국내에서는 xylanase 생산 Bacillus 균주 개발이 이루어졌지만, 대규모에서의 효소 생산과 xylan 분해, xylooligosaccharide 생산에 대한 연구는 제한적이다. 이에 따라, 본 연구에서는 xylan을 이용한 유용한 xylooligosaccharide 개발이 필요하며, 산업적 활용이 가능한 xylan 분해효소를 생산할 수 있는 재조합 균주의 개발이 요구된다. 이를 위해 재조합 Bacillus 균주를 이용하여 endoxylanase를 대량생산하고, 기능성 식품소재인 xylooligosaccharide의 최적 생산조건을 확립하는 것을 목표로 한다. 재조합 endoxylanase 발현을 위한 Bacillus subtilis DB431와 E. coli DH5 alpha를 숙주세포로 사용하였다. 본 연구에서는 강력한 구성적 promoter와 endoxylanase 유전자 자체의 promoter에 의해 조절되는 pJHKJ4 plasmid를 이용하였다.
<p>현재 국내의 유전자 재조합 기술에 의해 xylanase 생산 Bacillus 균주 개발을 수행한 바는 있으나, 수십 리터의 대규모에서 효소 생산, xylan 분해 및 xylooligosaccharide 생산 연구는 거의 진행되고 있지 않고 있다. 또한 회소생산을 위한 고역가 재조합 균주의 개발이나 발효 최적화에 대한 연구는 최근 수년 간 그 기술이 급속도로 증진되어 일반화되었으나 아직까지 국내에서 산업화 효소 생산에 적용한 예는 많지 않은 실정이므로 결과적으로 xylanase 효소의 과발현 및 대량생산 연구가 절실히 요구된다. 이러한 측면에서 xylan을 이용한 유용하고 새로운 xylooligosaccharide 개발은 필수적이며, 산업적으로 활용 가능한 xylan 분해효소(endoxylanase) 생산능이 우수한 재조합 균주를 통한 효소의 대량 공정기술의 확립이 필요하다. 이에 본 연구에서는, 재조합 Bacillus 균주의 유가배양을 통해 endoxylanase를 대량생산하여 기능성 식품소재인 xylooligosaccharide의 최적 생산조건을 확립하고자 한다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주, plasmid 및 형질전환</h2> <p>재조합 endoxylanase 발현을 위한 숙주세포로 Bacillus subtilis DB \(431 \) (trpC apr npr epr bpr)를 사용하였으며, plas-mid 증폭을 위한 E. coli 숙주세포로는 DH \(5 \alpha \)를 사용하였다. Bacillus sp.유래의 endoxylanase 유전자( \(639 \) bp) 발현은 강력한 구성적 \( \mathrm { P } _ {\mathrm { jH } } \) promoter와 endoxylanase 유전자 자체 pro-moter \( \left ( \mathrm { P } _ {\mathrm { B } } \right ) \) 에 의해 조절되는 \( \mathrm { pJHKJ } 4 \) plasmid \( \) 를 사용하였고, Contente와 Dubnau법을 사용하여 B. subtilis \( \mathrm { DB } 431 \) 에 형질전환을 실시했다.</p> <h2>회분, 유가배양의 배지 및 배양조건</h2> <p>pJHKJ4 plasmid를 함유하는 B. subtilis DB \(431 \)의 배양은 LB 배지 \( (0.5 \% \) Bacto-yeast extract, \( 0.5 \% \mathrm { NaCl } , 1 \% \) Bacto-tryptone)에 \( 2 \% \) maltose를 첨가한 LBM 배지를 사용하였다. 재조합 Bacillus 균주의 전배양은 LB 배지로 하였으며 풀라스크 배양 및 발효조 배양 시 접종양은 \( 1 \sim 5 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 로 하였다. 플라스크 배양에서는 \( 500 \mathrm { ml } \) baffled flask (working vol-ume: \( 50 \mathrm { ml } \) )로 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 170 \mathrm { rpm } \) 에서 수행하였으며, 발효조(KoBiotech Co., Korea) 회분배양은 LBM 배지에서 다음 조건하에서 수행하였다: working volume, \( 2.0 \mathrm { l } \); 온도, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \); 초기 \( \mathrm { pH } \), \(7.0 \), 교반속도, \( 300 \sim 800 \mathrm { rpm } \); 통기속도, \( 2 \sim 4 \mathrm { vvm } \). 간헐적 유가배양에서는 LB 배지로 \(5 \)~ \(6 \) 시간 회분배양 후 농축배지(10 \% Bacto-yeast extract, 20 \% dextrose)를 \( 50 \mathrm { ml } \) 씩 \(4 \) 번 나누어 공급하였다. 초기 배양액 부피는 \( 1.0 \mathrm { l } \), 통기속도는 \( 2 \mathrm { vvm } \), 교반속도는 \(300 \)~ \( 800 \) rpm (DO \(930 \% \)), pH \(7.0 \) 등 의 조건으로 유가배양하였다.</p>