밭 토양 시료에 밀기울과 PKM을 첨가한 SMM 배지에 접종 후 약 4일 동안 진탕 배양을 진행하였고, 이를 동일한 배지에 3-4일 간격으로 계대 배양하였다. Mannanase와 xylanase 활성은 각각 LBG와 oat spelt xylan을 기질로 하여 환원당을 DNS 방법으로 측정하였다. 조효소액은 SDS-PAGE 후, isopropanol이 포함된 sodium phoscitrate buffer로 세척하였다. 발색시키기 위해 ethanol, p-anisaldehyde, sulfuric acid, 그리고 glacial acetate를 혼합한 발색제 용액을 뿌린 후, \( 120^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 방치하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>Hemicellulases 생산균의 탐색</h2> <p>국내 밭 토양시료를 채취하여 \( 0.25 \% \) 의 밀기울과 palm kernel meal(PKM)이 첨가된 SMM 배지 \( \left(0.2 \%\left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4}\right. \), \( 1.4 \% \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}, 0.6 \% \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 0.1 \% \) trisodium citrate \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \), \( 0.02 \% \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) )에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 약 4 일간 진탕배양하고 동일한 배지에 3-4일 간격으로 3회 계대 배양을 실시하였다. 계대배양액을 \( 0.25 \% \) oat spelt xylan과 \( 0.25 \% \) locust bean gum(LBG)가 탄소원으로 첨가된 \( \mathrm{SMM} \) 평판배지에 도말하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 콜로니가 형성될 때까지 배양하였다.</p> <h2>효소 활성 측정</h2> <p>Mannanase 활성은 \( \mathrm{LBG} \) 를, xylanase 활성은 oat spelt xylan을 기질로 하여 각각 효소 반응 후에 유리된 환원당을 3,5-dinitrosalicylic acid(DNS) 방법[10]으로 다음과 같이 정량 함으로써 측정하였다. 증류수에 현탁 시킨 \( 1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \mathrm{LBG} \) 용액 또는 xylan 용액 \( 0.5 \mathrm{~mL} \) 와 \( 200 \mathrm{mM} \) sodium phosphate \( (\mathrm{pH} 6.5 / 6.0) 0.25 \mathrm{~mL} \) 를 효소 용액 \( 0.25 \mathrm{~mL} \) 와 혼합하여 적정온도에서 15 분 동안 반응시켰다. DNS 용액 \( 3 \mathrm{~mL} \) 를 첨가하여 반응을 정지시키고 끓는 물에서 5 분 동안 방치하여 발색시킨 후 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. Mannose 또는 xylose를 표준시료로 사용하여 동일조건에서 발색시켜 조사한 흡광도와 비교함으로써 유리된 환원당의 양을 결정하였다. 효소 활성도 \( 1.0 \) unit는 위의 조건에서 1분 동안 LBG 또는 xylan으로 부터 \( 1 \mu \mathrm{mol} \) 의 mannose 또는 xylose에 상응하는 환원당을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.</p> <h2>활성염색</h2> <p>조효소액을 SDS-PAGE한 후 polyacrylamide gel에서 \( \mathrm{SDS} \) 를 제거하기 위해 \( 25 \% \) isopropanol를 포함한 \( 50 \mathrm{mM} \) sodium phoscitrate buffer(pH 6.5)로 세척한 후 동일완충액에 15-30분간 방치하였다. Polyacrylamide gel을 꺼내어 동일한 완충용액에 \( 0.2 \% \) xylan 또는 \( 0.2 \% \) konjac과 \( 1.5 \% \) agar를 녹여 제조한 gel을 중층하여 비닐로 봉입한 후 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 일정시간 반응시킨 후 중층한 gel을 congo red로 염색하여 분해된 부분을 관찰하였다.</p> <h2>반응산물 분석</h2> <p>농산 부산물을 기질로 하여 과량의 효소를 첨가하고 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 실시하였으며, 반응액의 \( \mathrm{pH} \) 는 최적으로 조절하여 4 시간 반응을 수행하였다. 반응 후에 반응액을 3 분 동안 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 열처리한 후 원심 분리하여 단백질 침전물을 제거하고 상등액을 적정량 취해 chloroform, acetic acid와 증류수(4.3: \( 5: 0.7,(\mathrm{v} / \mathrm{v})) \) 혼합용액을 전개용액으로 하여 silica gel-precoated thin layer plate(Merck Kiesegel, No. 5748)에서 박층 크로마토그래피를 수행하였다. 전개된 물질을 발색시키기 위해서는 ethanol \( (9 \mathrm{~mL}), p \)-anisaldehyde \( (0.5 \mathrm{~mL}) \), sulfuric acid \( (0.5 \mathrm{~mL}) \) 와 glacial acetate 멏 방울을 혼합한 발색제 용액을 뿌린 후, \( 120^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 방치하였다.</p>