trh1과 trh2 유전자의 형별은 DNA colony blot을 사용하여 polynucleotide probe를 이용해 실시했다. Probe DNA는 DIG DNA Labeling and Detection Kit을 활용해 만들었고, labeling은 random primed DNA labeling 방법을 따라 digoxigenin-11-deoxyuridine-triphosphate를 이용해 수행하였다. 또한, ORF 8 유전자의 특이 영역 oligonucleotide를 합성한 primer를 이용해 PCR을 실시하였으며, 검출은 toxR 유전자 방법에 준하여 실행하였다. PFGE는 Not Ⅰ 효소를 사용하고, RAPD는 arbitrarily-primed polymerase chain reaction (AP-PCR)를 사용해 시행하였다.
<h2>DNA probe hybridization법</h2> <h3>a) Probe DNA의 제작</h3> <p>a) Probe DNA의 제작<p> <p>tdh, trh1 및 trh2 유전자의 형별은 polynucleotide probe를 사용한 DNA colony blot으로 실시하였다. 즉, tdh 유전자는 클론화된 plasmid pCVD518를 QIAGEN Plasmid Midi Kit(QIAGEN, Hilden, Germany)로 분리한 후, 415 bp Pst I 단편을 probe로서 사용하였으며, trh1 유전자는 클론화된 plas-mid pKTN 101을 분리하여 334 bp BamHI-EcoRI 단편을 그리고 trh2는 plasmid pKTN 909를 분리한 후, 419 bp BamHIEcoRI 단편을 probe로 사용하였다. 위의 probe DNA의 표지는 DIG DNA Labeling and Detection Kit (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 시행하였다.</p> <p>b) Southern blot hybridization</p> <p>Probe의 labeling은 random primed DNA labeling법에 의해서 digoxigenin-11-deoxyuridine-triphosphate (Boehringer Mannhein, Mannhein, Germany)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 시행하였다.</p> <h2>ORF 8 유전자의 검출</h2> <p>ORF 8 유전자의 염기배열 중에서 특이영역 oligonu-cleotide를 합성한 primer를 사용하여 PCR은 앞에서 언급된 toxR 유전자의 검출과 동일하게 실시하였다. 그리고 유전자 증폭과정은 \( 96 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 5분간 예비 가열한 후, 열변성 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } , \) 1분간 실시하고, 1분간 \( 53 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 annealing 과정, 1분간 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 신장과정을 \(25 \)cycles을 실시하였다. \( 10 \mu \mathrm { L } \)의 PCR 증폭산물과 molecular weight marker로는 \( 100 \mathrm { ~kb } \) DNA ladder (TaKaRa Biomedicals)를 \( 2 \% \) agarose gel 전기영동하였다.</p> <h2>유전자 형별의 시험</h2> <p>Not Ⅰ 효소를 이용한 PFGE, arbitrarily-primed polymerase chain reaction (AP-PCR)을 이용한 RAPD법으로 실시하였다.</p> <h2>Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)</h2> <p>Mold 제작은 CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 시행하였다. 각 plug당 \( 30 \mathrm { U } \) 의 Not I (TaKaRa Biomedicals) 제한효소를 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24시간 처리 후 CHEF-DR Ⅲ system (Bio-Rad)을 사용하여 \( 1 \% \) pulsed field certified agarose gel에서 전기영동을 실시하였다. 영동조건은 pulse시간 2초에서 40초, 전압 \( 6 \mathrm { ~V } / \mathrm { cm } , \) 18시간으로 하였다. 영동 후 EtBr로 염색하고 사진촬영을 실시하였으며 Lambda DNA ladders를 molecular weight marker로서 사용하였다.</p>