본 실험에서는 건조된 협죽도에서 ENIL 및 ENIS을 채취하였고, 분주 받은 인체혈구세포 U937을 RPMI-1640 배지를 사용해 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 및 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 배양하였다. 다음으로 세포 생존율 측정을 위해 혈구계산판을 이용했으며 MTT assay에 의한 세포 증식 변화 여부를 조사했다. 이에 관한 결과는 Microsoft EXCEL program을 사용하여 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>본 실험에 사용된 협죽도는 부산시 영도구에서 채집된 것을 동정하여 사용하였다. ENIL 및 ENIS를 얻기 위하여 채집된 협죽도의 잎과 줄기를 각각 분리하여 흐르는 물로 충분히 세척하고 건조시킨 후 잘게 분쇄하였다. 건조된 협죽도의 잎과 줄기 \( 100 \mathrm{~g} \) 에 ethanol \( 1 \mathrm{l} \)를 첨가하여 \( 60^{\circ} \mathrm{C}, 150 \mathrm{~rpm} \)으로 3일간 교반 후 상층액만 분리하여 Whatman 필터(No. 2)로 걸러내고 감압 농축과정을 통하여 고형성분을 얻어내어 막자 사발로 잘게 마쇄하고 밀봉시켜 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 초저온 냉동고에 보관하였으며, 실험 시에는 dimethyl sulfoxide (DMSO)를 이용하여 10\( \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 만든 다음 이를 적정 농도로 배지에 희석하여 처리하였다. mRNA 분석을 위하여 사용된 primer는 Bioneer (Taejeon, Korea)에서 구입하였으며, 단백질 분석을 위하여 사용된 actin, COX-1, COX-2, \( N F-\kappa B \) 및 \( I\kappa B \) 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. Immunoblotting을 위해 2차 항체로 사용된 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Life Science Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>실험에 사용된 인체혈구세포인 U937 세포는 한국생명공학 연구소에서 분주 받았으며, \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS)에 \( 1 \% \)의 penicillin 및 streptomycin (Biofluids, Rockville, MD, USA)이 포함된 RPMI-1640 배지(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 및 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건 하에서 배양하였다.</p> <h2>Hemocytometer를 이용한 세포 생존율의 측정</h2> <p>세포 배양용 6 well plate에 U937 세포를 \( 1 \times 10^{5} \) 개 \( / \mathrm{ml} \)의 개수로 well 당 \( 2 \mathrm{ml} \)씩 분주한 다음 ENIL 및 ENIS를 적정농도로 처리하여 배양하였다. 시료 처리 6시간 후 상층액을 제거하고 세포만 남긴 다음 PBS 를 \( 1 \mathrm{ml} \) 첨가하여 잘 섞은 후 세포 부유액과 \( 0.5 \% \) trypan blue (Gibco BRL)를 동량으로 넣어 2분간 처리하고 도립 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 살아있는 세포를 계수하였다. 이에 따른 결과를 Microsoft EXCEL program을 사용하여 분석하였다.</p> <h2>MTT assay에 의한 세포 증식 변화 여부 조사</h2> <p>U937 세포에 ENIL 및 ENIS를 적정농도로. 처리하고 6시간동안 배양한 후 배지를 제거하고 tetrazolium bromide salt (MTT, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 \( 0.5 \)\( \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 희석하여 \( 200 \mathrm{\mu } / \mathrm{l} \) 씩 분주하고 3시간 동안 다시 배양하였다. 배양이 끝난 다음 MTT 시약을 제거하고 DMSO를 \( 1 \mathrm{ml} \)씩 분주하여 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 후 96 well plate에 \( 200 \mathrm{\mu } / \mathrm{l} \) 씩 옮겨서 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정 하였다. 측정은 모두 세 번을 하였으며, 그에 대한 평균값과 표준 오차를 Microsoft EXCEL program을 사용하여 분석하였다.</p>