본 연구에서는 EDTA, β-ME, KPO4 용액에 단백질과 요소를 첨가한 후, 25℃에서 12시간 동안 구조풀림 평형실험을 수행하였다. 또한, 트립신을 첨가한 후 30분 동안 반응시킨 후 Shodex KW-804 칼럼을 사용하여 HPLC로 단백질을 측정하였다. Y173F 치환체의 영향을 평가하기 위해 이중 치환체를 만들고 대장균에서 발현, SDS-PAGE로 양을 확인하였다.
<h2>단백질 구조 풀림 평형(equilibrium unfolding) 연구</h2> <p>구조풀림 평형실험은 \( 0.2 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 1 \mathrm { mM } \beta- \mathrm { ME } , 10 \) \( \mathrm { mM } \mathrm { KPO } 4 \) 용액 \( ( \mathrm { pH } \) 7.8)에 있는 단백질 \( (0.15-0.2 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \) 에 요소(urea)를 첨가한 후 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 12 시간 평형시킨 후 측정했다. 형광은 \( 275 \mathrm { ~nm } \) 홍분광선으로 \( 303 \mathrm { ~nm } \) 에서 형광광도분도계 F-4500 (Shimadzu, Japan)로 측정 했다. 원편광이 색성(CD, circular dichroism)은 \( 260 \sim 205 \mathrm { ~mm } \)에서 \( 0.5 \mathrm { ~mm } \) cell을 사용하여 J-715 원편광이색성 분광계(spectropo-larimeter) (JASCO, Japan)로 측정하였다. 데이터 분석은 기술된 논문에 따라 처리 했다.</p> <h2>ANS (1-anilino-8-naphthalenesulfonate) 결합 및 트립신 처리</h2> <p>메탄올에 녹인 ANS의 농도는 \( 370 \mathrm { ~nm } \) 에서의 홉광도(몰홉광계수 \( \left .6800 \mathrm { M } ^ { -1 } \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \) 로 측정 했다. 단백질 에 12 시간 요소를 첨가한 후 단백질 몰수의 50 배 ANS롤 첨가하여 2 시간 후에 측정하였다. ANS는 \( 370 \mathrm { ~nm } \) 홍분광선으로 \( 490 \mathrm { nm } \) 형광을 측정하였다. 트립신 처리는 단백질을 상온에서 \( 10 \mu \mathrm { g } \) 트립신을 넣고 30 분 후 Shodex (Japan) KW-804 칼럼을 사용한 HPLC로 \( (0.5 \mathrm { ml } / \mathrm { min } ) 280 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다.</p> <h1>결 과</h1> <h2>여러가지 단일 잔기치환 트립토판 중합효소 \( a \) 소단위체 (aTS) 응집에 억제효과를 보이는 \( Y173F \) 치환</h2> <p>이전의 연구에서 \( Y4C \) (41번 Tyr이 Cys로 치환), \( P28L \), \( P28S \), \( S33L \), \( G44S \), \( D46N \), \( P96L \), \( P96S \)은 심한 응집 성질을보여주었다. 이들 치환체에 미치는 영향을 보기 위해 이들 치환체에 \( Y173F \)가 추가된 이중 치환체롤 만들었고, 대장균에서 발현시켜 용해형과 응집형의 양을 SDS-PAGE로 확인하였다(Fig. 1). 8가지 모두에서 \( Y173F \)의 추가 치환으로 응집형에서 용해형으로 발현 패턴이 바뀌었다. \( Y173F \) 치환이 응집을 억제하는 것을 알 수 있다.</p>