본 실험은 병반 증상이 있는 김 시료에서 한천을 강하게 분해하는 균주를 선별해 분리균 JY38의 병원성 검정 및 현미경 관찰, 세포벽분해효소, 한천 분해효소의 효소학적 특성에 대해 확인하였다. 그 결과, 분리균 JY38이 분비하는 세포벽분해효소 작용에 의해 김의 와해 현상이 진행되므로 JY38이 분비하는 세포벽분해효소의 조효소액을 이용하여 protoplast를 이용하여 기존의 세포벽 분해효소의 대체 가능성을 봤고, JY38의 세포벽분해효소 생성을 조사한 결과 A는 CMCase 활성, B는 xylanase 활성, C는 agarase 활성, D는 protease 활성을 나타내고 pectate lyase 활성은 관찰되지 않았다. 또한, 한천분해효소의 효소학적 특성은 \( \mathrm{pH} \)는 \( \mathrm{pH} 7 \) 부근에서 최대치를 나타내고 있으며 산성 및 알카리성 쪽으로 갈수록 효소활성은 낮아지고, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 최대치로 반응 초기 30분 이내에 대부분의 반응이 이루어진다.
<h1>결과 밎 고찰</h1> <h2>균 분리</h2> <p>병반 증상이 있는 김 시료에서 세균을 분리하여 한천고체배지 상에서 한천을 강하게 분해하는 균주롤 선별하였다. 분리균주의 병원성 검정을 한 결과 7일 이후부터 김 조직을 와해시키기 시작하였다. 분리균 JY38은 Bergey's Man-ual에 준하여 동정한 결과 황색 코로니로 그람 염색 결과 음성균이었고, 간균으로 운동성 편모가 관찰되었다. 호기성 균으로 catalase, oxidase 양성으로 나타났으며, urease, indole 반응은 음성이었다. D-arabinose, D-glucose, D-fru-ctose, D-mannose, \( \alpha \)-methyl-D-mannoside, esculine, tre-halose, melezitose, \( \beta \)-gentiobiose, D-turanose, L-arabinose, ribose, \( \beta \)-methyl-xyloside, L-sorbose, rhamnose, dulcitol, \( \alpha \)-methyl-D-glucoside, arbutine, D-lyxose, D-tagatose, L-arabitol, gluconate와 같은 상당히 광범위한 당을 이용하였으며 alanine, arginine과 같은 아미노산을 이용하였다. 이상의 결과로 분리균 JY38은 Pseudomonas sp.의 성질을 가지고 있었으며 정확한 종은 구별되지 않았다.</p> <h2>병원성 검정 및 현미경 관찰</h2> <p>분리균 JY38에 의한 김의 병원성 검정을 위해 표면 살균된 김 조직에 JY38을 접종하여 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양한 후 400배율의 광학현미경으로 관찰한 결과 Fig. 1A는 접종 1 주일 후 관찰한 것으로 JY38 균주에 의해 김조직이 서서히 분해 되는 현상을 관찰하였으며 2 주일 후에는 김 세포가 완전히 단리되는 현상을 퐌찰하였다 (Fig. 1B). 이상의 현미경적 관찰을 통하여 분리균 JY38이 분비하는 세포벽분해효소 작용에 의해 김의 와해 현상이 진행되는 것으로 판단되며 분리균 JY38이 분비하는 세포벽분해효소의 조효소액을 이용하여 protoplast 세포를 만들 때 이용함으로써 기존의 세포벽 분해효소를 대체할 수 있을 것으로 생각된다.</p> <h2>세포벽분해효소</h2> <p>한천 확산법에 의하여 JY38에 대한 세포벽분해효소 생성을 조사한 결과 Fig. 2의 A는 CMCase 활성, B는 xylanase 활성, C는 agarase 활성, D는 protease 활성을 나타내고 있으며 pectate lyase 활성은 관찰되지 않았다. Fig. 3은 \( 1.5 \% \) 한천을 완충액에 첨가하고 살균하여 제조한 고체배지에 분리한 조효소액 \( (5 \mu g / \mathrm{m}\ell) \)을 처리하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 6시간 반응시킨 결과이다. Fig. 3B의 효소액 처리구는 효소액을 전혀 처리하지 않은 대조구 (Fig. 3A)에 비해 한천이 분해된 현상이 64 배율의 해부 현미경 하에서 뚜렷하게 관찰되었다.</p> <h2>한천분해효소의 효소학적 특성</h2> <p>Fig.4는 한철을 탄소원으로 한 유도배지에서 분리균의 생육곡선과 한천분해효소 생성을 경시적으로 관찰한 결과이다. 한천분해효소 생성은 분리균의 대수 증식기에 최고로 생성되었다. 이후의 시기에서는 한천분해효소의 증가가 관찰되지 않았는데 이는 배양 중의 단백질 분해효소의 작용으로 한천분해효소가 서서히 분해된 것으로 추측된다. 그리고 한천의 존재 하에서는 glucose와 galactose 같은 단당류를 첨가하여도 효소 생성에는 별로 영향을 미치지 못하였으며 이들 단당류만을 유일한 탄소원으로 첨가하여 배양하였을 때는 한천분해효소가 생성되지 않았다(자료 미제시). 이들의 결과는 Vera 등이 Pseudoalteromonas 속에서 보고한 결과와 유사하였다. 한천분해효소 활성의 특성을 조사한 결과는 Fig.5와 같다. \( \mathrm{pH} \)에 따른 효소활성은 \( \mathrm{pH} 7 \) 부근에서 최대치를 나타내고 있으며 산성 및 알카리성 쪽으로 갈수록 효소활성온 낮았다 (Fig. 5A). 이 결과는 Pseudomonas atlantica ATCC 19292의 \( \beta \)-agarase 활성과 일치 하였다. 온도에 따른 효소 활성은 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 부근에서 최대치를 나타내었다 (Fig. 5B). 반응 시간에 따른 효소 활성을 조사한 결과 반응 초기 30분 이내에 대부분의 반응이 이루어지며 60분 후에는 반응이 진전되지 못하는 것으로 나타났다 (Fig. 5C). 열 처리별 효소 활성을 조사한 결과 Fig. 5D와 같이 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 효소 활성이 급격하게 실활되는 것을 알 수 있었으며 Pseudomonas atlantica ATCC 19292와 Pse-udomonas sp. PT-5에서 분리된 한천분해효소와 유사한 경향을 나타내었다. 그리고 Fig. 6은 금속성 양이온과 EDTA의 한천분해효소에 대한 활성효과률 나타낸 것으로 \( \mathrm{Ca}^{++} \)이온을 첨가하였을 때 활성이 가장 좋았으며 EDTA를 첨가하였을 때 효소활성이 급격하게 실활되었다.</p>