공시재료는 ECW-30R을 유리온실내 육묘용상토가 담긴 포트에 파종하여 발아, 포트에 옮겨 심었다. 실험 병원균은 Xanthomonas euvesicatoria KACC 18722이다. 8주 된 ECW-30R에 병원균을 접종하고 일정 co2농도를 유지시킨 후 2일 뒤에 시료를 채취하고 2주뒤에 발병도를 조사하였다. 병원균 접종 2일 후 병징이 나타난 조직을 이용하여 total RNA를 추출하고, cDNA를 합성하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>공시재료</h2> <p>본 실험에서 사용한 고추(Capsicum annuum)는 Early Calwonder (ECW) 계통인 ECW-30R을 경북대학교 원예학과로부터 분양받아 사용하였다. 각 종자는 유리온실 내에서 육묘용 상토가 담긴 72공 포트에 파종하여 발아시켰으며, 4엽이 되었을 때 지름 \( 9 \mathrm{~cm} \)의 포트에 옮겨 심었다. 고추에 세균 점무늬병을 일으키는 병원균인 Xanthomonas euvesicatoria KACC 18722는 \( 25 \% \) glycerol stock 상태로 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하며 사용하였다.</p> <h2>병원균 접종 및 \( \mathrm{CO}_{2} \) 처리</h2> <p>병원균은 8주 된 ECW-30R에 접종하였다. X. euvesicatoria는 TSB (Tryptic Soy Broth, \( 1.7 \% \) pancreatic digest of casein, \( 0.3 \% \) papaic digest of casein, \( 0.25 \% \) dextrose, \( 0.5 \% \) sodium chloride, \( 0.25 \% \) dipotassium phosphate) 배지에 접종 후 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 진탕 배양하였다. 미네랄 오일 : 병원균 현탁액은 1:4가 되도록 혼합하여 최종 병원균의 양은 \( 10^{8}~ \mathrm{cfu} / \mathrm{ml} \)이 되게 한 후 분무기를 이용하여 식물체에 접종하였다. 각 pot의 배양조건은 온도는 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 로 유지되며, \( \mathrm{CO}_{2} \)의 농도는 각각 \( 400 ~\mathrm{ppm} \) 과 \( 800 ~\mathrm{ppm} \)의 조건이 유지되는 생장상에서 각 각 습실 처리하였다. 병 접종 후 2일 뒤에 유전자 분석을 위한 시료를 채취하였고, 병 접종 후 2주 뒤 발병도를 조사하였다.</p> <h2>Total RNA 추출 및 cDNA 합성</h2> <p>X. euvesicatoria 접종 2일 후 병징이 나타난 고추 잎 조직을 액체 질소에 얼려 분쇄한 후, Quick-RNA\( { }^{\mathrm{TM}} \) Miniprep Kit (Zymo Research, USA)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 DeNovix DS-11+ Spectrophotometer (DeNovix, USA)로 정량하였다. cDNA 합성은 \( 2 \mu \mathrm{g} \)의 RNA와 \( 1 \mu \mathrm{l} \) oligo \( \mathrm{dT}(100 \mathrm{pmol} / l) \)를 혼합 후, DEPC-treated distilled water로 전체 부피를 \( 16 ~\mu \mathrm{l} \) 맞춘 뒤, \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 처리하였다. 이 후, \( 5 \times \) reverse transcription master mix (Elpis Biotech, Korea)를 \( 4 \mu \mathrm{l} \) 첨가하고, \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 90 분, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 반응하여 cDNA를 합성하였다.</p>