이 연구에서는 서로 다른 농도의 세포를 사용하여 5 mm 지름의 담체를 제조하였다. 담체의 지름이 작아지면 락툴로스의 생산 속도에 큰 영향을 미치지 않지만, 상대적으로 빠른 변환 속도를 보이는 것이 확인되었다. 또한, 락툴로오스의 전환율이 최소 \(40 \% \) 필요하다는 점을 감안하여, 유당의 최적 반응 농도를 200 g/l로 결정하였다. 또한, 담체의 반복 사용을 위해 4시간 간격으로 기질을 순환하여 반복회분식 반응을 수행한 결과, 반복횟수가 증가하더라도 전환율이 서서히 감소하며, 4회 반복실험까지는 최대전환율대비 \(80 \% \) 이상을 유지하였다.
<h2>담체제작 및 담체를 이용한 락툴로오스 전환</h2> <p>락툴로오스전환을 위한 담체를 제조하기 위하여 \( \mathrm { CS } - \mathrm { H } ^ {\mathrm { R } } \mathrm { C } ^ {\mathrm { E } } \)를 포함하고 있는 균주를 이용하여 담체제조에 사용하였다. 각각 다른 세포량을 이용하여 지름 5 mm 담체를 제조하였다. 5% (wet cell weight(wcw))에서 25% (wcw)까지 각각 다른 세포 함량을 이용하여 제조된 담체를 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20 g/l 유당과 시간별로 회분식으로 반응시켜 함량비에 따른 차이를 비교하였다. 각각의 담체반응물의 전환율을 확인한 결과 담체간 차이는 크지 않았으나 그 가운데 15% (wcw)의 세포로부터 제조된 담체가 가장 높은 전환율을 보였다(Fig. 4A).</p> <p>담체의 크기에 따른 락툴로스의 전환수율에 대한 영향을 알아 보기 위해 15%의 세포로부터 담체의 지름을 각각 2.0, 2.8, 5.0 mm의 세가지 크기로 제작하였다. 그 결과, 2.0 mm와 2.8 mm의 담체를 비교하여 보았을 때 락툴로스 생산 속도는 크게 차이를 보이지 않았으나 담체 직경이 작은 경우(2.0 mm), 5.0 mm 담체보다 상대적으로 다소 빠른 변환속도를 보였다(Fig. 4B).</p> <p>유당으로부터 락툴로오스의 전환 연구에서 중요한 목표 중 하나는 유당의 용해도가 허용되는 수준의 농도에서 최대한 전환 수율을 가지는 조건을 확립하는 것이다. 알려진 바에 따르면 유당의 용해도를 살펴보면 온도가 올라감에 따라 용해도가 증가하며, 선별효소의 최적반응온도인 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 445 g/l까지 녹을 수 있다(Fig. S3). 유당의 용해도 곡선에 따라 현재 선별된 효소를 함유한 균주를 이용하여 제조된 고정화 담체를 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 조건에서 20 g/l부터 최대 300 g/l 유당과 반응시켜 각각에 대한 전환율을 측정하였다(Table 1). 그 결과 유당 200 g/l 조건까지 \(40 \% \) 이상의 전환율을 보였으나 그이상의 농도에서는 전환율이 \(40 \% \) 이하로 감소하였다. 유당반응농도와 전환율간에 최적화가 필요하지만 정제공정시 냉각법에 의한 결정화법으로 유당과 락툴로오스의 혼합액을 정제할 경우 효율적인 분리를 위해 최소 \(40 \% \) 이상의 락툴로오스의 전환율이 필요하다. 따라서 고농도의 기질을 사용하는 것이 일반적으로 유리하지만 정제시 결정단계를 고려하여 \(40 \% \) 이상의 전환율을 유지할 수 있는 유당의 최적반응 농도를 200 g/l로 결정하였다. 고농도에서 시간에 따른 락툴로오스 전환 시험을 위하여 결정된 조건을 토대로 최적온도 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 유당농도 200 g/l 조건에서 \(15 \% \) 세포 이용하여 포괄법으로 담체를 만들어 회분식으로 교반하면서 4시간 동안 반응시켰다. 유당은 서서히 감소하여 락툴로오스와 epilactose로 전환되었으며, 이때 락툴로오스로의 최종 전환율은 약 2 시간 이후에 평형에 도달하여 \( 48.6 \pm 3.39 \% \) 로 나타났다(Fig. 5). Epilactose 역시 \( 9.81 \pm 2.83 \% \) 전환되어 2 시간 이후 평형에 도달하였을 때, 최종 평균 혼합액의 비는 42 : 48 : 10 (유당 : 락툴로오스 : epilactose)로 분석되었다.</p> <p>담체의 반복사용을 위해 4시간 간격으로 기질을 순환하여반복회분식 반응을 수행한 결과 반복횟수가 증가할수록 전환수율이 낮아졌으나 4회 반복실험까지는 최대전환율대비 \(80 \% \) 이상을 유지하면서 서서히 감소하였다(Fig. 6). 전반적으로 기질농도에 따라 다소 차이를 보였으나 200 g/l 이하에서는 비교적 덜 영향을 받는 것으로 나타났다.</p> <p>현재까지 다양한 균주로부터 정제한 CE에서도 비교적 높은 전환수율 또는 열안정성을 보여준 사례가 있으며 이에 대한 특성을 보고한 바가 있다. 그러나 높은 전환수율과 열안정성을 동시에 가지는 효소에 대한 보고는 많지 않다. 본 연구에서는 열에 대한 내성 및 전환율이 개선된 효소를 선별하여 발현시킨 대장균을 포괄법으로 고정화시켜 고온에서 락툴로오스를 전환하는 연구를 수행하였다. 효소정제과정이 필요없는 간단한 처리를 통해 효소고정화보다 경제적인 세포의 고정화로 담체를 제조하여 고온반응조건에서 CE를 제외한 나머지 효소들의 실활을 유도하고 락툴로오스 전환을 유도하는 실제적인 공정을 제안하였다. 특히 열내성 특성을 활용하여 조효소액을 열처리한 후 변성단백질을 제거한 경우 상당히 높은 정제순도를 나타냈다(Fig. S4). 따라서 전세포를 고정화하는 방법 이외에 세포를 열처리한 후 얻어진 효소파쇄액을 고정화하는 방법도 가능하다고 사료된다. 본 연구의 결과를 토대로 앞으로 담체의 안정성을 높이고, 담체를 이용한 최적 반응기를 구현하는 추가적인 연구와 함께 전세포 및 효소파쇄액 형태의 고정화를 통해 향후 산업화가 가능한 수준의 경제성있는 공정을 개발할 수 있을 것으로 사료된다.</p>