소의 난소 표면에서 관찰되는 난포들로부터 과립막세포(GC)를 분리하여 배양한 후 Duncan 다중검정으로 통계분석하고 결과들을 서로 비교하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>배양액</h2> <p>본 연구에 사용된 배양액은 Ham's F-10 (Flow Laboratories, Berlin)에 \( 25 \mathrm{~mM} \)의 \( \mathrm{NaHCo}_{3}, 18 \mathrm{~mM} \)의 \( \mathrm{L}(+) \) Lactate, \( 15 \% \) FCS, \( 50 \mathrm{~IU} / \mathrm{ml} \)의 Penicilline을 추가하여 사용하였다.</p> <h2>세포의 분리와 배양</h2> <p>과립막세포(GC)는 소의 난소표면에서 관찰되는 난포들로부터 분리 하였다. 직경이 \( 2 \sim 5 \mathrm{~mm} \)인 미성숙 난포(immature follicle)와 \(6 \sim 15 \mathrm{mm}\)인 성숙 난포(mature follicle)에서 미성숙과립막세포(immature granullosa cell)와 성숙 과립막세포(mature granulosa cell)들을 각각 따로 분리하여 배양하였다. 먼저 18 gage 주사침으로 난포액을 흡입하여 시험관에 모은 다음 \( 175 \times \mathrm{g} \)에서 5분간 원심 분리하여 과립막세포를 분리하였다. 분리 회수된 과립막세포는 \( 45 \% \) percoll (Pharmacia, Sweden) 농도의 PBS액에 넣고 \(700 \times \mathrm{g} \)에서 약 20분간 원심 분리하여 혈구 등을 제거 후 사용하였다. 소량의 과립막세포가 희석된 배양액 \( 1 \mathrm{~ml} \)를 4-well dish에 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 온도, \( 5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2}, 95 \% \) 공기 조건에서 배양하였다. 배양액은 2일마다 신선한 것으로 교체하였다.</p> <h2>내분비 측정</h2> <p>배양액 교체 시 회수 된 배양액은 각각 Efendorp튜브에 넣어 \( -40^{\circ} \mathrm{C} \)에 냉동보관 하였다가 해동하여 분석에 이용하였다. 배양과정 중 과립막세포들이 배양액 내로 분비한 progester-one과 estradiol의 분비량은 RIA (radioimmunoassay)법에 의하여 조사하였다. 배양액 중의 이 호르몬들 농도는 시판되는 RIA-kits (Bieranas, Bad, Nauheim, Germany)를 이용하여 crystal scintillation counter (LKB, Sweden)에서 측정하였다.</p> <h2>수정란의 체외배양</h2> <h3>실험동물 및 배의 회수</h3> <p>실험동물로 \( \mathrm{CB} 6 / \mathrm{F}_{1} \) 교잡종 생쥐(Chares River) 4~6주령의 암컷과 10~12주령의 수컷을 사용하였다. 먼저 암컷 생쥐에 PMSG (sigma, USA) \( 5 \mathrm{~IU} \)를 복강주사하고 48시간 후에 HCG (Sigma, USA) \( 5 \mathrm{~IU} \)를 복강 주사하여 과배란을 유도하였다. HCG 주사 후 암컷과 수컷을 \(1:1\)로 합사시켜 자연교미를 유도하고 48시간 후 암컷을 도살하여 수정란을 회수하였다. Ham's F-10 용액으로 난관을 관류시켜 2세포의 배를 회수하여 세척 하고 정상적인 배 만을 골라서 실험에 사용하였다.</p> <h3>배의 체외배양</h3> <p>과립막세포를 \( 15 \% \) FCS가 포함된 Ham's F-10 배양액에서 배양하고 2일마다 교체되는 배양액들을 모아서 \( -40^{\circ} \mathrm{C} \)에 냉동보관 하였다가 해동하여 \( 0.2 ~\mu \mathrm{m} \) millipore filter로 제균한 다음 배양액으로 사용하였다.</p> <p>준비된 배양액을 4-well dish에 각각 \( 1 \mathrm{~ml} \)씩 넣고 회수된 생쥐 배를 well 당 20개 내외를 이식하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{~CO}_{2}, 95 \% \) 공기조건에서 배양하였다.</p> <h2>통계분석</h2> <p>본 연구에서 얻어진 성적들은 Duncan 다중검정으로 통계분석하고 결과들을 서로 비교하였다.</p>