심근경색 및 심혈관계 질환을 초래하는 혈전증의 원인은 혈전의 주성분인 피브린의 작용을 받아 피브리노겐으로부터 형성되며 이 피브린 응고체가 축척됨으로써 나타난다.미생물 유래 혈전용해효소를 이용한 혈전분해특성을 규명하는 연구가 지속적으로 수행되고 있으며, Bacillus sp.는 산업적으로 유용한 다양한 효소를 생산하는 균주로서 알려져 있다. 본 연구에서는 한국 전통 발효 식품인 된장을 시료로 이용하여 혈전용해 효소를 생산하는 균주를 단리하고 동정하였으며, 2 종류의 시판용 박테리아용 배지를 이용하여 혈전용해효소의 생산에 적합한 Bacillus sp. CP-1배양 배지를 비교 검토하였다.
<h1>서 론</h1> <p>혈전용해효소(fibrinolytic enzyme)에 의해 분해되는 혈전의 주성분인 피브린은 트롬빈의 작용을 받아 피브리노겐으로 부터 형성되며, 혈관에서 이러한 피브린 응고체들이 용해되지 않고 축적되었을 때 심근경색을 비롯한 다양한 심혈관계 질환을 초래하는 혈전증의 원인이 된다. 그러므로 혈전분해를 위한 연구가 다양한 방법으로 진행되고 있으며 특히, 미생물 유래 혈전분해효소를 이용한 혈전분해특성을 규명하는 연구가 지속적으로 수행되고 있다. 미생물 유래 효소를 이용한 연구에 있어서 미생물에 의한 효율적인 효소 생산은 무엇보다도 중요한 연구분야라고 할 수 있으며 미생물 유래 혈전용해효소에 관한 연구에 있어서는 효소특성 규명에 관한 연구는 많은 보고가 이루어지고 있지만 효율적인 효소 생산을 위한 연구는 반드시 선행되어야 할 중요한 연구분야임에도 불구하고 현재까지 연구 보고가 매우 미흡한 실정이다. Bacillus sp.는 산업적으로 유용한 다양한 효소를 생산하는 균주로서 알려져 있으며, 특히, serine alkaline protease (subtilisin), neutral metalloprotease와 같은 protease를 비롯하여 다양한 esterase가 Bacillus sp. 유래의 유용한 효소로서 보고되어져 있다. 최근에는 발효 식품으로부터 단리된 Bacillus sp.유래의 다양한 혈전용해효소가 보고되고 있으므로 본 연구에서도 한국 전통 발효 식품인 된장을 시료로 이용하여 혈전용해 효소를 생산하는 균주를 단리하고 동정(Bacillus sp. CP-1)하였다. 그리고, 2 종류의 시판용 박테리아용 배지[tryptic soy broth (TSB) 와 Luria-Bertani (LB)]를 이용하여 혈전용해효소의 생산에 적합한 Bacillus sp. CP-1배양 배지에 대하여 비교 검토하였으며, Bacillus sp. CP-1유래 혈전용해 효소의 N-말단 아미노산배열 분석을 통하여 혈전용해효소의 동정과 함께 혈전 용해를 위한 효소의 특성에 대하여도 검토하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약 및 재료</h2> <p>Fibrin plate의 제조에 이용한 fibrin과 bovine 유래의 thrombin은Sigma (St. Louis, MO, U.S.A)로부터 구입을 하였으며, fibrin plate 제조를 위한agarose와 전기영동을 위한 모든 시약 및 기구는 Bio-Rad (Hercules, CA, U.S.A.)로부터 구입을 하였다. 그리고, 본 연구에서 사용한 시약은 모두 특급 등급을 이용하였다.</p> <h2>미생물 균주의 분리 및 동정</h2> <p>혈전용해효소를 분비하는 균주를 분리하기 위하여 대구의 재래시장 (서문시장)에서 구입한 전통재래식 된장을 시료로 사용하였다. 단리된 미생물을 동정하기 위하여 미생물의 16S rRNA 유전자 분석은 솔젠트(Daejeon, Korea)에 의뢰하였으며 생화학적 분석에 의한 균주의 형태학적 특성은 그람염색 후 광학현미경(Olympus BX60, Japan)을 이용하여 관찰하였다. 생리·생화학적 특성은 API 50 CHB kit (bioMrieux, Marcy I'Etoile, France)을 사용하여, 제조사의 지시대로 결과를 판독하였다.</p> <h2>Bacillus sp. CP-1 배양 및 효소 활성 비교</h2> <p>본 연구에서 사용한 Bacillus sp. CP-1는 한국전통발효식품인 된장으로부터 단리되었으며, 본 균주는 \( 100 \mathrm { ml } \) 의 tryptic soy broth (TSB) (Difco, Sparks, MD, U.S.A.) 배지와 Luria-Bertani (LB) (Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.) 배지에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양되었다. 배양 후 \( 1 \mathrm { ml } \) 의 배양액을 채취하여 \( 10,000 \times \) 에서 10 분간 원심분리 후 채취한 배양 상층액을 효소 활성 측정 및 단백질 분석을 위한 시료로 사용하였으며, 균체 중량은 균체건조중량을 측정하여 검토하였다. 혈전용해효소의 활성을 검토하기 위한 fibrin plat 제조는 이전에 보고된 방법으로 조제하였으며, 혈전용해효소 활성은 다음과 같이 검토하였다. \( 50 \mathrm { mM } \) sodium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } \) 7.4)에 녹아있는 \( 0.6 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) fibrinogen 용액 \( 5 \mathrm { ml } \) 를 동량의 \( 2 \% \) agarose 용액 그리고 \( 0.1 \mathrm { ml } \) 의 thrombin 용액(10 NIH unit/ml)과 함께 petri dish에서 섞어서 시료를 제조하였다. 이렇게 제조한 시료20 \( \mu \mathrm { l } \)를 capillary grass tube \( (5 \mathrm { ~mm } \) diameter)를 이용하여 사전에 제조한 hole속으로 적정한 후, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 12 시간 반응하였다. 이때 동량의 plasmin (1.0 NIH \( \mathrm { unit/ml } \))을 표준 혈전용해효소로서 이용하였으며, 효소활성은 clear zone의 직경을 측정함으로서 비교 검토하였다.</p>