본 연구에서는 약 30개의 서울 전철역에서 채집한 총미세분진(TSP)을 사용하여 실험을 진행하였다. 천식을 유발한 실험동물에 대하여 하루에 4시간, 총 5일 동안 DEP와 PM을 \(10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m}^{3}\)의 농도로 inhalation chamber에서 흡입 노출시키는 방식으로 실험을 수행하였다. 실험을 통해 확인된 단백질 band의 density는 laser densitometer를 이용하여 측정하였으며, 통계적인 분석은 SPSS를 사용하여 수행하였다. 실험설계에 대한 분산분석은 ANOVA로 진행되었으며, 각각의 처리 그룹 간의 비교는 independent sample t-test를 통해 유의성을 검증하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>DEP와 PM의 수집과 전처리</h2> <p>DEP는 국립환경연구원 자동차공해연구소에서 확보하였고, PM 시료는 서울시내 지하전철역에 설치된 공기정화기의 membrane filter에 흡착된 것을 채취하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 총미세분진(total suspended particle; TSP)은 서울시내 전철역 약 30곳에서 모은 혼합 미세분진이다. 확보된 DEP 및 PM은 in vivo 흡입실험에 사용하기 전 membrane filter에 통과시켜 섬유성분울 제거하였고, 생물학직 요소(예:바이러스, 세균, 곰팡이 등) 및 수분을 제거하기 위하여 가열건조기속에서 가열처리\( \left(200^{\circ} \mathrm{C}\right. \)에서 3시간)하였다.</p> <h2>천식유발</h2> <p>천식은 Balb/c 암컷마우스와 동일한 품종과 조건의 IL-10 KO 마우스를 대상으로 유발시켰다. 본 연구를 위한 Balb/c 마우스는 (주)오리엔트바이오에서 구입하였으며, IL-10 KO 마우스는 한국생명공학연구원에서 제공받았다. 실험을 위한 대조군과 각 처치군에는 12마리를 배정하였고, 실험동물에서 친식을 유발시키기 위하여 실험 1일에 \( 20 \mu \mathrm{g} \) ovalbumin (Sigma, USA)과 \( 2 \mathrm{~mg} \) aluminum hydroxide (Sigma)를 ad-juvant로 하여 \( 100 \mathrm{\mu l} \) PBS에 녹여 복강내로 투여하였다. 최초 감작 14일 후 동일한 방법으로 2차 감작을 실시하였다. 실험 28일, 29일, 30일에 \( 1 \% \) ovalbumin (Sigma)을 ultrasonic nebulizer (Sunrise Medical, USA)를 사용하여 aerosol 상태로 만든 후 하루에 60분씩 chamber안에서 자연스런 호흡을 통하여 감작시켰다. 실험 30일째의 최후 감작 후 24시간이 경과한 다음 실험동물을 안락사 시켰고, 실험에 필요한 폐조직 시료들을 채취하였다.</p> <h2>DEP와 PM의 노출</h2> <p>천식이 유발된 실험동물에 하루 4시간씩 5일간 DEP와 PM을 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m}^{3} \)의 농도로 inhalation chamber안에서 흡입 노출시켰다.</p> <h2>면역조직화학염색</h2> <p>Ketamin과 Xylazine (\(Rumpun ^{\circledR}\))을 1:5로 혼합하여 마우스의 복강 내로 주사하여 마취하였다. 마취된 마우스에서 폐와 기관지를 절제해낸 후 \( 10 \% \) 포르말린 \( 3 \mathrm{~ml} \)를 주입하여 고정한 후 파라핀 블록을 만들고 \( 5 \mu \mathrm{m} \)의 절편을 제작하였다. \( 56^{\circ} \mathrm{C} \) in-cubator에 30분 처리하여 파라핀을 녹인 후 xylene으로 제거하였다. 조직절편을 탈파라핀한 후 \( 100 \% \), \( 90 \% \), \( 80 \% \), \( 70 \% \) 알콜을 단계별로 거쳐 탈수하고 함수과정을 거친 후 조직의 내인성 peroxidase 활성을 제거하기 위해 \( 0.3 \% \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)로 15분간 처리하였다. Phosphate buffered saline (PBS)으로 수세한 후 항체의 비특이성 결합을 억제하기 위해 \( 3 \% \) bovine serum al-bumin을 함유한 PBS를 이용하여 1시간 동안 반응시켰다. 이 후 anti-mouse ICAM-1과 VCAM-1 (abCAM, UK)을 각각 20 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 희석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에 하룻밤 처리하였다. DAKO LSBA 2 kit로 이차항체와 streptavidin-conjugated peroxidase(DAKO, Carpinteria, CA)를 처리시켰다. 발색은 3, 3'-dia-minobenzidine (DAB, Sigma, USA)를 사용하였고 Harris's hematoxylin (Sigma, USA)으로 대조염색을 실시하였다.</p> <h2>Western blot</h2> <p>각 처치군의 마우스에서 폐 조직을 적출한 후 PRO-PREP for Cell/ Tissue protein extraction solution을 조직에 첨가하고 homogenizer를 이용하여 조직을 분쇄하였다. 분쇄된 조직을 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\) \(12,000 \mathrm{~rpm}\)에서 30분간 원심분리하여 단백질을 분리하였고, Bradford methods를 이용하여 정량하였다. 분리된 단백질은 \( 15 \% \) SDS- PAGE gel을 사용하여 전기영동을 실시하였고, nitrocellulose transfer membrane으로 읆긴 후 \( 5 \% \)skim milk로 비 특이반응을 억제하기 위하여 blocking을 실시하였다. Anti-mouse ICAM-1과 VCAM-1을 각각 1:1000으로 희석하여 nitrocellulose transfer membrane에 하롯밤 처리한 후 washing buffer로 세 번 세척하였다. 세척 후, horse-adish peroxidase와 2차 항체가 결합된 용액으로 처리하였고, ECL detection system을 이용하여 단백질의 band를 확인하였다. 확인된 단백질 band는 laser densitometer (Model PD 1211; Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 density를 측정하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>통계 프로그램인 SPSS를 사용하여 실험설계에 대한 분산 분석은 ANOVA로, 각 처치군들간의 비교는 independent sample t-test를 실시하여 유의성을 검정하였다. 각 자료는 3번 이상의 반복된 실험을 통하여 얻어진 결과를 평균 \( \pm \) 표준오차로 표시하였고, \( P<0.05 \)인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.</p>