본 논문에서는 후추나무과에 속하는 필발의 건조된 열매 \( \mathrm{MeOH} \) 추출물을 분석하였으며, 추출물을 NMR spectrum의 정보를 기반으로 분석한 결과 piperidine 계열의 pipernona-line으로 최종 동정하였다. 추출물을 세포 독성 측정을 측정한 결과 전립선 암세포의 성장 억제를 유도하고, 특히 호르몬에 영향을 받지 않는 세포에서 더 큰 세포 독성을 보임을 알 수 있었으며, 추가로 세포주기 조절에 대한 분석결과 세포주기 중 \( \mathrm{G}_{1} \)기를 억제함으로써 항암 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>활성물질의 분리 및 정제</h2><p>본 저자들은 백여 가지의 한약재 \( \mathrm{MeOH} \) 추출물로부터 전립선암의 세포 독성을 조사한 결과, 후추나무과에 속하는 필발의 건조된 열매 \( \mathrm{MeOH} \) 추출물이 강력한 세포독성 효과를 나타내었다. 따라서 본 연구에서는 필발의 열매를 \( \mathrm{MeOH} \)로 추출한 뒤, 증류수에 현탁 시켜 chloroform 용매로 용매 분획하였다. 필발 \( 1.2 \mathrm{kg} \)을 분말로 분쇄한 후 건조하여 \( \mathrm{MeOH} \)로 추출하고 chloroform으로 용매 분획하여 chloroform층 \( 130 \mathrm{g} \)을 얻었다. 이들을 silica gel (230-400 mesh, Merck) column chromatography, reverse phase (RP-18) column chromatog-raphy와 Sephadex LH-20 column chromatography를 이용하여 분획하여 TLC와 MTT 법으로 항암효과를 나타내는 분획을 검출하였다. 마지막으로 활성 분획을 YMC-PACK ODS C18 column \( (\phi ~6 \times 150 \mathrm{~mm} \), YMC-Gel Company, Tokyo, Japan)으로 분당 \( 0.5 \mathrm{~ml} \)의 유속으로 UV \( 254 \mathrm{~nm} \)에서 분리하였다. 활성 화합물은 retention time 15.3분에서 확인하였고, pho-todiode array를 이용한 UV spectrum 측정 시 자외선 최대흡수대(UV \( \lambda \max ) \)는 \(220, 260, 300 \mathrm{~nm} \)를 나타내었다(data not shown).</p><h2>활성물질의 구조해석</h2><p>본 연구에서 분리, 정제 된 활성 분획은 황색 분말의 형태로서 \( { }^{1} \mathrm{H}-\mathrm{NMR}\),\({ }^{13} \mathrm{C}-\mathrm{NMR} \)을 통한 구조 분석한 결과, ole-finic proton signal이 \( \delta ~6.02(\mathrm{~d}, J=15.6 \mathrm{~Hz})\), \(\delta ~6.83 \mathrm{~ppm}\)\(~(\mathrm{dt} \), \( J=15.0\), \(7.0 \mathrm{Hz} \))으로 trans double bond가 존재하는 것으로 추정되었다. 또한 \( { }^{1} \mathrm{H}-\mathrm{NMR} \) 에서 \( \delta ~2.13-2.23 \mathrm{~ppm} \)에서 2개의 al-lylic methylene group이 존재하고, piperidine ring의 proton과 겹쳐지는 \( \delta ~1.43-1.59 \)에서 두 개의 aliphatic methylene이 존재하였다. 한편, \( \delta ~1.50-1.63 \)에서는 3개의 aromatic methyl-ene이 확인 되었고, \( \delta ~6.71-6.83 \)에서는 aliphatic proton이 확인되었다. 이와 같은 NMR spectrum의 정보를 기반으로 하여 LRESIMS 및 HMQC spectrum 등의 결과를 기존의 논문들과 비교 분석한 결과, 필발로부터 분리한 전립선암 세포사멸조절물질은 piperidine 계열의 pipernona-line으로 최종 동정하였으며 \( { }^{1} \mathrm{H}-\mathrm{NMR} \)과 \( { }^{13} \mathrm{C}-\mathrm{NMR} \)에서의 chemical shift (ppm)는 Table 1과 같았다.</p><h2>활성물질의 세포 독성 측정</h2><p>필발의 건조된 열매로부터 piperettine, pipereoctadecalidine 및 piperlongumine 등과 같은 화학 성분들이 보고되어졌고, 그 화합물들이 항암 효과와 면역조절 효과 및 암 전이에 대한 억제 효과가 보고되어져 있다. 따라서 본 연구에서는 필발 열매로부터 분리한 활성 화합물인 pipernonaline이 사람의 전립선암 세포주에서 세포독성 및 세포사멸에 효과가 있는 지를 확인하기 위하여 PC-3 및 LNCaP 세포주를 사용하였으며, 두 세포주에 대한 세포 독성 영향을 먼저 조사하였다.</p><p>이를 위하여 다양한 농도를 처리한 세포들을 대상으로 MTT assay를 실시한 결과, pipernonaline을 처리한 암세포에서 농도 의존적으로 세포의 생존률이 감소하는 것을 관찰하였다. 또한 androgen dihydrotestosterone (DHT)을 처리한 LNCaP 세포보다 DHT를 처리하지 않은 세포에서 더 높은 세포독성을 나타내었고, androgen-independent 세포주인 PC-3 세포가 androgen-dependent 세포주인 LNCaP 세포보다 더 높은 세포독성을 나타냄을 확인하였다. 이 결과들로 미루어보아, pipernonaline은 인간 전립선 암세포의 성장 억제를 유도하고, 특히 호르몬에 영향을 받지 않는 세포에서 더 큰 세포 독성을 보임을 알 수가 있었다.</p><h2>활성물질의 세포주기 조절 분석</h2><p>본 연구에서는 pipernonaline이 사람의 전립선암 세포주의 세포분열 주기상에 미치는 영향을 조사하였다. Fig. 7에서 보는 바와 같이 정상세포의 경우, G0/G1기에 해당하는 세포는 약 \( 29 \% \) 정도였으며,S 및 G2/M기에 해당하는 세포는 각각 \( 18 \% \) 및 \( 26 \% \) 정도의 분포를 보였다. \( 10,20 ~\mu \mathrm{M} \)의 농도로 pi-pernonaline이 처리된 전립선 암세포주의 경우 G1기가 정상에 비하여 약 1.5 배 증가된 \( 50 \% \) 정도였으며, 상대적으로 S기와 G2/M기에 해당하는 세포의 빈도는 다소 감소함을 알 수 있었다. 또한 \( 30 ~\mu \mathrm{M} \)을 처리하였을 경우에는 세포사멸을 나타내는 \( \mathrm{G}_{0} \)기가 급격하게 증가함을 알 수 있었다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때, 필발의 열매로부터 분리한 활성물질 pi-pernonaline은 세포주기 중 \( \mathrm{G}_{1} \)기를 억제함으로써 항암 효과를 나타냄을 알 수 있으며 인간 전립선 암세포 성장 억제는 세포주기 억제와 밀접한 연관성이 있음을 알 수 있었다. 따라서 pipernonaline의 전립선암에 대한 세포사멸 기작에 대한 추가적인 연구가 필요한 것으로 사료된다.</p>