특정한 시료을 \( 1,000 \mathrm { ~g } \)에서 15 분간 원심분리해 핵을 제거하고 또 한 번 \( 10,000 \mathrm { ~g } \)에서 30분간 원심분리 하여 LDH 확인을 위한 세포기질 효소원을 준비하였다. LDH 동위효소 활성 측정은 확성측정법에 따라 특정한 시료가 산화되는 정도를 측정해 효소 활성을 측정하고 전기영동하여 동위효소를 확인하였다.
<h3>세포기질 효소원의 준비 및 LDH 확인</h3> <p>상기 시료액을 \( 1,000 \mathrm { ~g } \) 에서 15 분간 원심분리 하여 핵을 제거하고, 다시 이 시료액을 \( 10,000 \mathrm { ~g } \) 에서 30 분간 원심분리 하였다. 이 상등액을 다시 \( 20,000 \mathrm { ~g } \) 에서 30 분간 원심분리 하여 침전물은 제거하고 상등액을 세포기질 효소원으로 사용하여 \( \mathrm { LDH } \) 환성측정법에 따라 활성을 측정하고 전기영동 하였다.</p> <h3>미토콘드리아 막의 분리</h3> <p>Schanitman and Greenawalt 의 방법에 따라 내막과매트릭스, 외막과 막간물질을 각각 분리하여 전기영동 및 효 소활성을 측정하기위한 시료로 사용하였다.</p> <h3>\( \mathrm { LDH } \) 활성측정</h3> <p>\( \mathrm { LDH } \) 동위효소의 활성은 \( 1.50 \mathrm { mM } \) 피루브산과 \( 0.14 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { NADH } \) 를 함유하는 \( 0.1 \mathrm { M } \) potassium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } \) \( 6.85) \) 에 시료를 가한 후 \( \mathrm { NADH } \) 로부터 \( \mathrm { NAD } ^ { + } \)로 산화되는 정도를 spectrophotometer (Shimadzu UV-160A)를 사용하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } , 340 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다. 활성의 단위는 1 분 동안 감소되는 흡광도 \( 1.0 \) 을 1 unit로 하였다.</p> <h3>전기영동 Native-PAGE</h3> <p>Polyacrylamide gel은 항온기(Rikakikai CA-1100, Japan) 를 사용하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 유지시킨 polyacrylamide vertical slabsystem (Hoefer SE250, USA)으로 실시하였다. Davis 의방법에 따라 7.5 \% acrylamide separation gel과 3 \% acrylamidestacking gel이 되도록 slab gel을 만들었다. 시료에는 \( 50 \% \)sucrose와 \( 0.05 \% \) bromophenol blue.용액을 \( 1: 1( \mathrm { ~V } / \mathrm { V } ) \) 로 가한후 Tris-glycine buffer \( ( \mathrm { pH } \) 8.3)늘 사용하여 \( 100 \mathrm { ~V } \) 에서 20 분간 전개시킨 다음 \( 200 \mathrm { ~V } \) 에서 2 시간 10 분 동안 전기영동 하였다. 후소 염색은 Whitt 의 방법에 따라 DL-Lactate,NBT (nitroblue tetrazolium), PMS (phenazine methosulfate)및 \( \mathrm { NAD } ^ { + } \)혼합 용액에 gel을 넣어 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 염색한 후 \( 15 \% \)acetic acid로 고정한 후 동위효소볼 확인하였다.</p>