탄소원으로 포도당을 사용하여 발효를 통해 48시간에 \( 41 \mathrm{~g/L} \) PCA, 부산물로 DAH \( 15 \mathrm{~g/L} \)을 얻은 뒤, 수용액상에서 PCA를 \( 290^{\circ} \mathrm{C} \) 이상으로 가열하여 \( 90 \% \)이상의 수율로 catechol이 합성을 하는 화이트바이오텍기반 방향족화학원료을 생산하였다.
<h2>화이트바이오텍기반 방향족화학원료의 생산</h2><p>Hydroquinone(Benzene-1,4-diol) 생산: Hydroquinone(HQ)은 필름현상액, anthraquinone 염료, azo 염료, 암모니아 생산에 사용되는 탈황 혼합용매(desulfurization co-solvent), 고무 산화방지제, 아크릴산(acrylic acid) 및 MMA(methyl methacrylate) 모노머(monomer)의 중합억제제(polymerization inhibitor), 코팅 안정제, 가솔린 산화방지제등에 사용된다. 2004년 세계 HQ 수요는 약 4만4000톤 수준이며, 벤젠에서 유래된 페놀의 peroxide oxidation법 또는 1,4-diisoprppylbenzene의 Hock oxidation법에 의해서 생산되고 있다.</p><p>재생가능한 자원으로부터 HQ가 합성되는 경로는 재조합 미생물에 의해 포도당에서 quinic acid(QA)가 생합성되는 과정과 화학적 합성과정에 의해 QA로부터 HQ가 합성되는 2단계 과정을 통해서 진행된다. 먼저 AAA 생합성 대사경로의 공통경로 중간대사체인 3-dehydroquinate(DHQ)를 축적하기 위해서 염색체상 aroD 변이(aroD352)에 기인한 3-dehydroquinate dehydratase 효소 활성이 소실된 균주를 제작하고, DAHP로부터 DHQ 합성을 촉매하는 DHQ synthase 활성을 증가시키기 위해서 aroB를 추가적으로 1 copy 더 염색체상 serA 중간부위에 삽입된 균주를 제작하였다(E. coli QP1.1). 한편, 축적된 DHQ는 Klebsiella pneumoniae 유래의 dehydroquinate dehydrogenase(유전자 qad에 의해 암호화) 촉매에 의해서 QA가 생합성될 수 있다. 또 다른 경로는 대장균 유래의 shikimic acid dehydrogenase가 부반응으로 DHQ를 QA로 환원시키는 활성이 알려져 있는데, Ran과 Frost 등은 aroE 유전자를 plasmid에 cloning하여 QA를 축적시키는 결과를 얻었다. 이 재조합 plasmid에 AAA 생합성경로의 첫단계 생성물인 DAHP로의 탄소흐름을 끌어오기 위해서 tyrosine에 의한 feedback inhibition인 해제된 \( \mathrm{AroF}^{\mathrm{FBR}} \)의 유전자와 serA 유전자를 함께 도입한 벡터 pKD12.138을 제작하고, 이를 E. coli QP1.1에 형질전환하여 QA생산 재조합 대장균을 개발하였다. 탄소원으로 포도당을 사용하여 발효를 통해 48시간에 \( 49 \mathrm{~g/L} \) QA, \( 20 \% \mathrm{~mol/mol} \) 수율을 얻었다. 한편, 최종적으로 QA로부터 HQ를 합성할 수 있는 방법은 암모니아 이온이 제거된 발효액으로부터 sodium hypochlorite(\( \mathrm{NaOCl} \))를 이용한 산화적 탈탄산화법(oxidative decarboxylation), 전기화학적 산화방법, 금속이온을 이용한 chloride-free oxidative decarboxylation 방법이 보고되었는데, 특히, 금속이온 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{Ce}\left(\mathrm{SO}_{4}\right)_{3} \)를 이용한 산화적 탈탄산화 반응을 거쳐 HQ 합성수율 \( 91 \% \)를 얻었다.</p><p>Catechol(pyrocatechol, 1,2-dihydroxybenzene) 생산: Catechol은 농약 및 의약품을 생산하는 중간체로 사용될 뿐만 아니라 향수, 염료, 감광성 소재(photosensitiv meaterial), 전기도금제품(electroplating material), 특수잉크, 산화방지제, 살균제, 광안정제(light stabilizer), 방식제(anticorrosive agent) 및 프로모터(promoter)를 생산하는데 사용된다. 2004년 기준으로 세계 catechol 생산량은 2만5000톤 수준이며, 현재 벤젠에서 유래된 페놀로부터 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 사용하여 hydroxylation시켜 만들어지는 hydroquinone과 catechol의 혼합물에서 증류하여 얻는다.</p><p>미생물학적 catechol 생산방법은 3-dehydroshikimate(DHS)를 생산하는 대장균에 Klebsiella pneumoniae 유래의 각각 3-dehydroshikimate dehydratase와 protocatechuate decarboxylase를 암호화하는 aroZ 및 aroY를 도입하여 미생물에서 생산될 수 있다. 그러나, 세포에 대한 catechol의 강한 독성때문에 직접발효법으로 생산하는 방법은 부적절하여 그 대안으로 배양 과정중에 생합성되는 catechol만을 resin에 흡착/추출하고 세포를 다시 공급하는 in situ resin-based extraction법으로 배양액내 catechol농도를 \( 2.5 \mathrm{~g/L} \) 이하로 낮게 유지하는 방법이 개발되었다. 또 다른 방법은, 발효과정에 중간물질로 축적되는 DHQ 또는 DHS는 세포에 대한 독성이 없으며 protocatechuate(PCA)는 catechol에 비해 상대적으로 독성이 낮은 물질이기 때문에, 미생물에 대한 독성이 없거나 상대적으로 낮은 DHQ, DHS, PCA를 각각 생산하는 재조합 미생물을 개발하고 이를 화학적인 방법을 이용하여 catechol을 합성하는 방법이 보고되었다. 그중에서 catechol 생산 효율이 가장 높은 공법은 PCA 생산경로를 거치는 방법이다. AAA 생합성 공통경로 중간대사체인 DHS를 축적하기 위해서 대장균 염색체상 aroE 변이(aroE353)에 기인한 shikimate dehydrogenase 효소 활성이 소실된 균주를 제작하고(E. coli AB2834), DHQ 합성을 촉진하고 DAHP로부터 탈인산화된 DAP(3-deoxy-D-arabinoheptulosonate)의 생성을 방지하기 위해 aroB를 추가적으로 1 copy 더 염색체상 serA 중간부위에 삽입된 균주를 제작하였다(E. coli KL3). 한편, DHS로부터 PCA의 합성을 촉매하는 3-dehydroshikimate dehydratase 유전자 aroZ, PEP, E4P 및 DAHP pool을 증가시키키 위한 목적으로 유전자 ppsA, tktA 및 \( aroF^{\mathrm{FBR}} \), plasmid의 안정성 부여 및 염색체상 파괴된 serA를 복원하기 위한 목적으로 유전자 serA를 모두 한 plasmid에 cloning하여 벡터 pWL2.46B를 만들고, 이를 E. coli KL3에 형질전환하여 PCA를 생산하는 재조합 대장균을 개발하였다. 그 결과, 탄소원으로 포도당을 사용하여 발효를 통해 48시간에 \( 41 \mathrm{~g/L} \) PCA, 부산물로 DAH \( 15 \mathrm{~g/L} \)을 얻었다. 축적되는 PCA의 독성문제를 해결하기 위해 PCA 추출효율이 높은 AG-1 X8 resin으로 packing된 column을 이용한 resin-based extraction법으로 배양액내 PCA농도를 \( 13 \mathrm{~g/L} \) 이하로 유지하면서 발효할 경우 PCA 농도 \( 71 \mathrm{~g/L} \), 발효수율 \( 49 \% \), DAH \( 16 \mathrm{~g/L} \)의 결과를 얻었다. 최종적으로, 수용액상에서 PCA를 \( 290^{\circ} \mathrm{C} \) 이상으로 가열하면 \( 90 \% \)이상의 수율로 catechol이 합성되었다.</p>