Lactose가 포함된 E. coli BL21(DE3)/pET-pga 균주를 회분 배양하며 분석한 결과 PGA의 precursor, large subunit, 그리고 small subunit으로 보이는 protein band가 나타났다. pH-stat 방법을 이용한 유가 배양의 최종 결과 PGA가 세포질에서 periplasm 영역으로 성공적으로 분비 발현되어 활성한 것으로, 차후 PGA의 분리, 정제 시에 활용할 수 있을 것으로 본다. 재조합 plasmid가 함유된 본 균주를 집적 배양하는 가운데 저온에서 세포 분해 (cell lysis) 현상이 관찰되었는데 저온 세포 분해 현상을 해결한다면 유용한 단백질을 대량으로 생산할 수 있게 될 것이다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>pET-pga plasmid의 제작</h2><p>PCR을 수행하여 signal sequence를 포함하는 \(2.6 \mathrm{kbp}\)의 pga gene을 증폭하였고, 그 염기 서열은 Fig. 1과 같다. pET-pga plasmid를 NdeI, XhoI enzyme으로 동사에 절단하고 agarose gel에 전기영동을 하였을 때, \(5.2 \mathrm{kbp}\) 의 pET-24a(+) vector fragment와 \(2.6 \mathrm{kbp}\) 의 pga gene insert frag-ment를 확인할 수 있었다. pga gene의 PCR product는 pET-pga plasmid의 insert fragment와 전기영동 상에서 동일한 위치에서 나타났다.</p><h2>pET-pga 함유 균주의 회분 배양</h2><p>E. coli BL21(DE3)/pET-pga 균주를 lactose가 포함되어 있는 회분 배양용 배지에서 65시간 동안 고밀도 배양을 하고 배양액을 SDS-PAGE로 분석했을 때, PGA의 precursor, large subunit, 그리고 small subunit으로 보이는 protein band가 나타났다. 배양액을 원심분리하여 세포를 제거시키고 상등액만을 PAGE 분석하였을 때에는 protein band가 거의 나타나지 않는 것으로 보아 발현된 PGA는 세포 밖으로 분비되지 않는 것으로 판단되었다. 본 실험에 사용된 균주로부터 얻은 periplasm 획분을 SDS-PAGE로 분석하였을 때 PGA의 large subunit과 small subunit의 2개의 protein band가 나타났다. PGA가 가용성 전구체로 생성되고 processing을 거쳐서 large subunit과 small subunit으로 성공적으로 절단되었으며, HPLC를 이용하여 penicillin G로부터 6-APA가 생성되는 것을 확인하였다.</p><h2>고농도 배양</h2><p>발효는 대량배양의 조건인 \( 30 \% \) 이상의 D.O.농도를 유지하기 위하여 적절한 교반속도, 통기조건, 온도하강 등의 조건을 최적화하였다. 최적의 조건에서 본균주의 성장과 PGA 생산은 우수하였다. T7 promotor에 의한 유전자 발현을 유도하기 위하여 IPTG 또는 lactose를 사용하는데, IPTG는 가격의 문제로 효소를 산업적으로 대량 생산할 때에는 일반적으로 사용하지 않는다. 따라서 본 실험에서는 효소의 유도제로서 lactose를 사용하였다. 공정의 편의를 위하여 배양 초기에 lactose를 넣고 효소의 발현을 유도하였다. 회분배양의 견과는 포도당이 고갈된 20시간 이후에 효소의 발현이 시작되었으며 효소 생산이 꾸준히 증가하여 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도가 23일 때 최종 역가가 \( 6 \mathrm{U} / \mathrm{mL} \) 이었다. 이러한 회분배양의 결과를 토대로 하여 생산성을 높이기 위하여 유가배양을 실시하였다. 초기에 포도당의 농도를 충분히 유지시켜 효소의 발현을 억제하고 세포성장이 일정 수준에 도달하였을 때 포도당의 농도를 \( 0.04 \% \) 이하로 유지하면서 서서히 효소의 발현을 유도하였다. 이 때 \(\mathrm{pH}\) 고정(stat), glucose 최소 휴지 전략을 기본으로 수행하였다. \(\mathrm{pH}\)-stat 방법을 이용하여 유가 배양한 결과로서 시간에 따른 균체농도(\(\mathrm{O.D.}_{600}\)), 포도당 농도, PGA역가를 나타내었는데 최종 결과가 균체량은 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도가 62이며, PGA 역가는 \( 19.6 \mathrm{U} / \mathrm{mL} \) 로 나타났다. 이는 Deak 등이 보고한 \( 4.5 \mathrm{U} / \mathrm{mL} \) 보다는 약 4배의 높은 발현을 보여주었고 PGA는 세포질에서 periplasm 영역으로 성숙한 형태로 성공적으로 분비 발현되어 완전한 활성을 나타낸 것으로, 이는 나중에 PGA의 분리, 정제 시에 활용할 수 있을 것이다. 재조합 plasmid가 함유된 본 균주를 집적 배양하는 가운데 세포분해 (cell lysis) 현상이 관찰되었는데 이는 온도를 저하시킬 때 공통적으로 발생하였다. 이는 향후 안정적인 유가배양을 위하여 해결해야 할 문제로 남아있다. 이러한 현상은 cold shock에 의한 세포막의 유동성에 문제가 생겨 발생하는 것으로 추측할 수 있으며 대장균의 지질A(lipid A)생합성 구조에 관한 연구를 통하여 부분적으로 설명이 가능하다. 즉 대장균을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 생육시켰을 때 포화 지방산인 laurate가 지질A의 성분이 되며 그 결과 세포막의 견고함이 유지되는데 반하여 \( 12^{\circ} \mathrm{C} \) 의 저온에서 생육시켰을 때는 laurate대신에 불포화지방산인 palmotoleate가 지질A 성분으로 생합성 되므로 저온에서는 세포막이 불안정한 유연성을 가지게 된다. 따라서 저온에서 활성화되는 palmitoyl-acyl 운반단백질을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서도 발현시킬 수 있다면 저온에서 세포분해 현상은 해결할 수 있을 것이고 유용한 단백질을 대량으로 생산할 수 있을 것이라고 생각한다.</p>