세포배양용 48 well plate를 이용하여 \( 1 \times 10^{4} \mathrm{ cells/well}\)의 농도로 전립선 암 세포주인 PC-3 세포와 LNCaP 세포를 MTT를 이용하여 반응시킨 후 [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl] tetrazolium bromide (MTT)를 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도가 되게 배지로 희석한 후에 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 각 well에 존재하는 세포 생존 수와 비례한다. 또한 형광 반응을 통한 분석도 진행하였다. 이를 분획하기 위해서 HPLC를 수행하였으며 각종 proton 및 carbon NMR spectra를 사용하여 구조 동정을 진행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>한약 재료</h2><p>본 연구에 사용된 필발 (P. longum Linn.)는 2007년 부산광역시 서구 소재 한약건재상에서 구입하여 분쇄기로 분말로 제조한 다음 시료로 사용하였다.</p><h2>시약 및 기기</h2><p>시료의 추출 및 용매분획에 이용한 유기용매는 시약용(extra pure, Duksan, Ansan, Korea)을 그리고 HPLC에는 HPLC grade (J.T.Baker, Ashland,USA)의 용매를 이용하였다. Open Column chromatography 충진용 silica gel로는 Kiesel gel 60 (230-400 mesh, Merck, Germany)을 사용하였고, thin layer chromatography (TLC)용 plate로는 precoated silica gel 60F254 (Merck, Germany)과 RP-18 F254 (Merck, Germany)을, 발색시약으로는 \( 10 \% \)\(\mathrm{~H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \)을 사용하였다. 본 실험에 사용한 HPLC는 SCL-10A cotroller, SPD-M10A UV spectrophoto-metric detector, LC-10AT liquid chromatograph, FCV-10AL, DGU-14A (Shimadzu Scientific Co., Tokyo, Japan)로 구성 되었다. 각종 proton 및 carbon NMR spectra는 JEOL Eclipse NMR spectrometer (JEOL, Tokyo, Japan)을 이용하여 측정하였으며 internal standard로 tetramethylsilane (TMS)를 이용하여 chemical shift치를 정하였으며 \( \delta(\mathrm{ppm}) \)으로 표시하였다. 마지막으로 [3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl] tetra-zolium bromide (MTT), propidium iodide (PI)는 sigma사에서 구입하였다.</p><h2>암세포주와 세포배양</h2><p>인간 전립선암 세포주인 PC-3 세포와 LNCaP 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 분양받아 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS) (Hyclone Co.), \( 100 \mathrm{~unit} / \mathrm{ml} \) penicilin, \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) streptomy-cin (Hyclone Co.)이 첨가된 DMEM 배지(Hyclone Co., Logan, UT, USA)와 RPMI-1640 배지(Hyclone Co., Logan, UT, USA)에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \%\) \(\mathrm{~CO}_{2} \) 조건에서 배양하였다.</p><h2>MTT assay를 이용한 세포 증식률의 측정</h2><p>세포배양용 48 well plate를 이용하여 \( 1 \times 10^{4} \mathrm{ cells/well}\)의 농도로 전립선 암 세포주인 PC-3 세포와 LNCaP 세포를 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후, 동정한 pipernonaline을 \( \mathrm{MeOH} \)로 희석하여 각 well 당 적정 농도로 처리하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl] tetrazolium bromide (MTT)를 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도가 되게 배지로 희석하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4시간 반응시킨 후, MTT 시약을 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO)로 각 well에 생성된 formazan을 녹인 후 ELISA reader로 \( 540 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 이 흡광도는 MTT가 세포에 의해서 환원된 양으로, 각 well에 존재하는 세포의 생존 수와 비례한다.</p><h2>세포주기 분석</h2><p>세포배양용 6-well plate를 이용하여 \( 1 \times 10^{4} \mathrm{ cells/well}\)의 농도로 전립선 암 세포주인 PC-3 세포를 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후, 동정한 pipernonaline을 \( \mathrm{MeOH} \)로 희석하여 각 well 당 적정 농도로 처리하였다. 정상 및 pipernona-line이 처리된 배지에서 배양한 PC-3 세포들을 phosphate-buffered saline (PBS) 용액으로 세척한 후, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 \( 70 \% \) ethanol에 고정하였다. 고정한 후 RNase A를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간동안 처리하고 DNA intercalating dye인 propidium iodide(Sigma)로 DNA를 염색하였다. 다시 PBS로 세척 과정을 거친 후 DNA flow cytometry (Becton Dickinson Co., Franklin Lakes, NJ, USA)에 적용시켜 형광반응에 따른 his-togram을 Modifit software (Becton Dickinson Co.)를 사용하여 분석하였다.</p><h2>물질의 분리 및 동정</h2><p>건조된 필발 \( 1.2 \mathrm{kg} \)을 \( 100 \% \) methanol (\( \mathrm{MeOH} \)) \( 8\mathrm{ l } \)로 2회 반복 추출하여 MeOH 추출물을 얻었다. MeOH 추출물을 증류수에 현탁 시켜 chloroform \( \left(\mathrm{CHCl}_{3}\right) \)층과 water층으로 분리하여 chloroform 추출물 \( 130 \mathrm{g} \)을 얻었다. 정제되지 않은 chloroform 추출물을 silica gel (230-400 mesh, \( 1 \mathrm{~kg} \), Merck) column chromatography를 이용하여 chloroform/n-hexane \( (1:1, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \), n-hexane/ethylacetate (EtOAc) \( (3:1, 2:1, 1:1, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \)을 사용하여 순차적으로 용매 분획하였다. 각각의 분획물은 증발 건조시킨 후, 농축하여 TLC와 MTT assay를 통해서 활성을 관찰하였다. 활성이 관찰된 분획을 초기의 용매인 chloroform/n-hexane \( (1:1) \)로 녹인 후에 reverse phase (RP-18) column chromatography와 Sephadex LH-20 col-umn chromatography에 충진 시켜 \( 70 \% \)와 \( 100 \% \) \( \mathrm{MeOH} \)의 용매로 분리하였다. 각각의 분획을 증발 건조시킨 후, 농축하여 위에서 언급한 TLC와 MTT assay를 통해서 활성 분획을 선별하여 \( 75 \% \) \( \mathrm{MeOH} \)에 녹여서 항암효과를 나타내는 분획을 검출하였다. 검출된 분획을 HPLC를 수행하여 분리 및 정제하였으며, 각종 proton 및 carbon NMR spectra를 이용하여 구조 동정하였다.</p><h2>통계 분석</h2><p>모든 실험은 2회 이상 실시하였으며, Microsoft office Excel 프로그램을 이용하여 평균값과 표준 편차를 산출하였으며 표준편차는 그림에서 bar로 표시하였다.</p>