Ras는 세포 내 다양한 신호전달 경로를 통해 전사인자들의 발현을 조절하며, 이는 세포증식에 크게 영향을 미친다. Response Element 중 Serum Response Element (SRE)의 활성화가 Ras에 의해 크게 조절되는데, 이 연구에서는 YH3938과 YH3945의 영향을 관찰하였다. 실험은 Cos7 세포에 발암원성 ras 유전자와 pSRE-Luc vector를 trans-fection한 후, luciferase 활성 유도를 측정하였고, 이를 통해 SRE promoter의 활성화 정도를 확인하였다. 또한, YH3938과 YH3945의 영향을 Ras 단백질의 번역 후 변형에 미치는 영향을 확인하였다. 결과적으로, 이는 K-Ras나 N-Ras 특이적인 합성이 억제되거나 분해 속도의 증가로 인한 것으로 파악되었다.
<h2>YH3938 및 YH3945가 Ras에 의한 SRE promoter 활성화에 미치는 영향</h2> <p>Ras는 세포내에서 여러 신호전달 경로들을 통해 신호를 전달하여 oncogenesis에 관계되는 유전자의 발현을 조절하는 전사인자들의 발현을 조절하여 최종적으로 세포증식을 유도한다. 이들 전사인자들의 활성은 promoter 영역에 있는 Response Element의 활성화에 의해 조절된다. 이들 Response Element 중 대표적인 Serum Response Element (SRE)가 발암원성 Ras에 의해 활성화된다고 잘 알려져 있는데, 이에 대한 YH3938과 YH3945의 영향을 살펴보기로 하였다. Cos7 세포에 발암원성 ras의 유전자와 pSRE-Luc vector와 같이 trans-fection하고 luciferase 활성 유도를 측정하여 SRE promoter 활성화 정도를 관찰하고 YH3938 및 YH3945가 미치는 영향을 관찰하였다. 발암원성 H-, K-, N-Ras에 의해 SRE promoter 활성화가 증가되었는데, 이 활성화가 YH3938과 YH3945에 의해 선택적으로 억제되었다(Fig. 3). H-Ras에 의한 SRE pro-moter 활성화는 YH3938와 YH3945에 의해 강하게 억제되었으나, 반면에 K-Ras에 의한 SRE promoter 활성화에는 억제효과가 없었다. N-Ras의 경우에는 YH3938에 의해서는 강하게 억제되었으나, YH3945 에 의해서는 약하게 억제되는 것을 알 수 있었다. 따라서 YH3938과 YH3945가 발암원성 Ras에 의한 SRE promoter 활성화 유도 기전에 작용하여 Ras에 의한 세포증식 억제 효과를 나타내는 것으로 사료된다.</p> <h2>YH3938 및 YH3945의 Ras prenylation에 대한 영향</h2> <p>다음으로 YH3938과 {YH3945의 작용이 Ras 단백질의 번역 후 변형에 대한 영향을 조사하였다. 세포 증식이나 모양의 변화를 관찰한 조건과 같이 형질전환된 Rat2 세포들를 배양 및 처리한 후, anti-pan-Ras antibody로 immunoblotting하여 Ras 단백질의 bandshift를 조사하였다. Ras prenylation이 억제되 면 Ras band가 위로 shift하게 되는데, Fig. 4A에서 보는 바와 같이 YH3938에 의해 Rat2-H-RasV12 세포와 Rat2-N-Ras 세포의 Ras 단백질 band가 shift되는 것이 관찰되었다. 즉 YH3938에 의해 H-Ras와 N-Ras의 prenylation이 억제되었음을 알 수 있다. 그러나 K-Ras의 prenylation에는 YH3938이 영향을 끼치지 않음을 알 수 있었다. YH3945의 경우에는 H-Ras에만 영향이 있었다. 흥미롭게도 Fig. 4A에서 약물을 처리하면 K-Ras나 N-Ras의 단백질양이 bandshift와는 별도로 감소하는 것이 관찰되었다. 이 단백질 양의 감소를 조사하기 위해 대조군으로 GAPDH 항체로 immunoblotting하여 살펴본 결과, 전기영동 시 loading한 단백질의 양은 동일하다는 것을 알 수 있었다. 즉 세포독성 등에 의한 세포 감소가 아닌 아직 모르는 기전에 의한 K-Ras나 N-Ras 특이적인 합성이 억제되거나, 분해 속도의 증가로 인해 발생하는 것으로 추정된다.</p> <p>Ras단백질의 prenylation은 farnesylation과 geranygeranyla-tion이 일어날 수 있는데, 보고에 따르면 K-Ras나 N-Ras의 경우 Farnesyl transferase 억제제 존재 하에서 farnesylation이 억제된 반면 대신에 geranylgeranylation이 일어난다는 것이 알려졌다. 따라서 YH3938과 YH3945이 geranylgeranylation을 억제하는 지를 알기위해 H-Ras의 CAAX motif을 geranylgeranylation만 일어나는 CVLL로 바꾸어 bandshift를 조 사하였다. H-Ras-CVLL mutant를 Cos7 세포에 transfection하 고 Ras 단백질의 bandshift에 대한 YH3938의 영향을 조사하 였다. Fig. 4B에서 보는 것처럼 wild type H-Ras-CVLS는 YH3938과 YH3945에 의해 prenylation이 억제되어 bandshift 가 나타났다. Mutant H-Ras-CVLL의 경우에, YH3938에 의해 prenylation이 억제되어 bandshift가 나타났으나, YH3945에 의해서는 효과가 없었다. 이상의 결과로부터 YH3938은 Ras의 prenylation인 farnesylation 뿐 아니라 geranylgeranylation도 억제한다는 것을 알 수 있었다. 반면 YH3945 는 farnesylation만 억제한다는 것을 알 수 있었다.</p>