K.gwangalliensis의 phytoene desaturase ( \( \mathrm { crtI } \)) 유전자를 복제하기 위해 NCBI에 등록된 생물들의 염기서열을 분석하고 degenerate primer를 제작하였으며 DNA 라이브러리를 이용하여 PCR로 증폭하고 Seegene의 kit을 사용하여 open reading frame의 염기서열을 확보하였다. 대장균에서 생합성된 lycopene은 HPLC를 이용하고 분석하였으며 대장균으로부터 색소를 추출하기 위해 아세톤을 사용하여 균질화시킨 후 \( 12,000 \times g \) 에서 원심 분리하였다. 상층액을 분리하여 여과한 다음 HPLC로 분석하였으며 Column은 Nova-Pak HR \( 6 \mathrm { U } \mathrm { C } 18 \)column을 사용하고 이동상 유지시간은 30분이다.
<h2>Phytoene desaturase ( \( \mathrm { crtI } \)) 유전자 클로닝 및 염기서열 분석</h2> <p>K.gwangalliensis의 phytoene desaturase ( \( \mathrm { crtI } \)) 유전자를 복제하기 위해 NCBI(National Center for Biotechnology Information, USA)에 등록된 여러 생물들의 phytoene desaturase의 염기서열을 확보하였다. 이들 염기서열을 분석하고 서열이 잘 보존되어 있는 부분을 이용하여 degenerate primer를 제작하였다. \( \mathrm { CrtI } \) 유전자는 K. gwangalliensis의 DNA 라이브러리를 이용하여 PCR로 증폭하였다. \( \mathrm { CrtI } \) 유전자의 open reading frame을 복제하기 위해 DNA Walking SpeedUp Premix Kit (Seegene, Korea)를 사용하였고, 증폭된 DNA를 pGEM-T vector (Promega, USA)에 삽입하였다. 복제한 \( \mathrm { crtI } \)유전자는 ABI Prism \( ^ {\mathrm { TM } } \) DNA sequencing kit 및 ABI 377 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 염기 서열을 분석하였다. \( \mathrm { crtI } \) 유전자의 완전한 DNA의 염기 서열을 분석하여 GenBank에 등록하였다(JN582050.1).</p> <h2>K. gwangalliensis의 phytoene desaturase ( \( \mathrm { crtI } \)) 유전자의 비교 서열 분석</h2> <p>K. gwangalliensis의 phytoene desaturase ( \( \mathrm { crtI } \)) 유전자의 분자적 진화를 조사하기 위해 SwissPort databank/GenBank에서 Gloeobacter violaceus PCC 7421 (NC005125), Thermus thermophilus HB8 (AE017222), Xanthobacter autotrophicus (AF408848), Rhodopseudomonas palustris CGA009 (NC011004), Pantoea ananatis (D90087), Rhodobacter capsulatus (Z11165), Rhodobacter sphaeroides (S71770), Myxococcus xanthus (M94727), P.haeundaensis (AY957386), Erthrobacter longus (BAA20276) and Kocuria rhizophila (BAG30430)의 \( \mathrm { crtI } \) 유전자 데이터를 확인하였다. 알려진 세균의 상동성을 phytoene desaturase의 아미노산 서열을 분석하여 조사하였다. 아미노산 서열의 분석은 ClustalW 프로그램을 이용하여 분석되었다. 계통 발생 수를 분석하기 위해서 계통 발생 수를 분석하기 위해서 neighbor-joining 방법을 사용하는 NEIGHBOR (Mega, version 4.0) 프로그램을 사용하였다.</p> <h2>대장균에서 lycopene 합성을 위한 plasmid 구축</h2> <p>K. gwangalliensis의 genomic DNA 라이브러리에서 얻은 \( \mathrm { crtI } \) 유전자의 과발현을 위해, pColdI vector (Takara, Japan)의 NdeI 및 HindIII 부위를 사용하여 클로닝 하였다. 이를 위해, T-벡터의 NdeI 및 HindIII primer 부위를 사용하여 \( \mathrm { crtI } \) 유전자의 5' 및 3' 말단을 각각 연결하고 PCR을 이용하여 증폭시켰다. PCR 산물 및 pColdI 벡터를 NdeI 및 HindIII 제한 효소로 절단하고 이를 재조합하여 \( \mathrm { crtI } \) 유전자를 삽입한 발현 벡터인 \( \mathrm { pCcrtI } \) 플라스미드를 제작하였다. 이 플라스미드 DNA를 대장균 \( \mathrm { BL } 21 \)(DE3)에 형질 전환시켰다. 형질 전환된 대장균을 선별한 후, \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) ampicillin이 첨가된 LB 배지에서 \( \mathrm { OD } _ { 600 } \)에서 0.5에 도달할 때까지 배양하였다. 또한, \( 0.1 \mathrm { mM } \)IPTG를 첨가하고, \( 16 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 추가로 배양하여 DNA 과발현을 유도하였다. 발현 수준을 분석하기 위해 \( 12 \% \)SDS-PAGE를 수행 하였다. 단백질을 SDS-PAGE겔로부터 니트로 셀룰로오스 막으로 전이시켜 goat antiserum against 6-His tag으로 과발현된 단백질을 탐침하고, alkaline phosphatase와 결합된 against goat IgG를 이용하여 6-His tag antibody와 반응시켰다. 반응이 끝난 니트로 셀룰로오스막에 BCIP/NBT (Sigma-Aldrich)를 처리하여 재조합 단백질의 발현을 확인하였다. 또한, P. haeundaensis의 \( \mathrm { crtE } \) 및 \( \mathrm { crtB } \) 유전자를 pRSFDuet-1 벡터(Novagen, USA)에 삽입하여 \( \mathrm { pRScrtEB } \) 플라스미드를 구축하고 이것을 대장균 \( \mathrm { BL } 21 \) (DE3)에 형질 전환시킨 후 형질 전환된 대장균을 선별하였다. 대장균에서 lycopene을 합성하기 위해 2개의 플라스미드( \( \mathrm { pCcrtI } \)와 \( \mathrm { pRScrtEB } \))가 들어간 \( \mathrm { BL } 21 \) (DE3) 대장균을 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , \mathrm { OD } _ { 600 } \)에서 0.5가 될 때까지 배양한 후, 최종농도 \( 0.1 \mathrm { mM } \) 이 되도록 IPTG를 처리하고 \( 16 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5시간 동안 과발현을 유도하였다.</p> <h2>형질 전환된 대장균에서 lycopene의 추출 및 분석</h2> <p>대장균에서 생합성된 lycopene은 HPLC (High Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 분석하였다. 형질전환 된 대장균으로부터 색소를 추출하기 위해 세포를 \( 90 \% \)아세톤을 사용하여 3분간 균질화시킨 후 \( 12,000 \times g \) 에서 2분간 원심 분리하였다. 상층액을 분리하여 \( 0.22 \mu \mathrm { m } \)nylon filters로 여과한 다음 \( 20 \mu \mathrm { l } \)를 HPLC [Bio-rad Automated Biologic HR System ( \# 750-0047)]으로 분석하였다. Column은 Nova-Pak HR \( 6 \mathrm { U } \mathrm { C } 18 \)column을 사용하였고, 이 때 column의 온도는 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)를 유지하였으며, 이동상 유지 시간은 30분이다. 이동상 용매는 0-15분까지는 \( 14 \% 0.1 \mathrm { M } \) Tris- \( \mathrm { HCl } ( \mathrm { pH } 8.0), 84 \% \) acetonitrile, \(2 \% \)methanol을, 15-20분까지는 \( 68 \% \)methanol, and \( 32 \% \)ethyl acetate을 사용하였다. HPLC 분석 후, 10 분간 초기 이동상 용매로 HPLC 이동을 수행하였다. HPLC를 수행하는 동안 이동상 용매의 유속은 \( 1 \mathrm { ml } / \mathrm { min } \)이었다. HPLC로 분리된 카로티노이드는 photodiode array detector를 이용하여 \( 280 \mathrm { nm } \) 및 \( 470 \mathrm { nm } \)의 파장으로 측정하고, 표준 시료의 측정값과 비교하였다. Lycopene과 phytoene 표준 시료는 Sigma-Aldrich사에서 구입하였다.</p>