균주 WJ-1의 형태적·생리적 특성을 분석하기 위해 그람 염색, API 20NE, API ZYM kit 등을 사용하여 배지에 trace element와 NaCl을 첨가하여 조사하였다.\( \mathrm { pH } , \mathrm { NaCl } \) 농도, 온도 조건에서 동정된 균의 성장에 어떤 영향을 주는지를 연구했다. 균주 WJ-1의 16S rRNA 유전자를 bacterial universal primer로 증폭시키고 이 증폭된 유전자의 염기서열은 Genotech에서 분석했다.
<h2>균주 WJ-1의 형태적·생리적 특성 분석</h2> <p>그람 염색은 Gram stain kit (BD, USA)를 사용하여 제시된 방법에 따라 균체를 염색한 후 광학 현미경으로 관찰하였다. 생리학적 특성은 API 20NE와 API ZYM kit (Biomérieux, France)를 사용하여 제시된 방법에 따라 조사하였다. 단, 배지는 kit에서 제공된 \( \mathrm { AUX } \) 배지에 trace element와 \( \mathrm { NaCl } \) (최종 농도 \(1 \% \))을 첨가하여 사용하였다. 동정된 균의 성장에 미치는 \( \mathrm { pH } , \mathrm { NaCl } \) 농도, 온도 조건 등을 조사하였다. 우선, WJ-1 균주는 \( \mathrm { pH } \) 4.0-10.0 (pH 1.0의 간격)의 고체배지에 접종하여 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 일간 배양하여 성장을 관찰하였다. 성장에 미치는 온도의 영향은 접종 후 \( 4,20,30,37,40,50,55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 조건에서 5 일간 배양하여 판단하였다. 균주 \( \mathrm { WJ } -1 \) 의 성장에 미치는 배지내 \( \mathrm { NaCl } \) 농도는 동정된 균을 \( 0- \) \( 20 \% \) ( \(1 \% \) 간격) \( \mathrm { NaCl } \) 이 포함된 고체배지에 접종하여 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 일간 배양하여 관찰하였다.</p> <h2>16S rRNA 유전자 염기서열 해독 및 계통수 제작</h2> <p>균주 WJ-1을 LB 액체배지에 접종하여 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2 일간 배양한 후 액체배양액을 \( 10,000 \times g \) 에서 10 분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체로부터 genomic DNA Extraction kit (DyneBio, Korea)를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다. 균주 WJ-1의 16S rRNA 유전자는 bacterial universal primer (27F와 1492R)를 사용하여 genomic DNA로부터 증폭하였고, 증폭된 유전자 단편의 염기서열 분석은 Genotech (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 수행하였다. 균주 \( \mathrm { WJ } -1 \) 의 \( 16 \mathrm { ~S } \mathrm { rRNA } \) 유전자 염기서열 결과는 GenBank에 JN578483으로 등록하였다. 결정된 16S rRNA 유전자 염기서열의 상동성 검사는 BLAST program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)을 사용하여 수행하였고, 표준 균주(type strain)들과의 유사성(similarity) 조사 및 관련된 분류군의 16S rRNA 유전자 염기서열의 확보는 EzTaxon server (http://www.eztaxon.org/)에서 수행하였다. Multialignment는 ClustalW software를 사용하여 수행하였고, 5' 및 3'의 gap은 BioEdit program을 사용하여 편집하였다. 균주 WJ-1에 대한 phylogenetic tree는 PHYLIP suit program 을 사용한 Neighbor-Joining (NJ)법과 Maximum Parsimony (MP)법으로 작성하였다. Bootstrap value는 1,000 회의 재구성된 자료로부터 계산되었고, evolutionary distance matrices는 Kimura's two-parameter model의 algorithm에 따라서 계산하였다.</p>