두 가지 화합물이 메탄올에 용해된 후 -4°C에서 보관되었으며, 이들은 SK-N-MC 신경모세포종 세포에 적용되어 세포독성을 테스트하였다. 세포는 ATCC HTB-10™에서 구매한 후, 10% FBS와 1%의 penicillin-streptomycin이 첨가된 EMEM 배지에서 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 각 시료는 최종 농도가 100μM이 되도록 세포에 처리하고 24시간 동안 반응시켜 세포독성을 평가하였다. 이를 통해 얻어진 결과값은 대조군에 대한 백분율로 표시되었다.
<h2>화합물의 정량</h2> <p>분리된 화합물 \(2 \) 종을 검량 곡선을 이용하여 정량 하였다. 각 물질을 메탄올에 용해시켜 만들었으며 \( -4 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 보관하였다. 직선성은 \( 0.0156-1 \mathrm { ppm } \) 사이의 \(5 \) 농도에서 평가하였다.</p> <h2>세포 배양</h2> <p>본 실험에 사용한 사람의 신경모세포종인 SK-N-MC 세포는 American Type Culture Collection (ATCC HTB- \(10 ^ {\mathrm { TM } } ) \) 에서 구입하여 사용하였으며, \( 10 \% \) FBS 및 \( 1 \% \) penicillin-streptomycin 이 첨가된 EMEM 배지에서 \( 37 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건의 incubator 에서 배양하였다.</p> <h2>세포독성 측정</h2> <p>\SK- } -MC 세포에 대한 시료의 세포독성(Cytotoxicity)을 평가하기 위해 각각 최종 농도가 \( 100 \mu \mathrm { M } \) 이 되도록 시료를 세포에 처리한 후, \(24 \) 시간 동안 반응시켰다. \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) 농도의 MTT 시약을 첨가하여 \(4 \)시간 동안 반웅시킨 후, \( 200 \mu \mathrm { L } \mathrm { DMSO } \) 를 첨가하여 생성된 formazan crystal을 녹여 microplate reader (BIO-TEK, Winooski, VT, USA)를 이용하여 \( 550 \mathrm { nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 결과값은 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군 (Control)에 대한 백분율로 나타내었다.</p> <h2>세포 생존율 측정</h2> <p>\( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 처리에 의한 신경세포 사멸에 대한 시료의 세포보호 효과는 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 세포는 \(96 \) well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { cells } / \mathrm { mL } \) 로 분주하고, \(24 \) 시간 동안 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건으로 배양하였다. 시료를 \( 100 \mu \mathrm { M } \) 농도로 \(2 \)시간 동안 전처리 한 후, \( 200 \mu \mathrm { M } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 를 \(24 \)시간 동안 처리하였다. 각 well에 최종 농도 \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) 의 MTT 시약을 첨가하여 \(4 \)시간 동안 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건에서 반응시켰다. 생성된 formazan crystal은 \( 200 \mu \mathrm { L } \) 의 DMSO 를 첨가하여 녹인 후, (BIO-TEK, Winooski, VT, USA) 를 이용하여 \( 550 \mathrm { nm } \) 에서 흡광도를 측정하였으며, 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군을 \( 100 \% \) 로 하여 각 실험군의 상대적인 세포 생존율을 계산하였다. Positive control은 NAC을 사용하였다.</p>