Superoxide dismutase (SOD) 활성 측정은 SOD assay kit을 사용하여 manufacturer's instruction에 따라 진행하였다. \(\alpha\)-Glucosidase 활성억제 효과는 Tibbot 등의 방법으로 측정하였다. NO소거 활성은 마우스 대식세포인 RAW 264.7세포를 사용하였으며, 세포를 배양관에 분주한 후 LPS 자극하에 24시간 배양하여 NO 생성은 Griess 반응을 이용하여 측정하였다. 세 포독성 실험은 mitochondrial dehydrogenase activity의 지표인 MTT calorimetric reduction assay를 사용하여 추출물이 세포생존율에 끼치는 영향을 측정하였다.
<h2>SOD 활성 측정</h2><p>Superoxide dismutase (SOD) 활성은 SOD assay kit (Dojindo Molecular Technologies, Rockville, USA)를 사용하여 manufacturer's instruction에 기술된 방법에 따라서 수행하였다. 시료를 농도별로 희석하여 96 well plate에 \( 20 \mu \mathrm{l}\)씩 분주한 후, WST working solution을 \( 20 \mu \mathrm{l}\)을 넣고 혼합한다음 enzyme working solution을 \( 20 \mu \mathrm{l}\)을 첨가하여 \( 37 ^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 incubation 한 후 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 대조구 실험은 효소 대신 \( 20 \mu \mathrm{l}\) dilution buffer를 넣었으며, SOD 활성은 시료 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율\( (\%) \)로 나타내었다.</p><p>SOD activity \( (\%)=(1- \) 시료 첨가구의 흡광도/시료 무첨가구의 흡광도) \( \times 100 \)</p><h2>\(\alpha\)-Glucosidase 활성억제 효과 측정</h2><p>\(\alpha\)-Glucosidase 활성억제 효과 측정은 Tibbot 등의 방법에 따라 측정하였다. \( 50 \mathrm{mM} \) sodium succinate buffer \( (\mathrm{pH} 4.2) \)에 p-nitrophenol-a-D-glucopyranoside (PNPG, Sigma)를 용해시켜 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 기질용액을 조제하였다. 효소반응은 기질용액 \( 1 \mathrm{ml} \)와 효소액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)(30 unit, Sigma)을 혼합하고 대조구는 증류수 \( 0.1 \mathrm{ml} \), 반응구는 시료 \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시킨 후 \( 1 \mathrm{~N}\) \(\mathrm{NaOH} 0.1 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 발색시켰다. 이때 생성된 p-nitrophenol (PNP)은 ELISA reader (VersaMax Microplate Reader)를 이용하여 \( 400 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였으며, positive control로는 acarbose를 사용하였다. a-Glucosidase 활성 저해율은 다음 식으로 계산하였다.</p><p>저해율 \( (\%)=[1 \)-(반응구의 p-nitrophenol 생성량/대조구의 p -nitrophenol 생성량 \( ) \times 100 \)</p><h2>NO Assay 밎 cell viability 측정</h2><p>NO소거 활성은 마우스의 대식세포 세포주인 RAW 264.7세포를 배양관에 \( 1 \times 10^{5} \) \(\mathrm{cells/ml}\)의 세포가 되도록 분주하여 LPS (lipopolysaccharide) 자극하에 24시간 배양하고 그 배양상층액 내의 NO의 생성은 Griess 반응으로 세포 상등액에 축적되는 nitrite양으로 측정하였다. 시료에 대한 대조군으로 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 LPS를 처리하여 할성화를 유도한 세포를 사용하였다. 배양 후 \( 100 \mu \mathrm{l}\)의 상등액을 취하여 동량의 Griess시약 [\(1\% \)sulfanilamide \(30\% \) acetic acid)와 \(0.1 \% \) N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride (\( 60 \% \) acetic acid) 혼합액]을 가하여 상온에서 20분간 반응시킨 후 BLISA reader (Molecular Device, VersaMax Microplate Reader, California, USA)를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p><p>세포독성 실험은 mitochondrial dehydrogenase activity의 index를 나타내는 MTT calorimetric reduction assay 법으로 추출물이 세포생존율에 미치는 영향을 측정하였다, 96-well microtiter plate (Nunc, Vangaard, Neptune, NJ)에 RAW 264.7 macrophage를 \( 1 \times 10^{5} \)\(\mathrm{cells/well}\)의 농도로 분주하였다. 분주 24시간후 각 추출물이 함유되어 있는 배지를 \( 100 \mu \mathrm{l}\)씩 넣어 48시간 동안 배양하였다.</p><p>Plate에 MTT \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-di-phenyl-tetrazolium bromide (MTT, Sigma) 용액을 \( 20 \mu \mathrm{l}\)씩 첨가하여 4시간 동안 배양시키고 formazan을 형성시킨 후 조심스럽게 상등액을 제거하였다. DMSO \( 150 \mu \mathrm{l}\)을 첨가하여 formazan을 녹인 후 ELISA reader (Molecular Device, VersaMax Microplate Reader, California, USA)를 이용하여 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>