본 연구는 무세포 단백질 합성 시스템을 이용하여 광학활성 EH 유전자의 발현 가능성을 확인하기 위해 수행되었다. 이를 위해, Rhodotorula glutinis의 EH를 발현시키고 입체선택적 가수분해 활성을 평가하였다. 또한, 이 과정에서 \(R\). glutinis EH 유전자의 증폭을 위해 PCR을 사용하였으며, primer로는 pET 2b(+) vector 상의 T7 promoter 및 17 terminater의 염기서열 일부가 사용되었다. 이를 통해 무세포 단백질 합성을 이용하여 입체선택성을 유지시키면서 광학활성 EH 유전자를 발현할 수 있음을 확인하였다.
<p>이 경우 무세포 단백질 발현과정 중에서 입체선택성을 잃어 버린 것인지 아니면, 원래 효소가 입체선택성이 없는 것인지를 구분할 수 없기 때문에 screening 방법으로는 적합하지 못하다. 따라서 본 연구에서는 무세포 단배질 합성법을 통해 입체선택성올 유지시키면서 광학활성 \( \mathrm { EH } \) 유전자를 발현할 수 있는지를 검증하기 위하여, 무세포 단백질 합성시스템을 이용하여 Rhodotorula glutinis의 \( \mathrm { EH } \) 를 발현시키고 입체선택적 가수분해 활성을 평가하였다.</p> <h2>재료 및 방법</h2> <h3>PCR을 이용한 \( R \). glutinis EH 유전자 증폭</h3> <p>R. glutinis \( \mathrm { EH } \) 유전자를 재조합한 \( \mathrm { pET } 2 \mathrm { ~b } ( + ) / R . g \mathrm { EH } \) plasmid DNA를 E. coli DH5a로부터 정제한 후 이를 template DNA 로 사용하였다. Primer로는 \( \mathrm { pET } 2 \mathrm { ~b } ( + ) \) vector 상의 \( \mathrm { T } 7 \) promoter의 염기서열 일부인 5'-gatctcgatcocgcgaattaatacgac- \( 3 ^ {\prime } \) 과 17 terminater 염기서열 일부인 5'-ttcagcaaaaaccoctcaa-gacccgttta-3'을 사용하였다. PCR 조건은 변성 온도 \( 94 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \), annealing 온도 \( 58 \mathrm { C } \), 합성 온도 \( 72 \mathrm { C } \) 이었고, 총 30 cycle을 수행하였다. Agarose gel 전기영동을 통하여 \( 1,230 \mathrm { bp } \) 에서 확인된 PCR product를 PCR purification kit (Quagen)를 사용하여 정제한 후, \( 0.1 \% \) DEPC를 16시간 처리하였다. DEPC 처리한 PCR product와 동량의 phenol: chloroform: isoamy-lalcohol 혼합용액(PCI)으로 처리하고, ethanol로 침전시켜 1 undefined 농도의 DNA를 얻어 무세포 단백질 합성용 template로 사용하였다.</p> <h3>Coupled transcription/translation system을 이용한 무세포 단백질 합성</h3> <p>R. glutinis EH 선형 유전자를 E. coli 기반의 coupled trans-cription/translation cocktail (EcoPro \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) T7 system, Novagen)을 사용하여 무세포 단백질 합성을 실시하였다. \( 0.5 \mathrm {\mu g } / \mu \) 도 는 \( 1 \mu \mathrm { g } / \mu \) 농도의 DNA를 template로 사용하였고, \( 5 \mathrm { mM } \) methionine, Ecopro \( ^ {\text { TM } } \) extract를 첨가하고(total volume: 15 II) 37 C 에서 2시간동안 발현시켰다.</p>