파프리카 추출물을 Yu 등(2006) 논문에 보고된 방법을 참고하여 추출하여, HaCaT 세포를 PBS로 세척시킨 후 UVB (280-320 mm) 200 \( \mathrm{J} / \mathrm{m}^{2} \) 를 조사하고 정상배지 또는 파프리카 추출물, 비타민C (L-Ascorbic acid; USB, USA), 라이코펜(Sigma, USA)과 베타-카로틴(Sigma)이 농도별로 함유된 배지를 처리하여 적정시간 동안 배양하였고, 이렇게 배양된 물질을 자외선 혹은 파프리카 추출물, 비타민 C, 라이코펜과 베타-카로틴에 의한 핵의 형태 변화를 관찰하고자 DAPI 염색을 수행, 핵의 형태 변화를 관찰하고자 \( 200 \mathrm{~J} / \mathrm{m}^{2} \mathrm{UVB} \) 를 조사하고 파프리카 추출물, 비타민 C, 라이코펜이나 베타-카로틴을 농도별로 처리한 후 24시간 동안 배양한 세포를 수거하여 \( 200 \mu l \) 의 PBS로 희석시켰다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>추출물</h2> <p>본 실험에서 사용된 파프리카 추출물은 Yu 등(2006) 논문에 보고된 방법을 참고하여 추출하였다. \( 80 \% \) methanol과 혼합하여 24 시간 동안 추출하고, 이를 총 3 번 반복 추출하였다. 추출액은 여과지를 사용하여 3회 여과하고 회전감압 농축기로 농축하여 동결건조를 한 후에 분말화하여 사용하였다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>인간 각질형성 세포주인 HaCaT 세포는 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS)와 \( 2 \mathrm{mM} \) L-glutamine이 함유되어 있는 RPMI-1640 (Gibco, USA)에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 배양기(Sanyo, Japan)에서 24 시간 동안 배양하였다.</p> <h2>UVB 조사 및 성분 처리</h2> <p>HaCaT 세포를 PBS로 세척시킨 후 UVB (280-320 mm) 200 \( \mathrm{J} / \mathrm{m}^{2} \) 를 조사하고 정상배지 또는 파프리카 추출물, 비타민C (L-Ascorbic acid; USB, USA), 라이코펜(Sigma, USA)과 베타-카로틴(Sigma)이 농도별로 함유된 배지를 처리하여 적정시간 동안 배양하였다.</p> <h2>세포 생존율 분석</h2> <p>세포 생존율 실험은 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-di-phenyl tetrazolium bromide (MTT)를 이용하여 측정하였다. HaCaT 세포는 96 well multiplate (Nunc, USA)에 각 well 당 \( 1 \times 10^{5} \) 개의 세포를 분주하고, 24 시간 동안 배양한 후 FBS가 첨가된 새 배지로 교환하고 실험에 사용될 파프리카 추출물, 비타민 C, 라이코펜과 베타-카로틴을 다양한 농도에서 24시간 처리하였다. 배양 후 phosphate buffered saline (PBS)로 세척한 후 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 MTT (Sigma) 용액 \( 100 \mu \) 를 넣고, 4 시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양한 후, \( 570 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도(ELISA reader, ReTiSoft, Canada)로 측정하여 그 효과를 정상 대조군에 대한 백분율로 산출하여 비교하였다.</p> <h2>세포 고사에 의한 핵분절 분석</h2> <p>자외선 혹은 파프리카 추출물, 비타민 C, 라이코펜과 베타-카로틴에 의한 핵의 형태 변화를 관찰하고자 DAPI 염색을 수행하였다. \( 200 \mathrm{~J} / \mathrm{m}^{2} \mathrm{UVB} \) 를 조사하고 파프리카 추출물, 비타민 C, 라이코펜이나 베타-카로틴을 농도별로 처리한 후 24시간 동안 배양한 세포를 수거하여 \( 200 \mu l \) 의 PBS로 희석시켰다. 희석시킨 세포 \( 15 \mu 1 \) 에 DAPI \( 2 \mu l \)를 섞은 후 형광현미경 (Zeiss vision) X400 배율로 관찰하였다. 결과는 핵이 분절된 세포/전체 세포의 백분율로 계산하여 비교하였다.</p> <h2>Western blot</h2> <p>Lowery 방법에 따라 세포에 Lysis 용액을 넣은 후 얼음에서 20분간 처리하고 원심분리 (\( 12,000 \mathrm{rpm} \), 5분, \( \left.4^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 하여 단백질이 함유된 상층액만을 회수하였다. 정제한 단백질은 Bradford법으로 정량하였다. 정량한 단백질은 \( 12 \% \) SDS-poly-acrylamide gel에서 분리시킨 후 Eletroblot system (Bio Rad)을 사용하여 \( 250 \mathrm{~mA} \) 로 1시간 동안 polyvinylidene fluoride membrane에 옮겼다. TBS-T 완충용액으로 세척하고 5\% skim milk에 놓아두었다. 각각의 항체가 들어있는 항혈청을 block-\( \operatorname{ing} \) 용액에 \( 1: 1,000 \) 으로 희석하여 처리하고 상온에서 흔들어 준 다음 TBS-T 완충용액으로 15 분간 3번 세척하였다. Secondary antibody를 blocking 용액에 1:1,000으로 희석한 용액을 처리한 후 TBST로 세척하였다. 암실에서 developing solution A 와 B 를 1:1로 혼합한 액을 처리한 후 곧 바로 Hyper film을 얹어 10 초에서 5분 동안 노출한 후 현상하였다.</p>