임신 후 15일 경과한 EBD KO 쥐와 정상 쥐의 태아 뇌를 적출하여 NeuroCult NSC Basal Medium에서 신경세포를 배양하였다. 또한, 두 종류의 쥐 뇌에서 전체 RNA를 TriZol을 이용하여 분리하고, RNeasy Mini Kit과 DNase 처리를 통해 RNA를 정제하였다. 또한 각 연령대의 쥐 뇌에서 Phosphosafe extraction reagent와 protease-inhibitor cocktails를 이용하여 단백질을 추출하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>신경세포 배양 및 약품 처리</h2><p>EBD KO와 정상 쥐 각각에서 임신 후 15일 경과한 태아쥐의 뇌를 적출하고 NeuroCult NSC proliferation supple-ments (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada)와 human epidermal grow th factor (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)가 함유된 NeuroCult NSC Basal Medium (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada)에서 신경세포(Neurosphere)를 배양하였다. 이후 \( 100 \mu \mathrm{M}\) \(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 를 처리하고 24시간 경과 후 대조군에 \( 4 \mathrm{mM}\) N-acetyl-L-cysteine (Sigma, Saint Louis, MO, USA) 을 처리하고 24시간 경과 후 실험에 사용하였다.</p><h2>Reat-time PCR 분석</h2><p>EBD KO 쥐와 정상 쥐의 뇌를 적출하여 TriZol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 전체 RNA 를 분리하였고 RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)과 DNase 를처리하여 RNA를 정제하였다. 이후 SuperScript Ⅲ first-strand synthesis system (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 역전사효소를 처리하고 정량한 후, 각 시료별로 \( 10 \mathrm{ng} \)의 전체 RNA와 RNASYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 혼합 한 뒤, neurogranin primer를 통해 ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 통해 real-time PCR 을 수행하였다. 얻어진 결과는 ABI Prism Software ver-sion 1.01 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 통해 분석하였고 최종결과는 \( \beta \)-actin과 비교하여 정량분석을 실시하였다. 각각 3회의 반복실험을 통해 얻어진 실험결과는 평균±표준편차로 표기하였고, 통계적 유의성 검정은 Student's t-test를 통해 실시하였으며, p 값이 0.05 미만일 경우 통계적으로 유의하다고 판단하였다.</p><h2>Western blot 분석</h2><p>각 연령대 별로 쥐의 뇌를 적출하여 단백질 추출용 용해액인 Phosphosafe extraction reagent (EMD Biosciences, San Diego, CA, USA)와 protease-inhibitor cocktails (Sigma, SaintLouis, MO, USA)를 섞고 조직파쇄기를 통해 단백질을 추출하였다. 배양된 신경세포는 PhosphoSafe extraction reagent(EMD Biosciences, San Diego, CA, USA)와 섞은 뒤 얼음에서 1시간 반응시켜 단백질 추출물을 얻었다. 각 시료별로 \( 20 \mu \mathrm{g} \)의 단백질을 \(4-15\%\) sodium dodecyl sulfate-polyacryamaide gel electrophoresis (SDS-PAGE) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 실시하였고 이후 전기 이동을 통해 nitrocellulose membrane (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 단백질을 이동시켜 western blot 에 사용하였다. 단백질을 보유한 membranes은 \( 5\% \) non-fat dry milk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 통해 1차 처리를 한 후 anti-neurogranin과 anti-phospho-neuro-granin 1차 항체(Millipore, Billerica, MA, USA) 및 anti-\( \beta \)-actin (Sigma, Saint Louis, MO, USA)항체를 처리하였다. 2차항체는 goat anti-rabbit IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 사용하였고 Supersignal west pico lumi-nol/enhancer solution (Pierce, Rockford, IL, USA)을 통해 단백질 밴드를 확인하였다.</p>