V. anguillarum의 생육 저해균주를 분리하기 위하여 해산어를 대상으로 장의 다양한 부분, 어체 표면, 지느러미 등에서 가검물을 회수한 후 NSS buffer 와 VNSS broth로 균을 1차 배양, VNSS agar에 paper-disk 방법을 사용, 저해 균주를 재선별하였고 1종의 균주를 분류하여 생화학적 특성을 파악하고 1차 동정을 행한 후에 미생물 자동 동정분석기로 분석, 표준 균주와 분리균주의 생육 저해능 비교는 B. amyloliquefaciens KCTC 1724를 paper-disk 법을 사용하였으며 투명환의 생성여부로 V. anguillarum NCMB의 생육 저해능의 유무를 비교하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>균 분리</h2><p>V. anguillarum의 생육 저해균주를 분리하기 위하여 해산어를 대상으로 장의 여러 부위, 지느러미, 어체 표면 등에서 다양한 가검물을 회수하여 NSS buffer와 VNSS broth로 균을 1차 배양하고, VNSS agar에 paper-disk 방법을 사용하여 V. anguillarum을 저해하는 균주를 다시 선별하였다. 저해를 나타내는 1종의 균주를 선별하여 생화학적 특성을 파악하여 1차 동정을 행한 뒤 정확한 확인을 위해 미생물 자동 동정분석기로(E-10136, Biolog Microstation, Biolog, USA)분석하였다. 분리균의 생화학적 성상은 표준 균주인 Bacillus amyloliquefaciens KCTC1724 균주를 사용하여 비교하였고 생육 저해 대상균주로는 Vibrio anguillarum NCMB1 표준균주를 사용하였다. 분리후 균 배양을 위하여 기본 배지로 peptone을 사용하였다.</p><h2>분리 균의 생육저해물질 생성 확인</h2><p>VNSS 배양배지에 분리 균을 접종하고 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \)에서 18-24시간 배양한 후 원심 분리 \( (3,000 \mathrm{xg} \), 10분)하여 배양 상등액을 준비하고, 균체를 초음파 파쇄기를(Sonifier 250, Branson, USA) 이용하여 파쇄하고 V. anguillarum NCMB1 균주는 nutrient broth에 \( 0.5 \% \)의 \( \mathrm{NaCl} \)을 첨가하고 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \)에서 18-24시간 배양한 다음 다시 nutrient 한천배지에 도말한 후 paper-disk를 놓고 분리 균의 배양 상등액 및 균체 파쇄액을 투여하여 투명환의 생성여부로 생육저해 물질 생성 양성으로 판독하였다. 분리균주와 표준 균주와의 생육 저해능 비교는 분리균주와 표준균주 B. amyloliquefaciens KCTC 1724를 paper-disk 법을 사용하여 투명환의 생성여부로 V. anguillarum NCMB의 생육 저해능의 유무를 비교하였다.</p><h2>생육도 측정 및 생육저해물질 활성측정법</h2><p>V. anguillarum NCMB1균의 배양배지에 분리 균 \( 1 \% \)의 배양액을 접종하여 배양하면서 시간별로 단계적 희석을 하여 분광광도계로 (Shimazu UV-160A, Japan) \( 660 \mathrm{~nm} \)에서 생육도를 측정하고 저해물질의 활성 측정은 colony forming unit (CFU)/\(\mathrm{ml} \)로 하였으며 1 unit의 결정은 \( 50 \% \)의 생육억제를 기준으로 설정하였다.</p><h2>분리 균의 다른 Vibrio 속에 대한 생육 저해능</h2><p>병원균으로 알려진 V. parahaemolyticus, V. anguillarum, V. fluvialis, V. furnissii, V. mimicus, V. vulnificus 등의 Vibrio 속에 대해 분리균주가 저해능을 가지고 있는지를 paper-disk 법을 통하여 확인하였다.</p><h2>분리 균의 최적 생육 및 저해물질 생산조건</h2><p>분리 균의 최적 생육조건 및 저해물질 생산조건 점토를 위하여 기본 배지에, 배양시간, \( \mathrm{pH} \), 온도, 탄소원, 질소원을 사용하였고 금속이온농도는 \( 0 \%\), \(0.05 \%\), \(0.15 \%\), \(0.2 \% \) 등을 달리하여 최적 농도를 비교하였다.</p>