배아줄기세포를 우르솔산과 함께 저산소에 노출시킨 후 공초점 레이저 현미경으로 400배 배율로 세포를 관찰하였는데 파장 \( 485 \mathrm{~nm} \) 와 \( 535 \mathrm{~nm} \)에서 정량값을 얻었다. 배아줄기세포를 우르솔산과 함께 저산소에 노출시킨 후, lactate dehydrogenase kit 를 이용하여 활성산소종에 의해 발생되는 세포막 손상의 정도를 측정하였다. 배아줄기세포에 MTT를 처리하고 \( \mathrm{CO}_{2} \) 세포배양기에서 배양 후 흡광도를 측정하였다. 또 Western blot 실험을 수행하기 위하여, 배아줄기세포에 지정된 농도와 시간에 따라 우르솔산을 처리하고, PBS로 잘 세척한 후, whole 세포 단백질을 추출하였다. 노화된 세포에서 특징적으로 발현되는 \( \beta \)-galactosidase의 활성을 측정하기 위해 광학현미경으로 노화된 세포의 정도를 직접 세어 계산하였다.
<h2>세포 내 활성산소양 측정</h2> <p>배아줄기세포를 우르솔산과 함께 저산소에 노출시킨 후, 10\( \mathrm{mM} \) 의 \( 2^{\prime}, 7^{\prime} \)-ichlorofluorescein (DCFH-DA) 를 30분 동안 어두운 곳에서 배양시키고, 공초점 레이저 현미경(Olympus FluoView 300 confocal microscope, Tokyo, Japan)을 이용해 \( 488 \mathrm{~nm} \) (excitation) 과 \(515-540\ \mathrm{nm} \) (emission)의 파장에서 400배 배율로 세포를 관찰하였다. 활성산소양을 정량하기위해, 세포를 차가운 PBS에서 수확하고, \(100 \mathrm{\mu l} \)씩 96-well flat bot-tom plates 분주한 후, fluorescent plate reader (Victor3; Perkin-Elmer,Waltham, MA)를 이용해 \( 485 \mathrm{~nm} \) (excitation)과 \( 535 \mathrm{~nm} \) (emission)의 파장에서 그 정량값을 얻었다.</p> <h2>Lactate dehydrogenase 방출 분석</h2> <p>배아줄기세포를 우르솔산과 함께 저산소에 노출시킨 후, lactate dehydrogenase (LDH) kit (Iatron Lab, Tokyo, Japan)를 이용하여 활성산소종에의해 발생되는 세포막 손상의 정도를 측정하였다. 약 \(25 \mathrm{\mu l} \) 세포 배양액을 \(75 \mathrm{\mu l} \) LDH 기질 혼합물에 넣고, 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 그 흡광도를 측정하였다. LDH 측정값은 대조군에 대한 %로 계산하였다.</p> <h2>\( \left[{ }^{3} \mathrm{H}\right] \)-thymidine 결합 측정</h2> <p>\( \left[{ }^{3} \mathrm{H}\right] \)-thymidine 결합 측정은 Brett (1993)가 발표한 방법을 이용하였다. 배아줄기세포를 우르솔산과 함께 저산소에 노출시킨 후, \( 1 \mathrm{\mu Ci} \) 의 [methyl- \( { }^{3} \mathrm{H} \) ]-thymidine (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)를 처리하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 동안 배양 시켰다. 용출물속의 방사선 활성도를 liquid scin-tillation counter (Wallac, Turku, Finland)로 측정하였고, 실험결과는 대조군에 대한 %로 계산하였다.</p> <h2>MTT 분석</h2> <p>배아줄기세포를 우르솔산과 함께 저산소에 노출시킨 후, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT)를 처리하고 2시간 동안 \( \mathrm{CO}_{2} \) 세포배양기에서 배양하였다. 배양 후 형성된 자색의 formazen 결정을 육안 및 현미경을 이용해 관찰하고 세포를 PBS를 이용하여 2번 세척하였다. \(500 \mathrm{\mu l} \)의 Dimethyl sulfoxide (DMSO)를 2시간 동안 배양하여 for-mazen을 완전히 용해시킨 후, \(200 \mathrm{\mu l} \)씩 96-well flat bottom plates 분주하여 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 그 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Western blot 분석</h2> <p>Western blot 실험을 수행하기 위하여, 배아줄기세포에 지정된 농도와 시간에 따라 우르솔산을 처리하고, PBS로 잘 세척한 후, whole 세포 단백질을 추출하였다. Whole 세포 단백질은 protease inhibitor cocktail (Boehringer, Mannheim)이 포함된 lysis buffer (\( 20 \mathrm{~mM} \) HEPES, \( \mathrm{pH}~ 7.9 \), \( 400 \mathrm{~mM} \) NaCl, \( 0.2 \mathrm{~mM}\) EDTA, \( 1 \mathrm{~mM}\) DTT, \( 1 \mathrm{~mM}\) PMSF in isopropanol, \( 1.5 \mathrm{mM} \mathrm{~MgCl}_{2}, 25 \% \) glycerol, \( 0.5 \% \mathrm{~NP}-40 \) )에서 추출되었고, Bradford 방법을 이용하여 단백질의 농도를 확인하였다. 정량된 단백질들을 \( 10 \% \) polyacrylamide gel에 \( 100 \mathrm{~V}, 30 \mathrm{~mA} \)에서 \( 2.5 \mathrm{~h} \) 동안 전기영동 하였고, PVDF membrane에 transfer시킨 후, \(5 \% \) 탈지분유가 함유된 TBS-Tween 용액 \( (25 \mathrm{~mM} \) Tris base, \( 137 \mathrm{mM}\) NaCl, \(2.68 \mathrm{mM}\) KCl, \(0.05 \% \) Tween-20, \( \mathrm{pH}~ 7.5) \)으로 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 반응시켰다. 3,000배 희석된 primary antibody (cleaved caspase-3, cIAP-2, Bcl-2, \( \beta \)-actin)와 10,000배 희석된 secondary antibody를 적당한 시간 동안 순차적으로 처리하고, chemiluminescence 기계(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK)를 이용해 cleaved caspase-3, cIAP-2, Bcl-2, \( \beta \)-actin의 발현을 확인하였다.</p> <h2>\( \beta \)-galactosidase 활성 측정</h2> <p>노화된 세포에서 특징적으로 발현되는 \( \beta \)-galactosidase의 활성을 측정하기 위해 senecence-associated \( \beta \)-galactosidase kit (SA-\( \beta \)-gal, Sigma, St Louis, MO, USA)을 이용하였다. 배아줄기세포를 PBS로 두 번 세척한 후 \( 4 \% \) formaldehyde로 15분간 상온에서 고정한 다음, \( \beta \)-galactosidase 활성 측정 혼합물을 넣어 12시간까지 배양하였다. 광학현미경으로 \( \beta \)-galactosidase 양성인 푸르게 염색된 노화된 세포수와 전체 세포수를 세어서 노화된 세포의 정도를 계산하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험은 3회 이상 반복 하였으며, 실험결과는 means \( \pm \)SE로 표현 하였다. 유의적 차이는 Student's test 및 one-way analysis of variance (ANOVA) 이용하여 결정하였으며, \( \mathrm{p} \)-values \(<0.05 \) 의 값들을 유의적인 결과로 고려하였다.</p>