부탄올 내성 균주를 개발하기 위해 분리한 균 중 BRS 251은 모균주에 비해 부탄올 \( 17.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 첨가조건까지 세포 성장이 이루어지는 것을 확인할 수 있었다. 프로판올과 펜탄올에 대한 내성도 또한 대장균과 비교 실험한 결과, BRS 251은 프로판올 \( 25 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \)에서도 높은 내성을 나타내었고, 펜탄올 \( 8 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 이하에서 성장이 이루어져, 대장균에 비해 알코올에 대한 내성이 높다는 것을 확인하였다. 향후 본 연구에서 개발된 Staphylococcus를 이용하여, E. colil Staphylococcus shuttle vector 관련 유전자인 \( k d c \) 등을 발현시킨다면 호기적인 조건에서도 더 좋은 바이오 알코올을 생산할 수 있을 것으로 기대된다.
<h2>부탄올 내성균주의 개발 및 알코올류에 대한 내성도</h2> <p>액체배양에서 \( 15 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 이상의 부탄올에 대한 내성을 갖는 균주를 개발하기 위해 BRS02를 모균주로 사용하여 자외선을 조사하여 고농도 부탄올 내성균을 개발하였다. 15 분간 자외선을 조사한 결과 균주 사멸율은 \( 99.2 \% \) 를 나타내었으며, \( 25 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 와 \( 27.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 에서 내성을 나타내는 콜로니 중 성장이 우수한 균 5 종을 순수 분리하였으며, 최종적으로 \( 15 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 의 부탄올을 함유한 액체배지에서 가장 높은 내성을 나타내는 균주 BRS251을 선별하였다. 액체배지에서 모균주인 BRS02의 경우 \( 15 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 의 부탄올에서 성장이 완전히 저해된 반면에 BRS 251 은 \( 17.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 첨가조건까지 세포의 성장이 이루어졌다(Fig. 4). 시간별로 부탄올 농도 증가에 따른 세포의 성장을 관찰한 결과에서도 대장균의 경우 \( 12.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 첨가조건에서는 성장이 전혀 이루어지지 않은 반면, BRS251의 경우 부탄올 무첨가 상태에서 가장 성장이 빠르며, \( 12.5, 15, 17.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 에서 농도가 증가할 수록 세포의 성장속도가 느려짐을 확인할 수 있었으며, \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 에서는 그 성장이 매우 지연되며, \( 22.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 에서는 전혀 성장이 안 되는 것을 확인하였다(Fig.5). 부탄올 이외의 다른 알코올에 대한 내성도를 조사하기 위해 프로판올과 펜탄올에 대한 내성도를 대장균과 비교한 결과, 대장균은 프로판올 및 펜탄올 함유배지에서 각각 \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 및 \( 4 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 이상에서 성장이 억제되며, BRS251의 경우 프로판올 \( 25 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 에서도 높은 내성을 나타내었으며, \( 35 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 이상에서 그 성장이 완전히 정지되었으며, 펜탄올의 경우 \( 8 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 이상에서 성장이 완전히 저해를 받았다(Fig. 6, Fig. 7). 즉, Staphylococcus sp. BRS251은 대장균에 비해 부탄올, 프로판올 그리고 펜탄올에 상대적으로 높은 내성을 나타내었다. 최근 E. coli와 C. glutamicum sp.에서 아미노산 생합성 및 분해 대사경로에서 출발하여 대사공학적으로 개발된 균을 이용하여 부탄올 또는 이소부탄올을 생산할 수 있음을 보여주었지만 모두 바이오알코올이 생산되면서 세포의 성장이 멈춘 상태에서 매우 느린 속도로 축적이 되어 그 생산성 및 농도가 매우 낮은 상황이다. 따라서, 향후 본 연구에서 개발된 부탄올 내성을 갖는 조건부혐기성균인 Staphylococcus를 이용하여 더 높은 부탄올내성균을 개발하고, E. colil Staphylococcus shuttle vector에 관련 유전자들인 \( k d c \) 와 \( a d h \) 를 발현시켜 도입하면 호기적인 조건에서 보다 더 고 생산성, 고 농도의 바이오 알코올을 생산할 수 있을 것으로 기대된다.</p>