본 연구에서는 Mata[7]의 방법을 활용하여 S. parauberis, S. iniae, L. gar-veiae 세 종에 대해 종 동정을 할 수 있는 primer set을 개발하고 multiplex PCR assay를 실시하였다. 또한 API 20 Strep kit을 사용하여 생화학적 특성을 기반으로 종 동정을 실시하였고, 5% Sheep Blood Agar Plate를 이용하여 균주의 용혈성을 판정하였다. iniae의 serotype 식별 마커 P14와 S. parauberis, L. garvieae의 계통 유연관계 분석을 위한 random primer를 사용하여 PCR 반응을 진행하였으며, 이용한 RAPD primer sequence는 Table 1에 제시하였다.
<h3>Multiplex-PCR에 의한 종 동정</h3> <p>Mata[7]의 방법을 응용하여 S. parauberis, S. iniae, L. gar-veiae 각 3 종에 대해 동시에 종 동정이 가능한 3 종의 primer set (Spa-2152, Spa-2870, LOX-1, LOX-2, pLG-1, pLG-2)을 이용하여 multiplex PCR assay를 실시하였고, \( 1.2 \% \) agarosegel에서 수평 전기영동하여 S. iniae를 종.동정하였다. Primer sequence들과 목적하는 증폭크기는 Table 1에 나타내었다.</p> <h3>생화학적 성상을 이용한 S. iniae의 동정</h3> <p>생화학적 성상을 이용한 종 동정을 하기위해 API 20 Strep kit (bioMerieux, France)를 이용하여 제조회사의 man-ual에 따라 접종하여 4,24 시간대의 성상을 기록하였다. 이와 함께 균주들의 용혈성은 5 \% Sheep Blood Agar Plate (KOMED co., Korea)에 접종하고 \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } , 36 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 조건에서 배양하여 24-48시간대의 용혈성을 판정하였다. 이러한 결과를 APILAB identification system (APILAB PLUS, V 3-3-3, bioMerieux, France)으로 분석하여 종 동정을 실시하였다.</p> <h3>Random primer의 예비검정</h3> <p>본 연구에 사용된 random primer는 그룹 \( \mathrm { A } \) 연쇄상구균의 분류 marker로 사용되었고, S. iniae 각 serotype의 식별 marker로 사용된 P14와 어류 연쇄구균증 병원체로 보고된 S. parauberis와 L. garvieae의 계통 유연관계를 분석하기 위해 사용된 ramdom primer P1, P2, P3, P4, P5, P6 모두를 동일 조건하에 \( \mathrm { PCR } \) 반응을 실시하였고 예비검정에 사용하였다 \( [1,9,10,12] \). 본 연구에 사용된 RAPD primer sequence들은 Table 1에 나타내었다.<p>PCR-RAPD 반응용액은 각각 genomic DNA \( 20 \mathrm { ng } \), pri-mer \( 20 \mathrm { pmol } (0.75 \mu \ell), 10 \times \) Taq polymerase reaction buffer (100 mM Tris \( \mathrm { pH } \) 8.3, \( 400 \mathrm { mM } \mathrm { KCl } , 15 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } 210 \mathrm { mM } \) DTT, \( 500 \mu \ell / \mathrm { ml } \mathrm { BSA) } 2.5 \mu \ell, 2,5 \mathrm { mM } \) dNTP \( 4 \mu \ell \), Taq poly-merase \( 1.5 \mathrm { U } \) 를 넣고 증류수를 첨가하여 최종 volume을 25 \( \mu \ell \) 가 되게 하였다. DNA 증폭은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2 분간 pre-denature 시킨 후 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 denature 30 초, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2 분간 annealing 시켰으며 extension은 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 90 초간 실시하여 총 35회 PCR 반응을 실시하였다.</p>