(+)-Dihydromyricetin 분석을 위해 HPLC 시스템을 사용했으며, HPLC 분석은 표준 정량곡선을 사용했고, 표준물질은 Guilin Natural Ingredient, Inc.에서 구매한 순도 \( 98 \% \)의 제품을 이용했다. 관찰된 (+)-dihydromyricetin 침전물은 IT-Plus 시스템에서 동화상으로 확인했으며 이를 통해 (+)-dihydromyricetin 침전물의 모양을 확인했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>(+)-Dihydromyricetin 시료</h2> <p>본 연구에 사용된 (+)-dihydromyricetin는 Guilin Natural Ingredient, Inc. (Guilin, China)에서 구입한 조추출물(순도: \( 50.0 \%) \) 를 사용하였다.</p> <h2>(+)-Dihydromyricetin 분석</h2> <p>(+)-Dihydromyricetin 분석을 위해 HPLC 시스템(Waters, Milford, MA, USA)을 이용하였다. 분석은 \( \mathrm{C}_{18} \) 칼럼(4.6 \( \times 150 \) \( \mathrm{mm}, 5 \mu \mathrm{m} \), Beckman, USA)을 사용하였다. 이동상은 gradient 조건으로 \( 0.1 \% \) 트리플루오로아세트산/아세토니트릴 \( 90 / 10(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 5분 동안 흘려준 후 \( 30 / 70(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 전환하여 30분 동안 흘려주었다. 유속은 \( 1.0 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \), 시료 주입량은 \( 20 \mu \mathrm{l} \)이며 \( 254 \mathrm{~nm} \)에서 UV에 의해 검출하였다. HPLC 분석은 표준 정량곡선을 이용하였으며, 표준물질은 Guilin Natural Ingredient, Inc. (Guilin, China)에서 구입한 순도 \( 98 \% \)의 제품을 사용하였다.</p> <h2>분별침전(fractional precipitation)</h2> <p>조추출물의 (+)-dihydromyricetin 시료(순도: \( 50.0 \% \) )를 아세톤에 녹인 후 \( (0.1 \mathrm{~g} \) 조추출물 \( / 1 \mathrm{ml} \) 아세톤 \( ) \), 증류수 \( (5 \mathrm{ml}) \)를 교반 \( (350 \mathrm{rpm}) \)하에 한 방울씩 떨어뜨려 용해도 차이를 이용해 (+)-dihydromyricetin 침전을 유도하였다. 반응기 부피는 \( 20 \mathrm{ml} \)이며 반응액 부피는 \( 6 \mathrm{ml} \)이었다. 반응액 부피당 표면적(surface area/working volume, \( \mathrm{S} / \mathrm{V}) \)은 조업이 가능한 최대값 \( \left(0.428 \mathrm{~mm}^{-1}\right) \)으로 고정하여 실험을 수행하였다. \( \mathrm{S} / \mathrm{V} \)는 다음과 같이 계산하였다.</p> <p>\( \mathrm{S} / \mathrm{V}\left(\mathrm{mm}^{-1}\right)=\left[\right. \) 이온교환수지의 총 표면적 \( \left(\mathrm{mm}^{2}\right) / \) 반응액 부피 \( \left.\left(\mathrm{mm}^{3}\right)\right] \)<caption>(1)</caption></p> <p>반응액 부피당 표면적을 증가시키기 위하여 반응기 내부에 음이온교환수지(Amberlite IRA \( 400 \mathrm{OH} \), Amberlite IRA 400Cl, Amberlite IRA 910, Amberlite IRA 96, Amberlite IRA 67, Sigma-Aldrich, Seoul, Korea)와 양이온교환수지 (Amberlite IR \( 120 \mathrm{H} \), Amberlite IR \( 120 \mathrm{Na} \), Amberlite 200, Amberlite IRC 50, Sigma-Aldrich)를 각각 첨가하고 용액의 \( \mathrm{pH} \)를 \( 9.0 \)로 조정한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하여 (+)-dihydromyricetin 침전물을 얻었다. 실험에 사용된 이온교환수지의 입자크기는 16-50 mesh이며 표면적은 구의 표면적 계산 방법으로 구하였다. 이온교환수지는 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하루동안 건조한 후 실험에 사용하였다. (+)-Dihydromyricetin의 분별침전 개략도를 Fig. 2에 나타내었다. 침전 후 (+)-dihydromyricetin 침전물을 여과지 \( (150 \mathrm{~mm} \), Whatman, Buckinghamshire, UK)로 여과하여 침전물을 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 진공오븐(UP-2000, EYELA, Japan)에서 건조하였다. 건조된 침전물의 순도와 수율은 \( \mathrm{HPLC} \)로 분석하였다.</p> <h2>침전물 형태 확인</h2> <p>분별침전공정에서 (+)-dihydromyricetin 침전물 형태를 관찰하기 위해 전자현미경 SV-35 Video Microscope 시스템 (Some Tech, Korea)을 사용하였다. 분별침전 동안 (+)-dihydromyricetin 침전물을 고배율 \( (\times 100) \)에서 관찰하였다. 관찰된 (+)-dihydromyricetin 침전물은 IT-Plus 시스템 (Some Tech, Korea)에서 동화상으로 확인하였으며 이를 통해 (+)-dihydromyricetin 침전물의 형태를 확인하였다[11].</p>