균주배양액을 원심분리하고 생리식염수로 2회 세척한 후 0.1M sodium phosphate 완충액, glutaraldehyde, osmium tetroxide 등을 사용하여 전처리한 후 주사전자현미경(SEM)으로 20,000배 배율로 관찰하였다. YEPD 배지가 포함된 20L 발효조에서 24시간 동안 다양한 온도에서 배양한 후 균체농도를 측정하고 무기염류가 효모균주의 성장에 미치는 영향도 수행하였다.
<h2>주사전자현미경(SEM)</h2> <p>분리된 균주의 형태학적 특성을 확인하기 위하여 균주배양액을 원심분리 \( \left (10,000 \times g, 2 \right . \)분, \( \left .4 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \) 한 후 상층액을 제거하고 생리식염수로 2회 세척하였다. 주사현미경 관찰을 위한 전처리는 \( 0.1 \mathrm { ~M } \) sodium phosphate 완충액 \( ( \mathrm { pH } \) 7.4)으로 제조한 \(2.5 \% \) glutaraldehyde (TAAB Laboratoties Equipment Ltd., UK) 용액으로 세포를 3시간 고정시킨 후 같은 완충액으로 2회 세척한 후 \( 1 \% \) osmium tetroxide (Sigma-Aldrich) 용액으로 30분간 고정하였다. 농도구배 에탄올( \(50 { - } 100 \% \))로 각각 5분씩 탈수 후 \( 100 \% \) hexamethyldisilazane (Sigma-Aldrich)으로 완전히 탈수한 후 건조시켰다. 전처리한 균주는 주사전자현미경(JSM-35CF, JEOL, Japan)을 사용하여 20,000배 배율로 관찰하였다.</p> <h2>균주의 생육특성</h2> <p>혈전용해 활성이 우수한 효모균주를 YEPD 배지가 포함된 \( 20 \mathrm { ~L } \) 발효조에서 24시간 동안 다양한 온도 \( \left (24 { - } 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \)에서 배양한 후 균체농도(균체수)를 측정하였다. 무기염류가 효모균주의 성장에 미치는 영향도 같은 조건에서 수행하였다. \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 12시간 동안 배양한 종배양액은 초기 세포흡광도 \( \left ( \mathrm { OD } _ { 600 } \right ) \)가 \( 0.1 \)이 되도록 접종하였고 배양 중 교반속도는 \( 400 \mathrm { ~rpm } \) 으로 고정하였고 \( \mathrm { pH } \)와 용존산소는 조절하지 않았다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>혈전용해 활성이 우수한 효모 균주선발</h2> <p>항생제인 chloramphenicol이 함유된 YEDP 고체배지에서 1차 분리된 효모균주 중 혈전용해 활성이 우수한 균주를 선발하기 위하여 효모 균주를 YEPD 배지에서 12시간 배양한 후 원심분리하고 상층액을 조효소액으로 사용하여 혈전용해 활성을 측정하였다. 혈전용해활성의 상대적 비교를 위해서 단백질 농도를 측정하여 양성 대조구 농도로 희석한 후 각각 \( 20 ~ \mu \mathrm { l } \)를 분주하여 사용하였다. 각각 된장과 간장으로부터 분리된 효모인 AFY-1과 KA3Y1균주는 각각 \( 3.5 \mathrm { ~U } / \mathrm { mg } \) protein, \( 2.2 \mathrm { ~U } / \mathrm { mg } \) protein의 혈전용해 활성을 나타내었다. 대조구로 사용한 실험실 균주인 S. cerevisiae BY4742는 혈전용해 활성을 나타내지 않았다.</p>