Enterococcus faecalis의 ADC 유전자를 분석하기 위해 Pseudomonas dacunhae의 ADC 와 비교하여 상동성을 확인하였다. MacVector 프로그램을 사용하여 상동성을 갖는 부위를 확인하였다. EF_ADC02-F/EF_ADC02-R primer set를 이용하여 pTXB-EF_ADCE22로 Enterococcus faecalis의 ADC 유전자 발현을 위한 플라스미드를 구축하였다. 순수한 ADC로 정제된 것은 분자량이 약 \( 59~ \mathrm{KDa} \)이며, 불순물을 포함하지 않는 것이었고, 신규 유전자가 생산하는 단백질의 아미노산 분석 결과와 재조합 단백질의 정제률을 통하여 537개의 아미노산으로 구성된 효소를 얻을 수 있었고 ADC 기능을 보유하고 있음을 확인한 것은 향후 연구의 토대를 마련하였다고 할 수 있다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Enterococcus faecalis의 ADC 유전자의 분석</h2> <p>고순도의 L-alanine 생산을 위해 새로운 균주를 이용한 시도가 많이 있었고 재조합 대장균을 이용한 생산)등도 보고되고 있어 저자들은 신규 ADC (L-aspartate \( \beta \) -decarboxylase) 유전자를 확보하기 위하여 게놈 프로젝트가 완료된 세균들을 대상으로 현재까지 알려진 ADC 유전자 의 염기서열간의 비교를 수행하였지만 상동성을 찾을 수 없 었다. 하지만 아미노산서열로 검색한 결과 Pseudomonas dacunhae 유래의 ADC (NCBI accession #, BAC65229)와 부 분적 상동성을 가진 영역을 Enterococcus faecalis의 게놈서열 에서 확인할 수 있었다. MacVector 프로그램을(Accelrys, USA) 이용하여 상동성을 갖는 부위는 약 \( 1600 \mathrm{bp} \)의 ORF로 구성되어 있으며 게놈서열에서는 아직 기능을 정확히 알 수 없는 putative protein을 발현시키는 유전자로 표시된 것을 확인하였고 연구를 수행하였다. 본 연구에서의 Enterococcus faecalis의 ADC 와 Psudomonas dacunhae의 ADC의 아미노산 서열을 비교한 것으로 약 \( 48 \% \)의 상동성을 나타내 는 것을 알 수 있다.</p> <h2>재조합 ADC 유전자의 발현</h2> <p>EF_ADC02-F/EF_ADC02-R primer set를 이용한 약 1,900 bp의 PCR 산물을 pGEMT-easy vector (Promega, USA)와 연결하고 E. coli DH5a에 형질전환시킨 후 플라스미드 DNA를 분리하여 제한효소 EcoRI으로 절단하여 약 \( 1900 \mathrm{bp} \) 크기의 단편을 확인하여(data not shown) pGEMTe-EF_ADC022를 구축하였다.</p> <p>pGEMTe-EF_ADCO22 플라스미드를 주형으로 EF_ADC_E2-F/ EF_ADC_E2-R primer set를 이용하여 DNA 단편을 증폭하고 이를 대장균용 발현벡터에 연결하여 최종적으로 Enter-ococcus faecalis의 ADC 유전자의 발현을 위한 플라스미드인 pTXB-EF_ADCE22를 구축하였다.</p> <p>Fig. 2는 pTXB-EF_ADCE22로 형질전환된 E. coli BL21(DE3) 를 이용하여 발현된 ADC 단백질을 정제하여 SDS-PAGE 상에서 확인한 것으로 분자량이 약 \( 59~ \mathrm{KDa} \)이며, 불순물을 포함하지 않는 순수한 ADC로 정제된 것을 확인할 수 있었다.</p> <h2>재조합 ADC의 활성</h2> <p>Fig. 3은 정제된 재조합 ADC의 활성을 나타낸 그래프이다. ADC는 aspartate에 작용하여 탈탄산 작용을 통하여 ala-nine을 생산하는데 Fig. 3를 보면 \( 128.6 \mathrm{ug} \)의 효소를 사용하였을 때 \( 15 \mathrm{ug} \)을 사용한 경우와 달리 5 분 이내에 대부분의 반응이 이루어지는 것을 알 수 있었다. 이로써 값이 저렴한 aspartete를 대상으로 1단계의 효소반응으로 부가가치가 높은 alanine의 생산을 기대할 수 있었다. Alanine은 다양한 경로로 생성되지만 aspartate를 이용한 생산이 효과적이며 ADC를 이용한 생산이 가장 효율적인 것으로 보고되어 있다.</p> <p>본 연구는 게놈서열이 완료된 균체를 대상으로 한 신규효소 개발에 이용될 수 있을 것이다. 즉 알려진 유전자와 기능은 알 수 없지만 염기서열이 알려진 게놈과의 비교로 가능성있는 균체를 선정하여 신규효소를 개발하였다. 신규 유전자가 생산하는 단백질의 아미노산 분석 결과와(Fig. 1) 재조합 단백질의 정제률(Fig. 2) 통하여 537개의 아미노산으로 구성된 분자량 약 \( 59~ \mathrm{KDa} \)의 효소를 얻을 수 있었고 실제로 예상했던 ADC의 기능을 보유하고 있음을 확인한 것은(Fig. 3) 향후 연구의 토대를 마련하였다 할 것이다. 또한 저가의 aspar-tate를 이용한 고부가가치 L-alanine을 생산할 수 있는 신규효소의 개발과 이를 토대를 한 생산균주를 개발할 수 있는것도 의미있는 일이라 할 것이다.</p>