실험동물은 특정병원체부재 생쥐(C57BL/6)로 생후 68주된 암컷을 사용하며, 세포배양에는 RPMI 1640 배지, 항생제 및 FCS, 2-ME, sodium bicarbonate, MMC 등을 사용한다. 또한 세포증식의 측정에는 Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay를, 세포표면 단백질에 대한 특이항체는 anti-CD11c, CD40, CD86, MHC class II mAb 등을 사용한다. 황기, 백작약, 천궁, 가자, 당귀, 어성초 등의 한약재로부터 열수 추출물을 얻고, 생쥐 골수에서 분화 및 유도하여 수지상세포를 얻는다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험동물</h2> <p>실험동물은 대한실험동물센터(충북 음성)에서 공급받은 특정병원체부재(specific pathogen free) 생쥐(C57BL/6)로 생후 6 8주된 암컷을 사용하였고, 실험 전 까지 고형사료와 1차 중류수를 공급하면서 사육실에서 사육하였다.</p> <h2>사용시약</h2> <p>세포배양에 필요한 배지 RPMI 1640과 배지에 첨가하는 항생제(antibiotic-antimycotic), fetal calf serum (FCS)는 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였으며, 2-mercaptoethanol (2-ME), sodium bicarbonate \( \left ( \mathrm { NaHCO } _ { 3 } \right ) \), Mitomycin C (MMC)는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다. 또한 세포중식을 측정하는데 사용한 Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay은 Promega (Madison, WI, USA) 제품을 사용하였고, 세포표면 단백질에 대한 특이항체(anti-CD11c, CD40, CD86, MHC class II mAb) 는 Pharmingen (San Diego, CA, USA) 제품을 사용하였다. 골수세포를 수지상세포로 분화 유도하기 위해 사용한 GM-CSF와 IL-4는 R \&D (Mckinley Place NE, MN, USA) 제품을 사용하였다.</p> <h2>한약재 추출법</h2> <p>한약재(황기, 백작약, 천궁, 가자, 당귀, 어성초)의 열수 추출물은 다음과 같은 방법에 따라 실시하였다. 즉, 건조된 시료 \( 50 \mathrm { ~g } \) 을 분쇄하여 3차 증류수 \( 500 \mathrm { ml } \) 을 가한 뒤 rotary evaporator (BUCHI RE121, Switzerland)에서 3시간 전탕하여 추출하고 여과한 후에 \( 4 { } ^ {\circ } \mathrm { C } , 3,000 \mathrm { rpm } \) 에서 10 분간 원심분리하여 얻은 상층액을 감압 농축하였다. 그리고 저온에서 24시간 방치한 후에. membrane filter \( (0.22 \mu \mathrm { m } \), Whatman, Germany)로 여과하고, 여과된 생약재 열수 추출액을 freezer dryer룰 이용하여 완전 건조시킨 후 건조중량을 측정하였다. 건조된 시료를 \( \mathrm { PBS } \) 로 \( 50 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 로 희석하여 넹장 보존하면서 사용하였다.</p> <h2>수지상세포 배양</h2> <p>수지상세포는 다음과 같은 방법을 이용하여 생쥐 골수에서 분화 유도하여 사용하였다. 생쥐(C57BL/6)를 경추 탈골법으로 희생시킨 후 \( 1 \mathrm { ml } \) 주사기를 이용하여 대퇴골(femur)과 경골(tibia)안에 있는 골수를 분리한 다음 단일세포로 만들었다. 적혈구 용해 완충액(Tris-buffered ammonium chloride; \( 0.16 \mathrm { M } \mathrm { NH } _ { 4 } \mathrm { Cl } : 0.17 \mathrm { M } \) Tris =9:1)을 처리하여 적혈구를 제거한 후, washing용-역으로 \( 1,200 \mathrm { rpm } \) 에서 5 분간 3회 원심 분리하여 충분히 세척한 다음, \( \mathrm { GM } - \mathrm { CSF } (1,000 \mathrm { U } / \mathrm { ml } ) \) 와 \( \mathrm { IL } -4 \) \( (1,000 \mathrm { U } / \mathrm { ml } ) \) 가 포함된 배지(RPMI 1640, 10 \% FBS)에 골수세포 \( \left (1 \times 10 ^ { 6 } \right . \) cells \( / 5 \mathrm { ml } / \) well \( ) \) 를 6 well cell culture plate에서 배양하였다. 배양 4 일 후에 \( 1 \mathrm { ml } \) 의 배지와 동량의 \( \mathrm { GM } \)-CSF \( (1,000 \mathrm { U } / \mathrm { ml } ) \) 와 IL-4 \( (1,000 \mathrm { U } / \mathrm { ml } ) \) 를 첨가하고, 6 일 후 분화한 수지상세포를 회수하여 실힙에 사용하였다.</p>