PMA, FS, FBA, FYA 처리된 세포들에 lysis buffer를 첨가하여 분리한 상층액으로 단백질 정량을 진행하였다. 이후 동량의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel 전기영동을 이용하여 분리하고, nitrocellulose membrane으로 전이시켰다. 1차 항체 처리 후 2차 항체를 이용하여 반응시켰다. 또한 U937 세포에 TRizol reagent를 처리하여 RNA를 분리하였다.
<h2>단백질의 분리, 전기영동 및 Westem blotting</h2> <p>선행 실험에 의해 조건이 확립되어진 PMA와 위와 동일한 조건으로 \( \mathrm { FS } , \mathrm { FBA } \) 및 FYA를 처리한 배지에서 배양된 세포들에 적정량의 lysis buffer [25 mM Tris-Cl (pH 7.5), \( 250 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { NaCl } , 5 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 1 \% \) NP-40, \( 1 \mathrm { mM } \) phenylmeth-ylsulfonyfluoride (PMSF), \( 5 \mathrm { mM } \) dithiothreitol (DTT)]를 첨가 하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 시간 반응시킨 후, \( 14,000 \mathrm { rpm } \) 으로 30분 원심분리하여 그 상층액을 취하였다. 상층액의 단백질 농도를 Bio-Rad 단백질 정량시약 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 정량한 다음 동량의 Laemmli sample buffer (Bio-Rad)를 섞어서 sample을 만들었다. 이렇게 만든 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단박질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene,NH, USA 으로 전이시킨 후, 걱정 1차 항체를 처리하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 overnight 시킨 후 PBS-T로 세척하 고 처리된 1 차 항체에 맞는 2 차 항체를 사용하여 상온에서 적정시간 반응시켰다. 다시 PBS-T로 세척하고 enhanced chei-luminoscence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp., Arlignton Heights, IL, USA)을 적용시킨 X-ray film에 감광시 켜 특정단백질의 양을 분석하였다. 본 실험에 사용된 항체들 은 Santa Cruz Biotechnology Inc.에서 구입하였으며, Immunoblotting을 위해 2차 항체로 사용된 peroxidase-la-beled donkey anti-rabbit immunoglobulin 및 peroxidase-la-beled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Life Science Corp.에서 구입하였다.</p> <h2>Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 분석</h2> <p>동일한 조건에서 배양된 U937 세포들에 TRizol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 시간 동안 처리하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, 각각 의 primer (Table 1), DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭하였다. 각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하여 \( 1 \mathrm { X } \mathrm { TAE } \) buffer로 \( 1 \% \) agarose gel을 만들고 well 당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 loading 한 후 \( 50 \mathrm { ~V } \) 에서 전기영동을 행하였다. 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 ethidium bromide (EtBr)을 이용하여 염색한 후 UV 하에서 발현의 차이를 확인하였으며, glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 internal control로 사용하였다.</p>