\( A c / D s \) 삽입 계통의 \( D s \) 삽입여부와 부위를 분석하기 위해 Southern blot, PCR, FST 분석이 진행되었다. 특정 유전자 분리를 위해 Fc626 primer를 사용하였고, PCR 조건은 일정한 온도와 주기로 설정하였다. 분리된 유전자의 염기배열은 pGEM T-easy vector의 sp6와 T7 primer를 사용하여 결정하였다. 이후 얻은 DNA 염기서열 정보를 Gramene을 통해 벼 전체 염기서열 정보와 비교하였고, 유사성 분석은 NCBI를 통해 이루어졌다. 마지막으로 아미노산 서열의 alignment 및 homology 비교 분석은 Lasergene 7을 이용하였다.
<h2>선발 Ds 삽입 변이계통에서 유전자 분리</h2> <p>\( A c / D s \) 삽입 계통으로부터 \( D s \) 삽입여부 및 부위 해석을 위해 Southern blot, PCR 및 FST (flanking sequence tag) 분석은 Han (2002) 및 Kim 등 (2002; 2004)이 보고한 방법에 의해 수행하였다.</p> <p>유전자 분리를 위한 Fc626 primer는 forword; 5'-ATGGATCCTAATGAACCTTGCTGG-3'와 reverse; 5'-TCAGGCTTTCGGCTGTTGACGATC-3'를 각각 사용하였고, PCR을 위한 온도조건은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 1분, \( 61 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 40초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 1분으로 30 Cycles하였다. PCR 산물은 \( 1 \% \) agarose gel에서 증폭산물을 확인한 후, Gel Extraction Kit (solgent)에 의해 증폭한 DNA를 분리 정제한 후, pGEM T-easy vector (Promega)에 cloning하였다.</p> <h2>DNA 염기서열 결정 및 유전자 동정</h2> <p>분리한 유전자의 염기배열을 결정하기 위하여 pGEM T-easy vector에 존재하는 sp6 및 T7 primer를 이용하여 DNA 염기배열을 결정하였다. 얻어진 DNA 염기서열 정보는 Gramene (http://www.gramene.org/)을 통하여 벼 전체 염기서열 정보와 상동성 비교에 의하여 염색체 위치 및 knock-out 유전자를 결정한 후 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통하여 다른 유전자들과 유사성을 비교 분석하였으며, 유전자 염기배열 정보로부터 얻은 아미노산 서열에 대한 alignment, homology 비교분석은 Lasergene 7 (Version 7.0, DNASTAR Inc.)을 사용하였다.</p> <h2>RT-PCR에 의한 유전자 발현분석</h2> <p>선발한 Ds 삽입 변이 식물체로부터 분리한 유전자의 발현 양상을 알기 위해 RT-PCR 분석을 하였다. RT-PCR는 동진 벼의 14일 잎, 선발한 Ds 삽입 변이체 및 \( 250 \mathrm { mM } \) NaCl, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) cold, \( 100 \mu \mathrm { M } \) ABA, \(100 \mu \mathrm { M } \) IAA, \( 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) 2,4-D 등 처리한 식물 조직에서 분석하였다. Total RNA 추출은 Intronbio (Korea) 사에서 제공하는 plant RNA extraction kit를 사용하여 reagent 와 함께 제공되는 실험방법에 따라 수행하였다. RT-PCR분석은 Intronbio사에서 제공하는 one-step RT-PCR kit를 사용하여 이와 함께 제공되는 실험방법에 따라 수행하였다. RT-PCR를 위한 primer는 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 3'-UTR부위에서 fw; 5'-AAGTGTGGCTTATGCGAGAG-3'와 rv; 5'-TGCTTCTTAAAACGGTTTCG-3'를 각각 제작하였다. RT-PCR의 온도조건은 \( 45 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30분, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5분간 역 전사반응을 하고, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20초, \( 61 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 40초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분의 단계로 40회 반복하여 실시하고, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 최종 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 \( 1.5 \% \) agarose gel에 전기영동 하여 발현 정도를 확인하였다.</p>