Bacillus sp. J105의 배양액에서 \( \beta \)-lactamase 활성을 확인였고 그래서 이 효소를 분리하여 그 특성을 연구한 결과 Bacillus sp. J105균주의 세포외 \( \beta \)-lacta-mase의 유전자는 chromosomal DNA 상에 존재하고 있는 것으로 판단되어 본 균주의 chromosomal DNA를 변형된 방법으로 분리하고chro-mosomal DNA를 Sau3AI으로 부분 분해하여 단편만을 모았았는데 4개의 단편이 모든 재조합 plasmid에서 발견되었다.결과적으로 모든 재조합 plasmid가 동일한 것으로 판단되었고 \( \beta \)-lactamase의 유전자는이 plasmid는 숙주균내에서 안정하게 유지되고 있음을 알게 되었다.
<h3>\( \mathrm { U } = \) 가수분해된 기질의 농도 \( \times 1 / \mathrm { T } \times 1 / \mathrm { V } \)</h3> <ul> <ul type=○><li>T : 효소반응 시간(분)</li> <li>V : 반응액에 첨가된 효소용액의 부피 \( ( \mathrm { ml } ) \)</li> <li>U : 효소 단위 unit</li></ul> <p>\( \beta \)-Lactamase 활성의 1 unit은 1분 동안 \( 1 \mu \mathrm { mol } \)의 ampicillin을 가수분해하는 효소량으로 정의하였다.</p> <h2>E. coli에서 발현된 \( \beta \)-lactamase의 정제</h2> <p>Bacillus sp. J105 균주가 생산하는 세포 외 \( \beta \)-lactamase와 형질 전환된 E. coli HB101에서 생산되는 \( \beta \)-lactamase 간의 동일성 비교를 위해 조효소액을 조제한 후 아래와 같은 방법에 의하여 정제를 하였다. \( \beta \)-lactamase 유전자를 포함하고 있는 E. coli HB101 (pKL11- \( \Delta \)4.6)을 배양한 후 세포를 회수하여 세포분해 효소인 lysozyme \( (5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \)을 이용하여 세포를 파쇄한 후 원심분리하여 상층액을 취하였다. \( 20 \mathrm { mM } \) Tris-HCl buf-fer pH 8.0)로 투석한 조효소액을 DEAE Sephadex A-50 col-umn chromatography와 Sephadex G-75 gel filtration을 이용하여 \( \beta \)-lactamase 활성 분획을 얻은 다음, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 이행하여 단백질을 확인하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Bacillus sp. J105로부터 \( \beta \)-lactamase 유전자의 cloning</h2> <p>이전연구에서 Bacillus sp. J105의 배양액에서 \( \beta \)-lactamase 활성을 확인 하였으며 이 효소를 분리하여 그 특성을 연구하였다. 따라서 본 연구에서는 이들의 유전자를 클로닝하여 유전자 조절에 대한 연구를 위해 \( \beta \)-lactamase 유전자 cloning을 이행하였다. 먼저 Bacillus sp. J105균주의 plasmid 존재 유무를 파악하기 위해서 alkaline lysis 방법을 변형하여 plasmid 분리실험 결과, plasmid가 존재하지 않는다는 것을 확인하였다(data not shown). 따라서 Bacillus sp. J105균주의 세포외 \( \beta \)-lacta-mase의 유전자는 chromosomal DNA 상에 존재하고 있는 것으로 판단되어 본 균주의 chromosomal DNA를 Murray와 Thompson의 변형된 방법으로 분리하였고 분리한 chro-mosomal DNA를 Sau3AI으로 부분 분해하여 sucrose density ultracentrifugation을 행한 후 \( 20 \sim 30 \mathrm { ~kb } \) 단편만을 모았다. 이 단편과 cosmid vector의 양쪽 arm 과 ligation하여 in vitro packaging을 거쳐 \( \lambda \) phage의 형질도입방법으로 E. coli DH 5a에 재조합 plasmid를 형질도입 하였다. 형질이 도입된 E. coli DH 5 \( \alpha \) 균주를 X-gal과 IPTG가 함유된 LB agar배지에 ampi-cillin을 \( 2 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 첨가하여 spreading하였다. \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 18시간 배양 후 white colony이면서 ampicillin에 내성을 보이는 \( \beta \)-lactamase 양성 clone주( \( \left ( \beta- \mathrm { Lac } ^ { + } \right ) \)를 선별하였다. \( \beta \)-Lactamase 양성 clone주를 alkaline lysis 법으로 plasmid 분리하여, 확인 후 E. coli \( \mathrm { DH } 5 \alpha \) 에 다시 형질 전환시켰다. 전체적인 \( \beta \)-lacta-mase 유전자 클로닝 과정을 Fig. 1에 나타내었다. 형질전환된 균주를 50개 선별하여 재조합 plasmid를 확인하였고 SalI으로 처리하여 agarose gel 전기영동으로 확인한 결과, 4개의 단편이 모든 재조합 plasmid에서 발견되었다. 따라서 모든 재조합 plasmid가 동일한 것으로 판단되었고 \( \beta \)-lactamase의 유전자는 recombinant plasmid상에 존재하며 이 plasmid는 숙주균내에서 안정하게 유지되고 있음을 알았다. 이 recombinant plasmid를 pKB89라 명명하였고 여러 가지 제한효소를 처리하여 그 분해 형태를 조사한 결과, pKB89의 전체적인 크기는 분자량 marker와 \( \lambda \) phage의 packaging size를 고려해 볼 때 \( 40 \mathrm { ~kb } \)이상 될 것으로 추정되었다(data not shown).</p>