\( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{l}\) 이상의 프로판올에서 세포성장이 급격히 저해되는 야생주 W3110에 비해서 내성주 P19의 경우 상대적으로 높은 프로판올내성을 가즌다. 따라서 시료간에 RNA 발현의 유사성을 비교하기 위해서 Pair-wise scatter plots 한 결과 각각 균주에서 프로판올 첨가에 따른 유전자의 발현 비율이 많이 변화하였다. 이는 야생주와 변이주 모두 프로판올 첨가에 따라 스트레스에 의해 유전자들의 발현이 변화된 것을 의미한다. 프로판올 무처리한 변이주와 야생주 사이의 RNA발현, 그리고 프로판올을 처리한 변이주와 야생주에서의 RNA 발현을 비교한 결과 야생주와 내성주 모두 heat shock response 관련 유전자는 발현이 크게 증가하였고, ribosome 생합성에 필요한 유전자들은 발현이 크게 저하되어 세포의 성장이 저하되는 것을 알 수 있었다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>프로판올 첨가에 따른 전체 전사체 비교분석 및 해석</h2><h3>세포의 프로판올 내성도, 세포배양 및 RNA 정제:</h3><p>야생주인 E.coli W3110은 \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{l}\) 이상의 프로판올에서 세포의 성장이 급격히 저해되며 \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{l}\) 이상에서는 거의 완전히 정지된다. 반면 프로판올 내성주 P19의 경우, W3110과 비교하여 상대적으로 높은 프로판올 내성을 보여주었다. 또한, 균을 배양하면서 대수기 중간단계인 OD 0.7 정도에서 프로판올을 첨가하면, 두 균의 세포 성장이 저해됨을 알 수 있으며, P19보다 W3110이 더 프로판올에 민감하게 세포의 성장이 저해됨을 알 수 있었다. 두 균주에 대한 프로판올 첨가에 의한 초기 전체 유전자들의 발현을 분석하기 위해, OD 0.7에서 프로판올을 첨가한 다음 10분 후에 RNA를 정제하였다. 정제한 RNA 시료의 흡광도 비 \( \left(\mathrm{A}_{260 / 280}\right) \) 는 2.1로 기준치인 1.8이상 이였으며, 23S와 16S rRNA의 비율도 2:1의 비율을 이루어 RNA의 integrity를 확인하였다.</p><h3>전체적인 발현 profile 해석:</h3><p>시료간의 전체적인 RNA 발현의 유사성을 비교하기 위하여 Pair-wise scatter plots 한 결과, 프로판올 무첨가한 W3110 (W1)과 P19 (P1) 사이의 연관값 (correlation value)은 0.992로 매우 높으며, 그 다음으로 프로판올 첨가한 W3110 (W2)과 P19 (P2) 사이에 0.974로 높은 반면에, 각각의 균주에서 프로판올 첨가유무에 따른 유전자의 발현비율은 많이 변화하여 야생주의 경우 0.949 (W2/W1), 프로판올 내성주의 경우 0.952 (P2/P1)를 나타냈다. 이는 프로판올을 첨가하지 않은 경우, 야생주와 프로판올 내성주 모두 RNA의 발현양상이 매우 유사함을 의미하며, 마찬가지로 프로판올을 첨가한 경우에도 두 균주사이의 RNA 발현양상이 매우 유사함을 의미한다. 한편, 야생주 및 프로판올 내성주에서 프로판올의 첨가유무에 따른 연관값(W2/W1, P2/P1)은 상대적으로 낮은 수치를 보인 것은 프로판올을 첨가하면 많은 유전자들의 발현이 변화함을 알 수 있었다. 이는 2배 이상의 발현의 차이를 나타내는 유전자 사이의 Hierarchical clustering을 통한 분석에서도 W1과 P1, W2와 P2의 발현양상 이 매우 유사함을 보여주었다.</p><h2>균주별 프로판올 첨가에 따른 전사체 발현 분석 및 해석</h2><p>프로판올 첨가에 의해서 2배 이상 발현에 변화가 있는 유전자는, 야생주의 경우(W2/W1) 50개의 유전자의 변화가 관찰되었으며, 프로판올 내성주의 경우(P2/P1) 71개의 유전자의 변화, 프로판올 무처리한 변이주와 야생주를 비교하면 (P1/W1) 1개, 프로판올 처리한 변이주와 야생주(P2/W2)는 2개의 유전자가 발현에 큰 변화를 보여주었다. 즉, 야생주와 변이주 모두 프로판올을 첨가하면 프로판올 스트레스에 의해서 유전자들의 발현이 급격히 변화됨을 보여주었다. 반면, 프로판올을 무처리 또는 처리한 상태에서 두 균주의 전사체를 비교하면 발현이 거의 차이가 없음을 보여주었다. 이는 UV처리에 의한 프로판올 내성이 유전자 발현에 기인한 것이 아니라 특정 단백질의 특성 등의 변화에 의한 것으로 사료된다.</p><h3>야생주에서 프로판올 첨가에 따른 RNA 발현 비교분석:</h3><p>프로판올을 무첨가한 야생주(W1)와 첨가한 야생주(W2) 사이의 RNA 발현을 비교 분석한 결과, 프로판올 첨가에 따라 발현이 증가된 유전자들은 heat shock response에 관련된 8개의 유전자, acid-shock response에 관련된 1개의 유전자, galac-titol 당 수송에 관여하는 4개의 유전자, oligopeptide 수송에 관여하는 2개 유전자 등이었다. 반면 발현이 억제된 유전자들은 ribosome 합성에 필요한 유전자 11개, respiratory chain에 관련된 4개 유전자, TCA cycle에 관련된 3개 유전자, 지방산 합성에 관련된 2개 유전자, 트립토판 분해에 관련된 1개 유전자 등이 있었다.</p><h3>프로판을 내성주에서 프로판을 첨가에 따른 RNA 발현 비교분석:</h3><p>프로판올을 무첨가한 프로판올 내성 변이주(P1)와 첨가한 변이주(P2) 사이의 RNA 발현을 비교 분석한 결과, 프로판올 처리에 따라 up regulation 된 유전자는 heat shock response에 관련된 11개 유전자, glucitol과 galactitol 과 같은 당 수송 및 대사에 관련된 8개의 유전자, oligopeptide 수송에 관여하는 4 개의 유전자, glycine betaine 수송에 관여하는 유전자 3개, 트립토판 수송 및 분해에 관련된 3개 유전자, respira-tory chain에 관련된 2개 유전자, 글리세롤 분해에 관련된 1개 유전자 등이 있었다. Down regulation된 유전자는 ribosome합성에 필요한 유전자 10개, TCA cycle과 관련 6개 유전자, respiratory chain에 관련된 4개 유전자, lactate 대사에 관련된 3개 유전자 등 이었다.</p><h3>프로판올 무처리한 변이주(P1)와 야생주(W1) 사이의 RNA발현 비교분석:</h3><p>P1과 W1사이의 발현을 비교한 결과 2배이상 up regulation 된 유전자는 proline dehydrogenase 발현에 필요한 1개 유전자(putA)이며, 1.8배 이상 up regulation 된 유전자는 트립토판 분해유전가 2개, glutamate/aspartate transporter 1개였다.</p><h3>프로판올 처리한 변이주(P2)와 야생주(W2) 사이의 RNA 발현 비교분석:</h3><p>P2와 W2사이의 발현에서 2배 이상 up regu-lation 된 유전자는 yjiY (predicted inner membrane protein)와 ybbN (putative thioredoxin-like protein) 이었다.</p><p>위에서 언급한 결과에서, 발현 변화를 나타내는 공통적인 특징으로는, 야생주와 프로판올 내성주 모두 heat shock response에 관련된 유전자들의 발현이 크게 증가하였으며, ribosome 생합성에 필요한 유전자들은 발현이 크게 저하되었다. 프로판올 스트레스에서 표현형으로 나타나는 대표적인 특징 중의 하나는 세포들의 성장이 급격히 저하되는 현상이다. 이는 리보소옴 합성에 필요한 단백질을 암호화하는 유전자들의 발현 감소 현상과 세포의 성장저하라는 생리적인 특징과 잘 일치함을 알 수 있었다.</p>