각 미선나무꽃 시료를 메탄올에 침지하여 소니케이터를 사용해서 1시간 간격으로 물을 교환했으며, 5시간씩 3일간 추출했다. 각 시료는 100g씩 분리해 3번의 반복 실험을 시행할 수 있도록 하였다. 이후 추출물들은 감압농축기를 사용해 농축하고 petroleum ether 및 ethyl acetate를 사용하여 흰색 꽃(WF), 상아 꽃(IF), 분홍색 꽃(PF), 황금 꽃(GF) 분획물을 얻었으며, Waters 2996 PDA가 장착된 Waters 2695를 사용하여 WF, IF, PF, GF 및 표준 시약을 분석했다.
<p>Biothechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입헸다. NucleoSpin \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) RNA Plus kit는 Macherey-Nagel (Düren, Germany)에서 구입했다. ReverTra Ace- \( \alpha_ { - } { } ^ {\mathrm { TM } } \) and Quick Taq \( { } ^ { (1) } \) HS Dye Mix는 Toyobo Life Science (Osaka, Japan)에서 구입했다. Quanti Tect \( ^ { (1) } \) SYBR Green PCR kit는 Qiagen (Hilden, Germany)에서 구입헸다. DNA SafeStain은 Lamda Biotech (Ballwin, MO, USA)에서 구입헸다. 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) 는 Invitrogen (Waltham, MA, USA)에서 구입했다.</p> <h2>추출 및 분획</h2> <p>각 미선나무꽃 시료 \( (300 \mathrm { ~g } ) \) 들은 methanol에 침지하여 sonicator \( (40 \mathrm { KHz } ; 700 \mathrm { ~W } \); Hwashin Technology Co., Ltd.)를 이용해서 1 시간 간격으로 물을 교환해주면서 5 시간씩 3 일간 추출헸다. 각 시료는 \( 100 \mathrm { ~g } \) 씩 분리하여 추출하여 3번의 반복 실험을 실시할 수 있도록 설계하였다. 추출물들을 여과한 다음 감압농축기 N-1110 S, EYELA, Tokyo, Japan)를 사용해서 농축한 뒤, 농축된 추출물을 petroleum ether 및 ethyl acetate를 순서대로 사용해서 분획했다. 흰색 꽃 ethyl acetate 분획물(총 \( 1.89 \mathrm { ~g } \) )은 'WF', 상아 꽃 ethyl acetate 분획물(총 \( 1.05 \mathrm { ~g } \) )은 'IF', 분홍색 꽃 ethylacetate 분획물(총 \( 2.28 \mathrm { ~g } ) \) 은 'PF', 황금 꽃 ethyl acetate 분획물 (총 \( 1.35 \mathrm { ~g } ) \) 은 'GF'로 표시했다. 실험에 사용한 분획물들은 DMSO \( (0.1 \% \mathrm { w } / \mathrm { v } \) 이하)에 녹여 \( 100 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) 로 제조하여 실험에 사용헸다. 제조된 시료들은 실험을 진행하는 동안 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 냉장 보관했다.</p> <h2>High-performance liquid chromatography (HPLC)-Photodiode array detector (PDA)</h2> <p>Waters 2996 PDA가 장착된 Waters 2695 (Milford, MA, USA)을 사용하여 WF, IF, PF, GF 및 표준 시약을 분석했다. 분리는 C18 guard column이 있는 Xbridge-C18 (250×4.6 \( \mathrm { mm } , 5 \mu \mathrm { m } \) )을 사용하여 수행되었다. 이동상 용매는 acetonitrile (용매 A)과 \( 1 \% \) 의 acetic acid를 포함하는 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) (용매 B)로 구성했다. 유속은 gradient 조건으로 40 분 동안 \( 1.0 \mathrm { ~mL } / \mathrm { min } \) 으로 일정하게 유지되었으며, 0분, \( 90 \% \mathrm { ~B } \) ; 0-5 분, \( 90 \% \) 에서 \( 85 \% \) B ; 5-15 분, \( 85 \% \) B ; 15-40 분, \( 85 \%-60 \% \) B 으로 설정하였다. 시료 주입 용량은 \( 10 \mu \mathrm { L } \) 였다. PDA 검출기로 190-380 nm에서 모니터링하고 표준 시약(acteoside, rutin 및 hirsutrin)과 비교하여 분석하였다.</p>