2015년 부산 백운포에서 채취한 미야베 모자반을 미야베 모자반을 수세하고 자연건조하여 에탄올 추출물을 추출하였다. 한국세포주은행에서 분양받은 RAW 264.7 세포를 배양하였고, 8주령 ICR 마우스를 사용하여 귀부종 실험을 수행하였다. 변형된 MTT assay 방법을 이용하여 시료의 세포독성을 평가하고, 세포 증식능을 계산하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>에탄올 추출물 제조</h2> <p>부산 백운포에서 2015년도에 채취한 미야베 모자반은 담수로 수 회 깨끗하게 수세한 후 자연건조하였다. 그 후 동결건조하여 분말화 하였으며 진공 포장상태로 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 저장하며 실험에 사용하였다. 10 배 ( \( \mathrm { w } / \mathrm { v } \)) 양의 \( 95 \% \) ethanol을 분말에 가하여 교반기(H-0820, Dongwon Science Co., Korea)를 이용해 24 시간 추출하였다. 원심분리기(UNION 32R, Hanil Co., Korea)로 \( 1,977 \times g \) 에서 10 분간 원심분리한 후, 상층액을 분리하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 감압농축기(RE200, Yamoto Co., Japan)로 농축하였다. 남은 잔사는 동일한 방법을 이용해 2 회 반복하여 추출하여 에탄올 추출물을 얻었다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>한국세포주은행(KCLB 40071 , Korea)에서 murine의 대식 세포주 cell line인 RAW 264.7 세포를 분양받아 사용하였으며, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (GIBCO, USA)에 \( 10 \% \) inactivated fetal bovine serum (FBS)와 \( 1 \% \) penicillin-streptomycin을 첨가한 배지를 사용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) 조건에서 배양하였다.</p> <h2>실험동물</h2> <p>귀부종 실험을 위해 생후 8 주령의 수컷, ICR 마우스를 오리엔트바이오(Korea)에서 구입하여 사용하였으며, 마우스는 온도 \( 20 \pm 2 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 습도 \( 50 \pm 10 \% \), 12 시간 명암주기가 유지되는 동물 사육실에서 1 주일간 예비사육 하여 환경조건에 적응시켰다. 본 동물 실험은 부경대학교 동물실험윤리위원회로부터 동물실험 승인을 받아 수행하였다.</p> <h2>세포독성 측정</h2> <p>Park 등의 MTT assay 방법을 약간 변형하여 시료의 세포독성을 평가하였다. RAW 264.7 세포를 \( 1 \times 10 ^ { 6 } \mathrm { cells } / \mathrm { ml } \)의 농도로 96-well plate에 분주해 20 시간 전 배양한 후 미야베 모자반 에탄올 추출물(SMYEE)을 농도별로 \( (0.1,1,10,50,100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) ) 첨가하여 22 시간 본 배양하였다. \( 5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) MTT (thiazol blue tetrazolium bromide, Sigma-Aldrich Chemical Co.) 용액을 첨가하고 2 시간 재 배양하였다. 배양 후 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 879 \times g \) 에서 10 분간 원심분리하여 상층액을 걷어내고 dimethyl sulfoxide \( 100 \mu \mathrm { l } \) 분주하여 생성된 formazan을 녹여내 microplate reader (Model 550, Bio-Rad, USA)를 이용하여 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 세포 증식능은 다음 식에 의해 계산하였다.</p>