PureLink RNA Kit (Thermo Fisher)을 사용하여 회수한 재조합 대장균로부터 RNA를 추출한 후, cDNA TOPscript RT DryMIX (Enzynomics)를 이용하여 cDNA를 생성했다. 각 유전자의 발현은 Exicycler3 Analysis 프로그램 (버전 3.53, Bioneer, 대전, 한국)을 이용하여 분석했다. 단백질 발현은 polyacrylamide gel (\(12\%\)) 전기영동을 통해 확인했다. 재조합 대장균 배양액을 \( 10,000 \times \mathrm { g } \)로 5분간 원심분리하여 상등액을 회수한 후, \( (0.2 \mu \mathrm { m } \) 여과지 (Sartorius Stedim Biotech, Concord, CA, USA)로 여과하여 세피아프테린의 농도를 측정했다.
<h2>RNA 추출 및 유전자, 단백질 발현 확인</h2> <p>회수한 재조합 대장균으로부터 PureLink RNA Kit(Thermo Fisher)에서 제공된 방법으로 RNA를 추출한 후, cDNA TOPscript RT DryMIX(Enzynomics)를 사용하여 cDNA를 제작하였다. Real-time PCR 반응액은 \( 0.5 \mu \mathrm { g } \)의 cDNA, \(100 \mathrm { pmole } \)의 프라이머(Table 1), \( 25 \mu \mathrm { l } \)의 TOPreal qPCR 2X PreMIX(SYBR Green, Enzynomics)를 혼합한 후 멸균 증류수를 이용하여 최종 부피를 \( 50 \mu \mathrm { l } \)로 조정하였다. \( {\mathrm { Exicycler } } ^ {\mathrm { TM } } \) 96(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10초, \( 58 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20초간 진행되는 반응을 35회 반복하였다. 각 유전자의 발현은 Exicycler3 Analysis(ver. 3.53, Bioneer, Daejeon, Korea) 프로그램을 사용하여 분석하였다.</p> <p>단백질 발현은 polyacrylamide gel( \(12 \% \)) 전기영동을 통하여 확인하였다. 단백질 농도는 Bradford(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 용액을 사용하여 측정하였으며 BSA(Sigma-Aldrich)를 이용하여 검량선을 작성하였다.</p> <h2>세피아프테린 및 GTP 농도 측정</h2> <p>재조합 대장균 배양액을 \( 10,000 \times \mathrm { g } \)로 5분간 원심분리하여 상등액을 회수하고 여과지 \( (0.2 \mu \mathrm { m } \), Sartorius Stedim Biotech, Concord, CA, USA)로 여과한 후 세피아프테린의 농도를 측정하였다. 재조합 대장균 세포내의 GTP 농도 측정을 위하여 회수한 대장균 세포에 \( 0.4 \mathrm { ~N } \)의 perchloric acid(Duksan, Ansan, Korea), \( 0.1 \mathrm { ~N } \)의 \( \mathrm { NaOH } \)(Duksan), \( 0.4 \mathrm { ~N } \)의 \( \mathrm { KOH } \)(Duksan)를 첨가하여 용출된 상등액을 사용하였다. 세피아프테린과 GTP는 HPLC(LC-20A, Shimadzu, Kyoto, Japan)에 Inertsil ODS-3 컬럼(Phenomenex, Torrance, CA, USA)을 장착하여 분석하였다. 세피아프테린 정량을 위하여 이동상으로 \( 12 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \)의 메탄올을 \( 1.2 \mathrm { ml } / \mathrm { min } \)의 유속으로 사용하였고 \( 420 \mathrm { ~nm } \)의 UV 검출기(SPD-20A, Shimadzu)를 사용하였다. GTP 농도는 \( 0.2 \mathrm { ~N } \)의 sodium phosphate \( ( \mathrm { pH } ~6.5 \)를 \( 1.0 \mathrm { ml } / \mathrm { min } \)의 유속으로 사용하면서 \( 254 \mathrm { ~nm } \)의 UV 검출기(Shimadzu)를 이용하여 측정하였다.</p>