멸균된 유리 슬라이드가 있는 플레이트에 세포를 분주한 후 약물 처리를 실시하였다. 이어서 confocal microscope를 사용하여 세포 내의 fluorescent 이미지를 관찰하였다. p47 \( \mathrm { } ^ {\text { phox } } \) 유전자의 침묵을 위해 21-nucleotide du-plex siRNA를 Dharmacon 사에서 주문하여 사용하였다. 또한, CoPP 자극에 의해 유전자 발현된 HO-1을 DPI를 통해 억제했을 때, 이것이 HO-1의 전사인자인 Nrf2에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다.
<h2>Immunofluorescence assay</h2> <p>멸균된 fat-free glass slide가 깔려있는 plate에 세포를 분주한 뒤 약물을 처리하였다. PBS를 사용하여 세척한 후, 세포를 고정시키기 위해서 4 \( \% \) paraformaldehyde를 상온에서 5 분 반응시킨 후, PBS로 세척하였다. 그 다음 세포 permeability를 높이기 위해 0.2 \( \% \) Triton X-100 / 5 \( \% \) FBS를 상온에서 10 분 동안 반응시켰다. 고정된 세포에 Nrf2 항체를 1 시간 동안 반응시킨 후 FITC가 부착되어 있는 2 차 rabbit 항체를 반응시켰다. 세포 내 fluorescent image는 confocal microscope (Olympus,Tokyo, Japan)를 사용하여 관찰하였다.</p> <h2>Transfection of small interfering RNA (siRNA)</h2> <p>p47 \( \mathrm { } ^ {\text { phox } } \) 유전자를 silencing 하기 위하여, 21-nucleotide du-plex siRNA를 Dharmacon 사(Lafayette, CO, USA)에 주문하여 사용하였다. HepG2 세포를 1 \( \times \)10 \( \^ { 5 } \) cells/ \( \mathrm { ml } \) 의 농도로 60-mm dish에 분주한 뒤 12 시간 배양한 후, 준비한 p47 \( \mathrm { } ^ {\text { phox } } \) siRNA를 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) 제품인 Lipofectamin 2000 reagent를 이용하여 제조사가 추천하는 protocol에 의거하여 transfection 하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>간암세포주 HepG2에서 DPI에 의한 HO-1 발현의 억제</h2> <p>여 DPI를 사용하였다. 배양 중인 HepG2 세포에 다양한 농도(10, 50, 100 \( \mu \mathrm { M } ) \) 의 CoPP를 24시간 동안 처리하여, CoPP에 의한 HO-1의 발현이 농도 의존적으로 증가함을 Western blot analysis를 이용하여 확인하였다(Fig. 1A). DPI를 농도별 1,10,50 \( ( \mu \mathrm { M } ) \) 로 1 시간 전처리 된 HepG2 세포에 CoPP를 처리한 경우에는 HO-1의 단백질 양이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다. 이는 DPI에 의한 NADPH oxidase의 활성억제가 CoPP에 의한 HO-1의 유전자 발현을 감소시킨다는 것 을 나타내는 것이라 할 수 있다. 다른 HO-1 유도제로 사용되는 hemin을 처리하였을 때도 CoPP를 처리한 경우처럼 DPI에 의해 HO-1의 발현이 현저히 감소하는 것을 관찰할 수 있었다</p> <h2>HO-1 발현의 전사인자 Nrf2에 대한 DPl의 효과</h2> <p>다음으로 CoPP 자극에 의한 HO-1 유전자 발현의 DPI에 의한 억제가 HO-1의 전사인자 Nrf2에 미치는 영향을 조사하였다. 자극에 의한 HO-1의 유전자 발현의 개시는 전사인자 Nrf2의 핵으로의 이동과 더불어 세포 내 양적 증가도 수반되는 것으로 알려져 있다. 세포에 자극이 오면 Keap1에 부착되어 불활성 형태로 존재하던 Nrf2는 활성화된 형태로 핵으로 이동하게 된다. 핵으로 이동한 Nrf2은 Maf와 결합하여 전사억제 인자로 알려져 있는 Bach1을 밀어내고 HO-1 유전자의 ARE부착 부위에 결합하여 유전자 발현을 개시하는 것으로 보고되고 있다. 본 연구에서 HepG2 세포에 CoPP를 처리하였을 때 역시 비슷한 결과를 볼 수 있었는데, Nrf2의 핵으로의 이동과 Bach1의 세포질에서의 증가와 함께 HO-1의 증가를 관찰할 수 있었다. 그러나, DPI의 전처리는 CoPP에 의해 유도되는 Bach1의 세포질로의 이동과 Nrf2의 핵으로의 이동을 완전히 억제시켰다. 이는 세포질 및 핵 단백질을 분리한 후 수행한 Western blot analysis과 immunofluorescence 분석을 이용하여 확인할 수 있었다.</p>