시료로 사용된 군소내장은 메탄올을 첨가하여 추출하고, 회전식 진공농축기를 이용해 군소내장 methanol 추출물을 얻었으며, 이 추출물을 계통 분획하고 각 분획층을 감압 농축 후 동결 건조하여 분말로 만들어 시료로 사용하였다. 본 실험에 사용한 암세포주 HepG2, MCF-7, B16-F10 등은 FBS와 penicillin streptomycin이 함유된 flask에 이식한 후 배양하였다.
<h2>시료의 추출 및 분획물 제조</h2> <p>시료로 사용된 군소내장은 수세, 건조하여 분쇄한후 메탄올을 \( 1: 5( \mathrm { ~W } / \mathrm { V } ) \)의 비율로 첨가하여 상온에서 2회 추출하고, 극성과 비극성으로 선별물질을 추출하기 위하여 다시 메탄올과 다이클로로메탄 \( \left ( \mathrm { CH } _ { 2 } \mathrm { Cl } _ { 2 } \right ) \)을 \( 1: 1 \)로 섞은 용액에 2회 추출한 후 회전식 진공농축기로 일정시간 감압 농축시켜 동결건조한 후 군소내장 methanol추출물 \( ( \mathrm { AKM } ) \)을 얻었다. 이 추출물을 hex-ane층 \( ( \mathrm { AKMH } ) \), methanol층(AKMM), butanol층(AKMB) 및 aqueous층(AKMA)으로 나누어 비극성에서 극성으로 계통 분획하고 각 분획층을 감압 농축 후 동결 건조하여 분말로 만들어 시료로 사용하였다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>본 실험에 사용한 암세포주는 인체 간암 세포인 HepG2 (Human hepatocellular carcinoma), 유방암 세포인 MCF-7 (Human breast adenocarcinoma pleural effusion), 대장암 세포인 HT-29 (Human colon adenocarcinoma) 및 마우스 유래의 피부암세포주인 B16-F10 (mouse melanoma)로서 2005년 6월 한국세포주은행으로부터 분양받아 사용하였다.</p> <p>HepG2, MCF-7, B16-F10 세포주는 DMEM medium을 사용하였고 HT-29 세포주는 RPMI1640을 사용하였으며 medium에 \( 10 \% \)의 fetal bovine serum (FBS)와 \( 1 \% 100 \) units/ml의 pen-icillin streptomycin이 함유된 것으로 T-75 flask에 이식한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 monolayer로 배양하였다. 위의 3 종의 세포주는 일주일에 \( 2 \sim 3 \) 회 정도 새로운 배지로 교환하고 flask에 암세포주가 \( 5 \times 10 ^ { 4 } \) cells/ml 정도 증식되면 phos-phate buffered saline (PBS, pH 7.0)으로 2번 세척한 후 tryp- \( \sin \)-EDTA를 치리하여 바닥에서 세포를 분리한 후, 베양액으로 암세포가 골고루 분산되도록 희석하여 T-75 flask에 \( 10 \mathrm { ml } \)씩 분할하여 주입하고 \( 4 \sim 5 \)일마다 계대배양하먼서 실험에 사용하였다. 계대 배양시 각각의 passage number가 10회 이상일 때는 액체질소탱크로부터 새로운 세포를 꺼내어 다시 배양하여 실험하였다.</p>