Ogawa 등의 방법을 변형하여 어류 비늘에서 콜라겐 펩타이드를 제조하였다. 숭어의 비늘을 교반기가 부착된 세정기를 통해 여러 차례 세정하고 원심 분리하여 콜라겐 펩타이드 제조용 시료로 사용하였다. 이 시료는 산 가수분해법을 통해 총아미노산 분석용으로 분해하였다. 표준 시약을 HPLC에 주입하여 검량선을 작성한 후, TSK Gel G2500PW \( { }_{X L} \) column을 이용하여 SEC 방법에 따라 검체의 분자량 분포를 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>콜라겐 펩타이드 제조용 시료</h2> <p>부산광역시 자갈치 시장에서 구입한 숭어(gray mullet, Mugil cephalus)로부터 비늘을 분리한 다음, 교반기가 부착된 세정기에 넣어 수세를 수회 반복한 후, 원심분리하여 세정한 것을 콜라겐 펩타이드 제조용 시료로 사용하였다.</p> <h2>콜라겐 펩타이드의 제조</h2> <p>어류 비늘 콜라겐 펩타이드의 제조는 Ogawa 등의 방법을 변형하여 사용하였다. 세정한 비늘을 10배량의 \( 0.1 \mathrm{~N} \) 수산화나트륨 용액에 투입하여 24시간 교반한 후 원심분리하여 \( \mathrm{pH} \) 가 중성이 될 때까지 수세하였다. 시료 중량당 10 배량의 \( 0.5 \mathrm{M} \) 초산 용액에 \( 0.1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 펩신(EC 3.4.23.1; Showa, Japan)을 가하여 2일간 교반하여 가수분해한 후 \( 25,000 \times 8 \) 에서 30분간 원심분리하였다. 얻어진 상등액은 3일간 \( 0.02 \mathrm{M} \)\( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4}(\mathrm{pH} 7.2) \) 에서 투석한 후 동결 건조하여 콜라겐 단백질을 얻었다. 제조한 콜라겐 단백질에 대하여 10량의 물을 가하고 단백질 분해효소인 alcalase를 첨가하여 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48시간 가수분해한 후, 원심분리하여 잔사를 제거하고 한외여과막(ultrafiltration; Sigma, St. Louis, USA)을 이용하여 석회질의 잔사와 불순물을 제거하였으며, 탈염이나 농축을 위하여 다시 nano membrane filtration (Sigma, St. Louis, USA)을 사용하여 여과한 후, 동결 건조하여 최종적으로 콜라겐 펩타이드를 제조하였다.</p> <h2>콜라겐 펩타이드의 분자량 분포 분석</h2> <p>표준시약(polyethylene glycol kit, type PEG-10; Sigma, St. Louis, USA) 및 제조한 콜라겐 펩타이드 시료 \( 0.01 \mathrm{~g} \) 을 정칭하여 증류수(DW), 아세토니트릴(ACN) 및 트리플루오로초산(TFA)의 혼합 용매(DW:ACN:TFA \( =55: 45: 0.1, \mathrm{v} / \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 에 용해시켜 실온에서 하룻밤 방치한 후, \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) membrane filter (Sigma, St. Louis, USA)로 여과한 것을 표준 및 시험용액으로 사용하였다. 표준시약을 HPLC에 주입하여 검량선을 작성한 다음, 검체에 대하여 TSK Gel G2500PW \( { }_{X L} \) column \( (\Phi 7.8 \times 300 \)\( \mathrm{mm} \), TOSOH Co.)을 사용하여 size exclusion chromatog-raphy (SEC) 방법에 따라 검체의 분자량 분포를 GPC pro-gram Water 510 (Waters Co., Ltd, Boston, Massachusetts, USA)을 이용하여 분석하였다.</p> <h2>아미노산 조성 분석</h2> <p>총아미노산 분석용 시료는 산가수분해법으로 분해하였다. 즉, 단백질 함량으로 \( 30 \mathrm{mg} \) 정도의 콜라겐 분말을 cap tube에 취하고 \( \beta \)-mercaptoethanol \( 0.04 \% \) 를 함유한 \( 6 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} \) 을 단백질 량의 1,000 배 이상 가하여 질소 가스를 8분간 충전하여 탈기시킨 다음, \( 110^{\circ} \mathrm{C} \) sand bath상에서 24시간 가수분해한 후, 농축 건고하여 잔사를 \( 0.2 \mathrm{~N} \) sodium citrate buffer \( (\mathrm{pH~} 2.2 \) )로써 \( 50 \mathrm{ml} \) 로 정용하여, 아미노산 자동분석기(Hitachi model 835,Japan)로 분석하였다. tryptophan은 Hugli와 Moore 의 방법에 의하여 알칼리 가수분해법으로 분해시켜, \( 550 \mathrm{~nm} \) 에서 비색 정량하였다.</p>