D.radiodurans의 유전체 DNA로부터 증폭된 dr1558과 pprM 유전자는 항시성 프로모터를 포함한 pCES208GFP 플라스미드들을 BamHI과 NotⅠ으로 절단한 후, 같은 두 개의 제한효소들로 절단된 pprM과 dr1558 유전자를 각각 클로닝하여 재조합한 C. glutamicum KCTC1857는 RG배지에 접종하여 \(250\mathrm{rpm}\), \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 배양하였다.
<h1>미생물 및 배양 배지</h1> <p>본 실험에서 사용된 C. glutamicum KCTC1857은 KCTC 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, Jeongeup, South Korea)에서 분양 받았으며, 라이신 생산을 위한 숙주로 사용되었다. 항시성 프로모터 \( \left ( \mathrm { P } _ {\mathrm { L } 10 } , \mathrm { P } _ {\mathrm { L } 26 } , \mathrm { P } _ {\mathrm { I } 16 } , \mathrm { P } _ {\mathrm { I } 64 } , \mathrm { P } _ {\mathrm { H } 30 } \right . \), \( \mathrm { P } _ {\text { H36 } } \) )를 포함한 pCES208GFP 벡터들은 lysine decarboxylase의 발현을 통해 카다베린의 생산에 이용되었다. D. radiodurans 균주는 한국원자력연구원 첨단방사선연구소(ARTI, Korea)에서 분양받았다. 유전자 조작을 위한 대장균은 LB 배지(1 L 당 \( 10 \mathrm { ~g } \) tryptone, \( 5 \mathrm { ~g } \) yeast extract, \( 5 \mathrm { ~g } \) \( \mathrm { NaCl } \) )를 이용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다. C. glutamicum KCTC1857는 RG 배지(1 L 당 \( 10 \mathrm { ~g } \) glucose, \( 30 \mathrm { ~g } \) sorbitol, \( 10 \mathrm { ~g } \) beef extract, \( 40 \mathrm { ~g } \) brain heart infusion)에 접종하여 \( 250 \mathrm { rpm } , 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 동안 배양하였다.</p> <h1>재조합 C. glutamicum 제작</h1> <p>dr1558과 pprM 유전자는 D. radiodurans의 유전체 DNA로부터 각각 DR1558-F (5'-TAA GCA GGA TCC GTG ACT CTG CCT CAA GGA-3'), DR1558-R (5'-TAA GCA GCG GCC GCT CAC AAC TCC ACG CCC TC-3')와 pprM-F (5'-TAA GCA GGA TCC GTG TGC CGA GTT TCG ATT-3'), pprM-R (5'-TAA GCA GCG GCC GCT TAC CAG CGG TCG TC-3')을 이용하여 증폭되었고 증폭된 유전자는 제한효소 BamHI (Promega, USA)과 NotⅠ (Promega)으로 절단하였다. 항시성 프로모터를 포함한 pCES208GFP 플라스미드들을 BamHI과 NotⅠ으로 절단한 후, 같은 두 개의 제한효소들로 절단된 pprM과 dr1558 유전자를 각각 클로닝하였다. 대조군은 GFP가 절단된 pCES- \( \mathrm { P } _ {\mathrm { I } 64 } \) 플라스미드로 설정하였다. 모든 재조합 플라스미드는 논문에 보고된 방법을 따라서 C. glutamicum KCTC1857을 형질전환하는데 이용되었고, colony PCR, 이중 제한효소 처리와 DNA sequencing을 통해 서열을 확인하였다.</p>