선별된 EP15224 균주는 그람 음성의 운동성을 지니는 호기성간균으로, 이 균주에 의해 생산된 보라색 색소물질은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 두 개의 피크(retention time 4.52분과 5.24분)로 구분되었다. 이 균주를 MM2-I 배지에서 3일간 배양하면 비올라세인이 리터당 최대 280mg까지 생산될 수 있는 것으로 관찰되었으며, 이는 이전에 보고된 Massilia sp.BS-1에 의한 최대 비올라세인 생산량인 40mg/l보다 훨씬 높은 수치이다. 이러한 결과는 EP15224 균주의 높은 비올라세인 생산능력을 입증하는 것이며, 이 균주는 색소물질의 효율적인 생산에 적합할 수 있음을 보여준다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>비올라세인 생산 균주의 선발</h2> <p>한국의 삼림 토양에서 분리한 800여 주의 저 영양미생물 자원으로부터 R2A 고체배지(Difco사) 상에서 보라색 집락을 형성하는 EP15224 균주를 육안으로 우선 1차 선발 분리하였다. 선발 균주에 의해 생산되어 추출된 보라색 색소물질은 HPLC에 의해 주 피크(retention time 4.52분)와 작은 피크(retention time 5.24분)로 분리되었다. 각각의 피크를 MS/MS로 분석한 결과, 주 피크는 molecular mass \( (\mathrm{m} / \mathrm{z}) \) 가 344.1029 (positive), 작은 피크는 328.1089 (positive)으로 결정되었다(Fig. 1). 이는 violacein과 deoxyviolacein의 이론상 분자량이 각각 343.335 와 327.335 달톤 임을 고려하였을 때 이 균주가 생산하는 두 종의 보라 색소물질이 violacein 과 deoxyviolacein임을 확인해 주는 결과이다. 그리고 HPLC 정량 분석결과는 EP15224 균주가 생산하는 보라색소 중 \( 90 \% \) 이상이 violacein이라는 것을 제시하였다.</p> <h2>균주의 생리 생화학적 특성과 분류학적 위치</h2> <p>EP15224 균주는 운동성을 가지는 그람 음성 균의 호기성간균이다. R2A 고체 배지에서 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 로 배양하면 2일 후에는 보라색 집락으로 변한다. R2A 액체배양 시에는 \( 25-28^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 균도 잘 자라고 보라색소의 생산량도 많지만 \( 32^{\circ} \mathrm{C} \) 이상에는 균 성장은 우수하나 보라색소가 잘 형성되지 않았다. API32GN에 의한 생화학반응을 분석한 결과에서 이 균주는 4개의 당(D-glucose, maltose, glycogen, D-mannitol)과 4개의 유기산(acetate, citrate, lactate, propionate)을 주 탄소원과 성장원으로 이용하였으나 L-rhamnose, D-ribose, sucrose, D-melibiose, L-fucose, L-arabinose, D-mannose는 이용하지 못하였다. 이것은 2011년 Massilia 종에서 비올라세인 생산으로 최초 보고된 Massilia sp. BS-1 균주가 8개의 당(D-glucose, D-mannose, D-galactose, D-xylose, D-fructose, maltose, cellobiose, dextrin)과 3개의 유기산(acetate, citrate, malate)을 탄소원과 에너지원으로 이용한다는 결과와는 다른 특성을 보여준다. 그리고 Massilia의 표준균주로 사용한 KACC 12152 와 12178 의 생화학적 특성과도 상이하였다.</p> <p>또한 이 균은 16S rRNA 유전자 염기서열에서 Massilia dura KACC 12152 와 가장 높은 \( 97.5 \% \) 를 나타냈다. 그러나 이 표준 균주는 비올라세인을 생산하지 않음은 물론, 탄소원으로의 이용성을 조사한 API 32GN의 반응에서도 EP15224 균주와 많은 점이 달랐다(Table 2). 그리고 Massilia 종에서 처음으로 비올라세인의 생산을 보고한 Massilia sp. BS- 1 균주와는 \( 97 \% \) 의 상동성을 보였기 때문에 EP15224 균주는 Massilia 속 내의 다른 종임을 의미하다. 또한 비올라세인을 생산하는 다른 종의 세균과 Massilia 표준균주들 간의 16S rRNA 유전자 염기서열에 근거해 작성된 계통분석도(phylogenetic tree)에서 보는 바와 같이 이 Massilia sp. EP15224는 다른 종들과 뚜렷이 구분되어 있다(Fig. 2).</p> <h2>비올라세인 최적 생산 조건</h2> <p>EP15224 균주가 플라스크 배양 수준에서 경제적으로 보라색의 색소물질인 비올라세인을 생산할 수 있는 최적의 배지 조성 및 배양 조건을 조사하였다. MM2-B 기본 액체배지를 사용하여 \( 22-37^{\circ} \mathrm{C} \)에 걸친 비올라세인 생산능을 분석하였을 때, \( 32^{\circ} \mathrm{C} \) 이상에서는 보라색소 생산능이 현저히 떨어졌으며 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 균의 성장은 왕성하나 색소생산을 관찰 할 수 없었다. 이와 반면에 \( 22-28^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 비교적 우수한 생산 올라세인 생산 온도였다. 그리고 균의 접종 량을 비교하였을 때, \( 1 \% \) 보다는 \( 10 \% \) 로 접종하면 배양기간이 크게 단축되며 생산량도 현저히 높아졌다. 또한, MM2-B 기본배지에서 탄소원으로 \( 0.2 \% \) glucose, 질소원으로 \( 0.1 \%\left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4}, 1 \mathrm{mM} \) tryptophane, \( 0.1 \% \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 로 고정하고 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 와 \( \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \) 의 농도를 달리한 Table 1의 배지조성에 따라 비올라세인 생산량을 5일간 조사한 결과는 Fig. 3 과 같다. MM2-B 배지를 제외한 3종의 MM2배지 모두 배양 3일까지는 비례적으로 생산이 증가했으나 그 이후엔 생산량이 증가되지 않았다. 그러나 MM2-B 배지는 5일까지 증가했지만 생산량은 3일째 MM2-I 배지에 미치지 못했다. MM2-I 배지에서 배양 3일을 기준으로 비올라세인은 리터당 최대 \( 280 \mathrm{mg} \)까지 생산되었으며 이는 Massilia sp. BS-1에 의해 보고된 비올라세인 최대 생산량 \( 40 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \)보다 높은 결과이다. 특히 Massilia sp. BS-1의 경우 tryptophane과 histidine이 동시에 첨가되었을 때 비올라세인 생산량이 높았으나 본 균주는 tryptophane 첨가만으로도 생산이 증가되었다. 그리고 본 균주는 영양분이 풍부한 Luria-Bertani 액체배지나 nutrient 액체배지에서 성장은 잘 되지만 보라색소 생산능은 현저히 저하되었다. 그러나 배지 내 영양 성분 함량이 매우 낮은 저 영양배지인 R2A 액체배지나 MM2 합성액체배지에서 보라색소의 생산이 우수해지는 것은 기존의 비올라세인 생산 균주의 보고와는 다른 점이며 이는 실용화 단계에서 생산단가를 낮출 수 있는 장점이 될 수 있다.</p>