TRIzol B를 이용하여 total RNA를 분리 후 ONE−STEP RT-PCR PreMix를 이용하여 RNA에서 ss cDNA를 합성하였고 cDNA를 template로 사용하여 PCR로 증폭하였다. genistein이 처리된 배지에서 자란 세포들을 용해 후 동량의 단백질을 전기영동으로 분리시켰고, 분리된 단백질을 특정 단백질에 대한 항체와 이차 항체 반응 후 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 발현 양을 분석하였다. Telmerase 활성 측정 위해 genistein이 처리된 배지에서 배양된 세포들을 모아 lysis를 실시하였으며, \( \mathrm{PGE}_{2} \) 생성량 변화를 알아보기 위해 배지에 분주하여 genistein을 농도별로 배지에 희석하여 처리했다.
<h2>Reverse transcription (RT)-PCR 분석</h2> <p>동일한 조건에서 준비된 세포들을 대상으로 TRIzol B (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, ONE−STEP RT-PCR PreMix (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Korea)를 이용하여 2 \( \mu \mathrm{g} \) 의 RNA에서 ss cDNA를 합성하였다. 이들 cDNA를 template로 사용하여 관찰 대상 유전자를 PCR로 증폭하였다. 이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자를 internal control로 사용하였다. 각 PCR 산물들을 \( 1 \% \) agarose gel을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide (EtBr) 로 염색한 후 UV 하에서 확인하였다.</p> <h2>단백질의 분리, 전기영동 및 Western blotting</h2> <p>정상 및 genistein이 처리된 배지에서 자란 세포들을 lysis buffer로 용해한 후, 고속원심분리로 세포 내 잔사물을 분리 시킨 후 동량의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 전이시킨 후, 특정 단백질에 대한 항체와 그에 대한 이차 항체 반응을 실시한 후 enhanced chemiluminoesence (ECL) 용액 (Amersham Life Science)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 발현 양을 분석하였다.</p> <h2>Telomerase 활성 측정</h2> <p>정상 및 genistein이 처리된 배지에서 배양된 세포들을 모아 \( 200 \mu \) lysis reagent에 \( 1 \times 10^{6} \) 개의 세포를 섞어서 30분간 얼음 위에서 lysis를 실시하였다. TRAP 반응을 위하여 \( 2 \mathrm{mg} \)의 단백질이 함유된 \( 2 \mu \mathrm{l} \) 의 세포 추출액을 \( 25 \mu \mathrm{l} \) 의 reaction mixture에 혼합 후, 증류수를 첨가하여 최종 volume이 \( 50 \mu \)가 되도록 하였다. PCR은 primer elongation \( \left(25^{\circ} \mathrm{C}\right. \) 에서 30 분간), telomerase inactivation \( \left(94^{\circ} \mathrm{C}\right. \) 에서 5분간), product amplification \( \left(94^{\circ} \mathrm{C}\right. \) 에서 30초, \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초 및 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 90초를 30 cycles)의 순서로 진행이 되었으며, 이를 이용하여 hybridization과 ELISA reaction 반응을 시켰다.</p> <h2>Prostaglandin \( \mathrm{E}_{2} \) 의 측정</h2> <p>\( \mathrm{PGE}_{2} \) 생성량의 변화를 조사하기 위하여 준비된 세포를 96-well plate에 well 당 \( 160 \mu \) l의 배지에 \( 10^{4} \) cell/well 정도로 분주하여 24시간 동안 배양한 후, genistein을 농도별로 배지에 희석하여 처리하였다. 이때 마지막 배지의 양을 모두 \( 180 \mu \) l로 통일시켰다. 48 시간 후 배지에 \( 2.5 \% \) 의 dodecyltrimethylammonium bromide가 함유된 buffer를 \( 20 \mu 1 \) 첨가하여 총 배지의 양이 \( 200 \mu \mathrm{l} \) 되게 한 후 lysis가 잘 일어나도록 pipetting을 수희 실시하였다. 상온에 약 10 분간 incubation 한 후 trypan blue를 이용하여 암세포의 수를 계수 하였다. 약 \( 50 \mu \) 의 lysate를 취하여 kit에 준한 protocol에 따라 EIA를 실시한 후 \( 450 \mathrm{~nm} \) 의 파장에서 얻어진 값을 기준으로 \( \mathrm{PGE}_{2} \) 의 양을 추정하였다.</p>