들잔디의 형질전환은 1998년에 PEG를 활용해 원형질체에 유전자를 도입하는 방법으로 처음 보고되었다. 비록 완전한 형질전환 식물체는 얻지 못했지만, 미숙배에서 배발생한 캘러스에 electroporation을 사용한 유전자 도입법이 보고되었다. Agrobacterium을 사용한 형질전환은 비용이 저렴하고, 도입 유전자 수가 적으며, 큰 분자량의 유전자도 안정적으로 도입 가능하다는 장점을 가지고 있다. 현재까지 공개된 들잔디의 배발생 캘러스를 이용한 Agrobacterium 매개 형질전환 방법을 포함하여 연구소에서 사용 중인 형질전환 과정과 배지 구성을 종합하였다. 그러나 형질전환 들잔디 개발에 대한 연구 결과는 10개 미만으로, 안정적인 형질전환의 어려움을 보여준다.
<h2>들잔디의 형질전환방법에 관한 연구 동향</h2> <p>들잔디의 안정적인 형질전환은 분리한 원형질체에 PEG를 처리하여 유전자를 직접 도입시키는 방법으로 1998년에 처음 보고되었고 (Inokuma et al. 1998), 완전한 형질전환 식물체를 얻지는 못했지만 들잔디 미숙배에서 유도한 배발생 캘러스에 electroporation을 이용하여 유전자를 도입하는 방법이 보고되었다 (Park and Ahn 1998). 그러나 이들 방법들은 재료를 얻기가 쉽지 않은 점, 도입 유전자 수가 많아 후대에 도입 유전자의 불활성화가 자주 발견되는 점, 도입 유전자의 크기에 제한이 있는 점 등으로 인해 최근에는 많이 사용되고 있지 않다. 이에 비해 Agrobacterium을 이용한 형질전환은 경제적이고, 도입 유전자의 수가 적으며, 비교적 분자량이 큰 유전자도 안정적으로 도입이 가능하여 효율적인 형질전환 방법으로 알려져 있다. 들잔디의 Agrobacterium을 매개로 한 형질전환은 성숙종자 유래의 배발생 캘러스를 이용한 연구가 2003년 (Toyama et al.)과 2007년 (Zhang et al.)에 보고되었고 2006년에는 성숙종자 유래의 배발생 캘러스가 아닌 stolon을 이용한 형질전환 방법도 보고되었다 (Ge et al. 2006). 이 중에서 stolon을 이용한 형질전환은 방법이 간단하고 단시간에 형질전환 식물을 얻을 수 있는 장점이 있다고 생각되어 우리 연구소에서도 시도해 보았으나 안정적인 재료의 확보가 어렵고, 무엇보다 식물재료의 오염 제거가 쉽지 않은 문제점이 있어 실제로 형질전환에 적용하기에는 효율적이지 못한 측면이 있다고 판단되었다.</p> <p>현재까지 보고된 들잔디의 배발생 캘러스를 이용한 Agrobacterium 매개 형질전환 방법과 현재 우리 연구소에서 이용하고 있는 형질전환 방법을 종합한 형질전환 과정과 배지조성은 Figure 3과 Table 2에 나타낸 바와 같다.</p> <p>간단히 살펴보면, 선발된 재분화 능력이 좋은 배발생 캘러스를 Agrobacterium 접종 약 1주일 전에 전배양 배지에서 배양하고, Agrobacterium 을 재현탁한 액체감염배지에서 약 24시간 동안 현탁 배양하여 감염 한 후 약 3일간 공동 배양한다. 이 후 bialaphos 또는 phosphinothricin (PPT)을 포함하는 캘러스 선발배지에서 약 3~6주간 배양하며 살아있는 캘러스를 선발한 후 재분화 배지에 치상하고 재분화를 유도한다. 유도된 재분화 식물체는 뿌리를 유도하고 충분히 증식시킨 후 목적유전자의 도입 여부를 확인한다. 매 실험마다 선발 단계별 소요 기간에 상당한 차이가 있지만, 들잔디의 형질전환체 생산에는 대략 6~9개월이 걸리는 것으로 보여진다. 이런 과정을 통한 들잔디의 형질전환 효율은 약 \( 1 \% \) 전후이고, 형질전환에 사용된 배발생 캘러스의 계통에 따라 그 효율 및 재현성에 큰 차이를 보이고 있다. 배발생 캘러스를 이용한 들잔디의 형질 전환에서는 재분화 효율이 높고 Agrobacterium에 감염능이 좋은 배발생 캘러스를 선발하는 것이 가장 중요한 것으로 보이며, Agrobacterium 접종 단계에서의 처리방법 역시 형질전환 효율에 큰 영향을 미치는 것으로 여겨진다. Agrobacterium 접종 전단계로 캘러스를 Agrobacterium 접종 3~7일 전에 전배양배지에 처리하거나 접종 하루 전에 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 의 acetosyringone(AS) 을 첨가한 액체감염배지에 처리하는 방법과 Agrobacterium 배양 시에 acetosyringone을 첨가하는 등 여러 조건이 검토되었고 이와 같은 처리들은 형질전환 효율을 높이는데 효과가 있는 것으로 생각되고 있다. Toyama 등(2003)은 칼슘과 2,4-D를 포함하지 않고 \( \mathrm{pH} \) 를 5.2로 조정한 감염배지 및 공동배양 배지를 사용하여 Agrobacterium 을 접종하면 형질전환 효율이 증대됨을 보고 하였고, Kim 등 (2004)은 particle bombardment를 이용하여 캘러스에 상처를 유발 시킨 후 Agrobacterium을 감염시키면 무처리구에 비하여 3배 이상 높은 형질전환 효율을 보인다는 연구 결과를 보고한 바 있다. 본 연구진은 Agrobacterium 감염 직전의 캘러스를 초음파 처리하여 형질전환 효율에 미치는 영향을 검토 하였는데, 초음파 처리구는 무처리구에 비해 월등히 높은 형질전환 효율을 나타내었다. 그러나 캘러스에 상처를 유발하는 전처리는 감염효율을 증대시키는 효과는 있었지만 박테리아의 과잉증식 등에 의한 영향으로 재분화 효율이 크게 감소하는 문제점이 있었다. 이 외에도 감염 시의 Agrobacterium 농도, 감염시간, 공동배양 기간 등이 형질전환 효율에 미치는 영향이 검토 되었다 (Toyama et al. 2003; Kim et al. 2004; Zhang et al. 2007). 이들 결과를 살펴보면, 감염시의 Agrobacterium 의 농도가 높을수록 그리고 감염시간 및 공동배양 기간이 길어질수록 캘러스로의 유전자 도입 효율은 증가하였으나 박테리아에 의한 오염이 심각하여 공동배양 후의 캘러스를 멸균수 등으로 세정하는 과정을 필요로 했다. 그러나 한번 박테리아에 오염된 캘러스는 세정 등의 과정을 거치더라도 또다시 박테리아의 오염이 생길 가능성이 높고, 재분화 효율 역시 매우 낮아지게 되므로 성공적인 들잔디 형질전환을 위해서는 감염효율을 최대한 높이면서 동시에 박테리아의 과잉 증식이 되지 않는 감염조건의 확립이 필요하였다. 이에 본 연구진은 전배양배지 (Pre-culture I 또는 Pre-culture II 배지)에서 전배양한 캘러스를 Agrobacterium 의 농도를 \( \mathrm{OD}_{600 \mathrm{~nm}}=0.1 \) 로 조정한 감염배지에서 24시간 동안 감염하고 (현탁배양; \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 110 \mathrm{rpm} \) ), 3일간 공동배양 함으로서 박테리아의 오염을 최소화 하면서도 형질전환 효율은 초음파 처리구에 크게 뒤지지 않는 감염 방법을 고안하였다. 또한 위와 같은 연구 결과들을 토대로 수립된 형질전환체계를 이용하여 제초제 저항성, 음지회피성 조절, 환경 스트레스 내성 관련 유전자 등을 도입한 형질전환 들잔디를 제조하여 그 특성을 분석하고 있다. 그러나 형질전환 들잔디 개발 관련 학술지 발표는 현재까지도 10개가 되지 않을 정도로 미미한 결과를 보이고 있는데, 이는 재현성 있고 안정적인 형질전환이 매우 어려움을 단적으로 보여주는 것이라 생각된다. 따라서 다양한 특성을 가진 실용적 가치가 있는 형질 전환 들잔디의 개발을 위해서는 보다 효율적이고 안정적인 조직배양 및 형질전환체계를 확립하기 위한 연구가 지속적으로 수행되어야 할 것으로 판단된다.</p>