Bacillus licheniformis KJ-9를 사용하여 공시균주 및 배지를 준비하고, Botrytis cinerea KACC 40965, Corynespora cassicola KACC 40964, Fusarium oxysporum KACC 40047, Rhizoctonia solani KACC 40109의 식물병원성균주로 항균활성 측정을 수행하였다. PDA 평판배지를 사용하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하고, 균사가 평판배지의 \(1/3\) 정도를 덮을 때까지 배양하여 B. licheniformis KJ-9의 배양용액 \( 150 \mu \mathrm{l} \)를 접종한 후 \(30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(24\sim72\)시간 대치배양하여 식물 병원성균주의 균사성장 억제정도를 관찰하여 항균활성을 측정하였다. 톱밥우분은 B. licheniformis KJ-9를 정기적으로 투여하여 발효시킨 항균발효퇴비(BLC)를 사용하고 고추의 pot 실험은 Han 및 Ko 등의 방법에 따라 수행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>공시균주 및 배지</h2><p>공시균주는 carboxy methyl cellulase (CMCase), protease 및 chitinase 효소활성이 높고, 식물병원성균주에 대하여 항균활성이 우수한 균주로 전보에서 분리 · 동정된 Bacillus licheniformis KJ-9를 사용하있다. 항균활성 측정을 위한 식물병원성균주는 농업진흥청 용용미생물과에서 분양받은 Botrytis cinerea KACC 40965, Corynespora cassicola KACC 40964, Fusarium oxysporum KACC 40047, Rhizoctonia solani KACC 40109의 균주를 사용하였다. B. licheniformis KJ-9의 보존 및 배양은 \( 1.5 \% \) soluble starch, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 0.05 \% \)\( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)의 성분으로 구성된 배지를 사용하였으며, 배지의 초기 \(\mathrm{pH}\) 는7.0, 배양은도는 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 그리고 진탕속도는 \(180\mathrm{rpm}\)으로 행하였다. 그리고 식물 병원성균주의 생육 및 보존을 위한 배지는 PDA (Difco) 평판배지를 사용하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 행하였다.</p><h2>항균활성 측정</h2><p>항균활성 측정은 PDA평판배지 중앙에 corker borer No.5 (직경 \( 7 \mathrm{~mm} \) )를 이용하여 식물 병원성균주를 블록형태로 접종한 다음 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)의 항온기에서 곰팡이의 균사가 평판배지의 \(1/3\) 정도를 덮을 때까지 배양하였다. 이때 성장하는 곰팡이 균사의 끝으로부터 \( 1 \mathrm{~cm} \) 정도 떨어진 지점에 corker borer No. 5 (직경 \( 7 \mathrm{~mm} \) )를 이용하여 평판배지 상에 구멍을 뚫은 다음 \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) membrane filter로 여과한 B. licheniformis KJ-9의 배양용액 \( 150 \mu \mathrm{l} \)를 접종한 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(24\sim72\)시간 대치배양하여 식물 병원성균주의 균사성장 억제정도(inhibition zone)를 관찰하였다.</p><h2>배양용액의 온도 및 pH 안정성</h2><p>B. licheniformis KJ-9 배양용액의 온도 및 \(\mathrm{pH}\) 안정성 검토를 위한 시료용액은 B. licheniformis KJ-9를 액체배양한 후 그 배양액을 \( 8,000 \times g, \) 20분 동안 원심분리하여 얻어진 배양 상등액을 \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) membrane filter로 여과한 용액을 사용하였다. 온도 안정성 검토는 여과한 시료용액을 70, 80, 90 및 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 각각 10 분간 열처리한 다음 식물병원성 균주에 대한 상대적 항균활성을 열처리하지 않은 대조구와 비교하여 \( \% \)로 나타내었으며, \(\mathrm{pH}\) 안정성 검토는 시료용액을 \( 0.1 \mathrm{M} \mathrm{HCl} \) 및 \( 0.1 \mathrm{M} \mathrm{NaOH} \)로 \(\mathrm{pH}\) 3, 5, 7, 9 및 11로 조절한 후 상온에서 천천히 흔들면서 2시간 동안 방치한 다음 중성으로 중화시켜 열 안정성과 동일한 방법으로 측정하였다.</p><h2>항균발효퇴비의 제조</h2><p>톱밥우분에 B. licheniformis KJ-9를 정기적으로 투여하여 발효시킨 항균발효퇴비(BLC)는 경남 산청군 신안면에 위치한 신안위탁퇴비공장의 협조를 얻어 고속연속 퇴비발효장치를 이용하여 제조하였다. 고속연속 퇴비발효조는 Fig. 1에서보는 바와 같이 길이\(\times\)폭\(\times\)깊이가 각각 \( 60 \mathrm{~m} \times 6 \mathrm{~m} \times 1.5 \mathrm{~m} \)로 구성되어 있으며, 발효조의 밑바닥에는 직경 \( 100 \mathrm{~mm} \)의 통풍관을 6개 설치하여 산소의 공급이 원활하도록 하였다. 발효 중인 퇴비의 뒤집기는 횡단 이동이 가능한 자동 교반장치를 이용하였다. BLC 제조를 위한 미생물 접종용액은 \( 15\mathrm{~l}\)의 발효조에 \( 10\mathrm{~l}\)의 액체배지를 넣고 B. licheniformis KJ-9 전배양액을 \( 2 \% \) 접종하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C}\), \(120 \mathrm{rpm} \) 으로 72시간 배양하여 사용하였다. BLC는 B. lidheniformis KJ-9의 배양용액을 수돗물로 10배 회석하여 농약 살포 분무기로 2주일에 1회씩 톱밥우분퇴비의 표면에 분무하면서 30일 동안 발효를 행하여 제조하였다. BLC를 이용한 in vivo 실험의 대조구는 B. licheniformis KJ-9를 분무하지 않고 제조한 톱밥우분퇴비 즉, 종래의 판매퇴비(commercial compost, CC)를 사용하였다.</p><h2>고추의 pot 실험</h2><p>BLC를 이용한 식물의 pot 실험은 Han 및 Ko 등의 방법에 따라 수행하였다. 가로\(\times\)세로\(\times\)높이가 각각 \( 56 \mathrm{~cm} \times 36\ \mathrm{cm} \times 25 \mathrm{~cm} \)인 아이스박스의 밑바닥에 직경 \( 2 \mathrm{~cm} \) 정도의 구멍을 12개 뚫고 일반 밭 흙만을 사용한 시험구(a), 일반 밭 흙에 CC를 \( 10 \%\) \((\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 혼합한 시험구(b), 일반 밭 흙에 BLC를 \( 10 \%\)\((\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 혼합한 시험구(c) 각각에 시중의 종묘상에서 5 엽기 정도 성장한 고추종묘를 9포기씩 이식하여 60일 정도 재배하면서 고추역병, 탄저병 및 세균성 점무늬병 뿐만 아니라 고추의 잎 수, 줄기의 길이, 뿌리의 길이, 줄기의 횡단면 등의 고추 생장정도를 상호비교 검토하였다. a, b및 c 시험구는 각각 2시험구(총 18포기)씩 준비하여 동시에 실험을 행하였으며 결과는 평균값으로 나타내었다.</p><h2>항균발효 퇴비의 현장적용</h2><p>본 연구에서 개발한 BLC의 현장적용 시험은 경남 산청군 신안면 장죽리에 위치한 일반 농가에서 \( 400 \mathrm{~m}^{2} \) 정도의 밭을 A, B 구간으로 나누고 A구간에는 기존의 판매퇴비인 CC \( 400\mathrm{kg} \) (\( 20 \mathrm{~kg} \) 포대 20개)를 살포하고, B구간에는 본 연구에서 제조한 BLC \( 400 \mathrm{~kg} \) 살포한 후 늦가을에 마늘을 재배하여 생육상태를 관찰하였다. 그리고 마늘을 수확한 다음 해의 봄에는 들깨를 동일조건으로 재배하면서 작물의 질병 및 생육상태를 육안으로 관찰하였다.</p>