면역세포의 중식에 미치는 효과를 측정하기 위하여 마우스의 비장 세포에서 비부착성인 T세포만을 순수 분리하여 사용하였다. 그런 다음 최종 농도가 0.5, \( 1,2,4 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \)가 되도록 각각의 추출물을 \( 10 \mathrm{uL} \)씩 각 well에 분주한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24, 48 , 72시간 배양하였다. 실험 결과는 통계 프로그램인 SAS를 이용하였고, 평균과 표준 편차를 구하였다.
<h2>비장 세포 분리법</h2> <p>면역세포의 중식에 미치는 효과를 측정하기 위하여 마우스의 비장을 이용하였다. 먼저 마우스의 비장을 무균적으로 적출하여 RPMI 1640으로 씻은 다음 핀셋과 멸균 슬라이드를 이용하여 단일세포 부유액을 만들었다. 단일세포 부유액을 RPMI 1640으로 2회 세척한 다음 lysing buffer(BD PharmLyse \( ^{\mathrm{TM}} \) Lysis Buffer)에 3분간 현탁시켜 적혈구를 제거하고 다시 원심 세척한 다음 \( 5 \times 10^{5} \) cells\( / \mathrm{mL} \) 농도가 되게 희석한 후 96 well plate에 well 당 \( 90 \mathrm{uL} \)씩 첨가하여 세포 중식능 측정에 이용하였다.</p> <h2>T세포 분리법</h2> <p>분리한 마우스의 비장 세포를 \( 10 \% \) FBS-RPMI 1640 배지\( 1 \mathrm{mL} \)에 희석하여 nylon wool column(Polysciences, Inc.)에 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에 60분간 배양한 후, nylon wool column을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)로 미리 데워진 배지로 세척하여 비부착성인 T세포만을 순수 분리하여 사용하였다.</p> <h2>시험관 내에서 세포 증식 측정법</h2> <p>준비된 96 well plate에 세포 \(90\mathrm{uL}\)와 최종 농도가 0.5, \( 1,2,4 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \)가 되도록 조제된 각각의 추출물을 \( 10 \mathrm{uL} \)씩 각 well에 분주한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24, 48 , 72시간 배양하였다. 세포 증식 측정은 Cell Titer \( 96^{\circledR} \) Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega, USA)를 사용하였으며, 세포 배양액 \( 100 \mathrm{uL} \)에 Cell titer 용액을 \( 20 \mathrm{uL} \)씩 첨가하여 4시간 동안 배양한 다음 Fluorescence Multi-Detection Reader(Synergy HT, BIOTEK, USA)로 \( 490 \mathrm{nm} \)에서 O.D.값을 측정하여 증식 정도를 측정하였다.</p> <h2>실험 동물의 체중 측정 및 장기 중량 측정</h2> <p>모든 실험 동물에 대한 체중은 시험 물질 투여 개시 직전에 1회 측정하였고, 투여 개시 이후에는 매일 1회씩 동일한 시간에 측정하였다. 실험 종료 후 실험 동물에 대해 urethane\( (3 \mathrm{g}/\mathrm{kg} \) body weight; Sigma Chemical Co., St. Louis)을 복강에 주사하여 마취하에 복강을 절개하여 주요 장기인 간장, 신장(좌, 우), 흉선, 비장을 적출하여 중량을 측정하였다.</p> <h2>비장 지수(spleen index) 산정</h2> <p>무균적으로 비장을 적출하여 비장의 무게를 측정한 뒤, 실험 동물 체중의 차이에 따른 변이를 없애고 이를 표준화하 기 위하여 적출 비장의 무게와 마우스의 체중을 바탕으로 아래의 공식에 따라 비장 지수를 구하였다.</p> <p>비장 지수 \( =\sqrt{\frac{\text { 비장 무게 }(\mathrm{g}) \times 100}{\text { 마우스 몸무게 }(\mathrm{g})}} \)</p> <h2>경구 투여에서 세포 증식 측정법</h2> <p>준비된 96 well plate에 세포를 \( 90 \mathrm{uL} \)씩 분주하고 각 군당 양성 대조군으로서 concanavalin \( \mathrm{A}( \) Con \( \mathrm{A}, 5 \mathrm{ug} / \mathrm{mL}) \)와 lipopolysaccharide(LPS, \( 15 \mathrm{ug} / \mathrm{mL} \) )를 각각 \( 10 \mathrm{uL} \)씩 분주하고 대조군에는 3차 멸균 증류수를 동량 분주한 후, 각 plate는 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24, 48, 72시간 배양하였다. 세포 증식 측정은 Cell Titer \( 96^{\circledR} \) Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega, USA)를 사용하였으며, 세포 배양액 \( 100 \mathrm{uL} \)에 Cell titer 용액을 \( 20 \mathrm{uL} \)씩 첨가하여 4시간 동안 배양한 다음 Fluorescence Multi-Detection Reader(Synergy HT, BIOTEK, USA)로 \( 490 \mathrm{nm} \)에서 O.D. 값을 측정하여 증식 정도를 측정하였다.</p> <h2>통계 분석</h2> <p>모든 실험 결과는 통계 프로 그램인 SAS(Statistic Analysis System)를 이용하여 평균과 표준 편차를 구하였다. 통계 처리는 one-way analysis of variance(ANOVA)에 의해 수행하였고 \( p<0.05 \) 수준에서 Student \( t \)-test에 의해 유의차를 검증하였다.</p>