재조합 plasmid에는 alcohol oxidase 영역과 genome이 있다. 이 두 영역 사이에 존재하는 alcohol oxidase 영역 사이에 exo- \( \beta-1,3 \)-glucanase 유전자를 \( P \).pastoris \( \mathrm{X} \)-33 genome으로 삽입하였다. 또한 alcohol oxidase의 promoter하류 영역에 삽입된 유전자 exo- \( \beta-1,3 \)-glucanase와 exo- \( \beta \) - 1,3 -glucanase의 발현을 유도하여 약 \( 47 \mathrm{kDa} \) 부위에서 단일 밴드를 얻을 수 있었다.
<h2>Exo- \( \beta-1,3 \)-glucanase의 고발현</h2> <p>P. pastoris \( \mathrm{X}-33 \) 을 통해 exo- \( \beta-1,3 \)-glucanase의 과 발현을 실시하였다. 제한효소 \( E c o \) R I과 \( K p n \mathrm{I} \) 부착자리가 첨가된 정방향 및 역방향 primer를 제작하여 C. fermentati SI의 chlomosomal DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행한 후 exo-\( \beta \)-1,3-glucanase 구조유전자를 증폭하였다. 이 증폭된 PCR 산물을 정제 후 제한효소 \( E \mathrm{coR} \) I과 KpnI로 처리하고 미리 EcoR I과 KpnI로 처리된 pPICZA에 삽입하였다. Saccharomyces cerivisiae와 같이 선형화 된 DNA는 전체 genome내에 있는 homologous한 영역과 재조합 DNA사이에서 homogolous recombination이 일어남으로써 안전한 형질전환체를 얻을 수 있다고 알려져 있다. 마찬가지의 방법으로 재조합 plasmid 상에 있는 alcohol oxidase 영역과 genome내에 있는 alcohol oxidase 영역 사이에서 homologous recombination이 일으켜서 exo- \( \beta-1,3 \)-glucanase 유전자를 \( P \). pastoris \( \mathrm{X} \)-33 genome 내로 삽입시켰다. Alcohol oxidase의 promoter 하류영역에 삽입된 exo- \( \beta-1,3 \)-glucanase 유전자의 발현을 위해 24 시간마다 methanol 0.5\%가 되도록 첨가하면서 exo- \( \beta \) - 1,3 -glucanase의 발현을 유도하였다. 이렇게 발현시킨 exo- \( \beta \)-1,3-glucanase를 Ni-NTA Agarose resin (Qiagen, Germany)을 이용하여 정제 한 후 전기영동을 실시한 결과 약 \( 47 \mathrm{kDa} \) 부위에서 단일 밴드를 얻을 수 있었다(Fig. 2). 추정치와 실제 전기영동상의 분자량의 차이는 signal peptide에 기인하는 것으로 생각된다.</p> <h2>exo-1,3- \( \beta \)-glucanase의 활성과 안전성에 미치는 \( \mathrm{pH} \) 의 영향</h2> <p>정제된 exo- \( 1,3-\beta \)-glucanase의 활성에 미치는 \( \mathrm{pH} \) 의 영향을 조사하기 위해서 \( \mathrm{pH} 3.0-\mathrm{pH} 7.0 \) 은 \( 100 \mathrm{mM} \) citrate phosphate buffer, \( \mathrm{pH} \) 6.5-pH \( 8.0 \) 은 \( 100 \mathrm{mM} \) sodium phosphate buffer, pH 7.5-9.0은 \( 100 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) buffer 를 이용하여 \( \mathrm{pH} 3.0 \) 에서 \( \mathrm{pH} 9.0 \) 사이의 buffer를 만든 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응시킨 뒤 \( p \)-nitrophenyl- \( \beta \)-D-glucopyranoside를 기질로 사용하여 효소의 활성을 측정하였다. 그 결과 Fig. \( 3 \mathrm{~A} \)와 같이 정제된 exo- \( \beta \)-1,3-glucanase의 최적 \( \mathrm{pH} \) 는 \( 100 \mathrm{mM} \) citrate phosphate buffer가 사용된 \( \mathrm{pH} 4.5 \) 부근이었다. 또한 효소의 \( \mathrm{pH} \) 안정성을 조사하기 위해서 정제된 효소액에 \( \mathrm{pH} \) \( 3.0-9.0 \) 사이에서 위와 동일 완충액을 첨가하여 각 \( \mathrm{pH} \) 별로 효소를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 방치한 후 효소의 최적 \( \mathrm{pH} \) 에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)로 30 분 반응 후 효소의 잔존활성을 측정하였다. 그 결과 Fig. \( 3 \mathrm{~B} \) 와 같이 정제된 exo- \( \beta \)-1,3-glucanase는 비교적 넓은 영역의 \( \mathrm{pH} 4.5-8.0 \) 사이에서 \( 80 \% \) 이상의 활성을 유지하는 안정한 효소였다.</p>