본 연구에서 20개의 팽이버섯 균주들의 internal transcribed spacer re-gion의 염기서열을 획득하였고 F. velutipes 4154 균주는 rDNA-cluster의 하나인 SSU, ITS 1, 5.8S rDNA gene, ITS 2, SU , IGS 1 , 5S rDNA, 및 IGS 2 에서 총 \(10,974 \mathrm{~bp} \)의 염기서열을 정하였고 20개의 F. velutipes 균주들의 internal transcribed spacer region의 염기서열을 universal primer인 ITS 1 과 ITS 4 primer로 확인하였으며 계통수는 크게 2가지로 분류 할 수 있으며 이후 팽이버섯 균주들을 구별하기 위한 마커를 개발하기 위하여 분자유전학적 방법인 RAPD, AFLP, SSU rDNA, Histone 유전자 등을 통해서 보완연구가 필요하다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <p>본 실험에서 universal primer인 ITS 1 과 ITS 4 primer로 20개의 F. velutipes 균주들의 internal transcribed spacer re-gion의 염기서열을 얻었으며, F. velutipes 4154 균주는 rDNA-cluster에 해당하는 Small subunit gene (SSU), Internal transcribed spacer 1 (ITS 1), 5.8S rDNA gene, Internal tran-scribed spacer 2 (ITS 2), Large subunit gene (LSU), Intergenic spacer 1 (IGS 1), 5S rDNA, 및 Intergenic spacer 2 (IGS 2)에서 총 \(10,974 \mathrm{~bp} \)의 염기서열을 결정되었다. 이 균주의 rDNA cluster의 염기서열 결과는 NCBI의 GenBank에 등록하였으며(Accession No. HQ660197), Table 5에 명시하였다. SSU는 \(1,806\mathrm{~bp} \)였고, 종속 구별 시 사용되는 ITS 부분은 총 \(553\mathrm{~bp} \)로 염기배열이 결정되었다. ITS 1 부분은 \(245\mathrm{~bp} \)이고 ITS 2는 \(308\mathrm{~bp} \)임을 확인하였으며, LSU에 해당되는 염기서열 은 \(3,402\mathrm{~bp} \), IGS 1은 \(1,400\mathrm{~bp}\), 5S는 \(83\mathrm{~bp} \), IGS 2는 \(3,571\mathrm{~bp}\)임을 확인하였다.</p> <p>총 21개의 균주의 유연관계 분석 결과, 총 3개 그룹으로 나누어졌다. 첫 번째 그룹은 Flammulina sp. Group: F. fennae, F. populicola, F. rossica, F. elastica, F. cephalariae, F. ononidis, Physalacria bambusae, Gloiocephala aquatic, Oudemansiella radi-cata, Xerula incognita와 Armillaria mellea이고, 두 번째 그룹은 Cyptotrama asprata, Pleurotus eryngii, Gymnopus confluens, Rhodocollybia butyracea이며, 세 번째 그룹은 Lepista irina, Hypsizygus marmoreus와 Pleurotopsis longinquq가 속해 있음이 밝혀졌다. 첫 번째 그룹은 뽕나무 버섯과에 속하는 균주들이 서로 가까운 유연관계를 나타내었으며, 본 연구에서 rDNA-cluster 서열이 결정된 F. velutipes 4154균주도 이 그룹에 속해 있음을 확인하였다. 두 번째 그룹은 송이과에 속하는 균주들이며, 세번째 그룹은 L. irina, Hypsizygus marmoreus, Pleurotopsis Ionginqua이였으며, Rhizoctonia solani와 Puccinia triticina는 outgroup으로 이용되었다. 첫 번째 그룹인 P. bam-busae, G. aquatic, O. radicata, X. incognita, A. mellea와 두 번째 그룹에 속하던 C. asprata은 분류학적으로 뽕나무 버섯과에 위치하고 있으며, 두 번째 그룹인 G. confluens, R..butyracea과, 세번째 그룹인 L. irina, H. marmoreus, P. longinquq, P. eryngii은 송이과에 속한 균주들이다.</p> <p>Table 3에 나타낸 바와 같이 20개 팽이버섯 (F. velutipes) 균주에서 추출한 Genomic DNA를 주형으로 하여 ITS 1과 ITS 4 primer로 약 \(720\mathrm{~bp} \)의 증폭 산물을 얻었다. 증폭된 20개 균주의 rDNA-ITS region 염기서열을 분석한 결과, 증폭산물은 \(711\sim 717\)\(\mathrm{~bp} \)의 염기로 구성되어 있었음을 확인하였다. 5.8S 부위는 \(159\mathrm{~bp} \)로 보존적인 결과를 나타내었고, ITS 1은 약 \(245\sim 247\)\(\mathrm{~bp} \)였으며, ITS 2도 약 \(307\sim311\)\(\mathrm{~bp} \)로 20개 균주 간에 근소한 크기 차이를 보였다. ITS 부위에서 12종의 토종 팽이버섯 균주인 F. velutipes 4065, 4103, 4134, 4149, 4153, 4019, 4019-04, 4019-12, 4019-19, 4019-20, 4019-\(4 \times19\), 4019-\(12 \times 20\) 균주들과 일본에서 채집된 F. velutipes 4010, 4075, 4093, 4100, 4154, 4155균주, 중국이 원산지인 F. velutipes 4087균주와 필리핀에서 채집된 F. velutipes 4115 균주들 사이에서의 multiple alignment 분석 결과, 약 \(720 \mathrm{~bp} \) 중에서 총 25개의 염기 부위가 상이함을 확인하였다. ITS 1 region은 14개 염기부위가, ITS 2 region은 9개 염기서열상 차이를 보였으며, 보존적인 region으로 알려져 있는 5.8S도 2개 염기서열이 다름을 확인하였다.</p> <p>본 연구 결과로 얻어진 F. velutipes 균주들 간의 계통수는 크게 2가지로 분류 할 수 있었다.</p> <p>첫 번째 그룹은 F. velutipes 4154, 4153, 4010, 4134, 4075, 4100, 4087, 4103, 4155, 4093 균주들이 속해 있었으며, 이 중 4153, 4134, 4103은 국내 균주, 4154, 4010, 4134, 4075, 4100, 4155, 4093은 일본 균주, 4087은 중국 균주임을 알 수 있었고, 두 번째 그룹은 4019, 4019-19, 4019-\(4 \times 19\), 4019-04, 4019-\(12 \times 20\), 4019-12, 4019-20, 4149, 4065으로 국내 균주 였으며, 필리핀이 원산지인 4115 균주가 이 그룹에 속해 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 계통수 분석결과, 국내 팽이 균주와 외래 균주간의 지리학적인 차이가 있음에도 불구하고 뚜렷한 차이는 찾을 수 없었다.</p> <p>그러나 본 연구는 국내 균주와 외래 균주 간의 ITS region의 염기서열 분석을 최초로 수행하였으며, 20가지의 팽이버섯의 균주들의 multiple alignment를 통하여 염기서열 차이를 확인 하였다. ITS region은 많은 곰팡이균 동정에 효과적임이 보고 되어왔으나, 종내 수준에서의 분류에는 유효하지 않음을 확인하였다. 따라서 추후 팽이버섯 균주들을 구별하기 위한 마커를 개발하기 위하여 분자유전학적 방법인 RAPD (Random amplified polymorphism), AFLP (Amplified frag-ment length polymorphic DNA), SSU rDNA, Histone 유전자 등을 통한 다양한 보완연구가 필요할 것으로 판단된다.</p>