본 실험에서는 재래식 간장과 된장은 경기도 양주시와 남양주시 지역의 재래시장 또는 가정 내 직접 담근 장류를 수집하였으며, 표준균주 Leuc. mesenteroides KACC12312는 농촌진흥청 한국농업미생물보존센터에서 분양 받았다. mesenteroides KACC12312는 농촌진흥청 한국농업미생물보존센터에서 분양 받아 사용하였다.이 균주를 슈크로오스 액체배지에 배양 후 점성물질을 분비하는 것을 재확인 하여 EPS 생성 균주로 선발해 사용하였다. 분리 균주의 산 저항성은 산성 \mathrm{pH}pH에 대한 내성실험과 체내 소화관 조건과 유사한 환경에서 측정하기 위하여 인공위액 내성실험을 실시하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>시료</h2><p>본 실험에서 사용한 재래식 간장과 된장은 경기도 양주시와 남양주시 지역의 재래시장에서 구입하거나 가정에서 직접 담근 장류를 수집하였으며, 표준균주 Leuc. mesenteroides KACC12312는 농촌진흥청 한국농업미생물보존센터에서 분양 받아 사용하였다. 분석에 사용한 시약은 Sigma Aldrich (ST. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다.</p><h2>균주 배양 및 선발</h2><p>수집한 장류 시료 \( 10 \mathrm{~g} \)을 \( 90 \mathrm{ml} \)의 \( 0.85 \% \mathrm{~NaCl} \)로 현탁하여 MRS 고체배지에 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 도말하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 배양하였다. 배양된 미생물의 형태적 차이를 이용하여 1차 선별하고, 유산균으로 확인된 균주를 슈크로오스 배지(\(1\%\) tryptone, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 0.5 \% \) dipotassium phosphate, \( 0.5 \% \) diammonium citrate, \( 5 \% \) sucrose, \( \mathrm{pH} 7.0\))에 도말하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 배양하여 mucoid colony를 나타내는 점질균을 선별하였다. 이 균주를 슈크로오스 액체배지에 배양하여 점성물질을 분비하는 것을 재확인한 다음 EPS 생성 균주로 선발하여 실험에 사용하였다.</p><h2>EPS 생산 균주의 동정</h2><p>DNA 유전자 염기서열 분석은 Solutions for Generic Technologies (Solgent)사에 의뢰하여 분석하였으며, primer로는 Universal PCR primer 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하였다. 계통수 작성은 Lasergene사의 DNASTAR pro software (SeqMan Pro)와 The National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 제공하는 Advanced blast search 프로그램을 통하여 GenBank에 보고된 유사 균주와의 염기서열을 비교, 계통분류학적 유연관계를 분석 하였으며, MEGA v4.0을 이용하여 Tamura-Nei distance model과 neighbor-joining method에 의해 계통수를 작성하였다.</p><h2>내산성 및 인공위액 저항성</h2><p>분리 균주의 산 저항성은 단순 산성 \( \mathrm{pH} \)에 대한 내성실험과 체내 소화관 조건과 유사한 환경에서 측정하기 위하여 인공위액 내성실험을 실시하여 확인하였다. 산성 \( \mathrm{pH} \)에 대한 내성은 \( 0.05 \mathrm{M} \) sodium phosphate 용액( \( \mathrm{pH} \mathrm{3.0)} \)을 사용하여 측정하였다. 인공위액 내성 실험은 Kobayashi 등의 방법을 변형하여 \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} \)로 \( \mathrm{pH} 3.0 \)으로 조정한 MRS 액체 배지에 펩신을 \( 1,000 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \)가 되도록 첨가하여 인공위액을 조제, 실험하였다. EPS 생성을 위해 분리 균주를 슈크로오스 액체배지에 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 배양한 후, 원심분리 \( (10,000 \times \mathrm{g}\), \(5 \mathrm{~min}, 4^{\circ} \mathrm{C} \))하여 균체를 회수하였다. 제거된 상징액과 동량의 \( 0.05 \mathrm{M} \) sodium phosphate 용액 \( (\mathrm{pH} 3.0) \)과 인공위액을 각각 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 배양한 다음 생균수를 측정하여 내산성과 인공위액에 대한 저항성을 평가하였다. 대조군은 MRS 배지에서 배양하여 \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}\right. \), \( 48 \mathrm{~h}) \), EPS를 생성하지 않은 조건에서 실험구와 동일하게 처리하였다.</p><h2>인공 담즙 저항성</h2><p>인공 담즙은 MRS 액체배지에 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) filter로 여과한 oxgall 용액을 \( 0.3 \% \) 첨가하여 제조하였다. 담즙에 대한 저항성은 슈크로오스 액체배지에 균주를 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 배양한 다음 인공위액에 2시간 처리하여 후 인공 담즙 저항성을 실험하였다. 인공 위액 처리를 거친 유산균 배양액을 원심분리 \((10,000 \times \mathrm{g}\), \( 5 \mathrm{~min}\), \(4^{\circ}\mathrm{C})\)하여 상징액을 제거, 균체를 회수하였으며 회수된 균체에 조제된 인공 담즙액을 제거한 상징액과 동량으로 첨가하여 현탁시킨 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양하였고, 생균수를 측정하여 인공 담즙에 대한 저항성을 조사하였다. 대조군은 MRS 배지에서 배양하여 \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}, 48 \mathrm{~h}\right) \), EPS를 생성하지 않은 조건에서 실험구와 동일하게 처리하였다.</p>