본 논문에서는 새 배지의 첨가 시 첨가 횟수가 배의 생산에 미치는 영향을 조사하였으며, 새 배지의 첨가 시 첨가 횟수가 증가할수록 배의 발생은 감소하나 발생한 배의 발달은 좋아지는 것을 확인하였다. 결과를 바탕으로 배지 내에는 division factor가 있다는 것을 파악하였다. 추가로 액체배양이 아닌 2층배양이 배의 생산에 미치는 영향을 분석하였느느데, 2층배지 사용 시 자엽배의 발생이 많았으며 ELS들도 비교적 길이가 김을 확인하였다.
<h2>새 배지의 첨가 횟수가 배의 생산에 미치는 영향</h2><p>새 배지의 첨가 시 첨가 횟수가 배의 생산에 미치는 영향을 조사하기 위해 전처리가 끝난 소포자를 배양배지에 치상한 후 동량의 새 배지를 1∼3회 첨가하여 배양 4주 후 배의 발생 및 발달을 조사하였다. 한 개의 배양접시에서 발생한 전체 배의 수는 1회 첨가 시에는 104.6개인데 비해 2회 및 3회 첨가 시에는 각각 59.5개와 48.1개로 첨가 횟수가 많아질수록 감소하였으며 3회 첨가 시에는 1회 첨가 시에 비해 약 1/2 이하로 감소하였다.</p><p>배의 발달은 첨가 횟수가 증가할수록 좋아져서 배축이 발달한 배와 자엽배의 수가 증가하였다. 1회 첨가 시 발생한 배는 구형배, 심장형 배 또는 이들 배들이 서로 붙어있는 ELS가 많았으며 자엽배의 발생이 매우 적었다. 이에 비해 2회 또는 3회 첨가 시 발생한 배는 1회 첨가 시에 비해 배축이 길어졌으며, 자엽배의 발생도 1회 첨가 시 0.6개인 데 비해 2회와 3회 첨가 시에는 각각 2.9개와 3.2개로 크게 증가하였다. 따라서 배양 후 새 배지의 첨가 시 첨가 횟수가 증가할수록 배의 발생은 감소하나 발생한 배의 발달은 좋아지는 것으로 나타났다.</p><p>유채 (Brassica napus L. cv. Topas)의 소포자 배양 시 feeder culture를 하는 경우 배의 생산이 10배나 증가하며, 저밀도 \( ( 3,000,\sim4,000/ \mathrm{ml}) \) 배양 시 배양 소포자의 밀도가 \( 30,000\sim40,000 / \mathrm{ml} \)인 상태에서 1일 간 배양한 배지를 conditioned medium으로 사용하면 배의 생산이 3배나 증가한다. 이와 같은 사실들은 배양에 사용된 배지 내에는 division factor가 있다는 것을 의미한다. 본 연구 결과 배지 첨가횟수가 많아질수록 배의 발생이 감소하였으며 배의 질은 좋아졌는데 이와 같이 배의 발생이 감소한 것은 배지 내 division factor가 지나치게 희석되었기 때문이며, 배의 질이 좋아진 것은 배의 수가 적어 발생한 배들 간에 양분의 경쟁이 감소하였기 때문인 것으로 생각된다. 실제로 고추를 비롯하여 많은 식물들의 경우 배의 수가 감소하면 배의 질은 좋아진다.</p><h2>2층배양 시 첨가하는 새 배지의 양이 배의 생산에 미치는 영향</h2><p>첨가하는 새 배지의 양이 배의 생산에 미치는 영향을 조사하기 위해 액체배양이 아닌 2층배양을 하였으며 고체 배지 위에 소포자 현탁액을 \( 1.5 \mathrm{ml} \) 치상한 1일 후에 새 배지를 1.5, 2 및 \( 3\mathrm{ml} \) 첨가하여 4주간 배양한 후 배의 발생 및 발달을 조사하였다. 1개의 배양접시에서 발생한 배의 전체 수는 새 배지를 \( 1.5 \mathrm{ml} \) 첨가한 경우 27.8개로 가장 많았으며 \( 2 \mathrm{ml} \) 과 \( 3 \mathrm{ml} \) 첨가 시에는 각각 20.2개와 20.3개로 \( 1.5 \mathrm{ml} \) 첨가 시에 비해 감소하였다. 첨가배지가 \( 2 \mathrm{ml} \)과 \( 3 \mathrm{ml} \)인 경우 배의 발생에 큰 차이가 없었다.</p><p>자엽배의 발생은 새 배지를 \( 1.5 \mathrm{ml} \) 첨가한 경우에 15.2개로 가장 많았으며 \( 2 \mathrm{ml} \) 과 \( 3 \mathrm{ml} \) 첨가 시에는 각각 12.0개와 12.8개로 다소 감소하였다. 액체배지를 사용한 실험들에서와는 달리 2층배지 사용 시 자엽배의 발생이 많았으며 ELS들도 비교적 길이가 길었다. 본 실험 결과 배의 발생과 발달에 적합한 첨가 배지의 양은 치상 당시와 동일한 \( 1.5 \mathrm{ml} \)이며, 액체배지 사용에 비해 고체배지 사용 시에 배의 발달이 좋은 것으로 나타났다.</p><p>소포자배를 생산하기 위한 약이나 소포자 배양 시 고체배지, 액체배지, ficoll을 첨가한 액체배지, 또는 2층배지 등과 같이 물리적 상태가 다른 다양한 배지들이 사용되고 있는데 배지의 조성뿐만 아니라 사용한 배지의 물리적 상태에 따라서도 배의 발생과 발달이 달라지는 것으로 알려져 있다. 고추에서도 약배양과 shed-microspore culture 시 2층배지를 사용하여 다수의 배와 식물체를 획득하는데 성공하였다. 그러나 소포자 배양 시에는 2층배지를 사용한 경우 다핵체와 소수의 다세포체만 발생하였을 뿐 배가 발생하지 않았다. 또 고추의 소포자 배양에 성공한 Kim 등이나 Lantos 등은 액체배지를 사용하였다. 본 연구에서 액체배지와 2층배지를 사용한 결과 사용한 배지 모두에서 다수의 배를 획득하는데 성공하였다. 또 배의 발생은 감소하였으나 발생한 배의 질이 크게 좋아졌으며 자엽배의 발생이 많았다. 따라서 본 연구에서 사용한 소포자 배양의 효율이 비교적 높은 것으로 밝혀졌으며, 앞으로 배의 발생에 적합한 배양조건을 밝힘으로서 액체배양이 아닌 2층배양을 통해서 다수의 정상 자엽배를 생산 할 수 있을 것으로 생각된다.</p><p>본 연구 결과 첨가하는 배지의 양이 많아질수록 배의 발생이 감소하였을 뿐만 아니라 자엽배의 발생 비율도 감소하는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 액체배양 시 배지 첨가횟수가 많아질수록 배의 생산이 감소하였던 것과 같이 첨가하는 배지의 양이 많아질수록 치상 밀도가 최적 밀도 이하로 감소하게 되며 이로 인해 배지 내 division factor의 농도가 지나치게 낮아지게 되기 때문인 것으로 생각된다.</p>