\( 5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 조건하에서 암세포를 배양한 후, MTT assay를 이용하여 세포 성장 억제 조사를 수행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료</h2> <p>본 실험에 사용된 genistein은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고 mRNA 분석을 위하여 Bioneer (Taejeon, Korea)에서 구입한 primer는 Table 1에 나타낸 바와 같다. 단백질 발현 분석을 위하여 사용된 항체는 CalBiochem (San Diego, CA, USA), 및 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였으며, immunoblotting을 위해 2차 항체로 사용된 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulino Amersham Life Science Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다. Prostaglandin \( \mathrm{E}_{2}\left(\mathrm{PGE}_{2}\right) \) 의 생성양의 측정은 Amersham Corp.의 enzyme immunoassay (EIA) kit를 사용하였으며, telomerase 활성의 측정은 polymerase chain reaction (PCR)에 기초를 둔 면역반 응분석법[PCR-based telomeric repeat amplification protocol (TRAP) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)]을 이용하였고 이를 위한 kit는 Boehringer Mannheim (Mannheim, Germany)에서 구입하였다.</p> <h2>암세포의 배양</h2> <p>실험에 사용한 세포(AGS 인체위암세포, SK-MEL-2 흑색종세포, T24 방광암세포 및 U937 백혈병세포)는 생명공학연구소(KRIBB, Taejeon, Korea)에서 분양 받았으며 \( 90 \% \) 의 RPMI-1640 배지(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 10\% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL)에 \( 1 \% \) 의 penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL)이 포함된 배지를 사용하여 \( 5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 조건하에서 배양하였다. Genistein은 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여 \( 100 \mathrm{mM} \) 의 stock 용액으로 제조한 뒤 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였고 적정 농도로 배지에 희석하여 처리하였다.</p> <h2>MTT assay를 이용한 세포 성장 억제 조사</h2> <p>세포배양용 6 well plate에 well 당 \( 1 \times 10^{5} \) 개의 세포를 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 다음 genistein을 배지에 희석하였다. 48시간 후 배지를 제거하고 tetrazolium bromide salt (MTT, Sigma) 시약을 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mu \mathrm{l} \) 농도로 희석하여 \( 200 \mu \mathrm{l} \)씩 분주하고 3 시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 다음 MTT 시약을 제거하고 DMSO를 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 씩 분주하여 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 3회 실시하였으며, 그에 대한 평균값과 표준 오차를 Microsoft EXCEL program을 사용하여 분석하였다.</p>