생후 12시간 이내의 신생 쥐들을 선택하여 대조군과 두 종류의 인공 사육군으로 분류하였다. 대조군은 엄마 쥐가 직접 수유하며, 이유기 이후에는 \(3\%\) LNA가 첨가된 AIN-93 표준 식이를 제공하였다. 인공 사육군은 n-3 지방산이 적절히 포함된 그룹(n-3 Adq)과 결핍된 그룹(n-3 Def)으로 나누어 각각에 알맞는 분유를 제공하였다. 이후 이유기 이후에는 인공분유의 지방산 조성과 비슷한 고형사료로 급여하였다. 실험 쥐들이 15주가 되면 희생시키고 혈액, 뇌, 망막을 추출하여 지방산 조성을 검토하였으며, 개별 지방산 분석은 표준용액의 retention 시간 비교와 전체 peak area의 퍼센트를 통해 산출하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험동물의 종류 및 사육</h2><p>임신 3일된 Long-Evans 쥐를 Charles River 실험실(Portage, MI)에서 구입하여 \(3\%\) a-linolenic acid (LNA)가 첨가된 AIN-93 표준식이를 급여하여 적정 환경(온도 \( 23 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \), 명암 12시간 주기)에서 분만까지 사육하였다. 신생 쥐들을 생후 12시간 내에 체중을 고려하여 5마리 엄마 쥐들로부터 각 1마리씩 신생 쥐를 분리하여 3군으로 분류하였는데 즉, 대조군으로 엄마 쥐가 직접 수유하는 군(Dam-reared group)과 인공 사육시스템을 이용한 인공 사육 동물군을 다시 n-3 지방산이 적절히 함유된 군(n-3 adequate group, n-3 Adq)과 n-3 지방산이 결핍된 군(n-3 deficient group, n-3 Def)으로 나누었다. 대조군은 이유기(생후 3주) 이후부터는 \( 3 \% \) LNA가 첨가된 AIN-93 표준 식이를 급여하였고 인공 사육 동물군은 각각 n-3 지방산이 적절히 함유된 분유와 n-3 지방산이 결핍된 분유로 이유기까지 급여한 후 인공분유의 지방산 조성과 유사한 고형사료로 실험기간동안 급여하였다. 실험식이와 음용수는 실험기간동안 자유섭취방법으로 급여하였다.</p><h2>실험식이</h2><p>고형사료는 AIN-93에 따른 식이로 지방의 급원을 변형하였다. 대조군(Maternal diet)의 경우, 포화지방산의 급원으로 수소화된 coconut oil을 사용, linoleic acid (LA) 급원으로 safflower oil을 사용, LNA 급원으로 flaxeed oil을 사용하였다. 대조군식이의 LNA와 LA의 함유량은 각각 전체 지방산의 \(3\%\) 와 \(15\%\) 임을 Table 1에 나타내었다. 인공사육동물군의 경우는 인공분유의 지방산 조성과 유사하게 유지하기 위하여 medium-chain triglyceride와 수소화된 coconut oil을 사용하였고 불포화지방산으로 정제된 ester형의 지방산들 (oleate LA, LNA, Nu-Chek Prep, Elysian, MN)을 사용하였다. N-3 지방산 결핍군(n-3 Def)은 \( 17.8 \% \) LA와 \( 0.06 \% \) LNA를 함유, n-3 지방산 적절군(n-3 Adq)은 \( 17.6 \% \) LA와 \( 3.2 \% \) LNA를 함유하였다.</p><h2>신생 쥐용 인공분유 조제</h2><p>Kanno 등의 방법을 변형하여 단백질로는 지질성분이 최소인 casein과 whey protein을, 당질은 lactose를, 지질은 medium-chain triglyceride와 수소화된 coconut oil을 사용하였고 불포화지방산으로 정제된 ester형의 지방산들(oleate LA, LNA, Nu-Chek Prep, Elysian, MN)을 사용하였다. N-3 지방산 적절군은 \( 3.1 \% \) LNA를, n-3 지방산 결핍군은 \( 0.02 \%\) LNA를 함유하고 있어 두 식이군의 중요한 특징은 LNA 함유량의 차이이며 LA 함유량은 각각 \( 16.6 \% \) 와 \( 16.3 \% \)로 거의 동일하였다. 신생 쥐 성장에 필요한 모든 영양소들을 순서에 맞추어 배합하여 분유 조제 동안 응고되는 것을 피하고자 하였다. 혼합 후 고압 균질기(FES International, Irwindale, CA)를 이용하여 두 번 균질화하였고 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 2회 살균한 후 냉장 보관하며 산패방지를 위하여 필요시 매번 조제하였다.</p><h2>인공사육시스템을 이용한 신생 쥐 사육</h2><p>인공사육시스템은 Hoshiba의 방법과 Lim의 방법을 변형하였고 실리콘으로 만든 젖병(nursing bottle)과 젖꼭지를 이용하여 실린지로 매번 인공 분유를 주입시켰다. 젖병은 내부에 2개의 튜브, 즉 분유 주입구(fill tube)와 공기 튜브 (vent tube)로 구성되어 있다. 수유는 매 3시간 하루에 5번 정도로 총 15시간을 실험자가 직접 수유시켰다. 수유와 수유시간 사이에는 온도를 유지시켜주는 항온시스템에서 신생 쥐들을 사육시켰다. 인공사육시스템을 이용한 사육법은 생후 15일까지 계속 행하고 그 이후에는 신생 쥐들의 경우 감겨진 눈이 열리는 시기이므로 \( 50 \mathrm{ml} \) conical tube를 이용하여 신생 쥐가 시각적으로 보면서 스스로 마시는 형태로 분유를 취하게 하였다.</p><h2>Gas chromatography를 이용한 지방산 측정</h2><p>실험 쥐들이 15주가 되었을 때 희생시키고 혈액, 뇌 및 망막을 취해서 지방산 조성을 검토하였다. 지질 추출은 Folch 등을 변형하여 실시하였으며 Morrison과 Smith의 방법에 따라 추출된 지질에 methylation용 시약인 boron trifluoride methanol \( 1 \mathrm{ml} \) 와 hexane \( 0.4 \mathrm{ml} \)를 가한 후 1시간동안 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 가열하여 methylation시켰다. 지방산 분석은 HP-5890B gas chromatography (Agilent, Palo Alto, CA)를 이용하였고 이용된 칼럼은 silica capillary column (DB-FFAP, \( 30 \mathrm{~m} \times 0.25 \mathrm{mm} \) inner diameter \( \times 0.25 \mu \mathrm{m} \) film thickness, J and W Scientific, Folsome, CA)이었다. 지방산 분석은 표준용액의 retention 시간과 비교하여 정성하였으며 개개의 지방산들은 전체 peak area의 퍼센트로 산출하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>실험결과는 mean \( \pm \) SEM (Stadndard Error of Mean)으로 나타내었고 분석된 실험 데이터는 Statistica program (Statsoft, Tulsa, OK)을 이용하여 one-way ANOVA를 실시하여 살펴보았다. 유의성이 있을 경우에 post-hoc test로 Tukey's HSD (Honest Significant Difference) test를 실시하여 유의성을 검증하였다.</p>