실험에 사용된 균주는 국내에 분포하는 흰개미의 장을 적출하였고, skim milk agar을 이용하여 Protease를 분비하는 균을 분리하였다. 이후 최적의 균체생육과 효소생성을 밝혀내기 위해 배양시간은 3시간 간격으로, 온도는 \( 15^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(40^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \) 간격으로, \( \mathrm{pH} \) 는 \( 4.0 \) 에서 \( 10.0 \) 까지 \( \mathrm{pH} 1.0 \) 간격으로 조절하여 측정하였다. 이때 균체생육은 분광광도계를 이용하여 \( 660 \mathrm{~nm} \) 에서 배양액의 흡광도를 측정하여 결정하였고, 효소생성은 배양액을 원심분리 한 후 그 상등액을 조효소액으로 사용하여 측정했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험균주 분리</h2> <p>실험에 사용된 균주는 국내에서 분포하고 있는 흰개미의 장으로부터 유래된 것으로 흰개미(Reticulitermes speratus)는 경상남도 밀양시 삼랑진읍 야산에서 채집하여 일개미(worker)의 장을 적출하였다. Protease를 분비하는 균을 분리하기 위해 skim milk agar (skim milk \( 12 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), bactotryptone \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), yeast extract \( 5 \mathrm{~g} / \mathrm{l}\), \(\mathrm{NaCl} 5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), bactoagar \( 18 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), \( \mathrm{pH} 7)\)를 이용하여 clear zone이 크고 생육이 우수한 균주를 분리하였다. 활성이 가장 큰 균주는 액체배양한 후 glycerol을 첨가하여 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) deep freezer에 보관하였다.</p> <h2>균주 배양 및 protease 생산조건 검토</h2> <p>최적의 균체생육과 효소생성을 규명하기 위해 배양시간은 3 시간 간격으로 측정하였고, 온도는 \( 15^{\circ} \mathrm{C} \sim 40^{\circ} \mathrm{C} \) 로 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \) 간격으로, \( \mathrm{pH} \) 는 \( 4.0 \sim 10.0 \) 까지 \( \mathrm{pH} 1.0 \) 간격으로 조절하여 측정하였다. 효소생성 최적화에 사용한 배지는 NB 였으며, 균체생육과 효소생성에 관한 탄소원 영향은 glucose, fructose, sucrose, lactose, starch를 이용하여 조사하였으며, 선정된 최적 탄소원은 \( 0 \sim 1 \% \) 로 \( 0.2 \% \) 간격으로 최적농도를 측정하였다. 질소원 영향은 yeast extract, peptone, malt extract, casamaino acid, tryptone, beef extract, \( \mathrm{NaNO}_{2}\), \(\mathrm{NaNO}_{3}\), \(\mathrm{NH}_{4} \mathrm{NO}_{3}\), \(\left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \)를 이용하여 조사하였으며, 선정된 최적 질소원은 \( 0 \sim 1 \% \) 로 \( 0.2 \% \) 간격으로 최적농도를 측정하였다. 그리고 무기염 영향은 \( \mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\), \(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\), \(\mathrm{NaCl}\), \(\mathrm{CaCl}_{2} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(\mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 를 이용하여 조사하였으며, 선정된 최적 무기염은 \(0\sim0.1\%\)로 \( 0.02 \% \) 간격으로 최적농도를 측정하였다.</p> <p>액체배양은 \( 250 \mathrm{ml} \) 삼각플라스크에 배양액 \( 50 \mathrm{ml} \) 과 실험 균주 \( 2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 를 접종하여 \( 200 \mathrm{rpm} \) 으로 진탕배양하였다.</p> <h2>실험 균주의 동정</h2> <p>분리된 균주를 동정하기 위하여 Bergey's manual of systematic bacteriology에 기술된 방법에 따라 형태학적, 생리학적 특징을 조사하였고, 16S rRNA 염기서열을 분석하여 균을 동정하였다.</p> <h2>균체의 생육 및 효소활성의 측정</h2> <p>균체의 생육은 배양액을 분광광도계를 사용하여 \( 660 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 결정하였고, 효소생성 측정은 배양액을 원심분리 한 후 그 상등액을 조효소액으로 사용하였다. 효소생성 측정을 위하여 \( 2 \% \) hammersten casein 기질용액 \( 1 \mathrm{ml} \) 과 조효소액 \( 1 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에 10 분 동안 반응시켰다. 반응액에 \( 5 \% \) trichloroacetic acid 용액 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 을 가하여 반응을 중지시키고, 30분 동안 정치한 후 원심분리하여 상등액을 회수하였으며, 상등액은 \( 280 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 1 unit은 1 분당 흡광도 0.01 을 증가시키는데 필요한 효소량으로 하였다.</p>