AGS 세포를 분주하여 flow cytometry 분석을 사용하여 미토콘드리아의 막 전위 변화를 측정하고, 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 그리고 Caspase의 활성화 정도를 정량적으로 비교하기 위해, 배양 세포를 PBS로 세척하고 tryspin-EDTA 처리하여 부유시킨 후 원심분리하여 세포를 수집했다.
<h2>Mitochondrial membrane potential (MMP) 변화의 측정</h2> <p>6 well plate에 \( 1\times 10^{5}\)개/\(\mathrm{ml}\) 정도로 AGS 세포를 분주하여 24시간 동안 안정화시킨 다음 WEEH 및 TRAIL을 48시간 동안 처리하였다. 48시간 처리 후, 세포를 PBS로 씻어 내고 \( 0.05 \% \) trypsin-EDTA를 처리하여 부유시킨 다음 원심분리를 하여 세포를 모았다. 이렇게 모인 세포를 대상으로 미토콘드리아 막 전위(mitochondrial membrane potential, MMP)의 변화 측정을 위하여 lipophilic cationic probe인 5,5 V 6,6 V-tetrachloro-1,1 V,3,3 V-tetracthyl-imidacarbocyanine io-dide (JC-1, Sigma)을 이용하여 flow cytometry 분석을 실시하였다. JC-1은 ratiometric한 dual-emission fluorescent dye로서 정상세포의 미토콘드리아는 \( 590 \mathrm{~nm} \) (red) 파장에서, 미토콘드리아에 손상을 입은 세포의 경우 \( 527\mathrm{~nm} \) (green)에서 흡광도가 높게 나타난다. 이를 위하여 정상배지나 WEEH 및 TRAIL이 처리된 배지에서 배양된 AGS 세포를 PBS로 수세 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 10 ~\mu \mathrm{M} \)의 JC-1을 20분간 염색을 실시한 후 flow cytometry를 이용하여 흡광도에 따른 세포 분포도를 측정하였다.</p> <h2>SDS-polyacrylamide gel 전기영동 및 Western blot analysis</h2> <p>준비된 세포들을 PBS로 씻어 내고 \( 0.05 \% \) trypsin-EDTA를 처리하여 부유시킨 다음 원심분리하여 세포를 수집하였다. 이벟게 모아진 세포에 protease inhibitor cocktail이 포함된 적당량의 lysis buffer [\( 250 \mathrm{~mM} \) \(\mathrm{NaCl}\), \( 25 \mathrm{~mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\) \(\mathrm{pH~} 7.5\), \( 5 \mathrm{~mM} \) ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) \(\mathrm{pH~} 8.0\), \( 1 \% \) NP-40, \( 0.1 \mathrm{M} \) phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), \(1 \mathrm{M} \) 1,4-dithio-DL-threitol (DTT)]를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시킨 후, \( 14,000 \mathrm{rpm} \)으로 30분간 원심분리하여 그 상충액을 취하였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 그 사용방법에 따라 정량한 다음 동량의 Laemmli sample buffer ( \( \beta \)-melcapto-methanol \(5 \% \), Laemmli sample buffer \(95 \% \), Bio-Rad)를 섞어서 sample을 만들었다. 이렇게 만든 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. Western blot analysis를 위하여 SDS-polyacrylamide gel 전기영동으로 단백질을 분리한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 이동시킨 후, \( 10 \% \) skim milk를 함유한 PBST \( 0.1 \% \) Tween 20 in PBS) 용액을 이용하여 상온에서 1시간 이상 반응시켜 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하고, PBS-T 용액을 이용하여 5분 간격으로 최소 3회 이상 세척하였다. 세척 후 특정 단백질에 대한 항체블 membrane에 적용시켜 상온에서 1시간 이상 항원 항체 반응을 일으킨 후, PBS-T로 3회 이상 수세한 후, 특정 항체에 대한 이차 항체를 적용시켜 상온에서 1시간 이상 반응시켰다. 다시 PBS-T로 세척하고 en-hanced chemiluminescence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 양을 분석하였다. 본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA, USA) 및 Calbiochem (Cambridgc, MA, USA)에서 구입하였으며, 2차 항체로 사용된 peroxidase-la-belcd donkcy anti-rabbit immunoglobulin 및 peroxidase-la-beled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Corp.에서 구입하였다.</p> <h2>In vitro caspase activity 분석</h2> <p>Caspase의 활성화 정도를 정량적으로 비교하기 위하여 상기와 동일한 조건에서 배양된 세포들은 PBS로 씻어 내고 \( 0.05 \% \) trypsin-EDTA를 처리하여 부유시킨 다음 원심분리하여 세포를 수집하였다. 이맇게 모아진 세포에 적당량의 ly-sis buffer를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시킨 후, \( 14,000\mathrm{~rpm} \)으로 30분간 원심분리하여 그 상충액을 취하여 Bio-Rad 단백질 정량 시약과 그 사용방법에 따라 정량하였다. 이렇게 만들어진 sample \( 50 ~\mu \mathrm{l}\)를 96 well plate에 분주한 다음 \( 1\% \)의 \( 1 \mathrm{~M}\) DTT가 함유된 2x reaction buffor \( 50 ~\mu \mathrm{l}\)를 첨가하였다. 다시 \( 5 ~\mu \mathrm{l}\)의 capase colorimetric substrate [Asp-Glu-Val-Aasp (DEVD), Ile-Glu-Thr-Asp (IEID) and Leu-Glu-His-Asp (LEHD)-pNA for caspase-3, caspase-8 and cas-pase-9 activity]를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 정도 반응을 시킨 다음 ELISA reader롤 이용하여 \( 405 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>