동물세포유래 생물의약품의 안전성 보증을 위해 규제기관은 비내인성 바이러스 검출 및 제거 규정을 정하고 있다. 이에 본 연구에서는 다양한 숙주 범위를 갖고 있는 비내인성 바이러스인 MVM 안전성 확보를 위해 MVM의 VP1(capsid protein) 유전자를 대상으로 민감도가 우수한 primer 쌍 MVM-F5, MVM-R5를 활용하여 PCR 조건을 최적화 한 결과 MVM을 정량하는데 있어 민감도와 재현성이 우수한 real-time PCR 시험법을 확립할 수 있었다.
<h1>고 찰</h1> <p>동물세포를 배양하여 생산되는 생물의약품은 특성상 숙주 유래 DNA, 세포기질 유래 바이러스, 원료물질 유래 바이러스와 같은 공정관련 불순물의 올바른 이해와 관리가 제품의 안전성 보증을 위해 매우 중요하다. 미국, 유럽, 일본 등과 같은 선진국에서는 안전하고 우수한 생물의약품을 생산하기 위해 공정관련 불순물의 정성적 검출과 정량적 분석을 위해 최신의 과학기술방법을 개발도입하고 있다. WHO, EMEA, FDA와 같은 규제기관은 생물의약품을 생산하기 위해 사용하는 동물세포주의 마스터세포(Master cell)와 제조용세포(Working cell)에서 비내인성 바이러스 검출에 대한 관리 규정을 정하고, 세포주에 의한 바이러스 오염 사고를 최소화하고 있지만, 비용과 시간이 많이 드는 생물학적 시험법(In vitro 시험법, In vivo 시험법, 항체생산 시험법)을 대체할 수 있는 민감한 분자시험법이 상용화되지 않은 실정이다. 또한 규제기관은 동물세포유래 생물의약품의 안전성 보증을 위해 바이러스 불활화 공정과 제거 공정이 단백질 분리 정제 공정에 반드시 포함되도록 요구하고 있다. 따라서 생물의약품의 허가등록을 위해 바이러스 불활화와 제거 효율 검증이 필수적이다.</p> <p>인체에 유해한 바이러스가 오염되는 것을 방지하여 안전한 생물학적 제제가 제조되도록 하기 위해서는 오염 바이러스의 검출 및 불활화 또는 제거 검증 관련 기술을 확립해야만 한다. 또한 완제품은 물론 원료부터 완제품의 생산에 이르기까지 전체 제조공정에 대한 철저한 품질관리가 필수적이다. 바이러스 오염을 방지하기 위한 ICH 가이드라인(Q5A)은 원료의 오염 여부를 검사하고, 제조공정에서 바이러스 제거 능력을 평가하기 위하여 민감도와 특이도가 우수한 검증된 시험방법을 사용하도록 권장하고 있다.</p> <p>CHO cell 배양시 가장 오염 빈도가 높은 비내인성 바이러스는 MVM이다. MVM은 사람을 포함한 척추동물에서부터 곤충에 이르기까지 다양한 숙주 범위를 갖는 바이러스이기 때문에 CHO 세포 배양 공정에서 MVM 안전성 확보가 가장 큰 문제 중의 하나로 대두되고 있다. MVM은 크기가 18에서 \( 24 \mathrm { ~nm } \) 정도로 동물세포배양 유래 생물의약품에 오염될 수 있는 바이러스 중 가장 작은 크기의 바이러스에 속한다. 본 연구에서는 동물세포 배양 유래 생물의약품에서 MVM 안전성을 확보하기 위해, 세포주, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 MVM을 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 MVM 제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 민감도와 특이도가 우수한 real-time PCR 시험법을 확립하고자 하였다. MVM 전체 유전자를 대상으로 MVM에만 특이적인 primer 5쌍을 디자인하였다. 5 쌍의 primer 중 VP1(capsid protein) 유전자를 대상으로 디자인 한 primer 쌍 MVM-F5, MVM-R5의 민감도가 가장 우수하였다. 선별된 primer를 활용하여 annealing temperature와 \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \) 농도 등 PCR 조건을 최적화 한 결과 확립된 실험법의 민감도는 \( 6 \times 10 ^ { -2 } \mathrm { ~TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \)이었다. 본 연구를 통해 확립된 real-time PCR의 민감도는 다른 연구자들이 확립한 PCR 시험법 민감도인 \( 1 \mathrm { ~TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \) 보다 더 낮은 농도의 MVM을 검출할 수 있었다. 확립된 MVM DNA 정량법의 재현성 검증을 위해 서로 다른 날에 MVM 표준시료에서 DNA를 추출하고 real-time PCR을 수행한 후 crossing point 값을 비교한 결과, MVM log titer( \( \log _ { 10 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } ; \mathrm { x } \))에 대한 crossing point 값(y) 간의 표준 회귀식의 결정계수( \( r ^ { 2 } \))는 모두 0.97 이상으로 재현성뿐만 아니라 회귀성이 매우 높았다. 생물의약품의 품질관리 평가에 있어 시험법의 민감도와 재현성은 분석의 정확성, 특이성, 검출한계 등과 함께 매우 중요한 요인으로 고려되는데, 본 연구에서 확립한 정량법은 MVM을 정량하는데 있어 민감도와 재현성이 우수함을 확인할 수 있었다.</p>