2003년 10월부터 2004년 5월까지 서울아산병원에서 소화불량, 복통, 속 쓰림 등의 상부 위장관 증상을 보이는 환자들을 대상으로 한 연구가 진행되었다. 이들 환자는 위내시경을 시행하였고 조직학적 검사에서 14예에서 비심장성 위선암종의 존재를 확인하였다. 이 연구에는 위염 및 만성 위염으로 진단된 환자 48건도 포함되었습니다. PUREGENE 키트(Gentra System, Minneapolis, MN)를 사용하여 박테리아 콜로니에서 DNA를 추출했습니다. DNA 서열 분석은 GENTYX-Mac 소프트웨어(version 10.0; Software Development)를 사용하여 수행되었습니다. vacA 유전자형 확인에 사용되는 프라이머는 표 1에 제시되어 있습니다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>대상 및 위내시경 검사</h2> <p>2003년 10월부터 2004년 5월까지 소화 불량, 복통 및 속 쓰림 등의 상부 위장관 증상에 기인하여 서울아산병원을 방문한 환자들 중에서 위 내시경 검사를 시행하여 조직 검사로 비분문부 위선암이 확진된 환자 14예와 만성 위염 소견만을 보인 환자 48예를 대상으로 본 연구를 시행하였다. 위 내시경 검사 시 정상 점막 소견을 보인 위 전정부로부터 생검 겸자를 이용하여 조직 절편을 취하여 H. pylori 배양을 시행하였고, PCR로 cagA gene을 확인 하였으며, SHP-2 binding site의 서열을 보기 위하여 nucleotide sequence analysis를 시행하였다.</p> <h2>Helicobacter pylori의 배양.</h2> <p>생검 조직을 \( 0.5 \% \mathrm{NaCl} \)에 침지하여 1시간 내에 연구소로 옮긴 후 무균 페트리 접시에 넣고 수술용 칼을 이용하여 잘게 부순 뒤 Brucellar agar에 horse serum (\(10\%\))과 amphotericin B \( (8 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \), trimethoprim \( (5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \), vancomycin \( (6 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)을 첨가한 선택배지를 이용하여 각각 접종하였다. 배양 조건은 \( 10 \% \mathrm{CO}_{2}\), \(5 \% \mathrm{O}_{2}\), \(37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(3 \sim 5\)일간 배양하였다. 초기 배양에서 얻은 집락은 재배양한 뒤 그람 염색과 생화학적 방법(catalase, urease, oxidase test)을 이용하여 H. pylori 임을 확인하였다. 균주들은 \( 20 \% \) 글리세롤이 포함된 Brucella액체 배지에 넣어 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다.</p> <h2>H. pylori DNA의 분리 및 CagA의 \( 3^{\prime} \) variable region의 SHP-2 binding site 및 vacA 유전형의 확인</h2> <p>배양하여 얻은 균주의 집락에서 PUREGENE kit (Gentra System, Minneapolis, MN)를 이용하여 DNA를 분리하였다. DNA농도와 순도는 변광광도법(spectrophotometry)을 이용하여 측정하였다. PCR을 위한 oligonucleotides는 Table 1에 표시하였다. PCR시 표준균주는 H. pylori ATCC 43504 (cytotoxin/cagA+ vacA genotype s1/m1를 이용하였다. cagA 유전자의 3' region을 증폭하기 위한 PCR 조건은 \( 20 \mathrm{ng} \) 의 DNA, \( 10 \mathrm{mM} \) Tris ( \( \mathrm{pH} 8.3\)), \( 50 \mathrm{mM} \mathrm{KCl}\), \(1.25 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2} \), dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 \( 200 \mathrm{M}\), \(400 \mathrm{nM} \)씩의 forward primer(5'-ACCCTAGTCGGTAATGGGTTA-3') 와 reverse primer (5'-TAGCGTAATTGTCTAGTTTCGC-3') 그리고 \(1 \mathrm{unit}\) Taq DNA polymerase (Promega)가 포함된 \( 50 \mathrm{ul} \)의 buffer에서 시행하였다. 반응 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 초간 denaturation후, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초간 annealing하고 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분간 extension이 일어나도록 하여 총 시행 횟수는 총 30회로 하였다. PCR 산물은 \( 1.5 \% \) agarose gel에 전기영동하여 확인한 후, cagA 양성인 것들은 DNA band를 순수 분리하여 BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit를 이용하여 DNA염기서열을 결정하였다. DNA sequence의 분석은 GENTYX-Mac software (version 10.0; Software Development)를 이용하였다. vacA의 유전형을 확인하기 위해 사용된 primer들은 Table 1에 나타내었다.</p>