토양 시료를 증류수에 희석한 다음 투명환을 생성한 균주를 1차로 100여 군주로 분리한다. Bacillus subtilis JK-56이 생산하는 chitinase의 생성 최적 조건을 결정하기 위하여 균의 증식과 효소 생산성을 분석하였다. 최적의 생산 배지조건을 통해 Bacillus subtilis JK-56의 진탕 배양 시간에 의한 균의 생육도와 효소생산량, 단백질량, \( \mathrm{pH} \) 변화 등을 관측한다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Chitinase 생산 균주의 분리</h2> <p>부산 경남 일원에서 채집한 토양 시료를 증류수에 현탁하여 적당히 희석한 다음 colloidal chitin이 함유된 분리용 배지에 도말하여 투명환을 생성한 균주를 1차로 100여 균주를 분리하였다. 그 중에서 chitinase 활성을 측정한 결과, 활성이 가장 높은 56번 균주를 2차로 선별하여 편의상 \( \mathrm{JK}-56 \) 이라 명명하였다. Fig. \( 1(\mathrm{~A}) \) 과 같이 JK-56 균주는 세포 외로 chitinase를 분비한다는 것을 알 수 있다.</p> <h2>분리균주의 동정</h2> <p>JK-56 균주의 형태학적. 특성을 검토한 결과를 Table 2에 나타내었다. Fig. 1(B)의 전자현미경(transmission elec-tron microscope; TEM)상의 사진으로 볼 때 그람양성균의 전형적인 막대 모양으로 포자는 한쪽으로 치우쳐 있었다. 세포의 크기는 JK-56 균주가 Bacillus subtilis에 비해서 조금 작은 것으로 나타났다. Table 2에서 보는 바와 같이 citrate 이용능과 gelatin 가수분해 외에 나머지 특성은 Bacillus subtilis와 거의 홉사한 결과를 보였다.</p> <p>분리 균주 JK-56로부터 genomic DNA를 분리하여27f-1492r primer를 사용하여 16S rDNA 부위를 PCR로 증폭 시킨 후 auto-sequence를 이용해 염기서열을 결정하고 균주의 결정된 425개의 염기서열을 Gene bank database와 비교한 결과 Bacillus subtilis strain 09와 \( 100 \% \) 의 상동성을 보였다.</p> <p>JK-56 균주의 형태학적, 배양학적, 생화학적 특징 및 par-tial 16S rDNA sequencing 결과 등의 제반 분류학적 특징들을 비교해 볼 때 Bacillus subtilis strain 09와 가장 유사한 것으로 판명되었다. 따라서 본 균주를 Bacillus subtilis로 동정하고 편의상 Bacillus subtilis JK-56으로 명명하고 이후의 실험에 사용하였다.</p> <h2>Chitinase의 최적 생산조건 검토</h2> <p>Bacillus subtilis JK-56이 생산하는 chitinase의 생성 최적 조건을 결정하기 위하여 탄소원, 질소원, 무기염, 금속이온의 영향 및 각각의 농도 그리고 초발 \( \mathrm{pH} \), 온도의 영향을 검토하여 배양시간 경과에 따른 균의 증식 및 효소 생산성 을 검토하였다. 그 결과, Table 3에서 보는 바와 같이 효소 생산 최적 조건을 결정하였다.</p> <h2>배양시간에 따른 효소 활성 및 생육도</h2> <p>최적 생산 배지조건하에서 Bacillus subtilis JK-56의 진탕 배양 시간에 따른 균의 생육도와 효소생산량, 단백질량, \( \mathrm{pH} \) 변화 등을 관찰하였다. 그 결과, Fig. 2에서 보는 바와 같이 배양 시간은 약 10시간에서 30시간까지 대수증식기를 보였으며 30시간 이후에 정지기를 거쳐 약 40 시간 정도에 사멸기에 이르러 비교적 생장이 빠르다는 것을 알 수 있었다. Chitinase 효소생산 측면에서는 약 15시간까지 거의 효 소생산이 없다가 15 시간 이후에 효소생산이 급격하게 이루어지면서 40시간 때에 최고의 효소생산을 나타내었다. 따라서 배양 40시간을 효소생산 최적 시간으로 결정하였다 (Table 3). 배양액 내의 단백질량을 보면 균체가 성장하기 전까지 감소를 보이다가 균체가 성장하면서 전반적으로 증가하였다. 정지기에는 배양액 내의 단백질을 이용해 세포 증식의 준비를 하는 단계로 약 12시간까지 단백질이 줄어 들다가 대수증식기가 시작되면서 활발한 대사가 이루어져 효소를 많이 생산한 것으로 추정된다. 사멸기에 접어들면서 단백질량이 증가하는 것은 cell autolysis로 인해 단백질량이 계속 증가하는 것으로 생각된다. 배양 시간의 경과에 따라 배양액의 \( \mathrm{pH} \) 변화는 완만하게 상승해서 \( \mathrm{pH} 8.5\)정도 까지 상승하였다.</p>