Competitor가 클로닝된 plasmid를 T7 RNA polymerase를 이용하여 RNA를 얻었고, dual reporter plasmid가 transfection 된 cell을 IX passive lysis buffer로 깨서 dual luciferase assay를 한 후, 먼저 total RNA를 분리하여 제작한 competitor cDNA와 PCR하고, 남은 샘플은 Western blotting을 한 후 Enhanced Chemi-Luminisence로 검측하여 X-ray film에 감광하였다. HCV의 NS5B 단백질과 host의 p48 단백질의 상호작용을 yeast two hybrid library를 검색하여 확인하였다.
<p>IFN- \( \alpha \) 를 처리할 경우에는 transfection을 하고 \(5 \)시간 후에 IFN- \( \alpha \)를 100 unit으로 처리하였고 같은 방법으로 assay를 수행하였다.</p> <p>Competitive RT-PCR</p> <p>Competitor가 cloning 되어 있는 plasmid를 BamH I으로 잘라 linear form으로 만들었고, T7 RNA polymerase(pro-mega)를 이용하여 in vitro transcription 통해 RNA를 얻었다. 이 RNA를 RT를 수행하여 cDNA를 얻었다. Dual reporter plasmid가 transfection 된 cell을 IX passive lysis buffer로 cell을 깨서 dual luciferase assay를 한 후 남은 sample \( 300 \mu \mathrm { L } \) 를 가지고 \( \mathrm { RNeasy } ^ {\infty } \) Mini Kit(Qiagen)를 이용하여 total RNA를 isolation 하였다. 이 RNA를 이용하여 RT를 하였고, 미리 제작한 competitor cDNA와 핚께 섞어PCR을 수행하였다.</p> <p>Western blot</p> <p>Dual reporter plasmid가 transfection된 cell을 IX passive lysis buffcr로 cell을 깨서 dual luciferase assay를 한 후 남은 sample은 \( 6 \mathrm { X } \) loading dye와 섞은 후 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis \( (10 \% \) resolving gel, \( 4 \% \) stacking gel) 한 후 nitrocellulose membrane(Millipore)에 clectroblotting 하였다. Transfer 후에 membrane을 TBS-T blocking buffer (20 mM Tris-Cl pH \( 7.5,150 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } , 0.2 \% \) tween-20, \( 5 \% \) nonfat skim milk)에 ovemight blocking 하였다. TBS-T buffer를 이용하여 wash한 후에 anti-His tag antibody를 \( 1: 5000 ^ {\circ } \) 로- dilution하여 1 시간 동안 primary reaction을 수행하였다. Reaction이 끝난후 다시 TBS-T buffer를 이용하여 wash한 후에 HRP conjugated anti-mouse antibody를 \( 1: 5000 \) 으로 dilution하여 \(1 \)시간동안 secondary reaction을 수행하였다. 반응이 끝난 후 다시 wash하고 Enhanced Chemi-Luminisence( \( \mathrm { FCL } ^ {\circledast } \), Intron)로 detection 하여 X-ray film에 감광하였다.</p> <h2>결과 및 고찰</h2> <p>\( \mathrm { HCV } \mathrm { NS5B } \) 와 host \( \mathrm { p } 48 \) 의 상호작용 확인</p> <p>\( \mathrm { HCV } \)의 NS5B 단백질과 host의 p48 단백질의 상호작용함을 먼저 yeast two hybrid library를 검색하여 찾아내었다. 이를 다시 한번 yeast two hybrid assay(Fig. 1A)와 GST pulldown assay를 이용하여 두 단백질의 상호작용을 재확인하였다.</p>