HPLC분석을 통해 Varian high performance liquid chromatography(Agilent Technologies)과 photodiode array 검출기, Polaris 5 C18-A column을 사용하여 0.1% formic acid가 첨가된 A buffer와 B buffer를 사용하여 0분부터 15.1분까지 20%, 40%, 90% B buffer로 전이하여 분석하였다. 분석한 결과 BL-PR 균주는 naringenin을 기질로 하여 isokaempferide 생합성을 할 수 있다는 것을 알아냈다.
<h2>HPLC분석</h2> <p>반응물은 photodiode array 검출기와 Polaris 5 C18-A column( \( 250 \mathrm { ~mm } \times 4.6 \mathrm { ~mm } \), Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)가 부착된 Varian high performance liquid chromatography (HPLC) 시스템(Agilent Technologies)을 이용하여 분석하였다. HPLC분석은 \( 0.1 \% \) formic acid가 첨가된 증류수( A buffer)와, \( 0.1 \% \) formic acid가 첨가된 acetonitrile (B buffer)를 사용하여 실시하였다. 분석프로그램은 0분에 \( 20 \% \) B버퍼, 8분에 \( 40 \% \) B버퍼, 12분에 \( 90 \% \) B버퍼, 15분에 \( 90 \% \) B버퍼, 15.1분에 \( 10 \) B버퍼, 20분에 \( 10 \% \) B버퍼의 조건을 사용하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Naringenin으로부터 isokaempferide 생합성</h2> <p>Isokaempferide는 Amburana cearensis와 Cirsium rivulare (Jacq.)의 주요 구성물질로 간 보호, 항균, 항증식성, 항염 등의 생리 효과를 보이는 3-O-methylation된 kaempferol이다. Naringenin으로부터 isokempferide를 생합성 하기 위해서는 F3H, FLS, OMT (flavonoid O-methyl transferase) 등의 3유전자가 필요하다. 최근 연구결과에 의하면, 포플러에서 분리된 PFLS는 F3H와 FLS의 기능을 동시에 수행하는 것으로 보고되었다. 벼에서 분리한 ROMT-9은 flavone 및 flavonol \( 3 ^ {\prime } \)-O-methyltransferase이지만, flavonol의 경우 \( 3 ^ {\prime } \)의 hydroxyl group을 이용할 수 없을 때 3번 위치의 hydroxyl group을 methylation 시킨다. 따라서 대장균에서 naringenin을 기질로 isokaempferide를 생합성 하기 위해서 2개의 유전자, PFLS와 ROM-9을 이용하였다. 두 유전자, PFLS와 ROMT-9을 대장균 BL21 (DE3)에 형질전환 하였고 결과 균주를 BL-PR로 명명하였다. BL-PR균주를 이용하여 naringenin으로부터 isokaempferide의 생합성능력을 테스트하기 위하여 \( 2 \mathrm { ~mL } \) LB배지를 이용하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20시간 동안 재조합 단백질을 유도한 후 AMM배지를 이용하여 생물전환을 실시하였다. 생물전환 12시간 후 배양액을 회수하여 에칠아세테이트로 추출하고 완전히 건조한 후 HPLC분석을 실시하였다. 그 결과 기질로 사용된 naringenin \( (12.7 \mathrm { ~min } ) \)을 제외하고 총 3개의 새로운 peak이 생성되었다(Fig. 2B). P1 \( ( 9.5 \mathrm { ~min } ) \)의 UV 흡광도는 기질로 사용된 나린제닌과 유사하였고 이는 전형적인 flavanone의 UV흡광도 패턴과 일치하였다. 따라서 이 물질은 kaempferol의 전구물질인 aromadendrin으로 추정되었다(Fig. 2D). P2 \( ( 13.8 \mathrm { ~min } ) \)는 전형적인 flavonol의 UV 흡광도를 가지고 있으며, 표준물질 kaempferol과 동일한 흡광도와 용출 시간대를 보였다(Fig. 2B). P3 \( ( 14.1 \mathrm { ~min } ) \)는 kaempferol의 흡광도에 비해서 band Ⅰ의 UV최고 흡광도가 \( 365 \mathrm { ~nm } \)에서 \( 350 \mathrm { ~nm } \)으로 이동한 결과를 보였다(Fig. 2D). 이것은 flavonol의 3번 위치의 구조 변화에 의한 전형적인 hypsochromic shift 현상이다. 따라서 P3는 isokaempferide로 추정되었다. P3의 구조를 명확하게 결정하기 위하여 반응물을 HPLC로 분리하여 \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \)-NMR 분석에 이용하였다. NMR 데이터의 분석 결과는 Aceton d6, \( 500 \mathrm { MHz } \) ; 3.87 ( \(3 \mathrm { H } \), s), 6.26 ( \(1 \mathrm { H } \), d, J \( = 2.1 \mathrm { ~Hz } ) \), 6.50 ( \( 1 \mathrm { H } \), J= \( 2.1 \mathrm { ~Hz } \) ), 7.02 ( \(2 \mathrm { H } \), d, J \( =9.0 \mathrm { ~Hz } \) ), 8.03 ( \( 2 \mathrm { H } \), d, J \( =9.0 \mathrm { ~Hz } \)), 12.80 ( \(1 \mathrm { H } \), s)와 같았다. 이러한 결과는 이전에 발표한 \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \)-NMR 결과와 일치하였다. 이상의 결과를 종합해 보면 BL-PR 균주는 naringenin을 기질로 하여 isokaempferide 생합성이 가능하다는 알 수 있다.</p>