Wnt/\(\beta\)-catenin 신호전달체계는 세포 분화, 발생, 증식 및 암의 형성에 중요한 역할을 하며 Wnt 리간드 단백질의 존재 여부에 따라 \(\beta\)-catenin 단백질의 양이 달라진다. Wnt/\(\beta\)-catenin 신호전달체계는 세포 분화, 발생, 증식 및 암의 형성에 중요한 역할을 하며 Wnt 리간드 단백질의 존재 여부에 따라 \(\beta\)-catenin 단백질의 양이 달라진다. Bryostatin-1은 Bugula neritina 의 추출물로부터 분리되었으며 apoptosis 유도, 다중약물내성 변화, 면역성 자극 등의 생물학적 활성을 가지고 있으며 임상 실험이 진행 중이나 임상 전 연구결과를 토대로 진행된 전립선 암을 포함한 여러 암들에 대한 임상 연구에서 효과가 최소하거나 효과를 보이지 않기도 하였다.
<p>\(Wnt\)/\( \beta \)-\(catenin\) 신호전달체계는 세포의 분화, 발생, 증식 및 암의 형성에 중요한 역할을 하며 \(Wnt\)/\( \beta \)-\(catenin\)신호전달체계의 조절은 세포 내의 \( \beta \)-\(catenin\) 단백질 양에 의해 결정된다. \(Wnt\) 리간드 단백질이 없을 시에는 세포 내에 존재하는 \( \beta \)-catenin 단백질이 분해 복합체에 의해 인산화 된다. 이 인산화된 단백질에 유비퀴틴 표지가 일어나고 이는 프로테아좀에 의해 인식 및 분해된다. \(Wnt\) 리간드가 있을 경우에는 분해 복합체에 의한 인산화가 일어나지 않아 ( \beta \)-\(catenin\)이 프로테아좀에 의해 분해되는 경로가 저해됨으로써 \( \beta \)-catenin의 세포 내 농도가 증가된다. 증가된 \( \beta \)-\(catenin\)은 핵으로 이동하여 전사인자인 T 세 포인자-\(4\) (TCF-\(4\))와 결합하여 ( \beta \)-\(catenin\)의 표적 유전자인 \( c \) \( m y c \), cyclin D\(1\), MMP7, PPAR- \( \gamma \)등의 발현을 활성화 시킨다. 이 표적 유전자들의 발현 증가는 세포 증식 및 암 등의 질병과 밀접한 관계가 있음이 보고되었다. 그러므로 \(Wnt\)/\( \beta \)-\(catenin\) 신호전달체계의 효과적인 억제는 암 예방과 치료를 위한 중요한 표적이 된다.</p> <p>Bryostatin-\(1\)은 해양 이끼벌레류(marin bryozoans)의 Bugula neritina 의 추출물로부터 분리 되었으며 apoptosis 유도, 다중약물내성의 변화, 면역성의 자극, 일반 조혈 작용의 자극, 동물 모델에서의 기억과 인식의 향상 등의 생물학적 활성을 가진다. 또한 현재 난소암, 자궁암 흑색 종, 백혈병, 림프종, 대장암 등에 대한 치료제 개발을 위한 임상 실험이 진행 중에 있다. 그러나 임상 전 연구결과를 토대로 진행된 전립선 암을 포함한 여러 암들에 대한 임상 연구에서 bryostatin-\(1\)의 효과가 최소한이거나 효과를 보이지 않기도 하였다. 따라서 bryostatin-\(1\)의 임상학적 결과를 개선시키기 위해 bryostatin-\(1\)의 작용 기전에 대한 더 많은 연구가 필요하다.</p> <p>탐색하기 위하여 \( \beta \)-\(catenin\)에 의해 반딧불 발광효소의 발현 이 조절되는 TOPflash 표지 플라즈미드와 인간 Frizzled-\(1\) (hFz-\(1\))를 발현하는 플라즈미드가 안정적으로 발현되는 인간배아 신장 세포인 HEK\(293\) 세포주를 확립하였다(HEK\(293\) 표지세포). 이 세포주를 \(96\) well plate에 \( 2.6 \times 10^{5} \) cells \( / \mathrm{ml} \) 로 분주하여 \(24\)시간 배양하였다. 각 wellon Wnt\(3\)a 배지와 화합 물을 첨가하고 \(15\)시간 후에 반딧불 발광효소 활성과 세포 생존율을 Victor-\(5\) microplate reader를 이용하여 분석하였다.</p> <p>Wnt\(3\)a 배지를 첨가한 경우 TOPflash 표지의 활성이 증가 되는 것을 관찰할 수 있었고 \(100\)여종의 천연물 및 유도체를 스크리닝 한 결과 Wnt\(3\)a 배지에 의해 활성화된 TOPflash 표지의 활성을 저해하는 bryostatin-\(1\)을 발굴하였다(Fig. \( 1 \mathrm{~A}) \). 이 화합물의 구조는 Fig. \( 1 \mathrm{~B} \) 에서 보는 바와 같다. 또한 HEK\(293\) 표지세포를 다양한 농도의 bryostatin-\(1\)과 함께 배양한 후 반딧불 발광효소 활성을 측정한 결과 Wnt\(3\)a 배지에 의해 활성화된 \( \beta \)-catenin 의존적 전사가 bryostatin-\(1\)의 농도에 의존적으로 억제됨을 관찰할 수 있었다(Fig. \(1\)C).</p> <p>\(Wnt\)/ \( \beta \)-catenin는 유비퀴틴 의존적 분해에 의해 조절되는 세포 내 \( \beta \)-catenin 단백질의 수준과 밀접한 관련이 있다. 따라서 bryostatin-\(1\)이 세포 내 \( \beta \)-catenin 단백질 수준에 영향을 미치는지를 확인 하기 위하여 HEK\(293\) 표지세포에 다양한 농도의 bryostatin-\(1\) 을 처리한 후 세포질을 Dignam 등이 기술한 방법으로 분획하고 세포질 분획내의 \( \beta \)-catenin 단백질의 양은 \( \beta \) catenin에 특이적인 항체를 이용한 western blot 방법으로 측정하였다. 세포질 분획은 \(4\)-\(12\)\% gradient SDS-PAGE (Invitrogen)을 이용하여 분리하고 nitrocellulose membrane (Amersham Bioscience)에 옮겼다. Membrane을 \(5\)% 탈지 분유로 blocking 시킨 후 일차 항체인 anti-\( \beta \)-catenin (BD Transduction Laboratories)와 anti-actin (Sigma-Aldrich, USA)을 처리하였다. 일차 항체 처리 후 TBS-T로 \(5\)회 씻어내고, 이차 항체인 anti-mouse IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology)를 처리하였다. 밴드는 ECL detection system (Santa Cruz Biotechnology, USA)을 사용하여 확인하였다. \( \beta \)-catenin 의존적 전사로부터 얻은 결과와 동일하게 Wnt\(3\)a 배지를 첨가한 경우 HEK\(293\) 표지 세포내의 \( \beta \)-catenin 단백질 수준이 증가되었다(Fig. \(2\)A). 또한, Wnt\(3\)a 배지에 의해 증가된 세포 내 \( \beta \)-catenin 단백질의 수준이 bryostatin-\(1\)의 처리에 의해 농도의존적으로 감소함을 관찰할 수 있었다(Fig. \(2\)A).</p>