Caspase-3 활성측정을 위해 배양한 U-937세포를 원심분리하여 배지를 제거 후 상등액을 취했다. 그리고 세포사멸의 기전 중 apoptosis의 지표가 되는 DNA fragmentation 실험을 실시하여, U-937 human leukemia 세포를 통해 DNA fragmentation을 확인하였다.
<h2>Caspase-3 assay</h2> <p>Caspase-3 활성측정은 Yamazaki 등이 발표한 방법을 이용하였다. 배양한 U-937세포를 원심분리하여 배지를 제거한 다음 \( 1 \% \) Triton X-100를 첨가한 \( 10 \mathrm { mM } \) Tris/\(\mathrm{HCl}\) buffer( \( \mathrm { pH 7.5 } \)); \( 10 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { NaH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } / \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } \), \(10 \mathrm { mM } \) \(\mathrm{Na}\) pyrophosphate, \( 130 \mathrm { mM } \) \(\mathrm{NaCl}\), \(3 \mathrm { ml } \)를 넣고 상온에서 10분간 lysis를 시키고, \( 3,000 \mathrm { rpm } \)으로 3분간 원심분리하여 상등액을 취했다. 상등액 \( 50 \mu \mathrm { l } \), Ac-DEVD-amc( \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \)) \( 10 \mu \mathrm { l } \), \(10 \% \) glycerol과 \( 2 \mathrm { mM } \) dithiothreitol 을 함유한 \( 20 \mathrm { mM } \) Hepes buffer( \( \mathrm { pH } 7.5 \)) \(1 \mathrm { ml } \) 를 혼합하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1시간 반응을 시켰으며, \( 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) Ac-DEVD-al \( 5 \mu \mathrm { l } \)를 첨가하여 반응을 정지시키고 \( 440 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>DNA fragmentation assay</h2> <p>세포사멸의 기전 중 apoptosis의 지표가 되는 DNA fragmentation 실험을 실시하였다. U-937 human leukemia 세포를 \( 10 \% \) FBS가 포함된 RPMI 1640배지에 \( 2 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { cells } / \mathrm { ml } \) 농도로 \( 9.62 \mathrm { ~cm } ^ { 2 } \) dish에 시료와 함께 8시간 배양한 후, cell은 회수하였다. 회수한 cell에 lysis buffer \( 20 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 100 \mathrm { mM } \) Tris, \( \mathrm { pH } ~7.4\), \(0.5 \% \) Triton X-100)를 넣고 ice 위에서 10분간 정치를 시킨 다음 centrifuge를 하여 침전물을 제거하고 RNase를 처리하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1시간 배양을 하고, Proteinase를 처리하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1시간 배양을 한 다음 \( 2 \% \) agarose gel에 전기영동을 실시하여 DNA fragmentation을 확인하였다.</p>