실험 결과 ME가 tyrosinase 활성을 저해하고, 인간 멜라닌 세포에 처리 시 멜라닌 함량을 감소시키는바, tyrosinase 활성과 멜라닌 합성에 직접적으로 관여한다는 것을 확인했다. 또한 ME를 처리한 HM3KO 군에서 루시퍼라이제 활성이 그렇지 않은 군보다 감소하는 것으로 보아 ME가 HM3KO 세포에서 MITF 유전자 등의 프로모터 활성 억제 효과도 보유하고 있어 해당 단백질 발현 및 색소 생성 억제를 시킬 수 있음을 확인하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>겨우살이 추출물이 색소침착에 미치는 영향</h2><p>겨우살이 추출물(mistletoe extracts, ME)에 의한 tyrosinase 저해 효과를 측정하기 위하여 tyrosinase에 의한 L-EE로신의 산화 정도를 측정하였다. Tyrosinase는 멜라닌 합성 과정에서 티로신을 DOPA로 전환하는 tyrosine hydroxylase 활성과 DOPA를 DOPA quinone으로 산화반응을 촉매하는 DOPA oxidase 활성을 가진 반응속도 제한 효소이다. ME의 tyrosinase 활성 저해 효과를 측정한 결과, tyrosinase 활성을 저해하는 것으로 나타났다. 다음 으로 세포 내 tyrosinase의 활성 저해 효과를 확인하기 위하여 먼저 ME의 농도 변화에 따른 인간 멜라닌 세포의 생존율을 확인한 결과, \( 20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 농도까지는 \( 97.4 \% \) 이상의 세포 생존율을 확인하였으나 그 이상의 농도에서 세포 독성이 나타났다. 따라서 세포를 이용한 이후 추가 실험에서는 ME가 독성을 보이지 않는 \( 20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 이하의 농도에서 실험을 진행하였다. 인간 멜라닌 세포를 ME로 처리한 결과 세포 펠릿 색상과 멜라닌 함량은 유의하게 감소하였다. 이러한 결과는 ME가 tyrosinase 활성 및 멜라닌 합성 억제 효과에 직접적으로 관여하는 것으로 사료된다.</p><h2>겨우살이 추출물이 MITF, TRP-2, TYR, MLPH 유전자 프로모터 활성에 미치는 영향</h2><p>멜라닌 생성은 생체 내 티로신으로부터 산화적 반응에 의해서 일어나는데 이때 작용하는 주요 효소는 tyrosinase이다. 하지만 최근에는 tyrosinase 뿐만 아니라 MITF, TRP-1, TRP-2 등과 같은 단백질을 이용하여 멜라닌 합성 억제에 대한 연구가 이루어지고 있다. 본 연구에서는 ME가 멜라닌 생성에 관계된 주요 유전자인 MITF, TRP-2, TYR, 및 MHPH 프로모터에 미치는 영향을 알아보기 위하여 흑색종 세포(HM3KO)에 리포터 유전자로 루시퍼라아제를 지닌 아데노바이러스를 감염시키고 ME를 처리한 후 24시간 뒤에 리포터 활성을 측정하였다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 ME (\(20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)를 처리한 HM3KO 군에서는 MITF-luc, TRP2-luc, TYR-luc, MLPH-luc의 루시퍼라아제 활성이 ME를 처리하지 않은 군보다 감소하는 것을 확인 할 수 있었다.</p><p>TRP-2는 dopachrome을 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA)으로 재배열하는 것을 촉매하는 반면, TRP-1은 DHICA를 카르복실화된 indole-quinone으로 산화시키고, 이는 결국 멜라닌으로 전환된다. Tyrosinase는 멜라닌 생성의 마스터 전사 인자인 MITF에 의해 조절 된다. 또한 TRP-1 및 TRP-2는 MITF에 의해 유도되는 주요한 멜라닌 생성 효소이다. 따라서 MITF의 억제는 tyrosinase의 발현억제를 통하여 멜라닌 색소 생성을 억제할 수 있다. 또한, Kudo 등은 황금(Scutellaria baicalensis Georgi)에서 추출한 Wogonin과 같은 O-methylated flavone이 액틴 필라멘트의 melanosome 수송과 관련된 운반 단백질인 MLPH를 분해하여 세포 내 melanosome 수송을 억제할 수 있다고 보고하였다. 따라서 ME가 HM3KO 세포에서 MITF, TRP-2, TYR 및 MLPH 유전자의 프로모터 활성 억제 효과를 가지고 있는 것으로 보임에 따라 이들 단백질의 발현 억제를 통하여 색소 생성을 억제할 수 있음을 시사 하였다.</p>