DCFH-DA assay로 세포 내 활성산소종을 측정하였는데 대조군들은 시료 대신 PBS를 처리하였고, blank군은 \( 500 \mu \mathrm{M} \mathrm{~H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 대신 PBS를 처리하여 측정하였고, control군은 \( 500 \mu \mathrm{M} \mathrm{~H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 를 처리를 하여 측정하였다. MTT가 세포에 의해 환원된 양을 나타내는 흡광도는 각 well에 존재하는 생존 수와 비례하는데 이아 따른 실험결과는 Mean \( \pm \) SEM으로 나타내었고, 분석된 실험 데이터는 각 대조군과 시료로부터 얻은 자료로부터 one-way ANOVA를 통해 유의성을 검증하였다.
<h2>세포 내 활성산소종(reactive oxygen species) 측정</h2> <p>세포 내 활성산소종은 DCFH-DA \( \left(2^{\prime}, 7^{\prime}\right. \)-dichlorodihydro-fluorescin diacetate) assay로 측정하였다. DCFH-DA (Sigma, USA)는 세포 내 활성산소종과 반응하여 형광물질(dichlorofluorescein, DCF)을 만들어 내는 것으로 이 시약을 세포 속에 넣어 발생하는 형광을 측정함으로써 세포 내의 활성산소종을 측정할 수 있다. 세포를 96-well cell culture plate에 분주한 후 24 시간 배양하고, PBS로 씻은 후 \( 20 \mu \mathrm{M} \) DCFH-DA을 각 well에 분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) incubator에서 20 분간 pre-incubation하였다. 각 well에 시료를 처리하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) incubator에서 1시간 배양한 후, DCFH-DA을 없애고 세포는 다시 PBS로 씻은 후 \( 500 \mu \mathrm{M} \mathrm{~H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 를 처리하여 시간별로 DCF fluorescence를 excitation \( 488 \mathrm{~nm} \), emission \( 530 \mathrm{~nm} \) 에서 microplate reader (VICTOR3, Perkin Elmer, USA)로 측정하였다. 대조군들(blank군과 control군)은 시료 대신 PBS를 처리하며, control군은 \( 500 \mu \mathrm{M} \mathrm{~H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 를 처리를 하고, blank군은 \( 500 \mu \mathrm{M} \mathrm{~H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 대신 PBS를 처리하여 측정하였다.</p> <h2>MTT assay</h2> <p>배양된 암세포는 96-well cell culture plate에 \( 5 \times 10^{4} \) cells/\(\mathrm{ml}\)이 되도록 \( 100 \mu \mathrm{l} \)씩 분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) incubator에서 24 시간 배양한 후 배지는 제거한 뒤 각 시료를 배지로 희석하여 각 well당 \( 100 \mu \mathrm{l} \)씩 첨가하고, 대조군에는 시료 대신 PBS를 \( 100 \mu \mathrm{l} \)씩 첨가하였다. 이 plate를 다시 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) incubator에서 24시간 배양하였다. 배양 후 MTT assay 를 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bro-mide (MTT) 시약 \( 5 \mathrm{mg} \)을 \( 1 \mathrm{ml}\) PBS 로 녹인 후, \( 10 \% \) FBS가 함유된 배지 \( 9 \mathrm{ml} \)와 희석하여 \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하고 3~4시간동안 더 배양하여 MTT가 환원되도록 하였다. 배양종료 후 생성된 formazan 결정을 가라앉힌 후 각 well에 형성된 결정이 흐트러지지 않도록 주의하면서 반응 후 남은 MTT가 처리된 배지를 제거하였다. 배지가 제거된 각 well에 formazan 결정을 용해시키기 위하여 DMSO를 \(100 \mu \mathrm{l}\)씩 분주하여 5~10분간 반응시켜 microplate reader (VICTOR3, Perkin Elmer, USA)로 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 이 흡광도는 MTT가 세포에 의해서 환원된 양을 나타내며, 따라서 각 well에 존재하는 생존 수와 비례한다.</p> <h2>통계분석</h2> <p>실험결과는 Mean \( \pm \) SEM (Standard Error of Mean)으로 나타내었고 분석된 실험 데이터는 대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 자료로부터 one-way ANOVA를 실시하여 유의성을 검증하였다.</p>