세포의 형태와 크기는 Hucker의 방법을 이용한 그람 염색과 광학현미경으로 분석하였으며, 항산성 즉 염색이 어렵고 탈색되지 않는 특성은 갯지렁이 Bacillus 균주의 Ziehl-Neelsen 방법을 이용한 염색을 통해 살펴보았다. Bacillus의 내생포자는 MB 배지 접종 후 \(30^{\circ}C\)에서 24시간 배양, \(60^{\circ}C\) 및 \(80^{\circ}C\) water bath 처리 후 Moeller 방법을 통해 염색하였다. 또한, Catalase 활성은 \(3\% H_{2}O_{2}\)를 사용하여 관찰하였고, oxidase 활성은 Kovács 시약을 사용하여 균주의 색 변화를 관찰하였다.
<p>그람 염색을 통한 세포 형태 및 크기 관찰은 Hucker의 방법에 따라 Gram 염색을 실시한 후 광학현미경을 통해 관찰하였다. 세포벽이 두꺼운 waxy 물질로 덮여 있어서 염색이 쉽게 되지 않으며 일단 염색이 되면 acid alcohol로도 탈색이 되지 않는 성질을 항산성이라 하는데 항산성은 갯지렁이 Bacillus 균주들을 Ziehl-Neelsen의 방법에 따라 염색한 후, 균체가 내는 색의 변화로 관찰하였다. Bacillus의 내생포자를 관찰하기 위하여 균주들을 MB 배지에 접종 후 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) shaking incubator에 24시간 전배양한 균을 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) water bath와 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) water bath에서 10분간 방치한 후 MA 배지에 도말하고 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 배양한 균을 Moeller의 방법에 따라 염색한 후 현미경으로 관찰하였다. Catalase 활성은 MA 배지에 48시간 동안 전배양한 균주에 \( 3 \% \) \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)를 한 방울 떨어뜨려 기포 발생여부를 관찰하였고, oxidase 활성은 MA 배지에 48시간 동안 전배양한 균주의 colony 한 개를 멸균된 이쑤시개로 따서 filter paper 위로 옮기고 Kovács 시약 한 방울 떨어뜨려 균주의 색이 변하는지 관찰하였다. Cytochrome oxidase system이 있는 균은 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)로부터 환원형의 cytochrome의 산화를 통하여 산소를 생성하므로 30초 이내로 균주의 색이 보라색으로 바뀌면 양성판정을 하였다. 탄수화물의 발효는 다양한 유기산과 알코올을 형성하는데 본 연구에서는 \( 10 \% \) lactose가 포함된 ASS 배지에 균을 접종하여 균의 성장과 산의 생성 여부를 조사하였다. 균이 탄수화물을 산화하는지 발효하는지 여부는 OF 배지에 같은 균을 접종한 후 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양한 후 14 일간 매일 관찰하면서 판정하였다.</p> <p>본 연구에서는 배지별 생장여부와 온도, pH, 염도 등 세 가지 환경 조건을 달리하여 균주의 생장 여부를 조사하였다. 배지별 균 생장능은 이미 알려진 방법에 따라 제조한 LB agar, TSA, NA 배지와 MA (Difco), R2A (Difco) 배지에서 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 배양하여 조사하였다. 온도별 균 생장능은 MA 고체 배지에 접종 후 \( 4-50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 범위에서 배양하여 조사하였다. 배양의 최적 pH는 액체상의 MB 배지 제조 시 10N NaOH와 6N HCl을 이용하여 pH 3-pH 11까지 pH 1씩 차이를 두고 9개 tube에 각각 접종한 후 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 72시간 배양하면서 생장 유무를 관찰하였다. 염도에 따른 균 생장의 영향을 알아보기 위해 MA 배지를 제조할 때 salts 성분을 제거해 염도 \( 0 \% \) 배지를 만들고 추가적으로 원하는 농도만큼의 sea salts를 첨가하여 배지의 염도를 \(0-17 \% \)까지 염도 \( 1 \% \)씩 차이를 두고 만든 후 균을 접종, \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양한 후 균들의 생장여부를 조사하였다. 균주의 생장 여부는 균주 접종 후 각 균주의 적정 생장 온도에서 5일간 배양하면서 생장여부를 확인하였다.</p>