토양으로부터 클로닝이 가능한 genomic DNA 분리를 위해 humic acid 등의 저해 물질 제거 및 획득률 최적화를 위한 여러 분리 방법을 시도하였다. 하지만 토양 내 미량의 humic acid 등의 저해 물질로 인해 여러 방법 중 방법 III 을 이용하여 분리된 DNA 만 낮은 농도에서 product 확인이 가능하였다. 따라서 저해 물질을 효과적으로 제거할 수 있는 방법을 도입하여 DNA의 손상을 최소화하고, 토양 DNA 정제도를 높여 생산물의 활용도를 증대할 수 있을 것으로 기대된다.
<h1>고 찰</h1><p>본 연구에서는 토양으로부터 클로닝이 가능한 genomic DNA를 분리하기 위하여 제한효소 단편 DNA 제작에 저해작용을 하는 humic acid 등의 저해 물질 제거와 함께 토양무게 당 획득률을 최적화하기 위한 여러 가지 분리 방법들이 시도되었다. 우선 토양에서 genomic DNA를 분리하는 방법으로서 기존에 널리 이용되고 있는 방법 I 은 \( 1 \% \) 의 CTAB 와 \( 2 \% \) SDS가 포함된 DNA extraction buffer를 사용하여 미생물의 세포벽과 세포막을 용해하여 DNA를 추출하는 것으로서 DNA 회수율이 높은 것으로, 방법 II는 PEG와 \( \mathrm{NaCl} \) 및 potassium acetate 침전을 실시함으로써 DNA의 정제도가 높은 것으로 각각 알려져 있다. 본 연구진에서는 이를 토대로 토양 DNA를 분리하는데 있어 좀더 효율적으로 DNA 회수율과 정제도를 높이고, humic acid와 같은 저해물질을 제거하는 방법 III을 시도하였다. 이를 타 방법들과 비교하기 위하여 금정산에서 채취한 토양 1과 토양 2에 대해 각 분리방법을 이용하여 genomic DNA를 분리한 후, spectrophotometer와 agarose gel 전기영동을 이용하여 분리된 DNA의 회수율, 정제도 및 저해 물질의 제거 정도를 비교하였다. 방법 I은 CTAB를 사용하여 humic acid와 같은 화합물을 제거한 방법으로 DNA 회수율은 높았으나 정제도가 낮은 것으로 보아 실질적으로 RNA나 humic acid로 추정되는 이물질이 흡광도를 증대시켜 DNA 양이 높은 것처럼 보이는 것으로 판단되었고, 방법 II는 PEG와 \( \mathrm{NaCl} \) 및 potassium acetate 침전을 사용하여 분리한 결과로서, DNA 회수율과 정제도가 다른 분리방법에 비해 낮게 나타났다. 그에 비해 방법 III의 경우, DNA 회수율은 타 분리방법과 유사하였으나 정제도는 더 높은 것으로 나타났는데 이는 CTAB, PEG, phenol/ chloroform/ isoamyl alcohol 처리를 통해 humic acid와 같은 화합물의 제거가 잘 된 것으로 판단되며, 아울러 토양을 그늘지고 통풍이 잘 되는 곳에서 하루 건조시킨 후, 거즈로 작은 돌과 나무뿌리, 나뭇잎 등의 이물질을 제거하는 등의 전처리를 충분히 해 줄 경우 정제도가 더 높은 DNA를 얻을 수 있었다. 따라서 이상의 결과를 통해 본 연구진에서 확립 한 분리 방법 III이 기존의 분리 방법에 비해 상당히 효율적임을 확인할 수 있었다.</p><p>한편, 각 방법에 의해 분리된 genomic DNA에 대해 분자 생물학적인 적용 가능성을 검토하기 위해 먼저 PCR을 수행한 결과에서는 방법 III에 의해 분리된 DNA만 낮은 농도에서 product를 확인할 수 있었을 뿐, 나머지는 전혀 반응을 확인할 수 없었고, 제한효소를 처리한 경우, 모든 시료에서 반응을 전혀 확인할 수 없었는데 이는 토양 내에 미량 존재하는 humic acid와 같은 저해 물질들이 그 원인으로 판단되므로 반드시 이들 저해 물질의 제거가 필수적임을 알 수 있었다.</p><p>따라서 본 연구에서 확립된 분리방법 III에 대해 humic acid를 포함한 저해물질을 효과적으로 제거할 수 있는 방법을 도입하여 DNA의 손상을 최소화하면서 정제도가 높은 토양 DNA를 분리한다면 이를 이용하여 metagenomic DNA library를 구축하고 E. coli 와 방선균 등의 다양한 숙주세포를 형질전환시켜서 이후 생산되는 각종 항생제와 2차 대사산물 등을 항암제 및 면역조절 물질 등의 개발에 적극 활용할 수 있을 것으로 사료된다.</p>