혈전용해 효소 활성은 fibrin plate 방법을 개조하여 lysed zone을 이용해 측정하였으며, 플라즈민을 대조군으로 사용하였다. DPPH (\(\alpha \), \(\alpha^{\prime}\)-diphenyl-\( \beta \)-picrylhydrazyl) 용액은 100ml의 에탄올과 16mg의 DPPH를 섞은 뒤 100ml의 증류수를 혼합하여 만들었고, 이를 여과지로 여과하였다. 전자공여능은 시료 첨가군과 무첨가군의 흡광도 차를 백분율로 표현하였다. 또한, Tyrosinase 활성은 Masamoto 등의 방법을 변형하여 측정하였다.
<h2>혈전용해 효소 활성 측정</h2> <p>혈전용해 효소 활성은 fibrin plate 법을 변형하여 lysed zone으로 측정하였다. Fibrin plate는 \( 0.06 \% \) fibrinogen (Singma, St. Louis MO, USA)을 \( 0.2 \mathrm{M} \) borate buffer (\( \mathrm{pH} 7.5 \))에 용해시킨 후 petri dish에 \( 10 \mathrm{ml} \) 씩 분주하고 thrombin (\( 500 \mathrm{unit} \), Sigma, St. Louis MO USA) \( 40 \mathrm{unit} \)를 균일하게 섞이도록 가하면서 균일한 두께의 fibrin clot를 형성시킨 후 실온에서 30분간 방치한 후 사용하였다. 시료를 증류수에 \( 1 \% \) 농도로 용출시킨 후 여과(Whatman No. 2)하여 fibrin plate 상에 \( 50 \mu \mathrm{l}\)씩 점적하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 동안 반응시킨 후 생성된 투명환 부위의 직경을 측정하였다. 직경은 서로 수직인 두 개의 지름을 측정하였고, 투명대가 타원인 경우에는 가장 긴 지름과 가장 짧은 지름을 측정하여 투명대의 면적을 구하였다. 이때 대조구는 플라즈민을 시료와 동일한 농도로 용해시켜 사용하였다. 혈전용해 활성은 다음과 같은 식에 의해서 계산하였다.</p> <p>혈전용해활성 (\( \%\)) = 시료의 용해 영역 / 양성 대조구의 용해 영역 \( \times 100 \)</p> <h2>DPPH법에 의한 항산화 활성 측정</h2> <p>DPPH ( \(\alpha \), \(\alpha^{\prime}\)-diphenyl-\( \beta \)-picrylhydrazyl) 용액은 \( 100 \mathrm{ml} \)에탄올에 DPPH \( 16 \mathrm{mg} \)을 녹인 후 증류수 \( 100 \mathrm{ml} \)를 혼합하여 여과지(Whatman filter paper NO. 2)로 여과시켜 만들었다. DPPH 용액 \( 5 \mathrm{ml} \)에 일정 농도 \( (0.5 \%) \)의 시료용액 \( 1 \mathrm{ml} \)을 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 \( 528 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도의 감소를 측정하였다. 대조구인 시판항산화 BHT는 \( 0.05 \% \)로 첨가하여 상기와 동일한 방법으로 흡광도 감소를 측정하였다. DPPH를 이용한 전자공여능(electron donating ability; EDA)은 시료 첨가구와 무첨가구의 흡광도차를 백분율 (\( \% \))로 표시하였다.</p> <p>\( \operatorname{EDA}(\%)=\{1-(\mathrm{Abs} / \mathrm{Abc})\} \times 100 \)</p> <p>Abc: Absorbance of control treatment at \( 528 \mathrm{~nm} \)</p> <p>Abs: Absorbance of sample treatment at \( 528 \mathrm{~nm} \)</p> <h2>Tyrosinase 활성 측정방법</h2> <p>Tyrosinase 활성은 Masamoto 등의 실험 방법을 약간 변형하여 측정하였다. In vitro mushroom tyrosinase 활성 저해 능력을 측정하기 위하여 \( 1.5 \mathrm{ml} \) plastic cuvette에 \( 2.5 \mathrm{mM} \) 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) \( 0.3 \mathrm{ml} \), 시료 추출물 \( 0.05 \mathrm{ml} \) 및 \( 0.1 \mathrm{M} \) 인산완충용액 (\( \mathrm{pH}\ 6.8 \))을 혼합하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 preincubation 시켰다. 여기에 \( 1,380 \mathrm{units}/\mathrm{ml} \) mushroom ty-rosinase (2,500 \( \mathrm{unit} \), Sigma, St. Louis MO, USA) \( 0.05 \mathrm{ml} \)를 넣은 후 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분간 반응시키면서 \( 475 \mathrm{~nm} \) 흡광도를 측정하여 계산하였다. 대조구는 시료가 들어있지 않는 시료 용해 용액을 사용하였고, 양성대조구는 tyrosinase 저해제로 알려진 \( 0.5 \mathrm{M} \) acid를 사용하였다. 이때 tyrosinase 활성 저해율(\( \% \))은 다음의 공식에 의하여 산출하였다.</p> <p>Tyrosinase 활성 저해율 \( (\%)=100-[(\mathrm{A}-\mathrm{B}) / \mathrm{A}] \times 100 \)</p> <p>A는 시료가 들어있지 않은 반응액의 0.5~1분 사이의 흡광도 차이</p> <p>B는 시료가 들어있는 반응액의 0.5~1분 사이의 흡광도 차이</p> <h2>통계처리</h2> <p>실험으로부터 얻어진 결과치는 one-way ANOVA 검정에 의한 평균치와 표준오차 (mean\(\pm \)SE)로 표시하였으며, 각 실험군 간의 유의성 검증은 Duncan's multiple range test로 하였다.</p>