본 연구는 \( \mathrm{Fe}^{++} \)/ascorbate에 의해 유도된 항산화 활성을 측정하기 위해 흰쥐 간 조직에서 microsome 분획하였으며, 이를 Wong 등의 방법에 따라 항산화 활성을 측정하였다. 다음으로 영지버섯, 여주, 쓴메밀, 이들 혼합시료의 메탄올 추출물의 혈전용해 효소 활성을 측정하기 위해 fibrin plate 법을 참고한 방법을 사용했으며, 똑같은 메탄올 추출물의 tyrosinase 활성을 측정하기 위해 Masamoto 등의 실험 방법을 참고하였다. 위 방법으로 얻은 데이터는 평균치와 표준오차로 표시하였다.
<h2>\( \mathrm{Fe}^{++} \)/ascorbate에 의해 유도된 항산화 활성 측정</h2> <p>성장기의 정상 흰쥐 간 조직으로부터 microsome 분획을 조제 하였다. 간 microsome 분획을 이용한 항산화 활성은 Wong 등의 방법에 따라 측정하였다. 간 microsome 분획 \( 0.1 \mathrm{~ml}(1 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) 단백질), 각 시료 추출물 0.1, 0.5 및 \( 1 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) 농도 용액 \( 0.2 \mathrm{~ml}\), \(50 \mathrm{~mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\) buffer \( ( \mathrm{pH} ~7.5) \) \( 1.5 \mathrm{~ml} \), \( 0.1 \mathrm{~mM} \) ascorbate \( 0.1 \mathrm{~ml} \) 및 \( 5 \mathrm{~mM} \) \(\mathrm{FeSO}_{4}\) \(0.1 \mathrm{~ml} \)의 반응액을 잘 혼합한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시켜 지질 과산화를 유도시켰다. 이때 음성 대조구는 시료를 첨가시키지 않고 증류수를 첨가하였으며, 양성 대조구 BHT는 \( 0.05 \% \) 농도로 사용하여 동일한 방법으로 측정하였다. 1시간 반응 후 3 M trichloroacetic acid와 \( 2.5 \mathrm{~N} \mathrm{~HCl} \)의 혼합 용액 \( 0.5 \mathrm{~ml} \)를 가하고 \( 3,000 \mathrm{~rpm} \)으로 원심분리 한 후 그 상등액 \( 1 \mathrm{~ml} \)에 \( 0.67 \%\) TBA \(1 \mathrm{~ml} \)를 넣고 30분 동안 가열하여 발색시켰다. 냉각 후 \( 3,000 \mathrm{~rpm} \)에서 원심분리 하여 얻은 발색된 반응 상등액을 spectrophotometer (HITACHI U-2900) \( 535 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였으며, 지질과산화의 억제율은 대조구의 흡광도에 대한 저해율\( (\%\))로 비교하였다.</p> <h2>혈전용해 활성 측정</h2> <p>영지버섯, 여주, 쓴메밀, 이들 혼합시료의 메탄올 추출물의 혈전용해 효소 활성은 fibrin plate 법을 변형하여 lysed zone으로 측정하였다. Fibrin plate는 \(0.06\%\) fibrinogen (Sigma Co., St. Louis MO, USA) 을 0.2 M borate buffer \( ( \mathrm{pH} ~7.5) \)에 용해시킨 후 Petri dish에 \( 10 \mathrm{~ml} \)씩 분주하고 thrombin \( (5,000 \mathrm{~unit} ) \) \( 40 \mathrm{~unit} \)를 균일하게 섞이도록 가하면서 균일한 두께의 fibrin clot를 형성시킨 후 실온에서 30분간 방치한 후 사용하였다. 시료 분말을 증류수에 \( 1 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 만든 후 여과하여 fibrin plate 상에 \( 50\ \mu \mathrm{l} \)씩 점적하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 동안 반응시킨 후 생성된 용해면적을 측정하여 활성을 비교하였다. 대조구는 혈전용해 효소인 plasmin \( (0.75 \mathrm{~U} / \mathrm{ml}) \)을 사용하여 다음과 같은 방법으로 혈전용해 활성을 산출하였다.</p> <p>\( \mathrm{Fibrinolytic\ activity} (\%) = ( \mathrm{시료의\ 용해\ 면적/plasmin의\ 용해면적} \times 100 \))</p> <h2>Tyrosinase 저해 활성 측정</h2> <p>영지버섯, 여주, 쓴메밀, 이들 혼합시료의 메탄올 추출물의 tyrosinase 활성은 Masamoto 등의 실험 방법을 약간 변형하여 측정하였다. In vitro mushroom tyrosinase 저해 활성 측정은 \( 2.5 \mathrm{~mM} \) 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) \( 0.3 \mathrm{~ml} \), 각 시료 추출물 0.1, 0.5 및 \( 1 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) 용액 \( 0.05 \mathrm{~ml} \) 및 0.1 M 인산완충용액\( (\mathrm{pH}~ 6.8 ) \)을 혼합하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 preincubation 시켰다. 여기에 \(1,380 \mathrm{~units} / \mathrm{ml} \) mushroom tyrosinase (\( 2,500 \mathrm{~unit} \), Sigma, St. Louis MO, USA) \( 0.05 \mathrm{~ml} \)를 넣은 후 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분간 반응시키면서 spectrophotometer (HITACHI U-2900) \( 475 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 대조구는 시료가 들어있지 않는 용액을 사용하였고, 양성 대조구는 tyrosinase 저해제 또는 미백제로 알려진 koiic acid, ascorbic acid, arbutin을 사용하여 tyrosinase 활성 저해율\( (\% \))은 다음의 공식에 의하여 산출하였다.</p> <p>\( \mathrm{Tyrosinase\ 활성 저해율} (\%)=100-[(\mathrm{A}-\mathrm{B}) / \mathrm{A}] \times 100 \)</p> <p>A: 시료가 들어있지 않은 반응액의 0.5~1분 사이의 흡광도 차이</p> <p>B: 시료가 들어 있는 반응액의 0.5~1분 사이의 흡광도 차이</p> <h2>통계처리</h2> <p>실험으로부터 얻어진 결과치는 one-way ANOVA 검정에 의한 평균치와 표준오차(mean\(\pm\)SE)로 표시하였다.</p>