microcystin genome을 특이적으로 검출할 수 있는 primer를 염기서열로 제작하여 남조류 독성 마이크로시스틴 검출하여 PCR 반응을 수행하였고 PCR 산물의 형성 유무를 확인하였다.번거로운 과정으로 인해 시간소요가 많다는 기존 PCR 방법의 문제점을 해결하고자 Real-Time PCR법을 적용하였다.
<h2>중합효소연쇄반응(PCR)</h2> <p>남조류 독성 마이크로시스틴 검출을 위한 3종류의 primer는 microcystin genome을 특이적으로 검출할 수 있는 염기서열로 제작하였다. PCR 반응액은 총 \( 100 \mu l \) [DNA template, \( 10 \times \mathrm { PCR ~buffer } \) , 각각의 \( - \mathrm { F } ,- \mathrm { R } \) primer \( (50 ~ \mathrm { pmol } / \mathrm {\mu l } ) \), \( 5 \mathrm { U } / \mu \mathrm { l } \) Taq polymerase (Takara사), \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \)]이 되도록 하여 PCR 반응을 수행하였다.</p> <p>PCR은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 3분 동안 predenaturation을 실시한 후, \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초, \( 66 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분 30초씩 30 cycles을 반복하고, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분 동안 final extension을 실시하여 PCR 산물을 얻었다. PCR 반응 결과 생겨난 산물을 \( 1.5 \% \) agarose gel에 전기영동 하여 각각의 PCR 산물의 형성 유무를 확인하였다.</p> <h2>Real-Time PCR</h2> <p>기존의 PCR 방법은 증폭 후 전기영동을 실시하여 PCR 산물 생성 여부로 다시 확인하는 등 다소 번거롭고 시간이 소요되는 단점이 있다. 이러한 단점이 보완된 즉 증폭과 동시에 그래프로 마이크로시스틴 검출이 확인 가능하여 시간이 많이 단축되는 Real-Time PCR법을 본 실험에 적용하고자 하였다. Real-Time PCR 반응액은 총 \( 20 \mu l \) [ [DNA template, probe master, 각각의 -F, -R primer \( \left .(10 ~ \mathrm { nmol } / \mathrm {\mu l } ), \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \right ] \)이 되도록 하여 반응을 수행하였다. Real-Time PCR은 Roche사의 Light Cycler 480 Real-Time PCR 기기를 사용하였으며 반응조건은 PCR과 동일하게 수행하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>표준균주에 의한 Real-Time PCR 시험방법 정립</h2> <p>3종류의 primer쌍을 이용하여 한국생명공학연구원 생물자원 센터에서 분양받은 3종의 Microcystis aeruginosa 균주를 대상으로 Real-Time PCR 증폭을 실시하였다. 3회 분석한 결과 TOX2P/TOX2M primer를 이용한 3개의 균주에서만 그래프와 \( 350 \mathrm { bp } \)의 PCR 산물이 확인되었으나, 나머지 2개의 primer에서는 검출되지 않았다.</p>