C. hedleyi는 초기 세포 수가 \( 5 \times 10^{4} \) cells/ ml로, f/2 medium \( 250 \mathrm{~ml} \)이 포함된 \(500-\mathrm{ml}\) Erlenmeyer flask에서 특정 온도 및 광도 조건 하에서 suspension 방법을 통해 배양되었다. 배양 7일 후 C. hedleyi로부터 MAA를 분리하였고, 그 과정에서 특정 온도에서 반응 후 원심분리 및 증발 과정이 이루어졌다. 또한, PAGE gel에서 분리된 단백질은 PVDF membrane에 전기전이 방법으로 옮겨져, 단일클론항체인 5C6를 사용하여 PrP 단백질을 검출하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>Chlamydomonas hedleyi 배양</h2> <p>Mycosporine-glycine, porphyra-334와 shinorine의 분리 및 정제는 이전 연구를 참조하여 실시하였다. C. hedleyi 는 초기 세포 수가 \( 5 \times 10^{4} \) cells/ ml에서 시작하여 f/2 medium \( 250 \mathrm{~ml} \)이 포함된 \(500-\mathrm{ml}\) Erlenmeyer flask에서 suspension 방법을 통해 배양되었으며, 빛의 광도는 \( 80 \mu \mathrm{mol} \)photon \( \cdot \mathrm{m}^{-2} \cdot \mathrm{s}^{-1} \)와 \( 22 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \)의 온도 조건에서 배양되었다. 또한 \( \mathrm{CO}_{2}(\mathrm{l} \%) \)가 함유된 공기의 공급 및 배양 액 내의 \( \mathrm{pH} \)는 8-9를 유지하였으며, 16:8시간 비율로 낮과 밤을 구별하였다. 7일간의 배양 후, MAA 분리를 위해 C . hedleyi를 수집하였다.</p> <h2>MAA 분리 및 정제</h2> <p>MAA의 분리 정제는 \( 20 \mathrm{~mg} \) dry weight DW 의 C. hedleyi 에 \( 1 \mathrm{~ml} ~20 \% \) aqueous methanol \( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)을 첨가한 뒤 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 반응 후, \( 5,000 \times \mathrm{g} \)에서 1분간 원심분리 후, \( 700 ~\mu \mathrm{l} \)의 상층 액을 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) vacuum을 이용해 증발시켰다. 남아 있는 침전 층에 \( 500 ~\mu \mathrm{l} \) 증류수와 \( 100 ~\mu \mathrm{l} \) chloroform을 첨가하여 잘 섞은 후, \( 10,000 \times g \)에서 5분간 원심분리 후, 상층 액 제거를 통해 광합성에 관련된 색소를 제거하였다. 그리고 남아 있는 침전물에 \( 50 \% \) methanol을 첨가한 후에 HPLC(Shimadzu-LC20A, Seattle, WA, USA)와 DAD-SPD M20A detector (Quantum Northwest, Seattle, WA, USA)를 이용하여 mycosporine-glycine, porphyra-334와 shinorine을 분리하였다. 이후, \(30-60 ~\mu \)의 침전물에 \( 100 \% \) HPLC-grade methanol을 첨가하여 \( 0.5 \mathrm{~ml} \)을 만들고, 이를 rotary evaporator를 이용하여 증발시켰다. 그리고, \( 600~ \mu \mathrm{l} \) 증류수에 희석된 ( \( 1: 10) \)\( \mathrm{pH} 3.0 \)의 액상에 \( 0.2 \% \) trifluoroacetic acid와 ammonium hydroxide를 첨가하였다. Whatman \( 100 \mathrm{~kDa} \) filter를 이용하여 \( 12,000 \mathrm{~g} \) 에서 20분간 원심분리를 통해 큰 분자와 비수용성 물질을 제거한 후, HPLC를 이용하여 \( 10~ \mu \mathrm{l} \) 샘플을 \( 1 \mathrm{~ml} / \mathrm{min} \) flow rate로 분리하였다.</p> <h2>세포배양 및 MAA 처리</h2> <p>\( \mathrm{ScN} 2 \mathrm{a} \) 세포는 마우스에 적응시킨 prion이 영구적으로 감염된 세포주이며, Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM, high glucose), \(10\%\) fetal bovine serum, \(1\%\) glutamax와 \( 1 \% \) streptomycin/penicillin이 포함된 배양액을 사용하여 배양을 하였다. \( 5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 와 포화습도 상태의 세포 배양기조건에서 세포배양을 실시하였으며, 세포배양 후, \( 90 \% \)정도의 confluent state에서 세포배양 plate로부터 각각 \( 5 \% \)의 세포를 새로운 세포배양 plate로 옮겼다. 세포가 plate표면에 부착된 후, 여러 농도의 MAA \( (0.1, 0.3, 1, 3, 10~ \mu \mathrm{M}) \)를 세포 배양액에 첨가하였다. 3일에 한번씩 동일 MAA가 포함된 세포배양액으로 교체하였으며, 총 7일간 배양 후에 세포 파쇄액을 수집하였다.</p> <h2>Western blot 분석</h2> <p>\( \mathrm{PrP}^{\mathrm{Sc}} \)의 축적을 확인하기 위하여 western blot을 이용하였다. 7일간 MAA 처리된 세포를 lysis buffer ( \( 20 \mathrm{~mM} \mathrm{~Tris}\), \( \mathrm{pH} 8.0, 150 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaCl}, 0.5 \% \) Nonidet-P 40 and \( 0.5 \% \) sodium deoxycholate)를 이용하여 분쇄시켰다. 각 lysate의 \( 1 \mathrm{mg} \)을 \( 20~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \mathrm{~PK} \) (Invitrogen)를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 처리하였다. \( 1 \mathrm{~mM} \) phenylmethanesulfonyl fluoride 첨가를 통해, PK를 불활성화시킨 후에, \( 100,000 \times \mathrm{g} \)에서 1시간 동안 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 table-top ultracentrifuge (Optima TLX Ultracentrifuge, Beckman-Coulter, Fullerton, CA)을 이용하여 원심분리를 하였다. 상층액 제거 후, 1X SDS-PAGE sample loading buffer (\(50 \mathrm{mM} \mathrm{~Tris-HCl}\), \( \mathrm{pH} 6.8\), \(2\%\) SDS, \( 10 \% \) glycerol, \(1\%\) 2-mercaptoethanol, \( 12.5 \mathrm{~mM} \) EDTA, \(0.02\%\) bromophenol blue)를 첨가하여 pellet을 녹인 후에 \( 12 \% \) Tris-Glycine SDS-PAGE gel에서 단백질을 분리하였다. PAGE gel에서 분리 된 단백질은 PVDF membrane에 전기전이 방법으로 옮겨진 후, PrP 단백질 확인을 위해 단일클론항체인 5C6를 사용하여 검출하였으며, ECL Plus Detection reagents(GE Healthcare, Piscataway, NJ)와 G:BOX Chemi XR5 system (Syngene, Cambridge, UK)을 사용하여 단백질 밴드를 확인하였다.</p>