GP 5+/ GP 6+ primer를 이용한 2nd PCR을 실시하였다. DNA 칩 부합화와 Chip scanning을 진행하였다. 이후 결정된 염기서열은 기존의 보고된 바이러스와 염기배열 상동성을 비교하기위해 NCBI BLAST search program을 사용해 결정했다.
<p>이어서 GP 5+/ GP 6+ primer를 이용한 2nd PCR을 실시하였다. 1st PCR 산물 \( 2.0 \mu \mathrm{l}, 10 \times \) 버퍼 \( 2.5 \mu \mathrm{l}, 2.5 \mathrm{mM} \) dNTP \( 2.0 \mu \mathrm{l} \), Taq polymerase \( (5 \mathrm{IU} / \mu \mathrm{l}) 0.5 \mu \mathrm{l} \), GP5+ primer (5'-TTTGTTAC TGTGGTAGATACTAC-3') \( 1.0 \mu \mathrm{l}, \mathrm{Cy} 5 \) 가 표지된 GP6+ pri-mer (5'Cy5-GAAAATAAACTGTAAATCATATT-3') 1.0 씨를 넣고 증류수로 총 \( 25.0 \mu \mathrm{l} \) 되게 하였다. PCR 조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 초기 변성하고 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초, \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 40초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초간 20회 반복 증폭 후 최종적으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3분간 신장단계를 수행하였다. 유전자 증폭 후 \( 2.5 \% \) 아가로스 겔에서 전기 영동하여 \( 150 \mathrm{bp} \) 크기의 PCR 산물 밴드를 확인하였다.</p> <h2>DNA 칩 부합화</h2> <p>2nd PCR 산물 \( 10.0 \mu 1 \) 을 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 변성시키고 얼음에 5분간 방치하였다. 사용 직전에 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 가온한 부합화 버퍼 \( 30.0 \mu 1 \) 를 PCR 산물과 혼합한 후 DNA 칩에 분주하여 \( 43^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 동안 부합화 oven (Vision Co., Korea)에 두었다. 부합화가 끝난 slide는 세척용 완충용액 I \( (2 \times \mathrm{SSC}, 0.1 \% \) SDS), П(0.2×SSC), \( \Pi(0.1 \times \mathrm{SSC}) \) 으로 각각 5 분간 2회, 2회, 1회 세척하였다.</p> <h2>Chip scanning</h2> <p>실온에서 건조시킨 후 scan array (Perkin Elmer, USA)에서 HPV DNA 존재유무 및 유형을 확인하였다. 각 DNA 칩에는 24의 형 특이 HPV DNA probe 한 쌍이 부착되어 있고 기준선(M)이 있어 양성반응을 보이는 HPV 유전자형을 확인할 수 있었다.</p> <h2>DNA 염기서열 분석</h2> <p>PCR 시험결과 양성이나 DNA chip 상에서 유전자형이 동정되지 않는 others type의 경우 유전자형 확인을 위하여 그 증폭산물은 솔젠트사(SolGent Co., Daejeon, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하였다. BigDye \( { }^{\circledR} \) terminator V3.1 cycle se-quencing kit (Perkin Elmer, USA)을 사용하여 sequencing 반응을 하였고, Millipore-Montage dye removal kit로 sequenc-ing 산물을 정제하였으며 ABI 3730XL capillary DNA ana-lyzer (Applied Biosystems, CA, USA)로 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI BLAST search program을 사용하여 기존의 보고된 바이러스와 염기배열 상동성을 비교하여 유전자형을 결정하였다.</p>