본 논문에서는 Bacillus spp primers 특이성, 일반 토양에서의 B subtilis AH18의 monitoring, B subtilis AH18의 처리 농도별 monitoring 민감도, 고추가 이식된 토양 내에서 B subtilis AH18의 분포, 고추가 이식된 토양 내에서 B subtilis AH18의 기간별 monitoring에 대한 실험을 진행하였다. Bacillus spp에서의 primers 특이성 확인을 위해 Bacillus spp Bacillus spp에 해당되는 \(11\) 종의 균주 제작된 3종의 primers를 대상으로 PCR 및 mutiplex PCR을 진행하였으며, 일반토양에서 B subtilis AH18의 monitoring을 위해 template DNA를 만들어 PCR 및 multiplex PCR을 수행 후 B subtilis AH18을 확인하였다. 다음으로 B subtilis AH18의 처리 농도별 monitoring 민감도는 토양내 total DNA를 분리하여 PCR 및 multiplex PCR을 수행하여 분석하였으며, 고추가 이식된 토양 내에서 B subtilis AH18의 분포는 뿌리내 부 내생부위(endophytic), 근권(rhizosphere), 그리고 비근권 (non-rhizosphere)로 구분한 후 분석하였다. 마지막으로 고추가 이식된 토양 내에서 B subtilis AH18의 기간별 monitoring은 B subtilis AH18를 \( 10^{7} \mathrm{cfu} / \mathrm{pot} \)를 처리 후 rhizosphere의 토양을 분리하여, total DNA를 분리 후 PCR 및 multiplex PCR을 통해 분석되었다.
<h2>Bacillus spp.에서의 primers 특이성 확인</h2><p>Bacillus spp. 에 해당되는 11 종의 균주를 한국농업미생물 생물자원센터 (KACC, http://kacc.rda.go.kr/)에서 분양받아 제작된 3종의 primers를 대상으로 PCR 및 mutiplex PCR을 수행하였다. 11종의 균주에서 chromosomal DNA 분리하여 PCR 및 multiplex PCR을 위와 동일한 방법으로 수행하였다. 뿐만 아니라 11종의 균주를 대상으로 auxin, siderophore, 그리고 cellulase의 생산을 확인하였다. Auxin 생산은 정 등의 방법 즉, L-tryptophan \( 0.1 \% \) 를 첨가한 King's B broth( \( 2 \% \) proteose peptone No.3, \( 0.15 \% \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}, 0.15 \% \) \( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 1.5 \% \) glycerol, \( \mathrm{pH}~ 7.2 \))에 전배양액을 \( 1 \% \)\( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 접종하고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3일간 배양한 후 배양상등액 \( 1 \mathrm{~mL} \)에 Salkowski시약 \( \left(0.5 \mathrm{~M} \mathrm{~FeCl}_{3} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ~1 \mathrm{~mL}\right. \) in \( 35 \% \mathrm{~HClO}_{4} \) \( 50 \mathrm{~mL})\) \(2 \mathrm{~mL}\)를 첨가하고 30분간 반응시킨 후 spectrophotometer를 이용하여 \( 535 \mathrm{~nm} \)에서 측정하여 확인하였다. Siderophore는 CAS(chrome azurol S) blue agar와 CAS liquid assay로 확인하였으며, cellulase는 위와 동일한 방법인 Congo red plate방법과 DNS 방법으로 확인하였다.</p><h2>일반토양에서 multiplex PCR을 통한 B. subtilis AH18의 monitoring</h2><p>일반토양 \( 200 \mathrm{~mL} \)를 이용해 pot에 고추를 이식 후 B. subtilis AH18의 균체를 멸균증류수에 현탁하여 \( 10^{7} \mathrm{cfu} / \mathrm{pot} \) 관주하였으며, 대조구는 B. subtilis AH18을 처리하지 않았다. 7일간 매일 \( 10 \mathrm{~mL} \)의 멸균증류수를 주면서 관찰하였으며, 그 후 식물체를 뽑아 rhizosphere과 non-rhizosphere을 \( 125 \mathrm{mg} \)씩 혼합하여 PowerSoil \( { }^{\mathrm{TM}} \) DNA Kit(Mo Bio Laboratories, Inc., U.S.A.)를 사용해 total DNA를 분리하였다. 분리된 DNA를 template DNA로 사용하여 PCR 및 multiplex PCR을 수행 후 B. subtilis AH18을 확인하였다.</p><h2>B. subtilis AH18의 처리 농도별 monitoring 민감도 확인</h2><p>B. subtilis AH18의 토양내 monitoring 민감도 확인을 위하여 일반토양 \( 250 \mathrm{mg} \)에 B. subtilis AH18의 균체 \( \left(1.8 \times 10^{7}\right. \) cfu)를 10배씩 희석하여 접종하였으며, 이를 24시간 후 위와 동일한 방법으로 토양내 total DNA를 분리하였다. 그리고 이를 대상으로 PCR 및 multiplex PCR을 수행하여 monitoring을 위한 민감성을 확인하였다. B. subtilis AH18 의 균체 수 확인은 접종하여 남은 균체를 nutrient agar에 희석 도말하여 확인하였다.</p><h2>고추가 이식된 토양 내에서 B. subtilis AH18의 분포확인</h2><p>토양내 B. subtilis AH18의 분포를 확인하기위해 뿌리내 부 내생부위(endophytic), 근권(rhizosphere), 그리고 비근권 (non-rhizosphere)로 구분하여 확인하였다. 고추를 일반토양을 이용하여 위와 동일한 방법으로 이식하였으며, B. subtilis AH18을 \( 10^{7} \mathrm{cfu} / \mathrm{pot} \)로 관주처리 하였으며, 20일간 매일 \(10 \mathrm{mL} \)의 멸균증류수를 주면서 관찰하였다. 그 후 endophytic, rhizosphere, 그리고 non-rhizosphere로 구분하여 DNA를 분리하였으며, 이를 template DNA로 PCR 및 multiplex PCR 을 수행하여 B. subtilis AH18의 토양내 분포위치를 확인하였다.</p><h2>고추가 이식된 토양 내에서 B. subtilis AH18의 기간별 monitoring</h2><p>일반토양에 처리된 B. subtilis AH18의 우점능 기간을 확인하기위해 위와 동일한 방법으로 고추를 이식하였으며, B.subtilis AH18를 \( 10^{7} \mathrm{cfu} / \mathrm{pot} \)를 처리하여 7일 주기로 5주간 rhizosphere의 토양을 분리하여, total DNA를 분리 후 PCR 및 multiplex PCR을 통해 B. subtilis AH18의 우점능 기간을 확인하였다.</p>