Lansberg의 자외선 감수성 변이체에서 고리를 채취하여 얻은 mutant에 수분하여 \( \mathrm { F } _ { 1 } \) 잡종을 얻고, 이를 자가교배하여 \( \mathrm { F } _ { 2 } \)를 얻는다. 잎표면의 trichome을 판별 기준으로 사용하며, \( \mathrm { F } _ { 2 } \)의 분리는 trichome의 유무와 UV-B 감수성 등을 기준으로 한다. 이렇게 분류된 샘플들은 DNA 추출 재료로 사용되며, 감수성 판단은 잎의 색깔 변화와 퇴화 시기를 기준으로 한다. DNA 분리는 Ausbel 등의 방법을 사용한다.
<h2>교배실험</h2> <p>Arabidopsis종자는 Lansberg의 경우 영국 Nottingham의 Arabidopsis stock center로부터, uvs는 California State University, Fullerton의 Dr.Lois로부터 공급받았다. Growth chamber에서 재배하며 이때의 온도는 \( 23 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 하고 빛은 두 종류의 형광들을 사용하여 50 Ei m-2 sec-1 과 250Ei m-2 sec-1의 조건으로 조사하였다. UV-B 조사를 위해서 fluorescent ultraviolet lamp를 사용하였으며 이때 lamp 를 cheese cloth로 한두겹 둘러싸고 UV-C를 차단시키게 하 여 cellulose acetate plastic 판을 통과시켜 UV-B만을 조사 하였다. UV-B 조사는 정상 형광등의 빛과 같이 하고 조사 량은 0.1 혹은 \( 0.15 \mathrm { w } / \mathrm { m } ^ { 2 } \) 이 되게 하였다.</p> <p>자외선의 감수성에 따른 재료를 얻기 위한 교배는 uvs가 수분하기전에 Lansberg로부터 pollen을 채취하여 mutant의 암술에 수분시켜 잡종 \( \mathrm { F } _ { 1 } \) 을 얻었다. \( \mathrm { F } _ { 1 } \) 표현형이 Lansberg의 잎표면에 있는 trichome이 우성유전을 하기 때문에 이를maker로 하여 판별하였다. \( \mathrm { F } _ { 2 } \) 는 \( \mathrm { F } _ { 1 } \) 을 자가교배시켜 얻고 \( \mathrm { F } _ { 2 } \) 의 분리는 trichome을 가진 것과 가지지 않은 것, UV-B에 대하여 감수성을 나타내는 것과 나타내지 않는 것 등을 기준으로 4 가지로 분류하고 이들로부터 잎을 채취하여 DNA 추출재료로 사용한다. UV-B에 대한 감수성의 판단은 잎의 색깔변화와 퇴화시기를 기준으로 하였다. 즉 자외선은 조사한 후 일주일이내에 뚜렷한 퇴화 및 죽게되는 것을 나타내면 감수성인 것으로 2주이상 뚜렷한 변화가 없으면 저항성인 것으로 하였다. 1~2주 사이에 부분적인 변화를 보이다가 회복 혹은 계속적으로 일부손상을 나타내는 것은 hetero 로 하였다.</p> <h2>DNA분리 및 PCR</h2> <p>DNA분리는 Ausbel 등의 방법을 사용하였다. liquid nitrogen을 사용하여 채취 즉시 잎을 마쇄시키고 이를 ext-raction buffer \( (100 \mathrm { mM } \) Tris \( \mathrm { pH } 8,50 \mathrm { mM } \) EDTA \( \mathrm { pH } 8, 500 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } , 10 \mathrm { mM } \) mercaptoethanol 및 \( 20 \% \) SDS첨가)에 넣은 다음 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분간 incubation시키고 \( 5 \mathrm { M } \) 의 potassum acetate를 첨가한다. \( 0 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분간 처리한 다음 \( 15000 \mathrm { ~g } \) 네서 10 분간 원심분리하고 상등액을 새로운 tube에 옮겼다. 여기에 isopropyl alcohol과 \( 3 \mathrm { M } \) sodium acatate를 첨가하고 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분이상 보관하였다가 \( 10000 \mathrm { ~g } \) 에서 15 분간 원심 분리하고 상등액을 제거한 다음 \( 50 \mathrm { mM } \) Tris \( \mathrm { pH } 8.0,10 \mathrm { mM } \) EDTA용액에 침전물을 녹였다. 이를 \( 15000 \mathrm { ~g } \) 에서 5 분간 원심분리하고 상등액을 \( 3 \mathrm { M } \) sodium acetate와 ethanol(1:22)용 액에 섞고 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분이상 보관하였다가 \( 10000 \mathrm { ~g } \) 에서 5 분간 원심분리하여 DNA를 수거하였다.</p>