GST-MIF 단백질은 BL21 균주에서 유도하고, glutathione-Sephaore 4B beads를 이용하여 정제하였다. 정제된 GST-MIF는 glutathione과 thrombin을 이용하여 bead와 GST 부위를 제거하고, 이후 전기영동을 수행하였다. 또한, MIF의 L-dopachrome tautomerase 활성은 Spectra Max 250을 이용하여 흡광도 측정으로 확인하였다.
<p>GST-MIF 단벽질의 발현은 선행 구를 따라 BL21 균주에서 \( 0.1 \mathrm { mM } \) IPTG 조건하에 유도하고 정제하였다[19]. 발현이 유도된 GST-MIF 단백질은 glutathione-Sephaore 4B beads (Amersham Pharmacia Biotech., Buckinghamshire, UK)를 이용하여 상층액으로부터 정제하였다. 정제된 GST-MIF는 5 \( \mathrm { mM } \) glutathione을 이용하여 bead를 제거하여 free GST-MIF 라고 명하고, \( 5 \mathrm { U } \) 의 thrombin으로 GST 부위를 제거하여 \( \mathrm { tMIF } \) 라고 명하였다. 정제된 \( \mathrm { MIF } \) 단백질들은 \( 15 \% \) 또는 \( 18 \% \) SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동 하였다(SDS-PAGE). Coomassie 염색용액 \( [0.1 \% \) Brilliant blue R (Sigma), 45 \% methanol and \( 10 \% \) acetic acid]에 20 분간 염색시킨 후, destaining solution ( \( 10 \% \) methanol and \( 10 \% \) acetic acid)으로 씻어내어 단백질 밴드를 확인하였다.</p> <h2>L-dopachrome tautomerase 활성 측정</h2> <p>L-dopachrome tautomerase 활성을 측정하기 위하여, 먼저 기질로서 L-dopachrome을 제조하였다[8]. 이를 위해 sodium phosphate buffer ( \( 10 \mathrm { mM } \) sodium phosphate, \( \mathrm { pH } \) 6.2, 1 mM EDTA) 700 ul에 \( 10 \mathrm { mM } \mathrm { L-3,4-dihydroxy } \mathrm { phenyl- } \) alanine (L-dopa, Sigma, St. Louis, USA) 45 ㅆl와 \( 20 \mathrm { mM } \) sodium m-periodate (Sigma) \( 30 \mu \) 를 넣고 섞어 주었다. 제조된 L-dopachrome은 빛을 차단한 상태로 얼음에서 보관하였고, 활성 측정 시 마다 새로 만들어서 이용하였다. L-dopachrome tautomerase 활성 측정은 상온에서 96-well plate에 1 well 당 190 μl의 L-dopachrome을 넣은 다음 다양한 농도의 MIF 단백질을 첨가하여 수행하였다. MIF의 L-dopachrome tautomerase 활성은 Spectra Max 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, USA)를 이용하여 \( 475 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 10 분 동안 측정하였다.</p> <h2>\( \mathrm { FPLC } \) 시스템에 의한 단백질 정제</h2> <p>MIF 단백질의 정제는 선행연구를 참고하여 FPLC 시스템을 이용한 anion-exchange chromatography로 수행하였다 [5]. MIF 단백질은 pET11b-MIF의 plasmid를 갖고 있는 대장균에서 발현을 유도하였다. 이를 동해 얻어진 상충역 \( 2 \mathrm { ml } \) 열상온에서 buffer A (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, \( 15 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } ) \)로 평형상태를 조절한 anion-column (Uno Q1 column, Bio-Rad, Hercules, USA)에 loading하였다. Buffer A \( 10 \mathrm { ml } \) 로column을 세척한 후, buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 50 \( \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } ) \) 로 \( 15 \mathrm { ml } \) 을 추출한 후 \( 18 \% \) SDS-PAGE로 분석하여 \( \mathrm { MIF } \) 가 가장 높은 수준으로 정제된 추출액 \( 5 \mathrm { ml } \) 을 수득하였다. 정제한 MIF 단백질은 L-dopachrome tautomerase 활성을 측정한 후 \( -70 \mathrm { C } \) 에서 보관하였다.</p>