식물 배양의 MS 배지는 Duchefa 회사의 제품을 사용하고, 이외의 모든 시약은 Sigma에서 구매하여 사용하였다. 본 실험에 활용한 식물 재료는 담배로서, SA의 최적농도를 갖기 위해 기내배양된 담배 식물의 줄기를 3 \( \mathrm{~cm} \) 로 분리하여 10\(^{-6} \mathrm{mM}\), 10\(^{-5} \mathrm{mM}\), 10\(^{-4} \mathrm{mM}\), 10\(^{-3} \mathrm{mM}\), 10\(^{-2} \mathrm{mM}\), 10\(^{-1} \mathrm{mM}\), 1 \(\mathrm{mM}\), 10\( \mathrm{mM} \) 및 10\(^{2} \mathrm{mM} \) MS 배지에 3개씩 접종하여 9주간 배양한 후 농도에 따라 담배 식물의 생장을 검사하였다. 엽록소 함량의 측정은 Inskeep과 Bloom 의 기법을 통해 담배 식물 잎을 5\(^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 DMF 용액에 24시간 동안 보관한 후, 추출물을 8,000\( \times \mathrm{g}\) 에서 5분간 원심분리하였다. Wang 등의 기법을 활용하여 담배 식물 잎에서 rubisco 와 rubisco activase가 포함된 용액을 구분하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약</h2> <p>식물 배양의 MS 배지는 Duchefa 회사(Haarlem, Netherland) 제품을 사용하였으며, 이외의 모든 시약은 Sigma (ST. Louis, USA)로 부터 구입하여 사용하였다.</p> <h2>식물재료 배양 및 생장 측정</h2> <p>본 실험에 사용한 식물 재료는 담배로서, SA의 최적농도를 찾기 위해 기내배양된 담배 식물의 줄기를 3 \( \mathrm{~cm} \) 로 절단하여 10\(^{-6} \mathrm{mM}\), 10\(^{-5} \mathrm{mM}\), 10\(^{-4} \mathrm{mM}\), 10\(^{-3} \mathrm{mM}\), 10\(^{-2} \mathrm{mM}\), 10\(^{-1} \mathrm{mM}\), 1 \(\mathrm{mM}\), 10\( \mathrm{mM} \) 및 10\(^{2} \mathrm{mM} \) SA가 각각 함유된 MS 배지에 3개씩 접종하여 9주간 배양한 후 각 농도에 따른 담배 식물의 생장을 측정하였다.</p> <p>최적농도인 10\(^{-4} \mathrm{mM}\) SA 와 0.2 \( \mathrm{mM}\) \( \mathrm{CdCl}_{2} \cdot 2.5 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 를 사용하여, 대조구(SA와 카드믐 무첨가), SA 처리구, 카드뮴 처리구 및 카드뮴과 SA 혼합구로 구성된 MS배지 상에 각각 기내 배양된 3 \(\mathrm{~cm} \) 의 담배식물 줄기를 치상하여 배양하였다. 11주 후, 4개 실험구들의 생장을 측정하였고, 잎을 사용하여 엽록소 함량 및 rubisco와 rubisco activase의 함량과 활성을 측정하였다.</p> <h2>엽록소의 함량 측정</h2> <p>엽록소 함량의 측정은 Inskeep과 Bloom 의 방법에 의해, 담배 식물 잎을 5\(^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 DMF 용액에 하루 밤 동안 정치한 후, 추출물을 8,000\( \times \mathrm{g}\) 에서 5분간 원심분리하였다. 상등액을 664.5 \(\mathrm{~nm} \) 와 647 \(\mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 아래의 식으로 엽록소 a 와 b 의 함량을 계산하였다. 엽록소 a (\(\mathrm{mg} / \mathrm{g} \) \( \mathrm{fw}) = \) 12.70 \(\mathrm{~A}_{664.5} - \) 2.79 \(\mathrm{~A}_{647} \) 엽록소 b (\(\mathrm{mg} / \mathrm{g} \) \(\mathrm{fw}) = \) 20.70 \(\mathrm{~A}_{647} - \) 4.62 \(\mathrm{~A}_{664.} \)</p> <h2>Rubisco의 분리</h2> <p>Wang 등의 방법을 이용하여 담배 식물 잎에서 rubisco 와 rubisco activase가 함유된 용액을 분리하였다. 액체 질소를 가하여 마쇄한 잎 분말 (20 \(\mathrm{~g}) \) 에 grinding buffer (50 \(\mathrm{mM} \mathrm{BTP} \) \( \mathrm{pH} \) 7.0, 10 \(\mathrm{mM} \mathrm{NaHCO}_{3}\), 10 \(\mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2}\), 1 \(\mathrm{mM} \) EDTA, 0.5 \( \mathrm{mM} \) ATP, 10 \( \mathrm{mM}\) DTT, 1 \(\mathrm{mM} \) PMSF, 1 \(\mathrm{mM} \) benzamidine, 0.01 \(\mathrm{mM} \) leupeptin, 1.5\(\% \) PVPP, 3 \(\mathrm{mM}\) MBT) 를 첨가하여 4\(^{\circ} \mathrm{C} \) 에 교반하면서 4겹의 거즈와 1겹의 miracloth로 여과한 여과액을 16,000 \(\mathrm{rpm} \) 에서 40 분간 원심분리 하였다. 상등액에 solid \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 를 포화 농도가 35\( \% \) 가 될 때까지 천천히 가하면서 4\(^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 교반하였고, 8,000 \(\mathrm{rpm} \) 에서 8 분간 원심분리하여 상등액과 침전물로 분리하였다.</p> <p>상등액에 포화 농도가 55\( \% \) 가 될 때까지 solid \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 를 천천히 가하면서 4\(^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 교반한 후, 8,000 \(\mathrm{rpm} \) 에서 8 분간 원심분리하여 얻어진 침전물에 dissolving buffer 용액 (50 \(\mathrm{mM} \) tricine (\( \mathrm{pH} \) 8.0), 10 \(\mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2}\), 10 \(\mathrm{mM} \mathrm{NaHCO}_{3} \), 10 \(\mathrm{mM} \) DTT, 2 \(\mathrm{mM} \) MBT) 5 \(\mathrm{ml} \) 를 가하고, 17\( \% \) 가 되게 50\( \% \) (w/v) PEG-10K을 첨가하여 4\(^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 교반하였다. 8,000 \( \mathrm{rpm} \) 에서 8 분간 원심분리한 침전물에 DBR 용액을 다시 넣고 다시 한번 8,000 \(\mathrm{rpm} \) 에서 8 분간 원심분리 하였다. 얻어진 상등액을 20 \(\mathrm{mM} \) tris (\( \mathrm{pH} \) 7.5)로 평형화시킨 Q-Sepharose column 에 loading한 후, 0.1-0.5 \( \mathrm{M}\) \( \mathrm{NaCl} \) 용액으로 2.5 \(\mathrm{ml} \) 씩 용출하여 rubisco를 분리하였다.</p>