본 실험에서 Kilpatrick의 방법을 이용해서 lectin을 분리했고, 이를 Sephadex G-100이 들어있는 column을 이용해서 순수 분리했다. 이를 이용해서 적혈구 응집반응을 측정했고, lectin의 활성을 혈구 최종응집을 나타내는 희석 배수를 역수로 계산하여 측정했다. 또한 lectin 용액이 어떤 혈액에 특이적으로 반응하는지 혈액 응집반응에 따른 응집 여부를 통해 알아보았다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>식물재료</h2><p>대형 마트에서 구입한 가지 열매를 본 실험의 재료로 사용하였다.</p><h2>Lectin의 분리</h2><p>Kilpatrick의 방법을 일부 변형하여 lectin을 분리하였다. 껍질을 제거한 가지열매를 분쇄기에 넣고 분쇄한 후, \( 0.15 \mathrm{~M}\ \mathrm{NaCl} / 0.1 \mathrm{~M} \) sodium phosphate buffer를 넣어 밤새 교반하였다. 8겹의 거즈를 사용하여 여과한 용액을 \(1,000 \times g \)에서 원심분리를 하여 상등액를 얻었다. 이에 \(50\%\)의 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \)를 서서히 넣어 완전히 용해시켜 밤새 교반한 다음, \(40,000 \times g \)에서 1시간 원심분리 하고, 침전물을 소량의 neutral saline에 완전히 용해시켰다. 이 용액을 neutral saline으로 24시간 마다 교환하면서 48시간 투석하였다.</p><p>Neutral saline으로 평형화시킨 Sephadex G-100이 들어있는 column \( (1.5 \times 20 \mathrm{~cm}) \)에 투석된 용액을 주입한 후, neutral saline을 사용하여 \( 0.3 \mathrm{~ml/min} \)의 유속으로 유출시켜 \( 3 \mathrm{~ml} \)씩 분획하였다. \( 280 \mathrm{~nm} \)의 파장에서 측정된 흡광도가 0.03 이하로 될 때까지 분취하였다. 각 분획의 활성은 trypsin을 처리한 쥐의 혈액을 사용하여 적혈구 응집반응을 측정하였다. 활성이 가장 높은 분획을 생화학적 특성 연구에 사용하였다. 모든 과정은 단백질의 변성을 막기 위하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 수행하였다.</p><p>단백질 함량의 측정은 BSA를 표준물질로 하여 Bradford방법에 따라, microplate reader (Bio-Rad)를 사용하여 \( 595 \mathrm{~nm} \)의 단일파장에서 측정하여 계산하였다.</p><h2>적혈구 응집반응의 측정 및 lectin의 활성 측정</h2><p>적혈구 응집반응의 측정은 Takatsy의 방법을 변형하여 사용하였다. Microtiter plate의 각각의 well에 neutral saline과 분리한 lectin 용액을 넣어 2배 연속 희석법으로 희석하였다. Trypsin을 처리한 쥐의 혈액을 가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시킨 후, 응집 여부를 확인하였다. 쥐의 혈액은 neutral saline에 \(0.25\%\) trypsin을 가하여 활성화 시킨 2% 적혈구 부유액율 사용하였다.</p><p>적혈구 응집반응은 육안으로 선행 확인한 다음, 현미경을 사용하여 최종적으로 확인하였다. Lectin의 활성은 혈구 최종응집을 나타내는 희석 배수를 역수로 계산하여 나타내었다.</p><h2>혈액의 특이성 측정</h2><p>Trypsin 미처리구와 trypsin을 처리한 사람의 ABO 혈액, 쥐 및 토끼의 혈액을 neutral saline으로 세척한 후, \(2\%\) 적혈구 부유액을 만든 다음, 이들을 분리한 lectin 용액과 반응시켜 적혈구 응집 여부를 확인함으로서 어떤 혈액에 특이적으로 반응하는지와 혈액 응집반응에 따른 응집 여부를 조사하였다.</p>