RT-PCR을 사용하여 ALC의 TGF-\(\beta\)에 의한 간 손상 억제 효과를 확인하기 위해 Chang 세포에 0.2 및 0.5 mg/mL의 ALC를 배양하고 TRIzol 용액 500 \(\mu\mathrm{L}\)를 가해 4\(^\circ \mathrm{C}\)에서 30분간 용해하고 Chloroform을 첨가하여 10분간 상온에서 방치하였다. ICR mice 55마리를 무작위로 5그룹으로 나누어 실험을 수행하였고, 정상군과 알코올 투여군에는 생리식염수를, ALC 투여군에는 ALC\( (50 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \) body weight)를 경구투여하고 모든 그룹에는 에탄올을 일주일 간 매일 1회 투여하여 급성 알코올 독성을 유도하였다.
<h2>RT-PCR</h2> <p>ALC의 TGF- \( \beta \) 에 의한 간 손상 억제 효과를 확인하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. Chang 세포에 ALC를 \( 0.2,0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) 농도로 2시간 전처리 한 후 \(10 \mathrm{ng/mL}\) \(\mathrm{TGF-\beta}\)를 처리하였다. 24시간 배양 후 RNA 추출을 위해 TRIzol 용액 \( 500 \mu \mathrm { L } \) 를 가해 4에서 교반기에 30분간 용해 후 Chloroform을 첨가하여 10분 간 상온에서 방치하였다. \( 14,000 \mathrm { rpm } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 조건에서 15분간 원심분리 하여 얻은 상층액에 isopropyl alcohol을 첨가하여 상온에서 10분간 방치한 후 다시 원심 분리하였다. 원심분리하여 얻은 RNA에 \( 70 \% \) ethanol을 가하고 원심분리하는 세척과정을 두 번 반복한 후, 상층액을 버리고 RNA를 공기 중에서 건조하였다. 건조된 RNA에 DEPC 용액을 더한 뒤 정량 하였다. 정량 결과 를 통해 \( 0.9 \mu \mathrm { g } \) 의 RNA를 사용하여  cDNA를 합성하였다. 합성 된 cDNA는 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 냉동보관하며 사용하였으며 중합효소연쇄반응에 이용하였다. 각 유전자의 발현양은 GAPDH 발현양을 기준으로 정량 분석하였다.</p> <h2>실험동물 및 사육환경</h2> <p>본 실험을 위하여 오리엔트바이오(Korea)로부터 5주령 ICR mice 수컷 55마리를 구입하여 사용하였다. 실험기간 동안 사육 실의 온도는 \( 24 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \), 습도는 \( 50 \% \) 를 유지하였으며 조명은 12시간을 주기로 하였다.</p> <h2>급성 알코올 독성 유도</h2> <p>실험을 수행하기 위하여 무작위로 정상군 5마리, 알코올 투여 군 10마리, ALC 투여군 10마리로 그룹을 나누어 실험을 수행하였다. 먼저 정상군과 알콜투여군에 생리식염수를 투여하고, ALC 투여 군에는 ALC \( (50 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \) body weight)을 경구투여 후 30분 뒤에, 정상군에는 생리식염수를, 나머지 두 그룹에는 에탄올 \( (2 \mathrm { ~g } / \mathrm { kg } \) body weight \( ) \) 을 일주일 간 같은 시간에 매일 1회 투여하였다.</p>