항암 후보 균주의 항균성을 검정하기 위해 Bioscreen C 기기를 사용하였다. 13 시간 배양 후 성장이 대조군에 비해 현저히 적게 자란 것을 선발하였다. Egr-1과 세포 주기 억제 단백질인 p21 유전자 발현에 대한 미생물 배양액의 활성 증가 효과 여부를 관찰하기 위하여, 발광성 유전자(luciferase)가 포함되어 있는 pGL3 벡터에 Egr-1과 p21유전자의 promoter 부위를 삽입한 pGL3-Luc/egr-1(-780/+1)과 pGL3-Luc/p21(-2400/+1)를 사용하였다. HEK293 인간배아 신장세포를 12-well 세포배양판에 첨가하고 난 후, \( 0.5 \mu \mathrm{g} \) 농도에 해당하는 이들 reporter plasmid를 세포에 주입했다.
<h2>항균활성 검정</h2> <p>항암 후보 균주의 항균성을 검정하기 위해 Bioscreen C 기기를 사용하였다. 사전 배양된 S. aureus KACC13236을 O.D \( \mathrm{D}_{600 \mathrm{~nm}} \) (optical density at \( 600 \mathrm{~nm} \) )가 0.1 이 되도록 현탁시켜 Bioscreen C기기의 100 well plate에 well 당 \( 3 \times \mathrm{TSB} 70 \) \( \mu \mathrm{L} \) 접종하고 검색 대상의 \( 1 \times \) 제균배양액 \( 140 \mu \mathrm{L} \) 분주한 뒤 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 흔들어 주면서 90 분 간격으로 O.D. \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 13 시간 동안 균체 성장률을 경시적으로 측정하였다. 13 시간 배양 후 성장이 대조군에 비해 현저히 적게 자란 것을 선발하였다.</p> <p>선발된 균주 배양액의 항균성을 확인하기 위한 또 하나의 방법은 다음과 같다. \( 200 \mathrm{~mL} \) 의 R2A 액체배지에 균을 접종하고 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2일간 진탕 배양하였다. 이들 액체 배지들은 2 배의 ethylacetate로 1 시간 진탕 추출하여 분획 깔대기로 유기용매 층을 모아서 회전감압농축기로 농축하였다. 농축된 펠릿은 원래 배양액 부피의 1/00 의 메탄올로 용해하여 항균성 검정의 시료로 사용하였다. 지시세균에 대한 항균 스펙트럼을 확인하기 위하여, 포도상구균 \( (S \). aureus \( ) \), 고초균 \( (B \). subtilis \( ) \) 은 LB, 식중독 균 (L. monocytogenes \( ) \) 은 LEM 액체 배지 \( 10 \mathrm{~mL} \) 에 접종하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 하룻밤 진탕 배양한다. 그리고 \( 200 \mathrm{~mL} \) 의 해당 고체배지를 멸균기에서 꺼내 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 로 식혀서 이들 배양액을 첨가, 혼합한 뒤 페트리 디시에 분주하여 각 지시균의 항균검정용 배지를 만들었다, 이들 검정용 고체배지 위에 멸균 디스크 \( (\varphi 7 \mathrm{~mm}) \) 를 얹고 해당 시료를 \( 50 \mu \mathrm{L} \) 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 하루 밤 배양 한 후 디스크 주변 내 균 성장 저해환의 크기를 확인하는 방법으로 항균력을 확인하였다.</p> <h2>p21 및 Egr-1 luciferase 프로모터 리포터 활성 분석</h2> <p>Egr-1과 세포 주기 억제 단백질인 p21 유전자 발현에 대한 미생물 배양액의 활성 증가 효과 여부를 관찰하기 위하여, 발광성 유전자(luciferase)가 포함되어 있는 pGL3 벡터에 Egr-1과 p21유전자의 promoter 부위를 삽입한 pGL3-Luc/egr-1(-780/+1)과 pGL3-Luc/p21(-2400/+1)를 사용하였다. 12-well 세포배양판에 HEK293 인간배아 신장세포를 첨가하고 \( 0.5 \mu \mathrm{g} \) 농도의 이들 reporter plasmid를 세포에 주입(transfection)하였다. 이때 renillar luciferase를 발현시키는 \( 50 \mathrm{ng} \) 농도의 pRL-null 플라스미드(Promega Co.)를 같이 주입하였다. 플라스미드 주입 24 시간 후에 저 영양미생물 그룹 및 아그룹 물질은행 배양액를 처리하고 8-12 시간 후에 세포를 수확하였다. 세포 추출액에 luciferase 기질인 luciferin을 반응시켜 발광되는 형광을 측정함으로써, p21 및 Egr-1 유전자 프로모터 활성 정도를 분석하였다. luciferase 효소 활성 측정은 dual glo-luciferase assay kit(Promega Co.)로 firefly luciferase activity를 renilla luciferase activity로 normalize한 비율로 계산하였다. 리포터 효소 활성 재현성을 위해 실험을 두 번 반복하였다.</p>