자연 상태의 꽃송이버섯은 인공 재배가 어렵다는 문제를 해결하기 위해 본 연구는 균사가 필요로 하는 탄소원, 질소원 등을 조사하고 균사 액체 배양 특성을 조사하여 꽃송이버섯의 균사생리 특성을 규명하고자 하였다. 시험에 사용한 균주는 KFGS01 등 8종과 KFRI644 등 10종을 사용하였으며, 분자생물학적 동정을 위해 ITS1-5.8S rRNA-ITS2 영역의 염기서열을 분석하였다. DNA 추출 후 증폭을 진행하였으며, 중합효소는 EF Taq DNA polymerase를 사용하였고 이를 재조합하여 형질전환시킨 후 ITS1-5.8S rRNA-ITS2 부위의 염기서열을 분석하였다.
<h1>서 론</h1> <p>꽃송이버섯(Sparassis crispa Wulf.: Fr.)은 균계(Fungi), 담자균문(Basidiomycota), 담자균강(Basidiomycetes), 주름버섯아강(Agaricomycetidae), 구멍장이버섯목(Polyporales), 꽃송이버섯과(Sarassidaceae), 꽃송이버섯속(Sparassis)에 속하고 있다. 우리나라의 꽃송이버섯은 소나무, 잣나무, 낙엽송, 전나무 등 침엽수에 발생하고 5월부터 발생하기 시작하여 여름철(7~8월)에 많이 발견되고 9월까지 발생한다고 알려져 있다. 꽃송이버섯은 \( \beta-1 \),3-glucan 함량이 높아 세포 면역기능이 향상되어 항암활성이 뛰어난 것으로 나타나 있어 그 효능은 이미 입증된바 있다. 꽃송이버섯은 식·약용이 가능한 버섯으로써 최근 인공 재배까지 가능하게 되어 건강기능성 식품 및 의약품 소재로써 가능성이 매우 높다. 하지만 자연 상태의 꽃송이버섯은 발견하기 힘들고 인공 재배의 경우에도 평균 70~80일 배양 기간과 35~45일 자실체 생육 기간이 소요된다. 이와 같은 장기간 배양으로 인하여 안정적인 재배법이 확립되지 않고 있다. 이러한 문제의 해결을 위해서는 우선적으로 액체 종균 배양에서부터 생리적, 화학적 특성 규명이 필요하다. 따라서, 본 연구에서는 균사가 필요로 하는 탄소원·질소원 종류 및 농도, \( \mathrm { pH } \), 배양 기간 등을 조사하고 대량 생산을 위한 접종원의 형태로써 액체 종균이 적합하므로 꽃송이버섯의 균사 액체 배양 특성 조사를 통하여 꽃송이버섯의 균사생리 특성을 규명하여 꽃송이버섯 대량 재배 및 균사체 산업화에 응용하고자 한다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>공시 균주</h2> <p>본 시험에 사용한 균주는 경상북도산림환경연구원이 보유하고 있는 KGFS01 등 8종과 국립산림과학원이 보유하고 있는 KFRI644 등 10종을 분양 받아 사용하였다. 균주는 PDA(potato dextrose agar, Difco 사) 배지에서 배양하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 보존하고, 8주마다 계대 배양한 것을 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하면서 실험에 사용하였다.</p> <h2>분자생물학적 동정</h2> <p>본 연구에 사용된 경상북도산림환경연구원 균주 KGFS01 등 8종의 균주에 대하여 분자생물학적 동정을 위하여 internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, internal tran-scribed spacer 2(이하 ITS1-5.8S rRNA-ITS2) 영역의 염기서열을 분석하였다. PDB(potato dextrose broth) 배지에서 정치배양하여 수거된 균사체는 액화질소에 넣고 분쇄하여 total DNA를 추출 하였다. 추출한 DNA 증폭은 Takara 사의 'Takara PCR Thermal Cycler DICE'를 사용하고 중합효소는 Solgent 사의 'EF Taq DNA polymerase'를 사용하였다. PCR 반응 조건은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) (20초), \( 58 ^ {\circ } \mathrm { C } \) (40초), \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) (1분)으로 30회 반복하였다. 프라이머는 ITS1 primer(5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')와 ITS4 primer(5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3')을 Jenotech 사에 의뢰하여 제작하였다. PCR 결과물은 Promega 사의 'pGEM easy T-vector'를 사용하여 재조합하였고, 재조합 T-vector는 RBC(Real Biotech Corp.) 사의 'HIT-DH5a' competent cell에 형질전환 하였다. 형질전환이 확인된 재조합 T-vector는 Solgent 사에 의뢰하여 삽입 부위인 ITS1-5.8S rRNA-ITS2 염기서열을 분석하였다.</p>