쥐 눈의 LDH \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소를 정제하여 PBS에 녹이고, 토끼에게 7일 간격으로 3회 면역주사를 투여한 뒤, 토끼의 혈액을 추출하여 항혈청을 제작하는 과정을 거쳤다. 이를 통해 Western blot 분석을 통해 쥐 눈 조직의 LDH를 분석하였다. 이 과정에서는 semi-dry transfer system을 이용해 단백질을 nitrocellulose membrane에 transfer 시키는 방법을 사용하였다.
<h2>Eye-specific LDH C \( \mathrm{L}_{4} \) 동위효소에 대한 항혈청 조제</h2> <p>정제한 쥐노래미 eye-specific LDH \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 \( 0.013 \) \( \mathrm{mg}, 0.012 \mathrm{mg} \) 및 \( 0.013 \mathrm{mg} \)의 순서로 \( 0.01 \mathrm{M} \) phosphate buf-fered saline ( \( \mathrm{pH} \) 7.4, PBS)에 녹여 1차 면역은 동량의 Freund's complete adjuvant를 사용하고, 2차 면역부터는 동량의 Freund's incomplete adjuvant를 사용하여 완전히 유화 시킨 후, 뉴질랜드 화이트 순종토끼에 7일 간격으로 3회 근육에 주사하였다. 최종 면역주사 5일 후 항응고제를 첨가하지 않고 심장천자로 채혈하였고, 혈액은 실온에서 1시간, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 6시간 방치 후 혈병을 제거한 다음 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(790 \times g \)에서 20분간 원심분리 하였으며 상등액을 다시 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(23,000 \times 9 \) 에서 30 분간 원심분리하여 항혈청으로 사용하였다. 항혈청은 동량의 PBS를 가한 후 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \)로 \( 50 \% \) 포화시켜 \( 0^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 방치한 다음 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C}\), \(20,000 \times g \)에서 30분간 원심분리 하여 침전물을 얻었다. 침전물은 초기 단계의 항혈청과 동량으로 PBS에 녹여 전과 동일한 과정으로 2회 반복하였다. 이 때 침전물은 처음 항혈청 양의 \( 1 / 5 \)이 되도록 \( \mathrm{PBS} \)에 녹여 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{PBS} \)내에서 36시간 동안 투석한 후 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C}, 20,000 \times g \)에서 30분간 원심분리하여 상등액을 항체 용액으로 사용하였다.</p> <h2>Western blot 분석</h2> <p>쥐노래미 눈 조직의 LDH를 native-PAGE한 후 gel상의 단백질을 semi-dry transfer system (Trans-Blot SD cell, Bio-Rad Lab. Inc., Hercules, CA)에서 \( 15 \mathrm{mM} \) Tris-glycine buffer \( (\mathrm{pH} \) 8.3)를 사용하여 \( 25 \mathrm{~V} \) 에서 30 분 동안 nitrocellulose membrane (Trans-Blot Transfer Medium, Bio-Rad Lab. Inc., Hercules, CA)에 transfer시켰다. Membrane을 \( 50 \% \) skim milk/TBS \( 0.01 \) \( \mathrm{M} \) Tris buffered saline, \( \mathrm{pH} 7.5) \) 용액에 넣고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 동안 blocking시킨 후 TBS용액에서 10분간씩 3회 세척하였다. \( 5 \% \) Skim milk/TBS를 사용하여 \( 1: 100 \)으로 희석한 1차 항체 (eye-specific LDH \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소에 대한 항체)용액에 mem-brane을 넣고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 shaking 시킨 후 TBS용액 으로 10분간씩 2회 세척하여 membrane에 결합하지 않은 1차 항체를 씻어주었다. Anti-rabbit IgG (2차 항체)를 \( 5 \% \) skim milk/TBS를 사용하여 \( 1: 1,000 \)으로 희석시킨 용액에 mem-brane을 넣고 1시간 동안 shaking시킨 후 항원과 결합하지 않은 2차 항체를 TBS용액으로 10분간씩 3회 세척하여 씻어주었다. Chloronaphtol 및 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)의 혼합액으로 반응시킨 후 증류수로 세척하여 반응을 정지시킨 다음 밴드를 확인하였다.</p>