바이오센서는 질병 진단, 환경오염 물질 측정, 생물공정분석, 식품품질분석 등의 이용분야가 확대되고 있으며, 다양한 측정방식 및 소재 개발이 활발하게 이루어지고 있다. FRET 현상을 이용한 융합단백질 센서는 생체 내 칼슘 농도 측정 기술로 처음 소개되었으며, 이를 기반으로 생체 내 칼슘신호 전달연구에 활용되고 있다. 감지능을 증가시키는 방법으로 YFP 유전자를 개량하거나 순차치환하는 연구결과가 제시되었다. 이후 본 연구팀은 결합단백질과 형광단백질 사이의 링커를 최적화하고, 이를 통해 측정 농도범위 및 결합물질에 대한 특이성을 개선한 융합단백질 제작이 가능함을 보여주었다.
<h2>모퓰성 기반 단백질공학기술의 새로운 적용</h2> <h3>형광단백질 바이오센서</h3> <p>바이오센서는 질병 진단, 환경오염 물질 측정, 생물공정분석, 식품품질분석 등으로 이용분야가 확대되고 있으며, 다양한 측정방식 및 소재가 활발하게 개발되고 있다. 최근에는 단백질 공학기술을 이용하여 단백질 간 또는 기질-단백질 결합 시 형광을 유발하도록 하는 센서 개발 연구가 주목을 받고 있다. 이는 형광에너자전이(FRET)이 가능한 두 형광단백질들 사이에 결합단백질을 융합시킨 형태의 센서로서, 감지하고자 하는 물질이 융합단백질에 결합하면 구조와 함께 FRET값에 변화가 나타나게 되는 원리를 이용한 것이다. 특히 FRET센서기술은 세포이미지분석을 통하여 생체 내 대사물질의 농도를 분석하여, 살아있는 세포에서 주요 생체물실의 이동 및 생화학적 변화를 추적가능하게 할 수도 있다. FRET 현상을 이용한 융합단백질 센서는, San Diego 대학의 Tsien 그룹에서 1997년 calmodulin 및 이와 상호 작용하는 M13 peptide에 BFP와 GFP를 융합시켜서 세포내 칼슘 농도를 측정하면서부터 시작되었다[32, 45]. 또한, 1997년 Hellinga 그룹에서는 리간드의 결합에 의해 구조가 바뀌는 미생물의 periplasmic-binding proteins(PBPs)의 일종인 MBP에 형광 염료를 결합시켜 생체외부에서 높은 감지 신호를 갖는 센서를 구축하였으며, 다양한 종류의 PBPs에 적용한 사례가 보고되어 있다[11, 30]. 일본의 RIKEN 등에서는 calmodulin이 생체 내 칼슘과 결합하면 특정 펩타이드와 결합력을 갖는 원리와 형광단백질 간 에너지 전이현상을 결합하여 생체 내 칼숨농도를 추적하는 기술을 개발하였으며 세포내 칼슘신호 전달연구에 활용하고 있다[32]. 이러한 연구를 바탕으로 하여, 미생물 세포막간단백질 (PBPs)가 리간드 결합 시, 분자구조에 급속한 변화가 오는 것을 이용하여 형광발색을 유도하는 연구도 추진되어 왔다. 즉, \( \mathrm { FRET } \) 이 가능한 형광단백질을 결합한 경우 다양한 동물세포 내에서 당, 아미노산의 흡수 및 대사과정을 영상화할 수 있었다[15,16,20,21,27,38]. 이 밖에도 세포내 신호 전달에 중요한 역할을 하는 GTP/GDP의 농도변화를 살아있는 세포에서 실시간으로 관찰한 연구[33]와 Clostridium botulinum 의 신경독소 활성을 측정한 연구[13], 세포내 inositol 1,4,5-trisphosphate를 정량적으로 측정한 연구[44] 등에 cameleon과 유사한 형태의 융합단백질들을 이용하여 보다 다양한 물질들을 감지할 목적으로의 기술 발전이 이루어져 왔다. 초기에 개발되었던 상기 융합단백질들은 매우 미약한 수준의 감지 능을 보이는 단점이 있어, 보다 정확하며 정량적 인 축정수단으로의 활용을 위해서는 감지능이 우수한 융합 단백질의 개발이 요구되었다[17]. 이러한 단점을 보완하기 위하여 RIKEN에서는 cameleon의 YFP 유전자를 개량하거나, 순차치환 (circular permutation)하는 방법으로 감지능을 증가시킬 수 있다는 연구결과를 발표하였다[36, 37]. 또한, Stanford 대학에서는 GGBP 또는 GlnBP 등의 유전자에 형광단백질을 삽입시키는 in-frame fusion으로 각 융합단백질들의 감지능을 크게 증가시킬 수 있다는 연구결과를 발표 하였다[12]. 그러나, 융합단백질의 감지능을 증가시킬 목적으로 상기의 방법들을 적용하기 위해서는 유전자 조작에 많은 노력이 소요되며, 구조와 동적 특성이 다른 결합단백질들과 형광단백질들로 구성된 새로운 융합단백질의 제작에는 모든 개발과정이 초기부터 다시 설계되어야 하는 문제점이 있었다. 최근 본 연구팀은 결합단백질과 형광단백질 사이의 링커를 최적화하여 고도의 신호강도를 나타내는 "디자이너 단백질"을 제조한 후, 물질이 결합하는 특정 부위에 이성적 재설계 및 분자진화원리를 도입하는 방법으로, 측정 농도범위 및 결합물질에 대한 특이성을 개선한 융합단백질의 맞춤형 제작이 가능하다는 사실을 보고한 바 있다[22](Fig. 5).</p>