항균범위가 상대적으로 넓고 proteinase K를 처리할 경우 항균활성이 상실되는 박테리오신을 생산하는 균주로 실험한 결과 분리균주는 \(99.9 \%\) 의 유의성으로 Bacillus licheniformis 균주였다. 박테리오신의 최적 생산 온도는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양시간은 36시간 이상이며 최적 초기 \(\mathrm{pH}\)는 7.0이다. 분리주가 생산하는 박테리오신은 그람음성균에서만 항균활성을 보이고 그람음성균에서는 항균활성을 보이지 않았다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>박테리오신 생성 균주의 탐색 및 선발</h2> <p>MRS 고체배지에 생성된 집락의 모양과 크기 등 형태학적인 특징에 따라 상이한 30주를 분리하여 \( 5 \mathrm{ml} \) 의 MRS 액체배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 배양하여 회수한 배양 상등액을 대상으로 paper disc법으로 항균활성을 나타내는 시료 5주를 일차적으로 선별하였다. 이 중 항균범위가 상대적으로 넓으며 proteinase K를 처리할 경우 항균활성이 상실되는 단백질성 항균물질인 박테리오신을 생산하는 한 균주를 최종적으로 선별하였다.</p> <h2>박테리오신 생산 균주의 동정</h2> <p>API 50 kit를 이용하여 탄소원으로 당이나 당유도체의 이용성의 결과를 API 50 kit 제조사의 지침에 따라 on line으로 입력하고 분석하여 생화학적인 동정을 행한 결과, 분리균주는 \( 99.9 \% \) 의 유의성으로 Bacillus licheniformis 균주로 확인되었으며, 차 순위로 \( 0.1 \% \) 의 유의성으로 Bacillus pumilus로 동정되었다. 또한 16S rRNA의 염기서열을 분석한 결과도 분리주가 B. licheniformis로 나타났다(Data not shown).</p> <h2>박테리오신 생산균주의 배양조건</h2> <h3>온도의 영향</h3> <p>분리균주의 생육온도가 세포생장과 박테리오신 생산에 미치는 영향을 조사한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48시간 배양하는 동안 항균활성은 전혀 나타나지 않았다. \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였을 때에는 36시간 이후부터 항균활성이 나타나기 시작하여 48시간 때 최대 박테리오신 역가를 나타내었다. \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양 하였을 때는 배양 후 36시간 만에 \( 264 \mathrm{AU} / \mathrm{ml} \)로 가장 높은 박테리오신 역가를 나타내었으며, 이후 48시간까지 계속 유지되었다. 이상에서 박테리오신 최적 생산온도는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), 그리고 배양시간은 36시간 이상임을 알 수 있었다.</p> <h3>초기 \( \mathrm{pH} \)의 영향</h3> <p>배지의 초기 \( \mathrm{pH} \)에 따른 세포생장과 박테리오신 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 초기 \( \mathrm{pH} 5.0 \) 에서는 균체증식 및 박테리오신의 활성이 나타나지 않았다. \( \mathrm{pH} 6.0 \)에서는 배양 12시간부터 서서히 균이 증식되기 시작하였으며, 박테리오신 역가는 배양 44시간 이후 \( 132 \mathrm{AU} / \mathrm{ml} \) 로 최대를 나타냈었다. \( \mathrm{pH} 7.0 \)과 \( \mathrm{pH} 8.0 \)의 MRS 액체 배지에서는 거의 유사한 증식을 나타내었고, \( \mathrm{pH} 8.0 \)에서의 가장 높은 박테리오신 역가는 \(132 \mathrm{AU} / \mathrm{ml} \) 로, \( \mathrm{pH} 7.0 \)에서 역가의 약 \( 50 \% \) 수준을 나타내었다. 따라서 분리균주의 박테리오신 생산을 위한 배지의 최적 초기 \( \mathrm{pH} \)는 7.0임을 확인하였다.</p> <h2>항균 스펙트럼</h2> <p>각종 세균에 대한 항균활성을 조사한 결과는 Table 2와 같다. 분리주가 생산하는 박테리오신은 Bacillus sphaericus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Micrococcus lu-teus, Paenibacillus polymyxa 및 Pediococcus dextrinicus 등 주로 그람 양성균에 대해서 항균활성을 나타내었으나 대장균(E. coli)과 같은 그람 음성균에는 항균활성이 없었다.</p> <h2>열 안정성</h2> <p>항균물질을 \( 20 \sim 100^{\circ} \mathrm{C} \) 범위에서 일정 시간 배양하여 열 안정성을 조사하였다.</p> <p>\( 20^{\circ} \mathrm{C} \sim 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 60분간, \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분간 처리할 경우 항균활성이 유지되었으나 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 60분간 처리 시에는 \( 50 \% \) 의 항균활성을 나타내었다. 이를 토대로 분리균주가 생산하는 박테리오신은 비교적 열에 안정함을 알 수 있었다. Lactobacillus acidophilus 가 생산하는 lactacin B의 경우 \( 120^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 60 분 동안 열처리에도 안정하였으며, Lactococcus. lactis ssp. diac-etilactis S50가 생산하는 박테리오신의 경우는 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 각각 60분과 30분 열처리 시에도 활성을 유지하였으며, Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis의 경우 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분간 열처리 시에도 안정하는 등 내열성이 높은 박테리오신이 있는 반면에 Lactobacillus helveticus 균주가 생산하는 helveticin V-1829는 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 불활성화되기 시작하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서는 30분 안에 활성을 대부분 상실하였으며 Lactobacillus acidophilus AC1가 생산하는 항균물질은 분자량이 5,200의 저분자의 단백 물질로서 실온이나 냉장온도에서는 안정하나 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 열처리에서는 20분 안에 항균활성의 대부분이 상실됨이 보고되었다.</p>