알긴산 분해 활성을 가지는 해양 미생물을 분리를 위해 부산 해운대 앞 바다에서 여러종류의 미역류를 채취한 후 미생물 분리원으로 사용하여 실험한 결과 콜로니가 성장함에 따라 알긴산 한천 배지에서 콜로니 주변에 halo가 형성되고 직경이 커지는 것을 알 수 있었고 균체외 알긴산 분해효소 생성능이 있는 것이 확인 되었다. 또한 Vibrio sp. Vibrio sp. AEBL-211의 균체외 및 균체내 alginase 효소의 활성 특성평가를 위해 효소를 부분적으로 정제한 결과 SDS-PAGE 젤의 30 \mathrm{kDa}30kDa 부근에서 band가 검출되어 Vibrio sp. AEBL-211 유래의 intracel-lular alginase는 약 30 \mathrm{kDa}30kDa 정도의 분자량을 확인하였다. Alginase 부분정제 평가에서는 AEBL-211 유래의 균체내 alginase는 guluronic acid의 상대적 양이 많은 알긴산에 대한 활성이 뛰어났다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>알긴산 분해 균주 선발 및 동정</h2> <p>알긴산 분해 활성을 가지는 해양 미생물을 분리하기 위하여 부산 해운대 앞 바다에서 다양한 종류의 미역류를 채 취하여 미생물 분리원으로 사용하였다. \( \mathrm{NaCl} ~2.5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \), \( \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} ~0.1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v})\), \(\mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ~0.05 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v})\), \(\mathrm{KCl} 0.05 \% \) \( (\mathrm{w} / \mathrm{v})\), \(\mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl} ~0.1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \), agar \( 2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 로 구성된 하층 평판위에 유일 탄소원으로 sodium alginate \( 1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 을 첨가한 agar \( 2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 로 구성된 상층배지를 만든 다음, 무균의 homogenizer를 이용하여 균질화시킨 미역 샘플 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 를 spreading 하였다. 3~7일간 배양한 결과 알긴산을 유일탄소원으로 제공된 고체배지상에서 성장하는 콜로니를 다수 얻을 수 있었다. 성장을 보인 클로니들은 성장을 위해 알긴산을 분해하여 탄소원 및 에너지원으로 활용하였으므로 고체 배지상에 halo가 형성되는 것을 관측할 수 있었다.Table 1에서와 같이 콜로니가 성장함에 따라 알긴산 한천 배지에서 콜로니 주변에 halo가 형성되고 직경이 커지는 모습이 관측되어 균체외 알긴산 분해효소 생성능이 있음 을 알 수 있었다.</p> <p>분리된 균주는 rod 형태의 Gram-negative 균으로 spore가 없으며, 알긴산 한천 및 TCBS 평판에서의 콜로니 색깔은 노란색이었다. Oxidase 및 nitrase는 양성이고, glucose, maltose, mannitol, N-acetyl-glucosamine, sorbitol 등을 대사하여 산을 생성하였다. GC content는 약 \( 43 \% \) 정도였으며, 생화학 및 영양적인 특성 분석 결과와 Bergey's manual등에 의해 Vibro 속으로 동정되였으며, Vibrio sp. AEBL-211로 명명하였다.</p> <h2>알긴산 분해능</h2> <p>Vibrio sp. AEBL-211를 \( 0.8 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) sodium alginate가 들어있는 액체배지에서 배양하여 제조한 조효소액을 이용하여 sodium alginate 기질에 대한 분해반응을 실시하여 알긴산 분해능을 평가하였다. 알긴산 분해과정에서 생성되는 환원당을 비교해 본 결과, Vibrio sp. AEBL-211, AEBL-212 균주가 각각 \( 0.17 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\), \(0.16 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 로 가장 많은 환원당을 생성하였다. Vibrio sp. AEBL-211 등의 균주에 대하여 \( \mathrm{pH} \), 온도, 탄소원 및 질소원이 세포 성장 및 alginase 생성에 미치는 영향을 분석하고 최적화시킨 조건에서 얻은 조효소액이 아님에도 불구하고, 상대적으로 높은 환원당 생성량을 보여주어 alginase 효소생산용 균주로써의 이용 가능성을 보여주었다. 또한, Vibrio sp. AEBL-211는 고체 agar plate 상에서 시간 경과에 따른 halo 크기도 가장 크게 형성되어 알긴산 분해능이 좋은 것으로 판단하였다. 이들 알긴산 분해균주들은 알긴산 이외에 다른 탄소원을 제공하여 배양한 경우에서는 알긴산 분해능이 저하되는 현상을 보여주어 alginase는 유도효소의 일종으로 판단되었다.</p> <h2>Alginase 부분정제</h2> <p>Vibrio sp. AEBL-211의 균체외 및 균체내 alginase 효소의 활성 특성을 평가하기 위하여 효소를 부분적으로 정제하였다. 정제 방법 및 순서가 Fig. 1에 제시되어 있다. 균체외 조효소액은 배양액을 한외여과기로 농축하여 제조하였고, 균체내 조효소액은 원심분리한 균체를 냉각시킨 \(30 \mathrm{mM} \) Tris-HCI buffer ( \( \mathrm{pH} 7.0)\)로 세척하고 bead beater를 이용하여 약 30분간 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 균체를 냉각된 \( 30 \mathrm{mM} \) Tris-HCl buffer( \( \mathrm{pH} 7.0)\)에 재현탁시킨 다음 원심분리 \( (12,000 \mathrm{rpm}\), \(30 \mathrm{~min}) \) 하여 상층액을 균체내 조효소액으로 사용하였다. 조제된 조효소액을 한외여과기로 농축한 다음 \( 30 \mathrm{mM} \) Tris- HCl buffer\((\mathrm{pH} 7.0)\)로 평형화시킨 음이온 교환수지인 DE52-Cellulose column \( (4.0 \times 30 \mathrm{~cm}) \)에 \( \mathrm{NaCl} \) 을 용출용액으로 이용하여 \( 0 \sim 1.0 \mathrm{M} \) 까지 농도 구배를 주면서 효소를 용출시켰다. 용출액은 \( 10 \mathrm{ml} \)/tube로 분획하였으며, 활성이 있는 분획을 회수하여 ultrafilteration을 통해 농축시킨 다음, Sephacryl G-200 column \((1.5 \times 1 \mathrm{~m}) \) 을 이용하여 다시 정제하였다.</p> <p>Fig. 1에 제시되어 있는 방법을 이용하여 상대적 alg-inase 활성이 높았던 균체내 조효소액으로부터 alginase의 부분정제를 실시하였다. 우선, 파쇄된 균체에서 얻은 상층액에 대하여 DE 52-cellulose를 사용한 이온교환 크로마토 그래피를 행한 결과가 Fig. 2 에 제시되어 있다. \( 0.8 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) Sodium alginate 기질에 대한 분해 활성이 있는 획분이 검출되었으며, 이 활성 획분을 모아 투석 및 농축시킨 다음, Sephacryl G-200 column을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피를 실시하였다. Fig. 3과 같이 알긴산 분해능이 검출된 획분을 얻을 수 있었으며, 이러한 획분액을 투석 및 농축한 후 SDS-PAGE를 실시하였다. SDS-PAGE 젤의 \( 30 \mathrm{kDa} \) 부근에서 band가 검출되어 Vibrio sp. AEBL-211 유래의 intracel-lular alginase는 약 \( 30 \mathrm{kDa} \) 정도의 분자량을 가지는 것으로 판단하였다. 문헌에 보고된 Vibrio 유래의 세포외 alginate lyase 활성을 가지는 단백질의 크기는 약 25,000~27,000정도의 분자량을 가지며, 세포내 alginase는 약 23,000 정도의 분자량을 가지는 것으로 보고되고 있어, 이들 효소와는 다른 alginase 효소임을 추론할 수 있었다.</p> <h2>Alginase 활성 특성 분석</h2> <p>일반적으로 sodium alginate의 점도가 높을수록 gul-uronic acid에 대한 mannuronic acid의 비율이 낮아지는 것으로 알려져있다. 이러한 알긴산 조성의 차이를 alginase의 분해특성 평가에 활용하기 위하여, 부분 분리한 alginase 조효소를 이용하여 guluronic acid에 대한 man-nuronic acid의 비율이 다른 고점성, 중간 점성, 낮은 점성을 가진 3종류의 Na-alginate 시료에 대한 분해능을 평가하였다. 12시간의 반응시간동안 분해과정을 측정한 결과, guluronic acid에 대한 mannuronic acid의 비율이 가장 낮은 고점성 알긴산 시료에서 상대적 alginate 분해 효율이 가장 높아 Vibrio sp. AEBL-211 유래의 균체내 alginase는 guluronic acid의 상대적 양이 많은 알긴산에 대한 활성이 우수함을 알 수 있었다.</p>