효소 고정화는 담체에 흡착된 효소의 양은 초기에 투입된 효소의 양과 세척에 의해 상등액(supernatant)으로 빠진 효소의 양의 차이에 의해 결정하며, 효소의 활성 측정은 \( \mathrm{pH} \)와 온도에 따른 자유 효소와 고정화 효소를 비교한다. 또한, 장기 운전에 의한 안정성을 평가하기 위해 기질농도를 일정하게 하고 유량을 일정하게 유지하여 5일 동안 연속운전을 실시하면서 안정성을 평가했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>효소 및 시약</h2> <p>Trichoderma reesei에서 유래된 효소 cellulase는 Sigma Chemical (St. Louis, U.S.A.)에서 구입하였다. 고정화 담체로는 약 염기성 음이온 교환수지인 Duolite A568 (Rohm and Hass, Germany)를 사용하였다. 이 담체는 비교적 균일한 미세기공을 가지며 평균 입자크기는 \( 375\ \mu \mathrm{m} \)이고 매트릭스는 phenol formaldehyde 이다. 효소 반응에 대한 기질로는 셀룰로스에서 glucopyranose에서 수산화기를 carboxy methyl기로 치환하여 용해될 수 있는 유도체 CMC (carboxy-methyl cellulose)를 사용하였다. 다른 모든 시약들도 1급 이상을 사용하였다.</p> <h2>담체에 대한 효소 흡착 특성</h2> <p>담체에 고정화되는 효소의 흡착 특성을 관찰하기 위해 효소의 농도를 변화시키면서 약 염기성 음이온 교환수지에 고정화되는 효소의 양을 측정하였다. 대표적인 흡착 등온식은 Langmuir와 Freundlich이 있는데 식은 각각 다음과 같이 표시된다.</p> <p>Langmuir isotherm: \( Y=\frac{Y_{\max } C}{\theta+C} \)</p> <p>Freundlich isotherm: \( Y=k C^{1 / n} \)</p> <p>여기서 Y는 담체에 고정화된 효소의 농도이고 C는 용액에 있는 효소의 농도이고 \( \mathrm{Y}_{\max }\), \(\theta\), \(\mathrm{k} \) 그리고 \(\mathrm{n}\)은 흡착 등온선의 특성을 나타내는 상수이다. 고정화 담체에 효소의 농도를 달리하면서 효소용액 \( 20 \mathrm{~ml} \)를 투입하였고 고정화 효소의 양과 용액 속에 남아있는 효소의 양을 측정하여 흡착 등온선의 비교는 엑셀의 해 찾기 기능을 사용하여 비선형회귀 방법으로 결정하였다.</p></p> <h2>효소 고정화</h2> <p>효소 고정화는 담체 약 염기성 음이온 교환수지를 사용하여 충진층 반응기에서 넣고 흡착에 의한 방법으로 다음과 같이 실시하였다. 우선 충진층 반응기는 원통형 유리관을 사용하였고 지름은 \( 8 \mathrm{~mm} \) 그리고 높이는 \( 75 \mathrm{~mm} \)로서 부피는 \( 4.0 \mathrm{~ml} \)였다. 담체 \( 0.5 \mathrm{~g} \)을 충진층 반응기에 넣고 증류수 \( 500 \mathrm{~ml} \)를 연동펌프(peristaltic pump)로 1시간 동안 \( 10 \mathrm{~ml} \mathrm{~min}^{-1} \)의 유량으로 재순환(recirculation)시키면서 담체를 세척하였다. 그 다음에 sodium acetate 완충용액( \( 100 \mathrm{~mM}\), \(\mathrm{pH} ~4.6\))을 사용하여 마찬가지 방법으로 1시간 동안 세척을 실시하였다. sodium acetate 완충용액에 적절히 희석된 효소 용액 \( 20 \mathrm{~ml} \)를 연동펌프로 \(10 \mathrm{~ml} \mathrm{~min}{ }^{-1} \)의 유량으로 12시간 동안 재순환시키면서 효소 고정화를 실시하였다. 담체에 흡착되지 않은 효소를 제거하기 위해 인산완충용액 \( 20 \mathrm{~ml} \)로 2회에 걸쳐 연동펌프로 1시간 동안 재순환으로 세척을 실시하였다. 담체에 흡착된 효소의 양은 초기에 투입된 효소의 양과 세척에 의해 상등액(supernatant)으로 빠진 효소의 양의 차이에 의해 결정하였다. 효소의 양은 단백질 측정에 의해 결정되었고 Lowry 방법을 사용하였다</p> <h2>효소의 활성 측정</h2> <p>효소의 활성 측정은 기질인 CMC의 분해로 생성된 포도당을 DNS (3,5-dintrosalicyclic acid) 시약과 반응시켜 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 spectrophotometer에서 흡광도로 결정하였다. Michaelis-Menten 속도식에서 속도 상수를 결정하는 방법은 다음과 같다. 기질인 CMC의 농도를 달리하면서 초기 속도를 측정하고 이것을 Lineweaver-Burk plot을 통해 기울기와 절편을 선형회귀에 의해 엑셀에서 초기값을 결정하고 이것을 기준으로 하여 최종 값은 Excel의 Solver 기능을 사용하여 비선형회귀 방법으로 결정하였다.</p> <p>\( \mathrm{pH} \)와 온도에 따른 자유 효소와 고정화 효소의 활성을 비교하였다. \( \mathrm{pH} \)는 3.5에서 6.5까지 변화시켰고 온도는 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)까지 변화시키면서 자유 효소와 고정화 효소의 활성을 비교하였다. 열 안정성 평가는 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 자유 효소와 고정화 효소의 활성을 시간에 따른 측정을 실시하였고 이것을 로그 그래프를 이용하여 1차식의 효소 활성 감소를 보이는지 평가하였다.</p> <h2>충진층 반응기 운전</h2> <p>연속 운전에서는 기질의 농도와 유량을 달리하면서 정상상태에 도달한 후 포도당 농도를 측정하였다. 기질인 셀룰로스의 농도를 변화시켰고 각 기질 농도에 대해서 공급되는 유량은 0.5에서 \( 6 \mathrm{~ml} \mathrm{~min}{ }^{-1} \)로 변화시켰다. 또한 장기 운전에 의한 안정성을 평가하기 위해 기질농도를 일정하게 하고 유량을 \( 1.0 \mathrm{~ml} \mathrm{~min}{ }^{-1} \)로 5일 동안 연속운전을 실시하였고 이것에 대한 안정성을 평가하였다.</p>