Titer를 확인하고자 하는 시료와 함께 \( 1.3 \times 10 ^ { 5 } \) \( \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \)인 BPV를 차례대로 희석하고 real-time PCR을 진행하여 정량을 위한 표준곡선을 작성하였고, 이렇게 확립된 BPV DNA 정량법의 신뢰도를 보증하기 위해 실험법의 민감도, 재현성, 특이성 등을 검증하는 과정을 진행하였다.
<p>Titer를 측정하고자 하는 시료들과 함께 Titer가 \( 1.3 \times 10 ^ { 5 } \) \( \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \) 인 BPV를 순차적으로 \( 1.3 \times 10 ^ { -1 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \) 까지 10 단계 희석한 후 real-time PCR을 수행하여 정량을 위한 표준곡선을 작성하였다. 시료 속에 들어있는 BPV DNA의 양을 표준곡선에 대입하여 정량하였다. 표준곡선은 BPV의 농도에 따라 real-time PCR에 의해 검출되는 crossing point 값을 \( \mathrm { TCID } _ { 50 } \) equivalent/mL로 전환하여 작성하였다. Crossing point는 PCR cycle이 exponential phase로 들어가 는 cycle 수를 나타낸다.</p> <h2>Real-time PCR의 신뢰성 검증</h2> <p>확립된 BPV DNA 정량법의 신뢰성(reliability)을 보증하기 위해 확립된 실험법의 민감도(sensitivity), 재현성(reproducibility) 등을 검증하였다. 민감도를 측정하기 위해 titer가 \( 1.3 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \) 인 BPV를 순차적으로 \( 1.3 \times 10 ^ { -1 } \) \( \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \) 까지 10 단계 희석한 후 real-time PCR을 수행하였다. 재현성 검증을 위해 titer가 \( 1.3 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \) 인 BPV를 순차적으로 \( 1.3 \times 10 ^ { -1 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \) 까지 10 단계 희석한 표준시료를 서로 다른 날에 3회 정량 분석하여 crossing point 값을 비교하였다. 특이성 검증을 위해 minute virus of mice(ATCC VR 1346), human parvovirus B19(BBI Diagnostics, USA), porcine parvovirus(ATCC VR 742), bovine herpesvirus type 1(ATCC VR-188)에 대한 cross-reactivity를 측정하였다. 시험에 사용한 바이러스의 titer는 각각 \( 6 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } , 9.4 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { IU } / \mathrm { mL } , 10 ^ { 6 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \), \( 10 ^ { 6 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \) 이었다.</p>