본 연구에 사용된 myostatin prodo-main은 Lee 등에 의해 구축된 균주를 사용하였다. Lee 등(2010)의 방법에 따라 침지 하였으며 침지 후 12주와 22주에 각각 근육조직을 채집하여 근육 단백질과 지질 함량, 조직학적 분석을 하였다. 통계처리는 SPSS 18.0 프로그램을 이용하였고 대조 군과 비교하여 재조합 myostatin prodomain 실험의 유의성을 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>어류 유래 재조합 myostatin prodomain 발현 및 정제</h2> <p>본 연구에 사용된 넙치와 조피볼락 유래 myostatin prodo-main (pMALc2x-poMSTNpro, pMALc2x-sMSTNpro)은 Lee 등(2010; 2011)에 의해 구축된 균주를 사용하였다. 발현 균주로부터 재조합 단백질을 얻기 위해 고체배지에서 배양한 단일 콜로니를 \( 0.2 \% \) glucose가 포함된 LB (Luria-Bertani, \(1.2 \% \) tryptone, \( 0.6 \% \) yeast extract and \( 0.8 \% ~\mathrm{NaCl}) \) 배지에 접종하였다. 배양액은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 OD 600 값이 0.4~0.6이 될 때까지 배양한 뒤 \( 0.2 \mathrm{~mM} \) IPTG를 처리하고 2시간 동안 단백질 발현을 유도하였다. 발현 유도된 대장균은 \( 13,000 \mathrm{~rpm} \)으로 10분간 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 원심분리를 실시하여 상등 액만 회수하였고, 회수된 대장균은 초음파 분쇄기를 이용하여 파쇄한 후 원심분리 하여 상등 액만 amylose resin (NEB, USA)을 이용한 affinity chromatography를 통해 재조합 단백질을 정제하였다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE와 Bradford assay (Bio-Rad, USA)를 통해 정량 분석하여 동결건조 한 뒤 실험 전까지 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하였다.</p> <h2>재조합 myostatin prodomain 단백질 침지</h2> <p>실험에 사용한 시마연어는 무게 \( 1 \mathrm{~g} \) 내외의 개체를 선별하였다. 침지 실험방법은 Lee 등(2010)의 방법에 따라 수행하였으며 사용한 재조합 myostatin prodomain (pMALc2x-poMSTNpro, pMALc2x-sMSTNpro) 농도는 각각 \( 0.05 \mathrm{~mg} / \mathrm{l} \)와 \( 0.2 \mathrm{~mg} / \mathrm{l}\)이며 각 실험 군은 한 수조당 60마리의 시마연어를 수용하여 3회 반복 구 실험을 하였다. 재조합 단백질의 침지는 매주 2회, 4주간 처리하였고 매주 모든 그룹의 개체 무게를 측정하였다. 4주 이후에는 12주, 22주에 모든 그룹의 개체 무게를 측정하였다. 대조 군은 아무것도 처리하지 않은 그룹과 Tris buffer (\(20 \mathrm{~mM}\) Tris-\(\mathrm{HCl}\), \(\mathrm{pH~} 8.0\), \( 200 \mathrm{~mM}\) \(\mathrm{~NaCl}\), \(1 \mathrm{~mM} \) EDTA를 처리한 그룹을 사용하였다.</p> <h2>근육의 단백질/지질 함량 및 조직 분석</h2> <p>재조합 myostatin prodomain 단백질을 4주 동안 침지 한 후, 12주와 22주에 각각 근육조직을 채집하여 근육 단백질과 지질 함량, 조직학적 분석을 하였다. 단백질과 지질 함량 분석은 AOAC 방법에 의해 어류의 뼈와 피부를 제외한 순수 근육 부위를 가지고 수행하였다. 조직분석은 근육조직을 파라핀 고정을 통해 \( 10 ~\mu \mathrm{m} \) 박편을 제작하여 hematoxylin/eosin으로 염색 한 뒤 Image J 프로그램(http://rsbweb.nih.gov/ij)을 이용한 근섬유의 수, 면적 그리고 지름을 측정하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>통계처리는 SPSS 18.0 프로그램을 이용하여 One-way ANOVA test를 실시하여 Duncan 검정을 통해 12주와 22주에 개체 무게, 단백질과 지질 함량, 근섬유의 수와 평균 면적을 대조 군과 재조합 myostatin prodomain 실험구간의 유의성을 분석하였다. 모든 통계적 유의 수준은 \( p<0.05 \)에서 채택하였다.</p>