뇌줄기를 제거해 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 고정액에서 2시간 후고정한 후, 진동절편기를 사용해 \( 80 \mu \mathrm{m} \) 두께의 횡단 연속절편을 만들었다. 조직에서 \( \mathrm{HRP} \) 표식된 운동신경원을 세포체(Soma)와 가지돌기의 근위부(\( \mathrm{Pd} \)), 중간부(Id), 원위부(Dd)로 분류하였다. 표본은 Uranyl acetate 포화용액과 \( 0. 3 \% \) lead citrate 용액으로 염색한 후 25,000배로 확대해 촬영하였다. 표식된 운동신경원의 둘레와 길이, 인접한 신경종말의 수, 신경종말 인접부의 평균 길이, 신경종말에 의해 운동신경원이 덮여진 비율 등을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>Horseradish peroxidase (HRP) 주입 및 조직처리</h2> <p>체중이 \( 300-350 \mathrm{~g} \) 인 Sprague-Dawley 계통의 수컷 흰쥐 3마 리를 sodium pentobarbital \( (40 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \), i.p.)로 마취하고 턱끝 혀근을 노출시킨 후 glass microelectrode에 30\% HRP (Sigma, USA) 용액을 넣어 오른쪽 턱끝혀근에 \( 0.7 \mu 1 \)의 HRP를 주입하였다. 약 10시간 생존시킨 후 흰쥐를 sodium pentobarbital \( (80 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \), i.p.)로 마취시킨 뒤 심장을 통해 헤파린을 함유한 식염수와 \( 2.5 \% \) glutaraldehyde, \( 0.5 \% \) paraformaldehyde 및 \( 0.1 \% \) picric acid를 함유한 고정액[in \( 0.1 \mathrm{M} \) phosphate buffer (PB), \( \mathrm{pH} 7.4\)]으로 관류고정하였다. 뇌줄기를 적출하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 의 동일 고정액에서 2시간 정도 후고정 한 후 진동절편기를 이용하여 \( 80 \mu \mathrm{m} \) 두께로. 횡단 연속절편을 만들었다. Tungstate/tet-ramethylbenzidine (TMB) 방법을 이용하여 \( \mathrm{HRP} \) 를 가시 화하였고, diaminobenzidine \( (0.25 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) in PB, \( \mathrm{pH} \) 6.0)을 이용하여 절편을 안정화하였다. 광학현미경으로 관찰하여 \( \mathrm{HRP} \) 에 진하게 표식된 운동신경원을 포함한 절편을 골라서 \( 1 \% \mathrm{OsO}_{4} \) (osmium tetroxide in \( 0.1 \mathrm{M} \mathrm{PB}, \mathrm{pH} 6.0\) )로 1 시간 후고 정하였다. 에탄올로 탈수하고 Durcupan (Fluka, Switzerland) 으로 포매 한 후 \( 58^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48시간 동안 경화하였다.</p> <h2>Postembedding immunogold histochemistry</h2> <p>포매된 조직에서 \( \mathrm{HRP} \) 에 표식된 운동신경원들을 세포체(Soma)와 가지돌기의 근위부(primary dendrite, \( \mathrm{Pd} \) ), 중간부 (intermediate dendrite, Id) 및 원위부(distal dendrite, Dd)로 구분하였다. 원위부는 \( \mathrm{HRP} \) 에 표식된 가지돌기 중 적어 도 \( 100 \mu \mathrm{m} \) 이상의 길이를 가진 가지돌기만 선별하여 구분하였 다. 각 부위가 포함되어있는 절편부위를 면도날로 세절한 뒤 연속 초박절편을 형성하여 formvar film으로 지지막을 형성한 one hole-nickel grid 위에 얹은 후 다음과 같이 postembed-ding immunogold histochemistry를 시행하였다. \( 1 \% \) periodic acid 용액으로 7 분 동안 resin을 etching한 후, \( 9 \% \) sodium-m-periodate 용액으로 osmium을 제거한 다음 \( 1 \% \) sodium borohydride로 10 분간 반응시켜 aldehyde group을 환원시켰 다. \( 2 \% \) human serum albumin (HSA)으로 10 분간 반응시킨 뒤 rabbit anti-GABA항체(1:350, Sigma A2052, USA), rabbit anti-glycine항체(1:100, Abcam ab9442, UK) 및 rabbit anti-glutamate항체(1:400, Sigma G6642, USA)로 실온에서 4시 간 반응하였다. 그 후 \( 1: 20 \) 으로 희석한 \( 15 \mathrm{~nm} \) 의 금입자가 결합 된 goat anti-rabbit IgG (Bio Cell Co., London, UK)에 2시간 반응하였다. Uranyl acetate 포화용액과 \( 0.3 \% \) lead citrate 용액 으로 염색한 후 Hitachi H-7500 투과전자현미경으로 25,000배에서 쵤영하였다.</p> <h2>금입자 염색절편의 전자현미경적 분석</h2> <p>\( \mathrm{HRP} \)에 표식된 운동신경원에서 각 부위로 구분한 연속절편의 면역염색반응에 대한 전자현미경 사진들을 다음과 같이 분석하였다. 모든 정량적인 분석은 전자현미경 사진상에서 컴퓨터에 연결된 Wacom digitizing tablet과 \( \mathrm{NIH} \) image software (version 1.62; NIH, USA)를 사용하여 다음 각 항목을 측정하였다. 표식 운동신경원의 1) 둘레 및 길이, 2) 이와 인접하고 있는 신경종말의 수, 3) 각 신경종말 인접부의 평균 길이 (mean apposed length), 그리고 4) 신경종말에 의하여 운동신경원이 덮여진 비율(synaptic covering \%) 등을 측정하였다. 표식 은동신경원과 연접하근 신경종말을 면역반응의 결과에 따라 GABA 항체에만 면역양성인 신경종말(GABA only), glycine 항체에만 면역양성인 신경종말(glycine only), GABA 및 glycine 항체에 동시에 면역양성인 신경종말(GABA and glycine), glutamate 항체에만 면역양성인 신경종말(glutamate only), 그리고 모든 항체에 면역음성인 신경종말(none) 등 5군으로 분류하여 각각의 측정치를 구하였다. 면역양성 여부는 연접 후 세포질의 금입자 밀도(gold particle density)에 비해 5배 이상의 밀도를 보이근 경우 양성으로 간주하였다. 금입자밀도는 사립체를 제외한 세포질 부위의 면적을 측정하고 여기에 존재하는 금입자의 수를 헤아려 입자수 \( / \mathrm{\mu m}^{2} \) 으로 표시하였다.</p>