본 연구는 느타리버섯 재배에 큰 손해를 주는 세균성 갈반병 방제를 위해, 환경 친화적인 파지테라피 방법을 개발하고자 했다. 갈반병을 유발하는 균주들을 분리해 \(16S rRNA\) 유전자 분석을 통해 동정했으며, 특히 Pseudomonas tolaasii에 속하는 23종을 P1그룹으로 분류했다. 또한, 파지의 독성 실험 중에서 파지에 대한 저항성을 가진 균주들이 생겨나는 것을 확인했으며, 이 균주들은 용균반을 만드는 파지에게서 잘 감염되지 않거나 감염에 대한 둔감성을 보였다.
<h1>결 과</h1> <h2>파지저항성 균주의 분리</h2> <p>본 연구에서는 느타리비섯 재배 시 큰 피해를 유발하는 세균성 갈반병의 방제를 위하여, 사용이 금지된 농약이나 항생제 대신에 숙주균에 특이적이며 사멸효과가 큰 박테리오파지를 이용하여 친환경적인 파지테라피 방법을 개발하고자 하였다. 갈반병 등을 유발한 균주들을 재배농가에서 분리하여 \( 16 \mathrm{~S} r \) RNA 유전자 분석을 통하여 동정하였고, 이들 중 병원균인 Pseudomonas tolaasi에 속하는 균주 총 23종을 동정하였으며, 이들을 P1그릅으로 명명하였다. 또한, 이들을 다시 phylogenetic tree 분석을 통하여 크게 3종류로 분류하여 \( \mathrm{P} 1 \alpha, \mathrm{P} 1 \beta, \mathrm{P} 1 \gamma \)로 명령하였다 (Yun 등, 2013). 갈반병이 발생한 농가에서 수집한 병원성 균주를 숙주균으로 이용하여 특이적인 박테리오파지를 분리하였고, 파지의 숙주균 사멸활성은 수주균의 배지에 파지를 감염시켰을 때, 파지의 감염으로 숙주균이 사멸되어 나타나는 투명한 용균반(plaque)의 형성으로 확인하였다. 파지의 숙주균에 대한 독성에 따라 12시간 이상 배양하였을 때, 파지에 의한 용균반 형성과 용균반의 크기나 투명도가 다르게 나타났다(Kim 등, 2011).</p> <p>병원성 숙주균에 대한 파지의 독성실험 중 2일 이상 배양하는 경우 시간의 경과에 따라서 투명했던 용균반 내부에 자주 세균의 성장이 관측되었으며, 새로이 나타난 세균은 용균반을 만든 파지에 감염되지 않거나 파지의 감염에 둔감한 파지-저항성 균주인 것으로 확인하였다. 용균반 관측실험은 숙주균과 파지를 제외하고 무균 조건에서 수행되었기에 새로이 용균반 내에서 나타난 균주는 원래의 숙주균이 파지에 대하여 저항성을 획득함으로써 나타난 것으로 수정하고, 이 균주들을 분리하여 특성을 조사하였다. 균주의 분리는 고체배지의 상부에 반고체배지를 만들고 파지를 접종하여 용균반을 생성시킨 후, 용균반 내부에서 성장하는 세균의 콜로니를 분리하여 얻었다(Fig. 1).</p> <p>파지저항성 균주는 용균반 내부에 불투명한 균주성장반을 형성하거나, 다수의 콜로니 형태로 나타났다. 먼저, P. tolaasii 균주 중 Pl \( \alpha \) 세분류에 속하는 숙주균인 P. tolaasii 6264와\( \mathrm{HK}^{2}, \mathrm{HK}_{4}, \mathrm{HK} 5 \)에 각각의 특이적 파지인 \( \phi \mathrm6264\), \( \phi \mathrm{HK} 2 \), \( \phi \mathrm{HK} 3, \phi \mathrm{HK} 4, \phi \mathrm{HK} 5 \)를 접종하였고, 다른 세분류 \( \mathrm{P} 1 \beta, \mathrm{P} 1 \gamma \)에 속하는 숙주균 P. tolaasii \( \mathrm{HK} 19 \), P. tolaasii \( \mathrm{HK} 23 \)에 각각 \( \phi \mathrm{HK} 19 \)와 \( \phi \mathrm{HK} 23 \)를 접종하였다. 시간이 경과함에 따라 용균반 내부에서 저항성 균주의 콜로니가 발셍하는 것을 확인하였다 (Fig. 1). 파지 저항성을 획득한 P. tolaasii 6264 균주는 원래의 숙주균과 구별하기 위하여 P. tolaasii 6264R로 명명하였으며, 마찬가지로 파지저항성을 획득한 P. tolaasii \( \mathrm{HK} 2 \)는 P. tolaasii \(\mathrm{HK} 2 \mathrm{R} \)로 나타내, 파지 저항성 균주의 변종번호에 \( \mathrm{R} \)을 가하여 변종을 구별하였다.</p> <p>파지저항성 균주들의 클로니 양태를 관즉하면 P. tolaasii \( 6264 \mathrm{R} \) 균주와 \( \mathrm{HK} 19R\) 균주는 용균반 전체로 퍼져 나타났으며, 저항성균 성장반 주위에는 파지의 확산에 따라 용균반 밖에는 파지감수성 균이, 내부에는 파지저항성 균이 성장하여 퍼지는 상태로 이 사이에는 투병한 용균선이 관측되었다. 그러나, 같은 \( \mathrm{P} 1 \alpha \) 세분류 균주의 파지 감염에서 얻어진 \( \mathrm{HK} 2 \mathrm{R} \) 균주와 \( \mathrm{HK} 3 \mathrm{R}, \mathrm{HK} 4 \mathrm{R}, \mathrm{HK} 5 \mathrm{R} \) 균주들은 저항성균주 성장반을 형성하지 않고 용균반 내부에 다수의 콜로니를 형성하였고, \( \mathrm{P} 1 \gamma \) 세분류 균주의 파지 감염에서 얻어진 \( \mathrm{HK} 23 \mathrm{R} \)은 저항성균주 성장반과 콜로니 형태 두 가지 모두 관측되었다.</p>