선별된 유전자 재조합 형질전환체는 kanamycin \( (50 \mathrm{ug} / \mathrm{ml}) \) 이 포함된 potassium phosphate-buffered Terrific Broth medium (TB)에서 \( \mathrm{OD}_{600 \mathrm{~nm}} \) 의 값이 \( 2.0 \) 이 될 때까지 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 성장시켰고, 이후 \( 18^{\circ} \mathrm{C} \) 환경에서 \( 0.5 \mathrm{mM} \mathrm{IPTG} \) 를 첨가하여 human CGL의 발현을 유도, 정제된 효소의 보효소 PLP 함량은 보고된 방법으로 측정하여 \( 1 \mathrm{~mol} \) 의 PLP가 한 개의 subunit에 포함되어 있음을 확인하여 정제효소의 순도는 UV-visible spectrum,SDS-PAGE, western blot으로 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>Kanamycin, isopropyl \( \beta \)-D-1-thiogalgctopyranoside (IPTG), L-SeMet, 5,5'-Dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB), 3-methyl-2-benzothiazolone hydrazine \( (\mathrm{MBTH}) \) 는 Nacalai tesque (Japan)에서, dimethyldiselenide, 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene, DL-propagylglycine, hydroxylamine, \( \alpha \) -ketobutylic acid, \( \beta \)-mercaptoethanol, pyridoxal 5 ' phosphate (PLP)는 Sigma (USA)에서, tobacco etch virus (TEV) kit는 Invitrogen (USA)에서, His bind column resin은 Novagen (Germany)에서 각각 구입하여 사용하였다. 균의 파쇄는 Fisher Scientific (Korea)의 ultrasonic dismembrator를, UV-visible 흡수 스펙트럼은 Agilent 8453 (Agilent Technologies, USA)를 사용하였고 측정 중 큐벳 홀더를 일정 온도로 유지할 수 있는 Peltier 시스템을 사용하였다. GC/MS 분석은 Autosystem (XL) gas chromatograph와 TurboMass mass spectrometer (PerkinElmer, USA)를 사용하여 수행하였고, CG capillary column은 ULBON HR-1 \( (25 \mathrm{~m} \times 0.25 \mathrm{~mm} \) inside diameter, Shinwa Chemical Industries Ltd, Japan)을 사용하였다.</p> <h2>Human CGL의 발현과 정제</h2> <p>E.coli BL21 (DE3)을 cloning의 숙주세포로 사용하였다. Human CGL 유전자는 TEV 단백질 분해효소로 제거가 가능한 N-말단 His tag를 포함하고, T7 promoter와 lac operator, kanamycin 내성유전자로 연결된 pNIC-28-BsaI을 스웨덴 그룹(Dr. Sivaraman)에서 받아 사용하였다[25]. E.coli BL21의 형질 전환은 \( \mathrm{CaCl}_{2} \) 방법으로 만든 competent cell을 이용하였으며, 선별된 유전자 재조합 형질전환체는 kanamycin \( (50 \mathrm{ug} / \mathrm{ml}) \) 이 포함된 potassium phosphate-buffered Terrific Broth medium (TB)에서 \( \mathrm{OD}_{600 \mathrm{~nm}} \) 의 값이 \( 2.0 \) 이 될 때까지 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 성장시켰고, 이후 \( 18^{\circ} \mathrm{C} \) 환경에서 \( 0.5 \mathrm{mM} \mathrm{IPTG} \) 를 첨가하여 human CGL의 발현을 유도하였다. 집균은 20 시간 후 원심분리기를 이용하여 \( 8,000 \mathrm{rpm}(10,000 \times \mathrm{g}) \) 에서 20 분간 원심분리 하고, \( 0.85 \% \mathrm{NaCl} \) 로 현탁하여 균체를 세척하고 다시 원심분리를 하였다.</p> <p>Human CGL의 정제는 보고된 방법으로 하였다. 간단히 설명하면, human CGL을 과발현 시킨 균체는 lysis buffer (0.5 M NaCl, \( 20 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}, 10 \mathrm{mM} \) imidazole, \( 0.5 \mathrm{mM} \) tris (2-carboxyethyl)phosphine (TCEP), EDTA-free protease inhibitor, \( 20 \mu \mathrm{M} \) PLP, pH 7.9)에 현탁하고, 30 분간(pulse: \( 5 \mathrm{~min} \) on, \( 1 \mathrm{~min} \) off) 초음파 분쇄(80\% amplitude)를 하였고, 20 분간 \( 8,000 \mathrm{rpm} \) 에서 원심분리하여 crude extract를 제조하였다. His-TEV-human CGL의 정제는 Hi-Trap chelating nickel column (Novagen, Germany)을 이용하여 활성분획을 얻었다. 활성분획은 CGL이 \( \beta \)-mercaptoethanol과 L-cysteine을 기질로 한 반응에서 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{~S} \) 를 생성하는 반응을 이용하여 형성된 황화수소를 lead acetate와 반응시켜 생성된 lead sulfide \( (\mathrm{PbS}) \) 침전을 \( \mathrm{UV} \)-visible 분광광도계의 \( 390 \mathrm{~nm} \) 에서의 흡광도를 측정하였다[12]. 활성분획은 centricon tube (Millipore, \( 30 \mathrm{kDa} \) molecular weight cut-off)를 이용하여 농축한 후, TEV protease의 활성 buffer [50 mM Tris-\( \mathrm{HCl}, \mathrm{pH} \) 8.0, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 1 \mathrm{mM} \) 1,4-Dithiothreitol (DTT), \( 20 \mu \mathrm{M} \mathrm{PLP}] \) 로 희석과 농축을 3 회 반복하여 탈염 및 buffer 교환을 하였다. 그리고 TEV protease (Invitrogen, USA)를 첨가하여 \( 21^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4 시간 반응시킨 후, Hi-Trap chelating nickel column을 이용하여 \( \mathrm{N} \)-말단의 히스티딘 잔기가 제거된 순수한 human CGL을 얻었다. 정제된 효소의 보효소 PLP 함량은 보고된 방법으로 측정하여 \( 1 \mathrm{~mol} \) 의 PLP가 한 개의 subunit에 포함되어 있음을 확인하였고 정제효소의 순도는 SDS-PAGE, western blot, UV-visible spectrum으로 확인하였다.</p>