본 연구에서는 탈지 능이버섯 분말을 인산완충용액으로 추출한 후, 질산암모늄 침전과 DE52 anion exchange column chromatography를 통해 효소를 분리하였다. 이 효소는 건조버섯 중에 함량이 많으며, pH가 높아질수록 혈전용해활성이 증가하고 60℃ 이상에서는 활성이 급감하나, 80℃에서도 25%의 상대활성을 보였다. 또한, 금속 이온 chelator인 EDTA와 serine protease inhibitor인 PMSF에 의해 활성이 크게 저해되었음으로써, 이 효소가 금속 이온과 serine protease를 필요로 함을 알 수 있었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>효소의 정제</h2> <p>탈지 능이버섯 분말을 인산완충용액으로 추출한 조효소액을 \(\left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2}\mathrm{SO}_{4} \) 침전시키고 투석한 후 단백질을 DE52 anion exchange column chromatography로 분리한 결과는 Fig. 1과 같다.</p> <p>능이의 혈전용해효소의 활성은 \( \mathrm{NaCl} \)의 농도가 \( 0.2 \mathrm{M} \)전후에서 용출 되었으며 단일 peak로 나타나 상당히 높은 정제효과를 나타내었다. 이를 더욱 정제하기위해 활성획분만을 amicon으로 농축한 후, \( 20 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{Tris-HCl} \) 완충용액 (\(\mathrm{pH}~8.0\))으로 투석하여 Sephacryl-S 200 gel filtration chroma-tography를 실시한 결과 Fig. 2와 같은 chromatogram을 얻었다.</p> <p>혈전용해효소의 활성은 획분번호 50에서 65번 사이에 나타났으나, 효소 단백이 단일 peak로 분리되지 않았으므로 활성부위만을 amicon으로 농축하고 이를 투석한 후 MonoS cation column chromatography를 실시하여 정제하였으며, 그 결과는 Fig. 3과 같았다. 능이의 혈전용해효소활성은 분획번호 14번부터 17번 사이에서 단일 peak로 나타났으며 활성획분을 모아 투석하여 정제 여부를 전기영동으로 검토해 본 결과는 Fig. 4에서와 같이 단일 band로 나타나 정제되었음을 알 수 있었다.</p> <p>정제된 효소의 분자량을 측정하기 위하여 \( 12 \% \)의 SDS-PAGE 상에 전기영동 하였으며 표준단백질의 이동거리로부터 plotting 한 결과는 Fig. 4에서 보는 바와 같이 \( 29,300 \mathrm{Da} \)정도로 추정되었다. 이는 이[14]가 능이 protease의 분자량을 \( 30,100 \mathrm{Da} \)으로 은 등이 \( 29,000 \mathrm{Da} \)으로 보고한 것과 유사한 분자량이었다. 본 연구에서 정제한 능이의혈전용해 효소는 \( 29,300 \mathrm{Da} \)의 단일 band로 나타났으며, 양은 청국장으로부터 \( 35.000 \sim 45.000 \mathrm{Da} \)의 다양한 분자량의 혈전용해효소를 확인한 바 있으며, 일본의 대표적인 발효식품인 natto에서 분리한 nattokinase의 분자량은 \( 28,000 \mathrm{Da} \)인 것으로 보고되었다. 이와 같은 사실은 식품원에 따라 다양한 분자량의 혈전용해효소가 존재하고 있음을 알 수 있다. 능이버섯의 혈전용해효소를 정제한 결과는 정제표로 나타내었다. 즉 조효소의 특이활성은 \( 4.9 \mathrm{U} / \mathrm{mg} \) protein이었으나 Mono S cation column chromatography에서는 효소의 특이활성이 \( 55.2 \mathrm{U} / \mathrm{mg} \) protein으로 조효소액에 비하여 11.26배 증가하였고, 수율은 \( 49.5 \% \)로 나타났다. 이러한 결과는 본 효소가 정제배수는 낮으나 정제가 거의 완전히 이루어진 점 등으로 미루어보아 건조버섯 중 효소의 함량이 매우 높을 것으로 사료된다.</p> <h2>효소의 특성</h2> <h3>\( \mathrm{pH} \) 안정성</h3> <p>본 효소의 \( \mathrm{pH} \)안정성을 검토해본 결과는 Fig. 6과 같았다. 즉 \( \mathrm{pH}\) 3과 4 사이의 강산성에서는 혈전용해활성이 낮았으나 \( \mathrm{pH} \)가 높이질수록 혈전용해활성이 증가하기 시작하여 알카리성 용액에서도 매우 안정된 활성을 보여주었다.</p> <p>전체적으로 \( \mathrm{pH}~5\) 이상에서는 효소의 활성이 큰 변화가 없음을 보여주었으나 \( \mathrm{pH} ~10.5\)에서 \( 0.396\)(\(\mathrm{U} / \mathrm{ml}\))이였는데 \( \mathrm{pH}~11.5 \)에서는 \( 0.089(\mathrm{U} / \mathrm{ml}) \)로 급격히 활성이 실화 하였음을 나타내었고 이는 이[14]의 연구에 의하면 \( \mathrm{pH} ~10.8\)에서 급격히 안정성을 상실하였다고 보고되고 있어 본 효소와 비슷하였다. 대부분 버섯에서 추출한 효소는 산성 또는 중성에 안정하였는데 능이에서 추출한 본효소가 알카리 안정한 것은 특이할 만한 사실이다.</p> <h3>온도의 안정성</h3> <p>본 효소의 온도 안정성을 알아보기 위해 fibrin을 기질로하여 각각의 온도에서 30분간 보존한 후, 효소의 활성을 검토한 결과는 Fig. 7과 같다, 혈전용해활성은 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)이후에서 급격히 실활하였지만, \( 80^{\circ} \mathrm{C} \)에서도 \( 25 \% \)의 상대활성을 보였다. 한편 정은 fibrin 용해균주의 분리에 관한 연구에서 조효소의 열 안정성은 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)까지 \( 100 \% \)의 활성을 유지하다가 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 거의 모든 활성을 상실하였다. 따라서 본 정제효소가 fibrin에 대해 높은 온도안정성을 나타낸다하겠다.</p> <h3>금속이온 및 저해제의 효과</h3> <p>각종 금속이온 및 저해제의 농도를 \( 5 \mathrm{mM} \)되게 첨가하여 효소활성에 미치는 영향을 검토한 결과는 Fig. 8과 같았다. 혈전용해능은 \( \mathrm{Co}^{3+} \) 이온에 의하여 \( 38 \% \) 활성이 저해되었으며, \( \mathrm{Cu}^{2+} \) 이온의 첨가는 \( 68 \% \) 활성을 저해하였다. 능이로부터 정제된 혈전용해효소에 대하여 금속이온 chelator인 EDTA와 serine protease inhibitor로 알려진 PMSF가 활성을 크게 저해하였으므로 본 효소는 금속이온을 필요로 하며 serine protease인 것으로 사료된다.</p>