2012년 경북 의성에서 생산한 마늘과 2012년 경북 의성에서 가공한 흑마늘제품을 조제하여, 조제된 시료를 DMSO에 녹여 in-vitro 조건에서 항산화, 항균 및 항혈전 활성 평가에 사용하였으며, 항산화 활성은 DSA, ASA 및 NSA 측정으로 평가하고, 이때 항산화 활성평가의 대조구는 vitamin C를 사용하고 용매 대조구로는 DMSO를 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>본 실험에 사용된 마늘은 2012년 경북 의성에서 생산한 마늘을 구입하여 사용하였으며, 흑마늘은 2012년 경북 의성에서 가공한 흑마늘(의성흑마늘 바이오영농조합) 제품을 구입하여 사용하였다. 마늘 추출물 조제의 경우, 껍질을 벗긴 마늘과 동량의 멸균수를 분쇄용 백(Model 400, Closure Bags 6041, Seward, England)에 넣은 후 분쇄기(Stomacher 400, Seward, England)로 10분간 마쇄하였다. 이후 \(4,000 \mathrm{rpm}\)에서 10 분간 원심분리(HA-1000-3, Hanil Science Industrial, Korea)하여 상등액을 회수하였으며, 상등액은 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 조건하에 감압 농축(Eyela Rotary evaporator N-1000, Tokyo Rikakikai, Japan)하여 분말로 조제하였다. 흑마늘 추출물은 흑마늘 \( (20 \mathrm{kg}) \)을 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \)의 열수 추출기(YJ-EXT-1000, Yujin Technology, Korea)에 넣고 12 시간 상압 추출하여 조제하였으며, 조제된 추출액(\(3.2 \mathrm{brix}\)) 70 리터는 진공농축기(YJ-EV-1000, Yujin Technology, Korea)를 이용하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 조건하에 감압 농축하여 분말로 조제하였다. 흑마늘 추출물의 유기용매 분획물 제조의 경우, 추출물을 물에 현탁한 후 n-hexane, ethylacetate 및 butanol을 이용하여 순차적으로 분획하고 최종적으로 물 잔류물을 회수하였으며, 각각의 분획물들은 상기와 동일한 방법으로 감압건조하여 분말화 하였다. 조제된 시료는 DMSO에 녹여 in-vitro 조건에서 항산화, 항균 및 항혈전 활성 평가에 사용하였다. 기타 사용한 시약은 시약급 이상으로 Sigma (USA)의 제품을 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 마늘 및 흑마늘은 안동대학교 식품영양학과에서 보관하고 있다(voucher specimen 2012-AS1, 2012-AS2).</p> <h2>항산화 활성 측정</h2> <p>조제된 시료의 항산화 활성은 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) anion scavenging activity [DSA], ABTS [2,2-azobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)] cation scavenging activity [ASA] 및 nitrite scavenging activity [NSA] 측정으로 평가하였다. 먼저 DSA 측정의 경우, 다양한 농도로 희석한 시료 \( 20 \mu 1 \) 에 \( 99.5 \% \) ethanol 에 용해시킨 \( 2 \times 10^{-4} \mathrm{M}\) DPPH 용액 \( 380 \mu \mathrm{l} \) 를 넣고 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분 동안 반응시킨 후, \( 516 \mathrm{~nm} \) 에서 microplate reader (Asys Hitech, Expert96, Asys, Austria)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. DSA는 시료 첨가구와 비첨가구의 흡광도 백분율로 표시하였다. ASA 측정의 경우, \( 7 \mathrm{mM}\) ABTS (Sigma) \( 5 \mathrm{ml} \) 와 \( 140 \mathrm{~mM} \) potassium persulfate \( 88 \mathrm{ml} \)를 섞은 후 상온에서 16시간 빛을 차단하여 ABTS 양이온을 형성시켰으며, 이후 이 용액을 \( 414 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도 값이 1.5가 되도록 ethanol로 희석하였다. 조제된 희석용액 \( 190 \mu \mathrm{l} \)와 시료 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 를 혼합한 후 상온에서 6 분간 반응시킨 후 \( 734 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하고 다음의 식에 의해 ASA (\(\%\)) 를 결정하였다.</p> <p>\( \mathrm{ASA}(\%)=[(\mathrm{C}-\mathrm{S}) / C] \times 100 \)</p> <ul> <li>C: DMSO 첨가시 흡광도</li> <li>S: 시료 첨가시 흡광도</li></ul> <p>NSA 측정의 경우, 아질산염 용액 \( (1 \mathrm{mM}) \)에 시료용액을 가하고 여기에 \( 0.1 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} \)을 가해 \( \mathrm{pH} 1.2 \) 로 조정한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 시간 반응시킨 후 Griess reagent (Sigma)를 가하고 혼합하였다. 이후 15분간 실온에서 방치 후 \( 520 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 잔존 nitrite 양을 측정하였다. NSA\(\%\) 는 다음의 식에 의해 계산하였다.</p> <p>\( \operatorname{NSA}(\%)=[1-(\mathrm{A}-\mathrm{C}) / \mathrm{B}] \times 100 \)</p> <ul> <li>A: \( 1 \mathrm{~mM} \) nitrite 용액에 시료를 첨가하여 1시간 반응시킨후의 흡광도</li> <li>B: \( 1 \mathrm{~mM} \) nitrite 용액의 흡광도</li> <li>C: 시료의 흡광도</li></ul> <p>항산화 활성평가의 대조구로는 vitamin C (Sigma)를 사용하였으며, 용매 대조구로는 DMSO를 사용하였다. 흑마늘 시료의 radical 소거활성은 각각의 활성화된 anion, cation, nitrite를 \( 50 \% \) 소거하는데 소요되는 시료 농도 \( \left(\mathrm{RC}_{50}\right) \)를 계산하여 나타내었다.</p>