NC/Nga 생쥐의 등피부 조직과 ALN를 적출하여 각각에 RNAzol를 넣고 용해될 때까지 homogenizer로 분쇄를 하여 추출한 RNA는 DEPC를 처리한 증류수에 녹여 불활성화 시킨 후 first strand cDNA 합성에 사용하였다.
<h2>피부조직에서 \( \mathrm{foxp}3^{+} \) mRNA 유전자 발현 측정</h2> <h3>등피부 조직과 axillary lymph node(ALN)에서 RNA 분리</h3> <p>Atopic dermatitis-like skin NC/Nga 생쥐의 등피부 조직과 ALN를 적출하여 각각에 \( \mathrm{ RNAzol } ^ { \mathrm{B} } \) \( 500 \mathrm{~mL} \)를 넣고 용해될 때까지 homogenizer로 분쇄하였다. 이 혼합 부유액에 chloroform \( 50 \mathrm{~mL} \)를 첨가한 후 15초 동안 다시 혼합하였다. 이를 얼음에 15분 동안 방치한 후 \( 13,000 ~ \mathrm{rpm} \)에서 원심분리하고 약 \( 200 \mathrm{~mL} \)의 상층액을 회수하였다. 여기에 2-propanol \( 200 \mathrm{~mL} \)와 동량 혼합 후 천천히 흔들고 얼음에서 15분 동안 방치하였다. 이 혼합액을 다시 \( 13,000 ~ \mathrm{rpm} \)에서 원심분리한 후 \( 80 \% \) \( \mathrm{EtOH} \)로 수세하고 3분 동안 vaccum pump에서 건조하여 RNA를 얻었다. 추출한 RNA는 diethyl pyrocarbonate(DEPC)를 처리한 \( 20 \mathrm{~mL} \)의 증류수에 녹여 heating block \( 75^{\circ} \mathrm{C} \)에서 불활성화 시킨 후 first strand cDNA 합성에 사용하였다.</p> <h3>역전사중합효소 연쇄반응</h3> <p>역전사(reverse transcription) 반응은 준비된 total RNA \( 2 ~ \mathrm{\mu g} \)을 DNase Ⅰ(\( 10 ~ \mathrm{U} / \mathrm{mL} \)) \( 2 ~ \mathrm{U} / \mathrm{tube} \)를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) heating block에서 30분 동안 반응한 후 \( 75^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분 동안 변성시키고, 이에 \( 2.5 \mathrm{~mL} \) \( 10 ~ \mathrm{mM} \) dNTPs mix, \( 1 \mathrm{~mL} \) random sequence hexanucleotides(\(25 ~ \mathrm{pmole} / 25 \mathrm{~mL} \)), RNA inhibitor로서 \( 1 \mathrm{~mL} \) RNase inhibitor(\( 20 ~ \mathrm{U} / \mathrm{mL}\)), \( 1 \mathrm{~mL} \) \( 100 ~ \mathrm{mM} \) DTT, \( 4.5 \mathrm{~mL} \) \( 5 \times \mathrm{RT} \) buffer(\( 250 ~ \mathrm{mM} \) Tris-HCl(\( \mathrm{pH} ~ 8.3 \)), \( 375 ~ \mathrm{mM} \) \( \mathrm{KCl} \), \( 15 ~ \mathrm{mM} \) \( \mathrm{MgCl}_{2} \))를 가한 후, \( 1 \mathrm{~mL} \)의 M-mLV RT(\(200 ~ \mathrm{U} / \mathrm{mL} \))를 다시 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 \( 20 \mathrm{~mL} \)가 되도록 하였다. 이 \( 20 \mathrm{~mL} \)의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 \( 2,000 ~ \mathrm{rpm} \)에서 5초 동안 원심 침강하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) heating block에서 60분 동안 반응시켜 first-strand \( \mathrm{cDNA} \)를 합성한 다음, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 동안 방치하여 M-mLV RT를 불활성화 시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 polymerase chain reaction(PCR)에 사용하였다.</p> <h3>Quantitative real-time PCR(RT-PCR)</h3> <p>Real time quantitative PCR(RT-PCR)은 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였다. 사용된 foxp3 probe는 GCCACTCCAGCTCCCGGCAACTTCT(FAM)을 사용하였으며(probe는 Biosystems사에서 제공되는 product임), Sper-Taqman PCR Master mix(ABI)를 사용하였고, primer의 최종 농도가 \( 200 ~ \mathrm{nM} \)이 되게 반응시켰다. RT-PCR의 조건으로는 predenaturation은 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 2 \mathrm{~min}\), \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 10 \mathrm{~min} \), 그리고 40 cycles을 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 0.15 \mathrm{~min} \), \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 1 \mathrm{~min} \) 수행하였다. PGA-HM과 PGA-LM 투여군들과 대조군은 internal standard로 G3PDH를 사용하여 target group의 Quantitative PCR \( y=x(1+e) n \), \( x \) = starting quantity, \( y \)=yield \( n \)=number of cycles \( e \)=efficiency로 계산하여 RQ(relative quantitative)를 측정하였다.</p>