작잠, 천잠, 가중나무 산누에나방 및 옥색긴고리 산누에나방의 혈림프액을 채취하였다. 이 때, 4가지의 곤충 혈림프액은 phenylthiourea 분말 첨가를 통하여 흑화를 방지하고, 15분 간의 저온 원심 분리를 통하여 고형 불순물을 방지하였다. Laemmli 방법에 따라 행해진 SDS-PAGE를 실행하여 젤 속의 단백질 밴드를 NC 막에 transfer 시켰다. 만들어진 단백질과 N.C. filter를 사용하여 시약공급회사의 안내서에 따라 용액에 1시간 동안 실온 침지하여 웨스턴 블롯 분석을 진행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>공시곤충</h2><p>본 실험에 공시한 곤충은 작잠(A. permyi), 천잠(A. yamamai), 가중나무 산누에나방(S. cynthia pryeri) 및 옥색긴고리 산누에나방(A. gnoma)이었으며 천잠과 작잠은 실내 사육한 것을 사용하였다. 가중나무 산누에나방 및 옥색긴꼬리 산누에나방은 야생의 것을 채집(가중나무 산누에나방: 밀양에서 채집(2001년), 옥색긴꼬리 산누에나방: 경기도 수원에서 채집(2001년)한 것을 실내 사육하여 해당 발육시기별로 시료채취에 사용하였다.</p><h2>곤층 사육</h2><p>천잠 및 작잠은 부화 후 1령부터 5령까지 상법에 따라 사육하였으며 사료는 야생의 신선한 참나무잎(Quercus acutissima)을 사용하였다. 사육온도는 1~3령기는 온도 \( 23 \sim 26^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 80 \sim 90\% \mathrm{R.H.} \), 4~5령은 \( 20 \sim 23 { }^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 75 \sim 80\% \mathrm{R.H.} \) 하에서 사육하였고 광주기는 계절의 자연광주기에 준하였다. 옥색긴꼬리 산누에나방의 사육은 Ryu 등의 방법에 준하였으며 사육용 사료는 참나무잎(Q. acutissima)을 사용하였다.</p><h2>혈림프 채취 및 조직 샘플 채취</h2><p>공시된 4종의 곤충 혈림프액 채취는 4종의 곤충에 대해 다 같이 예냉시킨 에펜돌프회사의 \( 1.5 \mathrm{ml} \) 튜브에 혈림프액의 흑화(melanosis)를 방지하기 위해 소량의 phenylthiourea 분말을 첨가하여 5령 유충의 꼬리발 또는 배발을 해부용 가위로 상처를 내어 채혈하였으며 채혈 후 혈구 및 기타 고형 불순물을 제거하기 위해 \( 15,000 \mathrm{rpm} \)에서 15분간 저온 원심분리하였다. 원심분리가 끝난 후 상등액을 취하여 사용시까지 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 냉동 보관하였다. 또한 4종의 곤충의 피부, 지방체, 중장 및 실샘조직 채취는 5령 중기의 유충을 해부하여 해당 조직을 취한 후 차가운 PBS (Phosphate Buffered Saline, \( \mathrm{pH} 7.5 \))용액에서 혈액 및 불순물 제거를 위해 수회 씻은 후 Whatman filter paper No. 1로 수분을 제거한 후 조직별 공히 5배액\((\mathrm{v/w})\)의 PBS 용액을 첨가, 유리 균질기로 조직을 마쇄하였다. 마쇄된 조직액은 \( 15,000 \mathrm{rpm} \)에서 15분간 2~3회 저온 원심 분리하여 상등액을 취하여 \( 1.5 \mathrm{ml} \) 에펜돌프튜브에 분주한 후 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 사용 시까지 냉동 보관하였다.</p><h2>SDS-PAGE 전기영동 및 젤 내 단백질 밴드의 Nitrocellulose membrane에의 transfer</h2><p>SDS-PAGE (sodium dodescylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis)는 원칙적으로 Laemmli 방법에 준하여 행하였다. 젤 농도는 \( 0.1 \% \) SDS를 포함한 \( 11 \% \)였다. 젤 속의 단백질 밴드는 선기영동적으로 NC membrane에 transfer하였으며, 이것을 Western blot 분석에 사용하였다.</p><h2>항혈청 제작</h2><p>순수하게 분리·정제된 작잠 arylphorin을 사용, New Zealand white male rabbit에 complete Freund's adjuvant로 현탁한 것을 1주 간격으로 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 4회 피하주사한 후 5주째, 토끼의 귀 정맥으로부터 \( 10 \mathrm{ml} \) 시험관에 토끼 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤 균질화 한 후 \( 15,000 \mathrm{rpm} \)에서 15분간 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 저온 원심 분리하여 상등액을 항 혈청액으로 취하였다. 채취한 상등액은 \( 1.5 \mathrm{ml} \)에 분주하여 사용 시까지 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 냉동 보관하였다.</p><h2>Western blot 분석</h2><p>Western blot 분석은 시약공급회사의 안내서(Amplified Alkalin phosphatase Goat anti-Rabbit Immun-Blot Assay Kit Bio-Rad Co.)에 준하여 행하였으며 \( 11 \% \) SDS-PAGE 및 단벡질의 transfer가 끝난 N.C. filter를 \( 5\% \) non-fat dry milk with \( 20 \mathrm{mM} \) Tris, \( 500 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}, 0.05 \% \) Tween-20 \( (\mathrm{pH} 7.5) \)에 1시간 동안 실온에서 침지하였다. blocking 액으로 2회 씻은 후 실온에서 1시간 동안 1차 항체, incubation을 행한 후 다시 2차 항체 반응도 같은 방법으로 행하였다. N.C. filter는 실온에서 1시간 동안 미리 준비한 stretavidin-biotinylated alkalin phosphatase 혼합액에 반응한 후 안내서에 따라 발색반응을 행하였다.</p>