선발된 균주의 기초 생산조건에 따라 21개의 삼각플라스크에서 11번 배양하였다. dichloro-methane(DCM)을 이용해 배양액을 추출하여 DCM추출물을 생성하고, 6N HCl을 사용하여 펩티드를 추출하였다. 토양 시료를 멸균수에 희석한 후 PDA, SCA, NA 배지에서 도말, 이후에 25℃에서 3~14일간 배양하였다. 이 과정에서 약 100개의 방선균을 순수 분리하였다. BCNU 1030 균주의 동정을 위한 배양학적 및 생리·생화학적 특성 조사를 진행하였고, 여러 화학적 억제제 및 항생제에 대한 감수성 테스트를 수행하였다.
<h2>최소저해농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)측정</h2> <p>선발된 균주의 기초 최적 생산조건을 조사한 결과를 토대로 21 삼각플라스크에서 11 배양하였다. 배양 상등액을 dichloro-methane (DCM)으로 추출하여 DCM추출물을 얻었으며, 동등한 조건으로 \( 6 \mathrm { ~N } \mathrm { HCl } \)침전을 통해 peptide 추출물을 얻었다. 두 추출물을 감압 농축하여 최소저해농도를 측정하기 위한 실험시료로 사용하였으며 각각의 실험시료를 최고농도에서부터 2배수 씩 희석시켜 시험균주를 \( 0.5 \mathrm { MacFaland } \)의 농도로 \( 0.1 \mathrm { ml } \) 도말한 NA 배지에 농도별로 \( 10 μl \)씩 점적하였다. 시험균주의 최적온도에서 24 ~ 72시간 배양한 후 실험시료를 점적한 부분의 미생물의 증식 여부를 관찰하여 최소저해농도를 결정하였다.</p> <h1>결 과</h1> <h2>항균물질 생산 균주의 분리</h2> <p>항균물질 생산 균주를 분리하기 위하여 토양 시료 \( 1 \mathrm { ~g } \)을 멸균수에 \( 10 ^ { 3 } \sim 10 ^ { 5 } \)까지 희석하고 그 현탁액을 PDA, SCA, NA 배지에 도말하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 3 ~ 14일간 배양한 결과, 배양된 평판배지에서 약 100개의 방선균을 순수분리하였다. 순수분리된 방선균 중 MRSA, 그람 양성세균 및 그람 음성세균에 대해 우수한 저해 활성을 보이는 균주를 선발하여 BCNU 1030이라고 명명하였다.</p> <h2>항균물질 생산균주의 동정</h2> <p>BCNU 1030균주의 동정을 위하여 배양학적 성질과 생리 및 생화학적 특성을 조사하였다. ISP배지에서 배양상의 특징을 조사한 결과, ISP 1, ISP 2, ISP 3, ISP 4 배지에서는 집락의 색이 옅은 회갈색이며, 배면은 옅은 노란색을 나타내었고 생육이 좋았으며, ISP 5 배지에서는 흰색의 균사가 관찰되었고 생육 다소 속도가 느렸다. ISP 2, ISP 3, ISP 5 배지에서는 노란색의 가용성 색소의 생산이 관찰되었으며, ISP 6, ISP 7 배지에서는 멜라닌 색소는 형성하지 않음을 확인할 수 있었다. Basal medium을 사용하여 선발된 균주의 탄수화물 자화능을 확인 한 결과, D-,fructose, D-mannitol, raffinose, rham-nose, sucrose 그리고 D-xylose는 탄소원으로 잘 이용하여 생장함을 알 수 있었다. 한편 D-glucose는 탄소원으로 잘 이용하지 못하였으며, L-arabinose는 탄소원으로 전혀 이용하지 못하는 것을 알 수 있었다. 또한, BCNU 1030의 생리적 특징을 관찰한 결과, protease를 분비하는 것으로 나타났으며, pH3.5~9의 범위에서 생육하는 것으로 관찰되었다. \( \mathrm { NaCl } \)의 농도에 대한 내성을 조사한 결과 \( 5 \% \)의 농도에서는 생육하지 못하였다. 화학적 억제제인 \( 0.01 \% \) crystal violet, \( 0.1 \% \) phenol에서도 생육하지 못하였으며, 항생제에 대한 감수성 실험결과 strep-tomycin에 대해서는 내성이 없었다.</p>