환경오염은 식물이 갖고 있는 환경 내성을 심각하게 위협하는 수준으로 최근에는 산화스트레스와 환경스트레스에 강한 식물체를 만들려는 노력이 이루어지고 있다. 스트레스에 강한 식물체를 만들기 위한 연구의 일환으로 같은 배추로부터 얻은 type 3MT 인 BrMT3를 효모에 과발현 시켜 중금속에 대한 내성을 애기장대에 형질 전환하여 카드뮴에 대한 저항성을 살펴보고자 하였다.
<h1>서 론</h1><p>식물은 중금속이나 병원균의 감염, 상처 등 다양한 스트레스에 노출 되었을 때 뿐만 아니라 정상적인 호흡과 광합성기작을 통해서도 산화 스트레스를 받는다 (Apel et al. 2004). 산화 스트레스는 거의 모든 스트레스 반응에서 공통적으로 나타나는 과정이다. 산소는 호기성 생물의 생존에 필수적인 분자이지만 반응에 따라서는 치명적인 유해분자로 변할 수 있다. 여기 된 상태의 산소에 전자가 추가되어 화학반응 속도가 빠르게 된 분자를 활성산소종이라 하며 여기에는 singlet oxygen \( \left({ }^{1} \mathrm{O}_{2}\right) \), superoxide \( \left(\mathrm{O}_{2}\right. \) - \( ) \), hydrogen peroxide \( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \), hydroxyl radicals \( (-\mathrm{OH}) \) 등이 있다. 특히 엽록체는 식물에서 광합성이 일어나는 세포 내 소 기관으로 에너지 획득을 위한 고 에너지 전자 전달계의 존재와, 활성산소의 대량 생산으로 인해 항상 높은 산화스트레스 조건으로 생각되어진다. 따라서 식물은 이러한 산화스트레스에 대항하기 위한 다양한 항산화 시스템을 가지고 있다. 식물이 가지고 있는 항산화 물질에는 tocopherol, ascorbic acid, carotenoid, flavonoid 등이 있으며, 항산화 효소로서는 SOD (superoxide dismutase), APX (ascorbrate peroxidase), Catalase 등 기타 여러 가지 reductase들이 알려져 있다. 그러나 이러한 자체 항산화 기작에도 불구하고 비정상적인 조건에서 유입되는 산화스트레스들을 무독화 하는 데는 한계가 있다 (Lee et al. 2004).</p><p>Metallothioneins (MTs)는 낮은 분자량 \( (<10 \mathrm{kDa} \) )의 cysteine (Cys)rich 단백질로서 중금속과 결합할 수 있다 (Hamer 1986; Robinson et al. 1993). 이 단백질은 곰팡이, 식물, cyanobacteria 그리고 포유동물에 이르기 까지 다양한 생물체에 폭넓게 분포 하며, 세포 내에서는 금속이온의 항상성 그리고 중금속의 무독화에 관여한다 (Cobbett and Goldsbrough 2002; Andrews 2000; Cobbett 2000; Quesada et al. 1996). 식물 MT유전자의 발현은 일차적으로 금속이온에 의해 조절 되고, 다른 요인으로는 salt stress, ABA, sucrose starvation, heat shock, 상처 그리고 바이러스의 감염 등과 같은 스트레스에 영향을 받는다 (Haq et al. 2003; Robinson et al. 1993; Choi et al. 1996). 식물 MTs는 아미노산 서열에 기초하여 Class I, Class II, Class III의 3 가지 분류 군으로 나뉜다 (Rauser 1999; Murphy et al. 1997). Class I MTs는 중앙의 Cys-free spacer에 의해 분리된 두 개의 Cys rich 도메인을 가지며, 또한 아미노산과 \( \mathrm{COOH} \) 도메인에서의 cysteine 잔기의 배열에 따라 4 가지 type으로 나뉜다 (Yu et al. 1998). Type 1 MT는 두 개의 말단 도메인에 특이적인 Cys-Xaa-Cys motif를 갖는다. Type 2MT 는 N-terminal domain 안쪽에 Cys-Cys와 2개의 Cys-X-Cys, Cys-X-X-Cys motif를 통한 8 개의 보존된 Cys 잔기를 가지며, C-terminal domain 역시 6개의 Cys-X-Cys가 고도로 보존되어 있다. Type 3MT 는 전형적인 특징으로 N-terminal에 4개의 보존된 Cysteine 잔기를 가진다. Type 4MT 는 종자에서 특이적으로 발현한다. Class II MTs는 밀의 Ec protein으로 전체 아미노산 서열 내에 Cys 잔기가 흩어져있다. 마지막으로 Class III MTs는 Phytochelatins으로서 poly-glycin 구조로 효소적으로 합성되는 팹티드이다.</p><p>MTs의 또 다른 기능 중의 하나는 항산화 기능이다. Wong (2004) 등은 벼의 type 2 metallothionein (OsMT2b) 를 과발현시켰을 때 superoxide \( \left(\mathrm{O}_{2}-\right) \), hydrogen peroxide \( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \) 의 scavenger로서의 활성이 증가 된다는 것을 보고하였다. 또한 Andrew (2000)는 MT유전자의 발현이 산화스트레스에 의해 유도되고 antioxidant로서의 활성이 있음을 보고하였다.</p><p>최근 급격한 산업화에 따른 환경오염은 식물이 갖고 있는 환경 내성을 위협할 수 있는 수준으로 심각한 상태에 이르고 있다. 따라서 최근 산화스트레스뿐만 아니라 여러 가지 환경스트레스에 강한 식물체를 만들려는 노력이 진행되고 있고 이러한 문제를 해결하기 위한 전략적 연구로 항 산화 시스템관련 효소들을 도입하여 과발현 시키거나 (Kwon et al. 2002; Wong et al. 2004; Lee 2004) 여러 가지 중금속의 chelator나 수송자를 도입하는 연구가 진행되고 있다 (Song et al. 2004; Lee et al. 2004; Murgia et al. 2004; Allen et al. 1997). 이러한 최근의 연구에 입각하여 본 연구팀은 중금속이온의 무독화와 산화 스트레스에 강한 환경복합내성 작물을 개발하기 위한 기초 연구를 수행하고 있다. 특히 배추로부터 얻어진 type 1 MT 유전자가 엽록체에서 과다한 중금속의 유입이나 과도한 ROS 생산에 대해 어떤 기능을 하는지를 알아보기 위해 BrMT1 유전자를 chloroplast에 targeting 하도록 Rubisco small subunit (RbcS) transit peptide (Lee et al. 2002) 를 이용하여 식물 형질전환용 벡터를 제작하였다. 이 벡터를 모델식물인 애기장대에 형질 전환하여 광계 I 에서 전자를 탈취하여 스스로 라디칼화 되고 식물체내에 산화스트레스를 높여 식물체를 고사 시키는 것으로 알려진 Paraquat과 중금속인 카드뮴을 통해 BrMT1을 식물체의 엽록체에 과발현시킨 형질 전환 애기장대에서의 카드뮴저항성과 엽록체내에서의 ROS에 대한 저항성 기능이 어떻게 나타나는지를 알아보았다 (Kim et al. 2007).</p><p>본 연구에서는 같은 배추로부터 얻은 type 3MT 인 BrMT3를 효모에 과발현시켜 중금속에 대한 내성을 보기 애기장대에 형질전환 하여 카드뮴에 대한 저항성을 살펴보고자 하였다.</p>