벼 잎의 표면을 차아염소산나트륨용액과 Triton X-100을 활용해 살균하였으며, 병원균 배양액과 특정 추출물을 섞은 후 벼흰잎마름병 억제 활성 확인을 위한 실험을 수행하였다. 이 과정에서 Adobe Photoshop과 Image J analyzer를 활용하여 벼의 병변 면적을 수치화하였으며, 이를 통해 평균 병변 면적 퍼센트를 계산하였다. 흑색 부분이 95% 이상일 때는 흰잎마름병균에 의해 감염되지 않은 것으로, 20% 이하일 경우 생엽절편의 사멸로 판단하여 해당 추출물의 효과성을 평가하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약 및 기구</h2> <p>벼 잎의 표면 살균을 위한 살균액은 \( 0.05 \% \) 의 Triton X-100 (Sigma)를 포함하는 \( 1 \% \) 차아염소산나트륨용액(유한양행)을 사용하였다. 억제물질의 양성대조구로서는 2,4-di-acetylphloroglucinol (DAPG; Toronto Research Chemicals (Canada)을 사용하였다. 96 well plate는 SPL Lifesciences (Korea)에서 구입하였고 실험에 사용된 핀셋, 가위, 알루미늄포일 등은 고압 멸균 또는 화염살균하여 사용하였다.</p> <h2>병원균의 배양</h2> <p>실험에 사용한 병원균 균주는 벼흰잎마름병균 Xanthomonas</p> <p>oryzae pv. oryzae KACC10331(이명 KXO85)이었다. 병원균 균주의 배양온도는 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 였고 관행적인 가위접종 방법에 사용하는 배양조건을 따랐다. 즉, YGC (ATCC 459: glucose \( 5.0 \% \), yeast extract \( 0.5 \%, \mathrm{CaCO}_{3} 1.25 \% \), and agar \( 1.5 \%) \) 평판배지에서 유지되는 소량의 균집락을 \( 5 \mathrm{~mL} \) 의 210 broth (sucrose \( 0.5 \% \), casein enzymatic hydrolysate \( 0.8 \% \), yeast extract \( 0.4 \%, \quad \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 0.3 \% \), and \( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.03 \%) \) 에서 \( 24 \pm 4 \) 시간 동안 진탕배양한 다음 이 배양액을 PSA (peptone-sucrose-agar: Bacro-Peptone \( 1.0 \% \), sucrose \( 1.0 \% \), monosodium glutamate \( 0.1 \% \), and agar \( 1.5 \% \) ) 평판 배지에 도말하여 2일간 배양한 후 균집락을 멸균증류수에 분산시키고 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서의 흡광도가 \( 0.5 \) 가 되도록 희석하여 사용하였다.</p> <h2>벼 잎 생엽절편의 표면살균</h2> <p>표면 살균액 \( (0.05 \% \) Triton \( \mathrm{X}-100 \) in \( 1 \% \) sodium hypo-chlorite)에 \( 10 \sim 12 \mathrm{~cm} \) 길이의 벼 잎을 담그어 15분간 정치한 후 멸균 증류수로 3-4회 헹구었다. 표면 살균된 벼는 주맥을 제거하고 가로, 세로 3 4 mm의 크기로 잘라 사용하였다.</p> <h2>벼흰잎마름병 억제 활성 유무의 동시 확인과 재현성 확인</h2> <p>96 well plate의 각 well에 \( 200 \mu \mathrm{L} \) 의 병원균 배양액을 가하고, 벼흰잎마름병에 대한 억제 활성을 지니는지 확인하고자 하는 특정 추출물의 \( 10 \mathrm{mg} \) 당 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 의 \( 50 \%\) DMSO에 용해하여 \( 10 \mu \mathrm{L} \) 씩 처리하였다. Plate는 7일간 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \), 상대습도 \(90 \sim 95\%\)를 유지하며 암조건으로 정치하였다.</p> <p>이 방법이 물질 농도에 의존적으로 유효함을 확인하기 위하여 DAPG를 \( 512 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 에서 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 까지 2배 연속 희석을 사용하여 처리하였고, 모든 반복에서 양성대조구로 DAPG를 사용하였다.</p> <h2>벼 생엽절편에 나타난 병변 면적의 수치화</h2> <p>벼 생옆절편의 병변 면적을 수치화하기 위하여 Adobe Photoshop을 이용하였다. PC상에서 실험 결과 사진의 벼 생옆절편을 크기에 맞춰 사각형으로 오려 낸 후, threshold 값의 변화를 주어 흑백으로 전환하였다. 이렇게 전환된 사진을 gif 양식으로 저장하여 Image J analyzer 프로그램(http://chemist.hosting.paran.com/imgarea/)에서 불러낸 후 실행하였다. 프로그램에 의해 제시된 수치를 기준으로, 흑색 퍼센트를 건전한 잎의 면적으로, 백색 퍼센트를 병변의 면적으로 정량하였고, 3 반복한 실험결과 사진을 바탕으로 각 생엽 절편의 병변 면적 퍼센트의 평균값을 계산하였다. 흑색 부분이 95퍼센트 이상인 것은 흰잎마름병균에 의해 감염되지 않은 상태로 평가하였고, 20 퍼센트 이하를 생엽절편 사멸의 기준으로 삼아 처리 물질이 흰잎마름병균 예방에 효과가 없음으로 판단하였다. 병변 면적의 수치화 과정은 Fig. 4에 나타내었다.</p>