한국의 된장에서 분리된 Bacillus subtilis D7 균주를 사용하여 청국장을 제조하였다. 물에 17시간 동안 침지한 백태(150g)로 발아를 유도하였으며, 이를 위해 26시간마다 물을 공급하였다. B. subtilis D7은 Luria-Bertani 배지에서 \(30^{\circ}\mathrm{C}\), \(200 \mathrm{rpm}\)으로 20시간 동안 배양하여 발효 종균으로 사용하였다. 환원당의 양은 dinitrosalicylic acid(DNS)법으로 측정하였으며, glucose를 표준물질로 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주 및 대두</h2> <p>본 연구에 사용된 균주는 한국의 전통식품인 된장으로부터 분리 및 동정된 Bacillus subtilis D7이었다. 청국장 제조에 사용된 콩은 재배농가에서 직접 구입한 흰콩(백태, Glycine max L. Merr)이었다.</p> <h2>대두 발아조건 및 발아 전후 이소플라본 함량 비교</h2> <p>백태 \( 150 \mathrm{~g} \)을 각각 1 7시간 동안 증류수에 수침시킨 후, 26시간마다 물을 공급하면서 발아를 유도하였다. 이때 온도는 \(20\sim30^{\circ} \mathrm{C} \)로 각각 조정하였다. 발아율은 다음 식에 의하여 산출하였다.</p> <p>발아율 \( (\%)=( \) 발아콩의 수/전체 콩의 수 \( ) \times 100 \)</p> <p>발아 전후 콩의 이소플라본 함량은 HPLC를 사용하여 Wang 등의 방법을 일부 변경한 gradient solvent system으로 분석하였다. 동결건조하여 분쇄한 시료 \( 1\mathrm{g} \)에 \(0.1\mathrm{~NHCl} ~2 \mathrm{ml} \) 및 acetonitrile \( 10 \mathrm{ml} \)을 첨가하여 3시간 동안 진탕하였다. Whatman no. 4 여과지로 여과한 후, 여액을 진공농축하였다. 농축 시료를 \(80\% \) methanol에 용해시킨 후, \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) membrane filter로 여과하여 HPLC 분석을 위한 시료로 사용하였다. 사용된 컬럼은 \(\mu\)-Bondapak C18 컬럼이었고, UV detector를 이용하여 \( 254\mathrm{nm} \)에서 분석하였다. 이동상은 시작시 \( 20 \% \) methanol 100에서 50분 후 \( 60 \% \) methanol 100이 되도록 하였고, 유속은 \( 1\mathrm{ml} / \mathrm{min} \)이었다. 이소플라본 함량은 표준물질의 농도에 대한 피크의 면적을 표준정량곡선으로부터 계산하였다.</p> <h2>청국장 발효</h2> <p>B. subtilis D7을 Luria-Bertani 배지에서 \( 30^{\circ}\mathrm{C}\), \(200 \mathrm{rpm} \)으로 20시간 동안 배양한 후, 발효를 위한 종균으로 이용하였다. 발아된 백태를 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 증자한 후, 종균 배양액을 \(1\%\)(\(\mathrm{v}/\mathrm{w}\)) 접종하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 동안 발효시켜 청국장을 제조하였다(종균-발아콩). 청국장에 6배 부피의 증류수를 첨가하여 분쇄 및 원심분리한 후, 상등액을 각종 발효지표 분석에 사용하였다. 이때, 미발아콩에 B. subtilis D7을 접종한 것(종균-미발아콩)과 미발아콩에 볏짚 끓인 물을 접종한 것(볏짚-미발아콩)을 대조구로 이용하였다.</p> <h2>발효지표 분석</h2> <p>환원당은 dinitrosalicylic acid (DNS)법으로 측정하였으며, glucose를 표준물질로 사용하였다. 아미노태 질소 함량은 formol 적정법, 암모니아태 질소 함량은 indophenol blue법을 사용하여 측정하였다. \( \mathrm{pH} \) 측정은 \( \mathrm{pH} \) meter를 이용하여 측정하였다.</p> <p>Protease 활성은 상기에서 조제된 상등액을 조효소액으로 사용하여 측정하였다. 기질용액 \( (0.6 \% \) hammerstern casein, \( \mathrm{pH}~7.2 \) ) \( 1 \mathrm{ml} \)와 조효소액 \( 1 \mathrm{ml} \)를 시험관에 넣고 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), 10분간 반응시켰다. \( 0.4 \mathrm{M} \) trichloroacetic acid (TCA) 용액 \( 1 \mathrm{ml} \)를 가하여 반응을 중지시킨 후, 원심분리에 의하여 상등액을 회수하여 UV/VIS spectrophotometer를 이용하여 \( 280 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 효소 1 unit는 상기 조건에서 분당 0.01의 흡광도 증가를 나타내는 효소량으로 정의하였다.</p> <p>Amylase 활성은 \( \alpha\)-amylase와 \( \beta \)-amylase로 구분하여 측정하였다. \( \alpha\)-Amylase 활성은 다음과 같이 측정하였다. \( 0.5\% \) soluble starch 용액(0.4 M acetate buffer, \( \mathrm{pH}~4.8 \) ) \( 2 \mathrm{ml} \)와 조효소액 \( 1 \mathrm{ml} \)를 혼합하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시켰다. 0.4 MTCA \( 1 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 반응을 중지시킨 후, 원심분리에 의하여 회수한 상등액 \( 1 \mathrm{ml} \)에 \( \left[0.005 \%~\mathrm{I}_{2}\right. \) 및 \( \left.0.05~ \% \mathrm{KI}\right] \) 용액 10\( \mathrm{ml} \)을 첨가하여 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 효소 1 unit는 상기 조건에서 blank 흡광도가 \( 10 \%\) 감소되는 효소량으로 정의하였다. \( \beta \)-Amylase 활성 측정은 상등액을 DNS법으로 maltose의 양을 측정한 것만 제외하고 \( \alpha\)-amylase 측정법과 동일하였다. 이때 표준곡선은 maltose를 이용하여 작성하였다. 효소 1 unit는 상기 조건에서 \( 1 \mathrm{mg} \)의 maltose를 유리시킬 때의 효소량으로 정의하였다.</p> <p>생균수는 발효 중인 콩 \( 1 \mathrm{g} \)을 멸균수 \( 9 \mathrm{ml} \)에 첨가하여 계단 희석한 후, 표준평판법에 의하여 배양하여 계수하였다.</p>