Pediococci의 선택적 선발을 위해 발효 초기의 김치에서 16균주를 동정하여, 적숙기 김치에서 12종, 후숙기 김치에서 15종의 존재를 확인하였다. 예상과 달리, 공시 균주의 배지평가 결과 \( \mathrm { PSM } + \mathrm { A } \) 한천배지에서 \( Lb \). curvatus 외에도 \( W \). koreensis, \( Lb \). brevis, \( Lb \). sakei의 생육이 나타났으며, 따라서 \( \mathrm { PSM } + \mathrm { A } \)는 사용할 수 없음을 확인하였다. 이는 동종 미생물 간에도 균주에 따른 항생물질저항성에 차이가 있어 김치로부터 분리된 lactobacilli균주 중 다수가 기존 lactobacilli들보다 저항성이 높은 것으로 보인다. 연구 결과 발효침채류에서의 pediococci의 선택적 선발에 \( \mathrm { PSM } + \mathrm { A } \)는 비효율적이며, pediococci가 김치발효에 관련이 깊은 물질이며 김치발효의 적숙기에 김치미생물 군집 내에서 차지하는 비중이 가장 높은 것으로 확인하였다.
<h2>\( \mathrm { PSM } + \mathrm { A } \) 및 \( \mathrm { PES } \) 한천배지를 이용한 김치 유래 pediococci 검출</h2> <p>두 배지를 사용하여 김치에 존재하는 pediococci의 검출을 시도한다면 유제품 발효에 관여하는 \( Lb \). casei나 \( S \). thermophilus와 포도주의 malolactic fermentation에 관여하는 \( O \). oeni의 검출은 거의 없을 것으로 예상되지만, \( \mathrm { PSM } + \mathrm { A } \) 한천배지에서 생육한 균주들 중, \( \mathrm { PES } \) 한천배지를 이용하여 leuconostocs를 제외시키더라도 김치발효에 관여하는 Lb. curvatus의 혼입이 발생할 것으로 예상된다. \( L b \). curvatus의 혼입을 저지하기 위하여 lactobacilli의 생육저해에 대한 효과가 보고된 ampicillin을 Simpson 등이 사용한 양보다 2배 높여 \( 2 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 로 첨가한 \( \mathrm { PSM } + \mathrm { A } \) 한천배지를 사용한 결과, \( Lb \). casei는 저해되었지만 \( Lb \). curvatus는 저해되지 않은 반면 \( P \). pentosaceus의 생육이 저해되어 ampicillin의 증량으로 \( Lb \). curvatus의 흔입에 대한 문제점이 해결되지 않는 것으로 나타났다. 그러나 김치유산균 연구에서 \( \mathrm { PSM } + \mathrm { A } \)의 적용 가능성 검토를 위하여 \( P \). pentosaceus의 생육을 저해하지 않는 범위에 ampicillin \( (1.5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \) 을 첨가한 \( \mathrm { PSM } + \mathrm { A } \) 한천배지를 이용하여 1차 선발을 수행하였다. 배추김치는 실험실에서 제조한 다음, \( 15 ^ {\circ } \) 에서 보존하면서 발효진행에 따라 초기, 적숙기, 후숙기 시점으로 예상되는 2일, 7일, 15일에 Pediococcus 속 유산균 검출을 위한 시료로 사용하였다. 시료는 멸균된 거즈로 여과한 후, 생리식염수로 적당히 희석하여 약 200 colony가 형성되도록 1차 선발배지인 \( \mathrm { PSM } + \mathrm { A } \) 한천배지에 도말하였다. 발효 초기, 적숙기, 후숙기 김치로부터 각각 \( 110,87,77 \) 균주를 선발하였고, 이들 균주 중 leuconostocs의 선별을 위해 2차 선발배지인 \( \mathrm { PES } \) 한천배지에서 선발 균주의 생장 및 다당 생성을 확인하였다. 발효 초기의 김치에서 110균주 중 10균주, 적숙기의 김치 87균주 중 7균주가 다당을 생성하여 leuconostocs로 추정되었지만 후숙기의 김치에서는 다당 생성균이 검출되지 않았다. 이는 기존의 김치미생물 연구에서 보고된 leuconostocs가 초기 김치발효. 관련의 주요 유산균이라는 보고와 일치한다. 각 발효단계에 leuconostocs를 제외하고 선발된 균주는 colony 형상에 따라 8개 그룹으로 나누고, 각 그룹별로 2개씩 충 16개 균주의 \( 16 \mathrm { ~S } \) rDNA 염기서열을 견정하여 동정하였다. 선발 균주의 \( 16 \mathrm { ~S } \mathrm { rDNA } \)의 \( \mathrm { PCR } \) 증폭을 위한 primer는 본 연구자들이 기존에 사용한 universal primer(16F: 5'-GAA CGC TGG CGG CGN GCY T-3'; 16R: 5'-TGA CGG GCG GTG TGT ACA AG-3')를 사용하였다. 선발 균주의 total DNA는 MRS 액체배지에서 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } , 24 \) 시간 배양한 균체로부터 DNeasy \( { } ^ {\circledR } \) tissue kit(Qiagen, Germany)을 사용하여 추출하였다. PCR 반응에는 UNO II thermal cycler(Biometra,Germany)를 사용하였으며, \( 100 \mu \mathrm { L } \) 반응계에는 \( 20 \mathrm { ng } \) DNA, \( 0.25 \mathrm { mM } \) dNTP, 1 U Taq polymerase(Roche, Germany)및 \( 20 \mathrm { pmol } \)의 primer를 첨가하였다. 반응조건은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분 예비가열 후, \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } 1 \) 분간 변성, \( 69 ^ {\circ } \mathrm { C } 1 \)분 annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)분 합성의 과정을 30회 반복하여 수행하였다. PCR에 의하여 중폭된 단편은 전기영동한 다음, \( 0.8 \% \) agarose gel로부터 Solutions gel extraction kit(SolGent, Korea)을 사용하여 회수하였고, pGEM-T Easy vector(Promega, USA)에 cloning하였다. 재조합 plasmid에 삽입된 단편의 염기서열은 수탁업체 (SolGent)에 의뢰하여 결정하였다. 결정된 염기서열은 nucleotide blast search(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 이용하여 기존에 보고된 미생물과의 상동성 비교를 통하여 동정하였다. 발효 초기 김치에서 선발된 16균주는 모두 W. koreensis로 동정되었고, 적숙기 김치에서는 12종의 \( Lb \). brevis, 2종의 \( Lb \). sakei, 2 종의 \( P \). pentosaceus의 존재가 확인되었으며, 후숙기 김치에서는 15종의 \( Lb \). sakei, 1종의 \( Lb \). curvatus 존재가 확인되었다. 공시 균주를 이용한 배지평가 겹과에 따른 예상과는 달리 \( Lb \). curvatus 외에도 \( W \). koreensis, \( Lb \). brevis, \( Lb \). sakei의 생육이 \( \mathrm { PSM } + \mathrm { A } \) 한천배지에서 나타남에 따라, 김치를 비롯한 발효침채류의 발효에 관여하는 pediococci의 선택적 선발에는 \( \mathrm { PSM } + \mathrm { A } \)가 사용될 수 없음이 재확인되었다. 배지평가에서 \( Lb \). brevis와 \( Lb \). sakei가 생육하지 않았음에노 불구하고 \( \mathrm { PSM } + \mathrm { A } \) 한천배지에서 생장하는 이들 균주가 분리되는 것으로 보아 같은 종의 미생물에서도 균주에 따라 항생물질저항성에 차이가 있음이 시사되었고, 김치로부터 분리된 lactobacilli 균주 중의 많은 수가 novobiocin, vancomycin, ampicillin에 대해 기존에 보고된 lactobacilli들보다 높은 저항성을 가지고 있는 것으로 추측된다. 발효단계 별로 동정된 소수의 균주들의 결과를 기준으로, 김치 숙성과정 중의 유산균 천이를 논하기에는 다소 무리가 있지만, 본 실험의 결과는 2000년 이후에 진행된 분자생물학적 방법으로 도출된 결과들과 크게 다르지 않다. 이들 결과에 따르면 W. koreensis는 발효 초기에서 중기에 걸쳐, \( Lb \). sakei와 \( Lb \). brevis, \( Lb \). curvatus는 발효 후기에 우점하고, \( Lb \). brevis와 \( Lb \). curvatus는 \( Lb \). sakei에 비해 소수로 존재하는 것으로 보고되었다. 본 연구에서는 적숙기에 \( L b \). brevis가 Lb. sakei에 비해 우점적으로 검출되기는 하였지만, 이러한 결과는 김치의 발효온도가 다소 높은 \( 15 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 진행되어 \( Lb \). sakei에 비해 \( Lb \). brevis가 선택적으로 생장했을 가능성이 있으며, 항생물질 내성이 강한 균주들의 선택적 증식으로 추정된다. 선택배지와 고전적 동정법에 의해서 진행된 2000년 이전의 김치미생물 연구에 따르면 김치 유래 pediococci는 발효 적숙기에 증가했다가 후기에 급속히 감소하는 것으로 보고되었고, Bae 등이 microarray를 이용하여 김치유산균을 검출한 연구에서도 \( P \). pentosaceus가 적숙기 이후에 많이 검출되는 것으로 보고되었다. 본 연구에서도 \( P \) pentosaceus의 검출시점이 김치발효 적숙기인 것으로 확인되어, pediococci가 김치미생물 군집 내에서 차지하는 비중은 lactobacilli에 비해 크지 않지만 적숙기에 최고점에 달하는 것으로 추정된다. 본 연구는 leuconostocs가 크게 관여하는 발효침채류에 존재하는 pediococci의 선택적 검출에 \( \mathrm { PSM } + \mathrm { A } \)가 유용하지 않음을 규명하였고, pediococci의 김치발효 관련성 및 발효과정 중의 증식 단계 예측에 도움을 주었다는 측면에서 그 의의를 찾을 수 있다.</p>