본 연구에서는 파랑볼우럭 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)와 큰입우럭 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)를 분리하기 위해 acrylamide separation gel과 stacking gel을 사용하였으며, chamber 위치에 따라 Buffer을 달리 채운후 시료 \( 3 \mathrm{ml} \) 와 sample buffer을 gel 상부에 가해 전기영동하여 분획을 진해하였다. 다음으로 위 동위효소의 기질의존성 및 최적 \(\mathrm{pH}\)를 구하기 위해 NADH를 포함한 Buffer에서 동위효소의 활성을 측정하여 최대 활성을 구했으며, 서로다른 기질에 대한 기질 특이성을 분석하였다. 또한 동위효소의 상대 활성을 구해 \( \mathrm{pH} \) 안정성 및 최적 \( \mathrm{pH} \)를 구하였다.
<h2>Preparative native-PAGE에 의한 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 분리</h2> <p>Preparative native-PAGE (Model 491 Prep cell, Bio-Rad)는 파랑볼우럭 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)를 정제하기위해서 \( 5 \% \) acrylamide separation gel과 stacking gel을 5:1로 만들었고, 큰입우럭 LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)를 분리하기 위해 \( 6 \% \) acrylamide separation gel \( (28 \times 50 \mathrm{~mm}) \)을 만들었다. Buffer (0.025 M Tris-Glycine, \(\mathrm{pH} \) 8.3)를 upper chamber에 \( 400 \mathrm{ml} \), lower chamber에 2 l, elution chamber에 \( 800 \mathrm{ml} \) 채운 후 시료 \( 3 \mathrm{ml} \) 와 sample buffer (0.0625 M Tris-HCl, \(\mathrm{pH} \) 6.8, \( 10 \% \) glycerol, \( 0.025 \% \) bromophenol blue)를 \( 1: 1(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 섞은 용액을 gel의 상부에 가하고, \( 460 \mathrm{~V}, 40 \mathrm{~mA} \)에서 전기영동 하였으며, bromophenol blue가 separation gel을 빠져나갈 때 elution buffer를 \( 0.75 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 유속으로 유입시키면서 용출액을 \( 0.5 \mathrm{ml} \)씩 분획 하였다. 각 분획의 LDH 활성을 측정하고, native-PAGE하여 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)만 존재하는 분획을 모아 농축시킨 후 기질의존성 실험의 시료로 사용하였다.</p> <h2>LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 기질의존성 측정 및 최적 \( \mathrm{pH} \)</h2> <p>\( 0.14 \mathrm{mM}\) NADH 를 함유하는 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer (pH 6.85)에 피루브산 \( 0.01 \sim 10 \mathrm{mM} \)을 가하고 파랑볼우럭 눈조직 추출액 및 파랑볼우럭과 큰입우럭의 정제한 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 활성을 측정하여 최대 활성을 기준으로 상대 활성(\(\%, V/Vmax\))을 구하여 기질농도에 의해 저해되는 정도를 확인하였다. 그리고 Lineweaver-Burk plot에 의해 \( K_{\mathrm{m}}{ }^{\text {PYR}} \)를 얻었다. \( 0.7 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{NAD}{ }^{+} \)를 함유하는 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 6.85)에 L-lactate \( 0.1 \sim 200 \mathrm{mM} \)을 가하고 \( 340 \mathrm{~nm} \)에서 LDH 활성을 측정하였고, 최대 활성에 대한 상대 활성 (\( \%\), \( \mathrm{V} / \mathrm{Vmax}) \)을 확인하였다. 또한 \( \alpha \)-ketobutyric acid, \( \alpha \)-ketovaleric acid, \( \alpha \)-ketoglutaric aicids, \( \alpha \)-ketocaproic acid, DL-d-keto- 3 -methyl-n-valeric acid, \( \alpha \)-ketoisocaproic acid, 및 \( \alpha \)-ketoisovaleric acid 등의 \( \alpha \)-ketoacids 기질에 대한 활성을 측정하여 기질 특이성을 확인하였다.</p> <p>파랑볼우럭과 큰입우럭의 정제한 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소를 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 0.1 \mathrm{M} \) sodium acetate buffer ( \( \mathrm{pH}\) 4.0,4.5,5.0), 0.1 \( \mathrm{M} \) sodium citrate buffer \( (\mathrm{pH} \) 5.5), \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH}\) 6.0, 6.5, 7.0), \(0.1 \mathrm{M} \) Tris-HCl buffer \( (\mathrm{pH}\) 7.5, 8.0 , 8.5), 0.1 M Tris-glycine buffer ( \( \mathrm{pH} \) 9.0) 및 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium carbonate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 9.5, 10.0, 10.5) 에 \( 0.1 \mathrm{mM} \) 피루브산, \( 0.5 \) \( \mathrm{mM} \) 피루브산 및 \( 1.5 \mathrm{mM} \) 피루브산에서 LDH 활성을 측정하여 비교하였고, 또한 최대 활성에 대한 상대 활성(\%)을 구하여 \( \mathrm{pH} \) 안정성 및 최적 \( \mathrm{pH} \)를 확인하여, 눈 조직 LDH 및 LDH eye-specific \( C_{4} \) 활성을 측정하는 조건으로 제시하였다.</p>