이 실험에서는 접합과 형질전환을 통한 내성 전달 시험을 시행하였는데 내성 획득 원인이 plasmid 매개에 의한 것인지 아니면 염색체성 인지를 확인하기 위하여 먼저 교차접합시험을 실시하였다. 공시 균주와 피전달균주로 내성이 전달된 것을 확인하기 위하여 전달균주와 피전달균주의 균체수 비율을 1: 1 이 되게 하여 실험을 시작하였으며 항생제 감수성 검사와 생화학적 검사 역시 실시하여 균의 특성을 확인하였다. 그 외에도 여러가지 실험에 대한 자세한 내용을 확인할 수 있으며 재조합이 성공한 균주로 double disk synergy test를 실시하였고 plasmid DNA를 추출하여 PCR과 전기영동을 실시하고 염기서열분석을 시행하여 SHV-12 gene이 내재되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
<h2>내성유전자의 전달</h2><p>본 연구에서는 접합(transconjugation)과 형질전환(trans-formation)으로 내성 전달 시험을 시행하였다. 내성획득의 원인이 염색체성인가 혹은 plasmid 매개에 의한 것인가를 확인하기 위하여 먼저 교차접합시험을 실시하였다. 공시 균주인 Klebsiella pneumoniae에서 피전달균주인 E. coli RG176 \( { }^{\mathrm{Na}} \) 로 내성이 전달된 것을 확인하기 위하여 전달균주와 피전달균주의 균체수 비율을 1: 1 이 되게 하여 새로운 TSB에 혼합한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 이상 배양하였다. 그런 후 항생제가 첨가된 MacConkey 배지에 균주가 아주 미약하게 나타났다. 이 균주를 다시 위의 교차약제가 첨가된 배지에 접종하여 하룻밤 더 균의 성장을 재확인 한 결과 균주가 성장하였다. 이렇게 성장한 균주로 생화학적 시험으로 E. coli 임을 확인 하였고 이중디스크 확산법으로 ESBL효소 생성균 임을 확인 하였으며 disk 확산법으로 항생제내성 시험을 시행하여 내성전달을 확인 하였다. 그리고 PCR을 이용하여 세 가지 유전자가 모두 이동 한 것을 확인 하였다. 그리고 인위적인 형질전환으로도 plasmid에 존재하는 세 가지 유전자가 전이될 수 있음을 확인하기 위해 먼저 Klebsiella pneumoniae 균주 (NO. 60031)의 plasmid DNA를 추출하여 heat shock으로 E. coli DH 5\(\alpha \) 에 형질전환 시켰다. 이 transformant로 부터 다시 plasmid DNA를 추출한 후 PCR을 실시한 결과 TEM gene, SHV gene, CTX-M gene 등 세 가지 유전자를 확인 할 수 있었다. 또한 항생제 감수성 검사와 생화학적 검사를 실시하여 균의 특성을 확인하였으며, 특히 double disk synergy test로 ESBL gene의 발현이 되었는지를 확인하였다. 또한 균주가 가지고 있는 세 가지의 내성유전자 중에서 SHV-12 유전자가 항생제에 작용하는 내성발현의 차이점을 확인하기 위해 Klebsiella pneumoniae 균주 (NO. 60031)에 존재하는 SHV-12 gene만을 제한하여 vector를 이용하여 E. coli DH 5\(\alpha \)에 재조합하였다. 재조합이 성공한 균주(E. coli DH 5\(\alpha \))로 double disk synergy test를 실시하였고 plasmid DNA를 추출하여 PCR과 전기영동을 실시하고 염기서열분석을 시행하여 SHV-12 gene이 내재되어 있는 것을 확인 하였다.</p>