1995년 McKinney 등이 소개한 역유전학 분석법은 식물 유전자 기능 분석에 널리 사용되며, 특히 삽입돌연변이 계통, 과발현체, siRNA 등을 활용한 재료 육성이 활발하다. 돌연변이 개체를 조직화하여 특정 유전자 돌연변이를 PCR로 찾는 방법, 또는 삽입된 T-DNA나 transposon의 인접 염기서열을 데이터베이스로 활용하는 방법이 있다. 삽입돌연변이체 연구에서 열악한 형질의 돌연변이체가 빈번히 나타나며, 이에 따른 표현형 구분이 어려운 경우가 많다. 이를 보완하기 위해 loss-of-function과 gain-of-function 돌연변이체를 육성하여 유전자 기능을 더 효과적으로 밝히는 연구가 진행 중이다.
<h1>유전자의 역유전학적 (reverse genetics) 분석</h1> <p>역유전학 (reverse genetics) 분석방법은 1995년 애기장대에서 McKinney 등에 의해 소개된 후, 많은 고등식물 유전자들의 기능 분석에 활용되고 있다 (Vitha et al. 2003; Leonhardt et al. 2004; Li et al. 2004; Adham et al. 2005; Zolman et al. 2008). 식물의 전체 유전자의 염기서열이 해독됨에 따라 특정 유전자를 선택하여 해당 돌연변이체를 분석하여 기능을 밝히는 '유전자로부터 표현형 (from gene to phenotype)'의 방향으로 진행되는 역유전학 분석이 주된 연구방법으로 활용되고 있다.</p> <p>식물의 경우 삽입돌연변이 계통(Ac/Ds, T-DNA, Tos17), 과발현체 및 siRNA 등을 이용한 재료 육성이 많이 이루어지고 있으며 이들 재료를 이용한 역유전학적 유전자 기능분석 연구가 최근 활발히 이루어지고 있다.</p> <p>역유전학 연구방법은 주로 다음과 같은 두 가지 방법을 활용한다. 돌연변이 개체를 2차원 및 3 차원의 풀 (pool)로 조직화하고, 이를 이용하여 PCR을 통해 특정 유전자의 돌연변이를 찾는 방법과, 삽입된 T-DNA나 transposon의 인접 염기서열을 모든 라인으로부터 분리하여 데이터베이스로 만들어서 활용하는 방법이다.</p> <p>염기서열 결정에 의해 동정된 유전자의 기능을 밝히는 직접적인 방법은 기능상실(loss-of-function) 돌연변이체를 작성하여 그 변이체의 표현형을 비교 연구하여 기능을 밝히는 것이다. 여러 모델식물에서 정상의 유전자를 돌연변이 된 유전자로 교체함으로써 특정 유전자의 돌연변이를 연구하는 데에 homologous recombination 방법이 효율적으로 이용된 바 있지만(Kempin et al. 1997) 대규모로 유전자의 기능을 밝히는 데에는 효율적이지 못하다. 따라서, 유전체 염기서열분석에서 동정된 많은 유전자들의 돌연변이체를 얻기 위하여 T-DNA나 transposon의 삽입에 의하여 수많은 돌연변이체를 얻을 수 있었고(McKinney et al., 1995; Martienssen, 1998; Chin et al. 1999; Jeon et al. 2000) 이들을 이용하여 많은 미지 유전자의 분리와 그 기능을 밝히는데 효율적으로 이용되어 왔다. Arabidopsis에서 삽입돌연변이체를 이용한 연구에서 DNA의 삽입에 의해 육성한 돌연변이체에서 열악한 형질의 출현이 빈번히 나타났으며(Gilliland et al. 1998; Hirsch et al. 1998), 많은 경우에 삽입 유전자와 관련이 있는 변이체의 뚜렷한 표현형의 구분이 어려웠다(Bechtold et al. 1993).</p> <p>따라서, 이러한 문제점을 보완하고 유전자들의 기능을 보다 효율적으로 밝히기 위하여 유전자의 기능을 결실시킨(loss-of-function) 돌연변이체와 더불어 유전자의 발현을 증대시키는 과발현(gain-of-function) 돌연변이체를 육성하여 미지의 유전자의 기능을 밝히려는 연구가 시도되 고 있다. 벼나 Arabidopsis와 같은 모델 식물들에서는 유전체 염기서열결정 프로젝트를 통하여 이미 전체 염기서열이 밝혀져서 database에 저장되어 있고 T-DNA나 trans-poson의 삽입돌연변이체에서 삽입부위의 유전자에 대한 FST (flanking sequence tag) 정보가 밝혀져서 database에 저장이 되어 이용이 가능하므로 이들 정보를 이용하여 유전자를 RT-PCR 등에 의하여 분리하여 다시 정상 식물체에 형질전환에 의하여 과발현 변이체를 육성하고 T-DNA 또는 Ac/Ds 삽입돌연변이체, 정상 식물체를 상호 비교함으로써 유전자의 기능을 효과적으로 밝힐 수 있다(Zheng 2007).</p>