질소가 적게 포함된 배지에서 나타난 콜로니의 균들의 질소고정 능력을 검증하기 위해 Acetylene reduction assay를 실시했다. 분리된 균은 모두 Acetylene reduction assay를 시행하여 nitrogenase의 활성을 간접적으로 확인했다. 그 후 균주들을 특정하기 위해 16s rRNA sequence를 실시했다.
<h2>Acetylene reduction assay (ARA)</h2> <p>질소원이 소량 첨가된 배지에서 높은 성장을 보인 균들은 질소고정 능력을 확인하기 위해 Acetylene reduction assay를 실시했다. 분리된 균은 모두 ARA를 실시하여 nitrogenase의 활성을 간접적으로 확인했다. ARA는 serum bottle을 이용하여 실시했다. Serum bottle 안에 질소가 소량 함유된 배지 \( 100 \mathrm { ml } \) 을 넣고, aluminum seal과 고무 cap을 이용해 닫힌계를 만들었다. 고무 cap을 이용해 serum bottle 안의 기상부를 \( 99 \% \) 질소와 \( 1 \% \) 산소로 조성하고, 순수 분리된 균을 접종했다. 2일간 \( 28 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 적응시켰다. 적응된 균이 들어있는 serum bottle의 기상부를 \( 89 \% \) 아르곤과 \( 10 \% \) acetylene, \( 1 \% \) 산소로 조정한다. 0, 3, 5일에 GC-FID를 이용하여 ethylene 생성을 확인했다.</p> <h2>16s rRNA sequence analysis</h2> <p>ARA 통해 nitrogenase의 활성을 간접적으로 확인된 분리균주들은 동정하기 위해 16s rRNA sequence를 분석했다. Kim et al.에 의해 기술된 universal primer를 사용하여 16s rRNA 유전자 분석을 실시했다. 염기서열은 Macrogen에서 3730XL 자동화된 DNA sequencing system (Applied Biosystems)을 사용하여 분석했다. 16S rRNA 유전자 서열 은 Ezbiocloud 서버에서 BLAST 검색 분석에 의해 확인되었다.</p> <h2>Evaluation of plant growth promotion in grass treated with diazotrophic bacteria</h2> <p>분리된 균은 포트 실험를 통하여 식물 성장에 미치는 영향을 확인했다. 균의 준비는 분리된 질소고정 박테리아를 동일비율로 섞어 혼합 균주를 만들고 TSB (Tryptic soy broth)에 3일간 \( 28 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양했고, 원심분리기를 이용하여 배지성분을 제거했다. 토양을 준비된 플라스틱 포트에 \( 150 \mathrm { ~g } \) 씩 담았다. 준비된 균을 증류수에 부유시키고, 토양에 \( 1.0 \mathrm { ~g } \) bacteria \( / \mathrm { kg } \) soil의 농도로 접종했다. 식물은 perennial ryegrass를 이용했다. 포트당 seed는 3개씩 파종했다. 대조군으로 균을 접종하지 않고 같은 양의 증류수를 첨가한 포트의 식물로 했고, positive control로 광합성 혼합 균주를 이용했다. 각 실험군은 4 개의 포트를 사용했고, 식물은 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(6000 \mathrm { ~lux } \)의 빛 세기에서 배양했다. 모든 실험은 같은 조건에서 실시했다. 토양이 건조되는 것을 방지하기 위해 증류수를 일일 \(15 \mathrm { ~ml } \)씩 주었다. 50일 배양 후 줄기의 길이와 식물의 건조중량을 측정함으로써 식물 성장을 확인했다.<h2>Analysis of bacteria community in soil</h2>