본문에서는 lipase 저해활성 계산법을 소개하고, 저해 메커니즘을 탐색하기 위해 기질과 시료의 농도를 조절한 실험을 설명한다. 실험은 Lineweaver-Burk plot을 이용해 분석하였으며, 결과의 유의성은 SAS software를 이용해 분석하였다. 이를 통해 \(p<0.05\) 수준에서 유의미한 차이를 갖는 결과를 Duncan's multiple range test법을 이용해 판정하였다.
<h2>Pancreatic lipase 저해 활성</h2> <p>Lipase 저해활성 측정은 Kim 등[의 방법을 사용하여 측정하였다. Porcine pancreatic lipase(triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) \( 0.3 \mathrm { mg } \) 에 \( 10 \mathrm { mM } \) MOPS(3-[N-morpholino] propanesulfonic acid)와 \( 1 \mathrm { mM } \mathrm { EDTA } ( \mathrm { pH } 6.8) \) 를 포함하는 buffer를 \( 30 \mu \mathrm { l } \) 를 넣고, Tris buffer(100 mM Tris-HCl, \( \left .5 \mathrm { mM } \mathrm { CaCl } _ { 2 } , \mathrm { pH } 7.0 \right ) \) 를 \( 850 \mu \mathrm { l } \) 첨가하여 enzyme buffer를 준비하였다. Enzyme buffer에 시료 \( 100 \mu \mathrm { l } \) 를 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 15 분간 반응시켰다. 반응 후 \( 10 \mathrm { mM } \) p-nitrophenyl butyrate(Sigma Chemical Co.) \( 20 \mu \mathrm { l } \) 를 첨가하여 다시 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 15 분간 반응시켰다. p-Nitrophenyl butyrate가 p-nitrophenol로 가수분해된 정도를 UV/visible spectrophotometer(GENESYS \( 10 \mathrm { UV } \), Rochester, NY, USA)로 \( 400 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. Lipase 저해활성( \%)은 다음과 같이 계산하였다.</p> <p>Lipase 저해활성 \( ( \%) = [1-( \mathrm { B } - \mathrm { C } ) / \mathrm { A } ] \times 100 \)</p> <p>\( \mathrm { A } \) : 시료를 첨가하지 않은 흡광도</p> <p>\( \mathrm { B } \) : 시료를 첨가한 흡광도</p> <p>\( \mathrm { C } \) : 효소를 첨가하지 않은 흡광도</p> <h2>Lipase 저해 타입</h2> <p>Lipase에 대한 저해 기작을 알아보기 위해 기질의 농도를 \( 5,10,20 \mathrm { mM } \) (Stock concentration)로 달리하였으며 시료의 농도를 0, \( 0.4 \) 및 \( 0.6 \mathrm { mM } \) (Stock concentration, 몰 농도는 LC/ESI-MS를 통해 얻은 분자량을 이용하여 계산)로 하여 위의 실험방법으로 실험을 진행 한 후 Lineweaver-Burk plot을 이용하여 분석하였다.</p> <h2>통계 처리</h2> <p>각 실험에 대한 유의차 검정은 SAS software(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)에서 프로그램 된 general linear procedures, least square 평균값을 분산분석 한 후 \( p<0.05 \) 수준에서 Duncan's multiple range test법에 따라 분석하였다.</p>