Table 1과 같이 흔한 식용식물들에서 유방암세포에 대한 증식저해정도를 관찰하려 각 시료를 선택 후, 1차 증류수로 세척하고, clean bench내에서 멸균한 3차 증류수로 2회 세척하여, 유발에서 찧어 즙을 얻었다. 세포성장정도를 확인하기 위해 MTT (3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)비색법을 활용해 홉광도를 측정했다. 6회 실험을 평가하여 항암효과가 있는 것으로 간주할 수 있다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험재료</h2><p>실험재료는 Table 1과 같이 식탁에서 흔히 볼 수 있는 식용식물들에서 유방암세포에 대한 증식저해정도를 관찰하고자, Table1의 각 시료를 선택하여 먼저 1차 증류수로 수회 세척하고, clean bench내에서 멸균한 3차 증류수로 2회 세척하여, 유발에서 찧어, 즙을 얻었다. 사용한 각 시료는 \( 10 \mathrm{~g} \)당 추출액의 용량이 \( 10 \mathrm{ml} \) 되게 하여 농도를 일정하게 하였다. 추출 액은 \( 0.45 \mu \) cellulose acetate 막주사형 여과기(membrane syringe filter, Corning 사)로 여과시켜 시료로 사용하였다. 실험대상세포를 배양하기 위한 시약 중 fetal bovine serum (FBS), trypsin 및 RPMI 1640 배지는 Gibco BL 제품을 사용하였다. 일반 시약은 주로 sigma사 제품을 사용하였다.</p><h2>세포배양</h2><p>본 실험에 사용한 세포는 유선 종양세포주인 MCF-7 Mammary gland adenocarcinoma cell line (MCF-7 cell)이며, 세포배양을 위해 RPMl 1640배지를 사용하여, \( 10 \% \) FBS, \( 0.075 \% \mathrm{NaHCO}_{3}\), \(100 \mathrm{units}/\mathrm{ml}\) penicilin G, (Pfizer Co.)와 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) streptomycin (Dong-a Pharm Co.)을 첨가하고 세포배양을 위한 배지로 사용하였다. 세포 배양조건은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)의 \(95\%\) air: \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 배양기 내에서 행했다. 배지는 약55시간에 신선 배지로 교환하였다.</p><h2>각 시료에 대한 실험방법</h2><p>각 시료를 각 well에 \( 50 \mu \mathrm{l}\), \(75 \mu \mathrm{l} \), \(100 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ml} \) 농도가 되게 신선한 배지 \( 160 \mu \mathrm{l}\)와 함께 첨가하고, PBS (phosphate buffered saline)로 각 well의 총 용량을 \( 180 \mu \mathrm{l} \) 되게 하였다. MCF-7 세포는 trypan blue를 사용하여 생균수를 센 후, 세포 수가 \( 4 \times 10^{3} \)개 되게 \( 20 \mu \mathrm{l} \)씩 분주하였다. 이와 같이 시료가 첨가된 배지에서의 배양세포성장 및 착상을 관찰하기 위해 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\) \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 배양기내에 서 48시간 배양하였다. 배양 후 세포성장정도를 확인하기 위해 MTT (3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)비색법으로 그 홉광도를 측정했다. 측정값은 6회 실험 예를 평간하여 얻은 결과이며, 흡광도 측정치의 감소는 살아있는 세포수의 감소, 즉 항암효과가 있는 것으로 간주할 수 있다.</p><h2>세포 수 측정</h2><p>살아있는 MCF-7 세포의 수는 trypan blue 염색법으로 행하였다. 배양세포를 \( 0.05 \% \) trpsin-EDTA로 처리하여 부유 된 세포를 취하여, \(0.5\%\) trypan blue로 염색한 후, hematocytometer로 현미경하에서 세포 수를 세어 측정하였다. 배양 세포의 수와 MTT법에 의한 실험결과의 유의성 확인에 이 방법을 이용하였다.</p><h2>MTT assay</h2><p>각 시료의 MCF-7세포에 대한 성장저해효과는 MTT비색 정량법을 이용하여 검색하였다. 이 방법은 살아있는 세포의 mitochondrial dehydrogenase에 의하여 MTT가 환원되어 청색 침전물을 형성하는 원리를 이용한 분석방법이다. 생존세포수가 많을수록 청색침전물의 량이 증가하며, 반대로 흡광도의 감소는 생존세포수의 감소를 의미한다. 검사방법은 다음과 같다.</p><p>MCF-7세포는 배양병에 부착하여 성장하므로 trypsin-EDTA로 처리 후 부유상태로 취하여 일정수의 세포를 각 well에 각각 분주한 후, 시료를 첨가하여 배양하고, \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 MTT를 각 well에 \( 50 \mu \mathrm{l} \)씩 가하고 배양기내에서 4시간 동안 방치한다. 그리고 5분간 \( 500 \mathrm{rpm} \)에서 원심분리하여 상징액을 제거하고, DMSO (dimethyl sulfoxide) \( 150 \mu \mathrm{l} \)씩 첨가하여 microplate reader를 사용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>세포형태변화</h2><p>\( 25 \mathrm{~cm} \) canted neck flask에 MCF-세포 \( 2 \times 10^{5} \)개와 신선배지 \( 10 \mathrm{ml} \)을 첨가하여 배양하였다. 세포의 착상을 위해 24시간 배양 후 배지를 조심스럽게 제거하고, 준비된 시료와 신선배지를 각각의 flask에 첨가하였다. 첨가 후 배양하면서 매일 성장세포형태를 도립현미경으로 촬영하였다. 세포형태 관찰기간동안의 배양조건은 상기 세포배양에서의 기준과 같이 행하였으며, 55시간에 신선배지의 기환(시료를 첨가한)을 행하고 시료는 각각 \( 10 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ml} \) 씩 첨가하였다.</p>