공시 곤충을 표준사육 기준네 준하여 사육한 후 Uni-ZAP XR Vector Kit와 Gigapack Packaging Extract를 사용하여 cDNA 유전자은행을 제작하였다. 만들어진 cDNA를 이용, cDNA 유전자 은행을 제작하고 기주세포내에서 감염시킨 후 cDNA를 알맞은 농도로 증폭하여 실험에 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>공시 곤충 및 배양세포주</h2><p>본 연구에 사용된 공시 곤충 (누에)은 장려 잠풍종인 광식성 원종 (잠 306)으로 농업과학기술원 잠사곤충부의 표준사육 기준 (온도, \( 24 \sim 27^{\circ} \mathrm{C} \); 상대습도, \( 70 \sim 90 \% \))에 준하여 사육하였다. 곤충 배양세포주는 누에 (Bombyx mori : Silkworm) 난소 (ovary) 조직에서 수립된 Bm5 세포주 였다. N- gly-cosylation 억제를 위해 배양세포에 tunicamycin을 \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m \ell}\) 처리하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5시간 배양하였다.</p><h2>Total RNA 및 poly \( (\mathrm{A})^{+}\)RNA 분리</h2><p>Tunicamycin이 처리된 배양세포를 5시간 후에 PBS (phos-phate buffered saline)로 2회 세척한 다음 이로부터 total RNA 분리는 RNAgents Total RNA Isolation System (Promega Co., USA)을 사용하여 분리하였다. 분리한 total RNA는 전기영동으로 양상을 확인하고, 파장 \( 260 \mathrm{~nm} \)에서 UV 분광광도계로 정량하여 polypoly (A)\(^{+} \)RNA 분리에 사용하였다. Poly (A)\(^{+} \)RNA의 정제는 Poly (A) Quik mRNA Purification Kit (Stratagene Co., USA)를 사용하여 정제한 후 cDNA 유전자은행을 제작하는데 이용하였다.</p><h2>cDNA 유전자은행 제작</h2><p>N-glycosylation이 억제된 곤충 배양세포주의 cDNA 유전자은행의 제작은 Stratagene사의 Uni-ZAP XR Vector Kit와 Gigapack Packaging Extract를 사용하여 제작하였다. 즉, poly (A)\(^{+} \)RNA로부터 XhoI linker primer와 역전사효소를 이용하여 cDNA 말단을 평활말단으로 만들었다. 그리고 EcoRI adapter를 부착시킨 후, 제한효소인 Xho I으로 절단하고 size fractionation을 거쳐 \( 500 \mathrm{~bp} \) 이상 크기의 단편만을 취하였다. 이러한 cDNA를 Uni ZAP XR 벡터에 결합시켜 삽입한 후 완전한 bacteriophage 상태가 되도록 coat protein으로 packaging하여 cDNA 유전자 은행을 제작 하고 기주세포 (XL1-Blue MRF\( ^{\prime} \) strain)내에 감염시킨 후 cDNA 농도를 적정하고 이를 적당한 농도로 증폭하여 시험에 사용하였다.</p><h2>정상 및 N-glycosylation이 억제된 곤충 배양세포주의 차별화 선별</h2><p>Tunicamycin을 처리하여 제작된 cDNA 유전자은행으로부터 in vivo excision에 의해 무작위로 768개의 클론을 선발하여 플라스미드를 분리하였다. 분리한 플라스미드를 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 가온하여 변성시킨 후 두 장의 나일론 막에 각각 동일한 \( 0.5\ \mu \mathrm{g} \)의 플라스미드 DNA를 blotting 하였다. 두 장의 막을 각각 정상세포에서 분리한 poly (A)\(^{+} \)RNA와 N-glycosylation이 억제된 곤충 배양세포에서 분리한 poly (A)\( { }^{+} \)RNA를 M-MLV 역전사효소로 합성한 1st-strand cDNA를 탐침으로 사용하였다.</p><p>cDNA 탐침제조는 \( 1.5 \mathrm{~m \ell} \) 튜브에 \( 1 \mu \mathrm{g} \) poly (A)\({}^{+} \)RNA, \( 1 \mu \mathrm{g} \) oligo (dT) primer \( (1 \mu \mathrm{g} / \mu \mathrm{\ell})\), \(20\ \mathrm{units}\) RNase inhibitor, \( 5 \mu \mathrm{\ell}\ 5 \times \) reverse transciptase buffer, dGTP, dCPT, dTTP (\(20\ \mathrm{mM/each}\)), \( 120\ \mu \mathrm{M}\) dATP, \(10 \mu \mathrm{\ell} \left[\alpha-{ }^{32} \mathrm{P}\right] \) dATP \( (3000 \) \( \mathrm{Ci} / \mathrm{mmol}) \)와 \(20\ \mathrm{units}\) M-MLV 역전사효소를 넣고 1시간 동안 역전사하였다. 여기에 \(2\ \mathrm{units}\) RNaseH를 첨가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 반응하여 poly (A)\(^{+} \)RNA만을 선택적으로 제거시킨 후 동위원소가 표지된 단선 cDNA를 G-50 Sep-hadex 칼럼을 이용하여 회수하였다.</p>