본 논문에서는 진두발 에탄올 추출물이 대식세포에 영향을 주는 독성을 평가하기 위해서 \( (0.1,1,10,50,100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \mathrm{RAW} \) \( 264.7 \) cell에 처리하였을 때의 세포 변화여부를 MTT assay를 이용해 관찰하였다. 그 결과, 세포의 생존율이 PBS 처리군과 대조해보았을 때 유의미한 차이는 없음을 확인하였다. 또한 진두발 에탄올 추출물이 NO 생성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 LPS로 염증반응을 유발한 RAW \(264.7 \) cell에서의 NO 생성량을 측정하였다. 실험 결과, 세포의 생존율에 영향을 미치지 않는 농도 \( (0.1,1,10,50,100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 에서 COHEE를 처리하였을 때, LPS 단독처리했을 때와는 다르게 농도 의존적으로 NO 생성량이 유의성 있게 감소한 것을 확인하였다. 마지막으로 항염증에서 pro-inflammatory cytokines의 분비 억제 효과를 확인하기 위해 RAW \( 264.7 \) 세포배양액 내의 IL-6, TNF- \( \alpha \) 및 IL-1 \( \beta \) cytokine의 분비량을 측정한 결과, IL-1 \( \beta \) 또한 LPS 처리에 의해 급격하게 증가한 분비량을 농도에 따라 억제하는 결과를 확인하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>RAW 264.7 cell에 미치는 진두발 에탄올 추출물의 세포독성</h2> <p>추출물이 대식세포에 미치는 독성을 평가하기 위하여 COHEE를 농도에 따라 \( (0.1,1,10,50,100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \mathrm{RAW} \) \( 264.7 \) cell에 처리하였을 때 세포 생존의 변화여부를 MTT assay를 이용해 측정하였다. 그 결과, 세포의 생존율이 PBS 처리군과 비교 시 유의적인 차이가 없음을 확인하였다. 이를 통해 COHEE는 \( 0.1-100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 에서 독성이 없는 것으로 사료되어 염증 억제 활성을 확인하기 위한 추후실험을 동일한 농도로 진행하였다. 이는 참도박 에탄올 추출물의 세포독성 실험 결과, 농도 의존적으로 세포독성이 나타나지 않은 결과 및 잘피 에탄올 추출물의 세포독성 실험결과 독성을 나타내지 않은 결과와 유사하다.</p> <h2>Nitric Oxide 생성 억제 효과</h2> <p>\(\mathrm{NO}\) 는 반응성이 강한 무기 저분자 라디칼로 L-arginine 을 기질로 하여 NOS에 의해 L-citrulline으로 합성된다. 이는 신경전달기능, 혈액응고 및 혈소판억제, 혈관 확장에 관여하는 neurotransmitter, 암세포에 대항하는 apoptosis 유도작용 등의 인체 내 생리적이나 병적인 반응에서 중요한 물질로서 알려져 있다. 하지만 여러 세포에서 LPS, interferon- \( \gamma \) (IFN-\( \gamma), \mathrm{IL}-1 \) 과 TNF- \( \alpha \) 등의 자극에 의해 NO가 필요이상으로 생성되면 shock에 의한 혈관확장, 염증반응으로 유발되는 조직손상, mutagenesis, 신경조직의 손상 및 면역질환을 포함한 관절염, 기관지염, 다발성 경화증과 같은 병적 반응을 일으켜 생체에 유해한 작용을 나타낸다. 본 연구에서는 진두발 에탄올 추출물이 NO 생성에 미치는 효과를 알아보기 위하여 LPS로 염증반응을 유발한 RAW \(264.7 \) cell에서의 NO 생성량을 Griess 시약을 이용해 측정하였다. LPS로 염증반응을 유발한 RAW \( 264.7 \) cell의 \(\mathrm{NO}\) 생성량을 확인한 결과, LPS를 단독으로 처리했을 때 \(\mathrm{NO}\) 생성량이 \( 27.42 \pm 0.36 \mu \mathrm{M} \) 로, 아무것도 처리하지 않은 PBS 처리구의 \( 3.04 \pm 0.07 \mu \mathrm{M} \) 보다 약 9 배 증가함을 보였다. 세포의 생존율에 영향을 미치지 않는 농도 \( (0.1,1,10,50,100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 에서 COHEE를 처리하였을 때, LPS 단독처리구와 비교하여 농도 의존적으로 NO 생성량을 유의성 있게 감소시킨 것을 확인하였다. 특히, 비교적 낮은 농도인 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 에서 \( 35 \% \) 이상의 억제효과를 나타냈다. 본 연구 결과는 잘피 에탄올 추출물과 홍조류인 참도박 에탄올 추출물이 농도 의존적으로 \(\mathrm{NO}\) 생성량의 억제효과를 보인 결과 \( [1,19] \) 와 유사함을 확인 하였다.</p> <h2>Pro-inflammatory cytokines 생성 억제 효과</h2> <p>COHEE의 염증반응 매개물질인 pro-inflammatory cytokines의 분비 억제 효과를 통해 항염증 효과를 확인하기 위하여 RAW \( 264.7 \) 세포배양액 내의 IL-6, TNF- \( \alpha \) 및 IL-1 \( \beta \) cytokine의 분비량을 ELISA 방법으로 측정하였다. Pro-inflammatory cytokine은 면역 반응에서 필연적으로 동반되는 매개물로 정상조직에서도 발현되지만 과도한 pro-inflammatory cytokine의 분비량 증가는 \( \mathrm{PGE}_{2} \) 와 \(\mathrm{NO}\)의 발현으로 이어지게 되고 전신성 염증 반응 증후군, 패혈증 및 심한 조직 손상을 야기한다. 그 중 IL-6는 대표적인 염증 반응의 매개인자로서 T cell, monocyte, macrophage, synovial fibroblast 등의 면역세포에서 발현되는 pro-inflammatory cytokine으로 비만세포로부터 분비되어 B 림프구의 항체 생성을 촉진시키고 T 림프구의 분화를 유도한다. 종양괴사 인자인 TNF- \( \alpha \) 는 LPS 반응의 주요 내인성 매개체로서 T 림프구의 활성과 성장을 조절하여 염증 부위로의 cytokine과 내피 세포 부착 분자의 발현을 증가시키며 염증부위에서 생성이 증가된다. 전신적으로 분비량이 증가할 경우 eicosanoid, 산화질소, 활성산소 등과 같은 매개물질을 다량 분비시켜 조직 손상을 촉진하게 된다. 또한 IL-1k는 낮은 농도에서는 세포성장이나 항상성 유지에 필수적이지만 염증초기에 분비되어 숙주면역반응의 매개자로서 작용하다가 지속적인 자극에 의해 대량생산될 경우 T cell을 활성화 시키고 B cell을 성숙시켜 증상을 악화시킨다. 따라서 이려한 pro-inflammatory cytokine을 조절하는 물질은 염증반응으로 유도된 다양한 질병을 조절할 수 있는 가능성이 있음을 알 수 있다. 본 연구에서 LPS로 유도된 RAW \( 264.7 \) cell에서의 COHEE의 영향을 알아본 결과, IL-6, TNF- \( \alpha \) 및 IL-1ß의 분비량은 염증반응을 유도하는 강한 자극물질인 LPS를 단독으로 처리하였을 시에 \( 2081.30 \pm 20.32 \mu \mathrm{M}, 2334.41 \pm \) \( 19.81 \mu \mathrm{M}, 84.28 \pm 11.74 \mu \mathrm{M} \) 로 PBS 처리구에 비해 약 122 , 233 및 84 배 증가하였으며, COHEE의 처리에 따라 농도 의존적으로 유의성 있게 감소하였다. IL-6 및 TNF- \( \alpha \) 의 분비량은 각각 \( 50,100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도로 처리하였을 시에 LPS 단독 처리구에 비해 약 \( 50 \% \) 이상의 억제효과를 나타내었다(Fig. \( 3 \mathrm{~A}, 3 \mathrm{~B}) \). IL-1ß 또한 LPS 처리에 의해 급격히 증가한 분비량을 COHEE의 처리로 농도에 따라 유의적으로 억제하는 결과를 확인하였다. 특히 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도로 처리하였을 시에 LPS 단독 처리구에 비해 \( 93 \% \) 이상의 억제효과를 나타내어 이는 잔가시모자반 에탄올 추출물이 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도에서 \( 94 \% \) 이상의 억제효과를 나타낸 것과 비교하였을때도 매우 뛰어난 항염증 효과를 가짐을 알 수 있다.</p> <h2>iNOS, COX-2 및 NF-кB 발현 억제 효과</h2> <p>LPS나 cytokine과 같은 전염증성 매개물질은 \( \mathrm{NF}-\kappa B \) 을 활성화 시켜 iNOS와 같은 효소를 유도하여 장시간동안 다량의 \(\mathrm{NO}\)를 생성시켜 세포독성, 유전자 변이, 신경손상, 조직 손상 등과 함께 혈관투과성을 증가시켜 염증반응을 심화시킨다. 또한 COX-2는 arachidonic acid를 세포막의 인지질로부터 염증매개 물질인 \( \mathrm{PGE}_{2} \), thromboxane \( \mathrm{A} 2 \), prostacyclin의 생성에 관여하는 효소로 종양의 세포사멸을 억제하고 혈관 생성을 유도하는 데 관여한다. \( \mathrm{NF}-\kappa B \) 는 염증반응과 관련된 유전자의 promoter에 결합하여 iNOS, COX-2의 발현에 관여하는 것으로 알려져 있다[5]. COHEE가 이러한 염증 매개인자를 생합성하는 효소인 iNOS와 COX-2, \( \mathrm{NF}-\kappa B \) 의 발 현에 미치는 영향을 알아보기 위해 western blot에 의해 조사한 결과, COHEE은 농도 의존적으로 단백질들의 발현을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 COHEE에 의한 \( \mathrm{NF}-\kappa B \) 의 발현 억제로 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제함으로써 \(\mathrm{NO}\) 및 pro-inflammatory cytokine의 생성 억제 효과를 나타낸 것으로 사료된다.</p>