비파 잎의 각 용매 추출물의 DPPH radical 소거능을 시료 농도에 따라 측정한 결과 농도가 증가할수록 활성이 높게 나왔으며, 각 추출물의 SOD 유사활성을 농도에 따라 측정한 결과는 대조군인 BHA와 BHT에 비해 높거나 비슷하게 나타났다. Polyphenol 화합물 함량은 (\mathrm{MeOH}\) 추출물에서 가장 높았으며, n-hexane 추출물이 가장 낮게 나왔다. 다음으로 시료 농도에 따른 Flavonoid 함량은 \(\mathrm{MeOH} >\mathrm{EtOAc} >\)n-hexane 순이었다. 마지막으로 생리활성물질의 분리, 정제 및 동정은 mass spectrum을 통해 분석되었으며, 분석된 화합물은 세 개이다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>DPPH radical 소거능</h2><p>비파 잎의 각 용매 추출물의 DPPH radical 소거능을 농도에 따라 측정한 결과는 Table 1에 나타낸 바와 같이 시료의 농도가 증가할수록 활성이 높게 나타났다. BHA와 BHT는 각각 \( 52.84 \sim 59.06 \% \)와 \( 61.53 \sim 63.58 \% \)의 활성을 나타내었으며 n-hexane 추출물의 경우 \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 농도에서, \(\mathrm{EtOAc}\)와 \(\mathrm{MeOH}\) 추출물은 \( 0.3 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 \( 50 \% \) 이상의 소거활성을 나타내었다. \(\mathrm{EtOAc}\) 추출물의 경우 특히 시료 농도에 따라 DPPH의 증가 정도가 컸으며 \( 0.7 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)에서는 \(\mathrm{MeOH}\) 추출물에 비해 더 높은 항산화 활성을 나타내었다. 또한 \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도에서는 n-hexane과 \(\mathrm{MeOH}\) 추출물에 비해 \(\mathrm{EtOAc}\) 추출물이 \( 93.15 \% \)로 매우 뛰어난 소거활성을 보였으며 이러한 결과는 배 등의 연구에서 비파 부위별 용매추출물에서 \(\mathrm{EtOAc}\) 추출물의 DPPH 활성이 가장 높았다는 보고와 비슷하였다. \(\mathrm{MeOH}\) 추출물은 시료 농도에 따른 DPPH 활성 정도는 크게 차이가 나지 않았으나 \( 0.3 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)에서 n-hexane 추출물과 \(\mathrm{EtOAc}\) 추출물에 비하여 더 높은 항산화 활성을 나타내었다.</p><h2>SOD 유사활성</h2><p>비파 잎의 각 용매 추출물의 SOD 유사활성을 농도에 따라 측정한 결과, Table 2에 나타낸 바와 같이, 대조군인 BHA와 BHT는 각각 \( 45.80\sim50.32 \% \)와 \(43.99\sim52.33\%\)의 활성을 나타내었으며, 비파잎의 각 용매 추출물도 이와 비슷하거나 높은 활성을 나타내었다. 특히 n-hexane 추출물의 경우 \( 0.3 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 \( 55.30\pm6.31 \% \)로 가장 높은 활성을 나타내었으나 \( 0.7 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도와 \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도에서 각각 \( 54.84 \pm 3.05 \% \)와 \( 54.97 \pm 3.34 \% \)으로 감소하여 농도의 증가에 따른 활성의 증가는 나타나지 않았다. DPPH radical 소거능과 SOD 유사활성의 결과가 일치하지 않은 것은 효소계 시스템(SOD 유사활성과 hydrogen peroxide 소거능)에서의 radical 소거능과 비효소계 시스템(hydroxyl radical과 DPPH radical 소거능)에서의 radical 소거능이 차이를 보인다는 Calliste 등의 보고와 일치하였다.</p><h2>Polyphenol 화합물 함량</h2><p>Polyphenol 화합물의 함량은 Folin-Denis법을 이용하여 Folin-Ciocalteu reagent가 알칼리 조건에서 추출물의 polyphenol성 화합물에 의해 환원된 결과 노란색에서 몰리브덴의 청색으로 발색하는 것을 원리로 분석하였다. 표준물질로 tannic acid를 이용하여 검량선을 작성하고 함량을 \( \mathrm{mg} / \mathrm{g} \)으로 나타내었다. 시료 농도와 \( 725 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도 간의 회귀방정식은 \( \mathrm{y}=0.0076 \mathrm{x}+0.008\) \(((\mathrm{y} \)는 \( 725 \mathrm{~nm} \)에서의 흡광도이며, \( \mathrm{x} \)는 시료 농도, \( \left.\mathrm{r}^{2}=0.9109\right) \)이었다. 비파 잎의 각 용매 추출물의 농도별 polyphenol 함량은 Fig. 1 과 같다. 먼저 \(\mathrm{MeOH}\) 추출물 \( 0.3 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\), \(0.7 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\), \(1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 각각 \( 59.0 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \), \( 130.2 \mathrm{mg} / \mathrm{g}\), \(188.8 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \)으로 가장 높게 나타났으며 n-hexane 추출물 \( 0.3 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\), \(0.7 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\), \(1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 각각 \( 15.9 \mathrm{mg} / \mathrm{g}\),\( 23.6 \mathrm{mg} / \mathrm{g}\), \(36.4 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \)으로 가장 낮게 나타났다.</p><p>Kim 등은 비파 잎 메탄올 추출물을 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) 농도에서 polyphenol 함량을 측정한 결과에서 \( 94.2 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \)으로 보고하여 본 결과와 유사하였다. Lee 등은 건조 조건에 따른 비파잎의 열수 추출물과 \( 80 \% \) ethanol 추출물의 polyphenol 함량을 측정하여 동결건조한 잎에 비해 생잎의 polyphenol 함량이 더 많았으며, 동결건조한 비파 잎의 열수 추출물과 \( 80 \% \) ethanol 추출물의 polyphenol 함량은 각각 \( 116.2 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \)과 \( 170.6 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) 이었고, 생잎의 열수 추출물과 \( 80 \% \) ethanol 추출물의 polyphenol 함량은 각각 \( 125.7 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \)과 \( 215.4 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \)으로 보고하였다. \(\mathrm{MeOH}\) 추출물의 polyphenol 화합물이 가장 높았으며, 가죽나무(Ailanthus altissima) 잎의 추출물에서 phenol 화합물의 함량이 \( 78.56 \sim 80.40 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \)으로 나타났다는 Lee의 결과와 비교하여 보면 비파 잎의 polyphenol 화합물의 함량이 눞은 수준임을 확인하였다.</p><h2>Flavonoid 함량</h2><p>flavonoid 화합물의 함량은 표준물질로 rutin을 이용하여 검량선을 작성하고 함량을 \( \mathrm{mg} / \mathrm{g} \)으로 나타내었다. 시료 농도와 \( 420\mathrm{~nm} \)에서 흡광도 간의 회귀방정식은 \( \mathrm{y}=0.0006 \mathrm{x}+0.0407 \) (\(\mathrm{y} \)는 \( 420 \mathrm{~nm} \)에서의 흡광도이며, \( x \)는 시료 농도, \( \mathrm{r}^{2}=0.9882 \) )이었다. 비파 잎의 용매별 flavonoid 함량은 Fig. 2에 나타냈다. 시료의 농도가 증가할수록 flavonoid 함량 역시 증가하였으며, 추출 용매 별 flavonoid 함량은\(\mathrm{MeOH} >\mathrm{EtOAc} >\)n-hexane 순이었다. Flavonoid는 페놀성 화합물의 일종이므로 각 시료의 총 flavonoid 함량은 총 페놀성 화합물과 동일한 경향을 보였으며, 이는 건조 조건 별 비파 잎의 열수 추출물과 \( 80 \% \) ethanol 추출물의 flavonoid 함량이 \( 24.9 \sim 110 \)\( \mathrm{mg} / \mathrm{g} \)으로 나타났다는 Lee의 결과와 비교하였을 때, n-hexane 추출물은 이보다 낮았으나, \(\mathrm{EtOAc}\) 추출물과 \(\mathrm{MeOH}\) 추출물의 flavonoid 함량은 보다 높은 수준임을 알 수 있었다. 또한 polyphenol 함량과 flavonoid 함량을 검토한 결과, polyphenol 화합물의 대부분이 flavonoid로 구성되어 있는 것으로 추정되었다.</p><h2>생리활성물질의 분리, 정제 및 동정</h2><p>Column chromatography에 의하여 \(\mathrm{EtOAc}\) 추출물에서 24개, \(\mathrm{MeOH}\) 추출물 30개의 분획물들로 분리하였으며, 각 분획물의 DPPH radical 소거능과 SOD 유사활성을 측정하여 활성이 가장 높았던 \(\mathrm{EtOAc}\) F7 \((526.5 \mathrm{mg}) \)과 \(\mathrm{MeOH}\) F16 \((55.5 \mathrm{mg}) \) 분획물에 대하여 GC/MS 분석을 실시하여 \(\mathrm{EtOAc}\) F7에서 화합물 1과 2를, 그리고 \(\mathrm{MeOH}\) F16에서 화합물 3의 mass spectrum을 Fig. 3-5와 같이 확인하였다. 화합물 1 은 retention time \( \left(\mathrm{t}_{\mathrm{R}}\right) \) 17.727에서 검출되었으며, 이의 mass spectrum과 library와의 비교를 통하여 화합물 1을 phytol로 동정하였다. \(\mathrm{t}_{R}\) 33.367에서 검출된 화합물 2 는 \( \beta \)-sitosterol로, 그리고 \(\mathrm{t}_{R}\) 17.186에서 검출된 화합물 3은 (-)-loliolide로 동정하였다.</p>