소포체의 핵심 기능 중 하나는 분비 및 세포막 단백질의 접힘 및 조립을 촉진하는 것이며, 전사제어인자 Hac1p가 이 과정을 통제한다. 또한 포유동물 세포에서는 두 종류의 Ire1p homolog, \( IRE1 \alpha \) 및 \( IRE1 \beta \)가 발현됨을 확인하였다. 본 연구는 곤충 세포에서 이러한 메커니즘을 관찰하기 위해, UPR을 유도하여 cDNA 유전자은행을 제작하고, 다양한 스트레스에 의해 이상 구조를 가진 단백질이 재생되는 과정을 관찰하였다. 특히, tunicamycin으로 처리된 세포주에서 발현량이 증가하는 cDNA 클론을 선별하여 분석하였다.
<h1>서 론</h1> <p>소포체(endoplasmic reticulum; ER)의 가장 중요한 생물학적 기능 중의 하나는 번역 후 변형과정 (post-translationmodification)에서 새롭게 합성되는 분비단백질과 세포막단백질의 정확한 접힘과 조립 (folding & assembly)을 위한 적절한 환경을 제공하는 것이다. 이를 위하여 소포체는 여러 종류의 거주 단백질인 ER chaperone, ER foldase, ER degradase 등을 가지고 있다. 결국 이들은 비정상적인 단백질의 생산을 막는 품질관리(quality control)를 통하여 정확하게 접히고 조립된 단백질만을 세포내외의 적당한 위치에 분비 또는 수송하여 주어진 기능을 수행하도록 한다. 반면에 정확하게 접혀지지 않았거나(unfolded 또는 misfolded) 조립되지 못한 폴리펩타이드 (polypetide)에 대하여 세포는 분자 샤페론과 folding enzyme의 전사를 증가시킴으로써 소포체 내에 존재하는 비정상적인 구조를 가지는 단백질의 정상화를 촉진한다. 따라서 소포체의 단백질 고차구조 형성 능력은 필요에 의해서 조절된다. 만약, 세포가 heat shock, 중금속 오염, 산소결핍, \( \mathrm{Ca}^{2+} \) 이온의 항상성 파괴, 단백질 glycosylation 및 disulfide bond 형성 저해 등의 각종 스트레스를 받아 소포체 내강(ER lumen) 내에 이상한 구조를 가지는 단백질이 과다 발생하면, 세포는 소포체 내에 존재하는 분자 샤페론과 folding enzyme의 능력만으로 정상적 단백질로 복구가 불가능하므로 분자 샤페론과 folding enzyme의 전사를 증가시키기 위하여 intracellular signaling pathway 즉, unfolded protein response (UPR)라는 신호를 핵(nucleus)으로 보낸다. 이 UPR signaling pathway에 관해서는 이미 효.모(Saccharomyces cerevisiae)에서 대부분이 해명되었는 데, 3 개의 유전자 산물 즉, Ire1p, Reg1p 및 Hac1p가 효모의 UPR에서 필수적인 역할을 수행한다. 일단 소포체 내에 비정상구조의 단백질이 발생하면 transmembrane kinase인 Ire1p가 비정상 구조의 단백질을 인지하고 신호를 소포체나 핵 내막으로 전달한다. Ire1p는 growth factor receptor와 매우 유사하게 oligomerization과 autophosphorylation에 의해서 활성화되어 HAC1 precursor mRNA를 특이적으로 절단하며, 절단된 5' 엑손과 3' 엑손이 Rlg1p (tRNA ligase)에 의해서 연결됨으로써 성숙한 형태의 HAC1 mRNA가 된다. 성숙 HAC1 mRNA에 의해서 basic-leucine zipper (bZIP) type의 전자제어인자(transcription factor)인 Hac1p가 생성되어, 분자 샤페론이나 folding enzyme의 프로모터 상류에 위치하고 있는 UPRE (unfolded protein response element)에 결합함으로써 분자 샤페론의 전사를 증가시킨다. 이렇게 전사제어인자 Hac1p에 의해서 전사가 증가된 분자 샤페론들이 정확하게 접혀지지 않았거나 조립되지 못한 폴리펩타이드에 결합함으로써 적절하게 접혀지고 조립되게 하여 정확한 구조를 가지는 단백질로 재생된다.</p> <p>포유동물에도 효모의 UPR에서 필수적인 역할을 수행하는 Ire1p, Reg1p 및 Hac1p와 유사한 counterpart를 찾기위하여 많은 연구를 수행하였다. 그 결과로써, 포유동물 세포는 \( IRE1 \alpha \) 와 \( IRE1 \beta \) 라 불리는 두 개의 Ire1p homolog를 발현한다는 것을 발견하였다. \( IRE1 \alpha \) 와 \(IRE1 \beta \) 는 cytoplasmic region에 protein kinase와 endoribonuclease domain을 가지고 있는 소포체 내에 존재하는 type I transmembrane protein으로, 효모의 Ire1p와 동일하게 HAC1 precursor mRNA를 같은 위치에서 절단한다는 것을 발견 하였다. 따라서 포유동물의 경우에도 UPR 생성시 Irelp homolog가 존재함으로써 이후 Haclp-like-transcription factor를 찾기 위한 많은 연구가 수행되었다. 그 결과, 포유동물에서도 UPR에 의해서 조절되는 bZIP 도메인을 가지고 있는 전사제어인자인 \( ATF6 \alpha, \mathrm{ATF} 6 \beta \) 및 XBPl이 발견되었지만, 이들 전사제어인자가 \(IRE1 a \) 및 \( \operatorname{IRE1} \beta \)에 의해서 직접적으로 조절되는 지에 관해서는 아직까지 어떠한 증거도 밝혀지지 않았다.</p> <p>따라서 본 연구는 곤충에서 처음으로 각종 물리 - 화학적 스트레스에 의해서 소포체 내에 비정상 구조를 가지는 단백질들이 발생될 때 정상구조를 가지는 단백질로 재생하는 분자 샤페론이나 folding enzyme의 전사를 증가시키는 효모의 Hac1p와 유사한 기능을 하는 전사제어인자를 코딩하는 유전자를 선발하기 위하여, 누에 배양세포주 (Bm5)에 tunicamycin를 처리하여 UPR을 유도하고 이로부터 cDNA 유전자은행을 제작하였다. 또한 정상 세포주와 tunicamycin이 처리된 세포주로부터 각각 분리한 poly(A)+RNA 를 이용하여 합성한 1st-strand cDNA 를 탐침으로하여 차별화 선별을 하고, 이로부터 발현량이 증가하는 40개의 차별화 발현 cDNA 클론에 대하여 부분 염기서열을 분석하고, 이 중 기존에 밝혀진 전사제어인자와 1차 아미노산의 구조적 유사성을 나타내는 클론에 대하여 유전자의 구조와 발현 특성을 분석하였다. 이는 곤충에서 UPR pathway에 관련한 전자제어인자의 최초의 보고이다.</p>