군소내장 분획물의 암세포 증식억제효과는 MTT assay를 사용하여 대조군 세포수를 \( 100 \% \)로 정하고 상대적인 세포성장 억제율을 구하여 확인하였다. 군소내장 분획물을 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양한 후 위상차 현미경을 이용하여 각 농도에 따른 형태의 변화를 관찰하였고, phase II 무독화 효소 중의 하나로 돌연변이 또는 발암물질 등에 의한 DNA와의 상호 작용을 차단하는 효소인 Quinone reductase(QR)의 생성 유도 활성은 Prochaska와 Santamaria의 방법을 일부 변형하여 측정하였다.
<h2>암세포 성장 억제 효과(Cytotoxicity) 측정</h2> <p>군소내장 분획물의 암세포 증식억제효과는 MTT assay를 사용하여 행하였다. MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-di-phenyltetrazolium bromide) \( [1,5] \) assay는 세포의 생육을 측정하는 방법으로서 살아있는 세포의 미토콘드리아 내의 de-hydrogenase가 황색 수용성 물질인 MTT에 의헤 dark blue formazan을 생성하는 원리를 이용하였다.</p> <p>이를 위해 각 세포주는 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well의 농도로 맞추고 24 well에 각가 \( 1 \mathrm { ml } \) 씩 첨가하여 24시간동안 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에 배양한 후 용매종류별 분획물을 각각 일정량의 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여서 50, 100, 150, 200, 250 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도로 첨가하였다. 일정시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT 용액을 \( 100 \mu \mathrm { l } \)씩 첨가하여 4시간동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan이 흐트러지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO와 ethanol을 1:1로 혼합한 용액을 \( 1 \mathrm { ml } \)를 첨가하여 천천히 녹인 후 Multi-de-tection microplate를 이용하여 \( 570 \mathrm { ~nm } , 690 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다. 대조군 세포수를 \( 100 \% \)로 정하고 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.</p> <h2>위상차 현미경을 이용한 세포형태학적 관찰</h2> <p>세포배양용 petridish에 각각의 암세포주를 24시간 동안 안정화시킨 다음 군소내장 분획물을 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양한 후, 위상차 현미경을 이용하여 200배의 배율로 각 농도에 따른 형태의 변화를 관찰한 후에 Olympus DP70을 이용하여 촬영하였다.</p> <h2>Quinone reductase (QR) 유도 활성 측정</h2> <p>Quinone reductase는 phase II 무독화 효소 중의 하나로 돌연변이 또는 발암물질 등에 의한 DNA와의 상호 작용을 차단하는 효소이며, \( \mathrm { NAD } ( \mathrm { P } ) \mathrm { H } \)를 이용하여 quinone류의 환원을 촉매하는 flavoprotein이다.</p> <p>\( \mathrm { QR } \) 생성 유도 효과는 Prochaska와 Santamaria의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. T-75 flask의 세포가 \( 80 \% \) 이상 증식하게 되면 24 well plate의 각 well에 \( 1 \times 10 ^ { 4 } \) cells/ml되도록 HepG2 세포주를 분주하여, ncubator에 24시간동안 배양한 후 오징어내장 분획물을 \( \mathrm { HepG } \) 의 세포생존율이 \( 50 \% \)되는 양을 final 농도로 잡아 각각 \( \mathrm { DMSO } \)에 녹여 20, 40, 60, 80 및 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도로 첨가하고 다시 24시간동안 배양한 다음 배양액을 제거하였다. 배지가 제거된 각 well에 \( 250 \mu \)의 lysis buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.0, \( 14 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } , 15 \mathrm { mM } \) \( \left . \mathrm { MgCl } _ { 2 } , 0.5 \% mathrm { NP } -40 \right ) \)를 첨가한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에 10분간 두면서 cell을 lysis한 후 reaction mixture 즉, \( 10 \mathrm { mM } \) Tris-Cl ( \( \mathrm { pH } 7.4 \) ), \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \mathrm { BSA } , 0.008 \% \) tween-20, \( 40 \mu \mathrm { M } \) FAD, \( 0.8 \mathrm { mM } \) glucose-6-phosphate, 2 Unit/ml glu-cose-6-phosphate dehydrogenase, \( 25 \mu \mathrm { M } \mathrm { NADP } , 40 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) MTT 및 \( 1 \mathrm { mM } \) menadione을 혼합하여 well에 \( 1 \mathrm { ml } \) 씩 첨가하여 5분 동안 반응시킨 후, 반응 정지용액인 \( 10.3 \mathrm { mM } \) dicumar-ol, \( 0.5 \% \) pyridine, \( 5 \mathrm { mM } \) potassium phosphate \( ( \mathrm { pH } 7.4) \) 혼합액을 \( 250 \mu 1 \)씩 첨가하여 효소반응을 정지시키고 Multi-de-tection microplate를 이용하여 \( 610 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 그리고 단백질량은 동일한 set의 well plate에 대한 crystal violet 염색방법으로 정량하였다.</p>