PCR을 이용하여 콩 및 옥수수의 음성 대조 품종을 확인하기 위해 1차 확인시험에서 내재유전자 및 전사개시/종결인자에 대한 프라이머로 PCR을 실시하고 양성 밴드가 확인된 시료에 대하여 5종의 구조유전자 primer를 이용하여 2차 확인 PCR 시험을 실시하였다. 비형질전환 표준 시료를 작물의 음성대조품종으로 위해 구입하여 사용하였다. 반응액 조성은 10x PCR buffer, MgCl2, dNTPs, Taq DNA polymerase, 각 primer, template DNA로 준비하였다. 반은조건은 최초 변성으로 40 cycle을 실시하고 최종신장후 PCR 산물을 보존하였다. 과정을 거쳐 증폭된 DNA 산물을 확인하였다.
<h2>PCR</h2> <p>추출 DNA에 대한 PCR 은 2회 차 실시하였다. 1차 확인시험에서는 내재유전자(콩의 경우 Le1n, 옥수수의 경우 SSIIb)와 전사개시인자(P35S) 및 전사종결인자(NOS)에 대한 프라이머로 PCR을 실시하였고 양성 밴드가 확인된 시료에 대하여 콩의 경우 RRS, 옥수수의 경우 Mon810, Bt176, Bt11, GA21, T25 등 5종의 구조유전자 primer를 이용하여 2차 확인 PCR 시험을 실시하였다. 반응에 사용된 프라이머는 일본 Nippon Gene Co.에서 생산하는 유전자재조합식품 검출용 oligonucleotide를 구입 사용하였고 각각 프라이머에 대한 정보는 Table 1.에 나타내었다.</p> <p>GM 콩 및 옥수수의 음성 대조 품종으로는 Fluka Co.의 비형질전환(non GMO) 표준 시료를 구입하여 사용하였다.</p> <p>반응액 조성은 \( 10 \times \) PCR buffer \( 2.5 \mathrm {\mu l } \) (TaKaRa, Japan), dNTP \( 2.0 \mu \mathrm { l } \) ( \( 10 \mathrm { pM } \)), Taq DNA polymerase 1 unit, primer \( 0.5 \mathrm {\mu l } \), template DNA \( 2.5 \mathrm {\mu l } \), 증류수 \( 15.875 \mathrm {\mu l } \) 를 넣어 시료당 \( 25 \mathrm {\mu l } \)로 PCR를 수행하였다. 반응조건은 최초 변성 \( \left (95 ^ {\circ } \mathrm { C } \right . \), 10 분)수행 후 denaturation \( \left (95 ^ {\circ } \mathrm { C } , 30 \right . \) 초), annealing \( \left (60 ^ {\circ } \mathrm { C } \right . \) , 30초), extension \( \left (72 ^ {\circ } \mathrm { C } \right . \), 30초)으로 40 cycle을 실시하고 마지막 단계로 최종 신장( \( \left (72 ^ {\circ } \mathrm { C } \right . \) , 7분) 후 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( \mathrm { PCR } \) 산물을 보존하였다. 증폭된 DNA 산물은 \(1.5 \% \) agarose gel (TaKaRa LO3, Japan)에서 전기영동 후 ethidium bromide 염색하여 확인하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>DNA 추출 및 확인</h2> <p>가공식품에서 추출된 DNA의 순도는 대체로 1.7 ~ 2.0이었으며 농도는 \( 60.5 \sim 331.1 \mathrm { ng } / \mathrm {\mu l } \)로써 추출된 DNA는 PCR 을 수행하는데 있어서 적절한 것으로 확인되었다. 추출 DNA의 농도는 제품별로 차이를 보였는데 이는 藤波傳子 등 [17]의 보고와 같이 된장 등과 같은 발효식품의 경우 시료채취 시점에 따라 재조합 DNA 추출량에 변화가 있음을 알 수 있었다. 추출한 DNA를 \( 0.8 \% \) agarose gel에서 전기 영동한 결과 대부분의 경우 밴드는 확인 되지 않았다(data not shown). 이는 가공식품에서의 DNA는 분해되어 다양한 작은 크기로 존재하는 것으로 추정되었다. 김 등, 황 등은 이러한 현상은 가공공정 중에 DNA가 파괴되는 것으로서 두부, 두유에 비해 발효과정이 포함된 된장 등에서 보다 다양한 가수분해효소의 작용으로 내재 DNA의 대부분이 작은 DNA 형태로 관찰됨을 보고한 바 있다.</p>