본 연구에서는 CAL-0 조다당을 분리하기 위해 DEAE Sepharose CL-6B 이온교환 컬럼을 사용하였고, 7개의 획분을 얻었다. CAL-2의 정제를 위해 Sepharose CL-6B 컬럼을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피를 수행하였다. 다당의 분자량은 표준곡선과 비교하여 측정하였으며, 고추잎으로부터 추출한 조다당 CAL-0는 주로 중성당으로 구성되어 있었다. 결과적으로, 조다당 획분의 활성은 다당에 기인함을 확인할 수 있었다.
<h3>이온교환 크로마토그래피에 의한 조다당의 분획</h3> <p>조다당 CAL-0 500 mg을 증류수에 녹여 증류수로 평형화시킨 DEAE Sepharose CL-6B 이온교환 컬럼 (4.0X25 cm)에 흡착시킨 후 증류수, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1 M NaCl 용액으로 용출시켜 7개의 획분으로 분리하였다.</p> <h3>겔 여과 크로마토그래피에 의한 활성물질의 정제 및 분자량 검토</h3> <p>항보체 활성을 가진 CAL-2 획분을 0.2 M NaCl 용액으로 평형화시킨 Sepharose CL-6B 컬럼 (2.3X90 cm) 을 사용하여 분당 0.3ml/min 의 유속으로 \( 4 \mathrm { C } \) 에서 겔 여과 크로마토그래피를 행하여 분리, 정제를 행하였다. 정제 다당의 분자량은 dextran T-2000(M.W.: \( 2 \times 10 ^ { 6 } \) ), T-500(M.W.: \( 7 \times \) \( 10 ^ { 4 } \) ), T-40(M.W.: \( 4 \times 10 ^ { 4 } \) ), T-10(M.W.: \( 1 \times 10 ^ { 4 } \) ) 및 glucose를 표준물질을 사용하여 Sepharose CL-6B 컬럽에서 얻어진 표준곡선과 비교하여 측정하였다.</p> <h1>결 과</h1> <h3>보체계 활성화 물질의 추출 및 분획</h3> <p>줄기 부분을 제거한 고추잎 600g 으로부터 열수추출, 열수추출물의 methanol 환류, methanol 비가용성 물질의 ethanol 침전 그리고 침전물의 투석 및 동결건조를 통하여 186g 의 조다당(crude polysaccharide) CAL-0를 얻었다 (Fig. 1). 이 과정에서 얻은 methanol 및 ethanol 가용성 물질과 조다당의 항보체 활성을 비교한 결과(Fig. 2), methanol 가용성과 ethanol 가용성 물질에서는 20% 이하의 낮은 활성이 나타난 반면, 조다당 CAL-0는 1000 mg 의 시료농도에서 80% 이상의 높은 활성을 나타내어 저분자 획분보다 고분자 획분인 조다당 CAL-0에 보체계 활성화 작용이 있음을 알 수 있었다. 고추잎으로부터 얻은 조다당 CAL-0는 당 51.8%, 단백질 16.8%, 산성당 8.2% 를 함유하고 있었고, TLC와 gas chromatography 분석 결과 중성당은 주로 arabinose, galactose와 glucose로, 산성당은 galacturonic acid로 구성되어 있음이 확인되었다(Table 1).</p> <h3>보체계 활성화 물질의 본체 확인</h3> <p>총당 51.8% 와 16.8% 의 단백질이 함유되어 있는 조다당획분인 CAL-0의 보체계 활성화 본체를 파악하기 위하여 pronase처리에 의한 단백질 분해 및 periodate를 이용하여 다당부위를 선택적으로 산화시킨 후, 각각의 활성을 대조군인 CAL-0와 비교한 결과를 Fig. 3 에 나타냈다. Pronase 로 처리한 CAL-0에서는 보체계 활성능이 대조군에 비해 활성의 변화가 없었으나 CAL-0의 periodate 산화물은 활성이 20% 이하로 급감하였다. 따라서 고추잎에서 유래된 조다당 획분의 활성은 단백질이 아닌 다당에 기인함을 알 수 있었다.</p>