세포이동 실험에서 세포 이동 정도는 면적당 이동한 세포 수를 세어 비율로 정하였고 세포 부착실험은 부착된 세포 전체 세포의 비로 정량화 되었으며 세포탈착 실험에서 세포 탈착 정도는 원형의 탈착 부유 상태에 있는 세포의 비율로 정했다.
<h2>세포이동 실험</h2> <p>전면 성장한 BAEC에 \( 2 \mathrm{mM} \) thymidine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 24 시간 동안 처리하여 세포의 성장을 중지시킨 뒤 PBS (phosphate buffered saline)로 2 회 세척하였다. 그 후 스크래퍼 찰과기를 이용하여 창상선을 만든 후 다시 PBS로 2 회 세척하고 다양한 농도의 melatonin을 처리하였다. 세포 이동 정도는 일정한 면적에 이동한 세포 수를 세어 이동한 세포 수의 비율을 계산하여 결정하였다.</p> <h2>THP-1 응집 측정</h2> <p>THP-1을 24 시간 동안 배양한 후 12 시간 동안 혈청기아 시켰다. 그 후 다양한 농도의 melatonin을 처리하여 8 시간까지 시간별로 진행되는 응집 현상을 광학현미경으로 관찰하였다.</p> <h2>세포부착 실험</h2> <p>전면 성장한 BAEC을 혈청기아 배지에서 16 시간 동안 배양 하였다. 또한 THP-1 세포를 배양한 후 \( 10 \mu \mathrm{M} \) 의 Calcein \( \mathrm{AM} \) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 45 분간 반응시키고, \( \mathrm{PBS} \) 를 이용하여 3 회 세척하였다. Calcein AM으로 염색시킨 THP-1을 BAEC이 부착된 기판 위에 동량으로 첨가하여 부착된 THP-1 세포를 형광현미경으로 관찰하였다. 부착된 세포와 전체 세포의 비율을 계산하여 정량화 하였다.</p> <h2>산화질소 (NO) 측정</h2> <p>\( 60 \mathrm{~mm} \) 배양접시에 분주된 \( \mathrm{BAEC} \) 을 24 시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) 조건으로 배양한 후, 혈청기아 배지로 16 시간 동안 추가 배양하고 \( 5 \mu \mathrm{M} \) 의 DAF-2 DA (diaminofluoresceins diacetate, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 30 분간 반응시켰다. 그 후 \( \mathrm{HEPES} \) 완충액 \( \left(140 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 5 \mathrm{mM} \mathrm{KCl}, 2 \mathrm{mMCl}_{2}\right. \),\( 5 \mathrm{mM} \) glucose, \( 5 \mathrm{mM} \) HEPES, \( 1 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2}, \mathrm{pH} \) 7.4)으로 2 회 세척하여 치환한 HEPES 완충액에 melatonin을 농도별로 처리하였다. 그 후 세포를 수확하여 초음파파쇄로 분해한 후 세포 용해액을 \( 13,000 \mathrm{rpm} \)으로 20 분간 원심분리하여 상층액을 획득하였다. 형광분석계(Spectrofluorophotometer RF-5301 PC, SHIMADZU, Japan)를 이용하여 형광스펙트럼(Ex: 495 \( \mathrm{nm} \), Em: \( 515 \mathrm{~nm} \) )을 측정하여 산화질소 생산량을 분석하였다.</p> <h2>세포탈착 실험</h2> <p>전면 성장한 BAEC을 혈청기아 배지에서 8 시간 동안 배양한 후 PBS를 이용하여 2 회 세척하였다. 그 후 배지를 \( \mathrm{Ca}^{2+} \) 와 \( \mathrm{Mg}^{2+} \) 이온이 없는 PBS로 교체한 후 \( 0.53 \mathrm{mM} \) EDTA (Wel GENE Inc., Daegu, Korea), 150 nM SNAP (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), \( 2.5 \) μM L-NAME (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 그리고 다양한 농도의 melatonin을 30 분간 처리하여 세포 탈착을 현미경을 이용해 사진 촬영하여 기록하였다. Phosphatase 억제자 실험은 \( 100 \mathrm{nM} \) okadaic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 \( 100 \mathrm{nM} \) cyclosporin \( \mathrm{A} \) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 30 분간 전처리 한 후, 배지를 \( \mathrm{Ca}^{2+} \) 와 \( \mathrm{Mg}^{2+} \) 이온이 없는 PBS로 교체하고 다양한 농도의 melatonin을 30 분간 처리하여 세포 탈착 정도를 현미경을 이용해 사진 촬영하여 기록하였다. 세포 탈착 정도는 원형의 탈착 부유 상태에 있는 세포 수를 계산하여 탈착된 세포의 비율로 결정하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>실험결과는 mean \( \pm \) S.E (standard error)로 나타내었고 얻어진 데이터는 ANOVA test를 이용하여 분석한 후, 유의성이 있을 경우 post-hoc test를 통해 \( 95 \% \) 수준에서 유의성을 검증하였다.</p>