전구단백질에서 분비되는 단백질은 소포체 신호 펩타이드를 통해 성숙되며, 특히 G-CSF 단백질의 돌연변이 연구는 단백질의 분비에 큰 영향을 줄 수 있음을 보여준다. 본 연구는 세포 외 분비 단백질의 리모델링이 의료용 단백질의 생산 효율 향상에 기여할 수 있음을 제시하며, 특히 d3 돌연변이에 대한 더 깊은 연구가 필요하다는 결론을 내린다.
<h1>Results and Discussion</h1> <p>세포 외로 분비되는 단백질은 전구단백질로 만들어져 소포체에서 소포체 신호 펩타이드(Endoplamsic reticulum signal sequence, ER signal sequence)가 절단이 되어 성숙된 단백질로 된다. G-CSF는 25 개의 아미노산으로 된 ER-signal sequence를 가지며, 분비형의 성숙한 단백질은 174개의 아미노산으로 구성되어 있다. 세포 내 분비 경로 중 골지체에서 O-linked glycosylation이 일어나 당쇄가 부가된 당단백질로 세포 밖으로 분비된다. 분자량은 약 \( 25 \mathrm{~Kda} \)이다. 따라서 사람 유래 G-CSF의 생산은 분비경로의 시작인 소포체로의 이동이 아주 중요하며, 또한 동질성을 가지기 위해 당쇄의 부가가 중요하다. 현재 사용되고 있는 재조합 G-CSF는 Escherichia coli에서 생산되는 것과 Chinese Hamster Ovary cells (CHO)에서 생산되는 것으로 대별된다. Escherichia coli에서 생산되는 G-CSF는 Filgrastim이라 명명하며, E. coli 세포 내 inclusion body로 존재하는 것을 재구조화(renaturation)하는 과정을 거쳐 생산하는 반면에 Chinese Hamster Ovary cells (CHO)에서 생산되는 G-CSF는 Lenograstim 이라 명명하며 사람 유래 G-CSF와 동일한 post-translational modification을 거쳐 합성이 되어 안정성 및 활성이 상대적으로 높다고 알려져 있다.</p> <p>곤충세포는 진핵생물과 마찬가지로 세포 내 단백질 분비경로를 거쳐 분비 단백질을 세포 밖으로 보내며 또한 당쇄 부가와 같은 post-translational modification 과정을 수행한다. 또한 포유동물 사이에서 발생할 수 있는 위해성 감염원(예, 바이러스)에 대한 안전성이 높아 재조합 단백질을 생산하는 좋은 수단으로 인식된다. 본 연구팀은 누에 세포에서 사람 유래 G-CSF의 생산효율을 높이기 위해 ER signal sequence를 변경 하여 높은 분비율을 획득하였다. G-CSF의 구조는 4 개의 alpha-helix로 구성되어 있다. G-CSF의 활성은 이들 alpha-helix가 아주 중요한 역할을 하며, alpha-helix 구조는 두 개의 disulfide bond가 지탱을 한다고 알려져 있다. 이를 바탕으 로 하여 구조에 영향을 최소화 하며 G-CSF의 분비율에 N-말단이 어떤 영향을 주는지를 N-말단에 deletion mutation을 도입하여 조사하였다.</p> <p>과도한 deletion에 의한 구조변형을 최소화하기 위해 아미노산 3 개를 deletion하는 방법을 사용하였으며, 서로 중복되는 deletion mutant를 제조함으로 G-CSF의 생산 또는 분비에 중요한 아미노산을 선별하는 전략을 사용하였다. 또한 아미노산 3 개가 deletion된 각각의 돌연변이는 서로 아미노산이 한 개씩 중복되도록 만들어져 3 개의 아미노산 중 하나 또는 두 개의 아미노산을 더욱 세밀하게 구별될 수 있도록 하였다. G-CSF는 4 개의 alpha-helix로 이루어져 있고, 첫 번째 alpha-helix가 3 번째 proline 다음의 glutamine부터 시작 된다. 따라서 첫 번째 alpha-helix가 시작되기 전 3차 구조를 형성하고 있지 않는 영역에 돌연변이를 도입하였다. 각각의 deletion mutant는 site-directed mutagenesis 또는 화학적 DNA 합성을 통하여 제작되었으며, 제작된 모든 DNA는 곤충 발현 벡터인 pIZTv5/His에 삽입되었다. 이때 벡터에 존재하는 hig tag이 G-CSF의 C-말단에 위치하도록 클로닝되었 다. 벡터 내에 클로닝 된 wild type과 돌연변이 DNA는 다시 DNA sequencing을 하여 다른 위치의 돌연변이가 없음을 확인하였다. 각 DNA로부터 발현되어 생산되는 G-CSF의 양을 비교하기 위해서 일시적인 형질전환(transient transfection)을 통해서 할 수도 있으나 각각의 형질전환 효율과 지속적인 생산 가능성의 이유로 stable cell line을 구축하였다. 사용한 벡터에 zeocin 내성 유전자가 존재하여 zeocin에 내성을 가진 Bm5 세포들만을 선별하여 각각의 stable cell line을 구축하였다. Stable cell line은 형태적으로 원래의 Bm5 세포와 차이가 없었으며, 각 cell line 간에도 형태적 차이는 없었다. 생산되는 재조합 G-CSF는 세포 밖으로 분비가 되므로 각 cell line이 배양된 배양액을 분석하였다. 동일한 양의 배양 액 내에 존재하는 G-CSF의 상대적인 비교를 위해 \( 2 \mathrm{~ml} \) 배양액 내에 존재하는 G-CSF를 Nickel sepahrose bead를 사용하여 분리하고 이를 western blot으로 분석하였다. 동일한 양을 나타내기 위한 대조군으로는 배지 내에 존재하는 약 \( 66 \mathrm{~Kda} \)인 bovine serum albumin을 SDS-PAGE로 분리하여 Coomassie 염색으로 나타내었다. Western blot의 결과에서 d3 돌연변이의 경우 확연하게 G-CSF가 감소한 알 수 있었고, 이와 대조적으로 d1과 d2의 경우는 wild type보다 다소 높게 생산 되었거나 동일한 수준임을 알 수 있었다. 이는 돌연변이의 위치가 모두 alpha-helix와는 무관한 N-말단 끝에 존재하지만 G-CSF의 생산 또는 분비에 커다란 영향을 미친다고 생각된다. 일반적으로 proline은 단백질 구조에서 굴곡을 형성하는 것으로 알려져 있다. d1 돌연변이와 d2 돌연변이 모두 하나씩의 proline을 가지고 있지만 아주 대비되는 G-CSF의 생산량을 보여주고 있다. 이는 d3에 의해 제거된 3 번째 proline이 생산 또는 분비에 영향을 준다고 생각된다. 그러나 배양 배지 내에 존재하는 G-CSF를 분석한 것임으로 배지 내에서의 안정성에도 영향을 줄 수 있다고 생각할 수 있다. 당쇄가 없는 Filgrastim의 경우 serum 내에 존재하는 elastase에 의한 분해에 민감한 것으로 알려져 있다. 세포 내에 존재하는 G-CSF의 양을 상대적으로 비교하여만 d3 돌연변이가 단백질 합성에 영향을 주지 않았다고 결론 지을 수 있어 이에 대한 연구는 향후 수행되어야 된다고 생각한다. 다만 ER signal sequence가 세 종류의 돌연변이 모두 같으며, Bombix mori 유래 PPAE의 ER signal sequence가 정상적으로 기능을 하고 있음으로 d3 에 의한 영향을 분비문제로 여겨진다.</p> <p>G-CSF의 분비에 관한 특정 아미노산에 대한 연구는 현재까지도 아주 부족하며, 본 연구의 돌연변이 연구에서 알 수 있듯이 특정 위치의 G-CSF 돌연변이가 생산보다도 분비에 영향을 줄 수 있다고 생각된다. 단백질의 세포 외 분비는 결과적으로 생산성과 직결되어 있다. 따라서 본 연구는 세포 외 분비가 증가된 단백질 리모델링으로 조혈성장 단백질과 같은 의료용 단백질의 생산 수율을 향상시킬 수 있는 가능성을 제시하였다고 생각한다.</p>