biosurfactant 생성이 우수한 미생물을 분리해서 crude oil 분해능과 유화제 생성능을 가진 세균이 생육함을 확인하였다. 또한 이 유화안정도를 분리균주의 생성물질과 비교한 결과 Span 류와 SDS에 비해서 우수한 유화활성도과 안정성을 보여주므로, 산업적으로 이 물질의 물리 화학적 특성, 생분해도 및 환경 독성 조사의 필요성이 제기된다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>균주의 분리 및 동정</h2><p>부산시 남항의 선착장과 인근의 유류오염 지역으로부터 해수를 채취하여, biosurfactant 생성이 우수한 미생물을 분리하기 위하여 탄소원이 결핍된 C-배지 \( 200 \mathrm{m \ell} \)에 탄소원으로 crude oil 및 식용 oil이 \( 1 \% \) 되게 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(200 \mathrm{rpm}\)으로 7일간 진탕 배양한 후, crude oil 분해능 및 유화제 생성능을 가진 세균이 생육하는 것을 확인하였다. 이렇게 3회 반복하여 생육한 균주를 LB-고체배지에 도말하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다. 선별된 단일 균주를 LB 액체배지에서 각각 전 배양시킨 후, tributyrin이 첨가된 배지에 배양한 후 투명환이 생성된 것을 우수한 균주로 보아 단일 콜로니를 선별하였다. 이 단일 콜로니들을 LB 액체배지에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 전 배양시킨 후, crude oil 분해능 및 tributyrin 분해능을 가진 수십 종의 균주를 분리하였으며, 이중에서 분해능이 강력한 LSC11 균주에 대하여 계속하여 실험하였다.</p><h2>균주의 동정</h2><p>선별된 LSC 11의 동정을 위하여 그램 염색법, 형태학적 관찰 및 생화학적 실험을 수행한 결과를 Table 1에 나타냈다. 그램 염색법에 의해서는 그램 양성균으로 확인되었으며, 현미경 관찰에서는 활발한 운동성을 가진 균주로 확인되었다. 생화학적 실험은 미생물 동정 kit인 API 20 NE Kit를 이용하여 Bergey's manual of systematic bacteriology에 준하여 동정한 결과, Bacillus sp.으로 판명되어 Bacillus sp. LSC11로 명명하였다. 우리나라 및 외국의 경우 유류 분해 및 유화제생성 균으로 주로 분리되고 있는 균주로는 Pseudomonas sp., Aeromonas sp., Acinetobacter sp., Klebsiella sp. 및 Arthrobacter sp. 등이 보고되고 있다.</p><h2>균주의 생육특성</h2><p>분리균 Bacillus sp. LSC11의 생육에 미치는 온도의 영향을 검토한 결과 \( 25^{\circ} \mathrm{C}\), \(32^{\circ} \mathrm{C}\), \(37^{\circ} \mathrm{C} \) 및 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 비슷한 양상으로 왕성한 생육상태를 보여주었다. 분리균의 생육을 조사하기 위해 C -배지에 탄소원을 crude oil 및 수종의 oil을 \( 1 \% \) 를 첨가하여 Bacillus sp. LSC11를 진탕배양 하면서 시간별로 시료를 채취하여 균주의 성장을 조사하였다. 그 결과, 본 실험에 사용된 LSC11 균은 다양한 oil의 탄소원과 염분농도 \( 3 \% \) 배지에서 성장이 비교적 양호하였으며, 3일 정도의 배양에서 최대성장을 보였다 (자료 미제시). 이러한 결과는 유류분해 해양세균인 Klebsiella pneumoniae L25는 염분농도 \( 3.0 \) 및 \( 3.5 \% \)에서 최대의 성장을 보여주었으며, Acinetobacter sp.의 염분농도는 \(3\%\), Xanthomonas campestris M12 및 Pseudomonas maltophilia N246은 \(3.0 \sim 3.5\%\)로 Lee 등이 보고한 연구결과와 비슷하였다.</p><h2>Biosurfactants의 유화력</h2><p>Bacillus sp. LSC11의 배양용액에 생성된 biosurfactant의 특성을 알아보고자 경시적으로 표면장력을 측정한 결과 배양 후 6 시간대 부터 급격히 감소하다가 24 시간 후에 배지의 표면장력이 \(57\mathrm{mN} / \mathrm{m} \)에서 최대 \( 32 \mathrm{mN} / \mathrm{m} \) 정도까지 저하되었으며, 이러한 현상은 생육이 정지된 66시간 후까지 계속 되었다 (Fig. 1). 이러한 결과는 해양 유류 분해 세균인 Pseudomonas sp. 으로부터의 계면활성제의 생산이 배양 2일 후인 정지기 초기에 가장 많이 생산되는 결과와 유사하였다. 따라서, 표면장력이 최대로 감소된 24시간 배양한 용액에 생성된 biosurfactant를 다양한 소수성 탄화수소류와 oil을 기질로 사용하여 유화활성을 측정한 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 그 결과 LSC11이 생산하는 biosurfactant는 crude oil에 상당한 유화력을 보였으며, 대두유에서는 가장 높은 유화활성을 보였으며 kerosene, tributyrin, crude oil도 비교적 높은 활성을 보인다. 반면에, dodecane, decane 등의 소수성 탄화수소를 기질로 사용한 경우는 전반적으로 낮은 편이였고, 탄소수가 증가함에 따라 활성이 증가하는 경향이였다. 이와 같은 탄화수소류를 기질로 사용한 결과는 Pseudomonas aeruginosa가 생산하는 계면활성제의 경우와는 상반되는 활성도를 보였다. 배양액에서 산 침전 및 용매추출을 통해 부분 정제한 biosurfactant의 CMC는 Fig. 3에서와 같이 \( 35 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)인 것으로 나타났다. 이 때의 최소 표면장력은 배양상등액으로 측정한 값과 거의 비슷하게 \( 31.5 \mathrm{mN} / \mathrm{m} \) 였다. 이 결과는 지금까지 알려진 Bacillus sp. 및 Norcardia sp. 등의 균주들의 표면장력 저하능이 \( 25 \sim 40 \mathrm{mN} / \mathrm{m} \) 정도의 범위로 보고된 내용과 비슷한 경향을 나타낸 것이다.</p><h2>기질에 따른 유화 안정성</h2><p>분리균주의 생산 biosurfactant의 소수성 탄화수소계 및 각종 oil을 기질로 한 유화활성 및 유화안정성을 Fig. 4 와 Table 2에 나타내었다. 또, 현재 상용되고 있는 유화제 및 안정제를 대두유를 기질로 사용하여 측정한 유화활성의 안정도를 비교 조사한 결과를 Fig. 5와 Table 3에 나타냈다. 유화활성의 안정도는 상수 \( K_{d} \)로 나타냈으며, 여러 가지의 유화기질을 사용하여 측정하였다. 유화안정도를 분리균주의 생성물질과 현재 상용되고 있는 유화제 및 안정제를 비교한 결과, Tween 류와 Triton X-100, surfactant와 비슷한 활성과 안정성을 유지했으며, Span 류와 SDS에 비해서는 유화활성 및 안정성이 월등히 높은 것을 확인하였다. 이 결과는 Norcardia sp. L-417이 생산하는 biosurfactant와 매우 유사한 결과를 보여준 것이다. 따라서, Bacillus sp. LSC11이 생산하는 biosurfactant는 현재 상용되고 있는 유화제 및 안정제와의 비교에서 매우 우수한 활성도와 안정도를 보여 주었다. 산업적으로 이 물질을 이용하기 위해서 물리 화학적 특성, 생분해도 및 환경독성 등의 조사를 수행하여야 할 것으로 생각된다.</p>