본 논문은 조직 샘플의 면역 염색과 동물의 혈청 및 단백질 분석을 포함하는 일련의 실험 절차를 설명한다. 조직 샘플은 다양한 시약 및 장비를 사용하여 처리되고 면역 염색된다. 동물의 혈청은 혈청 분석기를 사용하여 트리글리세리드, 콜레스테롤 및 LDL 수준을 수집하고 분석한다. 간 조직에서 단백질을 추출하여 SDS-PAGE 전기영동으로 분리한 후 막으로 이동시킨 후 특정 항체를 이용하여 조사한다. 발광의 양은 특정 단백질의 존재와 수준을 결정하기 위해 ECL 키트를 사용하여 측정된다.
<h2>면역염색</h2> <p>랫드에서 적출한 췌장을 \( 10 \% \) formalin용액에 고정한 뒤, 조직처리기(Thermo Shandon Ltd./Thermo Fisher Scientific, England)와 Paraffin Embedding Station (LEICAMICROSYSTEMS NUSSLOCH GMBH, Germany)을 이용하여 블록을 만들어 Rotary Microtome (LEICA MICROSYSTEMS NUSSLOCH GMBH, Germany)을 사용하여 박절하였다. 박절된 조직의 면역염색을 실시하기 위하여 xylene과 ethanol에 담근 뒤, \( 3 \%\ \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)에 10분간 배양한 후 \( 1 \times\) PBS로 세척하였다. \( 10 \% \) BSA에 담궈 10분간 blocking 한 뒤에 인슐린항체 Antibody (#4590, Cell Signaling Technology)와 \(1\%\) BSA를 1:100 농도로 희석한 뒤에 슬라이드에 \(100\ \mu\mathrm{l}\)씩 떨어뜨려 밤새 배양하였다. \( 1 \times\) PBS로 세척한 후에 Polink-2 Plus HRP Detection Kit for Rabbit Primary Antibody (with DAB chromogen) (Golden Bridge International, USA)를 이용하여 염색하고 permounting를 실시한 후 현미경을 이용하여 관찰하였다.</p> <h2>혈청 분석</h2> <p>LP9M80-H이 OLETF 랫드의 혈청에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 혈청내 지질의 농도를 관찰하였다. 랫드를 약 8시간동안 절식하여 \( \mathrm{CO}_{2} \) 가스를 이용하여 안락사한 후 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 상온에서 30분 동안 방치한 후 원심분리하여 혈청을 수확하였으며, 혈청 내 단백질의 변화는 혈청분석기(HITACHI 7080 Automatic Analyzer, Japan)를 이용하여 triglyceride, cholesterol, LDL의 3개 항목에 대하여 분석하였다.</p> <h2>Westem Blot 분석</h2> <p>인슐린 수용체 신호전달과정의 변화를 관찰하기 위하여, 실험동물로부터 간 조직을 추출하여 \( 100 \mathrm{~mg} \)에 PRO-PREP Protein Extraction Solution (iNtRON Biotechnology, 17081)을 첨가하여 분쇄한 후 \( 13,000 \mathrm{~rpm} \) 에서 5분 동안 원심분리하여 단백질을 분리하고, SMARTTM BCA Protein Assay Kit (iNtRON Biotechnology, 21071)을 이용하여 단백질을 정량하여 western blot 분석에 사용하였다. \(4-20\%\) SDS-PAGE gel에 \( 50\ \mu \mathrm{g} \)의 단백질을 전기영동한 후 ECL membrane (Amersham Life Science, RPN2020D)에 전이하고, \(3\%\) skim milk에서 2시간 동안 블로킹하였다. 각 membrane은 Insulin Receptor \( \beta \) (Cellsignaling, 3025s), IRS-1 (Cellsignaling, 3407s), Glut-2 (abcam, ab554460), Glut-3 (abcam, ab15311), Glut-4 (abcam, ab41529)로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 밤새 배양한 후 HRP-conjugated secondary antibody를 첨가하여 ECL Kit (Amersham Life Science, RPN2108)를 이용하여 발광량을 측정하였다.</p> <h2>통계학적 분석</h2> <p>대조군 LETO 랫드와 OLETF 랫드 사이에 통계적 유의성은 one-way ANOVA 분석(SPSS for windows, Release 10.01; SPSS, USA)을 이용하여 실시하였고, OLETF 렛드 내에서 vehicle 처리군과 LP9M80-H 처리군 간의 통계적 유의성은 T-test를 이용하여 실시하였다. 모든 값은 평균\( \pm \mathrm{SD} \)로 제시하였고, 유의성 값은 \( p \times 0.05 \)로 설정하였다.</p>