해양환경의 생물에 대한 천연물 연구는 폭팔적으로 발전하여 이미 다수의 신 물질이 발견되었다. 다양한 해면동물 유래의 천연물은 면역억제제,항암제,항진균제,소염진통제 등의 소재로서 가치가 증명되고 있는만큼 보전에대한 관심과 우려 또한 커지고 있어 연구를 위한 확보 또한 어려워 지고있다. 본 연구진은 이러한 문제의 대응책 마련을 위해 국립 해양생물자원관으로부터 해면동물 추줄물을 분양 받아 추출물의 기초생리활성과 HPLC분석 실행해 그 결과를 토대로 해면동물 추출물에 대한 생리활성 및 성분프로파일 분석 데이버베이스를 구축고자 한다.이것은 향후 자원의 가치 평가 및 분석을 용이하게 하고, 불필요한 생물 자원 소비를 줄여 해양생태계 보존 및 효율적인 해면동물자원 연구를 가능하게 해줄 것이다.
<h1>해면 추출물의 신경세포 보호 및 항염증 활성과 함유 성분의 HPLC 프로파일링</h1> <h2>서론</h2> <p>의약후보물질을 탐색하는 천연물 연구는 전통적으로 생약을 비롯한 육상 식물과 토양 방선균, 진균 등을 포함하는 미생물을 중심으로 수행되어 현재 많은 연구결과가 보고되어 있다. 한편, 새로운 화합물 골격을 발굴하기 위하여 새로운 환경의 생물 자원에 대한 연구의 필요성이 부각되어 육상 생물에서 찾아 보기 어려운 유효한 생리활성을 가지는 해양환경의 생물에 대한 천연물 연구가 선진국을 중심으로 활발하게 수행되고 있다. 그 결과 비교적 짧은 연구기간에노 불구하고 해양생태계를 구성하고 있는 다양한 생물 종에 대한 연구는 폭발적으로 발전하여 이미 15,000여 신 물질이 해양의 동식물 및 미생물에서 발견되었다. 또한, 육상 환경에 비하여 해양 환경은 높은 변동성의 생태환경 변이에 따른 특이 생물 종이 다양하게 분포하고, 외부 감염에 대한 방어 기작이 발달되어있기 때문에 뛰어난 생리활성을 나타내는 물질들이 무준히 보고되고있다. 이들 중, 특히 해면동물 유래의 생리활성을 가지는 신 물질은 발견 빈도가 높은 편으로 천연물연구에서 많은 관심을 받고 있다.<p>해면동물 유래의 천연물은 alkaloids, polyketides, steroids, saponines, terpenoids, nucleosides 등 거의 모든 셍합성 기원의 물질을 포괄할 정도로 다양하며, 이들은 주로 강력한 세포독성을 나타내어 면역억제제(discodermolide), 항암제(halichodrin),항진균제, 소염진통제 등의 소재로서 가치가 증명되고 있다. 그러나, 해양생태계 보전에 대한 관심과 우려가 커지고 있는 상황에서 천연물연구를 위한 해면동물 확보는 더욱 어려워지고 있다.</p> <p>이러한 문제에 대응하기 위하여 본 연구진은 해면동물 추출물에 대한 생리활성 및 성분프로파일 분석 데이버베이스를 구축하여 자원의 가치 평가 및 분석을 용이하게 하고, 불필요한 생물 자원 소비를 줄여 해양생태계 보존 및 효율적인 해면동물자원 연구를 가능하게 함으로서 해결점을 찾고자 하였다. 이를 위해 국랍해양생물자원관으로부터 해면동물 추줄물을 분양 받은 후 추출물의 기초생리활성과 high-performance liquid chromatography (HPLC) 분석을 수행하였고, 이에 대한 결과를 보고하여 해면동물자원 연구데이버베이스를 구축하는 기초를 마련하고자 한다.</p> <h2>재료 및 방법</h2> <h3>시약 및 기구</h3> <p>메탄올, 아세토니트릴, 물은 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)의 HPLC등급을, formic acid는 Thermo Fisher Scientific의 LC-MS용을 사용하였다. 고체상 추출카트리지는 Waters (Milford, OH, USA)의 Sep-Pak Plus tC18 Environmental cartridge \( (900 \mathrm{mg}) \) 을 사용하였고 용출은 실린지를 이용하였다.</p> <h3>사용 기기</h3> <p>HPLC 및 electrospray ionization mass spectrometry 분석은 Agilent Technologies 1200 series/Agilent 6120 Quadrupole LC/MS (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA)을 사용하였고, 분석에 사용된 column은 Luna C18(2) \( 5 \mu \mathrm{m} \) column 4.6×150 mm (Phenomenex Inc., orrance, CA, USA)를 사용하였다. 전치리 시료의 농축을 위하여 SpeedVac concentrator (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)를 사용하였다.</p> <h3>시료 전처리</h3> <p>사용할 Sep-Pak 카트리지는 먼저 에탄올 \( 5 \mathrm{~mL} \), 증류수 \( 5 \mathrm{~mL} \) 을 흘려주어 활성화시킨 후, 제공반은 해면추출물 약 \( 10 \mathrm{mg} \) 을 증류수 \( 1 \mathrm{~mL} \) 에 충분히 녹인 후 활성화된 카트리지에 흘려 통과시킸다. 시료를 모두 통과시킨 다음, 수분이 제거되도록 충분히 air-aspiration한 후 에반올 \( 2 \mathrm{~mL} \) 로 용출 시켜 염이 제거된 해면 추출물 시료를 조제하였다. 용출된 시료는 HPLC-MS 분석에 사용하였고, 또한 시료를 농축 후 \( \mathrm{DMSO} \) (Merck KGaA, Darrnstadt, Germany)에 녹여 생리활성 탐색에 사용하였다.</p> <h3>HPLC-MS 분석 및 크로마토그램 변환</h3> <p>전치리 된 시료는 20 분간, \( 10-100 \% \) 아세토니트럴-물(v/v)의 기울기 용리를 이용하여 HPLC-MS 분석하였고, 각각 시료의 254 \( \mathrm{nm} \) 에서 측정한 크로마토그램을 스프레드시트로 변환하였다. 각 결과를 BioNumerics \( 7.5 \) 소프트웨어(bioMérieux company, Marcy-l'Étoile, France)에서 유사도 분석을 실시하였고 distance 는 Pearson's correlation로 계산하여 UPGMA 알고리즘을 이용하여 dendrogram을 생성하였다.</p> <h3>Nitric oxide (NO) assay</h3> <p>96 well plate 기준 \( 2.5 \times 10^{4} \) cell/well이 되도록 Raw264.7 cell 을 분주한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 ovemight 배양하였다. 이후 화합물을 \( 50,16.6,5.55 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도로 치리하여 2시간 후에 lipopolysaccharides (LPS from Escherichia coli 026:B6, Merck \( \mathrm{KGaA}) \) 를 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도가 되도록 침가하였고, 24시간 배양하였다. 배양된 세포에 griess reagent (sulfanilamide 1\% (w/v) in phosphoric acid 5\% (v/v) : \( N \)-(naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride \( 0.1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v})=1: 1) \) 를 침가하여 상등액과 반응하였고 Synergy HI multi-mode microplate reader (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 이후 남은 plate에 EZ-Cytox (DoGenBio., Seoul, Korea)를 \( 10 \mu \mathrm{L} \) 씩 치리하여 30 분간 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반응하였고 450 \( \mathrm{nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 확인하였다.</p> <h3>Calcein AM assay</h3> <p>96 well plate 기준 \( 3 \times 10^{3} \) cell/well이 되도록 \( \mathrm{HT} 22 \) cell을 분주한 후 세포의 밀도가 \( 40 \% \) 가 될 때까지 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 배양한다. 배양된 세포에 화합물을 \( 50,16.6,5.5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도로 처리하여 2시간 후에 glutamate (L-Glutamic acid monosodium salt hydrate, Merck KGaA)를 \( 5 \mathrm{mM} \) 농도가 되도록 첨가하였다. 이후 세포 셍존율이 \( 50 \% \) 가 되었을 때, Invitrogen \( ^{\mathrm{TM}} \) Calcein, AM (Thermo Fisher Scientific)을 제공된 지침에 따라 치리하여 세포를 염색하였다. 이후 \( \mathrm{Operetta}^{\mathrm{M}} \) (PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA)를 사용하여 염색된 세포를 계수하였다.</p>