Protease 활성도의 측정은 2일 배양된 균체액을 원심분리하여 고효소액을 조제, 기질액은 casein 용액으로 조제, \( \alpha \)-Amylase 활성 측정은 수용성 전분 기질로 측정, Glucoamylase 활성 측정은 생전분을 기질로 측정하였고, DNS법으로 반응 전후 액 중의 환원당 양을 측정하고, 양자의 차이로부터 효소반응에서 생산된 환원당 양을 산출하였다. 청국장의 혈전용해능 측정은 시료용액은 phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 7.5)에 \( 0.85 \% \mathrm{NaCl} \) 을 용해한 용액을 청국장에 첨가후 24시간 추출, 여과 후 제조하며, 멸균한 샤레에 분주하고 1시간 방치해 제조한다. Fibrinolytic activity의 측정은 시료용액과 fibrin plate를 보운 후 일정시간 반응시켜 형성괸 투명환의 장축 지금을 측정해 비교하는데 다음 시료용액의 활성과 비교한다.
<h2>효소활성 측정</h2> <p>Protease 활성도의 측정은 LB 배지에서 2 일 배양한 균체액을 원심분리하여 고 효소액을 조제하였으며, 기질액은 milk casein \( 1.8 \mathrm{~g}\)을 sodium phosphate buffer \(\mathrm{pH~} 7.2\) \(\mathrm{ml~}300 \)에 녹여 \( 0.6 \% \) casein 용액으로 조제하였다. 효소활성 측정은 기질용액 \(1 \mathrm{~ml} \)와 증류수 \( 1 \mathrm{~ml} \) 를 시험관에 넣고 항온수조에서 전처리한 후, 조효소액 \( 1 \mathrm{~ml} \)를 가하여 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 30 분 간 반응시킨 다음, \( 0.4 \mathrm{~M} \) trichloro acetic acid (TCA) \(3 \mathrm{~ml} \) 를 가하고 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 분간 방치하여 반응을 중지시켰다. 반응중지액을 원심분리하여 침전물을 제거한 다음, 상징액 \(2 \mathrm{~ml} \)에 \( 0.5 \mathrm{~M} \mathrm{~Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} ~ 5 \mathrm{~ml} \)와 3배 희석한 Folin phenol 시약 \(1 \mathrm{~ml} \)를 가하여 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 항연구조에서 30분간 발색시킨 후 실온으로 냉가시킨 다음, UV/Vis spectrophotometer로서 \(660 \mathrm{~nm} \)에서 optical density (OD)를 측정하여 tyrosine \( (\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)의 양으로 환산하여 protease활성을 나타내었다. Protease의 1 unit는 중호소액 \(1 \mathrm{~ml} \)가 1 분간에 \( 1 ~ \mu \mathrm{g} \)의 tyrosine을 생성하는 효소의 양으로 하였다.</p> <p>\( \alpha \)-Amylase 활성 측정은 수용성 전분을 기질로 하여 다음과 같이 측정하였다. 조효소액 \( 1 \mathrm{~ml} \)에 \( 1 \% \) 수용성 전분을 함유한 \( 0.1 \mathrm{M} \) acetate buffer \( (\mathrm{pH} \) 4.8) \( 10 \mathrm{~m} \) 를 가하고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반응시킨다. 10분 후에 반응액 \( 1 \mathrm{~ml} \) 를 취하고 여기에 \( 0.1 \mathrm{~N} \mathrm{HCl~} 10 \mathrm{~ml} \) 를 가하여 반응을 정지시켰다. 그 액 \( 0.5 \mathrm{~ml} \) 에 \( 0.005 \% \) iodine과 \( 0.05 \% \) potassium iodine을 함유한 발색액 \( 10 \mathrm{ml} \)를 가한 후 \( 660 \mathrm{~nm} \)에서 OD를 측정하였다. \( \alpha \)-Amylase의 1 unit는 amylose-iodine complex의 blue color가 \( 10 \% \) 감소되는 효소량으로 하였다.</p> <p>Glucoamylase 활성 측정은 생전분을 기질로 하여 다음과 같이 측정하였다. \( 1 \% \) 의 생전분을 함유한 \( 0.05 \mathrm{~M} \) acetate buffer \( (\mathrm{pH} 4.8) 5 \mathrm{~ml} \) 에 동일의 완충액 \( 2 \mathrm{~ml} \) 를 가하고, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 수 분간 보온하였다. 여기에 조효소액 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 가하고 30분간 반응시킨 후, 그 액 \( 1 \mathrm{ml} \)를 취하여 DNS법에 따라 반응 전후 액 중의 환원당 양을 측정하고, 양자의 차이로부터 효소반응에서 생산된 환원당 양을 산출하였다. Glu-coamylase의 1 unit는 1 시간에 \( 1 \mu \) mole의 glucose를 생산하는 효소 양으로 하였다.</p> <h2>혈전용해능 측정</h2> <p>청국장의 혈전용해능 측정을 위한 시료용액은 \( 0.1 \mathrm{~M} \) phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 7.5)에 \( 0.85 \% \mathrm{NaCl} \) 을 용해한 용액 \( 100 \mathrm{~ml} \)를 마쇄한 청국장 \( 5 \mathrm{~g} \)에 첨가하고 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24 시간 추출한 후 여과(Whatman No. 2)하여 제조하였다. Fibrin plate는 \( 0.01 \mathrm{~M} \mathrm{~NaCl} \) 이 함유된 \( 0.17 \mathrm{~M} \) 붕산염을 동일 완충용액( \( \mathrm{pH} 7.5) \)중에 용해시킨 용액 중에 fibrinogen의 농도가 \( 0.15 \% \)로 되게 한 다음, 이 용액 \( 10 \mathrm{ml} \)를 직경이 \( 90 \mathrm{ma} \)인 멸균된 샤레에 분주하고 thrombin (\(20 \text{unit}/\mathrm{ml}\)) \( 0.5 \mathrm{ml} \)를 가하여 잘 흔합한 다음 덮개를 덮어 실온에서 1 시간 방치하여 제조하였다.</p> <p>Fibrinolytic activity의 측정은 시로용액과 fibrin plate를 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 분간 각각 보온한 후, fibrin plate에 시료용액 \( 10 \mu \mathrm{l} \)를 적가하고 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 일정시간 반응시켜 형성된 fibrin용해 투명환의 장축 지름(\(\mathrm{mm} \))를 측정하여 비교하였다. 표준 plasmin용액을 \( 1.0 \text{unit} / \mathrm{m} \) 로 되도록 tris-\( \mathrm{NaCl} \) 완충용액으로 조제한 후, fibrin plate에 \( 10 \mu \mathrm{l} \)씩 적가하여 형성된 장축 지름을 측정한 다음 시료용액의 활성과 비교하였다.</p>