쥐의 각막 상피세포는 선행 연구를 일부 수정한 방법을 사용하여 외과적 절제로 분리한 후, 위상차현미경하에서 각막이식편에서 각막 상피를 분리하였고 pan-cytokeratin (CK) 항체를 이용한 면역 형광 염색을 실시하여 분리된 세포가 각막 상피세포임을 확인하였으며, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \(95\% \) 및 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 \( 25 \mathrm{mg} \) 소 뇌하수체 추출물과 \( 2.5 \mu \mathrm{g} \) 인간 재조합 표피성장인자를 함유한 각질세포 무혈청 배지를 이용하여 배양하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>쥐의 각막 상피세포 분리 및 배양</h2> <p>본 연구에서 사용한 6 주령의 Sprague-Dawley 암컷 쥐는 Samtako Bio Korea (Osan, Republic of Korea)에서 구입하여 1 주일 동안 사육장에서 적응시켰다. 쥐의 각막 상피세포는 선행 연구를 일부 수정한 방법을 사용하여 외과적 절제 후 분리하였으며, 이는 안과 및 시력 연구를 위한 동물사용지침에 따라 동의대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 수행하였다(승인번호 R2019-005). 이를 위하여 쥐의 눈에서 각막이식편(corneal buttons)을 절단하여 제거한 후, 상피가 위로 향하게 하여 6 well plate에 평평하게 도말하였다. 이식편을 plate에 부착하기 위해 \( 1.2 \mathrm{U} \) dis-pase \( { }^{\circledR} \) II (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 가 함유된 \( \mathrm{Mg}^{2+} \) 및 \( \mathrm{Ca}^{2+} \) 가 없는 Hank's Balanced Salt Solu-tion (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 첨가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분 동안 배양하였다. 각막 상피(corneal epithelium)는 위상차현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Ger-many) 하에서 각막이식편에서 분리하였고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \(95 \% \) 및 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 \( 25 \mathrm{mg} \) 소 뇌하수체 추출물(bovine pituitary extract)과 \( 2.5 \mu \mathrm{g} \) 인간 재조합 표피성장인자 (human recombinant epidermal growth factor)를 함유한 각질세포 무혈청 배지(keratocyte serum-free medium, KSFM; Invitrogen-Gibco)을 이용하여 배양하였다. 배지는 2일마다 교체하였으며, 약 10 일 후, 이식편을 새 plate로 옮겼다.</p> <p>쥐 각막 상피세포는 sub-confluence에 도달한 후 \( 1: 3 \) 의 분할 비율로 TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 계대 배양하였다. 이들 세포를 KSFM 및 \( 10 \% \) fetal bovine serum (Thermo Fisher Scientific)이 함유된 Dulbec-co's Modified Eagle's Medium/F12 (Thermo Fisher Scientific) 가 \( 1: 1 \) 비율로 혼합된 배지에서 배양하였으며, 5 번째와 10 번째 계대 사이의 세포를 모든 실험에 사용되었다.</p> <h2>면역 형광 분석</h2> <p>분리된 세포가 각막 상피세포임을 확인하기 위하여 pan-cytokeratin (CK) 항체를 이용하여 면역 형광 염색을 실시하였다. \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 처리에 따른 세포 내 ROS 수준을 조사하기 위해서는 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA; Thermo Fisher Scientific)를 이용하였으며, 미토 콘드리아 활성 변화를 측정하기 위해 MitoTracker \( { }^{\circledR} \) operatorname{Red} 염색 법(Thermo Fisher Scientific)을 적용하였다. 또한 mi-tochondrial membrane potential (MMP)을 조사하기 위해서 는 \( 5,5^{\prime}, 6,6^{\prime} \)-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide (JC-1, Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다. 각 제조사의 지침에 준하여 염색이 끝난 세포들은 4',6'-dia-midino-2-phenylindole (DAPI; Sigma-Aldrich Chemical Co.) 을 사용하여 핵을 대조 염색하고 phosphate buffer saline (PBS)로 2회 세척한 후 형광현미경(Carl Zeiss) 하에서 관찰하였다.</p>