생쥐를 경추 탈골법으로 희생시킨 후 주사기를 이용하여 대퇴골과 경골안에 있는 골수를 분리하여 단일세포로 만든 후 유도 배양한 수지상 세포를 UVB lamp 를 이용하여 에너지가 방출되도록 UVB를 조사하였다. OVA로 2차 면역한 생쥐의 비장으로 OVA에 특이적으로 증식반응을 나타내는 T 세포주를 수립 후, 유세포분석기로 분석하여 Type 1 helper T 세포인 것을 확인하고 HS-1으로 이름 붙였다.
<h2>수지상 세포 배양</h2> <p>생쥐(C57BL/6)를 경추 탈골법으로 희생시킨 후 \( 1 \mathrm{ml} \) 주사기를 이용하여 대퇴골(femur)과 경골(tibia)안에 있는 골수를 분리하여 단일세포로 만들었다. 적혈구 용해 완충액(Tris-buffered ammonium chloride; \( 90 \mathrm{ml} \) of \( 0.16 \mathrm{M} \mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl} \), \( 10 \mathrm{ml} \) of \( 0.17 \mathrm{M} \) Tris, PH 7.2)을 처리하여 적혈구를 제거한 후, washing용액으로 \( 1,200 \mathrm{rpm} \) 에서 5 분간 3회 원심 분리하여 충분히 세척한 다음, 혈구계산반을 이용하여 세포수를 계산하였다. GM-CSF \( (1,000 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) \) 와 IL-4 \( (1,000 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) \) 가 포함된 배지(RPMI 1640, FCS 10\%)에 부유된 골수세포( \( 1 \times 10^{6} \) 개 \( / 5 \mathrm{ml} /well \) )를 6 well culture plate에서 배양하였다. 4 일 후 새 배지 \( 1 \mathrm{ml} \) 과 동량의 GM-CSF와 IL-4를 첨가하고 3일간 더 배양한 후 세포를 5 분간 shaking하여 가볍게 부착되어있는 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 washing용액으로 1,200 \( \mathrm{rpm} \) 에서 5 분간 원심 분리하여 충분히 세척한 다음, 세포 ( \( 2.5 \times 10^{6} \) 개 \( / 5 \mathrm{ml} /well \) ) 배양액에 HemoHIM을 농도별(1, 10 ,100 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 로 첨가한 다음에 24 시간 배양하고 회수하여 실험에 사용하였다.</p> <h2>수지상세포에 자외선 조사</h2> <p>생쥐 골수에서 GM-CSF와 IL-4로 유도 배양한 수지상 세포를 회수하여 PBS에 현탁한 후 동량의 세포 수 \( \left(3 \times 10^{5}\right) \) 를 6 well plate에 넣고 \( 1,200 \mathrm{rpm}, 3 \mathrm{~min}\left(25^{\circ} \mathrm{C}\right) \), 원심 침전하여 배양접시의 바닥에 가라앉힌 다음에 UVB lamp (F20T10, Sankyo den- \( \mathrm{ki}, \mathrm{Japan} \) )를 이용하여 1 초에 \( 1 \mathrm{~mJ} / \mathrm{cm}^{2} \) 의 에너지가 방출되도록 UVB를 조사하였다. UVB 방출량 측정은 UVB Solarmeter (Mat SCIENCE TECH)를 이용하였다.</p> <h2>OVA항원 특이적 T 세포주 배양</h2> <p>생쥐 (C57BL/6) 를 OVA로 2차 면역한 후 비장을 분리하여 OVA에 특이적으로 증식반응을 나타내는 T 세포주를 수립하였고, 수립된 세포주는 유세포분석기로 분석하여 \( \mathrm{CD}^{+}, \mathrm{CD}^{-} \) T세포이며 항원자극에 대해 IL-2와 IFN- \( \gamma \) 를 생산하는 Type 1 helper T 세포인 것을 확인하였고 HS-1으로 명명하였다. 수립된 HS-1 T 세포주는 24 well plate에서 배양하면서, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 25 분간 MMC \( (50 \mathrm{~kg} / \mathrm{ml}) \) 로 처리하고 세포 배양액으로 \( 1,200 \mathrm{rpm}, 5 \) 분 \( \left(4^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 간 3 번 세척한 동종의 생쥐 비장세포 \( 5 \times 10^{6} \)개와 OVA \( (1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 항원으로 2주에 한 번씩 활성화시켜 세포수를 늘려서 사용하였다. 그리고 이틀에 한번씩 CAS (concanavalin A supernatant)가 \( 10 \% \) 가 되도록 첨가한 배지로 교환하면서 세포주를 유지하였다.</p>