미국산 옥수수와 인도산 옥수수로 부두 하역장에서 채취한 시료, 김해축산업협동조합 사료.공장 입고 시 시료, 사이로 저장 2일 후의 시료, steam flake전의 시료와 steam flake된 시료를 채취하여 mycotoxin 함량분석을 위해 총 72개의 시험관에서 in vitro 실험을 진행하였는데Duncan'smultiple range test[10]로 유의성을 검사하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>공시재료</h2> <p>공시재료로는 미국산 옥수수와 인도산 옥수수를 사용하여steam flaking (증기박편) 처리가 공정처리별 mycotoxin 함량의 변화(aflatoxin \( B_{1} \) 및 ochratoxin \( \mathrm{A} \) 함량)를 측정하기 위해 부두 하역장에서 채취한 시료, 김해축산업협동조합 사료 공장 입고 시 시료, 사이로 저장 2일 후의 시료, steam flake전의 시료와 steam flake된 시료를 채취하였다. 채취한 시료는 mycotoxin 함량분석을 위하여 \( 1 \mathrm{~mm} \) screen이 장착된Retsch GmbH ZM200를 이용하여 1,800 rpm으로 분쇄하였다. 또한 in vitro 발효성상에 미치는 영향을 구평하고자 원곡상태의 옥수수와 steam flaking 옥수수 등 총 4 종을 공시하였다. 공시재료는 \( 2 \mathrm{~mm} \) screen이 부착된 Wiley mill에서 분쇄한 다음, 미세한 전분입자를 제거한 후 입자가 \( 600 \mu \mathrm{m} \) (입자도 표현지수 \( \mathrm{MF}=2.5) \) 이하가 되도록 처리하여 공시재료로서 사용하였다.</p> <p>옥수수의 flaking 처리는 steam controller 내의 온도가 70\( \sim 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 50 분간 증기처리한 후, \( 5 \mathrm{~kg} / \mathrm{cm}^{2} \) 의 압력으로 박편하여 압편두께가 \( 3 \mathrm{~mm} \) 정도 되게 하였다.</p> <p>공시재료의 일반성분 분석은 시료를 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 의 건조기에서 3일간 건조시킨 후, \( 1.00 \mathrm{~mm} \) screen이 부착된 실헙용 분쇄기(Wiley mill)를 이용하여 입자로 분쇄한 후 사용하였다. 일반성분 중 건물( \( \mathrm{AOAC} 930.15) \), 조회분( \( \mathrm{AOAC} 942.05) \), 조단백질( \( \mathrm{AOAC} \) 984.13, model Tecator Kjeltec 1030 Analyzer), 조섬유(model Tecator Fibertec System M6)의 분석은 AOAC방빕에 준하였으며, \( \mathrm{NFE} \) 은 \( \mathrm{OM} \) 함량에서 \( \mathrm{CP} \) 과 조지방\( \mathrm{EE} \) 그리고 \( \mathrm{CF} \) 함량을 제하여 계산하였다. 칼숨과 인의 함량은 Schwarzenbach 등의 방법과 UV-vis spectropho-tometer (UVmini-1240, Japan)로 분석하였다. 원산지별 공시재료 옥수수의 화학적 조성은 Table 1 과 같다.</p> <h2>공시축 및 반추위액 준비</h2> <p>반추위액 공여를 위한 공여축으로 평균체중이 \( 550 \mathrm{~kg} \) 되는 반추위 누관이 장착된 Holstein (평균체중 \( 550 \mathrm{~kg} \) ) 수소2두를 공시하였다. 반추위약 공여축의 사양관리는 농후사료와 볏짚의 급여비율을 \(40:60\)으로 하여 체중의 \( 3 \% \) 수준으로1일 2회 (07:00, 19:00) 분할 급여 하였다. Mineral-vitaminblock을 자유롬게 섭춰토록 하였으며 물은 자유 음수토록 하였다. 급여된 사료의 조성과 화학성분은 Table 2 에서와 같다.</p> <p>반추위핵 공여축 2두의 반추위로부터 fistula를 통하여 공시동물 당 \( 1,000 \mathrm{ml} \) 의 위액을 채취하였다. 반추위핵은 오진 사료 급여 3시간 후, in vitro 실험 2 시간 전에 채취하여 4 겹의 cheese cloth로 거른 다음, 동일 양으로 합하여 소화율 측정용 위액으로 사용하였다. 채취한 위액은 미리 보온되고 산소 \( \left(\mathrm{O}_{2}\right) \) 가 완전히 제거된 탄산가스 \( \left(\mathrm{CO}_{2}\right) \) 인 \( \mathrm{O}_{2} \)-free \( \mathrm{CO}_{2} \) gas가충진된 \( 3,000 \mathrm{ml} \) 의 plastic용기에 담아 실험실로 운반하였다.위액 중의 사료입자에 부착되어 있는 미생물을 분리하기 위하여 homogenizer에 넣고 \( \mathrm{O}_{2} \)-free \( \mathrm{CO}_{2} \) gas 를 충전하며 강하게 3 분간 교반한 다음 30 분 1 시간 정도 정치시켜 사료입자를 상층액으로 부유시킨 후, vacuum 펌프로 부유된 사료 입자를 완전히 제거하였다. 사료입자가 완전히 제거된 투명한반추위액과 혐기희석액 을 동일한 양으로 회석하여 in vi-tro 실험을 위한 미생물원으로 사용하였다.</p> <h2>실험 설계</h2> <p>옥수수의 가공형태 2 방법(whole corn과 steam flaking)과원산지 2 곳(미국산과 인도산) 총 4 가지의 처리구에 처리구별6 시간대 \( (3,6,9,12,18 \) 및 24 시간)의 발효시간을 두고, 각발효시간별 3 반복으로 총 72 개의 시험관(serum bottle)에서 in vitro 실험을 수행하였다.</p> <h2>조사 항목 및 조사 방법</h2> <p>공정라인변 mycotoxin 함량 측정을 알아보기 위하여 afla-toxin \( B_{1} \) 과 ochratoxin \( A \) 함량측정을 하였다. Aflatoxin \( B_{1} \) 함량측정을 위해 Vicam사 Series-4 Fluorometer에 mycotoxincalibration standard를 이용하여 standard를 잡은 후, 공정라인별로 채취한 시료 \( 50 \mathrm{~g} \) 과 \( \mathrm{NaCl} 5 \mathrm{~g} \) 을 합한 후 methanol\( 80 \mathrm{ml} \) 와 distilled water \( 20 \mathrm{ml} \) 을 1분간 교반시켜 Vicam flut-ed filter paper \( (24 \mathrm{~cm}) \) 로 1 차 여과시킨 후 중류수 \( 40 \mathrm{ml} \) 를혼합한 후 2 차 여과시켜 glass syring \( (10 \mathrm{ml}) \) 에 \( 10 \mathrm{ml} \) 를 취한다. 이후 aflatest wash buffer \( 10 \mathrm{ml} \) 을 통과시킨 후 distill-er water \( 10 \mathrm{ml} \) 를 2회 통과시키고 cuvette에 methanol \( 1 \mathrm{ml} \)를 aflatest에 통과시켜 모은 후 aflatest developer \( 1.5 \mathrm{ml} \) 를합하여 series-4 Fluorometer에서 분석을 수행하였다.Ochratoxin \( \mathrm{A} \) 함량 측정은 aflatoxin \( \mathrm{B}_{1} \) 측정과 같이 측정을실시하며 전 처리된 시료에 ochratest wash buffer \( 10 \mathrm{ml} \) 을통과시킨 후 distiller water \( 10 \mathrm{ml} \) 를 두 번 통과시키고 cuv-ette에 ochratoxin developer \( 1.5 \mathrm{ml} \) 를 ochratest에 통과시켜추출한 후 Series-4 Fluorometer에 넣어 분석을 수행하였다. In vitro 실험은 Tilley와 Terry 방법을 Moore 가수정한 방법에 따라 수행되었다. 이 방법에서 환충액(buffersolution)은 artificial saliva 를 대신하여 Bryant와Burkey 가 사용한 험기 희석액을 사용하였고 첨기 배양액(anaerobic medium)은 Dehority 가 사용한 배양액에서 탄소원을 제거하고 사용하였다. In vitro 미생물 배양은 4 종류의 실험사료 \( 0.5 \mathrm{~g} \) 을 각각 혐기 배양액 \( 10 \mathrm{ml} \) 가 들어 있는 50\( \mathrm{ml} \) 용 serum bottle에 첨가한 다음, 24 시간 동안 \( 39^{\circ} \mathrm{C} \) 의shaking incubator에서 실시하였다. 배앙핵은 배양을 시작한후 \( 3,6,9,18 \) 및 24 시간째에 incubator로부터 꺼내어 즉시가스발생량을 측정한 다음, 분석을 위한 시료로 사용하였다.</p> <p>가스 반생량(Gas production)측정은 각 발효시간별로 se-rum bottle을 shaking incubator (120 rpm)에서 꺼낸 후, 온도에 따른 변화를 감안하여 상온에서 20 분간 방치한 다음,총 가스발생량은 serum bottle내의 head space에 축적된 가스를 water displacement apparatus에 부착된 주사기로 흡입하여 burette내의 물을 밀어 올리는 양(가스압, \( \mathrm{ml}) \) 을 가스발생량으로 하였다.</p> <p>\( \mathrm{pH} \) 측정은 가스발생량 측정을 완료한 즉시 Weaton de-capper를 이용하여 serum bottle의 stopper를 제거한 다음배양액의 \( \mathrm{pH} \) 를 \( \mathrm{pH} \) meter (Mettler Toledo, MP230)로 측정하였다.</p> <p>반추위 혼합 미생물에 의한 in vitro 발효에 있어서 베양맥중의 미생물 성장률은 각 발효시간대별 \( (3,6,9,12,18 \) 및 24시간)로 시험관으로부터 발효액 \( 1.5 \mathrm{ml} \) 를 Eppendorf tube에취하고, \( 3,000 \mathrm{rpm} \) 에서 3 분간 원심분리 하여 사료 입자를 제거하고, 상충액을 취하여 \( 14,000 \mathrm{rpm} \) 에서 3 분간 재 원심분러하여 미생물 pellet을 침전시킨 다음, 상충액 은 제거하고 침전물에 sodium phosphate buffer pH 6.5)를 첨가하여 교반하여 현탁 시켰다. 이 과정을 3회 반복한 후에 spectropho-tometer (BIO-RAD Model 680)를 이용하여 \( 550 \mathrm{~nm} \) 에서 OD(optical density) 값을 비교하여 미생물 성장률을 구하였다.</p> <h2>통계 처리</h2> <p>실험 결과는 SAS package program 의 General LinearMode (GLM) procedure에 따라 처리되었으며, 각 처리구간의 유의성 검증을 위하여 분산분석을 실시한 후, Duncan'smultiple range test \( [10] \) 로 유의성을 검정하였다 \( (\mathrm{P}<0.05) \).</p>