본 연구의 혈액학적 분석 결과 glucose, AST, ALT 결과, B. subtilis MD-02의 농도에 따른 유의적 차이는 없었으며, hematocrit, amylase, total protein에서만 대조구에 비해 유의적으로 증가하였고, 라이소자임 분석 결과 3주차 때부터 B. subtilis MD-02의 모든 농도군에서 대조구에 비해 높은 결과 값을 나타냈으며, 대식세포의 분석 결과 2주차 때부터 대조구에 비해 증가하였고, 3주차 때부터는 높은 결과값을 나타냈으며, 모든 실험이 종료된 시점에 20일 동안 누적 폐사율을 확인한 결과, 실험 시작 6일부터 대조구에서 폐사가 시작되어 15일에 \( 100 \% \) 의 폐사율을 보였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>혈액학적 분석</h2> <p>혈액성분은 같은 어종이라도 크기, 나이, 생리적 상태, 공급하는 먹이의 성분이나 첨가물의 성분, 성장 환경에 따라 혈액 성분이 변하는 것으로 알려졌다. 본 연구의 혈액학적 분석 결과 glucose, AST, ALT 결과, B. subtilis MD-02의 농도에 따른 유의적 차이는 없었으며(Fig. 1), hematocrit, amylase, total protein에서만 대조구에 비해 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 2). Hematocrit의 결과 1 주차에 비해 4주차 때 대조구에 비해 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 2A). B. subtilis MD-02의 농도에 따라 결과 값의 차이를 나타냈지만, 모든 농도에서 대조구에 비해 hematocrit의 값이 증가한 것을 확인하였다. 소화효소인 amylase 분석 결과 대조구에 비해 3주차 때부터 \( 1.2 \times \) \( 10^{4} \mathrm{CFU} / 100 \mathrm{~g} \) 에서 유의적으로 증가하였다(Fig. 2B). 이러한 결과는 B. subtilis MD-02가 장에 유착되면서 amylase의 분비를 촉진하는 것으로 사료되며, 향후 장내 균총 검사를 진행하고자 한다. total protein의 분석 결과 대조구에 비해 3주차 때부터 \( 1.2 \times 10^{4} \mathrm{CFU} / 100 \mathrm{~g} \) 그룹에서 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 2C). 일반적으로 단백질은 무척추 동물에서 중요하게 여겨지는 선천 면역의 지표인 동시에, 어류의 방어 기전으로 알려져 있다. 또한 Bacillus종은 어류 질병인 Edwardsiellosis, Furunculosis, Lactococcusis, Streptococcusis 등에 대한 억제 반응을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이에 B. subtilis MD-02를 \( 1.2 \times \) \( 10^{4} \mathrm{CFU} / 100 \mathrm{~g} \) 의 농도로 투여하였을 때 hematocrit, amylase, total protein을 유의적으로 향상시키는 것을 확인하였다.</p> <h2>비특이적 면역반응</h2> <p>라이소자임은 세균 세포벽의 펩티도글리칸에 작용하여 N- 아세틸뮤라민산과 N-아세틸글로쿠사민 사이의 베타 1,4-뮤라미드 결합을 가수분해하는 효소이다. 또한 그람양성세균의 세포벽에 직접 작용하고, 그람음성세균에 대해서는 항체와 보체의 작용을 증가시켜 준 후 펩티도글리칸 층을 분해 해주는 역할을 한다고 알려져 있다. 라이소자임 분석 결과 3주차 때부터 B. subtilis MD-02의 모든 농도군에서 대조구에 비해 높은 결과 값을 나타냈다. 실험이 종료되는 시점에서 때부터 \( 1.2 \times 10^{8} \mathrm{CFU} / 100 \mathrm{~g} \) 에서 가장 높은 결과 값을 나타냈으며(Fig. 3A), 이는 B. subtilis MD-02가 라이소자임 활성에 관여를 하는 동시에 고 농도로 투여 시 더 많은 활성을 나타내는 것으로 사료된다. 이러한 결과는 기존에 연구된 B. subtilis와 S. cerecisiae 를 양식 넙치에 투여했을 때, 라이소자임 활성이 증가한다는 결과와 일치하였다.</p> <p>대식세포는 동물체내에서 모든 조직에 분포하여 면역을 담당하는 세포이며, 외부에서 들어온 세균 등을 잡아서 식 작용하는 1차 면역체계이다. 대식세포의 세포질에는 가수분해 효소를 저장하는 리보좀이 다수 존재하며, 이물포식에 의해 형성된 파고좀과 융합하여 효소를 방출하고 이물의 식장용을 한다. 대식세포의 분석 결과 2주차 때부터 대조구에 비해 증가하였으며(Fig. 3B), 3주차 때부터는 \( 1.2 \times 10^{6} \mathrm{CFU} / 100 \mathrm{~g} \)와 \( 1.2 \times 10^{8} \mathrm{CFU} / 100 \mathrm{~g} \) 에서 높은 결과값을 나타냈다. 라이소자임과 마찬가지로 B. subtilis MD-02가 대식세포 활성에 영향을 끼치는 것으로 사료된다.</p> <h2>어류질병세균에 대한 생존율 분석</h2> <p>모든 실험이 종료된 시점에 S. parauberis를 \( 1.2 \times 10^{6} \) \( \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 로 접종하여 20일 동안 누적 폐사율을 확인하였다(Fig. 4). 대조구에서는 실험 시작 6일부터 폐사가 시작되어 15일에 \( 100 \% \) 의 폐사율을 보였다. \( 1.2 \times 10^{4} \mathrm{CFU} / 100 \mathrm{~g} \)의 그룹에서는 접종 후 7일부터 폐사가 시작되어 \( 60 \% \) 의 폐사율을 보였다. \( 1.2 \times 10^{6} \mathrm{CFU} / 100 \mathrm{~g} \) 과 \( 1.2 \times 10^{8} \mathrm{CFU} / 100 \mathrm{~g} \) 그룹에서는 6일부터 폐사가 시작되어 각각 \( 50 \% \) 와 \( 40 \% \) 의 폐사율을 보였다. 이러한 결과는 기존에 B. subtilis를 이용한 어류질병세균에 대한 여러 연구결과와 비슷한 결과를 보여주었다. 이러한 결과는 사료 내 B. subtilis 균주의 첨가가 어류질병세균에 대한 저항성을 높일 수 있을 것으로 사료된다.</p>