적혈구에 대한 활성산소의 세포손상 및 파괴 실험은 활성산소에 의한 세포손상 모델로 적합한다. 건강한 성인 남녀로부터 얻은 적혈구를 사용하여 O.D.가 0.6인 적혈구 현탁액을 만들어, 이를 실험에 사용하였으며, 해당 현탁액의 적혈구 수는 \(1.5 \times 10^{7} \mathrm{cells} / \mathrm{mL}\)였다. 이 현탁액에 시료용액을 첨가하였고, 대조군(control)의 \( \tau_{50} \)는 \( 32 \mathrm{~min} \)으로 오차범위는 \( \pm 1 \mathrm{~min} \)로 실험 재현성이 좋았다.
<h2>Photohemolysis법을 이용한 세포보호 효과 측정</h2> <p>사람 적혈구를 대상으로 수행하는 활성산소에 의한 세포손상 및 파괴 실험은 활성산소에 의한 세포손상 모델로 적합한 점이 많다. 따라서 이 실험법을 이용하여 천연물을 대상으로 활성산소에 대한 세포보호 효과를 측정할 수 있다.</p> <p>적혈구 현탁액 제조: 적혈구는 건강한 성인 남녀로부터 얻었다. 채혈 즉시 heparin이 첨가된 시험관에 넣은 후, 3,000 \( \mathrm{rpm} \) 으로 \( 5 \mathrm{~min} \) 동안 원심분리하여 적혈구와 혈장을 분리하고, 분리한 적혈구는 \( 0.9 \% \) saline phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 7.4 \), \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot 12 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 9.6 \mathrm{mM}, \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 1.6 \mathrm{mM} \) )로 세척하여 원심분리하고 흰색의 백혈구 층은 제거하였다. 3 회 반복하여 세척, 분리한 적혈구는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 의 냉장고에 보관하면서 사용하였고, 모든 실험은 채혈 후 \( 12 \mathrm{~h} \) 이내에 행하였다. 광용혈 실험은 이미 확립된 방법에 따라 수행하였다. 실험에 사용된 적혈구 현탁액은 \( 700 \mathrm{~nm} \) 에서 O.D.가 0.6이었으며 이때 적혈구 수는 \( 1.5 \times 10^{7} \mathrm{cells} / \mathrm{mL} \) 이었다.</p> <p>비수리 추출물의 광용혈 억제 효과: 적혈구 현탁액 \( 3.5 \mathrm{~mL} \)를 파이렉스 시험관(No. 9820)에 넣은 후, 시료용액을 첨가하였다. 추출물을 농도별로 각각 \( 50 \mu \mathrm{L} \) 씩 첨가하고 암소에서 \( 30 \mathrm{~min} \) 동안 pre-incubation 시킨 후, 광증감제 rose-bengal \( (12 \mu \mathrm{M}) 0.5 \mathrm{~mL} \) 를 가하고 파라필름(Whatman laboratory sealing film, UK)으로 입구를 막은 후 \( 15 \mathrm{~min} \) 동안 광조사하였다.</p> <p>광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 \( 50 \mathrm{~cm} \times 20 \) \( \mathrm{cm} \times 25 \mathrm{~cm} \) 크기의 상자 안에 \( 20 \mathrm{~W} \) 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 \( 5 \mathrm{~cm} \) 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 \( 15 \mathrm{~min} \) 동안 광조사 하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 파괴정도를 \( 15 \mathrm{~min} \) 간격으로 \( 700 \mathrm{~nm} \)에서 투광도(transmittance, \%)로부터 구하였다. 이 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도 증가는 적혈구의 용혈정도에 비례한다. 모든 실험은 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 항온실에서 행하였다. 비수리 추출물의 광용혈에 미치는 효과는 post-incubation 시간과 용혈정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 \( 50 \% \) 가 용혈되는 시간인 \( \tau_{50} \) 을 구하여 비교하였다.</p> <p>대조군(control)은 \( \tau_{50} \) 이 \( 32 \mathrm{~min} \) 으로 오차범위 \( \pm 1 \mathrm{~min} \) 이내로 모든 경우의 실험에서 재현성이 양호하게 나타났다.</p> <p>Rose-bengal을 첨가하고 광조사를 안 했을 경우와 rose-bengal을 첨가하지 않고 광조사만 했을 경우는 모두 암반응 \( 120 \mathrm{~min} \) 까지는 용혈이 거의 일어나지 않았다. 모든 실험은 4 회 반복하여 평균하였다.</p>