Western 분석은 옥수수 뿌리 끝으로 부터 추출한 total protein을 이용하였으며 ECL-solution으로 X-ray film을 현상하여 Western signal을 검출하였다. 다음으로 옥수수 뿌리 및 굴중성 측정은 각각 \(3\)일간 키운 옥수수와 \(2\)일된 옥수수의 원뿌리가 이용되었으며, 굴중성 측정에는 디지털 영상측정 장치와 ITPro\( ^{\mathrm{TM}} \) 프로그램이 이용되었다. 마지막으로 옥수수 뿌리의 IAA 측정은 fluorescence detector를 통해 진행되었다.
<h2>Western 분석</h2><p>옥수수 뿌리 끝으로부터 total protein을 추출하여 \( 50 \mu \mathrm{g} \)을 SDS-PAGE \( (8 \%) \)로 분리한 후 \( 350 \mathrm{mA} \)로 1시간 동안 Western transfer unit(HoeferTM TE-22, Amersham Bioscience, USA)를 이용하여 nitrocellulose membrane(Hybond \(^{\mathrm{TM}} \)-ECL\(^{\mathrm{TM}} \))으로 transfer하였다. 단백질이 transfer된 membrane을 1 \(\times \)TST buffer \( (50 \mathrm{mM} \) Tris-\( \mathrm{HCl}, \mathrm{pH} 8.5,150 \mathrm{mM} \) \(\mathrm{NaCl}, 0.5 \% \) Tween 20)로 1시간 blocking시켰다. 옥수수 산화효소에 특이적인 anti-peptide antibody(논문 준비중)를 1:2,000으로 1 \(\times \) TST buffer에 희석하여 1시간 동안 상온에서 처리한 후 1 \( \times \) TST buffer로 15분씩 3회 세척하였다. 2차 항체 (goat anti-rabbit IgG HRP conjugated)를 1:4,000 으로 1\( \times \) TST buffer에 희석하여 상온에서 1시간 이상 처리 후 1 \( \times \)TST buffer로 15분씩 3회 세척하였다. 그 후 ECL-solution으로 암실에서 X-ray film을 현상하여 Western signal을 검출하였다.</p><h2>뿌리 관찰 및 굴중성 측정</h2><p>뿌리의 길이는 3일간 키운 옥수수로부터 \( \mathrm{mm} \) 단위로 측정하였다.</p><p>굴중성 측정은 2일된 옥수수의 원뿌리(primary root)를 이용하였다. 어린 옥수수 식물을 수평으로 고정하기 위하여 사각 petridish의 접시와 뚜껑에 대칭되도록 양편으로 원형의 스티로폴을 부착하였으며, 스티로폼 사이에 발아 중인 옥수수의 열매를 넣고 뚜껑을 닫으면 스티로폴에 의해 발생하는 약한 압력에 의하여 옥수수 전체가 고정되도록 고안하였다. 사각 petridish 내분에는 수분에 적신 종이수건을 넣어두고, 전체 petridish를 틀에 고정한 후 물이 담긴 용기에 넣어 측정기간 동안 상대습도가 포화되도록 유지하였다. 측정 시작 시점까지는 식물체를 수직으로 유지하다가 일제히 수평으로 배치하였고, 매 시간 디지털 영상측정 장치로 촬영하여 ITPro\( ^{\mathrm{TM}} \) 프로그램(Sometech, Korea)으로 각도를 측정하였다. 각도는 최초 수평 위치를 \( 180^{\circ} \)로 표시하였으며 중력방향을 \( 90^{\circ} \)로 표시하여 굽어지는 정도를 표시하였다.</p><h2>HPLC를 이용한 IAA 측정</h2><p>IAA 측정은 기본적으로 Kim 등의 방법을 따랐다. 옥수수 뿌리 끝 \( 1 \mathrm{cm} \) 부위를 절단하여 internal standard로 indole-3-propionic acid(IPA)를 가한 후(\(10 \mathrm{~nm} / \mathrm{g}. \mathrm{f}. \mathrm{w}. \)) 막자사발을 이용하여 \( 100 \% \) 메탄을로 추출하였다. 세포 잔유물을 원심분리하여 (\(16,000 \mathrm{~g} \times 10 \mathrm{~min}, 4^{\circ} \mathrm{C}\)) 제거하고 상청액을 새로운 용기에 옮겨 감압 건조하여 농축하였다. 농축한 시료를 \( 10 \% \) 메탄올 \( 1 \mathrm{ml} \)에 희석한 다음 C18 cartridge에 loading하고, \( 20 \% \) 메탄올 \( 1 \mathrm{ml} \)로 세척한 후 \( 70 \% \) 메탄올 \( 1 \mathrm{ml} \)로 용리하였다. \( \mathrm{pH} \)를 낮게 유지하기 위하여 상기한 모든 용액에는 \( 0.3 \% \) 초산을 포함시켜 사용하였다. C18 cartridge를 통해 얻은 시료 중 일부를 역상인 RP-C18 column (Apollo C18, \(5 \mu \mathrm{m} \), Alltech, USA)을 장착한 HPLC system (Waters 600E)으로 분석하였으며, 아세토니트릴을 이용하여 isocratic 조건에서 용리하였다 (용액 A: \( 0.3 \% \) 초산이 포함된 \( 10 \% \) 메탄올 용액, C: \( 100 \% \) 아세토니트릴 용액; 0-25분: A용액 \( 30 \% \), C용액 \(70\% \)). 용리되는 IAA와 IPA는 emission \( 360 \mathrm{nm} \)의 형광(excitartion at \( 282 \mathrm{nm} \))을 fluorescence detector(Waters 470)를 이용하여 추적하였으며, 표준 시약과 비교하여 그 위치를 확인하였다.</p>