균주동정을 배양하고 각 종의 항균력을 agardiffusion method를 사용하여 측정하였다. agardiffusion method를 사용하여 ETEC는 37oC 6시간, 나머지 다른 종류의 병원성세균은 37oC 12시간 배양하여 항균력을 측정하였다. 2차로 선발된 유산균의 항균력을 agardiffusion method로 측정하여 결과를 비교하였다.
<h2>항균력 측정</h2> <p>각 장내 병원성세균의 항균력을 측정하기 위하여 agardiffusion method를 사용하였다. Penicylinder(용량 300 μl,ID 6 mm, OD 8 mm, H 10 mm)를 95% ethanol로 적신 후 화염살균하여 중층된 agar plate상에 일정 간격으로 놓은 후각 분리 유산균의 배양액 30 또는 100 μl를 loading하여ETEC는 37oC에서 6시간 배양하여 형성된 저해환의 지름을 비교하였으며 나머지 다른 종류의 병원성세균은 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서12시간이상 배양한 후 생성된 저해환의 지름(mm)을 측정하였다.</p> <h2>배양기간에 따른 배양상등액의 향균력 변화측정</h2> <p>분리된 유산균 중 여러 종류의 인수공통전염병세균에 대한 항균력이 공통적으로 우수한 유산균을 2 차로 선발하여 각 균주를 \( 10 \mathrm { ml } \mathrm { cMRS } \) broth에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 혐기적으로 배양하여 \( 1,2,3 \) 일째 배양액을 각각 원심분리하고 상등액 \( 30 \mu \mathrm { l } \) 씩을 \( S \). Enteritidis가 중층된 YM agar plate 상에 penicyliner에 loading하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 배양기에서 12 시간 배양한 후 저해환의 지름을 측정하였다.</p> <h2>균주동정</h2> <p>균주동정을 위한 16S rDNA 염기서열 분석을 위해 선발된 균주를 RB agar plate에서 배양한 후 생성된 단일 colony를 취하여 AccuPrep Genomic DNA Extraction kit (BIONEERCo., Ltd, Korea)를 사용하여 genomic DNA를 분리하였다.분리된 genomic DNA를 전기영동을 통하여 확인한 후, PCR(GeneAmp PCR System 2700, USA)을 denaturation 95oC/30 sec, annealing \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \)/1 min, extension \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)/1 min의 조건으로 primer 27F (5′ AGAGTTTGATCMTGGCTCAG>)와1492R (5′ TACGGYTACCTTGTTACGACTT>)을 사용하여총 35 cycle 수행한 후 전기영동을 통하여 약 1,500 bp 크기의16S rDNA를 확인하였다. 증폭된 16S rDNA를 AccuPrep PCRPurification kit를 사용하여 이 PCR product를 정제하였다.Automated DNA Sequencer (ABI 3100, Applied BiosystemInc., USA)를 이용하여 염기서열을 분석하였고, primer를 위와같은 27F, 1492R 외에 530F (5′ GTGCCAGCMGCCGCGG>)와 1100R (5′ GGGTTGCGCTCGTTG>)의 4가지를 사용하였다. 이 후 Clustal X software를 사용하여 염기서열을 조합하여 NCBI (The National Center for BiotechnologyInformation, http://www.ncbi.nlm.nih)에서 제공하는 AdvancedBlast search 를 이용하여 GenBank의 염기서열과 비교하여 동정하였다.</p>