신경세포 손상정도 측정을 위해 \( 100 \mu \mathrm { M } \) 농도로 전처리한 시료를 24시간 동안 세포배양 후 10분간 원심분리 하여 취한 상등액을 LDH 세포독성 검출 키트로 측정하였으며, Microplate reader로 \( 490 \mathrm { nm } \)에서 흡광도를 측정하고, 시료를 첨가하지 않은 정상 대조군을 \( 100 \ % \)로 하여 각 실험군의 상대적인 세포 독성을 구하였다. 모든 실험 결과는 mean\( \pm \mathrm { SD } \)로 Graph-pad prism 5 software를 이용하여 ANOVA 분산분석과 Tukey's multiple comparison test로 각 실험군 간 차이의 통계적 유의성 검정을 시행하였며\( ( p< 0.05 ) \), 결과들을 종합해 문헌과 비교하여 isosalicin로 구조 동정 하였다.
<h2>LDH assay</h2> <p>시료 \( 100 \mu \mathrm { M } \) 농도로 \(2 \) 시간 동안 전처리 한 후, \( 200 \mu \mathrm { M } \) \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 를 처리하여 \(24 \)시간 동안 배양한 후, 세포 배양액을 취하였다. \(10 \) 분간 원심분리 \( \left (250 \times \mathrm { g } , 4 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \) 하여 \( 100 \mu \mathrm { L } \) 상등액을 취한 후, LDH 세포독성 검출 키트(Takara bio inc, Tokyo, Japan)를 이용하여 신경세포 손상 정도를 측정하였다. 최종적으로 Microplate reader를 이용하여 \( 490 \mathrm { nm } \) 에서 흡광도를 측정하였고, 시료를 첨가하지 않은 정상 대조군을 \( 100 \% \) 로 하여 각 실험군의 상대적인 세포 독성을 구하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험 결과는 mean \( \pm \mathrm { SD } \) 로 나타내었고 \( (n=3) \), 각 실험군 간 차이의 통계적 유의성은 Graph-pad prism \(5 \) software를 이용하여 ANOVA 분산분석과 Tukey's multiple comparison test로 유의성 검정을 시행하였다 \( (p<0.05) \).</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <p>화합물 \(1 \)은 White amorphous powder 형상으로서 TLC 전개 후, \( 10 \% \) 황산 발색 시 갈색으로 발색 되었다. Positive ESI/MS 에서 \( m / z \) \(287[ \mathrm { M } + \mathrm { H } ] ^ { + } \) peak의 관측으로 질량 값은 \(286 \) \( [ \mathrm { M } ] ^ { + } \)로 확인하였다. \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \)-NMR \( \left (400 \mathrm { MHz } \right . \), methanol- \( \left .d_ { 4 } , \delta_ {\mathrm { H } } \right ) \) 의 olefin 영역에서 네 개의 olefin methine proton signal \( \left [ \delta_ {\mathrm { H } } 7.75 \right . \) \((1H, dd,J=7.6,1.6 \mathrm { Hz } , \mathrm { H } -6 \) ), \( 7.22 \) \((1H, ddd, J=8.0,7.6,1.6 \mathrm { Hz } , \mathrm { H } -4) \), \(7.11 \) \((1H, dd, J=8.0,1.2 \mathrm { Hz } , \mathrm { H } -3) \), \(6.93 \) \((1H, ddd,J=7.6,7.6,1.2 \mathrm { Hz } , \mathrm { H } -5) \) ]을 통해 \(1,2 \)-치환 benzene ring 이 하나 존재함을 예상하였고, 산소가 치환된 methylene proton signal \( [ \delta_ {\mathrm { H } } 5.46(1 \mathrm { H } , \mathrm { d } , J=12.4 \mathrm { Hz } , \mathrm { H } -7 \mathrm { a } ) \), \(5.24(1 \mathrm { H } , \mathrm { d } , J=12.4 \mathrm { Hz } , \mathrm { H } -7 \mathrm { ~b } )] \) 을 관측하였다. 한 개의 hemiacetal proton signal \( \left [ \delta_ {\mathrm { H } } 5.09 \left (1 \mathrm { H } , \mathrm { d } , J=7.6 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } -1 ^ {\prime } \right ) \right ] \) 및 산소가 치환된 영역에서 네 개의 oxygenated methine proton signal \( \left [ \delta_ {\mathrm { H } } 4.25 \right (1 \mathrm { H } , \mathrm { m } , \mathrm { H } -2 ^ {\prime } ) \), \( 4.25 (1 \mathrm { H } , \mathrm { m } , \mathrm { H } -4 ^ {\prime } ) \), \( 4.12 (1 \mathrm { H } , \mathrm { dd } , J=8.8,8.8 \mathrm { Hz } , \mathrm { H } -3 ^ {\prime } ) \), \(3.91 \left (1 \mathrm { H } , \mathrm { m } , \mathrm { H } -5 ^ {\prime } \right ) \), 그리고 한 개의 oxygenated methylene proton signal \( \left [ \delta_ {\mathrm { H } } 4.51(1 \mathrm { H } \right . \), dd, \( J=11.6,2.4 \mathrm { Hz } , \mathrm { H } -6 ^ {\prime } \)a), \( \left .4.39 \left (1 \mathrm { H } , \mathrm { dd } , J=11.6,5.2 \mathrm { Hz } , \mathrm { H } -6 ^ {\prime } \mathrm { b } \right ) \right ] \) 로부터 한 개의 당이 존재함을 예상하였다. \( { } ^ { 13 } \mathrm { C } \)-NMR \((100 \mathrm { MHz } \), methanol- \( d_ { 4 } , \delta_ {\mathrm { C } } \) ) spectrum에서 탄소수가 \(13 \) 개임을 확인하였고, 이를 통해 phenylmethyl glycoside임을 확인하였다. 또한 당에서 유래한 한 개의 hemiacetal carbon signal \( \left [ \delta \mathrm { c } 104.4 \left ( \mathrm { C } -1 ^ {\prime } \right ) \right ] \), 네 개의 oxygenated methine carbon signals [ \( \delta \mathrm { c } 78.6 \left ( \mathrm { C } -3 ^ {\prime } \right ), 78.6 \) \((C-5 ^ {\prime } \) ), \( 75.3 (C-2 ^ {\prime } ) \), \( 71.7 \left ( \mathrm { C } -4 ^ {\prime } \right ) \), 한 개의 oxygenated methylene carbon signals [äc \( \left .62.8 \left ( \mathrm { C } -6 ^ {\prime } \right ) \right ] \) 의 chemical shift 및 anomer proton signal의 결합 정수 \( (J=7.6 \mathrm { Hz } ) \) 로부터 당의 구조가 \( \beta- \) glucopyranose임을 확인하였다. Aglycone에서는 한 개의 oxygenated olefin quaternary carbon signal [ \( \delta \mathrm { c } 156.5( \mathrm { C } -2)] \), 한 개의 olefin quaternary carbon signal \([8c 125.8 (C-1)] \), 네 개의 olefin methine carbon signal [ \( \delta \mathrm { c } 129.7 (C-6) \), \( 129.0 (C-4) \), \( 119.5 (C-5) \), \( 115.9 (C-3) \)], 한 개의 oxygenated methylene carbon signal [ \( \delta \mathrm { c } 67.3 (C-7) \)]을 관측하였다. 당의 결합 위치를 확인하기 위하여 gHMBC 를 측정하였다. 그 결과, anomer proton \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } 5.09, \mathrm { H } -1 ^ {\prime } \right ) \) 이 C- \(7 \)의 oxygenated methylene carbon \( ( \delta \mathrm { c } 67.3) \)과 cross peak를 보여 glucose가 \(7 \)번에 결합하고 있음을 알 수 있었다. 이를 종합해 문헌과 비교한 결과, isosalicin로 구조 동정 하였다.</p>