항생제를 포함하는 LB배지를 사용하여 대장균 JM109, JM110, 및 BL21을 배양하였고, ptpA 유전자를 가지고있는 대장균을 새로운 배지에 \( 1 \% \) 접종하여 3시간 배양하였으며, 최종 농도 \( 1 \mathrm{mM}\) IPTG를 첨가하여 2시간 더 배양하여 단백질을 발현시켰고, pET26-BamHI 벡터를 만들었으며, p-nitrophenylphosphate 기질을 사용하여 \( 410 \mathrm{nm} \)에서 유리된 p-nitrophenol양을 측정하였고, 방선균 파쇄물을 SDS-PAGE하여 PVDF 막에 electrotransfer시킨후, 막을 \( 10 \% \) blocking reagent에 넣어 2시간 상온에서 반응하여 blocking시켰다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 플라스미드</h2> <p>실험에 사용한 대장균은 JM109, JM110, 및 BL21 (DE3)을 사용하였고, 항생제(Ampicillin; \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m \ell} \), Kanamycin; \( 25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m} \ell) \)를 포함하는 LB배지를 사용하여 대장균을 배양하였다. 대장균에 사용한 클로닝 벡터 및 발현벡터는 pUC19와 pET26b을 사용하였다. 방선균은 Streptomyce lividans와 Streptomyces coelicolor A3(2)을 사용하였고 배지는 YEME 배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다. 방선균의 발현벡터는 pIJ6021로서 항생제는 thiostrepton \( (50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m} \ell) \)과 Kan-amycin\( (15 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m} \ell) \)을 사용하였다.</p> <h2>일반적인 재조합 기술</h2> <p>제한효소, T4 ligase, Taq polymerase는 Takara Suzo Co에서 구입하여 사용하였고, 대장균의 유전자조작은 Maniatis 등에 따라서 행하였으며, 방선균에 곤한 실험은 Hopwood 등의 방법으로 실험하였다.</p> <h2>대장균에서 ptpA 와 ptpA(C9S) 유전자의 발현 및 단백질 정제</h2> <p>PtpA 및 ptpA(C9S) 유전자를 S. coelicolar 염색체를 주형으로 다음과 같은 primer로 PCR하였다 (NdeI: gccCATATGACCTACCGCGTCTGTTTCGTGTGC, XhoI attCTCGA-GCCGGCAGGTGGAAGTGGGCGGCGGCG). 증폭된 단편을 Nde과 Xhol으로 절단하여 pET26(+)에 삽입하여 대장균(BL21 DE(3))에 형질전환 하여 형질 전환체를 확인하였으며, 대장균 발현 숙주에서 단백질을 발현시켰다. PtpA(C9S) 단백질을 만들기 위해서 아미노산 9번의 시스테인을 세린으로 전환하기 위해 다음과 같은 primer로 PCR하였다(NdeI: gecCATATGACCTACCGCGTCTGTTTCGTGAGC, XhoI: attCTCGAGCCGGCAGGTGGAAGTGGGCGGCGGCG). PtpA 단백질을 발현시키기 위해 ptpA 유전자를 가지고있는 대장균을 16시간 전 배양하여 새로운 배지에 \( 1 \% \) 접종하여 3시간 배양하였고, 최종 농도 \( 1 \mathrm{mM}\) IPTG를 첨가하여 2시간 더 배양하여 단백질을 발현시켰고, 이들 단백질의 발현정도를 SDS-PAGE로 확인하였다. 그리고 대장균을 모아서 원심 분리하여 초음파로 파쇄하고 \( 13,000 \mathrm{rpm} \)으로 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 발현된 단백질은 Qiagen사의 protocol에 준하여 Ni-NTA Spin column을 사용하여 정제하였다.</p> <h2>방선균에서 ptpA와 ptpA(C9S) 유전자의 발현 및 단백질 정제</h2> <p>방선균에 발현시키기 위해 BamHI 제한효소 부위를 가지고있는 합성 올리고를 pET26벡터에 삽입하여 pET26-BamHI 벡터를 만들었다. PCR을 사용하여 ptpA와 ptpA(C9S) 유전자를 증폭하여 pET26에 삽입하여 pET26-PtpA을 만들었다. NdeI과 XhoI로 절단된 pET26-BamHI에 동일한 효소로 절단된 ptpA 유전자를 삽입하여 pET26-PtpA-BamHI 벡터를 만들었다. pET26-PtpA-BamHI 벡터에 제한효소 NdeI과 BamHI을 사용하여 ptpA을 분리하였고, 방선균의 발현벡터인 pIJ6021에 동일한 제한효소로 절단하여 ptpA 유전자를 삽입하여 pIJ6021-PtpA-His tag을 만들었다. 또한 pIJ6021-PtpA(C9S)-His tag 벡터도 상기와 같은 방법으로 구축하였다. 이렇게 만든 벡터 (pIJ6021-PtpA-His tag, pIJ6021-PtpA(C9S)-His tag)을 방선균 protoplast에 형질전환 하였다.</p> <p>PtpA 및 PtpA(C9S) 단백질을 발현시키기 위해 ptpA 및 ptpA(C9S) 유전자를 가지고있는 방선균을 YEME 배지에서 48시간 전 배양한 후, 새로운 YEME 배지에 전배양액 \( 1 \% \)를 접종하여 48시간 배양하였다. 그리고 원하는 유전자를 발현시키기 위해 최종 농도 \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) thiostrepton를 첨가하여 24시간 배양하여 유도시키고, 원하는 단백질의 발현정도를 SDS-PAGE로 확인하였다. 배양된 방선균을 모아서 원심 분리하여 초음파로 방선균을 파쇄하고 \( 13,000 \mathrm{rpm} \)으로 원심 분리하여 상등액을 회수하였다. 발현된 단백질은 Qiagen사의 protocol에 준하여 Ni-NTA Spin column을 사용하여 정제하였다.</p> <h2>Ptp효소 활성 측정</h2> <p>Phosphotyrosine phosphatase활성은 Wo의 방법에 따라 측정하였고, p-nitrophenylphosphate 기질을 사용하여 \( 410 \mathrm{nm} \)에서 유리된 p-nitrophenol양을 측정하였다.</p> <h2>Anti-phosphotyrosine 및 penta His-tag항체를 이용한 방선균 단백질의 Western blot 분석</h2> <p>방선균 파쇄물 \( 10 \mu \mathrm{g} \) 을 SDS-PAGE하여 PVDF 막에 electrotransfer시킨후, 막을 \( 10 \% \) blocking reagent (Boehringer Mannheim)에 넣어 2시간 상온에서 반응하여 blocking시켰다. 그리고 5000:1로 희석한 anti-phosphotyrosine peroxidase 및 penta His-tag항체를 첨가하여 1시간 상온에서 반응시킨 다음, 이 막을 TBST (Tris buffed saline-Tween 20) 완충액으로 5회 세척한 뒤 Boehringer Mannheim 헝광 발색 방법에 따라 현상하였다.</p>