압력과 온도범위, 미생물분포 양상이 다양한 해양환경의 미생물을 통해, 비배양 방식으로 새로운 효소에 해당하는 유전자를 찾는 일이 시도되고 있다. 비배양법은 메타게놈과 게놈라이브러리 등이 이용되는데, 서열기반의 게놈 분석과 게놈라이브러리를 이용한 기능기반법 등이 이용되며 각각의 장단점을 가지고 있다. 또한 배양법과 비배양법을 결합하여 게놈서열분석과 주석을 행한 후 활성을 확인하기도 하며, 인위적 돌연변이를 이용하여 활성이 개선된 아가레이스를 확보하기 위해 활성이 개선된 agarase를 통한 비배양법을 이용하기도 한다.
<h2>게놈 및 메타게놈 서열 분석 정보 이용</h2><p>배양법이 아닌 비배양법의 보고들을 보면 지구표면의 \( 70 \% \)는 바다이며 적도의 바다표면과 압력이 \( 100 \mathrm{MPa} \) 정도의 \( 11,000 \mathrm{~m} \) 이상의 심해, \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 이상의 열수구 등 해양환경은 압력과 온도의 범위가 매우 다양하며 미생물분포 양상도 다양한 것에 기초한다. 이러한 다양한 미생물군집에서 배양되지 않는 미생물에서 저온과 고온, 고압에서 유용하거나 새로운 효소에 해당하는 유전자를 찾는 일이 시도되고 있는데, 이는 해양에 존재하는 세균의 \( 0.00001 \sim 0.1 \% \) 만 배양이 가능하므로, \( 99.9 \% \) 이상의 세균이 가진 유용 유전자는 미지의 상태라는 것을 전제로 한다.</p><p>비배양법의 경우 메타게놈과 게놈라이브러리 등이 이용되는데 새로운 혹은 유용유전자 탐색법은 역시 서열기반법과 기능기반법이 있다. '서열기반의 게놈 분석'은 각 메타게놈의 서열을 파악한 후 상동성(homology)에 근거한 분석법으로 일반적으로 기능파악이 어려운 경우에 적용할 수 있는 장점이 있다. Voget 등은 토양 시료의 메타게놈분석에서 12개의 잠정적인 \( \beta \)-agarase 유전자를 발견하고 실험을 통하여 2개의 유전자가 활성이 있음을 보였다. 게놈라이브러리를 이용한 '기능기반의 게놈 분석'은 서열분석이 필요 없고 서열분석에 따르는 유전자 주석(annotation)의 실수를 줄일 수 있는 장점이 있다. 하지만 숙주가 메타게놈의 promoter를 인식하지 못하거나, 코돈 사용성(codon usage)이 다르거나, 생산된 효소가 분비되지 않으면 게놈라이브러리에서 활성효소를 생성하지 못하거나 검출이 어려운 단점이 있다. 이러한 기능기반법의 한계점을 극복하는 방안으로 Marine metagenomics 총설을 참고하면 도움이 될 것이다.</p><p>배양법과 비배양법이 결합하여 새로운 agarase 유전자를 탐색한 보고들도 존재하는데 한천분해 활성을 가지는 세균의 게놈서열분석과 주석(annotation)을 행한 후 후보 agarase 유전자를 이종 숙주에서 생산하여 활성을 확인한다. Mardanov 등은 초고온성 고세균인 Thermococcus 균주의 전체 게놈 분석으로 총 2061종의 단백질을 지정하는 유전자의 주석을 행하여 agarase 후보 유전자를 탐색하고 대장균에서 생산하여 그 기능을 확인하였다. Temuujin 등은 Streptomyces coeli-color A3의 게놈을 분석한 후 보고된 GH50 family \( \beta \)-agarase와 유사한 유전자 서열인 Sco3487을 확인하고 이종 숙주에서 생산하여 한천분해능을 확인하였다. 또한, Alteromonas 속 균주의 게놈을 분석하여 6개의 agarase 유전자를 신규로 탐색한 보고와 Saccharophagus degradans 2-40 균주의 게놈을 분석하여 GH16, GH50, GH86 families에 속하는 5개의 \( \beta \)-agarase 유전자를 탐색한 보고가 있고, 아직 연구되지 않 은 \( \beta \)-agarase 후보 유전자를 탐색하고 대장균에서 생산하여 활성을 확인한 보고도 있었다. 또 다른 보고로는 \( 0.2 \% \) 포도당이 함유된 \( 1.5 \% \) 한천 최소배지에 토양을 섞고 일정시간 경과 후 세균을 모아 메타게놈라이브러리를 제작하고 서열을 분석하여 agarase의 유전자를 탐색한 보고가 있는데, 이 방법은 토양세균의 \( 1 \% \) 이하가 배양가능하다고 알려져 유용할 것이다.</p><h2>인위적 돌연변이법</h2><p>활성이 개선된 agarase를 확보하기위한 비배양법으로는 이미 확보된 agarase 유전자에 대한 인위적 돌연변이가 있다. 일반적으로 기질인 한천이 겔(gel) 상태일 때보다는 졸(sol)상태일 때 agarase의 활성이 높고, 한천은 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 이상에서만 졸 상태이다. 따라서, \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 이상의 온도에서 활성이 높은 agarase를 탐색하고자 하는 노력이 있지만, 기존 내열성 agarase 유전자의 재발견의 가능성은 매우 높은 편이다. 이러한 단점을 극복하기위하여 기존의 agarase 유전자의 돌연변이를 통해 효소의 최적온도와 열안정성 증진에 관한 시도도 있다. Jang 등은 무작위 돌연변이를 통하여 Zobellia galactanivorans 의 \( \beta \)-agarase \( \) B가 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 열안정성이 증진되었고 최적온도의 범위가 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 향상되었으며 활성이 야생형에 비해 최대 \( 260 \% \) 증진되었다고 보고하였고, Lee 등은 Z. galactanivorans의 \( \beta \)-agarase A 유전자에 대한 선택적 돌연변이로 활성과 열안정성이 최소 \( 25 \% \) 이상 증진되었다고 보고하였다. Kittl과 Withers는 확보된 유전자의 direct evolu-tion을 행한 후, 원하는 돌연변이체의 검색을 위한 high-throughput 기법인 FACS, chemical complementation, robot 기반의 ELISA assay 등을 보고하여 향후 agarase 유전자 돌연변이 연구에 도움이 될 것이다.</p>