학명이 확인된 제비꽃 표준추출물은 한국식물추출은행(http://extract.pdrc.re.kr/extract/f.htm)에서 입수하여 본 연구에 활용하였다. 경기도 용인의 자생 제비꽃 잎을 채취하여 증류수로 세척하였다. 세척된 잎을 부유시키고 30분 동안 사전 배양한 후 \( (8 \mathrm{mm} \times 8 \mathrm{~mm}) \) 크기의 사각형으로 성형했습니다. 약 \( 0.25 \mathrm{~g} \)의 각 섹션을 \( 5 \mathrm{ml} \)의 배양액(5 mM potassium phosphate buffer, \( \mathrm{pH} \) 6.8)에 담군 후 에틸 아세테이트를 사용하여 3회 분획한 후 감압 건조시킨 후, 샘플을 10% 아세토니트릴에 용해시켰다. 그런 다음 이 용해된 샘플을 HPLC 주입에 사용했습니다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>Viola 표준 추출물 시료의 분석</h2> <p>학명이 확인된 제비꽃 속 식물들의 표준 추출물은 한국식물추출물은행(http://extract.pdrc.re.kr/extract/f.htm)으로부 터 구입하여 사용하였다(Table 1). 추출물을 \( 1 \mathrm{ml} \)의 \( 100 \% \)메탄올에 녹여 그 중 \( 200 \mu 1 \) 를 \( \mathrm{pH} 10 \) 이상에서 에틸 아세테이트로 분획한 후 감압 건조시키고 \( 20 \mu 1 \) 의 메탄올에 녹여 전량 HPLC로 분석하였다(Fig. 1A). Reverse-phase column (Apollo C18, \( 5 \mu \mathrm{m} \), Alltech, USA)을 HPLC system (600 E,Waters, USA)에 장착하여 \( 0.8 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 의 flow rate으로 isocratic elution 하였다(solution A: \( 10 \% \) methanol,solution ( B: acetonitrile; \(\mathrm{A}:\mathrm{B}=6:4\)). 용출되는 멜라토닌은 형광분석기(470, Waters, USA)를 이용하여 \( 360 \mathrm{~nm} \) emission을 측정하여 검출하였다(excitation: \( 275\mathrm{~nm}\) ).</p> <h2>Viola 식물재료의 준비 및 분석</h2> <p>경기도 용인 지역에 자생하는 제비꽃속(Viola) 식물들의 잎을 채취하여 증류수에 세척하고 띄워 30 분간 전배양한 후 정방형 \( (8 \mathrm{mm} \times 8 \mathrm{~mm}) \) 절편을 만들어 약 \( 0.25 \mathrm{~g} \) 씩 \( 5 \mathrm{ml} \) 의 배양용액(5 mM potassium phosphate buffer, \( \mathrm{pH} \) 6.8)에 띄웠다. 실험 목적에 따라 \( 1\mathrm{mM} \) Trp 또는 \( 1 \mathrm{mM} \) TAM을 배양용액에 첨가한 후 완전한 암흑 속에서 15 시간 배양하였다. 배양이 끝난 Viola 식물의 잎을 회수하여 \( 1.2 \mathrm{ml} \) 의 \( 100 \% \) 메탄올을 가하고 막자사발에서 곱게 간 후에 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 최소 1시간 동안 추출하였다. 그 후 추출물을 원심분리(13,000\( \mathrm{rpm} \times 20 \mathrm{~min}, 4^{\circ} \mathrm{C} \) )하고 상등액을 취하여 \( 100 \mu 1 \) 이하가 될 때까지 감압 건조하였다. 이 시료에 3차 증류수를 가하여 최종 부피를 \( 500 \mu 1 \) 로 맞춘 후 \( 12.5 \mu 1250 \mathrm{mM} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 와 \( 62.5 \mu 1 \)\( 2 \mathrm{M} \mathrm{CaCO}_{3} \) 를 가하고 30 분간 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 로 가열하여 멜라토닌을 N-[(6-methoxy-4-oxo-1,4-dihydroquinolin-3-yl) methyl] acet-amide (6-MOQMA)으로 산화시켰다. 에틸 아세테이트로 3회 분획하여 감압 건조시킨 후 \( 10 \% \) 아세토니트릴에 녹여 HPLC 주입용 시료로 사용하였다. 화학적으로 변형된 멜라토닌은 sterol C18 column을 이용하여 \( 1 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 의 flow rate으로 isocratic elution 하였다(A: \( 0.3 \% \) acetic acid \( +10 \% \) methanol, B: \( 100 \% \) acetonitrile; A:B=9: 1). Elution은 fluo-rescence detector를 이용하여 검출하였다(emission: 390\( \mathrm{nm} \); excitation: \( 245 \mathrm{~nm} \). 멜라토닌 전구체를 공급한 배양액에서 조직으로부터 유출된 멜라토닌을 검출한 실험에서는 메탄올 추출을 실시하지 않고 곧바로 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 와 \( \mathrm{CaCO}_{3} \) 를 가하여 화학적 변형을 가하는 단계부터 시료분석 과정을 진행하였다(Fig. 1B).</p>