Bristol Fairy의 Northern blot 분석은 기존의 백색 안개초에 대한 발현 검정을 위한 기초실험으로, 다양한 색소발현체계를 가진 품종의 육성을 위해 필수적인 기초실험이다. 가장 많이 재배되고 있는 품종인 Bristol Fairy의 꽃봉오리로부터 mRNA를 분리하고 DFR cDNA를 probe로 사용하여 Northern blot 분석을 수행한 결과 \(1.3 \mathrm{~kb}\) 크기의 강한 signal을 보였고, positive control로 사용한 핑크빛 안개초의 DFR cDNA를 probe로 사용한 경우도 \(1.3 \mathrm{~kb}\) 크기의 signal을 보여주었다. Translation mixture를 정제하여 분리한 유전자의 효소활성을 측정하기 위한 DFR 활성 실험을 수행하였으며, Soutnern blot 분석 결과 안개초의 DFR 유전자는 다른 대부분의 식물체와 유사하게 한 개 존재함을 확인할 수 있었다.
<h2>백색인 Bristol Fairy의 Northern blot 분석</h2> <p>본 실험의 최종 목적은 현재 백색과 핑크색의 색소발현체계를 가진 안개초를 적합한 유전자의 형질전환을 통하여 다양한 색소발현체계를 가진 품종의 육성이므로 기존의 백색 안개초에 대한 발현 검정은 필수적인 기초실험이다. 우선 현재 가장 많이 재배되고 있는 안개초 품종인 'Bristol Fairy'에 있어 어떠한 유전자가 blocking 되어 백색을 나타내는지 검정하기 위하여 본 실험에서 분리한 안개초의 DFR cDNA를 probe로 사용하여 DFR 유전자의 발현을 Northern blot 분석을 통하여 조사하였다. 'Bristol Fairy'의 꽃봉오리로부터 mRNA를 분리하고 Northern blot 분석을 수행한 결과 Fig. 7 에서 보는 바와 같이 \( 1.3 \mathrm { ~kb } \) 크기의 강한 signal을 보였고, positive control로 사용한 핑크빛의 색소발현체계를 가진 'Flamingo'와 'Red Sea'의 경우도 동일한 결과를 나타내었다. 이러한 결과로 분석해 보면 백색의 안개초인 'Bristol Fairy'의 DFR 유전자는 적어도 flavonoid 생합성 과정에서 온전하게 발현됨을 알 수 있었다. DFR 유전자를 제외한 다른 flavonoid 생합성 관련 유전자의 blocking 가능성을 추측할 수 있는데 DFR 이후의 유전자인 ANS (anthocyanidin synthase)와 FGT (flavonoid glucosyl transferase) 유전자 중 하나가 blocking 되거나 혹은 double blocking의 가능성도 생각할 수 있다. CHS 유전자의 경우는 진화학적으로 매우 안정되어 있기 때문에 blocking될 가능성이 희박하며, CHI 유전자가 blocking될 경우는 chalcone의 축적에 의해 황색의 색소발현을 나타내므로 역시 blocking될 가능성이 적다 (Heller 1993). 적어도 본 실험에서는 DFR 유전자는 정상적으로 발현하고 있음을 증명하였고 그 밖의 유전자는 계속적으로 분리하고 있으므로 앞으로 분석을 수행할 예정이다.</p> <h2>DFR 유전자의 효소 활성 측정</h2> <p>분리한 유전자의 효소활성을 측정하기 위하여 Sephadex G50 column을 통해 Translation mixture를 정제하여 DFR 활성 실험을 수행하였다. DFR 활성은 NADPH를 cofactor로 사용하여 \( \left ( { } ^ { 14 } \mathrm { C } \right ) \)dihydrokaempferol(DHK)이 \( \left ( { } ^ { 14 } \mathrm { C } \right ) \)leucopelargonidin(Lpg)으로 전이되는 양을 TLC 위에서 측정하였다. Fig. 8의 결과에서 보는 바와 같이 translation products의 경우 작은 leucopelargonidin peak를 나타냄으로써 기대했던 DFR 효소 활성을 보였고, negative control로 reticulocyte lysate만 넣어준 경우는 전혀 효소 활성을 보이지 않았다. 반면에 positive control로 사용한 'Red Sea'의 꽃으로부터 분리한 효소를 사용한 활성 측정의 결과는 trans-lation products 보다 높은 활성을 나타내었다. 이러한 결과를 종합하면 분리한 DFR-cDNA는 진정한 DFR 유전자임을 확인할 수 있다.</p> <h1>적 요</h1> <p>Dihydroflavonol 4-reductase(DFR)는 flavonoid 생합성 경로의 가장 중심부에 작용하는 효소로 2R,3R-trans-dihydro-flavonols로부터 leucoanthocyanidins 으로의 변환을 촉매한다. 본 연구에서는 색소유전자의 전이를 통하여 새로운 색소발현체계를 가진 품종을 육종하기 위한 기초연구로 안개초 (Gypsophila paniculata L.)의 꽃봉오리로부터 cDNA-library를 합성하였고 카네이션의 DFR 유전자를 probe로 사용하여 anthocyanin 합성경로의 중요 효소의 하나인 DFR 유전자를 분리하였다. 염기서열분석을 수행하여 분리유전자의 크기가 \( 1279 \mathrm { bp } \) 이며 이 중 coding region은 \( 1063 \mathrm { bp } \)임을 확인하였다. 이미 밝혀진 다른 식물체의 DFR 유전자와 서로 염기서열의 일치성을 비교해 본 결과 Cheddar pink, 카네이션, 양배추, 개나리, 페튜니아, cup flower, 장미, 과꽃 및 거베라에서 각각 \( 62 \% \) 이상을 나타내었다. 분리유전자의 발현을 확인하기 위하여 Northern blot 분석 및 인위적으로 기내에서의 transcription과 translation을 수행하였고, 분리한 유전자의 효소활성을 측정해 본 결과 leucopelargonidin의 작은 peak를 확인하였다. Southern blot 분석 결과 안개초의 DFR 유전자는 다른 대부분의 식물체와 유사하게 한 개가 존재함을 확인하였다.</p>