본 연구의 경제적이고 고효율적인 친환경형 생물비료의 개발을 위해 lactate dehydrogenase를 분리하여 토양에서 분리된 인산가용화능이 낮은 균주에 도입한 분자육종 균주의 인산가용화 효과를 확인하는 것에 목적이 있다. \( \mathrm { PCR } \) 통해 획득한 증폭된 DNA의 단면은 pSTL1이라 하며, E.coli JM109로 법에 의해 형질전환되었다. 그리고 이를 균체로부터 분리하여 pHSG398 cloning vecter의 EcoRI 절단부위에 연결한 것은 \( \mathrm { pLYJ } \) 라고 한다.
<p>본 연구는 난용성 인산염을 가용화시킬 수 있는 경제적이고, 고효율적인 친환경형 생물비료의 개발을 위한 기초연구로 lactate dehydrogenase를 분리하여 토양에서 분리되어진 인산가용화능이 낮은 기즌의 균주에 도입한 분자육종 균주 의 인산가용화 효과를 확인하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>Idh gene의 cloning</h2> <p>본 연구실에서 이미 분리되어진 Staphylococcus sp. LJ2로 부터 lactate dehydrogenase (ldh) gene이 cloning되었다. Staphylococcus sp. LJ2의 \( 165 \mathrm { rDNA } \) 염기 서열의 분석 결과 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228와 98 \% 상동성을 나타내었으며, ATCC 12228의 upstream 2,190,308-2,190,334 bp 와 downstream 2,191,298-2,191,324 bp의 영역을 oligonu-cleotide로 작성하여 ldh gene을 클로닝하기 위한 primer로 사용하였다(forword primer, LDH3: 5'-TGTGTAACTTTATT ATGAAGGAGTTCG-3', reverse primer, LDH4: 5'-TTCACT CAAAACATCTTCGTCATTCTC-3')[19]. PCR 반응 조건은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분간 pre-denaturalization시키고, \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 서 30 초 동안 denaturalization, \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초 annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 분간 extension시켰으며, 이를 30회 반복한 후, 마지막으로 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 분간 반응시켰다. \( \mathrm { PCR } \) 수행 결과 약 \( 1 \mathrm { ~kb } \) 의 \( \mathrm { PCR } \) product를 획득하였다. 증폭된 DNA 단편은 pGEM-T-easy vector (Promega co., Madison, WI, USA)에 연결되었으며, 이를 pSTL1이라고 명명하였다. pSTL1온 Hanahan법[6]에 의 하여 E. coli JM109로 형질전환되었다. 형질전환된 재조합체는 ampicillin \( (50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 이 첨가된 LB 변형 배지(polypepton \( 10 \mathrm { ~g } , \mathrm { NaCl } 5 \mathrm { ~g } \), yeast extract \( 5 \mathrm { ~g } \), glucose \( 1 \mathrm { ~g } \), per liter)를 이용하여 \( 180 \mathrm { rpm } , 37 \mathrm { C } \) 에서 배양되었으며, \( 13,000 \mathrm { rpm } \) 에서1 분간 실온에서 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체로부터 PSTL1 plasmid DNA를 분리하고, 제한효소 \( E c o \) II으로 절단하여 \( 1 \mathrm { ~kb } \) 의 ldh gene을 회수한 다음 pHSG398 cloning vecter의 EcoRI 절단부위에 연결하였으며, 이를 \( \mathrm { pLYJ } \) 라고 하였다(Fig. 1). pLYJ는 난용성 인산염 가용화능이 낮은 균주로써 토양에서 분리한 Klebsiella sp. DA71-1 균주에 electroporation법[3]으로 형질전환되었다.</p>