S. cerevisiae SEY2102/pYES-CGTS (GAL1 promoter에 의한 유도성 발현계)와 S. cerevisiae SEY2102/pVT-CGTS (ADH1 promoter에 의한 구성적 발현계)는 표면 발현계와 활성을 비교하기 위해 이전에 구축된 episomal 발현계로서 대조군으로 활용되었습니다. 효모에서의 표면발현을 위한 재조합 plasmid는 PCR를 통해 얻은 B. stearothermophilus의 cgtS 유전자와 pYD1를 EcoRI/XhoI 처리 후 Gel extraction kit를 사용하여 정제하였습니다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용 균주 및 Plasmids</h2> <p>본 연구에 사용한 재조합 CGTase 발현용 S. cerevisiae 균주는 모두 uracil 영양요구성 변이주이며 haploid로 S. cerevisiae EBY100(MATa ura3-52 trp1 leu2- \( \triangle1 \) his3 \( \triangle200 \) pep4::HIA3 prb1 \( \triangle1.6 \)R can1 GAL1)를 사용하였다. 또한 plasmid 구축 및 증폭을 위한 E. coli 숙주세포는 DH5a를 사용하였다. CGTase 유전자 공여 plasmid는 B. stearothermophilus 의 CGTase 유전자를 cloning한 pCGTS을 사용하였다. 효모 S. cerevi-siae에서 CGTase 표면발현 vector는 유도성 발현 vector로써 GAL1 promoter를 가진 PYD1 (Invitrogen Co., USA)를 사용하였다. 이 vector는 형질전환효소의 선택표지로 TRP1 (pho-sphoribosyl-anthranilate synthesis) 유전자를 가지며, \( 2 \mu \mathrm { m } \) replication origin을 이용하여 복제한다.</p> <p>이전에 구축된 episomal 발현계인 S. cerevisiae SEY2102/pYES-CGTS (GAL1 promoter에 의한 유도성 발현계)와 S. cerevisiae SEY2102/pVT-CGTS (ADH1 promoter에 의한 구성적 발현계)를 대조구로 하여 표면 발현계와 활성 비교 등에 사용하였다.</p> <h2>PCR primers의 제작</h2> <p>B. stearothermophilus의 CGTase 유전자 \( (2.1 \mathrm { ~kb } ) \) 의 경 우 효율적인 발현을 위해서 cgt 유전자 ORF 부위만 PCR로 증폭하였다. primers는 5'-AACTGAGAATTCATGAGAAGAT-GGCTTTCG-3' (sense primer)와 5'-GCCTCGAGGTCGACG-TTCTGCCAATCCACTAT-3' (anti-sense primer)로 제작하였다. Sense primer 부위에는 EcoRI 제한효소 인식부위를 가지며, anti-sense primer에는 XhoI 제한효소 인식부위를 가지고 있다. 주형 DNA로 B. stearothermophilus의 cgt 유전자를 함유한 pCGTS을 사용하여 Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 2400(USA)에서 \( 2.1 \mathrm { ~kb } \) 의 유전자 단편 (cgtS)만을 대량증폭하였다. 증폭된 cgtS 단편은 pYD1에 EcoRI/XhoI으로 연결하여 E. coli DH5a를 숙주세포로 \( \mathrm { CaCl } _ { 2 } \) 법으로 형질전환하여 cgtS 단편을 확보하였다.</p> <h2>재조합 plasmid 제작 및 형질전환</h2> <p>효모에서의 표면발현을 위한 재조합 plasmid의 구축은 PCR를 통해 확보된 B. stearothermophilus의 cgtS 유전자와 pYD1를 각각 EcoRI/XhoI으로 처리하여 Gel extraction kit (Biopro-gen Co.)로 정제하였다. 얻어진 cgtS단편을 GAL1 promoter와 AGA2 gene를 함유한 E. coli-S. cerevisiae shuttle vector인 pYD1 (각각 EcoRI/XhoI으로 미리 절단)에 재조합하여 재조합 plasmid pYDCGTS을 구축하였다. 구축된 재조합 plasmid는 E. coli DH5a로부터 중폭, 추출하여 LiCl 법으로 효모숙주세포 S. cerevisiae EBY100에 형질전환하였다.</p> <h2>효모 형질전환체 선별 및 배양조건</h2> <p>효모 형질전환체의 선별을 위한 배지로는 SD 배지 \(0.67 \% \) Bacto-yeast nitrogen base without amino acids, \(2 \% \) dextrose)에 leucine를 \( 30 \mathrm { mg } / \) l로 천가하여 사용하였고, CGTase활성 확인을 위해 \(1 \% \) 의 soluble starch를 첨가한 YPGS ( \(1 \% \) yeastextract, \(2 \% \) polypeptone, \(1 \% \) galactose, \(1 \% \) soluble starch) 고체배지 상에 도말, 배양 후 iodine 증기에 의한 전분 분해 환의 형성을 통해 CGTase 활성을 확인하였고, 이전에 episomal발현과 비교하기 위해 이전에 재조합된 S. cerevisiae SEY2102/pYES-CGTS (GAL1 promoter)와 S. cerevisiae SEY2102/pVT-CGTS (ADH1 promoter)를 S. cerevisiae EBY100/pYDCGTS와 함께 활성염색하였다. 또한, 형질전환체 세포와 \(2 \% \) soluble starch를 반응한 후 명확한 CD 결정을 보기 위해 요오드를 첨가하여 건조시키고 현미경으로 검경하여 CD 결정의 생성여부를 확인하였다.</p>