Na gene의 염기서열은 PCR를 통해 증폭하여 분석하였다. PCR 실험은 Taq DNA polymerase (Takara, Japan)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 실험하였으며, 염기서열은 ABI PRISM 3730XL DNA Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 분석하였다. 균주의 형태 및 생화학적 특성을 관찰하고 16S rRNA gene의 PCR 증폭 및 염기서열 결정을 위해 Gram 염색, Oxidase 실험, catalase 활성, chitin, starch, xylan 분해 특성 등의 실험을 수행하였다.
<h2>균주의 형태 및 생화학적 특성</h2> <p>선별된 균주를 MBS 배지에 배양하여 위상차 현미경 (Nikon 80i, Japan)을 이용하여 형태를 관찰하였다. Gram 염색은 Gram stain kit (BD, USA)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 실험하였으며 이외에도 Buck가 기술한 비염색 방법을 사용하였다. Oxidase 실험은 bioMerieux 사의 Oxidase reagent (bioMerieux, France)를 사용하여 제조자의 지시대로 사용하여 판단하였으며, catalase 활성은 \( 3 \% \mathrm{~H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 사용하였다. 다른 생체고분자 chitin, starch, xylan의 분해 특성은 skim milk 대신에 이들 기질을 고체평판배지에 \( 1 \% \)로 넣어 조사하였다.</p> <h2>16S rRNA gene의 PCR 증폭 및 염기서열 결정</h2> <p>분리균의 16S rRNA gene을 증폭하기 위하여 콜로니 PCR 방법을 사용하였다. \( 30\ \mu \mathrm{l} \)의 초순수에 고체배지에 자란 콜로니를 소량 취해 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10 분간 가열하였다. 그 후 얼음에 5 분간 정치한 다음 \( 19,000 \times \mathrm{g} \)에서 1 분간 원심분리하고 그 상등액 \( 1 ~\mu \mathrm{l} \)를 PCR 주형 DNA로 사용하였다.</p> <p>16S rRNA gene을 증폭하기 위하여 primer는 27F (E. coli; 5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1492R (E. coli; 5'-TGA GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3')을 사용하였다. PCR 반응은 \(1 \mathrm{~X}\) 반응용액 (\(20 \mathrm{~mM} \) Tris-\(\mathrm{HCI}\) [\(\mathrm{pH} ~ 8.0\)], \(100 \mathrm{~mM}\) \(\mathrm{KCI}\), \(0.1 \mathrm{~mM} \) EDTA, \( 1 \mathrm{~mM} \) DTT, \(0.5\%\) Tween 20, \(0.5\%\) Nonidet P-40, \(50\%\) Glycerol)에 \( 2.5 \mathrm{~mM}\) dNTP, 각 primer \(2 \mathrm{~pmol}\), 상기의 주형 DNA \(1\ \mu \mathrm{l} \) TaKaRa Ex Taq polymerase (Takara Biomedicals, Japan) \( 1.25 \mathrm{~unit}\)을 첨가하여 최종 \( 50 ~\mu \mathrm{l}\)로 반응 혼합액을 만들었다. PCR 반응은 MJ Mini\(^{\mathrm{TM}} \) Thermal cycler (Bio-Rad, USA)을 이용하였고, 반응 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 초, \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 분 30 초로 35회 반복 후 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10 분 동안 final extension을 수행하였다. 중폭된 산물은 PCR purification kit (Real Biotech Corp.,Taiwan)을 사용하여 정제한 후 Solgent 사 (Korea)에 의뢰하여 염기 서열을 결정하였다.</p> <h2>16S rRNA gene의 염기서열을 이용한 계통분석</h2> <p>결정된 염기서열의 상동성 검사는 GenBank의 database에 등록된 정보를 대상으로 Blast 프로그램 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)으로 수행하였다. 계통분석은 Clustal X의 multi-alignment program을 이용하여 정렬하였다. Gerbank에 등록된 다른 균주들의 16S rRNA gene염기서열 정보와 MEGA 프로그램을 이용하여 neighbor-joining method에 의해 염기서열간의 유전적 거리와 phylogentic tree를 얻었다. Branch의 신뢰도 (bootstrap 값)는 500 회의 재구성된 자료로부터 새로운 tree를 작성하여 계산하였다.</p>