2,2-diphenyl-1-picryl-hydrayl (DPPH, Sigma)을 사용하여 적송잎 추출물의 전자 공여능을 측정하고, 적송잎 추출물에 포함된 thiocyanate과 2-thiobarbituric aicd (TBA)에 의한 항산화 활성 조사를 수행하였다.
<h2>적송잎 추출물의 DPPH법에 의한 전자 공여능 조사</h2> <p>적송잎 추출물의 전자 공여능은 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrayl (DPPH, Sigma)을 사용하여 측정하였다. 여러 농도의 적송잎 추출물(최종농도: 500, 250, 100, 50, 10 \(\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ) \( 50 \mu \mathrm{l} \)에 DPPH \( (200 \mu \mathrm{M} / \mathrm{ml} \) in ethanol) \( 150 \mu \mathrm{l} \)를 혼합한 후 10 분간 vortexing을 행하였다. 실온의 차광한 상태에서 30분간 반응시킨 후 \( 528 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 이에 따른 항산화 활성은 \( \mathrm{IC}_{50} \)으로 나타내었다. 표준물질로 butylated hydroxytoluene (BHT, Sigma)과 \(96\%\) proanthocyanidin(Grape seed extract, Naturex)을 같은 농도로 사용하였다.</p> <h2>적송잎 추출물의 thiocyanate에 의한 항산화 활성 조사</h2> <p>Osawa의 방법에 따라 linoleic acid \( (25 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) inEtOH), ferrous chloride \( (2.45 \mathrm{~g} / \mathrm{ml} \) in \( 3.5 \% \) hydrochloricacid), ammonium thiocyanate \( \left(0.3 \mathrm{~g} / \mathrm{ml}\right. \) in \( \left.\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\right)\), \(0.2 \mathrm{M} \) phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} 7.0\))를 만들어 이것을 stock solution으로 사용하였다. 적송잎 추출물 \( 0.2 \mathrm{ml} \)과 linoleic acid \( 0.2 \mathrm{ml} \)을 시험관에 넣고 혼합한 후 phosphate buffer \( 0.4 \mathrm{ml} \)와 증류수 \( 0.2 \mathrm{ml} \)를 가하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 incubation하면서 일정간격으로 활성을 측정하였다. 활성측정방법은 흔합용액에서 \( 0.1 \mathrm{ml} \)을 취하여 시험관에 넣고 \( 70 \% \) ethanol \( 3 \mathrm{ml} \), ammonium thiocyanate 용액 \( 0.1 \mathrm{ml} \), ferrous chloride 용액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 흔합한 후 정확히 3분 후에 흡광도 \( (500 \mathrm{~nm}) \)를 측정하였다. 이때 활성비교를 위하여 BHT 및 \( 96 \% \) proanthocyanidin을 표준물질로 사용하였다.</p> <h2>적송잎 추출물의 2-thiobarbituric aicd (TBA)에 의한 항산화 활성 조사</h2> <p>적송잎 추출물 \( 1 \mathrm{ml} \)와 linoleic acid \( (25 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) in \( \mathrm{EtOH}) \) \( 1 \mathrm{ml} \)를 시험관에 넣고 혼합한 후 \( 0.2 \mathrm{M} \) phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 7.0)\) \(2 \mathrm{ml} \)와 증류수 \( 1 \mathrm{ml} \)를 가하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 incubation 하면서 일정간격으로 활성을 측정하였다. 활성측정방법은 시료액 \( 0.5 \mathrm{ml} \)를 원심분리관에 넣고 \(35\%\) trichloroacetic acid \( 0.25 \mathrm{ml} \)와 \( 0.75 \% \) aqueous TBA (Sigma) \( 0.5 \mathrm{ml} \)를 가하여 혼합한 후 boiling water bath에서 가끔 흔들면서 15분간 처리하고 흐르는 물에 냉각시킨 후 \( 70 \% \) trichloroacetic acid \( 0.5 \mathrm{ml} \)를 가한 다음 20분 후 15분간 원심분리 \( (3,000 \times g) \)를 행하여 상층액에 대한 흡광도 \( (532 \mathrm{~nm}) \)를 측정하였다. 이때 활성비교를 위하여 BHT 및 \( 96 \% \) proanthocyanidin을 표준물질로 사용하였다.</p>