고정화 K80을 이용하여 올리브오일과 메탄올을 바이오디젤로 전환시키는 반응을 수행하였고, 올리브오일과 메탄올을 반응기질로 하여 최종 몰비가 1:3이 되도록 반응을 진행시켰다. 또한 고정화 K80을 이용하여 다양한 오일을 바이오디젤로 전환시키는 반응을 수행하였고, 올리브유, 팜유, 해바라기씨유,콩기름, 청어유와 폐콩기름과 폐식용유를 메탄올과 최종 몰비가 1:3이 되도록 각각 섞고 반응을 진행시켰으며, 리파아제 \( \mathrm { K } 80 \) 및 고정화 \( \mathrm { K } 80 \) 의 반응 산물을 분석하기 위해 기체 크로마토 그래피 (gas chromatography) 분석을 수행하였다.
<p>\( \eta( \%) = \frac { U_ {\mathrm { A } } - \mathrm { U } _ {\mathrm { E } } } {\mathrm { U } _ {\mathrm { A } } } \times 100 \)</p> <p>\( \mathrm { R } ( \%)= \frac {\mathrm { U } _ {\mathrm { H } } } {\mathrm { U } _ {\mathrm { A } } - \mathrm { U } _ {\mathrm { E } } } \times 100 \)</p> <p>\( \mathrm { U } _ {\mathrm { A } } \), 첨가한 효소활성 \( ( \mathrm { U } ) \)</p> <p>\( \mathrm { U } _ {\mathrm { E } } \), 고정화과정 후 반응 상등액에 존재하는 효소 활성(U)</p> <p>\( \mathrm { U } _ {\mathrm { H } } \), 고정화된 효소활성(U)</p> <h2>리파아제 K80을 이용한 바이오디젤 합성반응</h2> <p>리파아제 K80을 이용하여 올리브오일과 메탄올을 바이오디젤로 전환시키는 반응을 수행하였다. 올리브오일과 메탄올을 반응기질로 하여 최종 몰비가 1:3이 되도록 반응을 진행시켰다. 반응시간은 총 9시간이었으며, 초기에 올리브오일과 메탄올의 몰비가 1:1로 혼합된 용액을 반응기질로 사용하였다. 3시간, 6시간 후에 각각 메탄올이 최종 몰비가 1:2,1:3이 되도록 첨가하였다(3 step-wise). 즉, 마이크로 튜브(Axygen 2 mL tube)에 올리브오일 1 mL과 메탄올(125 μL,최종부피)을 넣고 섞는다. 이후 800 U의 리파아제 K80를 넣고 30oC에서 진탕반응(230 rpm)을 진행하였다. 반응시간 0,3, 6시간에 각각 42 μL의 메탄올을 첨가하였다. 메탄올을 첨가하기 전 반응용액 200 μL 부피를 샘플링하였다.</p> <h2>리파아제 K80을 이용한 바이오디젤 합성반응</h2> <p>고정화 K80을 이용하여 올리브오일과 메탄올을 바이오디젤로 전환시키는 반응을 수행하였다. 올리브오일과 메탄올을 반응기질로 하여 최종 몰비가 1:3이 되도록 반응을 진행시켰다. 반응시간은 총 9시간이었으며, 초기에 고정화 K801 g(건조중량)와 올리브오일 5 mL을 넣고 30oC에서 15분간진탕반응(230 rpm)한다. 충분히 섞인 반응액에 0, 3, 6시간마다 최종 몰 비가 각각 1:1, 1:2, 1:3 이 되도록 210 μL의메탄올을 첨가해준다. 메탄올을 첨가하기 전 반응용액 200μL 부피를 샘플링하였다.</p> <h2>리파아제 K80을 이용한 바이오디젤 합성반응</h2> <p>고정화 K80을 이용하여 다양한 오일을 바이오디젤로 전환시키는 반응을 수행하였다. 올리브유, 팜유, 해바라기씨유,콩기름, 청어유와 폐콩기름과 폐식용유를 메탄올과 최종 몰비가 1:3이 되도록 각각 섞고 반응을 진행시켰다. 초기에 고정화 K80 0.5 g(건조중량)와 각종 오일 2.5 mL을 각각 넣고30oC에서 15분간 진탕반응(230 rpm)한다. 팜유의 경우 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 동일한 반응을 수행하였다. 충분히 섞인 반응액에 메탄올을 0, 3, 6시간마다 최종 몰비가 1:1, 1:2, 1:3이 되도록메탄올을 첨가해준다. 9시간 동안 반응을 수행한 후, 반응용액 200 μL 부피를 샘플링하였다. 폐식용유의 경우에도 올리브유와 같은 조건으로 반응을 수행하였다.</p> <h2>리파아제 K80 및 고정화 K80의 반응산물의 박층크로마토그래피(thin layer chromatography) 분석</h2> <p>리파아제 \( \mathrm { K } 80 \) 및 고정화 \( \mathrm { K } 80 \)의 반응 산물을 분석하기 위해 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC) 분석을 수행하였다. 일정 시간 별로 또는 반응 종료 후에 \( 200 \mu \mathrm { L } \)씩 샘플링하여 핵산 \( 1 \mathrm { ~mL } \)을 넣고 2분간 균일하게 섞어준 후 원심분리 \( (10,000 \times \mathrm { g } , 10 \)분 하여 추출 상층액 \( 10 \mu \mathrm { L } \)을 실리카겔 플레이트(TLC silica gel \( 60 \mathrm { ~F } _ { 254 } \), Merck)에 가하였다.</p> <p>전개용매로 핵산:에틸 아세테이트:아세트산(90:10:1)을 사용하였으며, 발색시약은 메탄올:황산(1:1)을 사용하였다. 전개 후 실리카 플레이트 위에 발색시약을 골고루 뿌린 후 고온에서 가열하여 분석하였다.</p> <h2>리파아제 K80 및 고정화 K80의 반응산물의 기체 크로마토그래피 분석</h2> <p>리파아제 \( \mathrm { K } 80 \) 및 고정화 \( \mathrm { K } 80 \) 의 반응 산물을 분석하기 위해 기체 크로마토 그래피 (gas chromatography) 분석을 수행하였다. 일정 시간 별로 또는 반응종료 후에 \( 200 \mu \mathrm { L } \)씩 샘플링하여 핵산과 Decane을 섞은 용액 \( 1 \mathrm { ~mL } \)을 넣고, 2분간 균일하게 섞어준 후 원심분리하여 추출 상층액 \( 1 \mu \mathrm { L } \)을 gas chromatography Hewlett-packard 7890 기기에 주입하였다. 분석 컬럼은 HP-5(Crosslinked 5 \% PH ME Siloxane, 0.32 \( \mathrm { mm } \times 30 \mathrm { ~m } \) )이며, FID 검출기를 통해 지방산 메틸 에스테르(fatty acid methyl ester)를 분석하였다. 컬럼 분석온도와 시간 조건은 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 300 ^ {\circ } \mathrm { C } \)까지 분당 \( 10 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 씩 증가시킨 후, 최종시간 3 분 동안 분석하여 총 27 분 동안 반응산물 피크를 분석하였다.</p>