실험에서는 각각의 세포의 배양 DMEM 배지를 활용하였으며, 세포배양기에 계대 배양하였다. 세포 생존율 측정은 Carmichael의 방법으로 측정했다. 멜라노마세포(B16F10)의 시료는 농도 별로 조제한 후 24시간 배양하였다. 멜라닌 생성에 연관이 있는 유전자 중 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2, GAPDH의 활성을 보기 위하여 cell line B16F10을 100 mm tissue culture dish에 cell seeding 한 뒤 하루의 시간동안 배양하여 cell을 안정화 하였다.
<h2>세포 배양</h2><p>본 실험에 이용한 각 세포의 배양은 \( 10 \% \) FBS와 \( 1 \% \) penicillin/streptomycin \( (100 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) \) 을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 세포배양기에 적응시켜 계대 배양하였다.</p><h2>3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay에 의한 세포 생존율 측정</h2><p>세포 생존율 측정은 Carmichael의 방법에 따라 측정하였다. 멜라노마세포(B16F10)을 96 well plate에 \( 5 \times 10^{4} \mathrm{cells}/\mathrm{well} \)이 되게 \( 0.18 \mathrm{ml} \) 분주하고, 시료를 농도 별로 조제하여 0.02 \( \mathrm{ml} \) 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24 시간 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 제조한 MTT 용액\( 0.02 \mathrm{ml} \) 를 첨가하여 4 시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO \( 0.15 \mathrm{ml} \) 를 가하여 실온에서 30 분간 반응시킨뒤 ELISA reader로 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율 측정은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p><p>세포 생존율\( (\%)=((\text{대조구의 흡광도}-\text{시료첨가구의 흡광도})/\text{대조구의흡광도}) \times 100 \)</p><h2>Western blot을 통한 단백질의 발현 측정</h2><p>멜라닌 생성에 관여하는 유전자 중 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2, GAPDH의 활성을 확인하기 위하여 cell line B16F10을 \( 100 \mathrm{~mm} \) tissue culture dish에 cell seeding 후 24 시간 동안 배양하여 cell을 안정화 시켰다. 배지를 제거한 후 추출물을 농도별로 처리한 배지로 24~48시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 phosphate buffered saline (PBS)로 2번 세척해주었다. Radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer \( 10 \mathrm{ml} \) 에 complete mini \( 1 \mathrm{tab} \) 를 가한 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 로 용해해서 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) \( 13,200 \mathrm{rpm} \)에서 20 분간 원심 분리하였다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 BCA protein assay kit를 사용하여 정량하여 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 의 단백질을 \( 10 \% \) SDS-PAGE사에서 전기영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 semi dry transfer cell 기기(Hofer, USA)를 이용하여 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane에 옮긴 다음 실온에서 1 시간 blocking buffer (\( 5 \% \) skim milk in TBST)에서 배양시켰다. 1 차 항체를 희석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 over night한 다음, 다시 10 분 간격으로 Tris-buffered saline and tween 20 (TBST)로 3 회 washing하고 2차 항체를 \( 1:1,000 \)으로 희석하여 실온에서 2 시간 배양하였다. 3 회 washing한 후 LAS 4,000 기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량하였다.</p>