protease 생산 미생물을 분리하기 위해 경상북도 경산시 영남대학교의 토양을 채취해 평판고체배지에 도말한 후 미생물 집락이 크고, 집락 주변에 skim milk를 분해해 투명환을 강하게 형성한 colony를 선별했다. 분리 균주의 형태학적 특성은 전계방사형 주사전자현미경으로 관찰했고, 배양학적 특성은 평판고체배지에서 colony의 색깔, 크기, 모양 등을 조사했으며, 생리학적 특성은 Biolog test와 API 50CHB kit를 사용해 조사했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>Protease 생산 미생물의 분리</h2> <p>토양에 서식하는 protease 생산 미생물을 분리하기 위하여 경상북도 경산시 소재 영남대학교 내의 토양을 채취하여 멸균식염수 \( (0.85 \% \mathrm { NaCl } ) 9 \mathrm { ml } \) 에 현탁한 후, \( 10 ^ { -5 } -10 ^ { -7 } \) 으로 희석하여 분리용 평판고체배지(TSB \( 3.0 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \), skim milk \( 2.0 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \), agar \( 2.0 \mathrm { ~g } / 1) \) 에 도말하였다. 도말한 평판고체배지는 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 시간 동안 배양한 후 미생물 집락의 크기가 크면서 skim milk를 분해하여 집락 주변으로 투명환(clear zone)을 강하게 형성한 colony를 선별하였다. 선별한 colony는 다시 분리용 평판고체배지에 옮겨 배양한 후, 본 연구에서 사용한 미생물 증식용 전배양 배지인 TSB (Bacto \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) Tryptic Soy Broth Soybean-Casein Digest Medium) 배지에 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 200 \mathrm { rpm } \) 으로 24 시간 동안 진탕배양 하였다. 배양액을 원심분리하여 얻은 상층액으로부터 protease 활성을 측정하고 활성이 가장 우수한 균주를 최종 분리하였다.</p> <h2>형태학적 및 배양학적 특성</h2> <p>형태학적 및 배양학적 특성 분리 균주의 형태학적 특성은 전계방사형 주사전자현미경 (SEM, Scanning Electron Microscope, S-4100, Hitachi Co., Japan)으로 관찰하였다. 액체 배지에 배양한 균체 현탁액을 원심분리하여 균을 침전시켜 충분한 양이 될 때까지 모은 후, \( 2.5 \% \) glutaraldehyde와 \( 1 \% \) osmium tetroxide로 고정하여 ethanol로 탈수시키고 임계점 건조기(Critical Point Dryer, HCP-2, Hitachi Co., Japan)로 건조한 후, 정밀에칭 코팅기(Precision Etching Coating System, Gatan 682, USA)로 코팅한 후 관찰하였다.<p>분리 균주의 배양학적 특성을 조사하기 위하여 TSB와 skim milk를 포함한 평판고체배지에서 생육한 colony의 색깔, 크기, 모양 등의 특성을 조사하였다.</p> <h2>생리학적 특성</h2> <p>탄소원 이용성 및 발효특성 등 분리 균주의 생리학적 특성은 Biolog test와 API 50CHB kit (Biomerieux, France)를 통하여 제조사의 지침에 따라 수행하였으며, API \( 50 \mathrm { CHB } \) kit test 결과는 API \( 50 \mathrm { CHB } \) database V4.0을 이용하여 동정하였다.</p>