생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제의 안전성 확보는 중요한 문제로, 감염성 병원체 오염을 방지하기 위해 ICH 가이드라인(Q5A)가 권장되고 있다. Bovine herpesvirus, bovine viral diarrhoea virus, bovine parainfluenza virus type 3는 소유래 원료에 빈번히 오염되는 바이러스로, 이들의 빠르고 정확한 검출을 위한 PCR 기반 연구가 활발히 진행되고 있다. 하지만, Bovine parvovirus(BPV)에 대한 PCR 기반 연구는 아직 없다. 이 연구에서는 소유래 원료를 사용하는 생물의약품과 조직공학제제, 세포치료제의 안전성 보장을 위해 BPV를 빠르고 정확하게 검출할 수 있는 real-time PCR 방법을 개발하려고 한다.
<h1>고 찰</h1> <p>소유래 혈액, 세포, 조직, 기관 등을 이용하여 생산되는 생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제는 원료 자체에 감염성 병원 인자가 오염될 가능성이 있기 때문에 안전성 확보가 가장 큰 문제 중의 하나로 대두되고 있다. 인체에 유해한 바이러스가 오염되는 것을 방지하여 안전한 생물학적 제제가 제조되도록 하기 위해서는 오염 바이러스의 검출 및 불활화 또는 제거 검증 관련 기술을 확립해야만 한다. 또한 완제품은 물론 원료부터 완제품의 생산에 이르기까지 전체 제조공정에 대한 철저한 품질관리가 필수적이다. BPV는 소에게 가장 흔하게 감염되는 바이러스 중의 하나이기 때문에 소유래 원료물질을 사용하는 생물의약품과 조직공학제제, 세포치료제의 경우 BPV에 오염될 가능성이 있다. BPV는 생물의약품 제조용 세포주의 배양을 위해 첨가하는 우혈청에 오염될 수 있기 때문에, 인체에 직접적인 위해 여부는 알려져 있지 않지만, 잠재적인 위해요소의 하나이다. 따라서 우혈청을 세포배양 원료로 사용한 세포주의 경우 반드시 BPV의 오염 여부를 민감도와 특이도가 우수한 검증된 시험법으로 확인하여야만 한다. 세포치료제의 배양 원료로 우혈청을 사용할 경우에도, BPV의 오염 여부를 확인하여야만 한다. 또한 소의 조직을 이용하여 생산되는 콜라겐과 조직공학제제의 경우에도 BPV의 오염 여부를 확인하여야만한다. 내인성 또는 외래성 위해 바이러스 오염을 방지하기위한 ICH 가이드라인(Q5A)은 원료의 오염 여부를 검사하고, 제조공정에서 바이러스 제거 능력을 평가하기 위하여 민감도와 특이도가 우수한 검증된 시험방법을 사용하도록 권장하고 있다.</p> <p>BPV 검출을 위한 혈청중화시험법과 혈구응집반응 시험법은 시간과 비용이 많이 들고, 민감도와 특이도가 떨어지는 단점이 있어, 생물의약품 생산 공정에서 BPV 검출 시험법으로 적용하는데 어려움이 있다. Bovine herpesvirus, bovine viral diarrhoea virus, bovine parainfluenza virus type 3도 소유래 혈액, 세포, 조직, 기관 등에 빈번하게 오염되는 바이러스들인데, 이러한 바이러스의 경우 민감도와 특이도가 우수한 conventional PCR, nested PCR, 또는 real-time PCR을 이용하여 신속.정확하게 검출하려는 연구가 활발히 진행되어 왔다. 하지만 BPV의 경우에는 PCR을 활용한 바이러스 검출 연구가 진행된 바가 없다.</p> <p>본 연구에서는 소유래 원료를 사용하는 생물의약품과 조직공학제제, 세포치료제의 안전성을 보증하기 위해서 BPV를 정량적으로 신속하게 검출할 수 있는 민감도와 특이도가 우수한 real-time PCR 시험법을 개발하고자 하였다. BPV 전체 유전자를 대상으로 BPV에만 특이적인 primer 5 쌍을 디자인하였다. 5 쌍의 primer 중 \( \mathrm { NS } -1 \) (Non structural protein 1) 유전자를 대상으로 디자인 한 primer 쌍 BPV- \( \mathrm { F } 4 \), BPV- \( \mathrm { R } 4 \) 의 민감도가 가장 우수하였다. 선별된 primer를 활용하여 annealing temperature와 \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \) 농도 등 PCR 조건을 최적화 한 결과 확립된 실험법의 민감도는 \( 1.3 \times 10 ^ { -1 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \)이었다. 확립된 BPV DNA 정량법의 재현성 검증을 위해 서로 다른 날에 BPV 표준시료에서 DNA를 추출하고 real-time PCR을 수행한 후 crossing point 값을 비교한 결과, BPV \( \log \) titer \( \left ( \log _ { 10 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } ; \mathrm { x } \right ) \) 에 대한 crossing point 값(y) 간의 표준 회귀식의 결정계수 \( \left (r ^ { 2 } \right ) \) 는 모두 \( 0.99 \) 이상으로 재현성뿐만 아니라 회귀성이 매우 높음을 알 수 있었다. 생물의약품의 품질관리 평가에 있어 시험법의 민감도와 재현성은 분석의 정확성, 특이성, 검출한계 등과 함께 매우 중요한 요인으로 고려되는데, 본 연구에서 확립한 정량법은 BPV를 정량하는데 있어 민감도와 재현성이 우수함을 확인할 수 있었다.</p>