\( 5 \mu l \) 의 PCR 산물은 agarose gel에 전기영동을 수행하여 PCR 증폭여부를 확인하고, 증폭된 PCR products는 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 시간 incubation시킨 후 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 15 분간 처리하고 direct sequencing의 주형으로 이용했다. 유전자 변이 분석은 LASERGENE-SeqMan 및 PHRED/ PHRAP/CONSED software suite를 이용하고 각 유전자에 대한 일배체형은 동형접합체나 PHASE 프로그램으로 추론하였다.
<p> <ul> <li>TAS1R3-F : 5'- acgtatgtgctgcgtgttg -3'</li> <li>TAS1R3-R : 5'-catgctgagcacacgtgaat-3'</li> <li>GNAT3(rs7792845)-F : 5'-acacccaaagaaggcaaatg-3'</li> <li>GNAT3(rs7792845)-R : 5'-cacgctactgagctttggtg-3'</li> <li>GNAT3(rs1524600)-F : 5'-ggttacatccgctttgcagt-3'</li> <li>GNAT3(rs1524600)-R : 5'-ttcatcagtgtcgtctgaatgac-3'</li></ul> <p>각 PCR (polymerase chain reaction)은 \( 25 \mathrm { ng } \) template genomic DNA, \( 2.5 \mu l \) 10× PCR reaction buffer, 1.5-2 mM \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } , 0.2 \mu \mathrm { M } \) dNTP, 15 pmol o 양쪽 primers, \( 0.75 \mathrm { U } \) Taq DNA polymerase (Solgent, Korea), 그리고 \( \mathrm { dH } _ { 2 } \mathrm { O } \) 를 넣어 최종 부피를 \( 25 \mu l \) 로 맞춘 후 잘 섞은 다음 반응을 시행하였다. 각 PCR cycle은 \( 95 ^ {\circ } athrm { C } \) 에서 2 분간 denaturation시킨 후, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초, 각 primer들의 \( \mathrm { Tm } \) 온도에 따라 30 초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 분간의 조건으로 35 cycles, 그리고 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분으로 최종 합성하였다. \( 5 \mu l \) 의 \( \mathrm { PCR } \) 산물은 \( 1.5 \% \) agarose gel에 전기영동을 수행하여 \( \mathrm { PCR } \) 증폭여부 및 크기를 확인하였다. 증폭된 \( \mathrm { PCR } \) products의 경우, 3 U exonuclease I (USB, Co., USA)와 \( 0.3 \mathrm { U } \) alkaline phosphatase (USB, Co., USA)를 넣어 섞은 다음, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 시간 incubation시킨 후, \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 15 분간 처리, direct sequencing의 주형으로 이용하였다. PCR product에 대한 염기서열 결정은 \( \mathrm { ABI } 3130 \mathrm { XL } \) 자동염기서열 분석기를 이용하며, DNA Sequencing Analysis software (ver.5.0)로 분석하였다. 유전자 변이 분석은 LASERGENE-SeqMan 및 PHRED/ PHRAP/CONSED software suite를 이용하여 앝아내었다. 각 유전자에 대한 일배체형은 동형접합체(homozygote)나 PHASE 2.0.2 프로그램을 이용하여 추론하였다.</p>