이 연구에서는 마우스 대식세포인 Raw 264.7 cell에 대한 CopA3의 세포독성을 MTT assay를 통해 검증한다. 결과적으로, CopA3는 \(100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\) 농도 이하에서 세포독성이 낮으며, 이는 세포 생존율에 큰 영향을 주지 않는다는 것을 보여준다. 따라서, CopA3의 항염증 효과는 세포 사멸에 의한 염증성 매개물질 생성억제가 아닌, CopA3의 고유한 효과로 인한 것임을 확인한다.
<h2>TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \), IL-6</h2> <p>세포배양액 내의 TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \), IL-6 생성량은 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 cell은 DMEM배지를 이용하여 \( 5 \times 10 ^ { 5 } \) cells/ \( \mathrm { ml } \)로 조절한 후 6 well plate에 접종하고, \( 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 24시간 배양하였다. 세포에 \( 1 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)의 LPS를 처리 한 뒤 1시간 후에 CopA3를 처리하여 24시간 배양한 후 배양배지를 취하여 TNF-a, IL-1 \( \beta \), IL-6를 측정하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험은 3회 반복하여 측정하였고, 그 결과는 평균값 \( \pm \) 표준편차로 나타냈으며 통계적 분석은 SPSS \( 10.0 \) 프로그램을 이용하여 각 처리구간의 유의성 \( (p<0.05,0.01) \) 검증을 위해 분산분석(analysis of variance, ANOVA) 후 tukey test로 다중 비교를 실시하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Raw 264.7 cell에 대한 독성</h2> <p>마우스 대식세포인 Raw 264.7 cell에 대한 CopA3의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. CopA3를 \( 5, 10, 25, 50, 100, 500 \mathrm { ~kg } / \mathrm { ml } \) 농도로 24시간 동안 처리한 결과 \( 100 \mathrm { ~kg } / \mathrm { ml } \)의 농도까지는 독성이 나타나지 않았지만, \( 500 \mu \mathrm { g } / \) \( \mathrm { ml } \)의 농도에서는 세포의 생존율을 \( 95 \% \) 감소 시켰다. CopA3는 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 이하의 농도에서는 세포독성이 낮아 세포의 생존율에 영향을 주지 않는다는 사실을 확인할 수 있었다. 즉, CopA3의 항염증 효과가 단순한 세포의 사멸에 의한 세포 염증성 매개물질의 생성억제가 아니라 CopA3의 고유한 효과라는 점을 의미한다.</p> <h2>Nitric oxide (NO) 생성억제 효과</h2> <p>NO는 체내 방어기능, 신호전달 기능, 신경독성, 혈관 확장 등의 다양한 생리기능을 가지고 있으며, 3종류의 NOS (neuronal NO synthase (nNOS), endothelial NO synthase (eNOS), inducible NO synthase (iNOS))에 의해 합성된다. 이들 NOS 중 iNOS에 의한 NO 생성이 절대적으로 많으며 이는 병리적으로 중요한 작용을 한다. LPS 자극에 의해 발현된 iNOS는 많은 양의 NO를 생성하게 되며, 이에 의한 세포독성은 염증반응, 세포의 돌연변이 및 종양발생 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 염증반응과 관련된 조직 손상에서 NO와 iNOS의 발현이 증가되어 있음이 보고되어 있다.</p>