Weissella confusa WIKIM51은 한국미생물보존 센터에 등록되어 있으며, 본 실험에 사용된 균체는 동결건조 보호제와 혼합하여 동결건조한 분말을 4\(^\circ \mathrm{C}\)에서 보관하였다. 3T3-L1 전지방세포주는 10% calf serum(CS), 100 unit/ml의 페니실린과 100 ng/ml의 스트렙토마이신을 함유한 DMEM에 배양하고, 세포는 37\(^\circ \mathrm{C}\)의 5% CO2 가스 상태에서 2일간 배양하였다. 시료들이 지방분화과정에서 지방축적(lipid accumulation) 정도에 미치는 효과를 알아보기 위해 Oil Red O 염색을 실 시하였다[21].\( 100 \% \) confluent stage 2 일 후, adipogenic cocktail 첨가 배양액, insulin 첨가 배양액, FBS 배양액 교 환 시, 시료들을 농도별로 처리하였으며, 9 일의 분화 후 배 양액을 제거하고 \( \mathrm{PBS} \) 로 세척한 다음 \( 10 \% \) 포름알데히드로 10 분간 고정시켰다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>Weissella confusa WIKIM51 유산균 분리 및 준비</h2> <p>민들레 김치 유래 W. confusa WIKIM51은 한국미생물보존 센터에 미생물 특허기탁(KCCM11914P) 되어 있으며, 본 실 험에 사용된 W. confusa WIKIM51은 식품 및 식품 첨가물 공 전에 등록된 개별 조성물을 이용한 혼합배지에 전 배양과 본 배양을 거쳐 회수된 균체를 동결건조 보호제와 혼합하여 동 결건조 한 분말을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하며 실험에 이용하였다.</p> <h2>3T3-L1 전지방세포주의 배양 및 분화유도</h2> <p>3T3-L1 전지방세포주를 \( 10 \% \) calf serum (CS)와 100 unit/ml의 페니실린과 \( 100 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 의 스트렙토마이신을 함유 한 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, \( \mathrm{USA} \) ) 배양액을 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 가 유지되는 배 양기에서 배양하였다. 이때 배지를 교환할 때마다 phosphatebuffered saline (PBS) 용액을 사용하여 세포표면을 세척하 였고, 신선한 \( 10 \% \mathrm{CS} \) 배지를 포함하는 DMEM 배양액으로 교환하였다. 세포가 단일층으로 플라스크 바닥에 \( 80 \% \) 정도 부착하면 PBS 용액을 사용하여 세포표면을 세척하여, \( 0.25 \% \) trypsin-EDTA (Gibco) 용액을 첨가한 뒤 원심분리 하였다. 이들 세포를 6-well plate에 \( 1 \times 10^{5} \) cells을 균등하게 분주하 였으며, \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS)와 100 unit/ml의 페니실린과 \( 100 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 의 스트렙토마이신을 함유한 DMEM 배양액을 사용하였다. \( 100 \% \) confluent stage 2 일 후, \( 10 \% \) FBS를 함유한 DMEM 배양액에 adipogenic cocktail인 dexamethasone \( 0.05 \mu \mathrm{M} \), IBMX \( 0.25 \mathrm{mM} \), 인슐린 \( 2 \mu \mathrm{g} / \) \( \mathrm{ml} \) 이 함유된 배양액으로 교환하여 3 일 분화를 유도하였다. 3 일 후 배양액 교환 시 \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 인슐린만을 포함하는 \( 10 \% \) \( \mathrm{FBS} \) 를 함유한 DMEM 배양액으로 3 일간 처리하였고, 마지 막 3 일간은 \( 10 \% \mathrm{FBS} \) 를 함유한 DMEM 배양액을 사용하 였다.</p> <h2>지질 축적량 측정(Oil Red O staining)</h2> <p>시료들이 지방분화과정에서 지방축적(lipid accumulation) 정도에 미치는 효과를 알아보기 위해 Oil Red O 염색을 실 시하였다[21]. \( 100 \% \) confluent stage 2 일 후, adipogenic cocktail 첨가 배양액, insulin 첨가 배양액, FBS 배양액 교 환 시, 시료들을 농도별로 처리하였으며, 9 일의 분화 후 배 양액을 제거하고 \( \mathrm{PBS} \) 로 세척한 다음 \( 10 \% \) 포름알데히드로 10 분간 고정시켰다. \( 10 \% \) 포름알데히드를 제거하고 다시 포 화된 포름알데히드를 넣어 1 시간 이상 세포를 고정시켰다. 그 후 \( 60 \% \) isopropanol을 넣고 바로 제거한 후 증류수로 세 척하고 Oil Red O 염색용액으로 30 분간 지방구를 염색한 후 증류수로 세척하였다. 염색된 지방구의 세포 내 지방축적을 현미경을 이용하여 관찰하였으며 사진촬영을 통해 육안적으 로 시료들이 지방분화 시 지방축적에 미치는 영향을 관찰하 였다. 축적된 지방 확인을 위해 잘 건조된 상태에서 isopropanol을 첨가하여 Oil Red O dye를 용출한 뒤 multiplate reader를 사용하여 \( 500 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였 다. 이때 isopropanol을 blank로 사용하였다.</p> <h2>3T3-L1 지방세포 및 조직 내 유전자 발현 측정(Real-time PCR)</h2> <p>Real-time PCR 방법을 통해 유전자 발현을 측정하였다. 3T3-L1 지방세포 및 지방 조직 내 total RNA는 Trizol reagent (Invitrogen, USA)를 사용하여 분리하고, UV/ visible spectrophotometer를 이용하여 정량하였다. 각각의 분리된 RNA \( 1 \mu \mathrm{g} \) 을 TOPscript \( { }^{\mathrm{TM}} \) cDNA Synthesis kit (Enzynomics, Korea)와 S1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, USA)을 사용하여 \( \mathrm{cDNA} \) 를 합성하였다. 합성된 \( \mathrm{cDNA} \) 를 각 각의 primer (Table 1), nuclease-free water, TOPreal \( { }^{\mathrm{TM}} \) qPCR 2x PreMIX (SYBR Green)를 넣고 BioRad CFX-96 Real Time System (Bio-Rad)을 이용하여 증폭하였다. Realtime quantitative PCR의 조건으로서: initial denaturation 은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분, 그리고 40 cycles을 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 초, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 초간 수행하였다.</p> <h2>실험동물 사육 및 식이</h2> <p>본 연구에서 수행된 동물실험은 세계김치연구소 동물윤리 위원회의 승인을 받아 진행하였다(WIKIM IACUC 202034). 실험동물은 생후 5 주령의 수컷 \( \mathrm{C} 57 \mathrm{BL} / 6 \) 마우스를 (주)오리엔 트바이오(Korea)에서 구입하였다. 상업용 고형사료로 7일간 사육환경에 적응시킨 후, 정상식이군(ND), 고지방식이 대조 군(HFD), W. confusa WIKIM51 \( 1 \times 10^{9} \mathrm{CFU} \) 섭취군, W. confusa WIKIM51 \( 1 \times 10^{10} \mathrm{CFU} \) 섭취군 총 4 개의 군으로 분리하였다. 실험동물은 물과 실험식이를 자유롭게 섭취하도록 하였고, 실험식이는 Research Diets (New Brunswich, USA)의 AIN-95 식이를 변형하여 정상식이 (Normal diet, ND; \( 10 \% \) fat kcal)와 고지방식이(High fat diet, HFD; \( 45 \% \) fat kcal)를 구입하여 섭취하도록 하였다. 실험동물에 적용한 유산균 W. confusa WIKIM51은 매일 PBS 에 현탁하여 경구투여하면서 10 주간 사육하였다. 실험 환경 은 온도 \( 22 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 50 \pm 5 \% \) 로 유지하였고, 12 시간 명암 주기로 일정하게 유지되는 동물 사육실에서 수행하였다.</p>