DNeasy Plant Maxi Kit를 사용하여 카나마이신 저항성 캘러스로부터 genomic DNA를 추출하였으며, 형질전환 담배 배양세포에서 생성된 PEDV 스파크 단백질의 존재를 dot 분석으로 확인하였다. 추출된 DNA는 HindIII로 절단 후 agarosegel에 전기영동하여 Zeta Probe membrane에 전이시켰다. 형질전환 담배 배양세포에서는 \( 50 \mathrm{mM} \)의 potassium phosphate buffer를 사용하여 전체 수용성 단백질을 추출하였으며, anti C-Myc 일차 항체와 peroxidase conjugated anti-rabbit IgG 이차 항체를 사용하여 단백질의 존재를 확인하였다.
<h2>Southern blot 및 northern blot 분석</h2> <p>DNeasy Plant Maxi Kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 카나마이신 저항성 캘러스로부터 genomic DNA를 분리하였다. 분리한 DNA \( (30 \mu \mathrm{g}) \)를 HindIII로 절단하여 \( 0.8 \% \) agarosegel에 전기영동한 후, Zeta Probe membrane (Bio-Rad 제품)으로 전이시켰다. Probe는 nptII 유전자를 PCR로 합성하여 이용하였다 (700 bp). 이 DNA를 동위원소 \( \left[\alpha-^{32} \mathrm{P}\right] \mathrm{dCTP} \)로 labelling시켜 prehybridization용액 (Zeta Probe membrane 용)에 첨가하여 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 혼성화시켰다. 반응을 바친 membrane을 세척하고 X-ray 필름에 노출시켜 밴드를 확인하였다.</p> <p>형질전환 담배배양세포에서 도입된 PEDV 유전자가 정상적으로 발현되는지를 알아보기 위하여 RNA를 추출해 northern blot 분석을 수행하였다. 형질전환 담배배양세포 \( 1 \mathrm{~g} \)을 액체질소를 이용하여 막자사발에서 곱게 분쇄하였다. 여기에 5\( \mathrm{mL} \)의 TRI 시약 (Molecular Research Center, MRC)를 이용하여 일상의 방법에 의해 RNA를 분리하였다. Probe는 PEDV 스파크 단백질 유전자 특이 primer (Table 1)를 이용하여 각각 PCR로 합성한 DNA 단편들을 이용하였으며 이후 Southern blot 시와 동일한 방법으로 수행하였다.</p> <h2>Dot blot 분석</h2> <p>형질전환 담배 배양세포로부터 생산되는 PEDV 스파크 단백질을 확인하기 위하여 dot 분석을 실시하였다. 형질전환 담배 배양세포로부터 \( 50 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 7.0)를 사용하여 전체 수용성 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질 \( 80 \mu \mathrm{g} \)을 nitrocellulose membrane으로 전이하였다. 일차 항체는 anti C-Myc를 사용하였으며 TBST로 세척한 후 이차 항체 (peroxidase conjugated anti-rabbit IgG)로 membrane을 1시간 동안 반응시킨 후 ECL kit (amersham pharmacia biotech사)로 감지하였다</p> <h2>형질전환 담배 배양세포유래 PEDV 스파크 단백질의 활성 분석</h2> <p>형질전환 담배 배양세포로부터 생산되는 PEDV 스파크 단백질의 면역활성을 조사하기 위하여 dot blot 조사에서 가장 높게 발현하는 형질전환 세포주 (35S::SP1-M의 3번, 35S::SP2-M의 74번, 35S::SP3-M의 61번, 35S::SP4-M의 56번)를 현탁배양하여 동결건조 시킨 후 PBS로 현탁액을 만들어 6주령의 BALB/c 마우스에 1일 1회 씩 3주간 \( 200 \mathrm{mg} / \) 마우스에 연속 투여하였고 총 6마리를 이용하였다.</p> <p>마우스로부터 채혈은 최초 투여시작 후 3주부터 7주까지 매주 1회 안구로부터 1회 약 \( 300-500 \mu \mathrm{L} \) 의 혈액을 채혈하여 혈청을 분리하여 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동고에 보관하였다. 마우스로부터 얻은 serum을 \( 56^{\circ} \mathrm{C} \) 항온 수욕조에서 30분간 불활화하였다. Serum free MEM \( 50 \mu \mathrm{L} \)를 96-well culture plate의 각 well에 넣고 5배 희석한 mouse 혈청 \( 50 \mu \mathrm{L} \) plate의 첫 well에 가하여 2배로 희석한 후 동량의 바이러스 희석액 \( 50 \mu \mathrm{L}(1 \)\( \mathrm{X} 100 \mathrm{TCID}_{50} / 0.1 \mathrm{~mL} \) )를 각각의 well에 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \)를 함유하는 배양기에 1 시간 동안 항체항원 반응을 시킨 다음 Vero cell 부유액 \( 100 \mu \mathrm{L} \)를 각 well에 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \)\( \mathrm{CO}_{2} \)를 함유하는 배양기에 배양하면서 CPE (cytopathic effect)를 관찰하였다. CPE가 관찰된 최종 희석배수를 항체역가로 산정하여 면역원성을 측정하였으며 총 6일 동안 관찰하였다.</p>