본 연구는 볏짚으로부터 B. coagulans을 빠르게 분리하는 방법을 개발하였으며, \( 16 \mathrm { S } \mathrm { ~rRNA } \) 염기서열 분석을 통해 B.coagulans의 근연종을 구분해내었다. \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서의 집적배양, \( \mathrm { CaCO } _ { 3 } \) 첨가배지를 이용한 Bacillus 속 균주의 제거, SF agar를 이용한 Enterococcus 속 균주의 제거를 통해 빠르고 정확하게 B.coagulans를 선발할 수 있었다.
<p>Bacillus 속 bacteria에는 \( 16 \mathrm { S } \mathrm { ~rRNA } \) 유전자 염기서열 상동성이 \( 99 \% \) 이상인 계통발생학적 근연종이 존재하는 경우가 있어, 동정의 신뢰성 확보를 위하여 근연종과의 \( 16 \mathrm { S } \mathrm { ~rRNA } \) 유전자 상동성을 분석하였다. B. coagulans \( \mathrm { C } 4 \)는 근연종 Bacillus smithii PR3와 \( 95 \% \), Bacillus jeotgali BVC61와 \( 94 \% \) 수준의 상동성을 나타내었고, 발효식품에서 자주 검출되는 다른 Bacillus 속 bacteria와도 \( 93 \% \) 수준의 상동성을 나타내었다. B. coagulans 균주 및 근연종의 \( 16 \mathrm { S } \mathrm { ~rRNA } \) 유전자를 ClustalW multiple sequence alignment program을 이용하여 나열한 결과, B. coagulans C4의 염기서열 기준으로 59-89 \( \text { bp } \) 구간 및 180-214 \( \text { bp } \) 구간에서 확연히 구분되는 두 곳의 변이영역(variable region)의 존재가 확인되었다(Fig. 2). 따라서 \( 16 \mathrm { S } \mathrm { ~rRNA } \) 염기서열 분석은 B. coagulans의 근연종과의 구분에 충분한 효용성이 있는 것으로 확인되었다.</p> <p>\( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 집적배양의 결과, B. coagulans와 함께 Bacillus 및 Enterococcus 속 균주가 검출됨에 따라, 유산 생성 유무에 따른 Bacillus 속의 제거와 E. faecalis 검출배지 Streptococcus faecalis(SF) agar(MBcell, Korea)를 사용한 Enterococcus 속 균주의 제거를 시도하였다. 유산 생성의 확인에는 \( 0.7 \% \) \( \mathrm { CaCO } _ { 3 } ( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \)가 첨가된 MRS agar(Difco)를 이용하였고, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 배양하여 불용성의 상태로 존재하던 배지 중의 \( \mathrm { CaCO } _ { 3 } \)가 생성된 유산에 의해 투명환(clear zone)을 생성하는 콜로니를 선발하였다. 유산 생성 균주들 중, SF agar를 이용한 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 24시간 배양에서 생장하는 균주를 Enterococcus 속으로 간주하였다.</p> <p>\( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 3일간의 집적배양을 통해 각 시료로부터 순수분리한 총 120 균주를 유산 생성을 확인할 수 있는 \( \mathrm { CaCO } _ { 3 } \) 첨가배지에서 배양한 결과, 각 시료에서 분리된 균주들의 \( 60 \% \)에서 \( 83 \% \)가 투명환을 형성하여 유산을 생성하는 것으로 나타났다(Table 1). 2차 선발에서 확보된 균주들을 SF agar에서 배양한 결과, 1차 선발에서 분리된 균주들의 \( 20 \% \)에서 \( 50 \% \)가 선발되었다. 각 시료로부터 최종적으로 선발된 42균주의 \( 16 \mathrm { S } \mathrm { ~rRNA } \) 유전자 염기서열 분석을 통한 동정 결과, 모두 B. coagulans로 확인되었다. 따라서 본 연구에서 수행한 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서의 집적배양, \( \mathrm { CaCO } _ { 3 } \) 첨가배지를 이용한 Bacillus 속 균주의 제거, SF agar를 이용한 Enterococcus 속 균주의 제거는 B. coagulans 선발을 위한 빠르고 정확한 방법이 될 수 있는 것으로 확인되었다.</p> <h1>요 약</h1> <p>Bacillus coagulans는 프로바이오틱스 및 내열성 생물소재의 생산에 활용 가능성이 높은 미생물로 주목받고 있지만, 우리나라에서는 관심의 대상이 되지 못하고 있으며 상용화된 바 없다. 따라서 기능연구를 통한 산업화 대상 균주가 국내에는 충분히 확보되지 못한 상태에 있다. 본 연구자들은 미래 활용을 위한 B. coagulans의 확보를 위하여 볏짚으로부터 B. coagulans의 빠른 분리법을 개발하였다. \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서의 집적배양, 산 생성 확인을 통한 Bacillus 속 균주의 제거, 선택배지를 이용한 enterococci 균주의 제거는 B. coagulans 선발을 위한 빠르고 정확한 방법이 될 수 있는 것으로 확인되었다.</p>