본 연구에서는 수산화 라디칼이 영향을 미치는 국화추출물의 2차 산화물 생성과 관련된 지질과산화 억제능은 KCI로 균질시켜 약품을 첨가시킨 후 2시간 동안 반응시켰다. 한편 유리 라디칼이 영향을 미치는 국화추출물의 유전정보 손상과 연관된 DNA 분절을 조사하기 위해 \( \Psi \) X-174 RF I plasmid DNA을 실시하였다.
<h2>지질과산화 억제능 분석</h2> <p>국화추출물이 수산화 라디칼에 의한 2차 산화물 생성에 미치는 영향을 조사하기 위한 지질과산화 억제능은 NIH 3T3 세포 \( \left (2 \times 10 ^ { 5 } \right . \) cells/ \( \left . \mathrm { ml } \right ) \)에 시료와 \( \mathrm { FeSO } _ { 4 } , \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)를 처리하여 배양 한 후 회수하여 1.15% KCl로 균질화시켰으며, \( 0.2 \mathrm { ml } \) sodium dodecyl sulfate (8.1%), \( 1.5 \mathrm { ml } \) acetic acid (20%) 및 \( 1.5 \mathrm { ml } \) thio-barbituric acid (0.8%)를 첨가하여 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 2시간 반응시켰다. 반응 후 \( 5 \mathrm { ml } \mathrm { n } \)-butanol/pyridine mixture \( (15: 1, \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \)로 분획을 통해 얻은 상등액의 흡광도를 \( 532 \mathrm { ~nm } \)에서 측정하였다.</p> <h2>DNA 손상 억제능 분석</h2> <p>국화추출물이 유리 라디칼에 의한 유전정보의 손상을 유발하는 DNA 분절에 미치는 영향을 조사하기 위하여 먼저 \( \Psi \) X-174 RF I plasmid DNA (New England BioLabs, County Road Ipswich, MA) 분석을 실시하였다. \( \Psi X-174 \) RF I plasmid DNA \( 5 \mu \mathrm { l } \), 농도별 시료 \( 10 \mu \mathrm { l } , \mathrm { FeSO } _ { 4 } \)와 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } 5 \mu \) 쓸 혼합하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 반응시킨 후 50% glycerol \( ( \mathrm { v } / \mathrm { v } ), 40 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 0.05 \% \) bromophenol blue을 첨가하여 전기영동 후 분석하였다. 또한 DNA tail 이동도 분석은 Cho 등의 방법에 따라 시료를 처리한 NIH 3T3 세포에 lysis buffer \( (50 \mathrm { mM } \) tris-HCl, \( \mathrm { pH } \) 7.4, \( 150 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { NaCl } , 1 \mathrm { mM } \) EDTA, 1 mM EGTA, \( 10 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) aprotinin, \( 10 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) leupeptin, \( 5 \mathrm { mM } \) phenyl-methylsulfonyl fluoride, \( 1 \mathrm { mM } \) DTT)와 \( 0.2 \mathrm { mg } \) proteinase K를 혼합한 후 전기영동을 실시하여 확인하였다.</p>