본 논문에서는 림프구 세포증식효과를 확인하기 위해 마우스의 경부를 탈구 및 무균 적출하고 HBSS로 세척하여 비장세포를 분리하였다. 이렇게 준비된 비장세포 부유액을 소 태아혈청을 가한 RPMI 1640 배지로 \( 2 \times 10^{6} \) 세포가 되도록 조절해서 berberine \( 0.3,1.0,3.0\ \mu \mathrm{g} \)을 각각 첨가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \%\ \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에 배양시켰다. 배양된 세포는 미국에서 제조된 GM-CSF ELISA을 이용하여 GM-CSF을 측정하였고 Student's t-test를 사용하여 통계학적 분석을 진행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>연구재료</h2><h3>실험동물</h3><p>암컷 Balb/C 마우스로서 생후 8주 내외, 체중 \( 25 \mathrm{~g} \) 내외 것을 한국 효창 사이언스(대구)로부터 구입하여 실험에 사용하였다.</p><h3>시약</h3><p>Berberine과 lipopolysaccharide (LPS)는 Sigma Co. (USA)제품을 사용하였고 concanavalin A (Con A)는 Pharmacia Fine Chemical (Sweden)의 제품을 사용하였다.</p><h2>연구방법</h2><h3>림프구 세포증식효과</h3><p>마우스 비장세포 분리는 다음과 같이 시행하였다. 경부를 탈구하여 희생시킨 마우스로부터 비장을 무균 적으로 적출하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)의 Hank's balanced salt solution (HBSS, Gibco, Grand Island, NY, USA)으로 2회 세척하였다. 이를 직경 \(60\ \mathrm{mm} \) 조직배양용 접시(Costar, Cambridge, MA, USA)에 옮기고 다시 신선한 HBSS를 가한 후 핀셋으로 가볍게 문질러 비장세포를 유리시켰다. 이 세포 부유 액을 \( 15\ \mathrm{ml} \) 원심 관(Falcon, Oxnard, U.S.A.)에 옮긴 후 2-3 분 동안 실온에 방치한 다음 세포 부유 액의 상층 액을 새로운 \( 15\ \mathrm{ml} \) 원심 관에 옮겼다. 이 세포를 \( 200\times \mathrm{g} \) 에서 5-10분 원침한 후 HBSS 로 1회 원침 세척한 다음 증류수와 10배 농축 phosphate buffered saline (PBS)를 이용하여 혼입된 적혈구를 용해시킨 후 HBSS로 2회 원침 세척하여 사용하였다. 림프구에 대한 세포증식효과는 상기와 같이 준비된 비장세포 \( (2 \times 10^{6}\mathrm{cells}/\mathrm{ml}) \)를 96 wells microplate에 \( 100\ \mu \mathrm{l} \) 씩 분주하고 berberine액은 배양액 \( \mathrm{ml} \)당 \( 1,10,30\ \mu \mathrm{g} \) 씩 되게 적하하였다. Con A 농도는 \( \mathrm{ml} \)당 \( 2\ \mu \mathrm{g} \)이 되게 사용하였다. Con A와 복합으로 berberine을 작용시킬 때는 Con A와 동시에 작용시켰다. 분주가 완료된 plate는 \( 5 \%\ \mathrm{CO}_{2}\), \(37^{\circ} \mathrm{C} \) 그리고 충분한 습도가 유지되고 있는 배양기에 3일 동안 배양하였다. 3일 배양 후에 plate의 각 well에 Cell Counting Kit-8액(Dojindo Laboratories, Japan) \( 10 \mu \mathrm{l} \) 씩을 적하하고 4시간 추가 배양하였다. Optical density (OD)는 microplate reader (Model 550 microplate reader, Bio-Rad, Richmond, USA)를 이용하여 \( 450\ \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다.</p><h3>비장세포배양 상층액</h3><p>비장세포배양 상층액 준비는 미리 준비된 비장세포 부유액을 \( 10 \% \) 가 되게 소 태아혈청을 가한 RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지 (complete \( 10 \% \) FCS RPMI 1640)로 \( \mathrm{ml} \) 당 \( 2 \times 10^{6} \) 세포가 되도록 조절하여, 24 wells tis-sue culture plate (Costar, Cambridge, MA, USA)에 \( 1\ \mathrm{ml} \) 씩 분주한 후 berberine \( 0.3,1.0,3.0\ \mu \mathrm{g} \)을 각각 작용시켜 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \%\ \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에 배양하였다. 또한 LPS \( 10\ \mu \mathrm{g} \) 혹은 Con A \( 2.0 \mu \mathrm{g} \)과의 복합작용도 함께 시험하였다. 배양시간은 상기의 조건에서 4, 24, 48시간으로 하였다. 각각 일정시간 배양이 끝난 후 전량 배양액을 수거한 다음 \( 300 \times \mathrm{g} \) 에서 10분간, \( 10,000 \times \mathrm{g} \)에서 30분간 원침 시킨 후 그 상층 액을 수거하여 배양 상층액에서 GM-CSF 생성을 정량하였다.</p><h3>GM-CSF 측정</h3><p>GM-CSF 측정은 Mouse GM-CSF ELISA kit (eBioscience, USA)을 이용하였다. 간략하면 미리 96 wells microplate에 mouse GM-CSF에 대한 capture 항체 \( 100\ \mu \mathrm{l} \) 씩을 분주한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤 방치하였다. 다음날 plate를 세척한 후 plate 의 각 well에 시료 \( 100\ \mu \mathrm{l} \) 씩 을 적하하여 실온에서 2시간 동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 5번 세척한 후 detection 항체 \( 100\ \mu \mathrm{l} \)씩을 분주한 후 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 5번 세척한 후 horseradish peroxidase 액 \( 100\ \mu \mathrm{l} \) 씩을 적하하여 다시 실온에서 30분 동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 7 번 세척한 후 tetramethylbenzidine이 포함된 기질 액 \( 100\ \mu \mathrm{l} \) 씩을 적하하여 실온에서 15분 동안 방치한 후 stop액 \( 50\ \mu \mathrm{l} \) 씩을 가하였다. Optical density는 microplate reader (Model 550 microplate reader, Bio-Rad, Richmond, USA)를 이용하여 \( 450\ \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다.</p><h3>통계학적 분석</h3><p>실험성적은 평균 또는 평균\( \pm \) 표준편차로 나타냈으며 각 군의 통계학적 검정에는 Student's t-test를 사용하고 P값 \( 0.05 \) 미만일 때 의의 있는 차로 간주하였다.</p>