본 연구에서는 Mycobacterium smegmatis에 적용 가능함과 동시에 mycobacteria 연구의 한계를 극복하기 위해 suicide vector pKOTs, lacZ transcriptional fusion vector pMV306lacZ, mini-transposon vector pTnMod-OKmTs를 개발하였으며, 이러한 vector들은 M. smegmatis에서 효과적으로 작동하는 것을 확인하여 앞으로의 연구에 도움을 줄 수 있을 것이라 기대한다.
<h2>pTnMod-OKmTs를 이용한 random mutagenesis</h2> <p>pTnMod-OKmTs vector는 mycobacteria에서의 random mutagenesis를 보다 효율적으로 수행할 수 있도록 본 연구에서 개발된 vector이다. pTnMod-OKmTs의 기반인 pTnMod-OKm은 Gram-negative 세균에서의 유전적 연구를 위해 고안된 vector였으나, 여기에 pAL500Ts를 pTnMod-OKm vector에 도입함으로써 실험자가 적절히 온도환경을 조절하여, 앞서 설명한 TSRO 작동 원리를 통해 vector의 복제를 실험적 의도에 맞게 조절할 수 있도록 하였다. 이를 통해 my-cobacteria 세포 내로의 vector의 도입 효율을 높이고, mini-transposon이 세포내에 다중의 copy수로써 존재할 수 있도록 유도할 수 있다. 이러한 실험적 조작은 minitransposon이 my-cobacteria chromosomal DNA 내로 transposition될 확률을 높여 줄 수 있게 된다. pTnMod-OKmTs를 이용한 random mutagenesis 체계를 이용함으로 인해 얻을 수 있는 실험적 이점을 나열하면 다음과 같다. 첫 번째, 실험자는 random mu-tagenesis를 수행한 후, minitransposon에 의한 삽입 돌연변이가 일어난 chromosomal DNA상에서의 위치를 정확히 알 수 있다. pTnMod-OKm vector의 구조를 보면 Tn5 외부 역반복 서열과 RP4 transfer origin사이에 하나의 EcoRRI 제한효소자리가 존재한다. Minitransposon의 transposition으로 인해 얻어진 kanamycin 내성으로 선별된 균주의 chromosomal DNA를 분리하여 EodRI으로 처리 한 후, self-ligation 시킨 다음 E. coli 형질전환과정을 거쳐 kanamycin 내성에 대한 선별 과정을 수행하면, colony를 형성하는 E. coli 균주는 mini-transposon이 삽입되어 있었던 mycobacteria의 chromosomal DNA의 일부 영역과 minitransposon 영역, 즉, 두 개의 연반복 서열로 정의된 부분인 pUC ori, kanamycin 내성 유전자를 포함한 영역이 self-ligation된 plasmid를 가지고 있을 것이다. 따라서, 이미 알려져 있는 pTnMod-OKm vector의 염기서열 정보를 이용한 primer를 제작하여, EcdRI 처리와 self-ligation 과정에서 얻어지는 mycobacteria chromosomal DNA의 일부 염기서열을 sequencing을 통해 알아낼 수 있게 되므로 trans-position이 일어난 chromosomal DNA 상에서의 정확한 위치를 파악할 수 있다. 두 번째, pTnMod-OKmTs는 kanamycin 내성 유전자를 가지고 있어 mycobacteria에서 selectable marker로 주로 쓰이는 hygromycin 내성 유전자를 가지는 vector와 호환이 가능하여, complementation test와 같은 돌연변이 균주를 이용한 다양한 실험 과정에 있어서 사용이 용이하다.</p> <h1>초록 : Mycobacteria에 적용 가능한 genetic tool로서의 새로운 vector system 개발</h1> <p>Mycobacterium 속은 Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium bovis와 같은 동물과 인체에 병원성을 나타내는 세균 종을 다수 포함하고 있다. 이들의 숙주에서의 생존과 병원성에 관한 유전학적 정보를 확보하는 것은 매우 중요하지만, 효과적인 유전학적 도구가 부족하였기 때문에 이들에 관한 연구가 미비하였다. 따라서 mycobacteria의 연구를 위한 분자생물학적 실험 도구로서 다양한 기능성 vector들이 고안되었고, 이러한 기능성 vector의 개발은 실질적으로 mycobacteria에서의 연구 효과를 증진시켰다. 본 연구에서는 Mycobacterium smegmatis에 적용 가능하고 기존에 제시되었던 mycobacteria 연구에 있어서의 한계점을 극복하기 위한 노력의 일환으로, 기능성 vector인 temperature-sensitive replication origin (TSRO)과 counterselectable marker로 le-vansucrase를 암호화하는 sacB 유전자를 포함하는 suicide vector pKOTs, chromosomal DNA로 site-specific re-combination을 통해 삽입되는 lacZ transcriptional fusion vector pMV306lacZ, 그리고 TSRO를 가지는 mini-transposon vector pTnMod-OKmTs를 개발하였다. 이 vector들은 실질적으로 M. smegmatis에서 효과적으로 작동하는 것이 확인되었으며 목적으로 하는 실험 결과 도출 가능성 또한 보여주었다. 따라서 이들 vector는 앞으로의 mycobacteria에 대한 효과적인 연구 기반이 될 것으로 기대된다.</p>