칠면초 expansin 유전자 cDNA의 분리를 위해 degen-erate primer를 사용하여 PCR을 수행해 3종의 full-length cDNA 클론을 확보했고, 각각 930개, 1391개 및 1214개의 염기로 이루어진 단백질을 암호화하는 것을 확인했다. 칠면초 expansin 단백질은 EXPA, EXPB, EXLA 및 EXLB 단백질군 중에서 속하는지 알기 위해 유추한 아미노산서열을 이용하여 단백질 구조분석을 수행해 C, W 및 HFD domain의 존재를 확인했다. 또한 상기 9종의 expansin과 칠면초 expansin의 아미노산서열을 비교한 결과 SjEXPA1과 SjEXAP3는 딸기의 expansin과, SiEXPA2는 대추나무 expansin과 유사도가 높은 것으로 나타났다. 또한 actin 유전자는 GenBank 데이터베이스에서 검색한 결과 칠면초에서는 보고된 바 없으므로 같은 명아주인 해홍나물과 나문재의 actin 유전자의 염기서열을 확보하여 칠면초의 actin 유전자 cDNA를 합성했고, 염기서열 분석 결과 칠면초 actin 유전자는 해홍나물과 나문재의 actin 유전자와 염기서열이 매우 유사함을 확인했다.
<h1>결과</h1> <h2>칠면초 Expansin cDNA 분리, 염기서열 및 아미노산서열 분석</h2> <p>칠면초 expansin 유전자의 cDNA를 분리하기 위해 degen-erate primer를 사용하여 PCR을 수행하였다. 여기에서 확보한 cDNA를 주형으로 하여 5' RACE PCR과 3' RACE PCR을 수행한 결과 3종의 full-length cDNA 클론을 확보하였으며 각각 SjEXPA1, SjEXPA2 및 SjEXPA3로 명명하였다. 염기서열을 분석한 결과 SIEXPA1, SiEXPA2 및 SiEXPA3는 각각 930개, 1391개 및 1214개의 염기로 이루어져 있으며, 각각 253개, 257개 및 247개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 암호화하는 것을 확인하였다.</p> <h2>칠면초 expansin 단백질 구조 분석</h2> <p>칠면초의 expansin 단백질 3종이 EXPA, EXPB, EXLA 및 EXLB 단백질군 중에서 어디에 속하는지 알기 위해 유추한 아미노산서열을 이용하여 단백질 구조분석을 수행하였다.</p> <p>칠면초 expansin 아미노산서열을 이용하여 유사도가 비슷한 다른 종의 expansin 아미노산서열을 GenBank 데이터베이스에서 선별하였다. 다른 종의 expansin 아미노산서열은 애기장대(AtEXPA1), 딸기(FaEXPA2), 고사리(MqEXPA1), 담배(NtEXPA1), 옥수수(ZmEXPA1), 이끼(PpEXPA5), 토마토(LeEXPA2), 벼(OsEXPA4) 및 대추나무(ZiEXPA)에서 확보하였다. 상기 9종의 expansin과 칠면초 expansin의 아미노산서열을 비교한 결과, 칠면초 expansin 단백질에 시스테인(C), 트립토판(W) 및 히스티딘-페닐알라닌-아스파르트산(HFD) do-main이 존재함을 확인하였다(Fig. 1).</p> <p>아미노산서열 비교를 통한 계통수 작성 결과, 칠면초 ex-pansin 중 SjEXPA1과 SjEXAP3는 딸기의 expansin(FaEXPA2)과, SiEXPA2는 대추나무 expansin (ZiEXPA)과 유사도가 높은 것으로 나타났다(Fig. 2).</p> <h2>칠면초 actin cDNA 클로닝 및 염기서열 분석</h2> <p>Expansin의 발현양상 분석에 대조구 유전자로 사용할 actin 유전자를 GenBank 데이터베이스에서 검색한 결과, 칠면초에서는 actin 유전자가 보고된 바 없으므로 같은 명아주과 염생식물인 해홍나물(Suaeda maritima)과 나문재(Suaeda glauca)의 actin 유전자의 염기서열을 확보하였다. 두 식물의 actin 유전자 염기서열을 비교하여 두 유전자 모두에 공통적으로 존재하는 염기서열을 찾아 제작한 primer로 PCR 증폭하여 칠면초의 actin 유전자 cDNA를 합성하였다. 염기서열 분석 결과 칠면초 actin 유전자는 해홍나물과 나문재의 actin 유전자와 염기서열이 매우 유사함을 확인하였다(Fig. 3).</p> <h2>기관별 expansin 발현양상 비교 분석</h2> <p>3종의 칠면초 expansin cDNA의 염기서열을 분석하여 각 expansin 유전자에 특이적인 염기서열로 primer를 각각 제작하여 semi-quantitative RT-PCR을 수행하였다. 그 결과 모든 expansin 유전자가 유식물의 지상부에서 발현되며, 잎에서는 SjEXPA1과 SjEXPA2의 발현이 강한 반면 SjEXPA3은 발현이 약함을 확인하였다. 한편, 뿌리에서는 SjEXPA1과 SjEXPA2의 발현이 강하며, SjEXPA3은 전혀 발현되지 않았다(Fig. 4).</p> <p>유식물의 줄기를 세분화하여 칠면초 expansin의 발현양상을 비교한 결과 줄기에서는 모든 expansin이 발현되었으며, 잎에서는 SjEXPA가 강하게 발현되는 것을 확인하였다(Fig. 5).</p> <h2>\( \mathrm { NaCl } \) 농도별 칠면초 생장 변화 분석</h2> <p>\( 28 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 24시간 연속광 조건의 배양기에서 각각 \( 0 \mathrm { ~ppt } \), \( 1 \mathrm { ~ppt } \), \( 2 \mathrm { ~ppt } \), \( 5 \mathrm { ~ppt } \), \( 10 \mathrm { ~ppt } \) 및 \( 20 \mathrm { ~ppt } \)의 \( \mathrm { NaCl } \)을 함유한 1/2 MS 배지에서 2주간 배양한 칠면초 유식물의 생장도를 측정하였다. 실험에 사용한 \( \mathrm { NaCl } \) 농도 범위 내에서 칠면초의 생장도는 큰 차이를 나타내지 않았으나 \( 1 \mathrm { ~ppt } \)와 \( 2 \mathrm { ~ppt } \) 처리구에서 가장 높은 생장도를 보였다(Fig. 6). 각 \( \mathrm { NaCl } \) 농도에서 유식물의 평균 초장은 \( 0.82 \mathrm { ~cm } \) \((0 \mathrm { ~ppt } ) \), \( 1.28 \mathrm { ~cm } \) \((1 \mathrm { ~ppt } ) \), \( 1.12 \mathrm { ~cm } \) \((2 \mathrm { ~ppt } ) \), \( 0.84 \mathrm { ~cm } \) \((5 \mathrm { ~ppt } ) \), \( 0.84 \mathrm { ~cm } \) \((10 \mathrm { ~ppt } ) \) 및 \( 0.78 \mathrm { ~cm } \) \((20 \mathrm { ~ppt } ) \) 로 측정되었다. \( \mathrm { NaCl } \) 농도에 따른 expansin 유전자의 발현을 확인하기 위해 semi-quantitative RT-PCR을 수행한 결과 expansin 유전자의 발현은 \( \mathrm { NaCl } \) 농도의 영향을 받지 않고 발현됨을 확인하였다(Fig. 7).</p>