Blank와 control group은 sample의 처리없이 배양하였으며 그 후 각 well의 상등액을 이용하여 procollagen type C-peptide assay kit와 MMP-1 hunam ELISA kit을 사용하여 실혐을 진행하였고, Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrate를 이용하여 60 분간 반응시킨 후 Chemi-Doc을 이용 하여 현상하였다. 실혐군 간의 차이는 \( 95 \% \) 수준에서 유의성 있는 것으로 하였다.
<h3>Pro-collagen 합성 및 MMP-1 발현 측정</h3> <p>CCD-986sk 세포를 배양한 후 6 well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cell/wells 로 접종하고 24시간 배양하였다. 동일 배지로 교체한 후 UVB \( \left (20 \mathrm { ~mJ } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \right ) \) 을 조사 한 뒤, casuarictin을 \( 5,10,25 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 희 석하여 처리한 후 48 시간 배양하였다. Blank와 control group은 sample의 처리없이 배양하였으며 그 후 각 well의 상등액을 이 용하여 procollagen type C-peptide assay kit와 MMP-1 hunam ELISA kit을 사용하여 실혐을 진행한 뒤, microplate reader로 \( 450 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h3>Western Blot을 이용한 단백질의 발현 측정</h3> <p>CCD-986sk 세포를 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { cell } / \) wells로 6 well plate에 분주하 여 24시간 배양한 후에 UVB \( \left (20 \mathrm { ~mJ } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \right ) \) 를 조사한 뒤 casuarictin을 처리하여 48시간 배양하였다. 세포를 RIPA buffer (Pierce, Rockford, IL, USA)로 용해하고 원심분리한 후 얻은 상층액을 \( 10 \% \) SDS-PAGE를 이용해 전기영동하고 PVDF membrane으로 이전시켰다. \( 5 \% \) skim milk가 함유된 tris 완충 용엑으로 1시간 blocking 한 후, Pro-collagen, MMP-1, \( \beta \)-actin 각각의 1 차 및 2 차 항체와 반응시켰다. 반응 후 Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrate (Millipore, Billerica, \( \mathrm { M } \Lambda, \mathrm { US } \Lambda \) )를 이용하여 60 분간 반응시킨 후 Chemi-Doc을 이용 하여 현상하였다.</p> <h3>통계처리</h3> <p>본 실험의 통계처리는 SPSS \( 12.0 \) 을 사용하였다. 각 실험군의 결과는 평균치와 표준편차로 나타내었으며, 각 실험군의 간의 결과는 2 -표본 \( \mathrm { t } \) 검정을 사용하여 분석하고 유의적인 차이가 있 는 항목에 대해서만 검정하였다. 실혐군 간의 차이는 \( 95 \% \) 수 준 \( \left ( { } ^ { * } p<0.05, { } ^ { * * } p<0.01 \right ) \) 에서 유의성 있는 것으로 하였다.</p>