본 실험에서는 254개 임상 검체에서 42개의 P. aeruginosa 균주를 분리해 항균제 감수성 검사를 실행했다. \( \beta \)-lactam계 항균제인 Carbapenem계의 meropenem, imipenem이 가장 높은 내성률을 보였고, Cephalosporins계인 cefta-zidime도 높은 결과를 나타냈으며, gentamicin, tobramycin, amikacin 등 비\( \beta \)-lactam계 항균제도 내성률이 높았다. 또한, Hodge 변법에서 28주가 양성반응을 보였으며, EDTA-disk synergy test 결과로 23주가 Imipenem, meropenem에서 양성반응을 나타냈다.
<h1>결 과</h1> <h2>항균제 감수성 검사</h2> <p>2008년 1월부터 9월까지 부산의 고신대학교 복음병원의 254개 임상 검체에서 42개의 P. aeruginosa 균주를 분리하였다. 이들 균주에 대한 \( \beta \)-lactam계 항균제인 Carbapenem계의 내성률(R)은 meropenem이 \( 95.2 \% \) (\(40 / 42 \)주), imipenem은 \(88.1\% \) (\(37/ 42 \))로 높게 나타났으며, Cephalosporins계인 cefta-zidime도 \( 71.4 \% \) (\(30 / 42 \)주)의 내성률을 나타냈다. 비\( \beta \)-lactam계 항균제로는 gentamicin \( 66.7 \% \) (\(28 / 42 \)주), tobramycin \(61.9\% \) (\(26 / 42 \)주), amikacin \( 59.5 \% \) (\(25 / 42 \)주)으로 나타났으며, colistin에 대한 내성은 없었다.</p> <h2>Carbapenemase 및 MBL 생성균주 선별</h2> <p>P. aeruginosa 42주중에서 28주가 Carbapenemase 생성균주를 선별하는 Hodge 변법에서 양성반응을 보였고, MBL 생성 균주를 선별하는 방법으로는 EDTA-disk synergy test (EDST) 결과 23주가 Imipenem 혹은 meropenem에서 양성반응을 나타냈다.</p> <h2>MBL 유전형 확인 및 접합</h2> <p>MBL생성 유전자인 \(\mathrm{bla}_\mathrm{IMP} \), \(\mathrm{bla}_\mathrm{VIM} \), \(\mathrm{bla}_\mathrm{SPM} \), \(\mathrm{bla}_\mathrm{GIM} \) 및 \(\mathrm{bla}_\mathrm{SIM} \) 등의 유전자 검출을 위한 PCR에서 \(\mathrm{bla}_\mathrm{IMP} \) 유전자에 8주가 양성반응을 보였고, \(\mathrm{bla}_\mathrm{VIM} \) 유전자에 17주가 양성반응을 보여 전체 균주 가운데 \(59.5\% \) \(25/42 \)가 MBL을 생성하였다. DNA의 염기서열 분석결과는 \(\mathrm{bla}_\mathrm{IMP} \) 유전자에 양성반응을 보인 8주 모두 \(\mathrm{bla}_\mathrm{IMP-6} \) 유전자(GenBank accession no. EU117233)이었고, \(\mathrm{bla}_\mathrm{VIM} \) 유전자에 양성반응을 보인 17주 모두는 \(\mathrm{bla}_\mathrm{VIM-2} \) 유전자 (GenBank accession no. AF191564)로 확인이 되었다. 접합에 의한 내성유전자 전달 시험은 PCR로 확인한 결과 band가 관찰되지 않아 MBL 생성 유전자가 수여균인 P. aeru-ginosa PAO4089에 전달되지 않은 것으로 나타났다.</p> <h2>MBL 생성 P. aeruginosa의 특성</h2> <p>\(\mathrm{bla}_\mathrm{IMP-6} \) 유전자를 지닌 P. aeruginosa 8주에 대한 imipenem의 MIC 범위는 \(8-32 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 이었고, meropenem의 MIC는 \( >256 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)이었다. \(\mathrm{bla}_\mathrm{VIM-2} \) 유전자를 지닌 P. aeruginosa 17주의 imipenem과 meropenem의 MIC 범위는 모두 \(32-128\mu \mathrm{g}/\mathrm{ml}\)이었으며 이 두 항균제의 \( \mathrm{MIC}_{50} \)과 \( \mathrm{MIC}_{90}\) 은 각각 \( 64 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)와 \( 128 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)으로 확인되었다.</p> <h2>\(\mathrm{bla}_\mathrm{IMP-6} \)가 포함된 integron의 구조</h2> <p>\( 5^{\prime} \)CS-mF와 \( 3^{\prime} \)CS-mR를 이용한 PCR에서 \( 5^{\prime} \)-CS 및 \( 3^{\prime} \)-CS 보존지역을 지닌 전형적인 class 1 integron이 검출되었다. Class 1 integron의 \( 5^{\prime} \)-CS 보존지역은 integrase 유전자(IntI1) 및 re-combination site (attI1)가 있으며, \( 3^{\prime} \)-CS 보존지역은 소독제 내성 유전자(qacE\(\Delta \)1) 및 sulfonamide 내성 sul1 유전자로 구성 되어 있었다. \( 5^{\prime} \)-CS 및 \( 3^{\prime} \)-CS 보존지역 사이에 있는 variable region에서는 IMP-6 MBL 생성 유전자(\(\mathrm{bla}_\mathrm{IMP-6} \)), quaternary ammonium compound-resistance protein 생성 유전자(qac) cassette, aminoglycoside \( 6^{\prime} \)-N-acetyltransferase 생성 유전자(aacA4) cassette, oxacillin계 항생제에 활성을 부여하는 broad-spectrum beta-lactamase OXA-1 생성 유전자(\(\mathrm{bla}_\mathrm{OXA-1} \)) cassette 및 streptomycin과 spectinomycin에 내성을 부여하는 aminoglycoside adenyltransferase 생성 유전자(aadA1) cas-sette 등이 관찰되었다. 다섯 유전자 cassette 모두는 59 base element (59-be) recombination site를 지니고 있었다.</p> <h2>ERIC PCR에 의한 IMP-6 및 VIM-2 생성 P. aeruginosa의 역학적 연관성 분석</h2> <p>내성균주의 역학적 연관성 조사에서 band의 분자량과 개수를 비교하여 두 개 이상의 band차이가 나면 역학적 상관 관계가 없는 것으로 판단하였다. IMP-6를 생성하는 8균주의 역학적 연관성을 확인하는 시험에서 다섯 균주 (1, 2, 3, 5, 8번)가 역학적 연관성이 있는 것으로 나타났다. 또한 VIM-2를 생성하는 17주 가운데 3균주인 (4, 5, 6번)이 연관성이 있고, (11, 12, 13번)이 서로 역학적 연관성이 있음이 확인되었다. Fig. 4에서는 P. aeruginosa에서 분리한 IMP-6와 VIM-2를 나타낸 것으로 2,3번은 IMP-6 producing이고 5,6번이 VIM-2 producing를 PCR banding pattern으로 나타낸 것이다.</p>