제한효소, 유전자 클로닝을 위한 숙주, 효모의 배양 배지 등을 준비하고 박테리오신 OR-7의 유전자는 아미노산 서열을 토대로 효모의 유전암호 이용성에 적합하게 DNA 염기서열로 바꾼 후 합성하였다. 제작한 재조합 DNA를 대장균에 형질전환 시킨 후 플라스미드 DNA를 분리하고 삽입된 \( 180 \mathrm{bp} \) 의 OR-7 유전자 단편을 확인하였고 pAUR-OR-7으로 명명하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약 및 배지</h2> <p>제한효소, DNA ligation kit ver. 2, Taq DNA polymerase는 Takara Korea(Seoul, Korea)에서 구입하였다.</p> <p>유전자 클로닝을 위한 숙주로는 대장균 세포 \( (E \). coli \( \mathrm{DH} 5 \alpha \) )를 사용하였다. 대장균은 LB 배지(1\% bacto tryptone, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 0.5 \% \mathrm{NaCl} \) )를 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하였다. 대장균 형질전환체의 선별을 위해서는 LB 배지에 ampicillin을 최종농도가 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 가 되게 첨가하여 사용하였다. 고체배지는 LB 배지에 한천(agar)을 \( 1.5 \% \) 가 되도록 첨가하여 제작하였다.</p> <p>효모의 배양에는 YPD 배지 \( (1 \% \) yeast extract, \( 2 \% \) polypeptone, \( 2 \% \) D-glucose)를 사용하였다. 효모의 발현 플라스미드는 alcohol dehydrogenase promoter(ADH)에 의해 발현이 유도되는 pAUR123(Takara Korea, Seoul Korea)을 사용하였다. 형질전환된 효모의 선별에는 YPD 배지에 aureobacidin A (Takara Korea)를 최종농도가 \( 0.2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 가 되게 첨가한 배지를 사용하였다.</p> <h2>박테리오신 OR-7의 유전자의 클로닝 및 효모세포의 형질전환</h2> <p>박테리오신 OR-7의 유전자 \( (180 \mathrm{bp}) \) 는 문헌고찰을 통해 확보된 아미노산 서열을 토대로 효모의 유전암호 이용성 (codon usage)에 적합하게 DNA 염기서열로 바꾼 후 (주)바이오니아(Seoul, Korea)에서 합성하였다(Fig. 1). OR-7 유전자의 용이한 클로닝 및 발현을 위하여 유전자의 \( 5^{\prime} \) 말단에 제한효소 \( \mathrm{KpnI} \) 인식부위와 개시코돈 \( \mathrm{ATG} \) 를 그리고 \( 3^{\prime} \) 말단에 종지코돈 \( \mathrm{TAA} \) 와 제한효소 \( \mathrm{XbaI} \) 인식부위를 도입하여 제작하였다(Fig. 1). 제작된 OR-7 유전자 단편을 효모발현 벡터 pAUR123의 KpnI과 \( \mathrm{XbaI} \) 부위에 연결하였다(Fig. 2). 이렇게 제작된 재조합 DNA를 대장균 (E. coli \( \mathrm{DH} 5 \alpha \) )에 형질전환시킨 후, 플라스미드 DNA를 분리하고 제한효소로 삽입된 \( 180 \mathrm{bp} \) 의 OR-7 유전자 단편을 확인하였고 pAUR-OR-7으로 명명하였다. pAUR-OR-7을 이용한 효모세포(S. cerevisiae KCTC 7913)의 형질전환은 electroporation(Cell-Porator, Life Technologies, MD, USA)법으로 행하였다. 형질전환된 효모의 선별에는 YPD 배지에 aureobacidin A(Takara, Korea)를 최종농도가 \( 0.2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 가 되게 첨가한 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3 일간 배양하여 형질전환된 효모를 선별하였다.</p>