밀리포어 96 well 멀티스크린 시스템을 이용해 150ul TB 배지에서 균일한 5-8ug의 플라스미드 DNA를 추출했다. 발아종자 염기서열분석을 통해 22,272개의 발현유전자를 분석하였고, 이 중 150bp 이하의 염기서열을 가진 클론과 불량 염기서열부분을 제거하여 최종적으로 18,101개 클론의 염기서열 정보를 확보하였다. 또한, 발아종자 EST의 염기서열 정보분석 및 기능분류를 위해 unigene을 분리하였다.
<p>대량 염기서열분석을 위하여 밀리포어 96 well 멀티스 크린 시스템을 사용하여 \( 150 \mathrm { ul } \mathrm { TB } \) 배지에서 \( 5-8 \mathrm { ug } \)의 플라스미드 DNA를 얻을 수 있었으며 무엇보다 균일한 DNA양을 얻을 수 있었다. 각각의 발아종자 발현유전자 클론의 염기서열 결정은 96well PCR plate를 이용하여 각 well당 \( 200 \mathrm { ng } \) 의 DNA, 5 pmol의 SK primer, 2 ull의 Bigdye terminater sequence reaction, 1 ul의 \( 5 \mathrm { X } \) buffer를 넣은 후 염기서 열분석 반응을 시키고 ABI3100과 ABI3730 염기서열 분석기를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 발아종자 염기서열분석은 총 22,272 (96well 232plate) 개의 발현유전자를 분석하였으며 이들 클론 중에서 \( 150 \mathrm { bp } \) 이하 길이의 염기서열정보를 가진 클론과 불량 염기서열부분의 제거를 행하여 최종적으로 18,101개 클론의 염기서열정보를 얻을 수 있었다. 발아종자 발현유전자 염기서열분석 성공률은 \( 81.2 \% \)로 나타났다. 발아종자 18,101개 클론으로부터 얻어진 전체 염기서열 길이는 \(11,403,648 \mathrm { bp } \)였으며 발아종자 발현유전자 1개 클론의 평균 길이는 \(630 \mathrm { bp } \)로 확인되었다. 앞서 발표한 미숙종자 발현유전자의 염기서열 분석 성공률 \( 76 \% \)와 1개 클론 평균 염기서열 길이 \(550 \mathrm { bp } \)(Yoon et al. 2009) 보다 높은 경향을 나타내고 있다.</p> <h2>일품벼 발아종자 unigene 선발</h2> <p>일품벼 발아종자 EST의 염기서열 정보분석 및 기능분류를 위하여 발아종자의 unigene을 분리하였다. 발아종자의 unigene 분리는 DNASTAR사의 SeqMan 프로그램을 이용하였으며 발아종자 18,101개 EST의 basecalling과 clustering을 행한 결과 2개 이상의 클론이 중복된 2,735개의 contig와 6,101개의 singleton 등 8,836개의 unigene을 얻었다. 발아종자에서 많이 발현하는 유전자들의 분포도 분석은 앞서 SeqMan으로 분석된 clustering 결과를 이용 하였다. 우선 50개 이상의 클론으로 구성된 contig를 분석한 결과 2,735개 contig 중에서 14개의 contig가 50개 이상의 클론으로 구성되어있었다. 이러한 경향은 콩 유래 68,661개의 EST 염기서열로부터 cluster 분석을 한 결과 60개 이상의 클론을 포함하는 contig는 10개 미만인 것으로 보고 한 것과 유사한 결과를 나타내고 있다 (Umezawa et al. 2008). 이와 달리 앞서 발표한 벼 미숙종자의 경우 50개 이상의 클론을 가진 contig는 32개였으며 그중 3개의 contig는 1000개 이상의 glutelin 유전자로 구성되어 있었다 (Yoon et al. 2009). 이와 같은 결과는 종자발아 시기에는 종자내부의 전분분해와 일반적인 대사 관련 유전자의 발현이 다양하게 이루어지는 것으로 생각 되어지며 상대적으로 glutelin 등 특정 단백질 합성 유전자 발현이 많이 나타나는 미숙종자와는 다른 경향을 나타내고 있었다.</p>