보통 urease 정제 목적인 Staphylococcus epidermidis ATCC12228 균주는 적정량의 \( \mathrm{NiCl}_{2} \) 를 함유하는 trypticase soy broth (TSB) 또는 Luria-Bertani (LB) 배지에서 지수 증식기 후반까지 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 진탕 배양하였다. S. epidermidis의 증식 단계에 따른 urease 활성을 측정◦비교하기 위하여, TSB \( 50 \mathrm{~mL} \) 에 세균을 접종하고 같은 온도로 배양하면서, 일정한 시간 간격으로 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서의 흡광도를 측정하고, 원심 분리하여 균체를 회수하였다. 동결 보존된 Staphylococcus epidermidis ATCC12228을 trypticase soy agar 평판배지 (TSA)에 접종하고 소량의 TSB 배지에서 종균 배양한 후 균체를 회수하였고 각각의 분획에 대하여 urease 효소 역가를 측정하여, 이중 urease 활성을 나타낸 분획을 수집하여 Phenyl-Sepharose 컬럼에 적용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 배양</h2> <p>Staphylococcus epidermidis ATCC12228 균주는 American Type Culture Collection (ATCC, USA) 사로부터 구입하여 사용하였고, 보통 urcase 정제 목적으로 적정량의 \( \mathrm{NiCl}_{2} \) 를 함유하는 trypticase soy broth (TSB) 또는 Luria-Bertani (LB) 배지에서 지수 증식기 후반까지 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 진탕 배양하였다.</p> <h2>증식단계 및 Nickel ion이 urease 활성에 미치는 영향</h2> <p>S. epidermidis의 증식 단계에 따른 urease 활성을 측정◦비교하기 위하여, TSB \( 50 \mathrm{~mL} \) 에 세균을 접종하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하면서, 일정한 시간 간격으로 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서의 흡광도를 측정하고, 각각 배양액 \( 5 \mathrm{~mL} \)씩을 분취하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 6,000 \times \mathrm{g} \) 로 10분간 원심 분리하여 균체를 회수하였다. 이를 빙냉한 \(20 \mathrm{mM} \mathrm{~KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\), \(1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 1 \mathrm{mM} \) 2-mercaptocthanol \( (\mathrm{pH} 7.0\), 이하 PEB)에 현탁시켜 \( 1 \mathrm{mM} \) phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)와 lysozyme \( (1 \mathrm{mg} / \mathrm{mL}) \)을 가한 후, 얼음 위에서 초음파 파쇄 \( (70 \mathrm{~W}\), \(1 \mathrm{~min} / \mathrm{mL}) \)한 후, \( 50,000 \mathrm{xg} \)로 30분간 원심분리하여 상징액에 대하여 urease 효소 활성을 측정하였다.</p> <p>한편 배지 내의 니켈 이온 농도가 urease 효소 활성에 미치는 영향을 측정하기 위하여 TSB 배지에 \( \mathrm{NiCl}_{2} \)의 최종 농도를 각각, 0, 10, 25, 50, 100, 200, 300 및 \( 500 \mu \mathrm{M} \)이 되도록 첨가한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 지수기 후반까지 18시간 동안 배양하고 위와 동일한 과정을 거쳐 urcase 효소 활성을 측정하여 비교 하였다.</p> <h2>S. epidermidis urease의 정제</h2> <p>동결 보존된 Staphylococcus epidermidis ATCC12228을 trypticase soy agar 평판배지 (TSA)에 접종하고 소량의 TSB 배지에서 종균 배양한 후, \( 50 \mu \mathrm{M} \mathrm{~N^{2 }} \mathrm{Nl}_{2} \) 를 함유하는 LB} 배지에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 지수기 후반까지 배양한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 8,000 \mathrm{xg} \)로 15분간 원심 분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 빙냉한 \( 20 \mathrm{mM}\) PEB로 1회 세척 후 다시 소량의 PEB로 현탁시켰다. 이 세포 현탁액에 lysostaphin (Sigma, USA)을 \( 40 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)로 가해 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 수욕상에서 1 시간 처리하여 세포벽을 부분 분해하였다. 여기에 PMSF를 최종 농도 \(1 \mathrm{mM} \)로 하여 가하고 French pressure cell (Aminco, USA) 을 \( 18,000 \mathrm{psi} \)의 압력으로 3회 반복 통과시킴으로써 세포를 파쇄하였다. 이를 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(100,000 \mathrm{xg} \)에서 90 분간 초 원심분리하고 상등액을 분리하여 조추출물을 얻었다. 이를 PEB\((\mathrm{pH} 7.0)\)로 미리 평형화시킨 DEAE-Sepharose 컬럼 \( (2.6 \times 40 \mathrm{~cm}) \)에 적용시킨 후 완충액 중의 KCl 농도를 \( 0 \mathrm{M} \)에서 \( 1 \mathrm{M} \)로 점진적으로 증가시키며 전개시켰다. 각각의 분획에 대하여 urease 효소 역가를 측정하여, 이중 urease 활성을 나타낸 분획을 수집하여 DEAE-pool로 하고 이를 \( 2 \mathrm{M}\) KCl을 함유한 PEB\((\mathrm{pH} 7.0)\)로 평형화시킨 Phenyl-Sepharose 컬럼 \( (2.6 \times 40 \mathrm{cm} \))에 적용하였다. 완충액 중의 KCl 농도를 \( 2 \mathrm{M} \)에서 \( 0 \mathrm{M} \)까지 다단계로 감소시키며 elution 시켰으며, 위와 같은 방법으로 분획에 대하여 효소 역가를 측정하고 활성 분획을 수집하였다. 이를 FPLC 상에서 PEB\((\mathrm{pH} 7.0)\)로 미리 평형화시킨 Mono-Q HR 5/5 column에 적용하였다. 완충액 중의 KCl 농도를 \( 0 \mathrm{M} \)에서 \( 1 \mathrm{M} \)로 다단계로 증가시키면서 전개시킨 후 활성 분획을 수집하여 FPLC상에서 \( 0.15 \mathrm{M}\) KCl을 함유한 PEB \( (\mathrm{pH} 7.0)\)로 평형화시킨 Superdex HR 200\((1.6 \times 60 \mathrm{~cm})\) column으로 전개시켰다. 이 중 peak 활성을 보인 분획을 \(50\mathrm{mL}\)-stirred ultrafiltration cell (Amicon, USA)에서 농축과 동시에 투석을 시행하였다.</p>