Lactobacillus 균주는 L. plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis, Lactobacillus acidophilus로 구성되어 있으며, 이들은 Difco Lactobacilli MRS broth를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 배양되었다. 이 실험에서는 Lactobacillus의 성장속도와 항균능력을 평가하기 위해 Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus와 같은 잠재적 병원성 세균을 사용하였다. 이들 세균은 Difco Nutrient broth를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 배양되었다. 배양액의 농축을 위해 최소배지인 M9 minimal media를 선택하였고, Lactobacillus와 세균의 배양 상층액을 농축하여 분말화한 후 필요한 농도로 조정하였다. 그리고 세균 M9과 Lactobacillus M9를 혼합하여 대조군 M9을 만들었다. 이 대조군은 M9 minimal broth를 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용 균주의 배양 조건</h2> <p>본 실험에서 사용한 Lactobacillus는 항생제내성균주은행 (CCARM, Seoul Women's University)에서 분양을 받았으며, 종류는 L. plantarum (CCARM 0067), Lactobacillus brevis (CCARM 0061), Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis (CCARM 0106), Lactobacillus acidophilus (CCARM 0059)이다. 이들 Lactobacillus는 Difco \( { }^{\mathrm{TM}} \) Lactobacilli MRS broth (Becton Dickinson, USA) 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간동안 정치 배양하였다.</p> <p>Lactobacillus spp.의 생장속도와 항균능력을 관찰하기 위해 사용된 잠재적 병원성 세균은 Escherichia coli (ATCC 23736), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 29336), Salmonella typhimurium (CCARM 0125), Staphylococcus aureus (CCARM 3709)이며, Difco \( { }^{\text {TM }} \) Nutrient broth (Becton Dickinson, USA)의 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간동안 배양하였다. 이 병원성 세균들은 항생제내성균주은행과 한국미생물보존센터(KCCM, Seoul, Korea)에서 분양받았다.</p> <h2>균 배양액의 농축</h2> <p>균의 정상배지에는 많은 영양요소가 함유되어 있으며, 균의 생장에 필요한 환경을 제공하기 때문에, 이러한 환경적 요인을 배제하기 위해 최소배지인 M9 minimal media를 선택하고 균을 배양하였다. 뿐만 아니라 실험을 통해 균이 분비한 물질에서 효과가 있음을 확인하였고, 정상배지의 요소를 배재하고 균이 분비한 물질의 효과에 초점을 두고 실험하기 위해 M9 minimal media를 선택했다. 시험 균주가 배양된 상층액은 균일한 농도로 실험하기 위해 농축하여 분말화 한 후 수용성인 부분만 취하였고 자세한 방법은 아래에 기술하였다.</p> <p>Lactobacillus M9: MRS 배지에 키운 \( \mathrm{OD}_{600}=8 \)의 Lactobacillus spp. 균은 M9 minimal broth(MB cell)의 \( 1 \mathrm{~L} \)에 \( 5 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 36-48시간동안 정치 배양한다. \( \mathrm{OD}_{600}=1 \) 의 Lactobacillus를 \( 10,000 \times \mathrm{g}\), 10분간 원심 분리하여 pellet을 제거한 후 상층액을 취한다. 이 상층액은 \( 10 \mathrm{~N} \mathrm{~NaOH} \)를 이용하여 M9 배지의 \( \mathrm{pH} \)를 6.8-7 사이로 맞춘다. \( 0.22 ~\mu \mathrm{m} \) filter (Millipore, USA)로 잔여의 균을 제거하고 감압 건조하여 분말화한다. 이 분말의 무게(Dry cell weight, DCW)는 \( 0.5 \mathrm{~g} /\mathrm{l} \)로서 ultrapure water \( 5 \mathrm{ml} \)에 녹여 최종 농도를 \( 0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)로 준비한다. 이 농축액을 Lactobacillus(spp.) M9이라 한다.</p> <p>세균 M9: Nutrient broth 배지에서 키운 병원성 세균들은 \( \mathrm{OD}_{600}=1 \) 까지 키우고, M9 minimal Broth의 \( 1 \mathrm{~L} \)에 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간동안 배양한다. 이와 같은 조건에서 \( \mathrm{OD}_{600}=1 \)의 균을 \( 10,000 \times \mathrm{g}\), 10분간 원심 분리하여 pellet을 제거한 후 상층액을 취한다. 이 상층액은 \( 0.22 \mu \mathrm{m} \) filter (Millipore, USA)로 제균 후 감압 건조하여 분말화한다. 이 분말의 무게는 \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)로서 ultrapure water \( 10 \mathrm{~ml} \)에 녹여 최종 농도를 \( 0.1 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \)로 준비한다. 이 농축액을 세균 M9 bacterial M9)이라 한다.</p> <p>세균 M9과 반응시킨 Lactobacillus M9: 농축된 세균 M9이 처리된 Lactobacillus (spp.) M9으로서 MRS에서 배양된 Lactobacillus 균주를 M9에 접종할 때 세균 M9의 \( 40 \mu \mathrm{g} \)을 동시 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 36-48 \)시간동안 정치 배양하고 위와 설명한 동일한 방법으로 분리한다. 이 농축액을 세균 M9+ Lactobacillus M9이라고 표현한다.</p> <p>대조군 M9: M9 minimal broth의 \( 1 \mathrm{~L} \)를 감압 건조하여 ultrapure water의 \( 10 \mathrm{ml} \)에 녹여 대조군 처리 시약으로 사용한다. 이 농축액을 M9이라고 한다.</p>