HaCaT 세포는 CLS Cell Line Service GmbH에서 얻어 배양하였고, 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물의 HaCaT 세포 독성 평가를 위해 MTT 방법을 사용하였다. 그리고, 과산화수소로 유도된 세포 손상에 대한 세포 보호 효과를 확인하기 위해 MTT 방법으로 세포 생존율을 분석하여 세포 보호 효과를 확인하였다.
<h2>HaCaT 세포 보호 효과 측정</h2> <h3>HaCaT세포 배양.</h3> <p>각질 형성 세포인 HaCaT 세포주는 CLS Cell Line Service GmbH (Eppelheim, Germany)에서 얻어 사용하였다. 세포는 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS)와 \( 1 \% \) penicillin/streptomycin (P/S)을 이용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.</p> <h3>인동덩굴 추출물 및 분획물의 HaCaT 세포 독성 평가.</h3> <p>인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물이 각질 형성 세포인 HaCaT 세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위해 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-di-phenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma, USA) assay를 이용하여 실험에 사용될 시료의 농도 범위를 결정하였다. 96-well plate에 \( 1 \times \) \( 10 ^ { 4 } \) cells/well로 분주하여 \( 60-80 \% \) 까지 배양하였다. 무혈청 배지에 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물을 농도별로 희석하여 \( 24 \mathrm { ~h } \) 동안 처리한 후, 배지를 모두 제거하고 \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \mathrm { MTT } \) 용액을 각 well에 첨가하여 \( 2 \mathrm { ~h } \)동안 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 반응시켰다. 생성된 formazan을 dimethyl sulfoxide (DMSO)로 녹이고 ELISA reader (Tecan, Austria)를 이용하여 \( 570 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h3>과산화수소로 유도된 세포 손상에 대한 세포 보호 효과.</h3> <p>HaCaT세포를 \( 1 \times 10 ^ { 4 } \) cells/well로 96-well plate에 분주하고 \( 24 \mathrm { ~h } \) 동안 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건으로 incubator에서 배양하였다. \( 24 \mathrm { ~h } \) incubation 후, 배지를 모두 제거하고 무혈청 배지에 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물을 농도별로 희석하여 \( 24 \mathrm { ~h } \) 동안 배양하였다. PBS \( 100 \mu \mathrm { l } \)로 1회 세척한 후, 과산화수소 \( 2 \mathrm { mM } \) 농도(in PBS)로 \( 30 \mathrm { ~min } \) 처리하였다. 과산화수소를 모두 제거 후, PBS \( 100 \mu \mathrm { l } \) 로 2 회 세척하였다. 세척 후, 무혈청 배지로 바꿔 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 \( 24 \mathrm { ~h } \) 배양하였다. \( 24 \mathrm { ~h } \) incubation후, MTT assay로 세포 생존율을 확인하여 과산화수소로 유도된 세포 손상에 대한 인동덩굴 \( 50 \% \) 에탄올 추출물과 분획물의 세포 보호 효과를 확인하였다.</p>