젓산에 대한 내성을 확인하기 위해서 분리균과 대조균을 대수기와 정지기까지 배양하고 각 생육주기의 균체믈모아 세척한 뒤, 다시 새 MRS액체배자로 옮긴 후 \( 0.6 \% \)\( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 젓산을 첨가하였다. 1시간 동안 젖산을 처리한 후 균체를 모아 실험재료로 사용하였다.\( 1 \% \mathrm{CaCO}_{3} \) 를 첨가한 MRS 한천배지에 김치샘줄을 \( 10^{6} \) 배까지 회석한 뒤 도말하여 콜로니 주변에 투명한 환을 생성하는 균을 일차적으로 선별하고 균을 분리하였고, \( 0.002 \)\%의 bromophenol blue를 첨가한 MRS한천배지에서 군청색의 콜로니를 나타내는 균주를 이차적으로 선별하였다.Miller의 방법을 응용하여 Gas chromatography를 실행하였다. MRS 액체배지에서 흡광도와 세포외부를 측정한 이후, 증류수 세척을 통해 젖산을 제거하고, 새 배지에 옮긴 후에 젖산은 농도별로 첨가하여 1시간 반응 후 추출, MRS 한천배지에 \( 5 \mu \) 떨어뜨려 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 배양한 후 결과를 관찰하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주분리 및 배양</h2> <p>대구지역 식당 및 가정에서 무작위로 채취한 200여 김치 샘플에서 산내성을 가진 Leuconostoc mesenteroides 균주를 분리하였다. 대조균주는 한국생명공학연구원 유전자은행에서 분양받은 Leuconostoc mesenteroides KCTC3505(ATCC8293, NCDO523)을 사용하였다. 이 실험에서 사용된 균주는 젖산균 선택배지인 MRS(DeMan, Rogosa, Shar-pe)배지 (Difco, Le Pont de Claix, France)에서 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 24 \) 시간동안 정치배양을 하였다.</p> <h2>젖산 처리조건</h2> <p>젓산에 대한 내성을 확인하기 위해서 분리균과 대조균을 대수기와 정지기까지 배양하고 각 생육주기의 균체믈모아 세척한 뒤, 다시 새 MRS액체배자로 옮긴 후 \( 0.6 \% \)\( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 젓산을 첨가하였다. 1 시간 동안 젖산을 처리한 후 균체를 모아 실험재료로 사용하였다.</p> <h2>선택배지</h2> <p>\( 1 \% \mathrm{CaCO}_{3} \) 를 첨가한 MRS 한천배지에 김치샘줄을 \( 10^{6} \) 배까지 회석한 뒤 도말하여 콜로니 주변에 투명한 환을 생성하는 균을 일차적으로 선별하고 균을 분리하였고, \( 0.002 \%\)의 bromophenol blue를 첨가한 MRS한천배지에서 군청색의 콜로니를 나타내는 균주를 이차적으로 선별하였다. 그리고 Lee의 방법 을 응용하여 Sucrose 한천배지(Sucrose\( 2 \% \), peptone \( 1.5 \%, \mathrm{NaCl} 0.5 \% \), Tween \( 800.1 \% \), Yeastextract \( 0.6 \% \), L-cysteine \( 0.01 \% \), Agar \( 1.5 \%, \mathrm{pH} \) 6.5)을 최종선택배지로 이용하였다.</p> <h2>지방산 분석</h2> <p>Miller의 방법을 응용하여 Gas chromatography늘 실행하였다. \( 50 \mathrm{ml} \) 의 MRS배지에서 배양한 세포를 screw captube(Pyrex)로 옮겨 \( 15 \% \mathrm{NaOH} \) 와 \( 50 \% \) methanol을 \( 1 \mathrm{ml} \)넣고 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 꿇인 후 다시 냉각시킨다. \( 6.0 \mathrm{~N} \)\( \mathrm{HCl} 325 \mathrm{ml} \), methanol \( 275 \mathrm{ml} \) 혼합한 용액을 \( 2 \mathrm{ml} \) 넣고섞은 후 80 에서 10 분간 가열하고 찬 물로 냉각시킨다.Hexan과 Methyl-tert Butyl Ether를 동량으로 넣은 용액을\( 1.25 \mathrm{ml} \) 첨가한 뒤 10 분간 섞어준다. 용액이 두 층으로 나뉘면 하충의 용액을 제거하고 \( \mathrm{NaOH} \) 용액 \( (10.8 \mathrm{~g} \mathrm{NaOH} \),\( 900 \mathrm{ml} \mathrm{d} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) )을 \( 3 \mathrm{ml} \) 넣고 5분간 섞어준다. 두 층으로 나뉘면 상둥액을 다시 screw sample vial (Hewlett Packard)로 옮겨 시료로 사용하였다. 지방산의 분석에는 HewlettPackard series I Gas Chromatography model 5890A(Microbial ID, Inc. Delaware, USA)를 이용하여 측정하였다. 이용한 separation column은 \( 25 \mathrm{~cm} \times 0.22 \mathrm{~cm} \times 0.33 \mathrm{~cm} \)methyl phenyl silicone fused silica capillary column (HP1909B-102)을 사용하였고, Microbial Identification SystemSoftware (Microbial ID, Inc., Delaware, USA)를 통해 지방산의 profile을 확인하였다. Standard calibration 용액(Microbial ID, Inc., Delaware, USA)을 이뵹하여 standardpeak을 잡았고, 이를 통혜 시료의 peak을 구하였다. Gas Chromatography의 조건은 다음과 같이 잡았다.</p> <h2>젖산 존재하의 생육</h2> <p>MRS 액체배지에서 24 시간 배양한 균주를 \( 0.1 \% \) 에서\( 1.0 \% \) 의 젖산을 첨가한 MRS 액체배지에 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하면서 2 시간 간격으로 흡광도와 세포외부 \( \mathrm{pH} \) 를 측정하였다. 흡광도는 Spectrophotometer (Beck-man, DU-40, USA)를 사용하여 \( 660 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였고,extracellular \( \mathrm{pH} \) 는 \( \mathrm{pH} \) meter (Mettler, DELTA 320, Rev\( \mathrm{A}, \mathrm{UK}) \) 를 이용하였다.</p> <h2>젖산에 대한 민감성 측정</h2> <p>MRS 액체배지에서 24 시간 배양한 균주를 증류수로 세척하여 균체가 생산하는 젖산을 제거한다. 동량의 새 배지에 옮긴 후, 젖산은 농도녈로 첨가하여 1 시간 반응 후 추출, MRS 한천배지에 \( 5 \mu \) 떨어뜨려 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 배양한 후 결과를 관찰하였다.</p>