트립토판 합성효소의 이소조절에 의한 기질채널 이동이 이루어지며, 세린과 인돌 존재 시 Ⅱ단계 반응이 발생하여 트립토판이 생성된다. 그러나 최종적인 트립토판 생성으로 리간드의 효과를 파악하기 어렵다. 이에 중간산물을 추적하기 위해 인돌 대신 유사체인 인돌린을 사용하였다. 야생종과 돌연변이 단백질인 D56E, D56G, D56N은 비슷한 흡광도 패턴을 보이지만, 활성이 약한 D56G와 D56N이 활성이 비슷한 D56E와 야생종보다 높은 흡광도를 가진다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>중간생성물에 대한 리간드의 영향</h2> <p>트립토판 합성효소의 기질채널이동은 이소조절 (allosterism) 방법으로 조절되어진다. 이소조절은 열린 구조와 닫힌 구조간의 상호변환을 조절하는 \( \beta \mathrm{Asp}^{305}, \beta \mathrm{Arg}^{141}, \beta \mathrm{Lys}^{167} \) 등과 \( \alpha \mathrm{Asp}^{56} \) 사이의 염다리(salt bridge)와 일가 양이온 결합 등에 의해 전달되는 것으로 알려져 있다. \( \beta \mathrm{Asp}^{305} \) 는 기질인 세린의 hydroxyl기와 반웅하는 자리이기도 하다. 이소조절 리간드인 일가 양이온이나 GP(DL-\(\alpha\)-glycerol 3-phosphatc)는 56번 잔기의 치환으로 인한 돌연변이 단백질에서 그 활성의 복귀에 관여한다.</p> <p>세린과 인돌이 있게 되면 Ⅱ단계 반응이 일어나게 된다. 그러나, 세린과 인돌이 있는 반응에서는 최종 산물인 트립토판이 생성되어 효소로부터 떨어져 나오게 됨으로 리간드의 효과를 보기가 힘들다. 본 실험에서는 중간산물의 생성과 분해반응을 추적할 수 있도록 인돌의 유사체인 인돌린을 첨가하였다. 이 상태에서는 470\( \mathrm{~nm} \) 근처에서 높은 흡광도를 갖는 quinonoid 종류들이 생성되는 데 Fig. 1에서도 비슷한 결과를 보여주고 있다. 야생종과 돌연변이 단백질 D56E, D56G, 그리고 D56N의 경우 흡광도에서 유사한 패턴을 보여주지만 활성이 낮은 D56G와 D56N의 경우가 야생종이나 이와 비슷한 활성을 갖는 D56E보다는 높은 흡광도를 보였다.</p> <p>일가 양이온의 효과를 살펴보았다(Fig. 2). \( \mathrm{Na}^{+} \)를 처리한 경우, 야생종과 D56E 단백질은 \( 470 \mathrm{~nm} \) 근처에서 흡광도가 증가하는 데, 마찬가지로 D56G와 D56N의 경우도 비슷한 정도로 증가했다. \( \mathrm{K}^{+} \)와 \( \mathrm{NH}_{4}{ }^{+} \)를 처리한 경우는 D56E와 D56N이 큰 증가를 보이는 반면, D56G와 D56N은 증가가 그렇게 크지 않아 오허려 야생종과 D56N의 수치가 더 크게 나타나고 있다.</p> <p>이 결과는 인가 양이온이 Ⅱ단계 반응에서의 이소조절에 관여하고 있음을 보여주며, 이 때 \( \mathrm{Na}^{+} \)보다 \( \mathrm{K}^{+} \)와 \( \mathrm{NH}_{4}{ }^{+} \)가 더 크게 작용하고 있음을 보여준다. 또한, \(\alpha\)소단위체의 56번 잔기 돌연변이로 나타나는 효소활성도의 결함은 일가 양이온들이 관여하는 이소조절기작단계에서 관여하고 있음을 알 수 있다.</p> <p>\( \alpha \)소단위체에 결합하는 리간드인 GP를 처리하였을 때, 야생종과 돌연변이 단백실 4가지 모두 비슷한 양상의 흡광도를 보여주괴 있다(Fig. 3). 이것은 GP의 결합으로 이 반응단계의 결함이 어느 정도 회복되있음을 나타낸다. \( \alpha \)소단위체의 활성부위에 기질이 남아있는 상태에서는 \( \alpha\mathrm{Asp}^{56} \)가 이 반응 단계에서는 역할이 크게 없음을 나타낸다. 즉, 이 조건이 아닌 상태에서의 결함이 있음을 시사해 주고 있다. GP와 \( \mathrm{Na}^{+} \)를 동시에 처리하여도 비슷한 결과가 나타났다. glycerophosphate는 모두 비슷한 양상의 홉광도를 보여주고 있다.</p> <p>\( \beta \) 반응은 9개의 연속적인 반응에 의해 복잡하게 진행된다. 이 중에 일부단계에서만 \(\alpha\)소단위체에 기질이 붙어있는 것으로 알려져 있다. \(\alpha\)소단위체의 기질 유사체인 GP의 영향이 56번 잔기 치환체에서는 별로 없어 보인다. 이는 기질이 \(\alpha\)소단위체에 붙어 있는 단계에서는 56번 잔기가 \(\alpha\)와 \( \beta \) 소단위체 간의 이소조절에 별 역할이 없음을 시사한다. 잔기 56번의 역할은 \(\alpha\)소단위체로부터 기질이 떨어진 이후에 일어나는 반응 단계에서 결함에 기인하는 것으로 추정된다.</p>