탄소원이 결핍된 C-배지(Carbon-minimal medium)를 분리 및 동정하여 선별된 균주의 생육도, 표면장력, CMC(critical micelle concentration)를 측정하고 Biosurfactant의 생성 미생물을 추출하여 유화활성 및 유화안정성에 대한 시험을 실시하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>미생물의 분리 및 동정</h2><p>Biosurfactant 생성 미생물을 분리하기 위하여 배지중에 탄소원이 결핍된 C-배지(Carbon-minimal medium)를 사용하였으며, 배지의 조성은 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} 5 \mathrm{~g} / \mathrm{L}^{2}\) \(\mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 2 \mathrm{g} / \mathrm{L}\), \(\mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.2 \mathrm{~g} / \mathrm{L}\), \(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} 1 \mathrm{~g} / \mathrm{L}\), \(\mathrm{CaCl}_{2} 10 \mathrm{mg} / \mathrm{L}\), \(\mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 10 \mathrm{mg} / \mathrm{L}\), \(\mathrm{NaCl} 30 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \), yeast extract \( 0.2 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 및 trace element 용액 \( 2 \mathrm{~mL}\) \( (\mathrm{MoO}_{3} 1 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \), \( \mathrm{ZnSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 7 \mathrm{mg} / \mathrm{L}\), \(\mathrm{CuSO}_{4} \cdot 5 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{L}\), \(\mathrm{H}_{3} \mathrm{BO}_{3} 1 \mathrm{mg} / \mathrm{L}\), \(\mathrm{CoCl}_{2} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 6 \mathrm{mg} / \mathrm{L}\), \(\mathrm{NiSO}_{4} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 1 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) )를 함유하고 있으며, \( \mathrm{pH} 7.0\)로 조정하여 사용하였다. 탄소원으로 원유 또는 식용유를 \( 1 \% \) 첨가한 C-배지에 채취한 샘플 희석액을 \( 1 \% \) 첨가하여 7일간 진탕 배양하여 생육된 균을 새로운 C-배지에 균주 및 원유를 각각 \( 1 \% \)로 첨가하여 다시 배양하였다. 이렇게 3회 반복하여 생육한 균주를 LB-고체배지에 도말하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다. 선별된 단일 균주를 LB 액체배지에서 각각 전 배양시킨 후, tributyrin이 첨가된 배지에 배양한 후 투명환이 생성된 것을 우수한 균주로 보아 단일 콜로니를 선별하였다.</p><p>선별된 균주를 동정하기 위하여 형태학적, 생리학적, 생화학적 특징을 조사한 후 Bergey's manual of systematic bacteriology를 근거로 하여 동정하였다.</p><h2>균주의 생육도 측정</h2><p>선별된 균주의 생육온도를 조사하기 위하여, \( 500 \mathrm{ml} \) 삼각플라스크에 crude oil \(1\%\)를 함유한 C-배지를 \( 200 \mathrm{ml} \) 넣고, LB 액체 배지에서 전 배양시킨 균주 \( 1 \% \)를 접종하여 \(25 { }^{\circ} \mathrm{C}\), \(32^{\circ} \mathrm{C}\), \(37^{\circ} \mathrm{C} \) 및 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 각각 \( 200 \mathrm{rpm} \)으로 진탕 배양하였다. 이때 배양시간에 따른 균체의 성장은 1, 3, 5일에 진탕 배양한 배양액을 일정량 취하여 UV-VIS spectrophotometer (U-1100, Hitachi, Japan)를 사용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도(optimal density)를 측정하였다.</p><h2>표면장력 측정</h2><p>표면장력의 측정은 배양시간에 따라 배양한 용액을 원심분리 하여 균체를 제거한 배양 상등액에 대해 DeNouy Tensiometer (Itoh Seisakusho, Japan)의 ring method를 이용하여 3회 반복하여 측정한 평균값을 표시하였다.</p><h2>Biosurfactant의 추출</h2><p>Bacillus sp. LSC11을 전 배양한 용액을 2 L의 배양배지에 재접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4일간 진탕배양 하였다. 배양용액을 원심분리 \( (10,000 \mathrm{rpm}\), \( 4^{\circ} \mathrm{C}) \) 하여 균체를 제거한 상등액에 진한 염산을 서서히 가하면서 \( \mathrm{pH} \)가 2.0이 되게 조정하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에 하룻밤 방치하면서 biosurfactant를 침전시켰다. 원심분리하여 침전물을 회수하고, 알카리성 수용액 \( (\mathrm{pH} \) \( 8.0 \) with \( \mathrm{NaOH} \) )에 용해하여 동결건조 시켰다. 건조된 물질을 methanol로 추출하여 농축한 것을 부분 정제한 biosurfactant로 사용하였다.</p><h2>CMC(critical micelle concentration) 측정</h2><p>Biosurfactant의 CMC는 부분 정제된 biosurfactant 용액을 연속적으로 2배의 농도씩 희석하면서 표면장력을 측정하였다. 이때, 희석비율 vs. 표면장력을 plotting하여 표면 장력이 갑자기 증가하는 지점의 희석비율로부터 농도를 계산하였다.</p><h2>유화활성 및 안정성 측정</h2><p>일반적으로 사용되는 화학계면활성제와 소수성 탄화수소의 oil성분에 대해 biosurfactant 용액시료의 유화활성 및 유화안정성 시험은 Cirigliano와 Carman의 방법에 따라서 실시하였다. 배양용액을 Millipore \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) 여과막을 통과시켜 멸균시킨 것을 biosurfactant 용액으로 하였다. 여과액 \( 2 \mathrm{ml} \)를 마개 있는 시험관에 넣고, \( \mathrm{pH} 3.0 \)의 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium acetate 완충액 \( 2 \mathrm{ml} \)와 혼합한 용액(CMC의 농도)에 \( 1 \mathrm{ml} \)의 기질을 넣고 2분간 최고속도로 vortex mixing한 후 10분 간 정치한 후 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서의 현탁도를 측정하였다. 유화안정성은 유화활성 측정 시와 동일한 방법으로 처리한 후에, 실온에 방치하면서 매 10분마다 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서의 현탁도를 측정하여 Log 값으로 환산하여 나타내고, 그 때의 기울기를 유화활성의 안정도는 상수 \( K_{d}( \) 시간당 붕괴되는 유화력의 기울기 값)으로 나타내었다.</p>