본 연구에서는 건조된 영실 5kg을 이용하여 70% ethanol로 24시간 동안 실온에서 추출하였고, 이 과정을 원심분리로 4번 반복하였다. 상징액을 모아서 회전 증발기를 통해 농축한 후 ethanol 추출물로 정제하였다. 이후 이 용출액을 사일리카 겔 플레이트와 다양한 용매를 이용하여 분리하고, 이를 건조 후 10% 황산으로 산화하였다. Sephadex LH-20 open column을 이용하여 분리하고, reverse phase type 용출용매를 이용하여 분리한 활성 분획물을 다시 C18 cartridge 컬럼을 통해 분리하였다.
<h2>영실 추출물의 분리 및 정제</h2> <h3>영실 추출물 제조</h3> <p>건조된 영실 \( 5 \mathrm { ~kg } \)에 \( 70 \% \) ethanol을 가하여 실온에서 24시간 추출한 후 원심분리 \( (4,700 \times g, 15 \mathrm { ~min } ) \)하여 상징액과 침전물을 얻었고 이 침전물에 다시 \( 70 \% \) ethanol을 가하여 위와 같은 추출과정을 4회 반복하였다. 각각의 상징액을 모아 rotary evaporator (Eyela N-11, Japan)로 농축한 후 ethanol 추출물로서 정제를 위한 시료로 사용하였다.</p> <h3>Thin layer chromatography</h3> <p>Column에 의해 분리된 용출액을 silica gel plate \( (5.0 \times 5.0 \mathrm { ~cm } \), Merck Co.)로 \( \mathrm { CHCl } _ { 3 } \):butanol: \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \):acetic acid:methanol \( (10:6:2:1:3 \), \( \mathrm { v } / \mathrm { v } / \mathrm { v } / \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \)의 용매를 사용하여 전개한 다음 건조시키고, \( 10 \% \) \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \)를 분무하여 \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 부근에서 발색시켰다.</p> <h3>Sephadex LH-20 및 \( \mathrm { C } _ { 18 } \) column chromatography에 의한 정제</h3> <p>Sephadex LH-20 open column ( \(10 \times 120 \mathrm { ~cm } \))을 충진한 후 흡착성의 성질에 의해 분리하였다. 용출용매는 reverse phase type으로 ethanol \( 100 \% \rightarrow \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \)로 하여 용출 분취하고, 활성 분획물을 다시 \( \mathrm { C } _ { 18 } \) cartridge 컬럼을 이용하여 ACE \( 10 \% \)와 for-mic acid \( 90 \% \)로 하여 용출시켜 분리하였다.</p> <h2>영실 추출물에서 분리한 phenol 화합물의 물리 및 화학적 성질</h2> <p>융해점은 시료 \( 1 \mathrm { ~mg } \)을 취하여 미량융점 측정 장치를 이용하여 측정하였으며, \( [a]_ { ~D } \)는 시료 \( 5 \mathrm { ~mg } \)을 \( \mathrm { Me } _ { 2 } \mathrm { O } \) 및 methanol에 용해하여 polarimeter (Jasco DIP-370, Japan)에 의해 측정하였다. IR spectrum은 할로겐화 알칼리 정제법을 이용하여 순수 분리된 시료 \( 1 \mathrm { ~mg } \)을 \( \mathrm { KBr } \) 분말 \( 100 \mathrm { ~mg } \)과 잘 섞어 혼합한 후 압력을 가해 가압 정제를 만들어 측정하였다. NMR spec-trum은 FT 방법(Pulse Fourier Transform method)을 이용하여 순수 정제물 \( 10 \mathrm { ~mg } \)을 측정 용매 \( \mathrm { CDCl } _ { 3 } + \mathrm { DMSO } _ { 2 } \mathrm { D } _ { 6 } + \mathrm { D } _ { 2 } \mathrm { O } \)에 \( 5 \sim 20 \% \) \( ( \mathrm { W } / \mathrm { V } ) \) 비율로 용해시키고 TMS [Tetramethylsilane; \( ( \mathrm { CH } _ { 3 } )_ { 4 } \mathrm { Si } \)] 를 기준 물질로 하여 PMR \( (300 \mathrm { ~MHz } \), Bruker AM-300, Japan)로 측정하였다. Negative FAB Mass spectrum 측정은 고체 시료 \( 1 \mathrm { ~mg } \)을 감압상태 \( \left (10 ^ { -4 } \sim 10 ^ { -6 } \mathrm { ~mmHg } \right ) \)에서 negative ion FAB-mass spectrum (Jeol JMS-PX 300, Japan)을 이용하여 화학적 분석법에 의해 측정하였다. 이때 측정 용매로서는 thioglycerol을 사용하였으며, 측정조건에서 emitter 전류는 \( 22 \sim 28 \mathrm { ~eV } \)이며, 이온원의 가속가압이 \( 6 \sim 7 \mathrm { ~kV } \)에서 질량분석을 하였다.</p>