Bacillus sp. J105 균주로부터 생성된 세포외 \( \beta \)-lactamase를 정제하는 과정을 보여준다. 생성된 침전물은 \( 0. 1 \mathrm { ~M } \) Tris-HCI buffer로 용해하고 2~3일간 투석한 후, DEAE-Sephadex A-50 column에 흡착시킨다. 비 흡착 단백질과 불순물은 동일한 buffer로 세척하여 제거하고, \( 0 \sim 0. 2 \mathrm { M } \)의 \( \mathrm { NaCl } \)이 포함된 Tris-HCI buffer로 line-ar-gradient elution하여 흡착 단백질을 분획 용출한다.
<p>\( \mathrm { U } = \text { 가수분해 된 기질의 농도 } \times 1 / \mathrm { T } \times 1 / \mathrm { V } \) ( \( \mathrm { T } \): 효소반응 시간, \( \mathrm { V } \): 반응액에 첨가된 효소용액의 부피)</p> <h2>단백질 농축 및 정량</h2> <p>동결건조법으로 효소 단백질을 농축하였다. 단백질 정량은 spectrophotometer를 사용하여 \( 280 \mathrm { ~nm } \)에서의 흡광도로 측정하는 방법과 Lowry 등의 방법을 병행하여 측정하였다. 단백질 표준물질은 bovine serum albumin (Sigma Co.)을 사용하였다.</p> <h2>효소의 정제</h2> <p>Bacillus sp. J105 균주가 생산하는 세포외 \( \beta \)-lactamase의 물리화학 및 효소화학적인 성질을 검토하기 위하여 전술한 바와 같이 조효소를 제조하여 다음과 같은 방법에 의하여 정제하였다.</p> <h2>Ammonium sulfate 침전</h2> <p>조효소액에 ammonium sulfate를 천천히 첨가하여 \( 80 \% \) 포화시킨 다음 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20시간 서서히 저어주면서 방치한 후 원심분리 \( (23,000 \times \mathrm { g } , \text { 20 min } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } ) \) 하였다. 생성된 침전물을 모아 적당량의 \( 0.1 \mathrm { ~M } \) Tris-HCI buffer ( \( \mathrm { pH~ } 7.5 \))로 용해하여 동일 buffer로 2~3일간 충분히 투석하였다. 투석이 끝난 효소액은 원심분리( \( (23,000 \times \mathrm { g } , text { 20 min } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } ) \)하여 침전물을 제거하고 효소활성을 확인한 후 다음의 정제 과정에 사용하였다.</p> <h2>DEAE-sephadex A-50 chromatography 와 gel filtration</h2> <p>전 단계에서 얻은 효소액을 \( 0.01 \mathrm { ~M } \) Tris-HCI buffer ( \( \mathrm { pH~ } 7.5 \))로서 충분히 평형화시킨 DEAE-Sephadex A-50 column \( (3 \times 15 \mathrm { ~cm } \), Sigma Co.)에 흡착시켰다. 그 후 비 흡착 단백질 및 불순물을 동일 buffer로서 충분히 세척하여 제거한 후 \( 0 \sim 0.2 \mathrm { M } \)까지의 \( \mathrm { NaCl } \) 함유 Tris-HCI buffer ( \( \mathrm { pH~ } 7.5 \))로 line-ar-gradient elution하여 흡착 단백질을 시간 당 약 \( 16 \mathrm { ~ml } \) 정도로 분획 용출하였다. 각 분획마다 효소활성과 단백질 량을 측정한 다음 활성이 가장 강한 분획을 모아 투석한 후 농축하여 다음 정제과정에 사용하였다. \( 0.1 \mathrm { ~N } \)의 \( \mathrm { NaCl } \)이 함유된 동일한 buffer로서 평형화시킨 Sephadex G-200 (Sigma Co.)이 충진된 column \( (2 \times 90 \mathrm { ~cm } ) \)을 사용하여 gel filtration을 행하였다. 유속을 시간 당 \( 8 \mathrm { ~ml } \) 정도로 하여 1 분획에 \( 2 \mathrm { ~ml } \) 씩 분취하여 효소활성과 단백질을 측정하여 활성 분획물을 취하였다.</p>