항혈전 활성은 시료의 thrombin time을 측정하고, 트롬빈 저해 활성은 기존의 보고한 Amelung coagulometer KC-1A를 이용하여 혈액 응고시간을 측정하여 평가하였다. 호이초 시료의 항산화 활성은 DPPH radical 소거능, superoxide dismutase 유사활성 및 환원력 측정에 의해 평가하였고, Superoxide dismutase 유사활성 평가는 pyrogallol 자동산화를 측정하는 Marklund와 Marklund의 방법을 변형하여 측정하였으며, 총 flavonoid의 함량 측정은 기존의 보고한 방법에 따라 흡광도를 측정하였다.
<h2>항혈전 활성</h2> <p>항혈전 활성은 시료의 thrombin time을 측정하여 평가하였다. 트롬빈 저해 활성은 기존의 보고한 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)를 이용하여 혈액 응고시간을 측정하여 평가하였다. \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 0.5 \mathrm{U} \) 트롬빈(Sigma Co., USA) \( 50 \mu \mathrm{L} \) 와 \( 20 \mathrm{~mM} \mathrm{~CaCl}_{2} ~50 \mu \mathrm{L} \), 다양한 농도의 시료 추출액 \( 10 \mu \mathrm{L} \) 를 coagulometer의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 \( 100 \mu \mathrm{L} \)를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였으며, 시료 대조군으로는 아스피린(Sigma Co.)을, 용매 대조군으로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 평균 33.1초의 응고시간을 나타내었으며, 트롬빈 저해 활성은 3회 이상 반복한 실험의 평균치를 용매 대조구인 DMSO의 평균치의 비로 나타내었다.</p> <h2>항산화 활성 평가</h2> <p>호이초 시료의 항산화 활성은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical 소거능, superoxide dismutase 유사활성 및 환원력 측정에 의해 평가하였다. 먼저 DPPH 소거능의 경우, 다양한 농도로 희석한 시료 \( 20 \mu \mathrm{L} \)에 \( 99.5 \% \) 에탄을에 용해시킨 \( 2 \times 10^{-4} \) M DPPH 용액 \( 380 \mu \mathrm{L} \)를 넣고 흔합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분 동안 반응시킨 후, \( 516 \mathrm{~nm} \)에서 microplate reader(Asys Hitech, Expert96, Asys Co., Austria)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 대조구로는 butyl hydroxytoluene, vitamin C 및 vitamin E(Sigma Co., USA) 를 사용하였다. DPPH free radical 소거능은 시료첨가구와 비첨가구의 백분율로 표시하였으며, \( \mathrm{IC}_{50} \)는 \( 50 \% \) 소거능을 나타내는 농도로 계산하였다. Superoxide dismutase 유사활성 평가는 superoxide와 반응하여 갈변물질을 만드는 pyrogallol 자동산화를 측정하는 Marklund와 Marklund,의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉 시료용액 \( 0.2 \mathrm{~mL} \)에 Tris- \( \mathrm{HCl} \) buffer(50 mM tris, 10 \( \mathrm{mM} \) EDTA, pH 8.5) \( 3 \mathrm{mL} \)와 \( 7.2 \mathrm{mM} \) pyrogallol \( 0.2 \mathrm{~mL} \)를 가하고, \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시킨 후, \( 1 \mathrm{N}~ \mathrm{HCl} ~1 \mathrm{mL} \)로 반응을 정지시킨 후, \( 420 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. SOD 유사활성은 시료 첨가군과 무첨가군과의 흡광도비로 나타내었다. 한편 호이초 시료의 환원력 평가는 Oyaizu등의 방법에 준해 측정하였다. 에탄올에 용해한 시료 \( 2.5 \mathrm{~mL} \)에 \( 0.2 \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer\(\mathrm(pH 6.6)\) \( 2.5 \mathrm{~mL} \) 와 \( 10 \% \) potassium ferricyanide \( 2.5 \mathrm{~mL} \) 를 첨가하고 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 분간 반응시킨 후, \( 10 \% \) trichloroacetic acid \( 2.5 \mathrm{~mL} \)를 첨가하여 반응을 종료하고 \( 4000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액은 증류수로 2배 희석한 후, 신선하게 조제된 \( 0.1 \% \) ferric chloride 용액과 \( 5: 1 \) (v/v) 비율로 혼합 하고 \( 700 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 평가하였다.</p> <h2>기타 분석</h2> <p>총 flavonoid의 함량 측정은 기존의 보고한 방법에 따라 측정하였으며, 각각의 시료를 18시간 메탄올 교 반 추출하고 여과한 추출검액 \( 400 \mu \mathrm{L} \)에 \( 90 \% \) diethylene glycol \( 4 \mathrm{~mL} \) 를 첨가하고 다시 \( 1 \mathrm{~N} ~\mathrm{NaOH} ~40 \mu \mathrm{L} \)를 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응 후 \( 420 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 표준시야으로는 rutin을 사용하였다. 총 polyphenol 함량은 추출검액 \( 400 \mu \mathrm{L} \)에 \( 50 \mu \mathrm{L} \)의 Folin-ciocalteau, \( 100 \mu \mathrm{L} \)의 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 \( 725 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 표준시야으로는 tannic acid를 사용하였다. 총당 정량의 경우에는 phenolsulfuric acid법을, 환원당 정량의 경우에는 DNS 변법을 이용하였다.</p>