한천분해 활성을 가지는 세균을 분리하기 위해 한천을 추가한 Marine broth 2216배지에 남해 바다에서 얻은 시료액을 바르고 배양하여 배지를 함몰시키는 SH-1 균주를 순수분리하여 균체의 DNA를 얻고, PCR 반응으로 16SrDNA 유전자 조각을 증폭시켰다. DNA 염기서열을 분석하여 이미 보고된 균주들과의 유사도를 검토하여 계통분류학적 지위를 알아보았다. 한천분해 균주의 시간에 따른 생육과 효소의 활성을 측정하는 실험으로 균주를 진탕배양기에서 배양할 때 한천을 추가한 후 12시간마다 배양액을 조사하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>한천분해 균주의 분리 및 동정</h2> <p>경상남도 남해군 미조면 연안에서 한천분해활성을 가지는 세균의 분리를 위한 시료를 채취하였으며, Marine broth 2216 (Difco, USA) 배지에 한천을 첨가한 Marine agar 2216 배지에 시료액을 도말한 후 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하면서 한천분해활성으로 Marine agar 2216 배지를 함몰시키는 SH-1 균주를 3차례 이상 순수분리하여 선별하였다. 순수분리된 균체로부터 Wizard Genomic DNA Isolation Kit (Promega, WI, USA)를 사용하여 genomic DNA를 획득하고, 16SrDNA 유전자 단편을 증폭하기 위한 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. PCR primer로는 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1492R (5'-TAC GGH TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 사용하였으며, 증폭된 DNA 단편은 PCR/Gel Combo Kit (NucleoGen, Korea)로 정제하였다. DNA 염기서열 분석은 Cosmo Genetech (Korea)에서 수행하였다. 분석된 염기서열은 BLAST를 사용하여 보고된 균주들과 유사도를 검토하였으며, Clustal 프로그램(ClustalW2)을 이용하여 다중염기배열(multiple alignment)을 수행한 후 Neighbor-joining method와 Bootstrap method \( (n = 1,000) \)로 분석하여 계통분류학적 위치를 파악하였다.</p> <h2>한천분해 균주의 배양</h2> <p>Marine broth 2216 배지 \( 4 \mathrm { ~ml } \)에 순수분리한 SH-1 균주를 접종한 후 진탕배양기를 이용하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } , 250 \mathrm { rpm } \)에서 하룻동안 진탕배양한 후, \( 0.2 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \)의 agar가 첨가된 Marine broth 2216 배지 \( 50 \mathrm { ~ml } \)가 들어있는 삼각플라스크에서 진탕 배양기를 이용하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } , 250 \mathrm { ~rpm } \)에서 3일 동안 진탕배양하였다.</p> <h2>배양시간에 따른 한천분해 균주의 생육과 효소활성 측정</h2> <p>Marine broth 2216 배지 \( 100 \mathrm { ~ml } \)에 \( 0.2 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \)의 agar를 첨가한 후 SH-1 균주를 접종하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } , 250 \mathrm { ~rpm } \)에서 진탕 배양하였고, 12시간마다 일부 배양액을 수득하여 시간에 따른 한천분해 균주의 생육과 효소의 활성을 측정하였다.</p>