본 논문에서는 LED에 의한 hormesis를 유발하기 위해 green파장의 LED를 사용하였고 환원당 함량은 DNS법으로 시료 DNS시약을 첨가하여 반응시킨 다음 증류수를 첨가한 뒤에 분광광도계로 흡광도를 측정 및 glucose 표준곡선으로부터 환원당 함량을 환산하였다. 유기산 함량은 고속액체크로마토그래피를 사용하여 측정하였고 메틸알코올 표준용액계열과 비색한 수치에 묽게 한 배수를 곱하여 계산하였으며 폴리페놀 함량은 Gutfinger의 방법을 사용해서 FolinCiocalteu reagent가 추출액의 폴리페놀 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주 및 와인의 제조</h2> <p>본 실험에 사용된 균주는 상업용 S. bayanus \(EC-1118\) (Lallemand Inc., Canada)을 YPD broth medium(Yeast extract \(1\%\), peptone \(2\%\), glucose \(2\%) \)에 \(48\)시간 \( 150 \mathrm{rpm} \)으로 진탕배양하여 \( 4000 \mathrm{rpm} \)에서 \(20\)분 centrifuging 후 상층액을 제거하여 사용하였다. Must는 경산에서 재배한 MBA(Muscat bailey A) 파쇄액 \( 1000 \mathrm{ml} \)에 잡균의 번식을 막기 위해 \(100\mathrm{ppm}\)의 Potassium metabisulfite를 투입하였으며 투입 후 \(4\)시간동안 안정화 시간을 거친 다음, 배양한 균주를 \( 1.5 \times 10^{5} \mathrm{cells} / \mathrm{ml} \) 접종하였다. 접종이 완료된 Must는 빛이 조사되지 않는 control group과 각각 \( 453 \pm 4 \mathrm{~nm} \) 파장의 Blue LED, \( 522 \pm 3 \mathrm{~nm} \) 파장의 green LED를 조사하며 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(10\)일간 속성발효하였고 \( 1,2,3,5,10 \)일차의 sample을 채취하여 실험에 사용하였다.</p> <h2>LED irradiation장치</h2> <p>\( \mathrm{LED} \)에 의한 hormesis를 유발하기 위해 실험에 사용된 \( 453 \pm 4 \mathrm{~nm} \) (blue), \( 522 \pm 3 \mathrm{~nm} \) (green) 파장의 LED는 X.H.Y OPTOELECTRONICS(GX-HP10W-B, China)에서 생산된 제품으로 각 chamber의 크기가 \( 59 \times 67 \times 38 \mathrm{~cm}^{3} \)인 fourchamber incubator 상부에 설치하였으며, 열 발생에 따른 그룹간 온도변화가 없도록 하기 위하여 cooling fan과 heat \( \operatorname{sink} \) 가 부착되어 설정된 온도가 유지되도록 하였다. 전류 전원은 AC adapter(\(0-2\) A, \(0-12\) V)를 이용하여 공급하였다.</p> <h2>발효 중 생균수변화</h2> <p>생균수는 YPD agar 배지(Yeast extract 1\%, peptone \( 2 \% \), glucose \( 2 \% \), agar powder \( 1.5 \% \) )를 이용하여 spread plate method로 도말한 후 차광하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(48\)시간 배양 하고 나타난 집락을 효모의 생균수로 계수하였다.</p> <h2>고형분 및 환원당 함량</h2> <p>발효액의 고형분 함량 측정은 \( \mathrm{AOAC} \) 방법에 따라 실온에서 Refractometer(Master-M, ATAGO, Japan)를 사용하여 측정하였다. 환원당 함량은 DNS(dinitrosalicyclic acid)법으로 시료\( 250 \mu \mathrm{l} \)에 \( \mathrm{DNS} \) 시약 \( 250 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하여 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(5\)분간 반응시킨 다음 증류수를 \( 1 \mathrm{ml} \) 첨가하여 분광광도계 (UV 1601PC, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)를 사용하여 \( 546 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하고 glucose 표준곡선으로부터 환원당 함량을 환산하였다.</p> <h2>유기산 함량</h2> <p>유기산 함량은 고속액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography)를 사용하여 측정하였다. 표준 용액은 citric acid, lactic acid, malic acid, tannic acid, tartaric acid(Sigma aldrich, USA)를 \( 5 \mathrm{mM} \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \)에 농도 별로 희석하여 \( 4000 \mathrm{rpm} \)에서 \(20\)분 centrifuging하고 \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) membrane filter에 여과한 후 표준검량곡선을 작성하여 사용하였으며, 유기산 함량 HPLC 분석 조건은 다음과 같다 (Table \(1\)).</p> <h2>메탄올 함량</h2> <p>메탄올 함량은 국세청 주류분석규정에 따라 알코올분을 \( 5 \pm 1 \% \)로 조정한 시료 \( 5 \mathrm{ml} \)을 시험관에 넣고 \( \mathrm{KMnO}_{4} \) 용액 \( 2 \mathrm{ml} \)을 가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(15\)분간 방치한 후 \( \mathrm{C}_{2} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{4} \) 용액 \( 2 \mathrm{ml} \)를 가하여 탈색하고 \( \mathrm{C}_{20} \mathrm{H}_{19} \mathrm{~N}_{3} \cdot \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{3} \) 용액 \( 5 \mathrm{ml} \)를 가하여 잘 혼합한 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(30\)분간 온도를 유지하였다. 같은 방법으로 처리한 메틸알코올 표준용액계열과 비색하여 그 수치에 묽게 한 배수를 곱하여 메틸알코올 함유량 \( (\mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)으로 하며 \( 590 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다.</p> <h2>Fusel oil 함량</h2> <p>퓨젤유 함량은 국세청 주류분석규정에 따라 물로 적당히 묽게 한 시료 \( 1 \mathrm{ml} \)을 시험관에 넣고 \( 0.5 \% \mathrm{C}_{8} \mathrm{H}_{8} \mathrm{O}_{3} \cdot \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \) \( 2 \mathrm{ml} \)을 가하여 혼합한 후, \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(3\)분간 가열하고 증류수 \( 1 \mathrm{ml} \)을 가한다. \(15\)분 후 표준용액 \( 1 \mathrm{ml} \)을 같은 방법으로 처리한 표준용액계열과 비색하여 퓨젤유함량(v/v\%)으로 하였으며, \( 500 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다.</p> <h2>총 폴리페놀 함량</h2> <p>폴리페놀 함량은 Gutfinger의 방법을 변형하여, FolinCiocalteu reagent가 추출액의 폴리페놀 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 측정하였다. 즉, 추출액 \( 0.2 \mathrm{ml} \)에 Folin-Ciocalteu's reagent(Sigma, USA) \( 1 \mathrm{ml} \)를 가하여 \(3\)분간 반응시키고 여기에 \( 10 \% \) 탄산나 트륨 \( 0.8 \mathrm{ml} \)를 첨가한 후 \(1\)시간 동안 실온에서 방치한 후 \( 765 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였으며 폴리페놀 함량은 Tannic acid 용액 표준곡선을 이용하여 나타내었다.</p>