본 실험에서는 건조한 한국산 겨우살이를 분말 상태로 만든 후 추출, 여과하였으며, 겨우살이 추출물을 Minimum Essential Medium으로 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \)를 유지한 조건에서 배양한 HM3KO 인간 흑색종 세포에 처리하여 세포 생존율을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험재료 및 추출물 제조</h2><p>본 연구에서 사용된 겨우살이(Viscum album var. coloratum)는 (재)경남한방항노화연구원(Sancheong, Korea)에서 제공받아 사용하였다. 건조한 한국산 겨우살이를 믹서기로 분쇄하여 분말 상태로 만든 후 시료 중량의 10배에 해당하는 양의 \( 70 \% \) 에탄올을 추출 용매로 하여 30분간 초음파 세척기(Ultrasonic Cleaner, DAIHAN, Korea)로 추출하여 여과지로 여과하였다. 이후 회전식 증발농축기(Rotary Evaporator, EYELA, Japan)를 이용하여 농축시켜 시험용액으로 이용하였다.</p><h2>세포 배양</h2><p>HM3KO 인간 흑색종 세포는 \( 10 \% \) 우태혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco, Carlsbad, CA, USA)과 항생제(Life Technologies Corporation, Grand Island, NY, USA)가 보충된 Minimum Essential Medium (MEM; Gibco, Carlsbad, CA, USA)으로 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \)가 유지되는 조건하에서 배양하였다. 인간 멜라닌 세포 배양을 위한 모든 foreskin 샘플은 경상국립대학교병원의 윤리 위원회 승인 절차에 따라 기증자의 서면 동의 하에 얻어졌다. Foreskin 샘플을 \( 70 \% \) 에탄올에서 살균하고 잘게 자른 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤 동안 dispase로 처리하였다. 표피를 \( 0.05 \% \) 트립신 및 \( 0.02 \% \) ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA; Gibco, Carlsbad, CA, USA)을 함유하는 용액에 담가 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분 동안 두었다. 격렬한 피펫팅 후, 세포를 원심분리하여 Medium 254와 human melanocyte growth supplement (HMGS; Cascade Biologics, Portland, OR, USA)로 구성된 성장 배지에 재현탁하였다. 인간 멜라닌 세포의 1차 배양 동안 \( 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 G418 (geneticin sulfate; Duchefa, Haarlem, The Netherlands)을 성장 배지에 첨가하여 섬유아세포의 증식을 억제하였다.</p><h2>세포독성 시험</h2><p>겨우살이 추출물 처리에 따른 인간 멜라닌 세포의 세포 생존율을 측정하기 위하여 Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japan)을 사용하여 다음과 같이 측정 하였다. 인간 멜라닌 세포는 24-well plate에 \( 1 \times 10^{5} \) \(\mathrm{cell}/\mathrm{well}\)로 분주한 다음 세포 부착을 위하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 24시간 배양하였다. 그 후 추출물을 \(10, 20, 40, 80, 100\) \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도로 24시간 처리한 후에 각 well에 8CCK-8 반응액을 첨가하여 2시간 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하고 무처리군을 \( 100 \% \)로 하여 세포생존율을 계산하였다.</p>