Lactobacillus reuteri KCTC3594 표준 균주를 활용하여 실시한 본 실험에서는 고체발효(solid-state fermentation)방식으로 가축용 생균제를 제조하였다. 이때 총 16종의 생균제 제품을 실험에 동원하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>정량분석용 표준균주 및 배양</h2> <p>본 실험에서 사용된 표준 균주는 Lactobacillus reuteri KCTC3594를 사용하였다. 또한 가축생균제용 유산균의 spe-cific primer 확인을 위해 Lactobacillus plantarum KCTC3104을 사용하였으며, Lactobacillus 균주들의 배양을 위해 MRS (deMan, Rogosa and Sharpe) Agar (Difco) 배지를 사용하였으며, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 혐기적으로 배양하였다.</p> <h2>시험용 생균제</h2> <p>본 시험에 사용된 생균제는 시중에서 판매되고 있는 유산균 배양 생균제를 구입하여 사용하였다. 가축용 생균제는 고체발효(solid-state fermentation)방법을 통해 제조되었으며, 총 16종의 생균제 제품을 본 시험에 사용하였다. 생균제 제조를 위해 고체배지로서 탈지강에 규산염제 및 다공성 물질을 첨가하였으며, 유산균 접종 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3 ~ 4일 동안 고체발효기에서 제조한 제품을 사용하였다.</p> <h2>생균수 측정</h2> <p>생균수 측정을 위해 멸균 생리식염수 \( 9 \mathrm{ml} \)에 시료 \( 1 \mathrm{~g} \)을 넣은 후 10진 희석하여 측정하였다. 유산균의 생균수 측정배지는 MRS Agar (Lactobacillsu Agar acc. To De Man, Rogosa and Sharpe. Difco)를 사용하였으며, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 동안 Anaerobic jar에 넣어 혐기배양한 후 균수를 측정하였다.</p> <h3>Lactobacillus genus primer를 이용한 based-PCR</h3> <p>\( 5 \% \) Chelex (Biorad, USA)를 사용하여 Lactobacillus 균주의 DNA를 추출하였고, 추출한 PCR template DNA의 16S-23S rRNA intergenic species region 을 Lactobacillus genus specific primer인 LbLMA-1 (forward), R16-1 (reverse)와 Lactobacillus genus Real-time PCR prime인 alllact-F (forward), allact-R(reverse)를 사용하여 각각 증폭하였다(Table 1). PolymeraseChain Reaction은 DNA thermal cycler (Biorad, USA)를 이용하였고, PCR 반응액은 template DNA \(1 μ1\), \( 2.5 \mathrm{mM} \) dNTPs \( 0.5μ1\), 1.25unit의 Taq polymerase (Takara) \(0.125 μl\), PCR buffer \(15 \mathrm{mM} \), MgC12, \( 100 \mathrm{mM} \) Tris-HCl pH 8.3, \( 500 \mathrm{mM} \)KCl) \( 2.5 μl \)와 10 pmol forward 및 reverse primer 각각 \( 1 μl \)를 넣은 후 최종 부피가 \( 25 \mu 1 \)가 되도록 멸균된 3차 증류수를 첨가하였다. PCR 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 실시 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 58^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초, 33 cycle 수행하였으며 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응하였다. PCR 산물은 \( 2.0 \% \) agarose gel에서 전기영동하여 그 크기를 확인하였다.</p> <h3>TA cloning 및 transformation</h3> <p>증폭된 16S-23S rRNA intergenic species region PCR 산물은 QIAquick \( { }^{\circledR} \) PCR purification kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 사용하여 정제한 후 PCR 생성물을 cloning하기 위하여 Promega (USA)의 pGEM - T Vector Syste과 T&A Cloning Vector (RBC Bioscience, KOREA)를 이용하였다. PCR 생성물을 T vector protocol에 따라 ligation reaction [T4 DNA Ligase 10 × Buffer \( 1 \mu \mathrm{l} \), pGEM - T vector (\(50 ng\)), PCR product \( \times \mu \mathrm{l} \), T4 DNA ligase (3 weiss units / \( μl\)) \(1 μl\), add deionized water up to 10 \( μl\))를 준비하여 상온에서 1시간 반응시켰다. \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관되어있는 E. coli Top10 competent cell 50 \( μl\)를 꺼내어 얼음에서 녹인 뒤 ligation을 실시한 반응물 0.5 \( μl\)를 Micropulser (Biorad, USA)를 이용하여 electroporation 시킨 후 \( 500 \( μl\) Medium을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 배양 후 배양액을 ampicillin이 \( 50 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 농도로 첨가된 Lirua-Bertani agar배지에 도말하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 하루 동안 배양하였다. 이때 transformation의 color selection을 위하여 plate당 X-gal (bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galacto-pyranoside, \( 20 \mathrm{mg} / \) \( \mathrm{ml}) 35 \) ul, IPTG (isopropyl-1-thio- \( \beta \)-D-galactopyranoside,\( 20 \% \mathrm{w} / \mathrm{v}) 7 \mu \)를 함께 첨가하였다. 배지 위에 형성된 white, blue colony 중에 white colony를 임의적으로 선택하여 다시 ampicillin (50 mg/ml)이 포함된 LB Broth에 배양하였다.</p>