다른 parvovirus 종류와 DNA 바이러스인 bovine herpesvirus를 실험 대상으로 한 특이성 실험에서, BPV만이 fluorescence값의 증가를 관찰할 수 있었으며, 다른 바이러스들에서는 fluorescence값의 증가를 관찰할 수 없었습니다. 이로부터 확립된 real-time PCR 방법이 BPV에 특이적인 실험법임이 확인되었습니다.
<p>다른 parvovirus 과 바이러스들(minute virus of mice, human parvovirus \( \mathrm { B } 19 \), porcine parvovirus) 과 DNA 바이러스인 bovine herpesvirus를 대상으로 특이성을 실험할 결과 BPV의 경우에만 fluorescence값의 증가를 관찰할 수 있었고, 다른 바이러스에서는 완충용액 음성 대조군과 같이 fluorescence값의 증가를 관찰할 수 없었다. Real-time PCR 산물을 \( 1.5 \% \) agarose gel 상에서 분석한 결과 BPV 양성 대조군에서만 PCR 반응 산물이 생성되었고, 다른 바이러스와 완충용액 음성 대조군에서는 PCR 반응 산물이 생성되지 않았다. 이와 같은 결과에서 확립된real-time PCR 방법은 BPV에 특이적인 실험법임을 확인후 였다.</p> <h2>CHO 세포주에서 real-time PCR을 이용한 BPV 검출</h2> <p>확립된 real-time PCR을 생물의약품 제조공정에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BPV를 오염시킨 CHO 세포주에서 BPV 검출 시험을 실시하였다. T-25 flask에 배양된 CHO DG44 세포에 BPV를 인위적으로 오염시킨 후 T-25 flask에 3번 이상 계대 배양하면서 병변효과를 관찰하였다. BPV는 CHO DG44 세포주에서 병변효과를 나타나지 않았다. 세포배양 상청액 \( 4 \mathrm { ~mL } \) 을 회수하고, CHO DG44 세포를 trypsin을 처리하여 \( 4 \mathrm { ~mL } \) 부피로 회수하였다. 세포배양 상청액과 CHO 세포에서 각각 DNA를 추출하고, 확립된 real-time PCR을 활용하여 BPV를 정량 검출하였다. 세포배양액에서는 \( 1.0 \times 10 ^ { 0 } \mathrm { TCID } _ { 50 } \) equivalent \( / \mathrm { mL } \) BPV가 검출되었고, 세포에서는 \( 2.4 \times 10 ^ { 1 } \) \( \mathrm { TCID } _ { 50 } \) equivalent \( / \mathrm { mL } \) BPV가 검출되었다. 중폭된 PCR 산물을 \( 1.5 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) agarose gel을 사용하여 전기 영동한 결과 각 BPV 양성시료, 세포배양액, 세포에서 예상 크기의 밴드를 확인할 수 있었지만, 음성 대조군에서는 PCR 산물을 확인할 수 없었다.</p> <h2>소유래 콜라겐에서 real-time PCR을 이용한 BPV 검출</h2> <p>확립된 real-time PCR을 소유래 콜라겐 제조공정에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BPV를 오염시킨 콜라겐에서 BPV 검출시험을 실시하였다. Titer가 \( 1.3 \times 10 ^ { 4 } \) \( \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \) 인 BPV를 순차적으로 10 배씩 희석한 후 각 희석액 \( 0.2 \mathrm { ~mL } \) 을 소유래 콜라겐 \( 1.8 \mathrm { ~mL } \) 에 spiking 한 다음 확립된 real-time PCR 방법을 사용하여 BPV를 검출하였다. 각 시료에 대해 real-time PCR cycle 수에 따른 fluorescence값의 증가를 관찰한 결과 \( 1.3 \times 10 ^ { 0 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \) 까지 정량적으로 검출할 수 있었다.</p>