본 연구는 혈관신생을 유도하는 인자들로서 성장인자 및 사이토카인 풍부한 물질을 배지에 첨가해 내피세포를 활성화시켰으며, 활성화된 HUVEC와 그렇지 않은 HUVEC, 두 그룹의 유전자를 조사했다. 조사결과 면역/염증관련 유전자와 세포 운동성 및 증식에 관련되어 있는 유전자들의 발현이 \(2\) 배 이상 증가되었으며, 세포의 흡착과 junction을 형성하거나 혈관의 morphogenesis와 형태 유지에 관련한 인자들의 발현이 상대적으로 적었다. 그리고 혈관신생에 직접적으로 관여하는 유전자들의 발현변화를 조사한 결과 morphogenesis시에 중요하게 작용하는 유전자의 경우 보통의 경우보다 \(4\)배 이상 발현한 것을 확인할 수 있었다.
<h1>결 과</h1><h2>유전자 발현 패턴의 총괄적 분석</h2><p>혈관신생을 유도하는 인자들로서 bFGF, VEGF, IL-8, angiopoetin 등을 포함하여 여러 다른 성장인자 및 사이토카인들이 알려져 있으므로, 본 연구에서는 이들 인자들이 충분하게 존재한다고 사료되는 ECGS (신경조직추출물)와 \( 20 \% \)FBS, heparin을 첨가한 배지를 이용하여 내피세포를 충분히 활성화시키고자 하였다. 계대수가 \(2 \sim 4\)인 HUVEC을 사용하였고, 이들 배지를 처리하여 13 시간 후의 유전자 발현 pattern을 처리하지 않은 것과 비교하였는데, 이 두 그룹의 세포모양은 전형적인 코볼스톤모양을 나타내었고, 형태상의 차이점은 관찰되지 않았다.</p><p>이들 세포로부터 얻은 cDNA를 labeling하여 \( 19 \mathrm{~K} \) 올리고칩과 hybridization 시켜서 유전자 발현을 분석하였다. Unsupervised hierarchical clustering을 실시하였을 때, 활성화된 HUVEC과 활성화되지 않은 HUVEC이 각각 clustering되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 각 lane의 data가 개개의 개체로부터 일차 배양된 HUVEC 세포로부터 얻어진 것을 감안할 때, 뚜렷하게 2 분법적으로 활성화된 그룹과 활성화되지 않는 그룹으로 clustering되지 않더라도, 단계적으로 그룹 내의 시료부터 clustering되어 나가는 패턴을 보이고 있어 일차 배양된 세포들이 실험조건 내에서 어느 정도 일관성 있는 세포 특성을 나타내는 것을 알 수 있다. 전체적으로 같은 세포 type에서 이루어진 실험이라 많은 유전자의 변화를 관찰할 수는 없었지만, 적어도 수십 개의 유전자들에서 발현의 차이가 현저하였다(Fig. 2).</p><h2>발현의 차이를 보이는 유전자들의 분석</h2><p>활성화된 HUVEC (AHUVEC)과 그렇지 않은 HUVEC(RHUVEC) 두 그룹의 유전자 발현의 clustering을 기초로, 구체적으로 발현의 차이를 보이는 유전자들을 조사하여 보았다. 먼저, AHUVEC이 RHUVEC 보다 2 배 이상 발현이 많이 되어 있는 유전자들을 분석하였다. 총 58 개의 유전자들이 검색되었고 이중 11 개의 유전자에서 3 배 이상의 발현 증가가 관찰되었고 기능이 알려진 유전자는 7 개가 포함되었다. 발현이 2 배 이상 증가된 유전자들을 보면, 면역/염증관련 유전자와 세포 운동성 및 증식에 관련되어 있는 유전자들이 많이 포함되어 있는 특징을 나타내었다. 세포 운동성과 관련하여 matrix metalloproteinase 3, tissue-inhibitor of metalloproteinase 1 , type 1 collagen, undulin 2 , moesin, connective tissue growth factor, GDP-dissociation inhibitor protein, src family associated phosphoprotein 2 등의 발현이 증대되는 것이 관찰되었다. 이는 배양 조건으로 인해 세포들이 휴지기 상태에서 활성화 되면서 증식 및 이동에 관련된 유전자들의 발현이 증대된 것 같다. 기능이 아직 밝혀지지 않은 유전자들로 발현이 2 배 이상 증대된 것이 26 종 발견되었고, 이중에는 혈관신생에 직접으로 관련이 있는 것들도 포함되어 있을 젓이라 생각되어진다.</p><p>이번에는 두 세포 그룹 간의 유전자 발현 변화 중 활성화시킨 HUVEC에서 2 배 이상 발현이 감소된 유전자들을 분석해 보았다. 2 배 이상 발현이 적은 유전자들은 총 64개가 검색되었다. 이들 유전자들을 살펴보면, 활성화시킨HUVEC에서는 세포의 흡착과 junction을 형성하거나 혈관의 morphogenesis와 형태 유지에 관련한 인자들의 발현이 상대적으로 적은 것을 알 수 있었다. 활성화시킨 세포에서 증식 및 세포 이동에 관련된 유전자들의 발현이 증가한 것과 상응하는 양상을 보이는 것을 알 수 있다. 15 종의 유전자가3 배 이상 down-regulation된 것으로 관찰되었고, 이 중에서 12 개의 유전자가 그 기능이 알려져 있다. Eph-B4의 유전자가 약 4 배 이상 발현이 감소된 것으로 관찰되었는데, Eph-B4는 정맥의 morphogenesis에 중요하게 관여하는 것으로 보고 되었다. 2 배 이상 발현이 적게 되는 유전자들 중에도 그 기능이 밝혀지지 않은 것들이 26 종 포함되어 있다.</p><h2>혈관 신생에 관여하는 인자들의 발현 변화 검색</h2><p>마지막으로, 현재 혈관신생에 직접적으로 관여하는 것으로 잘 알려진 유전자들의 발현 변화를 조사하여 보았다. 실험이 수행된 조건에서 대부분의 알려진 혈관 신생 인자들의 발현이 유의성 있게 차이를 보이지 않는 것을 관찰할 수 있었다. 다만, 앞에서도 언급하였지만 정맥의 morphogenesis시에 중요하게 작용한다고 보고되어 있는 Eph-B4유전자의 발현이 활성화시킨 HUVEC에서 그렇지 않은HUVEC 보다 약 4 배 이상 낮은 것을 확인할 수 있었다. 이는 제대 정맥에서 유래한 내피세포를 사용하여 조사하였기 때문에 정맥 내피세포의 특성이 두드러지게 나타난 것으로 생각된다. 10개의 암세포 세포주의 mRNA로부터 유래한 reference RNA를 기준으로 하였을 때 Eph-B4 뿐만 아니라,두 그룹 간에 발현의 차이를 보이지 않았지만 염증관련 내피세포 adhesion 분자인 ICAM2, vescular endothelial growth factor (VEGF)의 major receptor인 KDR, 그리고 내피세포 특이적인 endothelin의 발현 수준도 높은 것을 관찰할 수 있었다.</p>