본 논문에서는 조제된 3차 증류수, 오존 발생기, 압력 여과장치 등을 이용한 오존 농도별 바이러스 제거율 조사를 위한 실험을 진행하였다.또한 분양받은 BGM세포, 항생제, MEM/L−15 배지, 세포배양용기, 세포배양 플라스크를 이용한 세포 배양 실험을 진행하였는데 이때 원심 분리 과정을 거치기 전 BGM 세포들이 배양용기의 바닥에서 완전히 떨어진 것을 확인해야 한다.
<h2>오존농도별 바이러스 제거율 조사</h2> <p>먼저 시료를 \(3 \)차 증류수 \(5 \mathrm { ~l } \) 에 정량화된 바이러스 stock \(1 \mathrm { ml } (5000 \mathrm { PFU } ) \) 를 첨가하여 조제하였다. 조제된 \(3 \)차 증류수 \(5 \mathrm { ~l } \)를 펌프로 오존 발생장치 내로 순환시키고 오존 발생기(generator)를 사용하여 오존 발생량을 일정하게 유지시켜 시료와 시간별로 반응시켰다. 반응시킨 \(5 \mathrm { ~l } \) 시료는 압력 여과장치를 이용하여 여과하였다. 사용된 여과지는 수중에서 negative charge를 띄고 있는 virus의 포집이 잘 되도록 표면 자체가 positive charge로 이루어져 있는 \( 0.22 \mu \mathrm { m } \) membrane filter ( \( \mathrm { Hybond-N } ^ { + } \), \( \mathrm { RPN~303B } \) , Amersham pharmcia bioech.) 로서 여과한 후 여지를 \(1 \mathrm { ~l } \)의 \( 50 \mathrm { mM } \) glycine이 함유된 Beef extract가 들어있는 \(5 \mathrm { ~l } \) 플라스크에 즉시 넣어 30 분 동안 교반시켜 여지에 흡착되어 있는 바이러스를 탈리시켰다. 탈리 후의 실험과정은 Pilot-plant 공정수정별 제거실험과 동일하게 유기 응집 농축법을 이용하여 처리하였으며, 잔류 오존은 KI 용액으로 측정하였다. 실험에 사용된 모든 초자 기구는 \( 0.1 \% \) 염소용액으로 30 분 이상으로 소독하여 \( 2 \% \) 티오황산나트륨으로 중화시킨 후 다시 3차 증류수로 여러 번 씻은 후 \( 121 ^ {\circ } \mathrm { C } , 20 \) 분간 멸균하여 건조한 후 사용하였으며 실험은 3회 실시하였다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>바이러스 배양에는 국립환경연구원에서 분양받은 BGM세포를 사용하였다. BGM세포주의 배양액은 penicillin-strep-tomycin 용액과 amphotericin (fungizone) 용액이 혼합된 항생제와 \( 10 \% \) FBS가 첨가된 \( \mathrm { MEM } / \mathrm { L } -15 \) 배지를 사용하였다. 세포의 계대는 우선 monolayer가 형성된 BGM 세포주를 배양기에서 꺼내어 배양용기 안에 있는 배지를 우선 제거한 후 trypsin-EDTA 를 세포배양용기에 적정량 \( ( \)약 \( 10 \mathrm { ~ml } ) \) 을 넣고 \( 36.5 \pm 1 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 배양기에 5 분 정도 방치하였다. BGM 세포들이 배양용기의 바닥에서 완전히 떨어지는 것을 확인한 후 떨어진 세포들을 \( 1,000 \times \mathrm { g } , 10 \) 분간 실온에서 원심 분리한 후에 상층액을 깨끗이 제거하고 침전된 세포를 새로운 증식용 배양액에 혼합한 후 세포배양 플라스크 \( \left (25 \mathrm { ~cm } ^ { 2 } \right ) \) 에 분주하여 \( 36.5 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) 의 배양기에서 배양하였다.</p>