흑두를 사용한 청국에서 혈전용해능을 가진 9종의 미생물을 분리하였으며, 특히 BB-1 균주의 활성이 가장 높았다. 이 균주에서는 5종류의 혈전용해효소 isozyme band를 확인하였으며, 활성은 산성에서 안정적으로 나타났다. 이 효소는 적혈구 파괴 현상이나 혈액 내에서의 부작용 위험성이 없는 것으로 판단되었다. 또한, 염기서열을 토대로 크로닝을 통해 혈전용해효소를 생산하는 유전자가 포함된 DNA단편을 확인하였다.
<h2>결과 및 고찰</h2> <h3>혈전용해능활성이 높은 미생물의 분리 및 동정</h3> <p>국내산 흑두로 제조한 청국에서 혈전용해능이 있는 미생물을 9종 분리 하였으며\(\mathrm{(Fig.}\) \( 1)\), 현전용해능의 크기를 \(\mathrm{plasmin}\) \(1\) \(\mathrm{unit}\)와 비교실험을 실시한 결과 \(\mathrm{Table}\) \(2\)와 같이 \(\mathrm{BB}\)-\(1\)균주가 생성하는 효소가 \( 400 \%, \mathrm{BB}\)-\(2 \) 는 \( 324 \%, \mathrm{BB}\) -\(3,~4 \) 는 \( 100 \% \), \(\mathrm{BB}\) -\(7\)은 \( 196 \%, \mathrm{BB}\) -\(8 \) 은 \( 196 \%, \mathrm{BB}\)-\(9 \) 는 \( 100 \% \) 로 \(\mathrm{BB}\)-\(1\)균주의 활성이 가장 높았다. 혈전용해능이 우수한 \(\mathrm{BB}\)-\(1\) 의 동정을 위해서 한국미생물보존센터에 \( 16 \mathrm{~s} \mathrm{rDNA} \) \(\mathrm{sequence}\)를 의뢰하여 분석 결과 그 유전자의 상동성이 \(Bacillus subtilis\)와 \( 99 \% \) 유사성을 가지는 것으로 \(\mathrm{Fig.}\) \(2, 3\) 과 같이 동정되었다. 따라서 이 균을 \(Bacillus subtilis\) \(\mathrm{BB}\) -\(1\)로 병병하고 한국미생물보존센터\( (\mathrm{KCCM})\)에 위탁관리 시켰으며, 관리번호는 \( \mathrm{KFCC} 11344 \mathrm{P} \) 이다.</p> <h3>\(B.\) \(\mathrm{subtilis}\) \( \mathrm{BB}\)-\(1\)의 혈전용해동위효소 측정</h3> <p>흑두를 이용하여 제조된 청국에서 분리한 \(B. subtilis\) \(\mathrm{BB}\)-\(1\)의 혈전용해동위효소를 확인하기 위하여 \( 12 \% \) \(\mathrm{fibrin}\)-\(\mathrm{poly}\)-\(\mathrm{acrylamide gel}\)상에서 전기영동을 실시하였다. \(\mathrm{Fibrin}\) 분해능을 지닌 단백질 분획은 활성염색법에 의해 \(\mathrm{gel}\)상의 \(\mathrm{fibrin}\)을 분해하여 \(\mathrm{Coomassie~blue~R}\)-\(250\) 염색결과 투명대로서 활성을 가지는 \(5\) 종류의 혈전용해효소 \(\mathrm{isozyme~band}\)를 \(\mathrm{Fig.}\) \(4\)와 같이 확인하고 대략적인 분자량은 \( 60,45,30,25,19~\mathrm{kDa} \) 이었다.</p> <h3>혈전용해효소 유전자의 크로닝 및 염기서열의 결정</h3> <p>혈선용해효소를 세포외로 다량 생산하는 \(B.~subtilis\) \(\mathrm{BB}\)-\(1\)의 \(\mathrm{genomic~DNA}\)를 분리하여 \(\mathrm{Cl~ I}\)으로 절단한 다음 \( 7 \sim 3 \mathrm{~kb} \)의 \(\mathrm{DNA}\)단편과 \(\mathrm{Cla~I}\) 으로 절단 후 \(\mathrm{Calf~Intestinal~Alkaline~pho}\)-\(\mathrm{sphatase~(CIP)}\) 처리한 \(\mathrm{pBluescript~Ⅱ~SK}\) (-)를 \(\mathrm{ligation}\)시켜 \(\mathrm{E.~coli~XL}\)\(1\)-\(\mathrm{blue}\)에 형질전환 시켰다. \(\mathrm{Ampicillin}\) 과 \(\mathrm{X}\)-\(\mathrm{gal}\) , \(\mathrm{IPTG}\)가 포함된 선별 배지에서 자란 약 1,500여개의 형질전환체 중에서 혈전용해력을 갖는 하나의 \(\mathrm{clone}\)이 확인 되었다(\(\mathrm{Fig.}\) \(5)\). 이 균으로부터 \(\mathrm{plasmid}\)를 분리하여 \(\mathrm{insert}\)를 확인하여 본 결과 약 \( 3.0 \mathrm{~kb} \) 의 \(\mathrm{insert}\) 단편을 확인하였다. 이때 \(Cla\) \( \mathrm{I} \) 으로 절단시 \(\mathrm{insert}\)의 \(\mathrm{size}\)와 \(\mathrm{vector~size}\)가 유사하여 \(\mathrm{vector}\)의 \(\mathrm{multicloning~site}\) \(\mathrm{(MCS)}\)에 있는 \(Bam\)\(\mathrm{H~I}\) 으로 절단한 결과 \(6.0\mathrm{~kb} \)인 하나의 \(\mathrm{band}\)를 얻었으며, 염기서열의 결정은 먼저 \( \mathrm{T} 7\) \(\mathrm{primer}\)와 \(\mathrm{T}\)\(3\) \(\mathrm{ prime}\)r를 이용하여 양방향으로 염기서열을 확인하고 확인된 후 다시 연속적으로 새로운 p\(\mathrm{rimer}\)을 합성하여 확인함으로서 최종적으로 중복되는 연결순서에 의해 전체적인 염기서열을 결정하였다. 염기서열을 토대로 제한효소 지도를 작성한 후 \( \mathrm{PCR} \) 을 이용하여 크로닝한 결과 약 \( 2.5 \)\( \mathrm{kb} \) 크기의 \(\mathrm{DNA}\)단편안에 헐전용해효소를 생산하는 유전자가 포함된 클론을 확인하였다\(\mathrm{(Fig.}\) \(6, 7)\). 이 재조합 \(\mathrm{DNA}\)를 \(\mathrm{BSF}\)-\(1\)으로 명명하였다. \(\mathrm{BSF}\)-\(1\)은 기존에 알려진 혈전용해효소 유전자와는 상동성을 전혀 보이지 않아 새로운 혈전용해효소 유전자임을 알 수 있었다. 이 유전자는 안정성과 높은 생리활성이 입증된 청국의 고초균에서 분리되었다는 점에서 식품제조 사용시 위험성을 배제할 수 있으며, 혈전증 및 순환기계통의 성인병에 대한 예방인자로 사용가능하리라 판단된다.</p> <h3>\(\mathrm{BSF}\)-\(1\)의 \(\mathrm{deletion~mutation}\)에 의한 효소 활성측정</h3> <p>\(\mathrm{BSF}\)-\(1\)의 insert를 \(\mathrm{PCR}\)방법으로 \(\mathrm{Fig}\). \( 8 \mathrm{~A} \) 와 같이 크기를 줄여 다시 크로닝하였다\(\mathrm{(Fig}\). \( 8 \mathrm{~B} \) ). 크로닝된 각 \(\mathrm{clone}\)의 혈전분해력을 조사하였던 바 처음 \(\mathrm{ATG~(BSFF}\)\(1)\)와 \(\mathrm{TAA~(BSFR)}\) 사이에서 나온 \(\mathrm{clone}\)만이 혈전용해력이 있는 것\(\mathrm{(Fig}\). \( 8 \mathrm{C} \) )으로 나타났으며 나머지 클론들은 활성이 없었다.</p> <h3>\(\mathrm{BSF}\)-\(1\)을 함유한 균주의 헐전용해활성 측정 및 기질특이성 조사</h3> <p>\(\mathrm{BSF}\)-\(1\)을 함유한 균주의 혈전용해능을 조사하기 위하여 대조구로서 \(\mathrm{pBSK}\)(-)를 가지고 있는 \(\mathrm{XL}\)\(1\)-\(\mathrm{blue}\) 를 사용하여 혈전 용해활성과 기질특이성을 조사한 결과 재조합 균주의 배양 상등액\(\mathrm{(Fig}\). \(9\), \(\mathrm{A)}\)과 초음파 파쇄\(\mathrm{(Fig}\). \(9\), \(\mathrm{B)}\)에서 혈전분해활성이 관찰되었다. 배양상등액에서 \(\mathrm{BSF}\)-\(1의\) 활성은 초음파 파쇄물보다 활성은 낮았지만 혈전분해능이 보이는 것을 관찰하였다. 이 결과에 의하여 이 효소는 세포외로 분비되는 \(\mathrm{exo}\)-\(\mathrm{type~enzyme}\)임을 알 수 있었다. 기질특이성조사에서는 \(\mathrm{skim~milk,~casein,~gelatin,~blood~agar}\)에서 분해현상을 보이지 않았다\(\mathrm{(Fig}\). \(10)\). 특히 \(\mathrm{blood~agar~plate}\)에서 분해가 일어나지 않은 것은 \(\mathrm{urokinase}\)나 \(\mathrm{streptokinasev}\) 의 혈액 내 부작용에 대한 것을 비교하여 볼 때, 본 효소는 적혈구 파괴현상이나 혈액 내에서의 부작용에 대한 위험성을 배제할 수 있을 것으로 판단된다.</p> <h3>혈전용해효소생산의 최적 \(\mathrm{pH}\) 및 온도</h3> <p>혈전용해효소생산의 최적 \( \mathrm{pH} \) 와 온도를 검토한 결과 \(\mathrm{Fig}\). \(11\)과 같이 \( \mathrm{pH} 5.0 \), 온도 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 가장 높은 활성을 나타내었다. \( \mathrm{pH} \) \(5.0\)에서 높은 활성을 나타내는 것으로 보아 본 효소는 산성에 있어서 매우 안정적으로 기능을 하는 것으로 추정된다.</p> <h2>요약</h2> <p>흑두로 제조한 청국으로부터 혈전용해력이 우수한 균을 선발하여 동정하였으며, 그를 \(Bacillus~subtilis\) \(\mathrm{BB}\)-\(1\)로 명명하였다. 이 균은 혈전용해효소 \(\mathrm{isozyme}\)을 적어도 \(5\) 개이상 생성하는 균주로 확인되었다. 이 균으로부터 크로모좀을 분리하여 \(\mathrm{shot~gun}\)법으로 혈전용해효소 유전자를 크로닝하였으며, 이 유전자률 \(\mathrm{BSF}\)-\(1\)이라 명명하였다. 이 유전자는 \(714\)개의 아미노산을 암호화하고 있으며 기존에 밝혀진 혈전용해효소 유전자와 상동성은 검출되지 않은 새로운 혈전용해효소 유전자였다. 혈전용해효소활성 최적 \( \mathrm{pH} \) 및 온도는 \( 5.0 \) 과 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)였다. 기질특이성은 적혈구 배지 또는 \(\mathrm{skim~milk,~gelatin}\)등 에 전혀 분해활성이 없었다. 이는 혈전만을 특이적으로 분해하는 기질특이성을 보였으며, 혈전분해효소로서의 이용가능성이 충분한 것으로 판단된다.</p>