HL-60 인체 백힐병 세포에서 10-CPT와 doxorubicin에 의한 세포의 생육에 미치는 영향과 세포 유전자 발현 양상, 그리고 topoisomerase 효소 단백질에 약물의 결합을 통해 cleavable complex를 유도함으로써 유전자 발현 양상을 알아보았다.
<h1>결 과</h1> <h2>HL-60 인체 백힐병 세포에서 10-CPT와 doxorubicin에 의한 세포 독성</h2> <p>\( \mathrm{ml} \)당 \( 2 \times 10^{4} \) 세포 농도로 된 \( 10 \mathrm{ml} \)의 배양액을 분주한 \(25\)\(\mathrm{cm}^{2} \) culture flask에 10-CPT와 doxorubicin을 \(0, 2.5, 5, 10, 25,50,100,200,400 \mathrm{~nm} \)을 각각 투여한지 28시간 후 정상 배지로 갈아주고 다시 56시간(two doubling time) 배양하여 세포의 생육에 미치는 영향을 조사하였다. 10-CPT는 \( 2.5 \mathrm{~nm} \)의 10-CPT를 투여하였을 때 \( 80 \%\), \(5 \mathrm{~nm} \) 의 경우 약 \( 70 \% \)의 생육 도를 나타내었으며, doxorubicin은 \( 10 \mathrm{~nm} \) 이하를 투여하였을 때는 \( 90 \% \) 이상 의 생육을 나타내었고 \( 25 \mathrm{~nm} \) 이상에서는 급격한 세포 수의 감소를 확인하였다. 따라서 2가지 약물에 대한 동일한 생육 조건에서 각종 유전자의 발현 양상을 분석하기 위해 \(70-80\%\)의 생육정도를 나타내는 농도인 \( 4 \mathrm{~nm} \) (10-CPT)과 \( 25 \mathrm{~nm} \) (doxorubicin)을 유전자 발현 실험의 투여 농도로 정하였다.</p> <h2>HL-60 인체 백혈병 세포에서 10-CPT와 doxorubicin에 의한 세포 유전자 발현 양상</h2> <p>Topoisomerase I 억제제인 10-CPT와 doxorubicin을 각각 처리한 세포 및 정상 세포주로부터 total RNA를 분리하여 각각 Cy3과 Cy5 형광물질로 표지시킨 cDNA를 만들고 Oligo chip에 대한 microarray hybridization을 실시하였다. 형광물질로 표지된 microarray chip상의 \( 10 \mathrm{K} \) 유전자 각각에 대한 intensity를 측정하고 보정한 후 통계 프로그램을 사용하여 Scatter plot하였고, 의미 있는 데이타로 선정된 약 1,000개의 유전자를 동정하였으며, 그 중에 intensity ratio[ \( 2\mathrm{ log} \) \( (3 \mathrm{~F} / 5 \mathrm{~F})\)]가 약 \( -3.0 \) 이하인 뚜렷한 발현의 증가를 보이는 유전자와 현저한 발현의 감소블 보이는 약 \( +3.0 \) 이상의 유전자를 선별하여 Table 1-4에 나타내었다. 10-CPT를 투여한 HL-60세포에서의 과발현을 보이는 유전자들은 검색을 통하여 생물학적 기능별로 분류한 결과, 주로 signal transduction, cell adhesion, cell proliferation, cell differ-entiation, transcription 등에 관여하는 유전자들이 많았으며, 10-CPT에 의해 억제되는 유전자들은 cell adhesion, tran-scription, cell cycle, cell growth, cell proliferation, cell ad-hesion, signal transduction, immune response 등과 관련된 것으로 나타났다. Doxorubicin을 투여한 HL-60세포에서 과 발현을 보이는 유전자를 생물학적 기능별로 분류한 결과, transcription, signal transduction, cell growth (apoptosis), cell differentiation, cell adhesion, me-tabolism 등과 관련된 유전자들이 많았으며, 발현이 억제되는 유전자들은 apoptosis, signal transduction, transcription, cell proliferation, cell adhesion 등과 관련이 있었다.</p> <h2>HL-60 인체 백혈병 세포에서 10-CPT와 doxorubicin에 의한 topoisomerase 유전자 발현 양상</h2> <p>약물의 1차적 표적소인 topoisomerase 효소 단백질에 약물의 결합을 통해 "cleavable complex"를 유도함에 따른 세포내 topoisomerase 유전자들의 발현 정도를 비교하였다. Topoisomerase type Ⅰ의 억제제인 10-CPT를 HL-60 세포 주에 투여 하였을 때 type Ⅰ으로 분류되는 topoisomerase Ⅲ\( \alpha \)의 유전자의 발현은 현저히 증가되었으며, 같은 type인 Ⅲ\(\beta \) 및 Ⅰ의 발현도 약간 증가하였으나 다른 type인 top-oisomerase Ⅱ\( \alpha \)와 Ⅱ\( \beta \)의 유전자의 발현은 감소되었다. 반대로 type II의 억제제인 doxorubicin을 투여하였을 때는 앞의 결과와 상반된 topoisomerase Ⅱ\( \alpha \)와 Ⅱ\(\beta \)의 유전자의 발현이 현저히 증가되었으며, topoisomerase I의 발현도 약간의 증가를 보였고 topoisomerase Ⅲ\( \alpha \)와 Ⅲ\( \beta \)의 유전자의 발현은 약간 감소하는 양상을 보였으나 의미있는 차이는 없었다.</p>