A549, WI38VA13 세포를 \( 10 \% \) FBS을 함유한 RPMI 1640 또는 DMEM 배지로 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 조건에서 배양했으며, RNA를 추출한 후 제조된 장환형 단일가닥 센스 DNA는 poly-L-lysine 코팅 슬라이드 글래스에 점적해 LC-sense 칩 제작 및 마이크로어레이 실험을 진행했다. 다음으로 정량적 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용한 유전자 발현분석과 장환형 단일가닥 안티센스 DNA의 transfection을 이용한 기능분석을 진행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포 배양 및 RNA 추출</h2> <p>A549(lung cancer cell line)와 WI38VA13(lung normal cell line)를 한국세포주은행(KCLB, Korea)으로부터 분양받아 \( 10 \% \) FBS을 함유한 RPMI 1640 또는 DMEM 배지 (Welgene, Korea)로 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 조건에서 배양하였다. RNA 추출을 위해 세포를 phosphate-buffered saline으로 세척한 후 적정량의 트리졸(GibcoBRL, USA)을 넣고 제조사의 지침에 따라 total RNA를 분리하였고 mRNA 정제를 위해서는 Poly(A) Quick mRNA Isolation Kit(Stratagene, USA)를 사용하였다.</p> <h2>장환형 단일가닥 센스 DNA의 제조</h2> <p>헬퍼 페이지 M13K07(New England Biolabs, USA)을 미리 감염해 놓은 XL-1 Blue competent E. coli(Stratagene, USA)에 Human EST를 포함한 페이지미드를 형질전환 한 후, 암피실린(최종농도 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \))을 함유한 고체배지로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 16시간 동안 배양하였다. 다음날, 형성된 단일 군집을 \( 100 \mathrm{~mL} \)의 LB 액체배지 \((50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 암피실린, \( 70 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 카나마이신 함유)에 접종하고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 16시간 동안 배양하였다. 배양액을 \( 6,000 \mathrm{rpm} \)으로 10분간 원심분리한 후 얻어진 약 \( 100 \mathrm{~mL} \)의 배양 상청액에 \( 20 \mathrm{~mL} \)의 PEG/NaCl (20\(\%\) PEG 8000, \(2.5 \mathrm{M} \mathrm{NaCl}) \)을 첨가하고 상온에서 10분간 배양하였다. 정제한 LC-sense DNA들을 ethanol 침전으로 농축한 후 양을 확인하기 위해 \( 1 \% \) 아가로스 겔 전기영동을 수행하였고 기타 자세한 과정은 이전과 같다.</p> <h2>LC-sense 칩 제작 및 마이크로어레이 실험</h2> <p>Affymetrix 417 Arrayer(Affymetrix켜 USA)를 이용하여 장환형 단일가닥 센스 DNA는 poly-L-lysine이 코팅된 슬라이드 글래스에 점적하였다. 정제한 \( 2 \mu \mathrm{g} \)의 poly(A)\(^{+}\) mRNA를 각각 Cy3-dUTP 또는 Cy5-dUTP의 존재하에서 oligo-dT primer로 역전사시켰다. 표식한 cDNA를 column으로 정제한 후 \( 80 \mu \mathrm{L} \)의 혼성화 용액(3\(\times\)SSC, \(0.3 \%\) SDS)으로 재용해 하였다. 표식한 target cDNA를 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)의 습윤기 내에서 16시간 동안 혼성화 하였다. 이어서 2\(\times\)SSC/\(0.2 \%\) SDS 용액으로 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 세정한 후, 2\(\times\)SSC 용액으로 실온에서 5분, 0.05\( \times\)SSC 용액으로 실온에서 5분간 각 1회씩 세정하여 건조한 후 스캐닝에 사용하였다.</p> <p>마이크로어레이에서 결합된 형광 강도를 Affymetrix 428 Array Scanner(Affymetrix, USA)로 측정하였고, 수집한 이미지들을 ImaGene Ver.4.2 software(BioDiscovery, USA)로 분석하였다. 신호 강도는 각 spot의 강도 중간값에서 배경 중간값을 제하여 결정하였다.</p> <h2>정량적 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용한 유전자 발현분석</h2> <p>Total RNA \( 1 \mu \mathrm{g} \)을 역전사(Promega, USA)시켜 cDNA를 만들고 DyNAmo HS SYBR Green qPCR Kit(Finzymes, Finland)와 DNA Engine Opticon 2 System(MJ Research, USA)를 이용하여 중폭시켰다. 실험에 사용된 RNA 양을 보정하기 위해 b-actin도 동시에 증폭시켜 그 값을 비교하였다.</p> <h2>장환형 단일가닥 안티센스 DNA의 transfection을 이용한 기능분석</h2> <p>A549세포와 WI38VA13세포에 5K 장환형 단일가닥 센스 DNA 마이크로어레이 실험에서 과발현된 유전자에 대한 안티센스를 제작하였다. \( 1 \times 10^{3} \)개의 세포를 96 well plate에 분주하고 그 다음 날 안티센스를 transfection 하였다. 장환형 단일가닥 안티센스 DNA \( 0.1 \mu \mathrm{g} \)을 \( 0.3 \mu \mathrm{g} \) Enhancer Q(Welgene, Korea) 및 \( 0.5 \mu \mathrm{g} \) WelFect Ex(Welgene, Korea)와 섞은 뒤 transfection하였다. cDNA insert가 없는 대조군 장환형 단일가닥 센스 DNA와 DNA를 세포에 전달시키기 위해 사용한 양이온성 리포좀만을 사용한 군을 포함시켜 비교하였다. 세포의 성장 정도는 현미경을 통해 관찰하고 MTT법을 사용하여 정량화하였다.</p>