본 논문에서는 \(5 \)b와 \(5 \)f는 모두 \(3 \)OC \(12 \)-HSL의 수용체인 LasR의 신호물질 결합부위에 \(3 \)OC \(12 \)-HSL보다 높은 결합에너지를 가지는 구조로 실제 대장균 QS리포터 균주를 이용한 실험에서 LeaR의 활성을 억제하는 것이 밝혀진 물질이며, 이 물질들을 녹농균에 처리했을 때 수용체인 LasR과 QscR의 활성 변화를 알아보고자 하였다. 결과로는 \(5 \)b의 경우 성장 단계 전체에서 LasR의 활성을 억제하지 못하였고, QscR의 경우에는 예상과 달리 \(5 \)b에 의해 활성이 증가하는 것을 관찰하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>녹농균에서 QS 저해제들이 \(3 \)OC \(12 \)-HSL 수용체 단백질의 활성에 미치는 효과</h2> <p>본 실험에 사용된 QS저해 물질들인 \(5 \)b와 \(5 \)f의 구조는 Fig. \(1 \)에 제시되어 있다. \(5 \)b와 \(5 \)f는 모두 \(3 \)OC \(12 \)-HSL의 수용체인 LasR의 신호물질 결합부위에 \(3 \)OC \(12 \)-HSL보다 더 높은 결합에너지(docking score)를 가지는 구조로 in silico 모델링 분석에서 예측되었으며, 실제 대장균 QS 리포터 균주를 이용한 실험에서 LasR의 활성을 억제하는 것이 밝혀진 물질이다. 이 물질들을 실제로 녹농균에 처리했을 때, 녹농균의 QS 반응을 주도하는 신호물질인 \(3 \)OC \(12 \)-HSL의 수용체인 LasR과 QscR의 활성이 어떻게 변하는지 알아보고자 녹농균의 성장에 따른 LasR과 QscR의 활성 변화를 측정해 보았다. \(5 \)b의 경우 대장균 리포터 균주를 이용한 결과와는 달리 성장 단계 전체에 걸쳐 LasR의 활성을 억제하지 못하였다. LasR보다 늦게 활성이 증가하는 QscR의 경 우 예상과는 달리 \(5 \)b에 의해 오히려 활성이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. \(5 \)f의 경우에도 실험에 사용된 모든 농도범위에서 LasR의 활성에는 영향을 주지 않는 반면, QscR의 활성은 농도 범위에 따라 증가, 혹은 감소시키는 것으로 관찰되었다. 흥미롭게도 \(5 \)f는 \( 10 \mu \mathrm { M } \)이하의 낮은 농도로 처리하였을 때는 QscR의 활성을 증가시킨 반면, 그 이상에서는 QscR의 활성을 증가시키는 정도가 줄어들기 시작해서 \( 100 \mu \mathrm { M } \) 근방에서는 \(5 \)f를 넣지 않았을 때와 비슷한 수준이 되며, \( 1 \mathrm { mM } \) 수준의 높은 농도에서는 QscR의 활성을 강하게 억제하였다. \(5 \)b에서는 이러한 높은 농도에서의 QscR 활성 억제현상이 관찰되지 않았다(data not shown). 실험에 사용된 모든 농도 범위에서 두 저해제 모두 녹농균의 성장에는 큰 영향을 미치지 않았다. 이 결과는 멏 가지 중요한 사실을 시사해 준다. 첫째, 대장균을 이용한 실험에서는 \(5 \)b와 \(5 \)f가 모두 대장균에서 발현된 LasR의 활성을 억제할 수 있었는뎨, 녹농균에서는 LasR의 활성을 억제하지 못했다는 것은 대장균과 녹농균에서의 LasR의 접힘(folding)이 다소 다르게 일어날 가능성이 있다는 것을 시사한다. LasR의 경우 자신의 신호물질인 \(3 \)OC \(12 \)-HSL과 강하게 결합하고 있어, 보통의 투석 방법으로는 LasR로부터 \(3 \)OC \(12 \)-HSL을 유리시킬 수 없다는 것이 보고되어 있다. 이러한 현상은 LasR 단백질이 처음 접힘을 시작할 때 \(3 \)OC \(12 \)-HSL이 결합하여 들어가면서 접힘을 유도하기 때문으로 생각된다. 즉, \(3 \)OC \(12 \)-HSL이 없이는 적절한 접힘이 일어나지 않으며, 일단 \(3 \)OC \(12 \)-HSL과 함께 접힘이 일어나고 나면 \(3 \)OC \(12 \)-HSL은 가역적으로 빠져 나오지 않는 것으로 생각할 수 있다. 이와는 반대로 QscR의 경우는 같은 \(3 \)OC \(12 \)-HSL을 신호물질로 쓰면서도 \(3 \)OC \(12 \)-HSL의 결합과 유리가 가역적임이 밝혀져 있다. 이는 QscR } 은 \(3 \)OC \(12 \)-HSL이 없이도 적절한 접힘이 일어날 수 있으며, 접힘을 유지한 상태에서 \(3 \)OC \(12 \)-HSL이 다시 빠져나올 수 있음을 의미한다. 대장균의 경우는 스스로 acyl-HSL을 만들지 못하므로, QS 수용체를 발현시키거나 리포터를 이용한 QS 반응 측정시에 합성된 \(3 \)OC \(12 \)-HSL를 외부에서 첨가 하여야만 한다. 따라서 저해제와 \(3 \)OC \(12 \)-HSL가 모두 외부에서 들어오기 때문에, 처음 LasR 단백질이 합성되어 접힐 때 \(3 \)OC \(12 \)-HSL보다 저해제가 먼저 들어갈 수 있다. 하지만 녹농균은 스스로 \(3 \)OC \(12 \)-HSL을 포함한 여러 acyl-HSL을 합성하므로 \(3 \)OC \(12 \)-HSL은 내부에서 합성되어 있고 저해제는 외부에서 들어오기 때문에, 배양시 저해제를 빨리 넣더라도 LasR의 접힘 과정에서 일정 정도 \(3 \)OC \(12 \)-HSL가 우선적으로 들어갈 수 밖에 없다. LasR의 경우 일단 접힘이 일어나고 나면 그 구조가 매우 견고해서 \(3 \)OC \(12 \)-HSL이 빠져나올 수 없으므로 저해 효과도 나타나지 않을 수 있다고 생각된다. QscR의 경우는 LasR의 경우처럼 \(3 \)OC \(12 \)-HSL이 우선적으로 접힘 과정에 들어가더라도 다시 빠져나올 수 있으므로, 만약 저해제가 \(3 \)OC \(12 \)-HSL에 비해 QscR에 대한 결합력이 더 크다면 저해제가 \(3 \)OC \(12 \)-HSL을 대체해 들어갈 수 있을 것이다. 따라서 QscR에 대해서는 녹농균에서도 이들 저해물질들이 효과를 나타낼 수 있었을 것으로 생각된다. 또 한가지 중요한 시사점은 \(5 \)f의 경우 QscR에 대해서 농도에 따라 활성을 증가시키기도, 혹은 억제하기도 했다는 점이다. 사실 저해제도 \(3 \)OC \(12 \)-HSL처럼 수용체 단백질에 결합하여 그 구조를 변화시킬 수 있지만, \(3 \)OC \(12 \)-HSL의 경우 타겟 프로모터에 대한 결합과 전사활성화에 적합한 구조로 LasR이나 QscR의 구조를 변화시키는 반면, 저해물질은 프로모터 결합이나 전사활성에 부적절한 쪽으로 수용체 단백질의 구조를 변화시키는 것이라고 생각할 수 있다. 만약 그 구조가 프로모터 결합이나 전사활성에 적합한 형태로 수용체 단백질의 구조를 변화시킨다면 그 물질은 오히려 활성 물질이 될 수도 있을 것이다. 따라서 \(5 \)b의 경우 QscR에 결합하여 유도하는 구조 변화가 타겟 프로모터에 대한 결합이나 전사활성을 증가 시켰다고 생각할 수 있으며, \(5 \)f의 경우는 농도에 따라, 혹은 결합하는 \(5 \)f 분자 수에 따라 QscR이 구조가 단계적으로 변할 수 있는 경우라고 생각된다.</p>