codon usage를 고려하여 pRARE plasmid를 함유한 Rosetta(DE3)pLysS를 숙주세포로 사용하고, 이 균주로부터 Rhodotorula glutinis의 epoxide hydrolase(EH)를 고효율로 발현시켰다. EH가 발현된 재조합 E. coli를 생촉매로 사용하여 라세믹 styrene oxide 혼합물과 반응시킨 결과, 높은 (R)-styrene oxide에 대한 입체선택적 가수분해활성을 확인하고 광학적으로 순수한 (S)-styrene oxide를 얻을 수 있었다.
<h2>재조합 Rosetta 생촉매 특성분석 및 회분식 \( (S) \)-styrene oxide 제조</h2> <p>반응액의 styrene oxide 분석을 위해 \( 1 \mathrm { ml } \) 의 반응액을 취한 후 \( 1 \mathrm { ml } \) cyclohexane으로 추출하고 유기 용매층을 \( \mathrm { GC } \) 로 분석하여 ee값 및 \( \mathrm { EH } \) 활성을 평가하였다. R. glutinis의 \( \mathrm { EH } \) 유전자를 가지도록 재조합한 Rosetta 균주를 이용하여 (R)-styrene oxide와 (S)-styrene oxide에 대한 재조합 \( \mathrm { Rg } _ {\mathrm { EHH } } \) 의 초기 분해 속도를 Fig. 4에 나타내었다. 기질농도롤 완충용액에 최대용해농도인 \( 6 \mathrm { mM } \) 로 하였을 때, (R)-styrene oxide에 대한 초기분해속도가 \( 1600 \mathrm { nmol } / \mathrm { min } / \mathrm { mg } \) dcw으로 \( 700 \mathrm { nmol } / \) \( \mathrm { min } / \mathrm { mg } \) dcw인 (S)-styrene oxide에 비하여 기질 특이적 \( \mathrm { EH } \) 활성이 높은 것을 알 수 있었다. 또한 (R)-styrene oxide 및 (S)-styrene oxide 모두 농도가 낮을 때는 분해속도가 선형적으로 증가하지만, 높을 때는 점차 감소하여 점진적으로 최대치에 도달하는 경향을 보였다.</p> <h1>요 약</h1> <p>방향족 에폭사이드 기질에 대한 입체선택적 가수분해능이 우수한 Rhodotorula glutinis의 epoxide hydrolase (EH) 를 codon usage를 고려한 Escherichia coli 균주에서 고효율로 발현 할 수 있었다. 효모인 R. glutinis와 박테리아인 E. coli에서의 codon usage 선호도를 분석하고 그 차이를 고려하여 E. coli에서 잘 사용되지 않는 rare codon에 대한 tRNA 유전자정보가 들어 있는 pRARE plasmid를 함유한 E. coli 균주인 Rosetta(DE3)pLysS를 숙주세포로 사용하였다. R. glutinis EH를 발현시킨 재조합 E. coli를 생촉매로 사용하여 라세믹 styrene oxide 혼합물과 반응시켰을 때, (R)-styrene oxide에 대한 입체선택적 가수분해활성이 wild type R. glutinis 대비 매우 향상됨을 관찰할 수 있었다. 또한 라세믹 기질로부터 입체적으로 고순도인 \( 99 \% \) ee 값을 갖는 광학적으로 순수한 (S)-styrene oxide를 얻을 수 있었다.</p>