mathrm{PCR} 을 거쳐 나온 결과물은 1.2 kb의 사이즈를 갖고 있었으며 C. fermentati SI로부터 8개의 N-말단 아미노산 잔기의 서열을 NCBI BLAST 프로그램을 이용하여 alignment한 결과 Meyerozyma guilliermondii exo-1,3-beta glucanase의 N-말단의 배열순서와 유사함을 확인이 되고 degenerate primer를 제작하고 PCR을 실시한 결과 1.2kb의 사이즈를 갖는 결과물을 얻었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Isoflavone 배당체 가수분해효소의 유전자 클로닝</h2> <p>C. fermentati SI 유래의 단백질로부터 결정된 8 개의 \( \mathrm{N} \) 말단 아미노산 잔기(GLNCDYCN)의 서열을 \( \mathrm{NCBI} \) 의 BLAST 프로그램 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov /BLAST/)을 이용하여 alignment를 실시한 결과 Meyerozyma guilliermondii의 exo-1,3-beta glucanase의 N-말단의 배열순서(GLNWDYDN)와 가장 유사함을 확인할 수 있었다. 분석을 통하여 \( \mathrm{N} \) 말단 아미노산 잔기의 서열을 확인하였으나 그 정확성이 확보되지 않은 상태여서 NCBI 검색을 통하여 얻은 정보와 종합하여 degenerate primer를 제작하고 \( \mathrm{PCR} \) 을 수행하였다. 정방향 primer의 제작을 위하여 8 개의 \( \mathrm{N} \) 말단 아미노산 서열을 이용하여 degenerated primer GF1를 제작하였다(5'-GGIYTIAAYTGGGAYTAYGAYAA-3', I: inosine, Y: \( \mathrm{c} \) or t). 역방향 primer의 제작을 위해서 glycosyl hydrolase family 5 에 속하는 유전자들이 가지는 보전적인 부위의 아미노산 서열을 다른 family와 비교한 결과 가장 보존적인 아미노산 서열은 IGIEKKNEPL로 확인되었으며, 이 부위의 아미노산 서열을 기준으로 degeneration을 고려하여 역방향 primer GR2 을 제작하였다(5'-TCTGTCAAAGCAGCAGACCATTCACC-3'). 합성한 GF1 및 GR2 primer로 degenerated PCR을 이용하여 얻은 \( 841 \mathrm{bp} \) 의 DNA 단편의 정보(Fig. \( \mathrm{S} 1 \) )를 이용하여 inverse PCR을 실시하였다. DNA 단편의 내부를 절단하지 않는 제한효소 \( (E c o \mathrm{R} \mathrm{I}) \) 를 이용하여 chromosomal DNA를 처리한 후 T4 ligase를 이용하여 ligation을 시키고 동일한 말단으로 인해 self ligation된 \( \mathrm{DNA} \) 를 미리 제작해둔 primer를 이용하여 PCR을 통해 증폭을 실시한 결과 \( 3,160 \mathrm{bp} \) 의 DNA 단편을 얻었다(Fig. S2). 이 DNA 단편의 염기서열을 분석한 결과 \( 1227 \mathrm{bp} \) 의 exo- \( \beta-1,3 \)-glucanase 구조유전자를 가지고 있음을 확인하였다(Fig. 1).</p> <h2>염기서열이 결정된 DNA 단편의 정보 분석</h2> <p>염기서열이 결정된 \( \mathrm{DNA} \) 단편 내에 존재하는 \( \mathrm{ORF} \) 를 확인하기 위하여 NCBI에서 운영하는 ORF finder program을 이용하여 최종 아미노산 서열을 분석하였다. Expasy에서 운영하는 Compute pI/Mw (http://web.expasy.org/compute_pi) 프로그램으로 추정한 결과 분자량은 약 \( 50.4 \mathrm{kDa} \) 으로 추정되었다. 또한 glycoside hydrolase family 5 에 포함된 다른 종의 yeast 유래 exo-1,3- \( \beta \)-glucanase와의 homology 비교를 하였을 때 각 41-96\%의 homology를 나타내었고, 그 중 Meyerozyma guilliermondii ATCC 6260 의 exo-1,3- \( \beta \)-glucanase 와 \( 96 \% \) 로 가장 높은 homology를 나타내었다. 또한 \( \mathrm{N} \) 말단 아미노산 분석과 비교한 결과 19 개의 아미노산 잔기로 된 signal peptide가 존재함을 확인하였다.</p>