부탄올 내성세균의 분리는 부탄올을 함유한 LB 한천배지에서 큰 콜로니 형태를 보이는 미생물을 선택하여 수행되었고, 추가적으로 프로판올과 펜탄올에 대한 내성을 확인하였다. 분리된 세포는 광학현미경으로 관찰되었으며, 16S rDNA의 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>배지</h2> <p>부탄올 내성세균을 분리하고 배양하기 위해 LB( Luria-Bertani) 한천배지를 사용하였다. 필요할 경우, 부탄올을 \( 15-30 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 첨가하여 사용하였다.</p> <h2>부탄올 내성세균 분리</h2> <p>\( 99 \% \) 순도의 부탄올 용매(Junsei 제품, 일본) \( 100 \mathrm{ml} \) 을 \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) membrane filter를 사용하여 용매를 통과시켜 균체를 포집한 다음, 필터를 \( 2 \mathrm{ml} \) 생리 식염수에 현탁시킨 후, \( 15 \sim 30 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 부탄올을 함유한 LB 한천배지에 도말하여 \( 32^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 2 \sim 3 \) 일간 배양하였다. 큰 콜로니 형태를 보이는 미생물 32 종을 1 차 선택하여 \( 15,17.5,20,22.5,25 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 의 부탄올을 함유한 LB 한천배지에서 그 성장유무를 확인하여 최종적으로 \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 에서도 잘 성장하는 3종의 균을 선별하였으며, 분리된 균주들은 3 회 순수분리 후 \( 20 \% \) 글리세롤에 보관하면서 사용하였다.</p> <h2>부탄올 내성균주 개발</h2> <p>탐색 분리된 BRS02 균을 전날 밤 \( 4 \mathrm{ml} \) LB배지를 함유한 test tube에서 접종하여 16 시간 진탕 배양한 후 다음 날 \( 30 \mathrm{ml} {LB} \) 배지를 함유한 \( 300 \mathrm{ml} \) 삼각플라스크에 seed 균을 \( 2 \% \) 접종 한 다음 OD가 0.7 될 때까지 배양하였다. 배양액을 petri dish에 옮긴 후 stirring하면서 \( 40 \mathrm{~W} \) 자외선등으로 \( 40 \mathrm{~cm} \) 정도의 거리에서 15 분간 조사한 후 다시 1 시간 진탕 배양한 다음 원심 분리하여 \( 25-30 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 의 부탄올을 함유한 LB 한천배지에 도말하여 2-3일간 배양하였다. 큰 콜로니 형태를 보이는 미생물들을 1 차 선택하여 \( 25 ,27.5 ,30 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 부탄올 함유배지에서 그 성장유무를 다시 확인하여 \( 27.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 에서도 성장이 잘되는 3 종을 선별한 후, 다시 \( 15 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 부탄올 함유 액체배지에서 제일 높은 내성을 나타내는 균을 최종 선별하였으며, 3 회 순수 분리하여 \( 20 \% \) 글리세롤에 보관하면서 사용하였다.</p> <h2>부탄올, 프로판올, 펜탄올 내성도 측정</h2> <p>부탄올, 프로판올, 펜탄올에 대한 내성도는 LB 액체배지를 사용하여 측정하였다. 스크리닝한 미생물들과 E.coli Top10을 \( 0-20 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 의 부탄올, \( 0-35 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 의 프로판올, 또는 \( 0 \sim 10 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 의 펜탄올을 각각 농도별로 첨가한 \( 4 \mathrm{ml} {LB} \) 배지를 함유한 \( 15 \mathrm{ml} \) 시험관에 접종 한 후 \( 32^{\circ} \mathrm{C}, 16 \) 시간 배양하였다. 한편, 시간별 부탄올 내성도를 측정하기 위해서는 전날 배양한 seed를 각각 \( 12.5-22.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 부탄올을 함유한 \( 50 \mathrm{ml} {LB} \) 배지 \( (300 \mathrm{ml} \) 삼각플라스크 \( ) \)에 OD가 0.2-0.3 되게 첨가한 다음, 배양액을 시간 별로 취하여 세포 OD를 측정하였다. 세포성장은 분광광도계(Shimadzu UV mini-1240, Japan)를 이용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 관찰하였다. 모든 실험은 1 회 2 번, 총 3 회 반복 실험하였다.</p> <h2>부탄올 내성세균의 형태 및 생화학적 특성분석</h2> <p>세포의 형태는 그람염색(Difco Gram stain kit) 후 광학현미경(Model Motic BA210)으로 관찰하였다. D-galactose, D-maltose, D-mannitol 등과 같은 각종 탄소원에 대한 자화 능력, bacitracin, novobiocin, polymyxin B 등의 항생제에 대한 내성능력, arginine dihydrolase, \( \alpha \)-glucosidase, phosphatase 등의 여러 효소활성에 대한 생화학적 실험은 Biomerieux의 VITEK 2 Systems Version: 05.02 를 사용하였다.</p> <h2>16 S rDNA와 16S-23S Ribosomal DNA 유전자사이 공간 (intergenic spacer, IGS) 염기서열분석 및 계통발생도 작성</h2> <p>16 S rDNA 는 16S-27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 16S-1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR을 이용하여 증폭하였다. 증폭된 DNA 단편은 솔젠트(주)의 plasmid T-blunt와 접합하여 대장균 Top10에 형질전환하여 얻은 plasmid를 사용하여 염기서열을 분석 하였다. \( 16 {S} \) rDNA의 염기서열은 National Center for Biotechnology Information(NCBI; http://www.ncbi.nlm. nih. gov/)의 BLAST server를 사용하여 분석하였다. \( 16 {S}-23 {S} \) IGS는 16/23S-1525F(5'-GCTGGATCACCTCCTTTCT-3')와 16/23S-40R(5'-CTGGTGCCAAGGCATCCA-3') 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하여 약 \( 0.45 \mathrm{~kb} \) 의 DNA 단편을 정제한 후 T-blunt plasmid에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다. IGS에 존재하는 tRNA 분석은 genomic tRNA database (http://lowelab. ucsc. edu/GtRNAdb/)를 사용하였다. 다중서열배열(multiple sequence alignment)은 CLUSTAL W 프로그램을 사용하여 분석하였으며, 계통발생도는 MEGA5 프로그램을 이용하여, 통계적 방법은 neighbor joining법으로, 계통발생론 평가는 Bootstrap법을 이용하여 구축하였다.</p> <h2>염기서열 가입번호(accession number)</h2> <p>\( 16 {S} {rDNA} \) 염기서열의 GenBank 등재번호는 JX648551이다.</p>