본 논문에서는 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \)를 첨가해 얻은 침전물을 neutral saline으로 용해하여 투석한 후 용출 용액으로 neutral saline을 사용해 lectin을 분리하고, 분획을 활용해 lectin의 혈액 특이성과 활성, 분자량, 탄수화물의 특이성, 최적 반응온도, 열 안정성, \( \mathrm{pH} \) 안정성과 금속이온의 영향에 대한 조사 결과를 설명하고 있다.
<h1>결 과</h1><h2>Lectin의 분리</h2><p>\(50\%\) 농도의 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \)를 첨가하여 얻은 침전물을 neutral saline으로 용해하여 투석한 다음, Sephadex G-100 상에서 용출 용액으로 neutral saline을 사용하여 lectin을 분리하였다. 6~19번째 분획에서 높은 단백질 함량을 나타냈으나 이중 6번째 분획의 활성이 가장 높게 나타났다. 따라서 이 분획을 사용하여 lectin의 혈액 특이성과 활성, 분자량, 탄수화물의 특이성, 최적 반응온도, 열 안정성, \( \mathrm{pH} \) 안정성 및 금속이온의 영향을 조사하였다.</p><h2>혈액의 특이성과 활성화</h2><p>분리된 lectin에 trypsin으로 처리된 사람의 ABO형 혈액, 쥐 및 토끼의 혈액을 가하여 각각의 혈구 응집반응을 측정한 결과, 사람의 A, B, O, AB형, 토끼의 혈액에서 응집반응이 일어나지 않았으며, 쥐의 혈액에서만 응집이 일어났다. 이는 lectin이 혈액에 대한 특이성이 있음을 의미한다.</p><p>Trypsin을 처리하지 않은 혈액을 분리한 lectin과 반응 시킨 결과, 6종의 혈액형 모두에서 응집반응이 전혀 일어나지 않았다. 이 결과로서 활성화된 혈액만이 응집반응에 관여함을 알 수 있었다. 따라서 lectin의 생화학적 특성 연구에 trypsin으로 활성화시킨 쥐의 혈액을 사용하였다.</p><h2>SDS-PAGE와 lectin의 분자량</h2><p>SDS-PAGE에 의해 분리한 lectin은 단일 band로 존재함을 확인할 수 있었으며, 이 band의 분자량을 표준 단백질에 대한 상대이동도와 비교하여 측정한 결과 \( 19.3 \mathrm{~kDa} \)임을 알 수 있었다.</p><h2>탄수화믈의 특이성</h2><p>D-glucose, D-galactose, D-maltose, D-mannose, D-fructose, N-acetyl-D-glucosamine 및 D-sucrose를 \( 200 \mathrm{~mM} \) 농도에서 \( 6.25 \mathrm{~mM} \) 농도까지 희석하고, lectin을 가하여 반응시켰다. 탄수화물로 인한 lectin과 적혈구의 최소 저해농도를 측정하기 위하여, 그 활성을 측정한 결과, \( 100 \mathrm{~mM} \) 이하의 농도에서는 모든 탄수화물에서 적혈구 응집반응이 일어났다. 따라서 lectin의 활성에는 본 연구에서 사용한 탄수화물은 \( 100 \mathrm{~mM} \) 이하의 농도에서는 lectin과 적혈구의 응집을 저해시키지 않았으므로, 탄수화물에 대한 특이성이 나타나지 않았다.</p><h2>최적 반응온도</h2><p>\( 10-90^{\circ} \mathrm{C} \)의 범위에서 lectin의 최적 반응온도를 하였다. 그 결과 분리된 lectin의 가장 안정적인 반응온도는 \( 10-20^{\circ} \mathrm{C} \)로 활성이 \(100\%\)로 가장 높았고, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)부터는 활성이 \(20\%\)로 급격히 감소하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 매우 낮은 활성을 보였으며, \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)이상에서는 활성이 상실되었다.</p><h2>열 안정성</h2><p>\( 20-100^{\circ} \mathrm{C} \) 범위에서 lectin의 열 안정성을 측정하였다. 그 결과 분리된 lectin은 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)까지 안정적이었으며, \( 80^{\circ} \mathrm{C} \)부터는 급격히 감소하여 \(20\%\)의 활성을 나타내었고, \( 90-100^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 \(4\%\)의 활성이 나타났다.</p><h2>\( \mathrm{pH} \) 안정성</h2><p>2.0-10.0까지의 \( \mathrm{pH} \) 범위에서 lectin의 \( \mathrm{pH} \) 안정성을 측정하였다. 그 결과 분리된 lectin은 phosphate buffer를 사용한 \( \mathrm{pH} ~6.2-7.2\) 까지의 약산성과 중성에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 그러나 \( \mathrm{pH} ~4.2 \) 와 \( \mathrm{pH} ~8.0 \)에서는 활성이 급격히 감소하여 \( \mathrm{pH} ~3.2 \) 이하와 \( \mathrm{pH} ~9.1 \) 이상에서는 활성이 완전히 상실되었다.</p><h2>금속이온의 영향</h2><p>금속이온 \( \mathrm{Ca}^{2+}\), \(\mathrm{Co}^{2+}\), \(\mathrm{Cu}^{2+}\), \(\mathrm{Fe}^{2+}\), \(\mathrm{Mg}^{2+} \) 및 \( \mathrm{Mn}^{2+} \)를 \( 20 \mathrm{~mM} \) 농도에서 \( 1.25 \mathrm{~mM} \) 농도까지 희석하고, lectin을 가하여 반응시켰다. 금속이온으로 인한 lectin과 적혈구의 최소 저해농도를 측정한 결과, \( 20 \mathrm{~mM} \) 이하의 농도에서는 모든 금속이온에서 적혈구 응집반응이 일어났다. 이와 같이 lectin의 활성에는 본 연구에서 사용한 금속이온은 \( 20 \mathrm{~mM} \) 이하의 농도에서는 lectin과 적혈구의 응집을 저해시키지 않았으므로, 금속이온에 대한 특이성이 나타나지 않았다.</p>