SDS-PAGE와 zymography를 비교하여 키틴 분해효소의 분자량을 \( 52.1 \mathrm{kDa} \)로 추정하고, N-terminal 아미노산 서열을 Asp-Ser-Gly-Lys-Asn-Gly-Lys-Ile-Ile-Arg-Tyr-Tyr-Pro-Ile-Arg로 분석하였다. 최적반응 \( \mathrm{pH}\)는 \( \mathrm{5.0} \)으로, 조효소액과 정제한 효소액 모두 \( \mathrm{pH} 5.0-8.0 \) 사이에서 안정하였다.
<h2>키틴 분해효소의 분자량 측정과 Zymography</h2> <p>정제한 키틴 분해효소의 분자량을 측정하고 단일성을 확인하기 위하여 SDS-polyacrylamide gel과 zymography 전기영동을 수행하였다. SDS-PAGE와 zymography를 비교하여 키틴 분해활성이 나타난 위치의 band를 확인한 결과는 Fig. 2A와 Fig. 2B에 각각 나타내었으며, 황산암모늄 분획, 이온교환 크로마토그래피와 겔 크로마토그래피 모두 동일한 위치에서 분해환을 확인하였다. 정제한 키틴 분해효소 단백질의 분자량은 \( 52.1 \mathrm{kDa} \) 으로 추정되었다(Fig. 2C).</p> <h2>키틴 분해효소의 N-terminal 아미노산 서열분석</h2> <p>정제한 키틴 분해효소 단백질의 N-terminal 아미노산 서열은 Table 2에 나타내었는데 Asp-Ser-Gly-Lys-Asn-Gly-Lys-Ile-Ile-Arg-Tyr-Tyr-Pro-Ile-Arg로 분석되었다. Bacillus 속(이) 생산하는 키틴 분해효소의 N-terminal 아미노산 서열과 비교한 결과, B. licheniformis \( \mathrm{X}-7 \mathrm{u} \) 가 생산하는 키틴 분해효소인 Chi176, 166,159 와 일부 아미노산 서열(Asp-Ser-Gly-Lys-Asn)이 일치하였고[21], B. licheniformis Mb-2 가 생산하는 Chi67의 N-terminal 아미노산 서열(Ser-Gly-Lys-Asn-Tyr-Lys-Ile-Ile-Gly-Tyr-Tyr-Pro-Ser)과 B. circulans \( \mathrm{WL}-12 \) 가 생산하는 키틴 분해효소 ChiA1 역시 부분적으로 일치 (Ala-Asp-Ser-Tyr-Leu-Ile-Val-Gly-Tyr-Tyr-Pro-Ser-Trp-Ala-Ala-Gly-Arg-Asn-Tyr)하는 것을 확인하였다 \( [23,27] \). 그러나 그 외에 Bacillus 속(이) 생성하는 키틴 분해효소의 아미노산 서열은 일치하지 않는 것으로 확인되었다(Table 2).</p> <h2>최적반응 \( \mathbf{p H} \) 및 \( \mathbf{p H} \) 안정성 측정</h2> <p>조효소액과 정제한 키틴 분해효소의 최적반응 \( \mathrm{pH} \) 와 \( \mathrm{pH} \) 안정성 결과는 Fig. \( 3 \mathrm{~A} \) 와 Fig. \( 3 \mathrm{~B} \) 와 같다. 조효소액과 정제한 효소액 모두 \( \mathrm{pH} \mathrm{5.0} \) 에서 최대 활성을 나타내었으며(Fig. \( 3 \mathrm{~A}) \), 조효소액은 \( \mathrm{pH} 5.0-8.0 \) 사이에서 안정하였고 정제한 효소액의 경우 \( \mathrm{pH} 5.0-6.0\)에서 안정하였다(Fig. 3B).</p> <p>조효소액과 정제한 효소액의 키틴 분해활성은 알칼리 조건에서보다 산성 조건에서 비교적 높게 나타내었다. Wang 등이 분리한 Bacillus amyloliquefaciens V656이 생산한 두 개의 항진균성 키틴 분해효소 \( \mathrm{F} 1 \) 와 \( \mathrm{F} 2 \) 는 각각 \( \mathrm{pH} 7.0 \) 과 \( \mathrm{pH} 6.0 \) 에서 최대 활성을 나타낸다고 보고하였으며, \( B \). licheniformis \( \mathrm{Mb}-2 \) 가 생산한 키틴 분해효소는 \( \mathrm{pH} 6.0 \) 에서 최대활성을 나타내었고 \( \mathrm{pH} 4.0-11.0 \) 범위에서 효소활성이 \( 70 \% \) 이상 유지되었다고 보고하였다. B. cereus \( \mathrm{CH} \) 가 생 산하는 키틴 분해효소 \( \mathrm{A}, \mathrm{B} 1, \mathrm{~B} 2, \mathrm{~B} 3 \) 는 \( \mathrm{pH} 5.0-7.5 \) 에서 최대활성을 나타내었고[13], B. circulans No.41가 생산하는 키틴 분해효소는 \( \mathrm{pH} 8.0 \) 일 때 최대 활성을 나타내었으며 \( \mathrm{pH} \) \( 3.0 \) 과 \( \mathrm{pH} \) 12.0에서는 약 \( 50 \% \) 의 키틴 분해활성이 소실된다고 보고하였다. 대부분의 Bacillus 속(이) 생산하는 키틴분해효소들은 \( \mathrm{pH} 5.0-8.0 \) 사이에서 최대활성을 나타내는 것으로 확인되었다.</p>