본 논문에서는 장염 비브리오균이 생산하는 콜라겐 분해효소의 병원성인자로서의 역할을 조사하고자 allelic exchange 방법을 이용하여 콜라겐 분해효소가 불활성화된 균주를 얻고자 하였고, Plasmid pVCM01에 cloning된 \( \tau p p C \) 유전자를 불활성화 시키기 위하여 kanamycin 저항성 유전자를 \( v p p C \) 유전자에 삽입하였다.
<p>초기농도 \( 1.0 \times 10 ^ { 7 } \mathrm { CFU } / \mathrm { ml } \) 의 V. parahaemolyticus는 단계별로 희석하여 vero cell이 들어있는 96 well microplate에 100 씨씩 넣고 24 시간 배양한 후 상등액을 제거하고, 각 well에 DMEM배지로 희석된 MTT 용액 \( (5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) 50 \) 씨롤 첨가하였다. \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에서 4 시간 배양한 후, 상등액을 제거하고 100 150 ll dimethylsulfoxide를 첨가하여 피펫으로 20 분 정도 용해 시켜준 다음, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 배양기에서 5 분간 배양해서 공기 기포를 없애준 후, ELISA reader로 생성된 forma-zan의 흡광도를 \( 570 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <p>장염 비브리오균이 생산하는 콜라겐 분해효소의 병원성인자로서의 역할을 조사하고자 allelic exchange 방법을 이용하여 콜라겐 분해효소가 불활성화된 균주를 얻고자 하였다. V. parahaemolyticus 04 염색체 DNA를 이용하여 \( \mathrm { PCR } \) 을 통해 증폭된 \( 2.6 \mathrm { ~kb } \) 의 콜라겐 분해효소 유전자 \( v p p C \) 를 pGEM7Zf \( \left ( ^ { + } \right ) \)벡터에 cloning하여 \( \mathrm { pVCM01 } \) 를 구축하였다. 이 DNA를 Cla, HindIII, EcoKV, HincII등의 제한효소를 처리하여 DNA 단편들의 절단 형태로서 클로닝된 DNA가 vppC 임을 확인하였다. 재조합 suicide plasmid pVCM03의 구축에 대한 전과정은 Fig. 1에 바타내었다. Plasmid pVCM01에 cloning된 \( \tau p p C \) 유전자를 불활성화 시키기 위하여 kanamycin 저항성 유전자를 \( v p p C \) 유전자에 삽입하였다. 약 \( 1.2 \mathrm { ~kb } \) 의 kanamy-cin 내성 유전자는: pBSL86 plasmid에서 SmaI 제한효소로 절단하여 분리하였고 \( \mathrm { vppC } \) 를 포함하는 \( \mathrm { pVCM } 01 \mathrm { DNA } \) 는 EcoRV 제한효소르 처리하여 blunt-end로 만든 후 CIAP효소를 처리하여 \( 5 ^ {\prime } \) 의 인산기를 제거하였다. \( 1.2 \mathrm { ~kb } \) kanamycin 내</p>