24시간 동안 \( \mathrm{PM}_{2.5} \)처리 농도를 달리한 배지에서 배양 된 각막상피세포를 CCK-8 assay kit로 평가한 결과, 농도의 증가에 따라 세포 내 침착과 단편화된 PARP의 발현이 증가하였고 세포막 붕괴 및 응집의 형태학적 변화를 통해 \( \mathrm{PM}_{2.5} \)에 대한 세포독성은 세포사멸 유도와 관련이 밀접함을 확인 할수 있다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>각막 상피세포의 분리 및 \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 에 대한 세포독성 평가</h2> <p>쥐의 눈에서 각막 상피세포를 분리하기 위하여 제거된 각막이식편을 세포배양 plate에 부착하고 각막 상피를 분리하여 배양하였다. 초기 계대(\(<\)passage 5) 세포 집단에서는 섬유아세포(fibroblasts)가 일부 관찰되었으며, 이는 크고 작은 편평세포(squamous cells)의 이질적인 집단이었다. 그 후, 5 번째와 10 번째 계대 사이에서는 선행 결과와 유사하게 사람 및 쥐에서 얻은 안정적인 일차 각막 상피 세포주와 유사한 형태(topical cobblestone morphology)를 가진 균일한 작은 세포가 관찰되었다. 그러나 계대 수가 15 이상인 세포에서는 노화가 진행된 듯한 형태학적 변화를 보여 추후 모든 실험에서는 5 에서 10 사이의 계대번호를 가진 안정한 세포를 사용하였다. 배양된 각막 상피세포가 각막에서 유래한 상피세포의 특성을 가지고 있는지 확인하기 위해 pan-CK 항체를 사용하여 염색을 하였다. Fig. 1A에 나타낸 바와 같이, 각막 상피세포에 대한 양성 마커인 pan-CK가 세포질 전체에 걸쳐 광범위하게 발현되어 본 연구에 분리 배양한 세포가 각막에서 유래되었음을 알 수 의미한다.</p> <p>1 차 배양 각막 상피세포에 대한 \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 의 세포독성은 24시간 동안 다양한 농도의 \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 가 함유된 배지에서 배양 된 세포를 대상으로 CCK-8 assay kit를 사용하여 평가하였다. Fig. 1B에서 알 수 있듯이 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 농도에서는 유의적인 세포독성이 관찰되지 않았지만, \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 이상의 농도에서는 처리 농도의 증가에 따라 각막 상피세포의 생존율이 유의적으로 감소하였다. 또한 형태적 변화의 관찰에서, 미세먼지가 각막에 침투하여 각막 상피세포에 손상을 일으킨다는 선행 보고[28]와 잘 일치되게 \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 처리 농도의 증가에 따라 세포 내 \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 의 침착이 증가하였고, 세포막 붕괴 및 응집을 포함한 형태학적 변화가 나타났다 (Fig. 1C). \( \mathrm{PM}_{25} \) 처리에 따른 세포 생존율의 감소가 세포사멸과 연관성이 있는지를 조사하기 위하여 세포사멸이 유발된 세포에서 관찰되는 PARP의 단편화 여부를 조사하였다. Fig. 1D에 제시한 결과에 의하면, \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 의 처리 농도 증가에 따라 단편화된 PARP (c-PARP)의 발현이 증가하여, 각막 상피세포에서 \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 에 의한 세포독성은 세포사멸 유도와 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다. 한편, 전형적인 세포사멸 유도 과정은 caspase-cascade의 활성 의존적이며, 이 경로에 의해 최종적으로 활성화된 caspase-3은 PARP를 포함한 세포 생존에 필수적인 기질 단백질들을 분해하여 세포사멸을 종결한다. 본 연구에서 사용한 \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 와는 다른 종류의 미세먼지가 처리된 각막 상피세포에의 세포사멸 유도에 이 경로가 활성화되었다는 선행 보고를 고려할 경우, 본 연구의 결과는 \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 처리에 의한 각막 상피세포의 세포사멸은 caspase 활성 의존적으로 유발 될 수 있음을 의미하며, 1 차 배양 각막 상피세포에서도 재현되었음을 시사한다.</p>