반도체 제조에 중요한 빛에 민감한 감광성 수지의 원료인 poly-4-vinylphenol 제조에 사용되는 중요한 화학원료물질인 p-hydroxystyrene는 석유기반공정에 의해 생산된다. 효율적, 경제적으로 공정하기 위해, 1단계로 미생물을 이용한 직접발효법을 이용하여 tyrosine을 생산, 2단계로 PAL/TAL을 함유한 세포를 고정화하여 pHCA생산, 마지막으로 화학적 방법으로 pHS를 생산하는 방법이 개발되었다. 또한 250시간의 연속된 재사용공정으로 \( \mathrm{pH} ~ 9.8 \) 에서 \( 50 \mathrm{~g/L} \)의 tyrosine으로부터 약 \( 39 \pm 4 \mathrm{~g/L} \)의 pHCA를 생산할 수 있게 되었다. 이러한 결과는 화학원료물질의 생산용 숙주로 방향족 화합물 독성에 대한 내성이 강한 미생물이 사용가치가 높음을 보여준다. 또한 방향족 화합물에 대한 내성 미생물의 스크리닝 등에 대한 연구가 경쟁력있는 기술개발에 크게 기여할 수 있음과 동시에, 방향족 대사경로는 산업적으로 도움이 되는 화합물질 생산에도 이용가능하다.
<p>p-Hydroxystyrene(4-vinylphenol) 생산: 석유기반공정에 의해서 생산되는 p-hydroxystyrene(pHS)은 반도체 제조에 중요한 빛에 민감한 감광성 수지(photoresists)의 원료인 poly-4-vinylphenol(PVP)의 제조에 사용되는 중요한 화학원료물질이다. pHS는 tyrosine으로부터 phenylalanine/tyrosine ammonia lyase(PAL/TAL)의 작용에 의해 pHCA로 전환되고 p-hydroxystyrene decarboxylase(Pdc)의 촉매에 의해 pHS가 생산되는 결과가 보고되었다. 먼저 aroF, aroG, aroL, tyrA 및 tyrB의 발현억제에 관여하는 조절 유전자인 tyrR을 염색체상에서 결손시킨 후 branch pathway인 phenylalanine으로의 탄소흐름을 차단하기 위해서 pheA 유전자를 결손하고, tyrosine 생합성을 촉매하는 tyrA 유전자를 과발현하여 tyrosine을 생산하는 E. coli를 제작하였다. Tyrosine의 탈아미노반응(deamination)에 관여하며, 기존에 보고된 단백질보다 더 tyrosine에 대한 기질친화력이 높은 Rhodotorula glutinis 유래의 pal/tal 유전자 및 pHCA의 탈탄산화를 촉매하는 Lactobacillus plantarum 유래의 pdc 유전자를 plasmid에 cloning하여 tyrosine을 생산하는 E. coli에 형질전환하여 pHS를 생산하는 재조합 대장균을 개발하였다. 10-L 발효조에서 배양한 결과 약 \( 0.6 \mathrm{~g/L} \)의 pHS가 생성되었다. 이는 pHCA와 pHS와 같은 페놀계열의 화합물이 세포에 대한 높은 독성으로 인해 발효과정중에 소량의 축적되는 pHS 및 pHCA에 의해 세포가 쉽게 죽는 문제점, tyrosine ammonia lyase(TAL)가 product인 pHCA에 의해 강한 product inhibition을 받으며 효소 고유의 촉매활성능력이 떨어져서 낮은 catalytic turnover number를 갖는 문제점이 있기 때문에 미생물을 이용하여 포도당에서 pHS를 1단계로 직접 생산하는 공정은 매우 어렵다. 따라서, 공정의 효율성·경제성을 고려해서 1단계로 미생물을 이용한 직접발효법으로 tyrosine을 생산하고, 2단계로 PAL/TAL을 함유한 세포를 고정화하여 bioconversion법으로 pHCA를 생산하고, 최종적으로 화학적인 방법으로 pHS를 생산하는 방법이 개발되었다. TAL 효소활성에 대한 \( \mathrm{pH} \)와 pHCA의 효과를 조사한 결과에 의하면, \( \mathrm{pH} \)가 올라가면서 pHCA에 의한 product inhibition이 점점 없어지며 \( \mathrm{pH} ~ 9.5 \)에서 생산성은 최대화, product inhibition은 최소화되었다. 그러나, \( \mathrm{pH} ~ 9.5 \)에서도 효소의 느린 turnover number 때문에 회분식으로 효소를 첨가하는 것보다는 calcium alginate bead에 TAL 과발현 세포를 고정화하여 연속적으로 재사용하는 공정을 개발하여 낮은 효소활성도의 문제점을 극복하였다. 그 결과, 고정화 촉매반응을 통해 \( \mathrm{pH} ~ 9.8 \) 에서 \( 50 \mathrm{~g/L} \)의 tyrosine으로부터 250시간의 연속된 재사용공정으로 약 \( 39 \pm 4 \mathrm{~g/L} \)의 pHCA를 생산하는 결과를 얻었다. 화학적 반응을 통해서 pHS를 생산하는 공정(base-catalyzed thermal decarboxylation)은 N,N-dimethylacetamide 용매에 pHCA를 녹인 후 촉매제로 \( 1.9 \mathrm{~mole} \% \)의 potassium acetate를 첨가하여 \( 150^{\circ} \mathrm{C} \)에서 150분간 열처리하여 \( 98.6 \% \)의 pHS 생산수율을 얻었다. 한편, 최근 Verhoef등은 용매내성 P. putida S12 유래의 tyrosine을 생산하는 미생물에 유전자 pal 및 pdc를 발현한 재조합 Psuedomonas를 제작하고, pHS에 대한 높은 용해도를 갖는 유기용매인 1-decanol을 첨가한 2상계(two-phase) water-decanol 발효를 수행하여 포도당으로부터 직접발효법으로 pHS \( 2.5 \mathrm{~g/L} \)(\( 21 \mathrm{~mM}\)), 수율 \( 4.1 \% \)를 얻었다. 이는 방향족 화합물 독성에 대한 내성이 강한 미생물이 화학원료물질의 생산용 숙주로 사용가치가 높음을 나타내는 결과라고 볼 수 있으며, 방향족 화합물에 대한 내성 미생물의 스크리닝, 내성 기작의 규명등에 대한 연구가 경쟁력있는 화이트바이오텍기반 방향족화합물 생산 기술개발에 크게 기여할 것으로 사료된다.</p><p>기타 방향족 화합물 생산: 방향족 대사경로는 gallic acid, pyrogallol, vanillin, salicyclic acid, indigo, indole-3-acetic acid, 2,3-trans-CHD(S,S-2,3-dihydroxy-2,3-dihydrobenzoic acid), D-phenylglycine 등과 같은 산업적으로 유용한 화합물질의 생산에도 이용될 수 있다.</p><p>Gallic acid와 pyrogallol은 항생제 trimethoprim, 근육이완제 gallamine triethiodide, 살충제 bendiocarb등의 합성에 사용되는 화합물로 Frost 등은 P. aeruginosa 유래의 p-hydroxybenzoate hydroxylase 활성이 변이된 \( pobA^{*} \)를 발현시켜 PCA로부터 gallic acid를 생산하는 미생물을 제작하였으며, 추가적으로 K. pneumoniae 유래의 PCA decarboxylase 유전자 aroY를 과발현하여 pyrogallol을 생산하는 균주를 만들었다.</p><p>청색염색에 널리 사용되는 색소인 indigo는 트립토판을 생산하는 대장균에서 세포내 존재하는 tryptophanse에 의해서 indole로 전환이 된 후 P. putida 유래의 naphthalen dioxygenase 유전자를 과발현하여 \( 18 \mathrm{~g/L} \) 수준의 인디고를 생산하는 재조합대장균을 개발하였다.</p><p>Indole 3-acetic acid는 대표적인 식물성장호르몬으로 알려져 있는데 Patten 등은 P. putida GR12-2 균주를 사용하여 tryptophan을 첨가한 발효배지에 indolepyruvate decarboxylase 유전자를 과발현하여 indole 3-acetic acid가 생산될 수 있음을 보고하였다.</p><p>바닐라향의 원료인 바닐린은 AAA 생합성경로의 중간물질에서도 만들어질 수 있는데, PCA를 생산하는 대장균에 catechol-O-methyltransferase 유전자를 과발현하여 vanillic acid로 전환시킨 후 Neurospora crassa 유래의 aryl aldehyde dehydrogenase 유전자를 과발현하여 vanillin을 생산하였다.</p>