미생물 동정은 universal primer을 사용하여 \( 16 \mathrm { S } \) rRNA 유전자를 증폭하고, PCR 결과물을 정제한 후 NCBI blast를 통해 동정하였으며, 전배양 한천 배지에 접종하여 \( 15 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 7일간 배양하고, 액체 배양은 각 온도에서 \( 150 \mathrm { ~rpm } \)으로 교반하여 4일간 배양하였다. 성장률 측정은 UV/Vis spectrophotometer를 사용하여 \( 600 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다.
<h1>미생물 동정</h1> <p>각각의 미생물들은 universal primer인 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')과 1492R (5'-CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT-3')를 이용하여 \( 16 \mathrm { S } \) rRNA 유전자를 증폭하였다. PCR 결과물은 \( \mathrm { QIAquick } ^ {\circledR } \mathrm { PCR } \) Purification Kit (Qiagen, Venlo, Netherlands)를 이용하여 정제한 후 (주)마크로젠(Seoul, South Korea)에 의뢰하여 \( 16 \mathrm { S } \mathrm { rDNA } \) 염기서열을 확인한 후 NCBI blast를 통하여 동정하였다.</p> <h1>배양 조건</h1> <p>각각의 미생물들은 전배양 한천 배지에 접종하여 \( 15 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 7일간 배양하여 사용하였으며, 액체 배양은 \( 50 \mathrm { ml } \)씩 \( 250 \mathrm { ml } \) triangular flask에 넣고 멸균한 후 미생물을 접종하여 각각 \( 5,10,15,20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 150 \mathrm { ~rpm } \)으로 교반하여 4일간 배양하였다.</p> <h1>성장률 측정</h1> <p>각각의 미생물들의 성장률은 UV/Vis spectrophotometer (Mecasys Co., Seoul, South Korea)를 사용하여 \( 600 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 배양액을 \( 200 \mu \mathrm { l } \)b취하여 멸균된 각각의 액체 배지 \( 800 \mu \mathrm { l } \)에 넣어 5배 희석하여 흡광도를 측정 하였고, 멸균된 각각의 액체 배지를 blank로 사용하였다.</p> <h1>Protease 활성 측정</h1> <p>Protease 활성 측정은 배양액을 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 원심분리 \( (14,000 \) \( \mathrm { rpm } , 10 \mathrm { ~min } \))한 후 상등액을 회수하여 \( 50 \mathrm { mM } \) sodium phosphate (Daejung Chemical \& Metal Co., Sheung, South Korea) \( 200~ \mu \mathrm { l } \)에 배양 상등액 \( 100~ \mu \mathrm { l } \), 기질인 \( 10 \mathrm { mM } \) AAPF (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) \( 10 \mu \mathrm { l } \), 증류수 \( 690~ \mu \mathrm { l } \) 를 혼합하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분간 반응시킨 후 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20분간 불활성하여 UV/Vis spectrophotometer를 이용하여 \( 410 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였고, 기질대신 증류수를 첨가한 혼합액을 blank로 사용하였다.</p>