수집한 각종 김치 시료로부터 생산 균주를 선별하여 평판 배지에 균질화시킨 후 colony를 선별하였다. 고체배지 상에서 배양 후 형성된 colony를 액체배지에 접종, 배양하여 원심분리 후 상층액을 조효소액으로 사용하였다. Collagen 기질을 특정 조건에서 반응시킨 free alpha\(\alpha\)-amino group을 ninhydrin법에 의해 흡광도를 측정한 후 표준 검량선을 구하여 Collagenase의 활성을 측정하였다. 효소 생산 최적 배지 조건에서 배양한 원심분리 상층액을 농축하여 얻은 조효소액으로 Collagenase를 정제를 실시하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>균주 분리용 시료 및 사용 배지</h2><p>가정으로부터 수집된 각종 김치 시료로부터 collagenase 생산 균주를 선별하였다. Collagenase 생산 균주의 분리용 평판 배지는 \( 0.3 \% \) collagen (Insoluble Type Ⅰ, Sigma), \(0.1\%\) yeast extract, \(0.7\%\) \( \mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\), \(0.2 \%\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\), \(0.01 \%\mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(0.05 \%\) citrate \( \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \), 그리고 \( 1.5 \% \) agar로 구성된 것을 사용하였다. 평판 배지에 균질화시킨 시료를 도말하여 colony를 선별하였다.</p><h2>사용 균주 및 배양 조건</h2><p>분리용 배지에서 collagenase 생산을 확인한 균주들은 collagen 대신에 gelatin으로 대체된 액체배지에서 배양하였다. 고체배지 상에서 \( 3 \sim 4\)일 배양한 후 형성된 colony를 액체 배지에 접종하고, \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), \(200 \mathrm{rpm} \)에서 \(2 \times 3\)일 배양한 다음 원심분리하여 \( (17,000 \times \mathrm{g}\), \(30 \mathrm{~min} \), BECKMAN COULTER, Avati J-E centrifuge, USA) 상층액을 조효소액으로 사용하였다.</p><h2>Collagenase 활성 측정</h2><p>Collagenase 활성 측정은 collagen를 기질로 사용하여 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시킨 다음 반응 전후의 free \(\alpha\)-amino group을 Ninhydrin법에 의해 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정한 후 leucine에 대한 표준 검량선으로부터 구하였다. 효소 \(1 \mathrm{~unit}\)는 1분 동안 \(1 \mathrm{~μmol}\)의 leucine을 생산하는 효소의 양으로 정의하였다. 총 단백질의 농도는 Bradford assay법을 사용하여 \( 595 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.</p><h2>조효소액의 조제</h2><p>효소 생산 최적 배지 조건에서 72시간 동안 배양한 배양액을 원심분리 \( (17,000 \times \mathrm{g}, 30 \mathrm{~min}) \) 한 후 상층액을 취하여 ultrafiltration (Millipore YM10 membrane, Amicon Co., USA)으로 농축한 후 조효소액으로 사용하였다.</p><h2>Collagenase의 정제</h2><p>조제한 조효소액을 \( 4 \mathrm{mM} \mathrm{CaCl}_2 \) 를 포함하는 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\) 완충액 (buffer A, \(\mathrm{pH} 7.4\))으로 평형화시킨 Amberlite IRA-900 column \( (1.8 \mathrm{~cm} \times 15 \mathrm{~cm} \), Sigma Co., USA)에 \( 0.5 \mathrm{ml} / \) \( \mathrm{min} \) 유속으로 \( \mathrm{NaCl} \)을 이용하여 \( 0 \sim 1.5 \mathrm{M} \) 까지 농도 구배를 주면서 단백질을 용출시켰다. 활성 분획을 회수하여 ultrafilteration을 이용하여 농축시킨 후, buffer A로 평형화시킨 Sephacryl S-300 HR column \( (1.8 \mathrm{~cm} \times 53 \mathrm{~cm} \), Pharmacia Co., Sweden)에 \( 0.15 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 유속으로 단백질을 용출시켰다. 활성 분획을 회수하여 ultrafilteration을 이용하여 농축시킨 다음 DEAE-Sephadex A-50 column \( (1.8 \mathrm{~cm} \times 15 \mathrm{~cm} \), Pharmacia Co., Sweden)에 \( 0 \sim 1.5 \mathrm{M} \)까지 \( \mathrm{NaCl} \) (buffer A, \(\mathrm{pH} 7.4\)) 농도 구배를 주면서 \( 0.5 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \)의 유속으로 정제를 실시하였다.</p>