양하였다. \( 750 ~\mu \mathrm{l} \) phenol:chloroform:isomyl alchol (25:24:1)을 넣고 15초 vortexing, 5분 원심분리 하였다. 얻은 상층액을 \( 2 ~\mathrm{ml} \) tube로 옮긴 후 두 번에 걸쳐 chloroform:isomyl alcohol (24:1) 용액으로 세척한 후 EtOH를 \( 900 ~\mu \mathrm{l} \) 넣고 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 보관 후에 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 원심분리 하였다. DNA 펠렛을 확인한 후 상층액을 버리고 자연건조를 시켰다. 추출된 DNA는 증류수 \( 50 ~\mu \mathrm{l} \)로 현탁시켰다.</p> <h2>중합효소연쇄반응(PCR)과 gel 전기영동</h2> <p>CTAB method를 이용하여 얻은 '지부'와 '권심' DNA를 각각 디자인한 프라이머를 이용하여 PCR증폭을 하였다. PCR에 사용된 모든 시약은 솔젠트 회사의 e-taq kit를 사용하였다. 증폭에 이용된 DNA는 \( 15 ~\mathrm{ng} \)이고 total volume은 \( 15 ~\mu \mathrm{l} \)로 \( 10 ~\mathrm{mM} \) dNTP \( 0.3 ~\mu \mathrm{l}, 10 \times \)buffer는 \( 1.5 ~\mu \mathrm{l} \), taq polymerase는 \( 0.4 \mathrm{~unit} \)으로 \( 0.08 ~\mu \mathrm{l}, 100 ~\mu \mathrm{M} \)의 Foward primer, Reverse primer 각각 \( 1 ~\mu \mathrm{l} \), '지부'와 '권심'의 DNA는 \( 15 ~\mathrm{ng} \)을 사용하였다. PCR은 \( 93^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분 후 \( 93^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 68^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분 과정을 40회 반복하고, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 7분 후 종료 또는 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관되었다. 증폭된 DNA는 \( 2 \% \) 아가로스 gel에서 전기영동을 이용해 DNA 조각의 크기를 확인하였다.</p> <h2>염기서열분석과 유전자 다형성분석</h2> <p>PCR 증폭을 해 얻은 DNA를 쏠젠트(주)에 염기서열분석을 의뢰하였다. 얻어진 염기서열분석 결과는 staden package 프로그램(http://staden.sourceforge.net/)을 이용하여 '지부'와 '권심' 간 염기서열을 비교하였다.</p>