Nitric oxide \( (\mathrm{NO}) \) 측정은 세포의 supernatant 내의 nitric oxide를 nitrite와 nitrate로 측정하였다. 또한, 세포 생존율은 Carmichael 등의 방법을 사용하였다. Raw 264.7 macrophage cell을 96 well plate에 배치하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 환경에서 24시간 동안 배양한 후, 시료를 추가하였다. 대조군에는 시료와 동량의 무혈청 배지를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다.
<h3>Nitric oxide 저해활성 측정</h3> <p>Nitric oxide \( (\mathrm{NO}) \)측정은 cell의 supernatant에서의 nitric oxide \(\mathrm{NO} \)의 량을 nitrite and nitrate로서 측정을 하였다. Nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 griess reagent (Sigma, USA)를 사용하였으며, 6 well plate에 \( 2 \times 10^{6} \)개의 cell을 confluence가 \( 80 \% \)일 때, PBS로 2번 washing한 후에 무혈청 배지를 사용하여 12시간 이상 배양시킨 후에 lipopolysaccharide (LPS) \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)을 control군을 뺀 모든 well에 다 넣어서 자극시켰다. 2시간 후에 시료를 농도별로 처리하여 실험하였다. \(\mathrm{NO} \)생성량은 24시간 후에 supernatant를 모아 griess reagent로 10 분간 반응시킨 후에 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도로 측정하였다. LPS만 첨가한 군에서 생성된 \( \mathrm{NO} \)의 양을 \( 100 \% \)로 하여 시료가 첨가된 경우에 측정된 흡광도를 환산하여 표기하였다.</p> <p>Nitric oxide \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\text { 무철가군의 흡광도 }}\right) \times 100 \)</p> <h3>MTT assay에 의한 세포 생존율 측정</h3> <p>세포 생존율 측정은 Carmichael등의 방법에 따라 측정하였다. 세포주 macrophage (Raw 264.7)cell을 96 well plate에 \( 5 \times 10^{3} \) cells/well이 되게 \( 0.2 \mathrm{ml} \)분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \)incubator에서 24 시간 배양한 후, 무혈청배지 \( 0.18 \mathrm{ml} \)에 시료를 농도 별로 조제하여 \( 0.02 \mathrm{ml} \)첨가한 후 대조군은 시료와 동량의 무혈청 배지를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 \( 2.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)농도로 제조한 MTT 용액 \( 0.02 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 3시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO \( 0.1 \) \( \mathrm{ml} \)를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 홉광도를 측정하였다. 세포 생존율 측정은 시료용 액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <p>세포 생존율 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\text { 무첨가군의 흡광도 }} \times 100\right. \)</p> <h3>Western blot을 통한 iNOS, COX-2 단백질의 발현 측정</h3> <p>염증 관련 단백질 발현을 측정하기 위하여 Raw 264.7세포를 \( 10 \% \) FBS contained DMEM으로 희석하여 \( 1 \mathrm{ml} \)당 \( 5 \times 10^{4} \)가 되도록 한 후 \( 100 \mathrm{~mm} \)dish에 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24시간을 배양하였다. 그 다음 dish를 PBS로 2회 세척하고 serum excluded DMEM을 넣은 후 검색 시료와 LPS \( (1 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ml}) \)을 차례로 처리하여 10분, 16시간을 배양하였다. 배양 후 cold PBS로 2회 세척한 후 끓고 있는 cell lysis buffer를 넣고 scraper로 긁어 모으고 이를 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에 5분간 두었다. 식힌 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하였으며, 사용 직전에 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 녹여 단백질 정량 및 전기영동에 이용하였다. 단백질은 bradford법을 통하여 정량하였으며, \( 20 \mu \mathrm{g} \)의 샘플을 \( 10 \% \) SDS-polyacrylamide gel에 \( 100\mathrm{V} \) 로 2시간 동안 전기영동하였다. 원하는 부위의 gel을 잘라 3시간 동안 PVDF membrane으로 옮긴 후 PBST로 2회 세척하고 blocking buffer에 넣어 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 그 다음 TBST로 10분간 3회씩 세척한 다음 primary antibody를 염증 관련 단백질인 iNOS (BD Bionsience1:1,000), \( \mathrm{COX}-2 \ (Cayman1:1,000)와 house keeping gene인 \( \mathrm{GAPDH} \) (santacruz1:1,000)가 되도록 \( 3 \% \)skimmed milk in TBST로 희석하여 membrane과 함께 상온에서 \( 4\sim5 \)시간 배양하였다. Membrane을 PBST로 10분간 3회씩 세척한 후 HRP-conjugated secondary antibody (santacruz1)을 1:1,000으로 희석하여 membrane과 함께 상온에서 50분간 배양하였다. 이를 TBST로 10 분간 3회 세척한 후 ECL western blotting detection reagents를 처리하여 생성된 luminescence를 X-ray film에 감광해 확인하였다.</p>