감꼭지 추출물과 분획물이 멜라노마 세포 생존율에 미치는 영향을 연구하였다. 그 결과, 두 가지 물질 모두 \( 5 ~\mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 농도에서 세포 생존율이 \( 90 \% \) 이상임을 확인하였다. 또한, 세포 내 티로시나아제 및 멜라닌 생성에 대한 억제 효과를 측정하였으며, 에틸아세테이트 분획물이 효과적임을 입증하였다. 추가적으로, western blot을 통해 멜라닌 생성에 관여하는 단백질의 발현 양상을 분석하였으며, 감꼭지 추출물과 에틸아세테이트 분획물이 각각 티로시나아제, TRP-1, TRP-2의 발현을 저해함을 확인하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>세포 생존 능력 측정</h2> <p>세포 수준의 연구에 많이 이용되고 있는 MTT assay는 세포 증식과 생존능의 in vitro 분석에 매우 유용하게 사용되고 있다. 감꼭지 추출물과 분획물에 의한 멜라노마 세포의 생존율을 확인한 결과, 추출물과 분획물 모두 \( 5 ~\mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 \( 90 \% \) 이상의 세포 생존율을 확인하였다. 따라서 본 실험을 바탕으로 B16F10 세포에 \( 1\),\(5 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 농도를 처리하여 멜라닌 생합성, 티로시나아제 활성 측정 및 단백질 발현정도 실험을 진행하였다.</p> <h2>멜라닌 생성 억제 효과</h2> <p>감꼭지 추출물과 분획물의 멜라노마 세포에서의 멜라닌 생성 억제 효과를 측정한 결과를 Fig. 2와 같이 나타내었다. 측정 결과 감꼭지 추출물은 \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 무첨가군에 비해 멜라닌 생성을 \( 13.2 \% \) 저해하였고, 합성 미백원료인 코직산은 같은 농도에서 \( 17.2 \% \) 저해하는 것을 관찰하였다. 분획물의 경우 \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 비교하였을 때, 에틸아세테이트 >헥산 >부탄올 >물 순으로 멜라닌 생성이 억제되었고, 그 중 감꼭지 에틸아세테이트 분획물의 경우 \( 5 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 \( 43.2 \% \)의 멜라닌 생성을 억제하여 가장 뛰어난 활성을 관찰하였다. Jung 등이 보고한 푸코이단의 경우 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 B16F10 세포 내 멜라닌 생성을 \( 29.1 \% \) 억제한 결과와 비교하면 감꼭지 에틸아세테이트 분획물은 저농도에서 높은 활성을 나타내어 피부 색소 침착에 효능이 있는 미백 소재로 이용 가능할 것이라 사료 된다.</p> <h2>티로시나아제 활성 측정</h2> <p>티로시나아제는 피부가 자외선에 노출되면 티로신에서 멜라닌 생성에 가장 중요하게 작용하는 효소로써 티로시나아제 활성을 저해함으로써 멜라닌 생성을 억제 할 수 있으며 이로 인해 기미, 주근깨, 노인성 홍반 등의 유발을 막을 수 있는 것으로 알려져 있다. 감꼭지 추출물과 분획물을 농도 별로 처리 후 세포 내 티로시나아제 활성 측정 결과는 Fig. 3과 같다.</p> <p>감꼭지 분획물의 티로시나아제 활성은 \( 5 ~ \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 비교하였을 때, 부탄올 분획물의 경우 무첨가군에 비해 \(34\%\), 에틸아세테이트 분획물의 경우 \( 32 \% \) 활성이 저해되어 비슷한 결과를 관찰 할 수 있었다. 코직산의 경우 \( 5 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 무첨가군 보다 세포 내 티로시나아제 활성이 \(9.3\%\) 저해함으로써 합성 미백원료 보다 감꼭지 분획물의 티로시나아제 저해활성 효과가 더 우수하였다.</p> <h2>Western blot을 이용한 단백질 발현의 측정</h2> <p>감꼭지 추출물과 분획물을 처리 후 세포 내 티로시나아제 저해와 멜라닌 생성 억제 효과를 측정하여 에틸아세테이트 분획물의 우수한 효과를 입증하였다. 이와 같은 결과를 토대로 에틸아세테이트 분획물의 멜라닌 생성에 관련된 단백질 발현과의 연관성을 확인하기 위하여 western blot을 이용하여 티로시나아제, TRP-1, TRP-2의 발현 양상을 측정하였다. 이 중 TRP-1, TRP-2는 DHICA (5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid)를 흑갈색으로 나타내는 IQCA (indole-5,6-qui-none-2-carboxylic acid)로 전환시켜 최종적으로 멜라닌을 합성시키는 역할을 하며, 이들은 피부 미백제의 효능에 있어서 멜라닌의 생성을 억제하는 경로와 생성된 멜라닌의 분해를 촉진하는 단계에 관여하는 효소의 활성 조절이 중요시 되고 있어 미백 효과의 검증 방법으로 널리 이용되고 있다. 감꼭지 에틸아세테이트 분획물을 1, 5 \(\mathrm{~\mu g} / \mathrm{ml} \)으로 처리하였을 때 무첨가군에 비해 유의성 있게 억제하였다. 티로시나아제의 경우 감꼭지 에틸아세테이트 분획물 \( 5 \mathrm{~\mu g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 무첨가군에 비해 \( 44 \% \) 발현을 저해하였고, TRP-1의 경우 \( 5 \mathrm{~\mu g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 무첨가 군에 비해 \( 34 \% \) 발현을 저해하였고, TRP-2의 경우 \( 18 \% \) 저해함을 나타내었다. 김 등이 보고한 섬쑥부쟁이 에틸아세테이트 분획물의 경우 \( 100 \mathrm{~\mu g} / \mathrm{ml} \)의 농도를 처리하였을 때, 티로시나아제가 \(30.5\%\) 저해하였고, TRP-1의 경우 \( 41.5 \% \) 저해한 결과와 비교하였을 때 감꼭지 에틸아세테이트 분획물의 경우 저농도에서 높은 활성을 나타내어 미백 효과가 우수한 것으로 사료된다.</p>