본 논문에서 제시한 조효소액과 정제한 효소액은 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)부터 효소활성이 증가하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 정점을 찍고, \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)부터는 활성이 급격히 감소하여 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 활성이 소실됨을 보였다. 다음으로 금속이온과 저해제에 대한 영향을 분석한 결과 \( \mathrm{MgCl}_{2} \) 와 \( \mathrm{MnCl}_{2} \) 의 금속이온에 대해서는 효소활성 증가를 보이며, \( \mathrm{CuCl}_{2} \)의 금속이온에 대해서는 효소활성 감소를 보였으며, EDTA, PMSF, Antipain의 저해제에 대해 효소활성 감소를 보였다.
<h2>최적반응 온도 및 온도 안정성</h2><p>조효소액과 정제한 효소액에 대한 온도의 영향은 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)부터 효소활성이 점차 증가하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 최대활성을 나타내었다(Fig. 7A). \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 사이에서 온도에 대한 안정성을 나타내었으나 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 이상부터 활성이 급격히 감소하였고 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 활성이 소실되었다(Fig. 7B). Bacillus subtilis KCK-7이 생산한 혈전분해 효소는 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 최대활성을 나타내었고 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \)에서도 \( 20 \% \)의 효소활성을 유지하였다고 보고하였다. B. licheniformis KJ-31이 생산한 혈전분해 효소는 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 최대활성을 나타내었고 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 이상에서는 급격히 감소하는 경향을 나타내었다. Kim 등이 분리한 B. amyloliquefaciens CH51이 생산한 혈전분해 효소는 \(35-45^{\circ} \mathrm{C} \)에서 최대활성을 나타내었다고 보고하였는데, 이는 본 연구결과와도 유사하였다. Jo 등은 메주로부터 분리한 B. amyloliquefaciens MJ5-41이 생산한 혈전분해 효소는 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)에서 최대활성을 나타내었으나 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 이상에서는 급격히 활성이 감소되었다고 보고하였다. Yeo 등이 분리한 Bacillus subtilis A1이 생산한 혈전분해 효소는 \( 20-50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 효소의 안정성을 나타내었으나 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 이상에서는 급격히 감소하였는데 이는 본 연구결과와 유사한 경향을 나타내었다. 위와 같은 연구결과를 통해 청국장에서 분리한 미생물이 생산하는 혈전분해 효소활성의 특성은 \( 40-45^{\circ} \mathrm{C} \)에서 발효하는 청국장의 발효온도 조건과 유사한 것으로 사료된다.</p><h2>금속이온 및 저해제에 대한 영향</h2><p>정제한 효소의 금속이온과 저해제에 대한 영향을 알아보기 위해 각각의 금속이온과 저해제를 최종농도가 \( 2 \mathrm{mM} \) 과 \( 5 \mathrm{mM} \)이 되도록 사용하여 효소활성을 측정하였다(Table 3). \( 2 \mathrm{mM} \) 과 \( 5 \mathrm{mM} \) 농도의 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 와 \( \mathrm{CaCl}_{2} \) 의 금속이온과 \( 5 \mathrm{mM} \) 농도의 \( \mathrm{MgCl}_{2} \) 와 \( \mathrm{MnCl}_{2} \) 의 금속이온이 존재할 때는 효소활성이 증가하였으며, \( \mathrm{CuCl}_{2} \)의 금속이온이 \( 2 \mathrm{mM} \) 과 \( 5 \mathrm{mM} \)의 농도로 존재할 때는 효소활성이 감소하는 결과를 나타내었다. 깊은 바닷물로부터 분리한 B. subtilis ICTF-1이 생산하는 혈전분해 효소는 \( \mathrm{Ca}^{+2}, \mathrm{Mg}^{+2}, \mathrm{Mn}^{+2} \) 등의 금속이온이 존재할 때 효소활성이 증가하였다고 Mahajan 등은 보고하였으며, Hassanein 등은 B. subtilis K42가 생산하는 혈전분해 효소에 \( \mathrm{Co}^{+2} \) 금속이온이 존재할 때, 효소활성이 \( 137 \% \) 증가하였다고 보고하였는데 이는 본 연구의 결과와 유사함을 나타내었다. Yin 등이 분리한 B. subtilis YJ1이 생산하는 혈전분해 효소는 \( \mathrm{Ba}^{+2} \) 금속이온이 존재할 때, 효소활성이 증가하였으며, \( \mathrm{Cu}^{+2}, \mathrm{Zn}^{+2}, \mathrm{Fe}^{+2} \) 의 금속이온이 존재할 때는 효소활성이 감소하는 결과를 나타내었다.</p><p>정제한 효소의 inhibitor에 대한 영향을 알아보기 위하여 metalloprotease를 억제하는 ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA), serine protease를 억제하는 phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), serine/cystein protease를 억제하는 antipain, 그리고 aspartyl protease를 억제하는 pepstatin \( \mathrm{A} \)을 이용하여 효소활성을 측정하였다. \( 2 \mathrm{mM} \) 과 \( 5 \mathrm{mM} \) 농도의 EDTA, PMSF, Antipain의 저해제가 존재할 때, 효소활성이 감소하는 결과를 나타내어 B. amyloliquefaciens HC188이 생산하는 혈전분해 효소는 metallo-serine protease로 사료되었다. Wang 등 은 중국의 전통 발효식품인 Douchi에서 분리한 B. subtilis DC33이 생산하는 혈 전분해 효소가 PMSF에 의해 저해를 받았지만 EDTA에 의해서는 저해를 받지 않아 serine protease라고 보고하였으며, Kim 등이 분리한 Bacillus sp. KA38와 Lee 등이 분리한 Bacillus sp. KOD-13이 생산한 혈전분해 효소는 EDTA에 의해 효소활성의 저해를 받아 metalloprotease라고 보고하였다. Yang 등 은 PMSF와 EDTA에 의해 저해를 받아 metallo-serine protease라고 보고하였는데 이는 본 연구의 결과와도 유사하였다.</p>