본 연구에서는 Durham 튜브의 기체 포집이 nitrate reductase 효소를 통해 질산염을 질소로 환원하는 과정을 검증한다. 저영양 세균이 생성하는 기포를 통해 이를 검증하였으며, 배양액이 붉게 변하는 것을 통해 nitrate reductase 활성을 확인하였다. 이는 배지에서의 질산염이 세균에 의해 아질산염으로 환원되는 과정을 나타낸다. 음성으로 판명된 세균에서는 아질산염이 완전히 소모되지 않았는지 검증하기 위해 아연을 추가하여 재확인하였다.
<p>Durham 튜브에 포집된 기체가 질산염 \( \mathrm { NO } _ { 3 } ^ { - } \)를 \( \mathrm { N } _ { 2 } \)로 환원시키는 대사과정 중의 효소들 중 하나인 nitrate reductase 효소에 기인한다는 것을 확인하기 위하여 기포를 형성하는 저영양 세균을 대상으로 각 액체 배지 시료를 일일 단위로 채취하여 nitrate reductase 활성을 검사하였다. 효소 활성은 \( 8 \mathrm { ~g } \) 설파닐 산(sulfanilic acid, Fluka)을 5N 아세트산 1리터에 녹여서 상온에서 암 상태로 보존한 "시약 A"와 \( 6 \mathrm { ~g } \)의 N, N-Dimethyl-1-naphthylamine (Fluka)을 5N 아세트산 1리터에 녹여 암 상태 보존한 “시약 B"를 사용하였다. 상기 추출한 액체 시료 \( 10 \mathrm { ~mL } \)에 "시약 A"와 "시약 B"를 각 동일한 양(5방울) 떨어뜨려 잘 혼합하였다. 약 1분 후 상온에서 배양액의 색깔이 붉은 색으로 변화하는 것을 관찰하여 nitrate reductase 양성으로 판단하였다. 이 반응은 탈질소 배지에 포함된 질산염 \( \left ( \mathrm { NO } _ { 3 } ^ { - } \right ) \)일부가 균의 nitrate reductase에 의해서 아질산염 \( \left ( \mathrm { NO } _ { 2 } ^ { - } \right ) \)으로 환원되었음을 나타낸다. 음성으로 나타난 균들에 대해 배지 속의 아질산염이 균의 탈질소 과정에서 완전히 소모되어 상기 방법으로 검출되지 않는지 재확인하기 위하여, 색깔 변화가 없는 균에서 나온 액체 배지시료에 미량의 아연 \( ( \mathrm { Zn } ) \)을 촉매제로 더 첨가하였다. 이 촉매반응은 배지에 잔존하는 질산염 \( \left ( \mathrm { NO } _ { 3 } ^ { - } \right ) \)을 아질산염 \( \left ( \mathrm { NO } _ { 2 } ^ { - } \right ) \)로 환원시키는 역할을 한다. 따라서 아연 촉매 하에서도 색깔의 변화가 없는 경우는 탈질소 균에 의해 아질산염 \( \left ( \mathrm { NO } _ { 2 } ^ { - } \right ) \)이 완전히 소모되어 nitric oxide \( ( \mathrm { NO } ) \rightarrow \) nitrous oxide \( \left ( \mathrm { N } _ { 2 } \mathrm { O } \right ) \) \( \rightarrow \) 질소 \( \left ( \mathrm { N } _ { 2 } \right ) \)의 과정을 경유하여 탈질소 반응이 일어났음을 나타낸다. 아연 촉매 반응에서 색깔의 변화가 없는 것을 또한 nitrate reductase 양성으로 판단하였다.</p>