효모 기원의 \(\alpha\)-glucosidase에 용매 추출 분획물을 첨가해 37도에서 10분 반응시키고, 그 후 p-nitrophenyl \(\alpha\)-D-glucopyranoside를 첨가하여 3분 동안 preincubation을 실시하였다. 그 다음으로 효소를 첨가하여 반응 후 3분 동안 효소 활성을 측정하였다. 각각의 용매 분획물 농도를 변경하여 기질의 농도를 조절하며 저해활성을 측정하고, 이 결과를 Lineweaver-Burk plot를 사용하여 분석하였다.
<h2>\( \alpha \)-Glucosidase 저해활성</h2> <p>\( 1 \mathrm { unit } / \mathrm { ml } \) 의 효모 기원의 \( \alpha \)-glucosidase (Sigma, Mo, U.S.A) \( 20 \mu \mathrm { l } \) 에 각 용매 추출 분획물을 \( 5 \mu \mathrm { l } \) 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(10 \)분간 반응시킨 뒤, \( 1 \mathrm { mM } \) p-nitrophenyl \( \alpha \)-D-glucopyr-anoside ( \( p \mathrm { NPG } \), in potassuim phosphate buffer, \( \mathrm { pH } \) 6.9)를 \( 475 \mu \mathrm { l } \) 첨가하였다. \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20분간 반응 후 \( 1 \mathrm { M } \) \( \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { CO } _ { 3 } \) \( 500 \mu 1 \) 를 첨가하여 반응을 종결시키고, \( 405 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군으로 \( \mathrm { MeOH } \) 를 사용하였고, 양성대조군으로 \(1 \)-deoxynorjirimycin와 acarbose를 사용하였다.</p> <h2>Aldose reductase 저해활성</h2> <p>Human muscle cell 기원의 aldose reductase 억제활성은 Fujita, Funako and Hayashi의 방법에 준하여 측정하였다. \( 500 \mu \mathrm { l } \) 의 \( 0.1 \mathrm { M } \) sodium phosphate buffer ( \( \mathrm { pH } \) 6.2)에 \( 0.1 \) MDL-glyceraldenhyde \(100 \mu \mathrm { l } \)와 \(1.5 \mathrm { mM } \) \( \beta- \mathrm { NADPH } \) \(100 \mu \mathrm { l } \), 농도별로 조제한 시료 \( 10 \mathrm { ul } \) 를 첨가하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 반응시켰다. \(3 \)분 동안 preincubation 시킨 뒤, enzyme을 첨가하여 반응 후 \( 340 \mathrm { ~nm } \) 에서 \(3 \)분 동안 효소 활성을 측정하였다.</p> <h2>\( \alpha \)-Glucosidase 및 aldose reductase에 대한 저해 kinetics.</h2> <p>사방오리나무 추출물 중에서 활성이 높은 분획물에 대해 \( \alpha \)-glucosidase 및 aldose reductase에 대한 저해 kinetics을 조사하였다. 농도별로 조제한 각 용매 분획물을 사용하여 기질의 농도를 다양하게 하여 저해활성을 측정하였고, Lineweaver-Burk plot를 이용하여 분석하였다.</p>