본 연구에서는 겨우살이 cDNA를 합성하고, 이를 효모 발현 vector인 pYES2에 삽입하여 재조합 plasmid를 구축하였다. 이를 통해 효율적으로 목적 단백질을 발현시키는 방법을 개발하였다. 이 과정에서 Kozak translation initiation sequence 및 EcoRI, Xbal의 제한효소 site를 포함하는 합 성 oligonucleotide를 primer로 이용하였다. 유전자 산물의 발현을 확인하기 위해 배양 후 균을 세척하고 SDS-PAGE, immunoblotting, ELISA 분석을 실시하였다. 또한, Biotin-dCTP를 사용하여 한국산 겨우살이 lectin A, B 유전자를 PCR 증폭하고, 이를 이용하여 lectin RNA의 발현 여부를 확인하는 dot hybridization을 수행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주 및 배지</h2> <p>화모 형질전환용 plasmid로서 pYES2 (URA3, GAL1 P ::CYC1 T, Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA)를 사용하였으며 E.coli XL1-Blue MRF ' (\(\Delta\)(mcrA)183 \(\Delta\)(mcrCB-hsdMR-mrr)173 endA1 supE44thi-1 recA1 gyra96 relA1 lac[F' proAB lacqZdDM15 Tn10 (Tetr)], Stratagene, La Jolla, CA)과 S. cerevisiae INVSc (MATa, his3\(\Delta\)1, leu2, trp1-289, ura 3-52, Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA)를 형질전환용 및 단백질 발현용 host로 사용하였다. 효모의 transformation 은 LiAc/SS-DNA/PEG의 방법을 사용하였다. 형질 전환 후 유전자 유도발현을 위해 galactose \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 의 양을 첨가한 SC-minimal 배지를 사용하였다. E. coli는 LB 배지에서 선행연구에서와 같은 방법으로 배양하였다.</p> <h2>유전자 재조합 plasmid의 구축</h2> <p>겨우살이 cDNA는 깁 등의 방법에 의해 합성하였으며, 효율적으로 목적단백질을 발현시키기 위해 Kozak translation initiation sequence 및 EcoRI, Xbal의 제한효소 site를 포함한 합성 oligonucleotide를 primer로 이용, 겨우살이 cDNA를 templates로 하여 PCR 증폭으로 lectin A, B 유전자를 효모 발현 vector인 pYES2의 EcoRI, XbaI site에 삽입시켜 한국산 겨우살이 유래 lectin gene 을 포함하는 재조합 plasmid를 구축하였다.</p> <h2>단백질 발현</h2> <p>구축된 유전자 발현 vector를 효모에 형질전환 후 형질전환 균주를 선발하여 vector의 GAL-1 promotor의 유도발현을 위해 galactose 배지에서 각각 12, 24, 36, 48, 60시간으로 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 shaking하여 배양하였다. 배양 후 균을 증류수로 3회 세척한 후 SDS-PAGE에 의한 유전자 산물을 확인하였다.</p> <h2>Lectin A1 및 B1 유전자 산물의 확인</h2> <p>유전자 산물의 발현을 확인하기 위하여 immunoblotting, ELISA 분석을 실시하였다. 떤저 선발된 형질 전환 균주를 산세척한 glass bead로 파쇄한 후 얻어진 cell lysates로 BCA 분석을 통해 세포내 가용성 단백질을 정량한 후 SDS-PAGE, immunoblotting 및 ELISA분석에 의해 유전자 산물을 확인하였다.</p> <p>Immunoblotting 분석에서는 이미 확보된 anti KM lectin rabbit sera 의 polyclonal (3000배 희석) 항체를 사용하였으며 2차항체로는 alkaline phosphatase conjugate-goat anti-rabbit IgG (Sigma, St. Louis, MO)를, 이에 반응하는 기질로서 nitroblue tetrazolium chloride/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (NBT/BCIP, Sigma, St. Louis, MO) 사용하여 목적 단백질 band를 확인하였다. 또한, recombinant KM lectin의 단백질 발현을 정량하기 위하여 ELISA 분석을 실시하였다.</p> <p>겨우살이 lectin에 대한 polyclonal rabbit sera를 3000배 희석한 후 이를 96-well plate에 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 overnight coating한 다음 \(0.05\%\) Tween-20을 함유하는 PBS-T buffer로 3회 세척하였다. 각 well당 200 씨의 block solution (\(5\%\) skim milk, PBS-T)을 가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 동안 blocking한 후 3회 세척을 반복한 다음 효모로부터 추출된 단백질 및 positive control 로써 겨우살이 lectin을 \( 0.1 \sim 2000 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \)의 농도 범위로 PBS buffer에 serial dilution하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 binding시켰다. 3회 세척 반복 후 HRP가 라벨 된 겨우살이의 단일 클론 항체를 detector로써 5000배 희석하여 각 well 당 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 씩 분주한 후 1 시간 동안 binding시킨 다음, 3회 세척 후 \( 100 \mu \mathrm{l} \)의 TMB (Calbiochem co. Cambridge, MA)를 각 well에 첨가하여 실온, 암실에서 30분간 반웅 시켰다. \(50 \mu \mathrm{l} \)의 \( 10 \% \mathrm{~H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \)를 첨가하여 반응을 종료시킨 후 \( 492 \mathrm{~nm} \)에서 그 흡광도를 측정 하였다 (ELx800, microplate leader, Biotek, Winooski, VT).</p> <h2>RT-RCR에 의한 발현 RNA 확인</h2> <p>재조합 겨우살이 lectin 유전자 발현을 확인하기 위해 RT-PCR 및 dot-hybridization을 수행했다. 0시간부터 72시간까지 12시간 간격으로 유도배양 한 재조합효모로부터 total RNA를 추출한 후 이를 oligo(dT)-Primer와 M-MLV 역전사효소(Invitrogen, USA)를 사용하여 역전사시켜 cDNA를 합성하였으며, 이를 주형으로 하여 lectin 유전자에 대한 primer로 PCR하였다. 또한 추출한 재조합효모 total RNA를 Hybond (+) nylon membrane (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 위에 \( 10 \mathrm{ng} \) 씩 spotting한 다음 이를 UV cross-linker (Spectroline, Westbury, NY. USA) 에서 10분간 고정시켰다. Biotin-dCTP를 사용하여 한국산 겨우살이 lectin A, B 유전자를 PCR중폭함으로서 biotin이 라벨 된 lectin유전자를 제작, 이를 lectin RNA의 발현 여부를 확인하는 검출 probe로 사용하는 dot hybridization을 수행하였다.</p>