본 실험에 사용된 amylosucrase는 대장균을 이용하여 재조합 단백질의 형태로 생산하였으며, 사용된 폴리페놀은 부산대학교 노화 조직 은행에서 분양받았고, zingerone은 Sigma에서 구매하여 사용하였으며 Amylosucrase의 활성은 \( 40 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 sucrose를 기질로 하여 측정하였다. Amylosucrase의 배당체 합성 시 수용체인 폴리페놀의 구조적 특징에 따른 전이능을 확인하기 위해, 공여체와 수용체의 비율을 \( 1: 1(\mathrm{~mol} / \mathrm{mol}) \) 로 하여 공여체로 \( 25 \mathrm{mM} \) sucrose와 수용체로 aesculin, arbutin, vanillin, 그리고 zingerone을 각각 \( 25 \mathrm{mM} \) 로 첨가하여 전이 반응을 유도하였으며, 반응시간에 따른 배당체 합성 정도를 측정하기 위해 위와 같은 조건에서 \( 20 \mathrm{mM} \) sucrose와 \( 20 \mathrm{mM} \) aescu-lin을 공여체와 수용체로 각각 반응 하였고, 0,6,12,18, 그리고 24 시간 전이 반응 후 전이 산물을 Thin layer chromatography(TLC)로 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>본 실험에 사용된 amylosucrase는 대장균을 이용하여 재조합 단백질의 형태로 생산하였으며, 사용된 폴리페놀 중 aloin, baicalein, cinnamic acid, ferulic acid, 4-hydroxycin-namic acid, hesperidin, linalool, morin, rutin, silymarin 그리고 theophylline은 부산대학교 노화 조직 은행에서 분양받았고, aesculin, arbutin, baicalin, caffeic acid, polydatin, resver-atrol, vanillin, 그리고 zingerone은 Sigma에서 구매하였다. 또한 salicin은 Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA)에서 구매하였으며, aesculetin은 부산대학교 한의학 전문대학원 하기태 교수 연구실에서 분양받아 사용하였다. 사용한 폴리페놀 화합물들은 Table 1에 정리하였다.</p> <h2>효소 활성 측정</h2> <p>Amylosucrase의 활성은 \( 40 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 sucrose를 기질로 하여 측정하였다. 반응액은 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-HCl buffer \( (\mathrm{pH} \) 8.0)를 사용하였고, 효소액을 첨가하여 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 반응하였다. 효소반응 후, 생성된 fructose의 양은 3,5-dintrosalicylic acid(DNS) 방법 을 이용하여 측정하였다. 효소의 1 unit는 분당 \( 1 \mu \mathrm{mol} \) 의 fructose를 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.</p> <h2>당 전이 반응을 통한 배당체의 합성</h2> <p>Amylosucrase의 배당체 합성 시 수용체인 폴리페놀의 구조적 특징에 따른 전이능을 확인하기 위해, 공여체와 수용체의 비율을 \( 1: 1(\mathrm{~mol} / \mathrm{mol}) \) 로 하여 공여체로 \( 25 \mathrm{mM} \) sucrose와 수용체로 aesculin, arbutin, vanillin, 그리고 zingerone을 각각 \( 25 \mathrm{mM} \) 로 첨가하여 전이 반응을 유도하였다. 반응액은 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-HCl buffer \( (\mathrm{pH} \) 8.0)를 사용하였고 효소는 반응액 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 당 \( 70 \mu \mathrm{g} \) 을 첨가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12 시간 동안 전이 반응을 유도하였다. 반응시간에 따른 배당체 합성 정도를 측정하기 위해 위와 같은 조건에서 \( 20 \mathrm{mM} \) sucrose와 \( 20 \mathrm{mM} \) aescu-lin을 공여체와 수용체로 각각 반응 하였고, 0,6,12,18, 그리고 24 시간 전이 반응 후 전이 산물을 Thin layer chromatography(TLC)로 확인하였다.</p> <h2>반응산물의 TLC 분석</h2> <p>당 전이 산물의 확인과 분석은 TLC를 이용하였다. TLC는 Whatman K6F silica gel plates (Whatman, Maidstone, UK)를 사용하였으며, 전개용매로 butanol/ethanol/water를 5:3:2\( (\mathrm{v} / \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 로 혼합하여 사용하였다. TLC plate에 전이 반응액 1\( \mu \mathrm{l} \) 을 점적 후에 건조시키고, 전개용액에 넣어 일정 시간 동안 전개한 후, 공기 중에서 다시 건조 시켰다. 건조된 plate는 \( 254 \mathrm{~nm} \) 와 \( 366 \mathrm{~nm} \) 파장에서 폴리페놀이 갖는 ring 구조의 발광을 통해 전이산물을 확인하였다. 또한 건조된 plate를 \( 0.3 \% \)(w/v) N-(1-naphthyl)-ethylenediamine과 \( 5 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 를 포함하는 methanol 용액에 빠르게 담근 후 완전히 건조한 다음, \( 110^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 구워 전이 반응을 분석하였다.</p>