RAW264.7 cell을 96 well plate에 \( 5 \times 10 ^ { 4 } \) cells/well로 분주하고 ATX, LPS를 처리하여 37\(^\circ \mathrm{C}\), 5% CO2 incubator에서 20시간 배양한 후, MTT를 0.5 mg/ml로 처리하여 세포 생존율을 570 nm에서 ELISA microplate reader로 측정하고 Griess 시약으로 NO 생성량을 540 nm에서 ELISA microplate reader로 측정하여 세포 생존율과 NO 생성량을 측정하였다.
<h2>세포 생존율 측정</h2> <p>RAW264.7 cell을 96 well plate에 \( 5 \times 10 ^ { 4 } \) cells/well로 분주하여 16시간 배양한 후, ATX를 농도별 \( (25-100 \mu \mathrm { M } ) \)로 처리하여 1시간 동안 배양하였다. 그 후, lipopolysaccharide (LPS)를 처리하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 20시간 배양하였다. 세포배양액을 제거한 후, 세포에 MTT를 \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \)의 농도로 처리하여 4시간 배양한 후, 배지를 제거하고 생성된 formazan crystals을 DMSO에 녹여 ELISA microplate reader (Tecan, USA)로 \( 570 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 구하였다. 세포의 생존율은 control cell에 대한 백분율로 표시하엿다.</p> <h2>Nitric oxide ( \( \mathrm { NO } \)) 생성량 측정</h2> <p>RAW264.7 cell을 96 well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well로 분주 하여 16시간 배양한 후, ATX를 농도별( \(25-100 \mu \mathrm { M } \))로 처리하여 1시간 동안 배양하였다. 그 후, LPS로 처리하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 20시간 배양하고, \( \mathrm { NO } \)의 양을 Griess 시약으로 측정하였다. 즉, 세포배양액 \( 100 \mu \mathrm { l } \)와 Griess 시약(1 \( \% \) sul-fanilamide in \( 5 \% \) phosphoric acid + \( 1 \% \) \( \alpha \)-naphthylamide in \( \left . \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \right ) \) \(100 \mu \mathrm { l } \)를 혼합하여 96 well plate에서 15분 동안 반응시킨 후, \( 540 \mathrm { ~nm } \)에서 ELISA microplate reader (Tecan, USA)로 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite \( \left ( \mathrm { NaNO } _ { 2 } \right ) \)로 흡광도를 측정하여 표준곡선을 얻은 후, \( \mathrm { NO } \)의 농도를 산출하였다.</p>