\( \mathrm { NO } \) 의 농도를 배양액 내의 nitrite 농도를 griess 반응을 이용하여 측정하였는데, RAW 264.7 세포를 DMEM 배지에 2.5 x 10^5 cells/ml로 조절하고, 37\(^\circ \mathrm{C}\) 5% CO2 incubator에 18시간 배양한 후 LPS와 밀배아유(0.1, 1, 10, 50, 100\(\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml}\))를 처리하여 20시간 재배양하여 Nitric oxide 생성량을 Griess 반응을 이용하여 측정하였다.
<h2>Nitric oxide 생성량 측정</h2> <p>\( \mathrm { NO } \) 의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 griess 반응을 이용하여 측정하였다. RAW \( 264.7 \) 세포는 DMEM 배지를 이용하여 \( 2.5 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { cells } / \mathrm { ml } \) 로 조절한 후 24 -well plate에 접종하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 18 시간 전 배양하였다. 배지를 교환 후, \( \mathrm { RAW } 264.7 \) 세포에 \( 1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) LPS와 밀배아유 \( (0.1,1,10,50,100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 를 처리하여 20 시간 재 배양하였다. 배양액의 상층액을 얻은 후, 동량의 griess 시약(1 \% sulfanilamide \( + 0.1 \% \) naphthylendiamine dihydrochloride, \( 1: 1 \) )을 첨가하여 실온에서 10 분간 반응시킨 후, microplate reader를 이용하여 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 세포배양액 내 \( \mathrm { NO } \) 의 농도는 sodium nitrite \( \left ( \mathrm { NaNO } _ { 2 } \right ) \) 의 농도별 표준곡선과 비교하여 산출하였다.</p> <h2>염증관련 cytokine 분비량 측정</h2> <p>세포배양액 내의 TNF- \( \alpha \), IL-6, IL-1 \( \beta \) cytokine의 분비량을 ELISA-kit (Mouse ELISA set, BD Bioscience, USA)를 이용하여 측정하였다. 먼저, ELISA microplate에 anti-mouse TNF- \( \alpha \), IL-6 및 IL-1 \( \beta \mathrm { mAb } \) 를 분주하여 하릇밤 동안 coating시켰다. 이를 \( 0.05 \% \) Tween 20 이 포함된 PBST로 세척한 후, \( 10 \% \) FBS 용액으로 blocking하였다. PBST로 세척한 뒤, 각 microplate에 배양 상층액을 넣고 실온에서 2 시간 반응시켰다. 다시 PBST로 세척한 뒤 희석한 biotinylated anti-mouse TNF- \( \alpha \), IL-6 mAb와 streptavidin-horseradish peroxidase conjugate를 첨가하여 실온에서 1 시간 반응시켰다. IL- \( 1 \beta \) 의 경우, biotinylated anti-mouse IL- \( 1 \beta \) detection antibody 를 첨가하고 1 시간 반응시킨 후, streptavidin-horseradish peroxidase conjugate를 첨가하여 30 분 반응시켰다. 그 후, 이를 다시 PBST로 세척한 다음, OPD 용액을 첨가하여 암반응시키고 microplate reader를 이용하여 \( 490 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p>