효소활성에 영향을 미치는 요인은 여러가지가 있다. 효소 활성의 최적 \( \mathrm{pH} \) 는 염기성이 산성보다 더 우수하였으며, 금속이온에 대해서는 \( \mathrm{Mn}^{2+} \) 에서 최적의 활성 상태를 띄었다. 이밖에서도 정제 효소에 대한 기질 농도 및 chito 올리고당의 분해 양상을 실험을 통해 확인해 볼 수 있다.
<h2>Native PAGE를 이용한 활성 band 확인</h2> <p>효소정제를 위하여 40시간 동안 배양한 후 배양액을 원buffer, \( \mathrm{pH} 8 \sim 10 \)은 borate buffer, \( \mathrm{pH} 10 \sim 11 \)은 \( \mathrm{NaHCO}_{3} \). \( \mathrm{NaOH} \) buffer를 그리고 \( \mathrm{pH} 11 \sim 12 \) 는 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot \mathrm{NaOH} \) buffer에 각각 효소를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분간 방치한 다음 효소 의 잔류활성을 측정해 보았다. 그 결과 Fig. 6 (D)에서 보는 것과 같이 \( \mathrm{pH} 6 \) 에서 가장 안정하였다. 특이한 것은 \( \mathrm{pH} 11 \sim 12 \)에서 상당히 안정함을 보였는데 이것은 아마도 phosphate의 영향이 아닌가 생각된다. 그리고 대체적으로 산성 쪽에서보다는 염기성 쪽에서 더 안정한 것으로 확인되었다. 효소 활성 최적 \( \mathrm{pH} \) 에 대한 결과는 Fig. 6 (C)에서 보는 바와 같이 \( \mathrm{pH}6 \)의 phosphate buffer에서 가장 높은 활성 을 보였다. 효소활성에서도 \( \mathrm{pH} \) 안정성과 마찬가지로 염기성 쪽에서 더욱 높은 활성을 보였다.</p> <h2>정제효소의 금속이온에 따른 효소활성의 영향</h2> <p>효소활성에 미치는 금속이온의 영향을 검토하기 위하여 효소액을 \( 20 \mathrm{mM} \) EDTA가 포함된 phosphate 완충액 \( (\mathrm{pH} \) 7.0)에 24시간 투석 후 다시 EDTA가 없는 동일 완충액에 24시간 투석 처리하였다. 처리된 효소에 각각의 금속이온을 \( 10 \mathrm{mM} \) 되게 첨가한 후 효소활성을 측정하여 상대적인 효소활성을 측정하였다.</p> <h2>효소의 기질특이성 실험</h2> <p>효소의 반응 특이성을 알아보기 위하여 여러 종류의 chito 올리고당들을 기질로 하여 효소반응을 한 뒤 반응 산물을 HPLC를 통해 분석하였다. Column은 carbohydrate analysis P/N84038 (Waters社)을 사용하였고 용매는 acetonitlile : water \( (70: 30, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 를 사용하였으며 유속은 \( 0.5 \) \( \mathrm{m} \ell / \mathrm{min} \) 으로 하여 RI (refractive index) 검출기를 이용해서 검출하였다.</p> <h2>정제효소의 금속이온에 따른 효소활성의 영향</h2> <p>효소활성에 대한 금속이온의 영향을 검토하기 위하여 조효소액에 각각의 금속이온을 \( 1 \mathrm{mM} \) 되게 첨가하여 전술한 활성 측정법으로 비교하였다. 효소액은 \( 20 \mathrm{mM} \) EDTA가 포함된 \( 50 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 7)에 효소를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 투석한 후, EDTA가 없는 동일한 완충액에 24시간 투석하였다. 그 결과 Table 5 에 나타난 것처럼 \( \mathrm{Co}^{2+}, \mathrm{Mg}^{2+} \) 에서 비교적 높은 활성을 보였으며 \( \mathrm{Mn}^{2+} \) 에서 가장 높은 활성을 보였고 \( \mathrm{Hg}^{2+} \) 에서는 활성에 상당한 저해를 받는 것으로 확인되었다.</p> <h2>정제효소의 기질 농도에 따른 영향</h2> <p>정제된 효소에 대한 colloidal chitin의 농도에 대한 영향을 Lineweaver Burk plot으로부터 측정하여 \( K_{\mathrm{m}} \) 값을 구하였다. 그 결과 Fig. 7에서 보는 바와 같이 본 효소에 col-loidal chitin에 대한 \( K_{\mathrm{m}} \) 값은 \( 17.33 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 로 확인되었다.</p> <h2>정제효소의 chito 올리고당의 분해 양상</h2> <p>Chi-56A가 chito 올리고당을 기질로. 했을 때 어떤 분해 양상을 가지는지를 실험해 본 결과 Fig. 8 에서 보는 바와 같이 \( (\mathrm{GlcNAc})_{2} \)는 거의 분해하지 않았다. 그리고 \( (\mathrm{GlcNAc})_{4} \)와 \( (\mathrm{GlcNAc})_{6} \) 의 경우에도 Fig. 8 (D)와 \( (\mathrm{GlcNAc})_{32} \)(F)의 결과로 보아 분해산물로 \( (\mathrm{GlcNAc})_{2} \) 만이 생성되는 것을 확인하였다. 또한 Fig. 8 (C)와 (E)의 결과에서 와 \( (\mathrm{GlcNAc})_{5} \) 의 분해산물은 GlcNAc와 \( (\mathrm{GlcNAc})_{2} \) 를 함께 생성하였다. 위의 두 가지 결과에 의해 Chi- 56A는 chitin 사슬의 비환원성 말단으로부터 이당체인 diacetyl chitobiose \( (\mathrm{GlcNAc})_{2} \)를 생산하는 exo형 chitinase로 추정된다.</p>