헤파린 처리된 혈액을 lysing buffer solution과 섞어 원심분리하여 상층액을 제거하여 1x10^6 cell/ml로 조정하여 Isotype IgG1(rat)-FITC, Isotype IgG2(rat)-PE, Monoclonal Antibody Anti-Rat CD4+-FITC, Monoclonal Antibody Anti-Rat CD8+-PE를 이용하여 flow cytometer로 CD4+와 CD8+를 측정하고 Annexin V-FITC로 염색 후 flow cytometer로 세포사멸을 측정하였다.
<h2>Lymphocyte subset \( \left ( \mathrm { CD4 } ^ { + } \right . \)and \( \left . \mathrm { CD8 } ^ { + } \right ) \)assay</h2> <p>\( 100 \mathrm {\mu l } \) 헤파린 처리 혈액을 \( 3 \mathrm { ml } \) 의 lysing buffer solution (Beckman Coulter VersaLyse Lysing Solution)과 섞고 실온에서 15 분간 정지 시킨 후 \( 150 \times g \) 에서 5 분간 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. 여기에 세척을 위해 \( 2 \mathrm { ml } \) 의 PBS를 첨가하고 \( 150 \times g \) 에서 5 분간 원심 분리하여 상층액을 제거하였고 이 세척과정을 3회 실시한 후 잔존 펠렛 내 백혈구 양이 \( 1 \times 10 ^ { 6 } \mathrm { cell } / \mathrm { ml } \) 가 되도록 조정하여 측정 회 차 당 \( 5 \times 10 ^ { 3 } \mathrm { cell } / \mathrm { ml } \) 농도가 되게 하였다. Isotype IgG1(rat)-FITC (Beckman coulter Co., Germany), Isotype IgG2(rat)-PE (Beckman coulter Co., Germany), Monoclonal Antibody Anti-Rat \( \mathrm { CD4 } ^ { + } \)-FITC (Beckman coulter Co., Germany), 그리고 Monoclonal Antibody Anti-Rat \( \mathrm { CD8 } ^ { + } \)-PE (Beckman coulter Co., Germany)를 이용하여 시료처리를 한 후 flow cytometer (Cell Lab Quanta TMSC, Beckman coulter Co., Germany)에서 \( \mathrm { CD4 } ^ { + } \)와 \( \mathrm { CD8 } ^ { + } \)을 측정하였다.</p> <h2>림프구의 자멸사와 괴사</h2> <p>상기와 동일한 방법으로 용해와 세척 과정을 실시한 후 백혈구 양이 \( 1 \times 10 ^ { 6 } \mathrm { cell } / \mathrm { ml } \) 가 되도록 조정하여 처리한 후 측정 회 차 당 \( 5 \times 10 ^ { 3 } \mathrm { cell } / \mathrm { ml } \) 를 이용하였다. Beckman coulter Co. (Germany)에서 구입한 Annexin V-FITC와 PI를 이용하여 신속한 염색과정을 거친 후 flow cytometer (Cell Lab Quanta TMSC (Beckman coulter Co., Germany))에서 세포사멸을 측정하였다.</p>