실험에 사용한 dps knock-out 대장균(\( \boldsymbol{\Delta} \)dps E.coli)은 유전자원센터에서 구입하였으며, 세포 내부의 DNA를 직접 이용하여 유전자 증폭과정(PCR)을 수행하기 위하여 야생형 대장균(WT E. coli)와 dps 유전자가 제거된 대장균(\( \boldsymbol{\Delta} \)dps E. coli) 세포 \( 5 \mu \mathrm{l} \)를 2차수 \( 45 \mu \mathrm{l} \)에 희석시킨 다음, 끓는 물에서 5분간 끓임으로써 세포를 파괴하고 세포내부의 DNA를 용출시켰다. M9 배지 \( 35 \mathrm{ml} \)에 야생형 대장균과 \( \boldsymbol{\Delta} \)dps E.coli 세포 \( 500 \mu \mathrm{l} \)를 최소배지 환경하에서 배양하였다. 그리고 광학분광계를 이용하여 세포의 흡광도를 \( 600 \mathrm{nm} \)에서 한 시간마다 측정하여 48시간 동안 세포생장 관찰을 실시하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 실험재료</h2> <p>본 실험에 사용한 dps knock-out 대장균(\( \boldsymbol{\Delta} \)dps E.coli)은 유전자원센터(genetic stock center)에서 주문, 구입하였다. \( \boldsymbol{\Delta} \)dps E.coli에서 dps유전자의 결손상태를 확인하기 위하여 dps유전자(ACCESSION: NP\( \_ \)41533)를 코딩하는 일부 핵산조각에 대한 염기는 Oligonucleotide Bioneer Co.에서 합성하여 사용하였다.</p> <p>유전자 증폭을 위한 Colony PCR 실험을 위한 FIRE Tag DNA Polymerase 효소는 Solid BioDyne 회사로부터 구입하여 사용하였다.</p> <h2>세포 내 유전자 증폭(Colony Polymerase chain reaction, PCR)</h2> <p>세포 내부의 DNA를 직접 이용하여 유전자 증폭과정(PCR)을 수행하기 위하여 야생형 대장균(WT E. coli)와 dps 유전자가 제거된 대장균(\( \boldsymbol{\Delta} \)dps E. coli) 세포 \( 5 \mu \mathrm{l} \)를 2차수 \( 45 \mu \mathrm{l} \)에 희석시킨 다음, 끓는 물에서 5분간 끓임으로써 세포를 파괴하고 세포내부의 DNA를 용출시키도록 한다. 유전자 증폭과정의 실험을 위하여 유전자 증폭용 프라이머(primer)는 보고된 dps유전자 서열에 근거하여 특이적으로 설계하였다. dps 유전자(504 bp)의 특이적 프라이머의 염기서열 정보는 다음과 같다. dps Forward primer (BamHI)는 5'-GGATCCATGAGCACCGCGAAACTG-3'이고, dps Reverse primer (HindIII)는 5'-AAGCCTTTATTCAATGTTGCTTTCAATAAACCACAG -3'이다. 유전자 증폭 조건은 아래와 같이 실험하였다; \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5 분간 반응, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 초 반응, \( 58^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 초와 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분을 35회 반복 반응, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분 반응하였다. 반응하여 증폭된 유전자는 \( 0.8 \% \) 아가로스 겔을 사용하여 전기영동 법에 의하여 유전자의 존재유무와 크기, 이동속도 등을 관찰, 확인하였다.</p> <h2>최소배지에서의 대장균 생장측정</h2> <p>M9 배지 \( \mathrm{CaCl}_{2}~ 0.015 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} ~6 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), \( \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} ~ 3 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), \( \mathrm{NaCl} ~ 0.5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), \( \mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl} ~ 1 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), \( \mathrm{MgSO}_{4} ~ 0.5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), Glucose \( 2.0 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 포함) \( 35 \mathrm{~ml} \)에 야생형 대장균과 \( \boldsymbol{\Delta} \)dps E.coli 세포 \( 500 ~ \mu \mathrm{l} \)를 최소배지 환경하에서 배양하며 광학분광계(photo-spec-trometer)를 이용하여 세포의 흡광도를 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 한 시간마다 측정하여 48시간 동안 세포생장을 관찰하였다.</p>