고신대학교 복음병원에서 2008년 동안 254개의 임상 검체에서 P. aeruginosa를 분리 및 동정하였으며, 이는 생화학적 방법과 Vitek GNI card를 통해 확인되었습니다. Carbapenemase 생성균주는 Hodge 변법을 이용하여 선별하였으며, 이를 위해 참조균주인 E. coli ATCC 25922의 감수성도 함께 시험하였습니다. CLSI의 디스크 확산법을 활용하여 다양한 항균제 디스크를 사용하여 항균제 감수성 시험을 수행하였습니다. 내성 전달은 Broth mating법을 사용하여 조사되었고, 또한 \(\beta\)-lactamase 유전형인 bla gene의 유전형은 PCR을 통해 분석하여 내성유전자를 조사하였습니다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주의 수집</h2> <p>부산의 고신대학교 복음병원에서 2008년 한 해 동안 254개의 임상 검체에서 P. aeruginosa를 42주 분리 동정하였으며, 균주의 동정은 전통적인 생화학적 방법과 Vitek GNI card (bioMerierux Vitek Inc, Hazelwood, MO, USA)로 확인하였다.</p> <h2>Carbapenemase 생성균주 선별과 MBL 생성 선별시험</h2> <p>Hodge 변법으로 carbapenemase 생성균주를 선별하였으며, 시험의 정확성을 위해 참조균주인 Escherichia coli ATCC 25922의 감수성을 동시에 시험하였다. 또한 Lee 등의 방법에 따라서 EDTA에 sodium mercaptoacetic acid(SMA)를 첨가한 disk로 synergy 시험하여 선별하였다. 세균이 접종된 배지는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 항온기에 18시간 배양 후, 두 디스크 사이에서 상승효과에 의한 억제대의 확장현상이 관찰되면 양성으로 판정하였다.</p> <h2>항균제 감수성 시험과 최소억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 측정</h2> <p>Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 디스크 확산법으로 시험하였고, 항균제 디스크로는 ceftazidime, meropenem, imipenem, colistin, gentamicin, amikacin, to-bramycin 및 ciprofloxacin 디스크(BBL, Cockeysville, MD, USA)를 사용하였다. 또한 CLSI 한천희석법으로 meropenem (유한, 서울)과 imipenem (중외, 화성)에 대한 MIC를 측정하였으며, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 호기성 환경에서 18시간 배양 후 항균제 농도에 따른 집락의 증식 양상을 관찰하였다. 참조균주인 E. coli ATCC 25922의 감수성 시험도 동시에 시행하였다.</p> <h2>접합에 의한 내성 전달</h2> <p>Broth mating법으로 시험하였다. Azide에 내성인 P.aeruginosa PAO 4089를 내성 수여자로 사용하며, 내성 공여자와 수여자를 각각 Brain heart infusion (Difco, Detroit, MI, USA) 액체배지에 접종하여서 3시간 진탕배양 하였다. 공여자 배양액 \( 0.2 \mathrm{ml} \)와 수여자 배양액 \( 2.2 \mathrm{ml} \)를 시험관에 넣어서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 배양 후, imipenem \( 8 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \), rifampin \( 100\mathrm{mg} / \mathrm{l} \)가 함유된 MacConkey 한천(Difco, Detroit, MI, USA)에 접종하였다. \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 18시간 배양 후 피전달 접합균주를 선별하였고, 피전달 접합균주가 생겼을 경우 내성유전자의 전달을 확인하기 위하여 PCR (polymerase chain reaction)을 시행하였다.</p> <h2>분자유전학적 방법에 의한 \( \beta \)-lactamase 유전형 시험</h2> <p>\( \beta \)-lactamase 유전형인 bla gene은 PCR로 염기서열을 분석하여 내성유전자의 유전형을 조사하였다. 염기서열의 상동성에 따라서 17가지 이상의 변종이 보고 된 IMP형은 IMP-1, -2, -4,-11,-18, 및 -19인 6 set primers를 사용하였고, 11가지 이상의 변종이 보고된 VIM형은 VIM-1, -2의 2 set primers를 사용하였으며, 아형이 보고되지 않은 GIM-1, SPM-1 및 SIM-1은 각 1쌍의 primer를 사용하였다. 유전자의 염기서열은 GenBank의 염기서열 정보를 참고하였으며, DNA Space version 3.02 (Genetic System, Hitachi, Japan)와 Vector NTI Suite (InforMax, Frederick, MD, USA)를 사용한 multiple alignment 분석 결과에 기초하여 \( \beta \)-lactamase 유전자의 특이적인 부분을 primer로 고안하였다. 고안된 primer와 ESBL (extended-spectrum-\(\beta\)-lactamase) 유전자의 염기서열 동정은 BLAST로 분석하였다. DNA 추출액으로 premix를 만들어 Gene Amp PCR System 9600 (Perkin-Elmer Centus Corp., Norwalk, CT, USA)으로 PCR을 시행하였다. 전기영동 하여 band 확인한 후 Sequenase Version 2.0 DNA sequencing kit (U.S. Biochemicals, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 di-deoxy-mediated chain termination 법으로 양방향으로 염기서열을 분석하였다.</p> <h2>\(\mathrm{bla}_{IMP-6} \)가 포함된 integron의 유전자 환경</h2> <p>IMP (active on imipenem)형 MBL 생성 유전자인 \(\mathrm{bla}_{IMP-6} \) 유전자는 imipenem에 강한 활성을 나타내며, 처음 발견된 IMP-1 유전자의 196번 serine이 glycine으로 치환된 것으로 \(\mathrm{bla}_{IMP-6} \) 유전자가 포함된 integron과 이 유전자가 포함되지 않은 integron을 구분하여 class 1 integron의 \( 5^{\prime} \)-CS (conserved sequence), \( 3^{\prime} \)-CS 및 유전자 cassette primer로 PCR 하였으며, 증폭된 PCR 산물의 DNA 염기서열을 분석하여 class 1 in-tegron의 구조를 확인하였다.</p> <h2>Enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC)- based PCR</h2> <p>다양한 균주들의 분자생물학적 동정에 응용되는 ERIC PCR은 증폭된 크기가 다른 DNA 단편들을 이용하여 각 세균 균주마다 고유한 DNA fingerprinting pattern이 결정되고, 그 pattern들을 서로 비교하여 검체 균주간의 상보성과 유전학적 연관성 등을 결정하는 방법인데, 본 연구에서는 MBL생성 세균을 대상으로 ERIC PCR하여 내성유전자를 보유한 세균의 역학적 연관성을 조사하였다. primer sequence는 ERIC 1 (\( 5^{\prime} \)-GTG AAT CCC CAG GAG CTT ACA T-\( 3^{\prime} \))을 사용하였다. ERIC PCR의 결과 분석은 band의 강도와 상관없이 band의 분자량과 개수로 각 균주를 비교하며, 두 개 이상의 band 차이가 있으면 역학적 상관관계가 없는 것으로 판단하였다.</p>