본 연구에서는 새우젓에서 혈전 용해력과 chitin 분해능이 뛰어난 균주를 분리하여 그 균주가 생산하는 효소의 특성을 조사하고, 16S rRNA sequence에 의한 유전자간의 상동성비교로 동정하여 혈전용해제 관여 효소와 chitinase를 개발하고자 하였다. 또한 분리된 균주의 배양조건에 따른 생육특성을 조사하였다. 또한 효소 활성 측정을 위해 표준단백질 bovine serum albumin을 사용하였다.
<p>따라서 본 연구에서는 늘 가까이에서 접하고 있는 새우젓으로부터 기존의 효소들보다 우수한 기능을 가진 혈전용해제 관여 효소와 chitinase를 개발하고자 하였다. 우선 새우젓에서 혈전 용해력과 chitin 분해능이 뛰어난 균주를 분리하여 그 균주가 생산하는 효소의 특성을 조사하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>혈전 및 chitin 분해효소 생산 균주의 분리 및 동정</h2> <p>새우젓으로부터 혈전과 chitin 분해능이 우수한 균주를 선별하기 위하여 LB agar plate (Tryptone \( 1.0 \% \), Yeast extract \( 0.5 \%, \mathrm { NaCl } 1.0 \% \), Agar \( 1.5 \% \), \( \mathrm { pH } 7.2) \)에 도말하여 단일 colony를 분리하였다. 분리된 colony를 LB broth에 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양한 후 그 상등액을 fibrin plate와 \( 1.0 \% \) colloidal chitin plate에 \(20 \mathrm { ul } \)씩 loading하여 혈전과 chitin 분해능이 가장 우수한 균주를 선발하였다. 미생물의 동정은 한국미생물보존센터 KCCM에 의뢰하여 \( 16 \mathrm { S } \) rRNA sequence에 의한 유전자간의 상동성비교로 동정하였다.</p> <h2>16S rRNA 분석용 시료</h2> <p>선별된 혈전과 chitin 분해능이 가장 우수한 균주로부터 ge-nomic DNA (gDNA) 분리는 G-spin \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) genomic DNA ex-traction kit (iNtRON Biotechnol.)를 사용하여 분리하였으며 분리된 gDNA는 165 rRNA sequence 분석을 위한 template로 사용하였다.</p> <h2>분리된 균주의 생육특성 조사</h2> <p>분리된 균주의 배양조건에 따른 균주의 특성 분석을 위하여 온도, salt농도, \( \mathrm { pH } \)를 달리하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간동안 진탕배양한 후 \( 600 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 배양조건은 온도 \( (25,28,37,40,50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)), \( \mathrm { pH } (4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0) \), salt농도 \( (0.5,3,6,9,12,15 \%) \)에 따른 생육특성을 조사하였다.</p> <h2>조효소액 조제 및 단백질 정량</h2> <p>효소 활성 측정을 위한 조효소액 조제는 다음과 같다. 균주를 \( \mathrm { LB } \) 배지에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(200 \mathrm { rpm } \), 24시간 동안 진탕배양한 후에 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(12,000 \mathrm { rpm } \)에서 10분간 원심분리하여 얻은 상등액을 동결건조 한 후 완충용액 \( (25 \mathrm { mM } \) Tris-Cl \( \mathrm { PH } 7.5 \), \( 1 \mathrm { mM } \) EDTA)에 녹였다. 이후 배지용액의 제거를 위해서 \( 25 \mathrm { mM } \) Tris-Cl \( ( \mathrm { pH } 7.5) \) 완충용액을 이용하여 투석하였다. 이때 얻은 용액을 조효소액으로 사용하였으며, 단백질 정량은 Bradford의 방법에 따라 측정하였다. 흡광도는 \( 595 \mathrm { ~nm } \) 에서 UV-Vis spec- trophotometer (Ultrospec \( ^ Ⓡ \) 3000)를 이용하여 측정하였고, 표준단백질로는 bovine serum albumin을 사용하였다.</p>