식물의 형질전환 선발마커로는 NPTII, HPT, PAT등이 널리 사용되고 있다. 국내에서는 제초제 내성을 갖는 들잔디를 개발하여 잡초를 제거하는데 있어 여러 제초제를 사용해야하는 번거로움이 사라졌다. 한국 고유의 유채 품종 한라의 자엽 절편체를 사용하여 Agrobacterium을 이용한 형질전환 실험을 수행함으로써 제초제에 내성을 가진 한라 유채 품종을 확보하였다. 이에 살균처리한 종자를 \( 1 \% \) sucrose와 \( 0.4 \% \) phytagel이 첨가된 \( 1 / 2 \mathrm\) MS 배지(Murashige and Skoog 1962)에 파종하여 나흘간 배양하여 실험했다.
<p>식물의 형질전환 선발마커로는 다양한 항생제 저항성 유전자, kanamycin에 저항성을 갖게 하는 neomycin phospho-transferase II(NPT II)와 hygromycin에 저항성을 갖게 하는 hygromycin phosphotransferase(HPT) 등과 제초제 저항성 유전자, phosphinothricin acetyltransferase gene(PAT) 등이 널리 사용되어 왔다. 특히 국내에서는 제초제 내성을 갖는 들잔디를 개발하여 잡초를 제거하는데 있어 기존 여러 종류의 제초제를 사용하였던 번거로움을 개선할 수 있게 되었고, 국외에서는 대두, 면화, 옥수수, 벼, 유채 등이 개발되었다.</p> <p>본 연구에서는 국내에서 바이오에너지의 원료 생산을 위한 유채 형질전환 식물체를 개발하기 위한 기초연구로서 Prem과 Mohan(2008)의 방법을 기초로 하여 한국 고유의 유채 품종 한라의 자엽 절편체를 사용하여 Agrobacterium을 이용한 형질전환 실험을 수행하였다. 그 결과 제초제에 내성을 가진 한라 유채 품종을 확보하였고, 더불어 바이오디젤 원료 작물로 사용될 형질전환 유채 품종 개발의 응용가능성을 제시하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물재료</h2> <p>유채 (Brassica napus)는 내한, 영산, 탐미, 한라 품종을 농촌진흥청 바이오에너지작물센터 (http://www.nics.go.kr)로부터 분양 받아 실험에 사용하였다. 유채 종자는 3일간 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 저온 처리한 다음, 표면 살균을 위하여 \( 70 \% \) ethanol에서 5분간 침지한 후 \( 20 \% \) sodium hypochlorite에 20분 동안 처리하였으며, 멸균수로 \( 5 \sim 6 \mathrm { ~ } \)회 세척하였다. 살균된 종자를 \( 1 \% \) sucrose와 \( 0.4 \% \) phytagel이 첨가된 \( 1 / 2 \) MS 배지(Murashige and Skoog 1962)에 파종하여 \( 23 \pm 1 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 암 조건에서 4일간 배양하였다. 형질전환에 사용된 절편체는 발아한 유채 자엽을 날카로운 칼로 잘라 사용하였다.</p> <h2>형질전환에 사용된 운반체</h2> <p>유채의 형질전환에 사용된 식물 발현용 벡터는 형질전환이 된 박테리아 선별을 위한 neomycin phosphotransferase(NPT II) gene, 형질전환이 된 식물체 선별을 위한 제초제 저항성 phosphinothricin acetyltransferase(PAT) 유전자 그리고 리포터(reporter) 유전자로 B-glucuronidase(GUS) 유전자를 함유하는 pCAMBIA3301 벡터(Fig.1)를 freeze-thaw 방법을 이용하여 Agrobacterium tumefaciens GV 3101에 형질전환하였다. \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) rifampicin 과 \( 25 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) kanamycin이 포함된 YEP 고체배지에서 형성된 single colony를 취하여 YEP 액체배지에 접종하고, \( 28 ^ {\circ } \mathrm { C } ~180 \mathrm { rpm } \)의 조건에서 배양하여 A. tumefaciens.의 농도를 \( \mathrm{O.D} 600 = 0.5 \)로 조절하여 형질전환에 사용하였다.</p>