본 연구에서는 들께의 형질전환체 육성을 위해 운반체로 pMOG\(6\)-bar와 pCK-Bar 운반체를 사용했으며, 기존에 알려진 들깨의 재분화 조건을 기초로 하여 항생제의 선발농도를 규명하였다. 두 운반체 각각을 가진 균주에서 shoot을 선발하였으며, 이들을 phosphinothricin이 포함된 배지에서 \(2\)차 선발하였다. 이후 배지에서 \( 1-2 \mathrm{~cm} \) 정도 성장한 신초의 뿌리 형성을 유도하였으며, 이를 질석에 옮겨 식물체를 성장 시켰다. 이후 생성된 pMOG\(6\)-Bar 운반체를 이용한 형질전환체에 제초제를 뿌려 생존률을 확인하였으며 \(100\%\)생존하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 pCK-Bar 운반체의 식물체의 경우, 같은 실험에서 전자의 생존률 보다는 낮은 값이 나오는 것을 알 수 있었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>형질전환 운반체 작성 및 항생제 선발 농도</h2> <p>형질전환체 선발을 위한 운반체로 hpt와 bar 유전자가 포함된 pMOG6-bar와 nptII와 bar 유전자가 포함된 pCK-Bar 운반체를 이용하였다. 운반체는 Agrobacterium tumefaciens EHA105 에 삽입하여 항생제 선발 농도 및 들깨 형질전환에 사용하였다. 기존에 알려진 들깨의 재분화 조건을 기초로 하여 항생제의 선발농도를 규명하였으며 pMOG6-Bar와 pCK-Bar 운반체를 이용하여 각각 hygromycin과 kanamycin선발농도를 결정하였으며 적정 항생제 선발 농도는hygromycin은 \( 15 ~ \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 와 kanamycin은 \( 125 ~ \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 였다.</p> <h2>들깨 형질전환체 육성</h2> <p>파종 후 6-7일된 들깨의 배축을 이용하여 아그로박테리움과 공동배양으로 형질전환을 실시하였으며 pMOG6-Bar를 가진 균주는 hygromycin \( 15 ~ \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 의 항생제를 이용하여 shoot를 선발하였으며 pCK-Bar를 가진 균주는 kanamycin \( 125 ~ \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 로 형질전환 shoot를 1 차로 선발하였다. 두 운반체를 가진 Agrobacterium 을 배축과 공동배양 한 후 선발배지에 치상하였으며 치상한 배축은 2-3주 간격으로 새로운 배지로 옮겨 주었으며 1 개월이 경과하면 shoot가 형성되었으며 일부에서는 callus도 형성되었다. 배축의 끝 부분에서 직접적으로 shoot가 형성되는 경우는 2-3개월 정도 후에 정상적인 식물체의 모양을 형성하였다. 그러나 callus가 형성되는 배축은 shoot를 형성하기 위하여 4-5개월 정도를 계속해서 계대배양 하여야 하고 GUS 염색 시 callus 부위에서 escape가 많이 발생하였으며 shoot의 형성율도 상당히 떨어졌다. 이렇게 1차적으로 kanamycin과 hygromycin에서 형성된 shoot를 phosphinothricin이 포함된 배지에 이식하여 2차로 선발한 결과 재분화체 중 형질전환 식물체의 비율을 높일 수 있었다. 재분화 개체의 뿌리 형성을 위하여 재분화 개체에 NAA shock를 준 후에 MSO배지에서 뿌리를 유도하거나, 항생제와 carbenicillin의 농도를 선발배지에서 \( 1 / 2 \) 로 줄였으나 뿌리 유도에는 효과적이지 못하였다. 최종적으로는 선발배지에서 \( 1-2 \mathrm{~cm} \) 정도로 성장한 신초를 생장조절제와 항생제가 포함되지 않는 \( 1 / 2 \) MS 배지에 이식해서 뿌리 형성을 유도하였다. 이 조건에서는 1 주일 후부터 뿌리가 유도되기 시작하였으며 때로는 완전히 사멸되지 않는 Agrobacterium이 성장하여 식물체를 괴사시키는 경우도 있었으나 뿌리의 유도율은 \( 90 \% \) 이상으로 높았다. 2 주간 뿌리 형성을 유도한 후에 살균된 질석에 식물체를 이식하여 순화하였으며 이 과정에서 입자가 적은 질석은 수분 함량의 과다 및 통기 불량 때문에 식물체가 고사하는 비율이 높았으며 입자가 약간 큰 질석이 물 빠짐 및 통기가 좋아서 식물체의 생존율이 높았다.</p> <p>들깨의 재분화는 잎, 자엽, 배축 등 어느 부위를 사용하여도 잘 되었으나 kanamycin, hygromycin, carbenicillin 등의 항생제나 PPT를 첨가한 배지에서는 재분화가 잘 되지 않았다. 자엽을 이용하여 형질전환한 경우가 형질전환체의 형성이 양호하여서 자엽을 이용하여 pMOG6-Bar 운반체를 이용하여 PPT 선발로 200여 개체의 재분화 식물체를 획득하였다. 재분화 식물체의 형질전환여부를 확인하기 위하여 \( 0.3 \% \) 의 바스타 제초제를 살포시 모든 개체가 고사하여 형질전환체를 확인할 수 없었다 (data not shown). 자엽을 이용하여 형질전환하는 경우는 때로 생장점 부위가 포함되거나 이미 분화된 세포를 이용하여 형질전환이 되기 때문에, 다른 식물 부위보다 재분화율은 높았으나 형질전환체를 획득하지는 못하였다. 이외에 잎을 이용하여 형질전환를 실시한 경우는 거의 재분화체를 획득하기가 용이하지 않았기 때문에 파종 후 6-8일된 배축 부위를 이용하여 형질전환을 수행하였으며 형질전환효율은 \( 1.2 - 1.6 \% \) 정도였다.</p> <p>항생제 (hygromycin, kanamycin)와 PPT로 이중 선발 후 생존 개체를 순화하여 온실에 재배하였으며 재분화 개체수는 pMOG6-Bar와 pCK-Bar 운반체가 각각 40개체였다. pMOG6-Bar 운반체를 이용한 형질전환율은 \( 1.2 \% \) 로 낮았으나 40 개체 재분화체는 \( 0.3 \% \) 제초제와 \( 0.6 \% \) 제초제 처리시 모든 개체가 생존하여 형질전환체임을 확인하였다. pCK-Bar 운반체를 이용한 형질전환율은 \( 1.6 \% \) 로 약간 더 높았으나 제초제저항성을 확인한 결과는 40 개체 중에서 \( 0.3 \% \) 제초제에서 4 개체가 고사하고 \( 0.6 \% \) 제초제 살포시 8 개체가 더 고사하여 최종적으로는 28 개체만 생존하였다.</p>