Sinorhizobium meliloti는 토양과 근권에서 독립적으로 생육하는 종속영양균이자 그람 음성의 호기성 미생물로 단일 탄소원 기질로 다양한 당(sucrose, glucose, fructose)을 이용하며 mannitol은 fructose의 세포 내 흡수 과정에 관여하는 다양한 효소 유전자의 발현을 유도하는 것으로 알려졌다. MDH로 추정되는 유전자를 클로닝하여 대장균에서 대량으로 발현하고, 다양한 MDH유전자와 1차 구조, 서열 상동성 및 효소 특성 및 생체 내 역할을 비교하여 미생물학 및 효소학적으로 연구를 진행하고자 한다.
<p>Sinorhizobium meliloti는 토양과 근권에서 독립적으로 생육하는 종속영양균이며, 개자리속 뿌리혹의 내공생균으로 그람 음성의 호기성 미생물이다. 독립생활을 하는 세포로서 존재할 때, 자주개자리와 같은 식물 숙주의 뿌리혹으로 이송되는 주요 광합성 산물인 sucrose, glucose, fructose 등의 다양한 당을 단일 탄소원 기질로 폭넓게 이용한다. 이 과정에서 mannitol은 fructose의 세포 내 흡수 과정에 관여하는 다양한 효소 유전자의 발현을 유도하는 것으로 알려졌다. 그러나, 아직 MDH의 효소 특성 및 생체 내 역할에 대한 충분한 연구가 이루어지지 않았으므로, 본 연구에서 S. meliloti의 유전체로부터 MDH로 추정되는 유전자를 클로닝하여 대장균에서 대량으로 발현하고, 기존에 보고된 다양한 MDH유전자와 1차 구조, 서열 상동성 및 효소특성 등을 상호 비교하여 미생물학 및 효소학적으로 유용한 정보를 제공하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약 및 재료</h2> <p>연구에 사용한 일반 시약과 효소반응 기질 및 미생물 배지는 각각 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)와 Duchefa Biochemie (Haarlem, The Netherlands)에서 구입하여 사용하였다. 유전자 조작을 위한 제한효소 및 DNA ligase 등은 Roche Applied Science (Mannheim, Germany)에서 구입하였으며, 각종 PCR 및 sequencing primer는 Bioneer (Daejeon, Korea)로부터 합성하여 사용하였다. 또한 agarose 및 GENECLEAN turbo nucleic acid purification kit는 Qbiogene (Carlsbad, CA, USA)에서, 단백질 정제에 사용한 Ni-NTA 컬럼은 Qiagen (Hilden, Germany)에서 구입하였다. SmMDH 유전자의 PCR 클로닝에 주형으로 사용한 S. meliloti 1021 (KCTC 2353) 균주의 염색체 DNA는 한국생명공학연구원 미생물 프론티어사업단으로부터 제공받았다.</p> <h2>유전자의 증폭 및 클로닝</h2> <p>S. meliloti 1021의 염색체 DNA를 주형으로 사용하여 SmMDH 유전자를 선택적으로 증폭하였다. 유전자의 증폭을 위해 smMDH-N (5'-TGGATCCATGGCGACCAAATTCTCCC-3')과 SmMDH-C (5'-TAAGCTTTTCCCCGAGGTTTCCGTC-3') primer set를 사용하였다. PCR 증폭은 Taq DNA polymerase (Roche Applied Science)와 Px2 thermal cycler (Thermo Hybaid, Middlesex, UK) 를 사용하여 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분, \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분 30초로 30회 반복하였으며, 최종적으로 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10분간 추가로 증폭한 후 종료하였다. 증폭된 SmMDH 유전자는 pMD18-T (Takara Biomedical, Otsu, Japan)에 클로닝한 후, 서울대학교 유전체지원센터의 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였다.</p>