DAVIS 액체배지에 2%의 분리 미생물을 접종하여 30\(^\circ \mathrm{C}\)에서 72시간 배양 후 원심분리하여 상등액에 ammonium sulfate를 농도별로 포화시킨 분획별 침전물을 원심분리한 후, 얻은 침전물을 \( 10 \mathrm{mM} \) Tris \( \mathrm{HCl} \) buffer \( (\mathrm{pH} \) 7.2)에 용해시킨 후 완충용액에 24시간 투석하여 염을 제거했다. 키틴 분해효소의 단백질 정량은 Lowry's method를 따랐다.
<h2>효소의 분리 및 정제</h2> <p>분리 미생물을 DAVIS 액체배지에 \( 2 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 72 시간동안 배양한 후, 배양액을 원심분리 \( \left(10,000 \times g, 4^{\circ} \mathrm{C}, 30 \mathrm{~min}\right) \) 하여 상등액에 ammonium sulfate (Junsei, Japan)를 0-20\%, 20-40\%, 40-60\%, 60-80\%, \( 80 \% \) 이상의 농도로 포화시키며 분획별 침전물을 각각 원심분리 \( \left(20,000 \times g, 4^{\circ} \mathrm{C}, 25 \mathrm{~min}\right) \) 하였다. 원심분리하여 얻은 침전물을 \( 10 \mathrm{mM} \) Tris \( \mathrm{HCl} \) buffer \( (\mathrm{pH} \) 7.2)에 용해시킨 후 동일한 완충용액에 24 시간 동안 투석(Spectra/Por \( 1, \mathrm{MWCO} \) 6-8,000; Spectrum Laboratories Inc., USA)을 수행하여 잔존하는 염을 제거하였다. 모든 정제과정은 효소 단백질의 변성을 최소화하기 위하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 진행하였다. DEAE-sepharose fast flow으로 충진된 column \( (2.5 \times 50 \mathrm{~cm} \), Pharmacia Biotech., Sweden)을 \( 10 \mathrm{mM} \) Tris \( \cdot \mathrm{HCl} \) buffer (pH 7.2)로 평형화시킨 후, 투석한 농축 조효소액을 주입하여 \( 1 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 의 유속에서 동일완충액으로 흡착시켰다. 동일 완충액에 용해시킨 linear gradient한 \( 0-1 \mathrm{M} \mathrm{NaCl} \) 로 용출하여 \( 4 \mathrm{ml} \) 씩 분획하였다. 각 분획마다 키틴 분해활성을 측정하고 단백질 함량은 \( 280 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. Sephacryl S-300HR 으로 충진된 column \( (1.5 \times 100 \mathrm{~cm} \), Pharmacia Biotech.)을 \( 10 \mathrm{mM} \) Tris \( \mathrm{HCl} \) buffer \( (\mathrm{pH} \) 7.2) 로 평형화시키고 효소액을 \( 0.5 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 의 유속으로 용출하여 분획 당 \( 2 \mathrm{ml} \) 씩 분획하였다. 각 분획마다 키틴 분해활성을 측정하고 단백질 함량은 \( 280 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>단백질 정량</h2> <p>키틴 분해효소 단백질의 정량은 Lowry's method에 따라 수행하였다. 정제한 각각의 효소액 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 에 biuret reagent \( (0.75 \mathrm{mmol} / \mathrm{l} \) cupric sulfate, \( 94 \mathrm{mmol} / \mathrm{l} \) sodium hydroxide) \( 550 \mu \mathrm{l} \) 를 넣어 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에 10 분간 반응시킨 후, Folin-Ciocalteu's reagent (Sigma) \( 25 \mu \mathrm{l} \) 를 넣고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분동안 반응하였다. Spectrophotometer를 이용하여 \( 725 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였으며, 표준 단백질로 bovine serum albumin (BSA; Sigma)을 사용하였다.</p>