E. coli에서 발현된 \( \beta \)-lactamase의 정제과정은 조효소액을 트리스 버퍼로 흡착시킨 후, 이를 다시 NaCl이 함유된 Tris-HCl 버퍼로 세척 및 용출한 결과, 활성이 강한 부분은 \( 0.1 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } \)에서 용출되었다. 이를 다시 동결 건조하여 농축한 후, 최종적으로 정제된 활성부분의 분자량이 Bacillus sp. J105균주 유래의 세포외 \( \beta \)-lactamase와 일치하는 \( 31 \mathrm { kDa } \)임을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
<h2>E. coli에서 발현된 \( \beta \)-lactamase의 정제</h2> <p>E. coli에서 발현된 \( \beta \)-lactamase의 정제 과정의 요약은 Table 3에 나타내었다. 조제한 조효소액을 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris buffer \( ( \mathrm { pH } \)8.0)로서 충분히 투석한 후 동일 buffer로 평형화 시킨 DEAE Sephadex A-50 column에 흡착시켰다. 비흡착 단백질을 상기의 buffer로 충분히 세척 후 \( 0.1 \mathrm { M } \) 과 \( 0.5 \mathrm { M } \) 의 NaCl 이 함유된 Tris-HCl buffer ( pH 8.0)로 단백질을 용출 시켰으며 활성부분은 \( 0.1 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } \)에서 용출되었다. 활성이 강한 분획만을 모아 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris buffer pH 8.0)로서 투석 후 동결 건조하여 농축하였다. 농축되어진 활성부분을 \( 0.15 \mathrm { M } \) 의 NaCl이 함유된 상기의 buffer로 평형화 시킨 Sephadex G-75가 충진된 column \( (1.6 \times 140 \mathrm { ~cm } ) \)을 사용하여 gel filtration을 행하였다. 최종 gel filtration후 수율은 세포추출물 비례 \( 44.7 \% \)이였으며, 이때의 활성은 \( 133 \% \)를 나타내었다. 최종 정제된 활성부분을 \( 12 \% \) SDS-PAGE로 확인한 결과 분자량은 \( 31 \mathrm { kDa } \)로 이는 Bacillus sp. J105균주 유래의 세포외 \( \beta \)-lactamase의 분자량과 일치하였다.</p> <h1>요 약</h1> <p>\( \beta \)-Lactam계 항생물질에 강한 내성을 가지는 균주 Bacillus sp. J105가 생산하는 \( \beta \)-lactamase의 유전자를 E. coli DH5a에 cloning하였다. Cosmid vector pLAFR3을 이용하여, Sau3AI으로 부분 분해한 chromosomal DNA와 BamHI으로 처리한 pLAFR3을 ligation하였다. In vitro packaging kit를 사용하여 E. coli에 형질도입 하였으며 \( \beta \)-lactamase양성 clone주를 획득하였다. 이 recombinant plasmid \( \left ( \beta \right . \)-lac \( \left . { } ^ { + } \right ) \)를 pACYC184 (4.2 \( \mathrm { kb } ) \) vector를 사용하여 subcloning 하여 최종 \( \beta \)-lactamase의 활성이 있는 \( 6.4 \mathrm { ~kb } \) 단편이 포함된 \( \mathrm { pKL } 11- \Delta 4.6 \)을 제작하였다. 이 단편을 DNA 염기서열을 분석한 결과 309개의 아미노산으로 구성된 \( \beta \)-lactamase를 코딩하는 \( 927 \mathrm { bp } \)를 포함하고 있었다. 클로닝된 \( \beta \)-lactamase 유전자의 upstream을 포함하는 \( 170 \mathrm { bp } \)의 염기서열을 분석한 결과, B. thuringinesis와 B. cereus 유래의 B-lactamase 유전자의 upstream 부위와 \( 97 \% \)의 일치를 보였다. 본 연구에서 클로닝된 \( \beta \)-lactamase의 아미노산을 서열을 NCBI BLAST program을 이용하여 분석해 본 결과 B. thur-inginesis와 B. cereus의 B-lactamase와 각각 \( 97 \% \)와 \( 94 \% \)의 일치를 보였다. 또한 계통도 분석 결과 역시 본 연구에서 클로닝된 \( \beta \)-lactamase의 아미노산을 서열은 B. thuringinesis와 B. cereus와 유전학적으로 아주 밀접한 관계를 보여주었다. 이 pKL11- \( \Delta 4.6 \)를 E. coli에서 형질전환 시켜 발현 양상을 조사해 본 결과 \( \beta \)-lactamase의 secretion efficiency는 약 4 ~ 5 \( \% \)였다. E. coli의 세포 내 단백질로부터 \( \beta \)-lactamase를 정제하여 분자량을 확인한 결과 \( 31 \mathrm { kDa } \)로 wild type의 분자량과 일치함을 확인하였다.</p>