마를 이용하여 저온진공건조기를 사용해 절대압력 \( 15 \sim 40 \mathrm{mmHg} \) 에서 24시간 건조시켜 마 분말(60 mesh)을 제조한다. 이후 건조된 마의 분말을 냉동보관하여 추출하는데, 이를 세포배지에 필요한 농도로 희석한 뒤 실험에 사용한다. HT-29 세포와 HT1080 세포를 배양하는데 배양 중인 세포를 일주일에 2번 배지를 바꾸면서 세포를 배양한다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>본 실험에 사용된 마(yam, D. batatas Decne)는 부산 엄궁 농산물 시장에서 구입하여 저온진공건조기(STVD-50, SANYA, Korea)를 이용하여 상당포화온도 \( 15 \sim 25^{\circ} \mathrm{C} \), 절대압력 \( 15 \sim 40 \mathrm{mmHg} \) 에서 24시간 건조시켜 마 분말(60 mesh)을 제조하였다.</p> <h2>추출 및 분획</h2> <p>건조된 마 분말 \( (191.4 \mathrm{~g}) \)은 실험 사용 전까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)의 deep freezer (NF-400SF, NIHON FREEZER, Japan)에 냉동 보관되었다가 유기용매 추출을 위하여 acetone:methylene chloride를 1:1 비율로 혼합하여 마 분말이 충분히 잠기도록 하여 24시간 방치한 후 추출하였다. 이 과정을 2회 반복하여 얻은 여액은 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 수욕 상에서 rotary vacuum evaporator (N-1000, EYELA, Japan)로 농축하여 aceton/methylene chloride 추출물 (A+M) \((1.75 \mathrm{~g}) \) 을 얻었다. A+M 용매로 추출되지 않은 성분을 methanol 용매로 추출하고자 남은 잔사에 2 배의 methanol을 부어 위와 동일한 방법으로 2회 반복한 후 농축하여 meth-\( \mathrm{anol} \) 추출물 \( (\mathrm{MeOH})(3.73 \mathrm{~g}) \) 을 얻었다. 두 용매로부터 최대로 수득한 추출물을 혼합하여 다시 용매 극성에 따라 순차적으로 분획하여 \( n \)-hexane \( (0.67 \mathrm{~g}), 85 \% \) aq. \( \mathrm{MeOH}(0.34 \mathrm{~g}), n \)-buta-\( \mathrm{nol}(n-\mathrm{BuOH})(0.29 \mathrm{~g}) \), water \( (1.49 \mathrm{~g}) \) 분획물을 얻었다. 실험에는 각각의 추출물들을 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 현탁하여 세포배지로 필요한 농도로 희석하여 실험에 사용하였다.</p> <h2>세포 배양</h2> <p>한국 세포주 은행 (서울의대)으로부터 인체 결장암세포(HT-29)와 인체 섬유육종세포(HT1080)를 분양받아 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다. HT-29 세포와 HT1080 세포를 \(100 \mathrm{units}/\mathrm{ml}\) 의 penicillin-streptomycin (GIBCO, USA)과 \( 10 \% \mathrm{FBS} \) (Hyclone, USA)가 함유된 RPMI 1640과 DMEM을 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) incubator (MCO-15AC, SANYO Electric Biomedical Co., Ltd., Japan)에서 배양하였다. 배양 중인 세포를 일주일에 2 번 새로운 배지로 바꿔주었다. 일주일 후 phosphate buffered saline (PBS)으로 세척한 뒤 \( 0.05 \% \) trypsin- \( 0.02 \%\) EDTA (GIBCO, USA)로 부착된 세포를 분리하여 원심분리 한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 \( 75 \mathrm{~cm}^{3} \) cell culture flask에 \( 10 \mathrm{ml} \) 씩 일정한 수로 분할하여 주입하고 계속 6~7일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.</p>