해안지역은 육상과 해양의 전이지대로 내륙지역에 비해 염분, 고온, 바람, 자외선 등의 영향을 받는 환경이다. 국내에 분포하고 있는 해안염습지 중 대표적인 순천만은 원형에 가까운 모래갯벌과 갯벌의 토양형태를 가지고 있으며, 갈대, 칠면초, 나문재,해홍나물, 퉁퉁마디 등의 염생식물 종들이 자생하고 있다. 염생식물은 미생물과 상호작용을 반복해나가며 미생물에 의해 염,습도,온도,바람과 같은 환경에 스트레스 면역을 갖게 되며 염습지로 들어오는 각종 오염물질을 정화하는 역할을 한다. 최근 연구에서는 순천만에 자생하고 있는 염생식물-균류에 대한 연구가 보고되고 있지만, 해양세균에 대한 연구는 거의 이루어지지 않고 있다. 따라서 순천만에서 다양한 근권 세균을 분리하고 계통학적인 유연관계를 분석하고 다양성을 확인하고자 한다.
<p>해안지역은 육상생태계와 해양생태계가 만나는 전이지대로서 내륙지역에 비하여 염분, 고온, 바람, 자외선 및 해수에 대한 영향을 크게 받는 환경으로 알려져 있다. 해안지역은 크게 해안사구, 해안암반지역, 해안염습지 등으로 분류되며 육상지역과는 달리 식물이 생장하기 어려운 환경을 가진다. 국내에 분포하고 있는 해안염습지는 수심이 얕으며 조석간만의 차가 크고 경사가 완만하며, 서남해안에 잘 발달해 있다. 그리고 남해안에는 국내 대표적인 순천만이 자리잡고 있으며, 2006년에 “람사르습지"로 등재되었다. 순천만은 원형에 가까운 형태의 만으로서 모래갯벌, 갯벌 등의 토양형태를 가지고, 아주 잘 보존된 해안염습지 중에 하나이다. 또한, 독립적으로 적응된 염생식물(Halophyte) 종들이 자생하고 있고, 생물 종 다양성이 높은 것으로 알려져 있다. 대표적으로 자생하는 염생식물은 갈대(Phragmites australis), 칠면초(Suaeda japonica), 나문재(Suaeda asparagoides), 해홍나물(Suaeda maritima), 퉁퉁마디(Salicornia europaea) 등이 있고, 갈대와 칠면초가 우점하고 있다.</p> <p>염생식물은 다양한 미생물과 상호관계를 가지며, 미생물에 의해서 염, 건조, 고온, 바람 등과 같은 환경스트레스에 면역성을 가진다고 알려져 있으며, 염습지로 유입되는 오염물질 등을 분해 및 정화한다고 알려져 있다. 순천만은 세계 5대 연안습지로 알려져 있지만, 국내 분포하고 있는 해안 염습지의 규모에 비하여 해양미생물 연구는 많이 이루어지지 않았다. 최근에 순천만에 자생하고 있는 염생식물-균류에 대한 연구가 보고되고 있지만, 해양세균(Marine bacteria)에 대한 연구는 거의 없는 실정이다. 따라서 해양세균의 확보 및 다양성 연구가 먼저 이루어져야 할 것이며, 이를 토대로 생태학적, 유전학적, 분자생물학적 등의 다양한 연구가 필요할 것이다. 본 연구에서는 순천만에 자생하고 있는 칠면초의 근권토양에서 해양세균을 분리하고 이들의 계통학적인 유연관계를 분석하고 다양성을 확인하고자 하였다. 이에 더하여, 최근 해안식생 복원, 염해 농경지 복원에 대한 연구분야에서 해안 염생식물과 상호작용하며 식물생장촉진 및 식물면역성을 유도하는 해양 미생물자원과 관련된 연구가 증가하고 있는 바, 본 연구에서는 순천만 자생식물과 상호작용할 것으로 추측되는 다양한 근권 세균을 분리하고 분리균들과 그들의 표준균주 간 계통수를 확인하여 유용 미생물 자원을 확보하고자 하였다.</p> <p>이를 위해 순천만 연안에서 자생하는 칠면초 군락지 3곳을 선발하여 근권 토양을 채취하였다(Table 1). 토양시료는 멸균 tube에 담겨 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)를 유지하여 실험실로 운반되었으며, 멸균된 \( 0.85 \% \mathrm { ~NaCl } \) 용액과 토양시료를 1:1로 섞어 \( 40 \mathrm { ~rpm } \)으로 30분간 \( 40 \mathrm { ~rpm } \)으로 교반하였다. 이들의 supernatant를 \( 100~ \mu \) 씩을 덜어내어 standard serial dilution technique을 이용해 각각 희석배수별로 tryptic soy broth (TSB; Difco, USA) 한천배지와 marine broth (MB; Difco, USA) 한천배지에 도말 후, \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 7일간 항온기에서 배양하였다. 배양 후 형성된 colony들은 그들의 색, 모양, 크기 등으로 분리되었으며, 획선도말을 반복하여 각각 동일 배양조건 하에서 계대배양을 반복하여 순수분리 되었다. 또한 \( 16 \mathrm { S } \) rDNA를 이용한 분리균의 분자적 부분동정을 위해 다음과 같은 과정이 수행되었다. 각각의 세균을 원분리배지인 MB, TSB 액체배지 \( 10 \mathrm { ~ml } \)에 접종하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 180 \mathrm { ~rpm } \)으로 18시간 전배양 후 \( 100 \mathrm { ~ml } \) 액체배지에 전배양액 \( 1 \mathrm { ~ml } \) 씩을 접종하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 항온기에서 \( 180 \mathrm { ~rpm } \) 으로 5일간 진탕배양 하였다. 본배양액을 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 3,000 \mathrm { ~rpm } \)으로 10분간 원심분리하여 균체를 수집한 후, boiling method (Chelex Resin Bio-RAD, USA)를 이용해 genomic DNA를 추출하였다. 16S rDNA sequence 증폭을 위해 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'를 forward primer로, 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'을 reverse primer로 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은, 1차적으로 denaturation \( \left (95 ^ {\circ } \mathrm { C } , 15 \mathrm { ~min } \right ) \)을 실시한 후, denaturation \( \left (95 ^ {\circ } \mathrm { C } , 20 \mathrm { sec } \right ) \), annealing \( \left (50-58 ^ {\circ } \mathrm { C } \right . \), \( 40 \mathrm { ~sec } ) \), elongation \( \left (72 ^ {\circ } \mathrm { C } , 90 \mathrm { ~sec } \right ) \)을 35회 반복한 후 마지막으로 elongation \( \left (72 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \mathrm { ~min } \right ) \)을 실시하였다. PCR product의 염기서열 분석은 ABI 3730XL DNA analyzer (Perkin Elmer, USA)을 이용하여 실시되었다. 결정된 서열은 National Center for Biotechnology Information(NCBI) public domain site의 BLAST 및 EzTaxon server(http://eztaxon.org) database를 이용하여 기준균주(type strain)와 가장 상동성이 높은 type strain과 비교하여 판별하였다. 또한 순수분리된 균주들에 대해 NCBI의 GenBank로부터 \( 16 \mathrm { S } \) rDNA 서열에 대한 accession no.를 부여받았다.</p>