4가지 풍종의 어린잎의 양파를 채취하여 절차에 따라 DNA를 추출하였다. PCR 밴드양상을 비교하기 위하여 \( \mathrm{MgCl}_{2} \)의 농도를 달리하여 실험하였으며, PCR 반응이 끝난 후 전기영동을 통해 DNA증폭 양상을 관찰하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>식물재료</h2><p>본 연구에 사용된 양파 품종은 '창녕대고', '여의주황', '야광주', '다봉황' 등 4품종이며, 경상남도 농업기술원 양파 시험장에서 어린잎을 채취하여 사용하였다.</p><h2>Total DNA 추출 및 정제</h2><p>DNA의 추출을 위해 양파 잎 \( 0.2 \mathrm{~g} \)을 액체질소로 급냉시킨 후 유발에 넣어 마쇄하였고, DNA extraction buffer 10\( \mathrm{m} \ell \)과 \( 20 \% \) SDS \(700 \mu\ell \)를 넣어 혼합한 다음, \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 방치하였다. 여기에 \( 5 \mathrm{M} \) potassium acetate \( 4 \mathrm{m \ell} \)를 넣고, \( 0^{\circ} \mathrm{C} \)에 20분간 둔 다음 원심분리 \((10,000 \mathrm{rpm}\), 20분, \( \left.4^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 한 후 상등액을 취하였다. 이 상등액에 isopropanol \( 10 \mathrm{m \ell} \)를 넣고 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 30분간 방치한 후 원심분리(\( 10,000\mathrm{rpm} \), 10분, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) )하여 상등액을 취하고, \( 50 \mathrm{mM} \) Tris와 \( 10 \mathrm{mM} \) EDTA를 \( 0.7 \mathrm{ml} \) 넣고 10분간 원심분리하였다. 상등액에 \( 3 \mathrm{M} \) sodium acetate \( 75 \mu \ell\) 와 isopropanol \( 500 \mu \ell \) 를 넣고, 다시 원심분리 \( (13,000 \mathrm{rpm}\), 10분, \( \left.4^{\circ} \mathrm{C}\right) \)하여 DNA를 회수하고 \( 80 \% \) 에탄올로 세척하여 건조시킨 후 멸균수 \( (30 \mu \ell-50 \mu \ell) \) 에 녹였다. 추출된 DNA는 \( 0.7 \% \) agarose gel에서 약 25분간 전기영동하여, genomic DNA를 관찰하였으며, 아울러 \( 260 \mathrm{~nm} \)와 \( 280 \mathrm{~nm} \)에서 홉광도를 측정하여 농도를 확인하였다.</p><h2>PCR 변수</h2><p>본 실험에서 사용한 여러 가지 PCR 변수는 Table 1 에 나타내었다. Template DNA 농도를 10, 30, 50, 60, 80\(\mathrm{ng}\)으로 달리한 상태에서의 PCR 밴드양상을 비교하였으며, 이 때 primer는 Operon Technology사의 OPR01(TGCGGGTCCT)을 사용하였다. Primer 농도의 최적화 조건을 규명하기 위하여 primer OPR01(TGCGGGTCCT)과 OPZ20(ACTTTGGCGG)의 농도를 1, 5, 10 \(\mu \mathrm{M} \)로 달리한 상태에서의 PCR 밴드양상을 비교하였다. \( \mathrm{MgCl}_{2} \)의 농도에 따른 PCR 밴드양상을 비교하기 위하여 0, 1.5, 2, 3 \(\mathrm{mM} \)등을 사용하였으며, 이 때 OPR01 primer를 사용하였다. PCR 횟수에 따른 PCR 밴드양상을 비교하기 위하여 각 30, 45, 55회로 달리한 상태에서의 반응을 비교하였으며 이 때, OPR01 primer를 사용하였다. Annealing temperature를 47, 45,42 및 \( 38^{\circ} \mathrm{C} \)로 달리한 상태에서의 PCR 밴드양상을 비교하였으며 primer는 OPR01를 사용하였다. Pre-heating time \( \left(94^{\circ} \mathrm{C}\right. \), 7분)의 유무하에서의 PCR 밴드양상을 비교하였으며, primer는 OPR01을 사용하였다. PCR 반응은 Takara사의 \( 10 \times \) buffer와 dNTP, Taq polymerase를 이용하였다. 이 때 template DNA는 \( 50 \mathrm{ng} \), dNTP는 \( 2.5 \mathrm{mM} \), Taq polymerase는 \(0.6 \mathrm{unit}\), primer는 \( 5 \mu \mathrm{M} \)를 사용하였고, 전체 반응 용액량이 \( 25 \mu \ell \)가 되도록 멸균수로 조정하였다. Thermal cycler의 시간과 온도 중변수로 사용되지 않은 denaturation 시간은 30초, 온도는 94\( { }^{\circ} \mathrm{C} \)로 하였고, annealing 시간은 30초 및 extention 시간은 2분, 온도는 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)로 하여 실시하였다. PCR 반응이 끝난 후, ethidium bromide를 첨가한 \( 1.4 \% \) agarose gel 상에서 \( 50 \mathrm{~V} \)로 130분간 전기영동하여 UV램프 아래에서 DNA 증폭양상을 관찰하였다.</p>