주)동희(Yongin, Korea)에서 물엿을 제조 후 생성된 부산물을 수거하여 \( -19^{\circ} \mathrm{C} \)에서 냉동 보관하면서 해동한 쌀 시럽박을 사용하였고, 상업적으로 널리 사용되는 8가지 효소를 첨가하였으며, 수용성 성분을 제거한 뒤, 마쇄한 후 \(40 \mathrm{mesh}\)의 표준체를 통과시켜 실험의 시료를 제작하였다. 1 N HCl 또는 1 N NaOH를 사용하여 기존에 알려진 효소들의 최적 pH를 조절한 뒤, 시료의 고형분 대비 0.1%의 효소를 첨가하여 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 이후 현탁액을 원심분리 하여 얻어진 상등액과 침전물의 무게변화를 통해 단백질의 양을 비교하는 실험을 수행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>쌀 시럽박</h2> <p>본 실험에 사용된 쌀 시럽박은(주)동희(Yongin, Korea)에서 물엿을 제조 후 생성된 부산물을 수거하여 \( -19^{\circ} \mathrm{C} \)에서 냉동 보관하면서 해동하여 사용하였다.</p> <h2>효소</h2> <p>이 실험에 사용된 효소들은 상업적으로 널리 사용되는 Protamex (Novozyme, Bagsvaerd, Denmark), Neutrase (Novozyme), Flavourzyme (Novozyme), Alcalase (Novozyme), Protease M (Amino, Nagoya, Japan), Protease N (Amino), Protease A (Amino) 그리고 Molsin F (Seishin, Noda, Japan) 등 총 8가지의 효소를 구입하여 사용하였다.</p> <h2>시료의 수용성 성분 제거</h2> <p>쌀 시럽박에 존재하는 수용성 단백질을 제거하기 위해 쌀 시럽박 \( 100 \mathrm{~g} \)에 증류수 \( 400 \mathrm{ml} \)를 가하여 5분간 교반 후 이를 20분간 원심분리\( (3,000 \times g) \)를 하여 얻어진 침전물을 dry oven에 24시간 동안 건조하여 무게를 측정하였다. 증류수를 가하여 수세하는 횟수에 따라 각각 무게를 측정한 후 그 무게의 변화가 없을 때의 시료를 수용성 성분이 완전히 제거된 시료로 결정하여 마쇄한 후 \(40 \mathrm{mesh}\)의 표준체를 통과시켜 이후 실험의 시료로 사용하였다.</p> <h2>단일효소 처리</h2> <p>수용성 성분이 완전히 제거된 쌀 시럽박 \( 5 \mathrm{~g} \)에 증류수 \( (28.3 \mathrm{ml}) \)를 첨가하여 \( 15 \% \) 현탁액 형태로 제조한 후 \(1\ \mathrm{N}\ \mathrm{HCl} \) 혹은 \(1\ \mathrm{N}\ \mathrm{NaOH}\)를 사용하여 기존에 알려진 효소들의 최적 \( \mathrm{pH} \)를 조절하고, 시료의 고형분 대비 \( 0.1 \% \)의 효소를 첨가한 후 각 효소들의 최적 온도에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 현탁액을 20분간 원심분리\( (3,000 \times g) \)하고 이때 얻어진 상등액과 침전물, 그리고 침전물의 건조 후 무게변화를 통하여 생성된 단백질의 양을 비교하였다.</p> <h2>혼합효소 처리</h2> <p>단일효소 처리로 얻어진 결과를 토대로 가장 효과가 좋은 효소인 Protease M (M), Protease N (N) 그리고 Protease A (A)를 각각 다음과 같이 2개 또는 3개의 효소를 4가지의 방법 (M+N, M+A, N+A, M+N+A)으로 흔합하여 단일처리와 같은 방법으로 최적 \( \mathrm{pH} \)와 최적 온도에서 4시간 동안 반응한 후 20분 동안 원심분리\( (3,000 \times \mathrm{g}\))하여 상등액과 침전물을 분리, 분석하였다.</p> <h2>단백질 분석</h2> <p>단백질분석은 총 3가지의 방법으로 분석하였다. 원심분리하여 얻어진 상등액 중의 수용성 단백질은 TP0300- 1KT Kit (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 Lowry protein assay를 통하여 측정하였다. 또한 침전물은 Digester (MBCM12, Raypa, Barcelona, Spain), Distiller (DNP1500, Raypa, Barcelona, Spain)와 Titrater (Akku-drive, Hirschmann Laborgerate, Eberstadtt, Germany)를 사용하여 semimicro-Kjeldahl 법으로 측정하였으며, 무게변화를 통한 불용성 단백질의 변화량을 알아보기 위해 원심분리를 하여 얻어진 침전물을 \( 105^{\circ} \mathrm{C} \)의 Dry oven에서 24시간 건조한 후 처음 시료의 무게와 건조된 침전물의 무게 차이를 이용하여 단백질 변화량을 계산하고 3가지 방법의 값을 비교, 분석 하였다. 이때 각각의 분석방법에 대한 계산식은 다음과 같다.</p> <h3>-Lowry protein assay (\( \mathrm{mg} / \mathrm{~g} \) RSM)</h3> <p>\( \frac{P \times(28.3+E+C)}{S} \)</p> <ul> <li>P: Protein contents \( (\mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)</li> <li>E: Amounts of enzyme \( (\mathrm{ml}) \)</li> <li>C: Amounts of 1 N NaOH or HCl (\(\mathrm{ml} \))</li> <li>S: Sample weight \( (\mathrm{~g}) \)</li></ul> <h3>-Semimicro-Kjeldahl (\( \mathrm{mg} / \mathrm{~g} \) RSM)</h3> <p>\( \frac{1.4 \times T}{S} \times 5.95 \)</p> <ul> <li>S: Sample weight \( (\mathrm{g}) \)</li> <li>T: Amounts of 0.1 N HCl (\(\mathrm{ml}) \)</li></ul> <h3>-Gravimetric method (\( \mathrm{mg} / \mathrm{~g} \) RSM)</h3> <p>\( \frac{(S-W)}{S} \times 1,000 \)</p> <ul> <li>S: Sample weight \( (\mathrm{g}) \)</li> <li>W: Weight of sample after drying (g)</li></ul> <h2>수분함량</h2> <p>A.O.A.C. 방법에 따라 시료 \( 2 \mathrm{~g} \)을 Forced convection dry oven (HB-502M, Hanbaek scientific co., Gyeonggi-do, Korea)을 이용하여 \( 105^{\circ} \mathrm{C} \)에서 overnight 처리한 후 무게를 측정하여 수분함량을 계산하였다.</p> <h2>조회분 함량</h2> <p>A.O.A.C. 방법에 따라 시료 \( 1 \mathrm{~g} \)을 Electric muffle furnace (LMF 1200, Carbolite/Sheffield, Hope, England)를 사용하여 \( 550^{\circ} \mathrm{C} \)에서 overnight 처리한 후 무게를 측정하여 조회분 함량을 계산하였다.</p> <h2>조지방 함량</h2> <p>A.O.A.C. 방법에 따라 Refrigerated circulator (Isotemp 1006p, Pittsburgh, PA, Fisher Scientific, USA)를 사용하여 ether 추출을 하는 Soxhlet extraction을 하여 조지방 함량을 계산하였다.</p>