Fucoidan은 다양한 갈조류의 세포벽에서 주로 발견되며, 고분자량으로 구성되어 있어 고부가가치 산업으로 발전하는데 제한이 있어 생리활성을 증가시키기 위한 저분자량의 LMWF에 더 관심이 집중되고 있다. 이러한 LMWF는 산 및 효소 가수분해에 의해 얻을 수 있으나 함황 정도와 크기 조절에 어려움을 가지고 있어 가수분해 특성에 의해 함황량의 변화 없이 LMWF를 생산하는 특징이 있는 Fucoidan 가수분해효소를 활용하는 것이 효과적이다.
<h1>서 론</h1> <p>Fucoidan은 다양한 갈조류의 세포벽에서 발견된다. Fucoidan과 저분자의 다양한 oligosacchride는 anticoagulant , antithrombotic/ antithrombin activity , antiviral ], anti-inflammation , immumodulation 등의 다양한 생리활성을 갖는다. Fucoidan의 생리활성은 2 또는 4번 위치에 황을 함유하고 있는 fucose로 구성되고 \( a-1,2 \) 도는 \( a-1,3 \) 배당결합을 갖는 homo 또는 hetero형 산성다당류로 구성되는 특이적인 구조에 의해 결정된다. Fucoidan은 fucose 뿐만 아니라 mannose, xylose, galactose, rhamnose 및 uronic acid를 구성할 수 도 있다. 이러한 생리적인 특성은 전퉁적인 식폼산업븐만 아니라 향장 및 의약산업에서 그 활용성에 관심이 집중되고 있다.</p> <p>Fucoidan은 고분자량으로 구성되어있어 고부가가치 산업으로 발전하는데 제한요인으로 작용하고 있으며 생리활성을 증가시키기 위한 저분자량의 fucoidan (low molecular weight fucoidan (LMWF))에 더 관심이 집중되고 있다. 이러한 생리 활성은 분자량, 황함량, 당조성비 등에 의존하고 있다. \( \mathrm{LMWF} \) 는 산 및 효.소 가수분해에 의해 얻을 수 있으나 전자의 경우 함황 정도와 크기 조절에 어려움을 가지고 있다. 반면 Fucoidan 가수분해효소는 가수분해 특성에 의해 함황량의 변화 없이 LMWF를 생산하는 특징이 보고되고 있어 산가수분해 기술 보다 이점을 가진다.</p> <p>Exo- 및 endo-fucoidanase는 척추동물의 간췌장 \( [8,16,22] \), 해양세균[2,5,9,13-14,24-28,30,33] 및 진균[21,32]이 생산하는 것으로 보.고되고 있다. 본 연구에서는 저분자량의 fucoidan 생산을 목적으로 해양으로부터 fucoidan을 분해하는 해양세균을 분리하고 분류학적 특성과 함께 효소의 특성을 보고하고자 한다.</p> <h1>Fucoidan 분해미생물의 분리</h1> <p>Fucoidan 분해세균의 분리를 위해, 해수시료를 멸균해수로 희석하여 fucoidan-agar medium (FA; 0.4\% (w/v) fucoidan (Ecklonia cava), \( 10 \mathrm{~g} \) Bacto-peptone, \( 1 \mathrm{~g} \) yeast extract, \( 1 \mathrm{mM} \) ferrous solution, \( 1.6 \mathrm{mg} \) ammonium nitrate, \( 8 \mathrm{mM} \) disodium phosphate, 11 aged seawater, \( 1.5 \% \) agar)에 평판도말하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5일간 배양하였다. 성장된 집락들은 동일배지를 이용하여 순수배양한 후 fucoidan-liquid medium (FL)에 접종하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 일간 \( 150 \mathrm{rpm} \) 에서 진탕배양하였다. 원심분리 \( (10,000 x \mathrm{~g}, 10 \mathrm{~min}) \) 한 배양액의 fucoidanase 활성은 \( \mathrm{Wu} \) 등의 방법에 의거하여 반응한 후 dinitrosalicylic acid 방법에 의해 전환된 환원당을 정량하였다. \( 1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) fucoidan이 첨가된 \( 0.1 \mathrm{M} \) citric acid-sodium citric buffer ( \( \mathrm{pH} \) 6.0) \( 1 \mathrm{ml} \) 과 배양액 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 반응하였다. 환원당 정량을 위한 표준물질은 fucose (Signa, USA)를 이용하였다. 효.소의 활성은 1 분에 \( 1 \mathrm{uM} \) 의 fucose를 생산하는 효소의 양을 1 unit (IU)로 정하였다. 단백질의 정량은 Bradford 방법에 의해 분석하였다.</p> <p>분리균주의 성장조건과 효소활성을 조사하기 위해 균주는 \( \mathrm{FL} \) 배지에 접종하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1일간 전배양한 후 신선한 배지에 \( 0.1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 를 접종하였다. 배양 온도는 \( 25,30,35^{\circ} \mathrm{C} \)에서 진탕배양(150 rpm)하였다. \( \mathrm{pH} \) 에 따른 성장조사를 위한 \( \mathrm{FL} \) 배지는 \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} \) 와 \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} \) 을 이용하여 \( \mathrm{pH} \) 4 9로 조정하였으며 \( \mathrm{NaCl} \) 농도에 따른 성장조사를 위한 \( \mathrm{FL} \) 배지는 숙성해수대신 증류수로 대치하였고 0 20\% (w/v) \( \mathrm{NaCl} \) 로 조정하여 전배양액을 접종 후 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 150 \mathrm{rpm} \) 에서 진탕배양하였다. 성장은 흡광광도계를 이용하여 \( 660 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. Fucoisanase 활성은 배양액을 원심분리 \( (12,000 \times g, 10 \mathrm{~min}) \) 한 후 상등액을 대상으로 상기에 기술된 방법에 따라 측정하였다. 해양으로부터 분리된 세균을 대상으로 FL 배지에서 2일간 배양한 후 fucoidanase 활성을 측정한 결과 SB 1493 균주는 가장 높은 활성을 나타내었다. SB 1493 균주의 생장조건에 따른성장과 fucoidanase 활성을 검토한 결과 온도, \( \mathrm{pH} \) 및 \( \mathrm{NaCl} \) 요구성은 최적성장조건과 효소활성이 일치하였다(Fig. 1). 즉, 온도는 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{pH} \) 는 \( 7.8 \) 그리고 \( \mathrm{NaCl} \) 요구성은 \( 3 \% \) 로 나타나 \( \mathrm{SB} 1493 \) 균주는 fucoidan을 분해하는 전형전인 호염성의 해양 세균임을 확인할 수 있었다.</p>