본 연구는 알팔파 형질전환체에서 t-PA 특이 RNA와 재조합 t-PA 단백질의 발현양을 측정하였다. RT-PCR과 ELISA 방법을 통해, 알팔파 형질전환체에서는 재조합 t-PA 단백질의 항원력 및 발현양이 확인되었다. 그러나 이들의 발현량이 상대적으로 낮게 나타난 이유는 식물체 내의 프로테아제에 의해 t-PA 단백질이 분해되었기 때문으로 추정하였다.
<p>알팔파 형질전환체내의 전체 RNA중에 t-PA 특이 RNA의 전사 유무를측정하고자 RT-PCR을 실시한 결과, t-PA에 특이적인 band를 확인할 수 있었다 (Fig. 4. lanes 5-10). 또한 각각의 발현 벡터를 이용하여 PCR 실험 결과, \( 1.6 \mathrm { ~kb } \) 의 크기의 band를 확인할 수 있었다 (Fig. 4A-4F, lane 2). 음성 대조군으로 야생종 알팔파를 사용하여 RT-RCR 증폭을 실시한 결과 t-PA 유전자에 상응하는 band를 확인 할 수 없었다 (Fig. 4A-4F, lane 3). 또한 RNA 시료에 t-PA 특이 유전자가 오염되어 있는지 알아보기 위해서 DNase로 처리된 시료를 사용하여 PCR을 실시한 경우에서도 t-PA에 상응하는 band를 볼 수 없었다 (Fig. 4A-4F, lane 4).</p> <h1>재조합 t-PA 및 파생 단백질들의 생화학적 분석</h1> <h2>재조합 단백질 발현양 측정</h2> <p>알팔파 형질전환체 잎의 추출물내에 재조합 t-PA 및 t-PA 파생단백질들의 전체 수용성 단백질내의 재조합 t-PA 단백질의 항원력 및 발현양을 측정하기 위해서 ELISA를 실시하였다. 결론적으로 8-27 개의 알팔파 형질전환체의 추출물은 측정 가능한 재조합 t-PA 단백질 발현양을 나타내었다. 알팔파 형질전환체별 평균 발현양은 \( 39.5 \) (p221a-t-PA), \( 30.1 \) (p221a-t-PAER), \( 17.3 \) (p221a-t-PAHis \( { } _ { 6 } \) ), \( 23.1 \)(p221a-st-PA), \( 9.7 \) (p221a-rbc-t-PA), \( 11.8 \) (p221a-rbc-st-PA) \( \mu \mathrm { g } / \) TSP \( ( \mathrm { mg } ) \) 로 측정되었다 (Fig. 5). 가장 높은 발현양은 p221a-t-PAER 유전자로 형질전환된 식물체 추출물에서 \( 75.1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { TSP } ( \mathrm { mg } ) \) 로 발현됨을 확인할 수 있었다 (Fig. 5). 알팔파 형질전환체 잎에서 재조합 \( \mathrm { t } - \mathrm { PA } \) 단백질의 평균 발현양은 전체수용성 단백질 중 9.7-39.5 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { TSP } \) \( ( \mathrm { mg } ) \) 로 발현됨을 확인할 수 있었다. \( 35 \mathrm { ~S } \) 프로모터를 이용한 경우가 Rbcsk-1A를 이용한 경우보다 재조합 t-PA 발현양이 높게 나타났다. 그러나 기대하였던 합성 유전자를 이용했을 때는 합성전과 크게 차이를 보이지 않았다. 발현양의 순서는 p221a-t-PA >p221a-t-PAER >p221a-st-PA >p221a-t-PAHis \( >\) p p221a-rbc-st-PA >p221a-rbc-t-PA로 나타냈다. 반면 대조군으로 야생형 알팔파 추출물에서는 재조합 t-PA 단백질 발현양을 나타내는 흡광도를 관찰할 수 없었다. 이러한 재조합 t-PA 단백질 발현양은 식물시스템을 이용한 재조합 단백질 발현관련 문헌에 보고된 전체 수용성 단백질 중 \( 0.002-7 \% \) 발현양과 비교하면 낮은 발현양의 경우와 유사한 결과를 나타내었다. 발현양이 상대적으로 낮게 나타난 이유는 식물체 내에 존재하는 프로테아제의 절단에 의한 t-PA 단백질의 분해에 의한 것으로 생각된다.</p>