하고초의 PC12 세포 보호 효과 확인을 위해 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) (hydrogen peroxide solution) 등의 시약을 사용하였으며, 하고초에 methanol을 가하여 상온에서 추출하였다. 이 하고초 추출물인 PSE를 농도별로 처리한 후 위상차 현미경을 통해 세포 형태를 관찰하였다. 또한 PC12 세포의 생존율 측정을 위해 MTT reduction assay를 실시하였고, 그 대조군으로서 PSE를 처리하지 않고 배양시킨 세포를 \( 100 \% \)로 했을 때의 상대적인 세포생존율을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>시약 및 실험재료</h2><p>본 실험에서 사용된 하고초는 (주)금강제약으로부터 제공받아 추출하여 실험에 사용하였다. 하고초의 PC12 세포 보호효과를 확인하기 위한 실험에 사용된 시약으로 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) (hydrogen peroxide solution), 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT), dimethyl sulfoxide(DMSO)는 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)제품을 구입하였으며, LDH(lactate dehydrogenase) release assay kit는 Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Osaka, Japan)로부터 구입하였다. 세포주 배양을 위해 필요한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), horse serum(HS) 및 penicillin-streptomycin 등은 Invitrogen(NY, USA)에서 구입하였다. 그 외의 시약은 모두 일급 이상을 사용하였다.</p><h2>하고초 추출물(PSE) 제조</h2><p>하고초 \( 5 \mathrm{g} \)에 methanol을 \( 100 \mathrm{ml} \) 가하여 3일간 상온에서 추출한 후, Whatman No. 1 filter paper(Advantec, Tokyo, Japan)로 여과하였다. 이 추출여액을 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 회전감압농축기(EYELA N-1000, Tokyo, Japan)를 이용하여 하고초의 추출물을 얻었으며, 이를 PSE라 명명하였다. PSE는 \( 25 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)로 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹여 적당한 농도로 희석하여 사용하였다.</p><h2>세포 배양</h2><p>본 실험에 사용된 세포주는 rat pheochromocytoma PC12로써 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받아 사용하였다. 세포 배양을 위해 DMEM medium에 \( 10 \% \) fetal bovine serum(FBS), \(5\%\) horse serum(HS) 및 100 unit\(/\mathrm{ml}\)의 penicillin, \( 100\mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 streptomycin을 첨가하여 사용하였고, \( 95 \% \)의 습도가 유지되는 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \%~\mathrm{CO}_{2} \) incubator(MCO-18AIC, ANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다.</p><h2>세포의 형태학적 변화 관찰</h2><p>PC12 세포의 형태학적인 변화를 관찰하기 위해 6-well plate에 \( 2 \times 10^{5} \) cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. PSE를 농도별로 처리한 후 \( 0.5 \mathrm{mM} \)의 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)로 2시간 노출시켜 위상차 현미경(TS 100-F, Nikon, Tokyo, Japan)으로 각 well의 세포형태를 관찰하고 100배로 사진 촬영하였다.</p><h2>MTT 분석을 통한 세포생존율 측정</h2><p>PC12 세포의 세포생존율 측정을 위하여 MTT reduction assay를 실시하였다. 세포를 \( 1 \times 10^{5} \) cells\(\mathrm{/ml}\)로 맞추고 96-well plate에 각각 \(100\mathrm{\mu l}\)씩 첨가하여 24시간 동안 배양한 후, DMSO에 녹인 PSE를 \( 50, 100,250 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 제조하여 PC12 세포에 처리하였다. 30분 동안 배양시킨 후 \( 0.5 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 를 처리하여 2시간 배양하고 각 well에 PBS 완충용액에 녹인 MTT\( (5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 용액을 \(10\mathrm{\mu l}\)씩 첨가하여 1시간 동안 다시 배양하였다. 1시간 반응 후, formazan 형성을 확인하고 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 완전히 제거한 다음, \(100\mathrm{\mu l}\)의 DMSO를 첨가하여 녹이고 ELISA reader(Model 680, BioRad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 \( 540 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하여 PSE를 처리하지 않고 배양시킨 대조군 세포를 \( 100 \% \)로 하였을 때의 상대적인 세포생존율을 구하였다.</p>