경북 상주시 잠사시험장에서 채취한 청목노상 잎을 실험재료로 사용하였다. 에탄올과 sodium hypochlorite 및 멸균수로 살균, 세척한 잎을 고체배지에 spot 접종하였다. Bioreactor에서 수거한 청목노상 callus를 추출하여 Whatman No.1 여과지를 이용해 여과하였다. 추출 시료의 양을 환산할 때 gallic acid를 이용한 표준곡선을 이용하였다. 본문의 실험에서 표준균주인 ATCC 43504를 균주로 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>실험재료인 청목노상 잎은 2006년 5월 경상북도 상주시 잠사시험장에서 수집한 신선한 잎을 세척한 후 물기를 제거하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 냉장고에 보관하면서 사용하였다.</p> <h2>Spot 접종, 배양 및 callus 유도</h2> <p>Spot 접종은 채취한 청목노상 잎 시료를 24시간 이내에 \( 70 \% \) 에탄올을 사용하여 10초간 3회 표면 살균 후 \( 1 \% \) sodium hypochlorite로 20분간 살균하고, 멸균수로 수회 세척하여 가로×세로 약 \( 1 \mathrm{~cm} \) 정도의 크기로 잘라 내어 고체배지에 spot 접종하였다. 이때 사용된 고체 배지는 Table 1과 같이 MS배지를 사용하였으며, \( 27^{\circ} \mathrm{C} \) 암소에서 60일간 평판 배양하였다. Callus의 유도는 MS배지에 생장조절제로서 naphthalene ace-tic acid (NAA)와 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid 같은 hormone을 \( 10 \mu \mathrm{M} \) 의 농도로 처리된 배지에 시료를 치상하고 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 암배양하였다. Callus 형성배지에서 형성된 \( \mathrm{cal-} \)lus는 4주 간격으로 계대배양하였다.</p> <h2>Biomass를 위한 callus starter 제조 및 bioreactor 배양</h2> <p>청목노상 뼝잎으로부터 유도된 callus를 평판배양하여 배양된 배지의 callus를 잘게 자른 후, 자른 조각을 \( 100 \mathrm{ml} \) 의 액체 배지에 접종하여 증식시키고, 다시 \( 500 \mathrm{ml} \) 의 액체 배지에 접종하여 배양시켜 starter를 제조하고, starter 전량을 10 1의 bio-reactor에 접종하였다. 접종된 bioreactor는 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \) 암실에서 멸균공기로 순환시키며 60일 정도 배양시켰다.</p> <h2>청목노상 callus 추출물의 조제</h2> <p>Bioreactor에서 수거한 청목노상 callus를 수세 및 건조, 분쇄한 후 건조 callus \( 1 \mathrm{~g} \) 에 \( 80 \% \) ethanol \( 100 \mathrm{ml} \) 를 가하고 24시간 동안 진탕, 추출한 후 Whatman No. 1 여과지를 이용해 여과하고 필요에 따라 농축하여 사용하였다.</p> <h2>Phenol성 화합물의 정량</h2> <p>추출시료 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 \( 95 \% \) ethanol \( 1 \mathrm{ml} \) 와 증류수 \( 5 \mathrm{ml} \) 를 첨가하고 \( 1 \mathrm{~N} \) Folin-ciocalteu reagent \( 0.5\mathrm{ml} \) 를 넣어 잘 섞어주고, 5분간 방치한 후, \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} 1 \mathrm{ml} \) 를 가한 후, 흡광도 \( 725 \mathrm{~nm} \) 에서 1시간 이내에 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선으로 양을 환산하였다.</p> <h2>H. pylori 배양</h2> <p>실험에 사용한 균주는 위, 십이지장 궤양 원인균인 \( H \) pylari로서 표준균주인 ATCC 43504를 사용하였다. H. pylori의 배양에는 최적배지(special peptone \( 0.5 \mathrm{~g} \), agar \( 0.75 \mathrm{~g}, \mathrm{NaCl} 0.25 \)\(\mathrm{g} \), yeast extract \( 0.25 \mathrm{~g} \), beef extract \( 0.2 \mathrm{~g} \) 및 pyruvic acid \( 0.025 \)\( \mathrm{g} \) )를 사용하여 미호기성 조건을 유지시켜주기 위해서 \( 10 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator를 이용하였으며, incubator의 습도는 항상 \( 95\% \) 이상으로 유지하였으며, agar plate상에서 배양은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 로 48~72시간 동안 실시하였다.</p>