본 실험에서는 3T3-L1 지방전구세포의 Adipogenesis 진행과정에서 톳 분획물의 영향을 확인하기 위하여 , 3T3-L1 지방전구세포 배양 후 첫번째 분화유도 시 톳 분획물을 함께 처리하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>분획물의 제조</h2> <p>본 실험에 사용된 톳은 2009년 기장군에서 채집된 것으로, 추출물을 얻기 위하여 흐르는 물로 24 시간 동안 세척하여 염분과 불순물을 제거하고 깨끗한 물로 수 회 세척한 후 그늘에서 건조시켜 사용하였다. 건조된 톳을 \( 80 \% \) 에탄올에 24 시간 동안 침지시킨 후 환류 냉각시키면서 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 수욕상에서 3 시간씩 3회 반복 추출한 후 감압 추출 농축장치(EYELA, Japan)로 에탄올 추출물을 얻었다. 에탄올 추출물을 증류수에 현탁하고, 분 액깔때기에서 dichloromethane, ethyl acetate, butanol, water를 순차적으로 계층 분획한 뒤 여과 후 회전진공농축기로 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 감압 농축하여 각각의 분획물을 얻었다.</p> <h2>실험재료</h2> <p>mRNA 발현 양 분석을 위하여 사용된 Bioneer (Taejeon, Korea)에서 구입한 primer 염기서열은 Table 1에 나타내었으며, 단백질 분석을 위하여 사용된 PPAR \( \gamma\), C/EBP\( \alpha \), C/EBP\( \beta \) 및 actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 및 Cell Signaling Technology (Beverly, Ma, USA)에서 구입하였다. Immunoblotting을 위해 2차 항체로 사용된 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Life Science Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다. 또한 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 위하여 사용된 insulin, dexamethasone 및 IBMX와 지방세포 내 triglyceride TG 생성을 확인하기 위하여 사용된 Oil Red O는 Sigma-Aldrich (St. Luis, MO, USA)에서 구입하였다.</p> <h2>3T3-L1 지방전구세포의 배양</h2> <p>실험에 사용된 3T3-L1 지방전구세포는 90\%의 Dulbecco's Modified EaDCRT Media (DMEM, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), \( 10 \% \) 의 bovine calf serum (BCS, Gibco BRL) 및 \( 1 \% \) 의 penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL)이 포함된 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건 하에서 배양하였다. 세포수의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 성장배지의 교환을 매 48 시간마다 실시하여 적정 수의 세포를 유지하였다.</p> <h2>3T3-L1 지방전구세포의 분화유도</h2> <p>3T3-L1 지방전구세포를 세포 배양용 6 well plate에서 confluent 상태까지 배양한 후 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) insulin, \( 0.1 \mu \mathrm{M} \) dexamethasone 및 \( 0.5 \mathrm{mM} \) IBMX이 포함된 분화배지로 교환하여 2일간 배양하였으며, 그 후 매 2일마다 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) insulin이 포함된 배지로 교환하였다. Adipogenesis의 진행과정에서 톳 분획물의 영향을 확인하기 위해, 첫 번째 분화유도를 할 때 톳 분획물을 함께 처리하였다.</p>