본 연구에서는 소의 염색체에 위치한 10개의 microsatellite marker에 대한 유전자형을 분석하였다. Genemapper(version 3.7) 소프트웨어를 활용하여 각 microsatellite loci별 대립유전자들의 크기를 정확하게 결정하였다. 분석된 데이터는 Two-column diploid format으로 변환되어, 이를 MS Tool Kit S/W를 이용하여 처리하였다. 이 과정을 통해 각 locus별로 관측 이형질성(Observed heterozygosity), 대립유전자의 빈도, 그리고 품종별 대립유전자의 빈도를 산출하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>공시 재료</h2> <p>공시재료로는 한우 지역별 586 두(경기: 100 , 전남: 100 , 전북: 100 , 경남: 100 , 경북:86, 강원: 100 ), 종모우집단 39 두의 조직 및 정액에서 genomic DNA를 분리하여 본 실험에 공시재료로 이용하였다.</p> <h2>Microsatellite marker의 PCR 증폭</h2> <p>본 연구는 소의 염색체 상에 존재하는 10 개의 microsatellite marker의 유전자형을 분석하여 활용하였다. Microsatellite marker의 유전자형을 결정하기 위하여 multiplex PCR을 수행하였다. GeneAmp 9700 (Applied Biosystems)에서 각 반응액의 총량을 \( 15 \mu \mathrm{PCR} \) reaction으로 하고 약 \( 10 \sim 100 \mathrm{ng} / \mu \mathrm{ltem}- \) plate DNA, \( 20 \mathrm{ng} \) each primer, \( 1.25 \mathrm{mM} \) each of \( \mathrm{dNTP}, 0.5 \) U, of Taq DNA polymerases (AmpliTaq Gold with GeneAmp)과 \( 3 \mu 10 X \) PCR buffer mM (100 mM Tris-HCl, \( \mathrm{pH} \) 8.3, \( 500 \mathrm{mM} \mathrm{KCl}, 0.01 \% \) gelatin, \( 0.25 \% \) nonidet \( \mathrm{P} 40 \) and \( 20 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2} \) )을 이용하여 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 첫 반응을 시작하여, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45 초, 각 microsatellites marker의 조건 따라 \( 55 \sim 61^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분으로 31회 반복반응을 실시하고 신장 반응은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 60 분간 실시하고 마지막으로 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 시간 실시하여 종료하였다.</p> <h2>Microsatellite 유전자형 분석</h2> <p>PCR 을 수행한 후 증폭산물들을 \( 2 \% \) 의 agarose gel에 전기영동하고 그 결과에 따라 희석배율을 정하고 희석배율에 따라 Formamide를 이용하여 희석하고, 다시 Formamide와 GenescanTM -500 ROXTM standard를 잘 혼합하여 ABI 3130XL DNA sequencer (Applied Biosystems)를 사용하였다. Foundation Data Collection (version 3.0)을 사용하여 Plate manage 및 Run schedule을 정하고 PCR 단편들의 크기를 3 차원 최소자승법(Third order least squares method)으로 분석하였고, Genemapper (version 3.7)을 이용하여 micro-satellites loci별 대립유전자들의 정확한 크기를 결정하였다.</p> <h2>통계 분석 및 집단 간 유연관계 분석</h2> <p>MS marker별 유전자형 data를 Tow-column diploid for-mat의 file로 변환시킨 뒤 MS Tool Kit S/W 를 이용하여 각 좌위별 관측 이형질성(Observed heterozygosity), 대립유전자의 빈도 및 품종별 대립유전자의 빈도를 산출하였다. 품종별 유전적 다양성을 알아보기 위해 Hardy_Weinberg 법칙을 이용한 MS marker에 따른 기대이형질성(expected heter-ozygosity) 및 유전자 좌위의 다형성 정보량(polymorphism information content: PIC) 을 계산하였다.</p> <p>\( \operatorname{Het}_{\mathrm{E}}=1-\left(\sum_{i=1}^{k} P_{i}^{2}\right) \)</p> <p>PIC value \( =1-\left(\sum_{i=1}^{k} P_{i}^{2}\right)-\sum_{i=1}^{k-1} \sum_{j=i+1}^{k} 2 \mathrm{P}_{\mathrm{i}}^{2} \mathrm{P}_{\mathrm{j}}^{2} \)</p> <p>\( \mathrm{k} \) : 대립유전자의 수</p> <p>\( \mathrm{P}_{\mathrm{i},} \mathrm{P}_{\mathrm{j}}: \mathrm{I} \) 번째와 \( \mathrm{j} \) 번째의 대립유전자의 빈도</p> <p>\( \operatorname{Het}_{\mathrm{E}} \): 기대이형질성(expacted heterozygosity)</p> <p>PIC: 다형성 정보량(polymorphism information content)</p> <p>집단간 유연관계 분석을 위한 Da genetic distances의 추정은 등의 방법을 사용하는 집단유전학 분석프로그램인 DISPAN package를 이용하여 계산하였으며, DISPAN 을 이용하여 UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic average) 방법을 통해 집단 간의 유전적 거리를 근거로 한 phylogenetic tree를 작성하였다. 전체집단의 개체별 유전적거리의 추정치를 근거로 하여 모든 개체간의 Neighbor-Joining phylogenetic dendrogram 를 작성은 simple allele-sharing 측정 수준을 통하여 개체별 대립유전자의 빈도를 근거로 집단유전학적 분석 프로그램인 Phylip v.3.65를 이용하였다.</p>