RNA 추출 후, primer와 여러 반응 조건들을 이용하여 \( \mathrm { cDNA } \)를 합성하였다. 다음으로, MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase의 mRNA 발현을 파악하기 위해 PCR을 실행하였다. 각각의 단백질에 대한 PCR 조건은 주어진 온도와 시간에 따라 다르며, 각각의 PCR 반응이 완료된 후 1.5% agarose gel에 ethidium bromide를 첨가하고 100 V에서 40분간 전기영동 후 밴드를 확인하여 분석하였다.
<h2>Total RNA 분리 및 cDNA 합성</h2> <p>세포의 cell seeding은 100 culture dish에 \( 1 \times 10 ^ { 6 } \) cells/well씩 분주하여 24시간 동안 배양한 후 시료를 농도별 로 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 배지 상등액을 제거후 trizol lysis buffer를 well에 1ml씩 분주하였고, 세포를 lysis한 후 chloroform \( 200 \mu \) 를 분주하여 20 초간 반응시켰 다. 그 후 13,200rpm 에서 20 분간 원심 분리하여 상층액을 isopropanol \( 500 \mu \) l과 1:1 튜브에 섞었다. 다시 13,200rpm 에서 20분간 원심분리 하였고, 그 상층액을 제거 한 후 75% EtOH-diethylpyrocarbonate water를 각 튜브에 1ml 씩 분주하여 13,200rpm 에서 2 분간 원심분리한 뒤 상층액을 제 거하여 실온에서 건조시켰다. Diethylpyrocarbonate water (DEPC water) \( 50 \mu \) l로 녹인 후 96 well plate에 RNA \( 5 \mu \) 와 멸균수 \( 195 \mu \mathrm { l } \) 를 첨가하여 260nm, 280nm에서 각각 흡 광도를 측정하여 total RNA양을 측정하였다. 추출한 RNA \( 2 \mu \mathrm { g } \), Oligo (dT) 15 primer \( (500 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) 1 \mu \mathrm { l } \), nuclease free water로 \( 10 \mu \mathrm { l } \) 를 맞추고 \( 75 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분간 반응시킨 후 5X reaction buffer, \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \), reverse transcriptase, nuclease free water, PCR necleotide mix, rnasin inhibitor를 첨가 하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분, \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 60 분, \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 15 분간 반응 시켜 \( \mathrm { cDNA } \) 를 합성시켰다.</p> <h2>Reverse transcription-polymerase chain reaction</h2> <p>MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase의 mRNA 발현을 알아 보기 위하여 polymerase chain reaction (PCR)을 실시하였 다. 실험에 사용한 primer sequences는 Table 1 과 같다. PCR tube에 Go Flexi DNA polymerase, primer, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 는 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초, \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 45 초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 45 초 (35 cycles), tyrosinase는 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초, \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 45 초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 45초 (40 cycles), TRP-1, TRP-2, MITF는 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초, \( 58 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 서 45 초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 45 초 (40 cycles)을 하였으며, PCR로 합성 시킨 후 \( 0.002 \% \) ethidium bromide를 첨가한 1.5% agarose gel에 100 V 에서 40분간 전기영동 후 UV transilluminator 를 이용하여 밴드를 확인하여 분석 정량하였다.</p>