배양액 중의 ALA는 Ehrlich's reagent를 사용하여 정량하였으며, acetylacetone을 첨가해 중탕 후 냉각하였다. \( HemA \)가 과발현된 유전자 재조합 대장균의 최적 생장온도는 일반 대장균의 최적 생장온도인 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)보다 낮았다. 이는 배지에 포함된 과량의 유기산과 glycine이 영향을 미쳤을 것이라 추정되며, 상대적으로 낮은 배양온도가 ALA의 불 안정성을 줄이는 데에 도움이 되었다는 추정이다.
<h2>분석방법</h2> <p>배양액 중의 ALA는 Ehrlich's reagent를 사용하여 정량하였다. 배양액의 원심분리 상등액 또는 이의 희석액 \(10 \mu \mathrm { L } \) 를 \( 1 \mathrm { M } \) sodium acetate 완충용액 \( ( \mathrm { pH } 4.6) 1.0 \mathrm { ~mL } \) 와 혼합하여 acetylacetone \( 50 \mu \mathrm { L } \) 을 첨가하고, 10 분간 끓는 물에 중탕한 후 상온으로 냉각하였다. 상기 용액 \( 1 \mathrm { ~mL } \) 에 신선한 Ehrich 시약 \( ( \gamma \)-dimethylaminobenzaldehyde \( 1.0 \mathrm { ~g } \), glacial acetic acid \( 42.0 \mathrm { ~mL } , 70 \% \) perchloric acid \( 8.0 \mathrm { ~mL } ) 1 \mathrm { ~mL } \) 를 혼합하고, 5 분 후에 \( 555 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. \( \mathrm { ALA } ( \) Sigma, USA)의 표준용액으로부터 얻은 정량곡선을 이용하여 시료 중의 ALA 함량을 구하였다. 상기 시험법에서 \( 10 \mu \mathrm { L } \) 의 시료를 취한 경우, \( \mathrm { OD } _ { 555 } = 1.0 \) 은 대략 ALA \( 1.0 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \)에 해당하였다. Succinic acid의 정량을 위해서는 Aminex \( \mathrm { HPX } -87 \mathrm { H } \) organic acid column(Bio-Rad, USA)을 사용하였으며, \( 0.02 \mathrm { ~N } \) sulfuric acid, \( 0.5 \mathrm { ~mL } / \mathrm { min } \) 조건에서 HPLC (Gilson, France) 분석을 수행하였다. 배양액 중의 glucose 농도는 Glucose Analyzer(YSI Inc., USA)를 사용하여 측정하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>적정 배양온도</h2> <p>ALA 생산을 적정 배양온도를 결정하기 위해 SGYP 액체배지를 사용하였으며, \( 27-37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 사이의 온도구간에서 플라스크 배양실험을 실시하였다. \( HemA \)가 과발현된 유전자 재조합 대장균의 최적 생장온도는 glycine \( 5 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) 첨가구 및 glycine \( 10 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) 첨가구 공히 일반적으로 알려져 있는 대장균의 최적 생장온도인 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 보다 낮았다(Fig. 1). 한편, 5-aminolevulinic acid(ALA) 생성속도도 glycine \( 5 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) 첨가구 및 glycine \( 10 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) 첨가구 공히 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 가장 낮은 경향을 나타내었으며, \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 최대 생성속도를 나타내었다(Fig. \( 1 \)). 대체로 \( 27-30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 범위에서 균의 생육과 \( \mathrm { ALA } \) 생성이 잘 연관되어 안정적으로 \( \mathrm { ALA } \) 가 생성되는 것으로 나타났으므로, 배양 적정온도를 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 설정하였다. 재조합 대장균의 적정 배양온도가 낮아진 것은 배지에 함유되어 있는 과량의 유기산과 glycine이 영향을 미쳤을 것으로 추정되며, 또한 상대적으로 낮은 배양온도가 배양 중에 생성된 ALA의 불안정성을 줄이는 데에도 도움이 되었기 때문으로 추정된다. Chung 등은 재조합 대장균의 배양온도가 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 일 경우가 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양할 때보다 균체 생장은 빨랐으나 \( \mathrm { ALA } \) 생산성은 상대적으로 낮았다고 보고한 바 있는데, 이는 재조합 균주의 종류나 배양 조건 등에 따라 적정 배양온도가 달라질 수 있다는 점을 시사하였다.</p>