Thrombin을 사용하여 GST를 제거한 후, tMIF와 MIF 단백질을 소듐 인산 버퍼에 넣고 glutaraldehyde를 첨가하여 상온에서 15분 동안 단백질 크로스링킹 반응을 수행하였다. 이 후 Tris-HCl 버퍼로 반응을 중지하고, 크로스링킹된 단백질을 SDSPAGE로 확인하였다. 또한, pET와 pGEX 발현 시스템을 활용하여 인간 MIF 단백질을 발현하는 플라스미드를 제조하여 인간 MIF의 생화학적 특성을 연구하였다.
<h2>MIF 단백질의 cross-linking</h2> <p>Thrombin을 이용하여 GST를 제거한 \( 1.5 \mu \mathrm { g } \)의 tMIF와 10 \( \mu \mathrm { g } \) 의 MIF 각 단백질을 sodium phosphate buffer ( \( 20 \mathrm { mM } \), \( \mathrm { pH } 7.8 \) )에 넣은 다음 \( 0.1 \% \) glutaraldehyde (Sigma)를 첨가하여 단백질 cross-linking 반응을 상온에서 15 분간 수행하였다. Tris-HCl buffer \( (20 \mathrm { mM } , \mathrm { pH } \) 7.5)를 이용하여 단백질 cross-linking 반응을 정지시킨 후, 결합단백질들을 15 \% SDSPAGE로 밴드를 확인하였다.</p> <h1>결 과</h1> <h2>재조합 인간 MIF 단백질의 발현 및 정제</h2> <p>인간 MIF의 생화학적 특성을 연구하기 위하여, \( \mathrm { pET } \)와 pGEX 발현 시스텀을 이용하여 재조합 MIF 단백질을 발현하는 plasmid를 제조하였다(Fig. 1A). 먼저 어떤 종류의 epitope tag도 가지고 있지 않은 pET vector 시스템을 이용하여 \( \mathrm { MIF } \) 의 발현을 유도하였다(Fig. 1B). ExPASy (Expert Protein Analysis System, http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html)에서 아미노산 서열을 기준으로 하여 이론적으로 계산한 \( \mathrm { MIF } \) 단백질의 분자량은 약 \( 12,476 \mathrm { Da } \) 이며, \( 18 \% \) SDS-PAGE 분석 결과도 유사한 크기인 \( 12.5 \mathrm { kDa } \) 에서 밴드가 확인되었다. IPTG로 단백질의 발현을 유도하면 1 리터 대장균 배양액 당 약 \( 31 \mathrm { mg } \) 이상의 \( \mathrm { MIF } \) 가 발현되는데, 이는 전체 수용성 세포 단백질의 \( 22 \% \) 를 차지한다(Fig. 1B, lane 1).</p> <p>많은 경우 재조합 단백질을 단일과정으로 다량 정제하기 위해 \( \mathrm { pGEX } \) 시스템을 사용 한다[9]. 이 연구에서도 \( \mathrm { pGEX } \) 시스템을 이용하여 GST-MIF 융합 단백질을 대장균에서 발현하여 glutathione-Sepharose 4B bead로 정제하였다(Fig. 1B, lane 2). 전기영동을 한 결과 \( 40 \mathrm { kDa } \) 크기의 분자량 위치에서 \( \mathrm { GST } - \mathrm { MIF } \) 가 확인되었으며, 이 시스템을 이용하면 1 리터 대장균 배양액 당 \( 20 \mathrm { mg } \) 이상의 GST-MIF를 정제할 수 있다 (Fig. 1B, lane 2). 다음으로 \( 90 \mu \mathrm { g } \) 의 GST-MIF를 glutathione으로 반응 시킨 후 bead로부터 분리하면 약 \( 51 \% \) 의 회수율인 46 µg의 free GST-MIF를 얻을 수 있다(Fig. 1B, lane 3). MIF로부터 N-말단 GST를 제거하기 위해 \( 30 \mu \mathrm { g } \) 의 GST-MIF를 thrombin으로 반응한 후 bead로부터 GST가 절단된 MIF (tMIF, \( 14.5 \mathrm { kDa } ) 12 \) μg을 회수하였다 (Fig. 1B, lane 4). tMIF의 경우 GSI 부분이 절단되었지만, pGEX-4T-1 plasmid의 thrombin 절단 부위 위치상 \( \mathrm { MIF } \) 의 \( \mathrm { N } \)-말단 methionine \( \left ( \mathrm { M } ^ { 1 } \right ) \) 앞에 6개의 아미노산 (Gly-Ser-Pro-Glu-Phe-Ala, G-S-P-E-F-A)이 남아있다.</p>