Microplate에서 배양 중인 각 well에 \( 160 ~\mu \mathrm{L} \) 배지를 첨가한 후, ELISA 판독기를 통해 \( 800 ~\mu \mathrm{g} / \) \( \mathrm{mL} \) 유지 농도에서 \( 570 \mathrm{~nm} \) 파장에서 흡광도를 측정했다. 또한, 다양한 농도의 표준 TNF용액을 함께 측정하여 polynomial standard regression curve를 작성하고, 이를 통해 검체 내 TNF의 양을 산출하였다. 암세포 준비과정은 대수증식기의 암세포를 \( 0. 05 \% \) trypsin-\( 0. 02 \% \) EDTA 용액으로 수집하고, PBS로 농도를 조정한 뒤, B16F10 세포 \( (2 \times \) \( 10^{5} \))를 마우스에 주입하여 14일 후 흑색종의 수를 관찰하였다.
<h2>암세포 및 정상면역세포에 대한 세포독성 측정</h2> <p>MTT를 이용한 방법을 변형하여 실시하였다. MTT를 PBS용액에 \( 5 \mathrm{~mg} / \mathrm{mL} \)의 농도가 되도록 녹인 다음, 무균 여과하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)의 어두운 곳에 보관하였고, 보관된 지 3주 이내의 것을 검사에 사용하였다. 배양중인 microplate 의 각 well에서 상층의 배지를 조심스럽게 \( 160 ~\mu \mathrm{L} \)씩 첨가하였다. 이때 세포를 함유하지 않은 well에도 MTT 희석액을 가해 주었다. \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{~CO}_{2} \)에서 4시간 배양한 후 상층의 배지를 제거하여 세포 손실을 막기 위해 약 \( 40 ~\mu \mathrm{L} \) 정도는 남겼다. 각 well에 \( 100 ~\mu \mathrm{L} \)의 DMSO를 가한 후 실온에서 plate shaker로 약 20-30분간 흔들어 준 다음 ELISA reader (Micro plate EL311)를 사용하여 \( 570 \mathrm{~nm} \) 및 \( 650 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 이때 세포를 함유하지 않은 well을 blank로 하고 650 \( \mathrm{nm} \)는 비교치로서, \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 측정한 값을 \( 650 \mathrm{~nm} \)에서의 측정치를 감하고 이 값을 결과치로 사용하여 hexane, acetone, ethyl ether, methanol 및 water로써 추출한 용액들이 항암제의 세포독성에 어떠한 변화를 줄 수 있는가를 조사하였다.</p> <h2>T림프구 아형</h2> <p>T림프구 아형의 구성비는 phycoerythrin(PE)-conjugated rat anti-mouse CD4(L3T4)mAb와 FITC conjugated rat anti-mouse CD8(Ly-2)mAb를 이용하고 IL-2 수용체는 FITC-cojugated rat anti-mouse CD25 mAb를 이용하여 제조회사의 설명에 따라 분석하였다.</p> <h2>대식세포에 의한 Nitric Oxide (NO)생산 측정</h2> <p>복강대식세포를 세포배양판에 \( 5 \times 10^{5} / \mathrm{mL} \)의 세포가 되도록 재부유하여 IFN-v \( (10 \mathrm{~U} / \mathrm{mL}) \)와 LPS \( (1 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \)의 자극하에 48시간 배양하고 그 배양 상청액 내의 NO를 Griess 반응에 의해 측정하였다. 즉 \( 100 \mathrm{~uL} \)의 배양 상청액에 \( 1 \% \) sulfanilamie(\(30\%\) acetic acid)와 \(0.1\%\) N-(1-naphthyl) eth-ylenediamine dihydrochloride\( (60 \% \) acetic acid \( ) \) 혼합액 \(100 \mathrm{~uL} \)를 가하여 실온에서 방치하였다. 20분 후 ELISA 판독기(Bio Tek Instruments Inc, model EL311SL)를 사용하여 \( 800 ~\mu \mathrm{g} / \) \( \mathrm{mL} \)의 유지 농도에서 \( 570 \mathrm{~nm} \) 파장에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Tumor necrosis factor의 역가 측정</h2> <p>Tumor necrosis factor(TNF)의 측정은 ELISA kit(Genzyme, Boston, MA)를 사용하여 시행하였다. 즉 24시간동안 항 TNF 항체를 96 well plate에 부착시킨 뒤 세척하고 여기에 검체 \( 100 \mathrm{~uL} \)를 넣고 1시간 동안 96 well plate에서 반응시켰다. Tween 20이 \( 10 \% \)가 되게 첨가된 인산완충액(PBS)으로 새척 후 90분 동안 항 TNF 단세포군 항체와 반응시켰다. 이를 세척한 후 60분 동안 peroxidase가 결합된 항 IgG 항체를 반응시키고 다시 세척한 다음 orth-ophenylene diamine용액을 15분간 반응시켰다. \( 0.5 \mathrm{N}\) HCl 용액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 \( 450 \mathrm{~nm} \)의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준 TNF용액을 3200, 1600, 800, 400, 200, 100 및 \( 50 \mathrm{pg} / \mathrm{mL} \)의 농도로 조절하여 함께 측정하고 표준용액에서 측정된 흡광도를 근거로 polynomial standard regression curve를 작성하고 작성된 곡선방정식을 기준으로 검체내에 포함된 TNF의 양을 구하였다.</p> <h2>대식세포의 탐식능 측정</h2> <p>복강대식세포의 탐식능은 fluorescent microbead를 이용하여 flow cytometer로 측정하였다.</p> <h2>흑색종 세포(B16F10)의 폐전이 실험</h2> <p>본 실험에 공시한 암세포주는 B16F10 마우스 흑색종 세포(Tumor Repoitory of the National Cancer Institute, Bethesda, MD)로서 \( 10 \% \) 우태아혈청, sodium pyruvate, nonessential amino acids 및 L-glutamine이 함유된 RPMI-1640 배지에 유지하였다. 암세포의 준비는 대수증식기의 암세포를 \( 0.05 \% \) trypsin-\( 0.02 \% \) EDTA 용액으로 수집하여 2회 수세하여 PBS롤 농도를 조정하였다. B16F10 세포 \( (2 \times \) \( 10^{5} \))를 마우스 미정맥을 통하여 주사한 후 14일째에 폐를 제거하여 흑색종의 수를 관찰하여 산정하였다.</p>