타이로시네이즈는 L-tyrosine에서 DOPA quinone로의 멜라닌 생성 과정에서 중요한 역할을 한다. 이 효소의 저해 활성을 활용하여 멜라닌의 농도를 감소시키는 미백 활성을 평가하였다. MTT assay를 이용하여 세포 생존율을 측정하였으며, 세포는 72시간 동안 배양 후 triton X-100 용액으로 수확되어 원심 분리하였다. 그 후 상등액에서는 단백질 농도를, pellet에서는 건조 후 DMSO를 함유한 NaOH 용액으로 용해한 뒤 ELISA를 이용하여 측정하였다.
<h2>멜라닌 생성 저해 측정</h2> <h3>Mushroom tyrosinase 저해활성 측정:</h3> <p>타이로시네이즈는 멜라닌 생성과정 중 L-tyrosine에서 3,4-dihydroxy-L-phenylananine (DOPA)를 걸쳐 DOPA quinone으로 산화되는 과정에서 핵심효소로 작용한다. 따라서 타이로시네이즈의 저해활성으로 멜라닌 함량을 감소시키기 위한 미백활성 평가법을 이용하였다. L-타이로신 \( (0.3 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) 1.0 \mathrm{ml} \), potassium phosphate buffer ( \(0.1 \mathrm{~M}, \mathrm{pH} ~6.8 \) ) \( 1.85 \mathrm{ml} \), 시료 \( 0.05 \mathrm{ml} \) 를 혼합 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 수조에서 \( 10 \mathrm{~min} \) 동안 항온 배양한 다음, 반응 혼합물을 얼음수조에 넣어 반응을 종결 시키고, 이 때 생성되는 DOPA chrome의 양을 흡광도 \( 475 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. 타이로시네이즈 저해활성은 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 타이로시네이즈의 활성을 \( 50 \% \) 감소시키는데 필요한 시료의 농도 (inhibition concentration, \( \left.\mathrm{IC}_{50}, \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\right) \) 로 표기하였다.</p> <h3>세포배양:</h3> <p>B16F1은 쥐의 melanoma 세포주로 경희대학교 피부생명공학센터에서 얻어 사용하였다. 세포는 \( 10 \% \) fetal bovine serum (PAA, Austria), \( 1 \% \) penicillin-streptomy-cine (PAA, Austria)를 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지에 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) , \( 5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 조건에서 배양하였다. 모든 실험에 사용된 세포의 passage number는 15 이하로 제한하여 사용하였다.</p> <h3>세포 생존율 측정:</h3> <p>세포 생존율은 3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2, 5-diphenytetrazolium bromide(MTT, Sigma, USA) assay를 이용하여 살아있는 세포의 미토콘드리아에서 탈수소 효소작용에 의해 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium이 비수용성의 MTT formazan으로 환원되는 정도를 측정하여 세포 생존율을 측정하였다. B16 melanoma 세포를 96-well plate에서 \( 24 \mathrm{~h} \) 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 조건으로 항온 배양한 후, 각 농도 별로 목형 잎 추출물과 비교물질로서 arbutin을 처리하였다. 시료 처리 \( 24 \mathrm{~h} \) 후 MTT 용액 \( (2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 을 첨가하여 \( 3 \mathrm{~h} \) 동안 반응 시킨 다음 생성된 formazan을 DMSO에 녹여 ELISA를 이용하여 \( 570 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다.</p> <h3>세포 내 멜라닌 함량 측정:</h3> <p>멜라닌 함량은 Hosei 등의 방법을 변형하여 사용하였다. B16 melanoma 세포를 6-well plate에 \( 10 \times 10^{4} \) cells/well 씩 분주하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, ~5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 조건으로 항온 배양하였다. \( 24 \mathrm{~h} \) 후 세포가 부착한 것을 확인하고 PBS로 1회 세척 후 phenol red가 들어있지 않은 DMEM으로 교환하였다. \( \alpha \)-melanocyte stimulating hormone ( \( \alpha\)-MSH, Sigma, USA, \( 100 \mathrm{~nM}) \)와 목형 잎 추출물을 농도별로 처리하였다. \( 72 \mathrm{~h} \) 동안 배양 후 \( 1 \% \) triton X-100 용액으로 세포를 수확하여 원심분리하여 상등액은 단백질 함량을 측정하고, pellet은 건조시켜 \( 10 \% \mathrm{~DMSO} \) 를 함유한 \( 1 \mathrm{~N} \) \( \mathrm{NaOH} \) 용액 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 에 용해하여 96-well plate에 옮긴 후 ELISA를 사용하여 \( 405 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. 멜라닌 함량은 멜라닌 표준품으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 산출 하였으며, 단백질 함량은 DC protein assay kit (Bio Rad, USA)를 이용하여 측정 후 보정하였다.</p> <h2>목형 잎 추출물의 성분분석</h2> <h3>TLC 및 HPLC를 이용한 목형 잎 추출물 성분분석:</h3> <p>목형 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획을 \( 100 \% \) 에탄올에 녹여 syringe filter (Milopore \( 0.45 ~\mu \mathrm{m} \) )로 여과 후 TLC 및 HPLC 분석을 위한 시료로 이용하였다. TLC 분석에서 에틸아세테이트 분획의 전개용매는 ethyl acetate : formic acid: chloroform : water \( =8: 1: 1: 1(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 으로 성분확인은 각 성분들의 \( \mathrm{R}_{\mathrm{f}} \) 값과 자외선 및 발색법을 이용한 띠의 색상 등으로 확인하였다. HPLC 분석에 사용된 column은 Shim-pack VP-ODS (L : \( 250 \mathrm{~mm}, \mathrm{LD}: 4.6 \mathrm{~mm} \) )이며 detector는 SPD-M20A Diode array detector를 이용하였다. HPLC분석은 \( 2 \% \) acetic acid 수용액( \( \mathrm{A} \) 용매)과 \( 0.5 \% \) acetic acid를 함유한 acetonitile 수용액(B용매)을 이용해 \( \mathrm{B} \) 용매 기준으로 하여 \( 0 \sim 5 \mathrm{~min} \)까지 \( 20 \% \), \( 5 \sim 35 \mathrm{~min} \)까지 \( 20 \sim 40 \% \), \( 35 \sim 75 \mathrm{~min} \)까지 \( 40 \sim 80 \% \), \( 75 \sim 95 \mathrm{~min} \)까지 \( 80 \sim 100 \% \) 로 하여 HPLC 분리조건을 확립하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 \( 5 \% \) 유의수준에서 Student's \( t \)-test를 행하였다.</p>