T7 Tag 홉착컬럼을 이용한 CapR 단백질 분리는 항원 항체에 대한 반응을 이용한 방법으로, agarose를 컬럼에 채우고 세포 추출물을 흘려내려 결합시킨 후 완충용액으로 씻고 Elute 용액으로 5번 용출시켜 보관하였다. Biacore 3000을 사용한 SPR 근거 DNA 칩 실험에서는 각 샘플을 다른 항원과 비교하여 분석하였고, T7 tag 단백질이 항원과 결합할 때 SPR 시그널이 나타났다.
<p>T7. Tag 홉착컬럼 (Clontech, 미국)을 이용한 CapR 단백질의 분리는 \( \mathrm { T } 7 \mathrm { tag } \) 를 항원으로 보고, 항원 항체에 대한 반응을 이용한 분리방법이다. 분리는 회사에서 권고한 방식대로 시행하였으며, 그 과정은 간단히 기술하면 다음과같다. T7 - tag 항체 agarose를 컬럼에 채운 후 세포 추출물을 컬럼에 흘려내려 결합시키고 컬럽을 T7. Tag Bind/Wash 완충용액으로 씻었다. T7. Tag Elute 용액 \( 1 \mathrm { ml } \) 씩 5번 컬럽에 넣어 결합된 단백질을 용출시킨 후, 이를 중성화하여 보관하였다. 단백질은 \( 10 \% \) SDS-PAGE로 확인하였다.</p> <h3>\( \mathrm { SPR } \) 근거 DNA 칩 실헙</h3> <p>SPR 근거 DNA 칩 실험은 Biacore 3000 (Biacore, Inc.,스웨덴)을 사용하였다. 필터에 여과한 PBS 용액 \( (0.005 \% \)P20 포함)을 기본 용액 (running buffer)으로 사용했다. 칩표면을 활성화하기 위해 \( 0.05 \mathrm { M } \) NHS (N-hydroxylsuccinamide)와 \( 0.2 \mathrm { M } \) EDC ( \( \mathrm { N } \)-ethyl- \( \mathrm { N } \)-dimethyl ami-nopropyl carbodiimide)블 1:1로 혼합하여 리간드의 cou-pling을 위해 \( 35 \mu \ell \) 사용하였다. 이때 \( 5 \mu \ell / \mathrm { min } \) 유출속도가 사용되었다. 칩의 나머지 3 개의 센도 같은 방법으로 활성화시켰다. 항상 면적당 RU의 밀도가 같게 조절하였다.Coupling은 산성 \( \mathrm { pH } \) (pI 보다 낮은 \( \mathrm { pH } \) ) 나리고 낮은 이온강도에서 이루어지며 야 \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) (보통은 \( 5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) )의DNA가 부피 75 200 \( \mu \) 로 coupling에 사용되었다. 조절을 용이하게 하기 위해 자동에서 수동으로 방식으로 바꾸어 \( 100 \mathrm { RU } \) 이하가 되도록 리간드를 고정하였다. \( 2.5 \mu \ell \) 의 100 \( \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) streptavidin을 주입하였고 이때의 RU는 700 정도 였다. 새 칩을 사용할 경우 \( 25 \mu \ell \) 의 산과 염기를 흐르게 하여 칩 위에 있는 glycerol을 제거하였다. \( 1 \mathrm { M } \) ethanol-amine \( ( \mathrm { pH } \) 8.5)을 사용하여 남아 있는 칩 표면을 봉쇄하고 반응성 있는 에스터 화합불을 불활성화 시켰다. DNA의 양을 최소로 하여야 칩에 결합시키는 것이 견합할 단백질의 응집 (aggregation)을 막을 수 있다. 결합할 단백질은 기본 용액으로 희석하였고, 분석하기 전에 채널을 PBS \( 0.1 \% \) soluble dextran으로 씻었다. 분석시 시료는 기본 용액으로 \( 1 \mu \mathrm { M } \) 에서 \( 200 \mathrm { nM } \) 까지 희석하여 사용하였다. 용액의 속도는 \( 5 \mu \ell / \mathrm { min } \) 로 시작하였다. 칩을 다시 복구하기 위해 10 \( \mathrm { mM } \mathrm { HCl } \) 로 씻어 내리거나, \( \mathrm { SDS } \) 을 사용하여 단백질을 제거하였다.</p>