pGL1300 벡터는 식물체에서 Hygromycin 저항성을 지니고 있어, 해당 저항성을 이용하여 형질전환 식물체를 선별할 수 있다. 이 과정에서 PCR 생성물을 Agarose gel에 전기영동하여 형질전환 식물체의 genomic DNA를 확인하며, 그 결과 각 construct가 온전히 삽입된 형질전환 식물체를 확인할 수 있었다. 더욱이, 여러 복사본의 construct가 존재해 추가적인 영향을 미치는 형질전환 식물체를 배제하기 위해 Southern blot을 실행하였다.
<p>pGL1300 vector는 식물체에서 hygromycin 저항성을 가지기 때문에 \( T_ { 0 } \) 식물의 종자를 받아 hygromycin이 첨가된 식물 배지 파종하여 형질전환 식물체를 선별하였다. 선별된 형질 전환 시물체를 확인하기 위해 형질전환 식물체의 잎 조직에서부터 genomic DNA를 추출하여 SID2 promoter primer F1과 vector GUS부위의 primer R1를 이용하여 Diagnostic PCR을 수행하였다. 그리고 선별되어진 식물에서 리포트 유전자가 이상 없이 들어가 있는지 확인하기 위하여 GUS는 F2, R2 primer를 사용하였으며 LUC는 F3, R3 primer로 쌍을 지어 diagnostic PCR을 수행하였다. 대조군으로써 E. coli에서 분리한 vector와 SID2 promoter:GUS::LUC 플라스미드를 동일한 primer들을 사용하여 같은 조건에서 PCR을 반응시켰다. PCR 생성물을 agarose gel에 전기영동 하였을 때 형질전환 식물체의 genomic DNA를 주형으로 사용한 PCR 생성물과 크기가 일치하며 또한 염기서열 분석을 통하여 동일한 생성물임을 알 수가 있었다. 그리고 SID2 promoter 부위에 결합하는 primer F1과 vector 부위에 결합한 R1를 사용하여 PCR을 반응시킨 결과 vector만 들어가 있는 형질전환 식물체에서는 PCR 생성물이 생성되지 않으며 SID2 promoter:GUS::LUC construct가 삽입된 형질전환 식물체에서는 PCR 생성물이 나오는 것을 통하여 vector만 들어간 형질전환 식물체와 SID2 promoter가 들어간 형질전환 식물체를 구별할 수 있었다. 이러한 결과를 보았을 때 각각의 construct가 온전히 삽입된 형질전환 식물체를 확보하였음을 확인할 수 있었다(Figure 2B).</p> <h2>야생형과 siz1-2 돌연변이체에서 SID2 promoter에 의한 GUS 발현 조절</h2> <p>하나의 형질전환 식물체에 여러 copy의 construct가 들어가서 부가적인 영향을 주는 형질전환 식물체를 배제하기 위하여 Southern blot을 수행하였다. 형질전환 식물체 2세대에서 추출한 genomic DNA를 이용하여 blot을 만들었으며, vector내에 존재하는 GUS 부위를 probe로 사용하여 1 copy의 construct만 존재하는 형질전환 식물체를 선별하였다. 선별된 형질 전환 식물체를 사용하여 아생형과 siz1-2에서의 SID2의 조절이 어떻게 되는지 알아보았다. 첫 번째로 GUS의 발현을 통하여 SID2가 식물체의 어떤 조직에서 발현이 많이 되는지를 스트레스가 없는 조건에서 7일된 형질전환 식물체를 이용하여 GUS histochemical assay 수행하였다. GUS의 발현은 SID2 promoter:GUS::LUC/siz1-2 형질전환 식물체에서 SID2 promoter:GUS::LUC/WT에 비해 잎과 배축에서 높게 나타났다 (Figure 3A). 두 번째로 SID2 promoter에 의해 조절받아 발현되는 GUS의 정도를 정량화시켜 비교하기 위하여 MUG assay를 수행하였다. MUG는 GUS의 기질로써 GUS를 처리하게 되면 발광을 하게 되는 데 이 발광 정도를 1420 multilabel counter를 이용하여 측정함으로써 GUS의 발현 정도를 알 수 있다. 14일된 \( T_ { 2 } \) 식물체 중 30개의 독립적인 식물체의 잎에서부터 단백질을 추출하였다. GUS의 활성화 정도가 GUS histochemical assay와 동일하게 SID2 promoter:GUS::LUC/siz1-2 형질전환 식물체에서 SID2 promoter:GUS::LUC/WT에 비해 약 8배 값이 증가하였다 (Figure 3B).</p>