간잎돌김의 원형체질 분리의 가장 적합한 환경을 알기 위해 삼투압 안정제와 최정농도 \(\mathrm{pH}\) 등을 변경해가며 실험했다. 이후 원형체질간의 융합조건을 확인하기 위해 간잎돌김과 오카무라돌김의 원형질체들간의 세포융합을 하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>실험에 사용된 긴잎돌 김(Porphyra pseudolinearis Ueda)과 오카무라돌김(P. okamurae \( ) \) 은 강원도 강릉시 주문진 암반지대에서 채집하였다. 채집한 김은 붓으로 부착생물을 제거한 후, 멸균해수로 3회 씻은 다음, \( 1 \% \) povidone-iodine 용액에 각각 1 분간 3 회 처리하였다. 부착생물이 제거된 김은 멸균해수롤 주 1 희 교환하여 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하였으며, 해수 고환시 영양소 \( \left(120 \mu \mathrm{M} \mathrm{NO} 3,8 \mu \mathrm{M} \mathrm{PO}_{4}\right) \) 를 첨가하여 주었다. 기포발생에 의하여 물을 교반하여 주었고, 광도는 형광등을 이용하여 \( 80 \mu \mathrm{mol} \) photons \( \mathrm{m}^{-2} \cdot \mathrm{s}^{-1} \) (12:12h L:D) 로 처리하였다. 엽체의 크기를 약 \( 1 \mathrm{~mm}^{2} \) 크기로 자른 후, 효소용액을 처리하기 전까지 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하였다.</p> <h2>원형질체의 분리</h2> <p>긴잎돌김의 원형질체 분리에 가장 적합한 삼투압 안정제와 최적농도를 알아보기 위하여, 삼투압 안정제로 설탕, 솔비톨, 그리고 만니톨을 각각 \( 0.4 \mathrm{M}, 0.5 \mathrm{M} \), 그리고, \( 0.6 \mathrm{M} \) 로 처리하였다. \( \mathrm{pH} \) 에 따른 원형질체 분리율 비교하기 위하여, \( 25 \mathrm{mM} \) MES완충용액, \( 25 \mathrm{mM} \) HEPS 완충용액, 그리고 \( 25 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) 완충용액를 사용하여 각각 \( \mathrm{pH} 6.0, \mathrm{pH} \) \( 7.9, \mathrm{pH} 8.0 \) 그리고 \( \mathrm{pH} \) 9.0조건으로 만든 후, 원형질체 분리에 사용하였다. 효소용액의 최적조성을 알아보기 위하여, \( 25 \mathrm{mM} \mathrm{MES} \) 완충용액 \( (\mathrm{pH} \) 6.0), \( 0.5 \mathrm{M} \) 솔비톨이 용액에 각 효소를 다양한 농도와 조성으로 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 시간 동안 진탕배양기(60rpm)로 교반하면서 처리하였다. 효소조성은 각각 \( 1 \% \) agarase와 \( 3 \% \) hemicellulase, \( 2 \% \) agarase와 \( 2 \% \) hemicellulase, 3\% agarase와 1\% hemicellulase, \( 4 \% \) agarase, 그리고 \( 4 \% \) hemicellulase를 처리하여 원형질체 수율을 비교하였다.</p> <p>효소용액을 2 시간 처리한 후, 분해되지 않은 김 세포벽을 제거하기 위하여, \( 30 \mu \mathrm{mm} \) 뮬러가아제를 통과시킨 다음, \( 200 \times \mathrm{g} \) 로 10 분간 원심분리하여 상층액을 버리고 \( 0.6 \mathrm{M} \) 솔비톨로 씻어주었다. 이 세척과정을 3회 반복하여 효소용액을 제거하였다. 원형질체 분리과정은 가능한 암조건에서 진행되었으며, 분리된 원형질체는 혈구계수기를 사용하여 계수하였다. 상기의 모는 실험은 3번 반복하여 평균값을 구하였다.</p> <h2>원형질체 융합시험</h2> <p>원형질체간의 완전한 원형질체 분리와 융합조건을 확인하기 위하여, 긴잎돌김과 오카무라돌김의 원형질질체들간 세포질융합을 시도하였다. 오카무라둥근돌김 원형질체는 \( 0.05 \% \) neutral red로 20 분간 염색한 후, \( 0.5 \mathrm{M} \) 솔비톨이 함유된 멸균해수로 씻어주었다. 그리고 염색하지 않은 긴잎돌김 원형질체와 염색된 오카무라돌김 원형질체를 흔합하여 30\% polyethylene glycol 8000 을 처리한 다음, 5분 간격으로 관찰하였다. 상기의 모든 관찰은 고배율 현미경(Olymypus, BH-2)을 사용하였다.</p>