연세대학교 세브란스 병원에서 290명의 피험자를 모집하여 심혈관계 질환 약물이나 고지혈증 약물을 투약하는 사람들을 제외하고 SNP 발굴 및 분석, 통계적 유의성 검정을 진행하였다. QIAamp DNA blood mini kit과 TaqMan Genotyping Master mix, StepOne Real-Time PCR System을 사용하여 genomic DNA를 추출하고 SDS 2.1 software로 분석하였으며, un-paired t-test와 ANCOVA 분석법을 통해 통계적 유의성을 검증하였다. 지방세포형성 억제 물질로 알려진 WNT/ \( \beta \)-catain pathway의 주요 molecule들을 siRNA방법을 사용하여, 3T3-L1 세포가 분화될 때 지방세포형성의 주요 인자들에 미치는 영향을 확인하고, \(\beta\)-catenin의 상위에 위치한 인자들이 지방세포형성을 조절하는지 여부를 살펴보았다.
<h2>인간피험자 모집</h2> <p>연구대상이 되는 인간피험자들은 연세대학교 세브란스 병원(Seoul, Korea)에서 모집되었으며 연구계획은 상기 병원의 기관윤리위원회로부터 승인되었다. 피험자 가운데 심혈관계 질환 약물이나 고지혈증 약물을 투약 하는 자는 본 연구대상에서 제외하였다. 본 연구는 서면 동의서를 얻은 총 290명을 대상으로 하였고, 성비는 전체적으로 남성 152명, 여성 138명 이었다.</p> <h2>SNP 발굴 및 분석</h2> <p>Haploview 프로그램의 HapMap data release 22 를 사용하여 아시아 인종(CHB + JPT, 중국인과 일본인)의 SNP와 linkage disequilibrium을 확인하였다. QIAamp \( \circledR \) DNA blood mini kit (Qiagen. Hilden, Germany)을 이용하여 대상자의 말초혈액으로부터 genomic DNA를 추출하였다. 각 SNP에 대하여 제작 되어진 primer와 probe를 Applied Biosystems사로부터 구입하여 사용하였다. \( 20 \mathrm { ng } \)의 Genomic DNA을 TaqMan \( \circledR \) Genotyping Master mix (Applied Biosystems), \( 900 \mathrm { nM } \) pri-mer와 \( 200 \mathrm { nM } \) probe에 잘 혼합하여 최종부피를 \( 10 \mu \mathrm { l } \)로 맞춘 후, StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems) 장비를 사용하여 Genotyping을 진행하였다. 효소의 활성을 위하여 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분, \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분 반응 후 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 15초, \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분의 과정으로 40 싸이클을 진행하였다. 데이터는 SDS 2.1 software (Applied Biosystems)를 사용하여 분석하였다.</p> <h2>Statistical analysis</h2> <p>모든 실험결과는 평균(mean) \( \pm \)표준오차(S.E)로 나타내었고, SPSS ver. 18.0프로그램(SPSS, Chicago, IL, USA)을 이용하여 통계적 유의성을 분석하였다. si-RNA transfection된 세포 군과 대조군, 두군 사이의 비교에 대한 통계의 유의성은 un-paired t-test에 의해 검증되었다. \( \beta \)-catenin유전자 다형성에 따른 인체 표현형의 연관성 분석은 피험자들의 연령과 성별을 보정한ANCOVA 분석법에 따라 수행되었다. 통계적 유의성 검정은 p-value \(< 0.05 \) 로 하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>si-RNA 기법을 이용한 지방축적 관련 유전자후보 도출</h2> <p>본 연구에서는 si-RNA를 이용하여 지방세포 분화와 관련된 유전자들의 기능을 분석함으로써 지방축적 관련 유전자 후보들을 도출하고자 하였다. si-RNA기법은 double strand RNA가 상보적 mRNA를 분해하여 단백질을 합성하는 과정을 간섭하는 현상이다. 이는 특정 단백질의 발현을 억제하고 그 기능을 분석하기 위하여 최근에 많은 연구에 사용하고 있다. 따라서 지방세포형성을 억제한다고 알려져 있는 WNT/ \( \beta \)-catain pathway의 주요 molecule들을 siRNA방법을 사용하여 knock-down 한 후, 3T3-L1 세포가 분화될 때 지방세포형성의 주요 인자들에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.</p> <p>WNT/ \( \beta \)-catenin pathway의 주요 인자인 \( \beta \)-catenin은 지방세포형성의 주요 인자들인 PPAR \( \gamma \) 와 \( \mathrm { CEBPa } \) 의 발현을 저해하는 지방세포형성 억제조절자(anti-adipogenic regulator)로 알려져 있다. siRNA를 통해 \( \beta \)-catenin을 knock-down 한 후, 세포로부터 mRNA를 분리한 뒤 cDNA를 합성하여 re-al-time PCR실험을 수행하였다. 그 결과, 지방세포형성의 핵심인자인PPAR \( \gamma \), CEBP \( \alpha \)의 mRNA발현들이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 CEBP \( \alpha \)의 mRNA발현량이 유의하게 증가하였다. Western blotting을 통해 살펴 본 단백질의 발현양상 또한 mRNA와 같이 확연하게 증가함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 이미 보고된 바와 같이 \( \beta \)-catenin이 adipogenesis를 억제하는 기능을 가짐을 제시한다.</p> <p>다음으로, WNT/ \( \beta \)-catenin pathway에 포함된 여러 인자들 중 \( \beta \)-catenin의 상위에 위치한 인자들이 지방세포형성을 조절하는지 여부를 살펴보았다. LRP6는 WNT/ \( \beta \)-catenin path-way에서 \( \beta \)-catenin의 상위에 위치하여 FZ와 함께 WNT와 결합하는 것으로 알려져 있다. LRP6 유전자가 결손 된 마우스의 배아세포에 지방형성을 유도하여 분석한 결과 LRP6가 지방형성을 억제한다는 사실이 보고된바 있다. 본 연구에서 LRP6를 siRNA로 knock-down한 결과, 지방세포형성의 핵심 인자인 PPAR \( \gamma \) 와 CEBP \( \alpha \)의 발현이 증가되었으나 유의적 효과는 보이지 않았다. 이러한 결과는 LRP6가 adipogenesis의 조절에 있어서 미약한 영향을 주지만 그 효과가 뚜렷하지 못 함을 제시한다.</p>