본 연구에서는 서실을 이용한 실험을 진행하였으며, 서실의 극성과 비극성 물질 등을 선별 추출하였다. 추출물 분획과 관련하여서는 비극성에서 극성쪽으로 계통 분획하고 각 분획층을 감압 농축 후 동결 건조하여 분말로 만들어 시료로 사용하였다. 시료의 DPPH radical 소거활성 효과는 변형된 Blois의 방법을 이용해 분석되었으며, ROS 측정은 DCFDA 측정방법이 사용되었다. 한편 항균활성 실험의 경우, paper disc method가 사용되었다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 재료 및 방법</h2><h3>시료의 추출</h3><p>시료로 사용된 서실(Chondria crassicaulis, CC)은 2003년 1월 기장 재래시장에서 구입하여 해조류 분류 전문가에게 의뢰하여 학명을 확정하였다. 서실은 건조 후 분쇄하여 시료와 메탄올을 \( 1:5 \)(W/V)로 첨가한 후 상온에서 2회 추출하고, 극성과 비극성 물질등을 선별 추출하기 위하여 에탄올과 다이클로로메탄 \( \left(\mathrm{CH}_{2}\mathrm{Cl}_{2}\right) \)을 1:1로 섞은 용액으로 2회 추출한 회전식 진공농축기로 감압 농축시켜 동결건조하고 서실의 추출물(CCM)로 하여 본 실험에 사용하였다.</p><h3>시료 추출물의 분획</h3><p>서실 추출물 CCM은 scheme \(1 \)과 같이 비극성층에는 hexane층(CCMH), 약한 극성층은methanol층(CCMM), 극성층은 butanol층(CCMB), 강한 극성층인 aqueous층(CCMA)으로 나누어 비극성에서 극성쪽으로 계통 분획하고 각 분획층을 감압 농축 후 동결 건조하여 분말로 만들어 시료로 사용하였다.</p><h2>항산화효과 측정</h2><h3>DPPH radical 소거활성 측정</h3><p>DPPH (1,1-diphenyl-picryl hydrazyl) radical 소거활성 효과는 Blois의 방법을 변형하여 사용하였다. \( 100 \)ppm 농도의 서실의 추출물과 용매별 분획물을 각각 사용하였고 대조군으로는 일반적으로 잘 알려진 항산화제인 Vitamin C(Vit.C)와 Butyl Hydroxy toluene (BHT)를 사용하여 96 well plate에 \( 160 \mu \mathrm{l} \)를 각각 넣고 \( 0.2 \mathrm{mM} \) DPPH \( 40 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하여 vortex로 균일하게 혼합한 다음 실온의 암실에서 30분간 방치한 후, Multi-detection microplate로 \( 520 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. DPPH radical 소거율 측정은 다음과 같이 electron donating activity (EDA)\( \% \)로 구하여 계산 하였다.</p><p>\( { }^{*} \operatorname{EDA}(\%)=\frac{(\text { Blank }-\text { Sample })}{\text { Blank }} \times 100 \)</p><h3>ROS(reactive oxygen scavenger) 측정</h3><p>ROS 제거능을 측정하기 위하여 \( 2^{\prime}, 7^{\prime} \)-dichlorodihydo-fluorescein diacetate (DCFDA) 측정방법을 사용하여 측정하였다. 지용성 DCFDA가 esterase 또는 산화적 가수분해를 받아 비형광성인 \( 2^{\prime}, 7^{\prime} \)-dichlorodihydrofluorescein (DCFH)로 탈아세틸화 되며, DCFH는 활성산소에 의해 산화되어 강한 형광을 나타내는\( 2', 7^{\prime} \)-dichlorofluorescein (DCF)이 된다.</p><p>시료를 10,20 및 \( 30 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)의 농도로 각각 첨가하고 menadione \( 10 \mu l \)를 넣은 후 potassium phosphate buffer (pH \(7.4 \)) \( 130 \mu l \)를 넣어 \( \cdot \mathrm{O}^{2 \cdot} \)를 생성시킨 후, \( 125 \mu l \) DCFDA에 esterase를 넣어 \( \mathrm{DCFH} \)를 형성시키고 이를 \( 50 \mu l\)씩 첨가하여 60분간 생성된 형광의 변화를 측정하였다.</p><h2>항균활성 측정</h2><h3>사용균주 및 배지</h3><p>항균활성 측정에 사용한 균주는 단백질식품 부패균인 Proteus mirabilis와 Sserratia marcescens, 식중독 원인균인Staphylococcus aureus, 부패균인 Bacillus subtilis이며 각 균의 생육 및 보존을 위해 사용한 배지는 Nutrient agar (Difco), Yeast extract, Malt extract를 사용하였다.</p><h3>추출물의 용매 분획별 항균성 검색</h3><p>추출, 분획물의 항균성 검색은 paper disc method를 사용하여 이용하였으며, 항균성 시험용 평판배지는 멸균 후 petri dish에 \( 20 \mathrm{ml} \)씩 분주하여 응고시키고 전배양한 각종 시험균을 무균적으로 첨가하여 기층용 배지 위에 다시 \( 10 \mathrm{ml} \)씩 분주하여 이중의 평판배지를 만들었다. 각 용매 분획별 추출물의 농도를 \( 500 \sim 2000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)로 하여 멸균된 disc (직경 \( 8 \mathrm{~mm} \), Toyo Roshi Kaisha, Ltd,)에 흡수, 건조시켜 균주가 도말된 plate 표면에 올려눟은 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 24시간 배양하여 disc 주위에 생성된 clear zone의 직경 (mm)으로부터 각 분획물의 균 생육 저지대를 측정하여 항균활성을 측정하였으며 이 실험을 5회 반복하여 평균치를 나타내었다.</p><h3>통계분석</h3><p>대조군과 각 시료들로부터 얻은 실험 결과들은 \( \operatorname{mean} \pm \)SEM치로 표시하였고, 각 실험 결과로부터 ANOVA를 구한 후 student's t-test를 이용하여 유의성을 검증하였다.</p>