분별침전은 생리활성물질인 (+)-dihydromyricetin을 효율적으로 정제할 수 있는 매우 간편한 방법으로, 용해도 차이를 이용하여 높은 순도의 (+)-dihydromyricetin을 고수율로 얻을 수 있는 정제공정의 대표적인 방법이다.그러나간 이것이 간단하고 효율적으로 정제할 수 있는 방법이기는 하지만 분별침전에 많은 시간(24-32시간)이 소요되어 (+)-dihydromyricetin의 대량생산에 어려움이 따른다.그래서 이러한 분별침전에 소요되는 긴 침전시간이라는 단점을 개선하기 위해 반응기 내부의 반응액 부피당 표면적이 증가된 분별침전공정을 도입하고자 한다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>(+)-Dihydromyricetin 분별침전공정</h2> <p>분별침전은 생리활성물질인 (+)-dihydromyricetin을 효율적으로 정제할 수 있는 매우 간편한 방법으로, 용해도 차이를 이용하여 높은 순도의 (+)-dihydromyricetin을 고수율로 얻을 수 있는 대표적인 정제공정이다. 기존 문헌보고에 따르면 (+)-dihydromyricetin 분별침전을 위한 최적 조건으로 아세톤/증류수 비, 초기 (+)-dihydromyricetin 농도, 보관 온도, \( \mathrm{pH} \)는 각각 \( 1 / 5(\mathrm{v} / \mathrm{v}), 0.1 \mathrm{~g} / \mathrm{ml}, 4^{\circ} \mathrm{C}, 9.0 \)이었다. 주어진 최적의 분별침전 조건으로 실험을 수행하여 분별침전동안 침전물을 여과, 건조 뒤 HPLC 분석을 수행한 결과, Fig. 3에서 보는 바와 같이 분별침전 24 시간까지 수율( \( 70 \%) \)은 급격히 증가하다 24시간 이후 거의 변화가 없었다. 반면 분별침전 동안 순도(80-85\%) 변화는 미미함을 알 수 있었다. 이러한 경향은 기존에 보고된 연구결과[13]와 유사하였으며, 분별침전에 많은 시간(24-32시간)이 소요됨을 확인할 수 있었다.</p> <h2>반응액 부피당 표면적(S/V) 증가의 영향</h2> <p>분별침전은 간단하고 효율적으로 정제할 수 있는 방법이기는 하지만 분별침전에 많은 시간(24-32시간)이 소요되어 (+)-dihydromyricetin의 대량생산에 어려움이 따른다. 이러한 분별침전에 소요되는 긴 침전시간 문제를 개선하기 위하여, 반응기 내부의 반응액 부피당 표면적이 증가된 분별침전공정을 도입하고자 하였다. 분별침전공정에서 (+)-dihydromyricetin이 침전되는 양상을 살펴 본 결과, 반응기 바닥과 벽에 얇게 침전되어 존재하는 것을 알 수 있었다. 실제 대부분의 결정화는 외부표면(외부 불순물 입자, 반응기벽, 교반장치 표면 등)의 도움을 받아 핵이 생성된다. 이러한 사실을 토대로 침전공정에서 반응기 내부의 반응액 부피당 표면적(S/V)을 증가시켜 (+)-dihydromyricetin이 침전할 수 있는 공간을 증가시켜 줌으로써 침전효율을 향상시키고자 하였다. 기존 문헌의 분별침전을 위한 최적 조건을 토대로 아세톤/증류수 비, 보관온도, 초기 (+)-dihydromyricetin 농도, \( \mathrm{pH} \) 는 각각 \( 1 / 5(\mathrm{v} / \mathrm{v}), 4^{\circ} \mathrm{C}, 0.1 \mathrm{~g} / \mathrm{ml}, 9.0 \) 로 고정하고, 반응기 내부의 반응액 부피당 표면적 \( \left(\mathrm{S} / \mathrm{V}: 0.428 \mathrm{~mm}^{-1}\right) \) 증가를 위해 양이온교환수지와 음이온교환수지를 각각 첨가하여 분별침전을 수행하였다. Fig. 4에서 보는 바와 같이 침전시간이 경과함에 따라 (+)-dihydromyricetin 수율도 증가하였다. 반응기 내부 표면적을 증가시키지 않은 경우에 침전 24시간 경과 후 수율은 \( 70.0 \% \) 정도인 반면 표면적 증가를 위해 양이온교환수지 중 강산성수지인 Amberlite IR \( 120 \mathrm{H} \) 를 첨가한 경우 \( 83.0 \% \), Amberlite IR \( 120 \mathrm{Na} \) 를 첨가한 경우 \( 89.3 \% \), Amberlite 200 을 첨가한 경우 \( 90.9 \% \), 양이온교환수지 중 약산성수지인 Amberlite IRC 50을 첨가한 경우 \( 75.0 \% \)로 각각 나타났다. 표면적 증가에 의해 침전 효율이 매우 향상됨을 알 수 있었다. 특히 Amberlite 200 의 경우 침전 16시간에 높은 수율 \( (>90 \%) \)을 나타내어 상대적으로 짧은 침전시간에 높은 수율로 (+)-dihydromyricetin을 얻을 수 있었다. 이러한 결과는 표면적증가물질과 (+)-dihydromyricetin 간의 친화력 차이 때문으로 판단된다. 반면 표면적 증가를 위한 음이온교환수지인 Amberlite IRA \( 400 \mathrm{OH} \)와 Amberlite IRA \( 400 \mathrm{Cl} \)의 경우에는 적은 양의 침전물이 형성되었으나 수율이 매우 낮았으며 Amberlite IRA 910, Amberlite IRA 96, Amberlite IRA 67의 경우에는 침전물이 전혀 형성되지 않았다. 순도는 Fig. 5에서 보는 바와 같이 침전시간이 경과할수록 소폭 증가 하였으며, 침전 24시간에서의 순도는 반응기 내부 표면적을 증가시키지 않은 경우 \( 80.0 \% \), 표면적증가를 위해 양이온교환수지 중 강산성수지인 Amberlite IR \( 120 \mathrm{H} \)를 첨가한 경우 \( 89.5 \% \), Amberlite IR \( 120 \mathrm{Na} \)를 첨가한 경우 \( 90.0 \% \), Amberlite 200을 첨가한 경우 \( 90.2 \% \), 양이온교환수지 중 약산성수지인 Amberlite IRC 50을 첨가한 경우 \( 89.6 \% \)로 각각 나타났다. 분별침전 24시간에서 표면적증가물질로 양이온교환수지인 Amberlite 200을 첨가한 경우 가장 높은 순도 \( (90.2 \%) \)와 수율(90.9\%)를 얻을 수 있었다.</p> <p>음이온교환수지의 경우 표면적증가물질 첨가에 의한 반응액 부피당 표면적(S/V) 증가에도 불구하고 침전물이 형성되지 않는 이유를 조사하였다. 음이온교환수지에 (+)-dihydromyricetin이 흡착되었을 가능성을 확인하기 위하여, 분별침전 24시간 경과 후 상등액(supernatant)에서의 (+)-dihydromyricetin 함량을 분석하였다. Table 1에서 보는 바와 같이 침전물이 미량 형성되었던 Amberlite IRA \( 4000 \mathrm{H} \)와 Amberlite IRA \( 400 \mathrm{Cl} \)의 경우 상등액에서의 (+)-dihydromyricetin 함량은 각각 \( 31.3 \% \) 와 \( 33.2 \% \)이었다. 반면 전혀 침전물이 형성되지 않았던 Amberlite IRA 910, Amberlite IRA 96, Amberlite IRA 67의 경우 상등액에서의 (+)-dihydromyricetin 함량은 각각 \( 17.2 \%, 17.5 \%, 19.7 \% \)이었으며 침전물이 미량생성된 Amberlite IRA \( 400 \mathrm{OH} \) 와 Amberlite IRA \( 400 \mathrm{Cl} \)보다 상등액에서의 (+)-dihydromyricetin 함량이 현저히 낮음을 확인할 수 있었다. 즉, 음이온교환수지 중 Amberlite IRA 910, Amberlite IRA 96, Amberlite IRA 67의 경우 Amberlite IRA \( 400 \mathrm{OH} \)와 Amberlite IRA \( 400 \mathrm{Cl} \)보다 더 많이 이온교환 수지에 흡착됨을 알 수 있었다. 이러한 결과로부터 표면적증 가물질로 음이온교환수지를 사용한 분별침전의 경우, 침전물이 원활하게 형성되지 않는 이유는 이온교환수지에 대부분의 (+)-dihydromyricetin이 흡착되기 때문으로 판단된다.</p>