Oyaizu의 방법에 따라 pH 6.6의 200mM 인산 완충액, 1% potassium ferricyanide를 50\(^\circ \mathrm{C}\)에서 20분 동안 반응시켰다. \( 10 \% \)TCA를 첨가하여 13,500 x g에서 15분 동안 원심분리하고 700nm에서 흡광도를 측정하였다. 사람 피부 섬유아세포는 CO2, 37\(^\circ \mathrm{C}\), 95% 습도를 유지한 배양기에서 FBS, glutamine, penicillin-streptomycin을 포함한 DMEM 배지에서 배양하였다.
<p>Oyaizu의 방법에 따라 측정하였다. 시료 \( 1 \mathrm { ml } \) 에 \( \mathrm { pH } \) \( 6.6 \) 의 \( 200 \mathrm { mM } \) 인산 완충액 및 \( 1 \% \) 의 potassium ferricyanide를 각 \( 1 \mathrm { ml } \) 씩 차례로 가하여 교반한 후 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 수욕상에서 20 min 동안 반응시켰다. 여기에 \( 10 \% \) TCA (trichloroacetic acid) 용액을 \( 1 \mathrm { ml } \) 가하여 \( 13,500 \times g \) 에서 \( 15 \mathrm { ~min } \) 동안 원심분리하여 상등액 \( 1 \mathrm { ml } \) 에 증류수 및 ferric chloride 각 \( 1 \mathrm { ml } \) 을 혼합한 후 \( 700 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 환원력은 시료첨가군과 대조군의 흡광도 비를 % 값으로 환산하였다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>사람피부섬유아세포는 \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 및 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 95 \% \) 이상의 습도를 유지한 배양기에서 \( 10 \% \) fetal bovine serum, \( 2 \mathrm { mM } \) glutamine and \( 100 \mathrm { ~kg } / \mathrm { ml } \) penicillin -streptomycin을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다.</p> <h2>MTT assay</h2> <p>Hansen의 방법에 따라 HDFs에 대한 spermidine의 세포독성을 MTT (3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenylte-trazolium bromide)를 이용하여 측정하였다.</p> <h2>In vitro 지질과산화에 대한 항산화 활성</h2> <p>Spermidine을 \( 125,250,500 \) 및 \( 1,000 \mu \mathrm { M } \) 의 농도가 되게 linolenic acid emulsion과 혼합한 후 \( 0.8 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 및 \( 0.8 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { FeSO } _ { 4 } \)를 혼합한 용액을 \( 5 \mathrm { hr } \) 동안 반응 시킨 후 \( 0.4 \% \mathrm { TBA } \)를 첨가하고 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 2 \mathrm { hr } \) 동안 반응시켜 실온에서 \( 10 \mathrm { ~min } \) 동안 반응시켰다. 그 다음, 15:1 비율의 n-butanol:pyridine 용액을 \( 500 \mu \mathrm { l } \) 첨가하고 \( 1,000 \times \mathrm { g } \) 에서 \( 10 \mathrm { ~min } \) 동안 원심분리 하여 상등액을 \( 532 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였으며 지질과산화 정도는 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 % 값으로 환산하였다.</p>