본 논문에서 Cloning을 위한 형질전환용의 숙주 세포 E. coli JM109를 사용하였으며, 인산가용화 균주로서는 A. hydrophila DA33를 사용했다. E. coli W3110 genome DNA 분리에는 Qiagen의 kit가 사용되었으며, gdh 유전자를 PCR의 방법 GDH1과 GDH2 의 primer 작성하였다. 다음으로 DNA 구조 해석에 있어 plasmid DNA를 분리하여 dideoxy chain termi-nation 방법이 사용되었다. 다음으로 Glucose dehydrogenase 유전자의 인산가용화 세균으로의 도입은 E. coli PulserTM Transformation electroporator를 이용한 standard electroporation 방법으로 진행되었으며, GDH 측정은 전자 수용체 phenazine methosulfate (PMS)와 2,6-dichlorophenol in-dophenol (DCIP)를 통해 이뤄졌다. 또한, A. hydrophila pGHS/DA33의 유기산 gluconic acid 정량 파악, 인산가용화능 측정을 위한 실험이 수행되었다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>균주 및 배양 조건</h2><p>Cloning을 위한 형질전환용의 숙주 세포로서 E. coli JM109를 사용하였다. 인산가용화 균주로서 기존에 보고되어진 A. hydrophila DA33를 사용하였다. 균주 배양은 주로 LB배지(Difco, USA)를 사용하였고, 인산화가용화능 측정을 위해 SM배지(sucrose \( 10 \mathrm{g}\), \(\mathrm{NH}_{4} \mathrm{NO}_{3}\) \(0.27 \mathrm{g}\), \(\mathrm{KCl}\) \(0.2 \mathrm{g} \), \( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \(0.1 \mathrm{g}\), \(\mathrm{MnSO}_{4} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \(1 \mathrm{mg} \), yeast extract \( 0.1 \mathrm{g}) \)를 사용하여, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 200 \mathrm{rpm} \) 으로 진탕 배양하였다. 필요에 따라서 배지 \( 1 \mathrm{ml} \) 당 \( 100 \mu \mathrm{g} \) 의 chloramphenicol 또는 ampicillin을 첨가하여 배양하였다.</p><h2>Genome, plasmid DNA의 분리 및 glucose de-hydrogenase 유전자의 cloning</h2><p>E. coli W3110 genome DNA 분리는 Qiagen의 kit를 사용하여 분리 정제하였다. 배양된 균주를 집균하여 TE buffer \((50 \mathrm{mM}\) EDTA, \( 50 \mathrm{mM} \) \(\mathrm{Tris}\)-\(\mathrm{HCl}\) \(\mathrm{pH} 8.0\)에 현탁하고, 액체질소 또는 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 동결 후 lysozyme 용액 \( 4 \mathrm{ml} \) 을 가한 후 얼음에 45분간 방치한 다음, STEP solution \( (0.5 \% \) SDS, \(50 \mathrm{mM} \) \(\mathrm{Tris}\)-\(\mathrm{HCl}\) \(\mathrm{pH}8.0\), \( 0.4 \mathrm{M} \) EDTA, \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) pro-teinase \( \mathrm{K}) \) 을 \( 8 \mathrm{ml} \) 첨가하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 동안 반응하였다. TE buffer \( 45 \mathrm{ml} \) 와 phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) \( 96 \mathrm{ml} \) 을 가하여 5분간 반전한 후 \( 4,000 \times \mathrm{g} \) 에서 15분간 원심분리한다. 상층액에 \( 3 \mathrm{M} \) sodium acetate \( (\mathrm{pH} 5.2)\) \(9 \mathrm{ml} \)와 에탄올 \( 225 \mathrm{ml} \)를 가하여 혼합 후 유리봉으로 DNA를 감아서 회수하고, \( 80 \% \)에탄올에 세정, 건조한 후 \( 20 \mathrm{ml} \) 의 TE buffer에 용해한다. 다시 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) RNaseA \( 10 \mathrm{ml} \)를 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응한 후, phenol 처리 후 다시 유리봉으로 회수를 반복 실시하여 비교적 높은 순도의 DNA를 정제하였다. Sequencing 및 기타 유전자 재조합 실험을 위한 plasmid DNA 분리는 Promega사의 Wizard miniprep 정제 kit로 분리하여 준비하였다.</p><p>gdh 유전자를 PCR의 방법으로 클로닝 하고자 보고된 E. coli의 gdh 유전자 염기서열을 이용하여 GDH1과 GDH2 의 primer를 다음과 같이 작성하여 사용하였다.</p><p>GDH1: 5'-TAATGAATCGAAATGGTGTCTCTTTATGGC-3'</p><p>GDH2: 5'-ATAAGGCGTTCACGCCGGATCCGGCATGAACAACG-3'</p><p>PCR 반응은 Ex PCR kit를 사용하여 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, 및 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분의 조건으로 30회 반복하였다. 증폭된 단편은 gel extraction kit를 사용하여 정제하였고, pGEM-T Easy vector에 cloning하였다. 얻어진 유전자를 A. hydrophila DA33에 도입하고자 subcloning을 실시하였다. pGEM-T Easy vector에 cloning된 재조합체 pGGT를 EcoRI으로 절단한 후, insert DNA 영역을 gel extraction kit로 정제하여 EcoRI의 제한효소로 절단된 pHSG398에 subcloning 하여 재조합체인 pGHS를 획득하였다.</p><h2>DNA의 1차 구조 해석</h2><p>Cloning된 유전자의 구조적 확인을 위한 DNA 염기배열의 결정은 plasmid DNA를 분리하여 dideoxy chain termi-nation 방법으로 Pharmacia의 A.L.F DNA sequencer로서 수행하였다. 결정된 염기배열로부터 구조적인 특성 및 상동성 해석은 NCBI의 data base와 비교하여 1차 구조분석을 수행하였다.</p><h2>Glucose dehydrogenase 유전자의 인산가용화 세균으로의 도입</h2><p>Glucose dehydrogenase 유전자의 A. hydrophila DA33으로의 도입은 E. coli PulserTM Transformation electroporator를 이용한 standard electroporation 방법을 이용하여 수행하였다. A. hydrophila DA33은 ampicillin에 내성을 가지므로, chloramphenicol 내성 유전자를 가진 pHSG398 vector에 glucose dehydrogenase 유전자를 클로닝하여 획득한 재조합 체인 A. hydrophila pGHS/DA33는 chloramphenicol이 첨가된 LB 고체 배지 상에서 선별되어졌다.</p><h2>Glucose dehydrogenase (GDH)의 측정</h2><p>A. hydrophila pGHS/DA33의 배양액 속의 GDH 측정은 Matsushita 등이 개발한 분광학적인 방법인 전자 수용체 phenazine methosulfate (PMS)와 2,6-dichlorophenol in-dophenol (DCIP)를 이용하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 측정하였다. LB배지에 균을 하룻밤 배양 후, \( 10 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buf-fer \((\mathrm{pH} 7.5)\)에 두 번 씻은 후, glucose 최소배지 (\(1\%\) glucose와 \( 21 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer, \( \mathrm{pH} 6.8)\)에 \( 5 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)가 되게 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), \(160 \mathrm{rpm} \) 으로 수일간 배양하였다. 배양액을 \( 6,000 \mathrm{rpm} \) 에서 5분간 실온에서 원심분리하여 취한 상등액을 조효소로서 사용하였다. 상등액을 반응액 \( (0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer, \( \mathrm{pH} 6.0\), \( 10 \mathrm{mM} \) DCIP, \( 3 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{PMS}\), \(0.1 \mathrm{unit}\) GDH, \(\mathrm{H} 2 \mathrm{O} \) )에 혼합하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C}\), \(600 \mathrm{nm} \) 에서 DCIP의 감소 정도로 배양액 속의 gluconic acid 함량을 측정하였다. A. hydrophila pGHS/DA33로부터 생성된 gluconic acid의 함량은 Pseudomonas sp.로부터 정제된 gluconate de-hydrogenase (GDH) 를 0.1 unit으로 사용하여 측정하였다.</p><h2>A. hydrophila pGHS/DA33의 유기산 gluconic acid 정량</h2><p>Thiamine \( (20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 과 tri-calcium phosphate \( (20 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 를 함유한 GMS배지 \( 50 \mathrm{ml} \) 의 LB배지에 하룻밤 배양한 A. hydrophila pGHS/DA33이 \( 10 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 가 되게 재접종 한 뒤 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), 24 시간 동안 \( 180 \mathrm{rpm} \) 으로 진탕 배양하였다. 배양액을 \( 10,000 \mathrm{rpm} \), 10 분간 실온에서 원심분리한 후, 상등액 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 를 \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) Whatmam membrane filter에 여과시켰다. 여과된 시료를 thermo hypersil \( \mathrm{C}_{18} \) column \((250\times 4.6 \mathrm{mm})\)을 이용하여 high-performance liquid chromatography 분석을 하였다. 고정상은 \( 50 \mathrm{mM} \) sodium phosphate와 \( 5 \mathrm{mM} \) tetra-bu-tyl-ammonium hydrogen sulfate, \( \mathrm{pH} 6.5 \) \((95\%)\)에 acetoni-trile \((5\%)\)를 첨가하여 \( 0.25 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 의 속도로 흡광도 \( 220 \mathrm{nm} \) 에서 분석하였다.</p><h2>인산가용화능 측정</h2><p>\( 300 \mathrm{ml} \) 삼각 flask에 각종 난용성인산염이 \( 0.5 \% \) 첨가된 SM 배지 \( 100 \mathrm{ml} \) 에 전배양한 균주를 접종한 후, \( 160 \mathrm{rpm} \) 으로 필요한 시간동안 연속적으로 진탕배양하면서 배양액을 원심분리하여 얻어낸 상등액 내의 유리인산 농도와 \( \mathrm{pH} \) 변화를 일정시간마다 측정하였다. 균체배양액 \( 1 \mathrm{ml} \)을 \( 13,000 \mathrm{rpm} \) 에서 5분간 실온에서 원심분리 하여 얻어진 상등액을 조효소로서 사용하였다. 원심분리 후 상등액 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 에 멸균수 \( 90 \mu \mathrm{l} \) 을 첨가하여 총 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 가 되도록 희석한 다음, phosphorus re-agent (sigma) \( 900 \mu \mathrm{l} \) 를 혼합하여 15 분간 실온에서 반응하였으며, \( 340 \mathrm{nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p>