안산공단 내 하천의 토양을 시료로 미생물들을 분리하였다. 항진균 활성 미생물을 선발하여 생리 및 생화학적 동정을 했다. 16S rDNA를 통해 정확한 동정을 하고 선발 균주의 최적 생육조건을 알기 위해 최적 질소원과 탄소원을 조사했다. 항진균 물진 대량 생산을 위해 균주의 최적 \( \mathrm{pH} \) 및 온도를 알아보았고, 생리 활성 물질을 chromatography와 TLC를 통해서 정제했다. 분리 정제한 물질의 구조동정은 NMR을 통해 진행했다. 선발한 균주에서 항진균 물질 대량 생산을 위한 최적의 \(\mathrm{pH}\)과 온도를 조사하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>항진균 활성 미생물의 분리</h2> <p>진균 활성 물질을 생산하는 미생물을 분리하기 위하여 안산공단 내 하천의 토양을 채취하여 시료로 사용하였으며, 토양을 멸균수에 희석 도말하여 길항 미생물들을 분리하였다. 식물병원균인 Rhizoctonia solani AG-1, Botrytis cenerea KACC49574, Fusarium oxysporum KACC40053 (한국농용미생물보존센터)을 사용하여 항진균 테스트를 실시하였다.</p> <h2>선발균주의 생리 및 생화학적 동정</h2> <p>분리균주중 항균활성이 있는 균주를 선발하였으며, 선발 균주의 생리 및 생화학적 성질은 API Kit (bioMerieux, Marcy-1'Etoile, France)를 사용하여 조사하였으며, 이들 성질을 토대로 균주의 동정은 Bergey's manual of systematic bacteriology에 준하여 실시하였다.</p> <h2>선발균주의 16S rDNA 염기서열에 기초한 동정</h2> <p>항진균 활성을 토대로 하여 선발한 균주 중 활성이 가장 좋은 BCNU 315 균주의 정확한 동정을 위하여 16S rDNA 염기서열을 결정하였다. 염색체 DNA를 얻기 위하여 pre-cul-ture한 균주를 Luria-Bertani (LB) 배지 \( 3 \mathrm{ml} \)에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) shaking incubator에서 4~6시간 동안 배양하였다. 배양된 균주를 집균하여 1X TEN buffer (Tris-HCl, EDTA, NACI로 washing하였다. \( 100 \mu \mathrm{l} \) 멸균수를 첨가하여 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 이상의 water bath에서 10분간 세포를 파괴하였다. 파괴된 세포를 \( 2500 \times g\), \(4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 원심분리하여 염색체 DNA가 포함 되어 있는 상등액을 얻었고, 이렇게 분리된 염색체 DNA를 주형으로 하여 Polymerase Chain Reaction (PCR: \( 95^{\circ} \mathrm{C}\), \(1 \mathrm{min}\) ; \(55^{\circ} \mathrm{C}\), \(1 \mathrm{~min}\) ; \(72^{\circ} \mathrm{C}\), \(2 \mathrm{~min}\) ; \(30 \mathrm{cycle}\)) 반응을 수행하였으며, 이들 균주의 16SrDNA를 획득한 다음 16SrDNA의 염기서열을 결정하였다. 이때 PCR 반응에는 E. coli 16SrDNA의 upstream 9-27와 downstream 1,542-1,525 영역에 해당하는 염기서열을 이용하여 oligonucleotide을 작성하여 primer로서 사용하였다 (primer F: 5'-GAGTTTG ATCCTGGCTCA G-3', primer R: 5'-AGAAAGGAGGT GATCCAGCCAGCC-3'). 이들의16SrDNA의 염기서열을 결정한 다음 GenBank Database를 통하여 상동성을 비교하였다. 근연 속과 종들과 유전학적인 유연관계를 알아보기 위하여, ClustalX program 을 이용하여 phylogenetic tree를 제작하였다.</p> <h2>최적 질소원 및 탄소원 조사</h2> <p>선발 균주의 최적 생육조건 검토를 위하여 최소배지 \( \left(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} 1.0 \mathrm{~g}\right. \), \( \mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 2.0 \mathrm{~g} \), \( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ~0.2 \mathrm{~g} \), \( \mathrm{NaCl} 2.0 \mathrm{~g}\), \( \mathrm{CaCl}_{2} 0.01 \mathrm{~g} \), \( \left.\mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.01 \mathrm{~g} / \mathrm{l}\right) \)를 기본배지로 각종 질소원과 탄소원을 첨가하여 조사하였다. 먼저 균주를 최소배지에 접종하여 적응시켜, 적응된 균주를 질소원 urea, casami-no acid, beef extract, malt extract, peptone, tryptone, yeast extract가 각각 \( 0.5 \% \)씩 첨가된 배지에 접종하여 배양하였다. 18~24시간 후에 spectrophotometer (UV-2100, Shimadzu, Japan)로 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 탁도를 측정하여 균주에 알맞은 질소원을 선택하였다.</p> <p>선별균주에 알맞은 질소원 \( 0.5 \% \)를 고정으로 하여 탄소원 starch, sucrose, glucose, lactose, fructose, glycerol, mannitol 을 각각 \( 1.0 \% \)씩 첨가하여 균주를 접종한 뒤 최적 탄소원율 결정하였다.</p> <h2>최적 \( \mathrm{pH} \) 및 온도 조사</h2> <p>선발 균주의 항진균 물진 대량 생산을 위하여 균주의 최적 \( \mathrm{pH} \) 및 온도를 조사하였다. 기본배지에 최적 질소왼 \( (0.5 \% \) trypton)과 탄소원(\(1.0\%\) sucrose)을 첨가한 후, 산성부터 염기성까지 초기 \( \mathrm{pH} \)를 조정한 후 배양하였다. 또한 온도의 영향을 알아보기 위해 적정 \( \mathrm{pH} \)를 맞춘 다음 \( 25^{\circ} \mathrm{C}\), \(30^{\circ} \mathrm{C}\), \(35^{\circ} \mathrm{C} \), \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)로 나누어 배양한 후 탁도를 측정하였다.</p> <h2>선발 균주의 생리 활성 물질의 추출 및 정제</h2> <p>균주를 최적배지에서 대량 (60 1)으로 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5일간 진탕배양(\(180 ~\mathrm{rpm}\))하였으며, 배양액을 \( 900 \times g\), 15분간, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 원심분리한 후 세포침전물은 버리고 상등액을 수거하였다. 배양 상등액에 ethylacetate 108를 첨가한 후 electronic stirrer (EURO-ST D, Germany)로 추출하였으며 용매를 evaporator (Ratavapor R-121, Buchi, Switzerland)로 감압 농축하여 얻은 물질은 충진제 silcagel 60 (70 230 mesh, Merck)을 사용한 column chromatography \( (\varnothing 3.5 \times 25) \)를 사용하여 정제하였다. 이때 사용한 전개 용매는 hexane : ethylacetate : dichloromethane (5:1:1)이었으며, fraction I, II, III로 나누어 물질을 받아내었다. 각각의 분획을 사용하여 연속적으로 column chromatography와 thin layer chromatog-raphy (Silica gel \( 60 \mathrm{~F}_{254} \), Merck)를 이용하여 정제한 후 분석하였다.</p> <h2>선발균주의 생리활성물질의 구조동정</h2> <p>분리 정제된 물질의 단일성은 고성능 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC, CBM-20A, Shimadzu, Japan)를 이용하여 확인하였다. Detector는 photodiode array (PDA) detector를 이용하여 \( 205 \mathrm{~nm}\), \(254 \mathrm{~nm} \) 그리고 \( 300 \mathrm{~nm} \) 파장대에서 확인하였다. 유속은 분당 \( 1 \mathrm{ml} \)로 하였으며, 전개용매는 \( 40 \% \) acetonitrile를 사용하였고, \( \mathrm{C}_{18} \) column을 사용하여 분석하였다.</p> <p>정확한 구조를 결정하기 위하여 핵자기 공명 분석 장치 (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR)를 이용하여 HNMR spectra를 얻었다. 핵자기 공명 분석을 위한 용매로는 \( \mathrm{CDCl}_{3} \)를 이용하였다. 분리 정제한 균주의 대사산물의 대략적인 탄소의 수와 탄소의 종류를 관찰하기 위하여 carbon NMR spectrum을 조사하였으며 DEPT NMR spec-trum을 관찰하여 \( \mathrm{CH}, \mathrm{CH}_{2}, \mathrm{CH}_{3} \)의 수를 확인하였다. 또한 분리 정제한 물질의 구조 중 수소 원자가 어떤 탄소에 결합 하고 있는지 알아보기 위하여 COSY NMR spectrum-을 조사하였다.</p>