황칠나무 잎을 이용한 실험에는 특정 방법으로 추출/분획된 재료가 사용되었으며, 에틸아세테이트 분획을 통해 아글리콘을 제조하였다. 사람 각질형성 세포주인 HaCaT 세포를 사용하였고, 이 세포는 독일 암연구센터(DKFZ)로부터 분양받았다. 또한, 황칠나무 잎 추출물을 다양한 농도로 처리한 HaCaT 세포에 대한 세포 독성을 평가하였다.
<h2>황칠나무 잎의 추출 및 용매 분획</h2> <p>실험에 사용한 황칠나무 잎은 Fig. 1 과 같은 방법으로 추출/분획을 하여 사용하였다. 건조시킨 황칠나무 잎 \( 100 \mathrm { ~g } \) 을 잘게 자른 후 \( 50 \% \) 에탄올 \( 1 \mathrm { ~L } \) 를 이용하여 하루 동안 침적시킨 후 여과하였다. 이 여액을 감압 건조하여 이를 실험에 사용하였다. 또한 \( 50 \% \) 에탄올 추출물은 감압 농축한 후 물과 헥산(n-hexane)을 이용하여 엽록소, 지질 등의 비극성 성분을 제거하였으며, 이후 에틸아세테이트로 3회 반복 처리한 분획을 감압, 농축하여 유기용매를 완전히 제거하였다.</p> <p>에틸아세테이트 분획(Ethyle acetate fraction of \( D \). morbifera leaf, DM EA)으로부터 아글리콘(aglycone) 제조 : 에틸아세테이트분획에서 얻은 시료의 일부는 산 가수분해 반응을 이용해서 당을 제거시킨 후 얻은 아글리콘(aglycone fraction of D. morbifera leaf, DM Agly)을 실험에 사용하였다. 실험 방법은 에틸아세테이트 가용분 일정량에 \( 5 \% \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \) - \( 50 \% \) 아세톤 용액을 넣고, \( 4 \mathrm { ~h } \) 동안 중탕 가열하면서 환류, 냉각시킨다. 환류 시킨 용액을 \( 5 \% \mathrm { KOH } - \mathrm { MeOH } \) 용액으로 중화 적정한다. 중화 적정 후 다시 에틸아세테이트 층을 분획하고 감압, 농축하여 유기용매를 완전히 제거하였고, 이를 실험에 사용하였다.</p> <h2>세포 보호 효과 측정</h2> <p>세포 배양: 사람 각질형성 세포주인 \( \mathrm { HaCaT } \) 세포는 Dr. Fusenig (German Cancer Research Center, DKFZ)로부터 분양받아 사용하였다. 세포배양에 사용된 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)는 10 \% fetal bovine serum (PAA, Austria), 1 \% penicillin-streptomycin (PAA, Austria)을 혼합하여 사용하였고, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건에서 배양하였다.</p> <p>세포 독성 평가: HaCaT 세포를 96 well plate에서 \( 24 \mathrm { ~h } \) 동안 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건으로 항온 배양한 후, 각 농도 별로 황칠나무 잎 추출물을 처리한다. \( 24 \mathrm { ~h } \) 배양한 세포를 \( \mathrm { PBS } \) 로 세척하고 \( \mathrm { MTT } \) 용액 \( (2 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 을 첨가하여 \( 3 \mathrm { ~h } \) 동안 반응시킨 후, 생성된 formazan을 \( \mathrm { DMSO } \) 에 녹여 \( 570 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다.</p>