본 실험에 사용된 균주는 Saccharomyces cerevisiae VL6-48, DH10B FmcrA \(\Delta\)(mrr-hsdRMS-mcrBC) \(\phi 80\) dacZDM15 slacX74 deoR recA1 endA1 araD139 \(\Delta\)(ara, leu)7697 galU galK \(\lambda^{-}\) (ps. mupG)이며, DNA 증폭에 사용된 대장균의 균주는 pVC604 HIS3 선택마커를 지니는 Bluescript 유래 yeast 전용 vector이다.
<h1>재료 밎 방법</h1> <h2>사용 균주 및 plasmid DNA</h2> <p>본 실험에 사용된 출아효모 Saccharomyces cerevisiae는 VL6-48 균주 (Mata his3-△200 trp1-△1 ura3-52 ade2-101 met14)이고, DNA 증폭에 사용된 대장균의 균주는 DH10B (\(\mathrm{F^{-}}\) mcrA △(mrr-hsdRMS-mcrBC)\(\phi\)80dlacZDM15 △lacX74 deoR recA1 endA1 araD139 △(ara, leu)7697 galU galK\(\lambda^{-}\) rpsL nupG를 사용하였다. 기본 TAR vector로 사용되는 pVC604(Fig.1A)는 HIS3 선택마커를 지니며, 이는 Bluescript 유래의 yeast-E. coli shuttle vector인 pRS313으로부터 만들어졌다. 인간 게놈 DNA로부터 hHPRT 유전자의 분리와 마우스 게놈으로부터 hHPRT(Hprt1) 분리를 위한 총 4종류의 TAR vector는 Fig. 1B에서 보여주는 것과 간이 여러 종류의 hook을 제작하여 TAR vector의 multi-cloning site 에 삽입하였다.<h2>배지 및 배양조건</h2> <p>효모 및 대장균을 이용한 유전학적 방법은 Sambrook et al 및 Sherman et al 방법을 사용하였다. 대장균 DH5\(\alpha\)의 증식용 배지로 LB(Luria-Bertani) broth (\( 0.5 \% \) Yeast extract, \(1 \%\) Bactotrypton, \( 0.5 \% \mathrm { ~NaCl } , 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) Ampicillin)을 사용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다. 효모의 배양에는 YPD ( \(1 \%\) yeast extract, \(2 \%\) polypeptone, \( 2 \% \) glucose) 액체배지와 여기에 \( 2 \% \) Bacto-agar를 첨가한 YPD 고체 배지를 사용하였다. Spheroplasts transformation에 사용되는 Sorbitol-His 배지는 \(1 \mathrm{L} \)에 \( 28 \mathrm { ~g } \) 의 Ground His minus Powder Mixture \( (0.67 \% \) yeast nitrogen base, \( 2 \% \) glucose, Adenine sulfate  \( 3.0 \mathrm { ~g } \), L-Arginine \( \mathrm {\cdot HCl~ } 2.5 \mathrm { ~g } \), L-aspartic acid \( 3.75 \mathrm { ~g } \), L-glutamic acid \( 5.0 \mathrm { ~g } \), L-isoleucine \( 2.5 \mathrm { ~g } \), L-leucine \( 5.0 \mathrm { ~g } \), L-lysine \( \cdot \mathrm { HCl~ } 6.0 \mathrm { ~g } \), L-methionine \( 1.0 \mathrm { ~g } \), L-phenylalanine \( 2.5 \mathrm { ~g } \), L-serine \( 18.75 \mathrm { ~g } \), L-threonine \( 5.0 \mathrm { ~g } \), L-tryptophan \( 2.5 \mathrm { ~g } \), L-tyrosine \( 2.5 \mathrm { ~g } \), uracil \( 3.0 \mathrm { ~g } \), L-valine \( 7.5 \mathrm { ~g } ) \)과 형질전환체의 안정성을 위해 \( 1 \mathrm { M } \) sorbitol)을 첨가하고 \( 20 \mathrm { ~g } \) 의 Bacto agar (Difco)를 첨가하여 사용하였다. Top agar Sor-His 배지는 \(1 \mathrm{L} \)에 \( 28 \mathrm { ~g } \)의 Ground His minus Powder Mixture, \( 1 \mathrm { M } \) Sorbitol, 그리고 \( 30 \mathrm { ~g } \)의 Bacto agar (Difco) 를 넣어 사용하였다. SD-His 배지는 \(1 \mathrm{L} \)에 \( 28 \mathrm { ~g } \)의 Ground His minus Powder Mixture와 \(2 \% \) Bacto agar를 넣어 사용하였다.</p>