본문 3에 대한 요약: N-bromosuccinimide는 특정 조건 하에서 효소의 tryptophan을 선택적으로 수정한다. N-bromosuccinimide의 다양한 농도를 효소와 반응시켰을 때, 효소 활성의 감소는 pseudo first-order kinetics을 따르며, 이는 N-bromosuccinimide의 농도에 따라 달라진다. 그래프를 통해 N-bromosuccinimide의 농도와 inhibitionrate \( K_ {\mathrm { i } } \) 사이의 직선 관계를 확인할 수 있으며, 이는 N-bromosuccinimide에 의한 효소 수정이 단순 이분자 반응임을 시사한다. 최종적으로 직선의 기울기 \( n=0.99 \)는 효소 활성에 1개의 tryptophan 잔기가 필요함을 암시한다.
<h2>N-bromosuccinimide에 의한 효소활성저해</h2> <p>N-bromosuccinimide는 매우 선택적으로 tryptophan을 수식한다. Fig. 2(A)에 나타낸 바와 같이 여러 가지 농도의 N-bromosuccinimide를 효소와 반응시켰을 때 시간이 지남에 따라 효소활성이 소실됨을 알 수 있었고 효소 실활은 N-bromosuccinimide의 농도에 따라 pseudo first-order kinetics의 양상을 나타내었다. N-bromosuccinimide의 농도와 inhibitionrate \( K_ {\mathrm { i } } \)와의 관계를 도식화하였을 때 Fig. 2(B)와 같이 직선관계를 보여주었는데 이는 N-bromosuccinimide에 의한 효소의 수식이 단순 이분자반응임을 나타낸다. 이 수식반응의 second-order rate constant는 \( 1.05 \times 10 ^ { 3 } \mathrm { ~min } ^ { -1 } \mathrm { M } ^ { -1 } \)로 계산되었다. N-bromosuccinimide와 반응하는 tryptophan 잔기의 수를 결정하기 위하여 실활과정을 다음과 같이 표시하였다.</p> <p>xylanase \( + \mathrm { nN } \)-bromosuccinimide \( \rightarrow \) (xylanase-N-bromosuccinimide \( )_ { n } \)</p> <p>여기서 (xylanase-N-bromosuccinimide) \( n \)은 N-bromosuccinimide에 의해 수식된 효소를 나타내고 \( n \)은 효소를 불활성화하는데 필요한 tryptophan 잔기와 반응하는 N-bromosuccinimide의 mol 수를 나타낸다. 실활속도는 다음과 같이 표시할 수 있다.</p> <p>\( - \mathrm { d } [ \) xylanase \( ] / \mathrm { dt } = K_ { i } [x y \) lanase \( ][N \text { -bromosuccinimide } ] ^ { n } \)</p> <p>만일 [N-bromosuccinimide] \( >>\) [xylanase]라면 윗 식은 다음과 같이 적분할 수 있다.</p> <p>\( \log K_ {\text { iobs } } =n \log \) [N-bromosuccinimide \(] + \log K_ {\mathrm { i } } \)</p> <p>따라서 \( \log K_ {\text { iobs } } \)와 \( \log \) [N-bromosuccinimide \(] \)와의 관계를 도식화하면 그 직선의 기울기로 \( n \)값을 알 수 있다. \( \log K_ {\text { iobs } } \)와 \( \log \) [N-bromosuccinimide \(] \)와의 관계를 도식화 한 것을 Fig. 2(C)에 나타내었는데 이 직선의 기울기 \( n=0.99 \)로부터 1개의 tryptophan 잔기가 효소활성에 요구되는 것을 알 수 있었다.</p> <p>한편 화학수식제에 의해 수식되지 않은 효소의 \( K_ {\mathrm { m } } \) 값을 Lineweaver-Burk plot으로 측정한 결과 \( 1.56 \mathrm { ~mg } / \mathrm { ml } \)로 계산되었으나 N-bromosuccinimide에 의해 수식된 효소의 \( K_ {\mathrm { m } } \) 값은 \( 81.12 \mathrm { ~mg } / \mathrm { ml } \)로 계산되어 수식되지 않은 효소의 \( K_ {\mathrm { m } } \)값과 비교하였을 경우 50배 이상 증가함을 알 수 있었다(data not shown). 이는 tryptophan이 기질의 결합에 관여하며 tryptophan이 수식됨에 따라 기질의 친화도가 감소함에 따라 \( K_ {\mathrm { m } } \)값이 증가하였음을 의미한다.</p>