본 연구에서는 \(20\) 개의 오이품종 종자를 무균 발아시켜 얻은 유식물체의 배축 절편을 배양해 배 발생능 캘러스를 형성하는 오이를 선정하였으며, 이로부터 노란색의 단단한 캘러스를 절편을 얻고 이를통해 빠르게 생장하는 캘러스 클론을 얻었다. 캘러스 선발에 있어서는 빠른 생장을 보이는 캘러스와 생장속도가 느리고 백화현상을 보이는 캘러스가 구분되기에 선발에 효과적이었다. 한편 배양절편으로부터 항생제 저항성 캘러스 선발과 도입 유전자 발현은 chimeric현상이나 높은 비 형질전환체 생산빈도에 비해 효과적이었다.
<h1>결과 및 고찰</h1><p>국내에서 재배되는 20 개의 오이품종 종자를 무균 발아시켜 얻은 유식물체의 배축 절편을 \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{L}\) 2,4-D 를 첨가한 MS배지에서 배양한 결과, 배 발생능 캘러스를 형성하는 오이 (은성) 1품종을 선정 하였다 (결과 미제시). 체세포배 발생능을 갖는 은성 배축 절편을 Agrobacterium과 공동배양 한 후 paromomycin이 첨가된 선발배지에서 배양한 결과, 배양 2주 후 배축 절편 가장자리가 점차 팽창되어 상처부위로부터 노란색의 캘러스가 형성되기 시작하였다. 배양 4주 후 배축 가장자리에서 형성된 노란색의 단단한 캘러스를 절편으로부터 분리하여 2 주 간격으로 6-8동안 배양하면서 빠르게 생장하는 캘러스 클론을 얻었다. 해부현미경하에서 이러한 캘러스로부터 배발생캘러스를 선발하여 증식시켰으며, 1/2 MS 기본배지에 옮겨 체세포배를 유도한 후 식물체를 얻었다. 식물은 품종과 계통에 따라 배 발생 캘러스의 형태 및 식물체 재분화 능이 다를 수 있기 때문에 (Komatsuda 1992; Choi et al. 2002) 실험 목적에 맞는 품종 또는 계통을 선발하여 실험에 이용하는 것이 중요하다 할 수 있다. 특히 오이의 경우는 대부분의 품종에서는 체세포배 형성보다는 기관발생을 통한 식물체 재분화가 쉽게 이루어지기 때문에 (Selvaraj et al. 2007) 체세포배 발생을 통한 형질전환체 생산을 목적으로 할 경우 품종 스크리닝은 필수적이라 할 수 있다. 본 연구에서도 국내에서 유통되는 20 여 가지의 품종 중 "은성” 품종의 배축절편으로부터 체세포배 발생이 가능하였으며, 대부분의 품종에서는 기관발생이 잘 이루어졌다 (Cho et al. 2005a).</p><p>배양초기 paromomycin이 첨가된 선발배지에서 배축 절편으로부터 캘러스 형성이 대부분 이루어졌으나 선발배지에서 2주 간격으로 계대배양하는 동안 생장이 빠른 캘러스와 느린 캘러스로 구분되었다. 생장이 느린 캘러스의 경우 선발배지에서 점차 백화 현상을 보이면서 생장이 멈췄으며, 빠른 생장을 보인 캘러스의 경우 백화현상은 나타나지 않았으며, 노란색의 단단한 형태로서 배발생 캘러스와 유사하였다. 형질전환과정에서 첨가되는 선발제의 종류에 따라 식물세포의 반응은 다양하게 나타난다. 예를 들면 glufosinate는 형질전환이 일어나지 않은 세포의 경우에는 암모니아 축적으로 세포내 인산화과정을 저해시킴으로서 갈변현상을 보이면서 점차 세포를 괴사 시키지만 (Muller et al. 2001; Cho et al. 2005a), paromomycin은 neomycin phosphotransferase II (nptII) 효소 작용에 의해 불활성화됨으로서 형질전환이 일어나지 않은 세포는 백화현상을, 형질전환 세포는 항생제 저항성을 갖게 하여 정상적인 형태로 빠르게 생장할 수 있기 때문에 (Roa-Rodriguez and Nottenburg 1999) 옥수수와 같은 단자엽 식물에서 배발생캘러스 유도를 통한 형질전환체 생산이나 (Cho et al. 2005b) 배추와 무와 같은 십자화과 식물의 배축 절편으로부터 캘러스 형성을 통한 형질전환체를 얻는데 효과적으로 이용되어 왔다 (Cho et al. 2006, 2008). 이와 유사하게 오이와 동일 박과작물인 수박의 형질전환에서도 paromomycin의 선발효과가 확인되었다 (Kwon et al. 2007). 본 연구에서도 paromomycin은 노란색의 단단한 형태를 갖는 빠른 생장을 보이는 캘러스와 생장속도가 느리고 백화현상을 보이는 캘러스로 구분되어 배축절편으로부터 형질전환 캘러스를 선발하는데 효과적임을 알 수 있었다.</p><p>Agrobacterium 과 공동배양 한 928개의 배축절편으로부터 배양 6 - 8주 후 선발된 56개의 캘러스를 대상으로 GUS유전자의 발현빈도를 조사한 결과 실험군간 발현빈도 \( (2.1 \% \) - \( 9.1 \%) \) 는 차이가 있었으나 48개의 캘러스에서 GUS유전자가 발현되어 \( 5.2 \% \) 의 높은 빈도를 나타냈다. 이러한 캘러스로부터 체세포배발생을 통한 식물체 재생은 실험I 군에서 2개 \( (0.7 \%) \), 실험III 군에서 1 개 \( (0.6 \%) \), 실험VI 군에서 2개 \( (2.1 \%) \) 를 각각 얻어 총 48개중 오직 5개의 캘러스 클론에서만 식물체가 유도되어 매우 낮은 빈도 \( (0.5 \%) \) 를 나타냈다. 체세포배로부터 재생된 5개의 유식물체중에서 오직 1개체에서만 인공수정을 통해 \( \mathrm{T}_{1} \) 종자를 수확할 수 있었으며, GUS 유전자가 대조군에 비해 안정적으로 발현되고 있음을 확인하였다. 초기 오이의 형질전환 연구가 대부분 잎, 배축 및 자엽절편으로부터 기관발생을 통해 이루어진 이후 (Chee 1990; Dong et al. 1991; Saramento et al. 1992; Nishibayashi et al. 1996), 최근까지도 체세포배발생 (Woo et al. 2001)보다는 기관발생을 통한 식물체 재생 및 형질전환 연구가 진행되고 있다 (Lee et al. 2004; Cho et al. 2005a; Vasudevan et al. 2007; Selvaraj et al. 2007). 예외적으로 Woo (2001)등은 배발생캘러스의 현탁배양을 통해 형질전환체 생산을 위한 연구를 시도 하였지만 완전한 형질전환체를 생산하지 못하여 오이의 식물체 재생은 체세포배보다는 기관발생이 훨씬 쉬운 것으로 보고되어 있다. 본 연구에서도 배양절편으로부터 항생제 저항성 캘러스 선발과 도입 유전자 발현까지는 기관발생시 나타나는 chimeric현상이나 높은 비 형질전환체 생산빈도 (Gaba et al. 2004)에 비하여 매우 효과적이었다. 그러나 GUS 유전자발현이 확인된 항생제 저항성 캘러스로부터 배발생캘러스 선발, 체세포배유도 및 식물체 재생과정은 쉽지 않은 것으로 나타나 향후 오이 형질전환체를 안정적으로 생산하기 위해서는 항생제 저항성 캘러스로부터 식물체 재생에 대한 최적의 배양조건을 확립하는 것이 필수적이라 사료된다. 현재 보다 안정적이고 반복적인 형질전환시스템을 구축하기 위하여 항생제 저항성 캘러스로부터 식물체재분화 빈도를 증가시킬 수 있는 연구를 진행하고 있다.</p>