방울토마토 열매 \( 1 \mathrm{~kg} \)을 분쇄기를 이용하여 분쇄한 후, \( 1,000 \mathrm{xg} \)에서 10분간 원심분리하였다.Lectin을 neutral saline(\( \mathrm{pH} 7.0 \))으로 2배수로 연속 희석 한 다음, 사람의 ABO형 혈액을 사용하여 각각의 혈구응집반응을 확인함으로서 어떤 형의 혈액에 특이적으로 반응하는지 조사하였다.Laemmli의 방법에 따라, \( 15 \% \) SDS-polyacrýlamide gel을 사용하여 \( 40 \mathrm{~mA} \) 에서 4시간 동안 전기영동하였으며, gel은 Coomassie brilliant blue R-250으로 염색하고, \( 7.5 \% \) acetic acid로 탈색시켰다.분리한 lectin의 열 안정성을 조사하기 위해 \( 40-80^{\circ} \mathrm{C} \)사이 온도에서 적혈구 응집 반응을 이용하여 잔존하는 상대적인 lectin의 활성을 측정하였다.분리된 lectin은 10분간 열처리한 후, 급냉시킨 상태에서 사용하였고, 분리한 lectin의 \( \mathrm{pH} \)변화에 따른 활성을 조사하기 위해서 \( \mathrm{pH} 2.0-10.0 \)사이 buffer를 사용하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4시간 투석시킨 후, 안정성 측정을 위하여 혈구 응집 반응을 이용하여 잔존하는 상대적인 lectin의 활성을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재 료</h2> <p>본 실험의 재료는 대형 마트에서 구입한 방울토마토 열매를 사용하였다.</p> <h3>방울토마토 lectin의 분리</h3> <p>Lectin의 분리는 Kilpatrick[12]의 방법을 변형하여 시행하였다. 방울토마토 열매 \( 1 \mathrm{~kg} \) 을 분쇄기를 이용하여 분쇄한 후, \( 1,000 \mathrm{xg} \) 에서 10분간 원심분리하였다. 상등액을 모아 동량의 \( 0.15 \mathrm{M} \mathrm{NaCl} / 0.1 \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer를 넣어 교반시키고, 이에 최종농도가 \( 50 \% \) 가 되도록 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 를 천천히 넣어 용해시킨 후, 밤새 표반하였다. 이 용액을 \( 40,000 \times 8 \) 에서 1 시간 원심분리 한 후, 침전물을 neutral saline \( \left(\mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\right. \) 를 사용하여 \( \mathrm{pH} 7.0 \) 으로 조절된 \( 0.9 \% \mathrm{NaCl} \) ) 용액으로 용해시킨 다음, 이를 neutral saline으로 24시간 주기로 교환하면서 48시간 투석하였다.</p> <p>Sephadex G-200을 neutral saline으로 평형화시킨 column \( (1.6 \times 40 \mathrm{~cm}) \) 에 투석한 용액을 주입시킨 후, neutral saline을 사용하여 \( 0.2 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 의 유속으로 \( 280 \mathrm{~nm} \) 의 파장에서 흡광도가 0.03 이하가 될 때까지 각 분획 당 \( 3 \mathrm{ml} \) 를 얻었다. 각 분획의 활성은 trypsin으로 처리한 사람의 \( \mathrm{B} \) 형 혈액을 사용하여 혈구 응집반응을 측정하였다.</p> <p>각 분획의 단낵질 함량은 BSA를 표준물질로 하여 Bradford 방법에 따라 microplate reader(Bio-Rad)를 사용하여 단일파장 \( 595 \mathrm{~nm} \) 에서 축정하여 계산하였다.</p> <p>모든 분리과정은 단백질의 변성을 막기 위해 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 수행하였다.</p> <h3>적혈구 응집력 측정 및 lectin의 활성 측정</h3> <p>적혈구 응집력(hemagglutination activity)은 Takatsy의 방법을 변형하여 측정하였다. Microtiter plate의 well에 neutral saline \( 25 \mu \ell \) 에 분리된 lectin 용액 \( 25 \mu \ell \)를 2 배수로 연속 희석한 후, trypsin으로 처리한 B형 혈액을 \( 25 \mu \ell \) 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20분 동안 반응시켰다. 이때 혈액은 \( 0.9 \% \mathrm{NaCl} \) 을 함유한 neutral saline에 \( 0.25 \% \) trypsin을 포함시켜 활성화시킨 \( 2 \% \) 적혈구 부유액을 사용하였다.</p> <p>적혈구의 응집 여부는 먼저 육안으로, 그리고 현미경을 사용하여 최종적으로 확인하였으며, lectin의 활성은 혈구 최종 응집을 나타내는 희석 배수를 역수로 계산하여 나타내었다.</p> <h2>혈액의 특이성 조사</h2> <p>Lectin을 neutral saline(\( \mathrm{pH} 7.0 \))으로 2배수로 연속 희석 한 다음, 사람의 ABO형 혈액을 사용하여 각각의 혈구응집반응을 확인함으로서 어떤 형의 혈액에 특이적으로 반웅하는지 조사하였다.</p> <h2>SDS-PAGE 및 분자량 측정</h2> <p>Laemmli의 방법에 따라, \( 15 \% \) SDS-polyacrýlamide gel을 사용하여 \( 40 \mathrm{~mA} \) 에서 4시간 동안 전기영동하였으며, gel은 Coomassie brilliant blue R-250으로 염색하고, \( 7.5 \% \) acetic acid로 탈색시켰다.</p> <p>분자량은 Weber & Osborn 방법에 따라 측정하였다. 전기영동한 lectin과 표준 단백질에 대한 상대이동도(Rf)와 단백질 분자량에 대한 대수값으로 번자량을 구하였으며, 이때 표준 단백질은 rabbit muscle phosphorylase b (\( 97 \mathrm{kDa} \)), bovine serum albumin (\( 66 \mathrm{kDa} \)), chicken egg white ovalbumin (\( 45 \mathrm{kDa} \)), bovine erythrocyte carbonic anhydrase (\( 30 \mathrm{kDa} \)), soybean trypsin inhibitor (\( 20.1 \mathrm{kDa} \)), a-lactalbumin (\( 14.4 \mathrm{kDa} \)) 를 사용하였다.</p> <h2>최적 반응 온도의 측정</h2> <p>분리한 lectin의 최적 반응 온도를 조사하기 위해 온도 변화에 따른 활성을 측정하였다. 이때 정제된 lectin을 2배수로 연속 희석하였고, \( 20\sim70^{\circ} \mathrm{C} \) 의 온도에서 혈구 응집 반응을 이용하여 최대 희석 배수의 residual activity를 \( 100 \% \) 로 하여 잔존하는 lectin의 상대적인 활성을 측정하였다.</p> <h2>열 안정성 측정</h2> <p>분리한 lectin의 열 안정성을 조사하기 위해 \( 40\sim80^{\circ} \mathrm{C} \) 사이 온도에서 적혈구 응집 반응을 이용하여 잔존하는 상대적인 lectin의 활성을 촉정하였다. 이때 분리된 lectin은 10 분간 열처리한 후, 급냉시킨 상태에서 사용하였다.</p> <h2>\( \mathrm{pH} \) 안정성 측정</h2> <p>분리한 lectin의 \( \mathrm{pH} \) 변화에 따른 활성을 조사하기 위해서 \( \mathrm{pH} 2.0\sim10.0 \) 사이 buffer를 사용하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4시간 투석시킨 후, 혈구 응집 반응을 이용하여 잔존하는 상대적인 lectin 의 활성을 측정하였다. 이때 완충액은 \( 0.025 \mathrm{M} \) glycine-HCl buffer (\( \mathrm{pH} 2.0\)), \(0.2 \mathrm{M} \) acetate buffer (\( \mathrm{pH} 3.2, 4.2 \)), \( 0.01 \mathrm{M} \) phosphate buffer (\(\mathrm{pH} 6.2, 7.2\)), \(0.2 \mathrm{M} \) Tris buffer (\(\mathrm{pH} 8.0, 9.1\)), \(0.2 \mathrm{M}\) carbonate-bicarbonate buffer (\(\mathrm{pH} 10.0\))를 사용하였다.</p>