세포의 내단막막(endoplasmic reticulum, ER)이 분비단백질과 막 단백질의 폴딩과 결합을 돕는 환경을 제공하는 방식을 탐구하였다. 이를 위해 ER 내의 특이 단백질들, 즉 ER molecular chaperones를 고려했다. ERp29-binding protein 탐색을 위해 Matchmaker LexA two-hybrid system을 활용한 yeast two-hybrid assay를 진행하였으며, 이를 위해 ERp29 cDNA를 pLexA vector의 DNA-BD region에 결합시키고 yeast strain EGY48 strain에 형질전환시켰다.
<h1>서 론</h1> <p>세포에서 endoplasmic reticulum (ER)의 가장 중요한 기능 중의 하나근 ER내에서 정상적으로 신생분비단백질과 막구성 단백질이 folding/assembly할 수 있는 세포내 환경을 제공하는 것이다. 그러기 위하여 ER내에는 여러 종류의 특이 단백질이 존재하여 단백질의 최종 운명을 조절한다. 이들을 총칭하여 ER molecular chaperone이라고 한다. 1997년에 처음으로 Hubbard에 의해서 ERp29가 cloning되고 ER에 존재한다는 것이 보고되었으며(24.5 kDa soluble ER protein, pI 6.0), 분비단백질에 특이적인 역할을 한다는 것을 알았다. 그러나 뚜렷한 기능연구의 실마리를 찾지 못할 때에 우리는 TSH에 의해서 ERp29 유전자 발현이 조절되는 것을 밝혔다. 2001년에는 NMR을 사용하여 ERp29의 구조가 결정되고, 대표적인 분비당단백질인 thyroglobulin의 folding에 관여하는 것과 genomic DNA의 구조가 결정되었으며 전체적으로 brain에서 높은 발현을 보이는 것이 알려 졌다. 특히, 흥미로운 것은 ERp29가 세포에 침입하기 위한 polyomavirus와 결합하여 구조 변화를 유도하는 것이다. 세포 내에서 ERp29는 단백질의 분비를 촉진시키며, 정자형성과정과 방사선 조사, 손상된 척수에서 특이적으로 발현한다. 한편 ERp29가 connexin43 oligomerization과 apoptosis를 저해하고, 반대로 cytokeratin 19는 ERp29표현을 저해한다. 그러나 앞에서 기술한 것과 같이 여러 종류의 연구결과가 있음에도 불구하고 아직까지 ERp29의 정확한 기능을 알지는 못하고 있다. ERp29의 기능연구를 심화하기 위하여서는 ERp29-결합단백질에 관한 연구가 필요 불가결 하다고 판단하여, 먼저 yeast two-hybrid 방법으로 탐색하여 얻은 후보군을 상대로 GST pull-down assay를 통하여 최종적으로 ERp29-결합단백질로서 ADP-ribosylation factor 5 (ARF5)을 발견하였다. ARF family는 기능상 class I (ARF1-3), class II (ARF4, ARF5), class III (ARF6)로 분류된다. 알려진 대표적인 기능으로는 vesicular trafficking에 관여하는 것과 phospholipase D의 activator로 작용하는 것이다. 그러나 ARF5가 ER chaperone과 관련된 보고된 연구결과는 없다. 당쇄가 붙어 있지 않은 ARF5 단백질과 ER에 존재하는 ERp29와 interaction하는 것은 ERp29의 기능 연구 측면에서 아주 흥미로운 일이다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <p>Matchmaker LexA two-hybrid system (Clontech)을 사용하여 ERp29-binding protein screening을 위한 yeast two-hybrid assay 실시하였다. ERp29 cDNA을 pLexA vector의 DNA-BD region에 fusion시켜서 yeast strain EGY48 strain에 형질전환하였다. EGY48 strain은 total rat thyroid cDNA로 transformation되어서 ERp29 bait plasmid를 가지고 있는 것이다. 이들의 배양은 histidine, tryptophan, uracil이 결여되고 glucose를 포함하는 synthetic dextrose (SD) plate에서 행하였다. large scale 결과 약 350개 colony를 X-gal에 다시 옮겨 확인한 결과, 62개는 white였으므로 총 288개 colony를 다음 단계의 실험에 사용하였다. 그 결과 48개의 colony를 선별해서 yeast plasmid miniprep 실시하여 대장균 KC8 strain에 옮겨서 insert을 확인하고 \( 400 \mathrm { bp } \) 이하 insert을 제외하고 재형질전환 실험 결과 총 21개 blue colony 얻었다. 이중 아주 강한 blue와 강한 blue의 DNA sequence결과 10개의 ERp29-결합단백질 후보군을 얻었다. HEK293 (human embryonal kidney) cell은 \( 10 \% \) FBS가 포함된 DMEM 배지 내에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \), 충분히 습한 조건으로 배양하였다. pcDNA3.1-hERp29/GST와 pcDNA3.1-hARF5/V5을 HEK293 cell에 각각 transfection한 36시간 후에 발현을 확인하였다. pcDNA3.1-hERp29/GST을 확인한 다음에 pcDNA3.1- hARF5/V5를 transfection 하였다. 36시간이 지난 후에 실험에 사용하였다. pcDNA3.1-hERp29/GST을 HEK293 cell에 transfection 한 후 24시간 후에 다시 pcDNA3.1- hARF5/V5를 transfection 하였다. 36시간이 지난 후에 실험에 사용하였다. Immunoprecipitation (IP)에 사용할 cell을 차가운 PBS로 2회 씻어 준 다음 RIPA로 lysis하였다. Cell extract를 정량하여 \( 1 \mathrm { mg } \) 으로 양을 맞춘 후 ERp29 antibody \( 4 \mathrm { ul } \)를 넣고 에서 4시간 동안 head-over-tail swinging 시켰다. Protein A/G PLUS agarose를 \( 40 \mathrm { ul } \) 를 새 tube에 옮기고 PBS로 2회 rinse 한 후 각각의 sample에 첨가하 여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 12시간 동안 head-over-tail swinging 시켰다. Ripa buffer \( 1 \mathrm { ml } \) 씩 4회 씻어준 후 \( 2 \times \) SDS-PAGE sample buffer \( 40 \mathrm { ul } \) 넣고 5분간 boiling 하여 elution 하였다. IP 한 sample을 \( 12 \% \) SDS-PAGE gel 에 loading 하여 anti-V5 로 Western blotting 하였다.</p>