Biolog test 결과와 API 50CHB test 결과를 바탕으로 API \( 50 \mathrm { CHB } \) database V4을 이용하여 동정한 결과, 균주 FBL-1은 Bacillus megaterium 과 \(73 \%\), B subtilis와 \( 22.9 \% \) 특성이 유사한 것으로 판정되었으나 보다 더 정확한 동정을 위해서는 \( 16 \mathrm { ~S } \mathrm { rDNA } \) 염기서열 분석을 통한 비교가 필요할 것으로 판단되었고 균주 \( \mathrm { FBL } -1 \) 의 \( 16 \mathrm { ~S } \mathrm { rDNA } \) 염기서열을 분석하여 NCBI의 BlastN program으로 다른 미생물들과의 상동성을 조사한 결과, Bacillus 속 미생물들과 높은 상동성을 보였으며 subtilis FBL-1의 발효가 진행되는 동안 protease의 생산에 가장 큰 영향을 미치고, 보다 높은 수준의 protease를 생산할 수 있는 탄소원을 알아보기 위하여 총 9 가지의 탄소원 종류에 따른 protease 활성과 건조균체량을 비교하였다.
<p>starch, D-turanose에 대한 assimilation 반응에서 양성으로 관찰되었으며, esculin hydrolysis (ß-glucosidase) 효소반응에서 양성을 보였다. 비교 균주인 B. subtilis subsp. subtilis NCIB 3610의 경우 glycerol, L-arabinose, ribose, D-xylose, glucose, fructose, mannose, inositol, mannitol, sorbitol, \( \alpha \)-methyl-D-glucoside, amygdalin, arbutin, esculin, salicin, cellobiose, maltose, melibiose, sucrose, trehalose, inulin, raffinose, starch, glycogen, xylitol, D-turanose에 대하여 양성으로 반응하였으며, B. subtilis DSM 347의 경우 glycerol, L-arabinose, ribose, D-xylose, glucose, fructose, mannose, inositol, mannitol, sorbitol, \( \alpha \)-methyl-D-glucoside, arbutin, esculin, salicin, cellobiose, maltose, melibiose, sucrose, trehalose, inulin, raffinose, glycogen, xylitol, D-turanose에 대하여 양성반응을 나타냈다[14]. Table 2 에서 보는 바와 같이 protease 생산에 대해서는 FBL-1, B.subtilis subsp. subtilis NCIB 3610, B. subtilis DSM 347 모두 양성임을 알 수 있었다. Biolog test 결과와 API 50CHB test 결과를 바탕으로 API \( 50 \mathrm { CHB } \) database V4.0을 이용하여 동정한 결과, 균주 FBL-1은 Bacillus megaterium 과 73 \%, B. subtilis와 \( 22.9 \% \) 특성이 유사한 것으로 판정되었으나 보다 더 정확한 동정을 위해서는 \( 16 \mathrm { ~S } \mathrm { rDNA } \) 염기서열 분석을 통한 비교가 필요할 것으로 판단되었다.</p> <h2>계통발생학적 특성</h2> <p>균주 \( \mathrm { FBL } -1 \) 의 \( 16 \mathrm { ~S } \mathrm { rDNA } \) 염기서열을 분석하여 NCBI의 BlastN program으로 다른 미생물들과의 상동성을 조사한 결과, Bacillus 속 미생물들과 높은 상동성을 보였다. Table3 에서 보는 바와 같이 FBL-1 균주의 16S rDNA 염기서열은 B. subtilis subsp. subtilis NCIB 3610 (99.5 \%), B.subtilis subsp. inaquosorum KCTC 13429 (99.4 \%), B.subtilis subsp. spizizenii NRRL B-23049 (99.3 \%), B.methylotrophicus KACC 13105 (99.3 \%) 등 Bacillus 속 균주들과 높은 상동성을 나타냈다. 이 결과를 바탕으로 Neighbor-Joining 법, Maximum likelihood 법, Maximum parsimony 법으로 각각 계통도를 작성하여 그 결과를 Fig.2 에 나타냈다. 계통발생학적 관계를 바탕으로 균주 FBL-1을 B. subtilis FBL-1으로 최종 명명하였고, 그 \( 16 \mathrm { ~S } \) rDNA 염기서열은 GeneBank에 KR336550으로 등록하였다.</p> <h2>탄소원 종류에 따른 균체 성장 및 protease 활성 비교</h2> <p>B. subtilis FBL-1의 발효가 진행되는 동안 protease의 생산에 가장 큰 영향을 미치고, 보다 높은 수준의 protease를 생산할 수 있는 탄소원을 알아보기 위하여 총 9 가지의 탄소원 종류에 따른 protease 활성과 건조균체량을 비교하였다. Fig. 3에서 보는 바와 같이 건조균체량은 탄소원을 첨가하지 않은 경우를 제외하고 모두 높은 결과를 보였으나, protease 활성은 특정 탄소원에서만 높게 나타났다. Fructose를 탄소원으로 첨가한 경우의 protease 활성이 \( 201.436 \mathrm { U } / \mathrm { ml } \) 로 가장 우수한 결과를 보였으며, 그 다음으로 maltose 117.681 \( \mathrm { U } / \mathrm { ml } \), sucrose \( 90.116 \mathrm { U } / \mathrm { ml } \), glucose \( 36.046 \mathrm { U } / \mathrm { ml } \) 등의 protease 활성을 나타내었다. 균체 성장의 경우 glucose를 탄소원으로 사용한 경우 건조균체량이 \( 2.065 \mathrm { ~g } / 1 \) 로 가장 높게 나타났으나 protease 활성은 \( 36.046 \mathrm { U } / \mathrm { ml } \) 로서 상대적으로 낮은 결과가 관찰되었다. 반면, fructose를 탄소원으로 사용한 경우 건조균체량은 \( 1.580 \mathrm { ~g } / 1 \) 로 실험에 사용한 탄소원들 중 중간 정도의 균체 성장을 보였으나 protease 활성은 가장 높은 값을 나타냈다. 탄소원을 첨가하지 않은 경우에도 건조 균체량은 \( 0.689 \mathrm { ~g } / \) 까지 증가하였는데, 이는 복합질소원인 beef extract에 포함된 영양원에 의한 것으로 생각되나 protease 활성은 전혀 검출되지 않았다. 이 실험의 결과로부터 B. subtilis FBL-1을 이용한 protease 생산에 있어서 fructose가 가장 우수한 탄소원임을 알 수 있었다. 탄소원을 포함하지 않고 beef extract \( 5 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \) 만을 포함한 배지의 경우 protease 활성을 전혀 보이지 않았으나, 탄소원을 포함한 모든 배지에서 효소활성이 나타나는 것으로 보아 탄소원이 protease 생산에 중요한 영향을 미친다는 사실을 알 수 있었다.</p>