Laemmli의 방법에 따라 SDS-PAGE를 이용해 정제된 효소의 분자량을 측정하였고, 이를 위해 \( 12 \% \) polyacrylamide gel과 Tris-glycine buffer를 사용하였다. 효소의 온도 안정성을 검토하기 위해 온도별로 처리 후 상대 활성을 측정하였고, 이를 바탕으로 효소 활성의 최적 온도를 결정하였다. 금속 이온이 효소 활성에 미치는 영향을 검토하기 위해, 효소액을 포함하는 \( 20 \mathrm{~mM} \) EDTA와 phosphate buffer에 24시간 투석한 후, EDTA가 없는 같은 버퍼에 다시 24시간 투석하였다. 또한, collagen, gelatin, casein, elastin 및 합성 기질인 FALGPA를 기질로 사용하여 효소반응 후 기질별 collagenase 활성을 측정하였다.
<h2>SDS-PAGE 법</h2><p>정제된 효소의 분자량을 측정하기 위해서 Laemmli의 방법에 따라 SDS-PAGE로 확인하였으며, \( 12 \% \) polyacrylamide gel과 Tris-glycine buffer ( \( 25 \mathrm{~mM} \) Tris, \( 192 \mathrm{~mM} \) glycine, \( 0.1 \% \) SDS, \(\mathrm{pH} 8.3\))를 사용하였다. 단백질 시료는 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(5 \sim 10\)분간 가열 변성시킨 후, 시료양의 \( 10 \% \) 에 해당하는 TCA (tri-chloroacetic acid)를 첨가하여 ice에서 30분간 침전시켰다. 이를 원심분리 \( (10,000 \mathrm{rpm}\), \(10 \mathrm{~min}) \)하여 상등액을 제거하고 \( 0.1 \mathrm{~N} \mathrm{~NaOH}\) \(20 \mu \mathrm{l} \)을 첨가하여 단백질을 농축시켰다. TCA 처리 후 sample buffer \((60 \mathrm{~mM}\) Tris- \(\mathrm{HCl}\), \(\mathrm{pH} 6.8\), \(2\%\) SDS, \(5\%\) B-mercaptoethanol, \( 10 \% \) glycerol, \( 0.02 \% \) bromophenol blue)와 \(2:1\)의 비율로 섞어 전기 영동을 실시하였다. 단백질 염색은 Coomassie blue R-250으로 행한 후, 탈색액 (methanol\(:\) acetic acid\(:\) DW\(=1: 1: 8 \), \(\mathrm{v}/\mathrm{v}/\mathrm{v}\))으로 탈색하였다. 효소의 분자량 측정은 SDS-PAGE의 \( \mathrm{R}_{f} \) 값을 비교하여 분자량을 측정하였다.</p><p>\( R_{f}=\frac{\text { distance of protein migration }}{\text { distance of tracking dye migration }} \)</p><h2>효소의 활성 측정법</h2><p>정제된 효소액을 온도별로 30분 동안 방치한 후에 잔존 활성을 측정하여 상대 활성으로 안정성을 검토하였고, 온도에 따라 효소 활성을 측정한 후 효소 활성 최적 온도를 결정하였다.</p><p>정제된 효소액을 각각의 \( \mathrm{pH} \) 완충액에서 \( 55^{\circ} \mathrm{C}\), 30분간 방치한 후 잔존 활성을 측정하여 \( \mathrm{pH} \) 안정성을 검토하였고, 각각의 \( \mathrm{pH} \) 완충액에 기질을 녹여 효소 활성을 측정하여 효소활성 최적 \( \mathrm{pH} \)를 결정하였다. \( \mathrm{pH} 3.0 \sim 6.0 \) 은 \( 50 \mathrm{mM} \) citrate buffer, \( \mathrm{pH} 6.0 \sim 8.0 \)은 \( 50 \mathrm{mM} \) phosphate buffer, \( \mathrm{pH} 8.0 \sim 9.8\) 은 \( 50 \mathrm{mM} \) borate buffer, \( \mathrm{pH} 10.0 \sim 12.0 \) 은 \( 50 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaHCO}_{3} \cdot \mathrm{NaOH} \) buffer를 사용하였다.</p><p>효소 활성에 미치는 금속 이온의 영향을 검토하기 위하여 효소액을 \( 20 \mathrm{~mM} \) EDTA가 포함된 phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 7.0\))에 24시간 투석한 후 다시 EDTA가 없는 동일 buffer에 24시간 투석하였다. 처리된 효소에 각각의 금속 이온을 \( 1 \mathrm{mM} \) 과 \( 5 \mathrm{mM} \)이 되게 가한 후 효소 활성을 측정하였다. 저해제에 따른 효소 활성을 검토하기 위하여 각각의 저해제를 가하고 실온에서 30분간 방치한 후 효소 활성을 조사하였다.</p><p>효소 반응의 기질 특이성을 알아보기 위하여 collagen 및 gelatin, casein, elastin 그리고 합성 기질인 FALGPA {N-[3-(2-Furyl) acryloyl]-Leu-Gly -Pro-Ala}를 기질로 하여 효소반응을 한 뒤 기질별로 collagenase 활성을 측정하였다.</p>