신두리 해안사구에 자생하는 해안사구식물의 뿌리에서 분리한 내생진균류의 동정으로 ITS영역의 염기서열을 확인하기 위해 DNeasyPlant mini kit를 사용하여 동결건조 상태의 내생진균류의 균체의 genomic DNA를 추출하여 PCR의 주형으로 사용하였다. PCR 반응 후 QIAquick PCR purification kit를 사용하여 전기영동 단편들을 정제하였으며, 전기영동 단편들은 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit를 사용하고 반응 DNA 단편들은 ABI 310 DNA sequencer를 사용하여 염기서열 결정 반응을 수행하였다.
<h2>내생진균의 분리 및 배양조건</h2> <p>신두리 해안사구에서 채집한 해안사구식물의 뿌리의 토양을 세척하고, 계면활성제(Tween 80, Duksan, South Korea)를 10분간 2회 처리한 후에 멸균증류수(Sterile distilledwater)로 세척하였다. 그리고 과염소산(Perchloric acid, \( 1 \% \) , Duksan, South Korea)을 10분간 2회 처리한 후, 멸균증류수로 세척하여 수분을 제거하였으며, 식물 뿌리시료를 \(3 \sim 4 \mathrm { cm } \) 길이로 절단하여 실험재료로 사용하였다. 식물뿌리시료로부터 내생진균을 분리하기 위하여, 스트렙토마이신(Streptomycin, Sigam-aldrich, USA) 80 \(ppm \)이 함유된 Hagem minimal (HM) 배지를 사용하였고, 식물뿌리시료를 최소배지에 올려 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 조건에서 배양하였다. 그리고 식물뿌리시료 단면에서 내생진균류를 toothpicking하였고, HM 배지에 획선도말법(Streaking)을 이용하여 다시 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 조건에서 배양하였다. 그리고 식물뿌리 내생진균을 potato dextrose agar (PDA, Difco, USA)에 계대배양하였고, 균사의 형태, 색상 등을 확인하고 선별하여 순수 분리하였다. 해안사구식물의 뿌리에서 순수 분리한 내생진균류의 동정을 위하여, potato dextrose broth (PDB, Difco,USA)에서 7일동안 \(120 rpm \)으로 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 조건하에서 진탕배양(shake culture) 하였으며, 여과지를 사용하여 내생진균의 균체(mycobiont)를 동결건조하여 동정을 위한 시료로 사용하였다.</p> <h2>Genomic DNA의 추출과 PCR 조건</h2> <p>신두리 해안사구에 자생하는 해안사구식물의 뿌리로부터 분리된 내생진균류의 동정으로 ITS 영역의 염기서열을 확인하기 위하여, 동결건조 상태의 내생진균류의 균체를 DNeasyPlant mini kit (QIAgen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 genomic DNA를 추출하여 PCR의 주형으로 사용하였다. Genomic DNA로부터 rDNA-ITS 영역을 증폭하기 위해 ITS1과 ITS4 primer를 사용하였다. 그리고 내생진균의 동정을 위하여, polymerase chain reaction(PCR) 조건은 최종농도 PCR 조건은 최종농도 Tris-HCl \( 10 \mathrm { mM } \left ( \mathrm { pH } \right . \) 8.5), \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \) \( 1.5 \mathrm { mM } , \mathrm { dNTPs } ~200 \mathrm { nM } , \mathrm { KCl } ~40 \mathrm { mM } \) 이고, \( 10 \mathrm { pmol } \) 의 primer와 \( 0.1 \) unit의 Ex-Taq DNA polymerase (Takara, Japan)늘 사용하였다. PCR 반응조건은 \( \left (95 ^ {\circ } \mathrm { C } , 2 \mathrm { ~min } \right ) \) prodenaturation, \( \left (95 ^ {\circ } \mathrm { C } , 30 \mathrm { sec } \right ) \) denaturation, \( \left (49.5-54.5 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ., 1 min \)), annealing, \( \left (72 ^ {\circ } \mathrm { C } , 7 \mathrm { ~min } \right ) \) final extension으로 수행하였고, 증폭 된 \( \mathrm { PCR } \) 산불은 \( 1.5 \% \) agarose gel에서 전기영동 후, ethidium bromide ( \( \mathrm { EtBr } \), Sigam-aldrich, USA)을 사용하여 20분 염색한 후, UV transilluminator로 전기영동밴드를 확인하였다. PCR 반응 후, 전기영동 단편들은 QIAquick PCR purification kit (Qiagen Inc., Germany)를 사용하여 정제하였으며, ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (PE Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 염기서열 결정 반응을 수행하였다. 반응 DNA단편들은 ABI 310 DNA sequencer (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.</p>