본 연구에 사용한 A549 인체 폐암세포는 한국생명공학연구소(대전_에서 분주 받아 사용하고 RPMI- 1640, fetal bovine serum, penicillin 및 streptomycin이 포함된 배지를 사용해 배합하고 Kim et al.의 방법에 준해 처리하였다. 정상 및 다양한 농도의 resveratrol이 함유된 배지에서 48시간동안 자란 암세포들을 PBS로 두세 번 씻어내고 1시간 동안 염색한 후 DNA flow cytometry에 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 분석하였는데, resvertrol의 처리에 암세포의 apoptosis 유발 여부를 확인하기 위한 핵의 형태변화 관찰을 위해 형광 염색물질로 10분간 염색하였고, 형광현미경을 이용해 핵의 형태 변화를 정상군과 비교했다. 정상 및 서로 다른 농도의 resveratrol이 함유된 배지에서 배양된 암세포를 대상으로 RNAzol B(TEL-TEST, Inc., Texas, USA)를 이용하여 total RNA를 분리하고 전기영동하고 ethidium bromide (EtBr, Sigma)로 염색한 후 UV 하에서 확인하였다. 상기와 동일 방법으로 준비된 암세포를 lysis buffer로 용해한 후, 세포 내 잔사물을 분리시키고 동량의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel 전기영동으로 분리하고 X-ray flim에 감광시켜 단백질의 발현정도를 분석하였다. Choi et al.의 방법에 준하여 정상 및 다양한 농도의 resveratrol이 처리된 배지에서 자란 암세포들을 모은 뒤 단백질을 정량한 후, protein A-Sepharose (Sigma)와 혼합 후 1시간 동안 반응 시키고 원심분리 후 상틍액만 모은 다음 전기영동으로 분리하고 gel을 말린 후 autoradio-graphy로 반응의 정도를 비교하였다. COX-2의 대사산물인 prostaglandin E2 (PGE2)의 생성에 미치는 resveratrol의 영향을 측정하기 위하여 사용된 enzyme immunoassay (EIA) kit는 Amersham Corp.에서 구입하였고, A549 폐암 세포를 배지에 배양한 후, 농도별로 배지에 희석해 처리하고 용해가 잘 일어나도록 pipetting을 수회 실시하였고, trypan blue를 이용해 암세포의 수를 계수한뒤 EIA를 실시한 후 파장에서 얻어진 값을 기준으로 PGE2의 양을 추정하였다.
<h1>재료 밋 방법</h1> <h2>암세포의 배양 및 resveratrol 처리</h2> <p>본 연구에 사용된 A549 인체 폐암세포는 한국생명공학연구소(대전)에서 분주 받아 사용하였으며, \(90\%\)의 RPMI- 1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에 \(10\%\) fetal bovine serum (FBS), \(1\%\)의 penicillin 및 streptomycin (Biofluids, Rockville, MD, USA)이 포함된 배지를 사용하여 배양하였다. Resveratrol (Fig. 1A)은 Sigma Chemical Co. (St. Luis, MO, USA)에서 구입하였으며, Kim et al. 의 방법에 준하여 처리하였다.</p> <h2>Hematocytometer를 이용한 생존율의 측정</h2> <p>세포배양용 6 well plate를 이용하여 plate당 \(2\times10^{4}\)개의 A549 암세포를 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후, \(50~\mu \mathrm{M}\)의 resveratrol을 12시간 간격으로 처리한 후 세포를 phos-phate-buffered saline (PBS) 용액으로 수세하고 trypan blue (Gibco BRL)로 염색하였다. 이를 hematocytometer에 옮긴 후 위상차 현미경 \((\times200)\) 하에서 살아있는 세포의 수를 측정 하여 대조군과 비교 분석하였다.</p> <h2>Flow cytometry 분석</h2> <p>정상 및 다양한 농도의 resveratrol이 함유된 배지에서 48시간동안 자란 암세포들을 PBS로 두세 번 씻어내고, 고정액 (\(70\%\) ethyl alcohol, \(0.5\%\) Tween 20)을 첨가하여 \(4^{\circ}\mathrm{C}\)에서 고정시킨 후, propidium iodide (PI, concentration, \(50~\mu \mathrm{g}/\mathrm{ml}\); Sigma) 용액을 이용하여 \(4^{\circ}\mathrm{C}\)에서 1시간동안 염색하였다. 이를 다시 PBS로 두 번 씻어낸 후, DNA flow cytometry (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 ModiFit LT (Becton Dickinson) 프로그램으로 분석하였다.</p> <h2>DAPI염색을 틍한 핵의 관찰</h2> <p>Resveratrol의 처리에 의한 암세포의 apoptosis 유발 여부를 확인하기 위한 핵의 형태변화 관찰을 위하여 \(50 ~\mu \mathrm{g}\) 의 resveratrol이 48시간 처리된 세포들을 PBS로 세척하고 \(3.7\%\) paraformaldehyde (Sigma)로 상온에서 10분간 고정시킨 후 형광 염색물질인 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma) 용액을 이용하여 10분간 염색하였다. 이들 세포를 다시 PBS로 2회 수세한 후 형광현미경을 이용하여 핵의 형태 변화를 정상군과 비교하였다.</p> <h2>Reverse transcription-polymerase chain reaction 분석</h2> <p>정상 및 서로 다른 농도의 resveratrol이 함유된 배지에서 48시간 배양된 암세포를 대상으로 RNAzol B(TEL-TEST, Inc., Texas, USA)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, Choi et al. 의 방법에 준하여 oligo dT primer와 AMV reverse transcriptase를 이용하여\(2~\mu \mathrm{g}\)의 RNA에서 ss cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 template로 사용하여 관찰 대상 유전자를 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 증폭하였다. 이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 internal control로 사용하였다. 각 PCR 산물들을 \(1\%\) agarose gel을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide (EtBr, Sigma)로 염색한 후 UV 하에서 확인하였다.</p> <h2>단백질의 분리, 전기영동 및 Western blotting</h2> <p>상기와 동일 방법으로 준비된 암세포들을 선행 방법에 준하여 정상 및 resveratrol이 처리된 배지에서 자란 세포들을 lysis buffer로 용해한 후, 세포 내 잔사물을 분리시키고 동량의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 전이시킨 후, 특정 단백질에 대한 항체와 그에 대한 이차 항체 반응을 실시한 후 en-hanced chemiluminoesence (ECL) 용액 (Amersham Life Sci-ence Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 단백질의 발현정도를 분석하였다. 본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 및 Calbiochem (Cambridge, MA, USA)에서 구입하였으며, 이차 항체로 사용된 horseradish peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulin 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다.</p> <h2>In vitro immunocomplex kinase assay</h2> <p>Choi et al.의 방법에 준하여 정상 및 다양한 농도의 resveratrol이 처리된 배지에서 48시간 자란 암세포들을 모은 다음 단백질을 정량한 후, 적정량의 단백질을 취하여 protein A-Sepharose (Sigma)와 혼합한 후 \(4^{\circ}\mathrm{C}\)에서 1시간동안 반응시켰다. 이를 \(1,500~\mathrm{rpm}\)으로 10분간 원심분리하여 상층액만 모은 다음 Cdk2 및 Cdk4 항체를 첨가하고 다시 \(4^{\circ}\mathrm{C}\)에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 protein A-Sepharose를 넣고 \(4^{\circ}\mathrm{C}\)에서 2시간동안 반응시킨 후, 원심 분리하여 pellet을 모은 다음 세척한 후 \([\gamma-^{32} \mathrm{P}]\) ATP(ICN, Irvine, CA, USA) 및 histone H1 (Sigma)이 들어있는 reaction buffer를 혼합하여 \(37^{\circ}\mathrm{C}\)에서 30분간 반응시켰다. 동량의 \(2\times SDS\) sample buffer를 넣어 혼합한 후, \(10\%\) SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 이렇게 분리된 gel을 말린 후 autoradio-graphy로 반응의 정도를 비교하였다.</p> <h2>Prostaglandin E2 생성율의 측정</h2> <p>COX-2의 대사산물인 prostaglandin E2 (PGE2)의 생성에 미치는 resveratrol의 영향을 측정하기 위하여 사용된 enzyme immunoassay (EIA) kit는 Amersham Corp.에서 구입하였다. 먼저 준비된 A549 폐암 세포를 96-well plate에 well 당 \(160~\mu \mathrm{l}\)의 배지에 \(10^{4} ~\mathrm{cell/well}\) 정도로 분주하여 24시간 동안 배양한 후, resveratrol을 농도별로 배지에 희석하여 처리하였다. 이때 마지막 배지의 양을 모두 180 씨로 통일시켰다. 48시간 후 배지에 \(2.5\%\)의 dodecyltrimethyl-ammonium bro-mide가 함유된 buffer를 \(20~\mu \mathrm{l}\) 첨가하여 총 배지의 양이 \(200~\mu \mathrm{l}\)되게 한 후 용해가 잘 일어나도록 pipetting을 수회 실시하였다. 상온에 약 10분간 incubation 한 후 trypan blue를 이용하여 암세포의 수를 계수하였다. 약 \(50~\mu \mathrm{l}\)의 lysate를 취하여 kit에 준한 protocol에 따라 EIA를 실시한 후 \(450\mathrm{~nm}\)의 파장에서 얻어진 값을 기준으로 PGE2의 양을 추정하였다.</p>