HepG2 세포에서 약물 처리 후, lysis buffer를 사용하여 전체 단백질을 추출하였으며, 이후 Western blot analysis로 세포질 및 핵 단백질 오염을 측정하였다. histone과 \( \beta \)-actin에 대한 항체를 사용하여 분석하였고, 비특이적인 항체 부착을 막기 위해 skim milk에 Membrane을 한 시간 동안 담근 후, 일차 항체와 HRP가 부착된 2차 rabbit 항체를 반응시켰다. 이후, 부착된 면역복합체는 ECL kit를 사용하여 단백질 발현을 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약</h2> <p>CoPP, DPI, protease inhibitor cocktail, hemin, L-gluta-thione monoethyl ester (GSHmee)은 Sigma Cheminal Co.(St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다. HO-1, Nrf2, \( \beta \)-actin에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA,USA) 제품을 구입하였다. Bach1과 p47 \( { } ^ {\text { phox } } \) 에 대한 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. Enhanced chemiluminescence (ECL) Western blotting kit는 Amersham Pharmacia Biotech. (Piscataway,NJ, USA) 제품을 사용하였다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>실험에서 사용된 인간 간암세포주 HepG2는 한국세포주은행에서 구입하였다. 세포배양에 필요한 minimum essential medium (MEM), fetal bovine serum (FBS), 항생제, tryp-sin-EDTA는 HyClone Laboratories Inc. (Logan, UT, USA) 제품을 구입하여 사용하였으며, HepG2 세포는 10 \( \% \) FBS, 100 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) streptomycin/ 100 \( \mathrm { U } / \mathrm { ml } \) penicillin이 함유된 MEM 배양액에서 5 \( \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건에서 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) incubator에서 배양하였다.</p> <h2>Western blot analysis</h2> <p>약물을 처리한 HepG2 세포를 PBS로 세척한 후, protease inhibitor cocktail를 포함한 lysis buffer (50 \( \mathrm { mM } \) Tris-HCl \( \mathrm { ~pH } \)7.4, 150 \( \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } \), 1 \( \% \) Nonidet P-40)를 첨가하여 세포의 전체 단백질을 추출하였다. Bicinchoninic acid를 이용하여 정량하고, 동일한 양의 단백질을 10 \( \% \) SDS-polyacrylamide gel에 전기영동한 후, electroblotting apparatus (Bio-Rad, Richmond, CA, USA)를 이용하여 단백질을 nitrocellulose membrane에 이동시켰다. Membrane은 항체의 비특이적인 부착을 막기 위하여 5 \% skim milk에 1 시간 동안 두었고, 그 후 필요한 일차 항체 및 horse radish peroxide HRP가 부착되어 있는 2차 rabbit 항체를 반응시켰다. 부착된 면역복합체는 ECL kit를 사용하여 Fujifilm Las3000 (Fujifilm, Tokyo,Japan) 기기에서 단백질 발현을 분석하였다.</p> <h2>세포질 및 핵 단백질 분리</h2> <p>약물을 처리한 세포를 PBS로 세척한 후, Fermetas(Waltham, MA, USA) 제품인 ProteoJET \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) Cytoplasmic and Nuclear Protein Extraction Kit를 이용하여 제조사가 추천하는 protocol에 의거하여 세포질과 핵 단백질을 분리하였다. 분리된 각각의 단백질은 bicinchoninic acid를 이용하여 단백질을 정량하였다. 그리고 Western blot analysis를 이용하여 분석하였고, 세포질 및 핵 단백질 오염을 측정하기 위하여 histone과 \( \beta \)-actin에 대한 항체를 각각 사용하였다.</p>