37℃ 조건에서 다양한 농도의 IPTG로 90분 동안 GST-Parkin 단백질 발현을 유도한 결과를 보여주었다. Glutathione Sepharose 4B bead를 이용해 단백질을 정제하고 15% SDS-PAGE를 통해 단백질의 양을 비교하였다. IPTG 농도가 0.01mM일 때, 1ml 대장균 배양액 당 250ng의 GST-Parkin 단백질을 확인할 수 있었으나, IPTG 농도가 0.1mM와 0.5mM일 때는 5배 더 적은 양의 GST-Parkin 단백질이 관찰되었다.
<h2>대장균 내에서 GST-Parkin 발현을 위한 적정 조건 정립</h2> <p>상기의 결과로 일반적으로 사용되는 배양 및 단백질 유도 조건 (37 \( { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 배양온도와 0.5 \( \mathrm { mM } \) IPTG)에서는 GST-Parkin이 쉽게 분해되어 완전한 크기의 단백질로 정제하는 것이 용이하지 않음을 알 수 있다. 대장균 시스템에서 분해되지 않고 순도 높은 Parkin 단백질을 얻기 위해 단백질의 발현 유도를 위한 적정조건을 정립할 필요가 있다. 이를 위해 여러 배양 온도와 IPTG 농도에서 GST-Parkin 단백질울 발현하여 정제하였다(Fig. 2). 일반적으로 사용되는 조건인 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 90 분간 배양하고 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 90 분간 여러 농도의 IPTG (0.01, 0.1, \( 0.5 \mathrm { ~mM } \))로 GST-Parkin 단백질의 발현을 유도하였다(Fig.2A). Glutathione Sepharose 4B bead로 단백질을 정제하여 GST-Parkin 단백질의 양을 15 \( \% \) SDS-PAGE로 비교하였다. 그 결과 0.01 \( \mathrm { mM } \)의 IPTG 농도에서는 1 \( \mathrm { ml } \) 대장균 배양액 당 250 \( \mathrm { ng } \) 의 GST-Parkin (79 \( \mathrm { kDa } ) \)을 확인할 수 있었으나, 0.1 \( \mathrm { mM } \) 과 0.5 \( \mathrm { mM } \)의 IPTG 농도에서는 5배 더 적은 50 \( \mathrm { ng } \)을 관찰할 수 있었다. 또한, 이 조건에서 72 \( \mathrm { kDa } \) 외에도 29, 30, 38, 40, 43, 45 \( \mathrm { kDa } \) 크기의 6개 밴드가 더 나타났다. 특히, 38- \( \mathrm { kDa } \) fragment는 1 \( \mathrm { ml } \) 대장균 배양액 당 500 \( \mathrm { ng } \)으로 72 \( \mathrm { kDa } \) 크기의 GST-Parkin보다 10배 더 많은 양을 gel 상에서 확인할 수 있었다.</p> <p>배양온도 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 90 분간 키워 충분한 양의 대장균을 확보한 뒤, 단백질의 안정성을 높이기 위해 온도를 25 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 낮추어 여러 농도의 IPTG로 GST-fusion 단백질의 발현을 유도하였다. 그 결과 72 \( \mathrm { kDa } \) 크기의 GST-Parkin은 IPTG의 농도에 대해 큰 영향 없-1 \( \mathrm { ml } \) 대장균 배양액 당 250 \( \mathrm { ng } \)의 단백질을 정제할 수 있었으나, 0.1 \( \mathrm { mM } \)과 0.5 \( \mathrm { mM } \) 농도의 IPTG에서 38 \( \mathrm { kDa } \)과 40 \( \mathrm { kDa } \)의 단백질 fragment들은 0.01 \( \mathrm { mM } \) 농도에서 보다 10 배 더 많은 2.5 \( \mu \mathrm { g } \)의 단백질 양을 확인할 수 있었다. 상기의 조건에서 단백질 분해가 증가되므로 배양조건도 25 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 낮추어 발현한 결과 0.01 \( \mathrm { mM } \) IPTG 유도 조건에서는 분해된 fragment 없이 순수한 79 \( \mathrm { kDa } \)의 GST-Parkin만을 1 \( \mathrm { ml } \) 대장균 배양액 당 50 \( \mathrm { ng } \)을 얻을 수 있었다. 따라서 고온의 배양온도와 고농도의 IPTG가 Parkin 단백질의 안정성에 크게 영향을 미치는 것을 알 수 있다.</p>