LPS를 처리한 세포를 trizol lysis buffer로 lysis한 후 원심분리하여 건조시킨다. DEPC 처리한 증류수로 녹인 후 흡광도를 측정하여 total RNA양을 측정한 후 Oligo (dT) 15 primer, 추출한 RNA, reverse transcriptase 등을 사용하여 cDNA를 합성하였다.
<h2>Total RNA 분리 및 CDNA 합성</h2> <p>세포를 \( 100 \mathrm { ~mm } \) culture dish에 \( 1 \times 10 ^ { 6 } \) cells/well로 cell seeding하여 24시간 동안 배양한 후 LPS를 \( 1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도로 2시간 처리해준 뒤 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배지 상등액을 제거한 후 trizol lysis buffer를 well에 \( 1 \mathrm { ml } \)씩 분주하여 세포를 lysis한 후 chloroform \( 200 \mu \mathrm { l } \)를 분주하여 20초간 위아래로 흔들어주었다. 그 후 16,110 \( \times g \)에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 isopropanol \( 500 \mu \mathrm { l } \)가 들어있는 튜브에 옮겨 섞었다. 다시 16,110 \( \times g \)에서 20분간 원심분리하였고, 그 상층액을 제거한 후 \( 75 \% \) EtOH-diethylpyrocarbonate (DEPC) water를 각 튜브에 \( 1 \mathrm { ml } \)씩 분주하여 16,110 \( \times g \)에서 5분간 원심분리한 뒤 상층액을 제거한 뒤 실온에서 건조하였다.</p> <p>DEPC를 처리한 증류수를 \( 50 \mu \mathrm { l } \) 씩 분주하여 녹인 후 96 well plate에 RNA \( 5 \mu \mathrm { l } \)와 멸균수 \( 195 \mu \mathrm { l } \)를 첨가하여 \( 260 \mathrm { ~nm } , 280 \mathrm { ~nm } \)에서 각각 흡광도를 측정하여 total RNA양을 측정하였다. Oligo (dT) 15 primer \( (500 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) 1 \mu \mathrm { l } \), 추출한 RNA \( (2 \mu \mathrm { g } ) \)와 nuclease free water로 \( 10 \mu \mathrm { l } \)를 맞추고 \( 75 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 반응시킨 후 \( 5 \times \) reaction buffer, \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \), PCR nucleotide mix, rnasin inhibitor, reverse transcriptase, nuclease free water를 첨가하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5 분, \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 60분, \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 15 분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.</p>