아토피피부발진 NC/Nga 생쥐의 비장에서 분리한 CD4+ T 세포를 α-CD3/α-CD28로 자극하고 배양한 후, 세포내 형광염색을 통해 IFN-γ+의 분석을 수행하였다. 양성대조군에서의 CD4+IFN-γ+ 비율은 6.8%였으나, 실험군에서는 15.4%로 증가하였다. 또한, 실험군의 CD4+CD25+foxp3+ 비율은 13.7±3.2%로 양성대조군 대비 1.65배 이상 증가하였다.
<p>NC/Nga 생쥐의 CD4+ T세포에서 CD4+IFN-γ+의 세포내 염색 분석: 1980년대 후반 Mosmann 등이 생쥐에서 면역반응을 일으키는 조력 T 세포(naiver T cell)에는 IL-2, IFN-γ 등을 분비하는 Th1 세포와 IL-4, IL-5를 분비하는 Th2 세포가 존재한다고 보고하였다. 이 후 많은 연구에서 Th1 반응과 Th2 반응은 서로 길항작용을 하면서 균형을 유지하고있고, 아토피 및 천식 같은 알레르기 질환의 면역학적병인과 관련하여 이러한 Th1/Th2 반응의 불균형이 핵심적인 요인임을 알아내었다. 알레르기 질환의 면역학적 발생기전과 관련하여 Th2 가설을 기반으로 하여 아토피 및 천식발생과 관련하여 대표적인 Th1 사이토카인인 IFN-γ의 역할에 대한 많은 연구가 진행되었다. 이들 연구결과를 바탕으로 많은 연구자들이 IFN-γ가 알레르기 반응을 억제한다는가설에 동의하고 있다. 그러나 최근 연구에서 기존의 Th2가설과는 정반대로 아토피 및 천식환자의 면역기관에서 오히려 IFN-γ가 감염에 의하여 증가되었다는 연구결과들이 발표되었다. 본 연구는 아토피피부발진 NC/Nga 생쥐의 비장에서CD4+ T 세포를 VarioMACS를 사용하여 순수 분리하여 미리 coating해 놓은 α-CD3/α-CD28(1 μg/mL)로 자극하여 활성화시킨 후 72시간 배양하여 IFN-γ+를 세포내 형광염색으로 분석하였다. 그 결과 Fig. 4에서 보듯 α-CD3/α-CD28(1μg/mL)로 자극하지 않은 only CD4+ T 세포군의 CD4+IFN-γ+는 2.9%이었고, anti-CD3/anti-CD28(1 μg/mL)로 자극한대조군의 CD4+IFN-γ+는 10.8%이었다. 양성대조군으로cyclosporin A(1 μg/mL)를 α-CD3/α-CD28(1 μg/mL)와 동시 배양한 CsA 처리군의 CD4+IFN-γ+는 6.8%이었고, 실험군인 PGA-LM(100 μg/mL)를 α-CD3/α-CD28(1 μg/mL)와동시 배양한 PGA-LM 처리군의 CD4+IFN-γ+는 15.4%로대조군에 비하여 1.5배 이상 증가하였다. 그리고 PGA-HM에서도 PGA-LM과 같은 결과를 보였다.Bellinghausen 등의 연구에서 insect venom이 T 세포의 IL-10과 IFN-γ의 증가를 촉진시켜 알레르기반응에 대한 Th2 세포에서 Th1 세포로 전환시키는 면역억제제 효능을 보고하였고, 이와 같이 본 연구에서도 PGA-LM이 알레르기반응을 억제하는 IFN-γ를 증가시켜 알레르기 반응에 우위한 Th2 세포에서 Th1 세포로 shift시킬 수 있을 것으로 생각된다.</p> <p>NC/Nga 생쥐의 CD4+ T 세포에서 CD4+CD25+foxp3+Treg의 세포내 염색 분석: 면역 체계는 자가항원을 인식하는면역세포는 선택적으로 제거하고, 면역 반응의 조건이 충족되지 않았을 때는 알레르기를 유도하여 숙주를 보호한다. 면역반응을 직접적으로 억제할 수 있는 세포가 있을 것이라는의견이 오래 전부터 제기되어 왔으나 이 세포의 존재는 오랫동안 논쟁거리가 되어왔고, 최근의 연구 결과에 의해서야비로소 조절 T 세포(regulatory T cells, Treg cells)의 존재가 드러났다. 조절 T 세포는 흉선(thymus)으로부터 직접유래한 자연(natural) Treg와 말초(periphery)에서 미성숙(naive) T cell이 항원의 자극을 받아 유도되는 유도(induci-ble) Treg이 존재한다고 알려져 있다. 이러한 Treg의 특징은세포 표면에 CD25(IL-2Rα)를 지속적으로 발현하고 있고foxp3+라는 전사인자를 특이적으로 발현한다. 따라서 CD25와 foxp3+를 marker로써 CD4+CD25+foxp3+ natural Treg을 식별할 수 있고 Treg가 직접적으로 다양한 면역 반응을억제하는 역할을 한다는 연구 결과들이 발표되었다. foxp3+ Treg은 흉선에서 만들어지고 이들은 naive T 세포의 활성화와 성장 및 다양한 면역 반응을 주관하는 Th1,Th2, Th17을 포함한 effector T 세포로의 분화를 억제한다. Periphery에서는 비록 그 기전은 명확하지 않지만 naiveT 세포가 foxp3+ Treg으로 분화하기도 한다. 최근의 연구결과에 따르면 Treg은 대식세포, Th17 세포 분화, 과잉 Th2세포의 GATA3, 그리고 B 세포와 같은 다양한 면역세포들에 대하여 Treg의 세포 표면에 발현하는 CTLA4, GITR,CD25 그리고 LAG3 등을 통하여 면역억제 신호를 전달하거나 면역 세포들 사이의 상호작용을 저해한다고 한다. 본 연구는 아토피피부발진 NC/Nga 생쥐의 비장에서CD4+ T 세포를 VarioMACS를 사용하여 순수 분리하여 미리 coating해 놓은 α-CD3/α-CD28(1 μg/mL)로 자극하여 활성화시킨 후 72시간 동안 PGA-LM과 동시 배양하여CD4+CD25+foxp3+ Treg 세포를 세포내 형광염색으로 분석하였다. 그 결과 Fig. 5에서 보듯이 α-CD3/α-CD28(1 μg/mL)로 자극하지 않은 only CD4+ T 세포군의 CD4+CD25+foxp3+는 0.8±0.25%이었고, α-CD3/α-CD28(1 μg/mL)로 자극한 대조군의 CD4+CD25+foxp3+는 5.2±0.28%이었다. 실험군인 PGA-LM(100 μg/mL)를 α-CD3/α-CD28(1 μg/mL)와 동시 배양한 PGA-LM 처리군의 CD4+CD25+foxp3+는13.7±3.2%로 대조군에 비하여 1.65배 이상의 유의성 있는증가를 나타내었다(p<0.01). 그리고 PGA-HM도 PGA-LM과같은 결과를 보였다.Bellanti 등의 연구에서는 인체의 방어 기전인 면역체계는 T 세포의 활성화를 중심으로 이루어진다고 보고하였다.Th1/Th2 세포들은 서로 상호 견제를 통하여 균형을 이루는데 어떤 이유에서 Th2 세포 쪽으로 기울게 되면 알레르기반응이 일어난다. 그래서 PGA-LM 처리군의 CD4+CD25+foxp3+ Treg 세포의 유도로 알레르기 반응에서 IL-4를 분비하는 Th2 세포의 GATA-3 전사인자를 억제하는 결과로 우위한 Th2 세포에서 Th1 세포로 shift시킬 수 있을 것으로 생각된다. 이러한 결과는 최근 Peter(2008)의 보고에서 활성화된 CD4+CD25+foxp3+ Treg 세포의 Th2 세포 억제기전에의 내용과 일치하는 연구결과이다. CD4+CD25+ T 림프구(Treg cells)는 다른 T 세포의 아형들처럼 흉선에서 발생되고 전사인자인 foxp3+을 발현하여다양한 T 림프구의 활동들을 제어하는 능력을 갖고 있다. 그러나 Treg 세포가 T 림프구의 활동을 억제하는 기작에 대해서는 몇 가지 모델이 제시되었지만 각 모델마다 논쟁의 여지가 있고 그 메커니즘이 명확하지 않다. ‘NatureImmunology` 최신호에는 Treg 세포가 IL-2를 선택적으로 사용하여 결과적으로 목표 T 림프구의 사멸을 유도하는 새로운 모델을 제시하고 있다. Brunkow 등의 연구에서는조절 T 세포(Treg cells)에서 발현되는 foxp3+ 전사인자는자가 면역 질환들을 조절하는데 필수적이라고 보고하였다.따라서 세포독성이 없는 PGA-HM(data not shown) 과PGA-LM은 IL-1β, IL-6, 그리고 TNF-α mRNA 유전자 발현을 억제하고 IL-10, mRNA 유전자 발현을 증가시켜 염증유전자 발현을 억제하였다. 그리고 CD4+ T 세포에서CD4+IFN-γ+ 및 CD4+CD25+foxp3+ Treg의 세포내 형광염색으로 분석한 결과 대조군에 비해 그 값이 유의적으로 증가하였다. PGA-HM과 PGA-LM에 의한 이러한 염증유전자발현억제와 CD4+IFN-γ+ 및 CD4+CD25+foxp3+ 증가로 아토피 억제 가능성이 있을 것으로 사료된다.</p>