Periplasm으로부터 PGA를 추출하기 위해 원심 분리하여 얻은 세포를 sucrose와 lysozyme 용액에 현탁시킨 뒤 원심분리 하였다. 그 뒤 생육도와 포도당의 농도, 그리고 PGA와 HPIC 분석을 진행하였다.
<h2>Periplasm으로 부터 PGA의 추출</h2><p>Lysozyme/EDTA 처리는. French 및 Picrce 등의 방법을 보완하여 실시하였다. 즉 원심 분리하여 얻은 세포를 \( 20 \% \) sucrose와 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 의 lysozyme이 들어있는 \( 200 \mathrm{mM} \) Tris, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA( \( \mathrm{pH} 7.5)\) 용액에 현탁시킨 뒤 상온에서 20분 반응시켰다. \( 13,000 \mathrm{~g} \) 에서 15분 원심 분리하여 periplasm 분획을 얻었다.</p><h2>분석방법</h2><p>사용된 군주의 생육도는 자외선-가시광선 분광광도계 (Shimadzu UV-265, Japan)를 사용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. 포도당의 농도는 당분석기(YSI model 2700 STAT, Yellow Springs Instrument Inc., Ohio, USA)로 측정하였다. PGA의 분석은 SDS-PAGE(NuPAGE \( 4 \sim 12 \% \) Bis-Tris Gel, Invitrogen, USA)로 하였으며 coomassie brilliant blue R-200 (Biorad, USA)로 염색하여 카메라로 촬영하였다. PGA 활성은 배양액을 \( 0.05 \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 7.8) \) 로 희석하여 전체 부피가 \( 75 \mu \mathrm{L} \) 가 되게 하고, 여기에 \( 0.05 \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 7.8 \))에 녹인 \( 3.6 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 6-nitro-3-phenylacetamidobenzoic acid (NIPAB) \( 25 \mu \mathrm{L} \) 를 첨가하였다. 상온에서 반응시키며 \( 405 \mathrm{~nm} \) 에서의 흡광도를 측정하여 PGA 활성을 분석하였다. 또 다른 방법으로는 \( 2 \mathrm{mM} \) 인산완충액 \( (\mathrm{pH} 8.0) \) 에 \( 5 \% \) penicillin \( \mathrm{G}^{2} \) 를 첨가한 기질에 본 배양액 일정량을 첨가하여 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 경시적으로 소모된 기질의 양을 측정하였다. 활성 단위의 계산은 다음 공식과 같다.</p><p>\( \begin{aligned} \text { 활성 }(\mathrm{U} / \mathrm{mL})=&\{\text { 반응 } 2 \text { 분 후의 기질농도 }(\mu \mathrm{mol})\\ &-\text { 반응 } 10 \text { 분후의 기질농도 }(\mu \mathrm{mol})\} \\ & /\{\text { 사용한 효소량 }(\mathrm{mL}) \times 8 \text { 분 }\} \end{aligned} \)</p><h2>HPlC 분석</h2><p>\( 50 \mathrm{mM} \) 인산칼슘완충액( \( \mathrm{pH} 6.0 \) )에 \( 16 \% \) ACN(ACETO-NITRILE)이 포함된 이동상으로 RP-18 역상 HPLC 컬럼 (Hypersil OSD, \( 5 \mu \mathrm{m}, 250 \mathrm{~mm} \times 4.6 \mathrm{~mm} \) )을 사용하여 \( 1 \mathrm{~mL} \) \( / \mathrm{min} \) 속도로 분리하고 \( 225 \mathrm{~nm} \) 파장에서 분리한 물질을 검출하였다.</p>