분리균주 동정은 ISP 방법에 따라 ISP 평판배지에 접종한 후 \(28^{\circ}\mathrm{C}\)에서 7일, 14일, 21일 간격으로 배양특성을 관찰하고, GSS 배지에 접종한 분리균을 \(28^{\circ}\mathrm{C}\)에서 4일간 진탕 배양한 후 원심분리로 얻은 배양상등액에 ammonium sulfate를 처리한 뒤 30분간 원심분리하여 \(20\mathrm{mM}\)sodium phosphate buffer(\(\mathrm{pH}6.0)\)에 녹이고 동일 buffer에 투석하여 Xylanase 조효소액을 제조하였으며, Xylanase 활성은 oat spelt xylan을 기질로 효소 반응 후 유리된 환원당을 DNS방법으로 정량하여 측정하였다.
<h2>분리균주 동정</h2> <p>분리균주의 동정은 Bergey's Manual of Systematic Bac-teriology와 International Streptomyces Project(ISP) 방법에 준하여 실시하였다. 배양 특성의 조사는 ISP 방법에 따라 ISP 평판배지(Difco, USA) No. 2, 3, 4, 5, 7과 glucose asparagine 평판배지 및 Bennett 평판배지 에 접종 한 후 \( 28 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 7 일, 14 일, 21 일 간격으로 기균사의 색깔, 배면색깔, 배지색깔, 생육정도, 가용성 색소 생성 유무 및 멜라닌 색소 생성 유무를 관찰하였다. 탄소원 이용성은 부가 탄소원을 첨가하거나 첨가하지 않은 Bennett 평판배지에서 분리균을 배양한 후 성장정도를 비교하여 결정하였다. 분리 균주의 형태적 특성은 포자의 사슬형태, 표면상태, 포자형성능 등의 관찰을 통해 파악하였으며 포자형성능은 oatmeal 평판배지를 이용하여 \( 28 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 21 일간 배양한 후 조사하였다.</p> <h2>Xylanase 조효소액 제조</h2> <p>분리균을 G.S.S 배지에 접종하여 \( 28 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 4 일 동안 진탕 배양한 후 원심분리하여 얻은 배양상등액을 사용하였다. 배양상등액에 \( 15 \sim 70 \% \) ammonium sulfate를 처리하고 \( 12,000 \mathrm { rpm } \) 에서 30 분 동안 원심분리 한 후 침전물을 취하여 \( 20 \mathrm { mM } \) sodium phosphate buffer( \( \mathrm { pH } 6.0) \)에 녹이고 동일 buffer에 투석하여 조효소액을 제조하였다.</p> <h2>Xylanase 활성 측정</h2> <p>Xylanase 활성은 oat spelt xylan을 기질로 하여 효소 반 응 후에 유리된 환원당을 3,5-dinitrosalicylic acid(DNS) 방법으로 다음과 같이 정량함으로써 측정하였다. 증류수에 현탁시킨 \( 1.0 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) oat spelt xylan 용액 \( 0.5 \mathrm { ~mL } \) 와 \(200 \mathrm { mM } \) sodium citrate buffer \( ( \mathrm { pH } 5.5 \)) \( 0.25 \mathrm { ~mL } \) 를 효소 용액 \( 0.25 \mathrm { ~mL } \) 와 혼합하여 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 15 분 동안 반응시켰다. DNS 시약 \( 3 \mathrm { ~mL } \) 을 첨가하여 반응을 정지시키고 끓는 물에서 5 분 동안 방치하여 발색시킨 후 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하고 이를 glucose를 표준시료로 사용하여 동일 조건하에서 발색시켜 조사한 흡광도와 비교함으로써 유리된 환원당의 양을 결정하였다. 효소 활성도 \( 1.0 \) unit는 위의 조건하에서 1 분 동안 xylan으로 부터 \( 1 \mu \mathrm { mol } \) 의 xylose에 상응하는 환원당을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. Xylanase 활성에 미치는 반응 온도의 영향을 조사하기 위하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \sim 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지의 온도에서 각각 효소 활성을 측정하였으며, 활성에 미치는 pH의 영향을 알아보기 위해서는 \( \mathrm { pH } 3.5 \) 에서 \( \mathrm { pH } 9.0 \) 까지의 범위에서 xylanase 활성을 각각 측정하였다.</p>