카드뮴에 민감한 돌연변이인 Yeast strain DTY167에 BrMT3 유전자를 중금속이 없는 배지와 카드뮴, 납이 첨가된 배지에서 형질전환하여 실험한 결과, 중금속이 첨가된 배지에서 BrMT3를 과발현시킨 효모가 더 우수한 생장능을 나타냈다. 이로써 애기장대에 도입된 BrMT3 유전자가 엽록체에서 의도한대로 발현되었으며, 양적 측정 결과 RbcS-BrMT3-GFP 형질전환체가 WT에 비해 카드뮴에 대한 저항성이 더 크게 나타났다.
<h2>효모에 발현시킨 BrMT3 유전자의 중금속에 대한 저항성 분석 결과</h2><p>Yeast strain DTY167은 YCF라는 카드뮴 factor가 결핍되어 금속이온에 매우 민감한 돌연변이 종이다. 이 strain에 BrMT3를 과발현시켜 금속이온에 대한 회복능을 실험하였다. BrMT3를 형질전환시킨 효모를 중금속이 없는 배지와 카드뮴, 납이 첨가된 배지에 각각 키웠을 때, 중금속이 첨가돼지 않은 배지에서는 각 효모들 간에는 생장 차이가 없었으나 카드뮴 및 납이 첨가된 배지에서는 BrMT3를 과발현시킨 효모가 빈 벡터가 들어간 효모보다 생장을 더 잘했다. 이로써 B. rapa 식물체에 카드뮴을 처리하여 분리한 BrMT3 유전자가 카드뮴과 납을 포함하는 중금속에 저항성이 있음이 확인되었다.</p><h2>BrMT3 유전자의 애기장대 도입과 BrMT3 단백질의 확인</h2><p>발현벡터 RbcS-GFP와 RbcS-BrMT3-GFP를 Agrobacterium을 이용하여 애기장대에 형질전환하고 스크리닝 한 결과 17개의 독립된 형질전환체를 얻었으며 (결과 미제시), 이중 BrMT3 유전자의 발현이 높은 7번과 12번 라인을 대상으로 BrMT3 단백질이 엽록체에 제대로 발현하는지를 확인하기 위해 GFP형광을 분석하였다. WT 과 GFP만 도입된 RbcS-GFP 형질전환체, GFP와 BrMT3가 함께 도입된 RbcS-BrMT3-GFP 형질전환체들로부터 원형질을 추출하였다. 형광현미경을 통해 GFP를 관찰해 본 결과 WT의 엽록체로부터 나오는 자가 형광보다 두 형질전환체의 엽록체에서 더 강한 녹색 형광을 관찰할 수 있었다. 이로써 애기장대에 도입된 BrMT3 유전자가 의도한대로 엽록체에서 발현됨을 확인하였다. 또한 GFP만을 발현시킨 형질전환체의 잎 전체와 엽록체에서 각각 총단백질을 분리하여 GFP antibody를 이용해 western blot을 실시한 결과 두 단백질 시료 모두에서 GFP 단백질이 존재하는 것을 다시 한번 확인 할 수 있었다 (결과 미제시). 이를 토대로 BrMT3 유전자가 도입된 RbcS-BrMT3-GFP 형질전환체의 잎으로부터도 엽록체를 분리한 후 추출한 단백질과 전체 잎으로부터 추출한 단백질을 대상으로 GFP antibody를 이용해 western blot을 실시해 본 결과 전체 입과 엽록체 내에 GFP 단백질을 확인할 수 있었다. GFP 형광실험과 western blot 결과로부터 도입된 BrMT3 유전자가 애기장대의 엽록체에서 단백질 수준으로 발현함을 확인 할 수 있었다.</p><h2>형질전환체의 카드뮴에 대한 저항성 기능 분석</h2><p>잎에서 높은 카드뮴 농도는 chlorophyll 생합성 경로에서 효소의 활동과 광계의 색소 단백질 조합의 대사과정 혼란을 초래해 노화를 촉진하고 세포의 산화적 손상, chlorophyllase의 활성을 증폭, 또는 Fe나 Mg와 같은 필수 원소의 결핍들을 만든다고 보고되어왔다(Baryla et al. 2001). 따라서 BrMT3을 엽록체에 과발현시킨 형질전환체 (RbcS-BrMT3-GFP)가 \( \mathrm{CdCl}_{2} \)에 저항성을 가지는지를 알아보기 위하여 \( \mathrm{Cd} \) (II)이 각각 \( 50,60,70 \mathrm{uM} \) 의 농도로 포함된 1/2 MS agar 배지에서 2주간의 생장을 비교해 보았다. 그 결과, RbcS-BrMT3 형질전환체는 Figure 6A 에서 보여주는 것처럼 WT (Col-0) 보다 뿌리와 지상부 모두에서 더 잘 생장하는 것을 확인하였다. 이것은 아마도 BrMT3 유전자를 엽록체에 과발현시킨 형질전환체가 카드뮴으로 인한 엽록체의 손상과 산화스트레스에 저항성을 나타내는 것과 함께 일차적인 카드뮴의 흡수가 엽록체가 없는 뿌리의 세포들을 통해 이루어짐으로써 상대적으로 손실이 적었을 것으로 사료된다. 보다 정확한 양적 측정을 위해 카드뮴 처리 후 생체량을 비교해 본 결과 WT보다 RbcS-BrMT3-GFP-7의 경우 1.3배, RbcSBrMT3-GFP-12의 경우 1.4배 생체량이 큰 것으로 나타나 이들 형질전환체가 대조구보다 카드뮴의 저해를 덜 받는 것으로 확인되었다.</p>