RNA silencing은 dsRNA가 RNaseIII 효소로 인해 20~25bp의 siRNA 및 miRNA로 절단되어 RISC를 이루어 전사, RNA 안정성 및 번역 단계에서 유전자 발현을 억제하는 것이다. 현재 식물에서는 RNA-mediated silencing을 위해 virus-based vector나 hpRNA-mediated gene silencing 방법을 이용한다. EMS는 화학돌연변이를 유기하는데 흔하게 사용된다.
<p>RNA silencing이 발생할 때에는 dsRNA는 RNaseIII 같은 효소 (Dicerl)에 의하여 20 \( \sim \)25 \( \mathrm { bp } \) 의 짧은 RNA의 siRNA(short interfering RNA)와 miRNA (micro RNA) 절단되어진다. 이 siRNA와 miRNA가 RNA-induced silencing complex(RISC)를 이루어 전사, RNA 안정성 및 번역단계에서 유전자 발현을 억제하게 되는 것이다.</p> <p>식물에서 RNAi silencing을 이용하는 주요 내용은 어떻게 dsRNA를 식물내로 도입하는가이다. 현재 식물에서는 RNA-mediated silencing을 위하여 2가지 형태의 방법이 이용되고 있다는데, 하나는 식물 세포내로 dsRNA를 운반하는 virus-based vector이다. 그러나 이 시스템은 후대에 유전되지 않는 단점을 가지고 있다. 다른 방법은 hairpin RNA (hpRNA)-mediated gene silencing 방법으로 목표 유전자와 관련이 없는 염기서열로 중간이 채워진 inverted repeat의 형태로 제작하여 쌍자엽 식물에는 35S CaMV, 단자엽 식물에는 옥수수의 ubiquitin 1 과 같은 강력한 프로모터와 함께 이용하게 된다. 중간의 spacer로서 intron이 이용될 경우에는 효율이 매우 높아 형질전환체의 거의 100%가 gene silencing을 보인다 (Kusaba 2004). 그러나, 이 방법은 식물의 재분화를 방해하거나 배의 치사를 일으키는 유전자에는 사용할 수 없다.</p> <p>이 RNAi-mediated gene silencing 방법은 벼에서 미지 유전자들의 기능을 밝히는 데에 성공적으로 이용되어 왔다. 최근까지 전사인자, 개화 관련 단백질, pathogen/membrane 관련 단백질, 다양한 protein kinase 및 세포분열 관련 단백질 등 70 여종의 유전자들이 RNAi silencing에 의하여 그 기능이 밝혀졌다 (Zheng et al. 2007). 이러한 결과는 RNAi에 의한 gene silencing에 의하여 보다 다양한 유전자들의 기능분석에 효과적으로 적용될 수 있음을 보여주고 있다.</p> <h1>화학돌연변이 유기와 Tilling에 의한 유전자 기능연구</h1> <p>화학돌연변이의 유기에는 ethyl methane sulfonic acid(EMS)가 가장 흔하게 이용되고 있다. 이 alkylating agent는 핵산의 화학적 변형을 손쉽게 일으켜 nonsense, missense and silent mutations 등을 포함하는 다양한 점돌연변이를 유발한다. 이들 돌연변이 형태 중에서 silent mutation은 표현형의 변화를 일으키지 않으므로 돌연변이원으로는 사용할 수 없다. \(Arabidopsis \)에서 EMS는 주로 C를 T로 변화시켜 C/G를 T/A로 치환하며 낮은 빈도로 G/C를 C/G로 또는 7-ethylguanine hydrolysis에 의해 G/C를 T/A로 피리미딘이 퓨린과 치환되는 염기쌍치환 돌연변이 또는 3-ethyladenine pairing errors에 의한 \( \mathrm { A } / \mathrm { T } \) 를 \( \mathrm { G } / \mathrm { C } \) 로 전이시킨다 (Krieg 1963). EMS 처리된 애기장대의 codon usage를 분석한 결과 stop codon과 missense mutation의 발생빈도는 각각 5%와 65%인 것으로 보고되었다 (McCallum et al. 2000).</p>