지렁이의 장내 미생물 중 키틴 가수분해 활성이 우수한 Bacillus licheniformis GA9를 선발하고 동정하였다. 이 B. licheniformis GA9가 생산하는 키틴 분해효소는 40-60% 황산암모늄 침전, 음이온교환 크로마토그래피, 그리고 겔 크로마토그래피를 통해 정제되었다. 그 결과, 정제한 키틴 분해효소의 활성은 \(10 \mathrm { mM } \mathrm { Co } { } ^ { 2 + }\) 금속이온에 의해 증가하고, \( \mathrm { Fe } ^ { 2 + }\) 와 \( \mathrm { Cu } ^ { 2 + }\) 금속이온에 의해 감소하지만, \( \mathrm { EDTA }\)가 첨가될 경우 효소활성이 일부 회복되었다.
<h2>\( K_ { m } \) 및 \( V_ {\max } \) 측정</h2> <p>정제한 키틴 분해효소의 기질 친화도를 측정하기 위해 다양한 농도의 기질 \( (0.1-0.4 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) colloidal chitin)을 이용해 Lineweaver-Burk 방법으로 plot하여 기질별로 \( K_ {\mathrm { m } } \) 과 \( V_ {\max } \) 값을 계산한 결과, \( K_ {\mathrm { m } } \) 값은 \( 4.02 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 이었고 \( V_ {\max } \) 값은 \( 0.52 \mathrm { mg } / \mathrm { min } \) 이었다(Fig. 4).</p> <p>Kudan과 Pichyangkura는 B. licheniformis SK-1이 생산하는 키틴 분해효소의 \( K_ {\mathrm { m } } \) 값은 \( 0.23 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 이었다고 보고하였으며, Baik 등이 분리한 Bacillus sp. YE-1213이 생산하는 키틴 분해효소는 \( 1.74 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 의 \( K_ {\mathrm { m } } \) 값을 나타내었다. Bacillus 속(이) 생성하는 키틴 분해효소의 \( K_ {\mathrm { m } } \) 값이 \( B \). licheniformis GA9가 생산하는 키틴 분해효소보다 비교적 높아 기질 친화도는 낮은 것으로 판단되었다. Hong과 Seu 가 분리한 Streptomyces속(이) 생산하는 키틴 분해효소와 Lee 등이 분리한 Aeromonas salmonicida YA7-625가 생산하는 키틴 분해효소의 \( K_ {\mathrm { m } } \) 값은 각각 \( 1.28 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 과 \( 3.6 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 으로 B. licheniformis GA9가 생산하는 키틴 분해효소의 colloidal chitin에 대한 기질 친화도는 다른 미생물이 생산하는 키틴 분해효소들보다도 비교적 낮은 것으로 확인되었으나 효소정제도 및 실험조건에 따라 차이가 있어 일률적으로 비교하기는 어렵다.</p> <h1>요 약</h1> <p>지렁이의 장내로부터 분리한 미생물 중에서 키틴 가수분해 활성이 우수한 미생물을 선발하였으며, 이를 동정하여 Bacillus licheniformis GA9으로 명명하였다. B. licheniformis GA9이 생산하는 키틴 분해효소의 정제는 배양상등액 40 \( 60 \% \) 황산암모늄 침전, 음이온교환 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 최종적으로 정제한 키틴 분해효소는 \( 45.2 \) 배로 정제되었고 효소단백질 회수율은 \( 20.0 \% \) 를 나타내었다. 정제한 키틴 분해효소의 분자량은 약 \( 52.1 \mathrm { kDa } \) 으로 나타났으며, N-terminal amino acid sequencing 분석결과, 아미노산 서열은 D-S-G-K-N-G-K-I-I-R-Y-Y-P-I- \( \mathrm { R } \) 로 확인되었다. 키틴 분해효소의 최적반응 \( \mathrm { pH } \) 와 \( \mathrm { pH } \) 안정성을 측정한 결과, \( \mathrm { pH } 5.0 \) 에서 최대 활성을 나타내었으며 \( \mathrm { pH } \) 5.0-6.0에서 안정성을 나타내었다. 키틴 분해효소의 최적반응 온도와 온도안정성의 경우, \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 최대 활성을 나타내었으며, \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 \( 60 \% \) 의 잔존 활성을 나타내었다. 정제한 키틴 분해효소는 \( 10 \mathrm { mM } \mathrm { Co } { } ^ { 2 + } \) 금속이온에 의해 효소활성이 증가하였으며, \( \mathrm { Fe } ^ { 2 + } \) 과 \( \mathrm { Cu } ^ { 2 + } \) 금속이온에 의해 효소활성이 감소하였으나, \( \mathrm { EDTA } \) 첨가시 감소한 효소활성이 일부 회복되었다. 정제한 효소의 \( K_ {\mathrm { m } } \) 및 \( V_ {\max } \) 는 각각 \( 4.02 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 와 \( 0.52 \mathrm { mg } / \mathrm { min } \) 이었다. 또한 키틴 분해효소는 생명공학, 생물 의약, 농업, 식품영양 등 다양한 산업분야에서 응용이 가능하다.</p>