mouse 시각피질에 melanopsin이 존재하는지 확인하기 위해 마우스 8-12주, 25-30g를 사용하여 5-10분간고정액으로 관류고정하고 두개골을 제거한 뒤 뇌를 꺼내 postfix하였다. 그리고 vibratome을 이용하여 \( 50 \mu \mathrm { m } \) 관상단면으로 잘랐으며, HRP immunocytochemistry, thionin 염색, fluorescence immunocytochemistry를 이용하여 mouse 시각피질의 신경세포 아집단(neuronal subpopulation) 일부에 분포하는지를 확인하였다.
<p>지금까지 mouse 시각피질에서 melanopsin의 존재에 대한연구는 없었다. 시각피질은 망막의 정보가 인식되는 영역이기에 이번 연구에서는 mouse 시각피질에 melanopsin이 존재하는지를 살펴보았다. 또한, melanopsin을 가지는 신경세포가 신경세포의 marker로 중요하게 작용하는 calcium-binding proteins (CBP)과 nitric oxide synthase \( ( \mathrm { NOS } ) \) 를 함께 가지고있는지 알아보면서 melanopsin이 mouse 시각피질의 신경세포 아집단(neuronal subpopulation) 일부에 분포하는지를 확인하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>Perfusion and tissue processing</h2> <p>Mouse (C57BL/6, 8-12주, 25-30 g)는 에테르를 흡입시켜 마취하였다. 각 mouse는 5-10분간 20-30 ml의 고정액으로 관류고정 하였다. 그리고 두개골을 제거한 뒤 뇌를 꺼내어 동일한 고정액으로 하룻밤 동안 postfix하였다. Mouse뇌 시각피질 부위를 vibratome을 이용하여 \( 50 \mu \mathrm { m } \) 관상단면(coronal section)으로 잘랐다. 조직은 자른 순서대로 1~7번 vial에 나누어 담았다. 1~3번 조직은 horse radish peroxide(HRP) immunocytochemistry로 melanopsin-immunoreactive (IR)를 확인하는데 이용하였으며, 4 번째 자른 조직은 thionin 염색을 하여 cortical layer를 확인하는데 이용하였다.5~7번 조직은 fluorescence immunocytochemistry로 melanopsin과 CB, PV, NOS의 double labeling에 이용하였다.</p> <p>모든 실험에서 실험동물사용은 The National Institute of Health guidelines에 따라 진행되었다. 실험동물이 받는 고통 뿐 아니라 실험동물의 수를 최소화 하기 위해 노력하였다.</p> <h2>HRP immunocytochemistry</h2> <p>Melanopsin에 붙는 polyclonal antibody (Abcam, Cambridge, UK를 이용하여 immunocytochemistry를 진행하였다. Immunocytochemistry를 위해 자른 조직을 \( 1 \% \) sodium borohydride \( \left ( \mathrm { NaBH } _ { 4 } \right ) \) 에 넣고 상온의 incubator에 있는 shaker에서 30분간 흔들어 준 후, 조직을 Phosphate-buffer edsaline (PBS, pH 7.2)으로 \( 3 \times 10 \) 분 세척하였다. 그리고 PBS에 \( 4 \% \) normal goat serum, \( 0.5 \% \) Triton X-100를 넣어 준비하고 그 용액에 조직을 옮겨 담아 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) incubator에 있는 shaker에서하룻밤 동안 흔들어 주었다. 그 뒤에 PBS에 primary antiserum (1:500)을 넣고 \( 4 \% \) normal goat serum, 0.5 \% TritonX-100을 넣은 용액에 조직을 넣어 48 시간 동안 \( 4 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) incubator에 있는 shaker로 흔들어주었다. 그 뒤에 PBS로 \( 3 \times 10 \) 분 세척하였다. PBS에 1:200으로 희석한 biotinylated anti-rabbit igG를 넣고 \( 4 \% \) normal goat serum, 0.5 \% Triton X-100 넣었다.이 용액에 조직을 옮겨 담고 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) incubator에서 하룻밤 동안 흔들어 주었다. 그 뒤에 PBS에 1:50으로 희석한 avidin-bio-tinylated horseradish peroxide (Vector Laboratories, Bulingame, CA, USA)에 조직을 넣고 하룻밤 동안 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) incubator에서 흔들어 주었다. 그 뒤에 \( 0.25 \mathrm { M } \) Tris buffer로 \( 3 \times 10 \) 분 세척하였다. 마지막으로 염색된 것을 볼 수 있게 해주는 3'- diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) reagentset (Kirkegaard \& Perry, Gaithersburg, MD, USA)를 이용하였다. DAB와 hydrogen peroxide를 \( 0.25 \mathrm { M } \) Tris buffer에 넣은vial에 조직을 옮겼다. 조직은 1 3분간 염색하였다. 슬라이드에 올리기 전에 \( 0.25 \mathrm { M } \) Tris buffer로 \( 3 \times 10 \) 분 세척하였다. 조직은 super frost plus slides (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)에 올렸다. 조직을 올린 뒤에 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 오븐에서 하룻밤동안 건조시켰다. 알코올에 탈수시킨 뒤 xylene으로 세척하고 Permount (Fisher Scientific)를 떨어뜨린 후 커버 슬라이드를 덮었다. 조직은 Zeiss Axioplan microscope를 이용하여 관찰하고 사진을 찍었다. 사용렌즈는 기본 렌즈 또는 differential interference contrast (DIC) optic를 이용하였다.</p>