PGA-LM은 hFCs의 세포독성 실험에서 독성이 없는 것으로 나타났는데 PGA-HM도 같은 결과를 보였으며 고분자와 저분자의 \(\Upsilon\)-PGA 역시도 세포독성이 없는 것을 알 수 있으며 본 연구에서 Kanda 등의 보고와 같이 PGA-LM은 염증 cytokine인 IL-1\(\beta\), IL-6, TNF-\(\alpha\)를 만드는 유전자 발현을 억제한다고 생각, TGF-\(\beta\)가 T 세포나 대식세포 등에서 분비되어B 세포의 분화나 IgE 생성을 억제하는데 반하여, 우리가 B세포에서 TGF-\(\beta\)의 유전자 발현을 분석한 것이 그 원인이라 사료, 본 결과에서 대조군에 비해 PGA-LM군에서 IL-1\(\beta\), IL-6, TNF-\(\alpha\), 그리고 TNF-\(\beta\)mRNA 유전자 발현이 억제되었고, IL-10 mRNA 발현은 증가를 나타내었으며 이러한 결과로 PGA-HM과 PGA-LM이 B 세포에서NF-B의 활성조절 기전에 기여하는 것으로 추론된다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>PGA-LM의 in vitro 세포독성</h2> <p>세포독성 물질은 세포의 증식·분화·기능을 저해하며,세포분열을 할 때 염색체 복제 이전 단계에서 염색체의 활성을 방해한다. Sonication 하여 분자량 30 kDa 이하의PGA-LM을 얻은 후 PGA-LM이 정상세포에 미치는 영향을SRB법으로 측정하여 안정성 여부를 관찰하였다. 본 연구에서 사용된 사람섬유아세포(hFCs)는 정상세포로 세포 성장, 분열, 그리고 약물에 대한 반응이 최소한으로 조절되는데, 보편적으로 세포독성 판정에 있어서 기준이 되는 세포로 알려져 있다. 그러나 본 실험에 사용된 NC/Nga 생쥐의 T와 B 세포는 약물에 대한 반응이 세포분열, 사이토카인의 자가분비 및 타가분비 등이 다양하게 나타나 세포독성 측정에 적합하지 않아 보통 hFCs로 대체하여 실험을 한다.PGA-LM이 hFCs에 나타내는 세포독성을 실험하였다.hFCs을 96 well plate 에 5×104 세포로 분주하여 subculture한 후 PGA-LM을 10 mg/mL, 5 mg/mL, 1 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.25 mg/mL 농도로 48시간 동시 배양하였다. 그 후 핵내 단백질인 sulforhodamine B protein량을 측정하는 방법으로 1차 검색방법인 비색법 중 가장 민감하고 안정한 방법으로 알려져 있는 SRB방법으로 세포독성을 실험한 결과,PGA-LM를 처리하지 않은 상태인 대조군의 세포생존율은100.0±5.8(%)로 나타났다. 그리고 PGA-LM를 10 mg/mL, 5mg/mL, 1 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.25 mg/mL 농도로 처리한실험군도 각각 대조군에 비하여 처리한 모든 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다. Fig. 1 에 의하면 오히려PGA-LM 0.25 mg/mL 첨가에서는 약 25%의 세포생존율을증가시키는 것으로 나타났다. 따라서 γ-PGA은 현재도 식이가 가능하여 섭취하고 있는 식품으로 PGA-LM도 안전성이매우 우수할 것으로 사료되었다.Gracials 등의 보고에 의하면 20 kHz로 γ-PGA를 초음파 처리 시 분자량이 1/30 이하로 작아지는 것을 알 수 있다. 이러한 초음파처리 특성원리를 이용하여 본 논문에서는분자량 300 kDa인 PGA-HM을 40 kHz로 1시간 초음파처리하고 밀리포어필터로 여과하여 분자량이 1/10이하 즉, 30kDa 이하 PGA-LM을 얻었다. 이 PGA-LM은 hFCs의 세포독성 실험에서 독성이 없는 것으로 나타났는데 PGA-HM도 같은 결과를 보여, 고분자와 저분자의 γ-PGA 모두 세포독성이 없는 것을 알 수 있었다.</p> <h2>PGA-LM에 의한 아토피피부발진 NC/Nga 생쥐 B 세포의염증 유전자 발현 분석</h2> <p>NC/Nga 생쥐의 B세포에서 IL-1β, IL-6, 그리고 TNF-αmRNA 유전자 발현 분석: 생쥐의 B 세포는 anti-CD40/rmIL-4로 자극하면 전사인자인 NF-κB의 활성화로 IL-1β, IL-6,그리고 TNF-α mRNA의 발현이 증가되고, B 세포의 증식과 분화 및 IgE 생산이 유도되는 것으로 알려져 있다. 아토피피부발진 NC/Nga 생쥐의 비장세포를 anti-CD40/rmIL-4로 자극하여 활성화시킨 후 PGA-LM이 IL-1β, IL-6그리고 TNF-α mRNA 유전자 발현을 억제하는지를 관찰하였다. 결과는 Fig. 2에 B 세포에 anti-CD40/rmIL-4를 처리한 대조군에 대한 PGA-LM 처리군의 상대정량(RQ)값으로나타내었다. Fig. 2와 같이 무처리군(정상군)의 IL-1β, IL-6,그리고 TNF-α mRNA 유전자 발현은 대조군의 RQ값이 1일 때 각각 0.795, 0.109, 0.491 이었고, anti-CD40/rmIL-4와PGA-LM을 동시 배양한 실험군은 대조군의 RQ값이 1일 때IL-1β, IL-6, 그리고 TNF-α mRNA 유전자 발현이 0.715,0.608, 그리고 0.557로 유전자 발현은 현저하게 억제되었고,TNF-α mRNA 유전자 발현은 46% 이상 감소를 나타내었다.그리고 PGA-HM에서도 같은 현상을 보였다. 또한 rmIL-10을 처리하고 anti-CD40/rmIL-4로 자극한 양성대조군(PC)의유전자 발현은 대조군의 RQ값이 1일 때 IL-1β, IL-6, 그리고 TNF-α mRNA 유전자 발현이 0.233, 0.546, 그리고0.375로 IL-1β, IL-6 그리고 TNF-α mRNA 유전자 발현은55~75%이상 현저하게 억제되었다.Kanda 등은 최근 아토피 연구에서 ketoconazole이 사람혈액에서 분리한 B 세포에서 anti-CD40/rmIL-4에 의한IgE 생산과 IgG1 및 IL-1과 IL-6의 생산량을 억제하여 항아토피 효과를 나타내었고, 그 기전이 cAMP signal의 억제에기인한다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서 PGA-LM은Kanda 등의 보고와 같이 염증 cytokine인 IL-1β, IL-6, 그리고 TNF-α를 만드는 유전자 발현을 억제한다고 생각되었다.아토피피부발진 NC/Nga 생쥐의 비장 B 세포에서 IL-10와TGF-β mRNA 유전자발현 분석: 아토피피부발진 NC/Nga 생쥐의 비장 B 세포를 anti-CD40/rmIL-4로 자극하여 활성화시킨 후 PGA-LM이 IL-10과 TGF-β mRNA 유전자 발현에관여하는지를 관찰하였다. 결과는 Fig. 3에 대조군에 대한PGA-LM 처리군의 상대정량(RQ) 값으로 나타내었다. Fig.3과 같이 무처리군(정상군)의 IL-10과 TGF-β mRNA 유전자 발현은 대조군의 RQ값이 1일 때 각각 0.593과 0.816이었고, anti-CD40/rmIL-4와 PGA-LM을 동시 배양한 실험군은 대조군의 RQ값이 1일 때 IL-10과 TGF-β mRNA 유전자 발현이 1.885와 0.798이었고, IL-10 mRNA 유전자 발현은 대조군(RQ)보다 189% 증가를 하였고, TGF-β 유전자 발현은 20%이상 억제되었다. 그리고 PGA-HM에서도 같은 현상을 보였다. 또한 양성대조군인 rmIL-10을 처리하고 anti-CD40/rmIL-4로 자극한 실험군의 유전자 발현은 대조군의RQ값이 1일 때 IL-10 그리고 TGF-β mRNA 유전자 발현이0.815와 0.473으로 대조군에 비하여 모두 억제를 나타내었다. Punnonen 등은 IL-10에 대한 연구에서 사람의 PBMC에서 B 세포를 순수 분리하여 anti-CD40 mAb 와 rIL-4로자극하면 IL-4에 의해 유도되는 IgG4와 IgE가 증가되는데IL-10과 동시 배양하면 거의 억제된다는 것을 확인하고 IL-10이 IgE의 항알레르기 효과를 나타낸다는 것을 보고하였다. Komai-Koma와 Wilkinson에 의하면 TGF-β가 B세포에 anti-CD40 mAb와 rIL-4를 처리하여 배양할 경우 B세포의 분화와 IgE 생성을 억제한다고 보고하였다. 그러나본 연구 결과에서는 B 세포에서 TGF-β의 유전자 발현이PGA-LM 처리군에서 대조군과 차이를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 TGF-β가 T 세포나 대식세포 등에서 분비되어B 세포의 분화나 IgE 생성을 억제하는데 반하여, 우리가 B세포에서 TGF-β의 유전자 발현을 분석한 것이 그 원인이라생각된다.생쥐의 B 세포에 anti-CD40 + IL-4로 자극하면 IgE 생산과B 세포 증식이 일어나고, 또한 신호전달기전인 NK-B와 표면분자인 CD23이 증가하게 된다. Guido 등은 최근연구에서 in vitro에서 vitamin D(1 α,25-dihydroxyvitaminD3)를 처리하여 B 세포의 분화와 IgE 생산을 감소시키는 결과를 얻어 비타민 D가 NF-B의 활성을 억제하는 기전을 보고하였다. 또한 Worm 등은 in vitro에서 사람의 PBMC와 B 세포에 retinoic acid를 처리한 후 anti-CD40 + IL-4로자극하면 IgE 생산이 억제된다는 결과를 발표하였다. 또한Kimata, Kiniwa, Vercelli 등은 B 세포에 anti-CD40 + IL-4의 자극으로 IgE 생산의 억제는 cytokine으로IFN-γ, IL-8, IL-10, IL-12 등을 보고하였다. 그리고 Kang등은 생쥐의 B 세포에 NF-B를 활성화시키는 anti-CD40과 LPS 또는 rHRF를 처리한 후 RT-PCR로 IL-1, IL-2,IL-6, IL-10, TNF-α, 그리고 TGF-β mRNA 유전자 분석을관찰한 결과 IL-1, IL-6, TNF-α, 그리고 TGF-β가 유도되는결과를 얻었다.본 결과에서 대조군에 비해 PGA-LM군에서 Fig. 2와 같이 IL-1β, IL-6, TNF-α, 그리고 Fig. 3과 같이 TNF-βmRNA 유전자 발현이 억제되었고, IL-10 mRNA 발현은 증가를 나타내었다. 그리고 PGA-HM에서도 같은 현상을 보였다. 이러한 결과로 PGA-HM과 PGA-LM이 B 세포에서NF-B의 활성조절 기전에 관여하는 것으로 생각된다.</p>