간장획분을 분획하고 Lowry 등의 방법으로 단백질 함량을 측정하고 deoxyribose의 파괴정도로 hydroxyl radical 생성정도를 측정한 뒤 thio-barbituric acid와 반응하여 발색되는 aldehyde를 산성용액에서 측정하여 간장조직의 분획과 활성산소의 생성량을 측정하여 산화적 스트레스를 분석했다.
<h2>간장조직의 분획</h2> <p>간장의 분획은 Laganiere 등에 따라 HEPES완충용액 (10 \mathrm { mM } HEPES, \( 10 \mathrm { mM } KCl, 280 \mathrm { mM } \) sucrose, \( \mathrm { pH } \) 7.4)을 사용하여 mitochondria, microsome 및 cytosol획분으로 분획하여 사용하였다. 이들 획분의 단백질의 함량은 Lowry 등의 방법에 따라 측정하였다.</p> <h2>활성산소의 생성량 측정</h2> <p>히드록시 라디칼 \( ( \cdot OH) \) 의 함량은 deoxyribose의 파괴정도로서 hydroxyl radical 생성정도를 측정하는 방법으로서,간장획분의 산소대사산물에 의해 deoxyribose가 파괴되어 aldehyde가 생성되며, 이 aldehyde는 산성용액에서 thio-barbituric acid와 반응하여 발색되는 것을 이용한 Halli-well 및 Gultterdge의 방법에 따라 측정하였다. 간장획분중의 수퍼옥시드 라디칼(superoxide radical: \( { O } _ { 2 } \) )의 생성량은 McCord 및 Flundovch의 낭법과 Chan 및 Bielski의 방법에 따라 superoxide dismutase를 억제할 수 있는ferricytochrome C의 환원속도를 측정하였다. \( 0.1 \mathrm { mM } \) EDTA를 함유한 인산완충용액( \( ( \mathrm { pH } 7.8) 420 \mu \ell \) 에 cyanide의 농도가 \( 50 \mu \mathrm { M } \) 이 되도록 \( 20 \mathrm { mM } \) cyanide 용액을 가한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분간 가온하였다. 이 용액에 cytosol \( 300 \mu \ell 1 \) 와 \( 0.1 \) \( \mathrm { mM } \) cytochrome C \( 50 \mu \ell \) 를 넣어 분광광도계를 사용 \( 550 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 시간에 따라 측정하였다. 이 때 cytochrome C의 양은 분자흡광계수 \( 19,500 \mathrm { M } ^ { -1 } \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \) 로 계산하였다.</p> <h2>산화적 스트레스의 분석</h2> <p>간장획분중의 과산화지질의 함량은 Chol 등이 사용한 방법에 따라 분광광도계를 사용하여 TBA법으로 말론디알데히드(alondialdehyde : MDA)의 합량을 측정하여 과산화지질(lipid peroxide: LPO)의 함량을 측정하였다. 간장획분으로서 mitochondria와 microsome의 산화된 단백질의 함량은 Levine 등의 방법에 따라 carbonyl group의 생성량 을 측정하였다. \( 0.1 \mathrm { ml } \) 의 시료에 \(30 \% \) TCA (trichloroacetic acid)를 \( 0.5 \mathrm { ml } \) 혼합, \( 3,000 \mathrm { rpm } \) 에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거한 뒤 잔사에 \( 10 \mathrm { mM } \) DNPH (dinitrophenyl hydrazine) \( 0.5 \mathrm { ml } \) 첨가, 15분마다 흔합하며 11시간 동안 실 온에 방치 후 \( 3000 \mathrm { rpm } \) 에서 110분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 잔사에 ethanol/ethyl acetate (v/v 1:1) \( 3.0 \mathrm { ml } \) 를 첨가하여 실온에서 110분 방치한다. 다시 \( 3,000 \mathrm { rpm } \) 에서 10분간 원심분리 후 잔사을 얻은 뒤, \( 6 \mathrm { M } \) guanidine(20 \( \mathrm { mM } \) potassium phosphate buffer, \( \mathrm { pH } \) 2.3) \( 1.0 \mathrm { ml } \) 첨가·혼 합하여 \( 37 \mathrm { C } \) 의 항온 수조에서 15분간 가온한 후, 3,500 \( \mathrm { rpm } \) 에서 10분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 이때 carbonyl group의 양은 \( 360 \mathrm { ~nm } \) 와 \( 370 \mathrm { ~nm } \) 사이에 있는 흡광도의 파장에서 분자흡광계수 \( (E = 22,000) \) 를 이용하여 계산하였다.</p>