아가로스 gel 상에서 DNA size 차이와 지부DNA는 증폭이 되고 권심 DNA는 증폭하지 못하는 dominant 마커 타입인 TH9가 확인되었는데, DNA 크기 차이를 확인할 수 없었기에 나머지 trehalose 관련 유전자 증폭 DNA는 염기서열분석을 통해 SNP or insertion or deletion 다형성 유무를 확인하였다. 제작한 프라이머를 이용하여 처음 EST 시작부위와 끝 부위에서 DNA를 각각 PCR 증폭하고 제한효소를 처리하여 다형성을 확인하였고, 이를 통하여 앞으로 배추작물의 trehalose 합성 관련 유전자가 환경 스트레스 저항성 형질과 어떤 연관관계를 가지는지 조사하고, 배추 품종을 개발하는데 유용하게 사용할 수 있게된다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <p>PCR 증폭 때 사용한 최초의 프라이머 목록은 table 1과 같다. 아가로스 gel 상에서 DNA size 차이(예: TH16)와 지부DNA는 증폭이 되고 권심 DNA는 증폭하지 못하는 dominant마커 타입인 TH9가 확인되었다(Fig. 1). 따라서 TH9와 TH16프라이머의 경우는 지부와 권심의 다형성을 확인시켜주는 마커로 바로 사용이 가능하다.</p> <p>아가로스 gel 상에서 DNA 크기 차이를 확인할 수 없었던 나머지 trehalose 관련 유전자 증폭 DNA는 염기서열분석을 통해 SNP or insertion or deletion (in/del) 다형성 유무를 확인하였다. 염기서열 분석은 쏠젠트(주)에 의뢰를 하였으며 얻어진 염기서열을 이용하여 SNP와 in/del 분석은 staden pak-age program을 이용하여 수행했다. 발견된 SNPs와 in/del을 대상으로 아가로스 gel 상에서 다형성을 보여줄 수 있도록 새로운 프라이머를 제작하였다. 프라이머 제작 방법은 다음과같은 방법으로 시도하였다.</p> <p>In/del이 있는 경우(예: TH4)는 아가로스 gel 상에서 크기 차이가 관찰이 가능하므로 In/del을 대상으로 가까운 주변 염기서열에서 프라이머를 제작하였다. 이는 상대적으로 작은 DNA 크기에서 in/del에서 오는 염기서열 크기 차이를 아가 로즈 \( 2 \% \) gel 상에서 좀 더 자세히 관찰 가능하게 해주므로 염기서열 분석처럼 높은 비용과 고가의 장비 없이 다형성을 분석할 수 있다(Fig. 2).</p> <p>SNP를 대상으로 다형성을 보이는 마커 개발을 위하여 지부와 권심의 염기서열 데이터를 비교 분석하여 두 염기서열 간에 SNP 차이가 있음을 발견하였고(Fig. 2) 우선적으로 TH2와 TH5의 SNPs를 대상으로 프라이머의 3‘ 말단 마지막 염기서열위치에 SNP가 위치하도록 프라이머를 제작하였다. 하지만 TH2의 경우는 대상 DNA와 프라이머의 마지막 서열이 불일치함에도 불구하고 지부와 권심 모두에서 PCR 증폭이 일어나다 형성을 보이는데 실패하였고 TH5의 경우는 권심 DNA만 증폭되어 우성(dominant) 마커로 사용이 가능함을 확인하였다(Table 2). TH2의 경우는 제한효소를 이용하여 SNP를 보이는 마커로 개발하였다.</p> <p>이용된 방법은 SNP 위치에 특정 제한효소의 인식서열이 있는지 확인하고 이를 이용하여 지부와 권심 사이에 제한효소 인식서열 유무로 다형성 마커를 개발하였다. 예를 들어 TH6의 SNP 염기서열에 있어서 제한효소 RsaI는 지부의 GTAC 염기서열을 인식한다. 하지만 권심의 GTAT는 인식하지 못한다. 프라이머는 처음 EST 시작부위와 끝 부위에서 제작한 프라이머를 이용하여 지부와 권심 DNA를 각각 PCR 증폭하고 제한효소를 처리하여 다형성을 확인하였다(Fig. 2 and Table 2).</p> <p>하지만 모든 SNP 위치에 특정 제한효소의 인식서열이 반드시 존재하는 것은 아니므로 위와 같은 방법으로 모든 종류의 SNP의 다형성 마커를 개발하기 어렵다. 따라서 dCAP meth-od를 이용해 TH2와 TH26에 있어서 새로이 제작되는 프라이머에 각각 인위적인 PstI과 HindIII 제한효소 인식 염기서열을 가진 프라이머를 제작하였다. 예를 들어 HindIII 제한효소의 인식 염기서열은 AAGCTT 인데 TH26의 SNP 포함 염기서열은 권심의 경우 AAGCGT이다. 따라서 프라이머에 인위적인 불일치 염기서열을 포함시켜 최종 증폭 DNA는 AAGCTT를 가지게 만들어 준다. 하지만 지부의 경우는 해당 염기서열이 GAGCGT이므로 최종적으로 제한효소 인식서열을 가지지 못한다(Fig. 3). 이러한 인위적인 프라이머는 특정 DNA만 제한효소 인식 염기서열을 가지게하여 제작한 프라이머로 다시 PCR을 수행하고 제한효소 처리 후 아가로스 gel상에서 각각DNA 크기차이로 지부와 권심 간의 다형성을 확인할 수 있었다(Table 2 and Fig. 3)</p> <p>지금까지 다양한 DNA 마커종류가 개발되어 유전적 다양성 및 유전자 지도 작성 등에 활용되고 있다. 특히 특정한 기능성 유전자를 대상으로 염기서열의 다형성을 확인하고 발견된 SNP를 대상으로 쉽게 검증할 수 있는 기술개발이 시도되고있는데 본 연구에서는 dCAP 방법을 이용하여 배추작물 지부와 권심 사이에서 trehalose 합성 관련 유전자의 다형성 확인할 수 있는 10개의 분자 마커를 개발하였다. 개발된 마커는 육종가 또는 육종회사에서 PCR로 쉽게 이용이 가능한 마커이고 이는 앞으로 배추작물의 trehalose 합성 관련 유전자가 고온, 저온, 또는 건조 등의 환경 스트레스 저항성 형질과 어떤 연관관계를 가지는지 조사하는데 중요한 자료로 활용될 수있으며 나아가 환경 스트레스 저항성 배추 품종을 개발하는데 있어서 중요한 육종 도구로써 사용될 수 있다고 생각된다.</p>