미국 위스콘신 주립대학교에서 분양 받은 오이 'NC76'와 'GY14' 계통의 종자를 온실에서 발아시켜 키운 후 교배하여 \( \mathrm{F}_{1} \) 종자를 수확하고 다시 자가수분하여 \( \mathrm{F}_{2} \) 집단을 형성하였으며, 오이의 어린 잎을 수확하여 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동고에 보관한 후 CTAB 방법을 이용하여 total genomic DNA를 추출하였다. CTAB 방법을 이용하여 얻은 'NC76'와 'GY14' DNA를 995개 SSR 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 하였고, 증폭된 DNA는 2% agarose gel에서 전기영동 후 EtBr로 염색하여 UV광과 디지털 카메라를 통해 확인 및 전기영동 상에서 ‘NC-76’와 ‘Gy14’ PCR 증폭산물의 크기가 동일한 SSR 마커를 대상으로 Rotor-Gene Q6000을 사용하여 HRM 분석하여, 'NC76', 'GY14', 그리고 두 계통 간 이형 접합체의 유전자형을 Joinmap4 software를 이용하여 마커 연관분석과 유전지도 작성을 수행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물 재료 및 DNA 정제</h2> <p>미국 위스콘신 주립대학교에서 분양 받은 오이 'NC76'와 'GY14' 계통의 종자를 온실에서 발아시켜 키운 후 교배하여 \( \mathrm{F}_{1} \) 종자를 수확하고 다시 자가수분하여 \( \mathrm{F}_{2} \) 집단을 형성하였다. 오이의 어린 잎을 수확하여 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동고에 보관한 후 CTAB 방법을 이용하여 total genomic DNA를 추출 하였다. 곱게 분쇄된 시료에 CTAB buffer를 \( 750 \mu 1 \)을 가하고 30초 vortexing 한 후 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 배양하였다. \( 750 \mu 1 \) phenol:chloroform:isomyl alcohol (25:24:1)을 넣고 15초 vortexing 한 후, 5분 동안 원심분리 \( (14,000 \mathrm{rpm}) \) 하였다. 얻은 상층액을 \( 2 \mathrm{ml} \) 튜브로 옮긴 후 두 번에 걸쳐 chloro-form:isomyl alcohol (24:1) 용액으로 세척한 후 EtOH를 900 \( \mu 1 \) 넣고 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 보관 후에 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 원심분리(14,000 rpm) 하였다. DNA 펠렛을 확인한 후 상층액을 버리고 10분간 자연건조를 시켰다. 추출된 DNA는 증류수 \( 50 \mu 1 \)로 현탁시켰다.</p> <h2>중합효소연쇄반응(PCR)과 gel 전기연동</h2> <p>CTAB 방법을 이용하여 얻은 'NC76'와 'GY14' DNA를 995개 SSR 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 하였다. PCR에 사용된 모든 시약은 솔젠트(Seoul, South Korea) 회사의 e-taq kit를 사용하였다. 총 PCR 볼름은 \( 15 \mu 1 \) 로 \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{~dNTP}~ 0.3 \) \( \mu 1,10 \times \) buffer는 \( 1.5 \mu 1 \), taq polymerase는 \( 0.4 \) unit, \( 100 \mu \mathrm{M} \)의 Forward primer, Reverse primer 각각 \( 1 \mu l \), DNA는 \( 15 \mathrm{ng} \)을 사용하였다. PCR은 \( 93^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분 후 \( 93^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 68^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분 과정을 40회 반복하고, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 7분 후 종료 또는 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관되었다. 증폭된 DNA는 2% agarose gel에서 전기영동 후 EtBr로 염색하여 UV광과 디지털 카메라를 통해 확인하였다.</p> <h2>고해상도 용해 분석(High resolution melting analysis)</h2> <p>전기영동 상에서 ‘NC-76’와 ‘Gy14’ PCR 증폭산물의 크기가 동일한 SSR 마커를 대상으로 Rotor-Gene Q6000 (QIAGEN Co. Seoul, South Korea)을 사용하여 HRM 분석하였다. 각 SSR 마커의 PCR 수행 시 fluorescent dye의 일종인 Evagreen (Solgent, Seoul, South Korea)을 첨가하여 PCR 증폭산물을 형광표식하였다. HRM 분석은 PCR 산물을 \( 75^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( \rightarrow 90^{\circ} \mathrm{C} \)로 천천희 heating 시키면서 매 \( 0.3^{\circ} \mathrm{C} \) 상승시점 시 형광발광 정도를 측정하여 DNA 샘플 간 melting 온도 차이에 대한 변이곡선을 통해 분석하였다.</p> <h2>연관분석</h2> <p>'NC-76'와 'Gy14' 간 다형성을 보이는 20개 SSR 마커를 이용하여 \( \mathrm{F}_{2} \) mapping 집단 92개체의 마커 유전자형을 조사하였다. 'NC76', 'GY14', 그리고 두 계통 간 이형 접합체의 유전자형을 \( \mathrm{a}, \mathrm{b} \), 그리고 \( \mathrm{h} \) 기호로 각각 표시하고 Joinmap4 software (Plant Research international, Wageningen, The Netherlands)를 이용하여 마커 연관분석과 유전지도 작성을 수행하였다. 마커의 분리 비를 확인하기 위하여 \( X^{2} \) (chi-square) goodness-of-fit test를 수행하였다. 연관군 분석(grouping)은 independence LOD를 2.0에서 10범위에서 1 스텝 조건으로 수행되었고 mapping algorithm은 Maximum Likelihood mapping function을 사용하였다.</p>