본 실험에서는 식물의 가뭄 스트레스를 측정하기 위해 쓴메밀을 성장시키고 염 처리, PEG 처리를 수행했다. 쓴메밀을 4주간 키운 후 뿌리 하단에서 2cm를 절단하여 myo-Inositol feeding 실험을 진행했다. 또한 변화되는 cyclitols와 기준 물질의 retention time을 측정도 이루어졌으며 GC-FID 전처리과정을 진행한 뒤 쓴메밀 D-chiro-inositol, D-pinitol, ononitol, myo-inositol 측정도 진행했다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>쓴메밀 성장조건</h2><p>쓴메밀(Fagopyrum tataricum) 종자를 암 상태 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 침윤 시킨 후 원예용 상토에 심고 식물 성장기(명 상태: \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 14시간, 암 상태: \( 20^{\circ} \mathrm{C} 10 \) 시간)에서 4주 동안 재배하였다.</p><h2>비 생물학적 스트레스처리</h2><p>4주 동안 키운 어린 쓴메밀에 모든 것을 동일 조건으로 설정하고 염 \( (\mathrm{NaCl}\) \(100 \mathrm{mM}) \) 을 처리하여 3일 동안 매일 시료를 채취하였으며 가뭄 스트레스 처리는 염 스트레스와 동일한 조건에서 PEG \( 600010 \% \) 를 어린 쓴메밀에 처리한 후 3일 동안 매일 시료를 채취하였다.</p><h2>D-chiro-inositol, D-pinitol, ononitol, myo-inositol의 정체시간 측정</h2><p>식물에서 변화되는 cyclitols을 GC-FID로 측정하기 위해 myo-inositol은 Sigma (St. Louis, USA)을 사용하였으며 D-chiro-inositol, D-pinitol, ononitol는 NZP (Palmerston, New Zealand)에서 구입하여 기준 물질의 retention time 측정에 사용하였다.</p><h2>myo-Inositol feeding 실험</h2><p>쓴메밀을 4주 동안 키운 후 뿌리 하단에서 \( 2 \mathrm{~cm} \) 부분을 절단한 뒤 미리 제작 된 생장 용액(50 \(\mathrm{mM}\) myo-inositol, \( 30 \mathrm{mM} \) sucrose, \( 10 \mathrm{mM} \) asparagine, \(10 \mathrm{um}\) kinetin)과 대조구 용액(30 \(\mathrm{mM}\) sucrose, \( 10 \mathrm{mM} \) asparagine, 10 \(\mathrm{um}\) kinetin)에 넣은 후 1시간, 5일 동안 매일 시료를 채취하였다.</p><h2>D-chiro-inositol, D-pinitol, ononitol, myo-inositol의 측정</h2><h3>GC-FID 전처리과정</h3><p>스트레스가 처리된 쓴메밀 조직을 액체질소로 급속 냉각시고 조직 분쇄기로 마쇄하여 준비된 시료를 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\): \(\mathrm{C}_{2} \mathrm{H}_{5} \mathrm{OH} \) \( (1: 1, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 비율로 제작한 추출 용액 \( 40 \mathrm{ml} \) 에 첨가하였다. 중탕기 \( \left(100^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 에서 1시간을 처리하여 시료에서 모든 cyclitols을 추출하였다. 이후 \( 4,000 \mathrm { rpm } \) 원심분리하여 cyclitols이 용출된 상등액을 취하고 이를 다시 고온 원심증발기 \( \left(80^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 에서 6시간 처리하여 \( \mathrm{C}_{2} \mathrm{H}_{5} \mathrm{OH} \) 를 완전히 제거하였다. 식물조직용 nanosep 3K 필터에 용출된 상등액을 원심분리하여 남겨진 식물조직과 불순물을 제거하고 cyclitols이 녹아있는 추출 용액을 얻어냈다. 이를 저온 원심증발기 \( \left(-20^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 에서 24시간 동안 처리하여 수분을 완전히 제거하고 순수한 cyclitols을 얻었다. 이렇게 얻어진 각각의 시료를 작은 유리관으로 옮긴 후 잔여 수분을 완전히 제거하기 위하여 phosphorus pentoxide \( \left(\mathrm{P}_{2} \mathrm{O}_{5}\right) \) 가 담긴 유리 상자에 넣은 후 잔여 수분을 증발시켰다.</p><h3>GC-FID를 이용한 쓴메밀 D-chiro-inositol, D-pinitol, ononitol, myo-inositol 측정</h3><p>수분이 완전히 제거된 각각의 시료에 trimethylsilylimida-zole : pyridine mixture \( (1: 1, \mathrm{v} / \mathrm{v})\) \(200 \mu \mathrm{l} \) 를 처리하고 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 가열반응기에서 30-40분 동안 고온 반응 시킨 후 준비된 시료를 가스 크로마토그래피를 사용하여 분석하였다. 가스 크로마토그래피에 사용된 컬럼은 HP-5 capillary 컬럼을 사용하였으며 split mode injector (1:50)에 반응샘플 \( 1 \mu \mathrm{l} \) 를 삽입 하였다. 가스 크로마토그래피의 초기온도는 \( 150^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 300^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 맞추어 총 20분을 유지시켰다. 투입구의 온도는 \( 280^{\circ} \mathrm{C} \), 검출기의 온도는 \( 300^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 수행하였다.</p>