Micrroarray 실험을 위해서 UV를 이용하여 변이 처리해 분리한 프로판올 내성주 E. coil P19를 사용하였다. 이때 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 호기적인 조건에서 진탕 배양 하였으며 , 전체 RNA 분리 및 프로판올 내성 측정을 위해 50ml의 LB배지를 함유한 삼각플라스크 250ml을 이용하였으며 , 세포 성장은 분광광도계를 이용하여 600nm에서 흡광도를 관측하였다. 그리고 cDNA 합성은 Nimblegen Expressoion protocol에 따라 SuperScript double-stranded cDNA synthesis kit (Invitrogen Life Technologies, USA)을 사용하였으며 ,결과적으로 E.coil에 존재하는 rpoH 유전자를 클로닝 하기 위해 Forward primer의 5' 말단에는 BanHl , reverse primer의 5' 말단에는 Sphl 제한 효소 인식 서열을 삽입하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>균주 및 플라스미드</h2><p>Microarray 실험에는 야생주인 E. coli W3110과 W3110에서 UV를 이용하여 변이 처리하여 분리한 프로판올 내성주 E. coli P19를 사용하였다. E. coli W3110의 rpoH 유전자를 파손하기 위한 공여균은 일본 NBRP (National BioResource Project) 에서 분양받은 transposon insertion disruptant 중의 하나인 E. coli JD15211 (rpoH::Kn)를 사용하였으며, W3110에서 rpoH가 파손된 E. coli DRP17은 프로판올 내성효과 평가실험을 위한 균으로 이용하였다. rpoH 유전자의 클로닝을 위한 플라스미드는 pBeloBac11 (New England Biolabs, USA)을 사용하였다.</p><h2>배지 및 배양조건</h2><p>균주는 통상적으로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 LB (Luria-Bertani) 배지를 사용하여 호기적인 조건에서 진탕 배양하였으며, 항생제가 필요시, kanamycin과 chloramphenicol은 각각 \( 25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)와 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)을 첨가하였다. P1 파지 형질도입에 사용하는 배지는 LGCM (tryptone \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), yeast extract \( 5 \mathrm{~g} / \mathrm{l}\), \(\mathrm{NaCl} ~5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), glu-cose \( 2 \mathrm{~g} / \mathrm{l}\), \(\mathrm{CaCl}_{2} ~2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \(0.01 \mathrm{mM}\), \(\mathrm{MgSO}_{4} ~7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \(1 \mathrm{mM} \) )배지를 사용하였다. 전체 RNA 분리 및 프로판올 내성을 측정하기 위하여 \( 50 \mathrm{ml} \)의 LB배지를 함유한 \( 250 \mathrm{ml} \)의 삼각 플라스크를 사용하였으며, 세포성장은 분광광도계(Shimadzu UV mini-1240, Japan)를 이용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 관찰하였다.</p><h2>세포수확 및 RNA 정제</h2><p>전제 RNA를 분리하기 위해 야생주와 프로판올 내성주를 배양하다가 OD가 약 0.7 될 때, W3110과 P19 세포의 반은 프로판올을 \( 17.5 \mathrm{~g} / \mathrm{l}\) 를 첨가하고, 나머지 반은 프로판올을 첨가하지 않은 다음 10분이 경과한 후 세포 \( 1 \mathrm{ml} \)을 취해 원심분리 한 후 RNA later (Ambion, USA)를 첨가하여 보관한 다음, RNeasy Mini Kit (Qiagen, Dutch)를 사용하여 RNA를 분리하였다. 정제된 RNA의 순도와 온전함(integrity)은 \( 260 \mathrm{~nm} \) 와 \( 280 \mathrm{~nm} \)에서의 흡광도 비율을 계산하였으며, Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA)를 사용하여 분석하였다.</p><h2>Microarray 실험 및 분석</h2><p>cDNA 합성은 Nimblegen Expressoion protocol에 따라 SuperScript double-stranded cDNA synthesis kit (Invitrogen Life Technologies, USA)를 사용하였다. 즉, \( 10 \mu \mathrm{g} \)의 total RNA로부터 random primer를 이용하여 역전사(reverse-tran-scription)하여 second-strand cDNA를 합성하고 정제 후 ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop, USA)로 정량하였다. cDNA는 Nimblegen Expression protocol에 따라서 One-Color Labeling Kit (Nimblegen)를 사용하여 라벨링하였다. \( 1 \mu \mathrm{g} \) 의 cDNA 샘플을 Cy3-random nonamer를 사용하여 Cy3로 라벨링한 다음 ND-1000 Spectrophotometer로 정량하였다. Labeled cDNA 샘플은 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 16-20시간 Nimblegen Expression array (E. coli \( 4 \times 72 \mathrm{K} \) array)와 혼성화하였다. Arrays는 \( 532 \mathrm{~nm} \) 에서 \( 2 \mu \mathrm{m} \) 의 해상도로 NimbleGen MS 200 Microarray scanner set로 스캐닝하여 TIFF format으로 이미지를 만들었다. NimbleScan v2.5를 사용하여 array data를 추출가공하고 분석하였다. 미가공 data는 NimbleScan v2.5 (Gene Expression RMA algorithm)를 사용하여 추출하였다. 2,535개 유전자 각각의 24개 probes의 평균 spot replicates로부터 single raw intensity value를 결정하였다. 발현 data의 통계적 중요성은 fold change로 결정하였다. Hierarchical cluster 분석은 complete linkage와 Euclidean distance로 결정하였다.</p><h2>rpoH disruptant 균주제작</h2><p>Bacteriophage P1 lysate를 제작하기 위해 유전자 공여균주 (donor cell)인 E. coli JD15211을 kanamycin을 함유한 \( 3 \mathrm{ml}\) LB배지에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 16시간 진탕배양 후 \( 2 \mathrm{ml}\) LGCM 배지에 \( 1 \% \) 를 접종하여 OD가 0.2가 될 때까지 배양한 다음 P1 phage를 \( 20 \mu \mathrm{l}\) 주입하여 세포가 lysis될 때까지(약 2~3시간) 배양하였다. 배양액에 클로로포름 \( 100 \mu \mathrm{l}\)를 주입하여 잘 현탁시킨 후 30분간 실온에서 방치시킨 후 2회 원심 분리한 다음 상등액에 클로로포름 \( 50 \mu \mathrm{l}\)를 현탁하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다. 제작한 P1 lysate를 수용균주(recipient cell)인 E. coli W3110에 감염시키기 위하여 \( 3 \mathrm{ml} \)의 LB배지에 접종하여 16시간 동안 배양한 후 \( 2 \mathrm{ml}\) LGCM배지에 \( 1 \% \)를 접종하여 OD가 0.5가 될 때까지 진탕배양하였다. 배양액 \( 1 \mathrm{ml} \)을 원심분리 후 침전물을 \( 100 \mu \mathrm{l}\)의 LGCM배지에 현탁시킨 다음 상기에서 제작한 P1 ly-sate를 \( 20 \mu \mathrm{l}\) 주입하여 30분간 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 진탕배양 시킨 후 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium citrate \( (\mathrm{pH} 5.8) \) 완충액으로 3회 세척하였다. 이를 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium citrate \( 100 \mu \mathrm{l}\)에 현탁 시킨 후 kanamycin이 함유된 LB에 도말하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 성장하는 colony를 순수 분리하여 최종적으로 E. coli DRP17를 선별하였다.</p><h2>rpoH 유전자 클로닝</h2><p>E. coli에 존재하는 rpoH 유전자를 클로닝하기 위해 다음과 같은 primer를 제작하였다. Forward primer의 \( 5^{\prime} \) 말단에는 BanHI, reverse primer의 \( 5^{\prime} \) 말단에는 SphI 제한효소 인식서열을 삽입하였다(forward primer: CCGCGGATCCGGGTGGC AGCGTGGCTTGCC; reverse primer: ACATGCATGCTGCCAGTAACGCTTTACCCT). Pfu- X polymerase (Solgent, Korea)를 이용하여 E. coli W3110에서 추출한 염색체를 주형 DNA로 사용하여 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 20초, \( 55^{\circ} \mathrm{C}\) 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 45초의 조건으로 30 cycle의 polymerase chain reaction을 수행하였다. 정제한 rpoH유전자 단편 \( 1.46 \mathrm{~kb} \)와 클로닝 벡터 pBeloBac11을 각각 BamHI과 SphI 제한효소로 이중절단하고, 다시 ligation하여 재조합 plasmid pBRH46을 제작하고 염기서열을 확인하였다.</p>