본 연구에서는 제안한 20종의 MS marker 중 국내 서식하는 수달에 적합한 13종을 선별했으며 조직 시료는 Multiplex PCR 방법으로 분석했고 분변 시료는 증폭이 잘 되지 않아 2차 PCR까지 해서 MS 분석을 진행했다. 수달 D-loop 염기서열 다중정렬은 CLUSTAL W program, Fasta format과 Nexus format 간 Data 전환은 DAMBE와 DnaSP 4.50.3로 진행했고 최적의 분석 모델의 설정은 MrModeltest 2.3을 수행한 다음 PAUP* 4.0에서 분석했다. parsimony consensus NJ tree method를 이용해 국내 수달 사이의 haplotype 연관관계 분석을 한 후 계통수 작성과 분석에 사용했다.
<h2>염기서열 결정 및 다중정렬</h2> <p>수달 mtDNA D-loop 서열 결정은 ABI3130xI DNA Sequencer (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 direct se-quencing 을 수행하였다. 유전자간의 경계영역 설정은 2009년 Ki 등이 보고한 염기서열에 준하여 D-loop 염기서열 시작과 끝 위치를 결정하였다.</p> <h2>MS marker분석</h2> <p>본 연구에서 이용한 MS marker는 북미지역의 강에서 서식하는 Lontra canadensis를 대상으로 2004년과 2005년 Amanda 등이 제안한 20종의 MS marker 중 국내 서식하는 수달에 적합한 13종을 선발하여, 조직 시료의 경우 Multiplex PCR 방법을 이용하여 분석하였으며, 분변 시료의 경우 증폭이 잘 이루어 지지 않아 1차 PCR을 해서 나온 PCR 산물을 이용하여 2차 PCR을 한 후에 MS 분석을 실시하였다.</p> <p>조직 시료를 이용한 Multiplex PCR 증폭은 Genomic DNA (\( 50 \mathrm{ng} / \mathrm{\mu l}) \) \( 2 \mathrm{\mu l} \), primer Mix \( 8 \mathrm{\mu l} \), Hot-start Taq DNA poly-merase (Bioneer, Korea) \( 0.4 \mathrm{\mu l} \), \(10 \times\) buffer \( 1.5 \mathrm{\mu l} \), \(0.25 \mathrm{mM} \) dNTP \(1.2 \mathrm{\mu l} \) \( \mathrm{MgCl}_{2} \) \(1.1 \mathrm{\mu l} \), DMSO \(0.25 \mathrm{\mu l} \)의 조성에 증류수를 첨가하여 최종 부피를 \(15 \mathrm{\mu l} \)로 반응 하였으며, PCR 조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 denaturation을 실시한 후 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60초, \( 58^{\circ} \mathrm{C} \)에서 75초 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60초 1 cycle로 하여 4 cycle, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60초, \( 57^{\circ} \mathrm{C} \)에서 75초 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60초 1 cycle로 하여 4 cycle, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60초, \( 56^{\circ} \mathrm{C} \)에서 75초 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60초 1 cycle로 하여 24 cycle을 반복하는 Touch Down PCR 방법을 사용하였다. 그 후 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분 extension 후 \( 8^{\circ} \mathrm{C} \)에서 종료하였다.</p> <p>분변 시료를 이용한 1차 PCR의 경우 Genomic DNA (\( 100\mathrm{ng} / \mathrm{\mu l} \)) \(1 \mathrm{\mu l} \), primer 각각 \(1 \mathrm{\mu l} \) (\( 10 \mathrm{pmol} / \mathrm{\mu l} \)), Taq DNA poly-merase (TaKaRa, Japan) \(0.1 \mathrm{\mu l} \), \(10 \times\) buffer \( 1.5 \mathrm{\mu l} \), \(0.25 \mathrm{mM} \) dNTP \( 1.2 \mathrm{\mu l} \) 조성에 증류수를 첨가하여 최종 부피를 \( 15 \mathrm{\mu l} \)로 반응 하였으며, PCR 조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 DNA를 denatu-ration을 실시한 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 56^{\circ} \mathrm{C}\), \(51^{\circ} \mathrm{C}\), \(61^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분으로 이루어진 합성반응을 30회 반복한 후, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 extension하고 \( 8^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하였고, 2차 PCR의 경우 1차 PCR 산물 \( 1 \mathrm{\mu l} \), primer 각각 \( 1 \mathrm{\mu l} \) (\( 10 \mathrm{pmol} / \mathrm{\mu l} \)), Taq DNA polymerase (TaKaRa, Japan) \(0.1 \mathrm{\mu l} \), \(10 \times\) buffer \( 1.5 \mathrm{\mu l} \), \(0.25 \mathrm{mM} \) dNTP \( 1.2 \mathrm{\mu l} \) 조성에 증류수를 첨가하여 최종 부피를 \( 15 \mathrm{\mu l} \)로 반응 하였으며, PCR 조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 DNA를 denaturation을 실시한 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 59^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분으로 이루어진 합성반응을 30회 반복한 후, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 extension하고 \( 8^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하였다. 대립유전자형분석은 ABI3130xl DNA Sequencer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 전기영동을 수행하였으며, GeneMapper version 4.0 (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 크기 및 표식자의 종류별로 분류한 후 Microsoft Excel (Microsoft, USA)을 이용하여 자료를 취합하였다.</p> <h2>계통유전학적 분석</h2> <p>수달 D-loop 염기서열 다중정렬은 CLUSTAL W program을 이용하였고, Fasta format과 Nexus format 간 Data 전환은 DAMBE와 DnaSP 4.50.3로 수행하였다. 최적의 분석 모델 설정은 MrModeltest 2.3을 수행한 후 PAUP* 4.0에서 분석하였다. 계통수 작성은 MRBAYES 3.1을 이용해 3,500,000번 반복 수행하여, FigTree v1.3.1을 이용해 도식화 하였다. 국내 수달 사이의 haplotype 연관관계 분석은 parsimony consensus NJ tree method를 이용하여 계통수 작성과 분석에 이용하였다.</p> <p>MS data를 이용한 계통유전분석은 MSA (Microsatellite analyzer) version 3.15 program을 이용하여 유전력을 산출하였고, 산출된 유전력을 바탕으로 PHYLIP v3.6 package program의 pitch program을 활용하여 유전적 거리를 계산해, consense program을 이용하여 tree를 완성하였으며, MS marker의 heterozygosity (He)와 polymorphic information content (PIC), 그리고 Hardy-Weinberg equilibrium (HWE)은 Cervus version 2.0을 이용하여 추정하였다.</p>