본 논문에서는 식물재료 및 방사선 조사, RNA 분리와 SOD isoenzyme 유전자의 reverse tran-scription (RT)-PCR, Native-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)를 이용한 SOD isoenzyme 활성 분석, 단백질 정량, 엽록소와 카로테노이드 함량 측정에 대한 연구를 진행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>식물재료 및 방사선 조사</h2><p>본 연구의 공시재료로는 일품벼를 식물 배양기에서 14시간의 광주기(광세기 \( 330 \mu \mathrm{mol}^{-2} \mathrm{~s}^{-1} \) )와 \( 28 / 20^{\circ} \mathrm{C} \)(낮/밤)의 온도 주기를 가지면서 30일간 생육한 식물체를 이용하였다. 방사선 조사는 한국원자력연구소에서 보유중인 고준위 감마선 조사시설을 이용하여 \( 500 \mathrm{~Gy} \)수준으로 10분간 식물체에 직접 감마선을 조사하였다( \( { }^{60} \mathrm{Co} \), 약 \( 150 \mathrm{TBq} \)용량, Atomic Energy of Canada Limited사, Canada). 방사선 조사 후 6, 12, 24, 48, 72 \(\mathrm{h}\)에 끝부분을 \(3 \sim 5 \mathrm{cm}\)정도 제거한 신선한 잎을 채취하여 즉시 액체질소에서 얼린 후 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다.</p><h2>RNA 분리와 SOD isoenzyme 유전자의 reverse tran-scription (RT)-PCR</h2><p>RT-PCR 분석을 위해 사용한 RNA는 벼 잎을 액체질소에 마쇄한 뒤 \( 0.1 \mathrm{~g} \)씩 분주하여 Trizol (Invitrogen사, Carlsbad,CA, USA)을 사용해 추출하였다. cDNA 합성은 Accupower RT Premix (Bioneer사, Daejeon, Korea)에 RNA \( 1 \mu \mathrm{g} \)과 \( 0.5 \)\( \mu \mathrm{g} \)의 anchored oligo \( (\mathrm{dT})_{18} \mathrm{~V} \) primer (Bioneer사, Daejeon,Korea)을 넣고 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60분간 thermal cycler (TP600, Takara사, Shiga, Japan)를 이용해 반응시켰다. PCR 반응은 합성된 cDNA \( 3 \mu \mathrm{l}\), \(2 \times\) PCR premix \( 10 \mu \mathrm{l} \) (Perfect Premix ver 2.1, Takara Korea Biomedical사, Seoul, Korea), \( 10 \mathrm{pmol}\)로 희석 된 forward와 reverse primer 각각 \( 2 \mu \mathrm{l} \), 그리고 증류수 \( 3 \mu \mathrm{l} \)를 첨가한 후 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 predenaturation을 하였고, denaturation은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 45초, annealing은 \( 54^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60초 또는 \( 58^{\circ} \mathrm{C} \)에서 45초, polymerization은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 90초의 과정을 24 또는 30회 반복한 뒤 extension은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 수행하였다. 반응 후 PCR 증폭산물은 ethidium bromide EtBr로 염색된 \( 1 \% \) agarose 겔 상에서 확인하였다. PCR 반응에 사용된 각 isoenzyme에 특이적인 forward와 reverse primer들은 Table 1에 제시된 pCuZn-SOD와 Mn-SOD2를 제외하고는 Kim등이 기술한 것과 동일한 염기서열을 사용하였다.</p><h2>Native-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)를 이용한 SOD isoenzyme 활성 분석</h2><p>효소는 벼 잎 \( 0.1 \mathrm{~g} \)을 액체질소에 얼려 막자사발에서 마쇄한 후 Saruyama와 Tanida가 기술한 방법에 따라 \( 50\mathrm{mM}\) KPi buffer, \(1 \%\) Triton X-100, 그리고 \( 7 \mathrm{mM}\) \( \beta\)-mercaptoethanol로 구성된 extraction buffer로 추출하였다. 이 효소 추출액은 \( 30 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\) \((\mathrm{pH} 6.8)\),\( 25 \%\)\((\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) glycerol, \( 0.005 \%\)\((\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) bromophenol blue로 구성된 sample buffer와 동량으로 섞은 뒤 Beauchamp과 Fridovich의 방법에 따라 SOD 활성을 분석하기 위해 \( 10 \% \) non-denaturing gel 상에 load하고 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 끝난 후 gel은 \( 50 \mathrm{mM}\) KPi buffer (\(\mathrm{pH} 7.8)\), \( 2.8 \times 10^{-5} \mathrm{M}\) riboflavin, \( 0.028 \mathrm{M}\) N, N, N', N'-tetramethylethylenediamine (TEMED), \( 2.45 \times 10^{-3} \mathrm{M} \) nitroblue tetrazolim(NBT)을 포함하는 반응액에 3분간 염색한 후 light box 위에서 SOD band가 가장 선명해 질 때까지 빛을 주었다.</p><h2>단백질 정량</h2><p>벼 잎 \( 0.1 \mathrm{~g} \)을 액체질소에 얼려 막자사발에서 마쇄한 후 \( 50 \mathrm{mM} \) KPi buffer, \(1 \%\) Triton X-100, 그리고 \( 7 \mathrm{mM}\) \( \beta \) - mercaptoethanol로 구성된 extraction buffer로 단백질을 추출하였다. 전체 단백질 함량은 이 추출물을 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(10,000 \times g \)에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 따서 측정하였으며 Bradford의 방법에 기초한 Bio-Rad Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories사, USA)를 이용하였다.</p><h2>엽록소와 카로테노이드 함량 측정</h2><p>엽록소와 카로테노이드 함량은 Lichtenthaler 방법을 사용하여 측정하였다. 액체질소에 마쇄된 벼 잎 \( 0.1 \mathrm{~g} \)이 분주된 E-tube에 \( 100 \% \) 아세톤을 \( 1 \mathrm{ml} \) 넣은 후 암조건, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 한 시간 동안 흔들어 주면서 색소를 추출하였다. 엽록소와 카로테노이드 함량은 이 추출물을 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(10,000 \times g \)에서 원심분리하여 얻은 상층액의 661.6, 644.8 그리고 \( 470 \mathrm{~nm} \)에서의 흡광도 값을 이용해 다음과 같이 구하였다.</p><ul><li>엽록소 \( \mathrm{a}=11.24 \times \mathrm{A}_{661.6}-2.04 \times \mathrm{A}_{644.8} \)</li><li>엽록소 \( \mathrm{b}=21.13 \times \mathrm{A}_{644.8}-4.19 \times \mathrm{A}_{661.6} \)</li><li>엽록소 \( \mathrm{a}+\mathrm{b}=18.09 \times \mathrm{A}_{644.8}+7.05 \times \mathrm{A}_{661.6} \)</li><li>카로테노이드\( =\left(1000 \times \mathrm{A}_{470}-1.90 \times\right. \) 엽록소 \( \mathrm{a}-63.14 \times \) 엽록소 \(\mathrm{b}) / 214 \)</li></ul>