실험 재료로 Physalis alkekengi var. francheti의 뿌리로부터 분리된 Fusarium proliferatum KGL0401를 사용하고, Czapek's 액체배지를 기본배지로 하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 180 \mathrm { rpm } \)으로 7일 동안 배양하고, 배양액으로부터 HPLC 분석시료를 얻어 실험을 수행했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>Physalis alkekengi var. francheti의 뿌리로부터 분리된 Fusarium proliferatum KGL0401을 이용하여 본 실험을 수행하였다.</p> <h2>배지 및 배양조건</h2> <p>기본 배지는 Czapek's (1% glucose, \( 1 \% \) Bacto-peptone, \( 0.1 \% ~ \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } , ~0.05 \% ~ \mathrm { KCl } , 0.05 \% ~ \mathrm { MgSO } _ { 4 } \cdot 7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } , 0.001 \% \) \( \mathrm { FeSO } _ { 4 } \cdot 7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } , \mathrm { pH } 7.3 \pm 0.2 \) ) 액체배지를 이용하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 180 \mathrm { rpm } \)으로 7일 동안 배양하고, 탄소원으로서 fructose, glucose, lactose, maltose, 또는 sucrose을 사용하였고, 질소원으로서 \( \mathrm { KNO } _ { 3 } \), urea, glycine, \( \mathrm { NaNO } _ { 3 } \), 또는 \( \mathrm { NH } _ { 4 } \mathrm { Cl } \)을 사용하였다.</p> <h2>GAs 분석</h2> <h3>내생 gibberellins의 추출</h3> <p>7일 동안 미생물을 배양한 후 배양액을 membrane filter로 여과시킨 후 \( 6 \mathrm { ~N } \mathrm { HCl } \)을 이용하여 pH를 \( 2.5 \)로 조절하였으며, 내부표준물질로는 \( 20 \mathrm { ng } \)의 \( \mathrm { GA } _ { 1 } \), \( \mathrm { GA } _ { 3 } \), \( \mathrm { GA } _ { 4 } \), \( \mathrm { GA } _ { 7 } \) 그리고 \( \mathrm { GA } _ { 53 } \)을 추출하기 전 배양액에 첨가하여 내부표준물질로 사용하였다. 배양액에 동일한 양의 ethyl acetate를 첨가하여 3개로 나눈 후 ethyl acetate를 휘발시키고 \( 60 \% \) methanol로 희석한 후 \( 2 \mathrm { N~ } \mathrm { NH } _ { 4 } \mathrm { OH } \)로 pH를 8.3으로 조정하였다. 시료는 \( \mathrm { C } _ { 18 } \) column( \( 90 \sim 130 \mu \mathrm { m } \), \(60 \dot { A } \) pore size, Altech)을 통과시킨 후 감압농축하였다. 농축된 잔사는 \( \mathrm { Celite } / \mathrm { SiO } _ { 2 } \) column(용매 formic acid로 포화된 ethyl acetate : hexan = 95 : 5)으로 통과시킨 여액을 감압농축하여 인산완충용액 \( ( \mathrm { pH } \) 8.0)에 녹인 다음 \( 2 \mathrm { ~N } \mathrm { NaOH } \)로 pH를 8 9로 조정하고 인산 완충용액을 이용하여 3회 분획한뒤 여액(인산완충용액)에 PVPP를 가하여 1 시간 동안 진탕하였다. 여과한 여액의 pH를 \( 6 \mathrm { ~N } \mathrm { HCl } \)을 이용하여 2.5로 조정한 후 ethyl acetate로 3회 분획한 후 감압농축하였다. 농축한 잔사를 methanol에 용해 시켜 \( 0.2 \mu \mathrm { m } \) membrane filter로 여과한 후 HPLC용 분석시료로 사용하였다.</p>