Xenopus laevis를 얼음에 방치한 뒤 oocyte follicle을 적출해내어, 개개로 분리된 oocyte는 incubator에서 AQP4 cRNA를 micromanipulator와 microinjector를 이용하여 주입하고 3일간 배양하였다. 그 후 videomicroscopy를 이용하여 시간경과에 따른 oocyle의 용적변화로서 수분투과도를 측정하였다.
<h3>ㄴ. Xenopus oocyte 분리 및 AQP4 cRNA 주입</h3> <p>암놈 Xenopus laevis를 얼음에 30분 방치하여 동면상태를 유발시킨 뒤 복강을 열어 oocyte follicle을 적출해내어 Type lA collagenase ( \( 2 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \)가 포함된 \( \mathrm { Ca } ^ { 2 + } \)-free solution에 넣고 90분간 shaker로 진탕시킨 뒤 다시 새로운 colla-genase를 처리하여 90분간 진탕을 반복하여 개개의 oocyte로 분리하였다. 분리된 oocyte는 \( \mathrm { Ca } ^ { 2 + } \)-free solution으로 5회 세척하고 modified Barth's solution으로 다시 5회 세척한 뒤 stereoscope 하에서 stage V-VI에 해당하는 vocyte만 선별하여 \( 18 ^ {\circ } \mathrm { C } \) incubator에서 overnight 시킨 후 다음날 AQP4 cRNA를 stereoscope 하에서 micromanipulator와 microinjector를 이용하여 oocyte당 \( 50 \mathrm { nl } (1-10 \mathrm { ng } \)RNA) 의 AQP 혹은 AQP4 cRNA를 주입하였다. RNA를 주입한 oocyte는 매일 medium을 교환시키면서 \( 18 ^ {\circ } \mathrm { C } \) incubator에 3일간 배양한 뒤 실험에 사용하였다.</p> <h2>2. AQP4 expressed oocyte에서 삼투적 수분 투과도의 측정</h2> <p>cRNA 주입 후 3일 된 oocyte를 videomicroscopy를 이용하어 수분투과도를 측정하였는데, 수분이동의 원동력으로 3배의 hyposmotic shock (200 mosm-70 mosm)을 주어서 oocyte를 swelling시켜 시간경과에 따른 oocyle의 용적변화로서 수분투과도를 계산할 수 있다. 시간에 따른 oocyte image변화 phase-contrast microscope에 연결된 CCD camera를 통헤 computer에 digitalized data로 저장시킨 뒤 pixel 수를 계산하는 program을 이용하여 oocyte의 surface area를 얻을 수 있으며. 이렇게 얻은 surface area 는 아래 공식을 이용하여 용적으로 전환시킬 수 있다.</p> <p>\( \mathrm { V } = (4 / 3) \times( \) area \( ) \times( \text { area } / \Pi) ^ { 1 / 2 } \)</p> <p>시간에 따른 oocyte volume의 상대직인 변화랑 즉 \( \mathrm { d } ( \mathrm { V } / \) Vo \( ) / d t \) 는 computer에서 지수함수로 curve fitting시키면 swelling되는 초기속도로 전환시킬 수 있으며, 수분의 투과도 \( ( \mathrm { P } ) \) 는 아레공식을 이용하여 계산할 수 있다.</p>