모링가 지하부 시료의 항혈전 활성을 평가하기 위해 thrombin time (TT), prothrombin time (PT) 및 activated partial thromboplastin time (aPTT)를 통해 혈액응고 저해활성을 평가하였다. 또한, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 Whole Blood Aggregometer를 측정하고, impedance 법을 통해 미세전극에 혈소판이 부착되어 응집됨에 따라 발생하는 전기 저항값의 변화를 측정하며 혈소판 응집저해 활성을 평가하였다. 그 결과, 모링가 지하부의 H 및 EA 분획물을 이용하여 항혈전제 개발이 가능함을 알 수 있다.
<p>한편 모링가 지하부 시료의 항혈전 활성은 혈액응고 저해활성과 혈소판 응집저해 활성을 각각 측정하여 평가하였다. 혈액응고 저해활성은 기존과 동일한 방법으로 thrombin time (TT), prothrombin time (PT) 및 activated partial thromboplastin time (aPTT) 을 측정하였다. 먼저 fibrinogen을 fibrin polymer로 전환시키는 thrombin의 활성을 평가하는 TT는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 0.5 \mathrm{U} \) thrombin (Sigma Co.,USA) \( 50 \mu \mathrm{l}\)와 \( 20 \mathrm{mM} \mathrm{CaCl} 50 \mu \mathrm{l}\), 다양한 농도의 모링가 지하부 시료 \( 10 \mu \mathrm{l} \)를 Amelung coagulometer KC-1A (Amelung. Lemgo, Germany) 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 표준혈장(MD Pacific Technology Co., Ltd., Huayuan Industrial Area, China) \( 100 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. PT는 외인성 응고계(Ⅱ, Ⅴ, Ⅶ 및 Ⅹ 인자)의 응고 활성을 종합적으로 측정하는 방법으로, 혈장 \( 70 \mu \mathrm{l}\)와 다양한 농도의 모링가 지하부 시료 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 를 coagulometer 튜브에 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 가온 후, \( 130 \mu \mathrm{l} \)의 PT reagent (MD Pacific Technology Co., Ltd., Huayuan Industrial Area)를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 한편 내인성 경로에 의한 혈액응고활성을 평가하는 aPTT 측정의 경우에는, 표준혈장 \( 70 \mu \mathrm{l} \)와 다양한 농도의 모링가 지하부 시료 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 를 coagulometer 튜브에 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 가온 후, \( 65 \mu \mathrm{l} \)의 aPTT reagent (MD Pacific Technology Co., Ltd., Huayuan Industrial Area)를 첨가하고 다시 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3 분간 반응하였다. 이후 \( 65 \mu \mathrm{l}\mathrm{CaCl}_{2}(35 \mathrm{mM}) \)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. TT, PT 및 aPTT 측정결과는 각각 3회 이상 반복한 모링가 지하부 시료 첨가구 실험의 응고시간 평균치를 용매 대조구인 DMSO의 응고시간 평균치의 비로 나타내었다. 실험 결과는 SPSS 24.0 버전을 사용하여 mean \( \pm \)SD, 각 군간의 차이는 ANOVA로 분석하였으며, Duncan 다중비교 검증법으로 통계적 유의성 검정을 조사하였으며, 유의수준은 \( p<0.05 \) 로 하였다. 먼저 대조구로 사용된 aspirin은 \( 1.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도에서 TT, PT, aPTT를 무첨가구에 비해 각각 1.41, 1.42 및 1.37배 연장시켜 우수한 항응고 활성을 나타내었으며, \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도에서는 TT, PT, aPTT 모두를 15 배 이상 연장시켜 강력한 항응고 활성을 나타냄을 확인하였다. 반면, 모링가 지하부 에탄올 추출물에서는 TT가 무첨가구에 비해 1.42배 연장되어, 모링가 잎에서의 보고와 동일하게 thrombin 저해활성이 나타났다. 또한 prothrombin 저해도 유의적으로 나타났으나 무첨가구에 비해 PT는 1.16배 연장되었다. 반면 혈액 응고인자 저해는 인정되지 않았다. 한편 각각의 분획물에서는 서로 다른 응고저해 활성을 나타낸 바, H 분획에서는 농도 의존적인 강력한 thrombin, prothrombin 및 혈액응고인자 저해를 나타내었으며, 특히 aPTT는 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도에서 15배 이상 연장되어 아스피린과 유사한 응고인자 저해 활성을 나타내었다. EA 분획물 역시, 농도 의존적인 thrombin, prothrombin 및 혈액응고인자 저해가 확인되었으며, 기존에 보고된 모링가 잎의 TT 연장과는 달리 PT 및 aPTT 연장 효과가 높게 나타났다. 한편 B 분획물 및 물 잔류물의 경우 항응고 활성이 매우 미약하였다. 즉, 모링가 지하부의 H 및 EA 분획물의 항응고 활성은 기존 항응고 활성이 강력하다고 알려진 마가목 열매의 EA 분획물, 계혈등, 팔각향 추출물보다는 상대적으로 미약하나, 흑마늘, 백출, 단삼, 구기자보다는 우수하거나 유사한 활성이었다.</p><p>한편 제조된 모링가 추출물 및 분획물의 인간 혈소판 응집 저해활성을 기존 보고와 동일하게 평가하였으며, 그 결과는 Table 3에 나타내었다. 혈소판 응집저해 활성은 Whole Blood Aggregometer (Chrono-log, PA, USA)를 사용해 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 측정하였으며, 미세전극에 혈소판이 부착되어 응집됨에 따라 발생하는 전기 저항값의 변화를 측정하는 impedance 법을 사용하여 평가하였다. 상세하게는 인간 농축 혈소판(platelet rich plasma: PRP)을 전처리 및 수세한 후 최종 혈소판 농도가 \( 5 \times 10^{8} / \mathrm{ml} \)이 되도록 조정하여 사용하였으며, \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{CaCl}_{2} 50 \mu \mathrm{l} \), suspending buffer \( 147.5 \mu \mathrm{l} \), 모링가 시료 \( 5 \mu \mathrm{l} \)가 포함된 반응 cuvette에 혈소판 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 을 넣은 후 3 분 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)로 가온 후 응집유도제로 collagen \( (1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)을 \( 2.5 \mu \mathrm{l} \)를 넣고 혈소판 응집을 측정하였다. 응집반응은 collagen 첨가 후 12분간 측정하였으며 amplitude, slope, area under를 측정하여 평가하였다. 이때, amplitude (ohm)는 혈소판에 응집유도제를 첨가하였을 때 일어나는 최대 응집정도를 나타내며, slope는 응집유도제를 첨가한 직후부터 1분 동안의 응집곡선의 기울기를 나타내며, area under는 전체적인 혈소판 응집 정도를 표시하는 것으로 전기저항 증가에 따른 slope 곡선의 하강면적을 의미한다. 최종 혈소판 응집 활성은 DMSO를 첨가한 대조구와 모링가 시료를 첨가한 실험구의 area under 값의 비를 백분율로 나타내었다. 먼저, 대조구로 사용된 아스피린은 \( 0.25 \mathrm{mg} / \) \( \mathrm{ml} \) 농도에서 무첨가구에 비해 \( 27.6 \% \) 의 응집율, \( 0.125 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도에서 \( 40.2 \% \)의 응집율을 나타내어 농도 의존적인 혈소판 응집저해 활성을 나타내었다. 한편 모링가 지하부의 ethanol 추출물은 \( 0.25 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도에서 무첨가구에 비해 \( 181.2 \% \)의 혈소판 응집을 나타내어 매우 빠르고 강력하게 혈전 생성을 촉진하였으며, 이는 기존의 보고한 모링가 잎의 혈소판 응집저해 효과와는 상반되나, 모링가 씨의 혈전 생성 촉진효과와는 일치하는 결과였다. 모링가 지하부 추출물의 분획물 중, 물 잔류물 역시 혈소판 응집 촉진을 나타내었다. 그러나, H 및 EA 분획에서 우수한 응집저해 효과가 나타났으며, 특히 EA 분획은 \( 0.25 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도에서 무첨가구에 비해 \( 18.8 \% \)의 혈소판 응집을 나타내어 아스피린을 능가하는 강력한 응집저해 활성을 나타내었다. B 분획은 \( 84.9 \% \)의 응집도를 보여 미약한 응집저해를 보였다. 한편 모링가 지하부 추출물 및 이의 분획물의 실제적 이용 가능성 검토를 위해 인간 적혈구에 대한 용혈활성을 기존에 보고한 방법으로 평가한 결과, 모든 시료에서 \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도까지 전혀 용혈활성을 나타내지 않음을 확인하였다. 본 연구결과는 모링가 지하부의 H 및 EA 분획물을 이용한 항혈전제 개발이 가능함을 제시하고 있다.</p>