GL1300 벡터와 SID2 프로모터를 이용한 형질전환 식물체를 확인하기 위해 세 종류의 프라이머를 설계하고, 대조군으로 E. coli에서 정제한 플라스미드와 형질전환 식물체의 genomic DNA를 사용해 PCR 반응을 진행하였다. 그리고 SID2 프로모터에 의해 조절되는 GUS의 발현을 확인하기 위해 GUS histochemical assay와 MUG fluorescent assay를 실시하였다. 또한, GUS staining부위가 잘 보이도록 엽록소의 색을 제거하였으며, 다양한 실험체에서 GUS extraction buffer를 사용하여 단백질을 추출하고 이를 정량한 후, MUG를 이용하여 GUS 반응을 관찰하였다.
<h2>형질전환 식물체의 확인을 위한 diagnostic PCR</h2> <p>pGL1300 vector와 SID2 promoter:GUS::LUC가 들어간 형질전환 식물체 확인을 위하여 forward primerl (F1), 5'-TTTAGTGGGCCCCTGCTAC-3'; reverse primerl (R1), 5'-TGCCCAACCTTTCGGTATAAAGA CTT-3'; forward primer2 (F2), 5'-AAAGTGTGGGTCAATAATAATCAGGAAG-3'; reverse primer2 (R2), 5'-CAGTAAAGTAGAACGGTTTGTGTGTT-3'; forward primer3 (F3), 5'-TGTACACGTTGTCACATC TCATCTA-3'; reverse primer3 (R3), 5'-GTATTTGTCAATCAGAGTGCTTTTGG-3'을 설계하여 대조군으로써 E. coli로부터 정제한 플라스미드와 형질전환 식물체의 genomic DNA를 가지고 위의 primer들을 각각 짝지어 PCR 반응을 시켰다. PCR 조건은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 먼저 5분 반응시킨 후, \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초, \( 54 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 40초씩 30번 반복 반응시킨 후, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분 마지막 반응을 시킨 후에 \( 1 \% \) agarose gel에 전기 영동하였다.</p> <h2>형질전환 식물체에서 SID 2 promoter에 의해 조절 받는 GUS 발현 확인을 위한 GUS histochemical assay.</h2> <p>식물배지에서 키운 7일된 형질전환 식물체를 6 wall plate에 \( 50 \mathrm { mM } \) sodium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } 7.0), 0.2 \% \) triton X-100, \( 5 \mathrm { mM } \) Ferrocyanide, \( 5 \mathrm { mM } \) Ferricyanide, \( 2 \mathrm { mM } \) X-gluc로 구성된 GUS staining 용액에 식물 조직이 다치지 않게 식물을 채취하여 식물이 용액에 완전히 잠기도록 넣는다. GUS의 기질인 X-gluc는 빛에 약하기 때문에 알루미늄 호일로 plate를 암 상태로 만들어준 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양한다. 다음날 GUS staining 용액을 제거하고 에탄올 농도를 \( 25 \%, 50 \% \) \( 70 \%, 95 \% \)로 낮은 농도부터 높은 농도의 에탄올을 실온상태에서 처리하여 GUS staining 부위가 잘 보일 수 있도록 엽록소의 색을 빼준다 (Jefferson 1987). 그리고 현미경을 이용하여 형질전환 식물체들의 조직을 관찰하였다.</p> <h2>형질전환 식물체에서 SID2 promoter에 의해 조절받는 GUS의 발현 확인을 위한 MUG fluorescent assay.</h2> <p>훍에서 키운 14일된 \( \mathrm { T } _ { 2 } \)세대의 Vector/WT, SID2 promoter/WT, Vector/siz1-2, SID2 promoter/siz1-2 각각의 30개의 독립적인 형질전환식물체의 잎을 따서 얼린 상태에서 곱게 간 후 50 \( \mathrm { mM } \) sodium phosphate buffer \( \mathrm { pH } 7.0,10 \mathrm { ~mM } \) EDTA, \( 0.1 \% \) triton X-100, \( 10 \mathrm { ~mM } \) \( \beta \)-mecapthanol으로 조성된 GUS extraction buffer를 \( 100 \mu \mathrm { l } \) 넣어서 단백질을 뽑은 후 bradford 용액을 이용하여 파장 \( 595 \mathrm { ~nm } \)로 정량을 한 다음 \( 10 \mu \mathrm { g } \) 단백질을 GUS의 기질인 4-methylumbelliferyl- \( \beta \)-D-glucuronide (MUG) \( 1 \mathrm { mM } \)과 반응부피 \( 100 \mu \mathrm { l } \) 되게 나머지 부피는 GUS extraction buffer로 채우고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 40분간 반응 시킨 후 \( 0.2 \mathrm { M } \\mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { CO } _ { 3 } \)로 주성된 stop 용액을 동량으로 넣어준다. 검은색으로 된 불투명한 96 well plate (NUNC, DK)에 각 샘플 당 \( 100 \mu \mathrm { l } \) 동일 양으로 분주하여 1420 multilabel counter (PerkinElmer life science)로 GUS의 활성을 측정하였다 (Gallagher SR 1992).</p>