pGEX4T-1 시스템을 이용해 대장균에서 GST에 결합된 Parkin을 발현하였으며, parkin 단편은 EcoRI와 SalI로 절단 후 pBluescriptII KS +에 클로닝하여 pBS-Parkin (294-465)를 생성하였다. 포유류 세포에서 Parkin 발현을 위해 CMV promoter가 있는 pcDNA 3.0 표현 벡터를 사용하였다. Escherichia coli BL21에 pGST-Parkin을 형질전환하여 GST-Parkin fusion 단백질을 대장균에서 발현하였고, 대장균은 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) 또는 25 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 16시간 배양하였다. 15 \( \% \) SDS-polyacrylamide gel 전기영동 후 Coomassie 염색액으로 20분간 염색 후 씻어내어 단백질 밴드를 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>Plasmid 제조</h2> <p>대장균에서 GST에 fuse된 Parkin을 발현하기 위해 pGEX4T-1 (Amersham Pharmacia Biotech.) (GenBank account number U13853) 시스템을 이용하였다. pcDNA3.1( + )Myc-parkin을 BamHI과 Saclo로러 절단하여 아미노산 1~301을 포함하는 parkin cDNA를 얻어 pBluescriptII KS + (BamHI과 SacI으로 절단)에 cloning하여 pBS-Parkin (1-301)이라고 명명하였다. pcDNA3.1( + )Myc-parkin을 template로 하여 parkin-294F pri-mer (GCGCGAATTCGCCATGCCCAACTCCTGATT) 와 parkin-465R primer (GCGCGTCGACCTACACGTCGAACCAGTGGTC)를 이용하여 아미노산 294 465를 포함하는 parkin cDNA를 PCR로 증폭하였다. 증폭한 parkin fragment롤 EcoRI과 SalI으로 절단하여 pBluescriptII KS + (EcoRI과 SalI으로 절단)에 cloning하여 pBS-Parkin (294-465)를 언었다. pBS-Parkin (1-301)을 EcoRI과 SacI으로 젇단한 fragment와 pBS-Parkin (294-465)를 SacI과 SalI으로 절단한 fragment를 동시에 pBluescriptII KS + (EcoRI과 SalI으로 절단)에 cloning하여 pBS-Parkin (1-465)를 제작하였다. pBS-Parkin (1-465)를 EcoRI과 SalI으로 절단하여 아미노산 1~465를 포함하는 parkin cDNA를 얻어 pGEX4T-1 (EcoRI과 Sall으로 절단)에 삽입하여 pGST-Parkin을 제작하였다.</p> <p>포유류 세포에서 Parkin을 발현시키기 위해 CMV promoter가 존재하는 expression vector인 pcDNA 3.0 (Invitrogen)을 변형하여 이용하였다. C-말단에 HA를 tagging한 Parkin-HA (C-HA로 포기), N-말단에 myc을 tagging한 Myc-Parkin (N-Myc로 표기), 양쪽 N-말단과 C-말단에 HA로 tagging한 Parkin (HA-HA 표기), N-말단은 Myc, C-말단은 HA로 tag-ging한 Parkin (Myc-HA로 표기)을 제작하였다. N-Myc은 pcDNA3.1( + )Myc-parkin을 사용하였고, Myc-HA는 Myc-Parkin-FLAG에서 Xhol과 XbaI으로 절단함으로써 Parkin-FLAG이 없어진 pcDNA-Myc vector에 pBS-Parkin- HA (XhoI과 Xbal로 절단)에서 나온 Parkin-HA fragment를 cloning 하여 제작하였다. HA-HA는 pcDNA-HA 4T-1 (BamHI과 XbaI로 절단) expression vector에 Parkin-HA fragment를 cloning하여 제작하였다.</p> <h2>GST-Parkin 단백질 발현 및 정제</h2> <p>GST-Parkin fusion 단백질을 대장균에서 발현하기 위해 pGST-Parkin을 protease deficient strain인 Escherichia coli BL21에 transformation하였다. 대장균을 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) 또는 25 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 16 시간 배양한 후, ampicillin을 포합하는 LB 배지에 10 \( \% \)로 접종한 후 90 분 더 배양하였다. 최종 농도가 0.01, 0.1, 0.5 \( \mathrm { mM } \) 되게 isopropyl-1-thio- \( \beta \)-D-galatopyranoside (IPTG)를 첨가하여 GST-Parkin 단백질의 발현을 유도하였다. 수확한 대장균 세포들은 EBC lysis buffer (0.5 \( \% \) NP-40, 50 \( \mathrm { mM } \) Tris-Cl, \( \mathrm { pH } \) 8.0, 120 \( \mathrm { mM } \) \( \mathrm { NaCl } \))에 suspension한 후 soni-cation으로 세포를 파쇄 하였다. 세포파쇄 용액을 4 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 14,400 \( \times g \)로 15 분간 원심 분리하여 불용성의 세포 찌꺼기를 침전시켰다. 분리된 상층액은 EBC lysis buffer로 2번 씻은 Glutathione Sepharose 4B bead (Amersham Pharmacia Biotech)와 함께 혼합하였다. 흔합물은 상온에서 20 분간 반응시킨 후 14,400 \( \times \mathrm { g } \)에서 1 분간 침전시켰다. NETN buffer (1 \( \mathrm { mM } \) EDTA, 0.5 \( \% \) NP-40, 10 \( \mathrm { mM } \) Tris-Cl, \( \mathrm { pH } \) 8.0, 120 \( \mathrm { mM } \) \( \mathrm { NaCl } \), 0.05 \( \% \) \( \mathrm { SDS } ) \)로 4번 씻어주고 SDS-lysis buffer를 첨가해 준 후 3 분간 꿇인다. 이를 15 \( \% \) SDS-polyacrylamide gel에 걸어서 전기영동을 하고 Coomassie staining solution (0.1 \( \% \) Brilliant blue R, Sigma, 45 \( \% \) methanol, 10 \( \% \) acetic acid)으로 20 분간 염색시킨 후 destaining solution (10 \( \% \) methanol, 10 \( \% \) acetic acid)으로 씻어내어 단백질 밴드를 확인하였다.</p>