이 실험에서 사용된 elicitor는 Cho 등의 방법을 통해 이스트 추출물 수용액에 단백질 분해효소를 처리하고, 에탄올을 첨가로 유도된 불용성 성분인 침전물을 회수하고 건조하는 과정을 통해 이스트 효소 분해물을 제조한다. 삼백초 잎을 수확해 건조시킨 뒤 분쇄해서 시료로 사용한다. Total phenolic 정량은 추출물에 에탄올과 증류수를 첨가한 후 Folinciocalteu reagent를 잘 섞어 잠시동안 방치한 뒤 Na2CO3를 더해 흡광도 725nm에서 1시간 내에 측정해 gallic acid로부터 양을 환산했다. 피부 단백질과 유사한 혈액 단백질을 사용해 원심분리관 용기에 시료용액과 헤모글로빈 용액을 같은 비율로 넣어서 혼합한 뒤 3분간 원심분리 후 흡광도를 측정한다.
<h1>실험 재료 및 방법</h1> <h2>Elicitor의 제조 및 적용</h2> <p>본 실험에서 사용된 elicitor는 Cho 등의 방법에 따라 이스트 추출물 수용액에 단백질 분해효소(Aspergillus fumigatus 배양액에서 분리한 단백질 분해효소)를 처리하고, ethanol을 첨가로 유도된 불용성 성분인 침전물을 회수하고 건조하여 이스트 효소 분해물을 제조하였다. 제조된 이스트 효소 분해물 분말 \( \mathrm{kg} \)당 \( 5 \mathrm{~g} \)의 \( \mathrm{CuCl}_{2} \)를 균질하게 혼합하여 elicitor 분말을 제조하여 삼백초의 어린잎이 자라기 시작하는 4월 하순경(4월 30일)부터 잎이 다 자라는 5 월 중순경(5월 14일)까지 생잎 \( \mathrm{g} \) 당 \( 1.5 \mathrm{mg} \)(group A)과 \( 3 \mathrm{mg} \) (group B)의 농도로 3회에 걸쳐 용액으로 제조하여 분무기를 사용하여 직접 잎에 분무하였다.</p> <h2>추출물의 제조</h2> <p>삼백초 잎을 수확하여 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 건조시킨 후 \( 40 \mathrm{mesh} \)로 분쇄하여 시료로 사용하였다. 물 추출물의 경우 시료 \( 1 \mathrm{~g} \)에 증류수\( 200 \mathrm{~mL} \)을 넣고 액이 \( 100 \mathrm{~mL} \)이 될 때까지 가열한 후 냉각하였으며, ethanol 추출물은 시료에 \( 100 \mathrm{~mL} \) 의 \( 70 \% \) ethanol을 가하고 homogenizer로 \( 20,000 \mathrm{rpm} \)에서 1분간 균질화 시킨 후 12시간동안 교반 추출하였다. 물과 ethanol 추출액은 whatman No.1 filter paper로 여과한 후 ethanol 추출물은 rotary vacuum evaporator (BUCHI R-200, Flawil, Switzerland)를 사용하여 추출에 사용한 ethanol을 모두 휘발시킨 후 total volume을 DW로 조절하였으며, 필요에 따라 추출물 모두 농축하여 농도(50-\( 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{g}) \)를 조절한 후 시료로 사용하였다.</p> <h2>Total phenolic 정량</h2> <p>Total phenolic 정량은 추출물 \( 1 \mathrm{~mL} \) 에 95\% ethanol \( 1 \mathrm{~mL} \)와 증류수 \( 5 \mathrm{~mL} \) 를 첨가하고 \( 1 \mathrm{~N} \) Folin-ciocalteu reagent \( 0.5 \mathrm{~mL} \)를 잘 섞어 5 분간 방치한 후 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} 1 \mathrm{~mL} \)를 가하여 흡광도 725 \( \mathrm{nm} \)에서 1시간 이내에 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선 (Total phenolic compounds content in gallic acid (10-200 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \) was calculated using the following equation based on the calibration curve: \( y=0.0083 x-0.027, R^{2}=0.9963 \), where \( \mathrm{y} \) was the absorbance, and \( \mathrm{x} \) was the gallic acid equivalent \( (\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL})) \)으로부터 양을 환산하였다.</p> <h2>항산화 효과 측정</h2> <p>1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical에 대한 소거활성은 Lee 등의 방법에 준하여 측정하였으며, 전자공여능(\%)은 \( 1-( \) 반응구의 흅광도/대조구의 흅광도) \( \times 100 \)으로 나타내었다. Antioxidant protection factor (PF)는 Andarwulan과 Shetty의 방법에 준하여 측정하였으며, \( \mathrm{PF} \)는 반응구의 흅광도/대조구의 비로 나타내었다.</p> <h2>미백효과(Tyrosinase 억제) 측정</h2> <p>Tyrosinase 저해효과 측정은 Vincent와 Hearing의 방법에 준하여 측정하였다. 반응구는 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer\( (\mathrm{pH} \) 6.8) \( 2.3 \mathrm{~mL} \)와 기질액 \( 1.5 \mathrm{mM} \) L-tyrosine 용액 \( 0.4 \mathrm{~mL} \)의 혼합액에 mushroom tyrosinase (Sigma-Aldrich Co, Louis,\( \mathrm{MO} \), USA, \( 250 \mathrm{U} / \mathrm{mL}) 0.1 \mathrm{~mL} \) 와 시료 \( 0.2 \mathrm{~mL} \) 를 넣고 대조구에는 시료 대신 증류수를 \( 0.2 \mathrm{~mL} \)를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 반응시켜 흡광도 \( 475 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하여, 저해율(\%)은 (1-시료의 absorbance/대조구의 absorbance) \( \times 100 \)으로 계산하였다.</p> <h2>수렴효과(astringent) 측정</h2> <p>Astringent 활성 측정은 Wunsch과 Heidrich의 방법에 따라 측정하였다. 피부 단백질과 유사한 혈액 단백질(hemoglobin)을 사용하여, 원심분리관 용기에 각각의 시료용액과 헤모글로빈 용액을 1:1로 넣어서 진탕 혼합한 다음 1,500 rpm에서 3분간 원심분리 후 \( 576 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. Astringent 활성 \( (\%) \)은 (1-시료의 흡광도/대조구의 흡광도 \( ) \times 100 \)으로 계산하였다.</p> <h2>주름개선 효과(elastase 저해) 측정</h2> <p>Elastase 저해효과 측정은 Kraunsoe 등의 방법 에 준하여 측정하였다. 반응구는 \( 0.2 \mathrm{M} \) Tris-HCl buffer ( \( \mathrm{pH} 8.0 \) ) \( 1 \mathrm{~mL} \)에 기질액 \( 0.8 \mathrm{mM} \mathrm{N} \)-succinyl-(Ala) \( { }^{3}-\gamma \)-nitroanilide 용액 \( 0.1 \mathrm{~mL} \) 의 혼합액에 \( 1.0 \mathrm{U} / \mathrm{mL} \) porcine pancreatice elastase (PPE) (Sigma-Aldrich Co.) 효소용액 \( 0.1 \mathrm{~mL} \) 와 시료 \( 0.1 \mathrm{~mL} \)를 넣고 대조구에는 시료 대신 증류수 \( 0.1 \mathrm{~mL} \)를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 반 응시켜 \( \gamma \)-nitroaniline 생성량을 흡광도 \( 410 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. 저해율(\%)은 (1-시료의 absorbance/대조구의 absorbance) \( \times 100 \)으로 계산하였다.</p> <h2>염증억제 작용(Hyaluronidase, HAase 억제) 측정</h2> <p>HAase 저해효과는 Lee 등의 방법에 준하여 측정하였다. 반응구는 시료 \( 0.5 \mathrm{~mL} \)에 \( 20 \mathrm{mM} \) Sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \)6.9)에 녹인 HAase \( (1,000 \mathrm{U} / \mathrm{mL}) \quad 0.5 \mathrm{~mL} \) 을 혼합하여 \( 38^{\circ} \mathrm{C} \) 에 서 5 분간 반응시키고 \( 0.3 \mathrm{M} \) phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 5.3)^{\text {에 녹인 }} \) 기질( \( 4 \mathrm{mg} / \mathrm{mL}) 0.5 \mathrm{~mL} \) 을 넝어 다시 \( 38^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45분간 반응시킨 후 \( 0.04 \mathrm{M} \) acetate buffer \( (\mathrm{pH} 3.75) \)에 녹인 알부민용액 5\( \mathrm{mL} \)을 첨가한 후 5분간 방치하고 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 투과율을 측정하 였다. 대조구는 시료 대신 증류수 \( 0.5 \mathrm{~mL} \)를 넣어 반응시켰다. 저해율(\%)은 (1-시료의 부과율/대조구의 부과율 \( ) \times 100 \) 으로 계산 하였다.</p>