3T3-L1 전지방세포의 DMEM 배지로 배양 후 세포분화 배지를 통해 세포분화를 유도하였다. 그 다음에 Oil red O 염색시약으로 세포를 염색을 한 후 현미경을 통해 관찰 및 세포에게서 추출한 염색시약의 흡광도를 ELISA reader로 측정하였다. 이 측정된 흡광도와 시료 처리를 하지 않은 대조군의 흡광도의 비로 지방 축적율을 구하였다.
<h3>세포분화 유도 및 Oil red \( \mathrm{O} \) 염색을 통한 지방축적량 측정</h3><p>3T3-L1 전지방세포를 \( 1 \times 10^{4} \mathrm{cell} / \mathrm{ml} \)의 suspension 용액으로 만들어 6-well plate에 분주한 후 \( 10 \% \) BS 및 \( 1 \% \) P/S가 포함된 DMEM 배지를 2일 주기로 교체하면서 배양하였다. 세포가 confluent된 후 48시간 더 배양 한 다음 DMEM, \( 10 \% \) FBS (fetal bovine serum), \( 1 \% \) P/S, \(10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) insulin, \( 1 \mu \mathrm{M} \) dexamethasone 및 \( 0.5 \mathrm{mM} \) isobuthylmethylxanthine이 첨가된 배지로 교체하여 분화를 유도하였다. 여기에 시료 추출물을 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 처리한 다음, \( 5 \% \mathrm{CO}_{2}\), \(37^{\circ} \mathrm{C} \) 조건의 incubator에서 2일간 배양한 후, 분화유지 배지(DMEM, \( 10 \% \) FBS, \( 1 \%\) P/S, \(10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) insulin)로 교체하고 시료 추출물을 \( 100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 재처리하였다. 다시 48시간 후 DMEM, \( 10 \%\) FBS, \(1 \%\) P/ S 및 시료추출물을 함유한 배지로 교환한 후 2일 간격으로 8일 동안 배양하였다. 최종 배양 후 배지를 제거하고, 세포를 고정시키기 위해 \( 10 \% \) formaldehyde를 \( 500 \mu \mathrm{l}\)씩 well에 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 유지시켰다. Formaldehyde를 제거하고 PBS로 세 번 씻어낸 후 Oil red O (Sigma Co., St. Louis, MO, USA)를 isopropyl alcohol에 \( 0.5 \% \) 농도로 용해한 후 증류수와 \( 3: 2\)\((\mathrm{v}: \mathrm{v}) \)의 비율로 혼합하여 제조한 염색시약을 \( 500 \mu \mathrm{l}\)씩 가하여 상온에서 1시간 동안 염색하였다. 염색된 세포는 PBS로 3번 세척한 후 현미경(Ⅸ71,Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였으며, 지방에 염색된 염색시약을 isopropyl alcohol로 추출하여 ELISA reader (Victor \( { }^{\mathrm{TM}} \) X3, Perkin Elmer, USA)로 \( 595 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도 값을 측정하였다. 지방 축적율은 시료를 처리하지 않은 대조군의 흡광도 값에 대한 시료 처리군의 흡광도 값의 비로 나타내었다.</p><h3>통계처리</h3><p>반복 실험하여 얻은 결과는 SPSS 12.0 package를 사용하여 분산분석 하였으며, 결과는 평균 \( \pm \) 표준편차로 나타내었다. 각 실험군에 대한 유의성 검정은 분산분석을 한 후 \( p<0.05 \) 수준에서 Duncan's multiple test를 실시하였다.</p>