HT1080 세포에 대하여 ABGE를 처리한 후, Gelatin zymography 방법을 이용하여 MMP-2 및 MMP-9 활성을 조사하는 실험과, Western blot 분석을 통한 실험을 진행하였으며, 각 실험은 3회 이상 반복 실험을 통하여 결과를 얻어 각각의 시료 농도에 대해 평균표준편차로 나타내었다.
<h2>Gelatin zymography</h2> <p>MMP-2 및 MMP-9 활성은 FBS를 첨가하지 않은 DMEM 배지에서 배양한 HT1080 세포에 ABGE를 처리한 후에 기존 방법에 따라 실험을 수행하였다. \( 50 \mu \mathrm { g } \)의 총 단백질을 함유하는 세포 배양액을 \( 1.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) gelatin을 포함하는 비환원조건의 \( 10 \% \) polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동 하였다. Gel은 \( 1 \% \) Coomassie brilliant blue R250 용액으로 \( 1 \mathrm { hr } \) 동안 염색하고, 탈색용액( \( 30 \% \) methanol, \( 10 \% \) acetic acid)으로 \( 30 \mathrm { min } \) 동안 2회 탈색시켜 gel을 관찰하였다.</p> <h2>Western blot analysis</h2> <p>HT1080 세포에 용출 완충용액(50 \( \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCI } \), \( \mathrm { pH } 7.5 \), \( 0.4 \% \) Nonidet \( \mathrm { P } -40,120 \mathrm { mM } ~ \mathrm { NaCl } , 1.5 \mathrm { mM~ } \mathrm { MgCl~ } 2,2 \mathrm { mM } \) phenylmethylsulfonyl fluoride, \( 80 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) leupeptin, \( 3 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { NaF } \) 및 \( 1 \mathrm { mM } \) DTT 첨가하고 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 30 \mathrm { ~min } \) 동안 처리하였다. \( 10 \mu \mathrm { g } \)의 세포 용출액을 \( 10 \% \) polyacrylamide gel에서 전기영동한 후 단백질을 nitrocellulose membrane으로 전이시켰다. 그 다음, \( 10 \% \) skim milk를 nitrocellulose membrane에 전처리하고 목적 단백질에 대한 1 차 항체(anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-Nrf2, anti-SOD1, anti-beta-actin 항체)를 \( 2 \mathrm { hr } \) 동안 처리한 후 2차 항체를 처리하여, chemiluminescent ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech)로 제조사의 지침에 따라 목적 단백질을 검출하였다. Western blots의 band는 LAS \( 3000 ^ {\circledR } \) image analyzer (Fuifiilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰한 후 촬영하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>각 실험은 3회 이상 반복 실험을 통하여 결과를 얻어 각각의 시료 농도에 대해 평균표준편차로 나타내었다. 각 시료 농도군에 대한 유의검정은 대조군과 비교하여 Student's \( t \) test 한 후 \( \mathrm { p }<0.05 \) 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.</p>