2007년부터 2009년까지 3년 동안 부산지역 병원에 수족구병이나 (뇌)수막염으로 내원한 환자의 대변, 뇌척수액 인후도찰물를 활용하여 실험에 사용했으며, 세포배양은 RD, Hep-2, Vero, BGM 세포주를 사용하여 DMEM에 penicillin-streptomycin 첨가하여 배양하였다. 검체 및 배양액 200 ul을 ZR Viral RNA Kit를 이용하여 RNA를 추출하였다. 확인된 염기서열은 SeqMan program으로 align하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>연구재료</h2> <p>2007년부터 2009년까지 3년 동안 부산지역 병원에 수족구병이나 (뇌)수막염으로 네원한 환자의 데변, 뇌칙수액, 인후도찰물 총 2,743 건을 검체로 사용하였다. 분변의 경우 \( 10 \% \) 의 chloroform (Merck, Germany)을 처리한 pH 7.4의 phosphate buffered saline (PBS, Sigma, USA) 용액에 분변 \( 2 \mathrm{~g} \) 넣고 20분 동안 강하게 진탕한 후 \( 3,000 \mathrm{rpm} \) (UNION 32R PLUS, Hanil, Korea), \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 분간 원심분리한 후 상층액을 사용하였으며, 뇌칙수액과 인후도찰물은 전처리 없이 본 실험에 사용하있다.</p> <h2>세포 배양</h2> <p>국립보건원 간염 - 폴리오바이러스과로부터 분앙받은 hu-man rhabdomyosarcoma (RD), human larynx epidermoid carcinoma (Hep-2)와 African green monkey kidney cell (Vero), buffalo green monkey kidney cell (BGM) 세포주를 사용하있으며 각 세포들을 DMEM (GIBCO modified eagle medium, Invitrogen, USA)에 penicillin-streptomycin (Sigma, USA) 을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{CO}_{2} \) 항온배양기(MCO-18AIC, SANYO, Japan)에서 배양하였다. \( 56^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분간 불환성화 시킨 FBS (GIBCO fetal bovine serum, Invitrogen, USA) \(5\%\) 를 첨가한 배양액을 이용하여 24 well plate (Multidish 24wells, Corning, USA)에 각각의 세포를 \( 2 \times 10^{4} \) cells/well로 24시간 단층배앙한 후, 세포의 밀도가 약 70\% 정도 되었을 때 각각의 검체를 접종하였다. 세포배양액을 걷이낸 후에 PBS를 이용하여 세포를 세척하였으며 \( 2 \% \) 의 FBS가 포함된 배양액을 추가한 후 100 ul의 검체를 접종하였다. 2주일까지 도립 현미경(Axiovert 40 CFL, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 세포병변효과 (cytopathic effect; CPE) 를 관찰한 후에 약 \( 70 \% \) 의 세포병변이 관찰되었을 때에 초저온냉동고 \( \left(-70^{\circ} \mathrm{C}\right. \) freezer, Nihon freezer, Japan \( ) \) 에서 냉동시키고 다시 용해하는 과정을 반복한 후 현탁액을 세포에 재접종하여 바이러스를 분리하있다.</p> <h2>RT-PCR of VP1 region</h2> <p>검체 및 배양액 200 ul을 ZR Viral RNA Kit (ZYMO Research, USA)를 이용하여 RNA를 추출하있으며, VP1 re-gion의 증폭을 위하여 사용한 primer는 Table 1 에 제시하였다. RT-PCR 반응액은 추출한 RNA 1 ul를 RT-PCR kit (iNvitrogen, KOREA)에 넣이 부피가 20 ul가 되도록 한 후 1회( \( {42}^{\circ} \mathrm{C} \) 45분, \( {94}^{\circ} \mathrm{C} \) 5분), 40회 (\( {94}^{\circ} \mathrm{C} \) 30초, \( {55}^{\circ} \mathrm{C} \) 30초, \( {72}^{\circ} \mathrm{C} \) 40초), 1회( \( {72 }^{\circ} \mathrm{C} \) 5분)를 Thermal cycler (C-1000 thermal cy-cler, BIO-RAD, USA)에서 수행하였다. 2차 PCR 반응액은 1st PCR 산물 1 ul를 2차 PCR kit (BIONEER, KOREA)에 넣어 부피가 \( 20 \mathrm{ul} \) 가 되도록 한 후 1회( \( {94}^{\circ} \mathrm{C} \) 5분), 40회 ( \( {94}^{\circ} \mathrm{C} \) 30초, \( {55 }^{\circ} \mathrm{C} \) 30초, \( {72 }^{\circ} \mathrm{C} \) 40초), 1 회( \( {72 }^{\circ} \mathrm{C} \) 5분)를 Thermal cycler에서 수행하였다. PCR생성물(5 ul)은 prestaining (SYBR safe, Invitrogen, USA)된 agarose gel (TaKaRa, Japan)에 100 bp DNA ladder (TaKaRa, Japan)와 함께 loading 하고 30분간 전기영동(Advance, Japan)하여 Image analyzer (Geldoc XR image system, BIO-RAD, USA)로 350 bp band를 확인하였다.</p> <h2>염기서열 분석</h2> <p>\( 350 \mathrm{bp} \) 에서 증촉된 2차 PCR 산물은 염기서열분석을 위하여 agarose gel에서 가능한 자게 원하는 DNA band를 잘라 \( 1.5 \mathrm{ml} \) tube로 옮긴 후 QIAquick gel Extraction kit (QIAgen, Germany)를 이용하여 정제하였나. 이 정제과정을 통헤 회수된 DNA를 주형으로하여 ABI PRISM Dye terminator (Perkin-Elmer Applied Biosustem, USA)를 사용하여 염기서열 결정반응을 수행하였다. 염기서열 분석을 위한 primer는 엔테로바이거스 VP1 region RT-PCR에 사용된 것 중 VP1 2nd PCR과 같다. 확인된 염기서열은 SeqMan program (DNASTAR, Madison, WI)으로 align하고 Clustal W 방법으로 Lasergene program을 이용하여 계퉁수를 자성하였다.</p>