ADRB3 유전자 분석을 위해 24명의 연구대상자를 임의로 추출하여 GenBank sequences 기반 11개의 primer를 사용하여 PCR반응을 실행하였다. 그 결과, ADRB3 유전자에서의 단일염기서열 다형성을 확인할 수 있었다. Single base extension에 의한 유전형 분석에는 ABI Prism GeneScan and Genotype 프로그램을 사용하였다.
<h3>ADRB3 유전자의 염기서열분석</h3> <p>ADRB3 유전자에서의 단일염기서열다형성을 확인하기 위하여 연구대상자들 가운데 임의로 24명을 추출하여 ADRB3 유전자 전체에 대한 염기서열 분석을 시행하였으며 이때 \( \mathrm { pro } ^ { - } \) moter 부위 약 \( -1 \mathrm { ~kb } \)가 포함되도록 하였다. 염기서열 분석을 위해 GenBank sequences (Genome sequence: NT_007995 re-leased on 29, Aug. 2006)에 근거하여 고안한 11개의 primer를 사용하였다. 각 primer \( 1.25 \mathrm { pmol } \), genomic DNA \( 30 \mathrm { ng } , 250 \) \( \mu \mathrm { M } \mathrm { dNTPs } \), 그리고 \( 0.15 \) U Taq DNA polymerase 혼합물(Applied Biosystems, Foster City, CA)로 PCR을 하였다. 증폭은 GeneAmp PCR System 9700 thermal cycler (Applied Biosystems)를 사용하여 touch-down 조건으로 수행하였다. Nucleotide sequencing 은 Big Dye Terminator version \( 3.1 \) Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems)와 ABI 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)로 DNA 염기서열을 분석하였으며, 염기서열의 변이는 DNA star software를 사용하여 chromatogram으로 확인하였다. 염기서열분석 결과 exon1의 \( + 188 \mathrm { ~T } >\mathrm { C } \) (Trp64Arg), intron1의 + 1219G \( >\mathrm { T } \), intron2의 \( + 3558 \mathrm { ~A } >\mathrm { T } , + 3893 \mathrm { ~T } >\mathrm { C } \)의 4개의 유전자 변이가 확인되었으나 \( + 188 \mathrm { ~T } >\mathrm { C } \)와 \( + 1219 \mathrm { G } >\mathrm { T } , + 3558 \mathrm { ~A } >\mathrm { T } \)와 \( + 3893 \mathrm { ~T } >\mathrm { C } \)는 밀접하게 연관되어(tightly linked) 있었으므로 최종 분석에는 exon1의 \( + 188 \mathrm { ~T } >\mathrm { C } \)와 intron2의 \( + 3893 \mathrm { ~T } >\mathrm { C } \)를 사용하였다.</p> <h3>Single base extension에 의한 유전형 분석</h3> <p>각 \( \mathrm { PCR } \) primer \( 1.25 \mathrm { pmol } \)과 genomic \( \mathrm { DNA } 20 \mathrm { ng } , 250 \mathrm { mM } \) dNTPs, \( 0.15 \) U Taq DNA polymerase 혼합물(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 \( \mathrm { PCR } \)을 하였다. 증폭은 GeneAmp PCR System 9700 thermal cycler (Applied Biosystem)를 사용하여 touch-down 조건으로 시행하였다. Primer extension 반응을 보기 위해 \( 1 \mathrm { U } \mathrm { SAP } \) (Amersham Life Science)를 PCR 산물에 첨가하여 PCR을 깨끗이 하였다. 이 혼합물은 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1시간동안 배양 후 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 15분간 배양하여 효소를 불활성화 시켰다. Primer extension 반응은 SNaPshot ddNTP primer extension kit (Applied Biosystems)를 사용하여 수행하였다. \( 1 \mathrm { U } \mathrm { SAP } \)를 반응 혼합물에 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1시간, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 15분간 배양하였다. DNA 표본과 extension 산물, 그리고 Genescan \( 120 \mathrm { Liz } \) size-standard 용액을 Hi-Di formamide (Applied Biosystems)에 첨가하였다. 이 혼합물을 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 배양 후 5분간 얼음에 담궜다가 ABI Prism 3100 Genetic Analyzer에서 전기영동하였다. ABI Prism GeneScan and Genotyper (Applied Biosystems) 프로그램을 사용하여 결과를 분석하였다.</p>