아스코브산 과산화효소의 활성도는 액체 질소로 시료를 분쇄하고 아스코브산을 포함한 인산 완충액에서 추출한 조효소액을 사용해 측정한다. 반응은 과산화수소 첨가를 통해 시작하며, 아스코브산의 산화 변화를 \(290 \mathrm{~nm}\)에서 흡광도 측정을 통해 확인한다. DHA 환원효소의 조효소액 조제는 아스코브산을 추가하지 않는 동일한 방법으로 이루어진다. 과산화수소의 함량은 액체 질소를 이용한 시료 분쇄 및 TCA로 추출한 현탁액에서 측정하며, Northern Blot분석을 위한 RNA는 CTAB 사용하여 추출하고, 아가로스 젤 전기영동 후에 nylon membrane에 전이시킨다.
<h2>조효소액의 조제와 효소활성도 측정</h2> <p>아스코브산 과산화효소(APX)의 활성도 측정을 위한 조효소액의 조제는 보관중인 시료(3그램)를 액체질소를 넣어 마쇄한 후 \( 1 \mathrm{mM} \)의 아스코브산이 포함된 10배 부피의 인산완충액 (\(\mathrm{pH} ~7.5 \), \( 100 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{K}\)-\(\mathrm{P}_{\mathrm{i}} \) 완충액, \( 0.33 \mathrm{mM} \) mannitol, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \(1\%\)(\(\mathrm{w}/\mathrm{v}\)) PVP-40, \( 1 \mathrm{mM} \) PMSF, \( 1 \mathrm{mM} \) ascor-bate)에서 추출하였다. APX의 활성도의 측정은 \( 290 \mathrm{~nm}(\varepsilon \) \( =2.79 \mathrm{mM}^{-1} \mathrm{~cm}^{-1} \))의 흡광도 감소를 활성도 측정용 완충액이 포함된 반응액에서 다음과 같이 수행하였다. 효소활성도 측정용 반응액(총부피 \( 1 \mathrm{ml}) \)은 \( 50 \mathrm{mM} \) 인산완충액 \( (0.5 \mathrm{mM} \) ascorbate, \( 0.2 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\), \(30 \mu \mathrm{l} \) 조효소액)을 사용하였으며 반응용액에 과산화수소 첨가하면서 반응을 개시하고 1분 동안 산화된 아스코브산의 변화를 \( 290 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 효소액과 과산화수소를 첨가하지 않고 산화된 흡광도의 변화를 대조로 하여 보정한 후 아스코브산의 산화정도를 시간 당 \( \mu \mathrm{mol} \)로 계산하여 활성도로 나타내었다.</p> <p>DHA 환원효소(DHAR)의 조효소액은 아스코브산을 첨가하지 않은 동일한 완충액과 동일한 방법으로 추출하여 조제하였다. DHAR의 활성도 측정은 DHA가 아스코브산으로 환원되는 양을 \( 290\mathrm{~nm}\)(\( \varepsilon=2.79 \mathrm{mM}^{-1} \mathrm{~cm}^{-1} \))에서의 흡광도 변화를 \( 50 \mathrm{mM} \) 인산완충액 (\(\mathrm{pH~} 6.5\), \( 0.1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 0.5 \) \( \mathrm{mM} \) MDHA, \( 2.3 \mathrm{mM}\) GSH)에서 측정하였으며 GSH에 의한 비효소적 DHA의 환원된 량을 보정하였다. 각각의 조효소액의 단백질의 함량은 Bradford법으로 측정하였다.</p> <h2>엽록소와 카로티노이드 함량</h2> <p>총 엽록소와 엽록소 a와 b, 카로티노이드의 함량은 시료 0.2그램을 액체질소에서 마쇄한 후 10배 부피의 인산완충액 [\(\mathrm{pH~} 7.0\), \(20 \%~\)sorbitol, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA와 \( 0.1 \%\)(\(\mathrm{w} / \mathrm{v}\)) PMSF]으로 현탁하였다. 이 현탁액 \(100 \mu \mathrm{l} \)를 \(900 \mu \mathrm{l} \)의 \( 95 \%\)(\(\mathrm{v} / \mathrm{v}\)) 에탄올을 넣고 완전히 혼합하고 \( 12,000 \times g \)에서 10분간 원심분리한 상징액을 각각 \( 664 \mathrm{~nm}\), \(648 \mathrm{~nm} \), and \( 470 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 엽록소와 카로티노이드 함량을 환산하여 생체 중량 당 \( \mathrm{mg} \)으로 나타내었다.</p> <h2>과산화수소 함량</h2> <p>과산화수소의 함량은 시료 0.2그램을 액체질소를 넣어 마쇄하고 10배 부피의 \( 0.1 \%\)(\(\mathrm{w} / \mathrm{v}\)) trichloriacetic acid (TCA)로 추출한 현탁액을 \( 12,000 \times g \)에서 15분간 원심분리하여 상징액을 수집하였다. 상징액 \( 500 \mu \mathrm{l} \)를 \( 10 \mathrm{mM} \) 인산완충액 (\(\mathrm{pH~} 7.0\))과 \( 1 \mathrm{ml} \)의 \( 1 \mathrm{M}\) \(\mathrm{KI} \)를 첨가하여 발색시킨 후 \( 390 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 과산화수소 표준곡선으로부터 과산화수소의 함량을 \( \mu \mathrm{M} \)로 나타내었다.</p> <h2>APX와 DHAR의 cDNA증폭</h2> <p>APX와 DHAR의 cDNAs는 시금치의 cDNA (accession.No. AB063289, AF195783)로부터 프라이머[APX: 5'-CTG ATG GGT GAG AAA GAA GG-3'(F), 5'-ATG TTG CTT GCT TTG GTA AT-3'(R); DHAR: 5'-AGT CGC GTA TTC ACT TTC AT-3'(F), 5'-AGA TTG CAT TGG GAC ATT AC-3'(R)]를 제작 프로그램(Primer 3, Whitehead Institute, USA)을 사용하여 제작하여 PCR의 방법으로 증폭하였다. PCR은 최종 부피를 \( 25 \mu \mathrm{l} \)로 하여 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 반응시킨 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 52^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분의 순서로 35cycles로 수행한 다음 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 안정화시켰으며 \( 2 \%\)(\(\mathrm{w} / \mathrm{v}\)) 아가로스젤 전기영동으로 단일밴드를 확인하였다.</p> <h2>Northern Blot 분석</h2> <p>Northern Blot분석을 위한 RNA의 추출은 CTAB을 이용하여 추출하였으며, 추출한 총 RNA(\(11.4 \mu \mathrm{g}\))는 \( 10 \%\)(\(\mathrm{v} / \mathrm{v}\)) formaldehyde가 함유된 \( 1.2 \%\)(\(\mathrm{w} / \mathrm{v}\)) 아가로스 젤 전기영동을 한 후 nylon membrane (Sigma, CO, USA)에 전이시켰다. Membrane은 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)의 Prehybridization 완충액(\(6 \times\) SSC, \(5 \times\)Denhardt's 용액, \( 1 \%\)(\(\mathrm{w} / \mathrm{v}\)) SDS, \( 100 \mu \mathrm{g} \mathrm{ml}^{-1} \) denatured sal-mon sperm DNA)에서 3시간 동안 반응시켰으며, APX와 DHAR의 P-random primed cDNA가 들어있는 Hybridization 완충액에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응액을 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)의 세척완충액(\(2 \times \) SSC, \(0.1 \%~\)SDS)에서 10분간, \( 0.1 \times \) SSC, \(0.1 \%~\)SDS에서 1시간) 세척한 후 24시간 동안 노출시키고 Blot 분석시스템 (Storm, GE healthcare, USA)에서 스캔하였다.</p>