인삼밭과 주변 토양에서 채취한 시료를 희석한 후 R2A 고체배지에 도말하여 균주를 선발하였다. Ginsenoside 변환 균주를 위해 esculin agar에 도말하고, 이를 28℃ R2A 고체배지에서 순수하게 분리하였다. 또한, 분리한 Gsoil 235 균주의 16S rRNA 염기서열 분석 결과는 Cellulosimicrobium funkei ATCC BAA-886과 99.7% 일치함을 알 수 있었다. 이를 통해 해당 균주가 그람양성균으로, Cellulosimicrobium funkei 종에 속하는 것을 확인하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>균주의 분리</h2> <p>인삼밭과 주변 토양으로부터 시료를 채취하여 멸균 증류수에 \( 10 ^ { -1 } \) 부터 \( 10 ^ { -5 } \) 배수로 희석하여 \( \mathrm { R } 2 \mathrm { ~A } \) 고체배지에 도말한 후 colony를 취하여 균주를 선발하였다. Ginsenoside 변환균주를 선발하기 위하여 esculin agar에 streaking하여 변색되는 균주를 재차 선발하였으며, 이를 다시 \( 28 ^ {\circ } \) R2A 고체배지에서 순수분리 될 때까지 계대배양 하였다. 분리된 균주를 이용하여, \( 1 \mathrm { mM } \) 의 ginsenoside \( \mathrm { Rb } _ { 1 } \) 과 반응시켜 ginsenoside를 전환시킬 수 있는 균주를 선택적으로 선발, 이중 strain Gsoil 235 를 분리하였다. Gsoil 235균주의 16S rRNA 염기서열을 sequencing한 후, NCBI genebank에서 가장 가까운 type strain을 결정하여 유연관계를 분석한 결과, Cellulosimicrobium funkei ATCC BAA-886 \( { } ^ {\mathrm { T } } \) (AY501364)와 \( 99.7 \% \) 일치하는 것을 확인하였다. 이를 통해 인삼 토양에서 분리한 균주 Gsoil 235는 그람양성균주로, species funkei, genus Cellulosimicrobium, family Promicromonosporaceae, phylum Actinobacteria에 속하는 것을 알 수 있었다. Cellulosimicrobium funkei Gsoil 235의 phylogenetic tree는 Fig. 4에서 확인할 수 있다.</p> <h2>배지에 따른 균주의 생장</h2> <p>고체 배지의 순수 분리된 colony를 취하여 멸균된 LB에 24 시간 배양하여(O.D.600; 1.378), LB, TSB, NB 배지 50 \( \mathrm { ml } \) 에 \( 1 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 씩 접종한 후 일정 시간마다 \( \mathrm { O.D. } _ { 600 } \)값을 측정하여 균주의 생장속도를 확인한 결과, 대체적으로 모든 배지에서 배양 후 8 시간부터 대수 증식기에 접어들어 24 시간 후에 최대 증식을 나타내었다. 흡광도는 접종 후 24 시간까지 균이 급격하게 자라는 대수기를 보이며, 그 이후에는 일정한 양상을 보였다. TSB에서 Gsoil 235의 생장은 접종 후 8시간부터 다른 배지에 비해 빠르게 자라며, 특히 NB 보다 2 배 정도 생장이 뛰어난 것으로 확인되었다. 배양 24 시간의 \( \mathrm { O.D. } _ { 600 } \) 값은 LB에서 1.99, TSB에서 2.46, 그리고 NB 에서 1.21로 배지에 따른 균의 증식은 TSB >LB >NB의 순으로 잘 자라는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같이 배지 종류에 따라 생장이 다른 것은 세 종류의 배지가 함유하고있는 탄소원과 질소원의 함유량에 따른 것으로 사료된다. \( 1 \mathrm { ~L } \) broth에 용해되는 무기물질 이외의 영양원은 \( \mathrm { TSB } \ 22.5 \mathrm { ~g } , \mathrm { LB } \ 20 \mathrm { ~g } , \mathrm { NB } \ 8 \mathrm { ~g } \) 으로 함유량에 따라 균주의 생장에 영향을 주는 것으로 사료된다.</p>