리파아제 K80의 유기용매 특성을 조사하기 위해 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, n-부탄올을 이용하여 0-90% 농도의 다양한 유기용매와 리파아제 K80을 섞고 30분간 방치한 후 원심분리를 통해 상등액을 얻었다. pH stat 방법을 이용하여 리파아제 활성을 측정하고, 올리브오일과 다양한 알코올을 몰비 1:1로 섞고 리파아제 K80을 800 U 만큼 넣어 24시간 동안 반응을 진행하여 바이오디젤 생산용 알코올을 선택하였다.
<p>두 번째는 \( \mathrm { pH } \) stat 방법을 이용하여 리파아제 활성을 측정하였다. 기질혼합액으로 올리브유 에멀젼(1 \% 올리브유, 1% gum Arabic, \( \left .20 \mathrm { mM } \mathrm { CaCl } { } _ { 2 } , 100 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } \right ) \)을 사용하였다. 기질혼합액 \( 20 \mathrm { ~mL } \)의 \( \mathrm { pH } \)가 8.0으로 되도록 \( 10 \mathrm { mM } \mathrm { NaOH } \)를 첨가하였고 효소액 또는 고정화 \( \mathrm { K } 80 \)을 넣고 \( \mathrm { pH } \)가 8.0으로 유지되도록 조절하면서 반응을 진행하였다. 5 분간 생성된 자유지방산의 양을 \( \mathrm { pH } \) titrator로 측정하였다. (Titrino718, Metrohm) 효소활성 1 unit는 분당 \( 1 \mu \mathrm { mo } \)의 자유지방산이 생성되기 위해 필요한 효소의 양으로 정의하였다.</p> <h2>리파아제 K 80 의 유기용매에 대한 특성</h2> <p>유기용매는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, n-부탄올을 사용하였다. 0-90%농도의 다양한 유기용매와 리파아제 K80을 섞고, \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30 분간 방치한 후, 원심분리 \( (10,000 \times \mathrm { g } ,) 10 분, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) )를 통해 상등액을 얻었으며, 이 상등액의 효소활성을 \( \mathrm { pNPC } \) assay를 통해 측정하였다.</p> <h2>다양한 알코올을 이용한 바이오디젤 합성반응</h2> <p>올리브오일과 여러 가지 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올,부탄올)을 몰비가 1:1로 되도록 섞고 리파아제 K80을 이용하여 바이오디젤 합성반응을 진행시켰다. 리파아제 K80을800 U 만큼 넣고 24시간 동안 반응을 진행한 뒤, 박층크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)를 이용하여 반응산물을 분석하였다. 분석결과를 토대로 바이오디젤 생산용 알코올을 선택하였다.</p> <h2>담체를 이용한 고정화 K80 제조</h2> <p>담체 \( 1 \mathrm { ~g } \) (건조중량)을 메탄올 \( (100 \%) \) 과 섞고 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1시간 동안 진탕반응 \( (160 \mathrm { rpm } ) \)하여 활성화시킨다. 이후, 칼륨인 산용액 \( (10 \mathrm { mM } , \mathrm { pH } 7.0) \)으로 세척하고 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1시간 동안 다시 진탕반응한다. 활성화된 담체를 \( 15 \mathrm { ~mL } \) 부피의 리파아제 \( \mathrm { K } 80 \) 효소액(단백질 \( 100 \mathrm { mg } , 0.5 \mathrm { M } \) 황산암모늄용액)에 넣고 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 4시간 동안 진탕배양기에서 반응한다 \( (160 \mathrm { rpm } ) \). 반응시간 \( 0,2,4 \) 시간에 반응상등액 \( 200 \mu \mathrm { L } \)을 취해 \( \mathrm { pH } \) STAT방법으로 잔존활성을 확인하였다. 4시간 동안 반응한 후, 상등액을 제거하고 황산암모늄이 포함된 완충용액 0.5M \( \left ( \mathrm { NH } _ { 4 } \right )_ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } , 10 \mathrm { mM } \) potassium phosphate buffer, pH 7.0)으로 2시간 동안 세척과정을 거친다 \( \left (25 ^ {\circ } \mathrm { C } , 160 \mathrm { rpm } \right ) \). 진공농축기(EYELA UT-1000/CVE-2000)를 이용하여 수분을 제거한 후, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 보관하였다. 담체에 고정된 리파아제 \( \mathrm { K } 80 \)의 효소활성을 \( \mathrm { pH } \) STAT방법으로 측정하여 고정화 수율 \( ( \eta) \)과 활성 유지율(R)을 다음 식을 이용하여 계산했다.</p>