조골세포내 ALP 효소의 유도를 확인하고자 AZO 색소법을 활용하여 적색의 효소 활성 부위를 확인하였으며, PCR에 의해 얻어진 골기질 단백질을 전기영동으로 확인하였더니 MC3T3-E1 세포의 배양에 따른 분화인자 mRNA 발현양은 type 2 collagen, osteopontin, osteocalcin 등의 발현이 대조군에 비해 높게 발현되었다. Alkaline phosphatase 의 발현은 복분자추출물에서 대조군에 비해 발현이 높게 나타남을 확인할 수 있었으며 그 외 골기질 단백질인 Type2 collagen과 SOX9도 대조군에 비해 높게 발현되었다는 결과를 그림6과 같이 볼 수 있다.
<h3>ALP 염색법에 의한 조골세포 활성검색</h3> <p>조골세포내 ALP 효소의 유도를 확인하고자 AZO 색소법 (Burstone법)으로 검토하였다. 즉, Naphthol AS-BI phosphate기질은 조직내 존재하는 ALP효소에 의해 가수분해되어 orthophosphate와 naphthol이 유도체로 유리되고, 유리된 naphthol은 반응액에 함유되어 있는 diazonium 염과 즉시 결합하여 AZO dye를 형성하므로 적색의 효소 활성 부위를 나타내게 된다.</p> <p>복분자 추출물을 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 의 농도로 첨가하여 역시 \( 3 \sim 27 \)일간 배양한 다음 세포내 ALP 효소의 염색정도를 확인하였다. 결과 Fig. 3과 같이 시료를 처리하지 않은 대조군은 붉은색의 효소가 많이 형성되지 않은 반면, 메탄올추출물을 처리한 군에서는 9일째부터 효소의 붉은 반점이 많이 생겼으며 27일째까지도 전체적으로 붉게 변하는 것을 확인할 수 있다. 따라서 복분자 추출물이 조골세포내 ALP 효소활성을 유도하는 것을 염색을 통해 확인할 수 있었다.</p> <h3>Alizarin-Red 염색법에 의한 석회화 형성도 확인</h3> <p>Bone nodule 형성능은 조골세포의 분화에 중요한 포식인자이다. Alizarin은 식물성 염료로서 calcium에 특이적으로 흡착력이 높다. 이것은 무기질화된 세포의 세포외 기질에 염색되므로 무기질화된 양과 염색된 정도가 상호비례한다. 따라서 시간에 따른 무기질화 형성능을 측정하기 위해 Fig. 4와 같이, alizarin red로 염색하여 염색된 석회화물을 \( 10 \% \) cetylpyridinium chloride로 녹여 OD 값을 측정하여 상대활성을 나타내었다. 역시 복분자 추출물 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도에서 시간이 경과할수록 조골세포가 분화됨에 따라 염색된 정도의 흡광도값이 18일째에 대조군에 비해 약 1.6배까지 유의적으로 중가됨을 확인할 수 있었다. 따라서 복분자추출물은 MC3T3-E1 조골세포의 증식 유도 및 ALP 활성 증가 및 조골세포의 분화와 석회화 형성능을 확인하였다.</p> <h3>RT-PCR법에 의한 조골세포 분화 관련 골기질 유전자 발현의 변화</h3> <p>PCR에 의해 얻어진 골기질 단백질을 전기영동으로 확인해 본 결과는 Fig. 6과 같다. MC3T3-E1 세포의 18일간 배양에 따른 분화인자 mRNA 발현양을 나타낸 것으로 SOX9, type 2 collagen, osteopontin, osteocalcin, alkaline phosphatase의 발현이 대조군에 비해 높게 발현되었다. Alkaline phosphatase 의 발현은 복분자추출물에서 그 발현이 대조군에 비해 높게 나타남을 확인할 수 있었으며 그 외 골기질 단백질인 Type2 collagen과 SOX9도 대조군에 비해 높게 발현되었다.</p> <p>ALP의 발현은 조골세포 분화과정 중 중요한 역할을 하며 그 활성정도는 종종 조골세포의 분화단계를 상대적으로 평가하는 수단으로 사용되어왔다. 조골세포에 의한 석회화과정에서 이 효소의 정확한 기능은 분명하지는 않지만, organicphosphate를 가수분해하고 국소적으로 \( \mathrm{PO}_{4} \) 농도를 증가시킴으로써 석회화의 촉발제 역할을 하는 것으로 보고되었다. ALP가 조골세포가 유도하는 석회화에 관여됨을 제시하는 많은 보고들이 있다. Torii 등은 antisense RNA를 이용하여 ALP가 조골세포의 석회화에 관여하는 것을 입증하였다. Weiss 등은 liver/bone/kidney type ALP 유전자의 선천적 결핍으로 인한 저인산효소증에서 골조직 석회화부전을 보고하였다. Fukayama와 Tashjian은 ALP가 몇몇 조골세포주들에서 칼슘섭취에 관여하는 것으로 보고하였으며, 부갑상선호르몬의 신호전달의 조절에도 관여한다고하였다.</p>