플라스미드의 형질전환에서의 PRC1 프로모터 활성을 위해 pmGL-PRC1을 MRC5 정상폐세포주와 A549 폐암세포주에 각각 형질전환한다. 추가로 Virus 벡터와 Xenograft mouse 모델에서 promoter 활성에 대해 고찰도 진행했는데, Virus 벡터에서는 폐암에서도 유전자 치료용 바이러스 벡터의 프로모터를 사용 가능함을 확인하였고 Xenograft mouse 모델에서는 종양조직 부위에서만 발현 양상이 국한되는 것을 확인할 수 있었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>플라스미드의 형질전환에서의 PRC1 프로모터 활성</h2> <p>폐암세포주 특이적인 PRC1의 활성을 측정하기 위하여 pmGL-PRC1을 MRC5 정상폐세포주와 A549 폐암세포주에 각각 형질전환하였다. 이 때, 대조군으로 공벡터인 pmGL3와 이미 폐암특이적인 프로모터로 보고된 survivin (BIRC5) 프로모터가 포함된 pmGL-BIRC5를 같이 사용하였다. Fig. 1에서 보인 바와 같이 PRC1, BIRC5는 정상세포주에서는 공벡터와 비숫하게 활성이 거의 없으나, 폐암세포주에서는 높은 활성을 보여, 두 프로모터 모두가 공벡터에 비해 약 30배의 증가된 활성을 보인다. 이 결과는 PRC1이 BIRC5와 비슷한 활성을 보여 폐암 특이적인 프로모터로서의 이용 가능성을 시사한다.</p> <h2>Virus 벡터에서의 PRC1 프로모터 활성</h2> <p>AAV serotype 2벡터에 CMV, PRC1 및 BIRC5 프로모터를 각각 포함한 rAAV-GFP 벡터를 제작하였고, MRC5와 A549에 대해 세 종류의 rAAV 벡터를 감염하여 프로모터 활성을 상대적으로 비교하였다. 각 세포주에 대한 AAV의 감염율이 수용체단백질의 발현 정도에 따라 다르므로 CMV 프로모터에 의한 활성을 기준으로 하여 다른 프로모터의 활성을 상대적으로 각 세포주에 따라 분석하였다. 각 세포주에서 rAAV-CMV-GFP벡터에 의하여 나타내는 GFP 활성을 100으로 간주하고 다른 rAAV-CMV-GFP와 rAAV-PRC1-GFP 감염에 따라 나타나는 활성을 비교 분석한 그래프를 Fig. 2A에 보였다. 그림에서와 같이 PRC1은 정상 세포주에서는 CMV에 비해 그 활성이 \( 20 \% \) 정도로 비교적 낮은 반면에, 폐암세포주인 A459에서는 CMV 활성의 약 \( 75 \% \) 정도의 활성을 나타내었다. PRC1 프로모터는, 폐암 특이적인 고발현을 하는 것으로 보고된 BIRC5 프로모터에 비해 정상세포나 암세포 모두에서 약간 낮은 활성을 보이나, 정상세포주에서의 두 프로모터의 활성을 비교, 고려하면 치료 벡터에 응용될 경우에는 PRC1이 낮은 부작용으로 그 안전성이 좀 더 좋을 것으로 사료된다.</p> <p>아데노부속바이러스와 더불어 유전자치료에 많이 사용되는 벡터인 아데노바이러스(AV) 벡터에서의 PRC1 프로모터 활성도 비슷한 방법으로 실험하여 CMV 프로모터 활성과 비교한 결과를 Fig. 2B에 보였다. AAV의 경우와 같이 PRC1 프로모터가 정상세포주에서는 CMV에 비해 상당히 낮은 약 \( 15 \% \)의 활성을, 폐암 세포주에서는 비교적 높은 \( 66 \% \)의 활성을 보임을 알 수 있다.</p> <p>이상의 바이러스 실험 결과는 PRC1 프로모터가 이미 보고된 바와 같이 유방암에서뿐만 아니라 폐암에서도 유전자 치료용 바이러스 벡터의 프로모터로 사용이 가능함을 암시하고 있다.</p> <h2>Xenograft mouse 모델에서의 promoter 활성</h2> <p>우리는 생체 내 PRC1 프로모터의 활성을 luciferase 생체 이미징 기법을 이용하여 CMV 활성과 비교, 조사하였다 A549 세포를 이식하여 종양을 발생시킨 면역결핍생쥐에 AAV-PRC1-luciferase와 AAV-CMV-luciferase 바이러스를 각각 감염시켜 luciferase의 생체내 활성을 비교하였다. 각각 두 마리의 생쥐를 이용하여 실험한 결과 두 마리 모두 바이러스벡터 주입 후 2일 째부터 약한 발현을 보였으며 Fig. 3과 같이 10일 째에는 PRC1 프로모터가 CMV 프로모터보다 약간 우월한 활성을 보이는 강하고 안정된 발현을 보였다. 활성 부위를 분석한 결과, 등 쪽의 이미지에서는 CMV의 경우 한 쪽 종양의 부위에서만 약한 발현을 보이는데 비해, PRC1의 경우는 그 발현이 양 쪽에 이식한 종양 전체 부위에서 비교적 강한 발현을 보이는 것을 관찰할 수 있었다. 배 쪽의 이미지에서는 두 프로모터 모두 간으로 추정되는 넓은 부위에서 활성을 나타내는 결과를 보였다. 마우스에 발현된 luciferase 활성은 23일 째까지 지속되는 것을 확인하였다.</p> <p>우리는 이상의 연구에서 PRC1 프로모터가 세 가지의 다른 유전자 전달 방법(플라스미드 DNA 자체와 두 종류의 바이러스)과 두 대상 유전자(GFP, 루시퍼라제 reporter)에 대해서 폐암세포주에서만 높은 활성을 보이고, 정상세포주에서는 그 활성이 미미함을 보였다. 이러한 PRC1 프로모터는, 암에 유전자 치료법을 적용할 경우에, 암세포와 정상세포의 구별 없이 고발현하는 CMV 프로모터와는 달리, 주변 정상 세포에서의 발현을 감소시켜서 치료에 동반되는 부작용을 최소화시킬 수 있다. 그러므로, PRC1은 이미 발표된 유방암뿐 아니라 폐암의 유전자 치료용 벡터 제작에 필요한 프로모터로도 개발될 수 있는 높은 가능성을 보였으며, 저자의 기존 연구와 미 발표된 자료에 의해서도 PRC1은 이미 암 치료용 유전자로 많이 연구된 TERT보다 암특이적인 높은 전사 활성을 보였다. 또한, A549 폐암세포주를 이식한 xenograft 누드마우스를 이용하여 생체 내 PRC1 프로모터의 활성과 각 조직에서의 발현양상을 모니터한 결과, AAV 감염 10일 째에 CMV와 유사한 활성을 양 쪽 종양의 모든 부위에서 보여 유전자치료 벡터용 프로모터로서의 이용 가능성을 시사하였다. 그러나 배 쪽의 이미지를 분석하여 보면, 실질적으로 in vitro 세포주를 이용한 연구에서는 강한 암 특이적인 발현을 보였던 PRC1 프로모터가 in vivo 결과에서는 간으로 추정되는 다른 조직에서도 발현이 감지되는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 우선 본 실험에서 AAV 벡터의 투여 경로를 꼬리정맥을 통해 투여한 것에 기인할 것으로 추정된다. 미정맥투여된 바이러스 벡터는 우선적으로 간조직을 거처 체순환을 하는 것으로 예상되는데 투여한 바이러스 벡터의 상당 양이 일단 간에서 포획되고 그 결과 Fig. 3과 같이 어느 정도 발현을 하는 것으로 추측된다. 한편, 간을 벗어나 체순환으로 들어간 벡터는 Fig. 3의 결과와 같이 주로 종양조직 부위에서만 발현 양상이 국한되는 것을 확인할 수 있었다. 현재 본 연구에 포함되었던 PRC1 프로모터를 다양한 크기로 조작하여 동일한 조건에서 간에서는 전혀 발현되지 않고 종양조직에서만 발현되는 mutant 프로모터를 개발하고 있으며, 이러한 연구를 통해 부작용이 최소화된 안전하고 효율적인 암 치료용 전달체 개발에 이용 가능한 암 특이적 프로모터를 개발하고자 하는 연구를 진행하고 있다.</p>