BLAST 프로그램을 이용하여 GenBank database를 비교 분석한 결과, RIA1 유래 indole oxygenase와 상동성을 갖는 단백질을 탐색하였고, 그 결과, uncultured bacterium JEC54의 indole oxygenase(AAY54299)와 가장 높은 상동성이 나타났고, Rhodocnccus opacus B4(YP_002782537), Renibacterium salmoninarum ATCC 33209(YP_001623775) 유래 putative oxidoreductaes와도 높은 상동성이 관찰되었으므로 Rhodococcus RHA1 유래의 indole oxygenase의 65번째 V를 다시 A또는 다른 아미노산으로의 변이 및 효소활성 확인실험을 통해서 그 아미노산의 기능적인 역할을 재확인을 하여야 할 것으로 생각된다.
<h2>단백질 상동성 분석</h2> <p>Rhodococcus sp. RIA1 유래의 indole oxygenase와 상동성을 갖는 단백질을 탐색하기 위해 BLAST 프로그램을 이용하여 GenBank database를 비교 분석한 결과, 실험적으로 확인된 uncultured bacterium JEC54의 indole oxygenase(AAY54299)와 가장 높은 상동성을 나타내었다( \( 44 \% \) identity 및 \( 64 \% \) similarity). 그 외에 실험적으로 미확인된 Rhodocnccus opacus B4(YP_002782537, \( 45 \% \) identity, \( 62 \% \) similarity), Renibacterium salmoninarum ATCC 33209(YP_001623775, \( 44 \% \) identity, \( 60 \% \) similarity) 유래의 putative oxidoreductase 및 Streptomyces ghanaensis ATCC 14672(ZP_04691100, \( 34 \% \) identity, \( 54 \% \) similarity), Saccharopolyspora erythraea NRRL 2338(YP_001105703, \( 32 \% \) identity, \( 53 \% \) similarity), Streptosporangium roseum DSM 43021(ZP_04475636, \( 33 \% \) identity, \( 51 \% \) similarity) 유래의 acyl-CoA dehydrogenase와 높은 상동성을 보여주었다. 그러나, 실험적으로 확인된 Methylophaga sp. 유래의 flavin-containing monooxygenase(AF494423), Burkholderia cepacia G4 유래의 toluene ortho-monooxygenase(AF349675), Streptomyces venezuelae 유래의 cytochrome P450 monooxy-genase(AAC68886), Pseudomonas putida 유래의 naphthalene dioxygenase(NP_863072) 등과는 상동성이 매우 낮은 것으로 확인이 되었다. 한편, 본 연구에 사용된 Rhodococcus와 같은 genus에 속하는 실험적으로 중명된 또는 추정되는 indole oxygenase로는 Rhodococcus sp. strain T104(AY575969), R. opacus(CAA06672) 및 Rhodococcus strain ATCC 21145(M55641) 유래의 효소가 알려져 있는데, 이들과의 identity/similarity는 비교적 낮았다(각각, \( 30 \% / 48 \%, 29 \% / 49 \%, 25 \% / 47 \% \)). Fig. 4는 본 실험의 indole oxygenase와 uncultured bacterium JEC54, Rhodococcus sp. strain T104, R. opacus 및 Rhodococcus strain ATCC 21145 유래의 indole oxygenases와의 상동성을 비교하여 정렬하였다. FAD-dependent monooxygenase의 특징적인 서열인 FAD binding domain(GXGXXG), NADPH binding domain(GXGXX(A/G)), 그리고 FMO-identifying sequence motif(FXGXXXHXXX(Y/F))은 확인되지 않았으며, P450 monooxygenase와 상동성이 있는 conserved region도 보이지 않았다. 특이적인 것은 Rhodococcus sp. strain T104 유래의 ipoA를 이용하여 기능적으로 중요한 아미노산을 확인한 실험에 의하면, 58번째 아미노산인 alanine, 59번째 proline, 251번째 glycine의 변이에 의해서 효소의 기능을 잃는 변이를 얻었으며, 특히 59번 P 및 251번 G가 기능적으로 매우 중요하며, 또한 58번의 A가 V, D, F, I, K, N, P, R, W, Y으로의 변이에 의해서 효소의 indigo 생성기능이 소실되며, A를 S, G, M, C, H, L, E, Q, T로의 변이에 의해서는 indigo 생성활성이 변화되는 것으로 보고를 하였다. 본 연구의 효소의 경우, 이에 상응하는 아미노산 서열 중에서 66번 위치의 P, 255번 G는 잘 보존되어 있지만, 58번 A에 해당하는 위치인 65번에 위에서 언급된 효소의 활성을 상실하는 V가 존재하며, 또 다른 indole oxygenase 활성을 갖는 uncultured bacterium JEC54에서도 V가 존재하고 있는다. 한편 R. opacus 및 Rhodococcus strain ATCC 21145의 경우 각각 indigo 생성활성이 약간 저하되는 L 및 T가 존재한다. 이는 효소원에 따라 \( \mathrm { A } \rightarrow \mathrm { V } \) 변이가 효소의 기능에 크게 영향을 나타내는 경우와 그렇지 않은 경우가 존재하는 것으로 생각된다. 따라서, 본 연구자가 확인한 Rhodococcus. sp. RHA1 유래의 indole oxygenase의 65번째 V를 다시 A또는 다른 아미노산으로의 변이 및 효소활성 확인실험을 통해서 그 아미노산의 기능적인 역할을 재확인을 하여야 할 것으로 생각된다.</p>