단백질이 산화한 조건에서 disulfide bridge가 만들어지며, 이는 효소를 정제하고 결정화하는 와중에 생성된 것일 수 있다. 이로 인해 기질을 결합하지 않은 chronophin의 구조가 왜곡되었을 가능성도 있는데, 세포 속 chronophin이 환원된 환경에 있다면 C91과 C211 사이 이어진 disulfide bond가 없으며 cap 도메인과 core 도메인 사이의 움직임을 억제할 수 없어 열린 구조로 전환할 수도 있다. 본 연구에서는 chronophin의 결정구조(환원 상태에서 보이는)을 밝히고 두 cysteine간 결합이 없는 상태에서 보이는 chronophin의 구조를 산화된 상태의 구조와 견주어 열린 형태로 바꿀 수 있는지 그 가능성을 조사하였다.
<h1>서 론</h1> <p>진핵세포의 움직임과 형태전환은 많은 양의 세포골격단백질인 actin의 운동성에 의한다. Actin은 구형의 단량체 형태와 중합체인 filament 형태로 세포 내에 존재하는데 원형질막에서 actin 단량체가 filament로 중합되는 과정이 세포가 움직이는 기본적인 힘이 된다. F-actin cytoskeleton의 절단과 단위체화는 세포 내에서 높은 actin-filament의 재편성 속도를 나타내게 만드는데 이런 활성은 actin-depolyme-rizing factor (ADF)/cofilin에 의해 조절된다. ADF/co-filin은 F-actin에 결합함으로서 actin filament의 고인 형태를 유지시키며 조각나는 것을 유도하고 말단에서 소단위체가 떨어져 나가는 것을 촉진시킨다. ADP-actin mono-mer에 결합하여 ATP로 치환되는 것을 막는 cofilin은 두 가지의 인산화효소, LIMl-kinase와 testis-specfific protein kin-ases (TESKS)의 해서 N-말단의 3번째 serine 잔기가 인산화됨으로서 그 활성을 억제를 받는다. 이 인산화된 부분이 제거되면서 cofilin은 활성을 나타내는데 2005년 Gohla 등은 세포주기 동안 cofilin의 활성을 조절하는 chronophin이라 명명한 독특한 cofilin phosphatase를 보고하였다. Cofilin의 활성화를 통해 actin cytoskeleton dynamic을 조절하는 cofilin phosphatase 작용기작은 세포의 분열과 이동능력 등 세포 내의 절대적인 과정이며 손상된 chronophin을 갖는 세포의 경우 cytokinesis에 결함이 생기고 세포의 생존능력도 손상된다. Chronophin은 아며노산 서열분석을 통해 pyridoxal phosphatase (PLPP)로 알려진 단백질과 동일함이 밝혀졌다. PLPP는 vitamin \( B_{6} \) 의 한 형태로 다양한 세포 내 대사과정에서 여러 가지 효소의 활성에 필수적인 pyr-idoxal 5'-phosphate (PLP)의 농도를 조절하는 기능을 담당한다.</p> <p>Chronophin은 \( 32 \mathrm{kDa} \) 크기의 단백질로 \( \mathrm{Mg} \) 이온을 co-factor로 필요하는 haloacid dehalogenase (HAD) super-family에 속하는 것으로 알려져 있는데 HAD family phos-phatase는 세균에서부터 사람에 이르기까지 광범위하게 발현되며 다른 종류의 phosphatase와는 다르게 효소의 aspar-tate와 함께 anhydride를 갖는 중간체를 형성하면서 phos-phoryl-group을 전달하는 메카니즘을 가지고 있다. HAD superfamily는 잘 보존된 aspartate를 갖는 활성부위를 포함하는 core 도메인과 기질결합에 관여하는 cap 도메인을 가지고 있다. HAD 그룹에 속하는 phosphatase는 cap 도메인의 형태에 따라 세 종류로 나누어지는 데 cap 도메인이 \( a- \)helices로 구성된 subclass I과 \( \alpha / \beta \) 구조인 subclass II 그리고 cap 도메인이 없이 긴 loop로 대치된 subclass III이 있다. HAD family phosphatase는 활성부위가 cap 도메인과 core 도메인사이에 있으며 cap 도메인이 기질특이성을 부여해주는 것으로 알려져 있다. 따라서 subclass III의 phospha-tase는 넓은 범위의 기실을 이용하는 반면, subclass I과 II의 경우는 기질특이성이 비교적 높다. 또한 subclass I과 II에 속하는 phosphatase는 기질의 결합이 cap 도메인에 의해 조절이 되는데 core 도메인의 활성부위를 덮고 있던 cap 도메인이 기질과의 결합을 위해 젓혀져 열리는 형태의 전환이 일어난다.</p> <p>즉, core 도메인과 cap 도메인을 연결하는 hinge 부분의 움직임에 의해 기질이 없을 때의 열린 형태에서 기질이 결합된 닫힌 형태로의 전환이 일어난다. 따라서 \( \alpha / \beta \) 구조의 cap 도메인을 가지고 있어 subclass II에 속하는 chronophin도 cap 도메인이 열리는 형태의 전환이 수반될 것으로 기대되었다. 그러나 알려진 chronophin/PLPP의 구조를 보면 기질인 PLP가 결합된 구조(PDB ID 2CFT) 가 닫힌 형태일 뿐만 아니라 기질이 없는 구조(PDB ID 2CFS)도 닫힌 형태이다. 이들의 결정구조에는 cap 도메인의 \( \alpha 4 \) helix에 위치한 C91과 core 도메인의 \( \alpha 8 \) helix에 있는 C221 사이에 disulfide bridge가 있다. 이 disulfide bridge는 core 도메인과 cap 도메인을 연결하는 hinge의 바깥쪽 부위에 위치하여 두 도메인간의 움직임을 막는 지지대의 역할을 하고 있다. 따라서 chronophin의 경우는 cap 도메인의 움직임이 억제되었기에 열린 형태로의 전환이 없이 효소활성을 가질 것으로 생각된다. 그러나 이 disulfide bridge는 단백질이 산화된 조건에서 형성되는 것으로 효소를 정제하고 결정화하는 과정에서 만늘어진 것일 수 있으며 이로 인해 기질이 결합되지 않은 chronophin의 구조가 왜곡되었을 가능성을 배제할 수 없다. 즉. chronophin이 세포 내에서 환원된 환경에 있을 경우 C91과 C211 사이의 disulfide bond가 없으며 cap 도메인과 core 도메인 사이의 움직임이 억제되지 않아 열린 구조로의 전환이 가능할 수도 있다. 이에 본 연구에서는 환원된 상태에서의 chronophin의 결정구조를 밝히고 두 cysteine간에 결합이 없는 상태에서의 chronophin의 구조를 산화된 상태의 구조와 비교하여 열린 형태로의 전환이 가능한지 알아 보았다.</p>