본 연구에서는 MITF, TRP2, TYR, MLPH 유전자의 프로모터와 루시퍼라아제 유전자를 아데노바이러스 리포터 벡터에 클로닝하였으며, 이를 \( 293 \mathrm{~A} \) 세포에 삽입하여 아데노바이러스를 제작하였으며, 24-well plate에 배양된 HM3KO 세포에 아데노바이러스를 감염시킨 후 발광단백질인 루시퍼라아제의 발현을 측정해 루시퍼라아제의 활성도 측정하였다. 다음으로 웨스턴 블롯 실험을 진행하였으며, 멜라닌 합성 관련 유전자들의 발현을 단백질 수준에서 비교하기 위하여 준비된 세포를 buffer에 넣고 얼음 속에서 세포를 용해 시켰다. 그리고 이를 균질화하여 얻은 균질액을 이용해 총 단백질을 정량하는 과정을 거쳤다. 제브라피쉬 모델 실험의 경우 이전 방법대로 수행했으며, 위 세 실험을 통계분석하는 것은 GraphPad Prism을 통해 이루어졌다.
<h2>아데노바이러스 제작 및 루시퍼라아제(luciferase) 활성도 측정</h2><p>MITF, TRP2, TYR, MLPH (melanophilin) 프로모터의 활성을 측정하기 위하여 이들 유전자의 프로모터와 루시퍼라아제 유전자를 아데노바이러스 리포터 벡터에 클로닝하였다(MITF-Luc, MLPH-Luc, TRP2-Luc, and TYR-Luc). 아데노바이러스를 제조하기 위하여 상기에서 클로닝 된 벡터를 Lipofectamine 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 \( 293 \mathrm{~A} \) 세포에 삽입하였다. \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10일 동안 배양하여 아데노바이러스를 제조하였다. 제조된 아데노바이러스의 발광단백질인 루시퍼라아제의 발현을 측 정하기 위하여 24-well plate에 배양된 HM3KO 세포에 아데노바이러스를 감염시킨 후 24시간 경과 후 겨우살이 추출물을 24시간 처리하였다. Luciferase lysis buffer를 처리하고 20분간 교반한 다음 용해된 세포를 수확하였다. 세포 현탁액을 원심분리하여 상등액에 루시퍼라아제 활성 분석용 기질 시약을 첨가하고 루시퍼라아제 활성을 Glomax Multi Detection System (Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 측정하였다.</p><h2>웨스턴 블롯</h2><p>멜라닌 합성 관련 유전자들의 발현을 단백질 수준에서 비교하기 위하여 준비된 세포를 차가운 PBS 완충액으로 2회 세척 후, protease & phosphatase inhibitor cocktail (1861281; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 섞어 제조한 radioimmunoprecipation assay buffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)을 넣고 얼음 속에서 10분간 세포들을 용해시켰다. 다시 초음파분쇄기를 이용하여 균질화 하였다. 균질액은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 13,000 \times \mathrm{g} \)으로 15분간 원심분리 한 후 상층액을 BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 총 단백질을 정량하였다. 정량된 단백질은 동일한 농도 \( (30 \mu \mathrm{g}) \)로 \( 10 \% \) SDS polyacrylamide gel에서 전기영동 후 nitrocellulose membrane으로 옮기고 나서 \(5\%\) skim milk (Difco, Detroit, MI, USA)가 첨가된 Tris-buffered saline with \( 0.05 \% \) Tween 20 (TBST) 완충액으로 1시간 실온에서 blocking 하였다. TRP1 (sc-166857, Santa Cruz Biotechnology), TRP2 (sc-25544, Santa CruzBiotechnology), Tyrosinase (sc-20035, Santa Cruz Biotechnology), MITF (sc-515925, Santa Cruz Biotechnology), phospho-Akt (4060s, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), Akt (2972s, Cell Signaling Technology), phospho-CREB (9198s, Cell Signaling Technology), CREB (9197s, Cell Signaling Technology), phospho-Erk1/2 (9101s, Cell Signaling Technology), Erk1/2 (9102s, Cell Signaling Technology)에 대한 1차 항체를 \( 5 \% \) skim milk에 희석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 냉장고에서 overnight시켰다. 다음날 horseradish peroxidase (HRP)가 결합되어 있는 2차 항체와 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 다시 TBST 완충액으로 10분간 3회 세척한 후 Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad Laboratories, Inc., Berkeley, CA, USA)로 1분간 반응시킨 뒤 ChemiDoc \( { }^{\mathrm{TM}} \) Touch Imaging System(Bio-Rad Laboratories, Inc.)을 사용하여 band를 검출했으며, \( \beta \)-actin (Sigma, St Louis, MO, USA)을 loading control로 사용하였다.</p><h2>제브라피쉬 모델</h2><p>제브라피쉬를 사용한 평가는 이전에 보고된 방법대로 수행하였다. 배아는 아침에 불을 켜서 유도된 자연 산란에서 얻었다. 배아의 수집은 30 분 이내에 완료되었다. 동기화된 배아를 피펫으로 수집하고 웰당 \( 200 \mu \mathrm{l} \)의 배아 배지를 포함하는 96-well plate의 각 웰에 3~4 마리의 배아를 넣었다. ME는 \( 0.1 \% \mathrm{DMSO} \)에 녹이고 \(20\) 또는 \( 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 수정 후 9시간에서 55시간까지 처리하였다(46시간 노출). 화합물의 균일한 분포를 보장하기 위해 때때로 배지를 교체하고 교반하였다. 모든 실험에서 \( 0.2 \mathrm{mM} \) 1-phenyl 2-thiourea (PTU)를 양성 대조군으로 사용하였다. 관찰을 위해 배아를 집게로 dechorionation하고 tricaine methanesulfonate 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 마취하였다. 슬라이드(Aquatic Eco-Systems, Apopka, FL, USA)에 3\% methyl cellulose에 mounting하여 입체현미경(MZ16; Leica Microsystems, Ernst-Leitz-Strasse, Germany)을 사용하여 이미지를 얻었다.</p><h2>통계분석</h2><p>GraphPad Prism (버전 5.01; GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 통계 분석에 사용하였다. 데이터는 평균\( \pm \)표준편차로 표시하였다. 그룹 간 차이를 분석하기 위해 one-way ANOVA를 통해 통계적 유의성을 \( 5 \% \) 수준에서 분석하였고, 사후검정으로 Mann-Whitney test를 수행 하였다.</p>