실험에 사용된 모자반(S. fulvellum)은 건조 후 분쇄하여 시료의 10배량에 해당하는 80%methanol을 가하여 24시간동안 교반하며 3회 반복추출 하고극성층과 비극성층으로 나누어 비극성에서 극성쪽으로 계통 분획하고각 분획층을 감압 농축 후 동결 건조하여 시료로 사용하였다.모자반 분획물의 DPPH radical 소거능은 Blois의 방법을 수정한 version에 따라 측정하였고 SOD 활성은 SOD assay kit 사용하여 manufacturer's instruction에 기술된 방법에 따라서 수행하였다.아질산염 소거능은 Gray와 Dugan의 방법을 변형하여 측정하였으며 ADH 활성은 Choi 등의 방법을 변형하여 측정하였다.그리고 ALDH의 활성도는 Tottmar 등의 방법을 변형하여 NADH 생성에 따른 흡광도의 변화를 spectrophotometer를 이용해 측정했다.\alpha-Glucosidase 저해활성 측정은 Tibbot의 방법에 따라 측정하였고 피부노화, 특히 주름생성에 있어 주된 역할을 하는 matrix metallo proteinases인 elastase의 저해활성은 James의 방법에 따라 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료</h2> <p>본 실험에 사용한 모자반(S. fulvellumb)은 제주산 건 모자반을 구입하여 세척, 건조 후 분쇄기로 분말을 제조한 후 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하면서 모자반의 유기용매 추출 및 분획물 제조를 위한 재료로 사용하였다.</p> <h2>시료 추출 및 분획 제조</h2> <p>실험에 사용된 모자반(S. fulvellum)은 건조 후 분쇄하여 시료의 10배량에 해당하는 \( 80 \% \) methanol을 가하여 24시간동안 교반하며 3회 반복추출 하였다. 즉 \( 80 \% \) methanol 추출물을 물에 용해시켜 dichloromethane \( \left(\mathrm{CH}_{2} \mathrm{Cl}_{2}\right) \) 분획과 aqueous 층으로 나누고 dichloromethane층은 다시 n-hexane 분획층과 methanol 분획층로 분리하였으며, aqueous 층은 다시 부탄올 분획층과 aqueous 분획층으로 분획하였다. 이와 같은 방법으로 모자반 추출물을 극성층인 methanol층(SFMM), buthanol층(SFMB), aqueous층(SFMA)과 비극성층인 hexane층(SFMH)으로 나누어 비극성에서 극성쪽으로 계통 분획하고각 분획층을 감압 농축 후 동결 건조하여 시료로 사용하였다.</p> <h2>DPPH radical 소거능 측정</h2> <p>모자반 분획물의 DPPH radical 소거능은 Blois의 방법을 수정한 version에 따라 측정하였다. DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 용액은 \( 100 \mathrm{ml} \) 에탄올에 DPPH \( 1.5 \times 10^{-4} \mathrm{M} \)을 녹인 후 증류수 \( 100 \mathrm{ml} \)를 혼합하여 Whatman filter paper No.2로 여과하여 조제하였다. 96 well plate에 시료와 DPPH 용액을 \( 1: 4 \) 비율로 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시킨 후, ELISA reader를 이용하여 \( 520 \mathrm{~nm} \) (Molecular Device, VersaMax Microplate Reader, Calfornia, USA)에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능(Electron donating ability, EDA)은 EDA (\( \% \)) =(대조구흡광도-시료첨가구흡광도)/대조구흡광도 \( \times 100 \)으로 계산하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조그룹과 흡광도차를 비교하여 free radical의 제거활성을 백분율로 나타내었다.</p> <h2>SOD 활성 측정</h2> <p>SOD (superoxide dismutase) 활성은 SOD assay kit(Dojindo Molecular Technologies, Rockville, USA)를 사용하여 manufacturer's instruction에 기술된 방법에 따라서 수행하였다. 시료를 농도별로 희석하여 96 well plate에 \( 20 \mu l \)씩 분주한 후, WST working solution을 \( 200 \mu l\)을 넣고 혼합한 다음 enzyme working solution을 \( 20 \mu \mathrm{l} \)을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서20 분간 incubation 한 후 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 대조구 실험은 효소 대신 \( 20 \mu \mathrm{l} \) dilu-tion buffer를 넣었으며, SOD 활성은 시료 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율(%)로 나타내었다.</p> <p>SOD activity \( \% \)=(1-시료 첨가구의 흡광도/시료 무첨가구의 흡광도 \( ) \times 100 \)</p> <h2>아질산염 소거능 측정</h2> <p>아질산염 소거능은 Gray와 Dugan의 방법을 변형하여 측정하였다. 아질산염 용액에 시료 용액 \( 1 \mathrm{ml} \)을 가하고 여기에\( 0.1 \mathrm{~N}\) \( \mathrm{HCl} \)\((\mathrm{pH} \) 1.2) 및 \( 0.2 \mathrm{M} \) 구연산 완충용액 \( \mathrm{pH}\) 3.0 과 6.0을 사용하여 반응 용액의 \( \mathrm{pH} \)를 각각 1.2, 3.0 및 6.0으로 조정하여 반응용액을 준비 하였다. 이를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 시간동안 반응시킨 다음 반응액을 각각 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 취하고 Griess 시약을 가하여 혼합시켜 15분간 실온에 방치시킨 후, \( 520 \mathrm{~nm} \)에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염을 구하였다. 대조구 실험은 Griess 시약 대신 증류수를 \( 0.4 \mathrm{ml} \) 가하여 상기와 동일하게 행하였다.</p> <p>아질산염 소거능은 다음과 같은 계산식으로 계산하였다. 아질산염 소거율\( \% \)=[1-(실험첨가구의 흡광도-실험무첨가구의 흡광도)/대조구의 흡광도] \( \times 100 \)</p> <h2>ADH (alcohol dehydrogenase) 활성 측정</h2> <p>ADH 활성은 Choi 등의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 시험관에 NAD \(300\mu \mathrm{l} \), 증류수 \( 1.4 \mathrm{ml}, 1 \mathrm{M} \) Tris-\( \mathrm{HCl} \) \( (\mathrm{pH} \) 8.8) buffer \( 750 \mu l \), \( 0.2 \mathrm{M} \) 에탄올 \( 300 \mu \mathrm{l} \), 시료 \( 100 \mu \mathrm{l} \), ADH효소액 \( 150~ \mu \mathrm{l} \)를 넣고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시킨 후 생성된NADH의 양을 \( 340 \mathrm{~nm} \)에서 spectrophotometer (Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd.)를 이용하여 측정하였다. 이때 대조구는 시료대신 증류수를 넣었으며 positive control로 사용한 hepos는 약국에서 구입한 것으로, 처방전에 따라 1/2로 희석하여 사용하였다. ADH의 활성은 다음과 같은 식으로 계산 되었다.</p> <p>ADH activity \( (\%)=(B / A) \times 100 \)</p> <p>A : 대조구의 최대 흡광도 B : 실험구의 최대 흡광도</p> <h2>ALDH (acetaldehyde dehydrogenase) 활성 측정</h2> <p>ALDH의 활성도는 Tottmar 등의 방법을 변형하여 NADH 생성에 따른 흡광도의 변화를 spectrophotometer (Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd.)를 이용하여 \( 340 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 즉, ALDH의 활성도 측정을 위해 증류수\( 2.1 \mathrm{ml}\), \(1.0 \mathrm{M} \) Tris-\( \mathrm{HCl} \) buffer \( \left(\mathrm{pH}\right. \) 8.0) \( 0.3 \mathrm{ml}\), \(20 \mathrm{mM}\) \({NAD}{ }^{+} \) \( 0.1 \mathrm{ml}\), \(0.1 \mathrm{M} \) acetaldehyde \( 0.1 \mathrm{ml}\), \(3.0 \mathrm{M}\) \( \mathrm{KCl} \) \(0.1 \mathrm{ml}\), \(0.33 \mathrm{mM}\) M 2-mercaptoethanol \( 0.1 \mathrm{ml} \), 시료 \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 혼합한 다음 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10 분간 반응시키고 ALDH 효소액 \( 150 \mu 1 \)를 가하여 흡광도의 변화를 측정하였다. 이때 대조구는 시료대신 증류수를 넣은 것으로 하였다. Positive control은 ADH활성 측정에서 사용한 것과 동일한 것으로 하였으며, ALDH의 활성은 ADH 활성 계산식에 따라 측정되었다.</p> <h2>\alpha-Glucosidase저해 활성 측정</h2> <p>\alpha-Glucosidase 저해활성 측정은 Tibbot의 방법에 따라 측정하였다. \( 50 \mathrm{mM} \) sodium succinate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 4.2)에 p ni-trophenyl-a-D-glucopyranoside (PNPG)를 용해시켜 \( 1 \mathrm{mg} \) /\( \mathrm{ml} \)의 농도로 기질을 만들고, 기질용액 \( 0.2 \mathrm{ml} \)과 효소액 \( 0.075 \) unit/ml를 혼합하여 대조구는 증류수 \( 0.1 \mathrm{ml} \), 반응구에는 시료 \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시킨 후 1 N NaOH \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 발색시켰다. Positive control로는 acarbose를 사용하여 실험하였으며 \alpha-glucosidase 효소 활성측정은 생성된 \( \rho \)-nitrophenol (PNP)양을 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하여 다음의 식으로 저해율을 산출하였다.</p> <p>저해율 \( (\%)=[1 \)-(반응구의 \( \rho \)-nitrophenol생성량 \( / \) 대조구의 \( \rho \)-nitrophenol생성량) \( ] \times 100 \)</p> <h2>Elastase 저해활성 측정</h2> <p>피부노화, 특히 주름생성에 있어 주된 역할을 하는 matrix metallo proteinases (MMPs)인 elastase의 저해활성은 James의 방법에 따라 측정하였다. \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-\( \mathrm{HCl} \) buffer \( (\mathrm{pH} \)8.2)에 기질인 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroniline을 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 농도로 용해시킨 후 시료 및 elastase 효소액을 각각 \( 50 \mu 1 \)씩 첨가하였다. 이 혼합액을 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시킨 후 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 \( 415 \mathrm{~nm} \)에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다. Elastase 저해활성은 시료용액 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <p>저해율 \( (\%)=[1 \)-시료첨가구의 흡광도 \( / \) 무첨가구의 흡광도]\(\times 100\)</p>