MVM DNA는 GENE ALL \( { } ^ { T M } \) Blood SV mini Kit를 이용해 추출하였고, PCR 반응을 위한 혼합액에는 Genomic DNA, forward primer, reverse primer, 2X GoTaq \( { } ^ {\circledR } \)Green Master Mix, 그리고 Nuclease-free water를 사용하여 25마이크로리터의 최종 부피를 맞추었다. 핵산증폭은 95도 섭씨에서 2분의 pre-incubation, 동일한 온도에서 30초의 denaturation, 그리고 여러 온도(48, 50, 52, 54, 56, 58도 섭씨)에서 30초의 annealing을 거쳐서 진행하였고, 마지막으로 72도 섭씨에서 1분의 extention을 거친 후, 이 과정을 총 40 cycle 반복하였다.
<p>MVM DNA는 GENE ALL \( { } ^ { T M } \) Blood SV mini Kit(General Biosystem, Korea)을 사용하여 분리하였다. PCR 반응을 위해 바이러스 Genomic DNA \( 2 ~ \mu \mathrm { L } \), 10 pmol forward primer \( 1 ~ \mu \mathrm { L } \), 10 pmol reverse primer \( 1 ~ \mu \mathrm { L } \), 2X GoTaq \( { } ^ {\circledR } \)Green Master Mix(Promega, USA) \( 12.5 ~ \mu \mathrm { L } \) 혼합액에 Nuclease-free water \( 8.5 ~ \mu \mathrm { L } \)를 첨가하여 최종부피를 \( 25~ \mu \mathrm { L } \)로 맞추었다. 핵산증폭은 pre-incubation은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 2분, denaturation은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초, annealing은 30초(annealing 온도 최적화를 위해 \( 48 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 52 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 54 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 56 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 58 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 PCR 수행), extention은 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분으로 하여 40 cycle을 수행하였다. 40 cycle PCR 후 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분 반응시킨 후 \( 1.5 \% \) agarose gel(Sigma Co., USA)을 사용하여 \( 100 \mathrm { V } \) 전압으로 30분정도 전기영동한 후 ethidium bromide로 염색하여 PCR 반응산물을 확인하였다.</p> <h2>Real-time PCR을 이용한 MVM DNA 정량</h2> <p>MVM의 정량을 위해 일반 PCR을 통해 확립된 PCR 조건을 기초로 SYBR Premix Ex Taq \( { } ^ {\mathrm { TM } } \)(TaKaRa, Korea)을 사용하여 real-time PCR 조건을 확립하였다. MVM 정량을 위해 Corbett Research사(Australia)의 Rotor-Gene 3000 real-time PCR 기계를 사용하였다. PCR 반응액은 SYBR \( ^ {\circledR } \)Premix Ex Taq \( ^ {\mathrm { TM } } \) \( 12.5 ~ \mu \mathrm { L } \), 10 pmol forward primer \( 0.5 ~ \mu \mathrm { L } \), 10 pmol reverse primer \( 0.5 ~ \mu \mathrm { L } \), template \( 2 ~ \mu \mathrm { L } \)에 멸균된 3차 증류수를 넣어 총 \( 25 ~ \mu \mathrm { L } \)가 되게 하였다. 핵산증폭은 pre-incubation은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 15초, denaturation은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 15 초, annealing은 20초(annealing 온도 최적화를 위해 \( 48 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 52 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 54 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 56 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 58 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 real-time PCR 수행), extention은 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 15초로 하여 45 cycle을 수행하였다. 마지막 cycle 후에는 모든 반응물에 대하여 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)부터 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)까지 영역에서 melting curve 분석을 실시하였다. 최적 \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \) 농도를 설정하기 위해 최적화된 annealing 온도 \( 52 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \)를 \( 2 \mathrm { ~mM } \)에서 \( 6 \mathrm { ~mM } \)까지 변화시켜 첨가해준 MVM DNA 농도에 따른 crossing point 값을 비교하였다.</p>