Go Kit는 Amersham-Pharmacia사, T-vector와 Wizard Genomic DNA Purification Kit는 Promega사, ligation Kit는 TAKARA사, RNeasy mini-prep Kit는 Qiagen사들로 부터 구입하였다. 세포는 \( 100 \mathrm{~mm} \) plate에 \( 1 \mathrm{ml} \) 당 \( 4 \times 10^{5} \) 세포를 분주하고 최종 농도가 \( 2 \mathrm{uM} \) 이 되게 5-azacytidine을 처리하여 4일간 배양하였다.\( 1 \mathrm{mM} \) EDTA를 사용하여 세포를 때어내어 genomic DNA와 RNA를 준비하였다. Dab2의 promoter 부위의 methylation status를 분석하기 위하여 적절한 조건에서 추출한 genomic DNA (700 ug)은 Xho I으로 처리하여 절단하고, 5분간 끓여서 단일가닥으로 만들어 즉시 얼음 위로 옮겼다. Total RNA는 Qiagen RNeasy Mini Kit를 사용하여 회사의 protocol에 따라 정제하였다. 사람 자궁내막세포와 MDA MB-231세포의 genomic DNA는 Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega)를 사용하여 회사의 protocol에 따라 정제하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약 및 세포주</h2> <p>RPMI, FBS, antibiotic-antimycotic solution, 세포배양 dish, 제한효소는 GIBCO BRL사, RT-PCR Ready. To. Go Kit는 Amersham-Pharmacia사, T-vector와 Wizard Genomic DNA Purification Kit는 Promega사, ligation Kit는 TAKARA사, RNeasy mini-prep Kit는 Qiagen사로부터 각각. 구입하였다. 실험에서 사용한 사람의 유방암 세포주인 MDA MB-231세포를 한국세포주 은행(KCLB)에서 구입하였고, 사람의 정상 자궁내막조직은 미즈베베 산부인과에서 자궁 외 임신환자로부터 환자의 동의를 구하고 채취하여 사용하였다. PCR primer는 Bioneer사로부터 제작하여 사용하였다. DNA 염기분석은 MACROGEN사에 의뢰하여 분석하였다. 그 외에 5-azacytidine, sodium bisulfite 등의 일반 시약류는 SIGMA-ALDRICH사로부터 구입하여 사용하였다.</p> <h2>세포배양 및 5-azacytidine 처리</h2> <p>MDA MB-231은 \( 10 \% \) FBS, \( 1 \times \) antibiotic-antimycotic solution이 포함되어 있는 RPMI 1640 배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 배양하였다. 세포는 \( 100 \mathrm{~mm} \) plate에 \( 1 \mathrm{ml} \) 당 \( 4 \times 10^{5} \) 세포를 분주하고 최종 농도가 \( 2 \mathrm{uM} \) 이 되게 5-azacytidine을 처리하여 4 일 동안 배양하였다. \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA를 이용하여 세포를 때어내어 genomic DNA와 RNA를 준비하였다.</p> <h2>Bisulfite 반응과 염기서열분석</h2> <p>Dab2의 promoter 부위의 methylation status를 분석하기 위하여 Grigg 등이 개발한 bisulfite method를 Hajkova 등에 의하여 변형한 "Bisulfate-Assisted Genomic Sequencing Me-thod"를 이용하였다. 간단히 요약하면, 적절한 조건에 서 추출한 genomic DNA (700 ug)은 Xho I으로 처리하여 절단하고, 5분간 끓여서 단일가닥으로 만들어 즉시 얼음 위로 옮긴다. 최종농도가 \( 0.3 \mathrm{M} \)이 되도록 \( \mathrm{NaOH} \) 를 넣어주고 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15분간 반응하였다. \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 녹인 \( 2 \% \) 의 LMP (low melting point) agarose (SealPlaque agarose, FMC)를 2 volume 넣어서 DNA 단편과 agarose가 섞이도록 하였다. \( 2 \mathrm{ml} \) 의 eppendorf tube에 \( 1 \mathrm{ml} \) 의 \( 2.5 \mathrm{M} \) bisulfate 용액 \( (\mathrm{pH} 5.0) \) 을 넣고 \( 750 \mu \) 의 heavy mineral oil을 첨가하여 얼음 위에서 30분간 방치하였다. 준비된 DNA-agarose 흔합액을 \( 10 \mu \) 넣어서 30 분간 방치하였다. 얼음에 의해 차가워진 mineral oil내에서 agarose beads가 형성되도록 하였다. 계속하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 8시간동안 incubation하고 상등액을 완전히 제거하고 \( 1 \times \mathrm{TE}(\mathrm{pH} \) 8.0)로 세척해 낸다. \( 0.2 \mathrm{M} \mathrm{NaOH} \) 를 \( 500 \mu \mathrm{l} \) 를 가하여 15분간 2회 세척을 반복하였다. \( \mathrm{NaOH} \) 를 제거하기 위해 \( 1 \times \mathrm{TE}(\mathrm{pH} 8.0) \) \( 1 \mathrm{ml} \) 로 10분간 3회 세척한 후 DNA 증폭을 위해 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 로 15분간 2회 세척하였다. 얻어진 agarose beads는 PCR 반응에 이용 하였다. primer는 + strand; 5'TAGTGGTAATTTAGGGAA, strand; 5'AAAACTCCCCAAAAATATACC를 제작하여 사용하였다. 반응조건은 처음 1 cycle은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분 30초 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분간 반응하였고, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분간 30 cycle을 증폭하였다. 마지막으로 DNA가닥의 신장(extension)을 위해 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 7 분간 반응시켰다. PCR 증폭이 끝난 PCR 산물은 \( 1.2 \% \) agarose gel에서 전기영동 한 후 ethidium bromide로 염색해 UV transilluminator에서 band를 확인하였다. 얻어진 PCR 산물은 T-vector (Promega)에 subcloning하여 염기서열을 결정하였다.</p> <h2>RNA purification과 RT-PCR</h2> <p>Total RNA는 Qiagen RNeasy Mini Kit를 이용하여 Quagen사에서 제공되는 protocol에 따라 정제하였다. RT-PCR 은 Amersham-Pharmacia사의 RT-PCR Ready - To - Go Kit를 사용하였다. Primer는 + strand; 5'-AGGCAGGCCCATGG-CCCTTTTCAAGTTCGCAAAC，-strand; 5'-CTAGACCCA-CCAGGGGCCCCACTGGGGCAGGAGC를 제작하여 사용하였다. 주형 RNA는 \( 1 \mu \mathrm{g} \) 사용하였으며, 총 \( 50 \mu \mathrm{l} \) volume으로 반응하였다. 처음 1 cycle은 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분간, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 반응하였고, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분, \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분간 30 cycle-을 증폭하였다. 마지막으로 DNA가닥의 신장을 위해 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 7분간 반응하였다. PCR 산물은 \( 1.2 \% \) agarose gel에서 전기영동 한 후 ethidium bromide로 염색해 UV transilluminator에서 band를 확인하였다.</p> <h2>Methylation-specific PCR (MSP)</h2> <p>사람 자궁내막세포와 MDA MB-231세포의 genomic DNA는 Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega)를 이용하여 Promegat사에서 제공되는 protocol에 따라 정제하였 다. MSP를 위하여. \( 50 \mathrm{ng} \) 의 genomic DNA를 Hap II 와 Msp I으로 각각 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20시간 이상 절단하였다. 각각의 제한효소로 절단한 genomic DNA중 \( 10 \mathrm{ng} \) 을 PCR에 이용하였다. PCR에 이용한 primers는 Table 1 과 같다. 반응 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45초, \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 60초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45초로 1 cycle반응하였고, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초, \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초로 30 cycle 반응하였다. DNA가닥의 신장을 위해 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 7분간 반응하였다. PCR 증폭이 끝난 PCR 산물은 \( 1.2 \% \) agarose gel에서 전기영동 한 후 ethidium bromide로 염색해 UV transilluminator에서 band를 확인하였다.</p>