사람의 섬유아세포인 GM10은 \( 5\mathrm{~mM} \) (저농도) glucose DMEM 또는 \( 25 \mathrm{~mM} \) (고농도) glucose DMEM에 sodium bicarbonate \( 3.7 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \), penicillin 100\( \mathrm{U} / \mathrm{ml} \), streptomycin \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 와 \( 10 \% \) FBS를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건 하에서 배양한 후 실험하였다. 실험으로 얻은 Total RNA \( (10 \mu \mathrm{g}) \) 를 one step RNA PCR reaction buffer, \( 5 \mathrm{~mM} \mathrm{~MgCl} 21 \mathrm{~mM} \) dNTP mixture, 0.8 U RNase inhibitor, IGFBP-5 sense, antisense primer 각각 40pmol, 0.1 U AMV reverse transcriptase,0.1 U AMV- optimized Tag과 혼합하였다. 이 반응 혼합물을 PCR Thermal Cycler 480(TAKARA, Japan)를 사용하여 \( 50 ^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분, \( 94 ^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2분간 reverse transcription 시킨 다음 \( 94 ^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초간 30cycles, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 반응시켜 증폭시켰다. 반응 후, EtBr \((10 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml}) \) 을 함유하는 \( 2 \% \) agarose gel에 RT-PCR 생성물을 전기영동하였으며.,100 bp molecular weight marker를 사용하여 크기를 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시 약</h2> <p>Dulbeco's Modified Eagle Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), phosphate buffered saline (PBS)은 Gibco/BRL (Gaitherburg, MD, USA)에서 구입하였다. Sodium bicarbonate, antibiotics solution, bovine serum albumin (BSA), insulin, TRI-reagent, cell extraction buffer에 사용된 시약은 Sigma (St. Louis, MO, USA)제품을 사용하였다. 기타 세포 배양용 시약 및 추출용 유기용매는 특급시약을 사용하였다.</p> <h2>세포 배양</h2> <p>본 실험에 사용된 세포는 사람의 섬유아세포인 GM10은 \( 5\mathrm{~mM} \) (저농도) glucose DMEM 또는 \( 25 \mathrm{~mM} \) (고농도) glucose DMEM에 sodium bicarbonate \( 3.7 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \), penicillin 100\( \mathrm{U} / \mathrm{ml} \), streptomycin \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 와 \( 10 \% \) FBS를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건 하에서 배양하였다.</p> <h2>세포 수 측정</h2> <p>GM10 세포를 \( 5 \mathrm{~mM} \) glucose 배지 또는 \( 25 \mathrm{~mM} \) glucose 배지에서 배양한 후, \( 90 \%\) 정도 자라면 무혈청 배지로 교환하여 24시간 배양하였다. 배양액 제거 후 세포를 PBS로 2회 세척하고 trypsin 처리한 후 무혈청 배지로 세포를 회수하였다. 회수한 세포는 Brightline hemacytometer (Hausser Scientific.U.S.A.)를 사용하여 세포 수를 계산하였다.</p> <h2>IGFBP-5 western blot analysis</h2> <p>GM10 세포를 \( 5 \mathrm{~mM} \) glucose 배지 또는 \( 25 \mathrm{~mM} \) glucose 배지에 배양한 후 세포를 회수하였다. 회수한 cell lysate에 sample buffer를 첨가하여 \( 12.5 \% \) sodium docdecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리하여 Immobilon-PS \( { }^{Q} \) transfer membrane (Millipore, Bedford, MA, USA)에 이동시켰다. Membrane을 \( 3 \% \) BSA-TBS buf-fer(\( 20 \mathrm{~mM} \) Tris-base, \( 137 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaCl}, 1 \mathrm{~M} \mathrm{~HCl}, \mathrm{pH} \) 7.4)에 IGFBP-5(1:1,000) 1차 항체로 하릇밤 반응시켰다. 그 후 2차 항체 (1:1,000, anti-gunia pig alkaline phosphate conjugate)를 첨가하여 3시간 반응시킨 후에 color substrate solution (NBT/BCIP, Promega Co., WI, USA)으로 발색시켰다.</p> <h2>IGFBP-5 mRNA analysis</h2> <p>GM10 세포를 \( 5 \mathrm{~mM} \) glucose와 \( 25 \mathrm{~mM} \) glucose 배지에 배양한 후 \( 90 \% \) 자라면 무혈청 배지로 교환하고 \( 5 \mathrm{~mM} \) glucose 배지에 배양하거나, \( 25 \mathrm{~mM} \) glucose 배지에 IGF-I\(100 \mathrm{~ng} / \)\( \mathrm{ml}) \) 또는 insulin \( (100 \mathrm{~ng} / \mathrm{ml}) \) 을 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액을 제거한 다음, TRI reagent (Sigma) \( 1 \mathrm{~ml} \)을 첨가하여 회수하였다. Chloroform : isoamyl alcohol(24:1)을 첨가하여 원심분리 \( \left(4^{\circ} \mathrm{C}, 12,000 \mathrm{rpm}, 15\right. \) 분 )한 다음 RNA가 포함된 상층액을 옮기고 동량의 isopropanol을 첨가하여 \( -7^{\circ} \mathrm{C} \)에서 침전시켰다. 원심분리하여 상층을 제거하고 남은 total RNA에 \( 70 \% \) ice-cold ethanol로 2번 세척한 후 건조시켰다. 건조된 total RNA는 \( 0.1 \% \) DEPC로 처리한 물에 녹여서 \( 260\mathrm{~nm} / 280 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 RT-PCR에 사용하였다.</p> <p>Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 은 TAKARA one step RNA PCR kit (TAKARA Bio Inc.Japan)를 사용하였다. Total RNA \( (10 \mu \mathrm{g}) \) 를 one step RNA PCR reaction buffer, \( 5 \mathrm{~mM} \mathrm{~MgCl} 21 \mathrm{~mM} \) dNTP mixture, 0.8 U RNase inhibitor, IGFBP-5 sense, antisense primer 각각 40pmol, 0.1 U AMV reverse transcriptase,0.1 U AMV- optimized Tag과 혼합하였다. 이 반응 혼합물을 PCR Thermal Cycler 480(TAKARA, Japan)를 사용하여 \( 50 ^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분, \( 94 ^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2분간 reverse transcription 시킨 다음 \( 94 ^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초간 30cycles, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 반응시켜 증폭시켰다. 반응 후, EtBr \((10 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml}) \) 을 함유하는 \( 2 \% \) agarose gel에 RT-PCR 생성물을 전기영동하였으며, 100 bp molecular weight marker (Bio Labs, Korea)를 사용하여 크기를 확인하였다. RT-PCR에 사용한 IGFBP-5 primer는 아래와 같다.</p>