본 연구에서는 수지상세포의 분화와 성숙 분석 및 in vitro 활성평가, ex vivo 활성평가, in vivo 활성 측정을 진행하였다. 수지상세포의 분화와 성숙 분석은 전구체 세포로부터 GM-CSF와 IL-4에 의한 수지상세포 분화정도를 수지상세포에서 특이적인 CD11c 표면분자 발현정도로 조사하였으며, 실험 결과 MHC 분자 및 costimulatory molecule의 발현에 있어서 배양 \(6-7\)일 정도가 필요함을 알 수 있었다. 다음으로 in vitro 실험의 경우, 수지상 세포의 총 배양기간이 \(7\)일 이내가 적합함을 보였고, ex vivo 실험을 통해 in vitro 실험의 결과를 재확인 할 수 있었다. 마지막으로 in vivo 활성 측정에서는 항원 노출로 인한 수지상세포의 탈진상태를 유발을 고려해 면역반응에 있어 \(8\)시간 항원 노출이 보다 효과적임을 제시한다.
<h1>결과 및 토의</h1><h2>수지상세포의 분화와 성숙</h2><p>마우스 골수로부터 분리한 전구체 세포로부터 GM-CSF와 IL-4에 의한 수지상세포 분화정도를 수지상세포에서 특이적인 CD11c 표면분자 발현정도로 조사하였다. CD11c+ 세포는 \( 60 \% \) 이상의 분포를 보이는 배양 6일 이후로 배양시간이 경과함에 따라 점차 증가하였으며, 마지막 24시간 동안 OVA와 같은 특정항원 또는 LPS와 같은 성숙자극인자에 노출되어도 큰 변화를 보이지 않았다. 한편 CD11c+ 세포에서 항원제시세포의 기능적 활성을 나타내는 MHC class II 분자와 CD86 (B7.2) 분자의 발현도 시간 의존적으로 증가하였으나, CD40은 배양 7일 이후로는 오히려 감소하는 양상을 보였다. Costimulatory molecule들은 OVA와 같은 특정 항원 또는 LPS와 같은 성숙유도인자의 자극에 의하여 발현이 더욱 증가하는 현상을 관찰할 수 있었다. 이러한 실험결과는 미성숙한 수지상세포에서 항원탑재와 활성화 자극을 위한 MHC 분자 및 costimulatory molecule의 발현에 있어서 배양 6-7일 정도의 세포가 적합한 분화단계임을 제시한다.</p><h2>수지상세포의 in vitro 활성평가</h2><p>수지상세포는 in vitro에서 항원에 노출(pulsing)시켜 활성화를 유도할 수 있고, 이를 생체 내에 투입하여 고준위의 항원특이적인 면역반응을 유도할 수 있다. 본 실험에서는 OVA 항원 pulsing에 의한 수지상세포의 최적 활성 단계를 결정하기 위하여 배양 6일과 7일 수지상세포에 항원을 8, 16 및 24시간 동안 각각 노출시킨 다음, 수지상세포의 활성정도를 확인하기 위하여 IL-12 분비량을 측정하였다. OVA항원 노출 시간에 비례적으로 IL-12 생성량이 증가하였으며, 배양 6일 수지상세포가 7일에 비해 높은 IL-12 생성을 나타내었다. 한편 in vitro에서 항원에 노출된 수지상세포는 생체 내에서 다양한 성숙자극인자로 추가적인 자극을 받게 된다. 이에 본 실험에서는 항원 pulsing 이후에 LPS로 24시간 동안 추가로 자극한 수지상세포의 활성변화 추이를 조사하였다. 이 경우에도 배양 6일 수지상세포가 7일에 비해 전반적으로 사이토카인 분비능이 높았으나, 항원 노출 시간이 길어지면 오히려 IL-12 분비능이 감소하였다. 이러한 실험결과는 미성숙 단계의 수지상세포에 항원이 pulsing되어야 효과적인 활성화를 유도할 수 있으며, in vitro에서 총 배양기간이 7일 이내가 적합함을 보여준다. 또한 in vitro에서 조작된 수지상세포가 생체 내에서의 재자극 받는 것을 고려할 때, 8시간 이상의 항원 노출은 수지상세포를 고갈상태(exhaustion)에 빠지게 하여 항원제시능이 저하될 수 있다는 사실을 제시한다. 실질적으로 생체 내에 투입된 수지상세포는 림프조직에 도달할 즈음에 IL-12 분비가 최고조에 달해야 효과적으로 \( Th_{1} \) 반응을 일으키며, 보다 강력한 CTL 반응을 유도한다. 따라서 본 실험에서 나타난 바와 같이 in vitro에서 수지상세포에 항원노출 시간이 길어질수록 in vivo에서 재자극 인자에 대한 IL-12 분비능이 저하하여 효과적인 항종양 면역반응을 나타낼 수 없을 것으로 추정된다.</p><h2>수지상세포의 ex vivo 활성평가</h2><p>배양 6일 세포에 OVA 항원을 8시간 또는 24시간 노출시킨 수지상세포를 생체 내 투입한 마우스에서 면역반응 유도를 확인하기 위하여 일차적으로 비장세포 중의 세포독성에 관여하는 T세포 분획을 분석하였다. 항원에 노출된 수지상세포를 투입한 마우스의 CD8+ T세포 분획이 다소 증가한 것을 볼 수 있었으며, 특히 8시간 항원 노출한 경우의 수지상세포에서 가장 높은 분포를 나타내었다. 또한 CD8+ T세포 중 IFN-\(\gamma\)를 분비하는 세포도 동일한 결과를 보였다. 다음으로 이들 세포의 세포독성을 ELA 세포 또는 OVA를 발현하는 EG7 세포를 대상으로 조사하였다. OVA 항원을 pulsing한 수지상세포를 투여한 마우스 그룹에서는 EL4 세포와 대조적으로 EG7 세포에 대하여 3:1, 10:1, 30:1 및 100:1의 E:T ratio에 증가에 따라 세포독성도 증가하였다. 이 경우에도 OVA 항원을 8시간 노출한 수지상세포에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 이러한 실험결과는 IL-12 생성능 결과와 일치하는 것으로서 in vitro에서의 실험결과를 재확인할 수 있었다. 이는 24시간 종양항원을 처리한 수지상세포 치료제 임상시험에서 효과적인 항종양 면역반응을 유도하지 못하는 이유 중의 하나로 설명될 수 있을 것이다. 실제로 탈진상태의 수지상세포는Th2를 개시하거나 비분극 T 세포를 유도한다고 보고되고 있다.</p><h2>수지상세포의 in vivo 활성 측정 (종양 모델에서 항종양 치료 및 예방효과)</h2><p>EG7 세포에 의해 형성된 종양모델에 대한 실질적인 항종양 치료 및 예방효과를 측정하여, in vitro 및 ex vivo 실험을 통하여 검증한 최적 활성단계의 항원탑재(antigen-pulsed) 수지상세포를 확인하였다. OVA 항원 탑재 수지상세포를 투여한 치료효과 실험에서는 saline 혹은 항원을 처리하지 않은 수지상세포를 주사한 그룹과 비교할 때 뚜렷한 종양형성 억제효과를 나타내었다. 특히 OVA 항원을 8시간 pulsing한 그룹이 24시간 그룹보다 더 강력한 종양형성 억제 효과를 나타내었다. 또한 생존 시기에서도 8시간 그룹이 4주 이상의 지연 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 예방효과 실험에서도 유사한 결과를 보였다. 즉 OVA 항원을 8시간 pulsing한 그룹에서 강력한 종양형성 저지효과를 나타내었으며, 사망한 마우스 없이 지속적으로 생존함을 보였다. 현재 사용되고 있는 대부분의 수지상세포 치료제는 24시간 항원을 노출시켜 in vitro에서 최고조의 활성화 단계에 이른 세포를 생체 내로 투여한다. 그러나 본 연구의 결과로 24시간 항원 노출은 생체 내에서 수지상세포의 재자극에 의한 탈진상태를 유발하여 치료효과가 떨어질 수 있으므로, 실질적인 항종양 면역반응을 유도하는데 있어서 8시간 항원 노출이 보다 효과적임을 제안한다.</p>