한천분해균주를 해수시료액에 배양하여 PH와 온도변화를 주었다. 이전 한천분해 균주는 Glaciecola 속 세균들이 agarase를 생산한다는 보고는 있었지만 \alpha\(\alpha\)-agarase를 생산한다는 유일한 보고 외에는 주로 분류학적 특성 보고가 위주였고 생산된 agarase의 특성에 대한 보고는 거의 이루어지지 않았다. 본 연구로 \beta-\(\beta\)−agarase를 생산하는 신규의 Glaciecola sp. 균주를 확보하였고 \beta\(\beta\)-agarase 분해산물인 neoagarooligosaccharide는 산업과 식의약산업의 소재로 활용될 가능성이 높은 세균성장 억제, 전분노화 방지, 대식세포 활성화, 보습효과, 미백효과가 보고되고있다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>한천분해균주의 분리 및 배양</h2><p>해수시료액의 배양결과, 총 5,000여 개의 집락(colony)에서 한천분해 활성을 나타냈으며 한천분해능으로 함몰된 한천의 지름이 큰 균주 15개를 선발하였다. 통상적인 세균 순수분리 방법인 배지상의 집락을 채취한 후 한천배지 위에 streaking으로 분리하는 방법으로는 한천분해세균의 순수분리가 어려워 한천분해로 함몰이 일어난 부위의 균을 백금이를 이용하여 채취하고 이를 무기염 배지로 적절히 희석한 후에 무기염 한천배지에 도말하고 함몰된 한천의 지름이 큰 집락을 선택하여 다시 희석하는 것을 3차례 이상 반복한 후 균주들을 순수분리하였다. 분리한 균주들을 \( 0.2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 한천을 포함한 marine broth 2216 배지에서 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm} \)에서 60시간 진탕 배양한 후 배양액의 환원당 값을 측정하여 선별된 균주의 한천분해능을 검토하였으며 가장 분해능이 우수한 균주 3종을 최종적으로 선정하였다. 이들 균주들의 16rDNA 염기서열분석을 실시하여 본 연구자들에 의해 이미 보고된 \( \beta \)-agarase 생산균주인 Agarivorans 속 균주와 높은(\(99\%\)) 상동성을 나타내는 균주 두 종을 제외시켰고, 최종적으로 SL-12 균주 한 종을 선정하였다. 분리된 균주는\( \mathrm{NaCl} \)이 첨가되지 않는 배지에서는 성장이 거의 없고 \( \mathrm{NaCl} \)이 존재 하에서만 성장하는 호염성 균주로 확인되었다 (datanot shown). 분리한 SL-12 균주가 나타내는 한천분해 양상을 Fig. 1에 나타내었다.</p><h2>한천분해 균주의 동정</h2><p>분리된 한천분해균 SL-12 균주의 16S rDNA 염기서열분석 결과 Gamma-Proteobacteria인 Glaciecola mesophila 및 dimethylsulfide를 분해하는 Glaciecola 속 세균과 가장 높은 유사도(\(98\%\))를 보였으므로(Fig. 2) Glaciecola sp. SL-12로 명명하였다. 그 외 유사도가 높은 서열을 가지며 agarase를 생산하는 균주는 Bacterium QM28 (NCBI No. DQ822527)과 Bacterium QM15 (NCBI No. DQ822523) 세균 등이 있었지만 이들의 동정이나 특성에 관한 보고는 아직 이루어지지 않고 있다. 분리 균주와 가장 유사한 Glaciecola 속 세균들이 agarase를 생산한다는 보고는 있었지만 \( \alpha \)-agarase를 생산한다는 유일한 보고 외에는 주로 분류학적 특성 보고가 위주였고 생산된 agarase의 특성에 관한 보고는 거의 이루어지지 않고 있다.</p><h2>pH에 따른 한천분해 효소의 활성</h2><p>각 \( \mathrm{pH} \)에서 보이는 한천분해효소의 활성을 Fig. 3에 나타냈다. 사용한 완충용액과 \( \mathrm{pH} \) 중 최고의 활성을 나타내는 것은 \( 20 \mathrm{mM} \) sodium phosphate 완충용액에서 \( \mathrm{pH} 7.0\)으로 나타났다. 이는 Thalassomonas sp. SL-5와 동일하였다. 또한 \( \mathrm{pH} 5.0 \)과 \( 6.0 \)에서 한천분해 활성이 \( 85 \% \) 이상 유지되고 \( \mathrm{pH} 8.0 \)에서는 \( 70 \% \) 정도로 중성과 약산성 범위에서 높은 활성을 보이는 것도 Thalassomonas sp. SL-5 유래의 한천분해효소와 유사하였다. 균주에 따른 한천분해의 최적 \( \mathrm{pH} \)는 Agarivorans sp. JA-1 과 Vibrio sp. JT0107의 경우 \( \mathrm{pH} 8.0 \)이었고 Bacillus sp. MK03는 \( \mathrm{pH} 6.1 \), Bacillus cereusASK 202는 \( \mathrm{pH} 7.8 \) , Pseudomonas sp. PT-5는 \( \mathrm{pH} 8.5 \) 등으로 균주에 따라 다양한 것으로 보고되어 있다. \( \mathrm{pH} 8.0 \)에서의 활성을 비교하면 \( 20 \mathrm{mM} \) sodium phosphate 완충용액에 비해 \( 50 \mathrm{mM} \) TAPS 완충용액에서 활성이 낮은 것으로 나타났는데(Fig. 3) 이는 TAPS에 의한 영향과 염농도에 의한 영향일 가능성이 있다. 그리고 Agarivorans sp. JA-1 균주 유래의 \( \beta \)-agarase는 \( 20 \mathrm{mM} \) sodium phophate \( (\mathrm{pH} 8.0) \) 완충용액에 비해 \( 50 \mathrm{mM} \) glycine- \( \mathrm{NaOH}(\mathrm{pH} 8.0) \) 완충용액에서 더 높은 활성을 보여 효소에 의한 영향도 있을 것이므로 추후에 이에 대한 확인이 필요할 것으로 생각된다.</p><h2>온도에 따른 한천분해 효소의 활성</h2><p>각 온도별로 보이는 한천분해효소의 활성을 Fig. 4에 나타냈다. 한천분해활성은 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 233 \(\mathrm{units}/\mathrm{l}\)로 최고치를 나타냈으며 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)의 반응온도에서 나타난 효소활성을 \( 100 \% \)로 하였을 때 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 80 \%\), \(50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 76 \%\), \(60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 63 \% \)의 상대 활성을 나타냈으며 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 \( 28 \% \)의 활성을 갖는 것으로 나타났다(Fig. 4). 조효소액을 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 시간별로 처리한 후에 나타나는 활성을 측정한 결과, 15분 만에 \( 22 \% \) 정도의 잔존 활성을 나타냈다(Fig. 5). 이러한 결과로 이 효소는 고온에 민감한 내열성을 나타내지 않는 효소라는 것을 알 수 있다. 반면, Thalassomonas sp. SL-5의 경우 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 처리 후에도 \( 76 \% \) 정도의 잔존 활성을 나타냈고, 60분간 처리 후에도 약 \( 30 \% \)의 잔존 활성을 나타냈다.</p><h2>한천올리고당 가수분해산물의 TLC 분석</h2><p>Glaciecola sp. SL-12 균주를 1일간 배양하여 제조된 조효소액에 neoagarohexaose를 기질로 첨가하여 1일 혹은 3일 동안 반응시킨 결과를 Fig. 6에 나타냈다. Neoagarohexaose를 기질로 사용하면 \( \beta \)-agarase는 neoagarotetraose와 neoagarobiose를 생성하며 \(\alpha\)-agarase는 agaropentose와 agarotriose를 생성한다. Glaciecola sp. SL-12 균주의 한천분해효소의 분해산물을 TLC로 분석한 결과, 3일 내에 neoagarohexaose를 모두 분해하여 주로 neoagarobiose를 생산하고(\(72.7\%\)) 일부 neoagarotetraose도 생산하는(\(27.3\%\)) 것으로 나타나 이 효소가 \( \beta \)-agarase에 속하는 것을 확인되었다.</p><h2>확보된 Glaciecola sp. SL-12 균주의 활용방안</h2><p>현재까지 Glaciecola sp.를 대상으로 하는 연구결과로는 \( \alpha- \)agarase를 생산하는 결과만 보고되어 있어, 본 연구로 \( \beta- \)agarase를 생산하는 신규의 Glaciecola sp. 균주를 확보한 점에 큰 의미를 둘 수 있다. 한천의 \( \beta \)-agarase 분해산물인 neoagarooligosaccharide는 세균성장 억제, 전분노화 방지, 대식세포 활성화, 보습효과, 미백효과, 항산화효과, 항암활성 등이 보고되어 있어 향장품 산업과 식의약산업의 소재로 활용될 가능성이 높다. 본 연구로 본 연구진이 이미 확보한 \( \beta \)-agarase 생성 해양성 균주인 Agarivarans sp. JA-1, Thalassomonas sp. SL-5 등과 함께 Glaciecola sp.SL-12 균주에서 생산되는 \( \beta \)-agarase를 이용하면 균주 유래에 따라 각 \( \beta \)-agarase의 최적 온도와 \( \mathrm{pH} \) 등 특성이 서로 다르므로, 이들을 조합하여 한천의 액화와 당화공정 등에 이용하면 고부가가치 기능성 한천올리고당의 산업적 생산을 위한 생산성 개선에 도움이 될 수 있을 것으로 기대하고 있다.</p>