\( \beta \)-lactamase 유전자의 subcloning을 위해 E. coli \( \mathrm { DH } 5 \alpha \)를 LB 배지에 배양한 후 alkalinelysis 방법으로 대량 조제하여 subcloning을 진행하였고, subclone된 \( \beta \)-lactamase 유전자가 포함된 plasmid를 pKL11로 명명하였다. pKL11을 BamHI로 반응시키고 전기영동을 진행한 결과, \( 15.2 \mathrm { ~kb } \) 단편과 \( 1.7 \mathrm { ~kb } \)단편이 존재하는 것을 확인할 수 있었으며, Self liga-tion을 시킨 \( 15.5 \mathrm { ~kb } \mathrm { Bam } \mathrm { HI } \) 단편을 형질전환시켜 배양시킴으로써 ampicillin 내성 균주를 얻을 수 있었다.
<h2>\( \beta \)-Lactamase 유전자의 subcloning</h2> <p>클로닝된 단편의 크기가 \( 40 \mathrm { ~kb } \)이상으로 다루기 힘들기 때문에 \( \beta \)-lactamase 유전자의 subcloning을 위해 E. coli \( \mathrm { DH } 5 \alpha \) \( ( \mathrm { pKB } 89) \)를 \( 100 \mathrm { ml } \mathrm { LB } \) 배지에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 18 \) 시간 배양 후 alkaline lysis 방법으로 \( \mathrm { pKB } 89 \)를 대량조제 하였다. \( \mathrm { pKB } 89 \left ( \mathrm { TC } ^ {\mathrm { r } } , \beta- \mathrm { Lac } ^ { + } \right ) \) \( 3 \mu \mathrm { g } \)을 Sau3AI 0.3 unit로 5분간 부분분해 시킨 후 BamHI으로 처리한 pACYC184와 ligation시켰다. 그 후 E. coli \( \mathrm { HB } 101 \)에 형질전환 시켜 LB agar배지에 도말하였고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 18시간 배양하여 ampicillin에 내성을 보이는 \( \beta \)-lactamase 양성 subclone주를 선별하였다. 획득한 subclone주의 recombi-nant plasmid를 분리하여 제한효소를 처리하여 확인한 후 E.coli HB101에 다시 형질전환 시켜 plasmid의 안정성을 검토하였다. Subclone된 \( \beta \)-lactamase 유전자가 포함된 plasmid는 숙주균에서 안정하게 유지되었으며 이 plasmid를 pKL11로 명명하였다. pKL11 \( 3 \mu \mathrm { g } \)을 3 unit의 BamHI으로 2시간동안 반응시키고 \( 0.8 \% \) agarose gel 전기영동을 행한 결과, \( 15.2 \mathrm { ~kb } \) 단편과 \( 1.7 \mathrm { ~kb } \)단편을 확인하였다. 전기영동 후 \( 15.2 \mathrm { ~kb } \)단편의 위치를 확인한 뒤 면도칼로 잘라내었고 Sephaglas BandPrep Kit(Pharmacia Co., USA)를 사용하여 DNA band를 회수한 뒤 \( \mathrm { T } _ { 4 } \) ligase를 사용하여 \( 16 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 self ligation시켰다. Self liga-tion을 시킨 \( 15.5 \mathrm { ~kb } \mathrm { Bam } \mathrm { HI } \) 단편을 E. coli HB 101에 형질전환시켜서 LB agar (ampicillin \( 2 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) )에 spreading 한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 18시간 배양함으로서 ampicillin 내성 균주를 얻었다. \( 1.7 \) \( \mathrm { kb } \mathrm { Bam } \mathrm { HI } \)단편을 제거시켜 얻은 plasmid를 pKL11-triangle B 라 명명하였다. pKL11- \( \Delta \mathrm { B } 3 \mu \mathrm { g } \)을 BamHI과 BglII를 각각 3 unit씩 2시간 동안 반응시키고 \( 0.8 \% \) agarose gel 전기영동을 행하였다. 전기영동에서 \( 10.6 \mathrm { ~kb } \)단편의 위치를 확인한 뒤 면도칼로 잘라내었고 Sephaglas BandPrep Kit (Pharmacia Co., USA)를 사용하여 DNA band를 회수한 뒤 \( \mathrm { T } _ { 4 } \) ligase를 사용하여 \( 16 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 self ligation시켰다. Self ligation을 시킨 \( 10.6 \mathrm { ~kb } \)BamHI-BglII 단편을 E. coli HB101에 형질전환 시켜서 LB agar(ampicillin \( 2 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) )에 spreading 한 뒤 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 18시간 배양함으로서 ampicillin 내성 균주를 얻었다. E. coli HB101 균주에 다시 형질전환시켜 숙주균에서의 안정성을 검토하여 \( 4.6 \) \( \mathrm { kb } \) BamHI-BglII 단편을 제거시켜 얻은 plasmid를 (pKL11- \( \Delta \)4.6)이라 명명하였다.</p>