RAmy3E 프로모터를 사용하여 GFP 유전자 발현이 조절된 벼 세포를 형질전환하고, 2.4-D, kinetin, hygromycin B를 포함한 N6 액체 배지에 생체중량 2.5 g을 접종하여 25\(^\circ \mathrm{C}\), 120 rpm에서 7일 간격으로 10 mL의 비율로 계대배양하여 현탁 배양 세포를 생산하였다. Bradford assay kit을 사용하여 총 단백질을 측정하였으며 \( 0.5 \mathrm{~g} \)의 현탁 세포를 \( 5 \mathrm{~mL} \)의 buffer에 반응시킨 후 원심분리한 후 상층액에서 얻은 시료로 fluorescence를 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>형질전환된 세포의 현탁 배양</h2> <p>본 연구에서 사용한 세포주는 전북대학교에서 RAmy\(3\)E promoter에 의해서 GFP유전자의 발현이 조절되도록 벡터를 사용하여 벼세포를 형질전환 하여 제작된 세포주를 분양 받아 사용하였다. 현탁배양 배지로는 2,4-D \( (2.0 \mathrm{mg} \) \( / \mathrm{L}) \), kinetin \( (0.2 \mathrm{mg} / \mathrm{L}) \), hygromycin B \( (5.0 \mathrm{mg} / \mathrm{L}) \) 를 포함한 N6액체배지 \( (\mathrm{pH} \) \(5.7\))를 사용하였고, \( 50 \mathrm{~mL} \) 의 액체 배지에 초기 세포로 생체중량 \( 2.5 \mathrm{~g} \)을 접종하였다. 배양조건은 300 \( \mathrm{mL} \) 삼각플라스크를 이용하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 120 \mathrm{rpm} \)에서 암배양 하였으며, 배양된 현탁 세포를 7일 간격으로 auto pipette를 이용하여 \( 10 \mathrm{~mL} \)의 비율로 계대배양하였다.</p> <h2>세포량 측정</h2> <p>세포의 생장을 측정하기 위해서 건조중량을 측정 하였으며, 그 방법은 \( 300 \mathrm{~mL} \) 삼각플라스크에서 배양한 현탁 배양 세포를 Buchner funnel을 이용하여 거름종이 (ADVANTEC NO. 2, Qualitative)상에서 진공펌프로 시료의 배양액을 걸러내어 생체중량을 측정하였다. 생체중량을 측정한 세포를 옮겨 담아 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)의 건조기에서 \(24\)시간 동안 건조시켜 건조중량 (DCW)을 측정하였다.</p> <h2>총 단백질 측정</h2> <p>총 단백질의 측정은 Bradford assay kit (Bio-Rad, USA)을 사용하여 정량하였다. 표준물질로는 Bovine Serum Albumin (Sigma, St. Louis, USA)을 사용하여 spectrophotometer (Bio-Rad, USA)로 \( 595 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하고 표준 농도식을 구하여 이후 정량분석에 사용하였다. 배양액을 측정하여 나온 흡광도를 \( \mathrm{X} \)로 정의하였으며, \( \mathrm{X} \)값을 이용하여 나온 총 단백질의 양을 \( \mathrm{Y} \)로 정의하였다. \[Y=0.0201 X-0.0697, R^{2}=0,9966\]</p> <h2>GFP fluorescence 측정</h2> <p>보관된 배양액 시료를 1 / 2로 희석한 후 excitation wavelength \( (485 \mathrm{~nm}) \), emission wavelength \( (528 \mathrm{~nm}) \)에서 fluorescence spectrophotometer를 이용하여 측정하였다. Fluorescence spectrophotometer system은 microplate multi-detection reader (BIO-TEK., USA)를 이용하여 측정하였다. 세포내의 fluorescence를 측정하기 위하여 세포를 생체중량 측 정시 보관되었던 \( 0.5 \mathrm{~g} \)의 현탁 세포를 \( 5 \mathrm{~mL} \)의 buffer에 반응시킨 후 sonic dismembrator (Fisher Scientific Inc., USA)를 이용하여 세포벽을 파괴시켜 원심분리 \( (3,200 \times \mathrm{g}, 5 \mathrm{~min}) \)한 후 상층액을 회수하여 얻은 시료를 사용하여 위와 같은 방법으로 fluorescence를 측정하였다. 이 때 사용된 buffer는 \(10 \mathrm{~mM} \) \(\mathrm{Tris-} \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} 8.0), 50 \mathrm{~mM} \mathrm{~Na} \mathrm{H}_{2} \mathrm{PO}_{4}(\mathrm{pH} 8.0), 200 \mathrm{~mM} \) \( \mathrm{NaCl} \) 을 혼합한 buffer를 사용하였다.</p>