본문은 효모 단수체 유도 및 변이체의 영양요구성 마커 탐색 방법에 관한 것이다. 효모는 presporulation 배지에서 1일 동안, 그리고 sporulation 배지에서 5일 동안 각각 30°C에서 배양되었다. 형성된 포자의 유무는 YPD plate 도말 후에 확인되었으며, 변이체의 영양요구성 마커는 아미노산 풀을 이용해 탐색하였다. 원형질체 형성율은 Yamamura의 방법을 사용하여 계산하였다.
<h2>효모의 단수체 유도</h2> <p>효모의 단수체 유도는 presporulation 배지에서 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 1일간 배양한 후, sporulation 배지에서 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 5일간 배양하였다. 형성된 포자는 원심분리하여 균체를 회수한 뒤, \( 6.7 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } \) buffer(pH 7.8) \( 3 \mathrm { ~mL } \)에 현탁한 뒤, \( 200 \mathrm { U } / \mathrm { mL } \) lyticase(L-4025, Sigma, USA)를 처리하여 1일간 방치하였다. 초음파 세포 파쇄기(Sonosmasher, Ulsso Hitech Co., Korea)를 이용하여 포자를 분리하고 \( 8 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) streptomycin (S-9137, Sigma, USA)을 \( 0.5 \mathrm { ~mL } \) 첨가하여 1시간동안 방치하였다. 상등액을 취해 YPD plate에 도말한 후 sporulation 배지에 배양하여 포자 형성유무를 확인하였다.</p> <h2>영양요구성 변이주 제조</h2> <p>영양요구성 변이주 제조에 사용된 mutagenesis solution은 9.7 M ethylmethane sulfonate(220507, Sigma, USA) \(0.3 \mathrm { mL~ } 0.2 \mathrm { M } \) phosphate buffer(pH 8.0) \( 9.2 \mathrm { ~mL } \) 그리고 \( 40 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) glucose solution \( 0.5 \mathrm { ~mL } \) 로 제조하여 사용하였고, mutagenesis solution \( 0.2 \mathrm { ~mL } \) 에 \( 6 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) sodium thio-sulfate solution \( 9.8 \mathrm { ~mL } \) 을 첨가하여 반응을 중지하였다. 형성된 변이주의 영양요구성 marker 탐색은 amino acid pool을 이용하여 수행하였다.</p> <h2>원형질체 형성</h2> <p>효모를 \( 0.05 \mathrm { M } \) Tris-HCl(pH 7.5)로 세척한 다음, \( 0.05 \) \( \mathrm { M } \) Tris-HCl buffer(pH 7.5)와 \( 1.2 \mathrm { M } \) sorbitol(T-1378, Sigma, USA)로 구성된 protoplast buffer에 현탁하였다. 1M 2-mercaptoethanol(M-3148, Sigma, USA) \( 0.2 \mathrm { ~mL } \)을 첨가하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 15분동안 처리한 후 \( 200 \mathrm { U } / \mathrm { mL } \) lyticase를 첨가하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1시간동안 처리하였다. 원형질체 형성율은 Yamamura의 방법을 사용하여 다음 식에 의해 계산하였다.</p>