R2A 배지를 사용하여 저 영양 세균의 분리를 시도하였다. \( \mathrm{R} 2 \mathrm{~A} \) 배지의 조성은 Yeast extract \( 0.5 \mathrm{~g} \), proteose peptone \( 0.5 \mathrm{~g} \), casamino acids \( 0.5 \mathrm{~g} \), glucose \( 0.5 \mathrm{~g} \), soluble starch \( 0.5 \mathrm{~g} \), Na-pyruvate \( 0.3 \mathrm{~g} \), \(\mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\) \( 0.3 \mathrm{~g} \), \(\mathrm{MgS}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) \( 0.05 \mathrm{~g} \), distilled water \( 1000 \mathrm{~mL}\)이다. 분리된 저 영양 세균은 글리세롤이 첨가된 배지에 넣어 보관하여 항암, 항균력을 단독 배양하여 기능검색을 할 경우 경비 및 시간측면에서 매우 비효율적이다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용 배지 및 균주</h2> <p>저 영양 세균의 분리를 위해 R2A 배지를 사용하였으며, \( \mathrm{R} 2 \mathrm{~A} \) 배지의 조성은 다음과 같다(Yeast extract \( 0.5 \mathrm{~g} \); proteose peptone \( 0.5 \mathrm{~g} \); casamino acids \( 0.5 \mathrm{~g} \); glucose \( 0.5 \mathrm{~g} \); soluble starch \( 0.5 \mathrm{~g} ; \) Na-pyruvate \( 0.3 \mathrm{~g} ; \mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 0.3 \mathrm{~g} ; \mathrm{MgS}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) \( 0.05 \mathrm{~g} \); distilled water \( 1000 \mathrm{~mL} ; \mathrm{pH} 7 \) ). 항균성 검정을 위한 지시균으로 사용된 포도상구균(Staphylococcus aureus \( \mathrm{KACC} 13236 \) 과 고초균(Bacillus subtilis \( \mathrm{KACC} 11247 \) )의 증식은 tryptic soy broth 배지(TSB), 식중독 균(Listeria mo-nocytogenes LMG13305)은 LEM배지(listeria enrichment media; Difco BRL)를 사용하였다.</p> <h2>저 영양 세균 분리, 물질은행 제작, 선발</h2> <p>충북 충주, 음성, 괴산, 충남 안면, 태안 경북 안동 지역 경작지의 근권 토양을 채취하였다. 수집된 토양시료 \( 1 \mathrm{~g} \) 에 멸균수 \( 9 \mathrm{~mL} \) 을 넣고 실온에서 30 분간 진탕 한 후 \( 10^{-3} \) 과 \( 10^{-4} \) 별로 희석하여 \( \mathrm{R} 2 \mathrm{~A} \) 배지에 도말 하였고 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 주 일간 배양하여 집락을 생성하는 세균만을 분리하였다. 분리된 저 영양 세균은 최종 \( 20 \% \) 글리세롤이 첨가된 \( \mathrm{R} 2 \mathrm{~A} \) 배지에 넣어 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 넣어 보관하여 사용하였다. 항암, 항균력을 가진 저 영양 세균을 선발하기 위해 개개의 균주를 단독 배양하여 기능검색을 할 경우 시간이나 경비 측면에서 매우 비효율적이므로 한정된 기간 내에 막대한 수의 클론을 검색하기가 사실상 불가능하다. 따라서 384개의 균주를 \( 10 \mathrm{~mL} \) 의 \( \mathrm{R} 2 \mathrm{~A} \) 액체배지에 개별 접종하고 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3 일간 진탕 배양하여 원심분리하였다. 각 배양액을 \( 5 \mathrm{~mL} \) 씩 모두 모아서 약 \( 2 \mathrm{~L} \) 의 ethylacetate로 추출, 감압 농축한 것을 최종 \( 5 \mathrm{~mL} \) 의 \( \mathrm{DMSO} \) (dimethyl sulphoxide)로 용해하여 하나의 그룹 물질 은행으로 하였다. 동시에 각 48 개의 균주 배양액 \( 2 \mathrm{~mL} \) 씩을 모두 모아서 ethylacetate로 추출하여 감압농축한 것은 \( 2 \mathrm{~mL} \)의 DMSO로 용해하여 아그룹 물질은행 시료로 한다. 또한 개개의 균주 배양액은 일회용 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) 제균 필터로 균을 제거하여 각 배양 여액을 \( 1 \mathrm{~mL} \) 씩 보관하여 개별 물질은행으로 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동고에 보존하고 항암 후보 균의 최종 선발 자원으로 사용하였다.</p> <p>항암 후보물질 생산 균주의 선발 단계는 다음과 같다. 우선 384 개 균주 배양액이 동시 함유된 그룹 물질은행에서 1차, 여기서 1 차 선발된 그룹에 속하는 8 개의 아그룹 물질은 행에서 2차, 마지막으로 2차 선발된 아그룹 물질은행에 해당하는 개별 균주의 제균 배양액 48 개에서 최종적으로 균주를 선발하였다.</p>