MTT assay에 의한 세포 독성 측정은 Carmichael의 방법에 따라 실험을 진행하였으며 멜라노마 세포 B16F10 를 96-well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well로 \( 180 \mu l \) 씩 분주하였고, 시료를 농도구간 별로 조제하여 \( 20 \mu l \) 를 첨가한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 24 시간 배양하였다.
<h2>MTT assay에 의한 세포 생존율 측정</h2> <p>MTT assay에 의한 세포 독성 측정은 Carmichael의 방법에 따라 실험을 진행하였다. 멜라노마 세포 B16F10 를 96-well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well로 \( 180 \mu l \) 씩 분주하였고, 시료를 농도구간 별로 조제하여 \( 20 \mu l \) 를 첨가한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 24 시간 배양하였다. 여기에 MTT 용액을 \( 2.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 농도로 제조 후 \( 40 \mu \mathrm { l } \) 첨가, 3 시간 배양 후 배양액을 제거하고 DMSO \( 100 \mu \mathrm { l } \) 를 각 well당 가하여 실온에서 10 분간 반응시켜 ELISA reader로 \( 540 \mathrm { nm } \) 에서 흡광도 측정을 실시하였다. 세포 생존율 측정은 시료용액의 첨가구과 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <p>세포 생존율 \( ( \%)=( \)시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도) \( \times 100 \)</p> <h2>Western blot을 통한 단백질 발현 측정</h2> <p>미백인자인 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 인자들의 단백질 발현 활성을 알아보기 위해 cell line B16F10을 각각 \( 100 \mathrm { ~mm } \) tissue culture dish에 \( 1 \times 10 ^ { 6 } \) cells/dish로 seeding 한 후 24 시간 동안 배양하여 안정화시켰다. Cell line B16F]10에 추출물을 농도 구간별 처리한 배지로 24 시간 배양한 후 PBS로 2회 washing하였다. Radio-immunoprecipita-tion assay (RIPA) buffer \( 10 \mathrm { ml } \) 에 complete mini \( 1 \mathrm { tab } \) 을 가한 \( 80 \mu l \) 로 용해하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 13,200 \mathrm { rpm } \) 에서 20분간 원심 분리하였다. 분리된 상층액은 BCA protein assay kit를 이용하여 정량 후 \( 20 \mu l \) 의 단백질을 질량의 차이를 이용한 \( 10 \% \) 의 SDS-PAGE상에서 전기영동 하여 분리하였다. 분리된 단백질은 transfer 기기를 사용하여 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane에 옮기고 skim milk와 TBST를 혼합하여 제조한 \( 5 \% \) blocking buffer를 사용해 실온에서 1 시간 blocking을 진행하였다. 1 차 항체를 희석하여 \( 4 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 over night 한 후, tris-buffered saline and tween 20 (TBST)를 이용해 10 분 간격으로 3 회 washing한다. 2차 항체를 \( 1: 500 \)로 희석하여 실온에서 1 시간 30 분 반응시킨 후 3회 washing하여 Davinch-Chemi \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) Imager CAS-400SM 기기를 이용해 밴드를 확인하였다.</p>