실험에는 참외를 사용하여 추출하여 시료를 만들었으며, 시료의 효소활성저해 효과를 대조군의 흡광도와 실험군의 흡광도를 이용하여 측정하였다. 시료의 형광분석의 경우 반응용액에 530 nm를 조사한 후 590 nm에서 수행하였다. 마지막으로 쥐를 통해 training trial를 실시하였으며, Retention trial에서 반복 실허여 쇼코실 도달시간을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시료 제조</h2> <p>실험에 사용한 참외는 성주군 성주참외원예농협에서 구입하였으며 참외에서 과육을 분리하고 세절한 다음, \( 1 \mathrm{~kg} \)에 메탄올 \( 500 \mathrm{~ml} \)를 가하고 가열하면서 추출하였다. 추출물을 여과한 여액을 rotary evaporator을 사용하여 농축하였으며 얻어진 조추출물을 동결건조기로 건조시켜 분말로 하여 각종 실험의 시료로 사용하였다.</p> <h2>시약, 기기 및 실험동물</h2> <p>기억상실제인 scopolamine, 효소활성 측정용 시약인 ace-tylcholinesterase, DTNB (5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid), acetylthiocholine iodide 및 양성대조 약물인 tacrine 등은 Sigma (St. Louis, MO, USA)사 제품을 사용하였으며 \( \beta \)-secre-tase 측정 kit는 PanVera Co. (Invitrogen, Madison, WI, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 기타 유기용매는 모두 국산 특급을 사용하였다. 동물시험의 방법으로 사용한 수동회피시험 (passive avoidance task)의 측정기기는 Gemini Avoidance System (San Diego Instruments, USA)을 사용하였고 흡광도는 Optizen 2120UV (Mecasys, Korea)로 측정하였으며 형광분석기(Fluorescence microplate reader)는 Gemini EM (Molecular Devices, USA)을 사용하였다. 실험동물은 미생물 monitoring에서 모두 음성을 나타낸 건강한 ICR (Institute of Cancer Research) 계 mouse (6주령) 중에서 \( 25 \pm 3 \mathrm{~g} \)을 선별하여 사용하였으며 (주)대한바이오링크에서 구입하였다. 사육조건은 온도 \( 22 \pm 2^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 50 \pm 2 \% \), 그리고 명암은 12시간의 light/dark cycle을 유지하면서 사육하였다.</p> <h2>Acetylcholinesterase 활성 측정</h2> <p>추출물 및 분획의 acetylcholinesterase (AChE) 억제 활성 측정은 Ellman's coupled enzyme assay 방법을 사용하여 측정하였다. 효소반응은 \( 25 \pm 0.1^{\circ} \mathrm{C} \) 항온조 내에서 실행하였다. 기질, Ellman 시약 및 시료 \( (10, 20, 50, 100 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml}) \)를 포함한 반응용액을 항온조 내에서 4분간 항온하고 효소액(AChE 10 unit/ \( 10 ~\mu \mathrm{l}) \)을 첨가하여 60초 동안 항온한 다음, \( 412 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 효소활성저해 효과는 시료검액 대신 동량의 완충액을 넣은 대조군의 흡광도(C.T.)와 시료검액을 넣어준 실험군의 흡광도(S.T.)를 이용하여 측정하였다. 이상의 실험을 3회 실시한 다음, 효소활성 저해율을 다음 식에 따라 산출하였다.</p> <p>Inhibition \( (\%)=100-( \) S.T./C.T. \( \times 100) \)</p> <h2>\( \beta \)-Secretase 활성 측정</h2> <p>효소활성은 보고된 방법에 따라 \( \beta \)-secretase \( (1.0 ~\mathrm{U} / \mathrm{ml}) \) \( 10 ~\mu \mathrm{l} \), 기질인 \( 750 \mathrm{~nM} \) Rh-EVNLDAEFK-Quencher/\( 50 \mathrm{~mM} \) ammonium bicarbonate \( 10 ~\mu \mathrm{l} \) 및 assay buffer ( \( 50 \mathrm{~mM}\) so-dium acetate, \( \mathrm{pH} ~4.5\) )에 용해시킨 시료 \( 10 ~\mu \mathrm{l} \)의 반응용액을 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 암실에서 60분 동안 반응시킨 후, 효소정지 반응용액 \( 10 ~\mu \mathrm{l} \)를 가하였다. 반응용액에 \( 530 \mathrm{~nm} \)를 조사한 후 \( 590 \mathrm{~nm} \)에서 형광분석하였다. 효소활성의 저해율은 다음 식에 의하여 산출하였다. 이 식에서 \( \mathrm{C} \)는 대조군(효소, 완충용액 및 기질)의 형광, \( \mathrm{C}_{0} \)는 \( \mathrm{t}=0 \) 일 때의 대조군의 형광, \( \mathrm{S} \)는 시료용액 (효소, 시료용액 및 기질)의 형광, \( \mathrm{S}_{0} \)는 \( \mathrm{t}=0 \) 일 때의 시료용액의 형광을 의미한다.</p> <p>Inhibition \( (\%)=\left[1-\left\{\left(\mathrm{S}-\mathrm{S}_{0}\right) /\left(\mathrm{C}-\mathrm{C}_{0}\right)\right\}\right] \times 100 \)</p> <h2>기억증진 효과시험(수동회피시험)</h2> <p>컴퓨터로 모니터링이 되는 측정기기는 내부가 두 개의 방으로 구성된 상자 (shuttle box, \( 53 \mathrm{~cmW} \times 44 \mathrm{~cmH} \times 33 \mathrm{~cmD}) \)의 가운데에 guillotine door가 있으며 바닥(grid floor) 전체에 전기쇼크(scrambled foot-shock)를 가할 수 있는 장치가 되어 있다. 각 실험군에는 추출물 \( 500 \mathrm{~mg} / \mathrm{kg} \) 을 경구투여하였으며 양성대조약물로는 tacrine \( 2.5 \mathrm{~mg} / \mathrm{kg} \)을 7일간 복강주사하였다. 마지막 투여 1시간 후, 기억상실약물인 scopolamine \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \)을 복강주사하고 30분 후에 실험을 실시하였다. 실험과정은 흰쥐를 1마리씩 한쪽 방에 넣고 15초간 탐색시간을 준 뒤, 위에서 조명과 소음을 가하면 가운데의 guillotine door를 통과하여 조용하고 어두운 옆의 쇼크실로 건너간다. 쥐가 쇼크실에 들어가면 자동적으로 guillotine door가 닫히면서 \( 0.3 \mathrm{~mA} \)의 전기쇼크가 3초간 가해진다. 이러한 방법으로 training trial을 실시하여 120초간 쇼크실로 들어가지 않는 쥐는 실험대상에서 제외시켰다. Retention trial에서는 training을 받은 쥐에 대하여 24시간 후에 반복하여 실험하였으며 이 때는 쇼크실 도달시간(step-through latency time)을 최대 300초 (cut-off time)까지만 측정하였다.</p> <h2>통계 처리</h2> <p>모든 실험 data는 mean\( \pm \)S.E.로 표시하였으며 통계적 유의성은 Origin (Version 7.0) 프로그램을 이용하여 처리하였고 Student's \( t \)-test로 검정하여 \( \mathrm{P} \) value로 나타내었다.</p>