형질전환 이후 4주간 SI 배지에 2주씩 치상하며 1차 신초가 형성되고, 뒤이어 2차 신초가 자라나다가 multiple shoot이 형성되는 것이 중요하다. 선발은 초반에는 너무 강하지 않게 하고 후반부에 높은 농도로 하는 것이 일반적이며, silver nitrate 등의 에틸렌 억제제를 사용하여 죽음을 방지하고 clonal bud의 형성을 돕는다. 신초신장을 유도하기 위해 IAA, 사이토키닌, 지베렐린 등을 사용하며 \( 50 \% \) 이상의 형질전환체가 형성되는 것이 목표이다.
<p>세 번째 고려사항은 형질전환 직후에서부터 약 4 주 정도에 이르는 기간 동안의 신초형성이다. 형질전환과 세척 후에 떡잎에 연결되어 있는 자엽절은 SI (shoot induc-tion)배지에 2 주씩 4 주간 치상하게 되는데, 처음 2 주 동안에는 측아 (axillary bud/meristem)에서 1차 신초 (primary shoot)가 형성된다. 그러나 1 차 신초의 대부분은 형질전환 되지 않은 측아생장점의 세포들에서 자라나오기 때문에 선발이 시작되는 SI-2배지에서부터 점차 죽어가기 시작한다. 1 차 신초들이 서서히 죽어갈 때, 바로 하부에 새롭게 새살처럼 자라 올라오는 2차 신초 (secondary shoot)들이 관찰되는데 이들은 곧 바로 다수의 신초 (multiple shoot)를 생성한다 (Fig 3). 이 multiple shoot 형성은 다음에 연결되는 신초신장 (shoot elongation)에 직접적으로 영향을 미치기 때문에 성공적인 콩 형질전환을 위해서 매우 중요하다. 성공적인 multiple shoot형성은 측아를 과도하게 파괴시키지 않는 적당한 상처와 상처 후에 신초형성을 할 수 있는 품종자체의 능력에 크게 의존하는 것으로 생각된다.</p> <p>네 번째 고려사항은 효율적인 선발조건이다. 대개 형질전환 2주후부터 시작되는 선발은 초반에는 너무 강하지 않으나 후반부에 높은 농도의 선발을 하는 것이 일반적이다 (Olhoft 등 2003). 그러나 식물조직이 과도하게 죽어서 갈변이 일어나면 선발조건을 낮추거나 silver nitrate와 같은 에틸렌 억제제를 첨가하여 주는 것이 신초의 생장과 발육에 도움이 된다 (Santos 등 1997). 효율적인 선발의 결과는 형질전환세포들의 생장을 촉진시켜 clonal bud의 형성을 돕는데 이는 다음 단계인 신초 신장을 위해 매우 중요하다 (Fig 4).</p> <p>다섯 번째 고려사항은 효율적인 신초신장유도이다(Fig 5). Multiple shoot의 형성과 순조로운 선발이 이루어지면, 형질전환세포들의 생육은 빨라지고 조직 내의 빈도가 증가한다. 형질전환세포들의 증가는 이들 세포들로 구성된 clonal bud의 형성을 촉진한다. 그리고 이 clonal bud로부터 줄기의 신장이 이루어지는데 적절한 선발을 할 경우, 줄기가 신장된 개체의 \( 50 \% \) 정도가 유전자가 도입된 형질전환체였다. 신초의 효율적인 신장을 유도하기 위하여 미량의 옥신 (IAA)과 사이토키닌 (zeatin)이 적절한 비율로 배지에 첨가되며, 특히 줄기의 신장을 위해서 지베렐린을 넣어 주어야 한다.</p> <p>여섯 번째 고려조건은 효율적인 발근유도이다 (Fig 6). 효과적인 발근 유도를 위해서는 전단계인 신초신장이 매우 중요한데, 특히 줄기의 길이가 어느 정도 길어야 하고 (4cm이상), 특히 잎의 크기가 커야한다. 줄기의 길이가 너무 짧거나 잎이 작은 경우에는 장기간동안 식물체가 발근배지에 반응을 하지 않고 뿌리형성대신 줄기절단부 위에서 캘러스가 형성되는 것을 볼 수 있다. 이 경우, 다량의 캘러스형성에도 불구하고 발근이 이루어 지지 않으며, 발근이 되어도 캘러스에서 유래된 독자적인 뿌리로 서 상체부의 성장에 아무런 도움을 주지 않는다. 대부분의 현재 사용되는 콩발근배지에는 옥신인 IAA가 일정량 첨가되고 있는데 배지에 제공된 옥신과 함께 식물 자체 내에서 생산되는 옥신의 역할도 발근에 매우 중요한 것으로 생각된다. 발근이 성공적으로 이루어질 경우, 빠르면 2-3일내에 발근이 관찰되며 1-2주 안에 충분한 양의 뿌리성장과 함께 상부의 생장을 관찰 할 수 있다. 충분한 뿌리와 상부의 생장이 이루어 진 개체는 흙으로 옮겨져 일정기간의 순화를 거친 다음 온실에서 재배가 가능하다.</p> <p>위에서 기술된 6가지 고려사항은 국내 콩품종을 재료로 한 형질전환기술개발에 매우 중요한 고려사항들이고, 목표유전자가 도입된 형질전환체를 다수 확보한 후에는 다음 단계인 환경위해성 평가를 위해 적절한 형질전환체를 선발하는 것이 매우 중요하다. 환경위해성 평가에 사용될 수 있는 형질전환체들은 유전자의 도입이 완전한 T-DNA를 보존하고 있어야 하며 이에 대한 확인이 필요하다 (Fig 7). 개체들은 T-DNA의 LB (left boarder)와 RB (right boarder)가 정확히 검출되어야 하며, Southern분석을 통하여 1 개의 유전자가 도입된 것들을 재료로 환경위해성 평가가 수행될 수 있다.</p>