항균활성 효모의 활성 개선을 위해 pBT-GPDp 플라스미드 DNA를 KpnI 부위에 삽입한 발현 플라스미드 DNA를 electroporation 법으로 효모세포에 형질전환시키고, aureobacidin A을 첨가한 YPD 배지로 선별하였다. 형질전환 효모로부터 회수된 플라스미드 DNA를 이용해 대장균 세포를 형질전환시켰으며, 이 대장균 세포로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다. 추출된 플라스미드 DNA는 GPD 프로모터 유전자를 확인하기 위해 제한효소 KpnⅠ으로 절단하고, 0.8% agarose gel에서 전기영동을 수행하여 DNA 단편을 확인하였다.
<h2>항균활성 효모의 활성 개선을 위한 발현 플라스미드 DNA의 구축 및 형질전환 효모의 제작</h2> <p>항균활성 효모의 활성을 개선하기 위해 pBT-GPDp 플라스미드 DNA를 제한효소 KpnI으로 절단한 후 \( 748 \mathrm { ~bp } \)의 GPD 프로모터 유전자 단편을 추출하고 pAUR123 (Takara Korea, Seoul, Korea)과 선행연구에서 개발한 박테리오신 생산 플라스미드 DNA인 pAUR-SubpA, pAUR-SubpB 및 pAUR-OR-7의 KpnI 부위에 삽입하였고, 제한효소를 이용하여 삽입된 GPD 프로모터 유전자 단편 및 그 방향성을 확인하였다. 구축된 발현 플라스미드로 electroporation (Cell-Porator, Life technologies, MD, USA)법에 의해 효모세포(S. cerevisiae KCTC 7913)를 형질전환시켰다. 형질전환된 효모세포의 선별은 YPD 배지에 aureobacidin A (Takara Korea, Seoul Korea)를 최종농도가 \( 0.2 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)이 되게 첨가한 후 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 3일간 배양하여 행하였다.</p> <h2>형질전환 효모로부터 플라스미드 DNA의 분리 및 확인</h2> <p>재조합 플라스미드 DNA가 형질전환된 효모를 aureobacidin A(최종농도 \( 0.2 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) )가 첨가된 YPD 배지 \( 4 \mathrm { ml } \)에 접종하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 하룻밤 동안 배양한 후, 원심분리(14,000× \( g \), 5분)하여 균체를 회수하였다. 여기에 yeast lysis buffer ( \( 2 \% \) triton X-100, \(1 \% \) SDS, \( 10 \mathrm { mM } \) tris-HCl \(( \mathrm { pH } ~8.0) \) buffer, \( 1 \mathrm { mM } \) EDTA) \( 200 \mu l \)를 넣어 균체를 현탁시킨 후, acid-washed glass beads (425- \(600 \mu \mathrm { m } \), Sigma, MO, USA) \( 0.3 \mathrm { ~g } \)과 phenol/ \( \mathrm { CHCl } _ { 3 } \) 용액 \( 200 \mu \mathrm { l } \)를 넣고 2분간 vortex를 행하였다. \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 원심분리(14,000× \( g, 10 \) 분)를 행하여 상층액을 새로운 tube에 옮기고, 여기에 glycogen \( 1 \mu \mathrm { l } , 5 \mathrm { ~M } \mathrm { ~LiCl } \) 용액 \( 20 \mu \mathrm { l } \), cold 에탄올 \(500 \mu \mathrm { l } \)를 첨가한 후, 원심분리(14,000 \( \times \mathrm { g } , \) 10분)를 행하여 플라스미드 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA는 \( 70 \% \) 에탄올로 세정한 후 건조시키고, 멸균 초순수 \( \left ( \mathrm { ddH } _ { 2 } \mathrm { O } \right ) 20 \mu \mathrm { l } \)에 녹였다. 형질전환 효모로부터 회수된 플라스미드 DNA를 이용하여 대장균 세포 (E. coli DH5 \( \alpha \))를 형질전환시켰으며, 이로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다. GPD 프로모터 유전자를 확인하기 위하여 추출된 플라스미드 DNA를 제한효소 KpnⅠ으로 절단하고 \( 0.8 \% \) agarose gel에서 전기영동을 수행하여 DNA 단편을 확인하였다.</p>