Galactose로 유도되는 표면발현 vector인 pYD1에 cgtS 유전자를 subcloning하여 pYDCGTS를 구축하였다. 활성 염색 결과, 세포벽에 효소가 부착되어 분비 발현되는 표면발현 CGTase 활성이 낮아 보였으나 모두 CD는 잘 생성하였다. glucose가 완전 소모되는 12시간부터 CGTase의 활성이 증가하여 배양 30시간째 최대 활성으로 나타났으며, 정지기 이후 42시간 이후에는 효소활성이 감소하였는데, 표면 발현의 활성이 떨어지는 이유로 효모세포 포면에 발현되는 a-agglutinin의 수가 한정되어 있기 때문에 발현효소의 양도 일정하다. 목적 단백질을 고정해주는 세포벽 부착 매개 단백질이 필요한데, 세포벽과의 결합력이 약하거나 세포표면과의 거리가 멀어 결합력이 약하거나 외래단백질이 충분히 표면에 노출되지 못하며 세포벽으로 흡수되지 못하는 기질과의 접촉이 불가하고, 이 때문에 상대적으로 효소활성이 낮다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>재조합 plasmid의 구축 및 형질전환체 선별</h2> <p>Galactose로 유도되는 표면발현 vector인 pYD1 (GAL1 promoter)에 cgtS 유전자를 subcloning하여 pYDCGTS (7.2 \( \mathrm{kb}) \) 를 구축하였다. 구축된 plasmid는 우선 E. coli DH5a에 형질전환하여 증폭, 추출한 후 S. cerevisiae EBY100에 형질전환시켜 uracil 결핍 최소배지(SD)에서 형질전환체를 1차 선별하였다(EBY100/pYDCGTS). Fig. 2 A와 같이 대조구인 EBY100, EBY100/pYD1는 starch 함유 YPGS 고체 배지 상에서 starch 분해 활성 환을 형성하지 않았고, 형질전환체 EBY100/PYDCGTS는 starch 분해 환을 형성하여 CGTase 활성을 나타내었다. 따라서 형질전환체 EBY100/pYDCGTS는 cgtS를 잘 발현함을 알 수 있었다.</p> <h2>균체증식 및 CGTase의 발현</h2> <p>활성 염색 결과(Fig. 2 B), 배양 상등액으로 분비 발현되는 CGTase 보다는 세포벽에 효소가 부착되어 분비 발현되는 표면발현 CGTase 활성이 낮아 보였으나 둘 다 CD는 효과적으로 생성하였다. \(1\%\) soluble starch와 CGTase 표면 발현 호모세포를 반응시켜 생성물을 현미경으로 관찰한 결과, 시판 a-CD와 비슷한 육각형 결정 모양을 볼 수 있었다. 또한 재조합 균주 S. cerevisiae EBY100/pYDCGTS롤 YPDG 배지에서 풀라스크 배양하여 균체 증식과 CGTase 발현량을 조사하였다. 그 결과 Fig. 4와 같이 glucose가 완전히 소모되는 12시간부터 CGTase의 활성이 증가하기 시작하여 배양 30시간째 최대 활성인 \(6.5 unit/l\)로 나타났으며, 정지기 이후 42시간 이후에는 효소활성이 감소하였다. 반면 B. stearothermo-philus CGTase를 episomal 발현의 경우, 최적 발효 조건인 \( \mathrm{pH} 5.5,30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 CGTase의 최대 발현량은 배양 48시간에서 \( 0.624 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \) 이었고, 발현된 효소의 \(87\%\)가 세포 외로 분비 생산되어졌다. 이는 B. stearothermophilus의 signal peptide가 재조합 효모에서도 분비 기능을 발휘함을 나타낸다.</p> <p>Episomal 발현보다 표면 발현의 활성이 떨어지는 이유로 효모세포 포면에 발현되는 a-agglutinin의 수가 약 \( 10^{4} \) 개로 한정되어 있기 때문에 발현시킬 수 있는 효소의 양이 일정하다. 그리고 목적 단백질이 세포 밖으로 완전히 분비되지 못하게 잡아주는 역할을 하는 세포벽 부착 매개 단백질이 요구된다. 매개 단백질로는 자연적으로 효모 세포벽에 존재하는 다양한 세포벽 mannoprotein을 이용할 수 있는데, 일부 mannoprotein은 세포벽에 약하게 결합하는 단백질과 일부 plasma membrane 유래이며, 주로 분자량이 작은 단백질들이다. 이들은 세포벽과의 결합력이 약하거나 세포의 표면과의 거리가 먼 위치에 존재하기 때문에 이들을 매개로하여 외래 단백질을 표면발현 하였을 때 결합력이 약하거나 외래단백질이 충분히 표면에 노출되지 못하며 세포벽으로 흡수되지 못하는 기질과의 접촉할 수 없는 단점이 있다. 따라서, 일반적인 episomal 발현에 비해 상대적으로 효소활성이 낮은 것으로 사료되었다. 또한, Washida 등의 연구결과에서 따르면, Rhizopus orygae lipase를 a-agglutinin의 C 말단 하류에 유전적으로 융합하여 표면 발현시켰을 때와 a-agglutinin과 lipase 사이에 linker peptides를 삽입하여 표면 발현시켰을 때의 기질 친화성이 linker peptides의 수가 늘어감에 따라 증가하였다. 이는 표면 발현된 효소가 기질과 반응하기 위한 공간적인 확보가 일반 episomal 발현에 비해 어려워 기질과의 친화력이 감소하는 것으로 사료된다.</p>