OR-7을 만드는 L. salivarius 균체로부터 유전자를 클로닝하지 않고 화학합성으로 OR-7 유전을 제작하였고, 효모에 pAUR123-OR-7을 도입하고 aureobacidin A를 포함하는 YPD 배지에서 선별하여 OR-7 발현 유전자가 도입된 형질전환 효모를 제작하였다. 실험 결과, 형질전환 효모의 항균활성이 형질전환에 의해 도입된 pAUR123-OR-7의 유전자에 의한 것임을 확인하였고, pAUR123-OR-7 플라스미드가 형질전환된 효모에서 박테리오신 OR-7을 생산한 후 pAUR123-OR-7이 도입된 형질전환 효모가 항균활성을 갖고 있음을 확인하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>박테리오신 OR-7 유전자의 클로닝 및 형질전환 효모의 제작</h2> <p>OR-7은 유산균의 일종인 L. salivarius가 생산하는 아미노산 54개로 구성된 항균 펩타이드로 OR-7 유전자의 일차구조가 이미 보고되어 있고 그 길이가 비교적 짧으며 세균과 효모사이에 유전암호 이용성에 차이가 있기 때문에 OR-7을 생산하는 L. salivarius 균체로부터 유전자를 클로닝하지 않고 OR-7 유전자를 화학합성하였다(Fig. 1).</p> <p>효모 \( (S \) cerevisiae \( ) \) 에 pAUR123-OR-7을 도입하고 aureobacidin \( \mathrm{A} \) 를 포함하는 YPD 배지에서 선별하여 OR-7 발현 유전자가 도입된 형질전환 효모를 얻을 수 있었다(Fig.2). 형질전환 효모의 효과적인 선별을 위하여 선별 마커로 사용되는 aureobacidin \( \mathrm{A} \) 의 최종농도를 \( 0.1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 에서 \( 0.5 \) \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 까지 다양하게 사용하여 형질전환 효모 콜로니의 형성효율을 검토하였다. 그 결과, 이 연구에서는 aureobacidin A의 최종농도가 \( 0.2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 에서 가장 효과적으로 형질전환 콜로니를 형성하였다. Aureobacidin \( \mathrm{A} \) 의 최종농도가 너무 낮으면 콜로니 형성은 원활하지만 형질전환되지 않은 야생효모의 콜로니의 형성빈도가 높아지고, 최종농도가 너무 높으면 콜로니 형성이 되지 않거나 형성에 많은 시간을 필요로 한다는 사실을 확인할 수 있었다.</p> <h2>형질전환 효모로부터 플라스미드 DNA의 분리 및 박테리오신 OR-7 유전자 확인</h2> <p>형질전환된 효모로부터 pAUR123-OR-7 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA를 분리하였고, 이를 주형(template)으로 발현 vector에 특이적인 primer를 이용하여 PCR 을 행한 결과, pAUR123-OR-7의 유전자에 해당하는 약 \( 180 \mathrm{bp} \) 의 유전자 단편을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 이 결과로 형질전환 효모가 나타내는 항균활성이 효모 자체에 의한 활성이 아닌 형질전환에 의해 도입된 pAUR123-OR-7의 유전자에 의한 것이라는 사실을 확인할 수 있었다.</p> <h2>형질전환 효모의 박테리오신 OR-7의 생산 확인</h2> <p>형질전환된 효모로부터 세포추출액을 제작하고 \( 15 \% \) SDS-polyarylamide gel을 이용하여 박테리오신 OR-7의 생산을 확인하였다. 그 결과, pAUR123-OR-7 플라스미드가 형질전환된 효모에서 박테리오신 OR-7의 생산을 확인할 수 있었다(Fig. 4B).</p> <h2>박테리오신 OR-7을 생산하는 형질전환 효모의 항균활성 확인</h2> <p>그람양성 대표세균인 B. subtilis와 그람음성 대표세균인 E. coli, 녹농균인 P. aeruginosa, 식중독균인 C. jejuni 등에 대한 형질전환 효모의 항균활성에 의해 생성된 생육억제환 (clear zone)율 비교 - 분석한 결과, pAUR123-OR-7이 도입된 형질전환 효모의 경우는 이들 세균 모두에서 생육을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5). 반면, 효모 발현 vector (pUAR123) 만을 도입한 형질전환 효모의 경우는 생육억제를 나타내지 않았다(Fig. 5). 이 결과로 이들 세균 모두에 대해 항균활성을 나타내는 형질전환 효모가 성공적으로 제작되었음을 확인할 수 있었다.</p>