노화촉진모델 마우스의 성장 단계별 체중 및 장기의 변화 그리고 텔로미어의 양적 분석 실험을 위해 실험 쥐의 장기를 채취하였고 형광접합보인법 수행을 위해 조직 및 혈액 표본 및 Telomeric DNA probe를 제작했다. FISH 수행 후 Telomeric DNA 함량 등의 통계 분석을 실시했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 동물</h2> <p>노화촉진모델 마우스의 성장 단계별 체중 및 장기의 변화 그리고 텔로미어의 양적 분석을 위해 Senescence-Resistant (SAMR1) 계통과 Senescence-Prone (SAMP1) 계통 수컷 각 12마리씩 구입 공시하였다 ((주)중앙실험동물, 대전). 첫 1~2주간 사육실 환경 적응을 시킨 뒤 specific pathogen free (SPF)상태에서 온도 \( 23 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 40 \sim 60 \% \)에서 사육하였고, 체중증가량과 사료 및 음수섭취량은 매주 수요일 오전 10시에 측정하였다. 모든 실험은 부산대학교 실험동물운영위원회(IACUC)의 승인을 받아 본 위원회의 관리 지침에 준하여 수행하였다.</p> <h2>장기중량 및 채취</h2> <p>장기채취는 실험군별 각 3마리씩을 8, 18, 26주령 그리고 30주령에 채취하였다. 마우스를 개복한 후 뇌, 폐, 심장, 간, 위, 신장, 비장, 췌장, 정소를 때어내고 각 장기들의 무게를 측정한 후 \( -79^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동고에 보관하였다.</p> <h2>FISH를 위한 조직 및 혈액 표본 제작</h2> <p>실험군(SAMP1계통)과 대조군(SAMR1계통)의 백혈구 세포 표본의 제작은 실험구별 각 3마리의 심장으로부터 약 500\( ~\mu \mathrm{l}\)의 혈액을 채취하여 백혈구만 순수 분리하였고, 이러한 혈액 세포들은 \( 0.06 \mathrm{~M} \) \( \mathrm{KCI}\)용액을 이용하여 실온에서 15분간 저장 처리하였다. 저장처리가 끝나면 혼합된 고정액(3 methanol : 1 acetic acid )을 10방울정도 첨가한 후 원심분리 시키고, 상기 고정액을 이용하여 2회 반복 처리 후 슬라이드 표본을 제작하였다.</p> <h2>Q-FISH</h2> <h3>Telomeric DNA probe 제작</h3> <p>텔로미어 접합 특이 probe 제작을 위하여 (CCCTAA)\(_7\)으로 구성된 42mers 단일 oligomers를 primer로 이용하여 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 수행하고, 증폭된 산물을 PCR-DIG Probe Synthesis Kit (Roche, Mannheim, Germany)를 이용하여 digoxigenin labeling을 하였다.</p> <h3>FISH</h3> <p>본 연구에서 수행한 형광접합보인법(fluorescence in situ hybridization; FISH)은 먼저 슬라이드 표본을 RNase (Sigma-Aldrich) 처리 후 Hybridization 용액(\(13 ~\mu \mathrm{l}\) formamide, \( 5 ~\mu \mathrm{l} \) hybridization buffer, \( 2 ~\mu \mathrm{l} \) \((100 \mathrm{~ng}/ \mu\mathrm{l}\), human telomeric DNA probe; Roche)을 떨어뜨리고 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 변성(denatura-tion)하고 \( 38.5^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 접합(hybridization)시켰다. 접합 후 슬라이드를 \( 2 \times \) SSC로서 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 처리하고 PN buf-fer \((0.1\%\) sodium phosphate, \( 0.1 \% \) Nonidet P-40; Roche)로 2분간 처리하였다. 형광 접합 탐지를 위하여 P-4i-digox-igenin-fluorescein (FITC; Roche)으로 \( 38.5^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시키고 PN buffer로 세척한 후 암소에서 건조시켰다. 배경염색은 propidium iodide solution (PI; Sigma-Aldrich)을 이용하였으며 형광 접합 발현 양상은 PI와 FITC 파장대의 겸용 필터를 부착한 형광현미경(Model AX-70 with WIB filter, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.</p> <h3>Telomeric DNA 함량 분석</h3> <p>처리된 슬라이드를 형광현미경으로 관찰한 후 100배의 대물렌즈 하에서 평균 5개의 간기 핵을 한 프레임으로 촬영하고 개체 당 최소 100개 이상의 세포에 대하여 이미지 분석 프로그램(Image analyzer program, MetaMorph, UIC, Pennsylvania, USA)을 이용하여 핵 대비 telomeric DNA 분포량을 계산하였다.</p> <h2>통계 분석</h2> <p>노화촉진 마우스의 성장 단계별 조직 및 체중의 변화량과 세포내 텔로미어 함량을 비교 분석하기 위하여 SAS 통계 패키지(ver, 11.0, USA)를 이용하였고, 성장 단계별 조직 및 체중의 변화량은 T-test, 텔로미어 함량 분석은 GLM/Duncan 법에 의해 \( \mathrm{p}<0.05 \)의 유의 수준에서 유의성 검증을 수행하였다.</p>