에폭사이드 가수분해능이 있는 Rhodotorula sp. CL-82 균체를 생촉매로 이용하여, 반응표면 분석법(response surface analysis)으로 키랄 (S)-styrene oxide 제조함에 있어서 \( \mathrm{pH} \), 반응온도, cosolvent 비율의 반응조건 최적화를 실험하였다. 이는 중심합성계획법을 이용하여 반응표현 분석에서 입체선택적 가수분해에 미치는 영향을 분석하기 위함이다.
<h1>결과 및 토론</h1><h2>반응표면 분석법을 이용한 반응조건 최적화</h2><p>Lab culture collection에서 선별한 에폭사이드 가수분해능이 우수한 Rhodotorula sp. CL-82 유래의 EH 활성을 이용하여 라세믹 styrene oxide 기질에 대한 입체선택적 가수분해 반응을 이용하여 키랄 (S)-styrene oxide 제조함에 있어서 반응표면 분석법(response surface analysis)을 이용하여 \( \mathrm{pH} \), 온도 및 cosolvent 비율 등 반응조건 최적화를 실시하였다. \( \mathrm{pH} \), 반응온도, cosolvent 등 세개의 실험인자의 변화가 입체선택적 가수분해에 미치는 영향을 분석하기 위한 실험점들은 중심합성계획법(central composite design)을 이용하여 결정하였으며, 실험조건과 (R)-styrene oxide 가수분해 속도와의 함수관계를 설명해줄 수 있는 2차 회귀 모형의 계수는 Statistical Analysis System(SAS)을 이용한 회귀분석을 통해 결정하였다.</p><p>세 가지 반응조건을 각각 -2, -1, 0, 1, 2등의 다섯 단계의 실험수준으로 나누고 (Table 1), 중심합성 계획법에 따라 총 \( 2^{\mathrm{K}}+2 \mathrm{~K}+\mathrm{N}_{0}\)\(\left(\mathrm{~K}\right. \) : 변수 개수, \( \mathrm{N}_{0} \) : 중심점 갯수)개의 실험점에서 각각 2번 반복 실험을 실시하여 입체선택적 가수분해 속도에 대한 실험 결과를 얻었다. 실험 평균값에 대하여 SAS 프로그램을 사용하여 회귀분석을 실시한 결과, \( \mathrm{pH} \), 온도, cosolvent 첨가량에 따른 Rhodotorula sp. CL-82 생촉매의 입체선택적 가수분해 속도를 나타내주는 반응표면(response surface)에 대한 2차 회귀분석식은 아래와 같이 결정할 수 있었다.</p><p>\( \begin{aligned} y=& 0.00233+0.00010 X_{1}+0.00008 X_{2}-0.00001 X_{3}-\\ & 0.00035 X_{1}{ }^{2}+0.00027 X_{1} X_{2}-0.00027 X_{2}{ }^{2}+0.00012 X_{1} X_{3} \\ &-0.00008 X_{2} X_{3}-0.00030 X_{3}{ }^{2} \end{aligned} \)</p><p>여기서 \( \mathrm{y} \)는 생촉매의 입체선택적 가수분해 속도 \( (\mathrm{mM} / \) \( \mathrm{mg} \cdot \mathrm{min}) \)이며 \( \mathrm{X}_{1}\), \(\mathrm{X}_{2}\),\( \mathrm{X}_{3} \)는 각각 \( \mathrm{pH} \), 반응온도 \( \left({ }^{\circ} \mathrm{C}\right) \), cosolvent 첨가량 \( (\%(\mathrm{v} / \mathrm{v})) \) 이며 \( \beta_{0} \)는 절편, \( \beta_{n} \)은 회귀계수이다.</p><p>2차 회귀분석을 통해 결정된 Rhodotorula sp. CL-82 생촉매의 입체선택적 가수분해 속도를 나타내주는 반응표면 곡선에 대한 eigenvalues 값들이 세가지 변수에 대해 모두 음의 값들이 나와 최대점이 존재함을 알 수 있었다. F-ratio 값이 가장 적게 나온 실험인자인 cosolvent 첨가량을 \( 3 \% \) \(\mathrm{v} / \mathrm{v})\)으로 결정하고, \( \mathrm{pH} \) 및 반응온도 변화에 따른 입체선택적 가수분해 속도 변화를 분석하였다. Fig. 1 에서와 같이 최대점을 가진 3차원 반응표면을 얻을 수 있었으며, 최대점에서의 최적 \( \mathrm{pH} \) 및 반응온도는 각각 7.6, 33.3\(^{\circ} \mathrm{C} \)로 결정할 수 있었다.<h2>최적조건에서의 라세믹 styrene oxide에 대한 입체선택성 가수분해 반응</h2><p>반응표면 분석에서 셜정한 최적조건에서 Rhodotorula sp. CL-82 균체를 생촉매로 사용하여 라세믹 styrene oxide에 대한 입체선택적 가수분해 반응을 실시하였다. 최적조건으로 결정된 \( \mathrm{pH} 7.6 \), 온도 \( 33.3^{\circ} \mathrm{C} \), cosolvent 첨가량 \( 3 \%\)\((\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)에서 건조중량 \( 300 \mathrm{mg} \) 의 Rhodotorula sp. CL-82 균체를 \(80 \mathrm{mM} \)의 라세믹 styrene oxide가 들어 있는 \( 10 \mathrm{ml} \) reaction vessel에 넣고 shaking을 해주면서 입체선택적 가수분해 반응을 실시하였다. 약 4시간 정도의 반응 시간 경과 후 \( 20 \% \) 수율(이론 수율 대비 \( 40 \% \) ) 수준으로 광학적으로 순수한 (ee >\(99\%\)) (S)-styrene oxide을 얻을 수 있었다.</p>