본 연구에서는 축산악취 중 암모니아를 저감하는 미생물을 분리하기 위하여 암모니아저감 미생물의 분리를 시도하며, 암모니아 가스의 농도측정은 신속한 측정이 가능한 가스검지관법을 이용하였다. 암모니아가스 저감 메커니즘을 검증하기 위해 아질산성 질소과 질산성 질소의 농도를 관측하며, 동정한 결과 유사도는 98 % 98%로서 Alcaligenes sp.로 잠정적으로 동정되었다.
<h1>암모니아 제거 균주의 탐색 및 분리방법</h1> <p>본 연구에서는 축산악취 중 암모니아를 저감하는 미생물을 분리하기 위하여 경기도 지역의 A 하수처리장, B 하수처리장의 슬러지와 경기도 지역의 축사 및 종돈장의 돈분, 우분, 우사 주변의 토양을 시료로 하여 암모니아저감 미생물의 분리를 시도하였다. 미생물을 분리를 위해 TSA(Tryptic soy agar, Difco), NA(Nutrient Agar, Difco), PDA(Potato Dextrose Agar, Difco), MRSA(Lactobacilli MRS Agar, Difco) 및 Ammonia Oxidizing Medium(AOM, \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4}\) \( 0.5 \mathrm{~g} / \) \(\mathrm{L}\), \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\) \( 13.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L}, \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\) \( 0.7 \mathrm{g} / \mathrm{L}, \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \( 0.1\mathrm{~g} / \) \( \mathrm{L}, \mathrm{CaCl}_{2} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \( 0.18 \mathrm{~g} / \mathrm{L}, \mathrm{NaHCO}_{3}\) \( 0.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L}, \mathrm{FeCl}_{3} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \( 0.014\mathrm{g} / \mathrm{L} \))과 Nitrite Oxidizing Medium(NOM, \( \mathrm{NaNO}_{2} \mathrm{O}\) \(0.5\mathrm{~g} / \mathrm{L} \), \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\) \( 13.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L}, \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\) \( 0.7 \mathrm{~g} / \mathrm{L}, \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \quad 0.1 \mathrm{~g} / \) \( \mathrm{L}, \mathrm{CaCl}_{2} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \( 0.18 \mathrm{~g} / \mathrm{L}, \mathrm{NaHCO}_{3}\) \(0.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L}, \mathrm{FeCl}_{3} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \( 0.014\mathrm{g} / \mathrm{L} \))을 사용하였다. 이 각각의 배지에 시료를 도말하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2~3일간 배양하여 형성된 단일 콜로니를 분리하였다.</p> <p>암모니아를 제거하는 미생물을 분리하기 위하여 물과 혼합하였을 때 악취를 발생시키는 혼합유박(질소전량 \( 4 \% \), 인산전량 \( 2 \% \), 가리전량 \( 1 \% \) 및 피마자박 \( 57 \% \), 채종박 \( 25 \% \), 미강박 \( 18 \% \), (주)KG 케미칼)을 이용하였다. 이 때 악취발생이 고르게 하기 위해 믹서로 갈아서 사용하였다. 이 혼합유박으로 부터 암모니아 가스를 발생시키기 위해 \( 100 \mathrm{~mL} \)의 유리 바이알에 \( 0.2 \mathrm{~g} \)의 혼합유박과 \( 10 \mathrm{~mL} \)의 수돗물을 넣고 실리스토퍼를 사용하여 공기의 공급이 원활하도록 하였다. 이 유박물은 암모니아가 발생하기까지 2~3일 정도 소요되며 시간이 경과할수록 암모니아 발생이 증가한다.</p> <p>이렇게 준비된 유박물에 채취한 슬러지 \( 1 \mathrm{~mL} \)를 넣고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 180 \mathrm{~rpm} \)으로 진탕 배양하였다. 대조군의 경우 총 부피를 맞추기 위해 슬러지 대신 \( 1 \mathrm{~mL} \)의 증류수를 첨가하였다. 일주일 후에 암모니아 가스의 농도를 측정하였으며 4일 간격으로 계대 배양하였다. 계대 배양시 대조군은 새로 준비하여 실험군과 암모니아 농도 값을 비교할 수 있도록 하였다.</p> <p>암모니아 가스의 농도측정은 신속한 측정이 가능한 가스검지관법(Kitagawa, Japan)을 이용하였다. 바이알과 스토퍼 사이의 공간에 검지관을 끼워 넣은 후 \( 50 \mathrm{~mL} \)을 채취하여 암모니아 가스 농도를 측정하였으며, 암모니아 가스 측정농도 범위는 \( 0.2 \sim 20 \mathrm{ppmv} \)와 \( 5 \sim 200 \mathrm{ppmv} \)의 105SD, 105SE 검지관을 이용하였다. 암모니아 가스농도를 측정한 결과 대조군에서 일주일동안 발생된 암모니아가스의 농도는 약 \( 48 \mathrm{ppmv} \), A 하수처리장 슬러지를 접종했던 실험군은 약 \( 57 \mathrm{ppmv}\), B 하수처리장 슬러지를 접종했던 실험군은 검지관으로 검출되지 않았다.</p> <p>이 결과를 통하여 앞서 언급한 TSA, NA, PDA, MRSA 배지에 균을 도말 하였으나, 활성이 있는 균주를 찾지 못했다. 따라서 암모니아가스 저감 메커니즘을 확인하기 위해 아질산성 질소 및 질산성 질소의 농도를 측정하였다. 혼합유박 배양액을 분석 Kit(Test 'N Tube \( { }^{\mathrm{TM}}\) NitraVer \( ^{\circledR} \) X Reagent Set, Test 'N Tube \( { }^{\mathrm{TM}} \) NitriVer \( ^{\circledR} \) 3 Nitrite Reagent Set, HACH, USA)를 이용해 아질산성질소와 질산성질소의 농도를 측정하였다. 측정결과 대조군에서 아질산성질소와 질산성질소가 각각 \( 0.9 \mathrm{~mg} / \mathrm{L}, 0.6 \mathrm{~mg} / \mathrm{L} \)로 나타났으며, B하수처리장 배양액에서는 각각 \( 176.1 \mathrm{~mg} / \mathrm{L}, 21 \mathrm{~mg} / \mathrm{L} \)로 현저하게 차이를 보였다. 두 시료의 아질산 및 질산염의 분명한 차이는 암모니아의 제거에 질산화 기작이 큰 원인이 될 수 있음을 예측할 수 있었다.</p> <p>B 하수처리장에서 채취한 슬러지에 암모니아 산화세균이 있을 것으로 예상하여 혼합유박에 전배양 한 뒤, 배양액을 AOM과 NOM에 십진희석법으로 희석하여 도말하고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 7일간 배양하여 형성된 단일 콜로니를 분리하였다. 또한 축산악취를 제거하기 위한 미생물이 실제 사용될 때는 악취의 근원이 되는 분뇨에 직접 사용되므로 그와 유사한 환경에서 배양이 되어야 악취를 저감하는데 유리하다고 생각되었다. 이 점에 착안하여 본 연구진은 Pig feces Agar를 제작하여 분리된 균이 Pig feces agar 배지에서 성장하는지 알아보았다. 돈분 \( 100 \mathrm{~g} \)을 \( 1 \mathrm{~L} \)의 증류수에 넣고 고형물이 풀리도록 잘 섞은 다음 여러 장의 거즈를 이용하여 거르고 Agar를 첨가하여 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 멸균하여 고체배지로 사용하였다. 이 배지에 분리된 균을 도말하여 상온에서 2일~5일 간 배양한 후 집락의 출현 여부를 확인할 수 있었다.</p> <p>분리된 질산화 세균은 NS-1로 명명하였으며 현미경상에서 약 \( 0.015 \mu \mathrm{m} \)의 간균이며, 그람 음성의 호기성 세균으로, 16S rDNA 분석을 (주)솔젠트에 의뢰하여 Primer 337F-518R을 이용해 동정한 결과 유사도는 \(98\%\)로서 Alcaligenes sp.로 잠정적으로 동정되었다. 이후 보다 정밀한 분석을 통해 정확한 동정을 수행할 예정이다.</p>