효소 반응 과정에서 최종 농도가 \(1.0 \mathrm{mM}\)이 되도록 화합물을 첨가하고, iodine 시약과 acetic acid 버퍼를 이용해 반응을 유도한 후 효소 활성을 측정했다. Lineweaver-Burk plot method를 통해 정제 효소의 ampicillin에 대한 반응 초속도와 \(Km\), \(Vmax\)를 계산했다. 등전점은 polyacrylamide gel iso-electric focusing을 통해 측정했다. 정제 효소액은 증류수를 이용해 투석하고 원심분리 후 농축하였으며, 투석된 액체는 phenol이 함유된 HCI에 가수분해시켰다. 가수분해된 정제 효소는 아미노산 자동분석기에서 분석하였다.
<h2>효소 활성에 대한 금속 이온 및 효소 저해제의 영향</h2> <p>\( 2.0 \mathrm { ~mM } \) 농도의 각종 금속이온 및 효소 저해제 \( 0.6 \mathrm { ~ml } \)와 기질액 \( 0.4 \% \) ampicillin \( 1 \mathrm { ~ml } \)를 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 가온한 후 \( 0.5 \mathrm { ~mM } \) 효소액 \( 0.4 \mathrm { ~ml } \)를 첨가하고 같은 온도의 항온기에서 30분간 반응시켰다. 즉, 효소 반응 시 최종 농도가 \( 1.0 \mathrm { ~mM } \)이 되도록 이들 공시 화합물을 첨가하였다. 그리고 iodine 시약 \( 5 \mathrm { ~ml } \)를 가하고 최종 반응 용량이 \( 8 \mathrm { ~ml } \)가 되도록 \( 0.01 \mathrm { M } \) ace-tic acid buffer \( ( \mathrm { pH } 5.0) \) \( 1 \mathrm { ~ml } \)를 첨가하여 실온에서 10분간 방치한 후 효소의 잔존활성을 측정하였다.</p> <h2>Kinetics</h2> <p>정제 효소의 ampicillin에 대한 반응 초속도를 계산한 다음 Lineweaver-Burk plot method에 의한 \( \mathrm { Km } \)치와 \( \mathrm { Vmax } \)를 산출하였다.</p> <h2>등전점</h2> <p>등전점은 \( 0.2 \% \) ampholine ( \( \mathrm { pH } 3.5 \sim 10 \)과 \( \mathrm { pH } 2.5 \sim 4 \) am-pholites를 1:2로 혼합)을 사용한 \( 5 \% \) polyacrylamide gel iso-electric focusing에 의하여 측정하였다. Identical gel은 pH gradient 검정용과 protein 확인용을 사용하였다.</p> <h2>아미노산 조성의 분석</h2> <p>정제 효소액은 증류수를 외액으로 하여 투석을 행하고 원심분리 \( (23,000 \times \mathrm { g } , \text { 10 min } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } ) \)한 후 침전물을 제거하고 농축하였다. 약 \( 1 \mathrm { ~mg } \)의 시료를 \( 1 \% \) phenol이 함유된 \( 6 \mathrm { ~N } \mathrm { ~HCI } \)을 가하여 \( 110 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24, 48, 72시간 가수분해 시켰다. 가수 분해된 정제 효소는 아미노산 자동분석기(Perkin-Elmer Co.)에서 분석하였다.</p>