요소 또는 KSCN를 첨가하여 용해한 후 구조 재접힘이 일어났고 응집 단백질들의 분리정제에서 볼수 있었다. P28L 치환체를 대상으로 극자외선 원편형이색성(far UV CD)로 이차구조 함량을 축정하여, 요소 변성 평형실험과 ANS 결합을 통해 P28L/Y173F 단백질의 구조가 야생형과 비슷하게 회복되었음을 확인하였다.
<h2>\( a \)TS의 발현 및 정제</h2> <p>응집 단백질들의 분리정제는 요소 또는 KSCN를 첨가하여 용해한 후 구조 재접힘이 일어난 후 정제한다.단일 치환체 중 \( P28L \)치환체를 제외한 다른 치환 단백질으로부터는 충분한 양을 얻을 수 없었다. 따라서 \( P28L \)를 대상으로 상세한 연구를 진행하였다.</p> <h2>\( a \)TS의 이차구조</h2> <p>극자외선 원편형이색성(far UV CD)롤 사용하여 \( \alpha \) 나선구조, \( \beta \) 병풍구조, 무질서구조(random coli) 등의 이차구조 함량을 축정하였다(Fig. 2). 야생형(WT)은 \( 222 \mathrm { ~nm } \) 에서 최저치, \( 208 \mathrm { ~nm } \) 근처에서 굴곡, \( 195 \mathrm { ~nm } \) 근처에서 최대치를 보여주는 데, 이는 \( \alpha / \beta \) motif 단백질의 특징이다. \( P28L \)은 비슷한 패턴을 보여주는 데 전반적인 타원도(ellipticity)가 \( 30 \% \) 정도 감소되었다. 이는 구조의 전반적인 변화톨 나타낸다. 반면 \( P28L \)/ \( Y173F \)는 패턴과 세기에 있어 야생형과 비슷한 양상을 보여주는 데 이는 이 단백질의 구조가 야생형과 비슷하게 회복되었음을 나타낸다.</p> <h2>\( a \)TS의 요소 유도 구조풀림(urea-induced equilibrium unfolding)</h2> <p>단백질의 안정도롤 요소 변성 평형실험으로 조사하였다. 단백질 변성제인 요소를 여러 농도에서 첨가한 후 단백질의 구조롤 형광과 CD로 측정하였다(Fig. 3). 얻어진 데이터는 자연구조체 N, U, 중간구조체(I)의 3 상 모델에 잘 들어맞았다. 야생형(실선)은 \( 2 \mathrm { M } \) 요소에서 구조가 풀리기 시작해서 \( 5 \mathrm { M } \) 근처에서 모두 풀린 구조로 전환되었다. \( P28L \)(검은 원)는 안정도가 많이 감소한데 비해 \( P28L \)/ \( Y173F \)(빈 원)는 야생형과 비슷하게 회복되었다.</p> <h2>ANS (1-anilino-8-naphthalenesulfonate) 결합</h2> <p>ANS는 단백질의 소수성표면에 결합할 때 형광의 청색 이동과 청색 세기 증가가 일어난다. \( P28L \) 단백질은 \( 0 \sim 2 \mathrm { M } \) 요소에서 야생형에 비해 \( 25 \% \) 정도 형광세기가 증가하였는데, 이 단백질의 자연구조체가 소수성 표면이 증가되어 ANS가 더 많이 결합되었음을 나타낸다. 한편 \( P28L \)/ \( Y173F \)는 그 성질이 야생형으로 회복되었다(Fig. 4). 이는 소수성포면이 증가한 \( P28L \) 자연구조체가 \( P28L \)/ \( Y173F \)에서 야생형 상태로 되돌아갔음을 시사한다.</p>