CMV/hTMP21 벡터가 세포 내에서 TMP21 단백질을 합성하기 위해 B35 세포에 주입되었고, 이는 western blot을 통해 확인되었다. TMP21은 γ-secretase 활성을 조절하는 중요 단백질로, 이를 과발현시키면 γ-secretase의 발현을 억제하고, 이는 APP C-terminal의 생성을 증가시킨다. γ-secretase는 TMP21에 의해 조절되며, 이는 NGF receptor p75 NTR, APP, Notch 등의 다양한 세포 내 단백질을 절단한다.
<h2>통계분석</h2> <p>CMV/hTMP21 transfection 세포와 vehicle transfection 세포 간의 실험 결과에 대한 유의성은 One way ANOVA (SPSS for Windows, Release 10.10, Standard Version, USA)를 이용 하여 분석하였고, p-value<0.05를 유의성이 있는 값으로 인정 하였으며, 실험결과는 means \( \pm \mathrm { SD } \) 로 제시하였다.</p> <h1>결 과</h1> <h2>TMP21 유전자의 발현</h2> <p>\( \mathrm { TMP } 21 \) 의 기능을 연구하기 전에 제조된 CMV/hTMP21 벡터가 세포 내에서 성공적으로 발현되는지를 확인하기 위하여 \( \mathrm { B } 35 \) 세포에 재조합 벡터를 transfection 한 후 단백질을 west-ern blot 하였다. 그 결과, CMV/hTMP21 벡터를 transfection 한 세포는 vehicle을 transfection한 세포보다 TMP21 단백질이 약 2 배 정도 증가하였다(Fig. 1). 이러한 결과로 TMP21을 발현하기 위해 제조된 \( \mathrm { CMV } / \mathrm { hTMP } 21 \) 벡터가 \( \mathrm { B } 35 \) 세포에서 성공적으로 TMP21 단백질을 합성함을 확인하였다.</p> <h2>TMP21의 과발현이 \( \gamma \)-secretase 복합체 구성단백질과 APP에 미치는 영향</h2> <p>TMP21의 \( \gamma \)-secretase 활성을 조절하는 새로운 중요 단백질로 알려져있다. 따라서, 본 실험에서 제조된 CMV/ hTMP21 벡터로부터 합성된 TMP21의 과발현이 APP와 \( \gamma \) -secretase 구성단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해 \( \mathrm { CMV } / \mathrm { hTMP } 21 \) 넥터를 transfection한 세포에서 4 가지 구성단백질(PS-2, APH-1, Pen-2, NCT)의 발현을 특이적 항체를 이용하여 관찰하였다. 먼저, \( \gamma \)-secretase의 기질인 APP의 C-ter-minal은 vehicle를 transfection한 세포보다 CMV/ hTMP21 transfection 세포에서 발현양이 감소하였다. 그리고, 4 종류의 \( \gamma \)-secretase 구성 단백질의 발현도 vehicle transfectants보다 \( \mathrm { CMV } / \mathrm { hTMP } 21 \) transfectants에서 유의적으로 감소하였으며, 특히 PS2-NTF의 발현이 가강 많은 감소를 나타내었다. 이러한 결과는 CMV/hTMP21 벡터의 transfection에 의해 유도된 과발현이 \( \gamma \)-secretase 구성단백질의 발현을 억제하고, 이러한 억제가 APP C-terminal의 생성을 증가시킴을 제시하고 있다.</p> <h2>TMP21의 과발현이 \( \mathrm { NGF } \) receptor \( \mathrm { p } 75 ^ {\text { NTR } } \) signaling pathway에 미치는 영향</h2> <p>TMP21에 의해서 조절되는 \( \gamma \)-secretase는 NGF receptor p75 \( 5 ^ {\mathrm { NTR } } \) 을 비롯하여 APP, Notch 등 다양한 세포 내 단백질을 절단한다. 따라서 \( \gamma \)-secretase 활성을 억제하는 TMP21의 과발현이 \(mathrm { p } ^ {\mathrm { NTRR } } \) 과 downstream 신호전달에 미치는 영향을 평가하기 위하여 CMV/hTMP21 벡터를 transfection한 후 \( \mathrm { p } ^ {\text { NTRR } } \) 과 \( \mathrm { RhoA } \) 의 발현양 변화를 관찰하였다. 먼저, \( \mathrm { CMV } / \mathrm { hTMP } 21 \) transfectants 중에서 하나의 그릅에만 NGF를 처리 한 후 세포 배양액 내에 \( \mathrm { NGF } \) 의 농도를 ELISA로 측정하 였으며, 그 결과 NGF 농도는 치리그릅에서만 유의적으로 증가하였다. 또한 \( \mathrm { p } 75 ^ {\mathrm { NTR } } \) 의 발현양은 CMV/hTMP21 낵터를 transfection한 세포가 vehicle을 transfection한 세포보다 유의적으로 증가하였다. 그러나 NGF를 처리한 그롭에서는 \( \mathrm { NGF } \) 를 처리하지 않은 그룹에 비하여 \( \mathrm { p } 7 ^ {\mathrm { NIR } } \) 의 발현양이 감소 하였다. \( \mathrm { p } 75 ^ {\mathrm { NTR } } \) 의 downstream에 존제하는 RhoA 단백질도 \( \mathrm { p } ^ {\mathrm { NT } \mathrm { NR } } \) 과 유사한 발현의 변화를 나타내었다. 즉, \( \mathrm { NGF } \) 를 처리 하지 않은 CMV/hTMP21벡터를 transfection한 세포에서 RhoA의 발현은 vehicle 그룹에 비하여 증가하였으나 NGF를 처리하면 발현양은 감소하였다(. 이러한 결과는 \( \mathrm { TMP21 } \) 의 과발현이 \( \mathrm { p } ^ {\mathrm { NTRR } } \) 와 RhoA의 발현증가를 유도하지만 NGF 처리에 의해 발현은 다시 감소됨을 나타내고 있다.</p>