발색반응 특이성을 확인하기 위해 BPA와 대사산물을 반응한 결과 4-HBA의 경우, BPA에 대해 \( 36 \% \) 의 흡광도를, 4-HAP 및 4-HBAL은 BPA의 약 \( 20 \% \) 정도의 흡광도를 나타내었다. 비색절량법 반응 최적화 수행 결과 첨가한 bisphenol량의 \( 92 \sim 117 \% \) 범위에서 비색정량이 가능하며, 각종 수분 들과 큰 오차 없이 비색정량 가능함을 확인하였다.다른한편 토양시료의 물 추출물에 대한 BPA 발색반응 결과 검출 되지 않았으다. BPA를 인위적으로 첨가한 경우, 토양시료의 다양한 물질들의 흔재로 인해 오차범위가 최대 \( 114 \% \) 로 다소 크게 나타났다. 이번 실험의 결과는, 비색정량법이 다량의 시료로부터 효과적으로 BPA 관련물질을 간편하게 미생물을 선별하며 BPA등 페놀성 내분비교란물질의 검출에도 적용될 수 있음을 제시한다.
<p>발색반응의 특이성을 확인하기 위해, BPA와 이의 알려진 대사산물 각각 \( 100 \mu \mathrm{M} \) 용액을 대상으로 발색 반응한 결과, 4-HBA의 경우, BPA에 대해 \( 36 \% \) 의 흡광도를, 4-HAP 및 4-HBAL은 BPA의 약 \( 20 \% \) 정도의 흡광도를 나타내었다 (Fig. 3b). 일반적으로 BPA가 분해되는 경우, 상대적으로 낮은 독성과 매우 감소된 내분비 장애활성을 가지게 되는데, 이러한 결과는 본 비색법이 BPA 무독화 균주선별, 또는 분해과정 연구에 유용함을 시사하고 있다. 한편 phenol, nonylphenol, tannic acid, butyl hydroxytoluene, 2-acetoxybenzoic acid를 반응시킨 결과(Fig. 3c), 2-acetoxybenzoic acid에는 반응하지 않는 반면, 전반적으로 페놀성 화합물에 발색함을 확인하였다.</p> <p>비색정량법을 위한 반응 최적화를 수행하였다. 먼저 반응 \( \mathrm{pH} \) 로 \( \mathrm{pH} ~2, 4, 6, 7, 9, 11 \) 을 검토한 결과 \( \mathrm{pH} 6 \sim 7 \) 이 가장 우수하여, \( \mathrm{pH} 6.5 \) 를 결정하였다(Fig. 4a). 각각 \( 4, 20, 30, 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응결과 최적 반응온도는 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 이상에서 반응하는 것이 필요하며, 본 실험에서는 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 로 결정하였다(Fig. 4b). 또한 \( \mathrm{pH} 6.5, ~30^{\circ} \mathrm{C} \) 의 조건에서 반응시간별 발색도를 측정한 결과, 반응 시간의 중가에 따라 발색정도는 중가하였으나, 5분 반응으로도 발색이 충분하여, 반응시간은 5분으로 결정하였다(Fig. 4c). 또한 \( \mathrm{pH} 6.5,~30^{\circ} \mathrm{C}, ~5 \) 분 반응시 시료와 발색제 비율은 \( 4: 1(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 이 가장 양호한 결과를 나타내었다(Fig. \( 4 \mathrm{~d}) \). 정량분석을 위한 반응정지제로는 알카리 용액에서의 불안정으로 인해 \( 50 \mathrm{mM} \) HCl 용액이 우수하였으며(Fig. 4e), 반응 정지 후 1 시간까지는 발색물이 안정하게 유지됨을 확인하였다(Fig. 4f). 따라서 BPA 비색정량은 다양한 시료를 \( 1 \mathrm{N} \) \( \mathrm{NaOH} \) 또는 \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} \) 로 \( \mathrm{pH} 6.5\)로 조정한 후, 시료와 발색제 비율이 \( 4: 1(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 이 되도록 첨가하고, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분 반응 후, HCl용액(최종농도 \( 50 \mathrm{mM}) \) 으로 반응정지 후 \( 750 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하는 것으로 확정하였다. 표준조건하에서 BPA에 대한 비색반응 정량곡선을 Fig. 5 에 나타내었다. BPA에 대한 정량 곡선은 \( 0 \sim 100 \mu \mathrm{M} \) 의 농도에서 \( \lambda_{750}=0.061 ~\mathrm{BPA}~[\mu \mathrm{M}]+0.07155 \) 의 농도-흡광도 상관관계를 나타내었으며, 신뢰도는 0.992를 나타내었다.</p> <p>비색정량의 효율성 및 정확성을 확인하고자 지하수, 음용수, 강물, 토양, 생활용품 등을 대상으로 BPA의 발색반응을 실시하였다. 다양한 수계 시료 (증류수, 싱수도, 강물) 각각 10 종에서의 반응 결과 전혀 발색되지 않았으며, 이는 각각의 시료에 대한 HPLC분석 결과 BPA가 검출되지 않았다. 이후 각각의 시료에 BPA를 인위적으로 첨가한 후, 다시 발색반응을 통해 BPA를 정량하였다. 그 결과는 첨가한 bisphenol량의 \( 92 \sim 117 \% \) 범위에서 비색정량이 가능하여, 중류수, 수돗물, 강물 등에 큰 오차 없이 비색정량 가능함을 확인하였다. 한편 토양시료의 물 추출물에 대한 BPA 발색반응 결과 검출 되지 않았으며, BPA를 인위적으로 첨가한 경우, 토양시료의 다양한 물질들의 흔재로 인해 오차범위가 \( 73 \sim 114 \% \)로 다소 크게 나타났다(Table 2). 그러나, 물 추출물의 부유물질을 제거한 경우에는 안정된 분석값을 나타내어, 토양시료의 발색 반응의 경우 전처리가 필요함을 알 수 있었다. 한편 일회용-생활용품을 대상으로 BPA 검출을 위해 발색 반응한 결과, 모든 물 추출물 시료 및 일회용 컵, 일회용 실험용관의 메탄올 추출물에서 전혀 발색하지 않았다. 그러나 일회용 주사기의 메탄을 추출물에서는 강력한 발색 반응이 나타났으며, 메탄올 추출시료의 HPLC 분석에서도 BPA 및 기타 미확인물질들이 검출되었다(Table 3). 이는, 메탄올에 의한 일회용 주사기 고무부분 또는 내부물질의 다양한 물질의 용출결과로 추측된다. 이러한 결과는, 본 연구의 비색정량법이 매우 효과적으로 다량의 시료로부터 BPA 관련물질을 간편하고, 경제적으로 정성, 정량분석 할 수 있으며, 나아가 자연계로부터 BPA 및 기타 페놀계 화합물을 분해하는 미생물 선별, 자연계에서의 특정 페놀계 화합물의 분해율 측정, 특정 생활용기, 생활용품의 BPA 등의 페놀성 내분비교란물질의 검출 등 에도 효율적으로 적용될 수 있음을 제시한다.</p>