알코올 효모의 ethanol 내성을 비교하기 위하여 spot assay와 세포 viability를 측정하였으며 균체농도는 분광광도계(Amersham Pharmacia Ultrospec 2000 , USA)를 이용하여 \( 600 \mathrm { ~nm } \)에서 측정하였다.
<h2>Ethanol 내성 실험</h2> <p>알코올 효모의 ethanol 내성을 비교하기 위하여 spot assay와 세포 viability를 측정하였다. Spot assay를 위해서 세 효모를 \( 5 \mathrm { ~mL } \) YPD배지에서 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } , 250 \mathrm { rpm } \)의 조건으로 초기대수증식기에 도달할 때까지 배양한 후, 배양액의 균체량을 증류수를 이용하여 동일하게 맞추었다. 배양액을 YPD 배지를 이용하여 10 에서 \( 10 ^ { 5 } \)까지 10배 단위로 희석한 후 각각 \( 0 \% \)와 \( 10 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \)의 ethanol이 함유된 YPD plate에 \( 7 \mu \mathrm { L } \)씩 떨어뜨리고 colony가 형성될 때까지 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 정치배양하였다. 또한 ethanol에 대한 cell viability 비교 실험을 위해서 동일 과정으로 배양한 효모를 \( 15 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) ethanol이 함유된 \( 5 \mathrm { ~mL } \) YPD 액체배지에 배양하면서 1.0, 3.0, 6.0, 12.5, 16.0, 22.0 시간에 샘플을 채취하여 세포가 약 \( 2.5 \times 10 ^ { 2 } \)가 되도록 희석한 후 YPD plate에 도말하고 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 생성된 colony의 개수를 측정하였다.</p> <h2>균체농도 및 대사산물의 농도 측정</h2> <p>균체농도는 분광광도계(Amersham Pharmacia Ultrospec 2000 , USA)를 이용하여 \( 600 \mathrm { ~nm } \)에서 측정하였다. Glucose 및 ethanol, acetate, glycerol을 포함하는 대사산물의 농도는 refractive index (RI) detector가 장착된 HPLC (Agilent 1200 series, USA)를 이용하여 분석하였고, 컬럼은 REZEX ROA-organic acid column (Phenomenex, USA)를 사용하였다. 이동상으로 \( 5 \mathrm { mM } \)의 황산용액을 \( 0.6 \mathrm { ~mL } / \mathrm { min } \)의 속도로 흘려주었고, 컬럼 온도는 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 설정하였다. HPLC 샘플은 배양액 \( 2 \mathrm { ~mL } \)을 취하고 원심분리기를 이용하여 \( 13,000 \mathrm { rpm } \)으로 1분간 원심분리 시킨 후 상등액을 10배 희석하였고, 이를 필터링하여 준비하였다.</p>