뿌리 절편으로부터 total RNA 추출과 RT-PCR을 수행했다. 이를 위해 RNA 추출 용액, PCI, CI, 2.5M LiCl 등의 첨가물을 함께 사용하여 \(50^\circ \mathrm{C}\)에서 10분 동안 처리하고, \(4^\circ \mathrm{C}\)에서 30분, \(-20^\circ \mathrm{C}\)에서 1시간 동안 원심 분리하여 total RNA를 추출했다. 추출한 RNA을 AccuPower RT PreMix를 사용하여 cDNA로 역전사시키고, EmeraldAmp PCR Master MiX를 사용하여 PCR 증폭을 진행했다. 증폭된 PCR 샘플은 \(1.8\%\) 아가로스 젤에서 분리되고, ethidium bromide 용액으로 염색하여 gel image analysis system으로 촬영하는 과정을 거쳤다.
<h3>Total RNA 추출과 RT-PCR</h3> <p>뿌리 절편을 RNA extraction buffer \( (0.1 \mathrm { M } , \mathrm { pH } \) 9.0, Tris-HCl, \( 0.1 \mathrm { M } \quad \mathrm { NaCl } , 1 \%[ \mathrm { w } / \mathrm { v } ] \quad \mathrm { SDS } , 0.1 \% \quad[ \mathrm { v } / \mathrm { v } ] \) 2-mercaptoethanol)를 첨가하여 갈아준 다음, 동일부피의 PCI 를 첨가하여 잘 섞은 후 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분 동안 반응시켰다. 30 분간 원심분리 \( \left (4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 13,000 \mathrm { rpm } \right ) \) 하여 상등액을 취하고 여기에 동일부피의 CI를 첨가한 후 다시 30 분간 원심분리 \( \left (4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 13,000 \right . \) \( \mathrm { rpm } \) )하였다. \( 2.5 \mathrm { M } \mathrm { LiCl } \) 를 첨가하여 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 시간 동안 반응시킨 뒤 15 분간 원심분리 하여 침전물을 수거하고 \( 70 \% \) 에탄올로 세척 후 다시 15 분간 원심분리 하였다. 침전물을 잘 건조시킨 후 \( 0.1 \% \) DEPC (Diethyl pyrocarbonate)-treated water 30 씨에 녹여 total RNA를 획득 하였다. 추출한 total RNA는 Microplate Reader infinite \( { } ^ {\circledR } 200 \) (TECAN, USA)를 이용하여 정량하였다.</p> <p>추출한 total RNA를 주형으로 cDNA를 얻기 위해 역전사 과정은 AccuPower \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) RT PreMix (Bioneer, USA and Korea) 를 사용하였고, 합성된 first-strand CDNA를 사용하여 PCR 과정을 수행하였다. PCR에 사용된 primer set는 Table 1과 같다. PCR 증폭시키기 위하여 EmeraldAmp \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) PCR Master MiX (Premix, TaKaRa, Japan)를 사용하였으며 모든 조건과 방법은 manual에 따라 실험을 하였다. PCR product는 \( 1.8 \% \) agarose gel 상에서 분리하고 ethidium bromide 용액으로 염색한 후 gel image analysis system (CoreBio, i-MAX-D500, Korea)을 이용하여 촬영하였다.</p> <h2>통계 분석</h2> <p>모든 실험은 최소한 5회 이상 반복하였고, 각 실험 처리구당 40개의 뿌리 절편을 사용하였다. \( \mathrm { p }<0.05 \) 유의성을 검사하기 위하여 mean value는 Student \( t \) test에 따라 계산하였다.</p> <h1>초록 : 옥수수 일차뿌리에서 benzyladenine이 IAA에 의해 유도된 에틸렌 생성에 미치는 영향</h1> <p>본 연구는 옥수수 뿌리에서 cytokinin ( \( \mathrm { N } ^ { 6 } - \)benzyladenine; BA)과 IAA를 각각 혹은 같이 처리하여 ethylene 생성에 미치는 영향을 알아보았다. 두 호르몬을 외부에서 동시에 처리하면 ethylene 생성은 각각 처리하였을 때보다 함께 처리하면 상승적으로 증가하였다. 예를 들면, \( 10 ^ { 4 } \mathrm { M } \) BA와 \( 10 ^ { -4 } \mathrm { M } \) IAA를 처리하면 ethylene 생성량은각각 대조구의 87%와 170% 증가되지만 함께 처리하면 대조구의 480%가 증가된다. 이러한 상승적 효과는 에틸렌생성에 관여하는 효소인 ACC synthase의 활성과 유전자 발현 수준에서도 볼 수가 있었다. 그러나 에틸렌 생성에관여하는 다른 효소인 ACC oxidase의 활성에서는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 cytokinin인 BA와 IAA가 옥수수 뿌리에서 ACC synthase에 영향을 미쳐 ethylene 생성을 상승적으로 촉진시킨다는 사실을 제시한다.</p>