방선균의 PtpA및 PtpA(CgS) 유전자를 클로닝 단백질 발현 실험을 실시하였다. 발현된 단백질의 기능을 알기 위해 효소활성을 측정해 본 결과, PtpA에서만 활성을 나타내었고, PtpA(C9S)에서는 효소활성을 확인할 수 없었다. PtpA 유전자 발현 유도제인 thiostrepton을 첨가하면 더 많은 PtpA 및 PtpA(C9S) 단백질이 발현되었다. PtpA 단백질이 다량 발현될수록 타이로신 인산화 단백질은 감소하는 경향을 보였는데, 이는 PtpA가 세포내 여러 기질 단백질에 작용하여 탈인산화을 촉진함을 의미한다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>PtpA 및 ptpA(C9S) 유전자의 클로닝 및 대장균에서의 발현</h2> <p>방선균의 PtpA는 기존의 동물 및 세균의 phosphotyrosine protein phosphatase와 구조가 유사하며, 특히 효소 활성 부위의 시스테인 잔기가 두 개 붙어있는 것이 특징적이다. 방선균의 PtpA및 PtpA(C9S) (효소활성 부위인 시스테인을 세린으로 치환하여 효소활성이 없는 단백질) 단백질을 유전자 증폭기술을 이용하여 이들 유전자를 클로닝하였다. 그리고 이 유전자를 단백질 발현백터인 pET26b에 클로닝하여 단백질 발현 실험을 실시하였다. pET26b 발현 벡터에 클로닝한 ptpA 및 ptpA(C9S) 유전자는 \( 1 \mathrm{mM} \) IPTG에 유도되어 다량의 단백질을 발현하였고, 이들 대부분은 soluble 단백질이었다. 그리고 이들 효소를 정제하기 위해 \(\mathrm{Ni}\)-NTA 컬럼에 흡착시켜, \( 250 \mathrm{mM} \) 이미다졸로 용출하여 정제한 결과 대부분 불순물이 제거된 상태로 정제되었다. 정제된 효소를 투석하여 활성을 측정해본 결과 PtpA에서 활성이 존재하였지만, PtpA(C9S)에서 효소 활성은 존재하지 않았다는 것을 알 수 있었다.</p> <h2>방선균에서 ptpA 및 ptpA(C9S) 유전자의 발현</h2> <p>방선균에서 PtpA 및 PtpA(C9S) 단백질의 기능을 알기 위해서 앞 실험에서 사용한 ptpA 및 ptpA(C9S) 유전자를 이용하여 방선균 발현벡터인 pIJ6021에 cloning하였다. 지금까지 알려진 방선균의 발현벡터는 주로 방선균 tip promoter 및 tip terminator를 사용하여 단백질을 발현시켰는데, 이중 최근에 개발된 pIJ6021는 효율적인 방선균 발현벡터로 널리 알려져서 본 실험에 사용하였다. 따라서 본 실험에서 ptpA 및 ptpA(C9S) 유전자를 이 벡터에 cloning하고 방선균에서 발현시켰다. 이때 효율적인 단백질 정제를 위하여 C말단에 히스티딘 잔기에 해당하는 유전자를 붙여서 실험을 실시하였다. PtpA 및 ptpA(C9S) 유전자는 thiostrepton에 유도되어 다량의 단백질을 발현하였으며, 이들 대부분은 soluble 단백질로 나타났다. 발현량은 대장균보다는 적었지만 충분한 양을 확보할 수 있었고, 이들 효소를 정제하기 위해 \(\mathrm{Ni}\)-NTA 컬럼에 흡착시켜, \( 250\mathrm{mM} \) 이미다졸로 용출하여 정제한 결과, 대부분 불순물이 제거된 상태로 순수하게 정제되었다. 정제된 이 효소들을 투석하여 활성을 측정해 본 결과, PtpA에서만 활성을 나타내었고, PtpA(C9S)에서는 활성기 검출되지 않았다.</p> <h2>방선균에서 ptpA 및 ptpA(C9S) 유전자 유도 및 검출</h2> <p>PtpA 유전자 발현 및 유도제인 thiostrepton의 효과를 알아보기 위해 각 유전자를 발현시키고, 발현된 양을 확인하기 위해서 penta His-tag 항체(anti-penta His-tag)를 사용하여 Western blot을 실시하였다. 그 결과 유도제인 thiostrepton을 첨가하지 않아도 기본적으로 유전자가 발현되었고, thiostrepton을 첨가한 경우에는 보다 많은 양의 PtpA 및 PtpA(C9S) 단백질이 발현되었다. 이들 유전자의 표현형을 알기 위해서 과도하게 이 유전자들을 발현한 결과, 방선균의 균사형성 및 항생제 생산에 영향을 주지 못했다. 따라서 이 효소의 기능은 이차대사 생산 및 균사형성에 중요한 A factor cascade에 관련되어 있지 않다는 것으로 판명되었다. 따라서 PtpA binding 단백질을 분석해야만 이들의 생물학적 기능을 파악할 수 있으리라 생각되었다.</p> <h2>방선균에서 발현된 PtpA 및 PtpA(C9S)와 타이로신 인산화 단백질의 연관성</h2> <p>PtpA의 생물학적 기능을 파악하기 위해 이 효소의 기질 및 표적 단백질을 분석하였다. PtpA 및 효소활성부위가 변형된 PtpA(C9S)을 대량 발현시킨 방선균에서 각각의 타이로신 인산화 단백질의 패턴 변화를 시간 별로 분석하였다. 특히 Western blot의 감도를 증가시키고 부분적인 해상도를 증가시키기 위해서 아크릴 아마이드 함량을 \( 7.5 \%\), \(12.5 \% \)로 변화를 주어 실험을 실시하였다. 시간별로 분석한 결과 시간 변화 추이와 타이로신 인산화 단백질의 패턴 변화가 거의 없었지만, 발현된 유전자의 종류에 따라서는 타이로신 인산화 단백질의 패턴 변화를 명확히 나타내었다. PtpA 단백질이 다량 발현되는 방선균에서는 전체 타이로신 인산화 단백질의 종류 및 양의 현저한 변화를 확인할 수 있었으며, 전적으로 감소하는 경향을 나타내었고, 활성 부위의 변이에 의해 기질 단백질과 결합 만 하는 PtpA(C9S) 단백질(Dorminant negative)은 wild type과 같은 타이로신 인산화 단백질 패턴을 나타내었다. 따라서 이러한 결과로 보아 PtpA는 세포내 여러 기질 단백질에 작용하여 탈인산화을 촉진하며, 특히 3종류의 단백질 p200, p90, 그리고 p65에 직접 작용한다는 사실을 알 수 있었다. 또한 이들 세 타이로신 단백질은 PtpA의해 조절 받는 단백질로 확인되었으며, 보다 많은 실험을 통해 이들 단백질의 종류 및 기능을 파악하여야 할 것이다.</p>