MCF7 세포주는 American Type Culture Collection에서 획득하였고 \( 10 \% \)의 Fetal Bovine Serum을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium배지를 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \( 5 \% \) \( \mathrm{CO_2} \) incubator에서 배양, CAT 활성은 CAT-ELISA Kit를 이용하여 Manual에 따라 수행하였다. 파래, 새우, 불가사리, 스피루리나 건조시료 \( 100 \mathrm{g} \)을 에탄올로 추출, 농축한 후 동결건조하여 에탄올 추출물을 각각 \( 5.6 \mathrm{g}\), \(7.4 \mathrm{g}\), \(4.3 \mathrm{g}\), \(9.2 \mathrm{g} \)씩 얻었고 수율은 약 \( 4 \% \sim 9 \% \)로 스피루리나 추출물에서 가장 높은 수율을 나타냈다.
<h2>세포배양 및 Transient Expression Assay</h2> <p>MCF7 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, USA)에서 획득하였다. MCF7 세포주는 \( 10 \% \)의 Fetal Bovine Serum (FBS, Bio whittaker, USA)을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Bio whittaker, USA) 배지를 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \( 5 \% \) \( \mathrm{CO_2} \) incubator에서 배양하였다.</p> <p>MCF7 cell은 DMEM 배지에 subculture하여 48시간 후에 transfection하였다. 배양된 cell은 phosphate buffered saline로 2번 세척 후, FBS를 포함하지 않는 DMEM \( 2 \mathrm{ml} \)에 배양하였다. Transfection에 사용한 pCAT-ERE119-Ad2MLP 플라스미드는 Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Inc., USA)를 사용하여 분리하였다. FBS를 포함하지 않는 DMEM \( 250 \mu \mathrm{l}\)에 pCAT-ERE119-Ad2MLP DNA \( 5 \mu \mathrm{l}\)를 넣은 후 PLUS reagent (Life Technologies, USA)를 \( 5 \mu \mathrm{l}\) 첨가하여 조심스럽게 혼합한 뒤 실온에서 15분간 방치하여 Plus reagent와 DNA 혼합액 (용액 Ⅰ)을 만들었다. 그리고, Lipofectamine reagent (Life Technologies, USA) \( 5 \mu \mathrm{l}\)에 FBS를 포함하지 않는 DMEM \( 250 \mu \mathrm{l}\)를 넣어 혼합한 용액 (용액 Ⅱ)를 제조한 후, 용액 Ⅰ과 Ⅱ를 혼합하여 실온에서 방치하였다. 15분 후, 준비된 MCF7 cell에 첨가하여 3시간 배양한 뒤 \( 20 \% \)의 dextran-coated charcoal stripped FBS를 포함하는 DMEM \( 2.5 \mu \mathrm{l}\)를 첨가하였다.</p> <p>Transfection이 완료된 1시간 후, 시료들을 각각 \( 5 \mu \mathrm{l} \)씩 처리하였다. 각 시료의 추출물은 최종농도 \(500\),\(50\),\(5\)\( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\) 농도로 사용하였고, 표준물질로 이용된 \(17 \beta \)-estradiol(RBI, USA)은 최종농도 \( 10^{-7}\), \( 10^{-8}\), \( 10^{-9}\), \( 10^{-10} \mathrm{M} \) 로 사용하였다. 그 후, 48시간 동안 배양한 다음 세포를 회수하였고, \( -20 ^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 동안 4회 반복하여 cell을 lysis한 후, \( 1,4000\times \mathrm{g} \)에서 5분 동안 원심분리하여 상등액 \( 200 \mu \mathrm{l} \)를 취하여 chloramphenicol acetyltransferase (CAT) 활성을 측정하였다. CAT 활성은 CAT-ELISA Kit (Boehringer Mannheim, USA)를 이용하여 Manual에 따라 수행하였다. CAT 활성 결과는 BCA Protein Assay Reagent kit (Pierce, Rockford, IL)를 이용해 측정한 각 추출물의 단백질함량으로 표준화시켰다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>에스트로겐 유사물질의 수율</h2> <p>파래, 새우, 불가사리, 스피루리나 건조시료를 \( 100 \mathrm{g} \)을 에탄올로 추출하고, 농축한 후 동결건조하여 에탄올 추출물을 각각 \( 5.6 \mathrm{g}\), \(7.4 \mathrm{g}\), \(4.3 \mathrm{g}\), \(9.2 \mathrm{g} \)씩 얻었다. 이들의 수율은 약 \( 4 \% \sim 9 \% \)로 불가사리 추출물에서 가장 낮은 수율을 나타냈고 스피루리나 추출물에서 가장 높은 수율을 나타냈다. 이러한 결과는 사용한 시료의 물리적인 형태에 관계가 있는 것으로 판단되며 미세조류인 스피루리나의 경우는 입자가 적어서 효과적인 추출이 이루어진 것으로 사료된다.</p>