FBS를 배양하지 않은 조건에서 T98G 세포를 배양하면 세포주기가 G0 상태에 정지되는 것을 확인할 수 있다. 대조적으로 \(10\%\) FBS를 첨가한 배양 조건에서는 T89G 세포가 G1, S, G2/M 기에 다양하게 분포되어 있는 것을 관찰하였다. 이에 따라 cyclin D1과 cyclin B1 단백질 수준을 Western blot으로 측정하여 세포주기의 초기인 G1 기에서 S 기로의 전환과 G2/M 기의 진행에 특이적으로 발현되는지 확인하였다 (Fig. 1 참조).
<h2>면역형광 분석법</h2> <p>T98G cello chamber slide(Nalge Nunc, Rochester, NY) 에 \( 1.5 \times 10 ^ { 5 } / \mathrm { ml } \)으로 분주한 후 PI staining과 동일한 조건으로 배양한다. FBS가 첨가되지 않은 DMEM에서 배양한지 72시간 후에 배지를 제거하고 PBS로 씻어준다. \( 4 \% \) paraformaldehyde를 20분간 처리하여 고정시키고 \( 0.3 \% \) Triton \( X-100 \)을 10분간 실온에서 처리하였다. \( 4 \% \) BSA를 처리하어 1시간 동안 blocking시켰다. 일차 항체인 anti-FACT/cdc68을 1:400으로 PBS에 희석하여 1시간 동안 실온에서 처리하고 이차 항체인 anti-rabbit IgG-fluorescence(Molecular Probes, Junction City, OR)를 PBS에 1:400으로 희석하여 어두운 조건에서 1시간 동안 처리하였다. PI를 \( 50 \mathrm { ng } / \mathrm { ml } \)으로 희석하여 1분간 어두운 상태에서 처리한 후 ProLong® Gold antifade reagent (Molecular Probes)를 떨어뜨리고 sealing한다. 사용된 모든 시약은 PBS에 녹였고 시약의 처리 후에는 항상 PBS로 5회 씻어주었다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <p>인간 세포에서 세포 주기에 따른 FACT 복합체의 발현 양 상을 분석하기 위하여 인간 뇌로부터 유래한 다형성 아교모 세포종 세포주인 T98G 세포주를 FBS 없이 배양하여 세포 분 열 주기를 휴지기 \( \left ( \mathrm { G } _ { 0 } \right ) \)에 정지시켰다. 이를 확인하기 위하여 propidium iodide(PI)으로 DNA를 염색한 후 세포주기를 flow cytometry 분석법을 수행하였다. Fig. 1의 결과에서 보 듯이 FBS 없이 배양한 \( \mathrm { T } 89 \mathrm { G } \) 세포는 세포 주기가 \( \mathrm { G } _ { 0 } \) 기로 정지되어 세포분열이 일어나지 않음을 확인할 수 있었으며, 이와 대조적으로 \( 10 \% \) FBS 첨가 하에서 배양한 T89G 세포는 G1, S,G2/M기의 다양한 주기에 세포가 분포되어 있음을 관 찰하였다. 이를 다시 한번 확인하기 위하여 세포주기의 초기인 G1기에서 S기로 이전되는 과정에서 특이적으로 발현된다 고 알려진 cyclin D1과 \( \mathrm { G } 2 / \mathrm { M } \)기로 진행되는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있는 cyclin B1의 단백질 수준을 Westernblot을 이용하여 측정하였다. Fig. 2의 결과에서 보듯이 세포주기가 \( \mathrm { G } _ { 0 } \) 기로 정지되어 있는 T98G 세포에서는 cyclin D1과 cyclin B1의 발현이 관찰되지 않는 반면 세포주기가 진행되고 있는 T98G 세포에서는 cyclin D1과 cyclin B1의 발현이 관찰되었다. 위의 결과들로부터 FBS가 없는 조건하에서 T98G 세포를 배양할 경우 \( \mathrm { T } 98 \mathrm { G } \) 세포가 \( \mathrm { G } _ { 0 } \)기에 세포주기가 정지함을 알 수 있었다.</p>