본 논문의 실험은 3회 반복하여 평균, 표준편차를 결정했으며 실험값의 통계분석은 SPSS(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용했다. 또한 대장균에서 GTP 생합성 관여 유전자인 gmk, ndk 및 guaA-guaB를 이용해 발현벡터를 제작하였고, 이들 벡터로부터 한 종류 이상의 유전자를 동시에 발현할 수 있는 벡터를 제작하였다. 결과적으로 gmk, ndk, guaA, guaB의 추가발현을 통해 sepiapterin의 생산량이 증가를 확인할 수 있었고, 경제적인 생산을 위해 추가적으로 GTP 생합성 관여 유전자의 발현조건 최적화에 대한 연구가 필요할 것으로 여겨진다.
<h2>통계분석</h2> <p>모든 실험은 3회 반복하여 평균과 표준편차를 결정하였으며 실험값의 통계분석은 SPSS(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>발현벡터 제작</h2> <p>대장균에서 GTP 생합성에 관여하는 유전자인 gmk \((0.6 \mathrm { ~kb } ) \), ndk \((0.4 \mathrm { ~kb } ) \) 및 guaA-guaB \((3.0 \mathrm { ~kb } ) \)를 ITPG로 발현이 유도되는 pACYCDuet-1 플라스미드에 각각 삽입하여 발현벡터 pME782(pACYCDuet-1-gmk), pME991(pACYCDuet-1-ndk) 및 pME854(pACYCDuet-1-guaA-guaB)를 제작하였고, 이들 벡터로부터 한 종류 이상의 유전자를 동시에 발현할 수 있는 pME858(pACYCDuet-1-gmk-guaA-guaB), pME995(pACYCDuet-1-gmk-ndk), pME998(pACYCDuet-1-ndk-guaA-guaB) 및 pME987(pACYCDuet-1-gmk-ndk-guaA-guaB) 벡터를 제작하였다(Fig. 2).</p> <h2>유전자 발현 확인</h2> <p>재조합 대장균 BL21(DE3)에서 gch1, ptps, guaA, guaB, gmk 및 ndk 유전자의 발현은 SDS-PAGE 전기영동(Fig. 3A) 및 정량 real-time PCR(Fig. 3B)을 통하여 확인하였다. Real-time PCR 분석결과, 재조합 대장균에서 gch1 유전자의 발현이 확인되었으나, GCH1 \((27.5 \mathrm { kDa } ) \) 단백질은 대장균에서 주로 비가용성 형태(insoluble form)로 발현되는 것으로 나타났다. 모든 재조합 대장균에서 RNA 수준에서 ptps의 유전자의 발현이 확인되었으나, PTPS \((18.6 \mathrm { kDa } ) \) 단백질의 발현은 선행연구 결과와 유사하게 대장균에서의 발현 양이 매우 낮은 수준이었다. 유전자 gmk, ndk, guaA-guaB는 대장균의 염색체에 존재하는 유전자로서 발현벡터 제작을 통하여 발현양의 증대를 도모하였다. 유전자 gmk는 발현 벡터(pME782)에 의한 발현으로 대조구와 비교하여 4.6배 가량 mRNA 발현양이 증가하였으며, SDS-PAGE 상에서도 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 흥미로운 사실은 guaA-guaB 유전자 조합의 경우 ndk 또는 gmk 유전자와 동시에 발현하는 경우 GuaA \( (58.7 \mathrm { kDa } ) \), GuaB \((52.0 \mathrm { kDa } ) \) 단백질의 발현수준이 유의적으로 향상되었으며, 특히 gmk 유전자와 동시에 발현하는 경우에 가용성 형태(soluble form)로 발현되는 수준이 증가되었다. Real-time PCR 결과에서도 비슷한 경향이 나타났으며, gmk 유전자와 동시 발현한 경우 RNA 발현량이 4.1배 증가하는 것으로 나타났다. NDK 단백질 \((15.5 \mathrm { kDa } ) \)의 경우 SDS-PAGE 상에서 발현을 확인하 기 어려웠으나, mRNA 발현양은 모두 실험구에서 대조구와 유사한 발현량을 나타냈다.</p> <p>목적하는 6 종류의 유전자 모두가 발현되는 실험구(pME721 + pME987)에서 GuaA, GuaB, NDK, PTPS 단백질의 발현을 육안으로 확인하기 어려웠지만 real-time PCR을 통하여 RNA의 발현을 조사한 결과, ptps 유전자는 6종류의 유전자가 모두 발현된 균주에서 상대적으로 가장 높은 발현량을 나타냈다. 따라서, gmk, ndk, guaA, guaB의 추가발현을 통하여 sepiapterin의 생산량이 증가할 수 있다는 것을 확인하였으며, 경제적인 생산을 위하여 추가적으로 GTP 생합성에 관여하는 유전자의 발현조건 최적화에 관한 연구가 필요할 것으로 판단되었다.</p>