T98G 세포주를 DMEM에서 72시간 동안 배양하고, FACS 분석 조건과 동일하게 처리하여 원심분리를 수행했다. 세포주는 protease inhibitor cocktail이 첨가된 RIPA buffer에 담가서 \(4 ^ {\circ } \mathrm { C }\)에서 30분간 반응시켰다. 그 다음으로, anti-FACT/cdc68 이라는 일차 항체를 \(5 \% \)의 skim milk에 1:1000으로 희석하여 \(4 ^ {\circ } \mathrm { C }\)에서 9시간 처리했다. 일차 항체 처리 후 TBS-T로 5회 씻어내고 이차 항체를 \(1: 2500\)으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 처리했다. 마지막으로, \(10 \% \)의 FBS와 항생제가 첨가된 DMEM에서 \(37 ^ {\circ } \mathrm { C }, 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 }\)의 조건에서 세포 배양을 수행했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포배양에 사용한 시약</h2> <p>실험에 사용한 T98G세포주(CRL-1690)는 American Type Culture Collection(Roville, MD, USA)로부터 분양 받아 사 용하였다. 세포배양에 필요한 배지 Dulbecco's modified Eagles medium(DMEM)과 배지에 첨가하는 항생제 (120 \( \mu \mathrm { g } \) penicillin/ml, and \( 200 \mu \mathrm { g } \) streptomycin/ml) 및 FBS(fetal bovine serum)은 Hyclone(Logan, UT) 제품을 사용하였다.</p> <h2>DNA flow cyometry에 의한 세포주기 분석</h2> <p>T98G cell을 24well plate에 \( 1.5 \times 10 ^ { 5 } / \mathrm { ml } \)으로 분주한다. \( 10 \% \)의 FBS와 항생제가 첨가되어 있는 DMEM을 이용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에서 배양하였다. 24시간 후에 한 well 은 항생제만 첨가된 DMEM으로 두 번 씻어준 후 DMEM으로 배지를 교환하고 asynchronous한 T98G 세포주는 \( 10 \% \)의 FBS가 첨가된 DMEM배지로 교환한다. DMEM에서 72시간 동안 배양한 T98G 세포주와 \( 10 \% \)의 FBS가 첨가된 DMEM에 서 배양된 T98G 세포주를 원심분리 하여 모은다. PBS로 1회 씻어준 후 \( 1 \mathrm { ml } \)의 nuclear isolation buffer \( 0.5 \% \) BSA, \( 0.1 \% \) NP40, \( 50 \mathrm { ng } / \mathrm { ml } \) propidium iodide, \( 10 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) RNase, PBS)에 T98G 세포주를 현탁시키고 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 어두운 조건에서 20 분간 반응시킨다. FACS buffer \( 1 \% \) BSA, \( 0.2 \% \) \( \left . \mathrm { NaN } _ { 3 } \right ) \)로 두 번 씻어준 후 \( 300 \mu \)의 FACS buffer에 현탁시킨 후 flow cytometer 로 분석하였다.</p> <h2>Western blot 분석</h2> <p>FACS 분석과 동일한 조건으로 배양된 T98G cell을 PBS로 씻은 후 protease inhibitor cocktail(Sigma)이 첨가된 RIPA buffer(150 \( \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } , 1 \% \) Nonidet P-40(NP-40), \( 0.5 \% \) deoxycholate, \( 0.1 \% \) SDS, \( 50 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } \mathrm { pH } 8.0) \)를 넣고 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30 분간 반응시켰다. \( 4 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 반응시키는 중간에 5분 간격으 로 vortex해주었다. \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 13000 \mathrm { rpm } \)에서 10분간 원심분리 한 후 상층 액을 새 tube로 읆기고 이것을 이용하여 단백질을 정량하였다. 단백질의 정량은 Bradford method를 이용하였고, 표준 단백 시료는 bovine serum albumin (BSA)을 사용하였다. 동일량의 단백시료를 NuPAGE LDS sample buffer (4X, invitrogen)와 섞은 후 \( 90 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 꿇이고, NuPAGE gel (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 \( 80 \mathrm { ~V } \)에서 전기영동을 하였다. 이것을 Bio-Rad kit를 이용하여 PVDF membrane으로 옮긴 후 \( 5 \% \) skim milk로 실온에서 2시간 동안 blocking하 였다. 일차 항체인 anti-FACT/cdc68 (Upstate, Lake Placid, NY)을 \( 5 \% \) skim milk에 1:1000으로 희석하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 9시간 처리하였다. Cyclin D1(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 항체와 SSRP1(Santa Cruz Biotechnology) 항체는 1:200으로 Cyclin B1(Cell Signaling) 항체는 1:1000으로 희석하여 처리하였다. 일차 항체 처리 후 TBS-T로 5회 씻어내고 이차 항체를 \( 1: 2500 \)으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 처리하였다. 일차 항체를 anti-FACT/ cdc68 (upstate)를 처리한 경우에는 anti-rabbit IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology)를 이차 항체로 처리하였고, Cyclin D1 항체와 Cyclin B1 항체를 사용한 경우에는 anti-mouse IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology)를 이차 항체로 사용하였으며, SSRP1 항체를 사용한 membrane은 anti-goat IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology)를 사용하였다. 이차 항체를 처리한지 1시간 후에 PVDF membrane을 TBS-T로 4~5회 씻어낸 후 ECL detection system (Santa Cruz Biotechnology)을 이용하여 Spt16 의 양을 측정하였다. Western blot의 견과는 펼름을 scan한 후 Multi-Gage 프로그램을 이용하여 정량 하였다.</p>