vvp 유전자의 mRNA로 부터 cDNA로 역 전사를 진행하였다. 감마선을 조사 또는 조사하지 않은 균을 배지에 접종하고, 3시간마다 배양액을 채취하여 RNA를 추출하고 전기영동을 통해 순도를 확인하였다. 정제된 RNA를 AMV reverse transcriptase와 5X reaction buffer, dNTP 및 RNasin을 이용하여 역전사하여 cDNA를 합성하였다.
<h2>Oligonucleotides</h2> <p>vvp 유전자의 mRNA로부터 cDNA를 만들기 위한 역전사 반응에는 vvp1 primer (5'-gct aag gtc aac aga gcc tag agt-3')를 사용하였고 vvp 발현 정도를 측정하기 위한 real time PCR 반응에는 vvp2 (5'-act gag caa caa cga tct ct-3')와 vvp3 (5'-gtt tac ggt caa aca acg at-3') primer를 사용하였다. Reference 유전자로 사용된 16s rRNA의 경우, cDNA 합성에는 16S1 (5'-acg ctt tcg cat ctg agt gtc agt atc-3'), real-time PCR 반응에는 16S2 (5'-cag cca cac tgg aac tga ga-3')와 16S3 (5'-tta gcc ggt gct tct tct gt-3') primer를 각각 사용하였다.</p> <h2>Total RNA 정제 및 cDNA 합성</h2> <p>감마선 조사 또는 비 조사 균을 새로운 배지에 접종한 후 3시간 마다 배양액 \( 1 \mathrm { ~mL } \)을 채취하여 Trizol(Invitrogen)로 total RNA를 추출한 후 DNA-free \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) DNase(Ambion)로 genomic DNA를 제거하고 RNeasy mini kit(Qiagen)를 이용하여 추출된 RNA를 정제하였다. 모든 방법은 제작회사의 매뉴얼에 따라서 수행하였다. 정제된 total RNA는 agarose gel을 이용한 전기 영동법을 통하여 순도를 확인한 뒤 230, 260 및 \( 280 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하여 농도를 계산하였다. 정제된 total RNA \( 2 \mu \mathrm { g } \)의 부피를 \( 10 \mu \mathrm { L } \) 로 조절한 후 \( 75 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 가열하고 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 50 \mathrm { ng } \)의 primer (vvp1 또는 16S1), 30unit AMV reverse tanscriptase (Promega), 5X reaction buffer, \( 10 \mathrm { mM }\) dNTP, 40unit RNasin을 혼합하여 역전사 반응용액 \( (50 \mu \mathrm { L } ) \)을 만들었다. DNA thermal cycler(Primus \( 96 ^ {\text { plus } } \), MWG Biotech)를 사용하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분간 annealing, \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 90분간 역전사 반응을 수행한 후 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 역전사 효소의 활성을 중지시키고 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 냉각하여 반응을 종료시켰다.</p>