쏘가리의 여러 조직에서 LDH를 native-PAGE로 분석한 결과, 골격근과 뇌 조직을 제외하고 LDH \(\mathrm{B}_4\) 동위효소가 \(\mathrm{A}_4\) 동위효소보다 더 활성화되어 있다. LDH 동위효소들은 \(\mathrm{NAD}^+\) 및 피루브산과의 상호작용 차이 때문에 affinity gel에 다르게 결합한다. Oxamate-linked Sepharose gel을 이용하여 조직 추출물을 크로마토그래피할 때, NADH를 함유한 버퍼를 사용하면 LDH는 단계적 역학기전에 따라 NADH와 먼저 결합한 후 oxamate가 고정된 gel에 결 합하며, gel에 결합하지 않은 나머지 단백질들은 용출된다.
<h2>LDH 동위효소의 전기영동 상</h2> <p>쏘가리 골격근, 심장, 신장, 간, 눈 및 뇌 조직의 LDH를 native-PAGE한 결과 골격근 및 뇌 조직을 제외한 모든 조직에서 LDH \( \mathrm { B } _ { 4 } \) 동위효소가 \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소보다 강한 활성을 보였다. 하부단위체 C를 포함하는 LDH 동위효소는 눈 및 뇌조직에서 나타났다(Fig. 1). LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소가 \( \mathrm { B } _ { 4 } \) 동위효소보다 양극쪽에 나타나고, 눈 조직에서 eye-specific LDH \( \mathrm { C } _ { 4 } \) 동위효소가 발현되는 것은 꺽지, 얼룩동사리 및 가물치의 경우와 같아서 전형적인 농어목 어류의 LDH 동위효소 형태를 보여주었다.</p> <h2>LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소의 정제</h2> <p>조직추출액을 피루브산의 유사물인 oxamate를 이용한 oxamate-linked Sepharose gel (affinity gel)로 chromatography 할 때 NADH를 함유한 buffer를 유입하면 LDH는 단계적 역학기전에 따라 NADH와 먼저 결합한 후 피루브산 유사물인 oxamate가 고정된 gel에 결합하고 gel에 결합하지 않은 나머지 단백질들은 용출된다고 알려져 있다. 본 실험에서도 쏘가리 골격근을 oxamate-agarose gel로 chromatography한 결과 NADH를 함유한 buffer를 유입 시 LDH를 제외한 대부분의 단백질이 용출되었다(Fig. 2).</p> <p>LDH 동위효소들은 \( \mathrm { NAD } ^ { + } \)및 피루브산과 abortive complex를 형성하는 정도에 차이를 보이므로 각 동위효소들은 affinity gel에 결합하는 힘이 서로 다르게 나타난다. LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소는 \( \mathrm { NAD } ^ { + } \)를 함유한 buffer의 유입 시 \( \mathrm { B } _ { 4 } \) 동위효소보다 먼저 용출되거나, 기질억제정도가 \( \mathrm { B } _ { 4 } \) 동위효소와 유사한 경우 plain buffer 유입 시 용출되기 시작한다고 알려져 있고, 이에 근거하여 LDH 동위효소들을 분리 할 수 있다.</p> <p>본 실험에서 LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소는 \( \mathrm { NAD } ^ { + } \)를 함유한 buffer 유입 후 20번째 분획부터 용출되기 시작하여 plain buffer 유입 후 4번째 분획까지 용출되었고, LDH \( \mathrm { B } _ { 4 } \) 및 \( \mathrm { A } _ { 2 } \mathrm { ~B } _ { 2 } \) 동위효소는 plain buffer 유입 후 17번째 분획부터 22번째 분획에 걸쳐 용출되었다. 이 결과는 \( \mathrm { NAD } ^ { + } \)를 함유한 buffer와 plain buffer를 차례로 유입 시 LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소가 \( \mathrm { B } _ { 4 } \) 동위효소보다 먼저 용출된다는 결과들과 일치하였다. 본 정제과정에서는 최종적으로 \( 47.4 \% \) 의 LDH 수율을 얻었고, \( 32.8 \) 배로 정제된 \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소를 얻을 수 있었다(Table 2).</p>