녹두에서 추출한 단백질은 DEAE-cellulose를 이용하여 글루타닌, 아미노산 등의 정제를 거쳐 MBTI로 정제하여 동물실험을 하였다. MBTI의 분리 및 정제는 녹두를 분말로 만든 후 인산염 완충액을 첨가하여 교반 추출 후 여과액의 pH를 조절한 후 원심분리하여 침전물을 제거한 후 상등액을 얻은 후 다시 농축하여 Crude extract을 준비하였다. Crude extract를 trypsin 저해 활성이 있는 분획만을 모아Amicon ultrafiltration cell을 사용하여 농축한 후 동결건조한 후 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하여 실험 시료로 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험동물</h2> <p>실험동물은 대한실험동물센터에서 분양받은 guinea pig(Hartley albino, \( 250-350 \mathrm{~g} \), 웅성)을 일정한 조건(온도: 22\( \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 50 \pm 5 \% \), 명암: 12시간 주기)에서 1주일 간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.</p> <h2>시약 및 기구</h2> <p>실험에 사용한 녹두(Vigna radiata L. wilczek)는 농협중앙회(예산농협제품)에서 구입하였으며, 시약으로는 N-benzoy-dl-arginine p-nitroanilide (BAPNA), trypsin (from porcinepancreas), trypsin inhibitor (from soybean, BBI type), p-nitroanilide, elastase, chymotrysin, plasmin, thrombin, N-Benzoyl-L-arginine-4-methyl-coumarine-7-amide(Bz-Arg-MCA)은 Sigma Chem. Co (MO, USA)에서, Suc-Leu-Leu-Var-Tyr-MCA, Suc-Ala-Pro-Ala-MCA, Boc-Val-Leu-Lys-MCA, Boc-Val-Pro-Arg-MCA는 Peptide Institutide(Osaka, Japan), DEAE-cellulose, Sephadex G-50은 Pharmacia(Uppsala, Sweden)에서 각각 구입하여 사용하였다. Pseudomonal elastaset 2 Nagase Biochemical Co. (Kobe, Japan)로부터 기증받아 사용하였으며, 그 외 시약은 특급시약을 사용하였다. 실험에 사용한 기구로는 UV-VIS spectropho-tometer (Shimazu UV-1601), spectrofluorometer (JascoFP-750), blood pressure transducer (TP-400T, NihonKoden, Japan), ultrafiltration system (Amicon 8200) 등을 사용하였다.</p> <h2>실험방법</h2> <h3>MBT의 분리 및 정제</h3> <p>MBTI의 분리 밎 정제는 koo, Crispeels 및 Gennis의 방법을 변형하였으며 간단히 설명하면 다음과 같다.</p> <h3>Crude extract의 준비</h3> <p>녹두(Vigna radiata L. wilczek) \( 200 \mathrm{~g} \)을 분쇄하여 분말로 한 후 hexane \( 800 \mathrm{ml} \)를 가하여 상온에서 12시간 동안 교반한 후 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) 의 필터로 여과하여 탈지한다. 탈지된 녹두분말에 \( 1200 \mathrm{ml} \)의 \( 10 \mathrm{mM} \) 인산염 완충액 (pH 6.0, \( (25 \mathrm{mM}~ \mathrm{NaCl}, 0.1 \mathrm{mM} \) thiourea 포함)를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5시간 교반 추출하고 이를 가제로 여과한 후 그 여액에 \( \mathrm{HCl} \) 을 사용하여 pH를 4.01로 조절한다. \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 14,000 \mathrm{rpm} \) 으로 20분 간 원심분리하여 침전물을 제거하고, 상등액을 취하여 Amicon ultrafiltration cell (membrane cut off 3,000)을 사용하여 농축하였다.</p> <h3>MBTl의 정제</h3> <p>Step I : Sephadex G-50 gel filtration chromatographyCrude extract를 \( 0.1 \mathrm{M} \) 의 \( \mathrm{NaCl} \)을 포함하는 \( 10 \mathrm{mM} \) 인산염완충액으로 평형시킨 Sephadex G-50\( (3.5 \times 80 \mathrm{~cm}) \) 에 가한 후 \( 20 \mathrm{ml} / \mathrm{hr} \) 의 속도로 동일한 완충액을 사용하여 용출시키고 BAPNA를 기질로 사용한 trypsin 가수분해의 저해시험에서 trypsin 저해 활성이 있는 분획만을 모아 Amicon ultrafiltration cell (membrane cut off 3,000)을 사용하여 농축하였다.</p> <p>Step II : DEAE cellulose Ion-exchange chromatography Sephadex G-50 chromatography애서 trypsin 저해 활성을 가진 분획을 \( 50 \mathrm{mM} \) 인산염완충액 pH 7.4로 미리 평형시켜 놓은 DEAE cellulose column \( (2.5 \times 50 \mathrm{~cm}) \) 에 가하고 동일한 완충액을 사용하여 \( 40 \mathrm{ml} / \mathrm{hr} \) 의 속도로 DEAEcellulose column에 결합되지 않는 물질을 용출하여 제거하고, 결합되어 있는 물질은 동일 속도에서 \( 0 \sim 1 \mathrm{M} \) 의 염농도 linear gradient로 용출시킨 후 BAPNA를 기질로 사용한 trypsin 저해 활성 시험에서 활성이 있는 분획을 모아 Amicon ultrafiltration cell (membrane cut off 3,000 )을 사용하여 농축한 후 동결건조하였다.</p> <h3>Step Ⅲ : Trypsin affinity chromatography</h3> <p>미리 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\) pH 7.4로 평형시켜 놓은 trypsinaffinity column \( (1.5 \times 30 \mathrm{~cm}) \) 에 DEAE cellulose ion-exchangechromatography에서 얻은 물질을 가한 후 같은 완충액으로column에 결합하지 않은 물질을 용출하여 제거하고 \( 280 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도가 0.01 이하가 되도록 계속하여 세척한 후 \( 50 \mathrm{mM} \) citrate buffer pH 3.0로 column에 결합되어 있는 trypsin inhibitor를 용출시켰다. 용출액을 모아 Tris-HCl buffer로 pH를 7.0으로 조정한 후 Amicon ultrafiltration cell (3,000 cut membrane)을 사용하여 농축하였다. 이를 동결건조한 후 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하여 다음의 실험에 시료로 사용하였다.</p> <h3>전기 영동</h3> <p>SDS-PAGE는 Laemmli의 방법에 따라 \( 4 \% \) stacking gel과 20\% separating gel로 수행한 후 Coomassie brilliant blue R-250으로 염색하였다. SDS-PAGE를 위한 sample 10\( \mu \mathrm{l} \)에 2X loading buffer \( 10 \mu \mathrm{l} \) 와 2-mercaptoethanol \( 2 \mu \mathrm{l} \)를 첨가한 후 \(90^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 열처리하여 사용하였다.</p>