활성의 단위(unit)는 기질을 전환시키는 효소의 양으로, LDH의 경우 millimolar extinction co-efficient 6.22를, CS의 경우에는 13.6을 사용하여 계산하였다. 단백질은 BSA를 표준단백질로 사용하어 Bradford 방법으로 정량했고, LDH의 비활성은 단백질 양에 대한 효소의 활성으로 나타냈다. MAOX 활성은 Tabor 등의 방법을 변형하여 측정하고 미토콘드리아의 분리하여, 3분 간격으로 30초간 초음파로 파쇄한 후 LDH 활성을 측정하였다. 그리고 native-PAGE를 통하여 mitochondrial LDH 동위효소를 확인하였다.
<h2>LDH와 CS의 활성 측정 및 단백질 정량</h2> <p>LDH의 활성은 \( 1.50 \mathrm{mM} \) 피루브산과 \( 0.14 \mathrm{mM}\) NADH 를 포함한 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer ( \(\mathrm{pH} \) 6.85) \( 3 \mathrm{ml} \)에 시료를 가한 다음 NADH로 부터 \( \mathrm{NAD}^{+} \)로 산화되는 정도를 분광광도계(UV-160A, Shimadzu)를 사용하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 340 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. Citrate synthase (CS, EC 4.1.3.7)의 활성은 \( 0.2 \mathrm{mM} \) acetyl-CoA, \( 0.1 \mathrm{mM} \) DTNB[5,5'-dithiobis(2-nitro-benzoic acid)], \( 0.5 \mathrm{mM} \) oxaloacetic acid를 포함한 \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris-HCl buffer ( \(\mathrm{pH} \) 7.5) \( 3 \mathrm{ml} \)에 시료를 가한 후, DTNB가 전환되는 정도를 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 412 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였으며 LDH / CS를 구하였다. 활성의 단위(unit)는 1 분 동안 기질 \( 1 \mu \mathrm{M} \)을 전환시키는 효소의 양으로, LDH 경우 millimolar extinction co-efficient 6.22를, CS 경우 13.6을 사용하여 계산하였으며, 단백질은 BSA를 표준단백질로 사용하여 분광광도계로 595 \( \mathrm{nm} \)에서 Bradford의 방법에 따라 정량하였고, LDH의 비활성은 단백질 양에 대한 효소의 활성 (\( \mathrm{units/mg} \))으로 나타냈다.</p> <h2>미토콘드리아 분리 및 LDH 추출</h2> <p>파랑볼우럭과 큰입우럭 눈조직을 적출하여 혈액을 제거한 후 \( 0.25 \mathrm{M} \) sucrose를 함유한 \( 50 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 6.85)를 3배 \( (\mathrm{v} / \mathrm{w}) \) 가하고 glass homogenizer로 조심스럽게 파쇄하였다. 조직 추출액은 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 270 \times \mathrm{g} \)에서 7 분간 원심분리하였고, 상등액을 동일 조건에서 다시 원심분리하였다. 상등액을 \( 1,500 \times \mathrm{g} \)에서 10 분간 원심분리한 뒤 상등액을 \( 10,000 \times \mathrm{g} \)에서 1시간 동안 원심분리 한 후 미토콘드리아 침전물을 얻었다. Monoamine oxidase (MAOX)의 활성을 측정하여 미토콘드리아의 분리를 확인하였으며, 분리된 미토콘드리아를 3분 간격으로 30초간 초음파로 파쇄한 후 LDH 활성을 측정하고 native-PAGE로 mitochondrial LDH 동위효소를 확인하였다. MAOX 활성은 Tabor 등의 방법을 변형하여 측정하였다. \( 2.5 \mathrm{mM} \) benzylamine을 함유하는 \( 50 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer (\(\mathrm{pH} \) 7.2) \( 3 \mathrm{ml} \)에 시료를 가한 후 benzylamine이 감소되는 정도를 분광광도계로 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 활성의 단위는 1분 동안 \( 1 \mu \) mole benzylamine을 분해하는 효소의 양으로 millimolar extinction coefficient 13.8을 사용하여 계산하였다.</p>