RNA추출은 TRIzol 용액을 이용한 phenol-chloroform 기법을 사용하였으며 RNA를 cDNA master mix와 혼합하여 PCR을 이용해 cDNA를 합성하였다. 또한 2회 반복하여 현광 신호의 크기를 측정하여 확인한 융해 곡선 그래프를 통해 CT값을 데이터리하였다.
<h2>RNA 추출 및 cDNA 합성</h2> <p>RNA추출은 TRIzol 용액(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)을 이용한 phenol-chloroform 기법을 사용하였다. TRIzol 용액을 well당 각각 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 넣고, \(200\mu \mathrm{l} \)의 chloroform을 처리하여 섞어준 뒤 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 13,000 \mathrm{rpm} \)에서 15 분간 원심 분리를 하였다. 상층액을 분리하여 isoprophanol과 \( 1: 1 \) 비율로 섞어준 뒤, \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(12,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리를 하였다. 생성된 pellet을 DEPC로 회석한 \( 75 \% \mathrm{ETOH} \)을 첨가하여 씻어내고, \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(12,000 \mathrm{rpm} \)에서 5분간 원심분리를 하였다. 최종 추출된 pellet을 상온에서 10분간 완전히 말린 뒤 ultra pure water \( 30 \mu \mathrm{l}\) 에 녹인 후, UV 흡광도 \( 260 \mathrm{~nm} \)에서 농도를 측정하였다. \( 1 \mu \mathrm{g} / \mu \mathrm{l} \)의 RNA를 cDNA master mix (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)와 혼합하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10 분, \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60 분, 그리고 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5 분간 PCR을 이용해 CDNA를 합성하였다.</p> <h2>Real-time quantitative PCR</h2> <p>Plectin과 MACF1의 mRNA 발현을 측정하기 위하여 double-stranded DNA dye인 SYBR Green PCR master mix (Finnzyme, Espoo, Finland)를 이용하여 real-time PCR (ABI PRISM 7700 system) (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA)을 실시하였다. 사용한 primer sequence는 Table 1에 제시하였으며, 모든 Primer는 코스모사(Cosmo Genetech, KOREA)에서 제작 및 구입하여 사용하였다. 모든 샘플은 3회 반복 실험하여 합성시킨 cDNA를 2회 이상 반복 측정하였다. \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 15 초, \( 60^{\circ} \mathrm{C}\) 30 초간 40 cycle을 측정하여 CT 값을 얻어내고, 융해 곡선 확인을 위해 40 cycle 이후 dissociation stage를 2번 반복하여 현광 신호의 크기를 측정하였다. 반응이 완료된 후 증폭곡선의 S 커브가 급격히 올라가는 지점과 CT 값의 추출지점이 일치하였음을 확인하고, 융해 곡선 그래프의 단일 증폭 곡선을 확인한 뒤 최종적으로 CT 값을 데이터 처리 하였다. 결과는 단순 CT 값 비교 분석 방법을 사용하였으며, mRNA 발현양은 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GAPDH 의 CT 값으로 상대 정량하여 보정하였다.</p> <h2>자료처리</h2> <p>IGF-I 처리에 따른 C2C12 세포에서의 plectin과 MACF-1유전자 mRNA 발현의 유의성 검증을 위하여 SPSS 12.0 for window를 이용하여 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였다 \( (p<0.05) \).</p>