C. neoformans 유전자의 기능규명을 위해 일반적으로 사용되는 방식은 유전자 특이적 결손변이체를 제조하고 형질분석을 수행하는 것으로, 유전자변이체의 제조를 위해서는 overlap PCR 방법, 혹은 최근 반용선 교수 연구실에서 도입한 split-marker transformation 방법 등을 사용할 수 있다. 또한 유전자 발현 분석을 위하여 제조된 다양한 유전자 변이체에 대한 비교전사체분석을 진행하여 주목할만한 유전자를 선정하는데, 이러한 유전자가 실제로 예측된 기능을 갖는지 확인하려면 유전자변이체 제조에 의한 형질분석이 추가적으로 필요하다.
<h2>C. neoformans 유전자의 기능규명 방법</h2> <p>C. neoformans 유전자의 기능규명에 가장 일반적으로 많이 사용되는 방법은 유전자 특이적 결손변이체 (targeted gene-deletion mutant) 제조와 이의 형질분선 (phenotypic analysis)이다. 일반적으로 유전자변이체를 만들기 위한 gene-disruption cassette는 타깃 유전자의 \( 5^{\prime} \) 과 \( 3^{\prime} \) 영역의 약 \( 1 \mathrm{~kb} \) 크기의 flanking region과 dominant selectable marker인 NAT(Nourseothricin acetyltransferase) 사이의 overlap PCR 을 이용해 제조한다. C. neoformans는 일반적으로 곰팡이에 사용되는 형질전환 방법으로는 효과가 없기 때문에 particle delivery system(gene-gun이라고도 불리움)에 의한 biolistic transformation 방법으로 형질전환을 하고 있다. 최근에 반용선 교수 연구실의 경우에는 비효율적인 overlap PCR의 단점을 극복하고 단기간 내에 대용량의 유전자 결손변이체를 만들기 위해, 일부 곰팡이에서 효과적으로 사용된 바 있는 split-marker transformation 방법을 최초로 C. neoformans에 도입하였다. Split-marker transformation 방법은 double joint PCR(DJ-PCR)을 이용하여 기존의 overlap PCR 방법과는 달리 NAT selectable marker를 두 조각으로 나누어 합성하는 방법으로, gene-disruption cassette를 횔씬 더 쉽고 효율적으로 제조할 수 있고, 변이체 수득율을 향상시킬 수 있음이 연구를 통해 밝혀졌다. 이러한 방법을 통해 현재 반용선 교수 연구실에는 총 842개의 유전자변이체가 제조되어 보관 중에 있으며, 최근에 Hiten Madhani 그룹(University of California, San Francisco)에 제조한 1,200여개의 유전자 변이체 라이브러리와 함께 약 2,000 여 개의 유전자변이체를 보유하고 있다. 이들 유전자 결손 변이체들은 다양한표현형질분석(phenotypic analysis)과 동물실험을 통하여 병원성조절 여부를 검증하고 있다.</p> <p>이러한 개별유전자의 기능분석 이외에 유전체 수준의 유전자 발현 분석을 위해서 C. neoformans에서는 비교적 저렴한 가격(\$40/chip)으로 DNA microarray chip이 공급되고 있어, 현재 전 세계정으로 많은 전사체(transcriptome) 연구가 이루어지고 있다. 반용선 교수 연구실도 DNA microarray 분석시설을 갖추고 C. neoformans에서 제조된 다양한 유전자 변이체에 대한 비교전사체분석(comparative transcriptome analysis)을 진행하고 있다. 현재 분석에 쓰이는 DNA micro-array slide에는 Cryptococcus의 serotype A와 D genome을 이용해 만든 두 가지 종류의 slide가 있어 두 가지 serotype에 대한 연구가 모두 가능하다. 비교전사체 분석을 통해 특정 생육환경 및 스트레스 상황에 반응하는 유전자의 동정 및 유전자변이체의 전사체 발현 양상을 파악하여 정량적으로 주목할만한 변화를 보이는 유전자를 선정하는뎨, 이러한 유전자가 예측된 기능을 실제로 갖는지 확인하기 위해서는 역시 유전자변이체 제조에 의한 추가적인 형질분석이 필요하다.</p>