균주가 생산하는 항균물질의 분자량을 측정하기 위해 agar difussion 방법과 MRS 배지를 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양하고 원심분리, \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) membrane filter로 제균한 후 Amicon Ultra-15 centrifugal filter devices 3K를 사용하여 3,000Da 이상과 이하의 분획으로 나누어 농축하였다. ifussion 방법과 MRS 배지에서 24 시간 동안 배양하여 원심분리, \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) membrane filter로 제균한 후 Amicon Ultra-15 centrifugal filter devices 3K를 이용하여 3,000 Da 이상과 이하의 분획으로 나누어 농축하였다.
<h2>Lc. mesenteroides CK0122 균주의 배양 상징액 분획 및 조항균물질 제조</h2> <p>\( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 미호기 조건에서 24 시간 동안 MRS 배지에서 배양한 CK0122 균주 배양액을 원심분리 \( (6,000 \times \mathrm{g}, 20 \mathrm{~min}) \) 하여 회수한 상징액을 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) membrane filter(Gelman Science, USA)로 제균한 다음, Amicon Ultra-15 centrifugal filter devices 3K(Millipore, USA)를 이용하여 분자량 3,000 Da 이상과 이하의 분획으로 나누어 농축하였다.</p> <h2>Lc. mesenteroides \( \mathrm{CK} 0122 \) 가 생산하는 항균물질의 분자량</h2> <p>CK0122 균주가 생산하는 항균물질의 분자량을 agar disk diffusion method를 사용하여 검토하였다. 약 \( 10^{5} \mathrm{CFU} / \)( \mathrm{mL} \) 농도의 공시균주 Staphylococcus aureus ATCC 12692 배양액 \( 200 \mu \mathrm{L} \) 를 nutrient agar(Difco, USA)에 도말한 후, 공시균 용액이 건조되면 살균된 paper disk(Ø \( 6 \mathrm{~mm} \), Whatman, \( \mathrm{UK} \) )를 올려놓았다. 분자량 \( 3,000 \mathrm{Da} \) 를 기준으로 분획한 배양 상징액을 10 배 농축하여 각각 paper disk에 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 첨가한 다음, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 배양하여 생육저해환(clear zone) 을 확인하였다. \( 3,000 \mathrm{Da} \) 이하의 분획을 첨가한 경우에는 확실한 생육저해가 나타났지만, \( 3,000 \mathrm{Da} \) 이상의 분획을 첨가한 경우에는 생육저해활성이 나타나지 않아, CK0122 균주가 생산하는 생육저해물질은 분자량 3,000 \( \mathrm{Da} \) 이하의 물질로 추정된다(Fig. 1).</p> <h2>조항균물질에 의한 Lb. sakei 생육저해활성</h2> <p>배양 상징액을 분자량 \( 3,000 \mathrm{Da} \) 이상과 이하의 분획으로 나누어 동결건조한 조항균물질을 각각 \( 0.01 \mathrm{~g} / \mathrm{mL} \) 의 농도로 첨가한 MRS 배지 \( 50 \mathrm{~mL} \) 에 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 전배양한 \( L b \). sakei CK0155 균주와 표준균주 \( L b \). sakei subsp. sakei \( \mathrm{KCTC} 3603^{\mathrm{T}} \) 를 각각 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 농도로 접종한 다음, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하면서 조항균물질의 첨가에 따른 생육저해를 흡광도 \( (600 \mathrm{~nm}) \) 로 측정하였다. CK0155 균주는 본 연구자들이 선행연구에서 김치로부터 분리하여 동정한 균주이고, 표준균주는 Korean Collection for Type Culture(KCTC)로부터 구입하였다. \( 3,000 \mathrm{Da} \) 이하의 분획을 첨가한 경우에는 확실한 생육저해가 나타났지만, \( 3,000 \mathrm{Da} \) 이상의 분획을 첨가한 경우에는 조항균물질을 첨가하지 않은 대조군과 큰 차 이를 나타내지 않았다(Fig. 2). 3,000 Da 이하의 조항균물질은 김치에서 분리한 CK0155 균주와 표준균주의 생육을 모두 억제하는 것으로 확인되어 Lc. mesenteroides CK0122가 생산하는 Lb. sakei 생육저해물질은 분자량 \( 3,000 \mathrm{Da} \) 이하의 물질로 다시 한번 확인되었다. \( 3,000 \mathrm{Da} \) 이상의 조항균 물질도 약한 생육저해를 나타내어, 또 다른 생육저해물질의 존재를 배제할 수 없지만, 분획과정이 완전하게 진행되지 못한 것이 원인으로 추정된다. 조항균물질의 첨가로 \( \mathrm{CK} 0155 \) 균주와 표준균주의 생장이 느리게 증가하는 것으로 보아 분자량 3,000 \( \mathrm{Da} \) 이하의 물질은 bacteriocide라기보다는 bacteriostatic한 항균물질로 추정된다.</p>