collagenase의 활성을 조사를 위해 조효소액를 조제 하였으며, 평형화시킨 Amberlite IRA-900 column을 사용하여, 조효소액을 \( 0 \sim 1.5 \mathrm{M} \mathrm{NaCl}\) gradient (with buffer A,\( \mathrm{pH} 7.0\))를 실시하였다. Collagenase의 특성 검토 과정은 Laemmli의 방법에 따라 분자량을 측정 하였으며, 효소의 특성 검토에 조효소액을 사용하여 Type Ⅰ collagen, gelatin, albumin 및 casein을 기질로하여 효소 반응을 한 뒤 기질별로 collagenase 활성을 측정하는 실험을 하였다.
<h2>배양 조건에 따른 collagenase 생산능 검토</h2> <p>분리 균주가 어떤 배양 조건에서 가장 높은 collagenase 생산능을 보이는지 알아보기 위해 먼저 균의 생장 시간에 따른 collagenase의 활성을 조사하였다. 그리고 collagenase의 생산에 필요한 최적 배지 조건을 검토하기 위해 탄소원, 질소원, 염, 금속 이온의 증류와 농도에 따른 최적 배지 조성을 결정하였다. 그 후 초기 \( \mathrm{pH} \), 온도 및 통기량을 조사하여 해지 조성 외 collagenase의 최적 생산 조건을 검토하였다.</p> <h2>Collagenase의 정제</h2> <h3>조효소액의 조제</h3> <p>효소 생산 최적 조건에서 24시간 동안 배양한 배양액을 원심 분리 \( (10,000 \mathrm{rpm}, 30 \mathrm{~min}) \)하여 상층액을 취해 Ultrafiltration (Millipore YM10 membrane, Amicon Co., USA)으로 농축한 후 조효소액으로 사용하였다.</p> <h3>Column chromatography</h3> <p>\( 5 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{CaCl} \)를 포함하는 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-HCl 완충액 (bufferA, \(\mathrm{pH} 7.0\))으로 평형화시킨 Amberlite IRA-900 column (\(1.8 \mathrm{cm} \times 15 \mathrm{~cm} \), Sigma Co., USA)을 사용하여 조효소액을 \( 500 \mu \ell / \mathrm{min} \)의 유속으로 \( 0 \sim 1.5 \mathrm{M} \mathrm{NaCl}\) gradient (with buffer A,\( \mathrm{pH} 7.0\))를 실시하였다. 이후 전 단계의 활성 부분을 Ultrafiltration (Millipore YM10 membrane, Amicon Co.,USA)으로 농축한 후 buffer A로 평형화시킨 Sephacryl S-300 HRcolumn \(1.8 \mathrm{cm} \times 53 \mathrm{~cm} \), Pharmacia Co., USA)을 사용하여 \( 250 \mu \ell / \mathrm{min} \)의 유속으로 용출하였다. Collagenase 활성을 가지고 있는 부분을 \( 200 \mu \ell / \mathrm{min} \)의 유속으로 다시 전단계에 사용했던 Sephacryl S-300 gel filteration으로 용출하였다.</p> <h2>Collagenase의 특성 검토</h2> <h3>분자량 측정</h3> <p>Laemmli의 방법에 따라 SDS PAGE로 정제된 효소의 분자량을 측정하였으며, 이때 SDS PAGE에는 \( 12 \% \) poly-acrylamide gel과 Tris-glycine buffer ( \( 25 \mathrm{mM} \) Tris, \( 192 \mathrm{mM} \) glycine, \( 0.1 \% \) SDS, \(\mathrm{pH} 8.3\))를 사용하였다. 단백질 시료는 \( 100 \% \) trichloroacetic acid (TCA)로 농축시킨 후 sample buffer \( (60 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\), \(\mathrm{pH} 6.8\), \(2 \% \) SDS, \( 5 \% \quad \beta \)-mercaptoethanol, \(10\% \) glycerol, \(0.02\%\) bromophenol blue)를 섞어 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2~5분간 가열 변성시킨 후 전기영동을 실시하였다. 단백질 염색은 Coomassie blue R-250으로 행한후, 탈색액 (methanol:acetic acid:water \( =1: 1: 8, \mathrm{v} / \mathrm{v} / \mathrm{v}) \)으로 탈색하였다.</p> <h3>효소 반응 특성</h3> <p>효소의 특성 검토에 조효소액을 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\) 완충액 \( (\mathrm{pH} 7.0\) )으로 평형화시킨 Amberlite IRA-900 column (\( 1.8 \mathrm{cm} \times 15 \mathrm{~cm}) \)으로 용출시켜 사용하였다. 열안정성 및 최적 활성온도를 검토하기 위해 각각의 온도별로 조효소액을 30분동안 방치한 후에 잔존 활성을 측정하여 상대 활성으로 열안정성을 검토하고, 각각의 온도별로 효소 활성을 측정하여 효소활성 최적 온도를 검토하였다.</p> <p>\( \mathrm{pH} \) 안정성 및 최적 환성 \( \mathrm{pH} \)의 영향은 각각의 \( 50 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{pH} \)완충액에 조효소액을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), 30분간 방치한 후에 잔존 활성을 측정하여 \( \mathrm{pH} \) 안정성을 검토하였다. 또한 각각의 \( \mathrm{pH} \) 완충액에 기질과 효소액 간의 효소 활성을 측정하여 효소 활성 최적 \( \mathrm{pH} \)를 검토하였다. \( \mathrm{pH} \) 3~6은 citrate buffer, \( \mathrm{pH} \) 6~8은 phosphate buffer, \( \mathrm{pH} \) 8~10은 borate buffer, \( \mathrm{pH} \) 10~12는 \( \mathrm{NaHCO}_{3} \cdot \mathrm{NaOH} \) buffer를 사용하였다.</p> <p>효소 활성에 미치는 금속 이온의 영향을 검토하기 위하여 효소액을 \( 20 \mathrm{mM} \) EDTA가 포함된 phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 7.0\))에 24시간 투석한 후 다시 EDTA가 없는 동일 buffer에 24시간 투석하였다. 처리된 효소액에 \( 2 \mathrm{mM} \)과 \( 5 \mathrm{mM} \) 농도의 금속 이온을 각각 가한 후 효소활성을 측정하였다.</p> <p>저해제에 따른 효소 활성 검토는 각각의 저해제를 최종온도가 \( 10 \mathrm{mM} \)이 되게 \( 10 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\) buffer \( (\mathrm{pH} 7.5 \))에 가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 방치한 후 효소 활성을 검토하였다. Type Ⅰ collagen, gelatin, albumin 및 casein을 기질로하여 효소 반응을 한 뒤 기질별로 collagenase 활성을 측정하여 효소의 기질 특이성 실험을 수행하였다.</p>