본 실험에서 사용된 해조류들은 갈조류, 홍조류 및 녹조류 총 35종이며, 항혈전 활성과 flavonoid의 함량을 측정하여 그 상관관계를 linear regression을 이용하여 검토하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료 및 시료의 조제</h2> <p>본 실험에 사용된 해조류들은 갈조류 17종, 홍조류 11종 및 녹조류 7종의 35종으로, 그 중 33종은 2003년 6월에서 2008년 9월 사이에 부산, 경남, 경북 및 전남에서, 포도송이해초 및 코토니 2종은 각각 2008년 1월 Vietnam 및 2008년 9월 Indonesia에서 구입하여 시료로 사용하였다. 해조류들은 부경대학교에서 동정, 확인하였으며, 각각의 시료는 현재 부경대학교 생물공학과에 보관되어 있다. 채취한 해조류들은 이물질을 제거하고 수돗물로 세척한 후 실온에서 음건하였다. 건조 해조류들은 믹서기로 분쇄 후 \( -20^\circ \mathrm{C} \)에서 사용 전까지 보관하였다. 메탄올 추출물은 건조분말 해조류에 10배 부피의 메탄올을 가한 후 상온에서 2일 추출하였으며, 이를 4회 반복한 후 추출액을 모아 감압 농축하여 분말로 제조하였다. 사용한 해조류의 상세정보는 Table 1에 나타내었다. 추출물은 DMSO (dimethylsulfoxide)에 녹인 후 적당한 농도로 희석하여 coagulation parameter 인 TT, PT 및 aPTT를 측정하였으며, 활성물길 탐색을 위해 총 flavonoid, 총 polyphenol, 총당 및 환원당 함량을 측정하였다. 사용한 인간혈장은 최근 1개월 동안 약물투여를 받지 않은 지원자의 전혈로부터 조제하였으며, 채혈 후 \( 4^\circ \mathrm{C} \) 에서 \( 5,000 \times g \) 로 5분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하고 냉동보관 하였으며, 필요시 상온에서 해동하여 사용하였다. PT와 aPTT분석에는 MD Pacific Hemostasis (Tianjin MD Pacific Co., China)의 분석시약 및 표준혈장(MD Pacific Co., China )을 사용하여 측정하였다.</p> <h2>항혈전 활성</h2> <p>항혈전 활성은 해조류 시료들의TT, PT 및 aPTT를 측정하여 평가하였으며, 기존의 보고한 방법과 동일하게 Amelung coagulometer KC-1A (Tokyo, Japan)를 이용하여 혈액 응고시간을 측정하여 평가하였다. 시료 대조군으로는 아스피린과 헤파린(Sigma Co., USA)을, 용매 대조군으로는 DMSO를 사용하였다. 시료의 항혈전 활성은, 해조류 시료의 TT, PT 및 aPTT를 각각 3회 이상 반복한 실험의 평균치를 용매 대조구인 DMSO의 TT, PT 및 aPTT 평균치의 비로 각각 나타내었다.</p> <h2>기타 분석</h2> <p>해조류 시료의 총 flavonoid의 함량 측정은 기존의 보고한 방법에 따라 측정하였으며, 각각의 시료를 18시간 메탄올 교반 추출하고 여과한 추출 검액 \(400\) \( \mu \mathrm{l}\)에 \(90\%\) diethylene gly-col \( 4\) \( \mathrm{ml} \) 를 첨가하고 다시 \( 1\) \( \mathrm{N}\) \( \mathrm{NaOH}\) \( 40\) \( \mu \mathrm{l}^{2} \) 를 넣고 \( 37^\circ \mathrm{C} \) 에서 1시간 반응 후 \( 420\) \( \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 총 polyphenol 함량은 추출 검액 \(400\) \( \mu \mathrm{l}\)에 \(50\) \( \mu \mathrm{l}\)의 Folin-ciocalteau, \( 100\) \( \mu \mathrm{l} \)의 \( \mathrm{Na_2CO_3} \) 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 \( 725\) \( \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 총당 정량은 시료 \( 100\) \( \mu \mathrm{l} \) 를 \( 5 \% \) 페놀용액 \( 300\) \( \mu \mathrm{l} \) 및 진한황산 \( 1.5\) \( \mathrm{ml} \)를 가하여 실온에서 30분간 반응시킨 후, \( 490\) \( \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 결정하였으며, sucrose를 이용하여 작성한 표준검량선에 의해 계산하였다. 환원당 정량은 시료용액 \( 200\) \( \mu \mathrm{l} \) 를 dnitrosalicylic acid reagent \(600\) \( \mu \mathrm{l} \)와 잘 혼합한 후 \( 100^\circ \mathrm{C} \) 에서 10분간 중탕하였고, 실온에서 방냉 후, \( 546\) \( \mathrm{nm} \) 에서 흡광도를 측정하였으며, glu-cose를 이용하여 작성한 표준검량선에 의해 계산하였다.</p> <h2>통계분석</h2> <p>실험 결과는 SPSS 18.0 버전을 사용하여 \( mean \pm SD \)로 나타내었으며, 각 군간의 차이는 ANOVA Tukey LSD 통계처리방법으로 통계적 유의성 검정을 조사하였다. 유의수준은 \( p<0.05 \)로 하였다. 항혈전 활성과 추출물 성분과의 상관관계 검토는 SigmaPlot 2001 (Ver 7.0)의 linear regression을 이용하였다.</p>