초석잠을 채취해 분쇄한 뿌리 건조물의 시료 추출을 위해서 회전식 감압증류장치를 사용해 증류하였다. 그리고 흡광도를 측정하기 위해 UV/VIS 분광 광도계를 사용하고, Folin-Denis법으로 초석잠 뿌리의 total polyphenols 함량을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>본 실험에서 사용한 초석잠은 경남 밀양시 산외면 야산에서 직접 재배한 것이다. 겨울에 채취한 초석잠 뿌리를 바람이 잘 통하는 그늘에서 10 일간 건조하여 분쇄기로 분쇄하였다. 용매로 사용한 메탄올, 클로르포름(Fisher science)은 특급 시약이고, 나머지 용매들은 Junsei사의 1급 시약이다. 칼럼용 silical gel 60과 thin-layer chromatography silica gel 60 F254는 Merck사에서, 항산화 활성도 측정을 위한 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (이하 DPPH라 표기함), butylated hydroxy-toluene (이하 BHT라 표기함), butylated hydroxyanisole (이하 BHA라 표기함), \( \alpha \)-tocopherol등은 Sigma사의 시약용이다. 시료 추출을 위해 사용된 용매를 증류시키기 위해 회전식 감압증류장치(Yamato RE440A, Japen)와 흡광도를 측정하기 위해 UV / VIS 분광 광도계(Perkin Elmer, Germany)를 사용하였다.</p> <h2>시료의 추출</h2> <p>분쇄된 뿌리 건조물을 Fig. 1과 같은 계통으로 분획 추출하였다. \( 696.9 \mathrm{~g} \) 의 뿌리 분쇄 건조물을 메탄올 \( 4 \mathrm{~L} \)로 12시간씩 3 회 추출하고 GF/C (\( 47 \mathrm{~mm} \Phi \), Whatman)로 감압 여과 시킨 후 회전식 감압 증류 장치로 농축시켰다. 농축물을 \( 300\mathrm{~mL} \) 의 3 차 증류수에 녹인 후 헥산, 클로르포름, 에틸아세테이트, 부탄올순으로 1: 1의 비율로 혼합한 후 분액 여두를 사용하여 3시간씩 3 회 반복 분획하였다. 각각의 분획물을 농축하여 시료 건물량에 대한 백분율로 추출 수율을 계산하였다.</p> <h2>Total polyphenols과 flavonoids 함량 측정</h2> <p>초석잠 뿌리의 total polyphenols 함량을 Folin-Denis법으로 측정하였다. 메탄올 추출물( \( 99 \% \) 메탄올 \( 1 \mathrm{~mL} \) 에 추출물 \( 500 \mu \mathrm{g} \) 을 용해)용액 \( 0.1 \mathrm{~mL} \) 에 Folin-Ciocalteau 시약 \( 0.1 \mathrm{~mL} \) 을 섞어 3분간 실온에서 방치한 후, \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 포화용액 \( 0.2 \mathrm{~mL} \) 을 가하여 잘 섞고 증류수로 \( 2 \mathrm{~mL} \) 가 되게 첨가하여 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 그 후, \( 3,000 \mathrm{G} \) 에서 10 분 동안 원심분리하고 그 상등액을 취하여 \( 725 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. Caffic acid의 농도가 \( 0,3.125,6.25,12.5,25,50,100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)이 되도록 하여 작성한 검량선으로 측정한 흡광도를 농도로 환산하였다.</p> <p>Total flavonoids 함량은 메탄올 추출물 \( (99 \% \) 메탄올 \( 1 \mathrm{~mL} \) 에 추출물 \( 500 \mu \mathrm{g} \)을 용해)에 diethyleneglycol \( 2 \mathrm{~mL}\), \(1 \mathrm{~N}-\mathrm{NaOH} \) \( 0.02 \mathrm{~mL} \) 을 가한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 항온조에서 1 시간 동안 방치 후, \(420 \mathrm{nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 환산하였다. 이 때 Rutin의 농도가 \( 0,3.125,6.25,12.5,25,50,100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{mL} \) 이 되도록 하여 작성한 검량 선으로 농도를 산출하였다.</p>