강원도, 경상도, 제주 및 충남 지역에서 김치를 비롯한 전통 발효식품을 수집하여 1g과 9ml의 펩톤수를 혼합하여 적정 배수로 희석한 후 TSA 배지에 도말하고 37\(^\circ \mathrm{C}\)에 24시간 배양하여 투명환을 형성하는 균주 8점을 확보하였고 KCTC13112 균주를 대조구로 사용하였다. 균주의 단백질 분해 효소활성을 정량적으로 평가하기 위해 Cupp-Enyard 등의 방법을 일부 변형하여 흡광도를 측정하였으며, bovine serum albumin을 표준물질로 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>발효식품 수집 및 균주 분리</h2> <p>강원도(평창, 진부, 대관령, 양구, 삼척, 동해), 경상도(예천, 대구, 부산, 울산, 영덕, 울진), 제주 및 충남 지역에서 김치를 비롯한 전통 발효식품을 수집하였다. 발효식품 \( 1 \mathrm{~g} \) 과 \( 9 \mathrm{ml} \)의 펩톤수(BD Diagnostic, USA)를 혼합하여 적정 배수로 희석한 후 skim milk (1\%, BD Diagnostic, USA)가 포함된 Tryptic Soy Agar (TSA; BD Diagnostic, USA) 평판배지에 도말하였다. 도말한 배지는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 동안 배양한 후 투명환(clear zone)을 형성하는 균주 8점을 확보하였다. B. subtilis KCTC13112 균주를 한국미생물자원센터(KCTC, Korea)로부터 분양받아 대조구 균주로 사용하였다.</p> <h2>효소활성 측정</h2> <p>균주의 효소활성을 정량적으로 평가하기 위하여 단일 집락을 TSB 배지에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양액을 원심분리 \( (15,115 \times g, 5 \) 분 \( ) \) 하여 얻은 상등액은 단백질 농도 및 효소활성 측정을 위한 조효소액으로 사용하였다. 단백질 분해 효소활성의 정량적 측정은 Cupp-Enyard 등의 방법을 일부 변형하여 사용하였다. 인산염 완충액 (50 mM, \( \mathrm{pH} \) 7.5)에 casein (BD Diagnostic, USA)의 농도가 \( 0.65 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 가 되도록 용해한 것을 기질 용액으로 사용하였다. \( 1 \mathrm{ml} \) 의 기질용액에 \( 200 \mu \mathrm{l} \) 의 조효소액을 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 반응한 후, \( 1 \mathrm{ml} \) 의 \( 110 \mathrm{mM} \) trichloroacetic acid 를 첨가하여 반응을 종료하였다. 반응액을 원심분리(15,000 \( \times g, 10 \) 분)한 후 상등액 \( 400 \mu \mathrm{l} \) 를 \( 1 \mathrm{ml} \) 의 \( 500 \mathrm{mM} \) sodium carbonate (Sigma-Aldrich, USA), \( 200 \mu \mathrm{l} \) 의 folin \& ciocalteu's phenol reagent (Sigma-Aldrich, USA)와 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분 동안 반응시켜 \( 660 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 효소활성(1 unit)은 반응조건에서 1 분간 \( 1 \mu \) mole의 tyrosine 을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.</p> <p>반응조건에 따른 효소활성을 비교하기 위하여 반응온도를 \( 25-70^{\circ} \mathrm{C} \) 범위로 조정하였으며, \( 50 \mathrm{mM} \) citric acid-sodium citrate buffer \( (\mathrm{pH} \) 3.0), acetic acid-sodium acetate buffer ( \( \mathrm{pH} 4.0-5.0) \), phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} 6.0-8.0 \) ), glycine-sodium hydroxide buffer ( \( \mathrm{pH} \) 9.0-10.0)로 반응 \( \mathrm{pH} \) 를 조절하여 효소활성을 측정하였다[30]. 단백질 농도는 조효소액을 적정 농도로 희석하여 bradford dye reagent (Bio-Rad, USA)와 반응한 후 \( 595 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였으며, bovine serum albumin (BSA; Biosesang, Korea)을 표준물질로 사용하였다.</p>