부산물로 여겨지는 애플망고 껍질의 Tyrosinase 저해 활성 확인을 통하여 멜라린 생성에 관여하는 MITF, tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 단백질 및 mRNA 발현 측정으로 미백 화장품 재료로서의 높은 가능성을 확인하였다. 애플 망고껍질의 저해 활성을 확인하기 위해 열수 추출물, 에탄올 추출물을 활용한 실험을 진행하였고 단백질 발현량 등을 측정하여 미백 효과에 대한 검증을 하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>Tyrosinase 저해활성</h2><p>사람의 피부색을 결정하는 주요 인자 중 하나로 멜라닌 색소가 알려져 있으며 이는 멜라닌 생성 세포 내에서 합성이 일어나 각질형성세포로 전달되어 피부의 바깥층으로 이동하여 피부색을 결정한다. Tyrosinase는 구리를 함유한 효소로 멜라닌 생합성에서 중요한 역할을 하고 있다. 추출물이 멜라닌 합성을 효과적으로 억제하는지 확인하기 위해 mushroom 유래의 Tyrosinase 저해 활성 측정이 유용한 방법으로 알려져 있다.</p><p>애플망고 껍질의 열수 및 에탄올 추출물의 Tyrosinase 저해 활성 측정 결과 Fig. 1 과 같이 나타내었다. 애플망고 껍질의 Tyrosinase 저해 활성은 \( 1,000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서 열수 추출물은 \( 9.51 \%\), \(70 \% \) 에탄올 추출물에서는 \( 35.98 \% \)의 저해 활성을 확인하였다. 열수 추출물에 비해 \( 70 \% \) 에탄올 추출물이 더 높은 tyrosinase 저해활성을 보였다.</p><h2>MTT Assay에 의한 세포 생존율</h2><p>세포 생존율을 측정하는 방법으로 담황색 기질인 MTT가 살아있는 세포의 미토콘드리아 내의 redoxase의 효소 작용으로 인해 환원되어 보라색의 formazan을 생성하는데 이를 용해액으로 용해시킨 후 살아있는 세포의 수를 흡광도로 측정하는 방법이다.</p><p>애플망고 껍질의 열수 및 에탄올 추출물에 대한 멜라노마 세포인 B16-F10의 세포 생존율을 MTT assay를 활용하여 측정한 결과 Fig. 2와 같이 확인하였다. 애플망고 껍질의 열수 및 에탄올 추출물은 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도에서 각각 \( 95.64 \%\), \( 103.36 \% \) 이상의 세포 생존율을 나타내었다. 따라서 이후 B16-F10에서의 세포실험은 \( 95 \% \) 이상의 세포생존율을 나타낸 농도 이하인 5, 10, 50, 100 \(\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 설정하여 실험을 진행하였다.</p><h2>Western blot을 통한 MITF, Tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2 단백질 발현 억제 효과</h2><p>멜라닌 세포에서 멜라닌 생합성 단계에 관여하는 효소로 MITF, Tyrosinase, TPR-1 및 TRP-2의 인자가 알려져 있으며, 이러한 효소들은 \( \alpha\)-MSH에 의해 유도된다. 이 중 Tyrosinase는 멜라닌 생성에 있어 가장 중요한 역할을 하며 이는 DOPA와 L-tyrosine을 기질로 하여 DOPA quinone으로 산화시켜 멜라닌의 생성을 증가시키는 원인이다. 또한 DHICA를 indole-5,6-quinone-2-carboxylic acid로 산화시키는 TRP-1과 DOPA chrome을 DHICA로 전환시키는 TRP-2에 의해 멜라닌 종류 중 유멜라닌이 생성된다. 이러한 Tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 주요 전사 조절인자로 MITF가 보고되어져 있으며, 이러한 멜라닌 생성과 관련된 기전을 억제하는 것이 중요하다.</p><p>애플망고 껍질의 열수 및 에탄올 추출물에 의한 멜라노마 세포인 B16-F10 세포를 사용하여 미백 관련 인자인 MITF, Tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 단백질 발현을 western blot을 통해 확인하였으며, Fig. 3과 4에 나타내었다. B16-F10 세포에 자극제인 \( \alpha\)-MSH를 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도로 단독 처리군 및 시료군에 처리하였으며, \( \alpha\)-MSH와 시료를 처리한 구간을 실험군으로 사용하였다. 또한, \( \alpha\)-MSH 및 시료를 처리하지 않은 군을 무처리군으로 하여, \( \alpha\)-MSH 단독 처리군과 비교하여 결과를 나타내었다. 이때, positive control로는 발현이 일정하게 발생하는 housekeeping gene인 \( \beta \)-actin을 사용하여 인자와 비교하였으며, \( \alpha \)-MSH 단독 처리군에 비해 \( \alpha\)-MSH 무처리군에서 멜라닌 생성 인자들의 단백질 발현량이 저해되는 것을 확인하였다. MITF, Tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 단백질 발현량 측정 결과, \( \alpha\)-MSH 처리군에 비해 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서 열수 추출물은 각각 \( 59 \%\), \(65 \%\), \(26 \%\), \(18 \% \)가 나타났고, 에탄올 추출물은 각각 \( 64 \%\), \(40 \%\), \(18 \%\), \(52 \% \)의 억제 효과를 나타내었다.</p><h2>RT-PCR을 통한 MITF, Tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2 mRNA 발현 억제 효과</h2><p>멜라닌 생성 반응은 자외선에 의해 자극받은 멜라닌 형성 세포가 피부를 보호하기 위해 피부색을 검게 변화시키는 반응을 말하며, 불용성 중합체인 흑색의 eumelanin이 발생한다. 멜라닌 형성 세포의 세포막의 melanocortin 1 receptor (Mc1R)가 멜라닌 합성을 유도하며, 멜라닌 형성 조절 인자인 MITF가 세포 핵으로 이동하여 멜라닌 합성 관련 유전자 발현을 증가시키고 tyrosinase에 결합하여 멜라닌 생성을 발생시킨다. 따라서 미백 관련 효소인 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 활성을 조절하고, MITF의 발현을 억제하는 소재에 대한 연구 결과를 통해 미백 소재로서의 가능성이 있음을 확인할 수 있다.</p><p>미백효과를 확인하기 위해 미백 관련 인자인 MITF, Tyrosinase, TRP-1 및 TRP- 2의 mRNA 발현 억제 효과를 측정하기 위해 B16-F10 세포를 이용하여 RT-PCR을 진행하였다. B16-F10 세포에 자극제인 \( \alpha\)-MSH를 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도로 단독 처리군 및 시료군에 처리하였으며, \( \alpha\)-MSH와 시료를 처리한 구간을 실험군으로 사용하였다. 또한, \( \alpha\)-MSH 및 시료를 처리하지 않은 군을 무처리군으로 하여, \( \alpha\)-MSH 단독 처리군과 비교하여 결과를 나타내었다. mRNA의 발현량을 측정한 결과는 Fig.5 와 6에 나타내었다. 이때, positive control로는 발현이 일정하게 발생하는 housekeeping gene인 GAPDH을 사용하여 인자와 비교하였으며, \( \alpha \)-MSH 단독 처리군에 비해 \( \alpha \)-MSH 무처리군에서 멜라닌 생성 인자들의 mRNA 발현량이 낮은 것을 확인하였다. MITF, Tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 mRNA 발현량은 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서 열수 추출물은 각각 \( 27 \%\), \(44 \%\), \(40 \%\), \(22 \% \) 억제 효과를 나타내었고, 에탄올 추출물은 각각 \( 9 \%\), \(51 \%\), \(11 \%\), \(52 \% \)의 억제 효과를 나타내었다.</p><p>본 연구에서는 부산물인 애플망고 껍질을 활용하여 화장품의 천연 소재로서의 미백 효과에 대한 효능을 검증하고자 하였다. 최근 열대과일인 애플망고가 국내 재배가 가능해져 수요가 많아지고 있다. 하지만 과육이 제거된 껍질은 부산물로 버려지고 있으며 이에 대한 연구는 매우 부족한 실정이다. 본 연구 결과를 토대로 애플망고 껍질 열수 및 에탄올 추출물의 tyrosinase 저해 활성과 멜라닌 생성 관련 인자인 MITF, tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 단백질 및 mRNA 발현 측정 결과 우수한 저해 효과를 확인하여 미백 관련 화장품 소재로서의 활용 가능성이 있는 것으로 판단된다.</p>