Surfactant micelle과 W/O/W multiple emulsion을 제조하기 위해 SigmaChemical Co. 및 FisherScientific에서 구입한 시약들과 특급 시약, 진한 황산으로 씻은 2차 증류수로 행군 후 건조한 초자기구를 사용하였다. Surfactant micelle은 \( 10 \mathrm{mM} \) citrate buffer를 이용하여 Cho 등이 hydroperoxide 전이에 최적조건이라고 보고한 최종 농도 \( 3 \%, \mathrm{pH} 3.0 \) 으로 조절하여 제조하고, W/O/W multiple emulsion은 1차 수상phage를 첨가한 후 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지하고 \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 3분간 homogenization 시켜 제조하였다. 그리고 현미경과 주사투과전자현미경을 이용하여 W/O/W multiple emulsion의 입자안정성과 입자 사이즈를 관찰하였다. 연속상 분리를 위해, 에멀젼을 원심분리기에서 30분 동안 \(14,600 \times g\)의 힘으로 \(10^{\circ} \mathrm{C}\)에서 원심분리했다. 그 후, 18 게이지 바늘이 달린 \( 5 \mathrm{ml} \) 일회용 주사기를 사용하여 상징액을 분리하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약 및 재료</h2> <p>Brij72, imidazole, ferric chloride, ferrous sulfate, citricacid, ferrozine, hydroxylamine-hydrochloride, barium chlor-ide, ammonium thiosulfate와 sodium acetate 등은 SigmaChemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입해서 사용하였고, methanol, butanol, isooctane 및 isopropanol 등은 FisherScientific (Fair Lawn, NJ, USA)에서 구입하여 사용하였으며,기타 시약은 특급 시약을 사용하였고, 초자기구는 사용하기전에 진한 황산으로 씻은 뒤 2차 증류수로 행군 후 건조시켜사용하였다.</p> <h2>Surfactant micelle의 제조</h2> <p>Surfactant micelle은 Brij72를 사용하여 \( 10 \mathrm{mM} \) citrate buf-fer를 이용하여 Cho 등이 hydroperoxide 전이에 최적조건이라고 보고한 최종 농도 \( 3 \%, \mathrm{pH} 3.0 \) 으로 조절하여 제조하였다. Surfactant micelle은 자석교반기 위에서 micelle을 형성시키기 위해 10분간 교반 시키고 pH를 정확하게 조절하였다.</p> <h2>W/OM multiple emulsion 제조</h2> <p>유상phage에 1차 수상phage를 첨가한 후 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지시키고, 3,000 rpm에서 3분간 1차 homoge-nization 시켜 W/O type의 emulsion을 제조한 후 점증제와 2차 수상phage를 넣고 \( 3,000 \mathrm{rpm} \) 에서 3분간 2차 homoge-nization 시켰다. Homogenization 시킨 액은 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 냉각시키고 vacuum pumping cooling하여 W/O/W multiple emul-sion액을 제조한 후, \( \mathrm{FeCl}_{3} \) 용액(산화촉진제)을 emul-sion액에 첨가하고 30 분간 교반하여 W/O/W type의 emul-sion을 제조하였다.</p> <h2>현미경 및 주사투과전자현미경 관찰</h2> <p>W/O/W multiple emulsion의 입자안정성을 관찰하기 위하여 현미경(Olympus BX 51, Japan)을 이용하여, 입자를 관찰하였으며, W/O/W multiple emulsion의 2상과 3상의 입자 사이즈를 측정하기 위하여 주사투과전자현미경(scanning trans-mission electron microscope CM200, philips, Netherlands)을이용하여 입자 사이즈를 관찰하였다.</p> <h2>Continuous phase의 분리</h2> <p>Continuous phase의 분뢰를 위하여, emulsion을 원심분리기를 이용하여 \( 14,600 \times g \)로 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분간 원심분리 시킨후, 상징액을 18 gauge needle을 가진 \( 5 \mathrm{ml} \) disposable syringe를 사용하여 continuous phase를 분취하였다.</p> <h2>Ferric iron 농도 측정</h2> <p>Ferric iron 농도는 Fukuzawa와 Fujii의 방법으로 측정하였다. Continuous phase 용액 \( 1 \mathrm{ml} \) 에 \( 10 \% \) hydroxyl-amine-hydrochloride/2 N HCl \( 1 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 실온에서 15 분간 환원시킨 뒤, \( 10 \mathrm{mM} \) buffer \( 1 \mathrm{ml} \)를 첨가하고, \( 9 \mathrm{mM} \)ferrozine \( 0.5 \mathrm{ml} \)를 첨가한 후 10분간 방치시켜 발색시켰다. 발색 후 \( 562 \mathrm{~nm} \) 에서 홉광도를 측정하였으며, ferric iron의 농도는 표준곡선을 이용하여 환산하였다.</p> <h2>Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) 측정</h2> <p>TBARS는 Buege와 Aust의 방법에 따라 측정하였다. 1\% linoleic acid와 1\% Tween 40으로 emulsion을 만들고 emul-sion \( 0.8 \mathrm{ml} \)와 \( 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도의 시료 \( 0.2 \mathrm{ml} \)를 섞은 후 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)water bath에서 10시간 반응시켰다. 반응 후 반응액 \( 1 \mathrm{ml} \) 에TBA regent \( 2 \mathrm{ml} \)를 가하고 15분간 boiling한 다음 10분간 냉각시킨 후 15분간 \( 1,000 \mathrm{rpm} \) (vision, VS-5500N)으로 원심분리하고, 실온에서 10분간 방치 후 상등액을 \( 532 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를측정하였으며, TBARS 값은 \( 1 \mathrm{ml} \) 반응혼합물에 대해서 생성된 1,1,3,3-tetraethoxy propane (TEP)의 \( \mu \mathrm{M} \)로 표시하였다.</p> <h2>Headspace aldehyde의 측정</h2> <p>Headspace aldehyde는 Mancuso 등의 방법으로 head-space autosampler (Hewlet- Packard 19395A)를 장착한 gaschromatography (Shimadzu GC-17, Braintree, MA, USA)로측정하였다. 이때 auto sampler의 조건은 sample loop와transfer line 온도는 \( 110^{\circ} \mathrm{C} \), bath 온도는 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \), pressurization10 초, venting 10초, 그리고 injection 시간이 1분이었다. Headspace aldehyde의 분리는 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 HP methyl silicone(DB-1) fused silica capillary column으로 분리되었다. 이때injector 온도는 \( 180^{\circ} \mathrm{C} \) 이었고, flame ionization detector 온도는 \( 250^{\circ} \mathrm{C} \) 이었다.</p>