계란 노른자로부터 레시틴을 추출하고 남은 잔사는 두산인재기술개발원에서 구입하였으며, Law-rence 및 Weber의 방법을 이용하여 지질을 제거하고 단백질만을 분리하여 계란 노른자 단백질을 환원시킨 다음 동결건조하여 가수분해를 위한 시료로 사용하였다. 각 시료 \( 0.5\mathrm{g}\)을 완충용액에 분산시켜 \( 1 \%\)(\(\mathrm{w} / \mathrm{v}\)) 기질용액으로 만들고, 첨가된 효소량은 기질 대 효소비가 \(100: 1\)이 되도록 하였다. 이러한 반응 혼합물을 원심분리하여 가수분해도를 계산하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료 및 시약</h2><p>본 실험에 사용한 시료는 계란 노른자로부터 레시틴을 추출하고 남은 잔사로 경기도 용인에 위치한 두산인재기술개발원에서 구입하였다.</p><p>가수분해시 사용한 효소인 pepsin, \( \alpha \)-chymotrypsin, tryp-sin 및 pronase E는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA), Alcalase와 Neutrase는 Novo Co. (Denmark)로부터 구입하였고, TPCCE (tuna pyloric caeca crude enzyme)는 (주)동원산업에서 구입한 참치 유문수로부터 조효소를 추출하여 사용하였다. 또한, 항산화활성을 측정하기 위한 linoleic acid, thiobarbituric acid 및 ammonium thiocyanate는 Sigma Chemical Co. 제품을 사용하였으며, 그 외의 모든 시약은 분석용 특급시약을 사용하였다.</p><p>계란 노른자 단백질을 가수분해시켜 분자량별로 분획하기 위한 한외여과막장치 (ultrafiltration membrane system)는 Millipore Co. (Bedford, USA)로부터 구입하였고, 사용된 막의 분자량 한계범위 (molecular weight cut-off: MWCO)는 각각 \( 10 \mathrm{kDa}, 5 \mathrm{kDa} \) 및 \( 1 \mathrm{kDa} \)을 사용하였다.</p><h2>계란 노른자 단백질의 추출 및 환원</h2><p>계란 노른자로부터 레시틴을 추출하고 남은 잔사는 Law-rence 및 Weber의 방법을 이용하여 지질을 제거하고 단백질만을 분리하였다. 즉, 계란 노른자로부터 레시틴을 추출하고 남은 잔사 \( 30 \mathrm{g} \)에 \( 1\% \) \(\mathrm{KOH}\)용액 \( 150 \mathrm{m} \ell \)와 meth-anol \( 150 \mathrm{m} \ell\)를 가하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4시간 동안 교반한 다음, 원심분리 \( (3,900 \times g, 10\)분\()\)하여 상층액을 제거한 후, 침전물을 아세톤으로 여러 회 세척하여 지질을 완전히 제거하고, \( 2\% \) 2-mercaptoethanol을 사용하여 계란 노른자 단백질을 환원시킨 다음 동결건조하여 가수분해를 위한 시료로 사용하였다.</p><h2>단백질의 가수분해도 측정</h2><p>여러 가지 효소를 이용한 계란 노른자 단백질의 가수분해도 (degree of hydrolysis) 측정은 각 시료 \( 0.5\mathrm{g}\)을 Table 1에 나타낸 완충용액 \( 50 \mathrm{m}\ell \)에 분산시켜 \( 1 \%\)(\(\mathrm{w} / \mathrm{v}\)) 기질용액으로 만든 다음, 각 효소별 최적온도에서 8시간 반응시켰으며, 첨가된 효소량은 기질 대 효소비가 \(100: 1\)이 되도록 하였다. 반응종료 후 반응 혼합물을 \( 2 \mathrm{m} \ell \) 취하고 여기에 \( 20 \% \) trichloroacetic acid (TCA)를 동량 첨가하여 원심분리 \( (2,370 \times \mathrm{g}, 5\)분)한 다음, 상층액을 일정량 취하여 Lowry 법으로 \( 10 \%\) \(\mathrm {TCA} \) 가용성 단백질량을 측정한 후 다음 식으로부터 가수분해도를 계산하였다.</p><p>가수분해도 \( (\%)=\frac{10 \% \mathrm{TCA} \text { 가용성 단백질량 }}{\text { 총단백질량 }} \times 100 \)</p>