내열성 lipase 생산균 선별을 위해 Geobacillus 속 효소 활성이 가장 높은 균주를 선별하였다. 선별된 균주를 LB 배지에서 배양한 액을 이용해 상등액을 생성하고 황산암모늄, 인산나트륨을 이용하여 조효소액을 얻었다. 효소 활성측정은 colorimetric 방법으로 표준물질 p-nitrophenyl butyrate를 사용했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 선별</h2> <p>내열성 lipase 생산균을 선별하기 위하여 genome 정보에서 lipase 유전자를 모두 보유하는 것으로 잘 알려진 Geobacillus 속의 균주를 선별 대상균주로 삼았다. Geobacillus 속 균주는 한국농업미생물자원센터(KACC)로부터 표준균주 8종(G. caldoxylosilyticus, G. gargensis, G. jurassicus, G. kaustophilus, G. lituanicus, G. pallidus, G. stearothermophilus, G. subterraneus)을 분양 받아 사용하였다. 분양 받은 미생물 중에서 지질 분해균의 선별을 위한 기질로 tributyrin을 사용하였으며 plate assay법으로 lipase 활성이 높은 균주를 선별하였다. 지질 분해균 선별 배지에 균을 접종하여 colony 주위에 투명환(clear zone)을 형성하는 것을 lipase 활성 양성균으로 선별하였고 이들을 \( 1 \% \) olive oil nutrient broth에서 배양하여 배양 상등액의 효소 활성이 가장 높은 균주를 최종 선별하여 사용하였다.</p> <h2>효소 생산</h2> <p>효소 생산을 위해 선별된 균주를 LB 배지에서 \( 50^{\circ} \mathrm{C}\), 24시간 배양한 후 이 배양액을 \( 0.5 \% \) olive oil이 함유된 최소배지 \( (0.7 \% \) \( \mathrm{NaNO}_{3}\), \(0.2 \% \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\), \(0.1 \% \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\), \(0.01 \% \mathrm{KCl}\), \(0.05 \% \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H} 2 \mathrm{O}\), \(0.001 \% \mathrm{CaCl}_{2}\), \(0.0012 \% \mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(0.01 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) Trace elements solution \( (0.026 \% \mathrm{H}_{3} \mathrm{BO}_{3}\), \(0.05 \% \mathrm{CuCl}_{2} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \), \( 0.05 \% \mathrm{MnCl}_{2} \cdot 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(0.006 \% \mathrm{Na}_{2} \mathrm{MoO}_{4} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(0.07 \% \mathrm{ZnSO}_{4} \left.7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\right)\), \(0.1 \% \) yeast extract)에 \( 1 \% \) 농도로 접종한 후 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \), 36시간 배양한 후 원심분리\( (10,000 \mathrm{~rpm}\), \(10 \mathrm{~min}) \)하여 상등액을 회수하였다. 여기에 ammonium sulfate를 \( 70 \% \)로 포화시켜 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 방치한 후 원심분리\( (10,000 \mathrm{~rpm}, 20\mathrm{~min})\)하여 얻은 침전물을 \( 50 \mathrm{mM} \) sodium phosphate \( (\mathrm{pH}6.0 \))로 투석한 것을 조효소액으로 사용하였다.</p> <h2>Lipase 활성 측정</h2> <p>효소 활성측정은 표준물질로서 p-nitrophenyl butyrate를 사용한 colorimetric 방법에 의하여 수행되었다. p-nitrophenyl butyrate (PNPB) \( 30 \mathrm{mg} \)을 2-propanol \( 10 \mathrm{ml} \)에 녹인 용액과 sodium deoxycholate (Na-DOC) \( 0.207 \mathrm{~g} \) 및 gum arabic \( 0.1 \mathrm{~g} \)을 \( 50 \mathrm{mM} \) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 6.0 )\) \( 90 \mathrm{ml} \)에 녹인 용액을 혼합하고 혼합한 용액 \( 2 \mathrm{ml} \)에 효소액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)을 가하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응한 후 \( 2 \mathrm{M} \mathrm{~Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 용액 \( 0.9 \mathrm{ml} \)를 가하여 반응을 중지시켰다. Lipase 활성은 생성된 p-nitrophenol의 양을 \( 410 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 다른 lipase 활성 측정법으로 Kwon 등의 방법을 변형하여 사용하였다. 기질은 emulsion stock solution (\(50 \mathrm{mM}\) Tris- \( \mathrm{HCl} \mathrm{~pH} 7.0 \) buffer, \( 20 \mathrm{mM} \mathrm{~CaCl}_ 2\), \(1 \mathrm{mM} \) deoxycholate, \( 5 \% \) gum arabic을 함유)에 \( 5 \% \) olive oil을 첨가한 후, homogenizer를 이용하여 유화시켜서 사용하였다. 효소활성측정은 기질 \( 2 \mathrm{ml} \)에 효소액 \( 0.2 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 진탕 배양수조에서 \( 200 \mathrm{rpm} \)으로 진탕하면서 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 첨가하여 신탕 배양수조에서 \( 200 \mathrm{rpm} \)으로 진탕하면서 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \), 1시간 동안 반응시켰다. 효소반응 정지액으로 \( 6 \mathrm{~N} \mathrm{~HCl} ~0.5 \) \( \mathrm{ml} \)을 첨가한 후, 유리 지방산을 용해하기 위하여 isooctane \( 5 \mathrm{ml} \)을 넣어서 혼합한 다음 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 처리하였다. 분리한 isooctane 층에 발색제인 copper reagent (\( 5\% \) cupric acetate를 조제하여 Whatman 여과지로 여과한 후 pyridine으로 \( \mathrm{pH} 6.1 \)로 조정) \( 1 \mathrm{ml} \)을 첨가하여 90초간 vortex한 후 흡광도 \( 715 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. Lipase 활성 측정은 colorimetric 방법과 Kwon 등의 방법을 병행하여 사용하였고 두 가지 측정값의 평균값을 사용하였다. Lipase의 \( 1\mathrm{unit}\)는 1분 동안에 \( 1 \mu \mathrm{mol} \)의 유리지방산을 생산하는 효소 양으로 나타내었다.</p>