살아있는 세포의 미토콘드리아 내 de-hydrogenase가 황색 수용성 물질인 MTT에 의해 dark blue formazan을 생성하는 원리를 이용한 MTT assay를 사용하여 오징어내장 분획물의 암세포 증식 억제효과를 측정하였다. 그리고 위상차 현미경을 이용한 각 오징어내장 분획물의 농도에 따른 암세포주의 세포형태학적 관찰과 돌연변이 및 발암물질 등에 의한 DNA 상호작용을 차단하는 Quinone reductase (QR) 유도 활성 측정을 통하여 오징어내장 분획물의 암세포 증식 억제효과를 측정 및 확인하였다.
<h2>암세포 성장 억제 효과(Cytotoxicity) 측정</h2> <p>오징어내장 분획물의 암세포 증식억제효과는 MTT assay를 사용하여 행하였다. MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) [1,5] assay는 세포의 생육을 측정하는 방법으로서 살아있는 세포의 미토콘드리아 내의 de-hydrogenase가 황색 수용성 물질인 MTT에 의해 dark blue formazan을 생성하는 원리를 이용하였다.</p> <p>이를 위해 각 세포주는 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well의 농도로 맞추고 24 well에 각각 \( 1 \mathrm { ml } \) 씩 첨가하여 24 시간동안 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에 배양한 후 용매종류별 분획물을 각각 일정량의 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여서 100, 200, 300, 400, 500 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도로 첨가하였다. 일정시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT 용액을 \( 100 \mu 1 \) 씩 첨가하여 4 시간동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan이 흐트러지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO와 ethanol을 1:1 로 혼합한 용액을 \( 1 \mathrm { ml } \) 를 첨가하여 천천히 녹인 후 Multi-detection microplate를 이용하여 \( 570 \mathrm { ~nm } , 690 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였 다. 대조군 세포수를 \( 100 \% \) 로 정하고 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.</p> <h2>위상차 현미경을 이용한 세포형태학적 관찰</h2> <p>세포배양용 petridish에 각각의 암세포주를 24시간 동안 안정화시킨 다음 오징어내장 분획물을 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양한 후, 위상차 현미경을 이용하여 200배의 배율로 각 농도에 따른 형태의 변화를 관찰한 후에 Olympus DP70을 이용하여 촬영하였다.</p> <h2>Quinone reductase (QR) 유도 활성 측정</h2> <p>Quinne reductase는 phase Ⅱ 무독화 효소 중의 하나로 돌연변이 또는 발암물질 등에 의한 DNA와의 상호 작용을 차단 하는 효소이며, NAD(P)H를 이용하여 quinone류의 환원을 촉매하는 flavoprotein이다.</p> <p>QR 생성 유도 효과는 Prochaska와 Santamaria의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. T-75 flask의 세포가 \( 80 \% \) 이상 증식하게 되면 24 well plate의 각 well에 \( 1 \times 10 ^ { 4 } \) cells/ml되도록 HepG2 세포주를 분주하여, incubator에 24시간동안 배양한 후 오징어내장 분획물을 HepG2의 세포생존율이 \( 50 \% \) 되는 양을 final 농도로 잡아 각각 DMSO에 녹여 90, 180, 270 및 \( 360 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도로 첨가하고 다시 24 시간동안 배양한 다음 배양액을 제거하였다. 배지가 제거된 각 well에 \( 250 \mu \) 의 lysis buffer \( 10 \mathrm { mM } ~ \mathrm { Tris-Cl } , \mathrm { pH } 8.0, 14 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } , 15 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } _ { 2 } \), \( 0.5 \% \mathrm { NP } -40 \) )를 첨가한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에 10 분간 두면서 cell을 lysis한 후 reaction mixture 즉, \( 10 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { Tris-Cl } \mathrm { (pH } 7.4) \), \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \mathrm { BSA, } \mathrm { 0.008 \% } ~ \mathrm { tween-20, } ~40 \mu \mathrm { M } \mathrm { FAD } , 0.8 \) \( \mathrm { mM } \) glucose-6-phosphate, \( 2 \mathrm { Unit } / \mathrm { ml } \) glucose-6-phosphate dehydrogenase, \( 25 \mu \mathrm { M } \) NADP, \( 40 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) MTT 및 \( 1 \mathrm { mM } \) me-nadione을 혼합하여 wello에 \( 1 \mathrm { ml } \) 씩 첨가하여 5 분 동안 반응시킨 후, 반응 정지용액인 \( 10.3 \mathrm { mM } \) dicumarol, \( 0.5 \% \) pyridine, \( 5 \mathrm { mM } \) potassium phosphate \( ( \mathrm { pH } 7.4) \) 혼합액을 \( 250 \mu 1 \) 씩 첨가하여 효소반응을 정지시키고 Multi-detection microplate를 이용하여 \( 610 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 그리고 단백질량은 동일한 set의 well plate에 대한 crystal violet 염색 방법으로 정량하였다.</p>