MMP-9의 활성는 LPS에 따라 유도되며 sulforaphane이 어떠한 영향을 조사하기 위해 gelatin zymography, RNA isolation and reverse transcriptase-polymerase chain reaction을 시행하였다. Gelatin zymography로 6-well plate에 적적 사용량의 세포를 분주 및 시약 처리 후 1일 24시간 배양한 후 SDS polyacrylamide gel에서 전기영동을 실시하였다. 그리고 RT-PCR을 토대로 MMP-9의 mRNA 발현을 조사 및 분석하였다. 그 결과, sulforaphane는 LPS 유도 MMP-9 활성을 억제하고 있음을 확인하였다.
<h2>Gelatin substrate gel zymography</h2> <p>LPS에 의해 유도되는 MMP-9의 활성에 sulforaphane이 미치는 영향을 알아보기 위하여 세포에 LPS를 전처리 후 sulforaphane을 처리하여 gelatin zymography를 시행하였다. 6-well plate에 적당량의 세포를 분주 한 후 시약을 처리하여 24시간 배양 한 후 세포 배양액을 거두어 \(2 \% \) geletain이 함유된 \( 10 \% \) SDS polyacrylamide gel에서 전기영동을 실시하였다. \(2.5 \% \) Triton X-100으로 1시간 동안 Gel을 세척하여 SDS를 제거한 다음, \( 5 \mathrm { mM } \mathrm { CaCl } { } _ { 2 } \)과 \( \mathrm { ZnCl } _ { 2 } \)가 포함된 완충액에 넣고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24-48시간 동안 배양하였다. \(0.25 \% \) Coomassie blue를 이용하여 30분 동안 Gel을 염색한 후, acetic acid와 methanol이 포함된 탈색 완충액을 처리하여 흰색 밴드를 관찰하였다.</p> <h2>RNA isolation and reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)</h2> <p>Sulforaphane에 의해 억제되는 LPS 유도 MMP-9 활성이 MMP-9의 mRNA levels에 어떠한 결과를 초래하는 알아보기 위해서 RT-PCR을 이용하여 MMP-9의 mRNA 발현을 분석하였다. 시료를 처리한 세포에 Trizol reagent (Life Technologies)를 처리하여 total RNA를 분리 한 후, M-MLV 역전사효소(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 MMP-9 특이적 primer 와 함께 반응시커서 유전자를 증폭시켰다. 그 양적 차이를 비교하기 위해서 \( 1 \% \) agarose gel에 각각의 PCR 산물을 loading 하여 전기영동을 한 다음 EtBr로 염색 한 후 UV 상에서 발현의 정도를 확인하였다. PCR에 사용한 MMP-9 primer sequence 는 forward: 5'-CAC TGT CCA CCC CTC AGA GC-3', reverse: 5'-GCC ACT TGT CGG CGA TAA GG-3'이다.</p> <h2>Plasmids, transfections and luciferase gene assays</h2> <p>LPS 유도 시 MMP-9 유전자의 전사제어에 대한 영향을 분석하기 위하여 MMP-9-Luc (human MMP-9 promoter construct) 및 각종 전사인자의 binding site에 대한 point mutant promoter construct를 사용하였다. 6-well plate에 24시간 배양한 세포에 human MMP-9-Luc 및 각종 promoter construct를 lipofectamine 방법에 따라 transfection을 하였고, LPS와 sulforaphane이 처리된 배지에서 24시간 더 배양을 한 후, luciferase 활성을 측정하였다. 또한 AP-1, NF-kB reporter construct는 Clontech (Palo Alto, CA, USA)으로부터 구입하여 위와 같은 방법으로 활성을 측정하였다.</p>