E18 대뇌피질을 \(\mathrm{Ca}^{2+}\) and\(\mathrm{Mg}^{2+}\)이 포함되지 않고, \(1\mathrm{mM}\) sodium pyruvate과 10 \(\mathrm{mM}\) HEPES(\(\mathrm{pH}\)7.4)가 포함된 Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)(Gibco BRL, Grand Island, NY)에서 해부한 뒤, 잘게 자른 다음 개별 세포를 fire-polished Pasteur pipette으로 수 차례 통과시켜 분산하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD; 10 \( \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) toluene)은 Supelco (Belefonte, USA)로부터 구입하여 di-methyl sulfoxid(DMSO)에 필요한 농도로 희석하여 사용하였다. NF200 (mouse monoclonal) 항체는 Sigma 제품을 이용하였으며, CNPase 항체(rabbit polyclonal)는 본 연구실에서 제조하였으며 CNP1과 2를 모두 인식한다(논문준비 중).</p> <h2>대뇌세포의 배양</h2> <p>흰쥐(Sprague-Dawley) 태아령 18일(Embryonic day 18,E18) 대뇌세포의 배양은 Brewer의 방법을 수정하여 사용하였다. E18 대뇌피질을 \( \mathrm { Ca } ^ { 2 + } \) and \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \) 이 포함되지 않고 \( 1 \mathrm { mM } \) sodium pyruvate과 10 \( \mathrm { mM } \) HEPES( \( \mathrm { pH } \) 7.4)가 포함된 Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)(Gibco BRL, Grand Island, NY)에서 해부하고 잘게 자른 다음 개별 세포를 fire-polished Pasteur pipette으로 수 차례 통과시켜 분산하였다. 그 후 \( \mathrm { Ca } ^ { 2 + } \) and \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \) 이 포함된 2 volume의HBSS를 넣어divalent cation을 회복시키고, 분산되지 않은 조직을 3분 간 방치시켜 가라앉힌 후 상동액을 15 \( \mathrm { ml } \mathrm { Fal- } \) con tube에 옮겼다. 세포를 200 \( \mathrm { ~g } \) 에서 1분간 원심분리하여 침전시키고 재현탁한 후 poly-D-lysine 처리된 24-well plate에서 1,000 cells \( / \mathrm { mm } ^ { 2 } \) 의 밀도로 배양하였다. 사용한 배지는 0.5 \( \mathrm { mM } \) glutamine과 25 \( \mathrm { mM } \) glutamate를 첨가한 Neur-obasal/B27 (Gibco BRL)이며 TCDD \( (0 \sim 50 \mathrm { nM } ) \) 는 plating 때부터 첨가하였다. 세포를 humidified \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator (95 \% \( \mathrm { air } / 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } , 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) )에서 배양하고 2~3일마다 glutamte가 없는 Neurobasal/B27 배지로 1/3 씩 교체하였다. 세포생존률은 MTT colorimetric assay 방법(16-Mosmann, 1983)을 이용하였다.</p>