본문에서는 가정에서 수집된 된장으로부터 \( \beta \)-galactosidase 활성을 갖는 균을 탐색했고, 분리한 균주의 탄수화물 이용능과 생화학적 특성 및 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 동정했다. 분리균으로 부터 조효소액을 만들고 이를 가지고 반응특성 분석을 진행했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>\( \beta \)-galactosidase 생산균의 탐색</h2> <p>Spizizen 최소배지[25]의 탄소원인 포도당과 sodium citrate 및 질소원인 ammonium sulfate 대신에 대두분 \((1\%)\) 이 첨가된 변형 배지 \( \left(\mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}, 7 \mathrm{~g} ; \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 1.5 \mathrm{~g} ; \mathrm{MgSO}_{4}\right. \). \( 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.5 \mathrm{~g} ; \mathrm{MnCl}_{2} \cdot 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.04 \mathrm{~g} ; \mathrm{CaCl}_{2} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.003 \mathrm{~g} \); \( \mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.0025 \mathrm{~g} ;\left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{6} \mathrm{Mo}_{7} \mathrm{O}_{24} \cdot 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.002 \mathrm{~g} \); water, \( 1 \mathrm{~L} \) )에 가정에서 수집된 된장을 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 약 3일간 진탕 배양하고 동일한 배지에 3-4일 간격으로 3회 계대 배양을 실시하였다. 최종적으로 계대 배양액을 동일한 성분의 평판배지에 도말하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4일간 배양한 후 형성된 콜로니 중에서 서로 다른 모양을 보이는 콜로니를 채취하였다. 이들 분리균을 LB 액체 배지에서 24시간 동안 진탕 배양한 후 배양상등액을 회수하여 \( 1 \mathrm{mM} \) para-nitrophenyl- \( \beta \)-D-galactopyranoside (pNP- \( \beta \mathrm{Gal} \); Sigma, USA)을 포함한 \( 20 \mathrm{mM} \) sodium phosphate 완충액 \( (\mathrm{pH} \) 6.0)에 첨가하고 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2시간 동안 방치한 후 반응액의 색깔을 관찰함으로써 \( \beta \)-galactosidase 활성을 갖는 균을 탐색하였다.</p> <h2>분리균주의 동정</h2> <p>그람염색과 포자염색을 통해 분리균의 형태를 조사하였으며, 균체 현탁액을 API 20E와 API 50CHB (Biomereux사, France) kits에 제조사의 지침을 따라 접종하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하면서 1일과 2일째 각각 관찰하여 탄수화물 이용능과 생화학적 특성을 판별하였다. 분리균의 총 염색체 DNA를 주형으로 하고, 세균의 16S rRNA 유전자의 보존적 지역의 염기서열 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (E. coli 16S rRNA 유전자 염기서열 8-27), 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT- 3' (E. coli 16S rRNA 유전자 염기서열 1492-1510)을 primer로 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시한 후 증폭된 PCR 산물을 정제하여 분리균의 16S rRNA 염기서열을 분석하였다.</p> <h2>\( \beta \)-galactosidase 조효소액 제조</h2> <p>분리균 B. licheniformis YB-1414를 LB 배지에서 16시간 동안 배양한 배양액을 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 가 되도록 동일 성분의 본 배양액에 접종하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 36시간 동안 진탕 배양하였다. 원심분리하여 얻은 배양상등액을 ammonium sulfate \((25-75\%)\)로 처리하고 침전된 단백질을 \( 10 \mathrm{mM} \) sodium phosphate 완충액 \( (\mathrm{pH} \) 6.0)에 현탁하여 동일 완충액으로 투석한 후 조효소액으로 사용하였다.</p> <h2>\( \beta \)-galactosidase 반응특성 분석</h2> <p>\( \beta \)-galactosidase 활성을 결정하기 위해서는 \( 1 \mathrm{mM} \mathrm{pNP} \) - \( \beta \mathrm{Gal} \) 과 \( 50 \mathrm{mM} \) sodium phosphate 완충액 \( (\mathrm{pH} 6.0) \) 을 포함한 반응액에 효소를 첨가하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 반응시킨 후 반응액의 2배 부피의 \( 1 \mathrm{M} \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 용액을 첨가하여 반응을 종결시키고 \( 405 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. para-nitrophenol (pNP)을 표준물질로 하여 얻은 검량곡선을 사용하여 효소 반응에 의해 생성된 \( \mathrm{pNP} \) 의 양을 결정하였다. 효소의 활성도 1 unit는 1분 동안 \( 1 \mu \mathrm{mol} \) 의 \( \mathrm{pNP} \) 를 유리시키는 효소량으로 정의하였다. 효소 활성에 미치는 반응 온도와 \( \mathrm{pH} \) 의 영향을 조사하기 위하여 \( 30-70^{\circ} \mathrm{C} \) 와 \( \mathrm{pH} 5.0-8.0 \) 의 범위에서 각각 \( \beta \)-galactosidase 활성을 측정하였다. \( \beta \)-galactosidase의 열 안정성을 조사하기 위하여 조효소액을 서로 다른 온도에서 일정시간 방치한 후 잔존활성을 측정하였다. \( \beta \)-galactosidase에 의한 최종 가수분해산물을 조사하기 위해 lactose (1\%)와 과량의 조효소액을 포함한 반응액을 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5시간 반응시킨 후 반응액을 열처리하여 단백질을 제거하고 상등액을 취해 chloroform, acetic acid와 증류수 \( (4.3: 5: 0.7,(\mathrm{v} / \mathrm{v})) \) 혼합용액을 전개용액으로 하여 silica gel-precoated thin layer plate (Merck, Gemany)에서 박층크로마토그래피를 수행하였다. 전개된 물질을 발색시키기 위해서는 \( 9 \mathrm{ml} \) ethanol, \( 0.5 \mathrm{ml} p \)-anisaldehyde, \( 0.5 \mathrm{ml} \) sulfuric acid와 glacial acetic acid 몇 방울을 혼합한 발색제 용액을 뿌린 후, \( 120^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 방치하였다. 당이 효소 활성에 미치는 영향을 분석하기 위하여 기질로 \( \mathrm{pNP}-\beta \mathrm{Gal} \) 을 포함한 반응액에 종류와 농도가 다르게 당을 첨가한 상태에서 반응을 수행한 후 \( \beta \)-galactosidase 활성을 측정하였다.</p>