지방산패 억제능 실험에 사용된 oil emulsion은 실험 직전에 만들어 졌다. 미리 \( \mathrm{pH}6.5 \)로 보정한 \( 0.1 \mathrm{M} \) maleic acid buffer \( 8 \mathrm{ml} \)를 넣은 후, \( 0.05 \mathrm{ml} \)의 유화제인 tween-20 \( 0.05 \mathrm{ml} \) 와 \( 0.25 \mathrm{ml} \)의 fish oil을 넣고 15분 동안 교반하였다. 그리고 \( \mathrm{KOH} 2 \mathrm{g} \)을 넣고서 \( 150 \mathrm{ml} \)까지 정제수를 가한 후 교반하면서 \( 2 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} \)로 \( \mathrm{pH} 6.5 \)가 되도록 조제를 하여 사용하였다.
<h3>지방산패 억제능 측정을 위한 fish oil emulsion 조제</h3> <p>지방산패 억제능 실험에 사용하는 oil emulsion은 실험직전에 만들었으며, 미리 \( \mathrm{pH}6.5 \)로 보정한 \( 0.1 \mathrm{M} \) maleic acid buffer \( 8 \mathrm{ml} \)를 넣은 다음 \( 0.05 \mathrm{ml} \)의 유화제인 tween-20 \( 0.05 \mathrm{ml} \) 와 \( 0.25 \mathrm{ml} \)의 fish oil을 넣고 15분간 교반하였다. 이 후 \( \mathrm{KOH} 2 \mathrm{g} \)을 넣고 \( 150 \mathrm{ml} \)까지 정제수를 가한 후 교반하면서 \( 2 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} \)로 \( \mathrm{pH} 6.5 \)가 되도록 조제하여 사용하였다.</p> <h3>\( \mathrm{Fe}^{2+}, \mathrm{Cu}^{2+} \) 의 첨가에 따른 지방 산패 억제도 측정</h3> <p>산화 촉진제인 \( \mathrm{Fe}^{2+}, \mathrm{Cu}^{2+} \)의 첨가에 따른 지방 산패 억제도 측정은 Buege와 Aust의 방법에 따라 측정하였다. 미리 조제된 oil entulsion \( 0.5 \mathrm{ml} \)와 시료 \(0.1 \mathrm{ml}\) 및 \( 50 \mathrm{ppm} \)의 \( \mathrm{Fe}^{2+} \) 또는 \( \mathrm{Cu}^{2+} \)이온용액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)가 포함된 혼합물이 채워진 시험관을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간동안 반응시킨 후 \( 2 \mathrm{ml} \)의 trichloracetic acid (TCA) / 2-thiobarbituric acid (TBA)시약을 가하고 다시 흔합 후 끊는 물에서 15분간 끓인 다음 \( 5,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 흡광도 \( 531 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. \( \mathrm{Fe}^{2+} \), \( \mathrm{Cu}^{2+} \)의 첨가에 따른 지방 산패 억제도는 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <p>저해율 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\text { 무첨가군의 흡광도 }}\right) \times 100 \)</p> <h3>Hyaluronidase 저해활성 측정</h3> <p>Hyaluronidase (HAase) 저해활성 측정은 sodium-hyaluronic acid (HA)로부터 형성된 N-acetylglucosamine을 glucoxazoline 유도체로 변형시킨 후 p-dimethylaminobenzaldehyde (DMAB)로 발색시켜 흡광도를 측정하여 효소 활성을 측정하였다. \( 0.1 \mathrm{M} \) acetate buffer ( \( \mathrm{pH}3.5 \))에 녹인 HAase \( (7,900 \mathrm{U} / \mathrm{ml})\) \(0.05 \mathrm{ml} \)와 시료용액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 흔합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 배양한 다음 \( 12.5 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{CaCl} 2.1 \mathrm{ml} \)를 가하고 혼합 후 다시 20분간 배양하였다. 기질로서 \( 0.1 \mathrm{M} \) acetate buffer \( (\mathrm{pH} 3.5) \)에 녹인 \( \mathrm{HA}(12 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)를 첨가하여 다시 40 분간 배양하여 \( 0.4 \mathrm{~N} \) potassiumtetraborate \( 0.1 \mathrm{ml} \) 및 \( 0.4 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} \)용액을 \( 0.1 \mathrm{ml} \)반응 혼합물에 첨가하여 3분 동안 수욕상에서 가열한 후 완전히 냉각시켰다. 냉각시킨 반응물에 발색제로 DMAB시약 \( 3 \mathrm{ml} \)을 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 배양한 다음 \( 585\mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하여 저해활성을 산출하였다.</p> <p>저해율 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\text { 무첨가군의 흡광도 }}\right) \times 100 \)</p> <h3>Lipoxygenase 저해활성 측정</h3> <p>Lipoxygenase 저해활성 측정은 Tappel 등의 방법을 변형하여 실험하였다. 즉 반응구는 \( 0.1 \mathrm{M} \) tris-buffer ( \( \mathrm{pH} 8.5 \) ) \( 2 \mathrm{ml} \)와 시료용액 \( 0.02 \mathrm{ml} \)를 첨가하고 lipoxygenase (500 \( \mathrm{U} / \mathrm{ml}) 0.03 \mathrm{ml} \ 를 첨가하여 \( 18^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 배양한 다음 110 \( \mu \mathrm{M} \) linolenic acid \( 0.05 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 20분간 반응시켜 \(254 \mathrm{nm} \)에서 측정하였다.</p> <p>저해율 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\text { 무첨가군의 흡광도 }}\right) \times 100 \)</p>