배양한 A549와 H460 세포의 저 산소 상태를 유도하기 위하여 세포를 FBS가 없는 RPMI1640 배지에서 하루 동안 키운 후, \( 100-500 \mu \mathrm{M} \)의 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 포함한 RPMI 1640 배지에서 12시간 배양하였고, 다양한 조건으로 MTT assay, Westem blot, FACS, Immunofluorescence assay 분석을 실행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포배양 및 저 산소 상태 유도</h2> <p>인간 폐암세포(A549)와 비소세포폐암세포주(H460)를 경북대학교 의과대학 생화학교실로부터 분양 받아 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다. A549와 H460세포를 \( 100 \mathrm{units/ml} \)의 penicillin-streptomycin (GIBCO, USA)과 \( 10 \% \) FBS(Hyclone, USA)가 함유된 RPMI 1640 (invitrogen, USA)을 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 배양하였다. 배양 중인 세포는 2-3일에 한번씩 새로운 배지로 바꿔주었다. 저 산소 상태를 유도하기 위해서, A549와 H460 세포를 FBS가 없는 RPMI1640 배지에서 하루 동안 키운 후, \( 100-500 \mu \mathrm{M} \)의 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) (Sigma Chemical Co., USA)를 포함한 RPMI 1640 배지에서 12시간 배양하였다.</p> <h2>MTT assay</h2> <p>A549와 H460 세포에 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 적정농도로 처리하고 6-48시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 tetrazolium bromide salt (MTT, Sigma Chemical Co., USA)를 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 희석하여 \( 200 \mu \mathrm{l} \) 씩 분주하고 3-4시간 동안 다시 배양하였다. 배앙이 끝난 다음 MTT 시약을 제거하고 DMSO를 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 분주하여 well에 생성된 formazin를 모두 녹인 후 96 well plate에 \( 200 \mu \mathrm{l} \) 씩 옮겨서 ELISA reader로 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 이 흡광도는 MTT가 세포에 의해서 환원된 양을 나타내며, 따라서 각 well에 존재하는 생존 세포수와 비례한다.</p> <h2>Westem blot analysis</h2> <p>다양한 조건으로부터 준비된 세포들을 모은 다음, lysis buf-fer [\( 50 \mathrm{mmol/l} \) \( \mathrm{Tri-HCl} \) (\( \mathrm{pH} \) 7.4); \( 1 \% \) NP40; \( 150 \mathrm{mmol/l} \) \( \mathrm{NaCl} \); \( 1 \mathrm{mmol/l} \) EDTA; \( 1 \mathrm{mmol\l} \) phenylmethylsulfonyl flu-oride; \( 1 \mathrm{mmol\l} \) \( \mathrm{Na_{3}VO_{4}} \); and \( 5 \mathrm{mg/ml} \) each of aprotinin, leupeptin, and pepstatin] 을 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 동안 반응 시킨 후, \( 13,000 \mathrm{rpm} \)으로 10분간 원심분리 하여 그 상층액을 취하였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약 사용방법에 따라 정량 한 다음 Laemmli sample buffer를 섞어서 sample을 만들었다. 이렇게 만든 동량의 단백질을 so-dium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel를 이용하여 전기영동으로 분리한 다음 polyvinylidene difluoride membranes 으로 electroblotting 에 의해 membrane으로 전이시켰다. 전이가 끝난 membrane에 \( 5 \% \) BSA가 포함되어 있는 TBST buffer \( (50 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{Tris-HCl} \), \( 150 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{NaCl} \), and \( 0.05 \% \) Tween 20)을 이용하여 상온에서 1시간 동안 blocking을 시켰다. Blocking이 끝난 membrane에 1차 항체를 처리하여 \( 4^{\circ} \)에 16시간 반응시킨 다음 2차 항체를 사용하여 상온에서 1시간 정도 반응시켰다. 반응이 끝난 후 TBST buffer로 충분히 세척하고 Enhanced Chemiluminoesence (ECL) 용액(Amersham Pharmacia Biotech, USA)을 적용 시킨 다음 암실에서 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 양을 분석하였다.</p> <h2>FACS anlaysis</h2> <p>다양한 조건으로 준비된 세포를 \( 0.25 \% \) trypsin/ \( 0.05 \% \) EDTA를 이용하여 세포를 모은 후, phosphate buffered sal-ine (PBS)로 두 번 washing을 한다. Washing이 끝난 세포를 \( 0.1 \mathrm{ml} \) PBS에 현탁 시킨 후 실험에 맞는 특이한 항체를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 정도 반응을 한다. 반응이 끝난 후 \( 10 \mu \mathrm{g/ml} \) 농도의 형광이 달린 이차항체를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 반응한 후, Flow Cytometer FACScalibur system (BD Biosciences)를 이용하여 분석한다.</p> <h2>Immunofluorescence assay</h2> <p>세포를 chamber slide에 키운 후, \( 3.7 \% \) formaldehyde을 상온에서 10분간 반응하여 세포를 고정시킨다. 고정된 세포에 \( 0.25 \% \) Triton X-100을 상온에서 5분간 처리함으로써 세포를 permeablization된 상태로 만든 후, E-cadherin (1:100)과 DAPI (1:5000) 일차항체를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 16시간 정도 반응 후 형광이 달린 2차 항체를 상온에서 1시간 반응한다. 반응이 끝난 샘플은 antifading 용액으로 mounting 한 후 Axiophot microscope (Zeiss, Thornwood, NY)를 이용하여 이미지를 얻었다.</p>