효소 반응 생성물은 TLC와 HPLC로 수행하고 thin-layer chromatography로 효소반응 생성물을 확인하였다. 최종 CFs 생성물의 정량분석은 HPLC 방법을, 잔존 환원당 농도는 dinitrosalicylic acid 방법으로 측정하였다.
<h2>효소 반응</h2><p>효소반응은 \( 50 \mathrm{mM} \) 인산완충용액 \( (\mathrm{pH} 7.0 \))에서 수행하였다. Chicory, dahlia, 그리고 Jerusalem artichoke (Sigma Co., U.S.A.)을 기질로 하였다. 재조합 균주 S. cerevisiae EBY100/ pCTECFTN과 대조구인 S. cerevisiae EBY100을 최적 배양 조건인 YPDG 배지, \( 20^{\circ} \mathrm{C}\), 48 시간 배양한 배양액을 원심분리한 후 균체를 PBS(phosphate buffered saline)에 두 번 세척하였다. 균체를 PBS에 \( \mathrm{OD}_{600}=20 \) \( ( 5.05 \mathrm{unit}/\mathrm{l}\))로 희석하였다. CFTase 활성 측정은 \( 5\% \) inulin \( 100 \mu \mathrm{l} \)와 조효소 \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응 후 반응 종결은 \( 100^{\circ} \mathrm{C}\), 10분 가열하였다. CFTase 활성 \(1 \mathrm{unit}\) 정의는 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 1 \mu \mathrm{mol} \)의 CF6(cycloinulohexaose)을 생성하는 효소양으로 하였다. 반응 생성물은 TLC와 HPLC로 수행하였다.</p><h2>Thin-layer chromatography에 의한 효소반응 생성물의 확인</h2><p>효소반응 생성물은 thin-layer chromatography로 분석하였다. 반응액은 비등수에서 5분간 열처리한 후 각각의 반응액 \( 5 \mu \mathrm{l} \) 씩을 TLC plate (MERCK)에 점적한 후 butanol\(:\)isopropanol\(:\)water (\(3: 12: 4\), \( \mathrm{v} / \mathrm{v}\))을 전개용매로 3회 전개하였다. 생성물은 urea spray로 분무한 후 \( 110^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 가열하여 발색시켰다. Urea spray는 \( 1 \mathrm{M}\) \( \mathrm{H}_{3} \mathrm{PO}_{4} \) (water-saturated n-butanol \( 93.22 \mathrm{ml}\), \(\mathrm{H}_{3} \mathrm{PO}_{4} \) \( 6.78 \mathrm{ml} \) )에 \( 5 \mathrm{ml} \) ethanol과 \( 3 \mathrm{~g} \)의 urea를 첨가하여 제조하였다. Standard는 \( 2 \% \) inulin 용액과 \( 50 \mathrm{mM} \sim 100 \mathrm{mM} \)의 \( \mathrm{FeCl}_{2}\), \(\mathrm{AlCl}_{3} \) 용액을 \(1:1\)로 혼합하여 \(5 \sim 10\)분간 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 끓는 물에서 가수분해하여 사용하였다. CFs 생성 확인을 위한 표준물질로 fructooligosaccharides standard set (1-kestose, nystose, 1F-fructosylnystose (Wako, Japan)와 glucose, fructose, and sucrose (Junsei, Japan)를 이용하였다. TLC상의 반응생성물 분석은 image analyzer (FluorChem 5500, Alpha InnoTech., U.S.A.)를 사용하였다.</p><h2>High Performance Liquid Chromatography</h2><p>최종 생성된 CFs의 정량분석은 HPLC를 이용하였다. 효소적 반응을 통한 최종 반응액을 \( 0.4 \mu \mathrm{m} \) filter로 여과한 다음 여액을 HPLC로 분석하였다. Column은 TSK gel Amide- 80(Tosoh Co., Japan)을 사용하였고, 용출 용매는 탈기한 acetonitrile: \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) (\(65: 35\), \( \mathrm{v} / \mathrm{v}) \), 유속 \( 1.2 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \), column oven 온도는 \( 85^{\circ} \mathrm{C} \)로 하였다. Sample은 \( 30 \mu \mathrm{l} \)씩 주입하였다. HPLC 기종은 Waters (Alliance 2690, Milford, MA, U.S.A.)를 사용하였고, RI detector (Waters 410, U.S.A.)로 검출하였다.</p><h2>분석 방법</h2><p>잔존 환원당 농도는 dinitrosalicylic acid 방법을 사용하여 측정하였고, 그때 standard로서 glucose가 사용되었다. CFs를 포함하는 carbohydrate의 정량분석은 HPLC에 의해 수행 되었다. 총 CFs의 양은 cycloinulohexaose (CF6), cycloinuloheptaose (CF7), and cycloinulooctaose (CF8)의 합으로 산출 되었다. Jerusalem artichoke inulin으로부터 생성된 CFs를 \( 100 \% \)로 하였을 때 다른 inulin으로부터 생성된 CFs의 상대적인 양\( (\% \))을 결정하였다. 반응 혼합물에서 전체적인 carbohydrate 양은 phenol sulfuric acid 법으로 측정하였다.</p>