멜라닌 양은 Hosoi 등의 방법을 변형하여 사용하였고, 티로시나아제 활성 측정은 Choi 등의 방법을 변형하였다. B16F10 멜라노마 세포를 \(6\mathrm{ well}\)에 \( 1 \times 10^{5} \)\(\mathrm{cells/well}\)에 되도록 분주하고 24시간 동안 배양한 후, 배지를 제거 후에 각 well에 시료를 48시간 동안 처리한 뒤 PBS로 세척하였다. 실험 결과는 분산분석으로 유의차 검증하였고 Tukey's HSD test로 유의성 분석을 하였다.
<h2>멜라닌 생성 억제 효과</h2> <p>멜라닌 양은 Hosoi 등의 방법을 변형하여 사용하였다. B16F10 멜라노마 세포를 6 well에 \( 5 \times 10^{4} \) cells/well이 되도록 접종하여 배양하고, 각 well에 시료를 처리한 뒤 48시간 동안 배양한다. 배양 후 phosphate buffered saline (PBS)로 2회 세척한 후 원심 분리하여 세포 침전물을 만들었다. \( 10 \% \) dimethyl sulfoxide (DMSO)가 첨가된 \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{~NaOH} \) 용액을 \( 150 \mathrm{\mu l} \) 첨가하고 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 용해하였으며 \( 405 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정한 후 실험군의 멜라닌 양은 무첨가군의 멜라닌 양에 대한 백분율로 계산하여 나타내었다.</p> <h2>티로시나아제 활성 측정</h2> <p>티로시나아제 활성 측정은 Choi 등의 방법을 변형하여 측정하였다. B16F10 멜라노마 세포를 6 well에 \( 5 \times 10^{4} \) cells/well이 되도록 접종하여 배양하고, 24시간 뒤 각 well에 시료를 처리한 뒤 48시간 동안 배양한다. 배양 후 PBS로 2회 세척한 후 각 well의 세포에 lysis buffer ( \( 1 \% \) triton X-100, \( 0.1 \mathrm{~M} \) sodium phosphate buffer, \( 50 \mathrm{~mM} \) PMSF, \(\mathrm{pH~} 6.8\))를 가하였다. 얼음 위에서 세포를 파괴시키고 원심 분리한 후 상층액만 따로 모아 효소용액으로 사용하였다. L-DOPA를 \( 2 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 \( 0.1 \mathrm{~M} \) sodium phosphate buffer (\( \mathrm{pH} 6.8\))에 녹여 기질을 준비하고 기질 \( 160 ~ \mathrm{\mu l} \)에 효소용액 \( 40 ~ \mathrm{\mu l} \)를 가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시키고 생성된 DOPA chrome의 양을 \( 490 \mathrm{~nm} \)에서 측정한 후 (\(1- \text{시료의 흡광도}/\text{무첨가군의 흡광도} ) \times 100 \)에 의하여 억제율을 계산하였다.</p> <h2>Western blot을 통한 미백 관련 단백질의 발현 측정</h2> <p>B16F10 멜라노마 세포를 6 well에 \( 1 \times 10^{5} \) cells/well에 되도록 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 각 well에 시료를 48시간 동안 처리한 뒤 PBS로 세척하였다. Lysis buffer \( 100 ~ \mathrm{\mu l} \)를 첨가하여 세포를 용해시키고, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 12,000 ~\mathrm{rpm} \)으로 20분간 원심 분리하여 세포막 성분들을 제거하였다. 원심 분리하여 얻은 단백질은 BCA (bicinchoninic acid) kit assay로 정량 하였으며, \( 60 ~ \mathrm{\mu l} \)의 단백질을 \( 10 \% \)의 SDS-PAGE를 이용하여 전기 영동 한 후, PVDF membrane에 transfer하였다. Transfer가 끝난 membrane은 \(5\%\) skim milk로 1시간 동안 blocking을 한 뒤 1차 항체 tyrosinase, TRP-1, TRP-2는 \(3\%\) skim milk에 \(1:1,000\)으로 희석하여 사용하고 overnight하였다. Tris-buffered salin and tween 20 (TBST)로 3번 세척한 뒤 2차 항체 anti-goat, anti-mouse, anti-rabbit은 \( 3 \% \) skim milk에 \(1:1,000\)으로 희석하여 1시간 동안 붙이고, TBST로 3번 세척한 뒤 enhanced chemiluminescense (ECL) kit (Milipore, Germany)를 이용하여 발현 양상을 측정하였다. 밴드 정량은 gel doc (Amersham Pharmacia, England)을 이용하여 확인하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>결과 통계처리는 SPSS 12.0을 사용하였으며, 유의차 검증은 분산분석(analysis of variance: ANOVA)으로 Tukey's HSD test에 의해 유의성을 분석하였다.</p>