망간산화 단백질의 활성을 측정하기 위해 Okazaki의 방법을 사용하였다. 이를 위해 45 mM의 아세트산에 0.04%의 레우코베를린 블루를 첨가한 반응액 1 ml에, 기질로서 100 μM의 MnCl2를 첨가한 후, 0.2 ml의 시료를 이용하여 망간산화능을 측정하였다. 또한, 단백질 정제 실험을 위해 LD 액체 배지 200 ml에 Pseudomonas SP. MN5를 접종하여 30°C에서 12시간 배양한 후, 21 배지에 접종하여 동일조건(30°C, 200 rpm)에서 24시간 동안 추가 배양을 실시하였다.
<h2>망간 산화능 조사</h2> <p>망간산화 단백질의 활성은 Okazaki의 방법으로 측정하였다. \( 45 \mathrm { mM } \) acetic acid에 \( 0.04 \% \) leucoberbelin blue를 첨가한 반응액 \( 1 \mathrm { ml } \) 에 기질로 \( \mathrm { MnCl } _ { 2 } \) 를 \( 100 \mu \mathrm { M } \) 이 되게 첨가한 후, 시료 \( 0.2 \mathrm { ml } \) 을 넣어 망간 산화능을 측정하였다. 반응액은 상온에서 10분간 반응시킨 후, 분광광도계(SmartSpec \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) PlusSpectrophotometer, BioRad)를 이용하여 \( 620 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였고, 시료를 첨가하지 않은 용액을 대조구로 사용하였으며, \( \mathrm { KMnO } _ { 4 } \) 를 시료 대신 사용하여 망간의 산화된 정도를 비교 분석하는 표준곡선으로 사용하였다. 이때 \( 40 \mu \mathrm { M } \) 의 \( \mathrm { KMnO } _ { 4 } \) 는 \( 100 \mu \mathrm { M } \) 의 \( \mathrm { MnO } _ { 2 } \) 와 같은 산화 값을 갖는다. 망간 산화 활성은 1분 동안 \( 1 \mathrm { nmol } \) 의 망간이 산화하는데 관여하는 양을 1 unit로 환산하였다.</p> <p>또 완충액의 \( \mathrm { pH } \) 가 망간 산화능에 미치는 영향을 조사하기 위하여 \( 10 \mathrm { mM } \) HEPES- \( \mathrm { NaOH } \) 완충액을 \( \mathrm { pH } 4, \mathrm { pH } 5, \mathrm { pH } \) \( 6, \mathrm { pH } 7, \mathrm { pH } 7.5, \mathrm { pH } 8, \mathrm { pH } 9, \mathrm { pH } 10 \) 으로 각각 조정하여 균 배양액을 첨가한 후 망간 산화능을 조사하였다</p> <h2>망간 산화 단백질 정제</h2> <h2>Ammonium sulfate 분획침전</h2> <p>단백질 정제 실험을 위해 \( \mathrm { LD } \) 액체 배지 \( 200 \mathrm { ml } \) 에 Pseudomonas SP. MN5 를 접종하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 12시간 전 배양한 후, 21 배지에 접종하여 동일조건 \( \left (30 ^ {\circ } \mathrm { C } , 200 \mathrm { rpm } \right ) \) 으로 24시간동안 본 배양을 실시하였다. 균주 배양 후 원심분리를 통해 분리된 균체를 \( 10 \mathrm { mM } \mathrm { HEPES } - \mathrm { NaOH } ( \mathrm { pH } 7.5) \) 완충액으로 3 번 세척 후 동일 완충액 \( 100 \mathrm { ml } \) 로 현탁하고, 얼음에서 30초 파쇄 후 30초 쉬는 방법으로 30분간 파쇄(output watts \( 220 \mathrm { ~W } \); fisher scientific 550 sonic dismembrator) 하였다. 그 후 원심분리 \( \left (10,000 \times g, 20 \mathrm { ~min } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \) 하여 상등액을 얻었으며, 상등액에 포함되어 있는 망간산화물의 제거를 위해 상등액을 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 3시간 보관 후 녹이는 과정을 3 회 이상 반복 하고 동일 조건으로 원심분리하여 침전물로 망간산화물을 분리하였다. 이 상등액을 \( 40 \% \) ammonium sulfate로 침전시킨 후 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 10,000 \times g \) 에서 20분동안 원심분리하여 상등액은 제거하였다. 여기서 생긴 침전물은 \( 10 \mathrm { mM } \mathrm { HEPES } - \mathrm { NaOH } \) 완충액 \( 30 \mathrm { ml } \) 에 녹인 후, cenrifugal filter 장치 (3,000 millopore amicon ultra, MWCO) 를 이용 \( \left (5,000 \times g, 40 \mathrm { ~min } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \) 하여 완충액을 교환하였다. 이때 완충액은 새로운 완충액으로 3회 교체하여 주었다.</p>