SMYEE는 L-arginine을 기질로 하여 NOS에 의해 L-citrulline으로 합성되는 Nitric Oxide(NO)의 생성을 억제하는 효과를 나타내는 것으로, RAW 264.7 cell에서 griess 시약을 이용해 측정한 결과 0.1~100\(\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml}\) 농도 범위의 SMYEE가 LPS에 의해 증가한 NO 생성량을 억제하는 것을 확인하였으므로 SMYEE가 이러한 염증성 사이토카인을 조절하는 물질로서 염증반응으로 유도된 다양한 질병을 조절할 수 있는 가능성이 있음을 시사한다.
<h2>Nitric Oxide 생성 억제 효과</h2> <p>\( \mathrm { NO } \)는 인체 내 생리적이나 병적인 반응에서 중요한 물질로서 L-arginine을 기질로 하여 NOS에 의해 L-citrulline으로 합성되는 무기 유리체로 적절한 수준에서는 혈소판억제, 면역조절, 신경전달, 혈관확장 등의 역할을 한다. 하지만 \( \mathrm { NO } \)가 과도하게 생성되면 염증 반응을 심화시키고 shock에 의한 혈관확장, 기관지염, 다발성 경화증과 같은 병적반응 및 자가면역질환을 일으킨다. 본 연구에서는 SMYEE의 \( \mathrm { NO } \) 생성 억제효과를 알아보기 위하여 LPS로 염증반응을 유발한 RAW 264.7 cell에서의 \( \mathrm { NO } \) 생성량을 griess 시약을 이용해 측정하였다. 세포의 생존율에 영향을 미치지 않는 농도 \( (0.1,1,10,50,100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 에서 LPS로 염증반응을 유발한 RAW 264.7 cell의 \( \mathrm { NO } \) 생성량을 확인한 결과, LPS 만으로 염증을 유발하였을 때 \( \mathrm { NO } \) 생성량이 \( 16.26 \pm 0.15 \mu \mathrm { M } \) 이었으며 SMYEE를 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 로 처리하였을 때 \( 9.89 \pm 0.15 \mu \mathrm { M } \)로 \(44 \% \)의 \( \mathrm { NO } \) 억제효과를 나타내었다. 본 연구 결과는 큰잎모자반 추출물이 농도 의존적으로 \( \mathrm { NO } \) 생성량의 감소를 보인 결과와 참모자반 에탄올 추출물의 \( \mathrm { NO } \) 저해능을 확인한 연구결과와 유사함을 확인하였다. 따라서 SMYEE는 LPS로 유도된 대식세포에서 증가된 \( \mathrm { NO } \) 의 생성 억제하여 염증반응 조절제로서의 효과가 있는 것으로 확인되었다.</p> <h2>Pro-inflammatory cytokines 생성 억제 효과</h2> <p>LPS로 처리한 RAW 264.7 세포에서, SMYEE가 cytokine의 분비에 미치는 영향을 확인하기 위해 농도별로 처리하여 IL-6, TNF- \( \alpha \) 및 IL- \( 1 \beta \) 의 분비량 변화를 ELISA kit를 이용하여 정량하였다. 그 결과, LPS 의해 증가한 모든 cytokine의 분비량을 농도의존적으로 억제하는 것을 확인하였다. 먼저 IL-6의 경우, LPS에 의해 \( 2194.93 \pm 35.79 \mathrm { pg } / \mathrm { ml } \) 까지 증가한 분비량을 SMYEE를 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 로 처리했을 시 \( 577.07 \pm 15.34 \mathrm { pg } / \mathrm { ml } \) 로 억제하여 \( 74 \% \) 의 뛰어난 억제효과를 나타내었다. TNF- \( \alpha \) 의 경우, 농도 의존적으로 분비량이 억제되었으며, LPS를 단독으로 처리하여 \( 2008.59 \pm 7.73 \mathrm { pg } / \mathrm { ml } \) 의 분비량을 나타낸 것과 비교하여 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 처리구에서는 분비량이 \( 1289.62 \pm 10.62 \mathrm { pg } / \mathrm { ml } \) 로 \( 36 \% \) 이상으로 억제되었다. LPS에 의해 증가된 IL- \( 1 \beta \)의 분비량은 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 로 처리하였을 때 \( 72 \% \) 이상의 뛰어난 억제 효과를 보임을 확인하였다. 이는 참모자반 추출물을 처리한 후 pro-inflammatory cytokines의 분비량을 농도의존적으로 억제한 효과과 유사하였다. LPS는 대식세포의 활성화에 관여하는 대표적인 mitogen이자 대식세포의 표면 수용체인 toll-like receptor4 (TLR4)에 결합하는 ligand로 표면 수용체 복합체의 활성화를 통해 MyD88, TIRAP/Mal, TRIF와 같은 TIR 영역을 포함하는 어댑터 단백질과 결합하여 반응하게 된다. 이러한 LPS에 의해 생성되는 cytokine<p>의 분비는 \( \mathrm { PGE } _ { 2 } \) 와 \( \mathrm { NO } \) 의 발현을 야기하고 과도한 pro-inflammatory cytokine의 분비량 증가는 패혈증 및 심한 조직 손상, 전신성 염증 반응 증후군을 야기한다. 그 중 IL-6 는 T cell, monocyte, macrophage, synovial fibroblast 등의 면역세포에서 발현되는 염증성 cytokine으로 B cell을 plasma cell로 분화시켜 항체 생산을 촉진한다. TNF- \( \alpha \)는 염증반응 과정 중 초기 주요 내인성 매개자로서 대식세포 외에도 NK cell이나 CD4 + lymphocyte에서도 생성되어 염증부위로의 백혈구를 증가시키는 다른 염증성 cytokine과 내피 세포 부착 분자의 발현을 촉진시켜 패혈증이나 암, 염증성 장 질환 등의 자가면역 질환의 요인이 된다. 또한 IL- \( 1 \beta \) 는 염증반응 시 생성되는 촉진성 사이토카인으로 caspase-1 에 의해 활성형으로 전환되는데 낮은 농도에서는 세포성장이나 항상성 유지에 필수적이지만 염증반응 및 면역적 자극에 의해 대량생산될 경우 T cell을 활성화 시키고 B cell을 성숙시켜 증상을 악화시킨다. 따라서 본 연구 결과 SMYEE가 이러한 염증성 사이토카인을 조절하는 물질로서 염증반응으로 유도된 다양한 질병을 조절할 수 있는 가능성이 있음을 알 수 있다.</p>