본 논문에서는 Hsp70.1 유전자조작법으로 결손시킨 생쥐와 야생생쥐를 이용하여 실험하였으며, 전처치 운동방법으로는 설치류용 treadmill을 이용하였다. 다음으로 허혈성 신장손상유도모델 제작을 위해 생쥐의 혈관클램프(clamp)로 신장 뿌리(pedicle)의 혈류를 결찰하였다. 혈정의 creatinine 농도 측정에는 원심분리기가 이용되었으며, 상층액인 혈청만 모아 creatinine 측적용 kit를 이용하여 발색된 색을 \( 520 \mathrm{~nm} \)의 흡광도에서 농도를 측정하였다. 마지막으로 Western Blot에서의 단백질 농도 측정은 Gel doc 2000을 이용하였으며, 정량된 단백질의 농도를 수치화하여 WT의 그룹을 나눴다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험동물</h2><p>실험동물은 8 주령 C57/BL6계 숫컷생쥐(mouse)를 기반으로 Hsp70.1 유전자조작법으로 결손시킨 생쥐(Hsp70.1 knock-out mouse: KO)와 C57/BL6 야생형생쥐(wild type mouse: WT)을 사용하였다. KO생쥐는 gene-targeting technique 이용하여 Hsp70.1 null allele된 생쥐를 (주)마크로젠에서 구입하였다. 모든 실험동물은 H대학 동물실험윤리위원회로부터 승인을 받은 후 SPF된 실험동물실에서 사육되었다. 실험동물 WT과 KO군들은 정상군(Sham, \( \mathrm{n}=8 \)), 운동군(pre-exercise: Ex, n=\(8) \), 허혈운동군(ischemia with pre-exercise: \( E x+I R, n=8 \) ), 허 혈군(ischemia: \( I R, n=8 \) )으로 각각 8마리씩 4그룹으로 분류하여 사용하였다.</p><h2>전처치 운동방법</h2><p>운동방법은 설치류용 treadmill을 이용하였으며, 경사 \( 0 \% \)에서 운동적응기 1주는 \( 20 \mathrm{~m} / \mathrm{min} \)의 속도 \( \left(\mathrm{VO}_{2} \max 60-70 \%\right. \)해당)로 시간을 점진적으로 (5~30분) 증가를 시켰으며, 본 운동은 60분씩 7일 동안 실시하였다.</p><h2>허혈성 신장손상유도모델 제작</h2><p>모든 생쥐는 Rompun \( (5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \), Zoletil \( (5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 그리고 생리식염수를 \( 1:1:8 \) 비율로 혼합한 후 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 를 복강 내 주사하여 마취시켰다. 마취가 확인된 생쥐는 복강을 절개한 다음, 조심스럽게 양쪽신장을 노출하여 혈관클램프(clamp)로 신장 뿌리(pedicle)의 혈류를 결찰함으로써 허혈신장손상을 유도하였다. 허혈동안 열패드(heating ped)를 이용하여 체온을 \( 36-38^{\circ} \mathrm{C} \) 를 유지시켰고, 체온측정은 탐침(probe)이 부착된 디지털 체온계를 이용하여 생쥐의 직장(rectum)에 삽입하여 관찰하였다. 허혈 25분 후 클램프를 제거하여 혈류가 잘 관류되는지육안으로 확인한 후 절개된 피부를 봉합하였다. 정상군은 허혈군과 동일한 방법으로 신장만 노출시킨 25분 후 다시 봉합 하였으며 허혈관류는 시행하지 않았다.</p><h2>혈액 및 조직채취</h2><p>수술을 마친 1시간 후 생쥐의 심장에서 채혈하였고 심장을 통해 생리식염수로 관류시킨 후 신장을 적출하였다.</p><h2>혈청 creatinine 농도 측정</h2><p>혈액은 실온에 30분간 두었고, 이후 원심분리기로 옮겨 실온에서 \( 3,000 \mathrm{~rpm} \)으로 10분간 원심분리를 하였고, 상층액인 혈청만 모아 creatinine 측적용 kit (Vitros, Johnson & Johnson, USA)를 이용하여 발색된 색을 \( 520 \mathrm{~nm} \)의 흡광도에서 농도를 측정하였다.</p><h2>Western Blot</h2><p>적출한 신장은 lysis 완충액과 함께 homogenizer를 이용하여 조직을 균질화 하였다. 균질액은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 13,500 \times \mathrm{g} \) 으로 15분간 2회에 걸쳐 원심분리한 후 상층액을 Bradford법에 따라 총 단백질량을 정량하였다. 정량된 단백질은 \( 35 \mu \mathrm{g} \)으로 \( 10 \% \) SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동 후 PVDF mem-brane (Amersham Bio, UK) 으로 전이시켰다. 전이된 mem-brane은 TBST 완충액과 함께 \( 5 \% \) skim milk를 첨가한 후 1시간동안 실온에서 blocking 시켰다. CuSOD 와 MnSOD의 1차 항체는 \( 1: 1,000 \) (Chemicon, USA)으로 각각 첨가된 \( 5 \% \) skim milk 용액을 희석한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 overnight 하였다. 이어서 TBST 완충액으로 10분간 3회 세척한 후 2차 항체 \( (1: 5,000) \)를 첨가된 \(5\% \)skim milk용액과 함께 희석시킨 후 1시간동안 실온에서 반응시켰다. 이후 TBST 완충액으로 10분간 3회 세척한후 ECL substrate (Amersham Bio, UK)로 1분간 발색한 후 X-ray film (Kodak, NY)를 이용하여 현상하였다. 단백질농도 측정은 Gel doc 2000 (Bio Rad, ITALY)를 이용하여 농도를 정량하였으며, 정량된 단백질의 농도를 수치화하여WT의 정상군을 기준으로 다른 그룹간의 차이를 나타내었다.</p><h2>통계 처리</h2><p>모든 실험결과에 대한 통계처리방법은 SPSS 12.0을 이용하여 CuSOD, MnSOD 단백질변화와 creatinine 변화에 대한 평균과 표준오차를 산출하였으며, 측정변인별 평균 차이 검증을 위하여 이원변량측정(two way ANOVA)을 실시하였다. 모든 통계치의 유의확률은 \( \mathrm{p}<0.05 \) 로 설정하였다.</p>