재분화 효율을 높이기 위해 항산화제(ascorbic acid, cystein)를 단용 또는 혼용하여 실험하였고, 엽록체 형질전환을 위한 선발 항생제 적정 농도를 알아보기 위해 spectinomycin과 kanamycin을 첨가하여 실험하였다. 토마토 엽록체 형질전환용 벡터 pKRT22-A는 토마토엽록체 게놈 부위를 PCR 반응으로 증폭한 후 pCR2.1-topo vector로 도입되었다.
<h3>식물체 재분화 및 선발마커 농도</h3> <p>재분화 효율을 높이기 위하여 항산화제를 첨가하여 재분화능에 미치는 영향을 조사하였다. 국립원예특작과학원 육성 원홍1호 (계통번호 2001-58)를 공시품종으로 하였다. 재분화 배지에 항산화제인 ascorbic acid \( 100~400 \mu \( \mathrm { M } / \mathrm { L } \) 과 cystein \( 300 ~ 900 \mu \mathrm { M } / \mathrm { L } \)을 단용 또는 혼용으로 첨가하여 실험을 실시하였다. 항산화제는 멸균수에 녹인 후 filtering을 하여 사용하였으며, 멸균한 배지를 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 정도가 되게 식힌 후 첨가하였다. 엽록체 형질전환을 위한 선발 항생제 적정 농도를 알아보기 위해 재분화 배지에 spectinomycin \( 5~25 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) 을 각 각 첨가한 후 배양 4주후에 재분화능을 조사하였다.</p> <h1>토마토 엽록체 형질전환 벡터 제작</h1> <p>토마토 엽록체 형질전환용 벡터 pKRT22-A는 토마토엽록체 게놈의 rrn16~trnA (103,993 nucleotide [n.t.] 106,182 n.t., GenBank accession no. Z00044, EMBL Nucleotide Se-quence Database) 부위를 PCR 반응을 통하여 증폭 한 후 pCR2.1-topo cloning kit (Invitrogen)을 이용하여 pCR2.1-topo vector로 도입되었다. Daniell 등 (1998)의 방법을 이용하여 pUC18에 삽입한 후, 16S rRNA promoter와 psbA 3' terminator 사이에 aadA (aminoglycoside 3"-adenylyltransferase)유전자가 들어있는 cassette를 Sma Ⅰ으로 절단한 후 토마토 엽록체 flanking region내 존재하는 Pvu Ⅱ (105,331 n.t.)를 이용하여 벡터를 구축하였다. PCR primer는 forward primer (5'-AAA ACC CGT CCT CAG TTC GGA TTG CC-3')와 reverse primer (5'-CAC GAG TTG GAG ATA AGC GG3')를 사용하였다. PCR 반응은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5분간 반응 후, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 30초, \( 58.5 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 30초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 1분 30초간 30회 반복 실시하였다. 얻어진 PCR 산물은 0.5X TAE agarose gel을 이용하여 전기영동하였다. pKRT22-A의 토마토 엽록체내 발현 여부를 조사하기 위해 wild type pEGFP vector (clontech)를 Xba I으로 gfp 유전자를 분리한 후 토마토 엽록체 형질전환 벡터 pKRT22-A에 cloning 하여 pKRT22-AG를 작성하였다.</p>