수용성 EPCR 측정을 위한 세포 배양 배지 및 쥐 혈장에서 준비한 샘플과, TACE 측정을 위한 세포 용해물에서 준비한 샘플에 대하여 항 EPCR 항체를 사용한 경쟁적 효소면역측정법으로 실험하였고, 세포 내 총/인산화된 p38 발현과 총/인산화된 ERK1/2와 JNK의 측정은 효소면역측정법(ELISA)를 이용해 수행하였다. 패혈증을 일으키기 위해서 마취된 수컷 쥐를 이용하여 Cecal ligation and puncture(CLP)하였다.
<h2>수용성 EPCR과 TACE 측정을 위한 경쟁적 효소면역측정법(ELISA, Competitive ELISA)</h2> <p>96well microtiter plate (Corning, NY, USA) 는 \( 0.02 \% \) so-dium azide가 포함된 \( 20 \mathrm{mM} \) carbonate-bicarbonate 완충액\((\mathrm{pH} 9.6)\)에서 하룻밤 동안 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 수용성 EPCR 또는 TACE 단백질로 코팅되었다. 그 후 Plate는 PBS- \( 0.05 \% \) Tween 20(PBS-T)에서 3번 씻어주고, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에 두었다. 수용성 EPCR 측정을 위해 세포 배양 배지와 쥐 혈장으로부터 준비된 샘플 또는 TACE 측정을 위해 세포 용해물로부터 얻은 샘플은 항 EPCR 항체(Abnova; PBS-T에서 1:500으로 희석) 또는 항 TACE 항체(Santa Cruz; PBS-T에서 1:500으로 희석)와 함께 96well 둥근 microliter plate에 90분 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였고 전 처리된 plate에 옮겨서 상온에서 30분 동안 배양하였다. 그 후 PBS-T로 3번 씻어주고 peroxidase와 결합된 항 토끼 또는 항염소 IgG 항체(diluted 1:2000 in PBS-T, AmershamPharmacia Biotech)를 처리하고 상온에서 90분 동안 배양하였다. 다시 PBS-T로 3번 씻어주고 암상태에서 기질 \( (100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ophenylenediamine, \( 0.003 \% \mathrm{~H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 을 \( 200 \mu \mathrm{l} \)씩 넣어 상온에서 60 분 동안 배양하였다. 반응은 반응중지액인 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \) \( (8 \mathrm{~N}\), \(50 \mu \mathrm{l}) \) 을 사용하여 중지시키고 \( 490 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정한다. 수용성 EPCR의 변이계수(CV); inter-assay는 \( 6-10 \% \)보다 적었고, intra-assay는 \( 4-6 \% \)보다 적었다. TACE의 변이 계수(CV); inter-assay는 \( 7-10 \% \)보다 적었고, intra-assay는 \( 5-7 \% \)보다 적었다.</p> <h2>Cecal ligation and puncture (CLP)</h2> <p>패혈증을 유발하기 위해, 수컷 쥐를 zoletil 50과 rompun으로 마취시킨다. Wang, H. et al.의 방법에 따라 패혈증 쥐 모델을 제작했다. 즉, 쥐의 복부 중간에 \( 2 \mathrm{~cm} \) 정도 절개 후 장과 인접한 맹장을 꺼낸 후, 맹장의 끝에서부터 \( 5.0 \mathrm{~mm} \) 부위를 3.0-실크 봉합사로 결찰한 후 22 게이지 주사바늘로 한번 뚫어준 후 다시 4.0-실크 봉합사로 절개 부위를 봉합한다. Sham mouse는 절개 후 맹장을 묶거나 뚫어주지 않고 그대로 봉합한다. 이 실험 방법은 경북대학교 동물 관리위원회로부터 승인 받았다.</p> <h2>인산화된 p-38, ERK1/2와 JNK의 효소면역측정법(ELISA)</h2> <p>세포 내 총/인산화된 p38 발현(Cell Signaling Technology,Danvers, MA, USA)과 총/인산화된 ERK1/2와 JNK (R&D Systems, Minneapolis, MN)의 측정은 ELISA 키트를 이용하여 수행하였다.</p> <h2>Statistical analysis</h2> <p>각 실험은 최소 3번 이상 검정하였고, 실험 결과는 평균표준오차로 표시하였고 non-paired Student's t test로 검정하여 P값이 \( 5 \% \) 미만일 때 통계적으로 유의하다고 간주하였다.</p>