cDNA 유전자 은행 제작을 위해 Stratagene사의 Uni-ZAP XR Vector Kit과 Gigapack Packaging Extract를 사용하여 poly A+RNA로부터 XhoI linker primer와 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 평활말단으로 만들고, EcoRI adaptor를 부착하고 size fractionation을 거친 후 적당한 크기의 단편만을 취하여 Uni-ZAP XR 벡터에 결합시키고 coat protein으로 패키징하여 cDNA 유전자 은행을 제작하였다. 염기서열 분석은 in vivo excision한 후 자동염기서열 분석장치를 이용하여 수행하고 PCR반응을 수행하여 GenBank 데이터베이스를 통하여 상동성을 분석하고 DDBJ 국제 유전자은행에 등록하였다.
<h2>cDNA 유전자 은행 제작</h2> <p>cDNA 유전자 은행 제작을 위해 Stratagene사 (CA, U.S.A.)의 Uni-ZAP XR Vector Kit와 Gigapack Packaging Extract를 사용하였다. 실험방법은 제조회사의 제시방법에 따라 poly A + RNA로부터 XhoI linker primer와 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 평활말단으로 만들었다. 그리고 EcoRI adaptor를 부착시킨 후 XhoI으로 절단하고 size fractionation을 거쳐 적당한 크기의 단편만을 취하였다. 이러한 cDNA를 Uni-ZAP XR 벡터에 결합시켜 삽입한 후 완전한 bacteriophage 상태가 되도록 coat protein으로 패키징하여 cDNA 유전자 은행을 제작하고 기주세포 (XL1-blue \( \mathrm { MRF } ^ {\prime } \) strain)내에 감염시킨 후 cDNA 농도를 적정하고 이를 적당한 농도로 증폭하여 본 실험에 사용하였다.</p> <h2>염기서열 분석 및 데이터 베이스 검색</h2> <p>염기서열 분석은 cDNA 유전자 은행에서 Short 등 (1988)의 방법으로 in vivo excision한 후 자동염기서열 분석장치(Perkin Elmer Co., ABI 377)를 이용하여 수행하였다. In vivo excision후 부분염기서열 분석은 Wizard Plus SV Miniprep DNA Purification System (Promega Co.)을 이용하여 분리한 DNA( \( 200 \mathrm { ~ng } \))를 T3 혹은 T7 프라이머 (3.2 pmole)를 혼합한 후 Termination Reaction Mix (Perkin Elmer Co.)로 혼합한 후 PCR(polymerase chain reaction)반응을 수행하였다. PCR 산물은 \( 4.5 \% \)polyacrylamide 겔에 전기영동 후 DNA Sequencing Analysis Software (Perkin Elmer Co.)에 의해 분석되었다. 그후 얻어진 염기서열은 GenBank 데이터베이스를 통하여 상동성을 분석하고 DDBJ 국제 유전자은행에 등록하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>천잠 후부 견사선의 poly A + RNA 분리와 cDNA 유전자 은행 작성</h2> <p>천잠의 cDNA 유전자 은행을 작성하기 위해 천잠을 해부하여 천잠 실크가 특이적으로 발현되는 종령의 후부견사 선만을 분리한 후 액체 질소로 급속 냉동시켜 마쇄한 후 total RNA를 분리하고 \( 1.2 \% \) formaldehyde 겔에 전기영동</p> <p>으로 확인하였다. 분리한 total RNA로부터 poly A + RNA를 순수 분리하였다. 그리고 순수하게 분리한 poly A + RNA를 이용하여 cDNA를 합성하였다. poly A + RNA로부터 합성한 cDNA는 5'과 3' 말단에 EcoRI과 XhoI 인식부위를 각각 부여하였으며, 이 cDNA를 pBluescript \( \mathrm { SK } ^ { - } \)plasmid를 포함하는 lambda ZAP Ⅱ 벡터에 방향성 있게 클로닝하였다. 재조합된 DNA를 in vitro packaging하여 cDNA 유전자 은행을 제작하였다. 그리고 cDNA 유전자 은행은 plaque forming unit (pfu), 절편의 삽입율 (insert ratio) 및 삽입절편의 크기로 그 제작효율을 판단할 수 있는데, large-scale EST 분석시 pfu는 주요한 요소로 판단되어지며 절편의 크기는 항상 \( 5 ^ {\prime } \) 이나 \( 3 ^ {\prime } \) 의 non-coding 염기서열이 포함되어져 있으므로 한쪽방향으로의 부분염기서열 분석에 있어서 번역개시나 종결신호를 포함할만큼 충분히 길어야 더 많은 정보를 줄 수 있다. 여기에는 제작한 천잠 후부견사선의 pfu는 약 \( 1.1 \times 10 ^ { 6 } \) 였으며, 제작된 cDNA 유전자 은행에서 벡터내에 삽입된 cDNA 크기를 확인하기 위하여 무작위로 선발한 파아지를 in vivo excision하여 pBluescript SK 즉 플라스미드로 전환하였다. 전환된 플라스미드를 EcoRI와 XhoI 제한효소로 절단하여 삽입절편의 유무 및 크기를 확인한 결과, 모든 클론들의 절편 크기는 \( 0.5-1.5 \mathrm { ~kb } \)였으므로, 이 cDNA 유전자 은행은 ESTs 분석에는 적합한 것으로 판단되었다. 또한 시간적 (temporal) • 공간적 (spatial)으로 특이적으로 발현되는 후부견사선으로부터 cDNA 유전자 은행을 작성하였으므로 천잠의 fibroin 및 sericin 등 실크합성단계에 발현되는 유전자들을 포함하는 것으로 생각되었다.</p>