10종의 종자를 국립백두대간수목원 종자은행에서 분양 받아 X-ray로 충실률, Seed Information Database와 국가생물종지 식정보시스템을 참고하여 발아 조건을 설정하고 생장상에서 30일간 배양하여 발아율, T50, MGT를 계산하였다. 종자를 액체 질소와 균질기로 갈아 건중량 대비 20배 \( ( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) 의 \( 75 \% \mathrm { MeOH } \)로 7일간 추출하고 0.45\(\mu\mathrm{m}\) PVDF4525A를 이용하여 여과하고 감압 농축하여 DMSO 10mg/mL로 녹여 -20\(^\circ \mathrm{C}\)에 보관하였다. 또한 표준물질로 gallic acid를 희석하여 검량선을 만들고 종자 추출물 내 함량을 gallic acid equivalent로 나타내었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료 및 종자 활력 평가</h2> <p>본 실험은 국립백두대간수목원 종자은행에서 분양 받은 10 종의 종자를 사용하였다(Table 1). 추출을 진행하기 전 종자의 상태를 평가하기 위해 충실률 및 발아검사를 진행하였다. 충실률(Percent of filled seeds, PFS)은 X-ray (EMT-F70, Softex Co., Ltd, Kobe, Japan)를 이용하여 25립 4반복으로 즌사하였다. 각 종들의 발아조건은 Seed Information Database와 국가생물종지 식정보시스템을 참고하여 설정하였다. 앞서 조사된 발아 조건 및 충실률에 따른 발아능력을 평가하기 위하여 25 립 4 반복을 기준으로 over-sowing을 위한 종자량을 계산하여 생장상 (TGL-1S, ESPEC MIC Corp., Osaka, Japan)에서 최대 30일간 배양하였다. 발아율은 매일 24시간 마다 유근이 종피를 뚫고 돌출된 종자를 기준으로 조사하였으며, 최종발아율(Percent of germination, \%), T50 (Time to \( 50 \% \) germination, days), 평균발아소요일수(Mean ger nination time, MGT, days)을 계산하였다. T50과 평균발아소요일수는 Dezfuli의 방법을 참고하여 계산하였다. 또한, \( 50 \% \) 미만의 최종 발아율을 나타낸 종자는 \( 100 \mathrm { ppm } \) 의 \( \mathrm { GA } _ { 3 } \) 를 처리하여 추가적인 발아능력을 평가하였다.</p> <h2>종자 추출물 제조</h2> <p>종자를 액체 질소와 균질기(Bead Ruptor 24 Elite, Omni-International, Kennesaw, GA, USA)를 이용하여 곱게 갈아 건중량 대비 20 배 \( ( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) 의 \( 75 \% \mathrm { MeOH } \) (Macron Fine Chemicals, Radnor, PA, USA)을 가하여 진탕배양기에서 상온에서 7일간 추출하였다. 제조된 종자 추출물은 여과지 \( (0.45 \mu \mathrm { m } \), PVDF4525A, Hyundai Micro Co., Seoul, Korea)를 이용하여 여과한 후 감압 농축기로 감압 농축하여 용매를 완전히 제거한 후 \( \mathrm { DMSO } ^ {\text { 에 } } 10 \) \( \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) 의 농도로 녹여 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 보관하면서 본 실험에 사용하였다.</p> <h2>총 페놀성 화합물 함량 측정</h2> <p>총 페놀성 화합물 함량은 Singleton의 연구[19]를 변형하여 측정하였다. 종자 추출물 \( 20 \mu \mathrm { L } \) 에 증류수에 녹인 \( 0.4 \mathrm { ~N } \) Folin \& Ciocalteu's phenol reagent (Sigma Chemical Co.) \( 40 \mu \mathrm { L } \) 를 넣어준 후 5분간 방치한 후, \( 140 \mu \mathrm { L } \) 의 \( 700 \mathrm { mM } \mathrm { Na } 2_ { 2 } \mathrm { CO } \) - (Daejung, Siheung-si, Korea)를 넣어주고 상온에서 2 시간 반응 후 microplate reader (Multiskan go, Thermo Scientific, Vantaa, Finland)로 \( 765 \mathrm { ~nm } \) 에서 반응액의 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 gallic acid (Sigma Chemical Co.)를 희석하여 검량선을 만들어 종자 추출물 내 총 페놀성 화합물 함량을 gallic acid equivalent로 나타내었다.</p>