Taxus chinensis 잎에서 얻은 세포주를 사용한 식물세포 배양 실험은, \( 24 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 조건에서 현탁액 세포를 배양했다. 이 과정에서는 2주마다 배지 교환을 했고, 7일과 21일에는 1-2%의 maltose와 \( 4 \mu \mathrm { M } \)의 \( \mathrm { AgNO } _ { 3 } \)를 첨가했다. Paclitaxel 함량 분석은 HPLC system과 Capell Pak C \( { } _ { 18 } (250 \times 4. 6 \mathrm { ~mm } \), Shiseido, Japan \( ) \) 칼럼을 활용했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물재료와 배양조건</h2> <p>본 실험에 사용된 식물세포배양액은 Taxus chinensis의 잎으로부터 얻은 세포주(cell line)를 이용하여 배양하였다. Taxus chinensis로부터 기원된 현탁액 세포는 \( 24 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 암조건에서 \( 150 \mathrm { rpm } \) 으로 교반하여 배양하였다. 현탁(suspension)세포는 수정된 Gamborg's B5 배지[3], \( 30 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \) sucrose, \( 10 \mu \mathrm { M } \) naphthalene acetic acid, \( 0.2 \mu \mathrm { M } \) 6-benzylaminopurine, \( 1 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \) casein hydrolysate, \( 1 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \) 2-[ \( \mathrm { N } \)-morpholino] ethanesulfonic acid에서 배양하였다. 세포 배양은 2 주마다 새로운 배지로 갈아 주었으며 생산과 배양을 연장시키기 위해 7 일과 21일째 되는 날에 1-2 \%의 maltose를 첨가해 주고 elicitor로서 배양 초기에 \( 4 \mu \mathrm { M } \) 의 \( \mathrm { AgNO } _ { 3 } \) 를 첨가해 주었다. 식물세포배양 후 배양액으로부터 decanter (Westfalia, CA150 Claritying Decanter)와 고속원심분리기( \( \alpha \)-Laval, BTPX205GD-35CDEEP)를 이용하여 식물세포와 세포조각 (cell debris)을 회수하였다. 회수한 식물 세포와 세포조각(cell debris)을 합하여 바이오매스라 하였다. 본 연구에 사용된 바이오매스는 (주)삼양제넥스로부터 제공받았다.</p> <h2>Paclitaxel 분석</h2> <p>Paclitaxel 함량 분석을 위해 HPLC system (Waters, USA)과 Capell Pak C \( { } _ { 18 } (250 \times 4.6 \mathrm { ~mm } \), Shiseido, Japan \( ) \) 칼럼을 사용하였다. 이동상은 아세토니트릴과 증류수 혼합 용액(35/65-65/35, v/v, 구배용매조성법)을 유속 \( 1.0 \mathrm { ml } / \mathrm { min } \)으로 흘려주었다. 시료 주입양은 \( 20 \mathrm { ml } \) 이며 \( 227 \mathrm { ~nm } \) 에서 UV 에 의해 검출하였다. HPLC 분석은 표준정량곡선을 이용하였으며 표준시료는 Sigma-Aldrich 제품(순도: \( 95 \)%)을 사용하였다.</p> <h2>분별침전(fractional precipitation)을 위한 시료준비</h2> <p>식물세포배양액으로부터 회수한 바이오매스와 메탄올의 비율을 \( 1 / 1( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) 로 하여 실온에서 30 분 동안 추출하여 여과하고, 바이오매스에 새로운 메탄올을 첨가하여 동일한 방법으로 4 회 반복하여 추출을 수행하였다. 추출 여액을 모아 농축기(CCA-1100, EYELA, Japan)에서 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 감압상태에서 농축(원액의 \( 30 \% \) 하고 농축액에 메틸렌 클로라이드를 첨가 (농축액의 \( 25 \% \) 하고 실온에서 30 분 동안 액-액 추출을 3 회 반복 수행하였다. 액-액 추출을 통해 극성불순물은 상층인 메탄올 층으로 제거하고, paclitaxel은 하층인 메틸렌 클로라이드 층으로 회수하여 실온, 감압상태에서 농축/건조하였다. 식물세포 유래 타르 및 왁스 성분을 제거하기 위하여, 건조된 시료를 메틸렌 클로라이드에 \( 20 \%( \mathrm { v } / \mathrm { w } ) \) 비율로 녹이고 흡착제 sylopute (Fuji Silysia Chemical Ltd., Japan)를 건조된</p>