형질전환된 재조합 \( C \). glutamicum KCTC1857를 kanamycin이 포함된 배지에 접종하여 24시간 동안 배양하고, 그 배양액을 kanamycin이 포함된 액체배지에 접종하여 48시간 동안 배양하였다. 원심분리한 배양액에 포함된 라이신과 포도당의 농도를 측정하기 위해 HPLC 분석을 수행하였다.
<h1>라이신 생산 및 분석</h1> <p>형질전환된 재조합 \( C \). glutamicum KCTC1857는 \( 30 \mathrm{mg} / 1 \) kanamycin이 포함된 \( 2 \mathrm{ml} \mathrm{RG} \) 배지에 접종하여 \( 250 \mathrm{rpm} \), \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 배양하였다. 배양액 \( (10 \% \mathrm{v} / \mathrm{v}) \)을 \( 30 \mathrm{mg} / 1 \) kanamycin이 포함된 \( 20 \mathrm{ml} \mathrm{CG}(1 \mathrm{~L} \)당 \( 50 \mathrm{~g} \) glucose, \( 15 \mathrm{~g} \) yeast extract, \( 15 \mathrm{~g} \) ammonium sulfate, \( 0.5 \mathrm{~g} \) \( \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 0.5 \mathrm{~g} \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.01 \mathrm{~g} \mathrm{MnSO}{ }_{4} \cdot \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) and \( 0.01 \mathrm{~g} \) \( \mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.6 \mathrm{~g} \mathrm{CaCO}{ }_{3}, \mathrm{pH} \) 7.0) 액체배지에 접종하여 \( 250 \mathrm{rpm}, 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48시간 동안 배양하였다. 배양액은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 8,000 \times g \)으로 10분 동안 원심분리 하여 얻어졌다. 원심분리한 배양액에 포함된 라이신과 포도당의 농도를 측정하기 위해 high performance liquid chromatography (HPLC) (Agilent 1260 HPLC series, USA) 분석을 수행하였다.</p> <p>라이신 농도를 측정하기 위해 사용한 컬럼은 ZORBAX SB-C18 \( 5 \mu \mathrm{m} \) column (Agilent, \( 4.6 \times 250 \mathrm{~mm} \) )이고, 포도당의 농도는 Aminex HPX-87H ion exclusion \( 300 \mathrm{~mm} \times 7.8 \mathrm{~mm} \) column (Bio-rad, USA)을 사용하여 측정하였다. 먼저, 배양액의 라이신을 diethyl ethoxymethylenemalonate (DEEMM) (Sigma-Aldrich, USA)을 이용하여 유도체화 하기 위해, 배양액 \( 100 \mu \mathrm{l} \)에 DEEMM \( 6 \mu \mathrm{l}, 240 \mathrm{mM} \) methanol \( 200 \mu \mathrm{l} \), borate buffer pH \( 9.0600 \mu \mathrm{l} \), 3차 증류수 \( 94 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하여 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, 반응액을 \( 2 \mu \mathrm{m} \) membrane filter (Advantec, Japan)를 이용하여 여과하였다. 표준 물질로 \( 0.01,0.05,0.1,0.5,1 \mathrm{~g} /l \)의 라이신 용액을 사용 하였다. 이동상 A는 \( 25 \mathrm{mM} \) sodium acetate buffer \( \mathrm{pH} 4.8 \)을, 이동상 B는 acetonitrile을 사용하였고 gradient는 다음과 같이 설정하였다: 0-2분, \( 20 \%\); 2-32분, \( 25 \%\); 32-35분, \( 60 \%\) B. 각 시료는 \( 10 \mathrm{ml} \) 씩 주입하였으며 HPLC 조건은 다음과 같이 설정하였다: Flow rate \( 1.0 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \), stop time 36 min, optimum temperature \( 35^{\circ} \mathrm{C} \), UV detection wavelength \( 284 \mathrm{~nm} \), maximum pressure 400 bar. 포도당 농도 측정을 위한 표준 물질로 \( 0.025,0.05,0.1,0.25,0.5 \mathrm{~g} / \)의 포도당 용액을 사용하였다. 각 시료는 \( 10 \mathrm{ml} \)씩 주입하였으며 \( 5 \mathrm{mM} \) sulfuric acid를 이용한 등용매 용리로 분리되었다. HPLC 조건은 다음과 같이 설정하였다: Flow rate \( 0.6 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \), stop time \( 20 \mathrm{~min} \), RID optimum temperature \( 50^{\circ} \mathrm{C} \), maximum pressure 400 bar.</p> <p>실험은 모두 각각 3 반복하여 실험하였으며, 그 평균 값을 나타내었다.</p>