RT-PCR을 하기 위해 cDNA를 합성하였다. Total RNA는 \(70\)\(^\circ \mathrm{C}\)에 10분 변성한 후 \(4\)\(^\circ \mathrm{C}\)에서 급랭하고, Reverse Transcriptase, oligo d T, DNTP, Superscript II rev. transcriptase를 이용하여 \(42\)\(^\circ \mathrm{C}\)에서 60분 동안 역전사 반응을 실시하여 cDNA를 합성하였다.
<h2>역전사 중합효소 연쇄반응</h2> <p>역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 하기 위하여 cDNA를 먼저 합성하였다. cDNA는 \( 2 ~ \mu \mathrm { g } \) total RNA와 Reverse Transcriptase (Superscript II, Invitrogen, USA)를 이용하여 합성하였다. Total RNA를 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분 변성한 후 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 급랭하였다. 역전사 반응에 의한 cDNA의 합성은 total RNA \( (2 ~ \mu \mathrm { g } ), 1 ~ \mu \mathrm { l } \) oligo d T, \(2 ~ \mu \mathrm { l } \) DNTP \((10 \mathrm { ~mM } ) \), \( 2 ~ \mu \mathrm { l } \) Superscript II reverse transcriptase \( (5 \mathrm { ~U } / \mu \mathrm { l } ) \), DTT \( (10 \) \( \mathrm { mM } ) \), 및 RNasin \( (1 ~ \mu \mathrm { l } ) \)을 최종적으로 \( 20 ~ \mu \mathrm { l } \) 완충용액 ( \(50 \mathrm { ~mM } \) \( \mathrm { Tris-Cl } \) \( \mathrm { pH } \) 8.3, \( 75 \mathrm { ~mM } \mathrm { ~KCl } , 3 \mathrm { ~mM } \mathrm { ~MgCl_2 } \))과 혼합하여 \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 60분 반응시켰다. cDNA는 1/10으로 희석하여 RT-PCR에 사용하였으며 특정 유전자 증폭을 위한 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)은 \( 2 ~ \mu \mathrm { l } \) cDNA, \(2 ~ \mu \mathrm { l } \) 역전사 반응액, \( 2 ~ \mu \mathrm { l } \) dNTP \( (2.5 \mathrm { ~mM } ), 2.5 ~ \mu \mathrm { l } \) sense 와 antisense primer \( (1.1 ~ \mu \mathrm { M } ) \), Taq DNA polymerase (0.6 U; TAKARA)가 함유된 최종 30 \( ~ \mu \mathrm { l } \) 반응액 \( (20 \mathrm { ~mM } \) \( \mathrm { Tris-Cl } \) \( \mathrm { pH } \) 8.0, \( 100 \mathrm { ~mM } \) \( \mathrm { KCI } \), \(0.1 \mathrm { ~mM } \) EDTA, \( 1 \mathrm { ~mM } \) DTT)을 이용하였다. 이 때 사용한 각 유전자에 대한 sense 및 antisense primer 서열 및 반응조건은 다음과 같다.</p>