배양 온도는 미생물 생장과 생물질 합성에 중추적인 역할을 한다. 본 연구에서는, \(37 ^{\circ} \mathrm{C}\)의 배양 온도(Run 1과 Run 2)가 \(27 ^{\circ} \mathrm{C}\)의 배양 온도(Run 3과 Run 4)에 비해 세포밀도와 트레할로스 생산량이 높게 나타났다. 이 결과는 Table 1에서 확인할 수 있다. \(37 ^{\circ} \mathrm{C}\)에서는 대장균의 해당작용이 촉진되어 피루브산 생성 속도가 소비 속도를 초과하므로 잉여 피루브산이 발생한다. 그러나 흥미롭게도, 생산균주의 단위 세포당 생산량은 \(27 ^{\circ} \mathrm{C}\)에서 \(1.4\)배 더 높게 나타났다. 이는 \(27 ^{\circ} \mathrm{C}\)에서 발현된 효소의 활성이 \(37 ^{\circ} \mathrm{C}\)에서 발현된 것보다 높았기 때문으로 해석된다.
<p>본 실험결과는 생산균주가 전처리 폐글리세롤을 사용하여 순수 글리세롤을 사용한 배양에서와 비슷한 양의 트레할로스를 생산할 수 있음을 보여준다. 이는 고부가가치 생리활성 물질을 생산하기 위한 미생물 배양에서 전처리 폐글리세롤을 탄소원으로 활용할 수 있는 가능성을 시사한다.</p> <h2>배양온도와 IPTG induction이 트레할로스 생산에 미치는 영향</h2> <p>배양 온도는 미생물 생장과 생물질 합성에 영향을 미치는 주요 환경 인자이다. 일반적으로 대장균은 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 최적 생장을 보이는 반면 재조합 유전자 발현에 의한 고활성 단백질 생성은 이보다 낮은 온도에서 촉진되는 것으로 알려졌다. 생산균주가 함유한 PT-otsBA 플라스미드에는 IPTG에 의해 유전자 발현이 유도되는 trc 프로모터가 존재한다. 따라서 트레할로스 생산을 위한 재조합 대장균 배양에 적합한 온도의 결정과 IPTG induction에 의한 영향을 조사하기 위한 실험을 수행하였다. Table 1은 배양 온도 \( \left (37 ^ {\circ } \mathrm { C } \right . \) 와 \( \left .27 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \) 와 IPTG induction 유무에 따른 생산균주의 트레할로스 생산량을 보여준다. \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양하는 경우(Run 1 과 Run 2 )가 \( 27 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양(Run 3과 Run 4)하는 경우 보다 세포밀도와 트레할로스 생산이 높았다. Induction 하지 않은 배양(Run 2 와 Run 4)에서 트레할로스 생산이 관찰되었으나 IPTG로 induction한 경우가 더 많은 트레할로스를 생산하였다. 본 실험 결과는 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 IPTG로 induction 하는 배양에서 가장 높은 세포밀도와 트레할로스 생산을 달성할 수 있음을 보여준다.</p> <p>일반적으로 야생형 대장균은 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 세포의 해당작용(glycolysis)이 촉진되어 피루브산을 생성하는 속도가 TCA 회로에 의해 이를 소모하는 속도보다 빨라 잉여 피루브산이 발생한다. 이는 세포 내 아세트산 생합성을 촉진시켜 과량의 아세트산이 생성되어 분비되기 때문에 배양액의 \( \mathrm { pH } \) 가 급격히 떨어진다. 야생형 균주와 달리 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양된 생산균주의 배양액에서 두드러진 \( \mathrm { pH } \) 감소가 없었다. 생산균주가 발현하는 트레할로스 생합성 효소는 글루코오스와 UDP-글루코오스를 결합하여 트레할로스 생합성을 촉진한다. 탄소원으로 사용된 글리세롤은 생산균주에 글리세롤-3-인산 형태로 흡수된 후, 다이하이드록시아세톤 인산(DHAP)으로 전환되어 해당작용에 편입된다. 트레할로스를 생합성하는 생산균주에서는 다이하이드록시아세톤 인산(DHAP)의 일부가 포도당 신생합성(gluconeogenesis)을 활성화시켜 트레할로스 전구물질인 글루코오스와 UDP-글루코오스 생합성이 촉진되는 것 같다. 이로 인해 야생형 균주보다 피루브산 생성량이 적고 궁극적으로 아세트산 생성이 최소화되어 배양액의 \( \mathrm { pH } \) 감소폭이 적은 것으로 추측된다. 생산균주의 단위 세포당 생산량(specific productivity)은 \( 27 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양한 경우가 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 보다 \( 1.4 \) 배 높았는데, 이는 \( 27 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 발현된 효소의 활성이 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 발현된 것보다 높기 때문인 것으로 판단된다. 그러나 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 배양에서 얻은 세포농도가 \( 27 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 얻은 것보다 \( 1.9 \) 배 높아 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 더 많은 트레할로스가 생산된 것으로 판단되었다.</p>