누룩의 미생물은 발효하는 과정에서 효소활성, 알코올 발효력, 유기산 및 유리 아미노산 생성에 크게 기여하며 최종적으로 각 막걸리의 맛, 향기 등의 품질 특성에 영향을 미친다. 그중 Saccharomycopsis fibuligera 는 전분을 에너지원이자 탄소원으로 이용하는 효모로, 최근에는 표피 손상과 염증성 산회질소 생산의 억제 특성을 활용해 화장품 분야에 적용하고자 하는 보고 등 다양한 분야에 활용되고 있다. 이와 관련해 본 연구에서는 다양한 지역의 시판, 농가 제조 누룩을 대상으로 하여 Saccharomycopsis fibuligera를 분리하고 군주의 성장 속도 및 \( \alpha \)-amylase 및 glucoamylase 효소 활성을 비교하여 전분분해 활성과 내열성이 우수한 균주를 분리하는 것에 목적이 있다.
<h1>누룩으로부터 분리된 전분대사 효모 Saccharomycopsis fibuligera 균주의 생육특성</h1> <p>막걸리를 비롯한 우리나라 전통주는 쌀을 주원료로 하며 자연상태의 곰팡이, 효모 및 세균을 이용하여 제조한 누룩을 발효에 필요한 효소 및 미생물 원으로 사용하여 병행복발효방식으로 제조되고 있다. 우리나라 전통주인 막걸리는 탄수화물과 단백질을 풍부하게 함유하고 있으며 원료곡물의 종류에 따라 차이가 있지만, 발효과정에서 생성된 각종 유기산, 아미노산, 비타민 등을 함유하고 있어 영양학적 가치가 높다. 막걸리는 발효에 사용한 균주, 원료곡물의 종류 및 발효환경에 따라 독특한 풍미를 나타내는 것으로 알려져 있다. 막걸리의 발효과정에는 다양한 미생물이 관여하며 Mucor 속, Rhizopus 속, Aspergillus 속 등의 곰팡이, Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula, Troulopsis 속 등의 효모 그리고 Micrococcus, Bacillus, Lactobacillus, Leuconostoc, 속 등의 세균들이 보고된 바 있다. 누룩은 밀이나 보리, 쌀 등 곡류에 물을 첨가한 후 반죽하고 성형하여 자연적으로 발효시켜서 제조하는 것이 일반적이다. 따라서 당화제의 역할을 주로 수행하는 일본의 코지와는 달리 누룩 제조 과정 동안 주변 환경으로부터 유래된 다양한 미생물이 자연적으로 생육하므로 생산된 지역의 기후나 풍토, 제조 환경 등에 따라 특색 있는 누룩이 만들어 지게 된다. 이러한 누룩에 존재하는 다양한 미생물은 효소활성, 알코올 발효력, 유기산과 유리 아미노산 생성능 등에서 차이를 나타내게 되고 결국 막걸리의 맛, 향기, 색 등의 품질 특성에 영향을 미치게 된다. 누룩의 다양한 미생물 중에서도 효모는 대부분 \( \mathrm { GRIS } \) (Generally Recognized As Safe) 균주로서 오래 전부터 주류, 장류 등의 전통발효 식품제조에 사용되고 있으며, 최근 건강기능성 식품 소비의 증가에 따라 효모에 의해서 생성되 acetylcholinesterase 저해물질, 항고혈압성 안지오텐신 전환효소 저해물질, 항통풍성 xanthine oxidase 저해물질및 항치매성 \( \beta \) -secretase 저해물질과 같은 다양한 기능성 소재들이 보고된 바 있다. 최근 막걸리에서 항고혈압활성이 우수한 Pichia burtonii 등이 분리 동정되었고, urease, amylase 등의 유용 효소생산 균주가 분리되어 산업적 이용가능성 대한 관심이 고조되고 있다. 효모는 토양, 수생환경, 식물체, 곤충, 극한 환경 등의 다양한 환경에서 생육하고 있으며, 식품, 의약품, 농업 및 산업에 중요한 영향을 미치고 있다. 가장 많은 연구가 이루어진 Saccharomyces cerevisiae의 경우 포도당 이외의 당을 대사하는 속도가 느린 편이며, 전분질을 분해할 수 없는 특징이 있다. Saccharomycopsis fibuligera 는 glucoamylase 뿐만 아니라 \( \alpha \)-amylase를 발현시켜 전분을 분해할 수 있는 능력으로 전분을 에너지원과 탄소원으로 이용할 수 있는 효모이다. \( S \). fibuligera 의 \( \alpha \)-amylase 유전자 염기서열이 보고되었으며, 유전자 변이를 통하여 효소의 내열성 증진 및 단백질 분해 활성 저감에 대한 연구결과와 S. fibuligera와 \( S \). cerevisiae를 혼합배양하여 에탄올을 생산한 연구결과가 보고된 바 있다. 가용성 전분과 Saccharomycopsis 속 미생물의 발효물은 표피 손상과 염증성 산화질소 생산의 억제 연구결과 를 활용하여 화장품 제조에 이용하려는 연구가 최근 보고되고있다. 본 연구에서는 막걸리를 비롯한 전통주 생산에 사용할 수 있는 효모종균을 탐색하기 위하여 다양한 지역에서 수집된 누룩으로부터 전분을 분해할 수 있는 효모인 \( S \). fibuligera를 분리하고 이들 균주의 성장속도, \( \alpha \)-amylase 및 glucoamylase 효소활성을 비교하고 내열성과 전분분해 활성이 우수한 균주를 분리하고자 하였다. 진주, 용인, 상주, 예산, 제주, 광주, 부산, 상주 등 8개 지역의 재래시장에서 시판되는 누룩과 농가에서 직접 제조한 누룩 11점을 수집하였다. 분쇄한 누룩 \( 1 \mathrm { ~g } \) 을 펩톤수 \( 9 \mathrm { ml } \) 에 현탁한 후, 적정 희석배수로 희석하여 chloramphenicol(100 mg/l, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 함유된 YEPD (yeast extract \( 1 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \), peptone \( 2 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \), glucose \( 2 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ), \mathrm { BD } \), Franklin Lakes, NJ, USA) 평판배지에 도말 하였다. 도말한 배지는 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 48시간 동안 배양한 후 현미경 관찰을 통하여 효모로 추정되는 집락을 분리하였다. 대조구 균주로서 \( S \). fibuligera KCTC7806 균주를 미생물자원센터(KCTC, Daejeon, Korea)로부터 분양받아 사용하였다. Internal transcribed spacer (ITS) 영역을 증폭할 수 있는 프라이머인 ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')과 ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')를 사용하여 18S rRNA 단편을 증폭하였고, NL1(5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3') 및 NLA(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG- \( 3 ^ {\prime } \) ) 프라이머[31]를 사용하여 \( 26 \mathrm { ~S } \mathrm { rDNA } \) 영역의 D1/D2 단편을 증폭 후, 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, \( \mathrm { MD } , \mathrm { USA } \) )의 BLAST를 사용하여 18S rRNA 및 \( 26 \mathrm { ~S } \mathrm { rDNA } \) 유전자 단편의 염기서열 상동성을 근거로 동정하였다. 전분분해 활성 측정을 위하여 \( 1 \% \)의 가용성 전분을 함유 YEPS (yeast extract \( 1 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \), peptone \( 2 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \), soluble starch \( 1 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ), \mathrm { BD } ) \) 고체배지를 사용하였다. 효모균주는 \( \mathrm { YEPS } \) 액체배지에서 대수증식기로 성장할 때 회수하여 멸균수로 희석하고 동량을 고체배지에 분주한 후 세포의 성장을 관찰하였다. \( \mathrm { YEPS } \) 고체배지에서 효모에 의한 가용성 전분의 분해를 관찰하기 위하여 요오드-전분 반응법을 사용하였다. 요오드용액 \( \left ( \mathrm { I } _ { 2 } 2 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \right . \), KI \( 0.5 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \), Sigma-Aldrich) 을 평판배지에 분주 한 후 10분 동안 실온에서 반응하여 생성된 투명환의 크기를 관찰하였다. 배양온도에 따른 효모균주의 비성장속도를 측정하기 위하여 \( \mathrm { YEPS } \) 액체배지에 초기 세포 흡광도 \( \left ( \mathrm { OD } _ { 600 } \right ) \)가 \( 0.1 \)이 되도록 접종한 후 각각 30,37 , \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 진탕배양기를 이용하여 배양하면서 각 균주의 대수증식기에서 비성장속도를 측정하였다.</p>