다양한 농도의 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 용액을 첨가했을 때, 최종농도 \( 50 \% \)에서 침전시켜 얻은 분획이 가장 높은 활성을 보였고, neutral saline으로 투석된 용액을 Sephadex G-200 affinity chromatography하는 방식으로 lectin을 분리해냈다. 이 때 2-5번째 분획에서 활성을 나타냈고, 그 중 3번째 분획에서 가장 높은 단백질 함량과 활성이 드러났다. 이에 따라 이 분획을 활용하여 lectin의 분자량과 최적 반응온도, 열 안정, \( \mathrm{pH} \) 안정성을 측정하였다.
<h1>결 과</h1> <h2>Lectin의 분리</h2> <p>여러 농도의 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 용액을 첨가 하였을 때, \( 50 \% \) 의 최종 농도에서 침전시켜 얻은 분획이 가장 높은 활성을 보였으며, neutral saline으로 투석된 용액을 Sephadex G-200 affinity chromatography하여 lectin을 분리하였다. 이 때 2-5번째 분획에서 활성을 나타냈으며, 이중 3번째의 분획이 가장 높은 단백질 함량과 활성을 나타내었다(Fig. 1). 따라서 이 분획을 사용하여 lectin의 분자량, 최적 반응온도, 열 안정성 및 \( \mathrm{pH} \) 안정성을 측정하였다.</p> <h2>혈액의 특이성과 응집반응 정도</h2> <p>정제된 lectin을 neutral saline \( (\mathrm{pH} \) 7.0)으로 2배수로 연속 희석한 다음, trypsin이 처리된 사람의 ABO 혈액을 사용하여 각각의 혈구 웅집반응을 측정한 결과, A, B, O, AB형 모두에서 응집반응이 일어났으며, B형 혈역이 가장 높은 활성을 보였다(Fig. 2). 따라서 최적 반응온도, 열 안정성 및 \( \mathrm{pH} \) 안정성 조사에 B형 혈액을 사용하였다.</p> <h2>SDS-PAGE와 lectin의 분자량</h2> <p>활성이 가장 높은 분획을 SDS-PAGE한 결과, gel 상에 강도가 높은 두꺼운 band를 확인할 수 있었으며(Fig. 3), 이 band의 분자량을 표준 단백질에 대한 상대이동도와 비교하여 측정한 결과, \( 10.7 \mathrm{kDa} \) 의 저분자량이었다(Fig. 4).</p> <h2>Lectin의 최적 반응 온도</h2> <p>Lectin의 최적 반응온도를 측정하기 위하여, \( 20-70^{\circ} \mathrm{C} \) 의 범위에서 1시간 반응시켜 활성을 측정한 결과, 분리된 lectin의 가장 안정적인 반응온도는 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 로서 이 온도에서 활성이 \( 100 \% \) 로 가장 높았다. \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 부터는 활성이 떨어지기 시작하여 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 이상에서는 매우 낮은 활성을 보였으며, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 이하에서도 같은 경향을 보였다(Fig. 5).</p> <h2>Lectin의 열 안정성</h2> <p>Lectin의 열 안정성을 측정하기 위하여, 분리한 lectin을 \( 40-80^{\circ} \mathrm{C} \) 범위에서 적혈구 응집을 통한 활성을 측정한 결과, lectin은 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 까지는 활성이 매우 안정적이었으며, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 온도에서도 \( 80 \% \) 정도의 활성으로 안정적이었다. 그러나 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 이상에서는 활성이 현저히 떨어져, \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서는 전혀 혈구 응집반응을 보이지 않았다(Fig. 6).</p> <h2>Lectin의 \( \mathrm{pH} \) 안정성</h2> <p>Lectin의 \( \mathrm{pH} \) 에 대한 안정성을 측정하기 위하여, 분리된 lectin을 2.0-10.0까지의 \( \mathrm{pH} \) 에 대해 적혈구 응집 반응을 통한 활성을 측정한 결과, phosphate buffer를 사용한 \( \mathrm{pH} 7.2 \) 에서 활성이 가장 높았으며, acetate buffer와 phosphate buffer를 사용한 \( \mathrm{pH} 4.2-6.2\)까지의 약산성과, tris buffer를 사용한 \( \mathrm{pH} 8.0 \) 의 약알칼리에서 비교적 안정적이었다. Acetate buffer의 \( \mathrm{pH} 3.2 \) 와 \( \mathrm{pH} 9.1\)에서는 활성이 현저히 떨어져, glycine-HCl을 사용한 \( \mathrm{pH} 2.0\)과 tris buffer의 \( \mathrm{pH} 10.0\)에서는 활성이 전혀 나타나지 않았다(Fig. 7).</p>