수컷 흰쥐에게 적송잎에서 열수 및 아임계 추출을 통한 추출물을 3주간 식이하며, 수컷 흰쥐의 혈액, 혈청, 혈류 및 혈소판 응집력에 대한 변화를 실험, 관찰하였다. 실험을 통해 얻은 자료는 실험 그룹간 기술통계치 산술과 그룹 간 차이를 확인하기 위해 일원변량분석을 통해 분석되었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>추출물의 제조</h2> <p>본 실험에 사용한 적송잎은 2007년 7월경 지리산에서 채취 하여 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 열풍건조한 후 믹서로 분말화시켜 같이 열수 추출과 아임계 추출을 행하였다.</p> <p>열수 추출은 일반적으로 알려진 추출 방법으로 적송잎 분말 \( 743 \mathrm{~g} \) 에 물 \( 4,500 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15분간 추출 한 후 여과한 액을 동결건조 하여 제조하였다.</p> <p>아임계 영역은 임계점보다도 온도 및 압력이 낮은 과열영역으로 아임계 상태에서 과열된 수증기는 성분추출에 우수한 작용을 하는 것으로 알려겨 있어, 적송잎 분말 \( 232 \mathrm{~g} \) 에 \(60 \mathrm{kgf} / \mathrm{cm}^{3} \) 의 \( \mathrm{CO}_{2} \) 가스를 이용하여 separator 1 은 \( 120^{\circ} \mathrm{C} \) 로, sep-arator 2는 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 로 설정하여 210분간 추출을 행한 후 여과하여 추출액을 얻은 후 동결 건조하여 제조하였다.</p> <h2>실험동물, 사육조건 및 식이조성</h2> <p>실험동물은 \( 180 \sim 200 \mathrm{~g} \) 의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐(오리엔트사)를 구입하여 1주간 적응시킨 뒤 실험에 사용하였다. 적응 후 쥐들은 난괴법에 의해 4군으로 나누어 온도 \( 23 \pm 2^{\circ} \mathrm{C} \),습도 \( 50 \pm 5 \%, 12 \) 시간 조명주기의 조건 하에서 3주간 사육하였다. 실험군은 정상식이 (CON) 군, \( 0.5 \% \) 골레스테롤 첨가 식이 (CHOL) 군, \( 0.5 \% \) 콜레스테롤 첨가 식이에 적송잎 열수추출물 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) body weight 투여(Hot water)군 및 \( 0.5 \% \) 콜레스테롤 첨가 식이에 아임계 추출물 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) body weight 투여 (Sub-supercritical)군으로 구성하였으며, 본 실험의 식이 조성은 Table 2와 같다. 실험동물은 각 군마다 7마리씩 나누고, 실험식이와 탈이온수는 자유 섭취방법(ad libitum)으로 급여 하였고, 적송잎 추출물을 매일 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 3주간 경구투여 하였으며, 대조군은 동일용량의 생리식염수를 경구 투여하였다. 식이섭취량은 매일 일정한 시간에 측정하였고, 체중은 이틀에 한번 씩 정기적으로 측정하였다.</p> <h2>혈액 및 장기 채취</h2> <p>실험종료 전 실험동물을 하룻밤 절식시킨 후 ethyl ether마취 하에서 복부대동맥으로부터 채혈하였다. 채취된 혈액은 \( 3,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10분간 원심 분리하였고, 분리된 혈청은 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 냉동보관하면서 분석에 사용하였다.</p> <h2>혈청 중의 지질농도 분석</h2> <p>혈중 triglyceride, total cholesterol, Hdl-cholesterol 농도는 자동 측정용 slide (FUJI FILM, Japan)를 이용하여 Dry che-mistry analyzer 3500i (Fuji, Japan)로 측정하였다.</p> <h2>혈류 측정</h2> <p>혈류는 Micro Channel Array Flow Analyzer KH-6 (MC Lab, Japan)을 이용하여 채취 한 혈액 \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 주입하여 측정 하였다.</p> <h2>혈소판 응집력</h2> <p>Ether 마취 후 개복하여 대동맥으로부터 채혈하여 \( 3.2 \% \) sodium citrate 용액과 \( 1:9 \)의 비율로 혼합한 뒤 \( 1,100 \mathrm{rpm} \) 에서 10분간 원심분리하여 상층의 PRP (platelet rich plasma)를 취하고, \( 3,000 \mathrm {rpm} \) 에서 10분간 더 원심분리하여 상층에 혈장을 제거한 후 EDTA를 포함하는 washing buffer \( 138 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \), \( 2.7 \mathrm{mM} \) KCl, \( 12 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{ NaHCO3} \), \( 0.36 \mathrm {mM} \) \( \mathrm{NaH}{ }_{2} \mathrm{PO}_{4}, 5.5 \mathrm{mM} \) glucose, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( \left. \mathrm{pH} 7.4\right) \) ) \( 5 \mathrm{ml} \) 를 가하고 섞어주어 혈소판을 재 현탁시켰다. 이 혈소판을 다시 \( 3,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10분간 원심분리 한 후, 세척액을 버리고 헐소판을 위의 방법으로 한 번 더 세척하였다. 세척 후 suspending buffer ( \( 138 \mathrm{mM} \) NaCl, \( 2.7 \mathrm{mM} \) KCl, \( 12 \mathrm{mM} \mathrm {NaHCO} 3,0.36 \mathrm{mM} \mathrm{NaH}{ }_{2} \mathrm{PO}_{4} \), \( 5.5 \mathrm{mM} \) glucose, \( 0.49 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2}, 0.25 \% \) Gelatin, \( \left.\mathrm{pH} 7.4\right) \) 로 재 현탁 시켜 \( 3,000 \mathrm{rpm}\), 10분간 원심분리한 후 다시 sus-pending buffer로 현탁시켜 washed platelet을 조제하였다. Washed platelet는 suspending buffer로 희석하여 혈소판 수가 \( 5 \times 10^{8} / \mathrm{ml} \) 이 되도록 하였고, 응집유도제로 collagen을 \( 2.5 \) \( \mu \mathrm{l} \) 가하여 5분간 반응시켜, Whole blood lumi-aggregometer (Chrono-log, U.S.A)를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 혈소판 응집을 측정하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>연구결과 얻어진 자료를 SPSS Version \( 14.0 \) 통계 프로그램을 사용하여 하위그룹 각각의 기술통계치(mean, SD)를 산출하였다. 집단 간의 차이를 알아보기 위해 일원변량분석(one-way ANOVA)를 이용하여 분석하였고, 사후검증은 Tukey를 적용하였다. 유의수준은 \( \alpha<0.05 \) 수준으로 검증하였다.</p>