본 연구에서는 국내 종묘회사에서 육성된 총 20종 호박의 종자를 50공 플러그 육묘판에 파종하여 20일 정도 육묘한 다음 어린잎을 채취하였다. 이 어린잎으로 부터 DNA를 분리하고 PCR에 이용하였다. PCR이 완료된 후 UV illuminator에서 polymorphism 여부 역시 확인하였으며 RAPD 분석을 통하여 재현성이 높은 band를 선발하여 다형성 밴드의 유무를 확인한 다음 유전적 유사도 값을 계산할 수 있었으며 이 값을 기초로 하여 UPGMA법으로 집괴분석하여 dendrogram을 작성하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>식물재료 및 DNA 분리</h2><p>본 연구에서는 국내 종묘회사에서 육성된 동양계 \( (\mathrm{Cu}- \)curbita moschata) 3품종, 서양계(C. maxima) 2품종, 페포계(C. pepo) 11품종, 토좌류(C. maxima \( \times \) C. moschata) 4품종 등 20종의 호박을 대상으로, 대상품종의 종자를 50공 플러그 육묘판에 파종하여 20일 정도 육묘한 다음 어린잎을 채취하였다. 공시품종의 어린잎을 액체질소를 이용하여 마쇄하고, Nucleospion \( { }^{\circledR} \) Plant Kit (Cat no. 740.270.540.)의 방법에 준하여 DNA를 분리하였다. 추출된 DNA는 \( \mu \mathrm{l} \)당 \( 40 \mathrm{ng} \) 수준으로 농도를 맞추고 PCR에 이용하였다.</p><h2>RAPD 분석</h2><p>PCR 증폭을 위하여 호박 genomic DNA \( 40 \mathrm{ng} \)을 template DNA로 이용하였으며, Taq DNA polymerase reaction buffer (\(50 \mathrm{mM}\) KCl; \( 10 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \), \(\mathrm{pH} 9.0\); \( 1.5 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{MgCl}_{2}\) ; \(0.01 \% \) gelatin; \( 0.1 \% \) Triton X-100)에 \( 0.2 \mathrm{mM} \)의 dNTP mix, \(100 \mathrm{pmol}\)의 primer, 그리고 2 units의 Taq DNA polymerase를 첨가하여 실시하였다. 본 연구에서 총 100개의 Operon primer 중 다형성을 보이는 16개의 primer를 선발하였으며, primer의 sequence는 Table 2와 같다. PCR은 UNO II Thermocycler (Biometra, Germany)에서 45 cycle을 실시하였으며, denaturation은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, annealing은 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)에서 45초, 그리고 extension을 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분간으로 하여 수행하였다. PCR이 완료된 후 \( 5 \mu \mathrm{l} \)의 증폭산물을 \(1\mathrm{mg} / \mathrm{ml}\) 농도의 ethidium bromide가 첨가된 \( 1.5 \% \) agarosegel에 \( 150 \mathrm{~V} \)에서 30분간 전기영동한 후 UV illuminator에서 polymorphism 여부를 확인하였다.</p><h2>유연관계 분석</h2><p>RAPD 분석을 통하여 재현성이 높은 band를 선발하여 다형성 밴드의 유무(dominant marker scoring : present = 1. absent = 0)를 확인한 다음 NTSYS software에 입력하고 simple matching 방법에 의해 유전적 유사도 값을 계산하고 이 값을 기초로 하여 UPGMA법으로 집괴분석하여 dendrogram을 작성하였다.</p>