본 연구에서 사용한 실험동물은 6주령의 정상혈압쥐와 고혈압쥐를 분양 받았으며, 고혈압쥐는 고혈압대조군과 고혈압운동군으로 무작위로 분류하였고, 동일한 환경적 스트레스의 조건을 위해 트레드밀 운동을 실시할 때, 정상혈압군와 고혈압통제군, 고혈압운동군 모두 동일한 트레드밀 소음 및 진동에 노출시켰다. 혈압측정은 측정 전 12시간 이상 충분한 휴식을 취한 후,tail-cuff 방법으로 총 3회 수축기혈압을 측정하여 평균을 구했고, 적출한 근조직을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 4 \% \) PFA액에 24시간 침전시켰다. 파라핀 포매 후 \( 5 \mu \mathrm{m}\) 두께로 박절한 관상 절편은 모세혈관의 밀도 및 수의 발현을 알아보기 위해 염색을 실시하였고, 근육조직은 lysis buffe에서 균질화하고 \(4^{\circ} \mathrm{C}\)에서 \(14,000 \mathrm{rpm}\)으로, 30분간 원심분리하여 상층액을 분리하고 단백질을 정량하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험동물</h2> <p>본 연구에서 사용한 실험동물은 6주령의 정상혈압쥐 (wistar kyoto rat; WKY, \(n=9\))와 고혈압쥐(spontaneously hy-pertensive rats; SHR, \(n=18\))를 분양 받았으며, 고혈압쥐는 고혈압대조군(SHR-C, \(n=9\))과 고혈압운동군(SHR-E,\(n=9\))으로 무작위로 분류하였다. 사육실의 온도 \( \left(23 \pm 1^{\circ} \mathrm{C}\right) \), 습도 \( (50 \pm 5 \%) \) 및 조명(12시간 light/dart cycle)은 자동조절로 운영하였다. 실험동물은 실험 전 1주간의 사육실 환경적응기간을 두었으며, 무균음료 및 멸균사료를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 본 연구는 C대학교 동물윤리위원회 동물실험승인 CNU 20100241)을 받아 시행하였다.</p> <h2>운동프로그램</h2> <p>지구성운동은 중강도 트레드밀 운동방법을 이용하였고, 설치류 전용 트레드밀에서 속도와 운동시간을 점진적으로 늘려 16주간 실시하였다 (1~3주: \( 12 \mathrm{~m} / \mathrm{min} \),30분, 4~6주: \( 14 \mathrm{~m} / \mathrm{min} \), 40~50분, 7주: \( 16 \mathrm{~m} / \mathrm{min}, \) 50분, 8주: \( 18 \mathrm{~m} / \mathrm{min} \), 60분, 9~16주: \( 20 \mathrm{~m} / \mathrm{min},\) 60분). 동일한 환경적 스트레스의 조건을 위해, 정상혈압군와 고혈압통제군도 고혈압운동군이 트레드밀운동을 실시할 때, 동일한 트레드밀 소음 및 진동에 노출시켰다.</p> <h2>혈압측정</h2> <p>혈압측정은 측정 전 12시간 이상 충분한 휴식을 취한 후,tail-cuff 방법(AD instrument, USA)으로 총 3회 수축기혈압 (systolic blood pressure)을 측정하여 평균을 구하였다.</p> <h2>골격근 모세혈관밀도 측정</h2> <p>적출한 근조직을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 4 \% \) paraformaldehyde (PFA) 용액에 24시간 침전시키고 파라핀 포매 후 \( 5 \mu \mathrm{m} \) 두께로 박절한 관상 절편은 모세혈관의 밀도 및 수의 발현을 알아보기 위해 Hematoxylin & Eosin 염색을 실시하였다. 박절한 조직 절편은 xylene에 3회씩 3분, xylene:ethyalcohol에 3분간 처리하여 파라핀을 제거하고, \( 100 \% \), \( 95 \% \), \( 70 \% \) 에탄올을 각 2회씩 3분간 처리하고 중류수 처리로 함수과정을 실시하였다. Hematoxylin (MHS-32, Sigma, USA)으로 3분간 염색한 후 흐르는 물에서 수세하고 \( 80 \% \), \( 90 \% \), \( 100 \% \) 에탄올에 각각 10분, \( 100 \% \) xylene에 2회씩 10분간 조직을 처리하여 탈수 및 투명화 과정을 거쳤다. 모든 슬라이드는 perment mounting media를 이용하여 봉입하였다. 골격근의 모세혈관밀도 측정은 DP70 카메라 (Olympus, Tokyo)를 이용하여 100X와 300X를 촬영하고, 이미지는 TSView version 7 (Fuzhou Tucsen Image Technology, Japan)을 이용하였으며, 각각의 샘플은 9개 영역으로 구분하여 평균하여 모세혈관밀도를 계산하였다.</p> <h2>Western blotting</h2> <p>근육조직은 lysis buffer (Sigma, USA)에서 균질화하고 균질화된 조직은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 14,000 \mathrm{rpm} \)으로, 30분간 원심분리하여 상층액을 분리하고 BCA assay Kit (Bio-rad, USA)를 사용하여 단백질을 정량하였다. \( 40 \mathrm{ug} \)의 단백질을 \( 9 \% \) SDS-PAGE에서 전기영동한 후 PVDF membrane으로 전이시켰다. Membrane의 비특이적인 반응은 \( 5 \% \) nonfat dry milk가 첨가된 TBS-T 용액으로 상온에서 1시간 동안 반응시켜 제거하였다. VEGF-A (\( 1: 1,000 \), Cell signaling, USA)와 Beta-actin (1: 1,000, Sigma, USA)의 일차 항체를 \( 5 \% \) skim milk가 첨가된 TBS-T 용액에 희석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 18시간 동안 반응시켰고, 이차 항체는 HRP가 부착된 rabbit-antimouse IgG (Calbiochem, USA)를 이용하였다. 반응의 확인은 ECL detection system (Thermo, USA)을 이용하여 분석하였다.</p> <h2>자료처리</h2> <p>본 실험의 연구결과는 SPSS 통계 프로그램을 이용하여 기술통계량을 산출하고, 혈압, 모세혈관 밀도 및 VEGF 단백 발현량의 변화에 대한 검증은 일원변량분석(one-way ANOVA)을 이용하였으며, 사후검증은 Duncan을 이용하였다. 통계적 유의수준은 0.05이다.</p>