Human Umbilical Vein Endothelial Cell을 배양하여 저산소 상태유발을 위해 처리한 후 RNA을 추출하고 역전사 중합효소 연쇄반응을 확인하였다. 면역조직화학염색을 실행하였고 이를 형광현미경으로 관찰하였으며 저산소환경에서의 혈관형성능력을 비교실험하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포배양</h2><p>인간 제대혈 유래의 혈관내피세포인 Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)은 5\(\%\) FBS가 포함된 \( \mathrm{EGM}^{\mathrm{TM}} \) -2MV BulletKit \( { }^{\mathrm{TI}} \) (Lonza)에 \( 100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) penicillin streptomycin (Welgene)을 첨가하여 사용하였다. 세포는 \( 1 \% \) gelatin (sigma)로 코팅한 culture dish에 깔아 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\),\( 5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 배양기에서 배양하였으며, 세포가 \(80\sim 90\)\(\% \) confluence가 되면 Trypsin-EDTA (Welgene)을 처리하여 계대배양하였다.</p><h2>Hypoxia유도실험</h2><p>세포에 저산소 상태를 유발하기 위해서 \( 50 \mu \mathrm{M} \) 의 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) (Sigma)나 \( 100 \mu \mathrm{M} \) 의 DFO (Deferoxaminemesylate salt, Sigma)를 처리하여 저산소 상태와 유사한 환경을 조성하거나, \( 2 \% \mathrm{~O}_{2}\), \(5 \% \mathrm{~CO}_{2}\), \(93 \% \mathrm{~N}_{2} \)로 이루어진 혼합가스를 주입한 hypoxia chamber를 사용하였다.</p><h2>RNA 추출 및 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction; RT-PCR)</h2><p>RNA는 Trizol \( ^{\circledR} \) (TAKARA)을 사용하여 분리하고 멸균한 3차 증류수에 녹여 사용하였다. cDNA합성은 PrimScript \( { }^{\mathrm{TM}} 1^{\text {st }} \) strand cDNA Synthesis Kit (TAKARA)를 사용하여 RNA \( 1 \mu \mathrm{g} \)을 포함하는 반응액으로 60분 동안 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 진행하였다. HUVEC에서의 SIRT1-7의 발현은 TaKaRa Ex Taq\( { }^{\mathrm{TM}} \) (TAKARA)를 이용하여 타겟 DNA를 합성하여 전기영동을 통해 확인하였다.</p><h2>면역조직화학염색 및 관찰</h2><p>HUVEC을 6-well plate에 HUVEC을 \( 2.5 \times 10^{4} \)개로 심고 안정화된 후, \( 100 \mu \mathrm{M} \) 의 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리하여 24시간 배양하였다. 세포를 phosphate buffered saline (PBS)로 3번 세척하고 \( 2 \% \) paraformaldehyde (Wako)에 5분간 반응시킨 후 PBS로 5분간 세척하고 \(0.1 \% \) Triton X-100 (Sigma)에 5분간 반응시켰다. anti-SIRT2 (1:100; abcam)를 \( 2 \% \) BSA가 첨가된 PBS 용액에 희석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 처리하고 PBS로 세척 후, 형광이 부착된 2차항체(1:200; anti-rabbit Alexafluor 488 anti-rabbit \( \mathrm{IgG} \), invitrogen)를 상온에서 1시간 반응시켰다. 핵 염색을 위하여 상온에서 1 분간 \( 4^{\prime}, 6 \)-diamidino-2-(DAPI; Invitrogen)를 반응시켰다. 염색된 샘플은 형광현미경(Olympus)을 사용하여 관찰하였다.</p><h2>Matrigel을 이용한 저산소환경(hypoxia condition)에서의 혈관튜브형성능력 비교실험</h2><p>Matrigel Matrix (Becton Dickinson)를 96 well plate에 40\( \mu l \)씩 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\) \(\mathrm{~CO}_{2} \) incubator에서 30분 배양시켜 겔로 굳혔다. Matrigel 위에 10,000개의 HUVEC과 \( 1 \% \)의 FBS를 포함한 EBM-2 배지 \(100 \mathrm{µl}\)를 넣어 3시간 30분 배양하였다. Hypoxia는 hypoxia chamber를 이용하였으며, SIRT2 inhibitor인 AK-1 (3-(azepan-1-ylsulfonyl)-N-(3-nitrophenyl) benzamide, Calbiochem)을 \( 10 \mu \mathrm{M} \) 처리하였다. HUVEC의 혈관형성능력은 Image J프로그램을 사용하여, 세포의 길이를 측정하고 Excel로 통계처리 하였다.</p>