폐기능 검사를 위해 BSEO 군에서 12주 동안 주기적으로 메타콜린을 흡입하여 기도 협착을 유발시킨 후, Hamelmann 등의 방법을 사용하여 기도의 과민반응(AHR)을 측정하였다. 메타콜린은 다양한 농도로 제조되어 생쥐에 흡입되며, 10분 동안 기도의 반응성을 연속적으로 모니터링하였다. 기관지 폐포 세척액은 특정 조건에서 주사기를 사용하여 수집하였고, 세포를 슬라이드 글라스 위에 도말하여 염색하고 광학현미경으로 호산구, 호중구, 림프구 등을 400배 확대하여 조사하였다.
<h2>기도의 과민반응 측정</h2> <p>\( \mathrm{BSEO} \) 군의 폐기능 검사를 위하여 12 주째 마지막 분무를 실시하고 24 시간 후에 전신 체적변동기록(Whole body plethysmographs, Biosystem XA; Buxco research system, Wilmington, NC, USA) 장비를 사용하여 Hamelmann 등의 방법에 따라 메타콜린에 의한 기도 협착을 유발시켜 기도의 과민반응(airway hyperresponsiveness; \( \mathrm{AHR} \) )을 측정하였다. 메타콜린(Sigma. USA) 수용액을 \( 3.125,6.25,12.5 \), \( 25,50 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 의 농도로 준비하여 nebulizer로 생쥐에 흡입시킨 후, 각각의 농도에 대한 기도의 반응성을 10 분 동안 연속적인 모니터링으로 측정하였다. Penh 값은 Biosystem XA software (Buxco Research System, Wilmington, USA) 를 이용하여 분석하였고, Hamelmann 등의 다음의 공식에 의하여 측정하였다.</p> <p>Penh \( = \) Pause \( \times \) PIF \( / \) PEF, Pause \( =(\mathrm{Te}-\mathrm{Tr}) / \mathrm{Tr} \)</p> <h2>혈청과 기관지 폐포 세척액 분리</h2> <p>실험 종료 후 생쥐는 \( 10 \% \) chloral hydrate (Fluka, USA)를 복강 내에 투여한 후 혈액을 심장 채혈법으로 포집하고, \( 3,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분 동안 원심분리하여 혈청을 얻었으며, \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하면서 실험에 사용하였다.</p> <p>기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar labage fluid; BALF)은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 주사기로 10% FBS DMEM 배양액을 기도에 반복하여 주의 깊게 넣고 흡입시켜서 얻었으며, 이 과정을 3 회 반복하였다. 이 폐포 세척액의 세포를 cytospin centrifuge(Cellspin, Hanil, Korea)를 사용하여 1,000 rpm에서 슬라이드 글라스 위에 도말하고 Diff-Quik로 염색한 다음 호산구, 호중구, 림프구 등의 세포수를 광학현미경 (Nicon, Japan) 하에서 400 배로 관찰하여 조사하였다.</p> <h2>비장 및 MLN 세포 분리</h2> <p>비장을 적출하여 Eagle's minimum essential medium내에서 수술용 칼과 핀셋을 이용하여 단일세포 부유액을 만들었다. 이렇게 부유한 비장세포를 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) OVA, \( 10 \% \mathrm{FBS} \), \( 5 \times 10^{5} \mathrm{M} \) 2-mercaptoethanol, \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) streptomycin 과 \( 100 \mathrm{U} / \mathrm{mL} \) penicillin이 들어간 RPMI-1640 배양액 \( 200 \mu \mathrm{L} \) 를 첨가하여 \( 5 \times 10^{5} \) cells/well의 농도로 2 일 동안 배양한 후 원심분리하여 세포를 침전시키고 배양 상층액을 수거하였다.</p> <p>종격동 림프절(Mediastinal lymph node; MLN)을 분리한 후 림프절 세포를 주사침으로 유리하고 적혈구를 제거한 후 PBS로 세척하고 \( 5 \times 10^{5} \) cells/well의 농도로 3일 동안 배양한 후 유세포 형광분석기(FACS, Becton Dickinson, U.S.A)를 이용하여 분석하였다.</p>