본 연구에서는 소나무잔나비버섯의 균주를 한국농생명과학연구정보센터에서 분양받아 PDA 배지에 접종하여 \(25^{\circ}\mathrm{C}\)에 7일 동안 배양하고 \(4^{\circ}\mathrm{C}\) 냉장고에 보관하였으며, CVM, CDM, LEM, MCM, MYGM, PDA, YM, LPM, YSM 배지로 laccase의 생산성 비교를 실시하였다. Laccase의 효소활성은 Ullrich 등의 방법을 인용하여 측정하였고, 효소활성을 확인하기 위하여 \(10\%\) native \(\mathrm{PAGE}\)에 의한 \(\mathrm{ABTS}\) 활성염색법을 수행하였고, 효소활성에 대한 \(\mathrm{pH}\)의 영향을 조사하기 위해 \(0.1\mathrm{M}\) 글리신 완충용액 \((\mathrm{pH}1.5-3.0), 0.1\mathrm{M}\)구연산나트륨 완충용액\((\mathrm{pH}\)3.0-5.0), \(0.1\mathrm{M}\) 인산나트름 완충용액 \((\mathrm{pH}\)5.0-8.0)을 사용하여 효소활성을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주</h2> <p>본 연구에서 사용된 소나무잔나비버섯의 균주(MKACC 54347)는 한국농생명과학연구정보센터에서 분양받았으며, potato dextrose agar(PDA, Difco. Lab.) 배지에 접종하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 상에서 7일 동안 배양한 후 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 냉장고에 보관하였으며 약 1개월마다 계대배양하였다.</p> <h2>시험배지 및 균사배양</h2> <p>F. pinicola 균사체로부터 laccase의 생산성 비교를 위해 Coriolus versicolor medium(CVM), Czapex Dox medium (CDM), Lentinus edodes medium(LEM), mushroom complete medium(MCM), malt yeast glucose medium(MYGM), potato dextrose medium(PDM), yeast malt extract medium (YM), laccase production medium(LPM) 및 YpSs medium (YSM)을 사용하였으며, 각 배지의 조성은 Table 1 에 나타내 었다. F. pinicola를 \( \mathrm { PDA } \) 평판배지 상에 접종하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 7일 동안 배양한 후 한천배지 상의 균사를 직경 \( 5 \mathrm { ~mm } \) 의 cork borer로 agar plug를 만들어 각각의 액체배지 \( 100 \mathrm { ~mL } \) 에 5 개씩 접종하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 9 일간 \( 80 \mathrm { rpm } \) 으로 진팅배양 하였다. 탄소원, 질소원, 인산원 및 무기질원 등의 영양원에 따른 효소 생산성 관찰을 위하여 복합배지 중 가장 높은 효소 활성을 나타내는 \( \mathrm { MCM } \) 의 조성으로부터 해당 영양원을 제거하고 \( 2 \% \) 탄소원, \( 0.4 \% \) 질소원, \( 0.05 \% \) 인산원 및 무기질원을 각각 첨가하여 실험하였다. 실험에 사용한 모든 배지는 \( 121 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 15 분 동안 멸균하여 사용하였다.</p> <h2>효소 활성 측정</h2> <p>Laccase의 효소활성은 Ullrich 등의 방법을 인용하여 측정하였다. Laccase의 활성 측정을 위한 조효소액으로 \( F \). pinicola의 배양액을 \( 8000 \mathrm { rpm } \) 에서 20 분간 원심분리한 상등액을 사용하였으며, laccase 활성은 \( 2 \mathrm { mM } \mathrm { ABTS } \) 를 기질로 사용하여 \( 100 \mathrm { mM } \) 아세트산나트룸 완충용액 \( ( \mathrm { pH } 3.0) \) 상에서 효소와 반응시켜 생성되는 양이온 라디칼을 \( 420 \mathrm { ~nm } ( \varepsilon = \) \( \left .36,000 \mathrm { M } ^ { -1 } \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \) 에서 초기 3분 동안 촉정하였다. 효소활성의 단위는 분당 \( 1 \mu \mathrm { mole } \) 의 기질을 산화시키는 효소의 양을 1 unit( \( ( \mathrm { U } ) \) 로 정의하였다.</p> <h2>Activity staining</h2> <p>배양액 중의 효소활성을 확인하기 위하여 \( 10 \% \) native \( \mathrm { PAGE } \) 에 의한 \( \mathrm { ABTS } \) 활성염색법을 수행하였다. 전기영동 한 \( 10 \% \) 겔을 \( 0.5 \mathrm { M } \) 구연산나트륨 완충용액 ( \( \mathrm { pH } 3.0) \) 에 10 분 동안 방치 한 후 동일한 완충용액으로 제조한 \( 2 \mathrm { mM } \mathrm { ABTS } \) 용액과 상온에서 20 분 동안 반응시켜 효소 활성을 나타내는 띠롤 확인하였다.</p> <h2>최적 \( \mathrm { pH } \) 와 최적 온도</h2> <p>효소활성에 대한 \( \mathrm { pH } \) 의 영향을 조사하기 위해 \( 0.1 \mathrm { M } \) 글리신 완충용액 \( ( \mathrm { pH } 1.5-3.0), 0.1 \mathrm { M } \) 구연산나트륨 완충용액 \( ( \mathrm { pH } \) 3.0-5.0), \( 0.1 \mathrm { M } \) 인산나트름 완충용액 (pH 5.0-8.0)을 사용하여 효소활성을 측정하였다. 효소활성에 대한 온도의 영향은 효스액의 반응온도를 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 90 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 \( 5 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 간격으로 변화시키며 활성도롤 촉정하였다.</p>