PreMix WST-1 Cell Proliferation Assay System을 이용하여 RLE의 독성을 검증하였다. 지방 전구 세포의 분화 과정에서 RLE 처리가 전사인자 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \)의 발현에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해, MDI와 함께 RLE를 처리한 후 2일 뒤 세포를 회수하였다. 추가적으로, RLE 처리 후 PBS로 세포를 세척하고 lysis buffer를 처리한 후, 낮은 온도에서 반응시켜 용해하고 원심분리하여 상등액을 추출하였다.
<h2>세포 독성</h2> <p>RLE의 독성을 알아보기 위하여 PreMix WST-1 Cell Proliferation Assay System(Takara, Tokyo, Japan)을 이용하였다. 3T3-L1 지방전구세포를 96-well plate \( \left(5 \times 10^{3}\right. \)cells/well)에 seeding 하고 24 간 배양하였다. 이후, 대조군으로 \(0.5\%\) DMSO(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)를 처리하였으며, RLE를 600-1000 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 처리하고 48시간 배양하였다. WST-1 reagent를 각 well에 \( 20 \mu \mathrm{l} \)씩 첨가하여 30분 반응시킨 다음 ELISA reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>분화초기와 분화후기에 발현되는 전사인자들의 발현양상 확인</h2> <p>RLE에 의한 지방전구세포에서 지방세포로의 분화 과정동안 발현되는 전사인자들의 발현변화를 확인하기 위해, 지방전구세포에 MDI와 함께 RLE를 처리하고 2일 후 세포를 회수하여 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \) 발현 양상을 확인하였다(Day 2). 또한 지방세포 분화 후기에 발현되는 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta \)와 \(\mathrm{PPAR} \gamma \)의 발현양상을 확인하기 위해 MDI와 RLE를 함께 처리하여 2일간 반응 시킨 다음, FBS가 첨가된 DMEM 배지에 insulin만 처리할 때 RLE를 함께 처리하여 4일간 반응시킨 다음 세포를 회수하였다(Day 6).</p> <h2>Western blot analysis</h2> <p>RLE를 처리한 3T3-L1 세포를 회수하여 PBS로 washing한 후, lysis buffer(Cell signaling technology, Danvers, MA, USA)를 세포에 처리하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시켜 용해시킨 후 \( 14,000 \mathrm{rpm}, 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 원심 분리하여 상등액을 얻었다. 상등액의 단백질 농도는 BCA법을 이용하여 정량 한 후 동량의 단백질을 (SDS)-polyacrylamide gel에서 전기영동하였다. 전기영동 후 gel 내의 단백질을 polyvinylidene fluoride(PVDF) membrane(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 전사시키고 Blocking solution[0.15 M NaCl, \( 1 \mathrm{M} \) Tris-\( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} \) 7.5), 0.1\% Tween- \( 20,5 \% \mathrm{BSA}] \)을 사용하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 16시간 blocking 시켰다. 1차 항체는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 16시간 반응시켰으며, TBS[50 mM Tris-HCl(pH 7.5), \( 0.15 \mathrm{M} \mathrm{NaCl}] \)에 \( 0.1 \% \) Tween-20이 첨가된 buffer를 사용하여 membrane을 washing 한 다음 2차 항체를 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 16시간 반응시켰다. 면역반응 단백질은 화학발광시스템(Chemi-luminescence system; Super Signal West Femto Maximum sensitivity Substrate, Pierce, USA)으로 검출하였다. 본 실험에 사용한 1차항체는 Cell signaling technology(Danvers, MA, USA)에서 \( \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \alpha, \mathrm{C} / \mathrm{EBP} \beta, \mathrm{Rb} \), phospho-Rb를 구입하였으며, Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA, USA)에서 p21, Cyclin E, Cdk2, Actin를 구입하여 사용하였다. 2차 항체인 anti-rabbit IgG-HRP, anti-mouse IgG-HRP는 Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.</p>