본 연구에서는 배양방법에 따른 세포분열율을 통해 미소괴 생성율을 높이려 하였다. 결과적으로 액체배양보다는 고체배지위에서 액체배양을 하는 것이 세포분열율이 더 높았다. 그리고 원형질체의 배양방법이 세포분열과 캘러스 형성에 중요한 영향을 미치며, 원형질체의 분열정도와 미소괴의 생성정도에 따라 삼투조절제의 농도를 점진적으로 낮춰야 한다. 본 연구에서는 이 결과를 바탕으로 감자의 원형질체 현탁액을 고체배지 위에 배양하는 방법을 사용하여 높은 세포분열율을 얻었다. 또한, 오렌지와 탱자, 오렌지와 grapefruit, 그리고 오렌지와 감귤 근연속 Severinia disticha 간의 원형질체 융합으로 체세포 잡종체들을 생성하는 연구도 진행되고 있다.
<h1>결과 및 고찰</h1><p>오렌지 (Citrus sinensis)와 탱자 (Poncinus trifoliata), 오렌지와 grapefruit (C. paradisi), 오렌지와 감귤 근연속인 Severinia disticha 간 감귤 이종속간의 원형질체 융합에 의한 체세포 잡종체들이 생산되어오고 있다 (Ohgawara et al. 1985, Guo et al. 2000, Grosser et al. 1988). 이들 융합조합은 기본적으로 신초 재분화능이 높은 오렌지의 캘러스를 사용하여 배형성 과정을 거쳐 이루어졌다. 오렌지의 경우 미성숙 배수의 주심조직으로부터 재분화능이 높은 배형성 캘러스를 성공적으로 유기하기가 쉬우나 온주밀감의 경우 여러 연구자들이 미성숙 배주의 주심조직으로부터 캘러스를 유기하는 데 실패를 하였다 (Ling et al. 1990, Kunitake et al. 1991). 원형질체 분리에 있어서도 대부분의 연구 결과에서 보면 분리된 원형질체들의 많은 파열과 세포벽의 불완전한 분해로 인해 캘러스 배양물에서 직접 원형질체를 분리하지 못하고 현탁배양물이나 당조성을 조절한 배지에서 전처리를 한 후 원형질체를 분리하여 배양하였다 (Ling et al. 1989). 그러나 본 연구에서는 온주밀감 홍진조생의 미성숙 배주배양에 의해 주심조직으로부터 재분화능이 아주 높은 배형성 캘러스 (Figure 1A)를 유기시킬 수 있었으며, \( 5 \% \) sucrose 와 \( \mathrm{500} \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) malt extract 가 첨가된 MT 배지에서 \( 2 \sim 3 \)주 간격으로 계대배양한 캘러스로부터 직접 원형질체 (Figure 1B)를 분리하여 배양할 수 있었다.</p><h2>미소괴 형성에 효과적인 배양방법</h2><p>배양 \( 7 \sim 10 \) 일 후 첫 세포분열 (Figure 1C)이 관찰되었으며, \( 20 \sim 30 \)일 후에는 \( 30 \sim 40 \)개 정도의 세포들이 덩어리져 형성된 미소괴 (Figure 1D)가 생성되었다. 미소괴 생성율 향상을 위해 배양방법에 따른 세포분열율을 비교해 본 결과(Table 1, Figure 2), 오렌지와 홍진조생 모두 기존 배양법으로 사용되고 있는 액체배양의 경우 보다는 고체배지위에서 액체배양을 하는 것이 세포분열율이 더 높음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 감자의 원형질체 현탁액을 고체배지 위에 배양하는 liquid over solid 배양방법 사용시 가장 눞은 세포분열율을 얻은 결과(Ahn et al. 2001)와 일치함을 알 수 있었다.</p><p>원형질체 배양방법은 세포분열과 캘러스 형성에 중요한 영향을 미치는데, 액체배양의 경우에는 삼투조절제에 원형질체가 민감하게 반응하므로 원형질체의 분열정도와 미소괴의 생성정도에 따라 점차적으로 삼투조절제의 농도를 낮추어 주어야 한다. 생성된 미소괴는 배양 1달 후부터는 급속하게 생장 속도가 빨라지고 nodular calli로 발육하면서 점점 배형성 캘러스 원래의 형태를 보이기 시작하였다.</p>