SDS-PAGE 분석을 통해 확인된 hemolysin의 분자량은 대략 \( 79 \mathrm{KDa} \)로 나타났으며, 이는 VFH가 강한 세포독성을 지니고 있어, 병원성 인자로서 가능성을 시사한다. 더불어, 다른 Vibrio sp. 유래의 hemolysin과 비교했을 때, VFH는 상대적으로 큰 분자량을 가지고 있다. 또한, 이것은 이전에 보고된 V. cholerae E1 Tor의 hemolysin과 유사하게, VFH 또한 동일한 용혈기작을 가지고 있을 것으로 예측된다. 이러한 발견은 VFH의 병원성 특성과 그 메커니즘을 이해하는데 중요한 정보를 제공한다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>V. fluvialis의 hemolysin (VFH)의 정제</h2> <p>V. fluvialis로부터 hemolytic 활성을 가지고 있는 단백질을 순수 분리하였으며, VFH로 명명하였다. V. fluvialis 배양 상층액으로부터 황산 암모늄을 이용한 염석법, DEAE-cellulose ion exchange column과, Mono Q column을 이용하여 정제하였다. 배양 상층액에서 약 \( 170 \mathrm{mg} \)의 단백질을 회수하였으며, 전체 용혈 활성은 \( 33,660(\mathrm{HU}) \)를 나타내었고, 마지막 Mono Q column을 통하여 \( 20 \mu \mathrm{g} \)의 순수한 VFH를 정제할 수 있었다. 정제된 단백질의 비활성은 \( 10,000 \mathrm{HU} / \mathrm{mg} \)을 나타내었으며, 정제도(purification yield)는 49.3배였다.</p> <p>정제된 단백질은 SDS-PAGE를 통해 순수도와 분자량을 측정하였으며, 이를 Fig. 1 에 나타내었다. SDS-PAGE를 통 해 확인둰 hemolysin의 분자량은 약 \( 79 \mathrm{KDa} \)의 크기를 보이는 것으로 나타났다. 이전에 보고된 바에 따르면 V. cholerae유래의 hemolysin의 경우 \( 82 \mathrm{kDa} \)의 크기로 세포 내 에서 발현된 후 두 단계의 과정을 거쳐 약 \( 65 \mathrm{kDa} \) 의 크기로 세포 밖으로 분비되는 것으로 알려져 있으며, V. mimicus의 hemolysin의 경우도 이와 같은 유사한 경로를 거쳐 \( 51 \mathrm{kDa} \)의 크기로 세포 밖으로 분비되는 것으로 보고 되었다. 이러한 결과들과 비교해 볼 때 VFH 는 다른 Vibrio sp. 유래의 hemolysin에 비해 비교적 큰 크기를 가지는 것을 알 수 있다.</p> <h2>온도가 VFH의 활성에 미치는 영향</h2> <p>온도에 따른 VFH의 용혈 활성을 측정한 결과 Fig. 2에서 보는 것과 같이 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)에서 최대활성을 보였으며 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)까지의 온도 변화시에는 상승하는 온도와 더불어용혈 활성이 비례하여 상승하였으나, \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 용혈 활성이 감소 하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 VFH가 열 안정성이 없다는 것을 보여주는 것이며, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 반응후 혈구세포를 세척하고 다시 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)에서 재반응시에 용혈현상이 일어나는 것으로 보아 용혈현상 과정은 온도에 대하여 영향을 받으며, 용혈현상이 일어나기 전에 hemolysin이 적혈구 세포막에 결합하는 과정을 필요로 하는 것으로 생각된다. 이러한 현상은 이전에 보고된 V. cholerae E1 Tor의 hemolysin과 유사한 것으로 VFH 역시 같은 용 혈기작을 가지고 있는 것으로 추정된다.</p> <h2>VFH가 RTG-2 cell에 미치는 세포독성</h2> <p>Vibrio fluvialis로부터 정제한 hemolysin, VFH가 세포에 미치는 세포독성을 rainbow trout gonadal fibroblast 세포 주인 RTG-2 세포주를 이용하여 조사하였다. Fig. 3에서 보듯이 정제된 VFH \( (50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)를 RTG-2에 약 4시간 처리 후에, 세포주가 구형으로 형태가 변형되었음을 알 수 있었다.또한 VFH가 세포독성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 세포 사멸시 방출되어 나오는 LDH의 양을 측정하였으며, \( 10 \sim 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 정제된 VFH를 배양된 RTG-2 세포주에 처리한 후 4시간 동안 처리한 후에 상층액의 LDH 양을 비 교하였다. \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 VFH 처리시에는 약 \( 16 \% \)의 세포 사멸율을 나타내었고, \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 VFH를 처리하였을 때 \( 80 \% \)의 세포 사멸율을 나타내었다. Fig. 4에서 보는 바와 같이 세포 사멸율은 첨가된 VFH의 양에 따라 비례적으로 증가하였다. 따라서 V. fluvialis 의 hemolysin인 VFH는 어 류유래세포에 강력한 세포독성은 나타내는 중요한 세포 상해성 인자라고 생각된다. 또한 이러한 결과는 VFH가 강력한 세포독성을 가지고 있는 병원성 인자로서의 가능성을 보여주고 있다.</p>