실험에서는 반하를 이용하여 진행한다. 흰쥐를 마취하고 태아의 뇌를 잘라낸다. 대뇌피질 조직의 세포를 배양하고 Culture plate에 저산소증을 유발한다. 마지막으로 발색시약을 가하고 ELISA reader로 흡광도\( \left(\mathrm{ABS}_{450}\right) \)를 측정한다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>약재 및 물추출액의 제조</h2><p>실험에 사용된 반하는 대한약전 및 대한 약전외 한약(생약)규격주해에 근거하여 동국대학교 부속 한방병원에서 구입하였다. 반하\( (2 \mathrm{~g}) \)을 \( 20\ \mathrm{ml} \)의 증류수에 넣어 균질화하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 18 시간 진탕하였다. 이를 \( 15,000\ \mathrm{rpm} \)에서 15 분간 원심분리하여 상등액을 얻고 여과멸균\( (0.45\ \mu \mathrm{m}) \)한 후 소량씩 분주하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다. 건조물의 량은 \( 1\ \mathrm{ml} \) 추출액 3 튜브를 동결건조한 후 평균치를 사용하였다.</p><h2>신경세포 배양</h2><h3>동물</h3><p>임신 18일(embryonic day 18: \( \mathrm{E}_{18} \))의 Sprague-Dawley계 흰쥐를 대상으로 대뇌피질신경세포를 Brewer 등의 방법에 따라 배양하였다. 즉, \( \mathrm{E}_{18} \)의 흰쥐를 dry ice가 들어있는 통속에 3~5분간 넣어 마취하고, 자궁을 가른 후 흰쥐 태아를 취하고 뇌를 잘라내었다. 대뇌피질 조직을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5 분간 \( 0.25 \% \) trypsin으로 처리하고 \( 1\ \mathrm{mM} \) sodium pyruvate와 \( 10\ \mathrm{mM} \) HEPES ( \( \mathrm{pH}\ 7.4 \))가 첨가된 HBSS용액(Hank's Balanced Salt Solution, Invitrogen Life Technology) \( 5\ \mathrm{ml} \)로 4~5회 세척하여 반응을 중단시켰다. 조직을 \( 1\ \mathrm{ml} \) HBSS용액으로 옮기고, 끝을 불에 달구어 구멍을 작게 한 pasteur pipette으로 6~7회 통과시켜 세포를 분산시켰다. 이후 분산된 세포의 밀도를 측정한 다음 B27을 첨가한 plating neurobasal media (Invitrogen Life Technology; \( 100\ \mathrm{ml} \) neurobasal, \( 2\ \mathrm{ml}\) B27 supplement, \( 0.25\ \mathrm{ml} \) glutamax I, \( 0.1 \mathrm{ml}\ 25\ \mathrm{mM} \) glutamate,\( 0.1\ \mathrm{ml}\ 25\ \mathrm{mM} \) 2-mercaptoethanol)에 약 \( 1,500 \mathrm{cells} / \mathrm{mm}^{2} \)가 되도록 접종하여 \( 5 \%\ \mathrm{CO}_{2} \) 배양조에서 배양하였다. 2~3일 간격으로 배양액을 feeding neurobasal media (\( 100\ \mathrm{ml} \) neurobasal, \( 2\ \mathrm{ml}\) B27 supplement, \( 0.25\ \mathrm{ml} \) glutamax I)로 1/3씩 교환하였다.</p><h3>저산소증 유발</h3><p>Culture plate를 \( \mathrm{CO}_{2} \) Water Jacketed Incubator(Forma Scientific Inc.)를 이용하여 \( 2\%\ \mathrm{O}_{2}/ 5 \%\ \mathrm{CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C} \) 환경에서 3시간 처리하여 저산소증을 유발하였다. 저산소 처리가 끝나면 배양세포를 정상산소 환경 배양조에 옮기고 계속 배양하였다.</p><h3>LDH assay</h3><p>배양 12일(12 day in vitro: DIV 12)에 반하를 \(0.25, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0\ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도별로 처리하고 2일간 배양한 후 DIV 14에 저산소증을 유발하였다. 저산소증 유발 후 3일에 배양액 \( 20\ \mu \mathrm{l} \)를 96-well plate에 옮기고 pyruvate substrate (NADH \( 1\ \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)를 \( 20\ \mu \mathrm{l} \)씩 가한 다음, 상온에서 2 분간 흔든 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 분간 더 흔들었다. 발색시약(color reagent, Sigma 505-2)을 \( 20\ \mu \mathrm{l} \)씩 가하고 상온에서 20 분간 흔든 후 \( 0.4\ \mathrm{N} \) \( \mathrm{NaOH} \) 를 \( 100\ \mu \mathrm{l}\)씩 가하고 상온에서 15 분간 더 흔든 다음, ELISA reader로 흡광도\( \left(\mathrm{ABS}_{450}\right) \)를 측정하였다.</p>