각 추출물의 항산화능 보유 유무 및 그 정도를 알아보기 위해 항산화능의 주요 지표로 활용되고 있는 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) radical 소거능 분석을 수행하였고 대표적인 항산화제로 DPPH radical 소거능 측정 시 양성 대조군으로 주로 사용되는 ascorbic acid를 함께 비교 분석하였으며 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>추출물의 제조</h2> <p>본 연구에서 사용한 M. hupehensis, O. cantonensis, 그리고 P. rubra의 \( 95 \% \) 에탄올 추출물(이하 MHEE, OCEE, PREE)은 한국생명공학연구원, 해외생물소재허브센터에서 구입(분양번호 FBM123-027, 077, 100)하여 사용하였으며 추출 과정은 다음과 같다. MHEE와 PREE는 줄기 부위를, OCEE는 줄기를 포함한 전초를 건조하여 분쇄하고, \( 95 \% \) 에탄올을 용매로 하여 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일간 추출을 수행하였다. 추출이 끝난 시료를 filter로 여과하여 고형물을 없애고 감압농축(N-1000SW, EYELA, Japan) 및 동결 건조(FDU2100, EYELA, Japan)하여 사용 전까지 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다.</p> <h2>DPPH radical 소거능 측정을 통한 항산화능 분석</h2> <p>각 추출물의 항산화능 보유 유무 및 그 정도를 알아보기 위해 항산화능의 주요 지표로 활용되고 있는 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) radical 소거능 분석을 수행하였다. DPPH는 비교적 안정한 free radical로써, ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy 방향족 화합물, 방향족 아민류 등에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되며 이러한 원리를 이용하여 항산화 활성을 간단히 측정할 수 있는 동시에 식물체의 항산화 활성과도 연관성이 매우 높기 때문에 많이 이용되고 있다.</p> <p>DPPH radical 소거능 측정을 위해 각 시료를 농도별 \( (0.512-12.8 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 로 메탄올에 녹여 준비하고 96 well plate 에 메탄올에 용해된 \( 1.5 \times 10^{-4} \mathrm{M} \) DPPH \( 40 \mu 1 \) 와 각 시료 \( 160 \mu \mathrm{l} \)를 분주한 혼합액을 실온에서 30분간 반응시킨 후, multi-plate reader (Paradigm, Beckman, CA, USA)를 이용하여 \( 520 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 음성 대조군과 대비하여 free radical 소거 정도를 백분율로 나타내고, \( 50 \% \) 저해 농도(Inhibitory Concentration, \( \mathrm{IC}_{50} \) )를 계산하였다. 대표적인 항산화제로 DPPH radical 소거능 측정 시 양성 대조군으로 주로 사용되는 ascorbic acid를 함께 비교 분석하였으며 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.</p> <h2>RAW 264.7 murine macrophage의 배양</h2> <p>항산화 및 항염증 활성의 세포 실험 모델계로 murine macrophage cell line인 RAW 264.7을 American Type Tissue Collection (ATCC \( { }^{\circledR} \), TIB-71 \( { }^{\mathrm{TM}} \), Manassas, VA, USA)로부터 구입하여 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS) 및 penicillin/streptomycin (Pen/Strep)이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다.</p>