CHO-K1 세포배양액에서 PTGV를 효과적으로 검출한 것으로 보아, 본 논문에서 확립된 real-time PCR 시험법은 동물세포주 및 생산공정 검증에서 PTGV 오염 여부를 정성적 또는 정량적 검출 가능 시험법임을 확인했다. 이 시험법은 바이러스 제거를 위한 검증과 크로마토그래피 세척 검증에도 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 전망된다.
<h2>PTGV가 오염된 CHO 세포주에서 TaqMan probe real-time PCR을 이용한 PTGV 검출</h2> <p>확립된 TaqMan probe real-time PCR을 생물의약품 제조공정에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 PTGV를 오염시킨 CHO-K1 세포주에서 PTGV 검출 시험을 실시하였다. T-25 flask에 배양된 CHO-K1 세포에 PTGV를 인위적으로 오염시킨 후 T-25 flask에 3번 이상 계대 배양하면서 병변효과를 관찰하였다. PTGV를 오염시키지 않은 CHO-K1 세포주의 모양과 PTGV를 오염시킨 CHO-K1 세포주의 모양을 현미경으로 관찰한 결과 차이점이 나타나지 않아 PTGV가 CHO-K1 세포주에서 병변효과를 나타내지 않음을 확인하였다. CHO-K1 세포가 포함된 세포배양액 \( 4 \mathrm{ml} \)를 회수한 후 RNA를 추출하고, 확립된 real-time PCR을 활용하여 PTGV를 정량 검출하였다. 세포 배양액에서 \( 1.1 \times 10^{1} \mathrm{TCID}_{50} \) equivalent \( / \mathrm{ml} \) PTGV가 검출되었다.</p> <p>본 연구를 통해 확립된 PTGV 검출을 위한 real-time RT-PCR 시험법을 CHO-K1 세포주에서 PTGV 검출시험에 활용하였을 때, PTGV에 오염된 CHO-K1 세포주가 병변현상을 일으키지는 않았지만, CHO-K1 세포배양액에서 PTGV를 효과적으로 검출할 수 있었다. 따라서 본 연구를 통해 확립된 real-time PCR 시험법은 동물세포주 검증과 생산공정 검증에서 PTGV 오염 여부를 정성적 또는 정량적 검출할 수 있는 우수한 시험법임을 확인할 수 있었다. 생물의약품 생산공정 중 CHO 세포주에 MVM, Reo-3, BPIV-3가 오염된 사례가 있는데, MVM, Reo-3, BPIV-3가 CHO 세포주에 병변효과를 나타내는지 확인하기 위하여 인위적으로 오염시킨 경우 세포병변효과를 나타내었다. 하지만 소 혈청을 통해 오염 가능한 BVDV, BPV, BHV를 CHO 세포주에 인위적으로 오염시킨 경우 PTGV와 같이 CHO 세포주에 병변현상을 일으키지는 않았지만, CHO 세포주 배양액에서 real-time PCR로 검출되었다. 이와 같은 결과는 생물의약품 생산용 세포주가 세포병변현상을 나타내지 않는다고 해서 바이러스 오염이 없다고 단정할 수 없다는 것을 의미한다. 따라서 생물의약품의 바이러스 오염을 방지하기 위해서는 세포병변현상을 나타내지 않는 바이러스들의 검출 시험이 필요하다고 판단된다.</p> <p>Real-time PCR을 활용한 바이러스 정량 검출 방법은 크로마토그래피 공정과 같은 단백질 분리 정제 공정에서 미량의 바이러스를 실시간에 정량화 할 수 있기 때문에, 생물의약품 제조공정에서 바이러스 제거 검증 실험 시 감염역가시험과 함께 적용할 수 있는 유용한 평가기술일 뿐만 아니라, 감염역가시험으로는 분석할 수 없는 크로마토그래피 세척공정에서의 바이러스 안전성 검증에 활용할 수 있는 적절한 방법이다. 본 연구를 통해 확립된 PTGV real-time RT-PCR 시험법도 세포배양 유래 생물의약품 제조공정에서 PTGV 검출시험 뿐만 아니라 바이러스 제거 검증과 크로마토그래피 세척 검증에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.</p>