Southern blotting 분석을 위해 담배의 total genomic DNA를 분리하고, phenol을 이용하여 순수한 DNA만을 모은다. blotting 을 위해 gel을 멸균수로 씻어 낸 후 \( 0.25 \mathrm { ~N } \mathrm { HCl } \) 에 담구어 20분간 rocker로 흔들어 주어 DNA를 depurination 하고, 이후 Hybridization 과정을 끝낸 뒤 membrane을 \( 2 \times \mathrm { SSC } \), \(0.1 \% \) SDS로 20분간 2회 세척하고, \( 0.2 \times \mathrm { SSC } \), \(0.1 \% \) SDS로 20분간 2회 세척하여 X-ray 필름에 1주일간 expose시켰다.
<h2>Southern blotting 분석</h2> <p>Southern blotting 분석을 위해 담배의 total genomic DNA를 분리한다. 담배 잎 조직을 약 \( 0.5 \mathrm { ~g } \) 을 채취하여, 액체질소 하에서 막자사발을 이용하여 미세하게 분쇄한 다음 여기에 조직이 녹지 않게 \( 10 \mathrm { ml } \) 의 extraction buffer ( \( 100 \mathrm { mM } \) Tris-Cl/ \( \mathrm { pH } 8.0 \)/, \( 50 \mathrm { mM } \) EDTA / \( \mathrm { pH } 8.0 \)/, \( 50 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { NaCl } \), \(10 \mathrm { mM } \) 2-mercaptoethanol)를 넣었다. \( 20 \% \) SDS \( 1 \mathrm { ml } \) 을 첨가하고 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) water bath에 10분간 반응시켰다. SDS와 부서지지 않은 조직을 분리하기 위하여, \( 5 \mathrm { M } \) potassium acetate (salt)를 넣어서 얼음에 20분간 처리 하였다. \( 12,000 \mathrm { rpm } \) 으로 15분간 초고속 원심분리한 후, Miracloth filter를 이용하여 상등액을 걸러 내었다. 여기에 \( 10 \mathrm { ml } \) 의 isopropanol을 더 첨가하여 영하 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30분간 반응시켰다. 다시 원심분리하여 DNA pellet을 모은다. 모아진 pellet을 TE buffer ( \( 50 \mathrm { mM } \) Tris-Cl, \( 10 \mathrm { mM } \) EDTA) \( 700 \mathrm { ml } \) 에 녹이고 이에 RNA를 제거하기 위해 RNase를 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 시간 처리한다. 같은 양의 phenol을 이용하여 순수한 DNA만을 모은다. Phenol 처리는 3회 반복한 다음 2 배의 \( 100 \% \) ethanol로 pellet을 세척해 주었다. 그런 다음 \( 70 \% \) ethanol로 세척을 1회 반복하고 DNA pellet을 완전히 말린다. 잘 말린 DNA pellet을 TE buffer로 녹이고 제한 효소를 처리한다. 제한 효소 Hind Ⅲ, \( P_ { s t } \mathrm { I } \) 으로 절단한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 12 시간동안 충분히 DNA를 반응시켰다. 이때 사용되는 제한 효소는 DNA양의 2 배가 되는 unit을 사용하였고 \( 0.8 \% \) agarose gel에서 10 시간 전기영동 하였다. blotting 을 위해, gel을 멸균수로 씻어 낸 후 \( 0.25 \mathrm { ~N } \mathrm { HCl } \) 에 담구어 20분간 rocker로 흔들어 주어 DNA를 depurination 하였다. 다음으로 denaturation buffer ( \( 1.5 \mathrm { M } ~ \mathrm { NaCl } \), \(0.5 \mathrm { M } ~ \mathrm { NaOH } \) )에 30분간 담구어 gel을 denaturation 시켰으며, neu-tralization buffer ( \(1.5 \mathrm { M } ~ \mathrm { NaCl } \), \(0.5 \mathrm { M } \) Tris-HCl / \( \mathrm { pH } 7.4 \) /, \(1 \mathrm { mM } \) EDTA)에서 30분간 두어 neutralization 시켰다. 처리한 gel은 blotting buffer ( \(20 \times \mathrm { SSC } \))로 씻어 낸 후 semi-dry elec-troblotting units (V10-SDB, SCIE-PLAS)을 이용하여 nylon membrane (Hybond \( \mathrm { N } + \), Amersham)에 약 6시간동안 trans-fer시켰다. Transfer가 끝난 membrane은 UV crosslink시켰다. Probe로 사용할 DNA 는 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5분간 denaturation 시킨 후 얼음에 3분간 quick chilling 하였다. \( \left [ \mathrm { a } ^ { 32 } \mathrm { P } \right ] \mathrm { dCTP } \) la-belling은 Random Priming DNA labelling Kit (Amersham)를 사용하여 probe률 제작하였다. Hybridization은 Denharts hybrid solution을 사용하여 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2 시간 prehybridi-zation하였고 probe를 첨가하여 12시간동안 hybridization 시켰다. Hybridization이 끝난 후 membrane을 \( 2 \times \mathrm { SSC } \), \(0.1 \% \) SDS로 20분간 2회 세척하고, \( 0.2 \times \mathrm { SSC } \), \(0.1 \% \) SDS로 20분간 2회 세척하여 X-ray 필름에 1주일간 expose시켰다.</p>