본 연구에서는 tannic acid를 표준물질로 사용하여 총 폴리페놀의 함량을 산정하였으며, 총 플라보노이드 함량은 diethylene glycol 비색법으로 측정하였다. 추출물의 항산화활성은 DPPH와 ABTS radical 소거활성을 비교하였는데, 이를 위해 합성 항산화제인 BHT를 대조군으로 사용하였다. 항산화활성은 각 추출물과 동일한 방법으로 실험하였다. 실험은 총 3회 반복하여 진행하였고, SAS version 9.1을 이용하여 평균을 구하였다. 결과는 \( p<0.05 \)의 유의수준에서 Tukey's studentized range test를 이용하여 통계분석하였다. 이 연구는 폴리페놀과 플라보노이드의 함량 측정법과 추출물의 항산화활성 평가에 기여한다.
<h2>총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정</h2> <p>추출용매 및 추출방법에 따른 총 폴리페놀의 함량을 측정하기 위하여 청나래고사리의 각 추출물 \( 0.1 \mathrm{ml}, 2 \% \) 의 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) (Sodium carbonate, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) 용액 \( 2 \mathrm{ml} \) 를 혼합하고 3분 후 \( 1 \mathrm{~N} \) 의 Folin-Ciocalteu's phenol reagent (F9252, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA)을 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 첨가하여 실온에서 30 분 동안 반응시킨 후 UV/Visible spectrophotometer (Ultrospec 4000, Pharmacia Biotech., Orsay, France)로 \( 750 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였으며, tannic acid (T0200, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA)를 표준물질로 하여 작성한 검량선에 대입하여 건조시료 \( 1 \mathrm{~g} \) 에서 용출되는 총 폴리페놀의 함량을 tannic acid 기준으로 구하였다.</p> <p>총 플라보노이드 함량은 diethylene glycol 비색법을 이용하여 측정하였다. 추출물 \( 0.2 \mathrm{ml} \), diethylene glycol (H26456, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) \( 2 \mathrm{ml}, 1 \mathrm{~N} \) \( \mathrm{NaOH} \) (Sodium hydroxide solution, Samchun, Pyungtaek, Korea) \( 2 \mathrm{ml} \) 를 혼합한 다음 \( 37 \pm 2^{\circ} \mathrm{C} \) 의 water bath에서 1 시간동안 반응시켰으며, \( 420 \mathrm{~nm} \) 에서 반응물의 흡광도를 측정하였다. Naringin (N1376, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA)을 표준물질로 작성한 검량선에 대입하여 건조시료 \( 1 \mathrm{~g} \) 에서 용출되는 총 플라보노이드의 함량을 naringin 기준으로 구하였다.</p> <h2>추출물의 radical 소거활성</h2> <p>추출물의 항산화활성을 분석하기 위하여 실제 항산화 활성과 연관이 높아 시료의 항산화활성 특정에 자주 사용되는 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical 소거법과 극성과 비극성 시료의 항산화 활성을 모두 측정할 수 있어 DPPH radical 소거능보다 적용 범위가 넓은 ABTS [2,2'-azi-no-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] radical 소거법을 이용하였다.</p> <p>DPPH radical 소거활성은 \( 0.15 \mathrm{mM} \) 의 DPPH (D9132, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA)용액 \( 0.8 \mathrm{ml} \) 에 4단계로 희석한 각 추출물 \( 0.2 \mathrm{ml} \) 를 혼합하여 암실에서 30 분 동안 반응시킨 후, \( 517 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 구하였다. 각 농도별 추출물의 radical 소거활성을 아래의 식에 대입하여 계산하였으며, 대조구의 radical 소거활성을 \( 50 \% \) 감소시키는데 필요한 시료의 농도 \( \left(\mathrm{RC}_{50}, \mathrm{mg} \cdot \mathrm{ml}^{-1}\right) \) 를 단순회귀분석으로 구하였다.</p> <p>ABTS radical 소거활성을 분석하기 위하여 \( 2.6 \mathrm{mM} \) potas-sium persulfate (P5592, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA)에 녹인 \( 7.4 \mathrm{mM} \) 의 ABTS (A9941, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA)를 실온\(\cdot \)암소에 24시간 동안 방치하여 radical을 형성시켰으며, 실험 직전 \( 732 \mathrm{~nm} \) 에서 ABTS용액의 흡광도가 \( 0.7 \pm 0.02 \) 이 되도록 phosphate-buffered saline \( (\mathrm{pH} 7.4\))으로 희석하였다. ABTS용액 \( 950 \mathrm{ul} \) 에 각 추출물 \( 50 \mathrm{ul} \) 를 첨가하여 암소에서 10 분 동안 반응시킨 다음 \( 732 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. ABTS radical 소거활성은 DPPH radical 소거활성과 동일한 방법으로 계산하여 \( \mathrm{RC}_{50} \) 으로 나타내었다. 추출물의 DPPH 및 ABTS radical 소거활성을 비교하기 위하여 대조구로 합성 항산화제인 BHT (2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol; B1378, Sigma, Steinheim, Germany)를 사용하였으며, 추출물과 동일한 방법으로 실험하여 각 추출물의 항산화활성을 비교하였다.</p> <p>Radical scavenging activity \( (\%)=(1-\mathrm{A} / \mathrm{B}) \times 100 \)</p> <ul> <li>A: 추출물을 넣었을 때의 흡광도</li> <li>B: 추출물 대신 동량의 용매를 첨가했을 때의 흡광도</li></ul> <h2>통계분석</h2> <p>실험은 3반복을 1 회로 하여 3회 반복 실험한 다음 SAS ver-sion 9.1 (SAS institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 평균을 구하였으며, \( p<0.05 \) 의 유의수준에서 Tukey's studentized range test를 이용하여 통계분석 하였다.</p>