옥수수 종자를 발아 및 배양하여 gas chromatography를 이용하여 애틸렌 생성량을 측정하였으며, In vitro에서 ACC synthase activity가 AdoMet에서 ACC로 전환되는 단계에 관여하는 것을 근거로 하여 뿌리 분쇄와 분리 및 배양 후의 용액을 이용해 ethylene 생성을 유도한 뒤 GC를 이용하여 ACC synthase 활성을 측정하였다. 그 후 ACC 가 ethylene으로 전환하는 단계에 ACC oxidase activity가 작용함을 근거로 하여 ACC synthase의 활성을 억제 및 배양 후 GC 를 이용하여 In vitro ACC synthase activity를 측정하였다. 마지막으로 RNA extraction buffer, PCI, CI등을 이용해 추출한 total RNA를 주형으로 cDNA를 얻기 위해 역전사 과정은 AccuPower \( { }^{\mathrm{TM}} \) RT PreMix 를 사용하였고, 합성된 first-strand CDNA를 사용하여 PCR 과정을 수행한 후이 통계를 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물 재료</h2> <p>옥수수 종자(Zea mays L., Golden cross bantum 70)를 흐르는 물에 충분히 세척하고 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \) 암 상태에서 15 시간 동안 물에 침지 후, 플라스틱 쟁반에 젖은 종이 타월을 깔고 종자의 배(embryo) 부분이 쟁반 바닥에 닿도록 일렬로 배열한 다음 그 위에 종이 타월을 덮고 적셨다. 쟁반을 포개어 물이 들어 있는 통 안에 수직 방향으로 세우고 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \) 암실에서 42 시간 동안 발아시켰다. 옥수수 뿌리는 \( 15-20 \mathrm{~mm} \) 정도인 것을 선택하여 실험 재료로 사용하였다.</p> <h2>실험 방법</h2> <h3>에틸렌 생성량 측정</h3> <p>완충용액 \( (0.5 \mathrm{ml} \) potassium - phosphate buffer, \( 50 \mathrm{mM}, \mathrm{pH} \) \( 6.8,50 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) chloramphenicol)에 test chemical을 처리한 후, 옥수수 일차뿌리 조직절편 \( (1 \mathrm{~cm} \); root cap 포함) 40 개를 넣어 vial을 실리콘 마개로 막고 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \), 암소에서 진탕 배양하였다. 2시간 간격으로 기체 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩을 채취하여 gas chromatography (Hewlett Packard, 5890 series Ⅱ, USA)를 이용하여 측정하였다.</p> <h2>In vitro ACC synthase (ACS) activity 측정</h2> <p>In vitro에서 ACC synthase activity가 AdoMet에서 ACC로 전환되는 단계에 관여하는 것을 근거로 하여 Woeste 등의 방법을 일부 수정하여 수행하였다. 뿌리 조직 절편 80개를 extraction buffer ( \( 250 \mathrm{mM}, \mathrm{pH} \) 8.0, potassium phosphate buffer, \( 10 \mu \mathrm{M} \) pyridoxal phosphate, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 2 \mathrm{mM} \) PMSF, \( 5 \mathrm{mM} \) DTT)로 분쇄하고 원심분리하여 상등액 \( 1 \mathrm{ml} \) 에 \( 5 \mathrm{mM} \) AdoMet \( 0.1 \mathrm{ml} \) 를 첨가한 다음, 1 시간 동안 진탕 배양(dark, \( 22^{\circ} \mathrm{C}, 170 \mathrm{rpm} \) )하였다. 배양 후 \( 20 \mathrm{mM} \mathrm{HgCl} 2 \) 용액과 냉각된 \( \mathrm{NaOH} / \mathrm{NaOCl} \) (포화된 \( \mathrm{NaOH}: 5 \% \mathrm{NaOCl}=1: 1[\mathrm{v} / \mathrm{v}] \) )용액으로 ethylene 생성을 유도한 뒤 GC를 이용하여 ACC synthase 활성을 측정하였다.</p> <h3>In vivo ACC oxidase (ACO) activity 측정</h3> <p>ACC 가 ethylene으로 전환하는 단계에 ACC oxidase activity가 작용함을 근거로 하여 Wang과 Woodson의 방법을 일부 수정하여 사용하였다. 뿌리조직 절편 40개와 \( 0.1 \) \( \mathrm{mM} \) AVG (L-o(2-aminoethoxyvinyl)-glycine)를 첨가하여 조직 내의 ACC synthase의 활성을 억제시켰다. 배양이 끝난 후 뿌리조직 절편을 수거하여 증류수로 세척한 후 \( 1 \mathrm{mM} \)ACC 를 처리한 완충용액 \( (0.5 \mathrm{ml} \) potassium phosphate buffer, \( 50 \mathrm{mM} \), \( \mathrm{pH} \) 6.8)에 1시간 동안 배양하였다. 조직 절편을 다시 증류수로 세척하여 potassium phosphate buffer에 1 시간 동안 배양한 후 기체 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 채취하여 GC 를 이용하여 측정하였다.</p> <h3>Total RNA 추출과 RT-PCR</h3> <p>뿌리 절편을 RNA extraction buffer \( (0.1 \mathrm{M}, \mathrm{pH} \) 9.0, Tris-HCl, \( 0.1 \mathrm{M} \quad \mathrm{NaCl}, 1 \%[\mathrm{w} / \mathrm{v}] \quad \mathrm{SDS}, 0.1 \% \quad[\mathrm{v} / \mathrm{v}] \) 2-mercaptoethanol)를 첨가하여 갈아준 다음, 동일부피의 PCI 를 첨가하여 잘 섞은 후 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분 동안 반응시켰다. 30 분간 원심분리 \( \left(4^{\circ} \mathrm{C}, 13,000 \mathrm{rpm}\right) \) 하여 상등액을 취하고 여기에 동일부피의 CI를 첨가한 후 다시 30 분간 원심분리 \( \left(4^{\circ} \mathrm{C}, 13,000\right. \) \( \mathrm{rpm} \) )하였다. \( 2.5 \mathrm{M} \mathrm{LiCl} \) 를 첨가하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 동안 반응시킨 뒤 15 분간 원심분리 하여 침전물을 수거하고 \( 70 \% \) 에탄올로 세척 후 다시 15 분간 원심분리 하였다. 침전물을 잘 건조시킨 후 \( 0.1 \% \) DEPC (Diethyl pyrocarbonate)-treated water 30 씨에 녹여 total RNA를 획득 하였다. 추출한 total RNA는 Microplate Reader infinite \( { }^{\circledR} 200 \) (TECAN, USA)를 이용하여 정량하였다.</p> <p>추출한 total RNA를 주형으로 cDNA를 얻기 위해 역전사 과정은 AccuPower \( { }^{\mathrm{TM}} \) RT PreMix (Bioneer, USA and Korea) 를 사용하였고, 합성된 first-strand CDNA를 사용하여 PCR 과정을 수행하였다. PCR에 사용된 primer set는 Table 1과 같다. PCR 증폭시키기 위하여 EmeraldAmp \( { }^{\mathrm{TM}} \) PCR Master MiX (Premix, TaKaRa, Japan)를 사용하였으며 모든 조건과 방법은 manual에 따라 실험을 하였다. PCR product는 \( 1.8 \% \) agarose gel 상에서 분리하고 ethidium bromide 용액으로 염색한 후 gel image analysis system (CoreBio, i-MAX-D500, Korea)을 이용하여 촬영하였다.</p> <h2>통계 분석</h2> <p>모든 실험은 최소한 5회 이상 반복하였고, 각 실험 처리구당 40개의 뿌리 절편을 사용하였다. \( \mathrm{p}<0.05 \) 유의성을 검사하기 위하여 mean value는 Student \( t \) test에 따라 계산하였다.</p>