\(\beta\)-lactamase의 정제는 포화분획으로 진행되었으며, Ammonium sulfate를 80% 포화시켰을 때 효소활성 단백질의 침전율이 가장 좋았고, 원심분리를 통해 buffer 용액에 투석한 결과 배양액의 조효소에 비해 23배 정도의 단백질 정제 효과가 있었다. 전기 영동을 통해 정제 효소의 분자량을 측정하였는데, 대부분 \( 30 \mathrm { ~kDa } \) 전후의 분자량을 가져 본 균주의 효소가 \( \beta \)-lactamase 효소의 분자량과 거의 유사함이 밝혀졌다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>\( \beta \)-lactamase의 정제</h2> <p>모든 정제과정은 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)나 실온 이하에서 실시하였으며, 각 정제 단계의 개요를 Table 1에 나타내었다. Ammonium sul-fate를 \( 30 \% \sim 80 \% \)까지 포화시켜 효소활성 단백질의 침전율이 가장 좋은 분획을 선택한 결과 \( 80 \% \) 포화분획이 효과적이었다. 이 침전물은 원심분리 \( (23,000 \times \mathrm { g } , \text { 20 min } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } ) \)에 의하여 회수한 다음 \( 0.01 \mathrm { ~M } \) Tris-HCI buffer \( ( \mathrm { pH~ } 7.5) \)에 녹여 투석하였으며, 이 과정에서 배양액의 조효소에 비하여 약 23배 정도로 단백질 정제의 효과가 있었다. DEAE-Sephadex A-50 column chromatography과정에서 흡착된 효소 단백질은 \( 0 \sim 0.2 \mathrm { ~M } \)의 \( \mathrm { NaCl } \)로서 용출시킨 결과 Fig. 1에서 보는 바와 같이 약 \( 0.08 \mathrm { M } \)의 \( \mathrm { NaCl } \) 농도에서 활성 단백질이 용출되었다. 각 분획의 활성은 \( 0.01 \mathrm { M } \) acetate buffer \( ( \mathrm { pH~ } 5.0) \)를 사용하여 측정하였다. Sephadex G-200 gel filtration 과정에서는 전단계 ion exchange과정보다 약 2배정도의 정제 효과를 보였다. 효소의 수율에 있어서는 약 \( 40 \% \) 이하로 떨어졌으나 전체적인 정제 효과는 약 260배 정도가 되었다. Mono S (FPLC)에서의 최종 정제 효과는 약 1,000배 가까운 비율로 매우 높았다.</p> <h2>분자량</h2> <p>본 정제 효소를 Bio-Rad의 low molecular weight marker와 함께 전기영동 하여 Rf치를 구하여 표준곡선에 의한 분자량을 측정하였다. 그 결과 Fig. 3에서 보는 바와 같이 정제된 효소의 분자량은 \( 31 \mathrm { ~kDa } \)이었다. Wu는 B. subtilis가 체외로 분비하는 \( \beta \)-lactamase의 분자량이 \( 33.5 \mathrm { ~kDa } \)과 \( 30.7 \mathrm { ~kDa } \)이고 B. cereus가 분비하는 \( \beta \)-lacmase의 분자량은 \( 33.5 \mathrm { ~kDa } \)과 \( 31 \mathrm { ~kDa } \)임을 보고하고 있다. 또한, Staphylococcus속의 한 균주로 부터 Jan은 분자량이 \( 32 \mathrm { ~kDa } \)과 \( 28.8 \mathrm { ~kDa } \)의 \( \beta \)-lactamase가 존재하는 것을 보고 하여 Gram 양성 균주들은 대개 \( 30 \mathrm { ~kDa } \) 전후의 분자량을 가진 \( \beta \)-lactamase가 존재하는 것으로 사료되어 본 균주에서 생성되는 효소의 분자량도 이들 효소의 분자량과 거의 유사한 크기임을 나타내었다. 그러나 이에 비하여 Gram 음성균이 생성하는 \( \beta \)-lactamase의 경우는 거의 세포내성으로 Enterbacter cloacae의 경우 분자량이 \( 44 \mathrm { ~kDa } \)과 \( 45 \mathrm { ~kDa } \)이었고 E. coli와 P. mirabilis등의 -lactamase는 분자량이 각각 \( 24 \mathrm { ~kDa } \)과 \( 21.5 \mathrm { ~kDa } \)으로 보고된 바가 있다.</p>