피브린 플레이트법 방법으로 알팔파 형질전환체 추출물의 피브린 클랏을 용해하는 용해활성을 진행시켜 평균 8.1, 5.3, 7.9, 7.5, 3.5, 3.2cm의 용해능력을 얻을 수 있었다. 단백질들의 피브린 분해 활성과 ELSA를 이용한 단백질 발현양은 비슷한 결과를 나타내었다. 또한 12% SDS-PAGE로 추출된 전체 수용성 단백질을 알팔파 형질전환체와 분리시켰다. 결과적으로 식물체 내에 존재하는 프로테아제에 의한 단백질 분해결과와 유사함을 나타내었다.
<h2>피브린 용해 활성 측정</h2> <p>알팔파 형질전환체 추출물의 피브린 클랏을 용해하는 피브린 용해활성은 약간 변형된 피브린 플레이트법 방법에 의해서 실시하였다. 피브린 클랏의 용해능력은 6가지 발현벡터로 형질전환된 알팔파 형질전환체 추출물에서 각각 평균 \( 8.1 \) (p221a-t-PA), \( 5.3 \) (p221a-t-PAER) \( 7.9 \) (p221a-st-PA), \( 7.5 \) (p221a-t-PAHis \( { } _ { 6 } \) ), \( 3.5 \) (p221a-rbc-st-PA), \( 3.2 \) (p221a-rbc-st-PA) cm를 얻을 수 있었다 (Fig. 6). 섬유소 분해활성 정도는 발현벡터에 따라 p221a-t-PA >p221a-t-PAHis \( \geq \) p221a-st-PA >p221a-t-PAER >p221a-rbc-t-PA \( \geq \) p221a-rbc-st-PA로 확인 되었으며, \( 35 \mathrm { ~S } \) 프로모터를 이용한 경우가 Rbcsk-1A를 이용한 경우보다 재조합 t-PA 섬유소 분해활성이 높게 나타났다. 그러나 기대하였던 합성 유전자를 이용했을 때는 합성전과 크게 차이를 보이 지 않았다. 또한 p221a-t-PA, p221a-t-PAHis \( { } _ { 6 } \), p221a-st-PA로 형질전환된 세그룹의 섬유소 분해활성 능력은 오차 범위내에서 보면 유사하였다. 또한 p221a-rbc-t-PA과 p221a-rbc-st-PA로 형질전환된 형질전환체에서는 섬유소 분해활성에는 별 차이가 없었다. 특이한점은 ELISA 결과와 다르게 p221a-t-PAER로 형질전환된 알팔파 형 질전환체에서 섬유소 분해활성이 p221a-t-PAHis 로 형질전환된 군 \( ^ { 2 } \) 보다 낮게 나타났다. 이유로는 ER내에서 재조합 단백질이 세포내질 내에 존재하는 프로테아제의해서 안정성을 갖아 양적으로는 높게 나타났으나 (Benchabane et al. 2008) 소포체 지연 서열로 인한 \( \mathrm { t } - \mathrm { PA } \) 활성에는 영향을 미치는 것으로 생각된다. 대조군으로 사용된 야생형 알팔파 추출물에서는 하룻밤 배양 후에도 섬유소 분해활성을 나타내지 않았다. 이러한 재조합 t-PA 및 t-PA 파생 단백질들의 피브린 분해 활성은 ELISA를 이용한 단백질 발현양과 유사한 결과를 나타내었다.</p> <h2>재조합 단백질 분자량 측정</h2> <p>알팔파 형질전환체로부터 추출된 전체 수용성 단백질 (TSP, 50 \( \mu \mathrm { g } \) )을 분리하기 위해서 \( 12 \% \) SDS-PAGE를 실시하였다. 그런 후에 정제된 t-PA에 대해서 양으로 부터 생성된 항체를 사용하여 immunoblot 분석을 실행하였다. 6 가지 발현벡터로 형질전환된 알팔파잎으로부터 추출한 전체 수용성 단백질에서 기대하였던 65kDa 의 band를 확인하였다 (Fig. 7, lanes 3-8). 또한 상업적으로 판매되는 t-PA의 분자량도 위의 6 가지 발현벡터에 의해서 발현된 재조합 t-PA단백질들과 유사한 결과를 나타내었다. 반면 대조군으로 사용된 야생종 알팔파 추출물에서는 t-PA 단백질에 상응하는 어떠한 band도 관찰되지 않았다 (Fig. 7, lane 2). 또한 immunoblot 분석에서 21 and 31kDa의 단백질 band들이 관찰되었으며, 이러한 결과는 식물 시스템을 이용한 효소와 항체 단백질 발현 실험들에서 흔히 나타나는 식물체 내에 존재하는 프로테아제의한 발현 단백질의 분해결과 (Stevens et al. 2000; Outchkourov et al. 2003)와 유사함을 나타내었다.</p> <h1>적 요</h1> <p>의료용 단백질로 중요한 인체 혈관 내피세포 유래 t-PA를 알팔파 식물체를 이용하여 생산하는 기술을 개발하였다. 식물체에서 발현된 t-PA는 동물세포에서 생산된 t-PA와 동등한 시험관 내의 인공 혈전 용해 활성 및 생화학적 특성에서 유사함을 가지고 있었다.본 연구에서는 식물체에서 발현되는 t-PA 단백질의 알팔파 코돈 이용에 최적화된 합성 유전자이용 양적 증대, 소포체에 표적에 따른 발현양 증대, 6 개의 histidine의 부착에 따른 정제의 효율성을 고려하였고 두 종류의 프로모터 (CaMV 35S와 알팔파 Rbcsk-1A)를 이용하여 t-PA 및 파생 단백질들의 발현 효율을 비교 확인하고자 6가지의 식물발현 벡터를 제작하였다. \( 0.3 \% \) 의 제초제 살포 후에 저항성을 갖는 알팔파 식물체들의 t-PA 유전자 및 파생 유전자의 genomic DNA내의 삽입 유무는 PCR법을 활용하여 t-PA, 파생 유전자 및 합성 유전자의 크기에 해당하는 \( 1.6 \mathrm { ~kb } \) 의 PCR 산물을 확인할 수 있었다. 6 가지 발현벡터로 형질전환된 알팔파 잎 추출물에서 전체 수용성 단백질내의 t-PA 및 파생 단백질의 평균 발현양은 9.7-39.5 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { TSP } ( \mathrm { mg } ) \) 로 측정되었다. 이중 p221a-t-PAER 발현벡터로 형질전환된 알팔파의 잎 추출물에서 가장 높은 \( 75.1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { TSP } \) \( ( \mathrm { mg } ) \) 의 발현양을 나타났다. 알팔파 잎에 발현된 재조합 t-PA 분자량은 상업적으로 판매되는 t-PA와 동일한 68kDa으로 확인되었다. 형질전환된 알팔파 잎 추출물들의 평균 피브린 용해활성은 3.2-8.1 \( \mathrm { cm } \) 를 나타내었다. 또한 t-PA 및 그의 파생 단백질을 발현하는 알팔파 식물체는 야생종 알팔파와 비교했을 때 성장에 있어서 별 다른 차이를 보이지 않았다.</p>