Plasminogen kringle 5 (PK5) 발현 벡터 제작을 위해 PK5cDNA를 주형으로 하고, kringle DNA 조각을 PCR 수행하여 증폭시켰다. 이후 벡터를 추출하여 염기서열 확인 후 P. pastoris GS115 균주에 형질도입하였다. 또한 재조합 균주로부터 Pichia 발현 플라스미드를 절단하여 선형화하고, P.pastoris GS115에 형질도입하였다. 이때 높은 수율로 발현하는 균주를 배양하여 PK5 발현 벡터 발현한 후, 투석을 마친 시료를 정제하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>Restriction enzyme은 Roche Molecular Biochemical(Mannheim, Germany)에서, Medium 199 (M199), Dulbesco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), TOP10F', pPICZa-C vector, P. pastoris GS115 그리고 trypsin solution, Probond \( { }^{\mathrm{TM}} \) resim은 Invitrogen (Carlsbad, (A)에서, PCR에 사용되는 모든 primer들은 Life Technologies (Gland Island, NY)에서, endothelial cell growth supple-ment (ECGS), heparin, gelatin, RNAse A는 Sigma (St. Louis, MO)에서, Basic fibroblast growth factor (bFGF)는 R&D system (Minneapolis, MN)에서, Quikchange multisite-directed mutagenesis kit, DNA polymerase pfu는 Stratagene ( La Jolla, CA)에서, LB broth는 DIFCO (Detroit, MI)에서, isoprophy-B-D-thiogalactopyranoside (IPTG)는 Amresco (Solon, OH)에서, DNase I, Xba I, Cla I 은 Boehringer Mannheim (Mannheim, Germany)에서, Glass Econo Column은 Bio-Rad (Hercules, CA)에서, Labscale TFF system과 Centricon 100은 Millipore (Bedford, MA)에서, Anti-vinculin, rhodamine-conjugated phalloidin, FITC (fluorescein isothiocyanate)-labeled secondary antibodies 는 Chemicon (Temecula, CA)에서 구입하였다.</p> <h2>P. pastoris 발현 벡터의 제작</h2> <p>Plasminogen kringle 5 (PK5) 발현 벡터를 제작하기 위하여 목암 생명 공학 연구소의 윤엽 박사로부터 제공받은 PK5cDNA를 주형으로 kringle 특이 5'-primer (PK5 5'CAGTATCGATCACTCCTTCCGAAGAAGAC)와 3'-primer (PK5 3'-CTGATCTAGATCAAAATGAAGGGGCCGC)를 Pfu 중합효소를 이용한 PCR 을 수행하여 kringle에 해당하는 DNA 조각만을 denaturation (\(95 \mathrm{C}\), 1분), annealing(\(55 \mathrm{C}\), 1분), extension( \( 72^{\circ} \mathrm{C}\), 12분)의 조건으로 30 회 반응시켜 증폭 시켰다. 이때 얻어진 DNA 단편을 Cla I 과 Xba I 을 이용 하여, pPICZa-C 벡터에 클로닝 하였다. 그 후 벡터를 다시 추출하여 염기서열을 확인하였고, 재조합 단백질의 발현을 위해, 발현 목적으로 이용되는 P. pastoris GS115 균주에 형질 도입하였다.</p> <h2>P. pastoris에서 재조합 단백질 발현</h2> <p>재조합 균주로부터 분리한 Pichia 발현 플라스미드 (pPICZa-C/PK5) \( 10 \mu \mathrm{g} \) 을 Sac I 으로 절단하여 선형화 한 후, P. pastoris GS115 \( 80 \mu \mathrm{g} \) 에 형질도입 하였다. 약 \( 10 \mu \mathrm{g} \) 의 선형화된 플라스미드 DNA와 P. pastoris \( 80 \mu \mathrm{l} \) 를 \( 0.2 \mathrm{~cm} \) cuv-ette에서 현탁한 후 Gene pulser (Bio-Rad Hercules, San Jose, CA)를 이용하여 \( 1.5 \mathrm{kV}\), \(25 \mu \mathrm{F}\), \(400 \Omega \) 의 조건에서 elec-troporation 방법에 의해 형질도입 하였다. Pulsing 후 즉시\( 1 \mathrm{M} \) sorbitol \( 1 \mathrm{ml} \) 을 cuvette에 첨가하였고, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 동안 배양하였다. P. pastoris GS115는 \( 1000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 Zeocin 이 포함된 YPD에 도포한 후, 약 3 일간 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 단일 군체가 형성될 때까지 배양하여 zeocin에 대해 내성인 균주를 선별하였다. P. pastoris 형질 도입체는 BMGH (buffered minimal glycerol histidine) \( 10 \mathrm{ml} \) 에 접종한 후, \( \mathrm{OD}_{600}=3 \) 이 될 때까지 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 배양하였다. P. pastoris 형질 도입체를 \( 1,500 \times \mathrm{g} \) 에서 5 분간 원심분리 한 후, 30 개의 군체 각각을 BMMH (buffered minimal methanol histidine) \( 2 \mathrm{ml} \) 에 현탁하였다. 그 후, 4 일 동안 24 시간마다 최종농도가 \( 0.5 \% \) 가 되도록 메탄올을 첨가하였고, 단백질이 분비된 배양액을 SDS-PAGE로 분석하여 높은 수율로 발현하는 균주를 선별하였다.</p> <h2>재조합 PK5의 발현 및 정제</h2> <p>높은 수율로 발현하는 균주를 BMGH 배양액 \( 10 \mathrm{ml} \) 에 접종하여 약 4 일간 배양하였다. \( 10 \mathrm{ml} \) 배양액을 \( 1,500 \times \mathrm{g} \) 로 10 분간 원심분리한 후 BMMH \(2 \mathrm{l}\)에 접종하여 5 일간 배양하였다. 5 일 후 배양액을 \( 1,500 \times \mathrm{g} \) 에서 5 분간 원심분리한 후 \( 400 \mathrm{ml} \) 의 BMMH로 배양액을 교체하고 4 일 동안 24 시간마다 최종농도가 \( 0.5 \% \) 가 되도록 메탄올을 첨가하여 최종 \( 430 \mathrm{ml} \) 의 배양액 중 \( 195 \mathrm{mg} \) 의 단백질을 발현하였다. 원심분리하여 배양액을 회수한 후 Amicon kit. (Beverly, MA)로 농축시켜 \( 40 \mathrm{ml} \) 이 되게 하고 \( 50 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer, \( \mathrm{pH} 7.2\), \(350 \mathrm{ml} \) 을 넣어 재농축한 후 평형화 완충용액 \(20 \mathrm{mM}\) potassium phosphate 완충액, \( \mathrm{pH} 5.5\), \(20 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{NaCl}) \) 으로 투석하였다. 먼저 강 양이온 교환수지가 충진된 S column에 평형화 완충 용액을 \( 5 \mathrm{ml} \) 첨가한 후, \( 500 \times \mathrm{g} \) 에서 5 분간 2 회 원심 분리하여 컬럼을 평형화시켰다. 후 시료를 컬럼에 가한 후, \( 500 \times \mathrm{g} \) 에서 5 분간 원심분리 하였다. \( 5 \mathrm{ml} \)의 평형화 완충용액을 컬럼에 첨가하여 2 회 세척하였다. 그 후, 용출 완충액 (\(20 \mathrm{mM}\) potassium phosphate 완충액, \( \mathrm{pH} 5.5\), \(1 \mathrm{M} \mathrm{~NaCl}) \)을 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 가한 후, \( 500 \times \mathrm{g} \) 에서 5 분간 원심분리하여 용출하였다. 용출된 용액을 투석 bag(MWCO 6000~8000)에 넣은 후 증류수로 3 회, PBS로 4 회 투석을 실시하였다. 투석을 마친 시료를 centricon 100에 넣어 \(3,000\mathrm{rpm}\)에서 원심 분리하여 분자량 크기에 의한 정제 과정을 수행하였다. 얻은 하층액을 QCL-1000 kit (Cambrex, NJ)를 이용하여 en-dotoxin level을 조사하였을 때, \( 0.2 \mathrm{EU} / \mathrm{mg} \) 이하였다.</p>