남해안에서 잡힌 선도가 양호하고 어체의중량이 비슷한 고등어 10마리를 구입하였으며, 건조된 고등어는 실험 사용 전까지 acetone:methylene chloride 혼합하여 24시간 숙성한 후 추출하였다. HT1080 세포는 분양받아 배양하여 실험에 사용하였으며, 압세포는 RPMI 배지로 희석하였으며, 실험 결과는 Mean ± ± SEM (Standard Error of Mean)으로나타내었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>2005년 1월에 남해안에서 잡힌 선도가 양호하며 어체의중량 \( (540 \mathrm{~g}) \)이 비슷한 고등어 10마리를 구입하였다. 신선한상태에서 머리와 꼬리, 내장을 제거한 후 뼈를 중심으로 반으로 나누어 각각 3등빈으로 포를 떴다. 포를 뜬 고등어를 저온 진공 건조기를 이용하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 40 torr의 압력으로 5\( \mathrm{mm} \) 두께로 30시간 건조하였다.</p> <h2>추츨 및 분획</h2> <p>건조된 고등어는 실험 사용 전까지 \( -75^{\circ} \mathrm{C} \) 에 냉동 보관되었다가 유기용매 추출을 위하여 acetone:methylene chloride를 \( 1: 1 \) 비율로 혼함하여 건조 고둥어가 충분히 잠기도록 하여 24시간 방치한 후 추출하였다. 이 과정을 2회 반복하여 얻은 여액은 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 수욕 상에서 rotary vacuum evaporator(EYELA, Japan)을 사용하여 능축하여 acetone/methylcnechloride 주출물 \( (\mathrm{A}+\mathrm{M}) \)을 얻었다. 남은 잔사에 동량의 meth-anol율 부어 위와 동일한 방법으로 2회 반복한 후 농축하여methanol 추촐물 \( (\mathrm{MeOH}) \)을 얻었다. 두 추훌물을 흔합한 추출물은 용매 극성에 따라 순차적으로 분획하여 hexane, \( 85 \% \)aq. \( \mathrm{McOH} \), butanol ( \( \mathrm{BuOH}) \), water 분회물을 얻었다. 실험에는 각각의 추출물들을 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여실헙에 사용하였고 세포배지로 펄요한 놓도로 희석하여 실험에 사용하였다. 세포배양에 사용된 DMSO의 최종농도는\( 0.1 \% \) 이하가 되도록 하였다.</p> <h2>세포 내 활성산소종(reactive oxygen species) 측정</h2> <p>인체 섬유육종세포인 HT1080세포는 한국 세포 주 은행으로부터 분양받아 배양하여 실험에 사용하였다. HT1080세포는 100 units/ml의 penicillin-streptomycin과 \( 10 \% \) FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 cell culture dish에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \),\( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양하였다. 세포 내 활성산소종은\( 2^{\prime}, 7^{\prime} \)-dichlorodihydrofluorescin diacetate (DCFH-DA) assay로 측정하였다. DCFH-DA (Sigma, USA)는 세포 내활성산소종과 반응하여 형광물질(dichlorofluorescein, DCF)을 만들어 내는 것으로 이 시약을 세포 속에 넣어 발생하는형광을 측정함으로써 세포 내의 활성산소종을 측정할 수 있다. 세포를 96well plate에 분주한 후 24시간 배양하고, PBS완충액으로 씻은 후 \( 20 \mu \mathrm{M} \mathrm{DCFH-DA} \)을 각 well에 분주하여\( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 20 분간 pre-incubation하였다. 각 well에 시료를 처리하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 1시간 incubation한 후, DCFH-DA을 없애고 세포는 다시 PBS완충액으로 씻은 후 \( 500 \mu \mathrm{M} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 를 처리하여 시간별로 DCF fluorescence를 excitation \( 485 \mathrm{~nm} \), emission \( 535\mathrm{~nm} \) 에서 형광 분석기로 측정하였다. 대조군들(blank군과 control군)은 시료 대신 PBS를 처리하며, control군은 \( 500 \mu \mathrm{M} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 처리를 하고, blank군은 \( 500 \mu \mathrm{M} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 대신 PBS를 처리하여 측정하였다.</p> <h2>암세포 및 암세포 배양</h2> <p>한국 세포주 은행(서울의대)으로부터 인체 섬유육종세포(HT1080)와 인체 결장암세포(HT-29)를 분양받아 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다. HT1080과 HT-29 암세포를 100 units/ml의 penicillin-streptomycin과 \( 10 \% \) FBS가함유된 RPMI 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서배양하였다. 배양 중인 세포롤 일주일에 2번 새로운 배지로바꿔주었다. 일주일 후 phosphate buffered saline (PBS)으로세척한 뒤 \( 0.05 \% \) trypsin-0.02\% EDTA (Gibco Co., USA)로부착된 세포를 분리하여 원심분리 한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 꼴고루 분산되도록 잘 흔합하여 \( 75 \mathrm{~cm}^{2} \) cell culture flask에 \( 10 \mathrm{ml} \) 씩 일정한 수로 분할하여 주입하고 계속 6 7일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.</p> <h2>MTT assay</h2> <p>배양된 압세포는 96 well plate에 \( 2 \times 10^{4} \) cclls/mlo\( 100 \mu 1 \) 씩 분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator애서 24시간 배양한 후 배지는 제거한 뒤 각 시료를 RPMI 배지로 희석하여각 well당 시료를 \( 100 \mu 1 \) 씩 첨가하고, 대조군에는 시료 대신 PBS를 \( 100 \mu \)씩 첨가하였다. 이 plate를 다시 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \)incubator에서 24 시간 배양하였다. 배양 후 MTT assay를 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bro-mide MTT 시야 \( 5 \mathrm{mg} \)을 \( 1 \mathrm{ml} \) PBS로 녹인 후, \( 10 \% \mathrm{FBS} \) 가함유된 RPMI 배지 \( 9 \mathrm{ml} \)와 희석하여 \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하고 3 4시간 동안 더 배양하여 MTT가 환원되도록 한다. 배양종료후 생성된 formazan 결정을 가라앖힌 후 각 well에 형성된결정이 흐트러지지 않도록 주의하면서 MTT 시약처리 배지률 제거하였다. 배지가 제거된 가 well에 formazan 결정을 용해시키기 위하여 DMSO를 \( 100 \mu \) 씩 분주하여서 \( 5 \sim 10 \) 분간반응시켜 96 well plate용 광도계(ELISA reader)로 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도블 측정하였다. 이 흡광도는 MTT나 세포에 의해서 환원된 양을 나타내며, 따라서 각 well에 존재하는 생존수와 비례한다.</p> <h2>통계 분석</h2> <p>실험 결과는 Mean \( \pm \) SEM (Standard Error of Mean)으로나타내었고 분석된 실험 데이터는 대조군과 각 시료로부터얻은 실첨 자료로부터 one-way ANOVA를 실시하여 유의성이 있을 경우에 post-hoc test로 Duncan's multiple rangetest를 실시하여 \( \mathrm{p}<0.05 \) 수준에서 유의성을 검증하였다.</p>