세포에서 추출한 total RNA 10 \( \mu \mathrm { g } \) 를 이용하여 cDNA를 합성하였고, 암 억제 유전자인 p53 단백질의 발현 조절 여부를 확인하기 위해 대장암 세포주인 HCT116에 다양한 물질들을 처리하였다. 그 결과, Resveratrol 처리 3시간 이후부터 p53 단백질의 증가가 확인되었으며, 이 증가 추세는 24시간까지 지속되었다.
<h2>RT-PCR</h2> <p>세포로부터 추출한 total RNA 10 \( \mu \mathrm { g } \) 을 주형으로 하여 cDNA를 제조하였다. 합성된 CDNA의 1/10 부피 (1 \( \mu \mathrm { l } \)) 를 이용하여, 유전자 특이적인 oligo primer와 물을 이용하여 최종 농도를 25 \( \mu l \) 로 하였다. 마지막으로 Red Taq polymerase mixture (Sigma, USA) 25 \( \mu \mathrm { l } \)를 첨가하여 PCR 반응의 최종농도를 50 \( \mu \mathrm { l } \) 로 하였다. PCR 반응의 조건은 94 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 4 분간 denaturation시키고, 94 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30 초, 58 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30 초, 72 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 45 초의 cycle을 25 번 반복한 후, 최종적으로 72 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분간 반응시켰다. 최종적인 PCR 산물은 전기영동 후, UV하에서 사진 촬영하였다.</p> <h1>결과 밎 고찰</h1> <h2>Phytochemical에 의한 암 억제 유전자 p53의 과대발현</h2> <p>Phytochemical과 sulindac sulfide에 의해 암 억제 유전자인 p53 단백질의 발현이 유도되는 것을 확인하기 위하여, 대장암 세포주인 HCT116 세포주에 50 \( \mu \mathrm { M } \) resveratrol, 50 \( \mu \mathrm { M } \) genistein, 50 \( \mu \mathrm { M } \) epicatechin gallate, 50 \( \mu \mathrm { M } \) dially disulfide, 10 \( \mu \mathrm { M } \) caffeic acid phenethyl ester, 그리고 5 \( \mu \mathrm { M } \) 의 sulindac sulfide를 24시간 동안 처리하였다. 각 처리군에서 p53 단백질의 발현을 확인하기 위하여 p53 항체를 이용하여 Western blot analysis를 수행하였다. 그 결과 처리한 모든 phytochemical에 의해 p53 단백질의 발현이 현저히 증가됨을 확인하였다. 반면 비 스테로이드성 항염증약인 sulindac sulfide에 의해서는 p53 단백질이 증가되지는 않았다. 처리한 phytochemical 중 resveratrol과 genistein에 의해 많은 양의 p53 단백질이 발현됨을 확인하였다.</p> <p>이중 포도껍질이나 적포도주에 많이 존재하는 resveratrol을 농도별 (0, 10, 25, 50, 100 \( \mu \mathrm { M } ) \), 시간별 (0, 3, 6, 7, 12, 24, 48시간)로 처리한 다음, p53 단백질의 발현의 변화를 조사하였다. Fig. 2A에서 보는 바와 같이 농도별로 처리한 경우, 10 \( \mu \mathrm { M } \) resveratrol 처리에 의해서는 약한 p53 단백질의 증가를 보여주었고, 처리농도가 증가됨에 따라 p53 단백질의 발현이 농도 의존적으로 증가됨을 확인하였다. Resveratrol을 시간대 별로 처리한 결과, 처리한 3시간 이후부터 급격하게 p53 단백질이 증가됨을 확인하였고, 이러한 증가 추세는 처리 후 24시간 까지 지속되었다.</p>