활성 분석 수행 전 시료가 세포생존율에 미치는 영향을 확인하고, 세포 독성을 유발하지 않는 시료의 처리 농도를 결정하기 위해 각 추출물에 의한 세포 독성 유발 유무를 WST assay를 통해 수행하였다. ROS는 과량 생산 시 핵산, 단백질, 지질 등의 생체 내 고분자에 산화적 스트레스를 유발하여 다양한 질병의 원인이 되므로 이러한 ROS의 소거능은 항산화력의 중요한 지표가 된다.
<h2>세포생존율 분석</h2> <p>활성 분석 수행 전 시료가 세포생존율에 미치는 영향을 확인하고, 세포 독성을 유발하지 않는 시료의 처리 농도를 결정하기 위해 각 추출물에 의한 세포 독성 유발 유무를 WST assay를 통해 수행하였다. \( 1.0 \times 10^{5} \) cell을 24-well tissue culture plate에 분주하여 24시간 동안 부착시키고, 농도별 시료 처리 24시간 경과 후 WST 시약이 든 배지로 교체하여 한 시간 동안 반응시킨 다음 multi-plate reader를 이용하여 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었으며 독성을 유발하지 않는 농도 범위에서 이후 실험을 수행하였다.</p> <h2>Reactive oxygen species (ROS) 소거능 분석</h2> <p>ROS는 과량 생산 시 핵산, 단백질, 지질 등의 생체 내 고분자에 산화적 스트레스를 유발하여 다양한 질병의 원인이 되므로 이러한 ROS의 소거능은 항산화력의 중요한 지표가 된다. Hydrogen peroxide \( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \)는 대표적인 ROS 중 하나로 소재의 항산화능을 규명하기 위한 많은 연구에서 ROS 유도제로 사용되고 있다. 또한 그람 음성 박테리아의 세포 외벽 구성 인자인 lipopolysaccharide (LPS)는 대표적인 염증 유발 인자로 산화적 스트레스 또한 유발하는 것으로 알려져 있어 항산화능 및 항염증 활성을 규명하기 위한 많은 연구에서 스트레스 유도제로 사용되고 있다. 본 연구에서는 각 소재가 보유한 항산화능을 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 및 LPS로 유도한 ROS 생성에 시료가 미치는 영향을 통해 분석하였다. 이를 위해 RAW \( 264.7 \) cell에 cell permeable fluorescent dye인 \( 50 \mu \mathrm{M} \) 의 dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA)를 2시간 동안 전 처리한 후 제거하고 \( 500 \mu \mathrm{M} \)의 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 혹은 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 LPS를 농도 별 시료와 함께 처리한 후 시료에 의한 ROS 생성 억제능을 multiplate reader를 이용한 fluorescence 측정을 통해 분석하였다. 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.</p> <h2>항산화 효소 HO-1 및 상위전사인자 Nrf2 의 발현 조절능 분석</h2> <p>각 소재의 항산화 활성 기전을 알아보기 위해 대표적인 항산화 효소인 HO-1과 그 상위전사인자인 Nrf2의 시료 처리에 의한 단백질 발현 변화를 Western blot hybridization으로 분석하였다. HO-1의 일차항체는 Cell Signaling Technology (MA, USA)로부터 구입하였고, Nrf2 그리고 Actin의 일차항체와 anti-goat, anti-rabbit 등의 이차항체는 Santa Cruz Biotechnology (CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 시료 처리가 끝난 배양 세포에서 단백질을 추출하여 Bradford assay로 단백질 농도를 결정한 후 \( 50 \mu \mathrm{g} \)의 단백질을 \( 10 \% \) sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 전기영동하고 nitrocellulose membrane에 blotting한 후 \( 1: 1,000 \)으로 희석한 대상 단백질의 일차항체와 hybridization하였다. Membrane 수세 후 horse radish peroxidase (HRP)가 부착된 이차항체(1:1,000)로 한 시간 동안 반응시키고 chemiluminescence detection system (FluoChem \( ^{\circledR} \) FC2, AlphaInnotech, USA)을 이용하여 단백질 발현을 분석하였다. 실험의 결과는 3회 반복 실험을 통해 유의적인 단백질 발현 변화를 확인한 후 대표적인 데이터를 제시하였다.</p>