소 질병의 진단에 사용되는 BPV 검출시험법은 혈청중화시험법과 혈구응집 반응 시험(haemagglutination assay)을 포함한다. 본 연구에서는 BPV 안전성을 확보하기 위해, 소유래 물질을 원료로 하는 생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제 등에서 BPV를 정량적으로 검출하고, 제조 공정에서 BPV 제거 검증을 위한 시험법으로 real-time PCR 시험법의 민감도와 특이도를 확립하려 한다.
<p>BPV 검출시험법은 주로 소 질병의 진단을 위해 개발되어 왔다. BPV 검출시험법으로는 혈청에 존재하는 항체를 검출하는 혈청중화시험법과 기니픽의 적혈구를 사용한 혈구응집 반응 시험(haemagglutination assay)이 있다. 이러한 시험법은 시간과 비용이 많이 들고, 민감도와 특이도가 떨어지는 단점이 있어, 생물의약품 생산 공정에서 BPV 검출 시험법으로 적용하는데 어려움이 있다. 최근에 생물의약품과 조직공학제제, 세포치료제에서 내인성 또는 외래성 위해 바이러스의 검출을 위한 시험법으로 민감도와 특이도가 우수한 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 활용한 유전자 증폭기술이 널리 활용되고 있다. 또한 real-time PCR을 이용하여 바이러스의 정량검출과 바이러스 제거 검증 실험을 위한 시험법 확립 연구가 시도되고 있다. 하지만 지금까지 PCR 방법을 이용하여 BPV 를 정량적으로 검출하고자 하는 연구는 진행된 바가 없다.</p> <p>본 연구에서는 소유래 물질을 원료로 하는 생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제 등에서 BPV 안전성을 확보하기 위해, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 BPV 를 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 BPV 제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 민감도와 특이도가 우수한 real-time PCR 시험법을 확립하고자 하였다. 또한 확립된 real-time RT-PCR 시험법을 활용하여 인위적으로 BPV 를 감염시킨 CHO 세포와 소유래 콜라겐에서 BPV를 정량적으로 검출하여 바이러스 안전성 검증 시험법으로의 활용 가능성을 평가하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>BPV의 배양 및 정량</h2> <p>BPV ATCC VR \(767 \)의 배양과 정량을 위해 EBTr 세포(ATCC CCL 44)를 사용하였다. EBTr 세포를 \( 10 \% \) 우혈청 (Gibco BRL, USA)을 첨가한 Dulbecco's Minimun Essential Medium(DMEM: Gibco BRL, USA) 배지에 배양하였다. \( \mathrm { T } -150 \) flask에 배양된 단층 세포에 바이러스를 감염시킨 후 주기적으로 세포병변효과(cytopathic effect: CPE)를 관찰하였다. CPE가 명백하게 관찰 될 때 배양액과 세포를 수거한 다음, \( 400 \times 9 \) 에서 5 분간 원심 분리하여 상층액은 따로 모으고 pellet은 재현탁하였다. Pellet을 동결과 해빙과정을 2회 반복하여 파쇄한 후 \( 400 \times g \) 에서 5 분간 원심 분리하여 상등액을 얻었다. 원심 상등액을 혼합한 후 \( 0.45 \mu \mathrm { m } \) filter로 여과한 다음 소분하여 \( -70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 보관하였다.</p> <p>BPV 의 정량을 위해 감염성 있는 바이러스의 titer를 \( 50 \% \) tissue culture infectious dose ( \( \mathrm { TCID } _ { 50 } \)) 로 나타내었다. BPV를 \( 2 \% \) 우혈청을 첨가한 DMEM 배지로 7 배수로 희석하여 24 well plate에 배양된 세포에 \( 0.25 \mathrm { ~mL } \) 씩 접종하였다. 음성 대조군으로 세포배양배지를 \( 0.25 \mathrm { ~mL } \) 씩 접종하였다. 그 후 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에서 \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } , 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 배양하면서 계속적으로. 현미경으로 CPE를 관찰하였다.</p>