실험세포의 Total RNA을 분리하기 위해 LPS를 1\(\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml}\) 농도로 2시간 처리한 후 추출물을 농도별로 처리하여 배양하고 후속 과정을 진행한 후 RNA를 추줄하였고, 추출한 RNA를 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성시켰다. iNOS, COX-2의 mRNA 발현을 알아보기 위하여 합성한 cDNA를 첨가하여 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시하였고, PCR로 합성시킨 후 브로민화 에티듐을 첨가하여 전기영동한 후 LAS 4,000 을 이용하여 밴드를 확인하여 분석 정량하였다.
<h2>Total RNA 분리 및 cDNA 합성</h2> <p>세포를 \( 100 \mathrm{~mm} \) culture dish에 \( 1 \times 10^{6} \mathrm{cells} / \)well로 cell seeding한 뒤 24시간 동안 배양한 후 LPS를 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도로 2시간 처리해준 후 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배지 상등액을 제거한 후 trizol lysis buffer를 well에 \( 1 \mathrm{~ml} \)씩 분주하여 세포를 lysis한 후 chloroform \( 200 ~\mu l \)를 분주하여 20초간 위아래로 흔들어주었다. 그 후 \( 16,110 \times g \) 에서 20분간 원심분리하여 상층액을 isopropanol \( 500~ \mu \mathrm{l} \)가 들어있는 튜브에 옮겨 섞었다. 다시 \( 16,110 \times \mathrm{g} \)에서 20분간 원심분리 하였고, 그 상층액을 제거한 후 \( 75 \%~ \mathrm{EtOH}- \) diethylpyrocarbonate water를 각 튜브에 \( 1 \mathrm{ml} \)씩 분주하여 \( 16,110 \times g \)에서 5분간 원심분리한 뒤 상층액을 제거한 뒤 실온에서 건조시켰다. Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water를 \( 50~ \mu \mathrm{l} \)씩 분주하여 녹인 후 96 well plate에 RNA \( 5 \mu \) 와 멸균수 \( 195 \mu \) 를 첨가하여 \( 260 \mathrm{~nm}, 280 \mathrm{~nm} \) 에서 각각 흡광도를 측정하여 total RNA양을 측정하였다. Oligo (dT) 15 primer \( (500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) 1 \mu \mathrm{l} \), 추출한 RNA (2 \( \mu \mathrm{g}) \) 와 nuclease free water로 \( 10~ \mu \mathrm{l} \)를 맞추고 \( 75^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 반응시킨 후 \( 5 \times \) reaction buffer, \( \mathrm{MgCl}_{2}, \quad \mathrm{PCR} \) nucleotide mix, rnasin inhibitor, reverse transcriptase, nuclease free water를 첨가하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분, \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 60분, \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성시켰다.</p> <h2>Reverse transcription-polymerase chain reaction</h2> <p>iNOS, COX-2의 mRNA 발현을 알아보기 위하여 PCR 을 실시하였다. 실험에 사용한 primer sequences는 Table 1과 같다. PCR tube에 \( 5 \times \) green GoTaq flexi buffer, \( \mathrm{MgCl}_{2}, \mathrm{PCR} \) nucleotide mix (10 mM), primer, GoTaq DNA polymerase, nuclease free water, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR}을 실행하였다. GAPDH, iNOS는 \( 96^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분, \( 96^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10초, \( 64^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분 \( (40 \) cycles), COX- 2는 \( 96^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10초, \( 51^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분(40 cycles)을 하였다. PCR로 합성시킨 후 \( 0.002 \% \) ethidium bromide를 첨가한 \( 1.5 \% \) agarose gel을 \( 100 \mathrm{~V} \)에서 40분간 전기영동한 후 LAS 4,000 을 이용하여 밴드를 확인하여 분석 정량하였다.</p>