Real-time PCR을 사용하여 TPM-B 타입 결정을 위해 fluorescent dye로 만들어진 탐침자를 사용하여 DNA를 변성시킨 후, AGS 위암 세포주를 penicillin, streptomycin solution과 10% FBS를 포함한 RPMI 1640 배지에서 5% CO2, 37\(^\circ \mathrm{C}\) 배양기에서 배양한 후 위암 세포주에 감염시킨 후 6시간 동안 공동 배양하여 단백질을 추출하였다.
<h3>Real-time PCR</h3> <p>TPM-B 타입 결정을 위해 fluorescent dye \( \mathrm { Cy } 5 ^ {\prime } \)-AAT AAT GGA CTC AAA AAC AGC ACA GA-3'biotin으로 만들어진 탐침자를 사용하여, \(200 \mu \mathrm { M } \) deoxynucleoside triphophate (50 mM Tris-HCL, \(3 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } \), SYBR Green 1 diluted 1/ \(10,000), 2 \) pmole forward primer, 10 pmole reserve primer, 5 pmole 탐침자 그리고 0.8 unit의 Platinum Taq DNA poly-merase의 혼합물 \( 18 \mu 1 \) 와 DNA 주형 \( 2 \mu 1 \) 를 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 초간 DNA를 변성시킨 후 48 to \( 51 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 10초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 10초 동안 총 50주기를 시행하였다.</p> <h3>위암 세포주 배양</h3> <p>AGS 위암 세포주(한국세포주은행)를 penicillin (100 units/ \( \mathrm { mL } ) \), streptomycin \((100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \) solution과 \(10 \% \) 우태아 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하여 \(5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } , 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 배양기에서 배양시켰다.</p> <h3>위암 세포주에 H. pylori 감염</h3> <p>각 질환에서 분리된 균주를 \(2 \times 10 ^ { 7 } \)로 균수로 조정 한 후 항생제가 제거된 배지에서 \(1 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { AGS } \)위암 세포주에 감염시킨 후 \(5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } , 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 배양기에서 6시간 동안 공동 배양한 후 AGS 세포주를 모아 단백질을 추출하였다.</p> <h3>세포중식 및 세포상해 측정</h3> <p>96 well에 \(1 \times 10 ^ { 3 } \)/well의 위암 세포주를 분주하여 24-96시간 배양시킨 후, 배지를 제거하고 항생제를 포함하지 않은 배지를 첨가한 다음 \( 2 \times 10 ^ { 5 } \)개의 H. pylori를 감염시켜 6시간동안 \(37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 배양기 \( \left (5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \right . \), 포화습도 \( ) \) 에서 배양 시킨 훅, Premix WST-1 (Permix WST-1 cell proliferation assay system, takara, japan) 발색 시약을 1 well 당 \( 10 \mu 1 \) 씩 첨가하였다. \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \)에서 30분간 반응시킨 후 Microtplate (ELISA) reader를 이용하여 \(420 \mathrm { ~nm } \)와 \( 600 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p>