시료 전 처리의 경우에 5일간 배양한 수지상세포( \( 3 \times 10^{4} \) 개)에 HemoHIM을 농도별\( (1,10,100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml}) \)로 처리하고 24시간 후 자외선\( \left(0 \sim 160 \mathrm{~mJ} / \mathrm{cm}^{2}\right) \)을 조사한 뒤 동시에 OVA\((1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)항원을 처리하였다. 자외선을 수지상세포에 조사하기 전과 후에 HemoHIM을 농도별 \( (1,10,100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)로 처리하고 OVA 항원과 T 세포주를 첨가하여 24시간 배양 한 후, 배양 상층액을 수거하여 상층액에 포함된 IL-2, IFN-\( \gamma \)의 양을 효소 항체법(enzyme-linked immunsorbent assay : ELISA)를 이용하여 측정하였으며 DNCB (1-Chloro-2, 4-Dinitrobenzene, Sigma)를 사용직전에 만들어 합텐으로 사용하였으며 acetone과 olive oil을 4:1로 섞은 용액에 원하는 농도로 용해시켜 희석해 사용하였다.
<h2>OVA항원 특이적 T 세포주 증식 측정</h2> <p>시료 전 처리의 경우에 5 일간 배양한 수지상세포( \( 3 \times 10^{4} \) 개)에 HemoHIM을 농도별 \( (1,10,100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml}) \) 로 처리하고 24 시간 후 자외선 \( \left(0 \sim 160 \mathrm{~mJ} / \mathrm{cm}^{2}\right) \) 을 조사하고 동시에 \( \mathrm{OVA}(1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)항원을 처리하였다. 다시 24 시간 배양한 후 OVA에 특이적으로 반응하는 \( \mathrm{T} \) 세포주 \( \left(5 \times 10^{4}\right. \) 개 \( ) \) 를 첨가하여 3 일간 배양한 후 \( \mathrm{T} \) 세포주의 증식을 측정하였다. 시료 후 처리의 경우에 6 일간 배양한 수지상세포 \( \left(3 \times 10^{4}\right. \) 개)에 자외선 \( \left(0-160 \mathrm{~mJ} / \mathrm{cm}^{2}\right) \) 을 조사하고 \( \mathrm{HemoHIM} \) 을 농도별 \( (1,10,100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 로 처리하고 동시에 OVA \( (1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 항원을 처리하였다. 다시 24 시간 배양한 후 OVA에 특이적으로 반응하는 T 세포주( \( 5 \times 10^{4} \) 개)를 첨가하여 다시 3일간 배양한 후 T 세포주의 증식을 측정하였다. T 세포주 증식은 Cell titer \( 96^{\mathbb{R}} \) Aqueous One Solution Cell proliferation Assay를 사용하여 측정하였다. 즉 배양액 100 씨에 cell titer 시약을 15 씨씩 첨가하여 4~8시간 동안 배양한 다음 Microplate reader (OPTImax, Molecular Devices, USA)를 이용하여 \( 490 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>IL-2와 IFN-\(\gamma \) 분비량 측정</h2> <p>자외선을 수지상세포에 조사하기 전과 후에 HemoHIM을 농도별 \( (1,10,100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 로 처리하고 \( \mathrm{OVA} \) 항원과 \( \mathrm{T} \) 세포주를 첨가하여 24 시간 배양 한 후, 배양 상층액을 수거하여 상층액에 포함된 IL-2, IFN-v의 양을 효소 항체법(enzyme-linked immunsorbent assay : ELISA)를 이용하여 측정하였다. 즉, 일차항체 anti-IL-2, IFN- \( \gamma \) mAb를 coating buffer (0.1 \(\mathrm{M}\) \( \mathrm{NaHCO}_{3} \))에 희석하여 plate에 적정량을 넣고 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 하룻밤 둔 다음 washing \( (0.05 \% \) Tween 20/PBS)으로 세척한 다음, \( 10 \% \mathrm{FCS} \) 를 첨가한 PBS로 2시간 동안 blocking하였다. 그리고 배양 상층액을 적절하게 희석하여 넣은 다음, 4시간 후에 washing용액으로 세척하고 이차 항체 biotin-conjugated anti-IL-2, IFN-v mAb를 첨가하였다. 1 시간 후에 washing용액으로 세척한 다음, avidin-peroxidase를 첨가하고, 기질 \( (2,2 \) ' -azino-bis, \( 0.1 \mathrm{M} \) citric acid, \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) ) 를 넣어 발색시켜서 Microplate reader를 이용하여 \( 405 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하고 표준곡선을 이용하여 환산하였다. 이때 각 사이토카인의 측정 한계치는 \( 10 \mathrm{pg} / \mathrm{ml} \) 이었다.</p> <h2>DNCB 항원 처리 및 림프절 세포의 증식반응</h2> <p>DNCB (1-Chloro-2, 4-Dinitrobenzene, Sigma)를 사용직전에 만들어 합텐으로 사용하였으며 acetone과 olive oil을 4:1로 섞은 용액에 원하는 농도로 용해시켜 희석하였다. UVB 조사 2 시간 후 DNCB 피부 감작을 위하여 노출된 복부에 \( 0.25 \% \), \( 0.5 \%, 1 \%, 3 \%, 7 \% \) DNCB를 \( 100 \mu 1 \) 씩 도포하였다. DNCB를 적정량 복부에 도포한 생쥐의 경부(목), 액와(겨드랑이), 서혜부(복부), 슬와(다리근육) 림프절을 자외선 조사 4 일, 5일, 6일 후에 무균적으로 떼어낸 다음 핀셋을 이용하여 단일세포로 만들어 trypan blue로 염색하여 생세포 수를 혈구계산반으로 계산하여 사용하였다. 분리한 림프구 세포 \( 5 \times 10^{5} \) 개와 항원으로 DNBS (2,4-Dinitrobenzen-sulfonic acid dihydrate)를 농도별 \( (10,30,100,300 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml}) \) 로 96 well microplate에 분주하고 3 일간 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 배양한 후 림프구 세포의 증식을 측정하였다.</p>