Quinone redutase 유도활성은 Prochaska 등의 microtitier method를 일부 변형하여 측정하였고,과정은 먼저 HepG2 세포주를 분주및 배양, 대상 시료배양, cells을 lysis, 효소반응, 정지반응을 거쳐 UV-visible spectrophotometer를이용하여 \( 610 \mathrm { ~nm } \) 에서흡광도를 측정한다. 단백질량은 crystal violet 염색 방법으로 정량한다.
<h2>시료의 추출 및 분획</h2> <p>시료로 사용한 당근 뿌리는 흐르는 물에 깨끗이 씻고, 일정한 크기로 자른 후 그늘에서 건조시킨 후 분쇄하여 \( { -30 } ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 냉동고에 보관하였다. 건조된 뿌리 시료 \( 220 \mathrm { ~g } \)에 methanol을 \( 1.5 \ell \) 넣고 추출◦건조하였다. 잘 건조된 당근 씨앗의 경우 \( 975 \mathrm { ~g } \)에 methanol \( 1.5 \ell \)를 가해 각각 3회씩 추출하여 회전식 진공농축기로 농축한 후 동결 건조하여 methanol 추출물로 사용하였다. Methanol 추출물은 Scheme 1과 같이 n-hexane, methanol, ethylacetate, butanol 및 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 가용부로 각 과정올 거쳐 분배한 후 취하고, 각 분배층은 농축하여 건조시킨 뒤 분말로 만들어 사용하였다.</p> <h2>암세포 배양</h2> <p>인체의 간암 세포주인 HepG2 cell은 주 2회 계대 배양하였다. 배양액은 3차 증류수에 minimum essential medium(MEM medium) 1봉지, \( \mathrm { NaHCO } _ { 3 } \) \( 2.2 \mathrm { ~g } \)을 넣어 용해시키고, pH를 7.0으로 조절하여 전체량을 \( 1 \ell \) 로 하였다. 그리고, \( 1 \% \) Penicillin-streptomycin, \( 10 \% \) fetal bovine serum(FBS)을 첨가한 후 세균 여과기로 여과하여 사용하였다.</p> <h2>Quinone redutase 유도활성 측정</h2> <p>Quinone reductase 유도활성은 Prochaska 등의 microtitier method를 일부 변형하여 측정하였다. 우선 24-well plate의 각 well에 \( 1 \times 10 ^ { 4 } \) \( \mathrm { cells } / \mathrm { m } \ell \) 되도록 HepG2 세포주를 분주하여, 24시간 배양한 후, 대상 시료를 첨가하고 다시 24시간 배양한 다음 배지를 제거하였으며, 무처리구인 대조 세포군(control)이 균일하게 한 켜의 세포로 덮히는 상태에 도달했을 때 각 24 well plate에 \( 250 \mu \ell \)의 lysis buffer(10 \( \mathrm { mM } \) Tris-Cl, pH 8.0, \( 140 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } , 15 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } _ { 2 } , 0.5 \% \) \( \mathrm { NP } -40 \) )을 첨가한 후, \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 온도 하에서 10분간 서서히 흔들어 추면서 cells을 lysis하였다. 여기에 반응액의 최종 농도가 \( 10 \mathrm { mM } \) Tris-Cl(pH 7.4), \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { m \ell } \mathrm { BSA } , 0.008 \% \) Tween-20, \( 40 \mu \mathrm { M } \) FAD, \( 0.8 \mathrm { mM } \) glucose 6-phosphate, 2 \( \mathrm { U } / \mathrm { m } \ell \) glucose 6-phosphate dehydrogenase, \( 25 \mu \mathrm { M } \) NADP, \( 40 \mu \mathrm { g } / \mathrm { m } \ell \) 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)[MTT] 및 \( 1 \mathrm { mM } \) menadione이 되도록 \( 1 \mathrm { ~m } \ell \) 의 효소 용액을 첨가하여, 5분간 반응 시킨 후, \( 250 \mu \ell \) 의 반응 정지용액 \( 10.3 \mathrm { mM } \) dicoumarol, \( 0.5 \% \) pyridine, \( 5 \mathrm { mM } \) potassium phosphate(pH 7.4)으로 효소 반응을 정지시킨 다음, UV-visible spectrophotometer (Pharmacia Biotech 80-2105-20)를 이용하여 \( 610 \mathrm { ~nm } \) 에서 홉 광도를 측정하였다. 단백질량은 동일한 set의 well plate에 대한 crystal violet 엄색 방법으로 정량하였다. Quinone raductase 활성 측정( nmol/min/mg protein)은 다음과 같이 하였다.</p>