국내 시판 무의 항진균 단백질 유전자를 얻기 위해 각종 무 종자를 easy - Blue \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) Total RNA extraction Kit를 사용하여 RNA 시료를 제조하였으며, 이를 PCR amplification한 뒤 cloning하여 다중 염기서열 분석을 진행하였다. 분석된 DNA 단편 sequence의 pairwise alignment와 유연성을 관찰하기 위해 Clustal W program을 사용하였다. 본 연구는 이로부터 항곰팡이 및 항효모 활성을 확인하고 RNA 시료와 Primer를 이용해 RT-PCR amplification을 진행하였다.
<p>항 곰팡이 (Botrytis cenerea) 항 효모 (Saccharomyces cer-evisiae, Candida albicans ) 활성 측정을 위해 Disk assay 방법이 사용되었다.</p> <p>\( 100~ \mu \mathrm { l } \) 의 Botrytis cenerea의 포자 현탁액을 PDA plate에 도말 한 후 Disks로 접촉 시키고 그 위에 sample을 흡수시켜 \( 24 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 약 72시간 배양 후 inhibition zone을 특정 하였다.</p> <p>항 효모활성 측정에는 Saccharomyces cerevisiae, Candida al-bicans를 전 배양 후 \( 100~ \mu \mathrm { l } \) 를 취해, 하루 본 배양 시킨 다음 12시간 째 의 배양액을 \( 100 ~ \mu \mathrm { l } \) 취해 항 곰팡이 test와 같은 방법을 사용하였다.</p> <p>국내 시판 무의 항 진균 단백질의 유전자를 획득 하기 위해 농가에서 재배되고 있는 각종 무 종자 Songbaek, Myungsan, Jangwon, Palkwang, Beakja, Chungwoon, Baekwoon (Nongwoo Bio Co., Suwon, Korea) \( 50 \mathrm { ~g } \)을 수세 후 20배 부피의 \( 20 \mathrm { ~mM } \) Tric-HCl \(( \mathrm { pH } 8.0) \) 완충액을 첨가 하여 상용 Homogenizer를 사용하여 분쇄한 후 iNtRON사의 (iNtRON. Co., Sungnam, Korea) easy - Blue \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) Total RNA extraction Kit를 사용하여 RNA시료를 제조하였다. 이렇게 제조된 RNA 시료로부터 Anti fungal protein encoding gene을 Taq DNA polymerase를 사용하여 PCR amplification 하였다. Gene Bank/EMBL (NCBI, USA)상에서 획득한 항 곰팡이 단백질 서열을 토대로 AMPs의 degenerating primer를 제작하였으며 (Table 1) cloning을 위해 sense primer에는 Ncol site를 anti sense primer에는 Xhol 을 site를 삽입하여 pET-28a plasmid (WWW.Promega.com)를 이용하여 cloning하였다. 선별된 clone들은 DNA sequencing 통해 open read-ing frame의 in - frame을 확인하였으며, 또한 다중 염기서열 분석을 수행하였다.</p> <p>염기서열 분석된 DNA 단편의 sequence를 FASTA format으로 정리한 뒤 pairwise alignment 및 유연성(distance)를 관찰하기 위해 Clustal W program (http://www.ebi.ac.uk/clustalw)을 통해 분석하였다.</p> <p>저자는 이미 무 씨앗 (Baekwoon) 에서 항 곰팡이 단백질을 분리하여 MALD-ToF mass spectrometry 이용한 PMF 분석에서 이미 발표된 항 곰팡이 단백질 (Rs-AFP) 와 많은 상동성이 있음을 보고 한 바가 있다. 이에 본 연구에서는 먼저 이들 종자로부터 분리한 조 단백질을 이용하여 항 곰팡이 및 항 효모 활성을 확인 하고 또한 각 종자로부터 분리한 Total RNA시료와 Table 1의 Primer를 이용하여 RT- PCR amplification을 행한 반응 결과를 Table 2에 나타내었다.</p>