4종의 균주를 이용해 꿀풀의 꽃과 잎 열수 추출물을 첨가한 배양액에서의 생균수를 조사했다. 어류 질병 미생물에 대한 항균활성 측정과 전자공여능을 측정하기 위한 방법을 적용하였다. 이를 위해 꿀풀 열수 추출액과 probiotic bacteria 배양액을 혼합하고, UV/VIS spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
<h2>자생식물 추출물 첨가에 따른 lactic acid bacteria 생육 조건</h2> <p>본 연구에서 사용된 4종의 균주를 Lactobacilli MRS broth에 \(5 \% \)씩 접종하고 난 후 꿀풀 꽃과 잎 열수 추출물을 배양액에 \( 0 \%, 5 \%, 10 \%, 15 \%, 20 \% \)씩 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 48시간 정치배양하면서 생육시간에 따른 각각의 lactic acid bacteria에 생균수를 조사하기 위하여 배양기간 동안 12시간 마다 배양액의 \( \mathrm { pH } \) 및 glucose 함량을 \( 1 \% \) 높인 BCP plate count agar(Eiken chemical, Japan)를 사용하여 생성된 colony를 계측하여 생균수 변화를 측정하였다.</p> <p>또한 각 농도별로 12시간마다 배양액을 취하여 4000 xg로 원심 분리하여 상등액만을 모아 항균 실험 및 항산화능 실험에 사용하였다.</p> <h2>항균실험 균주</h2> <p>본 실험에 사용된 균주는 어류 질병 미생물로서 한국유전자은행인 KCTC(Korean Collection For Type Culture)에서 그람 음성균 12종과 그람 양성균 1종을 분양받아 실험에 사용하였다.</p> <h2>항균활성 측정</h2> <p>어류 질병 미생물에 대한 항균활성 측정은 Murry 등의 방법을 응용하여 측정하였다. L. plantarum, L. rhamnosus, E. faceium 그리고 P. pentosaceus가 접종되어진 배양액에 각 꿀풀 열수 추출액을 \( 10 \% \) 첨가하여 48시간 동안 배양한 배양액을 5000 xg로 원심 분리하여 상층액만을 모아 항균활성 측정 시료로 이용하였다. 먼저 전 배양된 공시균을 Muller Hinton broth (Difco, USA)에 12시간 정도 배양하여 배양액의 탁도를 MacFarland turbidity No. 0.5가 되도록 조절한 후 멸균된 면봉을 사용하여 Muller Hinton agar (Difco, USA)에 회전하면서 배지 전면에 균액을 골고루 도말하였다. 항균측정용 시료액은 \( 8 \mathrm { ~mm } \) paper disc (ADVANTEC, Japan)에 50 \( \mu \mathrm { l } \)를 흡수 건조시켜 배지위에 부착시켜서 각 공시균의 최적 온도에서 24시간 배양 후 생성된 억제환(직경 \( \mathrm { mm } \) )을 측정하여 항균 효과를 확인하였다.</p> <h2>DPPH radical 소거활성 측정</h2> <p>전자공여능은 \( 4.0 \times 10 ^ { -4 } \mathrm { M } \) DPPH(1,1-diphenyl-2-picryhy-drazyl)용액 \( 2 \mathrm { ml } \)와 꿀풀 꽃과 잎 열수 추출액을 농도별로 첨가하여 48시간 배양시킨 probiotic bacteria 배양액을 \( 1 \mathrm { ml } \)씩 혼합한 후, UV/VIS spectrophotometer(Hanson OPRON-3000 , Korea)로 \( 518 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로는 합성 항산화제인 BHA(butylated hydroxytoluene)와 BHT(butylated hydroxytoluene)를 \( 0.05 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \)의 농도로 제조한 후 제조된 DPPH용액 \( 2 \mathrm { ml } \)와 대조구액 \( 1 \mathrm { ml } \)를 혼합한 것과 꿀풀 꽃과 잎 열수 추출액을 농도별로 첨가하여 배양시킨 lactic acid bacteria 배양액을 시험구와 같은 농도로 희석액을 제조한 후 제조된 DPPH 용액 \( 2 \mathrm { ml } \) 와 대조구액 \( 1 \mathrm { ml } \)씩을 혼합한 후 30분간 상온에서 반응시킨 후 흡광도를 측정 하였다.</p>