폐글리세롤이 첨가된 배지에서 생산 균주를 배양한 후 생산균주의 세포 생장 및 ALA 생산량을 비교하여 ALA 생산은 세포생장과 함께 시작되었으며 세포 생장속도가 감소됨에 따라 그 속도가 감소하였지만 지속적인 생산이 이루어져 배양 96시간에 그 농도가 \( 2,193 \mathrm{mg} /l \)에 도달하였다.한편, 엔지니어링 균주의 초기 생장은 대조군 균주의 생장과 비슷하여 순수 글리세롤이 첨가된 배지에서 얻은 값보다 낮았으므로 이를 향상시키기 위하여 otsBA 발현을 최적화하기 위한 실험을 수행하였다.트레할로스가 폐글리세롤의 독성을 약화시키는지 여부를 조사하기 위하여 폐글리세롤이 포함된 기본 배지에 배양 30시간에 \( \mathrm{OD}_{600} \)가 10.8에 도달하였고 배양 50시간 이후에는 생장속도가 감소되었지만 계속 생장하여 배양 96시간에 \( \mathrm{OD}_{600} \)가 26에 도달하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>폐글리세롤의 독성약화에 미치는 트레할로스 영향</h2> <p>순수 또는 폐글리세롤이 첨가된 배지에서 ALA 생산 균주 (E. coli/pH-hemA)를 4일간 배양한 후 생산균주의 세포 생장 및 ALA 생산량을 비교하였다. 순수 글리세롤이 첨가된 배지(PG, 대조군)에서 얻은 세포밀도 \( \left(\mathrm{OD}_{600}\right) \)는 18이었고 생산된 ALA 농도는 \( 960 \mathrm{mg} /l\)였다. 반면 폐글리세롤이 첨가된 배지(CG)에서 \( \mathrm{OD}_{600} \)는 10이었고 ALA 농도는 \( 800 \mathrm{mg} /l \)였다. 본 결과는 폐글리세롤이 첨가된 배지에서 얻은 세포밀도와 ALA 생산량은 순수 글리세롤이 첨가된 배지에서 얻은 값보다 각각 1.8배와 1.2배 낮음을 보여준다. 이는 폐글리세롤이 세포 생장을 저해함으로써 ALA 생산을 감소시킨다는 것을 나타낸다.</p> <p>트레할로스가 폐글리세롤의 독성을 약화시키는지 여부를 조사하기 위하여 폐글리세롤이 포함된 기본 배지에 두 농도 범위(30과 \( 100 \mathrm{~g} / \mathrm{l}) \)의 트레할로스를 첨가한 후 생산균주를 배양하였다. \( 30 \mathrm{~g} /l\)의 트레할로스를 첨가한 배지(CG + Tre-30)에서 \( \mathrm{OD}_{600} \)는 13이었고 생산된 ALA 농도는 \( 900 \mathrm{mg} /l \)였다. 이는 트레할로스를 포함하지 않은 배지(CG)에서 얻은 세포 밀도와 ALA 생산량보다 각각 \( 30 \% \)와 \( 12.5 \% \) 높음을 나타낸다. \( 100 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 트레할로스를 첨가한 배지(CG + Tre-100)에서 \( \mathrm{OD}_{600} \)와 \( \mathrm{ALA} \) 농도는 각각 11과 \( 878 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \) 로 관찰되었다. 이는 트레할로스를 첨가하지 않은 배지(CG)에서 보다 세포밀도는 \( 10 \%, \mathrm{ALA} \) 생산량은 \( 9.8 \% \) 높지만 \( 30 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 트레할로스를 첨가한 배지(CG+Tre-30)에서 보다는 약간 낮음을 나타낸다. 본 결과는 트레할로스가 폐글리세롤의 독성으로부터 생산균주를 보호하고 그 효과를 극대화시키기 위해서 최적 농도로 첨가되어야 한다는 것을 시사한다.</p> <p>순수 글리세롤과 트레할로스가 첨가된 배지에서 세포생장 및 ALA 생산량을 측정하였고 이를 Fig. 2에 나타내었다. 첨가되는 트레할로스의 농도를 \( 100 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)로 증가시킴에도 불구하고, 얻은 세포밀도와 ALA 생산량에서 큰 차이를 발견할 수 없었다. 이는 고농도의 트레할로스가 생산균주의 생장 및 ALA 생합성을 저해하지 않음을 보여주는 결과이다. 호환성 용질(compatible material)인 트레할로스는 미생물이 삼투압 스트레스 하에서 세포의 탈수를 방지하기 위해 세포 내에서 생합성되는 물질이므로 세포 내·외부에 고농도\( (>100 \mathrm{~g} / \mathrm{l}) \)로 존재하더라도 세포 생장이 저해 받지 않는 것으로 알려졌다. 이미 언급하였듯이 본 연구팀의 선행연구에 의하면 퍼록사이드가 폐글리세롤의 독성을 유발하는 핵심 성분이었다. 따라서 퍼록사이드에 대한 미생물의 저항성을 높일 수 있다면 폐글리세롤에 대한 저항성도 동시에 향상될 것으로 판단되었다. Benaroudj 등은 \( 500 \mathrm{mM}(180 \mathrm{~g} / \mathrm{l}) \)의 트레할로스를 첨가한 배지에서 생장한 균주가 무기 퍼록사이드 \( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \)에 대한 높은 저항성을 보인 실험적 증거를 제시하였다. 기존의 보고자료와 기초실험 결과를 바탕으로 ALA 생산균주에 트레할로스 생합성 유전자인 ots\( B A \)를 추가로 발현시켜 트레할로스 생합성을 유도한다면 생산균주가 폐글리세롤에 대한 저항성이 향상되어 생장저해 없이 폐글리세롤을 탄소원으로 사용하여 ALA를 생산할 것으로 예상되었다.</p> <p> <h2>hemA와 ots\( B A \)를 공동발현하는 ALA 생산균주의 폐글리세롤에 대한저항성 테스트</h2> <p>ALA를 생산하는 균주 (E.coli/pH-hemA)에 ots\( B A \)를 추가적으로 도입한 엔지니어링 균주(E.coli/pH-hemA/pS-otsBA)와 벡터만을 도입한 대조군 균주(E.coli/pH-hemA/pSTV28)를 제작하여 두 균주의 생장 및 생산 특성을 비교함으로써 \( o t s B A \)의 추가 발현에 따른 영향을 조사하였다. Fig. 3은 순수 글리세롤이 포함된 배지에서 두 균주의 세포 생장 및 ALA 생산거동을 보여준다. 두 종류의 균주들은 12시간의 지연기를 거친 후, 생장과 함께 ALA 생산을 개시하였다. 대조군 균주는 지수성장기를 거쳐 배양 36시간 만에 \( \mathrm{OD}_{600} \)가 11.5에 도달하였고 이후 정체기로 접어들어 더 이상의 세포 생장이 관찰되지 않았다. 균주는 세포생장이 멈춘 후에도 지속적으로 ALA를 생산하여 배양 60시간 만에 최대량인 \( 1,771 \mathrm{mg} /l \)를 생산하였다. 한편, 엔지니어링 균주의 초기 생장은 대조군 균주의 생장과 비슷하여 배양 30시간에 \( \mathrm{OD}_{600} \)가 10.8에 도달하였고 배양 50시간 이후에는 생장속도가 감소되었지만 계속 생장하여 배양 96시간에 \( \mathrm{OD}_{600} \)가 26에 도달하였다. ALA 생산은 세포생장과 함께 시작되었으며 세포 생장속도가 감소됨에 따라 그 속도가 감소하였지만 지속적인 생산이 이루어져 배양 96시간에 그 농도가 \( 2,193 \mathrm{mg} /l \)에 도달하였다.</p> <p>다음은 폐글리세롤이 첨가된 배지에서 두 종류의 균주를 배양하며 시간에 따른 세포 생장 및 ALA 생산 거동을 비교하였다. Fig. 4에 나타내었듯이, 대조군 균주는 24 간 동안 생장하여 \( \mathrm{OD}_{600} \)가 8.4에 도달한 후, 생장을 멈추었다. 반면 엔지니어링 균주는 30시간까지 지수생장을 하여 \( \mathrm{OD}_{600} \)가 0.3에 도달하였다. 그런 후, 생장속도가 감소하였으나 꾸준히 \( \mathrm{OD}_{600 \text { }} \)가 증가하여 배양 66시간 후에 14.8에 도달하였다. 두 균주 모두 세포 생장과 함께 ALA 생산을 시작하였고 세포 생장이 멈춘 후에도 ALA를 생산하였다. 대조군 균주는 배양 84 시간 만에 \( 896 \mathrm{mg} /l \)의 AL를 생산한 반면, 엔지니어링 균주는 배양 96시간 동안 \( 1,320 \mathrm{mg} /l \)를 생산하였다.</p> <p>Table 2에 순수 글리세롤과 폐글리세롤이 첨가된 배지에서 두 균주의 생장 및 생산 거동을 비교하였다. 순수 글리세롤이 첨가된 배지에 비하여 폐글리세롤이 첨가된 배지에서 대조군 균주의 세포밀도는 1.2배 낮았고 ALA 생산량은 약 2배 낮았다. 뿐만 아니라, 최대 ALA 농도에 도달하는데 더 긴 배양 시간이 소요되어 부피생산성(volumetric productivity)은 2.8 배 낮았다. 한편, 엔지니어링 균주는 순수 글리세롤 대비 폐글리세롤이 첨가된 배지에서 세포생장은 1.8배, ALA 생산량은 1.7배 낮았다. 비생산성은 비슷한 수준을 유지하였지만 부피생산성은 1.7배 낮았다. 순수 글리세롤이 첨가된 배지에서 엔지니어링 균주는 대조군 균주보다 1.2배 많은 ALA를 생산하였으나 생산에 더 긴 시간이 소요되어 부피생 산성은 오히려 낮았을 뿐만 아니라 단위 세포당 ALA 생산량(비생산성, specific productivity)도 대조군 균주보다 낮았다. 그런데 폐글리세롤이 첨가된 배지에서 얻은 엔니지어링 균주의 세포 밀도, ALA 생산량, 부피 생산성 및 비생산성은 대조군 균주의 결과치들 보다 높아 ots\( B A \) 발현이 폐글리세롤에 대한 생산균주의 저항성을 향상시키는데 기여했다고 판단되었다. 그러나 폐글리세롤이 첨가된 배지에서 얻은 엔지니어링 균주의 세포 밀도 및 ALA 생산량이 순수 글리세롤이 첨가된 배지에서 얻은 값보다 낮았으므로 이를 향상시키기 위하여 otsBA 발현을 최적화하기 위한 실험을 수행하였다.</p>