해양 동물의 내장을 잘게 잘라 멸균된 희석액, 다층평판배지를 사용하여 1000배 희석된 시료 0.1mL을 25\(^\circ \mathrm{C}\)에서 2~3일간 배양하여 1mm 이상인 균주들을 백금이를 이용하여 다층평판 배지에서 순수 분리하여 알긴산 분해 세균을 분리하고 배지에 도말하였다. 이틀간 정치 배양한 균주가 성장한 배지에 CPC를 투여한 후, plate assay를 통해 알긴산 분해효소의 활성까지 최종 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>알긴산 분해 세균 분리원 및 전처리</h2> <p>알긴산 분해 세균의 분리를 위한 시료는 2009년 5월에 부산광역시 기장군 기장읍 대변항과 경상남도 통영에서 구입한 해양 동물인 전복(Haliotis discus hannai), 소라(Batillus cornutus), 해삼(Stichopus japonicus), 멍게(Halocynthia roretzi), 개불(Urechis unicinctus)이였다. 이들 해양 동물의 내장을 잘게 잘라서 멸균된 희석액 \(\mathrm{NaCl}\) \(2.5 \mathrm{g}\), \(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\) \( 0.1 \mathrm{g} \), \(\mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \(0.05 \mathrm{g}\), \(\mathrm{KCl}\) \(0.05 \mathrm{g}\), \(\mathrm{NH}_{4} \mathrm{CI}\) \(0.1 \mathrm{g} \), 증류수1 \( 1, \mathrm{pH} \) 7)을 이용하여 연속 희석하였다.</p> <h2>알긴산 분해 세균의 분리</h2> <p>알긴산 분해 세균의 분리를 위하여 다층평판배지를 이용하였다. 다층평판배지의 하층배지는 \( \mathrm{NaCl}\) \(2.5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \), \( \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\) \(\quad 0.1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v})\), \(\quad \mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \(\quad 0.05 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v})\), \(\quad \mathrm{KCl} \) \( 0.05 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v})\), \(\mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl}\) \(0.1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \), agar \( 2.0 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v})\), \(\mathrm{pH}\)7이었고, 상층배지는 sodium alginate \( 1.0 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \), agar \( 2.0 \%(\mathrm{w} / \) \( \mathrm{v}), \mathrm{pH} \)7로 하였다. 연속희석으로 1000배 희석된 시료 \( 0.1 \mathrm{mL} \)를 다층평판배지 위에 도말한 후 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2~3일간 배양하였다. 형성된 세균군체(colony)들 중에서 군체 크기가 \( 1 \mathrm{mm} \) 이상인 균주들은 백금이를 이용하여 다층평판 배지에서 순수 분리하였다.</p> <h2>분리 균주의 알긴산 분해능 확인</h2> <p>순수 분리된 각 균주를 PYS 배지(peptone \( 0.5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \), yeast extract \( 0.3 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \), sodium alginate \( 1.0 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}), \mathrm{NaCl} \) \( 1.5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}), \mathrm{pH} \)7)에 접종하고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 150 \mathrm{rpm} \) 조건으로 24시간 진탕 배양한 후에, 알긴산 분해능의 1 차적 확인은 plate assay로 하였다. Plate assay는 PS 한천배지(peptone \( 0.5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \), sodium alginate \( 0.8 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \), agar \( 1.5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v})) \)에 배양한 균주 \( 30 \mu \mathrm{L} \) 를 점적하고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2일간 정치 배양한 후 균주가 성장한 배지에 \( 10 \% \) cetylpyridinium chloride monohydrate(CPC)를 배지가 잠길 정도로 투여하였고, 10분 후 알긴산 분해효소의 활성을 확인하였다.</p>