본 연구에서는 짝잎모자반을 aceton/methylene chloride 용액에 넣은 후 여액 얻었으며, rotary vacuum evaporator를 이용해 aceton/methylene chloride 추출물를 얻었다. 그리고 같은 방법으로 methanol 추출물을 얻었으며, 두 추출물을 혼합하고 용매 극성에 따라 분획해 hexane, MeOH, butanol, 물 분획물을 얻었다. 이 추출물들은 세포배지로 사용되었는데, 배양하는 세포는 AGS와 HT-\(29\)이다. 세포배양에 있어서는 원심분리를 통한 집적화와 계대 배양이 이루어졌다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>실험에 사용된 짝잎모자반은 2003년 5월 제주도 귀덕(경도 126 \( ^ {\circ } \)-127 \( ^ {\circ } \), 위도 33 ^ \( ^ {\circ } \)-34 \( ^ {\circ } \)에서 채집하였으며 응달에서 건조한 후 추출하기 전까지 -25 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 보관하였다.</p> <h2>추출 및 분획</h2> <p>유기용매 추출을 위하여 채집한 짝잎모자반은 사용하기 전에 -25 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 냉동고에 보관하였다가 해빙하여 잘게 자른 후, acetone:methylene chloride를 1:1 비율로 혼합하여 짝잎 모자반이 충분히 잠기도록 하여 24시간 방치한 후 추출하였다. 이 과정을 2회 반복하여 얻은 여액은 \40 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)수욕 상에서 rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan)을 사용하여 농축하여 aceton/methylene chloride 추출물 \( ( \mathrm { A } + \mathrm { M } ) \)을 얻었다. 남은 잔사에 동량의 methanol을 부어 위와 동일한 방법으로 2회 반복한 후 농축하여 methanol 추출물 MeOH을 얻었다. 두 추출물을 흔합한 추출물은 용매 극성에 따라 순차적으로 분획하여 hexane, 85 \( \% \) aq. MeOH, butanol (BuOH), water 분획물을 얻었다. 실험에는 각각의 추출물들을 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여 실험에 사용하였고 세포배지로 필요한 농도로 희석하여 실험에 사용하였다. 세포배양에 사용된 DMSO의 최종농도는 0.05 \( \% \)이하가 되도록 하였다.</p> <h2>암세포 및 암세포 배양</h2> <p>한국 세포주 은행(서울의대)으로부터 인체 위암세포(AGS, human gastric adenocarcinoma cell)와 인체 결장암세포 (HT-29, human colon cancer cell)를 분양받아 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다. AGS와 HT-29 암세포를 100 \( \mathrm { units } / { ml } \)의 penicillin-streptomycin과 10 \( \% \) FBS가 함유된 RPMI 배지를 사용하여 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \), 5 \( \% \mathrm { CO } _ { 2 } \)incubator에서 배양 하였다. 배양 중인 세포를 일주일에 2번 새로운 배지로 바꿔 주었다. 일주일 후 phosphate buffered saline (PBS)으로 세척한 뒤 0.05 \( \% \) trypsin-0.02 \( \% \) EDTA (Gibco Co., USA)로 부착된 세포를 분리하여 원심분리 한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 흔합하여 75 \( \mathrm { ~mm } ^ { 3 } \)cell culture flask에 10 \( \mathrm { ml } \)씩 일정한 수로 분할하여 주입하고 계속 6 \( \sim \)7일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.</p>