본 연구는 단삼 에탄올 추출물이 C.albicans 임상균주가 형성하는 바이오필름에 미치는 영향을 관찰하고, 특이적인 유전자의 발현에도 바이오필름이 어떤 영향을 미치는지 분석했다. 연구 결과, 단삼 에탄올 추출물이 초기 단계의 바이오필름 억제에 효과적이었으며, 이를 통해 단삼 추출물이 바이오필름 발달에 영향을 줄 수 있는 것을 확인했다. 또한, 바이오필름 형성에서 중요한 역할을 하는 C. albicans의 표면 부착 과정에도 영향을 미치는지 알아보기 위해 폴리스티렌 표면의 부착 단계를 조사하는 adhesion assay를 수행했다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>항진균 감수성 검사</h2> <p>지난 연구에서 우리는 단삼 에탄올추출물이 C. albicans세포막의 지질성분 변화와 함께 막투과성을 증가시켰으며,동시에 세포벽 성분을 합성하는 (1,3)-β-D-glucan synthase활성을 저해하여 C. albicans의 세포막 기능과 세포벽integrity에 영향을 끼침을 밝혔다[12]. 본 연구에서는 단삼에탄올추출물이 캔디다증 환자로부터 분리한 10개의 C.albicans 임상균주가 형성하는 바이오필름에 미치는 영향을관찰하고, 유전자 서열이 알려진 C. albicans SC5314를 이용하여 바이오필름에 특이적인 유전자의 발현에 미치는 영향을 분석하고자 하였다. CLSI M27-A3의 기준에 따라 MIC를 분석해보니, C. albicans SC5314에 대한 단삼 에탄올추출물의 MIC는 39 μg/ml, 10개 C. albicans 임상균주에 대한MIC는 19.5 μg/ml에서 39 μg/ml의 범위로 이들 모두 단삼추출물에 대해 비슷한 감수성을 나타냈다(Table 1).Reference antifungal로 사용된 amphotericin B의 C.albicans SC5314에 대한 MIC는 0.5 μg/ml이었고, 10 개C. albicans 임상균주에 대한 MIC는 0.25 μg/ml에서 C. albicans 임상글수에 대한 \( \mathrm{MIC} \) 는 \( 0.25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 에서 5 μg/ml의 범위내로 실험에 사용된 C. albicans 균주들의amphotericin B에 대한 감수성 또한 비슷하였다. 더불어 이들 균주는 모두 단삼 에탄올추출물보다 amphotericin B에대해 39배 또는 78배 더 민감하였다(Table 1). 따라서 다음에 이어지는 모든 실험에서는 C. albicans SC5314를 이용하여 단삼 에탄올추출물에 대한 MIC인 39 μg/ml 또는 이의 배수 농도로 처리하여 단삼 에탄올추출물의 효과에 대한 결과를 분석하였다.</p> <h2>초기 단계 C. albicans 바이오필름에 대한 단삼의 효과</h2> <p>C. albicans 바이오필름의 발달은 세 단계로 이루어지는데, 초기 단계(early stage)에서는 주로 효모형과 약간의 균사가 표면에 부착하여 microcolony를 형성한다. 중기 단계(intermediate stage)에서는 비세포성 물질이 증가하여microcolony 주변에 안개같은 필름을 형성한다. 성숙 단계(maturation stage)에서는 세포외기질의 양이 계속 증가하여 C. albicans 집단의 주변을 완벽하게 감싸는 바이오필름을 형성한다. 본 연구에 사용된 단삼 에탄올추출물은 초기 단계의 바이오필름 억제에 대한 효과가 좋았기 때문에 10개의 C. albicans 임상균주가 형성한 초기 단계의 바이오필름을 이용하여 단삼 추출물이 바이오필름 발달에 미치는 영향을 정량하였다. 바이오필름의 정량은 XTT 환원분석법에의하며, 이는 살아있는 세포의 미토콘드리아 효소가tetrazolium salt XTT를 환원시켜 생성한 formazanderivatives의 양을 흡광도(A492)로 측정하는 방법으로서, 바이오필름의 대사 활성(metabolic activity)양을 바이오필름의양으로 간주하였다. 39 μg/ml의 단삼 에탄올추출물에 노출된 바이오필름은 대사율의 감소를 나타내기는 하였으나일부 데이터는 통계적으로 유의하지 않았다. 그러나 78 μg/ml 단삼 에탄올추출물에 노출된 10개 C. albicans임상균주의 바이오필름은 평균 51.3%의 대사율의 감소를 나타냈고 모두 통계적으로 유의하여, 단삼 에탄올추출물이 초기 단계의 바이오필름의 양을 줄이는 데 효과적이라는 것을알 수 있었다.</p> <h2>단삼이 C. albicans의 표면부착에 미치는 영향</h2> <p>C. albicans의 생물학적 또는 비활성 표면으로의 부착은바이오필름 형성에서 필수적인 단계이다. 단삼 에탄올추출물이 C. albicans의 폴리스티렌 표면부착 단계에 대한 영향을 adhesion assay로 분석하였다. C. albicans는 배지의 종류나 pH에 따라 효모형, 균사형 또는 바이오필름의 형태를적절하게 선택하는 개체인데, YNB/glucose 배지에서 C.albicans는 두꺼운 바이오필름 구조를 형성하기 보다는adhesion을 선호한다[19]. C. albicans SC5314 세포를 단삼에탄올추출물이 포함된 YNB/glucose 배지에 3시간 노출시킨 후, 폴리스티렌 표면에 부착된 세포를 위상차 현미경으로관찰하였다. 대조군에 비해 39 μg/ml (Figs. 1B and 1E) 또는 78 μg/ml (Figs. 1C and 1F)의 단삼 에탄올추출물을 처리한 실험군에서는 바닥에 부착된 C. albicans 세포의 양이 현저하게 감소하였다. YNB/glucose 배지에서 C. albicans는 주로 효모형을 나타내는데, 흥미롭게도 단삼 에탄올추출물을 처리한 실험군에서는 오히려 균사 형성이 촉진되는 것을 관찰할 수 있었다.</p>