대두를 기질로 사용하고 SFM배지에서 고체 배양을 진행하면서, 포자가 영양세포로 발아하는 최적온도와 시기를 측정하였다. 다양한 온도에서의 배양 결과를 바탕으로 발아조건을 결정하였고, 이 조건에 따라 포자체를 접종하여 발아를 진행하였다. 그 후, 다른 온도 조건에서의 배양을 통해 활성을 측정하고 최적 발효온도를 결정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주 및 배양</h2> <p>Bacillus subtilis BK-17 균주는 전보에서 Jeong 등이 사용한 균주를 사용해 기본 배양은 \( 1 \% \) Bacto-tryptone (Sigma, USA), \( 1 \% \) Sodium chloride와 \(0.5 \% \) Bacto-yeast extract (Sigma, USA)를 함유하는 Luria-Bertani 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 호기적으로 배양하였다. 보관 균주는 동일한 배지에서 \( 1.5 \% \) agar를 첨가한 사면배지에 이식하여 냉장보관하면서 1개월마다 계대하여 사용하였다.</p> <h2>혈전용해능의 활성측정</h2> <p>혈전용해능의 활성정도를 측정하기 위하여 Jeong 등의 방법에 따라 fibrin을 기질로 하는 fibrin plate법을 응용하였다. 즉 \( 0.2 \% \)의 fibrinogen 용액 \( 10 \mathrm{ml} \)을 petri-dish에 넣고 bo-rate saline buffer \( (\mathrm{pH} 7.8) \)에 녹인 thrombin 용액\( (40 \mathrm{unit} / \mathrm{ml}) \)을 총 20 units되게 가하여 균일하게 혼합되도록 잘 흔들어 준다. 서서히 fibrinogen이 fibrin으로 되면서 굳어지는데 이 plate를 실온에서 30분 정도 방치한 후 사용하였다. 활성 측정은 시료를 fibrin plate위에 분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 시간별로 반응하여 fibrin이 분해되어 생기는 면적을 측정한다.</p> <h2>고체배양과 기질</h2> <p>고체배양을 위한 전분기질은 밀, 쌀, 옥수수를 사용하였고 식물단백질 기질로서는 강남콩, 검정콩, 대두, 팥, 녹두를 사용하였다. 이들 기질은 각각의 곡물을 분쇄하여 만든 가루상태와 크기가 일정한 낱알 상태로 \( 500 \mathrm{ml} \)의 삼각flask에 \( 50 \mathrm{~g} \)씩 넣고, 멸 균증류수에 \( 0.1 \% ~\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, ~0.05 \% ~\mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, ~0.5~ \% \mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl}, ~0.0007 \% ~ \mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)의 무기질을 함유한 mineral me-dium이나 \( 0.8 \% ~ \mathrm{NaCl} \) 용액 \( 30 \mathrm{ml} \)을 가하여 잘 섞은 후 멸균하였다. 이것은 식힌 후 대수증식기에서 집균한 영양세포나 포자 현탁액 \( 1 \mathrm{ml} \)을 고체 배지에 고루 이식하였다. 배양은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 \( 1 \sim 3 \)일간 효소활성을 매일 측정하면서 배양하였다.</p> <h2>포자 생성조건의 설정</h2> <h3>배지조성과 포자 생성율</h3> <p>혈전용해효소 생산균주에 대한 최적배지를 위하여 nu-trient broth (NB), LB배지, nutreint yeast extract sporulation medium (NYSM), spore forming medium (SFM)의 조성을 중심으로 포자 생성율을 검토하였다. 포자 생성율은 Chevanet 등의 방법에 따라 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 90분간 열처리한 후 멸균식염수로 단계별 희석하고 nutrient agar plate에 도말하여 얻은 colony를 계측하여 그것을 colony forming unit (CFU)로 하였고, 그 unit를 포자수로 하였다.</p> <h3>\( \mathrm{pH} \) 및 온도설정</h3> <p>\( \mathrm{pH} \) 설정은 \( 0.05 \% \) yeast extract를 첨가한 NB배지에서 12시간 전 배양한 생산균을 \( \mathrm{pH} ~2\)에서 \( \mathrm{pH} ~12 \)까지 조정한 포자생성용 배지에 접종한 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60시간 동안 진탕배양 \( (160 \mathrm{rpm}) \)하여 생산균의 총균수와 포자의 수를 전술한 방법으로 측정하였다.</p> <p>온도설정은 포자생성용배지에 생산균을 접종한 후 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)까지 각 온도별로 60시간 동안 진탕배양\( ( 160 \mathrm{rpm} )\)하여 생산균의 총균수와 포자의 수를 측정하였다. 포자 생성율을 검토한 후 가장 알맞은 배양 온도를 정하였다.</p> <h3>포자생성 시기의 결정</h3> <p>생산균의 최적 포자 생성 시기를 조사하기 위하여 spore forming medium에서 배양 후 120시간까지 배양하면서 12시간마다 총균수와 포자수를 조사하였다.</p> <h2>고체배양조건 설정</h2> <p>대두를 기질로 하여 고체 배양하면서 포자가 영양세포로 발아하는 시기와 최적온도를 알아보기 위하여 SFM배지에 배양한 배양액을 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 90분간 처리한 후 LB 한천배지에 접종하여 \( 28,33,37,41,45^{\circ} \mathrm{C} \)에서 각각 배양한다. 배양 6시간째부터 plate상에 colony수를 3시간마다 계수하여 발아온도와 시간을 측정하였다. 발아조건을 결정한 다음, 이 조건에 따라 포자체를 접종하여 결정된 발아온도에서 발아 시킨 후 온도를 \( 28,33,37,41,45^{\circ} \mathrm{C} \)로 각각 조정하여 배양하면서 발효 6시간째부터 fibrin plate method로 활성을 측정하여 최적 발효온도를 결정하였다.</p> <h2>발효대두의 영양학적 기초성분조사</h2> <p>일반 성분분석은 수분, 조단백질, 조지방, 회분, 탄수화물 등을 식품공전에 수록된 방법에 따라 분석하였다. 아미노산 분석을 위하여 시료 \( 5.84 \mathrm{~g} \)을 \( 50 \mathrm{ml} \)의 cap tube에 넣고 \( 6 \mathrm{~N} \)\( \mathrm{~HCl} \) 용액 \( 20 \mathrm{ml} \)을 가하여 녹인 후 밀봉하여 \( 110^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 가수분해 시켰다. 이를 \( 50 \mathrm{ml} \)의 원심관에 옮겨 \( 2 \mathrm{N} \mathrm{~NaOH} \)용액 \( 2 \mathrm{ml} \)을 넣고 중화한 다음 \( 5,000 \mathrm{rpm} \)에서 30분간 원심분리하여 상충액을 취하여 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)의 수욕상에서 질소가스를 통과시키면서 농축하고 잔류물을 \( 0.02 \mathrm{N~} \mathrm{HCl~} 20 \mathrm{ml} \)에 녹이고 이를 pore size \( 0.45 \mu \mathrm{m} \)filter로 여과한 후 시료액으로 사용하였다. 정량은 아미노산 혼합 표준용액과 시료액을 각 \( 20 \mathrm{ml} \)씩 HPLC (Pharmacia Biotech model : Biochrom 20)에 주입하여 분석하였다. HPLC의 조건은 Table 1과 같다.</p>