한천은 홍조류 세포벽의 구성 성분으로 두 종류의 polysaccharide인 agarose와 agaropectin의 복합체로서Agarase는 agarose를 분해하는 효소로, \( \alpha \)-agarase와 \( \beta \)-agarase로 나뉘며 해양에서 태양에너지만으로 자라는 해조류로부터의 바이오에너지 생산은 starch 또는 ligno-cellulose 기반의 바이오매스보다 많은 장점이 있다. 최근에는 해조류 agar의 분해 능력이 있는 새로운 미생물을 동정하고 이로부터 신규의 agarase 효소를 분리하여 그 특성을 규명하는 연구가 진행 중이고 한천으로부터 생산되는 oligosaccharide는 식품, 화장품, 의약 분야 등의 많은 산업 분야에 적용될 수 있을 것으로 기대되고 있다.
<h1>서 론</h1> <p>한천은 홍조류 세포벽의 구성 성분으로 두 종류의 polysac-charide인 agarose와 agaropectin의 복합체이다. Agarose는 3-O-linked \( \beta \)-D-galactopyranose와 4-O-linked \( \alpha \)-L-galac-topyranose unit가 반복적으로 연결되어 있는 구조를 갖는데, agaropectin은 sulfoxy, methoxy, pyruvate 잔기 등에 의해서 수식된 3,6-anhydro- \( \alpha \)-L-galactose가 존재한다는 점에서 agarose와 구별된다. Agarase는 이러한 agarose를 분해하는 효소로, 그 작용 기작에 따라서 \( \alpha \)-agarase와 \( \beta \)-agarase로 나뉜다. ( \alpha \)-agarase는 ( \alpha \)-1,3 결합을 분해하여 환원말단에 3,6-anhydro-( \alpha \)-L-galactose를 갖는 agarooligo-saccharide를 생산하고, \( \beta \)-agarase는 \( \beta \)-1,4 결합을 분해하여 환원말단에 D-galactose를 갖는 neoagarooligosaccharide를 생산한다. 한천으로부터 생산되는 oligosaccharide는 다양한 생물학적 기능이 규명되어 식품, 화장품, 의약 분야 등의 많은 산업 분야에 적용될 수 있을 것으로 기대되고 있다.</p> <p>해조류로부터의 바이오에너지 생산은 starch 또는 ligno-cellulose 기반의 바이오매스를 재료로 한 경우보다 많은 장점이 있다. 우선, 해조류는 해양에서 태양에너지만으로 쉽게 자라기 때문에 경작을 위한 비용이 절감되고, 경작지가 필요치 않으며, 화학비료가 사용되지 않기 때문에 자연친화적이다. 또한 해조류 유래의 다당류에는 리그닌이 존재하지 않기 때문에 높은 수율의 에너지 전환율을 기대할 수 있다.전통적으로 한천 분해는 화학적 분해법을 통하여 수행되었는데, 최근에 자연친화적인 방법인 효소적 분해법이 주목 받고 있다. 이러한 효소적 분해법은 원하는 길이의 oligosaccharide를 특이적으로 생산할 수 있다는 장점이 있어 많은 연구가 진행 중이다. 이에 본 연구에서는, 해양으로부터 해조류 agar의 분해 능력이 있는 새로운 미생물을 동정하고 이로부터 신규의 agarase 효소를 분리하여 그 특성을 규명 함으로써 산업적으로 유용한 효소를 탐색하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>미생물 배양조건 밎 시약</h2> <p>홍조류로부터 미생물을 분리하고 배양하기 위해서 사용된 배지는 Artificial Sea Water (ASW) 배지 \( \left ( \mathrm { MgSO } _ { 4 } \ 12.3 \mathrm { ~g } \right . \), \( \mathrm { KCl } 0.74 \mathrm { ~g } , \left ( \mathrm { NH } _ { 4 } \right )_ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } \ 0.13 \mathrm { ~g } , \mathrm { NaCl } \ 17.5 \mathrm { ~g } , \mathrm { CaCl } _ { 2 } \ 0.14 \mathrm { ~g } \), Tris base \( 6.2 \mathrm { ~g } \) per \( 1 \mathrm { ~L } \), pH 7.2) [6]에 Bacto-Peptone \( 10 \mathrm { ~g } \) 과 Yeast extract \( 3 \mathrm { ~g } \) 을 첨가하여 ASW-YP로 명명하여 사용 하였다. 평판배지는 한천을 \( 1.5 \% \) 가 되도록 첨가하였고, 액체 배지는 한천을 \( 0.3 \% \) 가 되도록 첨가하여 사용하였다. 미생물 배양은 \( 28 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 수행하였으며, 액체배지의 경우에는 200 \( \mathrm { rpm } \) 으로 진탕배양하였다. 배지 및 효소한성측정을 위해 사용된 시약들은 모두 Sigma사로부터 구입하였고 16S rRNA 유전자의 PCR 증폭을 위해 사용된 효소 등은 Takara (Japan)로 부터 구입하였다. PCR에 사용된 primer는 Genotech사 (Dacjcon, Korea)에 의뢰하여 합성하였으며, genomic DNA와 agarose gel로부터 DNA fragment의 추출은 각각 DyneBio사 (Scongnam, Korea)의 Genomic DNA extraction kit와 Gene extraction kit늘 사용하여 수행하였다. API 20NE Kit (Bioméricux, France)와 API ZYM Kit (Bioméricux, France) 늘 사용하여 GNUM08120 균주의 대사특성과 효소활성을 측정하였다. Cellulase, amylase, cascinase 등의 효소활성 측정 시, 효소반응 기질은 AZCL-HE-cellulose (Megazyme, Ireland), starch azure (Sigma, USA), azocascin (Sigma, USA)을 각각 사용하였다.</p>