항균 활성 평가는 Higasi의 방법과 같이 paper disc법을 이용하였으며, 최소저해농도(MIC) 측정은 추출물을 제균한 후 단계희석법을 통해 농도별 시료를 제조하여 사용했다. 또한, \( \mathrm{pH} \)에 대한 안정성 평가는 본래의 \( \mathrm{pH} \)로 조절한 후 균 배양액을 첨가하여 최소저해농도를 측정하였고, 총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Denis assay법으로 Lee 등의 방법을 변형하여 분석하였다. 마지막으로 DPPH 유리라디칼 소거능은 Heo 등의 방법을 변형하여 분석하는 등 다양한 방법을 사용하였다.
<h2>항균 활성 평가</h2> <p>항균 활성 평가는 Higasi의 방법과 같이 paper disc법을 이용하였으며, 계대배양을 통해 활성화시킨 균은 멸균 생리식염수에 현탁하여 \( 1 \times 10^{7} ~\mathrm{CFU} / \mathrm{mL} \)의 농도로 맞춘 후 실험에 사용하였다. 주입평판법에 따라 petri dish에 균 현탁액 \( 1~ \mathrm{mL} \)를 분주한 후 용해된 고체배지를 주입하여 사용하였다. 제조된 고체배지 위에 \( 8~ \mathrm{mm} \) filter paper disc를 놓고 진공농축한 \(5 ~\mathrm{brix} \)의 시료 \( 20 ~\mu \mathrm{L} \)를 흡수시킨 후 \( 37~^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 24 \)시간 동안 배양하여 관찰하였다.</p> <p>최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 측정은 추출물을 \( 0.45 ~\mu \mathrm{m} \) filter (Whatman International, England)를 이용하여 제균한 후 단계희석법(serial dilution method)을 통해 농도별 시료를 제조하여 사용했다. \( 96 \) well plate에 희석된 시료 \( 50~ \mu \mathrm{L} \)와 \( 1 \times 10^{5}-10^{6} ~\mathrm{CFU} / \mathrm{mL} \)로 희석한 균 현탁액 \( 50 ~\mu \mathrm{L} \)를 혼합한 뒤 균주별 증식용 배지 \( 150 ~\mu \mathrm{L} \)를 넣고 \( 24 \)시간 동안 배양한 후 microplate reader (VERSAmax, Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 흡광도를 측정하였고, 균체의 성장이 억제되어 탁도로 나타나지 않는 최소의 농도를 최소저해농도(MIC)로 정하였다.</p> <h2>항균 활성의 안정성 평가</h2> <p>산과 알칼리에 대한 항균 활성의 안정성 평가를 위해 농도별 히비스커스 추출물을 \( 1 ~\mathrm{N} ~\mathrm{NaOH} \) 또는 \( 1 ~\mathrm{N}~ \mathrm{HCl} \) 수용액을 이용하여 \( \mathrm{pH} \)를 \(3, 5, 7\) 및 \(9\)로 조정한 후 \( 25~^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(3\)시간 방치하였다. 이후 본래의 \( \mathrm{pH} \)로 조절한 후 균 배양액을 첨가하여 최소저해농도를 측정함으로써 \( \mathrm{pH} \)에 대한 안정성을 평가하였다. 온도에 대한 안정성은 농도별 히비스커스 추출물을 \( 4, 25, 50 \) 및 \( 75~^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(30\)분간 방치한 후 균 배양액을 첨가하여 확인된 최소저해농도를 측정하여 확인하였다.</p> <h2>항산화 활성 평가</h2> <p>총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Denis assay법으로 Lee 등의 방법을 변형하여 분석하였다. 시료 희석액 \( 100 ~\mu \mathrm{L} \)에 folin-ciocalteu 시약 \( 50 ~\mu \mathrm{L} \)를 첨가하여 혼합한 뒤 \(4\)분 동안 반응시키고, \( 20 \% ~\mathrm{NO}_{2} \mathrm{CO}_{3} \)를 \( 1.5 \mathrm{mL} \) 가하여 \(2\)분간 방치한 후 \( 760 ~\mathrm{nm} \)의 파장에서 흡광도를 측정하였다. Chlorogenic acid를 총 폴리페놀 함량 분석의 표준물질로 선정하여 표준곡선으로부터 총 폴리페놀의 함량을 계산하였다. 총 플라보노이드 함량은 Kim 등의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 희석액 \( 0.5 ~\mathrm{mL} \)와 diethylene glycol \( 5~ \mathrm{mL} \)를 혼합한 후, \( 1 ~\mathrm{N} ~\mathrm{NaOH} \)를 \( 1 ~\mathrm{mL}\)씩 가하여 \( 37~^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(1\)시간 동안 반응시킨 후 \( 420 ~\mathrm{nm} \)의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량 계산용 표준물질은 naringin을 사용하였다.</p> <p>DPPH 유리라디칼 소거능은 Heo 등의 방법을 변형하여 분석하였다. 메탄올에 \( 0.6 ~\mathrm{mM} \)의 농도로 희석한 DPPH 시약 \( 160~ \mu \mathrm{L} \)와 희석한 시료 \( 40~ \mu \mathrm{L} \)를 혼합하여 암소에서 \(30\)분간 방치한 후 \( 515~ \mathrm{nm} \)의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 환원력은 Hazra 등의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 희석액 \( 1 ~\mathrm{mL} \)와 \( 10 ~\mathrm{mM} \) sodium phosphate 완충용액 \( (\mathrm{pH} \) 6.6) \( 1 ~\mathrm{mL} \)를 혼합한 후 \( 10 \% \) potassium ferricyanide \( 1 ~\mathrm{mL} \)를 첨가하여 \( 50~^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(20\)분 동안 반응시켰다. 반응액에 \( 10 \% \) trichloracetic acid를 \( 1 ~\mathrm{mL} \) 주입하고 원심분리(\(10,000\times \mathrm{g}\), 10분)를 하였다. 원심분리 상등액과 \( 0.1 \% \) ferric chloride를 각각 \( 100~ \mu \mathrm{L} \)씩 혼합하여 \(700 ~\mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>