Flow cytometry를 사용하여 apoptosis detection kit을 이용한 phosphatidylserine 노출과 propidium iodide 염색 정도, FITC와 PE 형광이 부착된 항체로 수지상 세포 표면 마커 발현의 양적 측정을 하였다. Protease 활성 측정은 tripeptide thiobenzyl ester가 가수 분해되는 정도를 측정하여 나타냈다. 세포사멸 결과는 평균 \( \pm \) 표준편차를 구하고, 통계학적 유사성은 자료둘의 분포를 확인하고 Student's \( \mathrm { t } \)-test로 검정하였고 \( P \) 값이 \( 0.05 \) 이하일때 통계적으로 유의미하다 라고 판정한다.
<h2>Flow cytometry 측정</h2> <p>세포사멸의 양적 측정은 phosphatidylserine의 세포막으로의 노출과 propidium iodide (PI) 염색 정도를 apoptosis detection kit을 사용하여 annexin V-FITC 형광 결합 정도로 측정하였다. 세포사멸의 정도는 \(\%\)값으로 나타내었다. 수지상 세포 표면 마커 발현의 양적 측정은 FITC와 PE 형광이 부착된 항체를 사용하여 형광 결합 정도를 측정하였고 실험에 사용한 항체들과 같은 면역글로블린을 가진 항체(isotype)를 이용하여 mean fluorescence intensity(MFI) 값을 보정하여 표시하였다. 간단히 실험 방법을 나타내면, 호중구 \( \left (1 \times 10 ^ { 6 } \right ) \) 를 채취하여 인산완충액으로 1회 세척한 후, annexin V-FITC와 PI 그리고 항체 부착 수지상 세포 표면 마커를 각 15분 및 30분간 \( 4 ^\circ \mathrm { C } \)에서 반응시켰다. 반응시킨 세포의 일부 \( \left (1 \times 10 ^ { 4 } \right ) \) 를 flow cytometry를 이용하여 측정하였다.</p> <h2>Protease 활성 측정</h2> <p>Protease의 활성은 tripeptide thiobenzyl ester(Boc-Als-Pro-Nva-Sbzl)가 가수 분해되는 정도를 측정하여 나타냈다. 세포 용해물(\(100~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml }\))을 완충액(\(\mathrm{6.5 ~mM}\) Boc-Ala-Pro-Nva-SBzl, \( 16 \mathrm { ~mM } \) 5,5'-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid, \( 100 ~\mathrm { mM } \) HEPES, \( \mathrm { pH }~ 7.2,0.5 \mathrm { ~mM }~ \mathrm { NaCl } \) 과 1시간 동안 반응시킨 후, 흡광도 정량법을 이용하여 \( 405 \mathrm { ~nm } \) 에서 호소 활성을 측정하였다.</p> <h2>Caspase-3 활성 측정</h2> <p>\( 1 \times 10 ^ { 7 } \) 개의 세포를 \( 50 ~\mu \mathrm{l}\) 의 용해 완충액(\(10~ \mathrm { nM } \) HEPES, \( \mathrm { pH } ~7.4\), \( 50~ \mathrm{ mM }~ \mathrm { NaCl }\), \(2~ \mathrm { mM } ~\mathrm { MgCl }\) , \(5 ~\mathrm { mM } \) EGTA, \( 2~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) leupcptin, \( 2 ~\mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) aprotinin)에 넣고 적당히 섞어준 후, 세포용해물을 \( 50~ \mu \mathrm { M } \) 의 caspase-3의 기질인 Ac-DEVD-pNa를 포함하고 있는 \( 200~ \mu \mathrm { l } \) 의 반응 완충액( \( 25 ~\mathrm { mM } \) HEPES, \( \mathrm { pH } 7.4 \), \( 0.1 \% \) CHAPS, 10 \% glycerol, \( 1 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 5 ~\mathrm { mM } \) DTT)에 나누어 담았다. 그리고 실온에서 90분간 반응 후, 흡광도 정량법을 이용하여 \( 405 \mathrm { ~nm } \) 에서 효소 활성을 측정한다. 활성도는 \(\mathrm{pmol/sec \cdot mg}\) 단백질 단위로 표기하였다.</p> <h2>T-세포 증식 실험</h2> <p>AEBSF와 사이토카인을 처리한 호중구를 Park 등과 같은 방법으로 T-세포 증식능을 측정하였다. 건강한 공여자의 혈액으로부터 CD3 항체가 결합된 MACS magnetic beads를 이용하여 T-세포를 분리하였다. 분리한 T-세포의 순도는 FITC가 결합된 CD 3 항체를 이용하여 황인하였으며 분리된 T-세포의 순도는 \( 95 \% \) 이상이었다. 혈액은 공여자와 동아대학교의 윤리위원회(Institutional Review Board)의 승낙을 얻어 사용하였다. AEBSF와 함께 20시간 배양한 호중구를 수집하여 배양배지로 세척한 후, \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) 개의 T-세포와 함께 96-well 배양 플레이트에 함께 5일간 배양하였다. 호중구와 T-세포를 SEB를 처리하거나 또는 처리하지 않은 상태에서 함께 4일 동안 배양 후 \( 1 \mu \mathrm { Ci } \left [ { } ^ { 3 } \mathrm { H } \right ] \) thymidine을 처리하고 액체섬광계수기를 이용하여 방사성 동위 원소 결합력을 측정하였다. T-세포만을 단독 배양하여 대조군으로 이용하였다.</p> <h2>사이토카인 측정</h2> <p>T-세포 증식 실험과 같은 방법으로 호중구와 T-세포를 2일 동안 함께 배양한 후, 상층액을 수집하고 ELISA kit(R&D system사)을 이용하여 생성된 IFN의 양을 측징하였다. 이 실험을 R&D사에서 제공한 사용자 지침서를 참고로 하여 실험하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>세포사멸 결과는 평균\( \pm \)표준편차(mean\(\pm\)SD)로 나타내었다. 통계학적 유사성은 자료들의 분포를 확인하고 Student's \( \mathrm { t } \)-test를 이용하여 검정하였고 \( P \) 값이 \( 0.05 \) 이하이면 유의성이 있는 것으로 판정하였다.</p>