실험재료는 건조된 능이버섯을 40 mesh의 체를 통과한 가루를 사용하였으며 분석기기는 헐전용해활성의 측정에 사용된 시약 및 SDS-PAGE 시약은 Sigma사 제폼을, DEAE-cellulose(DE52)는 Whatman 사 Sephacryl-S 200과 Mono S column pharmacia 사 제품을 이용하였다. 탈지 건조한 능이 100 \mathrm{~g}100 g에 10배의 0.1 \mathrm{M}0.1M 인산완충용액(pH 7.0)을 넣고 2시간동안 진탕 추출하여 20분간 원심분리한 상등액을 이용하여 조효소액 하였으며 이 상등액을 20분간 원심분리하여 침전물을 제거하고 그 상등액을 포화되도록 하였다. 그 후 활성물질 획분을 투입하여 \( 0.1 \mathrm{m\ell} / \mathrm{min} \)의 유속으로 용출시켜 \( 2 \mathrm{m\ell} \)씩 분획한 다음 fibrin용해활성이 있는 획분을 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>본 실험에 사용된 건조된 능이버섯을 서울 경동시장에서 구입하여 분쇄한 후 40 mesh의 체를 통과한 가루를 사용하였다.</p> <h2>시약 및 분석기기</h2> <p>헐전용해활성의 측정에 사용된 시약 및 SDS-PAGE 시약은 Sigma사 제폼을, DEAE-cellulose(DE52)는 Whatman 사 Sephacryl-S 200과 Mono S column pharmacia 사 제품을 이용하였고, 그 밖에 언급되지 않은 시약들은 특급을 사용하였다.</p> <p>원심분리기는 Beckman사, Gradifrac LC 및 FPLC는 phr-macia, LKB사제품을 electrophoresis 장치는 Heoffer사 제품을 이용하였다.</p> <h2>조효소액의 조제</h2> <p>분쇄한 능이버섯 분말을 5배(\(\mathrm{v} / \mathrm{v}\))의 아세톤으로 2시간 동안 탈지하기 음건하여 본 실험에 사용하였다. 탈지 건조한 능이 \( 100 \mathrm{~g} \)에 10배의 \( 0.1 \mathrm{M} \) 인산완충용액(pH 7.0)을 넣고 2시간동안 진탕 추출하고 cheese cloth로 걸러서 그 여액을 \( 16,000 \times \mathrm{g} \)로 20분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 조효소액으로 하였다.</p> <h2>\( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \)에 의한 분획</h2> <p>이 조효소액에 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \)을 가하여 \( 25 \% \) 포화용액이 되도록 한 후 \( 16,000 \times \mathrm{g} \)로 20분간 원심분리하여 침전물을 제거하고 그 상등액에 다시 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \)을 가해 \( 75 \% \) 포화되도록 하였다. 이 용액을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 방치한 후 전과 동일한 방법으로 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 이 침전물을 소량의 동일 완충용액에 용해하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 50배의 동일 완충액으로 여러번 교환하여 투석하였다.</p> <h2>DE52 anion exchange column chromatography</h2> <p>\( 20 \mathrm{mM} \) Tris-\( \mathrm{HCl} \) buffer(\( \mathrm{pH} 8.0 \))로 평형화된 DE52 anion exchange column(\( 4 \times 27 \mathrm{~cm}\))에 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \)으로 분획된 조효소액을 동일 완충액에 녹여 주입하였다. 처음 500분간 0.5\( \mathrm{m \ell} / \mathrm{min} \)의 유속으로 씻어 낸 후 동일 완충액 \( 1,000 \mathrm{~ml} \)과 여기에 \( 0.5 \mathrm{M}\) \(\mathrm{NaCl} \)을 함유하는 완충액으로 linear gradient(\(0.5 \mathrm{m \ell} / \mathrm{min}\)) 방식으로 용출 시키면서 \( 5 \mathrm{m \ell} \)씩 fraction collec-tor로 분획하고 fibrin용해활성이 있는 획분을 모아 투석 농축하여 Sephacryl gel filtration column chromatography에 사용하였다.</p> <h2>Sephacryl-S 200 gel filtration column chroma-tography</h2> <p>\( 0.1 \mathrm{M}\) \(\mathrm{NaCl} \)이 함유된 \( 20 \mathrm{mM} \) Tris-\( \mathrm{HCl} \) buffer(\(\mathrm{pH} 8.0\))로 평형화한 Sephacryl-S 200 column(\(1.5 \times 100 \mathrm{cm}\))에 DE52 an-ion exchange column chromatography에서 얻은 활성물질 획분을 주입하고 \( 0.1 \mathrm{m\ell} / \mathrm{min} \)의 유속으로 용출시키면서 \( 2 \mathrm{m\ell} \)씩 분획하여 fibrin용해활성이 있는 획분을 확인하였다.</p> <h2>Mono S cation exchange column chromatography</h2> <p>\( 10 \mathrm{mM} \) citrate-\( 20 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\)(\(\mathrm{pH} 4.0\)) 완충액으로 평형화시킨 Mono S cation column에 Sephacryl-S 200 gel fil-tration chromatography에서 얻은 효소액을 투석 농축하여 주입하였다. \( 0.5 \mathrm{M}\) \(\mathrm{NaCl} \)이 함유된 완충액을 이용하여 linear gradient 방법으로 용출시키면서 \( 0.5 \mathrm{m\ell} \)씩 fraction collector로 분획하여 fibrin 용해활성이 있는 획분을 확인하였다.</p>