N-아세틸글루코사민(GlcNAc)과 그 유도체인 글루코사민(GlcN)은 생물체에서 생합성되는 물질로, 식품, 화장품, 의약품 등에 광범위하게 사용되고 있으며, 골관절염 치료 및 관절건강 유지 등의 목적으로 의약품으로 사용되고 있다. 따라서 N-아세틸글루코사민과 글루코사민의 합성은 생명공학에서 중요한 주제이며, 본 연구에서는 � C. glutamicum ATCC 13032에서 대사공학을 통해 G l c N A c GlcNAc 생산에 필요한 � � � � glmS와 � � � 1 gna1 유전자를 과발현하고 G l c N A c GlcNAc의 분해반응과 부반응으로 가는 대사경로를 차단하여 포도당으로부터 G l c N A c GlcNAc를 생산하는 균주를 개발하여 보고한다.
<h1>\( N \)-아세틸글루코사민 생산을 위한 코리네박테리움 글루타미컴의 대사공학</h1> <h1>서 론</h1> <p>글루코사민(glucosamine, GlcN)과 그 유도체인 \( N \)-아세틸 글루코사민 ( \( N \)-acetylglucosamine, GlcNAc)은 세균, 진균류, 식물, 동물 등의 생명체에서 생합성되는 물질이다. \( \mathrm { GlcNc } \)는 진균류의 세포벽, 갑각류의 껍질, 곤충의 외골격등에 분포하는 키틴(chitin)의 구성성분이며, 사람 관절에 분포하는 히알루론산(hyaluronic acid)과 세균 세포벽인 뮤레인(murein)의 주성분이다. \( \mathrm { GlcN } \)과 \( \mathrm { GlcNc } \)의 용도로는 식품, 화장품, 의약용 등에 광범위하게 사용되고 있으며, 특히 관절 및 연골건강과 피부보습 기능성이 뛰어나 골관절염의 치료와 연골 및 관절건강을 유지하기 위한 목적으로 의약용 및 기능성 건강보조식품으로 많이 사용되고 있다. \( \mathrm { GlcN } \)과 \( \mathrm { GlcNc } \)는 화학적 방법, 효소처리법, 미생물 발효법 등으로 생산될 수 있다. 현재 대부분의 \( \mathrm { GlcN } \)은 게와 새우껍질에서 추출한 키틴을 진한 염산으로 가수분해하여 생산하고 있으며, 이를 \( 10 \% \) 메탄올에 녹인 다음 무수초산 (acetic anhydride)을 가하여 \( N \)-아세틸화 반응을 일으켜 \( \mathrm { GlcNAc } \)이 생산되고 있다. 그러나 이는 많은 폐수를 방출하는 비 친환경적인 공법이며, 제조과정에서 소량의 \( O \)-acetylated, di-acetylated 부산물들이 만들어 지며, 용매와 트리뷰틸아민(tributylamine) 등이 아주 소량 제품에 잔존되는 문제점이 있다. \( \mathrm { GlcN } \)과 \( \mathrm { GlcNc } \)은 endochitinases, exochitinases, chitobiosidases, \( N \)-acetylglucosaminidases로 이루어진 키틴분해효소에 의해 키틴의 가수분해에 의해 생산되는 연구결과가 많이 보고되어 있다. Trichoderma viride, Aspergillus niger, Carcica papaya, Aeromonium 등의 미생물에서 만들어지는 효소를 사용하여 키틴을 분해하여 \( \mathrm { GlcNc } \)를 만들 수 있다. 그러나, 효소의 활성과 안정성 유지, 낮은 전환율, 높은 효소제조비용 등의 문제점등을 해결해야 하며, 갑각류 껍질에 대한 알레르기가 있는 사람의 경우에는 사용이 제한되는 문제점이 있다. 한편 재생가능한 탄소원을 이용하여 미생물 발효를 통해 비 갑각류 유래의 \( \mathrm { GlcN } \)과 \( \mathrm { GlcNc } \)를 생산하는 방법은 좋은 대안으로 여겨진다. 곰팡이 Aspergillus sp. BCRC31742를 이용하여 배양 중 2단계에 걸쳐 용존산소를 조절하는 방법을 통해 \( 14.37 \mathrm { ~g } / \)의 \( \mathrm { GlcN } \)을 얻었다. 곰팡이를 이용한 \( \mathrm { GlcN } \)의 생산은 화학적 방법과 비교하면 수율과 생산성이 낮은 문제가 있다. 최근, Deng 등과 Liu 등은 대사공학을 통해 Escherichia coli와 Bacillus subtilis에서 매우 높은 농도의 \( \mathrm { GlcNc } \)를 생산하는 연구결과를 보고하였다. E. coli 에서 fructose-6-phosphate을 \( N \)-acetylglucosamine-6-phosphate (GlcN-6-P)로 단계적으로 전환하는 데 관여하는 효소들인 glucosamine-6-phosphate (GlcN-6-P) synthase와 glucosamine-6-phosphate \( N \)-acetyltransferase를 암호화하는 유전자 \( glmS \)와 \( gna1 \)을 발현하고, \( \mathrm { GlcNAc } \)-6-P에 의한 생산물 저해(product inhibition)가 해제된 변이 glucosamine synthase를 암호화하는 \( glmS \)를 과발현시키고, \( \mathrm { GlcNAc } \)-6-P의 분해에 관여하는 \( nagBACD \)를 염색체에서 결손하고, 배출된 \( \mathrm { GlcN } \)과 \( \mathrm { GlcNAc } \)를 세포 내로의 재 유입을 방지하기 위해 \( \operatorname { manXYZ } \) \( nagE \)를 결손한 균주를 개발하여 1-L 발효조에서 72시간 배양한 결과 \( 110 \mathrm { ~g } / \)의 \( \mathrm { GlcN } \)가 축적되는 것을 확인하였다. \( B \). subtilis의 경우, \( \operatorname { glmS } \)와 \( \operatorname { glm1 } \)을 과발현하고, \( \mathrm { GlcNAc } \)-6-P의 분해에 관여하는 \( \operatorname { nag } A, \operatorname { nag } B, \operatorname { gam } A \)를 결손하고, \( \mathrm { GlcNAc } \)의 세포 내 재 유입에 관여하는 \( nagP \)를 결손하고, 젓산과 아세트산의 축적을 방지하기 위해 \( l d h \)와 \( p t a \)를 결손하고, 해당과정과 펩티도글리칸 생합성에 관여하는 \( pfk \)와 \( glmM \) 유전자 발현을 억제하는 균주를 개발하여, 최종적으로 3-L 발효조에서 \( 31.65 \mathrm { ~g } / \)의 \( \mathrm { GlcNAc } \)을 생산하였다. 그러나, \( E \). coli는 GRAS (generally regarded as safe) 미생물이 아니기 때문에 의약용 및 기능성 건강보조식품용으로는 많은 제한이 따르며, \( B \). subtilis를 이용한 방법은 생산물의 농도가 낮아 추가적인 연구가 더 요구된다. Corynebacterium glutamicum 은 토양 유래 그람양성 미생물로, 글루탐산과 라이신을 생산하는 대표적인 산업미생물이다. 최근 합성생물학과 대사공학의 접목에 따라 dicarboxylic acid (succinic acid, glutaric acid, muconic acid), diamines (putriscine, cadaverine), alcohols (propanol, isobutanol), 아미노산( \( \gamma \)-aminobutyric acid, 5-aminovalerate)과 같은 다양한 고부가가치 화합물 생산 연구가 매우 활발히 진행되고 있다. 건강기능식품과 의약용으로 가치가 있는 \( \mathrm { GlcN } \)과 \( \mathrm { GlcNAc } \)를 생산하기 위한 숙주로 GRAS 미생물인 \( C \). glutamicum 을 사용하는 것은 매우 의미가 있다고 사료된다. 따라서, 본 연구에서는 \( C \). glutamicum ATCC 13032에서 대사공학을 통해 \( \mathrm { GlcNAc } \) 생산에 필요한 \( glmS \)와 \( gna1 \) 유전자를 과발현하고 \( \mathrm { GlcNAc } \)의 분해반응과 부반응으로 가는 대사경로를 차단하여 포도당으로부터 \( \mathrm { GlcNAc } \)를 생산하는 균주를 개발하여 보고한다.</p>