유전자 반현 분석을 위해 캘러스에서 total RNA를 분리하고, 이를 이용해 reverse transcription을 통해 cDNA를 합성하였다. 반응은 \(42^{\circ} \mathrm{C}\)에서 1시간 30분 동안 진행되었다. GeneFishing \( { }^{\mathrm{TM}} \) DEG kits를 이용하여 ACP-based PCR 방법으로 다르게 발현되는 유전자를 스크리닝하였으며, 생성된 PCR 산물을 2% agarose gel에서 분리하여 밴드 차이를 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물 재료</h2> <p>소독한 벼 종자를 2,4-D \( 2 \mathrm{mg} / \) 가 첨가된 \( \mathrm{N} 6 \) 배지 \( (\mathrm{Chu} \)et al. 1975)와 5-azacytidine \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \) 첨가된 \( \mathrm{N} 6 \) 배지 ( \( \mathrm{N} 6 \mathrm{~A} \) )에 각각 치상하여 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \), 암 상태에서 약 3 주간 배양하면서 캘러스를 유기하였다. 유기된 캘러스를 정상적인 재분화 MS(Murashige and Skoog 1962)배지 (MSR)와 5-azacytidine이\( 50 \mathrm{mg} / 1 \) 첨가된 재분화 MS 배지 (MSRA)에 치상하여 빛 상태에서 배양하면서 재분화 현상을 관찰하였다. 유전자 반현 분석을 위한 total RNA 분리를 위하여 각 단계별로 캘러스를 선발하였다.</p> <h3>RNA 분리 및 유전자 발현 분석</h3> <p>total RNA 분리는 RNeasy isolation kit (QIAGENE)를 사용하여 분리하였다. 분리된 RNA률 사용하여 다음과 같이 reverse transcription을 하여 cDNA를 합성하였다 : \( 3 \mu \mathrm{g} \) total RNA, \( 4 \mu \) reaction buffer (Promega, Madison, WI, USA), 5\( \mu \mathrm{dNTPs} \) (each \( 2 \mathrm{mM} \) ), \( 2 \mu 10 \mu \mathrm{M} \) dT-ACP1 (5'-CTGTGAA TGCTGCGACTACGATIIIIIT(18)-3'), \( 0.5 \mu \mathrm{R} \) Rasin RNase In-hibitor (40 U/ \( \mu \) Promega), \( 1 \mu \) Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (200 U/ \( \mu \) l Promega)를 포함하고 있는 반응액 \( 20 \mu 1 \) 를 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 30 분 동안 반응시켰다. 이렇게 합성된 \( \mathrm{cDNA} \) 를 GeneFishing \( { }^{\mathrm{TM}} \mathrm{PCR} \) 에 사용하였다.</p> <p>GeneFishing \( { }^{\mathrm{TM}} \) DEG kits (Seegene)를 사용하여 ACP-based PCR 방법 (Kim et al. 2004) 으로 다르게 발현되는 유전자를 스크리닝하였다. Second - strand cDNA 합성은 3-5 \( \mu \) (about\( 50 \mathrm{ng}) \) diluted first-strand cDNA, \( 1 \mu \mathrm{dT}-\mathrm{ACP} 2(10 \mu \mathrm{M}), 1 \mu \mathrm{l} \)\( 10 \mu \mathrm{M} \) arbitrary ACP, \( 10 \mu 12 \) Master Mix (Seegene)를 포함하고 있는 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 반응액을 \( 94^{\circ} \mathrm{C} 1 \mathrm{~min}, 50^{\circ} \mathrm{C} 3 \mathrm{~min}, 72^{\circ} \mathrm{C} 1 \mathrm{~min} \)에서 한 cycle을 반응시켰다. 그 다음 단계인 PCR ampli-fication은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} 40 \) 초, \( 65^{\circ} \mathrm{C} 40 \) 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} 40 \) 초 조건으로 40cycle을 반응시킨 후 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분 동안 처리하였다. 이렇게 생성된 PCR 산물을 2\% agarose gel에서 분리하여 밴드 차이를 확인하였다.</p>