단백질의 정량은 UV spectrophotometer를 이용하여 Bradford 법에 준하여 측정하고 단백질의 순도 검정 SDS-PAGE는 Laemmli의 방법에 준하여 수행하였으며 정제효소의 특성을 알아보기 위하여 \( 100 \mathrm{mM} \) citrate phosphate buffer (pH 4.5) \( 2.7 \mathrm{ml} \) 에 효소액 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 와 \( 10 \mathrm{mM} \) p-nitrophenyl- \( \beta \)-D-glycosides 종류의 각 기질을 \( 200 \mu \mathrm{l} \) 첨가하여 효소반응을 정지시켰다. 또 HPLC 를 이용하여 genistin, daidzin, genistein 및 daidzein을 정량하였다.
<h2>단백질 정량과 전기영동</h2> <p>단백질의 정량은 UV spectrophotometer를 이용하여 Bradford 법에 준하여 측정하였다. 단백질의 순도 검정은 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)는 Laemmli의 방법에 준하여 수행하였다. SDS-PAGE 상에서 분자량 측정을 위한 표준 단백질로는 pageruler \( { }^{\mathrm{tm}} \) prestained protein ladder (Fermentas, USA)를 사용하였다.</p> <h2>정제효소의 특성</h2> <p>정제된 효소의 특성을 알아보기 위하여 \( 100 \mathrm{mM} \) citrate phosphate buffer (pH 4.5) \( 2.7 \mathrm{ml} \) 에 효소액 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 와 \( 10 \mathrm{mM} \) p-nitrophenyl- \( \beta \)-D-glycosides 종류의 각 기질을 \( 200 \mu \mathrm{l} \) 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응시킨 후 \( 1 \mathrm{M} \) sodium carbonate를 \( 1 \mathrm{ml} \) 첨가하여 효소반응을 정지시켰다. 이때 생성된 p-nitrophenol을 \( \mathrm{A}_{420} \) 에서 흡광도를 측정 후 미리 작성된 검량식을 이용하여 효소활성을 측정하였다. 본 논문에서는 기질로부터 1 분간 \( 1 \mu \mathrm{mol} \) 의 p-nitrophenol을 생산하는데 사용된 효소의 양을 \( 1 \mathrm{U}(\mu \mathrm{mol} / \mathrm{min}) \) 로 정의하였다. 또한 천 연기질(laminarin, amygdalin, esculin, cellobiose, salicin)을 이용한 효소 활성 측정은 glucose assay kit (Sigma, USA)를 이용하였다. 각 \( 10 \mathrm{mM} \) 기질 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 와 정제된 효소 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 를 \( 800 \mu \mathrm{l} \) 의 \( 100 \mathrm{mM} \) citrate phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 4.5)와 섞은 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응시킨 뒤, \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 분간 끓임으로써 효소 반응을 정지하였다. 각 반응액을 \( 1 / 10 \) 로 희석하여 \( 200 \mu \mathrm{l} \) 를 만든 후 glucose assay kit의 assay reagent (glucose oxidase \( 500 \mathrm{U} \), peroxidase \( 100 \mathrm{U} \) ) \( 400 \mu \mathrm{l} \) 와 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응시킨 뒤 \( 12 \mathrm{~N} \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} 400 \mu \mathrm{l} \) 를 가하여 반응 정지 후 \( \mathrm{A}_{540 mathrm{~nm}} \) 에서 흡광도를 측정하여 glucose standard solution으로 미리 작성한 검량식을 이용하여 효소의 활성을 측정하였다. 본 논문에서는 기질로부터 1 분간 \( 1 \mu \mathrm{mol} \) 의 glucose를 생산하는데 사용된 효소의 양을 \( 1 \mathrm{U}(\mu \mathrm{mol} / \mathrm{min}) \) 로 정의하였다.</p> <h2>HPLC 분석</h2> <p>\( \mathrm{HPLC} \) 를 이용하여 genistin, daidzin, genistein 및 daidzein을 정량하였다. 이때 사용된 column은 Nova-Pak (Waters, \( 3.9 \times 150 \mathrm{~mm} \) )이고, mobile phase는 \( 1 \% \) acetic acid를 함유한 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 와 \( 1 \% \) acetic acid를 함유한 methanol (이때 methanol은 40 분 동안 \( 10 \% \) 에서 \( 60 \% \) 까지 증가하도록 농도구배를 주었다)이다. Flow rate는 \( 0.8 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 이며 검출을 \( \mathrm{UV} \) detector로 \( \mathrm{UV}_{254} \mathrm{~nm} \) 에서 검출하였다.</p>