본 실험에서 사용된 오디는 건조 분쇄하여 물 추출물과 에탄올 추출물로 나누어 원심분리하고 여과지로 여과하여 시료로 사용하였다. 시료 추출물의 총 페놀함량은 Folin-Danis법으로 정량하였으며, 고혈압 유발효소인 ACE 활성억제 측정은 Cushman과 Ondetti의 방법에 따라 측정하였고, 관절염 유발효소인 XOase 활성억제 측정은 Stirpe와 Corte의 방법에 따라 측정하여 각각 저해율을 계산하였다. pancreatin \(\alpha\)-amylase 활성억제 측정은 agar diffusion method를 이용하여 측정하였으며, \(\alpha\)-glucosidase 활성억제 측정은 Tibbot와 Skadsen의 방법에 따라 측정하여 두 가지 방법으로 항당뇨 활성을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>오디 추출물의 제조</h2> <p>본 실험에서 사용된 오디(뽕나무열매)는 경북 상주시 소재 잠사곤충시험장에서 Table 1에서와 같이 9종을 획득하여, 이를 건조시킨 후 분쇄하여 저온저장하면서 이용하였으며, 오디의 물 추출물은 시료 \( 1\mathrm{~g} \)을 증류수 \( 200 \mathrm{~ml} \)에 넣고 액이 \(100 \mathrm{~ml} \)가 될 때까지 가열 한 후 냉각하고, 에탄올 추출물은 시료 \( 1 \mathrm{~g} \)을 \(60\%\) 에탄올 \( 100 \mathrm{~ml} \)에 가하여, 이들 모두를 \( 150 \mathrm{~rpm} \)에서 24시간 교반 추출 한 뒤 \( 10,000 \mathrm{~rpm} \)으로 15분간 원심분리하고, 각각의 상징액을 Whatman No. 1 여과지로 여과하여 시료로 사용하였다.</p> <h2>Total phenolic compound 함량의 측정</h2> <p>시료 추출물의 총 페놀함량은 다음과 같이 Folin-Danis법으로 정량하였다. 시료액 \( 1 \mathrm{~ml} \)에 \(95\%\) 에탄올 \( 1 \mathrm{~ml} \), 증류수 \( 5 \mathrm{~ml} \), 그리고 \( 1 \mathrm{~N} \) Folinciocalteu시약 \( 0.5 \mathrm{~ml} \)를 각각 가하여 잘 섞어주고 5분간 발색시킨 후, \(5\%\ \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3}\) \( 1 \mathrm{~ml} \)를 가하고 어두운 실온에 정치시킨 후 1시간 이내에 \( 725 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선으로 양을 환산하였다.</p> <h2>Angiotensin converting enzyme (ACE) 활성억제 측정</h2> <p>고혈압 유발효소인 ACE 활성억제 측정은 Cushman과 Ondetti의 방법에 따라 0.3 M \( \mathrm{NaCl} \)을 함유하는 0.1 M potassium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} ~8.3\))에 \( 2.5 \mathrm{~mM} \) Hippuryl-his-tidyl-leucine을 녹인 기질액 \( 0.15 \mathrm{~ml} \)에 ACE \( (0.125 \mathrm{~unit} / \mathrm{ml}) \) \( 0.1 \mathrm{~ml} \)와 시료액 \( 0.1 \mathrm{~ml} \)를 가하고 대조구에는 시료액 대신 증류수를 \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시키고 \( 1 \mathrm{~N} \) \( \mathrm{HCl}\ 0.35 \mathrm{~ml} \)를 가하여 반응을 종료시킨 뒤 ethyl acetate \(3 \mathrm{~ml} \)를 가하고 ethyl acetate층만을 취하여 evaporating한 뒤, 그 잔사에 증류수 \( 2 \mathrm{~ml} \)를 가하여 효소에 의해 기질로부터 분리되어 추출된 hippuric acid를 녹여 \( 280 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 구한 뒤 표준곡선에서 양을 환산하여 아래의 식에 의해 저해율(%)을 계산하였다.</p> <p>\( 저해율 (\%)=\left(1-\frac{\text { 반응구의 hippuric acid생성량 }}{\text { 대조구의 hippuric acid 생성량 }}\right) \times 100 \)</p> <h2>Xanthine Oxidase (XOase) 활성억제 측정</h2> <p>관절염 유발효소인 XOase 활성억제 측정은 Stirpe와 Corte의 방법에 따라 측정하였다. 즉 반응구는 0.1 M potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} ~7.5) \)에 xanthine \( 2 \mathrm{~mM} \)을 녹인 기질액 \( 1 \mathrm{~ml} \)에 xanthine oxidase \( (0.25 \mathrm{~unit} / \mathrm{ml})\) \(0.1 \mathrm{~ml} \)와 시료액 \( 0.1 \mathrm{~ml} \)를 가하고 대조구에는 시료액 대신 증류수를 \( 0.1 \mathrm{~ml} \) 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 반응시키고 \(20\%\) trichloroacetic acid \( 1 \mathrm{~ml} \)를 가하여 반응을 종료시키고 \( 3,500 \mathrm{~rpm} \)에서 15분간 원심분리하여 단백질을 제거한 후 반응액 중에 생성된 uric acid양을 \( 292 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 구한 뒤 표준곡선에서 양을 환산하여 아래의 식에 의해 저해율(%)을 계산하였다.</p> <p>\(저해율 (\%)=\left(1-\frac{\text { 반응구의 uric acid 생성량 }}{\text { 대조구의 uric acid 생성량 }}\right) \times 100 \)</p> <h2>\(\alpha\)-Amylase 활성억제 효과 측정</h2> <p>항당뇨활성 측정을 위한 pancreatin \(\alpha\)-amylase 활성억제 측정은 agar diffusion method를 이용하여 측정하였다. 즉, plate는 \( 5 \mathrm{~g} \)의 agar와 \( 5 \mathrm{~g} \)의 soluble starch를 \( 500 \mathrm{~ml} \) 증류수에 녹여 긇인 후, \( 121^{\circ} \mathrm{C} \)로 15분간 멸균하고 \( 15 \mathrm{~ml} \)씩 petridish에 붓고 식힌 뒤 \( 200\ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도의 시료액 \( 0.8\ \mu \mathrm{l}\)와 효소액 \( 0.2 \ \mu\mathrm{l}\) \((1,000 \mathrm{~unit} / \mathrm{ml}) \)를 섞어 plate 위에 놓인 disc paper 위에 각각 분주하고 대조구에는 시료액 대신 증류수를 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일간 배양한 후 \( \mathrm{I}_{2} / \mathrm{KI}\left(5 \mathrm{~mM} \mathrm{~I}_{2}\right. \) in \( \left.3 \%\ \mathrm{KI}\right) 5 \mathrm{ml} \)를 가하여 15분간 발색시킨 후 다음의 식으로 저해율을 계산하였다.</p> <p>\(저해율 (\%)=\left(\frac{\text { 대조구의 면적 }-\text { 반응구의 면적 }}{\text { 대조구의 면적 }}\right) \times 100 \)</p> <h2>\(\alpha\)-Glucosidase 활성억제 효과 측정</h2> <p>항당뇨활성 측정을 위한 \(\alpha\)-glucosidase 활성억제 측정은 Tibbot와 Skadsen의 방법에 따라 측정하였다. \( 50 \mathrm{~mM} \) sodium succinate buffer \( (\mathrm{pH} ~4.2\))에 \( \rho \)-nitrophenol-\(\alpha\)-D-gluco-pyranoside (PNPG)를 용해시켜 \( 1 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 기질을 만들고, 기질 \( 1 \mathrm{~ml} \)와 효소액 \( 0.1 \mathrm{~ml} \)를 혼합하고 대조구에는 증류수 \( 0.1 \mathrm{~ml} \), 반응구에는 \( 200\ \mu \mathrm{g} / \mathrm{~ml} \) 농도의 시료 \( 0.1 \mathrm{~ml} \)를 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시킨 후 \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{~NaOH}\ 0.1 \mathrm{~ml} \)를 첨가하여 발색시켰다. 이때 생성된 \( \rho \)-nitrophenol (PNP)은 \( 400 \mathrm{~nm} \)에서 spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정하였으며, 그 양은 \( \rho \)-nitrophenol로부터 작성한 표준곡선으로부터 구하여 다음의 식으로 저해율을 구하였다.</p> <p>\(저해율 (\%)=\left(1-\frac{\text { 반응구의 } \rho \text {-nitrophenol 생성량 }}{\text { 대조구의 } \rho \text {-nitrophenol 생성량 }}\right) \times 100 \)</p>