폐글리세롤에 시약을 처리하여 PCR 수행 후 hemA 유전자를 증폭시켜 제한효소 처리 및 벡터 삽입을 통해 재조합 플라스미드 \( p H-h e m A \)를 만들었다. ALA 생산균주를 제작하여 적절한 배지에서 배양 후 IPTG의 첨가 시점과 첨가 농도 결정을 위한 실험을 진행했다. UV 분광광도계를 이용한 흡광도 측정을 통해 ALA 농도를 계산 및 결과를 분석했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>주식회사 M 에너지 사(Korea)로 부터 폐글리세롤을 입수 하였다. 효모추출액(yeast extract), 트립톤(tryptone)은 Difco 사(USA)로부터 구입하였고 Isopropyl \( \beta \)-D-1thiogalactopyranoside (IPTG), 엠피실린(ampicillin), 클로 람페니콜(chloramphenicol), 아미노레블린산 및 기타 시약들은 Sigma-Aldrich 사(USA)에서 구입하였다. Rhodobacter sphaeroides ATCC 17023으로부터 genomic DNA를 추출하고 이를 주형으로 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)에 의해 hemA 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자를 NdeI과 HindIII 제한효소로 처리한 후 동일한 제한 효소로 처리된 pHCEIIB (Takara Bio, Japan) 벡터에 삽입함으로써 재조합 플라스미드 \( p H-h e m A \)를 제작하였다. 대장균 유래 ots\( B A \)가 삽입된 \( p S \)-ots \( B A \) 플라스미드는 본 실험실에서 제작되었다. 사용된 유전자, 플라스미드 및 hemA 유전자 증폭을 위한 primer에 대한 정보를 Table 1에 나타내었다.</p> <h2>균주,배지, 및 배양 방법</h2> <p>호스트 균주로 사용된 E.coli \( \mathrm{DH} 5 \alpha \)에 pH-hemA 플라스미드를 도입한 ALA 생산균주를 제작하였다. ALA 생산균주에 \( p S-otsBA \) 또는 \( p S T V-28 \) 플라스미드를 추가적으로 도입한 균주를 제작하였다. \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관된 glycerol stock \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 항생제가 첨가된 LB 배지 \( 20 \mathrm{ml} \)를 함유하는 \( 250 \mathrm{ml} \) 플라스크에 접종한 후 진탕배양기에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 180 \mathrm{rpm} \)으로 배양하였다. 세포밀도를 나타내는 \( \mathrm{OD}_{600} \)가 0.6-0.8에 도달하였을 때, 접종균 \( 2.5 \mathrm{ml} \)를 \( 50 \mathrm{ml} \) 본 배양 배지를 함유한 \( 500 \mathrm{ml} \) baffled 플라스크에 접종한 후 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \)에서 본 배양을 수행하였다. 본 배양용 기본 배지로 \( 20 \mathrm{~g} / \) (폐) 글리세롤, \( 5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 글라이신, 및 \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 숙신산을 첨가한 \( 2 \times \mathrm{YT} \)를 사용하였다. 필요할 경우 항생제인 엠피실린 \( (100 \mathrm{mg} / \mathrm{l}) \) 또 는 클로람페니콜 \( (50 \mathrm{mg} / \mathrm{l}) \)을 첨가하였다. 트레할로스의 영향을 조사하기 위하여 기본 배지에 트레할로스를 농도 별로 첨가하여 균주의 생장 및 \( \mathrm{ALA} \) 생합성량을 측정하였다. \(otsBA \) 발현을 유도하기 위하여 \( \mathrm{OD}_{600} \)가 3-4에 도달하였을 때, IPTG 최종 농도 \( 0.2 \mathrm{mM}) \)를 첨가하였다. 최종적으로 IPTG 의 첨가 시점과 첨가 농도 결정을 위한 최적화 실험을 수행 하였다.</p> <h2>분석방법</h2> <p>Ehrlich's reagent를 발색시약으로 사용하는 기존의 방법을 따라 배양 상등액 중의 ALA를 정량하였다. \( 1 \mathrm{ml} \) 배양액을 채취하여 \( 9,800 \times g \)로 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 배양 상등액 \( 10 \mu \mathrm{l}, 0.5 \mathrm{M} \) 아세트산 나트륨(sodium acetate) 완충용액( \( \mathrm{pH} \) 4.6) \( 1 \mathrm{ml} \), 및 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 아세틸아세톤(acetylacetone)을 혼합하였다. 혼합액을 끊은 물에서 10 분간 중탕하고 상온으로 냉각한 후, Ehrlich's reagent (4-dimethylamino benzaldehyde \( 1 \mathrm{~g} \), glacial acetic acid \( 42 \mathrm{ml} \), perchloric acid \( 8 \mathrm{ml}) 3 \mathrm{ml} \)를 첨가하였다. 이를 상온에서 5분간 방치한 후 UV 분광광도계(Hewlett-packard, USA)를 이용하여 \( 554 \mathrm{~nm} \) 파장에서 흡광도를 측정하고 검량선과 비교하여 ALA 농도를 계산하였다.</p>