적송잎은 열풍건조후 분말화 하여 4가지 방법으로 추출물을 제조할 수 있다. 적송잎의 추출물을 제조할 수 있는 방법은 열수, 에탄올, 헥산 및 아임계 추출법이 있으며, 추출물은 폴리페놀성 성분을 포함하고 있다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>추출물의 제조</h2> <p>본 실험에 사용한 적송잎은 2007년 7월경 지리산에서 채취하여 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 열풍건조한 후 믹서로 분말화시켜 다음의 4가지 방법으로 추출을 행하였다. 열수 추출물은 적송잎 분말 \( 743 \mathrm{~g} \)에 물 \( 4,500 \mathrm{ml} \)을 첨가하여 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 추출한 후 여과한 액을 동결건조하여 제조하였다. 에탄올 및 헥산 추출물은 각각 적송잎 분말 \( 250 \mathrm{~g} \)에 \( 95 \% \) 에탄올 및 헥산을 각각 \( 1,500 \mathrm{ml} \)씩 첨가하여 상온에서 24시간 침지하여 추출한 후 여과한 액을 동결건조하여 제조하였다. 아임계(Sub-supercritical) 추출물은 적송잎 분말 \( 232 \mathrm{~g} \)에 \( 60 \mathrm{kgf} / \mathrm{cm}^{3} \)의 \( \mathrm{CO}_{2} \) 가스를 이용하여 separator 1은 \( 120^{\circ} \mathrm{C} \)로, separator 2는 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \)로 설정하여 210분간 추출을 행한 후 여과한 액을 동결건조하여 제조하였다.</p> <h2>총 폴리페놀성 성분의 농도 측정</h2> <p>총 폴리페놀성 성분의 농도는 Folin-Ciocalteu법에 의해 비색정량하였다. 각 추출물을 \( 70 \% \) 아세톤 용액으로 10배 희석한 후, 희석시료 \( 50 \mu \mathrm{l}\)와 \( 0.25 \mathrm{~N} \) Folin-ciocalteu's phenol reagent(Sigma, St. Louis, MO, USA) \( 0.475 \mathrm{ml} \)를 혼합하여 실온에서 3분 동안 반응시켰다. 여기에 \( 1 \mathrm{M} ~\mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \)를 \( 0.475 \mathrm{ml} \) 첨가하고 실온에서 60분간 반응시킨 후 \( 724 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 catechin(Sigma)을 사용하여 농도를 계산하였다.</p> <h2>Proanthocyanidin의 농도 측정</h2> <p>Proanthocyanidin의 농도는 acid butanol에서의 proanthocyanidin의 산화적 분해(oxidative depolymerization)로 측정하였다. 솔잎추출물 \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 메탄올 \( 0.9 \mathrm{ml} \)와 섞은 후, 여기에 \( 5 \%~ \mathrm{HCl} \) butanol \( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) ~6 \mathrm{ml} \)와 \( 2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) \( \mathrm{FeNH}_{4}\left(\mathrm{SO}_{4}\right)_{2} \cdot \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) (in \( \left.2 \mathrm{M} ~\mathrm{HCl}\right) 0.2 \mathrm{ml} \)를 첨가하고 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 40분간 반응시킨 후 실온까지 냉각시켰다. 반응액에 대해 원심분리(\(14,000 \times g\), 5분)를 행하여 불용성 성분을 제거한 상층액을 새 tube에 넣고 이를 \(5\%~\mathrm{HCl}\) butanol \( (\mathrm{v} / \mathrm{v})\)로 10배 희석시킨 후, \( 550 \mathrm{~nm} \)에서 즉시 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 \(96\%\) proanthocyanidin(Grape seed extract, Naturex, Avignon, France)을 사용하여 농도를 계산하였다.</p>