본 실험에서는 황금 추출액 제조 후 임신 18일의 Sprague-Dawley계 흰쥐의 대뇌피질 신경세포를 Brewer 등의 방법에 따라 배양하였다. \( 2 \%\) \(\mathrm{O}_{2}\), \(5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) 환경에서 3시간 처리하여 저산소증을 유발하였으며, 유전자 클로닝 과정으로 증폭된 DNA 절편을 pCRII-TOPO transcription vector에 삽입하고, 삽입된 방향을 DNA sequencing으로 확인하였다. 다음으로 InnoGenex in situ hybridization Kit를 활용하여 In Situ Hybridization을 수행한 후 T7 혹은 SP6 RNA polymerase를 이용하여 in vitro transcription 하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>약재</h2> <p>실험에 사용된 황금(Scutellaria baicalensis GEORGI, SB)은 대한약전 및 대한약전 외 한약 규격주해에 근거하여 동국대학교 경주한방병원에서 구입하였다.</p> <h2>황금 물추출액 제조</h2> <p>황금(\(85.227 \mathrm{mg}\))에 \( 12.5 \mathrm{ml} \)의 증류수를 넣어 균질화하고 상온에서 4시간, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 18시간 흔든 후, 이를 \( 15,000 \mathrm{rpm} \)에서 15분간 원심분리하여 상등액을 얻고 여과멸균 \( (0.45 \mu \mathrm{m}) \)한 후 소량씩 분주하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다. 건조물의 양은 \( 1 \mathrm{ml} \) 추출액 3튜브를 동결 건조한 후 평균치를 사용하였다.</p> <h2>신경세포 배양</h2> <p>임신 18일(embryonic day \( 18: \mathrm{E}_{18} \) )의 Sprague-Dawley계 흰쥐의 대뇌피질선경세포를 Brewer 등의 방법에 따라 배양하였다. 즉, \( \mathrm{E}_{18} \)의 흰쥐를 dry ice가 들어있는 통속에 \(3\sim5\)분간 넣어 마취하고, 자궁을 가른 후 흰쥐 태아를 취하고 뇌를 잘라내있다. 대뇌피질 조직을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 \( 0.25 \% \) trypsin으로 처리하고 \( 1 \mathrm{mM} \) sodium pyruvate와 \( 10 \mathrm{mM} \) HEPES (\(\mathrm{pH}~7.4\))가 첨가된 HBSS용액(Invitrogen Life Technology, Carsbad, CA, USA) \( 5 \mathrm{ml} \)로 \(4\sim5\)회 세척하여 반응을 중단시켰다. 조직을 \( 1 \mathrm{ml}\) Hank's 용액으로 옮기고 끝을 불에 달구어 구멍을 작게 한 pasteur pipette으로 \(6\sim7\)회 통과시켜 신경세포를 분산시켰다. 이 후 분산된 세포를 모으고 세포수를 측정한 다음 약 1,500 cells/ \( \mathrm{mm}^{2} \)되도록 B27을 첨가한 plating neurobasal media (Invitrogen Life Technology) (\(100 \mathrm{ml} \) neurobasal, \( 2 \mathrm{ml} \) B27 supplement, \( 0.25 \mathrm{ml} \) glutamax I, \( 0.1 \mathrm{ml}\) \(25 \mathrm{mM} \) glutamate, \( 0.1 \mathrm{ml}\) \(25 \mathrm{mM} \) 2-mercaptoethanol)에 접종하여 \( 5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2} \) 배양조에서 배양한 다음 \(2\sim3\)일 간격으로 배양액을 feeding neurobasal media (\(100 \mathrm{ml} \) neurobasal, \( 2 \mathrm{ml} \) B27 supplement, \( 0.25 \mathrm{ml} \) gluta-max I)로 \( 1 / 3 \)씩 교환하였다.</p> <h2>저산소증 유발</h2> <p>Culture plate를 \( \mathrm{CO}_{2} \) Water Jacketed Incubator (Forma Scientific Inc., marietta OHIO, USA)를 이용하여 \( 2 \%\) \(\mathrm{O}_{2}\), \(5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) 환경에서 3시간 처리하여 저산소증을 유도하였다. 저산소 처리가 끝나면 배양세포를 정상산소 환경 배양조에 옮기고 계속 배양하였다.</p> <h2>Immunocytochemistry</h2> <p>배양용기(24-well plate)를 얼음 위에 올려놓고 배양액을 \( 500 \mu l \)의 ice-cold D-PBS (phosphate-buffered saline) \( (0.1 \mathrm{~g} / \) \( \mathrm{L} \mathrm{CaCl}_{2}, 0.2 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \mathrm{KCl}, 0.2 \mathrm{~g} / \mathrm{L}_{2} \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 0.1 \mathrm{~g} / \mathrm{L}_{3} \mathrm{MCl}_{2}- \) \( \left.6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 8.0 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \mathrm{NaCl}, 2.16 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4}-7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\right) \) 로 교환하였다. D-PBS를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) methanol \( (500 \mu l) \) 로 교환하고 5분 후 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) methanol \( (500 \mu \mathrm{l}) \) 로 다시 교환한 다음 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 두었다. Methanol을 ice-cold D-PBS \( (500 \mu l) \)로 교환하고 15분 후 preblock solution[\(0.05\%\) triton, \(5\%\) normal goat serum in h-PBS (20 mM NaPO4, pH 7.4, \( 450 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}) \) ]을 넣어 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 처리하였다. 1차 항체(anti-HO-1 rabbit polyclonal, 1:200, Affinity BioReagents, Golden, CO, USA; anti-PSD95(postsynaptic density 95) monoclonal, 1:500, Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY, USA)를 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 반응시킨 후 실온에서 preblock solution으로 20분씩 3회 세척하였다. 형광물질이 표지된 2차 항체(anti-mouse IgG, Alexa 488-labeled, 1:2,000 혹은 anti-rabbit IgG, Alexa 568 -labeled, 1:2,000)를 넣고 1시간 더 반응시킨 후, D-PBS로 15분씩 3회 세척하였다.</p> <h2>유전자 cloning</h2> <p>중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 기법으로 합성 primer (FW 5'-atggagcgtccacagec-3' ; R: \( 5^{\prime} \)-gccttct gtgcaatcttc-3')를 이용하여 HO-1 단백질의 아미노말단에 해당하는 461bp를 증폭하였다. 증폭된 DNA 절편을 pCRII-TOPO transcription vector (Invitrogen Life Science)에 삽입하고, 삽입된 방향을 DNA sequencing으로 확인하였다.</p> <h2>in vitro transcription에 의한 riboprobe의 제조</h2> <p>유전자가 포함된 pCRII-TOPO 재조합 plasmid를 제한효소를 사용하여 선형화하고(insert의 삽입방향과 선형화할 때 사용한 효소는 각각의 해당그림에 표시하였다.) T7 (Roche Molecular Biotechemicals, Indianapolis, IN) 혹은 SP6 RNA polymerase(Invitrogen)를 이용하여 in vitro transcription하였다. 이 때 digoxigenin(DIG)으로 표지된 UTP (DIG-UTP) (Roche)를 첨가하여 cRNA를 DIG로 표지하였다.</p> <h2>in situ hybridization</h2> <p>InnoGenex in situ hybridization Kit(Komabiotech, 서울)를 이용하여 ISH를 수행하였다. 면역염색이 끝난 세포에 hybridization buffer \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 넣고 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분간 처리한 다음, DIG-labeled cRNA를 첨가하고(200ng \( / \mathrm{ml}) 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 16~18시간 처리하였다. PBS로 세척 후 biotin-conjugated anti-DIG 항체를 넣고 실온에서 30분간 반응시켰다. 다시 PBS로 세척한 다음 alkaline phosphatase-conjugated streptavi\( \operatorname{din} \)을 넣고 실온에서 20분간 반응시킨 후, BCIP/NBT를 넣어 발색시켰다.</p> <h2>이미지 처리 및 signal intensity 측정</h2> <p>염색된 세포를 CCD camera(Photometrics Inc., Germany)가 장착된 형광현미경(Leica Re search Microscope DM IRE, Germany)으로 관찰하고, QFluoro version V1.0b software (Leica Microsystems AG, Wetzlar, Germany)를 이용하여 digital image를 획득하였다. IC의 signal intensity를 측정하기 위하여 digital image는 Photoshop 5.0K (Adobe) software를 이용하여 흑백으로 전환(gray scale 0~255)하고 명암을 반전한 다음, NIH Scion Image (version beta 4.02; Scion Corporation, Frederick, MD, USA)로 분석하였다. ISH image의 가지돌기에 형성된 RNA granule의 수를 측정하기 위하여 ISH 흑백 image를 NIH Scion Image software를 이용하여 분석하였다. 이때 gray scale intensity 50을 threshold 로 하여 그 이상을 유효 signal로 보았으며, 반점의 크기는 10~100 pixel로 정의하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험은 최소 8배수로 시행하였고, 세포의 생존율은 대조군에 대한 백분율(\(\%\) of control)로 표시하였다. 통계학적 유의성은 Mann-Whitney U test로 검증하였다.</p>