사용 균주는 King's B 배지와 ABMM 배지이며, 각각 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다. 또한 18가지의 천연물에서도 시료를 추출하였으며, 이중 QS 저해 기능이 높은 마늘은 실험 대조군으로 사용하였다. 또한 N-acyl-homoserine lactones의 화학적 합성을 통해 Crude product를 얻었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용 균주</h2> <p>P. syringae pv. tabaci (ATCC 11528) 균주는 King's B 배지 (Peptone \( 2 \%\), \( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.15 \%\), \(\mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} ~0.15 \% \), Glycerol \( 1 \%) \)를 사용하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였고, QS을 확인하기 위해 사용된 지시 균주인 Agrobacterium tumefaciens NT1은 ABMM 배지 (Mannitol \(0.2\%\), Solution A \(5\%(\mathrm{v}/ \mathrm{v})\), Solution B \( 5 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v})) \)를 사용하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다. ABMM 배지 제조시 사용한 Solution A \((\mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} ~6 \%\), \( \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4} ~2 \%) \)와 solution B \((\mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl} ~2 \%\), \(\mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ~0.6 \%\), \(\mathrm{KCl} ~0.3 \%\), \(\mathrm{CaCl}_{2} ~0.02 \%\), \(\mathrm{FeSO}_{4} \cdot \mathrm{7H}_{2} \mathrm{O} ~0.005 \%) \) 는 각각 고압멸균 \( \left(110^{\circ} \mathrm{C}\right. \), \( 20 \mathrm{~min} \)) 후에 첨가하였다.</p> <h2>천연물로부터 시료 추출</h2> <p>18가지 천연물(양파, 고추장, 된장, 마늘, 오징어, 미역, 양배추, 무, 당근, 바나나, 파래, 파, 깻잎, 상추, 마른 새우, 고추, 브로콜리, 오미자)은 3차 증류수로 세 번 세척하여 준비하였다. 각각의 천연물 \( 50 \mathrm{~g} \)에 \( 150 \mathrm{~ml} \)의 3차 증류수를 추가하여 가정용 믹서(mixer)로 10분 동안 분쇄한 다음 48시간 동안 정치시켰다. 상등액을 Whatman No. 1 여과지로 여과한 다음 원심분리 \( (18,000 \times \mathrm{g}, 10 \mathrm{~min}) \) 하였고, 그 상등액을 다시 \( 0.20 ~\mu \mathrm{m} \) pore 크기의 막 여과지로 여과하였다. 여과액을 동결건조하여 분말화 시킨 후 3차 증류수를 추가하여 \( 5 \mathrm{~ml} \)로 녹여낸 다음 bioassay 시료로 사용하였다. 이 중 QS 저해 기능이 알려진 마늘은 실험 대조군으로 사용하였다.</p> <h2>N-acyl-homoserine lactones의 화학적 합성</h2> <h3>N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone의 합성</h3> <p>Dichloromethane 용액 \([ 2 \mathrm{~mM} \) carboxylic acid, \( 2.1 \mathrm{~mM} \) 4-(dimethylamino) pyridine, \( 2.2 \mathrm{mM}\) N, N-dicyclohexylcarbodiimide, \( 2 \mathrm{~mM} \) meldrum's acid\(]\)을 제조한 후, 여과 과정을 거쳐서 침전된 N, N-dicyclohexylurea를 제거하였다. 나머지 용액은 회전 농축기를 사용하여 건조시킨 다음 ethylacetate 용액에 녹이고, \( 20 \mathrm{~ml} \)의 \( 2 \mathrm{~M} \) hydrochloric acid로 세척하였다. 그 후, 무수 \( \mathrm{MgSO}_{4} \)를 사용하여 용액을 건조시킨 다음 농축하여 아실화된 meldrum's acid를 얻었고, \( 30 \mathrm{~ml} \)의 acetonitrile을 추가한 용액에 \( 1 \mathrm{~mM} \) L-homoserine lactone hydrochloride와 \( 1.2 \mathrm{~mM} \) trithylamine을 섞은 다음 실온에서 2시간 동안 교반하고 3시간 동안 가열하였다. 용매가 증발되고 남은 침전물은 ethyl acetate에 녹여 포화 sodium hydrogen carbonate 용액과 \( 1 \mathrm{~M} \) potassium hydrogen sulfate 용액, 그리고 포화 sodium chloride 용액에서 순서대로 세척 하였다. 무수 \( \mathrm{MgSO}_{4} \)를 사용하여 용액을 건조시켜 crude product를 얻었다.</p>