본 논문의 실험에서는 \(660\mathrm{nm}\) 다이오드 레이저를 사용하여 흡수 스펙트럼이 최대인 광감작제를 적용했다. 세포는 플라스크에 부착되어 자란 후 트립신 처리 후 계대배양했다. 6주령의 BALB/C/nu/nu 숫컷 누드마우스를 멸균 소독된 환경에서 유지되는 온습도로 사육했다. 실험군은 광감작제 첨가 배지, 레이저 조사만 시행한 배지, 그리고 광감작제가 녹여진 에탄올 첨가 배지로 구성되었다. 광감작제와 레이저 조사의 세포 독성을 평가하기 위해 MTT assay를 사용했다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>광감작제 및 레이저</h2><p>광감작제는 금호 생명과학연구소에서 녹조류의 클로로필을 산화반응과 산처리를 통해 10-hydroxypheophytin a 유도체로 만든 다음 이를 유기용매를 이용하여 추출한 10-hydroxypheophytin와 10-hydroxypheophytin a 유도체의 유도체를 유기합성 후 안정된 구조 및 대량 수율이 가능한 9-hydroxypheophorbide-a (9-HpbD-a)와 9-hydroxypheophorbide-a red (9-HpbD-a red)를 사용하였다.</p><p>레이저는 새로운 광감작제가 최대 흡수 스펙트럼을 보이는 \(660\mathrm{nm}\) 다이오드 레이저(Golden Light, Korea)를 사용하였다.</p><h2>세포 배양</h2><p>인체 하인두암 환자들의 수술 중에 채취한 조직에서 수립된 SNU-1041 편평상피세포암종의 세포주를 RPMI-1640(GibcoBRL, USA) 배양액 \(500\mathrm{ml}\)에 우태혈청(GibcoBRL,USA) \(50\mathrm{ml}\)와 antibiotic-antimycotic solution (Gibco, BRL) \(5.5\mathrm{ml}\)를 섞은 세포배양액으로 세포배양 플라스크(Nunc,Denmark)를 이용하여 \(5\%\)의 탄산가스와 \(95\%\)공기가 공급되고 적절한 습도와 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)의 온도가 유지되는 배양기(ThermoForma, USA)에서 배양하였으며 세포의 모양을 도립현미경(Olympus CK40, Japan)을 통하여 관찰하였다. 세포들은 플라스크 바닥에 부착하여 자랐으며 트립신(GibcoBRL, USA)처리 후 계대배양하였다.</p><h2>실힘동물 및 사육조건</h2><p>6주령의 BALB/C/nu/nu 숫컷 누드마우스(Charles River,Japan)를 온도는 \(22 \sim 23 ^{\circ} \mathrm{C} \), \(40 \sim 60\%\)로 유지되는 항온항습기(Jeung Do Industry Co, korea)에서 멸균 소독된 물과 방사능으로 조사한 멸균된 사료로서 급수 급식하면서 사육하였다.Clean rack에 4 mice/cage씩 나누어 무균적으로 3-4일에 한번씩 멸균된 깔집으로 교환하였으며 3-4일에 한 번씩 Hibitan용액으로 복도와 무균실내를 청소하였고 손은 \(70 \%\) 에탄올로 소독하고 소독된 일회용 장갑을 착용하여 세균에 감염되지 않도록 사육하였다.</p><h2>세포 독성능 측정</h2><h3>형태학적 변이 관찰</h3><p>96 well plate에 24시간 동안 배양한 세포에 \(0.2 \mathrm{μm}\) 주사기필터(Gelman, USA)로 광감작제 \((75 μ\mathrm{g/ml}\)) \(100 μ \mathrm{l}\)를 세포배양배지로 희석하여 2배수 희석을 통하여 광감작제의 농도를 줄여나갔다. 광감작제를 투여 후 레이저 조사까지의 시간과 레이저 조사시간을 다르게 하여 레이저조사를 시행하였다. 72시간 동안 도립현미경으로 세포의 형태학적 변이를 관찰하면서 광감작제와 레이저조사에 의한 독성능을 평가하였다. 대조군으로 광감작제만을 세포배양 배지에 첨가하여 배양한 실험군, 광감작제를 투여하지 않고 plate에 레이저조사만을 시행하고 배양한 실험군, 그리고 광감작제가 녹여져 있는 에탄올(Merck, Germany)만을 세포배양 배지에 첨가하여 배양한 실험군으로 하였다.</p><h3>MTT assay</h3><p>광감작제와 레이저조사가 세포에 미치는 독성능을 알아보기 위해 MTT assay 방법을 이용하였다. 96 well plate에 24시간 동안 배양한 세포에 광감작제\((75 μ\mathrm{g/ml}\)) \(100 μ \mathrm{l}\)를 2배수 희석을 통하여 광감작제의 농도를 줄여나갔으며 대조군으로 광감작제만을 세포배양 배지에 첨가하여 배양한 실험군, 광감작제를 투여하지 않고 plate에 레이저조사만을 시행하고 배양한 실험군 그리고 광감작제가 녹여져 있는 에탄올(Merck,Germany)만을 세포배양 배지에 첨가하여 배양한 실험군으로 하였다. 72시간을 배양한 후 각각의 well에 \(50 \mu \mathrm{l}\)의 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]용액(\(2 \mu \mathrm{g/ml}\), Sigma)을 첨가하고 4시간 배양 후 각 well의 배지를 모두 제거하고 \(150 \mu \mathrm{l}\)의 dimethylsulfoxide (DMSO:KANTO, Japan)를 첨가한 후 microplate reader (BIO-RAD550, USA)로 \(540 \mathrm{nm}\)에서 흡광도를 측정하였다. 생존율은 다음의 식을 이용하여 측정하였으며 광감작제의 농도마다 4개의 well의 평균 흡광도값을 계산하여 결과로 사용하였다.</p><p>Cell viability \( (\%)=\frac{\text { Mean optical density in test well }}{\text { Mean optical density in control well }} \times 100 \)</p>