배아의 척수 채취 및 신경줄기세포의 분리를 위해 횐쥐 10마리를 마취액으로 마취하고, 제왕절개술을 통해 자궁각을 잘라내어 얼음팩 위에 둔다. 척수는 D-PBS 용액에 넣고 핀셋을 사용하여 결합조직을 제거하고, DMEM과 F12 medium을 1:1로 혼합한 용액에 넣어 한 개의 세포로 분리하고 PORN coated 배양용기에 분주하여 3일마다 배지를 교환하면서 배양한다. 또한 천상복부동맥을 2cm 채취하여 신경줄기세포 배양액 내에 3일간 두고 24G 바늘을 이용하여 신경줄기세포를 주입하고 배양한 후 이식한다.
<h2>배자의 척수 채취와 신경줄기세포의 분리</h2> <p>임신 10 일경의 횐쥐를 ketamine \( 44 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \), acepromazine \( 4.0 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \), rompun \( 0.75 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \) 을 혼합한 마취액을 복강내 주사하여 마취시켰다. 제왕절개술을 실시하여 자궁각을 잘라내어 얼음 팩 위에 두고 태아를 한 마리씩 꺼내어 Dul-becco's phosphate buffered saline(D-PBS) 용액에 담구었다. 10마리의 배아로부터 척수를 꺼내어 D-PBS 용액에 넣고 핀셋을 사용하여 결합조직을 제거하였다. 신경줄기세포의 1차 배양을 위하여 잘게 썰은 척수조직은 D-PBS가 들어있는 \( 15 \mathrm { ml } \) 원심분리관을 이용하여 3 분 동안 \( 1,000 \mathrm { ~g } \) 로 원심분리하였다. Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)과 Ham's F12 medium(F12 medium)을 1:1로 혼합한 용액 1 \( \mathrm { ml } \) 을 넣어 재부유시키고 파이펫으로 조작하여 조직을 더욱 작게 만들었다. 다시 1-2배의 DMEM과 F12 medium을 1:1로 혼합한 용액에 넣어서 한 개의 세포로 분리될 때까지 조작하였다. 세포가 분리되면 세포수를 \( 1 \sim 2 \times 10 ^ { 4 } \) 개가 되도록 하여 poly-L-ornithine hydrobromide(PORN, Sigma, USA) coated 배양용기에 분주하고 3일마다 배지를 교환하면서 배양하였다. 신경줄기세포의 분화를 위하여 fibroblast growth factor-1(FGF-1)을 \( 20 \mathrm { ng } / \mathrm { ml } \) 이 되도록 배지를 갈아 줄 때마다 첨가하였으며 배양 9일째 신경줄기세포를 trypsin-EDTA를 이용하여 채취하였다.</p> <p>동맥내 신경줄기세포의 배양을 위하여 천상복부동맥(su-perficial epigastric artery)을 \( 2 \mathrm { ~cm } \) 채취하여 신경줄기세포 배양액내에 3 일간 두었다. 절취한 동맥의 내피세포가 혈관 내에서 빠져나와 배양용기 바닥에 부착하고 동맥의 탄력성이 제거되면서 동맥이 직경이 커지고 동맥벽이 매우 얇아지게 되었을 때 수술용 현미경 하에서 \( 24 \mathrm { G } \) 바늘을 이용하여 배양한 신경줄기세포롤 주입한 다음 신경줄기세포와 같은 배지내에서 1 일간 배양한 후 이식하였다.</p> <h2>광학현미경용 표본의 제작</h2> <p>광학현미경용 조직은 neutral buffered formalin(pH 7.4)으로 고정하고 탈수와 청명과정을 거친 후 파라핀으로 포매하여 \( 6 \mu \mathrm { m } \) 의 조직절편을 얻어 탈파라핀하여 함수시켰다. 일반적인 조직학적인 소견은 hematoxylin \& eosin 염색을 시행하였다.</p>