세균의 16S rDNA 염기서열 분석은 분리균주의 genomic DNA와 27F, 1522R로 이루어진 프라이머 한 세트를 PCR하여 수행했다. 분리균주를 배양해 얻은 DNA를 형질전환한 후 플라스미드 DNA를 얻어 ABI 377 자동염기서열 분석기에서 양방향 DNA sequencing을 수행하였다. 결정된 염기 서열은 Ribosomal Database Project-II의 데이터베이스를 이용해 분석하고, 계통도는 bootstrap 분석을 통해 평가했다. 갯지렁이 유래 Bacillus 균주의 생리학적 특성을 알아 보기 위해 본 연구에서는 혐기성 배양기 안에 AnaeroGen \( { } ^ {\mathrm { TM } } \)을 넣어 산소가 없는 조건을 만들어주고, \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 48시간 균을 배양하여 조사하면서 호기 생장 여부와 혐기 생장 여부를 알아보았다.
<h2>16S rRNA 유전자 염기서열 및 계통관계 분석</h2> <p>세균의 16S rDNA 염기서열 분석은 분리 균주들을 액체 배지에서 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 2-3일 동안 배양한 후 이로부터 추출된 genomic DNA와 27F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 1522R (5'-AAG GAG GTG ATC CAR CCG CA-3')로 이루어진 한 세트의 프라이머를 사용하여 이미 알려진 방법에 따라 PCR을 수행하였다.</p> <p>PCR 반응은 GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, CT)를 사용하여 수행하였고, 반응 조건은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5 분간 초기 열처리를 한 후, \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1 분, \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1 분, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1 분씩 30 번 반복하였고, 이어 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분간 처리한 후 \( 4 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 반응액을 보관하였다. 증폭된 DNA는 \( 1.0 \% \) agarose gel에서 전기영동한 후 gel extraction kit (SolGent)에 의해 회수하였다. 회수된 DNA는 pGEM-T easy vector (Promega, Madison, Wisconsin)에 ligation한 후 E. coli JM109에 형질전환하였다. 형질전환 된 클론의 플라스미드 DNA를 분리한 후 promoter primer나 SP6 promoter primer를 이용하여 ABI 377 자동염기서열 분석기(Applied Biosystem, Foster, USA)에서 양방향으로 DNA sequencing을 수행하였다.</p> <p>결정된 염기서열은 Ribosomal Database Project-II (http:/ /rdp.cme.msu.edu)와 GenBank (http:/ /ncbi.nlm.nih.gov)의 database를 이용하여 분석하였다. 염기서열이 결정된 미생물의 계통관계는 EZtaxon server를 이용하여 type 균주들의 16S rRNA 염기서열과의 관계를 나타내었다. Alignment는 CLUSTAL X 1.83에 의해 수행되었으며, 염기서열 간 gap은 BioEdit 프로그램을 이용하여 편집하였다. 계통도는 MEGA 5 program의 neighbor-joining 방법으로 그렸고, 계통도의 지형은 bootstrap 분석을 통해 평가되었다.</p> <h2>갯지렁이 유래 Bacillus 균주의 생리학적 특성 시험</h2> <p>절대 호기성 세균은 대사과정에서 필요한 에너지를 생성하기 위해서 최종 전자수용체로서 산소를 이용하고, 절대 혐기성 세균은 catalase가 없어서 산소에 노출되면 세포에 독성을 띠는 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)가 축적되기 때문에 산소의 존재여부는 균 생장에 영향을 줄 수 있다. 본 연구에서는 호기 생장 여부와 함께 혐기성 조건에서 균들의 생장 여부를 알아보고자 Oxoid사의 혐기성 배양기 안에 AnaeroGen \( { } ^ {\mathrm { TM } } \)을 넣어 산소가 없는 조건을 만들어주고, \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 48시간 균을 배양하여 조사하였다. 균의 운동성을 조사하기 위해 운동성 배지을 제조한 후 순수 배양된 균을 멸균된 백금선을 사용하여 수직으로 중앙에 \( 2 \mathrm { ~cm } \) 깊이까지 접종하고, \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 동안 배양한 후 관찰하였다.</p>