이 연구에서는 thymosin \(\beta\)4와 CD133의 정상 위 조직에서의 발현 형태 및 그 상관관계를 규명하기 위해 tissue microarray를 사용하여 면역조직화학검사 및 면역형광염색검사를 실시하였다. 면역형광염색검사 및 면역조직화학검사를 위해 농도와 산도를 맞추어 5분간 두 번 antigen retrieval을 실시했다.
<p>본 연구 결과에서는 정상 위 조직에서 티모신 베타4와 CD133의 발현을 최초로 조사함으로써 thymosin \( \beta 4 \)와 CD133이 정상 위조 직에서 어떠한 양상으로 발현 되는지 와 그 발현의 상관관계가 어떠한지를 규명하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>환자 조직</h2> <p>환자 조직은 tissue microarray를 Super Bio Chip (Super Biochips Laboratories, Seoul, KOREA)사로부터 구입하여 사용하였다. 나이와 성별을 제외한 조직을 제공한 환자의 정보는 가지고 있지 않다.</p> <h2>면역조직화학검사(Immunohistochemistry)</h2> <p>면역조직화학검사를 위해 tissue microarray 슬라이드를 탈파라핀화와 수화를 거친 다음 citrate buffer (0.01 \( \mathrm { M } \), \( \mathrm { pH } \) 6.0) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) 상에서 전자레인지로 최고출력으로(700W 이상) 5 분간 두 번 antigen retrieval을 실시하였다. PBS하에서 슬라이드를 충분히 식힌 후 \( 3 \% \) hydrogen peroxide 용액에서 5 분간 반응하여 endogenous peroxidase를 제거하였다. 이후 PBS로 5 분간 3 번 씻어 준 다음 PBS에 희석된 rabbit polyclonal thymosin \( \beta 4 \) 항체(ALPCO Diagnostics, Windham, NH, USA)를 1: 2,000 희석비율로 혹은 CD133 항체(Abcam Inc., Cambridge, MA, USA)를 1:100 희석 비율로 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 overnight 배양하였다. 다음날 PBS로 5분씩 3 번 씻어 준 후 2 차 항체를 처리하여 1 시간 동안 반응한다. PBS로 5분 동안 3번 씻어 준 후 Dako's EnVision Kit (DAKO, Carpinteria, CA, USA)를 사용하여 DAB 발색반응을 유도하였다. 슬라이드는 이후 대조 염색을 Meyer's hematoxylin (DAKO)로 10 초간 염색 후 탈수반응을 거친 다음 Permount (Fishier Scientific, Pittsburgh, PA, USA)로 고정하였다.</p> <h2>면역형광염색검사</h2> <p>면역형광염색을 위해 tissue microarray 슬라이드를 탈 파라핀화와 수화를 거친 다음 citrate buffer \( (0.01 \mathrm { M } , \mathrm { pH } \) 6.0)</p> <p>상에서 전자레인지로 최고출력으로(700W 이상) 5분간 두 번 antigen retrieval을 실시하였다. PBS하에서 슬라이드를 충분히 식힌 후 3 \% hydrogen peroxide 용액에서 5분간 반응하여 endogenous peroxidase를 제거하였다. 이후 PBS로 5분간 3번 씻어 준 다음 PBS에 희석된 rabbit polyclonal thymosin \( \beta 4 \) 항체(ALPCO Diagnostics)를 1:2,000 희석비율로 혹은 CD133 항체(Abcam Inc.)를 1:100 희석비율로 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 overnight 배양하였다. 다음날 PBS로 5분간 세 번 씻어 준 Alexa Fluor 546 anti-mouse antibody와 Alexa Fluor 488 anti-rabbit antibody (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 1시간 배양한 후 confocal laser-scanning microscope로 관찰한다.</p>