Birnbiom과 Doly의 알칼리 추출법을 수정하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. E. coli를 Ampicillin 또는 Tetracycline이 포함된 LB배지에서 배양한 후, 다양한 용액들을 사용하여 균체를 처리하였다. 이후, phenol/chloroform/isoamyl 알코올과 chloroform/isoamyl 알코올로 상층액을 추출하였다. 최종적으로 DNA를 에탄올 침전법을 사용하여 침전시킨 후, TE 완충액에 녹여서 보관하였다.
<h2>Plasmid DNA의 분리</h2> <p>Plasmid DNA는 Birnbiom과 Doly의 alkali 추출법을 변형하여 아래와 같이 분리하였다. Ampicillin \( (2 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \)또는 tetracycline \( (30 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \)이 포함된 LB배지 \( 7 \mathrm { ml } \)에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 18시간 배양한 E. coli DH5 또는 HB101 배양액을 \( 1.5 \mathrm { ml } \) tube에 옮겨 원심분리 \( (17,000 \times g, 5 \mathrm { ~min } ) \)하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체에 solution I \( \{ 50 \mathrm { mM } \) Glucose, \( 25 \mathrm { mM } \) Tris- HCl pH 8.0), \( 10 \mathrm { mM } \) EDTA, lysozyme \( (5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \} \) 용액 \( 100 \mathrm { ml } \)를 가하여 현탁하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20분간 정치하였다. solution II \( (0.2 \mathrm { ~N } \) mathrmNaOH, \( \ 0.1 \% \) SDS 용액 \( 200 \mu \mathrm { l } \)를 가하여 혼합 후 \( 0 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 둔 다음, solution III (3 M Potassium acetate, \(11.5 \% \) glacial acetic acid)용액 \( 150 \mu \mathrm { l } \)를 첨가하여 \( 0 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 15분간 정치한 후 \( 20,000 \times g \)에서 5분간 원심분리 하여 상층액을 새로운 1.5 \( \mathrm { ml } \) tube에 옮겼다. 동량의 phenol/chloroform/isoamyl alco- \( \mathrm { hol } ( \mathrm { v } / \mathrm { v } / \mathrm { V } , 25: 2: 1) \)로 상층액 추출하고, 추출액 동량의 chloro-form/isoamyl alcohol \( ( \mathrm { v } / \mathrm { v } , 24: 1) \)을 혼합하여 상층액을 추출하였다. 에탄올 침전방법으로 최종 DNA를 침전시키고 TE 완충액에 녹여 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 보관하였다.</p>