단백질분해효소인 Kiwifruit에서 얻은 조효소액으로 전기영동을 실시한 후 gelatin 분해정도를 통해 최적 pH와 저해제 및 금속이온의 영향을 조사하고, 열안정성을 조사하기 위해 다양한 온도에서 전기영동한다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>본 실험에서는 중국에서 수집한 야생종 kiwifruit(Actinidia chinensis)의 과실을 제주농업시험장으로부터 공급받아 사용하였다.</p> <h2>조효소액의 추출</h2> <p>Kiwifruit 과실의 껍질을 제거하고 과육 \( 1 \mathrm{~g} \) 당 \( 10 \mathrm{m \ell} \) 의 추출완충용액 \( (0.1 \quad \mathrm{M} \) Tris- \( \mathrm{HCl}, \mathrm{pH} \quad 8.0 ; 10 \mathrm{mM} \beta \) -mercaptoethanol, \( 2.5 \mu \mathrm{M} \) polyvinylpyrrolidone, \( 5 \mathrm{mM} \)ascorbic acid)을 넣어 호모게나이저(Miccra D-8, Artlab, 독일)를 사용하여 \( 19,000 \mathrm{rpm} \) 으로 마쇄하였다 마쇄액을 4겹의 cheesecloth로 여과한 후, 여과액을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 15,000 \times g \)로 30 분간 원심분리하고 그 상징액을 조효소액으로 사용하였다.</p> <h2>단백질분해효소의 전기영동분석</h2> <p>전기영동분석은 Heussen과 Dowdle의 방법을 변형한 \( \mathrm{Oh} \) 등의 방법으로 gelatin의 분해 여부를 통하여 분석하였다. 즉, 조효소액을 시료용 완충용액 (0.125 M Tris-\( \mathrm{HCl}, \mathrm{pH} 6.8 ; 0.005 \% \) bromophenol blue, \( 40 \% \) glycerol, \( 5 \% \) \( \beta \)-mercaptoethanol)과 동량 혼합하여 0.1\% gelatin을 함유하는 \( 12.5 \% \) SDS-polyacrylamide gel 위에 넣어 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후, 겔은 \( 1 \% \) Triton X-100을 함유하는 \( 25 \mathrm{mM} \) sodium citrate 완충용액 pH4.0으로 10 분간 세척하여 SDS를 제거하고, 다시 \( 25 \mathrm{mM} \) sodium citrate 완충용액 pH 4.0으로 10 분 동안 세척하여 Triton X-100을 제거하였다. Triton \( X-100 \) 이 제거된 겔은 \( 50 \mathrm{mM} \) sodium citrate 완충용액 \( (\mathrm{pH} \) 4.0; \( 10 \mathrm{mM} \ \mathrm{CaCl_{2}}) \) 에서 100 분 동안\( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 정치하여 반응시켰다. 반응시킨 겔은 \( 0.025 \% \)Coomassie brilliant blue R-250용액으로 염색하여 gelatin의 분해 여부와 그 양상을 관찰하였다. 단백질분해효소 활성을 정량화하기 위해서는 염색이 끝난 겔을 densitometer로 scanning하여 분석하였다. 그리고, 단백질분해효소의 casein분해 활성을 알아보기위해서 gelatin을 같은 농도의 casein으로 대치하여 조사하였다.</p> <h2>최적 pH</h2> <p>단백질분해효소의 최적 pH 는 전기영동이 끝난 겔을 pH \( 1.0 \sim 10.0 \) 의 완충용액 \( \left(10 \mathrm{mM} \mathrm{CaCl_{2}}\right. \) 포함)에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 100 분 동안 반응시켜 gelatin의 분해정도를 조사하였다. 완충용액은 \( 50 \mathrm{mM} \) 의 용액을 사용하였으며 \( \mathrm{pH} \) 에 따라 potassium chloride- \( \mathrm{HCl} \) (pH1.0), glycine- \( \mathrm{HCl}\)(pH 2.0),sodium citrate (pH 3.0 ~ 4.0), sodium acetate (pH 5.0 ~6.0), Tris- \( \mathrm{HCl}\)(pH 7.0 ~ 9.0) 과 sodium carbonate (pH10.0)를 사용하였다.</p> <h2>저해제의 영향</h2> <p>저해제의 영향은 전기영동이 끝난 겔을 저해제가 포함된 \( 50 \mathrm{mM} \) sodium citrate 완충용액(pH4.0; \( 10 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{CaCl}_{2} \) )에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 100 분 동안 반응시켜 gelatin의 분해정도를 조사하였다. 단백질분해효소 저해제로는 metalloproteinase 저해제로 \( 5 \mathrm{mM} \) ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)와 \( 0.1 \mathrm{mM} \) 1,10-phenanthroline을, serine proteinase 저해제로 \( 1 \mathrm{mM} \) phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)와 \( 0.1 \mathrm{mM} \) 3,4-dichloroisocumarin (DCl)을, aspartic proteinase 저해제로 \( 10 \mu \mathrm{M} \) pepstatin \( \mathrm{A} \) 를, cysteine proteinase의 저해제로 \( 20 \mu \mathrm{M} \) trans-epoxysuccinyl-L- leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)과 \( 10 \mathrm{mM} \) iodoacetate 등을 사용하였다. 그리고, cysteine proteinase의 촉진제로 서 \( 1 \mathrm{mM} \) DTT와 cysteine, \( 5 \mathrm{mM} \ \beta \)-mercaptoethanol의 영향도 조사하였다.</p> <h2>금속이온의 영향</h2> <p>금속이온의 영향은 전기영동이 끝난 겔을 \( 10 \mathrm{mM} \) 의 양이온을 함유하는 \( 50 \mathrm{mM} \) sodium citrate 완충용액 pH4.0)에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 100 분 동안 반응시켜 gelatin의 분해정도를 조사하였다. 2가 양이온으로는 \( \mathrm{Mg}^{2+}, \mathrm{Ca}^{2+}, \mathrm{Mn}^{2+} \),\( \mathrm{Co}^{2+}, \mathrm{Cu}^{2+}, \mathrm{Zn}^{2+}, \mathrm{Hg}^{2+} \) 등을, 3가 양이온으로는 \( \mathrm{Al}^{3+}, \mathrm{Fe}^{3+} \)등을 사용하였고, 대조구는 양이온 대신에 증류수를 넣어 조사하였다.</p> <h2>열안정성</h2> <p>단백질분해효소의 열안정성은 조효소액을 \( 15 \sim 60^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 다양한 온도에서 1 시간 동안 정치한 후 전기영동하여 gelatin분해정도를 비교하였다. 그리고, 열안정성이 높은 단백질분해효소를 대상으로 다양한 온도에서 48 시간 동안 정치하여 같은 방법으로 안정성을 조사하였다. 대조구는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관중인 조효소액을 사용하였다.</p>