연산 오골계를 물 \( 700 \mathrm{ml} \)에 가한 뒤 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 가열 처리하여 추출한 추출액을 여과하고 농축한 뒤 동결 건조하여 물 추출물을 제조하였으며 일반성분 분석은 수분함량, 조 단백질, 조 지방, 조 회분, 탄수화물을 측정하였고, 조골세포 배양은 RPMI 배지에 FBS, penicillin 및 streptomycin을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 2-3 일 마다 계대배양하고, 분화 유도를 위해 \(\beta\)-glycerol phosphate와 ascorbic acid를 첨가하여 분화 유도 배지로 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>연산 오골계 추출물의 제조</h2> <p>본 실험에 사용된 연산 오골계는 충남 논산시 화악리 지산농원에서 제공받아 육질과 껍질로 나누어 각각 \( 200 \mathrm{~g} \) 씩 정량하였고 물 \( 700 \mathrm{ml} \) 를 가한 뒤 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 가열 처리하여 추출하였으며 추출액은 여과지(Whatman, Maidstone, UK)로 여과하고 농축한 뒤 동결 건조하여 물 추출물을 제조하였다. 사용한 시료는 1년산 수탉 육질(Cock Flesh-1 year, CF-1), 1년산 수탉 껍질(Cock Skin-1 year, CS-1), 3년산 수탉 육질(Cock Flesh-3 year, CF-3), 3년산 수탉 껍질(Cock Skin-3 year, CS-3), 3년산 암탉 육질(Hen Flesh-3 year, HF-3), 3년산 암탉 껍질(Hen Skin-3 year, HS-3)로 나누어 사용하였으며 실험은 한 마리의 개체로부터 추출하여 얻은 추출물 시료를 세포 주에 한번 처리할 때 동일 농도를 3 번씩 3 반복하여 실험하였다.</p> <h2>일반성분 분석</h2> <p>일반성분은 수분함량, 조 단백질, 조 지방, 조 회분, 탄수화물을 측정하였다. 수분함량은 \( 105^{\circ} \mathrm{C} \) 상압 건조법, 조 단백질 함량은 식품공전 중의 micro-Kjeldahl법, 조 지방 함량은 에테르 추출법을 이용하여 분석하였고, 조 회분 함량은 \( 550^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 도가니에 희화하는 직접 희화 법을 이용하였다. 총 당질 함량은 차감 법으로 계산하였다.</p> <h2>조골세포 배양</h2> <p>인간 유래 조골세포인 MG-63 세포는 서울대학교 한국 세포 주 은행(KCLB 21427)으로부터 분양받아 RPMI 배지 (Welgene, Daegu, Korea)에 \( 10 \% \) 의 FBS(Hyclone, Logan, UT, USA)와 \( 1 \% \) 의 penicillin 및 streptomycin(GIBCO, Grand Island, \( \mathrm{NY} \), USA)을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기 ( \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator MC-15AC, Sanyo, Sakata, Japan)에서 2-3 일 마다 계대배양하고, 분화 유도를 위해 \( 10 \mathrm{mM} \beta \)-glycerol phosphate(Sigma Co., St. Louis, MO, USA)와 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 ascorbic acid(Sigma Co.)를 첨가하여 분화 유도 배지로 사용하였으며, 3 일마다 배지를 교환하였다.</p> <h2>Alkaline phosphatase(ALP) 활성</h2> <p>배양된 MG-63 세포를 \( 5 \times 10^{4} \mathrm{cells} / \mathrm{ml} \) 로 조정하여 96 웰 플레이트에 분주한 다음 24 시간 후 분화 유도 배지로 교환하고 농도별로 시료 처리를 하였다. 4 일 동안 배양한 뒤 배양액을 제거하고 증류수로 세척한 다음 \( 0.1 \% \) Triton X-100을 \( 20 \mu 1 \) 씩 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 용해하였다. 용해된 세포의 상층액에 \( 0.1 \mathrm{~N} \) glycine과 \( 100 \mathrm{mM} \) 의 \( p \)-nitrophenylphosphate( \( p \) -\( \mathrm{NPP}) \) 를 첨가한 뒤 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 30 분간 반응시켰다. 반응 후 \( 0.1 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} \) 을 넣어 반응을 정지시킨 다음, \( 405 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p>