예비실험에서 식물배양세포 20여종의 SOD의 활성을 측정했을 때 가장 활성이 높았던 고구마와 인동 두 가지 캘러스를 각각 다른 조건의 환경에서 배양 후 xanthine oxidase와 cytochrome c를 이용한 McCord와 Fridovich의 방법으로 SOD활성을 측정하고, Towill과 Mazur의 방법으로 2,3,5-triphen-yltetrazolium chloride (TTC)로 세포활력을 측정하며, 세포의 핵 DNA 손상정도를 알아보기 위해 Rojas 등의 방법으로 comet 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>식물세포 및 배양</h2><p>예비실험에서 식물배양세포 20여종의 SOD의 활성을 측정한 결과 활성이 가장 높게 나타났던 고구마(Ipomoea batatas)와 가장 낮게 나타났던 인동(Lonicera japonica)을 본 실험의 재료로 사용하였다. 고구마와 인동세포는 각각 생장점과 접합배에서 유도된 것으로 엽록소가 전혀 함유되지 않은 흰색의 캘러스와 엽록소가 세포 \( 1 \mathrm{~g} \) 당 \( 20 \mu \mathrm{g} \) 이상 함유된 녹화된 캘러스를 사용하였다. 흰색 캘러스는 MS 기본배지에 2,4-D \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \), sucrose \( 30 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)가 함유된 액체배지에서 \( 2^{\circ} \mathrm{C} \) 암상태로 배양하였으며, 녹화캘러스는 LS배지에 NAA \( 0.1+ \) zeatin \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \), sucrose \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)가 함유된 액체배지에서 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 광상태로 배양하였다.</p><h2>SOD 활성 측정</h2><p>조효소액의 조제를 위해 계대배양 후 10일째에 배지를 제거한 세포를 액체질소를 가하여 완전히 마쇄하였다. 마쇄된 세포에 \( 0.05 \mathrm{M} \) 인산완충액 \( (\mathrm{pH} 7.8) \)을 첨가하여 30분간 추출후, \( 4^{\circ} \mathrm{C}\) \(15,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리한 상등액을 조효소액으로 취하였다. SOD의 활성은 xanthine oxidase와 cytochrome c를 이용한 McCord와 Fridovich의 방법에 준하여 측정하였다. 효소활성 측정을 위한 반응액은 \( 10^{-3} \mathrm{M} \) xan-thine \( 2.5 \mathrm{ml}, 10^{-3} \mathrm{M} \) cytochrome c \( 0.5 \mathrm{ml}\), \(10^{-4} \mathrm{M} \) EDTA를 포함한 \( 0.05 \mathrm{M} \) 인산완충액 \( (\mathrm{pH} 7.8)\) \(47 \mathrm{ml} \)을 혼합하여 사용하였다. 효소반응은 반응액 \( 1 \mathrm{ml} \)과 효소액 \( 10 \mu \mathrm{g} \)를 큐벳에 넣은 후, \( 10^{-4} \mathrm{M}\) EDTA를 포함한 인산완충액 \( (\mathrm{pH} 7.8) \)으로 xanthine oxidase \( 10 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하여, \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응시켜 \( 550 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 조사하였다. 흡광도는 정제된 SOD효소(Sigma)를 희석배수별로 표준곡선을 작성하여 시료의 SOD 활성을 계산하였다. 단백질 함량은 Bradford의 방법에 따라 측정하였다.</p><h2>세포활력 및 전해물질 누출측정</h2><p>세포활력은 Towill과 Mazur의 방법으로 2,3,5-triphen-yltetrazolium chloride (TTC)로 측정하였다. \( 2.4 \% \) TTC가 포함된 \( 50 \mathrm{mM} \) 인산완충액 \( (\mathrm{pH}7.5 \))에 일정량의 세포를 넣고, \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 암상태에서 24시간 방치한 후 상등액을 제거하고 \(95\% \mathrm{EtOH} \)로 염색된 색소를 추출하여 \( 485 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 전해물질의 누출량 측정은 paraquat을 처리한 세포를 채취하여 증류수를 넣고, 2시간 동안 진탕한 후 전기전도도를 측정하였다. Paraquat은 원액을 일정농도로 희석한 후 여과멸균을 하였으며, 배지를 포함한 농도가 10, 50, 100 \(\mathrm{mg} / \mathrm{l} \)가 되도록 배지에 직접 주입하였고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)의 광상태를 유지하였다.</p><h2>Comet 분석</h2><p>세포의 핵 DNA 손상정도를 알아보기 위한 comet 분석은 Rojas 등의 방법에 따라, 냉각된 슬라이드에 \( 1.0 \% \) agarose를 도포한 후 세포액 \( 10 \mu \mathrm{l} \)와 \( 1.0 \%\) 저융점 agarose \( 90 \mu \mathrm{l} \)를 혼합하여 슬라이드에 도포하고 커버글라스를 덮어 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 방치하였다. 제조된 슬라이드를 해리용액에 1시간 동안 침지시킨 후, \( 300 \mathrm{~mA} \)에서 25분간 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 각각의 슬라이드를 \( 0.4 \mathrm{M} \) Tris \( (\mathrm{pH} 7.5) \) 용액으로 5분간 2회 세척하고, EtBr로 염색한 후 형광현미경 (\(200 \times\), DM IL, Leica)으로 관찰하였다. Comet 이미지는 'Komet 5.0' software (Kinetic Imaging, UK)를 사용하여 분석하였다.</p>