뇌조직의 mitochondria 및 microsome 획분을 얻어 각각의 단백질 함량을 Lowry 등의 방법에 따라, 산화단백질의 함량을 Levine 등의 방법으로 측정하였으며, 세포막 유동성(MF)은 DPH를 사용한 Heron 등의 방법 기반의 형광 분광법으로 측정하였다. 또한 두 획분의 기초활성산소 생성량을 Lebel 등의 방법에 따라 정량하여 뇌조직 중 산화적 스트레스를 확인하였으며, 노화색소인 리포푸신의 측정은 Fletcher 등의 방법에 따라 형광도 측정을 통해 리포푸신 함량을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>시료 분리 및 동물모델</h2><p>실험에 사용할 솔잎 추출물은 소나무(Pinus densiflora Siebet Zucc.)의 솔잎을 지난 해 4월 부경대 식품생명공학부에서 음건하여 파쇄 후\( (8.5 \mathrm{~kg}), 80 \% \) methanol로써 추출◦농축한 솔잎 추출물 \( (2.1 \mathrm{~kg}) \)을 용매분획법에 따라 EtOAc획분을 동결·건조하여 \( 210 \mathrm{~g} \)을 분리하여 실험에 사용하였다. 동물실험은 Sprague Dawley계 랫트 (male : \( 160 \pm 10 \mathrm{~g} \) )를 한국화학연구소에서 구입하여 실험에 사용하였다. 사육 및 실험조건은 매일 \( 18: 00 \)에 사료와 물을 공급하였다. 동물 사육실은 자동조절 \( \left(22 \pm 2^{\circ} \mathrm{C} ; 65 \pm 2 \% \mathrm{RH}\right) \)되고, 명암도 12시간 사이클 (18:00~06:00)로 조절된다. 실험사료의 조성은 전보와 같이 조제하여 SD계 랫트에 45일동안 투여하여 동물실험을 실시하였다.</p><h2>뇌조직의 분획</h2><p>뇌조직의 분획은 Choi와 Yu의 방법에 따라 균실 완충용액 \( (1.15 \% \mathrm{KCl} / 10 \mathrm{mM} \) phosphate buffer\(/5 \mathrm{mM}\) EDTA,\( \mathrm{pH} 7.4) \)을 사용, 균질화한 다음 \( 700 \times \mathrm{g} \)에서 10분간 원심분리하여 얻은 상층액을 다시 \( 9,000 \times \mathrm{g} \)에서 15분간 원심분리한다. 이 때 생긴 잔사는 균질 완충용액으로써 정용하여 mitochondria획분으로 하였고, 상층액은 다시 \( 105,000 \times \mathrm{g} \)에서 60분간 원심분라하여 얻은 잔사를 같은 완충용액으로 정용하여 microsome획분으로 사용하였다. 이들 획분의 단백질의 함량은 Lowry 등의 방법에 따라 측정하였다.</p><h2>세포막 유동성의 측정</h2><p>뇌조직의 mitochondria 및 microsome획분중의 세포막 유동성(MF)은 형광 probe로서의 1,6-diphenyl-1,3,5-hexa-triene (DPH)을 사용한 Heron 등의 방법에 의한 형광 분광법으로 측정하였다. \( 50 \mathrm{mM} \) 인산완충용액 \( (\mathrm{pH} 7.2 \), \( 2,750 \mu \mathrm{l}) \), 증류수 \( (250 \mu \mathrm{l}) \), 시료 \( (100 \mu \mathrm{l}) \)를 첨가·혼합하여 \( {37}^{\circ} \mathrm{C} \) 항온 수조에서 5분간 방치한 다음, probe인 \( 0.167 \mathrm{mM} \) TMA-DPH[1-(4-trimethyl-ammoniumphenyl)-6-phenyl-1,3,5-hexatriene, p-toluene-sulfonate] 용액을 \( 6.67 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가·혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 항온 수조에서 shaking하면서 30분간 반응시킨 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)을 유지하면서 형광광도계를 이용하여 \( 360 \mathrm{~nm} \) (excitation)와 \( 430 \mathrm{~nm} \) (emission)에서 측정하였다.</p><h2>기초 및 유도산소라디칼의 정량</h2><p>뇌조직 중의 산화적 스트레스(oxidative stress)의 유무를 확인하기 위해서 DCF-DA \( 2',7'-dichlorofluoresceindiacetate)을 probe로 이용한 뇌세포의 mitochondria와 microsome획분의 기초활성산소(basal oxygen radical : BOR)의 생성량의 측정은 Lebel 등의 방법에 따라 전보와 같은 방법으로 정량하였다.</p><h2>산화적 스트레스의 분석</h2><p>한편 뇌조직 중의 과산화지질(LPO)의 함량은 Choi 등의 방법에 따라 분광광도계(Luminescence Spectrophotometer, Aminco-Bowman, U.S.A.)를 사용하여 TBA법으로 말론디알데히드(malondialdehyde : MDA)의 함량을 측정하여 LPO의 함량으로 정량하였다. 또한 뇌조직의 mitochondria와 microsomes획분의 산화단백질의 함량은 Levine 등의 방법에 따라 carbonyl group의 생성량을 측정하였다.</p><h2>리포푸신 함량의 측정</h2><p>노화색소로서 리포푸신(lipofuscin)의 측정은 Fletcher 등의 방법에 따라 조직의 표면에 수분과 오물을 제거한 후 뇌조직 \( 0.2 \mathrm{~g} \)에 chloroform-methanol \( (2: 1, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 혼합용액 \( 4.0 \mathrm{ml} \)에 첨가 후 1분간 균질화시킨후 원심분리하여 chloroform층 \( 2.0 \mathrm{ml} \)를 분취하여 형광광도계를 사용, 345 \( \mathrm{nm} \) (excitation)와 \( 435 \mathrm{~nm} \) (emission)에서 표준용액 (quinine sulfate \( \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) of \( 0.1 \mathrm{N}\) \(\mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \) )을 대조군으로 형광도를 측정하여 리포푸신의 함량(\(\mathrm{g} / \mathrm{mg} \) protein)을 정량하였다.</p><h2>분석결과의 통계처리</h2><p>본 연구의 모든 실험결과는 통계 처리하여 평균치와 표준편차를 계산하였으며, 각 실험군간의 유의성 검정은 Student's t-test로 실시하였다.</p>