Inulin 분해 효소 중에 하나인 CFTase의 물리적, 화학적 특성은 식품, 의약, 농업, 화학공업 등의 여러분야에서 응용될 수 있다. 본 연구에서는 CFT 효모 발현계를 구축한 뒤 효모 S. cerevisiar에 형질전환시켜 식품산업 소재와 의약품으로 이용 될 수 있는 효소의 유전자 발현과 분비 양상을 비교하여 CF의 경제성 있는 대량생산공정 개발을 위한 기초 자료로 활용하고자 한다.
<p>Inulin은 돼지감자(Jerusalem artichoke), 치커리(Chicory), 다알리아(Dahlia) 등의 국화과(Compositae) 식물의 구근에 함유된 polyfructan으로 \( 30 \sim 35 \)개의 fructose가 \( \beta\)-1,2 결합에 의해 직쇄상으로 연결되어 있고 그 말단에 D-glucose가 \(\alpha\)-1,2 결합을 하고 있다. 돼지감자는 기후와 토양에 대한 적응럭과 번식력, 내병성 및 내충성이 강하고 단위 면적 당 수확량도 많아서 우리 나라에서 재배하기가 용이한 식물일뿐 아니라, inulin가수분해에 의해 \( 75 \% \) 이상의 fructose를 생산 할 수 있다고 보고되어 있어 감미 자원이 부족한 우리나라에서는 매우 유망한 감미 자원으로 활용할 수 있다. Inulin 분해 효소는 작용기작의 차이에 따라 exo-inulinase (EC 3.2.1.26; \( \beta \)-D-fructo-furanosidase), endo-inulinase (EC 3.2.1.7 ; 2,1- \( \beta \)-D-fructan fructanohydrolase), inulin fructotransferase (depo-lymerizing) (EC 2.4.1.93), 및 cycloinulooligosaccharide fructanotransferase (CFTase)로 분류되어진다.</p><p>CFTase는 inulin을 이용하여 분자내 당전이 반웅에 의해 주로 fructose 분자 \( 6 \sim 8 \)개가 \( \beta\)-(\(2 \rightarrow 1) \) 결합으로 연결된 비환원성의 cycloinulohexaose (CF6), cycloinuloheptose (CF7), 그리고 cycloinulooctaose (CF8)을 생산하는 효소이다. 현재 CFTase는 Bacillus circulans OKUMZ31B, B. circulans MCI-2554, Paenibacillus macerans CFC1, P. polymyxa MGL21 등의 주로 Bacillus 속의 세균이 생산하는 것으로 알려져 있다. 이러한 미생물들이 생산하는 CFTase의 효소적 특성은 inulin과 같은 fructan 기질에 작용하여 CF를 합성하는 분자내 당전이 반응인 cyclization 반응과 \( \beta\)-(\(2 \rightarrow 1\)) fructooligosaccharide 사이의 당전이 반응인 coupling 반응, disproportionation 반응 또는 hydro-lyzing 반응을 매개하는 다기능 효소(multifunctional enzyme)이다. CFTase의 작용에 의해 inulin으로부터 생산되는 cycloin-ulooligosaccharide (cyclofructan)는 환상 과당 중합체이다. CF의 구조는 bowl-shape 구조로 되어있고, 외부는 hydroxyl group이 친수성을 나타내며, 내부는 에테르 결합으로 인하여 소수성을 띠고 있다. 즉 CF는 cyclodextrin과 물리적, 화학적으로 유사한 구조로 되어 있다. CF6은 crystal 구조 분석에서 18-crown-6-skeleton 구조로 밝혀졌으며, 또한 금속 양이온과 복합체를 형성한다.</p><p>Open-chain fructooligosaccharide는 exo-type inulinase에 의해 쉽게 분해되는 반면에, CF의 경우는 exo-type inulinase에 의해 분해되지 않고, Aspergillus niger의 endo-type inulinase에 의해서 inulohexaose로 분해되어진다. CF의 물리적, 화학적 특성은 식품, 의약, 농업, 화학공업 등의 여러분야에서 응용될 수 있다. CF는 여러 물질의 동결, 해동에 안정적 효과를 나타내기 때문에 빵 제조에서 밀가루 반죽이나, 화장품 또는 의약분야에서 liposome 등에 사용되어 질 수 있을 뿐만 아니라 산업적으로 널리 이용될 수 있을 것으로 기대 된다. CFTase를이용한 CF의 생산은 최근 급격히 늘어가고 있는 기능성 식품, 건강식품 및 대체의약품에 대한 관심과 수요의 측면에서 그 유용성이 기대되고 있지만, 아직까지 CF를 산업적으로 생산하여 판매되지 않고 있다.</p><p>한편, 식품산업 소재와 의약품으로 이용 될 수 있는 효소들의 유전자를 효모 Saccharomyces cerevisiae에서 발현시킴으로서 목적 단백질을 대량생산하거나 효소의 활성을 개량하려는 연구가 최근 활발히 진행되고 있다. 유용 단백질의 산업적 실용화를 위한 효모에서의 재조합 발현에 관한 연구는 주로 plasmid 안정성 제고를 위한 자가선택 변이주(autoselective mutant)개발, 전사 및 번역 효율성 제고, 분비 신호 peptide의 절단 효율성 증대, 초분비 변이주, 세포벽 결손 변이주 개발, 단백질 분해효소 결손 변이주 개발 등에 관한 연구로 집중되고 있다. 또한 유전자 재조합 기술을 사용 하여 GRAS (Generally recognized as safe) 미생물인 효모 S. cerevisiae에서 재조합 단백질 형태로 생산하는 젓이 CF 생산성 향상과 식품소재, 의약품으로서의 안정성 확보에 크게 유리하다.</p><p>본 연구에서 사용한 CFTase는 P. macerans CFC1 유래의 cft 유전자이며, ORF가 \( 2,829 \mathrm{bp} \)이고 단백질 분자량은 \( 107 \mathrm{kDa} \)이다. cft 효모 발현계를 구축한 뒤 S. cerevisiar에 형질전환시켜 P. macerans와 P. polymyxa CFTase 발현과 분비 양상을 비교◦조사하고, CF의 경제성 있는 대량생산공정 개발을 위한 기초 자료로 활용하고자 한다.</p>