원형질체가 자라기 위해서는 효소의 농도와 사용 조건이 중요하다. Lyophyllum ulmarium에서는 Novozym 234 \( (10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)와 cellulase Onozuka R-10 \( (10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)를 혼합하여 사용 할때 가장 형성율이 높게 나타났으며 , 반응 시작 후 4시간이 지났을 때 최고치를 나타냈다. 안전성을 위해 사용하는 삼투압 안정제 중 \( 0.6 \mathrm{M} \) \( \mathrm{MgSO}_{4} \)가 제일 효과적이다. 산성도가 \( \mathrm{pH} 7\)일 때 최적이고 5일간 배양한 균사에서 형성율이 제일 높고 , 그 이후로 형성율이 떨어지기 시작했다.
<h1>실험 결과 및 고찰</h1><h2>균사 성장 조건</h2><p>각종 성분이 첨가된 고체배지에서 자란 Lyophyllum ulmarium의 성장 결과를 Table 2에 정리하였다. MCM보다 MCM의 경우 균사성장이 저지된 것으로 보아 MCM에 포함된 미량원소의 영향으로 사료 되며, C 배지에서 가장 높은 성장율을 보였으며 균사체의 모양은 Fig. 1과 같았다.</p><h2>원형질체의 생성 조건</h2><h3>(1) 세포벽 분해 효소의 효과</h3><p>시판되는 효소 제품 중 담자균류에서 효과가 인정된 몇 가지 효소를 병용하여 최적 농도를 결정하였다. 분리된 원형질체가 파괴되지 않도록 짧은 시간에 많이 얻는 것이 필요하기 때문에 적절한 효소의 농도와 처리시간의 선택이 매우 중요하다. Lyophyllum ulmarium에서는 Novozym 234 \( (10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)와 cellulase Onozuka R-10 \( (10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)를 혼합하여 사용하였을 때 원형질체 형성율이 가장 높았다. 또한 Novozym의 농도가 증가할수록 형성율이 증가하였으나 cellulase의 경우 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)에서 포화상태를 보였다. 반응 시작 후 1시간까지는 각 농도에서 유사한 원형질체의 형성율을 나타내었으나 2시간 이후부터는 농도에 따라 형성율의 차이를 보였으며 4시간에서 각각 최고치를 나타내었다. 그 후 시간이 경과되면서 원형질체의 수는 점차 감소하였다.</p><h3>(2) 삼투압 안정제의 효과</h3><p>윈형질체의 안전성을 유지하기 위하여 삼투압 안정제로 sucrose, mannitol, sorbitol, \( \mathrm{MgSO} 4 \), \( \mathrm{NaCl} \), \( \mathrm{KCl} \)을 실험하였다. \( 0.6 \mathrm{M} \) \( \mathrm{MgSO}_{4} \)가 가장 효과적이었고 유기물에 비해 무기염류에서 더 높은 형성율을 나타내었다.</p><h3>(3) 반응시간에 따른 영향</h3><p>원형질체가 형성되는 과정을 hemacytometer를 사용하여 반응시간 동안 계산하였다. 그 결과 4시간 동안 반응시켰을 때 가장 높은 형성율을 보였다.</p><h3>(4) \( \mathrm{pH} \)의 효과</h3><p>\( \mathrm{pH} 4,5,6,7 \)에서 원형질체의 안정성을 살펴보았더니 \( \mathrm{pH} 7\)에서 최적이었고 산성이 강해질수록 형성율이 감소하였다.</p><h3>(5) 균사성장 일수에 따른 효과</h3><p>세포벽 구성성분은 배양시기에 따라 변화하기 때문에 세포벽 분해효소가 특정시기의 세포벽 구성성분에 효과적으로 작용하는 시기를 결정하기 위하여 완전 고체배지 위의 셀로판지에 접종한 지 3일부터 7일까지의 균사체에서 원형질체의 분리를 시도한 결과 5일간 배양한 균사에서 원형질체의 형성율이 가장 높았는데 이는 성장속도가 느려서 원형질체의 형성에 필요한 균사가 생성되는데 소요되는 시간이 길기 때문이었다. 6일이 지나면서 세포벽이 경화되어 효소가 작용하기 어려워져 형성율이 떨어지기 시작하였다.</p><h2>균사체 염색</h2><p>균사체의 핵을 관찰하기 위해 DAPI (46-diamidine-2-phenyl indole dihydrochloride)로 염색한 후 형광현미경으로 관찰한 결과 septum 사이에서 핵이 관찰되었다.</p><h2>원형질체 재생 조건</h2><p>원형질체 재생에 사용되는 삼투압 안정제는 원형질체의 생성에 사용되었던 것과 동일한 것을 사용하는 경우가 많은데 원형질체의 생성시와는 다르게 \( 0.6 \mathrm{M} \) sucrose를 함유한 태지에서 가장 높은 재생율 \( (2.3 \sim 2.7 \%) \)을 나타내었다. 그리고 \( \mathrm{NaCl} \)과 \( \mathrm{KCl} \)의 두 무기염류에서는 매우 낮은 재생율을 보였으며 원형질체는 모든 배지에서 10-15일이 지나야 재생되었다.</p>