SA FtsZ 단백질은 polyhistidine 태그가 제거된 경우 크기가 41.1 kDa이지만 SDS-PAGE 결과 50 kDa에 위치함을 확인하였다. 자외선 홉광도를 이용한 농도 측정이 불가능하므로 Bradford 방법으로 농도를 측정한 결과, 395 ug/mL(9.5 uM)로 확인되었다. SA FtsZ 단백질의 폴리머 형성은 형광계를 통해 확인되었으며, SA FtsZ 단백질, GTP, 그리고 MgCl2가 결합하여 폴리머를 형성하였고, GTPase 활성에 의해 GTP가 분해되며 폴리머가 분해되었음을 확인하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>FtsZ 단백질의 발현 및 정제</h2> <p>SA FtsZ 단백질 full length의 발현 및 정제는 대장균 발현 시스템을 이용하였으며, 단백질의 순도는 \( 12 \% \) SDS-PAGE로 확인하였다. Ni-sepharose 컬럼을 이용한 친화크로마토그래피에서 SA FtsZ 단백질은 \( 100 \sim 300\mathrm{mM} \) imidazole에서 용출되었다. 그리고 아미노 말단에 결합되어있는 polyhisdidine tag을 제거하기 위해 TEV protease를 처리한 후 투석을 하고 Ni-sepharose 컬럼에 다시 통과하여 polyhistidine tag이 잘리지 않은 SA FtsZ 단백질을 제거 하였으며, Ni-sepharose 컬럼에 통과되어 나온 SA FtsZ 단백질은 SDS-PAGE를 통해 \( 95 \% \) 이상 순수하게 정제되었음을 관찰하였다. SA FtsZ 단백질의 polyhistidine tag이 제거되었을 경우 크기가 \( 41.1 \mathrm{kDa} \) 이기 때문에 SDS-PAGE에 서 단백질 마커 위치인 \( 37 \mathrm{kDa} \) 과 \( 50 \mathrm{kDa} \) 사이에서 나올 것 으로 예측하였으나 Fig. 1에서 보듯이 \( 50 \mathrm{kDa} \) 에 SA FtsZ 단백질이 위치하고 있는 것을 확인하였다. SA FtsZ 유전자가 클로닝된 벡터의 DNA 서열을 DNA sequencing을 통하여 확인하였으므로, SDS-PAGE 상에서 SA FtsZ 단백질의 크기가 이론값보다 크게 나온 이유는 SA FtsZ 단백질이 SDS-PAGE 상에서 실제 크기와 다르게 이동하기 때문인 것으로 예측되며, SA FtsZ 재조합 단백질이 본 연구에서와 같이 SDS-PAGE 상에서 \( \sim 50 \mathrm{kDa} \) 의 위치에서 관찰된 예는 다른 논문에서도 보고된 바가 있다.</p> <h2>Bradford 방법을 이용한 FtsZ 단백질의 농도 측정</h2> <p>SA FtsZ 단백질은 자외선 파장을 흡수하는 아미노산을 포함하지 않기 때문에 자외선 홉광도를 이용하여 단백질 농도를 측정할 수 없었고, Bradford 방법을 이용하여 단백질의 농도를 측정하였다. BSA단백질을 \( 0 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}, 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \), \( 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}, 400 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}, 600 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}, 1000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 의 농도로 각각 만든 후, Bradford 시약을 섞은 후에 분광계 (Triad LT, DYNEX technologies)에서 \( 620 \mathrm{~nm} \) 로 측정하였다. 이렇게 얻은 표준 검정선을 이용하여 SA FtsZ 단백질의 농도를 측정한 결과 \( 395 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}(9.5 \mu \mathrm{M}) \) 임을 확인하였다.</p> <h2>FtsZ 단백질의 효소 활성 측정</h2> <p>다른 박테리아의 FtsZ단백질의 경우에도 형광계를 이용하여 excitation 빛의 방향과 \( 90^{\circ} \) 를 이루는 방향에서 폴리머 형성 활성을 관찰한 예가 있다. 대조군에서는 FtsZ 단백질이 단량체로 존재하므로 빛의 산란이 없다가, 실험군에서 GTP를 첨가했을 때 FtsZ 단백질의 폴리머 형성이 유도되어 excitation 빛의 \( 90^{\circ} \) 방향의 검출기에서 FtsZ 폴리머로부터 산란된 빛이 감응되는 방식이다. 본 연구에서도 SA FtsZ 단백질의 폴리머 형성을 형광계를 이용하여 관찰하였는데, 먼저 SA FtsZ 단백질을 넣지 않고 폴리머 형성 완충용액 (B-완충용액, \( 50 \mathrm{mM} \) MES \( \mathrm{pH} 6.5,50 \mathrm{mM} \mathrm{KCl}, 10 \mathrm{mM} \)\( \mathrm{MgCl}_{2} \) 만 가지고 emission을 측정하였을 때 폴리머 형성이 거의 되지 않았음을 알 수 있었다. 이것은 GTP와 B-완충용액의 성분이 폴리머 형성을 하지 않았다는 것을 의미한다. 하지만 SA FtsZ 단백질에 \( \mathrm{GTP} \) 와 \( \mathrm{MgCl}_{2} \) 을 처리하였을 때, 반응 후 약 30 초 전후로 하여 emission peak가 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이것은 SA FtsZ 단백질에 GTP 와 \( \mathrm{MgCl}_{2} \) 이 결합하여 폴리머를 형성했다는 것을 나타내며, 1 분 전후로는 빛의 산란양이 급격하게 줄어든 것을 볼 수 있는데, 이것은 SA FtsZ 단백질의 GTPase 활성에 의해서 GTP가 분해되고, 이에 따라서 SA FtsZ 단백질의 폴리머가 분해되었기 때문이라고 예측된다.</p>