다양한 배지(PDB, YM, MCM, PMP, MY 등)를 활용하여 선택된 배지의 온도를 \( 5 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 간격으로 15 \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \), pH는 \( 0. 5 \) 간격으로 \( 4. 0 \sim 9. 0 \)으로 조절하고, 125 rpm으로 10일 간 진탕배양을 수행하였다. 또한, 같은 배지를 사용하여 100\(\sim\)175 rpm의 범위에서 25 rpm 간격으로 조절하여, \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)와 \( \mathrm { pH } 5. 5 \)에서 10일 간 배양하였으며, 이를 1일 간격으로 15일 간 진행하였다. 항체 활성은 Mayer 방법으로 측정하였다.
<h2>배양 배지</h2> <p>적정 기본 배지를 선별하기 위하여 PDB (potato dextrose brothe), YM (yeast malt), MCM (mushroom complete medium), PMP (potato malt peptone), 및 MY (malt yeast) 등의 배지를 이용하였다. 각 배지의 조성 \( ( \mathrm { g } / \mathrm { l } ) \) 은 다음과 같다. PDB: potato dextrose broth 24; YM: yeast extract 3, malt extract 3 , peptone 5, dextrose 10; MCM: glucose 20, yeast extract 2, peptone 2, \( \mathrm { K } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } 1, \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } 0.46, \mathrm { MgSO } _ { 4 } 0.5 \); PMP: potato dextrose broth 24, malt extract 10, peptone 1; MY: malt extract 20, yeast extract 2이며, \( \mathrm { pH } \) 는 멸균전 \( 4.5 \)로 조절하였다.</p> <h2>\( \mathrm { pH } \) 및 온도에 따른 배양</h2> <p>상기에 선택된 배지를 사용하여 온도는 \( 5 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 간격으로 15 \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로, \( \mathrm { pH } \)는 \( 0.5 \) 간격으로 \( 4.0 \sim 9.0 \)으로 조절하여 \( 125 \mathrm { rpm } \)으로 10 일간 진탕배양하였다. 배양 후 원심분리하여 균사체를 회수하고 냉동건조하여 균사체의 건조중량을 측정하였고, 배양액은 에탄올 침전하여 다당체를 회수하고 냉동건조하여 다당체의 건조중량을 구하였다.</p> <h2>교반속도 및 배양기간 따른 배양</h2> <p>상기에 선택된 배지를 사용하여 \( 25 \mathrm { rpm } \) 간격으로 \( 100 \sim 175 \mathrm { rpm } \)로 조절하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)와 \( \mathrm { pH } 5.5 \)에서 10 일간 배양하였으며, 배양기간별 실험은 1일 간격으로 15일간 배양하였다. 배양 후 균사체는 냉동건조하여 건조중량을 구하였고, 배양액은 에탄올 침전하여 다당체를 회수하고 냉동건조 후 다당체의 회수율을 구하였다.</p> <h2>항보체 활성의 측정</h2> <p>항보체 활성은 Mayer 법 으로 측정하였다. NHS (normal human serum), \( \mathrm { GVB } ^ { 2 + } \) \(( \)gelatine veronal buffered saline, \( \mathrm { pH } \) \( 7.2) \) 와 세포내, 외 다당체 \( (100,500 \) 및 \( 1,000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 를 각각 \( 50 \mu \mathrm { l } \)씩 혼합하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30분간 반웅시킨 후 반응액에 \( \mathrm { GVB } ^ { 2 + } \)를 \( 350 \mathrm {\mu \mathrm { l } } \)씩 첨가하고, 이를 10배에서 160배까지 연속 희석하여 \( 750 \mathrm {\mu \mathrm { l } } \)의 \( \mathrm { GVB } ^ { 2 + } \)와 양의 감작혈구 \( \left (1 \times 10 ^ { 8 } \right . \) \( \mathrm { cells/ml } \) )를 \( 250 \mathrm {\mu \mathrm { l } } \)씩 첨가하여 1시간동안 반응시킨 다음 PBS를 \( 2.5 \mathrm { ml } \)씩 가하여 원심분리 후 상등액을 흡광도 \( 412 \mathrm { ~nm } \)에서 측정하였다. 한편 대조구는 동일조건에서 시료를 함유하지 않은채 측정하였으며 항보체 활성은 대조구 대비 총보체 용혈( \( 50 \% \) of total complement hemolysis, \( \mathrm { TCH } _ { 50 } \) )의 저지율(inhibition of \( \mathrm { TCH } _ { 50 } , \mathrm { ITCH } _ { 50 } \) )로 나타내었다. Positive 물질은 LPS (lipopolysaccharide)를 사용하였다.</p>