시료에서 IGFs을 분리하기 위해 acid-ethanol과 formic acid 추출법을 사용했으며, 혈청내의 IGFs 농도는 방사면역 측정법을 이용하여 측정하였다. 또한, LPO 형성은 malonde-aldehyde의 양으로 측정하였고, 이를 위해 세포를 수확한 후 초음파로 분쇄하고 반응용액을 추가한 후 95도에서 60분간 반응시켰다. 마지막으로 이 시료를 spectroflurometry를 이용하여 파장에서 측정하여 nmol/mg protein으로 표시하였다.
<h2>시료의 전 처리</h2><p>시료중 IGF들은 대부분 IGF binding proteins (IGFBPs)와 결합된 형태로 존재하므로 IGFBP로부터 IGFs을 분리하기 위하여 acid-ethanol 추출과 formic acid 추출 방법에 의하여 분리하였다. IGF-Ⅰ의 분리는 혈청 \( 200 \mu \mathrm{l} \)에 acid-ethanol (\( 2 \mathrm{M} \) \( \mathrm{HCl} \):ethanol=1:7) \( 800 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하여 혼합한 다음 실온에서 30분간 방치하여 유리형과 결합형을 분리시켰다. 이 후 \( 3000 \mathrm{rpm}\), \(4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 원심분리하여 유리 IGF-Ⅰ을 함유하는 상층액 \( 500 \mu \mathrm{l} \)에 \( 0.855 \mathrm{M} \) trizma base를 \( 200 \mu \mathrm{l} \) 넣어 분석에 사용하였다. 간장, 신장 및 태반 조직은 각 조직 \( 0.25 \mathrm{~g} \)에 \( 1 \% \) trifluoracetic acid (TFA) \( 2 \mathrm{ml} \)를 넣어 균질마쇄기 (Polytron Co, U.S.A)로 마쇄 후 원심분리하여 상층액을 취한 다음 acid-ethanol 추출법으로 IGFBP로 부터 IGF-Ⅰ을 분리하여 농도를 측정하였다.</p><h2>IGFs 방사면역 측정법</h2><p>혈청내의 IGFs 농도는 \( \left[{ }^{125} \mathrm{I}\right]-\mathrm{IGFs} \) 에 polyclonal anti-IGFs를 사용한 방사면역 측정법(radioimmunoassay, RIA)을 이용하였다. 이를 요약하면, IGFs RIA 완충액으로 \( 0.5 \% \) BSA, \( 0.12 \mathrm{~M} \mathrm{~NaCl}\), \(0.1 \% \) sodium azide를 함유한 \( 0.04 \mathrm{M} \) 인산 완충액 ( \( \mathrm{pH} 7.4 \))을 사용하였다. IGFs 표준액과 시료에 1,000배 희석시킨 polyclonal anti-IGFs \( 50 \mu \mathrm{l} \)을 첨가하여 실온에서 1시간 반응시킨 후 각각의 시험관에 \( \left[{ }^{125} \mathrm{I}\right]-\mathrm{IGFs}(20,000 \mathrm{cpm} / \)\(100 \mu \mathrm{l}) \)을 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 18시간 반응시켰다. 이 후 horse serum \( 50 \mu l \)와 \( 12 \% \) polyethylene glycol #8000 (PEG) \( 1 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 30분간 원심 분리시켜 결합형과 비결합형을 분리시켰고 결합형의 방사능을 gamma counter (Wallac Wizard 1470, Turku, Finland)로 측정하였다.</p><h2>Lipid peroxide (LPO)형성</h2><p>LPO 형성은 Ohkawa 등의 방법에 따라 malonde-aldehyde의 양으로 측정하였으며, 간략히 요약하면 다음과 같다. 세포들을 수확한 후 초음파로 세포를 분쇄한 후, 반응용액 [\(8 \% \) SDS \( 100 \mu \mathrm{l}\), \(0.8 \% \) 2-thiobarbituric acid (TBA) \( 200 \mu \mathrm{l}\), \(20 \% \) acetic acid \( 200 \mu \mathrm{l}\)]을 넣은 후 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60분간 반응시켰다. 이후, 얼음으로 차게한 물에 식힌 후, 비특이적인 적색 색소를 제거하기 위하여 n-butanol-pyridine 혼합액 \( (15: 1, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \)을 첨가한 후 \( 4,000 \times g \)에서 10분간 원심분리하여 상층액을 수합하였다. 이 시료를 spectroflurometry (Beckman Instruments Inc, Fullerton, CA, USA)를 이용하여 emission 파장 \( 553 \mathrm{~nm} \) 및 excitation 파장 \( 515 \mathrm{~nm} \)에서 측정하여 \( \mathrm{nmol} / \mathrm{mg} \) protein으로 표시하였다. 단백질량은 Bradford 방법에 의해서 측정하고, 모든 실험은 triplicate로 실시하였다.</p>