MTT assay는 암세포가 배양된 96well plate에 2 \( \times \)10 \( ^ { 4 } \) \(cells/ \mathrm { ml } \)이 되도록 100\(\mu\mathrm{l}\)씩 분주하여 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \), 5 \( \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 24시간 배양 후 MTT 시약을 첨가하고 3~4시간 더 배양하여 formazan 결정을 용해시키고 540 \( \mathrm { nm } \)에서 흡광도를 측정하여 생존율을 계산하는 방법이다. HT-1080세포는 인체 섬유욱종 세포로써 100 units/ml의 penicillin-streptomycin과 10 \( \% \)FBS가 함유된 DMEM 배양액을 사용하였고, cell culture dish에서 3 \( 7 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 5 \( \% \mathrm { CO } _ { 2 } \)incubator에서 배양하였다.
<h2>MTT assay</h2> <p>배양된 암세포는 96well plate에 2 \( \times \)10 \( ^ { 4 } \) \(cells/ \mathrm { ml } \)이 되도록 100 \( \mu 1 \)씩 분주하여 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \), 5 \( \% \mathrm { CO } _ { 2 } \)incubator에서 24시간 배양한 후 배지는 제거한 뒤 각 시료를 RPMI 배지로 희석하여 각 well당 시료를 \( 100 \mu \mathrm { l } \)씩 첨가하고, 대조군에는 시료 대신 PBS를 100 \( \mu \)씩 첨가하였다. 이 plate를 다시 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \), 5 \( \% \mathrm { CO } _ { 2 } \)incubator에서 24시간 배양하였다. 배양 후 MTT assay를 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bro-mide(MTT) 시약 5 \( \mathrm { mg } \)을 1 \( \mathrm { ml } \)PBS로 녹인 후, 10 \( \% \)FBS가 함유된 RPMI배지 9 \( \mathrm { ml } \)와 희석하여 100 \( \mu \mathrm { l } \)를 첨가하고 3 \( \sim \)4시간 동안 더 배양하여 MTT가 환원되도록 한다. 배양종료 후 생성된 formazan 결정을 가라앉힌 후 각 well에 형성된 결정이 흐트러지지 않도록 주의하면서 MTT 시약처리 배지제거하였다. 배지가 제거된 각 well에 formazan 결정을 용해시키기 위하여 DMSO를 100 \( \mu l \)씩 분주하여서 5 \( \sim \)10분간 반응시켜 96well plate용 광도계(ELISA reader)로 540 \( \mathrm { nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 이 흡광도는 MTT가 세포에 의해서 환원된 양을 나타내며, 따라서 각 well에 존재하는 생존 수와 비례한다. 생존율 계산은 각 well로부터 한 칼럼의 평균값을 구하여 대조군 (100 \( \% \)생존군)의 평균값에 대한 백분율의 값을 산출하였다. 이 백분율은 비교한 시험군의 세포 생존율에 해당하는 값으로 세포의 생존율은 다음과 같은 식으로 계산 하였다.</p> <p>Cytotoxicity \( ( \%) = \frac {\text { 대조군의 홉광도 } - \text { 시료처리군의 흡광도 } } {\text { 대조군의 홉광도 } } \times 100 \)</p> <h2>세포내 지질 과산화물 측정</h2> <p>인체 섬유육종 세포인 HT-1080세포는 한국 세포 주 은행으로부터 분양받아 배양하여 실험에 사용하였다. HT-1080세포는 100 units/ml의 penicillin-streptomycin과 10 \( \% \)FBS가 함유된 DMEM 배양액을 사용하여 cell culture dish에서 3 \( 7 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 5 \( \% \mathrm { CO } _ { 2 } \)incubator에서 배양하였다. 세포의 지질 과산화물의 생성은 DCFH-DA (dichlorodihydrofluorescin diac-etate) assay로 측정하였다[17,26]. DCFH-DA(Sigma, USA)는 세포내 지질 과산화물과 반응하여 형광물질(dichloroflu-orescein, DCF)을 만들어 내는 것으로 이 시약을 세포 속에 넣어 발생하는 형광을 측정함으로써 세포내의 지질 과산화물을 측정할 수 있다. 세포를 96well에 분주한 후 24시간 배양하고, PBS 완충액으로 씻은 후 20 \( \mu \mathrm { M } \)DCFH-DA을 각well에 분주하여 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)5 \( \% \mathrm { CO } _ { 2 } \)incubator에서 20분간 pre-in-cubation하였다. 각 well에 시료를 처리하여 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)5 \( \% \mathrm { CO } _ { 2 } \)incubator에서 1시간 incubation한 후, DCFH-DA을 없애고 세포는 다시 PBS완충액으로 씻은 후 500 \( \mu \mathrm { M } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)를 처리하여 시간별로 DCF fluorescence를 excitation \( 488 \mathrm { ~nm } \), emission \( 530 \mathrm { ~nm } \) 에서 형광 분석기로 측정하였다. 대조군들(blank 군과 control군)은 시료 대신 PBS를 처리하며, control군은 \( 500 \mu \mathrm { M } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)를 처리를 하고, blank군은 500 \( \mu \mathrm { M } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)대신 PBS를 처리하여 측정하였다.</p>