pichia 발현을 통해 PK5를 가용성 형태로 배지에 분비되도록 발현시킨 후, 배양액을 정제하여 PK5를 효율적으로 생산할 수 있다. 정제한 재조합 PK5가 일차 배양한 내피세포의 이동에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다. PK5 가 이동인자와 관계없이 내피세포 이동을 효과적으로 저해하는 것을 알 수 있었다. 내피 세포 이동 억제 효과는 E.coli에서 발현하여, denaturation, 정제, in vitro refolding 과정을 거쳐 얻은 PK5를 500 \mathrm{nM}500nM 의 농도로 처리했을 때에도 관찰되었다. PK5는 PK4와 같이 lysine 결합 능력을 갖고 있고 동일한 kringle 구조를 가졌으나, 세포 증식 억제 효과와, 세포 이동 억제 효과를 동시에 보이는 점이 PK4와 다른 점이다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>P. pastoris에서 재조합 PK5의 발현 및 정제</h2> <p>Kringle로서 가장 강력하게 내피세포 증식을 억제하는 것으로 알려진 PK5 를 재조합 단백질로 발현하기 위하여, Thr456부터 Phe546에 이르는 plasminogen의 서열을 암호화하는 cDNA 부분에 대해 PCR 증폭을 수행하여 pPICZa-C 벡터의 Cla I-Xba I. site에 in frame으로 클로닝하였다. 제한효소 Cla I, Xba I 으로 잘랐을 때-삽입된 DNA가 \(258 \mathrm{bp}\) 크기임을 확인하였고, 염기서열을 조사하였을 때 PK5 서열이 정확함을 확인하였다. Sacl으로 자른 재조합 플라스미드를 P. pastoris GS115에 electrophoration하는 방법으로 형질도입 시키고 고농도 \( (1000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 의 Zeocin이 포함된 YPD 평판에서 배양하였을 때 약 55개의 단일 군체가 형성되었다. 높은 수율로 단백질을 발현하는 단일 군체를 선별하기 위해서 4 일간 BMMH 배지에 \( 0.5 \% \) 가 되도록 메탄올을 첨가하여 단백질 발현을 유도한 후 군체가 분비한 단백질을 함유한 배양한 후, \( 400 \mathrm{ml} \) BMMH 배지로 교환하여 96 시간 동안 메탄올 유도를 실시한 후, 얻은 배양액을 농축하였고, 투석 후 S-spin 컬럼을 이용하여 정제하였다. 최종적으로 정제한 단백질은 Bicinchoninic acid assay 분석에 의해 약 \( 26 \mathrm{mg} \) 얻어진 것을 확인하였다. SDS-PAGE상에서 Coomassie blue 염색에 의해 확인하였을 때, 한 개의 major 단백질 밴드만 보여 정제시 비특이 결합에 의한 불순 단백질은 관찰되지 않았고, 비환원 조건에서 이동한 단백질 밴드가 약 \(10 \mathrm{kDa} \) 예상 크기 부분에서 나타났고, 환원 조건에서는 좀 더 느리게 이동함을 관찰하였다. 이황화 결합 파괴에 의한 환원 조건에서 단백질 이동이 느린 것으로 볼 때, 재조합단백질의 이황화 결합이 유지된 것을 확인할 수 있었다. 선행 연구를 통해서도 구조가 유사한 urokinase kirngle domain 을 효율적으로 Pichia 발현 시스템을 통해 발현하여 보고한 바가 있어 kringle 구조가 효모에서 효율적으로 발현됨을 알 수 있다. 또한 PK5를 대장균에서 발현 시켰을 때 inclusion body를 형성하므로, 시간, 노동을 요구하는 in vitro refolding 과정이 필수적으로 요구된다. 따라서, pichia 발현을 통해 PK5를 가용성 형태로 배지에 분비되도록 발현시킨 후, 배양액을 정제하는 방법은 PK5를 효율적으로 생산할 수 있는 길을 제시한다 하겠다.</p> <h2>PK5의 내피세포 이동에 대한 억제 효과</h2> <p>정제한 재조합 PK5가 일차 배양한 내피세포의 이동에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다. 먼저, wound migration assay에서 bFGF에 의해 유도된 내피세포 이동에 대한 효과를 보았을 때, 정제된 재조합 PK5가 \(1-1000 \mathrm{nM}\) 농도 범위에서 농도 의존적으로 이동을 억제 하였다. 또한 modified Boyden-chamber assay를 실시하여 VEGF에 의한 chemotaxtic motility에 대한 재조합 PK5의 효과를 조사하였을 때, 강력하게 HUVEC 의 이동을 억제함을 관찰할 수 있었다. 두 assay 방법에서 \( \mathrm{IC}_{50} \) (최대 저해 효과의 \( 50 \% \) 를 나타내는 농도)는 대략 \( 500 \mathrm{nM} \) 로 추정되었다. 따라서, PK5 가 이동인자와 관계없이 내피세포 이동을 효과적으로 저해하는 것을 알 수 있었다. 이러한 내피 세포 이동 억제 효과는 E.coli에서 발현하여, denaturation, 정제, in vitro refolding 과정을 거쳐 얻은 PK5를 \( 500 \mathrm{nM} \) 의 농도로 처리했을 때에도 관찰되었다(data not shown). Urokinase kringle도 PK5와 마찬가지로 내피세포의 이동을 성장인자에 따른 차별성을 보이지 않고 VEGF 또는 uPA가 유도한 HUVEC의 이동을 억제한다. 흥미로운 것은 lysine binding 능력이 있는 PK4 domain의 경우 세포 증식 억제 효과는 없으나, 세포 이동 효과는 강력한 것으로 보고된 바 있다. PK5 의 경우엔 lysine 결합 능력을 갖고 있고 동일한 kringle 구조를 가졌어도 세포 증식 억제 효과와, 세포 이동 억제 효과를 동시에 보이므로 PK4와는 차별성이 보인다. 이는 3차원적 구조는 유사하더라도 아미노산 서열 동일성이 \( 52.5 \% \) 이므로, 두 krin-gle 간의 증식과 이동 억제에 작용하는 기능적 motif에 차이가 있을 것으로 예상되며, 이것이 무엇인지 밝혀 보는 것은 중요할 것 같다.</p>