팽이버섯 균주를 PDA배지에서 배양하여 그 균사를 DNA 추출 실험에 사용 하였다. 배양한 균사를 채취하여 마쇄한 후 원심분리 기술을 이용한 여러 과정들을 거쳐 Genomic DNA를 추출 하였다. ITS 염기서열을 분석하기 위해서 fungi의 ITS영역을 증폭하였다. 염기서열 증폭은 프라이머와 PCR 기술을 이용하였다.
<h2>균주의 배양</h2> <p>팽이버섯 균주 배양은 PDA (Difco USA) 배지를 이용하였으며, \( 39 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \)의 용량으로 조제하여, \( 121 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 15분간 멸균한 뒤 clean bench에서 \( 90 \mathrm { ~mm } \) petri dish에 \( 20 \mathrm { ml } \) 씩 분주하여 완전히 식힌 뒤 medium으로 사용하였다. 또한 균주의 계대 배양시 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 incubator에서 20일간 배양하여 본 실험에 사용하였다.</p> <h2>Genomic DNA 추출</h2> <p>Genomic DNA의 추출을 위해 PDA 배지에서 20일에서 23일간 배양한 균사를 사용하였으며, DNA 추출법은 Lee 등의 방법을 약간 변형하여 사용하였다.</p> <p>배양한 균사를 \( 0.2-1 \mathrm { ~g } \) 채취하여 mortar에 넣고 liquid nitro-gen으로 급냉 시켜 냉동상태에서 미세하게 마쇄한 다음 lysis buffer [ \(50 \mathrm { mM } \) Tris-HCl (pH 7.2), \( 50 \mathrm { mM } \) EDTA (pH 8.0), \( 3 \% \) SDS, \( 1 \% \) 2-Mercaptoethanol] \( 500 \mu \mathrm { l } \)를 넣어 잘 섞고, \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) Water bath에서 1시간 동안 반응시킨 후 \( 12,000 \mathrm { rpm } \) (Effendorf 5415 centrifuge, German) \( 4 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 15분간 원심분리 후 상등액만 취하였다. 여기에 동량의 phenol:chloro-form:isoamylalcohol (25:24:1) 용액을 첨가 \( 15,000 \mathrm { rpm } \)에서 5분간 원심분리하여 새로운 tube에 상등액만 취하였다. DNA가 녹아있는 상등액에 2배의 absolute ethanol을 넣고 20-30분간 DNA를 침전시켜 \( 15,000 \mathrm { rpm } \)에서 5분간 원심분리 하였다.</p> <p>DNA함량을 측정하기 위해 DNA를 100 배 희석하여 spec-trophotometer-(Shimadzu UV-VIS1201, Japan)로 \( 260 \mathrm { ~nm } \)와 \( 280 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도(OD)를 측정하여 농도를 계산하고, PCR을 위한 template DNA로 사용하였다.</p> <h2>ITS primer와 증폭</h2> <p>ITS 염기서열을 분석하기 위하여 증폭한 부분은 White 등에 의해 보고된 fungi의 ITS영역 즉 partial 16S ribosomal DNA, complete ITSI, 5.8S ribosomal DNA 및 partial 28S ri-bosomal DNA였다. 증폭을 위해 ITSP1, ITSP2, ITSP3, ITSP4 primer들을 사용하였다(Fig. 1). 증폭은 Bioneer PCR kit를 사용하였다. 본 실험은 MJ Research PTC 150 minicycler에서 수행하였으며 thermal cycle의 program은 primer ITSP 1 과 2, ITSP3과 ITSP4를 달리하여 사용하여 반응시켰다.</p>