Sulforaphane을 첨가한 배지에서는 sulforaphane의 농도에 따라 HepG2 세포의 증식이 크게 감소하는 것을 관찰하였다. 이 결과는 인체 유방암, 전립선암, 대장암, 췌장암 및 악성 백혈구에서 보였던 선행연구와 일관성을 보여주며, sulforaphane의 증식억제 효능이 간암세포에서도 나타남을 확인하였다. 또한, sulforaphane 처리 농도가 높아질수록 세포 밀도의 감소, 세포 형태의 변화, 세포막의 수축 및 파열 현상, 그리고 dendrite-like structure의 관찰이 가능하였다. Sulforaphane이 함유되지 않은 배지에서 자란 암세포의 경우, 세포주기의 분포는 G1, S, 2/M 기에 각각 약 \(62.03 \% \), \(23.69 \% \), 13.41%였으나 sulforaphane 처리에 따라 S기의 감소와 G2/M arrest가 관찰되었으며, 20 uM 처리군에서는 sub-G1기의 급격한 증가로 세포주기 특이적인 교란 현상을 관찰하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>HepG2 간암세포의 증식에 미치는 sulforaphane의 영향</h2> <p>HepG2 세포의 증식에 미치는 sulforaphane의 영향을 조사하기 위하여 준비된 HepG2 세포에 48시간 동안 sulfor-aphane을 적정 농도로 회석하여 처리한 후, MTT assay를 실시하였으며, 그 결과를 Fig. 1A 에 나타내었다. Fig. 1A에 나타낸 바와 같이 48 시간 동안 정상 배지에서 자란 HepG2 세포에 비하여 sulforaphane이 함유된 배지에서는 sulfor-aphane의 첨가 농도 의존적으로 세포의 증식이 매우 감소되었음을 알 수 있었다. 즉 10 uM 처리군의 경우 대조군에 비하여 \(30 \% \) 이상 세포증식이 억제되었으며, 20 uM 처리군에서는 약 \(80 \% \) 정도의 세포증식 억제현상을 관찰할 수 있었다. 그리고 30 uM 처리군에서는 생존율이 \(10 \% \) 이하로 나타나 HepG2 세포가 정상적인 생존을 하지 못하였음을 알 수 있었다. 이상의 결과들은 인체 유방암셰포, 전립선암세포, 대장암세포, 췌장암세포 및 악성 백혈구 등에서 관찰된 최근의 선행연구들에서 관찰된 경우와 유사한 경향성을 보여주는 것으로 sulforaphane은 간암세포에서도 다른 암세포에서처럼 비슷한 증식억제 효능이 있음을 알 수 있었다. 아울러sulforaphane의 처리가 HepG2 세포의 형태에 어떠한 영향을 주는 지에 대해 알아보기 위하여 여러 농도의 sulforaphane을 48시간동안 처리 후 도립 현미경을 이용하여 세포의 형태를 관찰한 결과는 Fig. 1B 에 나타낸 바와 같다. 즉 sulforaphane 처리 농도 의존적으로 현저한 세포밀도의 감소현상과 형태적인 변화를 관찰 할 수 있으며, sulfor-aphane의 처리 농도 증가에 따라 세포막의 shrinkage 및 blebbing 현상도 관찰할 수 있었고, 처리농도가 높은 경우 cell elongation을 포함하는dendrite-like structure가 관찰되었다. 이러한 sulforaphane 처리 농도 의존적인 형태적 변화와 밀도의 감소는 Fig. 1A에 나타낸 sulforaphane 처리에 따른 세포 증식 억제와 부합되는 결과임을 알 수 있었다.</p> <h2>세포주기 분포에 미치는 sulforaphane의 영향</h2> <p>세포 중식과 연관된 세포주기의 조절은 각 주기별 관여하는 다양한 유전자들에 의해 조절되는데, 기본적으로 세포주기 checkpoint 각 시기에 요구되는 양성 조절인자인 cyclins에 의하여 Cdks와의 complex 형성을 통한 연속적인 활성과 불활성이 결정되어진다. 세포주기 조절의 관점에서 암세포는 세포주기의 비정상화에 기인된 질병으로 정의 될 수있으며, 특정 시기의 세포주기 억제는 세포주기 조절 양성인자의 발현 저하 또는 음성 조절 인자의 과발현에 의한 것으 로 요약될 수 있다. 따라서 sulforaphane의 처리에 의한 HepG2 간암세포의 성장억제가 세포주기 특정 시기의 교란과 연관성을 지니는지의 여부를 조사하기 위하여 세포주기 분포에 미치는 sulforaphane의 영향을 조사하였다. 이를 위하여 정상 및 다양한 농도의 sulforaphane이 처리된 배지에서 48 시간 배양한 후 flow cytometer를 이용하여 분석한 결과는 Fig. 2A 및 B 에 나타낸 바와 같다. 결과에서 알 수 있듯이 sulforaphane이 함유되지 않은 정상 배지에서 자란 암세포의 경우 G1, S 및2/M 기에 해당되는 세포의 빈도는 약 \(62.03 \% \), \(23.69 \% \) 및 13.41% 정도였다. 그리고 5 uM 처리군의경우 G1기, S기 및 G2/M 기의 빈도는 대조군과 유사하였으나, 10 uM 처리군에서는 G1 및 G2/M 기가 다소 증가 ( \(71.62 \% \) 및 \(15.90 \% \))되는 경향성을 보여주었으며, 상대적으로 S기에 속하는 세포의 빈도 ( \(10.30 \% \))는 감소되었다. 그러나 15uM 처리군에서는 G2/M기에 속하는 세포의 빈도가 대조군에 비하여 약 2배 정도 증가( \(26.71 \% \))되었으며, S기에 속하는 세포의 빈도는 매우 감소되었다(7.87%). 즉 sulforaphane 처리 농도의 증가에 따라 DNA 합성기에 해당되는 S기의 감소가 상대적으로 감소되었으며, G2/M arrest 가능성을 보여주었다. 그러나 20 uM 처리군에서는 apoptosis 유발에 해당되는 sub-G1기의 급격한 증가( \(54.62 \% \))로 세포주기 특이적인 교란 현상을 관찰할 수가 없었다. 따라서 sub-G1기에 속한 세포를 제외한 나머지 세포들을 고려할 경우, sulforaphane 의 처리에 따라 G1 기에 속하는 세포의 빈도는 감소된 반면,G2/M기에 속하는 암세포의 빈도가 상대적으로 증가하였음을 알 수 있었고, sulforaphane 처리에 따른 HepG2 세포의 증식억제는 세포주기 G2/M arrest와 연관된 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다. HepG2 간암세포에서 과찰된 이러한 현상은 췌장암세포, 유방암세포, 대장암세포, 전립선암세포, 흑색종세포 등에서 나타난 결과와 매우 유사하였다.</p>