본 실험에서 D56G 또는 D56N 단백질을 이용하여 Ⅰ단계와 Ⅱ단계에 미치는 일가 양이온들의 역할을 알아보고, \( \mathrm{Na}^{+}\), \(\mathrm{K}^{+} \), 그리고 \( \mathrm{NH}_{4}{ }^{+} \)를 처리하였을 때 중간반응생성물의 분포를 살펴 효소 활성에서의 역할을 조사하고자 하였다.
<p>트립토판 합성효소는 기질이 터널이동을 하는 독특한 이소조절성(allosterism)을 보여주고 있다. 이 효소는 2개의 \( \beta \)소단위체(43,500 달톤)가 중앙에 결합되어 있고, 그 양쪽으로 각각 1개씩의 \( \alpha\)소단위체(28,600 달톤)가 결합되어 있다. \( \alpha\)소단위체(a subunit)는 indole-3-glycerolphosphate (IGP)로부터 인돌(indole)을 형성할 수 있다(\( \alpha\)반응). 이렇게 형성된 인돌은 \( \alpha\)소단위체와 \( \beta \)소단위체 간에 존재하는 25~30 \(\mathring{A} \) 길이의 터널 구조를 통해 \( \beta \)소단위체로 이동한다. \( \beta \)소단위체는 세린(L-serine)과 터널을 통해 이동된 인돌로부터 트립토판을 합성한다 \( (\beta \)반응). \(\alpha \beta \)복합체에 의한 전체 반응을 \( \alpha \beta \)반응이라 한다. 다음은 이들 반응 화학식이다.</p><p>indole-3-glycerol-phosphate \( \rightleftharpoons \) indole + D-glyceraldehyde-3-phosphate<caption>(\( \alpha\)반응)</caption></p><p>indole \( +\mathrm{L} \)-serine \( \rightleftharpoons \mathrm{L} \)-tryptophan \( +\mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)<caption>(\( \beta\)반응)</caption></p><p>indole-3-glyceol-phosphate \( + \) L-serine \( \rightleftharpoons \) D-glyceraldehyde-3-phosphate + L-tryptophan \( +\mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)<caption>(\( \alpha\ \beta\)반응)</caption></p><p>\( \beta \)소단위체에서 일어나는 \( \beta \)반응에서는 여러 단계의 화학 중 간산물이 생성된다. 이들은 기질의 하나인 세린과 결합하여 aminoacrylate (A-A)를 형성하는 Ⅰ단계와 E(A-A)에 \( \alpha\)반응의 산물인 인돌이 결합하여 트립토판을 형성하는 Ⅱ단계로 나눈다. \( \beta \)소단위체의 조효소인 PLP (pyridoxal 5-phosphate)는 87번 아미노산 리신과 결합하여 internal aldimine을 형성한다. 세린이 있게 되면 리신을 대체하여 external aldimine을 형성하고 이는 quinonoid를 거쳐 A-A로 주로 존재하게 된다. 인돌이 운반되어 들어오면, 다른 quinonoid를 거쳐 트립토판의 external aldimine이 만들어지며 이것이 떨어져 나가면서, 다시금 첫단계로 효소는 되돌아가게 된다. 이를 각 화합물의 최대 흡광도파장과 함께 화학반응식으로 요약하면 다음과 같다.</p><p>이러한 반응단계에서 이소조절성에 있어 aAsp56, \( \beta \)As-305, \( \beta \)Arg141, \( \beta \)Lys167번 잔기간의 염다리 결합(salt bridge)과 일가 양이온(monovalent cation, MVC)이 중요한 역할을 담당한다. \( \mathrm{Na}^{+}\), \(\mathrm{K}^{+}\), \(\mathrm{NH}_{4}^{+} \) 등의 일가 양이온들은 \( \beta \)소단위체에 결합하며, 이소조절 리간드인 GP (DL-a-glycerol 3-phosphate)는 \( \alpha \) 단위체에 결합한다. 이 연구들에는 주로 Salmonella thyphimurium의 효소를 사용하였다.</p><p>본 실험에서는 대장균의 트립토판 합성효소 \( \alpha \)소단위체 56잔기인 아스팔산이 글리신으로 치환된 D56G, 또는 아스파라긴으로 치환된 D56N 단백질을 이용하여 Ⅰ단계와 Ⅱ단계에 미치는 일가 양이온들의 역할을 알아보았다. \( \mathrm{Na}^{+}\), \(\mathrm{K}^{+} \), 그리고 \( \mathrm{NH}_{4}{ }^{+} \)를 처리하였을 때 생성되는 각각의 중간반응생성물의 분포를 살펴보고 이들이 이 효소활성에서의 역할을 조사하고자 하였다.</p>