본 논문은 단백질에 당이 첨가되는 당쇄화에 대한 연구로서 인간 유래 치료용 단백질은 거의 당쇄화를 거친다고 한다. 최근엔 단백질의 안정성이나 활성 등을 이용하여 당쇄화 변형 연구들이 실행되고 있고, RNA interference 기술으로 \( \beta\) \( \alpha\)1,3-FucT나 1,2-XylT 를 저해하는 시도들도 이루어지고 있다. 최근에는 완전한 sialy-lation이 이루어진 단백질을 생산하는데 성공하였다고 발표 되었으며, 이러한 glycoengineering의 기술을 이용하여 식물에서도 인간화된 당쇄구조를 갖는 치료용 단백질 생산이 가능하리라 기대된다.
<h1>식물유래 재조합단백질의 당쇄화에 대한 연구</h1><h2>당쇄화 (glycosylation)</h2><p>당쇄화란 단백질의 잔기나 지질에 당이 공유결합적으로 첨가되는 과정을 의미하며 대부분 인간 유래 단백질인 치료용 단백질들은 당쇄화 과정을 거치는 것으로 알려져 있다. 당쇄화 과정에서 당이 붙는 자리는 소포체 (endoplasmic reticulum)와 골지체 (Golgi apparatus)에 존재하는 효소들에 의해 특이적으로 정해져 있으며 당이 붙는 위치에 따라 크게 두 종류로 분류된다. 주로 proteoglycan 에서 볼 수 있는 O-linked 당쇄화는 당이 serine이나 thre-onine 잔기의 side chain에 결합한다. 반면, N-linked 당쇄화는 당이 asparagine의 side chain에 있는 Asn-X-Ser/Thr 자리에 결합하며 치료용 단백질을 생산할 때 주로 고려되는 부분은 바로 이 N-linked 당쇄화와 관련된 부분이다 (Warzecha et al. 2008). Fig. 2A 에는 식물에서의 일반적인 N-linked 당쇄화의 생합성 경로를 나타내었다. 골지체 초반부까지는 식물과 동물에서의 당쇄화 유형이 유사한 것을 볼 수 있다. 그러나 식물의 경우, \( \beta\) 1,2 -xylosyltransferase ( \( \beta\) 1,2-XylT), \( \alpha\) 1,3-fucosyltransferase (\( \alpha \)1,3 -FucT), \( \beta \)1,3 -galactosyltransferase (\( \beta\) 1,3 -GalT) 효소들의 영향으로 인해 식물 특이적인 당쇄 구조가 나타난다 (Lerouge et al. 2000).</p><h2>세포주에 따른 N-linked 당쇄화의 차이점</h2><p>N-linked 당쇄화는 당단백질을 생산하는 시스템에 따라 다소 차이를 보인다. 일반적으로 박테리아와 같은 원 핵세포에서는 소포체나 골지체와 같은 세포내 소기관이 존재하지 않아 당쇄화가 일어나지 않는 것으로 알려져 있다. 단세포이면서도 진핵생물인 효모의 경우 당쇄화가 일어나지만 high-mannose 형태의 당쇄를 갖는 특징을 보인다. 반면 다세포 진핵생물인 식물과 동물에서는 유사한 complex-type의 N-linked 당쇄를 형성하지만 몇 가지 서로 다른 특징을 보이는 것이 알려져 있다 (Bakker et al. 2001).</p><p>식물 특이적인 당쇄화 유형은 core structure에서 가지처럼 뻘어나간 2 개의 mannose 잔기 위에 각각 하나의 N -acetylglucosamine (GlcNAc)이 결합하여 \( \beta\) 1,3-linked galactose 잔기로 종결되는 것이 일반적이며 골지체 후반부에서 \( \alpha \) 1,3-linked fucose나 \( \beta \)1,2 -linked xylose와 같은 식물 특이적인 당들이 관찰되기도 한다. 반면 동물유래의 당단백질의 경우 \( \alpha \)1,6 -fucose가 관찰되며 말단부분은 \( \beta \)1,4 -linked galactose 위에 sialic acid로 종결되는 양상을 보인다 (Misaki et al. 2003). Sialic acid는 동물유래 당단백질에서만 발견되는 당으로 \( \beta \)1,4-linked galactose를 특이적으로 인지하여 결합하는 특징을 갖는다.</p><p>식물에서 인간유래 치료용 단백질을 생산할 경우 말단 galactose 잔기의 결합구조 차이와 그로 기인한 sialic acid의 부재로 인해 혈중 반감기나 체내 단백질의 안정성이 감소하며 기능적 활성에 영향을 미친다는 문제가 제기되고 있다. 또한 식물 특이적인 \( \beta \)1,2-xylose 와 \( \alpha \)1,3 - fucose의 경우 IgE와 반응하여 알레르기 반응을 유발할 가능성이 있다. 식물 특이적인 당 구조를 갖는 치료용 단백질을 인체 내에 투여하였을 때 간이나 기타 장기에 서 mannose receptor나 asialoglycoprotein receptor에 노출될 확률이 높아지기 때문에 체내 반감기가 현저히 줄어들 게 된다. 이와 같은 체내에서의 단백질 안정성이나 활성 등의 특성은 제품으로서 치료용 단백질의 품질과 직결 될 뿐만 아니라 환자에 대한 의약품의 투여 횟수와도 밀접한 관련이 있어 최근에는 이를 개선하기 위한 당쇄화 변형에 관한 연구들이 진행되고 있다 (Bakker et al. 2001; Jefferis 2009).</p><h2>Glycoengineering과 최신 연구동향</h2><p>당쇄 부분이 단백질의 기능적인 특성에 크게 영향을 미치지 않는 경우, 형질전환된 식물로부터 성공적으로 단백질이 생산되었다는 보고가 있었지만, 대부분의 치료용 단백질에서는 당쇄화가 단백질의 안정성, 활성, 혈중 반감기에 큰 영향을 미치고 있으며, 인체 내에서 당쇄화가 미치는 영향이나 작용하는 기작에 대해서는 아직까지도 알려지지 않은 부분이 많기 때문에 glycoengineering을 통해 단백질의 당쇄 구조를 개선하려는 연구들이 활발히 이루어지고 있다. 이러한 glycoengineering의 전략으로 소포체나 액포같은 세포내의 특정 소기관에 단백질이 잔류하도록 조작하여 골지체를 우회하는 방법이 있다. 또한, 원하지 않는 효소를 내재적으로 불활성화 시키는 방법으로 특히, 식물에서 말단의 \( \beta\) 1,3-galactose 잔기를 피하기 위해 \( \beta\) 1,3-galactosyltransferase가 발현되지 못하도록 knock-out 하는 방법도 생각해 볼 수 있지만 식물의 경우 상동재조합 (homologous recombination)이 불가능하다. 따라서 최근에는 RNA interference (RNAi) 기술을 이용하여 \( \beta\) 1,2-XylT 나 \( \alpha\)1,3-FucT를 저해하는 시도들이 활발히 이루어지고 있다.(Strasser et al. 2004)</p><p>최근에는 식물에 없는 이종의 효소 단백질이 발현되도록 조작하여 원하는 당을 얻을 수 있도록 당쇄 구조를 인간화시키는 연구가 많이 수행되고 있다. 식물에서 당쇄 구조의 인간화를 위해 B1,4-GalT를 담배 BY-2 (Bright Yellow 2) 세포나 벼 세포에 도입하여 성공한 사례들이 보고된 바 있다 (Misaki et al. 2003; Bakker et al. 2001). 그러나 여전히 sialic acid 잔기가 중요한 역할을 하는 단백질에서는 sialylation을 위한 추가의 단계가 필요하다는 부담이 있을 뿐만 아니라 생합성 경로를 통해 \( \beta\) 1,4-galactose 잔기 위에 sialic acid가 결합할 수 있도록 하기 위해서는 sialyltransferase와 관련된 5개 이상의 추가 유전자가 삽입되어야 하기 때문에 유전자 조작 및 해당 효소 발현에 어려움이 따른다. 그러나 최근 발표된 결과에 따르면 Arabidopsis thaliana에서 생합성 경로를 통해 완전한 sialy-lation이 이루어진 단백질을 생산하는데 성공하였고 (Castilhoet al. 2008), 이러한 glycoengineering의 기술 발전에 기초하여 앞으로 식물에서도 인간화된 당쇄구조를 갖는 치료용 단백질 생산이 가능하리라 기대할 수 있게 되었다.</p>