난포낭 세포수가 줄어도 1개의 크립토스포리디움 난포낭을 검출 가능함을 확인하였다. HCT-8 세포를 감염시킨 후, RT-PCR법과 direct RT-PCR법을 이용해 HSP70 유전자를 탐지하였으며, 이를 비교하였다. \( 1 \times 10 ^ { 2 } \)세포수에서 DNaseI 처리 여부와 상관없이 양성밴드를 확인하였다. 또한, Direct RT-PCR은 \( 1 \times 10 \)개까지 검출 가능하였으며, 이는 일반 RT-PCR법보다 민감도가 약 10배 더 우수하다는 것을 보여주었다.
<p>3 개의 양성 DNA 밴드를 확인할 수 있었으며, \( 1 \times 10 ^ { 0 } \)세포수의 경우에도 희미하지만 2개의 양성 DNA 밴드를 확인할 수 있었다. 따라서, 난포낭 세포수가 적어질수록 재현성은 다소 감소되어지지만 1개의 난포낭까지도 검출이 가능하여 크립 토스포리디움 난포낭의 활성을 조사하는데 아주 유용하게 이용될 수 있음을 보여주었다. HSP70 gene에 대한 RT-PCR결과와 비교하기 위해 같은 mRNA를 가지고 \( \beta \) -tubulin gene에 대해 RT-nested PCR을 한 결과 \( 1 \times 10 ^ { 4 } \)세포 수 정도 되어야 검출이 되는 것으로 나타나 HSP70 gene에 대한 RT-PCR결과와 비교할 때 10,000배 이상 민감도가 떨어지는 것으로 나타났다. 또한, nested PCR을 수행해야 함으로써 증폭시간 및 실험과정이 더 필요하게 되므로 \( \beta \)-tubulin gene을 대상으로 RT-nested PCR을 수행하는 것은 민감도면에서나 시간적 경제적인 면에서 효율성이 많이 떨어짐을 알 수 있었다. 따라서 RT-PCR을 수행하여 활성을 조사할 경우 HSP70 gene을 이용하는 것이 \( \beta \)-tubulin gene을 이용하는 것보다 훨씬 더 효과적임을 알 수 있었다.</p> <p>그러나 direct RT-PCR의 경우 활성을 조사하는데는 유용하지만 직접적으로 감염성 여부는 알 수 없는 단점이 있다. 따라서 세포배양 후 RT-PCR법과 direct RT-PCR을 비교하고자 HCT-8 세포에 크립토스포리디움 난포낭을 감염시키고 48시간후 HSP70 gene에 대한 RT-PCR을 수행하고, 같은 batch의 난포낭을 direct RT-PCR하여 그 결과를 비교하였다.</p> <p>HCT-8 세포에서 분리한 mRNA를 각각 \( 5 \mu \mathrm { L } \)씩 나누어 DNaseI을 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹으로 나누었다. 그 결과, DNaseI을 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹 모두에서 \( 1 \times 10 ^ { 2 } \)세포수 까지 양성밴드를 확인할 수 있었다. DNaseI을 처리한 그룹에서는 비특이적 밴드가 다수 감소하여 gel 확인시 보기에는 좋았으나 PCR 산물의 양이 다소 줄어드는 것을 알 수 있었다. Direct RT-PCR 결과 에서는 \( 1 \times 10 \)개까지 검출할 수 있어 direct RT-PCR의 경우가 민감도에 있어서 10 배정도 더 우수함을 나타내었다. 이는 direct RT-PCR의 경우 전처리 과정이 없어 난포낭의 손실이 없으나, 세포배양법의 경우 감염시킬 때 전처리 과정에서 난포낭의 손실이 일어나기 때문인 것으로 추정되었다.</p> <p>한편, 감염성 판별법인 HCT-8 세포배양 후, RT-PCR법을 수행할 경우, 정량화가 안되는 단점이 있었다. 따라서, HCT-8 세포배양 후, 크립토스포리디움 생활환 과정 중에 형성되는 sporozoite 및 merozoite등의 항체와 형광물질을 결합시킨 형광염색시약으로 염색한 후 형광현미경으로 검경하였다. 검경시 2 6개의 형광 클러스트(cluster)를 하나의 크립토스포리디움에서 분화한 것으로 간주하여 정량하였다.</p>