한약재의 methanol 추출물은 36종의 한약재를 멸균 후 냉각한 뒤 10배 부피의 methanol을 첨가하여 반복 추출하는 방식으로 조제하였다. 발효 한약재의 methanol 추출물과 균사체의 methanol 추출물을 조제하기 위하여 36종의 한약재 \( 100 \mathrm { ~g } \) 을 각각 \( 850 \mathrm { ml } \) polypropylene bottle에 넣고 멸균 후 냉각하였으며 장수상황버섯 균사체 액체 종균을 각각 무균적으로 접종하였다. 조제된 추출물들이 HCT116, HEK-293, 3T3-L1, MC3T3-E1 세포주의 세포 생육에 미치는 영향을 평가하기 위해 One solution cell proliferation assay kit을 사용하였다.
<h2>한약재의 methano추출물의 조제</h2> <p>준비된 36 종의 한약재 \( 100 \mathrm { ~g } \) 을 각각 \(1 \mathrm { l } \) 플라스크에 넣고, 이를 \( 121 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20 분간 멸간한 후 상온에서 냉각하였으며, 이후 10 배 부피의 methanol을 첨가하여 상온에서 24 시간 동안 3회 반복 추출하였다. 추출액은 filter paper (Whatman No.2)로. 거른 후 감압 하에서 농축하여 한약재 추출물을 조제하였다.</p> <h2>균사체를 이용한 한약재의 고체발효 및 발효 한약재의 추출물 조제</h2> <p>준비된 36종의 한약재 \( 100 \mathrm { ~g } \) 을 각각 \( 850 \mathrm { ml } \) polypropylene bottle (Namsan Eng., Korea)에 넣고 \( 121 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20분간 멸균한 후 냉각하였으며, PDB 배지에서 \( 25 \pm 1 ^ {\circ } \mathrm { C } , 130 \mathrm { rpm } \) 으로 10일간 배양한 장수상황버섯 균사체 액체 종균 \( 20 \mathrm { ml } \) 씩을 한약재에 각각 무균적으로 접종하였다. 이후 멸균마개를 이용하여 오염을 방지하고, \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 상대습도 \( 90 \% \) 의 배양기에서 20일간 발효시켰다. 발효 한약재의 methanol 추출물은 한약재 추출물 조제와 동일한 방법으로 조제하였다. 접종에 사용된 액체 종균 균사체는 원심 집균한 후 멸균수로 2회 수세하고 2일간 동결건조 후, 상기와 동일한 방법으로 균사체의 methanol 추출물을 조제하였다.</p> <h2>세포주 배양 및 생존율 조사</h2> <p>본 실험의 HCT116, HEK-293, 3T3-L1 및 MC3T3-E1 세포주의 배양 및 계대에는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(Gibco-BRL Inc., USA)를 사용하였으며, \( 10 \% \) Fetal Bovine Serum (Gibco-BRL Inc., USA), 1 \% penicillin 및 streptomycin(WelGene Inc., Korea)을 첨가하여 사용하였다. 한편 조제된 다양한 추출물들이 HCT116, HEK-293, 3T3-L1 및 MC3T3-E1 세포주의 세포 생육에 미치는 영향은 One solution cell proliferation assay kit (Promega, USA)을 이용하여 평가하였다. 즉, 96 well plate에 well당 \( 3 \times 10 ^ { 3 } \) 개의 세포를 접종하고 24 시간 배양한 후 다양한 농도의 한약재 추출물, 발효한 약재 추출물 및 균사체 추출물을 처리하였다. 각 추출물을 각각 24시간 동안 반응시킨 후, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2 \( \mathrm { H } \)-tetrazolium (MTS; Promega, USA) 용액을 각 well 당 \( 20 \mathrm {\mu l } \)씩넣고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 4 시간 동안 반응 시켰으며, 반응 종료 후 96 well plate reader (Expert 96 UV ASYS Hitech, Austria)를 이용하여 \( 490 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하여 성장률을 계산하였다. 결과 수치는 4 개의 독립적인 well 에서 수행한 값을 mean \( \pm \)SD 값으로 나타내었으며, \( 50 \% \) 성장억제를 나타내는 농도를 \( \mathrm { IC } _ { 50 } \) (Inhibitory Concentration 50)로 표시하였다.</p>