제주도에서 채집한 다시마,미역,곰피의 건조분말시료를 파라제주에서 구입하여 증류수를 첨가한후 추출액을 농축하여 농축된 추출액을 동결건조장치를 이용하여 동결건조 후 추출물을 얻었으며 공진단은 한국전통약선에서 제공받았으며, 함유성분으로는 당귀, 산수유, 인삼, 숙지황이, 녹용가수분해물, 꿀, 침향 , 유당으로 구성되어 있으며CAT 단백질의 함량측정 결과는 BCA protein assay reagent kit 를 이용해 측정한 각 추출물의 총 단백질 함량으로 표준화시켰다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>갈조류로부터 추출물의 제조</h2> <p>제주도에서 채집한 다시마(L. japonica), 미역(U. pinnatifida), 곰피(E. stolanifera) 의 건조분말시료를 파라제주에서 구입하여 각각 10배량 (W/v) 의 \( 80 \% \) ethanol 혹은 3차 증류수를 첨가한후, \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 6시간 동안 추출을 수행하였으며, 추출액을 지름 \( 150 \mathrm{~mm} \) 의 여과지(Advantec, Japan)를 이용하여 2회 여과한 후, rotary vacuum evaporator (R-200, Buchi, Switzerland)로 농축하여 농축된 추출액을 동결건조장치(FD8518, Ilshin Bio-Base, Korea)를 이용하여 동결건조 후 추출물을 얻었다. 동결 건조한 추출물 \( 100 \mathrm{mg} \) 을 \( 70 \% \) ethanol 혹은 3차 증류수 \( 1 \mathrm{ml} \) 에 용해한 후, 필터 \( (0.20 \mu \mathrm{m} \) filter)를 통과시켜 멸균하여 사용하였다.</p> <h2>해조공진단 제조</h2> <p>공진단은 한국전통약선에서 제공받았으며, 함유성분으로는 당귀, 산수유, 인삼, 숙지황이 \( 4 \% \) , 녹용가수분해물 \( 5.1 \% \) , 추출물형태의 당귀, 산수유, 인삼, 숙지황이 \( 28 \% \) , 꿀 \( 47.5 \% \) , 침향 \( 2 \% \) , 유당 \( 1.3 \% \) 로 구성되어 있으며, 공진단에 각각의 해조류를 \( 5 \% \) 씩 첨가하여 제조하였다.</p> <h2>에스트로겐 유사활성 측정</h2> <p>본 연구진에 의해 제작된 에스트로겐 유사물질 검정용 세포주 MCF7/pDsCAT-ERE119-Ad2MLP 세포를 \( 10 \% \) dextran-coated charcoal stripped FBS (CSF) 를 포함하는 Dulbec-co's modified Eagle's medium (DMEM, BioWhittaker, USA) 배지를 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 배양하였다.</p> <p>배양된 세포의 세포밀도(confluence)가 약 \( 90 \% \) 가 되었을 때 1X phosphate buffered saline (PBS)으로 세척한 후, 새로운 \( 10 \% \) CSF를 포함하는 DMEM배지로 교환하였다. 여기에 각 시료들을 최종농도 \( 5,50,500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 가 되도록 첨가하였고, 표준물질로 \( 100 \% \) 에탄올에 녹인 17ß-estradiol (RBI, Natick, MA, USA)을 최종농도 \( 10^{-7} \mathrm{M} \) 이 되도록 처리하였다. 그 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \%, \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 48시간 동안 배양한 다음 세포를 회수하였고, PBS로 2회 세정한 후, \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 5분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 이후 lysis buffer \( 250 \mu 1 \)를 첨가하여 세포를 현탁하고 실온에서 30 분간 방치한 후, CAT-ELISA Kit (Roche Applied Science, Mannheim, Ger-many)를 사용하여 각 세포추출물 \( 200 \mu \) 의 chloramphenicol acetyltransferase (CAT) 단백질의 함량을 측정하였다. CAT 단백질의 함량측정 결과는 BCA protein assay reagent kit (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용해 측정한 각 추출물의 총 단백질 함량으로 표준화시켰다.</p>