Balb/c 마우스를 사용하여 생후 7~8주 된 암컷을 사육하였고, (주)다사랑으로부터 건조된 함초를 구입하여 3시간 동안 열수 추출한 후 filter paper로 여과하여 Crude S. herbacea polysaccharide extract(CSP)를 얻고, Sephadex G-50 칼럼에 2차 증류수로 충전하여 다당체인(SP I)과 (SP Ⅱ)을 얻었다. 실험에 사용한 CSP, SP I, SP Ⅱ은 모두 \(0.1\) \(\mathrm{mg/mL}\)의 농도로 첨가하여 실험하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 동물</h2> <p>실험동물은 효창 사이언스로부터 특정병원체부재(specific pathogen free) Balb/c 마우스를 공급받아 사용하였다. 이들 마우스는 1주일간 실온에서 물과 사료를 충분히 공급하고, 가능한 스트레스를 최소화하여 사육하면서, 생후 7~8주 된 암컷을 사용하였다. 실험 동물의 사육 조건은 실내 온도 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \), 습도는 \( 50 \% \) 전후로 하였고, 명암은 12시간(day light 06:00~18:00)을 주기로 조절하였다. 본 연구는 실험동물의 사육에 대한 인제대학교 동물실험 윤리위원회의 가이드라인을 토대로 진행하였다.</p> <h2>함초(S. herbacea)로부터 시료의 추출</h2> <p>본 실험에 사용한 동결건조된 실험재료는 (주)다사랑으로부터 건조된 함초를 구입한 후 분말화하여 사용하였다. 건조된 함초를 잘게 분쇄하여 고온, 가압 조건 하에서 3시간 동안 열수 추출한 후에 filter paper(Whatman No. 1)로 여과하여 조추출물인 Crude S. herbacea polysaccharide extract(CSP)를 얻었다. Filter paper 여과 후 고온 가압 멸균시킨 2차 증류수로 Sephadex G-50(Sigma, USA)을 칼럼 \( (2.5 \mathrm{cm} \times 50 \mathrm{cm} \), Sigma Chemical Co.)에 충전시켰으며, 충전 후CSP를 칼럼에 \( 2 \mathrm{mL} \) 주입하여 분당 \( 3 \mathrm{mL} \) 유속으로 \( 2.5 \mathrm{mL} \)씩의 분획을 얻었다. 각각의 분흭은 페놀-황산법으로 총 당량을 측정하였고, blue dextran(Sigma, USA)을 standard로 하여 CSP로부터 분리되어 나온 다당체의 분자량을 추정하여 다당체인 S. herbacea polysaccharide I(SP I)을 얻었다. 다당체인 S. herbacea polysaccharide Ⅱ(SP Ⅱ)은 CSP를 한외 여과기(ProFlux M12, Millipore, USA)에서 \(1 \mathrm{kD} \) membrane(Millipore, USA)을 사용하여 여과한 후에 얻었다.</p> <h2>시료의 투여</h2> <p>시험관 내 실험에서는 함초의 3개 추출물(CSP, SP I,SP Ⅱ)을 3차 증류수에 용해시킨 다음 Single Filter Unit(Sartorius Minisart \( { }^{\circledR} \), Germany)으로 여과시킨 후 고온 가압 멸균하여 실험하고자 하는 농도가 되도록 희석하여 세포 배양 시 첨가하였다.</p> <p>생체 내 실험에서는 함초의 3개 추출물(CSP, SPI, SPⅡ)을 3차 멸균 증류수로 용해시킨 후 적정 농도로 희석하여 사용하였다. 마우스를 임의 배치법에 의해 대조군과 투여군으로 나누었으며, 실험군마다 6마리씩 사용하였다. 함초의 3개 추출물(CSP, SP I, SP Ⅱ)을 투여 직전 3차 멸균 증류수에 현탁하여 마우스 체중 \( 10 \mathrm{g} \)당 함초 추출물 현탁액 \( 0.1 \mathrm{mL} \)를 투여할 수 있는 농도로 조제한 다음, \( \mathrm{LD}_{50}(25,550 \mathrm{mg} / \mathrm{kg}) \)와 EPA의 면역 독성 지침서(U. S. EPA, 1996)를 기준으로 하여 결정한 용량을 하루 1회\( (200 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) body weight ) 7일간 경구 투여하였다. 대조군에는 동량의 3차 멸균 증류수를 같은 방법으로 투여하였다.</p>