세계적인 주요 사료작물인 옥수수에서 돼지 흉막폐렴의 항원유전자가 발현되는 형질전환체를 개발하는 것은 돼지 흉막폐렴을 예방하고, 국내 양돈산업에 있어서도 가치 있는 일이다. Agrobacterium과 공동배양한 Hill genotype의 type II 옥수수 배발생 캘러스로부터 2,4-D와 paromomycin항생제가 첨가된 선발배지에서 증식하여 putative transgenic 캘러스를 얻고, 1차 재분화 배지에 읆겨 16시간 광주기 조건으로 배양하여 완전한 유식물체로 분화시키는 방법이 구축되었다. 이는 미숙배를 이용하는 것보다 편리하고, 계절적 요인으로 실험적 제한을 받지 않고 연속적인 실험을 수행할 수 있는 효과적인 방법으로 사료되며, 뿐만 아니라 형질전환 가능성이 있는 클론의 경우 매우 빠른 생장속도를 보여주어 기 보고의 연구 결과와 일치되어 안정적으로 형질전환 식물체를 얻을 수 있는 효과적인 방법으로 사료된다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <p>세계적으로 주요 사료작물인 옥수수에서 돼지 흉막폐렴의 항원유전자가 발현되는 형질전환체를 개발하는 것은 돼지 흉막폐렴을 예방할 수 있을 뿐 아니라 국내 양돈산업에 있어서도 가치 있는 일이라 할 수 있다. Agrobacterium과 공동배양 한 Hill genotype의 type II 옥수수 배발생 캘러스는 delay배지를 거쳐 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 2,4-D와 \( 100 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) paromomycin항생제가 첨가된 선발배지에서 2주 간경으로 압 조건에서 계대 배양 하면서 선발한 결과 약 6~8주 후부터 육안으로도 비교될 만큼 생장속도가 빠른 캘러스가 선발되었으며, 이러한 캘러스를 putative transgenic 캘러스로 선정하여 3달이상 층분하게 증식시켰다. 증식된 putative transgenic 캘러스의 일부를 1차 재분화 배지에 읆겨 16시간 광주기 조건으로 2주간 배양하면서 부드러운 배발생캘러스 표면에서 흰색의 단단한 체세포배가 형성되는 것을 관찰 하였고, 이러한 체세포배를 분리하여 2차 재분화 배지와 발아배지에 순차적으로 배양하면서 완전한 유식물체로 분화시켰다. 유식물체를 토양에 옮겨 5~6일간 배양실에서 충분하게 적응시킨 후 온실로 옮겨 점차 순화시켰고, 이후 식물체는 온실에서 생육시키면서 후대종자 \( \left(\mathrm{T}_{1}\right) \) 종자를 얻었다.</p> <p>옥수수의 식물체 재분화 시스템 및 형질전환 연구는 일반적으로 미숙배를 이용하고 있으나, 미숙배를 생산하기 위해서는 많은 노동력과 시간 그리고 계절적 장애 요인 등의 제한을 받고 있기 때문에 그러한 단점을 극복하기 위해 최근에 type II형태의 배발생캘러스를 (Armstrong et al. 1991) 이용한 새로운 형질전환 방법이 구축되었다(Kim et al. 2009). 또한 neomycin phosphotransferase II효소는 배지에 첨가된 paromomycin 항생제의 작용을 불활성화시킴으로서 형질전환세포를 생존할 수 있게 한다 (Roa-Rodriguez and Nottenburg 1999). 특히 단자엽식물인 옥수수의 경우 다른 선발마커에 비해 매우 효과적인 선발마커로 이미 확인 되었다 (Cho et al. 2005). 본 연구에서도 미숙배의 경우보다 type II배발생캘러스의 경우 증식 및 유지가 매우 편리하였으며, 특히 계절적 요인으로 실험적 제한을 받지 않고 연속적인 실험을 수행할 수 있었다. 그뿐만 아니라 선발제로서 paromomycin이 첨가된 배지에서 Agrobacterium과 공동배양된 type II 배발생캘러스 클론은 비 형질전환세포와 형질전환 세포 간에 뚜렷하게 구분되었으며, 특히 형질전환 가능성이 있는 클론의 경우 매우 빠른 생장속도를 보여 줌으로서 기 보고의 연구 결과와 일치되어 안정적으로 형질전환 식물체를 얻을 수 있는 효과적인 방법으로 사료된다.</p> <p>각 벡터 즉 pMYV611, pMYV613, pMYV616, V621, V622 및 V623의 경우 각각 4,120 개, 5,959 개, 7,581개, 52,329 개, 48,948 개 및 56,188 개의 캘러스 클론을 Agrobacterium 과 공동 배양한 후 4주 후 선발배지에서 선발한 putative transgenic 캘러스를 선발하였고, 이 중 무작위로 선발된 캘러스를 대상으로 NPTII ELISA kit assay를 수행한 결과 양성대조군 수준에서의 반응 정도를 갖는 클론은 pMYV611벡터의 경 우 \( 3.0 \%\), pMYV613 은 \( 4.4 \%\), pMYV 616은 \(2.3\%\), V621은 \(2.4\%\), V622은 \( 2.3 \% \) 및 V 623 는 \( 2.5 \% \) 수준으로 벡터에 따라서 큰 차이가 없이 항체결합 양성반응을 보여 주었으며, 반면 비형질전환 세포의 경우 음성반응으로 나타났다. 또한 NPTII ELISA kit assay법에 의해 1 차 선별을 통해 얻은 형질전환 캘러스 클론을 8주 이상 2주 간격으로 계대배양 하면서 선발배지에서 완전하게 적응된 캘러스 클론을 다시 선발하였다. 최종적으로 pMYV611벡터에서 3개 캘러스 클론 \( (0.07 \%) \), pMYV61벡터에서 4개 \((0.07\%)\), pMYV616에서 2개 \((0.03\%)\), V621에서 51개 \( (0.1 \%)\), V622에서 72개 \( (0.15 \%) \) 및 V623에서 102개 \( (0.18 \%) \) 를 각각 얻어 선발과정에서 많은 수의 클론이 도태되는 것으로 또한 알 수 있었다. 또한 각 벡터별로 선발된 캘러스 클론으로부터 많은 식물체를 얻을 수 있었으며, 이 중 약 125 개체의 형질 전환체의 잎으로부터 genomic DNA를 분리하여 Southern blot을 수행한 결과, pMVY613 벡터가 도입된 2개체와 V623이 도입된 2개체에서 apxILA유전자의 도입을 약한 밴드형태로 확인할 수 있었다.</p> <p>각 발현벡터의 선발마커 유전자인 nptII유전자가 식물체의 genomic DNA에 정상적으로 도입되어 발현될 경우 neomycin phosphotransferase II효소를 생산할 수 있다. 이러한 효소의 발현여부를 확인하기 위해 개발된 NPTII ELISA kit assay는 매우 편리하며, 형질전환 실험에서 유전자 발현 정도 및 1차 선별을 통한 형질전환세포 선발에 많이 이용된다 (Curtis et al. 2000). 본 연구에서도 캘러스 클론의 선발과정에서 양성 대조군의 발현 정도와 비교 함으로서 형질전환 캘러스 클론을 비형질전환 캘러스 클론과 쉽게 구분 할 수 있는 효과적인 방법입을 알 수 있었지만, 이후 양성반응을 보인 캘러스를 8주 이상 배양 할 경우 일부에서 증식되지 봇하고 선발배지에서 도태되는 비율이 상당히 높게 나타나는 것으로 보아 항생제의 농도가 높아서 나타나는 현상인지 아니면 다른 요인에 의한 것인지 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다. 또한 선발된 각 캘러스 클론을 1차, 2차 및 발아배지 옮겨 많은 식물체를 얻을 수 있었으며, pMYV611벡터를 제외하고 모든 벡터에서 100개체 이상의 형질전환체를 얻을 수 있었다. 이증 Southern 분석을 통해 유전자 도입은 단지 4 개체에서 확인 됨으로서 매우 낮은 빈도를 보여주었다. 이러한 결과는 Southern분석에 대한 실험 방법상의 문제인 것으로 판단되어 형질전환체에 대한 분자 수준에서의 지속적인 분석을 수행하고 있다. 향후 본 연구를 통해 개발된 돼지 흉막폐렴 항원유전자가 도입된 옥수수 형질 전환체는 쥐와 돼지를 대상으로 임상실험을 수행하기 위하여 \( \mathrm{T}_{2} \)종자를 대량으로 증식하고 있다.</p> <h1>적 요</h1> <p>돼지 흉막폐렴백신을 개발하기 위해 옥수수 HiIl genotype 으로부터 유도한 type II형의 배발생캘러스를 식물발현벡터 pMYV611, pMYV613, pMYV616, V621, V622 및 V623로 형질전환시킨 Agrobacterium (C58C1)과 공동배양 하였다. 이들 식물발현벡터는 paromomycin 항생제 저항 유전자인 NPTII 선발마커와 표적 유전자로서 흉막폐렴균의 여러 가지 혈청을 생산하는 apxIIA 유전자로 재조합하여 구축하였다. 식물발현벡터 pMYV611, pMYV613, pMYV616, V621, V622 및 V623의 경우 각각 4,120개, 5,959개, 7,581개, 52,329 개, 48,948 개 및 56,188 개의 캘러스 클론을 Agrobacterium 과 공동한 후 NPTII assay kit에 의해 nptII 유전자의 발현빈도를 조사한 결과 각 벡터별로 2.3-4.4\(\%\)의 캘러스 클론에서 항체결합 양성반응을 보였고, 이들 중 최종적으로 선발된 형질전환 캘러스 클론은 pMYV611에서 3개 \( (0.07 \%) \), pMYV613에서 4개 \( (0.07 \%) \), pMYV616에서 2개 \( (0.02 \%) \), V621에서 51개 \( (0.1 \%), V622에서 72개 \( (0.15 \%) \) 및 V623에서 102개 \( (0.18 \%) \) 를 각각 얻었다. 형질전환된 캘러스 클론으로부터 재분화된 식물체에서 유전자 도입여부를 Southern 분석으로 통해 확인한 결과 pMYV613에서 2개 식물체 및 V623에서 얻은 2개 식물체에서 각각 확인되었다.</p>