광용혈 실험은 주어진 방법에 따라 진행되었으며, 적혈구 현탁액은 \(700 \mathrm { ~nm }\)에서 O.D. 값이 0.6에 해당하는 \(1.5 \times 10 ^ { 7 }\) cells \( / \mathrm { ml }\) 농도였다. 시료와 광증감제 rose-bengal을 첨가하여 암소에서 30분 동안 pre-incubation한 후, 15분간 광조사하였다. 광조사 후의 암반응 (post-incubation) 시간에 따라 적혈구의 파괴 정도를 15분 간격으로 700nm에서 투광도로 측정하였다. 이를 통해 인동덩굴 추출물 및 분획물의 광용혈 효과를 적혈구의 50%가 용혈되는 시간인 \( \tau_ { 50 } \)를 사용하여 비교하였다.
<p>ROS Scavenging ( \%) \( = \left \{\frac {\left ( \mathrm { Cpm } _ {\text { control } } - \mathrm { Cpm } _ {\text { experiment } } \right ) } {\left ( \mathrm { Cpm } _ {\text { control } } - \mathrm { Cpm } _ {\text { blank } } \right ) } \right \} \times 100 \)</p> <h2>광용혈(Photohemolysis)법을 이용한 세포 보호 효과 측정</h2> <h3>적혈구 현탁액 제조.</h3> <p>적혈구는 건강한 성인 남녀로부터 얻었다. 채혈 즉시 heparin이 첨가된 시험관에 넣은 후, \(1,518 \times g \) 으로 \( 5 \mathrm { ~min } \) 동안 원심 분리하여 적혈구와 혈장을 분리하고, 분리한 적혈구는 \( 0.9 \% \) saline phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } 7.4 \), \( \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } \cdot 12 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } 9.6 \mathrm { mM } , \mathrm { NaH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } \cdot 2 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } 1.6 \mathrm { mM } \) )로 세척하여 원심 분리하고 흰색의 백혈구 층은 제거하였다. 이를 3 회 반복하여 세척, 분리한 적혈구는 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 냉장고에 보관하면서 사용하였으며 모든 실험은 채혈 후 \( 12 \mathrm { ~h } \) 이내에 행하였다. 광용혈 실험은 이미 확립된 방법에 따라 수행하였다. 실험에 사용된 적혈구 현탁액은 \( 700 \mathrm { ~nm } \) 에서 O.D. 값이 0.6 이었으며 이때 적혈구 수는 \( 1.5 \times 10 ^ { 7 } \) cells \( / \mathrm { ml } \) 이었다.</p> <h3>인동덩굴 추출물 및 분획물의 광용혈 억제 효과.</h3> <p>적혈구 현탁액 \( 3.5 \mathrm { ml } \) 를 파이렉스 시험관(No. 9820)에 넣은 후, 시료 용액을 첨가하였다. 시료를 농도별로 각각 \( 50 \mu 1 \) 씩 첨가하고 암소에서 \( 30 \mathrm { ~min } \) 동안 pre-incubation 시킨 후, 광증감제 rose-bengal \( (13 \mu \mathrm { M } ) 0.5 \mathrm { ml } \) 를 가하고 파라필름(Whatman laboratory sealing film, UK)으로 입구를 막은 후 \( 15 \mathrm { ~min } \)동안 광조사하였다. 광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 \( 50 \mathrm { ~cm } \times 20 \mathrm { ~cm } \times 25 \mathrm { ~cm } \) 크기의 상자 안에 \( 20 \mathrm { ~W } \) 형광 등을 장치하고, 형광등으로부터 \( 5 \mathrm { ~cm } \) 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 \( 15 \mathrm { ~min } \) 동안 광조사하였다. 광조사가 끝난 후 암반응 (post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 파괴 정도를 \( 15 \mathrm { ~min } \) 간격으로 \( 700 \mathrm { ~nm } \) 에서 투광도(transmittance, %)로부터 구하였다. 이 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도 증가는 적혈구의 용혈 정도에 비례한다. 모든 실험은 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 항온실에서 행하였다. 인동덩굴 추출물 및 분획물의 광용혈에 미치는 효과는 post-incubation 시간과 용혈 정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 \( 50 \% \) 가 용혈되는 시간인 \( \tau_ { 50 } \) 을 구하여 비교하였다.</p>