선별된 분리주로부터 16S rRNA 염기서열을 확인한다. 용균작용을 수행하는 것으로 알려진 진균 외벽 가수분해효소를 이용해 식물병원성 곰팡이 생장을 저해하는 방법이 널리 사용된다. 본 실험에서 분리 균주를 대상으로 amylase, cellulase, protease 및 xylanase 생성능을 조사하였다. 최종 선별된 균주들은 식물 생장촉진 활성제, 식물병원성 곰팡이 방제제 등의 새로운 생물학적 제제로서 이용될 것이 기대된다.
<h2>선별된 다기능 분리주의 16S rRNA 동정</h2> <p>선별된 분리주로부터 16S rRNA 염기서열을 확인하고자 하였으며, NCBI의 BLASTN을 이용하여 염기서열을 분석한 결과를 Table 4에 나타내었다. 최종적으로 식물 생장촉진 활성, 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능 등 분리주의 비교우위에 따라 최종 Pseudomonas plecoglossicida ANG14, Pseudarthrobacter equi ANG28, Beijerinckia fluminensis ANG34, Acinetobacter calcoaceticus ANG35를 최종 선별하였으며, 분리주들의 계통학적 유연관계를 조사하기 위하여 16S rRNA 염기서열을 분석하여 계통도를 나타내었다(Fig. 3). 또한 분리주들에 대해서 형태학적 특성을 분석하기 위해서 SEM을 이용하여 균주의 형태를 관찰하였으며, 단간균형태를 나타내는 ANG35를 제외한 ANG14, ANG28, ANG34에서는 간균의 형태를 관찰할 수 있었다(Fig. 4).</p> <h2>분리 균주의 가수분해효소 생산</h2> <p>진균 외벽 가수분해효소는 식물병원성 곰팡이의 세포벽을 분해시키는 용균작용(degradative parasitism)을 수행한다고 보고되고 있으며, 여러 종류의 세포외 효소들에 의한 식물병원성 곰팡이 생장을 저해하는 방법이 널리 사용되고 있다. 따라서, 본 시험에서는 분리 균주를 대상으로 amylase, cellulase, protease 및 xylanase 생성능을 조사하였으며, 그 결과를 Table 5에 나타내었다. ANG34에서 amylase와 protease, xylanase 활성을 확인할 수 있었다. 그 중에서도 xylanase의 경우에는 72.06 U/ml로 비교적 높은 활성을 가졌다. 그러나 ANG14, ANG28 및 ANG35에서는 세포외 효소활성을 확인할 수 없었다. 또한 선정된 균주들의 혼합배양을 통해 세포외 효소활성 시너지 효과를 확인하고자 하였다. ANG14와 ANG34를 혼합배양 했을 때 amylase 활성이 약 5.1배, xylanase 활성이 약 2.3배 증가하는 것을 확인하였으며, ANG14, ANG28 및 ANG34를 혼합배양 했을 때는 amylase 활성이 약 6.1배, xylanase 활성이 약 3.7배 증가하였다(Fig. 5). ANG14, ANG34 및 ANG35를 혼합 배양 했을때는 amylase 활성이 약 7.5배, xylanase 활성이 약 3.9배 증가하였다. 또한 최종 선별된 4균주를 모두 혼합배양 했을때 amylase 활성이 약 7.8배, xylanase 활성이 약 4.4배로 시너지 효과를 확인할 수 있었다. 분리 균주의 생리학적 특성을 분석하기 위하여 API ZYM kit를 사용하여 효소 활성을 측정하였다(Table 6). 그 결과, 공통적으로 esterase (C4), esterase lipase (C8), leucine arylamidase, acid phosphatase, naphtol-AS-BI-phosphohydrolase 활성이 모든 균주에서 보였으며, ANG14에서는 alkaline phosphatase, valine arylamidase에서도 활성을 보였다. ANG28에서는 trypsin, \( \beta \)-galactosidase, \( \beta \)-glucuronidase, \( \alpha \)-glucosidase, \( \beta \)-glucosidase 및 \( \alpha \)-mannosidase 등 다양한 효소활성을 나타내었다. ANG34에서는 trypsin, \( \alpha \)-glucosidase 및 N-acetyl- \( \beta \)-glucosaminase에서 활성을 나타내었으며, ANG35에서는 valine arylamidase, \( \alpha \)-glucosidase 및 \( \beta \)-glucosidase에서 활성을 나타내었다. Phosphatases의 활성을 나타내는 경우 그람 양성균의 세포벽의 일부 구성 성분인 teichoic acid의 형성을 저해하며, esterase와 lipase 효소의 경우에는 그람 양성, 음성균의 중요 성분인 지질에 영향을 준다. 또한 leucine arylamidase와 valine arylamidase은 단백질 합성에 영향을 미치며, 그 외 효소인 fucosidase, galactosidase, glucosidase, glucuronidase및 mannosidase 등은 carbohydrate의 형성을 저해시키고 에너지 섭취에 부정적인 영향을 미친다. 따라서, 4가지 균주 모두 식물병원성 곰팡이에 대한 진균 외벽 가수분해 효소를 지닌 균주로 방제효과에 영향을 나타낼 것으로 기대된다. 본 연구에서 부산, 창원, 제주도 일대에서 채취한 토양으로부터 분리한 균주를 이용하여 식물의 생장을 촉진시키거나 방제 역할을 하는 균주를 선별하고자 하였다. 연구 결과, 균주 대부분 ACC deaminase 생성능, IAA 생성능, 질소 고정능, 인산 가용화능 및 siderophore 생성능을 나타내었다. 이는 직접적으로는 인산의 가용화, 질소 고정화를 통해 필요한 영양분 흡수를 촉진하여 식물 생장에 도움을 줄 것으로 기대된다. 또한 IAA 생성능 및 ACC deaminase 활성을 통해서 환경 스트레스로부터 식물을 보호하여 식물 생장에 도움을 줄 수 있을 것으로 판단되며, 선별한 균주 대부분 온도, 염, pH와 같은 다양한 환경 조건하에서 생존하는 것을 확인할 수 있었다. Siderophore의 경우에는 직접적으로는 불용성 \( \mathrm{Fe}(\mathrm{OH})_{3} \) 의 화합물을 \( \mathrm{Fe}^{3+} \) 의 이온 형태로 변화시켜 식물 생장에 도움을 주며, 간접적으로 근권 주위의 \( \mathrm{Fe}^{3+} \)의 흡수의 경쟁에서 우위를 선점함으로써 식물병원성 곰팡이에 대하여 방제효과를 나타낼 것으로 기대된다. 그 외에도 세포외 효소활성 및 항진균 활성을 통하여 식물 생장촉진 활성외에 식물병원성 곰팡이 방제제로서의 이용 가능성을 제시한다. 따라서, 식물 생장촉진 활성 및 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능에 따른 비교우위를 통해 최종 선별된 Pseudomonas plecoglossicida ANG14, Pseudarthrobacter equi ANG28, Beijerinckia fluminensis ANG34, Acinetobacter calcoaceticus ANG35를 이용하여 새로운 생물학적 제제로서 이용 가능성을 제시하며, 앞으로 선별된 유용미생물의 제형 연구 및 최적화, 보존 기간 연구, 작물 재배시험을 통해서 새로운 생물학적 제제로서 효과를 입증할 수 있는 연구가 필요할 것으로 사료된다.</p>