플라스미드 제작 및 단백질 발현을 위해 대장균 TOP10과 BL21(DE3) 균주를 사용하였다. 대장균의 플라스미드 제작은 LB 배지를 사용하였고, 단백질 발현 및 세피아프테린 생산은 글리세롤이 첨가된 배지를 사용하였다. kanamycin과 chloramphenicol을 항생제로 사용하였다. 세피아프테린 생산을 위해 Synechococcus sp. 유래의 gch1 유전자와 사람의 섬유아세포 유래 ptps 유전자를 동시에 발현할 수 있는 pME721 벡터를 사용하였다. 플라스미드 제작 후 대장균 BL21(DE3) 균주로 형질전환하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 배양조건</h2> <p>플라스미드 제작 및 단백질 발현을 위하여 대장균 TOP10(Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)과 BL21(DE3)(Thermo Fisher) 균주를 각각 사용하였다. 플라스미드 제작을 위한 대장균의 배양은 항생제가 함유된 LB(Luria-Bertani, \( 10 \mathrm { ~g/l } \) bacto-tryptone, \( 5 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \) bacto-yeast extract, and \( 5 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \mathrm { NaCl } \)) 배지를 사용하였으며, 단백질 발현의 확인 및 세피아프테린 생산을 위하여 글리세롤 \( (2 \%, \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \)이 탄소원으로 첨가된 준합성 배지를 사용하였다. 항생제로서 kanamycin \( (30 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \), Biosesang, Daejeon, Korea)과 chloramphenicol \( (34 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \), Biosesang)을 배지에 첨가하여 사용하였다. 목적 유전자의 발현을 확인하기 위하여 재조합 대장균은 준합성 배지를 사용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 세포흡광도 \( \left ( \mathrm { OD } _ { 600 } \right ) \)가 약 0.6 수준이 되도록 배양한 후, isopropyl \( \beta \)-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)의 최종 농도가 \( 0.1 \mathrm { mM } \)이 되도록 첨가하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 4시간 동안 배양한 후, \( 10,000 \times \mathrm { g } \)에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수하였다. 유전자 동시 발현에 의한 세피아프테린의 생산성 변화는 단 백질 발현 유도 후 24시간 동안 배양 후 세포와 배양액을 회수하여 분석하였다.</p> <h2>발현벡터 제작 및 대장균 형질전환</h2> <p>대장균에서 세피아프테린을 생산하기 위하여 Synechococcus sp. 유래의 gch1 유전자(GenBank Accession No. AY120852.1, \( 0.7 \mathrm { ~kb } ) \)와 사람의 섬유아세포 유래 ptps 유전자(GenBank Accession No. NM_000317.2, \( 0.4 \mathrm { ~kb } ) \)를 동시에 발현할 수 있는 pME721 벡터(Table 1)를 사용하였다. 대장균 K-12(GenBank Accession No. CP011343.2) 유래의 gmk \( (0.6 \mathrm { ~kb } ) \), ndk \((0.4 \mathrm { ~kb } ) \), guaA \((1.5 \mathrm { ~kb } ) \)와 guaB \((1.5 \mathrm { ~kb } ) \) 유전자는 Table 1에 제시된 프라이머를 사용하여 각각 증폭한 후 pACYCDuet-1(Merck Millipore, Darmstadt, Germany) 플라스미드에 클로닝하였다. 증폭된 gmk 유전자는 제한효소 NcoI과 PstI으로, ndk 유전자는 제한효소 HindIII와 NotI으로, guaA-guaB 유전자는 NdeI과 XhoI 제한효소로 각각 반응시켰다. 제한효소로 처리된 각각의 유전자는 동일한 제한효소로 처리한 pACYCDuet-1 플라스미드에 삽입하였고, 제조된 발현벡터에 두 가지 이상의 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 벡터를 제작하였다. 제작된 플라스미드는 삽입되어 있는 유전자의 염기서열을 확인한 후 대장균 BL21(DE3) 균주로 형질전환 하였다.</p>