2003년 Leuschner 등이 실시한 검증실험에 따르면, cysteine hydrochloride를 첨가한 MRS 한천배지에 vancomycin, novobiocin, nystatin을 각각 \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } , 0.1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \), \( 50 \mathrm { U } / \mathrm { mL } \)로 첩가한 Pediococci selectiv media는 CEN과 ISO 표준 시험법의 채택을 위해 유효하고 효율적인 방법임이 확인되었다. 김치에 다수로 존재하는 lactococci, lactobacilli, enterococci, streptococci 외에도 leuconostocs의 존재를 간과할 수 없고, 생육을 저해할 수 없는 것으로 추정되었고 pediococci의 선발이 불가능한 것으로 나타났다. 생육한 균주를 개상으로 2차 선발을 거쳐 leuconostocs를 제외하기 위해 선발배지를 조사한 결과, PES, LUSM, NLS 배지가 유용한 것으로 보고 되었고 본 연구에서 실지한 배지평가에 따르면 기존의 보고와는 달리 생육저해가 발생하지 않았다. 김치와 같은 반효침채류에 존재하는 Pediococcus 속은 검출하기 부적합한 것으로 나타났고, \( \mathrm { PSM } + \mathrm { A } \) 한천배지에서 생장한 \( Lb \) curvatus와 같은 일부 Lactobacillus 속의 혼입이 예상된다.
<h2>Pediococci 선발배지의 유효성 검증</h2> <p>Comitée Européan de Normalisation(CEN)과 Interna-tional Organization for Standardization(ISO) 표준 시험법의 채택을 위하여 2003년 Leuschner 등이 수행한 probiotic pediococci 계수법의 검증실험에 따르면, \( 0.05 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) cysteine hydrochloride를 첨가한 MRS 한천배지에 항생물진 vanco-mycin과 novobiocin, nystatin을 각각 \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } , 0.1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \), \( 50 \mathrm { U } / \mathrm { mL } \)가 되도록 첩가한 pediococci selective medium \( ( \mathrm { PSM } ) \)은 첨가되는 novobiocin과 vancomycin에 의하여 다수의 bacilli, enterococci, lactobacilli, streptococci를 저해할뿐만 아니라 lactococci, propionibacteria, bifidobacteria와 yeast 생장을 저해하지만 pediococci 저해하지 않아 동물사료나 사일리지 첨가제의 제조에 첨가된 pediococci의 선택적 계수에 적합하고, pediococci의 수가 \( 10 \% \)이하로 존재하는 경우에도 적용 가능한 것으로 보고되었다. 그러나 novo-biocin과 vancomycin은 \( L \). plantarum을 저해하지 못한다는 보고에 따라 Simpson 등이 몇몇의 lactobacilli를 대상으로 \( \mathrm { PSM } \)의 선택성을 검증해 본 결과 \( Lb \). plantarum 뿐만 아니라 \( Lb \). casei도 저해하지 못하는 것으로 판명되었다. 따라서 \( 1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \)의 \( \operatorname { ampicillin } ( \mathrm { A } ) \)을 첨가한 \( \mathrm { PSM } + \mathrm { A } \)를 제조 하여 pediococci에 대한 선택베지의 효용성이 증가한 것을 확인하였다. 한편, 본 연구는 김치로부터의 pediococci 검출은 목표로 하고 있어, 김치에 다수로 존재하는 lactococci, lactobacilli, enterococci, streptococci 외에도 leuconostocs의 존재를 간과 할 수 없다. Leuconostoc 속에 대한 \( \mathrm { PSM } \)의 선택성 검토를 위하여 leuconostocs의 항생물질 저항성을 조사한 결과,vancomycin 및 novobiocin에 대한 MIC(minimal inhibition concentration)가 각각 \( 500 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 및 \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 이상으로 보고되어 \( \mathrm { PSM } \)에 첨가하는 두 항생물질의 양으로는 leu-conostocs의 생육을 저해할 수 없는 것으로 추정되었다. 그러나 본 연구자들의 조사에 따르면 \( \mathrm { PSM } + \mathrm { A } \)가 발표된 이후 새로운 pediococci 선발배지에 대해 보기된 예가 없어, 현 시점에서 \( \mathrm { PSM } + \mathrm { A } \)의 사용만으로는 pediococci의 선발이 불가능한 것으로 나타났다. \( \mathrm { PSM } + \mathrm { A } \)에서 생육한 균주를 대상으로 2차 선발을 거쳐 leuconostocs를 제외하기 위하여 leuconostocs 선발배지를 조사한 결과, PES(phenylethanol sucrose) 배지, LUSM (leu-conostocs selective medium), NLS(novobiocin leuconostocs selective) 배지가 유용한 것으로 보고되었다. Vancomycin을 \( 30 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 첨가하는 LUSM을 2차 선발에 사용하면 pediococci는 leuconostocs와 거의 동일한 vancomycin 내성을 가지고 있어 두 균의 구분이 쉅지 않을 것으로 예상된다. \( 2,000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 이상의 vancomycin \( \mathrm { MIC } \)를 나타내는 \( Lb \). plantarum과 \( L \). brevis를 \( 5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 의 novobiocin의 첨가로 억제할 수 있는 NLS 배지는 발효침채류 유래 leuconostocs의 선발에 유용한 것으로 보고되었지만, \( \mathrm { PSM } + \mathrm { A } \)에 비해 50배 높은 농도의 novobiocin을 첨가하기 때문에 pediococci의 생육저해를 초래할 가능성을 가지고 있다. 한편 leuconostocs는 sucrose 존재 시 dextransucrase를 분비하여 점질의 dextran을 생성하는 특징을 지니고 있어 sucrose가 첨가된 \( \mathrm { PSM } \) 배지를 이용한다면 점질불질을 생성하는 leuconostocs를 쉽게 제외할 수 있을 것으로 추정하여, leuconostocs의 제거를 위한 2차 선별배지로 phenylethanol 한천배지(Difco, USA)에 \( 2 \% \) sucrose를 첨가한 \( \mathrm { PSM } \) 한천배지를 선정하였다. \( \mathrm { PSM } + \Lambda \)와 \( \mathrm { PES } \) 한천배지를 이용하여 김치에 존재하는 pediococci의 존재를 확인하기로 하고, 두 배지의 유효성을 공시 균주를 이용하여 검토해 보았다. 본 실험에 사용한 공시 유산균은 Korean Collections for Type Cultures(KCTC), Korcan Culture Center for Microorganisms (KCCM), 한국식쑴연구원(KIrRI), ATCC the global bio-resource center로부터 구입하였고, Lactobacilli MRS 액체배지(Difco, USA) 또는 \( 1.5 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) 한천은 천가한 고체배지를 사용하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 미호기성 조건에서 배양한 나음, 선발배지에서의 생육을 검토하였다. 본 연구에서 실시한 배지평가에 따르면 기존에 보고된 \( \mathrm { PSM } + \Lambda \) 한천배지의 유효성 결과와는 달리 Pediococcus pentosaceus와 leuconostocs 외에도 \( Lb \). casei, \( Lb \). curvatus,Oenococcus oeni, Streptococcus thermophilus에 대한 생육저해가 발생하지 않았다. \( \mathrm { PES } \) 한천배지에서는 leuconostocs와 \( S \). thermophilus 가 생육하였지만, leuconostocs 만이 다당을 형성하여 \( \mathrm { PES } \) 배지의 leuconostocs 선발에 대한 유용성은 확인되었다. 따라서 \( \mathrm { PSM } + \mathrm { A } \)는 김치와 같은 반효침채류에 존재하는 Pediococcus 속을 선택적으로 검출하기에는 부적합한 것으로 나타났고, \( \mathrm { PES } \) 배지와 함께 사용하여 leu-conostocs를 선별하더라도 \( \mathrm { PSM } + \mathrm { A } \) 한천배지에서 생장한 \( Lb \). curvatus와 같은 일부 Lactobacillus 속의 혼입이 예상된다.</p>