L6 근육세포와 RIN-m5F 췌장베타세포는 5\% ~\mathrm{CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C}5% CO2,37\(^\circ \mathrm{C}\) 배양기에서 100\mathrm{Units} / \mathrm{mL}100Units/mL penicilin, 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}100\(\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml}\) streptomycin, 2.5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}2.5\(\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml}\) amphotericin B, 10 \%10% FBS가 함유된 RPMI1640 이나 DMEM 배지 조건에서 배양됐고, 3T3-L1 지방전구세포는 동일한 배양조건의 10 \%10% FCS가 들어간 DMEM 배지 조건에서 배양됐다. 22일마다 모든 세포주는 신선한 배지로 보충하면서 계대배양하여 실험에 사용했다.
<h2>세포배양 및 분화유도</h2> <p>실험에 사용된 모든 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC; USA)으로부터 분양 받았다. RIN-m5F 췌장베타세포와 L6 근육세포는 \( 5 \% ~\mathrm{CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 \( 100 \mathrm{Units} / \mathrm{mL} \) penicilin, \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) streptomycin, \( 2.5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) amphotericin B, \( 10 \% \) FBS가 함유된 RPMI1640 또는 DMEM 배지 조건에서 배양되었고, 3T3-L1 지방전구세포는 동일한 배양조건의 \( 10 \% \) FCS가 함유된 DMEM 배지 조건에서 배양되었다. 모든 세포주는 \( 2 \)일마다 신선한 배지로 보충하면서 계대배양하여 실험에 사용하였다.</p> <p>3T3-L1 지방전구세포를 지방세포로 분화시키기 위하여 6-well plate에 \( 1 \times 10^{5} \mathrm{cells} / \mathrm{well} \)로 분주하고 \( 100 \% \) confluent 상대가 되면 분화유도 물질인 \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) insulin, \( 1 \mu \mathrm{M} \) DEX, \( 0.5 mathrm{mM} \) IBMX와 \( 10 \% \) FBS가 함유된 DMEM 배지로 교환하며 분화를 유도였으며, 2일 후 \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) insulin이 포함된 DMEM (\(10 \% \)~FBS)배지로 교환하였다. 이로부터 2일 간격으로 DMEM \( (10 \% \)~FBS)배지로 보충하면서 4일 후 실험에 이용하였다. L6 근육세포는 \( 10 \% \) FBS가 함유된 DMEM 배지로 배양한 후에 \( 80\)-\( 90 \% \) confluent 상태가 되면 분화유도 하기 위하여 4~5일 동안 \( 2 \% \) FBS 함유 DMEM 배지로 교환한다. 그런 다음에 myotube가 형성되면 실험에 이용하였다.</p> <h2>세포독성</h2> <p>3T3-L1 지방전구세포는 96-well plate에 \( 1 \times 10^{3} \)과 \( 5 \times 10^{3} \mathrm{cells} / \mathrm{well} \)로 분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24시간 배양하였다. 그 다음에 COE 추출물을 첨가하고 다시 24 또는 48시간 배양하였다. RIN-m5F 췌장 베타세포는 96-well plate에 well 당 \( 1 \times 10^{5} \)씩 분주하고 12시간 동안 배양시킨 후 3시간 동안 COE 추출물로 노출시키고 IL-\( 1 \beta \)\((2 \mathrm{ng} / \mathrm{mL}) \)와 IFN-\( \gamma(100 \) \( \mathrm{U} / \mathrm{mL}) \) 물질을 첨가하여 다시 48시간 동안 배양하였다. 실험이 종료되면 MTT \( (1 \mathrm{mg} / \mathrm{mL}) \) 용액을 각 well에 \( 200 \mu \mathrm{L} \)씩 첨가하고 4시간 동안 반응시켰다. MTT 용액을 제거하고 각 well에 DMSO 넣고 10분 후에 \( 540 \mathrm{~nm} \) (Immuno Mini NJ-2300)에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 control 값에 대한 비율로 계산하였다. L6 근육세포는 96-well plate에 \( 5 \times 10^{3} cells/well \)로 분주하고 분화유도 후 \( 0.5 \mu \mathrm{M} \) DEX을 24시간 동안 첨가하였다. 그런 다음 COE추출물을 넣고 24시간 배양시키고 cell counting Kit-8 (Dojindo Laboratory, Kumamoto, Japan) 용액으로 2시간 반응시킨 후 \( 450 \mathrm{~nm} \) (Immuno Mini NJ-2300)에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 control 값에 대한 비율로 계산하였다.</p> <h2>인슐린 함량</h2> <p>RIN-m5F 췌장베타세포를 24-well plate에 \( 2 \times 10^{5} \mathrm{cells} / \mathrm{well} \)로 분주한 후에 IL-\( 1 \beta (2 ng/mL) \), IFN- \( \gamma(100 \mathrm{U} / \mathrm{mL}), COE 추출물을 첨가하고 48시간 동안 반응시킨다. 그런 다음에 세포배양액에 분비된 인슐린 함량은 Rat Inulin ELISA Kit를 이용하여 정량화 한다.</p> <h2>Glucose uptake</h2> <p>3T3-L1 지방세포의 인슐린민감성 향상으로 인한 세포내 포도당 섭취 정도를 측정하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포는 \( 1 \times 10^{4} \mathrm{cells}/\mathrm{well} \) 및 L6 근육세포는 \( 5 \times 10^{3} \mathrm{cells} /\mathrm{well} \)로 black 96-well plate에 분주하고 배양하였다. 분화유도를 시작하는 0일째부터 COE 추출물을 처리한 후 실험이 종료된 시점에 배지를 제거하고 2-NBDG 용엑을 3T3-L1 지방세포에는 \( 150 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \), L6 근육세포에는 \( 80 \mu \mathrm{M} \) 농도로 첨가하였다. 30분 후에 PBS로 2회 세척하고 VICTOR \( 3^{TM} \) Multilabel Counter (PerkinElmer, MA, Boston, USA)의 excitation \( 485 \mathrm{~nm} \), emission \( 535 \mathrm{~nm} \)에서 형광을 측정하여 control 값에 대한 비율로 계산하였다.</p>