ENA-A 이온수 처리에 따른 조골 세포의 활성도, 석회화 형성도, 유전자 발현을 조사하였다. 조골 세포의 활성을 알기 위해 AZO 색소법을 이용하였고, ENA-A 이온수 처리군이 붉은색 효소가 대조군 대비 많이 생성됨을 확인하여 ALP 효소 활성이 유도됨을 확인하였다. Alizarin 염료를 통해 석회화 형성정도를 확인했으며 역시 ENA-A 이온수 처리군에서 조골 세포의 증식 유도, 석회화 형성능,즉 뼈의 생성이 유도됨을 확인하였다. 한편 RT-PCR을 통해 유전자 발현을 보았고, alkaline phosphatase, type Ⅱ collagen, osteopontin이 대조군에 비해 더 발현 됨에 따라 조골 세포 분화와 관련된 유전자가 대조군 대비 많이 발현됨을 확인하였다.
<h3>ALP 염색법에 의한 조골세포 활성검색</h3> <p>조골세포내 ALP 효소의 유도를 확인하고자 AZO 색소법 (Burstone법)으로 검토하였다. 즉, Naphthol AS-BI phosphate 기질은 조직내 존재하는 ALP효소에 의해 가수분해되어 orthophosphate와 naphthol이 유도체로 유리되고, 유리된 naphthol은 반응액에 함유되어 있는 diazonium 염과 즉시 결합하여 AZO dye를 형성하므로 적색의 효소 활성 부위를 나타내게 된다.</p> <p>ENA-A 이온수를 1, 2, 4, 8 \(\% \)의 농도로 첨가하여 9일간 배양한 다음 세포내 ALP 효소의 염색정도를 확인하였다. 그 결과 Fig. 3(A)와 같이 시료를 처리하지 않은 대조군은 붉은색의 효소가 많이 형성되지 않은 반면, 이온수를 1, 2, 4 \(\% \) 처리한 군에서는 효소의 붉은 반점이 많이 생겼으며, 특히 농도별로 염색이 증가됨을 확인할 수 있었다. 그러나 \( 8 \% \) 처리군에서는 다소 감소되는 경향을 보였다. 따라서 ENA-A 이온수는 조골세포내 ALP 효소활성을 유도함을 염색을 통해 확인하였다.</p> <h3>Alizarin-Red 염색법에 의한 석회화 형성도 확인</h3> <p>Bone nodule 형성능은 조골세포의 분화에 중요한 표식인자이다. Alizarin은 식물성 염료로서 calcium에 특이적으로 흡착력이 높다. 이것은 무기질화 된 세포의 세포외 기질에 염색되므로 무기질화 된 양과 염색된 정도가 상호비례 한다. 따라서 시간에 따른 무기질화 형성능을 alizarin red로 염색한 결과는, Fig. 3(B)와 같다. 역시 ENA-A 이온수 \( 4 \% \) 농도에서 조골세포가 분화됨에 따라 염색된 정도가 대조군에 비해 증가됨을 확인할 수 있었다. 따라서 ENA-A 이온수는 MC3T3-E1 조골세포의 증식 유도, ALP 활성 증가 및 조골세포의 분화와 석회화 형성능이 있음을 확인하였다.</p> <h3>RT-PCR법에 의한 조골세포 분화 관련 골기질 유진자 발현의 변화</h3> <p>조골세포 분화에 관련된 골기질 유전자 발현의 변화 정도를 RT-PCR 후 전기영동하여 확인하였다. Fig. 4는 MC3T3-E1 세포의 9일간 배양에 따른 분화인자의 mRNA 발현양을 나타낸 것으로, alkaline phosphatase, type Ⅱ collagen, osteopontin의 발현이 대조군에 비해 높게 발현되었다. Alkaline phosphatase의 발현은 대조군에 비해 더 높게 나타났으며, 특히 ENA-A 이온수의 처리 농도가 높을수록 그 발현이 더 증가하였다. 또한 골기질 단백질인 type 2 collagen에서도 대주군에 비해 ENA-A 이온수의 처리 농도가 높을수록 그 발현이 더 증가하는 경향이었다.</p> <p>ALP의 발현은 조골세포 분화과정 중 중요한 역할을 하며 그 활성정도는 종종 조골세포의 분화단계를 상대적으로 평가하는 수단으로 사용되어왔다. 조골세포에 의한 석회화과정에서 이 효소의 정확한 기능은 분명하지는 않지만, organic phosphate를 가수분해하고 국소적으로 \( \mathrm{PO}_{4} \) 농도를 증가시킴으로써 석회화의 촉발제 역할을 하는 것으로 보고되었다. ALP가 조골세포가 유도하는 석회화에 관여됨을 제시하는 많은 보고들이 있다. Torii 등은 antisense RNA를 이용하여 ALP가 조골세포의 석회화에 관여하는 것을 입증하였다. Weiss 등은 liver/bone/kidney type ALP 유전자의 선천적 결핍으로 인한 저인산효소증에서 골조직 석회화부전을 보고하였다. Fukayama와 Tashjian은 ALP가 몇몇 조골세포주들에서 칼슘섭취에 관여하는 것으로 보고하였으며, 부갑상선호르몬의 신호전달의 조절에도 관여한다고 하였다.</p> <p>이와같이 ENA-A 이온수는 MC3T3-E1 조골세포의 증식유도, ALP 활성 증가 및 조골세포의 분화와 석회화 형성능이 있었으며, 조골세포 분화에 관련된 골기질 유전자인 Alkaline phosphatase, Type Ⅱ collagen, osteopontin의 발현을 증가시킴을 알 수 있었다. 따라서 식용 오징어 (Sepia esculenta)와 두 종류의 해조류 (Phymatolithon calcareum, Lithothamnion corallioides)를 혼합하여 제조한 알칼리 이온수인 ENA actimineral resource A (ENA-A)는 골 형성 개선에 우수한 소재임을 알 수 있었다.</p>