DNS법을 이용하여 agarase 활성을 측정하였다. 가열한 후 반응온도까지 냉각한 후 기질용액과 조효소액을 첨가하여 30분간 반응시킨 후 DNS solution을 첨가하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 가열한 후 흡광도를 측정하여 한천 분해 효소의 활성을 1 unit \((U)\)으로 나타냈다. 반응온도에 따른 한천분해효소 활성을 보기 위해 \( 0.2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 agarose가 포함된 표준 기질용액으로 \(20-70^\circ \mathrm{C}\)의 온도별로 한천분해 효소의 활성을 비교하였다. \( \mathrm{pH}\)에 따른 한천분해 효소의 활성을 측정하기 위해 각 완충용액의 \(\mathrm{pH}\)를 바꿔가며 실험하였다.
<h2>효소활성 측정</h2> <p>Agarase 활성은 DNS법을 이용하여 측정하였다. DNS법은 3,5-dinitrosalicylic acid method의 변형법으로 환원당을 측정하는 방법이다. DNS solution은 \( \mathrm{NaOH} 13.2 \mathrm{~g} \), 3,6-dini-trosalicylic acid \( 7.07 \mathrm{~g} \), sodium sulfate \( 5.53 \mathrm{~g} \), potassium tar-trate (Rochelle salt) \( 204 \mathrm{~g} \), phenol \( 5.07 \mathrm{~g} \)을 증류수 1,000 ml에 녹여서 제조하였다. 최종농도 \( 0.2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 agarose가 포함된 완충용액을 중탕 가열한 후 반응온도까지 냉각하고 반응수조를 이용하여 온도를 유지하면서 기질용액 \( 1 \mathrm{ml} \)에 조효소액 \( 0.5 \mathrm{ml} \)을 첨가하여 30분간 반응시킨 후 효소활성을 측정하였다. \( 1 \mathrm{ml} \)의 효소 반응액에 \( 3 \mathrm{ml} \)의 DNS solution을 첨가하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 가열한 후 \( 550 \mathrm{~nm} \)의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준적정곡선으로 D-galactose를 사용하였다. 한천 분해 효소의 활성은 1 분당 \( 1 \mu \mathrm{M} \)의 galactose를 생산하는 한천 분해 효소의 양을 1 unit (U)으로 나타내었다.</p> <h2>반응온도에 따른 한천분해 효소의 활성측정</h2> <p>조효소액을 이용하여 온도에 따른 한천분해효소의 활성을 비교하였다. 표준 기질용액으로는 \( 0.2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 agarose가 포함된 \( 20 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} 7.0) \) 완충용액을 이용하였다. 기질 용액을 중탕 가열한 후 \( 20-70^{\circ} \mathrm{C} \)의 온도별로 냉각한 후 효소활성을 측정하였다.</p> <h2>\( \mathrm{pH} \)에 따른 한천분해 효소의 활성측정</h2> <p>\( \mathrm{pH} \)에 따른 한천분해 효소의 활성을 측정하기 위하여 20 \( \mathrm{mM} \) sodium acetate 완충용액( \( \mathrm{pH} \) 4.0-5.0), \( 20 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) 완충용액( \( \mathrm{pH} \) 5.0-8.0), \( 20 \mathrm{mM} \) GTA (3,3-dimethyl-glutamic acid, Tris (hydroxymethyl)-aminomethane, 2-amino-2-meth-yl-1,3-propanediol) 완충용액 \( (\mathrm{pH} \) 8.0-9.0)을 이용하였다. 각 완충용액에 최종농도 \( 0.2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 agarose를 첨가하고 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 효소활성을 측정하였다.</p> <h2>한천분해 효소의 열안정성 측정</h2> <p>조효소액을 이용하여 온도별 노출시간에 따른 한천분해효소의 잔존활성을 비교하였다. 표준 기질용액으로는 \( 0.2 \%(\mathrm{w} / \) \( \mathrm{v}) \)의 agarose가 포함된 \( 20 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} 7.0) \) 완충용액을 이용하였다. 조효소액 \( 0.5 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 각 온도별로 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 시간 열처리한 후, \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 효소활성을 측정하였다. 측정된 효소활성은 열처리하지 않은 효소활성과 비교하였다.</p> <h2>한천가수분해산물의 thin-layer chromatography (TLC) 분석</h2> <p>조효소액을 이용한 agarose의 분해산물을 TLC로 분석하였다. 조효소액과 \( 0.2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 agarose가 포함된 \( 20 \mathrm{mM} \) Tris-\( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} 7.0) \) 완충용액을 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 0, 0.25, 0.5, 1, 6, 12, 24시간 반응시킨 후, Silica gel 60 TLC plate (Merck, Darmstadt, Germany)로 분석을 수행하였다. \( n \)-Butanol/acetic acid/ \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) \( (2 / 1 / 1(\mathrm{v} / \mathrm{v} / \mathrm{v})) \)를 이용하여 전개시켰고, \( 10 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \)로 가시화시켰다. 표준물질로는 D-galactose (Sigma) 및 neo-agarooligosaccharides를 사용하였다. TLC에서 나타난 가수분해산물의 농도비율을 계산하기 위하여 Image J 1.44o (Wayne Rasband, Bethesda, USA)프로그램을 이용하여 측정하였다.</p>