이 연구에서는 이전에 제작한 바이오센서 플라스미드(pLZCapR)를 이용하였다. 에탄올에 녹인 페놀계 화합물에 agarose로 고정된 세포를 노출시켰다. 페놀 분해정도는 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서의 흡광도로 Elisa plate reader를 사용하여 정량화하였다. 또한, agarose에 고정된 바이오센서 세포 plates을 현장으로 이동시키고, 현장의 시료에만 추가하여 페놀 화합물의 존재 여부를 색 변화를 통해 확인하였다. 마지막으로, 바이오센서로 얻은 데이터의 타당성을 검증하기 위해 KEPA (한국환경부)에서 제시하는 표준 화학적 방법을 통해 다양한 폐수 샘플에서 페놀 화합물을 분석하고 결과를 비교하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포 배양</h2> <p>Pseudomanas putida KCTC1452은 tryptic soy broth, \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 진탕 배양하였다. 형질 전환된 Escherichia coli DH5a 는 \(30 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ampicillin을 포함하는 TYS media (\( 1 \% \) tryptone, \( 0.5 \% \)yeast extract, 그리고 \( 0.5 \% \mathrm{~NaCl})\), \(37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 키웠다.</p> <h2>시약</h2>본 연구에서 사용한 시약은 모두 특급시약을 사용하였으며 대부분 Sigma-Aldrich에서 주문하여 정제 없이 사용하였다.</p> <h2>pLZCapR 바이오센서 plasmid 제작</h2> <p>바이오센서 plasmid (pLZCapR) 제작은 본 연구진의 이전 논문에 언급되었으며 제작된 plasmid를 사용하였다. 간단히, Plasmids는 Qiagen spin column kit (Qiagen, Germany)은 이용하여 정제하였으며 Cloning과 ligation은 표준 방법을 이용하여 수행하였고 plasmid pLZCapR은 \( \mathrm{CaCl}_{2} \) 방법으로 E .coli DH5a에 형질 전환하였다.</p> <h2>바이오센서 세포 고정화</h2> <p>Plasmid pLZCapR을 포함하는 DH5a 세포는 \( 30 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\) ampicillin을 포함하는 \( 4 \mathrm{ml} \) of TYS medium, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 하룻밤 진탕 배양하여 키운 다음 \( \log \) phase \( \left(\mathrm{OD}_{600 \mathrm{~nm}} 0.6-0.8\right) \)가 될 때까지 subculture하였다. 이 subculture 세포 \( (50 \mu \mathrm{l}; \times 1 \times 10^{8} \)cells/\(\mathrm{ml}\))를 녹인 agarose (최종 \( 0.2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{w}) \) agarose 농도)와 3-galactosidase 기질 \( (3 \mathrm{mM}\) CPRG)과 함께 총 \(100 \mu \mathrm{l}\) 부피가 되도록 혼합하여 곧바로 96-well plate의 wells에 분주하였다. 굳어진 후, agarose로 고정된 세포 위층을 \(100 \mu \mathrm{l}\)의 \( 50 \mathrm{mM} \) 인산완충용액 \( (\mathrm{pH} 7.0) \) 으로 덮고 뚜껑을 잘 막고 알루미늄 호일로 빛을 차단한 후 사용하기 전까지 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하였다.</p> <h2>실험 조건 최적화</h2> <p>Agarose에 고정시킨 세포를 에탄올에 녹인 다양한 페놀계 화합물에 노출시킨 후 지시한 기간 동안 유지하였다. \( \beta \)-galactosidase activity는 페놀 존재 시 CPRG 기질 분해로부터 붉은색을 나타냄으로 확인하였다. CPRG 분해는 Elisa plate reader (Versa Max, VA)을 사용하여 \( 570 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도로 정량적으로 측정하였다. 실험 조건의 최적화를 결정하기 위해, 다양한 세포수 \( \left(0.2 \sim 1 \times 10^{8}\right) \), CPRG 농도\((1\sim8 \mathrm{mM})\), 및 agarose 농도\((0.1 \sim 0.5\%)\)를 실험하였다. 확산제한 (diffusion limitation)을 최소화하기 위해, 다양한 세포주기(overnightculture, 그리고 3, 12, 48 시간 subculture 세포)의 세포를 agar-ose gels에 고정한 후, \( 50 \mathrm{mM} \) phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} 7.0)\), \(6 \% \) DMF/\(0.1 \%\) SDS, \(10 \mathrm{mM} \mathrm{~CaCl} \), 혹은 \(6\%\) DMF/\(0.1\%\) SDS/\(10 \mathrm{mM} \mathrm{~CaCl} \) 를 처리하였다. Colony forming units (CFU)은 각 세포를 연속적으로 희석한 후 TYS agar에 접종하여 결정하였다. 상대적 \( \beta \)-galactosidase activity는 \( \mathrm{OD}_{600 \mathrm{~nm}} \) 에서 측정한 같은 세포 밀도 당 CPRG 분해로 계산하였다. 페놀 화합물의 현장검출을 위해 agarose로 고정된 바이오센서 세포 plates을 현장으로 운반하여 현장시료만 첨가한 후 페놀 존재를 나타내는 색깔 변화로 관찰하였다.</p> <h2>시료 측정</h2> <p>채에 거른 모래(토양 시료로 사용)를 씻고, 멸균한 후 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)오븐에서 완전히 건조시킨 후 \( 5 \mathrm{~g} \) 을 취해 phenol (final con-centration: \( 0.5 \mathrm{mM} \))과 혼합하였다. 오염된 토양은 \( 3 \mathrm{ml} \) 물과 섞고 \( 4,000 \times \mathrm{g}\) 에서 20 분간 원심분리 하였다. \( 1 \mathrm{ml} \) 의 상층액을 따서 연속적으로 희석하여 각 희석액(각 \( 100 \mu \mathrm{l}\))을 바이오센서 세포가 있는 wells에 넣고 분석하였다. 결과는 상대 표준 검정선과 비교하여 결정하였다. 또한 인근 병원에서 구한 병원폐수 및 각종 폐수 시료도 바이오센서로 연속적으로 희석하여 전처리 없이 분석하였다.</p> <h2>페놀의 화학적 분석</h2> <p>바이오센서 데이터를 확증하기 위해 각종 폐수 중 페놀 화합물을 KEPA (한국환경부)에서 제시하는 표준 화학적 방법으로 분석하여 비교하였다. 폐수는 \( 1 \mathrm{ml} \) 이 되게 연속 희석 \( \left(10^{-1}\right. \)또는 \( 10^{-2} \) )한 다음 \( 25 \mu \mathrm{l}\) \(0.5 \mathrm{~N} \mathrm{~NH}_{4} \mathrm{OH}\), \(10 \mu \mathrm{l}\) \(2 \% \) 4-amino-antipyrine 그리고 \( 10 \mu \mathrm{l}\) \(8 \% \mathrm{~K}_{3} \mathrm{Fe}(\mathrm{CN})_{6} \) 을 순차적으로 넣어 잘 섞은 뒤 \( \mathrm{OD}_{500 \mathrm{~nm}} \) 에서 흡광도를 읽었다.</p>