부평초 물 추출물을 환류 냉각하여 3시간동안 2회 반복 열수 추출하여 BHA를 대조물질로 사용하여 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도비로부터 산출하였다. 회석한 ABTS 라디칼 용액과 생약 추출액을 혼합하여 흡광도를 추출하였고, \( 10 \% \) fetal bovine serum과 \( 1 \% \) penicillin \( (100 \mathrm{U} / \mathrm{mL}) \) 을 첨가한 Dulbeco's modified eagle's medium를 사용하여 게대 배양하였다. 여기에 MTT 용액을 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하여 15분간 반응시킨 후 흡광도를 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료 및 추출물의 제조</h2> <p>부평초 \( (S \) polyrhiza)는 경산시 소재 악업사로부터 2016년 9월에 구입하였으며 원산지는 중국이다. 증거 표본은 한국한의약진흥원 표본실에 보관중이다. 부평초 물 추출물(SW)은 시료 \( 200 \mathrm{~g} \)을 환류 냉각하여 3 시간 2회 반복 열수 추출하였다. 이후 열수추출물을 여과하고 농축, 동결 건조하여 건조 중량 \( 23.5 \mathrm{~g} \) 을 얻었으며 수율은 \( 11.8 \% \) 이였다. 부평초 \( 70 \% \) 에탄올추출물(SE)은 부평초 \( 4 \mathrm{~kg} \) 을 \( 70 \% \) 에탄올 \( 30 \mathrm{~L} \) 를 사용하여 상온에서 2 일간 침지시켜 2 회 반복 추출하였다. 추출액을 여과하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 이하에서 감압 하에 완전히 농축하고 동결 건조하여 건조 중량\( 480.29 \mathrm{~g} \) 을 얻었으며 수율은 \( 12.0 \% \) 이었다. 이 중 \( 457.2 \mathrm{~g} \) 을 증류수에 현탁 시킨 후 용매 극성에 따라 \( n \)-hexane, EtOAc 및 \( n \)-BuOH을 이용하여 순차직으로 분획하여 \( n \)-hexane 분획물(SE-H) \( 94.05 \mathrm{~g} \), EtOAc 분획물(SE-E) \( 68.80 \mathrm{~g} \), \(n \)-BuOH 분획물 (SE-B) \( 50.26 \mathrm{~g} \) 을 얻었다. 나머지는 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 분획물(SE-W)로 하였으며 \( 212.09 \mathrm{~g} \) 이 얻어져서 각각의 회수율은 순서대로 20.6, \( 15.0,11.0,46.4 \% \) 이었다.</p> <h2>DPPH 라디칼 소거 활성</h2> <p>부평초 추롤물 및 분획물의 \(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl\)(DPPH) 라디칼 소거 활성은 Blois 방법에 따라 측징하였다. 각 시료용액에 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 에 \( 0.02 \mathrm{mM} \) 의 회석한 DPPH 용액 \( 50 \mu \mathrm{L} \) 을 넣고 교반한 후 10 분간 방치한 다음 microplate reader (Sunrise, Tecan Group Ltd., Mănnedorf, Switzerland)를 이용하여 \(517 \mathrm{nm} \) 에서 흡광도를 측징하였다. 이때 대조물질로는 Butylated Hydroxy Anisole (BHA)를 사용했으며 DPPH 라디칼 소거 활성은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도비로부터 산출하였다.</p> <h2>ABTS 라디칼 소거 활성 측정</h2> <p>부평초 수출물 및 분획물의 \(2,2'-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)\) radical 소거 활성을 Re 등의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 7mM ABTS(in water)와 2.4mM \( \mathrm{K}_{2} \mathrm{O}_{8} \mathrm{~S}_{2} \) 동량을 흔합 후 실온, 암소에서 12 시간 방치하여 라디칼의 생성을 유도한 후 ABTS 라디갈 용액을 희석하여 \( 734 \mathrm{~nm} \) 에서 흡강도 값이 0.6-0.7 정도가 되도록 회석하여 사용하였다. 희석한 ABTS 라디칼 용액 \( 100 \mu \mathrm{L}\)와 생약 추출액 \( 50 \mu \mathrm{L} \) 을 혼합하여 실온에서 7 분간 반응시킨 후 \( 734 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 이때 대조물질로는 BHA를 사용하였으며 견과는 시료를 처리하지 않은 군에 대한 흡광도비로부터 산출하였다.</p> <h2>세포 배양 및 세포 생존율 측정</h2> <p>본 실험에 이용한 각 세포의 배양은 \( 10 \% \) fetal bovine serum과 \( 1 \% \) penicillin \( (100 \mathrm{U} / \mathrm{mL}) \) 을 첨가한 Dulbeco's modified eagle's medium (DMEM) (Invitrogen Carlsbad, CA, USA) 배지를 사용하였으며, \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에 적응시켜 게대 배양하였다. 세포 생존율 측정은 Park 등의 방법에 따라 측정하였다. 각 세포주[melanoma (B16F10) (ATCC, Rockville, MD, USA), fibroblast (CCD-986sk) (ATCC, Rockville, MD, USA)]를 96 well plate에 \( 0.6-8 \times 10^{3} \) cells/well이 되게 \( 180 \mu \mathrm{L} \) 분주하고, 시료를 농도 벌로 조제하여 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24시간 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 5 \( \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 농도로 제조한 MTT 용액 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO \( 200 \mu \mathrm{L} \) 를 가하여 실은에서 15 분간 반응 시킨 뒤 microplate reader (Sunrise, Tecan Group Ltd., Mănnedorf, Switzerland)로 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p>