세포 발현을 위한 벡터는 개별 cDNA를 pcDNA3.1(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 도입하여 생성되었으며 Opti-MEM을 배양 접시에 첨가한 후, Lipofectamine을 사용하여 벡터를 첨가하였다. 세포를 4일간 배양한 후 트립신을 이용하여 탈착한 후 Coomassie 염색액을 이용하여 콜라겐을 염색하였다. 염색액을 제거한 후 세포에 의해 콜라겐이 분해된 부위를 무색 부위로 관찰하였다. 또한 벡터는 Fugene 6(Roche)를 사용하여 세포에 도입하고 5일 동안 배양하였다. Hematoxylin과 Eosin Y로 세포를 염색하고 증류수로 세척한 후 멤브레인이 있는 슬라이드 글라스로 옮겼다. 캐나다 발삼을 추가하고 그 위에 커버 글라스를 얹었습니다. 세포를 현미경으로 세었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약</h2> <p>DMEM를 비롯한 동물세포 배양에 필요한 시약은 Gibco(Gaithersburg, MD, USA)에서, 송아지 혈청은 Biowhittaker(Walkersville, MD, USA)에서 구입하였다. Lipofectamine2000은 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서, Fugene 6는 Roche에서, GM6001는 Chemicon (Temecula, CA, USA)에서 구입하였다. 그 외 일반 시약은 Sigma (St. Louis, Mo, USA)와 덕산 케미칼(Seoul, Korea)에서 구입하였다.</p> <h2>플라즈미드 제작 및 동물세포 배양</h2> <p>인간 MT1-MMP의 cDNA는 미시간대학의 와이스(Stephen Weiss) 교수로부터 얻었으며 카베올린-1의 cDNA는 경*대학교 김*원교수로부터 얻었다. 세포에서 발현하기 위한 벡터는 각 cDNA를 pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 삽입하여 만들었다. MT1-MMP의 돌연변이형 △CT는 세포질에 있는 부위(cytoplasmic tail)를 제거한 것이고, E240은 효소의 활성부위인 240번 글루탐산을 아스파르트산으로 치환한 것이며, MT1-MMP의 돌연변이형은 프라이머를 제작하여 PCR에 의해서 만들었다. 동물 세포는 항생제와 송아지 혈청(FBS)이 \(10\%\) 포함된 DMEM 배지에서 \(37^ {\circ} \mathrm{ C } \), \(5\%\) 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 벡터를 세포 내 주입하기 위한 시약은 Lipofectamine (Invitrogen)을 사용하였다.</p> <h2>젤라틴 zymography</h2> <p>Zymography는 \( 2 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) 젤라틴이 포함된 \( 8.4 \% \) 폴리아크릴아마이드 SDS 젤을 사용하였다. 전기 영동한 젤을 \( 2.5 \% \) Triton X-100에 넣어 30분간 혼들어 SDS를 제거한 후 \( 5 \mathrm{~mM} \ \mathrm{CaCl}_{2} \)와 \( 1\ \mu \mathrm{M}\ \mathrm{ZnCl}_{2} \)이 포함된 \(50 \mathrm{~mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}\), \(\mathrm{pH} ~7.6\)에 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응시키고 \( 0.1 \% \) Coomassie용액에서 1시간 염색한 다음 염색액을 제거한 후 관찰하였다.</p> <h2>콜라젠 분해 활성 측정</h2> <p>쥐꼬리에서 분리하여 동결건조를 시킨 콜라젠을 \( 0.2 \%\) 아세트산에 녹여 \(2.8 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \)되게 녹여 콜라젠 용액을 준비하였다. 콜라젠 코팅된 표면은 콜라젠 용액, \( 0.34\mathrm{~N} \mathrm{~NaOH} \)와 \(10\times\) 농축된 DMEM를 8:1:1 비율로 섞은 용액으로 12-well 표면에 얇게 바른 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 동안 건조시켜 준비하였다. 건조된 콜라젠 코팅된 표면을 증류수로 세척한 후 \( 1 \times 10^{4} \) 세포를 콜라젠 막표면 중앙에 떨어뜨리고 밤새 배양하였다. 배양접시에 Opti-MEM을 넣은 후 Lipofectamine을 이용해서 벡터를 넣고 4일간 배양한 후, 트립신으로 세포를 떨어뜨린 후 Coomassie 염색 용액으로 콜라젠을 염색하고 염색액을 제거하여 세포에 의한 콜라젠 분해에 의해 염색되지 않은 부위를 관찰하였다. 콜라젠 분해의 정량은 Gel Doc XR system(Bio-rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 Quantity One®에 의해서 계산하였다.</p> <h2>세포 이동(cell migration) 측정</h2> <p>Trans-well \( (8\ \mu \mathrm{m} \) pore size, Costar) 표면을 \( 1 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) 콜라젠 용액으로 막을 입힌 후, 혈청이 첨가된 DMEM에 30분간 담가 둔 후 웰의 안 쪽에 \( 4 \times 10^{4} \)개 세포를 첨가하고 밤새 배양하였다. Fugene 6 (Roche)를 사용하여 세포에 벡터를 주입하여 5일간 배양한 후, Hematoxylin과Eosin Y를 사용하여 세포를 염색하고 증류수로 세척 후, 막을 슬라이드 유리에 놓고 canada balsam을 넣은 후 커버글래스를 덮고 세포를 계수하였다.</p>