본 논문에서는 면역증강 물질의 활성에 영향을 주는 요소를 확인하기 위해, 크게 탄소원, 질소원, NaCl, 통기량 등으로 나누어 각각 농도별 대조군을 설정한 후 나머지 요소의 최적조건에서 실험을 진행하였다. 탄소원의 경우, 기본배지인 MMM 배지에 각종 탄소원을 \( 1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 씩 첨가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), \(180 \mathrm{rpm} \)에서 측정해본 결과 dextrose가 기본배지보다 높은 면역증강 활성이 관측되었다. 질소원의 경우에는 대부분은 균 생육 및 활성에 영향을 미치지 않았고 일부 yeast extract가 혼합된 대조구와 비교할 때 높은 면역활성을 나타내었다. NaCl에서는 \( \mathrm{NaCl} ~1 \sim 6 \% \) 까지는 균의 생육과 활성을 보였지만 \( \mathrm{NaCl}\) 첨가하지 않은 \( 0 \% \) 와 \( 7 \sim 10 \% \)까지는 균의 생육이 저지되었고 면역증강 활성도 저하되었다. 마지막으로 통기량의 경우에는 기타 최적조건에서 \( 50 \mathrm{ml} \)의 배지를 첨가한 플라스크에서 큰 활성을 나타내었으나 \( 30 \mathrm{ml} \)의 배지를 첨가한 플라스크에서 균의 생육이 가장 높은 것을 알 수 있었다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>탄소원의 영향</h2><p>Burkhoderia sp. IS-203의 기본배지인 MMM 배지에 각종 탄소원을 \( 1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 씩 첨가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), \(180 \mathrm{rpm} \)에서 35시간 배양한 후 면역증강 활성과 생육 정도를 검토한 결과 dex-trose가 기본배지보다 높은 면역증강 활성을 보였다. Fig.1, 2 와 같이 dextrose를 \( 0.5 \sim 3 \% \)까지 농도별로 첨가하여 배양한 결과 \( 1 \% \) dextrose를 첨가한 경우 가장 높은 면역활성을 나타냄으로써 최적 탄소원으로 \( 1 \% \) dextrose로 결정하였다.</p><h2>질소원의 영향</h2><p>MMM배지에서 결정된 탄소원인 dextrose를 \( 1 \% \) 첨가하고 MMM배지에 질소원인 peptone을 제거 한 후 여러가지 유기, 무기 질소원을 \( 1 \% \) 첨가하여 질소원의 영향을 검토하였다. 그 결과 Fig. 3에서와 같이 대부분의 균 생육 및 활성에 영향을 미치지 않았고 유기 질소원 중 yeast extract가 혼합된 대조구와 비교할 때 높은 면역활성을 나타내었다. yeast extract를 \( 0.5 \sim 3.0 \% \)까지 농도로 첨가하여 배양한 결과 Fig. 4에서와 같이 \( 1 \% \) yeast extract가 가장 높은 면역활성을 나타내어 질소원은 yeast extract의 \( 1 \% \) 농도로 결정하였다.</p><h2>\( \mathrm{NaCl} \) 농도에 대한 영향</h2><p>탄소원과 질소원이 결정된 해수 배지조성에 \( \mathrm{NaCl} \)을 \(0\sim10\% \)까지 첨가하여 균의 생육과 면역증강 활성을 검토한 결과 Fig. 5에서와 같이 \( \mathrm{NaCl} ~1 \sim 6 \% \) 까지는 균의 생육과 활성을 보였지만 \( \mathrm{NaCl}\) 첨가하지 않은 \( 0 \% \) 와 \( 7 \sim 10 \% \)까지는 균의 생육이 저지되었고 면역증강 활성도 저하되었다. 특히, \( \mathrm{NaCl} ~3 \% \)를 첨가한 배지는 기본배지와 같은 면역증강 활성을 보였고 균의 생육도 높았다. 그러므로 Burkhoderia sp. IS-203은 \( \mathrm{NaCl} \) 농도에 대해서 균의 증식과 면역증강 활성에 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 최적 \( \mathrm{NaCl} \) 농도는 \( 3 \% \)이고 자연해수 조건에서도 거의 같은 결과를 보였다.</p><h2>초기 \( \mathrm{pH} \)의 영향</h2><p>면역증강물질 생산을 위한 최적 배지의 초기 \( \mathrm{pH} \)를 \( 3.0 \sim 10.0 \)까지 조절하여 초기 \( \mathrm{pH} \)가 면역증강물질 생산에 미치는 영향을 검토한 결과는 Fig. 6과 같다. Burkholderia sp. IS-203은 \( \mathrm{pH} 3.0 \sim 10.0 \) 범위에서 높은 생육도를 나타냈으며 최적 \( \mathrm{pH} \)는 8.0으로 생육도와 면역증강물질 생산이 높았다.</p><h2>배양 온도의 영향</h2><p>최적 \( \mathrm{pH} \)를 8.0으로 한 최적 배지에 배양온도를 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)까지 범위에서 배양하여 면역증강물질 생산성을 조사한 결과 Fig. 7에서와 같이 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 가장 높은 생육과 면역증강 활성을 보였다.</p><h2>통기량의 영향</h2><p>통기량에 따른 균의 생육과 면역증강물질 생산성을 검토하기 위해 앞서 결정된 최적조건 생산 배지를 \( 250 \mathrm{ml} \) 플라스크에 \( 30 \sim 150 \mathrm{ml} \)씩 넣어 진탕배양기에서 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), \(180\mathrm{rpm}\)으로 35시간 배양한 후 균의 생육 및 면역증강 활성을 측정한 결과 Fig. 8과 같이 \( 50 \mathrm{ml} \)의 배지를 첨가한 플라스크에서 큰 활성을 나타내었으나 \( 30 \mathrm{ml} \)의 배지를 첨가한 플라스크에서 균의 생육이 가장 높았다.</p><h2>면역증강물질 생산을 위한 배양의 경시 효과</h2><p>면역증강물질 생산을 위한 최적 배양 조건으로 3 urkholdria sp. 1S-203을 배양하여 시간에 따른 면역증강 활성과 생육 및 배양여액의 \( \mathrm{pH} \)를 조사하였다. Fig. 9에 나타난 바와 같이 면역증강물질은 정지기부터 생산되었으며 최고 생산량은 36시간째로 나타났다. 이상과 같이 Burkholderia sp. IS-203에 의한 면역증강물질 생산을 위한 최적 조건은 Table 2와 같다.</p><h2>MTT 법에 의한 활성 측정</h2><p>면역활성을 알아보기 위하여 in vitro 실험으로 마우스 비장세포를 적출하여 \( 2 \times 10^{6} \mathrm{cell} / \mathrm{ml} \) 준비한 후, 해수에서 분리한 균주의 배양 여과액을 첨가하여 세포 증식률을 측정하였다. 그 결과 분리균주의 Burkholderia sp. IS-203 배양 여과액을 첨가하지 않은 마우스 비장세포에 대하여 약 23%의 면역활성을 나타내어, 마우스 비장세포내의 면역세포가 왕성하게 증식하였음을 알 수 있었다. 이처럼 해수에서 분리한 면역증강물질 생산 균주가 마우스 비장세포의 림프구의 분열을 유도하여 면역세포의 활성을 증진시키면서 정상세포에 대해서는 전혀 세포독성을 나타내지 않기 때문에 암세포에 대해서 선택적인 세포독성의 효과를 보였다. 따라서 시료에 존재하는 면역세포 활성 증진 물질을 순수 분리하여 계속적인 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다. 또한 더 나아가 in vivo 실험을 통하여 체내에서의 면역 증진능을 검토할 필요가 있다고 사료된다.</p>