딸기는 생과 및 가공 원료로 애용하는 과채류로, 비타민C와 함께 항산화 활성이 있는 다양한 페놀성 화합물을 함유하고 있으며 딸기의 안토시아닌 합성 유전자는 PAL, CHS, DFR 등, 구조 유전자와 유전자의 조절에 관여하는 전사인자 FaMYB1가 있다. 품종에 따라 안토시아닌 합성 유전자의 발현 profile이 조금씩 다른것을 알 수 있으며 딸기에 관한 연구는 식품 가공에 한정되어 있으며, 품종 개량 및 품질 향상을 위한 기본자료로 참고할 만한 생합성 유전자에 대한 정보가 거의 없는 실정이다. 본 연구는 '매향' 딸기를 식품 재료로 활용하기 위해 안토시아닌 생합성에 연관된 유전자를 분리하고 과실 발달과정에서 발현하는 양상에 대해 연구하였다.
<h1>서 론</h1> <p>딸기(Fragaria \( \mathrm { x } \) ananassa Duch.)는 생과 및 가공 원료로 애용되고 있는 과채류로서, 특히 비타민 \( \mathrm { C } \) 와 함께 항산화 활성이 있는 다양한 페놀성 화합물을 함유하고 있다. 이에 따라 품종이나 생장 온도, 그리고 수확 후 저장 조건 등에 따른 항산화 활성 및 페놀성 성분의 함량에 대한 연구가 많이 수행되어 왔다. 그러나 이와 같은 페놀성 화합물의 다양한 생리 활성에도 불구하고, 안토시아닌 등 각 성분의 생합성 과정에 대한 연구는 그리 활발하게 이루어지지 못했다. 그동안 보고된 딸기의 안토시아닌 합성 유전자는 phenyl-alanine ammonia lyase \( (P A L) \), chalcone synthase (CHS), dihydroflavonol 4-reductase (DFR) 등, 구조 유전자와 이들 유전자의 조절에 관여하는 전사인자 FaMYB1가 있다. 그 외 Gene bank에는 chalcone isomerase (CHI) [AY017478], flavanone 3-hydroxylase (F3H) [AY017482], UDP-glucose:fla-vonoid-3-O-glucosyltransferase (UFGT) [AY575056] 등이 동록되어 있다. 이와 더불어 최근 Almeida 등이 'Queen Elisa' 품종으로부터 여러가지 flavonoid 합성 유전자를 분리하면서, 딸기의 안토시아닌 생합성에 대한 연구가 더욱 활발해지고 있다. 이들은 과실 발달 단계별로 안토시아닌 합성에 관여하는 주요 유전자의 발현량을 조사하였는데, 'Chandler' 품종에서 기존에 보고된 DFR 유전자의 발현 양상과는 일부 다른 결과를 보여주었다. 딸기 품종에 따라 안토시아닌 합성 유전자의 발현 profile이 조금씩 다르다는 것을 알 수 있다.</p> <p>한편, 국내에서의 딸기에 관한 연구는 식품 가공에 국한되어 왔으며, 이에 따라 품중 개량 및 품질 향상을 위한 기초자료로 삼을 만한 기능성 성분의 생합성 유전자에 대한 정보는 거의 없는 실정이다. 특히 과실 발달 과정에서 이들 유전자의 발현 특성에 대한 통합적인 검토가 이루어진 적이 없다. 더군다나 국내에서 선발 - 육종된 '매향' 딸기를 모델로 이러한 연구가 수행된 경우는 전무하다. 따라서 본 연구에서는 '매항' 딸기의 품질을 높이고 유용 성분을 이용한 다양한 식품 소재로 활용하기 위해, 안토시아닌 생합성에 관여하는 주요 유전자를 분리하고 과실 발달과정에서 이들의 발현 양상을 분석하였다.<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료</h2> <p>충청남도 논산의 딸기 재배농가로부터, 국내산 '매향' 딸기를 개화시기부터 시작하여 과실 발달 단계별로 수확한 다음, 각각 액체 질소로 급냉시킨 뒤, \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 보관하였다.<h2>Total RNA 분리</h2> <p>\( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 보관되어 있는 재료로부터 \( 5 \mathrm { ~g } \) 을 채취하여 막자 사발에 옮겨 고운 가루로 만든 후, \( 25 \mathrm { ml } \) 외 extraction buffer(2 \% CTAB, w/v; \( 1.4 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } ; 1 \% \) PVP, w/v; \( 0.2 \% \)--mer-captoethanol, \( \mathrm { v } / \mathrm { v } ; 20 \mathrm { mM } \) EDTA; \( 100 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } , \mathrm { pH } \)9.0; \( 0.4 \mathrm { ~g } \mathrm { PVPP } / \mathrm { g } \) )를 첨가한 다음, \( 40 \mathrm { ml } \) 의 polypropylene tube로 옮겨 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 항온 수조에서 5분간 정치시켰다.</p>이후 동량의 phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1, v/v/v)을 첨가하여 혼합시킨 뒤 \( 13,000 \mathrm { rpm } \) 에서 원심 분리하였다. 상충액을 새로운 tube로 옮겨서 0.6 배의 isopropanol을 넣고, \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 분간 침전시킨 뒤, \( 13,000 \mathrm { rpm } \) 에서 10 분간 원심 분리 하였다. Pellet에 \( 0.6 \mathrm { ml } \) 의 \( \mathrm { DEPC } \) (diethyl pyrocar-bonate) 처리 멸균 증류수를 넣고 녹인 후 Eppendorf tube로 옮겼다. 동량의 \( 4 \mathrm { M } \mathrm { LiCl } \) 를 넣고 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 12 \sim 14 \) 시간 정치시킨 다음 원심 분리하였다. Pellet을 \( 70 \% \) ethanol로 씻고, 30 \( 50 \mu \mathrm { l } \) 의 \( \mathrm { DEPC } \) 처리 멸균 증류수에 녹여서 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 보관하며 사용하였다. Total RNA는 UV Spectrophotometer (BIO-RAD)를 사용하여 정량하였으며, \( 1.8 \% \) 의 formladchyde-agarose gel에서 RNA 상태를 확인하였다.</p>