본 연구를 통해 다양한 세기의 프로모터들과 pprM 유전자가 발현되어 재조합 벡터로 형질전환이 이루어진 균주를 배양하여 라이신의 농도를 측정했으며 그 과정에서 라이신 생산량 증가와 소모된 탄소원으로 부터 전화율이 증대되는 경우도 확인되었다. 또한 본 실험에서 플라스크 배양 과정에서 ph의 조절을 위해 CaCO3가 첨가해서 진행하였다. 다만 CaCO2가 첨가되지 않은 경우 ph7이 유지되지 못했으며 이는 라이신 생산영향에도 영향을 미쳤다. 따라서 방사선 대응 및 스트레스 관련 유전자가 생산 균주의 환경에 대한 대응성을 향상시켜 라이신 등의 생산 증대에 효율적 사용이 가능할 것으로 사료되며 각종 바이오매스로 부터 형성된 발효당에서 케미칼, 폴리머 및 연료 등의 생산성이 높아질 것으로 기대하고 있다.
<h1>DR1558과 PprM의 발현에 따른 라이신 생산 영향</h1> <p>다양한 세기를 갖는 프로모터 L10, L26, I16, I64, H30, H36하에 D. radiodurans dr1558과 pprM 유전자를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 C. glutamicum을 플라스크 배양하여 얻어진 라이신의 농도를 측정하였다. 플라스크 배양 후에 얻어진 잔여 포도당은 없는 것으로 확인되었다. 실험결과 대조군으로 사용된 I64 프로모터만을 갖는 재조합 C. glutamicum에서는 \( 9.83 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 라이신이 생산되었지만, DR1558이 발현된 재조합 C. glutamicum에서는 최대 \( 30 \% \) 라이신 농도가 증가되었다. DR1558이 L26의 프로모터 하에서 발현된 경우에는 라이신이 \( 12.76 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 농도로 생산 되었으며, I64 의 프로모터로 발현된 경우에는 라이신이 \( 11.79 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)로 생산량이 증가되었다. 이러한 라이신 생산량 뿐만 아니라 소모된 탄소원으로 부터의 전화율도 증대되었다. 대조구의 경우 탄소원당 라이신의 전환효율은 \( 0.196 \mathrm{~g} \) 라이신/\( \mathrm{g} \) 포도당이었지만, DR1885이 L26의 프로모터로 발현된 경우에는 전환효율은 \( 0.26 \mathrm{~g} \) 라이신 \( / \mathrm{g} \) 포도당으로 증가하였다. 하지만, DR1558이 I16의 프로모터 하에서 발현된 경우에는 라이신 농도가 \( 9.24 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)로 얻어져서 대조군과 큰 차이는 없었다. 또한, L10의 프로모터 하에서 발현된 경우에는 라이신 농도가 \( 10.77 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)로 얻어져 라이신 농도의 증가가 다른 종류의 프로모터보다 상대적으로 낮은 값을 보였다. L-glutamate decarboxylase를 발현하여 C. glutamicum에서 gamma-aminobutyrate (GABA)의 생산에 관한 이전이 연구에서는 H36, I16, L26의 순으로 높은 GABA 생산을 보였다. 본 연구에서 사용된 6 개의 합성 프로모터들의 발현세기는 Corynebacterium 에서 H30, H36는 상대적으로 높고, I16, I64은 중간 정도의 세기, 그리고 L10, L26는 상대적으로 낮은 프로모터의 세기는 갖는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서 확인된 가장 라이신 함량을 증가시킨 프로모터는 L26과 I64으로 보고된 프로모터 세기만으로 비교한다면 H36 보다는 낮은 것으로 알려져 있다. 하지만, 프로모터 세기에 따른 단백질의 발현 정도와 단백질 발현 양에 따른 대사 산물의 생산 영향은 경우에 따라 다른 결과를 보인다. 따라서, 본 연구에서와 같이 다양한 세기의 프로모터를 갖는 재조합 벡터를 제작하여 영향을 평가하는 것이 필요하다.</p> <p>저온자극유도 단백질인 PprM이 발현된 경우도 DR1558의 경우와 유사한 경향을 보였다. DR1558의 발현에서 높은 라이신 수율을 보인 I64와 L26 프로모터 하에서 PprM이 발현될 경우에 다른 종류의 프로모터보다 높은 라이신 수율 증대가 확인되어, 최대 \( 12.65 \mathrm{~g} / 1 \)의 라이신이 생산되었다. DR1558의 발현에서 라이신의 수율 증가가 상대적으로 낮거나 대조군과 유사한 I16과 L10 프로모터 하에서 PprM이 발현될 경우 라이신의 농도 증가는 이루어지지 않았다. 이러한 실험 결과 C. glutamicum에 의한 라이신의 발효에서 D. radiodurans에서 유래한 PprM이나 DR1558 단백질의 발현은 라이신의 생산 수율의 증대시켜 주었으며, 그 영향은 프로모터에 따라 달라진다는 것을 확인하였다. 본 실험에서는 플라스크 배양과정에서 배지의 \( \mathrm{pH} \)의 조절을 위하여 \( \mathrm{CaCO}_{3} \)가 첨가되었다. Razak 등은 Corynebacteriu, glutamicum을 이용한 라이신 생산에서 \( \mathrm{CaCO}_{3} \)는 \( \mathrm{pH} \) 조절을 위하여 배지에 반드시 첨가되어야 한다고 보고하였다. 이러한 조절 성분이 없는 경우에 DR1558이나 PprM 단백질의 발현의 영향을 확인하기 위하여 \( \mathrm{CaCO}_{3} \)가 첨가되지 않은 배지에서 발효를 진행하였다.</p> <p>Table 2 에 초기 배지의 \( \mathrm{pH} \)는 7로 조절하고 \( \mathrm{CaCO}_{3} \)가 첨가되지 않은 배지에서의 DR1558과 PprM의 발현에 따른 라이신 생산 변화 비교 결과를 정리하였다. \( \mathrm{CaCO}_{3} \)가 배지에 첨가되었을 경우, 48시간 배양 후에 배지의 \( \mathrm{pH} \)는 8정도로 확인되어졌다. 하지만, \( \mathrm{CaCO}_{3} \)가 배지에 첨가되지 않을 경우, 배지의 \( \mathrm{pH} \) 가 7근처로 유지되지 못하고, 배지의 \( \mathrm{pH} \)가 배양이 진행됨에 따라 낮아지게 된다. \( \mathrm{CaCO}_{3} \)가 첨가되지 않을 경우 48시간 배양 후에 배지의 \( \mathrm{pH} \)는 4-5 근처로 낮아졌으며, \( \mathrm{CaCO}_{3} \)가 첨가되지 않을 경우 48시간 배양 후에 라이신의 농도는 첨가한 배지에서 보다 낮은 값을 가졌다. 대조군으로 사용된 \( \mathrm{I} 64 \) 프로모터만 있는 재조합 C. glutamicum의 경우 약 \( 3.06 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 라이신이 생산되었다. 48 시간 후에 남아 있는 포도당의 농도도 \( 26.59 \mathrm{~g} /\mathrm{l} \)로 포도당이 배양 중 제대로 소모되지 못하였다. H30과 \( \mathrm{H} 36 \) 프로모터 하에서 DR1558이 발현된 경우에는 대조군 보다 높은 \( 3.48 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)와 \( 4.13 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 라이신 농도가 각각 얻어졌다. 이러한 결과는 PprM의 발현에 따른 라이신의 생산 영향에서도 확인되었다. H30과 \( \mathrm{H} 36 \) 프로모터 하에서 PprM이 발현된 경우에는 대조군 보다 높은 \( 3.43 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)와 \( 3.55 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 라이신 농도가 각각 얻어졌다. H30과 H36는 이전의 \( \mathrm{CaCO}_{3} \)가 첨가된 실험에서 높은 라이신 수율 증대를 보인 \( \mathrm{L} 26 \)과 I64보다는 낮은 프로모터 세기를 갖는 것으로 알려져 있다.</p> <p>본 연구에서는 D. radiodurans에서 방사선에 내성에 기여하는 유전자 dr1558과 pprM을 이용하여 라이신 생산균주인 C. glutamicum 재조합 균주를 제작하여 발현하여, 그 영향을 확인하였다. 본 연구 결과로부터 방사선 대응 또는 스트레스 관련 유전자의 발현이 생산 균주의 환경변화의 대응성을 향상시켜 라이신 등의 목적산물의 생산수율 증대에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다. 최근에 C. glutamicum KCTC1857 균주를 이용하여 나일론 5의 모노머인 5-aminovalreric acid (5AVA)를 억새로부터 유래된 발효당을 이용하여 생산한 연구가 발표되었다. 본 연구결과를 다양한 균주시스템에 활용한다면, 다양한 바이오매스로부터 유래된 발효당으로부터 바이오 유래 케미칼, 폴리머, 연료 등을 효율적으로 생산할 수 있을 것으로 기대된다.</p>