본문의 실험을 위하여 9종의 Saccharomyces cerevisiae가 최적 발효 효모 선발을 위해 사용되었다. 기능성 측정용 시약으로 Hip-His-Leu과 rabbit lung powder, fibrin, pyrogallol, 1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 등은 Sigma사 제품을 사용하였고 그 밖의 시약들은 분석용 특급을 사용하였다. 배 \( 300 \mathrm { ~g } \)에 증류수 \(600\mathrm {~mL}\)를 첨가하여 파쇄시킨 후 파쇄액을 \(24 \mathrm { ~brix }\)로 보당하고 \(\mathrm { K } _ { 2 } \mathrm {~S} _ {2} \mathrm {O} _ { 5 }\)를 \( 150 \mathrm {ppm}\) 첨가하여 상온에서 2시간 방치시킨 후 YEPD 배지로 \(30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 \( 150 \mathrm {rpm}\)으로 진탕배양한 효모를 \(2.5 \%\) 접종하여 \(25 ^ {\circ} \mathrm {C}\)에서 7일간 발효시켜 배 와인을 제조하였다. 그리고 배 와인 \(50 \mathrm {~mL}\)를 감압건조한 후 알콜 성분을 모두 제거하고 증류수를 이용하여 \(50 \mathrm {~mL}\)로 정용한 뒤 생리기능성을 측정했다.
<p>최적 발효 효모 선발을 위해 9종의 Saccharomyces cerevisiae 를 사용하였는데 먼저 Laparisienne(GB Ingredients, Netherlands, 본문에는 S. cerevisiae C-1으로 표기), Fermivin (DSM Food Specialties, France, 본문에는 S. cerevisiae C-2로 표기)과 Wangpyo Solid-cultured Yeast(Mido Chemical Co., Korea, 본문에는 S. cerevisiae C-3로 표기) 등은 시중에서 구입하여 사용하였다. 또한 현재 약주, 탁주 및 청주 제조용으로 많이 사용하고 있는 S. cerevisiae 발협 2호, 7호 및 10 호는 배재대학교 생물공학연구실에서 보관중인 것을 사용하였고 S. cerevisiae KCTC 7245, 7904 및 7919 등은 한국생명공학연구원 유전자은행에서 분양받아 사용하였다.</p> <p>기능성 측정용 시약으로 Hip-His-Leu과 rabbit lung powder, fibrin, pyrogallol, 1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 등은 \( \operatorname { Sigma } \) (St. Louis, Mo, USA)사 제품을 사용하였고 그 밖의 시약들은 분석용 특급을 사용하였다. 배 \( 300 \mathrm { ~g } \) 에 증류수 \( 600 \mathrm { ~mL } \) 를 첨가하여 파쇄시킨 후 파쇄액을 \(24 \mathrm { ~brix } \)로 보당하고 \( \mathrm { K } _ { 2 } \mathrm { ~S } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 5 } \) 를 \( 150 \mathrm { ppm } \) 첨가하여 상온에서 2 시간 방치시킨 후 YEPD 배지로 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 시간 \( 150 \mathrm { rpm } \) 으로 진탕배양한 효모를 \( 2.5 \% \) 접종하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 7 일간 발효시켜 배 와인을 제조하였다. 또한, 배 혼합 발효주는 배즙과 다른 과일의 쥬스를 \( 2: 1 \) 또는 \( 2: 1: 1 \) 의 비율로 혼합한 후 보당한 다음 위와 같이 발효시켜 제조하였다.</p> <p>배 와인 \( 50 \mathrm { ~mL } \) 를 감압 건조하여 알콜 성분을 모두 제거하고 증류수를 사용하여 \( 50 \mathrm { ~mL } \) 로 정용한 후 다음과 같이 생리기능성을 측정하였다. 먼저 안지오텐신 전환효소(Angiotensin-converting enzyme, ACE)저해 활성은 Cushman 등의 방법을 일부 변형시켜 \( 50 \mu \mathrm { L } \) 의 배 와인 농축액을 rabbit lung acetone powder에서 추출한 ACE용액 \( 150 \mu \mathrm { L } \) (약 \( 2.8 \sim 3 \mathrm { unit } ) \) 와 기질 용액 \( ( \mathrm { pH } 8.3 \) 의 \( 100 \mathrm { mM } \) borate 완충용액에 \( 300 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } \) 과 \( 23 \mathrm { mM } \) Hip-His-Leu을 녹인 것) \( 50 \mu \mathrm { L } \) 를 섞은 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 분간 반응시킨 다음 \( 1 \mathrm { ~N } \mathrm { HCl } \) 로 반응을 정지시켰다. 이 반응액에 유리되어 나온 hippuric acid 양과 비교하여 저해 활성을 계산하였다. 여기서 ACE 효소활성의 \(1 \mathrm { unit } \)는 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 분 동안 \( 1 \mu \mathrm { M } \) 의 hippuric acid를 Hip-His-Leu로부터 생성시키는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다. 혈전용해 활성은 Haverkate-Trass와 Seo 등의 fibrin 법을 일부 변형시켜 측정하였는데 먼저 \( \mu \mathrm { L } \) 당 \( 0.1 \) unit의 thrombin을 함유한 평판배지에 \( \mathrm { pH } 7.0 \) 의 인산 완충용액에 용해시킨 \( 0.6 \% \) 의 fibrinogen을 주입하여 고형화시켰다. 여기에 시료 \( 20 \mu \mathrm { L } \) 를 함유한 paper disc를 놓고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 6 시간 반응시킨 후 투명환의 크기를 측정하여 혈전용해활성을 \( \mathrm { mm } \) 로 표시하였다. SOD-유사 활성은 Marklund 등의 방법에 따라 시료액 \( 20 \mathrm { ~mL } \) 에 \( 55 \mathrm { mM } \) Tris-cacodylic acid buffer(TCB, pH 8.2)를 가하여 균질화하고 원심 분리하여 얻은 상등액을 pH 8.2로 조정한 후 TCB 를 사용하여 \( 50 \mathrm { ~mL } \) 로 적용하여 시료액으로 사용하였다. 시료액 \( 950 \mu \mathrm { L } \) 에 \( 50 \mu \mathrm { L } \) 의 \( 24 \mathrm { mM } \) pyrogallol을 첨가하여 420 \( \mathrm { nm } \) 에서 초기 2 분간의 흡광도 증가율을 측정하여 시료액 무첨가 대조구와 비교하여 활성을 계산하였다. 항산화 활성(전자공여능)은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)의 환원력을 이용하는 Blois와 Lee 등의 방법으로 측정하였다. 시료 \( 0.2 \mathrm { ~mL } \) 에 DPPH 용액(DPPH \( 12.5 \mathrm { mg } \) 을 EtOH 100 \( \mathrm { mL } \) 에 용해) \( 0.8 \mathrm { ~mL } \) 을 가한 후 10 분간 반응시키고 \( 525 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하여 시료 무첨가 대조구의 흡광도와의 백분율로 나타내었다. 항치매성 아세틸콜린에스테라아제 (AChE)저해 활성은 Ellman법을 사용하여 측정하였다. \( 0.1 \) M sodium phosphate buffer(pH 7.3) \( 110 \mu \mathrm { L } \) 를 넣고 효소인 아세틸티오콜린에스테라아제(acetylthiocholinesterase) \((0.8 \mathrm { U } / \mathrm { mL } \) )를 \( 30 \mu \mathrm { L } \) 를 넣은 후 발색시약인 5,5'-dithiobis-2- nitro-benzoic acid(DTNB)를 \( 20 \mu \mathrm { L } \) 를 가하여 섞어준 후 기질인 아세틸콜린클로라이드(acetylcholine chloride)를 \( 30 \mu \mathrm { L } \) 가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 60분 동안 반응생성물인 5-thio-2-nitrobenzo-ate의 생성값을 \( 415 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다.</p>