혈청병을 알루미눔 뚜껑으로 밀봉하고 고무마개에 주사기를 꽂아서 배양기에 백열등을 켜서 정치 배양하면서, 공탑공간 시료를 채취하여 수소생성량을 분석하였으며 균주의 분자생물학적 동정을 위해서 고체배지에서 배양한 균체를 Bionics에 의뢰하여 16S rDNA sequencing 방법에 의거하여 동정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>수소 생성균의 순수 분리 및 배양 조건</h2> <p>수소생성 미생물의 분리를 위하여 멸균된 무기염배지 \( \left(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 0.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L} ; \mathrm{MgCl}_{2} 0.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L} ; \mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl} 2.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L}\right. \); Yeast extract \( 6 \mathrm{~g} / \mathrm{L}) 80 \mathrm{~mL} \) 에 최종농도가 \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 가 되도록 sucrose(자당)를 첨가한 후 \( 500 \mathrm{~mL} \) 혈청병에 넣고 질소가스로 치환한 후 안양천의 공단 주변 슬러지를 최종 부피 \( (100 \mathrm{~mL}) \) 의 \( 20 \% \) 가 되도록 접종하였다. 혈청병을 알루미눔 뚜껑으로 밀봉하고 고무마개에 \( 50 \mathrm{~mL} \) 주사기를 꽂아서 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에 백열등을 켜서 정치 배양하면서, headspace(공탑공간) 시료를 채취하여 수소생성량을 분석하였다. 배양하는 혈청병의 수소 생산이 증가하지 않는 시점에 새로운 배지가 함유된 혈청병으로 \( 10 \% \) 가 되도록 접종하여 주었다. 약 13회 계대 배양한 배양액으로부터 gellan gum을 \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 함유한 무기염고체배지에 도말하여 약 7종의 미생물을 분리하였다. 그 중 수소 생성효율이 가장 좋고 생장속도가 가장 빠른 MeL 6-2 균주를 선정하였다. 균주의 분자생물학적 동정을 위해서 고체배지에서 배양한 균체를 Bionics에 의뢰하여 16S rDNA sequencing 방법에 의거하여 동정하였다. 이후 CLUSTAL \( \mathrm{W}^{16} \) 를 사용하여, 염기서열을 조합하여 NCBI(The National Center for Biotechnology Information http://www.ncbi.nlm.nih)에서 제공하는 Advanced Blast search를 이용하여 Genebank의 염기서열과 비교함으로써 균주의 분자 동정을 하였다.</p> <p>MeL 6-2 균주를 포도당 및 자당이 \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 함유된 무기염 배지에서 전배양하여 약 2일 배양하였다. \( 500 \mathrm{~mL} \) 혈청병에 \( 45 \mathrm{~mL} \) 의 멸균된 무기염배지와 포도당및 자당의 농도를 \( 1\sim12 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \)로 각각 다르게 설정한 후 균주 배양액을 \( 10 \% \)씩 접종하였다. 질소로 치환한 후 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 배양하였다. 각 조건은 매 2 set씩 실험하였으며, 5시간 간격으로 시료를 채취하여 OD, 포도당 (자당)농도, 및 수소를 측정하였다.</p> <h2>분석조건</h2> <p>MeL 6-2 균주의 세포농도를 측정하기 위하여 배양액을 취한 후 \( 600 \mathrm{~nm} \) 의 파장에서 spectrophotometer(Agilent 8453 , USA)로 OD를 측정한 후, 건조중량으로 환산하였다. 배양액상의 포도당 및 자당의 농도를 분석하기 위하여 배양액을 원심분리(10000 rpm, 5분)한 후 각각 Glucose-E kit(Yeongdong, Korea) 및 Phenol-sulfuric acid 법에 의거하여 분석하였다. 공탑공간 상의 수소를 분석하기 위하여 Molesieve \( \left(13 \times 80 \times 100,6^{\prime} \times 1 / 8^{\prime}\) SS, Alltech, USA)와 TCD가 장착된 gas chromatography(Younglin 600D, Korea)로 분석하였다. 오븐, 주입기 및 검출기의 온도는 각각 90, 120, 및 \( 160^{\circ} \mathrm{C} \) 으로 설정하였다.</p>