세포 생존능을 측정하기 위해 B16F10 melanoma 세포를 1×10 4 cells //well 농도로 접종하고 48시간 동안 배양한 후 각 well에 100 \mu100\(\mu\) 의 dimethylsulfoxide를 넣고 흡광도를 측정하였다. B16F10 melanoma cell 내의 멜라닌 생성량 측정하기 위해 2 \times 10 ^ { 5 }2×105cells //well로 접종하고 48시간 동안 배양한 후 멜라닌의 액화를 일으키기 위해 10 \%10% DMSO가 함유된 1 \mathrm { ~N } \mathrm { ~NaOH }1 N NaOH를 넣고 흡광도를 측정하였다.
<h2>세포 생존능(cell viability)의 측정</h2> <p>Yang 등의 방법에 준하여 다음과 같이 cell viability를 측정하였다. B16F10 melanoma 세포를 96-well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 4 } \) cells \(/ \)well 농도로 접종한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) incubator에서 하루 동안 안정화를 시킨 후 fucoidan을 1, 10, 20 및 50 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도로 처리를 한 후 48 시간 동안 배양하였다. 그 후 각 well의 배지들을 제거하고 MTT solution ( \(5 \mathrm { ~mg } / \mathrm { ml } \) in PBS) 을 \( 100 \mu \mathrm { l } \) 씩 첨가하고, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 4 시간 동안 반응시킨</p> <p>후 MTT solution을 제거하고, 각 well에 \( 100 \mu \) 의 dimethylsulfoxide (DMSO)를 첨가하여 \(15 \sim 20 \)분간 plate shaker로 흔들어 준 다음 microplate reader를 사용하여 \( 540 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>B16F10 melanoma cell 내의 멜라닌 생성량 측정</h2> <p>6-well plate에 well당 \( 2 \times 10 ^ { 5 } \) cells \(/ \)well로 접종한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) incubator에서 24시간 동안 배양을 하였다. 배지를 제거하고 fucoidan이 1, 10, 20, 및 50 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도로 희석된 배지로 교체한 후 48시간 동안 배양하였다. 그 후 배지를 제거한 세포를 PBS (phosphate buffered saline)로 2번 세척하고, \( 1 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) Triton X-100을 함유한 \( 100 \mathrm { mM } \) sodium phosphate \( \left ( \mathrm { pH } \right . \) 6.8) \( 100 \mu \mathrm { l } \) 를 넣고 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30분 용해시킨 후, 12000 \( \mathrm { rpm } \) 에서 30분 동안 원심 분리하여 얻은 pellet을 멜라닌 정량에 사용하였다. 물에 불용성을 나타내는 멜라닌의 액화를 일으키기 위하여 \( 10 \% \) DMSO가 함유된 \( 1 \mathrm { ~N } \mathrm { ~NaOH } \)를 적정량 넣고 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1시간 동안 반응을 시킨 후 microplate reader를 이용하여 \( 405 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>