연근 추출물 및 용매 별 분획물들의 흡광도를 측정하고, Blois의 방법에 준하여 DPPH에 대한 수소 공여 능을 측정하였다. 항산화 지수는 Joo 등의 방법으로 측정하고, Kato 방법 준하여 아질산염 소거능을 측정하였다. 실험은 3회 반복 시행하였고, 실험 결과는 SPSS 통계를 이용하여 평균과 표준오차를 계산하였다. 각 실험군의 평균치 간의 유의성은 Tukey's test로 검정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험재료</h2><p>연근(Nulumbo nucifera G.)은 2003년 4월 전남 무안에서 재배되어 시판되고 있는 것을 구매하여 수세하고 음건한 다음 blender(Braun MR 350. CA. USA)로 조분쇄하여 시료로 사용하였다.</p><h2>연근 에탄올 추출</h2><p>검색용 생리활성 물질은 건조 시료 \( 100 \mathrm{~g} \) 당 \( 80 \% \) 에탄올 \( 500 \mathrm{ml} \)을 첨가한 후 환류냉각관을 부착한 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 의 heating mantle에서 3시간 동안 3회 추출한 다음 Whatman filter pa-per(No. 2)로 여과하였다. 이것의 일부를 \( 110^{\circ}\mathrm{C} \) 에서 건조시킨 후 고형분 함량을 추출물 수율로 계산한 다음 시료의 산화방지를 위해 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 냉동 보관하면서 사용하였다.</p><h2>에탄올 추출물의 분획</h2><p>\( 80 \% \) 연근 에탄올 추출물을 극성을 달리한 용매별로 분획하여 Fig. 1과 같이 분획물을 얻었다. 농축한 추출물을 증류수에 희석한 후 n-hexane, chloroform, ethylacetate, n-buta-nol, 증류수(water) 순으로 각각 분획여두에서 3회 연속 반복 추출한 다음 rotary vacuum evaporator로 유기용매를 증발 시킨 추출물을 동결 건조시켜 고형물 함량을 산출하였다.</p><h2>총 polyphenol 함량</h2><p>용매별 분획물의 총 polyphenol 함량은 AOAC 법에 의하여 측정하였다. 연근 추출물 및 용매별 분획물 \( 1 \mathrm{ml} \)를 취하고 \( 2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 용액 \( 1 \mathrm{ml} \)를 가하여 3분간 방치한다음, \( 50 \% \) Folin-Ciocalteu 시약 \( 0.2 \mathrm{ml} \) 를 가하여 반응시켜 750 \( \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 tannic acid \( 0.01 \) \( \mathrm{g} \) 을 증류수 \( 10 \mathrm{ml} \)에 녹인 후 최종 농도가 0,0.2,0.4,0.6,0.8 및 \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 용액이 되도록 조제하고 이를 일정량 취하여 위와 같은 방법으로 \( 750 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 계산하 였다.</p><h2>1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) radical 소거능</h2><p>시료의 전자공여능 측정은 Blois의 방법에 준하여, 연근 에탄올 추출물 분획들의 DPPH에 대한 수소공여능을 측정하였다. 일정 농도의 시료 \( 2 \mathrm{ml} \) 에 \( 2 \times 10^{-4} \mathrm{M} \) DPPH 용액 (dissolved in \( 99 \% \) ethanol) \( 1 \mathrm{ml} \)를 가하고, 잘 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시켰다. 이 반응액은 \( 517 \mathrm{~nm} \) 흡광도에서 전자공여능(electron donating ability)으로 측정하였으며, 각 분획의 억제능은 대조군에 비하여 DPPH free radical을 \( 50 \% \)억제하는데 요구되는 함량 \( \left(\mathrm{RC}_{50}\right) \)과 비교하였다. 3회 반복 실험하여 얻은 결과를 평균한 값으로 나타내었다. 이때 활성비교를 위하여 합성항산화제인 butylated hydroxytoluene(BHT)를 사용하여 같은 방법으로 DPPH에 대한 수소공여능을 측정하였다.</p><h2>항산화지수</h2><p>항산화지수는 Joo 등의 방법에 의하여 Rancimat (Metrohm 679, Herisan, Switzerland)을 이용하여 측정하였는데, 분획에 포함된 용매를 완전히 제거한 후 각 분획의 함량이 \( 600 \mathrm{ppm} \) 이 되도록 soybean oil(Sigma Co., USA)에 첨가하고 초음파(Ultrasonic processor, UCX-750, USA)를 이용하여 시료 추출물과 유지가 잘 혼합되도록 하였다. 항산화지수의 측정 조건은 시료 \( 3.0 \mathrm{~g} \) 를 반응용기에 취하고 증류수 70\( \mathrm{ml} \) 을 측정용기에 넣은 후 \( 110^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 air flow rate를 \( 20 \ell \)\( / \mathrm{hr} \) 로 하여 산화 안정성을 비교하였다. 항산화지수 (antioxidant index, AI)는 분획을 첨가한 실험구의 유도시간을 분획을 첨가하지 않은 대조구의 유도시간으로 나눈 값으로 구하였고, 모든 측정치는 3회 반복 시험하여 얻은 값의 평균치로 표시하였다. 기존의 상업용 합성항산화제인 BHT를 연근 에탄올 분획들과 동일하게 유지에 첨가하여 비교 실험하였다.</p><h2>아질산염 소거능</h2><p>Kato 등의 방법에 준하여 아질산염 소거능을 측정하였는데, \( 1 \mathrm{mM} \mathrm{NaNO} \) 용액 \( 2 \mathrm{ml} \) 에 연근 에탄올 추출물 각 분획별 일정 농도의 시료 \( 1 \mathrm{ml} \)를 가하고 \( 0.1 \mathrm{~N} \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} \) 1.2),\( 0.2 \mathrm{M} \) citrate hosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 4.2, \( \mathrm{pH} \) 6.0)로 각각 \( \mathrm{pH} \)를 보정한 다음 반응액의 부피를 \( 10 \mathrm{ml} \)로 정용하였다. 용액을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 반응시킨 후 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 취하고 \( 2 \% \) 초산 5\( \mathrm{ml} \) 와 \( 30 \% \) 초산에 용해한 Griess 시약(1\% sulfanylic acid :\( 1 \% \) naphthylamine \( =1: 1) 0.4 \mathrm{ml} \) 를 가하여 15 분간 방치한 다음 \( 520 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 증류수 \( 0.4 \)\( \mathrm{ml} \)를 가하여 상기와 동일한 방법으로 측정하여 잔존하는 아질산 양을 구하였으며, 아질산염 소거능은 분획을 첨가하기 전과 후의 아질산염 백분율(\%)로 표시하였다. 실험결과는 3회 반복 시험의 평균값으로 하였다.</p><p>\( \mathrm{N}(\%)=1-\frac{(A-C)}{B} \times 100 \)</p><ul><li>\(N\) : Nitrite scavenging ability</li><li>\(A\) : Absorbance of \( 1 \mathrm{mM} \mathrm{NaNO}_{2} \) added sample after standing for 1 hr</li><li>\(B\) : Absorbance of \( 1 \mathrm{mM} \mathrm{NaNO}_{2} \)</li><li>\(C\): Absorbance of control</li></ul><h2>지질과산화 억제효능</h2><p>지질과산화 억제효과는 Ottolenghi 방법을 변형하여 기질 용액 0.1M phosphate buffer( \( (\mathrm{pH} \) 7.0)와 ethanol을 \( 4: 1 \)로 혼합한 용매에 linoleic acid를 \( 0.03 \mathrm{M} \) 이 되도록 첨가하였다. 기질 용액 \( 2 \mathrm{ml} \) 에 \( 0.1 \mathrm{M} \) phosphate buffer(pH 7.0) \( 19.2 \)\( \mathrm{ml} \) 와 각 분획별 시료가 \( 600 \mathrm{ppm} \) 이 되도록 첨가한 다음 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 항온기에서 진탕하면서 혼합액 \( 2.0 \mathrm{ml} \)을 취하여 분석하였다. 위 혼합액 \( 2.0 \mathrm{ml} \)에 \( 35 \% \) trichloroacetic acid(TCA) \( 1.0 \mathrm{ml} \) 와\( 0.75 \% \) TBA \( 2.0 \mathrm{ml} \) 를 가한 다음 30초 동안 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 진탕수욕상에서 40분 동안 반응시켰다. 이 반응액을 실온에서 냉각시켜 acetic acid \( 10 \mathrm{ml} \) 와 chloroform \( 2 \mathrm{ml} \) 를 가하여 진탕시킨 다음 4,500 \( \times \mathrm{g} \) 에서 5분 동안 원심분리하여 상징액의 흡광도를 \( 532 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다.</p><p>\( \begin{aligned} \text { 지질과산화 억제활성 }(\%)=&\left(\mathrm{A}_{\text {control }}-\mathrm{A}_{\text {sample }}\right) /\left(\mathrm{A}_{\text {control }}-\mathrm{A}_{\text {blank }}\right) \\ & \times 100 \end{aligned} \)</p><p>\( \mathrm{A}_{\text {control : }} \) 대조군(분획물 미첨가)의 흡광도\( \mathrm{A}_{\text {sample : 실험군(분획물 첨가)의 흡광도 }} \)\( A_{\text {blank : 대조군(증류수 첨가)의 흡광도 }} \)</p><h2>통계처리</h2><p>본 실험은 3회 반복 시행하였으며, 실험에서 얻은 결과는 SPSS통계 package를 이용하여 실험군 당 평균과 표준오차를 계산하였고, 일원배치 분산분석(one-way analysis of var-iance)을 한 후 \( \mathrm{p}<0.05 \) 수준 에서 Tukey's test에 의하여 각 실험군의 평균치간의 유의성을 검정하였다.</p>