MLN에서 분리한 세포의 표면 분자들에 대한 항체들에 면역 형광 염색을 실시하였다. 천식 생쥐에서 분리한 BALF와 혈청, 비장세포 배양 상층액을 ELISA kit을 사용하여 생산량을 측정하였다. 포르말린에 고정시켜 세절한 폐를 절편을 만들어 염색하였다. 위 실험들의 유의성 검증은 Student's tt-test 분석 방법을 이용하였다.
<h2>형광 유세포 분석</h2> <p>MLN 으로부터 분리한 세포로부터 여러 가지 세포. 표면 분자들에 대한 항체를 이용한 염색을 하기 위해 \( 5 \times 10^{5} \) cells/ well로 조정한 후 1회 인산왼충 생리식염수로 1회 세척한 후 4 에서 면역 형광염색을 실시하였다. 각각에 PE-anti-CD3e, FITC-anti-CD19, PE-anti-CCR3, FITC-anti-CD4, FITC-anti-CD8, PE-anti-CD23, FITC-anti-CD69, PE-anti-B220, FITC-anti-IgE, PE-anti-Gr-1, FITC-anti-CD11b를 넣고 30분간 얼음에서 반응시켰다. 반응 후 3회 아상 인산완충 생리식염수로 수세한 후 세포 표면 분자들의 발현을 FACS의 Cell Quest 프로그램을 이용하여 \( \mathrm{CD}^{+},{\mathrm{CD} 19^{+}, \mathrm{CCR}^{+} \text {, }}^{2} \) \( \mathrm{CD}^{+}, \mathrm{CD}^{+}, \mathrm{CD} 3^{+} / \mathrm{CD}^{2} 9^{+}, \mathrm{B} 220^{+} / \mathrm{CD} 23^{+},{\mathrm{CD} 3 e^{+}} / \mathrm{CCR}^{+} \), \( \mathrm{CD} 11 \mathrm{~b}^{+} / \mathrm{Gr}-1^{+} \)세포수를 백분율(%)로 분석한 후 총세포수를 적용하여 각 조직에서의 절대 세포수를 산출하였다.</p> <h2>ELISA 분석</h2> <p>천식 생쥐에서 분리한 BALF, 혈청 및 비장세포 배양 상층액에서 IL-4, IL-5, IL-13, eotaxin, IFN- \( y \) 및 OVA-specific IgE를 측정하기 위하여 ELISA kit을 사용히여 생산량을 측정하였다. 각 항체를 coating 완충용액에 희석하여 microwell에 coating한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 overnight하였다. 각 well을 3화 washing 완충용액으로 세척한 후 BALF, 혈청( 100 배 회석) 및 비장세포 배양 상층액을 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 씩 분주하였다. 1시간 동안 실온에서 방치한 후 2회 washing 완충용액으로 세척한 다음 antibody Avidin-HRP conjugated 100\( \mu \mathrm{L} \) 를 처리하고, 1 시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다. 여기에 TMB 기질을 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 씩 분주하고 암소에서 30 분간 방치한 후 \( 50 \mu \mathrm{L} \) 의 stop 용액을 처리한 후 ELISA reader \( 450 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>조직 병리 검사</h2> <p>폐를 때어내어 10% 포르말린에 고정시킨 후 세절하여 흐르는 물에 8시간 수세한 다음, epoxy에 포매한 후 microtome으로. 절편을 만들어 hematoxylin/eosin (H\&E), collagen deposition 염색인 Masson's trichrome (M-T), goblet cell 염색을 위한 Periodic acid-Shiff (PAS) 염색을 수행하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean \( \pm \) standard error 로 기록하였고, 유의성 검증은 Student's \( t \)-test 분석 방법을 이용하여 결정하였다.</p>