황금이 ROS 제거에 관여하는 효소인 HO-1의 mRNA 발현에 미치는 영향을 ISH 기법으로 조사하였다. 가지돌기에 형성된 HO-1 mRNA 과립의 수는 유의하게 증가하였다\((38.5 \%, \mathrm{P}=0.001)\). 가지돌기에 형성된 HO-1 mRNA 과립의 수는 상당히 증가되었다(59.2%, \mathrm{P}=0.001). HO-1은 신경세포의 핵에서는 황금에 의한 발현 변화가 거의 없었으나 세포체에서는 유의하게 증가하였다\((22.4 \%, \mathrm{P}=0.005)\). 정상산소 환경에서와 같은 방법으로 신경세포와 신경교세포에서의 발현정도를 측정한 결과 신경세포(15.7 \%15.7%, \mathrm{P}=0.048P=0.048), 신경교세포(77.5\%77.5%, \mathrm{P}=0.001P=0.001) 모두에서 황금을 처리한 배양에서 유의하게 증가하였다.
<h1>결 과</h1> <h2>정상산소환경(normoxia)에서 황금이 HO-1 mRNA 발현에 미치는 영향</h2> <p>황금이 ROS 제거에 관여하는 효소인 HO-1의 mRNA 발현에 미치는 영향을 ISH 기법으로 조사하였다. HO-1 단백질의 아미노말단에 해당하는 유전자 부위(461bp)를 PCR기법으로 증폭하고, transcription vector인 pCRⅡ-TOPO에 cloning하였다. Sense cRNA probe를 만들기 위하여 이 재조합 plasmid를 BamHI으로 잘라 선형으로 만들고 T7 RNA polymerase를 이용하여 in vitro transcription하였다. 이때 DIG-UTP를 첨가하여 cRNA를 DIG로 표지하였다. Anti-sense cRNA probe를 만들기 위하여 이 재조합 plasmid를 EcoRV로 잘라 선형으로 만들고 SP6 RNA polymerase를 이용하여 in vitro transcription하였다.</p> <p>DIV12의 배양세포에 황금(\(20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\))을 처리한 후 DIV14에 정상산소 환경에서 HO-1 mRNA 발현을 anti-sense RNA probe를 이용하여 관찰하였다. HO-1 mRNA는 핵, 세포체, 가지돌기에 발현되었다. 핵에서의 발현 정도를 densitometer로 측정한 결과 황금을 처리한 배양에서 약간 감소하였으나 통계적 유의성은 없었다. 그러나 가지돌기에 형성된 HO-1 mRNA 과립의 수는 유의하게 증가하였다(\( 38.5 \%\), \(\mathrm{P}=0.001 \)).</p> <h2>저산소증(hypoxia)에서 황금이 HO-1 mRNA 발현에 미치는 영향</h2> <p>다음으로 황금이 저산소증에서 HO-1 mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하였다. DIV12의 배양세포에 황금(\(20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\))을 처리한 후 DIV14에 저산소증을 유도하고, 다시 정상산소 환경에서 2시간 더 배양한 후 DIG-labeled anti-sense HO-1 cRNA를 이용하여 ISH 기법으로 관찰하였다. 핵에서의 발현 정도를 densitometer로 측정한 결과 황금을 처리한 배양에서 약간 감소하였으나 통계적 유의성은 없었다. 그러나 가지돌기에 형성된 HO-1 mRNA 과립의 수는 상당히 증가되었다(\( 59.2 \%\), \(\mathrm{P}=0.001 \)).</p> <h2>정상산소환경(normoxia)에서 황금이 HO-1 단백질 발현에 미치는 영향</h2> <p>황금이 정상산소 환경에서 ROS 제거에 관여하는 효소인 HO-1의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. DIV12의 배양세 포에 황금(\(20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\))을 처리한 후 DIV14에 정상산소 환경에서 HO-1의 발현을 항체를 이용하여 IC 기법으로 관찰하였다. 이때 PSD95 단백질에 대한 항체를 이중염색하여 신경세포를 확인하였다. HO-1은 신경세포의 핵에서는 강하게 발현되었으나 세포체에서는 약했으며, 가지돌기에서는 더 약하게 발현되었다. 반면에 PSD95를 발현하지 않고, 형태적으로 별아교세포(astrocyte)로 보이는 세포에서는 강하게 발현되었다. 발현의 정도를 관찰하고자 HO-1 면역염색 이미지를 흑백으로 전환하고 음양을 반전시킨 후 신경세포의 핵과 세포체의 신호강도(signal in-tensity)를 측정하였다. 그 결과 HO-1은 신경세포의 핵에서는 황금에 의한 발현 변화가 거의 없었으나 세포체에서는 유의하게 증가하였다(\( 22.4 \%\), \(\mathrm{P}=0.005 \)).</p> <h2>저산소증(hypoxia)에서 황금이 HO-1 단백질 발현에 미치는 영향</h2> <p>다음으로 황금이 저산소증에서 HO-1의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. DIV12의 배양세포에 황금(\(20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\))을 처리한 후 DIV14에 저산소증 (\(5 \% \) \( \mathrm{O}_{2} / 5 \% \) \(\mathrm{CO}_{2}\), \(37^{\circ} \mathrm{C}\), \(3 \mathrm{hrs}\))을 유도하고, 다시 정상산소 환경에서 2시간 더 배양한 후 HO-1의 발현을 항체를 이용하여 IC 기법으로 관찰하였다. HO-1은 정상산소 환경에 비하여 저산소증에서 더 강하게 발현되었으며, 특히 별아교세포로 보이는 신경교세포에 더욱 강하게 발현되었다. 정상산소 환경에서와 같은 방법으로 신경세포와 신경교세포에서의 발현정도를 측정한 결과 신경세포(\( 15.7 \%\), \(\mathrm{P}=0.048 \)), 신경교세포(\( 77.5\%\), \(\mathrm{P}=0.001 \)) 모두에서 황금을 처리한 배양에서 유의하게 증가하였다.</p>