본 연구에서는 표준균구(ATCC 29522, 43717, 43718, 43719)과 환자 및 건강인의 치주조직에서 분리된 임상 균주를 사용하여 실험을 수행하였다. 균주들은 TSBV 배지와 RFT 배지에서 배양되었으며, 항혈청을 사용하여 혈청형을 확인하였다. AP-PCR을 위해 균주들의 DNA를 희석하여 템플릿 DNA로 사용하고, 무작위 단일 프라이머를 사용하여 증폭을 진행하였다. 표준균주와 임상분리균주는 배지에서 배양한 후 원심분리하여 실험에 사용되었다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>균주 및 세포주</h2><p>본 연구에 사용된 표준균구 2. 2ctinonuycetemcomitans ATCC 29522, 43717, 43718, 43719는 ATCC(Amercian type culture collection)에서 구입하였고, 동아대학교 병원 치과에 내원한 환자와 건강인의 치주조직에서 임상 균주를 분리하기 위해 Table 1의 trypicase soy bacitracin vancomycin (TSBV) 배지와 tedduced transport fluid (RFT) 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(10 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 배양기에서 3일간 배양하였다. 분리된 임상 균주를 실험에 이용할 때는 brain heart infusion (BHI) 을 사용하여 배양하였다. 사람유래 T 세포주인 Jurkat는 한국 세포주 은행에서 분양 받아 사용하였다.</p><h2>임상분리주의 동정</h2><p>분리 $균주의 동정을 위$한 생화학적 성상 시험은 "Bergeys's Manual of Systematic Bacteriology (Vol. 2)를 참고로 하여, MacConkey배지에서의 생육여부, catalase 검사, indole 생성여부와 fructose 발효 여부를 확인하였다. 최종적으로 API 20E test kit(Biomeriux)를 이용하여 확인하였다.</p><h2>표준균주 및 임상분리균주의 혈청형</h2><h3>항혈청 준비</h3><p>항원의 제조를 위하여 표준균주 ATCC 43717(혈청형 a), 43718(혈청형 b), 43719(혈청형 c)를 BHI 배지에 각각 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(10 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 배양기에서 3일간 배양하고, 배양액을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 16,000 \mathrm{~g} \) 로 15분간 원심분리하여 세포침사를 얻었다. PBS로 3회 세척하여 세균현탁액을 준비하고 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 부터 \( 2.0 \mathrm{ml} \)까지 양을 증가시키면서 토끼 이정맥에 1주일 간격으로 총 8회 주사한 다음 현탁액 \( 2.0 \mathrm{ml} \) 를 연속 3회 주사하였다. 1주일 후 심장 채혈하여 혈청을 분리한 다음, 면역흡착으로 항혈청 내의 비특이 물질을 제거하였다.</p><h3>Serotype 결정</h3><p>혈청형을 확인하기 위하여 각각의 항혈청을 96 well microplate에서 PBS로 계단희석하였다. 각 혈청형의 희석액에 확인하고자 하는 항원 \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 약 2시간 반응시킨 후 응집여부를 관찰하였다. 그리고 ELISA로 혈청형을 결정하기 위하여 \( 580 \mathrm{~nm} \) 에서 OD값이 \( 0.25-0.3 \mathrm{nm} \) 되게 \( 0.1 \mathrm{M} \mathrm{~NaCO}_{3} \) buffer\( (\mathrm{pH} 9.6) \)로 각각의 항원을 조절하고 각 well에 \( 50 \mu \mathrm{l}\) 씩 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)배양기에 2시간 동안 두어 항원을 부착시키고, \( 0.05 \% \) Tween 20을 포함하는 PBS (PBS-T)로 3회 세척하였다. 그리고 항원이 부착된 각 well에 \(3\%\) 소의 혈청 알부민(bovine serum albumin)이 들어있는 PBS로 blocking하고 PBS-T로 다시 3회 세척하였다. 준비된 항혈청을 각 혈청형별로 계단희석하여 \( 50 \mu \mathrm{l}\) 씩 첨가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2시간 반응시켰다. 다시 PBS-T로 4회 세척하고 alkaline phosphatase가 부착된 2차항체를 PBS-T로 1000배 희석하여 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 씩 첨가하였고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2시간 반응시킨 후 PBS-T로 5회 세척하였다. \( \rho-\mathrm{NPP}\)(\( \rho \)-nitrophenyl phosphate, sigma)가 첨가된 기질용액을 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 씩 첨가한 후 발색반응이 나타나면 \(3 \mathrm{M}\) \( \mathrm{NaOH} \)를 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 씩 첨가하여 반응을 정지시킨 다음 ELISA reader로 \( 405 \mathrm{nm} \) 파장에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>표준균주 및 임상분리균주의 AP-PCR을 통한 유전자형</h2><p>4개의 표준균주 및 임상분리균주를 BHI배지 \( 10 \mathrm{ml} \)에 \(37^{\circ} \mathrm{C}\), \(10 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 조건으로 3일간 배양하였고, 배양액 \( 1.5 \mathrm{ml} \) 씩을 microcentrifuge tube로 옮겨서 \( 13,000 \mathrm{~g}\), 10분간 원심분리하였다. TE buffer (\( 10 \mathrm{mM} \) tris HCl, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA \( \mathrm{pH} 8.0\)) \( 600 \mu \mathrm{l} \)를 넣고 균체를 현탁시킨 다음 \( 10 \% \) $SDS(sodium dodecyl sulfate, sigma) \( 30 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하여 잘 혼합하고, \(37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 약 1시간 반응시켰다. \( 5 \mathrm{M}\) \( \mathrm{NaCl}\) \(100 \mu \mathrm{l}\)를 첨가하여 완전히 혼합한 다음 \( \mathrm{CTAB} / \mathrm{NaCl}\) \((\mathrm{NaCl}, 10 \% \) hexadecyl trmethyl anmonium bromide)용액을 \( 80 \mu \mathrm{l}\) 더하여 혼합한 후 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 반응하였다. Chloroform/isoamy alcohol 24:1 혼합액을 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 13,000 \mathrm{~g} \) 로 15분간 원심분리하여 상층액을 얻은 다음 phenol/chloroform/isoamy alcohol 25:24:1로 반복하여 단백을 제거하였다. Isopropanol을 첨가하고 잘 혼합한 다음 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤 방치하고, \( 13,000 \mathrm{~g}\), \(4^{2} \mathrm{C}\), 15분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 침사를 \( 70 \% \) ethanol로 세척하였다. TE buffer \( 100 \mu \mathrm{l}\) 로 침사를 녹여 RNase로 처리한 후 \( 0.7 \% \) agarose gel 전기영동 상에서 DNA band를 확인하였다.</p><p>AP-PCR을 수행하기 위해 4개의 표준균주와 분리균주들의 DNA를 \( 0.4 \mu \mathrm{g} / \mu \mathrm{l}\) 농도로 희석하여 template DNA로 사용하였고, 증폭을 위하여 16개의 random single primer (Bioneer, Korea)를 사용하였다. PCR 반응은 PCR premix-Top K-2014 (100unit-\(0.5 \mathrm{ml} \) microtube, \( 20 \mathrm{ml} \) reaction: Bioneer, Korea)에 template DNA \( (0.4 \mu \mathrm{g} / \mu \mathrm{l} \) bacterial genomic DNA)와 20pmole primer를 혼합한 후 mineral oil로 중층하여 PCR을 실행하였다. PCR은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 pre-denaturation 시키고 첫 번째 cycle은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분간 denaturation 시켰고 \( 36^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분간 annealing하였고 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분간 extention시켰다. 두 번째부터 35번째 cycle까지는 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분간 denaturation 시켰고 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분간 annealing하였고 \( 72 \mathrm{C} \)에서 2분간 extention시켰고 마지막 cycle의 extention은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 실시한 다음 \( 1 \% \) agarose gel상에서 확인하였다.</p>