Hyponex 배지를 사용하여 석곡 종자의 무균 발아를 위해 파종한 결과, 70여일 후부터 발아하기 시작하였으며, Hyponex 배지는 Cymbidium속, 새우난초와 해오라비난초의 종자 파종시 발아상태가 양호하고 발아소요 일수가 짧아 MS배지나 KC배지보다 발아용 배지로 적합하며, 사과즙, 코코넛 밀크, 바나나액과 같은 천연산물이 무균 파종 시 발아상태를 양호하게 하는 것으로 보고되고 있으며, 그러나 본 실험에서는 액체배지에서 석곡의 액아를 연속배양 하여도 액아로부터 식물체가 발달하는데 별 문제가 없었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>석곡 종자의 무균발아 및 유식물체 배양</h2> <p>석곡 종자의 무균 발아를 위해 Hyponex 배지를 사용하여 파종한 결과 Fig. 1B와 같이 석곡종자는 파종 후 70여일 후부터 발아하기 시작하였다. 종자의 성숙정도와 흡습상태에 따라 지속적으로 발아하였으며 파종한 종자의 발아가 오랜 기간 진행되므로 배지의 양과 배지에 첨가한 바나나액, 감자액, 사과액과 같은 천연산물의 효과가 중요하리라고 생각되었다.</p> <p>Hyponex 배지는 Cymbidium속 (Choi and Chung 1991), 새우난초와 해오라비난초 (Chung et al. 1998b)의 종자 파종시 발아상태가 양호하고 발아소요 일수가 짧아 MS배지나 KC배지 (Knundson 1946)보다 발아용 배지로 적합한 것으로 알려지고 있다. 또한, 난의 무균 파종시 첨가되는 사과즙이나 코코넛 밀크, 바나나액과 같은 천연산물은 Cymbidium속, 새우난초와 해오라비난초 발아 및 유묘생장에 효과적인 것으로 알려져 있다 (Chung et al. 1998b; Kim et al. 1998). 난 종자의 발아소요기간은 Cymbidium속 종자 경우 종피를 연화시키거나 제거시켜주는 \( 0.1 \mathrm{N} \) KOH와 초음파 처리로 단축할 수 있었는데 이와 같은 처리방법에 의해 43~90여일 사이에 종자가 모두 발아되는 것을 관찰할 수 있었다. 석곡 종자 무균 파종 후 발아에 소요되는 기간을 단축하기 위하여 살균 수에서 일정시간 침지하는 방법이외 물리적, 화학적인 방법을 동시에 실시해 볼 필요가 있다고 생각된다. 석곡은 자연 상태에서 줄기를 그대로 눕히거나 절단하여 육묘상에 삽목하는 방법으로 번식이 가능하다. 본 연구에서도 기내무균 발아된 석곡 유묘의 줄기를 절단하여 한천배지에서 배양할 경우 액아에서 식물체가 생성되었다.</p> <h2>석곡 유식물체 절편의 고체배지에서 배양</h2> <p>크기가 \( 3 \mathrm{cm} \) 정도인 석곡 유식물체의 줄기를 \( 0.5 \mathrm{cm} \) 정도로 잘라 MS배지에 식물생장조절제가 첨가되지 않은 배지 (hormone free 배지)와 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) NAA와 BA, \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) BA를 첨가한 배지에 배양한 결과는 Fig. 2와 같다. Hor-mone free 배지에서는 \( 26.7 \%, 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{L}\) NAA와 \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) BA 배지에서 \( 15.6 \%, 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) BA배지에서 \( 43.7 \% \) 로 원시구경 형성과 신초 발생에 차이가 나타났다. 온대산 Cymbidium 속의 유묘 배양에서는 생육한 신초를 이식하여 액아로부터 신아 출현을 조사한 결과, 품종에 따라 농도 차이는 있었으나 NAA와 BA 첨가배지에서 명배양시 신아 출현과 유묘증식이 양호하였다. 그러나 한란의 경우에는 BA를 처리하면 원시구경 증식, auxin을 처리하면 근경형성이 일어난다고 하였으며 (Chung et al. 1998a) Cymbidium은 BA처리에 의해 당년 구경과 구 구경으로부터 신초 발생이 촉진되어 개화수와 꽃대의 증가를 나타내었다. 석곡은 줄기를 그대로 눕히거나 절단하여 육묘상에 삽목하는 방법으로 자연번식하는데 이때 \( 50 \sim 500 \mathrm{ppm}\) BA 침적처리는 발아율을 크게 향상시키는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 결과는 기내에서 발생된 유식물체를 절단한 후 BA가 첨가된 배지에서 배양하였을 때 원시구경 형성과 신초발생을 촉진하는 것과 일치하였다.</p> <p>동일 배지내에 절단된 접종체의 수량에 따른 원시구경의 형성 정도를 조사한 결과는 Fig. 3 에 나타낸 바와 같다. 배지간의 원시구경 형성율의 차이는 크지 않았지만, 동일 배지 내에서도 절단된 접종체를 한개, 두개, 그리고 세 개 이상으로 접종하였을 때 1개나 2개를 접종한 경우에는 고사하여 신초 발생과 원시구경 형성이 저조하였으나 세개 이상인 경 우에는 고사되지 않고 생존하여 원시구경 형성율이 \( 95.2 \% \) 로 신초 발생이 매우 높게 나타났다. 자연상태에서 난은 난균근과 공생관계로 난에 필요한 필수아미노산, 복합탄수화물 및 cellulose를 공생균과 작용하여 합성하고 이는 난 생육을 좌우하는 것으로 알려져 있다. 따라서 난 자생지 토양에서 난균근 형성과 균구 형성을 관찰하였고 각각의 난과 난균근의 특이성이 보고되어 심비디움의 경우 최소 2 개 이상의 균근이 관여하는 것으로 보고된 바 있다. 자연 상태에서 난 분주번식시 3촉 이상을 한주로 번식하는 기존방식은 이와 같은 난과 난균의 상호관계를 고려한 방법으로 생각된다. 석곡의 치상체를 3 개 이상 군락 접종하여 동일배지에서 높은 생존율과 원시구경 형성을 관찰하였다. 난 배양시 배양조직의 갈변을 막고 배지의 산화방지를 위하여 배지에 첨가되는 활성탄, ascoribic acid, citric acid는 배지에서 polyphenoloxidase의 활성을 억제하여 경정배양에 효과가 있었다. 본 실험에서 치상체를 1개 또는 2개 접종하였을 때 갈변되며 고사되는 이와 같은 현상은 배지 내 산화방지제를 첨가함으로써 개선할 수 있으리라고 생각된다.</p> <h2>바이오리액터 배양에 의한 석곡 식물체 대량생산</h2> <p>MS 액체배지를 이용하여 바이오리액터 배양에 의한 석곡 식물체의 대량생산의 결과는 Fig. 1 에 제시한 바와 같다. 한천배지에서 \( 3 \mathrm{cm} \) 정도 자란 석곡 줄기는 여러 개의 액아를 가지고 있으므로 각각의 액아들로부터 새로운 식물체를 생산할 수 있다. 한천배지에서 증식시키는 것과 같이 석곡 유식물체의 줄기 절편에 액아가 포함되도록 절단해서 바이오리액터에서 배양하면 각각의 액아 (액아 절편)에서 하나의 줄기가 나와 생장하게 된다.</p> <p>바이오리액터에서 석곡 액아절편으로부터 식물체 생장은 배양초기에 MS배지 농도가 대체로 약한 배지에서 잘 생장하였다. 특히 저농도 배지인 1/4 MS배지에서 잘 자랐고, 배지 농도가 약간 높은 1/2 MS배지에서는 생장이 현저하게 늦어졌다. 석곡 액아절편을 1/4 MS 배지 조건에서 배양하면 2~3주까지는 서서히 생장하다가 3주 이후부터 급격하게 성장하여 6주간 배양하면 생중량이 5배 정도 증식되었다.</p> <p>식물 배양체를 액체배지가 들어있는 바이오리액터에서 배양할 때 고체배지와 같은 조건으로 배양하면 배양체의 생장이 고체배지에서와 같이 잘 이루어지지 않는다. 석곡 줄기배양의 경우에 그 원인을 검토한 결과 고체배지에서는 줄기의 절단된 부분으로 배지성분이 들어가지 않아 무기질 농도가 높은 MS배지를 사용해도 석곡 줄기는 잘 생장하지만, 액체배지의 경우 높은 농도의 배지성분이 줄기절편을 통해 내부로 들어가므로 세포들이 상해를 입히게 되어 배양하기가 힘들어진다. 따라서 액체배지는 줄기생장에 해가 없는 적정 농도의 액체배지를 제조해야만 배양이 가능한데 이는 배지농도를 낮추어주는 것이 가장 효율적이다. 바이오리액터내의 액체배지에 잠겨 배양되는 식물 줄기의 스트레스를 완화하기 위해 그물망 위에 배양체를 올려놓고 배양하거나, 반복적으로 배지를 빼주고 넣어주는 반연속 배양법을 사용하였을 때 줄기배양에 효과가 있었다. 그러나 본 실험에서는 액체배지에서 석곡의 액아를 연속배양 하여도 액아로부터 식물체가 발달하는데 별 문제가 없었다. 이는 액체배지의 농도를 낮게하여 석곡 마디절편이 액체배지 스트레스를 최소화하였기 때문으로 생각된다.</p> <h1>적 요</h1> <p>무균 발아된 석곡 종자로부터 생장한 줄기의 액아절편을 절단하여 배양한 결과, 새로운 원시구경 (protocorm)이 형성되었으며 형성율은 \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{L}\) BA가 첨가된 MS 기본 배지에서 \( 43.7 \% \) 로 나타났으며 배지에 치상한 접종체의 수를 1개, 2개, 3개 이상 군락 접종하였더니 1개, 2개 접종시보다 3개 이상 군락 접종하였을 때 생존율이 \( 95.2 \% \)로 높게 나타났다.</p> <p>바이오리액터에서 석곡 액아절편으로부터 식물체 생장은 저농도 배지인 1/4 MS배지에서 잘 자랐고, 배지 농도가 약간 높은 1/2 MS배지에서는 생장이 현저하게 늦어졌다. 1/4 MS배지 조건에서 6주간 배양하면 5배 정도로 유식물체 줄기를 증식시킬 수 있었다.</p>