백혈병 세포에 비해 봉독에 대한 감수성이 A549 폐암세포에서 다소 낮으나 봉독에 대한 농도가 증가할수록 A549 세포의 생존율은 매우 감소되고 봉독의 처리에 의한 암세포의 생존율 저하는 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다. A549 세포에서 봉독 처리에 의한 apoptosis의 유발에 Bcl-2 family가 중요한 역할을 하고 봉독 처리군에서 처리 농도가 증가될수록 IAP family의 유전자는 감소됨을 알 수 있었다. 이러한 결과 역시 선행 연구의 결과를 잘 뒷받침하여 주는 것으로서 caspases의 활성화가 중요한 역할을 한다는 뜻이며, 봉독이 A549 세포 생존율에 영향을 미치는 것으로 사료된다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>봉독에 의한 A549 세포의 생존율 억제 및 apoptosis 유발</h2><p>A549 인체 폐암세포의 생존율에 미치는 봉독의 영향을 알아보기 위하여 실험방법에서 서술한 것처럼 A549 세포에 봉독을 48시간 동안 처리한 후, trypan blue로 염색하여 hemocytometer로 살아있는 세포의 수를 계수하였다. 비록 인체 백혈병세포에 비하여 봉독에 대한 감수성이 A549 폐암세포에서 다소 낮으나, Fig. 1A에 나타낸 바와 같이 처리된 봉독의 농도가 증가될수록 A549 세포의 생존율은 매우 감소되었는데, \( 4.0 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 처리군 의 경우 대조군에 비하여 약 \( 40 \% \) 정도의 세포 생존율 감소가 관찰되었으며, \( 5.0 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 처리군에서 살아있는 세포가 \( 25 \% \) 미만 정도임을 알 수 있었다. 이러한 봉독 처리에 의한 A549 세포의 생존율 저하가 apoptosis 유발과 상관성이 있는지를 조사하기 위하여 DAPI staining을 실시하여 해의 형태를 조사하였다. Fig. 1B에 나타낸 바와 같이 봉독이 처리되지 않은 정상 배지에서 자란 A549 세포에서 핵의 형태가 뚜렷하게 정상으로 염색이 되었으나 봉독이 처리된 세포의 경우, 염색질 응축(chromatin condensation)에 의한 apoptosis가 일어난 세포에서 전형적으로 관찰되는 apoptotic body의 출현이 봉독 처리 농도 의존적 증가되었다. 이는 nucleosome의 linker DNA 부분의 절단에 의한 DNA 단편화의 결과이므로 봉독의 처리에 의한 암세포의 생존율 저하는 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다. 따라서 봉독 처리에 따른 A549 세포의 apoptosis 유발 정도를 정량적으로 비교 평가하기 위하여 동일한 조건으로 배양된 세포들을 대상으로 flow cytometry 분석을 통한 세포주기의 sub-G1기에 해당되는 세포들의 빈도를 조사한 결과는 Fig. 1C에 나타낸 바와 같다.</p><h2>Bcl-2 family에 속하는 유전자의 발현에 미치는 봉독의 영향</h2><p>Bcl-2 family에 속하는 몇 가지 인자들은 apoptosis 유발 조절에 가장 대표적인 유전자로 알려져 있는데, 그중 Bcl-2와 Bcl-xL은 anti-apoptotic 분자로서 apoptosis의 유발을 억제하는 기능을 가지며, Bax는 대표적인 pro-apoptotic 분자로 apoptosis의 유발과 관계가 있다. Anti-apoptotic 분자와 pro-apoptotic 분자는 서로 dimer의 형태로 존재하여 균형을 유지하고 있지만 이러한 균형이 깨어지게 되면 mitochondria로부터의 cytochrome c를 유리시켜 cysteine-related protease인 caspase, DNA의 단편화와 연관된 endonuclease 등의 활성화를 통하여 apoptosis가 유발되는 것으로 알려져 있다. 따라서 A549 세포에서 봉독 처리에 의한 apoptosis 유발에 이들 유전자가 관련되어 있는지의 여부를 RT-PCR 및 Western blot 분석법으로 조사한 결과는 Fig. 2의 좌측에 나타낸 바와 같다. 인체 백혈병세포에서와는 달리 A549 세포에서 Bax 및 Bcl-xL 유전자의 발현은 봉독 처리에 의하여 유의적인 변화는 관찰되지 않았으나, Bcl-2의 경우는 봉독의 처리에 따라 매우 감소되어 \( 5.0 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mll} \) 처리군의 경우 단백질 수준에서 \( 80 \% \) 이상의 감소 효과를 보였다. 따라서 A549 세포에서 봉독 처리에 의한 apoptosis의 유발에 Bcl-2 family가 중요한 역할을 하고 있으며, Bcl-xL의 감소나 Bax의 증가보다는 Bcl-2의 발현 감소에 따른 Bax의 상대적 발현 증가로 인한 apoptosis 유발 관련 인자들의 활성화가 이루어지고 있음을 시사하여 주는 것이다.</p><h2>IAP family에 속하는 유전자의 발현에 미치는 봉독의 영향</h2><p>Apoptosis에 관여하는 여러 인자들 중 inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) family에 속하는 여러 유전자 산물은 곤충 세포에서 바이러스 감염에 의한 apoptosis를 억제하기 위한 baculoviral 단백질 군들로서 외부 선호에 의한 세포 내 anti-apoptotic 활성을 지니는 것으로, caspases와 직접적인 결합을 통하여 그들의 활성을 억제함으로서 apoptosis 유발을 막을 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 따라서 봉독 처리에 의한 A549 세포의 apoptosis 유발에 IAP family에 속하는 주요 인자들의 발현 변화를 조사한 결과는 Fig. 2의 우측에 나타낸 바와 같다. 결과에서 알 수 있듯이 봉독 처리에 따른 조사된 2가지 IAP family의 유전자 발현은 봉독 처리군에서 처리 농도가 증가될수록 감소되었음을 알 수 있는데, 특히 CIAP-1 보다는 CIAP-2의 발현이 현저하게 감소되었으며, 이는 인체 백혈병 세포를 대상으로 조사된 선행연구 결과에서와 유사한 경향성임을 알 수 있었다.</p><h2>Caspase-3 및 caspase-9의 활성에 미치는 봉독의 영향</h2><p>Caspase protease는 apoptosis 유발에 중심적인 조절인자로서 작용하는데, 이 효소들은 핵과 mitochondria의 외막에 불활성 상태인 proenzyme 형태로 존재하다가 Bcl-2 family와 같은 apoptosis 유도를 활성화시키는 신호에 의해 mitochondria로부터 유리된 cytochrome c에 의하여 활성화된 protease로 전환되어 직접 또는 간접적으로 세포 내에 존재하는 많은 표적 단백질의 분해에 관여한다. 따라서 caspases의 활성화는 apoptosis의 유발에 대한 증거가 될 수 있다는 것이 많은 선행연구 등에서 검증되어 왔다. 지금까지 알려진 caspases 중 대부분의 apoptosis가 유발된 세포에서 높은 활성도를 보여주는 caspase-3 및 caspase-9의 발현 및 in vitro 활성에 미치는 봉독의 영향을 조사하였다. Fig. 3A의 결과에서 알 수 있듯이 비활성형인 pro-caspase-3 및 pro-caspase-9의 발현이 처리된 봉독의 농도가 증가될수록 점차 감소됨을 알 수 있었다. 또한 DEVD-pNA 및 LEHD-pNA를 기질로 한 in vitro 활성 결과에서도 조사된 두 caspase 모두 최고 농도에서 5-6배의 활성 증가를 보여 비활성형 caspase의 발현 감소와 일치된 결과를 보여주었다. 이러한 결과 역시 선행 연구의 결과를 잘 뒷받침하여 주는 것으로서, 봉독에 의한 A549 폐암세포를 포함한 암세포에서의 apoptosis 유발은 Bcl-xL 및 IAP family의 감소에 따른 caspases의 활성화가 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.</p>