LPS군에서는 38±1.52%, LPS+DEP 처리군에서는 45.3±0.33%로 iNOS 발현이 확인되었으며, nitrotyrosilated-protein은 LPS 처리군에서 49±1.15%, LPS+DEP 처리군에서는 50.6±0.88%로 발현되었다. 염증성 세포의 존재가 확인된 세포는 실험의 정확성을 위해 제외하였다. 또한, LPS와 함께 DEP를 처리한 군에서는 NO 형성 효과가 LPS 처리군에 비해 시간의 경과에 따라 유의하게 증가하였다.
<h1>결 과</h1> <h2>폐포대식세포의 분리</h2> <p>Fig. 1에서 (A)-a는 정상 흰쥐에서 채집한 폐 내에서 분리된 세포로서 \( 99 \% \) 이상이 폐포대식세포였다. 그리고 (A)-b는 염증성 질환이 있는 흰쥐의 폐 내에서 분리된 백혈구 세포들로 폐포대식세포가 \( 87 \% \) 를 차지했다. 본 실험에서는 염증성 세포의 존재가 확인된 (A)-b의 세포는 실험의 정확성을 위하여 사용하지 않았다.</p> <h2>DEP 및 LPS의 노출에 따른 폐포대식세포의 형태 변화</h2> <p>DEP \( (20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)만 처리한 실험군에서는 폐포대식세포가 DEP를 탐식하고 있는 것을 확인 할 수 있었으나(Fig. 1, (B)-c), 세포의 형태는 대조군의 세포와 큰 차이를 보이지 않았다(Fig. 1, (B)-a). 그러나 LPS \( (10 \mathrm{ng} / \mathrm{ml}) \)를 처리한 실험군에서는 세포들이 서로 결합하는 것을 관찰 할 수 있었으며 (Fig. 1, (B)-b) 이러한 현상은 LPS와 DEP를 함께 처리한 실험군에서도 관찰되었다(Fig. 1, (B)-d).</p> <h2>DEP 및 LPS의 노출이 폐포대식세포에서 NO의 형성에 미치는 효과</h2> <p>DEP를 처리한 경우 어느 농도에서도 NO 를 형성하는 효과가 없었다. 그러나 LPS의 경우 농도가 증가함에 따라 비례적으로 NO의 형성이 증가하였다 \( (\mathrm{P}<0.005) \) (Fig. 2).</p> <p>대조군에는 배지만을 처리하였고 실험군으로 DEP \( (20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)과 LPS \( (10 \mathrm{ng} / \mathrm{ml}) \) 를 개별적으로 처리한 군들을 설정하여 배양시간 6,12,24,36 시간에 따른 효과들을 비교하였다. LPS만 처리한 군과 LPS 및 DEP가 함께 처리된 군들에서 배양시간에 따라 NO의 형성이 증가하는 것을 볼 수 있었다(P<0.005). 또한, LPS와 함께 DEP를 처리한 군에서 NO 형성 효과는 LPS 처리군과 비교하였을 때 시간의 경과에 따라 유의하게 증가하였다(Fig. 3).</p> <p>세포의 배양시간을 24 시간으로 고정하고 DEP 처리 농도를 변화시켰을 때 \( (5,10,20,40,80 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \), LPS와 함께 DEP( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 농도를 처리한 것에서는 LPS의 단독 처리했을 때보다 NO 형성이 유의하게 증가하였으나, DEP의 처리 농도를 점차 증가시켰을 때는 오히려 NO의 형성을 억제하는 효과를 나타내었다 \( (\mathrm{P}<0.05) \) (Fig. 4).</p> <h2>iNOS 형성을 확인하기 위한 세포면역염색과 Western analysis</h2> <p>실험결과 대조군(a)과 DEP 처리군(c)에서는 세포들에 갈색으로 발색된 iNOS가 전혀 발현되지 않았음을 확인할 수 있었다. 이에 반하여 LPS군(b)에서는 \( 38 \pm 1.52 \% \), LPS+DEP 처리군(d)은 \( 45.3 \pm 0.33 \% \) 으로 iNOS가 많은 세포들의 세포질에 잘 발현된 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 5).</p> <p>면역염색의 결과를 검증하기 위하여 면역염색을 위한 세포배양 조건과 동일한 조건의 시료에서 Western analysis를 실시하였을 때, densitomer로 양을 측정하여 iNOS를 \( \beta \) -actin으로 나눈 값으로 대조군과 DEP 처리군에서는 iNOS 단백질의 발현이 전혀 감지되지 않았다. 반면, LPS 처리군은 \( 0.28 \) 정도이고, LPS+DEP \( (20 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 처리군은 \( 0.33 \) 이며, LPS+DEP \( (40 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)를 처리군은 \( 0.30 \) 으로 감지되었다(Fig. 6).</p> <h2>Nitrotyrosilated-protein에 대한 세포면역염색</h2> <p>대조군 (a) 에서는 \( 16.3 \pm 3.18 \% \), DEP 처리군 (c) 은 \( 13 \pm 1.20 \% \) 로 갈색으로 발색된 nitrotyrosilated-protein이 확인되었다. 또한 LPS 처리군 (b) 에서는 \( 49 \pm 1.15 \% \), LPS+DEP 처리군(d)은 \( 50.6 \pm 0.88 \% \) 로 발현되어 정도의 차이는 있으나 모든 군에서 nitrotyrosilated-protein이 형성된 것을 볼 수 있었다(Fig. 7).</p>