고정화 및 비고정화 반응조내 세균의 군집은 PCR-denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)로 분석을 하며 수소생산 세균 군집분석을 위해 샘플링을 진행하였고, 5분간 원심분히한 귀 바이오 매스를 회수해 DNA 추출시료로 사용하였다. DNA는 NucleoSpin \( ^{\mathbb{B}} \) Soil kit (Macherey-Nagel GmbH Co., Germany)을 이용하여 추출, 정제하였고, 추출방법은 매뉴얼에 따라 수행으며, genomic DNA는 2 반복으로 추출되었고 DGGE 분석은 추출한 DNA를 주형으로 하여, 16s-rRNA 유전자 단편을 PCR을 통하여 증폭하여 각 PCR 산물은 \( 2 \% \) 아가로즈 겔에서 확인하였다. PCR 증폭산물은 농도구배를 지닌 겔을 이용해 전기영동을 수행하고 Gel Logic 200 imagine system을 이용하여 band의 패턴을 확인하였으며, 세균 군집구조의 주성분 분석 (principal component analysis, PCA)은 DGGE band intensity로부터 Canoco progam (Microcomputer Power, USA)을 이용했다. 상위의 DGGE 분석에서 수행한 것과 동일한 방법으로 DNA를 추출과 수소생산 세균 절대정량을 위한 샘플링을 진행하였으며 bead 및 혐기소화 슬러지 반응조에서 채취한 시료로 절대정량을 분석하였다.
<h2>Denaturing gradient gel electrophoresis를 이용한 수 소생산 세균 군집분석</h2> <p>고정화 및 비고정화 반응조내 세균의 군집은 PCR-denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)로 분석을 하였다. Day 0,10,16,26에 수소생산 세균 군집분석을 위하여 샘플링을 진행하였다. 슬러지는 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 및 동량의 bead를 채취하여 \( 13,200 \mathrm{rpm} \) 에서 5분간 원심분리한 뒤 바이오 매스를 회수하여 DNA 추출시료로 사용하였다. DNA는 NucleoSpin \( ^{\mathbb{B}} \) Soil kit (Macherey-Nagel GmbH Co., Germany)을 이용하여 추출, 정제하였고, 추출방법은 매뉴얼에 따라 수행하였다. 모든 genomic DNA는 2 반복으로 추출되었다. DGGE 분석은 추출한 DNA를 주형으로 하여, 16s-rRNA 유전자 단편을 PCR을 통하여 증폭하였고, 이 때 사용된 primer set은 universal bacterial primer set으로 GC clamp가 달린 341f(5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3')와 \( 907 \mathrm{r} \) (5'-CCCCGTCAATTCATTTGAG TTT-3')을 이용하였다. PCR 반응 혼합물의 조성은 \( 5 \mu l \) 의 \( 10 \times \) bulfer, \( 4 \mu \) 의 \( 2.5 \mathrm{mM} \mathrm{dNTP} \), 각각 \( 10 \mu \mathrm{M} \) 의 primer set \( 1 \mu \mathrm{l}, 5 \mathrm{U} / \mu \mathrm{l} \) 의 \( \Gamma a q \) polymerase \( 0.25 \mu \) l와 DNA 시료를 \( 3 \mu \mathrm{l} \) 를 혼합하여 최종 부피를 \( 50 \mu 1 \) 로 하였다. PCR은 GeneAmp \( { }^{\mathbb{\circledR}}\) PCR system Model 2700(PE Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였고 그 조건은 다음과 같았다: initial denaturation \( 95^{\circ} \mathrm{C}, \) 4분; 30 cycles - denaturation \( 96^{\circ} \mathrm{C}, \) 30초; annealing \( 50^{\circ} \mathrm{C} \), 30초; elongation \( 72^{\circ} \mathrm{C} \), 30초; the final elongation step \( 72^{\circ} \mathrm{C},\) 5분. 각 PCR 산물은 \( 2 \% \) 아가로즈 겔에서 확인하였다. QIAquick PCR purification kit (Qiagen, Netherlands)을 이용하여 정제하였다.</p> <p>PCR 증폭산물은 \( 30 \% \) 에서 \( 70 \% \) 의 농도구배를 지닌 \( 6 \% \) 겔을 이용하여 전기영동을 수행하였으며, 각 well 당 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 의 시료를 loading 하였다. 전기영동 완충액은 \( 1 \times \mathrm{TAE} \) buffer를 사용하였으며, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 100 \mathrm{~V} \) 로 5분간 안정화 시킨 후, \( 50 \mathrm{~V} \) 로 전압을 내려 14시간동안 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 완료된 겔은 \( 1 \times \mathrm{TAE} \) buffer \( 500 \mathrm{ml} \) 와 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 ethidium bromide \( 50 \mu \mathrm{l} \) 를 이용하여 20 분간 염색하고, \( 1 \times \) TAE buffer \( 500 \mathrm{ml} \) 를 이용하여 30분간 탈색 하였으며, 염색 이 완료된 겔은 Gel Logic 200 imagine system을 이용하여 band의 패턴을 확인하였다. 세균 군집구조의 주성분 분석 (principal component analysis, PCA)은 DGGE band intensity로부터 Canoco progam (Microcomputer Power, USA)을 이용하였다.</p> <h2>Droplet digital PCR (ddPCR)을 이용한 수소생산 세균 절대정량</h2> <p>운전한 수소생산 유가배양조에서 운전시작일로부터 Day 0,10,16,26에 수소생산 세균 절대정량을 위한 샘플링을 진행하였다. 상위의 DGGE 분석에서 수행한 것과 동일한 방법으로 DNA를 추출하였다. 각각의 bead 및 혐기소화 슬러지 반응조에서 채취한 시료로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여, Firmicutes, Clostridium tyrobutyricum, Caldicellulosiruptor saccharolyticus, Enterobacter oryzae, Ruminococcus flavefaciens 및 Escherichia coli와 total bacteria, total archaea, total prokarya를 절대정량 분석하였고, 이 때 사용된 primer 및 probe를 Table 1 에 나타내었다.</p> <p>ddPCR 반응 혼합물의 조성은 \( 10 \mu \) l의 PCR premix (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA), 각각 \( 20 \quad u \mathrm{M} \) 의 primer \( 0.9 \mu \mathrm{l}, 5 \mu \mathrm{M} \) 의 probe \( 1 \mu \mathrm{l} \), 그리고 \( \mathrm{DNA} \) 시료 \( 2 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하여, 최종 부피가 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 가 되도록 하였으며, \( \mathrm{QX} 100 \mathrm{TM} \) Droplet DigitalTM PCR system (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 수행 조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 predenaturation을 한 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초간 denaturation, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45초간 annealing, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45 초간 extension을 하여, 이 과정을 40 cycle 수행한 후, 마지막으로 \( 96^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 final extension을 하였다. 정량분석 결과는 ml-sludge 당 측정된 gene copy number로 나타내었다.</p>