BAEC (bovine aortic endothelial cell) 은 소 대동맥 내피세포로 세포 외 기질에 부착하여 자라나는 세포이다. 전면 성장한 BAEC에 다양한 농도의 alliin을 일정한 시간 동안 처리 후 혈청기아 배지에서 다시 일정 시간을 배양한 뒤 완충액으로 분해하였다. THP-1을 24시간 동안 배양하고 난 후, 혈청기아 배지로 12시간을 배양하고, alliin을 각 농도 별로 처리하여 시간별로 응집 현상을 현미경으로 관찰한다. 정량 분석 후 RNA를 주형으로 사용하는 동시에 역전사효소(M-MLV reverse transcriptase, Promega, USA)를 이용하여 cDNA 합성의 과정을 거친다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>Alliin은 Sigma-Aldrich (USA)사에서 제공하는 시약을 구입하여 증류수에 녹여 사용하였다.</p><h2>세포배양</h2><p>소 대동맥 내피세포인 BAEC (bovine aortic endothelial cell)은 세포 외 기질에 부착하여 자라는 세포(adhesion cell)로, 소의 대동맥에서 추출한 후 계대 수 3에서 8 사이의 일차세포를 실험에 사용하였다. BAEC은 \(20\%\) 소태아혈청(fetal bovine serum, Wel GENE Inc., Korea)과 \(0.5\%\) 항생제(streptomycin/penicillin)가 포함된 DMEM (glucose \(1\mathrm{g}/\mathrm{liter}\) Wel GENE Inc.)를 이용하여 \(37\mathrm{^\circ C}\), \(5\%\)\( \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 배양하였다. THP-1은 부유세포(suspension cell)로 T-플라스크에 배양하였으며, \(10\%\) 소태아혈청과 \(0.5\%\) 항생제(streptomycin/penicillin)가 첨가된 RPMI1640 (Wel GENE Inc.)를 이용하여 \(37\mathrm{^\circ C}\), \(5\%\) \( \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 배양하였다.</p><h2>세포성장 실험</h2><p>세포성장은 \( \left[{ }^{3} \mathrm{H}\right] \)-Thymidine 편입 정도를 측정하여 평가하였다. \(0.5\%\) 소태아혈청이 첨가된 DMEM에 BAEC을 24시간 동안 배양한 후, 다양한 농도의 alliin을 24시간 처리한 뒤, \( \left[{ }^{3} \mathrm{H}\right] \)-Thymidine(\(3.3\sim 4.8\)\(\mathrm{TBq}/\mathrm{mM} \))을 1시간 동안 전처리 하였다. 그 후 \(5\%\) trichloroacetic acid (TCA)로 세척한 후, 세포를 \(0.2 \mathrm{N}\) \( \mathrm{NaOH} \), \(2\%\) SDS (sodium dodecyl sulfate)로 분해하여 얻은 분해액을 액체섬광계수기를 이용하여 방사능을 측정하였다. 세포 분해액의 단백질량은 Lowry 분석법으로 정량하여 세포 수의 변이를 보정하였다.</p><h2>세포사멸 실험</h2><p>전면 성장한 BAEC을 \(16\sim18\) 시간 동안 혈청기아시킨 후 다양한 농도의 alliin을 처리하였다. 처리는 0, 2, 4, 8, 16, 24 시간 동안 처리하였고, 시간 경과에 따른 변화를 현미경을 이용해 사진 촬영하여 기록했으며, 세포사멸 세포(둥글고 부유 상태에 있는 세포)를 계산하여 세포사멸 비율을 결정하였다.</p><h2>Western Blot</h2><p>전면 성장한 BAEC에 다양한 농도의 alliin을 20시간 처리한 후 혈청기아 배지에서 20시간 배양한 뒤 분해 완충액(\(50 \mathrm{mM}\) Tris, \(150 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{NaCl} \), \(1\%\) NP-40, 0.5\(\%\) Sodium deoxycholate, \(0.1\%\) SDS, \(\mathrm{pH}7.5\))으로 분해하였다. 그 후 원심분리를 통해 상층액을 획득하여, 세포 분해액으로 사용하였다. 각 실험조건에서 얻은 세포분해액은 단백질량을 측정하여 동일한 양의 총 단백질을 포함하는 일정량의 세포 분해액 내의 단백질들을 SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 분리시켰다. SDS-PAGE의 단백질은 PVDF (polyvinylidene fluoride)막으로 이동시켜 고정하고 분석하고자 하는 표적 단백질에 해당하는 1차 항체와 반응 후, 2차 항체를 반응시킨 뒤, 화학발광 검출법을 통해 X-선 필름에 현상한 후 western 결과를 관찰하였다.</p><h2>세포부착 실험</h2><p>전면 성장시킨 BAEC을 혈청기아배지를 이용하여 16 시간 동안 추가로 배양했다. 또한 THP-1 세포를 배양한 후 \(10 \mathrm{\mu M}\)의 Calcein AM (Sigma, USA)을 \(37\mathrm{^\circ C}\), 5\(\%\)\( \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 45 분간 반응시키고, PBS (phosphate buffered saline)를 이용하여 3회 세척하였다. Calcein AM으로 염색시킨 THP-1을 BAEC이 부착된 기판 위에 동량으로 첨가하여 부착된 THP-1 세포를 형광 현미경으로 관찰하였다. 부착된 세포와 전체 세포의 비율을 계산하여 정량화 하였다.</p><h2>세포이동 실험</h2><p>전면 성장한 BAEC에 \( 2 \mathrm{mM} \) Thymidine (Sigma-Aldrich)를 24 시간 동안 처리하여 세포의 성장을 중지시킨 후 PBS로 2회 세척하였다. 그 후 스크래퍼 찰과기(scraper)를 이용하여 창상선을 만든 후 다시 PBS로 2회 세척하고 다양한 농도의 alliin을 처리하였다. 세포이동 정도는 일정한 시면적에 이동한 세포 수를 세어 이동한 세포수의 비율을 계산하여 평가하였다.</p><h2>THP-1 응집 측정</h2><p>THP-1을 24시간 동안 배양한 후, 혈청기아 배지로 12시간 배양한 후에 alliin을 각 농도 별로 처리하여 8 시간까지 시간별로 진행되는 응집 현상을 현미경으로 관찰하였다.</p><h2>산화질소(NO) 측정</h2><p>\(35 \mathrm{mm}\) 배양접시에 분주된 BAEC을 24 시간 동안 \(37\mathrm{^\circ C}\), \(5\%\)\( \mathrm{CO}_{2} \) 조건으로 배양한 후 혈청기아 배지로 16 시간 동안 배양하였다. HEPES 완충액(\(140 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl} \),\(5 \mathrm{mM}\) KCl, \(2 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{CaCl}_{2} \), \(5 \mathrm{mM}\) glucose, \(5 \mathrm{mM}\) HEPES, \(1 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{MgCl}_{2} \), \(\mathrm{pH} 7.4\))으로 2회 세척하여 치환한 HEPES 완충액에 alliin을 농도 별로 처리하였다. 그 후 세포를 수확하여 초음파파쇄로 분해한 후 세포 분해액을 \(13,000 \mathrm{rpm}\)으로 10 분간 원심분리를 하여 상층액을 분획하였다. 산화질소를 측정하기 위해 상층액과 \(100 \mathrm{nM}\)의 DAF-2 (diaminofluoresceins)를 15 분간 상온에서 반응시킨 후 형광분석계(Spectrofluorophotometer RF-5301 PC, SHIMADZU, Japan)를 이용하여 형광스펙트럼(Ex: \(495 \mathrm{nm}\), Em: \(515 \mathrm{nm}\))을 측정하여 분석하였다.</p><h2>RT-PCR</h2><p>정량 분석 후 \(2 \mathrm{\mu g}\)의 RNA를 주형으로 사용하면서 역전사효소(M-MLV reverse transcriptase, Promega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이렇게 합성된 cDNA를 다시 주형으로 하여 PCR로 ECE-1 (endothelin converting enzyme-1)과 eNOS (endothelial nitric oxide synthase)의 전사체를 확인하였다. ECE-1와 eNOS 프라이머의 붙임온도는 \(60\mathrm{^\circ C}\)로 동일하게 하였으며 대조군으로 사용된 GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 역시 \(60\mathrm{^\circ C}\)로 동일하게 하였고, 28 주기를 실시한 후, PCR 생산물을 \(1.5\%\) 한천 겔 전기영동으로 확인하였다. 실험에 사용된 프라이머는 아래와 같다.</p>