본 절에서는 구강암 세포주 배양 방법을 소개하며, 세포 증식능 검색, TUNEL assay, Western blot , 유세포 계측, GFP-LC3 dot 검색방법에 대해 기술한다. SCC-\(4\) 및 SCC-\(9\)세포의 증식능과 관련해 DHA 등의 영향은 colorimetric MTT assay가 사용되었으며, TUNEL assay에서는 핵을 염색을 위해 DAPI가 사용되었고, confocal microscopy를 통해 검경이 진행되었다. 다음으로 Western blot의 경우 ECL Western blotting detection system이 사용되었으며, 이를 통해 단백질 band를 분석하였다. GFP-LC3 dot 검색의 경우 형광현미경을 통해 검경이 진행되었다. 위 과정을 통해 얻은 결과의 통계처리는 student's t-test를 통해 처리되었다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험재료</h2><p>Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12), fetal bovine serum (FBS) 등 세포배양에 필요한 시약들은 GIBCO-BRL사(Gaithersburg, MD)에서, PARP, \( \beta \)-actin 등의 항체는 Santa Crut사(California, DA), p-AKT\(^{\mathrm{Th} 308}\), p-AKT\(^{\text {Ser473, }}\), p-mTOR, LC3 등의 항체는 Cell Signalig사(Beverly, MA). DHA는 Cayman Chemical사(Ann Arbor, MI)에서, sodium dodecyl sulfate (SDS) 등은 Sigma사 (St. Louis, MO)에서, 구입하였으며 그 외 다른 시약은 특급의 것을 사용하였다.</p><h2>구강암 세포주의 배양</h2><p>구강암 세포주 SCC-4 및 SCC-9의 배양은 \( 10 \% \) heat-in-activated FBS, penicillin (\(100\ \mathrm{units/ml}\)), streptomycin (\(100\ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)을 첨가한 DMEM/F12 (1:1)을 배양액으로 \( 5 \%\ \mathrm{CO}_{2} \), \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 배양하고, 세포의 밀도가 높아지면 수분간의 trypsin-EDTA \( (0.05 \% \) trypsin, \( 0.02 \% \) EDTA in Hank's balanced salt solution without calcium and magnesium)로 처리하고 실험 시 지수기에 있도록 계대배양 하였고, 모든 실험은 FBS가 포함되지 않은 배지로 교환한 다음 24시간 후 시행하였다.</p><h2>세포 증식능 검색</h2><p>SCC-4 및 SCC-9세포의 증식능에 대한 DHA 등의 영향은 colorimetric MTT assay를 이용해 측정하였다. 즉 96 well microtiter tissue culture plate에 구강암 세포를 \(5-10\ \times\ 10^{3}\ \mathrm{cells/well}\)로 plating하고 하룻밤 배양 후 FBS가 포함되지 않은 배지로 교환한 다음 24시간 배양하고 DHA 등을 농도별로 처리하였다. 24시간 배양한 다음 세포의 배양액을 제거하고 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) \( (0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 용액으로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 반응시키고 상청액을 제거한 후 Dimethyl sulfoxide에 녹여 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 automatic ELISA plate reader로 흡광도를 측정하였다.</p><h2>Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assay</h2><p>SCC-4 및 SCC-9 세포를 \( 5 \times 10^{4} \mathrm{cells/well}\)로 cover glass가 들어있는 24-well plate에 plating한 후 DHA 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이들 세포를 PBS로 2회 washing한 다음 \( 4 \% \) paraformaldehyde로 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 고정시킨 다음 \( 0.2 \% \) TritonX-100으로 처리한 후 DeadEND Fluorometric TUNEL System (Promega, Madison, WI) kit를 사용하여 분해된 DNA에 anti-digoxigenin-phosphatase를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4시간 동안 반응시켜 붙였다. 이들 세포는 PBS로 3회 세척한 후 3,3-diaminobenzidine DAB를 이용하여 발색 시킨 후 4' ,6- diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI)로 핵을 염색한 것을 mounting medium을 넣고 coverslip으로 밀봉시켜 confocal microscopy (Olympus \( { }^{\mathrm{TM}} \))로 검경, 촬영하였다.</p><h2>Western blot</h2><p>SDS-PAGE 후에 분리된 단백을 전기적 전사법으로 nitrocellulose membrane에 옮긴 후 전사된 nitrocellulose membrane을 \(5\%\) skim milk로 실온에서 1시간 blocking한 다음 동일 용액으로 PARP, \( \beta \)-actin 등의 항체(1:1,000)로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 하룻밤 반응시켰다. 이 후 TBS-T로 수회 세척하고 peroxidase conjugated 된 이차항체를 \( 5\% \) skim milk/TBS-T용액에 1:10,000으로 희석하여 1시간 반응 시키고 TBS-T로 수회 세척한 후 ECL Western blotting detection system을 이용하여 단백질 band를 확인하였다.</p><h2>유세포 계측(Flow cytometric analysis)</h2><p>DHA를 일정시간 동안 처리하여 배양한 세포를 trysin-EDTA로 처리한 후 세포를 모아 원심분리 하여 pellet를 PBS에 부유시킨 다음 \( 70 \% \) ethanol로 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)에 사용 전까지 보관하였다. 유세포 계측은 ethanol로 고정된 세포에 RNase A \( (0.25\ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)을 처리한 후 propidium iodide \( (50\ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)를 이용하여 염색하고, spectra/Mesh Nylon로 filter하여 측정하였다. 세포주기별 분포율은 FACscan (Becton Dickinson)의 FL-2A와 FL-2W linear plot에 근거하여, Cell Quest software를 이용한 histogram으로 계산하였다.</p><h2>GFP-LC3 dot 검색</h2><p>SCC-4 및 SCC-9 세포를 6-well culture plate에 \( 80 \% \) confluent하게 plating한 후 \( 0.5\ \mathrm{\mu g/ well} \)로 green fluorescence (GFP)-LC3 plasmid 등을 lipofectamine (Invitrogen, Camarllo, CA)을 이용하여 transfection 하였다. Transfection된 세포에 DHA 등의 약물을 일정시간 처리한 후 형광현미경으로 GFP-LC3 dot를 검경, 촬영하였다.</p><h2>통계분석</h2><p>표시된 결과는 3번 이상의 독립적인 실험 결과이며, 실험 결과의 통계 처리는 student's t-test에 준하여 처리하였고, P-value가 최대치 0.05 \((p<0.05) \) 이하인 경우를 유의한 것으로 판정하였다.</p>