어린 참깨뿌리를 암 상태에서 3주 동안 배양하고 무게를 계측하고 실험 재료로 사용했으며, 5회 반복을 수행하여 얻어진 평균치를 표준편차로 계산했다. GC-MS 분석 방법을 사용해서 배양액으로부터 HMF의 합성 여부를 관찰하고, GC 분석 방법으로 합성된 HMF의 정량 작업을 했다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>식물재료 준비 및 뿌리배양</h2><p>참깨(Sesamum indicum L.) 종자를 \(0.5\%\) Dichloro-isocyanuric acid에 2시간 동안 살균처리를 한 다음에 멸균수에 세 번 세척하였다. \( 3 \% \) sucrose가 첨가된 MS 고체배지를 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \)에서 18분 동안 고압 멸균처리를 한 후에 이 고체배지에서 16시간 동안의 명 상태와 8시간 동안의 암 상태에서 일주일간 배양하여 생장한 어린 참깨뿌리 \( 200 \mathrm{mg} \)을 \( 500 \mathrm{ml} \) 삼각플라스크에서 옮겨 암 상태에서 배양하였으며, 식물생장조절제로 사용된 NAA의 농도는 0, 0.1, 0.5, 1.0 \(\mathrm{mg} / \mathrm{l} \)의 네 종류로 나누어서 각각 첨가되었다. Silver nitrate \( \left(\mathrm{AgNO}_{3}\right) \)가 첨가되는 처리구에서는 MS 액체배지 \( 200 \mathrm{ml} \)가 담긴 플라스크에 0, 0.5, 1.0, 1.5 \(\mathrm{mg} /\mathrm{l} \) 의 농도로 각각 첨가되었으며, 배양온도는 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \), \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 의 조건으로 암 상태에서 3주 동안 배양하여 실험 재료로 사용하였으며, 이렇게 생장한 배양뿌리의 무게를 측정하였다. HMF의 측정을 위한 실험 재료는 배양액을 Whatman No. 2 여과지로 배양을 여과한 후에 진공 냉동하여 HMF 측정 시료를 준비하였다. 각 실험 측정치는 다섯 반복을 수행하여 얻어진 평균치를 표준편차로 계산하였다.</p><h2>Gas chromatography-mass (GC-MS) 분석 방법</h2><p>배양액으로부터 HMF의 합성 여부를 확인하기 위하여 GC-MS 분석 방법이 사용되었다. 냉동 건조된 시료를 \( 0.1 \mathrm{~g} \) 정도 평량하여 원심분리용 tube에 담은 후에 \( 100 \% \) 메탄올을 \( 10 \mathrm{ml} \) 부은 다음 sonicator로 1 시간 정도 추출하였다. 이 추출액을 여과한 후에 진공증류기로 농축한 후에 \( 100 \% \) 메탄올에 재용해시켜 분석용 병에 담아 측정하였다. 시료 분석용 칼럼은 silica capillary column (DB-5; \( 30 \mathrm{~m} \times 0.25 \mathrm{~mm} \); J\(\&\)W)가 사용되었고, column oven 온도는 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분, \( 50-110^{\circ} \mathrm{C} \)에서 분당 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \)로, 그리고 \( 110^{\circ} \mathrm{C}-180^{\circ} \mathrm{C} \)에서 분당 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \), 마지막으로 \( 180-220^{\circ} \mathrm{C} \)에서 분당 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \) 온도로 column 온도를 조정하여 분석하였으며, 사용된 GC-MS는 HPG1800B GC-MS spectrometer가 사용되었고, 피크가 나온 화합물은 Willy library의 분석 data와 비교하여 HMF를 확인하였다.</p><h2>GC(Gas chromatography) 분석에 의한 HMF 측정 방법</h2><p>합성된 HMF의 정량을 위해서 GC 분석 방법이 수행되었다. 진공냉동 시료를 위에서와 동일한 방법으로 준비하였고, 시료의 분석을 위해 HP5890 series Ⅱ GC (Hewlett Packard, USA)가 사용 되였으며, 측정 조건은 다음과 같이 수행되었다. 사용된 column은 DB-5MS \( (30 \mathrm{~m} \times 0.25 \mathrm{~mm}) \) 였고, column oven 온도 \( 130^{\circ} \mathrm{C} \), injector 온도 \( 230^{\circ} \mathrm{C} \), split ratio는 \(25:1\), 그리고 detector는 FID (flame ionization detector)를 사용하였으며, detector 온도는 \( 230^{\circ} \mathrm{C} \)로 조정하여 측정하였다.</p>