해양에서 해조류의 난소화성 복합다당류를 분해하는 균주 SC092를 기장 해안의 해수에서 분리하였다. 이를 위해 marine broth (MB, Difco) 배지에 배양하였고, 16S rDNA sequence를 이용하여 동정하였다. 이 균주를 사용하여 조효소 생산을 진행하였으며, 그 과정에서 포화시킨 ammonium sulfate를 이용해 침전을 시켰다. 침전물은 원심분리 후 TE buffer에 녹여 투석하였다.
<h2>균주의 분리 및 동정</h2> <p>해양으로부터 해조류의 난소화성 복합다당류를 분해하는 균주를 분리하기 위해 기장 해안의 해수를 시료로 하여 \( 1.5 \% \) agar가 포함된 marine broth (MB, Difco) 배지에 배양하였다. 배양 후, agar plate 표면에 colony를 중심으로 움푹 파이거나 clear zone 형성하는 것을 선정하였으며, 순수 분리한 이 균주를 SC092로 명명하고 16S rDNA sequence를 이용하여 동정 후 RDF program (http://rdp.cme.msu.edu)을 통해 종의 유사성이 매우 가까운 것으로 분석하였다. 165 rDNA sequencing을 위해 사용된 프라이머는 F: 5 \( ^ {\prime } \)-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 \( ^ {\prime } \) 였고 R: 5 \( ^ {\prime } \)-AAGGAGGTGWTCCARCC-3 \( ^ {\prime } \) 였다.</p> <h2>균주의 조효소 조제</h2> <p>조효소 생산은 SC092균주를 최적 조건으로 전배양한 다음, \( 0.3 \% \) agar가 포함된 MB배지 \( 250 \mathrm { ml } \) 에 \( 0.1 \% \) 로 첨가한 후 3 \( 7 ^ {\circ } \mathrm { C } , 72 \) 시간 진탕배양 200rpm하였다. 배양액을 \( 6,000 \times g \) 에서 30 분 동안 원심분리하여 균체를 제거하고 상등액을 조효소액으로 하였다. 조효소액은 \( 30 \% \) ammonium sulfate로 포화시킨 후 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 시간 침전하였다. 침전물은 \( 8,000 \times g \) 에서 30 분 동안 원심분리한 후 상등액을 다시 \( 70 \% \) ammonium sul-fate로 포화시켜 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 시간 침전한 다음 \( 10,000 \times g \) 에서 30 분 동안 원심분리한 다음 침전물을 TE buffer \( (25 \mathrm { mM } \) Tris-HCl, \( 1 \mathrm { mM } \) EDTA, \( \mathrm { pH } \) 8.0)에 녹인 후 투석하였다(cut-off value, \( 12,000-14,000 \mathrm { MW } ) \). 조효소의 함랑은 Bradford의 방법에 따라 \( 595 \mathrm { ~nm } \) 에서 홉광도를 측정하였으며, 표준단백질로 BSA (Bovine Serum Albumin)를 사용하였다.</p> <h2>조효소 활성 측정</h2> <p>조효소 활성 측정은 TE buffer에 \( 1 \% \) Bacto-Agar를 첨가하여 조효소 작용에 의해 생성된 galactose 환원당을 DNS (3,5-Dinitrosalicylic acid) 법에 따라 측정하였다. 효소반응은 기질용액 \( 1 \mathrm { ml } \) 에 조효소액 \( 0.5 \mathrm { ml } \) 을 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 시간 동안 반응 시킨 후, 분광광도계를 이용하여 \( 550 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 활성도는 1 분간 \( 1 \mathrm {\mu mol } \) 의 galactose를 생산해 내는 효소의 양을 1 unit으로 정의하였으며, 표준곡선은 galactose를 사용하여 작성하였다.</p>