ESBL 생성균주인 Klebsiella pneumoniae에 대해 이중디스크 확산법으로 실험한 결과 \(b l a_{\mathrm{TEM}}\), \(b l a_{\mathrm{SHV}}\), \(b l a_{\mathrm{CTX}-\mathrm{M}} \) 의 세 가지 유전자가 모두 검출되었으며, 염기서열 분석 결과 \( bla_{\mathrm{TEM}} \) 은 TEM-1이었고, \(bla_{\mathrm{SHV}} \) 은 SHV-12이었고, \(bla_{\mathrm{CTX-M}} \) 은 CTX-M-15로 분석이 되었다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>ESBL 생성균주 확인</h2><p>cefotaxime \( (30 \mu \mathrm{g}) \), ceftazidime \( (30 \mu \mathrm{g}) \), ceftriaxone \((30\mu \mathrm{g}) \) 세 가지의 디스크주위에 억제대가 나타나서 synergy 시험 양성으로 ESBL효소의 생성이 확인 되었다.</p><p>본 실험에서 사용 한 이중디스크 확산법은 ESBL 생성균주의 확인을 위해 임상실험실에서 가장 많이 사용되는 방법이다. 이중디스크 확산법으로 ESBL 생성균주를 확인하는 방법의 원리는 다음과 같다. ESBL효소는 clavulanic acid, sul-bactam, tazobactam 등의 inhibitor에 억제되는 특징이 있다. 이러한 억제제에 효소의 활동이 저해 되는 동안 3 세대 cephalosporin의 약제 주위에 synergy 현상이 일어나는 것이다. 즉, 다시 말해서 synergy 현상이 일어나지 않는다는 것은 억제제에 반응 하지 않는다는 것이고 이는 ESBL효소를 가지지 않은 세균이라고 추정할 수 있는 것이다. 본 실험에서는 억제제로서 clavulanic acid를 사용하였다. 실험에 사용한 균주는 3 세대 cephalosporin 약제와 clavulanic acid 사이에서 뚜렷한 synergy 현상을 나타내어 ESBL효소의 생성균주임이 증명되었다.</p><p>ESBL 균주를 검출하는 방법으로는 이중 디스크 확산법 이외에 E-test, 분자생물학적 방법, 자동화기기를 이용한 방법 등이 있다. 이중에서 최근에 개발된 자동화기기를 이용한 ESBL 검출법(Vitek system)은 기존의 검출법과 비교 시 매우 일치율이 높으며, 또한 빠르고 간편하게 ESBL 생성균을 검출할 수 있는 장점이 있다. 본 연구에서의 실험대상 균주는 이중 디스크 확산법과 자동화기기인 Vitek system (bioMerieux, Inc., Hazelwood, MO, USA)의 GNS 433 card를 이용하여 동시에 ESBL 생성균주임을 확인 하였다.</p><h2>TEM,SHV,CTX-M의 유전자 검출 및 각각의 유전적 형별 규명</h2><p>본 실험의 대상균주인 ESBL 생성 Klebsiella pneumoniae (No. 60031)는 PCR을 시행한 결과 \( b l a_{\mathrm{TEM}}\), \(b l a_{\mathrm{SHV}}\), \(b l a_{\mathrm{CTX}-\mathrm{M}} \) 의 세 가지 유전자가 모두 검출되었다. \( bla_\mathrm{TEM}\) 은 \( 1080 \mathrm{bp} \) 에서 band가 확인 되었고, \( bla_\mathrm{SHV}\) 은 \( 861 \mathrm{bp} \) 에서 band가 확인 되었고, \( bla_\mathrm{CTX-M}\) 은 \( 861 \mathrm{bp} \)에서 band가 확인 되었다. 이렇게 한 균주가 plasmid상에 세 가지 내성유전자를 동시에 가지는 경우는 흔치 않은 일이다. 염기서열 분석을 통하여 확인 된 결과 \( bla_{\mathrm{TEM}} \) 은 TEM-1이었고, \(bla_{\mathrm{SHV}} \) 은 SHV-12이었고, \(bla_{\mathrm{CTX-M}} \) 은 CTX-M-15로 분석 되었다.</p><p>본 실험에서 나타난 TEM-1 형은 1965년 그리스 환자에서 분리한 E. coli에서 처음 발견되었는데 대부분의 그람음성세균에서 발견되는 \( \beta \)-lactamase 유전형이다. 그리고 SHV-12는 스위스에서 분리된 E. coli와 K. pneumoniae 에서 처음 검출되었다. 이 효소는 SHV-1의 아미노산 3 개가 치환된 (Leu35Gln, Gly238Ser, Glu240Lys) 것이며, 국내에서 분리되는 장내세균에서도 흔히 생성하는 것으로 알려져 있다. CTX-M-15 ESBL은 2001년 인도에서 처음 분리된 것으로 아시아와 유럽을 중심으로 보고되고 있다. 이 효소는 CTX-M-1의 다섯 군데의 아미노산(Asp114Asn, Ser140Ala, Val177Ala, Asn240Gly, Asn288Asp)이 치환된 것으로 국내에서도 여러 번 발견된 바 있다. 또한 CTX-M-15유전자는 최근에 국내에서도 급증하고 있다는 보고가 있다.</p>