미역 시료로부터 알긴산 분해 균주를 선별하고 알긴산 분해능이 확인된 균주들을 배양하였다. 알긴산 분해효소 활성은 흡광도 측정과 표준 검량선으로부터의 환원당량 측정을 통해 활성 분석을 수행했고 조제한 조효소액을 이용하여 Alginase를 정제했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 분리용 시료 및 배지</h2> <p>부산 해운대 앞 바다에서 채취한 다양한 종류의 미역 시료로부터 알긴산 분해 균주를 선별하였다. 균주 분리용 다층 평판배지의 하층은 \( \mathrm{NaCl} ~2.5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v})\), \(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} ~0.1 \% \) \( (\mathrm{w} / \mathrm{v})\), \(\mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ~0.05 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v})\), \(\mathrm{KCl} ~0.05 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v})\), \(\mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl} \) \( 0.1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \), agar \( 2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \), \( \mathrm{PH} 7.0 \)으로 구성하였고, 상층은 sodium alginate \( 1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \), agar \( 2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v})\), \(\mathrm{PH} 7.0 \)으로 구성하였다. 다층 평판 배지에 균질화시킨 미역 샘플 \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 spreading 하여 콜로니를 분리하였다.</p> <h2>균주 및 배양조건</h2> <p>고체배지에서 알긴산 분해능을 확인한 균주들은 bacto-peptone \( 0.5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \), sodium alginate \( 0.5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v})\), \(\mathrm{NaCl} \) \( 2.5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 로 구성된 액체배지에서 배양하였다. 고체배지 상에서 3~4일간 배양한 후 형성된 콜로니를 액체배지에 접종하고, \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), \(300 \mathrm{rpm} \) 에서 3 일간 배양한 다음 원심 분리하여 \((12,000 \mathrm{rpm}\), \( 30 \mathrm{~min}) \) 균체외 효소와 균체내 효소 분리를 위한 시료로 사용하였다.</p> <h2>알긴산 분해효소 활성 측정</h2> <p>알긴산 분해효소 활성은 \( 0.8 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) sodium alginate를 기질로 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 1 \mathrm{hr} \) 반응시킨 다음 반응 전후의 환원당량을 Somogy-Nelson법 또는 DNS법에 의해 \(550 \mathrm{nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 표준 검량선 (표준당은 maltose)으로부터 환원당량을 결정하여 활성을 분석하였다. 알긴산 효소활성을 측정하기 위한 기질로는 점성이 다른 sodium alginate를 사용하였다. 효소 1 unit는 1 분간에 \( 1 \mu \mathrm{mol} \) 의 환원당을 생산하는 효소량으로 하였다.</p> <h2>조효소액 제조</h2> <p>균체외 조효소액은 배양액을 한외여과기를 이용하여 농축하여 조효소액을 제조하였고, 균체내 조효소액을 제조하기 위하여 냉각시킨 \( 30 \mathrm{mM} \) Tris-HCl buffer \( (\mathrm{pH} 7.0)\)로 원심분리한 균체를 세척하고 bead beater를 이용하여 약 30분간 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 균체를 냉각된 \( 30 \mathrm{mM} \) Tris-HCl buffer(\(\mathrm{pH} 7.0\))에 재현탁시킨 다음 원심분리 \( (12,000 \mathrm{rpm}\), \(30 \mathrm{~min}) \) 하여 상층액을 균체내 조효소액으로 사용하였다.</p> <h2>단백질 농도 및 분자량 측정</h2> <p>효소 정제 과정중 단백질 획분은 분광광도계로써 \(280 \mathrm{nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 검색하였고, 단백질 농도는 Bradford법을 이용하여 bovine serum albumin (sigma. Co. USA)을 표준단백질로 하여 얻은 검량 곡선으로부터 구하였다. 분자량은 SDS-PAGE (12\% polyacrylamide gel electrophoresis)에 의하여 측정하였다.</p> <h2>Alginase 정제</h2> <p>조제된 조효소액을 한외여과기로 농축하여 \( 30 \mathrm{mM} \) Tris-HCl buffer(\(\mathrm{pH} 7.0\))로 평형화된 음이온 교환수지인 DE52-Cellulose column \( (4.0 \times 30 \mathrm{~cm}) \) 에 \( \mathrm{NaCl} \) 을 이용하여 \(0\sim1.0 \mathrm{M}\)까지 농도 구배를 주면서 단백질을 용출시켰다. 용출액을 \( 10 \mathrm{ml} \)/tube로 분획하였으며, 활성분획을 회수하여 ultrafilteration cell (Amicon Co., MWCO: 12,000)을 이용하여 농축시킨 다음, gel filteration chromatography인 Sephacryl G-200 column \( (1.5 \times 1 \mathrm{~m}) \) 을 이용하여 정제하였다. 각 분리단계에서의 각각의 획분액에 포함된 총단백질 농도는 Bradford법을 이용하여 결정하였으며, 기준 물질로는 bovine serum albumin을 사용하였다.</p>