세포 배양 및 시료 처리를 위해 \( 0.5 \mu \mathrm{M} \) 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), \( 1 \mu \mathrm{M} \) dexamethasone (DEX), \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 insulin)를 처리하여 백두구 추출물에 의한 항비만 활성을 분석하였다. 세포 독성 유무 분석을 위해 세포 독성을 유발하지 않는 시료의 처리 농도를 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내 독성을 유발하지 않는 범위에서 실험했다. 3T3-L1 지방전구세포는 지방세포로의 분화하기 위해 MDI를 처리하여 유도하였다.
<h2>세포 배양 및 시료 처리</h2> <p>백두구의 항비만 활성을 세포실험계에서 분석하기 위해 항비만 활성 분석에 사용되는 대표적인 cell model system인 3T3-L1 preadipocyte를 American Type Culture Collection (ATCC, VA, USA)로부터 구입하여 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS) 및 penicillin/streptomycin이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. \( 0.5 \mu \mathrm{M} \) 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), \( 1 \mu \mathrm{M} \) dexamethasone (DEX), \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 insulin (이하 MDI)를 처리하여 ipogenesis를 유도하고 백두구 추출물에 의한 항비만 활성을 분석하였다.</p> <h2>세포 독성 유무 분석</h2> <p>항비만 활성 분석 수행 전 시료가 세포생존율에 미치는 영향을 확인함과 동시에 세포 독성을 유발하지 않는 시료의 처리 농도를 결정하기 위해 water soluble tetrazolium (WST) assay를 수행하였다. \( 1 \times 10^{5} \) cell을 24-well tissue culture plate에 분주하여 24시간 동안 부착시킨 후 시료를 농도 별로 처리하여 72 시간 동안 배양하였다. 시료 처리 후 WST 시약이 든 배지로 교체하여 한 시간 동안 반응시킨 후 multi-plate reader를 이용하여 \( 450 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었으며 독성을 유발하지 않는 농도 범위에서 이후 실험을 수행하였다.</p> <h2>Oil Red O staining을 통한 지방세포 분화 및 TG 생성 저해능 분석</h2> <p>3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화는 상기의 MDI를 처리하여 유도하였다. 12-well tissue culture plate에 well 당 \( 2 \times 10^{5} \)개의 세포를 분주하고 2 일 후 \( 10 \%\) FBS가 든 배지로 교체하였다. 2일 경과 후 MDI가 든 배지로 교체하면서 시료를 농도 별로 처리하고 2일 간격으로 총 4회 insulin과 시료를 처리하였다. 마지막 시료를 처리하고 2일 경과 후 위상차 현미경을 이용하여 지방세포 분화 정도 및 시료에 의한 분화 억제 정도를 200배 배율로 관찰하여 촬영한 후, 지방세포 분화 억제능 및 TG 생성 저해능을 Oil Red O staining을 통해 분석하였다. 지방세포 분화 및 시료 처리가 완료된 세포를 \( 1 \times \) phosphate buffered saline (PBS)로 씻어준 다음 \( 10 \% \) formalin으로 고정하고 Oil Red O staining solution을 처리한 후 30분간 염색하였다. 염색 완료 후 \( 100 \% \) isopropanol을 사용하여 염색된 지방을 추출하고 multi-plate reader를 이용하여 \( 500 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>