RNA를 TRIzol을 이용하여 분리한 후 Moloney murin leukemia virus reverse transcriptase로 cDNA를 합성하고, PAI-1 primer sequence를 사용하여 PCR을 수행하여 결과를 확인하였다. 모든 실험결과에 대한 통계처리는 분산분석과 Duncan's test를 사용하여 P값 0.05 미만일 경우 통계적인 유의성이 있다고 판정하였다. 신장섬유아 세포에 대한 세포증식 효과를 조사하기 위해서 신장섬유아 세포 배양 후 혈청에서 12시간동안 처리한 결과 배지의 혈청 휴무와 상관없이 세포증식억제 효과가 10% 미만인 것으로 나타났다.
<h2>Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 분석</h2> <p>RNA 추출은 TRIzol (Invitrogen Co, Grand Island, NY, USA)을 이용하여 분리하였으며 \( 1 \mathrm { ug } \)의 RNA를 사용 Moloney murin leukemia virus reverse transcriptase (Promega, Meadison, WI)로 역전사 반응을 시켜 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA와 PAI-1 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였고, 생성된 결과물은 \( 1 \% \) 아가로즈 겔로 전기 영동하여 ethidium bromide로 염색하여 UV 하에서 결과를 확인 하였다. PCR에 사용한 PAI-1 primer sequence는 forward: 5'-tgtcctcggtgctggctatgctg-3'; reverse: 5'- tcagacttgtggaacaggcgctg-3'이고, \( \beta \)-actin primer sequence는 forward: 5'-agggtgtgatggtgggtatggg-3'; reverse: 5'-caggatcttcatgaggtagtc-3'이다.</p> <h2>Plamid transfection과 luciferase Reporter gene 분석</h2> <p>AF의 PAI-1 전사제어에 대한 영향을 분석하기 위해 p800neo-luc (PAI-1 luciferase promoter construct)를 사용하였다. 신장섬유아 세포를 \( 1 \times 10 ^ { 4 } \) \( \mathrm { ~cells/ml } \)로 \( 60 \mathrm { ~mm } \) 플레이트에 하루 동안 배양 후 plasmid constructs \( 2 \mathrm { ~ug } \)과 pCMA- \( \beta \)-galactosidase plasmid \( 1 \mathrm { ~ug } \)을 12 시간 동안 DNA transfection reagent (TransIT-LT1 Transfection reagent, Mirus, Madison, USA)로 co-transfection 시켰다. 12 시간 후 LPS와 AF를 6 시간 동안 처리하여 luciferase 및 \( \beta \)-galactosidase의 활성을 commercial kits (Promega Corp., Madison, WI)를 사용하여 확인하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험결과에 대한 통계처리는 각 실험 군별로 표준차이가 있는가를 검증하기 위해 분산분석을 수행하였으며 다양성 분석은 Duncan's test에 의해 분석하였다. 통계처리 후 P값이 0.05 미만일 경우 통계적인 유의성이 있다고 판정하였다.</p> <h1>결과</h1> <h2>신장섬유아 세포에서 세포증식에 대한 AF의 영향</h2> <p>신장섬유아 세포를 \( 1 \times 10 ^ { 4 } / \mathrm { ml } \)로 96 wells 플레이트에서 1 일 동안 배양 후, 혈청 유조건과 혈청 무조건에서 각각 AF를 1, 10, 30, 50 \( \mathrm { ~uM } \) 농도로 12 시간 동안 처리하였다. 12 시간 처리 후 WST-1 reagent를 4 시간 동안 처리하여 AF의 신장섬유아 세포에 대한 세포증식 효과를 조사하였다. AF는 배지의 혈청 유무에 상관없이 세포증식억제 효과가 \( 10 \% \) 미만으로 유의성이 없는 것으로 확인 되었다. 따라서 AF는 세포에 대한 독성 및 증식에는 큰 영향이 없음을 확인하였다.</p>