B. subtilis 형질전환체를 발현 숙주로 사용한 경우는 목적 단백질과 함께 분비되는 단백질의 양과 종류가 훨씬 적어 효소시료의 제조가 용의하며 배양액의 투석 및 농축과정만으로 순수한 단백질 band를 얻을 수 있다. 본 연구결과로 생산된 한천분해산물은 식품산업 등의 천연 항균제로서의 이용가능성이 있다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>발현숙주에 따른 발현양상 비교</h2> <p>발현숙주로 사용된 B. subtilis 168, DB104, ISW1214의 3가지 균주에서 배양시간별로 보이는 \( \beta \)-agarase 발현량을 Fig. 1에 나타냈다. B. subtilis 형질전환체가 생산하는 \( \beta \)-agarase의 분자량은 \( 109 \mathrm{kDa} \) 으로 대장균에서 생산된 것과 동일한 것으로 나타났다. 168 균주는 배양 9시간 후에 재조합효소가 관찰되었으며 DB104와 ISW1214 균주는 배양 7시간 후부터 재조합효소가 관찰되었다. ISW1214 균주에서 배양 9 시간에 최대발현량을 나타냈으므로 발현숙주로 B. subtilis ISW1214 균주를 선택하였다. E. coli BL21(DE3)를 발현숙주로 사용한 경우는 분비생산이 되지 않아 세포내에 생산된 많은 종류의 단백질들로부터 정제과정을 거쳐 목적 단백질을 분리해내야 하는데 반해, B. subtilis를 발현숙주로 사용한 경우는 목적 단백질과 함께 분비되는 단백질의 양과 종류가 훨씬 적어 효소시료의 제조가 용의할 것으로 기대된다.</p> <p>B. subtilis ISW1214를 발현숙주로 사용하여 1 Ⅰ의 배지에서 9시간 배양한 후, 재조합 \( \beta \)-agarase를 포함하는 배지를 20 \( \mathrm{mM} \) Tris-HCl \((\mathrm{pH} 7.4)\) buffer로 투석하고 농축하여 얻은 효소시료를 SDS-PAGE에서 확인하였다. 그 결과, 배양액의 투석 및 농축과정만으로도 \( 109 \mathrm{kDa} \) 의 \( \beta \)-agarase에 해당하는 순수한 단백질 band를 얻을 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다. 이 조건에서 생산된 총 단백질량은 \( 360 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \), 총 효소활성은 \( 52,460 \mathrm{U} / \mathrm{l} \), 비활성은 \( 201 \mathrm{U} / \mathrm{mg} \) 이었다. 본 연구와 동일한 \( \beta \)-agarase를 E. coli BL21(DE3)에서 생산한 경우와 비교하면 총 효소활성은 약 90 배, 비활성은 약 100 배 증가한 것으로 나타났다. Ohta 등은 Agarivarans sp. JAMB-A11 유래의 \( \beta \)-agarase 유전자를 B. subtilis 균주에서 발현시켜 총 단백질 \( 1,662 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 를 생산하였지만 비활성은 \( 0.8 \mathrm{U} / \mathrm{mg} \) 로 나타났다. 이 결과들을 비교해보면 총 효소활성은 Ohta 등의 연구결과에서 더 높게 나타났지만, 비활성의 경우는 본 연구결과에서 더 높게 나타났으므로 추후 대량 생산 공정개발을 위한 조건 확립에 참고가 될 수 있는 결과라 하겠다. B. subtilis 균주를 이용한 재조합효소의 장점은 외분비형으로 세포파괴 없이 다량의 효소를 생산할 수 있다는 것과 재조합 산물의 안전성을 들 수 있다. Ohta 등은 Agarivorans 속의 생물위해성에 대한 평가가 완전하지 않으므로 B. subtilis 균주를 이용한 \( \beta \)-agarase의 생산이 안전하고 효율적이라고 보고하였다.</p> <h2>한천분해산물의 생산</h2> <p>재조합 \( \beta \)-agarase로 한천(agar)을 분해하여 얻어진 분해산물인 neoagarooligosaccharides를 TLC로 분석한 결과를 Fig.3 에 나타냈다. 재조합 \( \beta \)-agarase로 한천을 분해한 결과, neo-agarobiose, neoagarotetraose 및 neoagarohexaose 등을 포함하는 neoagarooligosaccharides를 생산할 수 있었다. 일반적으로 \( \beta \)-agarase는 agarose를 가수분해하여 neo-agarobiose, neoagarotetraose, neoagarohexaose 등의 neo-agarooligosaccharide를 생산하는 것으로 보고되었다. 한천은 agarose와 agaropectin으로 구성되어 있어 \( \beta \)-agarase가 agaropectin을 분해할 수 없는 한계점이 있어 한천을 기질로 사용하면 기능성을 가진 순수한 neoagarooligosaccharides 만을 생산하기 어려운 단점이 있을 수 있지만, 본 연구에서는 고가의 agarose 대신 저가의 한천을 기질로 사용하여 기능성 소재의 생산을 시도하였음으로 산업적 의의가 있는 결과로 판단된다.</p> <h2>한천분해산물의 항균능</h2> <p>한천분해산물의 첨가에 따른 B. subtilis 168 과 E. coli DH5\(\alpha\)의 성장저해 양상을 Fig. 4에 나타냈다. 두 균주 모두 \( 1.5 \% \) 의 농도에서 성장이 억제되는 것을 관찰할 수 있었으며, 항균효과는 그람 음성균인 E. coli ( \( \mathrm{IC}_{50} \) : \( >1.5 \% \) ) 보다 그람 양성균인 B. subtilis ( \( \left.\mathrm{IC}_{50}: 1.5 \%\right) \) 에 대해 더 크게 나타났다. 이러한 결과로, 본 연구결과로 생산된 한천분해산물은 식품산업 등의 천연 항균제로서의 이용가능성이 있을 것으로 기대된다.</p>