NPTII ELISA kit assay (Agdia, catalog \#PSP73000) 분석에 의해 양성반응을 나타낸 형질전환 캘러스로 부터 유도된 식물체에서 \( \mathrm { T } _ { 1 } \) 종자를 수확한 후 다시 온실에서 발아시켜 유식물체를 Southern분석을 위한 재료로 사용하였으며 Probe는 forward primer 5'-GATAATGTATTTGTTGGG-3' 와 reward primer 5'-TGTAATAGAATCATTTCC-3'를 이용하여 \( 550 \mathrm { bp } \) 크기의 PCR product apxIlA 유전자를 gel elution하여 사용하였다.
<h3>형질전환된 캘러스로부터 식물체 유도와 순화</h3> <p>8주 이상 계대배양 하면서 선발된 캘러스를 1 차 재분화 배지 (MS salts, MS vitamins, \( 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) 2,4-D, \( 3 \mathrm { mM } \) MES, 2 \( \% \) sucrose, \( 100 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) myo-inositol, \( 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) ABA, \( 150 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) asparagine, \( 0.8 \% \mathrm { BBL } \) agar, \( 100 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) cefotaxim sodium, \( 50 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) paromomycin, \( \mathrm { pH } 5.8) \)에 옮겨 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } , 16 \) 시간 광주기 조건에서 2주간 배양하면서 체세포 배를 유도하였다. 유도된 체세포 배를 다시 2차 재분화 배지 (N6 salts, Eriksson's vitamins, \( 0.5 \mathrm { mg } / \) thiamine-HC, \(6 \% \) sucrose, \( 0.625 \mathrm { g } / \mathrm { L } \) malonic acid, \( 100 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) casamino acid vitamin assay, \( 0.35 \% \) phyta gel, \( 100 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) cefotaxim sodium, \( 50 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) paromomycin, \( \mathrm { pH } 5.8 \)로 옮겨 잎 혹은 뿌리 형태를 갖는 유식물체를 얻었으며, 이후 발아배지 (MS salts, MS vitamins, \( 3 \mathrm { mM } \) MES, \( 2 \% \) maltose, \( 100 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) myo-inositol, \( 1 \% \) glucose, \( 150 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) asparagine, \( 0.5 \% \) agarose, \( 50 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) cefotaxim sodium, \( \mathrm { pH } 5.8 \))에서 완전한 식물체로 재생시켰다. 15-20일 후 유식물체들을 토양에 순화 한 후 온실에서 생육시키면서 \( \mathrm { T } _ { 1 } \) 종자를 수확하였다.</p> <h3>NPTII ELISA Kit assay</h3> <p>각 발현벡터 (pMYV611, pMYV613, pMYV616, V621, V622 및 V623)로 형질전환된 Agrobacterium과 공동 배양한 후 선발배지에서 왕성하게 자라는 캘러스 일부를 선발하여 NPTII ELISA kit assay (Agdia, catalog \#PSP73000)로 nptII유전자 발현 여부를 분석하였다. 캘러스 클론으로부터 kit에서 제공한 buffer를 이용하여 단백질을 추출한 후 antibody가 코팅된 96-well plate에 각각 분주한 후 Agdia방법에 따라 분석하였다.</p> <h3>Southern-blot analysis</h3> <p>NPTII ELISA kit assay (Agdia, catalog \#PSP73000) 분석에 의해 양성반응을 나타낸 형질전환 캘러스로 부터 유도된 식물체에서 \( \mathrm { T } _ { 1 } \) 종자를 수확한 후 다시 온실에서 발아시켜 유식물체를 Southern분석을 위한 재료로 사용하였다. 온실에서 건강하게 자라는 어린 잎 절편 약 \( 2 \mathrm { g } \) 을 채취하여 genomic DNA를 추출하였으며 (Dellaporta et al. 1983), 약 \( 10 \mu \mathrm { g } \) 의 DNA를 ECoRI 제한효소 반응액에 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 16시간 동안 반응시켜 절단한 후 \( 0.8 \% \) agarose 겔에 전기영동하였다. Agarose 겔상의 DNA 밴드를 Zeta \( { } ^ {\mathrm { R } } \)-Probe nylon membrane (Bio-Rad, catalog \#162-0196)에 옮겨 \( { } ^ { 32 } \mathrm { P } \)-dCTP (Stratagene, catalog \#300385)로 표지된 약 \( 0.55 \mathrm { kb } \) apxILA probe를 이용하여 Southern 분석하였다 (Southern 1975). Probe는 forward primer 5'-GATAATGTATTTGTTGGG-3' 와 reward primer 5'-TGTAATAGAATCATTTCC-3'를 이용하여 \( 550 \mathrm { bp } \) 크기의 PCR product apxIlA 유전자를 gel elution하여 사용하였다.</p>