마우스 대식세포 RAW 264. 7와 rat basophil leukemia 세포주 RBL-2H3는 ATCC에서 구매해, Penicillin/streptomycin \( 100 \mathrm { ~unit } / \mathrm { ml } \) 과 \( 10 \% \) FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. LPS와 각 시료는 주어진 농도로 세포에 처리하였으며, \( 24 \mathrm { ~hr } \) 배양 후 MTT용액을 첨가하여 microplate reader를 통해 흡광도를 측정하였다. 또한, Total RNA로 cDNA를 합성하여 염증성 cytokine TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \), IL-6의 유전자 발현을 QuantStudio 1 Real-Time PCR로 측정하였다.
<h2>세포배양 및 세포 생존율 측정</h2> <p>본 연구에서 사용한 마우스 대식세포 RAW 264.7와 rat basophil leukemia 세포주 RBL-2H3은 American Type Culture Collection (ATCC)에서 구매하였고 Penicillin/strep-tomycin \( 100 \mathrm { ~unit } / \mathrm { ml } \) 과 \( 10 \% \) FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) incubator에서 배양하였다.</p> <p>RAW 264.7 세포를 96 well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { ~cell } / \mathrm { ml } \)의 세포수가 되도록 분주하고 \( 24 \mathrm { ~hr } \) 동안 배양한 후, 표고버섯 추출물의 농도가 \( 0.5,1,2,4 \mathrm { ~ug } / \mathrm { ml } \)가 되도록 처리하였다. \( 24 \mathrm { ~hr } \) 동안 배양한 후, \( 5 \mathrm { ~mg } / \mathrm { ml } \) 농도의 MTT용액 넣고 \(1 \mathrm { ~hr } \) 배양한 후 microplate reader를 이용하여 \( 540 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 세포 생존율은 대조군을 \( 100 \% \)로 하여 상대적으로 계산하였다.</p> <h2>항염증 효과</h2> <p>RAW 264.7 세포를 24 well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { ~cell } / \mathrm { ml } \)이 되도록 분주하고 \( 24 \mathrm { ~hr } \) 배양 후, 시료와 LPS를 처리하였다. LPS는 각각 \( 1 \mathrm { ~ug } / \mathrm { ml } \)의 농도로 처리하였으며, 각 시료는 \( 0.5,~1,~2 \mathrm { ~ug } / \mathrm { ml } \) 농도로 희석하여 세포에 처리하였다. \(24 \mathrm { ~hr } \) 후 염증성 cytokine 측정을 위해 세포 배양액을 회수하여 Quantikine ELISA kit (R \&D SYSTEMS, USA)을 사용하여 정량하였다.</p> <h2>염증성 cytokine의 mRNA 발현 측정</h2> <p>RAW \( 264.7 \) 세포를 6 well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { ~cell } / \mathrm { ml } \)로 분주하고 \( 24 \mathrm { ~hr } \) 배양 후, LPS \( (1 \mathrm { ~ug } / \mathrm { ml } ) \)와 표고버섯 추출물을 농도별로 처리하고 배양하였다. \( 24 \mathrm { ~hr } \) 뒤 Trizol reagent (Ambion, USA)를 사용하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 DEPC treated-water로 용해하여 사용하였다. Total RNA \( 1 \mathrm { ~ug } \)으로 cDNA를 합성하고 cDNA 합성 후 염증성 cytokine인 TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \), IL-6에 대한 유전자 발현은 Sybrgreen PCR master mix (ThermoFisher, USA), primer, 멸균 수, cDNA를 혼합하여 QuantStudio 1 Real-Time PCR (Ther-moFisher, USA )로 측정하였다. Internal control로 18S ribo-somal RNA (18S rRNA)를 사용하였고 실험에 사용된 probe들은 다음과 같다. 18S rRNA (sense primer, 5'-CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG-3'; antisense primer, 5'-GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT-3'), TNF- \( \alpha \) (sense primer, 5'-TTG ACC TCA GCG CTG AGT TG-3'; antisense primer, 5'-CCT GTA GCC CAC GTC GTA GC-3'), IL-1 \( \beta \) (sense primer, 5'-CAG GAT GAG GAC ATG AGC ACC-3'; anti-sense primer, 5'-CTC TGC AGA CTC AAA CTC CAC-3'), IL-6 (sense primer, 5'-GCT GGA GTC ACA GAA GTG GC-3'; antisense primer, 5'-GGC ATA ACG CAC TAG GTT TGC CG-3')</p>