본 실험실은 AA를 AA-2G로 전환하는데 요구되는 효소인 CGTase를 생성하는 균을 구별하여 Paenibacillus sp. JB-13이라 칭한다. 조효소액을 사용한 AA-2G의 생성의 최적 조건은 Bae 등의 분석에 의해 알려졌다. AA-2G와 비타민 C의 양을 분석하기 위해 발효액을 filtration하여 AA-2G을 산출하였다.
<h2>대량 생산 조건 검토</h2><h3>플라스크 정치 배양</h3><p>\( 100 \mathrm{ml} \) 플라스크에 양파즙 배지 \( 50 \mathrm{ml} \) 첨가한 후 상기에서 결정된 최적 조건으로 발효를 시작하여 5일 동안 6시간마다 \( \mathrm{pH} \), 균 생육도 및 알코올의 생산량을 측정하였다.</p><h3>발효조 정치 배양</h3><p>상기에서 결정된 균 생육 최적 조건에서의 균 생육 특성과 알코올 생성량 등을 검토하고 나아가 유가 배양에 필요한 기초 자료를 확립하기 위하여 5 \(\mathrm{l}\) 용량의 발효조(Korea Fermenter Co., Korea)에 양파즙 배지 3 \(\mathrm{l}\)을 첨가한 후 플라스크 배양과 같은 조건 하에 발효를 시작하여 5일 동안 6시간마다 \( \mathrm{pH} \), 균 생육도 및 알코올의 생성량을 측정하였다.</p><h3>정치 유가 배양</h3><p>발효조 정치 배양의 자료를 토대로 탄소원 부족에 의한 균체 생육과 알코올 생산의 저하를 막고 연속 배양으로의 가능성을 모색하기 위하여 일정한 시간, 즉 균 생육도가 대수 증식기에 있고 알코을 생성이 최고에 이를 때 \( 10 \% \) sucrose가 첨가된 양파즙 배지 \( 100 \mathrm{ml} \)을 첨가하여 \( \mathrm{pH} \), 균 생육도 및 알코올 생성량을 측정하였다. 이 때 \( \mathrm{pH} \)는 조절하지 않았다.</p><h3>정치 연속 배양</h3><p>72시간이 되는 때부터 24시간 간격으로 \( 10 \% \) sucorose가 첨가된 양파즙 배지 \( 100 \mathrm{ml} \)을 첨가하고 배양액을 \( 100 \mathrm{ml} \) 회수함으로서 배양액 부피는 항상 일정하게 유지하여 균체의 재 사용성과 알코올 생성을 측정하였다.</p><h2>AA-2G 반응 산물의 첨가에 의한 알코올 발효와 AA-G 확인</h2><p>본 실험실에서 AA를 AA-2G로 전환하는데 필요한 효소인 CGTase (Cyclodextrin glycosyltransferase)를 생산하는 균을 분리 · 동정하여 Paenibacillus sp. JB-13이라 명명하였다. \( 1 \% \) soluble starch, \( 0.5 \% \) polypeptone, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 1 \% \) \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3}\), \(0.1 \% \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\), \(0.02 \% \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \((\mathrm{pH} 7.0) \)로 구성된 배양 배지 \( 100 \mathrm{ml} \)을 \( 500 \mathrm{ml} \) 플라스크에 넣고 전배양한 Paenibacillus sp. JB-13 배양액을 \( 1 \mathrm{ml} \) 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 200 \mathrm{rpm} \)으로 36시간 배양하였다. 균 배양액을 \( 8,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심 분리한 후 상등액을 회수하고 \( 50 \% \)의 ammonium sulfate로 침전시켰다. 이를 다시 \( 8,000 \mathrm{rpm} \)에서 40분간 원심 분리하고 침전물을 회수하여 \( 50 \mathrm{mM} \) phosphate buffer \( (\mathrm{pH}6.5 \))로 투석한 후 조효소액으로 사용하였다. 이 조효소액을 사용한 AA-2G의 생산의 최적 조건은 이미 Bae 등의 연구에 의해 밝혀졌고 그 조건에 의하여 AA-2G를 생산하였다. 생산된 AA-2G를 양파즙 배지에 대해 \( 10 \% \)(\(\mathrm{v}/\mathrm{v}\))로 첨가하고 발효한 후 발효액의 성분을 측정하였다.</p><p>발효가 종료된 후 AA-2G와 비타민 C의 양을 알아보기 위해 발효액을 filtration하여 HPLC로 Table 3와 같은 조건 하에서 standard (AA-2G 표준품)의 면적과 비교하여 AA-2G양을 계산하였고 비타민 C (AA)도 확인하였다.</p>