맥문동탕 열수추출물의 에틸아세테이트 분획물(MW-EA)의 hesperidin과 narirutin 함량을 확인하기 위해 HPLC 분석을 YMC Triart C18, Agilent 1260 Infinity 장비로 수행하였다. CCD-986sk cell과 HEM glowth medium 배지를 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 배양하고 MTT assay를 사용하여 시료의 세포 독성을 측정하였다.
<h2>HPLC 분석</h2> <p>맥문동탕 열수추출물의 에틸아세테이트 분획물(MW-EA)이 포함하고 있는 hesperidin과 narirutin의 함량을 확인하기 위해 Table 1의 조건에서 분석을 수행하였다. HPLC 분석에 사용된 칼럼 및 장비는 YMC Triart \( \mathrm { C } 18(4.6 \times 250 \mathrm { ~mm } \), I.D. \( 5 \mu \mathrm { m } \), YMC Co., Ltd., Kyoto, Japan)과 Agilent 1260 Infinity(Agilent, Folsom, CA, USA)를 사용하였다. 시료의 standard 물질 함량에 대한 분석은 '의약품 등 분석법 의 벨리데이션 가이드라인(식품의약품안전처)'을 참고하여 수행하였다.</p> <h2>세포 배양</h2> <p>세포 배양은 DMEM/high glucose (10 \% FBS, \( 1 \% \) penicillin/streptomycin 첨가) 배지와 HEM glowth medium \( (0.68 \% \) Freezing medium, 1 \% penicillin/streptomycin 첨가) 배지를 사용하여 CCD-986sk cell과 \( \mathrm { HEM } \) cell을 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 배양하였다.</p> <h2>MTT assay에 의한 세포 독성 측정</h2> <p>시료의 세포 독성을 확인하기 위해 96 well plate에 CCD- \( 986 \mathrm { sk } \) 와 \( \mathrm { HEM } \) 세포를 \( 1 \times 10 ^ { 4 } , 3 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { cells } / \mathrm { well } \) 로 분주하고 24 시간동안 안정화시켰다. 그 후 시료를 농도별로 처리하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 의 조건으로 incubator에서 48 시간 동안 배양하였다. \( 5 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) 의 MTT 시약을 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>항산화 활성 측정</h2> <p>항산화 활성 검증은 \( \mathrm { DPPH } \) radical scavenging[18]과 \( \mathrm { ABTS } \) radical scavenging[19] 그리고 \( \mathrm { ROS } _ {\mathrm { G } } \mathrm { Glo } ^ {\mathrm { TM } } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) assay kit를 사용하여 측정하였다. \( \mathrm { ROS } \) 생성량 측정의 경우 96 well plate에 CCD-986sk cell을 \( 1 \times 10 ^ { 4 } \) cells/well의 양으로 분주하여 시료를 처리하고 \( \mathrm { ROS } \) 발생양을 microplate reader로 측정하였다.</p>