된장은 화영식품 주식회사로부터 구매하여 동결 건조한 다음 분말 \( (4080 \mathrm{~g}) \) 로 만들었고 헥산으로 3회 추출하고 잔사물(3975\( \mathrm{g} \) )을 2배의 메탄올로 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 환류냉각기를 활용하여 3회 추출한다. Salmonella typhimurium TA100은 S.typhimurium LT-2의 histidine auxotroph로서 미국 California 대학의 B.N. Ames 박사에게 공급받아 주기적으로 histidine 요구성, deep rough (rfa) 돌연변이, \( u v r \mathrm{~B} \) 돌연변이, R factor 등의 유전상태를 확인하면서 실험에 활용한다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>된장의 용매 추출 및 분획</h2> <p>된장은 화영식품(주)으로부터 구입하여 동결 건조한 후 분말 \( (4080 \mathrm{~g}) \) 로 만들었고 헥산으로 3회 추출하고 잔사물(3975\( \mathrm{g} \) )을 2 배의 메탄올로 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 환류냉각기를 사용하여 3회 추출(836 g)하였다. 회전식 진공 농축기(Buchi, Switzerland)를 이용하여 농축한 후, 다시 디클로로메탄(dichloromethane,\( \mathrm{CH}_{2} \mathrm{Cl}_{2} \) ), 에틸아세테이트(ethylacetate, EtOAc) 및 부탄을(Butanol, \( \mathrm{BuOH}) \) 순서로 분획깔때기를 이용하여 분획한 후 회전식 진공 농축기로 용매를 제거하고 각각 디클로로메탄 분획물 \( (104 \mathrm{~g}) \), 에틸아세테이트 분획물 \( (27 \mathrm{~g}) \), 부탄올 분획물\( (91 \mathrm{~g}) \) 및 물 분획물 \( (614 \mathrm{~g}) \) 을 얻었다. 각각의 분획물은 회전식 진공 농축기로 완전히 용매를 제거 한 후 dimethylsulfur-oxide (DMSO)에 녹여 실험에 사용하였다.</p> <h2>Ames 돌연변이 유발실험</h2> <p>Salmonella typhimurium TA100은 S. typhimurium LT-2의 histidine auxotroph로서 미국 California 대학의 B.N. Ames 박사로부터 제공받아 정기적으로 histidine 요구성, deep rough (rfa) 돌연변이, \( u v r \mathrm{~B} \) 돌연변이, R factor 등의 유전형질을 확인하면서 실험에 사용하였다. 간접 돌연변이 유발물질인 alflatoxin \( \left(\mathrm{AFB}_{1}\right) \) 은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA 에서 구입하여 DMSO 에 녹여 실험에 사용하였고 직접 돌연변이원인 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG)는 Sigma Chemical Co.에서 구입하여 증류수에 녹여 실험에 사용하였다. 간접돌연변이원인 \( \mathrm{AFB}_{1} \) 의 경우 활성화를 위하여 Maron과 Ames의 방법에 따라 S9 mixture 를 첨가하였다. 항돌연변이 실험은 미리 건열 멸균시킨 glass cap tube에 S9 mix 혹은 phosphate buffered saline (PBS) \( 0.5 \) \( \mathrm{ml} \), 하룻밤 배양된 균주 \( 0.1 \mathrm{ml}\left(1 \sim 2 \times 10^{9}\right. \) cells/ \( \left.\mathrm{ml}\right) \) 와 돌연변이 유발물질 \( (50 \mu \mathrm{l}) \) 을 가한 후, 시료를 \( 1.25 \mathrm{mg} / \) plate 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 분간 예비 배양한 다음 histidine/biotin이 첨가된 top agar \( \left(45^{\circ} \mathrm{C}\right) 2 \mathrm{ml} \) 씩을 가하고 vortex하여 minimal glucose agar plate에 도말하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48 시간 배양한 후 revertant 숫자를 계수하였다. 돌연변이 억제효과의 정도(in-hibition rate)는 아래식에 의해 계산하였다.</p> <p>Inhibition rate \( (\%)=100 \times[(a-b) /(a-c)] \)</p> <p>여기서 a는 돌연변이원에 의해 유도된 복귀돌연변이원수, b는 시료를 처리하였을 때의 복귀돌연변이의 수이며, c는 돌연변이원과 시료가 없을 경우의 자연복귀돌연변이원의 수이다.</p>