해당 연구에서는 단백질을 SDS-polyacrylamide gel에 전기영동하여 Nitrocellulose 막으로 이동시킨 후, 일차 항체와 이차 항체를 부착하여 X-ray film에 감광하였다. 또한, 96 well plate에 약 180 μl/well씩 넣어 ELISA reader에서 흡광도 값을 측정하였다. 고정된 세포에 일차항체인 type Ⅱ collagen을 노출시킨 후, 이차 항체와 반응시키고, 세포 내 type Ⅱ collagen의 발현량을 형광현미경으로 확인하였다.
<h2>Western blot analysis</h2> <p>\( 50 \mathrm { mM } \) Tris-HCl, pH 7.4, \( 150 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } , 1 \% \) Nonidet P-40, 0.1 \% Sodium dodecyl sulfate를 포함한 buffer에 다양한 protease inhibitor \( [10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) leupeptin, \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) pepstatin A, \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) aprotinin, \( 1 \mathrm { mM } \) 4-(2-aminoethyl) benzensul-fonyl fluoride]와 phosphatase inhibitor [ \( 1 \mathrm { mM } \mathrm { NaF } , 1 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { Na } _ { 3 } \mathrm { VO } _ { 4 } \) ]를 첨가한 후 lysis buffer를 사용하여 단백질을 lysis시켰다. 이 단백질을 \( 8 \% \) SDS-polyacrylamide gel에 전기영동하여 Nitrocellulose 막으로 이동시켰다. 후에 일차 항체 type Ⅱ collagen (Santa Cruz, CA, USA), Sox-9 (Santa Cruz), pERK (Santa Cruz), actin (Santa Cruz)과 이차 항체를 붙인 후 X-ray film에 감광시켰다.</p> <h2>Determination of chondrocyte phenotype</h2> <p>연골세포의 분화 정도는 \( 0.1 \% \) Alcian Blue 용액을 사용하여 sulfated proteoglycan의 축적량을 측정하였다. 세포를 PBS로 세 번 수세한 뒤, Kahle's solution에서 10분 동안 고정한 뒤 다시 PBS로 세 번 수세하였다. 그 후 alcian blue staining solution으로 12시간 이상 염색하였다. \( 0.1 \mathrm { ~N } \) \( \mathrm { HCl } \) 로 두 번 수세한 뒤 \( 4 \mathrm { M } \) guanidine \( \mathrm { HCl } \) 을 넣고 약 12시간 정도 shaking하였다. 96 well plate에 약 180 μl/well씩 넣어서 ELISA reader에서 \( 600 \mathrm { ~nm } \) 로 흡광도 값을 측정하였다.</p> <h2>Immunofluorescence staining</h2> <p>배양한 연골세포를 \( 3.5 \% \) paraformaldehyde로 10 분 동안 상온에서 고정시켰으며, 고정된 세포는 PBS로 두 번 수세 한뒤 \( 0.1 \% \) Triton X-100을 이용하여 세포막 투과성을 높여 주었다. 고정된 세포는 두 시간 동안 상온에서 일차항체인 type Ⅱ collagen (Santa Cruz)과 반응시켰으며, 세 번 수세한 뒤 형광단백질이 부착되어 있는 이차 항체와 한 시간 동안 반응시켰다. 두 번 수세 한 뒤, 그 후 형광현미경 하에서 세포 내 type Ⅱ collagen의 발현량을 확인하였다.</p>