글루타민 결핍 조건에서 배양된 PC3 세포에서 apoptosis 유발이 관찰되진 않았지만, 증식 억제는 발생했기 때문에 세포주기에 어떤 영향을 주었을 것으로 예상되어 배양된 세포들을 대상으로 세포주기 분포도 변화를 조사하였고, 그 결과 글루타민 결핍 시간 증가에 따라 세포주기 양성조절 인자 cyclin A, cyclin B1 발현이 전사, 번역 수준에서 현저히 감소된 것을 관찰할 수 있었다. 또한, Cdc2의 발현은 전사, 번역 수준에서 억제되었으나, Cdc2 인산화는 오히려 증가하였고, p21 발현 또한 증가하였는데, PC3는 p53이 존재하지 않는 세포인바, 글루타민 결핍에 의한 p21의 발현 증가는 p53 비의존적이라는 사실도 알 수 있었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <p>Fig. 1A 및 B의 결과에서 알 수 있듯이 글루타민이 결핍된 배지에서 배양된 PC3 세포는 배양된 시간이 증가할수록 세포의 밀도 감소와 함께 생존율의 감소가 관찰되었는데, 48 시간 및 72 시간 후에는 각각 30% 및 47% 정도의 생존율 억제를 보였다. 이러한 글루타민 결핍에 의한 PC3 세포의 증식억제가 apoptosis 유도와 연관성이 있는지의 여부를 DAPI 염색을 통하여 관찰해 본 결과는 Fig. 1C에 나타낸 바와 같이, 정상조건에서 배양된 PC3 세포에서 뿐만 아니라 글루타민이 결핍된 조건에서 배양된 PC3 세포에서도 apoptosis가 일어났을 경우 관찰되는 염색질의 응축에 의한 apoptotic body의 형성은 관찰되지 않았다. 이는 A549 폐암세포나, U937 또는 HL-60 혈구암세포에서와는 다소 상반된 결과이며, 특히 글루타민 결핍에 의한 apoptosis가 c-myc 의존적으로 일어난다는 점과 비교할 때, PC3 세포는 c-myc의 발현이 정상적으로 이루어지는 세포인 점을 고려하여 apoptosis와의 연계성에 관해서는 추가적인 연구가 필요한 부분이라고 생각된다.</p> <p>비록 글루타민 결핍 조건에서 배양된 PC3 세포에서 apop-tosis 유발이 관찰되지는 않았지만, PC3 세포의 증식이 억제되었기에 이는 아마도 세포주기 진행에 어떤 영향을 미쳤을 것으로 기대되어 동일 조건에서 배양된 세포들을 대상으로 세포주기 분포도 변화를 조사한 결과는 Fig. 1D에 나타낸 바와 같다. 결과에서 알 수 있듯이 글루타민이 결핍된 조건에서 배양된 시간이 증가 할수록 G2/M기에 해당되는 세포의 빈도가 매우 중가하였음을 알 수 있었는데, 정상 조건에서 배양된 PC3 세포의 G2 /M기에 해당되는 세포의 빈도가 약 19.56% 정도임에 비하여 48 시간 및 72 시간 후에는 각각 29.2% 및 32.2% 이상으로 증가되었으며, G1기 및 S기에 해당되는 세포의 빈도는 상대적으로 감소되었다. 이는 글루타민 결핍에 의한 PC3 세포의 증식 억제가 G2/M 세포주기 억제를 통해 이루 어짐을 의미하는 결과이다. Gaglio et al. 에 의하면 글루타민 결핍에 따른 증식억제가 S기 arrest 유발과 연관성이 있다 고 하였으나, 그들이 사용한 세포는 종양조직에서 유래한 암세포가 아니라 K-ras transformed fibroblast였으며, Fu et al. 의 결과에서는 글루타민을 포함한 특별한 종류의 아미노산들이 결핍될 경우 G1 arrest의 유발 가능성을 보여주었으나 글루타민 단독 결핍에 의한 본 연구의 결과와는 직접적인 비교가 어려웠다.</p> <p>이상의 결과에서 글루타민 결핍에 의한 PC3 세포의 증식억제는 G2/M arrest와 연관성이 있을 가능성을 관찰하였기에, 이에 관한 기전 연구의 실시를 위하여 세포주기 G2기에서 M기로의 전이에 중요한 조절인자들의 발현 변화를 전사 및 번역 수준에서 조사하였다. PC3 세포에서 글루타민 결핍에 의한 세포주기 교란의 시기인 G2/M기는 G1기와 함께 세포주기 진행에 중요한 check point로 세포분열이 시작되기 전 DNA 손상에 대한 복구를 시행하여 세포증식과 분열에 대한 문제를 해결하는 시기이다. 그리고 세포주기 각각의 단계는 cyclin, Cdk 및 Cdk 억제자의 상호 작용에 의하여 조절되는데, 특히 S기에서 M기로의 진입과 G2/M기 전이에는 cyclin A 및 cyclin B의 발현 증가와 cyclin-dependent kinase (Cdk 2) 및 Cdc2의 인산화가 요구되는데, Cdc2의 인산화는 Cdc25c의 탈인산화 과정과 Wee1의 인산화를 통하여 조절된다. 또한 check-point kinases (Chks)는 G2/M 조절에 중요한 ataxia telangiectasia-mutated (ATM) 및 Rad3-related (ATR)에 의하여 인산화가 조절되는 serine/threonine kinases로서 그들의 인산화로 인하여 Cdc 25 phosphatases의 기능을 억제하는 것 으로 알려져 있다. Cdc25의 인산화 억제는 Cdk2 및 Cdc2의 활성을 유발한다. 또한 Chks와 함께 G2/M checkpoint 의 중요한 조절인자인 Cdc2의 인산화는 G2 후반기 동안 Wee1 kinase에 의하여 이루어지며, Cdc25 tyrosine phosphatase에 의하여 탈인산화되면서 M기로의 진입이 이루어진다. 본 연구의 결과에 의하면 글루타민 결핍 시간의 증가에 따라 세포주기 양성조절 인자인 cyclin A 및 cyclin B1의 발현이 전사 및 번역 수준에서 현저히 감소되었으나, Cdk2의 발현은 큰 변화가 없었다. 그러나 흥미롭게도 글루타민 결핍에 따라 Cdc2의 발현 자체는 전사 및 번역수준에서 억제되었으나 Cdc2 단백질의 인산화는 오히려 시간의 경과에 따라 다소 증 가되었다. 뿐만 아니라 Cdk 저해제이면서 광범위한 세포주기 진행의 음성조절인자에 해당되는 p21(WAF1/CIP1)의 발현이 또한 증가되었는데, 특히 PC3 세포는 정상적인 종양 억제인자 p53이 존제하지 않는 세포이기 때문에 글루타민 결핍에 의한 p21의 발현 증가는 p53 비의존적임을 알 수 있었다(Fig. 2). 아울러 PC3 세포에서 글루타민 결핍 시간의 증가에 따라 Chk1 및 Chk2의 인산화가 증가되었으며, 이와 동반되어 Cdc25c 의 인산화는 억제되었으며, Cdc25c의 인산화 억제는 그들 단백질들의 발현 수준 억제와 유사한 경향을 보여주었으며, 글루타민 결핍 초기시기에 Wee1의 발현은 증가되었으며, 글루타민 결핍 시간의 증가에 따라 점차 감소되는 경향을 보여주었다(Fig. 3).</p>