에스터라제 효소는 다양한 에스테르 화합물의 가수분해 및 합성 가능한 효소촉매로, 특히 저온성 에스터라제는 낮은 온도에서도 높은 활성을 보이므로 고온에서 불안정한 화합물 합성 공정에 이용될 수 있다. 따라서 이는 유기합성 분야에서 효소촉매로의 개발이 진행되고 있다. 본 연구에서는 최근 메타게놈 연구로 발굴된 에스터라제 EM2L8을 이용하여 (S)-CHBacid를 생산하였고, 효소 반응 최적화를 위해 반응액에 유기용매나 금속 이온을 첨가하였다.
<h1>서 론</h1> <p>에스터라제 효소는 다양한 에스테르 화합물을 가수분해할수 있고 또한 합성할 수 있는 유용한 효소촉매이다. 많은 에스터라제 효소가 동물, 식물, 미생물로부터 발굴되고 보고되었는데 그중에서도 미생물유래의 에스터라제가 가장 다양한 특성을 갖고 있으며 효소의 종류에 따라서 기질특이성, 위치특이성, 입체특이성 등의 고유한 특성을 지닌 것으로 밝혀졌다.</p> <p>최근에 저온성 에스터라제가 산업적으로 크게 주목을 받고 있다. 저온성 효소는 낮은 온도조건에서도 높은 효소활성을 보이기 때문에 고온에서 불안정한 화합물을 합성하는 공정에서 유용하게 사용될 수 있다. 또한 중온성 및 고온성 효소와는 달리 활성부위가 분자 구조적으로 높은 유연성을 갖고 있기 때문에 수분활성이 낮은 환경(저온, 유기용매)에서도 효소활성을 유지할 수 있다는 장점을 갖고 있다. 이와 같은 이유로 인해서 저온성 에스터라제는 유기합성 분야에서 효소촉매로 개발되고 있다.</p>산업적으로 유용한 효소를 발굴하기 위한 연구가 오랫동안 진행되어 왔다. 온천, 심해, 남극 빙하지역과 같이 지구상 극한지역에서 사는 극한 미생물로부터 특수기능을 지닌 효소를 찾고자 연구가 활발히 진행되고 있다. 또한, 지구상 극한지역으로부터 DNA를 직접 추출하고 여기에 들어있는 유용 유전자를 발굴하고자 하는 메타게놈 연구도 활발하다. 메타게놈 연구의 장점으로 난배양성 미생물 유래의 유전자를 발굴할 수 있다는 점과 매우 다양한 환경유전자를 찾을 수 있다는 점을 들 수 있다. 이 방법을 통해서 이미 많은 에스터라제/리파아제 유전자가 발굴되었다. 현재 심해 바닥 또는 빙하지역의 메타게놈으로부터 신규 저온성 효소를 발굴하여 특성을 규명하고 산업적으로 활용하는 연구가 진행되고 있다.</p> <p>Atorvastatin은 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A(HMG-CoA) reductase 저해제 계열의 고지혈증 치료제이며 이 물질을 생산하기 위해서는 키랄소재인 (S)-4-chloro-3-hydroxybutyric acid ((S)-CHBacid)가 필요하다. 이물질은 ethyl-(R,S)-4-chloro-3-hydroxybutyrate ( rac-ECHB) 기질을 에스터라제 효소를 이용하여 입체 선택적으로 가수 분해함으로써 생산할 수 있다(Fig. 4A).</p> <p>본 연구에서는 (S)-CHBacid를 생산하기 위해서 최근 메타게놈 연구를 통해 발굴된 에스터라제 EM2L8을 사용하였으며, 효소반응을 최적화하기 위해서 반응액에 유기용매 또는 금속이온을 첨가해주었다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약 밎 재료</h2> <p>p-Nitrophenyl butyrate(pNPB)와 p-nitrophenyl caprate(pNPC)는 Sigma사에서 구입하였다. rac-Ethyl-4-chloro-3-hydroxybutyrate(rac-ECHB)는 (주)이큐스팜에서 공급받았다. 또한, 최근에 파푸아뉴기니의 심해바닥 메타게놈으로부터 발굴된 에스터라제 EM2L8 유전자(GenBank DQ846908)를 사용하였다. 그 밖의 시약은 일반 시약급으로 구입하여 사용하였다.</p> <h2>균주, 플라스미드, 배양조건</h2> <p>Escherichia coli BL21(DE3)을 재조합 단백질의 발현 숙주로 사용하였고 E. coli XL1-Blue를 재조합 플라스미드의 보관 숙주로 사용하였다. 에스터라제 EM2L8 유전자가 삽입되어 있는 pET28 벡터(Novagen, Madison, WI) 를 효소발현을 위한 재조합 플라스미드로 사용하였다. 형질전환된 E.coli BL21(DE3)균을 카나마이신 \( \left (50 \mu \mathrm { gmL } ^ { -1 } \right ) \) 이 첨가된 LuriaBertani 배지 \( \left (10 \mathrm { gL } ^ { -1 } \right . \) 트립톤, \( 5 \mathrm { gL } ^ { -1 } \) 효모추출액, \( 5 \mathrm { gL } ^ { -1 } \) 염화 나트륨)에 접종 \( (1 \%, \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 하고 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양하였다. 배양액 의 \( \mathrm { OD } _ { 600 \mathrm { ~nm } } \) 가 0.5로 되었을 때, IPTG를 1mM 농도로 첨가 하고 20시간동안 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 계속 배양하였다. 배양액 1 리터를 원심분리하여 균체를 모은 후, 증류수 25 mL에 현탁하였다. 초음파 파쇄법으로 균체를 파쇄한 후, 원심분리를 통해 상등액을 얻었다.</p>