미생물 후발효차는 동아시아에서 생산되며 녹차, 홍차 등과 구별되는 특유의 맛, 색, 향을 가지고 있는 미생물의 발효과정으로 제조하는데, 본 연구에서는 DG-DGGE를 통해 미생물 군집 구조를 분석하여 공통점과 차이점을 알아보았다. 한국이 전통 후발효차와 중국의 후발효차의 품질을 결정하는 것으로 후발효차에 존재하는 미생물은 매우 유사하나, 한국 후발효차간, 중국 후발효차간의 각각 미생물 군집의 유사성과 우점하는 군집과 크기를 기반하여 분석한 결과와 같으며 한국의 후발효차와 중국의 후발효차가 뚜렷하게 구분되었다. 앞으로 미생물 군집 분석을 통해 산지에 따른 후발효차를 구분할수 있을것으로 사료된다.
<h2>결과 및 고찰</h2> <p>미생물 후발효차는 동아시아에서 제한적으로 생산되며, 미생물의 발효과정으로 제조되기 때문에 녹차, 홍차 등과 구별되는 특유의 맛, 색, 향을 지니게 된다. 본 연구에서는 한국이 전통 후발효차와 중국의 후발효차의 품질을 결정짓는 미생물 군집 구조를 분석◦비교하여 한국 후발효차(2개 시료)나 중국 후발효차(2개 시료)의 공통점과 차이점을 규명하고자 하였다.</p> <h3>DG-DGGE를 통한 미생물 군집분석</h3> <p>한국의 알가차와 단차 그리고 중국의 보이차는 전통 미생물발효차로서 연구에 사용한 시료는 2015년 제조하여 1년 숙성된 후발효차를 이용하였다. 본 연구에서는 개선된 DG-DGGE 기법을 사용하였다. 기존 DGGE 기법은 homo-duplexs를 분리하지 못하는데 비해 DG-DGGE에서는 분리가 가능하기 때문에 보다 정확한 염기서열간의 차이를 구분할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 각 시료로 부터 total \( \mathrm { DNA } \)를 획득하였으며, 미생물 universal primer인 \( 341 \mathrm { ~F } - \mathrm { GC } \)와 \( 786 \mathrm { R } \) primer를 이용하여 \( \mathrm { PCR } \) 증폭산물을 얻었고, 군집구조를 확인하는데 유용한 기법인 DG-DGGE를 이용하여 미생물 군집구조 분석을 수행하여 미생물 군집 패턴을 확인하였다. 또한, 미생물 군집분석을 위한 밴드 동정을 위해 DG-DGGE gel로부터 알가차와 단차에서 7개의 밴드와 보이차에서 3개의 밴드를 회수하여 염기서열을 결정하였으며, NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)의 GenBank database를 이용하여 BLAST search (blastn)를 통해 상동성을 비교검색하였다. DG-DGGE를 통한 후발효차 우점 미생물 분석은 genus 수준에서 총 6종의 미생물을 동정했고, Pseudomonas (band 1, 2, 3) Burkholderia (band 4), Shigella sonnei (band 5), Ralstonia solanacearum (band 6, 7, 9), Sphingomonas (band 8)와 Enterobacter (band 10)로 확인되었다. 미생물 군집구조분석을 수행한 결과 DG-DGGE 밴드 패턴이 전체적으로 유사하였지만, 한국의 후발효차와 중국의 후발효차간의 매우 적은 밴드 패턴의 차이를 확인할 수 있었다. 9번 밴드는 중국의 보이차에서만 관찰되었고, 염기서열 분석결과 Uncultured Ralstonia (LN624415)로 보이차에서만 확인되었다. DG-DGGE 분석을 통해, 후발효차에 존재하는 미생물는 매우 유사하나, 한국 후발효차간, 중국 후발효차간의 각각 미생물 군집의 유사성을 확인하였다. 이러한 밴드 차이를 활용하여 한국 전통후발효차와 중국의 후발효차를 구별할 수 있는 가능성을 확인하였다. 또한, 미생물 군집 분석을 통한 원산지 구별 방법이 정립되기 위해서는 더 많은 연구가 수행되어야 할 것으로 판단된다.</p> <h3>\( 16S \\mathrm { rRNA } \) 유전자를 통한 미생물 군집분석</h3> <p>\( 16S \\mathrm { rRNA } \) gene clone library를 통해 미생물 군집의 다양 성과 각 군집의 크기를 확인하였다. 미생물 universal primer인 \( 27 \mathrm { ~F } \) 와 \( 1542 \mathrm { R } \)을 이용하여 \( \mathrm { PCR } \) 증폭산물을 얻었으며, cloning을 통하여 \( 16S \\mathrm { rRNA } \) 유전자 염기서열을 분석하였고, \( \mathrm { NCBI } \)의 BLAST search를 통해 검색하고 동정하였다. 한국 후발효차인 알가차의 \( 16 \mathrm { ~S } \mathrm { rRNA } \) 유전자의 미생물 군집분석결과 Rhodobacteracea \( (27.6 \%) \) , Pantoea ananatis \( (13.8 \%) \) , Roseomonas \( (13.8 \%) \)와 Uncultured bacterium \( (13.8 \%) \)가 각각 우점하였으며, 단차의 미생물 군집은 Rhodobacteraceae \( (27.1 \%) \), Acidovorax \( (23.7 \%) \), Pantoea ananatis \( (10.2 \%) \)와 Pseudomonas \( (10.2 \%) \)가 우점하였다. 그리고 중국의 전통 후발효차인 보이차 1의 미생물 군집분석 결과 Pantoea allii \( (19.4 \%) \), \ Gemmobacter caeni \( (16.1 \%) \),Sphingomonas \( (16.1 \%) \)와 Reyranella \( (12.9 \%) \)가 우점하고 있으며, 보이차 2의 미생물 군집 분석결과 Sphingomonas \( (17.7 \%) \), Exiguobacterium \( (16.1 \%) \), Pantoea allii \( (16.1 \%) \) 와 Klebsiella \( (12.9 \%) \)의 순으로 우점하는 것을 확인하였다. 한국 후발효차인 알가차와 단차에 가장 우점하는 미생물은 Rhodobacteraceae ( \( \alpha \)-proteobacteria, 알가차; \( 27.6 \% \), 단차; \( 27.1 \% \) )로 규명되었으나, 중국의 후발효차인 보이차 2종에서는 Pantoea allii ( \( \gamma \)-proteobacteria, 보이차 \( 2 ; 16.1 \%) \))와 Sphingomonas ( \( \alpha \)-proteobacteria, 보이차 \( 1 ; 16.1 \% \), 보이차 \( 2,17.7 \%) \)가 우점하는 것으로 분석되었다. 미생물 후발효차에 우점하는 미생물은 \( \alpha \)-proteobacteria(Rhodobacteraceae, Roseomonas, Gemmobacter, Reyranella, Sphingomonas, Thioclava)와 \( \gamma \)-proteobacteria (Acidovorax, Aeromonas, Klebsiella, Pantoea, Pseudomonas 등)가 전체적으로 우점하는 것으로 분석되었고, \( \alpha \)-proteobacteria와 \( \gamma \) -proteobacteria의 우점률은 모든 후발효차에서 \( 79 \% \) 이상으로 확인되었다. Pantoea는 주로 식물의 잎 등에서 분리가 되었으며, meta-genome 분석을 통해 떡차에서 우점하며, 발효과정에서도 Sphingomonas와 Bacillus가 함께 우점하고 있다고 보고되었다. 또한, Polyphenol tannic acid와 gallic acid의 분해과정에 관여하는 gallic acid decarboxylase는 Pantoea agglomerans T71에서 발견되었으며, gallic acid와 tannic acid의 생물학적 전환이 보고되었다. 또한, Pantoea dispersa Y08은 carotenoids를 아로마 화합물로 전환시키는 것이 보고되었다. Sphingomonas와 Rhodobacteraceae는 현재까지 다양한 방향족 화합물을 분해한다는 많은 보고가 있으며, 한국과 해외의 전통 발효식품을 제조하는데 관여하는 중요한 발효 미생물로 잘 알려져있다. 이와 같이 gallic acid, carotenoides와 방향족 화합물의 생물 전환능력이 보고된 Pantoea와 Sphingomonas 가 후발효차에서 우점하고 있는 것을 고려하면 후발효차의 발효과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 판단된다. \( 16S \\mathrm { rRNA } \) gene clone library 분석결과 주목할 점은 한국의 후발효차에 우점하고 있는 Rhodobacteraceae 는 2종의 한국차에서만 검출되었으며, Pantoea vegans ( \( \gamma \)-proteobacteria)는 한국의 후발효차에서만 검출되었다. 또한, 보이차에 우점하는 Pantoea allii와 Sphingomonas는 한국의 후발효차에서는 검출되지 않았으며, Gemmobacter, Klebsiella, Reyranella, Shigella, Thioclava 는 중국의 보이차에서만 검출되었다. 또한, 미생물 군집분석 결과를 기반으로 시료간 차이와 유사성을 규명하기 위해 SPSS program (SPSS V18, USA)를 이용하여 분석하였다. 각 시료에서 우점하는 군집과 크기를 기반하여 분석한 결과와 같으며 한국의 후발효차와 중국의 후발효차가 뚜렷하게 구분되었다. 향후 미생물 군집 분석을 통해 산지에 따른 후발효차를 구분할 수 있는 가능성이 있을 것으로 기대된다. 이를 위해서는 후발효차에 관한 활발한 연구를 통해 많은 지식이 축적되기를 기대한다.</p>