식물체 내에서 GUS 유전자의 발현 여부와 발현량을 알아보기 위해 실험을 진행하였다. 모든 클론에서 GUS 활성이 관찰되었으며, 부위에 따라 아랫쪽 잎보다는 위쪽 잎, 위쪽 잎보다는 줄기에서 더 높은 활성을 보였다. 줄기에서 유도된 callus를 현탁세포로 유도하였으며, \( 2.5 \mathrm{~g}\)(DCW)/\(\mathrm{L} \)의 농도로 세포를 배양한 결과, GUS 유전자로 형질전환된 식물체와 형질전환되지 않은 식물체의 생장추이가 유사하게 나타났고 최대 \( 15 \mathrm{~g}\)(DCW)/\(\mathrm{L} \) 에 도달했다. 형질전환된 담배세포를 \( 2 \mathrm{~L} \) 버블-컬럼 바이오리액터에서 회분식 배양과 유가식 배양으로 분리하여 생장, 당농도, GUS 활성, 이온농도 등을 관찰하였다. 이러한 결과는 이전 연구에서 보고된 바와 일치하며, 배양 중기 이후 프로테아제 활성이 증가하여 배양 환경이 악화되는 것과 세포의 생장이 활발할 경우 배지 내 이온이 소진되는 것으로 추측되었다. 또한, 배양 중반부터 배양액의 삼투압이 감소하여 세포 외부로 이온이 배출되거나 세포의 라이시스에 의해 배지 내 이온농도가 다시 증가하는 것으로 여겨진다. 형질전환된 담배세포를 버블-컬럼 바이오리액터에서 유가식 배양을 통해 생장, GUS 활성, 당농도 및 이온농도 변화를 관찰하였다.
<h1>RESULTS AND DISCUSSION</h1> <h2>식물체 내 GUS activity</h2> <p>식물체 내에 GUS의 발현 유무 및 부위별 발현량을 알아 본 결과 실험에 사용되어진 모든 clone에서 GUS activity가 관찰되었으며 부위별로는 아랫쪽 잎보다는 위쪽 잎, 위쪽 잎보다는 줄기에서 더 높은 activity를 보여 줄기에서 유도된 callus를 현탁세포로 유도하였다.</p> <h2>Shake Flask culture</h2> <p>세포를 \( 2.5 \mathrm{~g}\)(DCW)/\(\mathrm{L} \)의 농도로 세포를 접종하여 실험한 결과, Fig. 3에서 보듯이 GUS 유전자로 형질전환된 식물체와 형질전환되지 않은 식물체의 생장추이가 거의 유사함을 볼 수 있으며 최대 \( 15 \mathrm{~g}\)(DCW)/\(\mathrm{L} \)에 도달하였다. 따라서 식물체 내로 외래 유전자 삽입에 의한 단백질의 생산은 식물세포 생장에 별다른 영향을 주지 않는 것으로 여겨진다.</p> <p>Transgenic plant의 경우에는 배지내 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)의 kanamycin이 첨가되었는데도 형질전환되지 않은 식물체에 비 해 생장억제가 관찰되지 않음을 알 수 있다. 형질전환된 식물체의 GUS activity는 세포생장에 따라 증가하거나 감소하는 경향이 아니라 fluctuation 되는 경향을 보였다. 이는 두가지 경우로 생각할 수 있는데 첫째로 Lee 등의 보고와 같이 GUS 단백질이 일정량 생산되면 배지 밖으로 분비되어 activity를 잃어버리는 것과 두 번째는 단백질의 생산과 분해가 식물체내에서 계속적으로 이루어진다고 볼 수 있다. 최대생산은 배양 15일째, 성장이 정지기에 도달할 때 최대값을 나타내었다.</p> <h2>Batch Culture in Bubble-Column Bioreactor</h2> <p>GUS 유전자로 형질전환된 담배세포를 \( 2 \mathrm{~L} \) bubble-column bioreactor 내에서 회분식 배양과 유가식 배양으로 나누어 세포의 생장, 당농도, GUS activity, 이온농도의 변화 등을 관찰하였다. 세포생장변화는 flask와 유사하였으나 초기세포생장이 flask에서 보다는 조금 느리고 최대세포농도도 더 작았다. 이것은 bioreactor의 경우 초기 접종량이 flask culture시보다 적고, 교반상의 차이나 산소전달방법의 차에 의해 유발되어지는 것으로 볼 수 있다.</p> <p>당소비경향도 세포의 생장과 거의 일치하는 것을 볼 수 있는데 sucrose가 fructose와 glucose로 분해되면서 동시에 세포에 의해 소비되어짐을 볼 수 있다. 그러나 glucose와 fructose가 같은 속도로 분해되는 것이 아니라 fructose보다는 glucose가 먼저 소비되는 것을 볼 수 있었다. 세포의 사멸기에는 당의 상당량이 소모되는 것을 알 수 있었기 때문에 세포의 사멸은 당의 고갈이 중요한 이유라고 생각되어진다.</p> <p>GUS activity의 변화는 Figure 7에 나타내었는데 flask \( (30 \mathrm{U} / \mathrm{mg}) \)에 비해서는 약 \( 2850 \mathrm{U} / \mathrm{mg} \)으로 훨씬 더 높은 activity를 보였으며 변화경향은 flask 내에서와 같이 일정하게 증가하거나 감소하는 것이 아니라 증가와 감소가 연속적으로 일어남을 볼 수 있었다.</p> <p>이온농도의 경우 Figure 8에서 볼 수 있는 바와 같이 배양초반에는 급격히 감소하다가 배양중반 이후부터 다시 서서히 증가하여 처음의 농도까지 계속 증가되어짐을 볼 수 있다. 이는 Lee 등 이 보고한 바와 같이 배양중기 이후에 protease 활성이 급격히 높아지는 등 배양환경이 안 좋아지는 결과와도 일치하며, 세포의 생장이 왕성할 경우 배지내 이온을 홉수하여 세포의 증식에 사용되어진다고 여겨지며 배양중반이후 배양액의 삼투압의 감소로 세포밖으로 이온을 배출하거나 세포의 lysis 등에 의해 다시 배지내 이온농도가 증가한다고 여겨진다.</p> <h2>Fed-Batch Culture in Bubble-Column Bioreactor</h2> <p>형질전환된 담배세포를 bubble-column bioreactor 내에서 유가식배양을 통해 세포의 생장, GUS activity, 당농도 및 이온농도의 변화를 살펴보았다. 먼저 세포생장의 경우 당의 고갈을 막아주었는데도 회분식배양에 세포증식과 최대세포농도가 커다란 증가를 보이지 않았다. 그러나 삼투압의 증가로 인한 FCW의 감소로 인하여 세포의 교반이 회분식 배양에 비해 훨씬 원활하였다. 회분식 배양의 경우 배양후반에는 void fraction이 거의 없어 세포의 교반이 불가능한 상태였으나 유가식 배양의 경우에는 이런 현상을 보이지 않았다.</p> <p>Fig. 10 에 나타낸 것과 같이 당농도의 경우에는 회분식 배양과 다르게 당이 추가적으로 공급되었기 때문에 당농도의 고갈은 없었으나 세포증식면과 함께 고려할 경우 더 이상의 추가증식을 유도할 수 없었다. 이는 당농도외 세포증식에 다른 인자가 관여되어진다고 생각되어진다. 또한 첨가되어진 당이 지나치게 고농도여서 당의 소모가 원활하게 이루어지지 않는 것으로 추정된다. 따라서 변화되는 당농도를 관찰하면서 필요로 하는 가장 적절한 양의 당농도가 얼마인가를 먼저 알아내는 것이 유가식 배양의 선결요건이라 할 수 있겠다.</p> <p>GUS activity는 다른 배양 때와 마찬가지로 증감을 반복하는 경향을 보였으나 그리 심하지는 않았다. 그 양은 회분식배양 때와 커다란 차이를 보이지 않았다.</p> <p>Fig. 12에서 볼 수 있듯이 이온농도의 변화는 회분식배양과는 다르게 배양초반부터 계속 감소되어 배양 후반에는 거의 고갈되어졌다. 이것으로 보아 세포의 lysis는 회분식배양에 비해 훨씬 감소되어진다고 생각되어진다. 앞에서도 잠시 언급한바와 같이 당 이외에도 이온의 고갈이 더 이상의 세포생장이 이루어질 수 없도록 한 한가지의 원인으로 추정할 수 있다. 따라서 배양시 당 뿐아니라 Jung 등의 다른 보고에서와 같이 이온의 첨가도 고려되야 할 인자라고 여겨진다. 식물세포배양시 당의 첨가는 세포내의 생리에 많은 영향을 주는 것으로 보고되고 있으며 그 외에 빛의 영향 등도 세포의 생리와 재조합 단백질의 생산에 영향을 주므로 최적의 배양을 위해서는 이런 여러 가지 인자를 종합적으로 고려하여야한다.</p>