어류에서 아가미, 신장, 간, 근육 조직의 항산화와 관련된 여러 효소들의 활성을 측정하고, 어류의 뼈와 근육 조직의 미량중금속을 측정하였다.
<h2>항산화효소 활성 측정</h2> <h3>시료 추출</h3> <p>어류의 아가미, 신장, 간, 근육 조직을 적출하여 \( 100 \mathrm{mM} \) phosphate buffer \( \mathrm{pH~} 7.2 \)에 혈액 및 기타 이물질 등을 세척한 후 조직의 무게를 측정하였다. 무게를 측정한 시료는 homogenation buffer \( (5 \mathrm{mM} \) Tris, \( 38 \mathrm{mM} \) Glycine, \( \mathrm{pH} \) 8.4)에서 완전히 균질화 시킨 후 시료는 \( 13,000 \mathrm{rpm}, 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 원심 분리하여 지질층을 제외한 상등액만을 모아 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다. 항산화효소 활성 측정에 사용된 모든 시약은 Sigma사로부터 구입하였다.</p> <h3>Superoxide dismutase (SOD)</h3> <p>SOD 활성은 \( 50 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer \( \mathrm{pH~} 7.8 \), \( 0.1 \mathrm{M} \) cytochrome c, \( 50 \mathrm{mM} \) xanthine, \( 0.1 \mathrm{mM} \) EDTA 및 효소액이 포함된 용액을 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 예치한 다음 Xanthine oxidase를 첨가하여 반응을 개시하였다. 효소의 활성은 \( 550 \mathrm{~nm} \)에서 10초 단위로 150초간 흡광도를 측정하였고, Xanthine oxidase 첨가량은 효소액을 함유하지 않은 반응액의 흡광도 흡수가 분당 0.025가 되도록 조절하였다. 효소의 활성은 cytochrome c의 환원 속도를 \( 50 \% \) 억제하는 양을 1 unit로 하여 \(\mathrm{unit/mg ~protein/min}\)으로 나타냈다.</p> <h3>Catalase (CAT)</h3> <p>CAT 활성은 \( 50 \mathrm{mM} \) phosphate buffer (\( \mathrm{pH~} 7.0 \))와 시료액을 넣은 후 기질로 \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{H} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 용액을 가하여 잘 혼합한 후 \( 240 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도의 변화를 2분간 측정하였다. 대조실험으로는 기질인 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 용액 대신에 \( 50 \mathrm{mM} \) phosphate buffer \( \mathrm{pH~} 7.0 \)을 가하고 위와 동일한 방법으로 훕광도의 변화를 측정하였다. CAT의 활성은 1분 동안에 \( 1 \mu \mathrm{mol} \)의 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 분해하는 효소의 양을 1 unit로 하였다.</p> <h3>Glutathione peroxidase (GPX)</h3> <p>GPX 활성은 \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA가 함유된 \( 100 \mathrm{mM} \) phosphate buffer (\( \mathrm{pH~} 7.6 \))에 \( 0.25 \mathrm{mM} \) GSH, \( 0.12 \mathrm{mM} \) NADPH, \( 20 \mathrm{mM} \) glutathione reductase 0.72 U가 포함된 반응액을 제조하였다. 이 반응액에 효소 시료액을 혼합한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 방치한 다음 \( 4 \mathrm{mM} \) cumene hydroperoxide를 첨가하여 \( 340 \mathrm{~nm} \)에서 1분간 흡광도의 변화를 측정하였다. GPX의 활성은 1분 동안에 \( 1 \mu \mathrm{mol} \)의 NADPH를 NADP로 산화하는 효소의 양을 1 unit로 하였다.</p> <h3>Glutathione S-transferase (GST)</h3> <p>GST 활성은 \( 1 \mathrm{mM} \) GSH와 \( 1 \mathrm{mM} \) chlorodinitrobenzene (CDNB)이 함유된 \( 100 \mathrm{mM} \) phosphate buffer \( \mathrm{pH~} 7.0 \)에 효소 시료를 넣은 후 \( 340 \mathrm{~nm} \) 에서 1 분간 흡광도의 변화를 측정하였다. GST의 활성은 1분 동안에 \( 1 \mathrm{nmol} \mathrm{~GSH} \)를 소비하는 효소의 양을 1 unit으로 하였다.</p> <h3>Glutathione reductase (GR)</h3> <p>GR 활성은 \( 1 \mathrm{mM} \) oxidized glutathione (GSSG), \( 50 \mu \mathrm{M} \) NADPH가 함유된 \( 100 \mathrm{mM} \) phosphate buffer (\( \mathrm{pH~} 7.6 \))에 효소 시료액을 넣은 후 \( 340 \mathrm{~nm} \)에서 1분간 변화되는 흡광도를 측정하였다. GR의 활성은 1분 동안에 \( 1 \mathrm{nmol} \) 의 NADPH가 산화되는 효소의 양을 1 unit으로 하였다.</p> <h2>미량중금속 측정</h2> <p>어류의 빼, 근육 조직을 적출한 후 초음파세척기(5210, Branson)에서 표면에 부착된 점토의 미세입자 및 이물질을 최대한 제거하였다. 제거한 후에 액체 질소로 처리하여 재차 냉동건조기에서 완전히 건조 후 건조중량을 측정하였다. 각 조직의 미량중금속(As, Cd, Pb, Cr) 측정을 위해 전처리는 초단파 용해장치(Ethos Plus, Milestone)를 이용하였다. 전처리된 조직 내 미량중금속의 함량은 유도결합 플라즈마 질량분석기 (Elan DRC-e, Perkin Elmer)를 이용하여 측정하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>각 실험에서 얻어진 자료에 대하여 통계 프로그램 패키지 (SPSS Inc., ver 12.0K)를 이용하여 분석한 후, Anova test를 사용하여 평균값들 간의 유의성을 검정하였으며 \( (p<0.05) \), 모든 데이터는 평균 \( \pm \) 표준편차 \( (\operatorname{mean} \pm \mathrm{SD}) \)로 표시하였다.</p>