Indole oxygenase 유전자 재조합 대장균의 농축액으로 indigo 생성 효소활성도를 측정한 결과, \( E.~coli \) \( \mathrm { DH } 5 \alpha \)/pTCAN1의 활성이 \(\mathrm{1.75 nmol/min/mg}\)DCW, IPTG를 첨가하지 않고 배양시킨 \( E.~coli \) \( \mathrm { DH } 5 \alpha \)/pTCAN2의 활성이 \(\mathrm{3.85 nmol/min/mg}\)DCW로 확인되었다. LB, TB 및 M9 배지에서 트립토판 첨가유무에 따른 indigo 생산량을 측정한 결과, TB배지에서 트립토판 첨가시 \(236\mu\mathrm{m}\)의 인디고가 생산되었고, M9배지에서는 \(17\sim23 \mu\mathrm{m}\)의 indigo가 생성되었다. 효소개량을 통한 효소활성도 향상이 필요하다.
<h2>인디고생성 재조합 대장균 활성도</h2> <p>Indole oxygenase 유전자를 함유한 재조합 대장균 농축액을 이용하여 indole을 기질로 사용하여 indigo 생성 효소활성도를 간접적으로 측정한 결과, IPTG를 이용하여 발현시킨 \( E.~coli \) \( \mathrm { DH } 5 \alpha \)/pTCAN1의 경우 약 \( 1.75 \mathrm { ~nmol } / \mathrm { min } / \mathrm { mgDCW } \), IPTG를 첨가하지 않고 배양시킨 \( E.~coli \) \( \mathrm { DH } 5 \alpha \)/pTCAN2의 경우 약 \( 3.85 \mathrm { ~nmol } / \mathrm { min } / \mathrm { mgDCW } \)의 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 이는 styrene monooxygenase를 발현시킨 Pseudomonas putida 재조합미생물에서 측정한 활성도 \( 4.2 \sim 12.1 \mathrm { ~nmol } / \mathrm { min } / \mathrm { mgDCW } \) 보다 최대 약 3배 낮은 활성을 보여주었다. 따라서, 향후 효소개량을 통한 효소활성도의 향상이 필요한 것으로 사료된다.</p> <h2>인디고의 생산</h2> <p>\( E.~coli \) \( \mathrm { DH } 5 \alpha \)/pTCAN2를 이용하여 LB, TB 및 M9 배지에서 트립토판 첨가유무에 따른 indigo 생산량을 측정한 결과, LB배지의 경우 트립토판 첨가유무에 큰 차이 없이 48시간 배양 후 약 \( 50 ~ \mu \mathrm { M } \)의 indigo가 축적되었으며, TB배지의 경우 15시간 배양 후 트립토판을 첨가하면 무첨가보다 약 5배 높은 약 \( 236 ~ \mu \mathrm { M } \)의 인디고가 생산되었으며, 최소배지인 M9배지의 경우, 트립토판의 첨가유무에 차이 없이 약 \(17 \sim23 ~ \mu \mathrm { M } \)의 indigo가 생성되었다. 이는 TB배지의 경우 LB배지 및 M9최소배지보다 복합영양성분이 많아 단위부피당 세포가 많이 자라서 indole oxygenase 효소활성이 높아져서, 트립토판을 첨가한 TB배지에서 특히 indigo가 많이 축적되는 것으로 생각된다.</p> <h1>요 약</h1> <p>indigo는 염색산업에서 매우 중요한 색소로, 현재는 고가의 식물에서 추출된 indigo 대신에 합성 indigo가 주로 사용된다. 최근 미생물을 이용한 생물학적 방법으로 indigo를 생산하고자 하는 연구가 많이 진행되고 있으며, 여러 미생물원으로 부터 다양한 형태의 indole oxygenase를 탐색, 특성의 규명, 효소의 특성 개량, indigo 생산등의 연구가 진행되고 있다. 본 연구는 Rhodococcus sp. RHA1 유래의 indole oxygenase로 추정되는 유전자를 클로닝하여 대장균에서 발현시킨 결과, 청색 색소가 축적되었으며, 분광광도계, HPLC 및 TLC분석을 통해서 그 청색 색소가 indigo임을 확인하였으며, 또한 전세포를 이용하여 indole 첨가시 indigo가 생성됨을 측정하여, 본 연구의 효소가 indole을 indigo로 전환을 촉매하는 indole oxygenase임을 확인하였고, 트립토판을 첨가한 TB배지에서 약 \( 236 ~ \mu \mathrm { M } \)의 인디고가 생산됨을 알았다. 본 연구를 통해 조사된 특성 이외에 효소 활성의 개량, 적절한 생산용 균주의 선정, 경제적이며 안정적인 대량 발현, 배지 및 배양 공정의 최적화 과정등을 거칠 경우, 보다 더 실용적인 indigo 생산 생물공정의 확립이 가능할 것으로 기대된다.</p>