HaCaT cell-을 이용하여 Thymus and activation regualted chemokine (TARC)의 생성을 측정함으로서 시료의 아토피 개선 정도를 평가하는 방법을 사용하는 TARC assay는 Human TARC Immunoassay kit(R&D system, DDN00)을 사용하여 TARC 양을 측정하고, 총 단백질 양으로 보정하여 Student's t-test를 사용하여 유의확률 p<0.005, 양측검정을 통해 아토피 개선 효능평가를 하고 있다.
<h2>아토피 개선 효능평가(TARC assay)</h2> <p>TARC assay는 HaCaT cell-을 사용하여 Thymus and activation regualted chemokine (TARC)의 생성을 측정함으로서 시료의 아토피 개선 정도를 평가하는 방법이다. HaCaT cell \( \left (1 \times 10 ^ { 6 } \right . \) cells/ well)을 48 well plate 에 분주한 다음 세포배양 조건에서 24h 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고 \( 10 \mathrm { ng } / \mathrm { mL } \) 의 \( \mathrm { INF } - \gamma \) 와 \( 10 \mathrm { ng } / \mathrm { mL } \) 의 TNF- \( \alpha \) 및 시료를 적당한 농도로 배지에 dilution한 후 처리하여 세포 배양 조건에서 24h 배양하였다. 그 후 배양액을 취하여 Human TARC Immunoassay kit (R \&D system, DDN00)을 사용, TARC 양을 측정하였다. 측정된 TARC 양은 총 단백질 양으로 보정하였다.</p> <h2>통계</h2> <p>모든 자료는 \( \mathrm { mean } \pm \mathrm { SD } \) 로 나타내었고, 통계처리는 Student's t-test를 사용하였으며 유의확률 \( p<0.005 \), 양측검정을 사용하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <p>화합물 1은 흰색 무정형 분말 형상으로서, TLC에서 \( 10 \% \) \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \) 을 분무하여 heating시 갈색으로 발색 되었다. positive FABMS에서 \( m / z 301[ \mathrm { M } + \mathrm { H } ] ^ { + } \)molecular ion peak가 관측되어 molecular weight을 \( 270[ \mathrm { M } ] \) 로 확인하였다. IR spectrum 관측 시 공역화된 수산기 \( \left (3358 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \) 가 있는 것으로 확인되었다. \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } - \) NMR \( \left (600 \mathrm { MHz } \right . \), pyridine- \( \left .d_ { 5 } , \delta_ {\mathrm { H } } \right ) \) spectrum에서 발견된 다수의 proton signal 중, 다섯 개의 olefin methines \( \delta_ {\mathrm { H } } 7.53 \) \( (2H, dd, J=8.4,1.2 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } 2, \mathrm { H } 6) \), \( \delta_ {\mathrm { H } } 7.31 \) \( (1 \mathrm { H } \), overlapped, H4) \), \( \delta_ {\mathrm { H } } 7.29 \) \( (2 \mathrm { H } , \mathrm { dd } , J=8.4,8.4 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } 3, \mathrm { H } 5) \) 를 통해 mono-substituted benzene ring이 존재함을 예상하였다. 이를 통해 화합물 1이 phenyl 화합물임을 예상하였다. 또한 하나의 methylene \( \delta_ {\mathrm { H } } 5.19 \) \( (1 \mathrm { H } , \mathrm { d } , J=12.0 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } 7 \mathrm { a } ) \) /4.84 \( (1 \mathrm { H } , \mathrm { d } , J=12.0 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } 7 \mathrm { ~b } ) \) 을 관측하였다. 하나의 hemiacetal \( \delta_ {\mathrm { H } } 5.12 \) \( \left (1 \mathrm { H } , \mathrm { d } , J=7.8 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } ^ {\prime } \right ) \) 과 네 개의 oxygenated methines \( \delta_ {\mathrm { H } } \) \( 4.32 \left (1 \mathrm { H } \right . \), overlapped, \( \left . \mathrm { H } ^ {\prime } \right ), \delta_ {\mathrm { H } } 4.29(1 \mathrm { H } \), overlapped, H4'), \( \delta_ {\mathrm { H } } 4.15 \left (1 \mathrm { H } , \mathrm { dd } , J=7.8,7.8 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } 2 ^ {\prime } \right ), \delta_ {\mathrm { H } } 3.97(1 \mathrm { H } \), ddd, \( J=7.8,5.4,2.4 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } 5 ^ {\prime } \) ), 그리고 하나의 oxygenated methylene \( \delta_ {\mathrm { H } } 4.60(1 \mathrm { H } , \mathrm { dd } , J=12.0,2.4 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } 6 \mathrm { a } ) / 4.45(1 \mathrm { H } \), dd, \( J=12.0 \), \( 5.4 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } 6 ^ {\prime } \mathrm { b } \) )를 통해 hexose 하나가 존재함을 예상하였다. \( { } ^ { 13 } \mathrm { C } \)-NMR \( \left (150 \mathrm { MHz } \right . \), pyridine- \( \left .d_ { 5 } , \delta_ {\mathrm { C } } \right ) \) spectrum에서 13 개의 carbon signal을 확인하였고, 이를 통해 phenyl glycoside임을 확인하였다. 하나의 olefin quaternary \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } 139.0 \right ) \) 을 확인하였으며, 5개의 olefin methines \( \left [ \delta_ {\mathrm { C } } 129.2 ; 129.2 ; 129.1 ; 129.1; 128.6] \right . \) , 하나의 methylene \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } 71.7 \right ) \) 을 확인하였다. 또한 하나의 anomer \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } \right . 104.3) \), 네 개의 oxygenated methines \( \left [ \delta_ {\mathrm { C } } 78.0; 78.0 ; 75.1 ; 71.6] \right . \), 하나의 oxygenated methylene \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } 62.8 \right ) \) 을 확인하여 \( \beta \)-glucopyranoside 가 존재함을 확인하였다. 위의 data로부터 동정한 구조를 보고된 문헌과 비교한 결과, 화합물 1을 benzyl \( O- \beta \)-D-glucopyranoside으로 구조동정 하였다.</p>