본 실험은 RSP 및 RJ의 항유전독성 효과와 세포독성에 미치는 영향을 검증하고 있는데, 이를 위해 세포독성과 향균활성을 측정한다. 먼저 세포독성 유무를 확인하여 3T3 세포주에 대한 안정성을 검토하였다. 또한 향균활성을 알아보기 위해 RSP 및 RJ를 화장품 시료에 첨가하여 오염균에 대한 시료의 저해활성을 측정하였다.
<h2>In vitro 세포독성 측정</h2><p>RSP 및 RJ의 3T3 세포주에 대한 안전성을 검토하기 위하여 세포독성의 유무를 확인하였다. 세포독성을 확인하기 위해서 CytoTox \(96^{\circledR} \) Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit (Promega, USA)을 사용하였으며 제조사의 매뉴얼과 같이 실험하였다. RSP 및 RJ가 강한 항유전독성을 보이는 농도의 10배 농도(RSP : \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}, RJ : 100 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)가 되도록 DMEM 배지에 녹인 후 \( 0.22 \mu \mathrm{m} \) syringe filter로 여과하였고, 이를 4배씩 희석하여 시료를 준비하였다. \( 1.0 \times 10^{5} \) cells/well 로 96 well plate 상에 3T3 세포주를 분주 한 후 6시간동안 배양한 뒤 배양상청액을 제거하고 \( 50 \mu \mathrm{l} \)의 DMEM (\(5 \% \) FBS)을 첨가하였다. 각 시료를 well 당 \( 50 \mu \mathrm{l} \)씩 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% ~ \mathrm{CO}_{2} \) 하에서 1시간동안 반응시킨 다음 \( 1,000 \mathrm{rpm}, 3 \)분간 원심분리한 뒤 각 well의 상청액 \( 50 \mu \mathrm{l} \)를 새 plate에 읆겼다. 이후, \( 50 \mu \mathrm{l} \)의 substrate mix를 첨가한 뒤 실온, 암실에서 15분간 반응시킨 다음 \( 50 \mu \mathrm{l} \)의 reaction stop buffer 를 첨가하여 반응을 종료시킨 뒤 \( 492 \mathrm{~nm} \) 하에서 홉광도를 측정하였다.</p><h2>항균활성 측정</h2><p>기능성 한방화장품 생산업체인 소리소뷰티아카데미(대구 시 수성구)로부터 제공받은 보존료가 첨가되지 않은 화장품 시료 4종( \( C1 \sim C4) \)을 \( 2 \sim 4 \)주간 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 냉장보관한 다음 화장품시료 \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 멸균증류수에 10배씩 희석하여 LB agar 배지에 도말한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에 하룻밤 배양하여 오염되어있는 미생물의 수를 측정하였다. 또한 RJ 및 RSP를 화장품 시료에 동량 첨가한 후 1시간동안 실온에 방치한 후 이를 도말하여 균의 수를 계수함으로서 오염균에 대한 시료의 저해활성을 측정하였다. 음성대조구로서는 화장품에 멸균 중류수를 첨가한 것을 사용하였으며, 양성 대조구로는 화장품 보존제인 \( 0.1 \mathrm{M} \) methyl paraben (methyl 4-hydroxybenzonate, in ethanol, Sigma, USA)을 화장품에 첨가한 것을 사용하였다. 저해활성은 음성대조구에서 관찰되는 미생물의 수를 \( 100 \% \) 로 하여 첨가물에 따른 미생물의 수를 계수한 다음 백분율로 환산하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>시료의 항유전독성 효과 및 세포독성에 미치는 영향을 유의성 검증을 위해 Microsoft \( { }^{\circledR} \) Excel (Microsoft, USA)의 t-test를 이용하였다.</p>