EBV miRNA 서열들은 EBV 게놈의 두 부분에 밀집되며 그 위치는 BHRF1 유전자 근처와 BHRF1-2와 BHRF1-3이다. 세포주를 배양하기 위해서 Phenol- \( \mathrm { CHCl } _ { 3 } \)을 처리를 하여 추출했다. 역중합효소 연쇄반응과 중합효소 연쇄반응을 보기 위해 RNA \(1 ~ \mu \mathrm { g } \)에 \(200 \mathrm { units } \) Reverse Transcriptase M-MLV를 첨가해 합성했다.
<p>보고된 5종의 EBV miRNA 서열들은 EBV 게놈의 두 부분에 밀집되어 존재한다. 첫 번째 위치는 BHRF1 유전자 근처로 BHRF1-1 서열은 5' UTR에 있고 BHRF1-2와 BHRF1-3 서열은 3' UTR 부위에 존재한다. 다른 EBV miRNA들인 BART1과 BART2는 BARTs(BamHI-A region rightward transcripts) 유전자의 인트론 부분에 위치한다. 클러스터로 존재하는 이들 EBV miRNA들이 동물 세포의 miRNA들과 유사하게 polycistronic한 하나의 전사체로 전사되는지 아니면 개별적으로 전사된 다음 성숙한 miRNA로 형성되는지는 아직 알려져 있지 않다. 또한, 이들 바이러스 miRNA들도 동물세포 miRNA 들과 같이 pri-miRNA 및 pre-miRNA 단계를 거쳐 성숙된 miRNA로 만들어지는지 연구된 바가 없다. 본 논문에서는 EBV 양성 B 세포주인 B95-8에서 EBV miRNA들의 발현을 재확인하고, 이들이 동물세포와 유사한 miRNA 생성 과정을 거쳐 만들어지는지를 확인하기 위해 전구체인 pri-와 pre-miRNA에 대한 RT-PCR을 실시하였다. 그리고 클러스터를 이루는 동물세포 miRNA gene들과 같이 EBV miRNA들도 polycistronic하게 전사되는지 조사하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포주 배양</h2> <p>B95-8 세포주에 Phenol- \( \mathrm { CHCl } _ { 3 } \)을 처리하여 DNA를 추출하였다. RNA는 B95-8 세포주에 RNAzol \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) B reagent (Tel-Test Inc., Friendswood, TX)를 첨가하여 제품의 사용법에 따라 추출하였다. RNA 침전물은 \( 0.3 \% \) DEPC 용액에 녹여 \( -7 \) \( 0 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 보관하였다. 작은 분자의 RNA ( \( \sim 200 \mathrm { ~nt } \) 이하)는 mirVana \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) miRNA Isolation kit (Ambion, Austin, TX)를 사용하여 정제하였다. 추출된 RNA는 혼입될 가능성이 있는 DNA를 제거하기 위해 모두 RNase-free DNase I로 처리한 다음 실험에 사용하였다.</p> <h2>역중합효소 연쇄반응(RT-PCR)과 중합효소 연쇄반응(PCR)</h2> <p>추출된 RNA \(1 ~ \mu \mathrm { g } \)에 \(200 \mathrm { units } \)의 Reverse Transcriptase M-MLV (Takara, Co. Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 이때 pri-miRNA 증폭을 위한 cDNA 합성에는 hexamer로 된 random primer와 oligo dT를 절반씩 섞어 사용하였고, pre-miRNA 증폭을 위해서는 random primer를 사용하여 reverse transcription 반응을 실시하였다. 경우에 따라 BHRF1-1과 BART2에 대해 에측되는 pri- 및 pre-miRNA 확인을 위해서는 각 EBV miRNA에 특이적인 reverse primer들을 사용하기도 하였다. 음성 대조군은 cDNA 합성 시 reverse transcriptase를 빼고 반응시켰다. 각각의 EBV miRNA 서열을 근거로 예측되는 pri-miRNA와 pre-miRNA의 발현 확인을 위해 Schmittgen 등이 사용한 방법을 응용하여 Fig. 1에 표시된 primer들을 제작하고 사용하였다. 추정되는 EBV pre-miRNA들의 forward와 reverse primer들은 pre-miRNA의 2차 구조 염기서열 내측과 상보적이 되도록 하였다. 한편, 추정되는 EBV pri-miRNA들의 증폭을 위해서는 sense primer들이 pre-miRNA들의 5' 말단으로부터 \(27 \mathrm { ~bp } \) upstream(상류)에 위치하도록 제작하였다.</p>