HCW0811을 \(70\%\) ethanol으로 상온에서 48시간 동안 2회 반복 추출한 후 paper filter를 통해 여과하고 ethyl acetate로 분획하여 분말화했다. RAW 264.7 세포는 \(10\%\)FBS, \(100\mathrm{U}/\mathrm{mL}\)penicillin, \(100\mu\mathrm{g}/\mathrm{mL}\)streptomycin을 함유한 DMEM로 배양해 LPS로 염증을 유도한 후 세포 독성을 측정했다.
<h2>HCW0811 추출물 제조</h2> <p>건조된 HCW0811 분말 \( 1 \mathrm { ~g } \) 에 \( 70 \% \) ethanol \( 500 \mathrm { ~mL } \)을 가하여 상온에서 48시간 동안 2회 반복하여 추출하였다. 회수한 1차 추출물과 2차 추출물을 혼합 하여 \( 5.0 \mu \mathrm { m } \) 의 공극 크기를 갖는 paper filter (Toyo Roshi Kaisha, Tokyo, Japan)로 여과하였다. 이후, 여과액을 ethyl acetate로 분획한 뒤 감압농축기로 분말화하여 실험에 사용하였다.</p> <h2>실험 재료 및 세포배양</h2> <p>본 실험에 사용된 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행에서 분양 받아 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS, Gibco, NY, USA)과 \( 100 \mathrm { U } / \mathrm { mL } \) penicillin, \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) streptomycin을 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, NY, USA)을 사용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건의 incubator 에서 배양 하였다. 2일을 주기로 계대 배양을 시행하여 안정화 하였으며 염증 유발을 위해 사용된 LPS는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.</p> <h2>세포 독성 측정</h2> <p>HCW0811의 세포 독성은 MTT assay를 이용한 cell viability assay를 통해 측정하였다. 24-well plate에 RAW 264.7 세포를 \( 8.0 \times 10 ^ { 4 } \) cells/well의 농도로 분주하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 24시간 동안 전 배양 한 뒤 희석한 HCW0811 \( (12.5,25 \), \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \) 와 LPS \( (1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \) 를 동시 처리하여 동일한 배양 조건하에 24시간 동안 염증을 유도하였다. 반응 종료 후 MTT 시약을 첨가하여 incubator에서 2시간 동안 반응하였으며 각 well에 형성된 formazan blue를 DMSO로 용해시킨 후 ELISA reader (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 \( 570 \mathrm { ~nm } \) 파장에서 흡광도를 측정하였다.</p>