\( 200-300 \mathrm{~g} \)의 체중을 가진 9주령 Sprague-Dawley 암컷 흰 쥐를 (주)오리엔트 바이오에서 구입하여 1주일 동안 환경에 적응시킨 후 실험에 사용되었습니다. 적응 기간 이후에는 난소절제 수술(ovariectomy)을 통해 실험군을 분류하였고, 비 난소절제 대조군에게는 가짜 수술(sham-operation)을 시행하였습니다. 혈액 채취는 \( 3. 2 \% \) 소듐 시트르산 용액과 1:9 비율로 혼합한 후 \( 1,100 \mathrm{rpm} \)에서 10분 동안 원심분리하여 상층의 혈소판 풍부 혈장(platelet rich plasma, PRP)을 얻었다. 이어서 \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분 동안 더 원심분리하여 상층 혈장을 제거하고, EDTA를 포함하는 세척용 버퍼(washing buffer)를 사용하여 혈소판을 재현탁시켰다. 재현탁된 혈소판은 \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분 동안 원심분리한 후 다시 분산용 버퍼로 현탁시켜 세척된 혈소판을 조제하였다. 세척된 혈소판은 분산용 버퍼로 희석하여 혈소판 수가 \( 5 \times \) \( 10^{8} / \mathrm{ml} \)이 되도록 조절하였고, 응집 유도제로 collagen을 첨가하여 5분 동안 반응시킨 후, Whole blood lumi-aggregometer (Chrono-log, U.S.A)를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 혈소판 응집을 측정하였다. 실험 결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었으며, 통계적 유의성은 SPSS 버전 17.0 통계 프로그램을 사용하여 상호비교하였다.
<h2>실험동물</h2> <p>체중이 \( 200-300 \mathrm{~g} \)인 9주령의 Sprangue-Dawley계 암컷 흰 쥐를 (주)오리엔트 바이오에서 분양 받아 1주일간 환경에 적응시킨 뒤 실험에 사용되었다. 적응 후 난괴법(randomized com-plete block design)에 의해 군을 나누어 난소절제 수술(ovariectomy) 을 하였고 비 난소절제 대조군에게는 sham-op-eration을 실시하였다. 수술 후 1 주일간 고형 사료를 주어 상 가 회복된 후 각 군으로 나누었다. 즉, 실험동물은 비 난소절제 대조군(SHAM), 난소절제 대조군(OVX-CON), 난소절제 후 해조공진단 투여군 \( (\mathrm{OVX}-\mathrm{GJD} 5 \mathrm{~g} / \mathrm{kg}) \) 으로 각 6마리씩, 3군으로 나누어 매일 식이를 투여하며 5주간 사육하였다. 실험기간 동안 식이 섭취량과 체중은 매일 일정한 시간에 측정하였으며 동물실험실의 사육조건으로 온도 \( 24 \pm 2^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 50 \sim 55 \% \) 를 유지시켰고, 광주기 및 암주기를 12시간으로 조절하였다. 실험기간 동안 식이와 물은 모든 군에서 제한 없이 섭취하게 하였다.</p> <h2>난소절제시술</h2> <p>실험동물을 5:1로 혼합한 zolletil과 rompun을 이용하여 마취 후 심마취기에 이르면 복부 절개하여 난소를 제거하고 절개부는 봉합하였다. 수술 후 3일간 모든 군에게 일반 식이를 공급하며 상처를 회복시켰다. 또한 대조군 설정을 위하여 비난소절제군은 복막 절개 단계까지 난소절제 수술과 같은 방법으로 시행하고, 양측의 난소를 노출하였다가 절제하지 않고 복막 속으로 다시 넣어 난소절제와 같은 스트레스를 주었으며, 다시 봉합하는 모의수술(sham operation)을 시행하여 이들을 대조군으로 사용하였다.</p> <h2>실험 식이</h2> <p>실험 식이는 기본적으로 조단백질 \( 18 \% \) 이상, 조지방 \( 6.7 \% \) 이상, 칼슘 \( 0.8 \% \) 이상, 인 \( 0.6 \% \) 이상을 포함하고 있는 실험동물 전형 고형사료(5L79 rat용 사료, Lab Diet사)를 사용하였다. 해조 추출물이 \( 5 \% \) 함유된 해조공진단 투여군은 estrogen 유사 활성이 가장 높은 다시마 \( 5 \% \)가 함유된 해조공진단을 분쇄된 사료에 첨가하여 성형, 제조한 고형사료 형태로 공급하였다.</p> <h2>혈액 및 장기 채취</h2> <p>흰쥐의 혈액은 희생 전 24시간 절식시킨 후 5:1로 혼합한 zolletil과 rompun을 이용하여 마취 하여 개복한 후 복대정맥에서 채취하였으며, 심장, 신장, 부신, 비장, 자궁, 폐, 간을 적출하여 주위의 지방과 물기를 제거하여 무게를 측정하였다.</p> <h2>혈청 중의 지질농도 분석</h2> <p>채취한 혈액은 실온에서 30분 방치 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 3,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청 중의 중성지방, 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 분석은 자동 측정용 slide (FUJI FILM, Japan)를 이용하여 Dry chemistry analyzer 3500i (FUJI, Japan)로 측정하였다.</p> <h2>혈소판 응집력 분석</h2> <p>채혈한 혈액은 \( 3.2 \% \) sodium citrate 용액과 1:9의 비율로 혼합한 뒤 \( 1,100 \mathrm{rpm} \) 에서 10분간 원심분리하여 상층의 PRP (platelet rich plasma)를 취하고, \( 3,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 더 원심분리하여 상층 혈장을 제거한 후 EDTA를 포함하는 wash-ing buffer<p>\( (138 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 2.7 \mathrm{mM} \mathrm{KCl}, 12 \mathrm{mM} \mathrm{NaHCO} 3 \),\( 0.36 \mathrm{mM} \mathrm{NaH} \mathrm{H}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 5.5 \mathrm{mM} \) glucose, 1 nM EDTA, \( \mathrm{pH} \) 6.5) \( 5 \mathrm{ml} \) 를 가한 후 혼합하여 혈소판을 재 현탁시켰다. 이 혈소판을 \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리한 후 다시 suspending buffer로 현탁시켜 washed platelet을 조제하였다. Washed platelet는 suspending buffer로 희석하여 혈소판 수가 \( 5 \times \) \( 10^{8} / \mathrm{ml} \) 이 되도록 하였고, 응집유도제로 collagen을 \( 2.5 \mathrm{\mu g} \) 가하여 5분간 반응시켜, Whole blood lumi-aggregometer (Chrono-log, U.S.A)를 사용해 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 혈소판 응집을 측정하였다. 사용된 모든 용매 및 시약은 Sigma사에서 구입하였으며, 특급시약을 사용하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>본 실험에 대한 모든 실험의 결과는 \( \operatorname{mean} \pm S \mathrm{D} \) 치로 나타내었고, 통계적 유의성은 SPSS version 17.0 통계 프로그램을 이용하여 상호비교 하였다. 에스트로겐 유사활성 측정의 사후검증은 ANOVA를 사용하여 유의수준 \( p<0.001 \) 수준으로 검증하였으며, 동물실험의 사후 검증은 Tukey HSD test를 사용하여 유의수준 \( p<0.05 \) 수준으로 검증하였다.</p>