본 실험의 목적은 SK-Hep1 간암세포에서 유도성 소포체(ER) 스트레스가 유전자 발현에 미치는 영향을 연구하는 것이었다. 총 RNA는 ER 스트레스 유발 물질인 탑시가긴으로 처리된 세포에서 추출하였으며, 유전자 발현은 Affymetrix의 Human U133-Plus 2.0 칩을 이용하여 분석하였다. 그 결과 ER 스트레스 유도는 리소좀, 당결합, ER 루멘 관련 기능의 증가를 이끌었고, mRNA 처리, 유사분열, DNA 복제, DNA 복구, 세포주기, 전자전달계, DNA 손상에 대한 반응, 헬리케이스 활성, 작은 핵형 리보핵단백질 복합체, DNA 의존성 ATP 활성, RNA tr가 증가하는 것으로 나타났다. RNA transcription 관련 기능은 감소했다. functional cluster의 전사조절인자를 분석한 결과, ATF6, XBP1, CHOP가 ER 스트레스에 대응하여 상향 조절된 것으로 나타났다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포배양</h2> <p>실험에 사용한 세포주는 간암세포인 SK-Hep1으로 ATCC로부터 분양받았으며, \(15 \% \) fetal bovine serum (FBS), \( 2 \mathrm { ~mM } \) glutamine, \( 100 \mathrm { ~IU } / \mathrm { ml } \) penicillin, \( 100 ~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) streptomycin등 이 포함된 DMEM 성장배지를 사용하여 \( 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } , 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 조건에서 배양하였다. ER stress 유도를 위해 SK-Hep1에 thapsi-gargin을 \( 1 ~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도로 4, 8, 12, 24, 48 시간 처리하였다.</p> <h2>RNA 분리 및 Affymetrix GeneChip</h2> <p>Thapsigargin을 시간별로 처리한 cell들과 처리하지 않은 cell들로부터 total RNA를 TRizol reagent (GibcoBRL, Invitrogen Corporation, USA)으로 분리하였으며, 이를 이용하여 double stranded cDNA 합성하였다. Biotin-labelling은 Affymetrix Labelling Assay kit (Affymetrix Inc, USA)을 이용하여 cDNA로부터 cRNA을 합성하면서 labelling하였으며, factionation된 biotin-labelled cRNA는 Human U133-Plus 2.0 (Affymetrix Inc) chip과 18 시간 동안 hybridization을 행하였다. Hybridization image는 GeneChip operating Software (Affymetrix Inc)으로 scan하였으며, Affymetrix Inc에서 제공하는 Biconductor package로 expression level을 정량하였다.</p> <h2>Functional gene sets 작성</h2> <p>Normalization값을 gene ontology (GO) 데이터베이스를 이용하여 유전자를 기능적으로 분류하였고, 통계프로그램인 Hypergeometric distribution (GSEA)를 이용하여 유의한 유전자군의 기능을 밝혔다. 유전자들을 기능별로 분류하기 위해 public gene database인 GO, KEGG, GenMAPP들을 바탕으로 유전자들을 grouping하였다.</p> <h2>Functional gene sets의 expression coherence을 이용한 functional clustering</h2> <p>각 functional gene set에 대해 GSECA을 이용하여 각 유전자들의 상관성을 결정하였다. 모든 가능한 유전자쌍들에 대해 Pearson correlation coefficient (PCC)을 계산하여 그 평균값을 각 functional gene set에 대해 expression coherence로 사용하였다. 매우 높은 expression coherence를 가진 func-tional gene set을 위해 gene set에 속해있는 평균 expression값을 계산하여 비슷한 expression pattern을 나타내는 functional gene set을 hierachical clustering으로 나타내었다.</p> <h2>Functional cluster들의 전사조절인자 확인</h2> <p>Regulatory motif gene set을 이용하여 각각의 functional cluster의 putative transcriptional regulator을 GSEA 방법을 변형하여 분석하였다. 전반적인 방법은 GSEA방법과 유사하나, GSECA에서는 gene ordering parameter로서 single to noise ratioo (SNR) 보다는 PCC를 사용하였다.</p> <h1>결과</h1> <h2>ER stress을 유도한 SK-Hep1에서 gene expression microarray</h2> <p>SK-Hep1에 ER stress를 유도하기 위해 ER stress 유도물질인 thapsigargin을 시간별 0, 4, 8, 12, 24, 48 시간)로 처리하였으며, ER stress marker protein인 peIF를 측정함으로써 ER stress 가 유도되었음을 확인하였다(data not shown). Expression mi-croarray은 thapsigargin을 처리한 각각의 세포로부터 total RNA을 분리한 후 Affymetrix의 Human U133-Plus 2.0 chip을 사용하여 유전자들의 발현을 분석하였다.</p> <h2>ER stress 에 의한 유전자의 기능적 변화</h2> <p>ER stress에 의한 유전자들의 기능변화를 GSECA의 방법으로 분석하였다. 매우 유의적으로 expression coherence을 나타내는 gene sets을 functional annotation으로 우선적으로 선별한 후, 이러한 functional gene sets을 다시 발현이 비슷한 것끼리 묶고 일반적인 k-means clustering algorithm을 이용하여 약 12종류의 clusters을 분류하였다. 이들 중 발현이 ER stress 유도에 따라 증가하는 cluster들과 감소하는 clus-ter들에 대해 유전자들의 기능들을 분석하였다. Table 1 에서 보는 바와 같이 ER stress 유도에 따라 lysosome, sugar binding, ER lumen에 관련된 기능이 증가하는 반면, mRNA processing, mitosis, DNA replication, DNA repair, cell cycle, electron transport chain, response to DNA damage, helicase activity, small nucleolar ribonucleoprotein complex, DNA-dependent ATPase activity, RNA transcription 과 관련된 기능은 감소하였다.</p> <h2>ER stress에 관련된 전사조절인자</h2> <p>각각의 functional clusters에 속해있는 유전자들의 발현을 조절하는 조절인자를 확인하기 위해, 각 유전자들의 promoter 에 존재하는 putative transcription factor motif을 이용하여 GSECA의 방법[2]으로 분석하였다. Cluster 3, 5, 7 과 cluster 5, 8, 7, 9의 유전자들의 전사조절인자를 분석한 결과, ER stress 유도에 따라 발현이 증가하는 cluster들(Cluster 3, 5, 7)에 대해서는 FOXO4, AP-1, FOXO3, HNF4, IRF-1, GATA 등의 전사인자들이 공통적으로 존재하였으며, ER stress유도에 따라 발현이 감소하는 유전자들의 cluster들(Cluster 3, 5, 7)에서는 E2F, Nrf-1, Elk-1, YY1, CREB, MTF-1, STAT-1, ATF 등의 전사조절인자들이 공통적으로 존재하였다.</p>