DHA라는 오메가-3 지방산이 인체 구강암 세포주 SCC-4와 SCC-9에 세포 독성을 보임을 확인하였다. DHA는 AKT의 인산화 억제를 통해 mTOR의 활성을 억제하며, 이 과정을 통해 세포 자가사멸과 자가포식을 유도한다. 더욱이, DHA에 의한 자가포식 유도는 AMPK 인산화의 증가에 의한 mTOR 억제 역시 중요함을 보여준다. 이러한 결과는 오메가-3 지방산이 간담도암 등 다양한 암 세포주에 대해 세포독성을 나타내는 것으로 알려져 있다.
<h1>결 과</h1><h2>인체 구강암세포 SCC-4 및 SCC-9의 증식에 미치는 DHA의 영향</h2><p>오메가-3 지방산은 오메가-6 지방산과는 달리 간담도암을 비롯한 수종의 암세포주에 대해 세포독성을 나타낸다고 알려져 있다. 이에 먼저 인체 구강암 세포주 SCC-4 및 SCC-9에 대한 오메가-3 지방산 중 DHA의 세포 독성을 확인하였다. 이때 96 well tissue plate에 SCC-4 및 SCC-9 세포를 \( 0.5-1\ \times 10^{4}\ \mathrm{cells/well}\)로 배양한 다음 무혈청 배지로 24시간 배양하고 \( 0-40\ \mu \mathrm{M} \)의 DHA를 처리 하여 24시간 후 MTT로 세포 증식능을 검색하였다. DHA는 SCC-4 및 SCC-9 세포의 증식을 농도의존적으로 억제하였다. DHA에 의한 SCC-4 및 SCC-9 세포의 증식억제에 자가사멸이 관련되어 있는지 확인하기 위해 자가사멸 분자 표식자(marcker)의 하나인 PARP cleavage를 검색했을 때 DHA의 처리 후에 cleaved PARP 단백양이 DHA의 농도에 의존적으로 증가하였다. 세포주기분석에서도 SCC-4 및 SCC-9 세포는 DHA 처리에 의해 자가사멸된 세포가 함유되어 있는 subG1 분획이 증가하였다. 또한 이를 확인하기 위해 SCC-4 세포에서 DHA 처리 후 TUNEL assay를 시행하였을 때 대조군에 비해 DHA 의 농도에 의존적으로 TUNEL 양성세포가 현저히 증가하였다. 이는 DHA가 SCC-4 및 SCC-9 세포에 대해 세포 독성이 있으며, 이는 세포사멸이 밀접히 관련되어 있음을 시사한다.</p><h2>DHA에 의한 인체 구강암세포 SCC-4 및 SCC-9의 자가 포식 유도</h2><p>세포사멸에는 자가사멸, 괴사외에도 자가포식이 알려져 있으며, 최근 Jing 등은 DHA에 의한 자궁경부암세포인 SiHa의 세포독성기전에 자가 사멸뿐 만 아니라 자가포식도 중요하다고 하였다. 이에 먼저 구강암세포 SCC-4 및 SCC-9에 대한 DHA의 자가포식을 확인하기 위해 이들 세포에 \(0-40\ \mu \mathrm{M} \)의 DHA를 처리 후 자가포식의 중요한 분자표식자인 microtubule-associated protein1 light chain 3 (LC-3) 단백양을 Western blot으로 검색하였을 때 LC-3II 단백질 양이 처리한 DHA의 농도에 의존적으로 증가하였다. 이는 DHA에 의한 SCC-4 및 SCC-9 세포의 사멸에 자가포식도 관련되어 있음을 시사한다.</p><p>DHA에 의한 LC3-II증가가 자가포식 때문인지 확인하기 위해 autolysosome 형성을 억제하는 약물인 chloroquine (CQ) 처리 후 LC3-II 단백양을 측정하였다. 먼저 CQ 단독 처리 후 LC3-II 단백양이 증가하였으며, DHA에 의해 증가된 LC3-II 단백양은 CQ전처리 후 DHA 단독 처리 보다 더 증가하였다. 이는 DHA에 의해 증가된 LC3-III가 자가포식에 의해 일어남을 강력히 시사하는 것이다.</p><p>또한 SCC-4 및 SCC-9 세포에 GFP-LC3를 transfection 한 후 자가포식의 분자표식자인 GFP-LC3 형광 dot를 검색하였다. 이들 세포에 \( 40\ \mu \mathrm{M} \)의 DHA를 처리 후 GFP-LC3 형광 dot은 대조군에 비해 현저히 증가 하였다. 따라서 DHA는 구강암세포를 자가사멸 할 뿐만 아니라 자가포식을 유도하여 세포사멸 시킬 수 있으리라 생각된다.</p><h2>DHA에 의한 인체 구강암세포 SCC-4 및 SCC-9의 세포 독성에 대한 mTOR 신호전달 경로 억제</h2><p>최근 Jing 등은 p53 wild type인 자궁경부암세포에서 DHA가 자가포식을 유도하는데 이때 mTOR가 중요하다고 하였다. mTOR 신호전달 경로에는 AMPK와 AKT에 의한 인산화가 중요함으로 DHA 처리 후 이들 단백양의 변동을 검색하였다. 먼저 구강암세포 SCC-9에서 AKT 및 mTOR 의 인산화에 대한 DHA의 영향을 검색하였다. SCC-9세포에 DHA를 24시간 처리 후 농도에 따른 영향을 검색한 바 AKT의 thr308 및 ser473의 인산화가 DHA의 농도에 의존적으로 감소하였으며 또한 mTOR의 인산화도 감소하였다. 이는 DHA가 AKT의 인산화를 억제를 통한 mTOR의 활성 억제에 의해 자가포식이 유도될 수 있음을 시사한다.</p><p>AMPK의 인산화에 대한 DHA의 영향을 검색한 바 DHA 처리 후 AMPK의 인산화는 DHA의 농도에 의존적으로 증가하였다. AMPK의 인산화에 따른 그 효소 활성의 증가를 확인하기 위하여 AMPK의 내인성 기질의 하나인 acetyl CoA carboxylase (ACC)의 인산화를 측정하였을 때 DHA의 농도 의존적으로 ACC의 인산화가 증가 하였다. 이는 DHA에 의한 자가포식의 유도에는 AMPK 인산화의 증가에 따른 mTOR의 억제도 중요함을 시사한다.</p>