저산소증을 유발하고 tryphan blue로 죽은 세포를 염색하고 현미경으로 관찰하여 세포의 생존율을 조사했으며, Mitochondrial membrane potential(MMP)는 세포에 형광 색소인 JC-1을 사용하여 염색한 후 현광현미경으로 관찰했다. 활성산소(ROS) 및 활성질소(RNS)의 생성세포는 형광 색소인 \(\mathrm{H}_{2} \mathrm{DCF}\)-\(\mathrm{DA} \)를 사용해 세포를 염색한 후 현광현미경으로 관찰하였고, 염색된 세포에서 이미지 처리 및 신호강도를 측정하였다.
<h3>Tryphan blue 염색</h3><p>\( 0.4 \% \) tryphan blue (Sigma, T-8154; in \( 0.81 \%\ \mathrm{NaCl} \) and \( 0.06 \%\ 2 \mathrm{HPO}_{4} \))를 이용하여 죽은 세포를 염색하고 현미경으로 관찰하였다. DIV 12에 반하를 \( 2.5\ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 전처리하고 2일간 배양하고 DIV 14에 저산소증을 유발하였다. 저산소증 유발직전과 유발 후 1 시간, 3 일, 5 일에 각각 tryphan blue로 염색하여 세포 생존율을 조사하였다. Tryphan blue 처리 전에 세포를 feeding neurobasal media로 세척하였다. \( 0.4 \% \) try-phan blue 용액과 HBSS용액을 1:1로 섞어 각 well에 \( 500 \mu \mathrm{l} \)씩 처리해준 후 10 분간 배양조에서 배양하였다. HBSS용액 \( 1\ \mathrm{ml} \)로 4~5회 세척한 다음 현미경으로 관찰하였다.</p><h2>Mitochondrial membrane potential(MMP) 관찰</h2><p>MMP는 형광 색소인 5,5' ,6,6'-tetrachloro-1,1' ,3,3'-tetraethyl benzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1)를 사용하여 관찰하였다. DIV 12에 반하 \( 2.5\ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)를 전처리하고 2 일간 배양한 후 저산소증을 유발하기 직전과 유발 후 1 일, 3 일, 5 일에 각각 염색하였다. JC-1 처리 전에 세포를 feeding neurobasal media로 세척하였다. JC-1을 최종농도 \( 1\ \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \)가 되도록 배양액에 넣고 20분 동안 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양조에서 배양시킨 후 feeding neurobasal media로 두 번 세척한 다음 형광현미경으로 관찰하였다. JC-1은 DMSO에 \( 0.5\ \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)로 stock을 만들고 이를 feeding neurobasal media로 2,000배 희석하여 \( (1\ \mathrm{ng} / \mathrm{ml}) \) 세포에 처리하였다.</p><h2>활성산소(ROS) 및 활성질소(RNS) 생성세포 염색</h2><p>ROS 및 RNS 생성세포는 형광 색소인 2' ,7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate \((\mathrm{H}_{2} \mathrm{DCF}\)-\(\mathrm{DA}) \)를 사용하여 관찰하였다. DIV 12에 반하 \( 2.5\ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)로 전처리하고 2 일간 배양한 후 저산소증을 유발하기 직전과 유발 후 1 시간, 1 일, 3 일에 각각 염색하였다. \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{DCF}-\mathrm{DA} \) 처리 전에 세포를 feeding neurobasal media로 세척하고, \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{DCF}-\mathrm{DA} \)를 최종 농도 \( 10\ \mathrm{nM} \)이 되도록 배양액에 넣고 10 분 동안 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양조에서 배양시켰다. 이를 feeding neurobasal media로 두 번 세척한 다음 형광 현미경으로 관찰하였다. \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{DCF}-\mathrm{DA} \)는 dimethylsulfoxide(DMSO)로 \( 50\ \mathrm{mM} \)의 stock을 만들고 이를 feeding neurobasal media로 5,000배 희석하여 \( 10\ \mathrm{nM} \) 농도로 세포에 처리하였다.</p><h2>이미지 처리 및 신호강도(signal intensity) 측정</h2><p>염색된 세포를 CCD camera (Photometrics Inc., Germany)가 장착된 형광현미경(Leica Re search Microscope DM IRE,Germany)으로 관찰하였으며, QFluoro version V1.0b soft-ware (Leica Microsystems AG, Germany)를 이용하여 digital image를 얻었다. Signal intensity를 측정하기 위하여 digital image는 Photoshop 5.0K (Adobe) software를 이용하여 흑백으로 전환(gray scale 0~255)하고 명암을 반전한 다음, NIH Scion Image (version beta 4.02; Scion Corporation, USA)를 이용하여 2D rolling mode로 background subtraction을 한 다음 singal intensity를 측정하였다. MMP 측정의 경우 particle을 minimum pixel 5 로 정의하고 mean intensity를 측정하였다.</p>