강원도 각 지역에서 전통방식으로 제조한 장류를 수집하여 미생물을 분리하고, 혈전용해 효소(fibrinolytic enzyme) 활성이 있는 균주를 선발하여 전통장류 산업의 경쟁력 강화를 위한 연구를 수행하였다. 수집한 장류 시료로부터 단일집락을 형성하는 균주를 1차 선발하여 Astrup과 Mullerttz의 방법으로 효모 균주의 혈전분해 효소 활성을 측정하였고, plasmin을 양성 대조구로, S. cerevisiae BY4742을 음성대조구로 사용하여 각 균주가 나타내는 혈전용해 활성을 plasmin이 나타내는 혈전용해 활성의 상대활성으로 정의하였다.
<p>본 연구에서는 전통장류의 발효과정에 관여하는 효모를 분리하기 위해서 강원도 각 지역에서 전통방식으로 제조한 장류를 수집하여 미생물을 분리하였고, 분리된 효모 균주 중 혈전용해 효소(fibrinolytic enzyme) 활성이 있는 균주를 선발하였다. 강원도에서 생산되는 전통장류의 발효과정에서 유용한 효소생산에 관여하는 미생물을 선발·동정하여 추후 전통장류 산업의 경쟁력 강화를 위한 기초자료를 제공하고자 본 연구를 수행하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 분리원</h2> <p>본 연구에 사용된 전통장류는 강원도에서 전통적인 방법으로 제조되어 판매되고 있는 된장 10점, 고추장 5점, 막장 5점, 간장 5점, 그리고 청국장 5점 등 총 30점을 수집하여 사용하였다.</p> <h2>균주분리</h2> <p>생리식염수 \( 90 \mathrm { ~ml } \)에 수집한 장류 시료 \( 10 \mathrm { ~g } \)을 넣어 교반기(hb-201SF, Hanbaek Scientific, Korea)로 10시간 진탕한 후 정치시키고 상등액 \( 100 ~ \mu \mathrm { l } \) 를 chloramphenicol \( (100 ~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \)이 첨가된 YEPD ( \( 1 \%~( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) yeast extract, \( 2 \%~( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) peptone, \( 2 \%~( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) glucose) 고체배지에 도말하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 48시간 배양한 후 단일집락을 형성하는 균주를 1차 선발하였다.</p> <h2>혈전용해 활성 측정</h2> <p>효모 균주의 혈전분해 효소 활성은 Astrup과 Mullerttz의 방법을 변형하여 측정하였다. Fibrinogen을 최종농도가 \( 0.3 \%~( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \)가 되도록 PBS 완충액 \( (0.1 \mathrm { ~M } , \mathrm { pH } ~7.4) \)에 용해시켜 평판에 부은 후 \( 1.5 \%~( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) agarose 용액을 동량 첨가하여 혼합하였고 여기에 thrombin (20 U, Sigma-Aldrich, USA)을 \( 100 ~ \mu \mathrm { l } \) 첨가하여 상온에서 정치한 후 균주 배양액 \( 20~ \mu \mathrm { l } \)를 분주하여 paper disk 방법으로 활성을 측정하였다. 단백질은 Bradford protein assay plus kit (GenDEPOT, USA)을 이용하여 정량하였으며, 양성 대조구로는 plasmin ( \( 2 ~ \mathrm { U } / \mathrm { mg } \) protein, Sigma-Aldrich)을 사용하였고, 혈전분해 활성이 없는 S. cerevisiae BY4742 균주 배양액을 음성대조구로 각각 \( 20 ~ \mu \mathrm { l } \) 를 분주하여 사용하였다. 각 균주가 나타내는 혈전용해 활성은 아래 식과 같이 plasmin이 나타내는 혈전용해 활성의 상대활성으로 정의하였다. \[ \text { 혈전용해 활성 } ( \%) = \frac {\text { 시료에 의한 용해영역 } ( \mathrm { mm } ) } {\text { Plasmin에 의한 용해영역 } ( \mathrm { mm } ) } \times 100 \]</p>