대수기의 C. albicans ATCC 18804를 배양액으로 생존률을 측정 후 S. baicalensis에 의한 세포주기 변화를 확인했으며 모든 실험은 2회에서 3회 반복 진행하였다. 통계분석은 t-test, Paired t-test로 SigmaPlot 10.0을 이용해 분석했다.
<h2>생존률의 분석</h2> <p>대수기의 C. albicans ATCC 18804 를 YNB/Glc에 최종 농도 \( 2 \times 10^{7} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 로 희석하였다. MIC의 S. baicalensis를 처리한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 200 \mathrm{rpm} \) 으로 4시간 동안 진탕 배양하였다. \( 1 \mathrm{ml} \)의 배양액을 \( 5,000 \mathrm{~g} \) 로 1분간 원심분리하여 Candida를 회수한 후 phosphate-buffered saline (PBS)로 혱구었다. Muse \( { }^{\mathrm{TM}} \) Count and Viability kit (Merck Millipore, Germany)를 제조사의 방법에 따라 처리한 후 Muse \( { }^{\mathrm{TM}} \) Cell Analyzer를 사용하여 생존률을 측정하였다. 음성 대조군을 약 \( 95 \% \)의 생존률으로 조정한 후 S. baicalensis 의 효과를 분석하였다.</p> <h2>Time-kill curves</h2> <p>대수기의 C. albicans ATCC 18804 배양액을 YM 배지에 \( 2 \times 10^{4} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 로 희석한 후 음성 대조군을 포함하여 MIC의 S. baicalensis 를 넣은 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rpm} \)으로 진탕 배양하였다. 정해진 시간마다 \( 100 \mu \mathrm{l} \)의 배양액을 새로운 튜브에 옮긴 후 20초 이상 교반하여 출아 직후의 결합된 효모를 분리하였다. 증류수로 적당하게 희석하고 희석액 \( 100 \mu 1 \)를 YM agar plate에 도말하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 배양한 후 집락의 갯수를 기록하였다. 결과에 나타난 집락의 수는 quadruplicate로 관찰된 3회의 실험 중 하나를 나타낸다.</p> <h2>S. baicalensis에 의한 세포주기 변화</h2> <p>대수기의 C. albicans ATCC 18804 배양액 \( \left(1 \times 10^{8} \mathrm{CFU}\right. \)\( / \mathrm{ml}) \)에 S. baicalensis 를 처리한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 200 \mathrm{rpm} \)으로 진탕 배양하였다. 1, 2 ,3시간 후 각각 \( 1 \mathrm{ml} \)의 배양액을 \( 5,000 \mathrm{~g} \) 로 1분간 원심 분리하여 세포를 회수한 후 PBS로 혱구었다. \( 1 \mathrm{ml} \)의 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) ethanol/PBS (7:3)를 넣고 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분 이상 고정하여 세포막을 permeabilization시켰다. \( 0.5 \mathrm{ml} \)의 PBS로 혱군 후 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 의 PBS를 넣고 최종 농도 \( 200 \mu \mathrm{g} / \)\( \mathrm{ml} \) RNase A (Sigma, USA)를 넣었다. \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시킨 후, DNA 염색을 위해 \( 50 \mu \mathrm{g} \)의 propidium iodide 를 넣고 30분간 어두운 곳에 놓아둔 후 Muse\( { }^{\mathrm{TM}} \) Cell Analyzer로 분석하였다.</p> <h2>통계분서</h2> <p>모든 실험은 2 또는 3회 반복하였으며 통계분석은 t-test로, 두 그릅간의 차이는 Paired t-test로 SigmaPlot 10.0을 이용하여 분석하였다. \( p \) 값이 \( 0.05 \) 미만일 때 통계적으로 유의한 것으로 보았다.</p>