성 유전자를 클로닝하여 얻은 \( \mathrm { pVCM } 02 \)는 \( \mathrm { SacI } \), \( \mathrm { KpnI } \) 등의 제한효소로 처리하여 DNA 단편을 확인하고, suicide vector인 \( \mathrm {pDMS197} \)에 클로닝하기 위해 \( \mathrm { SacI } \), \( \mathrm { KpnI } \)로 처리하여 최종적으로 \( \mathrm {pVCM03} \)을 생성하였다.
<p>성 유전자를 \( E c o \mathrm { RV } \) 로 처리된 \( \mathrm { pVCM } 01 \) 에 클로닝하여 얻어진 재조합 플라스미드를 \( \mathrm { pVCM } 02 \) 라 명명하였다. \( \mathrm { pVCM } 02 \) 를 \( \mathrm { ClaI } \) 으로 처리하여 \( 6.8 \mathrm { ~kb } \) 크기의 DNA조각을 확인하였고 HindIII 처리 시 \( 4.5 \mathrm { ~kb } , 1.2 \mathrm { ~kb } \) 그리고 \( 1.1 \mathrm { ~kb } \) 의 단편을 확인하였고, SacI과 KpnI을 동시에 처리하여 \( 3.8 \mathrm { ~kb } \) 와 \( 3.0 \mathrm { ~kb } \) 의 \( \mathrm { DNA } \) 단편의 존재를 확인하여 \( \mathrm { pVCM } 02 \) 가 목적으로 하는 재조합 플라스미드임을 확인하였다. pVCM02 유래의 kana-mycin 내성 유전자를 갖는 \( v p p C \) 유전자(vppC::nptII) 를 최종적으로 suicide vector인 pDMS197에 클로닝하기 위해 \( \mathrm { pVCM } 02 \) 를 \( \mathrm { SacI } \) 과 \( \mathrm { KpnI } \) 제한효소로 처리하여 얻어진 \( 3.8 \mathrm { ~kb } \) DNA를 insert로, \( \mathrm { SacI } \) 과 \( \mathrm { Kpn } \mathrm { I } \) 제한효소를 처리하여 얻어진 \( 6.0 \mathrm { ~kb } \) pDMS197 DNA를 vector로 사용하여 ligation 시킨 후, 제조된 재조합 suicide 플라스미드를 \( \mathrm { pVCM03 } \) 이라 명명하였다. 구축된 pVCM03는 Sacl과 \( \mathrm { KpnI } \) 으로 처리하여 \( 3.8 \mathrm { ~kb } \) 와 \( 6.0 \mathrm { ~kb } \) 의 DNA 단편을 얻음으로 확인하였다. \( \mathrm { pDMS197 } \) 은 vibrio에서 suicide 기능을 하는 \( \mathrm { R } 6 \mathrm { ~K } \) origin을 가지고 있으며, sucrose가 함유된 배지에서 counter-selection을 용이하게하는 \( \operatorname { SacBR } \) 유전자를 포함하고 있다[9]. pVCM03를 E. coli \( \chi 7213 \) 에 형질전환하여 allelic exchange 실험에 사용하였다.</p>