PCR을 통해 증폭한 산물의 확인을 위해 \(0.7\%\) agarose가 첨가된 \(0.5x\) TAE 겔에 전기영동을 진행하였고, Ethidium Bromide로 염색하여 증폭된 DNA band를 UV light에서 확인하였다. 또한, Jukes와 Cantor의 방법을 사용하여 DNAstar software의 MegAlign 프로그램을 이용해 H. marmoreus 3-10 균주와 H. marmoreus 1-1 균주의 rDNA-ITS 염기서열을 CLUSTAL X algorithm으로 정렬하였다. H. marmoreus 3-10 균주와 H. marmoreus 1-1 균주의 rDNA-cluster의 염기서열을 얻기 위해 universal primer인 ITS 1과 ITS 4를 포함한 23개의 primer를 디자인하였고, SSU, ITS, LSU, IGS에서 각각 2개, 3개, 9개, 3개의 염기가 서로 다르다는 결과를 얻었다.
<h2>느티만가닥버섯의 rDNA-ITS 영역의 염기서열 분석</h2> <p>PCR로 증폭한 산물을 확인하기 위하여 \( 0.5 \mathrm { x } \) TAE에 \( 0.7 \% \)agarose를 첨가한 겔 상에 \( \lambda \) DNA-HindIII Digest와 함께 전기영동 하였다. Ethidium Bromide \( ( \mathrm { EtBr } ) \)로 염색하여 UV light상에서 증폭한 DNA band를 확인하였다. 정확하게 증폭된 증폭산물을 gel에서 회수하여 Gene cloning kit (Qiagen Co.)를 이용하여 정제하였으며, 그 뒤 얻은 이들 유전자 단편을 pGEMT-easy vector system (Promega Co.)에 삽입하였다. DH5 a(HIT Competent cell ; Donginbiotech Co.)에 형질전환 시켰으며, ampicillin을 첨가한 LB 고체 배지에 도말하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 14 \sim \) 16시간 배양하여 white colony를 선발하였다. 형질 전환된 col-ony를 한 strain당 8개를 무작위적으로 선발하여 \( 3 \mathrm { ml } \) 의 LB( \( 1 \% \) tryptone, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 1 \% \mathrm { NaCl } , \mathrm { pH } 7.2) \) 액체배지에 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 16시간 진탕 배양 한 후, plasmid mini-prep kit(Solgent Co.)를 이용하여 재조합 plasmid DNA를 분리 정제하였다. 팽이버섯의 rDNA cluster 증폭산물의 염기서열을 분석하기 위하여 분리한 plasmid DNA를 T7과 SP6 primer를 이용하여 염기서열 분석하고, 각 시료의 rDNA region 염기서열을 확정하였다.</p> <h2>느티만가닥버섯의 2차 구조 분석</h2> <p>Jukes와 Cantor의 방법을 이용하여, DNAstar software(Lasergene Co.)의 MegAlign program을 이용하여 H. mar-moreus 3-10 균주과 H. marmoreus 1-1 균주의 rDNA-ITS re-gion 염기서열을 CLUSTAL X algorithm으로 정렬하였다. 각 시료 rDNA-ITS 염기서열인 ITS 1, 5.8S, ITS 2 영역은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)에 등록된 염기서열과 비교한 후, 결정하였다. 두 균주의 ITS region의 2차구조 분석은 mFold (http:/ / frontend.bioinfo.rpi.edu/applicaions/mfold/cgi-bin/rna-form1.cgi)에 의해 산출되었다. 본 연구에서는 ITS region에 포함되는 ITS 1과 ITS 2, 5.8S가 2차 구조분석에 사용되었다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>rDNA cluster의 염기서열 분석</h2> <p>H. marmoreus 3-10 균주와 H. marmoreus 1-1 균주의 rDNA-cluster의 염기서열을 얻기 위하여 universal primer인 ITS 1과 ITS 4를 포함한 23개의 primer를 디자인하였다. 두 균주의 rDNA-cluster의 염기서열을 확보하고자 PCR 산물을 증폭하여 분석한 결과는 Table 2에 나타내었으며, 이들 \( H \). marmoreus 3-10 균주와 H. marmoreus 1-1 균주의 rDNA-cluster는 Small subunit gene (SSU), ITS 1,5.8S rDNA gene, ITS2, Large subunit gene (LSU), Intergenic spacer 1 (IGS 1), 5S rDNA, 및 Intergenic spacer 2 (IGS 2)로 구성되어 있다.</p> <p>SSU에 속하는 18S rDNA는 \( 1,796 \mathrm { bp } \)였고, LSU에 해당하는 28S rDNA는 \(3,348 \mathrm { ~bp } \)임을 확인하였다. 변이가 발생하는 ITS1과 ITS2는 각각 \( 229 \mathrm { ~bp } , 233 \mathrm { ~bp } \)였고, 보존적인 5.8S 영역은 \( 153 \mathrm { ~bp } \)임을 확인하였으며, ITS 영역의 nucleotide 서열은 Fig.1 에서 정렬하였다. 따라서 본 연구에서 2차구조 분석에 이용된 ITS 영역은 총 \( 462 \mathrm { ~bp } \)로 염기배열이 결정 되었으며, IGS1은 \( 390 \mathrm { ~bp } \), IGS2는 \( 900 \mathrm { ~bp } \)임을 확인하였다. rDNA-cluster는 H.marmoreus 3-10 균주와 H. marmoreus 1-1 균주가 동일하게 \( 7,049 \mathrm { ~bp } \)로 결정되었다.</p> <p>rDNA cluster의 염기서열 결과는, NCBI (National center for Biotechnology Information) GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)에 서열을 기탁하여 국내 개발 균주인 H. marmoreus 3-10 (Accession No. KF150213)과 일본 유래 균주인 H. marmoreus 1-1 (Accession No. KF192813)의 Accession No.를 받았다. 총 \( 7,049 \mathrm { bp } \) 중, 서열상에서 길이의 차이는 없었으나, 염기서열의 차이가 확인되었다. SSU에서 2개, ITS에서 3개, LSU에서 9개, IGS에서 3개 염기가 상이하다는 결과를 확인하였다. 가장 큰 변이율을 나타내는 영역은 \( 1.46 \% \)를 나타낸 ITS 영역임을 확인하였다. SSU는 \( 0.11 \% \), LSU는 \( 0.26 \% \), IGS 영역은 \( 0.32 \% \)의 변이율을 확인하였다. 따라서 총 \( 7,049 \mathrm { bp } \) 중에서 17개 염기서열이 다른 것을 알 수 있었으며, 느티만가닥버섯에서 가장 보존적인 영역은 SSU 영역과 5.8S rDNA 영역임이 확인되었다.</p>