멜라토닌 peak의 크기보다 분석에 사용한 모든 Viola식물들의 추출물에서 멜라토닌 peak이 골고루 추출되었다는 사실이 더 중요한 것으로 생각된다. 화학적 변형을 통해 만들어진 멜라토닌의 fluorescent 유도체를 검출하는 방법의 유용성을 입증하기 위해 20nmoles의 TAM,Trp 그리고 멜라토닌 표준시료를 각 변형시키고 전구체를 더해 식물 추출물 처리과정과 같은 과정을 밟은 다음 HPLC-FL (emission \(390\mathrm{~nm} \), excitation \(245 \mathrm{~nm} \) )로 추출하였다. 그 결과 전구체로 공급하는 Trp와 TAM은 elution profile에서 추출되지 않았고 단일 peak으로 melatonin이 추출되었다. 멜라토닌생합성의 최초전구물질인 Trp과 tryptophan decarboxylase에 의해 만들어지는 다음 단계의 중간대사 물질인 TAM을 공급하고 여기서 만들어지는 멜라토닌을 HPLC-FL로 추출했다. TAM을 공급했을 때 멜라토닌의 함량이 증가하는 결과를 통해, tryptophan decarboxylase가 Trp을 TAM으로 전환하는 과정이 속도결정단계라는 가설을 도와준다고 생각된다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Viola 식물들에 존재하는 멜라토닌의 검출</h2> <p>한국추출물은행에서 획득한 13종 18개 시료를 HPLC로분석한 결과 남산제비꽃(Viola dissecta var. chaerophylloides), 태백제비꽃 (\( V \). albida), 잔털제비꽃 (\( V \). keiskee), 제비꽃 \( V \).mandshurica), 왜제비꽃 (\( V \). japonica), 알록제비꽃 (\( V \).variegata), 우산제비꽃 \( (V.\quad \) woosanensis), 민둥뫼제비꽃 (\( V \).tokubuchiana var. takedana), 왕제비꽃 ( \( V \). websteri), 졸방제비꽃 (\( V \). acuminata), 섬제비꽃 (\( V \). takeshimana), 낚시제비꽃 (\( V \).grypoceras), 콩제비꽃( \( V \). verecunda)에서 멜라토닌이 검출되었다(Fig. 2). HPLC elution profile에서 태백제비꽃 (\( V \).albida, Fig. 2C)과 민둥뫼제비꽃( \( V \). tokubuchiana var.takedana, Fig. 2J)에서 멜라토닌 신호가 다른 시료에서보다 크게 검출되었으나 정성적으로 이루어진 본 분석에서 신호의 크기가 반드시 식물체 내의 멜라토닌 함량을 반영한다는 것을 의미하지는 않을 것이다. 낚시제비꽃 \( (V . g r y p o c e r a s) \) 의경우에는 같은 종에서도 추출물 시료에 따라서 peak의 크기가 다소 다르게 검출되었다(Fig. 2O-2Q). 그러므로 멜라토닌 peak의 크기보다는 분석에 사용된 모든 Viola 식물들의 추출물에서 멜라토닌 peak이 골고루 검출되었다는 사실이 더 중요한 것으로 사료된다. 이로부터 Viola 식물군에 따라서함량의 차이는 있을 수 있지만 일반적으로 멜라토닌이 존재할 것이라는 추론이 가능하였다.</p> <h2>Trp, TAM 및 멜라토닌 표준시료의 분석</h2> <p>화학적 변형을 통하여 생성된 멜라토닌의 fluorescent 유도체를 검출하는 방법의 유용성을 검증하기 위하여 20nmoles의 Trp, TAM 그리고 멜라토닌 표준 시료를 각각 변형시킨 뒤 전구체를 가하고 식물 추출물 처리과정과 동일한 과정을 거친 후 HPLC-FL (emission \(390\mathrm{~nm} \), excitation \(245 \mathrm{~nm} \) )로 검출하였다(Fig. 3). 그 결과 전구체로 공급하는 Trp와 TAM은 elution profile에서 검출되지 않았으며 melatonin은 단일 peak으로 검출되었다. 이로부터 본 분석방법은 고농도의 전구체를 공급하여도 이에 방해 받지 않고 산물인 멜라토닌을 검출하는데 유용한 것을 확인하였다. 표준 시료의 peak 면적을 이용하면 생성되는 멜라토닌 양을 수치화 할 수는 있으나, internal standard가 아닌 external standard에 의한 수치에 의한 정량은 신뢰성이 떨어지므로 이후 과정에서는 멜라토닌의 검출 여부만을 주목하는 정성적인 논의로 제한하였다.</p> <h2>전구체 공급시 생성되는 멜라토닌의 검출</h2> <p>멜라토닌 생합성의 최초 전구물질인 Trp과 tryptophan decarboxylase에 의하여 생성되는 바로 다음 단계의 중간대사 물질인 TAM을 공급하고 이로부터 생성되는 멜라토닌을 HPLC-FL로 검출하였다(Fig. 4). 자생하는 Viola 식물의 잎을 완충용액에 띄우고 \( 1 \mathrm{mM} \) 의 Trp 또는 TAM을 공급하고 멜라토닌이 생성될 것으로 예상되는 암조건에서 배양하였다. 시료로 사용한 식물은 잎의 형태 등을 근거로 제비꽃(Viola mandshurica)의 특징을 보이는 식물체를 채취하여 사용하였으나 근연종간의 자연적인 교배가 빈번하므로 잡종일 가능성을 감안하여 Viola 식물로 통칭하였다. 비록 유전학적 배경은 사용된 시료간에 차이가 있을 수도 있지만 Fig. 2에서 확인한 바와 같이 Viola에서 멜라토닌은 광범위하게 존재하는 것으로 판단되므로 전구물질들을 공급하고 최종산물을 확인하고자 하는 본 실험의 목적에는 사용 가능한 것으로 판단하였다. 그에 따라 TAM을 공급하였을 때 Viola 식물의 잎에서 멜라토닌이 생성되는 것을 확인하였다(Fig. 4C). 발견된 멜라토닌 신호는 동일한 화학적 변형을 가한 표준 멜라토닌 시료와 유사한 시간인 약 10 분에 elution 되었으며, 표준 멜라토닌 시료를 식물체에서 분리한 시료에 첨가하여 HPLC로 분석하였을 때 해당되는 신호의 크기가 증가하는 것으로 멜라토닌이라는 것을 확인하였다(data not shown). 흥미롭게도 TAM을 공급한 Viola 식물의 추출물뿐 아니라 잎을 배양하였던 배양용액에서도 멜라토닌이 검출되었다(Fig. 4F). 이 결과는 Viola 잎에서 생성된 멜라토닌이 조직 밖으로 유출될 수 있다는 점을 보여준다. 신호의 elu-tion time이 추출물의 경우와 약간 다르게 약 9분에 나타났으나 표준시료의 혼합 결과 멜라토닌 신호가 맞는 것으로 확인되었다(data not shown). 추출물과 배양용액 속에 포함된 서로 다른 물질들과의 상호작용 및 분석 시 전개용매의 증발 등이 elution time에 영향을 미쳤을 수 있지만 표준시료의 첨가로 신호의 정체성을 확인하였으므로 결과의 해석에는 이상이 없는 것으로 판단되었다.</p> <p>멜라토닌 생합성이 시작되는 최초 전구물질인 Trp을 공급하였을 때에는 부레옥잠 (Eichhornia crassipes) 에서의 연구 결과와는 달리 Viola 식물 추출물 및 배양용액 모두에서 멜라토닌의 증가가 확인되지 않았다(Fig. 4B and 4E). 그 이유로는 외부에서 가해준 Trp이 단백질 합성에 사용되는 아미노산 pool로 유입되거나 중간 산물을 공유하는 다른 경로로 유입되어 멜라토닌 합성 경로에서 사용되는 양이 적었을 가능성을 상정할 수 있을 것이다. 또한 조직 내로의 Trp 유입이 저조하여 효과가 없는 것으로 평가될 가능성도 있지만 외부에서 Trp를 공급하고 이루어진 다른 실험들에서 Trp 유입은 큰 문제가 없었으며, 본 실험에는 절단면을 지닌 잎의 절편을 사용하고 장시간 배양하였으므로 Trp 유입량이 저조한 것으로 모든 결과를 설명하기는 어려운 것으로 사로된다. 그 보다는 Trp 공급이 멜라토닌 함량에 직접적인 영향을 미치지 않는 것에 비추어 Trp 이후의 단계에서 멜라토닌 생합성의 조절이 이루어질 것이라는 점을 추론할 수 있다. 동물에서는 AANAT (Fig. 5)가 촉매하는 단계가 속도 결정단계인 것으로 알려져 있지만 식물에서는 본 결과가 지지하는 바와 같이 Trp을 TAM으로 전환하는 과정이 속도 결정단계일 것이라는 점이 이미 제시되어 있는 상황이기도 하다. 대조군 시료의 분석에서 내생 멜라토닌이 검출되지 않는(Fig. 4A) 이유는 외부에서 기질을 공급하고 실시하는 분석의 재료는 내생 멜라토닌이 검출될 수 있을 만큼 농축되지 않았기 때문에 내생 멜라토닌이 분석의 검출한계 이하로 존재하였기 때문이었다. 본 연구에서 TAM을 공급하였을 때 멜라토닌의 함량이 증가하는 결과는 tryptophan decarboxylase가 Trp을 TAM으로 전환하는 과정이 속도결정단계일 것이라는 가설을 지지하는 것으로 사료된다.</p>