본 연구에서는 (주)부농, Sigma-Aldrich Co., Welgene Inc., Cell Signaling Technology 등의 기업에서 구입한 재료를 사용하여 흰목이버섯 발효를 위해 Lactobacillus rhamnosus BHN 76을 MRS broth 배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 동안 배양하였고, 흰목이버섯 \( 100 \mathrm{~g} \)을 분말로 파쇄한 후 유산균을 \( 1 \times 10^{7} \) \( \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \)로 접종하여 배양기 \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}\right) \)에서 72시간 동안 발효하여 에탄올을 가하여 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 추출하고 감압 농축기로 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 감압 농축하여 동결 건조하여 얻은 추출물을 실험에 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <p>본 연구에서 사용한 흰목이버섯은 (주)부농에서 국내산을 구입하였다. Acarbose, p-nitrophenyl \( \beta \)-D-glucoside (pNPG), sodium phosphate (monobasic, dibasic), \( \alpha \)-glucosidase enzyme, dimethyl sulfoxide (DMSO), 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), dexamethasone, oil-red-o staining solution은 Sigma-Aldrich Co. (USA)에서 구입하여 사용하였으며 insulin은 Welgene Inc. (Korea)에서 구매하여 사용하였다. phospho-AMPK\( \alpha \) (Thr172), phospho-JNK (Thr183/ Tyr185), phospho-Akt (Ser473), \( \beta \)-actin, anti-HRP rabbit 항체는 Cell Signaling Technology (USA)에서 구매하여 사용하였다. ELISA reader는 \( \operatorname{Spark}^{\mathrm{TM}} 10 \mathrm{M} \) Multimode Microplate Readers (TECAN, Swizerland)를 사용하였다.</p> <h2>사용 균주 및 배양 조건</h2> <p>본 연구에서 흰목이버섯의 발효를 위해 사용된 유산균은 전통 발효식품으로부터 스크리닝을 통해 분리한 Lactobacillus rhamnosus BHN 76을 사용하였다(Fig. 1). 유산균 배양 조건은 초기 균수 \( 10^{5} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \)로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 동안 MRS broth 배지에서 배양한 후, 사용하였다.</p> <h2>유산균 발효 흰목이버섯 추출물(FTF)</h2> <p>흰목이버섯 \( 100 \mathrm{~g} \)을 분말로 파쇄한 후, 유산균을 \( 1 \times 10^{7} \) \( \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \)로 접종하여 배양기 \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}\right) \)에서 72시간 동안 발효하였다. 각각의 유산균으로 발효한 흰목이버섯의 추출법은 추출 용매, 시간, 온도에 따른 최적의 추출 수율을 통해 선별하였으며(data not shown), 선별된 조건인 시료 부피 10배의 에탄올 \( (\mathrm{EtOH}) \)을 가하여 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 추출하였다. 추출한 시료는 여과 후 감압 농축기(Eyela, Japan)로 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 감압 농축을 하고, 동결 건조하여 얻은 추출물을 실험에 사용하였다.</p> <h2>\( \alpha \)-Glucosidase 저해 활성 분석</h2> <p>\( \alpha \)-Glucosidase 저해 활성 측정은 Tibbot과 Skadsen의 방법에 따라 pNPG (p-nitrophenyl \( \beta \)-D-glucoside)에서 유리되어 나오는 반응 생성물(p-nitrophenol)을 측정하여 수행하였다. 각 농도의 시료 \( 25 \mu \mathrm{l} \)에 \( 2.5 \mathrm{mM} \mathrm{pNPG} 50 \mu \mathrm{l} \)와 \( 0.2 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \alpha \)-glucosidase enzyme solution \( 25 \mu \mathrm{l} \)를 첨가한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 반응시키고 \( 0.1 \mathrm{M} \mathrm{NaOH} 50 \mu \mathrm{l} \)를 넣어 반응을 정지시켰다. 반응액 중 p-nitrophenol 생성량은 microplate reader를 사용하여 \( 405 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정 하였으며, \( \alpha \)-glucosidase 저해 활성은 효소를 첨가한 처리구와 무처리구 사이의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다. 양성대조구로 acarbose를 사용하였으며, 음성대조구로 \( \alpha \)-glucosidase enzyme 대신 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 6.8) \)를 동량 분주하였다.</p> <p>\( \alpha \)-Glucosidase 저해 활성 \( (\%)= \)\[1-(\mathrm{S}-\mathrm{SB}) \times 100 /(\text { Control }-\text { Blank })\]</p> <p>\( \mathrm{S}: \alpha \)-glucosidase enzyme 처리구의 흡광도</p> <p>SB : \( \alpha \)-glucosidase enzyme 무처리구의 흡광도</p> <h2>세포 배양</h2> <p>본 실험에 사용된 3T3-L1 전지방세포는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)에서 분양받아 사용하였다. 3T3-L1 세포는 \( 10 \% \) bovine calf serum (BCS, Gibco,USA), \( 1 \mathrm{x} \) antibiotics (Welgene Inc., Korea)를 첨가한 Dulbecco modified Eagle medium (DMEM, Welgene Inc.) 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 배양하였다. 세포가 \( 80 \% \) confluent 되었을 때, \( 0.05 \% \) trypsin/EDTA (Welgene Inc.)을 사용하여 세포를 때어내고 1,100 rpm, 3분 동안 원심분리하여 세포 pellet을 모으고, 새로운 배지로 현탁하여 사용하였다.</p>