경골어류 농어목 파랑볼우럭은 4, 5, 9월에, 큰입우럭은 9월에 채집하여 얼음에 채워 운반하였고, 눈조직에 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer \( \left(\mathrm{pH} 6.85,4^{\circ} \mathrm{C}\right) \)를 3배 \( (\mathrm{v} / \mathrm{w}) \) 가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 glass homogenizer로 파쇄한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 20,000 \times g \) 에서 1시간씩 2회 원심분리(Mega 21R, Hanil)하였으며 상등액을 시료로 사용하였다. 파랑볼우럭 눈조직의 LDH 동위효소를 확인하기위해서 Western blotting 및 면역침강반응 후 native-PAGE를 실시하였다. 눈조직 추출액에 소(Bos taurus) LDH \( \mathrm{B}_{4} \), 꺽지(Coreoperca herz) LDH \( \mathrm{A}_{4} \) 및 조피볼락 LDH \( \mathrm{B}_{4} \) eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)에 대한 항혈청을 각각 1: 0.5, 1: 4, 1: 0.5\((\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 가했고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12h, \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1h 면역침강반응 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 20,000 \times \mathrm{g} \)에서 원심분리하고, 상등액을 native-PAGE해 LDH 동위효소를 확인했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료 및 조직 추출액의 준비</h2> <p>경골어류 농어목 파랑볼우럭(Lepomis macrochirus, \( 10 \pm 3 \) \( \mathrm{cm} \) )은 4, 5, 9월에, 큰입우럭(Micropterus salmoides, \( 35 \pm 5 \mathrm{~cm} \) )은 9월에 채집하여 얼음에 채워 운반하였고, 눈조직에 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer \( \left(\mathrm{pH} 6.85,4^{\circ} \mathrm{C}\right) \)를 3배 \( (\mathrm{v} / \mathrm{w}) \) 가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 glass homogenizer로 파쇄한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 20,000 \times g \) 에서 1시간씩 2회 원심분리(Mega 21R, Hanil)하였으며 상등액을 시료로 사용하였다.</p> <h2>Native-polyacrylamide gel 전기영동(native-PAGE): Western blotting 및 면역침강반응</h2> <p>파랑볼우럭 눈조직의 LDH 동위효소를 확인하기위해서 Western blotting 및 면역침강반응 후 native-PAGE를 실시하였다. Native PAGE는 polyacrylamide vertical slab system (SE250, Hoefer)으로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지시키면서 실시하였다. Slab gel은 \( 7.5 \% \) acrylamide separation gel 및 \( 2.67 \% \) acrylamide stacking gel로 만들었고, 시료에는 sucrose와 bromo phenol blue 용액을 1: 1\( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 가한 후 \( 5 \mathrm{mM} \) Tris-glycine buffer \( (\mathrm{pH} \) 8.3)를 사용하여 \( 100 \mathrm{~V} \)에서 20분간, \( 200 \mathrm{~V} \)에서 2시간 10분간 전기영동하였다. LDH는 DL-lactate, NBT, PMS 및 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 혼합한 용액으로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 염색한 후, \( 15 \% \) 초산 용액에서 고정하였다. Western blotting 실험은 LDH eye-specific \( C_{4} \) 동위효소를 native-PAGE한 후 semi-dry transfer systems (Trans-blot SD, Bio-Rad)에서 \( 0.015 \mathrm{M} \) Tris-glycine buffer \( (\mathrm{pH} \) 8.3)를 사용하여 \( 25 \mathrm{~V} \)에서 30분간 nitrocellulose 막에 전이시켰다. 막을 \(5\%\) skim milk/TBS \( (0.01 \mathrm{M} \) Tris buffered saline, \( \mathrm{pH} 7.5 \) ) 용액에 넣고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응 시킨 후 TBS 용액으로 10분간 3회 세척하였다. \( 1 \% \) skim milk/TBS로 희석한 조피볼락(Sebastes schlegeli) LDH eye-specific \( \mathrm{C}_{4}\)(1: 1,000)에 대한 항혈청 용액에 막을 넣고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응 시킨 후 TBS 용액으로 10 분간 2회 세척하였다. \(1\%\) skim milk/TBS를 사용하여 희석시킨 2차 항체 (anti-rabbit \( \mathrm{IgG}\), 1: 1,000) 용액에서 1시간 반응시키고 TBS 용액으로 10분간 3회 세척하였다. 전개용액(chloronaphtol, methanol, TBS, 30\% \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) )으로 반응시키고 증류수로 세척 후 밴드를 확인하였다.</p> <p>눈조직 추출액에 꺽지(Coreoperca herz) LDH \( \mathrm{A}_{4} \), 소(Bos taurus) LDH \( \mathrm{B}_{4} \), 및 조피볼락 LDH \( \mathrm{B}_{4} \) eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)에 대한 항혈청을 각각 1: 0.5, 1: 4, 1: 0.5\((\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 가하고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 면역침강반응 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 20,000 \times \mathrm{g} \)에서 원심분리하였으며, 상등액을 native-PAGE하여 항원-항체 복합체를 이루지 않은 LDH 동위효소를 확인하였다.</p>