Hansen의 방법에 따라 RAW 264.7과 EA-HY-926 세포에 대한 ABEE의 세포독성을 MTT를 이용하여, Griess 시약을 사용하여 \( \mathrm { NO } _ { 2 } ^ { - } \) 활성을 측정하였다. DMEM 배지를 이용하여 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well로 조절한 후 24 well plate에 접종하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(5 \% \) \( \mathrm { C } \mathrm { O } _ { 2 } \) 조건에서 배양하였다.
<h2>MTT assay</h2> <p>Hansen 의 방법에 따라 RAW 264.7세포와 EA-HY-926 세포에 대한 ABEE의 세포독성을 MTT (3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)를 이용하여 측정하였다.</p> <h2>Nitrite 활성 측정</h2> <p>RAW 264.7세포와 EA-HY-926 세포로부터 생성된 NO(nitric oxide) 라디칼의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 \( \mathrm { NO } _ { 2 } ^ { - } \)의 형태로서 측정하였다. RAW 264.7세포와 EA-HY-926 세포를 DMEM 배지를 이용하여 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well로 조절한 후 24 well plate에 접종하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \)의 습윤 배양기에서 배양하였다. 세포에 ABEE \( 0.000625 \), \( 0.00125,0.0025,0.005,0.01 \% \) 농도를 전처리하고 1시간 후 \(1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 LPS를 처리하여 72시간 배양하였다. 세포 배양 상등액과 동량의 Griess 시약을 흔합하여 96 well plate에서 10분 동안 반응시킨 후 \( 540 \mathrm { nm } \)에서 흡광도를 측정하고 대조군(control) 값을 \( 100 \% \)기준으로 하여 비교군의 값을 환산하였다.</p> <h2>Angiotensin I Converting Enzyme (ACE) 저해 활성측정</h2> <p>ACE 활성은 \( 0.3 \mathrm { M } \mathrm { ~NaOH } \)을 포함한 \( 0.1 \mathrm { M } \) 붕산나트륨완충액(sodium borate buffer, \( \mathrm { pH } 8.3 \))에 토끼 허파조직으로부터 제조한 아세톤분말(rabbit lung acetone powder, Sigma, USA)을 \( 1 \mathrm { ~g } / 10 \mathrm { ml } ( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \)의 농도로 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2시간 동안 추출한 후, 원심분리 \( \left (4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 4,000 \mathrm { rpm } , 40 \mathrm { ~min } \right ) \)하여 ACE 조효소액을 얻었다. ACE 저해활성은 시험농도 \( (0.00625,0.0125 \), \( 0.025,0.05,0.1 \%) \)의 ABEE의 및 양성대조군 ( \(0.1 \% \)의 captopril)에 각각 \( 0.1 \mathrm { M } \) 붕산 나트륨완충액 ( \( \mathrm { pH } 8.3 \)) \( 100 \mu l \)와 \( \mathrm { ACE } \) 조효소액 \( 50 \mu l \)를 가한 다음, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분 동안 예비반응을 시킨 후, \( 0.3 \mathrm { M } \mathrm { ~NaOH } \)이 포함된 \( 0.1 \mathrm { M } \) 붕산나트륨완충액( \( \mathrm { pH } 8.3 \)) \( 5 \mathrm { ml } \)에 hippuryl-histidyl-leucine (HHL) \( 25 \mathrm { mg } \)을 첨가하여 만든 기질 \( 50 \mu l \)를 가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30분간 반응을 시켰다. \( 1 \mathrm { N } \mathrm { ~HCl } ~250 \mu l \)를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 아세트산 에틸(ethyl acetate) \( 1.5 \mathrm { ml } \)를 가해 15초 동안 교반한 다음, 원심분리( \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 3,000 \mathrm { rpm } , 5 \mathrm { ~min } \))하여 상등액 \( 1 \mathrm { ml } \)을 얻었다. 이 상등액을 완전히 건조시켜 증류수 \( 3 \mathrm { ml } \)를 넣어 교반한 후 분광광도계로 \( 228 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군으로는 증류수 \( 50 \mu l \)를 사용하였으며, 양성 대조군으로는 captopril \( 0.1 \% \)를 사용하여 ABEE와 그 활성을 비교하였다. ACE 효소활성은 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 %값으로 환산하였다.</p>