본 연구의 재료는 아가콩 3호(노란 아가콩, YA와 아가콩 4호(검정 아가콩, BA)이며 72시간 발효된 콩중 혈전용해능이 가장 우수한 균주를 발효균주로 사용하였다. ethanol 추출액을 감압 농축하여 발효 대두 추출물 (FSBE), 발효 아가콩 3호 추출물(FYAE), 발효 아가콩 4호 추출물(FBAE)을 연구의 시료로 사용하였다. 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 시약이 페놀성 화합물에 의해 환원되어 몰리브덴 청색으로 발색되는 원리를 이용하여 분석하고, 단백질 함량은 protein assay kit를 사용하여 정량하여 측정한다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>일반 대두(SB)는 시중에서 판매되는 것을 구입하여 사용하였으며 육종 품종인 아가콩 3호(노란 아가콩, YA와 아가콩 4호(검정 아가콩, BA)는 경북대학교에서 제공받아 사용하였다.</p> <h2>발표 균주의 선별</h2> <p>각각의 콩을 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)의 물에 24시간 동안 침지하여 건져낸 후 30분간 물을 뺀 다음 \( 50 \mathrm{g} \)씩 담아 autoclave에서 30분간 가압증자하였다. 증자대두를 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 이하로 냉각시킨 후 혈전 용해능을 지닌 10가지의 Bacillus sp. 균주 배양액을 증자대두의 \(3\%(\mathrm{w} / \mathrm{w}) \)가 되도록 접종하고 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)에서 72시간 발효하였다. 발효된 콩의 혈전용해능을 Fibrin plate method로 측정하고 혈전용해능이 가장 우수한 균주를 발효 균주로 사용하였다.</p> <h2>발효콩 추출물의 제조</h2> <p>Bacillus sp. sm26 균주를 이용하여 발효시킨 콩 발효물을 \( 70 \% \) ethanol로 추출한 후 여과(whatman paper No.2)하여 얻어진 ethanol 추출액을 감압 농축하여 발효 대두 추출물 (FSBE), 발효 아가콩 3호 추출물(FYAE), 발효 아가콩 4호 추출물(FBAE)를 각각 얻었으며 이를 본 연구의 시료로 사용하였다.</p> <h2>총 페놀 함량 분석</h2> <p>총 페놀 함량은 Singleton and Rossi method을 이용하여 Folin-Ciocalteu 시약이 페놀성 화합물에 의해 환원되어 몰리브덴 청색으로 발색되는 원리를 이용하여 분석하였다. FSBE, FYAE, FBAE \(~40 \mathrm{mg} \) 씩을 각각 증류수 \( 1 \mathrm{ml} \)에 녹인 후 96-microwell plate (Nunc, Roskilde, Denmark)에 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 씩 분주하고 sodium carbonate \( (0.7 \mathrm{~M}) ~80 \mu \mathrm{l} \)를 혼합한 후 Folin-Ciocalteu regent (Folin-Ciocalteu : Water \( =1: 10 \mathrm{~v} / \mathrm{v}) 100 \mu \mathrm{l} \) 첨가하여 15분간 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응 후 microplate reader (Versa Max, USA)를 이용하여 \( 765 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 gallic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로 총 페놀 함량을 계산하였다.</p> <h2>총 단백질 및 당 함량 분석</h2> <p>단백질 함량 측정은 Bio-rad사의 protein assay kit를 사용하여 정량 하였다. 각 추출물의 농도가 \( 0.1 \sim 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)가 되도록 증류수로 희석하고, 이 시료 \( 0.1 \mu \mathrm{l} \)와 4배 희석한 protein assay reagent \( 0.5 \mu \mathrm{l} \) 혼합하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 방치한 후 595\( \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 BSA (bovine serum albumin) standard curve를 이용하여 작성한 표준곡선으로 총 단백질 함량을 구하였다. 총 당 함량은 시료 \( 2 \mathrm{ml} \)를 test tube에 넣고 \(5\%(\mathrm{w} / \mathrm{w}) \) phenol 수용액 \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 넣은 후 \( 95 \% \) 황산 \( 500\mu \mathrm{l} \)를 첨가하고 30분 동안 실온에서 반응시킨 후 470\( \mathrm{nm}\)에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡은 glucose standard curve를 이용하여 작성한 표준곡선으로 총 당 함량을 구하였다.</p>