7주령의 수컷 ICR 마우스에 실험용 방사선 조사기를 사용하여 \( { } ^ { 60 } \mathrm { Co } \) 감마선(선량률: \( 2 \mathrm { Gy } / \mathrm { min } ) \) 을 1 회 전신조사하여 실험을 진행한 후 시간 경과에 따른 변화 관찰을 위하여 \( 2 \mathrm { ~Gy } \) 의 방사선을 조사하고 \(0,2,4,8,12,16 \) 및 24 시간에 관찰되는 고환 정세관에서의 TUNEL 양성세포를 측정하였으며, 방사선 조사용량에 따른 변화 관찰을 위하여 \(0.5,1,2,4 \) 그리고 \( 8 \mathrm { ~Gy } \) 의 방사선을 조사하고 8시간 후 apoptosis 발생양상을 측정하였다.
<h2>실험 동물</h2> <p>7주령의 수컷 ICR 마우스(오리 엔트바이오, 성남)를 사용하였다. 동물의 사육은 온도 \( 22 \pm 2 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 상대습도 \( 50 \pm 10 \% \), 조명시간은 12시간(오전 8 시 점등-오후 8 시 소등) 및 조도 200-300 lux로 설정된 시설에서 수행하였다. 순화기간을 거쳐 polycarbonate 사육상자에 4 마리씩 수용하였고 실험동물용 고형사료(삼양사료, 원주)와 정수장치를 통과한 수도수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 마우스는 4 마리를 하나의 실험군으로 적용하였으며, 모든 실험동물은 Institute of Laboratory Animal Resources의 'Guide for the Care and Use of Laboratory Animal' (1996, USA)에 준하여 취급하였으며 동물실험은 전남대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인 하에 수행되었다.</p> <h2>방사선 조사</h2> <p>방사선조사는 실험용 방사선 조사기(Gamma-cell Elan 3000 , Nordion International, Canada)를 사용하여 \( { } ^ { 60 } \mathrm { Co } \) 감마선(선량률: \( 2 \mathrm { Gy } / \mathrm { min } ) \) 을 1 회 전신조사 하였다.</p> <h2>실험군의 분류 및 조직 관찰</h2> <p>방사선 조사 후 시간 경과에 따른 변화 관찰을 위하여 \( 2 \mathrm { ~Gy } \) 의 방사선을 조사하고 \(0,2,4,8,12,16 \) 및 24 시간에 관찰되는 고환 정세관에서의 TUNEL 양성세포를 측정하였으며, 방사선 조사용량에 따른 변화 관찰을 위하여 \(0.5,1,2,4 \) 그리고 \( 8 \mathrm { ~Gy } \) 의 방사선을 조사하고 8시간 후 apoptosis 발생양상을 측정하였다. 부검은 경추탈구를 실시하였으며 양측 고환을 채취한 후 Bouin's 고정액에 24 시간 동안 고정하고 통상적인 방법에 따라 파라핀 포매, 절편을 제작하여 hematoxylin-eosin (H-E) 염색을 실시하였다. Apoptosis를 확인하기 위해 TUNEL 염색과 고환정세관상피의 단계를 구별하기 위하여 periodic acid Schiff (PAS) 이중염색을 적용하였다. 방법을 간단히 기술하면 Apoptag in situ apoptosis detection kit (ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection kit, Intergen Co., USA)를 사용하여 \( 4 \mu \mathrm { m } \) 두께로 박절한 조직을 파라핀 제거 후 phosphate buffered saline (PBS) (pH 7.6)으로 세척하고 조직의 endogenous peroxidase를 불활성화 시키기위해 \( 3 \% \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 에 실온에서 30 분 동안 처리하였다. Kit에 포함되어 있는 equilibration 완충액으로 15 분 동안 처리한 다음 TdT 를 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 90 분 동안 반응시켰다. 반응을 중단시키기 위해 반응정지 완충액에 조직절편을 넣고 상온에서 30 분 동안 처리하였다. Anti-digoxigenin-peroxidase로 실온에서 30분 동안 반응시킨 후 diaminobenzidine (DAB)용액으로 발색시켜 증류수로 세척하였다. TUNEL 염색이 완료된 조직을 정세관상피 단계구분을 위하여 \( 0.5 \% \) periodic acid로 10분 동안 조직을 산화시키고 Schiff 시약으로 20 분간 발색 후 sodium metabisulfate로 수세하여 비결합물을 제거하였다. Hematoxylin으로 20 초간 대비염색을 시행하고 봉입하였다.</p>