MTT는 세포 내 미토콘드리아 내막의 oxido-reductase 효소 작용에 따라 환원되어 보라색의 formazan을 형성하는 특성을 이용하여 세포 생존률을 측정하는 실험 방법에 활용되고 있다. 본 연구에서는 맥문동 추출물의 인슐린 세포주 HIT-T15 cell에 대한 독성을 평가하였다. 이를 위해 각 well에 \( 2 \times 10 ^ { 4 } \) cells을 분주하였고, \( 70-80 \% \) 세포가 자랄 때까지 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 배양하였다.
<h2>MTT assay</h2> <p>MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazo-lium bromide)(sigma chemical Co. USA, 042K5313)는 살아있는 세포 내 미토콘드리아 내막에 존재하는 oxido-reductase의 효소 작용에 의해 환원되어 보라색의 formazan을 형성하게 되는데, 용해액 내 보라색 formazan의 발색정도를 흡광도로 측정함으로써 세포 생존률을 예측하는 실험방법으로 이용되고 있다. 맥문동 추출물이 인슐린 세포주 HIT-T15 cell에 미치는 독성을 평가하기 위하여 96 well plate의 각 well에 \( 2 \times 10 ^ { 4 } \) cells이 들어가도록 분주한 후 배양접시에서 \( 70-80 \% \) 자랄때까지 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 배양하였다. 여기에 맥문동 추출물을 농도별로 처리하고 24 시간 동안 배양하여 기존의 배지를 일부 제거고, MTT용액 50 ㅆl을 첨가하여 formazan이 형성될 수 있도록 4 시간 동안 배양하였다. 4 시간 뒤, 배지 220 \( \mu \mathrm { l } \) 를 제거한 후 \( 150 \mu \mathrm { DMSO } \) 을 이용하여 formazan을 녹였다. 각 well에 나타난 색깔의 변화를 ELISA-reader (VERSA max, micro-reader, MDS. Co, USA)를 이용하여 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다.</p> <h2>인슐린 분비량 측정을 위한 Insulin ELISA측정</h2> <p>맥문동추출물에 의한 인슐린 분비량은 Mercodia사의 Insulin ELISA kit (Cat.10-1113-01)를 이용하여 권장법에 따라 측정하였다. 먼저 인슐린분비세포인 HIT-T15 cell을 96 well plate에 \( 5 \times 10 ^ { 4 } \) cells/well이 되도록 분주한 후 \( 70-80 \% \) 로 자랄때까지 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에 배양하였다. 그리고 각 well에 맥문동 추출물을 \( 200 \mu \mathrm { g } \) 씩 첨가하여 24시간 동안 배양한 후 배양액을 채취하여 \( 15,000 \mathrm { rpm } \) 에서 3분 동안 세포를 침전시켜 상층액을 준비하였다. ELISA kit의 각 well에 \( 25 \mu 1 \) 의 배양액을넣고, \( 100 \mu \) 의 enzyme conjugate solution을 첨가하여 plate shaker에 1 시간 동안 방치하여 항원-항체반응을 유도하였다. 1 시간 후 상층액을 제거하고, wash buffer \( (350 \mu \mathrm { ll } ) \) 를 이용하여 비특이적으로 결합된 단백질이나 결합되지 않은 단백질을 세척하였다. 여기에 \( 200 \mu 1 \) 의 substrate (TMB)을 첨가하여 실온에서 15 분 동안 효소반응을 유도한 뒤 \( 50 \mu 1 \) 의 stop solution을 첨가하여 반응을 종결하였다. 반응종결에 따라 나타난 변화는 ELISA-reader (VERSA max, micro-reader, MDS. Co, USA)를 이용하여 \( 450 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다.</p>