서울 경동 한약재 시장에서 구입한 생약재 3종, 즉 당귀(Danggui, Angelica gigas Nakai)의 뿌리, 천궁(Chuanxiong, Cnidium offlcinale Makino)의 근경, 백작약(Baishaoyao, Paeonia japonica Miyabe)의 북리를 동일한 무게비율로 혼합한 후, 혼합 생약재 \(100\mathrm{~g}\)당 증류수 \(1,000\mathrm{ml}\)을 가하고 4시간 열탕 추출하였다. 사람 비만세포주 HMC-1 \((3 \times 10^{6}\)개)에 시료를 농도별로 처리하여 \(37^{\circ}\mathrm{C}\)에서 30분 동안 배양한 다음, compound 48/80 \((300\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml})\)을 첨가하여 20분 동안 반응시켰다. 수거한 용액에 \(0.1\mathrm{N}\) \(\mathrm{HCl}\) \(1\mathrm{ml}\)과 \(1\mathrm{N}\) \(\mathrm{NaOH}\) \(0.3\mathrm{ml}\), \(0.2\%\mathrm{OPT}\) \(0.2\mathrm{ml}\)넣고 냉암소에서 45분 간 반응시킨 다음, \(0.5\mathrm{N}\) \(\mathrm{H}_{2}\mathrm{SO}_{4}\) \(0.28\mathrm{ml}\)을 넣어 반응을 종결시킨 뒤 형광광도 측정기(Spectro-fluorophotometer, Shimadzu, Japan)로 excitation \(350\mathrm{~nm}\), emission \(440\mathrm{~nm}\)에서 석영 퀴벳을 사용하여 측정하였다. 사람 비만세포주 HMC-1 \((5\times 10^{5}\)개)에 시료를 농도별로 처리한 후, \(37^{\circ}\mathrm{C}\), \(5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2}\) incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 효소중합연쇄반응의 product는 \(20\mu\mathrm{l}\)씩 \(2\%\)agarose gel에 loading하여 \(100\mathrm{~V}\)에서 40분간 전기영동go ethidium bromide로 염색하여 UV아래에서 관찰했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용 시약</h2> <p>세포배양에 필요한 Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)과 항생제는 Gibco (Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였으며, fetal bovine serum (FBS)는 Hyclone (Logan, UT, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 2-mer-captoethanol(2ME)과 sodium bicarbonate \((\mathrm{NaHCO}_{3})\), compound 48/80, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), A23187 (calcium ionophore)는 Sigma (St. Louis, MO, USA)제품을 구입하여 사용하였다. 또한 cytokine 측정에 필요한 항체는 PharMingen (San Diego, CA, USA)에서 구입하였으며, RT-PCR에 필요한 시약 reverse transcriptase, dNTP Mixure, oligo (dT) 15 primer, Taq. DNA polymerase 등은 Promega (Madison, WI, USA) 제품을 사용하였다.</p> <h2>세포주 배양</h2> <p>사람 비만세포주 HMC-1은 IMDM 배지에 \(\mathrm{NaHCO}_{3}(3.024\mathrm{g}/\mathrm{l}\), 항생제(100 units/\(\mathrm{ml}\) penicillin G sodium, \(100\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml}\) streptomycin sulfate, \(0.25\mathrm{g}/\mathrm{ml}\) amphotericin B), 2-ME (50\(\mu\mathrm{M}\))가 첨가된 \( 10 \% \mathrm{FBS} \) 배지를 이용하여 \(37^{\circ}\mathrm{C}\), \(5\%\) \(\mathrm{CO}_{2}\) incubator에서 배양하였다.</p> <h2>생약복합조성물(HemoHIM) 및 분획의 제조</h2> <p>생약복합조성물 HemoHIM은 아래와 같은 방법으로 제조한 시료를 (주)선바이오텍에서 제공받아 사용하였다. 서울 경동 한약재 시장에서 구입한 생약재 3종, 즉 당귀(Danggui, Angelica gigas Nakai)의 뿌리, 천궁(Chuanxiong, Cnidium offlcinale Makino)의 근경, 백작약(Baishaoyao, Paeonia japonica Miyabe)의 북리를 동일한 무게비율로 혼합한 후, 혼합 생약재 \(100\mathrm{~g}\)당 증류수 \(1,000\mathrm{ml}\)을 가하고 4시간 열탕 추출하였다. 추출물의 괴형분을 제거하괴 감압농축하여 생약복합물 HIM-I을 얻었다. HIM-I의 일부를 취하여 4 배 부피의 \(100\%\) 에탄을 주정을 첨가하고(최종 에탄을 농도 약\(80\%), 25^{\circ}\mathrm{C}\) 이하에서 16시간 정치한 후, 원신분리하여 침전된 조다당 분획(HIM-I-P)과 상충의 에탄을 분획(HIM-I-E)을 수거하였다. 수거한 조다당 분획의 일부를 이에 해당하는 HIM-I에 첨가하여 생야복합조성물 HemoHIM을 제조하였다. 제조한 HemoHIM은 동결건조하여 냉동 저장하였으며, 실험 직전에 증류수에 녹여 사용하였다.</p> <h2>히스타민 분비량 측정</h2> <p>사람 비만세포주 HMC-1 \((3 \times 10^{6}\)개)에 시료를 농도별로 처리하여 \(37^{\circ}\mathrm{C}\)에서 30분 동안 배양한 다음, compound 48/80 \((300\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml})\)을 첨가하여 20분 동안 반응시켰다. Compound 48/80을 처리한 세포는 가볍게 원심 분리하여 상층액을 수거 하였고, 상층액에 포함된 히스타민은 OPT와 반응시킨 후 측정하였다. 즉 상층액 속에 포함된 histamine의 양을 측정하기 위해 상층액 \(500\mu\mathrm{l}\)에 \(0.5\mathrm{~N}\) \(\mathrm{HClO}_{4}\) \(2\mathrm{ml}\)을 넣고 혼합한 후 \(12,000\mathrm{rpm}\)에서 20분간 원심분리였다. 원심분리한 상층액 2\(\mathrm{ml}\)에 \(6\mathrm{N}\) \(\mathrm{NaOH}\) \(0.2\mathrm{ml}\), buthanol-chloroform (3:2) \(3.3\mathrm{ml}\)과 \(\mathrm{NaCl}\)을 넣고 \(3,000\mathrm{rpm}\)에서 10분간 원심 분리한다. 원심 분리한 상층액의 윗층 \(3\mathrm{ml}\)에 n-heptane \(3\mathrm{ml}\)과 \(0.1\mathrm{N}\) \(mathrm{HCl}\) \(1.2\mathrm{ml}\)을 넣고 혼합한 후 \(100^{\circ}\mathrm{C}\)에서 10분간 끓인 다음, \(3,000\mathrm{rpm}\)에서 5분 원심 분리하여 아래층을 파스퇴르 피펫으로 수거하였다. 수거한 용액에 \(0.1\mathrm{N}\) \(\mathrm{HCl}\) \(1\mathrm{ml}\)과 \(1\mathrm{N}\) \(\mathrm{NaOH}\) \(0.3\mathrm{ml}\), \(0.2\%\mathrm{OPT}\) \(0.2\mathrm{ml}\) 넣고 냉암소에서 45분 간 반응시킨 다음, \(0.5\mathrm{N}\) \(\mathrm{H}_{2}\mathrm{SO}_{4}\) \(0.28\mathrm{ml}\)을 넣어 반응을 종결 시킨 뒤 형광광도 측정기(Spectro-fluorophotometer, Shimadzu, Japan)로 excitation \(350\mathrm{~nm}\), emission \(440\mathrm{~nm}\)에서 석영 퀴벳을 사용하여 측정하였다.</p> <h2>염증성 사이토카인 측정</h2> <p>사람 비만세포주 HMC-1 \((5\times 10^{5}\)개)에 시료를 농도별로 처리한 후, \(37^{\circ}\mathrm{C}\), \(5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2}\) incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 시료를 처리한 세포는 다시 PMA (\(25\mathrm{ng}/\mathrm{ml})\)와 A23187 \((1\mu\mathrm{M})\)을 첨가하여 24시간 동안 반응시킨 후 배양 상층액을 수거하였다. 상층액에 포함된 TNF-\(\alpha\), GM-CSF, IL-6, IL-8의 양은 효소항체법(enzyme-linked immunosorbent assay)을 이용하여 측정하였다. 즉, 일차항체 anti-TNF-\(\alpha\), GM-CSF, IL-6, IL-8 mAb를 coating buffer \((0.1\mathrm{M~}\mathrm{NaHCO}_{3})\)에 희석하여 plate에 적정량을 넣고 \(4^{\circ}\mathrm{C}\)에서 하룻밤 둔 다음, washing buffer \((0.05\%\) Tween 20/\(\mathrm{PBS}\))로 세척한 다음, \(10\%\) FCS를 첨가한 PBS로 2시간 동안 blacking 하였다. 다시 세척 후 배양 상층액을 적절하게 희석하여 넣어 반응시키고, 4시간 후에 washing 용액으로 세척하고 이차 항체 biotin-conjugated anti-TNF-\(\alpha\), GM-CSF, IL-6, IL-8 mAb를 첨가하였다. 다시 1시간 후에 washing용액으로 세척한 다음, avidin-peroxidase를 첨가하고, 기질 (2, 2'-azino-bis, \(0.1\mathrm{M}\) citric acid, \(\mathrm{H}_{2}\mathrm{O}_{2}\)) 를 넣어 발색시켜서 Microplate reader를 이용하여 \(405\mathrm{~nm}\) 에서 흡광도를 측정하고 표준곡선을 이용하여 환산하였다. 이때 각 사이토카인의 측정 한계치는 \(10\mathrm{pg}/\mathrm{ml}\)이었다.</p> <h2>mRNA 발현량 측정</h2> <p>사람 비만세포주 HMC-1 (\(3\times10^{6}\)개)에 시료를 농도별로 처리하여 \(37^{\circ}\mathrm{C}\), \(5\%\) \(\mathrm{CO}_{2}\) incubator에서 24시간 동안 배양한 후, PMA \((25\mathrm{ng}/\mathrm{ml})\)와 A23187 \((1\mu\mathrm{M})\)로 2시간 동안 자극하였다. 자극한 세포를 모아 원심분리하여 상층액을 제거하고, RNA zol을 이용하여 RNA를 추출하였다. Total RNA \(1\mu\mathrm{g}\)을 \(75^{\circ}\mathrm{C}\)에서 5분간 변성시킨 후, dNTP \((1\mathrm{mM})\), oligo (dT)15 (\(0.5\mu\mathrm{g})\), AMV reverse transcriptase \((20\mathrm{~U})\), RNase inhibitor\((0.5\mathrm{~U})\), RT buffer, \(\mathrm{MgCl}_{2}\) \((5 \mathrm{mM})\)와 DEPC로 처리된 증류수로 최종 부피가 \(20\mu\)가 되도록 하여, \(42^{\circ}\mathrm{C}\)에서 30분간 반응시켜 cDNA를 합성하여 효소중합연쇄반응에 사용하였다. 효소중합연쇄 반응은 합성된 cDNA \(2\mu\)을 주형으로 \(Fc\varepsilon RI\alpha\), tryptase, c-kit와 GAPDH의 sense primer와 antisense primer \((15\mathrm{~pmol})\), Taq polymerase \((0.5\mathrm{U})\), polymerase buffer를 DEPC로 처리된 증류수로 최종 부피가 \(20\mu\mathrm{l}\)되도록 하여 predenaturation; \(95^{\circ}\mathrm{C}\) 5분, denaturation; \(94^{\circ}\mathrm{C}\) 1분, annealing; \(55^{\circ}\mathrm{C}\) 30초, elongation; \(72^{\circ} \mathrm{C}\) 1분을 40 cycle한 다음, postelongation을 \(72^{\circ}\mathrm{C}\)에서 5분하는 조건으로 수행하였다. 효소중합연쇄반응의 product는 \(20\mu\mathrm{l}\)씩 \(2\%\) agarose gel에 loading하여 \(100\mathrm{~V}\)에서 40분 간 전기영동하여 ethidium bromide로 염색하여 UV 하에서 관찰하였다. 전기영동 밴드의 밀도는 Densitometer (Bio-Rad Laboratories, Inc. Gel Doc \(^{\mathrm{TM}}\) XR)를 이용하여 측정하고 대조군에 대한 상대적 밀도를 측정하였다.</p>