고환 조직의 변화를 정량적으로 분석하기 위해 정자발생세포의 특징에 따라 분류한 곡세정관을 선별하여 각각의 세정관에서 생식세포의 수를 측정하였다. 고환을 균질화하고 혈구계산판과 광학현미경을 이용하여 총 정자두부수를 계산한다. 이를 정자세포 발생 소요 시간으로 나누어 일일 정자생성률을 계산한다. 정자배양액을 이용하여 정자의 운동성 유무를 관찰한다.
<h2>조직병리학적 검사</h2><p>고정이 완료된 우측고환은 파라핀 포매, 박절한 다음 Hematoxylin \(\&\) Eosin (H\(\&\)E) 염색을 하였고, 통상적인 조직관찰방법을 적용하여 광학현미경으로 검경하였다. 고환 조직의 변화를 정량적으로 관찰하기 위해서 각각의 곡세정관을 정자발생세포(spermatogenic cells)의 특징에 따라 14단계(stages Ⅰ \(\sim\) ⅩⅣ)로 분류하였으며, 본 시험에서는 정자발생 단계 중 Ⅱ, Ⅴ, Ⅶ 및 ⅩⅡ를 나타내는 곡세정관을 각 개체 당 2개씩 선별하여 세정관내의 발생단계별 생식세포수를 계수하였다. 고환독성평가 시 정자생성주기법의 사용은 독성 기전과 정자형성에 관한 세부적인 정보를 이해하는 데에 유용한 것으로 알려져 있다.</p><h2>고환의 정자두부수 검사</h2><p>투여개시 후 14 일째에 부검하여 적출한 좌측고환의 중량을 측정하고, 백막을 제거한 다음 \( 12 \mathrm{ml} \)의 증류수가 들어있는 튜브에 넣었다. 균질기를 이용하여 3분간 충분히 균질화한 후, 이 균질액을 초음파기를 이용하여 \( 4 \sim 7^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 초음파 처리하였다. 균질액 한 방울을 취하여 혈구계산판(hema-cytometer, Germany)에 고르게 퍼지도록 주입하고, 충분히 안정이 되도록 5분 이상 방치한 후에 광학현미경을 이용하여 200 배율로 관찰하여 고환당 총 정자두부수를 계산하였다.</p><h2>일일 정자생성률 측정</h2><p>일일 정자생성률은 고환에서 관찰된 정자두부수 즉, 균질화 및 초음파 과정에서 깨어지지 않고 계수된 step \(17 \sim 19\)의 정자세포수를 이용하여 산출하였다. 랫드에서 이 단계의 정자세포 발생에는 약 6.3일이 소요되기 때문에 고환 정자두부수에 6.3을 나누어서 고환당 일일정자생성률을 계산하였다.</p><h2>부고환의 정자수 검사</h2><p>좌측부고환 미부의 중량을 측정한 다음 \( 10 \mathrm{ml} \)의 생리식염수가 들어있는 용기에서 세절하고 균질기를 이용하여 충분히 균질화한 후, 정자두부수와 같은 방법으로 혈구계산판에서 정자수를 계수하였다.</p><h2>정자운동성 검사</h2><p>정자운동성을 관찰하기 위한 정자배양액은 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 bovine serum albumin이 들어있고 \( \mathrm{pH} 7.2\)로 조정된 Hank's balanced salt solution (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 이용하였다. 1회용 주사기를 이용하여 정관 내에 있는 정자를 수세하여 배양액에 넣고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)의 배양기에서 5분간 배양하였다. 이 정자배양액을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지된 홈이 파진 슬라이드 글라스에 놓고 커버글라스를 덮어서 현미경의 항온판(microwarm plate)에 놓은 다음 200배율로 검경하였으며, 각 개체당 200마리의 정자에 대해서 운동성의 유무를 관찰하였다.</p><h2>정자형태검사</h2><p>정관에서 얻은 정자배양액 1방울을 슬라이드 글라스상에서 \( 1 \%\) cosinY와 \(2:1\)로 잘 혼합한 다음 커버글라스를 덮어서 염색표본을 만든 후, 각 개체당 200마리의 정자에 대해서 형태학적 이상 유무를 관찰하였다.</p><h2>자료의 통계처리</h2><p>시험물질 투여군과 대조군과의 차이를 비교하기 위하여 SAS program (Statistical Analysis System Institute Inc., Version 6.12, NC, USA)을 이용하여 통계학적 분석을 실시하였다. 시험결과는 가능한 한 평균값과 표준편차로 표기하였으며, 대조군과 투여군간의 통계학적 분석은 Student t -test로 수행하였다. 통계학적 유의수준은 \( 5 \% \) 및 \( 1 \% \)에서 검정하였다.</p>