RT-PCR 검정을 이용하여 StACRE를 과발현시킨 형질전환 식물체의 과발현 여부를 검정하기 위해 total RNA로부터 cDNA를 합성하고 RT-PCR을 수행하였다. 또한, Ralstonia solanacearum (Rs) KACC10722 균주를 사용하여 2주간 감자의 풋마름병 저항성을 관찰하였다. Southern blot을 통해 배양된 감자의 genomic DNA를 분석하고, Northern blot을 통해 야생형과 형질전환 감자에서의 유전자 발현을 분석하였다.
<h2>RT-PCR 검정</h2> <p>StACRE를 과발현시킨 형질 전환 식물체의 과발현 여부를 검정하기위해 형질전환 식물체로부터 앞서 기술한 방법으로 total RNA를 분리하여 cDNA 합성에 이용 하였다. 우선, total RNA에 DNase I (deoxyribonuclease I, Sigma, Saint Louis)을 상온에서 15 분간 처리한 후, \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분간 불활성화 시켰다. \( 1 \mu \mathrm { l } \) 의 역전사효소 SuperScript III (200 units/ \( \mu \mathrm { l } \), Invitrogen, CA), \( 3 \mu \mathrm { g } \) 의 total RNA와 oligo (dT) 20 primer를 함께 넣어 최종 \( 20 \mu \)의 반응 혼합물에서 First-strand cDNA를 합성한 후 RT-PCR을 수행하였다. 합성한 \( 1 \mu 1 \) 의 First-strand cDNA와 rTaq polymerse ( 5 units/ \( \mu \) l, Takara)를 사용하였으며, \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2 분 동안 예열 후, \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초, \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분 동안 25 cycles을 수행하였고, 마지막 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10분간 증폭을 수행하였다. PCR산물은 \( 1 \% \) agarose gel에서 전기영동 후 관찰 하였다. Internal control로는 감자의 tubulin 유전자를 사용하였다.</p> <h2>병원균 처리 및 병저항성 측정</h2> <p>StACRE를 과발현시킨 형질전환 감자의 풋마름병 저항성을 관찰하고자 Ralstonia solanacearum (Rs) KACC10722 균주를 사용하였다. 이 균주는CPG agar에서 \( 28 ^ {\circ } \mathrm { C } , 48 \) 시간 동안 배양한 후 \( 10 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } 2 \) 를 사용하여 \( \mathrm { OD } 600=0.5 \) 되게 희석하였다. 희석된 균 현탁액에 뿌리를 절단한 감자의 줄기를 1시간 동안 침지한 후 Jiffy pot에 옮겨 양액을 보충해주면서 2주간 병 진 전 양상을 관찰하였다.</p> <h2>Southern blot 및 northern 분석</h2> <p>배양된 감자의 전체 조직을 액체질소와 막자 사발을 이용하여 잘 마쇄한 후 Plant Genomic DNA prep kit (Solgent, Daejeon)를 이용하여 분리한 genomic DNA \( 10 \mu \mathrm { g } \) 을 BanH1, EcdR1, HindIII (Enzynomics, Daejeon) 등의 제한효소로 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 12 시간 반응 시킨 후 정제하여 \( 1 \% \) agarose gel에 전기영동하여 분석하였다. 유전자 발현분석을 위해 야생형과 형질전환된 감자에서 Northern blot을 수행하였으며 RNeasy Plant Mini kit (Qiagen, Hiden)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 \( 10 \mu \mathrm { g } \) 의 total RNA는 \( 1.0 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) form-aldehyde-agarose gel에서 전기영동을 수행한 후, gel 위에 HyBond N + membrane (Amersham Biosciences, Bucks)을 놓고 membrane에 RNA를 전이시켰다. UV cross-linker를 이용하여 RNA를 고정 시킨 후, StACRE 유전자에 a- \( \left [ { } ^ { 32 } \mathrm { P } \right ] \mathrm { dCTP } \) 의 방사선 동위원소로 표지 한 probe를 \( 0.5 \mathrm { mM } \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } ( \mathrm { pH } \) 7.2), \( 1 \mathrm { mM } \) EDTA, 1 \% BSA, 7 \% SDS를 포함하는 hybrid-ization buffer에서 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 18 시간 동안 혼성화시킨 후, \( 0.1 \% \) SDS가 함유된 \( 2 x \) SSC washing buffer로 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 15분간 1번 세척하고, \( 0.1 \% \) SDS가 함유된 \( 1 x \) SSC washing buffer로 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10분간 1 번 더 세척하였다. 세척한 membrane은 BAS cassette (Fuii, Kanagawa)에서 스크린에 전이시킨 후 스캔하여 확인하였다.</p>