NGF 수용체 신호전달과정의 변화를 관찰하기 위해 PRO-PREP Protein Extraction Solution과 SMARTTM BCA Protein Assay Kit을 사용하여 단백질을 분리, 정량하여 western blot에 사용하였다. B35세포에 NGF 분비를 촉진하는 맥문동 유수추출물을 처리하여 확보한 배양액의 NGF 농도는 \( 28 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)이었다.이들 NGF 배양액을 CMV hTMP 벡터로 형질주입된 세포에 처리 후 수확하여 반응을 관찰하였으며, 배양액에서 NGF의 농도는 Chemikine NGF ELISA kit를 구입하여 권장법에 따라 측정하였고, 반응종결에 따라 나타난 변화는 ELISA-reader를 이용하여 \( 450 \mathrm { ~nm } \)에서 측정하였다.
<h2>Westem blot</h2> <p>세포에서 NGF 수용체 신호전달과정의 변화를 관찰하기 위하여 PRO-PREP Protein Extraction Solution (iNtRON Biotechnology, Sungnam, Korea)을 세포에 첨가하여 분쇄한 후 \( 13,000 \mathrm { rpm } \) 에서 5 분 동안 원심분리하여 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질의 농도는 SMARTTM BCA Protein Assay Kit (iNtRON Biotechnology)을 이용하여 정량하였으며, 30-60 \( \mu \mathrm { g } \) 의 단백질을 western blot에 사용하였다. 먼저, 8- \( 10 \% \) SDS-PAGE gel에 단벡질을 전기영동한 후 Enhanced hemiluminescence (ECL) 막(Amersham Life Science, Piscataway, \( \mathrm { NJ } \) )에 전이하고, 5 \% skim milk에서 1 시간 동안 블로킹하였다. 단백질이 전이된 막은 anti-p75 \( { } ^ {\mathrm { NIR } } \) antibody (Cell Signaling Technology, Beverley, MA), anti-RhoA anti-body (Cell Signaling Technology), anti-TrkA antibody (Cell Signaling Technology), anti-p-TrkA antibody(Cell Signaling Technology), anti-Akt antibody (Cell Signaling Technology), anti-p-Akt antibody (Cell Signaling echnology), anti-ERK antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), an-ti-p-ERK antibody (Santa CruzBiotechnology), anti-3-actinantibody (Sigma-Aldrich, St Louis Mo, USA)등의 1차 항체로 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 밤새 배양한 후, HRP-onjugated된 secondary anti-body를 첨가하여 ECL Kit (Amersham Life Science, Piscataway, NJ)를 이용하여 develop하였다.</p> <h2>NGF 처리 및 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 측정</h2> <p>신경세포에서 직접 분비되는 NGF 배양액을 확보하기 위하여 NGF 분비를 촉진하는 물질로 알려진 맥문동 유수추출물을 \( \mathrm { B } 35 \) 세포에서 24 시간 동안 처리하여 배양액을 확보하여 NGF 농도가 \( 28 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 임을 확인하였다. 이들 NGF 배양액을 \( \mathrm { CMV } / \mathrm { hTMP } 21 \) 벡터로 transfection된 세포에 24 시간동안 처리 한 후 세포를 수확하여 반응을 관찰하였으며, 배양액에서 NGF의 농도는 Chemikine NGF ELISA kit (Billerica, MA, USA)를 구입하여 권장법에 따라 측정하였다. 채취된 배양액은 먼저 \( 5,000 \mathrm { rpm } \) 에서 2 분 동안 원심분리하여 세포를 침전시 켜 상층액을 준비하였다. ELISA kit의 각 well에 100 ul의 배양 액을 넣고, plate sealer로 plate를 덮고 밤동한 배양하였다. Plate를 wash buffer 250 ㅆl로 4 번 세척하고, anti-mouse NGF monoclonal antibody \( 100 \Perp \) 를 첨가하고 실온에서 shaking 배양하였다. 2시간 후 wash buffer로 4번 세척해주고, perox-idase conjugated donkey anti-mouse IgG polyclonal anti-body 100 씨를 첨가하고 실온에서 shaking 배양하였다. 여기에 100 씨의 substrate (TMB)을 첨가하여 실온에서 15 분 동안 효소반응을 유도한 뒤, 100 씨의 stop solution을 첨가하여 반 응을 종결하였다. 반응종결에 따라 나타난 변화는 ELISA-reader (VERSA max, micro-reader, MDS Co., USA)를 이용하여 \( 450 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다.</p>