배양액 중에 생산된 laccase의 존재유무를 알아보기 위하여 조효소액을 \( 10 \% \) Native-PAGE를 사용하여 비변성 조건에서 전기영동한 후 활성염색법을 수행했다. 멜라닌 탈색 활성은 synthetic melanin (sigma) \( 10 \mu \mathrm{g} \)을 포함하는 \( 50 \mathrm{mM} \) sodium acetate buffer (pH 4.5) \( 0.9 \) ml에 효소 (50 Unit)를 첨가하고 redox mediator로서 \( 10 \mathrm{mM} 1 \) - hydroxybenzotriazole (HBT) 및 syringaldehyde를 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 추가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 동안 반응하였다. 균주 선별은 경상남도 삼림 지역의 토양, 고목 등에서 채취한 100여개의 샘플에 대하여 사람 머리카락 유래 천연 멜라닌을 첨가한 MDB 고체 배지상에서 균사체를 배양하면서 투명환을 형성하는 균주를 선별했다. 그 결과 고목에서 분리한 진균류 1종에서 투명환이 확인됐고, 배양을 시작한 후 23일째에 지름 \( 5.5 \mathrm{~cm} \)의 투명환을 형성하여 30일째에는 지름 \( 8.0 \mathrm{~cm} \)의 투명환이 확인됐고, 멜라닌 탈색 반응은 곰팡이 유래의 laccase, manganese peroxidase, lignin peroxidase에 의해 촉매되는 것으로 알려져 있다.
<h2>활성 염색</h2> <p>배양액 중에 생산된 laccase의 존재유무를 알아보기 위하여 조효소액을 \( 10 \% \) Native-PAGE를 사용하여 비변성 조건에서 전기영동한 후 활성염색법을 수행하였다. 전기영동한 겔은 \( 0.5 \mathrm{M} \) citrate buffer (pH 3.4)에서 30분간 방치한 후 새로운 buffer로 교환하는 과정을 3회 반복하였다. 이후에 전기영동 겔은 \( 0.5 \mathrm{M} \) citrate buffer \( (\mathrm{pH} \) 3.4)에서 조제한 \( 2 \mathrm{mM} \) ABTS 용액과 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분간 반응시켜 생성되는 단백질 band를 확인하였다.</p> <h2>멜라닌 탈색 활성 측정</h2> <p>멜라닌 탈색 활성은 synthetic melanin (sigma) \( 10 \mu \mathrm{g} \)을 포함하는 \( 50 \mathrm{mM} \) sodium acetate buffer (pH 4.5) \( 0.9 \) ml에 효소 (50 Unit)를 첨가하고 redox mediator로서 \( 10 \mathrm{mM} 1 \) - hydroxybenzotriazole (HBT) 및 syringaldehyde를 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 추가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 동안 반응하였다. 멜라닌의 탈색율은 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 다음 공식에 따라 구하였다. 탈색율 \( (\%)=[( \) 개시 흡광도값 \( )-( \) 반응 종결 후 흡광도값)] /(개시 흡광도값 \( ) \times 100 \).</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>균주의 분리 및 동정</h2> <p>경상남도 삼림 지역의 토양, 고목 등에서 채취한 100여개의 샘플에 대하여 사람 머리카락 유래 천연 멜라닌을 첨가한 MDB 고체 배지상에서 균사체를 배양하면서 투명환을 형성하는 균주를 선별하였다. 그 결과 고목에서 분리한 진균류 1종에서 투명환이 확인되었고, 배양을 시작한 후 23일째에 지름 \( 5.5 \mathrm{~cm} \)의 투명환을 형성하여 30일째에는 지름 \( 8.0 \mathrm{~cm} \)의 투명환이 확인되었다(Fig. 1). 투명환을 형성한 균주를 동정하기 위하여 \( 18 \mathrm{~s} \mathrm{rRNA} \)의 염기서열을 분석하고 BLAST program을 이용하여 상동성을 분석한 결과 \( 99 \% \)의 신뢰도로 Peniophora sp. (껍질고약버섯)으로 동정되었고, 다른 종과 염기서열이 일치하지 않는 것으로 판명되어 본 균주를 Peniophora sp. JS17로 명명하였다(Fig. 2A). 18s rRNA 염기서열에 근거하여 Clustal W 프로그램으로 계통도 (phylogenetic tree)를 작성하고 그 결과를 Fig. \( 2 \mathrm{~B} \)에 나타내었다.</p> <h2>배지의 영향</h2> <p>멜라닌 탈색 반응은 곰팡이 유래의 laccase, manganese peroxidase, lignin peroxidase에 의해 촉매되는 것으로 알려져 있다. Peniophora sp. JS17 균사체로부터 멜라닌 탈색에 관여하는 효소를 동정하기 위하여 Table 1에 제</p시한 여러 종류의 복합배지를 사용하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)로 12일간 균사체를 배양한 후 배양 상등액을 대상으로 laccase, manganese peroxidase, lignin peroxidase 활성을 조사하였다. 그 결과 Peniophora sp. JS17의 배양 상등액에서 lignin peroxidase 활성은 보이지 않는 반면, MNM 배지에서는 가장 높은 laccase 활성(19.9 U/ml)을 나타내었고, \( \mathrm{CVM} \) 배지에서는 가장 높은 manganese peroxidase 활성 \( (74 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) \)을 보이는 것으로 나타났다(Table 1).</p>