고추 종자로부터 단백질을 분리하는 과정에서, SDS-PAGE를 사용하여 resolving gel과 stacking gel을 각각 \(0.1\%\) SDS, \(15\%\) acrylamide와 \(0.1\%\) SDS, \(4\%\) acrylamide 농도로 조제하였다. 단백질과 laemmil buffer를 \(1:2\) 비율로 혼합한 후 \(100^{\circ}C\)에서 5분간 처리하여 샘플을 준비하고, 이를 \(150V\)에서 1시간 동안 전기영동하였다. 이후 한 gel을 PVDF 막으로 전이시킨 후, methanol로 세척하고, Blotto A와 TBS-T solution을 사용하여 처리하였다.
<h3>항암 펩타이드(lunasin peptide)의 분리, 동정 및 생물학적 활성</h3> <ul> <li>단백질의 추출</li> <p>분석을 위한 시료는 고추 종자 \( 50 \mathrm { ~g } \) 을 액체 질소를 이용하여 마쇄한 후 \( 0.1 \mathrm { M } \)-phosphate buffer (pH 7.0) \( 100 \mathrm { ml } \) 을 넣고 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 시간 추출 후, 7 겹의 거즈로 불용성 물질을 제거한 다음, 상등액을 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 14000 \mathrm { rpm } \) 에서 30 분간 원심 분리하여 상등 액을 취하였다.</p> <li>SDS-PAGE</li> <p>고추 종자의 단백질 분리는 SDS-PAGE에 의하여 수행하였다. SDS- PAGE시 resolving gel은 최종적으로 \( 0.1 \% \)-SDS, \( 15 \% \)-acrylamide 농도가 되게 조제하였으며, stacking gel은 \( 0.1 \% \)-SDS, \( 4 \% \)-acrylamide 농도가 되게 조제하였다.</p> <p>Loading sample은 고추 종자로부터 추출한 단백질과 laemmil buffer를 \( 1: 2 \) 로 혼합하여 \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분간 끊인 샘플을 사용하였고 lane 당 단백질 \( 25 \mu \mathrm { g } \) 을 주입하였으며, 전기영동시 전압은 \( 150 \mathrm { ~V } \) 로 1 시간 실시하였다. 전기영동이 끝난 gel은 shacking하면서 3 시간 staining solution (Coomassie</brilliant blue \( 1 \mathrm { ~g } / \) / methanol \( 450 \mathrm { ml } + \) acetic. acid \( 100 \mathrm { ml } \) \( + \mathrm { DH } _ { 2 } \mathrm { O } 450 \mathrm { ml } \) )에서 염색한 후 destaining solution (methanol \( 100 \mathrm { ml } + \) acetic acid \( 100 \mathrm { ml } + \mathrm { DH } _ { 2 } \mathrm { O } 800 \mathrm { ml } \) )에서 탈색하여 밴드를 확인하였다.</p> <li>Western blot</li> <p>전기영동한 나머지 하나의 gel은 \( 100 \mathrm { ~V } \) 에서 1 시간 40 분간 PVDF 막(Sigma, USA)으로 전이하였다. 단백질이 전이된 PVDF 막은 methanol로 헹구고, Blotto A (5 \%-nonfat milk and \( 1 \% \)-tween 20 in saline)에서 1 시간 30 분 동안 block한 후, TBS-T solution (1 \%-tween 20 in tris-buffered saline)을 넣어 3회 세척하였다. 세척한 PVDF 막을 Blotto B (3 \%-nonfat milk and 1 \%-tween 20 in saline)과 1차 항체인 Zymed R1을 5000 : 1으로 희석한 용액에 1 시간동안 넣어 흔들어준 다음 다시 TBS-T solution으로 3회 세척하였다. 2차 항체로서는 anti-rabbit 항체(Santacruze Biotec. SC2030)를 사용하였으며 Blotto B과 \( 1: 5000 \) 으로 희석하여 1 시간 동안 blocking하였다. TBS-T solution으로 3회 씻어준 후, ECL시약(Amersham) 을 이용하여 반응한 다음 X-ray film에 노출하였다.</p></ul>