열 안정성, pH 안정성 및 분자량에 따른 활성능 측정을 위해 배양액과 세포파쇄액을 대상으로 실험을 수행하였다. 열 안정성은 95도의 물에서 5분, 10분, 30분간 처리한 후 급냉하여 살조활성을 측정하였다. pH 안정성은 HCl과 NaOH를 이용하여 pH를 2, 7, 10으로 조절하고 24시간 동안 실온에서 정치한 후 다시 pH를 8.0으로 조절하여 살조활성능을 측정하였다. 분자량에 따른 활성능은 100 kDa, 10 kDa, 3 kDa 여과막(Amicon사)을 이용하여 단계별로 여과된 배양액의 살조활성능을 측정하였다.
<p>열안전성은 cell-free 배양액과 세포파쇄 상층액을 끊는 물 (약 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \))에 5분, 10분, 30분간 처리한 후 급냉하여 살조활성을 측정하였다. \( \mathrm { pH } \) 안전성은 cell-free 배양액과 세포파쇄 상층액은 \( \mathrm { HCl } \)과 \( \mathrm { NaOH } \)를 이용하여 \( \mathrm { pH } \)를 2, 7, 10으로 조절하여 24시간 동안 실온에 정치한 후 다시 \( \mathrm { pH } \)를 8.0로 조절하여 살조활성능를 측정하였다. 분자량에 따른 활성능은 배양액과 세포 파쇄액을 대상으로 \( 100 \mathrm { ~kDa } , 10 \mathrm { ~kDa } \) 및 \( 3 \mathrm { ~kDa } \) 여과막(Amicon사)을 이용하여 단계별로 여과된 배양액을 대상으로 살조 활성능을 측정하였다.</p> <h2>물질분리</h2> <p>살조물질의 분획 및 분자량유추는 다음과 같이 실시하였다. 분획을 위한 농축액은 51Jar fermenter를 이용하여 3 1의 배양액을 얻었으며 감압농축기를 이용하여 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 수분을 완전히 제거하였다. 증발잔류물질로부터 살조물질을 분리하기 위하여 증발잔류물질과 \( \mathrm { MeOH } \)을 1대 3의 비율 \( ( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \)로 혼합, 정치한 후 \( \mathrm { MeOH } \)층만을 감압 \( \cdot \) 농축하여 시료로 이용하기 전까지 \( -70 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 보관하였다. 농축과정 중 생성된 잔류 염분은 여과지와 원심분리 \( \left (4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 10,000 \times g, 10 \mathrm { ~min } \right ) \)방법에 의하여 제거하였다. 추출된 물질로부터 분자량별 분획을 얻기 위하여 gel permeable chromatography (Resin; Bio-rad P2, column; \( 10 \times 1,200 \mathrm { ~mm } \), flow rate; \( 0,1 \mathrm { ~ml } / \mathrm { min } \), fraction vol; \( 1 \mathrm { ~ml } / \mathrm { tube } \))를 통하여 분획물을 얻었다. 분자량 유추를 위해 사용된 molecular marker는 glucose ( \( \mathrm { MW } ~180 \)), sucrose ( \( \mathrm { MW } ~342 \)), raffinose ( \( \mathrm { MW } ~504 \)), vitamin \( B_ { 12 } \) ( \( \mathrm { MW } ~1,350 \))이용하였으며 당의 검출은 환원당 정량방법을, vitamin \( B_ { 12 } \)는 \( 550 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 분획물을 대상으로 Cochlodinium polykrikoides에 대한 살조활성능 \(( \% \))과 암모니아 이온의 농도를 측정하였다. 또한 살조활성능을 갖는 분획물의 잔존염류 분석은 ICP/MS를 이용하였다.</p>