\(100\mathrm{g}\)의 각 약재를 \(70\%\) 에탄올에 투입하여 초음파 추출법을 통해 에탄올 추출물을 얻었다. 또한, 미세먼지 PM2.5 (1650b)를 NIST에서 구입하여 DMSO에 현탁시킨 후, 초음파를 이용하여 30분 동안 균질화된 stock solution을 만들어 실험에 적합하게 희석, 혼합하여 사용하였다. 이후, hCEC 세포에 PM2.5와 추출물이 주어진 후 MTT assay를 통해 그들의 세포 독성을 측정하였다.
<h2>후보 약제 추출물의 준비</h2> <p>본 연구를 위해 선별된 12 종의 약재(Table 1 ) 중에서 금잔화는 한뫼산야초꽃차연구원(양산꽃차, Yangsan, Republic of Korea)에서 제공받았으며, 나머지는 (주)대한생약제품 (Miryang, Republic of Korea)에서 파쇄된 상태로 구입하였다. 각 약재에서 에탄올 추출물을 얻기 위해 약재 \( 100 \mathrm { ~g } \) 에 21 의 70 \( \% \) 에탄올을 가하여 초음파추출로 추출물을 제조하였다. 이를 위해 추출 용기에 약재와 70 \( \% \)에탄올을 혼합한 후 초음파 수조 바닥에 닿지 않도록 하여 40KHZ초음파를 가하여 2시간 동안 추출하였다. 각 추출물은 여과지로 여과한 후 Rotary Evaporator (EYELA Co. Ltd., Shanghai, China)를 이용하여 농축한 후, 동결 건조 분말을 제조하였다. 이들 시료는 dimethyl sulfoxide (DMSO, Am-resco, Solon, \( \mathrm { OH } , \mathrm { USA } \) ) 를 이용하여 \( 100 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 로 stock sol-ution을 만들어 실험에 따라 적절하게 희석 및 혼합하여 사용하였다. \( \mathrm { PM } _ { 2.5 } (1650 \mathrm { ~b } ) \)는 National Institute of Stan-dards and Technology (Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하여 DMSO에 \( 25 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \)로 현탁하고, 30분간 초음파를 이용하여 균질화된 stock solution을 만들어 실험에 따라 적절하게 희석, 혼합하여 사용하였다.</p> <h2>세포 독성 평가</h2> <p>hCEC세포에서 \( \mathrm { PM } _ { 25 } \)및 후보 추출물에 의한 세포 독성을 평가하기 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphe-nyltetra-zolium bromide (MTT) assay를 실시하였다. 이를 위하여 적정 농도의 \( \mathrm { PM } _ { 2.5 } \)와 후보 추출물을 처리하여 24시간 동안 배양하거나, 후보 추출물을 1시간 동안 전처리한 후, \( \mathrm { PM } _ { 2.5 } \) 를 처리하여 24시간 배양하였으며, 양성 대조군으로는 강력한 항산화제인 N-acetyl-1-cysteine (NAC,Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 1시간 전처리하였다. 배양 후, 각 well에 \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) MTT용액 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 넣은 후 1시간 30분 동안 반응시켰다. 이어서 배지를 제거한 후, DMSO를 넣어생성된 formazan을 모두 녹인 다음 96 well plate에 \( 200 \mu 1 \)씩 옮겨서 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA,USA를 이용하여 \( 540 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도 값을 측정하였 다. 각 물질에 대한 세포 독성은 대조군 값을 기준으로 백분율로 환산하여 나타내었다.</p>