2세대 바이오 에탄올 생산 기술은 목재, 폐지 등 목질계 바이오매스를 원료로 하며, 셀룰로오즈, 헤미셀룰로오즈, 리그닌을 주요 구성성분으로 갖는 차세대 환경친화적인 재생연료인 바이오연료 중 에탄올을 생산하기 위해 리그닌과 셀룰로오즈/헤미셀룰로오즈를 분리하고 유용화하는 전처리가 필요하며, 이 과정에서 많은 비용을 소모하고 공정이 복잡해진다. 1세대 바이오 에탄올 생산 기술은 곡물을 기반으로 하는 발효 위주의 생산공정이며, 곡물 재배를 위해 많은 경작지가 필요하여 산림훼손 및 곡물가격 상승 문제를 야기한다.
<h1>1. 서 론</h1> <p>바이오연료는 수송용으로 활용성이 큰 환경친화적인 재생연료이며, 화석연료에 대한 의존성을 낮추고 온실가스 배출을 감축시킬 수 있는 차세대 에너지이다. 바이오 연료 중 에탄올은 옥탄가가 휘발유와 비슷하여 휘발유와 혼합연료로 사용 가능하다고 알려져 있다. \(1\) 세대 바이오 에탄올 생산 기술은 주로 옥수수, 사탕수수와 같은 곡물을 기반으로 한 발효 위주의 생산공정이며, 곡물을 재배하기 위한 많은 경작지가 필요하여 산림훼손의 문제를 야기하고 곡물가격이 급격하게 상승하는 문제를 유발하는 단점을 가지고 있다. \(2\)세대 바이오 에탄올 생산기술은 목재, 폐지와 같은 목질계 바이오매스를 원료로 하며, 주요 구성성분은 셀룰로오즈, 헤미셀룰로오즈, 리그닌이다. 이러한 구성성분들을 이용하여 에탄올을 생산하기 위해서는 리그닌과 셀룰로오즈/헤미셀룰로오즈를 분리하고 유용화하는 전처리가 필수적이며, 이 과정에서 많은 비용을 소모되고 공정이 복잡해지는 문제를 가지고 있다. 화학적 가수분해나 생물학적 효소 반응과 달리 가스화(gasification)는 리그닌을 비롯한 모든 바이오 매스의 구성 성분을 합성가스(syngas)로 간단하고 효과적으로 전환시킬 수 있다. 합성가스의 주성분인 일산화탄소\( (\mathrm{CO}) \), 이산화탄소\( \left(\mathrm{CO}_{2}\right) \), 수소\( \left(\mathrm{H}_{2}\right) \)를 기질로 사용하는 미생물의 생물학적 발효를 통해 바이오 알코올을 직접 생산할 수 있는 기술이 최근 각광받고 있다.Clostridium autoethanogenum과 같은 acetogen은 절대 혐기 조건에서 우드-융달회로(Wood-ljungdahl pathway)를 통해 acetyl-CoA과 같은 중간체를 생산하고, acetyl-CoA는 에탄올과 아세트산 등 유용산물로 전환될 수 있다.합성가스 성분 중 일산화탄소\( (\mathrm{CO}) \), 이산화탄소\( \left(\mathrm{CO}_{2}\right) \)는 탄소원으로 사용되고, 수소\( \left(\mathrm{H}_{2}\right) \)는 전자전달체로 사용된다. 하지만 미생물을 이용한 합성가스의 생물학적 전환 시스템은 미생물의 성장속도가 현저히 느리고 최종 대사산물의 생산농도가 낮아 생산성이 떨어지는 한계를 가지고 있다. 이 문제를 해결하기 위해 합성가스 조성, 배지 조성과 같은 배양운전 조건을 변화시키는 등 생물공학적 접근과 균주 개량 등을 통하여 생산성을 증가시키고자 하는 유전공학적 시도가 이루어져 왔다. 대표적인 사례로 배지의 성분 중 탄소원, 질소원, 영양염류(질소 및 인), 중금속 등 다양한 배지구성 성분의 조성을 변화하는 시도가 이루어졌으며, 이러한 배지 성분의 변화는 acetogen 배양의 대사과정에 영향을 끼쳐 균주의 성장과 에탄올의 생산을 향상시킬 수 있다고 알려져 있다. Acetogen 배지 성분 중 vitamin 성분들은 에탄올 생산을 위한 환원력(reducing power)을 제공하여, 미생물의 성장과 대사산물의 생산을 증가시킨다는 보고가 있으며, C. ragsdalei, C. autoethanogenum을 이용한 최근 연구에서 vitamin 성분 중 \(\mathrm{D}-\mathrm{Ca}- \)pantothenate, vitamin \( \mathrm{B}_{12} \) (cobalamin)농도에 따른 미생물 성장과 대사산물의 생성 변화를 관찰하였다.</p> <p>본 연구에서는 합성가스 구성성분인 \( \mathrm{CO}, \mathrm{CO}_{2} \)를 유일한 탄소원으로 사용하는 C.autoethanogenum 배양과정에서 배지 내 vitamin 성분의 농도를 변화시켜 균주 성장과 에탄올 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 연구에 사용된 vitamin 성분은 biotin, thiamine-HCl과 folic acid이며, 각 성분의 농도를 달리하여 균주 성장과 에탄올, 아세트산 생산에 미치는 영향을 고찰하였다.</p> <h1>2. 실험재료 및 방법</h1> <h2>2.1 균주 및 배양배지</h2> <p>실험에 사용된 미생물은 Clostridium autoethanogenum(DSM \(10061\))을 German Collection of Microorganisms and Cell Culture 에서 구입하였다. 균주 배양을 위한 기본 배지의 조성은 본 연구진의 기존 연구와 동일하며, 배지는 시약용 화합물을 사용하여 제조하였다. Vitamin 성분은 vitamin용액을 별도로 제조한 후, 최종 배양 배지 \(1\mathrm{L}\)에 준비된 vitamin 용액 \( 1 \mathrm{mL} (\times 1,000\)배 희석)를 첨가하여 사용하였다. 본 연구에서 제시한 vitamin의 농도는 배양 배지 내 최종 농도로 표기하였다. 또한 실험에 사용된 합성가스는 MS 동민가스(Pyeongtaek, Gyeonggi-Do, Korea)에 제조 의뢰하여 공급되었으며 부피비 조성은 \( 20 \% \mathrm{CO} \), \( 20 \% \mathrm{CO}_{2}, 10 \% \mathrm{H}_{2}, 50 \% \mathrm{~N}_{2} \) 으로 이루어져있다.</p> <h2>2.2 배지조성 변화 배양실험</h2> <p>배양 실험은 \( 150 \mathrm{mL} \) serum bottle을 배양기로 사용하여 \( 25 \mathrm{mL} \) 의 배양 배지를 넣은 후, 고무마개와 알루미늄캡을 이용하여 외부 공기와 접촉을 차단시킨 상태에서 합성가스를 주입하여 절대 혐기 조건을 만들었다. C. autoethanogenum 균주는 절대 혐기성 균주이므로 완벽한 혐기조건의 유지는 매우 중요하다. 준비된 serum bottle에 계대배양에서 \(10\) 일 간 배양된 미생물 배양액을 접종액으로 사용하였으며, 배지 부피의 \( 10 \mathrm{vol} \% \) 를 접종하였다. 균주 접종 후, 탄소원 공급을 위해 serum bottle의 head space 부분에 합성가스를 \(5\)분 동안 주입하였으며, bottle내 내부압력은 약 \( 240 \mathrm{kPa} \)을 유지하도록 하였다. 준비된 serum bottle은 배양 온도 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 와 교반속도 \( 200 \mathrm{rpm} \) 조건의 진탕배양기에서 배양하였다. 균주 성장과 대사산물 분석을 위한 시료는 \(48\)시간마다 고무마개 부분에 주사기를 통과시켜 배양액을 채취하였다.</p> <p>균주 성장과 에탄올 생산에 대한 영향을 알아보기 위해 사용된 vitamin 성분의 농도는 각각 biotin \(0.2\), \(2\), \(20\), \(100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{L} \), thiamine-HCl \( 0.5,5,50,250 \mu \mathrm{g} / \mathrm{L} \), folic acid \( 0.2, 2, 20, 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{L} \) 이다.</p>