1999년 4월 전남 여수 시내의 쇼핑센터, 여수시 소재 잠수기조합, 대인물산, 강릉, 일본 후쿠이현 오바마시의 수산시장에서 8가지 식품(아가미젓, 창란젓, 갈치속젓, 조개젓, 전어밤젓, 꼴뚜기젓, 오징어젓, 새우젓)과 4가지 식해(가자미식해, 멸치식해, 명태식해, 오징어식해), 헤시코를 구입하여 열수 추출과 methanol 추출을 통해 시료를 추출하여 동결건조하여 냉동고에 보관하였다. 동물세포주는 인체 간암세포인 HepG22를 분양받아 실험에 사용하기 위해 배양하였으며, 동물세포에 대한 시료의 세포독성을 측정하기 위하여 생존 암세포의 효소활성을 측정하는 MTT assay를 실시하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료</h2> <p>본 실험에 사용한 재료 중 아가미젓(Salt-fermented gill), 창란젓(Salt-fermented poilack tripe), 갈치속젓(Salt-fermented haur-tail viscera), 조개젓(Salt-fermented clam), 전어밤젓(Salt-fermented shad gizzard), 꼴뚜기젓(Salt-fermented sea-arrow), 오징어젓(Sait-fermented squid), 새우젓(Salt-fermented small shrimp)은 1999년 4월 전남 여수 시내에 위치한 쇼핑센터에서 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관되어 있는 wp품을 구입하였고, 개불(Urectis unicinctus)은 여수시 소재 잠수기조합에서 구입하였다. 토하젓(Salt-fermented Toha shrimp)은 대인물산에서 구입헸으며, 가자미식해(Flounder Sikhae), 멸치식해(Anchovy Sikhae), 명태식해(Alaska pollack Sikhae), 오징어식해(Squid Sikhae)는 강릉에서 구입하였고, 헤시코(Hesico)는 \( 1999 \)년 \( 6 \)월 일본 후쿠이현 오바마시의 수산시장에서 구입하여 실험에 사용하였다.</p> <h2>시료 추출</h2> <p>시료의 추출은 \( 1 \)차 추출로서 수용성분을 대부분 용출할 수 있는 열수 추출과 지용성 성분을 포함하는 methanol 추출법을 사용하였다. 열수 추출은 시료 \( 20 \mathrm{g} \) 에 \( 200 \mathrm{ml} \) 의 증류수를 첨가하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 30 \)분간 가열 후 Whatman No.\( 4 \) 여과지로 여과한 뒤 추출물은 \( 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 \( 15 \)분 간 원심 분리 후 상등액을 재 여과하여 투석하였다. 각 추출물들은 동결건조 시킨 후 냉동고에서 보관하면서 사용하였다. methanol 추출은 시료 \( 20 \mathrm{g} \) 에 methanol \( 100 \mathrm{ml} \)을 가하여 실온에서 추출한 뒤 이 조작을 \( 3 \)회 반복하고 추출액은 vacuum evaporator로 농축한 후 투석하고 동결건조하여 냉동고에 보관하면서 사용하였다.</p> <h2>사용 암세포주 및 배양</h2> <p>동물세포 배양에 사용한 동물세포주는 인체 간암세포인 HepG\( 2 \)(cells derived from Hepatocellular carcinoma, ATCCHB-\( 8065 \))를 분양 받아 실험에 사용하였다. 세포는 \( 10 \% \) FBS(Fetal Bovine Serum, Gibco Co., U.S.A)가 함유된 RPMI \( 1640 \) 배지에 \( 20 \mathrm{mM} \) Hepes buffer를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) Incubator(Vision Scientific Co., LTD, Model VS-9011C)에서 배양 하였다. 배양세포는 일주일에 \( 2 \) ~ \( 3 \)번 refreeding하고 \( 7 \) ~ \( 8 \)일만에 \( 0.05 \% \) trypsin-\( 0.02\% \) EDTA로 부착한 세포를 떼어내고 분할하여 계대배양하면서 실험에 사용하였다.</p> <h2>MTT assay를 사용한 암세포 성장 억제 효과 실혐</h2> <p>동물세포에 대한 시료의 세포독성을 측정하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. MTT assay는 생존 암세포의 효소활성을 측정하는 것으로 세포들을 \( 96 \) well plate에 \( 1 \times 10^{4} \) cells/well 이 되게 \( 200 \mu \ell \)씩 분주하여 부착시킨 후 시료를 일정 농도로 제조하여 \( 20 \mu \ell \)씩 첨가한 뒤 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) Incubator에서 72 시간 배양하였다. 여기에 FBS가 첨가되지 않은 RPMl \( 1640 \) medium으로 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{me} \) 의 농도로 제조한 MTT [\( 3 \)-(\( 4 \),\( 5 \)-dimethylthiazol-\( 2 \)-yl)-\(2 \),\(5 \)-diphenyl tetrazolium bromide] 용액을 \( 20 \mu \ell \)씩 첨가하고, 동일한 배양조건에서 \( 4 \)시간 더 배양하였다. \( 4 \)시간 후에 상징액을 제거하고, 각 well당 \( 0.1 \% \) isopropanol을 \( 150 \mu \ell \) 첨가하여 \( 30 \)분간 배양한 후 \( 570 \mathrm{nm} \)에서 Microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였고, 성장억제효과(Growth inhibitory effect (\(\%\)) = [(대조구의 흡광도 - 시료처리구의 흡광도) / 대조구의 흡광도)] \( \times 100) \) 를 구하여 death ratio (\(\%\)) 로 나타내었다.</p>