GST-MIF가 인간 \( \mathrm { MIF } \) 의 L-dopachrome tautomerase 활성에 영향을 미치는 지를 조사한 결과, Bead에 결합된 GST-MIF와 free GST-MIF 모두 흡광도의 감소를 관찰할 수 없었다. \( \mathrm { N } \)-말단에 6개의 아미노산이 결합된 MIF의 oligomer 형성과 L-dopachrome tautomerase 활성 저해가 서로 연관되었는지 확인하기 위해 oligomerization 유무를 확인한 결과, 6개의 아미노산 잔기가 MIF oligomerization에는 전혀 영향을 미치지 않았고 \( \mathrm { P } ^ { 2 } \) 와 기질간의 결합을 막거나 \( \mathrm { P } ^ { 2 } \) 의 catalytic base로서의 역할을 방해하면서 MIF의 tautomerase 활성이 저해되는 것으로 보인다.
<p>GST-MIF의 경우 약 \( 27 \mathrm { kDa } \) 크기의 GST 단백질이 \( \mathrm { N } \)-말단에 존재하므로 정제를 위해 도입한 이 GST가 인간 \( \mathrm { MIF } \) 의 L-dopachrome tautomerase 활성에 영향을 미치는 지를 조사하였다(Fig. 3). Glutathione-Sepharose \( 4 \mathrm { ~B } \) bead를 이용하여 정제한 GST-MIF는 bead에 결합되어 있는 상태로 L-dopachrome tautomerase 활성을 측정하였다. 약 \( 5 \mathrm { nM } \) 의 MIF가 포함된 세포 추출물의 경우 L-dopachrome tautomerase 활성에 따른 흡광도의 감소를 확인할 수 있었으나, GST-MIF는 \( 5 \mathrm { nM } \) 에서 뿐만 아니라 \( 50 \mathrm { nM } \) 농도에서 조차 흡광도의 변화를 관찰할 수 없었다(Fig. 3A). HtrA2의 경우 bead에서 해리 시킨 상태에서 serine protease의 효소활성이 3 배 정도 더 높은 것으로 나타나는 것을 관찰할 수 있다. 그러므로 glutathione으로 GST-MIF를 bead로부터 해리하여 자유로운 상태의 GST-MIF로 L-dopachrome tautomerase 활성을 측정하 였다(Fig. 3B). Bead에 결합되어 있는 GST-MIF의 경우와 마찬가지로 free GST-MIF의 경우 어떤 농도에서도 흡광도의 감소를 관찰할 수 없었다. 그러므로 GST-MIF의 tautomerase 활성 저해는 반응용액에서 단백질의 자유도와는 전혀 상관이 없으며, \( \mathrm { N } \)-말단에 존재하는 GST 단백질이 MIF의 L-dopachrome tautomerase 활성을 저해할 것이라는 가능성을 제시한다.</p> <h2>N-말단에 6개의 아미노산이 결합되어 있는 MIF의 oligomerziation</h2> <p>생리적 조건에서 MIF가 homotrimer를 형성한다는 것은 X-ray crystallography 와 NMR study를 통하여 알려져 있다 \( [14,16,21] \). 이와 더불어 단백질 cross-linking법으로 MIF가 수용액 상태에서 trimer 뿐만 아니라 monomer와 dimer 상태로 존재한다는 것이 알려졌으나, MIF의 oligomerization이 생리적 기능과 어떤 연관성이 있는지는 아직 명확하지 않다 [12]. 따라서 \( \mathrm { N } \)-말단에 결합된 GST나 6 개의 아미노산으로 인한 L-dopachrome tautomerase 활성 저해가 MIF의 oligomer 형성과 서로 연관이 있는지 확인하기 위하여 단백질 cross-linking법을 이용하였다. Cross-linking 반응에는 효소활성이 저해된 \( \mathrm { tMIF } \) 와 대조군으로 tag을 갖고 있지 않는 MIF를 사용 하였다(Fig. 5). 그러나 본 연구에서 사용한 세포 추출물을 단백질의 cross-linking 반응하였을 경우, 대장균 내재성 단백질들로 인해 나타나는 비특이적 밴드들 때문에 분석에 방해가 되었다(data not shown). 이를 극복하기 위하여, anion-exchange chromatography를 이용하여 좀 더 순수한 MIF를 정제하였다(data not shown). 단백질 cross-linking 후 SDSPAGE 분석에 의해 MIF는 약 \( 12.5,25,37.5 \mathrm { kDa } \) 에서 crosslinking 을 수행하지 않은 \( \mathrm { MIF } \) 와는 양상이 다른 특이적인 밴드들이 나타나는 것을 확인하였다. tMIF의 경우도 약 \( 14.5 \), \( 29,43.5 \mathrm { kDa } \) 에서 cross-linking을 수행하지 않은 tMIF에서 나타나지 않았던 특이적인 밴드들을 확인하였다. 각각의 특이적인 밴드들의 분자량은 tMIF의 oligomer와 서로 부합하므로 tMIF도 수용액 상태에서 oligomerization이 일어났다는 것을 보여준다. 이는 6개의 아미노산 잔기가 MIF의 N-말단 에 존재하여도 MIF oligomerization에는 전혀 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 즉 MIF의 tautomerase 효소활성에 결정적인 역할을 하는 \( \mathrm { P } ^ { 2 } \) 와 기질간의 결합을 막거나 \( \mathrm { P } ^ { 2 } \) 의 catalytic base로서의 역할을 방해함으로써 MIF의 tautomerase 활성이 저해되는 것으로 보여 진다.</p>