대장균과 포유류 세포 내의 protein quality control은 chaperone과 protease들의 작용으로 이루어지며, ubiquitination이라는 단백질 분해 과정을 거친다. E3 ligase인 Parkin은 파킨슨병과 polyQ 이상 질환에 연관되어 있다. 본 논문에서는 pGEX vector를 이용하여 대장균 내에서 Parkin을 overexpression하고 정제를 통해 순도 높은 Parkin 단백질을 다량 얻을 수 있는 적정 조건을 확립하였으며, HA 또는 Myc tagging 시스템을 이용한 vector를 제작해 HEK293 세포에서 Parkin의 발현양상을 분석하였다.
<h1>대장균과 포유류 세포 내에서 parkin의 발현 양상에 관한 연구</h1> <p>Protein quality control은 chaperone과 protease들의 작용으로 세포내 단백질들의 활성이나 운명을 조절하는 역할에 의해 이루어지고 있다. Chaperone은 새로 만들어지는 단백질들의 정확한 구조형성을 돕는 역할을 하는 반면, protease들은 여러 과정들의 오차로 생겨난 비정상적인 단백질을 제거하는 역할을 한다. 단백질 분해 과정 중 다단계로 이루어지는 ubiquitination은 E1, E2, E3 효소들의 복합적인 상호관계를 거쳐 분해하고자 하는 단백질에 4개 이상의 ubiquitin들을 결합시키는 과정으로, ubiquitin이 결합된 단백질들은 궁극적으로 proteasome에서 제거된다.</p> <p>Protein quality control의 비정상적 작동이 퇴행성 뇌질환의 주원인들 중의 하나로 간주된다. 특히 E3 ligase들의 이상이나 ubiquitin proteasome system (UPS)의 비활성화로 인해 단백질의 aggregate들이 축적되어 신경세포의 손상을 일으킴으로써 퇴행성 뇌질환이 유발되기도 한다. 하나의 E3 ligase가 여러 퇴행성 뇌질환에 연관되기도 하는데, E3 ligase인 Parkin은 파킨슨병의 주요 원인 유전자로 알려져 있는 동시에 polyQ 이상 질환에서 세포를 보호하는 역할을 한다는 보고가 있다. Parkin은 465개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 분자량이 \(52 \mathrm { kDa } \)인 단백질이다. Parkin의 N-말단에 176 아미노산의 ubiquitin-like domain (ULD)이 있고, 현재까지 그 기능이 잘 알려지지 않은 central domain (145-232 아미노산)과 C-말단에 두 개의 RING finger domain (237-449 아미노산)이 존재한다.</p> <p>퇴행성 뇌질환의 발병기전을 분자생물학적 측면에서 이해하기 위해 Parkin에 의해 ubiquitination 되는 기질 및 Parkin과 상호작용하는 단백질들을 탐색하는 연구들이 진행되고 있다. 그러나 Parkin과 상호작용하는 단백질이나 Parkin의 기질에 대한 생화학적, 생리학적 측면에서의 기능 연구는 아직까지 상당 부분 수행되지 않은 상태이다. Parkin과 상호작용하는 단백질들과 기질에 대한 연구가 생화학적, 분자생물학적 측면에서 이루어진다면 퇴행성 뇌질환의 발병기전을 분자 수준에서 밝혀나갈 수 있을 것이다.</p> <p>Parkin과 상호작용하는 단백질들과 Parkin과의 관계를 in vitro에서 연구하기 위해서는 Parkin을 다량으로 발현, 정제할 수 있는 시스템이 필요하다. 또한, 포유류 세포에서 Parkin의 발현양상과 기능을 연구하기 위해서 Parkin을 발현할 수 있는 시스템을 구축할 필요가 있다. 이에 본 연구에서는 pGEX vector를 이용하여 대장균 내에서 Parkin을 overexpression하고 affinity column method로 정제하여 순도 높은 Parkin 단백질을 다량 얻을 수 있는 적정 조건을 확립하였다. 또한 Parkin의 발현을 용이하게 확인할 수 있도록 HA나 Myc tagging 시스템을 이용한 vector들을 제작하여 HEK293 세포에서 Parkin의 발현양상을 비교 분석하였다.</p>