3개월 사육기간 완료 후 절단하여 채혈 후 해부해 장기를 적출하여 측정한 후, 액체 질소가스에 급속 내옹하여 실험 전까지 냉동보관하여 분석에 이용하였다. 장기는 homogenizing buffer로 균질화한 다음 10분간 원심분리하였다. 중성지방과 콜레스테롤 함량은 표준 효소법에 의해 kit 시약을 사용하여 분석하였다. 시료의 흡광도는 총 콜레스테롤의 농도별 표준용액 표준곡선과 비교해 시료의 총 콜레스테롤 함량을 구했다.
<h2>재료</h2> <p>대두 경화유는 (주)한삶 R&D 식이회사에서 구입하였고 고등어의 경우 계절에 따라 지방함량이 다른데 1년 중 가장 맛있는 시기는 지방질이 최대로 되는 가을에서 겨울까지이며 가을에는 지질이 \( 20 \% \)로 연중 최고로 많고 상대적으로 수분은 최소가 되며 봄에는 지질의 양이 \( 10 \% \)로 최소이고 수분은 최대가 된다. 본 실험에 사용된 고등어는 2006년 1월에 남해안에서 잡힌 선도가 양호하며 어체의 중량 \( (540 \mathrm { ~g } ) \)이 비슷한 고등어 10 마리를 구입하였다. \( 5 \mathrm { ~mm } \) 두께로 포를 뜬 고등어를 저온 진공 건조기를 이용하여 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \(40 \mathrm { ~torr } \)의 압력으로 30시간 건조하였다. 건조된 고등어는 실험 사용 전까지 \( -75 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 냉동 보관되었다.</p> <h2>실험 동물의 희생 및 시료의 채취</h2> <p>3개월간의 사육기간이 완료된 후, 실험동물을 단두 절단하여 채혈한 후 즉시 해부하여 간, 심장 및 신장을 적출하였다. 적출한 장기들은 중량을 측정한 후, 액체 질소가스에서 급속 냉동하여 추후 실험 전까지 \( -75 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 냉동 보관하여 분석에 이용하였다.</p> <h2>혈장 및 조직의 지질 분석</h2> <p>간 및 심장과 신장은 homogenizing buffer ( \( 154 \mathrm { ~mM } \) KCl, \( 50 \mathrm { ~mM } \) Tris-HCl, \( 1 \mathrm { ~mM } \) EDTA, \( \mathrm { pH } \) 7.4)로 균질화한 다음 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 \(3,000 \mathrm { ~rpm } \)에서 10분간 원심분리(Combi-514R)하였다. 원심분리 후 상층액만을 취하여 분석 전까지 \( -75 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 보관하였다. 중성지방(Triglyceride) 함량은 표준 효소법에 의해 kit 시약(신양화학약품주식회사, 서울, 한국)을 사용하여 분석하였다. 즉 시료에 발색시약을 첨가하여 혼합한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 항온수조에서 5분간 반응시켜 발색시킨 뒤 흡광도계(Thermo Spectronic, Waltham, USA) \( 505 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 중성지방의 표준용액을 농도별로 준비한 것을 위의 방법과 동일하게 발색시켜 표준곡선을 만든 후, 시료의 흡광도와 비교하여 중성지방 함량을 구하였다. 총 콜레스테롤 함량은 위의 방법과 동일한 방법으로 표준 효소법에 의해 kit 시약(신양화학약품주식회사, 서울, 한국)을 사용하여 분석하였다. 시료의 흡광도를 총 콜레스테롤의 농도별 표준용액 표준 곡선과 비교하여 시료의 총 콜레스테롤 함량을 구하였다. HDL-콜레스테롤 함량은 시료와 침전시액(Phosphotungstic acid- \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \))을 1:1의 비율로 잘 혼합하여 실온에서 10분 이상 방치 후 \( 300 \mathrm { ~rpm } \)에서 10분간 원심 분리하여 그 상층액을 시료로 표준 효소법에 의해 kit 시약(신양화학약품주식회사,서울, 한국)를 사용하여 \( 555 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 흡광도를 HDL-콜레스테롤의 농도별 표준용액 표준 곡선과 비교하여 시료의 HDL-콜레스테롤 함량을 구하였다. LDL-콜레스테롤 함량은 다음 Friedewald 식을 이용하여 다음과 같이 계산하였다.</p>