참치 심장 분말은 죽동원 \( \mathrm { F \& B } \)에서 획득하였으며, 70% 에탄올을 첨가하여 교반기를 이용해 3시간동안 섞은 후 3회 추출하였다. 이후 원심분리기로 상층액을 분리하였다. MTT assay를 통해 세포독성을 평가하였으며, 상층액을 제거하고 DMSO를 분주하여 formazan을 녹였다. 마지막으로 microplate reader를 이용해 흡광도를 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>참치 심장 ethanol 추출 및 용매별 분획 제조</h2> <p>본 실험에 사용한 참치심장 분말은 (죽동원 \( \mathrm { F \& B } \) (Korea)에서 제공받았으며 분말 상태의 참치 심장 분말은 교반기 \( ( \mathrm { H } - \) 0820, Dongwon Science Co., Korea)를 이용해 \( 70 \% \) ethanol을 가한 후 3시간 동안 교반시킨 후 3회 추출하였다. 추출물은 원심분리기(UNION 32R, Hanil Co., Korea)로 \( 1,977 \times g \)에 10 분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. 남은 잔사는 동일한 방법으로 추출하였고 상층액은 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 감압 농축기 (RE200, Yamoto Co., Japan)로 농축하여 얻었다. 70 \( \% \) ethanol 추출물은 water에 용해시키고, dichloromethane을 water와 동일한 양으로 넣어 dichloromethane 분획물을 얻 었다. 그 water 층을 ethyl acetate, butanol의 순서로 분획 물을 제조하고, 나머지 용액을 water 분획물로 사용하여, 각 분획물을 감압 농축기를 이용하여 농축하였다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>Murine의 대식세포주인 RAW 264.7세포는 한국세포주 은행(KCLB 40071, Korea)에서 분양받아 사용하였으며, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (GIBCO,USA)에 \( 10 \% \) inactivated fetal bovine serum (Hy-Clone Laboratories, Inc., USA)과 1 \% penicillin/streptomycin (Hy-Clone Laboratories, Inc.)을 첨가한 배지를 배양액으로 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건에서 배양하였다.</p> <h2>세포독성 측정</h2> <p>시료의 세포독성을 평가하기 위해 MTT assay를 실시하였다. RAW 264.7세포를 \( 1 \times 10 ^ { 6 } \) cells/ml의 농도로 96-well plate에 분주하고 20 시간 동안 전 배양 후, 참치 심장 dichloromethane 분획물을 농도별로 첨가하여 22시간 동안 배양하였다. 배양 후, \( 5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \)의 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 시약 (Sigma Chemical Co., USA)을 첨가하여 2 시간 배양하였다. 이를 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 879 \times g \)에서 10분간 원심분리(UNION 32R, Hanil Co.,Korea)하여 상층액을 걷어내고 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma Chemical Co., USA)를 \( 100 \mu \mathrm { l } \)분주하여 생성된 formazan을 녹여내 microplate reader (Model 550, Bio- \( \mathrm { Rad } \), USA)를 이용하여 \( 540 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 다음 식에 의해 계산하였다.</p>