실험 결과, 재조합 CFTase의 효소반응의 최적 활성 \( \mathrm{pH} \)는 \( \mathrm{pH} 8.0\)이었으며, 최적 온도는 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)였다. 또한 최적의 기질농도는 dahlia inulin \( 5 \% \)를 사용할 때 였으며, 이 때 가장 높은 CFs 산물이 생성되었다. 생성된 CFs는 효모 세포 표면의 glucan 구조와 공유결합하여 life time이 길기 때문에 안정성이 높고, 회수가 용이하므로, CFTase 표면발현계 효모 생촉매제로서 산업적으로 유용할 것이라고 생각된다.
<h2>반응 최적 \( \mathrm{pH} \) 와 최적온도</h2><p>재조합 CFTase의 효소반응의 최적 활성 \( \mathrm{pH} \)를 \( \mathrm{pH} 4.0 \sim 10.0 \) 의 범위에서 측정한 결과 Fig. 3 에서 보는 바와 같이 episomal 발현 CFTase 최적 \( \mathrm{pH}[11] \)와 동일하게 \( \mathrm{pH} 8.0\)에서 최적 활성을 보였다. \( \mathrm{pH} 3.0 \)에서는 효소활성이 거의 나타나지 않았고, \( \mathrm{pH} 6.0 \sim 9.0\)에서 반응시에도 효소활성이 많이 남아있는 것으로 보아 효모에서 표층발현된 CFTase는 넓은 범위의 \( \mathrm{pH} \) 에서도 비교적 안정한 것으로 나타났다. 재조합 CFTase의 효소반응의 최적온도를 \( 30 \sim 60^{\circ} \mathrm{C} \)의 범위에서 측정한 결과 Fig. 4 에서와 같이 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 최적 활성을 보였다. 또한, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 이상에서 효소활성이 감소되었고, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 이상에서는 효소활성이 나타나지 않았다.</p><h2>최적 기질농도와 최적 inulin source</h2><p>최적의 기질농도를 결정하기 위해 다른 농도 \( (1-7 \%) \)의 dahlia inulin을 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 효소반응 한 결과 dahlia inulin \( 5 \% \)를 사용하였을 때 가장 높은 CFs 산물이 생성되었다.</p><p>CFs의 최적 생성을 위하여 inulin의 종류 (dahlia, chicory, Jerusalem artichoke)에 따른 효소반응의 차이점을 비교하였다. 각 inulin에 대한 효소반응생성물 CFs를 HPLC로 정량 분석한 결과, Jerusalem artichoke으로부터 생성된 CFs를 \( 100 \% \)로 하였을 때, chicory는 \( 70.8 \% \), dahlia는 \( 92.8 \% \)로 나타났다. Jerusalem artichoke와 dahlia가 효과적이었다. 이 결과로 Jerusalem artichoke와 dahlia은 산업적으로 활용가치가 거의 없던 농산부산물 inulin을 고부가가치 생물소재 생산원료인 CFs 생성에 유용할 것으로 사료된다. Ohta 등의 연구 결과에 따르면 fructose 평균중합도가 dahlia는 40.3, chicory는 33.6, Jerusalem artichoke는 40이상으로 나타났다. Jerusalem artichoke의 높은 fructose 평균중합도는 균체증식을 증가시키고 inulooligosaccharide (IOSs)와 에탄올 생성에 효과적으로 나타났다. 또한 inulin, Jerusalem ar- tichoke powder와 Jerusalem artichoke juice를 A. ficuum en-doinulinase와 반응한 결과 Jerusalem artichoke juice를 기질로 하였을 때 반응 72시간 때 가장 높은 IOSs 수율 \( (\ 79.8 \%\))을 얻었다.</p><h2>CFs 생성의 분석</h2><p>재조합 균주 S. cerevisiae EBY100/pCTECFTN를 초기 \( \mathrm{pH} 8.0\), \(50^{\circ} \mathrm{C}\), YPDG 배지에서 48시간 회분 배양한 후 세포를 \( 5 \% \) Jerusalem artichoke inulin과 함께 반응 후 TLC로 분석한 결과 생성된 CFs의 구성성분으로 cycloinulohexaose (CF6), cycloinuloheptaose (CF7), and cycloinulooctaose (CF8)이 생성되었고, 이 중에서 CF6이 주생성물이었다. CF6, CF7, CF8 생성비율은 \(8:1:1\)이었다(data not shown). \(\alpha\) -agglutinin를 사용하여 Kim 등은 B. macerans CGTase를 표면발현시켰고, 기질인 soluble starch와 CGTase가 표면 발현된 형질전환체를 60 시간 이상 반응시켜 \(\alpha\)-CD를 생산하였다. 그 연구 결과에 따르면 episomal 발현에 의한 CGTase는 \(\alpha\)-CD, glucose, maltose 분해 시 intermolecular transglycosylation에 의해 maltooligosaccharide 농도는 증가하고, 부수적으로 \(\alpha\)-CD는 감소하는 반면, 표면발현에 의한 CGTase는 반응 49시간까지 coupling, disproportionation에 의해 저농도의 maltooligosaccharide로 분해되다가 감소되어져 \(\alpha\)-CD만 남게 된다. 결론적으로 보다 순도가 높은 \(\alpha\)-CD를 생산할 수 있는 것과 그에 따른 안정성이 높은 것으로 나타났다. 이는 목적 단백질이 효모 세포 표면의 glucan 구조와 공유결합에 의하여 결합되어 있어 반응 중 추출되지 않아 life time이 길어지기 때문이다. 본 연구에서도 CF6을 주성분으로 하는 순도높은 CF를 안정적으로 생산할 수 있음을 알았다. 따라서, CFTase 표면발현계의 효모 생촉매제는 전통적인 고정화에 의한 발효과정과는 달리 효소의 안정성 및 회수가 용이하여 생산성 저하 문제를 피할 수 있어 산업적 응용에 유리할 것으로 사료된다.</p>