사전에 확보한 180종의 방선균들로부터 희소방선균만을 선별하기 위해, 방선균의 \( 70 \% \)이상을 차지하는 streptomycetes 만을 선별-제외 시키는 전략을 사용하였다.비록 streptomycetes 특이적인 PCR 기반의 genome screening 전략으로도 7종의 Streptomyces sp가 NRSA 균주들로 선별되었지만, 약 \( 90 \% \)이상의 156종의 Streptomyces sp.를 신속한 PCR 스크리닝 방법으로 제거할 수 있었으며, 향후 보다 향상된 NRSA-specific PCR primer 제작을 통하여 희소방선균 선별 정확도를 향상시킬 수 있으리라 사료된다.선별된 NSRA 균주들의 유전체 내에 유용 생리활성산물의 유전정보가 존재하는지를 확인하기 위하여, 방선균 유래 대표적인 2차 대사산물인 type polyketide와 non-ribosomal peptide의 생합성 유전자의 유무를 확인하였다.선별된 NRSA균주들이 실제 배양조건 하에서 생리활성물질을 생산하는지 확인하기 위하여, 항생 및 항진균 bioassay 실험을 수행하였다.항균활성을 좀 더 정확한 수치로 측정하기 위해 배양액을 추출하여 20종의 검색균주를 대상으로 MIC assay를 실시하였고, 시료는 S. aureus에 대한 항균력이 가장 높음이 확인되었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Genome screening \& rare actinomycetes isolation</h2> <p>사전에 확보한 180 종의 방선균들로부터 희소방선균만을 선별하기 위해, 방선균의 \( 70 \% \) 이상을 차지하는 streptomycetes 만을 선별-제외 시키는 전략을 사용하였다. 유전정보 비교를 통하여 streptomycetes 특이적 16S 23S rRNA 부분을 증폭할 수 있는 PCR primer를 제작하였고(Fig. 1A, B), 제작된 PCR primer를 사용하여 방선균 collection으로부터 일차적으로 156종의 streptomycetes를 선별할 수 있었으며, 남은 24종의 방선균들은 추가적인 16S rRNA 염기서열 분석 을 통해 최종적으로 7종의 희소방선균 NSRA(non-streptomycetes rare actinomycetes) 균주들을 선별할 수 있었다 (Fig. 1C). 선별된 NSRA 균주들은 Nocardioides sp. 1종, Nocardiopsis sp. 2종, Pseudonocardia sp. 4종으로 확인되 었다. 이렇게 선별된 7종의 NRSA 균주들을 MMBL005부 터 MMBL011로 각각 명명하였다(Table 1). 비록 streptomycetes 특이적인 PCR 기반의 genome screening 전략으로도 7종의 Streptomyces sp가 NRSA 균주들로 선별되었지만, 약 \( 90 \% \) 이상의 156 종의 Streptomyces sp.를 신속한 PCR 스크리닝 방법으로 제거할 수 있었으며, 향후 보다 향상된 NRSA-specific PCR primer 제작을 통하여 희소방선균 선별 정확도를 향상시킬 수 있으리라 사료된다.</p> <h2>Identification of bioactivities and biosythetic genes present in NRSA strains</h2> <p>선별된 NSRA 균주들의 유전체 내에 유용 생리활성산물의 유전정보가 존재하는지를 확인하기 위하여, 방선균 유래 대표적인 2차 대사산물인 type polyketide와 non-ribosomal peptide의 생합성 유전자의 유무를 확인하였다. type PKS와 NRPS 생합성 유전자에 잘 보존된 부분을 기반으로 primer(A3F: 5'-GCSTACSYSATSTACACSTCSGG-3' and A7R: 5'-SASGTCVCCSGTSCGGTAS-3' for NRPS, K1F: 5'-TSAAGTCSAACATCGGBCA-3' and M6R: 5'-CGCAGGTTSCSGTACCAGTA-3' for PKS-I)를 제작하여, 선별된 7종의 NSRA 균주들의 total DNA로부터 type PKS와 NRPS 존재 여부를 PCR로 확인하였다. 모든 7종에서 NRPS 유전자가 존재함이 확인되었고 일부 균주들에서는 type PKS 유전자도 함께 증폭됨으로써(Fig. 2A), 선별된 NSRA 균주들이 유용 생리활성물질을 생산할 수 있는 가능성이 제기되었다.</p> <p>선별된 NRSA균주들이 실제 배양조건 하에서 생리활성물질을 생산하는지 확인하기 위하여, 항생 및 항진균 bioassay 실험을 수행하였다. 선별된 7종의 NSRA 균주들을 다양한 배지(GSMY, ISP2, modified ISP4, MS, NDYE, R2YE) 에서 성장시킨 후, 각각의 배양액을 유기용매를 사용하여 추출하였다. Agar diffusion 방법을 사용하여 항생효과를 확인한 결과, Nocardiopsis sp. MMBL010에서만 진균류인 한 결과, Candida albicans에 대한 항진균 활성을 확인할 수 있었다(Fig. 2B). 또한 Nocardiopsis sp. MMBL010 균주에서 Grampositive 세균인 Bacillus mycoides와 Gram-negative 세균인 E. coli에 대한 항생효과도 관찰되었다(Fig. 2B).</p> <p>Nocardiopsis sp. MMBL010 균주가 생산하는 물질의 항균활성을 좀 더 정확한 수치로 측정하기 위해 배양액을 추출하여 20 종의 검색균주를 대상으로 MIC assay를 실시하였다(Table 2). 이 추출물은 측정에 사용한 Staphyloccus aureus 4종인 Methicillin 내성 S. aureus(MRSA)인 CCARM 3089, methicillin 감수성 S. aureus 인 CCARM 0201, CCARM 0204 , 및 CCARM 0205에 대해 \( 128 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 의 MIC를 나타내었다. 감수성 Enterococcus faecalis 보다 반코마이신 내성 균주인 E. faecalis(VRE)에서 MIC가 더 높아 이 추출물은 감수성 E. faecalis에 더 효과적임을 확인하였다. 그람 음성 검색 세균에 대한 MIC 값은 모두 \( 512 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 이상을 나타내어 시료는 S. aureus에 대한 항균력이 가장 높음이 확인되었다. MIC assay는 Nocardiopsis sp. MMBL010 균주의 전체 배양액 추출물을 이용하여 측정하였기 때문에 MIC값이 대체로 높게 측정되었다. 항균활성을 나타내는 항생물질만을 정제하여 MIC를 측정하면 더욱 정확한 항균력 수치를 확인할 수 있을 것으로 판단된다.</p> <p>비록 Nocardiopsis sp. MMBL010이 생산하는 생리활성물질의 정확한 구조는 아직 규명되지 않았으나, 이 균주가 갖는 유전적 잠재력과 다활성 특성 등을 감안할 때 향후 매우 유용한 산업균주로 확용될 수 있으리라 확신한다.</p>