유전체 전체를 다루는 물리지도의 제작은 염기서열 분석에 필수적이다. 이는 효율적인 BAC 클론 선발과 분석된 클론들의 연속적인 염기서열로의 연결에 필요한 정보를 제공한다. 물리지도 제작의 효율성, 정확도, 속도는 아가로스 전기 영동보다 우수하며, 최초의 HICF 물리지도는 옥수수에서 개발되었다. 그러나, 유전지도와 연관된 물리지도 contig가 유전체를 충분히 커버하지 못하며, 클론 중첩도가 낮아서 물리지도의 보완이 필요하다.
<h2>물리지도</h2> <p>유전체 전체 길이를 포괄하는 물리지도의 제작은 성공적인 clone-by-clone 염기서열 분석을 위하여 반드시 필요하다. 잘 구축된 물리지도는 염기서열 분석을 위한 효율적인 BAC 클론 선발과 분석된 클론들을 순서에 맞게 연속적인 염기서열로 연결하는데 중요한 정보를 제공한다. 유전체 해독에서 물리지도의 유용성은 인간 (Consortium 2001), 애기장대 (Marra et al. 1999), 벼 (Chen et al. 2002), 그리고 M. truncatula (Mun et al. 2006) 유전체 프로젝트에서 충분히 입증되었다. 이러한 물리지도는 과거에는 BAC 클론들의 제한효소 절단 패턴을 아가로스 젤에서 읽고 FPC software package를 이용하여 contig로 조립함으로써 제작하였다 (Soderlund et al. 2000). 그러나 이 방법은 전기 영동 및 제한효소 밴드 읽기가 수작업으로 이루어지기 때문에 속도와 정확성에서 한계가 있다. 한편, 최근에는 제한효소 밴드를 형광표지하여 자동염기서열장치 (auto-matic capillary sequencer)로 분석하는 방법이 고안되었다 (Gregory et al. 1997; Ding et al. 2001; Luo et al. 2003; Xu et al. 2004). 이 새로운 형광표지 자동분석 (Fluorescence-labeled capillary electrophoresis) 방법에는 3-enzyme 방법과 high-information content fingerprinting (HICF) 방법이 있는데, 각각 type IIS restriction enzymes 또는 SNaPshot labeling techniques을 사용한다. 이 방법은 종전의 아가로스 전기 영동 보다 수행능력과 정확도, 분석속도 면에서 횔씬 우수한데, 최초의 HICF 물리지도는 옥수수에서 보고되었다 (Nelson et al. 2005).</p> <p>우리는 배추 유전체의 물리지도를 SNaPshot 방법으로 제작하였다 (Mun et al. 2008). BAC 유전자은행 3종으로부터 총 99,456개 BAC 클론을 선정하고 (배추 유전체 크기의 약 \( 22.5 \) 배 길이), 5 종의 제한효소 (EcoRI, BamHI, XbaI, XhoI, and HaeIII)를 동시에 사용하여 절단한 후 4 가지 형광색의 SNaPshot 시약으로 3'-end를 표지하여 ABI 3730xl 자동염기서열 분석장치로 제한효소별 단편의 크기를 분석하였다. 분석 결과 \( 93 \% \) 에 해당하는 총 \( 93,689 \) BAC 클론의 핵산지문이 성공적으로 분석되었는데, 이중에서 이질염색질의 반복서열을 포함하는 \( 26,221 \) BAC 클론의 데이터를 제외하고 contig를 제작하였다. Contig 제작에 사용된 진정염색질을 포함하는 고품질의 \( 67,468 \) BAC 클론은 배추 유전체의 약 \( 15.2 \) 배 길이인데, 그 결과 1,417 개 contig를 얻었다. 이 결과를 바탕으로 contig 구조의 신뢰성을 검정하여 최종적으로 1,428 개 contig를 제작하였는데, contig의 평균 길이는 \( 512 \mathrm{kbp} \) 로서 전체 길이는 배추 유전체의 \( 1.3 \) 배에 해당하는 \( 717 \mathrm{Mbp} \) 였다. 이 contig들에는 핵산지문분석한 전체 BAC 클론의 약 \( 15 \% \) 에 달하는 다수의 Q 클론 (밴드의 \( 50 \% \) 이상이 consensus map과 일치하지 않는 클론)이 포함되어 있었으나, 3 개의 특별히 큰 contig에 전체 Q 클론의 \( 48.3 \% \) 정도가 포함되었다. 따라서 이들 3 개 contig를 중복오류 (false-positive overlaps)로 제외하면 나머지 contig에 포함되는 Q 클론은 약 7.7\%가 되며, 이 정도의 수치는 catfish (7.3\%) (Quiniou et al. 2007)와 옥수수 (11\%) (Nelson et al. 2005)의 HICF 물리지도에서와 비슷한 수준이다.</p> <p>물리지도 contig 내의 BAC 클론 242 개는 유전지도의 분자마커 315 개와 연관되어 있었기 때문에 이들 BAC 클론은 배추의 염색체별 염기서열 분석에 직접 사용될 수 있었다. 이렇게 유전지도와 연관된 contig의 총 길이는 배추 유전체의 약 \( 30 \% \) 길이에 해당하는 약 \( 160.7 \mathrm{Mbp} \) 에 달했다. 그러나 유전지도와 연관된 물리지도 contig가 전체 유전체를 충분한 수준으로 커버하지 못하고, 각 contig의 클론 중첩도 (depth) 역시 아직 낮기 때문에 물리지도의 보강이 필요했다.</p>