LIVE/DEAD BacLight bacterial viability kit은 대장균의 생육력을 측정하기 위해 사용되며, SYTO9과 propidium iodide라는 두 가지 핵산 염색 염료로 구성되어 있다. 구리 처리된 대장균의 경우, 시간이 경과함에 따라 정상 세포의 수가 감소하고 일부 세포막에 손상이 나타나는 compromised cell 집단과 죽은 세포 집단이 관찰되었다. VBNC 상태에 있는 대장균의 genomic DNA(g-DNA)와 RNA를 분리하여 상태를 확인한 결과, 구리에 노출된 시간이 경과할수록 g-DNA와 RNA 모두 붕괴되었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>구리를 이용한 VBNC 상태 형성</h2> <p>대조군과 \( 500 \mu \mathrm{M} \) 농도의 \( \mathrm{CuSO}_{4} \) 를 함유한 \( 0.9 \% \mathrm{NaCl} \) 용액에 현탁한 E. coli 균주에 대해 날짜별로 집락 형성수와 생육력을 측정한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 시간이 지남 에 따라 CFU는 급격히 감소하였으나 Flow cytometry 분석에 의한 생육력은 상대적으로 천천히 줄어들었다. 이 두 값 의 차이가 VBNC 상태에 들어간 세포수가 된다. \( 500 \mu \mathrm{M} \) 의 구리 처리 후 3일이 지나자 대부분의 E. col가 VBNC 상태로 유도되었다.</p> <p>일반적으로 많이 사용되는 VBNC 유도 방법인 저온 \( \left(4^{\circ} \mathrm{C}\right) \)과 인공 바닷물 병용처리 방법은 매우 오랜 시간(80일 이상)이 소요되는 단점이 있어 본 연구에서는 구리를 처리하여 신속하게 VBNC 를 유도하였다.</p> <h2>Flow cytometry 분석을 퉁한 VBNC 세포 distribution</h2> <p>대장균의 생육력을 측정하기 위해 사용한 LIVE/DEAD BacLight bacterial viability kit는 두 가지 핵산 염색 염료인 SYTO9(녹색)과 propidium iodide(PI, 빨강색)으로 구성되어 있다. 완전한 세포막을 지니는 미생물의 경우 PI는 투과하지 못하고 SYTO9만 투과해 밝은 녹색형광을 나타내고, 손상된 세포막을 지니는 미생물은 SYTO9과 PI 모두 투과해 약한 녹색형광과 붉은색 형광을 나타낸다. 이러한 원리를 이용해 정상세포와 죽은 세포 그리고 손상된 세포의 구분계수가 가능하였다.</p> <p>정상 상태의 대장균은 완전한 세포막을 가지고 있기 때문에 SYTO9만이 막 안으로 통과하여 핵산을 염색하여 FLl에서 강한 형광을 나타내었다(Fig. 2A). 구리를 처리한 대장균의 경우에는 시간이 경과함에 따라 정상 세포의 수는 감소하고 일부 세포막의 손상이 보이는 compromised cell 집단 (FL1과 FL3 모두 반응)과 죽은 세포 집단(FL3)이 나타났다. 이러한 결과는 구리에 의해 세포가 스트레스를 받게 되어 그 중 일부는 죽게 되고 일부는 VBNC 상태가 형성되었음을 나타낸다. 구리 처리 후 3일 이상 경과했을 때 집락형성계수는 0 으로 배양 가능한 미생물이 존재하지 않지만 flow cytometry 분석을 통해 여전히 많은 수의 세포가 VBNC 상태로 살아있음이 확인되었다.</p> <h2>VBNC 상태에서의 DNA와 RNA의 stability</h2> <p>VBNC 상태에 들어간 대장균의 genomic DNA(g-DNA) 와 RNA를 분리하여 상태를 확인한 결과 Fig. 3 에서와 같이 \( \mathrm{Cu} \) 에 노출된 시간이 경과할수록 g-DNA 와 RNA 모두 붕괴가 진행됨을 확인하였다. RNA의 붕괴가 상대적으로 더 빨리 진행되었으며 6일이 경과한 후에는 23S 와 16S rRNA가 거의 보이지 않을 정도로 분해되었다. 하지만 비특이적인 RNA 분해효소에 의해 매우 작은 크기로 분해되는 것과는 다르게 일정한 크기가 유지되면서 분해되는 것이 관찰되었다. 이를 통해 VBNC 상태의 세포는 유전정보인 유전체 DNA는 상대적으로 잘 보존하면서 유리한 환경이 올 때까지 생존에 꼭 필요한 대사활동을 유지하기 위하여 생육력 유지에 불필요한 RNA는 분해하는 것으로 추정하였다.</p>