효소 활성의 최적 pH는 0.1M sodium acetate buffer (pH 4.0-6.0), 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0-8.0) 및 0.1 M Tris HCl buffer (pH 8.0-10.0)를 사용하여 측정하고, 최적 반응 온도는 20\(^\circ \mathrm{C}\)~80\(^\circ \mathrm{C}\)까지 각 온도에서 2시간 반응시키면서 측정하였다. 또한 효소의 pH 안정성과 온도 안정성은 각각 4시간 방치한 후 잔존 효소 활성을 측정하여 확인하였다.
<h2>최적반응 \( \mathrm{pH} \) 및 \( \mathrm{pH} \) 안정성</h2> <p>효소 활성의 최적 \( \mathrm{pH} \) 를 측정하기 위하여 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium acetate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 4.0-6.0), 0.1 M sodium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} 6.0-8.0 \) ), 0.1 M Tris \( \mathrm{HCl} \) buffer ( \( \mathrm{pH} 8.0-10.0 \) ) 를 키틴분해 활성측정 완충액으로 사용하였다. 최적반응 \( \mathrm{pH} \) 는 조효소액과 정제한 효소액 각각 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 에 \( 10 \mathrm{mM} \) sodium acetate buffer (pH 5.0) \( 450 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가한 후, colloidal chitin을 각 \( \mathrm{pH} \) 의 buffer ( \( \mathrm{pH} 4.0-10.0) \) 에 \( 1 \% \) 농도로 녹여 기질로서 사용하여 측정하였다. 효소의 \( \mathrm{pH} \) 안정성은 조효소액과 정제한 효소액 각각 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 와 \( \mathrm{pH} 4.0-10.0 \) 로 조정한 완충액 \( 450 \mu \mathrm{l} \) 를 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4 시간동안 방치한 후 잔존 효소활성을 측정하였다.</p> <h2>최적반응 온도 및 온도 안정성</h2> <p>효소 활성의 최적반응 온도는 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 각 온도에서 조효소액과 정제한 효소액을 2 시간동안 \( 1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) colloidal chitin (0.1 M sodium acetate buffer, \( \mathrm{pH} 5.0 \) ) 기 질과 반응시켜 측정하였고, 온도 안정성은 조효소액과 정제한 효소액을 최적온도 조건과 동일하게 4 시간동안 반응시킨 후, 잔존효소 활성을 측정하였다.</p> <h2>금속이온의 영향</h2> <p>키틴분해 효소의 활성에 영향을 미치는 금속이온을 조사 하기 위하여 \( \mathrm{CaCl}_{2}, \mathrm{CoCl}_{2}, \mathrm{CuCl}_{2}, \mathrm{FeCl}_{2}, \mathrm{MgCl}_{2}, \mathrm{MnCl}_{2} \), \( \mathrm{ZnCl}_{2} \) 를 사용하여 측정하였다. 정제한 효소 \( 50 \mu 1 \) 와 금속이온 \( 450 \mu \mathrm{l} \) 를 혼합하여 금속이온의 최종 농도가 각각 \( 2 \mathrm{mM} \) 과 \( 10 \mathrm{mM} \) 이 되도록 하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응시켜 잔존효소 활성을 측정하였다.</p> <h2>\( K_{m} \) 및 \( V_{\max } \) 측정</h2> <p>키틴분해 효소의 \( K_{\mathrm{m}} \) 값과 \( V_{\max } \) 값은 기질농도([S])에 따른 반응속도([V])를 측정하고 측정값의 역수를 취해 Lineweaver-Burk plot을 작성하여 결정하였다. 기질은 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium acetate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 5.0)에 \( 0.1-0.4 \% \) (w/v) colloidal chitin 농도로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 60 분간 반응시켜 기질 농도별 효소활성을 측정하였다.</p>