항산화 효소의 활성을 측정함에 있어 superoxide dismutase의 활성과 catalase의 활성을 분석하였다.
<h2>재료 및 방법</h2> <h3>실험 재료</h3> <p>본 실험에 사용한 호랑나비(Papilio xuthus)는 대구광역시 수성구 매호동 금호강 인근에서 여름형 호랑나비 유충을 채집하여 동정하였다. 이 공시충은 자연 상태와 거의 유사한 조건(광주기 16L : 8D , 온도 \( 27 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 75 \pm 5 \% \) r.h.)에서 탱자나무(Poncirus trifoliata) 잎을 식초로 사육하였고, 발생시기에 따라 종령기(5L), 전용기(PP), 용화 직후(P0), 용화 1일(P1), 용화 3 일(P3), 용화 5 일(P5), 용화 7 일(P7)의 간격으로 구분하여 시료를 채취하였다.</p> <h3>시료의 추출</h3> <p>발생단계에 따라 공시충으로 부터 혈림프는 미세한 침으로 공시충의 전지을 찌른 후 몸통을 눌러 뽑아내었으며, 암화를 방지하기 위해 소량의 phenylthiourea를 첨가하여 10,000 RPM 에서 10 분간 원심분리 후 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다. 지방체,표피, 큐티클 및 중장 조직은 Ringer 용액하에서 적출하였다.이 조직은 homogenation buffer (5 mM tris, \( 38 \mathrm{mM} \) glycine, \( \mathrm{pH} \mathrm{8.4)} \) 하에서 완전히 균질화 시킨 후 \( 15,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심분리를 한 후 지질층을 제외한 상등액만을 모아 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다.</p> <h2>항산화효소의 활성 측정</h2> <h3>Superoxide dismutase(SOD)</h3> <p>superoxide dismutase의 활성은 \( 50 \mathrm{mM} \) potassium phos-phate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 7.8), \( 0.1 \mathrm{M} \) cytochrome \( \mathrm{C}, 50 \mathrm{mM} \) xan-thine, \( 0.1 \mathrm{mM} \) EDTA 및 상기 조직의 추출액이 포함된 용액을 cytochrome C 에서 예치한 다음 xanthine oxidase를 첨가하여 반응 을 개시하였다[17]. 효소의 활성은 \( 550 \mathrm{~nm} \) 에서 10 초 단위로 150 초간 흡광도를 측정하였으며, xanthine oxidase 첨가량은 효소액을 함유하지 않은 반응액의 흡광도 흡수가 분당 \( 0.025 \)가 되도록 조절하였다. 효소의 활성은 cytochrome C의 환원을 \( 50 \% \) 억제하는 양을 1 unit로 하여 unit/mg protein/min 으로 나타내었다.</p> <h3>Catalase CAT</h3> <p>catalase의 활성은 \( 50 \mathrm{mM} \) phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 7.0) \( 2 \mathrm{ml} \) 와 시료액 \( 20 \mu \) 를 취하고 기질로 \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 용액 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 가하여 잘 혼합한 후 \( 240 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도의 변화를 2 분간 측정하였다[1]. 대조실험으로는 기질인 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 용액 대신에 50\( \mathrm{mM} \) phosphate buffer (pH 7.0)을 가하고 위와 동일한 방법으로 흡광도의 변화를 측정하였다. CAT의 활성은 1 분 동안에 \( 1 \mu \mathrm{mol} \) 의 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 를 분해하는 효소의 양을 1 unit로 하였다.</p>