본 연구에서는 반응조 내 수소생산 세균 군집의 구조를 시간 경과에 따라 분석하였다. DGGE를 통한 분석 결과, 비고정화 반응조에 비해 PVA bead를 이용한 고정화 반응조에서의 세균 군집 변화가 상대적으로 적었다. PCA 분석을 통해 시간이 지남에 따라 두 반응조 내 세균 군집구조가 다르게 형성되는 것을 확인하였다. 특히, 초기 식종슬러지에서 존재하였던 Firmicutes, Clostridium, Enterobacter, Ruminococcus, Escherichia 등은 운전시간 경과에 따라 빠르게 증식하였으며, 이 증식은 약 26일간 유지되었다. 반면에 고온환경을 선호하는 Caldicellulosiruptor는 거의 생장하지 않았으며, 고정화 반응조에서는 감소하는 것으로 관찰되었다. 또한, 주요 우점종으로 나타난 Firmicutes와 Clostridium은 acetic acid와 butyric acid뿐만 아니라 소량의 propionic acid를 생산하는 것으로 확인되었으며, 이는 유기산 분석 결과와 일치하였다. 이 결과들은 반응조 내 세균 군집구조와 그 변화가 수소생산 과정에 미치는 영향에 대한 중요한 통찰을 제공한다.
<h2>수소 생산 세균의 군집 분석</h2> <p>반응조 내부의 세균 군집을 DGGE로 분석한 결과를 Fig. 2 에 나타내었다. 반응조내에 존재하는 수소생산 세균 군집 구조를 관찰하기 위해 수행한 DGGE 분석 결과, 시간이 경과함에 따라 비고정화 반응조에 비하여 PVA bead를 사용한 고정화 반응조에서 DGGE band 패턴 및 intensity의 변화가 상대적으로 적었다. 이는 고정화 반응조에서 수소생산 세균의 군집이 좀 더 안정적으로 유지되고 있는 것을 시사하는데, 수소생산 과정에서 발생하는 유기산에 의한 배양액의 \( \mathrm{pH} \) 강하 등의 영향이 고정화에 의해 약간 완화되었기 때문이라고 추측된다.</p> <p>DGGE band를 통한 세균 군집의 PCA 분석 결과, 운전시간이 경과함에 따라 비고정화와 고정화 반응조 내 세균 군집구조가 다르게 형성된 것으로 나타났다. 비고정화 반응조의 경우 식종전 열처리에 의해 형성된 유효 수소생산 세균 군집과 운전기간중의 세균 군집이 유사하게 형성되기는 하였으나 군집내 주요 활동 세균의 변동이 다소 큰것으로 나타났다. 반면, 고정화 반응조내 세균 군집구조는 초기 유효 수소생산 세균 군집과는 운전기간 중 형성된 세균 군집과는 상당한 거리가 있는 것으로 나타나나 주요한 수소 생산 세균 군집이 운전초기(Day 10)에 형성된 이후 운전종료시까지 안정적으로 유지되는 것으로 나타났다. 이는 고정화 담체성분 자체가 세균의 이용기질로 사용될 수 있기 때 문에 이러한 담체성분이 운전초기의 수소생산 세균 군집 형 성에 영향을 끼쳤을 가능성이 있는 것으로 생각된다.</p> <h2>고정화 및 비고정화 반응기의 세균 정량 분석</h2> <p>기존의 많은 문헌들을 바탕으로 수소생산 세균으로 잘 알려진 6종을 절대정량하였다. 선정한 n종의 세균 중 Firmicutes와 Clostridium, Ruminococcus 및 Caldicellulosirupior 는 절대혐기성균이며, Enterobacter와 Escherichia 는 통성혐기성균이다. 이 중 Clostridium과 Enterobacter가 가장 대표적인 수소생산 세균이며, 인공기질을 사용한 경우는 물론 Enterobacter의 경우 당밀폐수에서 발견되기도 하였다. 반응조 내부의 세균을 ddPCR로 절대정량분석 한 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 운전시작 시점에는 비고정화와 고정화 경우 모두 전체 박테리아 중 Firmicutes 와 Clostridium 가 가장 많이 존재하는 것으로 나타났으며 archaea도 상당량 존재하는 것으로 나타났다. 비고정화 경우가 고정화 경우에 비해 전체 bacteria 와 achaea 및 Clostridia class가 1.5-7배 이상 존재하는 것으로 나타났다(Day 0). 그러나 운전시간 10일 경과후 비고 정화 경우가 고정화 경우보다 2-3배 높은 것으로 나타났으며, 이러한 경향은 운전초기 Day10 부터 운전종료 시점까지 일정하게 유지되는 경향을 나타내었다. 비고정화와 고정화 경우 모두 achaea는 운전종료 시점에 급감한 것으로 나타났다. 두 반응조 모두에서 모든 수소생성이 가능한 세균종들 (Clostridium, Caldicellulosiruptor, Enterobacter, Escherichiae, Ruminococcus 및 Firmicutes)이 운전시간 10일까지 증식한 이후 변화하지 않았다. 또한 운전시간 10일부터 실험종료까지 두 반응조내 유효 수소생산 세균의 양적 차이는 없는 것으로 나타났다. 따라서, 2주 경과시점에서 두 반응조의 미생 물군집의 형태가 다소 차이가 있더라도, 수소생산성의 차이 가 나타나지 않았다. 고농도로 축적된 유기산에 의한 저해 등의 요인에 의해 수소생성미생물이 충분히 존재함에도 불구하고 수소생성이 제한되었을 것으로 사료된다.</p> <p>두 반응조 모두에서 Caldicellulosiruptor를 제외한 Firmicutes, Clostridium, Enterobacter, Ruminococcus 및 Escherichia 가 초기 식종슬러지에서 다양한 범위(278-699, 500 copy number of ml-sample)에서 존재하였던 것과 달리 운전시간 경과됨에 따라 운전초기에 \( 1 \times 10^{5}-1 \times 10^{6} \) copy number of \( \mathrm{ml} \)-sample 정도로 빠르게 증식하였으며 이는 26일 경과시까지 유지되는 것으로 나타났다. 이는 초기의 열처리에 의해 혐기소화슬러지의 수소 생산 세균 군집이 잘 형성되었기 때문이라고 판단되며, 운전시작 시점에 다른 세균에 비해 적은 수로 존재했던 Enterobacter(1635-8485 copy number of ml-sample)와 Escherichia (279-381 copy number of ml-sample)도 10일 이내 운전초기에 빠르게 생장한 것으로 나타난 것으로 보아, 초기 접종원에 있어서 유효 수소생산 세균의 양보다는 존재의 유무가 안정적 세균군집을 형성하는 데 주요한 인자가 될 것으로 판단되었다. Caldicellulosiruptor 는 고온환경을 선호하기 때문에 운전시간이 경과함에 따라 생장이 거의 없는 것으로 나타났으며 고정화의 경우는 감소하는 것이 관찰되었다.</p> <p>Firmicutes, Clostridium, Enterobacter 및 Escherichia 는 발효산물로 주로 acetic acid와 butyric acid를 생산하는 것으로 알려져 있다. 특히 본 연구에서 주요 우점종으로 나타난 Firmicutes와 Clostridium 는 acetic acid와 butyric acid의 생산과 더불어 소량의 propionic acid를 생산하는 것으로 보고되었으며, 이는 유기산 분석에서 나타난 결과와 일치하였다.</p>