또한, laccase 유전자의 primer를 이용한 PCR 반응에서 wild-type의 담배 (Panel B; Lane 4)에서는 예상되는 \( 1.6 \mathrm { ~kb } \)의 밴드가 나타나지 않았으나 형질 전환 식물체 (Panel B; Lane 3, 5) 모두에서는 예상되는 \( 1.6 \mathrm { ~kb } \)의 PCR product를 확인할 수 있었다. Particle bombardment을 사용하여 RMOP 배지에 치상된 담배 잎을 bombarding하고, 6-7주 동안 배양하여 6개의 개체를 확보하고, 계대배양을 통해 homoplasmy를 유도하고 발근배지로 순화하여 형질전환 식물체를 검정하였다.
<p>한 후, particle bombardment를 이용하여 RMOP 배지에 치상된 담배 잎에 bombarding하였다. 1-2개의 절편이 치상된 plate 20 개를 준비하여 형질전환을 수행하였다. Bombarding한 담배 잎을 2 일간 배양 후 \( 5 \times 5 \mathrm { ~mm } \) 크기로 절단하여, RMOP sp 선발배지에서 6-7주 동안 배양하였고, 6개의 개체를 확보 하였다. 확보된 6개체를 계대배양 하면서, 정상적으로 자라는 3 개 line을 선발하였다. 선발된 line의 개체를 3-4번의 계대배양으로 homoplasmy를 유도한 후 발근배지 (MS 배지, \( 500 \mathrm { ~mg } / \mathrm { L } \) spectinomycin \( \mathrm { pH } ~5.8 \))를 거쳐 토양 순화를 하였다(Figure 2).</p> <h2>형질전환체 검정</h2> <h3>PCR 분석</h3> <p>발근배지로 옮겨진 식물체의 잎에서 genomic DNA를 추출하여 2개의 primer set으로 PCR 분석을 수행하였다. 먼저, P1 primer (chloroplast genome seqeunce: 5'-AATCGCTA GTA ATCGCCGG-3')와 P2 primer(aadA sequence: 5'-AATCAATATCACTGTGTGGC-3')를 이용하여 형질전환 벡터의 도입부분이 엽록체 genome으로 도입되었는지를 확인하였고, P3 primer (laccase 5' sequence)와 P4 primer (laccase 3' sequence)를 이용하여 laccase 유전자의 도입을 확인하였다 (Figure 3).</p> <p>엽록체 genome과 aadA 유전자의 primer를 이용한 PCR 반응에서 wild-type의 담배 (Panel A; Lane 2)에서는 예상되는 \( 1.7 \mathrm { ~kb } \)의 밴드가 나타나지 않았으나 형질 전환 식물체 (Panel A; Lane 3-5) 모두에서는 예상되는 \( 1.7 \mathrm { ~kb } \)의 PCR product를 확인할 수 있었다.</p> <p>Laccase 유전자의 primer를 이용한 PCR 반응에서, 형질전환 식물체 중 하나인 CTVL4 (Panel B; Lane 4)에서는 예상되는 \( 1.6 \mathrm { ~kb } \)의 밴드가 확인되지 않았고, wild-type에서 확인된 복수의 희미한 비특이 밴드 (non-specific band)가 검출되었다. 반면 다른 형질전환 식물체인 CTVL2, CTVL6 (Panel B; Lane 3, 5)에서는, 대조 플라스미드 (Panel B; Lane 2)에서 확인된 laccase 유전자 크기인 \( 1.6 \mathrm { ~kb } \)의 밴드가 확인되었다. 따라서 형질전환 식물체 CTVL2, 4, 6 모두 목표 유전자가 엽록체 genome에 도입된 것을 확인하였지만, 형질전환 식물체 CTVL4의 경우는 laccase 유전자 도입이 정상적으로 이루어지지 않은 것으로 사료된다.</p> <h2>Southern lot</h3> <h3> <p>Laccase 유전자의 담배 엽록체 도입과 homoplasmy의 확인을 위해서 Southern blot을 수행하였다. Southern blot 분 에 사용한 DNA는, 발근배지로 옮겨진 식물체의 잎에서 추출한 genomic DNA를B Gl제한효소로 digestion한 후 이용하였고, Southern blot 분석에 이용한 probe는 wild-type 식물체의 genomic DNA를 template로 하여, \( \operatorname { trnI } \) 와 \( \operatorname { trnA } \) 유전자의 sequence를바탕으로 제작한 primer로 증폭한 PCR product를 방사선 동위원소로 labeling 하여 이용하였다.</p>