Gateway system을 이용하여 감자 형질전환용 vector를 제작하고, Agrobacterium tumefaciens LBA4404에 도입한 뒤 감자(수미)에 전파하여 감자 형질전환을 시도하였다. 형질전환 식물체로부터 total RNA를 분리하여 cDNA 합성에 이용한 후 RT-PCR을 수행하였으며, PCR산물은 \( 1 \% \) agarose gel에서 전기영동 후 StACRE를 과발현시킨 형질 전환 식물체의 과발현 여부를 검증하였다.
<h2>식물형질전환용 Vector 제작 및 감자 형질전환</h2> <p>감자 형질전환용 과발현 vector를 제작하기 위하여 Gateway system (Invitrogen, CA)을 이용하였으며, Table 1의 StACRE-attB1과 StACRE-attB2 primer를 이용하여 1차 PCR을 수행한 후 Table 1의 attB1 and attB2 adaptor primer를 이용하여 2차 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 BP Clonase II(Invitrogen, CA)를 이용하여 pDONR201 vector에 클로닝하고 LR Clonase II (Invitrigen, CA)를 이용하여 35S 프로모터와 bar 표지를 포함하고 있는 pB7WG2D 벡터에 삽입하여 pB7WG2D/StACRE 벡터를 제작하였다. 제작된 pB7WG2D/StACRE 벡터를 Agrobacterium tumefaciens LBA4404 에 도입한 다음 감자(품종: 수미)에 형질전환 하였다. MS 배지에서 4주간 배양한 수미감자의 분열조직을 제외한 줄기를 \( 5 \mathrm { ~cm } \) 씩 절단하여 PreM 배지에서 1 일간 전 배양한 후 \( 50 \mathrm { ppm } \) 의 Spectinomycin (Duchefa, Haarlem)이 함유된 YEP broth에서 pB7WG2D/StACRE 를 함유한 Agrobacterium tumefaciens LBA4404를 OD \( 600=2.0 \) 되게 배양하여 30분간 감염 시킨 후 물기를 제거하고 PreM 배지에서 4 일간 배양 후 cefotaxim(Duchefa, Haarlem)이 함유된 증류수로 줄기에 자란 균을 제거하고 callus 유도배지에서 3주간 배양하여 callus를 유도하고 유도된 callus를 잘라내어 새로운 phosphinothricin(Duchefa, Haarlem)이 함유된 callus 유도 배지에 옮겨 2주간 배양한 후 phosphinothricin이 함유된 줄기 유도배지로 옮겨 10주간 배양하여 줄기를 유도하였다. 유도된 줄기를 phosphi-nothricin이 함유된 뿌리유도 배지에 옮겨 4 주간 배양하여 뿌리를 유도하면서 형질전환체를 선별하였다.</p> <h2>RT-PCR 검정</h2> <p>StACRE를 과발현시킨 형질 전환 식물체의 과발현 여부를 검정하기위해 형질전환 식물체로부터 앞서 기술한 방법으로 total RNA를 분리하여 cDNA 합성에 이용하였다. 우선, total RNA에 DNase I (deoxyribonuclease I, Sigma, Saint Louis)을 상온에서 15 분간 처리한 후, \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분간 불활성화시켰다. \( 1 \mu \mathrm { l } \) 의 역전사효소 SuperScript III (200 units/ \( \mu \mathrm { l } \), Invitrogen, CA), \( 3 \mu \mathrm { g } \) 의 total RNA와 oligo (dT) 20 primer를 함께 넣어 최종 \( 20 \mu \)의 반응 혼합물에서 First-strand cDNA를 합성한 후 RT-PCR을 수행하였다. 합성한 \( 1 \mu 1 \) 의 First-strand cDNA와 rTaq polymerse ( 5 units/ \( \mu \) l, Takara)를 사용하였으며, \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2 분 동안 예열 후, \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초, \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분 동안 25 cycles을 수행하였고, 마지막 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10분간 증폭을 수행하였다. PCR산물은 \( 1 \% \) agarose gel에서 전기영동 후 관찰 하였다. Internal control로는 감자의 tubulin 유전자를 사용하였다.</p>