대구지역에서 수집한 김치를 사용하여 유산균주를 분리하였으며, 이를 위해 CaCO3가 포함된 MRS 배지를 활용하였다. Leconostoc속 균죽은 bromophenol blue가 첨가된 배지에서 특징적인 군청색 염색을 보이며, sucrose를 탄소원으로 사용할 경우 끈적한 액체처럼 변형되는 형태를 갖는다. 분리된 균주들 중에서 내산성을 가진 균주는 \(0.6\%\) 젖산을 함유하는 MRS 배지에서 생육하도록 선정되었다. LM3 균주는 \(0.5\%\) 이상 농도의 젖산을 처리한 배지에서 성장이 느려지는 경향을 나타내며, 이는 대조균주의 패턴과 유사하다. 그러나 LM3 균주는 젖산 처리에 관계없이 거의 활성 변화가 없었다.
<h1>결 과</h1> <h2>김치에서 Leuconostoc mesenteroides LM3 분리</h2> <p>대구지역 식당과 가정에서 채집한 김치를 사용하여,\( \mathrm{CaCO}_{3} \) 가 포함된 \( \mathrm{MRS} \) 배지에서 1차적으로 유산균주를 분리하였다. 즌, MRS한친배지에 도말된 균주의 콜로니에서젖산을 생산할 경우 투명한 환을 형성하는 특징은 이용해서 젖산발효균(Lactic acid bacteria)를 일차적으로 분리하였다. 이후 분리된 균주에서 Leuconostoc녹 균주를 분리하기 위해 Bromophenol Blue가 첨가된 MRS내지와 Sucrose배지를 사용하였다. Leconostoc속 균죽의 경욱 bromophenol blue가 포함된 배지에서 자라게 되면 골로니 전체가 군청색으로 염색되는 모습을 띄게 되고, 또한 sucrose를 탄소원으로 대사할 경우 콜로니의형테가 끈적한 액체처림 변하게 된다. 이들 균주 중에서 Gram staining과 fermentation type을 조사하여 균주의 모양과 이산화탄소 생성유무를 확인하고, 위의 배지에서의결과와 더불어 Leuconostoc mesenteroides로 추정되는 균주를분리하였다. 이들을 대상으로 \( 0.6 \% \) 젖산을 함유하는 MRS에서 생육하는 균주를 최종적으로 내산성은 가진 균주로 간주하였다.</p> <p>위와 같은 과정에서 분리한 균주를 LM3 라 명명하고, 그의 지방산 조성을 한국생명공학연기원 유전자은행에 의뢰하여 분석을 하였다. 그 결과 탄소수 14 개에서 19개 사이에서 지방산 조성이 관찰되었고, \( \mathrm{C}_{1600} \) 과 \( \mathrm{C}_{19.0} \) (cyclow8c)가 전체의 \( 54 \% \) 이상을 차지하는 것을 알 수 있었다.LM3균주는 상대적으로 탄소수 18 개의 지방산의 함량이 높게 나타났다. 전체적으로 각 탄소 조성 간에 LM3균주와대조가주간의 조성비율이 \(3\%\) 미만의 낮은 오차가 나타남으로써 LM3균주가 Leuconostoc mesenteroides인 것으로 동정할 수 있었다.</p> <h2>젖산 존재하의 분리균주의 성장패턴</h2> <p>분리한 LM3균주의 성장패턴을 알아보고 젖산은 첨가하여 그에 따른 생육저해현상은 조사하였다. 실험결과 이 균주의 성장속도가 대조균주와 거의 다르지 않음을 알 수 있었다. \( 0.5 \% \) 이상 농도의 젖산을 첨가한 배지에서 자랐을 때 LM3 균주의 경우 성장이 느려지는 것을 관찰할 수가 있었고, 이는 대조균주의 패턴과 비슷하였다. 그리고 성장속도가 빠른 지수성장기 동안 첨가한 젖산에 의해 외부\( \mathrm{pH} \) 가 급격히 떨어지는 것을 관찰하였다. 정상적인 성장에서는 초기 \( \mathrm{pH}^{2}=5.5 \) 이고 정지기로 들어선 후 \( \mathrm{pH} \) 는 \( 4.2 \) 까지 떨어지는 결과를 보여주었다. 그러나 \( 0.2 \% \) 젖산을 첨가한 경우 생육이 \( 40 \% \) 정도 감소하였고, \( 0.5 \% \) 이상 젖산을 첨가한 경우 균의 생장 속도가 느려졌으며, 더불어 이 농도에서는 초기에 첨가한 젖산에 의해 떨어진 \( \mathrm{pH} \) 도 변동없이 계속되고 있음을 볼 수 있었다. 균의 성장이 가장 활발한 지수성상기일 때 젖산을 첨가한 결과, \( 0.4 \% \) 이상에서는 성장이 지연되었고 그 역시 대조균주와 같은 결과를 보여주었다.</p> <h2>젖산에 대한 분리균주의 내산성도</h2> <p>정지기에서 여러 농도로 젖산을 첨가하여 30 분씩의 간격을 주어 90분까지 처리하여 생존유무를 관찰한 결과, LM3균주의 경우 \( 4 \% \) 농도에서 30 분 처리한 경우에,도 정상상태와 같은 콜로니 밀도를 보여주고 있다. 이에 비해 대조균주의 경우는 
\(3\%\) 농도를 처리하였을 때 60 분에서부터 영향을 받으며, \( 4 \% \) 이상에서는 생존이 불가능한 것으로 나타났다. 이에 따라 성장 동안에 젖산을 첨가하면 성장에 큰 영향을 미치고 이는 대조균주와의 차이가 없었으나. 정지기에서 고농도로 짧은 시간에 처리하는 경우 LM3균주가 대조균주보다 더 큰 생존율을 보이는 것을 알 수있었다.</p> <h2>젖산 존재하의 세포내 trehalose 양과 trehalase 활성의 변화</h2> <p>지수성장기와 정지기의 세포에 젖산을 처리하였을 때의 trehalose 양의 변화를 관찰한 결과이다. 대표적인 stress protectant도 알려져 있는[18] trehalose의 세포 축적은 대조균주보다 LM3 균주에서 높게 나타나는 것을 알 수있었다. 젖산 처리 후 대조균주의 trehalose축적량이 증가하는 것과 비표했을 때, 이 균주의 경우 초기 trehalose양은적으나 젖산을 처리함에 따라 trehalose의 축적량이 높게나타났다. 그리고 지수성장기 보다 정지기에서 trehalose축적량이 더 높은 것을 관찰할 수 있었다.</p> <p>한편 trehalose를 분해하여 효과적으로 스트레스에 대처하도록 하는 trehalase 활성은 대조균주에서는 정지기에서감소하는 경향을 보였다. 이는 젖산에 대한 반응에따른 trehalose축적을 위해 trehalase의 활성이 감소한 것이라 여겨진다. 그러나 LM3 균주는 젖산 처리에 관계없이 거의 변화하지 않는 활성을 보였다.</p> <h2>젖산 존재하의 ATPase 활성, 세포내 \( \mathrm{pH} \) 의 변화</h2> <p>균주가 생성하는 유기산에 의해 변화하는 세포 외부 \( \mathrm{pH} \)는, 지수성장기의 경우 \( \mathrm{pH} 5.2 \), 정지기 에서는 \( \mathrm{pH} 4.1 \) 까지 떨어졌다. \( 0.6 \% \) 젖산을 처리했을 때, \( \mathrm{pH} \) 는 \( 4.2 \) 정도로 나타났다(data not shown). 각 성장시기별 ATPase 활성을 측정한 결과, 젖산처리 후 대조간주는 ATPase 활성이 증가한 반면, LM3균주는 다소 감소하는 양상을 보였으나 성장시기에 상관없이 거의 동일한 활성을 유지하였다.세포내의 \( \mathrm{pH} \) 를 측정한 결과에서 LM3 균주는 젖산 처리 후\( \mathrm{pH} \mathrm{6} \) 으로 처리전의 \( \mathrm{pH} \) 와 거의 동일하게 나타났다. 이는 젖산 처리 후에 \( \mathrm{pH} \) 까지 감소하는 경향을 보이는 대조균주와 다른 양상을 보였다.</p>