Protease의 최적 기질을 확인을 위해 \( 6 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) BSA, casein, gelatin을 이용하여 분해능을 조사했으며, 각각의 기질을 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-\( \mathrm{HCl} \) 완충액 \( (\mathrm{pH} 9.0\))에 녹여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 동안 반응시킨 후 효소 활성을 측정한 결과, casein은 gelatin보다 2.5배, BSA보다 128배 강한 단백질 분해 활성을 보였다. 그리고 LB broth에 skim milk와 gelatin을 첨가한 배지에서 우수한 효소생산이 관찰됐는데 casein이 gelatin보다 \( 1.5 \) 배 높은 효소생산을 나타냈다. 최적 효소활성은 \( \mathrm{pH} 9.0 \)이며 \( \mathrm{pH} \) \(11.0 \) 까지도 효소활성이 안정적으로 유지됐으며, Metal ion의 농도가 높아질수록 효소활성을 저해했다.
<h2>Protease의 기질 특이성</h2> <p>Protease의 최적 기질을 확인하기 위하여 \( 6 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) BSA, casein, gelatin을 이용하여 분해능을 조사하였다. 각각의 기질 을 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-\( \mathrm{HCl} \) 완충액 \( (\mathrm{pH} 9.0\))에 녹여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 1 \) 시간 동안 반응시킨 후 효소 활성을 측정한 결과, 최적 기질은 casein으로서 gelatin의 \( 2.5 \) 배, BSA보다 \( 128 \) 배 더 강한 단백질 분해 활성이 확인되었다. 이 결과는 앞서 확인되었던 배양배지의 질소원 특성 결과와 유사한 경향을 보였다. 즉, LB broth에 첨가한 질소원 중 skim milk와 gelatin를 첨가한 배지에서 우수한 효소생산이 관찰되었으며, gelatin 보다 skim milk에서 효소생산이 \( 1.5 \) 배 더 높은 것으로 확인되었다. 따라서 skim milk의 주성분이 casein인 것을 고려할 때 Microcaxws sp. PS-\( 1 \)이 생산하는 protease 효소의 기질 특이성이 casein에서 가장 높은 것으로 사료되었다.</p> <h2>Protease의 최적 효소활성과 안정성</h2> <p>Protease의 최적 \( \mathrm{pH} \) 를 확인하기 위하여 4 가지 완충액 \( (\mathrm{pH} \) \( 3.0 \) ~ \( 6.0 \): \( 50 \mathrm{mM} \) sodium acetate, \( \mathrm{pH} \) \( 8.0 \) ~ \( 9.0 \): \( 50 \mathrm{mM} \) sodium phosphate, \( \mathrm{pH} \) \( 8.0 \) ~ \( 9.0 \): \( 50 \mathrm{mM} \) Tris- \(\mathrm{HCl} \)\( \mathrm{pH} \) \( 9.0 \) ~ \(14.0 \) : \( 50 \mathrm{mM} \) glycine \( \mathrm{NaOH}) \) 을 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 효소활성을 측정하였다. 그 결과, 최적 효소활성은 \( \mathrm{pH} 9.0 \) (50 mM Tris-\(\mathrm{HCl} \))에서 나타났고 \( \mathrm{pH} \) \(11.0 \) 까지도 효소활성이 안정되게 유지되었다. 또한 \( \mathrm{pH} \) \( 12.0 \) 에서도 약 \( 75 \% \) 정도의 효소활성이 유지되어 전형적인 alkaline protease의 특성을 보였다. 한편 효소의 최적 온도를 측정하기 위하여 proetase를 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) 완충액 \( (\mathrm{pH} 9.0) \) 에서 \( 25,30,37,45,50,60,70^{\circ} \mathrm{C} \) 의 온도에서 반응시켜 효소활성을 조사하였다. 효소의 최적 반응온도는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 로 나타났으며 반응온도가 높아질수록 효소활성이 급격히 감소하며 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서는 최적온도의 \( 52 \% \) 수준의 호소활성을 나타냈으며, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 부터는 활성이 거의 관찰되지 않았다.</p> <p>Protease의 \( \mathrm{pH} \) 와 온도에 대한 안정성을 확인하기 위해 다양한 온도와 \( \mathrm{pH} \) 조건에서 \( 30 \) 분간 반응 한 후, 최적 반응조건인 \( \mathrm{pH} \) \(9.0\)와 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(1 \) 시간 동안 추가로 반응시켜 잔존활성을 확인하였다. 그 결과, \( \mathrm{pH} 9.0 \sim 10.0 \) 사이에서 효소활성이 매우 안정하였으나 \( \mathrm{pH} \) \(6.0\)과 \( 12.0 \) 에서는 각각 상대 효소활성이 \( 52 \% \) 와 \( 63 \% \) 로 확인되어 분리된 균주의 protease는 알카리 조건의 \( \mathrm{pH} \) 에서 효소활성이 매우 안정하였다. 온도에 대한 안정성은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 이하의 온도에서는 큰 영향을 받지 않았지만 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서는 잔존활성이 \( 53.7 \% \) 로 감소하면서 열에 매우 불안정한 것으로 나타났으며, \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 이후에는 효소활성이 완전히 사라졌다.</p> <h2>효소활성에 대한 metal ion, chernical reagent와 SDS의 영항</h2> <p>Metal ion과 chemical reagent가 protease의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 각각을 \( 1,5,10 \mathrm{mM} \) 의 농도로 첨가하여 효소의 활성을 측정하였다. Metal ion은 농도가 높아질수록 효소활성을 저해하였으며, 특히 \( 10 \mathrm{mM} \) 의 \( \mathrm{Zn}^{2+}, \mathrm{Cu}^{2+} \) 와 \( \mathrm{Fe}^{2+} \) 이온에서 강한 저해작용을 보여 잔여활성이 각각 \( 43.5 \% \), \( 25.6 \% \) 와 \( 30.2 \% \) 로 나타났으나, \( 1,5 \mathrm{mM} \) 의 \( \mathrm{Zn}^{2+}, \mathrm{Cu}^{2+} \) 에서는 영향이 없었다. 또한 \( \mathrm{Mg}^{2+} \) 과 \( \mathrm{Ca}^{2+} \) 이온에서는 \( 10 \mathrm{mM} \) 의 농도 에서도 잔여활성이 \( 80 \% \) 이상까지 유지되어 다른 metal ion보다 효소활성에 영향이 있는 것으로 관찰되었다.</p> <p>EDTA와 PMSF의 경우, \( 1 \mathrm{mM} \) 부터 활성이 강하게 저해되었고 EGTA와 DTT에서는 \( 1 \mathrm{mM} \) 에서 각각 \( 76.5 \% \) 와 \( 93.6 \% \) 의 잔존활성이 유지되었으나 \( 5 \mathrm{mM} \) 부터 효소활성이 급격히 감소되었다. Serine protease inhibitor로 알려져 있는 PMSF와 metal ion의 chelating agent로 알려진 EDTA와 EGTA에서 의 강한 저해작용을 통헤, Micrococcus sp. PS-\( 1 \)가 생산하는 protease는 serine protease와 metallo protease의 특성을 함께 갖는 것으로 사료되었다.</p> <p>SDS 대한 효소의 안정성을 측정하기 위해 \( 1,2,4,5,6 \% \)\((\mathrm{w} / \mathrm{v} )\) SDS를 처리하여 활성을 확인한 결과, \( 5 \% \) 까지 약한 저해활성을 보였으나 \( 6 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 의 농도에서도 잔존 효소활성이 \( 72.3 \% \)로 측정되어 Micrococcus sp. PS-\(1\)이 생산하는 protease는 SDS에서 비교적 안정함을 확인할 수 있었다.</p> <p>해양미생물이 생산하는 alkaline protease의 생리적 특성을 비교해 볼 때, 저온성 세균인 Pscuidomanas sp. DY-A가 생산하는 alkaline protease의 경우 효소생산은 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서, 효소의 최적활성은 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 관찰되었다. Bacillus sp. Ve1은 \( 10 \% \)(\( 2.1 \mathrm{M} \)) \( \mathrm{NaCl} \)에서도. protease가 안정되게 생산하는 것으로 나타났다. 본 연구에 사용된 Micrococus sp. PS-\( 1 \)의 경우, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 와 \( 1 \mathrm{M} \mathrm{NaCl} \) 농도에서 최적의 효소 생산을 나타내어 해양미생물이 다양한 생육조건에서 성장하기 때문에 효소의 산조건 역시 다양하게 나타난 것으로 추정된다.</p> <p>한편 Micrococcus sp.가 생산하는 protease의 특성을 비교해볼 때, Micrococcus sp. ATCC \(407 \)의 경우 \( 43 \mathrm{kDa} \) 의 extracellular calcium metalloenzyme 의 최적 활성이 \( \mathrm{pH} 6.5 \) 와 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 나타났고, Micrococcus sp. INIA \( 528 \) 은 \( 19.4 \mathrm{kDa} \)의 cysteine proteinase가 \( \mathrm{pH} \) \(7.0\)과 \( 34^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 최적활성을 보였다. 그러나 Microococus sp. MCC-\( 315 \)의 \( 28.9 \mathrm{kDa} \) 의 caseinolytic enzyme이 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서도 그 활성을 유지한다는 검을 고려할 때, Micrococcus sp.가 생산하는 protease는 넓은 범위의 환경조건에서 효소활성을 나타내는 것으로 사료된다.</p> <p>따라서 Micrococcus PS-1이 생상하는 protease 의 분자량과 효소학적 특성을 정확하게 조사하기 위해서는 단백질의 정제 연구가 추가적으로 수행되어야 할 것이다.</p>