효소 고정화 방법은 담체의 활성화와 효소 고정화 2가지 단계로 이루어졌으며 자유 효소와 고정화 효소는 \( \mathrm{pH}6 \)에서 11의 조건에서 2시간 동안 반응을 얻은 다음 효소의 활성을 연구했다. 고정화 효소의 재사용 성능을 알아내기 위해서는 고정화 효소를 2시간 동안 casein의 가수분해를 하고난 다음 고정화 효소를 증류수로 1번, Tris-HCl buffer (0.1 M, pH 9.0)로 2번 씻은 다음 반응을 다시 얻었다. 충진층 반응기의 길이는 \( 20 \mathrm{~cm} \), 내부지름은 \( 2.8 \mathrm{~cm} \)이고 sin-tered glass filter와 water jacket을 붙여 온도를 조절했으며 충진층 반응기에 고정화 효소를 넣고 난황 단백질 용액을 부피유속을 다르게 공급했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>효소 및 시약</h2> <p>단백질 가수분해 효소는 alkaline protease인 Orientase BF-22 (EC 3.4.21.62; Hankyu Bio-industry, Osaka, Japan)를 사용하였다. 효소 고정화를 위해 5가지의 담체는 무기 담체인 Celite R640과 Silica gel 60은 Fluka에서 구입하였고, 이온교환수지로 사용되는 유기 담체인 Duolite A568는 Rohm and Haas에서, 그리고 Dowex W50과 Dowex 1 은 Sigma에서 구입하여 사용하였다. 난황 단백질은 난황 분말을 에탄올로 추출하여 사용하였고 효소 가수분해 전에 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \)에서 열처리하였다. 다른 모든 시약은 특급 이상을 사용하였다.</p> <h2>효소 고정화</h2> <p>Duolite A568에 효소 고정화 방법은 담체의 활성화와 효소 고정화 두 단계로 실시되었다. 담체 활성화 방법은 다음과 같다. Duolite A568 \( 1.0 \mathrm{~g} \)에 증류수 \( 10 \mathrm{ml} \)로 10분간 교반 세척한 다음 원심 분리하였고 여기에 \( 1 \mathrm{M} \mathrm{HCl} 5 \mathrm{ml} \)를 투입한 후 증류수 세척과 같은 방법으로 실시하였고 그 다음에 \( 1 \mathrm{M} \mathrm{NaOH} \) \( 5 \mathrm{ml} \)를 투입한 후 10분간 교반 세척 후 원심 분리하였다. 마지막으로 증류수 \( 10 \mathrm{ml} \)를 넣고 세척한 후 \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris-HCL 완충 용액( \( \mathrm{pH} \) 9.0) \( 10 \mathrm{ml} \)으로 2회에 걸쳐 담체를 세척하였다. 이와 같이 활성화된 담체에 효소를 고정화하였는데 Duolite A568\( 1.0 \mathrm{~g} \)을 \( 8.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 효소용액 \( 20 \mathrm{ml} \)에 첨가하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 동안 고반 하면서 고정화하였다. 고정화된 효소를 완충용액으로 세척하였다. Silica gel 60 과 Celite R640의 효소고정화는 각각 담체 \( 1.0 \mathrm{~g} \)을 \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris- HCL 완충 용액 \( (\mathrm{pH} \mathrm{9.0}) \)으로 제조된 \( 8.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 효소용액 \( 20 \mathrm{ml} \)에 첨가하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 교반 하면서 고정화하였다. 고정화된 효소를 완충용액을 사용하여 세척하였다. Dowex에 효소를 고정화하기 위해서는 우선 담체 \( 1 \mathrm{~g} \)을 완충용액 \( 25 \mathrm{ml} \)에 첨가하고 상온에서 24시간 교반 하면서 담체가 완충용액에 평형이 되도록 하였다. 담체를 회수하여 \( 8.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 효소용액 \( 20 \mathrm{ml} \)에 첨가하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 교반하면서 고정화하였다.</p> <h2>효소 활성 측정</h2> <p>단백질 분해 효소 활성은 다음과 같이 측정하였다. Tris-HCL buffer (0.1 M, pH 9.0)에서 제조된 \( 1.5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 수용성 casein \( 2 \mathrm{ml} \)에 자유효소의 활성을 측정하는 경우에는 \( 8.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 효소용액 \( 1 \mathrm{ml} \) 혹은 고정화 효소 활성 측정인 경우에는 무게가 측정된 고정화 효소를 넣고 반응 용액으로 하였다. 반응용액을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에 항온조에서 10 분간 반응한 후, \( 15 \% \) \( (\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) Trichloroacetic acid \( 2 \mathrm{ml} \)를 넣고 반응을 중지시켰다. \( 0.5 \mathrm{M} \)의 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 용액 \( 5 \mathrm{ml} \) 에 증류수 \( 1 \mathrm{ml} \) 와 Folin 시약 \( 1 \mathrm{ml} \)를 넣고 원심분리 후 얻어진 상등액과 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분 동안 반응하여 발색시켰다. \( 660 \mathrm{~nm} \)에서 tyrosine을 표준으로 흡광도를 측정하여 효소 활성을 결정하였다. 효소 활성 1 unit는 분당 tyrosine \( 1 \mu \mathrm{mol} \)을 생성시키는 효소의 양으로 정의 한다. 자유 효소와 고정화 효소의 단백질 양은 Lowry 방법으로 Bovine serum albumin을 표준으로 하여 측정하였다.</p> <h2>최적의 \( \mathrm{pH} \)와 온도</h2> <p>자유 효소와 고정화 효소 활성에 대한 최적의 \( \mathrm{pH} \)와 온도를 다음과 같이 조사하였다. \( \mathrm{pH} \)는 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 0.1 \mathrm{M} \mathrm{NaOH} \) 나 HCl로 조절하면서 6에서 11까지 변화시켰다. 온도는 \( \mathrm{pH} \) 9에서 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)부터 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)까지 변화시켰다.</p> <h2>\( \mathrm{pH} \) 안정성</h2> <p>자유 효소와 고정화 효소를 \( \mathrm{pH} \) 6에서 11의 조건에서 2시간 동안 반응 시킨 후 효소 활성을 측정하였다.</p> <h2>열 안정성</h2> <p>자유 효소와 고정화 효소의 열 안정성은 Tris-HCL buffer \( (0.1 \mathrm{M}, \mathrm{pH} \) 9.0)에서 온도를 달리하면서 30 분간 반응시킨 후 남아있는 효소활성을 측정하고 이것을 원래의 효소 활성에 대한 비율로서 표시하였다.</p> <h2>재사용 회분식(repeated batch) 조업</h2> <p>고정화 효소의 재사용 성능을 평가하기 위해 고정화 효소를 2시간 동안 casein의 가수분해를 실시한 후 고정화 효소를 증류수로 1회 그리고 Tris-HCl buffer (0.1 M, pH 9.0)로 2회 세척한 후 다시 반응을 실시하였다. 각 반응 단계에서 고정화 효소의 활성을 측정하였다.</p> <h2>충진층(packed-bed) 반응기 조업</h2> <p>충진층 반응기의 길이는 \( 20 \mathrm{~cm} \), 내부지름은 \( 2.8 \mathrm{~cm} \)이고 sin-tered glass filter와 water jacket을 부착하여 온도조절이 가능하게 하였다. 충진층 반응기에 고정화 효소를 투입하고 난황 단백질 용액을 부피유속을 달리하면서 공급하였다. 연속공정에서는 원료인 난황단백질 용액의 오염을 방지하기 위해 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)항온조에서 용액을 유지하였다. 고정화된 효소 \( 30 \mathrm{~g} \)을 충진층 반응기에 투입한 후 peristaltic 펌프(Eyela MP-3, Japan)로 원료 난황단백질 용액을 반응기에 공급하였다. 충진층 반응기를 이용한 연속공정의 개괄도가 Fig. 1에 나타내었다. 연속 공정에서는 5시간의 간격마다 시료채취를 하였으며 96시간 동안 운전하면서 효소의 활성을 측정하였다. 부피유속을 30 에서 \( 110 \mathrm{ml} / \mathrm{hr} \)로 변화시키면서 고정화된 효소의 활성 및 운전 성능을 평가하였다. 또한 난황 단백질을 원료로 사용하였을 때 casein과 연속 조업의 특성을 비교하였다.</p>