Epoxy-activated Sepharose 6B 수지를 여러 완충액으로 세척하고 처리한 후, 이를 Pharmacia XK16/20 column에 충진하였다. 이후, E. coli BL21(pHU1013) 배양액을 원심 분리하여 회수하고 cell pellet을 세척 후 현탁시켰다. 마지막으로, pylori urease IgG column에 적용하여 다양한 완충액을 이용하여 용출을 시도하였다.
<h2>Epoxy-activated Sepharose- urea column의 제조</h2> <p>Epoxy-activated Sepharose 6B 수지 (Pharmacia, Sweden) 동결 건조 분말 \( 2 \mathrm { ~g } \)을 Buchner funnel에 가하여 실온에서 멸균 증류수 \( 400 \mathrm { ~mL } \)로 습윤 및 세척하고 소량의 coupling 완충액 \( (10 \mathrm { ~mM } \) boric acid, \( \mathrm { pH } ~9.3 \))에 현탁시켰다. 여기에 \( 144 \mathrm { ~mg } \) 의 urea가 녹아 있는 \( 15 \mathrm { ~mL } \) coupling 완충액을 가하고 실온에서 16 시간 서서히 교반 하여 coupling 시켰다. Coupling 되지 않은 과잉의 urea를 제거하기 위하여 gel 부피의 5배량 \( (35 \mathrm { ~mL } ) \)의 coupling 완충액으로 세척하고, \(1 \mathrm { ~M } \) ethanolamine \( ( \mathrm { pH } ~8.0) \) 용액을 가하여 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 6 시간 방치 함으로써 치환되지 않은 epoxy-activated Seph-arose 수지의 잔여 활성 부위를 차단하였다. 이를 \( 0.5 \mathrm { ~M } \) NaCl을 함유하는 \( 0.1 \mathrm { ~M } \) acetate 완충액 \( ( \mathrm { pH } ~4.0) \) 및 \( 0.5 \mathrm { ~M } \) NaCl을 함유하는 \( 0.1 \mathrm { ~M } \) Tris-HCl 완충액 \( ( \mathrm { pH } ~8.0) \) 각 \( 50 \mathrm { ~mL } \)로 교대로 세척한 다음 Pharmacia XK16/20 column에 충진하고 5배 column부피의 \( 20 \mathrm { ~mM } \) N-(2-hydroxyethyl) piperazine)- \( \mathrm { N } ^ {\prime } \)-(2-ethanesulfonic acid) (HEPES), \( 1 \mathrm { ~mM } \) EDTA, \( 0.5 \mathrm { ~mM } \) 2-mercaptoethanol (HEB, \( \mathrm { pH } ~7.5 \))완충액으로 평형화시켰다.</p> <h2>재조합 H. pylori urease의 정제</h2> <p>E. coli BL21(pHU1013) 배양액을 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 8,000 \mathrm { ~xg } \)에서 15분간 원심 분리하여 회수하고 cell pellet을 빙냉한 \( 20 \mathrm { ~mM } \) \( \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } \), \(1 \mathrm { ~mM } \) EDTA, \( 1 \mathrm { ~mM } \) 2-mercaptoethanol (이하 PEB, \( \mathrm { pH } ~7.2 \)) 완충 용액으로 2 회 세척한 후, 동량의 PEB에 현탁 시켰다. Phenylmethylsulfonylfluoride를 최종 농도 \( 1 \mathrm { ~mM } \)로 하여 가하고 French pressure cell (Aminco, USA) 을 \( 18,000 \mathrm { ~psi } \)의 압력으로 3회 반복 통과시켜서 세포를 파쇄하였다. 이를 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(100,000 \times g \)에서 90 분간 원심 분리하고 그 상등액을 취하여 조 추출물로 하였다. \(( \mathrm { pH } ~7.2) \)완충액으로 미리 평형화 시킨 DEAE-Sepahrose CL-6B(Pharmacia, Sweden) column \( (2.5 \times 16 \mathrm { ~cm } ) \)에 조 추출물을 적용하고 \( 50 \mathrm { ~mL } \) PEB로 세척한 후, KCl 농도를 0에서 \( 1 \mathrm { ~M } \)까지 직선적으로 증가시켜서 흡착된 단백질들을 용출 시켰다. 각 분획에 대하여 indophenol 법에 준하여 urease 효소 활성 측정을 행하였으며 이 중 활성 분획 만을 모아서 \( 50 \mathrm { ~mL } \)-stirred ultrafiltration cell (Amicon, USA)에서 농축과 동시에 용매 교환을 시행하였다. 이를 전 항에서 제조하여 \( \mathrm { pH } ~7.2 \) PED 완충액으로 미리 평형화시킨 CNBr-anti H. pylori urease IgG column \( (1 \times 6.4 \mathrm { ~cm } ) \)에 적용하여, 4 배 column 부피의 PED 완충액으로 세척한 다음, \( 1 \mathrm { ~M } \) KCl, \(20 \% \) dimethylsulfoxide(DMSO)를 각각 함유하는 PED \( ( \mathrm { pH } ~7.2) \) 완충액, 냉 초순수 (Milipore 급), \( 1 \mathrm { ~N } \) NaOH용액, \( 100 \mathrm { ~mM } \) glycine HCl \(( \mathrm { pH } ~3.2) \) 완충액 및 \( 100 \mathrm { ~mM } \) 탄산 \( ( \mathrm { pH } ~10.5) \) 완충액 등으로 각각 용출을 시도하였다.</p>