HPLC 시스템은 Waters 제품군으로 구성되어 있고, Chromatographic data의 분석과 수집은 Millenium \( { } ^ { 32 } \)system을 사용하였다. Varian (Pursuit XRs 5uC-18 \( 250 \times 4.6 \mathrm { ~mm } \)) 칼럼과 형광 detector를 이용하였다. 참치 부산물을 활용하여 histamine 생성균주를 분리하는 실험을 수행하였고, 분리된 균주는 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 48 \) 시간 동안 배양하였다. 최종 분리 균주는 glycerol 첨가 후 냉동 보관하였다.
<p>HPLC는 system600E system controller (Waters, Milford),Waters 616 pump, Waters 717 plus autosampler로 구성되어 있으며 Chromatographic data의 분석과 수집은 Millenium \( { } ^ { 32 } \)system을 이용하였다. Column은 Varian (Pursuit XRs 5uC-18 \( 250 \times 4.6 \mathrm { ~mm } \) )을 이용하였다. 형광 detector의 excitation파장은 \( 330 \mathrm { ~nm } \) 및 emission 파장은 \( 418 \mathrm { ~nm } \) 이었다.</p> <h3>Histamine 생성 미생물 분리</h3> <p>어분 내 주요 항영양 인자로 작용하는 Histamine을 생성하는 주요 균주를 분리하기 위하여 참치 부산물 \( 1 \mathrm { ~g } \) 을 potas-sium phosphate buffer ( \( 0.05 \mathrm { M } , \mathrm { pH } \) 7.0) \( 9 \mathrm { ml } \) 에 희석한 후Histamine 선택배지로 사용되고 있는 Niven's media 에도말하였다. 도말 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 48 \) 시간 배양한 후 그 중 파란색 또는 보라색 콜로니만 분리하여, 분리된 미생물의 순수배양을 위해 각각 \( 1 \% \mathrm { ~L } \) - histidine (Sigma)이 첨가된 TrypticaseSoy broth (TSB)와 Trypticase Soy agar (Difco, USA)에 접종, 도말하였다. 최종 histamine 생성균주를 분리하기 위해 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 48 \) 시간 배양한 후 분석 전까지 glycerol를 첨가한 후 분리균주를 냉동보관하였다.</p> <h3>히스타민 생성능 확인</h3> <p>히스티딘이 첨가된 배지에서 분리한 미생물은 \( 10 \mathrm { ml } \)methyl alcohol에 혼합 후 원심분리하여 상층액만 채취하였다. 상층액은 methanol을 제거한 후 \( 110 ^ {\circ } \mathrm { C } \) dry oven에서 60분간 건조된 silical gel TLC (thin layer chromatography)plate에 점적하였다. 히스타민 생성을 확인하기 위하여 아세톤 95 \%와 암모니아 5 \%로 채워진 TLC chamber에서 발현시킨 후 \( 3 \% \) ninhydrin 시약을 분무하여 발색정도를 확인하였다.</p> <h3>16S rRNA gene 염기서열 분석에 의한 동정</h3> <p>Histamine 생성균주의 genomic DNA 추출은 \( 1 \% \) L- histi-dine이 첨가 된 TSB (trypticase soy broth)에서 \( 1 \mathrm { ml } \) 를 취한뒤 \( 15,000 \mathrm { rpm } \) 에서 5 분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 다시 5 분간 원심분리하고 펠렛만 남긴 후 \( 500 \mu 15 \% \)Chelex (Biorad)를 처리하여 DNA를 추출하였다. PCR(Polymerase chain reaction)반웅은 DNA thermal cycler(Biorad, USA)를 사용하였다. 증폭에 사용된 universal Primer는 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와1492R (5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 사용하여 수행하였다. \( \mathrm { PCR } \) 조건은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분간 초기변성을 실시한 다음 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 45 초간 변성, \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 45 초간 부착, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 분간 신장 반응 과정을 32 회 반복하여 증폭한 다음 마지막으로 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분간 신장하였다. PCR 생성물 cloning하기 위하여 Promega (USA)의 \( \mathrm { pGEM } ^ { (1) } \) - T Vector System을 이용하였다. 16S rRNA 유전자의 염기 서열 분석은 \( \mathrm { ABI } 310 \) Automatic Sequencer (Perkin elemer co., USA)를 이용하여 실시하였다. \( 16 \mathrm { ~S } \) rRNA 유전자의 염기서열간의 유사도가 높은 유전자를 찾기 위하여 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) search program을 이용하여 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의Genbank에서 염기서열을 비교하였다. \( 16 S \) rRNA 유전자 염기서열과 database에 얻어진 염기서열은 CLUSTAL W pro-gram으로 정렬된 계통수 제작에 이용하였다. PHYLIP software (version 3.6)의 neighbor-joining 방법의 Kimura2-parameter 모델을 사용하여 계통수를 작성하였다. neighbor-joining data의 bootstrap 분석 시 1,000 회의 resam- pling을 적용하여 tree topology의 평가 기준으로 사용하고 이를 토대로 계통수를 작성하였다.</p>