균주는 LB 배지에서 37\(^\circ \mathrm{C}\), 200 rpm 속도로 18-20시간 배양하였다. B. subtilis DB104을 숙주세포로 사용하고 plasmid pJHKJ4를 이용하여 형질전환을 Contente와 Dubnau 등의 방법으로 하였으며, kanamycin 함유LB 평판배지에서 형질전환 균주의 선별 및 보존을 하였다. B. subtilis DB104 숙주세포 및 재조합 균주는 37\(^\circ \mathrm{C}\), 200rpm 속도로 18-20시간 LB 배지에서 배양하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주, Plasmid 및 형질전환법</h2> <p>본 연구에서는 B. subtilis DB104 (hisH nprR2 nprE18 aprE)를 숙주세포로 사용하였고, plasmid는 구성적 \( P_{\mathrm{JH}} \) promoter와 endoxylanase 자체 promoter인 \( \mathrm{P}_{B} \) promoter 하류에 endoxylanase 유전자 (ORF는 \( 639 \mathrm{bp} \) )가 연결된 pJHKJ4를 사용하였다. B. subtilis DB104의 형질전환은 Contente와 Dubnau 등의 방법으로 하였으며 형질전환 균주의 선별 및 보존은 kanamycin 함유 \( (25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m \ell}) \)LB 평판배지에서 하였다.</p> <h2>배지 및 배양조건</h2> <p>B. subtilis DB104 숙주세포 및 재조합 균주 (DB104/pJHKJ4)의 기본 배양을 위하여 LB (1\% tryptone, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 0.5 \% \mathrm{NaCl} \) )를 사용하였으며, 탄소원과 질소원의 영향을 조사하기 위해서는 반합성 배지 (Semi-synthetic medium; SSM) (per \( 1.0 \ell \), yeast extract \( 1 \mathrm{~g}, \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} 1.5 \) g, \( \mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 7 \mathrm{~g} \), \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} 5 \mathrm{~g}, \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.5 \mathrm{~g}, 1 \mathrm{ml} \) 미량원소액)에 탄소원과 질소원을 첨가하여 사용하였다. 미량원소액의 조성은 다음과 같다: per \( 100 \mathrm{ml} 0.1 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} \), \( \mathrm{MnSO}_{4} \cdot 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 1.51 \mathrm{~g}, \mathrm{CaCl}_{2} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.17 \mathrm{~g}, \mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) \( 0.13 \mathrm{~g}, \mathrm{ZnSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.025 \mathrm{~g},\left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{6} \mathrm{Mo}_{7} \mathrm{O}_{24} \cdot 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.0125 \) \( \mathrm{g}, \mathrm{CuSO}_{4} \cdot 5 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.0125 \mathrm{~g}, \mathrm{CoCl}_{2} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.023 \mathrm{~g}^{\prime} \mathrm{H}_{3} \mathrm{BO}_{3} \) \( 0.25 \mathrm{~g} \).</p> <p>\( 25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m} \ell \) 의 kanamycin을 함유한 \( 10 \mathrm{m \ell} \) LB 배지에서 일정한 세포농도 \( \left(\mathrm{OD}_{660}\right. \) 값이 약 \( \left.1.0\right) \) 까지 전배양 후 플라스크에 접종하여 진탕배양하였다. 플라스크 배양은 배지 \( 50 \mathrm{ml} \) 을 함유하는 \( 500 \mathrm{ml} \) baffled-flask로 \( 180 \mathrm{rpm} \) 에서 수행하였으며, 발효조 (Korea Fermentor Co., Korea)에서의 회분배양은 다음의 조건으로 수행하였다: working volume, \(1.0 \ell \); 온도, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \); \( \mathrm{pH}, 7.0 \); 교반속도, \( 300 \sim 800 \mathrm{rpm} \); 통기속도,\( 1 \sim 2 \mathrm{vvm}\).</p> <h2>균체농도 및 잔존 환원당농도 측정</h2> <p>균체농도의 측정은 \( 660 \mathrm{~nm} \) 에서의 탁도 \( \left(\mathrm{OD}_{660}\right) \) 로 하였으며, 잔존 환원당농도는 3,5-dinitrosalicylic acid법으로 측정하였다.</p> <h2>Endoxylanase의 활성측정</h2> <p>Endoxylanase의 활성은 환원당 측정법을 이용하여 \( 1 \% \) xylan으로부터 생성되는 환원당의 양으로 측정하였다. 즉, \( \mathrm{pH} 6.6(0.1 \mathrm{M} \) 인산완충액 \( ), 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 분당 \( 1 \mu \mathrm{mol} \) 의 환원당 (xylose equivalent)을 생성하는 효소의 양을 \(1 \mathrm{unit} \)로 정의하였다.</p> <h2>균체 파쇄</h2> <p>B. subtilis 세포내 endoxylanase 활성 측정을 위해 \( \mathrm{Neu} \)와 Heppel의 방법에 따라 균체를 파쇄하였다. 즉, 배양액을 원심분리하여 얻은 균체를 TE 완충액 ( \( 10 \mathrm{mM} \) Tris, \( 0.1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( \mathrm{pH} \) 7.0)으로 2~3회 세척 후, \( 0.1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) lysozyme \( 1 \mathrm{~m} \ell \) 과 \( 20 \mathrm{mM} \) phenyl methyl sulfonyl fluoride \( 10 \mu l \) 에 균체를 현탁하였다. 이를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 진탕한 다음 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20분간 급속동결 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 다시 30분간 진탕하여 해동시켰다. 이 현탁액을 원심분리하여 얻은 상등액을 균체분획으로 사용하여 세포내 endoxylanase 활성을 측정하였다.</p> <h2>Plasmid 안정성</h2> <p>배양액을 적당히 희석하여 LB 평판배지에 도말한 후 생성된 100~200개의 colony를 선별배지인 kanamycin 함유 LB 배지로 옮긴 다음 형성된 colony 수의 비(백분율)로 측정하였다.</p> <h2>전기영동 분석</h2> <p>세포외 endoxylanase의 생성 양상과 분자량 분석은 SDS-PAGE \( (12 \% \) gel \( ) \)를 통해 행하였으며, 대조구로 사용한 endoxylanase는 배양상등액을 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 침전, 한외여과 및 CM52 cation-exchange chromatography를 통해 정제한 것이다. 전기영동한 gel 또는 사진은 Image Analyzer (Image Master VDS, Pharmacia Biotech., USA)로 scanning하였다.</p>