RAPD 분석에 있어 DNA 농도는 재현성과 정확성을 위해 중요한 요인이므로 안정적인 결과 도출을 위해 적정한 DNA 농도를 규명할 필요가 있다. 여러가지 template DNA의 농도 하에서 작물들의 PCR을 실시한 결과, 대체로 DNA의 농도가 높아질수록 밴드가 다소 뚜렷해지는 경향이 있었으나 몇몇 작물에서는 상방된 결과를 얻었다. 이는 template DNA의 최적온도가 작물의 종류와 사용한 primer의 종류에 따라 다르기 때문이라고 추측한다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>Template DNA 농도</h2><p>RAPD 분석에 있어 DNA의 농도는 분석의 재현성과 정확성을 위하여 중요한 요인이다. PCR분석의 장점 중 하나는 비교적 순수하지 않은 DNA를 사용할 경우에도 일정한 결과를 얻을 수 있다고 알려져 있으나, RAPD 표지인자를 이용한 유전자지도 작성 등을 위해서는 안정적이고 재현성 있는 결과가 필요하며, 이를 위해선 적절한 DNA농도를 규명할 필요가 있다. 여러 가지 template DNA의 농도 하에서 PCR을 실시한 결과는 Fig. 1과 같다. Primer OPR01의 경우, 모두 9개의 밴드가 나타났다. DNA농도가 10, 30, 50, 60 및 \( 80 \mathrm{ng} \) 등 모든 농도에서 전체적으로 양호한 밴드양상을 보였으나, 농도가 높아질수록 다소 뚜렷해지는 경향이 있었다.</p><p>이러한 현상은 포도작물에 있어서 template DNA 양이 \( 25 \mathrm{ng} \)부터 \( 125 \mathrm{ng} \)까지 변하여도 RAPD 표지의 증폭 양상에는 미미한 차이만 있었던 결과와 비슷하며, Koller et al.의 사과의 RAPD에 대한 보고처럼 template DNA 양이 \( 55 \mathrm{ng} \)이 되어도 밴드양상은 달라지지 않는다는 내용과 비슷하다. 그러나 Nam et al.은 고추에서는 DNA 농도가 \( 40 \mathrm{ng} \) ~ \( 10 \mathrm{ng} \)으로 낮아짐에 따라 밴드의 smear한 현상이 줄어든다고 보고한 바 있어 DNA 농도가 높아질수록 밴드의 양상이 양호하게 나타난 본 실험과 상반된 결과를 나타내였다. 이처럼 template DNA의 최적농도가 다른 것은 작물의 종류와 사용한 primer의 종류 등이 다르기 때문이라고 추측된다. 결론적으로, 양파의 RAPD 분석에 있어 template DNA 농도가 높을수록 미세하게 나마 밴드가 뚜렷하게 나타나는 경향이 있었으나 전반적으로 \( 30 \) ~ \( 50 \mathrm{ng} \) 의 template DNA 농도가 최적조건인 것으로 분석되었다.</p><h2>Primer의 농도</h2><p>Template DNA를 상기 적정농도로 고정한 후 primer OPR01과 primer OPZ20을 각각 \( 1 \sim 10 \mu \mathrm{M} \)까지 처리하여 RAPD를 수행한 결과는 Fig. 2와 같다. Primer OPR01의 경우, \( 1 \mu \mathrm{M} \) 처리구에서는 밴드가 전혀 나타나지 않았고, 5\( \mu \mathrm{M} \)의 처리구에서는 4품종 모두 약 13개씩의 밴드가 나타났다. \( 10 \mu \mathrm{M} \)의 처리구에서는 '야광주'와 '다봉황'의 두 품종에서만 밴드가 나타났는데, \( 5 \mu \mathrm{M} \) 처리구에 비해 짧은 밴드가 뚜렷하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. Primer OPZ20의 경우, \( 1 \mu \mathrm{M} \)의 처리구에서는 primer OPR01과 마찬가지로 밴드가 나타나지 않았으며, \( 5 \mu \mathrm{M} \)의 처리구에서는 4품종 모두에서 총 6개의 밴드를 확인할 수 있었다. 10 \( \mu \mathrm{M} \)의 처리구에서는 '창녕대고'와 '다봉황' 두 품종에서만 밴드가 나타났고, 이 경우에도 \( 5 \mu \mathrm{M} \)의 경우보다 작은 크기의 DNA가 더 뚜렷하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.</p><p>Yae et al.은 primer농도가 \( 0.1 \mu \mathrm{M} \)에서 \( 1.3 \mu \mathrm{M} \)로 높아질수록 작은 크기의 DNA가 뚜렷하게 나타나고 반대로 낮아질수록 크기가 큰 DNA가 더 뚜렷하게 나타났다고 보고하였는데 본 연구에서 얻은 결과와도 일치하였다. 결론적으로, primer 농도에 따른 PCR 증폭양상 실험결과, \( 5 \mu \mathrm{M} \)가 가장 적절한 것으로 판명되었다.</p><h2>\( \mathrm{MgCl}_{2} \) 농도</h2><p>상기 선정된 조건하에서 PCR 반응용액 내의 \( \mathrm{MgCl}_{2} \)를 \( 0 \sim 3 \mathrm{mM} \)까지 농도별로 달리 첨가하여 PCR을 시행한 결과는 Fig. 3과 같다. Primer OPR01의 경우, \( \mathrm{MgCl}_{2} \) 농도가 \( 0 \mathrm{mM} \)인 경우에는 밴드가 나타나지 않았고, \( 1 \mathrm{mM} \)의 처리구에서는 '창녕대고', '여의주황', '다봉황'의 3품종에서만 밴드가 나타나 재현성이 부족함을 알 수 있었다. 그러나 농도가 \(1.5 \mathrm{mM} \)일 때, 4품종 모두에서 밴드가 나타나 가장 적절한 농도임을 확인할 수 있었다. 반면, \(2 \mathrm{}\) ~ \(3 \mathrm{mM} \)의 고농도 \( \mathrm{MgCl}_{2} \) 처리구에서는 반응산물이 없었다.</p><p>이러한 현상은 Weeden et al.이 \( \mathrm{MgCl}_{2} \)가 DNA 증폭에 직접적인 영향을 미칠 수 있다고 보고한 결과와 고추에서 \( \mathrm{MgCl}_{2} \)가 첨가되지 않았거나 \( 1 \mathrm{mM} \) 이하의 저농도로 처리된 경우 반응산물을 얻을 수 없었다는 결과와 유사하다. 결론적으로, 양파에 있어서 \( \mathrm{MgCl}_{2} \)의 적정농도는 \( 1.5 \mathrm{mM} \) 정도로 분석되었다.</p>