C-fermentati SI는 재래식 된장에서 직접 분리한 균주로서, plasmid의 조작, 보존 및 추출을 하고, pPICZA plasmid을 사용하여 재조합 단백질의 고 발현을 위한 host로서 사용하였다. C-fermentati SI로부터 정제된 단백질의 \( \mathrm{N} \)-말단의 아미노산 서열과 pPICZA plasmid의 DNA 염기서열과 Pichia pastoris X-33의 형질전환, 형질전환주의 단백질 발현 유도를 진행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주의 선발 및 사용된 plasmid</h2> <p>실험에 사용된 C. fermentati SI는 경북 일대에서 수집한 재래식 된장에서 직접 분리한 균주로서, 내염성이 높고 isoflavone glucosidase를 생산하는 능력이 우수한 균주이다. Escherichia coli TOP10F'는 plasmid의 조작, 보존 및 추출을 위하여 사용되었으며, P. pastoris X-33은 재조합 단백질의 고 발현을 위한 host로서 사용하였다. P. pastoris X-33 을 이용한 재조합 단백질의 고 발현을 위한 plasmid로서 pPICZA plasmid (Invitrogen, USA)를 사용하였다.</p> <h2>DNA 염기서열 및 아미노산 서열의 분석</h2> <p>C. fermentati \( \mathrm{SI} \) 로부터 정제된 단백질은 한국기초과학지원연구원에 의뢰하여 \( \mathrm{N} \)-말단의 아미노산 지기의 서열을 결정하였고, DNA 염기 서열의 결정은 Bioneer사(Korea)에 의뢰하여 분석하였다. 분석된 단편을 이용하여 미지의 염기서열을 찾기 위해서 inverse PCR을 통한 primer walking 법을 사용하였다. 염기서열이 결정된 DNA 단편의 결과로부터 각 말단의 염기서열을 기초로 양방향 primer를 제작하였으며, inverse PCR에 의한 양방향의 염기서열의 분석은 Bioneer사(Korea)에 의뢰하여 분석하였다. 염기서열결과에 대한 open reading frames (ORFs)의 검색은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)서 운영하는 ORF finder (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf.html)를 사용하여 조사하였다. DNA의 염기서열의 분석 및 단백질 아미노산 서열의 상동성의 검색은 BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov. BLAST)를 이용하였다.</p> <h2>Pichia pastoris X-33의 형질전환</h2> <p>P. pastoris \( \mathrm{X}-33 \) 의 형질전환을 위한 competent cell은 \( \mathrm{YPD} \) 배지에서 \( \mathrm{OD}_{600} \fallingdotseq 1.3-1.5 \) 가 될 때까지 배양 원심집균한 균체를 \( 0^{\circ} \mathrm{C} \) 로 냉각된 멸균 증류수로 2 차례 세척한 후, \( 0^{\circ} \mathrm{C} \) 로 냉각된 \( 1 \mathrm{M} \) sorbitol 다시 한번 세척한 후, 원심 집균하고 이를 \( 1 \mathrm{M} \) sorbitol 용액에 현탁하여 P. pastoris X-33의 competent cell로 사용하였다. 준비된 competent cell을 \( C \). fermentati SI의 exo- \( \beta \)-1,3-glucanase gene이 삽입되어 있는 plasmid와 섞은 후 electroporator (Bio-Rad, Gene pulser X-cell)를 이용하여 electroporation을 실시하였다.</p> <h2>형질전환주의 단백질 발현 유도</h2> <p>형질전환 된 P. pastoris \( \mathrm{X}-33 \) 의 발현을 위하여 먼저 BMGY 배지에 exo-1,3- \( \beta \)-glucanase 유전자가 삽입된 \( P \). pastoris \( \mathrm{X}-33 \) 을 접종 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 배양한 뒤 원심 분리하여, 균체를 취한 후 새로운 BMMY 배지에 현탁하였다. 그 후 24 시간마다 methanol을 \( 0.5 \% \) 가 되게 첨가하여 효소의 생산을 유도하다. 유도된 재조합 단백질의 정제는 Ni-NTA Agarose resin(Qiagen, Germany)을 이용하여 제조사의 추천 방법에 따라 정제하였다.</p>