AF 처리가 신장섬유아 세포의 PAI-1 발현을 억제하는 점을 확인하였으며, 이는 LPS에 의해 증가된 PAI-1 전사 레벨에 대해 유효하다. 이전 연구결과에 따르면, AF는 MEK/ERK 기전을 조절함으로써 PAI-1의 발현을 억제하고, LPS 또한 ERK-1/2 신호전달 기전을 활성화한다. 본 연구에서는 이러한 과정을 통해 LPS에 의해 유도된 PAI-1 발현이 AF에 의해 억제되는 메커니즘을 분석하였다.
<h2>LPS로 유도된 PAI-1 단백질의 발현에 대한 AF의 억제효과</h2> <p>AF 처리에 의한 PAI-1의 발현 저해효과를 조사하기 위하여 신장섬유아 세포에 LPS 및 AF를 각각 처리하여 PAI-1 발현변화를 확인하였다. 우선 LPS를 처리한 후 PAI-1 발현의 증가현상을 시간 및 농도 의존적으로 확인하였다. 신장섬유아 세포에 LPS \( 2 \mathrm { ~ug/ml } \)을 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 시간 동안 처리한 경우 PAI-1 발현이 시간 의존적으로 유도되었으며, 6 시간 동안 LPS 0, 0.5, 1, 2 \( \mathrm { ~ug/ml } \)의 농도로 처리한 경우에도 농도 의존적으로 PAI-1 발현이 증가됨을 확인하였다. 신장섬유아 세포에서 LPS로 유도된 PAI-1 단백질 레벨이 AF를 농도 의존적으로 처리한 결과 효과적으로 감소되었다. 또한 PAI-1 mRNA 발현 레벨 역시 AF 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다. 따라서 신장섬유아 세포에서 LPS에 의해 증가된 PAI-1 전사 레벨이 AF 처리에 의해 효과적으로 억제되는 사실을 확인 하였다.</p> <h2>AF에 의한 PAI-1 단백질의 발현조절 작용</h2> <p>AF가 LPS로 유도된 PAI-1 발현을 프로모터 활성화 저해를 통한 발현조절임을 확인 하기 위하여 reporter gene assay를 수행하였다. 신장섬유아 세포에 p800-PAI-1-luci reporter gene을 transfection 시킨 후 LPS 처리구와 무처리구, LPS + AF 처리구로 나누어 실험하였다. 약물 처리에 따라 LPS만 처리한 경우 luciferase 활성이 무처리구와 비교하여 3배 정도 증가하였으며, AF와 함께 처리한 경우에는 LPS 처리구와 비교하여 농도 의존적으로 luciferase 활성이 감소하였다. 또한 PAI-1과 더불어 신장섬유화 유도인자로 알려진 fibronectin 단백질 발현도 신장섬유아 세포에 AF 농도 의존적으로 처리한 결과, 효과적으로 저해되는 것으로 확인되었다. 따라서 AF는 신장섬유화 유도인자인 fibronectin과 PAI-1의 단백질 발현을 저해함과 동시에, PAI-1의 경우 프로모터 활성 저해를 통한 발현 조절 현상임을 확인하였다.</p> <h2>AF의 ERK-1/2 인산화 조절을 통한 PAl-1 발현 저해효과</h2> <p>최근 본 연구실에서 AF가 신장섬유아 세포에서 MEK/ERK 기전 조절을 통해 PAI-1의 발현을 억제한다는 연구결과를 발표하였으며, LPS 또한 ERK-1/2 신호전달 기전를 활성화시킨다고 보고되었다. 따라서 본 연구에서는 LPS에 의해 유도된 PAI-1 발현 레벨이 AF 에 의해 저해되는 PAI-1 발현조절 기전를 해석하였다. 먼저 신장섬유아 세포에 ERK-1/2 상위에 존재하는 MEK inhibitor인 PD98059 및 AF를 각각 처리하여 PAI-1의 발현을 확인한 결과, MEK inhibitor 및 AF 을 처리한 경우 각각 동일하게 PAI-1의 발현 레벨이 감소 하였다. 또한 AF에 대한 MEK/ERK 인산화 조절기전을 조사한 결과, 신장섬유아 세포에 처리한 LPS는 ERK-1/2의 인산화를 증가시켰으며, AF를 처리한 결과 농도 의존적으로 ERK-1/2의 인산화가 감소됨을 확인하였다. 따라서 LPS로 유도된 PAI-1 발현레벨이 AF에 의해 감소되는 현상은 MEK/ERK 기전 조절을 통하여 저해함을 예상 할 수 있다.</p>