본 논문에서는 조골세포 활성검색 실험을 하고자 불순물을 제거하고 동결건조해 분말화한 복분자 추출물을 사용해 시료를 제조하는 과정을 보여주고 있다. 시료의 농도별 처리에 따른 조골세포의 성장 정도는 Green등의 방법에 따라 MTT assay를 사용해 측정했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시료조제</h2> <p>본 실험에 사용된 복분자는 대구 약령시장에서 건조된 것을 구입하여 불순물을 제거하고 세척한 다음 동결건조한 후 분말화 하였다. 분말화 된 시료무게의 10 배량 \( (\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 의 \( 80 \% \) methanol로 24시간동안 3회 추출하였으며, 추출액은 여과지 (Whatman No.3, England)로 2회 여과하고 상등액은 rotary vacuum evaporator (Buchi R-205, Flawil, Switzerland)로 농축한 후 동결건조하여 methanol 추출물을 제조하였다.</p> <h2>복분자 추출물을 이용한 조골세포 활성검색</h2> <h3>세포배양</h3> <p>Mouse calvaria osteoblast cello인 MC3T3-E1 cell은 계명대학교 의과대학 생화학교실에서 분양받아 사용하였다. 최 등의 방법을 참고하여 a-MEM배지에 \( 10 \% \) FBS (Gibco)와 \( 1 \% \) antibiotics (Gibco) 를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 2-3일 마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였으며, 분화유도를 위해 \( 5 \mathrm{mM} \beta \)-glycerol phosphate와 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 의 vitamin \( C \) (Sigma)를 첨가하여 분화유도배지로 사용하였으며, 3일마다 배지를 교환하였다.</p> <h3>조골세포 증식유도 측정</h3> <p>시료의 농도별 처리에 따른 조골세포의 성장 정도는 Green등의 방법에 따라 (3-(3,4-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide 시약의 환원정도를 측정하는 MTT assay로 측정하였다. 먼저 배양한 cell을 \( 0.4 \% \) trypan blue를 사용하여 계수한 후 \( 1 \times 10^{5} \) cells/well로 조정하여 분주한 다음 각 시료를 최종농도 1, 10, 100, 및 \( 1,000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 되게 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 씩 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 48시간 배양하였다. 대조군은 시료 대신 배지를 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 첨가하여 동일하게 배양하였다.</p> <p>배양 후 (3-(3,4-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide 시약을 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 농도로 \( 10 \mu \mathrm{L} \) 를 각 well에 첨가하여 4시간 더 배양한 후 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 DMSO를 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 씩 첨가하여 생성된 불용성의 formazan 결정을 용해시켜 ELISA reader로 \( 550 \mathrm{nM} \) 에서 흡광도를 측정하였고 세포의 증식률은 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.</p> <p>Cell growth \( (\%)=\frac{\text { 대조군의 훕광도 }-\text { 시료처리군의 흡광도 }}{\text { 대조군의 흡광도 }} \times 100 \)</p>