다양한 식초(감 식초, 사과 식초, 숙성된 김치 액)에 출현하는 초산균은 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), \(200 \mathrm{rpm} \) 조건에서 72시간 동안 액체 배지에서 배양된 후, 평판 배지에 이식되었다. 다음으로, 양파즙과 발효액의 pH는 Corning Co.의 pH meter를 이용해 측정하였다. 그 후, 알코올 발효를 거친 양파즙은 \( 7,000 \mathrm{rpm}\)에서 20분 동안 원심분리되었고, 상등액은 Sartorius Co. 제조의 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) membrane filter를 이용해 여과되었다. 여과된 액체 \( 1 \mu \mathrm{l}\)은 Hewlett Packard Co. 제조의 GC 장비에 적재되어 absolute ethanol을 기준으로 알코올 함량을 계산하였다.
<h1>실험 재료 및 방법</h1> <h2>사용 균주 및 배지</h2> <p>실험에 사용한 균주는 탁주 생산에 이용되는 시판 중인 효모 Saccharomyces cerevisiae를 구입하여 순화시켜 사용하였다. 사용된 시약은 모두 일급이상의 Sigma사 제품을 사용하였다. 초산균은 시판중인 감 식초와, 사과 식초, 숙성된 김치 액을 초산균 분리용 액체 배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), \(200 \mathrm{rpm} \)에서 72시간 배양하였고, 이 배양액을 분리용 평판 배지에 도말하였다. 그리고 \( \mathrm{CaCO}_{3} \)를 분해하여 clear zone을 형성하는 단일 colony를 1차로 분리하였다. 분리한 균주들을 다시 분리용 액체배지에 배양하여 실험에 사용하였다.</p> <p>효모를 위한 배지는 양파알코올 음료의 제조와 동일한 배지를 사용하였다. 초산균의 분리용 평판 배지의 구성 성분은 \(3\%\) glucose, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 1 \% \mathrm{CaCO}_{3}\), \(3 \% \) ethanol, \( 1.5 \% \) agar이며, 배양용 액체 배지의 구성 성분은 \( 0.5 \% \) glu-cose, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 1.0 \% \) glycerin, \( 0.02 \% ~\mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 5.0 \% \) ethanol, \( 1.0 \% \) acetic acid이다.</p> <h2>양파의 처리, 주모의 제조 및 알코올의 생성</h2> <p>김 등의 방법에 의해 양파를 쵸핑하고, 착즙하여 냄새를 제거하였다. 또한, 주모의 제조와 알코올 생성능력도 김 등의 방법에 준하여 준비하고 관찰하였다.</p> <h2>종초의 제조</h2> <p>초산을 경제적으로 대량 생산하기 위해서는 먼저 고농도의 균체 배양이 필요하므로 적절한 종초의 제조 조건을 결정하는 것이 중요하다. 먼저 양파를 믹서기로 분쇄한 후 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \), 30분간 열처리를 하여 냄새를 제거하고 착즙한 양파즙을 \( 110^{\circ} \mathrm{C}\), 10분간 멸균(EYELA autoclave MAC-601)하여 식혔다. 그리고 알코올 농도를 \( 5 \% \), 초기 산도를 \( 2 \% \)로 조절하였다. 초산균 배양 배지를 이용하여 전배양을 2차례 한 초산균을 양파 배지에 \( 10 \% \) 접종한 후, \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), \(200 \mathrm{rpm}\), 72시간 동안 배양하여 종초로 사용하였다.</p> <h2>균주의 초산 생성 확인</h2> <p>1차로 분리한 초산균의 초산 생성을 확인하기 위하여 초산 생성 실험을 하였다. 초산균 분리용 액체 배지에서 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \), \( 200 \mathrm{rpm}\), 72시간 동안 배양시킨 배양액을 초산균 분리용 고체 배지에 paper disc 법을 이용하여 \( \mathrm{CaCO}_{3} \)를 분해하여 생기는 clear zone의 크기를 확인하였다.</p> <h2>발효 산물의 성분 분석</h2> <p>양파즙 및 발효액의 \(\mathrm{pH}\)를 \(\mathrm{pH}\) meter (Corning Co., USA)로 측정하였다. 알코올 발효된 양파즙을 \( 7,000 \mathrm{rpm}\), 20분간 원심 분리 한 후, 상등액을 membrane filter \( (0.45 \mu \mathrm{m} \), Sartorius Co., Australia)로 여과하여 여과액 \( 1 \mu \mathrm{l}\)를 GC [gas chromatog-raphy (Hewlett Packard Co., USA)]로 loading하였고 stand-ard (absolute ethanol)의 면적과 비교하여 알코올의 양을 계산하였다. 식초의 초산 정량은 \( 0.1 \mathrm{~N} ~\mathrm{NaOH} \) 용액으로 중화 적정하여 초산 함량(\(\%\))으로 환산하였다.</p> <h2>초산 생산 최적 조건 검토</h2> <p>공시균의 초산생성 최적 ethanol의 함량을 조사하기 위하여 종초를 양파즙 배지의 \( 10 \% \)농도로 접종하여 ethanol를 각각 2, 4, 6, \(8\% \)씩 첨가하였다. 각 농도의 ethanol이 포함된 \( 10 \mathrm{ml} \) 배지를 시험관에서 9일 동안 \( 200 \mathrm{rpm} \)에서 진탕 배양하여, 전술한 분석 방법에 따라 \( \mathrm{pH} \), 초산의 변화를 측정하였다.</p> <p>공시균의 초산생성 최적 온도를 조사하기 위하여 종초를 양파즙 배지의 \( 10 \% \) 농도로 접종하여 \( 25, 30, 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 각각 9일 동안 \( 200 \mathrm{rpm} \)으로 진탕 배양하여 전술한 분석 방법에 따라 \( \mathrm{pH} \), 초산의 변화를 측정하였다.</p> <p>공시균의 초산 생성에 필요한 산소 요구성을 파악하기 위하여 종초를 양파즙 배지의 \( 10 \% \) 농도로 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)의 온도에서 150, 200, 250 \(\mathrm{rpm} \)으로 각각 달리하여 최종 액량 10 \( \mathrm{ml} \)이 유지된 시험관내에서 9일 동안 배양하였다. 그리고 배양 용기를 달리하여 공기와의 접촉 면적에 따른 초산 생성의 변화를 관찰하기 위하여 \( \Phi 20 \mathrm{~mm} \) test tube와 \( 50 \mathrm{ml} \) 삼각 flask에 각각 \( 10 \mathrm{ml} \)의 전처리된 양파즙을 넣고 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), 200 \(\mathrm{rpm} \)에서 9일 동안 배양하였다. 전술한 분석 방법에 따라 \( \mathrm{pH} \), 초산의 변화를 각각 측정하였다.</p> <h2>2단계 연속 발효에 의한 식초 생산</h2> <p>2단계 연속 발효를 위해 생양파는 믹서기로 파쇄하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C}\), 30분간 열처리하여 양파의 고유한 냄새를 제거하고 착즙하였다. 착즙한 양파즙에 sucrose(sigma)로 초기 양파즙의 당도가 \( 16^{\circ}\mathrm{brix} \)가 되게 보당하였다. 보당된 양파즙에 미리 제조된 주모를 양파즙 부피 대비 \( 5 \% \)를 접종하여 \( 500 \mathrm{ml} \) 플라스크에 \( 100 \mathrm{ml} \)의 액량으로 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \), 5일간 정치 배양을 실시하였다. 알코올 발효가 끝난 양파주를 \( 8,000 \mathrm{rpm}\), 10분간 원심분리하여 상등액만을 취하여 \( 40 \mu \mathrm{m} \) filter에 통과시켜 찌꺼기를 완전히 제거했다. 여과된 양파주에 초기 알코올 농도를 확인하고, 준비된 종초를 양파주 부피대비 \( 10 \% \)를 접종한 뒤 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), \(200 \mathrm{rpm} \)에서 진탕 배양하며 10일 동안 초산발효를 진행하면서 생산된 초산의 농도, 알코올 함량의 변화 등을 확인하였다.</p>