본 연구에서는 uracil 영양요구성 변이주이며 haploid인 Saccharomyces cerevisiae 2805와 plasmid 구축 및 증폭을 위한 E.coli DH5 \(\alpha\) 를 사용하였다. 효모 형질전환체의 1차 선별을 위한 SD 배지를 사용하였으며, CGTase의 활성은 Methyl Orange 법을 통해 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주 및 plasmids</h2> <p>본 연구에 사용한 효모 숙주세포는 uracil 영양요구성 변이주이며 haploid인 Saccharomyces cerevisiae 2805 (MAT a pep4::HIS3 prb1-1.6R can1 GAL2, his3-200 ura3-52)를 사용하였으며, plasmid 구축 및 증폭을 위한 숙주세포는 E. coli DH5 \(\alpha\) 를 사용하였다. CGTase 유전자 공여 plasmid는 pET21에 Bacillus macerans IAM 1243의 CGTase 유전자 (cgtM)가 subcloning된 pTCGT1을 사용하였다. 효모 발현용 vec-tor는 구성적 ADH1 promoter를 가진 pVT103-U를 사용하였다.</p> <h2>재조합 plasmid 제작 및 형질전환</h2> <p>pTCGT1 plasmid를 BamHⅠ과 SalⅠ으로 처리하여 CGTase 유전자를 함유하는 \(2.28 \mathrm{kb} \)의 단편을 얻은 다음, BamHⅠ과 XhoⅠ으로 미리 절단한 pVT103-U vector에 subcloning하였다. 구축된 재조합 plasmid pVT-CGTM (\(9.15 \mathrm{kb}\)) 은 S. cerevisiae 2805 숙주세포에 lithium acetate 법으로 형질 전환시켰다.</p> <h2>효모 형질전환체 선별 및 배양조건</h2> <p>효모 형질전환체의 1차 선별을 위한 배지로는 SD 배지 (\(0.67\%\) Bacto-yeast nitrogen base without amino acids, \(0.5\%\) Casamino acids, \(2\%\) dextrose)를 사용하였다. SD 배지에서 선별된 호모세포를 \(0.25\%\) starch azure 함유 YPD 고체배지 (\(1\%\) yeast extract, \(2\%\) Bacto-peptone, \(2\%\) dextrose, \(1.5\%\) agar)에서 배양하여 가장 큰 starch 분해환을 보이는 균주를 2차 선별하였다. 탄소원의 영향은 YP 배지에 dex-trose와 starch를 농도별로 첨가한 배지로 조사하였다. Flask 배양에서는 \(500\mathrm{mL} \) baffled-flask (working volume; \(50 \mathrm{mL})\)로 \(30^{\circ}\mathrm{C} \), \(170 \mathrm{rpm} \)에서 수행하였다.</p> <h2>균체농도와 Plasmid 안정성</h2> <p>균체 농도는 채취한 배양액을 적당한 비율로 희석하여 분광광도계 (Shimadzu UV-160A, Japan)를 사용하여 \(600 \mathrm{nm} \) 에서 흡광도(\( \mathrm {OD}_{600}\))로 측정하였다. Plasmid 안정성은 배양역을 적당히 희석하여 YPD 평판배지에 도말한 후 자란 100개의 colony를 SD 선별배지로 toothpicking한 다음 형성된 colony 수의 비로 측정하였다.</p> <h2>CGTase 활성 측정</h2> <p>CGTase의 활성은 Leujeune 등에 의해 제안된 Methyl Orange 법으로 측정하였다. 효소반응은 \(3 \mathrm{ml} \)의 \(50 \mathrm{mM} \) 인산염 완충액 (\( \mathrm{pH} 6.0\))에 soluble starch와 Methyl Orange 최종농도가 각각 \(1 \%\)와 \(0.035 \mathrm{mM} \)이 되도록 첨가하여 잘 섞고, 이 혼합액에 효소 용액을 가하여 \(50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시켰다. 반응 후 \(6 \mathrm{N} \mathrm{~HCl} \)을 가하여 반응을 정지시키고 반응액을 \(16^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 방치한 후 \(505 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 효소활성은 위와 같은 조건에서 분당 \(1 \mu \)mole의 \( \alpha\)-CD 를 생성하는 효소량을 1 unit로 정의하였다. 비활성도(specific activity)는 각 효소 활성을 세포농도(\( \mathrm {OD}_{600}\))값으로 나누어서 계산하였다.</p>