항세균 활성 평가는 Nutrient broth에 세균을 접종하여 배양 후, 각 균주를 멸균 petri dish에 도말하고, 각 시료를 멸균 disc-paper에 가하여, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 배양했다. 진균은 같은 방법으로 Sabouraud dextrose를 이용하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 배양 후, 생육저지환의 크기를 측정하여 항균활성을 평가하였다. 항응고 활성은 혈액응고측정기를 이용하여 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임 측정 후 평가했다. 혈장은 표준혈장을 구입하여 사용하였으며, PT reagent와 aPTT reagent는 MD Pacific Hemostasis의 분석시약을 사용하여 측정하였다.
<h2>항균 활성 측정</h2> <p>마늘 및 흑마늘 시료의 항균 활성은 기존의 보고된 방법과 동일하게 평가하였다. 항균 활성평가를 위한 그람 양성세균으로는 Staphylococcus aureus KCTC 1916, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Listeria monocytogenes KACC 10550, Bacillus subtilis KCTC 1924를, 그람 음성세균으로 Escherichia coli KCTC 1682, Pseudomonas aeruginosa KACC 10186, Proteus vulgaris KCTC 2433, Salmonella typhimurium KCTC 1926, 진균으로는 Candida albicans KCTC 1940 및 Saccharomyces cerevisiae IF0 0233를 사용하였다. 항세균 활성 평가의 경우, Nutrient broth (Difco, USA)에 각각의 세균을 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24 시간 동안 배양한 후, 각 균주를 \(\mathrm{O.D.}_{600}\) 0.1로 조정하여 Nutrient agar (Difco, USA) 배지를 포함하는 멸균 petri dish \( (90 \times 15 \mathrm{~mm} \), Green Cross, Korea)에 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 도말하고, 각각의 시료 \( 5 \mu \mathrm{l} \)를 멸균 disc-paper(지름 \( 6.5 \mathrm{~mm} \), Whatsman No.2)에 가하여, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 배양하였으며, 진균 경우에는 Sabouraud dextrose (Difco, USA)를 이용하여 동일한 방법으로 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 배양 후, 생육저지환의 크기를 측정하여 항균활성을 평가하였다. 대조구로는 항세균제인 ampicillin과 항진균제인 miconazole (Sigma)을 각각 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{disc} \) 농도로 사용하였으며, 생육저지환의 크기는 육안으로 생육이 나타나지 않는 부분의 지름을 \( \mathrm{mm} \) 단위로 측정하였고, 3회 이상 평가 후 대표 결과로 나타내었다.</p> <h2>항응고 활성 측정</h2> <p>항응고 활성은 기존에 보고된 방법과 동일하게 혈액응고측정기(Amelung coagulometer KC-1A, Amelung, Lemgo, Germany)를 이용하여 트롬빈 타임(Thrombin Time, TT), 프로트롬빈 타임(Prothrombin Time, PT) 및 에이피티 타임 (activated Partial Thromboplastin Time, aPTT)을 측정하여 평가하였다. TT, PT 및 aPTT 측정의 용매대조구로는 DMSO를 사용하였으며, 양성대조구로는 아스피린(Sigma)을 사용하였다. 먼저 TT는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 0.5 \mathrm{U} \) 트롬빈(Sigma) \( 50 \mu \mathrm{l} \) 와 \( 20 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{CaCl}{ }_{2}\) \(50 \mu \mathrm{l} \), 다양한 농도의 시료 추출액 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 를 coagulometer의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였으며, 트롬빈 저해 활성은 3회 이상 반복한 TT 실험의 평균치를 용매 대조구인 DMSO의 TT 평균치의 비율로 나타내었다. PT 측정은 혈장 \( 70 \mu \mathrm{l} \)와 다양한 농도의 시료액 \( 10 \mu \)를 Amelung coagulometer KC-1A의 튜브에 첨가하여 \( 37{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3분간 가온 후, \( 130 \mu \mathrm{l} \) 의 PT reagent를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 프로트롬빈 저해 활성은 3회 이상 반복한 PT 실험의 평균치를 용매 대조구인 DMSO 의 PT 평균치의 비율로 나타내었다. aPTT 측정의 경우에는, 표준혈장 \( 70 \mu \mathrm{l} \)와 다양한 농도의 시료액 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 를 Amelung coagulometer KC-1A의 튜브에 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 가온 후, \( 65 \mu \)의 aPTT reagent를 첨가하고 다시 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3분간 반응하였다. 이후 \( 35 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{CaCl}_{2}\) \(65 \mu \mathrm{l}\) 를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다. aPTT 연장 활성은 3회 이상 반복한 aPTT 실혐의 평균치를 용매 대조구인 DMSO의 aPTT 평균치의 비율로 나타내었다. 혈장은 표준혈장(Control plasma, MD Pacific Technology, China)을 구입하여 사용하였으며, PT reagent와 aPTT reagent는 MD Pacific Hemostasis (MD Pacific Technology, China)의 분석시약을 사용하여 측정하였으며, 기타 시약은 Sigma사(USA)의 제품을 구입하여 사용하였다.</p>