국내 품종 고구마의 인체 모유 우래 락토페린 cDNA가 들어있는 pLSM1 벡터를 사용하여 텅스텐 입자에 코팅한 후 BioRad PDS-1000/He particle delivery system을 이용하여 6cm 거리, 1100 psi에서 particle bombardment을 수행하였다. 그 후에 \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) 2,4-D, \( 100 \mathrm { mg/L } \) kanamycin이 첨가된 MS 선발배지에서 선발 증식된 배발생 캘러스를 기본배지로 옮겨 체세포배를 유도하고 식물체로 분화시켰다. 이 과정을 거쳐 재분화된 우식물체의 잎을 Edwards 등의 방법을 이용하여 genomic DNA를 분리하고 PCR을 수행하였으며, 추출한 단백질은 전기영동 후 membrane에 전이하였다. Membrane을 TBS buffer로 세척한 후 발색용액을 이용하여 락토페린의 생산을 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물재료 및 Particle bombardment</h2> <p>국내 품종 고구마 (Ipomoea batatas L. cv. Yulmi)의 정단분열조직 우래 배발생 캘러스 (Liu et al. 1989; Min et al. 1994)에 인체 모유 우래 락토페린 cDNA가 들어있는 pLSM1 벡터 (Liu et al. 1999; Min et al. 2006, Fig. 1)를 이용하여 Min 등 (1998,2006,2007)의 방법에 따라 텅스텐 입자에 코팅 (Sanford et al. 1993)한 후 BioRad사의 PDS-1000 /He particle delivery system을 이용하여 \( 6 \mathrm { ~cm } \) 거리, \(1100 \mathrm{psi}\)에서 particle bombardment를 수행하였다.</p> <h2>형질전환체 생산</h2> <p>Particle bombardment 후 \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) 2,4-D, \( 100 \mathrm { mg/L } \) kanamycin이 첨가된 MS (Murashige and Skoog 1962) 선발배지 (MS1DK)에서 선발 증식된 배발생 캘러스를 MS 기본배지 (MSBMK)로 옮겨 체세포배를 유도한 후 식물체로 분화시켰다. 재분화 식물체는 순화과정을 거쳐 생육상에서 재배하여 정상적인 괴근을 수확하였다.</p> <h2>형질전환체 분석</h2> <p>선발배지에서 형성된 배발생 캘러스로부터 체세포배 발생 과정을 거쳐 재분화된 기내 우식물체의 잎으로부터 Edwards등 (1991)의 방법으로 genomic DNA를 분리하여 PCR을 수행하였다. 락토페린 특이 염기서열 부분 (Lacto F: 5'-GGC TCC TGC AAA TTT GAT GA-3', Lacto R: 5'-TTA CTT CCT GAG GAA TTC AC-3')을 사용하여 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1 분, \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 분 및 \( 72 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 분으로 30 회 PCR 수행하였다. 또, PCR로 유전자 도입이 확인된 고구마 식물체의 잎에서 식물 DNA 추출 kit인 PHYTOpure \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) (Amer-sham Co.)을 이용하여 genomic DNA를 분리한 후, 약 \(50  \mu \mathrm { g } \) 의 DNA를 제한효소 HindIII로 절단한 후 \( 0.8 \% \) agarose 젤에서 전기 영동 하였다. 전기 영동을 마친 후 젤을 \( 0.2 \mathrm { ~N } \) \( \mathrm { HCl } \) 용액에서 depurination 후 \( 1.5 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } , 0.5 \mathrm { M } \mathrm { NaOH } \) 용액에 담가 30분 동안 변성시키고 이어서 \( 1.5 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } , 0.5 \) \( \mathrm { M } \) Tris \( \cdot \mathrm { HCl } ( \mathrm { pH } 8.0) \) 용액에서 30분간 중화시킨  10X SSC 용액에서 Zeta-Probe membrane (Bio-Rad)에 전이하였다. \( 1.0 \mathrm { ~kb } \) 크기의 EcoRI- BglII lactoferrin DNA fragment를 random primed DNA labeling kit (Boehringer Mannheim, Germany)을 사용하여 동위원소 \( \left [a ^ { 32 } \mathrm { P } \right ] \mathrm { dCTP } \) 로 표지한 후 probe로 사용하여 Southern 분석을 수행하였다. Membrane을 prehybridization ( \( 1 \mathrm { M } \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } , 1 \mathrm { M } \mathrm { NaH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } , 7 \% \) SDS, \( 1 \mathrm { mM } \mathrm { Na } \). EDTA)용액에 넣고 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2 시간 정도 pre-hybridization한 후 약 16 시간 동안 hybridization 시켰다. 반응을 마친 membrane을 세척용액 ( \( 1 \mathrm { M } \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } , 1 \mathrm { M } \mathrm { NaH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } \), \( 1 \% \mathrm { ~SDS } , 1 \mathrm { mM } \mathrm { Na } \mathrm { Na } _ { 2 } \).EDTA)으로 세척한 후 X-ray 필름에 노출시켰다. 또한, 도입된 외래 유전자의 발현을 보기 위하여 식물체의 잎으로부터 \( \mathrm { TRIzol } ^ {\mathrm { TM } } \) (GIBCO/BRL, Grand Island, NY, USA)을 이용하여 분리된 약 \( 20 \mathrm { mg } \) 의 total RNA를 \( 5.1 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) formaldehyde가 포함된 agarose gel에 전기영동한 후 Zeta-Probe membrane (Bio-Rad)에 blotting한 후 Southern과 동일한 방법으로 northern blot을 수행하였다. 한편, 수확한 형질전환 고구마 괴근 절편체 (\( 200 \mathrm { mg } \)) 로부터 \( 10 \mathrm { mM } \) DTT를 포함한 \( 80 \mathrm { mM } \) Hepes buffer (\( \mathrm { pH  7.4} \))를 이용하여 얼음위에서 마쇄한 뒤 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 10,000 \mathrm { rpm } \) 에서 10분간 2회 원심분리 후 상등액을 취하여 총 단백질을 Bradford (1976) 방법으로 정량하였다. 추출한 \( 20 \mathrm { mg } \) 의 단백질을 끓는 물에 denature 시킨 후 \( 10 \% \) polyacrylamide gel에서 전기영동 (Laemmli, 1970) 시킨 후 nitrocellulose membrane에 전이하였다 (Towbin et al. 1979). Membrane을 \(1 \%\) BSA와 TBS\( [10 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } ( \mathrm { pH }  7.4)\), \( 0.15 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } ] \) 가 첨가된 blocking solution에 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2시간 동안 처리한 후 \( 1: 10,000 \) 으로 희석된 락토페린 항체와 함께 1시간 동안 incubation 하였다. Membrane을 TBS buffer로 세척한 후 1시간 동안 alkaline phosphatase-conjugated goat anti-rabbit IgG (Bio-Rad)에 담근 후 membrane을 alkaline phosphatase 발색용액 \( [0.015 \% \) BCIP, \( 0.03 \%  \) NBT, carbonate buffer ( \( 0.1 \mathrm { M } \mathrm { NaHCO } _ { 3 } , 1 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } , \mathrm { pH }  9.8)]\)을 이용하여 락토페린 생산을 확인하였다.</p>