Lipoxygenase 활성 측정은 tris buffer, 시료용액, lipoxygenase 및 linolenic acid를 첨가하여 18\(^\circ \mathrm{C}\) 5분간 배양한 후 110\(\mu\mathrm{m}\) linolenic acid를 첨가하여 20분간 반응시키고 254nm에서 측정하였다. 각 세포의 배양은 RAW 264.7 세포에 1~1000\(\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml}\) 시료용액 또는 양성 대조군을 1시간 전처리한 후 LPS를 처리하고 37\(^\circ \mathrm{C}\) 5% CO2 incubator에 24시간 배양하여 측정하였다.
<p>저해율 \( ( \%)= \left (1- \frac {\text { 시료첨가군의 흡광도 } } {\text { 무첨가군의 흡광도 } } \right ) \times 100 \)</p> <h2>Lipoxygenase 저해활성 측정</h2> <p>Lipoxygenase 활성 측정은 기존의 방법을 변형하여 실험하였다. 즉 반응구는 \( 0.1 \mathrm { M } \) tris buffer(pH 8.5) \( 2 \mathrm { ~mL } \) 와 시료용액 \( 0.02 \mathrm { ~mL } \) 를 첨가하고 lipoxygenase \( (500 \mathrm { U } / \mathrm { mL } ) \) \( 0.03 \mathrm { ~mL } \) 를 첨가하여 \( 18 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분간 배양한 다음 \( 110 \mu \mathrm { M } \) linolenic acid \( 0.05 \mathrm { ~mL } \) 를 첨가하여 20분간 반응시켜 \( 254 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다.<p>저해율( \%) \( = \left (1- \frac {\text { 시료첨 가군의 흡광도 } } {\text { 무첨가군의 흡광도 } } \right ) \times 100 \)</p></p> <h2>세포배양</h2> <p>본 실험에 이용한 각 세포의 배양은 \( 10 \% \) fetal bovine \( \operatorname { serum } \) (FBS)과 \( 1 \% \) penicillin/streptomycin( \( 100 \mathrm { U } / \mathrm { mL } ) \) 을 첨가한 Dulbeco's modified eagle's medium(DMEM) 배지를 사용하였으며, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에 적응시켜 계대 배양하였다. RAW \( 264.7 \) 세포에 시료용액의 여러 농도 \( (1,10 \), \( 100,1000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) ) 또는 양성 대조군을 1 시간 전처리한 후 \( \mathrm { LPS } (1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \) 를 처리하고 24 시간 배양하였다.</p> <h2>MTT assay에 의한 세포 독성 측정</h2> <p>세포 독성 측정은 Carmichael 등의 방법에 따라 각 세포주 macrophage(Raw 264.7) cell을 96 well plate에 \( 0.6 \) \( 8 \times 10 ^ { 3 } \) cells/well이 되게 \( 0.18 \mathrm { ~mL } \) 분주하고, 시료를 농도 별 로 조제하여 \( 0.02 \mathrm { ~mL } \) 첨가한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에서 24시간 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 \( 5 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) 농도로 제조한 MTT 용액 \( 0.02 \mathrm { ~mL } \) 를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO:EtOH(1:1) \( 0.15 \mathrm { ~mL } \) 를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 550 \( \mathrm { nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 측정은 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p>