Hepa 1c1c7 세포를 96-well plate에 위에서 설명한 QR 생성 유도 방법과 동일한 절차로 접종하고, 이후 시료를 처리하였습니다. 세포는 약침액이 처리된 배양액에서 48시간 동안 배양되었습니다. 이후, PBS로 3번 세척한 후 3회의 freeze-thaw cycles를 통해 세포를 용해시켰습니다. 또한 bicinchoninic acid protein assay kit를 사용하여 세포 내의 총 단백질 양을 측정하였습니다. 이를 위해 BSA (Bovine Serum Albumin)를 표준 단백질 용액으로 이용하여 표준 검량선을 생성하고, 이를 기반으로 세포 내의 총 단백질 양을 계산하였습니다.
<h2>세포내 glutathione S-transferase 활성 유도</h2> <p>GST \( \alpha\), GST \(\mu \) 를 발현하는 Hepa 1c1c7 세포를 이용한 세포내 GST 활성측정은 Habig등의 방법을 변형하여 측정하였다. Hepa 1c1c7 세포를 96-well plate에 위의 QR 생성 유도와 같은 방법으로 세포를 접종시키고 시료를 처리하였다. 세포를 약침액이 처리된 배양액에서 48시간 배양 후, PBS로 3회 세척하고, 3회의 freeze-thaw cycles에 의해 세포를 용해시켰다. 배양된 세포내에서 유도된 GST 활성 측정을 위해 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} 6.5)\)에 \( 2.5 \mathrm{~mM} \) GSH, \(1 \mathrm{~mM} \) CDNB를 첨가한 reaction mixture 용액을 \( 100 \mu \ell\) 씩 각 well에 가하고 1 분간 plate shaker에서 교반한 후, 3분간 흡광도의 증가를 microplate reader, \( 405 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. GST 활성측정을 위한 단백질 함량은 bicinchoninic acid protein assay kit를 사용하여 측정하였다.</p> <h2>세포내 glutathione 함량 측정</h2> <p>Hepa 1c1c7 세포내의 총 GSH의 함량은 Griffith등의 방법을 변형하여 96-well plate에서 측정하였다. 즉, Hepa 1c1c7 cell을 96-well plate에 위의 QR 생성 유도와 같은 방법으로 세포를 접종시키고 시료를 처리하였다. 시료처리 후 48시간 뒤 배양액을 버리고 phosphate buffered saline 으로 3회 세척하고 freeze-thaw cycle을 3회 반복하여 세포를 용해시킨 후, 각 well에 \( 40 \mu l \) stock buffer \( (125 \mathrm{~mM} \) Na-phosphate, \( 6.3 \mathrm{~mM} \) Na-EDTA, \( \mathrm{pH} 7.4 )\)를 가하고 \(6 \mathrm{mM}\) 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB), glutathione reductase solution (50 units in \( 10 \mathrm{m \ell} \) stock buffer), NADPH-generating system \( \{0.5 \mathrm{M} \) Tris-HCl \((\mathrm{pH} 7.4), 150 \) \( \mathrm{mM} \) glucose-6-phosphate, \( 50 \mathrm{~mM} \) NADP\( ^{+}, 100 \) units glucose-6-phosphate dehydrogenase 을 혼합한 reaction mixture \( 170 \mu \ell \) 와 반응시켰다. 상온에서 5분간 교반하면서 반응시킨 후 microplate reader, \( 450 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. GSH 함량은 GSH 표준곡선으로 계산하였고,\( \mathrm{nmol} / \mathrm{mg} \) protein으로 표시하였으며, GSH 함량의 비는 대조군에 의한 GSH 양과 포공영약침액에 의해 생성된 GSH 양의 비율로 측정하였다. 세포내 총 단백질은 bicinchoninic acid protein assay kit를 사용하여 BSA를 표준 단백질 용액으로 이용한 표준 검량선을 구하고 그 양을 산출하였다.</p>