Xylan은 D-xylose 잔기간에 \( \beta-1,4 \) 배당결합의 골격을 하는 다당류로 목재, 초본류와 곡류를 두루 포함한 식물에서 반섬유소 형태로 존재한다. Xylanase는 여러 종류의 효소가 관여하며, endo- \( \beta \)-1,4-xylanase (xylanase)가 가장 중요한 작용을 한다. Aspergillus, Trichoderma, Bacillus 속 균주들이 xylanase의 생산균으로 사용되고 있으며, 이들 균주로부터 xylanase 유전자를 클로닝하고 재조합 대장균이 생산하는 xylanase의 반응 특성을 비교하기 위해 PCR 및 염기서열 분석을 수행하였다.
<p>목재, 초본류와 곡류를 두루 포함한 식물에서 반섬유소 형태로 존재하는 xylan은 D-xylose 잔기간에 \( \beta-1,4 \) 배당결합의 골격을 하고 있는 다당류이다. Xylan의 분해에는 여러 종류의 효소가 관여하며 이들 중 D-xylosyl 잔기간 배당결합을 무작위로 절단하는 endo- \( \beta \)-1,4-xylanase (xylanase)가 가장 중요한 작용을 한다. Xylanase를 생산하는 다수의 미생물이 분리되고, 효소 생산성, 효소 특성 및 그 유전자에 대한 연구가 꾸준히 수행되어 glycosyl hydrolase family (GH) 2, 5, 7, 8, 10, 11, 16, 30, 35, 43, 52와 62에 널리 분포해서 속하는 xylanases가 알려졌다. Xylanase는 식품분야, 사료분야, 제지와 펄프분야, 직물 가공분야 및 바이오매스 당화분야와 같이 여러 산업분야에서 활용되고 있다. Aspergillus, Trichoderma와 같은 균류나 Bacillus 속 균주가 xylanase의 생산균으로 사용되고 있으며, xylanase의 산업적 활용성을 증가시키기 위해 효소 생산성이 향상된 균주의 개발, 효소의 특성 개량이나 고정화 효소의 개발 등의 다양한 접근이 진행되고 있다. Bacillus sp. YB-1401과 B. amyloliquefaciens YB-1402는 서로 아미노산 배열이 유사한 mannanase를 생산하는 것으로 보고되었으며, xylanase도 생산하는 것으로 확인되었다. 본 연구에서는 이들 균주로부터 xylanase 유전자를 클로닝하고 재조합 대장균이 생산하는 xylanase의 반응 특성을 비교하고자 하였다.</p> <p>중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 두 균주로부터 xylanase 유전자를 클로닝 하기 위해서 B. subtilis 또는 B. amyloliquefaciens의 xylanase 유전자 정보를 (Genbank accession no. CAD60654, AAD10834, AAL32473, ADK92885, ABA64459, ACX32454, CAA41783) 비교 분석하여 PCR 반응으로 완전한 구조유전자의 증폭이 가능한 염기서열로 구성된 oligonucleotide를 primer로 설계하였다. Upper primer(BCSG2-1F; 5'-GCTRCCTCATGTCAAAGTCAGAA-3')는 개시코돈으로 예상되는 지점으로부터 약 20개 nucleotides가 앞으로 떨어져 있는 상부지역 서열에 해당하며 lower primer (BCSG2-R; 5'-CCCCTVATTAARRATRAKCTGTTA-3')는 종결코돈의 염기를 포함하며 그 하부 지역에 해당하는 서열이다. Xylanase 유전자에 따라 염기서열이 다른 부분도 있어 degenerated primers로 제작하였다.</p> <p>Bacillus sp. YB-1401과 B. amyloliquefaciens YB- 1402의 유전체는 genomic DNA prep kit (Solgent, Korea)로 분리하여 주형 DNA로 사용하였으며, primers BCSG2-1F/R과 혼합하여 Pfu-X DNA polymerase로 xylanase 유전자를 증폭하였다. PCR 반응은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 3분간 열처리한 후 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초, \( 57 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 40초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분간 반응을 30회 반복하고 최종적으로 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20분간 방치하여 수행하였다. 그 결과 약 \( 0.7 \mathrm { ~kb } \) 크기로 증폭된 DNA를 얻 었고 이를 HincⅡ로 절단된 pUC19와 ligation한 후 Escherichia coli DH5 \( \alpha \)에 도입하였다. 형질전환된 E. coli를 oat spelt xylan (OSX, \( 0.5 \%) \)과 ampicillin \( (100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \)이 첨가된 LB 평판배지에 배양하여 xylan 분해능이 있는 재조합 균주를 선발하였다. PCR 과정 중 변이가 발생하였는지 여부를 조사하기 위해 YB-1401 과 YB-1402로부터 xylanase 유전자가 클론된 형질전환주를 각각 3주씩 선발하여 플라스미드 DNA를 분리하고 그 염기 서열을 결정하였다. 그 결과 동일한 균주에서 유래된 xylanase 유전자의 염기서열은 동일한 것으로 나타났으며 PCR 과정 중에 변이가 일어나지 않은 것이 확인되었다. YB-1401 (xyn1401, KX620014)과 YB-1402 (xyn1402, KX620015)의 xylanase 유전자는 213개 아미노산으로 구성된 단백질을 동일하게 코드하였으며, 구조 유전자는 서로간 6개의 염기서열이 달랐다. 한편 PCR로 클로닝된 B. subtilis cho40 (ADN03187)와 B. subtilis ABGx(AFV73208)의 xylanase 유전자는 아미노 말단지역이나 카르복실 말단지역에 상응하는 염기서열이 누락되어 완전한 구조유전자의 서열이 확인되지 않았다. 이로 보아 본 실험에서 설계된 BCSG2-1F와 BCSG2-R은 xylanase 구조유전자를 완전하게 증폭하기에 유용한 primers로 여겨진다.</p>