분자량 한계범위가 \(10,000 \mathrm{Da},5,000 \mathrm{Da}\) 및 \(1,000 \mathrm{Da}\)인 막을 통과하여 나온 각 가수분해물이 그 막의 분자량 이상에서도 일부 분포되어 있는 것은 그 막의 제조공정상의 분자량 한계에 의한 것으로 판단된다. ACE 저해 펩타이드의 분리◦정제 및 아미노산 서열 분석 실험에서 ACE 저해활성은 저분자의 펩타이드가 고분자의 펩타이드보다 더 뛰어나다는 것을 알 수 있었다. 대구의 간 가수분해물로부터 최종적으로 정제된 두 종류의 펩타이드는 모두 hexapeptide로 구성되어 있었으며, 이 중에서 활성이 가장 뛰어난 획분은 ACE의 활성부위를 저해하는데는 펩타이드 \( \mathrm{C} \) 말단의 아미노산이 imino acid와 방향족 아미노산 등의 잔기로 구성되어 있는 펩타이드가 ACE 저해활성이 매우 양호한 것으로 보고된 것과 일치한 결과를 가졌다. 최근 보고에 따르면, ACE 저해활성을 나타내는 펩타이드의 구조는 뱀독 유래 펩타이드의 C말단 부분인 Pro-Pro 및 Ala-Pro 뿐 아니라 \( \alpha \)-zein (Leu-Arg-Pro, \( \mathrm{IC}_{50}=0.27 \mu \mathrm{M} \) )과 같이 다른 조합의 아미노산에서도 강한 ACE 저해활성을 나타낸다고 한다. ACE 저해활성에 펩타이드의 길이 역시 영향을 미치는 요인이 될 수 있을 것으로 판단된다. 따라서 펩타이드의 구조 예측을 위해서는 ACE 저해 펩타이드를 대상으로 구성 아미노산의 종류 및 길이와 ACE 저해효과와의 상관관계를 밝히는 것이 필요하다.
<h2>가수분해물의 분자량 분포</h2> <p>대구의 간을 \( \alpha \)-chymotrypsin으로 2시간 가수분해시켜 제조한 가수분해물을 한외여과막을 사용하여 분자량 한계범위가 \( 10,000 \mathrm{~Da}, 5,000 \mathrm{~Da} \) 및 1,000 Da인 막을 통과시켜 나온 분획물의 분자량 분포는 Fig. 4 와 같다. 즉, 분자량 한계범위가 \( 10,000 \mathrm{~Da} \)인 막을 통과하여 나온 가수분해물은 대부분 \( 12,000 \sim 5,000 \mathrm{~Da} \)의 분자량 범위에 분포하고 있음이 확인되었으며, 주로 \( 10,500 \mathrm{~Da} \)과 \(9,000 \mathrm{~Da}\)의 분자량이 주요 획분이었다. 분자량 한계범위가 \( 5,000 \mathrm{~Da} \)인 막을 통과하여 나온 가수분해물은 \( 5,500 \sim 1,800 \mathrm{~Da} \)의 범위에 분포되어 있었으며, 주요 획분으로서는 \( 5,000 \mathrm{~Da}, 4,000 \mathrm{~Da} \) 및 \( 2,000 \mathrm{~Da} \)이었다. 그리고, 분자량 한계범위가 \( 1,000 \mathrm{~Da} \)인 막을 통과하여 나온 가수분해물은 주로 \( 800 \sim 650 \mathrm{~Da} \)의 분자량 범위에 분포하였다. 이와 같이 각각의 막을 통과하여 나온 가수분해물이 그 막의 분자량 이상에서도 일부 분포되어 있는 것은 그 막의 제조공정상의 분자량 한계에 의한 것으로 판단된다.</p> <p>Turgeon and Gauthier는 2단계 막반응기에서 trypsin과 \( \alpha \)-chymotrypsin으로 유장 단백질을 가수분해하여 분자량을 측정한 결과, 분자량 한계범위가 \( 30,000 \mathrm{~Da} \)인 막에서 분리한 분자량의 분포는 \( 5,000 \sim 20,000 \mathrm{~Da} \)이 주종을 이루었으며, 분자량 한계범위가 \( 1,000 \mathrm{~Da} \)인 막에서 분리한 분자량은 \( 2,000 \mathrm{~Da} \)이하였다고 보고한 바 있다.</p> <h2>ACE 저해 펩타이드의 분리◦정제 및 아미노산 서열 분석</h2> <p>대구의 간을 \( \alpha \)-chymotrypsin으로 2시간 가수분해하여 제조한 가수분해물을 분자량 한계범위가 \( 10,000 \mathrm{~Da}, 5,000 \) \( \mathrm{~Da} \) 및 \( 1,000 \mathrm{~Da} \)인 막을 통과시켜 나온 분획물을 각각 동결건조하여 ACE 저해활성을 측정한 결과는 Table 3에 나타내었다. 즉, 분자량 한계범위가 \( 1,000 \mathrm{~Da} \)인 막을 통과하여 나온 가수분해물이 ACE 저해활성에서 \( \mathrm{IC}_{50} \) 값은 \( 1.31 \mathrm{mg} / \mathrm{m \ell} \)로 \( 10,000 \mathrm{~Da} \)과 \( 5,000 \mathrm{~Da} \)인 막을 통과하여 나온 가수분해물보다 활성이 더 좋았다. 따라서, 본 실험에서 ACE 저해활성은 고분자의 펩타이드보다는 저분자의 펩타이드가 더 뛰어나다는 것을 알 수 있었으며, 이후로는 \( 1,000 \mathrm{~Da} \)의 막을 통과하여 나온 분획물을 이용하여 ACE 저해활성 펩타이드의 분리◦정제용 시료로 사용하였다.</p> <p>각 단계별 막반응기에서 분리한 가수분해물들 중에서 ACE 저해활성이 가장 우수한 펩타이드를 분리하기 위하여, 먼저 양이온 교환수지인 SP-Sephadex C-25를 사용하여 분리하였다. 즉, 분자량 \( 1,000 \mathrm{Da} \) 이하의 가수분해액을 20\( \mathrm{mM} \) sodium acetate buffer \( (\mathrm{pH} \) 4.0)로 평형화시킨 SP-Sephadex C-25 양이온 교환수지에 넣어 30분간 반응시킨 후, 비흡착부분을 용출시키고 수지에 흡착된 부분은 \( 0.25 \mathrm{M} \), \( 0.5 \mathrm{M} \) 및 \( 1.0 \mathrm{M} \mathrm{~NaCl} \) 용액 \( 500 \mathrm{m} \)를 순차적으로 각각 용출하여 4개의 획분으로 분리하였다. 이들 각 분획물을 동결건조한 후 일정량을 정평하여 ACE 저해활성을 측정하였다. 그 결과는 Table 4에서와 같이 4개의 획분 중에서 ACE 저해활성이 가장 우수한 획분은 \( 0.25 \sim 0.5 \mathrm{M} \mathrm{~NaCl} \) 농도범위에서 용출된 획분으로 \( \mathrm{IC}_{50} \) 값이 \( 0.99 \mathrm{mg} / \mathrm{m} \ell \)였다. 이 획분을 다시 Sephadex G-15를 충진시킨 칼럼 \( (\phi 2.5 \times 62 \mathrm{~cm}) \)에 용출시켜 분리한 후, 각 획분을 \( 280 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하여 분획한 후, 이 획분을 동결건조하여 ACE 저해활성을 측정하였다. 이들 획분의 ACE 저해활성은 획분 Ⅲ에서 \( \mathrm{IC}_{50} \) 값이 \( 0.56 \mathrm{mg} / \mathrm{m} \ell \)로 가장 우수하였다. 그리고 획분 Ⅳ의 ACE 저해활성은 \( 0.58 \mathrm{mg}/ \mathrm{m} \)로 획분 Ⅲ와 거의 비슷하였지만 분획량이 매우 적게 나타나 주된 획분이 아님을 알 수 있었다.</p> <p>겔 크로마토그래피에서 분리한 획분 중에서 ACE 저해활성이 가장 우수한 III획분을 동결건조한 후, ODS 칼럼이 장치된 HPLC를 이용하여 \( 0.1 \% \) TFA가 용해되어 있는 물과 acetonitrile 용액으로 선형상 농도구배법 \( (0 \sim 20 \% \) acetonitrile, 30min)으로 용출 \( (2 \mathrm{~mm} \ell / \mathrm{min})\)시켜 분리한 결과를 Fig. 6에 나타내었다. 즉, 겔크로마토그래피에서 ACE 저해활성이 뛰어난 획분인 Ⅲ를 HPLC상에서 선형상 농도구배법으로 용출시킨 결과, A, B 및 C의 3개의 주된 획분을 얻었다. 이들 획분들의 ACE 저해활성을 측정한 결과, 획분 B에서 \( \mathrm{IC}_{50} \) 값이 \( 14 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m \ell} \)로 가장 우수하였으며, 다음으로 획분 C가 \( \mathrm{IC}_{50} \) 값이 \( 39 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m} \ell \)로 나타났다. 가장 활성이 좋은 B획분을 HPLC로 재분리하여 2개의 단일 획분을 얻었으며, 이 2개의 단일 획분을 capillary electrophoresis를 이용하여 순도를 확인한 결과, 모두 단일 피크로 나타났으므로 이 물질은 하나의 순수한 단일 펩타이드임을 확인할 수 있었다.</p> <p>대구의 간 가수분해물로부터 최종적으로 정제된 두 종류의 펩타이드의 아미노산 서열을 분석한 결과는 Table 7에 나타내었다. 즉, 정제된 두 종류의 펩타이드 중에서 획분 B-1의 아미노산 서열은 Met-Ile-Pro-Pro-Tyr-Tyr \( \left(\mathrm{IC}_{50}=10.9 \mu\right. \)\( \mathrm{M}) \)이었으며, 다음으로 획분 B-2는 Gly-Leu-Arg-Asn- Gly-Ile \( \left(\mathrm{IC}_{50}=35.0 \mu \mathrm{M}\right) \)으로 구성되어 있었다. 이들 펩타이드는 모두 hexapeptide로 구성되어 있었으며, 이 중에서 활성이 가장 뛰어난 획분은 C말단에 Tyr이 배열되어 있었는데 이 결과는 ACE의 활성부위를 저해하는데는 펩타이드 \( \mathrm{C} \) 말단의 아미노산이 imino acid와 방향족 아미노산 등의 잔기로 구성되어 있는 펩타이드가 ACE 저해활성이 매우 양호한 것으로 보고되어 있는 결과와 일치하였다.</p> <p>Wako 등은 오징어 간과 몸통육을 자가분해시켜 얻은 추출물로부터 ACE 저해활성이 높은 펩타이드를 분리 정제하여 아미노산 서열을 결정한 결과 Try-Ala-Leu-Pro-His-Ala\(\quad\left(\mathrm{IC}_{50}=9.8 \mu \mathrm{M}\right) \) 및 Gly-Tyr-Ala-Leu-Pro-His-Ala \( \left(\mathrm{IC}_{50}=27.3 \mu \mathrm{M}\right) \) 였다고 보고하였으며, Maruyama 등은 casein의 효소적 가수분해물로부터 ACE 저해활성이 높은 펩타이드의 아미노산 서열은 Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Glu-Val-Phe-Gly-Lys \( \left(\mathrm{IC}_{50}=77.0 \mu \mathrm{M}\right. \) ), Ala-Val-Pro-Tyr-Pro-Gln-Arg \( \left(\mathrm{IC}_{50}=15.0 \mu \mathrm{M}\right) \) 및 Phe-Phe-Val-Ala-Pro \( \left(\mathrm{IC}_{50}=\right. \) \( 6.0 \mu \mathrm{M} \) )였다고 보고하였다. 또한, Yokoyama 등은 가다랑어의 효소적 가수분해룰로부터 ACE 저해활성이 높은 펩타이드의 서열은 ILe-Lys-Pro-Leu-Asn-Tyr ( \( \mathrm{IC}_{50}=43.0 \mu \)M) 및 Asp-Tyr-Gly-Leu-Tyr-Pro \( \left(\mathrm{IC}_{50}=62.0 \mu \mathrm{M}\right) \) 였다고 보고하였으며, 이들을 부분적으로 절단된 형태인 Ile-Lys-Pro, Leu-Asn-Tyr, Asp-Tyr-Gly 및 Leu-Tyr-Pro의 ACE 저해활성은 각각 \( 1.7 \mu \mathrm{M}, 81 \mu \mathrm{M}, 2700 \mu \mathrm{M} \) 및 \( 6.6 \mu \mathrm{M} \) 이었다고 보고하였다. 한편, Kawakami 등은 Leu-Lys-Tyr ( \( \mathrm{IC}_{50}= \) \( 9.78 \mu \mathrm{M} \) )과 유사한 tripeptide를 합성하여 ACE 저해활성을 측정한 결과, Leu-Lys-Pro \( \left(\mathrm{IC}_{50}=2.8 \mu \mathrm{M}\right) \) 및 Val-Lys-Pro\( \left(\mathrm{IC}_{50}=2.6 \mu \mathrm{M}\right) \)이었다고 보고하였다.</p> <p>이상에서 살펴본 바와 같이 ACE 저해활성을 나타내는 펩타이드의 구조는 과거 강력한 ACE 저해제로 알려져 있는 뱀독 유래 펩타이드의 C말단 부분인 Pro-Pro 및 Ala-Pro과 깊은 관계가 있는 것으로 생각되어 왔으나, 최근에는 \( \alpha \)-zein (Leu-Arg-Pro, \( \mathrm{IC}_{50}=0.27 \mu \mathrm{M} \) )과 같이 다른 조합의 아미노산에서도 강한 ACE 저해활성을 나타내는 것으로 보고되어 있다. 뿐만 아니라 펩타이드의 길이 역시 저해활성에 중요한 영향요인이 될 수 있을 것으로 판단된다. 따라서 ACE를 저해할 수 있는 펩타이드의 구조 예측을 위해서는 본 연구와 같은 광범위한 ACE 저해 펩타이드를 대상으로 구성 아미노산의 종류 및 길이와 ACE 저해효과와의 상관성 규명이 필요할 것으로 판단된다.</p>