본 연구에서는 8% SDS-PAGE 후 단백질을 이동시키고, 여러 단계의 세척과정을 거친 뒤에, 1차 항체와 2차 항체를 각각 반응시킨 후 alkaline phosphatase 완충용액으로 세척한 다음, 얻은 시그널의 강도를 측정하였다. 이를 통해 단백질의 수량을 측정하였으며, 그 결과는 NIH Scion Image Beta 3b software를 이용하여 분석하였다. 분석 결과는 Mann-Whitney U test를 사용하여 통계적 유의성을 조사하였다.
<h2>Immunoblot</h2> <p>8% SDS-PAGE 후 단백질을 전이완충용약(50 mM Tris-base, 380 \( \mathrm { mM } \) glycine, 0.1 \( \% \) SDS, 20 \( \% \) methanol)에서 400 \( \mathrm { mA } (40 \sim 50 \mathrm { ~V } ) \) 로 2시간 \( \mathrm { NC } \) 에 옮겼다. \( \mathrm { NC } \)를 Ponceau 5용액 [0.1 \( \)% (w/v) Ponceau S, 0.1 \( \% \) acetic acid]으로 1분간 염색 하고, 증류수로 세척하여 분자랑 marker를 표시하였다. NC를 TTBS용액 10mM Tris-HCl, pH7.5, 200 \( \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } , 0.2 \% \) Tween-20, \( \left .0.02 \% \mathrm { NaN } _ { 3 } \right ) \) 으로 10분간씩 네 차례 세척하고, 같은 용액에 2시간 더 처리하였다. 일차항체믈 넣고 2시간 반응시킨 후, 과량의 50 \( \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } \) 로 10분간 세척하고, TTBS용액으로 10분간씩 네 차례 더 세척하였다. alkaline phosphatase-conjugated 2차 항체를 넣고 1-2시간 반응시킨 후 TTBS용액으로 10분간씩 두 번, TBS용액( \(10 \) mM Tris-HCl, pH7.5, \( \left .200 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } , 0.02 \% \mathrm { NaN } _ { 3 } \right ) \) 으로 두 번 alkaline phosphatase 완충용액 \( (100 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } , \mathrm { pH } \) 9.5, \( 100 \mathrm { ~m } \mathrm { M } \mathrm { NaCl } , 50 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } 2 \) 으로 한번씩 각각 세척하였다. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate P-toluedine salt (BCIP, \( 3.3 \mu \ell / m \ell \) )와 및 \( p \)-nitro blue tetrazolium chloride \( ( \mathrm { NBT } , 6.6 \mu \ell / \mathrm { ml } ) \) 를 넣고 상온에서 발색시킨 후 증류수로 세척하여 발색을 중지하였다. Blot을 scan하여 얻은 signal 의 강도를 \( \mathrm { NIH } \) Scion Image Beta 3b software를 이용하여 측정하고 Mann-Whitney U test로 통계적 유의성을 조사하였다.</p>