보관된 DEP는 필요 시 녹인 후, \(0.05\%\) dimethyl sulfoxide에서 30초 동안 3번 초음파로 분쇄하고, 최종적으로 \(5\%\) fetal bovine serum (FBS)이 포함된 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)으로 희석해 사용하였다. 세포는 건조한 후 Diff-Quik \( { }^{\text {R }} \) 염색을 실시하고, 염증성 세포가 없음을 확인 후 선별하여 실험에 사용하였다. NO의 형성은 배지에서 채집한 후 Griess reaction 방법을 통해 측정하였다. 300개의 세포를 세어서 발색된 세포의 비율로 항체 발현정도를 관찰하였다. 마지막으로, 일차 항체 (anti-iNOS 1:1000) 처리 후, horseradish peroxidase와 이차 항체가 결합된 용액을 처리하고, \( \mathrm{ECL} \) detection sys-tem (Amersham Pharmacia Biotech)를 이용하여 densitometer로 양을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>DEP 시료의 확보</h2> <p>DEP는 국립환경연구원 자동차공해연구소에서 확보하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하였다. 보관된 DEP는 필요한 경우, 녹인 후 30 초 동안 3 번씩 초음파로 분쇄하였고 (in \( 0.05 \% \) dimethyl sulfoxide) 최종적으로 \( 5 \% \) fetal bovine serum (FBS)이 포함된 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)에 희석하여 사용하였다.</p> <h2>기관지 폐포 세척술 및 폐포대식세포의 분리</h2> <p>실험동물로는 Sprague-Dawley계 흰쥐을 이용하였으며 고정틀에 고정한 후 \( 70 \% \) 의 에탄올로 피부를 소독하여 개복하였고, 복부 대동맥을 통하여 완전히 사혈시켰다. 이후 폐와 기관지를 노출시킨 후 경부의 기도를 약 \( 1 / 2 \) 로 절개하였고, 18-gauge cannula를 넣고 결찰한 후 폐와 기관지를 흉강에서 완전히 분리하였다. annula를 통해 폐 안으로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 phos-phate buffered saline (PBS) \( 7 \mathrm{ml} \) 을 6회 반복 주입한 후 세척을 실시하여 폐 내 세포를 채취하였다. 채취된 세포는 \( 1000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심 분리를 실시하였다. 기관지 폐포 세척술로 채취된 세포를 원심분리 후, 폐나 세포들은 Cytospin \( { }^{{\text{R}}} \) (Shandon, Pittsburgh, PA)을 사용하여 slide glass 위에 부착하였다. 부착된 세포는 완전히 건조한 후 Diff-Quik \( { }^{\text {R }} \) stain (Dade Behring Inc., Newark, DE)을 이용하여 염색을 실시하였고, 현미경하에서 염증성 세포가 없는 것으로 확인된 세포액만을 선택하여 배양 및 각종 실험에 사용하였다.</p> <h2>폐포대식세포에서 NO 형성의 측정</h2> <p>선택된 폐포대식세포를 12-well tissue culture plates에 각 well 당 \( 3 \times 10^{5} / \mathrm{ml} \) 로 seeding한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 에서 2 시간 배양하여 세포들을 plate에 부착시킨 후 DEP에 노출시켰다. 시간별 및 농도별 세포 배양에서 채집한 배지에서 NO의 형성은 oxidation product인 \( \mathrm{NO}_{2}{ }^{} \)을 Griess reaction 방법을 통해서 측정하였다.</p> <h2>iNOS protein와 nitrotyrosilated-protein의 세포면역염색</h2> <p>폐포대식세포를 4-well chamber slides (Lab-Tek, Naperville, IL)에 각 well 당 \( 3 \times 10^{5} / \mathrm{ml} \) 세포로 \( 5 \% \) FBS가 함유된 DMEM으로 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 에서 2시간 배양하여 세포를 부착시킨 후, DEP \( (20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \), lipopolysaccharide (LPS) (10 \( \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 및 LPS + DEP를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 실험에 따라 일정 시간을 배양한 후 \( 10 \% \) 포르말린으로 5 분 동안 상온에서 세포들을 고정한 후 냉장 보관하였고 이후 필요에 따라 각종 면역염색을 실시하였다. 사용된 일차 항체의 특이성을 검증하기 위하여 복수로 준비된 동일한 다른 시료에는 일차 항체를 처리하지 않고 염색반응을 함께 실시하였다.</p> <p>폐포대식세포의 endogenous peroxidase 활성을 억제하기 위해서 \( 3 \% \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 용액에 15 분간 보관하였다. 그 후 \( 1 \% \) bovine serum albumin (BSA) 용액에서 30분간 blocking을 실시한 후, monoclonal anti-inducible nitric oxide synthase (iNOS) protein 항체 \( (10 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \); Transduction Laboratories, Lexington, KY), anti-nitrotyrosine 항체 \( (10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \); Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)를 상온에서 1 시간 처리하였다. 그 후 DAKO LSBA 2 kit로 이차 항체와 streptavi-din-conjugated peroxidase (DAKO, Carpinteria, CA)을 부착시켰다. 발색은 3, 3'-diaminobenzidine (DAB, Sigma Chemical Co.)를 사용하였다. Slide glass를 완전히 건조한 후 Harris's hematoxylin (Sigma Chemical Co.)으로 대조염색을 실시하였다. 무작위로 300 개의 세포를 세어 발색된 세포의 백분율로써 각 군의 항체 발현정도를 관찰하였다.</p> <h2>iNOS protein 검출을 위한 Western analysis</h2> <p>iNOS 항체 (Transduction Laboratories, Lexington, KY)와\( \beta \)-actin 항체 (Sigma Chemical Co.)를 각기 사용하였다. Western analysis를 위하여 면역염색과 같은 조건으로 배양된 cell을 PBS로 씻어낸 후, radioimmunoprecipitation assay (RIPA) B buffer (0.5 \% Nonidet P-40, \( 20 \mathrm{mM} \) Tris, \( \mathrm{pH} \) 8.0, \( 50 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 50 \mathrm{mM} \mathrm{NaF}, 100 \mu \mathrm{M} \mathrm{Na}_{3} \mathrm{VO}_{4}, 1 \mathrm{mM} \) di-thiothreitol, \( 50 \quad \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) phenylmethylsulphonylfluoride)로 처리하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분 동안 보관하였다. \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 20 분 동안 원심 분리하여 단백질을 분리하였고 Bradford methods를 이용하여 정량하였다. \( 8 \% \) SDS-PAGE gel을 사용하여 전기영동을 실시하였고 blotting membrane으로 옮긴 후 \( 5 \% \) skim milk로 blocking을 실시하였다. 일차 항체 (anti-iNOS 1:1000)를 처리한 후, horseradish peroxidase와 이차 항체가 결합된 용액으로 처리하여 \( \mathrm{ECL} \) detection sys-tem (Amersham Pharmacia Biotech)를 이용하여 densi-tometer로 양을 측정하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>통계 프로그램인 SPSS \( 10.0 \) for windows를 사용하여 실험 설계에 대한 분산분석은 ANOVA로, 각 처치군들 간의 비교는 Dunkun test를 실시하여 검정하였다. 각 자료는 3 번 이상의 반복된 실험을 통하여 얻어진 결과를 평균 \( \pm \) 표준편차로 표시하였고, \( \mathrm{p}<0.05 \) 인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.</p>