미세조류 배양 배지 조제를 위해 원심분리로 상등액을 회수 후 활성탄을 사용하여 발효저해물질이 제거된 정제된 바이오매스 가수분해물과 PG 배지 성분을 혼합 하였으며 모든 배양은 조건마다 2회 반복하고 일정 시간마다 샘플을 취하여 분석에 사용하였다. 분석에는 미세조류 수확, Cell density 측정 그리고 오일 추출 및 함량 측정 방법으로 진행한다.
<h2>미세조류 배지 및 배양 조건</h2> <p>바이오매스 가수분해물을 미세조류 배양에 사용하기 위해 바이오매스 가수분해물을 원심분리하여 상등액을 회수하여 활성탄을 사용하여 발효저해물질을 제거하였다. 정제된 바이오매스 가수분해물과 PG 배지 성분을 혼합하여 미세조류 배양 배지를 조제하였다. 바이오매스 가수분해물의 환원당의 농도는 증류수를 이용하여 희석하여 환원당의 농도가 \( 10 \mathrm { ~g } / \) 가 되도록 하였다. \( 121 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 15 \mathrm { ~min } \) 멸균하여 미세조류 배양에 사용하였다. 미세조류 배양은 shaking incubator (Vision Scientific Co., Ltd., Korea)를 이용하며, 배양 온도 는 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 교반속도 \( 120 \mathrm { rpm } \) 으로 배양하였다. 한국미세조류 은행에서 분양받은 Chlorella saccharophila (Kruger) Migula (KMMCC-195)를 본 실험에서 사용하였다. 미세조류 초기 접종량은 배지의 \( 3 \% \) 를 접종하였다. 모든 배양은 조건마다 2 회 반복하였으며, 일정 시간마다 샘플을 취하여 분석에 사용하였다.</p> <h2>분석 방법</h2> <p> <b>미세조류 수확.</b>미세조류의 지질함량 및 성분 분석을 위해 시료를 원심분리 하여 상등액은 당분석에 사용하였고, 남은 미세조류는 증류수를 사용하여 세척 과정을 2 회 반복하여 배지 성분을 제거하였다. 세척을 마친 미세조류는 동결 건조하고 분쇄하여 보관하였다.</p> <p> <b>Cell density 측정.</b>미세조류의 성장을 측정하기 위해 분광 광도계(SPEKOL 1300, Analytik Jena)를 이용해서 흡광도를 \( 660 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였으며, 표준곡선을 이용하여 건조 세포 농도로 환산하였다. 흡광도에 따른 cell 건조 중량의 표준 곡선식은 \( \mathrm { Y } = 0.5351 \mathrm { X } -0.016 \left ( \mathrm { R } ^ { 2 } =0.995 \right ) \) 이다. 이때, \( \mathrm { X } \) 는 측정된 흡광도 값이며, \( \mathrm { Y } \) 는 cell density \( ( \mathrm { g } / \mathrm { l } ) \) 이다.</p> <p> <b>오일 추출 및 함량 측정.</b>오일 추출 방법은 Bligh and Dyer method를 이용하였다. 동결 건조된 미세조류 \( 10 \mathrm { mg } \) 에 \( 5 \mathrm { ml } \) 의 DW를 첨가한 후, homogenizer를 사용해 cell을 파쇄 하였다. 파쇄된 cell에 chloroform과 methanol을 1:2 비율로 첨가한 다음 5 분간 vortexing한 후 \( 3,914 \times g \) 으로 10 분간 원심분리하여 cell debris를 제거하였다. 이후 chloroform과 \( \mathrm { DW } \) 를 1 : 1 비율로 첨가하여 5 분간 vortexing 후 다시 \( 626 \times g \) 에서 10 분간 원심분리하여 층분리하였다. 아래의 chloroform 층을 회수하여 chloroform을 제거한 후 시료를 상온에서 건조하고 무게를 측정하였다. 측정된 chloroform 층의 무게(oil 량)는 추출에 사용한 바이오매스의 초기 무게 와 비교하여 % of dcw (오일무게/건조중량 \( \times 100 \) )을 계산하였다.</p>