시료에 대해 다양한 농도의 에탄올을 50mL 씩 가해 120rpm으로 24시간 동안 상온에서 교반하여 추출하였고, 이후 여과 및 농축 과정을 통해 에탄올을 제거한 후, 페놀류 화합물 농도에 맞추어 효소 및 세포 실험을 진행하였다. 각 추출물의 전체 페놀류 화합물은 Folin과 Denis의 방법을 통해 측정하였고, Hyaluronidase 저해활성은 Reissig 등의 방법으로 측정하였다. 또한, 세포 배양은 약 23x10^6/mL의 밀도에서 5% CO2 조건으로 진행하였다.
<h2>추출물의 제조</h2> <p>시료 추출은 열수 추출물은 건조된 물레나물 분말 \( 5 \mathrm { ~g } \) 에 증류수 \( 100 \mathrm { ~mL } \) 를 가하고 액이 \( 50 \mathrm { ~mL } \) 가 될 때까지 가열, 증발시킨 후 shaking incubator에서 \( 120 \mathrm { rpm } \) 으로 24시간 동안 상온교반 추출하였다. Ethanol 추출물은 시료에 각 농도별 ethanol 50 \( \mathrm { mL } \) 를 가하여 \( 120 \mathrm { rpm } \) 으로 24 시간 동안 상온교반 추출하였으며 추출액은 Whatman No. 1 filter paper (GE healthcare life sciences Piscataway, NJ, USA)로 여과한 후 rotary vacuum evaporator (Eyela NE, Tokyo, Japan)에서 농축하여 ethanol을 모두 제거한 뒤 phenolic compounds 농도에 맞추어 효소 실험을 진행하였으며, cell 실험 시 추출하여 동결 건조한 시료를 사용하였다.</p> <h2>Total phenolic compound 함량 측정</h2> <p>각 추출물의 total phenolic compound는 Folin과 Denis(1921)의 방법으로 측정하였으며, 시료 \( 1 \mathrm { ~mL } , 95 \% \) ethanol \( 1 \mathrm { ~mL } \), 증류수 \( 5 \mathrm { ~mL } \) 를 넣은 후 \( 1 \mathrm { ~N } \) Folin-Ciocalteu reagent \( 0.5 \mathrm { ~mL } \) 를 첨가하여 섞은 후 \( 5 \% \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { CO } _ { 3 } \) 용액 \( 1 \mathrm { ~mL } \) 를 가하여 암실에서 1시간 방치하여 발색시키고, \( \mathrm { UV } \)-visible spectrophotometer로 \( 725 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선 으로 양을 환산하였다.</p> <h2>Hyaluronidase 저해 (항염증) 효과 측정</h2> <p>Hyaluronidase 저해활성 측정은 Reissig 등(1995)의 방법으로 측정하였으며, sodium-hyaluronic acid (HA)에서 형성된 N-acetylglucosamine을 유도체 glucoxazoline로 변형시킨 다음 p-dimethylamino benzaldehyde로 발색시켜 흡광도를 측정하였다. \( 50-200 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) phenolic compounds 농도의 시료 \( 0.1 \mathrm { ~mL } \) 에 \( 0.1 \) \( \mathrm { M } \) acetate buffer \( ( \mathrm { pH } \quad 3.5) \) 에 녹인 hyaluronidase \( (7,900 \mathrm { U } / \mathrm { mL } ) \) \( 0.05 \mathrm { ~mL } \) 을 혼합하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 20 \) 분간 반응시킨 뒤 \( 12.5 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { CaCl } _ { 2 } 0.1 \mathrm { ~mL } \) 을 가하여 혼합한 후 다시 20분간 반응시켰다. \( 0.1 \) \( \mathrm { M } \) acetate buffer \( ( \mathrm { pH } \) 3.5)에 녹인 기질 \( (12 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } ) \quad 0.5 \mathrm { ~mL } \) 을 넣고 \( 38 { } ^ {\circ } \mathrm { C } , 45 \) 분 동안 반응시킨 다음 \( 0.4 \mathrm { ~N } \) potassiumtetraborate \( 0.1 \mathrm { ~mL } \) 와 \( 0.4 \mathrm { ~N } \mathrm { NaOH } \) 용액 \( 1 \mathrm { ~mL } \) 를 첨가하여 3 분 동안 water bath에서 반응 후 완전히 냉각하여 \( 600 \mathrm { ~nm } \) 에서 투과율을 측정하였다. 대조구는 시료 대신 증류수 \( 0.5 \mathrm { ~mL } \) 를 넣어 반응시켰으며, 저해율 \( ( \%) \) 은 (1-시료의 투과율/대조구의 투과율 \( ) \times 100 \) 으로 계산하였다.</p> <h2>항염증 효과 측정을 위한 세포배양</h2> <p>Mouse macrophage cell line인 Raw \( 264.7 \) cell은 한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank)에서 구입하였으며, DMEM에 Hyclone사의 FBS를 \( 10 \% \), Hyclone사의 \( 100 \mathrm { U } / \mathrm { mL } \) penicillin 및 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) streptomycin 1 \%를 혼합한 배지를 사용하여 37 \( { } ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 72 시간 동안 배양하였다. Cell 배양 dish에 cell의 밀도가 \( 23 \times 10 ^ { 6 } / \mathrm { mL } \) 정도가 되게 계대 배양하여 \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건으로 cell 상태를 유지하였다.</p>