H . pylori균은 세포공포독소생성양성이나 음성인 균주로 구분하여 brain heart infusion agar에 접종하고 배양 후 균을 수거하였다. LPS와 SEB는 구입하여 사용하였다. \( \mathrm { TGF } - \beta 1 \) 및 NO 의 생성부유시킨 섬유아세포를 LPS와 SEB 그리고 H . pylori 분해물을 적용시킨 후 배양상층액을 수거하였다. 이렇게 얻어진 배양상층액은 NO 생성 효과측정에 사용하였다.
<h2>섬유아세포 배양상층액의 준비</h2> <h3>LPS, SEB 및 H. pylori 항원의 준비</h3> <p>H. pylori균은 세포공포독소생성양성(KR2067) 혹은 음성(KMC96)인 균주로 구분하여 brain heart infusion agar(brain heart infusion agar with \( 0.1 \% \) yeast extract and \( 5 \% \) human packed red blood cell)에 접종한 후 \( 37 \mathrm { C } , 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에서 5 일 동안 배양한 다음 균만을 수거하였다. 수거된 균을 PBS로 3회 원심세척하였다. 세척된 균액은 \( 100 \mathrm { watt } \) 에서 30 초씩 3 회 초음파분쇄하여 단백정량을 실시한 후 사용하였다. Lipopolysaccharide(LPS)와 Staphylococcus enterotoxin B(SEB)는 Sigma 사(Sigma, St. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다. \( \mathrm { TGF } - \beta 1 \) 및 \( \mathrm { NO } \) 의 생성부유시킨 섬유아세포 \( \left (2.5 \times 10 ^ { 5 } / \mathrm { ml } \right ) 1 \mathrm { ml } \) 싹을 24 wells 배양판( Corning, NY, USA)에 분주한 후 ml 당 LPS \(0.01,( 0.1,1.0 \mu \mathrm { g } \), SEB \( 0.01,0.1,1.0 \mu \mathrm { g } ,\) H. pylori 분해물 \( 0.01,0.1 \), \( 1.0 \mu \mathrm { g } \) 을 각각 작용시킨 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에서 24 ,48, 72 시간 동안 배양하여 배양상층액을 수거하였다. 용량별 시험 well은 triplicate로 시행하였다. 수거된 배양상층액은 \( 300 \mathrm { ~g } \) 에서 30분간 원침시킨 후 그 상층액을 수거하여 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 보관하면서 TGF- \( \beta 1 \) 과 \( \mathrm { NO } \) 생성 효과측정에 사용하였다.</p> <h3>\( \mathrm { TGF } - \beta \) 의 측정</h3> <p>TGF- \( \beta \) 1의 측정은 Human TGF- \( \beta 1 \) Duoset ELISA kit (Genzyme, Cambridge, USA)을 이용하였다.</p>