Cyclosporin A의 생산량을 증가시키기 위해, 모균주인 T. inflatum ATCC 34921에서 6-7배 높은 Cyclosporin A 생산성을 가진 변이주 YHC-004를 선정하였다. 이 변이주를 이용해 Cyclosporin A의 생산량과 비율을 개선하는 배지 최적화 실험을 수행하였다. Cyclosporin A의 아미노산 구성 성분 중에서, 분지 아미노산인 valine, leucine의 첨가 효과와 복합 첨가 효과를 검증하였다. 또한, 아미노산 공급원이자 질소영양원인 복합유기질소원들의 첨가 효과 역시 확인하였다. 이러한 방식으로 Cyclosporin A의 생산성을 향상시키는 방법론을 연구하였다.
<h1>서 론</h1> <p>Cyclosporin A는 메틸화된 leucine, valine 등 11개의 아미노산으로 구성된 환상형의 올리고펩타이드성 물질로서 신장 등의 장기이식 수술 후 면역 억제제로 널리 사용되고 있다. 또한 약하지만 좁은 항균스펙트럼을 지닌 항진균 활성, 항기생충 활성, 항염증 활성도 갖고 있다. 균사체형 불완전균류인 \(Tolypocladium~inflatum\)(일명 \(Tolypocladium ~niveum\)) 을 이용한 발효 공정으로 생산되는 cyclosporin 혼합물은 구조적으로 유사한 25 여종의 cyclosporin 유도체들로 이루어졌는데 그 가운데 면역억제제로서 활성이 가장 높은 것이 cyclosporin A이다. 25종의 cyclosporin derivative들 가운데, \(Tolypocladium~inflatum\)을 생산균주로 사용한 최적화된 배양 조건에서는 cyclosporin 유도체들 중 \( \mathrm{A}, \mathrm{B}, \mathrm{C}, \mathrm{D}, \mathrm{G}, \mathrm{U} \)등 6가지 유도체 거의 \( 100 \% \)를 조성하며, 그 가운데 cyclosporin A가 거의 \( 70 \% \)이상을 차지한다. Cyclosporin A는 자연계에 흔하지 않은 아미노산인 butenyl dimethyl threonine, 2-amino-butryic acid 그리고 D-alanine,을 1,2,8번 위치에 각각 지니고 있다. 최적화된 배양 조건에서 주로 생성되는 6가지 cyclosporin 유도체들은 단지 2번째와 6번째 아미노산만이 다른 화학적 구조를 가지고 있다(Fig. 1). Cyclosporin 발효공정에서 주요 유도체들인 A, B, C, D, G, U 등의 생성 농도와 유도체 구성비율이, 특정 아미노산들의 첨가에 따라 크게 변화된다고 보고 되었다.</p> <p>Cyclosporin A와 그 유도체들은 non-ribosomal 생합성 기작에 의한 11개 아미노산의 순차적인 활성화와 N-methylation, 그리고 cyclosporin synthetase에 의한 최종적인 oligopeptide 형성 등에 의해 생합성 된다. Agathos 등은 \(T. inflatum\)의 야생형 및 변이주를 사용한 cyclosporin A 생합성에서 질소원인 L-valine 혹은 L-thronine을 첨가할 경우 cyclosporin A 생성량과 구성비율이 변화함을 확인하였다. 탄소원의 경우 야생형은 sorbose, 변이주 M6는 maltose를 사용할 경우 cyclosporin A 생산성이 우수함을 보고하였다. 한편 Issac 등은 접종되는 spore의 농도와 그 형태가 cyclosporin A 역가와 구성비율에 미치는 영향에 대하여 보고하였다. Lee 등은 종균 접종에 사용할 \(Tolypocladium~niveum\)의 포자 형성 최적인 배지 조성과 cyclosporin A 생산성을 향상 시킬 수 있는 접종량을 보고하였다. 최근에 통계학적 방법인 factorial experimental design을 통한 cyclosporin A 최적화 연구를 통하여 탄소원으로 포도당, 설탕, 전분을 사용한 배지에서 생산성을 2배 향상 시킨 보고가 있었다. 또한 flask scale에서 bioreactor로 scale-up할 경우에 \( \mathrm{pH} \)를 5.9로 일정하게 조절해 줌으로써 균체 생장도 증가하였고, cyclosporin A의 생산성도 2배 정도 증가하였으며, 분해가 억제된 것으로 보고 되었다.</p> <p>Cyclosporin A를 산업적으로 생산하기 위해서는 주요 활성 성분인 cyclosprin A의 생산성 향상이 우선적으로 이루어져야하며, 정제공정을 용이하게 하고, 최종 제품의 품질 기준을 관리하기 위해 다른 cyclosporin 유도체들의 구성비율을 낮추는 것이 매우 중요하다. 따라서 본 연구에서는 우선 cyclosporin A의 생산성을 향상시키기 위하여 모균주인 \(T. inflatum \) ATCC 34921로부터 cyclosporin A 생산성이 6-7배 높은 고생산성 변이주 YHC-004를 선별하였고, 그 변이주를 이용하여 cyclosporin A의 생산성과 cyclosporin A의 비율을 높일 수 있는 배지 최적화 실험을 실시하였다. Cyclosporin A 분자의 구성 아미노산들 가운데 분지 아미노산인 valine, leucine 등의 단독 첨가 효과와 혼합 첨가효과를 확인하였고, 질소영양원이면서, cyclosporin A 생합성에 아미노산 공급원인 복합유기질소원들에 대한 첨가 효과도 확인하였다.</p>