세포 생존률 측정을 위해 멜라노마 세포의 well plate에 cells을 분주한 후 이를 배양하였다. 이후 MTT용액을 첨가하고 배양액을 제거하였으며, DMSO로 반응시킨 후 흡광도를 통해 생존률을 측정하였다. 다음으로 미백 관련 인자들의 활성을 측정하기 위해 B\(16\)F\(10\)을 배양했으며, 각 인자들을 추출해 다시 배양하였다. 그리고 RIPA Buffer을 배양지에 가한 후 원심분리를 하였으며, 이를 통해 얻은 상층액에서 특정 단백질을 분리하고 Imager CAS-\(400\) SM를 통해 마백 관련 단백질의 발현을 측정하였다.
<h2>MTT assay에 의한 세포 생존율 측정</h2> <p>MTT assays는 Carmichael의 방법[17]에 따라 실시하였다. 멜라노마 세포(B16F10) 96 well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well 을 \( 180 \mu \mathrm { l } \) 씩 분주하고, 시료를 농도 별로 조제하여 \( 20 \mu \mathrm { l } \) 첨 가한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 24 시간 배양하였다. 여기에 \( 2.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 농도로 제조한 MTT용액 \( 40 \mu \mathrm { l } \) 를 첨가하 여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO \( 100 \mu \mathrm { l } \) 를 가하여 실온에서 10 분간 반응시킨 뒤 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 측 정은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <h2>Western blot을 통한 단백질의 발현 측정</h2> <p>MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase, ERK, p-ERK, CREB, \( \mathrm { p } \)-CREB 미백 관련 인자들의 활성을 알아보기 위해 cell line B16F10을 100mm tissue culture dish에 cell seeding 후 24 시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 추출물을 농도별 로 처리한 배지로 24-48시간 배양한 후 PBS로 2 회 세척해 주었다. Radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer 10ml 에 complete mini 1 tab 를 가한 \( 100 \mu \mathrm { l } \) 로 용해한 후 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) \( 13,200 \mathrm { rpm } \) 에서 20 분간 원심 분리하였다. 원심 분리하여 얻 은 상층 액은 BCA protein assay kit를 사용하여 정량하였 으며, \( 20 \mu \mathrm { l } \) 의 단백질을 10% SDS-PAGE 상에서 전기영동 하여 분리하였다. 분리된 단백질은 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane에 옮겨 blocking buffer (5% skim milk in TBST)을 제조한 후 실온에서 1 시간 blocking을 실시하였 다. 1 차 항체를 희석하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 over night 후 다시 10 분 간격으로 tris-buffered saline and tween 20 (TBST)로 3 회 세척하고 2 차 항체를 \( 1: 1,000 \) 로 희석하여 실온에서 2시간 반응하였다. 3 회 세척한 후 Davinch-Chemi \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) Imager CAS-400 SM 기기를 사용하여 밴드 확인을 하였다.</p>