본 연구에 사용된 배지는 \( 300 \mathrm { mM }\)의 \( \mathrm { NaCl }\)을 포함하는 고장성 용액으로 대장균에 삼투압스트레스를 유발시켜 트레할로스생산을 촉진시킬 수 있으며 IPTG를 첨가하지 않은 배양에서 생산균주가 트레할로스를 생산한 것은 배지의 고삼투성에 기인한 것으로 판단된다. IPTG는 재조합 유전자를 induction시키고 발리다마이신은 트레할라이즈의 활성을 저해하며, \( \mathrm { NaCl }\)은 삼투압 상승제로서 생산균주의 트레할로스 생산양을 증가시키는데 기여하는 핵심물질들이다. Box-Behnken design 실험계획법을 통하여 IPTG, 발리다마이신과 \(\mathrm { NaCl }\) 농도를 최적화하기 위한 실험을 진행하였다.
<p>본 연구에 사용된 배지는 \( 300 \mathrm { mM } \) 의 \( \mathrm { NaCl } \)을 포함하는 고장성 용액으로 대장균에 삼투압 스트레스를 유발시켜 트레할로스 생산을 촉진시킬 수 있다. 기존연구에서 야생형 대장균이 고장성 배지에서 약 \( 40 \mathrm { mg /l}\)의 트레할로스를 생산하였다. 따라서 IPTG를 첨가하지 않은 배양에서 생산균주가 트레할로스를 생산한 것은 배지의 고삼투성에 기인한 것으로 판단된다. 뿐만 아니라 생산균주가 함유하는 재조합 유전자의 leaky expression으로 인하여 otsBA 오페론이 소량 발현되어 트레할로스 생산에 기여하였을 것으로 판단된다. 재조합 유전자가 탑재된 \( p \operatorname { Trc } 99 A \) 벡터의 leaky expression이 몇몇 논문에서 보고되었다. 본 결과를 바탕으로 모든 배양을 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 IPTG로 induction 하며 실시하였다.</p> <h2>트레할로스 생산 극대화를 위한 IPTG, 발리다마이신 및 NaCl 농도 최적화</h2> <p>IPTG는 재조합 유전자를 induction시키고 발리다마이신은 트레할라이즈 활성 저해제이며 \( \mathrm { NaCl } \)은 삼투압 상승제로서 생산균주의 트레할로스 생산양을 증가시키는데 기여하는 핵심물질들이다. 따라서 Box-Behnken design 실험계획법을 사용하여 IPTG, 발리다마이신 및 \( \mathrm { NaCl } \) 농도를 최적화하기 위한 실험을 수행하였다. Table 2에 나타내었듯이, IPTG는 \( 0.1-1 \mathrm { mM } \), 발리다마이신은 \( 0.01-1 \mathrm { mM } \) 및 \( \mathrm { NaCl } \) 은 \( 50-450 \mathrm { mM } \) 농도 범위를 선정하였고 각각 세가지 농도 범위 \( (-1,0, + 1) \)에서 테스트를 수행하였다. 총 17개의 플라스크 실험을 수행하였는데, 중심점에서는 5회의 반복실험을 수행하여 실험의 재현성을 조사하였다.</p> <p>실험데이터를 이용하여 SAS 프로그램에서 완전 2차식으로 분석하였다. F-테스트와 분산분석 결과를 토대로 생성된 모델 방정식의 적합성을 평가하였고 그 결과를 Table 4에 나타내었다. 일반적으로 Prob > F 값이 0.05보다 작으면 모델이 유의미하다는 것을 나타내고 0.1보다 크면 보통 무의미한 것으로 간주된다. 2차식 모델의 Prob > F 값은 0.0020으로 나타나 높은 유의성을 나타내었다. 이는 ANOVA 절차에서 얻어진 모델이 적절하다는 것을 보여준다. 관측점들의 변동을 표본 회귀선들이 얼마나 잘 설명해주는가를 상대적으로 나타내는 결정계수인 \( \mathrm { R } ^ { 2 } \) 값도 \( 0.9668 \)로 높은 값을 나타내었다. 모델 방정식의 독립변수들 중에 \( \mathrm { X } _ { 1 } \)(IPTG 농도), \( \mathrm { X } _ { 3 } \)( \( \mathrm { NaCl } \) 농도), \( \mathrm { X } _ { 3 } { } ^ { 2 } \), \( \mathrm { X } _ { 1 } \mathrm { X } _ { 3 } \)가 유의미함을 나타내었고 \( \mathrm { X } _ { 2 } \)(발리다마이신 농도) 또는 이를 포함한 항은 통계적으로 무의미하였다. 이는 IPTG 농도와 \( \mathrm { NaCl } \) 농도가 트레할로스 생산에 영향을 미치는 핵심 변수인 반면 발리다마이신 농도의 영향은 크지 않음을 나타낸다. 따라서 예측 모델 방정식 수립 시 발리다마이신의 기여항을 고려하지 않았다. 이로부터 얻은 신뢰성 있는 모델 방정식은 다음과 같다.</p>