호중구를 사용하여 PLD활성도를 측정하고 그 세포막을 분리하는 실험 과정에 대하여 설명하였다. 실험에 사용된 구체적인 물질과 기구에 대하여 자세히 설명하였으며 효소의 활성도는 phosphatidylethanol으로 라벨된 정도를 전체 방사선의 양에 대한 \( \% \)로 환산하여 표시하였다.
<h2>PLD 활성도 측정</h2><p>\( 1 \times 10^{6} \)의 호중구를 반응액에 넣고 시료를 첨가하여 10분동안 배양하고 활성도를 측정하는 경우에는 \( 1 \mathrm{mM} \mathrm{CaCl} \)와 \( 1.6 \% \) 에탄올이 들어있는 상태에서 \( 1 \mu \mathrm{M}\) fMLP로서 반응을 시작시키고 15분 후 \( 1.5 \mathrm{ml} \) chloroform/methanol\((1:2 \mathrm{v} / \mathrm{v}) \)을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 반응이 중지된 용액에 \( 0.5 \mathrm{ml} \)의 chloroform과 \( 0.5 \mathrm{ml} \)의 \( 2 \% \) acetic acid를 넣고 잘 섞은 다음 원심분리 \( (850 \times g\), 2분) 를 하여 수용성 층과 지용성 층을 분리한 다음 아래층의 지용성 부분을 질소가스를 이용하여 건조시켰다. 다시 시료를 \( 30 \mu \mathrm{l} \) chloroform/methanol \( (95: 5 \mathrm{v} / \mathrm{v}) \)에 녹인 다음 모세관 튜브를 이용하여 Silica gel 60의 편평 크로마토그라피판(EM Science, Gibbstown, NJ)에 점적한 다음 chloroform/methanol/acetic acid \((90:10:10 \mathrm{v} / \mathrm{v} / \mathrm{v}) \)용액으로 전개시켰다. 효소의 활성도는 phosphatidylethanol으로 라벨된 정도를 전체 방사선의 양에 대한 \( \% \)로 환산하여 표시하였다.</p><h2>호중구 세포막의 분리</h2><p>시약을 처리한 호중구를 원심분리 \( (850 \times \mathrm{g},\)) 5분 한 후 완충액 B에 다시 부유시키고 \( 4.6 \mathrm{mM} \) diisopropyl fluorophosphate를 넣어 20분간 방치한 후 세포를 즉시 원심분리하여 단백질 분해효소 억제제 \( (0.5 \mu \mathrm{M} \) leupeptin, \( 1 \mu \mathrm{M} \) aprotinin 및 \( 10 \mathrm{mM} \) phenylmethylsulfonylfluoride)가 첨가된 \( 10 \mathrm{ml} \) 완충액 C\((25 \mathrm{mM} \) triethanolamine \( \mathrm{HCl} \), \(\mathrm{pH}7.4 \), \( 100 \mathrm{mM} \,\mathrm{KCl}\), \(5 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl_2}\), \(3 \mathrm{mM} \,\mathrm{NaCl}) \)에 부유시켰다. 세포는 ultrasonic disruptor를 사용하여 파괴하고 다시 원심분리하여 파괴되지 않은 세포와 핵성분을 제거하였다. 완충액 C에 녹인 \( 50 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)와 \( 30 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 sucrose로 된 discontinous sucrose gradient에 세포 추출액을 조심스럽게 얹고 이 gradient를 Beckman SW-41 Ti 로터를 이용하여 Beckman L8-80M 초원심분리기에서 \( 209,000 \times \mathrm{g} \)로 90분간 원심분리하여 \( 30 \% / 50 \% \) 중간충의 분획을 막성분(membrane fraction)으로 이용하였다.</p>