본 연구에서는 2005년 4월부터 9월까지 부산지역 4개 병원의 무균성 수막염 의심 환자 292건의 검체를 사용하였다. 10세 미만 환자가 256건, 10세 이상이 36건이며, 남성 환자가 154건, 여성 환자가 138건이었다. 대변, 뇌척수액, 인후도찰물을 원료로 사용하였으며, 이를 처리하기 위해 다양한 방법을 사용하였다. RNA 추출은 NucleiSens Lysis Buffer와 NucleiSens Isolation Reagent를 사용하였다. 최종적으로는 Real-time NASBA를 이용하여 enterovirus RNA를 검출하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>공시재료 및 세포배양</h2> <p>2005년 4월부터 9월까지 부산지역 4개 병원 소아과 내원 무균성수막염 의심 환자의 대변 197건, 뇌척수액 69 건, 인후도찰물 26 건 등 총 292 건의 검체를 공시재료로 사용하였다. 검체의 연령별 구분은 10 세 미만이 256건, 10 세 이상이 36 건이며, 성별 구분으로는 남자 154 건, 여자 138 건이었다. 인후도찰물은 VTM (virus transport medium)을 사용하여 채취하였고 뇌척수액은 별도의 전처리 없이 사용하였다. 대변은 PBS/ chlorform을 사용하여 \( 10 \% \) 부유액으로 만든 다음 5분 동안 강하게 진탕하고 \( 4,000 \mathrm { rpm } \) 에서 20 분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 실험에 사용하였다. 각각의 검체는 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 운반하였고 \( -70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 를 유지하여 보관하였다. 일반적으로 enterovirus의 분리에 가장 적절한 세포는 일차배양 원숭이 신장세포(primary monkey kidney cell)이지만 매번 이 세포를 획득하기가 현실적으로 어려우므로 세계보건기구(WHO)가 추천하는 세포 중 RD (human rhabdomyosarcoma) 세포주를 사용하였다.</p> <h2>RNA 분리</h2> <p>대변상층액, 뇌척수액, 인후도찰물의 RNA 추출은 NucleiSens Lysis Buffer와 NucleiSens Isolation Reagent를 사용하여 제조사(bioMerieux, Boxtel)의 프로토콜에 따라 수행하였다. 검체 \( 200 \mu 1 \) 와 \( 900 \mu 1 \) 의 lysis buffer를 사용하였고 \( 25 \mu \mathrm { l } \) 를 elution하였다. 이 RNA 추출물을 real-time NASBA와 RT-PCR에 사용하였다.</p> <h2>Real-time NASBA 시험</h2> <p>Real-time NASBA를 이용한 enterovirus RNA 검출을 위하여 190 nucleotides의 specific primers와 molecular beacon probe는 Eurogentec (Seraing, Belgium)에 의뢰하여 합성 및 HPLC 정제하였고, NucleiSens Amplification kit (bioMerieux, Boxtel)를 사용하여 수행하였다(Table 1). \( 10 \mu \mathrm { l } \) master mix \( (0.2 \mu \mathrm { M } \) primer \( 1,0.2 \mu \mathrm { M } \) primer \( 2,0.2 \mu \mathrm { M } \) molec-ular beacon probe, \( 90 \mathrm { mM } \mathrm { KCl } \) )에 \( 5 \mu \) template RNA를 첨가한 후 template RNA의 predenaturation과 master mix에 pri-mer가 용해되게 하기 위해 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } 5 \) 분, \( 41 ^ {\circ } \mathrm { C } 5 \) 분간 반응하였다. 그리고 이 mixture에 5 씨의 enzyme mix (T7 RNA polymer-ase, AMV reverse transcriptase and RNase \( \mathrm { H } \) )를 첨가하여 NucleiSens EasyQ analyzer (bioMerieux, Boxtel, The Netherlands)에서 \( 41 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 150 분간 반응하면서 증폭 및 검출을 수행하였다. 데이터는 NucleiSens EasyQ analyzer 제조사의 NucleiSens EasyQ director software (version 1.2.1.0)를 이용하여 분석하였다. 20 건의 enterovirus 음성검체를 이용하여 4 회의 real-time NASBA 실험을 수행하여 나온 결과 값을 제조사의 방법에 따라 계산하여 threshold fluorescence level을 결정하였다.</p>