항돌연변이 활성을 알아보기 위해서 잠재적 생리활성 기능을 가질 것으로 예상되어지는 여러 후보물질들의 경제성 및 간편성 때문에 에틸아세테이트 분획물 \( (\mathrm{EtOAc})\)은 각각 \( 67 \% \)로 가장 높은 항돌연변이 효과를 나타내었으며 중간 분획물과 디클로로메탄 분획물 \( \left(\mathrm{CH}_{2} \mathrm{Cl}_{2}\right) \)은 각각 \( 63 \%\), \(49 \% \)의 돌연변이 저해효과를 직접돌연변이원인 MNNG 의 경우, \( \mathrm{AFB}_{1} \) 에 비해 돌연변이 저해효과가 떨어지지만 그 중에서도 특히 항암제를 대량적으로 신속하게 검토할 수 있다는 장점을 있어서 최근 미국 국립 암 연구소 등지에서 많이 사용되어지고 있는 SRB assay는 호르몬의 비의존형 세포(MDA-MB-231)에서 메탄을 추출물 처리군이 대조군에 비해 apoptosis된 세포가 노란콩, 검은콩 및 현미 추출물에서 모두 유의적 apoptosis가 일어나지 않았으나 유의적으로 증가한 것을 연구로 silica gel 및 thin layer chromatogrphy 등을 이용한 대두 용매 추출물의 정제에 대한 연구가 현재 진행 중이다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Ames test에 의한 항돌연변이 효과</h2> <p>잠재적 생리활성 기능을 가질 것으로 예상되어지는 여러가지 후보물질들의 항돌연변이 활성을 알아보기 위한 방법으로 경제성 및 간편성 때문에 Ames 실험계가 세계적으로 널리 이용되어 왔다. 이에 본 연구에서도 Salmonella typhimurium을 돌연변이 시킨 histidine 요구성 균주인 S. typhimurium TA100 등을 이용하여 균주에 돌연변이물질을 노출시킨 다음 minimal glucose agar plate에 형성된 his+ 복귀 돌연변이의 colony 수를 계수하여 돌연변이 및 항돌연변이성의 유무를 판정하였다. 대두 메탄올 추출물 \( (\mathrm{MeOH}) \) 과 각 분획물들을 실험에 사용한 농도(\( 2.5 \mathrm{mg} / \)plate)에 대한 독성실험을 한 결과 독성이 나타나지 않았다. \( 2.5 \mathrm{mg} / \)plate 농도를 정한 이유는 선행 된 연구에서 기타 식품들로부터 추출된 용매 추출물의 경우 독성이 없는 범위에서 높은 활성을 나타내므로 결정하였다. 대두를 먼저 헥산(Hex)으로 지방을 제거한 후 메탄올로 추출한 추출물에서 항돌연변이성 물질을 분리하기 위해 극성이 다른 용매인 디클로로메탄 \(\left(\mathrm{CH}_{2} \mathrm{Cl}_{2}\right) \), 에틸아세테이트\( (\mathrm{EtOAc})\), 부탄올( \( \left.\mathrm{BuOH}\right) \)로 분획하여 각 분획물의 항돌연변이 효과를 검토해 보았다. Table 1에서 나타나는 것과 간이 간접돌연변이원인 \( \mathrm{AFB}_{1} \) 에 대한 돌연변이 억제효과는 대두의 메탄올 추출들 \( (\mathrm{MeOH}) \)을 \( 2.5 \mathrm{mg} / \)plate 농도로 첨가했을 때 \( 37 \% \) 의 돌연변이 저해효과를 나타내었고 같은 첨가농도에서 메탄올 분흭물들 중 디클로로메탄 분획물\( \left(\mathrm{CH}_{2} \mathrm{Cl}_{2}\right) \)과 에틸아세테이트 분획물\( (\mathrm{EtOAc})\)은 각각 \( 83 \% \) 로 상당히 높은 항돌연변이 효과를 나타내었다. 중간 분획물(Inter)의 경우는 \( 56 \% \) 의 항돌연변이 효과를 나타내었으나 다른 분획물들의 경우 항돌연변이 효과가 낮았다. 한편, 직접돌연변이원인 MNNG 의 경우, \( \mathrm{AFB}_{1} \) 에 비해 돌연변이 저해효과가 떨어지지만 그 중에서도 에틸아세테이트 분획물 \( (\mathrm{EtOAc})\)은 각각 \( 67 \% \)로 가장 높은 항돌연변이 효과를 나타내었으며 중간 분획물과 디클로로메탄 분획물 \( \left(\mathrm{CH}_{2} \mathrm{Cl}_{2}\right) \) 은 각각 \( 63 \%\), \(49 \% \) 의 돌연변이 저해효과를 나타내었다. Mirsalis 등은 콩 추출물이 화학발암물질을 무독화시키는데 필요한 특이한 효소들 즉 glutathione S-transferase (GST)와 UDP-glucuronyl transferase의 활성을 증가시켰다고 보고하였다.</p> <h2>SRB assay법에 의한 항암활성 효과</h2> <p>최근 미국 국립 암 연구소 등지에서 많이 사용되어지고 있는 SRB assay는 특히 항암제를 대량적으로 그리고 신속하게 검토할 수 있다는 장점을 지닌 실험방법이다. 이에 본 연구에서는 위암, 간암 및 결장암세포를 이용하여 대두 메탄올 추출물 및 그 분흭물들에 대해 SRB assay를 행하여 암세포 증식 억제효과를 살펴보았다. Fig. 2A 는 인체 위암세포인 AGS를 이용하여 대두 메탄을 추출물 및 그 분획물들의 암세포 저해효과를 보여주고 있다. 선행 된 연구 결과를 토대로 대두의 용매 추출물의 농도는 \( 2 \mathrm{mg} / \)assay로 결정하였고 대두 메탄올 추출물의 경우 \( 44 \% \) 의 위암세포 증식 억제효과를 나타내었다. 대두 메탄올 추출물의 분획물들 중 에틸아세테이트층 \( (\mathrm{EtOAc})\)의 저해 효과가 가장 높았는데 동일농도에서 \( 66 \% \) 로 위암세포 성장을 저해시키는 효과를 나타냄을 관찰할 수가 있었고 디클로로메탄 \( \left(\mathrm{CH}_{2} \mathrm{Cl}_{2}\right) \) 과 중간 분획물 (Inter)의 경우에는 각각 \( 54 \% \) 및 \( 51 \% \) 의 저해효과를 나타내었다. 반면, 다른 분획물의 경우 다소 낮은 암세포 증식 억제효과를 보였다. Hep 3B 인체 간암세포의 경우, 대두 메탄을 추출물을 \( 2 \mathrm{mg} / \)assay 투여했을 때 \( 60 \% \) 의 저해효과를 나타내었으며 여기에서도 분획물들 중에서 에틸아세테이트 분획물 \( (\mathrm{EtOAc})\)이 \(73\%\)로 가장 높은 저해효과를 보였고, 그 다음으로 중간 분획물(Inter)과 디클로로메탄 \( \left(\mathrm{CH}_{2} \mathrm{Cl}_{2}\right) \) 으로 각각 \( 65 \% \) 및 \( 56 \% \) 의 저해효과를 나타내었다. Fig. 2C는 인체 결장암세포인 HT-29를 이용하여 대두 메탄올 추출물 및 그 분획물의 저해효과를 보여주고 있다. 대두의 메탄올 추출물은 첨가농도 \( 2 \mathrm{mg} / \)assay에서 \( 44 \% \) 의 억제효과를 가졌고 대두 메탄을 추출물의 분획물들 중 에틸아세테이트층\( (\mathrm{EtOAc})\)의 저해 효과가 가장 높았는데 동일농도에서 \( 77 \% \) 의 결장암세포 성장을 저해시키는 효과를 나타냄을 관찰할 수 있었고 중간 분획물(Inter)과 디클로로메탄 \( \left(\mathrm{CH}_{2} \mathrm{Cl}_{2}\right) \) 은 각각 \( 63 \% \) 및 \( 52 \% \) 의 저해 효과를 보였고 다른 분획물들의 경우 그 저해효과가 다소 낮았다. Ames test를 이용한 항돌연변이 실험과 SRB assay에 의한 저해효과 실험에서 대두의 분획물들 중에서 에틸아세테이트 분획물의 억제효과가 가장 큰 것으로 나타남을 알 수 있었으므로 이 분획물 속에 활성 물질이 존재할 것으로 추정되어진다. 한 등은 대두의 메탄올 추출물은 인체 위암 및 대장암세포의 증식을 억제시켰으며 그 저해효과는 대두 유래 이소플라본 중의 하나인 glycitein에 의한 항암활성과 유사하다고 보고하였고 대두의 용매별 추출물에 의한 항산화효과에도 메탄올 추출물의 항산화능이 가장 우수하였고 항산화력도 genistein과 거의 유사하였다고 언급하였다. 성과 박은 노란콩, 검은콩 및 현미의 메탄올과 아세톤의 두 추출물은 호르몬 의존형 유방암 세포인 MCF-7의 경우 전반적으로 배양시간과 농도 의존적으로 유방암의 세포생존율을 억제하였으나 호르몬 비의존형 유방암세포인 MDA-MB-231에서는 두류 추출물의 경우 그 저해효과가 적게 나타났다고 보고하였다. 반면, 세포생존율 결과와는 달리 호르몬 의존형 세포(MCF-7)에서는 노란콩, 검은콩 및 현미 추출물에서 모두 유의적 apoptosis가 일어나지 않았으나 호르몬 비의존형 세포(MDA-MB-231)에서는 메탄을 추출물 처리군이 대조군에 비해 apoptosis된 세포가 유의적으로 증가한 것을 관찰하였다고 보고하였다.</p> <p>이상의 결과로부터 대두 분획물들 중 특히 에틸아세테이트과 중간 분획물은 in vitro Ames test과 SRB assay 법에서 비교적 높은 돌연변이 유발 억제 작용과 항암활성을 나타냈음을 확인 할 수가 있었다. 따라서 대두가 나타내는 항돌연변이 및 암세포 증식 억제 활성 물질은 에틸아세테이트 분획물에 함유되어 있는 것으로 추정되어지며 콩 속에 함유되어있는 isoflavone류인 genistein, daidzein, glycitein이 그 활성물질로서 가능성이 있고 또한 saponin과 식물성 스테로이드도 예상되어지는 활성물질로 여겨지며 여기에 관한 연구로 silica gel 및 thin layer chromatogrphy 등을 이용한 대두 용매 추출물의 정제에 대한 연구가 현재 진행 중이다.</p>