엽록체 flanking region이 포함된 pCR2.1-topo vector를 정제하고 PCR 반응을 진행한 후, 결정된 염기서열을 DNAStar 소프트웨어를 이용해 담배의 엽록체 게놈과 비교하였다. 또한, 국립원예특작과학원에서 분양받은 18계통의 토마토에 대해 재분화능을 비교하였고, 특히 계통번호 2001-58과 2001-159의 자엽에서 재분화율이 각각 \( 93 \% \) 와 \( 69 \% \)로 높게 나타났다.
<h2>토마토 엽록체 flanking region 염기서열 분석</h2> <p>토마토 엽록체 flanking region이 삽입된 pCR2.1-topo vec-tor를 정제한 후, dideoxynucleotide chain termination 방법 (ABI prism dye terminator) 으로 PCR 반응을 실시하였다. PCR primer는 M13 forward primer와 M13 reverse primer를 사용하였다. 염기서열은 automatic DNA sequencer (ABI9700)를 이용하였다. 결정된 염기서열은 DNAStar 소프트웨어 프로그뱀을 이용하여 담배 (Nicotiana tabacum) 엽록체 게놈과 비교분석하였다.</p> <h3>엽록체 형질전환을 위한 유전자총 조건</h3> <p>GFP가 들어있는 토마토 엽록체 형질전환 벡터인 pKRT22-AG를 이용하여 DNA 농도 \( (0.5, 1, 1.5 \mu \mathrm { g } / \) bombardment), \( 0.6 \mu \mathrm { m } ) gold particle \( (0.5, 1, 1.5, 2 \mathrm { mg } \) /bombardment) 및 target distance \( (6, 9, 12 \mathrm { cm } ) \)를 달리하여 엽록체 형질전환을 위한 적정 유전자총 조건을 구명하고자 하였다. Bombardment를 실시한 후 자엽을 재분화배지에 치상하여 암 상태에서 배양한 후 이틀 후에 원형질체를 나출하여 공초점현미경을 이용하여 GFP 발현 여부를 관찰하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>공시품종 선정 및 식물체 재분화</h2> <p>국립원예특작과학원에서 분양받은 18계통을 공시하여 자엽과 하배축에서의 재분화능을 조사한 결과 하배축에 비해 자엽에서의 재분화능이 좋았고, 특히 계통번호 2001-58과 2001-159의 자엽에서 재분화율이 각 각 \( 93 \% \) 와 \( 69 \% \) 로 양호하였다 (Table 1). 자엽에서 식물체로의 재분화 과정에서 보여 지는 갈변현상과 phenolic compound에 의한 식물조직의 괴사현상을 막기 위하여 항산화제인 ascorbic acid와 cystein을 단용 또는 혼용으로 첨가한 후 식물체 재분화에 미치는 영향을 살펴보았다 (Fig. 1). 줄기 형성율에 있어서 항산화제 첨가 시 줄기 형성율이 높아지는 것을 관찰할 수 있었으며, 전체 처리구 중 ascorbic acid 단용 처리구에서 효과가 좋았으며, 특히 ascorbic acid 200~300 \( \mu \mathrm { M } / \mathrm { L } \) 처리구에서 줄기형성율이 \(72~74 \% \) 로 양호하였다. Ascorbic acid가 첨가되어진 배지에서의 식물체 재분화 특성은 대조구에 비해 생체중이 증가되는 현상을 나타내었으며, 자엽 절편당 형성되는 줄기수는 대조구와 비슷한 경향치를 보였고, 줄기신장 속도는 대조구에 비해 다소 빨라짐을 알 수 있었다 (Table 2). Cystein 첨가시 보여지는 재분화 특성 중 가장 두드려진 현상은 다른 처리구에 비해 줄기신장속도가 빨라서 대조구에 비해 cystein이 첨가된 단용 또는 혼용처리구 모두에서 줄기길이가 길어짐을 볼 수 있었으며, 생체중과 자엽 절편당 형성되는 줄기수에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 보여 진다. 또한 대조구의 경우 배양 2주가 지나면서 갈변현상이 나타나는 것과 달리 항산화제 첨가 배지에서는 녹색의 캘러스가 배양 4주까지 유지되는 것으로 보아 형질전환 시 식물체 조직에 가해지는 상처부위의 활성산소의 산화력을 감소시키는 데 항산화제가 효과가 있다고 사료되었다. 실질적으로 토마토 형질전환 시 항산화제인 티아민을 첨가하였을 때 형질전환효율이 높아졌다는 보고가 있으며 (Cortina and Culianez-Macia 2004), 항산화제인 tri-potassium citrate를 C. pendulum의 자엽에 처리하였을 때 캘러스의 necrosis 현상이 감소되고 체세포배 형성이 증가되었다는 (Anthony et al. 2004) 실험결과가 보고된 바 있다.</p>