Terminal marker의 발현은 C/EBP\( \alpha \) 와 PPAR\( \gamma\)에 의해 조절되고, 대표적으로 ADIPOQ, GLUT4, FASN 등은Adipogenesis가 정상적으로 유도될 때 나타난다. Shikonin이 유도하는 anti-adipogenesis의 기작을 목적으로 주요 전사 인자들의 shikonin의 영향은 비의존적으로 PPAR\gamma\(\Upsilon\)와 그 상호조절자인 C/EBP\alpha\(\alpha\)의 발현 조절을 통해 나타난다.
<h1>결 과</h1><h2>Shikonin은 adipogenesis의 terminal marker들의 mRNA 발현을 억제한다</h2><p>ADIPOQ, GLUT4, FASN 등은Adipogenesis가 정상적으로 유도될 때, 발현되는 대표적인 terminal marker들이다. ADIPOQ의 mRNA 발현은 초기 분화인 48시간에서 변화가 없었고 후기 분화인 96시간에서 전지방세포에 비해 분화된 세포에서 1,300배 이상 증가하였다. 그러나 \( 2 \mu \mathrm{M} \)의 shi-konin을 첨가한 경우, ADIPOQ의 mRNA 발현은 유의하게 감소하였다. 또한, GLUT4의 mRNA 발현은 700배 이상 증가하지만 shikonin 처리 시 유의하게 감소하였다. FASN의 mRNA 발현도 역시 3T3-L1에서 분화가 유도될 때 3배 이상 증가하지만, shikonin에 의해 유의하게 억제되었다. 이러한 terminal marker의 mRNA 발현을 억제하는 결과들은 shikonin이 adipogenesis를 저해함을 증명한다.</p><h2>Adipogenesis의 주요 전사 인자들에 대한 shikonin의 효과</h2><p>Terminal marker의 발현은 후기 분화의 major tran-scription factor (주요 전사 인자)인 C/EBP\( \alpha \) 와 PPAR\( \gamma\)에 의해 조절된다. Shikonin이 유도하는 anti-adipogenesis의 기작을 밝히기 위해, C/EBP\( \alpha \)와 PPAR\( \gamma \)의 mRNA 발현에 shikonin이 주는 영향을 살펴보았다. 그 결과, 분화 전에 비해 각각 11배와 7배 이상 증가하였던 C/EBP\(\alpha \)와 PPAR\( \gamma \)의 mRNA 발현은 shi-konin이 첨가된 세포에서 유의하게 감소되었다. 초기의 분화에서 발현되는 C/EBP\( \beta \)와 C/EBP\( \delta \)는 C/EBP\( \alpha \)와 PPAR\( \gamma \) 상위에서 mRNA 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. C/EBP\(\beta \)와 C/EBP의 mRNA 발현에 미치는 shikonin의 효과를 살펴본 결과, C/EBP\( \alpha \)와 PPAR\( \gamma \)와는 달리 변화가 거의 없었다. 이러한 결과는 shikonin에 의한 anti-adipo-genesis효과가 C/EBP\( \beta \)와 C/EBP\( \delta \)에 비의존적으로 PPAR\( \gamma \)와 그 상호조절자인 C/EBP\( \alpha \)의 발현 조절을 통해 나타날 수 있음을 제시한다.</p><h2>Shikonin은 major transcription factor 의 상위 조절자들의 발현과 관련된다</h2><p>Shikonin이 어떤 인자들을 조절하여 PPAR\( \gamma \)와 C/EBP\(\alpha \)의 mRNA 발현을 억제하는지 밝히기 위해 상위 조절자들의 mRNA 발현을 살펴보았다. 또한 Fig. 2의 결과대로, shikonin이 C/EBP\(\beta \) 와 C/EBP\(\delta \)와는 독립적으로 anti-adipogenesis를 유도하는지 확인하기 위해 C/EBP\(\beta \)와 \C/EBP\(\delta \)의 상위 조절자들의 mRNA 발현도 살펴보았다.</p><p>C/EBP\( \gamma \), CHOP (C/EBP homologous protein) 및 KROX20은 C/EBP\(\beta \)의 상위에 존재하여 mRNA 발현을 조절하고 C/EBP\(\beta \)와 상호작용하는 C/EBP\( \delta \) 의 mRNA의 발현에도 간접적으로 작용한다. Adipogenesis pathway에서 anti-adipo-genic regulator (지방세포 형성 억제 조절자)로 알려진 C/EBP \( \gamma \)와 CHOP은 지방세포가 분화될 때 shikonin에 의해 거의 변화가 없었다. 이러한 결과는 shikonin이 C/EBP\( \beta \)와 C/EBP \( \delta \)의 발현에 영향을 주지 않았던 Fig. 2의 결과를 다시 한번 증명한다. 그러나 pro-adipogenic regulator (지방세포 형성 촉진 조절자)인 KROX20의 발현은 그렇지 않았다. Fig. 3C에서, KROX 20의 mRNA 발현은 shikonin에 의해 48시간과 96시간에서 유의하게 감소되었다.</p><p>KLF (Kruppel-like factor) family (군집)에 속하는 KLF2, KLF5 및 KLF15는 PPAR\( \gamma \)의 상위 조절자로 알려져 있다. pro-adipogenic regulator로서 PPAR\( \gamma \)을 조절하는 KLF15의 mRNA 발현은 Shikonin이 첨가되지 않았을 때, 분화 후 지방세포가 전지방세포에 비해 250배 이상 증가되었다. 그러나 shkikonin이 첨가된 지방세포의 분화에서 KLF15의 mRNA 발현은 매우 유의하게 감소되었다. 이와는 달리, 초기분화에서 pro-adipognesis를 유도한다고 알려져 있는 KLF5는 초기 분화인 48시간에서 shikonin의 첨가에 큰 영향을 받지 않으며 후기 분화인 96시간에서는 약간 증가한다. Adipogenesis pathway에서 anti-adipogenic regulator인 KLF2의 경우 shikonin에 의한 변화가 거의 없었다. 이러한 결과들은 shikonin이 유도하는 anti-adi-pogenesis의 효과가 major transcription factor들의 여러 상위 조절자들에 의해 조절됨을 나타낸다. 또한 그 중에서도 초기 분화에서 발현되는 pro-adipogenic factor인 KROX20과 후기 분화에서 발현되는 pro-adipogenic factor인 KLF15 가 shikonin의 anti-adipogenesis의 효과에 관여하는 것으로 보여진다.</p>