한국에서 25개의 수달 시료를 채취하여 남미에 서식하고 있는 Southern river otter를 대상으로 만든 primer (CR F 5'-GAC GTG TAC CTC TTC TCG-3', CR R 5'-CTA TAG GTA TTT GTA TAC TTT TG-3')를 똑같이 제작하여 PCR증폭을 해서 국내 서식하는 수달에도 적용이 가능한지 검증하는 실험을 한 것이다. 시료의 양은 일정한 채로 같은 PCR조건에서 annealing 온도만 50\( ^{\circ} \mathrm{C} \)에서 65\( ^{\circ} \mathrm{C} \)까지 조정해가면서 DNA의 증폭여부를 실험하는 것이다. 검증여부는 \(1.5\%\) agarose gel 상에서 전기영동으로 확인한다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>공시동물 및 DNA 추출</h2> <p>본 연구에 사용한 25개의 수달 시료는 (사)수달생태연구센터의 도움으로 경남의 수달 주요 서식지인 진주 진양호, 창녕 우포늪, 거제해변지역을 대상으로 수집하였다. 진주 인근 국도에서 Road-Kill 된 수달 사체에서 채취한 9개의 조직시료(Lutra_01부터 09까지)와 창녕 우포늪 인근지역에서 Road-Kill 된 수달 사체에서 채취한 1개의 조직(Lutra_10) 그리고 진주인근 지역(진양호)에서 채취한 분변시료 8개(Lutra_11부터 18까지)와 거제지역에서 채취한 분변시료 7개(Lutra_19부터 25까지)로 구성되어 있으며, 조직 시료의 경우 proteinase K/phenol/ chloroform/isoamylalcohol 방법으로 Genomic DNA를 추출하였으며, 분변 시료의 경우 Genomic DNA 추출 KIT (iNtRON. Korea)를 이용하여 Genomic DNA를 추출해 mtDNA 분석 및 MS marker 분석을 수행하였다.</p> <h2>mtDNA D-loop PCR 증폭</h2> <p>국내에 서식하고 있는 수달을 대상으로 mtDNA의 D-loop 지역에 관한 연구가 전무하여 국외의 선진 연구자들이 연구한 결과를 기초로 국내 수달에 적용 가능한 primer를 선발하였다. 2008년 Centrón 등이 남미에서 서식하는 Southern river otter (Lontra provocax)를 대상으로 연구한 결과(NCBI: DQ368686)를 기초로 1 쌍의 primer (CR F 5'-GAC GTG TAC CTC TTC TCG-3', CR R 5'-CTA TAG GTA TTT GTA TAC TTT TG-3')를 제작하였다. 제작한 primer가 국내에서 서식하는 수달에도 적용이 가능한지 검증하기 위해 Gradient PCR (MJ Research, USA)을 이용하여 \( 50^{\sim} 65^{\circ} \mathrm{C} \)까지 annealing 온도를 설정하여 DNA증폭 여부를 검증하였다.</p> <p>검증 후 PCR 증폭은 Genomic DNA \( 1 \mathrm {\mu l}\) (조직시료의 경우 \( 50 \mathrm{ng} / \mathrm{\mu l} \), 분변시료의 경우 \( 100 \mathrm{ng} / \mu \mathrm{l}) \), primer 각각 \( 1 \mu \mathrm{l} \) (\( 10\mathrm{pmol} / \mu \mathrm{l} \) ), Taq DNA polymerase (TaKaRa, Japan) \( 0.1 \mu \mathrm{l}, 10 \times \) buffer \( 2.5 \mathrm{\mu l}\), \(0.25 \mathrm{mM} \) dNTP \( 2 \mu l \)에 증류수를 첨가하여 최종 \( 25 \mathrm{ \mu l} \) 용량으로 반응하였다. PCR 조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 de-naturation을 실시한 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 56^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분을 1 cycle로 하여 35회 반복한 후, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 ex-tension하고 \( 8^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하였다. PCR 산물은 \(1.5\%\) agarose gel 상에서 전기영동 확인하였다.</p>