Flow-cytometry 측정으로 Annexin V-FITC와 Pl의 결합 차이로써 생존하는 세포는 모두 음성 염색되었고 사멸된세포는 annexin V-FITC 양성, 세포사멸말기 세포나 괴사된 세포는 annexin V-FITC와 PI 양인것으로 구분되었다. SDS-PAGE 후 Mcl-1의 발현 정도를 측정하고자 Mcl-1에 대한 항체(Santa Cruz, USA)를 western blot법을 이용하였다.
<h2>Flow-cytometry 측정</h2><p>\( 5 \times 10^{5} \)의 호중구를 인산염 완충액으로 세척하고 \( 70 \% \) 에탄올에 부유하였다. \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤을 방치하고 다시 인산염 완충액으로 1회 세척한 다음 \( 0.5 \mathrm{~mM} \) EDTA가 들어있는 인산염 완충액에 시료를 부유하였다. RNase (\( 20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)와 propidium iodide (PI)(\( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \))를 첨가하여 실온에서 15분간 배양하였다. 측정할 때까지 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관한 다음 \( 10^{4} \)개의 세포를 이용하였다. Phosphatidylserine (PS)의 세포 외막으로의 노출되는 정도는 annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)의 결합을 이용하였다(TACS apoptosis detection kit, Trevigen, Netherland). 세포를 \( 1 \times 10^{6} \)으로 분리하여 인산염 완충액으로 2회 세척한 다음 annexin V-FITC와 PI를 첨가하고 15분 동안 반응시켰다. \( 1 \times 10^{4} \)의 세포를 flow-cytometry (Beckton Dickinson, USA)으로 측정하였다. Annexin V-FITC와 Pl의 결합 차이로써 다음과 같은 세포들을 구분하였다; 세포사멸된 세포: annexin V-FITC 양성, 세포사멸 말기 세포나 괴사된 세포: annexin V-FITC와 PI 양성, 생존하는 세포: 모두 음성 염색.</p><h2>Western blot</h2><p>배양한 세포(\( 2 \times 10^{7} \))를 인산염 완충액으로 세척한 다음 단백질 분해효소 억제제(\( 0.5 \mu \mathrm{M} \) leupeptin, \( 1 \mu \mathrm{M} \) aprotinin 및 \( 10 \mathrm{~mM} \) phenylmethylsulfonylfluoride)와 \( 50 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaF} \) 및 \( 2.5 \mathrm{~mM} \mathrm{~Na}_{3} \mathrm{VO}_{4} \)가 첨가된 세포용해 완충액(\( 1\% \) Triton X-100, \( 50 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaCl} \) 및 \( 20 \mathrm{~mM} \) Tris-HCl, \( \mathrm{pH} 7.4 \))을 이용하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 하에서 1시간 동안 방치하였다. 파괴된 세포를 함유하는 용액을 Eppendorf microcentrifuge를 이용하여 \( 16,000 \times \mathrm{g} \)로 10분간 원심 분리하여 핵 분획 및 파괴되지 않은 세포 등을 침전시키고 상층액을 얻어서 단백질양을 측정한 다음 전기영동에 이용하였다.</p><p>SDS-PAGE 후 western blot법을 사용하여 Mcl-1에 대한 항체(Santa Cruz, USA)를 이용하여 Mcl-1의 발현 정도를 측정하였다. 약물을 처리한 호중구는 \( 2.5 \% \) mercaptoethanol과 \( 1.2 \% \) sodium dodecyl sulfate를 넣고 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 가열하여 처리한 다음 \( 15 \% \) polyacrylamide 겔에 loading하여 전기영동을 시행하였다. 전기영동 후 겔의 단백질을 nitrocellulose membrane으로 전이시켰다. Nitrocellulose membrane을 \( 10 \mathrm{~mM} \) Tris-HCl, \( 0.15 \mathrm{~M} \mathrm{~NaCl} \), \( 0.1 \% \) sodium azide로 구성된 완충액에 \( 5\% \) skim milk을 포함하는 용액으로 2시간 처리하며 1차 항체는 \( 1:1000 \)으로 희석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 2차 항체를 실온에서 1시간 반응시키고 nitrocellulose membrane을 세척하였다. 다시 Triton X-100이 들어있지 않는 Tris 용액으로 세척하고 ECL chemiluminescence (Amersham)나 nitroblue tetrazolium과 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate 발색 방법으로 전개시켰다.</p><h2>통계 처리</h2><p>세포사멸의 결과는 평균\( \pm \)표준편차(mean\( \pm \)SD)로 나타내었다. 통계학적 유의성은 자료들의 분포를 확인하고 Student's t-test를 이용하여 검정하였고 \( p \) 값이 0.05이하이면 유의성이 있는 것으로 판정하였다.</p>