MC1R 유전자형은 말의 기본모색을 결정하는 중요한 인자로, TaqI -RFLP 방법을 이용해 확인하였다. 선천성 우성 백모색 확인을 위해 논설된 SNP 중 돌연변이를 PCR, SSCP, 그리고 DNA sequencing을 통해 검증하였다. 또한, 총마 현상의 주요 요인인 STX17 유전자의 중복과 비중복 유전자형은 3개의 프라이머와 long PCR 방법을 이용하여 판단하였다.
<h2>MC1R, KIT, STX17 유전자형 결정</h2> <p>말의 기본모색을 결정하는 주요 인자인 MC1R 유전자형은 Marklund 등의 방법에 따라 TaqI -RFLP 방법으로 결정하였다. 선천성 우성 백모색 여부를 확인하기 위해 Haase 등에 의해 보고된 핵심 SNP 중 nonsense 돌연변이 exon 4 c.706A>T, exon 15 c.2151C>G는 각각의 exon을 PCR로 증폭한 후 SSCP와 DNA sequencing을 통해 확인하였다. 우성 백모색의 원인으로 보고된 Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog (KIT) 유전자의 exon 12 c.1805C>T, exon 13 c.1960G>A는 각각 Haell, DdeI -RFLP를 통해 결정하였다. 총마 현상의 주요인으로 보고된 Syntaxin 17 (STX17) intron 6에서의 4.6-kb 중복(duplication)과 비중복에 대한 유전자형은 기존에 고안한 3 개의 프라이머들을 이용하여 long PCR 방법으로 결정하였다. 집단분석에는 4.6-kb 중복서열 특이적인 프라이머를 고안하여 일반적인 PCR 방법으로 중복된 절편의 보유 여부를 판독하고, 중복이 발견된 경우 다시 long PCR로 확인하였다. PCR 반응에 이용한 모든 프라이머의 서열은 Table 1 에 제시하였다. 각각의 유전자형 결정을 위한 PCR 반응은 1 \( \times \)반응완충액, \( 20 \, \mathrm { mM } \) dNTP, 각각 \( 10 \, \mathrm { pmol } \) 프라미어, 2 units i-Taq DNA polymerase (Intron Biotechnology, Korea)와 50-60 \( \mathrm { ng } \) genomic DNA를 혼합하고, PTC-200 (MJ Research, USA)을 이용하여 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 3 분 초기변성 후, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)-30 초, annealing-45 초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)-45 초로 구성된 연쇄반응을 35 회 반복한 후 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5 분간 최종 신장하였다. Long PCR은 1 \( \times \)반응완충액, \( 40 \mathrm { mM } \) dNTP, 2 units LA-Taq DNA polymerase (TaKaRa, Japan), 50-60 \( \mathrm { ng } \) genomic DNA, DupForward \( 3.75 \, \mathrm { pmol } \), DupReverseN \( 2.5 \, \mathrm { pmol } \), DupReverseD \( 5 \, \mathrm { pmol } \)을 혼합하여, PTC-200 (MJ Research, USA)을 이용하여 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 2 분 초기변성 후, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)-20 초, \( 68 ^ {\circ } \mathrm { C } \)-10 분으로 구성된 연쇄반응을 30 회 반복한 후 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 15 분간 최종 신장하였다. 증폭산물은 유전자형 결정에 바로 이용하거나 염기변이 확인을 위한 DNA sequencing에 이용하였다.</p>