E coli 배양을 하기위해 LB 배지를 사용했다. 가용성 단백질 생산에 대하여 chaperone의 효과를 알기위하여 E. coli에 pTCGT1과 pGro11을 도입시켜 대장균주를 LB배지에서 배양한 뒤 tetracycline 10 ng/ml과 IPTG 1mM을 대수증식기 초기와 대수증식기 중기에 맞추어 첨가하는 것으로 각 유전자 발현을 유도했으며 25\(^\circ \mathrm{C}\), 30\(^\circ \mathrm{C}\), 37\(^\circ \mathrm{C}\) 온도에 맞추어 배양했다.
<h2>형질전환</h2> <p>pTCGT1와 pGro11을 1 g 사용하여 E. coli BL21 (DE3)에 도입시켰으며 형질전환 된 E. coli는 20 g/ml ampicillin(pTCGT1의 선별)와 20 g/ml chloramphenicol (pGro11의 선별)이 함유된 LB agar 배지에서 선별하였으며 pTCGT1만 함유한 균주는 20 g ml ampicillin이 첨가된 LB agar 배지에서 선별하였다.</p> <h2>배지와 배양 조건</h2> <p>E. coli 배양을 위해 LB 배지(1% Bacto-tryptone, 0.5% Bactoyeast extract, 0.5% NaCl)을 사용하였다. pTCGT1과 pGro11을 함께 지닌 균주는 20 g/ml ampicillin과 20 g/ml chloramphenicol이 함유된 LB배지에서 배양, pTCGT1만을 지닌균주는 20 g/ml ampicillin을 함유한 LB배지에서 배양하였다. 37℃에서 전 배양한 후 80 ml flask로 옮겨 25℃, 30℃,37℃에서 배양하였으며 groEL/ES와 cgt 유전자의 발현을 위해 각각 tetracycline 10 ng/ml과 isopropyl- -D-thiogalactopyranoside (IPTG) 1 mM을 대수증식기 초기(early-exponential phase : 2 hr)와 대수증식기 중기(mid-exponentialphase : 3 hr) 때 첨가하였다.</p> <h2>SDS-PAGE 분석</h2> <p>생산된 CGTase의 응집정도를 알아보기 위해 배양이 끝난 세포만을 모아 sonication을 한 뒤 4,000×g에서 10분 동안 원심 분리하여 가용성과 비가용성분획으로 나눈 뒤 각각의 분획을 SDS-PAGE (8% gel)로 분석하였다. Gel은 Coomassie brilliant blue로 염색하였고 Image Analyzer (Image Master VDS, Pharmacia Biotech., NJ, USA)로scanning하여 분석하였다.</p> <h2>CGTase 활성 측정</h2> <p>CGTase 활성측정은 methyl orange method로 측정하였다. 효소 반응 조건은 0.03 mM methyl orange, 1% soluble starch, 효소 용액 50 l을 50 mM 인산 완충액(pH 6.0)에 전체 양이 1.5 ml이 되게 잘 섞은 다음 50℃에서 반응시켜 505 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소 1.0 unit는 1분당 1 mol의 -cyclodextrin을 생산하는 효소의 양으로 정하 였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>CGTase 활성의 비교</h2> <p>가용성 단백질 생산에 대한 chaperone의 효과를 알아보기 위해 E. coli에 pTCGT1과 pGro11을 함께 도입시킨 대장균주를 LB배지에서 배양하면서 tetracycline 10 ng/ml과 IPTG 1mM을 대수증식기 초기(2 hr)와 대수증식기 중기(3 hr)에 첨가하여 각각의 유전자 발현을 유도하였으며 25℃, 30℃, 37℃ 온도에서 배양하였다. 단독배양에서는 37℃보다 30℃와 25℃ 배양 시 균체증식속도가 조금씩 감소하는 것으로 나타났고 공동발현시에는 초기성장속도에 있어 이러한 현상이 더 두드러져 나타나는 것을 관찰 할 수 있었다(Fig. 1). pTCGT1를 단독으로 발현시켰을 때 활성 측정 결과, 37℃의 0.48unit/ml에서 30℃의 0.84 unit/ml, 25℃의 0.94 unit/ml로 25℃에서 가장 높은 활성을 나타내었으며, chaperone과 공동발현시킨 것 역시 37℃의 0.83 unit/ml에서 30℃의 1.09 unit/ml, 25℃의 1.11 unit/ml로 25℃ 배양 시 CGTase활성이 더 높아지는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 세 가지 조건 모두에서 25℃ 배양이 훨씬 높은 CGTase 활성을 나타냈다.</p>