본 연구는 골격근에서의 내인성과 외인성 신호 경로에 대한 민감성과 HSP70과 같은 Chaperone 요소의 역할에 대해 연구하였다. 8주간 \(16.4 \mathrm { ~m } / \mathrm { min }\) 속도, \(4 \% \) 경사도로 40분간 진행한 트레드밀 운동 후 48시간 이후에 비복근을 채취하였다. 실험에 사용된 동물은 생후 8주령 이상의 ICR 수컷으로, 일주일의 적응기간 후 무작위로 운동 그룹 10마리, 통제 그룹 10마리로 설정하였다.
<p>따라서 본 연구에서는 기존 연구에서 다루어 지지 않은 운동에 따른 골격근에서의 내인성 신호 경로와 외인성 신호 경로 기전 모두의 민감성 여부에 대한 연구와 이와 관련한 apop-tosis과정 중 HSP70과 같은 Chaperone 기능을 하는 요소의 작용에 관해 연구하고자 한다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 대상</h2> <p>실험동물은 생후 8주령 이상 된 ICR계 수컷을 이용하여, 일주일의 적응기간을 거친 후 무작위로 운동집단 10마리, 통제집단 10마리로 설정하였다. 사료와 물은 자유스럽게 섭취하도록 하였다. 온도 \( \left (22 \pm 1 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \), 습도 \( (55 \pm 3 \%) \), 밤낮은 자연주기 조건에서 사육하였다.</p> <h2>운동 방법</h2> <p>운동그룹은 트레이드밀 속도 \( 10 \mathrm { ~m } / \mathrm { min } \), 경사도 \( 0 \% \), 10분씩 2일간의 적응기를 실시하였으며 1일 경과된 후 8주간 주당 5회 운동을 실시하였다. 8주간의 본 운동을 위한 트레드밀 프로토콜은 경사도 \( 4 \% \), 속도 \( 16.4 \mathrm { ~m } / \mathrm { min } \)로 40분간 지속하였고, 운동기간 동안 동일한 시간대에 운동을 수행하였다.</p> <h2>조직적출 및 분석</h2> <p>마지막 운동 종료 48시간 이후에 비복근을 적출한 후, 액화질소에 급속 냉동시켜 분석 시까지 \( -70 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 보관하였다. 통제 집단 동물들도 같은 시간에 동일한 방법으로 조직을 적출하고 보관하였다.</p> <h2>Western Blotting</h2> <p>각 조직에서 cell lysis buffer를 이용하여 \( 2 ~ \mu \mathrm { g } / 1 ~ \mu \mathrm { l } \) 단백질을 얻었다. 단백질 분리하기 위해 \( 10 \% \) polyacrylamide one-Gel (Elpis Biotech, Korea)을 사용하여 SDS-PAGE를 시행한 후 PVDF membrane (polyvinylidine difluoride)로 gel transfer 하였다. Membrane을 TBS-T로 1회 세척한 후 3 \( \% \) bo-vine serum albumin/TBS-T로 2시간 이상 blocking한 후, TBS-T로 1회 세척하였다. 일차 항체는 tubulin antibody ( \(1:5,000 \) dilution), Bax antibody ( \(1:1,000 \) dilution), Bcl-2 anti-body ( \(1:1,000 \) dilution), 그리고 caspase-3 antibody ( \(1:1,000 \) dilution), caspase-8 antibody ( \(1:1,000 \) dilution), HSP70 anti-body ( \(1:1,000 \) dilution)를 각각 첨가 후 membrane과 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 overnight 반응시킨 후 TBS-T 용액으로 5분씩 6회 세척하였다. 이차 항체로는 horseradish peroxidase (HRP) 결합된 an-ti-mouse IgG antibody ( \(1:15,000 \) dilution) 또는 anti-rabbit IgG antibody ( \(1:20,000 \) dilution)를 membrane과 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1시간 반응시킨 후 TBS-T 용액으로 5분씩 6회 세척하였다. 반응 후, HRP의 기질인 ECL용액으로 발색반응을 일으켜 X-ray film에 감광하여 분석하였다.</p>