본 연구에서는 수세, 분쇄, 여과, 원심분리, 동결건조 등의 방법을 이용하여 RJ 및 RSP를 제조하여 실험에 사용하였다. 실험은 Choi의 방법을 일부 수정하여 진행되었으며, HBSS 완충용액에 녹여 유전독성을 분석하고, 발암원인 MNNG를 첨가함으로서 항유전독성을 평가하였다. 이러한 평가를 통해 RJ와 RSP의 안정성과 효용성을 모색하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>시료의 조제</h2><p>무 추출물을 만들기 위하여 포항시 죽장면 일대의 고랭지에서 생산된 김장용 무의 일종인 백운무를 구입하였다. 이를 수세 및 분쇄한 후 여과지를 통하여 걸러진 여액을 8,000 \( \mathrm{rpm} \)에서 원심분리 함으로서 고형물을 제거하였으며 이를 동결건조하여 무추출물(Radish Extract: RJ) 시료를 조제하였다. 종자 단백질의 경우 \( 50 \mathrm{~g} \)의 백운 무 씨앗을 수세 후 10배 부피의 \( 20 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} (\mathrm{pH} 8.0) \) 완충액을 첨가한 다음 분쇄하였다. 이 분쇄액을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 일간 침지시킨 다음 거즈 및 여과지를 통해 1회씩 거른 후 얻어진 여액을 \( 12,000 \mathrm{rpm} \)에서 원심분리하여 상청액만을 분리한 뒤 \( 0.4 \mu \mathrm{m} \) 여과막을 통해 고형물을 제거한 조단백질 용액을 얻어내었다. 조단백질 용액은 DEAE-cellulose 음이온교환 크로마토그래피를 통하여 활성을 나타내는 비흡착 분흭을 분리하였으며, 이를 동결건조를 통하여 재 농축 한 뒤 sephadex G-50 젤 크로마토그래피를 통하여 약 \( 6 \mathrm{kDa} \) 크기의 활성분획(Radish seed protein : RSP) 을 분리하여 실험에 사용하였다.</p><h2>In vitro 유전독성 및 항유전독성 측정</h2><p>RJ와 RSP의 첨가제로서 안전성 및 효용성을 모색하기 위해 in vitro 상에서의 유전독성 및 항유전독성 분석을 Choi의 방법을 일부 수정하여 다음과 같이 수행하였다.</p><p>RJ 및 RSP가 강한 항균활성을 나타내는 농도가 되도록 HBSS 완충용액(Cambrex, USA) 에 녹인 후(RJ : \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \), \( \mathrm{RSP}: 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \), 각각 \( 10 \mu \mathrm{l} \)씩 세포주에 처리하여 유전독성을 검색하였으며, 여기에 최종농도가 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)이 되도록 직접 발암원인 MNNG (Fluka, Germany)를 첨가한 후 세포주에 투여함으로서 항유전독성을 검토해 보았다. 음성대조구로서는 HBSS 완충액만을, 양성대조구로서는 MNNG만이 첨가된 HBSS 완충액을 사용하였다. 본 실험의 세포주로 사용된 비종양성 3T3 세포주(ATCC CCL No. 163)는 매 세포 계 대시에 직경 \( 3 \mathrm{~cm} \)의 둥근조직배양접시에 \( 1.0 \times 10^{5} \) cells/plate로 분주하여 24시간 배양한 후 PBS 완충액으로 2회 세척한 다음 상기 시료를 가한 뒤 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% ~ \mathrm{CO}_{2} \)의 조건 하에서 30분간 반응시켰다. 반응이 종료된 세포는 PBS 완충액으로 세척하고 \( 0.125 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도의 proteinase K (Amnesco, USA) 100 l를 처리후 \( 1 \mathrm{ml} \) 의 무혈청 DMEM 배지(Cambrex, USA) \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하여 세포를 현탁시켰으며 이를 \( 1000 \mathrm{RPM} \)에서 3분간 원심분리 후 상청액을 제거하였다. 원심분리된 처리구별 3T3 세포주는 육안으로 관찰하여 침전된 세포의 양에 따라 \( 150 \sim 200 \mu \mathrm{l} \)의 DMEM 배지(FBS free)를 첨가 후 현탁한 후, 이 중 \( 10 \mu \mathrm{l} \)를 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)의 \( 1 \% \) low melting point agarose (LMA, in PBS; Sigma, USA) \( 75 \mu \mathrm{l} \) 섞어서 사전에 \( 0.5\% \) normal melting point agarose (NMA, in PBS; Sigma, USA)로 coating 된 slide 위에 올리고 그 위에 cover glass를 덮어 세포 및 LMA 현탁액이 고르게 분산되도록 한 뒤, ice bath 위에 5분간 두어 젤을 굳혔다. 여기에 cover glass 제거 후 다시 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)의 \( 1 \% \) LMA \( 75 \mu \mathrm{l} \)를 올려서 top layer를 만든 다음 앞에서와 마찬가지로 cover glass 로 덮어 젤을 굳혔다. 그 이후의 세포 용해, 전기영동, 핵 염색 및 분석은 전술한 Choi 등의 방법과 동일하게 수행하였다. DNA 손상에 의해 생성되는 'comet' tail 의 길이에 따라 5단계\( (0 \sim 4) \)로 임의적 분류를 하였는데, 0단계는 \( 5 \% \) 미만의 비손상, 1단계는 \( 5 \sim 20 \% \)의 낮은 수준의 손상, 2 단계는 \( 20 \sim 40 \% \)의 보통 수준의 손상, 3단계는 \( 40 \sim 90 \% \)의 높은 DNA 손상을 의미하며 마지막으로 4단계는 \( 90 \% \) 이상의 매우 높은 수준의 DNA 손상단계를 의미한다. 각 시료당 100개 이상의 세포를 관찰하고 전술한 손상단계로 세포를 분류한 후 시료당 손상 지수를 관찰하였다. 각 시료에 대한 유의성을 관찰하기 위해 3회 반복 실험 하였다.</p>