Rhodocobacer capsulatus ATCC 11166로부터 PCR(polymerase chain reaction) 방법으로 클로닝한 \( (h e m A) \) 유전자를 pHCEIIB 플라스미드 벡터의 Nde I/Hind III 제한효소 사이트에 삽입하여 재조합 플라스미드 pHEMA를 구축하고, Escherichia coli BLR(DE3)에 침투하여 ALA 생산을 위한 발현을 시도하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주 및 플라스미드</h2> <p>ALA 생산을 위해 Rhodocobacer capsulatus ATCC 11166 로부터 \( (h e m A) \) 유전자를 PCR(polymerase chain reaction) 방법으로 클로닝한 바 있으며, 항시발현벡터인 pHCEIIB (Takara, Japan)의 Nde I/Hind III 제한효소 사이트에 삽입하여 재조합 플라스미드 pHEMA } \) 를 구축하였다. pHCEIIB 플라스미드 벡터의 유전자 삽입부위 상류에는 Geobacillus toebii 유래의 D-amino acid aminotransferase (D-AAT) 유전자의 promotor가 존재하며, 발현유도물질을 첨가하지 않아도 세포생장 의존적으로 \( (h e m A) \) 효소의 발현이 가능하였다. 재조합 플라스미드 pHEMA를 \(Escherichia coli \) BLR(DE3) (Takara, Japan)에 도입되어 ALA 생산실험에 사용하였다. 전 배양용 배지로 Luria-Bertani 액체배지(Difco, USA)를 사용하였다.</p> <h2>발효 실험</h2> <p>배양시험에 사용한 기본 배지로 SGYP 배지(succinic acid \( 10 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \), glycine \( 5 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \), yeast extract \( 10 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \), peptone \( 5 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \), \( \mathrm { K } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } 10 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } , \mathrm { pH } \) 6.3)를 사용하였으며, 재조합 플라스미드의 안정성을 유지하기 위해 ampicillin(Sigma, USA, 50 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) )을 첨가하였다. 플라스크 배양실험의 경우, SGYP 배지 \( 50 \mathrm { ~mL } \) 에 전배양액 \( 1 \% \) 를 접종하여 진탕배양기에서 교반 배양 \( (180 \mathrm { rpm } ) \) 하였다. Jar fermentor 배양실험의 경우, \( 2.5 \mathrm { ~L } \) glass-jar(KoBiotech Co., Korea)에 \( 1.2 \mathrm { ~L } \) 의 SGYP 배지를 투입하고 멸균한 후에 전배양액 \( 1 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 를 접종하였다. 반응기의 운전조건은 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } , \sim 1,200 \mathrm { rpm } \), 통기량 \( 0.5 \mathrm { vvm } \) 으로 하였으며, \( 5 \mathrm { ~N } \) 황산용액을 사용하여 배양액의 \( \mathrm { pH } \) 를 6.3으로 유지하였다.</p>