단백질의 정량은 Ohnishi 등의 정량법에 따라 실시하였다.검량 곡선 작성을 위한 표준물질은 bovine serum albumin 을 사용해서 분리 선발한 미생물의 동정은 Gram 염색과 현미경 관찰을 통해 형태학적 특성을 조사하였다.
<h2>단백질 정량</h2> <p>단백질의 정량은 Ohnishi 등의 정량법에 따라 실시하였다. 시료용액 \( (50 \mu \mathrm{L}) \) 에 \( 550 \mu \mathrm{L} \) 의 biuret reagent \( (0.75 \mathrm{mmol} / \) \( \mathrm{L} \) cupric sulfate, \( 94 \mathrm{mmol} / \mathrm{L} \) sodium hydroxide)를 넣어 혼합한 후, 실온에 10 분간 방치하였다. 그 후에 \( 25 \mu \mathrm{L} \) 의 folin and ciocalteu's phenol reagent(Sigma, USA)를 넣고 실온에 30 분동안 방치한 후, \( 725 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 검량 곡선 작성을 위한 표준물질은 bovine serum albumin (Sigma, USA)을 사용하였다.</p> <h2>미생물 동정</h2> <p>분리 선발한 미생물의 동정은 Gram 염색과 현미경 관찰을 통해 형태학적 특성을 조사하였다. API \( 50 \mathrm{CHL} \) kit(bio-Merieux Co., France)로 49개의 탄소원에 대한 이용성을 조사하고 이 결과를 API \( 50 \mathrm{CHL} \) database V3.0(http://apiweb. biomerieux.com)을 이용하여 잠정적으로 동정하였다. 보다 더 정확한 동정을 위하여 \( 16 \mathrm{~S} \) ribosomal DNA gene sequencing 분석을 통하여 동정하였다. 선발미생물의 chromosomal DNA를 분리한 다음 \( 16 \mathrm{~S} \) rDNA sequencing에 일반적으로 사용하는 27F(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3') primer를 사용하여 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 분간 denaturation, \( 51^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분간 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 분 30 초동안 polymerization을 시키는 조건에서 PCR(Minicycler \( { }^{\mathrm{TM}} \), MJ research Inc., USA)로 증폭하였다. 증폭된 약 \( 1400 \mathrm{bp} \) 의 fragment를 \( \mathrm{T} \) vector (Invitrogen, USA)에 결합시킨 후 형질전환하였다. \( \mathrm{T} \) vector sequencing primer를 이용하여 염기서열 결정을 수행하였으며 그 결과는 BLAST search(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) program을 이용하여 GENBANK(NCBI, USA)의 ribosomal DNA gene sequenc-ing과 비교하여 동정하였다.</p> <h2>효소의 분리 및 정제</h2> <p>선발미생물이 생산하는 효소를 정제하기 위하여 soy medium 액체 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 24 \) 시간동안 배양한 후, 배양액을 원심분리 \( (10,000 \times \mathrm{g} / 15 \mathrm{~min}) \) 하여 상등액을 취하였다. 배양 상등액에 3 배 용량의 cold ethanol을 첨가하여 서서히 교반하였다. 침전물의 에탄올을 제거하기 위해 진공 데시케이터에서 1-2시간 방치한 후, \( 50 \mathrm{mM} \) sodium phosphate buffer( \( \mathrm{pH} \) 6.5)를 첨가하여 현탁하였다. 이 시료를 DEAE Sepharose Fast Flow(Pharmacia, Sweden) column(25 \( \times 350 \)\( \mathrm{mm} \) )에 적용하여 DEAE Sepharose에 결합시킨 후, 0-1 M \( \mathrm{NaCl} \) 를 linear gradient하게 \( 3 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \) 유속으로 용출하여 \( 5 \mathrm{~mL} \) 씩 80 개 분흭을 받았다. 효소활성을 측정하여 활성분흭만을 모아 dialysis 장치 (6-8 kDa cut-off)를 사용하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 18 시간동안 투석하였다. 위의 과정에서 얻어진 시료는 Sephacryl S-100HR(Pharmacia, Sweden) column \( (18 \times 350 \) \( \mathrm{mm} \) )을 사용하여 gel filtration을 수행하였다. Gel filtration에서 용출액은 증류수로 하였고 용출속도는 \( 1.0 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \) 으로 \( 2 \mathrm{~mL} \) 씩 분획하였다. 효소활성 분획만을 모아 동결건조하여 정제하였다.</p>