Davis의 방법에 따른 실험 절차는 다음과 같다. acrylamide separation gel과 acrylamide stacking gel을 함께 사용해 slab gel에 50% sucrose와 0.05% BPB 용액을 1:1 비율로 가한 후, 5 mM Tris-glycine buffer를 사용하여 100 V에서 20분 동안, 그리고 200 V에서 2시간 10분 동안 전기영동을 실시하였다. 실험에 사용된 Polyacrylamide gel은 4°C에서 유지시킨 poly-acrylamide vertical slab system에서 실행되었다. LDH 효소 염색은 Whitt의 방법에 따라 실시하였고, Oxamate-agarose gel을 이용한 affinity chromatography는 O'Carra와 Barry 그리고 O'Carra의 방법을 Kim과 Yum이 변형한 방법으로 실행하였다. 그리고 부분 정제된 시료는 continuous-elution electrophoresis system을 사용하여 4% acrylamide separation gel을 만들어 정제하였다.
<h2>Native-polyacrylamide gel 전기영동(native-PAGE)</h2> <p>Polyacrylamide gel은 항온기(EYELA CA-1100, Rikakikai Co. Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지시킨 poly-acrylamide vertical slab system (SE250, Hoefer Sci. Instr., San Francisco, CA)으로 실시하였다. Davis 의 방법에 따라 7.5\%T, 2.67\%C acrylamide separation gel과 3\%T, 2.67\%C acrylamide stacking gel이 되도록 slab gelo에는 \( 50 \% \) sucrose, \( 0.05 \% \) BPB 용액을 \( 1: 1(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 가한 후 5 \( \mathrm{mM} \) Tris-glycine buffer ( \( \mathrm{pH} \) 8.3)를 사용하여 \( 100 \mathrm{~V} \)에서 20분 간 전개시킨 다음 \( 200 \mathrm{~V} \)에서 2시간 10분 동안 전기영동 하였다. LDH 효소염색은 Whitt 의 방법에 따라 DL-lactic acid, \( \mathrm{NBT}, \mathrm{PMS} \) 및 \( \mathrm{NAD}^{+} \)혼합용액에 gel을 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 염색한 후 \( 15 \% \) 초산용액 내에서 고정시켰다.</p> <h2>eye-specific LDH \( C_{4} \) 동위효소의 정제</h2> <p>Oxamate-agarose gel을 이용한 affinity chromatography는 O'Carra와 Barry 및 O'Carra의 방법을 변형한 Kim과 Yum의 방법으로 실시하였다. Oxamate-agarose col-umn은 \( 0.5 \mathrm{M} \mathrm{KCl} \) 을 포함하는 \( 0.05 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 6.85, 이하 buffer로 칭함)로 평형 시킨 후 사용 전에 \( 0.2 \mathrm{mM} \mathrm{NADH} \)를 함유한 buffer로 평형 시킨 다음 \( 0.5 \mathrm{M} \mathrm{KCl} \)과 \( 0.2 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{NADH} \) 를 첨가한 쥐노래미 눈 조직 추출액 \( 5 \mathrm{ml} \)를 가하였다. Column으로부터 단백질이 용출되지 않을 때까지 \( 0.2 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{NADH} \)를 함유한 buffer로 씻어 준 후 \( 1.6 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 함유한 buffer와 buffer를 차례로 유입시키면서 용출액을 \( 3.2 \mathrm{ml} \)씩 분획하였다. 각 분획은 LDH 활성 측정 및 단백질 정량을 실시하여 elution profile을 작성하고 native-PAGE 상에서 eye-specific LDH \( C_{4} \) 동위효소가 확인된 분흭은 모아서 PM-10 membrane으로 농축시킨 후 다음 단계의 정제시료로 사용하였다.</p> <p>부분 정제된 시료는 continuous-elution electrophoresis system (Model 491 Prep Cell, Bio-Rad Lab. Inc., Hercules, CA)으로 \( 4 \% \) acrylamide seperation gel \( 20 \mathrm{ml} \)를 만들어 정제하였다. 0.025 M Tris, \( 0.192 \) M glycine buffer (pH 8.3) 400 \( \mathrm{ml} \)는 upper electrophoresis buffer reservoir에, 2 1는 lower buffer chamber에, \( 800 \mathrm{ml} \) 는 elution buffer reservoir에 채웠다. 시료와 sample buffer (0.0625 M Tris-HCl, pH 6.8, \( 10 \% \) glycerol, \( 0.025 \% \mathrm{BPB}) \)를 1:1(v/v)로 섞은 eye-specific LDH \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소를 포함한 시료를 gel의 상부에 가하였다. \( 12 \mathrm{~W} \)에서 전개한 후 track marker가 separation gel을 빠져나갈 때 elution buffer를 \( 0.75 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \)의 flow rate로 유입시키면서 용출액을 \( 2 \mathrm{ml} \)씩 분획하였다. 각 분획은 LDH 활성 측정과 단백질 정량을 실시하여 elution profile을 작성하고 native-PAGE상에서 eye-specific \( \mathrm{LDH} \mathrm{C}_{4} \) 동위효소의 활성만 나타나는 분획을 모아 PM-10 membrane으로 농축시킨 다음 역학실험 및 항원으로 사용하였다.</p>