저해제인 EDTA와 1,10-phenathroline의 작용에 따른 metalloprotease 활성과 IGFBP-5의 분해 감소 정도를 관찰하였다. 저농도 글루코스 배양 조건에서 IGFBP-5의 분해가 미약했으며, 이는 고농도 글루코스 배양 조건에서 IGFBP-5 분해를 크게 저해하지 못한 점으로 보아, 고농도 글루코스 배양 조건에서는 IGFBP-5를 분해시키는 효소 활성이 강하다는 것을 확인하였다. 또한, GM10세포의 다양한 글루코스 배양 조건에서 metalloprotease의 크기를 확인하고, protease활성이 시간에 따라 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 IGFs와 같은 세포 성장인자에 대한 연구에 기여할 것으로 보여진다.
<h2>Protease 저해제에 의한 IGFBP-5 protease의 특성</h2> <p>앞선 결과에서 고농도 glucose 배양 조건에서 IGFBP-5의 감소는 protease 활성이 증가되어 단백질 분해가 일어났으며 serine protease에 의한 것으로 추정하였다. 이에 고농도, 저농도 glucose 배양 조건과 고농도 glucose 하에서 IGF-I 또는 인슐린을 첨가한 세포 배양액 중의 IGFBP-5의 분해에 관여하는 효소의 성질을 살펴보기 위해 여러 종류의 저해제를 처리하여 proteolysis를 수행하였다. GM10 세포에 저농도 glucose, 고농도 glucose 배양 조건 하에서 IGF-I과 인슐린을 첨가하여 배양한 세포 배양액에 EDTA, PMSF, 1,10-phenathroline, aprotinin, E64, benzamide, heparin을 처리한 뒤에 IGFBP-5 발현에 미치는 각 protease의 특성을 western blot analysis로 살펴보았다. 그 결과, metalloprotease 저해제인 EDTA에 의해서는 거의 저해되었으며, 1,10-phenathroline에 의해서는 약간의 저해를 볼 수 있었다. Serine protease 저해제인 PMSF의 경우는 IGF-I을 처리한 세포 배양액에서만 protease 활성을 저해시키지 못했으며, aprotinin의 경우 고농도 glucose 배양 조건을 제외한 다른 조건에서 모두 protease 활성을 억제시켰다. Serine protease 및 metalloprotease를 동시에 저해시키는 저해제로 알려진 heparin의 경우 protease 활성이 모든 조건에서 저해되었다. 또한 E64와 benzamide의 경우에는 단백질 분해 억제작용이 약화되어 있음을 확인할 수 있었다. 본 결과에는 제시하지 않았지만, 고농도 glucose 배양 조건에서 IGF-I을 처리한 경우 22kDa 과 20kDa의 fragment만 나타났으며, 다른 조건에서와는 달리 heparin 처리 시 20kDa의 fragment가 진하게 나타났다. 그리고 인슐린의 경우에서는 22kDa과 17-,16kDa 의 fragment만이 확인되었다. 따라서, IGF-I과 인슐린은 IGFBP-5 protease 활성에 관여하는 것으로 여겨지며, 고농도 glucose의 배양조건 하에서 섬유아세포에서 IGFBP-5의 분해는 serine protease 뿐만 아니라 metalloprotease 역시 관여한다는 것을 확인하였다. 섬유아세포에 있어서 IGFBP-5의 분해는 serine protease와 metalloprotease가 모두 관여하며, 특히 serine protease가 우세하게 작용하며, metalloprotease도 작용한다고 하였다. 또한 serine protease 저해제인 aprotinin, 3,4-DC I, PMSF와 metalloprotease inhibitor인 EDTA, 10-phenathroline 등에 의해 IGFBP-5 proteolysis 억제 효과를 나타냈으나, E64, Benzamide, NEM, iodoacetic acid등은 protease 활성을 억제시키지 못한다고 하였다.</p> <p>이상의 결과에서 저농도 glucose의 배양 조건에서 IGFBP-5의 분해가 약하였고, 고농도 glucose 배양 조건에서는 같은 농도의 저해제를 사용하였음에도 불구하고 IGFBP-5 분해를 크게 저해하지 못하는 것으로 보아, 고농도 glucose 배양 조건에서는 IGFBP-5를 분해시키는 효.소의 활성이 강하다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 당뇨 상태의 in vivo 연구에서 나타나는 결과와 일치하며, 더 나아가 glucose 농도 및 IGF-I과 인슐린의 첨가에 의해 유도되어지는 IGFBP-5 protease 활성의 변화와 관련된 작용 기전의 규명과 IGFBP-5 protease가 고농도 glucose 배양 조건에서 왜 강한 활성을 나타내는지에 대해서는 이들 효소를 분리 정제하여 다른 각도로 보다 많은 연구가 진전되어야만 해석이 가능할 것이라고 생각된다.</p> <h2>Glucose 농도가 IGFBP-5 protease의 크기에 미치는 영향</h2> <p>앞선 결과에서 IGFBP-5를 분해하는 metalloprotease가 활성화됨을 확인하였으므로 metalloprotease의 크기를 알아보기 위해 gelatin zymography를 실시하였다. 그 결과, GM10세포에서 고농도와 저농도 glucose 배양 조건과 고농도 glucose 배양 조건 하에 IGF-I과 인슐린을 처리한 세포 배양액 중의 metalloprotease의 크기를 확인한 결과 모든 조건에서 72-, 69-, 55-kDa의 gelatinase를 확인하였다. 그 중에서도 69kDa 의 gelatinase가 가장 큰 활성을 가지고 있었으며 특히, 고농도 glucose 배양 조건에서 효소 활성이 증가함을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 GM10 세포에서 고농도와 저농도 glucose 배양 조건에 있어서 시간의 경과에 따른 protease의 크기를 gelatin zymography로 살펴보았다. 그 결과, 고농도와 저농도 glucose 배양 조건에 있어서 protease활성이 시간 의존적으로 증가하였으며, 앞의 결과와 마찬가지로 고농도 glucose 배양 조건에서 protease의 활성이 크게 증가함을 확인하였다.</p> <p>이상으로 GM10 세포를 사용하여 고농도 glucose 배양 조건하에서 protease 활성의 증가로 인해 IGFBP-5의 분해가 촉진됨을 확인하였다. 그러나 당뇨병과 같은 이화상태에서 어떤 기전을 통해 IGFBPs의 분해가 촉진되는지, 여기에 관여하는 효소의 발현 및 그 분자적 수준 등에 관해서는 아직까지 밝혀진 바가 없다. 또한, 당뇨병에 관여하는 유전자 수준이다 치료의 목적으로 가능성을 제시하고 있는 효소 정제등에 있어서 보다 효율적인 in vitro system을 필요로 한다. 본 연구 결과를 바탕으로 IGFs와 같은 세포 성장인자에 대한 연구는 세포수준의 당뇨병과 관련된 in vitro model system이 가능하리라고 여겨지며 더 많은 연구가 진행되어야 할 것으로 보인다.</p>