세포는 \(37^{\circ} \mathrm{C}\)와 \(10 \% \mathrm{~CO}_{2} \)의 탄산가스 인큐베이터에서 습기 공급하며 배양하였다. 또한, 탈이온수를 이용하여 \(1.5 \mathrm{~g} \)의 글리신과 \(0.2 \mathrm{M} \)의 글리신 stock 용액을 결합하여 총 \(400 \mathrm{ml} \)의 글리신 \( \mathrm{NaOH} \) 완충액 (\( \mathrm{pH} 10.3 \))을 만들었다. 이후, 에테르 마취 상태의 모르모트(Hartley, 10~12 weeks)에게 \(12 \% \)의 카제인 산나트리윰을 \(20 \mathrm{ml} \)/마리로 녹여서 주입하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>배지 및 세포배양</h2><p>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, Rockville, MD, USA)는 분말 DMEM (high glucose)를 증류수에 녹여 \( 3.7 \mathrm{~g} \)의 탄산수소나트륨 및 항생제로 \( 50 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) 페니실린(Meiji Co., Tokyo, Japan)과 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 스트렙토마이신(Meiji Co., Tokyo, Japan)을 넣어 \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{~HCl} \) 로 \( \mathrm{pH} 7.3\)에 조정한 후, \( 0.22 \mu \mathrm{m} \) pore 멸균필터를 이용하여 멸균했다. 혈청은 소 태아혈청(fetal calf serum, FCS; Japan Bio-Test) 및 말혈청(horse serum, HS; Gibco)을 사용, 세포 계대배양용 배지로서는 \(5\%\) FCS와 \(5\%\) HS 를 가하여 사용했다. 신경세포 초대배양용 배지로서는 DMEM에 \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 인슐린(Sigma, St. Louis, MO, USA), \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 트란스페린(Sigma), \( 1 \mathrm{mM} \) 피루 빈산나트륨(Sigma), \(5\%\) HS를 첨가하여 실험에 사용했다.</p><p>본 실험에 사용한 모든 세포는 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(10 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 의 탄산가스 인큐베이터 내에 습기를 공급한 상태에서 배양하였다.</p><h2>글리신 완충액</h2><p>글리신 \( 1.5 \mathrm{~g} \)에 탈이온수 \( 100 \mathrm{ml} \)을 첨가, \( 0.2 \mathrm{M} \)의 글리신 stock 용액을 \( 7.22 \mathrm{ml} \) 넣은 후, 탈이온수로 희석하여 총 \(400 \mathrm{ml} \)의 글리신 \( \mathrm{NaOH} \) 완충액 \( (\mathrm{pH} 10.3)\)을 조제했다. 해파린나트리움 주사액 Novo-heparin 1000\((1000 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) \)를 Nordisk사(Denmark)로부터 구입 후 희석하여 사용했다. N-form-yl-L-methionyl-L-leucyl-phenylalanine (FMLP)는 Sigma사, 4-methylumbelliferyl-D-gluculonide와 카제인산나트리윰은 Nakara사(Tokyo, Japan)의 제품을 구입하여 사용했다. \( 0.1 \% \) 글리코겐 생리식염수용액은 글리코겐분말 \( 0.4 \mathrm{g}\), \(\mathrm{NaCl} ~3,6\mathrm{g} \)에 탈이온수 \( 400 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 \( 121^{\circ} \mathrm{C}\), 20분간 완전 멸균하여 사용했다. Hanks 완충액은 \( \mathrm{KCl} ~0.4\mathrm{g}\), \(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} ~50 \mathrm{mg} \), \( \mathrm{MgSO}_{4}\cdot7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}~97.7 \mathrm{mg}\), \(\mathrm{NaCl} ~8\mathrm{g}\), \(\mathrm{NaHCO}_{3} ~0.35 \mathrm{g} \), \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} ~47.5 \mathrm{mg} \)에 탈이온수 \(1\mathrm{~l}\)를 가해 완전 멸균했다. 별도로 멸균한 \( \mathrm{CaCl}_{2}\), \(2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}(185.5 \mathrm{mg} / \mathrm{l}) \) 및 \( 0.22 \mu \mathrm{m} \)의 pore 멸균필터로 필터 멸균한 glucose \( (1 \mathrm{~g} / \mathrm{l}) \)를 첨가하여, \( 1 \mathrm{N} \) \( \mathrm{NaOH} \)로 \( \mathrm{pH} 7.4\)로 조정해여 세정용 완충액으로 사용했다. 초산 완충액은 탈이온수 \( 100 \mathrm{ml} \)에 초산 \( 1.15 \mathrm{~g} \)을 첨가하여 \( 0.3 \mathrm{M} \)의 초산 stock 용액 \( 51 \mathrm{ml} \) 당, \( 0.2 \mathrm{M} \)의 sodium acetate 용액을 \( 49 \mathrm{ml} \) 첨가 후, 탈이온수로 희석하여 총 \( 200 \mathrm{ml} \)의 초산완충액 \( (\mathrm{pH} 4.6)\)을 조제했다.</p><h2>몰모트의 neurophil 조제법</h2><p>본 실험은 Tsujii 등의 방법을 변형하여 행했다. 몰모트(Hartley, 10~12 weeks)에 생리식염수로 녹인 \( 12 \% \) 카제인 산나트리윰 \( 20 \mathrm{ml} \)/마리를 에테르 마취 하에서 주사했다. 주사 후 후두부를 구타하여 실신시킨 후, 경동맥을 전달하여 방혈사시켰다. \( 5 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) 헤파린이 든 Hanks 완충액 \( 20 \mathrm{ml}\)/마리를 ip 주사하여 neurophil을 취한다. \( 1,100 \mathrm{rpm}\), \(5\mathrm{~min}\), \(4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 원심분리하여 상청을 버리고, Hanks 버퍼에 1회 세정한 후, 세포현탁용 D-MEM에 \( 1.2 \times 10^{7} \mathrm{cells}/\mathrm{ml} \)로 조제하여 얼음 위에 보존했다.</p>