외국에서 개발된 일상적으로 사용하는 콩형질전환 방법이 국내에서는 재현이 잘되지 않는 문제를 국내 여러 연구자들은 공통적으로 경험해왔다. 미국의 경우에는 식물학 기초연구 분야의 발달과 회사들의 적극적인 기술개발 참여, 연구자들 간의 잦은 소통과 교류, 그리고 경쟁적 협력으로 고효율형질전환기술이 개발되었다. 국내에서도 기업의 활발한 기술 개발 참여나 연구자들 간의 협력체례를 구축하는 것이 쉽지는 않겠지만 콩형질전환 기술의 개발과 보급은 이후 진행 될 분자 육종을 위해 매우 중요한 일이다. 따라서 그 동안 성공한 미국과 일본의 콩형질전환실험실을 토대로 국내 콩형질 전환 기술을 개발하는 데 큰 도움이 되었던 기술적 고려사항을 설명하고자 한다.
<h1>국내 콩 고효율형질전환기술개발을 위한 고려사항</h1> <p>외국에서 개발되고 일상적으로 사용되는 콩형질전환 방법이 국내에서는 잘 재현이 되지 않는 문제점을 국내 여러 연구자들은 공통적으로 경험해왔다. 국내 연구 분야의 경쟁을 고려할 때, 많은 연구자들이 결과 도출에 따른 압박감 때문에 조급함을 보여 왔고 이는 결과적으로 기초연구의 집중부재로 이어져 궁극적으로 완성된 콩형질전환 방법의 개발을 늦춰 왔다. 미국의 경우에도, 연구자간의 경쟁은 존재하나 식물학 기초연구분야 (식물해부학 및 식물생리학)의 발달과 몬산토와 같은 세계적 회사들의 적극적인 기술개발 참여에 힘입어 콩형질전환에 필요한 기초기술이 완성되었고, 연구자들의 간의 잦은 소통과 교류, 그리고 경쟁적 협력에 힘입어 높은 효율과 안정적인 유전자 도입을 가능하게 한 콩형질전환기술이 개발되었다. 국내에서도 미국과 같이 회사의 적극적인 기술개발 참여나 연구자들 간의 협력체계를 구축하는 것은 쉽지 않겠지만 안정적인 콩형질전환 기술의 개발과 보급은 향후 진행될 형질전환을 통한 분자육종을 위해 매우 중요한 일이다. 따라서 그 동안 미국과 일본의 성공적인 콩형질전환실험실을 방문하고 이를 기초로 국내 콩형질 전환 기술을 개발하는 데 매우 큰 도움이 되었던 기초적이나 해결이 쉽지 않았던 기술적 고려사항을 설명하고자 한다.</p> <p>첫째 고려사항은 형질전환 순응형 품종의 스크린이다. 콩형질전환과정은 가장 먼저 아그로박테리움의 식물감염과 유전자의 도입을 전제로 한다. 아그로박테리움의식물감염력은 자체의 virulence에 기인을 하고 (Gelvin 2003),이는 이미 많은 균주에 대한 검정을 통하여 최상의 식물 감염력을 가지는 균주들에 대한 정보가 유용하다. 야생형 아그로박테리움의 사용은 이들이 가진 높은 공격력에 의하여 보편적으로 사용해왔던 아그로박테리아들에 비해 높은 효율의 형질전환빈도를 제공해왔다 (Hood 등 1993). 일반적이 균주도 super plasmid를 사용할 때에는 높은 형질전환효율을 주었지만 (Hiei 등 1994), 일반적인 백터를 사용할 때에는 효율성에서 매우 떨어지는 경향이 있다. 따라서 공격력이 매우 강한 야생형 아그로박테리아를 사용할 때에는 그 다음 고려사항인 감염에 순응적인 (amenability) 품종을 사용하는 것이 매우 중요하다. 아그로박테리아의 감염은 식물에서 협조적으로 생산하는 특정단백질에 의해서 그 효율이 매우 증대될 수 있다(Hwang 과 Gelvin 2004). 이는 식물과 아그로박테리움과-의 감염이 박테리아와. 박테리아간의 접함 (conjugation)에서 감염이 박테리아와 박테리아간의 접합 (conjugation)에서 발전한 모델로 생각되며 접함을 위하여 박테리아간에 단백질 연계반응이 중요하듯이 식물과 아그로박테리움간의 단백질 상호작용이 유전자의 식물세포내로의 도입에 매우 중요하다. 그 한 예가 식물의 BT1단백질 (VirB2-interacting protein)인데 이 단백질을 Arabidopsis에 과다발현 시켰을 때, 아그로박테리움 감염에 대한 과다이병성 (Hypersusceptibility)을 나타내었다. 우리에게 알려진 형질 전환이 잘 되는 콩품종들은 아그로박테리움에 대해 이병성을 높이는 단백질을 생산하는 것으로 생각되며, 현재 형질전환실험을 통하여 경험적으로 판단되는 품종 또는 유전자형선발을 분자수준에서 아그로박테리움에 대한 이병성을 결정하는 식물유전자들에 대한 발현 조사 등으로 보완 할 필요가 있다. 아그로박테리움감염 후, GUS transient assay를 이용하여 국내 콩품종들의 감염정도를 조사한 결과, 국내 콩품종 중에 소진콩, 광안콩, 다채콩, 청자콩2호 등이 높은 GUS발현을 보여 이병성정도가 매우 높은 것으로 나타났다 (Table 1). 중급정도의 감염을 보이는 품종으로는 검정콩 1,2 호, 다원콩, 단백콩등 다수의 콩들이 감염이병성을 나타내어 현재 국내에서 형질전환에 사용 할 수 있는 콩품종들의 유전적 배경은 충분하게 보인다. 앞에서 언급한 것처럼 좀 더 정확한 분자적 수준에서의 스크린을 위하여 아그로박테리움의 식물감염을 돕는 식물 유전자들을 마커로 구성하여 유전자형을 구별해 내는 방법에 대한 연구도 앞으로 필요할 것으로 생각 된다.<p>둘째 고려사항은 정확한 부위로의 유전자 도입이다. 현재 전 세계적으로 가장 보편적으로 사용하는 자엽절 형질전환방법은 발아 후 5-6일 된 떡잎을 사용하는데 하 배축이 제거된 떡잎의 node와 측아 (axillary bud)의 경계 부위가 아그로박테리아감염의 목표부위이다 (Fig 1; 그림 안의 박스부위). 콩형질전환의 목표부위는 생장점조직을 포함한 부위로써 다른 작물에서는 형질전환의 목표로써 적절하지 않은 것으로 알려져 있다. 생장점의 경우, 빠른 생장속도 때문에 효율적인 선발이 어렵고 분화가 이미된 세포의 존재 시에 키메라식물이 나올 확률이 매우 높아지기 때문이다. 그럼에도 콩의 경우, 생장점을 포함한 부위가 형질전환의 목표부위로 사용되는 것은 다른 조직을 explant로 사용하였을 때, 조직반응정도가 매우 낮고 기관발생 (organogenesis)이 거의 일어나지 않기 때문이다. 또한 콩 측아의 기부에 상처를 내고 형질전환을 하면 생장점을 포함한 상처부위가 빠른 속도로 회복 및 재구성 되어 부풀어 오르다가 잎의 원기들이 다시 형성됨으로써 선발과정 중에 형질전환세포가 빠른 비율로 자라나는 것을 알 수 있다 (Fig 2). 이와 같은 현상은 선발과 함께 유전자 도입세포들이 초기의 낮은 비율에서 빠르게 증식되어 이차 신초 (secondary hoot)의 발생에 관여하여 키메라의 발생을 억제하는 것으로 생각된다. 앞에서 언급되어진 것과 마찬가지로 이때 가장 중요한 요인 중에 하나가 상처부위를 중심으로 한 갈변화의 억제이고 현재 갈변화의 억제를 위하여 황화합물 (L-Cysteine, Sodium thiosulfate, DTT)을 첨가하고 있다 (Olhoft 등 2001, 2003). 형질전환초기의 황화물첨가효과는 이미 다른 식물에서 밝혀졌는데 (Perl 등 1996), 콩에서도 최적합화된 조합과 농도의 황화물첨가는 초기에 식물세포내의 갈변화를 유도하는 단백질들 (PPO & POD)의 활력을 억제하여 초기신초형성과 형질전환효율증대에 크게 기여하는 것으로 밝혀졌다. 황화물의 첨가와 함께 콩형질전환 효율증대를 위해서는 반드시 정확한 부위에 상처를 내야 한다. 현재 고효율의 콩 형질전환효율 (\( 10 \% \)이상의 stable transformation)을 얻고 있는 실험실들의 경우, 측아와 하배축의 아주 좁은 부위에 매우 정밀하게 상처를 낸 후에 아그로박테리움 감염을 시키고 있는데 이와 같은 정확한 상처방법이 높은 형질 전환효율의 원인으로 생각되고 있다.</p>