사료작물의 시험포장 관리와 조사방법은 사료작물이 발아하기 시작한 후부터 시작하여 주별로 생장 정도를 관찰하였고, 서양금혼초 수용성 추출액을 다른 농도로 조절하여 세구의 사료작물 근계에 적용하였다. 서양금혼초는 4개 부위로 나누어 세척한 후 액체질소로 얼린 뒤, 건조시켰다. HPLC 분석을 통해 이들 서양금혼초의 추출물과 표준물질을 분석하였고, 특정 조건에서 용매 B의 농도를 조절하고 유속을 변화시켜 분석을 진행하였다. 분석은 UV detector를 사용하였으며, 파장은 280nm, 감도는 0.05로 설정하였다.
<h2>사료작물에 대한 서양금혼초 allelopathy 효과 시험</h2> <p>시험포장 관리 및 조사방법은 파종 후 6일내지 10일 후부터 사료작물이 발아하기 시작하였으며, 1주에 1회씩 생장 정도를 관찰하였고, 0%, 20%, 40%, 80% 농도별 서양금흔초 수용성 추출액을 각 세구의 사료작물 근계까지 관주하여 추출액이 접할 수 있도록 \( 10 \ell \) 씩 제 1회 관주하였다. 그 후 1주일 간격으로 최종 6회 관주하고 수용체 식물인 사료작물의 생장 및 수량의 조사 시기는 최종 관주 후 21일째에 조사를 하였다. 사료작물의 생장 및 수량조사 항목은 농촌진홍청의 「농업과학기술 연구조사 분석기준」 콩과와 화본과 사료작물편 조사기준에 의하여 조사하였다.</p> <h2>서양금혼초의 allelochemicals 성분 분석</h2> <p>서양금혼초를 잎, 꽃, 줄기, 뿌리 4 부위로 나누어서 증류수로 세척하고 액체질소로 얼린 후, freeze dry를 이용하여 건조시킨다. 건조된 시료를 분쇄한 분말 \( 2 \mathrm { ~g } \) 에 \( 0.1 \mathrm { ~N } \mathrm { HCl } 2 \) \( \mathrm { ml } \) 와 Acetonitrile \( 10 \mathrm { ml } \) 롤 넣어 흔합한 후 2시간 동안 교반시켰다. 여과지(Whatman No. 42)로 여과과정을 거친 후 다시 freeze dry로 건조시킨다. 80% \( \mathrm { MeOH } 10 \mathrm { ml } \) 로 건조된 물질을 용해시키고 \( 0.45 \mu \mathrm { m } \) syringe filter (Cameo \( 13 \mathrm { ~N } \) syringe- filter, nylon)를 이용하여 여과시킨 용액을 분석 샘플로 하여 HPLC에 주입하였다. HPLC의 고정상 column은 YMC-Park ODS-AM-303 (250×4.6 mm I.D.)를 사용하였으며, 이동상은 \( 0.018 \mathrm { M } \) ammonium acetate에 \( 2 \% \) glacial acetic acid로 혼합한 용액을 용매 \( \mathrm { A } , 70 \% \) 용매 \( \mathrm { A } \) 에 \( 30 \% \) 유기용매를 혼합 한것을 용매 B로 하는데 \( 0.018 \mathrm { M } \) ammonium acetate에 \( 82 \% \) methanol, \( 16 \% n \)-butanol 및 \( 2 \% \) glacial acetic acid를 혼합한 용액을 유기용매로 한다. 추출물과 표준물질을 (a) 분석초기에서 1 분까지는 용매 \( \mathrm { B } \) 를 \( 10 \% \) 로 유속은 \( 1.0 \mathrm { ml } / \mathrm { min } \), (b) \( 1.0 \)분에서 21 분까지는 용매 \( \mathrm { B } \) 를 10% 에서 25%, (c) \( 21.0 \) 분에서 36 분까지는 용매 B를 25% 에서 45%, (d) \( 36.0 \) 분에서 56 분까지는 용매 B를 45% 에서 100%로 증가하는 농도구배, (c) \( 50.0 \)분에서 \( 50.15 \) 분까지는 유속을 \( 1.20 \mathrm { ml } / \mathrm { min } \) 중가, (f) \( 82.0 \) 분에서 \( 82.15 \) 분까지는 용매 \( \mathrm { B } \) 를 \( 100 \% \) 로 조절, \( ( \mathrm { g } ) 92.0 \) 분에서 \( 92.15 \) 분까지는 유속을 \( 1 \mathrm { ml } / \mathrm { min } \) 감속, (h) 99 분에서는 sam-ple loop의 세척 및 위의 농도구배를 반복하는 조긴에서 1회 주입량은 \( 20 \mu \mathrm { l } , \mathrm { UV } \) detector의 파장은 \( 280 \mathrm { ~nm } \), 감도는 \( 0.05 \)로 조절하여 분석하였다[29-31]. 표준검량선 작성은 Salicylicacid를 비롯한 14개의 표준물질(Sigma Co, U.S.A)를 meth-anol에 용해시켜 0.1-25 \( \mathrm { gg } / \mathrm { ml } \) 범위의 표준용액을 조제하여 위의 조건에서 HPLC 분석을 실시하고 peak area로부터 검량선을 작성하였다. 추출물과 표준물질의 retention time의 비교는 표준물실을 개별적으로 분석한 젓과 표준물질을 3회 분석한 것의 평균값을 이용하였다.</p>