DNA 추출은 지수 생장기의 세포를 원심분리하여 수확한 뒤, 10% SDS, protease K, 페놀, 3M sodium acetate (pH 5.2), 에탄올을 첨가하여 DNA를 얻는 과정이다. 포도당 유도성 유전자 프로모터가 삽입된 발광유전자 리포터 벡터 제작은 8종의 포도당 유도성 유전자의 프로모터 부위를 포함하는 유전자간 염기서열을 야생종 Synechocystis sp. PCC6803에서 추출한 DNA를 주형으로 하여 PCR한 후, pILA 벡터에 클로닝하여 제작하는 과정이다.
<h2>DNA 추출</h2> <p>지수 생장기의 세포를 원심분리 \( \left (3,000 \times \mathrm { g } , 15 \right . \) 분, \( \left .4 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \) 하여 세포를 수확하였다. 수확된 세포를 \( 200 \mu \mathrm { TEN } \) 완충액 (10 mM Tris-Cl, \( 150mM NaCl, 100 mM EDTA)에 현탁 한 뒤, 10 \mu \) lysozyme \( \left (20 \mathrm { mg } \mathrm { ml } ^ { -1 } \right ) \) 을 첨가하여 37℃에서 15분 반응시켜 세포를 파괴한 뒤, 10% SDS \( 5 \mu \mathrm { l } \) 을 첨가하여 흔들어 주었다. 이 반응물질에 \( 5 \mu \mathrm { l } \) protease \( \mathrm { K } \left (20 \mathrm { mg } \mathrm { ml } ^ { -1 } \right ) \) 을 첨가하여 60℃에서 1 시간 반응 시켰다. 반응 후, \( 400 \mu \mathrm { l } \) 페놀을 첨가한 뒤, 원심분리 (3,500 rpm, 3분, 상온)하여 상등액을 새 튜브에 옮겼다. 상등액과 동일량의 페놀 : 클로로포롬 : 아이소아밀 알코올을 첨가하여 상온에서 3-5분 흔들어 주었다. 다시 원심분리 (3,500rpm, 3분, 상온) 후, 얻어진 상등액 은 \( 20 \mu \mathrm { l } \) 3M sodium acetate (pH 5.2), \( 400 \mu \mathrm { l } \) 에탄올과 혼합한 뒤, 원심분리 (3,500rpm, 3분, 상온)를 통해 DNA만 얻었다.</p> <h2>포도당 유도성 유전자 프로모터가 삽입된 발광유전자 리포터 벡터 제작</h2> <p>8종의 포도당 유도성 유전자 (atpI, ndbA, ctaDl, tkt, pgi, pdh, ppc, 그리고 \( c y d A \); Lee et al. 2007)의 프로모터 부위를 포함하는 유전자간 염기서열 (intergenic sequences) (Table 1)을 야생종 Synechocystis sp. PCC6803에서 추출한 DNA를 주형으로 하여 제한효소 \( P_ { s t } \) I과 \( K p n \mathrm { I } \) 서열의 링커를 붙인 프라이머 (Table 1)를 이용하여 PCR한 후, 제한효소 Pst \( \mathrm { I } / K p n \mathrm { I } \)로 절단된 pILA 벡터 (Genbank AJ251840)에 클로닝하였다.</p>