예방접종은 감염 균 퇴치의 중요한 방법으로, 재조합 단백질 기반 백신 사용 증가로 면역보조제의 필요성이 커지고 있다. 알루미늄염 기반 면역보조제가 많이 사용되며, 이들 보조제는 주로 세균 파생 물질이 사용되며 그 중 Gram (-) 세균의 세포벽 구성물은 항원에 대한 면역 반응을 강화한다. AYS의 용혈성은 Muller와 Bock의 방법에 따라, 그리고 hPBMC의 반응은 Ciapetti 등의 MTT법에 따라 측정되었다.
<p>예방접종(vaccination)은 감염 균을 퇴치하는 가장 효과적인 방법 중에 하나다. 최근 재조합 단백질을 항원으로 한 백신의 사용이 증가함에 따라 안전하고 효과적인 면역보조제의 필요성이 증대되고 있으나, 지난 10 년간 면역보조제에 관한 활발한 연구가 이루어졌음에도 불구하고 여전히 알루미늄염을 기초로 한 면역보조제에 상당 부분을 의지하고 있다. 알루미늄염은 주로 \( \mathrm{Al}(\mathrm{OH})_{3} \) 또는 \( \mathrm{AlPO}_{4} \) 형태로 사용되는데 일반적으로 단백질 항원을 흡착하여 천천히 방출함으로서 면역증강효과를 나타내는 것으로 생각되었다. 또한 최근에 알루미늄염이 수지상세포(dendritic cell)를 활성화시키고 interleukin(IL)-1와 IL-18과 같은 사이토카인분비를 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 한편 알루미늄염은 여러 백신에 널리 사용되고 있어 매우 안전한 것으로 생각되고 있지만 알러지 반응을 유발하고 신경독성도 있는 것으로 추정되고 있으며, 또한 항체가 매개된 체액성 면역반응은 강하게 유도하나 세포성 면역반응은 거의 유도하지 못한다는 단점이 있다. 따라서 현재 유럽 및 미국에서 승인을 받아 백신에 사용되고 있는 면역보조제로는 MF59, AS03, AS04 등이 개발되어 있다.</p> <p>일반적으로 뛰어난 면역자극 능력으로 세균에서 파생된 물질들이 보조제의 주요한 역할을 한다고 알려져 있으며, 특히 Gram (-) 세균의 세포벽 펩티드글리칸 또는 지질다당류는 그들 자신이 면역성은 강하지 않지만 공동 조절되는 항원에 대한 면역 반응을 강화시킨다. 이점에 착안하여 일종의 세균성 proteoglycan (anti-yeast substance; AYS)은 Gram(-)균인 Rhanella aquatilis AY2000 균이 생산하는 고분자 물질로서 1) 정상세포에 대한 독성시험과 또한 2) in vitro에서 인체 PBMC (human peripheral blood mononuclear cells; hPBMC)에 대한 자극과 관련된 반응 및 3) in vivo에서 소의 혈청단백질(bovine serum albumin; BSA)에 대한 항체생산에 대한 AYS의 증강효과를 검토하였다.</p> <p>우선 세포독성시험의 일환으로 인체 적혈구 세포(human red blood cell; hRBC)에 대한 AYS의 용혈성 시험을 Muller와 Bock가 기술한 방법에 따라 행하였다. 즉, 건강한 지원자의 혈액 \( (3 \mathrm{ml}) \)을 취하고 미리 항응고제 \( \left(\mathrm{Na}_{2}\right. \) - EDTA ; \( 3 \mathrm{mg}) \)가 함유된 멸균 tube에 넣고 상온에서 잘 혼합하여 원심분리 \( (1000 \mathrm{~g}, 5 \mathrm{~min}) \)를 행하였다. 그 후 혈장이 함유된 상층액은 제거하고, 적혈구가 함유된 침전물에 saline 함유 인산완충액(PBS: \( 3 \mathrm{ml}) \)을 넣은 후 원심분리하여 적혈구를 3회 세척시켜서 사용하였다. 먼저 96-well microplate의 각 well에 PBS \( (100 \mu \mathrm{l}) \)를 넣은 후 알맞게 희석된 시료 AYS (\(100 \mu \mathrm{l}) \)를 첫 번째 well에 주입하고, 잘 혼합한 후 혼합액 \( (100 \mu \mathrm{l}) \)을 취하여 PBS \( (100 \mu \mathrm{l}) \)가 함유된 각 well에 주입하여 단계별로 희석 \( (500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)부터 2배씩 단계희석)하였다. 단계별로 희석된 각 well에 PBS (\(100 \mu \mathrm{l}) \)를 더 첨가한 후 상기에서 기술한 바와 같이 조제한 RBC (\(20 \mu \mathrm{l}) \)를 첨가하여 반응 \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}, 24 \mathrm{~h}\right) \)시키고, 96-well microplate를 원심분리(상온, \( 750 \mathrm{~g}, 3 \mathrm{~min} \) )한 후 상층액 \( (100 \mu \mathrm{l}) \)을 취하여 \( \mathrm{EtOH} / \mathrm{HCl} \) (39/1) 혼합액 \( (2 \mathrm{ml}) \)을 가하여 잘 섞은 후에 흡광도 \( (398 \mathrm{~nm}) \)를 측정하였다. 이때 RBC에 대한 hemolysis의 백분율을 산출하기 위해 양성 대조군(Hemolysis \(0\%\))은 RBC (\(20 \mu \mathrm{l}) \)에 PBS \( (200 \mu \mathrm{l}) \)를 혼합하고, 음성 대조군(Hemolysis \( 100 \%) \)은 RBC (20 \mu \mathrm{l}) \)에 증류수 \( (200 \mu \mathrm{l}) \)를 혼합하여 시료와 동일한 방법으로 측정한 결과를 기준으로 산출하였다. 모든 실험은 2반복으로 행한 후 평균값으로 산출하였다. 그 결과 AYS를 \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도까지 처리하여도 hRBC는 전혀 용혈되지 않았다.</p> <p>또한 AYS에 대한 hPBMC의 반응은 Ciapetti 등이 기술한 MTT법으로 측정하였다. 즉, 먼저 건강한 지원자의 정맥에서 혈액을 채혈하고, 미리 heparin으로 처리된 Acuspin tube에 옮긴 후 Ficoll-Hisopaque (Sigma)를 이용하여 hPBMC를 분리하였다. 이와는 별도로 AYS \( (20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)를 제조하고, 제조된 AYS는 96-well microplate의 첫 번째 well \( (100 \mu \mathrm{l}) \)에 넣고 RPMI 1640 배지로 2배씩 단계별로 희석하였다. 그 후 각 well에 분리한 hPBMC \( \left(1 \times 10^{5}\right. \) cells/well \( ) \)를 넣고, \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양 \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}, 3-7\right. \) days)하면서 현미경으로 배양된 세포를 관찰(Magnification; 100)하였다. 이때 AYS의 hPBMC에 대한 응집활성은 hPBMC의 응집이 관찰되는 가장 낮은 AYS의 농도로 나타내었고, 대조 군으로 PHA \((10 \mu \mathrm{g}\mathrm{ml} \))가 사용되었다. 또한 hPBMC의 증식(proliferation)은 일정 시간 배양시킨 후 MTT 법으로 세포 량을 측정하고, 다음식에 의해 Stimulating Index \( \mathrm{SI}\)로 나타내었다.</p> <p>\( \mathrm{SI}=\left(\mathrm{A}_{540}\right. \) of PBMC stimulated \( ) /\left(\mathrm{A}_{540}\right. \) of PBMC unstimulated \( ) \)</p>