본 논문에서는 total RNA 분리와 cDNA 합성 실험을 진행하기 위해 \(100 \mathrm( mm )\) tissue culture dish에 B16-F10 세포 \( 1 \times 10^{ 6 } \) cells/well을 분주 후 \( 37^{ \circ } \mathrm{ C }\), \(5 \% \mathrm{ CO }_{ 2 } \) incubator에서 24시간 배양하여 사용하였다. 더불어 mRNA 발현으로 미백 효과가 있었는지 확인하기 위해 B16-F10를 사용하여 RT-PCR로 측정하였다. 또한 모든 실험은 세번 반복하여 평균값과 표준편차를 구하여 Mean\(\pm\)SD로 결과 통계처리를 했다.
<h2>Total RNA 분리 및 CDNA 합성</h2> <p>B16-F10 세포를 \( 1 \times 10^{6} \) cells/well을 \( 100 \mathrm{~mm} \) tissue culture dish에 분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24시간 배양하였다. Stimulator로 B16-F10 세포에 \( \alpha \)-MSH \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도로 처리하여 2시간 후 농도별로 시료를 처리하여 24시간 배양하였다. RNA 분리를 위하여 시료를 처리한 배양액을 제거하고 PBS로 2회 세척하였으며 trizol reagent \( 1 \mathrm{ml} \)을 첨가해 scraping하여 세포를 lysis 하였다. Chloroform \( 200 \mu \mathrm{l} \) 첨가 후 흔들어 혼합한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 13,200 \mathrm{rpm} \)에서 20분간 원심 분리하였다. 원심분리가 완료된 후 상층액 \( 500 \mu \mathrm{l} \)를 취하여 isopropanol \( 500 \mu \mathrm{l} \)와 혼합한 다음 흔들어주었다. 이후 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(13,200 \mathrm{rpm} \) 조건에서 20분간 원심 분리하여 pellet을 제외한 상층액을 제거해주어 diethylpyrocarbonate (DEPC) water로 희석한 \( 75 \% \) 에탄올로 세척하였다. 액체를 모두 제거해준 후 DEPC water \( 50 \mu \mathrm{l} \)를 분주하여 tapping 한다. Nano drop으로 total RNA량을 측정하여 Oligo (dT) 15 primer \( (500 \mathrm{mg} / \mathrm{ml})\) \(1 \mu \mathrm{l} \), 추출된 RNA \( (2 \mu \mathrm{g}) \)을 섞어준 후 nuclease free water (NW)로 total \( 10 \mu \mathrm{l} \)로 맞추어 주었다. \( 75^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5 분, \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 반응 후 5X reaction buffer, \( \mathrm{MgCl}_{2} \), polymerase chain reaction (PCR) nucleotide mix, reverse transcriptase, rnasin inhibitor, NW를 첨가하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분, \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60분, \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분, \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분 반응시켜 cDNA를 합성하였다.</p> <h2>Reverse Transcription-PCR (RT-PCR)</h2> <p>미백 효과를 mRNA 발현으로 확인하기 위해 B16-F10 세포를 이용하여 RT-PCR로 측정하였다. PCR PreMix에 합성한 cDNA와 primer sequences를 충분히 섞어 준 후 실험을 진행하였다. 실험에 사용한 primer sequences는 Table 1과 같다. GAPDH는 \( 96{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분, \( 96^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10초, \( 64^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분(30 cycles), MITF는 \( 96^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10초, \( 57^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분(35 cycles), Tyrosinase는 \( 96^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분, \( 96^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10초, \( 56^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 72{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분(35 cycles), TRP-1은 \( 96^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10초, \( 58^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분(35 cycles), TRP-2은 \( 96^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분, \( 94{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10초, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분(35 cycles)을 실행하였다. \( 1 \% \) midori green을 첨가한 \( 1.5 \% \) agarose gel을 \( 100 \mathrm{~V} \)에서 30분간 전기영동 한 후 UV를 조사하여 밴드를 확인하였다.</p> <h2>통계 처리</h2> <p>모든 실험은 3회 반복으로 행하여 평균치와 표준편차로 나타내었고, 결과 통계처리는 Mean±SD (Standard diviation)로 나타내었으며, 실험 데이터는 대조군과 각 시료에 대한 실험 자료로부터 ANOVA를 실시하여 유의성에 대하여 post-hoc test로 Tukey tange test를 실시하여 \( 95 \% \) 수준에서 유의성을 검증하였다.</p>