HCT116 대장암 세포는 DMEM에서 37\(^\circ \mathrm{C}\), 5% CO2 조건 하의 incubator에서 배양했으며 sulindac sulfide는 100 mM stock solution을 제조하여 -20\(^\circ \mathrm{C}\)에서 저장하여 사용하였다.96 well plate에 3,000개의 HCT116 세포를 접종한 sulindac sulfide의 최종농도가 10 \(\mu\mathrm{m}\)가 되게 처리하고 24시간 동안 배양하였으며 MTS 용액을 20\(\mu\mathrm{l}\)씩 넣고 4시간 동안 반응한 다음, 96-well plate reader를 이용하여 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 측정했고 Total RNA의 분리는 제조사의 프로토콜을 따랐다.
<h1>재료 밎 방법</h1> <h2>세포배양 및 시약</h2> <p>본 연구에 사용된 HCT116 대장암 세포주의 배양은 \( 10 \% \) FBS (Fetal Bovine Serum, GIBCO Inc. USA)와 \( 1 \% \) penicillin/streptomycin (WelGENE Inc. Korea)이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, GIBCO Inc. USA)을 사용하였으며, 배양은 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(5 \% \) \( \mathrm { CO_ { 2 } } \) 조건 하의 incubator에서 실시하였다. NSAID인 sulindac, sulindac sulfone, sulindac sulfide 그리고 DMSO (Dimethyl Sulfoxide)는 Sigma-Aldrich Chemical Co. (USA)에서 구입하였다. Sulindac sulfide는 DMSO에 녹여 \( 100 \mathrm { ~mM } \)의 stock solution을 제조한 후, 이를 aliquot하여 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 저장하여 사용하였다.</p> <h2>세포 생존율 측정</h2> <p>세포 생존율 측정을 위하여 96 well plate의 각 well에 3,000개의 HCT116 세포를 접종한 후, 24시간 후에 sulindac, su-lindac sulfone 그리고 sulindac sulfide의 최종농도가 \( 10 \mathrm { ~ \mu M } \)가 되게 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 배양한 후 미국 Promega사의 MTS 용액 [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)5-(3-carboxymethoxphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium]을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. NSAID 처리 후, 각 well 당 MTS 용액을 \( 20 \mathrm { ~ \mu l } \)씩 넣고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 5 \% \mathrm { ~CO_ { 2 } } \) incubator에서 4시간 동안 반응한 다음, 96-well plate reader (Expert 96UV ASYS Hitech, Austria)를 이용하여 \( 490 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정 하였다. 실험 결과는 4개의 독립적인 well에서 수행한 값을 \( mean \pm SD \)값으로 나타내었다. Sulindac sulfide의 농도 의존적 처리 실험의 경우, 최종농도가 0, 10, 20 그리고 \( 30 \mathrm { ~ \mu M } \)이 되도록 처리한 다음, 위와 동일한 방법으로 측정하였다.</p> <h2>Total RNA의 분리</h2> <p>Total RNA의 분리는 Qiagen 사의 RNeasy mini kit (USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 정제한 total RNA는 UV-spectrophotometer를 이용하여 \( 260 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 분리된 total RNA는 DNA micorarray 실험, RT-PCR, quantitative real-time PCR 등에 각각 사용하였다.</p>