시료에 효소액을 첨가하여 NADH 산화 의한 흡광도 감소를 측정하여 효소 활성도를 알아보았고 얻은 단백질을 정량 및 전기영동법을 수행 후 효소 활성이 있는 부분을 정제하여 크로마토그래피를 수행하고 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약</h2> <p>Bovine serum albumin, NADH, glycine, ethylenediam-inetetraacetic acid (EDTA), N, N, N', N'-tetramethylethylen-ediamine (TEMED), acrylamide, sucrose, N, N'-methylene-bisacrylamide, CM-sepharose, Sephacryl S-200-HR, brom-ophenol blue, Coomassie brilliant blue R-250, lauryl sulfate, ammonium persulfate, Tris[hydroxymethyl]amino-methane, ammonium sulfate, TCA 등은 Sigma사 제품을 사용하였다. 1,4-benzoquinone, methyl-1,4-benzoquinone, 1,4-naphthoquinone, 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone, 2-hy-droxy-1,4-naphthoquinone, dicumarol, methyl orange, an-thraquinone, Cibacron blue 3GA, 1-aminoanthraquinone, phenanthrenequinone, 4-nitrosophenol, nitrosobenzene, 4-nitroacetophenone, cyclohexanone, pyruvic acid, 2-benzoylpyridine, p-anisaldehyde, 4-(dimethylamino)benzaldehyde 등은 Aldrich사에서 구입하였으며 Coomassie brilliant blue G-250은 Bio-rad사에서 구입하였다. 기타 시약은 특급 내지 일급 시약을 사용하였다.</p> <h2>효소 활성도 측정</h2> <p>Assay tube에 \( 25 \mathrm{mM} \) Tris-\( \mathrm{HCl}\)(\(\mathrm{pH} 8.0\)), \( 200 \mu \mathrm{M} \) NADH, \( 250 \mu \mathrm{M} \) 1,4-benzoquinone, 효소액을 첨가하여 Shimadzu model 3100 UV-NIR spectrophotometer를 사용하여 \(340 \mathrm{nm} \)에서 NADH 산화에 의한 흡광도 감소를 측정하였다. Quinone reductase의 \( 1 \mathrm{unit}\)는 1분당 \( 1 \mu \mathrm{mol} \)의 NADH의 산화를 촉매하는 양으로 정의하였다.</p> <h2>단백질 정량 및 전기영동법</h2> <p>단백질 정량은 bovine serum albumin (BSA)을 표준물질로 하여 Bradford법으로 정량하였다. Polyacrylamide gel electrophoresis는 Laemmli법에 따라 수행하였다.</p> <h2>효소 정제</h2> <p>1,4-benzoquinone reductase를 Kim and Shin 방법으로 정제하였다. 소 간에 \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA를 포함하는 \( 50 \mathrm{mM} \) potassium phosphate 완충액 (\(\mathrm{pH}7.5\))를 가한 다음 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 균질화시키고 균질액을 \( 10,000 \times\mathrm{g} \)에서 15분간 원심분리하였다. 상층액을 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2}\mathrm{SO}_{4} \)로 \( 50 \% \) 포화시켜 \( 20,000 \times \mathrm{g} \)에서 15분간 원심분리하여 침전물을 제거한 후 상등액에 다시 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \)로 \( 75 \% \) 포화시켜 \( 20,000 \times \mathrm{g} \)에서 15분간 원심분리하여 침전물을 얻었다. 이 침전물을 \( 1 \mathrm{mM}\) EDTA를 포함하는 \( 10 \mathrm{mM} \) potassium phosphate 완충액 (\(\mathrm{pH}~ 7.0 \), 완충액 A)에 녹인 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 투석한 효소 용액을 완충액 A로 평형시킨 CM-Sepharose 컬럼에 loading 하였다. 같은 완충액으로 충분히 씻어준 후 \( 0 \sim 0.5 \mathrm{M} \) \(\mathrm{NaCl}\) 상승 농도 기울기로 단백질을 용출시켰다. 효소 활성부분을 모아 농축하여 완충액 A로 평형화한 Sephacryl S-200 컬럼에 가해 같은 완충액으로 전개시킨 후 효소 활성이 있는 분획을 모아 다음 실험에 사용하였다. 이상의 과정은 모두 \( 0 \sim 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 수행하였다.</p> <h2>Thin layer chromatography (TLC)</h2> <p>Silica gel 60F-254 plate를 사용하여 TLC를 수행하였으며 hexane/ethylacetate (\(6:4\)) 용액을 전개액으로 사용하였다.</p> <h2>Gas chromatography (GC)</h2> <p>HP5 column과 flame ionization detector (FID)가 장착된 Hewlett-Packard 6890 Plus gas chromatograph system을 사용하였다. Oven temperature는 \( 15^{\circ} \mathrm{C} / \mathrm{min} \)로 \( 100\sim300{ }^{\circ} \mathrm{C} \)로 프로그램 하였으며 injection port temperature는 \(200 { }^{\circ} \mathrm{C} \), detector temperature는 \( 300^{\circ} \mathrm{C} \)로 조절하였다. Gas flow rate는 질소 \( 1 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \), 수소 \( 20 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \), 공기 \( 200 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \)이었다.</p> <h2>GC-mass spectrometry (GC-MS)</h2> <p>HP6890 Plus gas chromatograph에 연결된 HP 5973 mass spectrometer로 \( 70 \mathrm{eV} \)에서 수행하였다. Oven temperature는 \( 15^{\circ} \mathrm{C} / \mathrm{min} \)로 \( 100-250^{\circ} \mathrm{C} \)로 프로그램 하였다.</p> <h2>Nuclear magnetic resonance spectrometry (NMR)</h2> <p>Jeol-LA-300 NMR spectrometer를 사용하여 \( 300 \mathrm{MHz} \)에서 \( \mathrm{CDCl}_{3} \)를 사용하여 proton NMR spectra를 얻었다.</p>