S. cerevisiae D452-2 균주를 이용해 \(5\% \) [EMIM][Ac]를 포함한 배지에서 유도적 돌연변이 유발 실험을 진행하였다. 이를 통해 얻어진 7차 배양액을 도말 후 \(30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10일간 배양하여 단일 colony를 확보하였다. 결과적으로 glucose 소비속도와 ethanol 생산량이 높은 균주가 선별되었다. 발효 과정에서의 세포 성장은 UV-visible spectrophotometer를 사용해 \(600 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>Yeast extract, bacto peptone, agar 는 Becton, Dickinson and Company (USA)로부터 구매하였다. Glucose는 대정화금(Korea)에서 구매하였다. 1-Ethyl-3-methylimidazolium acetate([EMIM][Ac])는 C-TRI (Korea)에서 구매하였다.</p> <h2>실험에 사용된 균주 및 발효조건</h2> <p>본 배양을 위하여 사용된 균주는 Saccharomyces cerevisiae D452-2이며, 전 배양에 사용된 배지는 \( YPD_{20} \) (yeast extract \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), glucose \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)) 이다. Ionic liquid에 대한 내성을 확인하기 위해 \( 250 \mathrm{~ml} \) flask에 [EMIM][Ac]를 \( 5 \% \) 농도로 첨가한 \( 50 \mathrm{~ml} \)의 \( YPD_{80} \) (yeast extract \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), peptone \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), glucose \( 80 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)) 배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 그리고 \( 150 \mathrm{~rpm} \) 조건에서 발효를 진행하였다.</p> <h2>유도적돌연변이유발방법(Directedevolutionaryapproach)</h2> <p>S. cerevisiae D452-2 균주를 이용하여 \( 5 \% \) [EMIM][Ac]가 포함된 배지에서 유도적 돌연변이 유발 실험을 수행하였다. 유도적 돌연변이 유발에 사용된 배지는 \( 5 \% \) [EMIM][Ac]와 \( 80 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 glucose가 포함된 \( YPD_{80} \) 배지이며 초기 흡광도 (OD600)가 1이 되도록 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 그리고 \( 150 \mathrm{~rpm} \)에서 배양하였다. 그 후 glucose가 모두 소비되어 잔여 농도가 \( 0 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)일 때 \( 5 \% \) [EMIM][Ac]와 \( 80 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 glucose가 첨가된 새로운 \( YPD_{80} \) 배지에 배양액의 \( 1 \% \)를 접종하는 방법으로 유도적 돌연변이 유발을 진행하였으며 이 과정을 약 70여일간 8차례에 걸쳐 수행하였다.</p> <h2>[EMIM][Ac]에 대한 내성이 향상된 돌연변이 균주 선별</h2> <p>유도적 돌연변이 유발 방법을 통해 얻어진 제 7차 배양액을 \( 5 \% \)의 [EMIM][Ac]가 첨가된 \( YPD_{20} \) 고체배지에 단계적으로 희석하여 도말한 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 약 10일간 배양하여 단일 colony를 확보하였다. 그 후 colony의 크기 별로 구분하여 \( 5 \% \) [EMIM][Ac]와 \( 80 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 glucose가 포함된 \( YPD_{80} \) 배지에 초기 OD가 \( 1.0\left(A_{600} \mathrm{~nm}\right) \)이 되도록 접종한 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 그리고 \( 150 \mathrm{rpm} \) 조건으로 배양을 진행하여 비교하였다. 최종적으로 glucose 소비속도와 ethanol 생산량이 높은 균주를 선별하였다.</p> <h2>분석방법</h2> <p>발효과정의 세포성장은 UV-visible spectrophotometer(Biomate 5, Thermo, USA)로 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 분석하였다. 다양한 대사산물(glucose, acetate, glycerol, ethanol)의 분석은 HPLC (HPLC 1200 Series, Agilent Technologies, USA)를 이용하였다. 분석용 컬럼은 Rezex ROA-Organic Acid \( \mathrm{H}^{+} \)column (Phenomenex, USA)을 사용하였으며 refractive index detector (RID)를 이용하여 측정하였다. Column과 detector의 온도는 각각 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)이고, 이 동상은 \( 0.005 \mathrm{~N} \) 황산용액을 \( 0.6 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \)의 유속으로 사용하였다.</p>