유전자지도를 이용한 유전자분리는 염색체상의 유전자 위치와 물리지도 거리를 이용하여 유전자를 분리하는 기술이다. 이를 위해 100-200 계통의 유전집단과 DNA 마커의 분자유전자지도가 필요하다. 고밀도 유전자지도를 작성하기 위해서는 500-600 계통의 유전집단과 낮은 빈도로 발생하는 recombination을 필요로 한다. 목표 유전자와 마커간의 공 분리가 이루어질 때까지 정밀유전자지도를 작성하며, 마지막으로 구조유전자의 염기서열을 결정하고 추가 분석을 통해 최종 목표 유전자를 결정한다.
<h1>분자유전자지도에 의한 유전자 분리</h1> <p>유전자지도를 이용한 유전자분리 (map-based cloning)는 목표로 하는 유전자 산물에 대한 사전 정보 없이 염색체상의 유전자 위치와 물리지도 거리에 근거하여 유전자를 분리하는 기술이다. 이러한 유전자지도를 이용한 유전자 클로닝의 첫 걸음은 우선 목적 형질 또는 유전자와 밀접히 연관된 DNA 마커를 찾는 것이다. 이를 위해서는 형질이 분리하는 100-200 계통으로 구성된 유전집단이 필요하고 이 집단을 이용하여 DNA 마키들을 염색체별로 위치시키는 분자유전자지도 (molecular genetic map)를 작성해야 한다. 또한, 이 유전집단에서 형질의 발현을 분석하고 각 계통에서의 유전분리 양상을 조사하여 유전분석을 통하여 유전자지도에 위치시켜서 그 형질과 밀접히 연관된 DNA 마커의 정보를 얻게 된다. 일단 형질 또는 유전자의 염색체상의 위치정보를 얻은 후에는 그 유전자 주변에 마커가 밀접히 분포하는 유전지도 작성이 되도록 고밀도 유전자지도를 작성해야 한다. 고밀도 유전자지도의 작성을 위해서는 유전자와 마커간에 낮은 빈도로 발견되는 recombination의 확률을 높이기 위하여 500-600 계통을 가진 유전집단이 필요하게 된다.</p> <p>그 다음 단계에는 유전자와 밀접히 연관된 마커를 가지고 거대 genomic DNA 은행으로부터 BAC 또는 YAC 클론을 선발하여야 한다. 그렇게 하여 밀접히 연관된 마커를 거대 DNA 단편에 위치시키면 그곳으로부터 유전자가 있는 곳까지 'chromosomal walking'에 의하여 찾아가야 한다. 이 단계에서는 새로운 마커의 개발이 요구되고 마커와 유전자간의 recombination을 높이기 위하여 1,000-3,000 개체의 대집단을 이용해야 한다. 이 정밀유전자지도의 작성은 목표 유전자와 마커간에 조환이 발견되지 않고 공 분리 (co-segregation) 할 때까지 하여야 하며 이때 공 분리의 의미는 마커와 목표 유전자간에 조환이 없고 염색체 상의 마커의 위치에 바로 찾고 있는 유전자가 위치함을 뜻하는 것이다. 일단 목표 유전자 양쪽의 마커와 유전자간에 조환이 없는 마커들을 찾게 되면 목표 유전자는 이들 마커 사이에 존재하게 되는 것이다. 이 마커들 사이에 존재하는 모든 구조유전자들을 클로닝하여 벡터에 삽입하여 wild type 식물체에 유전자 형질전환에 의하여 각 유전자를 도입하여 돌연변이체를 육성하고 돌연변이체에서 목표 유전자의 발현을 분석한다. 만일 목표 유전자의 표현형이 돌연변이체에서 발현을 하게 되면 바로 그 구조유전자가 목표 유전자인 것이다. 마지막으로 그 구조유전자의 염기서열을 결정하여 추가적으로 필요한 분석을 통하여 최종 목표 유전자를 결정하게 된다.</p> <p>이와 같은 방법은 현재 질적 및 양적형질 유전자 모두에 광범위하게 적용되고 있는데, 그 예로 토마토의 Pseu-domonas 저항성 유전자인 protein kinase ( \(Pto \)) 유전자를 map-based cloning으로 Martin 등이 분리하여 Science 262호(1993)에 보고한 이래, 벼의 \(Xanthomonas \) 저항성 유전자인 \(Xa \)21 (Song et al. 1995), 토마토의 \(Pseudomonas \) 저항성 유전자인 \(Prf \) (Salmeron et al. 1996) 등의 분리가 보고되고 있다. 질적유전자인 병 저항성인자 뿐만 아니라, 양적형질에 대한 연구결과로 토마토의 fruit size를 결정하는 인자인 \(fw \)2.2 (Frary et al. 2000)나 애기장대의 blue light receptor인 NPL1 (Kagawa et al. 2001), 벼의 개화조절 유전자 \(Hdl \)(Yano et al. 2000), 붉은 종피색 \( R c \) (Sweeney et al. 2006, 2007) 등의 유전자가 클로닝되고 있다. 한편, 벼에서는 분자유전자지도를 이용한 유전자분리 기술로 70 종의 유전자가 분리되어(Jiang and Ramachandran 2010) 왔다.</p>