흰쥐 간 조직으로부터 microsome 분획을 조제하여 50mM Tris-HCl buffer, 간 microsome 분획, ascorbate 및 5mMFeSO4 반응액을 잘 흔합한 후 1시간 반응시켜 항산화 활성을 측정하였다. 또한 Linoleic acid를 기질로 하여 phosphate buffer와 각 시료 용액을 가하여 40\(^\circ \mathrm{C}\)에서 1주일 동안 지질 과산화를 유도하고 trichloroacetic acid와 aqueous TBA를 혼합하여 그 상등액을 532nm에서 흡광도를 측정하여 항산화 활성을 조사하였다.
<h2>\( \mathrm { Fe } ^ { + + } \)/ascorbate에 의해 유도된 항산화 활성 조사</h2> <p>성장기의 정상 흰쥐 간 조직으로부터 microsome 분획을 조제 하였다. 간 microsome 분획을 이용한 항산화 활성은 Wong 등의 방법에 따라 \( 50 \mathrm { mM } \) Tris-HCl buffer ( \( \mathrm { pH } \) 7.5), 간 microsome 분획 \( (1 \mathrm { ml } \) 중 \( 1 \mathrm { mg } \) 의 단백질 함유), \( 0.1 \mathrm { mM } \) ascorbate 및 \( 5 \mathrm { mM } \mathrm { FeSO } _ { 4 } \) 반응액을 잘 흔합한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 시간 반응시켜 과산화를 유도시켰다. 이때 대조구는 시료를 첨가시키지 않고 동일한 방법으로 실시하였다. 반응액에 \( 3 \mathrm { M } \) trichloroacetic acid와 \( 2.5 \mathrm { ~N } \)HCl 의 혼합용액을 가하고 원심분리 한 후 상등액에 \( 0.67 \% \) TBA를 넣고 가열하여 발색시켰다. 발색된 반응액은 \( 535 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였으며, 지질과 산화의 억제율은 대조구의 흡광도에 대한 저해율(%)로 비교 하였다.</p> <h2>TBA (2-thiobarbituric acid)에 의한 항산화 활성 측정</h2> <p>Linoleic acid \( (25 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) in \( \mathrm { EtOH } ) \) 를 기질로 하여 \( 0.2 \mathrm { M } \) phosphate buffer ( \( \mathrm { pH } \) 7.0)와 각 시료 용액을 가하여 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 주일 동안 지질 과산화를 유도하였다. 과산화 지질 측정은 반응액에 \( 35 \% \)trichloroacetic acid와 \( 0.75 \% \) aqueous TBA를 혼합하고 가열처리 한 후 \( 70 \% \) trichloroacetic acid를 가한 다음 원심분리 하여 그 상등액을 \( 532 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Thiocyanate에 의한 항산화 활성 측정</h2> <p>Ohkawa의 방법에 따라 먼저 linoleic acid로 유도된 과산화 지질 용액에 \( 70 \% \) ethanol과 ammonium thiocyanate 용액 \( \left (0.3 \mathrm { ~g } / \mathrm { ml } \right . \) in \( \left . \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \right ) \), ferrous chloride 용액 \( (2.45 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) in \( 3.5 \% \) hydrochloric acid)을 혼합한 후 정확히 3 분 후에 \( 500 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 이때 활성의 비교를 위하여 BHT 를 \( 0.05 \% \) 농도로 사용하였다.</p>