Morris water maze(MWM)를 사용해 두 그룹에서 운동군과 비운동군의 뇌 인지기능 효과를 검증하는 실험을 실시했다. 다음으로 트레드밀 훈련 전/후 각각 꼬리 정맥에서 혈액 \( 1 \mathrm{ml} \)를 채혈해 혈청지질성분 및 8-OHdG를 분석했다. 효소법을 이용하는 정량용 kit로 TC, TG, HDL-C 함량을 측정하고, DNA damage ELISA kit를 써서 산화적 DNA 손상 지표로 쓰이는 8-OHdG를 측정했다. 본 연구로 얻은 모든 데이터는 SPSS Windows Ver 14.0 통계 package를 활용해, 모든 측정항목에 대하여 평균과 표준 편차를 도출해 기록하였다.
<h2>공간적 인지학습 능력</h2> <p>두 그룹 내 운동과 비운동군 뇌 인지기능의 효과를 검증하기 위해 Morris water maze (MWM)를 사용하였다. 실험 절차는 미로학습 검사를 시작하기 하루 전에 도피대가 없는 상태에서 수영풀 안을 60초 동안 자유롭게 수영하도록 하여 물에 대한 적응을 유도하였으며, 훈련이 시작되면 동물은 4 사분면 중 한쪽에서 동물의 머리가 벽면을 향하도록 하여 살며시 물 안으로 놓아주어, 2그룹 모두 3일 동안 총 6회 실시하여 platform을 찾아 올라갈 때까지의 잠재기를 측정하였다.</p> <h2>채혈 및 조직 샘플링</h2> <p>트레드밀 훈련 전과 후에 꼬리 정맥에서 \( 1 \mathrm{ml} \) 의 혈액을 채혈하였으며, 혈청지질성분과 8-OHdG를 분석하였다. 트레드밀 훈련 후 채혈과 조직샘플링은 일시적인 운동 효과를 배제하기 위해, 훈련종료 48 시간 경과 후에 실시하였으며, 사료는 12 시간 전에 공급을 중단하였지만, 음수는 계속 제공하였다. 실험동물들은 충분한 안정을 취한 뒤 마취제 에틸에테르 (ethyl ether)를 이용하여 마취 시켰다. 마취된 실험동물은 해부판 위에 사지를 고정시키고, \( 70 \% \) 알코올 분무기로 분무한 후, 복부를 절개하여 복부 정맥에서 \( 10 \mathrm{ml} \) 의 정맥혈을 채혈하였으며, 이후 약 \( 3 \mathrm{~g} \) 의 해마와 \( 5 \mathrm{~g} \) 의 간을 샘플링 하였다. 두 조직은 deepfreezer (MVE Co., USA)에 넣어 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 상태로 보관한 뒤 분석하였다.</p> <h2>생화학적 분자생물학적 분석</h2> <h3>Lipid profiles</h3> <p>TC, TG 및 HDL-C 함량은 효소법에 의한 정량용 kit (각각 AM201-K, AM202-K, AM157S-K, AM203-K, Asan Co., Korea)로 측정하였다. 혈청 \( 0.002 \mathrm{ml} \) 에 효소용액 \( 0.3 \mathrm{ml} \) 를 첨가하여 교반하고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 수조에서 5 분간 반응시켜 발색시킨 후 blank를 대조로 하여 분광광도계(UVmini-1240, Shimadzu Co., Japan)로 흡광도를 측정하였다.</p> <h3>8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG)</h3> <p>산화적 DNA 손상의 지표로 이용되는 8-OHdG는 DNA damage ELISA kit (Assay Designs, USA)로 측정하였다. Sample diluent에서 8-OHdG standard와 sample을 준비한 다음, 8-OHdG immunoassay plate의 각 well에 standard와 sample을 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하였으며, 각 well에 anti-8-OHdG를 \( 50 \mathrm{\mu l} \) 첨가하였다. 그 후 1 시간 실온에서 incubate하고, wash buffer \( 300 \mu \mathrm{l} \) 6 번 씻어낸 다음, 각 well에 anti-Mouse IgG: HRP cohjugate를 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 첨가하였다. 그 후 다시 1 시간 동안 실온에서 incubate 한 후, 각 well에 TMB substrate \( 100 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하였다. 다시 실온에서 15 분 동안 incubate 한 후, \( 450 \mathrm{~nm} \)흡광도를 통해 측정하였다.</p> <h3>Western blot</h3> <p>인지기능의 주요 담당과 초기 발현 단백질의 발현이 가장 두드러진 Hippocampus (c-fos, c-jun, Erk, BDNF, NGF)와 산화적 스트레스를 조절하는 liver (MDA)의 protein을 분리하기 위해서 radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer [\(50 \mathrm{mM} \) Tris-HCl, \(\mathrm{pH} 8.0\), with \( 150 \mathrm{mM} \) sodium chloride, \( 1.0 \% \) Igepal CA-630 (NP-40), \(0.5\%\) sodium deoxycholate, \( 0.1 \%\) so-dium dodecyl sulfate, Protease Inhibitor Cocktail and Phosphatase Inhibitor Cocktails] \( 200 \mu \mathrm{l} \) 를 넣고 homogenazer로 조직을 균질화한 다음, 30분간 ice incubation하여 hippocampus를 융해시키고, \( 13,000 \mathrm{rpm}\), 30분간 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 원심분리하여 상층액만을 깨끗한 e-tube에 옮기고 사용하기 전 까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다. Western blot 실험을 시작하기 전 \( \mathrm{BCA}^{\mathrm{TM}} \) protein assay kit (PIERCE, IL)로 단백질을 정량한 다음 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에 로딩하여 전기영동을 하고 \( 100 \mathrm{~V} \) 에서 membrane에 옮긴 후 \( 5 \% \) SKIM MILK로 blocking하였다. 1차 antibody NGF (sc-548)와 BDNF (sc-546), b-actin (sc-1616) (Santa Cruz biotechnology, Santa, CA, USA), Erk (AF 1576), c-fos, c-jun (R&D system, Minneapolis, MN, USA, MDA 를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 overnight 반응하였으며, 2차 antibody를 실온에서 1시간 반응한 뒤 ECL solution (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)으로 발색한 뒤 LAS-3000으로 단백질 발현을 확인하였다.</p> <h2>자료처리</h2> <p>본 연구에서 얻은 자료는 SPSS Windows Ver 14.0 통계 package를 이용하여, 모든 측정항목에 대해 평균과 표준 편차를 산출하였다. 집단 간의 트레이닝에 따른 혈액성분에 대한 차이검증을 위해 이원분산 분석(two-way ANOVA)을 이용하였으며, 시기 간 차이가 있을 시 대응표본 t-test를 실시하였고, 집단 간 차이가 있을 시 독립표본 t-test를 실시하였다. 조직분석은 독립표본 t-test를 실시하였으며, 모든 통계적 유의 수준 은 \( a=0.05 \) 로 설정하였다.</p>