성호르몬인 에스트로겐과 유사한 구조 및 기능을 가지고 있는 Phytoestrogen은 육상식물에서 흔히 발견되며, 각종 질병을 예방하는데 도움을 준다는 연구결과가 있다. 지구 전체 생물의 80% 이상을 차지하는 해양생물에 대해서도 최근 많은 연구가 이루어짐에 따라 다양한 생리활성 물질을 포함한 유용한 성분들이 지속적으로 밝혀지고 있다. 따라서 본 연구를 통해 해양생물을 대상으로 에스트로겐 유사활성을 가질 가능성이 높은 생물을 선정하여 대상 생물의 에스트로겐 유사효과를 검증하였다.
<h1>서 론</h1> <p>자연계에 존재하고 있는 천연물이나 식품에는 약효를 나타내는 성분들이 많이 있으며, 천연물 성분들의 각 분획별 생리활성 물질을 규명하는 연구가 세계적으로 활발히 진행되고 있다. 육상식물에서 많이 보고되고 있는 phytoe-stogen은 성호르몬인 에스트로겐과 유사한 구조 및 기능을 가지고 있으며 배당체(glycoside) 형태로 발견된다. Phytoestrogen은 폐경기 이후의 여성에게 에스트로겐 대체 작용을 할 수 있는 것으로 밝혀져 질병예방 차원에서 많은 연구가 수행되고 있다. Phytoestrogen은 in vitro 실험에서 에스트로겐과 유사한 작용을 함으로써 여성의 에스트로겐 결핍으로 유발되는 골다공증 예방, 폐경기 증상의 완화 그리고 유방암, 전립선암, 심장질환 등의 예방에 중요한 역할을 하고, 알츠하이머 질환을 예방하는데 도움을 줄 수 있다는 연구결과가 발표된 바 있다.</p> <p>그러나 지구 전체 생물의 \( 80 \% \) 이상을 차지하고 있는 해양생물에 대해서는 육상생물 만큼의 연구가 이루어지지 않아 미지의 요소가 많이 산재해 있다. 최근 해양생물의 연구가 활발히 이루어짐에 따라 다양한 생리활성물질을 포함한 유용한 성분들이 지속적으로 밝혀지고 있다. 특히, 노화방지, 암 예방, 항 혈액응고 등 생리활성기능 측면에서 관심이 고조되고 있으며 많은 연구가 이루어지고 있다. 본 연구에서는 해양생물을 대상으로 에스트로겐 유사활성을 탐색하여 에스트로겐 대체물질로의 이용 가능성 여부를 확인하기 위해 연구를 수행하였다.</p> <p>불가사리는 steroidal glycoside인 triterpene glycosides를 대사산물로 생산하고, 다양한 형태의 saponine을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 새우는 다량의 콜레스테롤이 함유되어 있어 콜레스테롤로부터 생성되는 에스트로겐의 존재 가능성이 높을 것으로 예상되어 실험에 이용하였다. 최근 건강식품으로 개발되어 크게 각광받고 있는 스피루리나는 여러 가지 기능성을 가진 미세 녹조류이다. 이들은 특히 단백질, 아미노산, 비타민, 페놀산 (phenolic acid), 토코페롤, 베타카로틴, 필수지방산, 탄수화물 등을 다량 함유하고 있으며, 이들 중 페놀산 (phenolic acid), 토코페롤, 베타카로틴 등은 항산화 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 스피루리나는 장내 유산균의 생육을 돕는 유익한 생리활성 물질을 생산하는 것으로도 알려져 있다. 한편, 최근 해조류에서 다양한 생리활성물질이 발견되고 있는 녹조류의 하나인 파래도 에스트로겐 유사활성 탐색 대상으로 선정하여 연구를 수행하였다.</p> <p>이 연구는 해양생물을 대상으로 에스트로겐 유사활성을 가질 가능성이 높은 생물을 선정하여 본 연구에서 개발한 에스트로겐 반응성 리포터 시스템을 이용하여 대상 생물의 에스트로겐 유사효과 활성을 검증하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>해양생물로부터 추출물의 제조</h2> <p>구멍갈파래(Ulva pertusa)와 별불가사리(Asterina pectinifera)는 부산시소재 민락수변공원 앞바다에서 채집하고, 세척 후 음건하여 사용하였다. 새우(Penaeus chinensis)는 건조새우를 구입하여 사용하였고, 스피루리나(Spirulina, Kordel's Spirulina, Australia)는 순수함량 \( 100 \% \)의 제품을 사용하였다. 각 건조시료 \( 100 \mathrm{g} \)에 \( 95 \% \) 에탄올 \( 500 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 동안 추출하였다. 추출액은 여과지 (GFC \( 20 \mathrm{mm} \))로 여과하고, 여액을 진공 농축한 후, 동결건조하여 추출물을 얻었다. 추출물 \( 0.5 \mathrm{g} \)을 \( 99 \% \) ethanol에 용해시킨 후 필터 (\( 0.45 \mu \mathrm{m}\))를 통과시켜 멸균하여 사용하였다.</p> <h2>플라스미드의 구축</h2> <p>Xenopus vitellogenin A2 estrogen responsive elements(ERE)가 두 번 반복된 ERE119와 전사활성을 나타내는데 ERE 영역을 요구하는 promoter로 알려진 adenovirus-2 major later promoter (Ad2MLP)의 cloning을 위해 합성된 oligonucleotide들의 sequence를 Table 1에 나타내었다. Ad2MLP에 해당하는 oligonucleotide 두 가닥을 ann-ealing하여 이중가닥 DNA로 만든 후, 이를 먼저 pCAT-Basic (Promega, USA)의 CAT 유전자 상류인 PstI과 XbaI 부위에 삽입하여 pCAT-Ad2MLP를 구축하였다. ERE119에 해당하는 oligonucleotide 두 가닥을 annealing하여 이중가닥 DNA로 만든 후, 이를 pCAT-Ad2MLP의 Ad2MLP pro-moter 상류인 HindIII와 PstI 부위에 삽입하여 pCAT-ERE119-Ad2ML을 구축하였다.</p>