단일 효소처리를 하여 가장 높은 분해율을 나타낸 세 가지 효소 중 두 가지 혹은 세 가지 모두를 혼합하여 쌀 시럽박의 단백질을 분해한 결과 단일에서 가장 효과가 좋았던 Protease N과 3가지 효소 모두 혼합한 것을 비교하였을 때 모든 방법에서 효소를 혼합하였을 때 상승효과가 있는 것으로 나타났다. 효소를 이용하여 분리한 대부분의 단백질은\( 1\ \mathrm{kDa} \) 미만의 작은 peptide나 amino acid의 형태로 분해가 된다. 단백질 분해 효소를 단일 혹은 혼합 처리하였을 때의 아미노산 조성은 특정 패턴을 보이지 않았으며 쓴맛을 유발하는 아미노산의 함량이 높은 것으로 보아 샘플의 쓴맛이 강할 것이라고 예상되며 효소처리 후 생성된 총 단백질 함량은 효소를 혼합할수록 증가하였지만 아미노산 함량은 단일과 비교하였을 때 비슷한 결과를 나타내었는데 상대적으로 효소를 혼합할수록 아미노산으로 분해되지 못한 polypeptide가 단일 처리에 비해 다량 존재할 것으로 예상된다.
<h2>혼합효소 처리</h2><p>단일 효소처리를 하여 가장 높은 분해율을 나타낸 Protease M, Protease N 및 Protease A 세가지 효소 중 두가지 혹은 세가지 모두를 혼합하여 쌀 시럽박의 단백질을 분해한 결과 단일에서 가장 효과가 좋았던 Protease N과 3가지 효소 모두 혼합한 것을 비교하였을 때 Lowry protein assay의 경우 단일처리 한 것은 \( 59.02 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM, 혼합의 경우 \( 75.96 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM이며, Gravity method는 단일처리 한 것은 \( 85.36 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM, 혼합의 경우 \( 147.51 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM이다. Kjeldahl 의 경우는 단일처리 한 것은 \( 70.43 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM이고, 혼합의 경우 \( 93.80 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) RSM 으로 모든 방법에서 효소를 혼합하였을 때 상승효과가 있는 것으로 나타났다. 또한 단일 처리에서 가장 분해능력이 높았던 Protease N에 비하여 효소들을 두 개씩 혼합하여 단백질을 분해하여도 이들 간의 유의적인 차이가 인정되어 상승효과가 뚜렷했음을 알수 있었다. 이는 쌀 시럽박의 불용성 단백질 중 분해가 가능한 부분이 Protease N에 의해 완전히 분해되지 못하고 남은 단백질들이 다른 효소들에 의해 분해가 일어나기 때문으로 판단된다. 특히 상업적으로 사용되는 protease의 경우 크게 endo- 혹은 exo- 형태이며 서로 분해할 수 있는 아미노산이 틀리므로 Protease N이나 Protease M 혹은 Protease A가 각각 분해를 하지 못했던 아미노산을 분해하여 상승효과가 생긴 것으로 생각된다. Treimo 등의 실험에서도 쌀 시럽박과 유사한 부산물인 맥주박에 carbohydrase를 혼합하여 처리하였는데 protease와 마찬가지로 단일 처리하였을 때 보다 상승효과가 있는 것으로 나타났다. 이는 곡물의 탄수화물의 경우 당뿐만 아니라 cellulose, hemicellulose, lignin 등이 존재하여 carbohydrase가 혼합이 될수록 cellulose 혹은 lignin 등이 분해되어 상대적으로 단백질의 노출부분이 증가되고 효소가 반응할 수 있는 표면적이 증가하여 이런 상승효과를 나타낼 수 있는 것으로 알려졌다. 또한 protease는 각각 가수분해 할 수 있는 고유의 특정 아미노산이 있는데 이러한 특정 아미노산이 곡물에 풍부하면 protease의 가수분해 효과가 증가하는 것으로 알려져 있다.</p><h2>효소에 의해 분해된 단백질의 특성</h2><p>효소를 이용하여 분리한 단백질의 특성을 확인하기 위하여 단일효소를 사용한 경우 수용성 단백질을 가장 많이 생성한 Protease M, Protease N, Protease A와 혼합효소에서 가장 효과가 좋았던 Protease M+Protease N+Protease A를 선택하여 SDS-PAGE를 하였다. 효소처리를 한 모든 시료에는 어떠한 밴드도 형성이 되지 않는 것을 확인할 수 있었는데(data not shown), 이것은 쌀 시럽박에 존재하는 단백질이 \( 15\ \mathrm{kDa} \) 이하의 작은 크기의 polypeptide 혹은 amino acid의 형태로 분해가 된 것을 의미한다. Treimo 등이 연구한 맥주박의 경우도 protease를 맥주박에 처리 하였을 경우 분자량이 \( 10\ \mathrm{kDa} \) 미만의 polypeptide와 같은 물질들이 나타났고 대부분의 단백질은 \( 1\ \mathrm{kDa} \) 미만의 작은 peptide나 amino acid의 형태로 분해가 되는 것을 알 수 있었다.</p><h2>아미노산 분석</h2><p>단백질 분해 효소로 처리한 쌀 시럽박의 수용성 성분에 존재하는 아미노산의 조성을 분석한 결과를 Table 2에 나타내었다. 효소를 단일 혹은 혼합처리 하였을 때의 아미노산 조성은 특정 패턴을 보이지 않았으며 쓴맛을 유발하는 아미노산인 Leucine, Isoleucine, Valine, Phenylalanine, Arginine의 함량이 높은 것으로 보아 샘플의 쓴맛이 강할 것이라고 예상된다. 필수 아미노산인 Phenylalanine, Valine, Leucine, Isoleucine 등의 함량은 일반 쌀에 비해 높게 나타내었으며 특히 곡물의 제 1 제한 아미노산인 Lysine의 경우 효소의 종류에 따라 그 값의 차이가 있었지만 Protease M의 경우 일반 쌀에 비해 높은 함량을 나타내는 것을 알 수 있었다. 특히 총 아미노산 함량의 경우 Protease M을 단일 처리하였을 때와 3가지 효소를 혼합하였을 때의 값이 비슷함을 확인 할 수 있었는데, 이는 Protease M의 경우 단백질을 분해할 때 peptide와 amino acid를 동시에 생성하고 자신이 생성한 peptide를 또다시 amino acid로 분해하는 특성을 가지고 있으므로 이러한 특징으로 인해서 효소를 혼합하였을때와 그 값이 비슷한 것으로 판단된다. 한편 효소처리 후 생성된 총 단백질 함량은 효소를 혼합할수록 증가하였지만 아미노산 함량은 단일과 비교하였을 때 비슷한 결과를 나타내었는데 이것 또한 Protease M의 특성으로 인해서 기인된 것으로 판단되며 상대적으로 효소를 혼합할수록 아미노산으로 분해되지 못한 polypeptide가 단일 처리에 비해 다량 존재할 것으로 생각된다.</p>