원형질체 pellet을 glucose, mannitol, coconut water 및 PGR로 이루어진 B5 배지에 분주하여 희석한 후 petri-dish에 3mL씩 분주했다. 이렇게 해서 만들어진 pellet을 25\(^\circ \mathrm{C}\)에서 암배양한 후 배추 인자형에 대한 각각의 처리별 세포분열율을 조사하는 한편, PGR 조성이 동일한 8p−KM 수정배지를 각 배양물에 첨가하였다. 배양 시작 14일 후에는 배추 인자형에 대한 micro-callus 생장을 처리별로 조사하고 동일한 생장조절제 조성의 MS 수정배지를 추가로 첨가하였다.
<h2>원형질체 배양과 micro-callus 생장</h2> <p>수세가 완료되어 tube에 침강한 원형질체 pellet은 glucose \( 0.1 \mathrm { M } \), mannitol 0.3 M, coconut water (Sigma-Aldrich, USA) \( 10 \mathrm { ~mL } / \mathrm { L } \) 및 식물생장조절제 (PGR) 조성을 달리한 4종의 B5 배지 (Gamborg et al. 1968)를 이용하여 \( 5 \times 10 ^ { 4 } \)개/mL로 희석한 후 \( 60 \times 10 \mathrm { ~mm } \) petri-dish에 \( 3 \mathrm { ~mL } \) 씩을 분주하였다. 배양물은 연속 암배양 하거나 처음 3일간 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 암배양한 후 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } , 16 \) 시간 명 \( \left (12.5 \mu \mathrm { mol } \cdot \mathrm { m } ^ { -2 } \cdot \mathrm { s } ^ { -1 } \right ) / 8 \) 시간 암 조건으로 이동하였다. 원형질체 배양 시작 7일 후 6개 배추 인자형 (노랑봄, 조생추석, 향풍, 국보65일, 서울, 원예20021호)에 대한 각각의 처리별 세포분열율을 조사하는 한편, PGR 조성이 동일한 8p−KM 수정배지를 각 배양물에 \( 3 \mathrm { ~mL } \)씩 첨가하였다. 8p-KM 수정 기본배지는 KM배지 (Kao and Michayluk 1975)에 glucose와 sucrose를 각각 \( 50 \mathrm { mM } \), mannitol \( 0.1 \mathrm { M } \), mannose, fructose, ribose, xylose, rhamnose, cellobiose를 각각 \( 250 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \), casamino acid \( 250 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) 및 coconut water \( 10 \mathrm { ~mL } / \mathrm { L } \)를 첨가하고 \( \mathrm { pH } \) 를 5.8로 조정하여 조제하였다. 원형질체배양 시작 14 일 후 6개 배추 인자형에 대한 micro-callus 생장을 처리별로 조사하고 동일한 생장조절제 조성의 MS 수정배지 (MS 배지, sucrose \( 50 \mathrm { mM } \), mannitol \( 50 \mathrm { mM } \), PVP K40 \( 500 \mathrm { mg } / \mathrm { L } , \mathrm { pH } 5.8) \)를 \( 6 \mathrm { ~mL } \)씩 추가 첨가하였다. MS 수정배지 추가 첨가 직 후 배양물을 약 \( 3 \mathrm { ~mL } \)씩 균일하게 4등분하여 새로운 \( 60 \times 10 \mathrm { ~mm } \) petri-dish로 옮겨 배양하였다. Petri-dish는 매일 2회씩 가볍게 흔들어 줌으로써 배양물이 petri-dish 바닥에 부착하는 것을 방지하였다. 모든 수정 배양액 조성은 Jee와 Chung ( (1989a ; 1989b ; 1989c)의 보고를 참고하였다.</p>