A549 폐암세포를 10% fetal bovine serum, 1% penicillin 및 streptomycin 환경 RPMI-1640 배지에 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2}\), \(37^{\circ} \mathrm{C} \)의 조건하에서 배양하여 MTT assay를 진행하였다. 또한 암세포에서 cDNA를 분리하여 template로 삼아 관찰 대상 유전자를 PCR로 증폭, internal control 로 housekeeping 유전자 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase를 사용하여 각 PCR 산물들을 1% agarose gel로 전기영동 후 ethidium bromide 로 염색, UV 하에서 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>본 실험에 사용된 봉독은 Sigma Chemical Co. (St. Luis, MO, USA)에서 구입하였고 mRNA 분석을 위하여 Bioneer (Taejeon, Korea)에서 구입한 primer는 Table 1에 나타낸 바와 같다. 단백질 발현 분석을 위하여 사용된 항체는 CalBiochem (San Diego, CA, USA), 및 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였으며, immunoblotting을 위해 2차 항체로 사용된 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Life Science Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다. \( \mathrm{PGE}_{2} \)의 생성양의 측정은 Amersham Corp.의 enzyme immunoassay (EIA) kit를 사용하였으며, telomerase 활성의 측정은 polymerase chain reaction (PCR)에 기초를 둔 면역반응분석법[PCR-based telomeric repeat amplification protocol (TRAP) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)]을 이용하였고 이를 위한 kit는 Boehringer Mannheim (Mannheim, Germany)에서 구입하였다.</p> <h2>암세포의 배양</h2> <p>실험에 사용한 A549 폐암세포는 생명공학연구소(KRIBB, Taejeon, Korea)에서 분양 받았으며 90%의 RPMI-1640 배지 (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL)에 \( 1 \%\)의 penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL)이 포함된 배지를 사용하여 \( 5 \% ~\mathrm{CO}_{2}\), \(37^{\circ} \mathrm{C} \)의 조건하에서 배양하였다. 봉독은 3차 증류수에 희석하여 stock 용액으로 제조한 뒤 적정 농도로 배지에 희석하여 처리하였으며, 봉독처리에 따른 암세포의 형태변화는 도립현미경 하에서 관찰하였다.</p> <h2>MTT assay를 이용한 세포 성장억제 조사</h2> <p>세포배양용 6 well plate에 well 당 \( 1 \times 10^{5} \)개의 세포를 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 다음 봉독을 배지에 희석·처리 48시간 후 배지를 제거하고 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mu 1 \) tetrazolium bromide salt (MTT, Sigma)를 처리하였다. 3시간 후 MTT를 제거하고 DMSO를 이용하여 well에 생성된 formazin을 녹인 후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 3회 실시하였으며, 그에 대한 평균값과 표준 오차를 Microsoft EXCEL program을 사용하여 분석하였다.</p> <h2>Reverse transcription RT-PCR 분석</h2> <p>준비된 A549 세포들에 TRIzol B (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 total RNA를 분리·정량한 후, ONE-STEP RT-PCR PreMix (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Korea)를 이용하여 \( 2 \mu \mathrm{g} \)의 RNA에서 ss cDNA를 합성하였다. 이들 cDNA를 template로 사용하여 관찰 대상 유전자를 PCR로 증폭하였으며, housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 를 internal control로 사용하였다. 각 PCR 산물들을 \( 1 \%\) agarose gel을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide (EtBr)로 염색한 후 UV 하에서 확인하였다.</p>