본 연구에서는 비타민 C의 영향을 조사하기 위해 환원형 및 산화형 비타민 C, erythorbic acid, glutathione, 3,4-dihydroxybenzoate를 첨가한 lysyl oxidase를 정제하였다. 실험재료는 DE52 이온 교환체는 증류수를 첨가한 후 상등액을 폐기하는 과정을 여러 번 반복하여 불순물인 미립자를 제거한 후 알칼리와 산으로 세정하여 glass column에 충진하여 완충액으로 평형화하여 조효소 정제에 사용하였다. 본 연구는 lysine 산화반응에 비타민 C가 미치는 영향을 실험하고 그 반응 과정을 확실히 하는 것을 목적으로 하였다.
<p>이와 관련하여 본 연구에서는 정제한 lysyl oxidase에 환원형 및 산화형 비타민 C (dehydroascorbic acid; DHA)와 그 이성질체인 erythorbic acid (ErA) 환원제glutathione(GSH) 및 3,4-dihydroxybenzoate를 첨가하여 lysine 산화반응에 미치는 비타민 C의 영향을 조사하여 그 반응 기구를 확실히 하는 것을 목적으로 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료 및 시약</h2> <p>Dehydroascorbic acid (DHA)는 Sigma Chemical Company (U.S.A.)로부터 ascorbate (AsA), erythorbate (ErA), 3,4-dihydroxybenzoate 및 glutathione (GSH)은 (주)화광순 약공업(Japan)에서, dimethylaminoethyl cellulose (DE52)는 Whatman으로부터, 소혈청알부민은 (주)생화학공업(Japan) 으로부터 각각 구입하였다.</p> <h2>DE52 이온 교환체의 조제</h2> <p>DE52 이온 교환수지 \( 20 \mathrm { g } \)에 \( 500 \mathrm { mL } \)의 증류수를 첨가하여 잘 저은 후 \( 30 \sim 40 \) 분 정치 후 상등액을 폐기하는 과정을 여러 번 반복하여 불순물인 미립자를 제거한 후 \( 0.5 \mathrm { N } \mathrm { ~NaOH } - \)물 \(- 0.5 \mathrm { ~N } \mathrm { ~HCl } - \)물 \(-0.5 \mathrm { ~N } \mathrm { ~NaOH } \)-물의 순서로 세정하였다. 알칼리와 산으로 세정한 교환체는 glass wool로 선단을 채운 glass column \( (3.0 \times 20 \mathrm { ~cm } ) \)에 충진하여 완충액 \( ( 6 \mathrm { ~M } \) Urea / \(0.1 \mathrm { ~M } \) Tris-HCl buffer, \( \mathrm { pH } 7.6 \) )으로 평형화하여 조효소 정제에 사용하였다.</p> <h2>Lysyl oxidase의 정제</h2> <p>Lysyl oxidase는 다음과 같이 조제하였다. 지방을 제거한 소의 대동맥 \( 200 \mathrm { ~g } \) 에서 추출정제한 조효소를 완충액 PBU \((6 \mathrm { ~M } \) Urea / \( 10 \mathrm { ~mM } \mathrm { ~Na } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } \) buffer, \( \mathrm { pH } ~7.8) \)에 용해하여 원심 분리에 의하여 얻어진 상등액을 \( 10 \mathrm { ~mM } \mathrm { ~Na } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } \) buffer \( \mathrm { pH } \) 7.8, PB)로 평형화한 Sephacril S-200 column에 부하하여 용리하였다. 용출액은 fraction collector를 이용하여 \( 9 \mathrm { mL } \)씩 분획하여 자외선 \( 280 \mathrm { nm } \) 에서 흡광도 0.2 이상을 나타내는 용출획분을 모아, PB로 2일간 투석하였다. 이상의 조작에 의해 얻어진 투석 내액을 효소액으로 하여 동결건조 후 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 동결보존 하였다. 효소단백질은 Lowry법에 의해 측정하였다.</p>