화석연료의 고갈을 해결하기 위해서 바이오연료를 생산하는 가장 유망한 신재생 자원 중 하나인 해조류가 많은 관심을 받는데 이를 이용하기 위해 초고온 열산 가수분해와 효소 당화를 통해 다당류의 분해를 해야한다. 그래서 본 연구에서는 해조류인 미역에서 5-hydroxy-methylfurfural, levulinic acid 그리고 formic acid와 같은 저해물질을 생성해 균의 생장을 저해하고 생산성을 감소시키는 초고온 열산 가수분해와 효소 당화를 거쳐 당을 얻은 후, Clostridium종 세 가지를 사용하여 아세톤, 부탄올, 에탄올의 생산을 최대화하는 연구를 시행하였다.
<h1>서 론</h1> <p>최근 화석연료의 고갈로 인한 불안정한 유류 가격과 이산화탄소에 의한 환경 문제로 인해 신재생 자원으로 만든 바이오연료의 개발이 각광받고 있다. 전통적으로 옥수수, 밀 그리고 사탕수수를 사용하여 바이오연료를 만들어왔지만 원료의 높은 가격과 식용작물이라는 점에서 적합하지 못한 바이오매스였다. 따라서 대체 원료로서 짚과 나무 등 농업 폐기물이 고려되었지만 lignocellulosic biomass의 특징인 리그닌을 쉽게 분해하지 못한다는 단점을 아직도 해결하지 못하고있는 실정이다.</p> <p>해조류는 바이오에탄올, 바이오부탄올, 바이오디젤, 바이오가스 및 바이오수소 등 바이오연료 생산을 위한 가장 유망한 신재생 자원 중 하나이다. 해조류는 적은 경작지 사용, 빠른 성장률이라는 장점을 가지고 있다. 또한 높은 탄수화물함량과 lignocellulosic biomass보다 훨씬 쉽게 단당으로 전환된다. 해조류는 광합성을 통한 대기중의 이산화탄소의 감소와 산소의 증가로 환경 문제도 해결할 수 있다. 그 중 갈조류는 한국에서 대량 생산되고 있는 바이오매스이며 본 연구에 사용된 미역의 탄수화물 구성은 alginate, laminaran, fucoidan 그리고 mannitol로 구성되어 있다.이러한 다당류의 분해를 위해 초고온 열산 가수분해(hyper thermal acid hydrolysis)와 효소 당화(enzymatic saccharifi-cation)를 진행하였다.</p> <p>열산 가수분해 방식으로 전처리를 진행하면 5-hydroxy-methylfurfural (HMF), levulinic acid 그리고 formic acid와 같은 저해물질이 생성된다. 이러한 저해물질들은 균의 생장을 저해하고 생산성을 감소시킨다. 이를 보완하기 위하여 온도를 높임으로써 열처리 시간을 감소시키는 초고온 전처리 방식을 이용하였다.</p> <p>부탄올은 높은 에너지 함량, 낮은 증기압과 부식성을 가졌고 가솔린과 비슷한 특성을 지니고 있는 액체 연료이다.부탄올은 Clostridium종을 사용한 혐기 조건에서 생산되며, 먼저 acetic acid와 butyric acid가 생성되고 난 이후 아세톤과 부탄올, 에탄올이 생성된다. Clostridium종은 5탄당과 6탄당과 같은 다양한 당을 이용해 아세톤, 부탄올, 에탄올을 생산한다. 따라서 본 연구에서는 해조류인 미역에서 초고온 열산 가수분해와 효소 당화를 거쳐 당을 얻은 후, Clostridium종 세 가지를 사용하여 아세톤, 부탄올, 에탄올의 생산을 최대화하는 연구를 진행하고자 한다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료 및 균주</h2> <p>본 실험에서는 부탄올 생성을 위해 갈조류인 미역(U.pinnatifida)을 사용하였다. 미역은 자연건조 후 분쇄기로 갈아서 입자 크기가 \( 355 \mu \mathrm { m } \) (45 mesh) 이하의 분말을 사용하였다. 구성성분 분석은 부경대학교 사료영양연구소에 의뢰하여 AOAC 방법에 의해 분석을 실시하였다. 배지는 PGY 배지( \( 3 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \) peptone, \( 20 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \) glucose, \( 1 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \) yeast extract 그리고 cysteine \( 0.15 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \))를 사용하였고 N2 incubator에서 \( 120 \mathrm { rpm } \), \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 24시간동안 배양한 Clostridium acetobutylicumKCTC 1724, Clostridium beijerinckii KCTC 1785와Clostridium tyrobutyricum KCTC 5387을 사용하였다.</p> <h2>초고온 열산 가수분해와 효소당화</h2> <p>해조류의 농도 범위는 \( 6-14 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) 로 하였고, 황산의 농도 범위는 \( 90-450 \mathrm { mM } \)로 설정, 열처리 시간은 \( 160 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 2.5-10 \) 분간 처리하였다. 온도는 \( 140-200 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 진행하여 초고온 열산 가수분해를 수행하였다. 초고온 열산 가수분해의 효율(Ep, \( \% \))은 식 (1)로 나타낼 수 있다.</p> <p>\( \mathrm { Ep } ( \%) = \frac {\Delta \mathrm { S } _ {\text { mono } } } {\mathrm { TC } } \times 100 \)<caption>(1)</caption></p> <p>여기서 \( \Delta \mathrm { S } _ {\mathrm { mono } 0 } \) 는 가수분해시 생성되는 단당의 농도(g/l)이며, TC는 U. pinnatifida의 총 탄수화물 함량(g/l)이다.</p> <p>효소당화를 위해 전처리 후 10N NaOH를 이용하여 pH 5.0로 중화하였다. 효소당화는 Viscozyme L (121 \( \beta \)-glucanase unit/ml; Novozymes, Denmark)과 Celluclast 1.5 L (854 endo-glucanase unit/ml; Novozymes, Bagsvaerd, Denmark), Ultraflo Max (700 endo-glucanase unit/ml; Novozymes, Denmark)를 \( 16 \mathrm { U } / \mathrm { ml } \) 로 희석하여 단일 혹은 혼합하여 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 48시간 동안 반응시켰다. 또한 세 가지 효소 중 최적이라 판단되는 효소를 선택하여 효소의 최적 농도를 \( 4, 8, 12, 16 \mathrm { U } / \mathrm { ml } \) 로 처리하여 확인하였다. Cellulase와 \( \beta \)-glucosidase의 효소활성은 Mandels 등 및 Kubicek의 방법에 의해 분석을 실시하였다.</p>