본 장은 실험균주로부터 추출한 색소의 in vitro 항산화능력을 DPPH 의 환원에 의한 free radical 소거 활성 반응을 기반으로 측정하였으며, 분리된 색소의 인체 세포 DNA 손상 회복능을 comet as-say 방법을 통해 조사하였고, 마지막으로 색소의 항균 활성을 주요 식품유해균인 그람 음성 세균 3종과 그람 양성 세균 2종을 대상으로 디스크 확산법을 이용하여 확인하였다.
<h2>Free radical 소거 활성</h2> <p>분리된 색소의 in vitro 항산화능력은 DPPH (1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)의 환원에 의한 free radical 소거 활성 반응에 의한 방법으로 평가하였다. Ethanol에 녹여 농도별(5 - 50\( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 로 희석한 시료에 DPPH/ethanol solution을 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응시킨 후 \( 517 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 각 농도별로 3 회 반복하여 실험을 수행하였다. 비교구로 합성 항산화제인 BHA (butylate hydroxy anisole)를 각 시료와 같은 농도로 사용하였으며 시료를 첨가하지 않은 대조구의 DPPH radical을 \( 50 \% \) 소거시키는데 필요한 시료의 농도를 \( \mathrm{IC}_{50} \) 으로 표기하였다. 통계처리는 SPSS-PC+ 통계 package(version 10.0)를 사용하였으며, DPPH 소거능은 평균치 \( \pm \) 평균편차(SD)로 표시하였다. 시료의 DPPH radical 소거능 정도를 비교하기 위해 one-way 분산분석(ANOVA)를 시행하고 군간의 비교는 Duncan의 다중비교검정법에 의해 사후 검증하였으며, 통계적 유의성은 \( 0.05 \) 이하 수준에서 평가하였다.</p> <h2>DNA 손상 회복능</h2> <p>실험균주로부터 추출한 색소의 인체 세포 DNA 손상 회복능에 대한 조사는 Margarita 등[22]의 방법에 따라 comet as-say를 이용하였다. 색소 추출물 시료는 에탄올에 녹여 농도별 (5-100 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 로 준비하였다. 건강한 성인 여자의 혈액으로부터 임파구 세포를 \( 1,300 \mathrm{rpm}, 6 \) 분간 원심 분리하여 준비한 색소추출물 시료를 인체 임파구 세포에 적정 농도별로 PBS \( (160 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 2.7 \mathrm{mM} \mathrm{KCl}, 11.3 \mathrm{mM} \mathrm{Na} \mathrm{NPOO}_{4}, 1.7 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, \mathrm{pH} \) 7.4)에 희석하여 혼합한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 전 처리하였다. 전 처리가 끝난 각 인체 임파구 세포에 \( 100 \mu \mathrm{M} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 를 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 넣어 혼합한 뒤 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분 동안 반응시킨 다음 PBS로 세척하였다. 세척 후 \( 25 \mathrm{~V}, 300 \mathrm{~mA} \) 에서 20 분간 전기영동을 실시하였다. 양성대조구는 PBS 처리된 임파구세포에 DNA 손상을 야기하는 물질인 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 를 \( 100 \mu \mathrm{M} \) 농도로 처리하였으며, 음성대조구는 PBS 처리세포에 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 를 처리하지 않고 사용하였다. 임파구의 DNA 손상정도는 핵으로부터 이동한 DNA 파편의 거리(tail length, TL)에 tail 내 함유된 DNA 양 (Tail \%DNA)을 곱해준 tail moment (TM) 값을 측정하여 나타내었으며 각 처리구 당 2 개의 slide를 만들어 그 중 에서 50 개 세포를 관찰하여, \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 에 의한 DNA 손상 억제정도를 측정하였고, 모든 실험과정은 blind 방식으로 수행하였다. 모든 자료의 처리는 SPSS-PC+ 통계 package를 사용하여 처리하였다. 각 처리구별로 50개의 세포에서 측정한 DNA 손상도(TL, Tail \% DNA, TM)의 평균값과 표준오차를 구하였으며, 양성대조구와 음성대조구를 기준으로 각 농도별로 상대적인 DNA 손상도를 relative score로 표시하였다. 시료의 DNA 손상 억제 정도를 비교하기 위해 농도별로 one-way 분산분석(ANOVA)을 시행하였고, 모든 통계적 유의성은 \( \mathrm{p}<0.05 \) 수준에서 평가하였다.</p> <h2>항균 활성</h2> <p>색소의 항균 활성은 주요 식품유해균, 그람 음성 세균 3종과 그람 양성 세균 2종에 대하여 디스크 확산법(disk agar meth-od)을 이용하여 확인하였다[7]. 우선 \( 8 \mathrm{~mm} \) paper disk에 etha-nol에 녹인 색소를 \( 10 \mu \mathrm{g}, 50 \mu \mathrm{g}, 100 \mu \mathrm{g}, 200 \mu \mathrm{g} \) 이 되도록 하여 대상 균주가 도말된 평판배지에 올려놓고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 배양 후 투명대의 지름을 측정하였다. 균주는 그람 음성균인 E. coli KCTC 1116, Salmonella typhimurium KCTC \( 2514^{\mathrm{T}} \), Pseudomonas aeruginosa KCTC \( 1750^{\mathrm{T}} \) 와 그람 양성균인 Bacillus subtilis IAM \( 12188^{\mathrm{T}} \), Stapylococcus aureus ATCC \( 25923^{\mathrm{T}} \) 를 사용하였다.</p>