NO의 농도는 griess reagent를 이용해 배양액 내의 nitrite 농도를 측정하여 백분율로 표시했다. iNOS protein은 Raw 264.7 cell이라는 대식세포주를 이용하여 활성을 측정하며, 최종적으로는 ECL 용액으로 반응시켜 LAS 4000 chemiluminescence detection system을 이용해 현상 및 정량을 통해 활성을 측정하였다.
<h2>Nitric oxide 생성량 측정</h2> <p>NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 griess reagent를 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 cell은 DMEM 배지를 이용하여 \( 5 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { cells/ml } \)로 조절한 후 6 well plate에 접종하고, \( 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 24시간 전 배양하였다. 세포에 \( 1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 LPS를 처리하고 1시간 뒤에 농도별로 CopA3를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액의 상층액을 얻은 후 griess 시약과 반응 시킨 후 ELISA reader로 \( 540 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하여 NO 생성율을 백분율로 표시하였다.</p> <h2>Western blot을 이용한 inducible NO synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2) 활성 측정</h2> <p>iNOS protein 활성 측정을 확인하기 위하여 대식세포주인 Raw 264.7 cell은 DMEM 배지를 이용하여 \( 5 \times 10 ^ { 5 } \) cells/ml로 조절한 후 \( 100 \mathrm { ~mm } \) cell culture dish에 접종하고, \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 24시간 전 배양하였다. 세포에 \( 1 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)의 \( \mathrm { LPS } \)를 처리하고 1시간 뒤에 \( 5, 25, 50, 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 CopA3를 처리하여 24시간 배양 한 후 배지를 제거하고 phosphate buffer saline (PBS)로 2번 세척해 준 후, lysis buffer를 이용하여 단백질을 추출한 후 원심 분리하여 상등액을 취하였다. 상등액을 bradford assay로 단백질 농도를 정량 한 후 \( 10 \% \) SDS-PAGE를 시행하고, 전개된 단백질을 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. 이 membrane을 \(5 \% \) skim milk로 1시간 동안 blocking하고, 1차 항체 \( (1: 1,000) \)를 희석하여 \( 4 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 over night한 다음, TBST로 10분 간격으로 3회 세척하고, 각각의 2차 항체를 \( 1: 1,000 \)으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 다시 TBST로 10분간 3회 세척 후 ECL용액으로 반응시켜 LAS 4000 chemiluminescence detection system(Fuji, Tokyo, Japan)을 이용하여 현상 및 정량을 하였다.</p>