NIH-3T3 L1 세포는 DMEM에 FBS, penicillin, streptomycin이 첨가하여 배양 후, DEXA, insulin, IBMX을 첨가하여 48시간 배양하고 2일 간격으로 6일간 \( 10 \% \) FBS가 첨가된 배지에 insulin을 첨가하여 분화를 유도하였다. 분화 정도는 역상현미경과 Oil red O로 관찰하여 측정하였고,\( 510 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다.
<h2>NIH−3T3 L1 세포의 분화 및 분화능 측정</h2> <p>실험에 사용된 NIH-3T3 L1 세포(preadipocyte)는 ATCC 에서 분양받아 \( 10 \% \) FBS, \( 50 \mathrm { U } / \mathrm { ml } \) penicillin, \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) streptomycin이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 세포배양기에서 배양하였다. NIH-3T3 L1 세포를 phosphate buffered saline (PBS) 용액으로 세척한 후, \( 5 \times 10 ^ { 4 } \) cells \( / \mathrm { ml } \) 을 12 well-flat plate에 배양하였다. 48 시간 동안 배양 후 \( 10 \% \) FBS, \(0.5 \mathrm { mM } \) dexamethasone (DEXA), \( 10 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) insulin, \( 1 \mu \mathrm { M } \) 3-iso-butyl-1-methyxanthine (IBMX)이 첨가된 배지에서 48시간 동안 배양하고, 이후 2 일 간격으로 6일 동안 \( 10 \% \) FBS가 첨가된 배지에 \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) insulin과 시료를 첨가하여 분화를 유도하였다.</p> <p>NIH−3T3 L1 세포의 분화 정도는 역상현미경으로 관찰하여 세포 내 밝은 색의 지방과립이 형성되는 것을 확인하였고, 세포의 분화정도는 Oil red O로 염색하여 측정하였다. \( 60 \% \) triethyl-phosphate \( 100 \mathrm { ml } \) 에 \( 500 \mathrm { mg } \) Oil red O 를 녹인 후 여과하여 Oil red O stock solution을 제조하고, Oil red O stock solution \( 12 \mathrm { ml } \) 에 증류수 \( 8 \mathrm { ml } \) 을 혼합하여 실험에 사용하였다. 세포 배양 8 일 후 분화된 세포를 관찰하기 위하여 배지를 제거하고 \( 10 \% \) formaldehyde를 처리하여 1 시간 동안 고정하였다. PBS 용액으로 두 번 세척하고 건조시킨 후, \( 1 \mathrm { ml } \) Oil red O 용액으로 처리하여 3시간 동안 염색하였다. 다시 PBS 용액으로 세척하고 건조시킨 후, isopropanol을 처리하여 염색된 지방과립을 추출하여 microplate reader (Beckman, USA)로 \( 510 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정함으로써 세포의 분화 정도를 결정하였다.</p>