RNA를 RNeasy kit로 분리하고, 역전사효소를 이용해 cDNA로 전환하여 Takara HS ExTaq DNA Polymerase를 이용해 Mycycler Thermal Cycler에서 94\(^\circ \mathrm{C}\) 2분, 98\(^\circ \mathrm{C}\) 10초, 59\(^\circ \mathrm{C}\) 30초, 72\(^\circ \mathrm{C}\) 45초로 25회 실시하여 PCR product를 1.2% agarose gel에서 확인하고, SigmaStat for windows를 이용해 Student's t test나 ANOVA로 두 그룹 데이터 비교하고 그래프로 시각화하여 보여주었다.
<h2>Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)</h2> <p>RNA는 RNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA)를 통해서 분리하였다. 추출된 RNA \( (100 \mathrm { ng } ) \) 을 역전사효소를 이용해서 cDNA로 전환하였다. BD Sprint PowerScript (Clontech, Mountain View, CA). 유전자 증폭은 Takara HS ExTaq DNA Polymerase (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)을 이용하여 Mycycler Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA)에서 아래의 조건에서 시행하였다. 즉, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 2분 및 denaturation \( \left (98 ^ {\circ } \mathrm { C } \right . \), \( \left .10 \mathrm { sec } \right ) \), annealing \( \left (59 ^ {\circ } \mathrm { C } \right . \), \( \left .30 \mathrm { sec } \right ) \), elongation \( \left (72 ^ {\circ } \mathrm { C } , 45 \mathrm { sec } \right ) \) 에서 25회를 실시하였다. PCR product는 \( 1.2 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) agarose gel에서 확인하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>데이타는 SigmaStat for windows (Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA)를 이용해서 분석하였다. 두 그룹의 데이터 비교는 Student's \( t \) test를 하였고, multiple groups 비교는 ANOVA를 실시한다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>P. fluorescens (PF)에 의한 인체 폐포 상피세포 A549에서의 세포 생존률(viability)에 대한 영향</h2> <p>균주 P. fluorescens 및 식품공정에서 사용되는 lipase 재조합 P. fluorescens (PF-lipase)에 대한 세포증식억제효과를 MTS assay를 이용하여 분석하였다. A549세포의 개수에 대해 10배에서 100배의 PF 및 재조합 PF-lipase를 처리 시 세포의 증식이 유의성 있게 감소하였다. 하지만, 원균주 PF와 재조합형 PF-lipase 사이에는 세포 생존율의 유의성 있는 변화를 보이지 않았다. 실제 예비 실험상에서 비병원성 대장균 \( \mathrm { DH } 5 \mathrm { a } \)를 높은 농도로 인체세포에 처리 시에도 viability가 소량 감소되는 것으로 보아(데이터제시 않음), 세포 생존율에 대한 감소효과는 세균에 대해 병원성과는 상관없는 비 특이적인 작용의 가능성도 있음을 다양한 연구들에서도 이미 밝혀지고 있다. 이후 상피세포의 생존율 외에 염증성 인자에 대한 발현 분석을 요구되어 아래에서 진행하게 되었다.</p>