세포내 ferritin함량측정을 위해\( \mathrm{KCl }~(10\mathrm{mmol}/\mathrm{l})\)와 \(DTT(dithiothreitol,0.5 \mathrm{mmol}/\mathrm{l})\)가 포함된 냉각HEPES \(( 10\mathrm{mmol}/\mathrm{l}\),\(\mathrm pH 7.9)\)용액을 cell lysate를 \( 10,000 \times g \)의 속도로 5분간 원심분리했다.세포 내 ferritin iron의 농도측정를 위해 ferritin함량측정과 동일한 방법으로 cell lysate를 준비했고 \(70^{\circ}\mathrm{C}\)에서 10분간 반응 후 \( 15,000\times g\)의 속도로 15분간 원심분리해 \(-20^{\circ}\mathrm{C}\)에 보관했다.
<h2>Ferritin 함량 측정</h2> <p>세포 내 ferritin 함량을 측정하기 위해 \( \mathrm { KCl } ~(10 \mathrm { mmol } / \mathrm { l } ) \)과 DTT (dithiothreitol, \( 0.5 \mathrm { mmol } / \mathrm { l } ) \)가 포함되어 있는 냉각된 HEPES \(( 10 \mathrm { mmol } / \mathrm { l } \), \( \mathrm pH 7.9) \) 용액에 \( 1 \mathrm { ~mg } \)의 cell lysate를 준비 한 후, cell lysate를 \( 10,000 \times g \)의 속도로 5분간 원심분리 하였다. ferritin의 정량을 위해 말의 표준 ferritin (standard horse ferritin)을 이용하여 Tris-Na 용액에 \( 0.25 \sim 15 \mathrm { ng } / 50 \mu \mathrm { l } \)의 농도로 희석하였고, Roskams와 Connors의 방법에 따라 진공 도트 블롯(vacuum dot blot)을 이용하여 Tris-Na 용액에 미리 담가둔 nitrocellulose membranes (MSI, Westboro, MA, USA)에 cell lysate (Tris-Na 용액에 단백질을 \( 50 \mu \mathrm { g } / \mu \mathrm { l } \)의 농도로 희석)를 각 샘플마다 3개 씩 흡착시켰다. 탈지분유(Skim milk, \( 3 \mathrm { ~g/l } \) )가 포함된 Tris-Na 용액을 이용하여 nitrocellulose mem-brane을 상온에서 1 시간 동안 블로킹(blocking)을 한 후, Tris-Na 용액에 5분간 3회 세척하였다. ferritin 1차 항체(rabbit anti-horse ferritin)가 포함된 Tris-Na 용액에 nitrocellulose membrane을 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 12시간 이상 교반기에서 반응시켰다. 1차 항체를 반응시킨 nitrocellulose membrane을 Tris-Na 용액에 5분간 3회 세척하고, 상온에서 2차 항체(peroxidase con-jugated, goat anti-rabbit immunoglobulins)를 1시간 동안 반 응시킨 후 Tris-Na 용액에 5분간 3회 세척하였다. 메탄올과 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)가 포함된 \( \alpha \)-chloronaphthol 용액을 반응시켜 현상하였다. 블롯에 현상된 도트는 농도계(densitometer) 프로그램 (Gel-Pro analyzer 3.1 version, Media Cybernetics)을 이용하여 정량 하였다.</p> <h2>Ferritin iron 농도 측정</h2> <p>세포 내 ferritin iron의 농도를 측정하기 위해 ferritin 함량 측정과 동일한 방법으로 cell lysate를 준비하였다. 준비된 cell lysate를 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분간 반응 후 \( 15,000 \times g \)의 속도로 15분간 원심분리하여 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 보관하였다. 세포 내 ferritin을 추출하기 위해 염산 \( ( \mathrm { HCl } , 2.8 \mathrm { ~mol/l } ) \)에 \( 90 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1시간 동안 가수분해하였다. 가수분해 후 침전된 단백질은 \( 15,000 \times g \)의 속도로 15분간 원심분리하여 제거하였다. 단백질이 제거된 상등액 \( 1 \mathrm { ml } \)을 \( 20 \mu \mathrm { l } \)의 hydroquinone \( (20 \mathrm { ~g/l } ) \)과 \( 20 \mu \mathrm { l } \)의 o-phenanthrolene \( (10 \mathrm { ~g/l } \))에 반응시킨 후 \( 505 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 마이크로플레이트리더기로 측정하였다. Ferritin iron의 정량을 위해 ferrous sulfate \( ( \mathrm { pH } 3.0) \) 표준 용액의 흡광도를 기준으로 표준곡선을 만들어 사용하였다. ferrous sulfate 표준 용액 또한 cell lysate를 준비하는 과정과 동일하게 염산으로 가수분해하였다.</p>