토마토의 잎으로부터 분리한 미토콘드리아에 아세토카민과 MitoTracker로 염색하고 추출하여, 튜브내에 전층이 \( \mathrm{mt} \)가 존재해 있음을 확인하였다. 본 실험의 protocol 중 원심분리한 후에 상등액을 모아서, 원심한 튜브내의 하층부위는 모두 mt임을 추정할 수 있다. 고이온성재배지에서 분리한 mtDNA와 해바라기 및 목화유묘기의 mtDNA 추출에 이용된 많은 양의 시료를 이용하여 Southern 분석으로 mtDNA임을 확인하였는데, 본 실험에서는 PCR에 의하여 mtDNA임을 간소하게 확인하였다. 마지막으로 RT-PCR을 통해 얻은 mtRNA의 검정방법으로 Northern 분석을 통해 수행한 결과와 동일하게 mtRNA임을 확인 할 수 있었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <p>Fig. 1은 토마토의 무균 잎을 900 300 mg을 \( 5 \mathrm{~mL} \) 호모게나이져 A 버퍼에 넣어 \( 16,200 \mathrm{rpm} \)으로 20초 호모게나이져 한 다음 동량의 차가운 호모모게나이져 B 버퍼를 넣어 100\( \mu \mathrm{l} \) 메시를 이용하여 찌거기를 거른다. \( 2,600 \mathrm{rpm} \)으로 10분간 원심한 후 상등액을 새로운 튜브로 이동한 다음, 3,900 rpm으로 10분간 2회 반복한다. 상등액을 새로운 튜브로 옮긴 다음 \( 12,700 \mathrm{rpm} \)으로 5분간 원심한 후, \( 1 \mathrm{~mL} \)의 호모게나이져 \( \mathrm{A} \) 버퍼로 넣는다. \( 12,700 \mathrm{rpm} \)으로 15분간 원심한 후 상등액은 버린다. 이때 튜브 바닥에 있는 것이 mt이다. 바로 mtDNA와 mtRNA를 추출할 경우 곧 바로 사용하지만, 오랫동안 보존할 경우에는 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에 저장한다.</p> <p>토마토의 무균배양한 잎으로부터 분리한 미토콘드리아에 아세토카민과 MitoTracker \( { }^{\circledR} \)로 염색한 결과(Fig, 2), \( 600 \mathrm{mg} \)과 \( 900 \mathrm{mg} \)의 토마토의 잎으로부터 추출한 \( \mathrm{mt} \) 가 든 \( 16 \mathrm{ml} \) 튜브를 3 등분하여 아세토카민과 MitoTracker를 염색한바, 분리한 \( \mathrm{mt} \)는 \( 90 \% \)이상 (아세토카민염색 MitoTracker 염색세포수와 차이) 세포가 건전한 mt로 추출할 수가 있었으며, 또한 듀브내에 전층이 \( \mathrm{mt} \)가 존재해 있음을 확인하였다. 따라서 본 실험의 protocol 중 10분간 \( 3,900 \mathrm{rpm} \)에서 2 번하여 상등액을 모두 모아서, 15분간 \( 12,000 \mathrm{rpm} \) 원심한 튜브내의 하층부위는 모두 mt임을 추정할 수 있다. 이는 Scotti 등이 이용하여 얻어진 \( \mathrm{mt} \)의 확인방법을 mtDNA와 mtRNA에서 확인한 것 보다 MitoTracker \( { }^{\circledR} \)로 염색함으로 그 다음 단계인 mtDNA 추출 과정을 보다 확신을 가져줌으로써 mt에 관한 실험의 효율을 향상 시킬 수가 있다고 생각된다.</p> <p>토마토의 무균배양된 잎 조직으로부터 분리 정제된 mt로부터 mtDNA 추출(Fig. 3)은 다음과 같다. 분리된 mt를 200 \( \mu l \) lysis 버퍼에 녹인 다음, \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) proteinase \( \mathrm{K} \)를 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에 1시간 인큐베이션 한다. \( 0.1 \)배 볼륨의 \( 2 \mathrm{M} \) ammo-nium acetate와 동량의 TE-saturated phenol/chloroform \( (50: 50) \)를 넣고, 2배 볼륨의 \( 100 \% \) 에탄올을 넣은 다음 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 하룻밤을 방치한다. \( 16,000 \mathrm{rpm} \) 으로 20분 처리하고 상등액을 버린다. \( 20 \mu 1 \) 의 멸균수를 넣고 \( 0.8 \% \) 아가로즈젤에 전기영동하여 mtDNA임을 확인하였다. Fig. \( 4 \mathrm{~A} \) 는 3종의 제한효소를 이용하여 \( \mathrm{mtDNA} \) 를 절단하여 전기영동한 양상으로 모두 mtDNA의 양상임을 확인할 수 있었다. Table 1 과 같이 \( m t \)에 연관 있는 유전자를 이용하여 6 set의 PCR primer를 제작하여 Fig. \( 4 \mathrm{~B} \)와 같이 \( 1,2,4,5,6 \) 번의 PCR primer 조합에서 증폭된 밴드를 확인 할 수 있었으며, 특히 \( 2,4,5 \) 번은 밴드 증폭 양상이 아주 깨끗하였다. Bookjans 등이 보고한 고이온성재배지에서 분리한 mtDNA와 Pérez 등이 발표한 해바라기 및 Hsu와 Mullin이 보고한 목화유묘기의 mtDNA 추출에 이용된 많은 양의 시로를 이용하여 Southern 분석으로 mtDNA임을 확인하였는데, 본 실험에서는 PCR에 의하여 mtDNA임을 확인하여 Southern 분석에 의한 실험 절차의 복잡함을 간소화 할 수 있었다.</p> <p>식물의 잎으로부터 분리한 mt로부터 mtRNA 추출방법은 Fig. 5와 같다. mt가 든 튜브에 \( 200 \mu \mathrm{l} \mathrm{RNA} \) extraction 버퍼를 넣고 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 의 2분간 인큐베이션하고, \( 0.1 \) 볼륨의 \( 2 \mathrm{M} \) so-dium acetate \( (\mathrm{pH} \) 4.0), 동량의 water-saturated phe-\( \mathrm{nol} / \)chloroform/isoamyl alcohol (50:49:1), 1배 볼륨의 iso-propanol을 차례대로 넣은 다음 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에 1시간 방치한다. \( 16,000 \mathrm{rpm}, 20 \)분간 원심한 후 상등액은 제거하고, \( 200 \mu \mathrm{\mu l} 4 \)\( \mathrm{M} \mathrm{LiCl} \) 을 넣고 녹인다. 그리고 \( 16,000 \mathrm{rpm}, 20 \)분간 원심하고 상등액은 제거하고 \( 300 \mu \mathrm{RNA} \) extraction 버퍼를 넣고 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)</p> <p>에서 2분간 녹인 후, 1 배 볼륨의 isopropanol을 넣고 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 시간 방치한 다음 \( 16,000 \mathrm{rpm} 20 \)분간 원심한 후 상등액은 버리고 mtRNA를 \( 75 \% \) ethanol로 2번 세정하고 대기 상태에서 건조시킨다. mtRNA 확인은 Fig. 6에서 PCR primer 2번으로 RT-PCR 하여 얻어진 band로 하였다. 본 실험에서 추출된 mtRNA의 검정방법을 RT-PCR에 의하여 수행하여 얻어진 결과는, Scotti 등에 의하여 mtRNA 검정 방법을 Northern 분석으로 수행한 결과와 동일하게 mtRNA임을 확인 할 수 있었다.</p>