M. scorodenius를 농업유전자원정보센터에서 분양받아 PDA 사면배지에 7일 동안 배양하고, 0.2% lignin과 0.1% guaiacol을 첨가한 PDA 배지에 14일 동안 배양하여 갈색환을 확인하였으며, BTS의 산화에 의해 생성된 산화물은 420 n m ( � = 36 , 000 M − 1 ⋅ c m − 1 ) 420 nm(ε=36,000M −1 ⋅cm −1 )에서 측정하였다.
<h2>재료 및 방법</h2> <h3>사용 균주</h3> <p>본 연구에서 사용한 \( M \). scorodonius는 농촌진흥청 농업유전자원정보센터에서 분양받아 사용하였고, 보관용 배지는 potato dextrose agar (PDA) 사면배지를 사용하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 7일 동안 배양한 후 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 냉장고에 보관하였다. 본 균주의 리그닌 분해능을 조사하기 위하여 \( 0.2 \% \) lignin (Sigma-Aldrich, USA) 및 \( 0.1 \% \) guaiacol (Sigma-Aldrich)을 첨가한 \( \mathrm { PDA } \) 배지에 균주를 접종하고 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 14일 동안 배양시킨 후 형성된 갈색환을 확인하였다.</p> <h3>배양 조건</h3> <p>\( M \). scorodonius 균사체로부터 laccase의 최적 생산을 위한 배지조성을 조사하기 위해 Coriolus versicolor medium(CVM), Czapex dox medium (CDM), Lentinus edodes medium (LEM), mushroom complete medium (MCM), malt yeast glucose medium (MYGM), yeast malt extract medium (YM), laccase production medium (LPM) 및 \( \mathrm { YpSs } \) medium (YSM)을 사용하였으며, 각 배지의 조성은 Table 1에 나타내었다. \( M \). scorodonius 을 \( \mathrm { PDA } \) 평판배지 상에 접종하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5일 동안 배양한 후 한천배지 상의 균사를 직경 \( 5 \mathrm { ~mm } \)의 cork borer로 agar plug를 만들어 각각의 액체배지 \( 100 \mathrm { ml } \)에 접종하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 100 \mathrm { rpm } \)으로 15일간 진탕배양 하였다. 탄소원 및 질소원의 영양원에 따른 효소 생산량을 조사하기 위하여 복합배지 중 가장 높은 효소활성을 나타내는 YM 배지의 조성으로부터 해당 영양원을 제거하고 \( 2 \% \) 탄소원 및 \( 0.4 \% \) 질소원을 각각 첨가하여 실험하였다.</p> <h3>효소활성측정</h3> <p>\( M \). scorodonius 배양액을 whatman No. 1 filter paperi 사용하여 여과하고 원심분리 \( (10,000 \times \mathrm { g } , 10 \)분 \( ) \)를 통하여 균체를 완전히 제거한 후 상등액을 회수하여 조효소액으로 서용하였다. Laccase 활성은 \( 50 \mathrm { mM } \) sodium acetate buff ( \( \mathrm { pH } \) 3.4)에서 \( 2 \mathrm { mM } \) 2,2'-azino bis(3-ethylbenzthiazolin 6 -sulfonate) (ABTS)을 기질로 사용하여 \( 75 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 조효소와 반응시켰으며, ABTS의 산화에 의해 생성된 산화물은 \( 420 \mathrm { ~nm } \left ( \varepsilon = 36,000 \mathrm { M } ^ { -1 } \cdot \mathrm { cm } ^ { -1 } \right ) \)에서 측정하였다. 효소난성의 단위는 분당 \( 1 \mu \mathrm { M } \)의 기질을 산화시키는 효소의 양을 1 unit \( ( \mathrm { U } ) \)로 정의하였다.</p>