DPPH 방법을 이용하여 LED의 항산화능 시험을 진행하는데 흡광도를 측정하여 측정했다. 동물 실험을 동하여 rat liver 독성 완화를 위한 실험을 진행하여 rat의 심장채열을 하였다. 또한 같은 방법으로 Ethanol을 유도하여 rat liver 독성 완화 실험도 진행한다. 해당 실험들을 통하여 생화학적 지표성분 측정하는데, 혈장, 간조직 등을 분석한다. 실험의 결과는 분산분석을 통해 다중검증으로 검증한다.
<h2>항산화실험</h2> <p>DPPH 방법을 이용한 LED의 항산화능 시험은 Kim 등의 방법에 준하여 측정하였다. 즉, DPPH 용액 \( (0.0197 \mathrm{~g} / 100 \) \( \mathrm{ml} \) in ethanol) \( 4.5 \mathrm{ml} \) 와 LED 시료용액 \( 0.5 \mathrm{ml}(0.4,0.8,1.6 \)\( \mathrm{mg} \) LED 함유)을 흔합하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 각각 10,40 및 160 분 반응시킨 후 \( 517 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도(Human corporation, X-ma 3000 spectrophotometer, Seoul, Republic of Korea)를 측정하였다. Mouse mitochondrial fraction을 이용한 LED의 항산화능 실험은 Terada 등의 방법에 준하여 실시하였다. Female ICR mouse (10주령, \( 30 \pm 1 \mathrm{~g}) \) 의 간 mitochondrial fraction을 \( 250 \mathrm{mM} \) sucrose 용액을 사용하여 분리한 다음, mitochon-dria-sucrose 혼탁액을 사용하였다. 이 mitochondria-sucrose 혼탁액 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 중의 protein 함량은 Bradford 방법으로 측정하였을 때 \( 0.54 \mathrm{mg} \) 이었다. Mouse mitochondrial fraction에 대한 산화 유도는 \( \mathrm{NADPH} / \mathrm{Fe}^{2+} \) 와 \( \mathrm{CuOOH} \) 를 사용하였다.LED 시료의 항산화성은 Table 1과 같이 총 부피가 \( 1.5 \mathrm{ml} \) 이되도록 처리하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15 분간 반응시켜 생성된 thio-barbituric acid reactive substance (TBARS)를 1,1,3,3,-tetra-methoxy-propane (TMP)를 표준물질로 하여 malondialde-hyde (MDA, mM)의 함량을 측정하였다.</p> <h2>동물실험</h2> <h3>\( \mathrm{CCl}_{4} \) 유도 rat liver 독성 완화</h3> <p>수컷 Sprague-Dawley (SD) (Samtako, Osan, Republic of Korea, \( 170 \sim 200 \mathrm{g} \))에 AIN-96G semipurified diet (Samtako, Osan, Republic of Korea)를 제공하면서 1주 적응시킨 후 Normal (증류수 \( 0.2 \mathrm{ml} \) ), Control (증류수 \( 0.2 \mathrm{ml} \) ), LED (LED \( 200 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \mathrm{BW}+ \) 증류수 \( 0.2 \mathrm{ml}) \), Silymarin처리군(Silymarin\( 200 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \mathrm{BW}+ \) 증류수 \( 0.2 \mathrm{ml}) \) 으로 나누고(6마리/처리군) 1일 1회 2주간 경구 투여 하였다. 식이와 물은 ad libitum으로 공급하였고, 사육실의 온도 및 습도는 각각 \( 22 \pm 1^{\circ} \mathrm{C}, 50 \pm 3 \% \) 로 유지하였고, Light와 dark cycle을 12시간 간경으로 조절하였다. 시료처리 15일째에 Normal group을 제외한 모든 group의 rat에 \( \mathrm{CCl}_{4}\left(\mathrm{CCl}_{4}\right. \) : corn oil, 1:1 v/v; \( \left.0.5 \mathrm{ml} / \mathrm{kg} \mathrm{BW}\right) \) 를 복강 주사하여 간독성을 유발하고, 12시간 절식한 후 심장채혈 (heparin 함유 채혈 시험관)로 sacrifice하였다. Normal 쥐에는 corn oil \( (0.5 \mathrm{ml} / \mathrm{kg} \mathrm{BW}) \) 을 복강 주사하였다.</p> <h3>Ethanol 유도 rat liver 독성 완화</h3> <p>SD rat \( (220 \sim 240 \mathrm{~g}) \) 과 사육방법은 \( \mathrm{CCl}_{4} \) 유도 rat liver 독성 완화 실험과 동일하였다. 식이는 Lieber-DeCarli rat liquid di-et 제조방법에 준하여 ethanol 사료를 조제하여 사용하였다. 처리구는 Normal, Pair-fed control (PFC), Control (ethanol), LED군(ethanol diet + LED) 및 Silymarin군 (ethanol diet + silymarin) group (6 rats/group)으로 나누었고, Normal과 PFC군은 basal diet (Table 2, Basal group)를 공급하였다. Control, LED 및 Silymarin군은 ethanol diet (Table 2, Ethanol group)를 기본으로 한 실험식이 \( 1 \mathrm{ml} \) 당 1 \( \mathrm{kcal} \) 가 되게 공급하였다. LED \( (200 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) BW) 및 Silymarin \( (200 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \)을 섭취하도록 ethanol diet에 첨가하였다. Ethanol 섭취로 인한 diet 섭취량의 차이를 배제하기 위하여 ethanol 처리 rat에게 diet를 자유로이 공급하고, ethanol의 di-et 섭취량만큼 PFC군 rat에게 basal diet를 공급하였다. 처리 8주 후 rat을 12시간 절식시키고, 심장채혈(heparin 함유 채혈 시험관)로 sacrifice하였다.</p> <h2>생화학적 지표성분 측정</h2> <h3>혈장 분석</h3> <p>GOT,GPT 및 lactate dehydrogenase (LDH) 활성 (U/ l) 은 assay kit (Asan Pharmaceutical, Republic of Korea)를 이용하여 분석하였다. Triglyceride (TG), 총 cholesterol, HDL-cho-lesterol은 assay kit (BioAssay Systems, USA)를 이용하여 분석하였다.</p> <h3>간조직 분석</h3> <p>총 지방을 Folch법으로 추출한 후, 총 cholesterol 및 TG 함량을 assay kit (BioAssay Systems, USA)로 분석하였다. 지질과산화물은 TMP를 표준물질로 하여 MDA 함량을 측정하였다. Total glutathione 농도는 Tietze 방법, SOD 활성은 Marklund의 방법, catalase 활성은 Abei법, 그리고 glutathione (GSH) peroxidase 활성은 Lawrence 방법에 준하여 측정하였다. CYP2E1 유전자 발현은 microsome을 분리한 후 Western blot 으로 측정하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>실험의 분석결과는 \( \mathrm{mean} \pm \mathrm{SD} \) 로 표시하였다. 각 군의 평균치의 유의성 검정은 분산분석(ANOVA)을 사용하여 Duncan의 다중검증으로 \( (p<0.05) \)수준에서 유의성을 검증하였다.</p>