본 연구에서 사용한 대기 미립자 물질(PM\(10\), ERM-CZ\(100\))은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고,Fernando et al. (\(2017\))에서 설명된 대로 미세먼지 입자를 배지에 현탁시켰다. 시료는 잎, 줄기, 꽃 그리고 열매로 나누어 수확하였으며 세포 생존율은 MTT 분석법을 이용하여 분석하였으며 (Yoo et al. \(2021\)), 각 well에 형성된 formazan blue를 DMSO로 용해시킨 후 \( 550 \mathrm{~nm} \) 파장에서 흡광도(iMARK \( { }^{\mathrm{TM}} \) microplate reader, Bio-RAD, CA, USA)를 측정하였다. 해당화 줄기 추출물은 CFX\(96\)TM Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad, Hercules, \( \mathrm{CA} \), USA)을 이용하여 각 유전자의 발현 패턴을 분석하였으며 실험 결과는 독립적으로 3회 이상 실시되었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>본 연구에서 사용한 대기 미립자 물질(PM\(10\), ERM-CZ\(100\))은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고,Fernando et al. (\(2017\))에서 설명된 대로 미세먼지 입자를 배지에 현탁시켰다. 본 실험에서 사용한 해당화는 충북대학교포장에서 수확 후 사용하였다. 시료는 잎, 줄기, 꽃 그리고 열매로 나누어 수확하였으며, 동결 건조 후 분쇄된 시료에ethanol (\(1:10\))을 첨가하여 \(24\)시간 동안 \(2\)회 추출하였고, 여과지를 이용하여 여과 하였다. 여과한 추출물은 감압농축기를 사용하여 농축하였으며, 이 시료는 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하여 사용 하였다.</p> <h2>Nitric oxide(NO) 생성 억제 활성 측정 및 세포생존율 측정</h2> <p>대식세포에서 미세먼지 PM\(10\)으로 유도된 염증반응에 대한 해당화 추출물의 항염증 효과를 조사하고, 대식세포에 대한 PM\(10\)과 해당화의 세포독성을 측정하기 위해 RAW\(264.7\) 대 식세포(ATCC® TIB-71TM, ATCC, Rockville, MD, USA)에 \( \mathrm{PM} 10(100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)과 각 추출물 \( (100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)을 동시에 처리 하 였다. \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2}\right) \)에서 \(24\)시간 동안 배양한 후 배양액 \( 100 \mu \)와 Griess 시약(Griess Reagent System, Promega, \( \mathrm{WI}, \mathrm{USA} \) )을 혼합하여 흡광도 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 \( \mathrm{NO} \)생성량을 측정 하였다.</p> <p>세포 생존율은 MTT 분석법을 이용하여 분석하였으며 (Yoo et al. \(2021\)), 각 well에 형성된 formazan blue를 DMSO로 용해시킨 후 \( 550 \mathrm{~nm} \) 파장에서 흡광도(iMARK \( { }^{\mathrm{TM}} \) microplate reader, Bio-RAD, CA, USA)를 측정하였다.</p> <h2>Real-time PCR을 통한 유전자 발현 분석</h2> <p>RAW\(264.7\) 대식세포에 PM10 \( (100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)과 해당화 줄기 추출 물 \( (100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)을 처리하여 \(24\)시간 동안 재 배양한 후 PBS로 세포를 세척하였다. Total RNA는 TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 추출하였으며, ReverTra AceⓇ qPCR RT Master Mix with gDNA Remover (TOYOBO Co., Ltd, Osaka, Japan)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. CFX\(96\)TM Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad, Hercules, \( \mathrm{CA} \), USA)을 이용하여 각 유전자의 발현 패턴을 분석하였다. 각 유전자( \( i N O S, C O X-\(2\), I L-\(1\) \beta, I L-\(6\)) \)의 전사 수준은 내부 대 조군으로 사용된 \( \beta-a c t i n \)의 전사 수준으로 정량 비교 분석하였다. 본 연구에 사용된 특정 qRT-PCR 프라이머 서열은 Table \(1\)과 같다.</p> <p>본 연구로부터 얻어진 실험 결과는 독립적으로 \(3\)회 이상 실시되었으며, 평균 \( \pm \) 표준 오차로 나타내었다. 통계분석은 SPSS (Version \(23\), IBM, USA)를 통한 일원배치분산 분석(one way ANOVA)을 진행한 후, Duncan's Multiple Range Test을 수 행했다 \((p<0.05)\).</p>