R. glutinis EH 유전자의 고효율 발현을 위해 codon usage를 고려하는 것은 상업적인 면에서 중요하다. 특히, E. coli에서는 Arginine의 경우 rare codon인 AGG, CGA가 상당 부분 사용되고 있고, EH gene에서도 arginine 14개 중 3개가 이런 rare codon으로 이루어져 있어, \(21.4 \% \)가 rare codon으로 사용되고 있다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>R. glutinis EH의 codon usage 선호도 분석 및 숙주세포 선택</h2> <p>기존 문헌에 따르면, R. glutinis EH 유전자를 클로닝하여 E. coli를 숙주세포로 사용하여 얻은 유전자 재조합 E. coli 경우, 단백질 발현정도 및 그 EH 활성이 높지 않았다. 일반적으로 고효율로 발현된 유전자 재조합 미생물의 경우, wild type 균주보다 촉매능이 우수하며, 효소를 분리 정제하여 사용하지 않아도 생촉매로써의 가능성이 높기 때문에 상업 적 가치가 매우 높다. 따라서 고효율 유전자 재조합 E. coli 생촉매를 개발하고자 할 때 codon usage를 고려하여 R. glutinis EH 유전자를 고효율로 발현시키는 것은 상업적 측면에 서 중요한 일이다.</p> <p>E. coli에서 주로 사용되지 않는 codon을 살펴보면, 주로 arginine, glycine, leucine 등의 codon 중에서 주로 rare codon들이 존재함이 알려져 있다. E. coli의 지수성장기에서 높게 발현되는 195종의 단백질 유전자들을 중심으로 codon usage를 살펴보면 arginine을 coding하는 여섯 개의 codon 중에서 AGG ( \(0.3 \% \)), AGA( \(0.6 \% \)), CGG( \(0.8 \% \)), CGA( \(1.1 \% \)) 가 rare codon이며, glycin은 GGA( \(2.0 \% \)), isoleucine은 AUA( \(0.6 \% \)), leucine은 CUA( \(0.8 \% \)), proline은 CCC( \(1.6 \% \)) 등이 rare codon이다. R. glutinis EH 유전자가 위에 제시되어 있는 E.coli rare codon을 사용하는 빈도가 높다면, codon usage 차이에 따라 번역이 제대로 이뤄지지 않아서 발현 효율이 저하될 수 있으므로 R. glutinis EH 유전자에 대한 codon을 조사해 보았다(Table 1). Arginine의 경우 E. coli에서 rare codon인 AGG, CGA가 높은 비율로 사용되고 있음을 알 수 있었으며 EH gene에 있는 총 14 개의 arginine 중 rare codon 이 3개가 존재하고 있어 \( 21.4 \% \) 의 높은 비율로 rare codon이 사용되고 있음을 알 수 있었다. Proline의 경우에서도 총 39개 중에서 19개의 rare codon이 있어 \( 48.7 \% \) 의 높은 비율로 존재하고 있었다. 따라서 R. glutinis EH gene에는 E. coli의 rare codon 존재 비율이 다소 높아 고효율로 발현됨이 어려움을 알 수 있었다.</p> <p>고효율 발현을 위하여 R. glutinis EH gene 전체를 E. coli 선호도가 높은 codon으로 변경시키는 것은 시간과 비용이 많이 드는 비효율적인 방법이다. 특정 codon의 usage가 낮은 이유는 그 codon에 해당하는 tRNA의 양이 부족한 것이므로, 이러한 특정 tRNA를 coding하고 있는 plasmid를 host에 넣어주는 경우 rare codon usage 문제를 해결할 수 있을 것이다. 따라서 R. glutinis EH gene을 효율적으로 발현하기 위하여 Arg, Ile, Gly, Leu 및 Pro 등의 rare codon 관련 tRNA 유전자를 가지고 있는 E. coli Rosetta(DE3)pLysS 균주를 숙주로 사용하였다.</p>