이 연구에서는 pBIG 벡터를 사용하여 식물에 Brcpi1 유전자를 형질전환시키는 방법을 개발하였다. 유전자는 SfiI 제한효소 사이트를 이용하여 벡터에 삽입되었고, 35S 프로모터에 의해 발현되며, hygromycin 저항성 유전자(HPT)를 선발 마커로 사용하였다. 이 후, 스트레스 처리된 애기장대에서 Brcpi1 유전자의 발현 양상을 RT-PCR 분석으로 조사하였다.
<h2>Southern blot 분석</h2> <p>Brcpil 유전자의 소송체 게놈에서 copy를 알아보기 위하여 소송체 잎으로부터 genomic DNA 분리는 CTAB 방법 (Sambrook et al. 2001)에 따라 수행하였다. 분리한 DNA ( \( 20 \mu \mathrm { g } ) \)를 BamHI, EcoRI, HindⅢ와 Pst I으로 각각 소화하여 \( 0.8 \% \) agarose gel에 전기영동한 후, Hybond N 나이론 membrane (Amersham)에 전이시켰다. Southern blot을 위한 Probe 및 detection 과정은 DIG labelling and detection system (Roche)를 사용하여 회사에서 제공한 매뉴얼에 따라 수행하였다.</p> <h2>Brcpi1 유전자 도입 형질전환 애기장대 육성</h2> <p>형질전환을 위한 식물 발현벡터는 pBIG vector 에 SfiI 처리한 후, Brcpi1 유전자 말단에 SfiI 제한효소 site를 primer에 의해 PCR합성하여 얻어진 단편과 ligation 하여 구축하였다. 따라서 Brcpi1 유전자는 35S promoter의 지배 하에 발현되며, 선발 marker 유전자로 hy-gromycin 저항성유전자 (HPT)를 포함하고 있다. 애기장대의 형질전환은 Brcpi1 유전자가 삽입된 Agrobacterium을 이용하여 Steven 등이 보고한 스프레이 방법에 의해 수행하였다. 얻어진 T1종자를 hygromycin 이 포함된 MS배지에서 정상적으로 생육한 식물체를 선발하여 T2 세대를 육성하였다.</p> <h2>Abiotic stress 처리에 따른 유전자 발현 분석</h2> <p>Brcpi1 유전자의 비생물학적 스트레스에서 반을을 알아보기 위해 형질전환 애기장대에 스트레스 처리 후, 얻어진 조직에서 유전자의 발현 양상을 RT-PCR 분석에 의해 조사하였다. 스트레스의 종류는 \( 100 \mathrm { mM } \) ABA } , drought, osmotic (15 \% PEG6000, \( 250 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) cold 등으로 하였다. 처리방법은 종자 발아 후, 14일된 육묘을 이용하여 Yosida 양액 (Yosida et al. 1976)에서 온도 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 상대습도 \( 70~75 \% \) 조건의 생장상에서 처리하여 시간대별로 식물 조직의 잎과 뿌리를 채취하였다. Total RNA 추출과 RT-PCR분석은 인트론 바이오사에서 시판하고 있는 plant RNA extraction kit과 one-step RT-PCR kit를 각각 사용하였다. 각 각의 유전자 특이적으로 증폭할 수 있는 Primer들은 유전 자의 3'-UTR부위 중심으로 BCM Program (Baylor college of Medicine HGSC))을 이용하여 GC함량 비율 등을 고려하여 선정하였다. Primer합성은 Takara사에 의뢰하여 제 작하였다. Real-time qPCR은 BIO-RAD iQ5 real-time PCR system (BIO-RAD, USA)을 사용하여 Huang 등이 기술한 방법에 의해 수행하였다. Brcpi1 유전자의 qRT-PCR 을 위해서, \( 2 \mu \mathrm { g } \) 의 Total RNA을 이용하여 역전사효소 (Pro-mega)에 의해 cDNA를 합성하여 이용하였다. 유전자의 상대적 발현량을 위해 reference 유전자로 actin을 사용하여 Ct 방법으로 계산하였다.</p>