분리균주의 생화학적 분석을 위해 API 50 CHL kit를 통해 선별균주를 대상으로 49종의 탄수화물에 대한 발효능을 확인하였다. 분리균주의 형태학적 분석에서는 Gram staining하기 위하여 slide glass에 선별된 균주를 약한 불로 고정하여 crystal violet 시약으로 1분간 염색한 뒤 세척하고, Gram' iodine을 1분간 처리하여 세척한 후 마지막으로 95 \(\%\) 에탄올로 10~20초 동안 탈색한 다음 세척하여 현미경으로 관찰하였다.
<h2>분리균주의 생화학적 분석</h2> <p>API 50 CHL kit (bioMérieux sa, Marcy-l'Etoile, France)를 사용하여 선별균주를 대상으로 49 종의 탄수화물에 대한 발효능을 확인하였다. 선별균주를 MRS 액체배지에 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 배양한 뒤 스트립 튜브에 분주하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48 시간 동안 호기적으로 배양하였다. 실험 결과는 동정용 프로그램 Apiweb \( ^{TM}\) 에서 확인하거나 Bergey's manual을 참고하였다.</p> <p>\( CO_{2} \) 생성을 확인하기 위하여 시험관에 MRS 액체배지 5 \( \mathrm{ml} \) 을 넣고 기포가 생기지 않게 Durham tube을 넣은 다음 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15 분간 멸균하였다. 선별된 균주를 준비된 시험관에 접종한 뒤 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48시간 배양하여 Durham tube 내의 기포 발생 여부를 확인하였다.</p> <h2>분리균주의 형태학적 분석</h2> <p>Gram staining하기 위하여 slide glass에 선별된 균주를 약한 불로 고정하여 crystal violet 시약으로 1분간 염색한 뒤 세척하고, Gram' iodine을 1분간 처리하여 세척하였다. 마지막으로 95 \(\%\) 에탄올로 10~20초 동안 탈색한 다음 세척하여 현미경으로 관찰하였다. 전자현미경으로 균의 형태를 관찰하기 위해서 1시간 동안 \( 2.5 \% \) glutaraldehyde로 1차 고정하고 1시간 동안 \( 1 \% \) os-mium teroxide로 2차 고정을 한 뒤, 10~15분 동안 에탄올 \( (50,70,90,95 \% \) )을 이용하여 단계별로 탈수하고 \( 100 \% \) 에탄올로 10분씩 2번 탈수하였다. Hexametyldisilazane (HMDS)으로 10분씩 2번 처리하여 시료를 air-dry한 후, 이온중착기(hitachi E-1010, Japan)를 이용하여 백금이나 금으로 코팅하고 Scanning electron microscope (SEM, hitachi S-3500N, Japan) 으로 관찰하였다.</p> <h2>분리 균주의 whole cell protein의 특성</h2> <p>선별된 균주를 MRS 액체배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 배양한 후, \( 1 \mathrm{ml} \) 을 13,000 rpm 으로 1분간 원심분리하여 침전물을 멸균증류수로 2번 세척하고 멸균 중류수 200 \(\mu \mathrm{l} \)를 넣어 초음파세포분쇄기(Sonics \& Materials INC., Newtown, USA)를 이용하여 단백질을 추출하였다.</p> <p>선변 균주로부터 단백질을 추출한 시료를 13,000rpm으로 30초간 원심분리하고 상등액 100 \(\mu \mathrm{l} \)에 \( 5 \times \) loading buffer ( 250 \( \mathrm{mM} \) Tris-HCl, pH 6.8, \( 0.5 \mathrm{M} \mathrm{DTT}, 10 \% \) SDS, \( 0.5 \% \) bromophe-nol blue, \( 50 \% \) glycerol)를 20 \(\mu \mathrm{l} \) 첨가하여 \( 12 \%, 15 \% \) poly-acylamide gel에 각 시료 30 \(\mu \mathrm{l} \)씩 loading하고 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 뒤 \( 0.05 \% \) Coomassie brilliant blue R-250 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, USA)로 2 시간 동안 염색하고 destaining buffer Ⅰ (40\(\%\) methanol 160 \( \mathrm{ml}\), 10\(\%\) acetic acid \( 40 \mathrm{ml} \) ), destaining buffer Ⅱ (methanol 5 \(\% \) 20\( \mathrm{ml} \), acetic acid 7 \(\ %\) 28 \(\mathrm{ml} \)) 로 순차적으로 탈색하여 Sodium dodecyl sul-fate-polyacylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에서 나타나는 단백질 band를 분석하였다.</p>