본 연구에서는 미역 에탄올 추출물이 3T3-L1 세포를 지방세포로 분화시키는 PPAR \(\Upsilon\), leptin, HSL의 mRNA과 단백질 발현량을 분석하여 미역 에탄올 추출물이 3T3-L1 분화 유도능 억제에 관한 mRNA 전사과 단백질 발현에 관한 연구를 실행하고자 한다.
<p>본 연구에서는 미역 에탄올 추출물의 항비만 효과를 3T3-L1 세포에서 지방세포로의 분화를 촉진시키는 PPAR \( \gamma \), 지방세포에서 분비되는 호르몬인 leptin, HSL의 mRNA와 단백질 발현량을 분석하여, 미역 에탄올 추출물에 의한 3T3-L1의 분화 유도능 억제에 관한 mRNA 전사 및 단백질 발현에 관한 연구를 수행하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>미역 에탄올 추출물의 제조</h2> <p>본 실험에 사용된 미역은 (주)기장물산에서 제공 받았으며, 건조된 미역은 Hammer mill을 이용하여 잘게 분쇄 하였다. 건조 미역 \( 100 \mathrm { ~g } \) 당 에탄올 1 를 첨가하여 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } , 3 \) 시간 동안 추출하였다. 미역 에탄올 추출물은 20 분간 \( 708 \times g \) 로 원심 분리하여 상등액만 분리하였다. 분리된 상등액을 \( 0.45 \mu \mathrm { m } \) fil-ter로 여과하여 감압 농축과정과 동결건조를 통해 미역 에탄올 추출물을 제조하였다. 미역 에탄올 추출물은 DMSO에 녹여 \( 250 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 농도로 만들어 적정한 농도로 희석하여 사용하였다.</p> <h2>세포 배양 및 시약</h2> <p>본 실험에 사용된 3T3-L1 지방전구세포는 미국세포은행 (American Type Culture Collection: ATCC, USA)에서 분양받아 사용하였다. 세포배양은 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에 \( 10 \% \) bovine serum (Gibco BRL)과 100 units/ \( \mathrm { ml } \) 의 penicillin, \( 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 의 streptomycin 및 \( 0.25 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 amphotericin B (Sigma Aldrich, St. Luis, \( \mathrm { MO } , \mathrm { USA } \) )을 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건에서 배양하였다.</p> <h2>3T3-L1 지방전구세포의 분화유도</h2> <p>3T3-L1 지방전구세포를 6 well plate에서 confluent 상태가 될 때까지 배양한 후 분화배지 I [DMEM, \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS, Cellgro, Manassas, VA, US), \( 10 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) Insulin, \( 0.25 \mu \mathrm { M } \) dexamethasone, \( 0.5 \mathrm { mM } \) 3-isobuthyl-1-methyl-xanthin (IBMX, Sigma Aldrich)]을 첨가하여 지방전구세포의 분화를 유도하였다. 2일간의 분화유도 후 dexamethasone과 IBMX를 제거한 분화배지 П로 배지를 교환하여 지방전구세포의 분화를 촉진하였다. Insulin이 제거된 배지에서 분화가 촉진된 지방세포를 2일간 배양하여 세포독성과 지방세포분화 및 지방축적의 억제효과를 확인하였다.</p>