흰쥐 도파민 D1과 D2 수용체의 cDNA는 pGEM-3Z vector에 cloning되어 2kb로 HindIII-EcoRI, EcoRI-ApaI이 삽입되어 있으며, C-terminal 부분에서 500bp cDNA segment로 subcloning하였다. 이에 사용된 RNA probe의 경우, EcoRI, HindIII, ApaI 제한절단 부위에 흰쥐 도파민 \( \mathrm { D } _ { 1 } \)과 \( \mathrm { D } _ { 2 } \) 수용체 cDNA clones이 삽입된 pGEM-3Z(promega)를 사용하였다.
<h2>도파민 \( D_ { 1 } \) 및 \( D_ { 2 } \) 수용체의 subcloning</h2> <p>본 실험에 사용할 probe를 위하여 도파민 \( \mathrm { D } _ { 1 } \) 수용체는 pGEM 3Z vector(promega)에 cloning된 흰쥐 도파민 \( \mathrm { D } _ { 1 } \) 수용체 cDNA가 \(2 \mathrm { kb } \)로 HindIII-EcoRI이 삽입되어 있었는데 그 중 C-terminal 부분에서 \(500 \mathrm { ~bp } \) cDNA segment로 subcloning 하였다. 도파민 \( \mathrm { D } _ { 2 } \) 수용체는 pGEM-3Z vector에 cloning된 흰쥐 도파민 \( \mathrm { D } _ { 2 } \) 수용체 cDNA가 \( 2 \mathrm { ~kb } \)로 EcoRI-ApaI이 삽입되어 있었는데 그 중 C-terminal 부분에서 \(309 \mathrm { ~bp } \) cDNA segment로 subcloning 하였다. Quiagen plasmid midi kits를 이용하여 많은 양의 도파민 \( \mathrm { D } _ { 1 } \)과 \( \mathrm { D } _ { 2 } \) 수용체 cDNA가 삽입된 Plasmid DNA를 얻었다. 그 뒤 도파민 \( D_ { 1 } \) 수용체는 EcoRI(antisense)과 HindIII(sense)로 소화시켜 probe용 cDNA를 회수하였고, 도파민 \( \mathrm { D } _ { 2 } \) 수용체는 Apal(antisense)과 EcoRI(sense)으로 소화시켜 probe용 cDNA를 회수하였다.</p> <h2>Probe 준비</h2> <p>RNA probe의 in vitro 합성에 사용할 template DNA는 EcoRI, HindIII, ApaI 제한절단 부위에 흰쥐 도파민 \( \mathrm { D } _ { 1 } \)과 \( \mathrm { D } _ { 2 } \) 수용체 cDNA clones이 삽입된 pGEM-3Z(promega)였다. 제한효소를 사용하여 template DNA plasmid를 선형으로 만든 후, SP6 또는 T7 RNA polymerase로 전사시켜서 \( \alpha \) - \( { } ^ { 35 } \) S-UTP에 의해 방사표지된 antisense와 sense RNA probe \( \left (1.3 \times 10 ^ { 9 } \mathrm { cpm } / \mu \ell \right ) \)를 얻었다. \( 4.0 ~ \mu \ell \) 의 \( 5 \times \) transcription buffer ( \(200 \mathrm { ~mM } \) Tris-HCl( \( \mathrm { pH } ~7.9 \)), \( 30 \mathrm { ~mM } \) \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } , 10 \mathrm { ~mM } \) spermidine), \( 2 ~ \mu \ell \) 의 \( 100 \mathrm { ~mM } \) DTT, \(0.33 ~ \mu \ell \)의 \( 10 \mathrm { ~mM } \) RNasin( \(60 \mathrm { ~units } \)/ \( \mu \ell \), BM), \(1 ~ \mu \ell \)의 \( 10 \mathrm { ~mM } \) NaCl, \(1 ~ \mu \ell \)의 \( 10 \mathrm { ~mM } \) GTP, \( 1 \mu \ell \) 의 \( 10 \mathrm { ~mM } \)CTP, \(2.4 ~ \mu \ell \)의 \( 100 \mathrm { ~M } \) UTP, \( 0.2 ~ \mu \mathrm { g } \) 의 linearized DNA template, \( 0.3 ~ \mu \ell \)의 SP6 혹은 T7 RNA polymerase( \(15 ~ \mathrm { units } / \mu \ell \), BRL), \(5.0 ~ \mu \ell \)의 \( \alpha- { } ^ { 35 } \)S-UTP( \(10 \mathrm { ~mCi } / \mathrm { m } \ell) \)를 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 DNA template를 제거하기 위해 \( 92 ~ \mu \ell \)의 distilled water(DW), \( 5 ~ \mu \ell \)의 \( 1 \mathrm { M } \) Tris-HCl( \( \mathrm { pH } ~8.0 \)), \( 1 \mu \ell \)의 \( 1 \mathrm { ~M } \) \( \mathrm { MgCI } _ { 2 } , 1 ~ \mu \ell \)의 yeast tRNA( \(10 \mathrm { ~mg } / \mathrm { m } \ell) \), DNase Ⅰ \( (10 ~ \mu \mathrm { g } / \mu \ell) \) 을 첨가하고, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30분간 반응시켰다. Antisense 및 sense RNA probe는 Sephadex G-50 Nick column(Pharmacia)으로 각각 분리하였다.</p>