본 연구는 6 종의 제한효소를 이용한 PCR 산물의 RFLP 분석을 통해 6 종의 Vibrio 균주에 대한 종 동정을 시도하였다. 이를 위해 알려진 V. algindyticus 와 V. parahaemdyticus를 포함한 6 종의 Vibrio 표준 균주와 참고 균주 Grimontia(Vibrid) hollisae를 대상으로 하였고, 제한효소를 이용하여 생성된 패턴에 근거하여 16S rRNA의 RFLP type을 분석하였다. 분석 결과, 6 종의 Vibrio 균주에 대한 제한효소패턴 조합을 통해 총 6 개의 서로 다른 RFLP type (a-f)이 구분되었다.
<h2>RFLP 분석 및 덴드로그램 작성</h2> <p>PCR 산물의 RFLP 분석을 위해 4 base를 인식하는 Alu I, Cfo I, Dde I, Hae Ⅲ, Msp I, Rsa I , 6 종의 제한효소(TaKaRa, Japan)를 사용하였다. 제한효소의 처리는 PCR 산물 \( 15 \mu \mathrm { l } \), 제한효소 2 units, \(10 \times \) reaction buffer \( 2 \mu \mathrm { l } \) 를 첨가하여 최종 \( 20 \mu \mathrm { l } \)로 하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 4 시간 반응시켰다. \(6 \times \) tracking dye와 혼합하여 \( 13 \mu \mathrm { l } \) 를 \( 3 \% \) NuSieve agarose (FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA)에 loading하여, \(0.5 \times \) TBE buffer에서 \( 80 \mathrm { V } \) 로 4 시간 전기 영동한 후 EtBr ( \(50 \mathrm { ng } / \mathrm { ml } ) \) 로 염색하고 Gel Logic 200 (Kodak, USA)을 이용하여 UV 하에서 관찰하여 각 균주의 밴드패턴을 확인하였다.</p> <p>RFLP type의 패턴 분석을 위해 \( \mathrm { FPQuest } ^ {\mathrm { TM } } \) (Bio-Rad, Belgium) software를 이용하였으며 Similarity coefficient는 Dice 방법에 의해 구하고 덴드로그램은 Neighbor-joining에 의해 작성하였다.</p> <h1>결 과</h1> <h2>RFLP 분석</h2> <p>Vibrio 종 동정에 대한 16S rRNA 의 PCR-RFLP방법을 평가하기 위해 core group으로 알려진 V. algindyticus 와 V. parahaemdyticus를 포함하여 6 종의 Vibrio 표준 균주와 참고 균주 Grimontia(Vibrid) hollisae를 대상으로 하였다. 6 종의 제한효소를 이용하여 생성된 제한효소패턴에 근거하여 16S rRNA의 RFLP type을 분석하였다. Vibrio의 RFLP type은 각각 Alu I 를 이용한 경우 6 개, Cfo I, 2 개, Dde I, 3 개, Haelll, 5 개, MSp I, 2 개, Rsa I, 3 개의 type이 관찰되었다. 6 종의 Vibrio 종, 즉 V. alginolyticus V. parahaemolyticus, V. protedyticus, V. vulnificus, V. fluviali, V. mimicus에 대한 6 종류의 효소를 이용한 제한효소패턴을 조합한 결과 총 6 개의 서로 다른 RFLP type (a-f)이 구분되었다.</p>