Leucocin A를 생산하는 효모세포의 항균활성을 보기 위해 식품 부패에 연관있는 고초균을 배양 후 100배 희석하고 aureobacidin A를 첨가한 고체 배지에 도말하였다. 그 후 실험군으로 Leucocin A를 생산하게끔 형질전환한 효모 배양액, 대조군으로 일반 야생 효모 배양액을 각각 paper disc에 접종하고 배양후 생육억제환을 비교 관찰하였다. 실제 형질전환이 이루어졌는지 실험군 효모를 회수하여 플라스미드를 회수, PCR을 통해 leucocin A 유전자를 확인하였다.
<h2>Leucocin A를 생산하는 형질전환 효모세포의 항균활성 측정</h2><p>식품의 부패에 관여하는 고초균 (Bacillus subtilis, ATCC 6633)을 LB 배지를 이용하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하롯밤 배양하고 사용직전에 이를 100배로 희석하였다. 이 균의 희석액을 aureobacidin A (최종농도 \( 0.2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) )를 첨가한 YPD 고체배지에 도말하였다. 여기에 paper disc를 놓고 leucocin A 유전자를 도입한 효모 배양액과 아무런 조작을 가하지 않은 일반 야생효모 배양액을 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 씩을 paper disc에 접종하였다. 이를 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하릇밤 동안 배양한 후 항균작용에 의해 형성된 생육억제환(clear zone)을 비교 · 관찰하였다.</p><h2>형질전환 효모로부터 플라스미드 DNA의 분리 및 leucocin A 유전자의 확인</h2><p>형질전환 효모를 aureobacidin A (최종농도 \( 0.2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) )를 첨가한 YPD 배지 \( 4 \mathrm{ml} \)에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤 동안 배양한 후, 원심분리 \( (14,000 \times \mathrm{g} \), 5 분)하여 균체를 회수하였다. 여기에 yeast lysis buffer (\(2\%\) Triton X-100, \( 1 \% \) SDS, \( 10 \mathrm{mM} \) tris-\(\mathrm{HCl}\) (\(\mathrm{pH} 8.0\)) buffer, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA)를 \( 200 \mu \mathrm{l} \)을 넣어 균체를 현탁한 후, acid-washed glass beads (425-600 \( \mathrm{m} \), Sigma \(\#\)G-8772) \( 0.3 \mathrm{~g} \) 과 phenol/ \( \mathrm{CHCl}_{3} \) 용액 \( 200 \mu \mathrm{l} \)를 넣고 2분간 vortex하였다. 이것을 원심분리(\(14,000 \times \mathrm{g} \), 10분)하여 상등액을 새로운 tube에 옮기고, 여기에 glycogen 1 \( \mu \mathrm{l} \), \(5 \mathrm{M} \mathrm{LiCl} \) 용액 \( 20 \mu \mathrm{l} \), 차가운 에탄올 \( 500 \mu \mathrm{l}\)를 넣은 후, 원심분리(\(14,000 \times \mathrm{g} \), 10분)하여 플라스미드 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA는 차가운 \( 70 \% \) 에탄올로 세정한 후 건조시키고, 초순수 \( 20 \mu \mathrm{l}\) 에 녹였다.</p><p>효모로부터 회수된 플라스미드 DNA의 확인은 leucocin A에 특이적인 primer를 이용한 PCR(polymerase chain reaction) 법으로 행하였다. 회수된 플라스미드 DNA \( 50 \mathrm{ng} \)과 leucocin A에 특이적인 primer인 Leuco4-F (23 mer, 5'-CTCGAGAAGTATTATGGTAACGG-3')와 Leuco5-R (26 mer, 5'-GGGCCCTTACCAGAAACCATTTCCAC-3')을 각각 \( 10 \mathrm{pmol} \)씩 사용하여 PCR 반응을 행하였다. PCR 반응산물은 \( 2 \% \)의 agarose gel에 전기영동하여 그 위치를 확인하였다.</p>