본 연구에서는 분리한 lectin 용액에 대한 탄수화물의 특이성, 최적 반응온도, 열 안정성, pH 안정성 그리고 금속이온의 영향에 대해 분석한다. 탄수화물의 특이성 분석은 분리한 lectin 용액에 적혈구 부유액을 가하여 적혈구 응집 여부를 통해 이뤄졌으며, 최적 반응온도는 온도 변화에 따른 활성을 측정을 통해 이뤄졌다. 다음으로 열 안정성 측정은 lectin을 열처리한 후, 급냉시켜 잔존하는 상대적 lectin의 활성을 통해 측정하였으며, pH 안정성 측정은 \( \mathrm{pH} ~2.0-10.0 \) 사이 buffer를 투석후 잔존하는 상대적 lectin의 활성을 측정을 통해 이뤄졌다. 마지막으로 금속이온의 영향은 lectin 용액에 희석법이 적용된 금속이온 용액을 가한 후 적혈구 응집여부를 통해 분석하였다.
<h2>SDS-PAGE 및 분자량 측정</h2><p>Laemmli의 방법에 따라 \(12\%\) SDS-polyacrylamide gel 전기영동을 \( 30 \mathrm{~mA} \)에서 1시간 동안 실시하였다. 전기영동 후 gel을 Coomassie brilliant blue R-250으로 염색을 하였고, acetic acid로 탈색시켰다.</p><p>Weber와 Osborn의 방법에 따라 분자량은 전기영동한 lectin과 표준 단백질에 대한 상대이동도(Rf)와 단백질 분자량에 대한 대수값을 통해 계산하였다. 이때 사용한 표준 단백질은 rabbit muscle phosphorylase b \( (97 \mathrm{~kDa}) \), bovine serum albumin \( (66 \mathrm{~kDa}) \), chicken egg white ovalbumin \( (45 \mathrm{~kDa} \) ), bovine erythrocyte carbonic anhydrase ( \( 30 \mathrm{~kDa}) \), soybean trypsin inhibitor \( (20.1 \mathrm{~kDa} \) ), \( \alpha \)-lactalbumin \( (14.4 \mathrm{~kDa}) \)이다.</p><h2>탄수화물의 특이성</h2><p>분리한 lectin 용액에 \( 200 \mathrm{~mM} \)의 D-glucose, D-galactose, D-maltose, D-mannose, D-fructose, N-acetyl-D-glucosamine 및 D-sucrose 용액을 각각 가한 후, 이를 \( 6.25 \mathrm{~mM} \) 농도까지 2배 연속 희석법으로 연속 희석하여 30분간 반응시켰다. 여기에 활성화 시킨 쥐의 2% 적혈구 부유액을 가하여 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 반응시켜 적혈구 응집 여부를 확인하였다.</p><h2>최적 반응온도 측정</h2><p>분리한 lectin의 최적 반응온도롤 알아보기 위하여 온도 변화에 따른 활성을 측정 하였다. 이때 분리한 lectin을 2배 연속 희석법으로 연속 희석한 후, 활성화 시킨 쥐의 2% 적혈구 부유액을 넣어 주었다. 항온수조에서 \( 10-90^{\circ} \mathrm{C} \) 사이의 온도를 각각 처리한 후, 혈구 응집 반응을 측정 하였으며, 최대 희석 배수의 residual activity를 \(100\%\)로 하여 잔존하는 lectin의 상대적인 활성을 계산하였다.</p><h2>열 안정성 측정</h2><p>분리한 lectin의 열 안정성을 알아보기 위하여 lectin은 \( 20-100^{\circ} \mathrm{C} \) 사이의 온도에서 각 10분간 열처리한 후, 급냉시켰다. 적혈구 응집반응을 통해 잔존하는 상대적 lectin의 활성을 측정하였다.</p><h2>\( \mathrm{pH} \) 안정성 측정</h2><p>분리한 lectin의 \( \mathrm{pH} \) 안정성을 알아보기 위하여, \( \mathrm{pH} ~2.0-10.0 \) 사이 buffer를 사용하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4시간 투석 후, 적혈구 응집반응을 통해 잔존하는 상대적 lectin의 활성을 측정하였다. 이때 buffer는 \( 0.025 \mathrm{~M} \) glycine-\( \mathrm{HCl} \) buffer \( (\mathrm{pH} ~2.0 \)), \( 0.2 \mathrm{~M} \) acetate buffer \( (\mathrm{pH} ~3.2,~4.2)\), \(0.01 \mathrm{~M} \) phosphate buffer \( (\mathrm{pH} ~6.2, ~7.2) \), \( 0.2 \mathrm{~M} \) Tris buffer \( (\mathrm{pH} ~8.0, ~9.1) \), \( 0.2 \mathrm{~M} \) carbonate-bicarbonate buffer \( (\mathrm{pH} ~10.0) \)를 사용하였다.</p><h2>금속이온의 영향</h2><p>분리한 lectin 용액에 \( 20 \mathrm{~mM} \)의 \( \mathrm{CaCl}_{2}\), \(\mathrm{CoCl}_{2}\), \(\mathrm{CuSO}_{4}\), \(\mathrm{FeSO}_{4}\), \(\mathrm{MgSO}_{4} \), 및 \( \mathrm{MnSO}_{4} \) 용액을 각각 가한 후, 2배 연속 희석법으로 \( 1.25 \mathrm{~mM} \)의 농도가 될 때까지 연속 희석한 다음, 이들을 30분간 반응시켰다. 여기에 활성화 시킨 쥐의 \(2\%\) 적혈구 부유액을 가하여 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 반응시켜 적혈구 응집 여부를 확인하였다.</p>