2009년 3월 부산 기장시장에서 구입한 실험에 사용된 따개비는 세척 및 동결건조 후 분쇄되어 시료와 메탄올을 1:5\((\mathrm{~W} / \mathrm{V}) \)의 비율로 첨가한 후 상온에서 2회 추출 되었다. 또한 극성 및 비극성으로 선별물질을 추출하기 위한 목적으로 메탄올과 다이클로로메탄을 같은 양으로 섞은 용액에 2회 추출한 후 회전식 진공농축기로 감압 농축한 뒤, 동결 건조하여 따개비의 methanol추출물을 얻었다. 따개비의 분획된 추출물은 paper disc method를 이용해 향균력 검색하였고, 본 실험에 사용된 암 세포주는 한국 세포주 은행에서 구입된 것으로, 사람의 간암세포주와 마우스 유래의 피부암세포주를 배양시킨 것이다. MTT assay를 사용하여 분획물의 암세포 증식 억제 효과를 알아보았다. 또한 돌연변이 되는 발암물질 등에 의한 DNA와의 상호 작용을 차단하는 효소이자, NAD(P)H를 이용하여 quinone류의 환원을 촉매하는 flavoprotein인 Quinone reductase도 측정했다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험재료 및 시료 추출</h2><p>실험에 사용된 따개비(Amphitrite albicostatu, AA)는 2009년 3월 부산 기장시장에서 구입하여 깨끗이 세척한 후 동결건조 후 분쇄하여 시료와 메탄올을 1:5\((\mathrm{~W} / \mathrm{V}) \)의 비율로 첨가한 후 상온에서 2회 추출하고, 극성과 비극성으로 선별물질을 추출하기 위하여 우선 메탄올과 다이클로로메탄 \(\left(\mathrm{CH}_{2}\mathrm{Cl}\right) \)을 1: 1로 섞은 용액에 2회 추출한 후 회전식 진공농축기로 일정시간 감압 농축시켜 동결 건조한 후 따개비의 methanol추출물(AAM)을 얻었다. 이 추출물을 hexane층(AAMH), methanol층(AAMM), butanol층(AAMB) 및 aqueous층(AAMA)으로 나누어 비극성에서 극성으로 계통 분획하고 각 분획층을 감압 농축 후 동결 건조하여 분말로 만들어 시료로 사용하였다.</p><h2>사용 균주 및 배지</h2><p>본 실험에 사용한 균주는 Staphylococcus aureus (ATCC 25923), E-coli (ATCC 21990), Salmonella enteritidis (ATCC 13076) 및 Proteus mirabilis (ATCC 25933) Proteus valraris(ATCC 13315) 균이었으며 각 균의 생육 및 보존을 위해 사용한 배지는 Nutrient agar (Difco), Yeast extract, Malt extract를 사용하였다.</p><h2>항균활성 측정</h2><p>분획된 따개비 추출물의 항균력 검색은 paper disc method를 사용하였다. 항균성 시험용 평판배지는 멸균 후 petri dish에 \( 20\mathrm{ml} \)씩 분주하여 응고시키고 전 배양한 각종 시험균을 무균적으로 첨가하여 기층용 배지 위에 다시 \( 10 \mathrm{ml} \)씩 분주하여 이중의 평판배지를 만들었다. 각 용매 분획 별 추출물의 농도를 \( 500 \sim 2,000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 로 하여 멸균된 disc (직경 \(8\mathrm{~mm} \), Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Japan)에 흡수, 건조시켜 균주가 도말 된 plate 표면에 올려놓은 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 24시간 배양하여 disc 주위에 생성된 clear zone의 직경(\(\mathrm{~mm} \))으로 부터 각 분획물의 항균활성을 측정하였으며 실험을 5회 반복하여 평균치를 나타내었다.</p><h2>암세포 배양</h2><p>본 실험에 사용된 암 세포주는 인체 간암세포주인 HepG2 (human hepatocellular carcinoma)와 마우스 유래의 피부암세포주인 B16-F10 (mouse melanoma)을 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank, KCLB)에서 구입하여 배양시킨 후 실험에 사용하였다. HepG2와 B16F10의 각 세포주는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \(5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) 조건하에서 배양하였고, 주 2-3회 정도 배지를 교환하고 세포배양용 petridish에 각 세포주가 \( 5 \times 10^{4} \mathrm{cells}/\mathrm{ml}\) 정도 증식되면 phosphate buffered saline (PBS)로 2번 세척한 후 tryp-sin-ethylenediamine tetracetic acid (EDTA, Gibco)를 \(2\mathrm{ml} \) 씩 처리하여 바닥에서 세포를 분리한 후, 배지로 세포가 골고루 분산되도록 희석하여 세포배양용 petridish에 \( 10\mathrm{ml} \)씩 분할하여 주입하고 주 2회 계대 배양하면서 실험에 사용하였다. 계대 배양 시 각 세포주의 passage number가 10회 이상일 때는 액체질소탱크로부터 새로운 세포를 꺼내어 다시 배양하여 실험하였다.</p><h2>암세포 증식 억제 효과(Cytotoxicity) 측정</h2><p>분획물의 암세포 증식 억제 효과는 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay를 사용하여 행하였다. MTT assay는 세포의 생육을 측정하는 방법으로서 황색수용물질인 MTT가 미토콘드리아내의 탈수소효소 작용에 의하여 dark blue formazan을 생성하는 원리를 이용한다. 이를 위해 각 세포주를 \( 1 \times 10^{4} \mathrm{cells/well}\)의 농도로 맞추고 \(96 \mathrm{well}\)에 각각 \(200 \mu \mathrm{l} \) 첨가하여 24시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \),\( 5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) incubator에서 배양한 후 용매종류별 분획물을 각각 일정량의 dimethyl-sulfoxide (DMSO)에 녹여서 50, 100, 150, 200, 250\(\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 첨가하였다. 48시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충용액에 녹인 MTT 용액을 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 첨가하여 4시간 동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO와 ethanol을 1: 1로 혼합한 용액 \( 200 \mu\mathrm{l} \) 를 첨가하여 천천히 녹인 후 Multi-detection microplate를 이용하여 \( 540\mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 대조군 세포수를 \( 100 \% \) 로 하였을 때의 상대적인 세포증식 억제 율을 구하였다.</p><h2>Quinone reductase (QR) 유도 활성 측정</h2><p>Quinone reductase는 phase II 무독화 효소중의 하나로 돌연변이 되는 발암물질 등에 의한 DNA와의 상호 작용을 차단하는 효소이며, NAD(P)H를 이용하여 quinone류의 환원을 촉매하는 flavoprotein이다.</p><p>본 실험에서는 Prochaska와 Santamaria의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 세포배양용 petridish에 HepG2 세포가 \( 80 \% \) 이상 증식하게 되면 24 well plate의 각 well에 \( 1 \times 10^{4} \mathrm{cells}/\mathrm{ml} \) 되도록 세포를 분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) incubator에서 24 시간 동안 배양한 후 따개비 분획물을 HepG2의 세포생존율이 \( 50\%\) 되는 양을 final 농도로 잡아 각각 DMSO에 녹여 \( 20,40,60,80,100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 농도로 첨가하고 다시 24 시간 배양하였다. 배양액을 제거한 후 각 well에 \(250\mu \mathrm{l}\)의 lysis buffer(\(10 \mathrm{mM}\) Tris-HCl \(\mathrm{pH} 8.0\), \( 14 \mathrm{mM} \mathrm{~NaCl}\), \(15 \mathrm{mM} \mathrm{~MgCl} \), \(0.5\%\) \( \mathrm{NP}-40 \) )를 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) incubator에 10 분간 두면서 cello 을 lysis한 후 reaction mixture 즉, \( 10 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH}7.4)\), \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) BSA, \( 0.008 \% \) tween-20, \( 40 \mu \mathrm{M} \mathrm{~FAD}\), \(0.8 \mathrm{mM} \) glucose-6-phosphate, \(2 \mathrm{Unit/ml}\) glucose-6-phosphate dehydrogenase, \( 25 \mu \mathrm{M} \) NADP, \( 40 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) MTT 및 \( 1 \mathrm{mM} \) menadione을 혼합하여 well에 \( 1 \mathrm{ml} \)씩 첨가하여 5 분 동안 반응시킨 후, 반응정지 용액인 \( 0.3 \mathrm{mM} \) dicumarol, \( 0.5 \% \) pyridine, \( 5 \mathrm{mM} \) potassium phosphate \( (\mathrm{pH} 7.4) \) 혼합액을 \(250\mu \mathrm{l} \)씩 첨가하여 효소반응을 정지시키고 Multi-detection microplate를 이용하여 \( 610 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 계산하였다.</p><p>단백질량은 동일한 set의 well plate에 대한 crystal violet 염색방법으로 정량 하였다. 24 well plate에 crystal violet 용액을 첨가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) incubator에서 배양한 후 증류수로 세척하였다. 각 well에 \( 0.5 \% \mathrm{SDS} \) (in \(50\%\) EtOH) 용액을 \( 1 \mathrm{ml} \)씩 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) incubator에서 1시간 방치한 후 \( 610\mathrm{nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. Quinone reducatse 활성측정\( (\mathrm{nmol} / \mathrm{min} / \mathrm{mg} \) protein)은 다음과 같이 하였다.</p><p>\( \begin{array}{l}\text { "Quinone reducatse } \\ (\mathrm{QR}) \text { activity }\end{array}=\frac{\text { absorbance change of MTT } / \mathrm{min}}{\text { absorbance of crystal violet }} \times 3345 \mathrm{nmol} / \mathrm{mg} \)</p><h2>통계처리</h2><p>본 실험에 대한 실험결과는 세 번 실험하여 얻어진 평균치 및 표준편차를 나타내었고, 그룹간의 통계적 차이는 student's t-test를 이용하여 분석하였다.</p>