분리균주의 배양시간에 따른 생육도와 항균 활성을 조사하기 위해 TSB 액체배지에 1% 접종하여 37\(^\circ \mathrm{C}\)에서 0~120시간 동안 진탕배양하고 paper disk method를 사용하여 B. subtilis ATCC 6633을 지시균으로 LB 평판배지에 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { cfu } / \mathrm { mL } \) cfu/mL로 도말한 후 8mm 직경의 paper disk에 승강하여 37\(^\circ \mathrm{C}\)에서 24시간 동안 적산하여 항균 활성을 측정하였다.
<h2>생육시기에 따른 항균 활성 측정</h2> <p>분리균주의 배양시간에 따른 생육도와 항균 활성을 조사하기 위하여 분리균주를 \( 50 \mathrm { ~mL } \) TSB 액체배지에 \( 1 \% \) 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 0~120시간 동안 진탕배양하면서 \( 600 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하여 생육곡선을 그리고, 이때 생육시기에 따른 항균 활성을 측정하였다. 항균 활성 측정은 paper disk method를 사용하여 다음과 같이 시행하였다. 항세균 활성은 B. subtilis ATCC 6633을 지시균으로 사용하여 LB 평판배지에 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { cfu } / \mathrm { mL } \) 로 도말한 후 \( 8 \mathrm { ~mm } \) 직경의 paper disk(ADVANTEC, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Japan)를 늫고 항균 물질을 \( 100 \mu \mathrm { L } \)씩 일정하게 가하였다. 항진균 활성은 감수성 곰팡이인 Aspergillus petrakii PF-1의 포자를 PDA 배지 \( 20 \mathrm { ~mL } \) 에 \( 1 \times 10 ^ { 6 } \mathrm { cfu } / \mathrm { mL } \) 로 첨가하여 petri dish에 부은 후에 굳으면 \( 8 \mathrm { ~mm } \) 직경의 paper disk를 놓고 항진균 물질을 \( 100 \mu \mathrm { L } \) 씩 일정하게 가하였다. 항세균 활성은 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24시간 배양하여, 항진균 활성은 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 48시간 배양한 후 활성을 측정하였다. 항균활성은 diamatic caliper(CD-15CPX, Mitutoyo, Japan)를 사용하여 생육저지환의 지름으로 측정하였으며 3회의 반복실험을 한 후 평균값을 사용하였다.</p> <h2>조향균 물질의 준비</h2> <p>조항균 물질을 준비하기 위해 분리 균주를 \( 5 \mathrm { ~mL } \) TSB 액체배지에 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 12시간 전배양한 후 \( 50 \mathrm { ~mL } \) TSB 액체 배지에 전배양액을 \( 1 \% \) 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30시간 동안 본배양하였다. 본배양액을 원심분리 \( (9,500 \times g, 15 \mathrm { min } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) ) 후 상등액을 \( 0.2 \mu \mathrm { m } \) membrane filter(Advantec MFS, Inc., Japan)로 제균하여 배양상등액을 조항균물질로 사용하거나 또는 동결건조(Labconco Co., U.S.A.)한 후에 3차 증류수로 녹여 5배, 10배, 20배 농축하여 사용하였다. 이 때 TSB 액체 배지를 동결건조 후 실험구와 같은 배율로 농축한 것을 대조구로 사용하였다.</p>