chronophin을 과발현시킨 후 배양하여 길이가 \( 200 \mu \mathrm{m} \) 정도로 자란 결정체로 회절실험을 하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>Chronophin의 정제 및 결정화</h2> <p>단백질분해효소, TEV의 인식부위를 포함한 hexa-His를 갖는 pHIS parallel 벡터에 사람의 chronophin/PLPP 유전자가 클로닝된 pHIS-hPLPP 플라스미드를 대장균 B834 strain에 도입하여 재조합 chronophin을 과발현시켰다. pHIS-hPLPP를 갖는 대장균을 M9 배지에서 3시간 진탕배양한 후 재조합단백질의 발현을 유도하기 위해 \( 1 \mathrm{mM} \) ITPG를 첨가하고 단백질이 수용성인 형태로 발현되도록 배양온도를 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 로 낮춘 다음 24시간 더 배양하였다. 배양액을 \( 7,000 \times g \)에서 20 분간 원심분리하여 균체를 얻은 후 \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \)와 \( 5 \mathrm{mM} \beta \)-mercaptoethanol을 포함한 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-HCl, \( \mathrm{pH} 7.5 \)(buffer A)에 재현탁하고 초음파를 이용하여 파쇄한 다음, \( 26,000× g \)에서 45분간 원심분리하여 cell lysate를 얻었다. 이를 buffer A로 평형화시킨 Ni-NTA (Qiagen) 컬럼을 통과시키고 \( 300 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \)과 \( 5 \mathrm{mM} \beta \)-mercaptoethanol, \( 20 \mathrm{mM} \)의 imidazole을 함유한 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-HCl, \( \mathrm{pH} 8.5 \)로 컬럼을 씻은 다음, hexa-his \( \operatorname{tag} \)를 갖는 재조합 chronophin을 250\( \mathrm{mM} \) 의 imidazole이 함유된 완충용액으로 용출시켰다. 용출된 단백질은 \( 21^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 rTEV (Invitrogen)를 이용하여 자른 후 Ni-NTA column을 다시 통과시켜 hexa-His tag를 제거하였다. Tag가 제거된 단백질은 \( 5 \mathrm{mM} \)의 dithiothreitol (DTT)을 함유한 \( 20 \mathrm{mM} \) Tris-HCl, \( \mathrm{pH} 7.5\)로 미리 평형화시킨 Bio-Silect SEC 125 컬럼(Bio-Rad)을 통과시켜 순도를 높였다. 정제된 단백질은 Centriprep YM10 (Amicon)을 이용하여 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 농축한 후 hanging drop vapor dif-fusion 방법으로 \( 21^{\circ} \mathrm{C} \)에서 chronophin의 결정을 만들었다. Chronophin의 결정화조건으로 \( 16 \% \)의 PEG 4,000을 침전제로 \( 20 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2} \)을 함유한 \( 0.1 \mathrm{M} \) HEPES, \( \mathrm{pH} 7.0 \)의 완충용액을 사용하였다.</p> <h2>Chronophin 결정체에 대한 X-선 회절 및 결정구조의 규명</h2> <p>길이가 \( 200 \mu \mathrm{m} \)의 정도로 자란 결정체를 이용하여 포항가속기연구소의 6B 빔라인에서 회절실험을 하였다. 단백질결정체롤 결정화에 사용-된 완충용액에 \( 15 \% \)(v/v)의 글리세롤을 cryoprotectant로 첨가한 용액에 잠시 담군 후 사용하였으며 X-선은 \( 1.127 Å \)의 파장을 사용하였다. 한 frame에 \( 1^{\circ} \) 씩 결정체를 회전시켜 총 \( 180^{\circ} \)에 대한 회절 데이터를 수집하였다. 수집된 데이터는 HKL2000 프로그램을 이용하여 in-dexing과 integration, scaling을 수행하였다. 총 10,643개의 reflection을 얻었으며 redundancy가 13.3에 unique re-flection은 10,643으로 \( 2.6 Å\) 해상도에서 completeness는 \( 100 \% \)이다. Chronophin의 분자구조는 PLPP의 분자구조 (PDB ID 2CFR)를 주형으로 하여 AMORE 프로그램을 사용하여 molecular replacement 방법으로 찾았으며 프로그램 'O'를 이용하여 입체구조 모형을 수정하였으며 CCP4 suit에 있는 refmac4 프로그램으로 refinement 과정을 수행하였다.</p>