\(\alpha\)-Glucosidase 활성억제 효과 측정은 생성한 기질용액과 효소액 혹은 대조구 용액과 혼합하여 반응시킨 후 NaOH를 첨가하여 발색시킨 후 생성된 PNP를 ELISA를 이용하여 흡광도를 측정한 후 저해율을 구하는 것으로 하였다. SOD 유사활성은 농도가 다른 시료에 pyrogallol을 첨가하여 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하여 시료 첨가구와 무첨가구 간의 흡광도 차이를 백분율로 나타내어 활성 산소종을 과산화수소로 전환시키는 반응을 매개하는 pyrogallol의 생성량을 측정하는 것으로 하였다. ADH 활성 측정은 시험관에 NAD수용액과 시료를 첨가하고 ADH를 가하고 spectrophotometer를 이용하여 측정하는 것으로 하였다. ALDH 활성도는 NADH 생성에 따른 흡광도 변화를 spectrophotometer를 이용하여 측정하였다. 위 실험은 실험군 별로 세 번씩 반복하여 얻은 결과의 평균과 표준편차를 계산하여 통계분석하였다.
<h2>α-Glucosidase 활성억제 효과 측정</h2><p>α-Glucosidase 활성억제 효과 측정은 Tibbot 등의 방법에 따라 측정하였다. \( 50 \mathrm{mM} \) sodium succinate buffer ( \( \mathrm{pH} 4.2 \) )에 ρ-nitrophenol- α-D-glucopyranoside (PNPG, Sigma)를 용해시켜 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 기질을 만들고, 기질용액 \( 1 \mathrm{ml} \)와 효소액(Sigma) 30 unit/\( 0.1 \mathrm{ml} \)를 혼합하고 대조구에는 증류수 \( 0.1 \mathrm{ml} \), 반응용액은 시료 \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시킨 후 1N NaOH \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 발색시켰다. Positivecontrol로는 acarbose를 사용하여 실험하였다. 이때 생성된 ρ-nitrophenol (PNP)은 ELISA reader (Molecular Device,VersaMax Microplate Reader, Los Angeles, CA, USA)를 이용하여 \( 400 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 다음의 식으로 저해율을 구하였다.<p><p>저해율 \( (\%)=[1 \)-(반응구의 \( \rho \)-nitrophenol 생성량/대조구의 \( \rho- \) nitrophenol 생성량)] \( \times 100 \)</p><h2>SOD 유사활성 측정</h2><p>SOD 유사활성(superoxide dismutase-like activity)은 Marklund와 Marklund의 방법에 따라 활성 산소종을 과산화수소\( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \)로 전환시키는 반응을 촉매하는 pyrogallol의 생성량을 측정하여 나타내었다. 시료를 농도별로 희석하여 10μl씩 96 well plate에 첨가한 후, Tris-HCl buffer \( (50 \mathrm{mM} \) Tris, \( 10 \mathrm{mM} \) EDTA, pH 8.0)150 μl와 \( 7.2 \mathrm{mM} \) pyrogallol 10 μl을 첨가하여, 실온에서 10분간 반응시키고, 1 N HCl 50 μl을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 ELISA reader (VersaMax MicroplateReader)를 이용하여 \( 420 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. SOD 유사활성은 시료 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율\((\%)\)로 나타내었으며 다음 식에 의해 계산하였다.</p><p>\( \operatorname{SODA}(\%)=\left(1-\frac{\text { 시료 첨가구의 흡광도 }}{\text { 시료 무첨가구의 흡광도 }}\right) \times 100 \)</p><h2>ADH 활성 측정</h2><p>ADH 활성도는 Choi 등과 Racker 의 방법을 변형하여 수행하였으며, \( 340 \mathrm{~nm} \)에서 형성되는 NADH의 흡광도를 spectrophotometer (Ultrospec 3000 pro UV/Visible,Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd., Little Chalfont,Buckinghamshire, UK)를 이용하여 측정하였다. 시험관에 alcohol, NAD (Sigma)수용액, 시료 \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 첨가하고 \( 0.01 \) \( \mathrm{M} \) glycine-NaOH 완충용액(pH 8.8)을 총 부피가 \( 1.8 \mathrm{ml} \)가 되게 첨가한 후 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 항온수조에서 10분간 반응시키고 ADH (10 unit/ml, Sigma)를 가하여 \( 340 \mathrm{~nm} \)에서 spec-trophotometer (Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd.)를 이용하여 흡광도의 변화를 측정하였다. 대조구는 시료대신 증류수를 사용하였으며, positive control로 사용한 hepos는 약국에서 구입한 것으로, 처방전에 따라 1/2로 희석하여 사용하였다. ADH의 활성은 반응 종료시의 최대 흡광도를 대조구의 최대 흡광도에 대한 비율로 나타내었으며 다음과 같은 식으로 계산하였다.</p><p>ADH activity \( =(\mathrm{B} / \mathrm{A}) \times 100 \)</p><h2>ALDH 활성 측정</h2><p>ALDH의 활성도는 Tottmar등의 방법을 변형하여 NADH생성에 따른 흡광도의 변화를 spectrophotometer(Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd.)를 이용하여 \( 340 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 즉, ALDH의 활성도 측정을 위해 증류수, 1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5), 3 M KCl, 시료, \( 20 \mathrm{mM} \) NAD(Sigma), \( 0.33 \mathrm{M} \) 2-mercaptoethanol, \( 0.1 \mathrm{M} \) acetaldehyde(Sigma)를 혼합한 다음 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시키고 ALDH(1 unit/ml, Sigma)를 가하여 \( 340 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 이때 대조구는 시료대신 증류수를 넣은 것으로 하였다. Positive control은 ADH 활성 측정에서 사용한 것과 동일한 것으로 하였으며, ALDH의 활성은 ADH 활성 계산식에 따라 측정 되었다.</p><h2>통계분석</h2><p>본 실험에서 얻은 결과는 각 시료마다 세 번씩 반복 실험을 통해 실험군당 평균과 표준편차를 계산하여 나타내었다.</p>