신장섬유아 세포를 96 wells 플레이트에서 1일 동안 배양한 후, 농도에 따라 AF를 12시간 동안 처리했다. 그 후, WST-1 reagent를 4시간 동안 반응시켜 ELISA에서 측정했다. 또한, 신장섬유아 세포를 80-90% 정도의 밀도가 되도록 배양하였다. 기존의 배양액을 제거한 후, LPS와 AF를 농도 별로 처리하여 6시간 동안 반응시켰다.
<h2>WST-1에 의한 세포 증식억제 조사</h2> <p>신장섬유아 세포를 96 wells 플레이트에서 1 일 동안 배양 후 12 시간 동안 AF를 농도 별로 처리하였다. AF 처리 후 WST-1 reagent를 4시간 동안 반응 시켜 ELISA \( 480 \mathrm { ~nm } \)에서 측정하였다. Cell proliferation reagent WST-1 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) 분석방법에 의해 신장섬유아 세포의 증식에 대해 AF가 미치는 영향을 평가하였다.</p> <h2>SDS-polyacrylamide gel 전기영동 및 면역학적 검색법</h2> <p>신장섬유아 세포를 \( 80-90 \% \) 정도의 밀도가 되도록 배양하였다. 기존의 배양액을 제거하고 LPS와 AF를 농도 별로 처리하여 6 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 배양액을 제거하고 세포를 스크레퍼로 모아 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 12000 \mathrm { rpm } \)으로 5 분간 원심분리를 하여 상등액을 제거하고 IPH lysis buffer [ \( 50 \mathrm { ~mM } \) Tris \( \mathrm { pH } \) 8.0), \( 150 \mathrm { ~mM } \mathrm { NaCl } \), \( 5 \mathrm { ~mM } \) EDTA, \( 0.5 \% \) NP40, \( 100 \mathrm { ~mM } \) PMSF, leupeptin \( 1 \mathrm { ~mg/ml } \), aprotinin \( 1 \mathrm { ~mg/ml } \) and \( 1 \mathrm { ~M } \) DTT]로 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 30 분 동안 용해시킨 후 \( 12,000 \mathrm { rpm } \)에서 20 분 동안 원심 분리를 하였다. 상등액으로부터 얻어진 단백질을 정량하여 \( 2 \times \)SDS-loading buffer [Trin-Cl ( \( \mathrm { pH } \) 6.8) \( 100 \mathrm { ~mM } \), Glycerol \( 20 \% \), Bromophenol blue \( 0.2 \% \), SDS \(4 \% \), Dithiothreitol \( 200 \mathrm { ~mM } \)]와 섞어 \( 98 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5 분간 가열 한 후 SDS-PAGE gel로 전기 영동하여 Immobilon-P-membrane (Millipore, Harrow, Middlesex, UK)에 이동 시켰다. Membrane은 \( 5 \% \) 탈지분유로 blocking 하여 anti-PAI-1 (Santa Cruz Biotechnology Inc., USA)과 anti-fibronectin (Santa Cruz), anti- \( \beta \)-actin (Santa Cruz)에 각각 반응시켰다. 반응 후 각각의 항체에 단일 혹은 복합 이차항체를 반응 시켜다. 항체들에 대한 발현분석은 Horseradish Peroxidase-Linked 이차항체에 의해 발현되는 enhanced chemiluminescence (ECL) Western Blot Analysis (Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, USA) 시스템을 이용하여 결과를 확인하였다.</p>