본 절에서는 발효 TMR 제조 방법 및 In situ 시험방법을 소개한다. 발효 TMR은 완전혼합사료인 TMR을 기초로 하여 각각 혐기성 곰팡이와 박테리아의 복합물로 제조한synbiotics, 혐기성 곰팡이와 효모의 복합물로 제조한 synbiotics, 혐기성 박테리아와 효모의 복합물로 제조한 synbiotics을 첨가한 후 혐기 발효장치를 통해 발효하여 제작하였다. 이후 밀봉작업을 거쳤으며, 혐기상태에서 이루어졌다. 다음으로 In situ 시험방법으로 실험체는 젖소 \(2\)를 사용했으며, \(1\)일 \(2\)회로 위 사료와 볏집을 혼합한 먹이를 주며 진행하였다. 한편, 사료는 발효시간별로 nylon bag에 넣어 발효했으며, 이후 세척과 건조를 진행했고, 이때 얻어진 소실률을 바탕으로 건물 분해율이 계산되었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>발효 TMR의 제조</h2> <p>처리구는 박편처리 옥수수, 주정박, 대두피, 당밀, 볏짚 및 perennial ryegrass를 주요 원료로 한 비육후기용 완전혼합사료(TMR)를 기초사료로 하여 synbiotics를 첨가하지 않은 대조구(Control), 혐기성 곰팡이와 박테리아의 복합물로 제조한 synbiotics 첨가구(T1), 혐기성 곰팡이와 효모의 복합물로 제조한 synbiotics 첨가구(T2), 그리고 혐기성 박테리아와 효모의 복합물로 제조한 synbiotics 첨가구(T3)로 나누었다. Probiotics로서 혐기성 박테리아는 LAB (Lactobacillus planta-rum), 효모는 Saccharomyces cerevisiae, 곰팡이는 Aspergillus or-yzae를 이용하였고, prebiotics로는 mannan oligosaccharide, lactose, sodium acetate 및 ammonium citrate를 첨가하여 synbiotics를 각각 제조하였다.</p> <p>시료 채취는 bag의 개봉 표면 \( 5 \mathrm{cm} \)까지 부분을 제외한 중심부위에서 약 \( 200 \mathrm{g} \)씩 3반복으로 채취하여 대표시료로 하였다.</p> <p>발효 TMR (F-TMR)의 제조는 vinyl bag (가로 \( 43 \mathrm{cm} \times \) 세로 \( 58 \mathrm{cm} \) )에 기초 TMR을 각각 \( 3 \mathrm{kg} \)씩 넣은 후, 공시된 균주액 (control은 증류수) \( 100 \mathrm{ml} \)을 고르게 접종하고 잘 섞은 다음, 진공포장기(AZ-450, (주)인트라즈, Korea)를 이용하여 완전 밀봉 (heat sealing)하여 상온에서 1, 3, 5, 7, 14 및 21일 동안 혐기 발효시켰다.</p> <p>혐기 발효장치는 Holdman 등, Ogimoto와 Imai 및 Mitsuoka의 방법으로 제작하여 사용되었고, 밀봉작업 직전까지의 모든 처리는 혐기상태에서 이루어졌으며, 총 72개 (4처리 \( \times 6 \) 발효기간 \( \times 3 \) 반복)의 F-TMR bag을 제조하였다.</p> <h2>In situ 시험방법</h2> <p>공시축은 반추위 누관이 장착된 Holstein (평균체중 \( 550 \mathrm{kg} \)) 젖소 2두를 사용하였으며, 사양관리는 농후사료와 볏짚의 급여비율을 \( 40:60 \)으로 하여 체중의 \( 3 \% \) 수준으로 1일 2회(07:00, 19:00) 분할 급여하였다. Mineral-vitamin block은 자유 섭취토록 하였고, 물은 자유 음수토록 하였다. 공시축에게 급여된 사료와 nylon bag에 투입된 F-TMR의 조성과 화학성분은 각각 Table 1 및 Table 2에서 보는 바와 같다.</p> <p>시험설계는 synbiotic처리를 하여 21일 동안 발효시킨 4개의 F-TMR을 반추위내에서 현수시간별(1, 3, 6, 9, 18, 24, 48 및 72시간)로 각각 3반복하여 총 96개의 nylon bag을 제조하였다.</p> <p>Nylon bag에 투여되는 F-TMR은 drying oven에서 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)로 48일간 건조시킨 다음, \( 1 \mathrm{mm} \) screen이 부착된 실험용 분쇄기를 이용하여 분쇄하였다. 그리고 약 \( 3\mathrm{g} \)의 F-TMR을 칭량하여 nylon bag (Swiss screen P/L Co. Ltd, NYTAL 25T, pore size; \( 45 \mu \mathrm{m} \) )에 넣고, 윗부분에서 \( 3 \mathrm{cm} \) 지점을 묶은 후에 반추 위내에서 같은 부위에 위치하도록 Linnen망 \( (15 \times 25 \mathrm{cm}) \) 에 넣었다. 시료의 반추위내 적응시간을 고려하여 온수에서 10분가량 침지시킨 다음, 누관을 열고 반추위의 ventral sac 부위에 nylon bag이 위치하도록 하였다. 설정된 발효시간별로 회수한 nylon bag은 즉시, 얼음물에 침지하여 미생물의 활동을 억제시킨 후, 맑은 물이 나올 때까지 세척하고 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) dry oven에서 48시간 동안 건조시킨 후, 무게를 측정하였다.</p> <p>건물 소실율은 상등액을 회수한 후, 시료 잔량을 진공 흡입장치로 수거한 다음, \( 75^{\circ} \mathrm{C} \) 로 유지되는 송풍건조기에서 18시간 건조시킨 후, 잔량을 측정하였다. 영양소 소실율은 투입 시료량과 잔량의 백분율로 구하였다.</p> <p>건물 분해율은 nylon bag 실험을 통하여 얻어진 발효시간대별 건물 소실률을 바탕으로 다음의 공식으로 측정하였다.<p>\( P=a+b\left(1-e^{-c t}\right) \)</p> <ul> <li>P: " \( t \) "시간 경과 시의 반추위내 건물 분해율 \( (\%) \)</li> <li>a:" 0 "시간대의 건물 분해율 \( (\%) \), 즉 빠르게 분해되는 건물부분</li> <li>b: 주어진 시간에 분해될 수 있는 잠재적 건물 분해율 (\%)</li> <li>c: " \( b \) "의 시간당 분해상수</li> <li>t: 반추위내 발효시간</li> <li>e: 지수방정식</li></ul> <p>건물의 유효분해도(effective ruminal degradability, ED 혹은 ERD는 사료의 반추위내 통과속도를 시간당 \( 4 \%(\mathrm{r}=0.04) \)으로 가정하여 다음과 같은 공식으로 계산하였다.</p> <p>\( ERD=a+b \times\{c /(c+r)\} \) ERD : 건물의 유효분해도 \( a, b, c \) : 건물 분해율 상수 r: 사료의 반추위내 통과속도 (passage rate)로서 시간당 \( 4 \% \)로 가정</p>