24시간 동안 배양한 세포를 trizol lysis buffer로 lysis하고, isopropanol과 EtOH-diethylpyrocarbonate(DEPC)이 들어있는 튜브에 옮겨 섞어 total RNA를 측정한 후 cDNA를 합성하였다. PCR을 실시하여 Tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2의 mRNA 발현을 살펴보았다.
<h2>Total RNA 분리 및 cDNA 합성</h2><p>세포를 \( 100 \mathrm{~mm} \) culture dish에 cell seeding한 뒤 24시간 동안 배양한 후 sample을 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배지 상등액을 제거한 후 trizol lysis buffer를 각 well에 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 분주하여 세포를 lysis 한 후 chloroform 200 \( \mu \mathrm{l} \) 를 분주하여 20 초간 위아래로 흔들어주었다. 그 후 13,200 \( \mathrm{rpm} \) 에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 isopropanol \( 500 \mu \mathrm{l} \) 이 들어있는 튜브에 옮겨 섞었다. 다시 \( 13,200 \mathrm{rpm} \) 에서 20 분간 원심분리 하였고, 그 상층액을 제거 한 후 \( 75 \% \) EtOH-diethylpyrocarbonate water를 각 튜브에 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 분주하여 13,200 \( \mathrm{rpm} \)에서 5 분간 원심분리 한 뒤 상층액을 제거한 뒤 실온에서 건조시켰다. DEPC를 50 \( \mu \mathrm{l} \) 씩 분주하여 녹인 후 96 well plate에 RNA 5 \( \mu \mathrm{l} \) 와 멸균수 \( 195 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하여 \( 260 \mathrm{~nm}, 280 \mathrm{~nm} \) 에서 각각 흡광도를 측정하여 total RNA양을 측정하였다. Oligo(dT) 15 primer \( (500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) 1 \mu \mathrm{l} \), 추출한 RNA (2 \( \mu \mathrm{g}) \) 와 nucle-ase free water로 10 \( \mu \mathrm{l} \) 를 맞추고 \( 75^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 반응시킨 후 5X reaction buffer, \( \mathrm{MgCl}_{2} \), PCR necleotide mix, rnasin inhibitor, reverse transcriptase, ruclease free water를 첨가하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분, \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 60 분, \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15 분간 반응시켜 cDNA를 합성시켰다.</p><h2>Reverse transcription-polymerase chain reaction</h2><p>Tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2의 mRNA 발현을 알아보기 위하여 polymerase chain reaction (PCR)을 실시하였다. 실험에 사용한 primer sequences는 Table 1과 같다. PCR tube 에 \( 5 \times \) green GoTaq flexi buffer, \( \mathrm{MgCl}_{2}\), PCR nucleotide mix \( (10 \mathrm{mM}) \), primer, GoTaq DNA polymerase, nuclease free wa-ter, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다.Tyrosinase는 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 3분, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 30초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 45초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 45초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 5 분 (\( 40 \mathrm{cycles} \))를 하였으며, TRP-1, TRP-2, MITF은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 3분, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 30초, \( 58^{\circ} \mathrm{C} \) 45초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 45초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 5분(\( 40 \mathrm{cycles} \))를 하였으며, GAPDH는 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 3분, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 30초, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 45 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 45 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 5분(\( 35 \mathrm{cycles} \))를 하였다. PCR로 합성 시킨 후 \( 0.002 \% \) ethidium bromide를 첨가한 \( 1.5 \% \) agarose gel에 \( 100 \mathrm{~V} \) 에서 40분간 전기영동 후 LAS 4,000 을 이용하여 밴드를 확인하여 분석 정량하였다.</p>