체중 200~220\(\mathrm{~g}\)의 7주령 암컷 쥐 30마리를 일주일 적응시킨 뒤 난괴법을 기준으로 군을 나누어 난소절제 수술을 하였으며 비 난소절제 대조군은 sham-operation을 실시했고 1주일 동안 주위환경에 적응시켜 체중에 따라 난괴법에 의해 군을 나누어 난소절제 수술을 실시하였다. 실험동물은 해부 전 24시간 절식시켰으며, zoletil과 rom-pun을 이용하여 마취한 후 개복하여 복부대정맥에서 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 실온에서 30분 방치 후 4\(^{\circ} \mathrm{C}\), 3,000\(\mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리했다. 혈소판은 채취한 혈액을 \( 3.2 \% \) sodium citrate 용액과 1:9 비율로 혼합 뒤 1,100\( \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심 분리한 뒤 상층의 PRP를 취하고,\(3,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 더 원심 분리한 뒤 상층의 혈장을 제거한 뒤 EDTA를 포함한 washing buffer \( 5 \mathrm{ml} \)로 재현탁했다.
<h2>실험동물 사육 조건</h2> <p>체중이 \( 200-220 \mathrm{~g} \)인 7주령의 암컷(Sprague-Dawley) 쥐 30마리를 (주)오리엔트 바이오에서 분양받아 1주일간 적응시킨 후 난괴법(randomized complete block design)에 의해 군을 나누어 난소절제 수술(ovariectomy)을 하였고 비 난소절제 대조군에게는 sham-operation을 실시하였다. 수술 후 1주일간 고형 사료를 주어 상처가 회복되면 각 군으로 나누었다. 실험동물은 총 5개의 군으로 분류하였으며 비 난소절제 대조군 (SHAM), 난소절제 대조군(OVX-CON), 난소절제 후 17-beta-estradiol 주사군(OVX-ES), 난소절제 후 패 에탄올 추출물 \(50 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 투여군(OVX-IE50), 난소절제 후 패 에탄올 추출물 \(200 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 투여군(OVX-IE200)으로 각 6마리씩 5군으로 나누어 \( 1 \mathrm{ml} \)의 시료를 매일 경구 투여하며, 7주간 사육하였다. 양성 대조군으로는 17-beta-estradiol를 corn oil에 용해 \( (200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{kg} \) subcutaneously in \( 0.1 \mathrm{ml} \) corn oil/ \( 100 \mathrm{~g} \) body weight)하여 피하 주사하였다. 실험기간 동안 식이 섭취량과 체중은 매일 일정한 시간에 측정하였다. 동물실험실의 사육조건은 온도 \( 24 \pm 2^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 50-55 \% \)를 유지시켰고, 물과 식이는 제한 없이 제공하였다.</p> <h2>난소절제시술</h2> <p>1주일 동안 주위환경에 적응시켜 체중에 따라 난괴법 (randomized complete block design)에 의해 군을 나누어 난소절제 수술을 실시하였다. 수술은 zoletil과 rompun을 이용하여 마취 후 심마취기에 이르면 복부를 절개하여 난소를 제거하고 절개부는 봉합하였다. 수술 후 일주일간 일반 식이를 급여하며 상처를 회복시켰다. 또한, 대조군 설정을 위하여 비난소절제군은 복막 절개까지 난소절제 수술과 같은 방법으로 시행하고, 양측의 난소를 노출 하였다가 절제하지 않고 복막속으로 다시 넣어 난소절제와 같은 스트레스를 주고 다시 봉합하는 모의수술(sham operation)을 시행하여 대조군으로 사용하였다.</p> <h2>혈액 및 조직 채취</h2> <p>실험동물은 해부 전 24시간 절식시켰으며, zoletil과 rom-pun을 이용하여 마취한 후 개복하여 복부대정맥에서 혈액을 채취하였다. 혈액의 생화학적 분석을 위해 상온에서 30분간 방치 한 후, \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심 분리하여 혈청을 분리 하여 사용하였다. 조직은 심장, 신장, 부신, 비장, 폐, 간 및 자궁을 적출하여 주위의 지방과 물기를 제거하여 실험 시까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다.</p> <h2>혈청 중의 지질농도 분석</h2> <p>채취한 혈액은 실온에서 30분 방치 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(3,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청 중의 중성지방, 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 분석은 자동 측정용 slide (FUJI FILM, Japan)를 이용하여 Dry chemistry analyzer 3500i (FUJI, Japan)로 측정하였다.</p> <h2>혈소판 응집력 분석</h2> <p>채취한 혈액을 \( 3.2 \% \) sodium citrate 용액과 1:9의 비율로 혼합한 뒤 \( 1,100 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심 분리하여 상층의 PRP(platelet rich plasma)를 취하고, \(3,000 \matrhm{rpm}\)에서 10분간 더 원심 분리하여 상층의 혈장을 제거한 후 EDTA를 포함하는 washing buffer (\(138 \mathrm{mM}\) NaCl, \( 2.7 \mathrm{mM}\) KCI, \(12 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{NaHCO}_{3}\), \(0.36 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\), \(5.5 \mathrm{mM} \) glucose, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( \mathrm{pH} ~6.5\)) \( 5 \mathrm{ml} \)를 가하여 혈소판을 재현탁 하였다. 이 혈소판을 \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리한 후 다시 suspending buffer로 현탁시켜 washed platelet을 조제하였다. Washed platelet는 suspending buffer로 희석하여 혈소판 수가 \( 5 \times 10^{8} / \mathrm{ml} \)가 되도록 하였고, 응집유도제로 collagen을 \( 2.5 \mu \mathrm{g} \) 가하여 5분간 반응시켜, Whole blood lumi-aggregometer (Chrono-log, U.S.A.)를 사용해 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 혈소판 응집을 측정하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>연구결과 얻어진 자료를 SPSS (statistical package for social science, version 17.0) 통계 프로그램을 사용하여 하위그룹 각각의 기술 통계치(mean, SD)를 산출하였다. 집단간의 차이를 알아보기 위해 일원변량분석(one-way ANOVA)를 이용하여 분석하였고, 사후검증은 Duncan's multiple range test로 \( p<0.05 \) 수준에서 검증하였다.</p>