본 연구는 인체 백혈병 HL-60 세포에서 발견된 항암 활성을 나타내는 topoisomerase의 억제제 중에서 top-oisomerase type Ⅰ의 억제제 10-CPT와 type Ⅱ의 억제제 doxorubicin을 투여했을 때 세포내에 유전자 발현 양상을 microarray 방법으로 분석하였다. 10-CPT를 HL-60 세포 주에 투여했을 때 type Ⅰ으로 분류되는 topoisomerase Ⅲ\(\alpha \)의 유전자의 발현이 현저히 증가하였으며 다른 type인 topoisomerase Ⅱ\(\alpha \)와 Ⅱ\(\beta \)의 유전자의 발현은 감소하였다. 또한 type Ⅱ의 억제제 doxorubicin을 투여했을 때는 앞의 결과와 상반되게 topoisomerase Ⅱ\(\alpha \)와 Ⅱ\( \beta \)의 유전자의 발현이 크게 증가했고, topoisomerase Ⅲ\(\alpha \)와 Ⅲ\(\beta \)의 유전자의 발현은 다소 감소하였다.
<h1>고 찰</h1> <p>Topoisomerase type Ⅰ은 helix DNA의 한 가닥을 절단하고 상대편 DNA가닥을 통과시키고 절단 부분은 다시 연결하여 한 개의 DNA linking number를 변화시키며, type Ⅱ는 supercoiling DNA의 두 가닥을 동시에 끊어 DNA의 다른 부분을 절단된 곳으로 통과시키고 절단부위를 봉합하는데 ATP를 필요로 하며 2개의 linking number가 변화된다. 인체 DNA topoisomerase Ⅰ은 type ⅠB에 속하며 \( 91 \mathrm{kDa} \)의 monomer이고 DNA 이완 활성에 ATP와 \( \mathrm{Mg}^{2+} \)을 요구하지 않는 반면 인체 DNA topoisomerase Ⅱ는 type ⅡA에 속하며 \( 170 \mathrm{kDa} \)과 \( 180 \mathrm{kDa} \)의 isozyme을 가지며 homo-dimer이고 DNA 이완 활성에 ATP와 \( \mathrm{Mg}^{2+} \)을 요구한다. 현재까지 알려진 생물들의 topoisomerase들 사이에는 유전자 염기 배열상 상동성은 거의 없고 새롭게 밝혀진 효소들의 독특한 특징들이 차츰 밝혀지고 있기 때문에 가까운 장래에 새로운 분류체계가 정립될 것으로 생각된다.</p> <p>진핵 세포의 topoisomerase Ⅰ, Ⅱ의 억제제들은 top-oisomerase 촉매 반응의 전 단계인 phosphodicster bond 절단 과정에는 영향을 주지 않으며 그 후속 단계인 phospho-diester bond의 재 봉합을 방해하여 "cleavable complex"를 형성하는데 camptothecin은 \(3 \mathrm{'} \)-phosphotyrosyl-공유결합에 의한 중간 산물을 형성하여 DNA 재 봉합을 방해하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 결과들은 본 실험실의 선행된 연구결과를 통해 HL-60 인체 백혈병 세포에서 topoisomerase Ⅱ의 저해제인 doxorubicin 과 topoisomerase Ⅰ의 저해제인 camptothecin, 10-hydroxy-camptothecin, irinotecan이 topoisomerase의 이완 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, topoisomerase 억제제들은 모두 cleavable complex를 유도함을 확인하였고, doxorubicin을 HL-60 세포에 투여하였을 때 핵내 topoisomerase의 활성과 topoisomerase의 발현을 조사한 결과, doxorubicin의 투여에 의해 topoisomerase의 활성이 감소하였기 때문에 top-oisomerase의 유전자 발현에 영향을 미칠 것으로 추측하였으나 topoisomerase 활성의 감소에도 불구하고 topoisomerase Ⅱ\(\alpha\) 약간 증가한 반면 topoisomerase I과 Ⅱ\( \beta \)유전자 발현은 큰 변화가 없었다. 또한 topoisomerase Ⅰ 억제제인 camptothecin을 HL-60 세포에 투여하였을 때에도 topoisomerase Ⅰ의 활성은 억제되었으나 topoisomerase Ⅰ의 발현에는 영향을 미치지 못하였는데, 이는 1999년 Pu 등이 melphalan (alkylator)을 HL-60세포에 투여하여 내성을 가진 세포 주에서 Topo Ⅱ\(\alpha\)의 활성은 증가한다고 하였으나 Topo Ⅱ\(\beta \)와 Topo Ⅰ의 활성에는 아무 변화가 없는 것을 확인한 바 있는데 본 실험에서도 같은 경향을 나타내었다. 또한 Perego 등이 여러 type의 인체 세포 주에서 campto-thecin에 의한 topoisomerase Ⅰ 유전자 발현을 조사한 결과와도 일치하는데, 앞의 핵 추출물의 topoisomerase Ⅰ 활성 실험에서 활성이 약물에 의해 억제되는 점으로 미루어 볼 때 camptothecin은 topoisomerase Ⅰ의 기능에는 영향을 나타내지만 효소 발현의 조절에는 아무 영향을 주지 못하는 것으로 추정하였으나 RT-PCR 기법을 통한 일부 효소에 대한 단편적인 연구보다는 topoisomerase 종류에 따른 발현을 종합 분석하여 상호 관계 연구가 필요할 것으로 생각된다. 반면 camptothecin처리한 군에서 RT-PCR법으로 분석한 결과 c-myc 유전자 발현이 억제되었는데 northern blot 분석에서도 비슷한 양상을 나타내었다.</p> <p>DNA chip은 slide glass상에 수백에서 수천 개의 DNA 유전자를 정렬, 고정화 한 것으로 해석하고자 하는 세포에서 추출한 RNA로 조제한 형광포식 cDNA 또는 oligonucleo-tide를 hybridization하여 각 유전자의 발현 변화를 측정하는 방법으로, 한 번의 실험으로 매우 많은 유전자의 발현변화에 대한 정보를 얻을 수 있기 때문에 체계적인 발현해석을 위한 강력한 screening tool로 이용되고 있다.</p> <p>따라서 본 연구에서는 이들의 선행된 연구 결과들을 좀 더 폭 넓게 유전자들의 변화와 상호작용을 동정하기 위하여 본 연구에서는 인체 백헐병 HL-60 세포에 현재까지 발견된 항암 활성을 나타내는 topoisomerase의 억제제 중 top-oisomerase type Ⅰ의 억제제인 10-CPT와 type Ⅱ의 억제제인 doxorubicin을 투여하였을 때 세포내 유전자 발현 양상을 microarray 방법으로 비교 분석하였다. 본 실험을 위한 약물의 적정 투여량을 결정하기 위하여 세포독성 실험을 통해 약 \( 70-80 \% \)의 생존율을 나타내는 조건에서 약물을 투여하였고, \( 10 \mathrm{K} \) 유전자 중에 통계프로그램을 통해 선정한 약 1,000여개의 의미있는 발현 양상을 나타내는 유전자들을 생물학적 기능별로 분류하였다. 10-CPT를 투여한 세포에서 유전자 발현이 촉진 또는 억제되는 유전자들은 signal transduction, cell adhesion, cell cycle, cell growth, cell proliferation, cell dif-ferentiation, transcription, immune response에 관여하는 유전자들이 고루 검출되었다. 또한 doxorubicin을 부여한 HL-60세포에서도 비슷한 양상을 보였다. 특히 두 약물에서 transcription과 cell growth와 관련된 유전자들이 크게 영향을 받았으며, 약물에 따른 생물학적 기능별 분류상의 큰 차이는 없었으나 개별 유전자의 발현 양상에는 뚜렷한 차이를 나타내었다.</p> <p>Topoisomerase가 DNA에 결합하여 "cleavable complex"를 이룬 후에 다시 끊어졌던 DNA 부위가 재 봉합하는데 앞의 선행된 실험 결과를 통해 type Ⅰ, Ⅱ 억제제가 재 봉합을 지연하면 topoisomerase 유전자의 발현에도 일부 영향을 미치는 것을 RT-PCR을 통해 확인하였기 때문에, 따라서 본 연구에서는 type별 대표적 억제제인 10-CPT와 doxor-ubicin을 HL-60 세포 주에 투여한 후 topoisomerase의 기능 활성에 영향을 미치는 topoisomerase 종류별 유전자 발현의 차이를 확인하였다. Topoisomerase type Ⅰ의 억제제인 10-CPT를 HL-60 세포 주에 투여 하였을 때 type Ⅰ으로 분류되는 topoisomerase Ⅲ\(\alpha \)의 유전자의 발현은 현저히 증가되었으며, 같은 type인 Ⅲ\( \beta \) 및 Ⅰ의 발현도 약간 증가하였으나 다른 type인 topoisomerase Ⅱ\(\alpha \)와 Ⅱ\(\beta \)의 유전자의 발현은 감소되었다. 또한 type Ⅱ의 억제제인 doxorubicin을 투여하였을 때는 앞의 결과와 상반된 topoisomerase Ⅱ\(\alpha \)와 Ⅱ\( \beta \)의 유전자의 발현이 현저히 증가되었고, topoisomerase Ⅰ의 발현도 약간의 증가를 보였으며 topoisomerase Ⅲ\(\alpha \)와 Ⅲ\(\beta \)의 유전자의 발현은 약간 감소하는 양상을 보였으나 의미 있는 차이는 없었다. 이와 같은 연구로는 Kersting 등이 doxorubicin이 topoisomerase Ⅱ\(\beta \)의 발헌을 유도한다고 하였으며, Stahl 등이 camptothecin에 의해 topoisomerase Ⅱ를 down-regulation시키며, 앞에 언급한 선행의 연구결과와도 대체로 일치하였다. 이와 같은 결과는 억제를 받은 효소의 세포내 기능 활성을 회복시키기 위해 같은 type의 효소 발현을 증가시킨 것으로 여겨진다. 그러나 Chen 등은 RT-PCR에 의해 Topotecan (type Ⅰ 억제제)에 의해 topoisomerase Ⅱ\(\alpha\) mRNA의 발현이 촉진된다는 상반된 보기도 있으므로 따라서 본 실험에서의 뚜렷한 발현의 변화를 보이는 유전자들을 검증하기 위하여 real time PCR과 northcrn blot 분석, Western blot을 통한 검증 등 그 발현 기전에 대해 앞으로 더 연구하여야 할 것으로 사료된다.</p>