\( 0.5 \% \) agar, \( 1 \mathrm { mM } \) acetosyringone)에 첨가하여 배양하였다. Agrobacterium tumefaciens를 YEP배지에 rifampicin, gentamicin, kanamycin이 첨가된 것으로 접종하여 28\(^\circ \mathrm{C}\)에 2일간 배양한 후, 3000rpm에 10분간 원심분리한 후 pellet을 CCM(1/2 MS salts, MS vitamins, 20mM MES, 0.115g/L L-proline, 2% sucrose, 0.5% agar, 1mM acetosyringone)에 첨가하여 배양하였다.
<h3>A. tumefaciens culture 준비</h3> <p>형질전환된 각각의 콜로니를 \( 50 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) rifampicin, \(50 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) gentamicin과 \( 50 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) kanamycin이 첨가된 YEP배지에 접종하여 \( 28 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2일간 배양하였다. Agrobacterium 배양액을 \( 3000 \mathrm { rpm } \) 에서 10 분간 원심분리한 후 박테리아 pellet을 공동배양액 (CCM: 1/2 MS salts, MS vitamins, 20 \( \mathrm { mM } \) MES, \( 0.115 \mathrm { g } / \mathrm { L } \) L-proline, \( 2 \% \) sucrose, \( 1 \% \) glucose, \(200 \mathrm { uM } \) acetosyringone, \( 100 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) L-cysteine, \( \mathrm { pH } 5.4 \))으로 다시 희석하여 \( \left ( \mathrm { OD } _ { 650 } 0.6-0.9 \right ) \) 접종액으로 사용하였다.</p> <h3>Type II 배발생캘러스 공동배양 및 선발</h3> <p>왕성하게 자라는 type II 배발생캘러스를 무균상태의 페트리 디쉬에 옮기고 spatula로 캘러스 덩어리를 잘게 으깬 후 준비한 Agrobacterium 현탁액을 넣고 30분 간 접종하였다. 아그로박테리움 용액을 피펫으로 제거한 후 무균 filter paper를 올려놓은 고체 공동배지 (CCM: 1/2 MS salts, MS vitamins, \( 0.5 \mathrm { mg } / \) thiamine-HCl, \(1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) 2,4-D, \( 20 \mathrm { mM } \) MES, \( 0.115 \mathrm { v } \mathrm { g } / \mathrm { L } \) L-proline, \( 2 \% \) sucrose, \( 1 \% \) glucose, \( 200 \mathrm { uM } \) acetosyringone, \( 5.5 \mathrm { g } / \mathrm { L } \) agarose, \( 20 \mathrm { uM } \) AgNO3, \( \mathrm { pH } 5.4) \)에 캘러스를 치상하여 \( 28 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2일간 공동 배양하였다. 48시간 동안 공동배양 후 각각의 캘러스 클론을 분리하여 delay medium (MS salts, Eriksson's vitamins, \( 0.5 \mathrm { mg } / \) Thiamine-HCl, \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) 2,4-D, \( 3 \mathrm { mM } \) MES, \( 25 \mathrm { mM } \) L-proline, \( 2 \% \) sucrose, \( 100 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) myo-inositol, \( 100 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) casamino acid vitamin assay, \( 0.7 \% \mathrm { BBL } \) agar, \( 1.7 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) AgNO3, \(300 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) cefotaxim sodium, \( \mathrm { pH } \ 5.8 \)에 치상하여 5~7일간 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 암배양 하였다. 배양 후 각각의 캘러스 클론을 \( 100 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) paromomycin이 포함된 선발배지로 옮겨 암 조건에서 2주간 간격으로 계대배양 하면서 왕성하게 자라는 캘러스를 선발하였다.</p>