동해 영일만 해안에 서식하는 홍조류 Sargassum fulvellum으로부터 Agarase를 생산하는 미생물을 분리하였다. 분리된 균체에서 genomic DNA를 추출하여 PCR 반응으로 16S rRNA를 증폭시켰다. 그 후, 진화적 거리는 Kimura’s two-parameterevolutionary model에 의해 계산하였고, 이를 바탕으로 Neighbor-Joining 방법으로 phylogenetic tree를 작성하였다. 마지막으로, DNA-DNA hybridization 분석을 위해 GNUM08120 균주와 계통발생적 유연관계가 높은 표준균주들을 LB 평판배지에서 배양하여 DNA를 추출하였다.
<h2>Agarase 생산균주의 순수 분리</h2> <p>Agarase를 생산하는 미생물을 분리하기 위해서 동해 영일만의 해안에 서식하는 홍조류 Sargassum fulvellum을 채취하였다. S. fulvellum을 멸균해수로 2 회 씻어준 후 잘게 잘라 \( 1 \mathrm { ml } \) 의 멸균수에 현탁하였다. 현탁액은 \( 10 ^ { -2 } \sim 10 ^ { -5 } \) 배로 serial dilution하여 \( 0.1 \mathrm { ml } \) 를 ASW 평판배지에 도말하여 \( 28 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5일간 배양하였다. Lugol's iodine 용액 \( (25 \mathrm { gL } \) Iodine, \( 50 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) Potassium Iodine)으로 염색하여 콜로니 주 변에 한천 분해환을 형성하는 각각의 콜로니를 agarase 생산주로서 선별하였다. 이후의 모든 배양에서는 박테리아의빠른 성장을 위하여 ASW-YP 배지를 사용하였다. 선별된 콜로니는 ASW-YP 평판배지에 도말하여 같은 조건에서 배양하였다. 생성된 콜로니를 다시 새로운 배지에 계대하는 작업을 반복하여 순수한 균주를 확보하였다.</p> <h2>16S rRNA 유전자 염기서열 분석과 계통수(phylogenetic tree) 구축</h2> <p>선별된 Agarase 생산 균주를 ASW-YP 액체배지에서 2일 간 진탕 배양 후 15,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 균체만을 회수하였다. 회수된 균체로부터 genomic DNA를 추출하여 이를 주형으로 사용하여 PCR 반응을 실시하여 16S rRNA를 코드하는 유전자 단편을 증폭하였다. PCR 반응을 위한 프라이머는 bacterial universal primer (27F와 1492R)를 사용하였으며, 증폭된 DNA 단편은 Genotech Inc.(Daejeon, Korea)에 염기서열분석을 의뢰하였다. 확보된 16S rRNA 유전자의 염기서열은 GenBank에 JN578475로 등록하였으며, National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 BlastN program (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 사용하여 GenBank의 database의 정보로부터 염기서열의 상동성 검사가 수행되었다. 또한 EzTaxondatabase (http://www.eztaxon.org/)로부터 표준 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 확보하여 계통발생적 연관성을 분석하였다. 확보된 염기서열들간의 Multi alignment는ClustalW program을 사용하였고 5’과 3’-end의 gap은GeneDoc program 으로 편집하였다. 진화적인 거리(evolutionary distance matrix)는 Kimura’s two-parameterevolutionary model에 의해 계산하였고 Neighbor-Joining 방법으로 phylogenetic tree를 작성하였다. Branch의 신뢰도(bootstrap value)는 1,000회의 재구성된 자료로부터 새롭게 tree를 작성하여 계산하였다.</p> <h2>DNA-DNA hybridization</h2> <p>DNA-DNA hybridization 분석을 위해서, GNUM08120균주와 계통발생적 유연관계가 높은 표준균주인 Alteromonas macleodii DSM6062 \( { } ^ {\mathrm { T } } \) (Y18228), Alteromonas marina SW-47 \( ^ {\mathrm { T } } \) (AF529060), Alteromonas simiduï BCRC17572 \( { } ^ {\mathrm { T } } \) (DQ836766) 등의 균주를 LB 평판배지에서 배양하여 균체로부터 DNA를 추출하여 준비하였다. Negative standard 균주로는 Staphylococcus simulans KCCM41686 \( { } ^ {\mathrm { T } } \)가 사용되었다. 탐침용 DNA 준비와 hybridization 반응은 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II(Roche Applied Science, Germany)를 사용하여 주어진 방법에 따라 수행하였다. Hybridization signal은 Quantity One Program (Bio-rad, USA)으로 측정하였고, GNUM08120 균주의 signal을 100%로 하여 표준균주들의 값을 환산하였다. 각균주들에 대한 hybridization 값은 세 번의 반복적인 실험을 통하여 계산하였다</p>