탈질소 기능을 가진 세균의 동정을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 진행하였으며, 분리한 탈질소 균의 호기성 상태에서의 온도, \( \mathrm { pH } \), 염, 질산염에 대한 생리적 적응능력을 분석하였다. 탈질균은 저영양 배지에서 균의 \( 11.9 \% \)가 탈질균으로 선발되어 가장 높은 빈도를 보였고 선발된 135개 균주는 모두 질산염을 아질산염으로 환원하는 nitrate reduction 활성이 관찰되었는데, 이는 탈질 과정에 일련의 질산염 환원반응 효소들이 관여하고 있음을 시사한다.
<h2>탈질소 세균의 \(16 \)S rRNA 유전자 염기서열 분석</h2> <p>탈질소 기능을 가진 세균의 동정을 위해서 16S rRNA 유전자 염기서열분석을 이용하였다. DNA extraction kit(Toyobo, Japan)로 분리균주의 DNA를 추출한 후 universal primer 27F(5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1492R(5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3')을 이용하여 16S rDNA 유전자를 증폭하였다. PCR 산물은 DNA sequencing 키트(BigDye terminator Cycle Se-quencing Ready Reacions v. 3. 1.; Applied Biosystem)를 사용하여 반응시킨 후, Genetic Analyser 3100(Applied Bio-systems)로 염기서열을 분석하였다. 계통 분석도는 Kimura's two-parameter model(1,000 replicate bootstrap value)에 따른 Neighbor-joining과 Maximum-parsimony clustering 결과를 MEGA 4 분석프로그램을 사용하여 작성하였다.</p> <h2>탈질소 세균의 생존 특성 분석</h2> <p>분리한 탈질소 균은 호기성 상태에서의 온도, \( \mathrm { pH } \), 염, 질산염에 대한 생리적 적응능력이 조사되었다. 온도 조건은 \( 4 \sim 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 범위에서, \( \mathrm { pH } \)는 \( 4 \sim 10, \) NaCl 염의 농도는 \( 2 \sim 12 \% \), 무기질소염 농도는 \( 1 \sim 10 \% \)에서 생존 유무를 R2A 배지를 기본 배지로 하여 평판 배지와 액체 배지에서 각각 세 번 반복 실험을 통하여 생리적 생존 능력을 결정하였다. 온도에 따른 생존 특성을 측정할 때는 \( 1 \% \) NaCl가 첨가된 R2A \(( \mathrm { pH } 8.0) \)를 기본 배지조건으로 하였다. \( \mathrm { pH } \)에 대한 생존 특성을 측정 할 경우에는 \( 1 \% \) NaCl가 첨가된 R2A를 기본 배지조건으로 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다. NaCl 염과 무기질소염에 대한 저항성은 R2A \(( \mathrm { pH } 8.0) \)를 기본배지로 온도 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } , \mathrm { pH } 8.0 \)하에서 24시간 액체 배양하여 균 성장이 O.D. \( 600 \mathrm { ~nm } \)에서 0.6 이상일 경우를 생존한 것으로 판단하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>탈질소 균의 선발</h2> <p>국내 생태환경이 잘 보존된 다양한 지역의 토양에서 분리한 총 3,471 개주의 저영양 미생물 자원으로부터 탈질소 능력을 가진 135균주를 선발하였다(Table 1). 저영양 세균을 수집한 여러 토양 시료 중 논 토양은 저영양 배지에서 배양 가능한 균의 \( 11.9 \% \)가 탈질균으로 선발되어 가장 높은 빈도를 나타내었다. 이는 질소시비가 많은 작물 경작지 토양에서 다른 토양보다 탈질균이 우점 하리라는 예상과 일치한 결과였다. 반면 비교적 생태환경이 잘 보존된 늪이나 섬에서는 약 \( 5.1 \% \)의 선발율을 보였고 중금속 오염 토양에서는 \( 0.7 \% \)의 가장 낮은 선발율을 보였다. 선발된 135개 균주는 모두 질산염 첨가배지의 혐기성 조건 배양에서 질소 기포를 형성하였고, 질산염 \( \left ( \mathrm { NO } _ { 3 } ^ { - } \right ) \)을 아질산염 \( \left ( \mathrm { NO } _ { 2 } ^ { - } \right ) \)으로 환원하는 nitrate reduction 활성이 있음을 확인하였다(Fig. 1). 이는 질소가스 발생에 의한 탈질 과정이 일련의 질산염 환원반응 효소들이 관여하고 있음을 시사해준다.</p>