세포 생존율은 ELISA plate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하고, 620 nm의 reference 흡광도를 보정해준다. 신혈관형성 억제 활성 측정은 암 세포 이식 이주일 후에 부검하여 암 조직에 유도된 신생 혈관의 수를 측정한다. 폐전이 억제 활성 측정은 암세포 주입 이주일 후, 폐를 적출하여 bouin's solution에 전이된 종양의 colony 수를 측정한다. 종양세포 부착 억제 활성 측정은 농도별에 따라서 Gomisin A를 처리하고 배양해 흡광도를 측정한다.
<h2>세포 생존율(Cell viability) 측정</h2> <p>HUVECs, A549, B16BL6, Du145 및 Huh7 각 세포와 세포 주를 \( 50,000 \mathrm{cells/ml} \) 의 농도로 맞추고 96 well microtiter plate (Corning costar. Co)에 \( 100 \mu \mathrm{l} \)씩 주입한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 12시간 동안 배양하였다. Gomisin A (0, 0.01,0.1,1,10,100 \(\mu \mathrm{l} \) 농도별로 각 well 당 \( 100 \mu \mathrm{l} \)씩 세포에 처리하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 24시간 동안 배양 한 후 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 MTT 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT; Sigma Co., USA) solution \( 20 \mu \) 를 각 well에 첨가하고 4시간 동안 다시 배양 시킨 후, well 바닥에 형성된 푸른색의 MTT formazan이 생성되면 상등액을 제거하고 dimethyl sulfoxide (Sigma Co., USA)와 ethanol을 1:1로 혼합한 용액 \( 200 \mu \mathrm{l} \)을 첨가하여 천천히 녹인 후 ELISA plate reader (Synergy2, BioTek, USA)를 이용하여 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하고 \( 620 \mathrm{~nm} \)의 ref-erence 흡광도를 보정하였다.</p> <h2>신혈관형성 억제 활성 측정</h2> <p>C57/BL6 마우스에 배양된 B16BL6 melanoma cell line을 50,000 cells/ \( 50 \mu \mathrm{l} \)/head로 피하 이식하였다. 3일 간격으로 대조군(vehicle)과 양성 대조군에는 생리 식염수를 투여하고, 실험군에는 Gomisin A를 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{head} \)와 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{head} \)로 \( 100 \mu \mathrm{l} \)씩 정맥투여 하였다. 암 세포 이식 14일 후 부검하여 암 조직을 포함하는 마우스의 표피 조직을 적출하여 암 조직에 의해 유도된 신생 혈관의 수를 측정하여, Gomisin A의 신혈관형성 억제 활성을 확인하였다.</p> <h2>폐전이 억제 활성 측정</h2> <p>C57/BL6 마우스에 배양된 B16BL6 melanoma cell line을 마우스의 꼬리 정맥에 50,000 cells/ \(50\mu \mathrm{l/head}\) 주입한 후, 3일 (3회) 간격으로 대조군과 양성 대조군에는 생리 식염수 투여하였고, 실험군에는 Gomisin A를 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{head} \)와 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{head} \)로 정맥 주사를 통해 투여 하였다. 암세포 주입 14일 후, 종양의 표적기관인 폐를 적출하여 bouin's solution (Sigma Chemical Co., USA)으로 전이된 종양을 고정시킨 후 전이된 종양 colony 수를 측정함으로써 Gomisin A의 암세포 전이 억제 활성을 확인하였다.</p> <h2>종양세포 부착 억제 활성 측정</h2> <p>암 세포의 전이 시, 암세포와 세포외기질간에 부착하는 과정은 중요하며, B16BL6 melanoma cell line과 bovine serum albumin (BSA, control protein), gelatin, collagen, Matrigel, 3종류의 matrix protein을 사용하여 암세포의 부착능 확인 실험하였다. 96 well plate에 gelatin, type I collagen, Matrigel, BSA를 각각 코팅한 후, B16BL6 melanoma cell line을 \( 20,000 \mathrm{cells/ml} \) 로 분주하였다. Gomisin A를 농도별로 (0,0.01,0.1, 1,10,100 \(\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 처리하고, 4시간 동안 배양한 후, PBS로 3회 세척하여 부착하지 않는 세포를 제거하고, XTT solution을 \(20 \mu 1 / \mathrm{well} \) 로 처리한 후 \( 590 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p>