DPPH법에 의한 항산화 활성측정과 유리아미노산분석, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis 및 분자량 측정, NO Assay 방법, Cell viability 측정을 하였으며 세포활성은 MTT assay에 의하여 측정하였다.
<h2>DPPH법에 의한 항산화 활성측정</h2> <p>DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)용액은 \( 100 \mathrm{ml} \) 에탄올에 DPPH \( 1.5 \times 10^{-4} \mathrm{M} \) 을 녹인 후 증류수 \( 100 \mathrm{ml} \) 혼합하여 Whatman filter paper No. 2 에 여과시켜 만들었다. Blois의 방법에 따라 DPPH 용액 \( 4 \mathrm{ml} \) 균 배양액 \( 1 \mathrm{ml} \) 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응시킨 후 \( 520 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능(Electron donating ability, EDA)은 EDA\( (\%)=( \) 대조구흡광도-시료첨가구흡광도 대조구흡광도 \( \times 100 \)으로 계산하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조그륩과 흡광도차를 비교하여 프리라디칼의 제거활성을 백분율로 나타내었다.</p> <h2>유리아미노산분석</h2> <p>유리아미노산의 분석은 Csonka의 방법에 따라 균주를 LB medium \( (10 \mathrm{ml}) \) 에 하루 동안 배양한 후 membrane filter \( (0.45 \mu \mathrm{m}) \) 로 여과한다. Filter는 \( 70 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 에탄을 \( 10 \mathrm{ml} \) 를 첨가하여 20 분 동안 실온에서 shaking한 후 원심분리 한다. 상등액을 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) water bath에서 증발 건조시킨 후 \( 0.2 \mathrm{M} \) sodium citrate 용액에 녹인 후 Amino acid autoanalyzer (Biochrom 20 plus)로 분석하였다.</p> <h2>SDS-polyacrylamide gel electrophoresis 및 분자량 측정</h2> <p>균주의 단백질 분석은 Noel and Brill의 방법에 따라 LB 배지에 colloidal chitin을 각 각 \( 0.5 \%, 1.0 \% .20 \% \) 첨가한 후 균을 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 배양한 후 microcen trifuge tube로 원심분리 하여 세포를 회수하였다. 세포는 \(10 \mathrm{mM} \) Tris-HCl (pH 7.6) \(100 \mathrm{ml} \) 에 현탁시킨 후 동량의 \( 2 x \) SDS sample buffer (\(50 \mathrm{mM}\) Tris-HCl pH 6.8, \( 100 \mathrm{mM} \) dithio threitol, \(2\%\) SDS, \(0.1\%\) bromophenol blue, \(10.0\%\) glycerol) 가하여 잘 혼합한 다음 3분 동안 끓인 후 얼음에 방치한다. 반응액은 vortex 후 단백질 전기영동을 위한 시료로 사용하였다. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)은 Laemmli방법에 따라 수행되었다. Stacking 겔과 running 겔의 acrylamide 농도는 \( 12 \% \) 와 \( 3 \% \) 을 각각 사용하였다. 단백질은 \( 0.2 \% \) Coomassie brilliant blue R-250로 염색되었다. 표준단백질은 (NEB #P7702) MBP-B-galactosidase(175 kDa), MBP-paramyosin(83 kDa), Glutamic dehydrogenase(62 kDa), Aldolase 47.5kDa), Triosephophate isomerase(32.5 kDa), \beta \)-Lactoglobulin A(25 kDa), Lysozyme(16.5 kDa), Aprotinin(6.5 kDa) 을 사용하였다.</p> <h2>NO Assay 방법</h2> <p>NO의 생성은 비색법으로 세포 상등액에 축적되는 nitrite 양을 측정하였다. 대식세포를 세포 배양판에 \( 5 \times 10^{5} \mathrm{cells} / \mathrm{ml} \)의 세포가 되도록 재부유하여 LPS의 자극하에 24시간 배양하고 그 배양 상층액 내의 NO를 Griess 시약과 반응시켜 측정하였다. 100 µl의 세포배양 상층액을 취하여 동량의 Griess 시약[ \( 1 \% \) sulfanilamide ( \( 30 \% \) acetic acid)와 \( 0.1 \% \mathrm{~N} \) -1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride \( (60 \% \) acetic acid) 혼합액 을 가하여 상온에서 20분간 반응시켰다. NO의 활성 정도는 ELISA 판독기를 사용하여 \( 800 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도 범위에서 \( 540 \mathrm{~nm} \) 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Cell viability 측정</h2> <p>세포활성은 MTT assay에 의하여 측정하였다. 96-well nicrotiter plate (Nunc, Vangaard, Neptune, NJ)에 RAW 264.7 macrophage를 \( 1 \times 10^{5} \) cells/well의 농도로 분주하였다. 분주 24시간 후 각 추출물이 함유되어 있는 배지를 100 µl 씩 넣어 48시간 동안 배양하였다. Plate에 MTT \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} 3 \)-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide IMTT, Sigma) 용액을 20 µl씩 첨가하여 4 시간 동안 배양시키고 formazan을 형성시키 후 조심스럽게 상등액을 제거하였다. DMSO (dimethyl sulfoxide) \( 150 \mu \) 를 첨가하여 formazan을 녹인 후 \( 570 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다, 추출물의 농도는 \( 10,20,50,100,200 µl \) well로 하였다.</p>