Weissella cibaria \( \mathrm{K}-\mathrm{M} 1-4 \) 의 배양상등액을 에탄올 침전하고 DEAE Sepharose ion-exchange chromatography를 행하였더니 \( \alpha \)-galactosidase는 마지막 gel filtration 정제에 의하여 5.3배 정제되었고 \( \beta \)-glucosidase는 4.4 배 정제되었다. 정제한 효소액을 \( \rho \)-nitrophenyl- \( \alpha \)-D-galacto-pyranoside와 \( \rho \)-nitrophenyl- \( \beta \)-D-gluco-pyranoside를 사용하여 \( \alpha \)-galactosidase 활성과 \( \beta \)-glucosidase 활성을 측정하였더니, \( \alpha \)-Galactosidase는 \( \mathrm{pH} \) 8.0에서 최대 활성을 나타내었으며, \( \beta \) - Glucosidase의 경우, \( \mathrm{pH} \) 7.0에서 최대 활성을 나타내었다. 안정성은 각각 \( \mathrm{pH} \) 5.0-9.0 사이에서 안정함을 보였으므로 유사했지만 \( \rho \)-nitrophenyl- \( \alpha \)-D-galacto-pyranoside의 경우 \( \mathrm{pH} 10.0 \) 이상에서 효소 활성이 급격히 감소하여 \( \mathrm{pH} \) 11.0에서는 효소 활성이 소실하였다. 전반적으로 \( \mathrm{pH} \) 가 중성일때 효소의 활성이 높은걸 알수있다.
<h2>효소의 분리와 정제</h2> <p>Weissella cibaria \( \mathrm{K}-\mathrm{M} 1-4 \) 의 배양상등액을 에탄올 침전하고 DEAE Sepharose ion-exchange chromatography를 행하였다. \( \mathrm{NaCl} \) 의 농도를 0-1 M linear gradient하게 용출시켰을때, 효소활성은 fraction number 49에서부터 61사이에서 나타났다. 이들 효소활성 분획을 따로 모아 dialysis 장치(6-8 kDa cut-off)를 사용하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 18 시간동안 투석하고 동결건조한 후, \( 50 \mathrm{mM} \) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 6.5)에 현탁하였다. 그리고 나서 효소활성 분획은 Sephacryl \( \mathrm{S}-100 \mathrm{HR} \) 을 사용한 gel filtration을 수행하여 효소활성 분획인 fraction number 26에서부터 33사이를 모았다. \( \alpha \) -Galactosidase 및 \( \beta \)-glucosidase의 활성은 fraction에 전부 포함되었고 각 효소의 활성은 거의 중첩되었다. 각 fraction은 동결건조하여 농축하였다. 이때 \( \alpha \)-galactosidase의 배양액 비활성은 108 units \( / \mathrm{mg} \) 이었고, 마지막 gel filtration 정제에 의하여 5.3배 정제되었다. \( \beta \)-glucosidase의 배양액 비활성은 \( 110 \mathrm{unit} / \mathrm{mg} \) 이었고, 마지막 gel filtration 정제에 의하여 4.4 배 정제되었다.</p> <h2>최적반응 \( \mathrm{pH} \) 및 \( \mathrm{pH} \) 안정성 측정</h2> <p>정제한 효소액은 \( \rho \)-nitrophenyl- \( \alpha \)-D-galacto-pyranoside(PNPG)와 \( \rho \)-nitrophenyl- \( \beta \)-D-gluco-pyranoside(PNPG)를 사용하여 각각의 \( \alpha \)-galactosidase 활성과 \( \beta \)-glucosidase 활성을 측정하였다. 효소에 대한 \( \mathrm{pH} \) 의 영향을 알아보기 위해 \( \mathrm{pH} \) 별로 적합한 buffer를 이용하였는데 \( \mathrm{pH} 2.0 \) 는 citrate \( \cdot \mathrm{HCl} \) buffer, \( \mathrm{pH} 3.0 \) 은 glycine \( \cdot \mathrm{HCl} \) buffer, \( \mathrm{pH} 4.0-5.0 \) 는 sodiu-macetate buffer, \( \mathrm{pH} \) 6.0-10.0은 Tris \( \cdot \mathrm{HCl} \) buffer, \( \mathrm{pH} 11.0 \) 은 glycine \( \cdot \mathrm{NaOH} \) buffer를 사용하였다. \( \alpha \)-Galactosidase는 \( \mathrm{pH} \) 8.0에서 최대 활성을 나타내었으며, \( \mathrm{pH} \) 5.0-9.0 사이에서 안정함을 보였다. \( \mathrm{pH} 10.0 \) 이상에서는 효소 활성이 급격히 감소하여 \( \mathrm{pH} \) 11.0에서는 효소 활성이 소실하였다(Fig. 4). \( \beta \) - Glucosidase의 경우, \( \mathrm{pH} \) 7.0에서 최대 활성을 나타내었고, \( \mathrm{pH} \) 안정성은 \( \alpha \)-galactosidase의 특성과 유사하였다. Yeo 등의 보고에 의하면 Bifidobacterium sp. Int-57이 생산한 \( \alpha \)-galactosidase의 최적 \( \mathrm{pH} \) 는 7.0이었고, Bacillus licheniformis YB-42이 생산한 \( \alpha \)-galactosidase는 \( \mathrm{pH} \) 6.5, Streptomyces sp. YB-4[14]이 생산한 \( \alpha \)-galactosidase는 \( \mathrm{pH} \) 6.0, Scopulariopsis brevicaulis이 생 산한 \( \alpha \)-galac-tosidase는 \( \mathrm{pH} 7.0 \) 이었고, \( \mathrm{pH} 6.0-8.0 \) 사이에서 안정하였다고 보고하였다. Bifidobacterium sp. Int-57이 생산한 \( \beta \)-glucosid-ase는 \( \mathrm{pH} \) 7.0에서 최적이었으며, \( \mathrm{pH} \) 4.0-7.0에서 안정하다고 보고하였다. 본 실험결과와 이들 결과 사이에는 근소한 차이가 있는 것으로 보아 균종간의 차이에서 비롯된 것이라고 사료되며, 대체적으로 \( \mathrm{pH} \) 가 중성일때 효소의 활성이 높았다. 게다가 Weissella cibaria K-M1-4의 \( \alpha \)-galactosidase 및 \( \beta \)-glucosidase 효소활성의 \( \mathrm{pH} \) 안정폭이 넓기 때문에 산업적으로 효소를 이용하는데 효율적이라 사료된다.</p>