PYS 배지를 기본으로 사용하여 알긴산 분해효소의 활성을 측정하였다. 이는 알긴산 농도, 질소원, yeast extract 첨가 유무, \( \mathrm{NaCl} \) 농도\( (0 \sim 3 \%) \), 배양 온도\( \left(20 \sim 40^{\circ} \mathrm{C}\right) \), 배양 시간 등의 조건에 따라 변화되었다. DNS법을 이용해 흡광도를 측정하였고, 이를 통해 효소활성을 분석하였다.
<h2>분리 균주의 알긴산 분해능 측정</h2> <p>알긴산 분해효소 활성이 확인된 분리 균주를 PYS 배지에 접종하여 진탕배양하면서 \( \left(25^{\circ} \mathrm{C}, 150 \mathrm{rpm}\right) \) 배양액의 원심분리 \( \left(14,000 \times g, 4^{\circ} \mathrm{C}, 5 \mathrm{min}\right) \) 상층액으로 제조한 조효소액이 나타내는 환원당 생성능을 시간별로 측정하여 분석하였다. 효소반응 산물인 환원당 측정에는 DNS법을 이용하였다. Sodium alginate \( (0.8 \%, \mathrm{w} / \mathrm{v}) \)가 포함된 기질용액 \( 1.0 \mathrm{mL} \)에 조효소액 \( 500 \mu \mathrm{L} \)를 혼합한 후 30분 동안 항온조에서(150 \( \left.\mathrm{rpm}, 25^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 반응 시킨 후 반응액을 원심분리 \( \left(14,000 \times g, 4^{\circ} \mathrm{C}\right. \), \( 5 \mathrm{min} \) )하였다. 원심 분리된 상층액 \( 500 \mu \mathrm{L} \)에 DNS용액 \(2 \mathrm{mL} \)을 가한 후 10분간 가열하였고 \( 540 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. Mannuronic acid를 이용하여 작성한 표준 검량선을 이용하여 생성된 환원당을 정량하였으며 환원당 생성능을 알긴산 분해효소 활성과 비례하는 것으로 간주하였다. 효소 1unit는 1분에 \( 1 \mu \mathrm{mole} \)의 환원당을 생산하는 효소량으로 정의하였고, 각 실험조건에서 최대 활성을 보인 것을 \( 100 \% \)로 간주하고 다른 것들을 백분율로 비교하는 상대 활성으로 나타내었다.</p> <h2>배양조건별 균주의 성장 및 알긴산 분해효소 활성 측정</h2> <p>알긴산 농도, 질소원 종류, yeast extract 첨가 유무, \( \mathrm{NaCl} \) 농도의 영향\( (0 \sim 3 \%) \), 배양 온도\( \left(20 \sim 40^{\circ} \mathrm{C}\right) \), 배양 시간 등에 따른 알긴산 분해효소의 활성을 조사하기 위하여 PYS 배지를 기본으로 하여 물질을 첨가하거나 온도 등을 달리하여 균주를 배양하면서 DNS법으로 효소활성을 측정하였다.</p> <h2>분리균주의 동정</h2> <p>분해능이 우수한 균주는 16S rDNA의 염기서열을 결정하기 위해 (주)마크로젠에 의뢰하여 16S rDNA의 염기서열을 구하였고 NCBI 의 blast search를 통하여 동정하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>알긴산 분해효소 생산 균주 분리 및 동정</h2> <p>갈조류를 섭식하는 5 종의 해양동물 내장시료를 이용하였을 때 약 5만 개의 콜로니가 분리배지 위에서 성장하는 것이 확인되었다. 소라에서 가장 많은 수의 콜로니 성장이 확인되었고 크기가 \( 1 \mathrm{mm} \) 이상인 콜로니를 알긴산 분해능이 우수한 균주로 간주하고 분리하였다. 분리된 균주의 알긴산 분해능을 plate assay로 1차 확인하고 DNS법으로 2차 측정한 결과, 27종의 콜로니가 알긴산을 분해하는 활성이 높은 것으로 판단되었다. 전복에서 분리한 균주가 알긴산 분해 효소 생산균 중 가장 활성이 높은 균주로 파악되어 이후 그 균주로 연구를 진행하였다.</p>