혈소판 응집저해 활성은 impedence 법을 사용하여 평가되었으며, 혈소판 응집 평가는 Whole Blood Aggregometer를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)의 온도 환경에서 측정되었다. 시료 대신 DMSO를 처리한 대조구와 상대적인 area under curve 값의 비를 통해 혈소판 응집저해 활성을 확인하였다. 제조된 마늘 및 흑마늘 시료의 안정성을 확보를 목적으로 인간 적혈구의 \(4\%\)를 이용하였고, 이를 통해 용혈 활성을 평가하기 위해 \(\%\) 단위의 \( Hemolysis =[( \) Abs. S \( - \) Abs. C) \( /( \) Abs. T \( - \) Abs. C) \( ] \times 100 \) 를 계산하였다.
<h2>혈소판 응집 저해 활성</h2> <p>항혈전 활성 중 혈소판 응집저해 활성은, 미세전극에 혈소판이 부착되어 응집됨에 따라 발생하는 전기저항값의 변화를 측정하는 impedence 법을 사용하여 평가하였다. 혈소판은 건강한 인간의 혈액을 \( 3.2 \% \) sodium citrate 용액과 1:9\( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 로 혼합한 후 \( 1,100 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심분리하여 platelet rich plasma (PRP)를 회수하였으며, 이를 적십자로부터 공급받아 사용하였다. PRP는 기존의 보고와 동일하게 washing buffer \( (138 \mathrm{mM} \mathrm{~NaCl}\), \(2.7 \mathrm{mM} \mathrm{~KCl}\), \( 12 \mathrm{mM} \mathrm{~NaHCO}_{3}\), \(0.36 \mathrm{mM} \mathrm{~NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\), \(5.5 \mathrm{mM}\) glucose, \( 1 \mathrm{nM} \) EDTA, \( \mathrm{pH} 6.5\))로 3회 수세하였으며, 최종적으로 suspending buffer (\(138 \mathrm{mM} \mathrm{~NaCl}\), \( 2.7 \mathrm{mM} \mathrm{~KCl}\), \( 12 \mathrm{mM} \mathrm{~NaHCO}_{3}\), \(0.36 \mathrm{~NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\), \(5.5 \mathrm{mM} \) glucose, \( 0.49 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2}\), \(0.25 \% \) gelatin, \( \mathrm{pH} \) 7.4)에 희석하여 최종 혈소판 농도가 \( 5 \times 10^{8} \) cells \( / \mathrm{ml} \) 되도록 조정하였다. 혈소판 응집 평가는 Whole Blood Aggregometer (Chrono-log, USA)를 사용해 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 측정하였다. 즉, \( 10 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{CaCl}{ }_{2}\) \(50 \mu \mathrm{l} \), suspending buffer \( 147.5 \) \( \mu \mathrm{l} \), 시료 \( 5 \mu \mathrm{l} \) 가 포함된 반응 cuvette에 혈소판 \( 50 \mu \mathrm{l} \)을 넣은 후 3 분 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)로 가온 후 응집유도제로 collagen \( (1 \mathrm{mg} / \) \( \mathrm{ml}) \)을 \( 2.5 \mu \mathrm{l} \) 를 넣고 혈소판 응집을 측정하였다. 응집반응은 collagen 첨가 후 12 분간 측정하였으며 amplitude, slope, area under curve를 측정하여 평가하였으며. 이때, amplitude (ohm)는 혈소판에 응집유도제를 첨가하였을 때 일어나는 최대 응집정도를 나타내며, slope는 응집유도제를 첨가한 직후부터 1분 동안의 응집곡선의 기울기를 나타내며, area under curve는 전체적인 혈소판 응집 정도를 표시하는 것으로 전기저항 증가에 따른 slope 곡선의 하강면적을 나타낸다. 시료의 혈소판 응집저해 활성은 시료 대신 DMSO를 첨가한 대조구와의 상대적인 area under curve 값의 비로 나타내었다.</p> <h2>인간 적혈구 용혈 활성 평가</h2> <p>제조된 마늘 및 흑마늘 시료의 안전성 평가의 일환으로 인간 적혈구 \(4\%\)를 이용하여 용혈 활성을 평가하였다. PBS로 3회 수세한 인간 적혈구 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 를 96-well microplate에 가하고 다양한 농도의 시료용액 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 를 가한 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응시켰으며, 이후, 반응액을 10 분간 원심분리 \( (1,500 \mathrm{rpm}) \) 하여 상등액 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 를 새로운 microtiter plate로 옮긴 후 용혈에 따른 혜모글로빈 유출 정도를 \( 414 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 시료의 용매 대조구로는 DMSO \(2\%\)를 사용하였으며, 적혈구 용혈을 위한 실험 대조구로는 Triton X-\( 100(1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 를 사용하였다. 용혈활성은 다음의 수식을 이용하여 계산하였다.</p> <p>(\(\%\)) Hemolysis \( =[( \) Abs. S \( - \) Abs. C) \( /( \) Abs. T \( - \) Abs. C) \( ] \times 100 \)</p> <ul> <li>Abs. S: 시료 첨가구의 흡광도</li> <li>Abs. C: DMSO 첨가구의 흡광도</li> <li>Abs. T: Triton X-100 첨가구의 흡광도.</li></ul> <h2>기타 분석</h2> <p>추출물 및 분획물의 총 flavonoid의 함량 측정은 기존의 보고에 따라 측정하였으며, 각각의 시료를 18시간 methanol 교반 추출하고 여과한 추출검액 \( 400 \mu \mathrm{l} \)에 \( 90 \% \) diethylene glycol \( 4 \mathrm{ml} \)를 첨가하고 다시 \( 1 \mathrm{~N}\) \(\mathrm{NaOH}\) \(40 \mu \mathrm{l} \)를 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 반응 후 \( 420 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin (Sigma, USA)을 사용하였다. 총 polyphenol 함량은 추출검액 \( 400 \mu \mathrm{l} \)에 \( 50 \mu \mathrm{l} \)의 folin-ciocalteau, \( 100 \mu\mathrm{l} \)의 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 \( 725 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 tannic acid (Sigma, USA)를 사용하였다. 총 당 정량의 경우에는 phenol-sulfuric acid 법을, 환원당 정량의 경우에는 DNS 법을 이용하였다. 각각의 분석결과는 3회 반복한 실험의 평균과 편차로 나타내었다.</p>