루시퍼라제 활성 분석을 위해 항산화 특성을 나타내는 4가지 추출물에 의해 유발되는 hPrx 6/Luc의 반응을 조사하기 위해 Luciferase assay kit(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 세포에서 SOD 활성을 확인하기 위해 SOD Assay Kit(Dojindo Molecular Technologies, Inc., Japan)를 사용하여 비색 분석을 수행했습니다. 처음에는 세포를 1x PBS를 첨가하고 균질화기를 사용하여 균질화하였다. 이어서 세포 파쇄물을 \( 10,000 \times g \)에서 15분 동안 원심분리하여 상등액을 얻었다.
<h2>Luciferase activity analysis</h2> <p>항산화능을 갖는 4가지 추출물에 의해 유도되는 hPrx 6/Luc의 반응을 관찰하기 위해 실시한 luciferase activity analysis는 Luciferase assay kit (Promega, Madison, WI,USA)를 이용하였다. 먼저, NCI-H460 세포에 hPrx 6/Luc 벡 터를 transfection하고, 24시간 경과 후에 KWG, KRG, LP, RLP 추출물을 처리하였다. 24시간 경과 후, 배지를 제거하고 \( 1 x \) lysis buffer를 첨가하여 얻은 세포용해물을 \( 12,000 \times g \) 에서 15초 동안 원심분리한 후 상층액을 분리하였다. Luminometer tube에 \( 100 \mu \) 의 Luciferase Assay Reagent를 넣고, 분리한 세포용해물 \( 20 \mu 1 \) 을 첨가하였다. 이를 섞은 후 Clinilumat (Berthold, Germany)을 이용하여 luciferase activity를 측정하였다.</p> <h2>Activity analysis of superoxide dismutase (SOD)</h2> <p>세포에서 SOD activity를 확인하기 위하여 SOD Assay Kit (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Japan)를 사용하여 calorimetric assay을 실시하였다. 먼저, 세포는 1x PBS를 첨가 한 후 homogenizer를 이용하여 균질화하고, 세포용해물을 \( 10,000 \times g \) 에서 15분동안 원심분리하여 상층액을 분리하였다.</p> <p>분리한 세포용해물은 dilution buffer (1x PBS)로 \( 1 / 2,1 / 2^{2} \), \( 1 / 2^{3}, 1 / 2^{4} \) 로 희석한 후, 96 well plate에 sample solution을\( 20 \mu 1 \) 씩 넣고, \( 200 \mu 1 \)의 WST working solution을 첨가하였다. 각 well에 enzyme working solution (\( 20 \mu 1 \))을 첨가하고 Plate 를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 분간 배양하여 효소와 반응시킨 후, spec-trophotometer를 이용하여 \( 450 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. SOD activity는 아래의 식을 이용하여 계산하였다: SOD activ-ity \(\(Inhibition rate, %)\) \( =\left[\left(\mathrm{A}_{\text {blank1- }}-\mathrm{A}_{\text {blank3 }}\right)-\left(\mathrm{A}_{\text {sample }}-\mathrm{A}_{\text {blank } 2}\right)\right] \) / ( \( A_{\text {blank1-A }} \) blank3) 100 ( \( A_{\text {blank1: absorbance of blank1, }} \) blank2: ab-sorbance of blank2, A blanks: absorbance of blank 3 , Asample: ab-sorbance of sample).</p> <h2>통계분석</h2> <p>실험 결과에 대한 유의성은 One way ANOVA (SPSS for Windows, Release 10.10, Standard Version, USA)를 이용하여 분석하였고, \( P-value<0.05 \) 를 유의성이 있는 값으로 인정하였으며, 실험결과는 means \( \pm \) SD로 제시하였다.</p>