Tyrosinase inhibitor screening kit (\#K575-100; BioVision, Inc., Milpitas, CA, USA)을 통해 tyrosinase 저해 활성을 평가하였고, microplate reader를 이용하여 세포 내 멜라닌 함량을 측정하였다.
<h2>Tyrosinase 저해 활성</h2><p>Tyrosinase inhibitor screening kit (\#K575-100; BioVision, Inc., Milpitas, CA, USA)을 사용하여 tyrosinase 저해 활성을 평가하였다. 제조사의 매뉴얼에 따라 실험을 진행하였다. Multimode microplate reader로 \( 510 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 30분 동안 kinetic mode로 측정하고 흡광도 차이 값을 시간으로 나누어 slope를 계산하였다. Tyrosinase 저해 활성 측정을 위한 계산 방법은 다음과 같다.</p><p>\( \% \) Relative inhibition \( = \) Slope of \( \mathrm{EC}- \) Slope of \( \mathrm{S} / \) Slope of EC \( \times 100 \)</p><p>(EC = Tyrosinase Enzyme Control, S = test inhibitors (Sample, S), IC = Inhibitor Control)</p><h2>세포 내 멜라닌 함량 측정</h2><p>인간 멜라닌 세포는 Medium 254 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 HMGS가 첨가된 성장배지를 포함하는 \( 100 \mathrm{~mm} \) dish에 \( 1 \times 10^{6} \) cell/dish 로 seeding 하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 추출물의 미백 효과를 확인하기 위해 \( 20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도로 인간 멜라닌 세포 배지에 함께 처리한 후 48 시간 동안 배양하였다. 멜라닌 합성 억제능을 비교하기 위해 미백 표준물질로 잘 알려진 kojic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 \( 600 \mu \mathrm{M} \) 농도로 처리한 후 48시간 동안 배양하였다. 처리 가 완료된 \( 100 \mathrm{~mm} \) dish의 배지를 모두 제거한 뒤, \( 5 \mathrm{ml} \)의 phosphate buffered saline (PBS)로 2회 세척하고 성장배지로 세포를 회수하여 e-tube로 옮긴 후 10분간 원심분리 \( \left(12,000 \times \mathrm{g}, 4^{\circ} \mathrm{C}\right) \)를 실시하였다. Pellet 색상을 제대로 확인하기 위해 상층액을 제거하고 PBS 용액으로 한 번 더 세척한 후 10분간 원심분리 \( \left(12,000 \times \mathrm{g}, 4^{\circ} \mathrm{C}\right) \)하여 상층액을 제거한 후 pellet을 디지털 카메라로 촬영하였다. 세포 내 멜라닌 함량을 측정하기 위해 상층액이 제거된 pellet에 \( 1 \mathrm{M}\) \(\mathrm{NaOH} \) 를 \( 500 \mu \mathrm{l} \) 씩 주입한 후 교반기로 pellet을 잘 섞었다. \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 정치시킨 후, \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분동안 가열하여 멜라닌을 충분히 용해한 후 microplate reader를 이용하여 \( 400 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>