발효홍어에 존재하는 박테리아 집단의 다양성 확인을 위해 박테리아의 16S rDNA 절편들을 통해 라이브러리를 구축하였다. 이후 염기서열을 결정하였으며, BLAST 분석을 통해 미생물 동정을 진행하였다. 그 결과, uncultured bacterium clone 054E11.b가 \(57.1 \% \) 나타나 발효홍어에서 우점균에 해당된다는 것을 알 수 있었고, 발효홍어 현탁액을 한천배지에 도말하여 형성된 집락을 콜로니 PCR 반응을 진행한 결과, Pseudomonas sp KC-EP-S13 등 12종의 박테리아가 동정된 것을 확인할 수 있었다. 또한, Psychrobacter sp. J466만이 배양 의존적 방법 및 배양 비의존적 방법 양쪽 모두에서 검출되었다.
<h2>배양 비의존적 방법에 의해 발효홍어로부터 동정된 균주들의 계통수 분석</h2> <p>증폭된 PCR 산물의 염기서열을 결정하여 얻은 데이터를 BLAST와 EzTaxon Server version 2.1을 이용하여 균주를 확인하였다.</p> <p>16S rDNA 조각들의 라이브러리로부터 얻은 12종류의 클론들은 그람 음성 박테리아인 Pseudomonas, Stenotrophomonas, Acinetobacter, Azomonas, Azotobacter, Psychrobacter 등 총 6가지의 속과 연관이 깊은 것으로 나타났으며(Fig. 1), 대부분 Pseudomonas 속과 유사한 종으로 보인다.</p> <h2>도말평판법에 의해 형성된 집락 분석</h2> <p>발효홍어(홍어회)에 서식하는 미생물들을 분리하기 위해, 홍어회를 PBS 완충용액을 사용하여 균질화 시켰다. 이 현탁액을 \( 10 ^ { -3 } -10 ^ { -7 } \)배로 LB broth를 이용하여 연속희석을 했다. 희석된 시료들을 그람음성세균을 선별적으로 배양할 수 있는 MacConkey 한천평판배지, 유산균이 선별적으로 생장할 수 있는 MRS 한천평판배지, 그리고 전체 세균들이 생장할 수 있는 PCA 한천평판배지에 각각의 희석 배율에서 2장씩 도말한 후 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 배양기에 36시간 동안 배양하였다.</p> <p>각각의 한천평판배지에서 형성된 집락을 접종 고리로 분리하여, 새로운 한천평판배지로 옮겨 원판을 만들었다. 총 23개의 집락들을 분리하였고, 이들을 대상으로 338F와 518R 프라이머 세트를 이용한 콜로니 PCR 반응을 수행하여 \( 181 \mathrm { bp } \) 크기의 16S rDNA 절편들을 증폭하였다. 증폭된 DNA 절편들을 아가로스 젤에서 전기영동을 한 후 QIAEX II를 사용하여 회수하여 DNA 염기서열을 결정하였다. 23개의 콜로니로부터 증폭된 16S rDNA 절편들을 분석한 결과, 14종류의 염기서열을 얻을 수 있었다. NCBI의 BLAST를 이용하여 상동성을 조사함으로써 홍어회에 서식하는 미생물들을 동정하였다. BLAST에 의해 상동성을 비교한 결과, 동정된 박테리아들은 Pseudomonas sp. KC-EP-S13, Salmonella enterica subsp. Enterica serovar typhimurium str. 14028S, Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Typhi strain SRDF10, uncultured bacterium clone R4J3M4-H2, Psychrobacter sp. HTGH24, uncultured bacterium clone LaYa5a70, uncultured Leuconostoc sp. Clone TKL42, Staphylococcus equorum strain SIP12, Psychrobacter sp. J466, uncultured bacterium clone R2J7M4_E4, uncultured bacterium clone nbw709f07c1, Staphylococcus sp. DHHS4, uncultured bacterium clone OKHOTSK-Bac-B38, uncultured bacterium clone PDTRI1OCT044 등이 밝혀졌으며 이들 결과는 Table 2에 정리되어 있다. 이 결과를 16S rDNA 절편 라이브러리 분석에 의해 얻은 결과와 비교해 보았을 때, 두 가지 실험 방법에서 Psychrobacter sp. J466만이 모두 검출되고 나머지 박테리아들의 균총은 상이하다는 점이 특이하다. 예를 들어, 실험에 사용한 MRS, PCA 그리고 MacConkey 한천평판배지의 \( \mathrm { pH } \) 는 \(6.5-7.1\)로서 홍어회의 \( \mathrm { pH } \)인 \(8.9-9.4\)와 상당히 다르며, 또한 영양소의 조성도 차이가 있으므로 한천평판배지가 홍어회와 다른 생장환경을 제공하였을 것으로 추측된다. 따라서 홍어회에 존재하는 미생물 집단은 16S rDNA 라이브러리 분석 결과가 실제에 근접하게 반영하고 있다고 판단된다. 이들의 상세한 역할은 추후 수행될 연구에 의해 규명될 것으로 예상된다.</p> <h2>발효홍어로부터 도말평판법에 의해 동정된 균주들의 계통수 분석</h2> <p>PCR 산물을 염기서열을 결정하여 얻은 데이터를 BLAST 프로그램과 EzTaxon Server version 2.1을 이용하여 균주를 확인하였다. 배양 의존적 방법에서 분리한 14개의 균주들은 Pseudomonas, Salmonella, Stenotrophomonas, Psychrobacter, Kocuria, Acinetobacter, Staphylococcus, Microbacterium, Delftia, Exiguobacterium, Leuconostoc sp. 등 총 11가지의 속과 연관이 깊은 것으로 나타났다(Fig. 2).</p> <h1>요 약</h1> <p>발효홍어(홍어회)에 존재하는 박테리아 집단의 다양성을 확인하기 위해, 박테리아의 16S rDNA 절편들을 증폭하고 클로닝하여 라이브러리를 구축하였다. 삽입 서열의 염기서열을 결정한 후, BLAST 분석에 의해 미생물 동정을 하였다. 동일한 삽입서열 빈도를 계산하였을 때, 발효홍어(홍어회)에는 uncultured bacterium clone 054E11.b가 \(57.1 \% \) 나타남으로써 우점균으로 존재하고 있다고 추정하였다. 또한 발효홍어(홍어회) 현탁액을 한천배지에 도말하여 형성된 집락을 콜로니 PCR을 수행하였을 때, Pseudomonas sp. KC-EP-S13 등 12종의 박테리아가 동정되었다. 배양 의존적 방법과 배양 비의존적 방법으로 홍어회를 분석하였을 때, Psychrobacter sp. J466만이 두 가지 방법에서 모두 검출되었고 나머지 박테리아들의 균총은 상이하였다.</p>