실험을 위해 브로콜리의 줄기와 꽃송이를 세절하여 에탄올을 첨가하여 추출하였으며 감압건조로 조제하였다. 브로콜리 추출물 및 이의 분획물의 항산화 활성은 DPPH,ABTS , nitrite scavenging activity [NSA] 및 환원력을 측정해 평가했다.NSA 측정의 경우, 아질산염 용액 \( (1 \mathrm{mM}) \)에 시료용액을 가하고 여기에 \( 0.1 \mathrm{N} \mathrm{HCl} \)을 가해 \( \mathrm{pH} 1.2 \)로 조정한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시켜 Griess reagen를 가하고 혼합했다.Ethanol에 용해한 시료 \( 2.5 \mathrm{ml} \)에 \( 0.2 \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 6.6) \( 2.5 \mathrm{ml} \)와 \( 10 \% \) potassium ferricyanide \( 2.5 \mathrm{ml} \)를 첨가하고 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 반응시킨 후, \( 10 \% \) trichloroacetic acid \( 2.5 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 반응을 종료하고 \(4,000 \mathrm{rpm}\)에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>본 실험에 사용된 브로콜리는 2012년 6월에 H사에서 구입하였고, 흐르는 물에 세척 후 꽃송이(floret)와 줄기(stalk)를 각각 구분하여 사용하였다. 시료 조제를 위해서는 수세한 \( 1 \mathrm{kg} \) 브로콜리 줄기 및 꽃송이를 각각 세절하여 \( 10 \mathrm{L} \)의 에탄올(Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. Korea)을 첨가하여 실온에서 24시간씩 2회 추출하였으며, 각각의 추출액은 여과지(Whatsman No. 2)로 거른 후 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 감압 건조(Eyela Rotary evaporator N-1000, Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Japan)하여 조제하였다. 각각의 추출물의 유기용매 분획물 조제를 위해서 각각의 추출물을 증류수에 현탁한 후 n-hexane, ethylacetate 및 n-butanol을 이용하여 순차적으로 분획하고 최종적으로 물 잔류물을 회수하였으며, 여과지로 거른 후 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 감압 건조하여 분말화하였다. 각각의 시료는 DMSO에 적당한 농도로 녹여 in-vitro 항산화, 항균 및 암세포 생육억제 활성 평가에 사용하였다. 기타 사용한 시약은 시약급 이상으로 Sigma Co. (USA)의 제품을 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 브로콜리 꽃송이 및 줄기 시료는 안동대학교 식품영양학과에서 보관하고 있다(voucher specimen 2012-BO-F1 F5 및 2012-BO-S1 S5).</p> <h2>항산화 활성</h2> <p>브로콜리 추출물 및 이의 분획물의 항산화 활성은 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) anion scavenging activity [DSA], ABTS [2,2-azobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)] cation scavenging activity [ASA], nitrite scavenging activity [NSA] 및 환원력 측정으로 평가하였다. 먼저 DSA 측정의 경우, 다양한 농도로 희석한 시료 \( 20 \mu \mathrm{l} \)에 \( 99.5 \% \) ethanol에 용해시킨 \( 2 \times 10^{-4} \mathrm{M} \) DPPH 용액 \( 380 \mu \mathrm{l} \)를 넣고 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분 동안 반응시킨 후, \( 516 \mathrm{nm} \)에서 microplate reader (Asys Hitech, Expert96, Asys Co., Austria)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. DSA(\(\%) \)는 시료 첨가구와 비첨가구의 백분율로 표시하였다. ASA 측정의 경우, \( 7 \mathrm{mM} \) ABTS (Sigma Co., USA) \( 5 \mathrm{ml} \)와 \( 140 \mathrm{mM} \) potassium persulfate \( 88 \mathrm{ml} \)를 섞은 후 상온에서 16시간 빛을 차단하여 ABTS 양이온을 형성시켰으며, 이후 이 용액을 \( 414 \mathrm{nm} \)에서 흡광도 값이 1.5가 되도록 ethanol로 희석하였다. 조제된 희석용액 \( 190 \mu \mathrm{l} \)와 시료 \( 10 \mu \mathrm{l} \)를 혼합한 후 상온에서 6분간 반응시킨 후 \( 734 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하고 다음의 식에 의해 ASA\((\%) \)를 결정하였다.</p> <p>ASA \( (\%)=[(C-S) / C] \times 100 \)</p> <ul> <li>\( C \): DMSO 첨가시 흡광도</li> <li>\( S \) : 시료 첨가시 흡광도</li></ul> <p>한편 NSA 측정의 경우, 아질산염 용액 \( (1 \mathrm{mM}) \)에 시료용액을 가하고 여기에 \( 0.1 \mathrm{N} \mathrm{HCl} \)을 가해 \( \mathrm{pH} 1.2 \)로 조정한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시킨 후 Griess reagent (Sigma Co., USA)를 가하고 혼합하였다. 이후 15분간 실온에서 방치 후 \( 520 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하여 잔존 nitrite 양을 측정하였다. NSA(\(\%\))는 다음의 식에 의해 계산하였다.</p> <p>NSA\((\%)=[1-(A-C) / B] \times 100 \)</p> <ul> <li>\(A\): \( 1 \mathrm{mM} \) nitrite 용액에 시료를 첨가하여 1시간 반응시킨 후의 흡광도</li> <li>\(B\): \( 1 \mathrm{mM} \) nitrite 용액의 흡광도</li> <li>\(C\): 브로콜리 시료의 흡광도</li></ul> <p>환원력 평가의 경우 Oyaizu 등의 방법을 변형하여 측정하였다. Ethanol에 용해한 시료 \( 2.5 \mathrm{ml} \)에 \( 0.2 \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 6.6) \( 2.5 \mathrm{ml} \)와 \( 10 \% \) potassium ferricyanide \( 2.5 \mathrm{ml} \)를 첨가하고 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 반응시킨 후, \( 10 \% \) trichloroacetic acid \( 2.5 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 반응을 종료하고 \(4,000 \mathrm{rpm}\)에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액은 증류수로 2배 희석한 후, 신선하게 조제된 \( 0.1 \% \) ferric chloride 용액과 \( 5: 1(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 비율로 혼합하고 \( 700 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하여 평가하였다. 상기의 항산화 실험에서 대조구로는 vitamin C (Sigma Co., USA)를 사용하였으며, 용매 대조구로는 DMSO를 사용하였다. 각각의 활성 평가는 각각 3 회 반복한 실험의 평균과 편차로 표시하였다.</p>