Potassium phosphate buffer \( 0.1~ \mathrm { M } \)를 \( \mathrm { pH } ~ \) \(7.5 \), Superoxide Dismutase Activity은 제조사의 프로토콜에 따라 상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트(Biovision, Milpitas, CA, USA)를 사용하였고, 250 mM \(\mathrm { KH } 2 \mathrm { PO } 4\), \(0.27 \% \) \(~ \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \), methanol을 샘플 혹은 STD와 혼합하여 2020분 방치하였으며, Trizol 을 사용하여 배양된 세포에서 RNA를 분리하였다. 여기서 모든 측정값의 통계 분석은 SPSS program를 사용해 진행하였다.
<h2>Glutathione assay</h2> <p>Potassium phosphate buffer \( 0.1~ \mathrm { M } \)를 \( \mathrm { pH } ~ \) \(7.5 \)에 맞춰 준비하였다. Potassium phosphate buffer를 기반으로 Glutathione(GSH) standard (Sigma, St.Louis, Missouri, USA, cat. no. G- \(4251 \)), DNTB용액, Glutathione reductase (GR) (Sigma, cat. no. G- \(3664 \), \( \beta \)-NADPH (Sigma, cat. no. N- \(7505 \)) 용액을 준비하였다. HEK \(293 \) 세포가 seeding 되어있는 \(96 \) well-plate에 DTNB 용액과 GR 용액을 \(1 \): \(1 \)로 잘 섞어 각 well에 \( 120 ~ \mu \mathrm { L } \)씩 분주하였다. \(30 \)초 후, 빛을 차단하고 \( \beta- \mathrm { NADPH } \)을 \( 60~ \mu \mathrm { L } \)씩 분주한 후 microplate reader (BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 \( 412 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Superoxide dismutase</h2> <p>Superoxide Dismutase Activity은 제조사의 프로토콜에 따라 상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트(Biovision, Milpitas, CA, USA)를 사용하여 측정되었다. 세포를 PBS로 세척한 다음 PBS에서 균질화하여 상청액을 수집하고 SOD activity 수준을 측정하였다. 시료를 적절하게 희석한 후 각 well에 standards와 상청액을 분주한 후 WST 용액과 enzyme 용액을 분주한다. \(37 \) \( { } ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \(20 \)분동안 방치 후 \( 450 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Catalase activity</h2> <p>\( 250~ \mathrm { mM } \) \(~ \mathrm { KH } 2 \mathrm { PO } 4 \) (Daejung, Siheung-si, Gyeonggi-do, Korea, cat. no. \(6613 \)- \(4405 \)), \(0.27 \% \) \(~ \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) (Duksan, Ansan-si, Gyeonggi-do, Korea, cat. no. \(1145 \)), methanol (Duksan, cat. no. \(58 \))을 샘플 혹은 STD와 혼합하여 \(20 \)분 방치하였다. \( 7.8 ~ \mathrm { M } ~ \) \( \mathrm { KOH } \) (Daejung, cat. no. \(6597 \)- \(4400 \))로 반응을 종결한 후, \( 34.2 ~ \mathrm { mM } \) purpald 용액을 가하여 \(10 \)분간 배양하였다. \( 65.2 ~ \mathrm { mM } \) potassium periodate (Samchun, Seoul, Korea, cat. no. P \(3453 \))을 추가하고 실온에서 \(10 \)분 방치하였다. 흡광도는 \( 550 \mathrm { ~nm } \)에서 측정되었다.</p> <h2>RT-qPCR</h2> <p>Trizol (Life Technologies, Rockville, MD, USA)을 사용하여 배양된 세포에서 RNA를 분리하였다. cDNA는 transcriptor first strand cDNA synthesis kit (Life Technologies)를 사용하여 역전사 방법을 통해 합성되었으며 Step-One-Plus RT-PCR system에서 Universal Probe Library probe method을 사용하여 RT-qPCR에 사용되었다. 상대적인 mRNA 수준은 comparative \(2 \)- \( \Delta \Delta \)CT method을 사용하여 계산하고 \( \beta \)-actin으로 정규화하였다. 사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다: Keap \(1 \) forward \(~5' \)- \( \mathrm { accacaacagtgtggagaggt } \)- \(3' \) and reverse \(5' \)- \( \mathrm { cgatccttcgtgtcagcat } \)- \(3'; \) Heme oxygenase \(1 \) forward \(5' \)- \( \mathrm { ggcagagggtgatagaagagg } \)- \(3' \) and reverse \(5' \)- \( \mathrm { agctcctgcaactcctcaaa } \)- \(3'; \) GST-a forward \(5 \)'- \( \mathrm { ggtgacagcgtttaacaaagc } \)- \(3' \) and reverse \(5' \)- \( \mathrm { ccgtgcattgaagtagtgga } \)- \(3'; \) GSR forward \(5 \)'- \( \mathrm { atgatcagcaccaactgcac } \)- \(3' \) and reverse \(5' \)- \( \mathrm { cgacaaagtctttttaacctcctt } \)- \(3'; \) b-actin forward \(5' \)- \( \mathrm { aagtccettgccatcctaaaa } \)- \(3' \) and reverse \(5' \)- \( \mathrm { atgctatcacctcccctgtg } \)- \(3' \).</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 측정값의 통계 분석은 SPSS program ( \(20.0 \), SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 수행되었다. 모든 데이터는 평균 \( \pm \)표준 오차 (SE)로 표시하였다. 통계 분석은 Duncan's multiple range test one-way ANOVA를 수행하였으며, \( p< \) \( 0.05 \)에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.</p>