덱스트란 생산 균주는 잘 발효된 배추김치를 직접배양법으로 분리하여 염배지에 24시간 배양 후 사용하였다. 이 덱스트란 생산 최적 조건을 구하기 위하여 계획된 실험, 수식 모델의 계수, 모델 적합성 판정 등 총 세가지 모델로 진행되는 Box-Benken design를 사용하였다. 또한 실험 후에 확정된 결과들은 Design Expert 통계 분석을 사용하였다. 이후 덱스트란 생산 발효는 250ml의 배양 플라스크를 이용해주었고 각각의 플라스트 배양에 대하여 1%(v/v)의 배양액을 접종해주었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주의 분리 및 배양</h2> <p>덱스트란 생산 균주는 잘 발효된 배추김치를 구입하여 직접배양법(enrichment culture technique)으로 분리하였다. 균주의 분리 방법은 전에 기술된 방법을 부분적으로 응용하여 사용하였다. 김치 액체 국물에서 한 백금이를 취하여 MRS(Difco. NJ. USA)평판 배지에 옮겨 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48시간을 배양한 후 유산균으로 보이는 콜로니들을 선택을 하였다. 덱스트란 생산 가능 균을 분리하기위하여 슈크로즈을 5% 함유한 TSA(Difco. NJ, USA)에 옮겨 24시간 배양을 하였다. 덱스트란 생성하는 콜로니들을 선별하여 \( 5 \% (w/v) \) 슈크로즈를 함유한 염(salt) 액체 배지로 옮긴 다음 덱스트란 생산 능력을 평가하였다.</p> <p>실험에 사용된 모든 균주는 염배지(mineral medium; MM) \(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} 3 \mathrm{~g} / \mathrm{l} ;  \mathrm{MgSO}_{4} \cdot \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ~0.01 \mathrm{~g} / \mathrm{l} ; \mathrm{MnSO}_{4} \cdot 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) \( 0.01 \mathrm{~g} / \mathrm{l} ; \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ~0.2 \mathrm{~g} / \mathrm{l} ; \mathrm{NaCl} ~0.01 \mathrm{~g} / \mathrm{l} ; \mathrm{CaCl}_{2} ~0.05 \) \( \mathrm{g} / \mathrm{l} \) 를 이용하여 배양하고 보관을 하였는데, 한천 염배지 (MMA)는 MM에 \( 1.5 \% \) 한천을 넣고 만들서다. 위의 염배지에 효모 추출물(yeast extract)을 포함하였을 때는 MMY로 표기를 하였다. 실험하기 전까지 균주는 \( 2 \% \) 과당과 \( 0.5 \% \) 효모 추출물을 포함하고 있는 MMA배지를 20×125 mm 테스트 튜브에 사면배지를 만들어 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관을 하였다. 실험 균주는 사면배지에서 한 백금이에 해당하는 균체량을 \( 2 \% \) 과당과 \( 0.5 \% \) 효모 추출물을 포함하고 있는 \( 10 \mathrm{ml} \mathrm{~MMA} \); 들어 있는 25×150 mm 테스트 튜브에 옮기고 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rpm} \) 에서 24시간 배양 후 사용하였다.</p> <h2>반응표면 분석을 위한 실험 계획</h2> <p>덱스트란 생산 최적 조건을 구하기 위하여 모든 실험 계획은 3 개의 독립변수 즉, 배양 온도, 배양 초기 \( \mathrm{pH} \), 효모 추출물의 농도를 각각 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{pH} 6.5,0.5 \% \) 로 하는 center run을 5번 반복을 포함하여 총 17개의 처리 조합으로 구성을 하였다. Box-Benken design은 세 가지의 중요한 절차에 따라 진행이 되는데, 첫째는 계획된 실험(designed experiment)에 따라 통계적으로 실험을 수행하고, 둘째는 수식 모델의 계수(coefficients of model)를 구하고, 셋째는 모델의 적합성을 판정하는 것으로 진행이 된다. 본 실험에서의 반응 변수들은 덱스트란 생산량, 덱스트란 생산 수율, 균체량 생산, 덱스트란 생산 속도로 하였다.</p> <p>통계적인 계산을 원활히 하기 위하여 독립 변수를 다음과 같이 표준화(code)하여 사용을 하였다. 세 개의 변수들을 각각 X1(온도), X2(pH), X3(효모 추출물)로 하였다. 표준화의값들은 다음과 같은 공식에 의하여 수 할 수 있고 그 값을 Z로 하였다.</p> <p>\( Z=(X-X) / \Delta X \)<caption>(1)</caption></p> <p>\( X^{0} \)는 표준화 값의 중심 값이고 \( X \)는 표준화 값이다. \( \Delta X \)는 1 단위만큼의 증가 또는 감소하는 값의 크기이다. 실험 결과에 대한 분석은 표면 반응 분석법으로 사용을 하였으며 최적 공정 조건을 나타내는 다중 회귀식은 다음과 같다.</p> <p>\( Y=B_{0}+\sum_{i=}^{k} B_{i} X_{i}+\sum_{1}^{k} B_{i} X X_{j} \)<caption>(2)</caption></p> <p>여기서 \( \mathrm{Y} \)는 predicted response이고 본 실험처럼 3개의 변수가 있을 경우에는 k값이 3이 되고 궁극적으로 다음과 같은 식으로 표현된다.</p> <p>\( \begin{aligned} Y=& B_{0}+B_{1} X_{1}+B_{2} X_{2}+B_{3} X_{3}+B_{12} X_{1} X_{2}+B_{13} X_{1} X_{3} \\ &+B_{12} X_{2} X_{3}+B_{11} X_{1}^{2}+B_{22} X_{2}^{2}+B_{33} X_{3}^{2} \end{aligned} \)<caption>(3)</caption></p> <p>실험 후에 확정 된 결과들의 통계 분석은 Design Expert (Couresy: Stat-ease Inc.,Statistics Made Easy, Minneapolis, USA)를 사용하였다. 독립변수들의 값의 선택은 예비 실험에서 얻은 결과로부터 선택을 하여 \( X_{1} \) (온도)는 \( 25^{\circ} \mathrm{C}(-1), 30^{\circ} \mathrm{C} \) \( (0), 35^{\circ} \mathrm{C}(+1) \)로 정하고, \( X_{2}(\mathrm{pH}) \) 는 5.5(-1), 6.5(0) 7.5(+1)로 하고 \( X_{3} \) (효모 추출물의 농도)는 \(0.1(-1), 0,5(0), 0.9(+1)\% \)로 하였다(Table 1). 덱스트란 생산 발효는 \( 50 \mathrm{ml} \mathrm{MM} \)를 담고 있는 \( 250 \mathrm{ml} \) 배양 플라스크를 이용하였는데, 각각 플라스크 배양에 대하여 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)의 배양액을 접종하였다.</p>