Resveratol에 의해 대표적인 전사조절인사이자 암조절에 관련된 다수의 유전자 발현을 조절하는 암억제 유전자인 p53이 대량으로 발현되는 것을 확인하였다. p53 유전자가 없는 HCT116 세포주를 이용하여 TSP-1, MASPIN 유전자의 발현을 확인함으로써 실제로 membrane microarray에 의해 확인된 유전자의 발현은 p53에 의존적이라는 것을 확인하였다. 본 연구에서는 다섯 종류의 phytochemical에 의해서는 p53 단백질의 발현이 강하게 유도되었지만 sulindac sulfide에 의해서는 그렇지 않았다는 것을 확인하였다.
<h2>Resveratrol에 의해 차별적으로 발현되는 유전자의 분석</h2> <p>Resveratrol에 의해 암 억제 유전자인 p53이 대량으로 발현되는 것을 확인하였다. 암억제 유전자인 p53 은 대표적인 전사조절인자로서 암의 조절에 관련된 많은 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 암 억제 유전자 p53의 하위단계의 유전자가 집적되어 있는 미국 Superarray사의 GEarray p53 signaling pathway micro-array를 이용하여, resveratrol의 처리에 의해 어떤 유전자들의 발현이 조절되는지를 분석하였다. Fig. 3에서 보는 바와 같이 100 \( \mu \mathrm { M } \) 의 resveratrol의 처리에 의해 약 25개의 p53 하위 유전자들이 up-regulation 되는 것을 확인하였고, 이에 반해 2개의 유전자가 resveratrol의 처리에 의해 down-regu-lation 되는 것을 확인하였다.</p> <h2>RT-PCR을 통한 마이크로어레이 실험결과의 검증</h2> <p>Resveratrol의 처리에 up-regulation 되는 유전자들 중 4개(mammary serine protease inhibitor [MASPIN], thrombo-spondin-1 [TSP-1], tumor necrosis factor-alpha-induced protein 1 [TNFAIP1], wild type p53-induced gene 1 [WIG1])를 선택하여 membrane microarray 실험결과를 검증하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. Fig. 4 에서 보는 바와 같이 모든 유전자의 발현이 resveratrol에 의해 up-regulation되는 것을 검증하였고, 반면에 control로 사용한 GAPDH 유전자의 발현의 변화는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 membrane microarray 실험결과와 모두 일치하였다.</p> <h2>p53 null HCT116 세포주를 이용한 p53 의존성 유전자검증</h2> <p>Membrane microarray에 의해 확인된 유전자의 발현이 실제 p53 발현 의존적인지 확인하기 위하여 p53 유전자가 null인 HCT116 세포주를 이용하여 TSP-1 유전자와 MASPIN 유전자의 발현을 확인하였다. TSP-1 유전자는 an-giogenesis의 negative regulator로 알려져 있으며, wild type p53의 발현에 의해 TSP-1 유전자의 발현이 촉진되는 것으로 알려져 있다. MASPIN 유전자는 암의 전이를 막는 것으로 알려져 있는 항암 유전자로서 p53 단백질이 MASPIN 유전자의 프로모터에 있는 p53 consensus-binding site에 직접 결합 함으로서 MASPIN 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 따라서 두 유전자 모두 p53 유전자에 의해 up-regualtion 되는 것으로 생각된다.</p> <p>하지만, Fig. 5 에서 보는 바와 같이 TSP-1 유전자는 p53 유전자의 존재와 관계없이 발현이 up-regulation 되는 것을 확인할 수 있었고, 이에 반해 MASPIN 유전자의 발현은 p53이 존재해야만 up-regulation 된다는 것을 확인할 수 있었다. 이 연구결과는 TSP-1 유전자와 MASPIN 유진자가 모두 p53 하위의 유전자이기는 하나, resveratrol에 의한 두 유전자의 발현증가는 서로 다른 기전에 의해 조절된다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 실험모델과 연구방법은 어떤 유전자의 발현이 암 억제유전자인 p53 의존적인지 아닌지를 결정하는데 좋은 모델이 될 수 있을 것으로 생각된다.</p> <h1>요 약</h1> <p>본 연구에서는 다섯 종류의 phytochemical (resveratrol, genistein, epicatechin gallate, dially disulfide, caffeic acid phenetyl ester)과 sulindac sulfide가 암 억제 단백질 p53을 유도할 수 있는지에 대해 연구하였다. 처리한 모든 phy-tochemical에 의해 p53 단백질의 발현이 강하게 유도된 반면, sulindac sulfide에 의해서는 p53 단백질이 유도되지 않았다. 처리한 phytochemical 중 포도껍질이나 와인에 많이 들어있는 resveratrol에 의해 p53 단백질이 농도의존적 혹은 처리시간 의존적으로 증가 발현되는 것을 확인하였다. 암 억제 단백질인 p53 하위 단계의 유전자들만 집적되어 있는 membrane microarray를 이용하여 실험을 수행한 결과, 25개의 유전자가 up-regulation 된 반면, 2개의 유전자가 down-regulation 되는 것을 확인하였다. Up-regulation 되는 유전자중 4개를 선택하여, RT-PCR을 수행한 결과 모두 membrane microarray 실험의 결과와 일치하였다. 게다가 p53 null인 HCT116 세포주를 이용한 RT-PCR을 통하여 TSP-1 유전자의 발현은 p53 의존적이지 않은 반면, MASPIN 유전자는 p53 의존적임을 확인하였다. 이러한 연구 결과는 resveratrol에 의한 화학적 암 예방법의 분자생물학적 기전을 이해하는데 도움을 줄 것으로 기대된다.</p>