항균활성 측정을 위해 그람양성 세균 3종, 그람음성 세균 3종 및 인체병원성 진균 6종을 테스트 균주로서 사용하였다. 항균 물질의 최적 생산 조건을 조사하기 위한 기본배지로 nutrient broth (NB), Luria-Bertani (LB) broth, tryptic soy broth (TSB) 등을 사용하였으며, 각종 \( \mathrm{pH} \) 및 온도조건 등을 달리하여 8 일 동안 배양하면서, 24 시간 간격으로 배양액을 회수하여, 전처리 후 항균활성을 조사하였다. BCNU 2003 균주의 주요 항균활성 물질을 동정하기 위해 부분정제하여 EA 추출물과 펩타이드 추출물을 얻었으며, 각 추출물에 대하여 액체배지감수성실험 (broth microdilution susceptibility test) 방법을 통하여 최소저해농도를 측정하였다. 테스트 균주를 최적배양조건에서 배양할 때 이에 대한 연속희석된 EA 추출물과 펩타이드 추출물의 저해능을 조사하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>분리 균주의 동정</h2> <p>선발된 BCNU 2003 균주는 태백산 일대에서 토양을 채취하여 그람양성 세균, 그람음성 세균, 인체병원성 효모와 곰팡이 각 1종에 대한 스크리닝을 통해 항균스펙트럼이 넓고 활성이 뛰어난 균주를 최종적으로 분리하여 사용하였다. 생리학적 및 생화학적 특성은 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 를 참고하여 조사하였고, 16S rRNA 염기서열 분석을 실시하여 균주를 동정하였다. 16S rRNA의 PCR sequencing을 위하여 16F (5'-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R (5'-ACG GCTACCTTGTTACGACTT-3') primer를 사용하여 염기서열을 분석하였다. Blast search를 통해 16S rRNA를 비교 분석하였으며 계통수는 neighbor joining 법과 bootstrap 분석을 기반으로 확인하였다.</p> <h2>테스트 균주</h2> <p>항균활성 측정을 위해 그람양성 세균 3종, 그람음성 세균 3종 및 인체병원성 진균 6종을 테스트 균주로서 사용하였다. 즉, Bacillus subtilis KACC 10111 (ATCC 465), Micrococcus lu-teus KACC 10488 (ATCC 4698), Staphylococcus aureus IMSNU 11088 (ATCC 6538)와 Escherichia coli IMSNU 10080 (ATCC 10798), Pseudomonas aeruginosa IMSNU 10191 (ATCC 10145), Pseudomonas fluorescens KACC 10071 (ATCC 13525), Aspergillus niger KACC 40280 (ATCC 4695), Candida albicans KACC 30062 (ATCC 10231), Epidermophyton floccosum KCTC 6921, Saccharomyces cerevisiae KCTC 7968, Trichophyton menta-grophytes KCTC 6077 (IFO 6202) 및 Trichophyton rubrum KCTC 6375를 사용하였다. 이들 균주들은 한국농업미생물자원센터, 한국생물자원센터, 서울대학교 미생물연구소로부터 분양받았다.</p> <h2>항균스펙트럼 조사</h2> <p>BCNU 2003 균주의 배양액을 이용하여 12종의 테스트 균주에 대해 평판배지확산법(agar diffusion method) 및 대치배양법으로 항균스펙트럼을 조사하였으며, \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3-10일간 배양 한 후 저해 정도를 측정하였다. 사상균에 대한 저해능 측정은 Whipps의 방법에 준하여 측정하였으며, 저해능은 증식 저해율(growth inhibition: GI)로 나타내었다.</p> <p>\[ \text {GI}=(\text {R1-R2)} / \text {R } \times 100 \] GI: growth inhibition \( \% \), R1: 배양 후 균 사이의 거리, R2: 배양 전 접종 거리</p> <h2>항균활성 물질의 생산 조건 및 부분정제</h2> <p>항균 물질의 최적 생산 조건을 조사하기 위한 기본배지로 nutrient broth (NB), Luria-Bertani (LB) broth, tryptic soy broth (TSB) 등을 사용하였으며, 각종 \( \mathrm{pH} \) 및 온도조건 등을 달리하여 8 일 동안 배양하면서, 24 시간 간격으로 배양액을 회수하여, 전처리 후 항균활성을 조사하였다. 따라서 최적배양 조건으로 각각 11 를 진탕배양하였고, 배양 상등액을 회수 \( \left(7,500 \times g, 10\right. \) 분, \( \left.4^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 하여 ethyl acetate (EA) 추출과 6 NHCl 침전을 통해 EA 추출물과 펩타이드 추출물을 얻어, 테스트 시료로 사용하였다.</p> <h2>최소저해농도(Minimum inhibitory concentration; MIC 측정</h2> <p>BCNU 2003 균주의 주요 항균활성 물질을 동정하기 위해 부분정제하여 EA 추출물과 펩타이드 추출물을 얻었으며, 각 추출물에 대하여 액체배지감수성실험 (broth microdilution susceptibility test) 방법을 통하여 최소저해농도를 측정하였다. 즉, 테스트 균주를 최적배양조건에서 배양할 때 이에 대한 연속희석된 EA 추출물과 펩타이드 추출물의 저해능을 조사하였다.</p>