세포를 배양에서 ATX와 LPS 처리 후 IL-6과 TNF-\(\alpha\) 생성량을 ELISA Kit로 측정하였다. NGL cell을 ATX와 LPS 처리 배양된 cell을 분리하여 Promega luciferase assay system과 luminometer를 이용하여 NF- \( \kappa \)B 매개된 luciferase activity를 측정하였고, 이를 총 cell lysates의 단백질함량으로 표준화하여 BCA protein assay kit로 측정하였다. Superoxide radicalscavenging activity assay는 산소 라디칼의 제거능으로 확인하였다.
<h2>Cytokine 측정</h2> <p>96 well plate에 세포 ( \(5 \times 10 ^ { 5 } \)cells/ \( \mathrm { ml } \))를 분주하여 16시간동안 배양한 후, ATX를 농도별 ( \( 25-100 \mu \mathrm { M } \)) 로 1시간 처리한 후, LPS로 처리하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 20시간 배양하였다. 세포배양액 안에 존재하는 IL-6와 TNF- \( \alpha \) 생성량을 ELISA Kit (Pierce Endogen, Rockford, IL, USA)를 사용하여 측정하였다.</p> <h2>Reporter constructs, transfection, reporter cell line, and luciferase assay</h2> <p>NGL cell \( \left (5 \times 10 ^ { 5 } \right . cells/ \mathrm { ml } ) \)를 16시간 배양한 후, ATX를 농도 별 \( (25-100 \mu \mathrm { M } ) \)로 1시간 처리한 후 LPS( \(1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 로 처리하고 24시간 동안 배양한 후, cell을 분리하여 Promega luciferase assay system (Promega, Madison, CA, USA)과 luminometer (Tecan, USA)를 이용하여 luciferase activity를 측정하였다. NF- \( \kappa \)B 매개된 luciferase activity를 총 cell lysates의 단백질함량으로 표준화하였고, 단백질의 양은 BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA)로 측정하였다.</p> <h2>Superoxide radical scavenging activity assay</h2> <p>Superoxide radical \( \left ( \mathrm { O } _ { 2 } ^ { - } \right ) \)scavenging activity assay는 산소 라디칼의 제거능을 확인하는 실험법으로 PMS- \( \mathrm { NADH } \) super-oxide generating system을 이용하였다. 즉, Nitroblue tetrazo-lium (NBT, \( 156 \mu \mathrm { M } \)) 1 \( \mathrm { ml } \) 와 \( \beta \)-nicotinamide adenine dinu-cleotide hydrate (NADH, \(468 \mu \mathrm { M } \)) 1 \( \mathrm { ml } \) 를 혼합하고, positive control과 각 농도의 시료를 \( 1 \mathrm { ml } \) 씩 넣어 교반한 후, \( 1 \mathrm { ml } \) 의 phenazine methosulfate (PMS, \(60 \mu \mathrm { M } \)) 를 넣고 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5분간 배양한 후, \( 560 \mathrm { ~nm } \) 에서 absorbance를 측정하였다.</p>