본 연구는 대조군 100명, 제2형 당뇨병 환자군 100명을 대상으로 한다. 설문지를 통해 현재의 병력, 과거력 등을 조사하였다. 혈액 검사는 최소한 10시간 이상의 공복 상태에서 채혈한 후 당화혈색소, 공복 혈장 포도당, 중성지방, 콜레스테롤을 측정하였다. 체혈된 혈액의 일부는 EDTA 처리된 시험관에 보관하였다가 실험실로 운반하여 DNA를 검사하였다. 유전자 분석을 위하여 Applied Biosystems 7300 Real Time PCR을 사용한다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>대상</h2> <p>본 연구는 대조군 100명, 제2형 당뇨병 환자군 100명을 대상으로 하였고, 성비는 전체적으로 남자 99명, 여자 101명이였다. 평균 연령은 제2형 당뇨병 환자군 62.8세, 대조군 63.2세였다. 대조군은 60 세 이상, 공복혈당 \( 110 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \) 이하, 당화혈색소 \( 5.8 \% \) 이하인 100명으로 고혈압, 심근경색, 협심증, 고지혈증, 뇌졸중, 갑상선, 결핵, 간질환, 천식, 관절염, 우울증, 파킨슨병, 골다공증, 전립선 비대증, 암 등의 질병이 없는 사람으로 정하였으며, 남자 36명, 여자 64명이였다. 제2형 당뇨병 환자군은 2006년 4월부터 2006년 8월까지 경북대학교 병원과 계명대학교 동산의료원 내분비내과를 내원하였던 환자 100명으로 제2형 당뇨병의 과거 병력이 있거나 내원 후 제2형 당뇨병 진단을 받은 환자를 대상 환자군으로 정하였으며 남자 63명, 여자 37명이였다. 대상자에게 시행된 모든 검사들은 임상시험 심사위원회(Institutional Review Board, IRB)의 기준에 맞게 환자들의 자발적인 서면 동의 하에 이루어졌다.</p> <h2>설문조사 및 신체계측</h2> <p>현재의 병력, 과거력, 흡연력, 음주력, 사회 인구학적 특성 등은 설문지를 이용하여 자기 기입식 방법으로 작성되었다. 조사에 사용된 설문지는 한국인 만성병 역학조사 및 유전체 연구사업의 설문지를 참고하였다. 대상자는 검사 전날 밤부터 최소한 10 시간 이상 금식한 공복 상태에서 가벼운 의복을 착용하게 하였고, 자동신장체중계를 이용하여 신장과 체중을 동시에 측정하였다. 체질량지수(body mass index, \(\mathrm{BMI} = \mathrm{kg} / \mathrm{m}^{2} \) )는 측정한 기본 신체 계측기로부터 산출하였다.</p> <h2>임상검사</h2> <p>혈액 검사는 전날 밤부터 최소한 10시간 이상 금식한 공복상태에서 채혈한 후, 당화혈색소, 공복 혈장 포도당, 중성지방, 총 콜레스테롤, 고밀도 콜레스테롤, 저밀도 콜레스테롤을 측정하였다. 당화혈색소, 총 콜레스테롤, 고밀도 콜레스테롤, 저밀도 콜레스테롤, 중성지방은 Histachi Modular D2400 기계(Roche, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였고, 공복혈당은 Modular Analytics SWA (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 이용하여 측정하였다.</p> <h2>채혈 및 DNA 분리</h2> <p>채혈된 혈액의 일부는 EDTA 처리된 시험관에 넣어 냉장보관하였다가 실험실로 운반하여 DNA를 분리하였다. DNA 분리는 "Genomic DNA isolation kit (Gentra, Maryland, USA)"를 이용하였다. \( 6 \mathrm{ml} \) 의 RBC lysis solution을 혈액 \( 2 \mathrm{ml} \)에 넣은 후 5분간 흔들어 섞어주었고, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 3,500 \mathrm{rpm} \)의 속도로 5분간 원심분리한 후, 상등액과 분리하였다. Vortex mixer로 잘 풀어준 후 Cell lysis solution \( 2 \mathrm{ml} \)를 넣고 다시 vortex mixer로 10초간 잘 섞어준 후 10분 이상 실온에서 방치하였다. Protein precipitation 용액 \( 0.7 \mathrm{ml} \)를 넣고 충분히 vortex한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 3,500 \mathrm{rpm} \)으로 10분간 원심분리하여 단백질을 포함한 모든 불순물을 가라앉혔다. 상등액을 조심스럽게 \( 100 \% \) isopropyl alcohol \( 2 \mathrm{ml} \)에 옮겨 DNA가 보일 때까지 섞었다. \(2,500 \mathrm{rpm}\)으로 5분 동안 원심분리한 후 상등액은 버리고, \( 70 \% \) ethanol로 탈수시켰다. DNA 수용액 \( 150 \mu \mathrm{1} \)를 넣어 \( 2 \sim 3 \)시간 정도 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 방치한 후 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관한 후 사용하였다.</p> <h2>유전자 분석 및 유전자 다형성 검사</h2> <p>유전자 분석을 위해서 Applied Biosystems 7300 Real Time PCR (Applied Biosystems, California, USA)을 사용하였다. PCR 반응 조건은 T45G의 경우에는 predenaturation 반응을 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분, denaturation 반응을 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, annnealing 반응을 \( 59^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 초, extension 반응을 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초로 설정하여 35 cycle 반복해 DNA를 증폭시킨 후 마지막으로 extension 반응을 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 유지하였다. G276T의 경우에는 annealing 반응을 \( 57^{\circ} \mathrm{C} \)에서 실시한 것을 제외하고 나머지 반응은 모두 같았다.</p> <h2>통계학적 분석</h2> <p>제2형 당노병 환자군과 대조군 사이의 대립형질(allele)의 빈도와 유전자형(genotype) 빈도의 차이에 대한 통계분석은 SPSS version 15.0 프로그램을 사용하였다. 변수는 평균\(\pm\)표준 편차로 나타내었고 각각의 단일 염기 다형성이 Hardy-Weinberg 평형을 따르는지 알아보았다. 로지스틱 회귀분석을 이용하여 Odds Ratio (OR)과 신뢰구간(\(95\%\) Confidence Interval: CI)을 구하였고, 연령, 성별, 허리둘레 등의 교란변수들을 보정하였다. 통계적 유의수준은 \( \mathrm{p}<0.005 \)로 하였다.</p>