Non-ribosomal peptide synthase (NRPS)와 type poly-ketide synthase (PKS)의 유전자 존재를 확인하기 위한 PCR 실험에 두 종류의 primer를 사용하였다. 대장균 Escherichia coli DH5 \( \alpha \) strain은 DNA 클로닝과 재조합 플라스미드 제작에 사용 되었으며, 희소방선균으로의 유전자 도입에는 methylation-deficient \( E \). coli ET12567/pUZ8002가 사용되었다. SCO5147 유전자의 도입 여부는 항생제 선별과 재조합 DNA 분리를 통해 확인하였다. 또한, 항생제 내성 균주 은행에서 Nocardiopsis sp. MMBL010 균주의 배양액 추출물을 이용해 20 종의 균주에 대한 항균력을 측정하였다.
<h2>Minimum inhibitory concentration assay</h2> <p>항생제 내성 균주 은행(Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes)을 통하여 Nocardiopsis sp. MMBL010 균주의 배양액 추출물을 이용해 20 종의 균주에 대한 항균력을 측정하였다. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI)의 minimum inhibitory concentration(MIC) 측정 지침에 따라 Muller-Hinton 평판배지희석법으로 측정하였다. 시료의 측정농도는 \( 512 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} 0.5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 의 농도가 되도록 희석하고 배지에 첨가하여 준비하였다. 대조 시료로 norfloxacin을 사용하였다.</p> <h2>Detection of DNA fragment specific for Type PKS and NRPS</h2> <p>Non-ribosomal peptide synthase (NRPS)와 type poly-ketide synthase (PKS)의 생합성 유전자 존재여부의 확인을 위해 두 쌍의 PCR primers를 사용하였다. NRPS sequence-specific primers A3F: 5'-GCSTACSYSATSTACACSTCSGG-3' and A7R: 5'-SASGTCVCCSGTSCGGTAS-3'; PKS-I se-quence-specific primers K1F: 5'-TSAAGTCSAACATCG-GBCA-3' and M6R: 5'-CGCAGGTTSCSGTACCAGTA-3'. 선별된 희소방선균들로부터 추출된 DNA를 template로 사용하여 PCR을 진행하였다. 총 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 의 부피의 PCR 혼합액을 만들었고(containing \( 20 \mathrm{pM} \) of each primer, \( 0.25 \) \( \mathrm{mM} \) of each of the four dNTPs (TaKaRa, Japan), \( 1 \mu \mathrm{L} \) of extracted DNA, \( 5 \mathrm{U} \) Taq polymerase (TaKaRa) with its recommended reaction buffer, \( 10 \% \) of DMSO and pure water up to \( 20 \mu \mathrm{L} \) ), PCR은 BIO-RAD C1000 Thermal Cycler를 이용하여 \( 15 \mathrm{~min} \) at \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) and 35 cycles of \( 45 \mathrm{~s} \) at \( 95^{\circ} \mathrm{C}, 1 \mathrm{~min} \) at \( 59^{\circ} \mathrm{C} \) for A3F/A7R, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) for \( \mathrm{K} 1 \mathrm{~F} / \) M6R and 90 s at \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) followed by \( 10 \mathrm{~min} \) at \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 조건에서 수행하였다. PCR을 통해 얻어진 product는 \( 1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) agarose gels(stained with ethidium bromide)을 이용한 전기 영동을 사용하여 확인하였다.</p> <h2>Optimization of E. coli-driven conjugation system</h2> <p>DNA 클로닝 및 재조합 플라스미드 제작을 위해 대장균 Escherichia coli DH5 \( \alpha \) strain을 사용하였으며, 희소방선균으로의 유전자 도입을 위해서 methylation-deficient \( E \). coli ET12567/pUZ8002을 사용하였다. Nocardiopsis sp. MMBL010 균주의 형질전환을 위하여, 기존 알려져 있는 P. autotrophica 및 S.benihana 기반의 대장균 기반 접합방법을 개량하였다. 플라스미드 공여체인 대장균은 기존의 방법과 동일하게 준비하였으며, 수용체인 희소방선균 Nocardiopsis sp. MMBL010은 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) TSB 액체 배지에 2 일동안 배양한 뒤 sonication을 실행하여 mycelia를 확보하였다. 동일한 조건에서 하루 동안 더 배양 하고, sonication을 한번 더 실행한 후 준비된 두 세포를 섞어준 뒤 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) modified ISP4 고체 배지에서 약 22~24시간 동안 배양하였다. 항생제 apramycin을 사용한 flooding 후, \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 포자 가 생성될 때 까지 배양하였다. SCO5147 유전자는 방선균 삽입-발현벡 터인 ermE*pSET152 벡터에 클로닝 하였으며, 앞서 언급한 최적화된 접합기법을 이용하여 Nocardiopsis sp. MMBL010 균주 내로 도입하였다. SCO5147 유전자의 도입 여부는 항생제 선별과 재조합 DNA의 분리를 통해 확인하였다.</p>