관측기의 연산은 전류제어기와 동기를 이루고 전동기의 회전수와 전압의 크기는 비례관계에 있어서 고속 모드에서는 위상 지연이 발생하여 회전자의 위치 및 속도 추정에 어려움이 발생하게 되며 이런 지혈과정을 거친 후 조직이 재생되고 생성되었던 혈전은 혈관 내 \( \mathrm{plasminogen} \) 활성화인자에 의해서 활성화된 \( \mathrm{plasmin} \) 이 작용하여 용해되지만, 완전한 용해는 일어나지 않아 혈관을 따라 흐르면서 혈액의 흐름을 방해하게 되어 혈관계 질환을 초래하게 된다. 이러한 혈전을 분해하는 것으로서 현재 사용중인 헐전용해제로는 \( \mathrm{urokinase} \) 와\( \mathrm{streptokinase} \) 그리고 \( \mathrm{tPA} \) 가 있는데 이들은 장기간 복용시 혈전에 대한 특이성이 낮아 혈관벽 분해 및 적혈구 파괴 그리고 구입가격이 고가인 단점등이 있으며, \( \mathrm{urokinase} \)를 제외하고는 경구 투여가 불가능한 실정이며 본 연구에서는 대두청국보다도 혈전용해력이 우수한 흑두청국으로부터 혈전용해력이 가장 우수한 미생물을 선발하고 그 미생물이 생산하는 혈전용해효소의 특성을 조사하고, 또한 그 유전자를 크로닝하여 특성을 규명하고 산업적 이용가능성을 조사하였다.
<h1>흑두로 제조한 첨국에서 분리된 Bacillus subtillus BB-1으로부터 혈전용해효소 유전자 크로닝 및 특성규명</h1> <p>혈관벽이 손상되면 혈소판에서 \( \mathrm{thrombin} \) 이 생성되어 섬유소원을 섬유소로 만들어 섬유소혈관을 형성하게 되어 출혈을 막게 된다. 이런 지혈과정을 거친 후 조직이 재생되고 생성되었던 혈전은 혈관 내 \( \mathrm{plasminogen} \) 활성화인자에 의해서 활성화된 \( \mathrm{plasmin} \) 이 작용하여 용해되지만, 완전한 용해는 일어나지 않아 혈관을 따라 흐르면서 혈액의 흐름을 방해하게 되어 혈관계 질환을 초래하게 된다. 이 혈전에 의한 질환이 인간의 가장 큰 사망원인으로 알려져 큰 관심을 불러일으키고 있다. 이러한 혈전을 분해하는 것으로서 현재 사용중인 헐전용해제로는\( \mathrm{urokinase} \) 와\( \mathrm{streptokinase} \) 그리고 \( \mathrm{tPA} \) 가 있는데 이들은 장기간 복용시 혈전에 대한 특이성이 낮아 혈관벽 분해 및 적혈구 퐈괴 그리고 구입가격이 고가인 단점등이 있으며, \( \mathrm{urokinase} \)를 제외하고는 경구 투여가 불가능한 실정이다. 따라서 현재 새로운 혈전용 해제의 개발이 절실히 요구되고 있다.</p> <p>최근에 혈전분해효소를 뱀독과 지렁이로부터 분리. 정제하였다는 보고가 있었으며, 일본에서는 \( \mathrm{natto}\) 를 발효하여 그 식품중에 혈전용해효소가 존재하는 것을 발견하고 기능성 식품으로서의 개발을 시도한 바 있다. 그리고 국내에서도 전통발효식품인 청국장,된장, 젓갈, 김치등에서 혈전용해작용에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.</p> <p>본 연구에서는 대두청국보다도 혈전용해력이 우수한 흑두청국으로부터 혈전용해력이 가장 우수한 미생물을 선발하고 그 미생물이 생산하는 혈전용해효소의 특성을 조사하고, 또한 그 유전자를 크로닝하여 특성을 규명하고 산업적 이용가능성을 조사하였다.</p> <h2>재료 및 방법</h2> <h3>청국의 제조</h3> <p>청국제조를 위해 원료인 콩은 재래시장에서 시판중인 한국산 흑두를 구입하여 사용하였다. 연등의의 방법을 변형하여 원료콩을 세척 후 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 의 멸균수에서 \( 10\) 시간동안 침지하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(1\) 시간의 조건으로 중자한 후 상온에서 냉각시켰다. 청국의 발효는 \( \mathrm{starter}\)롤 접종하지 않고 자연상태로 \( 40 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \),습도는 포화습도를 유지하도록 조절하였으며, 발효시간은 \(48\)시간으로 하였다.</p> <h3>혈전용해효소 생산 미생물의 분리 및 동정</h3> <p>이미 제조된 청국으로부터 혈전용해효소 생성능이 우수한 미생물을 선별하기 위하여 청국 \( 1 \mathrm{~g} \) 을 멸균생리식염수에 현탁, 희석하고 이를 \(\mathrm{LB ~agar~plate}\) ( \(\mathrm{Tryptone}\) \(1.0\%\), \(\mathrm{Yeast extract}\) \(0.5\%\), \(\mathrm{NaCl}\) \(1.0\%\) , \(\mathrm{Agar}\)\(1.5\%\). \(\mathrm{pH}\) \(7.2.\) \(\mathrm{Difco}\))에 \( 0.1 \) \(\mathrm{ml} \) 를 도말한 후 단일 \(\mathrm{colony}\)를 분리하였다. 분리된 \(\mathrm{colony}\)를 \(\mathrm{LB~broth}\) \( 5 \mathrm{ml} \) 에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(\mathrm{optical density (OD)}\)가 \( 1.0 \) 이 되게 배양한 후\(\mathrm{ fibrin plate}\)에 \(20\) \(\mathrm{ul}\) 씩 \(\mathrm{ loading}\)하여 혈전용해능이 가장 우수한 미생물을 선발하였다. 미생물의 동정은 한국미생물보존센터\(\mathrm{(KCCM)}\) 에 의뢰하여 \( 16 \mathrm{s} \) \(\mathrm{rDNA sequence}\)에 의한 유전자간의 상동성비교로 동정하였다.</p> <h3>분리균주의 혈전용해동위효소 측정</h3> <p>\(\mathrm{SDS}\)-\(\mathrm{fibrin}\) \(\mathrm{zymography}\) 는 \(\mathrm{fibrinogen}\) 농도가 \( 0.12 \%(\mathrm{~W} / \mathrm{V}) \)가 되게 \(\mathrm{ polyacrylamide}\) 용액에 혼합한 후 즉시 \(\mathrm{thrombin}\)\( (1,000 \) \(\mathrm{unit/ml)}\)을 첨가하여 제조한 \( 12 \% \) \(\mathrm{fibrin}\)- \(\mathrm{polyacryla}\)-\(\mathrm{mide~gel}\) 에서 수행하였다. 각 \(\mathrm{lane}\)에 혈전용해능이 우수한 분리균주의 배양상둥액을 점적한 후 전기영동을 실시한 다음 \( \mathrm{SDS} \) 에 의해 불활성화된 효소를 재활성화 시키기 위하여 \(\mathrm{gel}\)을 \( 2.5 \% \) \(\mathrm{Triton}\) \( X\)-\(100 \)을 포함한 \(\mathrm{Tris}\)-\(\mathrm{HCl}\) \( (50 \mathrm{mM}, \mathrm{pH} 7.4) \) 에 \( 3\) 시간 동안 침적하여 단백질을 활성화시킨 후 \(\mathrm{Triton~X}\) -\(100\)을 제거하기 위하여 멸균수로 \(15\)분간 \( 2\)회 세척하였다. 분획된 단백질의 혈전분해활성은 활성반응 완충용액(\( 200~\mathrm{mM}\ \mathrm{NaCl} \), \( 10~\mathrm{mM}\) \(\mathrm{CaCl}\)\(2\), \(0.02 \%\) \(\mathrm{NaN}\)\(3\) 가 포함된 \( 30 \mathrm{mM} \) \(\mathrm{Tris}\) -\(\mathrm{HCl}\) . \( \mathrm{pH}\) \(7.4\))에 \(\mathrm{gel}\) 을 침적하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 항온기에서 \(16 \)시간 반응을 시켰다. \(\mathrm{Fibrin}\) 분해능을 지넌 단백질 분획은 활성염색법에 의해 \(\mathrm{gel}\)상의 \(\mathrm{fibrin}\)은 분해하여 \(\mathrm{Coomassie~blue}\) \(\mathrm{R}\)-\(250\) 염색결과 투명대로 활성을 확인하였다.</p> <h3>혈전용해활성 측정</h3> <p>\(\mathrm{Astrup}\) 와 \(\mathrm{Hullertz}\) 의 방법을 변형하여 사용하였다. \( 0.4 \% \) \(\mathrm{Fibrinogen}\) \(\mathrm{(Sigma)}\) 을 \(\mathrm{sodium~borate~buffer}\) (\(10~\mathrm{mM}\) \(\mathrm{sodium~borate}\) , \( 160 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{boric~acid}\), \( 40 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}\). \(\mathrm{Merck}\))에 녹인 후 \(\mathrm{unit/}\) \(\mathrm{ml}\) \(\mathrm{Sigma)}\) \(20\) \(\mathrm{unite}\) 를 첨가하여 실온에 \(30\)분간 방치하여 응고시켰다. 응고된 \(\mathrm{fibrin~plate}\)에 각 시료를 적당량 점적하여 \( 6 \mathrm{hrs} \) 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반응시켜 용해된 분해면적을 측정 하였으며, 활성의 세기를 측정하기 위하여 혈전분해효소\(\mathrm{plasmin}\)과 비교 후 \(\mathrm{unit}\)로 환산하여 단위를 정하였다.</p> <h3>사용균주 및 플라스미드</h3> <p>사용된 숙주세포로서는 \(Escherichia~coli\) \(\mathrm{XL1}\)-\(\mathrm{blue}\) (\(sup\) \(\mathrm{E}\)+ \(lac\)- \(hsd\)\(\mathrm{R17}\) \(rec\)\(\mathrm{A1~F}\) \(pro\)\(\mathrm{AB}\) + \(lacl\) \(\mathrm{Z}\) \( \triangle \mathrm{M15}\) 을 사용하였고 \(cloning\) 및 \(\mathrm{subcloning~vector}\)로서 \(\mathrm{pBluescriptⅡ}\) \(\mathrm{SK}\)(-) \(\mathrm{[Stratagene］}\)와 \( \mathrm{pET}\)-\(\mathrm{28a}\) \mathrm{a}(+)［\(\mathrm{Novagen}\) ］\(\mathrm{vector}\) 를 사용하였다</p> <h3>Chromosomal DNA의 분리</h3> <p>\(\mathrm{IntRon}\) 사의 \(\mathrm{Genomic~DNA~Extraction~kit}\) 를 이용하여 분리하였다. 흑두에서 분리한 미생물을 \( \mathrm{OD} \) 가 \( 1.0 \) 이 되게 배양한 후 얼은 균체를 \(50\) \(\mathrm{ul~Pre~buffer (added}\) \( 20 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) RNaseA)로 현탁시킨 후 \( 100 \mathrm{~g} / \mathrm{ml}\) \(\mathrm{Lysozyme}\) \(3\) \(\mathrm{ul}\) 를 첨가, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15분간 반응시켰다. 반응 후 \(250\) \(\mathrm{ul~G}\)-\(\mathrm{buffer}\) \(\mathrm{(added}\) \(20\) \( \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\) \(\mathrm{RNase~A}\) , \( 20 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) \(\mathrm{Protease ~K)}\)를 첨가, \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(15\)분간 반응시켰다 반응이 끝난 후 \(250\) \(\mathrm{ul}\) \(\mathrm{Binding~buffer}\)를 첨가하여 \(\mathrm{binding}\) 시킨 후 \(\mathrm{column}\) 을 이용하여 \(\mathrm{DNA}\) 를 분리하였다.</p>