\( \mathrm{CoCl}_{2} \) 농도 의존적으로 HIF-1\(\alpha\)의 발현이 증가함을 확인 할 수 있었고, \( 500 \mathrm{\mu} \mathrm{M} \)에서 최고의 HIF-1\(\alpha\)의 발현 증가를 확인하였으며, 본 연구에 사용한 저 산소 상태 유도 조건이 두 인간 폐암 세포에 cytotoxicity 영향은 없음을 시사한다. \( 500 \mu \mathrm{M} \) \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 24시간 처리한 인간 폐암세포, H460에서의 \(\alpha\)-SMA의 발현양을 조사한 결과, \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리한 인간 폐암세포, H460에서 \(\alpha\)-SMA의 발현양이 증가함을 확인하였고, 결론적으로 저 산소 상태에 노출된 인간 폐암세포가 세포막에 있는 integrin \( \beta 3 \)의 발현양의 증가에 의한 FAK의 활성 증가로 EMT가 됨으로써 악성 암세포 전환 될 가능성이 있음을 알 수 있었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>인간 폐암 세포에서 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리에 의한 HIF-1\(\alpha\) 변화</h2> <p>세포 배양 실험에서 생리적 저산소증과 유사하게 만들기 위한 산소의 농도는 일반적으로 \( 1-5 \% \)이며, 이를 위하여 heme moiety에 있는 철(iron)을 대치하여 환원상태를 지속시켜 저산소증과 유사한 상태를 만드는 전이금속원소인 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 사용하였다. 인간 폐암세포(A549)에서의 저 산소 상태 조건을 최적화 하기 위해 다양한 농도의 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리 후 HIF-1\(\alpha\)의 발현 정도를 조사하였다. 그 결과, \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 농도 의존적으로 HIF-1\(\alpha\)의 발현이 증가함을 확인 할 수 있었고, \( 500 \mathrm{\mu} \mathrm{M} \)에서 최고의 HIF-1\(\alpha\)의 발현 증가를 확인 하였다. 따라서, 인간 폐암 세포, A549와 H460에 \( 500 \mu \mathrm{M} \) \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 24시간 처리한 후 HIF-1\(\alpha\)의 유도를 다시 확인해 본 결과, 두 세포 모두에서 HIF-1\(\alpha\) 발현의 증가를 확인 하였다(Fig. 1B).</p> <h2>인간 폐암 세포 증식 억제 효과</h2> <p>Ardyanto, Corley 그리고 Lee의 연구에서는, \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 암세포 및 vascular smooth muscle 세포에 처리하였을 때 유도 되는 HIF-1\(\alpha\)에 의해 암세포의 증식 및 사멸 그리고 vascular smooth muscle 세포의 부착 및 이동에 영향을 미친다고 발표된 바 있다. 따라서 본 연구에서는 HIF-1\(\alpha\)의 유도를 위해 사용한 \( 500 \mu \mathrm{M} \) \( \mathrm{CoCl}_{2} \)에 의해서 인간 폐암 세포 증식에 영향을 미치는지를 알아보기 위해 MTT assay를 행하였다. 인간 폐암세포, A549와 H460에 \( 500 \mu \mathrm{M} \) \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 시간 별로 처리한 후 MTT assay 행한 결과, 두 세포 모두에서 \( 500 \mathrm{uM} \) \( \mathrm{CoCl}_{2} \)에 의한 어떠한 세포 증식에 대한 영향을 확인 할 수 없었다. 이 결과는 본 연구에 사용한 저 산소 상태 유도 조건이 두 인간 폐암 세포에 cytotoxicity 영향은 없음을 시사한다.</p> <h2>인간 폐암 세포에서 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)처리에 의한 EMT</h2> <p>다양한 암세포들은 세포-세포간 결합에 관여하는 단벡질 중 하나인 E-cadherin의 발현이 줄어 듬으로써 암세포의 EMT가 일어나고 최종적으로 전이를 유발한다는 보고가 있다. 뿐만 아니라, 암세포를 둘러싸고 있는 미세환경 중 대표적인 특징이 저 산소 상태이고, 저 산소 상태에 노출된 암세포는 악성화 된다는 보고가 있다. 이러한 악성 암세포의 특징은 전이가 일어난다는 것으로써, 암세포 전이를 위해서는 먼저 세포-세포 간 부착력이 감소하고 세포의 운동성이 증가하여야 하며, 세포와 세포, 세포와 기질간의 상호작용에 관여하는 유착 물질로 integrin, cadherin, immunoglobulin super-family와 selectin의 4가지 군이 알려져 있다. 이들 중 E-cadherin은 세포와 세포의 상호간의 인식과 조직의 형태 유지 등에 가장 중요한 역할을 한다는 보고가 있다. 따라서, 본 연구에서 저 산소 상태에서의 세포-세포 간 부착력을 조사하고자, \( 500 \mu \mathrm{M} \) \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 24시간 처리한 인간 폐암세포에서의 E-cadherin 발현 및 세포막의 존재 양상을 보기 위하여 웨스턴 및 형광염색 실험을 통하여 알아보았다. 그 결과, \( 500 \mu \mathrm{M} \) \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 24시간 처리한 인간 폐암세포, H에서 E-cad herin 발현양이 감소함을 확인하였다. 그리고 Normoxia 상태의 인간 폐암세포, H460에서의 E-cadherin 형광염색은 세포-세포 간 junction 부위에 균일하게 나타나는 반면, \( 500 \mu \mathrm{M} \) \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리한 H460 세포는 세포-세포 간 junction 부위가 깨어져 있는 형광염색 결과를 확인 하였다. 뿐만 아니라, EMT 동안 세포의 운동성이 증가하기 위해서는, elongated shape, mesenchymal 마커의 발현등과 같은 fibro-blast-like 세포의 특징 필요하고 이 특징 중 대표하는 마커가 alpha-smooth muscle actin (\(\alpha\)-SMA)의 발현 증가라는 보고가 많이 있다. 따라서 본 연구에서는 \( 500 \mu \mathrm{M} \) \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 24시간 처리한 인간 폐암세포, H460에서의 \(\alpha\)-SMA의 발현양을 조사하였다. 그 결과, \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리한 인간 폐암세포, H460에서 \(\alpha\)-SMA의 발현양이 증가함을 확인하였다.</p> <h2>\( \mathrm{COCl}_{2} \) 처리에 의한 EMT의 기전 규명</h2> <p>Ryu와 Chung의 연구에서는, 저 산소 상태의 편평 암세포(oral squamous cell) 와 유방암 세포(breast carcinoma cell)에서 alpha 5 그리고 alpha6beta1 integrin의 발현이 증가 함으로써 암세포의 invasion을 증가 시켰다고 보고하였다. 따라서 본 연구는 폐암세포에서 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리에 의한 저 산소 상태에 의해 유도되는 EMT의 기전을 규명하고자, \( 500 \mu \mathrm{M} \) \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 24시간 처리한 인간 폐암세포, A549와 H460에서의 integrin의 발현 변화를 FACS anlaysis로 조사하였다. 그 결과, Normoxia 상태에서는 전혀 나타나지 않던 integrin \( \beta 3 \) 의 발현이 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리한 인간 폐암세포에서 integrin \( \beta 3 \)의 발현양이 증가하는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, 지금까지 알려진 보고에 의하면 저 산소 상태에서 EMT가 일어 날 때, 세포내의 PI3K-AKT 단백질의 활성이 중요한 역할을 한다고 알려져 있고, FAK 단백질이 integrin의 하부에서 그리고 PI3K-AKT의 상부 신호전달 단백질로서 암 화 과정에 중요한 역할을 한다고 잘 알려져 있다. 따라서 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리한 인간 폐암세포에서의 인테그린 하부 신호전달 물질을 조사하기 위해, FAK의 활성 정도를 확인한 결과, \( \mathrm{CoCl}_{2} \)에 의한 저 산소 상태에서 FAK의 총 발현양은 변화가 없는데 반하여 FAK의 인산화가 중가함으로써 활성 또한 증가된다는 것을 확인하였다. 본 연구 결과로서 저 산소 상태에 노출된 인간 폐암세포가 세포막에 있는 integrin \( \beta 3 \)의 발현양의 증가에 의한 FAK의 활성 증가로 EMT가 됨으로써 악성 암세포 전환 될 가능성이 있음을 확인하였다. 본 연구는 FAK의 활성을 조절 함으로써 암세포의 악성화를 저해할 가능성이 있음을 시사하는 바이다.</p>