혈전분해 효소활성이 가장 높은 간균 HC188은 Gram 양성 Bacillus subtilis/amyloliquefaciens로 확인되었다. 이 미생물은 B. amyloliquefaciens HC188으로 지정되었으며, 이를 최적 배지에 접종해 \(37^{\circ}\mathrm{C}\)에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후에 정제된 혈전분해 효소의 효소활성이 배양액 대비 약 50.7배 증가하였으며, 이때 효소단백질의 회수율은 \(5.5\%\)였다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>혈전분해 효소 생산미생물의 분리 및 선발</h2><p>전통방식으로 제조한 청국장과 청국장 발효에 사용하는 볏짚을 멸균 생리 식염수로 각각 십진 희석하고 tryptic soy agar (TSA) 배지에 도말하여 배양한 후, colony 형태가 서로 다른 미생물 총 1,592주를 순수 분리하였다. 혈전분해 효소는 단백질 분해효소의 일종으로 알려져 있어 단백질 분해효소 활성이 높은 미생물의 탐색이 선행되었다. 분리미생물은 \( 1 \% \) ISP배지에서 배양한 후, 배양상등액을 조효소액으로 사용하여 단백질 분해효소 활성을 측정한 결과, 단백질 분해효소 활성이 우수한 72주를 1차 선발하였다(data not shown). 단백질 분해활성이 우수한 72주를 대상으로 혈전분해 효소활성을 측정하였다. \( 0.6 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) fibrin plate의 paper disc 주위로 생성된 투명환의 직경을 비교하여 혈전분해 효소 활성이 우수한 분리미생물 9주를 2차 선발하였다. 2차 선발한 미생물은 김점례할머니 청국장에서 분리한 5주(KC75, KC76, KC77, KC84, KC91), 흥업토속된장 청국장에서 분리한 1주(HC188), 서일농원 청국장에서 분리한 2주(SC12, SC14), 풀목산농원 청국장에서 분리한 1주(PS46)이었다. 동일한 방법으로 \( 0.8 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) fibrin plate를 제조하여 2차 선발한 미생물의 혈전분해 효소활성을 측정한 결과(Fig. 1), 혈전분해 효소 활성이 가장 우수한 isolate HC188을 최종 선발하였다.</p><h2>선발미생물의 동정</h2><p>혈전분해 효소활성이 가장 높은 isolate HC188를 현미경으로 관찰한 결과, Gram 양성의 간균이었으며, 선발미생물의 당이용성 검토를 위하여 API 50 CHB kit test를 실시한 결과, Bacillus subtilis/amyloliquefaciens와 \( 84.7 \% \)의 상동성을 나타내었다. 보다 더 정확한 동정을 위하여 16S rDNA 분석을 실시한 결과, Bacillus amyloliquefaciens와 \( 99 \% \) 의 상동성을 나타내었다. 따라서 선발미생물을 B. amyloliquefaciens HC188이라 명명하였다(Fig. 2).</p><h2>혈전분해 효소의 정제</h2><p>B. amyloliquefaciens HC188가 생산하는 혈전분해 효소를 정제하기 위해 최적배지에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 동안 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 얻은 배양상등액에 황산암모늄을 첨가하여 \( 20-80 \% \)로 포화시킨 후, 투석하였다. 조효소액은 ion-exchange chromatography인 CM-sepharose Fast Flow column에 loading하고 \( 0-1 \mathrm{M} \mathrm{NaCl} \)을 linear gradient하게 1 fraction 당 \( 5 \mathrm{ml} \)씩 용출하였다(Fig. 3). 활성분획이 있는 fraction no. 128-137를 모아 동결건조한 후, \( 10 \mathrm{mM} \) sodium acetate buffer ( \( \mathrm{pH} 6.0\))에 현탁하였다. 현탁액을 sephacryl S-200HR gel filtration을 수행한 결과는 Fig. 4에 나타내었다. 혈전분해 효소활성을 나타내는 fraction no. 46-50을 모아 동결건조 하였다. 전체적인 효소의 정제과정은 Table 1 에 나타내었다. 최종 정제한 혈전분해 효소는 배양상등액에 비해 약 50.7배 효소활성이 증가되었으며, 이때 효소단백질의 회수율은 \( 5.5 \% \) 를 나타내었다.</p>