TriZol을 사용하여 환자와 정상인의 골격근 세포로터 RNA를 추출하고, Accupower PCR PreMix를 통해 cDNA로 전환하여 KCNJ11 primer를 이용하여 quantitative RT-PCR을 수행하여 각각 3회의 반복실험을 동해 얻어진 결과를 Student's t-test를 통해 P값 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 정의하였다. 추출한 단백질을 이동시켜 western blot을 시행하였고 1차 항체, 2차 항체를 통해 단백질 밴드를 확인하였다. 본 연구는 가족성 저칼름성 주기성마비 환자와 정상인의 골격근 세포를 저칼른 농도에 노출시켜 KCNJ 11의 mRNA발현양상과 단백질 산물인 Kir6.2의 세포내분포 변화 유무를 확인하였다.
<h2>Quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) 분석</h2> <p>저칼륜성 주기성마비 환자와 정상인의 골격근 세포로터 RNA를 추출하기 위해 TriZol (Invitrogen, Carlabad, CA, USA)을 사용하였고 전체 RNA중 \( 100 \mathrm { ng } \) 을 역전사 효소를 이용하여 cDNA로 전환하였다. Accupower PCR PreMix (BIONEER, Dacjeon, Korea)를 혼합한 후 KCNJ11 primer를 통헤 quantitative RT-PCR을 수행하였다. 각각 3회의 반복실험을 동해 얻어진 결과는 평균 \( \pm \) 표준편차로 표기하였고, 통계적 유의성 검정은 Student's t-test를 통해 실시하였으며, P값이 \( 0.05 \) 미만인 경우 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 정의하였다.</p> <h2>Western blot 분석</h2> <p>가족성 저칼륨성 주기성마비 환자와 정상인의 골격근 세포에 각 농도 별로 칼륨 완충용액을 30분 둥안 처리한 후 세포질 과 세포막 단백질 분획을 실시하였다. 세포질과 세포막 단백질의 분획방법은 세포의 분획방법으로. 기존에 시행되었던 방법을 응용하여 사용하였고, 각 단계별로 protease-in-hibitor cocktail (Sigma, Saint Louis, MO, USA)을 섞어 단백질을 추출하였다. 각 시료별로 \( 50 \mu \mathrm { g } \) 의 단백질을 \( 12 \% \) sodiumdodecyl sulfate-polyacryamaide gel electrophoresis (Bio-Rad,Hercules, CA, USA)하였고, 이후 전기 이동을 통해 poly-vinylidene fluoride membrane (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 단백질을 이동시켜 western blot을 시행하였다. 단백질을 보유한 membrane은 5% Skim milk (Bio-Rad, Hercules, CA, \( \mathrm { USA } ) \) 를 통해 1차 처리한 후 Kir6.2 1 차 항체(Abcam, Cambridge, MA, USA)를 처리하였고, anti-mouse 2차 항체를 사용하였으며, supersignal west pico luminal/enhancer sol-ution (Pierce, Rockford, IL, USA) 을 통해 단백질 밴드를 확인하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <p>가족성 저칼륨성 주기성마비는 시양에시 가장 흔한 주기성 마비의 원인으로, 과거 동양인보다 서양인에서 흔한 것으로 알려져 왔으나 최근 질환에 대한 지식과 경험이 늘어나면서 국내에서도 많은 환자들이 보고되고 있다. 질환의 발병기전에 관한 다양한 연구가 진행되고 있으며 이 중 일부 연구에서 세포막에 위치한 \( \mathrm { K } _ {\mathrm { ATP } } \) 채널 활성도 감소가 발병과 관련 있는 것으로 보고되고 있으나, 아직까지 정확한 분자생물학적 기전은 밝혀져 있지 않다</p> <p>본 연구에서는 가속성 지칼름성 주기성마비 환자와 정상인의 골격근 세포를 생리적 정상 세포외 칼륨 농도 \( (4 \mathrm { mM } ) \) 와 환자 세포의 탈분극을 유발하는 저칼른 농도 \( (1 \mathrm { mM } ) \) 에 노출시켜 \( \mathrm { K } _ {\mathrm { ATP } } \) 체널의 pore를 구성하는 major subunit 유전자인 \( \mathrm { KCNJ } 11 \) 의 mRNA발현양상과 단백질 산물인 Kir6.2의 세포내분포 변화 유무를 확인하였다. 이전의 연구에서 본 연구팀은 SUR2A 단위체가 가족성 저칼륨성 주기성 마비 환자의 골격근 세포에서 탈분극시 세포막에서 세포질 내로의 이동을 통한 외향성 칼륨 current 형성의 장애로 인해 세포의 탈분극을 지속시켜 환자의 마비 증상을 유발할 수 있음을 보고한바 있어 곤 연구를 통해 환자 세포의 탈분극시 기존의 연구에서 발현 감소가 보고된 Kir6.2 단위체의 세포막상의 분포변화 유무를 확인함으로써 \( \mathrm { K } _ {\mathrm { ATP } } \) 채널의 활성도 감소와 관련한 분자 생물학적 발병 기전을 알아보고사 하였다.</p>