세포 배양용 6 well plate에 암세포를 \( 3 \times 10 ^ { 5 } \) 개 \( / \mathrm { ml } \) 농도로 배양하고, platycodin D를 적절한 농도로 처리한 후 48시간 동안 배양하였다. 그 후, tetrazolium bromide salt (MTT)를 \( 0. 5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 농도로 희석하여 추가 배양하였다. PBS로 세척 후, 0.2%의 Triton X-100을 첨가하여 고정하고, \( 4 ^ {\prime } , 6 \)-iamidino-2-phenyl-indole (DAPI)로 염색한 후, 암세포 핵의 형태 변화를 400배 확대하여 관찰하였다.
<h2>MTT assay를 이용한 세포 생존율의 측정 및 형태의 관찰</h2> <p>세포 배양용 6 well plate에 \( 3 \times 10 ^ { 5 } \) 개 \( / \mathrm { ml } \) 로 암세포를 분주하 고 platycodin \( \mathrm { D } \) 를 배지에 희석하여 각 well 당 적정 농도로 처리하였다. 48시간 후 배지를 제거하고 tetrazolium bromide salt (MTT, Ameresco, Solon, Ohio, USA)를 \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 농도 로 희석하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 3 시간 동안 다시 배양하였다. 배양이 끝난 다음 MTT 시약을 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma)로 생성된 formazan을 모두 녹인 후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 에 서 흡 광도를 측정하였다. Platycodi \( \mathrm { D } \) 처리에 의한 \( \mathrm { U } 937 \) 세포의 형 태 변화 정도를 살펴보기 위하여 platycodin \( \mathrm { D } \) 를 적정 농도로 희석 처리하여 배양 48 시간 경과 후 도립 현미경을 이용하여 200 배의 배율로 관찰하였다.</p> <h2>DAPI staining에 의한 세포핵의 형태 관찰</h2> <p>Apoptosis가 유발되었을 경우 특이적으로 나타나는 핵의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 platycodin \( \mathrm { D } \) 가 처리된 세포 를 모은 다음 37 \% formaldehyde 용액과 PBS를 1:9의 비율로 섞은 fixing solution으로 10 분 동안 고정하였다. 고정된 세포를 cytospin을 이요하여 slide glass에 부착하였다. 세포가 부착된 slide glass를 PBS로 2 3회 정도 세척하고 PBS가 마르그전에 0.2 \%의 Triton X-100 (Amresco)을 첨가하여 상온에서 10분간 고정한 후 \( 2.5 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) 농도의 \( 4 ^ {\prime } , 6 \)-iamidino-2-phenyl-indole (DAPI, Sigma) 용액을 처리하여 상온에서 15 분간 염식하였다. 염색이 끝난 후 400 배의 배율로 각 농도에 따른 암세포의 핵의 형태 변화를 관찰하였다.</p> <h2>DNA fragmentation의 분석</h2> <p>propanol (Sigma)과 \( 100 \mu \mathrm { l } \) 의 \( 5 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } \) 를 첨가하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 은 24 시간 동안 반응시킨 후, \( 14,000 \mathrm { rpm } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 분간 원리시켜 상층액을 제거하고 DNA pellet을 추출하였다. Dpellet에 RNase A가 적당량 들어있는 TE buffer를 이용하여녹인 후, \( 6 \mathrm { X } \) gel loading dye (Bioneer, Daejeon, Korea)를주었다. 마지막으로 \( 1.6 \% \) agarose gel을 만들어서 1시간 \( 50 \mathrm { ~V } \) 로 전기영동 시킨 후 ethidium bromide \( ( \mathrm { EtBr } \), Sigma염색하여 DNA fragmentation 현상을 확인한 다음 ultralet (UV) 하에서 관찰하였다.</p>