세포 배양 중 혼입 가능한 외래성 바이러스인 PTGV는 세포 배양 유래 생물의약품의 잠재적인 위해요소중의 하나이므로 PTGV의 오염 여부를 민감도와 특이도가 우수한 검증된 시험법으로 확인하여야만 하고 바이러스 오염을 방지하기 위한 ICH 가이드라인(Q5A)은 원료의 오염 여부를 검사하고, 제조공정에서 바이러스 제거 능력을 평가하기 위하여 민감도와 특이도가 우수한 검증된 시험방법을 사용하도록 권장하고 있다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Primer와 Probe 선별</h2> <p>세포 배양 중 혼입 가능한 외래성 바이러스인 PTGV는 세포 배양 유래 생물의약품의 잠재적인 위해요소중의 하나이므로 PTGV의 오염 여부를 민감도와 특이도가 우수한 검증된 시험법으로 확인하여야만 한다. 바이러스 오염을 방지하기 위한 ICH 가이드라인(Q5A)은 원료의 오염 여부를 검사하고, 제조공정에서 바이러스 제거 능력을 평가하기 위하여 민감도와 특이도가 우수한 검증된 시험방법을 사용하도록 권장하고 있다. Real-time PCR 방법을 사용하여 특정 바이러스 존재를 확인하고, 정량분석하기 위해서는 바이러스 내에서 유전적인 변이가 심하지 않은 conserved sequence를 가진 부위를 선택하여야 한다. 선택된 sequence는 특정 바이러스에만 존재하여 특이성이 높아야 한다. 또한 생물의약품의 원료물질, 공정 중간물질, 최종제품 등에 미량으로 오염될 수 있는 바이러스 검출을 위한 정량 PCR 의 경우 높은 민감도가 요구된다.</p> <p>다양한 PTGV strain을 모두 검출하기 위해 NCBI data base에 보고된 PTGV 유전자 염기서열 alignment를 통해 conserved sequence를 가진 부위인 ORF 7 유전자 부위를 기초로 primer를 디자인하였다(Table 1). Purdue strain (GenBank number AJ271965.2)의 sequence를 기초로 할 때 primer 쌍의 nucleotide position은 280,300-28,453으로 amplicon 크기는 \( 154 \mathrm{bp} \)이다. PTGV 유전자를 실시간으로 검출하기 위한 TaqMan probe도 PTGV 유전자 염기서열 alignment를 통해 mismatch가 없는 부분을 선별하여 디자인하였다. PCR 산물을 sequencing한 후 blast searching (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi) 한 결과 PCR 산물이 PTGV 유전자임을 확인할 수 있었다(자료 미제시).</p> <h2>TaqMan probe real-time RT-PCR 최적화</h2> <p>TOPreal \( ^{\mathrm{TM}} \mathrm{qPCR} 2 \times \) PreMIX를 사용하여 real-time PCR 조건을 확립하였다. Titer가 \( 1.10 \times 10^{4} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \)에서 알 수 있었다(자료 미제시).</p> <p>최적 온도에서 \( \mathrm{MgCl}_{2} \) 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화하였다. Titer가 \( 1.10 \times 10^{4} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \)에서 \( 1.10 \times 10^{1} \) \( \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \)까지 10배씩 순차적으로 희석한 PTGV를 시료로 하여 \( \mathrm{MgCl}_{2} \) 농도를 \( 3 \mathrm{mM} \)에서 \( 7 \mathrm{mM} \)로 변화시켜가며 real-time PCR을 수행하였을 \( \mathrm{MgCl}_{2} \) 농도에 따른 Ct 값 차이가 나타나지 않아 최적 \( \mathrm{MgCl}_{2} \) 농도를 \( 3 \mathrm{mM} \)로 결정하였다(자료 미제시).</p> <p>최적화된 조건에서 Titer가 \( 1.10 \times 10^{4} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \)인 PTGV를 \( 1.10 \times 10^{1} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \)까지 10배씩 순차적으로 희석한 후 real-time PCR을 수행하였다. PTGV log titer \( \left(\log _{10} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} ; \mathrm{x}\right) \)에 대한 Ct 값 \( (\mathrm{y}) \) 간의 표준 회귀식을 구한 결과 \( \mathrm{y}=-3.474 \mathrm{x}+40.325\left(\mathrm{R}^{2}=0.995\right) \)로 나타나 PTGV log titer와 Ct 값 간의 회귀성이 매우 높아 정량 분석이 가능한 시험법임을 확인하였다.</p>