본 연구는 MBL 유전자에 존재하는 돌연변이로 인한 MBL 단백질의 기능 이상을 연구하였다. 이를 위해 클로닝한 MBL-A cDNA를 사용하여 세 가지 점돌연변이를 도입하였고, 이들 세 가지는 사람의 MBL 돌연변이와 대응된다. 또한, 이 세 가지 돌연변이를 함께 포함하는 triple mutant MBL-A를 제작하였다. Mutagenesis에 필요한 primers는 돌연변이 염기가 치환된 서열을 포함하게 제작하였으며, 각 primer가 일부 overlapping 되도록 디자인하였다.
<h1>결 과</h1> <h2>Site-directed Mutagenesis system을 사용한 mutant MBL 제조</h2> <p>MBL 유전자에 존재하는 돌연변이로 인한 MBL 단백질의 비정상적인 기능 연구를 위하여 Kwon등이 클로닝한 MBL-A cDNA를 주형으로 사용하여 세 종류의 점돌연변이를 GeneTailor \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen) Kit을 사용하여 도입하였다. 사람의 경우 MBL의 돌연변이는 Arg40Cys, Gly42Asp, Gly45Glu 세 곳의 위치에 각각 존재하는 것으로 알려져 있으며, 이들 세 곳에 대응되는 쥐의 MBL-A 염기위치에 3 개의 point mutation 함께 존재하는 triple mu-tant MBL-A을 제작하였다. Mutagenesis의 primers의 합성은 \( 5 ^ {\prime } \) primer (sense)는 돌연변이 염기가 치환된 서열이 포함되게 제작하고, 3' primer (antisense)가 5' primer와 일부 over-lapping 되도록 디자인 하였다. Triple mutation은 각각의 점돌연변이를 순차적으로 도입하여 제작하였다. 즉, 먼저 Arg40Cys로 치환된 점돌연변이 DNA를 제작한 후, 이를 주형으로 Gly42Asp 돌연변이를 추가로 도입하였으며, 다시 두 개의 돌연변이가 존재하는 DNA를 주형으로 하여 Gly45Glu의 돌연변이를 최종적으로 도입하였다. 각 단계별로 DNA sequencing을 실시하여 돌연변이 도입 여부를 확인하였다. PCR product를 BamH 과 Xhd를 사용하여 절단하였고 동일한 제한효소로 절단한 DSL-HA vector에 클로닝하였다. 클로닝한 지도와 돌연변이가 도입된 부분의 염기서열을 Fig. 1에 나타내었다.</p> <h2>세포에서 wild type과 triple mutant MBL 단백질 발현 확인</h2> <p>\( 35 \mathrm { ~mm } \) tissue culture plates에 HeLa cell이 \( 4 \times 10 ^ { 5 } \) cells/dish 되게 seeding하여 \( 2 \mathrm { ml } \) 의 DMEM (10 \% fetal bo-vine serum, 10,000 U of penicillin \( \mathrm { g } / \mathrm { ml } \), streptomycin 100 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) ) 배지를 첨가하여 18 시간 배양한 후, wild type MBL-A과 triple mutant MBL-A를 형질전환 하였다. 형질 전환된 세포에서 생산된 각 단백질을 western blot 방법으로 분석하였다. 형질 전환 2 일 후, 형질 전환된 HeLa cell의 cell lysate를 NP-40 lysing buffer를 사용하여 회수하였고, 각 cell lysate의 동일 양인 700 μll을 적용하여 anti-HA와 protein A bead를 사용하여 면역 침강을 시행하였다. 면역침강 후 SDS-PAGE와 western blot을 하고 항체 anti-HA를 사용하여 단백질의 발현을 확인하였다. 확인 결과 wild type MBL과 triple mutant MBL의 단백질 양이 크게 차이가 나지 않아 정상과 돌연변이의 단백질 사이에 발현의 차이는 없는 것으로 나타났다. 다만, triple mutant MBL 단백질 band가 shift 되어 wild type 단백질 보다 size가 높게 나타났는데, 이는 arginine과 2개의 glycine이 cysteine과 aspartic acid, glutamic acid로 치환되어 분자량이 약간 증가된 것과 치환된 이들 아미노산이 음이온을 가짐으로써 인산화된 단백질들이 PAGE에서 mobility shift가 나타나는 것과 같이 shift가 일어난 현상으로 생각된다.</p>