American Type Culture Collection에서 구입한 NCI-H460 세포주를 배양하여 assay법으로 세포생존률을 측정하였고, 세포를 공동염색한 후 세포주기와 세포사멸, 단백질의 발현량을 분석하였다. 이는 통계적으로 유의하다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포배양</h2> <p>NCI-H460 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS; Gibco BRL, Grand Ishand, NY, USA)과 1\% penicillin streptomycin이 포함된 RPMI 1640 medium에 2\( \mathrm{mM} \) L-glutamine, \( 1.5 \mathrm{~g} / 1 \) sodium bicarbonate, \( 4.5 \mathrm{~g} / 1 \mathrm{gglu}- \)cose, \( 10 \mathrm{mM} \) HEPES와 \( 1.0 \mathrm{mM} \) sodium pyruvate (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 첨가하여 배양하였다. 배양은 \( 5 \% \) 의 \( \mathrm{CO}_{2} \)와 \( 95 \% \) 의 air가 포함된 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 하며, 세포 수는 trypan blue dye로 염색하여 haemacytometer로 계수하였다. 세포의 배양액은 2-3일에 한번씩 교체 했고, \( 70-80 \% \) 의 세포밀도(cell density)를 보일 때 계대배양(subculture)을 수행하였다. Sodium butyrate (Sigma, St. Louis, MO, USA) 처리는 6-well의 배양접시에 각각 \( 2.3 \times 10^{5} \)개의 세포를 분주하여 24시간 동안 세포배양기에서 부착시키고, 새로운 배양액으로 교체한 후 수행하였다. 세포에 시료를 처리한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 배양시킨 뒤, 세포를 수획하여 실험을 수행하였다.</p> <h2>세포생존률 측정</h2> <p>MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide] assay법으로 세포생존률을 측정하였다. 6-well의 배양접시에 각각 \( 2.3 \times 10^{5} \)개의 세포를 분주하여 24시간 동안 세포배양기에서 부착시킨 후, sodium butyrate를 0, 2.5, 7.5 및 20\(\mathrm{mM} \)의 농도로 처리한 후, 각각의 처리군을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 동안 배양 시킨 뒤, 배양액을 제거하고 PBS로 세척 해준 다음, 각 well에 MTT (Sigma, St. Louis, MO, USA)의 최종농도가 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)이 되도록 하였다. 4시간 동안 반응시킨 후 상등액을 완전히 제거한 뒤, 각 well에 최종적으로 DMSO를 첨가하였다. Microplate reader (BIOTEK EL-312e, VT, USA)를 사용하여 파장 490\(\mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Annexin-V 염색 및 세포사멸 평가</h2> <p>세포의 염색은 AnnexinV-FITC Apoptosis Detection kit (BD Biosciences, NJ, USA)에서 제시한 실험방법으로 수행하였다. Annexin-V와 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) propidium iodide를 공동염색하여 유세포측정기로 분석하였다.</p> <h2>세포주기 분석</h2> <p>세포주기 분석과 세포사멸률 측정을 위해서 수획된 세포는 \( 75 \% \) ethanol에서 냉장 상태로 24시간 동안 고정하였다. 고정된 세포의 핵은 propidium iodide (PI, \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \); Sigma, St. Louis, \( \mathrm{MO}, \mathrm{USA}) \) 용액으로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 염색하고, 염색하는 동안 RNase A \( (100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \); Sigma, St. Louis, MO, USA)를 처리하여 세포내의 RNA를 모두 제거하였다. 실험에 사용된 세척액은 \( 1 \% \) bovine serum albumin (BSA)이 포함된 phosphate buffered saline (PBS, \(\mathrm{pH }\) 7.4)을 사용하며, 세포주기와 사멸률은 유세포 측정기(Epics XL; Beckman Coulter, MI, USA)로 분석하였다.</p> <h2>Western blot 분석</h2> <p>각각의 시료를 처리한 세포를 세포용균용액인 lysis buffer [50 mM Tris \( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} 7.6), 0.5 \% \) Triton X-100, \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \), \( 10 \mathrm{mM} \) EDTA, protease inhibitor cocktail (104 mM AEBSF, \( 0.08 \mathrm{mM} \) aprotinin, \( 2.1 \mathrm{mM} \) leupeptin, \( 3.6 \mathrm{mM} \) bestain, \( 1.5 \) \( \mathrm{mM} \) pepstatin)]로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 40 분간 용해시키고, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분 간 \( 14,000 \mathrm{rpm} \) 으로 원심분리 한 후 단백질이 포함된 상등액만을 취하여 Bradford (Pierce, Rockford, IL, USA) 방법으로 총 단백질을 정량하였다. 각각의 시료에서 단백질 \( 30 \mu \mathrm{g} \)을 균등하게 취하여 SDS-polyacrylamide gel (8-15\(\%\) gradient gel)에서 전기영동 한 후, nylon membrane에 전기적으로 전위시켰다. Anti- XIAP (Trevigen, Ave. Carlsbad, CA, USA), anti-caspase 3 (Santa Cruz Biotech, CA, USA), anti-cleaved caspase 3 (Cell Signalling, Beverly, MA, USA), anti-cleaved caspase 7 (Cell Signalling, Beverly, MA, USA), anti-PARP (Cell Signalling, Beverly, MA, USA), anti-p53 (Santa Cruz, CA, USA), anti-ERK (Cell Signalling, Beverly, MA, USA), anti-pERK (Cell Signalling, Beverly, MA, USA), anti-actin (Sigma, St. Louis, MO, USA) 등을 1차 항체로 하고, enhanced chemiluminescence 방법(ECL, Amersham Co.)으로 단백질의 발현량을 분석하였다.</p> <h2>통계분석</h2> <p>통계적 검증은 Student-t test를 사용하고, 신뢰구간은 \( 5 \% \)로 하여 \( \mathrm{p} \) 값이 \( 0.05 \) 보다 낮은 경우를 유의하다 판단하였다.</p>