반응 온도와 pH에 따른 Chitinase의 활성을 분석하고자, 기질용액 colloidal chitin을 포함한 Tris-Cl 완충용액을 \(25,35,45^{\circ}\mathrm{C}\) 또는 \(\mathrm{pH}3\sim9\)에서 1시간동안 조효소액과 반응시켰고, DNS법으로 기질용액에서 유리한 환원당을 정량함으로써 효소 활성의 세기를 측정하였다. 또한 Laemmli 방법에 따라 SDS-PAGE을 수행하고, \(10\%\) fibrin-polyacrylamide gel에서 SDS-fibrin zymography을 수행하였다.
<h2>반응온도 및 \( \mathrm { pH } \)에 따른 chitinase의 할성 분석</h2> <p>Chitinase의 활성 분석은 기질용액으로 \( 1.0 \%( \mathrm { W } / \mathrm { V } ) \)의 col-loidal chitin을 포함한 \( 25 \mathrm { mM } \) Tris-Cl \( ( \mathrm { pH } 7.5) \) 완충용액을 이용하였으며, \( 25,35,45 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 또는 \( \mathrm { pH } 3 \sim9 \) 에서 1시간동안 조효소액과 반응시킴으로써 이루어졌다. 반응이 끝난 다음 5분간 boiling하여 반응을 정지시킨 후 남아있는 colloidal chi-tin을 제거하기 위하여 원심분리( \(12,000 \mathrm { rpm } \), 10분)를 하였고, 그 상등액을 이용하였다. 효소 활성의 세기는 DNS(Dinitrosalicylic acid)법으로 colloidal chitin으로부터 유리된 환원당을 정량함으로써 알 수 있었고, 표준당으로는 glu-cose들 사용하였다.</p> <h2>SDS-PAGE 및 zymogram assay</h2> <p>Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electro-phoresis (SDS-PAGE)은 Laemmli방법에 따라 수행되었다. Stacking 겔과 running 겔의 acrylamide 농도는 \( 3 \% \)와 \( 10 \% \)을 각각 사용하였으며, 단백질은 \( 0.2 \% \) Coomassie brilliant blue R-250로 염색하였다.</p> <p>SDS-fibrin zymography는 fibrinogen 농도가 \( 0.12 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \)가 되게 polyacrylamide 용액에 혼합한 후 즉시 thrombin \( (1,000 \mathrm { unit } / \mathrm { ml } ) \)을 첨가하여 제조한 \( 10 \% \) fibrin-poly-acrylamide gel에서 수행하였다. 각 lane에 혈전분해능이 우수한 분리균주의 조효소액을 점적한 후 전기영동을 실시한 다음 SDS에 의해 불활성화된 호스를 재활성화 시키기 위하여 gel을 \( 2.5 \% \) Triton X-100을 포함한 Tris- \( \mathrm { HCl } (50 \mathrm { mM } , \mathrm { pH } 7.5) \)에 30분 동안 침적하여 단백질을 활성화 시킨 후 Triton X-100을 제거하기 위하여 멸균수로 5분 동안 세척하였다. 분획된 단백질의 혈전분해활성은 활성반응 완충용액 \( (50 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } , \mathrm { pH } 7.5 \))에 gel을 침적하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 항온기에서 16시간 반응을 시켰다. Fibrin 분해능을 지닌 단백질 분획은 활성염석법에 의해 gel상의 fibrin을 분해하여 Coomassie blue R- 250 염색결과 투명대로 활성을 확인하였다.</p>