8-10주령의 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 실험 전에 24시간 금식시켰다. 이어서 펜토바르비탈 나트륨 (1ml/kg)을 복강내 투여하여 쥐를 마취시켰다. 그런 다음 쓰리클램프 방법을 사용하여 신장을 분리하고 스트렙토마이신과 페니실린을 (100U/ml)의 농도와 \( 30 \mathrm{ml} \)의 부피로 신장 동맥을 통해 전달했습니다. 혈액을 완전히 제거하기 위해 30 ml의 HBSS 용액을 천천히 관류한 후 HBSS를 이용하여 신장에서 사구체가 포함된 신피질을 분리하였다. 피질 조직을 잘게 다진 다음 30 또는 60 메쉬 필터를 통해 HBSS로 여과했습니다. 여과된 샘플은 이번에는 20 메쉬 필터를 사용하여 또 다른 여과를 통과했습니다. 마지막으로 샘플을 HBSS 용액으로 세척하였다.
<h1>재료 밎 방법</h1><h2>재료</h2><p>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (D-MEM)/Ham's nutrient mixture F-12 (D-MEM/F-12)와 Class Ⅳ collagenase는 Life Technologies (Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였다. D-glucose, streptomycin, penicilin, insulin, fungizon, pentobarbital sodium, Hanks' balanced salts (HBSS), D-va-line media, RPMI media 및 reduced GSH는 Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. Total gin-senoside, penoxatriol 및 penoxadiol은 한국인삼연초연구원(대전, 한국)에서 구입하였다. \( { }^{125} \)I-IGFs 및 \( \left[{ }^{3} \mathrm{H}\right]\)-arachidonic acid는 Amersharm international (Buckinghamshire, UK)에서 구입하였다. \( \mathrm{PGE}_{2} \) assay kit은 R&D system (Minneapolis, Minnesota, USA)에서 구입하였다.</p><h2>Mesangial 세포의 초대배양</h2><p>실험에 사용할 수컷 Spraque-Dawley 랫트(8-10주령)를 24시간 절식시킨 다음 pentobarbital sodium \( (1 \mathrm{ml} / \mathrm{kg}) \)을 복강내 주사하여 마취시킨 후 신속하게 isolated 3 claps method를 이용하여 신장을 분리하고, 신동맥을 통하여 streptomycin과 penicillin \( (100 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) \)이 포함된 \( 30 \mathrm{ml} \)의 HBSS 용액을 서서히 관류시켜 혈액을 완전히 제거한 후 HBSS에 옮겨서 사구체가 존재하는 신피질을 신장으로부터 분리하였다. 분리한 피질 조직을 가능한 세절한 다음 HBSS와 함께 30, 60 mesh에 여과시킨 후 다시 통과된 시료를 20 mesh에 여과하여 HBSS 용액에 세척하였다. 사구체가 함유되어 있는 HBSS 용액을 다시 한번 \( 120 \times g \), 30초간 원심분리하여 상층액만을 취하고 다시 \( 1,000 \times g \), 1분간 원심분리시켜 침전된 시료를 채취하였다. 채취된 시료를 RPMI 1640 (Sigma)에 세척한 다음 \( 1,000 \times g \), 1분간 원심분리 하였다. 정제된 사구체를 피막을 제거하기 위하여 collagenase (\( 750 \mathrm{~IU} / \mathrm{ml} \), Sigma)에 15분간 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 서서히 교반한 다음 무혈청 RPMI 1640 배지에 3번 계속 세척하였다. 이와 같은 과정을 통하여 얻어진 사구체 세포들을 세포배양 접시에 500 사구체/\(\mathrm{cm} \)가 되도록 분주한 다음 D-valine으로 치환된 Minimum Essential Media Eagle (Sigma)에서 \(5\%\) \( \mathrm{CO}_{2}\), \(95 \%\)\(\mathrm{O}_{2} \)인 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 흔들리지 않도록 고정하여 72시간 동안 배양시킨다. 이때 D-valine 배지, HEPES, streptomycin, penicillin (\(100 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \)) \( 0.25 \% \) fungizon, insulin (\(0.013 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\)) 그리고 \( 20 \% \) fetal bovine serum을 함유하도록 하고, 이후 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기예 배양시켰다. 계대 배양시에는 \( 5 \mathrm{mM} \)의 포도당을 함유한 DMEM/F-12를 사용하였다.</p>