ethanol 추출물은 hexane 분획으로 물 잔류물과 ethylacetate 분획물은 ethanol 추출물의 극히 일부를 차지하였고, 이화누룩에 대해 ethylacetate 분획물을 얻게 되며, 이는 매우 정제된 상태이다. 조제된 이화누룩 추출물 및 분획물의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량은 ethylacetate 분획에서 가장 높은 TP 및 TF 함량을 나타내었고, 한편 내인성 경로에 의한 혈액응고활성을 평가하는 aPTT 측정의 경우에는 용매 대조군인 DMSO의 실험 평균치의 비를 통하여 나타내었다.
<h1>실험 방법</h1> <p>ethanol 추출물의 수득율은 4.23 ± 0.3%이었으며, 순차적 분획시 ethanol 추출물의 34.6%는 hexane 분획으로, 33.2%는 물 잔류물로 이행되었으며, ethylacetate 분획물은 ethanol 추출물의 5.1%를 차지하였다. 이러한 결과는 이화누룩 100 g에 대해 ethylacetate 분획물 약 0.215 g을 얻게 됨을 의미하며, ethylacetate 분획은 상당히 정제된 상태로 판단된다. 조제된 이화누룩 추출물 및 분획물의 총 폴리페놀(total polyphenol:TP) 및 총 플라보노이드(total flavonoid: TF) 함량을 측정한 결과, 한방 약재 및 베리류보다는 낮은 함량의 2.5-9.3 mg/g의 TP 및 0.7-3.4 mg/g의 TF 함량을 나타내었으며, ethylacetate 분획에서 가장 높은 TP 및 TF 함량을 나타내었다. 이때 TP 함량은 추출 검액 400 µl에 50 µl의 folin-ciocalteau, \( 100 \mu \mathrm{l} \)의 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 포화용액을 넣고, 실온에서 1 시간 방치한 후 725 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였으며, 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. TF 함량은 시료를 18시간 메탄올로 교반 추출하고, 여과한 추출 검액400 µl에 90% diethylene glycol 4 ml를 첨가하고 다시 1N NaOH 40 µl를 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응 후 420 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였으며, 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 조제된 이화누룩 추출물 및 분획물의 항혈전 활성을 평가하기 위해 혈액응고 저해활성과 혈소판 응집 저해 활성을 측정하였다. 혈액응고 저해활성은 기존에 보고된 방법에 준해 평가하였으며, thrombin time (TT), prothrombin time (PT) 및 activated partial thromboplastin time (aPTT)을 측정하였다. 먼저 혈액 응고에서 중추적 역할을 수행하는 thrombin의 활성을 평가하는 TT는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 0.5 U thrombin (Sigma Co., St. Louis, MO, USA) 50 µl와 20 mM \( \mathrm{CaCl}_{2} \) 50 µl, 다양한 농도의 시료 10 µl를 Amelung coagulometer KC-1A (Amelung. Lemgo, Germany)의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 표준혈장(MD Pacific Technology Co., Ltd., Huayuan Industrial Area, China) 100 µl를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였으며, PT는 외인성 응고계(II, V, VII 및 X 인자)의 응고 활성을 종합적으로 측정하는 방법으로, 혈장 70 µl와 다양한 농도의 시료 10 µl를 coagulometer의 튜브에 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 가온 후, 130 µl의 PT reagent (MD Pacific Technology Co., Ltd., Huayuan Industrial Area, China)를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 한편 내인성 경로에 의한 혈액응고활성을 평가하는 aPTT 측정의 경우에는, 표준혈장 70 µl와 다양한 농도의 시료 10 µl를 coagulometer 튜브에 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 가온 후, 65 µl의 aPTT reagent (MD Pacific Technology Co., Ltd.,, Huayuan Industrial Area, China) 를 첨가하고 다시 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 반응하였다. 이후 65 µl\( \mathrm{CaCl}_{2} \) (35 mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다[15]. 이때 시료 대조군으로는 아스피린(Sigma Co., St. Louis, MO, USA)을, 용매 대조군으로는 DMSO를 사용하였으며, TT, PT 및 aPTT 연장활성은 각각 3회 이상 반복한 시료 실험의 평균치를 용매 대조구인 DMSO의 실험 평균치의 비로 나타내었다.</p>