딸기에서 분리한 \( 2 \mu \mathrm { g } \)의 total RNA를 이용하여 oligo (dT)-adaptor primer로 CDNA를 합성하고, 이를 주형으로 사용하는 PCR 실험을 수행하였다. cDNA 합성 시에는 상보적인 primer로 Antisense primer를 사용하였다. 클론의 염기서열 작성은 dideoxy chain termination 방법을 사용하였고, NCBI Blast와 TIGR database를 이용하여 염기서열을 분석하였다. Membrane은 pre-hybridization 용액에 \( 5 \times \mathrm { SSC } , 0.1 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \mathrm { N } \) - lauroylsarcosine, \( 0.2 \%(w / v) \) SDS, 1 \% blocking reagent를 포함하여 처리하였고, \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 2 시간 동안 교반되었다.
<h2>RT-PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction)</h2> <p>딸기에서 분리한 \( 2 \mu \mathrm { g } \) 의 total RNA로부터 oligo (dT)-adaptor primer (CTGTGAATGCTGCGACTACGATT \( { } _ { 18 } \) ) 를 이용하여 CDNA를 합성한 다음, \( \mathrm { PCR } \) 의 주형으로 사용하였다. 여러 식물체로부터 분리된 anthocyanin 생합성 경로에 관여하는 주요 유전자의 염기 서열을 비교하여, 유사성에 따라 단일 혹은 degenerate primer를 제작하여 forward pri-mer로 사용하였다. Antisense primer는 cDNA 합성 시 사용한 adaptor에 대한 상보적인 primer를 제작하여 사용하였다. \( \mathrm { PCR } \) 반응은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초, \( 52 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 40 초, 그리고 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 50 초의 반응을 30 cycle 반복하는 것을 기본으로, 제작 primer의 annealing 온도에 맞게 변형하였다. PCR 반응으로 얻어진 산물을 정제하여 pCR \( 2.1 \mathrm { TOPO } \) vector에 ligation한 후 E.coli TOP10에 형질전환 하였다.<h2>염기서열 작성 및 분석</h2> <p>Dideoxy chain termination 방법을 이용하여 각 클론의 염기서열을 작성하였으며, NCBI Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)와 TIGR (http://www.tigr.org/) database를 이용하여 염기서열을 분석하였다.<h2>Northern blot 분석</h2> <p>발달 단계별 과실 시료로부터 추출한 RNA \( 20 \mu \mathrm { g } \) 에 load-ing buffer를 넣고 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분간 처리한 후, \( 1 \mu \) 의 ethi-dium bromide \( (0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \) 와 함께 \( 1.8 \% \) formaldehyde가 포함되어 있는 \( 1.3 \% \) agarose gel에서 \( 50 \mathrm { ~V } \) 로 전기영동하였다. 전기영동한 gel을 DEPC-water로 15 분간 세척하고 20용액으로 20분 동안 침윤시킨 뒤, Sambrook 등의 방법으로 membrane에 옮긴 후, UV cross linker (Fisher)로 고정시켰다.</p> <p>Membrane을 \( 5 \times \mathrm { SSC } , 0.1 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \mathrm { N } \) - lauroylsarcosine, \( 0.2 \%(w / v) \) SDS, 1 \% blocking reagent가 포함된 pre-hybrid-ization 용액에 넣고 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2 시간 동안 교반시켰다. 전혼 성화반응이 끝난 뒤, probe를 넣고 \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 18 시간 hybrid-ization 반응을 시켰다. 각각의 유전자에 대한 cDNA clone을 주형으로 DIG-dUTP (Rochc)와 함께 PCR을 수행한 다음 PCR product를 probe로 사용하였으며, primer를 포함한 반응조건은 RT-PCR 실험과 동일하였다. 혼성화 반응이 끝난 후 1 차 washing buffer ( \( 2 \times \mathrm { SSC } , 0.1 \% \mathrm { SDS } ) \) 로 신온에서 15분씩 3회 세척하고, 다시 2 차 washing buffer ( \( 0.5 \times \mathrm { SSC } , 0.1 \%) \)로 \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 15 분간 세척하였다. CSPD detection kit (Roche)을 사용하여 X-ray film에 감광시켰다.</p>