크립토스포리디움은 수인성 병원성 기생충이며, EPA 1623 method에 의한 면역형광분석법을 통해 환경시료에서 원생동물을 분석할 수 있다. 그러나 이 방법으로는 활성 또는 감염성의 정보를 얻을 수 없다. 크림토스포리디움의 감염성 판별법으로 세포배양법과 동물세포감염법이 있다. 감염성 판별법 중 대표적인 방법으로 마우스 등에 크립토스포리디움의 난포낭을 주입하여 감염여부를 확인하는 방법이 있으나 실험에 비용 및 노력이 굉장히 많이 든다는 단점이 있었다. 대신 HCT-8 등 사람의 암세포를 배양해 크립토스포리디움의 난포낭을 감염시켜 감염성 유무를 확인할 수 있는 대안을 사용할 수 있다.
<h1>서 론</h1> <p>크립토스포리디움은 사람에게 장염 등을 일으키는 수인성 병원성 기생충으로, 현재 환경시료에서 원생동물을 분석하는 방법으로는 EPA 1623 method에 의한 면역형광분석법을 가장 널리 사용하고 있다. 그러나 이 방법은 크립토스포리 디움 단일항체를 이용한 세포벽 형광염색(Fluorescein iso-thiocyanate, FITC), DAPI (4',6-diamidino-2- phenylindole)에 의한 핵 염색, 그리고 DIC (Differential interference contrast)를 이용하여, 내부구조를 확인하는 방법으로, 활성 또는 감염성에 대한 정보는 얻을 수 없는 단점이 있다. 따라서 크립토 스포리디움의 활성 또는 감염성을 분석하기 위한 다양한 방법이 제시, 연구되어 왔다. 이러한 방법들 중 활성판별법으로는 vital dye staining, in vitro excystation, direct RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) 등이 있는데, 이들 방법으로는 세포의 생사에 대한 정보만 줄 뿐 사람에게 감염성을 가지는지는 알 수가 없다.</p> <p>크립토스포리디움의 감염성 판별법으로는 세포배양법, 동물세포감염법등이 있다. 감염성 판별법의 대표적인 방법은 마우스 등에 크립토스포리디움의 난포낭을 주입하여 감염여부를 확인하는 방법으로 개별 난포낭에 대한 감염성은 알 수 없으며, 실험하는데 비용 및 노력이 굉장히 많이 든다는 단점이 있다. 이에 대한 대안으로 HCT-8과 같은 사람의 암세포를 배양하여 여기에 크립토스포리디움의 난포낭을 감염시켜 감염성 유무를 확인한다. 이 때, 감염성 유무확인 방법에는 두 가지가 있는데, 첫 번째는 PCR 또는 RT-PCR 방법을 시도하는 것이다. 여러 보고를 통해 세포배양 후 PCR 및 RT-PCR 방법으로 감염여부를 판정한 결과와 마우스 감염 실험결과와 매우 유사하다는 것이 확인된 바 있다. 두 번째는 세포배양 후 크립토스포리디움의 생활환(Life Cycle)과정 중에 형성되는 merozoite 및 sporozoite등에 대한 poly-clonal항체와 형광염색시약이 결합된 키트를 이용하여 형광 염색함으로써 감염성 유무를 확인하는 것이다.</p> <p>본 연구에서는 활성판별법중의 하나인 Direct RT-PCR과 감염성 판별법인 HCT-8 세포를 이용하여 크립토스포리디움을 감염시킨 후, RT-PCR 및 면역형광염색법(Immunofluorescence Assay, IFA)으로 검출하는 방법 등의 민감도 등을 비교하여 환경시료중 크립토스포리디움 난포낭의 감염성 또는 활성을 모니터링할 때 어떤 방법이 효율적인 것인가를 알아보고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>크립토스포리디움 난포낭 준비</h2> <p>실험에 사용된 크립토스포리디움 난포낭은 건국대학교 의과대학 기생충학교실에서 실험용 마우스(C57BL)를 이용해 계대 배양한 난포낭 및 bovine 유래의 상용화된 살아있는 크립토스포리디움을 구입하여 사용하였다. 민감도 실험을 위해 먼저 준비된 크립토스포리디움을 in vitro excystation방법에 의해 \( 98 \% \)이상의 활성을 가졌음을 확인한 후, hae-mocytometer를 이용하여 세포수를 측정한 다음 원하는 세포 수가 되도록 인산완충용액으로 희석하여 사용하였다.</p>