플라스미드 분리 및 형질전환은 rapid alkaline lysis 법과 Spin column kit(IntRon) 사용하여, Hanahan이 제시한 과정에 따라 실시하였다. Agarose gel electrophoresis는 TAE buffer를 사용한 Maniatis 방법에 따라 실시하고, DNA 단편은 gel elution 방법으로 추출하였다. 혈전용해효소 유전자 염기서열의 분석은 Sanger의 dideoxy termination method에 따라 ABI 377A 자동 염기서열 분석기를 사용하였고, 크로닝된 혈전용해효소 유전자의 deletion mutation에 의한 효소 항원 측정은 PCR 에 의해 size를 줄여 6가지 DNA 단편을 얻고, 그것을 크로닝하여 혈전용해효소 활성을 조사하였다. 혈전용해효소생산의 최적 \( \mathrm{pH} \) 및 온도 측정을 위해서 \(\mathrm{fibrinogen}\) 용액의 \( \mathrm{pH} \)를 \(5.0\)부터 \(9.0\)까지 조절한 다음 \(\mathrm{thrombin}\) \(10\) \(\mathrm{unit}\)를 더하여 \( 37^{\circ}\mathrm{C} \)에서 \(6\)시간 정도 반응시켜 용해된 분해면적을 측정했다.
<h3>플라스미드 분리 및 형질전환</h3> <p>\(\mathrm{Plasmid~DNA}\) 분리 정제는 \(\mathrm{rapid~alkaline~lysis}\) 법가 \(\mathrm{Spin~column~kit(IntRon)}\) 른 이용하였고, 각종 \(\mathrm{plasmid}\)를 사용 한 형질전환은 \(\mathrm{Hanahan}\)이 화립한 과정에 따라 실시하였다.</p> <h3>Agarose gel electrophoresis 및 분리 DNA 단편의 회수</h3> <p>\(\mathrm{Gel~electrophoresis}\)는 \(\mathrm{TAE~buffer}\) 블 사용한 \(\mathrm{Maniatis}\) 방법에 따랐으며, \(\mathrm{agarose gel}\)상에서 분리된 \(\mathrm{DNA}\) 단편은 \(\mathrm{gel elution}\) 방법을 이용하여 추출 회수하였다.</p> <h3>혈전용해효소 유전자 염기서열의 분석</h3> <p>혈전용해효소 유전자의 염기서열분석은 \(\mathrm{Sanger}\) 의 \(\mathrm{dideoxy}\) \(\mathrm{ termination~method}\) 에 따라 \(\mathrm{ABI}\) \(377\)\(\mathrm{A}\) 자동 염기서열 분석기에서 분석하였다.</p> <h3>크로닝된 혈전용해효소유전자의 \(\mathrm{deletion~mutation}\)에 의한 효소 할성 측정</h3> <p>크로닝된 열전용해 효소 유전자의 \(\mathrm{deletion~mutation}\) 을 구축하기 위해 \(\mathrm{primer}\) 를 \(\mathrm{Table}\) \(1 \)과 같이 합성하여 \(\mathrm{PCR}\) 에 의해 점차 \(\mathrm{size}\)를 줄여 \(6\)가지의 \(\mathrm{DNA}\) 단편을 얻었으며, 각 \(\mathrm{DNA}\) 단편을 크로닝하여 혈전용해효소 활성을 조사하였다. \(\mathrm{PCR}\)증폭에 사용된 \(\mathrm{Perkin~Elner}\)-\(2400\)은 조건을 초기 \(\mathrm{denaturation}\)단계에서 \( 95^{\circ} \mathrm{C}~30 \)초를 유지하였으며, \( 55^{\circ} \mathrm{C}~30 \)초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) \(30\)초에서 \(30\)\(\mathrm{cycle}\) 로 증폭한 후 최종 단계인 \(\mathrm{DNA}\) 합성은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(10\)분 동안 실시하였다.</p> <h3>크로닝된 혈전용해효소유전자를 함유한 균주의 혈전용해활성 측정 및 기질특이성 조사</h3> <p>크로닝된 혈전용해효소 유전자를 함유한 균주의 혈전용해능을 조사하기 위하여 대조구로서 \( \mathrm{pBSK} \)(-) 를 가지고 있는 \(\mathrm{XL1}\)-\(\mathrm{blue}\) 를 사용하였으며, 재조합 균주 및 대조기를 각각 \(600 \mathrm{~nm} \)에서 \( \mathrm{OD} \) 가 \( 1.0 \) 이 되게 배양하여 \( 13,000 \mathrm{rpm} \) 에서 \(30\)분간 원심분리 후 배양상등액과 균체를 혈전분해활성측정에 사용하였으며, 집균된 균체는 멸균생리식염수로 \(2\)회 세척한 후, \( 20 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}\left(\mathrm{pH}\right. \) \(7.2)\)에 현탁시켜 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) 이하를 유지하면서 초음파 파쇄기\(\mathrm{(Bandelin~Co.~Sonopuls~GM70.~USA)}\) 를 사용하여 \( 120\mathrm{Hz} \) 로 파쇄시켰다. 파쇄균체는 \(13000 \mathrm{rpm} \) 에서 \(10\)분간 원심분리하여 상등액을 \(\mathrm{fibrin~plate,~skim milk,~casein,~gelatin,~blood~agar~plate}\) 에 각각 점직하여 혈전분해활성 및 기질특이성을 조사하였다.</p> <h3>혈전용해효소생산의 최적 \( \mathrm{pH} \) 및 온도</h3> <p>혈전용해효소생산의 최적 \( \mathrm{pH} \) 와 온도를 측정하기 위하여 \( \mathrm{pH} \) 는 \(\mathrm{fibrin~plate}\)를 제조함에 있어서 \(\mathrm{fibrinogen}\) 용액의 \( \mathrm{pH} \)를 각각 \(5.0\)부터 \(9.0\)까지 조절한 후 \(\mathrm{thrombin}\) \(10\) \(\mathrm{unit}\)를 가하여 본 현전용해효소를 적당량 점적한 후 \( 37^{\circ}\mathrm{C} \)에서 \(6\)시간 반응시켜 용해된 분해면적을 측정하였다. 이때 \( \mathrm{pH} \) \(4.0\)이하와 \( 10.0 \) 이상에서는 강산과 강염기로 인해 \(\mathrm{fibrin~plate}\)가 만들어지질 않았다. 최적활성온도는 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 부터 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 로 온도를 조절 후 \(6\)시간 반응시켜 용해된 분해면직을 측정하였다.</p>