MTT assay를 이용하여 시코 농도범위의 IC50을 측정하고 10% DMSO를 포함한 배지로 시료를 희석하여 37\(^\circ \mathrm{C}\), 5% CO2 incubator에서 1, 2, 4, 8hr 동안 반응시킨 후 trypsin-EDTA를 사용하여 cell을 수집하고 0.2mm filter를 통해 cell debris를 제거하여 위암세포 DNA 손상을 측정하였다.
<h2>위암세포 DNA 손상 측정</h2> <p>시코 처리의 농도범위는 MTT assay로 \( \mathrm { IC } _ { 50 } \)을 설정하여 cell이 배양되어 있는 \(24 \mathrm { ~well } \)에 \( 10 \% \) DMSO 포함한 배지로 시료를 희석하여 처리하였고, 대조군은 \( 10 \% \) DMSO를 같은 조건으로 처리하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 \( 1,2,4,8 \mathrm { ~hr } \) 동안 반응시켰다. 각 반응시간이 지난 후 well을 PBS로 두번 세척 한 다음, \( 0.25 \% \) trypsin-EDTA \( 100 \mathrm { ~ } \mu \mathrm { l } \)를 처리하여 cell을 수집한 후 \( 500 \mathrm { ~ } \mu \mathrm { l } \) PBS에 현탁시켜 micro -centrifuge tube에 옮겨 원심 분리하였다. 두 번의 원침세척 후 세포의 DNA 손상을 측정 하기 위해 Bojana 등의 방법을 참고로하여 comet assay를 실시하였다. \(1.2 \% \) Normal melting point agarose (NMPA)가 precoating된 fully frosted slide 위에 현탁된 cell과 \( 1 \% \) Low melting point agarose (LMPA)를 골고루 섞은 후 \( 100 \mathrm { ~ } \mu \mathrm { l } \) loading하여 cover glass로 덮고 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 냉장고에 넣어 굳힌 후 cover glass를 벗기고 그 위에 다시 \( 1 \% \) LMPA용액 \( 100 \mathrm { ~ } \mu \mathrm { l } \)를 올려 굳힌 뒤, lysing solution ( \(2.5 \mathrm { ~M } \) \( \mathrm { NaCl } , 100 \mathrm { ~mM } \) EDTA, \( 10 \mathrm { ~mM } \) Tris, \(1 \% \) Triton X-100, \( 10 \% \) DMSO)에 slide를 담가 저온, 암실에서 \(1 \) 시간 동안 침지시켜 lysis시켰다. 그 후 slide를 electrophoresis tank에 배열하고 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) buffer ( \(10 \mathrm { N } \) \( \mathrm { NaOH } , 200 \mathrm { ~mM } \) EDTA)를 채워 25분 동안 unwinding한 후 \( 25 \mathrm { ~v } / 300 \mathrm { ~mA } \)의 전압을 걸어 30분간 전기영동을 실시하고 전기영동이 끝난 slide는 neutralization buffer ( \(0.4 \mathrm { ~M } \) Tris, \( \mathrm { pH~ } 7.5 \))로 15분씩 세척하였다.</p>