이는 황련 물 추출물이 저산소증에서 신경 세포 사망을 억제하는 효과가 있다는 것을 의미한다. 이는 세포가 손상을 받아 ROS를 많이 생성하고 있음을 나타낸다. 이는 ROS을 생성하는 세포의 수뿐만 아니라 생성되는 양도 대조군과 비교하여 유의하게 많음을 나타낸다 (\(p<0.01\)). Fig. 7에서 확인할 수 있듯이, 황련의 작용으로 ROS 생성 세포의 수는 정상 산소 환경에서 유의하게 감소했지만, 저산소증 유발 후에는 대조군과 차이가 없었다. 그러나 형광의 강도에 대해서는 5일째를 제외하고는 실험군 전체에서 현저히 감소한 것을 알 수 있다.
<h1>결 과</h1> <h2>저산소증에서 황련이 신경세포사멸에 미치는 영향</h2> <p>추출물이 저산소증을 유도한 신경세포를 보호하는 효능을 조사하기 위하여 흰쥐 \( \mathrm{E}_{18} \) 대뇌신경세포를 뉴로베이잘 배지에 배양하고 DIV 10에 황련 \( 1.0 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)를 처리하고 3일간 더 배양 한 후, DIV 13에 배양용기를 특수 이산화탄소 배양조 \( (\mathrm{CO}_{2}\) Water Jacketed Incubator, Forma Scientific Inc.)를 이용하여 \( 2 \%\) \(\mathrm{O}_{2} / 5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2} \) 환경에서 3시간 처리하여 저산소증을 유도하였다. 저산소 처리가 끝나면 배양세포를 정상산소 환경 배양조에 옮기고 계속 배양하면서 세포의 생존율을 LDH 방법으로 조사한 결과, 대조군에 비하여 황련을 첨가하기 직전(DIV 10)에는 \( 100.8 \pm 2.01 \% \), 저산소증을 유발하기 직전(DIV 13), 유발 후 1일(DIV 14), 3일(DIV 16), 5일(DIV 18)에 각각 \( 98.16 \pm 4.62\), \(108.98 \pm 4.24\), \(122.74 \pm 4.60(\mathrm{p}<0.01)\), \(128.88 \pm 2.64 \%(\mathrm{p}<0.01) \)의 생존율을 나타내었다. 이는 황련 물추출물이 저산소증에서 신경세포 사망 억제 효능이 있음을 의미한다.</p> <h2>\( \mathrm{H}_{2}\)DCF-DA 염색을 이용한 ROS의 측정</h2> <p>\( \mathrm{H}_{2}\)DCF-DA는 세포막 투과성으로서 세포내에 들어가면 esterase에 의하여 2',7'-dichlorodihydrofluorescein (\(\mathrm{H}_{2}\)DCF)로 변환된다. (\(\mathrm{H}_{2}\)DCF)는 민감하게 산화되어 2',7'-dichloro-fluorescein (DCF)로 바뀌어 초록(green) 형광을 낸다. 저산소증을 유발하고 3일후 \( \mathrm{H}_{2}\)DCF-DA를 이용하여 ROS 생성세포를 관측한 사진을 Fig. 2에 나타내었다. 초록형광을 내는 세포들(asterisk)은 그렇지 않은 세포(arrow)에 비하여 세포체가 팽윤되어 있는 것이 분명히 나타났다. 이는 세포가 손상을 받아 ROS를 많이 생성하고 있는 것으로 해석된다.</p> <h2>정상산소 환경(normoxia)에서 황련이 활성산소(ROS)의 생성에 미치는 영향</h2> <p>\( \mathrm{H}_{2}\)DCF-DA 염색을 이용하여 황련이 ROS 생성에 미치는 영향을 조사하였다. DIV 10에 황련 \( 1.0 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)를 처리하고 3일간 배양한 후 저산소증을 유발하기 직전(DIV 13)에 \( \mathrm{H}_{2}\)DCF-DA로 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다. 황련을 첨가하지 않은 대조군의 경우 ROS를 생성하는 세포가 흔히 발견되었으며 그 강도도 높았다. 가끔 세포내 점박이(puncta) 모양으로 형광을 내는 세포가 관측되었는데 이는 ROS을 생성하는 미토콘드리아들인 것으로 보인다. 반면에 황련을 처리한 실험군에서는 정상산소 환경 하에서 \( \mathrm{H}_{2}\)DCF-DA에 염색되는 세포의 빈도가 \( 7 \% \)로서 대조군 \( 15 \% \)에 비하여 매우 낮았다. 또한 형광의 강도에 있어 현저한 차이가 있어 대조군에서 거의 2배 강하였다. 이는 ROS을 생성하는 세포의 수 뿐 아니라 생성하는 량도 대조군에서 유의하게 많음을 의미한다\( (\mathrm{p}<0.01) \)</p> <h2>저산소증(hypoxia)에서 황련이 활성산소(ROS)의 생성에 미치는 영향</h2> <p>DIV 10에 황련 \( 1.0 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)를 처리하고 3일간 배양한 후 저산소증을 유발하고 \( \mathrm{H}_{2}\)DCF-DA로 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다. 저산소증 처리 후 1시간 후에 관찰한 사진을 Fig. 4에 나타내었다. 녹색 형광을 내는 세포는 대조군과 실험군에서 각각 13 및 12\( \% \)로 유의한 차이가 없었다. 그러나 형광의 강도는 5.5배 (84:15)로 대조군이 훨씬 더 강했다. 저산소증 처리 3일 후에 관찰한 형광사진을 Fig. 5에 나타내었다. 이 경우에는 대조군과 실험군에서 각각 18 및 17\( \% \)의 세포가 형광을 나타내고 있어 1시간 후 보다 더 많은 세포가 형광을 보였으나 두 군 사이에 유의한 차이가 없었다. 그러나 형광의 강도는 3배 (60: 20)정도 대조군에서 더 강했다. 강하게 형광을 보이는 세포 가운데는 흔히 세포질이 팽윤되어 풍선과 같은 형태로 되고, 핵은 웅크러져 있는 모양을 하고 있었다. 저산소증 처리 5일 후에 관찰한 형광사진을 Fig. 6에 나타내었다. 이 경우에는 각각 35 및 32\(\% \)의 세포가 형광을 나타내고 있어 3일 후 보다 더 많은 세포가 형광을 보였으나 대조군과 실험군 사이에 유의한 차이가 없었다. 또한 형광의 강도도 54:52로서 서로 비슷하였다. 그러나 3일 후의 경우에 비하여 전반적으로 더 강한 형광을 나타내었다. 이 결과들을 종합하여 ROS 생성의 변화추이를 Fig. 7에 나타내었다. Fig. 7에서 보면 황련에 의하여 ROS 생성 세포의 수는 정상산소 환경에서는 유의하게 감소하였지만, 저산소증 유발 이후에는 대조군과 차이가 없었다. 그러나 형광의 강도에 있어서는 5일째를 제외하면 전반적으로 실험군에서 현저히 감소하였다.</p>