된장에서 증균하여 분리된 분리균 YB- \( 1401 \)의 RDNA 및 산성조건에서 균의 성장도를 조사하였다. rRNA 유전자를 PCR로 증폭한 후 BLAST 검색방법으로 \( 16 \mathrm { S } \) rDNA database와 비교한 결과 Bacillus속의 어느 균종에 속한다고 판단할 수 없다. 플라스크. 또한 \( \mathrm{pH} 4.5\) LB 액체 배지에서 16시간 정도 배양하며 배양액의 흡광도를 조사한 결과, B.subtilis 168의 실험 결과와는 큰 차이를 나타냈다.
<p>또한 분리균 YB- \( 1401 \)의 \( 16 \mathrm { S } \) rRNA 유전자를 PCR로 증폭한 후 \( 1,496 \mathrm { bp } \) 크기의 염기서열을 결정하고 (GenBank accession no. \( KJ57222 \)) 이를 미국 NCBI의 BLAST 검색방법으로 \( 16S \) rDNA database와 비교하였다. 그 결과 \( B \).amyloliquefaciens \( FZB42 \) (NR_ \( 075005 \))와 가장 유사도가 높았으며 비교된 \( 1,493 \)개 염기중 \( 1 \)개 염기가 달랐고 B. subtilis \( 168 \) (NR_ \( 102783 \))과는 \( 4 \)개 염기가 다른 것으로 확인되었다. 그러나 분리균과 생화학적 특성의 유사도가 가장 높았던 B. laterosporus의 \( 16S \) rDNA 염기서열(AB \( 112720 \))과는 \( 89 \% \) 수준의 낮은 유사도를 보였다. 그러므로 현재의 결과로는 분리균이 Bacillus속의 어느 균종에 속한다고 판단할 수 없다고 하겠다. 한편 된장이나 청국장으로부터 \( B \). licheniformis가 \( \beta \)-glucanase 와 \( \alpha \)-amylase 의 생산균으로 분리되었으며, mannanase를 생산하는 B. subtilis도 분리된 바 있으나, mannanase를 생산하는 B. laterosporus 또는 B. amyloliqueaciens는 보고되지 않았다.</p> <p>\( \mathrm { YB } -1401 \)은 된장을 \( \mathrm { pH~ } 4.5 \)의 조건에서 증균한 후 분리된 것이므로 산성조건에서 균의 성장도를 조사하기 위해 \( \mathrm { pH } \)가 \( 4.0 \)과 \( 4.5 \)로 조절된 LB 액체 배지에서 \( 16 \)시간 동안 플라스크 배양을 하면서 배양액의 흡광도를 조사하였다. 그 결과 \( \mathrm { YB } -1401 \)은 \( \mathrm { pH~ } 4.0 \) 배지에서는 전혀 성장하지 못하였고 \( \mathrm { pH } \) \( 4.5 \) 배지에서는 배양초기에 균의 성장이 매우 느렸지만 배양 시간이 \( 10 \)시간 정도에 이르렀을 때부터 빠른 성장을 보였다. 한편 된장에서 B. subtilis에 속하는 균주가 mannanase 생산균으로 분리된 바가 있어 B. subtilis 중 실험균으로 널리 사용되고 있는 B. subtilis \( 168 \)를 \( \mathrm { pH~ } 4.5 \) 배지에서 배양한 결과 전혀 성장하지 못하여 분리균 YB- \( 1401 \)과는 큰 차이를 나타냈다(결과 미제시).</p> <h1>부가탄소원에 따른 mannanase 생산성</h1> <p>곰팡이와 세균 유래의 mannanase는 mannan 다당류를 함유한 물질에 의해 그 생산성이 크게 증가하는 경우가 많다. B. subtilis BS \( 5 \), B. subtilis WL- \( 7 \)과 B. subtilis WY \( 34 \)는 곤약, Aspergillus niger BCC \( 4525 \)와 B. halodurans PPKS- \( 2 \)는 copra meal에 의해 mannanase 생산성이 증가하는 것으로 보고되었다. 그러므로 부가 탄소원이 Bacillus sp. YB- \( 1401 \)의 mannanase 생산성에 미치는 영향을 조사하기 위해 여러 종류의 탄수화물이 \( 0.5 \% \) \(( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \)가 되도록 각각 첨가된 \( \mathrm { LB } \) 배지에서 배양온도를 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 하여 \( 24 \)시간 동안 진탕 배양한 후 배양상등액에 존재하는 mannanase 활성을 조사하였다. 그 결과 곤약이 첨가된 배지에서 효소 생산성이 가장 높았으며, 이외에도 mannan 다당류를 함유한 LBG와 guar gum에 의해서도 그 생산성이 크게 증가하였다. 그러나 mannan 다당류를 함유한 농산부산물인 palm kernel meal에 의한 효소 생산량의 증가정도는 높지 않은 것으로 나타났다(Table \( 2 \)). 또한 곤약의 첨가량을 달리하였을 때 그 함량이 높을수록 효소 생산량이 크게 증가하여 \( 4 \% \) 곤약을 첨가하였을 때 최대 생산성을 보였다. 이는 곤약을 첨가한 LB 배지에서 곤약의 함량이 \( 0.5 \% \)일 때 mannanase 생산성이 최대이고 그 이상의 함량을 첨가해도 mannanase 생산성이 더 이상 증가하지 않은 B. subtilis WL- \( 7 \)에 비해 크게 다른 점이라고 할 수 있다. B. subtilis WY \( 34 \)도 \( 2 \% \) 곤약을 첨가한 배지에서 mannanase 생산성이 가장 높은 것으로 알려젔다. 실제 곤약이 첨가된 LB 배지는 점도가 높아지고 특히 \( 2 \% \) 이상을 첨가하였을 때는 배양 초기에 액체배지가 제대로 진탕이 되지 않았으며, \( 4 \% \) 곤약을 첨가한 배지는 agar를 첨가하지 않았지만 거의 고형의 상 태였다. 그러나 배양이 진행되면서 분리균이 생산하는 mannanase에 의해서 곤약이 분해됨으로써 배양 중기부터는 배지의 점질도가 급격하게 저하되고 \( 24 \)시간 배양 후에는 배양액에 점질도가 없었다.</p>