본 논문에서 트레할로스 생합성 유전자(\( \)otsBA) 발현 최적화를 위한 IPTG첨가시기 및 첨가량을 결정하기 위해, 벡터의 특성 및 기존 연구결과를 바탕으로 IPTG의 최적 첨가량 및 첨가 시기를 결정하기 위한 실험을 진행했다. 특히 최적화를 통하여 얻은 ALA 생산량은 순수 글리세롤이 첨가된 배지에서 얻은 값과 비슷한 수준을 나타내었다. 이는 폐글리세롤이 첨가된 배지에서 엔지니어링 균주의 세포생장 및 ALA 생산이 IPTG의 첨가량과 첨가 시기에 크게 영향을 받는다는 것을 의미한다. 본 연구에서는 ALA 생합성 유전자와 트레할로스 생합성 유전자의 공동 최적 발현을 유도하여, ALA 생산 균주의 폐글리세롤에 대한 저항성을 높임으로써 폐글리세롤을 탄소원으로 생산성의 저하없이 고부가치의 ALA를 생산 가능함을 증명했다.
<h2>트레할로스 생합성 유전자(\( \)otsBA) 발현 최적화를 위한 IPTG첨가시기 및 첨가량결정</h2> <p>\( h e m A \) 발현을 위해 사용된 \( p H C E I I B \) 는 대장균 증식에 따라 항시적으로 발현되는 벡터(constitutive expression vector)이므로 유도인자인 IPTG가 필요없다. 그러나 (\( \)otsBA) 발현을 위해 사용된 \( p S T V 28 \)은 외래 유전자의 발현이 lac 프로모터에 의해 조절되는 벡터로서, IPTG에 의해 유전자의 전사가 시작되는 특징을 갖는다. 따라서 \( p S T V 28 \)에 삽입된 외래 유전자의 발현 정도는 IPTG 첨가량 및 첨가 시기에 상당한 영향을 받는다. 유전자 발현을 최적 화시키기 위하여 일반적으로 다양한 농도 범위 \( (0.05-5 \mathrm{mM}) \)의 IPTG가 첨가 되고, 동일한 첨가농도라도 발현되는 호스트 균주, 벡터, 프로모터에 따라 발현도가 다르게 나타난다. 벡터의 특성 및 기존 연구결과를 바탕으로 IPTG의 최적 첨가량 및 첨가 시기를 결정하기 위한 실험을 수행하였다.</p> <p>본 연구에서는 배양 시작 직전 \( \left(\mathrm{OD}_{600}=0\right) \), 지수생장 초기 \( \left(\mathrm{OD}_{600}=3-4\right) \), 및 후기 \( \left(\mathrm{OD}_{600}=7-8\right) \)에 세 농도 범위 \( (0.2 \), \( 0.6,1 \mathrm{mM} \) )의 IPTG를 첨가하며 그 영향을 조사하였다. Table 3은 폐글리세롤이 첨가된 배지에서 IPTG 첨가 시기 및 첨가량에 따른 엔지니어링 균주의 세포 생장 및 ALA 생산농도을 나타낸다. 배양시작 직전 IPTG를 첨가한 경우 IPTG 농도 증가에 따라 ALA 생산량은 감소한 반면, 지수생장 초기와 지수생장 후기에 \( 0.6 \mathrm{mM} \)의 IPTG를 첨가한 경우에 다른 농도에서보다 상대적으로 ALA 생산량이 높았다. 또한 첨가시기에 관계없이 \( 0.6 \mathrm{mM} \)의 IPTG를 첨가한 경우 다른 농도에서보다 상대적으로 세포밀도가 높았다. 한편 지수 생장 초기에 \( 1 \mathrm{mM} \)의 IPTG를 첨가한 배양에서 비생산성 (specific productivity)은 \( 450.8 \mathrm{mg}-\mathrm{ALA} / \mathrm{g} \)-DCW로 \( 0.6 \mathrm{mM} \)의 IPTG를 첨가한 배양에서 얻은 \( 463.2 \mathrm{mg}-\mathrm{ALA} / \mathrm{g}-\mathrm{DCW} \)과 비슷하였으나 생산된 ALA 농도는 \( 0.6 \mathrm{mM} \)의 IPTG가 첨가 된 배양에서 얻은 값의 \( 65 \% \) 수준으로 낮았다. 이는 단위세포 당 ALA 생산능력은 우수하나 세포밀도가 낮았기 때문인 것으로 사료된다. 결과적으로 지수생장 초기에 \( 0.6 \mathrm{mM} \)의 \( \mathrm{IPTG}^{2} \) 첨가한 경우에 \( \mathrm{OD}_{600} \)와 생산된 ALA 농도가 각각 16과 \( 2121 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \)로 최대치를 나타내었다. 최적화 전보다 세포 밀도는 \( 8.3 \% \), ALA 생산량은 \( 57 \% \) 향상된 값이다. 주목할만한 사실은 최적화를 통하여 얻은 ALA 생산량은 순수 글리세롤이 첨가된 배지에서 얻은 값과 비슷한 수준을 나타내었다는 점이다. 이는 폐글리세롤이 첨가된 배지에서 엔지니어링 균주의 세포생장 및 ALA 생산이 IPTG의 첨가량과 첨가 시기에 크게 영향을 받는다는 것을 의미한다.</p> <p>일반적으로 \( 1 \mathrm{mM} \)의 IPTG를 첨가하는 경우에 유도 발현 벡터에 삽입된 외래유전자가 최대로 발현되는 것으로 알려져 있으나, 본 연구에서는 생산 균주의 세포생장 및 ALA 생산이 오히려 감소하였다. 재조합 대장균 배양에서 외래 유전자의 과도한 발현은 균주의 대사회로를 교란시킴으로써 세포에 대사부담(metabolic burden)을 주어 오히려 세포생장을 저해할 수 있다. 뿐만 아니라 ALA 생산균주는 \( p S \)-ots\( B A \) 이외에 ALA 생합성에 필요한 pH-hemA를 포함 하고 있기 때문에 ots\( B A \) 오폐론만을 과도하게 발현시키는 경우 ALA 생산량이 감소할 수 있다. 따라서 \( 0.6 \mathrm{mM} \)의 IPTG 첨가로 ots\( B A \) 오페론이 적절히 발현되어 세포생장, ALA 생합성, 트레할로스 생합성이 대사적 균형을 이루는 것으로 사료된다. 본 결과는 트레할로스 생합성 오페론의 발현을 최적화시킴으로써 트레할로스의 생합성을 유도하고 이의 세포 내 축적을 통해 ALA 생산성을 감소시키지 않으며 재조합 대장균이 폐글리세롤에 대한 저항성을 높일 수 있다는 것을 보여준다.</p> <p>본 연구에 사용된 폐글리세롤의 순도와 불순물들의 조성을 고려한다면, \( 20 \mathrm{~g} / \)의 폐글리세롤 첨가는 글리세롤 뿐만 아니라 \( 6.4 \mathrm{mM} \) 칼륨, \( 3.2 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 메탄올, 및 \( 3.9 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 지방산도 함께 제공하는 역할을 한다. 대장균에 대한 염화칼륨 \( (\mathrm{KCl}) \)의 최소저해농도(Minimum inhibitory concentration, MIC)는 \( 469 \mathrm{mM} \)이고 \( \mathrm{IC}_{50}(50 \% \) 저해 농도값)은 \( 205 \mathrm{mM} \)로 알려 졌다. 또한 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 이상의 메탄올이 대장균의 생장을 억제한다. 이러한 점을 고려한다면 \( 20 \mathrm{~g} / \)의 폐글리세롤이 함유된 배지에 존재하는 칼륨 또는 메탄올에 의해 세포 생장이 저해 받지 않을 것으로 사료된다. 불포화지방산은 많은 미생물들의 생장을 저해하는 것으로 알려져 있으나, 대장균은 폐글리세롤에 포함된 지방산의 주성분인 고급 불포화 지방산(C12-C18)에 대한 저항성을 갖는다. 그러나 폐글리세롤의 멸균과정에서 불포화지방산 산화로 발생된 퍼록사이드가 생산균주의 생장을 억제할 수 있다. 본 연구팀은 멸균 처리된 \( 20 \mathrm{~g} / 1 \)의 폐글리세롤이 첨가된 배지에 \( 8.1 \mathrm{mM} \)의 무기 퍼록사이드 \( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \)와 \( 18.8 \mathrm{mM} \) 유기 퍼록사이드 (tert-butyl hydroperoxide)가 존재하고 이들 퍼록사이드가 폐글리세롤의 독성을 유발하는 주된 성분임을 밝혔다. 본 연구에서 사용한 폐글리세롤이 선행연구에서 사용한 것과 동일한 회사에서 입수한 것이므로 성분조성들은 비슷할 것으로 추측된다. 대장균은 퍼록사이드에 노출될 경우, 세포를 보호하기 위하여 항산화효소를 합성하지만 유전자가 발현되어 효소가 합성되는데 상당한 시간이 소요되기 때문에 이 기간 동안 세포는 치명적인 손상을 입게 된다. 또한 합성된 항산화효소의 처리용량보다 많은 퍼록사이드가 존재할 경우, 미생물들은 심각한 스트레스 상황에 직면하여 세포 생장이 저해를 받는다. 그런데 트레할로스가 축적된 효모균 (Yeast)이 그렇지 않은 효모균에 비하여 퍼록사이드에 높은 저항성을 보였다. 이는 트레할로스가 퍼록사이드에 의한 지질과산화 반응을 방해함으로써 효모균(S. cerevisiae)의 세포막을 보호해주기 때문이다. Oku 등은 트레할 로스 분자가 불포화지방산 분자의 cis-olefin 이중결합과 상호작용을 통해 불포화지방산 분자를 안정화 시킴으로써 퍼 록사이드와의 반응성을 낮춘다고 보고하였다. 본 연구에서 는 ALA 생합성 유전자와 트레할로스 생합성 유전자의 공동 최적 발현을 유도하여 ALA 생산 균주의 폐글리세롤에 대한 저항성을 향상시킴으로써 폐글리세롤을 탄소원으로 생산성의 저하없이 고부가치의 ALA를 생산할 수 있음을 밝혔다.</p>