혈액이 일절량 흘러나온 뒤 거즈로 간엽을 싸서 조금 팽팽하게 당긴 후 가능한 이중 묶음을 한 부위에 가깝도록 절단하였다. 전체 간의 30\( \% \)만 남겨두는 간부분 절제술을 실행한 후 10일 뒤 배양세포를 비장내에 이식하였다. 배양세포의 비장이식은 간부분 절제술을 시행한 흰쥐의 좌측 늑연골 하부를 소독, 개복하여 흰쥐의 비장을 꺼내어 위장으로 가는 상부의 두 개의 혈관은 결찰하고 다른 혈관은 수술실을 넣어 당겨서 혈류의 흐르지 않게 하였다. 염색은 전자현미경 조직 처리를 하고 표본의 투명화와 수지침투과정은 상온에서 propylene oxide를 사용하여 3회 매회 10분간 실시하고 polyresin을 이용하여 포매한 후 3일 동안 중합하였다.
<h2>간부분 절제술</h2> <p>횐쥐의 복강내로 동물용 sedaject \( (10 \mathrm{mg} / \mathrm{m \ell} \), 삼우화학, 한국) \( 0.1 \mathrm{m \ell} \) 을 투여하여 전마취시킨 후 다시 ketala \(50 \mathrm{mg} / \mathrm{m \ell} \), 유한양행, 한국) \( 0.1 \mathrm{m \ell} \)를 투여하여 마취시켰다. 횡격막을 연결하고 있는 겸상인대를 절개한 후 중간엽과 좌외측엽을 잡아서 수직으로 들어 올려서 기저부 주위의 헐관을 이중으로 묶었다.</p> <p>혈액이 어느 정도 스며 나온 후 거즈로 간엽을 싸서 약간 팽팽하게 당긴 후 가능한 이중 묶음을 한 부위에 가깝도록 절단하였다. 절단 후 베개 받침을 빼고 근육과 피부를 봉합하였으며 gentamycin \( (50 \mathrm{mg} / \mathrm{m \ell} \), 대성미생물연구소, 한국 \( 0.1 \mathrm{~m \ell} \))을 근육주사 하였다. 전체 간의 \( 30 \% \)만 남겨두는 간부분 절제술을 실시한 10일 후 배양세포를 비장내에 이식하였다.</p> <h2>간세포화 줄기세포의 비장내 이식</h2> <p>8일 동안 간세포와 합동배양한 후 \( 0.05 \% \) trypsin- \( 0.53 \mathrm{mM} \) EDTA (GI \( 25300 \)-\(054 \))로 처리하여 줄기세포를 배양용기에서 분리한 후 \( 800 \mathrm{~g} \), 15분간 원심분리하여 trypsin-EDTA 용액을 제거하고 \( 5 \times 10^{3} \) 개 세포 \( / m \ell \)를 \( 26 \mathrm{G} \)의 바늘을 끼운 \( 3 \mathrm{m \ell} \) 주사기에 준비하였다.</p> <p>배양세포의 비장이식은 간부분 절제술을 시행한 흰쥐의 좌측 늑연골 하부를 소독한 후 개복하여 흰쥐의 비장을 완전히 꺼내어 위장으로 가는 상부의 두 개의 혈관은 결찰하고 다른 혈관은 수술실을 넣어 당겨서 혈류의 흐름이 없도록 하였다. 혈류를 차단한 상태에서 비장의 꼬리부분에서 \( 26 \mathrm{G} \)의 주사기를 통하여 배양세포들을 서서히 주입하였으며 주사기를 빼고난 부위에는 피가 흐르지 않도록 수술용 보비를 이용하여 지혈시켰다. 비장은 원래의 위치로 넣고 복막과 복부근육 및 피부의 순으로 봉합하고 gentamycin \(50 \)\( \mathrm{mg} / \mathrm{m} \ell \) \(0.1 \mathrm{~m} \ell \) 를 근육주사 하였다.</p> <h2>광학현미경용 조직표본의 제작</h2> <p>배양세포를 비장내 이식한 후. 시간경과에 따라서 흰쥐를 희생시키고 비장을 채취하였다. 채취한 조직은 neutral buffered formalin( \( \mathrm{pH} \) \( 7.4 \))으로 고정하고 탈수와 청명과정을 거친 후 파라핀으로 포매하여 \( 6 \mu \mathrm{m} \)의 조직절편을 얻어 탈파라핀 하여 함수시켰다. 일반적인 조직학적 소견은 hematoxylin & eosin(H-E) 염색을 시행하고, 면역조직화학적인 transforming growth factor- \( \beta \)(TGF)와 epidermal growth factor(EGF)에 대한 염색은 LSAB Kit(DAKO, USA)를 이용하였으며, 세포자멸(apoptosis)에 대한 염색은 ApopTag peroxidase in situ apoptosis detection kit(Intergen S\( 7100 \), USA)를 사용하였다.</p> <p>면역조직화학을 위한 절편은 탈파라핀 후 \( 3 \% \) hydrogen peroxide에 5분간 반응시킨 뒤 증류수로 수세하고 신선한 Tris 완충액에 5분간 둔 다음 생리식염 인산염 완충액으로 5분 동안 반응시켰다. TGF는 TGF(Santa Cruz Co., USA) 항체로 1시간 반응시킨 후 Tris 완충액 bath에 5분간 두었다. EGF에 대한 반응을 위하여 미리 준비한 면역조직화학 절편에 EGF(Santa Cruz Co., USA) 항체를 1시간 동안 반응시킨 후 Tris 완충액 용기에 5분간 두었다.</p> <p>반응시킨 TGF와 EGF 절편은 생리식염 인산염 완충액으로 만든 biotinylated anti- rabbit와 anti-mouse immunoglobulins로 10분간 반응시킨 후 Tris 완충액으로 수세하고 \( 0.05 \mathrm{M} \) Tris 완충액(\(\mathrm{pH~} 7.6\))으로 제조한 streptoavidin peroxidase 내에서 10분간 둔 다음 다시 Tris 완충액으로 수세 후 Tris bath에 5분간 두었다. 발색반응은 \( 2 \mathrm{m \ell} \)의 기질 완충액을 눈금 있는 시험관에 넣고 각 완충액 \( 2 \mathrm{m \ell} \)마다 AEC chromogen액을1방울씩 첨가하고 즉시 혼합한 다음 완충액 \( 2 \mathrm{m \ell} \) 마다 기질-hydrogen peroxide 용액 1방울씩 첨가하고 즉시 혼합하여 제조한 기질-chromogen 용액으로 10분간 반응시켰다.</p> <p>세포자멸 염색을 위한 조직은 탈파라핀 후 수화시키고 염색용기에 넣어서 \( 0.05 \mathrm{M} \) 생리식염 인산염 완충액로 제조한 \( 2 \% \mathrm{~H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)도 5분간 담구었다. 세척 후 절편 위에 평형완충액 2방울을 표본에 직접 적용시킨 후 working strenghth TdT enzyme \( 54 \mu \ell \)를 절편 위에 적용시키고 커버슬립을 다시 덮어 습윤상자 내에서 \(37^ {\circ} \mathrm{ C } \)로 1시간 두었다. 효소를 적용한 절편은 working strength stop/wash 완충액 \( (1.5 \mathrm{cc}: 51 \mathrm{cc} )\)이 들어 있는 coplin jar에 넣고 15초간 진탕시켜서 실온에서 10분간 항온시키고 생리식염 인산염 완충액으로 5분간 3회 세척한 다음 anti-digoxigenin-peroxidase를 2방울 떨어뜨린 후 습윤상자에 실온 상태에서 30분간 반응시켜 생리식염 인산염 완충액으로 5분간 3회 세척하였다. 절편을 발색시키기 위하여 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 여과된 DAB를 표본이 완전히 덮이도록 충분히 첨가하고 3-6분간 실온에 두었다가 증류수로 수세 후 methyl green으로 10분간 대조염색 하였다.</p> <p>광학현미경 하에서 배자줄기세포가 간세포로 분화되는 것을 좀 더 자세하게 관찰하기 위하여 toluidine blue염색을 시행하였다. 염색은 전자현미경 조직 처리 후 표본의 투명화와 수지침투과정은 실온에서 propylene oxide를 이용하여 3회 각 10분간 실시하고 polyresin을 이용하여 포매한 후 3일간 중합하였다. 중합시킨 조직은 초박절편기(LKB, NOVA)로 준초박절편 \( (0.5 \mu \mathrm{m}) \)하고, toluidine blue 염색을 시행하여 400배에서 광학현미겅으로 관찰하였다.</p>