본 논문에서는 세포 배양 및 시약 처리, Western blot의 방법에 대해 서술하였다. C2C12 세포를 DMEM을 이용하여 \( 37^{\mathrm{\circ}} \mathrm{C}\), \(5 \% ~\mathrm{CO}_{2} \)의 환경에서 배양하였다. 단백질을 추출하기 위하여 cell lysis buffer처리 후 원심분리하였고 반응이 끝난 후 용기를 씻어내고 ECL 용액을 1:1 비율로 섞어 1분 동안 반응시킨 뒤 LAS-3000 imaging system으로 발현을 확인하여 densitometry를 통해 수치화 하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포 배양 및 시약 처리</h2> <p>C2C12 세포는 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS) (Hyclone, Logan, UT), \( 100 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \)의 penicillin \( \mathrm{G}, 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 streptomycin sulfate (Welgene, KOREA)를 함유하고 있는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Welgene, KOREA)을 이용하여 \( 37^{\mathrm{\circ}} \mathrm{C}\), \(5 \% ~\mathrm{CO}_{2} \)의 환경에서 배양하였다. 세포는 6-well plate에 \( 2 \mathrm{ml} \)당 \( 5 \times 10^{5} \) 세포를 분주하고 48시간 후 \( 2 \% \) horse serum (HS) (Hyclone, Logan, UT)이 함유된 분화배지에 분화를 유도하면서 \( 250 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \)의 IGF-I (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)을 처리하거나 \( 250 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \)의 IGF-I을 p38 MAPK 억제제인 \( 10 \mu \mathrm{M} \)의 SB203580, 또는 ERK1/2 억제제인 \( 30 \mu \mathrm{M} \)의 PD98059와 함께 5분 또는 30분간 처리하였다.SB203580과 PD98059는 Sigma Aldrich사로부터 구입하였다.</p> <h2>Western blot</h2> <p>단백질을 추출하기 위하여 cell lysis buffer (\(50\mathrm{mM}\) Tris, \(\mathrm{pH}\) 7.5, \( 150 \mathrm{mM}~ \mathrm{NaCl}\), \(1 \% \) Triton X-100, \( 1 \mathrm{mM} \) PMSF, and complete protease inhibitor cocktail)를 처리한 후 scraper를 이용해 세포를 긁어낸 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 13,000 \mathrm{rpm} \)으로 15분간 원심분리 하였다. 분리된 단백질을 얻어낸 뒤 Bradford protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. \( 60 \mathrm{\mu g} \)의 단백질을 \( 8 \% \) SDS-PAGE gel에서 \( 150 \mathrm{~V} \)로 1시간 동안 전기 영동 한 뒤, PVDF membrane으로 transfer 하였다 \(12\mathrm{~V}\), \(1\mathrm{hr}\). 또한 Ponceau S로 모든 lane의 동량의 단백질을 확인한 후 각각의 membrane 을 \(5\%\) skim milk로 1시간 blocking 한 뒤 \(0.1\%\) TBST로 5분씩 3번 씻어내었다. 다음으로 GRIP-1 (polyclonal rabbit antibody, 1:1,000), SRC-1 (monoclonal mouse antibody, 1:1,000), ARA70 (polyclonal rabbit antibody, 1:2,000) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), 그리고 a -tubulin (monoclonal mouse antibody, 1:2,500) (Calbiochem, Gibbstown, NJ) 1차 항체를 \(5\%\) bovine serum albumin (BSA)에 희석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 반응시켰다. 그 후, \( 0.1 \% \) TBST로 5분씩 3번 씻어낸 뒤 2차 항체(anti-rabbit or mouse IgG horse-radish peroxidase-linked secondary antibody, 1:5,000) (Cell signaling, Beverley, MA)를 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 위와 동일한 방법으로 씻어낸 뒤, enhanced chemiluminescent (ECL) (GE Healthcare UK Ltd., Little Chalfont, UK)용액을 1:1 비율로 섞어 1분 동안 반응시킨 뒤 LAS-3000 imaging system (Fuii Film, Tokyo, Japan)으로 단백질 발현을 확인하였다. 모든 coactivator들의 단백질 발현양은 각각의 a-tubulin의 단백질 양으로 보정하여 densitometry (Scion image)를 이용하여 수치화 하였다.</p>