본 연구에서는 토마토의 영양결핍을 유도하기 위해 Sonneveld 용액을 변형하여 배양액으로 사용하였으며, 이후 BallMill를 이용한 분쇠물을 시료로 사용하였다. 시료의 무기성분 함량분석은 산가수분해액 용액을 이용한 Inductively coupled plasma spectrometer (ICP)로 측정하였다. 한편 시료의 단백질 분석과 관련하여 농도 분석은 Bradford 법을 통해 진행하였으며, 단백질 동정을 위해 mass spectrum을 이용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>토마토의 영양결핍 유기 및 식물체 분석</h2><p>공시 품종은 우리나라에 많이 재배되고 있는 서광을 2일간 최아한 후 50공 프러그 폿트에 파종하여 충분히 물을 뿌려주고 젖은 신문지로 덮어 상면이 건조하지 않도록 관리하여 싹을 틔운 뒤 본엽이 7~8매 전개되었을 때 뿌리에서 상토를 제거하고 시중에 시판되고 있는 간이양액재배시스템에 이식하였다. 영양결핍을 유도하기 위해 Sonneveld 용액을 약간 변형하여 사용한 배양액 농도는 다음과 같다. 물 \(40\mathrm{l}\)에 \( 1\mathrm{M} \)에 해당하는 \( \mathrm{Ca}\left(\mathrm{NO}_{3}\right)_{2} \cdot 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \(200\mathrm{ml}\), \(\mathrm{KNO}_{3} \) \(200\mathrm{ml} \), \( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) \(80\mathrm{ml}\), \(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \) \( 40\mathrm{ml} \)를 첨가하였고, Minor elements는 \(\mathrm{l}\) 당 \(1.81\mathrm{~g} \) \( \mathrm{MnCl}_{2} \cdot 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \), \(0.22\mathrm{~g} \) \( \mathrm{ZnCl}_{2} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \), \(0.08\mathrm{~g} \) \( \mathrm{CuSO}_{4} \cdot 5 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \), \(0.09\mathrm{~g} \) \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{MoO}_{4} \cdot \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)를 혼합하여 \(40 \mathrm{ml} \)를 첨가하였다. \( \mathrm{Na} 2 \mathrm{FeEDTA} \)는 \(\mathrm{l}\) 당 \(5\mathrm{~g} \)를 녹여 0, 10, 20, 30, \(50 \mathrm{ml} \)를 각각 첨가하여 용존산소 폭기 하에 25일간 재배 하였다. 영양결핍된 시료를 채취하여 \(70^{\circ} \mathrm{C} \) 건조기 내에서 2일간 건조하여 BallMill를 이용하여 분쇄한 후 \(200\mathrm{mesh} \) 채에 통과된 분쇄물을 시료로 사용하였다. 식물체의 무기성분 함량분석은 토양 및 식물체분석법에 의해 산가수분해액 \( \mathrm{HClO}_{4}+\mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 용액으로 분해하여 Inductively coupled plasma spectrometer (ICP)로 측정하였다.</p><h2>단백질체 분석</h2><p>영양결핍된 시료를 채취하여 액화질소 하에 막자사발로 분쇄하였다. 분쇄된 재료 \(1\mathrm{~g} \)를 Tris- \( \mathrm{HCl}\)\((\mathrm{pH}6.8\))에 혼합하여 혼합액의 다섯 배 부피의 아세톤을 가한다음 \(-20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 침전시켜 원심 분리한 침전물에 전기영동용액 (\( 7\mathrm{M} \) urea, \(2\mathrm{M} \) Thiourea, \(4 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) CHAPS, \(1\%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) DTT, \(2 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) pharmalyte, \(1 \mathrm{mM} \) benzamidine)에 녹여 \(-20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하며 이차원전기영동 시료로 사용하였다. 단백질의 농도측정은 Bradford 법으로 분석하였다. 일차적으로 등전점 전기영동 (IEF)을 위하여 IPG strips를 전기영동용액 \(7\mathrm{M} \) urea, \(2 \mathrm{M} \) thi-ourea, \(2\% \) CHAPS, \(1\% \) DTT, \(1\% \) pharmalyte)에 상온에서 12-16시간 정도 reswelling하였고, Strip당 시료는 \(200 \mu \mathrm{g} \)를 사용하여 Multiphore II system(Amersham Biosciences Co)을 이용하여 상온에서 IEF를 수행하였다. 이차적으로 전기영동을 수행하기 위해 IPG Strips을 \(1 \% \) DTT를 함유한 equili-bration buffer(\( 50 \mathrm{mM} \) Tris-Cl, \( \mathrm{pH}6.8\), \(6\mathrm{M}\) urea, \(2 \% \) SDS, \(30 \% \) glycerol)로 10분간 incubation한 후 DALT 2D system (Amersham Biosciences Co.)을 이용하였다. 완료된 이차원 gel은 Oakley 등의 방법으로 silver 염색한 후 스캐닝하여 컴퓨터에 저장하였다. 스캐닝된 단백질 spots의 발현변화 확인을 위한 정량적인 분석은 PDQuest software(BioRad)를 이용하였고, 각 spot의 quantity는 대조군에 비해 두 배 이상의 발현변화를 보여주는 단백질 spots을 선정하였다. 단백질 spots은 Shevchenko 등의 방법에 따라 modified porcine trypsin을 이용하여 작은 단편으로 효소적으로 분해하여 \( C_{18} \) ZipTips(Millipore)을 사용하여 탈염 및 농축한 후 질량분석을 위해 target plate 위에 적하하였다. 질량분석기는 Ettan MALDI-TOF(Amersham Biosciences Co)를 사용하여 Target plate 상에 적하되어 있는 단백질 단편들을 mass spectrum 으로 분석한 후 ProFound 검색엔진을 이용하여 단백질을 동정하였다.</p>