Cysteine protease 저해제는 세포 보호와 생물학적 방어 체계에 중추적인 역할을 하는데, 특히 바이러스나 진균 등의 침략자로부터 식물을 보호하는데 필요하다. 이 저해제는 비생물학적 스트레스 반응에서도 중요한 역할을 하며, 특히 cold shock 및 암흑 상태에서의 보리나 추위, 염분, 고온 스트레스에 노출된 밤나무에서 높은 mRNA 축적을 보인다. 본 연구에서는 이러한 특성을 이용하여 배추 유묘로부터 phytocystatin 유전자 Brcpi 1을 분리하고, 이의 기능을 형질전환실험과 발현분석을 통해 밝혀내고자 한다.
<h1>서 론</h1> <p>동 식물체 내의 생리대사 특히 생체방어와 관련된 다양한 생리반응들은 단백질 분해과정을 통해 특정단백질이 활성화 되는 방식으로 진행된다. Cysteine protease 저해제는 세포 내부 또는 외부로부터 cysteine protease에 의한 비우호적인 단백질 분해활환성으로부터 세포를 보호하며, 침략자에 대한 생물학적 방어 체계로서 중요한 역할을 담당한다. 지금까지 cysteine protease 저해제는 cathepsin B, H, L, S와 papain등으로 thiol기를 갖는 cysteine 계열 단백질분해효소 작용을 저해하는 단백질로 동식물에 널리 분포하고 그 종류와 특성이 다양하다. 식물유래 cysteine protease 저해제는 약 30개 정도 알려져 있으며, 12 내지 \( 16 \mathrm { kDa } \)의 크기로 \( \mathrm { Q } \times \mathrm { V } \times \mathrm { G } \) 의 활성 부위 및 이황화 결합이 되지 않은 상태로 존재하며 계란 유래의 동물 cystein protease 저해제와 매우 높은 상동성을 갖는다. 염기배열에 따라 식물유래 cystein protease 저해제는 phytocy-statin의 용어로 새로운 subfamily 분류되고 있다. 이들 단백질은 식물의 생장과 발육과정에서 상이한 발현 양상을 보이며, 생물학적 및 비생물학적 스트레스에 민감하게 반응하는 것으로 알려져 있다. 식물세포내에서 이들 단백질의 역할은 세포자살 (Programed cell death) 과정에서 사용하기 위해 비축한 생물학적 활성을 갖는 cysteine protease작용이 억제함으로써 세포를 보호 할 뿐만 아니라 종자발아 및 유묘생장속도를 조절한다. 또한 외부로부터 침입한 바이러스, 진균, 선층류 및 딱정벌레 등으로부터 식물을 보호하기위한 방어기작은 cysteine protease이 세포 복제 및 소화기관 (gut)에서 소화효소로서 중요한 역할을 하고 있기 때문에 inhibitor가 매우 중요한 면역 요인으로 작용한다. 특히 비생물학적 스트레스 반응에서의 cysteine protease inhibitor는 cold shock 및 암흑상태에서 자란 보리의 생체조직에서 mRNA 축적이 높게 나타났으며, 추위, 염분 및 고온 스트레스 처리한 밤나무의 뿌리 및 잎에서 발현량이 높게 나타났다. 또한 phytocystatin은 식품산업의 보조제로 사용하고 있으며, 생물공학기술에 적용하고 있다. 브로컬리, 양배추, 케일 등이 포함한 Brassica 속 식물들은 자가불화합성 연구의 모델식물로 알려져 있다. 그러나 아시아에서 매우 중요한 채소작물 중 하나인 배추에서 방어기작에 관한 연구는 전무한 상태이다. 본 연구에서는 배추 유묘로부터 phytocystatin 유전자 Brcpi 1의 분리, 발현분석 및 형질전환실험을 통한 유전자의 기능을 구명하고자한다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물재료</h2> <p>배추 종자를 유리 온실에서 \( 12 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 이하의 저온을 일정기간 유지하여 화아분화를 유도하였다. 개화 전에 뿌리, 줄기, 잎, 주두, 꽃잎, 수술, 꽃받침, 화경 등을 분리하여 액체질소에 넣어 동결한 후, \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 냉동고에 보관하여 RNA 추출 재료로 이용하였다. 또한 발아 초기의 식물 재료를 얻기 위해, 배추 종자를 여과지상에서 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 암 상태에서 발아시킨 후, 1, 2, 4, 8, 10 일의 유묘를 각각 채취하여 액체질소에 넣어 동결한후, \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 냉동고에 보관하여 total RNA를 분리하였다.</p>