경남 김해지역의 염류집적 및 인산과다처리 재배지로부터 채취한 토양시료를 흔합하여, 10 g을 취하고 100ml 의 멸균수에 넣고 200rpm 30분 동안 혼합한 후 6단계 희석 평판법으로 LB 배지에 도말하여 세균의 콜로니를 생성시켰다. 난용성 인산염 가용화능이 확인된 인산 가용화 균을 동정하기 위하여 생화학적, 생리적 특성을 Bergey's manual에 따라 조사하여 동정하였으며, 아울러 정확성을 높이기 위해 그램 염색을 실시한 결과를 이용하여 API system 32GN strip과 API 20E strip을 이용하여 동정하였다. phosphorus reagent 800 ul를 첨가하여 혼합 한 후 20분간 \(50^{\circ} \mathrm{C}\) 에서 반웅시킨 다음, \(820 \mathrm{~nm}\) 에서 흡광도를 축정하였다. 이때 실험에 사용한 용액은 Sigma사에서 제조한 phosphrous reagent kit를 사용하였다. 세 종류의 난용성 인산염 tri-calcium phosphate, hydroxyapatite, aluminium phosphate가 0.5% 함유된 SM배지(pH 6.0)에서 배양하면서 12시간마다 경시적으로 분리균주의 인산 가용화능을 측정하였다. 균주에 의한 \mathrm{pH}pH 변화와 유리인산 생성능은 12시간마다 변화를 측정하였으며, 이상의 배양 환경에 관한 모든 실험은 2회 반복 수행하여 평균값을 구함으로서 실험 오차를 최소화하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>인산 가용화 균주의 선별</h2> <p>경남 김해지역의 염류집적 및 인산과다처리 재배지로부터 채취한 토양시료를 흔합하여, \( 10 \mathrm{~g} \)을 취하고 \( 100 \mathrm{ml} \) 의 멸균수에 넣고 \( 200 \mathrm{rpm}\) 30분 동안 혼합한 후 6단계 희석 평판법으로 LB 배지에 도말하여 세균의 콜로니를 생성시켰다. 생성된 콜로니를 \( 0.5 \% \) hydroxyapatite가 함유된 sucrose minimal (SM) 고체배지(sucrose \( 10 \mathrm{~g}, \mathrm{NH}_{4} \mathrm{NO}_{3} 0.27 \mathrm{~g}, \mathrm{KCl} 0.2 \mathrm{~g} \),\( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.1 \mathrm{~g}, \mathrm{MnSO}_{4} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 1 \mathrm{mg}, \mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 1 \) \( \mathrm{mg} \), Yeast extract \( 0.1 \mathrm{~g} \), 난용성 인산염 \( \left.5 \mathrm{~g}, \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} / 1 \mathrm{~L}\right) \) 에 접종하여 \( 27^{\circ} \mathrm{C}, \) 3일간 배양하여 투명대를 형성하는 균주를 선발 하였다. 선발된 균주는 단일 콜로니가 생성되도록 수차례 계대배양을 실시하면서 인산염 가용화 투명대를 확인하였다.<h2>분리균주의 동정</h2> <p>난용성 인산염 가용화능이 확인된 인산 가용화 균을 동정하기 위하여 생화학적, 생리적 특성을 Bergey's manual에 따라 조사하여 동정하였으며, 아울러 정확성을 높이기 위해 그램 염색을 실시한 결과를 이용하여 API system 32GN strip과 API 20E strip을 이용하여 동정하였다.</p> <h2>인산 가용화능의 측정</h2> <p>\( 500 \mathrm{ml} \) 삼각 플라스크에 \( 0.5 \% \) Hydroxyapatite가 함유된 SM액체배지 \( 100 \mathrm{ml} \) 에 전배양한 균주를 접종한 후, 배양 시간동안 \( 180 \mathrm{rpm} \) 으로 진탕배양하면서 배양 상등액내의 유리인산 농도와 \( \mathrm{pH} \) 변화를 12시간 마다 측정하였다. 균체배양액 \( 1 \mathrm{ml} \) 을 소형 원심용 튜브에 담은 후 소형원심분리기로 \( 5,500 \mathrm{rpm}, \) 5분간 실온에서 원심분리 하였다. 원심분리 후 상등액을 취하고, 여기에 멸균수를 첨가하여 총 \( 200 \mu 1 \) 가 되게하였다. 여기에 phosphorus reagent 800 ul를 첨가하여 혼합 한 후 20분간 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반웅시킨 다음, \( 820 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 축정하였다. 이때 실험에 사용한 용액은 Sigma사에서 제조한 phosphrous reagent kit를 사용하였다.</p> <h2>난용성 인산염 종류별에 따른 인산가용화 특성 조사</h2> <p>인산 가용화균 DA71-1의 난용성 인산염 종류별에 따른 난용성 인산염 가용화능의 차이를 조사하였다. 세 종류의 난용성 인산염 tri-calcium phosphate, hydroxyapatite, aluminium phosphate가 \( 0.5 \% \) 함유된 SM배지( \( (\mathrm{pH} \) 6.0)에서 배양하면서 12시간마다 경시적으로 분리균주의 인산 가용화능을 측정하였다.</p> <h2>배양학적 조건에 따른 인산가용화 특성 조사</h2> <p>인산 가용화 균주, DA71-1 의 배양학적 특성에 따른 난용성 인산염 가용화능의 차이를 조사하였다. 배양온도 차이에 따른 영향은 \( 26^{\circ} \mathrm{C}, 30^{\circ} \mathrm{C}, 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 실시하였고, 초기 배양 \( \mathrm{pH} \)별에 따른 영향은 배양에 사용할 배지의 초기 \( \mathrm{pH} \) 를 5.0, 6.0, 7.0에서 실시하였다. 균주에 의한 \( \mathrm{pH} \) 변화와 유리인산 생성능은 12시간마다 변화를 측정하였으며, 이상의 배양 환경에 관한 모든 실험은 2회 반복 수행하여 평균값을 구함으로서 실험 오차를 최소화하였다.</p>