EAHF가 두 유방암 세포인 MDA-MB-231와 MCF-7세포에 대해 증식억제 및 형태 변화가 있는지 실험하였는데, 농도가 진할수록 세포 밀도가 감소하고 형태가 변화함을 알 수 있었다. 또한 EAHF 처리와 apoptosis 유발 사이의 상관관계를 알아보기 위해 실험한 결과, 특히 MDA-MB-231세포의 경우 전형적인 DNA laddering 현상이 관찰되어 높은 상관관계가 있음을 확인했다.
<h1>결 과</h1><h2>유방암세포의 증식 및 형태에 미치는 EAHF의 영향</h2><p>EAHF가 인체 유방암 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 EAHF을 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양한 후 MTT assay를 이용하여 조사하였다. Fig. 1에서 나타난 바와 같이 EAHF이 두 유방암세포에서 처리시간 및 농도 의존적으로 증식을 억제하는 것으로 나타났으나 MDA-MB-231 세포에서 EAHF의 세포독성 효과가 MCF-7 세포에 비하여 다소 높게 나타났다. 다음은 EAHF 처리에 따른 유방암세포의 증식억제 현상에 따른 암세포의 형태 변화를 관찰하기 위하여 정상 및 다양한 농도의 \EAHF가 처리된 배지에서 48시간 동안 배양된 MDA-MB-231 및 MCF-7 세포를 도립현미경을 이용하여 관찰하였다. Fig. 2A에서 알 수 있듯이 두 세포주 모두에서 EAHF의 농도가 증가할수록 세포의 밀도가 감소되었으며, 부착력을 상실하고 배지 위로 부유되는 경향성이 증가하는 것과 같은 심한 형태적 변화가 나타났다. 특히 MCF-7 세포에 비해 MDA-MB-231 세포에서는 길고 분지를 형성하는 듯한 dendrite-like한 구조로 바뀌는 것이 관찰되었다.</p><h2>핵의 형태변화에 대한 EAHF의 영향</h2><p>EAHF 처리에 의한 유방암세포의 증식억제 및 형태적 변형이 apoptosis 유발과 연관성이 있는지의 여부를 조사하기 위하여 EAHF가 처리된 유방암세포를 대상으로 핵산에 특이적으로 결합하는 형광물질인 DAPI 염색을 실시하고 형광현미경을 이용하여 핵의 형태 변화를 관찰하였다. Fig. 2B에서 나타난 바와 같이 정상 배지에서 배양된 세포의 경우 핵의 전체가 완전한 형태로 염색되었으나 MDA-MB-231 세포의 경우는 EAHF의 처리 농도가 증가할수록 apoptosis가 일어난 세포에서 전형적으로 관찰되는 염색질 응축의 정도가 매우 증가되었다. 그러나 MCF-7 세포에서는 염색질 응축의 정도가 MDA-MB-231 세포와 비교해서 매우 낮게 나타났다. 따라서 EAHF의 처리에 따른 유방암세포의 증식억제 및 형태변화가 MDA-MB-231 세포에서는 apoptosis 유발과 밀접한 연관성이 있을 것으로 생각되지만 MCF-7 세포에서는 상대적으로 apoptosis에 대한 감수성이 낮게 나타남을 알 수 있었다.</p><h2>EAHF 처리에 의한 유방암세포의 apoptosis 유발</h2><p>이상의 결과에서 EAHF 처리에 의한 유방암세포의 증식억제 현상 및 형태변화가 특히 MDA-MB-231 세포에서 apoptosis 유발과 밀접한 연관성이 있음을 알 수 있었다. 따라서 EAHF 처리에 의한 apoptosis 유발의 정도를 정량적으로 비교 평가하기 위하여 동일한 조건으로 배양된 세포들을 대상으로 PI 염색액을 이용하여 핵을 염색한 후 DNA flow cytometry를 이용하여 세포주기의 sub-G1기에 해당되는 세포들의 빈도를 조사하였다. Fig. 3A 및 B에 나타낸 결과에서 알 수 있듯이 MDA-MB-231 세포의 경우는 EAHF의 처리 농도의 증가에 따라 sub-G1기에 해당하는 세포의 빈도가 증가하여 \( 400 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서는 약 \( 23 \% \) 정도로 나타났다. 반면에 MCF-7 세포에서는 EAHF의 처리 농도의 증가에 따른 sub-G1기 세포의 빈도가 소폭 증가하였지만 세포주기의 G1기 arrest 현상이 강하게 나타났다. 또한 염색질 응축과 함께 apoptosis 유발의 직접적인 증거에 해당하는 DNA fragmentation 여부를 agarose gel 전기영동으로 조사하였다. 이를 위하여 정상 및 EAHF가 함유된 배지에서 자란 유방암세포를 대상으로 총 DNA를 추출하여 조사한 결과는 Fig. 3C에 나타낸 바와 같다. 결과에서 나타낸 바와 같이 MDA-MB-231 세포에서는 apoptosis가 일어난 세포들에서 볼 수 있는 전형적인 DNA laddering 현상을 관찰할 수 있었지만 MCF-7 세포에서는 DNA laddering이 거의 관찰되지 않았다. 이는 결국 MDA-MB-231 세포의 경우는 EAHF의 처리에 의하여 endonuclease가 활성화되어 chromosomal DNA가 단편화되었음을 의미하는 것이며, 동일 조건에서 MCF-7 세포의 경우 apoptosis 유발보다는 세포주기의 G1 arrest 유발 현상이 더 강하게 나타났음을 알 수 있었다.</p>