SDS-PAGE를 사용하여 키틴 분해효소의 분자량을 측정하였다. Sample buffer, 효소액을 혼합하여 90\(^\circ \mathrm{C}\)에서 3분간 열처리한 후 80V에서 2시간 전기영동을 수행하였고, 표준단백질 이용하여 분자량을 측정하였다. Zymography 분석을 위해 전기영동한 10% polyacrylamide gel을 1% Triton X-100 용액과 멸균증류수로 15분동안 세척하고 8% colloidal 키틴을 함유한 10% polyacrylamide gel 위에 중첩후 반응시켰다. 정제한 효소단백질을 전기영동한 후 PVDF membrane으로 transfer하여 Edman법으로 아미노산 서열을 확인하였다.
<h2>분자량 측정</h2> <p>키틴 분해효소의 분자량 측정은 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 사용하였다. Sample buffer [12.5 mM Tris \( \mathrm { HCl } ( \mathrm { pH } \) 6.8), \( 2 \% \beta \) -mecaptoethanol, 20 \% glycerol, 0.02 \% bromophenol blue, \( 2 \% \mathrm { SDS } ] \) 와 효소액을 \( 4: 1 \) 로 혼합하여 \( 90 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 3 분간 열처리한 후, \( 80 \mathrm { ~V } \) 에서 2 시간동안 전기영동을 수행하였다. 전기 영동이 완료된 gel은 coomassie brilliant blue로 4 시간동안 염색하고 증류수로 탈색하였다. 단백질 분자량 측정을 위한 표준 단백질로 broad-range pre-stained marker (7-240 \( \mathrm { kDa } \); Elpis Biotech Inc., Korea)를 사용하였다.</p> <h2>Zymography 분석</h2> <p>SDS-PAGE 전기영동한 \( 10 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) polyacrylamide gel을 \( 1 \% \) Triton X-100 용액(10 mM Tris \( \mathrm { HCl } \) buffer, \( \mathrm { pH } \) 7.5)과 멸균증류수를 이용하여 각각 15 분동안 세척하여 \( \mathrm { SDS } \) 를 제거한 후, \( 8 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) colloidal 키틴을 함유한 \( 10 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) polyacrylamide gel 위에 중첩시켰다. 중첩시킨 두 장의 gel은 \( 10 \mathrm { mM } \) Tris \( \mathrm { HCl } \) buffer ( \( \mathrm { pH } \) 7.5)가 존재하는 square dish에 보관하며 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 72 시간동안 반응시켰다.</p> <h2>N-terminal 아미노산 서열분석</h2> <p>정제한 효소단백질을 SDS-PAGE 전기영동한 후, transfer buffer \( [10 \times \) transfer buffer (Tris \( 30.3 \mathrm { ~g } \), glycine \( 144.2 \mathrm { ~g } \), D.W 1 liter, pH 8.3) \( 100 \mathrm { ml } \), methanol \( 200 \mathrm { ml } \), D.W \( 700 \mathrm { ml } ] \) 에 평형화시킨 polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Bio-Rad Laboratories, USA)에 \( 17 \mathrm { ~V } , 40 \) 분동안 transfer 하였다. Transfer한 후, PVDF membrane은 coomassie brilliant blue로 염색하고 methanol로 탈색하였다. PVDF membrane을 건조하여 염색한 효소단백질을 확인한 후, Edman 방법에 따라 Protein/Peptide sequencer (Applied Biosystems Inc.)를 이용하여 아미노산 서열을 확인하였다.</p>