phenol-chloroform 추출 기법을 사용하여 RNA 추출 후, PCR을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 그리고 real-time PCR을 통하여 mRNA 발현량을 측정하였다. target mRNA 발현량은 house keeping gene인GAPDH의 CT값으로 상대 정량하여 보정하였다. 일원배치분산분석을 통해 단백질 발현과 mRNA 발현의 유의성을 검증했고, Tukey's 사후검정을 통해 집단 간에 유의한 차이가 있는지 검증하였다.
<h2>RNA 추출 및 cDNA 합성</h2> <p>RNA를 추출하기 위하여 TRIzol 용액(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)을 이용한 phenol-chloroform 추출 기법을 사용하였다. TRIzol 용액을 well당 각각 \( 1 \mathrm{ml} \)씩 넣고, \( 200 \mu \mathrm{l} \)의 chloroform을 처리하여 잘 섞어준 뒤 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(13,000 \mathrm{rpm} \)에서 15분 동안 원심분리를 하였다. 상층액을 분리하여 isoprophanol과 1:1 비율로 섞어준 뒤, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), \( 12,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리를 하였다. 생성된 pellet을 DEPC로 희석한 \( 75 \%\) ETOH에 씻어내고, \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(12,000 \mathrm{rpm} \)에서 5분간 원심분리를 하였다. 최종 추출된 pellet을 상온에서 10분간 말린 뒤 ultra pure water \( 60 \mu \mathrm{l}\)에 녹인 후, UV 흡광도 \( 260 \mathrm{~nm} \)에서 농도를 측정하였다. cDNA를 합성하기위해 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mu \mathrm{l} \)의 RNA를 \( 5 \times \) buffer \( 4 \mu \mathrm{l} \), random primer \( 2 \mu \mathrm{l} \), \( 2.5 \mathrm{mM} \) dNTP \( 2 \mu \mathrm{l} \), Rnase inhibitor \( 0.5 \mu \mathrm{l} \), 그리고 reverse transcriptase \( 0.25\mu \mathrm{l} \) (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)와 혼합하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C}\) 10분, \( 42^{\circ} \mathrm{C}\) 60분, 그리고 \( 95^{\circ} \mathrm{C}\) 5분간 PCR을 이용해 cDNA를 합성하였다.</p> <h2>Real-time quantitative PCR</h2> <p>GRIP-1과 SRC-1, 그리고 ARA70 messenger RNA (mRNA) 발현을 측정하기 위하여 double-stranded DNA dye인 SYBR Green PCR master mix (Finnzyme, Espoo, Finland)를 이용하여 real-time PCR을 실시하였다. 실험에 사용한 primer sequence는 Table 1에 제시하였으며, 모든 Primer는 코스모사(Cosmo Genetech, KOREA)에서 제작 및 구입하여 사용하였다. 모든 real-time PCR 분석은 ABIPRISM 7700 system (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA)을 이용하였으며, 모든 샘플은 3회 반복 실험하여 합성시킨 cDNA를 각각 2회 이상 반복 측정하였다. \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 15초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 1분간 40 cycle을 측정하여 CT값을 구하고, 융해 곡선 확인을 위해 40 cycle 이후 dissociation stage를 추가하여 \( 95^{\circ} \mathrm{C}\) 15초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 1분의 조건을 2번 반복하여 현광 signal의 크기를 측정하였다. 반응이 완료된 후 증폭곡선의 S 커브가 급격히 올라가는 지점과 CT값이 추출된 지점이 일치하였음을 확인하고, 융해 곡선 그래프에서 단일 산물이 증폭 되었음을 확인한 뒤 최종적으로 CT값을 데이터로 처리 하였 다. 결과는 상대 정량법인 단순 CT값 비교 분석 방법을 사용하였다. 따라서 target mRNA 발현양은 house keeping gene으로 많이 사용되고 있는 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GAPDH의 CT값으로 상대 정량하여 보정하였다.</p> <h2>자료처리</h2> <p>IGF-I 처리와 p38 MAPK 억제제인 SB203580, ERK1/2 억제제인 PD98059 처리에 따른 C2C12 세포에서의 엔드로젠 수용체 coactivator 유전자들의 단백질 발현과 mRNA 발현의 유의성 검증을 위하여 SPSS 12.0 for window를 이용하여 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였으며, 집단 간에 유의한 차이가 있는지를 검증하기 위하여 Tukey's 사후검정을 실시하였다\( (p<0.05) \).</p>