각 시험법의 특이도를 알기위해 무균성수막염에서 en-terovirus와 감별진단이 필요한 임상검체들과 유전적으로 en-terovirus와 유사한 rhinovirus검체를 바이러스 배양법,real-time NASBA, 2 step RT-PCR으로 실험했다. 결정된 염기서열은 NCBI BLAST search program을 사용해 sequence homology와 기존 보고된 바이러스 비교를 통해 기존혈청형의 염기서열과 \( 75 \% \)이상의 상동성을 보일 때 바이러스의 유전자형을 결정하였다. 검체를 RD세포주에 배양 후 검체에 따라 3-5일에서 늦으면 일주일 후에 장내 바이러스에 의한 전형적인 세포 변성효과 (CPE)인 세포의 원형화, 세포질의 수축, 세포의 파괴 등의 현상이 유발됨을 관찰할 수 있었다.
<h2>특이도 시혐</h2> <p>각 시험법의 특이도를 알아보고자 무균성수막염에서 en-terovirus와 감별진단이 필요한 임상검체들과 유전적으로 en-terovirus와 유사한 rhinovirus 검체를 real-time NASBA와 2 step RT-PCR, 그리고 바이러스 배양법으로 실험하였다. 각각의 바이러스는 특이적인 primer를 이용한 PCR로 양성이 확인된 것들을 사용하였다. 3건의 herpes simplex virus type 1 (HSV-1)과 3건의 HSV-2, 3건의 adenovirus, 2건의 mumps vi- rus를 실험에 사용하였고 광주보건환경연구원에서 분양받은 10 건의 rhinovirus를 각각의 실험에 사용하였다.</p> <h2>염기서열 분석</h2> <p>바이러스 배양 결과 세포변성효과를 보이는 배양 상층액과 \( 5 ^ {\prime } \)-NCR 2 step RT-PCR 결과 양성을 보이는 검체에 대하여 유전자형 확인을 위하여 VP1 2 step RT-PCR을 수행하고 그 증폭산물은 솔젠트사(SolGent Co., Daejeon, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하였다. BigDye \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) terminator V3.1 cycle se-quencing kit (Perkin Elmer, USA)을 사용하여 sequencing 반응을 하였고, Millipore-Montage dye removal kit로 sequenc-ing 산물을 정제하였으며 ABI 3730XL capillary DNA ana-lyzer (Applied Biosystems, CA, USA)로 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI BLAST search program을 사용하여 기존의 보고된 바이러스와 sequence homology를 비교하여 기존 혈청형의 염기서열과 \( 75 \% \) 이상의 상동성을 보이는 경우를 기준으로 바이러스의 유전자형을 결정하였다.</p> <h1>결 과</h1> <h2>Real-time NASBA, \( 5 ^ {\prime } \)-NCR 2 step RT-PCR, 바이러스배양 시험결과 비교</h2> <p>대변 197건, 뇌척수액 69건, 인후 도찰물 26건 등 총 292건의 검체를 대상으로 real-time NASBA, 바이러스배양, 5'-NCR 2 step RT-PCR 시험을 각각 실시하였다. 검체를 RD 세포주에 배양하여 검체에 따라 3-5일에서 늦으면 일주일 후에 장내 바이러스에 의한 전형적인 세포 변성효과 (CPE) 인 세포의 원형화, 세포질의 수축, 세포의 파괴 등의 현상이 유발됨을 관찰할 수 있었다(Fig. 1). 그리고 NucleiSens Isolation Reagent와 NucleiSens Lysis Buffer를 사용하여 RNA를 분리하여 enter-ovirus real-time NASBA를 수행하고, 동시에 5'-NCR 2 step RT-PCR 시험하여 \( 436 \mathrm { bp } \) 산물을 확인하였다 (Fig. 2). 대변 42건과 뇌척수액 1 건, 인후 도찰물 3 건 등 총 46 건에서 3 가지 시험법 모두 양성으로 나타났고, 대변 94건, 뇌척수액 45건, 인후 도찰물 8 건 등 총 147 건의 검체는 3 가지 시험법 모두에서 음성이었다. 양성 검체는 real-time NASBA 145건, 세포 배양 101건, 2 step RT-PCR 86건순으로 나타났다(Table 2). 바이러스 배양과 5'-NCR 2 step RT-PCR의 결과를 비교하여 보면 두 가지 시험 모두에 양성인 검체는 대변 42건, 뇌척수액 1 건, 인후도찰물 3건 등 총 46건이었고, 바이러스 배양 시험에서만 양성인 경우는 대변 33건, 뇌척수액 17 건, 인후 도찰물 5 건 등 총 55 건이었으며, 5'-NCR 2 step RT-PCR에서만 양성인 경우는 대변 26건, 뇌척수액 4 건, 인후 도찰물 10 건 등 총 40 건이었다(Table3). 모든 5'-NCR 2 step RT-PCR 양성 검체와 세포배양 양성검체는 real-time NASBA에서도 양성으로 나타났고 2건의 대변, 2건의 뇌척수액 등 총 4 건의 검체에서는 real-time NASBA에서만 양성으로 나타났다.</p>