키틴은 N-acetylglucosamine (GlcNAc)로 이루어진 고분자 물질로, 생합성되고 일부는 진균의 세포벽 성분으로 존재하며, Bernard에 의해 처음 밝혀진 키틴 분해효소는 Bacillus 속 미생물이 생성하고 있으며, Aeromonas, Arthrobacter, Clostridium, Enterobacter, Pseudomonas, Serratia, Streptomyces 등과 같은 미생물들도 키틴 분해효소를 생성한다. 키틴 분해효소는 의약품 및 식품분야, 글루코사민(glucosamine) 유사 키틴 단량체(GlcNAc) 생산, 식물 병원성 진균의 생장 억제 등 산업적으로 다양하게 활용되고 있다. 또한 키틴 분해효소를 산업적으로 활용하기 위해 미생물을 분리하여 선발한 후 이화학적 특성을 확인하였다.
<h1>서 론</h1> <p>생태계에서 합성되는 바이오매스에는 키틴, 셀룰로오스, 단백질, 지질, 탄수화물, 리그닌 등과 같이 매우 다양한 성분들이 존재하는데 그 중에서 키틴은 N-acetylglucosamine (GlcNAc)이 \( \beta-1,4 \) 결합으로 중합되어 있는 고분자 물질로서 주로 절족동물과 곤충, 해양 무척추동물 등에 의해서 생합성되고 일부는 진균의 세포벽 성분으로 존재한다. 키틴은 매년 약 10 억톤 정도 생성되며, 분자 구조는 셀룰로오스와 유사하지만 쉽게 분해되지 않는다.</p> <p>키틴 분해효소는 N-acetylglucosamine 중합체의 \( \beta-1,4 \) 결합을 가수분해하는 효소로 Bernard 에 의해 처음 난초에서 키틴 분해효소의 존재가 밝혀졌으며, 이후로 키틴 분해효소가 다양한 생물 종으로부터 발견되어 많은 연구가 진행되었다. 최근에는 사람에게도 키틴 분해효소가 존재하는 것으로 보고되어 있다. 최근에 사용되고 있는 산업용 세균유래 키틴 분해효소들은 주로 Bacillus 속 미생물이 생성하고 있으며 그 외에 Aeromonas, Arthrobacter, Clostridium, Enterobacter, Pseudomonas, Serratia, Streptomyces 등과 같은 미생물들도 키틴 분해효소를 생성하는 것으로 보고되었다.</p> <p>키틴 분해효소를 활용한 산업은 매우 다양하며, 고전적인 황산과 염산을 이용한 산가수 분해방법을 사용해 온 의약품 및 식품분야에 키틴 분해효소를 적용하고 있다. 퇴행성 관절염의 통증 완화에 효과가 있는 글루코사민(glucosamine) 유사 키틴 단량체(GlcNAc) 생산에도 이용하고 있으며, 또한 진균의 외벽을 이루고 있는 키틴의 \( \beta-1,4 \) 결합을 분해함으로서 식물 병원성 진균의 생장을 억제하는 친환경 방제제로도 사용하고 있다. 현재까지 화학농약은 식물병해를 예방함으로써 식용 및 약용 작물의 수확량을 증대시켰지만, 잔류 독성과 농약으로 인한 환경오염 및 농업생태계 파괴, 식물 병원성 진균의 농약에 대한 내성 증가와 같은 부작용이 발생되었다. 따라서 최근 친환경 생물학적 방제로서 미생물 유래 바이오제제에 대한 관심이 높아지고 있는 추세이다.</p> <p>본 연구는 키틴 분해효소를 산업적으로 활용하기 위해 키틴 분해활성이 우수한 미생물을 지렁이 장내에서 분리 및 선발하였고, 선발 미생물이 생산하는 키틴 분해효소를 정제하고 이화학적 특성을 확인하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>미생물 분리 및 배양</h2> <p>키틴 분해활성이 있는 미생물의 분리는 지렁이 농장(강원도 홍천)에서 지렁이(Eisenia fetida)를 구입하여 각종 우분, 도축 부산물, 키틴, 제지 슬러지, 톱밥 등을 먹이원으로 공급하면서 16 주동안 지렁이를 사육하였다. Clean bench내에서 지렁이 표면을 70 \% ethanol로 소독하고 화염 멸균한 blade로 절개한 후, 지렁이 장 내용물을 취해 \( 0.85 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \mathrm { NaCl } \) 용액에 현탁하였다. 현탁액 \( 1 \mathrm { ml } \) 를 \( 0.85 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \mathrm { NaCl } \) 용액 \( 9 \mathrm { ml } \) 에 십진 희석하여 \( 2 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) colloidal chitin이 포함된 screening 고체배지 \( \left (0.2 \% \right . \) colloidal chitin, \( 0.07 \% \mathrm { ~K } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } \), \( 0.03 \% \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } , 0.05 \% \mathrm { MgSO } _ { 4 } \cdot 5 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } , \quad 0.001 \% \mathrm { FeSO } _ { 4 } \cdot \) \( 7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } , 0.001 \% \mathrm { ZnSO } _ { 4 } , 0.01 \mathrm { ~g } \mathrm { MnCl } _ { 2 } , 0.2 \% \) yeast extract, \( 1.5 \% \) agar powder)에 도말하였고 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 48 시간동안 배양하였다. 배양 후 분해환(clear zone)을 형성하는 미생물 군집을 순수 분리하였다.</p> <h2>Colloidal chitin 제조</h2> <p>키틴(Sigma Co., USA) \( 40 \mathrm { ~g } \) 을 \( \mathrm { HCl } \) 용액 \( 400 \mathrm { ml } \) 에 넣어 상온에서 30 분간 교반하였다. 염산에 의해 갈색으로 점액질용액이 된 키틴에 증류수 \( 2 \mathrm { ~L } \) 를 첨가하여 약 2 시간 동안 교반하였고 Whatman No.2 여과지(Whatman Intl. Ltd., England)를 이용하여 감압여과를 수행하였다. 키틴 수용액의 \( \mathrm { pH } \) 가 \( 6.0 \) 이 될 때까지 감압여과를 반복하였다. 최종 생성된 colloidal chitin은 \( 121 ^ {\circ } \mathrm { C } , 15 \) 분동안 멸균하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 보관하였으며, sodium acetate buffer ( \( \mathrm { pH } \) 5.0)에 colloidal chitin을 혼합하여 기질로 사용하였다.</p>