TSA가 C2C12 myoblast 융합에 미치는 영향을 알아보기 위해 TSA를 DM (분화배지) 상태에 있는 세포에 \( 5 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 을 처리하였다. 이틀째부터 대조군은 융합을 보이기 시작하였으나 TSA가 처리된 세포에서는 4일까지 융합이 관찰되지 않았고 TSA에 대한 가역성을 알아보기 위해서 TSA로 4일을 처리한 후 TSA를 제거하고 DM 으로만 4일을 다시 배양되었을 때 가역성은 대조군과 유사하게 시간이 지남에 따라 증가함에 따라 TSA가 C2C12 myoblast의 융합에 억제효과를 나타내고 있으며 가역적인 성질로 작용하고 있음을 보여주고 있지만 TSA가 융합현상에 관련되는 많은 인자 중 어떤 것을 직접적으로 방해하는지에 대한 연구는 계속적인 과제로 남아있다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>TSA가 C2C12 myoblast fusion에 미치는 영향</h2><p>TSA가 C2C12 myoblast 융합에 미치는 영향을 알아보기 위해서 TSA를 DM (분화배지) 상태에 있는 세포에 \( 5 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 을 처리하였다. DM상태에 TSA를 처리한 후 이틀째부터 대조군은 융합을 보이기 시작하였고 TSA가 처리된 세포에서는 융합이 관찰되지 않았다. TSA로 처리한 후 4일이 되었을때 대조군은 다핵의 근육소관을 형성하였고 TSA가 처리된 세포에서는 여전히 융합이 형성되지 못하였다. TSA에 대한 가역성을 알아보기 위해서 TSA로 4일을 처리한 후 TSA를 제거하고 DM 으로만 4일을 다시 배양하였다. 이때 C2C12 myoblast는 다시 융합을 형성하였다(Fig. 1). 구체적으로 융합의 상태를 파악하기 위해서 융합 index를 구해 보았다 (Fig. 2). 융합 index를 통하여 TSA가 제거되었을 때 가역성은 대조군과 유사하게 시간이 지남에 따라 증가하였다. 이결과는 TSA가 C2C12 myoblast의 융합에 억제효과를 나타내고 있으며 가역적인 성질로 작용하고 있음을 보여주고 있다.</p><h2>분화진행과정에 있어 NF-\( \kappa \)B 의 조절</h2><p>먼저, 분화가 진행될 때의 NF-\( \kappa\)B가 조절되는지를 알아 보았다. 분화가 유도되기 전 즉, GM(성장배지)에서 자란 세포인 경우 NF- \( \kappa \)B DNA 결합활성이 높게 나타났으나 DM(분화배지)에서 분화가 되면 NF-\( \kappa \)B 활성이 현저하게 떨어졌으며 4일째에는 약하게 나타났다. 하지만 성장배지에 비하여 여전히 활성은 감소되어 나타남을 알 수 있었다(Fig. 3). 이 결과는 Guttridge (1999)의 결과와 비슷한 양상을 보여주고 있다. 이것은 성장중인 근육아세포에서는 NF-\( \kappa \)B 활성이 근육분화를 억제하기 위해서 필요하고 분화 과정에서도 완전히 없어지지 않고 최소의 활성이 유지됨을 보여준다. 이 억제효과는 NF-\( \kappa \)B 에 의한 MyoD의 활성억제에 따른 것으로 보고되어 있다.</p><h2>TSA가 NF-\( \kappa \)B에 미치는 영향</h2><p>TSA에 의한 NF-\( \kappa \)B DNA 결합 활성을 알아보기 위해서 EMSA를 실시하였다. 대조군로 NO TSA는 TSA를 처리하지 않고 4일간 배양하였고, TSA는 TSA를 \( 5 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 로 처리하여 4일간 배양하였다. 그리고 DE-TSA는 TSA를 \( 5 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 로 처리하여 4일간 배양한 후 다시 TSA를 제거하고 분화 배지만 처리하여 배양하였다. TSA를 처리하지 않은 대조군은 NF-\( \kappa \)B DNA 결합 활성을 나타내었고 TSA를 처리한 것은 NF-\( \kappa \)B DNA 결합 활성이 거의 사라졌으며 DE-TSA는 분화가 유도되면서 대조군과 동일하게 NF-\( \kappa \)B DNA 결합 활성을 나타내었다(Fig. 4). 이 결과는 TSA가 NF-\( \kappa \)B DNA 결합 활성을 억제함을 보여주고 있다. NF-\( \kappa \)B DNA 결합 활성 조절에 HDAC가 중요한 요인으로 작용함으로, HDAC inhibitor인 TSA에 의한 NF-\( \kappa \)B DNA 결합 활성의 억제는 HDAC inhibition에 의한 간접적인 효과일 것으로 시사하며, myogenesis를 진행하기 위해서는 최소한의 NF-\( \kappa \)B DNA 결합 활성이 필요할 것으로 사료된다.</p><h2>농축분화배지 CM에 의한 융합과 NF-\( \kappa \)B DNA 결합 활성의 회복</h2><p>TSA에 의한 융합 억제현상이 직접적인 것인지 알아보기 위해서 TSA를 처리하지 않은 DM상태의 배지를 농축하여 세포에 첨가하였다. 각각의 세포들은 DM으로 교환될 때에 TSA와 농축분화배지롤 처리하였다. 분화배지 상태에 있는 세포에 농축분화배지만 처리한 것은 대조군과 비슷한 경향으로 융합이 일어났으며 TSA만 처리한 것은 여전히 융합을 형성하지 못하였고 TSA 와 CM을 동시에 처리한 것은 2일 정도가 지나면서 약하게 융합이 형성되기 시작하였다(Fig. 5). 이 상태에서 세포들의 nuclear extracts을 추출하여 EMSA를 실시하였다. TSA만 처리한 것은 NF-\( \kappa \)B DNA 결합 활성이 억제되었고 TSA와 CM을 동시에 처리한 것에서는 NF-\( \kappa \)B DNA 결합 활성이 회복되었다(Fig. 6). 이러한 결과는 TSA가 융합현상과 NF-\( \kappa \)B DNA 결합 활성을 억제함을 보여주며 또한 DM 배지에 존재하는 정상적인 융합 관련 인자들에 의해 회복됨을 시사하고 있다. 그러나 TSA가 융합현상에 관련되는 많은 인자 중 어떤 것을 직접적으로 방해하는지에 대한 연구는 계속적인 과제로 남아있다.</p>