Random primer의 예비검정을 통해 polymorphic band 빈도가 높은 primer를 선발하였다. 이를 사용하여 RAPD fingerprints를 얻어낸 후 Dissimilarity index(D)를 이용하여 S. iniae의 유연관계를 분석하였다. 2004년부터 2005년까지 2년간 제주도 전·연안 11곳에서 분리된 S. iniae 94균주는 Gram 양성 구균, catalase 음성, cytochrome oxidase 음성이며 API 50 CHL 배지에서 S. iniae 94균주로 동정되었다.
<p>Random primer의 예비검정을 위해 \( 1.5 \% \) agarose gel상에서 수평전기영동을 실시하였고 각 random primer에 의한 증폭양상을 관찰하였다. 그 중에서 polymorphic band 빈도 수가 많아 본 실험에서 사용이 가능한 primer를 선발하였다.</p> <h3>RAPD fingerprints의 수집과 유연관계 분석</h3> <p>Random primer 예비검정 시험에서 선발된 primer를 이용하여 제주도에서 분리된 S. iniae 94 균주에 대해 PCR을 실시한 후 RAPD fingerprints를 얻어내었다. 또한 재현성을 판별하기 위해 각각의 대표적 genotype에 대해 5 회 반복 실시하였다. S. iniae의 유연관계 분석은 2 개체 간에 검출된 총 증폭단편 중 공유하지 않는 증폭단편의 비율로 나타내는 비유사도 지수(Dissimilarity index = D)를 이용하였다[11], 비유사도는 다음 식에 의하여 구하였다.</p> <caption>비유사도(D) \( =N_ { a b } / \left (N_ { a } + N_ { b } \right ) \)</caption></p> <caption>\( \mathrm { N } _ {\mathrm { ab } } = \) 개체 \( \mathrm { a } \) 와 \( \mathrm { b } \) 의 공유하지 않는 단편 수.</caption></p> <caption>\( \mathrm { N } _ {\mathrm { a } } + \mathrm { N } _ {\mathrm { b } } = \) 개체 \( \mathrm { a } \) 와 개체 \( \mathrm { b } \) 에 나타난 총 단편 수의 합.</caption></p> <p>유전적 비유사도의 계산처리는 밴드의 유무에 따라 1 과 0으로 수치화하여 산출하였으며, 유전적 유연관계는 이 값을 근거로 neighbor-joining법을 이용하여 유전적 유연도로 나타내어 분석하였다.</p> <h2>결과 및 고찰</h2> <h3>S. iniae의 분리 배양 및 간이동정</h3> <p>2004년 부터 2005년까지 2년간 제주도 전·연안에 분포하는 대표적 넙치 양식장 11 곳을 선정하여 어류 뼝원성 S. iniae 분리를 시도하였다(Table 4). 검체는 전형점인 연쇄구균증 증상을 보이는 양식넙치 병어 각각을 대상으:로 하였고, \( 1.5 \% \) \( \mathrm { NaCl } \) 이 첨가된 BHIA에서 우유빛 작은 집락의 Streptococcus sp. 186 균주를 순수 분리하였다. 순수 분리된 균주의 간이동정 결과 모두 Gram 양성 구균, catalase 음성, cytochrome oxidase 음성이었다.</p> <h3>Multiplex PCR법을 이용한 S. iniae의 동정 및 병리 생태학적 특성</h3> <p>분리균주 186 균주에 대해 multiplex PCR detection assay 동정법을 이용하여 S. iniae 94 균주와 S. parauberis 92 균주를 동정하였다. S. iniae로 동정된 균주들의 multiplex PCR 반응 산물은 모두 목적하는 증폭 크기인 \( 870 \mathrm { bp } \) 와 일치하였으며, 비특이적인 반응은 관찰되지 않았다. 또한 S. parauberis로 동정된 균주들도 목적하는 증폭 크기인 \( 718 \mathrm { bp } \) 와 일치하였으며, 비특이적인 반응은 관찰되지 않았다(Fig. 1). 한편, 이들 이외에 어류의 연쇄구균증 병원체로 알려진 L. garvieae는 검출되지 않았다.</p>