여러 과정을 거친 Western blot의 발현 수준은 Un-SCAN-IT gel Version 5.1프로그램을 통해 분석하였고 통계처리는 분산과 평균의 동일성 여부를 검정하였으며, 분석결과는 p값이 0.05 미만일 때 유의한 것으로 간주하였다. 본 논문에서는 국화추출물의 항산화 활성 분석을 위해 DPPH 유리 라디칼과 수산화 라디칼의 제거 활성과 \(\mathrm{Fe}^{2+}\)-che-lating 효과를 알아봤으며 결과적으로 국화추출물의 DPPH 유리 라디칼 제거능은 농도에 따라 약 92.8%의 활성을 보여 높은 유리 라디칼 제거 효과가 나타났다.
<h2>Western blot 분석</h2> <p>NIH 3T3 세포( \( 1 \times 10 ^ { 6 } \) cells/well)를 6-well plate에서 분주하여 16시간 배양한 후 농도별 시료, \( \mathrm { FeSO } _ { 4 } , \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)를 처리하여 24시간 반응시켰다. 반응 후 시료를 처리한 NIH 3T3 세포로부터 lysis buffer (50 mM Tris-HCl, \( \mathrm { pH } \) 7.4, \( 150 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { NaCl } \), \( 1 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 1 \mathrm { mM } \) EGTA, \( 10 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) aprotinin, \( 10 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) leupeptin, \( 5 \mathrm { mM } \) phenylmethylsulfonyl fluoride [PMSF] and \( 1 \mathrm { mM } \) DTT) 이용하여 추출한 단백질을 15% SDS-PAGE로 전기영동 후 PVDF membrane (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 transblot 하였다. 이 후 5% BSA로 blocking 시키고, p21 rabbit polyclonal IgG (Cell Signaling Technology, Beverly, MA)와 P-histone H2AX rabbit antibody (Cell Signaling Technology, Beverly, \( \mathrm { MA } ) \)로 1 차 처리 후 \( \mathrm { IgG } \) HRP-linked anti-rabbit antibody (Cell Signaling Technology, Beverly, MA)를 2차 처리하여 반응시켰다. 이 후 ECL de-tection polaroid camera (Amersham Biosciences, USA)를 사용하여 촬영하였으며, 발현 수준은 Un-SCAN-IT gel Version 5.1 (Silk Scientific, Inc.). 프로그램을 통해 분석하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험은 독립적으로 3회 이상 실시하였으며 각 실험에서 얻어진 결과는 평균±표준편차로 나타내었다. 통계처리는 SPSS version 12.0로 분석한 후 t-검정을 실시하여 분산과 평균의 동일성 여부를 검정하였으며, 분석결과는 일원분산분석 (one way ANOVA)에 의한 Duncan 검정을 실시하여 p값이 0.05 미만일 때 유의한 것으로 간주하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>국화추출물의 항산화활성</h2> <p>본 연구에서 국화추출물의 항산화 활성을 분석하기 위하여 DPPH 유리 라디칼과 수산화 라디칼의 제거 활성 및 \( \mathrm { Fe } ^ { 2 + } \)-che-lating 효과를 조사하였다. 국화추출물의 DPPH 유리 라디칼 제거능은 농도가 높아짐에 따라 활성이 증가하여 \( 0.32 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)에서 \( 7.4 \%, 1.6 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)에서 10.5%, \(8 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)에서 23.6%, \(40 \mu \mathrm { g } / \) \( \mathrm { ml } \)에서 71.3%, \(200 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)에서 92.8%의 제거 효과를 나타내었다. 또한 수산화 라디칼 제거능은 \( 20 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 저농도에서 약 50% 미만의 활성을 나타내었으나 \( 200 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)의 고농도에서는 73.6%의 제거 활성을 보여주었다. 최근 연구에 따르면 국화과 식물인 구절초(Chrysanthemum zawadskir) 추출물의 DPPH 유리 라디칼 소거능은 \( 1,000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 농도에서 51%로 나타내고 있으며, 수리취(Synurus palmatopinna-tificus) 추출물은 73%의 DPPH 유리 라디칼 제거 활성을 보여 우수한 항산화 효과를 가진다고 보고된 바 있다. 본 연구에서도 국화추출물의 DPPH 유리 라디칼 제거능은 농도에 따라 약 92.8%의 활성을 나타내고 있어 높은 유리 라디칼 제거 효과를 보여주고 있다.</p>