항경련제를 실험동물에 투여하고 전기자극 후 뒷다리의 반응을 보고 항견련 효과의 여부를 판단하였다. 항경련제 투입 후 경련을 일으킨 생쥐의 뇌에서 조직을 적출하여 단백질을 분리하였고 단백질의 발현 정도을 계측하기 위해 조직에서 분리한 단백질을 전기영동으로 분리하였다.
<lis>(2)MES 경련 검사</lis><p>MES에 의한 경련유발의 시간대적인 과정은 그림 \( 1- \mathrm { B } \) 에 제시되어 있다. 항경련제를 실험동물의 복강내 주사하고 15분 후 corneal electrode로 \( 60 \mathrm { ~Hz } , 50 \mathrm { ~mA } , 0.2 \) 초의 전기자극을 가한다. 전극은 \( 5 \mathrm { ~mm } \) 직경의 스테인레스 스틸로 된 볼을 사용하며 생리식염수에 적셔 전기자극한다. 전기자극 후 뒷다리에 긴장성 신전이 나타나지 않으면 전기자극에 의한 경련에 대하여 항경련 효과가 있는 것으로 판단하였다.</p> <h2>4. NOS 측정</h2> <lis>(1)단백질 분리</lis><p>항경련제 투입 후 경련을 일으킨 생쥐의 뇌에서 해마부와 전녀피질부를 적출하여 단백질을 분리하였다. 적출된 조직은 차가운 phosphate buffered saline (PBS)로 2회 세척 후 단백질분해효소 억제제 \( (0.5 \mathrm { mM } \) leupeptin, \( 1 \mathrm { mM } \) pepstin A, \( 1 \mathrm { mM } \) aprotinin, \( 10 \mathrm { mM } \) PMSF)가 첨가된 균질 용액(100 mM KCl, \( 2 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 6 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } , 1 \mathrm { mM } \) DTT, \( 20 \mathrm { mM } \) Hepes, \( \mathrm { pH } \) 7.4)에 넣고 tissue homogenizer로 분쇄하여 균질액을 만들었다. 이 균질액에 \( 2 \% \) Tween 20 을 첨가하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 시간 처리한 뒤 \( 4,000 \mathrm { rpm } \) 에서 10 분간 원심분리하여 얻은 상충액을 실험에 사용하였다. 단백질의 농도는 BSA를 표준 단백질로 하여 Bradford 방법으로 정량하였다.</p> <lis>(2)Western Blotting</lis><p>단백질 발현 정도를 측정하기 위하여 조직에서 분리한 단백질을 전기영동으로 분리하였다. \( 7.5 \% \) polyacrylamide gel (0.38 M Tris- \( \mathrm { HCl } , \mathrm { pH } \) 8.3) 위에 \( 4.5 \% \) polyacrylamide (0.13 M Tris \( \mathrm { HCl } , \mathrm { pH } \mathrm { 6.8) } \) 가 놓이는 불연속 gel을 만들어 추출한 단백질을 gel-loading buffer \( (50 \mathrm { mM } \) Tris \( \cdot \mathrm { HCl } , \mathrm { pH } \) \( 6.8 ; 5 \% \) mercaptoethanol, \( 2 \% \) SDS, \( 0.1 \% \) bromophenol blue, \( 10 \% \) glycerol)에 처리하여 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분간 가열한 후 급냉시켜 각 lane 당 \( 20 \mu \mathrm { g } \) 씩 gel에 부하하였다. 이것을 Tris-glycine buffer \( (0.025 \mathrm { M } \) Tris \( \mathrm { HCl } , \mathrm { pH } \) 8.3, 190 \( \mathrm { mM } \) glycine, \( 1 \% \mathrm { SDS } \) )를 사용하여 \( 100 \mathrm { ~V } \) 에서 3 시간 동안 전기영동을 시행하였다.</p>