DLD-1, WiDr 대장암세포는 RPMI 1640 배양액과 MEM 배지에 항생제, \( 10 \% \mathrm { FBS } \) , \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 배양하고, Polymannuronate의 증식 영향을 측정하기 위해 96-well plate와 24-well plate에 분주한 HT-29, DLD-1, WiDr 대장암세포에 Polymannuronate를 첨가하여 배양하였고, Celltiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit률 사용하여 ELISA plate reader 로 흡광도를 측정하였다. 각각의 polymannuronate가 DNA 합성에 미치는 영향을 살펴보고 cpm을 측정해 세포의 DNA 합성정도를 계산한다.
<h2>대장암세포 배양</h2> <p>HT-29 대장암세포는 RPMI 1640 배양액에, DLD-1, WiDr 대장암세포는 MEM 배지에 미생물의 오염이나 증식을 억제 하기 위해 항생제 ( 100 units / mL penicillin, 100 units /mL streptomycin)와 \( 10 \% \mathrm { FBS } \) 를 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) , \( 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 배양하였다. 세포가 \(80 \% \) 정도 자라면 PBS-EDTA로 monolayer를 씻어내고 \( 0.25 \% \) trypsin-EDTA로 부착된 세포를 분리하여 96-well plate와 24-well plate에 분주하여 실험에 사용하였다.</p> <h2>Polymannuronate가 대장암세포 증식에 미치는 영향 측정</h2> <p>HT-29, DLD-1, WiDr 대장암세포에 각각의 polymannuronate를 처리하였을 때 세포의 중식에 미치는 영향을 알아보기 위해 각 대장암세포를 \( 10 \% \ FBS 가 포함된 배양액으로 희석하여 96-well plate에 40,000 cells/well의 밀도로 분주하였다. 24시간 배양한 후에 serum free media로 배양액을 교환하여 24시간 serum starvation 시켰다. 그 후 배양액에 각 polymannuronate를 \( 0.01 \% \), \( 0.1 \% \), \( 0.25 \% \), \( 0.5 \% \) 의 농도로 첨가하여 24시간 배양하였다. Celltiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit률 사용하여 ELISA plate reader (VERSA max tunable microplate reader, Molecular Devices, USA)로 \( 490 \mathrm { ~nm } \) 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 중식정도는 대조군에 대한 실험군의 \( \% \)로 계산하였다.</p> <h2>Polymannuronate가 대장암세포의 DNA 합성에 미치는 영향 측정</h2> <p>각각의 polymannuronate가 DNA 합성에 미치는 영향을 살펴보기 위해서 세포를 \( 13 \mathrm { ~mm } \) diameter cell culture coverslip을 넣은 24-well plate에 50,000 cells/well의 밀도로 분주하고, \( 10 \% \) FBS를 함유한 배양액으로 희석하여 배양하였다. 각 well 당 세포가 \( 60 \% \) 정도 자라면, SFM으로 교환하여 24시간 동안 배양한 후, 각 polymannuronate를 \( 0.01 \%, 0.1 \%, 0.25 \) \( \%, 0.5 \% \) 의 농도별로 첨가하였다. \( \left [ { } ^ { 3 } \mathrm { H } \right ] \) thymidine을 200,000 \( \mathrm { cpm } / \) wellof 농도로 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) incubater에서 24 시간동안 반응시켰다. 배양액을 제거하고 \( 5 \% \) trichloroacetic acid (TCA)를 첨가하여 실온에서 10 분간 방치한 다음, 탈이온수로 2 회 세척한 후에 \( 70 \% \) 에탄을을 첨가하여 실온에 5 분간 방치하였다. Cell culture coverslip을 cocktail solution에 넣고 liquid scintillation counter (Wallac 1409, Amersharm Phamacia Co., England)로 cpm을 측정하여 세포의 DNA 합성정도를 계산하였다.</p>