동일 조건으로 배양된 세포들은 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 발현된 단백질을 검출한 후 시각화하였으며, one-way ANOVA를 사용하여 통계 분석을 실시하였다. 통계 분석 결과는 p<0.05 값을 유의미하게 처리하였다. hCEC세포에 대해 \( \mathrm { PM } _ { 2. 5 } \)를 다양한 농도로 24시간 처리한 후, MTT assay를 통해 \( \mathrm { PM } _ { 2. 5 } \)의 세포 독성을 평가하였다. 이 결과는 \( \mathrm { PM } _ { 2. 5 } \)의 세포 독성이 산화적 스트레스와 밀접한 연관이 있음을 보여준다.
<h2>단백질 분리 및 Western blot analysis</h2> <p>동일한 조건에서 배양된 세포들을 수확한 후, 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, lysis buffer [ \( 25 \mathrm { mM } \) Tris-Cl (pH 7.5), \( 250 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } , 5 \mathrm { mM } \) ethyl-enediaminetetraacetic acid, \( 1 \% \mathrm { NP } -40,1 \mathrm { mM } \) phenyme-thylsulfonyl fluoride, \( 5 \mathrm { mM } \) dithiothreitol]를 첨가하여 \( 4 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30 분간 반응시킨 후 \( 14,000 \mathrm { rpm } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , \) 30분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 동량의 단백질과 Laemmli sam-ple buffer (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 혼합하여 전기영동을 위한 샘플을 만들었고 sodium dodecylsulphate -polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동을 실시한 후, nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell,Keene, NH, USA로 단백질들을 전이시켰다. 그 후 5 \( \% \)skim milk를 30분 처리하였고 1차 항체(Santa Cruz Bio-technology, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA 및 Abcam, Inc., Cambridge, MA, USA)를 처리하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 12시간 반응시킨 다음 적정 2차 항체(Santa Cruz Bio-technology, Inc.)를 사용하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 단백질의 발현을 검출하기 위하여 enhanced chemilumi-nescence detection kit (Thermo Fisher Scientific)를 사용하였으며, Chemi-Smart (Vilber Lourmat, France)를 이용하여 시각화하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>GraphPad PrismⓇ version 5.0(Graphpad Inc., San Diego,CA, USA)의 one-way ANOVA를 사용하여 통계 분석을 실시하였으며, Tukey's test로 사후검정하여 p<0.05값을 유의한 값으로 처리하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>hCEC세포의 증식에 미치는 \( \mathrm { PM } _ { 2.5 } \)의 영향 평가</h2> <p>hCEC세포에 대한 \( \mathrm { PM } _ { 2.5 } \) 의 독성을 평가하기 위해 \( \mathrm { PM } _ { 2.5 } \)를 농도별로 24시간 동안 처리한 후 MTT assay를 실시하였다. Fig. 1A에 나타낸 바와 같이, \( 25 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 \( \mathrm { PM } _ { 2.5 } \)가 처리된 \( \mathrm { hCEC } \) 세포의 생존율은 약 73 \( \% \)로 나타났으며, 50 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)가 처리된 경우 약 59 \( \% \)로 나타나 \( \mathrm { PM } _ { 2.5 } \)처리 농도 의존적으로 hCEC세포의 생존율이 억제되었다. 본 연구를 위하여 사용한 \( \mathrm { PM } _ { 2.5 } \)와 NAC을 hCEC세포에 처리하기위하여 \( 1 \mathrm { mM } \)의 DMSO에 희석하였으나, 상기에서 관찰된 세포 독성이 DMSO와는 무관함을 확인하였으며, \( \mathrm { PM } _ { 2.5 } \)의 처리에 따른 hCEC세포의 형태 변화에서 \( \mathrm { PM } _ { 2.5 } \)가 처리된 hCEC세포의 수축과 배지로의 부유된 세포의 증가가 동반되었다. 몇몇 선행 연구들의 결과에 의하면, \( \mathrm { PM } _ { 2.5 } \)에 노출된 각막상피세포의 증식 억제는 ROS의 생성과 연관된 산화적 스트레스의 유발과 밀접한 연관성 이 있음을 알 수 있다 \( [5,32] \). 특히 Gao et al.은 \( \mathrm { PM } _ { 25 } \)에 의한 각막상피세포의 손상이 ROS 억제제인 NAC의 존재 하에서는 현저히 차단되었음을 보고한 바 있다. 본 연구 실의 선행 연구에 의하면, 이러한 ROS 생성 의존적 \( \mathrm { PM } _ { 2.5 } \)의 세포 독성은 각막상피세포에서 뿐만 아니라 망막색소 상피세포를 포함한 다양한 세포에서 나타나는 공통적인 현상임을 알 수 있다. 따라서 hCEC세포에서도 이러한 현상이 관찰되는지를 조사하기 위하여 NAC을 전 처리된 조건에서 \( \mathrm { PM } _ { 2.5 } \)를 노출시킨 경우, \( \mathrm { PM } _ { 2.5 } \)에 의한 세포 생존율의 억제가 유의적으로 회복됨을 확인하였다. 이는 hCEC세포에 미치는 \( \mathrm { PM } _ { 2.5 } \)의 세포 독성은 산화적 스트레스 유발과 밀접한 연관성이 있음을 의미하는 것이다.</p>