R. aquatilis AY2000균주가 항효모성 물질의 생산균주로 쓰였으며, AYS생산을 위해서는 MYCS 배지를 썼는 데 먼저 MYCS 액체배지에 AY2000균주를 접종하고, \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 하루 동안 전 배양을 한 다음 전배양액을 새로 만든 MYCS 액체배지에 \( 1 \% \) 농도로 접종했다. AYS의 활성측정은 Micro-dilution법으로 측정했고 AYS의 최소생 육저해농도는 효모생육이 전혀 일어나지 않는 가장 낮은 농도로 나타냈고 대조구로 amphotericin B를 이용했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주, 배지 및 시약</h2> <p>본 연구실에서 분리한 R. aquatilis AY2000균주가 항효모성 물질(Anti-yeast substance; AYS)의 생산균주로 사용되었으며, AYS생산을 위해서는 MYCS 배지가 사용되었다. 또한 AYS의 활성을 측정하기 위한 균주는 본 연구실에 보관 중인 S. cerevisiae ATCC2120균주가 사용되었으며, 이때 사용된 배지는 YM 배지였다. Trehalose( \( \alpha \)-D-glucopyranosyl \( \alpha \)-D-glucopyranoside)는 Sigma사(Cat\# Lot No. T9531)에서 구입하여 사용하였다.</p> <h2>균주 배양법 및 AYS 조제</h2> <p>R. aquatilis AY2000균주에서 AYS를 생산하기 위한 배양법은 Kang 등 이 기술한 바와 같다. 즉, 먼저 MYCS 액체배지에 AY2000균주를 접종하고, \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 하룻밤 동안 전 배양시킨 후 전배양액을 다시 새로 조제한 MYCS 액체배지에 \( 1 \% \) 농도로 접종하였다. 접종된 균주는 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 진탕 배양하고, 배양된 액은 원심분리 \( (12000 \mathrm{rpm} \), \( 10 \mathrm{~min}, 4^{\circ} \mathrm{C} \) )를 행하였다. 원심분리 후에 침전된 세포는 제거하고 AYS가 함유된 상층액은 모은 후 상층액에 2 배량 \( (\mathrm{V} / \)\( \mathrm{V}) \) 의 미리 냉각된 isopropanol을 가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 침전시킨 후 형성된 침전물은 곧 바로 다시 냉각원심분리 \( (8000 \mathrm{rpm} \), \( 5 \mathrm{~min}) \)를 행하였다. 이때 모여진 침전물은 미리 냉각된 증류수 \( \left(4^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 에 적당히 녹인 다음 혼입된 isopropanol을 제거하기 위해 투석(SPECTRA/POR; MW cutoff 6,000-8,000, \( \left.4^{\circ} \mathrm{C}\right) \)을 행하고, 투석된 용액은 진공 동결 건조시켜서 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하면서 시료(AYS)로 사용하였다.</p> <h2>AYS 의 열처리 및 항효모 활성측정</h2> <p>AYS의 열처리는 전보[6]에서 기술한 바와 같이 고온(\(50- 70^{\circ} \mathrm{C} \) )에서 2시간 동안 행하였다. 즉, 상기에서 기술한 isopropanol로 침전시킨 조정제AYS시료(dry weight \( 20 \mathrm{mg} \) )를 평량하여 멸균된 증류수 \( (1 \mathrm{~mL}) \)에 용해시키고, 별도로 trehalose도 각각 알맞은 농도가 되도록 멸균된 증류수 \( (1 \mathrm{~mL}) \)에 용해시켰다. 이들 두 용액을 동량(1:1)으로 혼합시킨 후 그 혼합액을 각 온도에서 2 시간 동안 열처리를 행한 다음 잔존하는 AYS의 S. cerevisiae에 대한 항효모 활성을 측정 하였다.</p> <p>AYS의 활성측정은 National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS)에서 기술된 Micro-dilution법으로 행하였다. 즉, tetracycline(Tc) \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)가 함유되도록 미리 멸균된 YM배지(2배 농축배지)를 조제하여 96-wellmicroplate의 각 well에 \( 100 \mu \mathrm{L} \)씩 넣고, 처리된 AYS 시료용액(dry weight 10 mg/mg) \( 100 \mu \mathrm{L} \)를 잘 혼합시킨 후 미리 일정한 농도로 조제된 AYS 용액을 단계별로 2배씩 희석시켰다. 희석된 AYS시료가 함유된 각 well에 다시 \( 100 \mu \mathrm{L} \) YM 배지를 가하여 \( 200 \mu \mathrm{L} / \mathrm{well} \) 이 되도록 한 후, 이 micro-plate의 각 well에 미리 배양 \( \left(28^{\circ} \mathrm{C}, 24\mathrm{~h}\right) \) 된 S. cerevisiae효모 \( \left(10^{5}\right. \) cells \( \left./ \mathrm{mL}\right) \) 를 \( 10 \mu \mathrm{L} \)씩 접종하여 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 배양시켰다. 이때 효모의 수는 Hemacytometer를 사용하여 현미경 상에서 계측하였고, 항효모 활성측정은 MTT방법으로 행하였으며, 효모가 배양된 microplate는 ELISA Reader로 흡광도 \( \left(\mathrm{A}_{540} \mathrm{~nm}\right) \)를 측정하였다. 또한 AYS의 최소생 육저해농도(Minimal Inhibitory Concentration, MIC)는 NCCLS에서 기술한 바와 같이 효모생육이 전혀 일어나지 않는 가장 낮은 농도로 나타내었으며, 대조구로는 amphotericin B가 사용되었다.</p>