본 실험에서는 mammalian cell line HEK293, mouse B lymphoma Ag8(8), COS-1을 사용하였다. Histidine tag이 붙은 recombinant BiP \( 2 \mu \mathrm{g} \) [7,18]과 \( 20 \mu \mathrm{l} \) \( \mathrm{Ni}^{2+} \)-agarose bead (Qiagen, Germany)를 섞은 후에 각각 10\( \mu \mathrm{M} \) 의 ATP와 ADP를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시켰다. B lymphoma Ag8(8) 세포 또는 BiP과 면역글로불린 heavy chain cDNA를 칼슘침전방법으로 transfection한 COS-1 세포를 \( 1 \mathrm{ml}\) NP-40 lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, \( 150 \mathrm{mM} \) NaCl, \(0.5 \%\) deoxycholic acid, \(0.5\%\) Nonidet P-40)를 사용하여 파쇄하였다. \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양하고, 48시간 후에 세포를 회수하여 실험에 사용하였다. HEK293 세포를 상기의 방법과 같이 transfection 한 후 18시간 동안 pro-mix L-\( \left[{ }^{35} \mathrm{~S}\right] \) in vitro cell labeling mix \( (300 \mu \mathrm{Ci} \), Amersham-Pharmacia)를 사용하여 metabolic labeling을 하였다. \( \mathrm{DSP} \) 처리 후 얻은 세포파쇄액을 본 실험실에서 제조한 10 \( \mu \mathrm{l} \) 토끼 anti-BAP과 anti-Grp170 항체를 사용하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2시간 동안 면역침강을 실시하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>Cell lines</h2> <p>본 실험에서는 mammalian cell line HEK293, mouse B lymphoma Ag8(8), COS-1을 사용하였다. HEK293과 COS-1 cello \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS), \( 2 \mathrm{mM} \) L-glutamine, 100 unit/ml penicillin-streptomycin이 함유된 DMEM 완전 배지를 사용하였고, Ag8(8)은 \( 10 \%\) FBS, 2\(\mathrm{mM} \) L-glutamine, 100 unit/ml penicillin-streptomycin이 함유된 RPMI-1640 완전배지를 사용하여 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \)가 공급되는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 배양하였다.</p> <h2>In vitro에서 BAP의 핵산 의존적 BiP과의 결합</h2> <p>Histidine tag이 붙은 recombinant BiP \( 2 \mu \mathrm{g} \) [7,18]과 \( 20 \mu \mathrm{l} \) \( \mathrm{Ni}^{2+} \)-agarose bead (Qiagen, Germany)를 섞은 후에 각각 10\( \mu \mathrm{M} \) 의 ATP와 ADP를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시켰다. COS-1 세포를 500\(\mu \mathrm{l} \) HEPES 완충액(20 mM Hepes, \(0.5\%\) Triton X-100, \(5\%\) glycerol, pH 7.2)으로 파쇄하고 원심분리 하여 상층액을 회수하였다. 회수한 세포파쇄액 200\(\mu \mathrm{l} \)에 10\( \mathrm{mM} \) ATP 와 ADP를 첨가한 후 recombinant BiP이 결합된 \( \mathrm{Ni}^{2+} \) agarose bead에 첨가하여 세포 내 BAP이 BiP에 결합되 도록 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 더 반응시켰다. 반응 후 \( 100 \mu \mathrm{M}\) ATP 또는 ADP 함유 HEPES 완충액으로 bead를 3번 세척한 후 SDS-PAGE로 단백질 분리하였다. 분리된 단백질은 nitrocellulose membrane에 transfer하여 토끼 anti-BiP과 anti-BAP 항체로 western blot을 하였다.</p> <h2>BiP으로부터 면역글로불린 heavy chain 해리 분석</h2> <p>B lymphoma Ag8(8) 세포 또는 BiP과 면역글로불린 heavy chain cDNA를 칼슘침전방법으로 transfection한 COS-1 세포를 \( 1 \mathrm{ml}\) NP-40 lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, \( 150 \mathrm{mM} \) NaCl, \(0.5 \%\) deoxycholic acid, \(0.5\%\) Nonidet P-40)를 사용하여 파쇄하였다. 세포파쇄액에 \( 10 \mu \mathrm{l} \) protein A-agarose bead ( \( 50 \% \) \( \mathrm{w} / \mathrm{v}) \)를 첨가하여 BiP-면역글로불린 heavy chain 복합체를 침전시켰다. 침전된 복합체에 본문에서 명기한 여러 조절인자들을 첨가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 SDS-PAGE로 복합체를 분리하고 Coomassie blue 염색을 하여 BiP-면역 글로불린 heavy chain 복합체의 변화를 분석하였다.</p> <h2>Ca 침전에 의한 DNA transfection</h2> <p>HEK293 세포 \( 3 \times 10^{6} \) cells을 \( 100 \mathrm{~mm} \) 배양접시에 배양하여 \( 1.8 \mathrm{ml} \) Hepes buffered saline (pH 7.11), \( 6 \mu \mathrm{g} \) DNA, \( 50 \mu \mathrm{g} \) carrier DNA (salmon testes DNA, Sigma), \( 120 \mu \mathrm{l} \) 2M \( \mathrm{CaCl}_{2} \)를 혼합한 후 30분 동안 실온에 둔 뒤 배양세포에 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양하였다. 48시간 후에 세포를 회수하여 실험에 사용하였다.</p> <h2>Metabolic labeling과 cross-link</h2> <p>HEK293 세포를 상기의 방법과 같이 transfection 한 후 18시간 동안 pro-mix L-\( \left[{ }^{35} \mathrm{~S}\right] \) in vitro cell labeling mix \( (300 \mu \mathrm{Ci} \), Amersham-Pharmacia)를 사용하여 metabolic labeling을 하였다. [ \( { }^{35} \) S] labeling이 된 cell을 PBS로 3회 세척 후 \( 30 \mu \mathrm{l} \) cross-linking agent인 Dithiobis[succinimidylpropionate] (DSP, \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \), Pierce, USA)를 넣은 후 1시간 동안 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응시켰다. \( 100 \mu \mathrm{l} \) M glycine을 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분 동안 cross-linking을 종결하였다. Cross-linking이 종결된 세포를 \( 1 \mathrm{ml}\) NP-40 lysing buffer에 현탁하여 20분간 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 방치하여 파쇄한 후 13,000rpm으로 원심분리를 하여 세포파 쇄액을 회수하였다.</p> <h2>BAP과 Grp170 결합분석</h2> <p>\( \mathrm{DSP} \) 처리 후 얻은 세포파쇄액을 본 실험실에서 제조한 10 \( \mu \mathrm{l} \) 토끼 anti-BAP과 anti-Grp170 항체를 사용하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2시간 동안 면역침강을 실시하였다. 면역침강된 단백질을 \( 10 \% \) SDS polyacrylamide gel을 사용하여 전기영동을 하고, 분리 된 단백질을 \( 150 \mathrm{~mA} \) 조건에서, 3시간동안 nitrocellulose membrane에 흡착시킨 후 X-ray film에 노출하였다. 또한 whole cell lysate는 SDS-PAGE로 분리한 후 동일한 항체를 사용하여 western blot 방법으로 BAP과 Grp170의 발현을 분석하였다.</p>