Ecoli/pTCAN2를 LB 배지에서 밤새 배양한 액을 spectrophotometer, HPLC, TLC 등을 이용하여 생산된 청색 색소인 indigo를 확인하였다. DMF를 첨가하여 침전한 상등액을 취하여 400~700nm의 파장에서 흡광도를 측정하고 Sigma에서 구입한 indigio 시약과 비교하여 확인하였다. indigo 색소 형성능력을 측정하려고 시간 별로 각각의 tube를 꺼내서 원심분리하고 침전물에 DMF를 첨가하여 녹이고 원심분리하고 그 상등액을 취하여 \( 610 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하여 indigo 생성량을 정량하였는데 idigo 색소를 만드는 세포의 활성도는 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 반응 시작 후 30분에서 1시간 사이의 구간에서, 1분간 \( 1 \mathrm { ~nmol } \)의 indigo 형성을 촉매하는 건체세포중량으로 정의한다.
<h2>인디고 확인 및 정량방법</h2> <p>세포배양액에서 생산되는 청색 색소가 indigo 임을 확인하기 위해 spectrophotometer를 이용하는 방법, HPLC(high performance chromatography)법, TLC(thin layer chroma-tography)법을 이용하였다. \( E.~coli/p \)TCAN2을 사용하여 LB 배지에서 밤새 배양한 액을 \( 13,000 \mathrm { ~rpm } \)에서 2 분간 원심 분리한 후 침전물에 \( N, N \)-dimethylformamide(DMF)를 첨가하여 침전된 청색색소를 녹인 다음 원심 분리하여 상등액을 취하여 spectrophotometer(HITACHI, U-3010)를 이용하여 \( 400 \sim 700 \mathrm { ~nm } \)의 파장에서 흡광도를 측정하였으며, Sigma에서 구입한 indigio 시약 \( (50 ~ \mu \mathrm { M } ) \)을 DMF에 녹인 표준액을 이용하여 흡광도를 측정하여 비교 분석하였다. HPLC에 의한 분석법(Agilent 1200 HPLC system)의 경우, 청색 색소를 함유한 배양액을 원심분리 및 2회 증류수로 세척한 후 DMF 용매에 녹인 상등액을 초음파 파쇄법으로 분쇄한 다음 PTCKERING column \( (5 ~ \mu \mathrm { m } , 4.6 \times 250 \mathrm { ~mm } ) \)을 사용하여 \( 70 \% \)methanol 용매로 \( 0.8 \mathrm { ~mL } / \mathrm { min } \)의 유속으로 용출하면서 \(600 \mathrm { ~nm } \)에서 측정하여 표준 indign와 비교하여 그 양을 측정하였다. TLC법의 경우, \( 0.05 \% \) tryptophan을 함유한 LB배지에서 밤새 배양한 배양액 \( 1 \mathrm { ~mL } \)을 원심 분리한 후 침전물을 2회 증류수로 세척 및 원심분리 후 침전물에 dimethylsulfoxide(DMSO) \( 200 ~ \mu \mathrm { L } \)를 첨가하여 현탁 시킨 용액과 표준 indigo 용액을 각각 \( 0.2 \mathrm { ~mm } \) 두께의 silica gel TLC plate(Merck, Germany)를 이용하여 Toluene:Acetone:Choloroform \( = 2: 1: 1 \) 용액으로 전개하여 비교하였다.</p> <h2>인디고 생산촉매 효소할성 측정방법</h2> <p>유도발현 재조합 plasmid인 pTCAN1은 함유한 대장균에서 indole oxygenase를 발현할 경우, colony 1개를 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 ampicillin이 첨가된 LB 배지(LBAp, \( 3 \mathrm { ~mL } \)) 에서 밤새 배양한 후, \( 2 \% \)를 새로운 \( 30 \mathrm { ~mL } \)의 LBAp 배지에 접종 한 다음 \( \mathrm { OD } 0.7 \sim 0.8 \) 정도되면 IPTG를 \( 1 \mathrm { ~mM } \) 첨가하여 청색 indigo 화합물이 생성되기 시작하는 시점까지 배양하였다. 항시발현 재조합 plasmid pTCAN2를 함유한 대장균에서 indole oxygenase를 발현할 경우, colony 1개를 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 LBAp( \(3 \mathrm { ~mL } \))에서 밤새 배양한 후, \( 2 \% \)를 새로운 \( 30 \mathrm { ~mL } \)의 LBAp 배지에 접종 한 다음 청색 indigo 화합물이 생성되기 시작하는 시점까지 배양하였다. 세포배양액 \( 30 \mathrm { ~mL } \) 모두를 각각 \( 13,000 \mathrm { ~rpm } \)에서 1 분간 원심분리 후 3차 증류수로 세척하면서 침전된 indigo 색소를 최대한 많이 제거하였다. 이러한 세척과정을 3회 반복하면서 indigo 색소가 거의 완전히 제거된 세포 침전물에 5배 희석된 LB배지를 \( 8 \mathrm { ~mL } \) 첨가하였다. 먼저 \( 1.5 \mathrm { ~mL } \) tube에 \( 0.1 \mathrm { ~M } \) indole \( 2 ~ \mu \mathrm { L } \)와 LB배지 \(80~ \mu \mathrm { L } \)를 함유한 \( 0.1 \mathrm { ~M } \mathrm { ~K } - \mathrm { Pi } \) buffer( \( \mathrm { pH } 7.4 \))를 \( 400 ~ \mu \mathrm { L } \)를 첨가한 다음 10분간 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 예열시킨 후, 세척된 세포현탁액 \( 100 ~ \mu \mathrm { L } \)를 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) shaking incubator에서 호기적인 조건에서 반응을 진행하였다. Indole oxygenase 효소를 함유한 세포의 indigo 색소 형성능력을 측정하기 위해서 시간 별로 각각의 tube를 꺼내서 원심분리 한 다음 침전물에 DMF를 \( 1.5 \mathrm { ~mL } \) 첨가하여 녹인 후 다시 원심분리한 다음 그 상등액을 취하여 \( 610 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하여 indigo 생성량을 정량하였다. Indole로부터 indigo 색소를 만드는 세포의 활성도는 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 반응 시작 후 30분에서 1시간 사이의 구간에서, 1 분간 \( 1 \mathrm { ~nmol } \)의 indigo 형성을 촉매하는 건체세포중량(dry cell weight)으로 정의하였다. 본 실험은 각 sample당 3회 반복, 동일한 실험을 총 5회 반복하여 그 평균치를 표시하였다.</p>