경상북도 안동시 안동댐 주변에 서식하는 배추나비를 채집하여 안동대학교 비닐하우스에서 대량 사육한 후 그 유충이 5령 되었을 때 실험재료로 사용하였다. 혈림프를 추출하고 조직절편을 제거한 후 homogenation buffer \( (5 \mathrm{mM} \) Tris, \( 38 \mathrm{mM} \) Glycine, \( \mathrm{pH} \) \( 8.4 \))에서 완전히 균질화 시킨 후 원심 분리를 진행한 후에 단백질 시료로 사용하였다. 이후 항체 제조용으로 사용하기 위해 전기영동으로 확인된 \( 27 \mathrm{kd} \) 용기 특이 큐티클 단백질을 freeze-dryer에서 lyophilize 시켰다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험곤충</h2> <p>경상북도 안동시 안동댐 주위에 서식하는 배추흰나비를 채집, 동정 후 안동대학교내 비닐하우스에 재배중인 케일밭에서 배추흰나비를 대량 사육하였다. \( 5 \)령이 되었을 때 유충을 실내 실험실로 옮겨 실험재료로 사용하였다.</p> <h2>단백질 시료 추출</h2> <p>배추흰나비 유충, 용 및 성충기의 발생단계에 따라 공시충으로 부터 우선 혈림프를 추출하였으며 압화를 방지하기 위하여 소량의 phenylthiourea롤 첨가하였다. 혈림프를 추출한 후 Ringer 용역하에서 날개 큐티클, 복부 큐티를 및 인접조직인 지방체 및 epidermis를 적출하였으며 적출된 조직은 Ringer 용액으로 3-4회 세척하여 혈림프 및 기타 조직절편을 제거하였다. 이 후 이 조직들을 homogenation buffer \( (5 \mathrm{mM} \) Tris, \( 38 \mathrm{mM} \) Glycine, \( \mathrm{pH} \) \( 8.4 \))에서 완전히 균질화 시킨 후 \( 12,000 \mathrm{rpm} \)에서 \( 10 \) 분간 원심분리한 후 상등액을 각 조직에 대한 단백질 시료로 사용하였다.</p> <h2>SDS-전기영동 및 electro-elution</h2> <p>상기에서 추출된 단백질 시료는 \( 0.1 \)% SDS가 포함된 \(3 \)% stacking gel과 \(9-14 \)% gel에서 SDS-전기영동을 하였으며, 단백질시료와 함께 SDS-PAGE low molecular weight standards (phosphorylase B, MW \( 97,400 \); bovine serum albumin, MW \( 66,200 \); ovalbumin, MW \(44,699 \); carbonic anhydrase, MW \(31,000 \); soybean trypsin inhibitior, MW \( 21,500 \); lysozyme, MW \(14,400 \), Bio-Rad))을 병행 사용하였다. 전기영동을 통해 확인된 \( 27 \mathrm{kd} \) 용기 특이 큐티클 단백질은 electro-eluter(Bio-Rad)에서 단백질을 추출하였으며, SDS-PAGE 상에서 단일 band로 확인한 후 freeze-dryer에서 lyophilize 시킨 후 항체 제조용으로 사용하였다.</p> <h2>2차원 전기영동</h2> <p>2차원 전기영동은 O' Farrell의 방법을 이용하여 실시하였다. 우선 isoelectric focusing은 Biolyte (Bio-Rad) \( \mathrm{pH} \) \( 4-8 \) 과 \( \mathrm{pH} \mathrm{3-10} \) 을 \( 4:1 \)로 혼합한 후 \( 4 \% \) urea gel에서 등전점에 따라 단백질을 분리하였으며 상기의 SDS-PAGE법에 따라 2차원적으로 분리하여 나타난 spot를 분석하였다.</p> <h2>항체제조</h2> <p>상기에서 부분적으로 정제된 \( 27 \mathrm{kd} \) 용기 특이 큐티클 단백질에 Freund adjuvant를 각기 동량 \( (0.5 \mathrm{~m} \ell) \) 혼합하여 토끼에 일주일마다 한번씩 \( 3 \)주간 피부하 주사를 하였다. 마지막 주사 후 \( 10 \)일 후에 다시 한번 booster injection하여 \(10 \)일 경과 후에 토끼의 marginal ear vein 혹은 심장에서 혈액을 채취하여 혈장만을 취하였다. 이 혈장을 ammonium sulfate로 \( 40 \% \) 되게 포화시켜 이의 침전물을 \(2\)일간 dialysis를 하여 큐티클 단백질에 대한 항체로 이용하였다.</p> <h2>Western blot</h2> <p>각 조직에서 추출된 단백질 시료를 \(9-14\% \) gradient SDS-PAGE상에서 전개시킨 후 이를 다시 2차적으로 PVDF paper에 transblot하였다. 이 membrane을 1차직으로 \( 27 \mathrm{kd} \) 용기 특이 큐티클 단백질의 항체로 처리한 후 Bio-Rad사의 Immune-blot assay kit를 사용하여 Hawkes 등의 방법이나 Bio-Rad사의 protocol에 따라 goat anti-rabbit \( \mathrm{IgG}(\mathrm{h}+\mathrm{L}) \) 로 처리한 후 발색하였다.</p> <h2>Autoradiography</h2> <p>종령 말기에 \( 5 \mu \mathrm{Ci} \) 의 \( \left[4,5-{ }^{3} \mathrm{H}(\mathrm{N})\right] \)-leucine (NEN)을 혈강에 주사하여 중령말, 용기 및 성충기의 발생시기에 따라 큐티클, 지방체 및 epidermis 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 \(9-14\% \) SDS-PAGE른 실시하였으며 PPO-DMSO 혼합액 혹은 Enhance \( ^{\mathrm{TM}}\) (NEN)로 처리한 후 autoradiography를 실시하였다.</p>