Wild type과 triple mutant MBL 단백질의 세포 밖 분비 차이를 확인하기 위해 각각의 단백질을 HeLa 세포에 형질전환 한 후 mannan-agarose로 침강하여 western blot을 실시한 결과, wild type MBL이 검출되어 lectin domain이 정상 기능을 하는 것을 확인하였고 triple mutant MBL 역시 정상적인 기능을 하는 것으로 나타났다. 또한 wild type MBL은 band를 확인할 수 있었으나 triple mutant MBL의 경우에는 확인할 수 없었다. 이러한 결과는 secretory pathway를 거쳐 세포 밖으로 분비가 이루어지는 wild type MBL과는 달리, triple mutant MBL은 세포 밖으로 분비가 되지 않음을 의미한다. 결과적으로 N-말단 쪽의 돌연변이가 세포 밖으로의 분비와 연관이 있음을 의미하며 정상 및 돌연변이 단백질의 발현은 돌연변이와는 무관한 것으로 보인다. 이는 과발현한 상태에서 얻은 결과이므로 단백질을 생리적 농도로 낮추어 정상과 돌연변이 단백질 간에 순환율을 측정한다면 돌연변이가 미치는 영향을 보다 정확하게 알 수 있을 것이다. 선천성 면역을 담당하는 중요한 면역인자인 MBL의 낮은 혈청 농도로 인한 면역결핍증은 분자 세포 생물학적 측면에서 연구되어야 할 부분이 아직 많다.
<h2>Mannan-agarose를 사용한 Lectin의 기능 검증</h2> <p>Wild type MBL-A과 triple mutant MBL-A DNA를 HeLa 세포에 형질전환 하고 48 시간 후 cell lysate를 회수하여 man-nan-agarose로 침강을 시행하였다. Mannan-agarose에 침강된 단백질을 anti-HA로 western blot한 결과, 예상한 것과 같이 wild type MBL이 검출되어 lectin domain이 정상 기능을 하는 것을 확인하였다. 이와 마찬가지로 triple mutant MBL이 mannan-agarose와 함께 침강된 것이 확인되었는데 이는 돌연변이 위치와 떨어진 C-말단 쪽의 lectin domain이 정상인 구조를 형성하여 정상적인 기능을 하는 것으로 여겨진다.</p> <h2>Wild type과 triple mutant MBL 단백질의 세포 밖 분비 차이</h2> <p>Wild type MBL과 triple mutant MBL 단백질의 세포 밖 분비의 차이점을 알아보기 위하여 wild type과 triple mutant MBL DNA를 HeLa 세포에 형질전환 하고 48 간 배양한 후 회수한 각각의 배지를 mannan-agarose로 침강을 시행하여 세포 밖으로 분비된 MBL 단백질을 검출하였다. Mannan-agar-ose에 침강된 단백질을 anti-HA로 western blot한 결과, wild type MBL은 band를 확인 할 수 있었지만, triple mutant MBL은 확인 할 수 없었다. 이것은 wild type MBL이 secretory pathway를 거쳐 세포 밖으로 분비는 것과는 달리 triple mutant MBL은 세포 밖으로 분비가 되지 않음을 나타내며, triple mutant MBL의 lectin domain이 정상적 기능을 하는 것으로 보아 N-말단 쪽의 돌연변이가 세포 밖으로의 분비와 연관되어 있음을 뜻한다. 분비되지 못하는 triple mutant MBL의 세포 분포를 조사하기 위해 wild type MBL-A과 triple mutant MBL-A DNA를 COS세포에 형질전환 하고 anti-HA 항체를 사용하여 immunohistochemistry를 하였다. Fig. 3B에서 보여지는 것과 같이 wild type MBL은 세포 내 endoplasmic reticulumn에 존재하며, endoplasmic reticulumn 구조도 정상적으로 망상구조(network)를 유지하고 있는 것에 반해, triple mutant MBL은 endoplasmic retic-ulumn에 존재하나 망상구조가 손상된 비정상적인 endoplas-mic reticulumn 구조를 나타내었다. 즉, wild type MBL은 en-doplasmic reticulumn에서 합성되어 정상적으로 분비됨으로써 endoplasmic reticulumn network가 정상적인 것과는 달리, triple mutant MBL은 비록 정상적으로 합성이 이루어지고 있고, lectin 기능도 정상적이나 어떤 이유로 인하여 endoplas-mic reticulumn으로부터 더 이상 분비경로를 거치지 못하고 endoplasmic reticulumn 내에 머물고 있음으로써 endoplas-mic reticulumn 망상구조가 비정상적인 것으로 보여진다.</p> <h1>고 찰</h1> <p>병원성 미생물의 세포 표면 pattern을 인식하여 제일선의 방어체계를 형성하는 선천성 면역은 획득면역이 성숙되지 않은 영아기에 매우 중요한 역할을 하며, 어른의 경우에도 감염 초기에 작용하여 숙주를 보호하는데 커다란 기여를 한다. 혈청 내 MBL 의 농도는 정상 백인의 경우 \( 1680 \pm 250 \mathrm { ng } / \mathrm { ml } \) 인데 비하여 면역결핍증 환자의 경우 \( 19 \pm 8 \) \( \mathrm { ng } / \mathrm { ml } \) 로 약 80 배 이상이나 낮다. MBL은 선천성 면역을 담당하는 중요한 면역인자로서, 면역결핍증을 가지고 있는 사람은 MBL 유전자에 돌연변이가 존재하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어 류마티스 관절염(rheumatoid ar-thritis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus eryth-ematosus), 스조그렌 증후군(Sjogren's syndrome) 등의 자가 면역질환에 걸린 사람에게서 \( \mathrm { MBL } \) 의 유전적 변이에 의한 MBL 의 혈청 내 농도의 감소가 보고 되어있다. 이 유전적 결함은 MBL2 유전자의 콜라겐 유사 domain을 발현하는 exon1에서 일어난 3 개의 점돌연변이 때문인 것으로 유전학적 연구를 통하여 밝혀졌다. 이 돌연변이로 인해 MBL은 기능적인 multimeric protein으로 조립되지 못하여 carbohy-drate recognition domain은 정상인데도 불구하고 콜라겐 do-main이 돌연변이인 비기능적인 MBL protein을 형성하게 된다. MBL의 낮은 혈청 농도로 인한 면역결핍증은 유전학적 연구는 많이 진행되었으나 분자 세포 생물학적 원인은 아직도 연구되어야 할 부분이 많이 남아 있다. 쥐의 MBL 유전자는 사람의 MBL2 유전자와 상동성이 높아 사람 MBL의 연구 모델로 많이 사용되고 있다. MBL2 내에서 발견되는 세 개의 점 돌연변이를 쥐 MBL 단백질에 도입하기 위해 MBL-A 유전자가 선행 연구로 구축 되었다. 본 연구에서는 혈청 내 MBL의 농도가 낮은 이유가 mutant MBL이 소포체 내에서 정상적인 folding과 assembly가 되지 않고 ER qual-ity control에 의해 통제 되어 분비 되지 않는다는 가설을 알아보기 위해 돌연변이 \( M B L \) 을 제작하였으며, mutant MBL의 축적이 유발하는 세포의 반응 과정을 알아보고자 하였다. Wild type MBL을 주형으로 하여 GeneTailor \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) Site Directed Mutagenesis System을 이용하여 사람의 MBL2 유전자에서 발견되는 점돌연변이인 Arg40Cys, Gly42Asp, Gly45Glu를 쥐의 유전자에 대응되는 동일한 위치에 도입하여, 세 종류의 돌연변이를 모두 가지고 있는 triple mutant MBL 제작하여, mu-tant와 wild type MBL을 비교하였다.<p>세 종류의 돌연변이를 모두 가지고 있는 triple mutant MBL을 제작한 이유는 단일 돌연변이 보다 triple mutant MBL이 보다 현저한 현상을 나타낼 것으로 기대하고 명확한 비정상적 생리 현상 증거를 우선적으로 확보하기 위해서였다. 구축한 wild type과 triple mu-tant MBL DNA는 HeLa와 COS세포 내에서 정상적으로 작동하여 각각의 단백질을 생산하였다. 동일한 vector로 구축하였기 때문에 동일한 양의 단백질이 생산된 것으로 예상하였으며 western blot과 면역침강(immunoprecipitation) 법의 두 가지 방법 모두 비슷한 결과를 나타내어 정상 및 돌연변이 단백질 의 발현은 돌연변이와는 무관한 것으로 여겨진다. 그러나 과발현한 상태에서 얻은 결과이므로 향후 발현되는 단백질을 생리적 농도로 낮추어 정상과 돌연변이 단백질 간에 순환율을 측정함으로써 돌연변이가 미치는 영향을 보다 정확히 알 수 있으리라 생각된다. 3 개의 돌연변이 도입으로 SDS-PAGE 상에서 mobility shift가 관찰되었는데, 이런 mobility shift는 인산화 전후의 단백질에서 흔히 나타나는 현상으로 단백질에 음이온 수의 증가와 이로 말미암은 구조변형 등으로 나타나는 현상으로 생각된다.</p>