분리균 B. licheniformis YB-1414도 배양상등액에서 \( \beta \)-galactosidase가 높은 활성으로 관찰되기 때문에 균의 성장과 효소 생산성과의 관계의 조사를 위해 LB 액체배지에서 진탕 배양하면서 일정시간마다 배양액을 채취하여 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도와 배양상등액에 존재하는 \( \beta \) -galactosidase의 활성을 측정하였다. B. licheniformis YB-1414는 배양 시간이 12시간일 때 최대 성장도에 도달하고 \( \beta \)-galactosidase 생산이 시작되어 정지기를 지나 사멸기에 도달한 후까지 효소 생산성이 지속적으로 증가하였으며 30시간이 되었을 때 \( 2.8 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \)로 최대에 이르렀고 이후에도 배양상등액에 존재하는 효소활성이 감소하지 않고 그대로 유지되었다. 밀기울을 첨가한 배지에서 효소 생산성이 가장 높았기 때문에 밀기울의 농도를 다르게한 배지에서 동일조건으로 배양하였을 때 밀기울 첨가량이 \( 1 \% \)가 될 때까지 효소 생산성이 증가되고 \( 1.5 \% \) 이상의 밀기울이 첨가되었을 시 효소 생산성이 약간 감소하는 현상을 보였다. B. subtilis도 분리균 YB- 1414와 비슷하게 yeast extract를 질소원으로 사용했을 경우 효소 생산성이 가장 높았고, 분리균과 다르게 peptone이 tryptone 보다는 효소 생산능을 증가시키는 것으로 보고됬다. 밀기울의 불용성 물질이 첨가된 배지에서 효소 생산성은 밀기울이 변화없이 첨가되었 경우에 비해 약간 낮은 것으로 나타났고 수용성 물질이 첨가된 배지에서 더 높았다.
<h2>B. licheniformis YB-1414의 \( \beta \)-galactosidase 생산성</h2> <p>\( \beta \)-galactosidase는 균체내 효소로 존재하는 경우가 많으며 B. stearothermophilus, B. megaterium ATCC 14581, B. subtilis KL88에서 균체내 효소로 보고된 바 있다. 또한 청국장에서 분리된 B. licheniformis YB-1105 도 배양상등액 보다 균체내에 \( \beta \)-galactosidase 활성이 높은 것으로 알려졌다. 한편 면양유에서 분리된 B. subtilis와 온천에서 분리된 Bacillus sp.는 균체외로 \( \beta \)-galactosidase를 분비 생산하며, B. coagulans \( \mathrm{RCS} 3 \) 의 경우 5개의 \( \beta \)-galactosidase isozymes 중 한 개가 배양상등액에서 관찰된 바 있다. 분리균 B. licheniformis YB-1414도 배양상등액에서 \( \beta \)-galactosidase가 높은 활성으로 관찰되므로 균의 성장과 효소 생산성과의 관계를 조사하기 위해 LB 액체배지에서 진탕 배양하면서 일정시간마다 배양액을 채취하여 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도와 배양상등액에 존재하는 \( \beta \) -galactosidase의 활성을 측정하였다.</p> <p>B. licheniformis YB-1414는 배양 시간이 12시간되었을 때 최대 성장도에 이르렀고 이때부터 \( \beta \)-galactosidase 생산이 시작되어 정지기를 지나 사멸기에 도달한 후까지 효소 생산성이 지속적으로 증가하였으며 30시간이 되었을 때 \( 2.8 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \)로 최대에 이르렀고 이후에도 배양상등액에 존재하는 효소활성이 감소하지 않고 그대로 유지되었다(Fig. 1). 균체외 \( \beta \) -galactosidase를 생산하는 Bacillus sp.의 경우도 효소 생산성이 정지기 이후에 지속적으로 증가되는 현상을 보여 분리균과 유사하였으며, 이러한 현상은 균체내에서 합성된 효소가 균체외로 확산되는데 걸리는 시간의 차이 때문인 것으로 추정된 바 있다. 또한 B. stearothermophilus의 \( \beta \)-galactosidase 유전자를 함유한 B. subtilis 재조합 균주는 균체내 \( \beta \)-galactosidase를 생산하므로 효소 생산성이 균의 성장과 연계된 형태로 정지기에 이를 때까지 지속적으로 증가하여 최대 생산성이 약 \( 6.3 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) 로 나타났다.</p> <p>\( \beta \)-galactosidase 생산성은 배지내 탄소원과 질소원 성분에 따라 영향을 받는다고 알려져 있으므로 potassium phosphate \( (0.01 \%) \) 와 magnesium sulfate \( (0.1 \%) \) 를 기본 성분으로 하고 탄소원과 질소원을 달리하여 분리균 YB-1414의 효소 생산성을 조사하였다. 질소원으로 peptone \( (0.5 \%) \) 을 함유하는 배지에 서로 다른 탄소원을 \( 0.5 \% \) 가 되도록 각각 첨가한 상태에서 분리균을 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 36시간 동안 진탕 배양한 후 배양상등액의 효소 활성을 측정한 결과 Table 1에 보인바와 같이 밀기울을 비롯하여 쌀기울, locust bean gum 또는 guar gum을 첨가한 배지에서 효소 생산성이 증가되었으며 glucose와 lactose를 비롯한 단당류나 이당류가 첨가된 배지에서는 탄소원을 첨가하지 않은 배지보다 효소 생산성이 감소하였거나 큰 변화가 없는 것으로 나타났다. 이는 쉽게 대사되는 glucose와 lactose보다 귀리가루, 밀기울과 쌀기울이 함유된 배지에서 B. subtilis의 \( \beta \)-galactosidase 생산성이 증가되거나, 왕겨를 첨가한 고체배지에서 B. licheniformis의 \( \beta \)-galactosidase 생산성이 증가한 현상과 유사하지만, B. megaterium과 B. stearothermophilus 및 B. stearothermophilus의 \( \beta \)-galactosidase 유전자가 함유된 재조합 B. amyloliquefaciens에서 효소 생산이 lactose에 의해 유도된다는 결과와는 달랐다. 또한 밀기울을 첨가한 배지에서 효소 생산성이 가장 높았으므로 밀기울의 농도를 달리한 배지에서 동일조건으로 배양하였을 때 밀기울 첨가량이 \( 1 \% \) 가 될 때까지는 효소 생산성이 증가되었으나 \( 1.5 \% \) 이상의 밀기울이 첨가되었을 때는 효소 생산성이 약간 감소하는 현상을 보였다(Table 1).</p> <p>탄소원으로 밀기울 첨가량을 \( 1 \% \) 로 고정하고 유기질소원 \((0.5\%)\)의 종류를 달리한 배지에서 효소 생산성을 조사하였을 때 yeast extract 또는 tryptone이 첨가된 배지에서 효소 생산성이 높았으며, soytone, peptone 또는 casein 가수분해물이 첨가된 배지에서는 서로 유사한 수준의 효소 생산성을 보였고 특이하게도 corn steep powder가 함유된 배지에서는 효소가 거의 생산되지 않았다(Table 2). 효소 생산성을 가장 크게 증가시킨 yeast extract의 첨가량을 달리하였을 때 yeast extract의 첨가량이 많아질수록 \( \beta \)-galactosidase 생산성이 증가하여 \( 2.5 \% \) 에서 최대 생산성을 보이고 \( 3.0 \% \) 에서는 약간 감소하였다. B. subtilis도 분리균 YB- 1414와 유사하게 yeast extract를 질소원으로 사용하였을 때 효소 생산성이 가장 높았으나, 분리균과는 달리 peptone이 tryptone 보다는 효소 생산능을 더 증가시키는 것으로 보고되었다.</p> <p>한편 밀기울의 불용성 물질과 수용성 물질 중 어느 것이 효소 생산성을 증가시키는지 확인하기 위해서 밀기울 \( 1 \% \) 를 증류수에 현탁하고 원심분리 후 불용성의 침전물과 수용성의 상등액 부분으로 나누고 yeast extract (2.5\%)와 기본 성분을 각각 첨가하여 제조된 배지에서 효소 생산성을 비교하였다. Table 3 에 보인 바와 같이 밀기울의 불용성 물질이 첨가된 배지에서 효소 생산성은 밀기울이 그대로 첨가되었을 때보다 약간 낮은 것으로 나타났지만 수용성 물질이 첨가된 배지에서 보다 더 높았다. 또한 밀기울의 수용성 물질이 함유된 배지에서의 효소 생산성은 밀기울이 첨가되지 않고 yeast extract만 첨가된 배지에서 보다 2배 이상 높은 것으로 나타났다. 이로 보아 \( \beta \)-galactosidase의 생산성을 증가시키는 물질이 밀기울의 불용성 물질과 수용성 물질에 모두 있으며 불용성 물질에 좀 더 많이 존재하는 것으로 판단된다. 한편 yeast extract를 첨가하지 않고 밀기울만을 첨가한 배지에서는 효소 생산성이 매우 낮았는데 이는 질소원이 거의 없어 균의 성장이 낮아진 때문으로 여겨진다.</p>