가수분해물은 Kim 등의 방법에 따라 대구의 간을 효소로 가수분해시켜 얻은 가수분해물을 각 단계별로 분자량 크기에 따라 제조하였다. 분자량은 한외여과막 반응기를 사용하여 분자량 한계범위가 10 \( \mathrm{~kDa}, 5 \mathrm{~kDa} \) 및 \( 1 \mathrm{~kDa} \)의 막을 통과시켜 분획한 가수분해물의 분자량은 고성능 액체크로마토그래피 (high performance liquid chromatography : HPLC, Hewlett Packard, USA)를 사용하여 측정하였으며, ACE 저해활성은 Cushman and Cheung의 방법에 준하여 측정하였다.
<h2>가수분해물의 제조</h2> <p>가수분해물은 Kim 등의 방법에 따라 대구의 간을 효소로 가수분해시켜 얻은 가수분해물을 각 단계별로 분자량 크기에 따라 제조하였다. 즉, 대구의 간을 \( \alpha \)-chymotrypsin으로 2시간 가수분해시킨 후, 한외여과막 장치를 이용하여 분자량 한계범위가 각각 \( 10 \mathrm{~kDa}, 5 \mathrm{~kDa} \) 및 \( 1 \mathrm{~kDa} \)인 막을 통해 분획한 후 동결건조하였다.</p> <h2>분자량 측정</h2> <p>한외여과막 반응기를 사용하여 분자량 한계범위가 10 \( \mathrm{~kDa}, 5 \mathrm{~kDa} \) 및 \( 1 \mathrm{~kDa} \)의 막을 통과시켜 분획한 가수분해물의 분자량은 고성능 액체크로마토그래피 (high performance liquid chromatography : HPLC, Hewlett Packard, USA)를 사용하여 측정하였다. 즉, GPC column [Zorbax PSM \( 60\left(110 \sim 10^{3} \mathrm{~Da}\right), 300\left(3 \times 10^{3} \sim 3 \times 10^{5} \mathrm{~Da}\right), 3000\left(10^{5}\right. \) \( \sim 10^{7} \mathrm{~Da}\)), I. D. \( 6.2 \mathrm{mm}, 250 \mathrm{mm} \times 4.6 \mathrm{mm} \)] 3개를 직렬로 연결하여 3차 증류수로 평형화시킨 후, 각 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{m} \ell \) 의 시료용액 \( 100 \mu \ell \)를 유출속도 \( 1 \mathrm{m} \ell / \mathrm{min} \)로 용리시켜 UV 검출기로서 \(230\mathrm{nm}\)에서 홉광도를 측정하였다. 표준물질은 carbonic anhydrase (MW 29,000 Da), cytochrome C (MW 12,327 Da), aprotinin (MW 6,000 Da) 및 pentaphenylalanine (MW \( 753.9 \mathrm{Da} \))을 사용하였다.</p> <h2>ACE 저해활성 측정</h2> <p>ACE 저해활성은 Cushman and Cheung의 방법에 준하여 측정하였다. 즉, 일정량의 가수분해물을 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium borate buffer ( pH 8.3, 300mM NaCl 함유)에 녹인 가수분해액 \( 100 \mu l \)에 \( 25 \mathrm{mU} / \mathrm{m} \ell \) ACE용액 \( 100 \mu l \) 를 가한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 항온처리하였다. 여기에 \( 25 \mathrm{mM} \) Hip-His-Leu (107.4\(\mathrm{mg}\)/10\(\mathrm{ml}\) sodium borate buffer) \( 50 \mu \)를 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60분간 반응시킨 후, \( 1 \mathrm{N} \mathrm{~HCl} \) 용액 \( 0.5 \mathrm{m} \ell \) 를 가하여 반응을 정지시켰다. 반응용액에 ethyl acetate \( 1.5 \mathrm{m \ell} \) 를 가하여 교반한 다음, 원심분리 \( (2,500 \times \mathrm{g}, 5 \mathrm{~min}) \) 시켜 상층액 \( 1 \mathrm{~m} \ell \) 를 분취하였다. 이 상층액을 완전히 건조시킨 다음 증류수 1 \( \mathrm{m} \ell \)를 가하여 용해시키고, 228\(\mathrm{nm}\)에서 흡광도를 측정하였다. ACE 저해제의 농도는 ACE의 저해활성을 \( 50 \% \) 저해시키는데 필요한 가수분해물의 농도를 계산하여 \( \mathrm{IC}_{50}(\mathrm{mg} / \mathrm{m \ell}) \) 으로 정의하였다.</p>