BAEC은 소의 대동맥에서 추출한 후 계대수 8 에서 13 사이의 일차세포를 사용했으며, DMEM을 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \)조건에서 배양하였다. cell viability assay kit를 이용하여 평가했으며 세포사멸 비율은 세포사멸 세포를 계산하여 결정하였다. 그리고 western blot 방법으로 결과를 얻었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>Melatonin 은 Sigma-Aldrich (M5250, St. Louis, MO, USA)사에서 제공하는 시약을 구입하여 에탄올에 용해하여 사용하였다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>BAEC (bovine aortic endothelial cell, 소 대동맥 내피세포)은 세포 외 기질에 부착하여 성장하는 세포(adhesion cell)로, 소의 대동맥에서 추출한 후 계대수 8 에서 13 사이의 일차세포를 실험에 사용하였다. BAEC은 \( 20 \% \) 소태아혈청(fetal bovine serum, Wel GENE Inc., Daegu, Korea)과 \( 0.5 \% \) 항생제 (streptomycin/penicillin)가 포함된 DMEM (glucose \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{li}- \) ter, Wel GENE Inc., Daegu, Korea)을 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \)조건에서 배양하였다. THP-1은 부유세포(suspended cells)로 T-플라스크에 배양하였으며, \( 10 \% \) 소태아혈청과 \( 0.5 \% \) 항생제가 첨가된 RPMI 1640 (Wel GENE Inc., Daegu, Korea)을 배지로 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \)조건에서 배양하였다.</p> <h2>세포성장 실험</h2> <p>세포성장은 cell viability assay kit (Daeillab Service Co., LTD, Seoul, Korea)을 이용하여 평가하였다. 전면 성장한BAEC을 16 시간 동안 혈청기아 시킨 후, 다양한 농도의 melatonin을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후 PBS (phosphate buffered saline)로 2 회 세척하여 WST reagent와 반응시켜 세포성장 비율을 결정하였다.</p> <h2>세포사멸 실험</h2> <p>전면 성장한 BAEC을 16 시간 동안 혈청기아 시킨 후 다양한 농도의 melatonin을 0,2,4,8,16,24 시간 동안 처리하여,시간 경과에 따른 변화를 현미경을 이용해 사진 촬영하여 기록하였다. 세포사멸 비율은 세포사멸 세포(원형 탈착 부유 세포)를 계산하여 결정하였다.</p> <h2>Western Blot</h2> <p>BAEC을 16 시간 동안 혈청기아 시킨 후, 다양한 농도의 melatonin을 처리하여 배양한 뒤, RIPA (radioimmunoprecipitation) 완충액 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris, \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 1 \% \mathrm{NP}-40,0.5 \% \) sodium deoxycholate, \( 0.1 \% \) SDS) 또는 Triton X-100 완충액(50 mM HEPES, \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 1 \mathrm{mM} \mathrm{Na}_{3} \mathrm{VO}_{4}, 1 \% \) triton \( X-100,10 \% \) glycerol)으로 분해하여 원심분리를 통해 상층액을 얻었다. 각 실험 조건에서 얻은 세포 용해액은 BCA assay kit (Thermo scientific Inc., Waltham, MA, USA)을 이용해 단백질량을 측정하였으며, 동일한 양의 총 단백질을 포함하는 일정량의 세포 용해액(cell lysates) 내의 단백질들을 SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 분리시켰다. 그 후 단백질을 PVDF (polyvinylidene fluoride) 막으로 이동시켜 고정하고, 분석하고자 하는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 1차 항체와 반응시킨 후, 2차 항체와 연속적으로 반응시켰으며, 이를 화학발광 검출법을 통해 \( X \)-선 필름에 현상하여 western blot 결과를 확보하였다.</p>