In vitro에서 ACC synthase activity가 AdoMet에서 ACC로 전환되는 단계를 조절하는 것에 근거하여 Woeste 등의 방법을 일부 수정하여 실험을 진행하였으며, \( \mathrm { GC } \) 를 이용하여 ACC synthase 활성을 측정하였다. 또한, \( \mathrm { ACC } \) 가 ethylene으로 전환하는 단계에 \( \mathrm { ACC } \) oxidase activity가 작용함을 근거로 하여 Wang and Woodson의 방법을 일부 수정하여 실험을 진행하였으며, PMA가 처리된 완충용액에 뿌리조직 절편 40개와 AVG를 첨가하여 조직 내의 ACC synthase의 활성을 억제시켰다.
<h2>In vitro ACC Synthase (ACS) activity 측정</h2> <p>In vitro에서 ACC synthase activity가 AdoMet에서 ACC로 전환되는 단계를 조절하는 것에 근거하여 Woeste 등[24]의 방법을 일부 수정하여 수행하였다. 시간 별로 배양하여 수거한 뿌리 조직 절편 40 개를 extraction buffer ( \( 250 \mathrm { mM } \), \( \mathrm { pH } 8.0 \), potassium phosphate buffer, \( 10 \mu \mathrm { M } \) pyridoxal phosphate, \( 1 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 2 \mathrm { mM } \mathrm { PMSF } , 5 \mathrm { mM } \mathrm { DTT } \) 로 분쇄 후 원심 분리하였다. 이 중 상등액 \( 1 \mathrm { ml } \) 를 취하여 vial에 옮기고 실리콘 마개로 막고 \( 5 \mathrm { mM } \) AdoMet \( 0.1 \mathrm { ml } \) 를 첨가한 다음, 1 시간 동안 진탕 배양(dark, \( \left .22 ^ {\circ } \mathrm { C } , 170 \mathrm { rpm } \right ) \) 하였다. 배양 후 \( 20 \mathrm { mM } \mathrm { HgCl } 2 \) 용액과 냉각된 \( \mathrm { NaOH } / \mathrm { NaOCl } \) (포화된 \( \mathrm { NaOH } : 5 \% \quad \mathrm { NaOCl } = 1: 1[ \mathrm { v } / \mathrm { v } ]) \) 용엑을 주사기를 이용하여 \( 0.1 \) \( \mathrm { ml } \) 씩 주입하여 얼음에서 10 분 동안 반응시켜 ethylene 생성을 유도하였다. 기체 \( 1 \mathrm { ml } \) 를 춰한 후 \( \mathrm { GC } \) 를 이용하여 ACC synthase 활성을 측정하였다.</p> <h2>In vivo ACC Oxidase (ACO) activity 측정</h2> <p>\( \mathrm { ACC } \) 가 ethylene으로 전환하는 단계에 \( \mathrm { ACC } \) oxidase activity가 작용함을 근거로 하여 Wang and Woodson [23]의 방법을 일부 수정하여 수행하였다. PMA가 처리된 완충용핵 ( \( 0.5 \) \( \mathrm { ml } \) Potassium - phosphate buffer, \( 50 \mathrm { mM } \), \( \mathrm { pH } 6.8 ; 50 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) chloramphenicol)에 뿌리조직 절편 40 개와 \( 0.1 \mathrm { mM } \) AVG (L- \( \alpha \)(2-aminoethoxyvinyl)-glycine)를 첨가한 후, 8시간 동안 진탕 배양(dark, \( 27 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(170 \mathrm { rpm } \)) 하여 조직 내의 ACC synthase의 활성을 억제시켰다. 배양이 끝난 후 뿌리조직 절편을 수거하여 중류수로 세척한 후 \( 1 \mathrm { mM } \) ACC를 처리한 완충용핵 \( (0.5 \mathrm { ml } \) potassium phosphate buffer, \( 50 \mathrm { mM } , \mathrm { pH } 6.8 \)) 에 1시간 동안 배양하였다. 조직 절면을 다시 증류수로 세척하여 완충용액 potassium phosphate buffer ( \( 50 \mathrm { mM } , \mathrm { pH } 6.8 \) ) 에 1시간 동안 진탕 배양한 후 기체 \( 1 \mathrm { ml } \) 를 채취하여 GC를 이용하여 측정하였다.</p>