PC3 세포들의 RNA를 TRIzol reagent로 분리하고, ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit과 Mastercycler gradient를 사용하여 PCR 산물을 증폭하였다. 1% agarose gel과 DNA gel loading solution을 사용하여 PCR 산물의 양적 차이를 확인하고, Western blot analysis를 이용하여 PC3 cell line에서 생성된 protein의 양적 차이를 확인하였다.
<h2>RT-PCR 및 Western blot analysis</h2> <p>Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)을 위하여 준비된 PC3 세포들의 RNA를 TRIzol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA)를 이용하여 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, 각각의 primer, DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭하였다. 각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하여 1× TAE buffer로 \( 1 \% \) agarose gel을 만들고 well 당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 loading 한 후 \( 50 \mathrm { ~V } \) 에서 전기영동을 행하였다. 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 ethidium bromide (EtBr) 을 이용하여 염색한 후 UV 하에서 발현의 차이를 확인하였으며, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) internal control로 사용하였다. 또한 Western blot analysis 를 위하여 동일 조건에서 배양된 PC3 세포에 적당량의 lysis buffer [25 mM Tris-Cl ( \( \mathrm { pH } 7.5 \)), \( 250 \mathrm { mM } \) NaCl, \( 5 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 1 \% \) NP-40, \( 1 \mathrm { mM } \) phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), \( 5 \mathrm { mM } \) dithiothreitol (DTT)]를 첨가하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30분간 반응시 킨 후, \( 14,000 \mathrm { rpm } \) 으로 30 분간 원심분리하여 그 상층액을 취하 였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 정량 한 다음 Laemmli sample buffer (Bio-Rad)를 섞어서 sample을 만들었 다. 이렇게 만든 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 전이시킨 후, 해당 항체를 처리하여 한 후 Enhanced Chemiluminoesence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 암실에서 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <p>Fig. \( 1 \mathrm { A } \) 및 \( \mathrm { B } \) 의 결과에서 알 수 있듯이 글루타민이 결핍된 배지에서 배양된 PC3 세포는 배양된 시간이 증가할수록 세포의 밀도 감소와 함께 생존율의 감소가 관찰되었는데, 48 시간 및 72 시간 후에는 각각 \( 30 \% \) 및 \( 47 \% \) 정도의 생존율 억제를 보였다. 이러한 글루타민 결핍에 의한 PC3 세포의 증식억제가 apoptosis 유도와 연관성이 있는지의 여부를 DAPI 염색을 통하여 관찰해 본 결과는 Fig. \( 1 \mathrm { C } \)에 나타낸 바와 같이, 정상조건에서 배양된 PC3 세포에서 뿐만 아니라 글루타민이 결핍된 조건에서 배양된 PC3 세포에서도 apoptosis가 일어났을 경우 관찰되는 염색질의 응축에 의한 apoptotic body의 형성은 관찰되지 않았다. 이는 A549 폐암세포나, U937 또는 HL-60 혈구암세포에서와는 다소 상반된 결과이며, 특히 글루타민 결핍에 의한 apoptosis가 c-myc 의존적으로 일어난다는 점과 비교할 때, PC3 세포는 c-myc의 발현이 정상적으로 이루어지는 세포인 점을 고려하여 apoptosis와의 연계성에 관해서는 추가적인 연구가 필요한 부분이라고 생각된다.</p>