Supcroxide anion radical의 소거능은 NBT 방법으로 측정되었다. HAase의 저해활성은 sodium-hyaluronic acid로부터 형성된 N-acetylglucosamine을 glu-coxazoline 유도체로 변형시키고 이를 DMAB로 발색시켜 측정하였다. 또한, 반응물에 DMAB 시약을 가하여 흡광도를 측정하여 저해활성을 계산하였다. 이 모든 과정은 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 이루어진다.
<p>전자공여능 \( ( \%) = \left (1- \frac {\text { 시료첨가군의 흡광도 } } {\text { 무첨가군의 흡광도 } } \right ) \times 100 \)</p> <h2>Superoxide anion radical 소거능 측정</h2> <p>Supcroxide anion radical 소거능은 nitroblue tetrazolium (NBT) 횐원방법에 의해 측정하였다. 각 시료용액 \( 0.1 \mathrm { ~mL } \)와 \( 0.1 \mathrm { M } \) potassium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } 7.5) 0.6 \mathrm { ~mL } \) 에 xanthine \( (0.4 \mathrm { mM } ) \) 과 \( \mathrm { NBT } (0.24 \mathrm { mM } ) \) 을 녹인 기질액 \( 1 \mathrm { ~mL } \) 를 침가하고 xanthine oxidase \( (0.049 \mathrm { U } / \mathrm { mL } ) 1 \mathrm { ~mL } \) 를 가하여 37 \( { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20 분간 반응시킨 후 \( 1 \mathrm { ~N } \mathrm { HCl } 1 \mathrm { ~mL } \) 를 가하여 반응 을 종료시킨 다음, 반응액 중에 생성된 supcroxide anion radical의 양을 \( 560 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <p>저해율 \( ( \%)= \left (1- \frac {\text { 시료첨가군의 superoxide anion radical 생성량 } } {\text { 무첨가군의 superoxide anion radical 생성량 } } \right ) \times 100 \)</p> <h2>Hyaluronidase 저해활성 측정</h2> <p>Hyaluronidase(HAase) 저해활성 측정은 sodium-hyalu-ronic acid(HA)로부터 형성 된 \( \mathrm { N } \)-acetylglucosamine을 glu-coxazoline 유도체로 변형시킨 후 p-dimethylaminobenzalde-hyde(DMAB)로 발색시켜 흡광도를 측정하여 효소 활성을 측정하였다. 0.1 M acetate buffer(pH 3.5)에 녹인 HAase \( (7,900 \mathrm { U } / \mathrm { mL } ) 0.05 \mathrm { ~mL } \) 와 시료용액 \( 0.1 \mathrm { ~mL } \) 를 혼합하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20 분간 배양한 다음 \( 12.5 \mathrm { mM } \mathrm { CaCl } { } _ { 2 } 0.1 \mathrm { ~mL } \) 를 가하고 혼합 후 다시 20 분간 배양하였다. 기질로서 \( 0.1 \mathrm { M } \) acetate buffer \( ( \mathrm { pH } 3.5) \) 에 녹인 \( \mathrm { HA } (12 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } ) \) 를 첨가하여 다시 40 분간 배양하여 \( 0.4 \mathrm { ~N } \) potassiumtetraborate \( 0.1 \mathrm { ~mL } \) 및 \( 0.4 \mathrm { ~N } \) \( \mathrm { NaOH } \) 용액을 \( 0.1 \mathrm { ~mL } \) 반응 혼합물에 첨가하여 3분 동안 수욕상에서 가열한 후 완전히 냉각시컸다. 냉각 시킨 반응물 에 발색제로 DMAB 시약 \( 3 \mathrm { ~mL } \) 을 가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20 분간 배양한 다음 \( 585 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하여 저해활성을 산출 하였다.</p>