'Red Sea' 품종의 꽃봉오리로부터 poly(A)+ mRNA 5\(\mu\mathrm{g}\)를 분리하여 cDNA-library를 합성하고 Lambda-ZAP II vector에 삽입하여 재조합하고 in vitro packaging과 amplification을 통해 cDNA-library를 완성하였다. 그리고 RT-PCR을 통해 DFR 유전자의 기내발현 여부를 확인하였다.
<h2>cDNA-library의 합성</h2> <p>안개초 cDNA-library 구축을 위하여 핑크색의 색소발현 체계를 가진 품종인 'Red Sea'의 꽃봉오리로부터 \( 5 \mu \mathrm { g } \)의 \( \operatorname { poly } ( \mathrm { A } + )- \mathrm { mRNA } \)를 분리하여 사용하였다. cDNA-library를 합성하기 위하여 Pharmacia (USA) 제품인 cDNA-library 합성 kit를 사용하여 cDNA를 합성하고 이 ds-cDNA는 Lambda-ZAP II vector에 삽입시킨 후 재조합시켰으며 재조합 된 lambda-zap II는 in vitro packaging (Stratagene, USA)과 amplification을 통하여 cDNA-library를 완성하였다.</p> <h2>유전자의 기내발현</h2> <p>분리한 DFR 유전자가 목적했던 유전자임을 확인하기 위하여 분리유전자를 template로 T7 RNA polymerase를 사용하여 기내에서 transcription 시키고 \( { } ^ { 35 } \mathrm { ~S } \) ]-methionine (Amersham, USA)을 사용한 reticulocyte lysate system (Promega, USA)에 의해 translation 시켜 기내발현을 수행하였다. In vitro trans-lation을 위하여 \( 2 \mu \)l 의 \( 1 \mathrm { mM } \) amino acid mixture (Promega, USA), \( 5 \mu g \)의 poly \( \left ( \mathrm { A } ^ { + } \right ) \mathrm { RNA } \) 및 \( 40 \mathrm {\mu l } \) reticulocyte lysate (Promega, USA)를 혼합한 후 이 혼합물은 1 시간 동안 \( 30 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 incubation 하고 Sephadex G50 (Phamacia, USA) column을 사용하여 전체량을 \( 1 \mathrm { ml } \) 에 맞추고 enzyme buffer [0.1 \( \mathrm { M } \) Tris \( / \mathrm { HCl } ( \mathrm { pH } 7.5), 20 \mathrm { mM } \) sodium ascorbate \( ] \)를 통하여 정제하였다.</p> <h2>Genomic DNA의 분리 및 Southern blot 분석</h2> <p>유전자의 분석을 위하여 안개초의 어린꽃잎으로부터 Manning (1991)의 방법을 이용하여 genomic DNA를 분리하였다. 분리된 안개초의 DNA를 제한효소 EcoRV와 XhoI으로 각각 절단한 후 \( 0.8 \% \) agarose gel에 전기영동하고 이를 nylon membrane (Hybond-N, Amersham, USA)으로 옮긴 후 안개초의 DFR cDNA를 probe로 이용하여 Southern blot hybridization을 실행하였다 (Southern 1975).</p>