항균성 시험 대상 약재 38종을 한국미생물보존센터로부터 분양받은 균주 3종을 이용하여 paper disc 방법으로 항균활성을 측정하였다. 또한 예비 실험에서 항균력이 있음이 입증된 4종의 약용식물을 서로 혼합하여 배양시킨 후 항균력의 상승효과를 측정하였다.
<h1>재료 밎 방법</h1><h2>시료제조</h2><p>본 실험에서 사용한 항균성 시험 대상 약재 38종은 대구시 중구 남성로 약전 골목에서 건조 상태의 것을 구입하여 사용하였다. 불순물을 제거하기 위해 가볍게 2번 수세하여 건조시킨 후, 시료무게의 10 배량 \( (\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 \( 80 \% \) methanol로 72 시간동안 3회 추출하였으며, 추출액은 여과지(Whatman No.3, England)로 3회 여과하고 상등액을 rotary vacuum evaporator (Büchi R-205, Flawil, Switzerland)로 농축한 후 동결건조하여 추출물을 제조하였다.</p><h2>사용 균주 및 배지</h2><p>본 실험에서 사용한 균주는 S. aureus 표준균주 ATCC 25923, 항생제 내성균주는 penicillin에 내성을 갖는 MRSA KCCM 11812과 methicillin에 내성을 갖는 MRSA KCCM 40510을 한국미생물보존센터로부터 분양받아 사용하였다. 각각의 균들은 Tryptic Soy Broth (TSB, Difco, Detroit, USA)에 한 백금이 접종하여 3회 계대배양 후 성장 최적 조건에서 사용하였다. 고체배지로는 Tryptic Soy Agar (TSA, Difco, USA)와 S. aureus 선택배지인 Mannitol Salt Agar (MSA, Becton, USA)을 사용하였다.</p><h2>항균활성 측정</h2><p>항균활성을 검색하기 위해 본 실험에서는 paper disc방법을 사용하였다. 우선 균주는 해당 평판배지에 균주를 streaking하여 배양한 후 배양된 각 균주 한 백금이를 취해 \( 10 \mathrm{~mL} \) TSB에 접종하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양하여 활성화 시킨 후 3일 계대 배양 후 spectrophotometer (UNIKON 922 , Kontron, Itly)를 이용하여 \( 625 \mathrm{~nm} \)에서 측정하여 흡광도 값이 \( 0.5 \) (McFarland nephelometer)가 되게 하여 균수를 \( 1.5 \times 10^{8} \mathrm{cfu} / \mathrm{mL} \)로 사용하였다. 항균력을 측정하는 평판배지 TSA 배지조제는 TSB 배지에 agar \( 1.5 \sim 2.0 \% \) 첨가 후 1기압, \( 121^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 멸균하고 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 정도로 냉각한 후 멸균된 petri-dish에 약 \( 15 \mathrm{~mL} \)씩 분주하여 사용하였고, MSA 평판배지 또한, 동일한 방법을 이용하여 사용하였다. 각각의 평판배지에 멸균된 glass loader로 균을 고르게 도말해서 균을 흡수시킨 다음 배지의 표면 위에 멸균된 \( 8 \mathrm{~mm} \) paper disc(diameter \( 8 \mathrm{~mm} \), Adantec Co., Japan)를 올려놓은 다음 \( 10 \% \)DMSO(dimethylsulfoxide, JUNSEI, Japan)로 녹이고, membrane filter \( (0.45 \mu \mathrm{m}) \)로 제균 시킨 추출물을 \( 50 \mu \mathrm{L} \)씩 주입하여 최종농도가 1.0, 2.5, 5.0 \(\mathrm{mg} / \mathrm{disc} \)가 되게 완전히 흡수시킨 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 24시간 배양시켜 paper disc의 직경을 포함한 주위의 inhibition zone의 직경을 측정하였다.</p><h2>항균력의 상승효과 측정</h2><p>본 실험의 예비 실험에서 항균력이 있음이 입증된 4종의 약용식물을 서로 혼합함으로서 항균력의 상승 여부를 확인하고자 4종의 약용식물을 서로 혼합하였다. 4종의 약용식물추출물을 세신과 황련, 세신과 호장근, 세신과 미역취씨, 황련과 호장근, 황련과 미역취씨, 호장근과 미역취씨순으로 2가지씩 추출물을 혼합하였으며, 각각 추출물을 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \)로 혼합하여 \( 8 \mathrm{~mm} \) paper disc에 \( 50 \mu \mathrm{L} \)씩 주입 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 24시간 배양시켜 paper disc의 직경을 포함한 주위의 inhibition zone의 직경을 측정하였다.</p>