실험에서 사용한 식물재료는 1999년부터 안성 주변에 자생하고 있는 돼지감자 구근을 수집하여 한경대학교 자생식물 유지 포장에서 직경 \( 2 \sim 3 \mathrm{~cm} \) 정도의 크기로 절단하여 수돗물로 깨끗이 닦고, 마지막으로 멸균수로 3회 세척한 후, 비닐장갑을 끼고 껍질을 벗긴 후 사용하였으며, 이로부터 total RNA를 추출하였다. 유전자 추출은 역전사시켜 만든 cDNA를 주형 DNA로 하여 RT-PCR 분석으로 진행하였다. 한편, 벼의 형질전환은 1-sst와 1-fft 유전자가 삽입된 Agrobacterium tumefaciens 를 이용하여 수행하였으며, 1-sst 및 1-fft 유전자의 도입여부를 확인하기 위해 포트에 이식하기 전 \( 50 \sim 100 \mathrm{mg} \)의 잎을 채취하였고 CTAB 방법 (Sambrook et al.2001)으로 DNA 를 추출하였다. 이후 단백질 발현 양상을 관찰하기 위해 SDS-PAGE 법을 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물재료</h2> <p>1999년부터 안성 주변에 자생하고 있는 돼지감자 구근을 수집하여 한경대학교 자생식물 유지 포장에서 직경 \( 2 \sim 3 \mathrm{~cm} \) 정도의 크기로 절단하여 수돗물로 깨끗이 닦고, 마지막으로 멸균수로 3회 세척한 후, 비닐장갑을 끼고 껍질을 벗긴 후, total RNA의 추출재료로 사용하였다.</p> <h2>RT-PCR에 의한 유전자 분리</h2> <p>돼지감자 구근(직경 \( 2 \sim 3 \mathrm{~cm}) \) 을 이용하여 mRNA 를 추출하였다. 약 \( 2 \mathrm{~g} \) 의 시료를 이용하여 Guanidine 방법 (Chirgwin et al. 1979)으로 mRNA를 추출한 후 oligo(dT)-칼럼에 의해 poly( \( \left.\mathrm{A}^{+}\right)\) RNA 를 조제하였다. Total RNA를 역전사 반응시켜 cDNA로 만든 다음 이 cDNA를 주형 DNA로 하여, RT-PCR (reverse transcription-PCR) 분석을 실시하였다. 이때 사용한 primer는 Ingrid et al (1998) 등이 보고한 fructan 생합성에 관련된 유전자인 1-sst 와 1-fft 의 염기서열을 이용하여 각각 1-sst와 1-fft 유전자 특이적인 primer (SST-1; 5'-ATGATGGCTTC ATCCACCACCACC-3'), (SST-2; 5'-TCAAAGTTCGAAAGTCCACCCAGG-3'), (SST-3; 5' -ATGATAAGTGGTACCCAGATGACC-3'), (SST-4; 5'-GGTCATCTGGGTACCACTTAT CAT-')와 (FFT-1; 5'-ATGCAAACCCCTGAACCCTTTACA-3'), (FFT-2; 5'-TTAAAAAG GGTATTGATGAATTGG-3'), (FFT-3; 5'-TGCTGATCAGGACCTCTCTAGAGGAT-3'), (FFT-4; 5'-CCTCTAGAGAGGTCCTGATCAGCA-3')들을 합성하여 사용하였다.</p> <p>PCR 반응은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분간 pre-denaturation시킨 후, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 분간 denaturation, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 분간 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4 분간 extension 과정을 35 cycles로 하였으며, \( 1.5 \% \) 아가로스 겔 상에서 증폭된 밴드를 확인하였다. 증폭산물은 pGEM T-Easy vector (Promega)에 cloning하여 염기서열을 조사하였고, 유전자 염기배열을 토대로 아미노산서열을 결정하여 유전자간 상동성 비교는 Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 분석에 의하여 실시하였다.</p> <h2>유전자 도입 형질전환 벼 육성</h2> <p>형질전환을 위한 식물 발현벡터는 GUS (ß-glucuronidase) 유전자를 포함하고 있는 KJG V-B2 vector에 Sma \( I \) 을 처리하여 절단하고, 그 위치에 \( 1.8 \mathrm{kbp} \) 의 1-sst와 1-fft 유전자를 삽입하여 재조합 DNA를 제작하였다 (Fig. 1). 1-sst와 1-fft 유전자는 35S promoter의 지배하에 발현되며, 선발 marker 유전자로 hygromycin 저항성유전자 (HPT)를 포함하고 있다. 벼의 형질전환은 1-sst와 1-fft 유전자가 삽입된 Agrobacterium tumefaciens 를 이용하여 수행하였다.</p> <h2>형질전환 벼의 유전자 도입 확인</h2> <p>재분화된 식물체에서 1-sst 및 1-fft 유전자의 도입여부를 확인하기 위하여, 포트에 이식하기 전 \( 50 \sim 100 \mathrm{mg} \) 의 잎을 채취하였고, CTAB 방법 (Sambrook et al. 2001)으로 DNA 를 추출하였다. 추출한 DNA \( 20 \mathrm{ng} \) 을 PCR 분석에 이용하였다. PCR에 사용한 primer는 35S promoter 단편의 특이적인 DNA 증폭을 위하여 (5'-TTCAACAAAGGGTAATATCCGG-3')와 (5'-CGAAGGATAGTGGGATTGTGC-3')를 합성하여 사용하였다. 또한 1-sst 및 1-fft 유전자의 증폭을 위하여 1-sst 특이적으로 증폭되는 primer set와 1-fft 특이적으로 증폭되는 primer set를 합성하여 이용하였다. PCR 반응조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 pre-denaturation시킨 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 분간 denaturation, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분간 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분간 extension 과정을 35 cycle, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 마지막 extension을 실시하여 증폭하였으며 \( 1 \% \) agarose gel 상에서 35S promoter와 1-sst 및 1-fft 유전자의 도입여부를 확인하였다.</p> <h2>Southern blot 분석</h2> <p>벼 식물체로부터 분리한 DNA를 제한효소를 처리하여 절단한 다음 \( 0.8 \% \) agarose gel에서 전기영동한 후, nylon membrane (Hybond-N, Amersham)에 transfer시켰다. DNA가 전이된 membrane을 filter paper 위에 올려놓고 UV transilluminator로 2 분간 cross-linking 시켰다. Pre-hybridization은 \( 6 \times \) SSC, \(5 \% \) dextran sulfate, \( 0.1 \% \) SDS 용액을 넣고 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 시간 동안 수행하였으며, 1-sst 및 1-fft 특이적으로 증폭할 수 있는 primer set에 의해 증폭된 DNA를 \( { }^{32} \mathrm{P} \) 로 labelling한 probe와 15 시간 동안 hybridization시켰다. Membrane의 세척은 \( 2 \times\) SSC, \( 0.1 \% \) SDS 용액으로 실온에서 5 분씩 2 회, \( 0.5 \times \) SSC, \(0.1 \% \) SDS 용액으로 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15 분간, \( 0.1 \times \) SSC, \( 0.1 \% \) SDS 용액으로 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15 분간 세척한 후, X-ray film (Agfa)에 감광시켜 band를 확인하였다.</p> <h2>SDS-PAGE에 의한 단백질 분석</h2> <p>단백질의 발현 양상을 관찰하기 위해 단백질을 추출한 후 SDS-PAGE로 확인하였다. 단백질 추출을 위해 마쇄한 시료 \( 0.05 \mathrm{~g} \) 에 \( 1 \mathrm{ml} \) buffer \( (0.05 \mathrm{M} \) Tris-HCL, \( 0.2 \% \) SDS, \(5 \mathrm{M} \) urea, \( 0.1 \% \) mercaptoethanol)를 가하여 30 분간 추출하였으며 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 13,000 \mathrm{rpm} \) 에서 20 분간 원심분리 후 상등액만을 취하였다. SDS-PAGE는 Bio-Rad사의 protein III를 사용하였으며 전기 영동시 \( 12 \% \) 의 resolving gel과 \( 5 \% \) 의 stacking gel을 사용하여 1 시간 30 분간 실시하였다. 염색은 staining solution \( (0.5 \% \) coomassie blue R-250: \( 40 \% \) methanol: \( 10 \% \) acetic acid)에서 3 시간 염색 후 destaining solution (\(40\%\) methanol : \( 10 \% \) acetic acid)에서 탈색하여 밴드의 양상을 분석하였다.</p> <h2>Fructan 합성 확인 및 함량 분석</h2> <p>신운봉벼 등 내냉성이 상이한 보급 품종을 온도조건이 다른 인공환경 조절실과 영남농업시험장 상주출장소 내냉성 시험포장 \( \left(15^{\circ} \mathrm{C}\right. \) 이하의 지하수를 이용함 \( ) \) 에 재배하면서 수용성 탄수화물이 많이 저장, 이용되는 엽신, 엽초, 생장점 부위를 일정주기별로 분석시료로 채취하였다. 탄수화물과 fructan 분석시료는 채취 후 \( 78^{\circ} \mathrm{C} \) 로 유지되는 열풍건조기를 이용하여 48 시간 건조 후 건물시료로부터 수용성 탄수화물 및 fructan을 분석하였다. 채취된 시료를 이용하여 첫째로 수용성 탄수화물을 추출하고 추출되어진 용액을 TLC (thin layer chromatography)를 이용하여 당의 DP (degree of polymerization)별로 분리한 후 벼의 생육시기별, 식물체부위별, 온도수준별, 품종별로 fructan의 합성 및 존재여부를 확인하였고, 분리되어진 fructan을 Anthrone 법을 이용하여 비색정량하였다.</p>