pNPB 합성기질을 사용해 EM2L8 에스터라제의 가수분해 활성을 흡광도를 이용해 측정한 후 효소반응 산물인 pNP 양을 측정하였다. 효소활성 1U는 1 \( \mu \mathrm { mole } \)의 pNP를 1분동안 생성하기 위한 효소의 양으로 정의했다. 효소의 반응조건을 확인하는 기준으로는 온도와 pH의 영향을 조사했다.
<h2>에스터라제 EM2L8의 pNPB 분해활성 측정</h2> <p>합성기질 pNPB를 사용하여 에스터라제 EM2L8의 가수분해 활성을 측정하였다. 기질 (10mM 농도로 아세토니트릴 용매에 녹아 있음), 에탄올, Tris-HCl 용액(50 mM, pH 8.0)을 10:40:950의 비율로 총 \( 1 \mathrm { ~mL } \) 를 제조하였다. 이 혼합액에 효소액 \( 10 \mu \mathrm { L } \) 을 넣고 \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 3-5분간 반응시킨 후, \( 405 \mathrm { ~nm } \) 파장의 흡광도를 측정하여 효소반응으로 생성된 \( \mathrm { p } \)-nitrophenol(pNP) 양을 정량하였다. 효소활성 \( 1 \mathrm { U } \) 는 1 분 동안 1 \( \mu \mathrm { mole } \) 의 pNP를 생성하기 위해 필요한 효소의 양으로 정의하였다.</p> <h2>에스터라제 \( \mathrm { EM } 2 \mathrm { ~L } 8 \) 의 온도 및 \( \mathrm { pH } \) 특성 조사</h2> <p>효소의 반응조건을 확인하기 위해서 pNPB 기질을 사용하여 온도와 pH의 영항을 조사하였다. 먼저 최적 반응온도를 측정하기 위해서 \( 15 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 온도를 \( 5 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 씩 증가시키면서 효소의 활성을 측정하였다. 이때 반응시간을 15 분으로 정하고 효소반응을 수행하였다. 온도 안정성을 구하기 위한 실험에서는 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } , 35 ^ {\circ } \mathrm { C } , 40 ^ {\circ } \mathrm { C } , 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 조건에서 효소를 6시간동안 방치하먼서 1시간 간격으로 효소의 잔존활성을 측정하였다. 또한, 장기보관 시의 효소안정성을 확인하기 위해서 효소를 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 와 실온 \( \left (25 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \) 에서 4주 동안 보관하면서 1주 간격으로 효소의 잔존활성을 측정하였다.</p> <p>pH에 따른 효소의 활성을 조사하는 실험에서는 pNPC 기질을 사용하였으며 \( \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } - \mathrm { K } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } \) 용액 \( (50 \mathrm { mM } , \mathrm { pH } \) 6-7.5), Tris- \( \mathrm { HCl } \) 용액 \( (50 \mathrm { mM } , \mathrm { pH } 7.5-9) \), glycine- \( \mathrm { KCl } - \mathrm { KOH } \) 용액(50 mM, pH 9-11)에서 \( \mathrm { pNPB } \) 기질과 동일한 spectro-photometric assay를 수행하였다. pH에 따른 효소의 안정성 을 조사하기 위해서 Tris-HCl 용액( \( 100 \mathrm { mM } , \mathrm { pH } \) 8.0, pH 9.0) 및 glycine- \( \mathrm { KCl } - \mathrm { KOH } \) 용액 \( (100 \mathrm { mM } , \mathrm { pH } \mathrm { 10.0) } \) 과 효소 액을 1:1로 섞은 후, \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 6시간동안 방치하면서 1시간 간격으로 효소의 pNPB 분해 활성을 측정하였다.</p>