신경세포 배양 실험에는 대한동물실험센터에서 제공받은 Sprague-Dawley 흰 쥐를 사용하였으며, 학습과 기억능력 측정을 위해 대한동물실험센터에서 생쥐(ICR 계통, 6주령 숫컷)를 Morris 수중 미로(Morris water-maze) 실험에 사용하였습니다. 약제 1은 \( 10(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 증류수로 희석하고, 이를 상온에서 12-18시간 동안 추출한 후 10,770× \( g \)에서 15분 동안 원심 분리하여 상등액을 얻었습니다. 상등액은 \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) 시린지 필터로 여과되었습니다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h3>동물</h3> <p>신경세포배양을 이용한 실험에서는 Sprague-Dawley계 흰 쥐(대한동물실험센터)를, Morris 수중 미로(Morris water-maze)를 이용한 학습과 기억능력 측정에는 생쥐(ICR 계통,6주령 숫컷; 대한동물실험센터)를 사용하였다.</p> <h3>약재 및 물추출액 제조</h3> <p>실험에 사용된 황금, 석창포, 천마는 대한약전 및 대한약전 한약 규격주해[19]에 근거하여 동국대학교 경주 한방병원에서 구입하였다. 황금, 석창포, 천마 각각의 뿌리를 이물을 제거하고 분말화하였다. 약제 1: 증류수 \( 10(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 으로 증류수를 가하고 상온에서 12 18시간 동안 추출한 후 10,770× \( g \) 에서 15 분간 원심 분리하여 상등액을 얻고 \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) 시린지 필터로 여과하였다. 시료는 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 냉동 보관하였으며, 실험직전 상온에서 녹여 시료로 사용하였다. 이때 각 추출물의 효능실험에서는 황금은 \( 20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \), 천마와 석창포는 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 농도로 첨가 하였으며, 복합 추출물의 효능실험에서는 그 절반씩을 첨가하였다. 건조물은 \( 1 \mathrm{ml} \) 추출액 튜브를 이동하여 troplicate로 동결건조한 후 평균치를 사용하였다.</p> <h3>신경세포 배양</h3> <p>임신 18 일(embryonic day \( 18: E_{18} \) )의 Sprague-Dawley계 흰쥐 대뇌피질신경세포를 Brewer 등[3]의 방법에 따라 배양하였다. 즉, \( \mathrm{E}_{18} \) 의 흰쥐를 dry ice가 들어있는 통속에 \( 3 \sim 5 \) 분간 넣어 마취하고, 자궁을 가른 후 횐쥐 태아를 취하고 뇌를 잘라내었다. 대뇌피질 조직을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 \( 0.25 \% \) trypsin으로 처리하고 \( 1 \mathrm{mM} \) sodium pyruvate와 \( 10 \mathrm{mM} \) HEPES \( (\mathrm{pH} \) 7.4)가 첨가된 HBSS용액(Invitrogen Life Technology) \( 5 \mathrm{ml} \) 로 4 5회 세척하여 반응을 중단시켰다. 조직을 \( 1 \mathrm{ml} \mathrm{Hank's} \) 용액으로 옮기고, 끝을 불에 달구어 구멍을 작게 한 pasteur pipette으로 6 7회 통과시켜 신경세포를 분산시켰다. 이 후 분산된 세포를 모으고 세포수를 측정한 다음 약 1,500 cells \( / \mathrm{mm}^{2} \) 가 되도록 B27을 첨가한 plating neurobasal media (Invitrogen Life Technology; \( 100 \mathrm{ml} \) neurobasal, \( 2 \mathrm{ml} \) B27 supplement, \( 0.25 \)\( \mathrm{ml} \) glutamax I, \( 0.1 \mathrm{ml} 25 \mathrm{mM} \) glutamate, \( 0.1 \mathrm{ml} 25 \mathrm{mM} \)2-mercaptoethanol)에 접종하여 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 배양조에서 배양한 다음 2 3일 간격으로 배양액을 feeding neurobasal media (100 ml neurobasal, \( 2 \mathrm{ml} \) B27 supplement, \( 0.25 \mathrm{ml} \) glutamaxI)로 \( 1 / 3 \) 씩 교환하였다.</p>