형질전환에 앞서 아그로박테리움을 이용한 형질전환에 가장 적합한 품종을 찾기위해 콩의 자엽마디를 이용한 아그로박테리움 형질전환에 대한 재분화 효율을 조사하고 자엽 마디와 아그로박테리움을 5일간 공배양 후 GUS발색 반응을 수행하였으며 선발된 식물체에서 유전자의 삽입여부를 확인하기 위하여 제초제 저항성 유전자 bar에 대한 PCR 분석을 실시하였다. 식물체 재분화율과 GUS발색 반응을 종합적으로 검토한 결과 '단백콩', '은하콩', 'Jack', 'Peking'이 재분화율이 높고 형질전환에 적합한 품종으로 여겨지며 품종에 따른 최적의 형질전환 조건이 다를 수 있다는 것과 효율적인 콩의 형질전환을 위해서는 재분화율이 높은 품종을 이용함으로서 안정적인 형질전환 체계를 갖출 수 있다고 생각된다.
<h2>GUS 발현 조사</h2> <p>자엽 마디와 아그로박테리움을 5 일간 공배양 후 Jefferson 등 (1987)의 방법을 이용하여 GUS발색 반응을 수행하였다. 아그로박테리움과 공배양한 자엽마디를 \( 1 \mathrm { mM } \) 5-bromo-4-chloro-3-indole-glucuronidase (X-gluc) 용액에 침지하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 16 시간 이상 반응시킨 후, \( 70 \% \) 알코올로 탈색시켜 GUS의 발색 여부와 정도를 관찰하였다.</p> <h2>PCR 및 Southern 분석</h2> <p>선발된 식물체에서 유전자의 삽입여부를 확인하기 위하여 제초제 저항성 유전자 bar에 대한 PCR 분석을 실시하였다. bar의 5'과 3'을 인지하는 한 쌍의 primer를 제작하여 (bar-F : 5'-GCT GAA GTC CAG CTG CCA GAA ACC C-3, bar-R : 5'-AAC CAC TAC ATC GAG ACA AGC ACG GTC A-3') \( 400 \mathrm { bp } \) 크기의 밴드가 증폭되도록 하였다. \( 35 \mathrm { ~S } \) 프로모터는 35S-F: 5'-GAG GAC CTA ACA GAA CTC GCC GTA AAC-3', 35S-R: 5'-GTC CCC CGT GTT CTC TCC AAATG-3'로 하여 \( 515 \mathrm { bp } \) 가 증폭되도록 하였다. GUS 프로모터는 GUS-F: 5'-GTG CAC GAC CAC GCA TTA ATG GAC T-3', GUS-R: 5'-AAA TCG CCG CTT TGG ACA TAC CAT C-3'로 하여 \( 500 \mathrm { bp } \)가 증폭되도록 하였다. PCR조건은 premix (Accupower \( { } ^ { ( \mathrm { R } } \), Bioneer) 제조사의 프로토콜을 이용하였다. 전체 PCR반응양은 \( 20 \mu l \)로 하였으며 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 회 5 분간 pre-denaturation후 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초간 denaturation, \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초간 annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30 초간 elongation하여 30회 반응시켰으며 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 최종 10분간 post-elongation시켰다. 증폭된 DNA는 \( 0.8 \% \)</p> <p>agarose gel로 전기영동 후 band를 확인하였다. 온실에서 생육중인 콩의 어린잎을 이용하여 genomic DNA를 분리하였으며 분리한 DNA \( (20 \mathrm { ug } ) \) 를 EcoRI 제한효소로 절단하여 \( 0.8 \% \) agarose gel에 전기영동 하였다. Agarose gel상의 DNA를 Zeta-Probe \( { } ^ { R } \) Blotting Membranes (BIO-RAD)에 전이시켜 \( \left [a ^ { 32 } \mathrm { P } \right ] \) dCTP로 표지된 bar probe를 이용하여 Southern blot을 실시하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>배양 절편체의 재분화 검정</h2> <p>Meurer 등은 콩의 형질전환에 영향을 미치는 여러 요인들 중에서 형질전환에 적합한 품종을 선발하여 이용하는 것이 중요하다고 보고하였으며, 현재까지의 보고에 의하면 'Jack' , 'Bert', 'Williams 82' 등의 품종을 이용하여 형질전환에 성공한 예가 있었다. 따라서 본 실험에서도 형질전환에 앞서 아그로박테리움을 이용한 형질전환에 가장 적합한 품종을 찾고자 국내외의 28개 재배품종들을 수집하였으며, 이들 품종에 대하여 콩의 자엽마디를 이용한 아그로박테리움 형질전환에 대한 재분화 효율을 조사하였다. 한 품종당 100 개 이상의 종자를 사용하여 재분화율을 조사하였으며, 재배품종에 따라 식물체 재분화율은 \( 10 ~ 50 \% \) 로 다양한 차이를 나타내었는데 'Peking' 품종의 경 우에는 식물체 재 분화율이 \( 60 \% \) 에 이를 정도로 식물체 재분화가 잘 이루어졌다. 또한 GUS발색 반응을 통해 gus 유전자의 도입여부를 확인한 결과, 식물체 재분화율이 높은 품종에서 gus 유전자의 발현도 높게 나타났지만 종실크기에 따른 재분화율 및 GUS 발현의 차이는 나타나지 않았다. 이는 품종에 따른 최적의 형질전환 조건이 다를 수 있음을 시사하며, 효율적인 콩의 형질전환을 위해서는 재분화율이 높은 품종을 이용함으로서 안정적인 형질전환 체계를 갖출 수 있을 것으로 생각된다. 또한, Rie와 Ko가 벼에서 외부유전자의 발현과 관련하여 gus 유전자가 선발먀커로 효과적임을 보고한 것과 같이 콩의 형질전환에 있어서도 GUS발색 반응이 형질전환 조건을 찾기 위한 마커로 효과적으로 이용될 수 있을 것로 생각된다. 식물체 재분화율과 GUS발색 반응을 종합적으로 검토한 결과 국내품종으로는 '단백콩'과 '은하콩'이, 외국품종으로는 'Jack'과 'Peking'이 재분화율도 높고, gus 유전자의 발현율도 강하게 발현되므로 형질전환에 적합한 품종으로 여겨지며 따라서 이 품종들을 이용하여 제초제 저항성 유전자를 도입하기로 하였다.</p>