배양이 끝난 세포를 3회 PBS로 세척한 후 iNOS, COX-2는 cytosolic lysis buffer, NF-\( \kappa B \mathrm{p} 65 \)의 경우 nucleus lysis buffer를 첨가하여 lysis시켜 원심분리 하였다. 분리된 단백질을 전사시켜 blocking 후 단백질 밴드를 확인하여 발현량을 측정하였다. MAPKs의 발현에 관련된 밀배아유의 억제 효과를 조사하기 위해 세포를 배양하였고 iNOS, COX-2 및 NF-\( \kappa B \mathrm{p} 65 \)와 동일한 방법으로 실험을 진행했다.
<h2>iNOS, COX-2 및 NF-KB p65 발현량 측정</h2> <p>배양이 끝난 세포를 수집하여 3회 PBS (phosphate buffered saline)로 세척한 후, iNOS 및 COX- 2 의 경우 cytosolic lysis buffer [50 mM HEPES (pH 7.4), \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \), \( 5 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 1 \% \) deoxycholate, \( 5 \mathrm{mM} \) phenylmethylsulfonyl fluoride, \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) aprotinin, 1\% Triton X-100, 0.1\% NP-40]를 이용하였으며, \( \mathrm{NF}-\kappa \mathrm{B} \) p65의 경우 nucleus lysis buffer (10 mM HEPES, \( 100 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 1.5 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2} \), \( 0.1 \mathrm{mM} \mathrm{EDTA}, 0.1 \mathrm{mM} \) dithiothreitol)를 첨가하여 30 분간 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 lysis 시킨 후, \( 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 20 분간 원심분리 하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 \( \mathrm{BCA} \) protein assay kit (Pierce, USA)를 사용하여 정량하였으며, \( 30 \mu \mathrm{l} \) 의 lysate를 \( 10 \% \mathrm{SDS}-\mathrm{PAGE} \) 로 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane (Bio-Rad)에 \( 200 \mathrm{~mA} \) 에서 1 시간 동안 전사시킨 후, \( 5 \% \) skim milk가 포함된 TBSS (tris buffered saline; \( \mathrm{pH} \) 7.5) 용액으로 상온에서 2 시간 동안 blocking 하였다. iNOS, COX-2 및 \( \mathrm{NF}-\kappa \mathrm{B} \) p65의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS, COX-2 및 NF-кB p65를 사용하여 1:500으로 희석하고 상온에서 2 시간 반응시킨 후 TBSS로 3회 세정하였다. 2차 항체로 horseradish peroxidase가 결합된 anti-mouse IgG 및 anti-rabbit IgG를 1:2,000으로 희석하여 상온에서 1 시간 반응시킨 후 TBSS로 3 회 세정하여 ECL 기질과 \( 1-3 \) 분간 반응 후 각각의 단백질 밴드는 Gene tool (GeneGnome5, Syngene, UK)을 이용하여 가시화하였다.</p> <h2>MAPKs 측정</h2> <p>MAPKs의 발현에 미치는 밀배아유의 억제 효과를 알아보기 위해 RAW \( 264.7 \) 세포를 DMEM 배지를 이용하여 \( 1 \times 10^{6} \mathrm{cells} / \mathrm{ml} \) 으로 18 시간 전 배양 하고 LPS를 단독 또는 밀배아유 \( (0.1,1,10,50,100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 와 함께 처리하여 30 분동안 본 배양 하였으며, 이후의 실험은 iNOS, COX-2 및 NF-\( \kappa B \mathrm{p} 65 \) 와 동일한 방법으로 진행하였다. p-JNK, p-ERK 및 p-p38의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse p-JNK, p-ERK 및 p-p38을 이용하여 1:500으로 희석하여 사용하였다.</p>