2006년 7월부터 2007년 9월까지 5개의 양돈장에서 호흡기 질병 증세를 보이는 돼지 251두의 폐 가검물을 연구한 결과, 혈액배지에서 P. multocida 의심 콜로니를 선발하여 순수 분리했다. Gram stain, Catalase test, Oxidase test, OF test, MacConkey agar의 발육 유무 등으로 1차 동정한 후, 최종 동정은 PCR로 수행하였다. Zoetendal 등의 방법으로 P. multocida의 DNA를 추출하였고, Townsend의 방법을 응용하여 P. multocida species-specific gene을 검출하였다. 분리된 균에 대해 NCCLS 기준에 따른 항생제 감수성 시험을 실시하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>공시 재료</h2> <p>2006년 7월부터 2007년 9월까지 영남지방 5개 양돈장에서 사육되고 있는 돼지 중 호흡기 질병 증세를 보이는 돼지 251두의 폐 가검물을 본 연구의 공시재료로 사용하였다. P. multocida의 분리를 위한 시료의 채취는 폐 병변부의 경계면을 중심으로 폐 표면을 무균적으로 처리한 다음, 폐의 일부를 절개하여 멸균 면봉으로 폐조직 내부를 충분히 swab한 후 4시간 이내에 실험에 이용하였다.</p> <h2>P. multocida의 분리 및 동정</h2> <p>환돈의 폐렴 병소로부터 swab한 시료를 혈액배지에 도말한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 18~24시간 배양하였다. 배양한 혈액배지로부터 P. multocida가 의심되는 colony 2~3개를 선발하여 순수 분리한 후 Gram stain, Catalase test, Oxidase test, OF test, MacConkey agar에서의 발육 유무 등을 바탕으로 1차 동정하였으며, 최종 동정은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 통해 실시하였다.</p> <h2>P. multocida로부터 DNA의 추출</h2> <p>분리균 P. multocida로부터 DNA의 추출은 Zoetendal 등의 방법에 준하여 실시하였다. 먼저 Luria-Bertani broth (Becton Dickinson, USA) \( 3 \mathrm{~ml} \) 에 colony를 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 overnight시켜 배양한 후 \( 1.5 \mathrm{~ml} \)의 Eppendorf tube (Eppendorf, USA)에 \( 1 \mathrm{~ml} \)를 분주하고 \( 13,000 \mathrm{~rpm} \)으로 1분 동안 원심분리한 다음 상층액 \( 800 \mu \mathrm{l} \)를 제거하였다. 그 후 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 가열한 후 다시 \( 13,000 \mathrm{~rpm} \) 으로 10분간 원심분리하여 얼음에서 10분동안 침지시킨 다음 상층액 \( 150 \mu 1 \)를 회수하여 PCR을 위한 template DNA로 사용하였다.</p> <h2>PCR을 이용한 P. multocida species-specific 유전자 검출</h2> <p>PCR을 이용한 P. multocida species-specific gene의 검출은 Townsend 의 방법을 응용하여 실시하였다. P. multocida species-specific gene의 검출을 위한 primer 염기서열은 KMT1 F-ATCCGCTATTTACCCAGTGG, R-RGCTGTAAAC GAACTCGCCAC이다. PCR을 위한 조성은PCR premix buffer (Intron Biotechnology, Korea)에 template DNA \( 1 \mu \mathrm{l} \), 10pmole의 forward 및 reverse primer 각각 \( 1 \mu \mathrm{l} \), 멸균증류수 \( 17 \mu \mathrm{l} \)를 혼합하여 총 \( 20 \mu \mathrm{l} \)로 조정한 후 GeneAmp PCR system 2720 (Applied Biosystems, USA)으로 증폭하였다.</p> <p>PCR은 먼저 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 가열하여 변성을 유도하고, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초간 denaturation, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초간 annealing, 그리고 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초간 extension의 3단계를 총 30회 반복하였으며 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 final extension 과정을 거쳤다. PCR 산물은 2% Seakem ME agarose gel (Cambrex Bioscience사, USA)로 전기영동한 후 ethidium bromide (Corebio사, Korea)로 20분 동안 염색하여 UV transilluminator (Corebio사, Korea)상에서 PCR 산물의 크기를 확인하였다.</p> <h2>P. multocida에 대한 항생제 감수성 양상</h2> <p>분리균을 대상으로 national committee for laboratory standard (NCCLS)의 기준에 따라 디스크 확산법으로 항생제 감수성 시험을 실시하였다. 분리된 세균은 \( 4 \mathrm{ml} \)의 Muller-Hinton broth (BBL, USA)에 접종하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2~8시간 증균시킨 후 McFarland No. \( 0.5 \) turbidity standard \( \left(1.5 \times 10^{8}\right. \) \(\mathrm{CFU} / \mathrm{ml}) \) 의 농도로 조절한 다음, Muller-Hinton agar (BBL, USA) plate에 도말하여 항균제 disc (BBL, USA)를 균등한 간격으로 놓고, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 두었다가 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 18~24시간 배양한 후 발육저지대 범위의 크기를 측정하여 감수성 유무를 결정하였다.</p> <p>본 연구에 사용한 항균제는 BBL (BBL, USA)과 Oxoid (Oxoid, UK)사의 제품으로 amikacin, amoxicillin, ampicllin, apramycin, cefoxitin, ceftiofur, cephalothin, chlor-amphenicol, ciprofloxacin, clindamycin, doxycycline, enro-floxacin, erythromycin, florofenicol, gentamicin, kanamycin, lincomycin+spectinomycin, neomycin, norfloxacin, oflox-acin, spectinomycin, streptomycin, sulfonamides, tetracyclin, tiamulin, trimethoprim/sulfamethoxazole, tylosin 등 총 27종의 항균제에 대한 감수성 시험을 실시하였다.</p>