효모 균주를 배양하고 회수한 뒤 STES 완충용액으로 세척한 후 동일 부피의 유리 구슬을 추가하여 세포를 파쇄하였다. 그 후, ITS1과 ITS4 프라이머를 사용하여 \( 18 \mathrm { S } \mathrm { ~rRNA } \) 유전자의 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 NCBI의 Blast 프로그램을 통해 비교하였고, 이를 통해 계통분류학적 유연관계를 분석하였다. 그리고 이 정보를 바탕으로 Neighbor-joining method을 사용하여 효모 균주의 계통도를 작성하였다.
<h2>효모 염색체 DNA 분리</h2> <p>효모 균주를 \( 200 ~ \mathrm { ml } \)의 YEPD 배지에서 12시간 동안 진탕 배양한 후 원심분리( \( 1,200 \times g, \) 5분)하여 회수한 균체를 \( \mathrm { STES } \) 완충용액( \(0.5 ~ \mathrm { M } ~ \mathrm { NaCl } , 0.2 \mathrm { ~M } \) Tris-HCl, \( 001 \mathrm { ~M } \) EDTA, \( 1 \% \) sodium dodecyl sulfate (SDS), \( \mathrm { pH } ~7.6 \))으로 세척하고 \( 30 ~ \mu \mathrm { l } \)의 STES 완충용액으로 균체를 현탁하였다. 동일부피의 glass bead (Sigma-Aldrich)를 첨가하고 microtube mixer (Advance, Japan)로 5분간 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄액에 \( 200~ \mu \mathrm { l } \) 의 \( \mathrm { TE } \) ( \( 0.01 \mathrm { ~M } \) Tris, \( 1 \mathrm { ~mM } \) EDTA, \( \mathrm { pH } ~8.0 \)) 완충용액과 동량의 phenol/chloroform을 첨가하고 교반한 후 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 원심분리( \( 1,200 \times g, \) 10분)하여 상층액을 회수하였다. \( 3 \mathrm { ~M } \) sodium acetate ( \( \mathrm { pH } ~5.2 \)) 용액 \( 30 ~ \mu \mathrm { l } \)와 \( 900 ~ \mu \mathrm { l } \)의 ethanol을 첨가하고 원심분리한 후 회수한 침전물을 \( 70 \% \) ethanol로 세척하였다. \( \mathrm { RNaseA } \) ( \( 1 ~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \), Thermo Scientific, USA)가 첨가된 \( \mathrm { TE } \) 완충용액을 \( 100 ~ \mu \mathrm { l } \) 첨가하여 염색체 DNA를 얻었다</p> <h2>균주동정</h2> <p>분리된 효모균주의 동정을 위하여 ITS1(5'-TCCGTAGGT GAACCTGCGG-3')과 ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') 프라이머를 사용하여 \( 18 \mathrm { S } \mathrm { ~rRNA } \) 유전자의 염기서열을 분석하였다. 염색체 DNA \( (10 \mathrm { ~ng } ) \)를 주형으로 사용하고 \( 1.25 \mathrm { ~U } \) Taq polymerase (Bioneer, Korea), \( 10 \mathrm { ~pmol } \) primers, \( 0.2 \mathrm { ~mM } \) dNTPs와 10배 농축반응용액( \( 10 \mathrm { ~mM } \) Tris-HCl, \( 50 \mathrm { ~mM } \) KCI, \( 50 \mathrm { ~mM } ~ \mathrm { MgCl } _ { 2 } , ~ \mathrm { pH } ~8.3 \))을 첨가하고 최종 부피를 \( 50 ~ \mu \mathrm { l } \) 로 하여 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 3분간 반응시키고 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분, \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분 반응을 28회 수행한 후, 최종적으로 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분간 반응시켰다. PCR 반응산물은 \( 1.5 \% \) agarose gel을 사용하는 전기영동장치를 이용하여 분석하였고, 약 \( 400 \mathrm { ~bp } \)의 증폭산물의 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 제공하는 Blast 프로그램을 이용하여 염기서열을 비교하여 계통분류학적 유연관계를 분석한 후, Neighbor-joining method을 사용하여 계통도를 작성하였다. 분리된 균주의 탄소원 이용 특성은 API 20C AUX kit (BioMèrieux, France)으로 조사하였다.</p>