Thermus thermophilus HJ6 균주의 염색체는 추출하여 유래 DNA polymerase의 유전자를 클로닝하여 DNA 단편의 염기서열을 분석하였다. DNA polymerase 유전자는 \( \mathrm { pJLA503 } \) 벡터에 연결하고 \( E \).coli \( \mathrm { DH } 5 \alpha \) 에 형질전환 하여 배양된 균체를 원심분리하여 집균한다. 이렇게 집균된 균체는 초음파로 파쇄되고 \( \mathrm { HiPrep } ^ {\mathrm { TM } } \) Sephacryl S-200 HR 26/60 column를 사용하여 단백질을 용출한다. 이 후 SDS-PAGE를 이용하여 단백질 정제도를, coomassie staining를 이용하여 전기영동 밴드를 확인하였다.
<h2>유전자 클로닝 및 염기서열 분석</h2> <p>Thermus thermophilus HJ6 균주의 염색체는 \( \mathrm { GeneAll } ^ {\mathrm { R } } \) GENEx Genomic kit(GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea)를 이용하여 추출하였다. T. thermophilus HJ6 유래 DNA polymerase(Tod, Top Of DNA polymerase)의 유전자를 클로닝 하기 위하여 게놈 염기서열이 밝혀진 Thermus thermo-philus HB8과 HB27의 DNA polymerase 유전자 염기서열은 바탕으로 각각 개시코돈의 상류와 종결코돈의 하류에 해당하는 두가지 primer(Primer 1: 5'-caggtggccctggagtagcatg- \( 3 ^ {\prime } \), primer 2: 5'-tctaaacggcagggccccccta-3') 를 사용하여 polymerase chain reaction \( ( \mathrm { PCR } ) \) 을 수행하였다. \( \mathrm { PCR } \) 은 \( \mathrm { Pfu } \) DNA polymerase를 사용하여 약 \( 2.5 \mathrm { ~kb } \) 의 DNA 단편을 증폭하였고 \( \mathrm { pGEM } - \mathrm { T } \) 벡터에 클로닝한 후, pGEMTOD라고 명 명하였다. 클로닝 된 DNA 단편의 엽기서열은 ABI Prism 3700 genetic analyzer (Perkin-Elmer Applied Biosystems, USA)를 사용하여 분석하였다.</p> <h2>Tod DNA 중합효소 생산 및 정제</h2> <p>온도 감수성 프로모터(PR, PL)를 포함하는 발현 벡터 pJLA503에 DNA polymerase 유전자를 클로닝하기 위하여 GEMTOD plasmid를 주형으로 Primer 3(5'-ctggag-tcatatggaggcgatgctt-3', 밑줄은 Nde I 부위)과 Primer 4(5'-tggaattcctaacccttggcggaa-3', 밑줄은 Eco RI 부위)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 \( 2.5 \mathrm { ~kb } \) 의 DNA 단편은 \( N d e \) I 과 Eco \( \mathrm { RI } \) 으로 절단한 후 같은 효소로 절단한 \( \mathrm { pJLA503 } \) 벡터에 연결하고 \( E \). coli \( \mathrm { DH } 5 \alpha \) 에 형질전환 하였다. 클로닝된 plasmid를 pJLATOD로 명명하고 E. coli BL21(DE3) codon plus에 다시 형질전환한 후 \( 2 \times \mathrm { YTA } \) 배지(tryptone \( 16 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \), yeast extract \( 10 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } , \mathrm { NaCl } 5 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \), ampicillin 100 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \) 에서 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 20 시간 전배양 하였다. 전배양액의 \( 1 \% \)를 새로운 \( 2 \times \mathrm { YTA } \) 배지에 접종한 후, 흡광도 \( \left ( \mathrm { A } _ { 600 } \right ) \) 가 \( 0.6 \) 이 되었을 때 \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 온도를 올려 5시간 동안 유도배양 하였다. 배양된 균체는 원심분리를 통하여 집균하고 buffer \( \mathrm { A } (50 \) \( \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } , \mathrm { pH } \) 8.0, \( 1 \mathrm { mM } \) dithiothreitol)에 녹인 다음 초음파로 파쇄 하였다. 초음파 파쇄 후 세포추출물은 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 서 20분간 열처리한 후 원심분리 하여 상등액을 회수하였다. 상둥액은 ÄKTAprime(GE Healthcare) 을 이용하여 buffer A 로 평헝화시킨 \( \operatorname { HiTrap } ^ {\mathrm { TM } } \mathrm { Q } \) column(GE Healthcare)에 로딩한 후 \( 0 \sim 1.0 \mathrm { M } \) 의 \( \mathrm { NaCl } \) 로 농도구배를 주어 결합된 단백질을 용출하였다. 용출된 획분은 DNA 중합효소 활성을 측정한 후 할성이 있는 획분을 모아 Amicon(Milipore) filter로 농축한 다음 buffer B \( (50 \mathrm { mM } \) Tris-HCl, pH \( 8.0,150 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { NaCl } , 1 \mathrm { mM } \) dithiothreitol)로 투석하였다. 투석액은 buffer B 로 평형화된 \( \mathrm { HiPrep } ^ {\mathrm { TM } } \) Sephacryl S-200 HR 26/60 column (GE Healthcare)에 로딩하고 buffer B를 이용하여 용출 하였다. 용출된 단백질의 정제도는 SDS-PAGE(10 \% acrylamide gel) 를 봉하여 확인하였고, 전기영동 밴드는 coomassie staining으로 확인하였다.</p>