조효소의 기질 특이성은 단당류를 정량하여 측정하였고, 최적 감태분해 조건을 조사후, 감태 효소분해산물은 운심분리하여 사용하였다. 감태 효소분해산물의 전자공여능은수소공여 효과로 측정하였고, SOD 활성은 SOD assay kit를 사용하였으며, 흡광도 측정은 ELISA reader를 이용하였다.
<h2>조효소의 기질 특이성 조사</h2> <p>조효소의 기질 특이성은 TE buffer에 다당류인 fucoidan, laminarin, alginic acid, starch, chitin 및 agar를 각각 \( 1 \% \) \( ( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) 씩 첨가하여 조효소액과 반응시킨 후 생성된 단당류를 정량하여 효소에 대한 기질의 특이성을 측정하였다.</p> <h1>감태 효소분해산물 제조</h1> <p>단백질의 함량이 \( 1.7 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 인 조효소액 \( 8 \mathrm { ml } \) 에 \( 0.5 \% \) 감태 분말을 첨가하여 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) water bath에서 48 시간 동안 반응시켰다. 감태 효소분해산물의 생성량은 효소에 의해 생성된 galactose 환원당의 양을 DNS (3,5-Dinitrosalicylic acid) 법에 따라 측정하여 최적 감태분해 조건을 조사하였다. 생성된 감태 효소분해산물은 원심분리하여 상등액을 농축한 후 동결건조시켜 \( -70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 보관하면서 생리활성 측정을 위한 시료로 사용하였다.</p> <h1>DPPH radical 소거능 측정</h1> <p>감태 효소분해산물의 전자공여능은 Blois의 방법에 따라 DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)에 대한 수소공여 효과로 측정하였다. DPPH 용액은 \( 100 \mathrm { ml } \) 에탄올에 DPPH \( 1.5 \times 10 ^ { -4 } \) \( \mathrm { M } \) 을 녹인 후 증류수 \( 100 \mathrm { ml } \) 과 혼합하여 Whatman filter paper No. 2로 여과하여 조제하였다. 96 well plate에 시료와 DPPH 용액을 \( 1: 4 \) 비율로 혼합하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 분간 반응시킨 후, ELISA reader (Molecular Device, Versa Max Microplate Reader, California, USA)를 이용하여 \( 520 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능(Electron donating ability, EDA)은 \( \operatorname { EDA } ( \%) = ( \) 대조구흡광도-시료첨가구흡광도 \( ) / \) 대조구흡광도 \( \times 100 \) 으로 계산하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조 그룹과 흡광도차를 비교하여 free radical의 제거 활성을 백분율로 나타내었다.</p> <h1>SOD활성 측정</h1> <p>감태 효소분해산물의 SOD (superoxide dismutase) 활성은 SOD assay kit (Dojindo Molecular Technologies, Rockville, USA)를 사용하였으며, 흡광도 측정은 ELISA reader를 이용하였다. 먼저 시료를 농도별로 회석하여 96 well plate에 \( 20 \mu l \)씩 분주한 후, WST working solution을 \( 200 \mu l \)를 넣고 섞어주었다. 이 후, enzyme working solution을 \( 20 \mul \) 를 넣고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20 분간 incubation 한 후 \( 450 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였으며, SOD 활성은 시료 첨가구와 무첨가구 사이의 홉광도 차이를 백분율 \( \% \)로 나타내었다.</p>