V.parahaemolyticus CM은 콜라겐 분해효소 \( VppC \)에 항생제 내성 유전자 nptII를 삽입하여 제작된 재조합 DNA를 원 균주 V.parahaemolyticus 04에 전달하여 돌연변이체를 얻었다. MTT assay를 통해 원 균주보다 약 \( 25 \% \) 낮은 흡광도가 나타나고, 이는 세포가 사멸하게 되어 나타난 결과라고 본다. 따라서 콜라겐 분해효소가 병원성 인자일 수도 있다는 가능성을 보이는 것으로 생각할 수 있다.
<h2>돌연변이체 V. parahaemolyticus CM의 세포 독성 조사</h2> <p>\( \mathrm { VppC } \) 의 세포독성 효과를 조사하기 위해 원 균주 \( V \).parahaemolyticus 04와 돌연변이체 \( V \). parahaemolyticus \( \mathrm { CM } \) 를 vero cell에 처리하여 MTT assay를 통하여 독성효과를 관찰한 결과 동일한 세표 농도에서 원균주인 V. parahaemolyticus 04 는 상대적으로 \( V \) parahaemolyticus \( \mathrm { CM } \) 보다 약 \( 25 \% \) 정도 낮은 홉광도를 보였다(Fig. 4). 이러한 낮은 흡광도는 vero cell이 vibrio에 감옘되어 세포들이 궁극적으로 사멸하게 되어 나타난 결과라고 사료된다. 그러므로 원 균주와 비교하여 낮은 흡광도를 보이는 돌연변이체는 vero cell에 대한 약한 세포독성 효과에 기인한 것으로 판단되며, 이는 콜라겐 분해효소가 병원성 인자로서의 가능성을 보이는 것으로 생각할 수 있다. 그러나 보다 자세한 역할은 여러 종류의 세포를 이용한 세포독성 실험과 동물 실험을 통하여 얻어진 결과들을 토대로 하여 결정하여야 할 것으로 사료된다.</p> <h1>요약</h1> <p>장염비브리오균의 숙주내 감염을 일으키는 기작을 이해하기 위하여 세포외호소 중의 하나인 콜라겐분해효소의 유전자가 불활성화된 돌연변이체를 제작하였다. 콜라겐분해효소의 유전자인 \( v p p \mathrm { C } \) 유전자에 항생제 내성 유전자인 nptII를 삽입하여 제작된 재조합 DNA를 suicide vector인 pDMS197에 클로닝하여 \( \mathrm { pVCM } 03 \) 이라 명명하였다. 재조합 suicide 플라스미드 \( \mathrm { pVCM } 03 \) 을 E. coli 7213에 형질전환하여 접합을 통하여 원 균주인 V. parahaemolyticus 04에 전달하였다. 전달된 pVCM03 유래의 재조합 vppC::nptII DNA는 homologous recombination에 의해 wild-type allele와 교환되어 돌연변이체를 형성하게 되고, 돌연변이체는 \( 10 \% \) sucrose가 함유된 TCBS 배지에서 선별되었다. Allele exchange는 \( \mathrm { PCR } \) 에 의한 증폭된 DNA의 크기 비교로 확인하였다. 돌연변이체인 \( V \). parahaemolyticus \( \mathrm { CM } \) 은 원 균주와 비교하였을 때 약 4 배 정도 낮은 콜라겐 분해 활성을 나타내었고, vero cell을 이용한 MTT assay에서도 원 균주에 비하여 낮은 세포독성을 보였다.</p>