본 논문에서 GFp 형광을 관찰하기 위해 애기장대의 원형질체를 분리후 형광현미경을 통해 관찰하였고, 엽록체 및 엽록체 단백질 분리를 위해서는 Western blot을 이용하였다. 또한 형질전환된 애기장대에서의 카드뮴에 관한 저항성 기능 분석을 위해 애기장대를 저온처리후 광조건에서 키워 적정한 조건을 맞췄다.
<h2>원형질체 (protoplast)의 분리 및 GFP형광의 관찰</h2><p>GFp 형광을 관찰하기 위한 원형질체를 분리 하기 위해 RbcS-GFP, RbcS-BrMT3-GFP 그리고 WT 애기장대를 1/2 MS agar 배지에서 2 주 동안 키운 후 잎을 따서 enzyme solution (\(1-1.5\%\) Cellulase R10, \(0.2-0.4\%\) Macerozyme R10, \( 0.4 \mathrm{M} \) mannitol, \( 20 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{KCl}\), \(20 \mathrm{mM} \) MES, \( \mathrm{pH} 5.7\), \(0.1 \%\) \(\mathrm{BSA}) \) 을 처리하였다. \( 22^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 dark상태로 한 시간 동안 천천히 흔들어준 뒤 screen cup을 사용해서 solution 상태로 걸렀다. \( 500 \mathrm{rpm} \) 에서 원심 분리하여 상층액은 버리고 침전물에 \( 5 \sim 10 \mathrm{ml} \) 의 W5 \((154 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}\), \( 125 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{CaCl}\), \(25 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{KCl} \), \( 2 \mathrm{mM} \) MES, \( \mathrm{pH} 5.7)\) 용액을 넣고 천천히 현탁 하였다. 분리된 원형질체를 슬라이드 글라스에 놓고 커버글라스로 덮은 다음 형광현미경 (Carl Zeiss)을 통해 관찰하였다.</p><h2>Western blot을 위한 엽록체 및 엽록체 단백질의 분리</h2><p>엽록체의 분리는 Obokata (1987)의 방법을 수정하여 \( 0-4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 수행하였다. RbcS-BrMT3-GFP와 RbcS-GFP 그리고 WT의 잎 \( 10 \mathrm{~g} \) 을 채취하여 냉각시킨 막자 사발에 넣고 STN buffer \( (0.4 \mathrm{M} \) sucrose, \( 0.05 \mathrm{M} \) Tris, \( \mathrm{pH} 8.0\), \(0.01 \mathrm{M}\) \(\mathrm{NaCl})\) \(10 \mathrm{ml} \) 에 넣어 마쇄 한 다음 2 겹의 거즈로 여과하여 여과 액을 \( 300 \mathrm{~g} \) 에서 1 분간 원심 분리하여 침전물은 버리고 상등액을 새로운 튜브로 옮겼다. \( 600 \mathrm{~g} \) 에서 10 분간 원심 분리한 후 상등액을 따라 버린 다음 침전물에 STN buffer \( (\mathrm{pH} 7.8) \) \( 10 \mathrm{ml} \) 을 분주하여 현탁 하였다. 이 후 \( 1,000 \mathrm{~g} \) 에서 10 분간 다시 원심분리 하여 얻은 침전물을 이용하였다. 분리된 엽록체와 전체 잎을 마쇄 한 뒤 단백질 추출 버퍼 \( (20 \mathrm{mM} \) Hepes-\( \mathrm{KOH} \), \( \mathrm{pH} 7.4 \), \( 1 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{MgCl}_{2}\), \(0.5 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 0.5 \mathrm{mM} \) phenylmethylsulfonyl fluoride, \( 0.7 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) pepstain A, \( 20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) leupeptin, \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) aprotiuin, \( 10 \mathrm{mM} \) DTT)를 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(10,000 \mathrm{~g} \) 에서 5 분간 원심분리 하였다. 이 상층액을 새 튜브에 옮긴 다음 spectrophotometer를 이용하여 단백질을 정량 하였다. Western blot을 위하여 \( 10 \sim 45 \mu \mathrm{g} \) 의 총단백질을 SDS-PAGE 에서 전기 영동 한 뒤 nitrocellulose membrane에 electro blotting을 통해 옮겼다. 이 membrane을 \( 7.5 \% \) nonfat-dry milk를 넣은 \( 1 \mathrm{X} \) TBST \( (0.1 \% \) Tween 20, \(1 \mathrm{X} \) TBS)로 상온에서 1 시간 blocking 한 후에 \( 1 \mathrm{X} \) TBST로 5 분 간 두 번 씻은 다음 GFP-antibody를 상온에서 3 시간 처리하였다. 이 membrane을 다시 \( 1 \mathrm{X} \) TBST로 10 분간 3 번 씻은 다음 sheep anti-mouse \( 1 \mathrm{gG} \) 에 1 시간 처리하였다. 그런 다음 \( 1 \mathrm{X} \) TBST로 membrane을 10 분간 3 번 씻은 후 ECL regent (Amersham Pharmacia Biotech)을 통해 시그널을 확인하였다.</p><h2>형질전환체의 카드뮴에 대한 저항성 기능 분석</h2><p>형질전환 애기장대에서 카드뮴에 대한 저항성을 실험 하기 위해 애기장대 WT (Col-0)와 RbcS-BrMT3 형질전환 종자들의 표면을 소독한 후 \( \mathrm{CdCl} 2 \) 를 포함하는 1/2 MS, \(1.5 \% \) sucrose와 \( 0.8 \% \) agar 배지에서 3 일간 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 저온처리 하였다 이 후 \( 21^{\circ} \mathrm{C} \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \) 광 조건에서 2~3 주 동안 세워서 키웠다.</p>