원심분리된 배양액을 키트를 이용하여 RNA를 추출하고 RT-PCR을 통해 인플루엔자 바이러스 아형을 확인하고, 염기서열을 위한 템플릿으로 사용하였다. 또한 아형이 확인 된 인플루엔자 바이러스를 층화무작위표본추출법으로 HA와 NA 유전자에 대한 염기서열 분석을 실시하여 아형을 확인하는 방법을 사용하였다.
<h2>바이러스 RNA 분리 및 RT-PCR을 이용한 아형 확인</h2> <p>원심분리된 배양액 \( 140 \mu \) 을 QIAamp viral RNA Mini Kit(QIAGEN; Germany)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 RT-PCR을 통한 아형 확인 및 염기서열 분석을 위한 template로 사용하였다. 인플루엔자바이러스를 확인하고 아형을 분석하기 위해 RNA \( 10 \mu \) l를 RT-PCR pre-mix kit for influenza virus detection (CosmoGentech, Korea)에 넣어 부피가 \( 50 \mu 1 \) 가 되도록 한 후 \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 1시간, \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 3분, \( \left (94 ^ {\circ } \mathrm { C } \right . \) 1분, \( 61 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 1분 , \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 1분)을 35회, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 5분 1회를 조건으로 PCR (PTC- \( 100 ^ {\mathrm { TM } } \), Inc. USA)을 실시한 후 증폭산물 확인을 위해 \( 1.5 \% \) agarose gel에 증폭산물을 \( 10 \mu \mathrm { l } \) 씩 loading하여 \( 100 \mathrm { ~V } \) 에 30분간 전기영동을 수행하였다. SYBR Safe \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) DNA gel stain (Invitrogen, USA)을 전기영동 buffer \( 100 \mathrm { ml } \) 당 \( 8 \mu \mathrm { l } \) 첨가하여 agarose gel을 5분에서 10분간 염색하고 증폭산물을 UV 하에서 관찰하여, A/H1, A/H3, B형을 확인하였다.</p> <h2>염기서열분석을 위한 HA와 NA 유전자에 대한 RT-PCR</h2> <p>아형이 확인된 인플루엔자바이러스를 층화무작위표본추출(stratified random sampling)법으로 H1 15건, H3 16건, B 29건 표본 추출하여 HA 유전자와 NA 유전자에 대한 염기서열 분석을 실시하였다. 분석을 위해 HA와 NA 대해 특이적으로 제작된 각각의 primer를 이용하였다(Table 1). RNA \( 10 \mu \mathrm { l } \), primer \( 2.5 \mu \mathrm { l } \) (10 pmol)를 RT-PCR one-step ReadyMix (COSMOGentech, korea)에 넣어 부피가 \( 50 \mu \) l가 되도록 한 후 각 gene에 적합한 조건으로 \( athrm { PCR } \) 을 실시하였다(Table 2). 아형확인에서 사용한 방법으로 증폭산물을 확인하였다.</p>