재조합 단백질을 발현시키기 위해 E. coli BL21을 사용하였다. groEL/ES와 dnaK/dnaK/grpE를 나타내는 pG-KJE6은 pACYCl84가 기본적인 플라즈미드로 chloramphenicol 내성을 가지며 각 Pzt-1 promoter와 araB promoter에 의하여 조절되고 있다. 또한 E. coli를 배양하기 위해 LB배지를 사용하였다.
<h1>재료 밎 방법</h1><h2>사용균주와 플라즈미드</h2><p>재조합 단백질의 발현을 위한 숙주세포로 E. coli BL21(DE3) [F', ompT, \( r_{B}^{'} \), \( m_{B}^{'} \), (DE3)]를 사용하였다. 재조합 플라즈미드로 pG-KJE6 (TaKaRa Korea. Inc., Seoul, Korea)와 pALP4를 사용하였다. Pseudoalteromonas elyakovii 유래 alginate lyase(aly, \( 1.19 \, \mathrm{kb} \))를 XhoI/NdeI 부위를 인식하는 제한효소로 처리하여 GeneClean Kit (Bio101, USA)을 사용하여 아가로즈겔상에서 정제한 DNA 밴드를 pET25-vector에 subcloning 한 결과, \( 6.7 \, \mathrm{kb} \) 의 플라즈미드 \( \mathrm{pALP} \)를 얻었다. groEL/ES와 dnaK/dnaK/grpE를 발현하는 pG-KJE6은 pACYCl84가 기본 플라즈미드로 chloramphenicol 내성을 가지며 각각 Pzt-1 promoter와 araB promoter에 의해 조절된다.</p><h2>Co-transformation</h2><p>재조합 플라즈미드 pALP4와 pG-KJE6는 Mandel과 Higa 등이 확립한 \( \mathrm{CaCl}_{2} \) 방법에 따라 같은 양 \( 1 \, \mu \mathrm{g} \) 씩 E. coli BL21 (DE3)에 co-transformation 시켰으며 형질전환된 E.coli는 \( 50 \, \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ampicillin (pALP4의 선별)와 \( 50 \, \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) chloramphenicol (pG-KJE6의 선별)이 함유된 LB agar 배지에서 각각 선별하였다.</p><h2>배지와 배양 조건</h2><p>E. coli 배양을 위해 LB 배지( \( 1 \% \) Bacto-tryptone, \( 0.5 \% \) Bacto-yeast extract, \( 0.5 \% \, \mathrm{NaCl} \) )를 사용하였다. pALP4와 pG-KJE6의 공발현 배지는 \( 50 \, \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ampicillin과 \( 50 \, \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) chloramphenicol이 함유된 LB 배지에서 배양, pALP4의 단독 발현시에는 \( 50 \, \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ampicillin을 함유한 LB 배지를 이용하였다. \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 전 배양한 후 \( 10 \mathrm{ml} \) 시험관로 옮겨 배양 하면서 groEL/ES와 DnaK/Dna//GrpE gene의 발현을 위해 각각 tetracycline \( 0, 10, 20, 50, 100 \, \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \)과 L-arabinose \( 0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5, 1.0, 5.0 \, \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)를 대수증식기 초기 ( \( OD_{600}=0.5 \): 배양 2 시간 째)에 첨가하였고, 또한 aly gene의 발현을 위해 isopropyl-3-D-thiogalacto pyranoside (IPTG) \( 0, 10, 20, 50, 100 \, \mu \mathrm{M} \)을 대수증식기 중기(\( OD_{600}=0.8 \): 배양 3 시간 째)에 첨가하였다.</p>