본 논문은 PLB 계대 배양 시 절단 부위가 위로부터 1/3 정도인 경우 증식율이 90% 이상으로 가장 높고, 2/3 정도인 경우 40% 정도로 증식율이 낮아지는 것을 확인하였다. Agrobacterium 접종 방법을 개선하여 dipping 처리를 해 PLB의 증식율이 높아지고 형질전환이 효율적으로 이루어지는 것을 확인하였다. 형질전환체의 선발을 위한 항생제의 농도를 조사한 결과 접종된 PLB는 hygromycin 농도가 높아질수록 PLB의 증식이 억제되고 형질전환 되지 않은 개체는 갈별하여 죽었으며 형질전환된 개체도 항생제의 농도가 증가함에 따라 형질전환체의 증식이 억제되어 1 \( \mathrm { mg } / 1 \)의 저농도 hygromycin을 함유한 배지에서 형질전환된 PLB를 정하는 것이 바람직하다는 결론을 얻었다.
<h2>PLB 계대 배양 시 절단 방법이 증식 과정에 미치는 영향</h2> <p>호접란 계대 배양 시 PLB의 절단 정도가 PLB의 증식율에 미치는 영향을 조사한 결과, PLB를 위로부터 \( 1 / 3 \) 부위를 절단하여 계대 배양한 경우 PLB의 증식율이 \( 90 \% \) 이상으로 가장 높았고, 절단 부위가 \( 1 / 2 \) 정도인 경우 \( 80 \% \), 절단부위가 위로부터 \( 2 / 3 \) 정도인 경우 \( 40 \% \) 정도의 PLB의 증식율을 보이며, 절단부위가 아래쪽으로 내려갈수록 증식율이 떨어지는 경향을 나타냈다.</p> <h2>형질전환</h2> <p>Agrobacterium 접종 방법은 유도된 PLB를 scarpel을 이용하여 절단한 뒤 절편체를 Agrobacterium 배양액에 넣어 감염시키는 방법을 개선하여 Agrobacterium 배양액을 농축한 후 철제 침에 묻혀 PLB를 찔러 감염시키는 dipping 처리를 하였다. 특히 상처를 내는 철제 침 자체에도 농축된 Agrobacterium 배양액을 묻혀서 더 효율적으로 감염시키는 방법을 사용하였다. 또한 이렇게 처리된 PLB를 다시 OD 값 0.8 정도의 Agrobacterium 배양액에 넣어 20 분간 더 접종시켜 그 효율을 높였다. Dipping 처리된 호접란 PLB를 20 분간 Agrobacterium 배양액에 넣어 접종 시키는 것이 가장 효과적인 것으로 나타났으며, 감염 시간을 30분으로 한 경우 Agrobacterium 의 과다증식으로 PLB의 증식이 지연되며 다시 제균 작업을 거치더라도 제대로 자라지 못했다(자료 미제시). Agrobacterium 배양액의 농도가 호접란의 형질전환에 미치는 영향을 조사한 결과, 배양액의 흡광도 값이 0.8 일 때 형질전환 효율이 가장 높았고, 1.2 의 경우 과다 증식된 Agrobacterium이 많이 생겨 제거에 어려움이 있었으며, 이로 인해 PLB의 증식이 억제되고 형질전환된 PLB를 선발하기가 매우 어려웠다. OD가 0.4 인 경우는 OD가 1.2 일 때와는 반대로 Agrobacterium의 감염이 잘 되지 않아 형질전환 효율이 낮게 나타난 것으로 생각된다.</p> <h2>형질전환체의 선발</h2> <p>본 실험에서는 형질전환체의 선발을 위한 적정 항생제의 농도를 조사하기 위해 hygromycin의 농도를 1.0, 1.5, 3.0 및 \( 6.0 \mathrm { mg } / 1 \)로 나누어 배지에 첨가하여 실험을 수행하였다. 접종된 PLB는 hygromycin 농도가 높아질수록 PLB의 증식이 억제되며 형질전환 되지 않은 개체는 갈변하며 고사했다. 그리고 형질전환된 개체도 항생제의 농도가 증가함에 따라 형질전환체의 증식이 억제되는 경향을 나타내어 1 \( \mathrm { mg } / 1 \)의 저농도 hygromycin을 함유한 배지에서 형질전환된 PLB를 선발하는 것이 바람직할 것으로 생각된다. 외떡잎식물인 벼의 경우 형질전환 캘러스의 선발을 위해 \( 40 \mathrm { mg } / 1 \) 정도의 고농도 hygromycin을 사용하고 있는데 반해 같은 외떡잎식물인 호접란 PLB의 경우 항생제에 대한 감수성이 높아서 캘러스보다 훨씬 낮은 농도에서 선발을 해야 PLB의 증식이 원활이 이루어져 선발효율을 높일 수 있을 것으로 생각된다. Agrobacterium이 접종된 PLB를 hygromycin이 함유된 PLB 증식 배지에 치상하여 형질전환된 PLB를 선발하였고, 새롭게 유도된 PLB를 shooting 배지에 옮겨 multishoot을 유도한 후 rooting 배지에 옮겨 재분화 개체를 확보하였다. 선발된 형질전환체를 GUS assay로 형질전환 유무를 확인한 결과, 형질전환된 호접란 PLB로부터 증식된 대부분의 새로운 PLB는 GUS 염색이 강하게 나타났고, 특히 dipping 처리된 부위에서 새롭게 생성되는 PLB에서 GUS 염색이 강하게 나타났다. 형질전환체의 잎 부위에서도 GUS 발현을 확인할 수 있었으나 형질전환 되지 않은 야생형 식물체는 GUS 염색이 되지 않았다. 이러한 결과로 보아 호접란 PLB를 dipping 처리함으로서 형질전환 효율을 더욱 증대시킬 수 있을 것으로 생각된다.</p>