cerevisiae에서 유도성 발현하는 vector로써는 pCTcon을 arylsulfatase 표면발현 하여 배지에서 48시간 배양한 균체를 원심분리하여 최적의 배양 조건인 YPDG 균체를 두 번 세척하고 균체를 희석하였다. 면역항체염색은 1차 항체로 90분 반응 후 세척하고 2차 항체로 1시간 반응 후에 세척하여서 반응액 효소를 2 분간 반응 후 용액을 첨가시켜 반응을 멈추고, 제조하여 생성된 흡광도 agarose를 \( 0.6 \% \) 농도로 겔을 만든 다음 DNA HindIII marker를 사용하여 DNA 전기영동을 하였다. 유전자를 cloning한 pHCE-AST, GAL1 pro-moter를 가진 pCTcon vector를 사용하여 arylsulfatase 발현을 하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주 및 재조합 plasmid 구축</h2> <p>본 연구에 사용한 arylsulfatase 발현용 S. cerevisiae 균주는 모두 uracil 영양요구성 변이주이며 haploid로 \( S \). undefined pep4::HIS3 prb14l.6R can1 GAL1)을 사용하였다. 또한 plasmid 구축 및 증폭을 위한 E. coli 숙주세포는 DH5을 사용하였다. Arylsulfatase 유전자 공여 plasmid는 P. carageenovora의 arylsulfatase 유전자를 cloning한 pHCE-AST를 사용하였다. 효모 S. cerevisiae에서 arylsulfatase 표면발현 vector는 유도성 발현 vector로써는 GAL1 pro-moter를 가진 pCTcon을 사용하였다. 이 vector는 형질전환효소의 선택표지로 TRP1(phosphoribosyl-anthranilate synthesis) 유전자를 가진다.</p> <h2>PCR primers 제작</h2> <p>P. carageenovora의 arylsulfatase \( (1 \mathrm{~kb}) \) 의 경우 효율적인 발현을 위해서 ast 유전자 부위만 PCR로 증폭하였다. pri-mers의 제작은 5'-AACTGAGAATTCATGAGAAGATGGCT TTCG-3'(sense primer)와 5'-GCCTCGAGGTCGACGTTCTGCCAATCCACTAT-3'(anti-sense primer)로 제작하였다.</p> <h2>Immunofluorescence Microscopy</h2> <p>최적 배양 조건인 YPDG 배지(1\% yeast extract, \( 2 \% \) poly-peptone, \( 1 \% \) dextrose, \( 1 \% \) galactose), \( 20^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{pH} \) 6.0에서 48 시간 배양한 균체를 원심분리(8000 rpm, 10 분) 하여 균체를 phosphate-buffered saline(pH 7.4, PBS)에서 두 번 세척한 후 균체를 PBS에 \( \mathrm{OD}_{600}=20 \) 로 희석하였다. 면역항체염색은 c-myc monoclonal antibody(mAb) 9E10(Covance Inc., USA)를 1 차 항체 \( (1: 500) \) 로 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 90 \) 분 반응 후 세척하고 fluorecein-isothiocyanate(FITC)-labeled anti-mouse \( \operatorname{IgG}(\mathrm{H}+\mathrm{L}) \) (KPL Co., USA)를 2차 항체 \( (1: 100) \) 로 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 1 \) 시간 반응 후 세척하였다. 면역항체 염색한 균체의 형광 분석은 confocal laser scanning microscope(Carl Zeiss, LSM 510 META, Germany)를 이용하였다.</p> <h2>효소 반응</h2> <p>효소반응은 \( 200 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} \) 8.5)에서 수행하였다. 4-nitrophenyl sulfate \( (p \mathrm{NPS}) \) 를 기질로 하였다. 재조합 균주 S. cerevisiae EBY100/pCTAST와 대조구인 S. cerevisiae \( \mathrm{EBY} 100 \) 을 최적 배양 조건인 YPDG 배지, \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 48 \) 시간 배양한 배양액을 원심분리 한 후 얻은 균체로 aryslulfatase 활성을 측정하였다. Arylsulfatase의 효소 활성은 \( p \)-nitrophenyl sulfate \( (p \mathrm{NPS}) \) 로부터 분리된 \( p \)-nitrophenol의 양으로 측정하였다. 반응액 \( 700 \mu \mathrm{L}(200 \mathrm{mM} \) Tris-HCl buffer(pH 8.5) 400 \( \mu \mathrm{L}, 25 \mathrm{mM} p \mathrm{NPS} 200 \mu \mathrm{L} \), 효소 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 포함)를 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 분간 반응 후 \( 5 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} \) 용액을 첨가시켜 반응을 멈추고, 생성된 \( p \)-nitrophenol의 흡광도를 \( 410 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. Arylsulfatase 1.0 unit는 1 분당 \( 1 \mu \mathrm{mol} \) 의 \( p \)-nitrophenol을 생산하는 효소의 양으로 정의하였다.</p> <h2>Agarose의 제조와 DNA 전기영동</h2> <p>한천을 탈황시켜 agarose를 제조하기 위해 YPDG 배지를 사용하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48 시간 배양 후 원심분리로 균체만 모아서 arylsulfatase 조효소액을 얻었다. 0.6% 한천(Junsei, Japan) 용액에 \( 20 \mathrm{unit} / \mathrm{mL} \) arylsulfatase 조효소로 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3 시간 반응 시킨 후 \( 300 \mathrm{~mL} \) 의 acetone으로 침전시키고 3 배양의 증류수로 세척한 다음 동결견조하여 분말상태로 만들었다. 이렇게 제조된 agarose를 0.6% 농도로 겔을 만든 다음, גDNA HindIII marker(Takara Co. Japan)를 사용하여 DNA 전기영동을 하였다. 이때 agar(Junsei Co., Japan)와 시판용 agarose(Cambrex Co., USA)로 0.6% 겔을 만들어 같은 DNA marker로 전기영동하여 DNA 해상도와 이동도의 성능을 비교 - 분석하였다.</p>