부산 해수욕장에서 얻은 해수를 이용하여 Protease를 생산하는 균주를 분리하였다. LB 고체배지에 Skim milk를 첨가하여 배지를 구성하고, Kunitz의 casein hydrolysis법을 변형하여 Protease 활성을 측정하였다. Hammersten casein과 Tris-HCl 완충액을 기질로 사용하였으며, 조효소액은 Skim milk와 NaCl이 포함된 LB broth에서 배양하여 얻었다. Protease 생산배지에 균주를 접종하여 30도 shaking incubator에서 12시간부터 72시간까지 12시간 간격으로 배양한 후 시료를 취하여 최적 배양시간을 확인하였다. 이를 통해 균주의 성장과 효소의 생산을 조사하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약 및 배지</h2> <p>본 실험에 사용된 기본 배지는 LB (Difco, Franklin Lakes, New Jersey, USA)이었고, ammonium chloride (Samchun, Pyeongtaek, Korea), ammonium sulfate (Katayama Chemical, Osaka, Japan), casamino acid, peptone, skim milk, soytone, tryptone, yeast extract (Difco), gelatin (Sigma, St. Louis, Missouri, USA), malt extract (Oxoid, Madrid, Spain), soybean meal (Busan, Korea)과 같은 질소원과 \( \mathrm{NaCl} \) (Samchun)를 첨가하여 사용하였다. 효소의 활성측정에 사용된 시약은 Hammarsten casein (USB, Cleveland, Ohio, USA), trichloroacetic acid (Sigma), Folin-Ciocalteu reagent (Sigma), sodium carbonate (Samchun) 등을 사용하였다. 단백질의 침전에는 HPLC급 acetone (SK chemical, Ulsan, Korea)을 사용하였다.</p> <h2>Protease 생산 균주의 분리 및 동정</h2> <p>본 연구에 사용된 해수는 부산 해수욕장 일대에서 얻어 이를 멸균된 중류수로 \( 10^{-5} \) 으로 희석하고 고체배지에 도말하여 균주를 분리하였다. Protease를 생산하는 균주를 분리하기 위한 배지로는 LB 고체배지를 기본으로 하여 \( 0.5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) skim milk를 첨가하여 사용하였다. 균주의 동정을 위해 그람 염색법으로 형태적 특성을 확인하였다. \( 16 \mathrm{~S} \mathrm{rDNA} \) 분석을 위해 universal forward primer bact_F (\( 5 \)'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-\(3 \)')와 universal reverse primer bact_R (\( 5 \)'-ACGCTACCTTGTTACGACTT-\(3 \)')를 사용하여 PCR 하였다. 증폭 된 PCR 산물은 GeneAll PCR SV (Seoul, Korea)를 이용하여 정제하여 코스모진텍(Seoul, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰 하였다. 염기서열간의 유사도를 확인하기 위하여 The National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 제공하는 Advanced Blast Search 프로그램을 통하여 GenBank에 보고된 유사 균주의 염기서열과 비교하여 계통분류학적 유연관계를 분석하였다.</p> <h2>Protease의 활성 측정</h2> <p>Protease 활성은 Kunitz의 casein hydrolysis 법을 변형하여 측정 하였다. 기질용액은 \( 6 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) Hammersten casein을 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-\( \mathrm{HCl} \) 완충액 \( (\mathrm{pH} 9.0) \)에 녹여 기질로 사용하였다.조효소액은 \( 2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) skim milk와 \( 1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) \( \mathrm{NaCl} \) 이 포함된 LB broth에서 \(48 \)시간 동안 배양한 뒤, \( 13,000 \mathrm{rpm} \) 으로 \(5 \)분간 원심분리하여 얻었다. \( 50 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) 완충액 \( (\mathrm{pH} 9.0)\) \( 40 \mathrm{yl} \)에 조호소액 \( 50 \mathrm{yl} \)와 \( 6 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) casein ( \( \mathrm{pH} 9.0) \) \( 50 \mathrm{yl} \)를 가하 여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 1 \)시간 동안 반응시킨 후, \( 750 \mathrm{yl} \)의 TCA solution (\( 0.1 \mathrm{M} \)trichloroacetic acid, \( 0.22 \mathrm{M} \) sodium acetate, \( 0.33 \mathrm{M} \) acetic acid)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응액을 \( 13,000 \) \( \mathrm{rpm} \) 에서 \(15 \)분 동안 원심분리 한 후, 상충맥 80 씨에 200 p11의(\( 0.1 \mathrm{M} \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 와 \( 50 \mathrm{yl} \)의 \( 1 \mathrm{~N} \) Folin-Ciocalteu reagent를 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 30 \) 분 동안 반응하였다. VERSAmax microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, California, USA)를 이용하여 OD \( 66 \mathrm{~nm} \)에서 반응액의 흡광도를 측정하였다. \(1 \) unit의 효소 활성도는 위의 조건에서 \( 1 \) 분 동안 \( 1 \mathrm{uM} \) tyrosine 에 해당하는 아미노산을 생성하는 효소의 양으로 하였다. 단백질의 농도는 Bradford의 방법으로 측정하였다.</p> <h2>배양 시간과 \( \mathrm{NaCl} \) 농도의 영향</h2> <p>최적 배양시간을 확인하기 휘해 protease 생산배지에 균주 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 를 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) shaking incubator에서 배양하면서 \( 12 \) 시간에서 \( 72 \) 시간까지 \( 12 \) 시간 간격으로 시료를 얻었다. 또한 \( \mathrm{NaCl} \) 농도에 대한 영향을 확인하기 위해 protease 생산배지에 \( 1,3,7 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 의 \( \mathrm{NaCl} \) 을 첨가하고 균주 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 를 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 48 \) 시간까지 배양하면서 12 시간 간격으로 시료를 얻었다. OD \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서의 흡광도를 측정하여 균주의 성장을 조사하였으며 protease 활성 측정을 통해 효소의 생산을 조사하였다.</p>