본문에서는 지방세포로 분화시키기 위해 adipogenic cocktail이 포함된 분화유도배지에서 배양한 후 분화유지배지로 교체하는 과정을 진행했다. \( \mathrm { ddH } _ { 2 } \mathrm { O } \)와 \( 60 \% \) isopropanol로 1분 동안 2번 세척하고 Oil Red O solution을 사용해 염색한 후 위상차 현미경을 이용하여 지방세포 분화를 확인했다. TRIzol을 사용해 total RNA를 추출한 뒤에는 Total RNA Clean up kit를 사용하여 정제하였다.
<p>Cell viability ( \( \% \))=(시료처리군의 흡광도/대조군의 흡광도) \( \times 100 \)</p> <h2>Adipogenesis 유도</h2> <p>\( 2 \times 10 ^ { 5 } \) \( \mathrm { cells/ml } \)을 6 well-plate에 세포 밀도가 \( 100 \% \)가 될 때까지 배양한 후 배지를 바꿔 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \)의 환경에서 48시간 더 배양하였다. \( 1 ~ \mu \mathrm { M } \) dexamethasone, \( 0.5 \mathrm { ~mM } \) IBMX, 1 \( ~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) insulin등 세포분화유도에 사용된 시약은 Sigma (USA)에서 구입하였다. 지방세포로 분화를 유도하기 위해 adipogenic cocktail이 포함된 분화유도배지에서 48시간 배양한 후 insulin \( 1 ~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)이 포함된 분화유지배지로 교체하였다. 이후 48시간 간격으로 배지를 2회 교체한 후 분화유도 상태를 확인하였다. 분화유도과정 중에 대두부산물의 분화 억제 효능을 확인하기 위해 분화유도배지에 대두부산물을 함께 처리하였으며, 대두부산물을 처리하지 않고 분화 유도한 것을 대조군으로 하였다.</p> <h2>Oil Red O 염색</h2> <p>세포배양배지를 제거하고 PBS (WelGENE Inc., Korea) 용액으로 2회 세척한 후 \(4 \% \) formaldehyde (Sigma, USA)를 처리하여 20분 간 상온에 두었다. 이후 \( \mathrm { ddH } _ { 2 } \mathrm { O } \)와 \( 60 \% \) isopropanol로 1분간 각각 2회 세척하고 Oil Red O solution (Sigma, USA) 으로 10분간 염색한 후 위상차 현미경을 이용하여 지방세포 분화를 확인하였다. 또한 정량을 위해 isopropanol을 가하여 염색된 시약을 용출시켜 회수한 후 microplate reader (Infinite \( { } ^ {\circledR } 200 \), Tecan Co, Switzerland)를 이용하여 \( 520 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Total RNA 분리 및 RT-PCR</h2> <p>TRIzol (Gibco Inc., USA)을 이용하여 total RNA를 추출한 후 Total RNA Clean up kit (Ambion, USA) 를 사용하여 정제하였다. 정제된 RNA를 template로 SuperScript \( { } ^ {\mathbb { TM } } \) kit (Invitrogen, USA)를 이용하여 single stranded cDNA를 제조하였다. 지방세포분화와 관련된 유전자들을 특이적으로 증폭하기 위해 primer를 제작하였으며 각 유전자의 발현정도를 GAPDH 유전자의 발현과 비교하여 확인하였다. 유전자의 발현정도는 전기영동 후 ImageQuant 5.2 (GEHealthcare, USA) 프로그램을 이용하여 분석하였다.</p>