정제된 1,4-benzoquinone reductase는 NADH와 NADPH를 전자공여체로 사용하며, nitrosobenzene의 환원도 촉매하였다. 이때, quinone reductase의 inhibitor인 Cibacron blue 3GA를 첨가하면 니트로소 환원 반응이 저해되었다. 본 연구에서는 이 효소를 포유동물인 소의 간에서 추출하여 사용하였으며, 효소가 quinone류 화합물 뿐만 아니라 아릴니트로소 화합물의 생변환에도 관여한다는 것을 확인하였다. 이를 통해 퀴논 reductase가 xenobiotic metabolizing enzyme의 한 형태로서 작용함을 밝혔다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <p>소 간으로부터 정제된 1,4-benzoquinone reductase를 disc polyacrylamide gel 전기영동 한 결과 단일 band로 나타났으며 이 효소액을 사용하여 기질특이성을 조사하였다. 정제된 1,4-benzoquinone reductase는 Phanero-chaete chrysosporium으로부터 정제된 quinone reductase와 마찬가지로 NADH와 NADPH를 모두 electron donor로 사용할 수 있었다. 또한 치환된 benzoquinone들과 naphthoquinone들 뿐만 아니라 phenanthrenequinone에 대해서도 높은 활성을 나타내었다. Constam 등은 P. chry-sosporium quinone reductase가 methylbenzoquinone, 2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4-benzoquinone 등 다양한 benzoquinone들에 대하여 활성을 나타낸다고 보고하였으며, Brock 등도 P. chrysosporium으로부터 정제된 1,4-benzoquinone reductase가 2-methoxy-1,4-benzoquinone, 1,4-naphthoquinone 등을 기질로 사용한다고 보고하였다. 소 간에서 정제된 1,4-benzoquinone reductase는 4-nitrosophenol, 4-nitroace-tophenone 등에 대하여도 활성을 나타내었으며 생성물의 구조를 확인하기 위하여 TLC, GC, GC-MS, NMR을 시행 하였다. 효소액에 4-nitrosophenol과 NADH를 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 ethyl acetate로 추출하여 \( \mathrm{MgSO}_{4} \)로 수분을 제거한 다음 TLC, GC, GC-MS를 수행하였으며 추출액을 silica column으로 분리한 후 NMR로 생성물의 구조를 확인하였다. 반응 추출액을 thin layer chro-matography (TLC) 한 결과는 Fig. 1과 같다. Hexane/ ethylacetate (\(6:4\)) 용액을 전개액으로 사용하였으며 생성물은 4-aminophenol의 Rf 값인 0.12에서 spot을 나타내었다. 반응 추출액을 gas chromatography (GC) 한 결과는 Fig. 2와 같으며 retention time \( 8.829 \mathrm{~min} \)에서 생성물인 4-aminophenol의 큰 peak가 나타났다. GC-MS spectrum을 Fig. 3에 나타내었으며 Mass (EA \( 70 \mathrm{V}\)) 109로 나타났고 Wiley 275 Database를 사용하여 생성물을 확인하였다. 정제된 생성물을 proton NMR spectrometer (\(300 \mathrm{MHz} \), \( \mathrm{CDCl}_{3} \))를 사용하여 분석한 결과는 다음과 같다. \( \delta 3.92 \) (\(1 \mathrm{H} \), bro S), \( 6.50\)(\(2 \mathrm{H}, \mathrm{d}, 8.6 \mathrm{~Hz}\)), \(6.57\)(\(2 \mathrm{H}, \mathrm{d}, 8.6 \mathrm{~Hz}\)), \( 8.24\)(\(2 \mathrm{H} \), bro S). 이상의 결과로부터 4-nitrosophenol을 기질로 사용하였을 때 생성물은 4-aminophenol임이 확인되었다. 또한 정제된 소 간 1,4 -benzoquinone reductase는 nitrosobenzene의 환원도 촉매하였으며 quinone reductase 의 inhibitor인 Cibacron blue 3GA를 \( 1 \mu \mathrm{M} \) 첨가하면 니트로소 환원 반응이 저해되어 \( 44.4 \% \)의 활성을 나타내었고 \( 2.5 \mu \mathrm{M} \) 첨가하면 활성이 완전히 저해되어 환원 반응이 전혀 진행되지 않았다. 소 간 1,4-benzoquinone re-ductase에 의한 nitrosobenzene 환원은 quinone reductase의 저해제인 dicumarol에 의해서도 저해되었으며 dicu-marol \( 1 \mu \mathrm{M} \) 첨가시에 \( 88.6 \% \)의 활성을 나타내었고 \( 5 \mu \mathrm{M} \) 첨가하면 \( 22.5 \% \)의 활성을 나타내었다. 소 간 1,4-benzoquinone reductase는 N, N-dimethyl-4-nitrosoaniline의 환원도 촉매하였으며 다양한 농도의 N,N-dimethyl-4nitrosoaniline을 사용하여 실험한 결과 dicumarol이 비경쟁 억제물로 작용함을 보여주었다. 정제된 효소용액에 Natural orange 6 (2-hydroxy-1,4-naphthoquinone)를 혼합한 후 absorption spectra 변화를 측정한 결과는 Fig. 7과 같으며 가시광선 영역에서 다소 흡광도 감소를 보여주었으나 Naphthol yellow, Alizarin을 사용하였을 경우에는 absorption spectra에 변화를 나타내지 않았다. 본 연구에서는 포유동물에서 퀴논 환원효소가 퀴논 화합물들의 환원을 촉매할 뿐만 아니라 아릴니트로소 화합물의 생변환에도 관여하는지 여부를 밝히기 위하여 포유동물인 소의 간으로부터 quinone reductase를 정제한 후 정제된 효소를 반응에 직접 사용하여 quinone reductase가 xenobiotic metab-olizing enzyme으로서 퀴논류의 화합물들 뿐만 아니라 아릴니트로소 화합물의 생변환에도 관여한다는 사실을 확인하였으며 반응의 특성에 관하여 조사하였다.</p> <h1>요 약</h1> <p>소 간으로부터 퀴논 환원효소를 정제하였으며 정제된 효소는 벤조퀴논과 나프토퀴논 뿐만 아니라 페난트렌 퀴논의 환원도 촉매하였다. 소 간으로부터 정제된 퀴논 환원 효소는 아릴니트로소 화합물의 생변환을 촉매하였으며 반응 생성물은 TLC, GC, GC-MS, NMR을 사용하여 확인되었다. 이 반응은 포유동물 퀴논 환원효소의 강력한 저해제인 Cibacron blue 3GA나 dicumarol에 의하여 크게 저해되었다.</p>