본 연구에서는 실험을 통해 단삼 에탄올추출물의 germ tube 형성 억제능은 크지 않을 것임을 확인했다. 따라 단삼 에탄올추출물이 바이오필름에 주는 영향을 qRT-PCR의 방법으로 분석하였다. 그 원인으로는 ALS1과 ALS3의 발현 감소로 인한 표면 부착 저해 현상과 EAP1 발현을 억제하면서 세포들이 표면 부착을 제어받는 것에 있다. 이러한 분석을 통해 C. albicans이 초기단계 바이오필름의 성장억제에 기여한다고 추정할 수 있다.
<h2>단삼추출액의 C. albicans germ tube 형성 억제에 대한 효과</h2> <p>C. albicans가 바이오필름을 형성하기 위해서는 표면부착후 germ tube라는 짧은 관을 출아포자에 내어 가균사를 형성하는데, germ tube의 형성은 균사로 진입하기 위한 필수적인 과정이다. 단삼 에탄올추출물이 germ tube 형성을 얼마나 효과적으로 억제하는지 알아보기 위해 C. albicansSC5314 세포를 germ tube 형성을 유도하는 FBS와 RPMI 1640 배지에 노출시켜 37°C에서 배양하였다. 1x MIC에 해당하는 39 μg/ml 단삼 추출물을 넣은 경우 germ tube 형성은 억제되지 않았다(Fig. 2B). 단삼의 양을 증가시켜 5xMIC에 해당하는 195 μg/ml 단삼 추출물을 처리했을 때 germ tube 형성이 억제되어 효모형만이 관찰되었으며 반복된 실험에서도 고용량의 단삼 에탄올추출물의 존재하에서만 germ tube 형성에 대한 억제효과가 있었다. 따라서 단삼 에탄올추출물의 C. albicans의 germ tube 형성 억제능은 그다지 크지는 않을 것으로 생각된다.</p> <h2>균사와 관련된 유전자들의 발현분석</h2> <p>단삼 에탄올추출물의 바이오필름에 대한 영향을 분석하기 위해 본 연구에서는 qRT-PCR의 방법을 사용하여 바이오필름 또는 균사에 특이적인 유전자발현의 변화를 분석하였다. 바이오필름 발달에서 표면부착은 필수적인 단계이므로 Candida Genome Database (CGD, http://www.candidagenome.org/)의 정보에 기초하여 효모의 표면부착과 바이오필름 형성에서 중요한 역할을 하는 유전자인 EAP1, HWP1, ALS1, ALS3, ECE1의 발현량 변화를 분석하였다. housekeeping gene인 actin 유전자 ACT1의 발현량으로normalization을 하여 단삼처리 실험군의 유전자 발현을 비교하였다. Eap1 (Enhanced adherence to polystyrene protein 1)은 세포벽 adhesion 단백질로서 세포와 세포 또는 세포와 기질간 부착을 매개하는 바이오필름 형성에 필수적인 단백질이다. C. albicans Eap1은 adhesin 당단백질 중의 하나로서 불용성 아밀로이드를 형성하고 아밀로이드 형성은 이들 단백질간에 세포간 aggregation을 형성할 수 있게 하는 중요한 인자이다. 단삼 에탄올추출물을 처리한 바이오필름의 EAP1 발현량은 0.653배로 감소하였다(p< 0.001) (Fig. 3). Lee and Kim의 연구에서 백작약(Paeonia lactiflora) 추출물은 EAP1의 발현량을 증가시켰는데, 형광현미경 관찰에서 많은 C. albicans cell aggregates가 바닥에 부착되어 있지 않고 둥둥 떠 있는 현상을 관찰할 수 있었다. 반면에 Fig.1에 보여지는 바와 같이 단삼 에탄올추출물을 처리한 실험에서는 C. albicans cell aggregates 없이 낱개로 분리된 효모형의 세포들이 소량 바닥에 붙어 있는 형태가 많았다. 따라서 이 결과는 단삼에 의한 EAP1 발현의 감소와 일치하는 현상으로 보인다. ALS gene family는 세포표면의 당단백질을 코딩하는 유전자군으로서 숙주표면 부착에 관여한다. Als1 (agglutinin-like sequence 1)과 Als3 (agglutinin-like sequence 3) 단백질은 균사 발달을 시작하게 하고 바이오필름의 표면 부착과 세포벽의 integrity 유지에 관여한다. 단삼 에탄올추출물을 처리한 바이오필름에서 ALS1과 ALS3 유전자의 mRNA양은 각각 0.55배와 0.519배로 감소하였다. 이 결과는 Fig. 1의 단삼을 처리한 실험군의 C. albicans 세포들의 표면 부착량이 현저하게 감소되는 현상과 일치하는 결과이다. ECE1 (Extent of cell elongation protein 1)은 균사가 형성되는 동안 분비되어 세포의 신장(elongation)을 통해 바이오필름 형성에 관여한다. Ece1은 숙주 상피세포의 세포막을 직접적으로 손상시키는 candidalysin이라는 세포용해성 펩타이드 독소의 전구체로서 이 독소를 분비하지 않는 C.albicans는 동물모델에서 점막감염을 유발하지 않는 것으로 관찰되었다. 단삼은 C. albicans 바이오필름의 ECE1의 발현양을 0.787배로 낮추었는데(p = 0.006) (Fig. 3), 이 결과는 단삼이 C. albicans 초기 단계 바이오필름에서의 신장을 억제하며 숙주 감염시 독성을 낮추는 효과를 나타낼 것으로 생각된다. Hwp1 (hyphal wall protein 1)은 세포벽 단백질을 코딩하는 단백질로 숙주세포로의 부착에서 중요한 역할을 한다. 이 단백질은 효모형의 캔디다에서는 발현이 되지 않으나 균사형에서 매우 높게 발현이 된다. 단삼 에탄올추출물에 노출된 바이오필름의 HWP1 발현량은 1.32배(p = 0.008)로 증가했다. Fig. 2에서 단삼을 처리하였을 때 germ tube 형성을 억제하지 못했고, YNB/glucose 배지에서 오히려 일부 균사의 형성이 촉진되는 현상은 HWP1의 발현량이 증가하는 현상과 일치하는 결과이다. C. albicans의 독성을 나타내는 인자는 다양한 요인에 의해 결정이 되는데 그 중 생물학적 또는 비활성 표면에 부착하는 능력과 균사로의 진입과 숙주세포 부착을 용이하게 하는 germ tube 형성은 독성 인자로 작용한다. C.albicans germ tube 형성 단계에서 단삼 에탄올추출물의 영향은 그다지 크지 않았다. 오히려 효모형을 촉진하는 YNB/glucose 배지에서 일부 C. albicans는 단삼 처리 후 균사를 형성했다. 이는 C. albicans가 단삼에 노출되어 세포막의 기능과 세포벽 integrity의 손상에 대한 적응을 위해 바이오필름 단계로 진입하려고 시도하는 것으로 보인다. 바이오필름에 단삼 추출물을 처리한 후 HWP1 발현이 증가했는데 이는 균사형성이 촉진된다는 것을 암시한다. 그러므로 단삼 에탄올추출물은 C. albicans 바이오필름의 성장을 매우 효율적으로 저해하지는 않는 것 같다. 그럼에도 불구하고 단삼에탄올추출물은 다음과 같은 기전을 통해 C. albicans의 표면부착에 영향을 주어 초기단계 바이오필름의 성장억제에 기여하는 것으로 보인다. 첫째, ALS1과 ALS3의 발현 감소를 통해 C. albicans의 표면 부착을 저해한다. 둘째, EAP1 발현을 억제하여 세포와 세포간 또는 세포와 표면 부착을 억제한다. 이 밖에도 세포막 지질성분 변화로 인한 삼투변화와(1,3)-D-glucan synthase 활성 감소로 인한 부실한 세포벽 구조 또한 세포부착능 감소에 기여할 것으로 추정된다.</p>