여수시농업기술센터에서는 14 품종에 대한 생육 및 형태 특성을 3번에 걸쳐 조사하였으며, 이를 바탕으로 DNA를 분리하였다. DNA 추출에는 cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) 방법을 활용하였고, 추출한 DNA를 이용해 RAPD 분석을 진행하였다. 분석을 위해 Perkin-Elmer사의 PE-9700을 이용하여 PCR 반응을 수행하였으며, PCR 반응액은 template DNA \( 10 \mathrm{ng} \), 50 pmol random primer, \( 10 \times \text{Ex buffer}\), dNTP, 1 U Ex Taq (TaKaRa, Japan)를 혼합하여 \( 25 \mu \mathrm{l} \)의 최종량을 만들었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>공시 재료</h2> <p>여수시농업기술센터에서 분리육종 기술로 선발된 14 품종의 생육특성 및 형태적 특성을 10개체씩 3번에 걸쳐 조사한 후, 잎조직으로부터 DNA를 추출하여 RAPD 분석에 이용하였다.</p> <h2>Total DNA 추출 및 정제</h2> <p>DNA 추출은 cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) 방법을 응용하여 추출하였다. 새로 신장한 어린 잎 \( 0.2 \mathrm{~g} \)을 막자사발에 넣고 액체질소로 마쇄하여 extraction buffer \( 15 \mathrm{ml} \) \( [2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \mathrm{CTAB}, 100 \mathrm{mM} \) Tris \( (\mathrm{pH} 8.0), 500 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{NaCl} \), \( 50 \mathrm{mM} \) EDTA]와 2-mercaptoethanol \( 750 \mu \mathrm{l}, 20 \% \) SDS \( 1 \mathrm{ml} \)을 첨가한 후 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시켰다. 5 M potassium ace-tate \( 5 \mathrm{ml} \)를 첨가한 후 얼음에 20 분간 방치한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 15,000 \) \( \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리 하였다. 상층액을 새로운 튜브에 옮긴 후 isoprophanol를 \( 10 \mathrm{ml} \) 첨가하고 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 20분간 방치하였다. 튜브를 꺼내 다시 원심 분리시킨 다음 상등 액을 버리고 건조시킨 후 \( 1 \times \mathrm{TE} \) buffer \( 500 \mu \mathrm{l}\)에 녹였다. 동량의 phenol과 chloroform을 첨가하여 DNA를 정제하였고 isoprophanol \( 500 \mu \mathrm{l}\)와 \( 3 \mathrm{M} \) sodium acetate \( 75 \mu \mathrm{l} \) 를 넣고 원심 분리시켜 DNA를 침전시켰다. \( 100 \mu \mathrm{l} \) 의 \( 1 \times \mathrm{TE} \) buffer로 DNA를 용해시켰으며, spectrophotometer (Optizen 3220UV)를 이용하여 DNA를 정량하였다. 이 DNA를 PCR 분석의 template로 사용하였다.</p> <h2>RAPD 및 유연관계 분석</h2> <p>RAPD 분석을 위해 Perkin-Elmer사의 PE-9700을 이용하여 PCR 반응을 수행하였으며, PCR 반응액은 template DNA \( 10 \mathrm{ng} \), 50 pmol random primer, \( 10 \times \text{Ex buffer}\), dNTP, 1 U Ex Taq (TaKaRa, Japan)를 혼합하여 최종량을 \( 25 \mu \mathrm{l} \)로 하였다. Random primer는 시판되는 39종(OPA 20종, OPB 19종, Operon Co, USA)을 사용하였다. PCR 증폭 반응은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 pre-denaturation한 다음 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초간 denaturation, \( 39^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분간 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분간 ex-tension을 45회 반복한 후, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 post-extension하였다. 증폭된 PCR 산물은 \( 1.5 \% \) agarose gel에 전기영동한 후 \( \mathrm{UV} \) transilluminator를 이용하여 증폭된 DNA 단편을 확인하였다. 실험의 재현성을 위해 2회 반복 실험하여 증폭된 DNA 단편을 확인하였다. RAPD 분석결과 다형성을 나타내는 DNA 단편의 유무에 의해있는 경우는 1 , 없는 경우는 0으로 기록하고 기초 행렬을 작성하였다. 유연관계 분석은 Nei와 Li의 방법에 준하여 유사도 지수를 계산한 후 작성된 정보를 통계 프로그램인 NTSYS complete Program (Numerical taxonomy system과 multivariate analysis system, version 2.1, Applied Biostatistics Inc, USA)을 이용하여 유사도 값을 구했으며, UPGMA clustering 방법으로 14 품종간의 유연관계를 분석하였다.</p>