활성유도분획법을 목적으로 황금추출물에서 11개의 분획물들을 준비하여 MG53-IRS-1 결합 억제 스크리닝을 사용하여 우수한 분획물을 가려내었다. 실험에서 실시한 단일화합물 분리 및 구조분석은 다음과 같이 진행하였다. 또한 개방형칼럼 분취 방법으로 확보된 표준 유효분획물을 prep-HPLC에 Waters Atlantis T3 칼럼을 사용하여 분석하고, MeOH 조건으로 세부 분획물을 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 지표성분들을 분리한 후에 NMR, MS, UV 등의 분광학적인 기기로 생리활성물질의 구조를 분석하였다. 특히 2D-NMR에서 수소-탄소의 관계를 통해서 치환기의 정확한 위치와 탄소 차수와 물질의 구조를 확인하고 구조를 결정하였다.
<h2>단일화합물 분리 및 구조분석</h2> <p>황금추출물에서 활성유도분획법을 위해 11개의 칼럼분획물들(SB Frs. 1-10)을 준비하여 MG53-IRS-1 결합 억제(MID, MG53-IRS-1 dissociator) 스크리닝을 통해 가장 우수한 SB Fr. 10번 칼럼분획물을 확인하였다(data not shown). SB Fr. 10번을 대량 확보 가능한 합리적이고 효율적인 방법인 개방형칼럼 분취 방법으로 확보된 표준 유효분획물을 prep-HPLC에 Waters Atlantis T3 칼럼을 사용하여 증류수(A), MeOH (B)의 혼합 용매를 이동상으로 하는 \(0-5 \mathrm { min } \) \(50 \% \) MeOH, \(5-30 \mathrm { min } \) \(100 \% \) MeOH, \(30-35 \mathrm { min } \) \(100 \% \) MeOH, \(35-36 \mathrm { min } \) \(50 \% \) MeOH, \(36-46 \mathrm { min } \) \(50 \% \) MeOH 조건으로 세부 분획물(SB Frs. 10-1 10-6)을 반복하여 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 지표성분들을 분리하고자 하였다. SB Fr. 10-2를 prep-HPLC에 Acclaim \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) polar advantage II (PAII) 칼럼을 사용하여 증류수(A), ACN(B)의 혼합 용매를 이동상으로 하는 \(0-5 \mathrm { min } \) \( 50 \% \) (B), \(5-50 \mathrm { min } \) \(75 \% \) (B), \(50-55 \mathrm { min } \) \(75 \% \) (B), \(55-57 \mathrm { min } \) \(50 \% \) (B) 조건으로 SB Fr. 10-2-1 (5, skullcapflavone II, \(31.0 \mathrm { mg } \) ), SB Fr. 10-2-2 (1, 5,7,2'-trihydroxy-8-methoxyflavone, \(30.0 \mathrm { mg } ) \) 를 분리하였다. SB Fr. 10-3을 prep-HPLC에 Acclaim \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) PAII 칼럼을 사용하여 증류수(A), ACN (B)의 혼합 용매를 이동상으로 하는 \(0-5 \mathrm { min } \) \(50 \% \) (B), \(5-50 \mathrm { min } \) \(75 \% \) (B), \(50-55 \mathrm { min } \) \(75 \% \) (B), \(55-57 \mathrm { min } \) \(50 \% \) (B) 조건으로 SB Fr. 10-3-1 (7, dihydrooroxylin A, \(16.0 \mathrm { mg } \)), SB Fr. 10-3-2 (2, wogonin, \( 30.0 \mathrm { mg } \) ), SB Fr. 10-3-3 (1, 5,7,2'-trihydroxy-8-methoxyflavone, \(5.0 \mathrm { mg } \) 를 분리하였다. SB Fr. 10-4을 prep-HPLC에 Acclaim \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) PAII 칼럼을 사용하여 증류수(A), ACN (B)의 혼합 용매를 이동상으로 하는 \(0-5 \mathrm { min } \) \(50 \% \) (B), \(5-50 \mathrm { min } \) \(75 \% \) (B), \(50-55 \mathrm { min } \)) \(75 \% \) (B), \( 55-57 \mathrm { min } \) \(50 \% \) (B) 조건으로 SB Fr. 10-3-1 (7, dihydrooroxylin A, 16.0 mg), SB Fr. 10-3-2 (2, wogonin, \(30.0 \mathrm { mg } \) ), SB Fr. 10-3-3 (1, 5,7,2'-trihydroxy-8-methoxyflavone, \(5.0 \mathrm { mg } ) \) 를 분리하였다. SB Fr. 10-4을 prep-HPLC에 Acclaim \( ^ {\mathrm { MM } } \) PAII 칼럼을 사용하여 증류수(A), ACN(B)의 혼합 용매를 이동상으로 하는 \(0-5 \mathrm { min } \) \(50 \% \) (B), \(5-50 \mathrm { min } \) \(75 \% \) (B), \(50-55 \mathrm { min } \) \(75 \% \) (B), \( 55-57 \mathrm { min } \) \(50 \% \) (B) 조건으로 SB Fr. 10-4-1 (4, 5,7-dihydroxy-6,8-dimethoxyflavone, \(18.0 \mathrm { mg } \) ), SB Fr. 10-4-2 (2, wogonin, \( 33.0 \mathrm { mg } \) )를 분리하였다. SB Fr. 10-5을 prep-HPLC에 Acclaim \( ^ {\mathrm { TM } } \) PAII 칼럼을 사용하여 증류수(A), ACN(B)의 혼합 용매를 이동상으로 하는 \(0-5 \mathrm { min } \) \(50 \% \)(B), \(5-50 \mathrm { min } \) \(75 \% \)(B), \(50-55 \mathrm { min } \) \(75 \% \)(B), \( 55-57 \mathrm { min } \) \(50 \% \)(B) 조건으로 SB Fr. 10-5-1 (6, oroxylin A, \(20.0 \mathrm { mg } \) ), SB Fr. 10-5-2 (3, 5,7-dihydroxy-flavone, \(2.0 \mathrm { mg } \) 를 분리하였다. SB Fr. 10-6을 prep-HPLC에 Acclaim \( ^ {\mathrm { TM } } \) PAII 칼럼을 사용하여 증류수(A), ACN (B)의 혼합 용매를 이동상으로 하는 \(0-5 \mathrm { min } \) \(50 \% \)(B), \(5-50 \mathrm { min } \) \(75 \% \)(B), \(50-55 \mathrm { min } \) \(75 \% \)(B), \(55-57 \mathrm { min } \) \(50 \% \)(B) 조건으로 SB Fr. 10-6-1 (6, oroxylin A, \( 27.0 \mathrm { mg } ) \), SB Fr. 10-6-2 (8, 5,2'-dihydroxy-6,7,8-trimethoxyflavone, \(12.6 \mathrm { mg } \) )를 분리하였다. 순수하게 분리정제한 생리활성물질의 구조를 동정하기 위하여 NMR, MS, UV 등의 분광학적인 기기를 사용하였다. 먼저, \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } - { } ^ { 13 } \mathrm { C } - \mathrm { NMR } \) 에서 수소와 탄소의 개수와 chemical shift 값으로 기본적인 골격을 예상하였고, 2D-NMR (COSY, HMQC, HMBC, DEPT)에서 수소-탄소의 연관관계를 통해 치환기의 정확한 위치와 탄소 차수를 확인하여 물질의 구조를 확인하였고 선행문헌의 화합물들을 확인하여 구조를 결정하였다.</p>