표준균주에 해당하는 M. hominis PG21은 Chanock's 액체배지에 배양하였으며, MF의 농도를 단계적으로 높여가면서 인위적인 돌연변이를 유도하였다. 이후 돌연변이 실험균주에 RNase를 넣어 반응시키고 에탄올로 \( \mathrm{DNA} \) 를 침전시켜 PCR 반응 검사를 진행하였으며, 그 산물을 아가로즈 겔에서 전기영동하여 ethidium bromide 용액에서 염색하여 관찰하였다. 관찰에 성공한 산물은 자동염기분석기를 통해 염기서열을 분석하였으며, 그 후에 산물의 항생제 감수성 검사로부터 최저발육저지농도인 MIC를 측정하기 위해 액체 계단희석법을 사용하였다.
<h1>재료와 방법</h1> <h2>균 배양과 인공 돌연변이 유도</h2> <p>표준균주인 M. hominis PG21을 \( 20 \% \) 마혈청, \( 10 \% \) 신선 효모 추출물, \( 5 \mathrm{~mM} \) arginine, \( 0.001 \% \) phenol red, 페니실린 \(200 \mathrm{~U} / \mathrm{ml} \) 이 함유된 Chanock's 액체배지에 접종하여 배양하고, 배양된 균은 MF의 농도를 \( 0.5 \mathrm{~\mu g} / \mathrm{ml} \) 부터 단계적으로 높여가면서 인위적으로 돌연변이를 유도하였다. 생성된 돌연변이 균주는 다음 실험을 할 때까지 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다.</p> <h2>항생제</h2> <p>실험에 사용된 항생제는 amikacin (AK, 보령제약주식회사), clarithromycin (CL, 한국애보트주식회사), gentamicin (GM, 국제약품), ciprofloxacin (CF, 일동제약주식회사), levofloxacin (LF, 국제약품공업주식회사), moxifloxacin (MF, 바이 엘코리아), oflaxacin ( \( \mathrm{OF} \), 제일제당), sparfloxacin (SF, 제일제당)이다.</p> <h2>Polymerase chain reaction (PCR)</h2> <p>\( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관되어 있는 실험균주를 녹여서 계대배양하여 최종적으로 각각 \( 3 \mathrm{ml} \) 를 배양 한 후 \( 14,000 \mathrm{~rpm} \) 에서 20 분간 원심하고 균을 인산완충액 \( (\mathrm{pH} \) 7.2 \( ) \) 으로 2 번 세척하였다. 이 균들을 STE 완충용액 \( (100 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaCl}, 10 \mathrm{~mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}~[\mathrm{pH} \) 8], \( 1 \mathrm{~mM} \) EDTA) \( 500 ~\mu \mathrm{l}\) 에 잘 현탁 한 후 \( 10 \% \) sodium dodecyl sulfate \( 25 \mu \mathrm{l}\) 를 넣고, \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15 분 동안 가열하였다. 여기에 RNase \( 100 ~\mu \mathrm{g} \) 을 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분 동안 반응시킨 후 phenol-chloroform으로 처리하고 에탄올로 \( \mathrm{DNA} \) 를 침전시켜 PCR 반응에 사용하였으며, 사용한 primers는 Table 1과 같다. PCR 반응은 추출한 DNA에 Taq polymerase (TaKaRa, Japan)와 10× PCR buffer, \( 200 ~\mu \mathrm{M} \) deoxynucleoside triphosphates, \( 1.5 \mathrm{~mM} \mathrm{~MgCl}_{2} \) 를 첨가한 후 MiniCycler (MJ Research, USA)에서 \( 94^{\circ} \mathrm{C}, 10 \) 분간 denaturation 시켰다. 그리고 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45초, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45 초 동안 35회 반응시켰고, 마지막 주기에서 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 로 10 분간 더 반응시킨 후 그 산물을 \( 1.5 \% \) 아가로즈 겔에서 전기영동하여 ethidium bromide 용액에서 염색하여 관찰하였다. 결과가 확인된 산물은 자동염기분석기인 ABI PRISM 3730XL Analyzer (Applied Biosystems, USA)로 염기서열을 분석하였다.</p> <h2>항생제 감수성 검사</h2> <p>돌연변이주들에 대한 각 항생제들의 최저발육저지농도 (minimal inhibitory concentration, MIC)를 측정하기 위해 액체 계단희석법을 사용하였으며, 각 항생제들의 최고농도는 \( 128 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \), 최저농도는 \( 0.06 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 되도록 2 배 계단희석법으로 희석하였다. 균 배양액은 각각 \( 10^{4}-10^{5} \) color changing units \( (\mathrm{CCU}) / \mathrm{ml} \) 가 되게 접종하였으며, 18~24시간 배양한 후 관찰하여 색깔의 변화가 일어나지 않은 가장 낮은 농도를 최저발육저지농도로 하였다.</p>