CRP 유전자는 발현벡터 pRE2에 클로닝된 CA8445pRK248 pRE2crp를 배양하였고, CRP 유전자의 돌연변이는 M13crp DNA와 83번/128번 염기가 바뀐 프라이머를 사용하였다. 배양된 균체를 완충액 처리, 원심분리, 농도 기울기 칼럼 등의 과정을 거쳐, \( 0.33 \mathrm { M } \mathrm { K } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } / \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } \)의 기울기로 단백질을 elution한다. 다음으로 \( 0.1 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } \)에서 \( 0.35 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } \)의 기울기로 elution하고, elution시 각 fraction에 모인 단백질 용액을 SDS-PAGE로 확인하는 절차를 거친다.
<h1>재료 및 방법</h1> <p>시먁 및 재료</p> <p>Glycine, boric acid, lauryl sulfate (SDS), potassium phosphate, ammonium sulfate, potassium chloride, EDTA, Tris, subtilisin (protease type XXVII), sodium chloride, glycerol, sodium phosphate, CM Sephadex, Coomassie brilliant R 등은 Sigma 제품을 사용했으며, Hydroxyapatite, ammonium persulfate는 BioRad의 제품을 사용했다. Pho-sphocellulose resin은 Whatman 제품을 사용했으며, LB medium은 DIFCO사 제품을 사용했다. CRP 유전자는 ex-pression vector pRE2에 클로닝된 CA8445pRK248( \( \left . \lambda \mathrm { CI } ^ {\text { is } } \right ) \) pRE2crp를 배양하여 CRP 단백질을 분리하였다.</p> <p>실험방법</p> <p>CRP 단백질 정제</p> <p>crp 유전자의 돌연변이는 Kunkel이 제안한 방법인 uracil을 포함한 한 가닥의 M13crp DNA와 그리고 83번 위치와 128번 위치의 염기가 바뀐 프라이머를 사용하였다. CRP 단백질 분리는 CA8445pRK248pRE2crp를 LB media \( (50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { m } \ell \) ampicillin, \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) tetracycline, \( 0.5 \% \) glucose)를 이용하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 항온 기반하여 배양하였다. 배양된 균체는 \( \mathrm { PC } \) buffer \( \left (20 \mathrm { mM } \mathrm { K } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } / \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } ( \mathrm { pH } \right . \)7.5), \( 7 \mathrm { mM } \beta \)-mercaptoethanol, \( 1 \mathrm { mM } \) EDTA, 10 \% glycerol)에 \( \mathrm { KCl } \) 용액이 \( 300 \mathrm { mM } \)이 되게 조정한 용액에 녹인 후 lysozyme \( (50 \mathrm { mg } / \mathrm { m } \ell \) ) 을 넣고 얼음에 30 분 정도 둔다. \( \mathrm { OD } \) 측정으로 cell이 \( 90 \% \) 이상 깨어질 때까지 ultra sonicator를 이용해 cell을 깬 후 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 15000 \mathrm { rpm } \) 에서 \( 1 \mathrm { hr } \) 동안 원심 분리하며 그리고 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 35000 \mathrm { rpm } \) 에서 \( 1.5 \mathrm { hr } \) 동안 원심분리로 찌꺼기를 제거한다. 칼럼에 phosphocellulose 수지를 packing한 후 \( \mathrm { PCK } \) 완충액에 \( \mathrm { KCl } \) 이 \( 300 \mathrm { mM } \)로 조정된 용액으로 칼럼을 씻어준다. 위 과정에서 준비한 상등액을 3 배로 희석하여 칼럼에 주입한다. 다시 칼럼을 washing한 후에 \( 300 \mathrm { mM } \mathrm { KCl } \) 에서 \( 1.2 \mathrm { M } \mathrm { KCl } \)의 농도 기울기 칼럼에 걸어준다. \( \mathrm { UV } \) 검출기의 자료를 이용하여 피크에 해당하는 fraction을 선택해서 SDS-PAGE로 확인하였다. 두 번째 단계로 hydroxylapatite 수지를 칼럼에 packing하고 PCK buffer에 \( \mathrm { KCl } \)이 \( 200 \mathrm { mM } \)되게 조정한 buffer로 washing한 후 sample을 loading한다. 그리고 D에서 \( 0.33 \mathrm { M } \mathrm { K } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } / \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } \)의 기울기로 단백질을 elution한다. 각 fraction에 모인 단백질 용액을 SDS-PAGE로 확인한다. 다음으로 CM sephadex을 column에 packing하고 \( \mathrm { CM } \) 완충용액에 \( \mathrm { NaCl } \)이 50mM로 조정된 buffer로 씻어주고 dialysis한 sample을 loadng한다. 1 bedvolume의 buffer로 씻어주고 \( 0.1 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } \)에서 \( 0.35 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } \)의 기울기로 elution한다. 각 fraction에 모인 단백질 용액을 SDS-PAGE로 확인한다.</p>