2015년 제조된 한국 전통 후발효차인 알가차와 단차, 2015년 제조된 중국 보이차 중 \( \mathrm { O } \)사의 후발효차(보이차 1)와 \( \mathrm { T } \)사의 후발효차(보이차 2)를 각각 분석했다. 이 것들을 시료로 사용해 미생물 다양성을 확인하기 위해서 \( \mathrm { DNA } \)를 주형으로 1차 \( \mathrm { PCR } \)과 nested-PCR 반응을 실험했다. 이렇게 얻어진 1차 PCR의 증폭산물을 주형으로 Double Gradient-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DG-DGGE) 분석을 위해 2차 \( \mathrm { PCR } \)을 수행했다. 이후 얻어진 2차 \( \mathrm { PCR } \)의 산물을 이용해 DG-DGGE를 수행한다.
<h2>재료 및 방법</h2> <h3>시료</h3> <p>한국 전통 후발효차인 알가차와 단차는 2015년 제조되었고, 중국 보이차는 2015년 제조된 \( \mathrm { O } \)사의 후발효차(보이차 1)와 \( \mathrm { T } \)사의 후발효차(보이차 2)를 각각 분석하였다.</p> <h3>\( \mathrm { DNA } \) 추출</h3> <p>Total \( \mathrm { DNA } \)는 후발효차 \( 0.5 \mathrm { ~g } \)을 사용했고, Fast \( \mathrm { DNA } \) Spin kit for Soil (MP bio, Korea)를 이용하여 추출하였다. 추출된 \( \mathrm { DNA } \)의 농도 및 순도는 NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific, USA)을 이용하여 확인하였다.</p> <h3>미생물 군집분석을 위한 \( \mathrm { PCR } \)</h3> <p>미생물 다양성을 확인하기 위해 시료로부터 얻은 \( \mathrm { DNA } \)를 주형으로 1차 \( \mathrm { PCR } \)과 nested-PCR 반응을 수행하였다. 1차 \( \mathrm { PCR } \)은 \( 27 \mathrm { ~F } \) (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC \( \mathrm { AG } -3 ^ {\prime } \) )와 \( 1541 \mathrm { R } \) (5'-AAG GAG GTG ATC CAN CCR CA- \( 3 ^ {\prime } \) )을 이용하여 \( 50 \mu \mathrm { l } \)안에 \( 1 \times \mathrm { PCR } \) buffer, \( 20 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } _ { 2 } \), \( 40 \mathrm { mM } \mathrm { dNTP } \) mixture, 각 primer \( (1 \mu \mathrm { M } ) \), template \( \mathrm { DNA } \)와 \( 0.5 \mathrm { U } \mathrm { Taq } \) polymerase를 첨가하였다. \( \mathrm { PCR } \) 반응조건은 우선 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 5 \mathrm { ~min } \) 동안 \( \mathrm { DNA } \)를 pre-denaturation 시킨 후, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 45 \mathrm { sec } \) denaturation, \( 56 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 45 \mathrm { sec } \)annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 45 sec extension을 25 cycles을 수행한 후 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 7 \mathrm { ~min } \) 동안 final extension을 수행하였다. \( \mathrm { PCR } \) 산물은 ethidium bromide 염색 후 \( 1 \% \) agarose gel에서 확인하였다. Double Gradient-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DG-DGGE) 분석을 위하여, 1차 PCR의 증폭산물을 주형으로 2차 \( \mathrm { PCR } \)을 수행하였으며, 이때 \( 16 \mathrm { ~S } \) \( \mathrm { rDNA } \)를 증폭하기 위하여 사용된 primer는 40개의 \( \mathrm { GC } \) -clamp가 붙은 341F-GC (5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3')와 \( 786 \mathrm { R } \) (5'-CTA CCA GGG TAT CTA ATC-3')을 이용하였다. 2차 \( \mathrm { PCR } \)을 위한 \( \mathrm { PCR } \) 혼합물은 1차 \( \mathrm { PCR } \)에 사용된 것과 동일하며, 사용된 \( \mathrm { PCR } \) 반응조건은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 5 \mathrm { ~min } \)동안 \( \mathrm { DNA } \)를 pre-denaturation시켜, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 45 \mathrm { sec } \) denaturation, \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 45 \mathrm { sec } \) annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 45 \mathrm { sec } \) extension하고 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 7 \mathrm { ~min } \) 동안 final extension을 수행하였다. Annealing 온도는 초기에는 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 시작해서 1 cycle 당 \( 0.5 ^ {\circ } \mathrm { C } \)감소하게 20 cycles 수행하였고, 그 후 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 15 cycles을 수행하여 touch-down \( \mathrm { PCR } \)을 완료하였다. 얻어진 2차 \( \mathrm { PCR } \)의 산물을 이용하여 DG-DGGE를 수행하였다.</p>