독성 남조류의 대발생을 조기에 예측하고 신속대응을 위한 검출방법이 필요하다. LC/MS (Liquid-Chromatograph/Mass Spectrometer)법 분석하고 있으나 복잡하고 많은 시간이 소요된다. Real-Time PCR법을 이용하여 마이크로시스틴 시험방법을 정립하고 , LC/MS법과 상수원수(표층수)와 정수처리 공정별 시료를 대상으로 마이크로시스틴 분석을 실시하고 그 검출방법을 비교 평가한다.
<p>국내에서도 상수원수를 중심으로 주로 Microcystis spp..에 의한 수화가 빈번하게 발생하고 있으며, 이들에 의해 생성된 마이크로시스틴의 농도가 구체적으로 보고된 바 있다. 현재 마이크로시스틴 농도는 남조류 독소분석 지침에 의해 LC/MS (Liquid-Chromatograph/Mass Spectrometer)법 분석하고 있으나 복잡하고 많은 시간이 소요되어 검출 시 신속하게 대처하는데 어려움이 있다. 하지만, 대부분의 식수를 낙동강 상수원수로부터 공급받는 우리의 여건을 고려할 때, 독성 남조류의 대발생을 조기에 예측할 수 있는 검출방법의 도입은 적절하고 신속한 대응을 위해서도 반드시 필요하다.</p> <p>본 연구는 mcy gene을 target으로 하는 primer를 대상으로 현재 가장 많이 사용되고 있는 PCR법 보다 진보된 방법이며 국내에서는 아직 적용사례가 없는 Real-Time PCR법을 이용하여 먼저 마이크로시스틴 시험방법을 정립하고 아울러 마이크로시스틴 표준시험방법인 LC/MS법과 동시에 상수원수(표층수)와 정수처리 공정별 시료를 대상으로 마이크로시스틴 분석을 실시하고 그 검출방법을 비교 평가하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>표준균주 및 배양</h2> <p>실험에 사용된 남조류는 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받은 3개의 Microcystis aeruginosa (AG30001, AG30082, AG30083) 균주들을 이용하였다. 실험을 위해 균주들은 약 \( 30 ~ \mu \mathrm { mol } \) photon \( \mathrm { m } ^ { -2 } \mathrm { ~s } ^ { -1 } \)의 조도와 \( 25 \pm 1 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 온도에서 CB 배지를 사용하여 배양시켰다.</p> <h2>현장시료 및 정수공정별 시료</h2> <p>현장시료인 표층수는 남조류 수화현상이 발생한 2009년 6월에서 9월 사이에 부산시 상수원수인 물금 · 매리 지점에서 채취한 시료(\(10 \mathrm{~l}\))를, 정수처리 공정별 시료(\(4 \mathrm{~l}\))는 화명 · 덕산 정수장을 대상으로 3회 분석하였다. 출현한 남조류 종 동정은 도립 현미경(Zeiss Axiovert 135M, Germany) 400~1,000배에서 실시하여 확인하였고 남조류 군체는 증류수로 씻어낸 후 시료를 Falcon tube (USA)에 넣어 분석 때까지 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 보관하였다.</p> <h2>LC/MS법</h2> <p>마이크로시스틴 분석을 위한 LC/MS법은 환경부에서 규정한 지침을 근거로 정제, 용출 그리고 농축과 같은 전처리를 한 후 분석을 실시하였다.</p> <h2>DNA 추출 및 정제</h2> <p>배양 및 현장에서 채취한 남조류 시료의 DNA는 Quigen kit (QIAamp DNA mini kit)를 이용하여 추출하였다. 먼저 배양액 시료 \( 1 \mathrm { ml } \)를 ATL Buffer \( 180 ~ \mu l \)와 Proteinase K ( \( 20 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \) \( 20 \mu l \)를 넣고 잘 섞은 후 \( 56 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1시간 이상 반응시켰다. 반응 후 각 tube에 \( 200 \mu l \) AL buffer를 첨가하여 15초간 조심스럽게 혼합(vortexing)하고 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 10분간 반응시켰다. 반응 후 \( 200 \mu l \) ethanol \( (100 \%) \)를 넣고 15초 정도 inverting하여 QIAamp spin column에 넣어 \( 8,000 \mathrm { rpm } \) , 5분간 원심 분리하였다. 여기에 \( 500 ~ \mu l\) AW 1를 넣고 같은 조건으로 원심분리 한 후 다시 \( 500 ~ \mu  l \) AW 2를 첨가하여 \( 14,000 \mathrm { rpm } \), 3분간 원심분리하여 세척하였다. 여기에 AE buffer \( 200 \mu l \)를 넣어 5분간 반응 시킨 후 \( 8,000 \mathrm { rpm } \), 1분간 원심분리한 후 이를 PCR의 주형으로 사용하였다.</p>