본 논문에서는\( \mathrm{HaCaT} \) 세포주에 \( \mathrm{TNF}-\alpha \) 및 quercetin이 주는 독성을 확인하기 위해 CCK-8 assay를 실험하였다. 실험결과 quercetin은 TNF- \( \alpha \)로 유도된 \( \mathrm{HaCaT} \) 세포주에서 염증성 사이토카인, 케모카인 분비를 억제하고 건선 피부에서의 \( \mathrm{KRT} 6 \mathrm{~A} / 16 \) 발현도 억제함을 확인하였다. 또한 Quercetin에 의한 IкB \( \alpha \) 및 STAT3 단백질 인산화 조절을 관측하기 위한 실험으로 western blot 기법을 활용하여 quercetin에 의한 CCL20 신호전달 조절 메카니즘을 규명하고 \( \mathrm{IkB} \alpha \mathrm{NFkB} \) complex 내 \( \mathrm{IkB} \alpha \) 의 인산화 조절 여부를 확인하였다. 실험결과 , quercetin에 의한 CCL20 케모카인및 염증성 사이토카인의 발현은 \( \mathrm{IkB} \alpha \) 및 STAT3 인산화 신호조절과 관련이 있음을 확인하였다.
<h2>결 과</h2> <h3>TNF- \( \alpha \) 유도 \( \mathrm{HaCaT} \) 세포주에서 quercetin에 의한 CCL20 발현 억제</h3> <p>\( \mathrm{TNF}-\alpha \) 및 quercetin이 \( \mathrm{HaCaT} \) 세포주에 미치는 독성을 평가하기 위해 CCK-8 assay를 수행하였다. Serum-free 조건에서 \( \mathrm{TNF}-\alpha(20 \mathrm{ng} / \mathrm{mL}) \) 와 quercetin을 동시 치리한 결과, quercetin \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도 조건에서 세포 생존율이 \( 131.5 \pm 7.13 \% \) 로 세포 독성이 전혀 관찰되지 않았다(Fig. 1A). 따라서 이후 실험에서는 TNF- \( \alpha \) 를 \( 20 \mathrm{ng} / \mathrm{mL} \), quercetin의 최대 농도는 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 으로 설정하였다. 건선 피부염 시험 모델인 \( \mathrm{TNF}-\alpha \) 유도 \( \mathrm{HaCaT} \) 세포주에 quercetin을 최대 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도 조건으로 처리한 후 염증성 사이토카인 \( \mathrm{IL}-1 \alpha, \mathrm{IL}-1 \beta, \mathrm{IL}-6 \) 의 mRNA 발현을 확인한 결과, \( \mathrm{TNF}-\alpha \) 단독 처리군에서 \( \mathrm{IL}-1 \alpha \mathrm{mRNA} \) 발현량은 무 처리군 대비 \( 2.5 \pm 0.40 \) 배 증가하였고, 양성대조군으로 사용된 brazilin은 \( \mathrm{TNF}-\alpha \) 처리군 대비 \( 64.3 \pm 4.56 \% \) 감소하였으며, quercetin \( 2.5,5,10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도별로 처리한 결과 \( \mathrm{TNF}-\alpha \) 처리군 대비 각각 \( 33.8 \pm 9.00,37.8 \pm 9.98,49.1 \pm 7.14 \% \) 감소하였다(Fig. 1B). 또 다른 염증성 사이토카인 \( \mathrm{IL}-1 \beta \) 에서는 quercetin \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도 처리군에서 \( \mathrm{TNF}-\alpha \) 처리군 대비 약 \( 42.8 \pm \) \( 8.16 \% \) 감소 하였다(Fig. 1C). Quercetin에 의한 IL-6, IL-8 mRNA 발현양 또한 quercetin에 의해 유의성있게 감소하였다 (Fig. 1D, 1E). 건선 푀부염의 중요한 인자인 CCL20 케모카인의 \( \mathrm{mRNA} \) 발현 변화를 관찰한 결과, \( \mathrm{TNF}-\alpha \) 에 의해 활성화된 \( \mathrm{HaCaT} \) 세포주에서 CCL20 mRNA 발현량이 무처리군 대비 \( 5.6 \pm 0.55 \) 배 증가되어 \( \mathrm{TNF}-\alpha \) 유도 \( \mathrm{HaCaT} \) 세포주에서 CCL20 mRNA 발현이 정상적으로 작동하였음을 확인하였다. 양성 대조군인 brazilin을 \( 7 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도 조건으로 처리하였을 때 TNF-\( \alpha \) 단독 처리군 대비 약 \( 79.0 \pm 2.23 \% \) 감소하였고, 동일한 조건에서 \( \mathrm{TNF}-\alpha \) 와 quercetin을 각 농도별로 동시 처리한 결과 \( \mathrm{TNF}-\alpha \) 단독 처리군 대비 각각 \( 19.5 \pm 5.71,32.5 \pm 4.64,52.9 \pm \) \( 4.59 \% \) 감소하여 농도 의존적 방식으로 감소됨을 획인하였다(Fig. 1F). 마지막으로 건선에서 비특이적으로 증가되는 KRT6A 및 \( \mathrm{KRT} 16 \) 의 발현 변화를 관찰한 결과, \( \mathrm{KRT} 6 \mathrm{~A} \) 및 \( \mathrm{KRT} 16 \) 유전자의 mRNA 발현량 또한 quercetin에 의해 농도 의존직 방식으로 감소하였다(Fig. 1H). 위 결과들을 통해 quercetin은 TNF- \( \alpha \)로 유도된 \( \mathrm{HaCaT} \) 세포주에서 염증성 사이토카인, 케모카인 분비를 억제할 뿐 아니라 건선 피부에서 비특이적으로 증가하는 \( \mathrm{KRT} 6 \mathrm{~A} / 16 \) 발현 또한 유의직으로 억제함을 알 수 있었다.</p> <h3>Quercetin에 의한 IкB \( \alpha \) 및 STAT3 단백질 인산화 조절</h3> <p>각질형성세포 내 CCL20 단백질 발현은 NF-KB 및 STAT3 신호전달 기작과 밀접하게 연결되어 있다. 따라서 \( \mathrm{TNF}-\alpha \) 에 의해 유도된 \( \mathrm{HaCaT} \) 세포주에서 quercetin에 의한 CCL20 신호전달 조절 메카니즘을 규명하기 위해, western blot 기법을 활용하여 \( \mathrm{IkB} \alpha \mathrm{NFkB} \) complex 내 \( \mathrm{IkB} \alpha \) 의 인산화 조절 여부를 확인하였다. \( \mathrm{TNF}-\alpha \) 로 유도된 \( \mathrm{HaCaT} \) 세포주에서 인산화된 \( \mathrm{IkB} \alpha \) 단백질은 약 \( 6.7 \pm 0.07 \) 배 증가하였고, quercetin을 각각 농도별 \( 2.5,5,10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 로 처리한 결과 \( \mathrm{IkB \alpha} \) 단백질의 인산화가 유의성 있게 억제되었다(Fig. 2A). 인산화된 \( \mathrm{IkB \alpha} \) 단백질은 양성 대조군으로 사용한 brazilin 치리군에서 약 \( 92.2 \pm 3.05 \% \) 감소 하였고, quercetin \( 2.5,5,10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 치리군에서는 \( \mathrm{TNF}-\alpha \) 단독 처리군 대비 \( 17.3 \pm 2.41,75.8 \pm 3.57,91.1 \pm 2.10 \% \) 감소하였다 (Fig. 2B). 이는 quercetin이 IкB \( \mathrm{I} \alpha \) 단백질 인산화 억제를 통해 CCL20 유전자 발현을 유의성 있게 억제함을 보여준다. 또한 TNF- \( \alpha \) 에 의한 CCL20 발현 조절 기삭은 STAT3 단백질 활성화와도 밀접하게 연관되어 있다. 따라서 TNF- \( \alpha \) 에 의해 유도된 \( \mathrm{HaCaT} \) 세포주에서 quercetin에 의한 STAT3 단백질의 인산화를 관찰하였다. \( \mathrm{TNF}-\alpha \) 로 유도된 \( \mathrm{HaCaT} \) 세포주에서 인산화된 STAT3 단백질은 \( 6.9 \pm 0.12 \) 배 증가되었고, quercetin에 의해 STAT3 단백질 인산화가 유의성 있게 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 2C). 이를 정량 분석한 결과, 양성 대조군으로 사용한 brazilin은 약 \( 96.3 \pm 0.40 \% \) 감소시켰고, quercetin \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도 조건에서 \( 99.1 \pm 0.27 \% \) 감소시켰다(Fig. 2D). 위 결과를 토대로 \( \mathrm{TNF}-\alpha \) 로 활성화된 \( \mathrm{HaCaT} \) 세포주에서 quercetin에 의한 염증성 사이토카인 및 CCL20 케모카인의 발현 조절 기작은 \( \mathrm{IkB} \alpha \) 및 STAT3 인산화 신호조절과 밀전하게 연관되어 있음을 확인하였다.</p>