cochlear explant 배양 후, 고정과 세척 과정을 거친 후 \( 0. 1 \% \) Triton X- 100과 함께 실온에서 반응시켰다. 이어서 TRITC-labeled phalloidin을 이용하여 30분간 실온에서 반응시킨 후, PBS로 3회 세척하였다. 표본 제작 후 형광현미경으로 관찰하였으며, 마지막으로 검체는 \(50 \% \) glycerin을 이용하여 slide에 mounting한 뒤 형광현미경으로 재차 관찰하였다. 필요한 경우에는 Phalloidin-TRITC와 DAPI를 동시에 염색하였다.
<h2>Primer Sequences</h2> <ol type = start=1><li>TNF- \( a \) 5'-CAG GGG CCA CCA CGC TCT TC-3' 5'-CTT GGG GCA GGG GCT CTT GAC-3'</li> <li>IL-1 \( \beta \) 5'-TCA TGG GAT GAT GAT GAT AAC CTG CT-3' 5'-CCC ATA CTT TAG GAA GAC AGG GAT TT-3'</li> <li>IL-6 5'-TTG CCT TCT TGG GAC TGA TGC-3' 5'-TTG GAA ATT GGG GTA GGA AGG A-3'</li></ol> <h2>Phalloidin 염색</h2> <p>배양한 cochlear explant는 시약 처리 후, \( 4 \% \) paraf-ormaldehyde로 30분 고정하고 생리식염수로 세척한 후 \( 0.1 \% \) Triton X- 100으로 5분 실온에서 반응하였다. TRITC-la-beled phalloidin (Sigma P1951, 1:4,000)으로 30분 실온에서 반응한 후 PBS로 3회 세척하고 표본 제작하여 헝광현미경으로 관찰하였다.</p> <h2>Immunocytochemistry</h2> <p>배양된 cochlear explant를 PBS로 3번 세척하여 \( 4 \% \) paraf-ormaldehyde로 30분 고정한 후 PBS로 세척하였다. Blocking solution ( \( 100 ~ \mu \mathrm { l } \) of normal goat serum, \( 5 ~ \mu \mathrm { l } \) of \( 10 \% \) Triton X-100 및 \( 895~ \mu \mathrm { l } \) of PBS)에 2시간 실온에서 반응하였다. Cochlear explant는 1차 항체 anti-TNF- \( \alpha \) ( \(2 ~ \mu \mathrm { l } \) goat anti TNF-a antibody, \( 2 ~ \mu \mathrm { l } \) Triton X-100 \((10 \%) \), \(6 ~ \mu \mathrm { l } \) normal goat serum, \( 190 ~ \mu \mathrm { I } \) PBS)를 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 12시간 반응하였다. 이 검체는 PBS로 3번 세척한 후에 2차 항체인 anti-goat IgG FTTC ( \(1 ~ \mu \mathrm { l } \) FITC-labeled phalloidin, \( 12 ~ \mu \mathrm { l } \) normal goat serum, \(4 ~ \mu \mathrm { l } \) Triton X-100 \((10 \%) \) and \( 383 ~ \mu \mathrm { l } \) PBS)와 상온에서 90분 반응하고, PBS로 각각 10분 3번 세척하였다. 최종적으로 검체는 \(50 \% \) glycerin을 이용하여 slide에 mounting한 후에 형광현미경으로 관찰하였다. 필요한 경우에 검체는 Phalloidin-TRITC와 DAPI를 동시에 염색하였다.</p>