항산화물질에 의해 유도되는 hPrx 6의 반응성에 대한 다양한 확인을 진행하기 위해 hPrx6 promoter, luciferase 그리고 SV40 terminator를 결합시켜 hPrx 6/Luc 벡터를 제작하였고, 제한효소 절단과 염기서열 분석을 이용하여 이 벡터가 이전에 보고된 서열과 염기서열이 같음을 확인했다. 반응성에 대한 확인 결과 제조된 벡터는 세포내에서 안정적으로 작용하고 항산화물질에 의해 효과적으로 반응하였으며, RT-PCR 방법은 4가지 항산화추출물에 의해 유도되는 hPRx 6 mRNA의 반응을 정확히 반영하지 못했고, 항산화물질에 의해 유도되는 반응은 세포 내 hPrx 6 유전자의 발현보다 hPRx 6/Luc 벡터에 의한 측정이 정량적으로 우수했다. 또한 KWG, KRG, RLP는 SOD 활성을 증가시킴에 반해 LP는 거의 효과가 없었으며, 이러한 추출물의 SOD 활성은 hPrx 6/Luc 벡터의 반응성과 유사하게 나타났다.
<h1>결 과</h1> <h2>hPrx 6/Luc 벡터의 제조 및 확인</h2> <p>항산화물질에 의해 유도되는 hPrx 6의 반응성을 정량적인 평가에 적용 가능한 형질전환마우스를 제조하기 위한 벡터로 사용될 hPrx 6/Luc 벡터는 hPrx6 promoter, luciferase 그리고 SV40 terminator를 결합시켜 제작하였다. hPrx 6는 항산화효소로 작용하기 때문에 이들 promoter 부위에는 AP-1-C, TBP, Nrf2 반응 element 등과 유사한 염기서열이 각 각 1개씩 포함되어 있다. hPrx6 promoter 단편은 NCI-H460 세포의 genomic DNA를 분리하여 long-PCR 방법으로 증폭하여 1,496-bp 단편을 agarose gel에서 전기영동하여 확인하였으며, pTransLucent \( { }^{\mathrm{TM}} \) Reporter 벡터에 삽입하여 hPrx 6/Luc 벡터를 완성하였다. 제조된 hPrx/6Luc 벡터는 제한효소 절단과 염기서열 분석을 이용하여 염기서열이 이전에 보고된 서열과 동일함을 확인하였다.</p> <h2>hPrx 6/Luc 벡터의 항산화물질에 대한 반응성 확인</h2> <p>KWG, KRG, LP, RLP는 세포 혹은 실험동물에서 우수한 항산화능을 갖고 있는 추출물로 알려져 있기 때문에 Prx 6 반응 항산화물질 검색시스템 개발에 적용하였다. 제작된 hPrx 6/Luc 벡터의 세포내 안정적 발현과 항산화물질에 대한 반응성을 신속히 평가하기 위해, hPrx 6/Luc 벡터를 NCl-H460 세포에 transfection한 후 4가지 추출물을 처리하여 luciferase activity를 측정하였다. NCI-H460 세포에서 trans-fection efficiency는 약 \(57\%\)임을 pEGFPC-1 벡터를 이용하여 확인하였다(Data not shown). 그 결과, vehicle 그룹에 비하여 4가지 추출물을 처리한 모든 그룹에서 높은 luciferase activity를 나타내었다. 특히, KRG와 LP는 가장 높은 activity를 나타 내었으며, KWG와 RLP는 상대적으로 낮은 activity를 나타내었다. 이들 추출물 중에서 RLP를 농도 별로 처리하여 농도의존적 변화를 유발하는 지를 관찰하였다. 그 결과, 비록 \( 25 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 처리그룹에서 activity가 상대적으로 높지만, 전체적으로 농도의존적으로 activity가 증가하였다. 이러한 결과는 제조된 hPrx 6/Luc 벡터는 세포내에서 안정적으로 작용하고, 항산화물질에 의해 효과적으로 반응함을 제시하고 있다.</p> <h2>hPrx 6/Luc 벡터와 hPrx 6 mRNA의 반응성 차이 관찰</h2> <p>항산화추출물에 대한 hPrx 6/Luc 벡터와 hPrx 6 mRNA 의 반응성의 차이를 확인하기 위하여, hPrx 6/Luc transfection된 세포에 각 물질을 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 로 24시간 동안 처리하여 hPrx 6 mRNA 의 발현을 RT-PCR을 이용하여 측정하고, 이를 luci-ferase 활성과 비교하였다. 먼저, Prx 6 mRNA의 발현은 증류수를 처리한 vehicle 그룹에서 매우 높게 관찰되었으며, 각 추출물을 처리한 세포에서도 vehicle 그룹과 유사한 hPrx 6 mRNA발현 수준을 나타내었다. 그러나 vehicle 그룹과 각 추출물 처리그룹 간의 유의적인 차이는 없었다. 또한, 처리한 추출물의 농도에 따른 변화를 관찰하기 위하여, RLP를 농도 별로 처리한 후 hPrx 6 mRNA 의 변화를 관찰하였다. 그 결과, RLP의 농도에 의존적이지 않지만 \( 25 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 이상 처리한 집단에서 유의적으로 hPrx 6 mRNA발현이 증가되었다. 이러한 결과는 RT-PCR방법이 4가지 항산화추출물에 의해 유도되는 hPrx 6 mRNA의 반응을 정확히 반영하지 못함을 제시하고 있다. 더불어, 항산화물질에 의해 유도되는 반응은 세포 내에 hPrx 6 유전자의 발현에 의해서보다는 hPrx 6/Luc 벡터에 의해 측정하는 것이 정량적 측정면에서 우수한 방법임을 제시하고 있다.</p> <h2>hPrx 6/Luc 벡터와 SOD 활성의 반응성 차이 관찰</h2> <p>마지막으로, 항산화물질에 의한 hPrx 6 /Luc 벡터의 반응성 과 SOD 활성의 차이를 관찰하기 위해, 4가지 추출물을 hPrx 6/Luc transfection한 세포에 추출물을 각각 처리한 후, SOD 활성을 측정하고 이를 hPrx 6/Luc벡터의 반응성과 비교하였다. SOD는 superoxide를 oxygen과 hydrogen peroxide로 분해시키는 효소로서 oxygen에 노출된 모든 세포에서 항산화 방어작용의 수행에 중요하다. 그 결과, 비록 물질 별로 증가량의 차이는 있었으나 KWG, KRG, RLP는 vehicle 그룹에 비해 SOD 활성을 증가시키는 효과가 있었으며, LP은 거의 효과가 없었다. 특히, SOD 활성은 KRG, RLP를 처리한 그룹에서 유의적으로 높은 증가를 나타내었다. 따라서 이러한 결과는 비록 LP의 효과는 적지만, 다른 3가지 추출물은 SOD활성을 증가시키는 효과가 우수함을 제시하고 있다. 또한, 이러한 추출물의 SOD 활성은 일부 차이는 있지만 hPrx 6/Luc 벡터의 반응성과 유사하게 나타남을 제시하고 있다.</p>