본 논문에서는 DADLE 처리에 따른 U\(937\) 혈구암세포의 증식, 세포 주기 변화, 세포 사멸의 연관성을 분석한다. U\(937\) 혈구암세포의 증식과 관련해서는 \(6 \mu \mathrm{M} \) 의 농도까지는 DADLE가 U937 암세포주의 cell viability에 큰 영향성을 가지지 않으나,그 이후 농도서부터는 큰 감소를 일으켰다. 세포 주기 변화와 관련해서는 낮은 농도에서는 cell cycle arrest를 야기하며, 높은 농도에서는 세포 사멸을 야기했다. 세포 사멸의 연관성 분석은 Bcl-2 집단의 상대적인 발현양, IAP 집단의 발현 변화를 통해 분석하였으며, 높은 농도에서 세포 사멸이 유발되는 것을 관측했으며 FasL 유전자가 높은 농도에서 감소하는 것을 통해 어느 경로로 세포 사멸이 진행되는지를 알 수 있었다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>DADLE의 처리에 의한 U937 혈구암세포의 증식에 대한 영향</h2><p>인체혈구암세포인 U937을 \( 5 \times 10^{5} \) 개 \( / \mathrm{ml} \) 로 6 well에 분주한 후 DADLE를 0~10 \( \mu \mathrm{M} \) 의 농도로 처리하였다. 72시간 동안의 배양 후 MTT assay를 이용하여 정상 및 DADLE 처리집단의 증식 억제의 정도를 분석하였다. Fig. 1에서 보는 바와 같이 약 6\( \mu \mathrm{M} \) 의 농도까지는 DADLE가 U937 암세포주의 cell viability 에 큰 영향성을 가지지 않지만, 8\( \mu \mathrm{M} \) 과 10\( \mu \mathrm{M} \) 처리집단에서는 정상집단과 비교하여 급격한 cell viability의 감소를 보였다. 즉, 농도가 낮은 경우와 농도가 높은 경우에 DADLE의 처리에 따른 영향성에 있어서 다소 차이가 있음을 알 수 있었다.</p><h2>DNA flow cytometry에 의한 DADLE의 영향성 평가</h2><p>세포주기에 DADLE가 미치는 영향성을 알아보기 위하여 정상 및 DADLE 처리집단을 72시간동안 배양시킨 후 DNA flow cytormeter를 통하여 실험해보았다. Fig. 2 에서 보는 바와 같이 0~6\( \mu \mathrm{M} \) 과 같은 낮은 농도의 DADLE 처리집단의 경우 G1기와 G2/M기가 다소 증가하는 arrest 현상을 관찰할 수 있었으며, 세포의 죽음을 의미하는 Sub-G1 집단은 낮은 농도에서는 그다지 큰 유의성을 찾아볼 수 없었으며, 8\( \mu \mathrm{M} \) 과 10\( \mu \mathrm{M} \) 과 같은 비교적 높은 농도인 경우 Sub-G1 집단이 증가하였으며, 이는 세포의 죽음이 어느 정도 발생하였다는 사실을 알 수 있었다. 이는 DADLE를 U937 암세포주에 처리하였을 경우 낮은 농도에서는 cell cycle arrest를 야기 시키며 비교적 높은 농도를 처리하였을 경우에는 세포 사멸을 야기시키는 것을 알 수 있다.</p><h2>DADLE의 처리와 세포 사멸의 연관성</h2><p>U937 암세포주에서 낮은 농도와 높은 농도의 DADLE처리에 따른 영향성을 검증하고자 세포의 사멸과 관련된 유전자들을 mRNA 수준에서 발현 정도를 관찰하였다. 세포 사멸에 가장 대표적인 Bcl-2 집단에 속하는 유전자에는 anti-apoptotic 유전자로 알려진 Bcl-2와 Bcl-\(\mathrm{X}_{\mathrm{L}} \), 그리고 pro-apoptotic 유전자로 알려진 Bax가 있다. Bcl-2 집단의 상대적인 발현양의 차이는 세포 사멸의 유발을 예측하고 검증하는 척도로 사용되어지고 있다. 세포사멸 신호체계를 억제하는 IAP 집단의 발현 변화 역시 세포 사멸 유발의 또 다른 척도로 사용된다.</p><p>Fig. 3에서 보는 바와 같이 0~6\( \mu \mathrm{ M } \) 과 같은 낮은 농도의 DADLE 처리집단에서는 그다지 큰 Bcl-2 집단의 변화가 관찰되지 않았지만, 8~10\( \mu \mathrm{ M } \) 과 같은 높은 농도의 DADLE 처리집단에서는 다른 유전자에 비해 BCL-\( \mathrm{ X }_{\mathrm{ L }} \) 유전자가 크게 감소하였으며 이는 세포 죽음과 연관성이 높은 것으로 생각된다. 아울러 IAP 집단에서는 높은 농도의 처리집단에서만 c-IAP-1 및 survivin의 발현감소가 관찰되었으며 이것 역시 높은 농도에서의 세포 죽음 유발과 연관성이 큰 결과로 생각된다. 하지만, 낮은 농도의 DADLE 처리집단에서는 그 어떤 변화도 관찰되지 않았는데, 낮은 농도의 DADLE 처리집단은 다른 경로를 통하여 세포에 영향성을 미친다는 것으로 사료된다.</p><p>염증을 포함한 다양한 생체 반응에서 prostaglandin 계열 물질들은 세포분열이나 증식에 영향을 줌으로서 암과 같은 인체 질병의 유발과 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있고 Prostaglandin의 합성에는 두 가지의 COX isoform이 관여하는데, COX-1 은 인체의 항상성 유지와 연관된 기능을 수행하며, COX-2는 성장인자, cytokines, 암유발인자 등에 의해 유도되는 isoform으로 알려져 있다. COX-2가 과발현 될 경우 혈관신생 및 전이능력이 높아지고 세포 사멸을 억제함으로 암 예방전략에 많이 이용되고 있다. U937 암세포주에서 DADLE 의 처리집단에서는 이런 COX-2 의 발현이 높은 농도에서 크게 감소하나 0~6\( \mu \mathrm{ M } \) 과 같은 낮은 농도에서는 별다른 변화가 관찰되지 않았다.</p><p>Fas와 FasL는 세포 사멸과 관련된 death receptor 경로의 한 부분으로서, 세포 사멸과 관련된 신호들을 세포 내부로 전달하는 역할을 하며, PCNA 의 경우 세포 증식과 관련된 마커 역할을 하고 있다. DADLE의 처리에 의한 Fas 유전자 변화는 관찰되지 않았지만, FasL의 경우 높은 농도에서 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 이는 높은 농도에서 세포 사멸이 Fas와 FasL 경로를 어느 정도 경유하는 것으로 유추해 볼 수 있다. 세포 증식과 관련한 PCNA의 발현 역시 높은 농도의 DADLE 처리 집단에서 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 0~6\( \mu \mathrm{ M } \) 의 DADLE 처리집단의 경우 death receptor 경로와는 별개로 그 영향성을 발휘하는 것으로 사료된다.</p>