본 논문에서는 A. actinonuycetemcomitans의 표준균주 및 임상분리균주의 형태적 특징과 생화학적 성상을 파악하였다. 또한 A. actinonuycetemcomitans의 Proinflammatory cytokine의 정량을 알기위해 표준 균주 및 임상분리 균주가 apoptosis를 유도 할 때 생산하는 Proinflammatory cytokine의 종류를 조사하고 시간별로 배지 내에 분비되어 축적된 cytokine의 양을 연구하였다.
<h1>결 과</h1><h2>표준균주 및 임상분리균주의 형태적 특징 및 생화학적 성상</h2><h3>형태적 특징</h3><p>본 연구에 사용된 표준균주 A. actinonuycetemcomitans ATCC 29522,43717,43718,43719와 임상 분리 균주들을 BHA 평판배지에서 3일간 배양하였을 때의 집락의 양상은 Fig. 1의 a와 같았다. 특히 임상분리균주는 TSBV 배지에서 특징적으로 집락의 중앙에 이균의 특징적인 inner star 형태을 나타내었으며, 이를 BHA에서 연속 계대배양할 경우 이 형태는 없어지고, 표준균주와 동일한 양상을 나타내었다. A. actinomycetem -comitans 균주의 그람 염색 결과는 그람음성 구, 간균의 형태를 나타내었다.</p><h3>생화학적 성상</h3><p>Bergeys's Manual of Systematic Bacteriology에 의한 A. actinomycetentcomtans의 일반적인 생화학적 성상 분류기준에 따라 생화학적 성상을 조사한 결과 A. actinomycetencomitans로 동정된 모든 분리균주들은 장내세균 감별에 이용되는 MacConkey배지에 성장하지 않았고, catalase반응에 양성을 나타내었으며 nitrate를 nitrite로 환원시켰다. Oxidase와 urease에는 음성을 나타내었고 indole을 생성하지 않았다. Arigine dilhydrolase, lysine decarboxylase에 음성반응을 보였고 glucose, fructose, mannose를 fermentation시켰다.</p><h3>임상분리균주의 혈청형</h3><p>병원성과 비병원성의 A. actinonlycetemcomitans는 5가지의 혈청형으로 분류하는데, 일반적으로 우리나라에서 치주질환과 관련성이 있는 혈청은 헐청형 b로 알려져 있고, 일부 유럽이나 다른 지역에서는 혈청형 a와 c가 치주질환과 관련이 있다는 보고가 있다. 본 연구에 사용된 A. actinomycetemcomitans 균주의 혈청형은 응집반응과 ELISA를 통하여 확인한 결과, 분리된 균주 17주 중에 혈청형 a에 속하는 것이 8주, b에 속하는 것이 1주, 혈청형 c에 속하는 것이 8주였다. 슬라이드 응집반응보다는 ELISA에서 역가 차이가 분명하였으므로 혈청형 결정에는 ELISA 방법이 더 유용함을 확인할 수 있었다.</p><h3>표준균주 및 임상분리균주의 유전자형</h3><p>본 연구에 사용된 표준균주와 헐청형이 b인 임상분리균주 J 1의 유전자형을 결정하기 위하여 AP-PCR을 실시하였다. 1차적으로 16개의 random primer를 사용하여 가장 유용한 primer를 찾는 실험을 실시하였으며, 그 중 primer-15와 primer-16을 이용한 결과가 균주간의 가장 뚜렷한 전기 영동상의 차이를 나타내었다. 임상분리균주 J 1 은 primer 15에서 비병원성 혈청형 균주 ATCC 43717과 가장 유사한 유전자형을 나타내었고, primer 16의 경우에서는 병원성 혈청형 균주 ATCC 29522와 가장 유사한 유전자형을 나타내었다.</p><p>표준균주와 혈청형 a와 b로 확인된 분리균주는 모두가 다른 RAPD 유전자형을 나타내었다. 혈청형 c로 확인된 분리균주에서도 다양한 유전자형을 나타냈으나, 일부 특히 같은 환경에서 많은 시간을 함께보이는 건강인(동아의대 학생)에서 분리한 경우에 비교적 일정한 패턴을 보이는 것을 관찰할 수 있었다.</p><h3>A. actinomycetemoomitans에 의한 Jurkat 세포주의 생존율 검사</h3><p>표준 균주인 ATCC 29522, 43717, 43719 균주와 임상 분리균주인 J 1을 대상으로 Jurkat 세포주에 접종하여 세포의 생존율을 조사하였다. ATCC 29522 표준균주는 균 접종 후 12시간에 세포의 생존율이 감소하기 시작하였다. 세포주의 생존율은 세균과 세포의 비가 500:1일 때 균 접종 후 15시간과 24시간에 각각 \( 68 \% \) 와 \( 18 \% \) 로 감소하였다. 임상분리균주 J 1도 균 접종 후 12시간부터 세포의 생존율이 감소하였으며(생존율; \( 82 \% \) ), 세포주의 생존율은 균 접종 후 15시간과 24시간에 각각 \( 69 \% \) 와 \( 33 \% \) 로 감소하였다. 그러나 혈청형 a와 c에 속하는 ATCC 43717, 43719 균주는 24시간 내에는 균을 접종하지 않은 대조군과 생존율에 차이가 없었다.</p><p>이러한 세포의 생존율 저하가 A. actinomycetemcomitans ATCC 29522와 J 1에 의해 Jurkat 세포조가 apoptosis로 유도되기 때문임을 확인하기 위하여 Jurkat세포주의 DNA가 fragmentation이 되는지를 조사하여 A. actinomycetemcomitans J 1의 경우에 Fig. 5과 같은 결과를 얻었다. DNA가 fragmentation되는 정도는 균 접종 후 15시간에서 24시간에 증가하였다. 이 결과는 trypan blue 염색약 배제 실험을 실시하였을 때 살아있는 세포의 수가 감소하는 결과와 일치하며, 이는 살아있는 Jurkat 세포주의 감소가 A. actinomycetemcomitans 에 의해 유도된 apoptosis 때문임을 시사한다. 세포주와 생존율에 차이가 없었던 ATCC 43717 및 43719는 Jurkat 세포주에 apoptosis를 유도하지 못하였다.</p><h2>Proinflammatory cytokine의 정량</h2><p>A. actinomycetemcomitans 표준 균주 및 임상분리 균주가 apoptosis를 유도 할 때 Jurkat 세포주가 생산하는 proinflammatory cytokine (Il-1 \(\beta \), Il-6, IFN-\( \gamma\), TNF-\(\alpha\), TGF \( \beta \))의 종류를 조사하고 시간별로 배지 내에 분비되어 축적된 cytokine의 양을 ELISA 방법으로 조사하였다. 실험 결과 J 1 임상분리균주에 의해 Jurkat 세포주가 강력한 포유동물의 골 융해요소로 알려져 있는 IL-1\( \beta \)는 균 감염 후 6시간 째부터 TNF-\( \alpha \)는 균 감염 후 3시간 후에 생산되었다. 반면에 표준균주인 ATCC 29522는 IL-1\( \beta \) 는 균 감염 후 6시간 째부터, IL-6는 균 감염 후 9시간후에 생산되어, 동일 유전자형, 동일 혈청형의 균주간에도 Jurkat 세포주의 cytokine 생산양상에 차이를 보였다. 표준균주인 ATCC 29522 와 J1 임상분리균주는 Jurkat 세포주에서 IFN-\( \gamma \) 와 TGF \( \beta \) 의 생산을 유도하지 않았다.</p>