본 연구에서는 EH(유전자 재조합)의 촉매적 특성을 분석하였고, 제조용 광학활성 생촉매로서의 이용 가능성을 확인하였다. EH(epoxide hydrolase) 발현 백터를 얻기 위해, 형질 전환을 시킨 후 암피실린이 함유된 LB plate에서 positive colony를 선별하였다.
<p>본 연구에서는 codon usage를 고려하여 다양한 방향족 에폭사이드 기질에 대한 입체선택적 가수분해능이 우수한 \( R \). glutinis EH를 고효율로 발현시키기 위하여 E. coli rare codons에 대한 tRNA 유전자를 가지는 숙주세포인 E. coli Rosetta(DE3)pLysS 균주를 사용하였으며 유전자 재조합 EH의 촉매적 특성을 분석하고, 광학활성 styrene oxide 제조용 생촉매로써의 가능성을 평가하였다.</p> <h1>실험 및 방법</h1> <h2>균주 및 DNA 조작</h2> <p>R. glutinis ATCC 201718의 epoxide hydrolase (EH) 유전자를 cloning 하기 위하여 \( \mathrm { DH } 5 \mathrm { a } \) 를 사용하였고 발현용 숙주세포로는 E. coli Rosetta(DE3)pLysS (Novagen, USA)를 사용하였다. 세포로부터 plasmid DNA를 정제할 때는 Qiagen사(Hilden, Germany) 제품인 Qiagen Miniprep Kit를 사용하였고 PCR 산물 또는 agarose gel로부터 DNA를 정제할 때는 Qiagen사의 Qiagen PCR Purification Kit 및 Qiaquick Gel Extraction Kit 등을 사용하였다.</p> <h2>R. glutinis \( \mathrm { EH } \) 발현벡터 제작</h2> <p>R. glutinis의 EH 유전자를 E. coli에 발현시키기 위하여 P.pastoris에 발현시킬 때 사용하였던 plasmid DNA (pGEM-T /RgEH Y2)를 template로 사용하였다. Forward primer (5RgEH-EcoRI)로 \( 5 ^ {\prime } \)-tcgaattcgatggcgacacacacattcgct - \( 3 ^ {\prime } \)를, reverse primer (3RgEH-XhoI-no stop)로 \( 5 ^ {\prime } \)-tcctcgagcttctcc-cacatgacgccaa - \( 3 ^ {\prime } \) 를 사용하였다. 먼저 PCR로 얻은 EH 유전자를 Promega사(Wisconsin, USA)의 pGEM-T easy vector에 삽입시킨 다음 E. coli \( \mathrm { DH } 5 a \) competent cell에 형질전환 시켜 X -gal \( (80 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) ), IPTG (final conc. \( 0.5 \mathrm { mM } \) ) 및 ampicillin \( (50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 이 함유된 LB plate에서 positive colony를 선별하였다. 제한효소를 이용하여 R. glutinis의 EH 유전자가 올바르게 삽입되었다고 판단되는 plasmid DNA의 유전자서열을 DNA sequencing을 통해 확인하였다. 확인된 pGEM-T/RgEH plasmid DNA를 E. coli expression vector인 pET21b ( \( + ) \) vector에 삽입시키기 위하여 E.coRi 및 XhoⅠ으로 가수분해하고 \( 0.8 \% \) agarose 전기영동을 행한 후 약 \( 1230 \mathrm { bp } \) DNA 조각을 gel로부터 추출하여 pET-21 b \( ( + ) \) vector에 삽입시켰다. 삽입된 pET-21 b \( ( + ) \)/ RgEH plasmid DNA 를 DH5a competent cell에 형질전환시킨 다음 ampicillin \( (50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 이 함유된 LB plate에 배양하여 positive colony를 선별하였다. 단백질을 발현시키기 위하여 정제한 pET-21 b \( ( + ) \) /RgEH plasmid DNA 약 \( 0.1 \mu \mathrm { g } \) 을 Rosetta competent cell \( 50 \mu \mathrm { l } \) 에 전기충격법을 이용하여 형질전환시킨 후 ampicillin \( (50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 과chloramphenicol \( (34 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 이 함께 함유된 LB plate에 16시간동안 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양하여 positive colony를 얻었다.</p>