본 연구에는 농촌진흥청 농업생물부의 표준 사육 기준에 준하여 사육된 장려 잠품종인 칠보잠과 protein kinase ingibitor 처리를 위해 Bm5 세포주를 사용하였다. 누에의 조직별 및 다양한 스트레스제 주사 및 경구감염 후 시간 경과별 BmTf 유전자 검정을 위해서는 real-time PCR 및 정량적 RT-PCR을 수행하였고, 누에 혈림프 내 유리 철 양 측정을 위해서는 Serum Iron and Serum Iron Binding Capacity Assay Kit을 제조사의 지시에 따라 수행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 곤충 및 곤충 배양세포주</h2> <p>본 연구에 사용된 누에(Bombyx morri. Silkworm)는 장려 잠풍종인 칠보잠(잠123×잠124)으로 농촌진흥청 농업생물부의 표준 사육 기준(온도, \( 24 \sim 27^{\circ} \mathrm{C} \); 상대습도, \( 70 \sim 90\% \))에 준하여 사육하였고, protein kinase inhibitor 처리는 Bm5 (Bombyxmori) 세포주를 사용하였다. Bm5 세포주는 누에 난소유래 세포주로서 \( 10 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) heat-inactivated fetal bovine serum를 첨가한 TC- 100 medium을 이용하여 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양되었다.</p> <p>Protein kinase inhibitor로는 \( 20 ~ \mu \mathrm{M} \) extracellular signal regulated kinase (ERK), \( 10 ~ \mu \mathrm{M} \) phospholipase C (PLC), 500 \( \mathrm{nM} \) protein kinase A (PKA), \( 20 ~ \mu \mathrm{M} \) phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), \( 20 ~ \mu \mathrm{M} \) p38 Mitogen-activated protein kinase(MAPK) 및 \( 20 ~ \mu \mathrm{M} \) Jun N-terminal kinase (JNK) inhibitor를 사용하였다.</p> <h2>전사체 발현 분석</h2> <p>조직별 및 대장균 주사후 시간 경과별 BmTf (B. mori transferrin) 유전자 전사체 검정을 위하여 면역 유도 누에로부터 각각 total RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 이용하여 앞서 누에로부터 분리된 항생펩타이드인 enbocin, nuecin 및 Tf 전사체 발현양상 비교를 위해 RT-PCR 및 real-time PCR을 수행하였다. Primer는 Beacon Designer 소프트웨어(PREMIER Biosoft, USA)를 이용하여 enbocin의 sense (5'-TTTCTTGTTCGTTGTTGTTTTCG-3') 및 anti-sense (5'-CGCGCTCGATTTCCTTGA-3'), nuecin sense (5'-AAGGTGGGCGCATCGTT-3') 및 anti-sense (5'-CCGAGTAGTCATTCCGGTTGA-3')와 BmTf의 sense (5'-GGACTTGACGCTCCATTGTATTAT-3') 및 anti-sense (5'-GCTGGGATTGTTCTCTGGTTTG-3') primer를 제작하였다. RT-PCR을 위해 우선 High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems Co., USA)을 이용하여 RNA부터 cDNA를 합성한 후 CDNA를 template로 각각의 primer를 이용하여 Bioneer (Korea)사의 AccuPower PCR Premix를 이용하여 \( [95^{\circ} \mathrm{C} \) ( 2 분) \( \rightarrow 1 \) cycle ; \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) (20초), \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) (30초), \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) (50초) \( \rightarrow 25 \) cycle ; \( 72^{\circ} \mathrm{C}(10 \)분) \( \rightarrow 1 \) cycle]을 수행한 후 PCR 산물은 \( 1 \% \) 아가로스 겔에 전기영동 하였다.</p> <p>누에의 조직별 및 다양한 스트레스제 주사 및 경구감염 후 시간 경과별 BmTf 유전자 전사체 검정을 위해 real-time PCR 및 정량적 (quantitative) RT-PCR을 수행하였다. TaKaRa(Japan)사의 SYBR premix Ex Taq 및 endogeneous control로서 B. mori actin의 sense (5'-GAAGCTGTGCTACGTCGCTCT-3') 와 antisense (5'-CCGATGGTGATGACCTGACC-3') primer를 이용하여 relative quantification (RQ)를 수행하였다. 이때 사용한 stage별 condition은 ABI PRISM \( { }^{\circledR} 7300 \) real-time PCR System의 default 값을 취하였다. 정량적 RT-PCR 역시 real-time PCR과 동일한 primer를 이용하였으며 cycle 수는 25회를 취하였다.</p> <h2>유리 철(free iron) 양 측정</h2> <p>누에 혈림프(hemolymph) 내 유리 철 양 측정을 위하여 Serum Iron and Serum Iron Binding Capacity Assay Kit(Diagnostic Chemicals, USA)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 먼저 시료 및 standard에 ascorbic acid dissociating reagent를 섞은 후 \( 595 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도 \( \left(A_{1}\right) \)를 측정한 후, color reagent를 부가한 다음 다시 \( 595 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도 \( \left( A_{2}\right) \)를 측정하였다. 그리고 누에 체액 및 standard에 ascorbic acid를 부가하고 binding buffer를 부가한 후 \( 595 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도\( \left( A_{3}\right) \)를 측정하였다. 그리고 상온에서 20분간 반응 후 각각의 튜브에 color reagent를 부가한 후 상온에서 5분간 반응시키고 \( 595 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도 \( \left( A_{4}\right) \)를 측정하였다. 유리철분량( \( ( \mu \mathrm{M} / \mathrm{l}) \)은 \( \left[\left\{\left( A_{4}- A_{3}\right)\right.\right. \) hemolymph \( \} \div\left\{\left( A_{2}-\mathrm{A}_{1}\right)\right. \) standard \( \} \times \) standard 농도 \( ] \)에 의해 결정하였다.</p>