크로마틴을 움직이지 않게 하기 위해 미량의 포름알데히드로 상온에서 10분동안 두고 글리신을 넣어서 포름알데히드 작용을 멈추게 하는데, 고정된 세포는 용해액으로 처리한 후 원심 분리를 통해 핵을 따로 떼어낸다. 보통 작은 좌위보다 큰 좌위가 2bp 더 많이 사용하는데 제한효소 자리의 양쪽에 위치한 프라이머 조합들과 제한효소 자리가 없는 부분의 프라이머 조합을 이용하여 절단 정도의 분석을 한다. PCR을 이용해 얻은 두가지 DNA 절편 사이의 상대적 연결 빈도는 대부분의 경우 Fig.2와 같이 나타낸다.
<h1>3C 기법의 실험 과정</h1> <h2>세포 고정과 핵 분리</h2> <p>크로마틴을 고정하기 위하여 세포를 1-2\(\%\)의 포름알데히드로 실온에서 10분 동안 처리하고, 글리신(glycine, \( 0.125 \mathrm{M} \) )을 첨가하여 포름알데히드 작용을 중지시킨다. 포름알데히드 농도는 세포의 종류 및 단백질과 DNA사이의 결합 상태에 따라 제한효소의 절단 효율에 영향을 미치기 때문에 적정 농도를 사용하여야 한다. 고정된 세포는 용해 액(lysis buffer) (\(10 \mathrm{mM}\) Tris, \( \mathrm{pH} 8.0\), \(10 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}\), \(0.2 \%\) NP-40으로 처리한 후, 원심분리를 통해 핵을 분리해낸다.</p> <h2>제한효소 선택, 처리 그리고 절단 정도 확인</h2> <p>분리된 핵을 제한효소 완충액(buffer)으로 부유시킨 후, \( 0.1 \% \)SDS 와 \( 1 \% \) triton X-100을 넣고 각각 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간씩 반응한다. 반응이 끝난 후, undigested genomic DNA control (UnD)로 사용될 약간의 시료를 덜어내어 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관해둔다. 남은 시료에 400-800 \(\mathrm{U}\)의 제한효소를 첨가하고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12-16시간 동안 반응한다. 이때 사용된 제한 효소는 분석하고자 하는 DNA 부분들을 각각 다른 절편으로 분리할 수 있는 것이어야 하며, 이는 정확한 입체 구조 설명을 위해 중요하다. 일반적으로 작은 좌위 \( (<10 \sim 20 \mathrm{~kb}) \)의 경우, DpnⅡ 또는 NlaⅢ 처럼 \( 4 \mathrm{bp} \)를 인식하고 자르는 제한효소 (four-cutters)를 주로 사용하고, 이보다 큰 좌위는 EcdRI, BgAl, HindⅢ와 같은 \( 6 \mathrm{bp} \) 제한효소(six-cutters)를 사용한다. 제한효소 반응이 끝난 후, digested genomic DNA control (D)로 사용 될 약간의 시료를 덜어낸다. 제한효소 자리의 절단 정도를 측정하기 위하여 덜어낸 UnD 와 D control 시료에 proteinase K를 처리하고, 페놀-클로로포름(phenol-chloroform)과 에탄올(ethanol) 침전법을 이용하여 DNA를 추출한 후, real-time PCR로 두 DNA를 비교 분석한다. 절단 정도는 분석하고자 하는 제한효소 자리의 양쪽에 위치한 프라이머 조합들 (Restriction site, R)과 제한효소 자리가 없는 부분의 프라이머 조합 (Control, C)을 이용하여 qPCR에서 얻어진 Ct값으로 계산한다.</p> <p>\(\text{Cutting ratio} (\%)=100-100 \times 2^{\wedge}\left(C t R_{U n D}-C t R_{D}\right) / 2^{\wedge}\left(C_{U} C_{U n D}-C t C_{D}\right) \)</p> <p>절단 정도가 최소 \( 80 \% \) 이상은 되어야 다음 실험 과정을 진행할 수 있으며, 그 이하는 유효한 결과를 줄 수 없기 때문에 사용하지 않는 것이 바람직하다.</p> <h2>연결효소 처리 및 DNA 정제</h2> <p>제한효소 반응이 끝난 시료에 SDS \( (0.16 \%) \)를 넣고 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 25 분간 반응시켜 제한효소를 불활성화 시킨 후, 연결효소 완충액과 triton X-100 \((0.1 \%) \)를 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 반응시킨다. 반응이 끝나면 \( 400 \mathrm{U} \)의 연결효소를 넣고 \( 16^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4시간, 추가로 실온에서 30분간 반응함으로써 제한효소에 의해 잘린 DNA 절편들을 연결시켜준다. 연결된 DNA는 proteinase K 처리 후, 페놀-클로로포름, 에탄올 침전법으로 추출한다. 추출된 DNA의 농도는 optical density (OD260)로 측정할 수 없기 때문에 genomic DNA의 standard curve를 이용하여 정량을 하고, \(50 \sim 200 \mathrm{ng}/\mu \mathrm{l}\)의 농도로 희석 한다.</p> <h2>대조군 DNA 준비</h2> <p>제한효소에 의해 생성된 DNA 절편들의 무작위적 연결 및 연결 선호도 그리고 PCR 프라이머 조합의 증폭 효율을 보정하기 위하여 대조군(control) DNA를 준비한다. 분석하고자 하는 좌위가 들어있는 Bacterial 또는 Yeast Artificial Chromosome (BAC or YAC) clone과 genomic DNA를 동량으로 혼합한 후, 고정하지 않은 상태에서 실험군에 사용한 것과 동일한 제한효소로 절단하고 연결효소로 연결한다. 대체 방법으로 분석하고자 하는 제한효소 자리 주 위의 DNA 를 PCR로 합성하여 추출한 뒤, 같은 수의 DNA 가닥을 혼합하여 대조군을 만들 수도 있다.</p> <h2>PCR을 이용한 연결 빈도(ligation frequency) 측정</h2> <p>DNA 절편들 사이의 연결 빈도는 각 절편의 끝부분에 고안된 프라이머를 조합하여 PCR기법으로 측정한다. 정량적 분석을 위해 일반적으로 SYBR green 형광 기법을 이용한 real-time PCR 기법을 사용하며, 이때 프라이머를 제한효소에 의한 절단부위로부터 약 \( 50 \mathrm{bp} \) 근처에 고안하여 증폭된 DNA (amplicons)의 길이가 약 \( 100 \mathrm{bp} \)가 되도록 한다.</p> <p>한 좌위에서 여러 DNA 절편 사이의 연결 빈도를 측정하기 위하여 고정 절편(constant or anchor fragment)을 선정한 후, 이 절편의 한 쪽 프라이머와 주변 절편들의 프라이머를 각각 조합하여 PCR을 수행한다. 그리고 대조군과 비교하여 실험군 시료의 연결 빈도를 결정한다. 또한 반복 실험(independent experiment)에서 생길 수 있는 제한효소 절단 효율 및 연결 효율은 대조군 프라이머를 이용하여 보정한다.대표적인 대조군 프라이머로 ERCC3 (excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 3) 유전자 내에서 고안된 것이 있으며, 이는 이 유전자가 모든 조직에서 비슷한 수준으로 발현되고 비슷한 크로마틴 입체 구조를 갖고 있을 것이라 생각되기 때문이다. 따라서 특정한 두 DNA 절편 사이(Two Fragments, TF)의 상대적 연결 빈도는 실험군 DNA (Ligated DNA, L)의 연결 빈도를 대조군 DNA (Control DNA, C)의 연결 빈도와 비교한 후, 그 값을 대조군 프라이머(ERCC3, ER)의 연결 빈도로 보정하여 얻어진다.</p> <p>\(\text{Relative ligation frequency} =2^{\wedge}\left(\mathrm{CtTF}_{\mathrm{c}}-\mathrm{CtTF} \mathrm{L}_{\mathrm{L}}\right) / 2^{\wedge}\left(\mathrm{CtER}_{\mathrm{C}}-\mathrm{CtER_{ \textrm {L } }}\right) \)</p> <h2>측정된 연결 빈도의 표현</h2> <p>PCR를 통해 얻어진 두 DNA 절편 사이의 상대적 연결 빈도는 많은 경우 Fig. 2와 같은 방법으로 표현된다. Fig. 2 A는 \( \beta \)-글로빈 좌위에서 3C 실험에 사용된 제한효소 자리와 PCR 프라이머의 위치를 보여주고 있으며, Fig.2B 와 C는 결과를 표현한 그래프이다. 그래프에서 PCR에 실험에 사용된 고정 절편은 검정색 판으로 표현되어 있으며, 고정 절편과 각 절편 사이의 연결 빈도는 회색 판으로 표현된 각 절편에 그래프로 나타나있다. Fig. 2B에 표현된 3C 결과를 보면, 적혈구 K562 세포에서 HS5를 포함하는 고정 절편은 다른 절편에 비해 \( \mathrm{G \gamma} \)-글로빈유전자를 포함하는 절편과 높은 연결 빈도를 보이며, 이는 크로마틴 환경에서 이 두 절편이 가깝게 위치하고 있음을 의미한다. 그러나 두 절편 사이의 높은 연결 빈도는 비적혈구 세포인 293T에서 측정되지 않으며, 이는 세포/조직 특이적인 연결 빈도, 즉 크로마틴 입체구조의 차이를 나타낸다. Fig. 2C는 적혈구 세포 MEL에서 전사 활성 유도에 따른 \( \beta \)-글로빈 좌위의 크로마틴 구조 변화를 보여준다. 예를 들어 HS3와 \( \beta- \) 및 \( \delta \)-글로빈 유전자를 포함하는 절편 사이의 연결빈도는 활성 유도 후에 증가하며, 이는 활성 유도에 의해 크로마틴 고리 구조가 새롭게 형성됨을 의미한다.</p>