본 실험에서는 초기 단계의 줄기세포를 얻기 위해 배배체의 속세포덩이를 분리한 후 6일 동안 배양하면서 배자체 형성과정을 관찰하였습니다. 그러나 각 세포의 독립적인 분화 능력을 유지하기 위해 후속으로 다시 분리하여 개별적으로 배양하였습니다. 이식 후 분화세포의 조직화에 영향을 주는 TGF 반응은 이식 초기에는 미약한 반응을 보였으나, 분화가 활발한 이식 후 40일에는 뚜렷한 TGF 반응이 증가하였습니다. 그러나 이 반응은 80일까지 지속되지는 않았습니다. 분화 중인 줄기세포의 세포막 표면에는 TGF에 대한 수용체가 존재하며, 이 수용체의 발현은 분화 및 증식하는 다른 세포들의 상호작용에 의해 증가됩니다. 이러한 세포 간 상호작용으로 인해 TGF 면역반응이 증가하는 것으로 생각되며 이식 후, 비교석인 이식 초기인 20일과 30일 그룹에서는 EGF에 대한 양성반응을 보이는 세포들이 많이 나타났으며, 40일째에는 양성반응 세포의 수가 감소하여 80일째에는 대부분의 세포에서는 EGF 반응이 나타나지 않았습니다.
<h1>고 찰</h1> <p>배자줄기세포는 포배의 속세포덩이로부터 분리하며 체외에서 계대배양이 가능하고 거의 모든 종류의 조직과 세포로 분화하는 다능성(pluripotency)을 지니고 있다. 이미 여러 동물에서 배자줄기세포를 활용한 다양한 업적이 보고되고 있고 최근에는 사람에 적용하는 문제로 많은 논란이 빚어지고 있다.</p> <p>줄기세포의 초기 배양과정에서 볼 수 있는 배자체의 형성은 줄기세포의 다능성의 좋은 예이며, 지금까지 접근이 어려웠던 초기 발생과정을 체외에서 관찰할 수 있다는 점에서 획기적인 연구재료로 활용되고 있다. 즉, 이들 배자체는 초기 배자와 거의 유사한 구조와 분화능이 있어서 생체 구성의 세배엽 유래의 모든 조직으로 광범위하게 분화할 수 있다. 또한, 시험관 배양에서도 활발한 분화상을 관찰할 수 있다고 한다.</p> <p>본 실험에서는 초기 단계의 줄기세포를 얻고자 포배의 속세포덩이를 분리한 후 6일간 배양하면서 배자체 형성과정을 보였으나 각 세포의 독립적 분화능을 유지하기 위해 다시 분리 배양하였다. 초기 배자세포의 이러한 집단화 현상을 조밀(compaction)이라 하는데, 특히 분화초기의 배자 줄기세포에서 뚜렷하다고 한다. 이와 관련하여 세포막 표면에 있는 TGF를 위한 수용체에서 TGF a6A integrin subunit의 표현에 의해 세포가 뭉쳐진다고 알려져 있다. 그러나, 본 실험에서는 각 줄기세포분화의 다능성이 유지된 상태를 지속시키기 위하여 배자체 형성을 못하게 하는 단백분해 효소인 collagenase를 처리하여 각 세포를 분리 배양하였다. 그 후 실험에 필요한 간세포화의 계통적 분화를 자극하기 위하여 따로 배양한 간세포와 합동배양하였다.</p> <p>이미 분화가 끝난 간세포를 비장내에 이식한 연구에서 간을 부분 절제한 후 \( { }^{3} \mathrm{H} \) - thymidine을 병합시킨 간세포를 비장내로 이식하였던 바 간세포는 1주일내에 현저히 감소되고 세포증식이 일어나지 않았다고 하였다. 또한, 이식한 간세포의 m-albumin-RNA도 급격히 감소되었다. 즉, 비장내 간세포 이식시 초기에 간세포의 괴사가 일어나 충분한 대사성 유지를 위해서는 효과가 없는 방법이라고 보고하고 있다.</p> <p>배자줄기세포의 이식에 대한 연구에서 이식에 필요한 배자줄기세포와 이식할 수 있는 적합한 부위가 확보되면 이식을 성공적으로 실행하기 위해서는 세포를 분열시켜 증식시키면서 목적하는 계동세포로 분화되어야 한다. 배자줄기세포의 계대성 분화를 억제하는 것은 '세포 증식인자'이며, 계대성 분화를 촉진하는 것을 '세포 분화인자'이다. 세포 증식인자와 분화인자를 단순히 첨가하는 것만으로는 원하는 계대증식이 빠르게 일어나지 않으므로 필요한 여러 자극인자를 첨가하는 것이 필요하다고 알려져 있다.</p> <p>본 실험에서는 간세포로의 분화 자극인자로 줄기세포를 일정 동안 간세포와 합동배양하였으며, 이식 후 분화를 촉진하기 위하여 간부분 절제술을 시행하였다. 실험의 결과에서 관찰된 전자현미경적 소견으로 비장이식 후 20일부터 간세포화된 분화를 확인하였고 30일에는 간세포의 기능을 할 수 있을 정도로 분화되었다. 나아가 40일에는 간세포 집단 사이에 담세관과 같은 관이 형성되었다. 80일에는 세포소기관 중 사립체, 형질내세망의 발달이 현저하였다. 그러나, 그 외 어떤 자극인자를 더 추가하여야 간세포의 분화가 촉진되는지는 여러 가지 신호전달인자를 연구함으로써 차츰 밝혀가야 할 것이다.</p> <p>또한, 본 실험에서 이식한 분화세포의 조식 적응성을 관찰하였던 바 분화중인 이식세포들이 비장 혈관이 있는 육수 주위에 소엽을 형성하며 증식하였으며 이식 후 80일까지 활동적이었다.</p> <p>배아줄기세포의 분화능에 영향을 주는 cytokine 및 기타 수용성 전달물질은 분화억제제인 LIF(leukemia inhibitory factor)가 있으며, TGF도 분화억제 능력이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 미분화된 줄기세포가 표현형을 지속적으로 유지하기 위해서는 세포핵내 전사 활성인자인 STAT3의 임계적인 양이 필수적인 역할을 하는 것으로 보고되어 있다. 그러나, 다분화능을 지닌 세포가 어떻게 분화되어 가는지에 대한 확신은 이식 실험에 의해 생체내의 복잡한 환경에서 연구되어 분화상의 추이를 관찰하여만 분화 조절 인자와 세포 상호작용의 파악에 활용할 수 있다.</p> <p>간세포의 비장이식은 실험적으로 유발시킨 간질환에 일시적인 효과가 있다는 것으로 검증되어 있지만 비장내에서 간세포로 지속적으로 빠른 증식을 촉진하는 방법은 여전히 한계에 부딪혀 있다. 간세포의 빠른 재생을 위하여 간경화를 일으킨 흰쥐의 비장에 이식된 간세포는 간세포 자극물질(hepatic stimulatory substances, HSS)을 투여하여 증식을 유도되었으며, 그 결과 간경화의 정도에 따라 HSS의 자극 효과가 촉진되는 것을 밝혔다. 그러나, 간세포의 빠른 증식을 위해서는 자극하는 여러 인자의 복합적인 세포사이의 상호작용이 관여하기 때문에 본 실험에서는 배양과정에 간세포와 줄기세포의 합동배양을 시행하고, 이식한 흰쥐에는 간부분 절제술을 시행하여 줄기세포의 분화를 유도하였다.</p> <p>본 실험의 합동배양 결과 8일 후에 간세포화 분화가 진행되는 것을 전자현미경 표본에서 확인할 수 있었다. 간부분 절제술 시행 후 비장내에 이식된 배양 줄기세포의 관찰에서도 분화와 증식은 지속되어 소엽성 간세포의 집단 형성 등 기능성 간조직화를 관찰할 수 있었다. 비장내 이식 초기에 간세포화 줄기세포는 빠르게 증식하였으며, 그 후에 세포의 크기가 커지며 혈관이 있는 육주 근처에서 소엽을 형성하였다. 이들 변화는 비장의 배중심에 분화된 세포보다 더욱 미분화된 세포가 들어감으로써 지속적으로 이식된 줄기세포의 증식이 촉진된 것으로 추론할 수 있으며, 이는 TGF 및 EGF 반응의 변화에서 관찰할 수 있었다.</p> <p>이식 후 분화세포의 조직화의 지침이 되는 TGF 반응은 이식 초기에는 미약한 반응을 나타내었으나 분화가 활발한 이식 \( 40 \)일 후에는 뚜렷한 TGF 반응의 증가를 나타내었으며 80일까지 지속되지는 않았다. 이는 분화중인 줄기세포의 세포막 표면에는 TGF를 위한 수용체가 있으나 이의 발현이 증가하기 위해서는 분화, 증식하는 다른 세포가 증가하면서 세포 상호간의 작용으로 TGF 면역반응이 증가한 것으로 생각된다. 그러나, 80일 이후에는 분화된 줄기세포의 조직화가 어느 정도 소강상태를 유지한 때문인 것으로 생각된다.</p> <p>EGF는 개체발생 및 기관형성 시기의 가장 기본적인 활성인자로 분화와 증식의 기준이 될 수 딨다. 이식 후 EGF 반응은 비교석 이식 초기인 20일과 30일군에서 양성반응을 보이는 세포가 다수 출현하였으며 40일째에는 양성반응 세포가 감소하여 80일째는 대부분의 세포에서 반응이 나타나지 않았다. 이는 이식 줄기세포의 분화와 증식이 이식 초기인 20일과 30일군에서 더욱 왕성하여 이 시기에 활성이 증가되었으나 40일 이후 간세포로의 분화가 안정기에 접어들며 활성이 감소한 것으로 추론할 수 있겠다.</p> <p>이상의 실험 결과는 윤리상 인간 생체에서 다룰 수 없는 여러 발생학적인 연구에 응용될 수 있으며 이런 연구를 바탕으로 형질변환기법과 접목하여 최근 주목받고 있는 난치병의 세포이식 치료 등에도 적용할 수 있는 기초를 마련하게 될 것이다.</p> <p>본 실험에서 배자줄기세포 등 간세포와 함께 배지에 합동배양하여 간세포로 분화할 수 있는 능력을 확인함에 따라 다른 세포의 이식시에도 같은 방법을 적용하여 줄기세포를 목적하는 세포로 분화 유도시킨 후 세포이식 치료에 활용할 수 있으리라는 기대를 갖게 되었다. 특히 배자줄기세포는 무한 증식이 가능하기 때문에 특정 세포로의 분화법을 개발하면 그 세포의 결핍으로 인해 초래되는 질환의 이식을 위한 세포 공급의 문제점이 해결될 수 있게 된다. 이러한 활용을 위하여 배자줄기세포의 발생, 분화과정에 있어서의 분자조절, 세포 특이성의 진행, 신호전달의 유도 등에 대한 연구가 앞으로 활발히 이루어져야 할 것이다.</p>