본 논문에서는 Adipic acid 생산, Shikimic acid 생산, pHBA 생산에 대한 기존 방법 문제를 해결할 다른 제조 방법을 제시한다. Adipic acid 생산에 관해서는 재조합 대장균을 이용하여 \(1\)단계로 cis,cis-muconic acid를 얻고 \(2\)단계에서 백금촉매를 이용한 수소화반응를 일으켜 adipic acid를 얻는 방법이 소개된다. 다음으로 Shikimic acid 생산 방법으로는 AAA 생합성 공통경로상에서 축적되는 shikimic acid를 shikimate 3-phosphate(S3P)로 전환시키는 shikimate kinase 유전자를 제거하여 생산하는 방법과 EPSP synthase(AroA) 결손 미생물을 제작하고 세포내의 bacterial phosphatases 활성을 이용하여 shikimic acid를 만드는 방법을 소개한다. 마지막으로 pHBA 생산으로는 유기용매 내성 P. putida S12 미생물을 이용하여 pHBA를 생산하는 방법 및 담배의 엽록체내 게놈에 E. coli ubiC 유전자를 삽입/발현하여 건체중량을 이용한 방법이 소개된다.
<p>Adipic acid(butane-1,4-dicarboxylic acid) 생산: 아디핀산은 주로 나일론(nylon) 66, 가소제, 그리스(grease), PU(polyurethane) 제조용으로 사용되고 있으며, 2005년 기준 세계시장 규모는 약 250만톤에 이르는 거대품목이다. 현재 benzene으로부터 cyclohexane, cyclohexanol, cyclohexanone을 거쳐서 합성되는데, 환경규제, 건강상의 규제, 지정학적인 문제뿐만 아니라 제조과정에서 부산물로 생기는 \( \mathrm{N}_{2} \mathrm{O} \)에 의한 오존결핍 및 지구온난화에 기여하는 문제가 발생한다. 따라서, 벤젠대신에 포도당으로부터 adipic acid를 생산하는 기술개발이 필요한 상황이다. Wei와 Frost 등은 재조합 대장균을 이용하여 1단계로 cis,cis-muconic acid를 생산하고, 2단계로 화학공정을 통한 adipic acid 생산기술을 개발하였다.</p><p>AroE 효소활성이 상실된 E. coli AB2834의 염색체내에 유전자 serA 및 lacZ부위 안에 각각 aroBaroZ 및 tktAaroZ 유전자들을 삽입한 E. coli WN1를 제작하였다. 한편, PCA를 catechol로 전환시키는 K. pneumoniae 유래의 protocatechuate decarboxylase 유전자 aroY, catechol로부터 cis,cis-muconic acid의 합성을 촉매하는 Acinetobacter calcoaceticus 유래의 catechol 1,2-dioxygenase 유전자 aroZ, 그리고 \( aroF^{\mathrm{FBR}} \) 및 serA를 모두 한 plasmid에 cloning하여 벡터 pWN2.248을 만들고, 이를 E. coli WN1에 형질전환하여 cis,cis-muconic acid를 생산하는 재조합 대장균을 개발하였다. 그 결과, 탄소원으로 포도당을 사용하여 발효를 통해 cis,cis-muconic acid \( 36.8 \mathrm{~g/L} \), 수율 \( 22 \% \), 그리고 부산물로 DHS \( 3 \mathrm{~g/L} \), catechol \( 1.6 \mathrm{~g/L} \)을 얻었다. 발효배양액을 활성탄 및 여과법으로 세포를 제거한 액에 \( 10 \% \) 백금촉매(Pt on carbon)를 이용하여 \( 3,400 \mathrm{~kPa} \)의 수소가스 압력에서 수소화반응을 시켜 \( 97 \% \) 수율로 adipic acid를 얻었다.</p><p>Shikimic acid 생산: Shikimic acid는 기능성을 가진 6개의 탄소 환상구조와 3개의 비대칭성 중심을 가지기 때문에 생물학적으로 중요한 화합물 합성의 building block으로 사용되고 있다. 그 예로, 조류독감바이러스 치료제인 Tamiflu 합성의 출발물질로 사용되고 있으며, combinatorial library synthesis의 핵심 골격물질로 이용되며, 또한 수분이 거의 없는 상황에서 고온·가열처리하여 phenol 합성에 이용될 수 있다. 과거에는 중국의 전통 향신원료인 팔각(star anise)에서 추출하였는데 원료공급의 부족, 제조공정의 번거러움 및 낮은 수율때문에, 재조합 미생물에 의한 생산 연구가 많이 보고되고 있다. Shikimic acid를 생산하는 미생물을 개발하는 방법은, AAA 생합성 공통경로상에서 축적되는 shikimic acid를 shikimate 3-phosphate(S3P)로 전환시키는 shikimate kinase 유전자를 제거하여 생산하는 방법과 S3P를 EPSP(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate)로 전환을 촉매하는 EPSP synthase(AroA) 결손 미생물을 제작하고 세포내의 bacterial phosphatases 활성을 이용하여 shikimic acid를 생산하는 2가지 개발방법이 알려져 있다. Shikimate kinase 결손 미생물에 의한 shikimic acid를 생산하는 대표적인 방법은, 대장균 염색체에서 shikimate kinase를 암호화하는 2가지 유전자인 aroK 및 aroL을 결손하고, serA를 결손하면서 aroB유전자를 1copy 삽입한 E. coli SP1.1을 제작하고, DAHP의 기질인 PEP의 공급을 잘 하기 위해서 포도당 phosphoenolpyruvate-phosphotransferase system(PTS)에 관여하는 ptsH, ptsI, crr유전자를 결손하여 E. coli SP1.1pts 균주를 제작하였다. 한편, hydroquinone 생산균주 제작에서 언급된 plasmid pKD12.138에 포도당의 세포내 수송시 facilitated diffusion을 매개하며 PEP를 사용하지 않고 직접 인산화시키는 Zymomonas mobilis 유래의 glf-glk(glucose facilitator 및 glucose kinase를 암호화하는 유전자)를 cloning하여 최종적으로 pSC6.090B를 제작하고 E. coli SP1.1pts 균주에 형질전환하여 shikimic acid를 생산하는 재조합대장균을 개발하였다. 그 결과, 10-L 발효조에서 shikimic acid \( 84 \mathrm{~g/L} \), 수율 \( 33 \% \)의 매우 높은 기술수준을 얻었다. 그런데, 생산되는 shikimic acid는 DHQ, DHS와의 평형반응 및 AroE의 부반응에 의해 QA로의 전환이 이루어져서 부산물로 DHS \( 10 \mathrm{~g/L} \), QA \( 2 \mathrm{~g/L} \)가 생성되는 문제점이 나타나는데, 향후 이러한 부산물을 더 감소시킬 수 있는 연구가 필요한 상황이다.</p><p>p-Hydroxybenzoic acid(pHBA) 생산: pHBA는 방부제 및 보존제로 사용되는 parabens 합성에 사용되며, 타이어의 방부제로의 수요가 증가하는 상황이며, 최근에는 결정과 액체의 성질을 모두 가진 기능성 소재인 액정고분자(liquid crystal polymers)의 major monomer로 사용되는 석유화학원료물질로, 현재 페놀로부터 고온, 고압하에 상당량의 부산물이 생기면서 화학적으로 합성(Kolbe-Schmidt reaction)된다.</p><p>포도당으로부터 생물학적인 방법으로는 얻는 방법은 E. coli 유래의 chorismate pyruvate-lyase(CPL) 유전자 ubiC를 E. coli, Mycobacterium tuberculosis 또는 식물체인 Nicotiana tabacum의 엽록체 게놈에 도입하여 chorismate로부터 pHBA를 생합성하는 방법, 유기용매 내성 Pseudomonas putida S12에 Rhodosporium turuloides 유래의 phenylalanine ammonia lyase 유전자를 도입하여 tyrosine으로부터 pHBA를 생산하는 방법등이 알려져 있다. 대장균에서 pHBA를 생산하기 위해서는 먼저 chorismate에서 곁가지로 빠지는 경로를 차단하기 위해 chorismate mutase-prephenate dehydratase를 암호화하는 pheA, chorismate mutase-prephenate dehydrogenase를 암호화하는 tyrA, anthranilate synthase를 암호화하는 trpE~C 유전자들이 결손된 대장균을 제작하고 여기에 방향족 공통경로의 탄소흐름을 증가시키기 위해 serA 유전자 부위에 tac promoter에 연결된 aroA, aroL, aroC, aroB 유전자를 추가적으로 1copy 더 삽입한 재조합 E. coli JB161을 개발하였다. 한편, chorismate로부터 pHBA의 합성을 촉매하는 효소의 유전자 ubiC는 \( aroF^{\mathrm{FBR}} \), tktA 및 serA와 함께 plasmid에 cloning하여 벡터 pJB2.274을 만들고, 이를 E. coli JB161에 형질전환하여 pHBA를 생산하는 재조합 대장균을 개발하였다. 그 결과, 탄소원으로 포도당을 사용하여 발효를 통해 pHBA \( 12 \mathrm{~g/L} \), 수율 \( 13 \% \), 그리고 부산물로 prephenic acid \( 6.3 \mathrm{~g/L} \), phenylalanine \( 4.1 \mathrm{~g/L} \), DHS \( 1.4 \mathrm{~g/L} \)가 축적되었다. 생성되는 pHBA는 세포에 대한 독성이 심하며, 낮은 농도에서도 UbiC 효소의 대한 강한 feedback inhibition을 일으키는 문제점이 나타났다. 또한, chorismate로부터 방향족 아미노산 합성경로를 차단하더라도 비효소적인 반응에 의해서 prephenate가 생기며, 추가적인 효소반응에 의해서 phenylpyruvate, phenylalanine등이 축적되는 문제점도 있어 pHBA 생산효율이 높지 않은 상황이다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서 Suzanne 등은 유기용매 내성 P. putida S12 미생물을 이용하여 pHBA를 생산하는 결과를 보고하였다. 즉, 기질로부터 tyrosine을 합성하는 탄소흐름이 증가되어 있으며, 생성되는 pHBA의 분해에 관여하는 pobA(p-hydroxybenzoate hydroxylase 유전자)가 결손된 P. putida S12palB1 미생물에 phenylalanine ammonia lyase를 과발현하여 tyrosine으로부터 p-coumarate(4-hydroxycinnamic acid)로 전환시킨 후 세포내 원래 존재하는 효소들에 의해서 최종적으로 pHBA가 축적되는 재조합 Pseudomonas를 개발하였다. 그 결과 glycerol을 탄소원으로 이용하여 pHBA \( 1.8 \mathrm{~g/L} \), 수율 \( 8.5 \% \)의 결과를 보고하였지만, 대장균을 이용한 Barker 등의 연구결과보다는 매우 낮은 수준이다. 한편, Viitanen 등은 식물체인 담배의 엽록체내 게놈에 E. coli ubiC 유전자를 삽입/발현하여 건체중량으로 \( 13 \)~\( 18 \% \)의 glucose-conjugative form의 pHBA를 생산하는 연구결과를 발표하였다. 비록 현재는 그 수율이 낮지만 향후 추가적인 기술개발로 pHBA 수율을 올릴 수 있다면 재조합 식물기반 화학원료물질을 생산하는 좋은 예가 될 수 있을 것으로 사료된다.</p>