생후 2일이 지난 Sprague-Dawley rat를 clean bench에서 와우기관 분리 작업을 수행하였는데, 분리된 와우기관에서 또 분리한 코르티기관에서 basal turn만을 배양하여 실험에 사용하였다. 배양된 세포로부터 염증성 사이토카인 분비 측정과, Total RNA 분리하는 실험을 진행 하였다.
<h2>Sprague-Dawley rat에서 cochlea 분리 및 배양</h2> <p>생후 2일이 지난 렛트를 알코올로 소독한 후 clean bench에서 모든 분리작업을 수행하였다. 실험도구는 알코올에 소독한 후 사용하였으며, 렛트 두경부를 통하여 두개골을 절단하고 bullar를 노출 시킨 후 냉 생리식염수로 세척 후에 와우기관을 분리하였다. 와우기관의 배양은 collagen으로 코팅한 coverslip을 이용하였다. 먼저, coverslip을 알코올로 소독해서 12 well plate에 넣고, Type I rat-tail collagen ( \(3.76 \mathrm { ~mg } \) \( / \mathrm { ml } \) in \(0.002 ~N \) acetic acid), 10x basal medium Eagle (BME) 그리고 \(2 \% \) sodium carbonate를 9:1:1의 비율로 혼합하여 coverslip에 \( 15 ~ \mu \mathrm { l } \)씩 분주한다. 실온에서 15분 반응하여 colla-gen matrix가 완성되면 media를 첨가하였다. 와우기관 에서 분리한 코르티기관은 base, middle, apex의 세 부분으로 구분하였으며 이 연구에서는 basal turn만을 실험에 사용하였다. 코르티기관 basal turn은 12 well plate의 coverslip에 부착한 후 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) 세포 배양기에서 배양하였다.</p> <h2>염증성 사이토카인 분비 측정</h2> <p>Cisplatin에 의한 염증성 사이토카인의 생성은 \( 30 ~ \mu \mathrm { M } \)의 cisplatin을 처리한 세포배양 상층액에서 pro-inflammatory cytokine assay kit (R \&D System Inc., Minneopolis, USA)를 이용하여 ELISA 방법으로 TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \), 및 IL-6의 사이토카인을 정량하였다.</p> <h2>Total RNA의 분리</h2> <p>배양 세포로부터 total RNA의 분리는 TRizol \( ^ {\circledR } \)을 이용하였다. 세포는 냉 생리식염수로 세척하여 \( 1.5 \mathrm { ~ml } \) microtube로 옮긴 후 \( 3,000 \mathrm { ~rpm } \)에서 5분 원심분리하여, 침전물을 \( 1 \mathrm { ~ml } \) TRIzol \( ^ {\circledR } \)로 용해시킨 후, \( 200 ~ \mu \mathrm { l } \) chloroform을 첨가하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20분간 원심분리하였다. 새로운 microtube에 옮긴 상충액은 동량의 isopropanol과 혼합하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30분 반응하여 \( 13,000 \mathrm { ~rpm } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20분간 원심분리하여 침전물은 \( 80 \% \) 에탄올로 세척하였다. 세척한 RNA는 건조 후 DEPC를 처리하여 RNase 활성이 제거된 증류수로 용해시켰다. Total RNA양을 정량하기 위하여 Nano drop (Nano Drop Technologies Inc., USA)을 이용하여 시료의 total RNA의 양을 정량하였다.</p>