Biorenovation 생물 전환 기법에 썼던 균주인 Bacillus sp. JD3-7 (KACC 92346P)은 미생물센터에서 RAW \( 264.7 \) 세포는 한국세포주은행에서 받아 연구에 이용했다. \( \mathrm{CH} \) 와 \( \mathrm{CHB} \) 및 대조군인 JD3-7의 RAW \( 264.7 \) 세포에 대한 독성을 연구하기 위해 세포를 \( 8.0 \times 10^{4} \) cells/ well로 분주한 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24시간 동안 배양하고 농도별로 각 시료를 처리해 24시간 반응했고 \( \mathrm{NO} \) 저해 활성을 조사하기 위해서는 RAW \( 264.7 \) 세포를 24-well plate에 \( 8.0 \times 10^{4} \) cells/well 로 분주를 한 후에 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2}\right) \)에서 24시간 동안 배양했다.
<h2>재료 및 방법</h2> <h3>고란초 추출물 제조</h3> <p>본 연구에 사용된 고란초 (Crypsimus hastatus (Thunb.) Copel) 전엽체는 (재)충북테크노파크로부버 제공반았다. 건조된 고란초 전엽체 파우더 \( 10 \mathrm{~g} \) 에 \( 70 \% \) Ethanol \( 1 \mathrm{~L} \) 를 침가하여 상온에서 24시간 동안 2회 반복 추줄하였으며, 추줄액은 paper filter (Toyo Roshi Kaisha, Tokyo, Japan)를 사용하여 여과하였다. 이후, 여과된 추출몰은 감압 농축한 뒤, \( -110^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 동결 건조하여 실험에 사용하였다.</p> <h3>미생물 배양 및 biorenovation 반응</h3> <p>Biorenovation 생물 전환 기법에 사용한 균주인 Bacillus sp. JD3-7 (KACC 92346P)은 미생물센터로부터 분양 받아 실험에 사용하였다. 균주의 증식을 위해 nutrient broth (Peptone \( 5.0 \mathrm{~g} / \) \( \mathrm{L} \), Beef extract \( 3.0 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) )를 이용하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rm} \) 조건하에 18시간 배양하였으며, 배양 종료 후, 배양액을 4,000 rpm에서 15분 동안 원심 분리하여 pellet을 회수하였으며, 회수한 pellet은 PG buffer (50 mM Phosphate buffer, \( 2 \% \) Glycerin)를 이용하여 2회 세척하였다. 세척 후, pellet을 PG buffer \( 100 \mathrm{~mL} \) 에 재현탁하여 대조군(JD3-7)으로 사용하였으며, 동일 현탁액에 주정 추출한 고란초 시료 \( (\mathrm{CH}) \) 를 침가 한 뒤, \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rmm} \) 조건 하에 72 시간 동안 반응하여 셍물 전환 된 \( \mathrm{CH} \) 추출물(CHB)를 제조하였다, 반응 종료 후, 반응액은 \( 4000 \mathrm{rpm} \) 에서 원심 분리하여 pellet을 제거하였으며, 회수한 상등액은 \( -110^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 동결 건조하여 시료화 하였다.</p> <h3>Biorenovation 전환물의 HPLC 분석</h3> <p>\( \mathrm{CH} \) 와 CHB 및 JD3-7의 peak 분석을 위해 Shimadzu Spectro-Monitor 3200 digital UV/Vis detector와 Shim-pack GIS C18 column (5 بm ODS, \( 250 \times 4.6 \mathrm{~mm} \) id) 사용하였으며, 이동상 용매로 0.1\% Trifluoroacetic acid (TFA, SAMCHUN, Pyeongtaek, Korea)를 첨가한 water (Solvent A)와 acetonitrile (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, Solvent B)을 사용하였다. 추출물의 분석은 gradient 조건하에 30분간 수행되었으며, 용매의 구배는 solvent \( \mathrm{B} \) 를 \( 10 \% \) 에서 \( 100 \% \) 가 되도록 설정 하였다. 또한 유속 \( 1.0 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \), column의 온도를 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 로 하여 \( 254 \mathrm{~nm} \) 파장에서 분석을 진행하였다.</p> <h3>실혐 재료 및 세포배양</h3> <p>본 연구에 사용된 RAW \( 264.7 \) 세포는 한국세포주은행에서 분양 받았다. 세포 배양을 위해서 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS, Welgene, Gyeongsan, Korea), \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) sterptomycin 과 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) penicillin이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM, Welgene)를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 2 일을 주기로 계대 배양 하였으며, 세포 자극에 사용한 LPS는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.</p> <h3>세포 생존율 측정</h3> <p>\( \mathrm{CH} \) 와 \( \mathrm{CHB} \) 및 대조군인 JD3-7의 RAW \( 264.7 \) 세포에 대한 독성을 조사하기 위하여 24-well plate에 세포를 \( 8.0 \times 10^{4} \) cells/ well로 분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24 시간 동안 배양 한 뒤, LPS \( (1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \) 와 각 시료를 농도별로 치리하여 24시간 반응하였다. 그 후 각 well에 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-phenyltetrazolium Bromide (MTT, Sigma-Aldrich) 시약을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 3시간 동안 incubation 하여 formazan blue를 형성 하였다. 이후 상등액을 제거한 각 well에 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich)를 첨가하여 formazan blue를 용해시킨 후, 96-well plate로 옮겨 담아 microplate reader (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 을 사용하여 \( 570 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h3>\( \mathrm{NO} \) 생성 억제 활성 측정</h3> <p>\( \mathrm{CH} \) 와 \( \mathrm{CHB} \) 및 대조군인 JD3-7의 \( \mathrm{NO} \) 저해 활성을 조사하기 위해서 RAW \( 264.7 \) 세포를 24-well plate에 \( 8.0 \times 10^{4} \) cells/well 로 분주한 뒤, \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2}\right) \) 에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 LPS \( (1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \) 와 각 시료 \( (50,100,200 \) \( \mu \mathrm{g}(\mathrm{mL}) \) 를 동시 치리하였으며, 24 시간 반응 후 96 -well plate에 배양액 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 와 Griess 시약 [1\% (w/v) sulfanilamide, \( 0.1 \% \) (w/v) naphylethylenediamine in \( 2.5 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) phosphoric acid] 을 동량 혼합하여 10 분 동안 암 반응 시킨 다음 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p>