본 연구에서는 대황을 분말을 이용하였으며, 분말에 에탄올을 가한 후 진탕 추출하였고, 이 추출물에 대해 원심분리기를 통해 상층액을 분리하였다. 그리고 추출물에 증류수를 넣어 현탁 후, \( n \)-hexane을 가했으며, 이후 여과 및 감압 농축과정을 거쳐 \( n \)-hexane 층을 얻었으며, 같은 방법으로 여러 분획물을 얻었다. 한편, 대황 에탄올 추출물의 ethyl acetate 분획물에 대해 ethy acetate과 methanol의 비중을 달리해 slica gel column chromatography로 분획을 시도했으며, 이중 \( \mathrm{EA} 1 \) 획분에 대해 membrane filter로 여과 후 HPLC로 분획을 시도하였다. 이를 통해 얻은 분획물은 C\(18\) column 등을 통해 분자량을 측정하는데 이용되었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>대황(Eisenia bicyclis)는 동해안에서 채취하여 담수로 깨끗이 세척한 후 동결건조 하여 분쇄기(DA282-2, Deasung atron, Seoul, Korea)로 잘게 분쇄시킨 뒤 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 저장하면서 실험에 사용하였다.</p> <h2>추출</h2> <p>분말상태의 시료에 10 배량의 에탄올을 가하여 실온에서 24시간 동안 진탕 추출하였다. 추출물은 원심분리기(UNION \( 32 \mathrm{R} \), Hanil Co., Incheon, Korea)로 \( 3000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심분리한 후 상층액만 취하였다. 잔사는 이와 동일한 방법으로 2 회 반복 추출하였다. 이를 여과지(Advantec \( 5 \mathrm{~A} \), Toyo Roshi Kaisha, Tokyo, Japan)로 여과한 후 rotary evaporator(RE200, Yamato Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 감압 농축하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 건조하였다. 이를 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하며 실험에 사용하였다. 대황 에탄올 추출물을 10 배량의 증류수에 현탁한 후, 동량의 \( n \)-hexane을 가하여 \( 180 \mathrm{rpm} \) 으로 2 시간동안 shaker(Dongwon Science Co., Busan, Korea)에서 교반하였다. 이를 정치시켜 상층액을 취하고 여과, 감압 농축하여 \( n \)-hexane층을 얻었다. 같은 방법으로 수층을 chloroform, ethyl acetate, butanol로 용매분획한 다음, 농축하여 각각 분획물을 얻었으며 최종적으로 물 분획물을 얻었다(Fig. 1).</p> <h2>Lipase inhibitor 분리</h2> <p>대황 에탄올 추출물의 ethyl acetate 분획물을 ethy acetate에서 methanol로 용매계를 단계적으로 극성을 높여가며 slica gel column chromatography를 실시하여 분획물을 얻었다. 활성화된 slica gel(230-400 mesh, Merck Co., Germany) 50 g에 ethyl acetate를 가하여 slurry로 만들고 glass column \( (5065 \mathrm{~mm}, 120 \mathrm{ml}) \) 에 충진한 후 이를 3 배의 ethyl acetate로 세척하였다. 대황 ethyl acetate 분획물 \( 1 \mathrm{~g} \) 을 methanol로 농도가 \( 500 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 이 되도록 녹이고 3000 rpm에서 10 분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 column에 loading하였다. Ethyl acetate와 methanol을 용매로 하여 \( (10: 0 \rightarrow 9: 1 \rightarrow 8: 2 \rightarrow 7: 3 \rightarrow 6: 4 \rightarrow 5: 5 \rightarrow 4: 6 \rightarrow 3: 7 \rightarrow 2: 8 \rightarrow 1: 9 \rightarrow 0: 10) \) 순차적으로 \( 100 \mathrm{ml} \) 씩 분획하여 22 개의 분획물을 얻었다(Fig.1). Slica gel column chromatography를 이용하여 분리된 \( \mathrm{EA} 1 \) 획분을 희석하고 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) membrane filter로 여과한 후 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 을 취하여 Table 1 과 같은 조건으로 HPLC를 실시하였다. HPLC로 분리한 분획을 LC/ESI-MS(Nanospace SI-2, Shiseido, Tokyo, Japan)에서 C18 column(LUNA 5 micron-C-18, \( 1501 \mathrm{~mm} \), Phenomenex, Torrance, Canada)을 이용하여 분자량을 측정하였으며 결과는 LCQ Deca XP mass spectrometer(Thermo finnigan San Jose, CA, USA) 로부터 얻었다. NMR 측정의 경우, \( 1 \mathrm{H} \) spectra는 JNM-ECP400(500 MHz, JEOL Co., Tokyo, Japan), \( { }^{13} \mathrm{C} \) spectra 는 Avance II 900(900 MHz, Bruker, Karlsruhe, Germany) spectrometer를 각각 이용하여 측정하였다.</p>