본 논문은 항산화물질에 대한 hPrx 6의 발현과 변화를 분석하기 위해 hPrx 6 promoter DNA 단편을 인간 NCI-H460세포로부터 얻어 hPrx 6/Luc 벡터를 제조하고 세포배양 및 transfection을 실시하였다. 세포에서 hPrx\6 mRNA 발현을 관찰하기 위해 인삼, 홍삼, 맥문동, 홍문동 \(4\)가지 추출물을 준비하고 NCI-H460세포에서 \(24\)시간 처리한 후 RNA를 분리하여 RT-PCR을 실시했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>hPrx 6/Luc 벡터제조</h2> <p>hPrx 6 promoter DNA 단편은 인간 NCI-H460세포로부터 genomic DNA를 분리한 후 hPrx 6 promoter 특이적인 프라이머(forward primer; 5'-GCGCT AGCGC ACCAA CACAT CACTG TGATG AAAAC-3', reverse primer; 5'-GCAGA TCTGA CAGCA AGCAA CCGGT TGGTT CTGGC-3')를 이용하여 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, \( 62^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 1분 조건에서, 35 cycle로 반응하여 합성하였다. 합성된 hPrx6 promoter DNA 단편 (1,496-bp)은 pGEM-T easy 벡터(Promega, Madison, WI, USA)에 클로닝한 후 Nhd II와 Bg으로 절단하여 DNA 단편을 준비하였고, 동일한 제한효소로 절단된 pTransLucent \( ^{\mathrm{TM}} \) Reporter 벡터(Panomics, CA, USA)와 결합하여 hPrx 6/Luc 벡터를 제조하였다. 제조된 hPrx 6/Luc 벡터는 제한효소 절단과 automatic sequencing을 통해 정확한 유전자 서열의 삽입을 확인하였다.</p> <h2>세포배양 및 transfection</h2> <p>항산화물질에 대한 hPrx 6의 발현변화를 분석하기 위하여 사용한 인간 NCI-H460 세포는 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA), L-glutamine, penicillin 및 strep-tomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 함유한 RPMI 1640 (Hyclone Co., Logan, UT, USA)에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건의 incubator에서 배양하였다. Transfection을 위하여 \( 20 \mu \mathrm{g} \) 의 재조합 DNA를 Lipofectamine \( { }^{\mathrm{TM}} \) Reagent (Invitrogen)과 실온에서 20분간 혼합하여 준비하고, NCI-H460 세포는 항생제가 없는 배지에서 24시간 배양하여 \( 2 \times 10^{7} \) 세포가 되도록 준비하였다. 세포를 Opti-MEM medium (Invitrogen)으로 한 번 세척한 후 준비된 DNA/Lipofectamine 혼합물을 세포에 첨가한 후 5시간 동안 유전자가 주입되도록 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 배양하였다. 5시간 경과 후 항생제가 있는 정상배지로 교환하여 24시간동안 배양하여 분석에 사용하였다.</p> <h2>물질처리 및 reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis</h2> <p>세포에서 hPrx\6 mRNA 의 발현을 관찰하기 위하여 사용된 인삼(Korea White Ginseng, KWG), 홍삼(Korea Red Ginseng, KRG), 맥문동(Liriope platyphylla, LP), 홍문동(Red Liriope pla-typhylla, RLP)의 4가지 추출물은 이전에 보고된 논문에서 제시된 방법으로 준비하였다. 준비된 추출물은 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 로 NCI-H460 세포에 24시간 동안 처리한 후 RNA를 분리하여 RT-PCR을 실시하였다. RNA의 분리를 위해, 먼저 세포로부터 배지를 모두 제거한 후 RNA-Bee \( { }^{\mathrm{TM}} \) solution (Tel-Test, Austin, TX, USA)을 이용하여 회사의 권장법에 따라 RNA를 추출하였다. RNA-Bee \( { }^{\mathrm{TM}} \) solution 추출물에 포함된 단백질을 chloro-form을 이용하여 침전시킨 후 isopropanol을 이용하여 RNA를 침전시켜 RNA만을 수확하였다. 분리된 전체 RNA는\( 260\mathrm{nm} \) 흡광도에서 양을 측정하고, \( 5 \mu \mathrm{g} \) )을 RT반응에 사용하였다.</p> <p>RT반응은 먼저 \( 5 \mu \mathrm{g} \)의 RNA에 \( 0.5 \mu \mathrm{g} \)의 oligo dT (Invitrogen)를 처리하고, \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분 동안 반응하여 \( 500 \mathrm{ng} \) 의 oligo dT 를 RNA에 결합시켰다. 여기에 5x 완충용액, \( 10 \mathrm{mM}\) dNTP, \( 0.1 \mathrm{M} \) DTT, Superscript II (Invitrogen, \( 200 \mathrm{U} / \mu \mathrm{Ll} \) )를 첨가하여 실온에서 10분 동안 방치 후 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 50분 동안 RT반응을 수행하였다. RT반응이 끝나면 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분 동안 처리하여 RNA와 cDNA를 분리하고, RNase H (Invitrogen)를 \( 3.2 \mathrm{U} / \mu 1 \) 처리하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20분 동안 반응하여 RNA를 분해하였다.</p> <p>합성된 cDNA를 주형으로 \( 94^{\circ} \mathrm{C}(30 \mathrm{sec}), 62^{\circ} \mathrm{C}(30 \mathrm{sec}), 72^{\circ} \mathrm{C} \) \(45 \mathrm{sec}\) 25 cycle로 hPrx 6 특이적인 서열(sense primer: 5'- GCGCT AGCGA ACCAA CCGGT TGCTT GCTGT CC-3', anti-sense primer: 5'-GCCTC GAGCA GCTTC TCCAA GAGAC TTAAG-3')과 actin 특이적 서열(sense primer: 5'-GTGGG GCGCC CCAGG CACCA GGGC-3', anti-sense pri-mer: 5'-CTCCT TAATG CTACG CACGA TTTC-3')을 이용하여 PCR을 실시하였다. 증폭된 유전자는 \( 1 \% \) agarose gel에서 전기영동을 실시한 후 UV에서 관찰하였다. PCR 산물이 전기영동에서 나타내는 band의 density는 Kodak Electrophoresis Documentation and Analysis System 120을 이용하여 분석하였다.</p>