OJSE는 지방전구세포의 분화 단계 중 mitotic clonal expansion 단계를 저해하여 지방세포로의 분화를 억제하는 것으로 알려져 있다. Flow cytometry를 사용하여 OJSE 처리 후 지방전구세포의 세포주기 변화를 분석한 결과, G1기 개체군의 비율이 증가하고 S기 개체군의 비율이 감소하는 것으로 나타났으므로 OJSE는 분화유도제에 의한 mitotic clonal expansion 단계의 지방전구세포의 세포주기를 G1기에서 정지시켜 지방세포 분화를 위한 지방전구세포의 증식을 억제하는 것으로 추정된다.
<h2>OJSE에 의한 mitotic clonal expansion 저해</h2> <p>지방세포분화의 단계 중 하나인 mitotic clonal expansion 단계에서는 증식이 멈추었던 지방전구세포가 분화유도제에 의해 새롭게 증식을 시작하는 시기이므로 세포의 수가 \( 2 \sim 3 \)배 증가된다. 따라서 OJSE가 mitotic clonal expansion 단계를 저해시키는지 확인하기 위해, confluence 상태의 세포에 분화유도제와 OJSE \( (50,100,200 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } ) \) 를 동시에 처리하여 0,24 ,48 시간 배양한 다음 생세포수를 측정하여 변화를 관찰하였다. 그 결과 분화유도제만 처리한 세포의 증식은 0 시간에 비해 48 시간 때 \( 1.5 \) 배의 증식을 하였지만, 분화유도제와 OJSE를 동시에 처리한 세포의 증식은 현저하게 저해되었다(Fig. 4). 처리한 OJSE의 농도는 Fig. 1의 세포독성 결과에서 독성이 없는 농도이므로 OJSE 처리에 의한 세포수의 감소는 독성에 의한 것이 아니라, mitotic clonal expansion 단계에서 일어나는 세포 증식의 저해에 의한 것으로 사로된다. 즉, OJSE는 지방세포 분화 단계 중 mitotic clonal expansion 단계를 저해함으로써 지방세포로의 분화를 억제하는 것으로 생각된다.</p> <h2>세포주기 변화분석</h2> <p>지금까지 알려진 여러 연구 결과에 의하면 3T3-L1 지방전구세포에 분화유도제를 처리하여 지방세포로의 분화를 유도하였을 때 contact inhibition으로 정지되어있던 세포주기가 재개되어 세포분열 및 증식이 일어난다고 보고되어 있으므로, 앞에서 확인한 OJSE의 처리에 따른 mitotic clonal expansion의 억제 기전을 확인하기 위해 OJSE 처리 후 지방전 구세포의 세포주기 변화를 Flow cytometry를 사용하여 분석하였다. 그 결과, Fig. 5에서 알 수 있듯이 분화유도제만을 처리 한 세포보다 분화유도제와 OJSE를 농도별 1,5,10,50,100 , \( 200 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)로 처리한 세포의 G1기 개체군의 비율이 \( 63.73 \% \)에서 \( 74.8 \% \)까지 농도의존적으로 점차 증가하였으며, S기 개체군의 비율은 \( 16.57 \% \)에서 \( 3.69 \% \)로 상대적으로 감소함을 알 수 있었다. 즉, OJSE의 처리에 따라 지방전구세포의 세포주기는 G1기에서 정지됨을 알 수 있었다. 따라서 OJSE는 분화유도제에 의한 mitotic clonal expansion 단계의 지방전구세포의 세포주기를 G1기에서 정지시킴으로 인하여 지방세포 분화를 위한 지방전구세포의 증식을 억제하고, 이러한 mitotic clonal expansion 단계의 저해를 통해 지방세포로의 분화를 억제하는 것으로 추정된다.</p> <h2>G1 arrest 관련 단백질의 변화</h2> <p>앞서 살펴본 OJSE 처리에 의한 mitotic clonal expansion 단계에서 지방전구세포의 G1 arrest 유도에 관하여 좀 더 명확하게 분석하기 위하여 G1 arrest 관련 단백질의 발현량 변화를 검토하였다. 지방전구세포를 confluence 상태까지 배양시킨 후, 분화유도제와 동시에 OJSE를 농도별로 처리하였을 때 G1기에서 S기로의 전이에 필수적인 단백질인 cyclin \( \mathrm { E } , \mathrm { Cdk } 2 \), \( \mathrm { Rb } \), phospho- \( \mathrm { Rb } \), 전사인자 \( \mathrm { E } 2 \mathrm { ~F } -1 \) 및 \( \mathrm { G } 1 \)기 전이를 저해하는 Cdk inhibitor p21의 발현 변화를 Western blot analysis로 확인하였다(Fig. 6). 그 결과, cyclin E, Cdk2, phospho-Rb와 E2F-1의 발현량은 OJSE의 처리 농도가 증가될수록 감소되었다. 반면 Cdk2 inhibitor인 p21의 경우는 OJSE 농도의존적으로 발현량이 증가되었고, 최고농도인 \( 200 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)OJSE 처리 시 control에 비해 7 배 이상 발현되었다. 따라서, OJSE 처리에 따른 p21의 발현 증가로 인해 Cyclin/CDK complex의 활성이 억제되고 Rb의 인산화가 저하되어 3T3-L1 지방전구세포의 G1 arrest가 유발되는 것으로 사료된다.</p>