PC3 세포의 글루타민 결핍에 의한 증식억제와 apoptosis 유도에 대한 연관성을 조사하기 위해 DAPI 염색과 flow cytometry 분석을 수행하였다. PC3 세포들의 RNA를 분리하여 RT-PCR에 사용하였고, Western blot analysis을 위해 원심분리와 전기영동을 통해 분리 후 X-ray film을 이용해 특정단백질 양을 분석하였다.
<h2>DAPI staining 및 flow cytometry 분석</h2> <p>글루타민 결핍에 의한 PC3 세포의 증식억제가 apoptosis 유도와 연관성이 있는지의 여부를 조사하기 위하여 \( 4 ^ {\prime } , 6 \)-dia-midino-2-phenylindole (DAPI) 염색을 이용한 핵의 형태적 변화를 관찰하였다. 이를 위하여 동일 즉건에서 배양된 PC3 세포를 37% formaldehyde 용액과 PBS를 1: 9 의 비율로 섞은 fixing solution을 이용하여 상온에서 10 분 동안 고정하였다. 이들 세포를 PBS로 2~3회 washing하고 0.2%의 triton X-100 (Amresco)을 첨가하여 상온에서 10 분간 고정한 후, DAPI (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 용액으로 염색시켰다. 15 분 정도 염색시킨 후, mounting solution을 처리한 후 형광 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 400 배의 배율로 핵의 형태 변화를 관찰하였다. 아울러 세포주기 진행에 미치는 영향의 분석을 위해서는 글루타민이 결핍된 배지에서 적정시간 동안 배양시킨 PC3 세포들을 CycleTEST PLUS DNA REAGENT Kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 고정 및 염색을 하여 4℃, 암실에서 30 분 동안 반응을 시킨 다음 DNA flow cytometry (Becton Dickinson)에 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 분석하였다.</p> <h2>RT-PCR 및 Western blot analysis</h2> <p>Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 을 위하여 준비된 PC3 세포들의 RNA를 TRIzol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA)를 이용하여 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, 각각의 primer, DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭하였다. 각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하여 1× TAE buffer로 1% agarose gel을 만들고 well당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 loading 한 후 50V에서 전기영동을 행하였다. 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 ethidium bromide (EtBr)을 이용하여 염색한 후 UV 하에서 발현의 차이를 확인하였으며, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 internal control로 사용하였다. 또한 Western blot analysis를 위하여 동일 조건에서 배양된 PC3 세포에 적당량의 lysis buffer [25 mM Tris-Cl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 5mM EDTA, 1% NP-40, 1mM phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), 5 \( \mathrm { mM } \) dithiothreitol (DTT)]를 첨가하여 4℃에서 30분간 반응시 킨 후, 14,000rpm으로 30 분간 원심분리하여 그 상층액을 취하 였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 정량한 다음 Laemmli sample buffer (Bio-Rad)를 섞어서 sample을 만들었다. 이렇게 만든 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA으로 전이시킨 후, 해당 항체를 처리하여 한 후 Enhanced Chemiluminoesence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 암실에 서 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다.</p>