한외여과 장치는 공급탱크, 순환펌프, 여러 막을 쓴 모듈로 구성되며 모듈은 MWCO 2,000~5,000 사이를 사용하였다. 한외여과 운전은 연속적으로 농축과 투석을 실험했다. 고형문은 시료를 건조하여 사용했으며 TBA 방법으로 Sialic acid 함량을 측정했다.
<h2>Sialic산 회수를 위한 한외여과 및 투석</h2> <p>본 실험에 사용된 한외여과 막 모듈의 제원을 Table 1 에 나 타내었다. 모듈은 MWCO (Molecular Weight Cut-Off)가 2,000 에서 5,000 사이를 사용하였다. 막 모듈은 flat, sprial wound 및 tubular 형태를 사용하였다. 한외여과 장치의 개괄도는 Fig. 1 에 나타내었다. 한외여과 장치는 공급탱크, 순환펌프, 그리고 여러 막을 사용한 모듈로 구성되었다.</p> <p>한외여과의 운전 조건은 다음과 같다. 효소 가수분해물은 \( \mathrm { pH } \mathrm { 5.0,55 \textrm { C } } \) 에서 한외여과되었다. 막 모듈의 입구압력과 출구압력의 평균을 취한 transmembrane pressure (TPM)은 \( 1.5 \) bar로 하였다. 막 모듈은 실험 후에 다음과 같이 재생되었다. \( 0.5 \% \) 의 \( \mathrm { HNO } _ { 3 } \) 로 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 30 \mathrm { ~min } \) 동안 순환시키고, 다음에 \( 4.0 \% \) 의 \( \mathrm { NaOH } \) 로 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 30 \mathrm { ~min } \) 동안 순환시켰다. 계속해서 증류수로 permeate의 \( \mathrm { pH } \) 가 7.0이 될 때까지 계속해서 순환시켜 재생하였다.</p> <p>한외여과 운전은 농축과 투석의 두 단계로 연속적으로 실시하였다. 첫 단계는 농축 단계로서 공급탱크에 있는 가수분해물의 용액이 처음 부피의 \( 1 / 4 \) 이 될 때까지 계속적으로 permeate를 배출시켜 공급탱크의 부피를 감소시켰다. 두 번째 단계는 투석 과정으로서 효소반응에 발생한 염의 농도를 낮추고 sialic acid를 정제하기 위한 것으로 최종 전기전도도가 \( 600 \mu \mathrm { S } / \mathrm { cm } \) 가 될 때까지 실시하였다. 투석은 permeate로 빠지는 액의 유량만큼 증류수를 공급하였고, 이 때 공급탱크의 부피를 일정하게 유지시켰다.</p> <h2>분석방법</h2> <p>고형물은 \( 105 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 오븐에서 3, 4시간 정도 시료를 건조하여 측정하였다. 효소 가수분해시에 발생하는 peptide와 아미노산에 관계하는 총 단백질의 양은 Kjeldahl 방법으로 정량하였다. Sialic acid의 함량은 TBA 방법에 의해 실시하였다. 즉 시료 \( 50 \mathrm { mg } \) 을 취하여 물 \( 10 \mathrm { ml } \) 에 용해시키고 \( 5 \mathrm { M } \) \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } 100 \mu \mathrm { L } \) 를 가하고 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응액에 periodate 용액 \( 0.1 \mathrm { ml } \) 첨가한 후 실온에서 \( 20 \mathrm { ~min } \) 동안 반응시킨 다음, \( \mathrm { TBA } \) 용액 \( 1.5 \mathrm { ml } \) 를 첨가하고 15 분간 \( 90 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 가열시켰다. Cyclohexanone \( 1.0 \mathrm { ml } \) 를 첨가하여 원심분리시켰고 spectrophotometer로 \( 550 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하 여 sialic acid의 양을 정량하였다.</p>