세포주기 동안의 세포의 유전자 발현량을 조사하기 위하여, RNA 분리에는 Nothern blot 분석법을 사용하고, 단백질간 상호작용을 확인에는 two-hybrid 법을 사용하여 실험을 진행하였다. 대장균 증식용 배지로 Towhybrid 용 pla-smides 의 형질전환 배지를 사용하였으며, 형질전화된 세포를 이용하여 two-hybrid system으로 상호결합을 확인, 3일 후 코로니 형성 조사를 수행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용 균주 및 plasmid DNA</h2> <p>본 실험에 사용된 출아효모 균주와 대장균은 Table 1에 표시하였다. 세포주기가 진행되는 동안 DPB11 유전자의 발현량을 조사하기 위한 Northern blot analysis에 사용된 total RNA 분리에는 W303A 균주를 사용하였고, 단백질간 in vivo 내의 상호작용을 조사하기 위한 two-hybrid법에는 Y190과 양성 대조군으로서 SNFI(pSE1111)과 SNF4(pSE 1112)를 지니고 있는 Y190/SNF 균주를 사용하였다. 또한 CB001 균주는 proteinase 생성이 결손된 균주로서 형질 전환된 멕터로부터 단백질의 검출에 사용하였다.</p> <h2>배지 및 약제</h2> <p>효모 및 대장균을 이용한 유전학적 방법은 Sambrook 등 및 Sherman 등의 방법을 사용하였다. 대장균 DH5\( \alpha \)의 증식용 배지로 LB (Luria-Bertani) broth(\(0.5\%\) Yeast extract, \( 1 \% \) Bactotrypton, \( 0.5~\% \mathrm{NaCl}\), \(50\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) Ampi-cillin)를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다. Two-hybrid용 pla-smids의 형질전환에 사용되는 선택배지는 SC-leu와 SC-trp 배지 (\(0.67 \% \) yeast nitrogen base, \( 2 \% \) glucose, \( 1 \times \) amino acids dropout leucine 혹은 tryptophan)를 사용하였다. 이러한 형질전환체를 이용한 Two-hybrid system을 통해 상호결합을 알아보기 위해 SC-his + \( 25~ \mathrm{mM} \) 3-AT (3-Amino-1,2,4-triazole; Sigma co.) 배지에 형질전환체를 streaking하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일간 배양한 후 콜로니의 형성을 조사하였다.</p> <h2>Two-hybrid analysis</h2> <p>DPB2와 DPB11 유전자의 ORF 영역은 Table 2의 primer를 이용해서 PCR을 수행하여 얻는다. 이렇게 얻어진 단편을 각각 pAS1과 pACT Ⅱ에 삽입하여 Gal4-Dpb11과 Gal4-Dpb2 융합 단백질(fusion protein)을 만든다. pAS1과 pACT Ⅱ plasmids는 각각 Gal4의 DNA binding domain과 activation domain을 포함하여 최종적으로 pAS1/DPB2, pACT I/DPB2, pAS1/DPB11과 pACT Ⅱ/DPB11이 만들어졌다. 각 plasmid는 Y190 균주에 형질전환하였고 각 형질전환체는 선택배지 SC-trp, SC-leu, SC-trp-leu에서 얻어졌다. 이렇게 얻어진 형질전환체를 각 선택배지에서 다시 patch하여 자라게 한 후, filter paper(Whatman no. 50)에 replica한다. 이 filter paper를 액체질소로 냉동시킨 후, 색깔을 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-\( \beta \)-D-galactopyrano-side)을 포함한 Z buffer(\( 10~ \mathrm{mM~} \mathrm{KCl}\), \(1~ \mathrm{mM~} \mathrm{MgSO}_{4}\), \( \mathrm{Na-} \mathrm{PO}_{4}\), \(\mathrm{pH} ~7.0\) )를 사용하여 조사하였다. 또한 Permea-bilized cell assay를 통한 \( \beta \)-galactosidase의 활성단위를 조사하기 위해서는 \( \mathrm{OD}_{420} / \mathrm{OD}_{600} \times \) volume assayed(\(m \ell) \)\( \times \) time(min) 식을 이용하였다.</p> <h2>Western blot analysis</h2> <p>각 plasmid를 사용하여 형질전환된 CB001 균주를 배양한 후, 집균하여 lysis buffer(\(10\% \) glycerol, \( 50~ \mathrm{mM} \) Tris[\(\mathrm{pH}\), \( 1~ \mathrm{mM} \) EDTA, \( 0.15~ \mathrm{M~} \mathrm{NaCl}\), \(0.2 \% \) Nonidet P-40, \( 1~ \mathrm{mM} \) phenylmethylsulfonyl fluoride, complete protein inihibitor [Boehringer Mannheim]로 현탁한 후 glass bead로 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질을 polyacrylamide gel에 lane 당 \( 10~ \mu \mathrm{g} \)씩 전기영동하여 분리한 후, Immo-bilon-P 막에 transfer를 수행한 후 HA(hemagglutinin) mo-noclonal antibody에 의해 검출하였다.</p>