반응시킨 세포를 35-mm mesh를 이용하여 단일세포로 분리한 후 FACS Calibur를 적용시켜 형광반응에 따른 Cellular DNA content 및 histogram을 CellQuest software 및 ModiFit LT프로그램을 이용하여 분석하였고, ROS의 양적 변화를 확인하기 위하여 준비된 세포들을 DNA flow cytometer를 사용하여 분석을 하였다.
<h2>Flow cytometry 분석</h2> <p>U937 세포에서 EMCP가 유발하는 apoptosis 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 정상 및 EMCP 가 24 시간 동안 처리된 세포들을 모은 다음 2,000 rpm으로 5 분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 PBS 를 이용하여 2 3회 정도 세척하였다. 준비된 세포는 Cycle TEST PLUS DNA REAGENT Kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 고정 및 염색을 하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), 암실에서 30 분 동안 반응을 시켰다. 반응시킨 세포를 35-mm mesh를 이용하여 단일세포로 분리한 후 FACS Calibur (Becton Dickinson)를 적용시켜 형광반응에 따른 Cellular DNA content 및 histogram을 CellQuest software 및 ModiFit LT (Becton Dickinson) 프로그램을 이용하여 분석하였다.</p> <h2>ROS 생성 변화 측정</h2> <p>ROS의 양적 변화를 확인하기 위하여 준비된 세포들을 flu-orescent probe 인 \( 2^{\prime} 7^{\prime} \)-di-chlorodihydrofluorescein diacetate ( \( \mathrm{H}_{2} \) DCFDA, Molecular Probes, Leiden, Netherlands) \( 10 \mu \mathrm{M} \) 로 20 분간 염색 후 DNA flow cytometer를 사용하여 분석을 하였다. ROS 억제를 위한 ROS scavenger인 \( \mathrm{N} \)-ace-tylcysteine (NAC, Sigma-Aldrich) 처리는 EMCP을 처리하기 1 시간 전처리하였다.</p> <h2>Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석</h2> <p>준비된 세포들을 모은 다음 적당량의 lysis buffer [ \( 25 \mathrm{mM} \) Tris-Cl (pH 7.5), \( 250 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 5 \mathrm{mM} \) EDTA, 1\% NP-40, \( 1 \mathrm{mM} \) pheny- methylsulfonyl fluoride (PMSF), \( 5 \mathrm{mM} \) dithio-threitol (DTT)]를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 동안 반응시킨 후, \( 14,000 \mathrm{rpm} \) 으로 30 분간 원심분리하여 상층액에 있는 total 단백질을 분리하였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Herculs, CA, USA)을 이용하여 정량한 다음 동량의 Laemilni sample buffer (Bio-Rad)를 섞어서 protein sample을 만들었다. 정량한 후, 동일한 양의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리한 후, nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electro-blotting에 의해 전이시켰다. 분리된 단백질이 전이된 nitro-cellulose membrane을 \( 5 \% \) skim milk를 1 시간 처리하여 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하고 1 차 antibody 를 처리하여 상온에서 2 시간 이상 또는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 over night 시킨 다음 PBS-T로 세척(10 분간 3 번)하고 처리된 1 차 anti-body에 맞는 2차 antibody (PBS-T로 1:1,500으로 희석하여 사용)를 사용하여 상온에서 1 시간 정도 반응시켰다. 반응이 끝난 후 암실에서 Enhanced Chemiluminoesence solution (Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA) 을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 발현 양을 분석하였다.</p> <h2>핵 및 세포질 단백질의 분리</h2> <p>핵과 세포질 단백질을 분리하기 위하여 \( \mathrm{NE}-P E R^{\circledR} \) kit (PIERCE, Rockford, IL, USA)를 사용하였으며, 준비된 적정량의 세포에 cytosolic extraction reagent (CER) I 을 처리하고 약 15 초간 부유시킨 후 10 분간 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관했다. 다시 적정량의 CER 프를 넣은 뒤 10 츠간 부유시킨 후, \( 14,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심분리를 한 뒤 세포질인 부유층을 제거하였다. 분리된 핵들에 nuclear extraction reagent를 혼합하여 15 초간 부유시킨 후 10 분간 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하는 과정을 총 3 회 반복했다. 최종적으로 \( 16,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심분리를 시행하여 핵의 단백질로 이루어진 상층액을 얻어냈다. 분리된 상층액에서 단백질을 정량법에 의해 정량하였다.</p> <h2>통계 처리</h2> <p>모든 실험결과는 평균값으로 표시하였고 SigmaPlot을 이용하여 Student \( t \)-test를 이용하여 통계적 유의성을 얻었다.</p>