pTnMod-OKmTs vector를 선별하기 위해, pTnMod-OKmTs에 의해 형질전환된 M.smegmatis 균주를 고체배지에 colony가 형성될 때까지 배양하였다. mycobacteria에서 suicide vector로 사용될 수 있는 pKO vector는 세균 내로의 도입 확률이 낮다. 본 연구에서는 pKO vector를 주형으로 temperature-sensitive suicide vector인 pKOTs vector를 구축하여 이를 해결하였다.
<h2>\( \beta \)-galactosidase 활성 측정</h2> <p>\( \beta \)-galactosidase 활성은 Miller (1972)에 의해 보고된 방법을 토대로 수행되었다.</p> <h2>pTnMod-OKmTs를 이용한 M. smegmatis에서의 mini-transposon에 의한 random mutagenesis</h2> <p>구축된 pTnMod-OKmTs를 이용하여 M. smegmatis 균주를 형질전환 시킨 후, pTnMod-OKmTs vector의 선별을 위한 \( 30~ \mathrm { ug } / \mathrm { ml } \) 농도의 kanamycin이 포함된 \( 7 \mathrm { H } 9 \) 고체배지에 도말하여 colony가 형성될 때까지 5~6일 정도 \(30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다. 생성된 colony를 \(30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 삼분도말을 통해 단일 클론(clone)을 얻은 다음, 이를 \(100 ~ \mathrm { ml } \) 플라스크에 준비된 \(20 ~ \mathrm { ml } \) \( 7 \mathrm { H } 9 \) 액체배지에 kanamycin을 첨가하여 이에 접종하고 \(30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다. \( \mathrm { OD } _ { 600 } \)값이 0.5일 때, 배양액을 \( 10 ^ { -1 } \)으로 시작하여 \( 10 ^ { -5 } \)에서 \( 10 ^ { -6 } \)정도의 희석 배수까지 연속희석법으로 희석하고, 이를 \(100 ~ \mathrm { ul } \)씩 \( 7 \mathrm { H } 9 \) 액체배지에 kanamycin이 첨가된 고체배지 2개에 각각 도말하였다. 같은 sample이 도말되어 있는 두 개의 고체배지 중 하나는 \(42 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서, 나머지 하나는 \(30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다. 이때 \(30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양되어 생성된 colony의 수는 희석된 배양액 내에 존재하는 실질적인 세균 수를 의미하며, \(42 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 배양조건에서 선별된 colony들은 이론적으로 minitransposon에 의한 transposition이 일어난 클론으로 간주하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>pKOTs 구축</h2> <p>일반적으로 suicide vector에 의한 mutagenesis의 방법은 유전자 교환을 기본으로 하며, single-crossover를 통한 목적 유전자로의 selectable marker와 일부가 돌연변이(결실 혹은 삽입)된 목적 유전자 서열의 삽입, 그리고 negative selection을 통한 double-crossover 형질전환체 분리의 두 가지 과정으로 이루어진다. Mycobacteria 내의 homologous recombina-tion은 \( 10 ^ { -3 } \) 이하의 낮은 확률로 일어나기 때문에, 유전자 교환이 일어난 돌연변이를 얻기 위해서는 새로운 유전학적 방법이나 mycobacteria의 낮은 형질전환율 (DNA \( \mu \mathrm { g } \)당 \( 10 ^ { 2 } \sim 10 ^ { 5 } \)의 형질전환체)을 극복하는 것이 필요하다. 효과적으로 돌연변이를 얻기 위한 suicide vector의 조건은 (i) 형질전환에 이용될 vector가 세균 내로 높은 효율로 도입되고, 특정 조건에서 세균 내에서 충분한 양으로 증폭됨으로써 chromo-somal DNA에 삽입될 수 있는 확률이 높아야 하며, (ii) coun-terselection 조건에서 vector를 포함하고 있는 클론이 쉽게 제거될 수 있어야 한다. pKO vector는 selectable marker로서 kanamycin과 hygromycin에 저항성을 가지는 유전자 및 le-undefined (2,6- \( \beta \)-D-fructan 6- \( \beta \)-D-fructosyltransferase; EC 2.4.1.10)를 암호화하는 sacB 유전자를 가지며 mycobacteria의 복제시작점이 존재하지 않기 때문에 mycobacteria에서 sui-cide vector로 사용될 수 있지만, 세균 내로 vector의 도입 효율이 낮아서 확률적으로 homologous recombination에 의한 single-crossover를 얻는데 어려움이 있다. 이점을 극복하기 위하여 본 연구에서는 pKO vector를 주형으로 pKO_F (5'-ATATAAGCTTCGGTCCTCCGATCGTTG-3')와 pKO_R (5'-CCCCGGTACCATGCAACAGAAACTATAA-3')을 pri-mer로 사용하여 hygromycin에 저항성을 가지는 유전자와 sacB 유전자를 포함하는 \(3,944- \mathrm { bp } \) DNA 단편을 얻은 후 Kpnl과 HindIII로 절단하고, pDE vector를 동일한 제한효소로 처리하여 E.coli의 복제시작점인 pUC ori와 pAL500Ts를 포함하는 \(3,918- \mathrm { bp } \) DNA 단편을 얻어 temperature-sensitive suicide vector인 pKOTs vector (7,852 \( \mathrm { ~bp } \))를 구축하였다. pAL500Ts는 \(32 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 또는 그 이하에서는 세포 내에서 안정하게 유지되지만 \(39 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 이상에서는 복제 활성을 잃게 된다. 따라서 mycobacteria를 pKOTs로 형질전환 시킨 후 \(32 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 이하에서 배양할 경우에는 pKOTs는 복제가 가능한 vector로서 기능을 하지만, \(39 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 이상에서는 복제를 하지 못하고 mycobacteria 내에서 suicide vector로 작용한다. 이러한 점을 이용하여 \(32 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 이하에서 vector가 도입된 형질전환체를 선별하여 mycobac-teria 내로의 낮은 DNA 도입 효율을 극복하고, 유전자 교환이 일어날 수 있는 확률을 증가시킬 수 있다. Hygromycin을 포함하는 배지에서 \(39 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 이상으로 형질 전환된 균주를 배양할 경우 suicide vector가 chromosome에 삽입된 single-crossover 형질전환체를 얻을 수 있으며, pKOTs에는 sacB유전자가 존재하기 때문에 \(10 \%~( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) sucrose를 포함하는 배지에서 sacB 유전자를 가지고 있는 균주는 생존할 수 없으므로 dou-ble-crossover가 일어난 돌연변이 후보군을 쉽게 얻을 수 있는 장점이 있다. pKOTs에서 돌연변이 제작을 위한 제한효소로 FindII, EcoRV, Notl, KpnI, Nrul을 이용할 수 있다.</p>