식물 재료로는 오이의 체세포배발생능을 갖는 "은성" 종자를 사용하였다. Agrobacterium tumefaciens strains 절에서는 freeze-thaw 방법으로 EHA101에 형질전환한 균주를 소개하며, 형질전환체 생산 절에서는 오이 형질전환체를 얻기 위한 공동 배양과 계대배양 방법을 소개한다. \(\beta\)-Glucuronidase (GUS)발현 절에서는 Agrobacterium과 배축절편을 공동배양 한 후 선발배지에서 배양 후 얻은 캘러스와 GUS발현 형질전환체로부터 수확학 종자와 캘러스 빈도를 조사해 \(\beta\)-Glucuronidase (GUS)이 발현되었는지를 판펼하는 방법을 소개한다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>식물 재료</h2><p>국내 20 개 오이 품종 중 체세포배발생능을 갖는 "은성" 종자를 \( 70 \% \) 알코올에 1 분간, \( 2 \% \) sodium hypochlorite 용액에 15 분간 표면 살균 하였다. \( 2 \% \) sucrose와 \( 0.8 \% \) agar가 첨가된 MS기본배지 (Murashige and Skoog 1962)에 페트리디쉬 당 10개의 종자를 치상하고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 암상태에서 10일 동안 발아시켰다. 배양 10일 후 발아된 오이 유식물체로부터 배축절편 \( (0.7 \mathrm{~cm}) \) 을 절단 한 Agrobacterium과 공동배양하기 위한 재료로 사용하였다.</p><h2>Agrobacterium tumefaciens strains</h2><p>Ubiquitin 프로모터, B-glucuronidase (GUS) 유전자, 선발 표지로서 nptII유전자 (pPTN290)를 freeze-thaw 방법으로 EHA101에 형질전환하여 균주로 사용하였다 (Jefferson et al. 1987). \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) streptomycin과 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) spectinomycin이 첨가된 YEP액체배지 \( 50 \mathrm{mL} \) 에 각각의 colony를 접종하여 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 로 8 시간 이상 배양한 후 대수기 증식기 \( \left(\mathrm{OD}_{650}=\right. \)0.6 - 1.0)의 균을 사용하였다.</p><h2>형질전환체 생산</h2><p>오이 형질전환체를 얻기 위하여 약 928 개 배축 절편을 pPTN290벡터로 형질전환시킨 \( 25 \mathrm{mL} \) 의 Agrobacterium 용액(EHA101)에 30분 동안 침지한 후 공동배양용 배지 (co-cultivation medium : CM, \( 1 / 10 \) MS salt, \( 20 \mathrm{mM} \) MES, \( 100 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) cysteine, \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 2,4-D, \( 39 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) acetosyringone, \(3\%\) sucrose, \( \mathrm{pH} 5.4) \)에 15개씩 치상하여 3일 동안 공동 배양하였다. 공동 배양한 배축절편을 3 - 5 회 수세한 후 캘러스 유도배지 (Callus Induction Medium: CIM, MS salt, MS vitamin, \(3\%\) sucrose, \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 2,4-D, \( 100 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) paromomycin, \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) ticarcillin, \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) cefotaxime, \( 3 \mathrm{mM}\) MES, \(\mathrm{pH} 5.6)\) 에 옮겨 6 - 8주 동안 2주 간격으로 계대배양 하였다. 유도된 캘러스 중 배발생 캘러스를 현미경 하에서 선발하여 \( 1 / 2 \mathrm{MS} \) 기본배지 ( \( 1 / 2 \mathrm{MS} \) salt, \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) \( \mathrm{GA}_{3}\), \(50 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) paromomycin, \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) ticarcillin, \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) cefotaxime, \(3 \mathrm{mM}\) MES, \(\mathrm{pH} 5.6)\)에 옮겨 유식물체를 얻었다. 모든 배지는 \( 8 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) Phyto-agar를 첨가하기 전 \( \mathrm{pH} \) 를 조정하여 \( 121^{\circ} \mathrm{C}\), 1.2 기압에서 15 분간 고압 멸균 하였으며, \( 90 \times 15 \mathrm{~mm} \) 플라스틱 페트리디쉬에 \( 25 \mathrm{~mL} \) 씩 분주하여 사용하였다. 배양은 \( 24^{\circ} \mathrm{C} \) 로 조절되는 배양실에서 종자발아와 배발생 캘러스 유도는 암 조건으로 그리고 배발생 캘러스로부터 식물체 유도는 광도 \( 46 \mu \mathrm{mol} \mathrm{m}^{-2} \mathrm{~s}^{-1} \) 의 16시간 광주기에서 배양 하였다. 선발배지에서 얻은 유식물체는 토양으로 옮겨 온실에서 순화 하였다.</p><h2>\( \beta \)-Glucuronidase (GUS)발현</h2><p>Agrobacterium과 배축절편을 공동배양 한 후 선발배지에서 6 -8주 동안 배양 후 얻은 캘러스와 GUS발현 형질전환체\( \left(\mathrm{T}_{0}\right) \) 로부터 수확한 \( \mathrm{T}_{1} \) 종자를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5-bromo-4-chloro-3-indole-glucuronidase-용액에 침지 시켰다 (Jefferson et al. 1987). 24시간 후 \( 70 \% \) 알코올 용액으로 탈색 시킨 후 GUS 양성반응을 나타낸 캘러스의 빈도를 조사하였으며, \(\mathrm{T}_{1} \) 종자에서 GUS유전자의 발현을 확인하였다. 대조구로서는 Agrobacterium과 공동배양하지 않은 종자를 사용하였다.</p>