사람자궁경부암세포주인HeLa 세포는 태아송아지혈청과 penicillin, streptomycin으로 첨가된 DMEM 내에서 배양을 유지했다. 배양된세포는 trypsin과 플레이트에서 분리하고, Hemacytometer로 세포수를 counting 한 후, 3,000∼4,000 cell/well을 골고루 분주했다. 다양한 농도의 17\(\beta\)-estradiol과 progesterone, tamoxifen을 HeLa 배양세포에 첨가한 다음, 에스트로겐, 프로게스테론, 타목시펜을 2.5일, 4일, 6일 동안 처리했으며 각 처리별 세포의증식은 colorimetric MTT 세포분석법에 의해 분석되었다.
<h1>재료 및 방법</h1><p>HeLa 세포주는 American Type Culture Collection (ATCCHTB-22; Rockville, MD)로부터 구입하였으며, \(30 \sim 40\)회 계대 배양을 통하여 실험에 사용되었다. 배양을 위한 Dulbeco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 및 태아송아지 혈청은 GIBCO Invitrogen (Grand Island, NY, USA)으로부터, 그리고 세포배양 플레이트는 Nunc A/S (Roskilde, Denmark)로부터 구입하였다. 17\(\beta\)-estradiol, progesterone (P4), 그리고 tamoxifen은 Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.</p><h2>Cell culture</h2><p>사람 자궁경부암세포주인 HeLa 세포는 5% 태아송아지 혈청, \( 100 \mathrm{U} \)의 penicillin 그리고 \( 100 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 streptomycin으로 첨가된 DMEM 내에서 배양을 유지하였다. 배양된 세포는 phosphate buffered saline (PBS)에 용해된 \(0.05\%\) trypsin 및 \( 2 \mathrm{mM}\) EDTA로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), 5분간 처리하여 배양된 \( 10 \mathrm{~cm} \) 플레이트로부터 분리하고, Trypan Blue 염색을 통한 Hemacytometer로 세포수를 counting 한 다음, 각 호르몬 농도 별 처리 군에 따라 96-well 또는 48-well plate에 \(3,000 \sim 4,000\) cell/well을 균등히 분주하였다. 분주된 HeLa 세포는 각 농도별 호르몬 처리 전 \( 12 \mathrm{hr} \) 동안 \( 5 \% \mathrm{CO} 2\), \(37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다.</p><h2>Cell Proliferation assay (MTT assay)</h2><p>다양한 농도의 \( 17 \beta \)-estradiol (E2; 0, 10, 100, 1,000, 10,000 \( \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \)의 \( \mathrm{EtOH} \) ), progesterone (P4; 0, 100, 1,000, 10,000, 100,000 \(\mathrm{ng} / \mathrm{ml} \)의 DMSO) 그리고 tamoxifen (0, 1,000, 5,000, 10,000, 100,000 \(\mathrm{ng} / \mathrm{ml} \)의 EtOH)을 96-well 또는 48-well plate에 균등히 분주된 HeLa 배양세포에 첨가한 다음, 에스트로겐과 프로게스테론은 2.5일, 4일 그리고 6일 동안 처리하였으며, 타목시펜은 6일 동안 처리하였다. 각 호르몬과 배양액은 매 48시간 마다 교체하였다. 각 처리 별 세포의 증식은 시약공급자의 프로토콜(CellTiter 96 Aqueous One Solution)에 따라 colorimetric MTT (Promega, Madison, WI) 세포분석법에 의해 분석되었다. 간단히 말하면, \(100 \sim 150 \mu \mathrm{l} \)의 배양액 내 세포를 함유하는 plate의 각 well에 \( 2 \mu \mathrm{l} \)의 MTS 반응용액을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(\mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 약 40분간 반응시킨 후 \( 490 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 이러한 실험은 각각 6회 반복하였으며, 값은 흡광도 단위/well로 표시하였다.</p><h2>Statistical analysis</h2><p>실험결과는 평균 \( \pm\) SE로 표시되었으며, 처리군 사이의 통계적 유의성은 Student's t-test에 의해 결정되었다. \( p<0.05 \)의 값은 통계적으로 유의성이 있음을 의미한다.</p>