암컷 흰쥐를 난소절제 대조군(OVX-control), 비 난소절제군(Sham), 다시마 추출물 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 투여군(OVX-ST50) 및 \( 200 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 투여군(OVX-ST200)으로 나누어 실험하였고, 난괴법에 의해 군을 나누어 난소 절제 수술 및 3일부터 다시마 시료를 6주간 매일 경구 투여하였다. 해부하기 전에 절식시킨 후 혈청을 분리하였고, 늑골과 연골을 분리, 피부의 털 및 표피 위의 지방을 제거하여 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관했다. 또한 alkaline phosphatase reagent kit (FUJIFILM Co, Japan)를 사용하여 혈액 자동 분석기(FUJI DRI-CHEM 3500, Japan)로 serum alkaline phosphatase 활성을 측정하였다. SAS 8.2 프로그램을 이용하여 평균치와 표준편차로 실험결과를 표시했고, ANOVA test 후 Duncan's multiple range test 하여 실험군 사이의 유의한 차이를 \mathrm{p}<0.05p<0.05 수준에서 검증하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시료 제조 방법</h2> <p>본 실험에서 사용된 다시마(sea tangle, ST)는 2007년 부산광역시 기장군 대변항에서 채취된 다시마를 광명제약에서 구입하여 물로 3~4회 채로 씻어 내어 염분과 불순물을 제거하고 수세, 정선 및 탈수과정을 거쳐 자연 건조시켜 분말화하여 사용하였다. 건조 시료에 \( 80 \% \) ethanol \(2 \mathrm{l}\) 를 가해 3회 열 추출 \( \left(78^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 하여 감압 농축기로 농축한 후 동결 건조한 에탄올 추출물을 \( 0.9 \% \) 생리 식염수로 희석한 후 동물 실험에 사용하였다.</p> <h2>실험 동물</h2> <p>실험 동물은 체중이 평균 \( 180 \mathrm{~g} \) (8주)되는 Sparague-daw-ley 계 암컷 흰쥐를 (주)오리엔트바이오(경기도, 성남시)로부터 구입하여 본 실험실에서 고형사료(삼양유지)로 사육하였고, 실험 시작 1 주일 동안 적응시킨 후 동물의 체중에 따라 4군으로 나누었다. 즉 실험 동물은 난소절제 대조군(OVX-control), 비 난소절제군(Sham), 다시마 추출물 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 투여군(OVX-ST50) 및 \( 200 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 투여군(OVX-ST200)으로 나누어 실험하였다.</p> <p>수술 후 대조식으로 2\( \sim \)3일간 회복하게 한 후 다시마 추출물을 매일 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 6주간 경구투여 하였으며, 대조군은 동일용량의 생리식염수를 경구 투여하였다. 체중은 실험 사육 기간 중에 격일로 일정 시간에 측정하고, 식이 섭취량은 매일 식이 잔량을 측정하여 산출하였다. 동물 실험실의 사육조건은 온도 \( 24 \pm 2^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 55 \sim 60 \% \) 을 유지 시키며 물과 식이는 자유 공급하였다.</p> <h2>난소 절제 시술</h2> <p>1 주일 동안 주위환경에 적응시켜 난괴법에 의해 군을 나누어 난소 절제 수술을 실시하였다. 수술은 ether 마취 후 심 마취기에 이르면 늑골하부를 절개하여 난소를 제거하고 절개부는 봉합하였다. 시술 후 3일부터 매일 다시마 시료를 6주간 경구 투여하였다.</p> <h2>혈청 분리 및 장기 적출</h2> <p>실험 동물을 해부 전 24 시간 절식시킨 후 ether 마취 하에서 개복한 후 정맥에서 채혈하고 실온에서 30 분간 방치한 후 \(3,000 \mathrm{rpm}\), \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였고, 실험 시까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다. 혈청 분리 후 \( 0.9 \% \) 생리 식염수 용액으로 관류시킨 후 물기를 제거하였고, 늑골과 연골은 경계면에서 분리하였으며 피부는 털을 잘라내고 표피 위의 지방을 제거하여 무게를 잰 후 분석할 때 까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다.</p> <h2>분석 시료의 조제 및 분석 방법</h2> <p>골격형성의 지표인 serum alkaline phosphatase 활성은 alkaline phosphatase reagent kit (FUJIFILM Co, Japan)를 사용하여 혈액 자동 분석기(FUJI DRI-CHEM 3500, Japan)로 측정하였다.</p> <p>적출한 결합조직 골, 연골, 피부는 \( 6 \mathrm{~N} \mathrm{~HCl} ~10 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 \( 110^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20시간 산 가수분해 후 여과 농축하여 시료 용액으로 하였다. 결합조직 중의 collagen양은 Woessner법에 의하여 hydroxyproline 양을 측정한 후 collogen 양으로 환산하였다. Collagen의 아미노산 조성으로부터 collagen 중의 hydroxyproline 비율은 평균 110잔기/1000잔기 이므로 collagen 양의 환산은 일반적으로 다음 식에 준한다.</p> <p>Collagen \( (\mu \mathrm{g})=9.09 \times \) hydroxyproline \( (\mu \mathrm{g}) \)</p> <p>결합 조직 중의 pyridinoline 함량은 collagen 측정 시 사용된 시료 중 골, 연골 시료를 \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) membrane filter로 여과한 후 HPLC을 이용하여 pyridinoline 함량 분석에 임하였고, 분석조건은 Table 2와 같다.</p> <h2>통계 처리</h2> <p>실험 결과는 SAS 8.2 프로그램을 이용하여 평균치와 표준편차로 표시하였고, ANOVA test 후 Duncan's multiple range test 하여 실험군 사이의 유의한 차이를 \( \mathrm{p}<0.05 \) 수준에서 검증하였다.</p>