호미곶 연안의 해역의 해수 시료에서 한천무기염 평판 배지를 함몰시키는 한천 분해능이 우수한 균주를 선별하였으며 분리한 균주들을 배지에서 진탕 배양하여 한천 분해능을 검토한 결과 SL-5가 가장 분해능이 우수한 균주로 선정되었다. 분리된 SL-5 균주의 염기서열 분석 결과 Thalassomonas agarivorans와 가장 높은 유사도를 보여 Thalassomo-nas sp. SL-5로 명명하였고, 균주 실험 결과 한천분해활성은 세포농도에 비례하였으며, 한천분해활성은 세균성장 속도에 비례하여 감소됨을 확인하였다. 따라서 한천분해효소가 성장의존성 산물이라고 판단하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>한천분해균주의 분리 및 배양</h2> <p>호미곶 연안 해역의 해수 시료에서 한천분해활성에 의한 한천분해로 한천무기염 평판 배지를 함몰시키는 한천 분해능이 우수한 균주를 선별하였다. 총 3200여 개의 한천분해 균주 중에서 한천분해 활성이 뛰어난 균주 10개를 선발하였으며, 함몰이 일어난 부위의 균을 백금이를 이용하여 무기염 배지로 적절히 희석한 후에 무기염 한천배지에 도말하는 것을 3차례 이상 반복한 후 균주들을 순수분리하였다. 분리한 균주들을 \( 0.2 \%\) \((\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 한천을 포함한 marine broth 2216 한천배지에서 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{~rpm} \)에서 60시간 진탕 배양한 후 배양액의 환원당값을 측정하여 선별된 균주의 한천분해능을 검토하였으며 가장 분해능이 우수한 균주인 SL-5를 최종적으로 선정하였다. 분리한 균주는 \( \mathrm{NaCl} \)을 성장에 필요로 하여 (data not shown) 해양성 균주로 확인되었다. 분리한 SL-5 균주가 나타내는 한천분해 양상을 Fig. 1에 나타내었다.</p> <h2>한천분해 균주의 동정</h2> <p>분리된 한천분해균 SL-5 균주의 \( 16 \mathrm{S} \) rDNA 염기서열분석 결과 Gamma-Proteobacteria인 Thalassomonas agarivorans와 가장 높은 유사도\((96\%)\)를 보였으므로 Thalassomo-nas sp. SL-5로 명명하였다. 그 외 유사도가 높은 서열을 가지는 세균은 alpha-agarase를 생산하는 Thalassomonas 속 세균과 Colwellia 속 세균 등이었다. 분리 균주와 가장 유사한 Thalassomonas agarivorans는 a-agarase를 생산하는 것으로 보고되었는데, 이 효소는 neoagarobiose, neoagarotetraose, neoagarohexaose를 분해하여 3,6 anhydro-L-galactose와 neo-agartriose, neoagraropentose 등의 neoagarooligosaccharide를 만드는 것으로 보고되고 있고 공업적 생산을 위한 연구도 보고되어 있었다.</p> <h2>분리균주의 성장과 한천분해효소 생산</h2> <p>분리한 Thalassomonas sp. SL-5 균주를 \( 50 \mathrm{~ml} \) 용량의 시험관을 이용하여 \( 5 \mathrm{~ml} \)의 marine broth 2216 배지로 배양하였을 때 \( (27^{\circ} \mathrm{C}, 37^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{~rpm})\) 보이는 생육양상과 한천분해효소 활성을 Fig. 3에 나타내었다. 한천을 첨가하지 않아도 세균의 성장이 관찰되었지만 성장속도가 아주 느렸다.</p> <p>배지에 한천을 첨가하지 않아도 한천분해효소의 활성이 관찰되었지만 한천의 농도가 높아짐에 따라 효소활성도 높아졌으며 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에 비해 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양한 경우 효소활성이 더 높은 것으로 나타났다. 한천분해활성/세포농도 (unit/1/ \( \mathrm{OD}_{600} \))는 한천이 존재할 경우 배양 3일째에 가장 높은 수치를 나타냈으며 한천농도가 증가함에 따라 세균성장도 증가하였다. 하지만 \( 0.2 \% \)와 \( 0.3 \% \) 한천농도 사이에서 세균 성장과 한천분해활성은 오차범위 내에 있어 \( 0.2 \% \)의 한천농도가 가장 효율적인 것으로 나타났다. 따라서 이후의 실험에서는 \( 0.2 \% \)의 한천을 첨가한 marine broth 2216 배지에서 3일간 배양한 배양액을 사용하였다.</p> <p>\( 250 \mathrm{~ml} \) 용량의 플라스크에 \( 0.2 \% \)의 한천이 첨가된 \( 50 \mathrm{~ml} \)의 marine broth 2216 배지에서 배양하였을 때 \( (27^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{~rpm}) \) 보이는 생육양상과 한천분해효소 활성을 Fig. 4에 나타냈다. 성장양상과 한천분해활성은 앞의 시험관을 이용한 배양과는 많은 차이를 보였는데, 이는 아마 배양 환경의 차이에 의한 결과로 판단되어 진다. 한천분해활성은 세포농도에 비례하는 것으로 나타났으며 한천분해활성은 세균성장 속도가 감소됨에 따라 비율도 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 한천분해효소는 성장의존성 산물(growth-related product)로 판단하였다.</p>