본 실험에서는 Aeromanas protedytica aminopeptidase, Streptomyces griseus aminopeptidase, aminopeptidase와 leucine aminopeptidases 및 L-leu-cine-p-nitroanilide di-와 tripeptide을 사용하였고 Bacillus sp. N2 유래의 LAP은 4가지의 크로마토그래피 방법을 이용하여 정제하고, 아미노펩티데아제 활성은 합성 기질인 L-Leu-pNA를 이용하여 흡광도 \( 405 \mathrm{~nm} \) 파장에서 흡광도를 측정하여 조사하였으며 LAP에 의한 di-와 tripeptide의 가수분해 활성조사는 Cd-ninhydrin 방법을 이용하여 leucine이 방출되는 양을 측정했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>본 실험에 사용된 Aeromanas protedytica aminopeptidase, Streptomyces griseus aminopeptidase, porcine kidney cytosol의 aminopeptidase와 porcine kidney cytosol의 microsomes 유래의 leucine aminopeptidases는 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 모든 합성 기질인 L-leu-cine-p-nitroanilide (L-Leu-pNA) di-와 tripeptide은 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.</p> <h2>LAP의 단백질 정제</h2> <p>본 실험에 사용된 단백질은 이전에 발표된 Lee 등의 방법에 따랐다. 간단히 요약하면, Bacillus sp. N2 유래의 LAP은 4가지의 크로마토그래피 방법(CM-Sepharose, CL-6B, Mono- Q, and Superdex-200)을 이용하여 정제하였다. 정제된 LAP은 실험을 위한 효소로 사용하였다.</p> <h2>아미노펩티데아제(Aminopeptidase) 활성조사</h2> <p>아미노펩티데아제 활성은 합성 기질인 L-Leu-pNA를 이용하여 흡광도 \( 405 \mathrm{~nm} \) 파장에서 흡광도를 측정하였다. 간단히 요약하면, 효소액 \( 0.1 \mathrm{~ml} \)를 \( 5 \mathrm{~M}\) L-Leu-pNA 기질을 포함한 완충용액(\( 50 \mathrm{~nm} \) \(\mathrm{Tris}\)-HCl, \( \mathrm{pH} \) 7.5)에 혼합하여 총량이 \( 1 \mathrm{ml} \)이 되도록 하였다. 그런 다음, 상기 혼합물을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분 동안 반응시킨 후, 흡광도 \( 405 \mathrm{~nm} \) 파장에서 측정하였다. 또한, 여러 염 \( (\mathrm{NaCl}, \mathrm{LiBr}, \mathrm{NaBr}, \mathrm{KBr}, \mathrm{LiCl}, \mathrm{KCl}) \)들의 농도에 의한 LAP 활성을 조사하기 위하여, 상기 기질 액에 각 염의 농도를 \( 0\sim 4.5\mathrm{~M} \)을 포함하여 상기의 방법을 이용하여 측정하였다.</p> <h2>Di-와 tripeptide의 가수분해</h2> <p>LAP에 의한 di-와 tripeptide의 가수분해 활성조사는 Cd-ninhydrin 방법을 이용하여 Leu-Xaa와 같은 여러 di-peptide들로부터 leucine이 방출되는 양을 측정하였다. Cd-ninhydrin 시약은 ninhydrin \( 0.8 \mathrm{~g} \) 을 \( 99.5 \% \) 에탄올 \( 80 \mathrm{~ml} \)과 아세트산 \( 10 \mathrm{~ml} \) 의 혼합액에 녹인 다음, \( \mathrm{CdCl}_{2} ~1 \mathrm{~g} \) 를 증류수 \( 1 \mathrm{~ml} \) 에 녹인 용액을 첨가하여 준비하였다. 완충용액 \( (50 \mathrm{~mM} \) \(\mathrm{Tris}\)-HCl, \( \mathrm{pH} \) 7.5) \( 800 \mu \mathrm{l} \)에 \( 2 \mathrm{~mM} \) di-와 tripeptide 기질 (leu-Xaa)을 포함한 완충용액(\( (20 \mathrm{~mM} \) \(\mathrm{HEPES}\), \( \mathrm{pH} \) 7.0) \( 100 \mu \mathrm{l} \)와 효소액 \( 100 \mu \mathrm{l} \)을 혼합하여 총량이 \( 1 \mathrm{~ml} \)이 되도록 하였다. 그런 다음, 상기 혼합물을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분 동안 반응시킨 후, \( \mathrm{Cd} \)-nin-hydrin 시약 \( 1 \mathrm{~ml} \)을 첨가하여 \( 84^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 동안 가열한 후 냉각시키고, 흡광도 \( 507 \mathrm{~nm} \) 파장에서 유리된 Leucine을 측정하였다.</p> <h2>\( V \max \) 과 \( \mathrm{Km} \)값</h2> <p>\( V \max \) 과 \( \mathrm{Km} \) 값은 이전에 보교된 실험방법에 따랐다. 각 실험은 9가지의 다른 기질 농도에서 수행되었다. 그 기질액(S) 농도 \( (\mathrm{mM}) \) 는 \( 1 / \mathrm{S} \) 가 \( 1 / \mathrm{Km}(\mathrm{mM}) \) 의 \( 20 \sim 200 \% \) 의 범위까지로 정했다. 기질인 L-Leu-pNA의 양은 \( \mathrm{Km} \) 값이 높았기 때문에 \( 0.5 \sim 5 \mathrm{~mM} \) 까지 측정하였다.</p>