V_parahaemolyticus균을 배양한 후 배양상등액을 사용하여 collagen (type I) \(10\mathrm{mg}\)를 \(4\mathrm{mM}\) \(\mathrm{CaCl_2}\)가 첨가된 \(50\mathrm{mM}\) Tris-HCl 완충액 \(0.8\mathrm{ml}\)에 녹이고 효소용액 \(0.2\mathrm{ml}\)을 잘 섞어 30\(^\circ \mathrm{C}\)에서 30분간 반응시킨 후 \(0.1\mathrm{M}\) NaOH \(1\mathrm{ml}\)로 전환하여 absorbance를 \(660\mathrm{nm}\)에서 측정하여 콜라겐 분해효소의 역가를 측정하였다. 콜라겐 분해효소의 세포독성효과는 MTT 방법을 사용하여 vero cell을 대상으로 관찰하였다.
<h2>콜라겐 분해효소의 역가 측정</h2> <p>V. parahaemolyticus 균을 배양한 후 \( \left ( \mathrm { OD } _ { 660 \mathrm { ~nm } } = 1.0 \right ) \), 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 배양상등액이 효소활성 측정에 사용하였다. 기질인 collagen (type I) \( 10 \mathrm { mg } \) 을 \( 4 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { CaCl } _ { 2 } \) 가 첨가된 \( 50 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } \) 완충액 \( 0.8 \mathrm { ml } \) 에 녹인 뒤, 효소용액 \( 0.2 \mathrm { ml } \) 을 잘 섞어 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 분간 반응시켰다. 1 \( \mathrm { ml } \) 의 \( 0.1 \mathrm { ~N } \) acetic acid를 첨가하여 실온에서 20 분간 방치하면서 반응을 정지시켰다. 생성된 \( \alpha \)-유리 아미노산의 측정은 ninhydrin방법을 이용하였다[21]. 반응이 정지된 시료를 다시 원심분리하여 얻어진 상등액 \( 0.1 \mathrm { ml } \) 에 \( 0.2 \mathrm { M } \) citrate-sodium citrate buffer ( \( \mathrm { pH } \) 5.5), \( 1.4 \mathrm { ml } \) 과 ninhydrin buffer (2 \% ninhydrin, \( 0.05 \% \mathrm { SnCl } _ { 2 } \cdot \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 을 methylcellosolve에 녹여서 사용) \( 1.0 \mathrm { ml } \) 를 첳어서 섞어 준 뒤 \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 15 분간 반응시키고, 반응이 끝건 시료를 얼음에서 5 분간 처리한 후 570 \( \mathrm { nm } \) 에서 훕광도를 춪정하였다. 효소활성은 1 번 동안 \( 1 \mu \mathrm { g } \) 의 leucine의 생성에 필요한 효스의 양으로 정의하였다.</p> <h2>In vitro 세포 독성 검사</h2> <p>콜라겐 분해효소의 세포독성효과는 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) 방법을 사용하여 vero cell을 대상으로 관찰하였다. Vero cello은 \( 10 \% \) fetal bovine serum이 함유된 DMEM (Dulbeccos modified Eagless medium)배지에 \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 시간 배양하였다. 배양 후 PBS (phosphate-buffered saline)로 두번 세척하고 \( 2 \mathrm { ~m } \) 의 trypsin-versin 용액을 2 분간 처리하여 cell을 회수하여 96 well microplate에 각각 150 씨씩 넣고 \( \left (10 ^ { 4 } \sim 10 ^ { 6 } \right . \) cells \( \left ./ \mathrm { ml } \right ), 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 24 \) 시간 배양 하였다.</p>