실제로 INF- \( \alpha \)가 cap mediated translation과 HCV IRES mediated translation를 하향조절할 수 있는지, NS5B가 INF- \( \alpha \)에 의한 translation level의 감소를 회복시킬 수 있는지 알아보기 위해 실험을 진행했다. 그 결과 luciferase의 cap mediated translation과 HCV IRES mediated translation이 회복 되었음을 알 수 있다. 이후 \( \mathrm { p } 56 \)이 cap mediated translation 과 HCV IRES mediated translation에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위한 실험을 했다. 측정 결과 반응액에 넣는 \( \mathrm { p } 56 \)의 양이 증가할수록 cap mediated trans-lation과 HCV IRES mediated translation level이 감소했다.
<p>Hepatoma cell line에서 INF- \( \alpha \) 에 의한 translation 조절과 NS5B의 역할</p> <p>INF- \( \alpha \)가 실제로 cap mediated translation과 HCV IRES mediated translation를 down-regulation할 수 있는지 알아보고, NS5B가 INF- \( \alpha \)에 의한 translation level의 감소를 회복시킬 수 있는지 알아보기 위하여 Huh7 cell에 dual reporter plasmid와 NS5B가 expression 되는 plasmid를 cotransfec-tion 시켜주고 5시간 후에 INF-을 처리하였다. 결과에서 보듯이 INF- \( \alpha 100 \) unit을 처리하였을 경우 cap mediated translation 과 HCV IRES mediated translation이 모두 down-regulation 되었고 NS5B가 존재할 경우에는 cap mediated translation과 HCV IRES mediated translation이 모두 회복되는 것을 확인 할 수 있었다. Reporter인 firefly luciferase gene에 대한 competitive RT-PCR을 수행해 본 결과 INF- \( \alpha \) 를 처리했을 경우나 NS5B가 존재 함에도 불구하고 RNA 발현에는 변화가 없음을 확인하였다. 따라서, luciferase activity의 감소는 translation level에서의 영향임을 알 수 있었다. 또한 NS5B를 cotransfection 해준 sample에서 western blotting을 통하여 NS5B를 detection 해본 결과 NS5B가 dose dependent 하게 expression 되는 것을 확인하였다. 이는 cell 내에서 expression 되는 \( \mathrm { NS } 5 \mathrm { ~B } \)에 의해서 luciferase의 cap mediated translation과 HCV IRES mediated translation이 회복 되었음을 의미한다.</p> <p>In vitro 상에서 p56의 발현에 의한 cap mediated trans-lation과 HCV IRES mediated translation의 조절</p> <p>앞선 실험에서 INF- \( \alpha \)에 의한 translation의 감소가 NS5B에 의해 다시 회복되는 것을 보았다. 이는 \( \mathrm { NNF } -0 \)의 의 pathway 중 \( \mathrm { p } 56 \) pathway에 NS5B가 관여하기 때문이라 예상하였다. 따라서 \( \mathrm { p } 56 \) 과 \( \mathrm { NS } 5 \mathrm { ~B } \) 에 초점운 맞추어 실헉을 진행하였다. \( \mathrm { p } 56 \)이 cap mediated translation 과 HCV IRES mediated translation에 어떤 엉향을 미치는지 알아보기 위하여 dual luciferase reporter plasmid와 p56이 expression 되는 plas-mid를 rabbit reticulocyte lysate에 넣어주어 반응을 시켰다. Rabbit reticulocyte lysate에 plasmid를 넣어주면 rabbit reticulocyte lysatc에는 transcription과 translation에 필요한 factor들이 모두 포함되어 있으므로 renilla와 firefly luciferase gene이 expression 된다. 반응 후 luciferase activity를 측정한 결과 Fig. 4에서화 같이 반응액에 넣어주는 \( \mathrm { p } 56 \)의 양이 증가할수록 reporter의 cap mediated trans-lation과 HCV IRES mediated translation level이 감소하였다. 특히 HCV IRES mediated translation은 \( \mathrm { p } 56 \)에 의해 영향을 덜 받는 반면 cap mediated translation은 \( \mathrm { p } 56 \)의 발현 정도에 따라 dose dependent manner로 expression level이 급격히 낮아졌다.</p>