한천분해 활성 세균에서 agarase의 유전자를 확보하는 방법으로 기존 보고된 염기서열이나 아미노산서열을 이용하는 방법과 기존 서열에 대한 정보 없이 확보하는 방법로 나눌 수 있다. 기존 agarase의 유전자서열 정보를 이용한 신규 agarase의 유전자 확보 접근법은 이미 알려진 agarase 유전자가 알려진 세균과 동일한 속의 세균과 유연관계가 있는 세균에서 agarase 유전자를 탐색하고 확보하는 경우에 이용될 수 있는데, 기존의 Pseudoalteromonas 속 세균이 갖는 agarase 유전자 서열을 기반으로 제작된 PCR primer를 이용하여 새로운 agarase 유전자를 확보한 보고와 Agarivorans와 Vibrio의 유연관계가 높다는 점을 이용하여 Vibrio sp. JT0107의 \beta\(\beta\)-agarase 유전자를 기초로 PCR primer를 제작하여 Agarivorans sp. JA-1의 \beta\(\beta\)-agarase 유전자의 확보에 이용한 보고가 있다. 기존 agarase의 유전자서열 정보 없이 신규 유전자를 확보하는 접근법 경우 기존 서열 정보 이용이 어려운 경우에 사용되는데, agarase정제 후 부분적으로 아미노산서열을 파악하고 이를 토대로 PCR primer를 제작하여 유전자를 확보하는 방법, 서열 혹은 기능 기반 게놈라이브러리 분석 방법, degenerative primer 이용 유전자 확보방법 등이 있다.
<h1>Agarase의 유전자 확보</h1><p>한천분해 활성이 있는 세균에서 agarase의 유전자를 확보하는 방법으로 기존 보고된 염기서열이나 아미노산서열을 이용하는 방법과 기존 서열에 대한 정보 없이 확보하는 방법로 나눌 수 있다.</p><h2>기존 agarase의 유전자서열 정보를 이용한 신규 agarase의 유전자 확보</h2><p>이 접근법은 이미 알려진 agarase 유전자가 알려진 세균과 동일한 속의 세균과 유연관계가 있는 세균에서 agarase 유전자를 탐색하고 확보하는 경우에 이용될 수 있는데, 기존의 Pseudoalteromonas 속 세균이 갖는 agarase 유전자 서열을 기반으로 제작된 PCR primer를 이용하여 새로운 agarase 유전자를 확보한 보고와 Agarivorans와 Vibrio의 유연관계가 높다는 점을 이용하여 Vibrio sp. JT0107의 \( \beta \)-agarase 유전자를 기초로 PCR primer를 제작하여 Agarivorans sp. JA-1의 \( \beta \)-agarase 유전자의 확보에 이용한 보고가 있다.</p><h2>기존 agarase의 유전자서열 정보 없이 신규 agarase의 유전자 확보</h2><p>이 접근법은 기존 서열 정보의 이용이 어려운 경우에 사용되는데, agarase를 정제하고 부분적 아미노산서열을 파악하여 이를 토대로 PCR primer를 제작하여 유전자를 확보하는 방법, 서열 혹은 기능 기반의 게놈라이브러리를 분석하는 방법, degenerative primer를 이용한 유전자 확보방법 등이 있다.</p><p>첫째, 위 3 가지 방법이 모두 동원된 보고를 보면 한천분해 활성이 있는 Alteromonas agarilytica의 \(\alpha\)-agarase를 분리정제한 후 효소의 \( \mathrm{N} \)-말단과 internal peptide 서열에 근거하여 degen-erative PCR primer와 표지자(probe)를 제작한 후, A. agarilytica의 게놈라이브러리에서 서열기반으로 agarase 유전자의 단편을 함유한 집락(colony)을 탐색하고, 이후 완전한 염기서열을 분석하여 \(\alpha\)-agarase 유전자를 확보하였다. 이 보고는 한천분해 활성이 있지만 분리한 세균의 게놈라이브러리에서는 한천분해 활성이 없거나 세포질형 agarase 등의 탐색에 유용하게 활용될 수 있다. 아래의 '게놈 및 메타게놈 서열 분석 정보 이용'은 전체 게놈의 서열 파악 후 agarase 유전자를 탐색하는데 반해 이 방법은 전체 게놈의 서열 파악이 필요 없는 장점이 있다.</p><p>둘째, 기능기반(function-based)의 게놈라이브러리 분석을 사용한 사례를 보면 Fu 등은 Agarivorans albus YKW-34의 DNA를 이용하여 제작된 게놈라이브러리에서 한천분해 활성을 보이는 집락을 확보하고 이로부터 확보된 plasmid의 염기서열을 분석하여 \( \beta \)-agarase 유전자를 확보하였다. 이와 동일한 기법을 이용하여 Pseudoalteromanas sp., Vibrio sp. V134, Pseudomonas atlantica, Pseudoalteromonas sp. CY24 유래 agarase 유전자의 확보가 보고되었다.</p><p>셋째, degenerative PCR primer를 이용한 사례를 보면 기존에 보고된 agarase 유전자들의 서열기반(sequence-based) 기법으로 분석하여 보존된 부위(conserved protein domain)에 해당하는 degenerate PCR primer를 제조하는 방법에서 출발한다. GH16 \( \beta \)-agarase가 N-말단에 SDDFNY와 EIDVLE 아미노산 서열을 가지고 C-말단에 VDWIR 아미노산 서열을 가지는 것을 기반으로 degenerative primer를 제작하고 Flammeovirga 속 세균에서 \( \beta \)-agarase 유전자를 확보하고 이종숙주에서 생산한 보고가 있다. 또한, Vibrio sp. CN41의 DNA에 agarase의 각 GH family에 해당하는 PCR primer를 모두 적용한 후 sitefinding PCR로 agarase 유전자의 염기서열을 파악하고, GH 50 family \( \beta \)-agarase 유전자를 확보하고 이종 숙주에서 생산한 보고도 있다.</p><p>넷째, 부분적 아미노산 서열 파악과 degenerate primer를 사용하는 기법으로, 파악된 부분적 아미노산 서열로 degenerate primer를 제작하고 PCR로 agarase 유전자의 일부분을 획득하여 염기서열을 파악한 후 다시 primer를 제작하고 agarase 유전자의 전체 염기서열을 확보하는 방법이다. 이 방법은 게놈라이브러리를 필요로 하지 않아 첫째와 구분된다. 이러한 기법으로 \( \beta \)-agarase 유전자인 Vibrio sp. JT0107의 agaA, Vibrio sp. PO303의 agaC, agaD 유전자 등을 확보한 보고가 있다.</p>