본 실험은 망간 산화기작이 뛰어난 균을 충청남도 병천 일원의 토양으로부터 구분하고, 망간 산화능이 가장 우수한 Pseudomoans sp. MN5을 검별하여 최적 생장 조건과 생리적 특성, 당 이용능, 중금속 내성, 항생제 내성 등을 탐구하고 망간 산화 단백질의 특성과 서열을 밝히고자 한다.
<p>본 실험은 광물자원의 활용, 농업, 생물학적정화, 음용수 처리 등에서 다양하게 이용될 수 있는 망간 산화기작에 대한 연구의 일환으로, 망간산화 기작이 우수한 균을 충청남도 병천 일원의 토양에서 분리하고 망간 산화능이 가장 우수한 것으로 선별, 동정된 Pseudomoans sp. MN5를 대상으로 이 균의 최적 생장 조전과 생리적인 특성을 확인하고 망간 산화 단백질을 정제하여 그 특성과 서열을 밝히고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 분리 및 배지</h2> <p>충청남도 병천 일원의 \(6 \) 곳의 토양을 채취하여, 각각 \( 1 \mathrm { ~g } \) 을 멸균 생리식염수 \( 100 \mathrm { ml } \) 이 들어 있는 \( 250 \mathrm { ml } \) 삼각 플라스크에 넣고 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 시간 진탕한 후, 고 gus탁액 \( 100 \mu 1 \) 를 망간 최소배지에 접종하고 \( 2-3 \) 일 배양한 다음, 단일 콜로니를 분리하였다. 분리된 세균집락은 망간 최소(LD) 고체배지에 접종해서 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양하며 갈색 콜로니를 형성하고 생장이 가장 우수한 균주롤 육안으로 확인하고, 최소배지에서 망간산화능이 가장 우수한 균주롤 최종 선별하여 본 실험에 사용하였다. 또 당 이용능은 bushnell-hass 최소배지 \( (0.02 \% \) magnesium sulfate, \( 0.002 \% \) calcium chloride, \( 0.1 \% \) monop-otassium phosphate, \( 0.1 \% \) ammonium phosphate dibasic, \( 0.1 \% \) potassium nitrate, \( 0.005 \% \) ferric chloride, \( \mathrm { pH } \) 7.0)에 \( 1 \% \) 의 당을 단임 탄소원으로 첨가하여 조사하였고, 영양배지로는 nutrient broth (NB, 0.3 \% becf extract, \( 0.5 \% \) peptone, \( \mathrm { pH } \mathrm { 7.0) } \) 를 사용하였다.</p> <h2>생리 생화학적 특성 조사</h2> <p>최종 선별된 균주는 Bergey's mannual of systematic bac-teriology 와 Biochemical tests for identification of med-ical bacteria에 의거하여 형태, 생리 및 생화학적 특성을 조사하였고, 당 이용능과 중금속, 항생제 내성 등의 균주 특성도 조사하였다.</p> <h2>\( 16 \mathrm { ~S } \) rRNA 염기 서열 조사</h2> <p>최종 선변 균주의 정확한 동정을 위해 최종 선별균주의 genomic DNA를 \( \mathrm { CTAB } \) 방법으로 추출하기, 이 DNA를 주형으로 중합호소연쇄반응(polymerase chain reaction, \( \mathrm { PCR } ) \) 을 수행하여 \( 16 \mathrm { ~S } \) rRNA 유전자 염기 서열을 조사하였다. 이때 선별 균주의 \( 16 \mathrm { ~S } \) rDNA를 증폭하기 위해 forward primer \(5 \) -AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3' (27F)와 reverse primer \(5 \) -GGT TAC CTT TGT TAC GAC TT-3' \( (1492 \mathrm { R } ) \) 를 사용하고(BIONEX), 염기서열은 ABI model \(310 \) (Applied Biosystem, USA)을 사용하여 분석하였다. 이렇게 분석된 rDNA 염기서열은 BLAST search (www. ncbi. nih.gov/BLAST/)를 사용하여 비교, 분석 하였다.</p>