C2C12 골격근 세포를 적정 환경에서 배양하고 Plectin과 MACF-1 유전자의 단백질 및 mRNA 발현 변화를 관찰하기 위해 IGF-I을 처리하였으며 이후 항체를 이용하여 면역 형광 염색을 실시하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포 배양 및 시약 처리</h2> <p>본 연구에서 사용한 C2C12 골격근 세포는 American Type of Culture Collection (ATCC, USA)으로부터 구입하였으며, \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS) (Hyclone, Logan, UT), 100 \( \mathrm{U} / \mathrm{ml} \)의 penicillin G, \(100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 streptomycin sulfate (Welgene, Korea)를 함유하고 있는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Welgene, Korea)으로 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \)의 환경에서 배양하였다. 세포는 \( 35 \mathrm{~mm} \) plate에 \( 2.5 \times 10^{5} \)개 씩 분주하고 \( 90 \% \) 이상 자라면, 배지를 제거하고 \( 2 \% \) horse serum (HS) (Hyclone, Logan, UT)이 함유된 분화 배지, IGF-I을 함유한 분화배지로 각각 교체하여 배양하였다. Plectin과 MACF-1 유전자의 단백질 및 mRNA 발현의 변화를 알아보기 위하여 시간에 따라 \( 20 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 의 IGF-I (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)을 처리하였다.</p> <h2>면역 형광 염색</h2> <p>C2C12 세포를 PBS로 한번 씻어낸 뒤, plate에 고정시키기 위하여 \( 1 \mathrm{ml} \)의 \( 4 \% \) formaldehyde를 상온에서 20 분간 처리한 뒤 TBS로 2번 씻어내고, \( 0.2 \% \) triton X-100을 함유한 TBS \( (0.2 \% \) TBST)로 5 분간 상온에서 permeabilizing 하였다. 그 다음 \( 0.1 \% \) TBST로 5 분간 3번 씻어낸 후 \( 5 \% \) BSA를 함유한 \( 0.1 \% \) TBST로 상온에서 1 시간 동안 blocking 하였다. 이후 TBS로 한번 씻어낸 뒤 \( 3 \% \) BSA를 함유한 TBS에 Plectin polyclonal rabbit antibody, \(\alpha\)-tubulin monoclonal mouse antibody (Abcam, Cambridge, UK)를 각 \(1:500\)으로 회석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12 시간 동안 반응시켰다. 그 후, \( 0.1 \% \) TBST로 5 분간 3 번 씻어 낸 뒤 alexa 594-conjugated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, alexa 488-conjugated goat anti-mouse IgG secon-dary antibody (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)를 \( 3 \%\) BSA 에 \( 1: 250 \)으로 희석하여 상온에서 20 분간 반응시킨 후 \( 0.1 \% \) TBST로 5 분간 3번 씻어내었다. 사진은 digital imaging system이 갖춰진 Axiovert 200 fluorescence microscope (Carl Zeiss, Germany)로 촬영하였다.</p>