\({ \mu g / mL } \) 이하로 농축하고, reversed-phase HPLC system (Agilent 1200 series, Agilent Technologies, USA)을 사용하여 ACE inhibitory activity \( ( \%) = \frac {\text { 대조구의 HA-시료의 HA } } {\text { 대조구의 HA } } \times 100 \) 검사를 수행하였다. Ultrafiltration과 Reversed-phase HPLC system을 사용하여 굴 효소 가수분해물 시료를 분리하고 농축한 후 ACE inhibitory activity를 검사하였다.
<p>ACE inhibitory activity \( ( \%) = \frac {\text { 대조구의 HA-시료의 HA } } {\text { 대조구의 HA } } \times 100 \)</p> <h2>Ultrafiltration에 의한 분리</h2> <p>Ultrafiltration은 굴 효소 가수분해물 시료를 molecular weight cut-off가 \( 30 \mathrm { kDa } , 10 \mathrm { kDa } \) 인 ultrafiltration (Hisep ul-trafiltration membrane, SYNOPEX, Chemicore, Korea)을 사용하여 분자량 \( 30 \mathrm { kDa } , 10 \mathrm { kDa } \) 이하의 시료를 분리하여 농축시킨 후 동결 건조하였다.</p> <h2>Reversed-phase HPLC system에 의한 분리</h2> <p>시료의 농도 \( 100 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 을 \( 0.22 \mu \mathrm { m } \) PVDF filter로 여과한 후 HPLC로 분리하였다. HPLC column은 watchers (120 ODS-AP \( 250 \times 4.6(5 \mu \mathrm { m } )) \) 를 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 유지하여 사용하였고, solvent delivery pump (Model L-2130, HITACHI), column oven (Model UV-8010, TOSOH), detector (Model Agilent 1100 series, Agilent)를 이용하여 \( 228 \mathrm { ~nm } \) 에서 분리하였다. 분리 시 용출속도는 \( 1 \mathrm { ml } / \mathrm { min } \), 이동상으로는 \( \mathrm { CH } _ { 3 } \mathrm { CN } \) 을 gra-dient (0-20 min 20 \%; 20-40 min 40 \%; 40-45 min 100 \%)로 하여, 시료는 \( 100 \mu 1 \) injection하였고, 분획량은 \( 1 \mathrm { ml } \) /tube로 얻어 dry oven \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 over night 하여 시료를 건조시켰다.</p> <h2>Peptide 서열 분석 및 합성</h2> <p>건조된 분획물을 \( 20 \mu 1 \) 의 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) (0.1 \% TFA)로 용해시킨 후, 염분을 제거하기 위하여 solvent \( \mathrm { A } \left (50 \% \mathrm { CH } _ { 3 } \mathrm { CN } \right ) \) 로 활성화되고 solvent \( \mathrm { B } \left (0.1 \% \mathrm { TFA } / 100 \mathrm { ml } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \right ) \) 로 처리한 ZipTip C18 (Pierce, Meridian Rd, Rockford, USA)에 loading하였다. loading이 끝난 후, solvent \( B \) 로 2 3회 반복하여 세척하고 마지막으로 ZipTip C18에 결합된 peptide를 solvent C (70 \% ACN, 0.1 \% TFA)로 용출시켰다. 용출된 peptide용액을 biomembrane (AB systems Co, USA)이 전처리 되어져 있는 Micro-filter에 \( 10 \mu 1 \) 를 가하고 Argon gas로 건조시켰다. 건조 가 끝난 filter를 cartridge에 장착하고 ABI492 automated protein sequencer의 pulsed-liquid method를 통해 peptide 서열을 Scientfic Instrument Services(SIS, Seoul, Korea)에서 결정하였다. 그리고 확인된 peptide를 (주코스모진텍에서 합성하였다.</p>