Elastase 저해활성은 시료를 tris-HCl 버퍼로 녹인 후, 30분간 반응시켜서 측정하였다. 반면, 미백 활성은 mushroom tyrosinase를 사용하고, 이를 sodium phosphate buffer로 녹인 후, 37도에서 2분간 반응시켜서 측정하였다. 이 두 가지 방법을 통해 각각의 활성을 확인하였다.
<h2>주름 억제 활성 측정</h2> <p>Elastase 저해활성은 다음과 같이 진행하였다. \( 40 \mu \mathrm { L } \) 의 시료를 96 well plate에 넣고 \( 50 \mathrm { mM } \) tris-HCl buffer \( ( \mathrm { pH } \) 8.6)로 기질과 효소를 녹인후 처리한다. 30분간 반응시킨 후 \( 445 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다. Procollagen type-I 생합성 측정은 96 well plate에 CCD-986sk cell을 \( 1 \times 10 ^ { 4 } \) cells/well로 분주하여 UV-B \( \left (20 \mathrm { ~mJ } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \right ) \) 와 TNF- \( \alpha(10 \mathrm { ng } / \mathrm { mL } ) \) 를 처리한 후 48 시간 배양하였다. 이것의 상등액을 취하여 propeptide의 양을 측정하였다.</p> <h2>미백 활성 측정</h2> <p>미백 활성은 mushroom tyrosinase \( (110 \mathrm { U } / \mathrm { mL } ) \) 를 사용하여 측정하였다. \( 0.175 \mathrm { M } \) sodium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } \quad 6.8) \) 로 10 \( \mathrm { mM } \) L-DOPA와 효소를 녹인후 각 반응구에 넣고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2 \( \min \) 간 반응시켜 \( 492 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다.</p> <h2>Western blot을 통한 주름 및 미백 관련 단백질의 발현 측정</h2> <p>CCD-986sk, HEM cell을 6 well plate에 각각 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well, \( 3 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { cells } / \mathrm { well } \) 로 분주하고 24 시간 동안 안정화시켰다. 그 후 UV-B \( \left (20 \mathrm { ~mJ } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \right ), \mathrm { TNF } - \alpha(10 \mathrm { ng } / \mathrm { mL } ) \) 또는 forskolin \( (1 \mathrm { nM } ) \)을 시료와 함께 48시간 동안 배양하였다. 처리된 세포를 lysis buffer로 모은후 bradford assay를 통해 정량하였으며 \( 10 \% \) SDS-PAGE로 전기영동 하였다. PVDF membrane에 transfer하는 과정과 primary \&secondary antibody를 반응시키는 것을 통해 결과를 측정하였다. 결과는 ImageQuant LAS-4000 (GE life sciences, Taipei, Taiwan)를 사용하여 수치화 하였다.</p>