부탄올에 대한 내성 정도 확인을 위해 미생물을 배양한 결과, 스크리닝한 부탄올 내성주는 E.coli에 비해 약간의 세포성장이 이루어지는 것을 확인할 수 있었으며, 그 중 BRS02 균주가 가장 높은 내성 효과를 나타내어 이를 본 연구의 모균으로 선정하였다. BRS02를 그람염색한 후 관찰한 결과 해당 모균은 그람양성 세균인 것으로 확인할 수 있었으며, 생화학적 특성과 \( 16 {S} \) rRNA 염기서열 등으로 보아 모균은 Staphylococcus sp.임을 알 수 있었다. 또한 모균을 분리, 동정한 결과 기존의 Staphylococcus sp.들과는 달리 rRNA 오페론의 유전적 특징 면에서 다른 신규의 미생물임을 확인하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>부탄올 내성 세균 분리 및 특징</h2> <p>부탄올 용매를 필터한 후 식염수에 현탁한 시료를 사용하여 \( 15-25 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 의 부탄올을 함유한 한천배지에 도말하여 성장하는 콜로니를 분리하여 부탄올 내성균을 선별하였다. 큰 콜로니 32 개를 1 차 선별하고, \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 부탄올 함유배지에서 잘 성장하는 균을 2 차 선별 후 몇 단계의 순수분리 작업을 거쳐서 최종적으로 3 개의 균주를 선택하였다. 부탄올의 내성 정도를 확인하기 위하여 부탄올을 농도별로 함유한 액체배지를 이용하여 진탕 배양한 결과, 대조균주로 대표적인 산업 미생물인 E.coli는 \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 에서 세포의 성장이 완전히 저해되는 반면, 스크리닝한 부탄올 내성주의 경우 모두 \( 12.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \)까지 약간의 세포성장이 이루어졌으며 \( 15 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 이상의 농도에서는 세포의 성장이 완전히 저해되었는데, 그 중 균주 BRS02가 가장 높은 부탄올 내성효과를 나타내어 본 연구의 모균으로 선정하였다(Fig. 1).</p> <h2>부탄올 내성균주의 생화학적 특성</h2> <p>그람염색 후에 현미경으로 관찰한 결과 포도상 모양의 구형의 그람양성 세균으로 확인이 되었다(Fig. 2). BRS02에 대한 생화학적 특성을 조사한 결과 \( 6.5 \% \mathrm{NaCl} \) 에서 성장이 가능하며, arginine dihydrolase, \( \alpha \)-glucosidase, urease 효소 활성을 가지고 있었다(Table 1). 호기적인 조건에서 D-galactose, D-maltose, D-mannitol, D-mannose, methyl- \( \beta \) -D-glucopyranoside, D-ribose, sucrose, D-trehalose를 탄소원으로 자화하여 산을 생성할 수 있었다. 항생제에 대한 내성실험의 경우, bacitracin, vibriostatic agent \( {O} / 129 \) 및 optochin에 내성이 있는 반면 novobiocin과 polymyxin B에 대해서는 감소성을 나타냈다.</p> <h2>균주 BRS02의 \( 16 S-r D N A \) 및 16S-23S ribosomal DNA IGS 서열분석</h2> <p>균주를 동정하기 위해 BRS 02 의 \( 16 { S} \) rDNA 서열을 결정하였다. BLAST를 이용하여 상동성 분석을 한 결과, 많은 Staphylococcus sp. ( HQ407248, FJ695588, AJ704792, AJ704791, AM491462, EU373323, AJ717376 )의 \( 16 { S} {rDNA} \) 서열들과 \( 99 \sim 100% \)의 서열 동일성(sequence identity)을 확인하였다. Fig. 3은 BRS02의 계통발생도를 표현한 것으로, Staphylococcus sp.에 속하며, 특히 Staphylococcus sp. es13과 가장 유사한 것으로 확인이 되었다. 따라서, 본 연구에서 분리된 BRS02는 현미경 관찰, 생화학적인 특징, \( 16 {S} \) rRNA 염기서열, 그리고 계통발생도 분석결과 Staphylococcus sp. 임을 확인하였다. 한편 rRNA 오페론의 유전적 배열을 더 확인하기 위하여, BRS02의 16S-23S IGS부위를 PCR로 증폭하여 약 \( 450 \mathrm{bp} \) 크기의 1 가지 단편을 얻었으며, \( 438 \mathrm{bp} \) 의 염기서열을 결정하여 tRNA를 분석한 결과, 특정 tRNA를 암호화하는 유전자는 확인할 수 없었다. 상동성을 분석한 결과, uncultured bacterium clone BITS_URP1_W28 (HQ543010)의 IGS와는 435 염기쌍 중에서 하나의 염기서열 차이를 나타내어 가장 높은 서열 상동성을 나타냈으며, Staphylococcus sp. 3 (AY728166) 및 Staphylococcus aureus (CP002110)의 IGS와는 각각 \( 92 \%, 90 \% \) 의 상동성을 나타내었다. 본 연구에서 분리, 동정한 BRS02는 기존에 보고된 Staphylococcus sp. 들과는 rRNA 오페론의 유전적 특징 측면에서 다른 신규의 미생물임을 확인할 수 있었다.</p>