WEEH와 TRAIL를 혼합 처리하였을 경우 각각을 단독 처리를 하였을 때보다 세포의 생존율이 매우 감소되었으므로, apoptosis 유도와 연관성이 있을 것으로 추정되어 flow cytometry를 이용하여 apoptosis가 일어난 세포의 집단에 해당되는 세포주기 sub-G1기에 속하는 세포의 빈도를 측정하여 apoptosis의 정량화를 실시하였고, 직접적인 증거를 제시하기 위하여 WEEH와 TRAIL의 단독 및 혼합처리에 따론 세포의 형태변화를 관찰하였으며, WEEH와 TRAIL 혼합 처리에 따른 AGS 세포 핵의 형태적 변화를 DAPI 염색을 통하여 확인하였다.
<h1>결 과</h1> <h2>AGS 인체 위암세포의 증식에 미치는 WEEH와 TRAIL의 영향</h2> <p>WEEH와 TRAIL의 단독 및 혼합 처리에 의한 AGS 위암세포의 세포 생존율을 측정하기 위하여 MTT assay를 이용하였다. Fig. 1에서 알 수 있듯이 AGS 세포에 WEEH를 0.02 및 \(0.04\mathrm{~mg} /\mathrm{ml} \)의 농도를 처리를 하였고, TRAIL은 \( 200\mathrm{~ng} / \mathrm{ml} \)의 농도로 단독 혹은 WEEH와 혼합 처리하였다. 본 실험의 조건에서 WEEH와 TRAIL을 단독으로 처리 하였을 경우 AGS 세포의 생존율에 큰 변화가 없었으나, WEEH와 TRAIL를 혼합 처리하였을 경우 각각을 단독 처리를 하였을 때보다 세포의 생존율이 매우 감소되었음을 알 수 있었다 \( (0.04 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \)외 WEEH 및 \( 200 \mathrm{~ng} / \mathrm{ml} \) TRAIL 동시 처리의 경우 약 \( 43 \% \) 이상 억제). 이러한 결과는 WEEH나 TRAIL이 단독으로 처리 되었을 때보다 두 가지의 약물을 동시에 처리하였을 경우 AGS 위암세포의 증식을 보다 효과적으로 억제할 수 있음을 의미한다.</p> <h2>WEEH와 TRAIL의 혼합 처리의 의한 apoptosis의 유발</h2> <p>Fig. 1의 결과에서 WEEH와 TRAIL의 혼합 처리에 의한 AGS 세포의 증식억제가 apoptosis 유도와 연관성이 있을 것으로 추정되어 flow cytometry를 이용하여 apoptosis가 일어난 세포의 집단에 해당되는 세포주기 sub-G1기에 속하는 세포의 빈도를 측정하여 apoptosis의 정량화를 실시하였다. Fig. 2에 제시된 것과 간이 AGS 세조에 WEEH가 단독으로 처리된 경우 sub-G1기에 속하는 세포의 빈도는 대조군\( (3.01 \%) \)에 비하여 약간 증가되었으며, \( 200 \mathrm{~ng} / \mathrm{ml} \)의 TRAIL 단독 처리군\((2.67\%)\)에서는 대조군과 유사하였다. 그러나 WEEH와 TRAIL이 흔합 처리되 경우 대조군에 비하여 매우 높은 sub-G1기 빈도를 보여 WEEH와 TRAIL의 단독 처리보다는 흔합 처리가 AGS 세포에서 apoptosis 유발에 배우 효과적이있으며, 이러한 경향성은 MTT assay의 결과와도 잘 일치하였다.</p> <h2>WEEH와 TRAIL의 혼합 처리에 의한 세포 형태 변화 유발</h2> <p>WEEH와 TRAIL의 단독 처리 보다 혼합 처리에 의한 AGS 세포의 중식억제와 연관된 apoptosis 유발의 직접적인 증거를 제시하기 위하여 WEEH와 TRAIL의 단독 및 혼합처리에 따론 세포의 형태변화를 관찰하였다. Fig. 3A는 도립 현미경하에서 관찰된 AGS 세포의 전체적인 형태의 변화를 보여 주는 결과로서, WEEH와 TRAIL이 흔합 처리된 경우 각각의 단독 처리에서는 관찰되지 않았던 세포 밀도의 감소에 따른 membrane shrinking을 동반한 세포 내 과립 형성과 같은 apoptosis가 유반되었을 경우 관참되는 세포변형 현상을 관찰할 수 있었다. 또한 단독 처리군에 비하여 혼합 처리군의 경우 세포의 길이가 길어지고 dendrite와 같은 분지의 형성이 많아졌다.</p> <p>Apoptosis가 일어난 세포에서 가장 일반적으로 관찰되는 현상이 DNA의 절단에 의한 염색질의 응축이기 때문에 WEEH와 TRAIL 혼합 처리에 따른 AGS 세포 핵의 형태적 변화를 DAPI 염색을 통하여 이를 확인하였다. Fig. 3B에 나타낸 바와 같이 정상배지에서 배양된 AGS 세포나 WEEH 및 TRAIL가 단독 처리된 배지에서 배양된 AGS 세포의 경우 핵의 전체가 완전한 형태로 염색이 되는 양상을 보였으나, WEEH와 TRAIL이 혼합 처리된 배지에서 배양된 AGS 세포의 경우 DNA 절단에 의한 염색질의 응축된 형태인 apop-totic body의 형성이 매우 증가되었다. 이는 Fig. 1 및 2에서 제시된 WEEH 및 TRAIL 단독 및 혼합 처리에 의한 AGS 세포의 증식 억제효과가 apoptosis 유발에 의한 것임을 뒷받침하여 주는 결과이다.</p>