눈꽃동충하초 균사체를 이용한 실험은 경남농업기술원에서 분양받아 진행하였으며, 실험에 사용한 포도와 오이는 진주시 재래시장에서 구매했다. Ultrospec 2000으로 475nm와 540nm 파장에서 흡광도를 측정하였고, ELISA reader로 490nm에서 흡광도를 측정하여 melanin의 생합성을 측정하였다. 눈꽃동충하초 균사체를 PDA 배지에 접종하여 7일 동안 25°C에서 배양한 후, 포도와 오이즙액을 각각 47.5%씩, 감자 5%를 첨가하여 액체배지에 접종, 25일간 각각 진탕 배양하였다. 마지막으로 배양이 완료된 배양액은 13000rpm에서 10분간 원심분리 후, 여과하여 4°C에 보관하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료 및 기기</h2> <p>본 실험에 사용한 버섯 균사체는 경남농업기술원으로부터 분양받은 눈꽃동충하초(Paecilomyces japonica) 균사체를 사용하였으며, 포도와 오이는 경상남도 진주시 인근 재래시장에서 구입하여 사용하였다. 세포주인 B16BL6 mouse melano-ma cell (No. 80006)은 한국 세포주 은행으로부터 분양받아 사용하였으며, 우태아혈청(Fetal Bovain serum, FBS)은 Gibco사의 것을, 배양용 배지(Minimum Essential Medium. MEM)는 Sigma사의 것을 사용하였다.</p> <p>UV-Vis spectrophotometer는 Ultrospec 2000 (Pharmacia Biotec, Swiss)을 사용하여 475와 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 파장에서 흡광도를 측정하였고, melanin 생합성 측정에 있어서는 ELISA reader (Synergy \( { } ^ { T M } \)HT. Bio-tek, USA)를 사용하여 \( 490 \mathrm { ~nm } \) 파장에서 흡광도를 측정하였다. 기타 활성 측정 및 분석에 사용된 시약은 특급품을 사용하였다.</p> <h2>포도와 오이즙액에 동충하초 균사체 배양액의 제조</h2> <p>시료의 제조에 있어서 동충하초 균사체 액체배양을 위한 균사체는 potato dextrose agar (PDA. Difco, USA) 배지에 눈꽃 동충하초 균사체를 접종하여 7일간 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 정치 배양한 것을 사용하였다. 본 배양은 천연재료인 포도와 오이즙액을 각각 \( 47.5 \% \)씩 되게 한 후, 감자 \( 5 \% \)를 첨가한 액체배지에 전 배양된 동충하초 균사체 \( 1 \%( \mathrm { W } / \mathrm { V } ) \)를 접종하여 \(25 ^ {\circ } \mathrm { C } , 120 \mathrm { ~rpm } \)의 조건으로 5, 10, 15, 20, 25일씩 각각 진탕 배양하였다. 배양이 완료된 각각의 배양액을 회수하여 \(13,000 \mathrm { ~rpm } \)에서 10분간 원심분리 후 상등액을 \( 0.2 ~ \mu \mathrm { m } \) syringe filter (Sartorius, Germany)로 여과하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 보관하면서 실험에 사용하였다.</p> <h2>세포 배양 및 수확</h2> <p>B16BL6 mouse melanoma cell (No. 80006)은 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) 세포배양기 \( \left (37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \right ) \)에서 \( 10 \% \) fetal bovain serum (Gibco. Co.)이 포함된 MEM 배지를 사용하여 배양하였다. 여기에 penicillin-streptomycin (Sigma Chemical Co., USA) 100 I.U. \( -100 ~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)를 첨가하였으며, 약 24시간 주기로 MEM 배지를 교체하였다. 세포 수확에 있어서는 trypsin-EDTA (Gibco. Co.)를 cell이 부착되어 있는 dish에 5분간 처리한 후 trypsin-EDTA를 완전히 제거하고, MEM 배지를 이용하여 수확하는 방법을 사용하였다.</p>