전자공여능(Electron donation ability : EDA)은 각 추출물의 DPPH에 대한 수소공여 효과로 측정하였고, SOD 유사활성(Superoxide dismutase-like activity : SODA)은 pylogallol의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성으로 나타내었다. 또한 총 폴리페놀의 함량(total polyphenol content)은 Folins-Denis 방법을 이용하고, NO assay 및 세포활성(cell viabilit)을 측정하였다.
<h2>전자공여능(Electron donation ability : EDA) 측정</h2><p>전자공여능 측정은 Blois의 방법에 따라서 각 추출물의 DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl)에 대한 수소공여 효과로 측정 하였다. 추출시료를 DMSO에 녹여 농도별로 희석하여 시료 \( 40 \mu \mathrm{l} \)와 \( 1.5 \times 10^{4} \mathrm{M}\) DPPH 용액 \( 160 \mu \mathrm{l}\)를 섞은 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분 동안 반응시킨 다음 ELISA reader를 이용하여 \( 520 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능(Electron donating ability, EDA)은 \( \mathrm{EDA}(\%)= \) (대조구흡광도-시료첨가구흡광도)/대조구흡광도 \( \times 100 \)으로 계산하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조그룹과 흡광도차를 비교하여 프리라디칼의 제거활성을 백분율로 나타내었다.</p><h2>SOD 유사활성(Superoxide dismutase-like activity : SODA) 측정</h2><p>추출물의 SOD 유사활성은 Marklund 와 Marklund의 방법에 따라 과산화수소 \( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \)로 전환시키는 반응을 촉매하는 pylogallol의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성으로 나타내었다. 각 추출시료를 DMSO에 녹여 농도별로 희석하여, 시료 \( 10 \mu \mathrm{l} \)에 \( \mathrm{pH} 8.5\)로 보정한 Tris-HClbuffer (\(50 \mathrm{mM}\) tris [hydroxymethyl] aminomethane, \( 10 \mathrm{mM} \) EDTA, \( \mathrm{pH} 8.5)\) \( 150 \mu \mathrm{l} \)와 \( 7.2 \mathrm{mM} \) pyrogallol \( 10 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응 후 \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{~HCl}\) \(50 \mu \mathrm{l} \)를 가하여 반응을 정지 시켰다. 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양은 ELISA reader를 사용하여 \( 420 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. SOD 유사활성은 추출물첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율 (\(\%\))로 나타내었다.</p><p>\( \operatorname{SODA}(\%)=\left(1-\frac{A}{B}\right) \times 100 \)</p><p>\( \mathrm{A} \) : 추출물 첨가구의 흡광도, \( \mathrm{B} \) : 추출물 무첨가구의 흡광도</p><h2>총 폴리페놀의 함량측정</h2><p>총 폴리페놀의 함량(total polyphenol content)은 분석방법으로 널이 사용되고 있는 Folins-Denis 방법으로 측정하였다. Ethyl acetate 추출물을 DMSO에 농도별로 녹여, 10배로 희석한 액 \( 50 \mu \mathrm{l} \)에 Folin reagent \( 50 \mu \mathrm{l} \)을 가하고 3분간 정치한 다음 \( 50 \mu \mathrm{l} \)의 \( 10 \% \mathrm{~Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 용액을 가하였다. 이 혼합액을 1시간동안 정치한 후 ELISA reader를 이용하여 \(730 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 표준용액으로는 galic acid를 사용하였다.</p><h2>NO assay 및 cell viability 측정</h2><p>NO의 생성은 비색법으로 세포 상등액에 축적되는 nitrite 양을 측정하였다. 대식세포를 세포 배양판에 \( 5 \times 10^{5} \mathrm{cells}/\mathrm{ml}\)의 세포가 되도록 재부유하여 LPS의 자극하에 24시간 배양하고 그 배양 상층액 내의 \( \mathrm{NO} \)를 Griess 시약과 반응시켜 측정하였다. \( 100 \mu \mathrm{l} \)의 세포배양 상층액을 취하여 동량의 Griess 시약 [\(1 \%\) sulfanilamide ( \( 30 \% \) acetic acid)와 \( 0.1 \% \mathrm{~N} \)-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride \( (60 \% \) acetic acid) 혼합액]을 가하여 상온에서 20분간 반응시켰다. NO의 활성 정도는 ELISA 판독기를 사용하여 \( 800 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도 범위에서 \( 540 \mathrm{~nm} \) 흡광도를 측정하였다.</p><p>세포활성은 MTT assay에 의하여 측정하였다. 96-well microtiter plate (Nunc, Vangaard, Neptune, NJ)에 RAW 264.7 macrophage를 \( 1 \times 10^{5} \mathrm{cells}/\mathrm{well}\)의 농도로 분주하였다. 분주 24시간 후 각 추출물이 함유되어 있는 배지를 \( 100 \mu \mathrm{l} \)씩 넣어 48시간 동안 배양하였다. Plate에 MTT \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyl -tetrazolium bro-mide (MTT, Sigma) 용액을 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 씩 첨가하여 4시간 동안 배양시키고 formazan을 형성시킨 후 조심스럽게 상등액을 제거하였다. DMSO \(150 \mu \mathrm{l}\)를 첨가하여 formazan을 녹인 후 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다, 추출물의 농도는 10, 20, 50, 100, \(200 \mu \mathrm{l}/\mathrm{well}\)로 하였다.</p>