Tween 20 첨가에 따른 (R)-styrene oxide의 분해속도와 (S)-styrene oxide의 수율 및 광학순도에 주는 영향을 조사하였다. 결과적으로, Tween 20을 \(0.5\%\) 첨가할 경우 가수분해 속도가 향상되며, 가장 우수한 결과를 보였다. \(10^{\circ}C\)에서 생촉매 \(2\mathrm{mg}\) dcw 및 \(20\mathrm{mM}\) 라세믹 styrene oxide에 Tween 20을 \(0.5\%\) 첨가하여 반응시킨 결과, 높은 광학순도와 높은 수율의 (S)-styrene oxide를 얻을 수 있었다. 또한, 반응온도를 \(10^{\circ}C\)로 낮추면 광학활성 에폭사이드의 수율이 더욱 향상되었다.
<h2>Tween 20 첨가가 입체선택적 가수분해 반응속도에 미치는 효과</h2> <p>Kronenburg 및 Bont [11]는 막-결합형태의 R. glutinis EH 효소에 비이온성 detergent를 첨가함으로서 반응속도를 향상시켰다고 보고하였으며 Lee 및 Lee 는 R. glutinis의 EH 단백질을 P. pastoris에 발현시킨 재조합균주를 동결건조 시키는 과정에서 Triton X-100, Tween 20 및 Tween 80 등을 첨가하였을 때 epichlorohydrin 초기 가수분해 반응속도가 2 배 이상 향상되었다고 보고된 바 있다.</p> <p>Fig. 5는 Tween 20을 반응액에 최종농도 \( 0.1,0.5,1 \) 및 \( 5 \% \) \( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 되도록 첨가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 20 \mathrm{mM} \) 라세믹 styrene ox-ide에 대한 가수분해 반응속도 및 수율을 측정한 결과이다. 세포중량 \( 2 \mathrm{mg} \) (dcw)을 사용하였을 때 Tween 20 을 첨가한 모든 실험군에서 10분 15 분 사이에 (R)-styrene oxide를 모두 분해시킬 수 있었으며 (S)-styrene oxide은 39.7% 41.7% 의 수율로 얻을 수 있었다. Tween 20 을 첨가하지 않은 경우 (R)-styrene oxide를 20분 만에 분해하여 (S)-styrene oxide를 \( 30.2 \% \) 를 얻은 결과와 비교해 볼 때 \( 0.1 \sim 5 \% \) 의 Tween 20 의 첨가는 가수분해속도 및 수율을 향상시켰음을 알 수 있었으며, 그 중에서도 Tween 20을 0.5\% 첨가한 반응이 가장 우수하였다.</p> <h2>반응온도가 입체선택적 가수분해 반응속도에 미치는 효과</h2> <p>Fig. 6 는 double expression cassette 재조합 P. pastoris 생촉매 \( 2 \mathrm{mg} \) dcw를 사용하여 \( 20 \mathrm{mM} \) 라세믹 styrene oxide 혼합물을 가수분해하는데 있어 반응온도가 반웅속도 및 광학 활성 (S)-styrene oxide의 수율에 미치는 영향을 실험한 결과이다. Fig. 5 에서 보는 바와 같이, 반응온도가 30,20 및 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) 로 낮아질수록 (R)-styrene oxide가 입체선택적으로 가수분해되어 제거되는 시간은 각각 20,40 및 60 분으로 반응속도는 낮아졌다. 그러나 생성물인 (S)-styrene oxide의 광학순도 및 수율 측면에서 결과를 살펴보면, \( e e \) 값은 모든 온도에서 \( 99.9 \% \mathrm{ee} \) 이상을 얻을 수 있었고, 수율은 각각 \( 30.2 \%, 32.0 \% \) 및 \( 33.2 \% \) 로 반응온도를 낮출수록 높은 수율로 광학활성 에폭사이드를 얻을 수 있었다.</p> <h2>최적조건에서 회분식반응을 이용한 (S)-styrene oxide의 제조</h2> <p>Fig. 5 및 Fig. 6의 결과로부터 생촉매 \( 2 \mathrm{mg} \) dcw 및 20 \( \mathrm{mM} \) 농도의 라세믹 styrene oxide 반응혼합액에 Tween 20 를 \( 0.5 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 로 첨가하고, \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반응시키면 높은 광학순도의 (S)-styrene oxide을 높은 수율로 얻을 수 있음을 알 수 있 었다. Fig. 7은 R. glutinis EH 유전자를 pPICZ vector에 dou-ble expression cassette로 재조합하여 발현시킨 재조합균주 P. pastris을 이용한 회분식반응에서 라세믹 styrene oxide 혼합물로부터 광학순도가 높은 (S)-styrene oxide를 제조한 실험결과이다. Tween 20 을 \( 0.5 \% \) 첨가한 반응흔합물을 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반응시켰을 때, 온도만 낮추거나 Tween 20 만을 첨가했을 때에 비하여 가수분해속도 및 수율이 향상되었음을 알 수 있었다. \( 20 \mathrm{mM} \) 라세믹 styrene oxide 혼합물을 기질로 사용하였을 때, \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 (R)-styrene oxide가 완전히 분해되는데 60 분이 걸렸으나 Tween 20 을 \( 0.5 \% \) 로 첨가하였을 때 10 분이면 완전히 분해되어 분해속도가 6 배 빨라짐을 볼 수 있었다. 또한 광학순도 \( >99.9 \% \) 인 (S)-styrene oxide를 제조하는데 있어 Tween 20 을 \( 0.5 \% \) 첨가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반응하였을 때 수율이 \( 41.7 \% \) 이었으나 Tween 20 을 \( 0.5 \% \) 첨가하고 반응온도를 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) 로 낮춘 경우 \( 43.4 \% \) 의 수율로 향상되었다.</p>