다양한 염 농도에 대한 대주군 의 종자 발 아율 감수성을 조사하기 위하여, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225 그리고 \( 250 \mathrm{mM~} \mathrm{NaCl} \) 이 첨가된 MS 기본 배지에 종자를 파종하고 5일 후 발아율을 조사하였다. 염 농도에 대한 WT 종자 발아율 감수성 조사 결과를 바탕으로 우리는 EMS 돌연변이 종자들을 \( 150 \mathrm{mM~} \mathrm{NaCl} \)이 함유된 MS 기본 배지에 파종하고 2주 후 염해 내성 돌연변이체를 3개를 고른다. 돌연변이체들은wild-type과 교잡 후 얻어진 종자를 가지고 \( 150 \mathrm{mM~} \mathrm{NaCl} \) 이 함유된 MS 배지에 파종한 뒤 발아 실험을 한 결과, 열성 돌연변이체인것으로 조사되었다. Total RNA는 MS 기본 배지에 종자를 파종하여 2주간 자란 식물체를 \( 150 \mathrm{mM~} \mathrm{NaCl} \)이 포함된 MS 액체 배지에 옮긴다. 그 후 0, 3, 6시간 동안 처리한 식물체로부터 aurintricarboxylic acid방법에 의하여 추출했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물 재료 및 생육 조건</h2> <p>염해 내성 돌연변이체를 선발하기 위하여, 애기장대 (Arabidopsis thaliana, ecotype Col-O) 종자에 ethyl methane sulfonate (EMS)로 처리된 M2 세대 종자(50,000 종자)를 Lehle Seeds (Round Rock, TX) 회사로부터 구입하였다. 종자는 \( 70 \% \) 에탄을로 1분, \( 2 \% \) sodium hypochlorite 용액으로 10 분간 살균한 다음 멸균수로 5회 충분히 세정한 후, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에 서 암상태로 2일간 저온 처리하여 MS 기본 배지에 파종하였다. 식물 생장 조절실내의 환경조건은 16/8 시간 명기/암기로 조절된 광주기 하에서 온도는 \( 22^{\circ} \mathrm{C} \), 습도는 \( 70 \% \) 로 유지되도록 조절하였다.</p> <h2>염 농도별 종자 발아율 감수성 조사</h2> <p>다양한 염 농도에 대한 대주군 (wild-type, WT)의 종자 발 아율 감수성을 조사하기 위하여, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225 그리고 \( 250 \mathrm{mM~} \mathrm{NaCl} \) 이 첨가된 MS 기본 배지에 종 자를 파종한 5일 후, 발아율을 조사하였다. 이 실혐은 3회 반복 실험을 하였다.</p> <h2>염해 내성 돌연변이체 선발</h2> <p>염 농도에 대한 WT 종자 발아율 감수성 조사 결과를 토대 로 우리는 EMS 돌연변이 종자들을 \( 150 \mathrm{mM~} \mathrm{NaCl} \)이 함유된 MS 기본 배지에 파종한 2주 후, 염해 내성 돌연변이체를 선발하였다. 이러한 선발과정을 통하여 3 개의 돌연변이체를 선발하였으며 (salt tolerance; sto42-14, sto42-18, sto48-4로 명명), 선발된 3개의 돌연변이체들은 M3 세대에서 \( 150 \mathrm{mM~} \mathrm{NaCl} \) 농도에 대해 single locus로 분리됨을 알 수 있었고 M 4 세대를 거쳐 안정된 homozygous 돌연변이체들을 확보하였다. 또한 이들 3 개의 돌연변이체들은wild-type과 교잡 후 얻어진 종자를 가지고 (F1 및 F2), \( 150 \mathrm{mM~} \mathrm{NaCl} \) 이 함유된 MS 배지 에 파종하여 발아 실험한 결과, 열성 돌연변이체 임을 확인 할 수 있었다.</p> <h2>Total RNA 추출과 Northern blot 분석</h2> <p>Total RNA는 MS 기본 배지에 종자를 파종하여 2주 동안 자란 식물체를 \( 150 \mathrm{mM~} \mathrm{NaCl} \) 이 함유된 MS 액체 배지에 옮 긴 후, 0, 3, 및 6시간 동안 처리한 식물체로부터 aurintricarboxylic acid (ATA) 방법에 의하여 추출하였다. Northern 분석을 위해 total RNA \( (20 \mu \mathrm{g}) \) 는 \( 1.2 \% \) formaldehyde-agarose gel에서 전기 영동한 후, nylon membrane (Roche, Indianapolis, IN)으로 옮겨졌다. Hybridization과 membrane wash 과정은 Sambrook 등의 방법으로 수행 하였다.</p> <p>애기장대로부터 RD29A 유전자를 분리하기 위하여, Forward Ⅰ primer (5'-GATAACGTTGGAGGAAGAGTCGGC-3')와 Reverse Ⅰ primer (5'-CAGCTCAGCTCCTGATTCACTACC \( \left.-3^{\prime}\right) \) 를 가지고 Reverse transcription PCR (RT-PCR)을 통하여 증폭된 DNA를 pGEM T-easy 벡터에 클로닝하였다.</p>