RT-PCR을 위해 배지에 숙주세포 HCT-8를 MEM 배지에 배양하고 monolayer가 형성되면 크립토스포리디움 난포낭을 감염시켰다. 또한 IFA실험을 위해 HCT-8 세포를 RPMI 1640 배지에 배양하고, 숙주세포가 monolayer를 형성하면 세포를 Chamber slide system의 웰에 세포를 균일하게 주입한 뒤 크립토스포리디움 난포낭에 감염시켰다.
<h2>RT-PCR을 위한 숙주세포배양 및 크립토스포리디움 난포낭 감염</h2> <p>숙주세포로는 건국대학교에서 계대배양중인 HCT-8 세포를 사용하였으며, RT-PCR실험을 위해 MEM배지에 \( 24 \mathrm { mM } \) Sodium bicarbonate, \( 20 \mathrm { mM } \) HEPES, \( 2 \mathrm { mM } \) L-glutamine, \( 100 \mathrm { U } / \mathrm { mL } \) penicillin \( \mathrm { G } , 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) streptomycin, \( 10 \% \) Fetal bovine serum (FBS)를 첨가한 배지에 HCT-8 세포를 배양하였고, 숙주세포가 monolayer를 형성하면 크립토스포리디움 난포낭을 감염시켰다. 난포낭은 멸규 증류수로 3회 세척 후 \( 10 \% \) sodium hypochlorite solution에 얼음위에서 10 분간 정치 후 차가운 PBS로 3회 세척하였으며, Trypsin in acidified HBSS (0.01 M HCl in HBSS-1 \% trypsin)를 넣어 3 \( 7 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1시간 정치 후, \( 2 \% \) FBS를 넣은 DMEM 배지로 세척하고 \( \mathrm { HCT } -8 \) 세포에 감염시켰다.</p> <h2>IFA를 위한 숙주세포배양 및 크립토스포리디움 난포낭 감염</h2> <p>IFA실험을 위한 HCT-8 세포는 RPMI 1640 배지에 \( 10 \% \) FBS 및 \( 1 \mathrm { mM } \) Sodium pyruvate 및 penicillin/streptomycin 을 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 및 일정한 습도를 유지하면서 2~3일간 배양하였다. monolayer가 형성되면 Trypsin-EDTA 용액으로 세포를 세포배양 플라스크 바닥으로부터 때어낸 뒤 원심분리하여 8개의 well을 가진 Chamber slide system (Lab-Tek chamber slide system 177445)에 적당한 농도가 되도록 각 웰에 세포를 균일하게 주입한 후 배양하였다. 여기에 적당히 희석한 크립토스포리디움 난포낭에 sodium hy-pochiorite solution을 첨가하고 실온에서 20 분간 방치한 후 원심분리하여 상등액을 제거하였으며, 여과멸균한 \( 0.5 \% \) Trypsin ( \( \mathrm { pH } \) 2.5)를 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30분간 배양한 후 상등액을 제거하고 RPMI 1640배지에 \( 2 \% \)의 여과멸균된 FBS를 첨가한 세포유지배지를 첨가하여 Chamber slide system의 상등액을 제거 후, 각 웰에 감염시켰다.</p>