실험에 필요한 백혈병 세포주 K562와 HL-60 세포는 한국 세포주 은행에서 구입하고 RPMI640 배지를 사용해 배양기에서 배양하였다. 그리고 STC, STD, anti-cytochrome c 등 실험에 필요한 시약을 마련하였다. Apoptotic 분석을 위해 각 세포를 분주하고 다양한 농도의 STC와 STD를 첨가하여 배양하였다. 이후 시약을 처리하고 세포 10,000개 당 apoptotic cell의 수를 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포 배양</h2> <p>백혈병 세포주인 HL-60와 K562 세포는 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 구입하였고, \(10\%\) 우태아 혈청(Fetal Bovine Serum; FBS, GIBCO, Grand Island, NY)과 \( 100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{mL} \)의 페니실린과 스트렙토마이신(GIBCO, Grand Island, NY)이 첨가된 RPMI640 배지(GIBCO, Grand Island, NY)를 사용하여 \( 37 \mathrm{C}\), \( 5 \% \) \(\mathrm{CO}_{2} \), 완전 습윤 상태의 배양기에서 배양하였다.</p> <h2>시약</h2> <p>STC와 STD는 정제된 가루의 형태로 러시아의 Stonik 교수 (Pacific Institute of Bioorganic Chemistry)로부터 받아서 사용하였다. 3, 3'-dihexyloxacarbocyanine iodide \( \left(\mathrm{DiOC}_{6}\right) \) 는 Molecular Probes (Eugene, OR)사로부터 구입하였으며, anti-cytochrome c 그리고 anti-\(\beta\)-actin antibodies는 Sigma (St Louis, MO, USA)사의 제품을 사용하였고, anti-poly (ADP-ri-bose) polymerase (PARP) 및 anti-AIF, anti-Smac/DIABLO antibodies는 Cell Signaling사의 제품을 사용하였으며, anti-procaspase 3, anti-COX Ⅳ (cytochrome oxidase IV)는 Santa-Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)사의 제품을 사용하였고, anti-procaspase 8, anti-procaspase-9 anti-bodies는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)사의 제품을 사용하였으며, anti-ceramide antibody는 Alexis Biochemicals (San Diego, CA, USA)사의 제품을 사용하였다. Caspase-8 저해제인 Z-Ile-Glu-Thr-Asp-fluoromethyl ketone (Z-IETD-FMK), caspase-9 저해제인 Z-Leu-Glu-His-Asp-fluoromethyl ketone (Z-LEHD-FMK), pan-caspase 저해제인 Z-Val-Ala-Asp-fluoromethyl ketone (Z-VAD-FMK)와 caspase-3 저해제인 Z-Asp (OCH3)-Glu (OCH3)-Val-Asp (OCH3)-fluo-romethyl ketone (Z-DEVD-FMK)는 Sigma (St Louis, MO, USA)사로부터 구입하였으며, Annexin V-FITC apoptosis detection kit는 BD pharmingen (Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)사의 제품을 사용하였다. 그 외의 모든 시약은 Sigma (St Louis, MO, USA)사의 제품을 사용하였다.</p> <h2>Apoptosis assay (Annexin V/PI staining)</h2> <p>각 세포를 6 well plates에 세포 수가 \( 3 \times 10^{5} / \mathrm{ml} \)이 되도록 분주하여 \( 0.1 \% \) DMSO (대조군) 및 다양한 농도의 STC와 STD를 첨가하여 2, 4, 및 6시간 배양하였고 또한 여러 가지 저해제의 영향을 살펴보기 위하여 \( 0.5 \mu \mathrm{M} \) STC와 \( 1.0 \mu \mathrm{M} \) STD를 처리하기 1시간 전에 저해제들을 처리하여 배양하였다. 배양 후, 배양된 세포들을 수확하여 \( 200 \mu \mathrm{l} \)의 annexin V binding buffer를 넣은 후, annexin V-FITC와 PI를 \( 5 \mu \mathrm{l} \) 첨가하고, 빛을 차단하여 \( 37 ^{ \circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 반응한 후, 유세포 분석기(FACScan, Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 세포 10,000개 당 apoptotic cell의 수를 측정하였다. 각 실험은 3회 반복하여 시행하였다.</p>