3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT), Dulbeco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) 및 Antibiotic-Antimyotic (100X)를 사용하여 CCD-986sk (Human fibroblast) 세포를 \( 10 \% \) FBS, \( 5 \% \) antibiotic-antimyotic을 첨가한 DMEM으로 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건으로 배양하였다. Matrix metalloproteinase-1 (MMP-1), Pro-COL1 \( 11, \beta \)-actin 항체는 undefined 하여 사용하고 MMP-1, Pro-collagen kit는 각각 \( \Lambda \) bcam, TaKaRa에서 구입하여 사용하였다. Spectrostar Nano, Chemi-Doc LAS4000 장비를 사용하여 American Type Culture Collection (ATCC)에서 구매한 CCD-986sk 세포 독성 실험 및 배양을 수행하였다.
<h2>재료 및 방법</h2> <h3>실험재료 및 기기</h3> <p>세포 독성 실혐 및 배양을 위한 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) 는 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) 의 제품을 사용하였으며 Dulbeco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) 및 Antibiotic-Antimyotic (100X)는 Gibco (Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였다. 유효성 평가를 위한 Matrix metalloproteinase-1 (MMP-1), Pro-COL1 \( 11, \beta \)-actin 항체는 undefined 하여 사용하였으며, MMP-1, Pro-collagen kit는 각각 \( \Lambda \) bcam (Cambridge, MA, USA), TaKaRa (Shiga, Japan)에서 구입하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 microplate reader 장비는 Spectrostar Nano (BGM LabTech, Ortenberg, Germany)를 사 용하였으며, Chemi-Doc은 LAS4000 (Fuji Film, Tokyo, Japan) 제품을 사용하었다.</p> <h3>세포배양</h3> <p>American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA) 에서 구매한 CCD-986sk (Human fibroblast) 세포를 \( 10 \% \) FBS, \( 5 \% \) antibiotic-antimyotic을 첨가한 DMEM으로 배양기에 서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건으로 배양하였다.</p> <h3>세포독성축정</h3> <p>본 실혐에서 CCD-986sk 세포에 대한 시료의 유효농도를 결정 하기 위해 세포독성측정(MTT assay)을 진행하였다. 배양된 CCD-986sk 세포를 48 well plate에 각각 \( 5 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { cell } / \mathrm { wells } \) 로 접종하고 24 시간 배양하였다. 둥일 배지로 교체한 후 casuarictin 을 농도별 \( (5,10,25,50,100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \) 로 희석하여 처리한 후 48시간 CO2 incubator에서 배양하였다. 5 mg/mL MTT 용액과 \( 10 \% \) FBS, \( 5 \% \) antibiotic-antimyotic을 첨가한 DMEM을 혼합 하여 세포에 \( 10 \mu \mathrm { L } \) 씩 처리한 후 3 시간 배양하였다. Demethyl sulfoxide \( 100 \mu \mathrm { L } \) 넣은 후, 10 분간 교반 한 후 microplate reader 로 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h3>ROS (Reactive Oxygen Species) 생성량 측정</h3> <p>CCD-986sk 세포를 배양한 후 96 well white plate에 \( 2 \times 10 ^ { 5 } \) cell/wellse로 접종하고 24 시간 배양하였다. 동일 배지로 교체한 후 UVB \( \left (20 \mathrm { ~mJ } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \right ) \) 을 조사 한 뒤, casuarictin을 \( 5,10,25 \) \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 의 농도로 희석하여 처리한 후 48 시간 배양하였다. 그 후 제조사의 매뉴얼에 따라 ROS Clo \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) assay를 수행하였다.</p>