락툴로오스 전환에 최적인 효소 선별을 위해 미생물 유래 CE의 열내성과 효소활성을 비교하였다. Bc, Sm, Dt, St, Ra, Rm, Cs 균주에서 분리된 유전자를 발현한 재조합 균주로 조효소액을 만들어 락툴로오스 전환율을 측정하고 비교하여, Cs 균주의 CsCE 효소를 모효소로 선정하였다. 이를 바탕으로 열내성 돌연변이 효소를 선별하기 위해 CsCE helix 4 - 12 구간에 error-prone PCR을 통해 효소의 다양한 위치에 돌연변이를 유발하였으며, 이 중 열내성만 향상된 균주 K149N 돌연변이를 \( \mathrm{CS}-\mathrm{H}^{\mathrm{R}} \), 열내성과 전환율이 향상된 K323M 돌연변이를 \(\mathrm{CS}-\mathrm{H}^{\mathrm{R}} \mathrm{C}^{\mathrm{E}} \)로 선별 후 명명하였으며 이후 관련 실험을 진행하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>미생물 유래 CE의 열내성 및 락툴로오스 전환수율비교</h2><p>미생물 유래의 CE의 열내성과 효소활성을 비교하여 락툴로오스 전환에 유리한 효소를 선별하기 위하여 B. coagulans(Bc), S. maltophilia (Sm), D. turgidum (Dt), S. thermophilia(St), R. albus (Ra), R. marinus (Rm), C. saccharolyticus(Cs) 균주로부터 분리된 유전자를 발현시킨 재조합 균주를 파쇄한 후 수득한 조효소액을 이용하여 락툴로오스 전환율을 비교하였다(Fig. 1). 대부분의 CE가 원통형으로 배열된 \( (\alpha / \alpha)_{6} \) barrel 구조를 가지고 있기 때문에 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)까지도 락툴로오스 전환율이 최대로 나타났다(Fig. 1A). 그러나 낮은 온도에서는 오히려 반응의 특이성이 높아 중간산물인 락툴로오스 보다는 최종산물인 epilactose 쪽으로 전환되는 경향을 보였다. 시험한 균주가운데 SmCE와 RmCE가 가장 열내성이 높게 나타났으나 가장 락툴로오스 전환율이 높은 CsCE의 경우 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 활성이 급격히 감소하는 경향을 나타내었다. 기질에 대한 영향에서는 모든 시험한 효소의 경우에서 기질의 농도가 증가할수록 서서히 감소하는 경향을 나타내었으며, 다른 효소들에 비해 CsCE가 비교적 높은 전환율을 보이며 감소하였다(Fig. 1B). 이 결과는 CsCE가 다른효소에 비해 기질의 결합이 다른 효소에 비해 약하기 때문으로 사료되며, 이에 따라 최적의 락툴로오스 전환을 위한 효소의 개량을 위해 CsCE를 모효소로 선정하여 열내성 돌연변이 효소를 선별하고자 하였다.</p><h2>Error-prone PCR 기술을 이용한 효소의 개량</h2><p>CsCE의 경우 12개의 helix가 촘촘히 barrel을 형성하고 있으며 helix를 강화하는 잔기로 치환될 경우 더 높은 열내성을 나타내는 경우가 알려져 있다(Fig. S1A). 즉 열내성의 향상을 위해서 특정한 부위의 돌연변이 보다는 전체 구조가 열 내성을 가질 수 있는 단단한 구조가 되어야 한다는 것을 의미한다. 따라서 부분적인 변경보다는 전체적인 범위에서 1−2개 정도의 아미노산의 돌연변이가 효소의 활성을 유지하면서 열내성을 증진시킬 수 있는 가능성이 높다.</p><p>열내성 돌연변이 유발을 위해 CsCE의 helix 4부터 12까지의 구간에 대해 error-prone PCR을 통해 돌연변이을 유발시켜 Fig. S1B에서 보는 바와 같이 다양한 위치에 돌연변이를 포함한 효소를 선별하였다. 이와 같이 1개 이상 아미노산의 돌연변이가 확인된 균주에 대하여 조효소액을 추출하여 65°C와 75°C에서 각각 40분간 열처리한 단백질의 열안정성과 이에 따른 락툴로오스 전환율을 확인하였다(Fig. 2). 모효소의 경우 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 75^{\circ} \mathrm{C} \)로 온도를 올렸을 때 거의 단백질 band가 확인되지 않았다. 이 현상은 열처리 후 변성이 일어날 경우 변성단백질응집으로 인해 상등액회수 단계에서 침전으로 제거되어 일어났을 것으로 사료된다. 이에 비해, L239H 돌연변이는 열안정성이 증가하여 \( 75^{\circ} \mathrm{C} \) 처리 후에도 효소 band가 확인되었다(Fig. 2). 그러나 락툴로오스 전환율은 모효소에 비해 \(70\%\) 수준으로 감소되었다. E174D 돌연변이는 열내성은 증가하지 않아 단백질의 분해가 확인되었고 전환율도 전혀 나타나지 않았다. K201R, L330S는 201번 lysine과 330번 leucine이 각각 arginine, serine으로 바뀌었으며 열안정성은 증가하였으나 전환효율이 모효소의 60%정도로 감소하였다. Q322L, E362D 돌연변이는 322 glutamine이 leucine으로, 362 glutamic acid가 aspartic acid로 바뀌었으며, 열 안정성은 조금 증가했지만 전환 효율은 모효소의 30%수준이었다. K149N 돌연변이는 열내성은 증가하였고 전환효율도 모효소의 90% 수준을 유지하였다. Y126F, Y197N, K260N, V315I 돌연변이는 4군데의 아미노산이 바뀌면서 열내성도 나타나지 않았고 전환율도 0%로 전혀 효소활성이 나타나지 않았다. K140R 돌연변이는 열내성은 증가하지 않고 전환율 또한 60% 수준으로 감소하였다. Y193H 돌연변이는 전환효율이 0%로 활성을 보이지 않았다. Q257L 돌연변이는 모효소와 비슷한 수준(95%)의 전환활성을 보이면서 열 내성이 동시에 증가하였다. 152 arginine, 159 glutamine, 253 tryptophan, 359 glutamic acid 가 각각 lysine, leucine, cysteine, alanine으로 바뀐 돌연변이도 모효소와 비슷한 전환율을 유지하면서 열내성이 증가된 것을 확인하였다. 두 군데의 아미노산이 바뀐 돌연변이(345 valine이 alanine으로, 354 leucine이 proline으로)는 열내성은 증가하여 band가 확인 되었지만 전환율은 0%로 활성은 확인 되지 않았다. 선별된 돌연변이중 유일하게 323 lysine이 methionine으로 전환된 K323M 돌연변이는 열내성 증가와 함께 기존 모효소에 비해 전환율도 기존 전환율 대비 15% 가량 상승된 전환율(50.1%)을 보였다. 나머지 돌연변이는 모두 열내성은 증가하였으나 모효소에 비해 60% 수준으로 전환율이 감소하였다. 이중 열내성만 향상된 균주 K149N 돌연변이를 \( \mathrm{CS}-\mathrm{H}^{\mathrm{R}} \) 로 명명하고, 열내성과 전환율이 향상된 K323M 돌연변이를 \(\mathrm{CS}-\mathrm{H}^{\mathrm{R}} \mathrm{C}^{\mathrm{E}} \)로 명명하여 이후 시험에 사용하였다.</p>