포도당 특이적으로 유전자 발현이 증가하는 남세균 고유의 프로모터를 활용하여 개발한 생물검정용 바이오센서는 ATP 생산을 억제하는 여러 가지의 대사물질에도 저해 효과가 미약하여 환경 위해 물질을 검출할 수 있다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <p>당 (sugar)은 모든 생물체에서 에너지 공급원, 삼투 조절 물질, 거대분자 생합성의 전구물질노서 작용할 뿐만 아니라, 유전자 발현, 생장 및 발달에 영향을 미치는 조절신호 (regulatory signal)로 작용한다. 단일세포 광합성 세균인 남세균 Synechocystis에서의 포도당 감지 및 신호전달 경로는 종속영양 세균인 대장균 (Escherichia coli) 과 상이하다. 고등식물의 경우, 포도당 감지는 1) 포도당 센서로서의 혝소키나아제 (hexokinase), 2) 혝소키나아제 비의존성 포도당 신호전달, 및 3) 대사작용 의존성 포도당 감지 경로가 제안되었다 (Moore et al. 2003). 남세균에서의 포도당 신호전달 경로에 대한 연구는 대장균이나 효모 및 고둥식물에 비해 연구가 미진하다. 최근에 카로티노이드 생합성 유전자의 발현에 포도당이 관여하며, 신호전달은 세포질 redox state와 pH 의 증가에 의한 것으로 보고된 바 있다 (Ryu et al. 2004; Lee et al. 2007).</p> <p>포도당 특이적으포 유전자 발현이 증가하는 호흡관련 유전자 (Lee et al. 2007) 중에서 pgi, cydA, ppc, atpI, ndbA, pdh, tkt 및 ctaDl의 프로모터 부위를 포함하는 유전자간 염기 (intergenic sequence)가 바이오센서로 이용될 수 있는지를 조사하였다. \( L u x A / L u x B \) 유전자를 포함하는 플라스미드 pILA 를 갖는 균주를 대조구로 하여 프로모터 부위를 포함하는 형질전환 균주에 각각 10mM 의 포도당을 생장광 조건 하에서 1 시간 처리한 후 생물발광량을 측정하였다. Fig. 1 에 나타낸 바와 같이, pILA 대조구 균주에 비해 포도당 유도성 유전자의 프로모터 부위를 함유하는 균주는 적게는 2 배에서 많게는 약 40 배까지 포도당 처리에 의해 생물발광양이 증가하였으며, pdh와 tkt 프로모터 부위를 함유하는 균주가 가장 강력한 활성을 나타내었다. 이러한 포도당 유도성 생물발광량 증가결과는 남세균 고유의 포도당 유도성 프로모터를 활용한 생물검정용 바이오센서가 개발되었음을 의미한다.</p> <p>개발된 바이오센서가 ATP 생산을 억제하는 여러 가지의 대사물질에 의해 민감하게 영향을 받는지를 조사하였다. 광합성 기구의 광계2에 작용하는 제초제 디우론 (diuron)의 일종인 DCMU (dichlorophenyl dimethyl urea: D), 호흡전자전달계의 NAD (P) H 탈수소효소의 작용을 억제하는 \( \mathrm { Hg } ^ { 2 + } ( \mathrm { H } ) \) 와 로테논 \( ( \mathrm { R } ) \), 시도크롬 \( \mathrm { b } _ { 6 } / \mathrm { f } \) 복합체 환원을 억제하는 DBMIB (dibromothymoquinone: B), 말단 시토크롬 옥시다제를 억제하는 \( \mathrm { CN } ( \mathrm { C } ) \), 전자전달에 의한 양성자 기울기 발달을 억제하는 짝풀림인자인 CCCP (carbonylcyanide m-chlorophenyl-hydrazone: CP) 등 (Ryu et al. 2004)을 10mM 포도당으로 12시간 처리된 \( I L A \) 와 pdh 균주에 처리하였다. Fig. 2 에 나타낸 바와 같이, ILA 균주에 비교하여, \( p d h \) 균주의 경우, 포도당에 의해 생물발광량이 7 배 이상 높았다 (대조구, Co). 한편, 전자전달억제제의 처리에 의해 생물발광량이 감소하였는데, 특히 DCMU와 \( \mathrm { Hg } ^ { 2 + } \) 가 동시에 처리된 경우 (DH) 현저하게 억제되었다. 또한, mRNA 합성과 단백질 생합성 억제제인 리팜피신 ( \( \mathrm { Rf } ) \) 과 클로람페니콜 (CR)이 처리되었을 경우에도 각각 20% 와 50%의 저해효과를 보여주었다. 유전자 발현 억제제가 대사억제제에 비해서 저해 효과가 미약한 것은 \( L u x A / L u x B \) 생물발광 시스템이 유전자 발현에 의해서보다는 세포내 ATP 함량에 더욱 민감하게 반응함을 의미한다. 이는 Shao 등 (2002)에 의해서 개발된 라이트-오프 어세이 시스템이 세포내 ATP 생합성이 원활하지 못할 경우 환경 위해물질 검출에 한계가 있을 수 있음을 의미한다.</p>