준비된 녹차 열수추출물의 유기용매 층을 분리하여 감압농축하고 저해활성을 측정하여 SQS 저해물질의 용매 이행성을 검토하고 여과하여 감압농축하고 crude catechins 분획을 얻었다. 다음, 돼지 간을 잘게 썰어서 충분히 다지고 균질화 완충액을 첨가하여 균질화하였다. 침전물을 균질화하고 30분간 초원심분리하여 침전한 microsome 분획을 균질화 완충액에 현탁하고 squalene synthase 활성 측정의 효소원으로 사용하였다. hexane층과 cocktail solution을 혼합하고 LSC를 이용하여 cpm을 측정하고 저해 정도를 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약 및 사용기기</h2> <p>녹차 분말은 태평양기술연구원으로부터 공급받은 제품을 사용하였으며, 두부는 (주)풀무원 제품을 사용하였다, 한약재와 식품소재는 경동시장과 기타 재래시장 등에서 구입하여 사용하였으며 (+)-catechin ((+)-C), (-)-epicatechin ((-)-EC), (-)-epicatechin gallate ((-)-ECg), (-)-epigallocatechin ((-)-EGC), (-)-epigallocatechin gallate ((-)-EGCg) 등은 Sigma-Aldrich (ST Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 동위원소 측정을 위한 liquid scintillation counter (LSC)는 Beckman사의 LS 6500을 사용하였다.</p> <h2>시료의 준비 및 탐색</h2> <p>시료의 준비는 용매추출법과 열수추출법을 병행하였다. 용매추출에서는 10 배 용량의 \( 80 \% \) 수용성 methanol을 이용하여 상온에서 3시간 동안 3회 추출하고 원심분리한 뒤 상등액을 회수하여 감압농축하였다. 또한 열수추출법은 증류수를 이용하여 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 위와 같은 방법으로 추출하였다. 추출액은 동결건조기에서 건조하고 methanol에 녹인 후 여기에 물을 첨가하여 추출물의 최종농도는 \( 100 \mu \mathrm{g} / 10 \mu \mathrm{l} \)가 되게 하였다. 이때 methanol 농도가 높으면 enzyme assay에 영향을 주고 낮으면 잘 녹지 않아 \( 20 \% \) methanol 용액이 되도록 조제하였다. 천연물을 처리하여 얻은 시료를 squalene synthase 효소활성 측정을 위한 반응액에 첨가한 것과 시료를 넣지 않은 반응액의 cpm값 차이를 측정하여 효소활성의 저해정도를 판단하였다.</p> <h2>유기용매 추출성 및 crude catechin의 분리</h2> <p>녹차 열수추출물을 \( 10 \mathrm{ml} \) 씩 취하여 동량의 hexane, chloroform, ethyl acetate, 1-butanol을 가하여 1시간 간격으로 3회에 걸쳐 반복 추출한 후 유기용매 층을 분리, 감압농축 하고 저해활성을 측정하여 SQS 저해물질의 용매 이행성을 검토하였다. 녹차 추출물로부터 crude catechin을 분리하기 위하여, 녹차 열수추출물 \( 100 \mathrm{ml} \)에 chloroform \( 100 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 caffein 및 지질, 색소 등을 제거한 뒤 수층을 얻었다. 여기서 얻은 수층에 동량의 ethyl acetate를 가하여 3회 추출 하였고 진탕추출 시 처음에는 매우 천천히 진탕하여 emulion이 생기지 않도록 한 다음 강하게 진탕하였으며, 적당량의 \( \mathrm{NaCl} \)을 가하여 층의 분리를 원활하게 하였다. Ethyl aceate 층은 sodium sulfate로 탈수시키고 여과한 다음 감압농축하여 crude catechins 분획을 얻었다(Fig. 1).</p> <h2>돼지 간 microsome의 분리</h2> <p>돼지 간 \( 100 \mathrm{~g} \)을 잘게 썰어서 충분히 다지고 \( 200 \mathrm{ml} \) 의 균질화 완충액(0.1 \( \mathrm{M} \) potassium phosphate, \( \mathrm{pH} 7.4 \) / \( 0.3 \mathrm{M} \) sucrose / \( 5 \mathrm{mM}\) DTT / \(10 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl} 2 \) / \( 50 \mathrm{mM} \mathrm{KCl}) \)을 첨가한 다음 균질화하였다. \( 4,000 \times g \)에서 15분간 원심분리를 한 다음 상등액을 취하고 다시 \( 15,000 \times \mathrm{g} \)에서 30분간 원심분리를 하였다. 다시 상등액을 취해 \( 105,000 \times g \)에서 1시간 초원심분리하여 microsome 분획을 얻었다. 세척을 위해 \( 50 \mathrm{ml} \)의 균질화 완충액을 첨가하여 침전물을 균질화시키고 \( 105,000 \times g \)에서 30분간 초원심분리하여 침전된 microsome 분획을 균질화 완충액에 현탁시켜 squalene synthase 활성 측정을 위한 효소원으로 사용하였다.</p> <h2>Squalene synthase에 대한 저해 활성 측정</h2> <p>저해물질 시료 \( 10 \mu \mathrm{l} \)와 반응완충액(\(100 \mathrm{mM}\) potassium phosphate, \( \mathrm{pH} 7.4 \) / \( 5 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2} \) / \( 100 \mathrm{mM} \mathrm{KCl} / 10 \mathrm{mM} \) DTT / \(2 \mathrm{mM}\) NADPH) \( 100 \mu \mathrm{l} \) , microsome 분획(\(1.92 \mathrm{mg}\) protein/\(\mathrm{ml}\)) \( 50 \mu \mathrm{l} \)를 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 방치시킨 후 125 \( \mu \mathrm{M}\left[{ }^{3} \mathrm{H}\right] \) farnesyl pyrophosphate \( 10 \mu \mathrm{l} \)의 기질을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 다시 30분간 반응시켰다. \( 200 \mu \mathrm{l}\)의 냉각한 ethanol을 첨가하여 반응을 정지시키고 n-hexane으로 3회 추출하여 얻은 hexane 층과 \( 5 \mathrm{ml} \)의 cocktail solution을 혼합하여 LSC를 이용하여 cpm을 측정함으로써 저해 정도를 측정하였다.</p>