OVA에 면역된 생쥐의 비장에서 추출한 T세포주(HS-1)는 CD+ / CD8- Type 1 helper T세포로, IL-2와 IFN-γ를 생산하는 특성을 갖고 있다. 이 세포주의 활성 유지를 위해 정기적으로 항원 및 항원 제시세포를 첨가하였다. HS-1의 세포증식과 사이토카인 분비 정도는 각각 Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay와 효소연결면역흡광검사(ELISA)를 이용하여 Microplate Reader에서 흡광도를 측정함으로써 확인하였다.
<h2>Ovalbumin(OVA) 특이적 T세포주 배양</h2> <p>OVA로 면역한 생쥐( \( ( \mathrm { C } 7 \mathrm { BL } / 6) \) 의 비장을 분리하여 \( \mathrm { OVA } \) 항원에 특이적으로 반응하는 \( \mathrm { T } \) 세포주를 수립하였다. 수립된 세포주는 유세포분석기로 분석하여 \( \mathrm { CD } ^ { + } / \mathrm { CD } 8 ^ { - } \mathrm { T } \) 세포이며 항원자극에 대해 IL-2와 IFN- \( \gamma \) 를 생산하는 Type 1 helper T 세포인 것을 확인하였고 HS-1으로 명명하였다. 세포주를 계속 유지하기 위해 정기적으로 항원과 항원 제시세포를 첨가하여 활성화시켰다. 즉 HS-1을 24 well micro-plate에서 배양하면서 2주 간격으로 항원인 OVA \( (1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \) 와 MMC \( (50 \mu \mathrm { g } \) \( / \mathrm { ml } ) \) 로 처리한 \( \mathrm { C } 57 \mathrm { BL } / 6 \) 비장세포 \( \left (5 \times 10 ^ { 6 } \right . \) cells/well)를 항원제시세포로 첨가하여 세포주를 활성화시키면서 배양하였다.</p> <h2>세포증식 측정</h2> <p>수지상세포를 6일 동안 배양한 다음, OVA \( (1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \) 와 시료를 농도별로 처리하여 24 시간 배양한 후 회수하였다. 세포증식 정도를 알아보기 위해 96 well micro-plate에 회수한 수지상세포 \( 1 \times 10 ^ { 4 } \) 개와 \( \mathrm { T } \) 세포주(HS-1) \( 5 \times 10 ^ { 4 } \) 개를 분주하여 3 일 동안 배양한 다음, Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay를 이용해 Microplate Reader (Sunnyvale, CA, USA)로 \( 490 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Cytokine 측정</h2> <p>수지상세포를 6일 동안 배양한 다음, 시료를 농도별로 처리하고 동시에 OVA \( (1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \) 를 처리하여 24 시간 배양한 후 회수하였다. T세포가 분비하는 cytokine의 양을 알아보기 위해 회수한 수지상세포를 96 well micro-plate에 \( 1 \times 10 ^ { 4 } \) 개와 HS-1 \( 5 \times 10 ^ { 4 } \) 개를 분주하여 24 시간 배양 한 후, 배양 상층액을 수거하여, 상층액에 포함된 IL-2와 IFN-y의 양을 효소항체법(enzyme-linked immunsorbent assay : ELISA)을 이용해 Microplate Reader로 \( 405 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도률 측정하였다.</p>