생후 4주령 Sprague Dawley계 수컷 흰쥐 24마리를 구입하여 1주일간 일반사료(F사의 정제 일반사료)를 사용하여 모든 군에게 섭취하고 물도 충분히 공급하였으며 실험동물의 운동은 트레드밀로 실시하였는데 운동은 1주차에 속도 \( 15 \mathrm{m} / \mathrm{min} \) (\(0\%\) grade), 주5회, 1일 30분 실시하였고, 2주에서 4주차에는 속도 \( 15 \mathrm{m} / \mathrm{min} \) (\( 0 \% \) grade), 주5회, 1일 60분으로 실시하였다. 각 실험 군의 실험동물은 희생하기 전 12시간 이상 절식시켜 ether 마취 후 복부를 절개하여 혈액과 간을 채취하고 자료는 SPSS Ver 18.0 통계 package를 이용하여, 각 변인들 간에 평균 및 표준편차를 산출한 후 집단간 one-way ANOVA를 실시하였고, 사후검증은 Duncan방법을 이용하였으며, \( a=0.05 \)로 유의수준을 설정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험동물</h2> <p>생후 4주령 Sprague Dawley계 수컷 흰쥐 24마리(Samtako, Korea)를 구입하여 1주일간 일반사료로 적응시켰다. 그룹은 흑마늘운동군(6마리), 운동군(6마리), 흑마늘군(6마리), 대조군(6마리)으로 사육은 cage \( 50 \times 30 \times 25.5 \mathrm{~cm} \)의 크기에 2마리씩 사육하였으며, 사육실의 온도는 \( 22.0 \pm 1.0^{\circ} \mathrm{C} \), 상대습도는 \( 50 \pm 10 \% \)로 조절하고, 명암주기는 12시간 간격으로 유지하였다. 실험 동물의 신체적 특성은 Table 1과 같다.</p> <h2>식이조성 및 훈련방법</h2> <p>사료는 F사의 정제된 일반사료를 사용하여 모든군에게 섭취하도록 했으며, 물은 충분히 섭취하도록 공급하였다. 흑마늘섭취는 유산소운동과 흑마늘군을 대상으로 주 5회 운동 30분 전에 C사의 흑마늘진액 \( 2.86 \mathrm{~g} / \mathrm{kg} \)의 정량을 구강 투여시켰으며, 체중을 측정하여 증가한 체중에 비례하여 흑마늘 투여량을 늘려갔다. 구강투여 시 받는 스트레스를 동일하게 하기 위하여 운동군과 대조군은 물을 구강투여 시켰다.</p> <p>실험동물의 운동은 트레드밀(Pro-Jog EJ36GLE, Korea Hi-Tech)로 실시하였으며, 운동은 1주차에 속도 \( 15 \mathrm{~m} / \mathrm{min} \) (\(0\%\) grade), 주5회, 1일 30분 실시하였고, 2주에서 4주차에는 속도 \( 15 \mathrm{~m} / \mathrm{min} \) ( \( 0 \% \) grade), 주5회, 1일 60분으로 실시하였다. 고강도 운동은 시료를 채취하기 바로 직전에 실시하였으며, 일회성 고강도 운동으로 \( 15 \mathrm{~m} / \mathrm{min} \)속도로 시작하여 10분마다 점진적으로 속도를 높여 \( 24 \mathrm{~m} / \mathrm{min} \)속도까지 높였고, 더 이상 쥐들이 외부 자극에도 운동을 하지 않고, 지속할 수 없다고 판단되었을 때 운동을 중지하였다.</p> <h2>시료수집 및 분석방법</h2> <p>각 실험 군의 실험동물은 희생하기 전 12시간 이상 절식시켜 ether 마취 후 복부를 절개하여 혈액과 간을 채취하였다. 채취 후 액체 질소에 급속 동결시킨 후 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하여 TBARS, HSP 70과 COX-2을 분석하였다.</p> <p>지질과산화를 측정하는 방법으로 과산화지표인 Thiobarbituric acid reactive substance (TBARS)는 ZeptoMetrix의 Assay Kit를 이용하여 Ohkawa 등이 기술한 방법을 이용하여 Thiobarbituric acid (TBA)와 반응하는 물질을 추출하여 측정하였다. 혈장 \( 0.2 \mathrm{ml} \)에 \( 8.1 \% \) sodiumdodecyl sulfate와 \( 20 \% \) acetic acid \( 1.5 \mathrm{~ml} \)를 가한 후 잘 섞고. \( 0.8 \% \) TBA \( 1.5 \mathrm{~ml} \)와 증류수 \( 0.6 \mathrm{ml} \)를 넣고 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 가열 후 5분간 냉각하였고, 증류수 \( 1 \mathrm{~ml} \)와 n-butanol/pyridine \( (15: 1, ~\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)과 \( 5.0 \mathrm{~ml} \)의 증류수를 가하여 30초간 진탕하였다. \(3,000 \mathrm{~rpm}\)에서 15분간 원심 분리한 후 상층액을 취하여 10분간 실온에서 안정시킨 후 \( 532 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <p>실험 동물에서 적출한 조직을 PBS용액을 이용하여 조직 내의 혈액을 최대한 제거한 후 해부가위를 이용하여 세절하였다. 다음으로 단백질을 추출하기 위해 lysis buffer (Loche. CA)에 protease inhibitor (Loche. CA)가 함유된 용액을 첨가하여, 호모게나이저에 마쇄하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에 \( 30 \mathrm{~min} \) 간 lysis후, \( 4^{\circ} \mathrm{C} ~14,000 \mathrm{~rpm} \)에서 \( 30 \mathrm{~min} \)동안 원심분리하였다. 원심 분리된 용액 중 상층액 만을 분리한 후 상층액의 \( 2 ~\mu \mathrm{l} \)를 protein assay 용액 (Bio-Rad, USA) \( 1 \mathrm{~ml} \)에 첨가한 다음 spectrophotometer (eppendorf, USA)를 이용하여 \( 560 \mathrm{~nm} \)의 흡광도에서 단백질량을 정량하였다. 정량화된 단백질에서 각 샘플 당 동일한 단백질량(\(20 ~\mu \mathrm{g})\)을 SDS-gel loading 용액에 총 \( 20 ~\mu \mathrm{l} \)가 되도록 혼합한 다음 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 변성시켰다. 변성된 단백질(\(20~\mu \mathrm{l} \))을 스탠다드 단백질 마커(SDS-PAGE molecular weight maker, Bio-rad)와 함께 Mini-Protein Ⅱ dual-slab appara-tus(Bio-Rad)에 의해 만들어진 \( 10 \% \) SDS-polyacrylamide gels에 각 샘플을 주입한 다음 \( 100 \mathrm{~V} \)에서 2시간 동안 단백질이 바닥에 닿을 때까지 전기영동 하였다. 전기 영동된 단백질을 PVDF membrane (Amersham, USA)에 전이하기 위해 Minitrans - module (Bio-Rad)를 이용하여 transfer 용액(\(190 \mathrm{~mM}\) glycine, \( 50 \mathrm{~mM} \) Tris-base, \(20\%\) methanol, \(0,05\%\) SDS)속에 단백질이 전기영동된 젤과 PVDF membrane (millipore) 및 \( 3 \mathrm{M} \) paper를 차례로 겹치도록 한 다음 \( 240 \mathrm{~mA} \)에서 2시간 동안 전이 하였다. 단백질이 전이된 membrane은 phosphate-buf-fered saline (PBS) (\( \mathrm{Nacl} ~8\mathrm{g}\), \(\mathrm{~KCl} ~0.2 \mathrm{~g} \), \( \mathrm{Na2HPO4} ~1.44 \mathrm{~g} \), \( \mathrm{KH2PO4} ~0.24 \mathrm{~g} \), \( \mathrm{pH} 7.4 \))에 \(5\%\) skim milk가 첨가된 용액에서 1시간 동안 rocker platform (Fine PCR, Co)에서 blocking되었다. 그 다음 membrane는 PBS에 \(0.1\%\) tween-20이 함유된 용액(PBST)에서 10분간 3번 세척되었으며, 세척된 membrane은 일차 항체인 Monoclonal COX-2 antibody, Monoclonal HSP 70 antibody (Santacruz, CA)가 1: 1,000으로 PBST 용액에 희석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 overnight 반응시킨 후 PBST용액에서 \( 10 \mathrm{~min} \)씩 3회 동안 세척되었다. 일차 항체에서 반응된 membrane은 donky anti goat, goat anti mouse IgG conjugated secondary antibody가 첨가된 용액에서 1시간 동안 반응된 다음 PBST용액에서 \( 10 \mathrm{~min} \)씩 3회 동안 세척되었다. 세척된 membranes은 ECL detection reagent (Amersham, USA) 용액(\(1 \mathrm{ml}\))에 1분간 노출된 후 imaging system인 Bio-Rad chemidoc XRS을 통해 immuno reactive bands의 상대적 강도가 정량화되었다.</p> <h2>자료처리</h2> <p>자료는 SPSS Ver 18.0 통계 package를 이용하여, 각 변인들 간에 평균 및 표준편차를 산출한 후 집단간 one-way ANOVA를 실시하였고, 사후검증은 Duncan방법을 이용하였으며, 유의수준은 \( a=0.05 \)로 설정하였다.</p>