ADH와 ALDH 및 아미노산 10종, 숙취해소 음료를 준비하고 Bergmeyer's의 방법을 변형하여 ADH 활성을 측정하고 Koivula 및 Koivusalo의 방법을 변형하여 ALDH 활성을 측정하였다. 그리고 ADH와 ALDH 활성 염색을 진행한 후 실험 결과를 one-way ANOVA 검정에 의한 평균치와 표준오차로 표시하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료</h2> <p>알코올 대사에 관련된 효소인 yeast Saccharomyces cerevisiae 유래 ADH 및 ALDH는 Sigma사(Sigma Chemical Co., Saint Louis, Mo., USA)에서, 동결건조 된 S9 rat liver homogenate는 MolTox Co. (North Carolina, USA)에서 구입하였으며, 본 실험에 사용한 아미노산 10종은 Ajinomoto사(Tokyo, Japan) 제품을 구입하여 사용하였다. 숙취해소 음료인 컨디션파워는 C]제일제당(주)에서 구입 한 후 효소 활성의 양성대조구로 사용하였다.</p> <h2>ADH 효소 활성 측정</h2> <p>효모 유래 및 간 조직 유래의 ADH 활성 측정은 Bergmeyer's의 방법을 약간 변형하여 흡광도 \( 340 \mathrm{~nm} \) 에서 NADH의 생성양를 측정하여 대조군에 대한 상대적 활성으로 비교하였다. 즉, 반응액 조성은 증류수 \( 1.4 \mathrm{ml}, 1.0 \mathrm{M} \) Tris-HCl buffer \( (\mathrm{pH} 8.8) \) \( 0.75 \mathrm{ml}, 20 \mathrm{mM} \mathrm{~NAD}{ }^{+} ~0.3 \mathrm{ml} \), ethanol \( 0.3 \mathrm{ml} \), 시료 \( 0.1 \mathrm{ml} \), 효소원 \( 0.15 \mathrm{ml} \) 를 cuvette에 넣고 총 \( 3 \mathrm{ml} \) 이 되도록 조절하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 preincubation 시킨 후 5분 동안 \( 340 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 이때 시료를 첨가하지 않은 것을 대조구로 하여 상대 활성\(\%\)을 나타내었으며, 양성대조구는 시판중인 숙취해소 음료인 Condition-Power를 사용하였다.</p> <h2>ALDH 효소 활성 측정</h2> <p>효모 유래 및 간 조직 유래의 ALDH 활성 측정은 Koivula 및 Koivusalo의 방법을 야간 변형하여 acetaldehyde에서 acetate를 생성하는 효소로 NAD로부터 NADH를 생성하는 원리를 이용하였다. 즉 반응액의 조성은 증류수 \( 2.1 \mathrm{ml}, 1.0 \) M Tris-HCl buffer ( \( \mathrm{pH} \) 8.0) \( 0.3 \mathrm{ml}, 20 \mathrm{mM} \mathrm{~NAD}{ }^{+} ~0.1 \mathrm{ml} \), \( 0.1 \mathrm{~M} \) ~acetaldehyde \( 0.1 \mathrm{ml}, 3.0 \mathrm{~M} \mathrm{~KCl} ~0.1 \mathrm{ml}, 0.33 \mathrm{~M} \) 2-mercaptoethanol \( 0.1 \mathrm{ml} \), 시료 \(~ 0.1 \mathrm{ml} \) 의 혼합액과 효소원 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 를 총 \( 3 \mathrm{ml} \) 이 되도록 조절하여 cuvette에 넣고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 preincubation 한 후, 5분 동안 \( 340 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 이때 시료를 첨가하지 않은 것을 대조구로 하여 상대 활성(\%)으로 나타내었으며, 양성 대조구는 시판되고 있는 숙취해소 음료인 Condition-Power를 사용하였다.</p> <h2>ADH 및 ALDH 활성 염색</h2> <p>ADH 및 ALDH 활성 염색을 위하여 Saccharomyces cerevisiae KCCM 11350 효모 균주를 YPD 배지(yeast extract \( 2 \% \), polypeptone \( 1 \% \) 및 dextrose \( 2 \% \) )에서 전 배양 시켜 활성화시킨 후 YPD 배지에 arginine을 \( 0 \sim 0.1 \% \) 농도로 첨가시켜 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 18시간 본 배양 시켰다. 배양된 효모 균체를 회수한 후 멸균수로 3회 세척한 후 균체만을 회수하여 sonicator에서 세포 파쇄 한 다음 \( 5,000 \mathrm{rpm} \) 에서 20분간 원심분리 하여 상등액을 회수 하였다. 세포 파쇄액의 단백질 농도는 bovine serum albumin을 표준물질로 하여 정량하였다. Native polyacrylamide gel electrophoresis는 Gennady의 방법에 따라 효모 유래의 ADH및 ALDH 단백질을 각각 비변성 \( 7.5 \% \) slab-type polyacrylamide gel을 사용하여 Tris-glycine 완충액 (\( 25 \mathrm{mM} \) Tris, \( 192 \mathrm{mM} \) glycine) 하에서 \( 1.5 \mathrm{~mA} / \mathrm{gel}(\mathrm{cm}) \) 의 정전류를 통하여 행하고, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 전기영동을 하였다. ADH 활성 염색은 \( 0.5 \mathrm{M} \) ethanol, \( 7 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \mathrm{NAD}, 25 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) phenazine methosulfate (PMS), \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) nitro blue tetrazolium chloride (NBTC) 및 \( 60 \mathrm{mM} \) Tris-HCl (\( \mathrm{PH} \) \( 8.6\ \))을 함유한 zymogram staining solution으로 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 반응시켰으며, 이때 활성 band는 blue band로 나타나는 것을 사진촬영 하였다. 이 때 ALDH 활성 염색은 ethanol 대신에 기질로서 \( 0.5 \)\( \mathrm{M} \) acetaldehyde를 사용하고, 나머지 반응은 ADH 활성 염색과 동일하게 하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>실험으로부터 얻어진 결과는 one-way ANOVA 검정에 의한 평균치와 표준오차( \( mean \pm S.E. \) 로 표시하였다.</p>