ald 유전자는Mycobacteria의 alanine dehydrogenase를 암호화하는데, ald 유전자는 저산소 조건뿐만 아니라 Ala에 의해서도 발현이 유도된다. MV306lacZ가 mycobacteria내에서 효과적으로 작동하는지 알아보기 위한 방법으로 primer로 사용하여 ald의 promoter가 존재할 것이라 예상되는 \( 513 \mathrm { ~bp } \) DNA 단편을 얻은 후 절단하여 동일한 제한효소로 처리된 PCR 산물을 lacZ 유전자와 같은 방향으로 cloning하였는데 그 결과 pMV306lacZ는 안정하게 chromosomal DNA내로 삽입이 되어 유지되며, 유전자 발현 연구에 유용한 삽입 vector로서 작용하는 것을 알게 되었다.
<h2>pMV306lacZ를 이용한 M. smegmatis의 ald 유전자 발현 확인</h2> <p>Mycobacteria의 alanine dehydrogenase (EC 1.4.1.1)를 암호화하는 ald 유전자는 저산소 조건뿐만 아니라 alanine (Ala)에 의해서도 발현이 유도된다. 따라서 pMV306lacZ가 mycobacteria내에서 효과적으로 작동하는지 알아보기 위한 목적으로, pALDLACZ vector를 주형으로 F_ald_int (5'-ATTAAAGCTTGCCGCGCGCGTTGGATTG-3')와 R_ald_int (5'-CAAAGAATTCACCTCGTGACCTCTGCGG-3')를 primer로 사용하여 alanine dehydrogenase를 암호화하고 있는 MSMEG_2659 (ald) 유전자의 start codon 앞 \(398 \mathrm { ~bp } \)와 뒤 \( 97 \mathrm { ~bp } \)를 포함하는, ald의 promoter가 존재할 것이라 예상되는 \( 513 \mathrm { ~bp } \) DNA 단편을 얻은 후 pMV306lacZ을 EcdRI과 HindII로 절단하여 동일한 제한효소로 처리된 PCR 산물을 lacZ 유전자와 같은 방향으로 cloning 하였다 (pMV360lacZald). 구축된 pMV306lacZald를 이용하여 M. smegmatis wild type을 형질전환 시켰다. Kanamycin \(30 ~ \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)이 첨가된 \( 7 \mathrm { H } 9 \) 액체배지에서 \( \mathrm { OD } _ { 600 } \) 0.5~0.6까지 배양한 후, \(25 \mathrm { ~mM } \) L-alanine을 첨가한 다음 추가적으로 1시간 동안 배양하여 \( \beta \)-galactosidase 활성을 측정하였다. 실험결과, 배지에 alanine을 첨가한 조건에서 alanine이 존재하지 않는 조건에 비해 ald 유전자 발현에 의해 \( \beta \)-gal-actosidase의 활성이 29배 정도 증가한 것을 확인하였다. 또한 X-Gal을 포함하는 \( 7 \mathrm { H } 9 \) 고체배지에서도 alanine이 존재하는 경우 \( \beta \)-galactosidase의 활성에 의해 colony의 푸른색 정도가 진해짐을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과들을 통해 pMV306lacZ는 안정하게 chromosomal DNA내로 삽입이 되어 유지되며, 유전자 발현 연구에 유용한 삽입 vector로서 작용하는 것을 알 수 있었다.</p> <h2>pTnMod-OKmTs 구축</h2> <p>pTnMod-OKm vector를 주형으로하여 minitransposon과 transposase, 그리고 E. coli 복제시작점 영역을 포함하는 vec-tor 부분인 \( 3775 \mathrm { ~bp } \)를 양 말단에 SphI, BamHI 제한효소 자리를 갖도록 두 primer (pTnMod_OKm_F, 5'-GAAAGCATGCACCATTCCTTGC-3'과 pTnMod_OKm_R, 5'-ATATGGATCCCATCACCAATTTCCTTTG-3')를 이용하여 inverse PCR을 통해 얻어냈다. 또한 pAL500Ts는 이를 포함하고 있는 \(2,808 \mathrm { ~bp } \)의 DNA 단편을 pDE vector를 주형으로 하여, primer set인 BamHI site를 포함하는 pAL500Ts_F (5'-AATTGGATCCCACCGCTCAGCTGCGCAC-3')와 SphI site를 포함하는 pAL500Ts_R (5'-GGCCGCATGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAG-3')을 사용한 PCR을 통해 얻었다. PCR을 통해 얻어진 vector 부위와 pAL500Ts를 포함하는 DNA 단편을 SphI과 BamHI을 처리한 다음, ligation을 통해 pTnMod-OKmTs vector ( \( 6,563 \mathrm { ~bp } \))를 구축하였다.</p>