NZW 토끼를 이용하여 OmpW 특이적인 다클론성 항체를 생산하였으며, Immunoblotting 결과, 여러번 항원 접종이 이루진 이후에야 OmpW 특이적인 항체가 생성된 것을 확인할 수 있다. OmpW 단백질은 상대적으로 항원성이 낮다고 판단 할 수 있었다. OmpW 단백질의 역할 조사에 필요한 OmpW 결손 돌연변이 주를 생성하기 위해 약 \( 600 \mathrm { nt } \)의 OmpW 유전자가 결손된 재조합 suicide 플라스미드 pBP31을 구축하였다. CK10 균주에서는 OmpW 단백질 특이적인 immuno-reactive 밴드를 관찰할 수 없었으므로 allelic exchange법을 사용한 S .typhimurium ompW 결손 돌연변이주의 구축이 분명하다는 것을 확인할 수 있었다.
<p>\( \mathrm { OmpW } \) 특이적인 다클론성 항체의 생산에는 \( \mathrm { New } \)Zealand White (NZW) 토끼를 이용하였다. 1차 항원 주입을 하기 전에 토끼로부터 혈액을 얻었으며 이것은 이후 음성 대조구로 사용하였다. 약 \( 500 \mu \mathrm { g } \) 에 해당하는 정제 \( \mathrm { OmpW } \) 단백질을 동량(v:v)의 complete Freund's adjuvant (Sigma)와 잘 혼합하고 여과하여 1 차 면역의 항원으로 사용하였다. 준비한 항원은 \( \mathrm { NZW } \) 토끼 몸의 각기 다른 부위에 3 4회로 나누어 피하주사하였다. 1 차 면역 후 3주가 지난 후에 토끼 귀의 정맥으로부터 혈액을 얻었으며, 동시에 1 차 면역 때와 같은 양의 항원을 incomplete Freund's adjuvant (Sigma)와 혼합하여 같은 방법으로 피하주사하였다. 토끼로부터 얻은 혈액을 2,000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하여 혈구 성분을 제거하고, \( \mathrm { OmpW } \) 특이적인 항체가 포함되어 있는 상등액인 혈청을 분리하였다. Immunoblotting 결과, 수 회의 항원 접종이 이루진 이후에야 \( \mathrm { OmpW } \) 특이적인 항체가 생성된 것을 확인할 수 있었으며, \( \mathrm { OmpW } \) 단백질은 비교적 항원성이 낮다고 판단 할 수 있었다(data not shown).</p> <h2>\( o m p W \) 유전자 결손 돌연변이주의 구축</h2> <p>\( \mathrm { OmpW } \) 단백질의 역할 조사에 필요한 \( o m p W \) 결손 돌연변이 주를 생성하기 위하여 약 \( 600 \mathrm { nt } \) 의 ompW 유전자가 결손된 재조합 suicide 플라스미드 pBP31을 구축하였다(Table 1). ompW 유전자를 결손시키기 위해서 E. coli \( \times 7213 \) (Asd) 균주에 들어있는 pBP31을 S. typhimurium 균주로 접합을 통해 이동시켰다. 1차 crossover를 통해서 Salmonella의 염색체 DNA로 suicide 플라스미가 끼어들어간 균주들은 ampicillin 항생제 내성의 특성을 이용하여 선별하였다. 2차 crossover에 의해 염색체 DNA로부터 재조합 suicide 플라스미드를 결손한 균주는 suicide 플라스미드에 포함된 positive selection marker인 \( s a c B \) 유전자의 특성을 활용하여 \( 5 \% \) sucrose가 포함된 배지에서 자라는 세포들로부터 분리할 수 있었다. \(5 \% \) sucrose에 내성을 가지는 하나의 돌연변이주를 선택하였으며, 선택한 돌연변이주 내의 ompW 유전자 결손은 parental 균주인 X3339와 돌연변이주의 ompW 부분에 해당하는 \( \mathrm { PCR } \) 산물 크기 비교를 통해 확인하였다. ompW 유전자에 대한 primer 쌍 [5-gctctagagtcacggtaaacggactt-3'과 5'-gcgcggccgcctgccgc-3']을 이용하여 \( \mathrm { PCR } \) 을 수행한 후 증폭된 DNA의 크기를 비교한 결과 X3339 균주의 염색체 DNA로부터 약 \( 2.4 \mathrm { ~kb } , \triangle o \mathrm { mpW } \) 돌연변이주의 염색체 DNA로부터 약 \( 1.8 \mathrm { ~kb } \) 의 DNA를 얻을 수 있었다(Fig.2A). 이 균주가 S. typhimurium인지를 확인하기 위해서 원래 균주가 가지는 streptomycin 항생제에 대한 내성을 조사한 결과 이 항생제에 내성을 나타내므로 이 균은 오염균이 아님을 확인할 수 있었다. 다양한 종류의 primer쌍을 이용하여 증폭한 PCR 산물들의 크기를 비교하여 확인한 \( \triangle o m p W \) 돌연변이 주를 CK10으로 명명하였다(Table 1). 앞에서 제조한 \( \mathrm { OmpW } \) 특이적인 항체를 이용한 immunoblotting 결과, CK10 균주에서는 \( \mathrm { OmpW } \) 단백질 특이적인 immuno-reactive 밴드를 관찰할 수 없었으므로 이를 통해 allelic exchange법을 이용한 \( S \). typhimurium ompW 결손 돌연변이주의 구축이 분명하다는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2B).</p>