AccuPower Greenstar PCR Premix Ex Taq를 이용해서 BPV 정량을 위한 real-time PCR 조건을 알아보았다. annealing 온도 최적화를 위해 여러 온도에서 real-time PCR을 수행하였고, 최적의 annealing 온도 \( 52 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \) 농도를 달리한 BPV DNA 농도에 따른 crossing point 값을 비교하여 최적의 \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \) 농도값을 찾았다.
<h2>Real-time PCR을 이용한 BPV DNA 정량</h2> <p>BPV의 정량을 위해 일반 PCR을 통해 확립된 PCR 조건을 기초로 AccuPower Greenstar PCR Premix Ex Taq(Bioneer,Korea)을 사용하여 real-time PCR 조건을 확립하였다. BPV 정량을 위해 Corbett Research사(Australia)의 Rotor-Gene 3000 real-time PCR 기계를 사용하였다. PCR 반응액은 AccuPower Greenstar PCR Premix Ex Taq \( 12.5 \mu \mathrm { L } , 10 \)pmol forward primer \( 0.5 \mu \mathrm { L } , 10 \mathrm { pmol } \) reverse primer \( 0.5 \) \( \mu \mathrm { L } \), template \( 2 \mu \mathrm { L } \) 에 멸균된 3차 증류수를 넣어 총 \( 25 \mu \mathrm { L } \) 가 되게 하였다. 핵산증폭은 pre-incubation은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 분, denaturation은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 초, annealing은 20초(annealing 온도 최적화를 위해 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } , 52 ^ {\circ } \mathrm { C } , 54 ^ {\circ } \mathrm { C } , 56 ^ {\circ } \mathrm { C } , 58 ^ {\circ } \mathrm { C } , 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 real-time PCR 수행), extention은 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20 초로 하 여 45 cycle을 수행하였다. 마지막 cycle 후에는 모든 반응물에 대하여 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 부터 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 영역에서 melting curve 분석을 실시하였다. 최적 \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \) 농도를 설정하기 위해 최적화 된 annealing 온도 \( 52 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \) 를 \( 2 \mathrm { mM } \) 에서 \( 5 \mathrm { mM } \) 까지 변화시켜 첨가해준 BPV DNA 농도에 따른 crossing point 값을 비교하였다.</p>