미생물 protease 생산을 위해 탄소원 20 g/l, 질소원 5 g/l로 배지를 조성하고 250ml 삼각플라스크에 100ml 조업부피로 37\(^\circ \mathrm{C}\), 200rpm으로 24시간 동안 배양하였다. 그 후 660nm에서 배양액의 광학밀도가 0.7 이하로 되도록 희석하여 분광광도계를 사용하여 성장을 분석하였다.
<p>분리 미생물의 protease 생산에 탄소원이 미치는 영향을 알아보기 위하여 탄소원 20 g/l, 질소원 5 g/l로 배지를 조성하여 배양하였다. 탄소원은 glucose, maltose, xylose, starch, fructose, glycerol, galactose, sucrose, lactose 총 9 가지 종류를 각각 이용하였고 질소원은 beef extract로 고정하고 \( 250 \mathrm { ml } \) 삼각플라스크에서 \( 100 \mathrm { ml } \) 조업부피로 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 200 \mathrm { rpm } \), 24 시간 동안 진탕배양 하였다.</p> <h2>미생물 성장 분석</h2> <p>배양액의 광학밀도가 \( 0.7 \) 이하로 되도록 희석하여 분광광도계(UV-1201, Shimadzu Co., Japan)를 사용하여 \( 660 \mathrm { ~nm } \) 에서 광학밀도(optical density)를 측정한 후, 표준곡선에 의한 광학밀도와 건조균체량 \( ( \mathrm { g } / \mathrm { l } ) \) 의 관계식으로부터 건조균체량 \( ( \mathrm { g } / \mathrm { l } ) \) 을 산출하였다. 광학밀도와 건조 균체량 \( ( \mathrm { g } / \mathrm { l } ) \) 의 관계식을 얻기 위하여 전배양 배지에 분리된 균주를 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 시간 배양한 후, 그 배양액과 증류수의 비율을 \( 0.0 \) 에서 \( 1.0 \)까지의 용액으로 제조하여 각각 광학밀도를 측정하였다. Bench-top centrifuge (VS-15000N, Vision Scientific Co., Korea)를 사용하여 \( 13,000 \times g \) 에서 10 분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고 가라앉은 균체를 항량이 될 때 까지 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24 시간 동안 건조기(VS-1202D3, Vision Scientific Co., Korea)에서 건조하고 그 무게를 측정하였다.</p> <h2>Protease 활성 분석</h2> <p>\( 50 \mathrm { mM } \) glycine- \( \mathrm { NaOH } \) buffer (pH 9.0)에 casein (Sigma Aldrich Co., USA)을 녹인 \( 1 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) casein 용액 \( 500 \mu \mathrm { l } \) 에 배양액을 \( 13,000 \times g \) 에서 10 분 원심분리하여 얻은 조효소액 \( 20 \mu \mathrm { l } \) 를 첨가하여 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분간 반응시킨 후, 반응 정지를 위해 \( 10 \% \) trichloroacetic acid를 \( 500 \mu \mathrm { l } \) 첨가하였다. 분해되지 않은 단백질을 제거하기 위하여 \( 12,000 \mathrm { rpm } \) 에서 10 분간 원심분리하여 얻은 상층액을 다시 동일 조건에서 원심분리하였으며, 이후 얻은 상층액을 반응물로 사용하였다.</p>