모양, 크기 같은 외형이 같은 무 종자를 골라서 표면을 살균한 다음 증류수로 씻어서 배양하였다. 4일 동안 자란 무 식물을 세 그룹으로 나누어서 자엽에 농도가 \( 10^{-5} \mathrm{M} \) 에서 \( 10^{-3} \mathrm{M} \) 사이이고 \( 0.1 \% \) Tween 20 이 들어있는 spermidine, spermine, putrescine 세 용액을 1mL 뿌린 후 12시간 동안 배양하였다. 그 다음 \( 50 \mu \mathrm{M} \mathrm{PQ}\) 용액을 뿌린 후 24시간 배양하였다. PQ 처리 후 무 식물의 자엽만을 분리해서 생체량 변화를 측정하였고, Bernt and Bergmeyer의 효소적 방법을 이용해서 자엽의 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 함량을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료식물의 생육조건</h2> <p>크기, 모양, 색깔이 균일한 무 (Raphanus sativus L. cv. Taewang) 종자를 선별하여 \( 1 \% \) sodium hypochlorite 용액에 15 분간 표면 살균 시킨 후 증류수로 충분히 세척하였다. Ball 상토 No. 1 (흥농종묘) 을 \( 1 / 3 \) 가량 담은 투명한 플라스틱 용기 \( (11.5 \times 11.5 \times 7.5 \mathrm{~cm}) \) 에 증류수 \( 120 \mathrm{~mL} \) 를 가해 충분히 적신 후 이 용기 1 개당 25 개씩의 살 균된 종자를 파종하고 투명한 wrap을 씌웠다. 이 발아용기를 \( 75 \% \) 상대습도, \( 24 / 20^{\circ} \mathrm{C} \) (낮/밤)의 온도 및 8,000 lux 빛 세기로 \( 16 \mathrm{~h} / 8 \) \( \mathrm{h} \) (낮/밤)의 광주기 조건을 갖는 growth chamber내에 넣고 발아, 생 육시켰다. 파종 후 2 일째 wrap을 벗기고 3 일째에 \( 30 \mathrm{~mL} \) 증류수를 추가로 공급하였다.</p> <h2>Polyamine (PA) 전처리 및 paraquat \( (\mathrm{PQ}) \) 처리</h2> <p>파종 후 4 일된 무 유식물을 각 그룹 별로 나누어 이들 유식물의 자엽에 \( 0.1 \% \) Tween 20 이 포함된 \( 10^{-5} \mathrm{M} \) 에서 \( 10^{-3} \mathrm{M} \) 농도 범위의 putrescine (Put), spermidine \( (\mathrm{Spd}) \) 및 spermine \( (\mathrm{Spm}) \) 용액을 각각 spray ( \( 1 \mathrm{~mL} / \) plant) 한 후 12 시간 배양하였다. 12 시간 각각의 \( \mathrm{PA} \) 로 전처리된 자엽에 다시 \( 50 \mu \mathrm{M} \mathrm{PQ}(0.1 \% \) Tween 20 포함 \( ) \) 용액을 동일한 방법으로 spray한 후 24 시간 추가 배양하였다. 대조구 자엽 은 \( 0.1 \% \) Tween 20 용액으로만, \( \mathrm{PQ} \) 단독 처리구 자엽은 \( 50 \mu \mathrm{M} \mathrm{PQ} \) (0.1\% Tween 20 포함) 용액만을 처리 후 배양하였다.</p> <h2>자엽의 생라. 생화학적 변인 측정</h2> <p>PQ 처리 24 시간 후 무 유식물에서 하배축과 뿌리를 제거한 후,자엽을 취하여 생체량 변화를 측정하였다. 자엽의 엽록소 정량은 5 쌍의 자엽을 냉각된 mortar와 pestle을 이용해서 \( 80 \% \) aceton \( (0.1 \% \),w/v, \( \mathrm{CaCO}_{3} \) 포함)으로 추출 후, 원심분리 \( (1,000 \mathrm{~g}, 10 \mathrm{~min}) \) 하여 얻은 상등액의 흡광도 \( \mathrm{A}_{645} \) 와 \( \mathrm{A}_{663} \) 값을 이용하여 Arnon (1949)의 방정식으로 산출하였다. 단백질 정량은 10 쌍의 자엽을 냉각된 mortar와 pestle을 이용해서 \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris-HCl (pH 7.5, 1\% PVPP 포함)로 마쇄 후 이 마쇄물을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 원심분리 \( (20,000 \mathrm{~g}, 20\mathrm{~min}) \) 하여 단백질 추출액을 얻었다. 이 추출액 \( 0.1 \mathrm{~mL} \) 에 증류수 \( 0.9 \mathrm{~mL} \) 를 섞어 \( 1 \mathrm{~mL} \) 로 만든 후 동부피의 \( 15 \% \mathrm{TCA} \) 를 가하고 1 시간 냉장 보관 후 재원심분리 \( (1,000 \mathrm{~g}, 10 \mathrm{~min}) \) 하여 얻은 단백질 침전물을 \( 0.1 \mathrm{~N} \)\( \mathrm{NaOH} \) 용액으로 녹인 후 Lowry (1951)의 방법으로 정량하였다.</p> <h2>\( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 함량 측정</h2> <p>자 엽의 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 함량은 Bernt and Bergmeyer의 효소적 방법 을 기초로 하여 측정하였다. 자 엽 10 쌍을 냉각된 mortar와 pestle을 이용해서 \( 2.5 \mathrm{~mL} \) 의 \( 0.1 \mathrm{mM} \) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 6.8) \) 와 \( 0.3 \) \( \mathrm{g} \) 의 sea sand를 넣고 마쇄한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 원심분리 \( (20,000 \mathrm{~g}, 20 \mathrm{~min}) \) 하여 상등액을 얻었다. 이 중 \( 0.5 \mathrm{~mL} \) 를 취해 여기에 \( 2.5 \mathrm{~mL} \) 의 peroxide 시약 (0.12 M sodium phosphate, \( 0.005 \% \) o-dianisidine, \( 40 \mu \mathrm{g} \) peroxidase \( / \mathrm{mL} \) 포함)을 혼합한 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 반응시켰다. 반응 후 \( 1 \mathrm{~N} \) perchloric acid \( 0.5 \mathrm{~mL} \) 을 첨가하여 원심분리 \( (1,000 \mathrm{~g} \), \( 10 \mathrm{~min} \) )한 후 얻은 상등액의 흡광도를 \( 436 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. 이 때의 흡광도 값을 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 표준곡선과 대조하여 자엽 내 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 의 함량 을 정량하였다.</p>