본 논문에서 분리된 균주들은 디스크 확산법으로 imipenem에 내성인 균주를 일차선별하고 다시 Vitek 32 (bioMeriex, France)를 이용하여 imipenem의 MIC가 \( 16 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 이상임을 확인 한 후 동일 환자로부터 반복 분리된 균주를 제외한 54균주를 실험에 사용했으며, 반응 결과를 Vitek 32 의 database를 통해 세균을 동정했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>Imipenem 내성 균주 분리</h2> <p>2007년 3월부터 2008년 2월까지 병원 환자 검체로부터 우점하는 그람음성 간균들을 분리하였다. 분리된 균주들은 디스크 확산법으로 imipenem에 내성인 균주를 일차선별하고 다시 Vitek 32 (bioMeriex, France)를 이용하여 imipenem의 MIC가 \( 16 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 이상임을 확인 한 후 동일 환자로부터 반복 분리된 균주를 제외한 54 균주를 실험에 사용하였다. 미생물 분리와 디스크 확산법의 실시는 Mueller Hinton II 한천(MHA; Becton Dickinson) 배지를 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 16-18시간 배양하여 사용하였다.</p> <h2>생화학적 특성을 이용한 세균 동정</h2> <p>순수 분리된 세균의 동정은 TSI (triple sugar iron) 시험과, 황화수소 생성능, indol생성능, 운동성 유무와, MR (methyl red) 반응, VP (Vogas-Proskauer) 반응, citrate 이용능과 oxi-dase 시험을 실시하였다. 그리고 Vitek 32 GNI kit를 이용하여 동정을 실시하였다. MHA 배지에 자란 세균 집락을 \( 0.45 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)식염수에 혼탁하여 GNI 카드에 접종한 후 배양시켰다. 1시간 간격으로. 균의 증식을 확인 하며 반응 결과를 Vitek 32 의 database를 이용하여 세균을 동정 하였다.</p> <h2>DNA 추출</h2> <p>MHA배지에 자란 세균집락 1 loop를 Lysis buffer [ \( 10 \mathrm{mM} \) Tis-HCl \((\mathrm{pH} 8.0)\), \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl,2 \%}\) SDS \(100 \mu l\)와 2 small spoon의 glass bead (size: \( 0.4 \mathrm{~mm} \) ) 혼합체에 넣고 10분간 TOMY mixer (TOMY, USA)에 혼합하였으며, \( 1 \times \)TE buffer \( 200 \mu l \) 와 phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) \( 300 \mu \mathrm{l} \)를 넣고, 3분간 TOMY mixer에 다시 혼합 한 후 원심분리 \((12,000 \mathrm{rpm}\), \( 4 \mathrm{~min}) \)하였다. 상등액을 새로운 tube에 옮긴 후 RNase A \( (20 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) 3 \mu l \)을 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에 30분간 배양하였고, \( 0.1 \) volume의 3 M sodium acetate \( (\mathrm{pH} 5.2 \) )와 \(2 \) volume의 \( 100 \% \) ice ethanol을 넣고 DNA를 침전 시킨 후 원심분리\((12,000 \mathrm{rpm}\), \( \left.10 \mathrm{~min}, 4^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 하였다. 차가운 \( 70 \% \) etha-nol로 세척 한 후 건조하여 멸균된 증류수에 녹여 실험에 사용할 때까지 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 냉동 보관하였다.</p>