경상남도 삼림 지역의 토양, 썩은 나무 등에서 채취한 100여개의 샘플 중 멜라닌 탈생능을 가진 균주를 선별하기 위하여 사람 머리카락으로부터 분리한 천연 멜라닌을 첨가한 배지에서 30일동안 배양하였다. 그 후 Peniophora sp. JS17 균사체로부터 멜라닌 탈색 효소의 최적 생산을 위한 배지조성을 조사하기 위해 9가지 조건의 배지를 조성해 배양실험을 진행하여 MNM 배지의 조성에서 가장 높은 laccase 활성을 확인한 후, 탄소원 및 질소원의 영양원에 따른 효소 생산량을 조사하기 위하여 MNM 배지에서 기존의 영양원을 제거하고 \( 2 \% \) 탄소원 및 \( 0.4 \% \) 질소원을 각각 첨가하여 실험을 진행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>멜라닌 분해 균주의 screening</h2> <p>경상남도 삼림 지역의 토양, 썩은 나무 등에서 채취한 100여개의 샘플을 phosphate buffered saline (PBS)와 혼합한후 potato dextrose agar (PDA) 평판배지 상에 접종하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5 일 동안 배양하였다. 멜라닌 탈색능을 가진 균주를 선별하기 위하여 배양된 PDA 평판배지 상의 균사를 직경 \( 5 \mathrm{~mm} \)의 cork borer로 agar plug를 만들어 human hair melanin \( (0.6 \mathrm{~g} / \mathrm{l}) \)을 첨가한 malt extract dextrose (MDB) 배지(glucose \( 4 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), malt extract \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), peptone \( 4 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), agar \( 15 \mathrm{~g} / 1) \)에 접종하고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 일 동안 배양하였다. 투명환을 형성하는 균주는 동일한 배지에 계대 배양하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였고, \( 18 \mathrm{~s} \mathrm{rRNA} \) 서열 분석을 통하여 계통학적으로 동정하였다.</p> <h2>Human hair melanin 추출법</h2> <p>천연 melanin은 사람 머리카락으로부터 Krol and Libler의 방법을 사용하여 분리하였다. 머리카락 \( (15 \mathrm{~g}) \)을 작은 조각으로 자르고 \( 1 \mathrm{M} \mathrm{NaOH} 500 \mathrm{ml} \)을 첨가하고 24시간 stirrer로 교반하였다. 혼합물은 원심분리 \( (2400 \times g 15 \mathrm{~min}) \) 한 후, 갈색의 상등액을 회수하고 \( 0.1 \mathrm{M} \mathrm{HCl} \)를 첨가하여 \( \mathrm{pH} \)를 감소시키면서 멜라닌 침전을 형성하였다. 침전물은 원심분리 \( (2400 \times g 15 \mathrm{~min}) \) 한 후, \( 0.1 \mathrm{M} \mathrm{HCl} \)로 washing하고 \( 2 \mathrm{M} \mathrm{NaOH} \)를 첨가하여 중화하였고 다시 \( 6 \mathrm{M} \mathrm{HCl} \)를 첨가하여 원심분리 \( (2400 \times g 15 \mathrm{~min}) \)하였다. 이 과정은 상등액의 색깔이 없어질 때까지 약 5번 반복하였다. 마지막 침전물은 \( 6 \mathrm{M} \mathrm{HCl} \)에 6시간 동안 stirrer로 교반한 후 원심분리 \( (2400 \) \( \times g 15 \mathrm{~min} \) )하여 상등액을 제거하였다. 침전물은 ethanol로 wash한 후 methanol에 용해시키고 evaporator로 완전히 건조시켜 실험에 사용하였다.</p> <h2>배양 조건</h2> <p>Peniophora sp. JS17 균사체로부터 멜라닌 탈색 효소의 최적 생산을 위한 배지조성을 조사하기 위해 Coriolus versicolor medium (CVM), Czapex dox medium (CDM), Lentinus edodes medium (LEM), mushroom complete medium (MCM), malt yeast glucose medium (MYGM), yeast malt extract medium (YM), laccase production medium (LPM), YpSs medium (YSM), Minimal medium \( (\mathrm{MNM}) \)을 사용하였으며, 각 배지의 조성은 Table 1에 나타내었다. Peniophora sp. JS17을 PDA 평판배지 상에 접종하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5일 동안 배양한 후 한천배지 상의 균사를 직경 \( 5 \mathrm{~mm} \)의 cork borer로 agar plug를 만들어 각각의 액체배지 \( 100 \mathrm{ml} \)에 접종하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 100 \mathrm{rpm} \)으로 12 일간 진탕배양 하였다. 탄소원 및 질소원의 영양원에 따른 효소 생산량을 조사하기 위하여 복합배지 중 가장 높은 laccase 활성을 나타내는 MNM 배지의 조성으로부터 해당 영양원을 제거하고 \( 2 \% \) 탄소원 및 \( 0.4 \% \) 질소원을 각각 첨가하여 실험하였다.</p>