참깨의 발육종자에서 Plaque hybridization 방법을 통해 선별된 6 개의 cDNA clone 중에서 가장 큰 cDNA 단편을 선발하여 염기배열을 분석한 결과 그 크기는 \( 1845 \mathrm{bp} \) 이었으며, 다른 종에서 분리된 MIPS 단백질의 크기와 유사하였다. 이 cDNA를 SeMIPS 로 명명하였고 이 유전자의 MIPS 유전자 발현 정도를 notrhern blotting 분석을 시행한 결과, 식물의 어느 기관이나 조직에서 발현하고 있다는 것, 특히 대사 작용이 활발한 기관,조직에서 더 활발히 발현하는 것을 보여주어, MIPS가 식물의 대사작용에 필수적이라는 사실을 간접적으로 입증해주었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>SeMIPS cDNA의 분리와 구조분석</h2> <p>참깨의 발육종자에서 Plaque hybridization 방법을 통해 선별된 6 개의 cDNA clone 중에서 가장 큰 cDNA 단편을 선발하여 염기배열을 분석한 결과 그 크기는 \( 1845 \mathrm{bp} \) 이었으며, 나머지 5 개의 clone들 역시 이 cDNA sequence에 정확하게 일치하는 것으로 확인되었고, 이 cDNA를 SeMIPS 로 명명하였다. 이 cDNA의 open reading frame (ORF)은 510 개 아미노산을 암호화하고 있는 것으로 추측되었으며, 이 cDNA에 의해서 합성되는 SeMIPS 단백질의 크기는 약 \( 56 \mathrm{KDa} \) 으로써 다른 종에서 분리된 MIPS 단백질의 크기와 유사하였다. SeMIPS 단백질의 3'-말단에는 poly (A) 꼬리에서부터 \( 24 \mathrm{bp} \) 와 \( 39 \mathrm{bp} \) 상류에 각각 polyadenylation signal (AATAAA)이 존재하였다.</p> <p>그리고 참깨에서 분리된 SeMIPS cDNA에 의해서 합성될 것으로 추정되는 MIPS의 아미노산 잔기들의 구성으로 볼 때 SeMIPS는 세포질형 MIPS로 예상되었다. 그 이유로는 세포 소기관 또는 엽록체로 향하는 신호펩타이드의 아미노산 잔기들이 N-말단에 존재하고 있지 않을 뿐 아니라, 다른 식물의 세포질형 MIPS의 아미노산 잔기들과의 서열 유사성이 상당히 높다는 점이 그러한 예상을 뒷받침해 주었다(http://www.cbs.dtu.dk). 그리고 아미노산 배열의 유사성을 비교한 결과 tabacco, maize, rice 등 다른 식물 종의 MIPS와는 88-94\%의 동일성과 \( 94-97 \% \) 의 유사성을 가지고 있었으며, human MIPS와는 다소 낮은 \( 60 \% \) 의 아미노산 배열의 동일성과 \( 77 \% \) 의 유사성을 나타내었다. 그리고 SeMIPS 단백질에는 네 종류의 특징적인 domain이 잘 보존되어 있다는 사실이 확인되었으며, 이 domain 들의 아미노산 구성은 GWGGNNG (domain 1), LWTAN-TERY (domain 2), NGSPQNTFVPGL (domain 3), SYN-HLGNNDG (domain 4)로 조성되어 있었다. 이 영역들은 \( \mathrm{NAD}^{+} \)보조인자가 MIPS와 결합하여 이 효소의 촉매 반응에 관여하는 중요한 영역이라 추측되었다. 따라서 참깨에서 분리된 SeMIPS는 MIPS의 정상적인 활성을 가지고 있는 MIPS효소라는 간접적인 증거를 이들의 구조로부터 확인할 수 있었다.</p> <h2>참깨 조직별 MIPS의 발현</h2> <p>참깨 조직별 MIPS 유전자 발현 정도를 알아보기 위해 northern blotting 분석을 실시하였다. 조직은 재료 및 방법에서 제시한 바와 같이 완숙종자, 잎, 줄기, 뿌리로부터 동일한 조건에서 total RNA를 분리하였다. Fig. 4에서 보여주는 바와 같이 SeMIPS의 발현정도는 종자, 줄기 및 뿌리에서보다는 잎에서 상대적으로 많음이 확인되었다. 종자의 발육 단계에 따른 SeMIPS의 발현은 종자형성 초기부터 완숙 전 단계까지 일정한 발현 패턴을 보이다가 완숙 단계(꽃 핀 후 4 주 이후)에서는 현저히 줄어드는 양상을 예비실험 결과에서 얻었다. 따라서 이러한 연구결과들을 종합하여 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다. 첫 째는 MIPS유전자의 발현은 식물의 어느 기관이나 조직에서도 작용하고 있다는 것이고, 둘 째는 대사 작용이 활발한 기관이나 조직에서는 이 유전자의 발현작용이 더 활발하다는 것을 보여주는 것으로 사료되었으며, 셋 째는 MIPS가 식물의 대사작용에 필수적이라는 사실을 간접적으로 입증해 주는 자료로 제시될 수 있었다.</p> <h2>Yeast 돌연변이체를 이용한 SeMIPS의 활성 검증</h2> <p>Yeast 돌연변이체를 이용한 효소 활성 검증은 특정 유전자를 돌연변이 시킨 후 분석하고자 하는 유전자를 형질전환 한 다음 그 기능을 분석함으로써 목적하는 유전자의 기능을 증명하는 기술이다. 본 연구에서 사용한 SH306 효모균주(ino1, ura)는 MIPS 유전자가 부분 결실되어 inositol을 공급해야만 배양되는 균주로써 inositol을 스스로 합성하는 능력을 상실한 호모이다. 따라서 SeMIPS cDNA의 활성 검증을 위하여 강력한 효모 과발현 벡터인 pRS426GPD 를 이용하여 동일한 위치에 각각 SeMIPS cDNA의 EcoR I - Xho I 단편과 EcoR I - Cla I 단편을 삽입하여 pRS426GPD-SeMIPS 발현 벡터를 구축하였다. 이것을 각각 SH306 효모 균주에 형질전환시켜 발현된 SeMIPS가 효모의 myo-inositol 1-phosphate synthase (INO1)의 기능을 대체할 수 있는지 여부를 검증하였다. 열단 inositol이 첨가된 uracil 결실 배지에서 형질전환효모를 선별한 후, inositol assay medium (Difco)에 재접종하여 3-4일 간 배양하였다. Fig. 5 B에서 보여주는 바와 같이 pRS426GPD-SeMIPS벡터의 EcoR I - Cla I로 절단된 DNA단편을 갖고있는 형질전환 효모는 MIPS (INO1)의 기능을 완벽히 보완하여 배지 상에서 생장하였다. 반면에 C-말단의 \( { }^{491} \mathrm{~N}-{ }^{510} \mathrm{~K} \) 의 20개 아미노산이 제거된 단백질을 암호화하는 pRS426GPD-SeMIPS 벡터의 EcoR I- Xho I로 절단된 DNA단편을 가진 형질전환효모는 전혀 MIPS의 기능을 하지 못하여 배지에서 생장 되지 않았다. 이러한 결과는 SeMIPS가 myo-inositol 1phosphate synthase의 효소 활성을 가지고 있다는 증거일 뿐 아니라, 이 효소 반응에 있어 C-말단 영역의 아미노산 서열이 MIPS의 기능에 필수적 영역이라는 점을 암시하고 있다. 앞에서 언급된 아미노산 서열 이외에 MIPS의 활성에 직접적으로 영향을 미치는 특정 아미노산 영역에 관하여 보고된 바는 아직 없다. 특히 SeMIPS의 C-말단 영역은 phosphorylation 및 glycosylation 동의 변형이 예상되는 아미노산 서열을 포함하지 않고 있기 때문에 SeMIPS의 C말단의 아미노산 잔기들의 역할에 대한 중요성이 본 실험에서 처음으로 제시되었다. 따라서 SeMIPS 활성에 있어 필수적이라 추측되는 C-말단 아미노산 서열의 역할을 보다 세밀하게 규명하기 위해서는 점돌연변이 방법 등을 통하여 이 아미노산 영역의 역할에 관한 추가 연구가 수행되어야 할 것이다.</p>