\( \mathrm{CuSO}_{4} \) 처리를 통해 유도된 E. coli의 VBNC 상태를 분석했다. 이 처리는 주변세포질의 손상과 세포 내외막의 분리, 세포 내 물질의 감소를 일으킨다. 그러나 세포가 죽지 않고 생존하는 증거는 세포소생인데, 이는 E. coli에서 잘 일어나지 않았다. 이에 대한 유전적, 분자생물학적 정보가 아직 부족하므로, 본 연구팀은 이를 파악하기 위해 추가 연구를 계획하고 있다.
<h2>VBNC 미생물의 형태</h2> <p>대장균의 VBNC 형태를 관찰하기 위하여 한국기초과학지원연구원의 생물전용 투과전자현미경 장비를 사용하였다. \( \mathrm{CuSO}_{4} \) 처리에 의해 유도된 VBNC 미생물은 대조군에 비해 주변세포질(periplasmic space)이 온전하지 못하며 세포 외막과 세포 내막이 분리되는 특징과 세포 내 물질의 양이 현저히 감소되어 있는 것이 관찰되었다. 이는 필수 유 전자와 단백질을 제외한 세포 내 물질을 제거하여 대사량을 최소한으로 유지하며 장기 생존을 대비하고자 하는 VBNC 고유의 특성 때문으로 생각되었다. \( \mathrm{Cu} \) 처리 6 일째와 12 일째를 관찰하였는데 12 일째의 미생물에서 더 심한 형태의 변화가 관찰되었다.</p> <p>VBNC 미생물의 외형을 더 잘 관찰하기 위해 주사전자현미경 (Scanning electron microscopy, SEM)을 사용한 다른 연구팀의 연구결과를 통해, Erwinia amylovora의 경우 정상 상태에서는 막대형이지만 VBNC 상태에서는 외막이 보다 두꺼워지고 세포의 크기가 조금 더 커지며 형태의 변형이 확인되었고, Vibrio 속 균주에서는 막대형에서 원형으로의 형태 변형 등이 보고되었다.</p> <h2>세포 소생에 대한 결과</h2> <p>VBNC 상태의 세포가 죽은 것이 아니라 살아있다는 가장 확실한 증거는 세포소생이다. 이를 확인하기 위해 기존의 알려져 있는 방법을 모두 사용하였다. VBNC를 유도하는데 사용한 \( \mathrm{Cu} \) 를 EDTA 를 사용하여 제거한 후 \( 0.9 \% \mathrm{NaCl} \) 에 현탁하고 날짜별로 LB 고체배지에 도말하여 생장성을 확인하였으나 소생되어 형성된 집락이 관찰되지 않았다. EDTA 보다 \( \mathrm{Cu} \) 를 제거하는데 더욱 효과적이라고 보고된 배즙, King's Broth media를 이용하였으나 역시 세포소생은 확인할 수 없었다.</p> <p>세포소생에 관해서는 여러 주장이 있다. 단순히 가한 스트레스를 제거하는 것만으로도 세포소생이 일어난다는 보고, 세포소생시 사용되는 영양배지에서 활성 산소나 라디칼이 만들어져 VBNC 세포에 독성이 있기 때문에 이를 제거 하는 물질을 함께 넣어주면 세포소생이 된다는 보고. 또한 세포소생에 관여하는 신호물질이 있고 이를 통해 세포소생이 일어난다는 보고 등이 있다. 반면 최근의 연구결과 에서 E. coli에 대해 위에서 언급한 모든 방법을 사용해보아도 세포소생이 잘 되지 않았다는 보고가 있으며 이는 우리의 연구결과와 일치하는 것이다.</p> <p>VBNC 에 대해 가장 많은 연구가 진행된 것은 Vibrio속의 균주로서, VBNC 를 유도하는 여러 환경적 조건에서부터 세포소생에 이르기까지 많은 연구가 진행되어 있다. 반면 E. coli의 경우 vibrio 균주에 비해 아직 연구가 많이 진행되지 않아 지속적 연구가 필요하다. 또한 병원성 세균의 경우에도 VBNC상태에 들어간다고 알려져 있는뎨 이러한 VBNC 상태의 병원성 미생물 중 일부는 병원성을 유지하고 있다는 연구결과가 있다. VBNC 미생물을 접종한 쥐가 죽거나 VBNC 미생물이 들어있는 물을 섭취한 쥐가 죽었다는 보고가 있다. 이처럼 VBNC 미생물은 공중위생상 매우 중요하기 때문에 유도와 관련한 분자생물학적 기작과 그 특성에 관한 기초 연구가 진행되어야 할 것이다.</p> <p>본 연구에서는 E. coli에 \( \mathrm{CuSO}_{4} \) 를 처리해 \( \mathrm{VBNC}^{2} \) 상태를 유도하고 이의 특성을 조사하였다. 그 결과, VBNC 상태의 세포는 g-DNA는 상대적으로 적게 붕괴되고 RNA는 빠른속도로 붕괴가 일어났으며 특히 특정 크기로 붕괴됨을 관찰 하였다. 세포의 내막과 외막은 분리되었고 세포질의 양은 현저하게 줄어들었다. 이러한 결과를 통해 VBNC 세포가 대사 활성을 최대한으로 억제하되 유전정보는 상대적으로 잘 보호하고 있음을 알 수 있다. 아직까지 E. coli 균주의 VBNC 상태에 대한 유전적, 분자생물학적 정보는 명확히 밝혀져 있지 않아서 향후 본 연구팀은 VBNC E. coli에서 특이적으로 발현되는 유전자나 VBNC 상태를 유도하는 유전자를 찾는 연구를 진행할 계획이다.</p>