Neutral GCs는 PAS반응법으로, acid GCs는 alcin blue 염색을 실시하였다. GCs 잔기에 특이적인 lectin 조직화학을 위하여 탈파라핀한 조직을 전처리 후 특정 탄수화물을 인지할 수 있는 lectin에 각각 반응시켰다. 세척 후 ABC kit에 반응시켜 DAB substrate kit로 발색 후 대조 염색하였다. 면역조직화학적 관찰을 위해 전저리 후 ER- \( \alpha \), c-fos, c-jun을 희석하여 반응시켰다.
<h2>GCs에 대한 조직화학적 관찰</h2> <p>Neutral GCs에 대한 관찰은 periodic acid Schiff반응법을, acid GCs는 alcian blue \( \mathrm { pH } \) 2.5염색을 실시하였다. acid GCs 중 sulfated GCs는 alcian blue \( \mathrm { pH } \) 1.0염색을, sulfated와 nonsulfated GCs 구별은 aldehyde fuchsin pH 1.7-alcian blue \( \mathrm { pH } \) 2.5염색을 사용하였다.</p> <p>GCs 잔기에 특이적인 lectin 조직화학을 위하여 탈파라핀한 조직을 \( 3 \% \) methanolic hydrogen peroxide에 실온에서 30분간 처리하고, PBS로 10분간 3회 세척한 후 \( 1 \% \) bovine serum albumin용액에 실온에서 30분간 두었다. 이를 bioti-nylated lectin (Vector Lab.) 중 \( \alpha \)-D-mannose, \( \alpha \)-D-glucose를 인지하는 Con A (Canavalia ensiformis)를 \( 5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { m } \ell, \beta \) -N-acetyl-D-glucosamine, \( \alpha / \beta \)-N-acetyl-D-galactosamine, \( \alpha \) -D-galactose를 각각 인지하는 succinylated WGA (Triticum vulgaris), SBA (Glycine max), BSL-1 (Bandeiraea simplicifolia)을 \( 20 \mu \mathrm { g } / \mathrm { m \ell } \) 농도로 HEPES buffer (10 mM HEPES, \( \mathrm { pH } 7.5 \), \( 0.15 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } , 0.1 \mathrm { mM } \mathrm { Ca } { } ^ { 2 + } , 0.01 \mathrm { mM } \)의 \( \left . \mathrm { Mn } ^ { 2 + } \right ) \)에 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 세척후 상용화된 ABC kit (Vector Lab., PK-4000 )에 60분간 반응시키고 DAB substrate kit (Vector Lab., SK-4100)로 실온에서 5분간 발색시켜 Mayer's hematoxylin으로 대조 염색하였다. 각 kit의사용법은 제조회사의 매뉴얼에 근거하여 실시하였다.</p> <h2>ER- \( \alpha \), c-fos, c-jun에 대한 면역조직화학적 관찰</h2> <p>면역조직화학적 관찰을 위해 탈파라핀한 후 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } 10 \mathrm { mM } \) sodium citrate buffer \( ( \mathrm { pH } \) 6.0)에 5분간 처리하였고 이를 \( 3 \% \) methanolic hydrogen peroxide에 30분간 실온에서 처리하였다. PBS로 세척한 후 goat normal serum (Vector Lab.,PK-6101)으로 30분간 처리하였으며, Santa Cruz Biotech-nology Inc.의 ER- \( \alpha \) (sc-542), c-fos (sc-253), c-jun (sc-1694)을 모두 \( 500: 1 \)로 희석하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 humidity chamber에서 16시간 동안 반응시켰다.</p>