N. crassa의 cDNA를 제한효소로 절단하여 pYGAP2 플라스미드 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 형질 전환하기 위해 YPD 배지에 배양하였다. 이 후 N. crassa cDNA가 헝질전환된 S. cerevisiae 균주들에서 상보성을 나타내지 유무를 성장속도 측정으로 확인하였고 불포화지방산에 대한 감수성 조사도 Do등의 방법으로 수행되었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용 균주, 플라스미드 및 배지</h2> <p>본 실험에 사용된 균주 및 플라스미드는 Table 1에서 볼수 있다. S. cerevisiae의 야생형 균주와 coq7 돌연변이 균주는 UCLA의 Cathy Clarke에 의해서 제공되었고, 이들 균주의 배양에 사용된 배지는 YPD(\(1 \% \) yeast extract, \(~2 \% \) peptone, \( 2 \% \) glucose), YPG(\(1 \% \) yeast extract, \( 2 \% \) peptone, \( 3 \% \) glycerol), SD(0.17% yeast nitrogen base without amino acid, \( 0.5 \%\left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4}\), \(2 \% \) glucose)이다. SD 배지는 루이신, 트립토판 혹은 히스티딘을 필요에 따라서 첨가하였다. 상보성을 알아보기 위한 벡터 조립에는 pYGAP2가 사용되었다 .</p> <h2>N. crassa cDNA의 분리</h2> <p>S. cerevisiae coq 7의 상동성을 보이는 유전자를 분리하기 위해서 N. crassa genome data의 BLAST 프로그램을 이용하여 예상 유전자 부위를 찾아서 각각 제한효소 부위를 분석하였고, PCR에 이용될 프라이머를 디자인하였다. coq-7 예상 유전자 \( 5^{\prime} \)말단의 프라이머(AATGAATTCATATGAAGATGCTTCGTCCAGCAACC)에는 \(\underline{EcoR I}\), NdeI과 KOZAK(AAG) 부위가 도입되었고, \( 3^{\prime} \) 말단의 프라이머(ATTCTAGAAGCTTAAGAAAACCCCCCTCTTACAC)에는 \( \underline{X b a}\)Ⅰ과<strong>Hind Ⅲ</strong>부위가 인위적으로 도입되었다. PCR 조건은 최종 부피를 \( 100 \mu \ell \)로 한 reaction mixture에는 N. crassa cDNA library \( 1\mu \ell \)를 template로 하고, 10X reaction buffer \( 10\mu \ell \), primer 각 \( 200 \mathrm{nM} \), dNTPs 각 200\( \mu \mathrm{M} \)와 ExTaq DNA polymerase(Takara) 2.5 unit를 첨가했다. coq-7 유전자를 증폭하기 위한 program은\( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분; \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, 그리고 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분의 30 times; \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분으로 MJ Research(Cambridge, MA) thermocycler를 이용하였다. PCR 조건으로 증폭된 \( 771 \mathrm{bp} \)의 coq-7 예상 유전자 단편을 정제한 후에 EcoRI과 Hind Ⅲ로 절단하여 각각 pUC19벡터로 클로닝하여 auto-sequenc-ing 방법으로 서열을 분석하였다. 일반적인 DNA의 조작 및 분자생물학 기술은 Maniatis et al.의 방법을 따랐다.</p> <h2>발현 벡터 조립 및 형질전환</h2> <p>분리된 N. crassa의 cDNA는 각각 S. cerevisiae의 GAP 프로모터를 갖는 pYGAP2 플라스미드 벡터로 삽입하였다. coq-7 유전자가 클로닝된 pBluescript 벡터를 EcoR I 과 Xho I으로 절단하고. EcoR I과 Sal I 으로 절단된 pYGAP2으로 클로닝하여 pEJ-YQ7을 조립하여 이들을 발현 벡터로 사용하였다.</p> <p>S. cerevisiae cog7 돌연변이체로 발현 벡터를 형질전환하기 위해 균주를 YPD 배지에 접증하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 밤새 배양 하였다. \( 40\mathrm{ml} \)의 YPD 배지에 100배 희석하여 흡광도가 1.3에서 1.5(\( \mathrm{OD}_{600} \))이 될 때까지 배양한 후, \( 5000 \mathrm{rpm} \)에서 6분간 원심분리하였다. \( 40 \mathrm{ml} \)과 \( 20 \mathrm{ml} \)의 ice-cold water로 세포를 두 차례 씻어 주되 \( 0^{\circ} \mathrm{C} \)를 유지시켜 주었다. 마지막으로 \( 1 \mathrm{M} \) sorbitol로 세포를 현탁시키고, \( \leq100 \mathrm{~ng} \)의 trans-forming DNA를 첨가하여 \( 40 \mu \ell\)의 세포 현탁액을 미리 차게 해 둔 폭이 \( 2 \mathrm{~mm} \)인 electroporation cuvette에 넣은 후, electric field pulse ( \( 1.5 \mathrm{kV} ; 25 \mu \mathrm{F} ; 200 \Omega \), pulse length \( 4.2\sim 4.9 \mathrm{msec} \).)를 수행하였다. \( 1 \mathrm{ml} \)의 \( 1 \mathrm{M} \) sorbitol로 현탁하고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간을 진탕 없이 배양하고 마지막으로\( 1 \mathrm{ml} \)의 YPD 배지를 첨가하여 1시간 키운 후에 우라실이 없는 SD 배지에서 \( 2\sim 3\)일 배양하여 형질전환체들을 확인할 수 있었다.</p> <h2>성장 및 성장 속도 관찰 및 측정</h2> <p>N. crassa cDNA가 헝질전환된 S. cerevisiae 균주들에서 상보성을 나타내는지의 유무를 확인하기 위해 성장속도를 측정하였다. coq-7 유전자가 각각 도입된 형질전화체들, S.cerevisiae cog7 돌연변이 균주들과 positive control로 이용되는 야생형 균주를 글리세롤 \( 2 \% \)를 포함하는 YPG 배지에 접종하여 밤새 배양하였다. 균주들을 동일한 배지에서 100배 희석하고 분광광도계(HITACHI, Tokyo)를 이용하여 \( \mathrm{OD}_{ 600} \)에서의 균 밀도를 1시간 단위로 10시간동안 측정하였다.</p> <p>발효가 불가능한 탄소원인 글리세롤을 포합하는 배지에서의 성장 속도를 비교하기 위해 5종류의 균주들을 YPD 배지에서 성장시킨 후, 각각의 콜로니들을 YPG 배지에 접중하여 이틀 동안 배양하였다.</p> <h2>불포화지방산의 영향</h2> <p>불포화지방산에 대한 감수성 조사는 Do 등의 방법에 따라 수행되었다. 5종류의 균주들올 YPD 배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 진탕 배양기에서 밤새 배양하였다. 배양액을 같은 배지에 100배 희석하여 대수기 (\( \mathrm{A}_{600}=0.1-1.0 \))까지 배양하였다. 멸균 증류수 (\( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(1000 \times \mathrm{g} \), 5분)로 세포를 씻어주고, 세포 pellet은 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium phosphate, \( \mathrm{pH} 6.2 / 0.2 \% \) glucose 용액으로 재혼탁하였다. 5종류의 배양액에 oleic acid 및 linolenic acid를 각각 최종 농도가 \( 820 \mu \mathrm{M} \)가 되도록 첨가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다. 지방산을 첨가하기 전의 표본과, 1 , 2, 4 시간동안 배양한 후의 표본을 \( 2 \% \) agar가 첨가된 YPD 및 YPG 고체 배지에 도말하였다. 생존한 균들의 비율은 측정하기 위하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일 동안 배양한 후, 지방산을 처리하기 전의 표본으로부터 나온 콜로니들의 수를 \( 100 \% \)로 하여 계산하였다.</p>