해저 퇴적물과 피조개 샘플시료는 강진만 연안 및 진해만의 피조개 양식장 3지점에서 채취해서 marine 고체배지, 1/10 marine 고체배지, R2A 고체배지, 1/10 R2A 고체배지에 도말과 phosphate buffered saline (PBS)로 희석하여 배양하였다. 분리한 미생물은 Manns 등의 변형된 방법으로 용혈활성을 확인하고, glycerol 보존법을 이용하여 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 보관하였다. 혈액고체배지에 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 알파, 베타 또는 감마 용혈 활성의 유무를 평가하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시료채집, 미생물의 배양 및 보존</h2> <p>해저 퇴적물 및 피조개 샘플시료는 강진만 연안의 피조개 양식장 3 지점과 진해만의 피조개 양식장 3 지점에서 각각 채취하였으며, 채취 직후 무균상태에서 marine 고체배지 (Difco, USA), 1/10 marine 고체배지, R2A 고체배지(Difco, USA), 그리고 1/10 R2A 고체배지에 직접 도말 및 phosphate buffered saline (PBS)과 동량으로 희석하여 도말하였다. 각각의 고체배지는 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 단위로 배양하며 배지상에 생겨난 균체 및 군락을 분리하여 배양 가능한 미생물로 선별하였다. 선별한 미생물은 각각의 액체배지에서 배양하여 실험을 수행하였으며, 선발한 균주의 보관은 glycerol 보존법을 이용하여 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 보관하였다.</p> <h2>용혈성 테스트</h2> <p>분리한 모든 미생물을 각각 분리된 marine 또는 R2A 액체배지에 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24시간 단위로 배양한 뒤 Manns 등의 변형된 방법으로 용혈활성을 확인하였다. 혈액고체배지 (Micro media Co. Ltd., Korea)에 구멍을 내어 배양액을 떨어 뜨린 뒤 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 19시간 동안 반응하여 구멍 주위의 투명환 유무 및 환 주변의 색깔로써 알파, 베타 또는 감마 용혈 활성의 유무를 평가하였으며, 베타 용혈 활성의 경우 활성 정도의 세기를 투명환의 크기로써 판단하였다.</p> <h2>Chromosomal DNA의 분리 및 16S rDNA amplification</h2> <p>Alpha- 또는 beta-hemolytic activity를 보이는 균주만을 선별한 뒤 각각의 marine 또는 R2A 액체배지를 이용하여 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1-4일 배양 후 원심분리를 통하여 집균하였다. 집균한 균체를 Magnetic isolation kit (TNT, Japan)의 lysis 용액을 이용하여 현탁 한 뒤 protease \( \mathrm { K } \)와 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 16-20시간 반응 후 핵산 추출 자동화 기기(MFX-6100, TOYOBO, Japan)를 이용하여 total chromosomal DNA를 순수하게 분리하였다. 순수하게 분리한 DNA의 농도를 분광광도계로 순도 및 농도를 측정한 후, Weisburg 등의 방법을 응용하여 목적한 16S rDNA를 증폭하였다. 분리한 chromosomal DNA를 주형으로 사용하여 forward primer (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 reverse primer (5'-ACG GTT ACC TTG TTA CGA CTT-3') primer를 이용한 PCR 법으로써 16S rDNA 부분만을 증폭하였으며, PCR 증폭의 조성은 주형으로 chromosomal DNA \( 0.1 \mu \mathrm { g } , 10 \mathrm { pM } \) primer set, \( 2.5 \mathrm { mM } \) dNTPs, reaction buffer, 1U ExTaq (Takara, Japan)을 넣은 뒤 최종 부피 \( 20 ul \)가 되도록 하여 반응하였으며, 반응 조건은 initial denaturation \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 2분 뒤, denaturation \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 20초, annealing \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C }\) 20초, extension \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C }\) 1분을 총 30회 반응한 뒤 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 반응하였다.</p>