T-flask에서 배양한 세포는 PBS로 두 번 washing 한 후, Trypsin과 EDTA solution을 넣고 3분 동안 배양하여 MEM-a로 세포를 회수하고, Trizol Reagent로 Total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA를 template로 하여 각각 \( ( \mathrm { Cu } / \mathrm { Zn } \) SOD 와 \( \beta \)-actin)의 cDNA를 합성하였다.
<h2>Total RNA의 추출</h2> <p>T-flask에서 배양한 세포는 PBS \( 20 \mathrm { ml } \)로 두 번 washing한 후, \( 0.25 \% \) Trypsin과 \( 0.03 \% \) EDTA solution \( 3 \mathrm { ~ml } \)을 넣고, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 3 분 동안 배양하여 세포를 culture flask에서 분리한 후, MEM-a \( 5 \mathrm { ml } \)을 첨가하여 세포를 회수하였다. 각각의 농도, 시간, cell passage의 조건에서 세포를 모은 다음, 다시 PBS로 두 번 washing 하였다. Trizol Reagent (Life Technologies, Glasgow, United Kingdom) \( 1 \mathrm { ~ml } \)을 첨가하여 vortexing 한 후, 세포를 완전히 resuspension 하여 total RNA를 추출하였으며, 사용 전까지 \( -70 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 보관하였다.</p> <h2>\( \mathrm { Cu } / \mathrm { Zn } \) SOD와 \( \beta- \) actin의 Reverse Transcriptase Reaction</h2> <p>추출한 total RNA를 template로 하여 각각 \( ( \mathrm { Cu } / \mathrm { Zn } \) SOD 와 \( \beta \)-actin)의 cDNA를 합성하였다. 각각의 primer들은 pri-merfinder v0.07 프로그램을 사용하여 gene spesific하게 디자인 하였다( \( \mathrm { Cu } / \mathrm { Zn } \) SOD RS-1 primer: sense 5'-CCGTGTG CGTGCTGAAG-3', RS-2 primer: antisense 5'-GGCA'ATCCCAATCACACCA-3' / \( \beta \)-actin M \( \beta \)-1 primer: sense \( 5 ^ {\prime } \)-GGCTGTATTCCCCTCCAT-3', M \( \beta \)-2 primer: antisense 5'-TGCTGGAAGGTCGACAGTGA- 3'). Total RNA \( 15 ~ \mu \mathrm { l } \)을 DEPC로 처리한 \( \mathrm { ddH } _ { 2 } \mathrm { O } \)로 \( 10 ~ \mu \mathrm { l } \)되게 첨가한 후, \( 10 \times \)RT-amplification buf-fer \( 2 ~ \mu \mathrm { l } \), dNTPs \( (2.5 \mathrm { ~mM } ) ~1 ~ \mu \mathrm { l } , \mathrm { MgCl } _ { 2 } (25 \mathrm { ~mM } ) ~1 ~ \mu \mathrm { l } \), reverse primer \((10 \mathrm { ~pmol } \)) \( 1 ~ \mu \mathrm { l } \), RNase inhibitor \(40 \mathrm { ~unit } \), AMV reverse transcriptase \( 5 \mathrm { ~unit } \), DEPC로 처리한 \( \mathrm { ddH } _ { 2 } \mathrm { O } ~3 ~ \mu \mathrm { l } \)를 첨가하여 \( 39 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 60 분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다.</p>