Sambrook 등의 방법을 이용한 대장균의 DNA 분리 및 형질전환과 Rao 등의 방법으로 S. S. natalensis의 genomic DNA를 회수한 연구를 진행하였다. 방선균 유래 MetK의 보존성이 높은 영역을 기반으로 S. natalensis에서의 metK 유전자 클로닝을 위한 PCR을 수행하였고, 그 결과를 \( \mathrm { pUC19 } \) 를 이용하여 클로닝하였다. 염기서열은 ABI PRISMTM 3100으로 결정하고, NCBI의 BLASTX 상동성 검색으로 PCR산물을 동정하였다. 선발된 접합전달체는 nalidixic acid와 apramaycin이 포함된 배지에서 계대배양하고, 그 결과로부터 chromosome DNA를 추출하여 형질전환 유무를 PCR로 확인하였다.
<h2>\( \mathrm { DNA } \) 조작 및 염기서열 결정</h2> <p>대장균에서의 DNA 분리 및 형질전환은 Sambrook 등의 방법을 사용하였고 S. natalensis의 genomic DNA는 Rao등의 방법으로 회수하였다. S. natalensis로부터 metK 유전자의 클로닝을 위해 방선균 유래 MetK로부터 확인된 보존성이 높은 2영역을 토대로 제작된 F2 (5'-CGGAATTCARG GNCAYCCSGAYAARATC-3')와 R2 (5'-CGGAATTCTCN ACYTTSSWSGGRTCYTT-3')를 primer로 사용하여 PCR을 진행하였다. 얻어진 PCR 산물은 \( \mathrm { pUC19 } \) 를 이용하여 클로닝한후, ABI PRISMTM 3100 (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였으며 NCBI의 BLASTX 상동성 검색을 통해 PCR산물을 동정하였다. Southern blot과 Colony hy-bridization을 위해 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche Applied Science, Tokyo,Japanj와 0.5-kb metK 유전자 단편을 probe로 사용하였다.</p> <h2>metK 고발현용 재조합 플라스미드 및 형질전환체의 구축</h2>><p>metK 유전자의 고발현 벡터를 구축하기 위해 erythromycin내성유전자의 프로모터를 토대로 만든 \( e r m E ^ { * } \) 프로모터와 aparamycin 내성유전자 \( (a p r) \), phC31유래의 attachment site (attP)와 integrase (int), 그리고 RK2 oriT를 포함하고 있어 접합전달의 부위-특이적 재조합(site-spectific recombination)벡터로 사용되는 pSET152ET \( (6 \mathrm { ~kb } ) \)를 이용하여 metK의고발현을 위한 재조합 플라스미드(pCD1)를 구축하였다. pSET152ET 벡터의 \( \operatorname { lacZ } \) 유전자에 존재하는 Ban円II과 XbaIsite에 자체 ribosome-binding sequence와 terminator를 포함한 1.3-kb metK유전자 단편을 삽입하여 metK 고발현용 재조합 플라스미드인 pCD1을 제작하였다. 또 pCD1을 S. lividansTK24에 도입하기 위해 메틸화가 결손된 E. coli ET12567/ \( \mathrm { pUZ8002 } \) 를 DNA 공여균주로 사용하는 접합전달법(conjugal transfer)을 이용하였다. pCD1을 포함하는 공여균주 E. coliET12567/pUZ8002은 apramycin (50 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \), chlor-amphenicol \( (25 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \), kanamycin \( (50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 이 첨가된 LB 배지에 접종한 후, \( \mathrm { OD } _ { 600 } \) 에서 \( 0.4 \) 가 될 때까지 배양하여 침전 회수하고 \( 0.1 \) 배의 LB 배지로 재현탁하여 \( 0.5 \mathrm { ml } 2 \times Y \mathrm { ~T } \) 에 현탁된 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) S. lividans \( \mathrm { TK } 24 \) 포자와 잘 혼합한 다음, 원심분리하여 상징액을 제거한 뒤 얻어진 pellet을 \( 10 \mathrm { mM } \) 의 \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \) 를 포함한 \( \mathrm { MS } \) 배지에 도말하고 \( 28 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 16 \sim 20 \) 시간 동안 정치배양하였다. 형질전환체의 선별을 위해 \( 1.5 \mathrm { ml } \) 의 살균수에 \( 0.5 \) \( \mathrm { mg } \) 의 nalidixic acid와 \( 1 \mathrm { mg } \) 의 apramaycin을 첨가하여 배지위에 중첩시킨 후, \( 28 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 6 일간 더 배양하였다. 선발된 접합전달체를 nalidixic acid ( \( 25 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 및 apramaycin ( \( 25 \mu \mathrm { g } / \) \( \mathrm { ml } ) \) 이 함유된 선텍 배지에 계대배양한 뒤 얻어진 균주들로부터 chromosome DNA를 추출하고 PCR 를 이용하여 형질전환 유무를 확인하였다.</p>