P.vulgaris K80 리파아제 유전자를 발현벡터 pET-3에 서브클로닝하여 제조한 pKLE 재조합 플라스미드를 사용하였다. E.coli BL21(DE3)과 XL1-Blue를 숙주로 사용하고, LuriaBertani 배지에 암피실린 100 \(\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml}\)농도로 첨가하여 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 진탕배양하였다. 600 nm 파장의 흡광도 \( \mathrm { OD } _ { 600 } \)가 0.5로 증가 되었을 때, IPTG 1mM 농도로 첨가하고 24시간 동안 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 진탕배양하였다. 초음파 분쇄법으로 균체를 파쇄하고 칼륨인산용액과 바닐라산에 현탁하여 상등액을 얻었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약 및 재료</h2> <p>p-Nitrophenyl caprylate(pNPC), methyl ester palmitic acid, methyl ester oleic acid, methyl ester stearic acid, olive oil, soybean oil, sunflower seed oil, Fish oil(menhaden)는 Sigma사에서 구입하였다. Waste soybean oil은 국립 수산과학원에서 제공받았으며, 가정용 폐식용유를 waste cookingoil로 사용하였다. 고정화 과정에서 쓰인 담체는 한국생명공학연구원에서 공급받았다. Palm oil은 Newpia사, methylester linoleic acid는 Fluka사, 메탄올과 에탄올은 Merck사, 그리고 1-프로판올과 n-부탄올은 Junsei사에서 구입하였다. 이 밖의 시약들은 모두 일반 시약급을 사용하였다.</p> <p>이 밖의 시약들은 모두 일반 시약급을 사용하였다. 본 연구에서 사용한 pKLE 재조합 플라스미드는 P.vulgaris K80 리파아제 유전자(GenBank accession number AAB01071)를 발현벡터인 pET-3에 서브클로닝하여 제조한것이다.</p> <h2>균주, 플라스미드, 배양조건</h2> <p>E. coli BL21(DE3)을 재조합 단백질의 발현 숙주로 사용하였고, E. coli XL1-Blue를 재조합 플라스미드의 보관 숙주로 사용하였다. 리파아제 K80 유전자가 삽입되어 있는 pKLE 재조합 플라스미드를 발현 벡터로 사용하였다. LuriaBertani 배지(10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 5 g/L NaCl)에 암피실린(ampicillin)을 100 µg/mL 농도로 첨가한 후, 형질전환된 E. coli BL21(DE3)균을 접종하고 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 진탕배양하였다. 재조합 리파아제 K80의 발현을 유도하기 위해, 배양액의 600 nm 파장의 흡광도 \( \mathrm { OD } _ { 600 } \)가 0.5로 증가 되었을 때, 배지에 isopropyl-bbb-D-thiogalactopyranoside(IPTG)를 1 mM 농도가 되도록 첨가하고 24시간 동안 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 진탕배양하였다. 배양액 1.8리터를 원심분리하여 균체를 모은 후, 칼륨인산용액(100 mM, pH 7.0) 36 mL에 현탁하였다. 초음파 분쇄법으로 균체를 파쇄한 후, 원심분리를 통해 상등액을 얻었다.</p> <h2>리파아제 K80의 활성 측정</h2> <p>리파아제 K80의 활성 측정은 크게 두 가지로 나누어서 진행하였다. 첫 번째로, 합성기질을 사용한 효소의 활성 측정을 다음과 같이 수행하였다. 기질혼합액은 p-nitrophenyl caprylate(10 mM 농도로 아세토니트릴 용매에 녹아 있음), 에탄올, 트리스-염산(Tris-HCl)용액(50 mM, pH 8.0)을 1:4:95의 비율로 구성하여 사용하였다. 이 혼합액 1 mL에 소량(~10µL)의 효소액을 넣고, 빠르게 섞어 주었다. \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 4분간 반응시킨 후 405 nm 파장의 흡광도 \( \left ( \mathrm { OD } _ { 450 } \right ) \)를 측정하여 효소반응으로 생성된 p-nitrophenol(pNP)의 양을 정량하였다. 효소활성 1 unit은 1분 동안 1 µmol의 pNP를 생성하기 위해서 필요한 효소의 양으로 정의하였다.</p>