소포자 확보를 위한 고추 재료는 목원대 김문자교수 실험실에서 시료를 확보하였으여 밀양재래 품종을 사용하였고 형질전환을 위해 전처리 완료된 소포자를 이용 하여 Cefotxaxime 과 Kanamycin두 종류의 항생제 내성 정도를 농도별로 screening 하였으며 형질전환에 사용한 벡터에는 mGFP5-ER 를 함유한 Agrobacterium strain EHA105에 transformation 시켰다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물재료</h2> <p>소포자 확보를 위한 고추 (Capsicum Annuum L.) 재료는 밀양재래 품종을 사용하였으며 목원대 김문자교수 실험실에서 시료를 확보하였다. 약의 채취 방법, 소포자 분리 및 확보, 소포자 전처리과정, 소포자 배양 방법은 목원대에서 사용하는 방법을 이용하였다.</p> <h2>고추 소포자의 Kanamycin 및 Cefotaxim 내성 조사</h2> <p>소포자 형질전환을 위해 전처리가 완료된 소포자를 이용 하여 Kanamycin과 Cefotxaxime 두 종류의 항생제 내성 정도 를 농도별로 screening 하였다. 형질전환에 사용되는 선발 마커는 NPTII 유전자를 이용하기 때문에 전처리 과정을 거친 소포자에 Kanamycin 적응력을 시험하고자 0,5,10,20,50, \( 100 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 농도로 처리 하였다. Agrobacterium의 오염 및 성장을 억제시키기 위한 Cefotaxime은 0, 50, 100, \( 200 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 농도로 처리하였다. 각각의 처리구에 대하여 배양 2일째와 6일째에 소포자의 활력을 FDA 용액을 이용하여 조사하였다.</p> <h2>Agrobacterium 을 이용한 소포자 형질전환</h2> <p>밀도가 \( 2 \times 10^{5} / \mathrm{mL} \)인 소포자를 \( 90 \times 15 \mathrm{~mm} \) Petri dish에 \( 8 \mathrm{~m} 1 \)씩 분주하여 \( 31^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일간 암상태에서 배양하였다. 형질전환에 사용한 벡터에는 GFP 유전자인 mGFP5-ER 를 함유하고 있으며 Agrobacterium strain EHA105에 transformation 시켰다. Agrobacterium EHA105를 공동배양하기 위해서 Agrobacterium 을 \( \mathrm{OD}_{600 \mathrm{~nm}} \) 값 0.2까지 배양한 후 \( 200 u \mathrm{M} \) acetosyringone을 넣고, 전처리가 완료된 \( 2 \times 10^{5} / \mathrm{mL} \)인 소포자를 sucrose가 포함된 NLNS 치상배지 내에서 \( 8 \mathrm{~mL} \)의 소포자에 \( 40 \mathrm{\mu l} \)의 Agrobacterum 을 접종하여 1일간 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 조건에서 공동배양 하였다. 공동배양 후 \( 500 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)의 cefotaxime이 함유된 치상 배지로 3회 \( 1000 \mathrm{rpm} \) 으로 씻어주었다. Kanamycin \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \), cefotaxime \( 400 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 함유된 NLNS 치상배지에 소포자 0.5\( \times 10^{5} / \mathrm{mL} \)의 밀도로 \( 3 \mathrm{~mL} \)씩 \( 60 \times 15 \mathrm{~mm} \)의 Petri dish에 분주 하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 암배양을 통하여 소포자 배를 유도하였다. 치상 배지 7-14일 경과부터 형광현미경의 GFP filter \( (510-550 \mathrm{~nm}) \)를 이용하여 GFP 유전자의 발현을 관찰하였다.</p>