실험에 사용된 시료는 남해섬 흑마늘 액기스로 농축한 것이고, 실험에 사용된 마우스 비장세포는 생후 6~8주령, 체중 \( 25 \mathrm{~g} \) 내외의 C57BL/6 마우스였다. 동일 실험을 3회 반복하여 실시한 결과 실험성적은 평균\(\pm\)표준편차로 나타났고, 각 군의 통계학적 검정에는 Student's t-test를 사용함으로써 P값이 \( 0.05 \) 보다 작은 범위에서 통계적 유의성을 검토하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <p>흑마늘 추출물의 제조는 남해섬 흑마늘 액기스(농업회사법인 남해섬흑마늘, 한국)를 구입하여 Rotary Evaporator (Buchi Labortechnik, Flawil, Swiss) 로 농축하여 시료로 사용하였다. 마우스 비장세포는 생후 6~8주령, 체중 \( 25 \mathrm{~g} \) 내외의 C57BL/6 마우스를 대한바이오링크(음성군, 충청북도)로부터 구입하여 실험에 사용하였다. 마우스 비장세포를 얻기 위하여 마우스를 \( \mathrm{CO}_{2} \) gas처리하여 희생시켜 비장을 무균적으로 적출하여 유출된 비장세포는 \( 10 \% \) fetal bovine serum를 함유하고 있는 RPMI 1640 (Gibco BRL., Grand Island, NY, USA)에 세포의 농도가 \( 2 \times 10^{5} cells/ml\)이 되도록 현탁하여 24 wells tissue cul-ture plate (Costar, Cambridge, MA. USA)에 각각 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 분주하였다. 준비된 세포배지에 lipopolysaccharide (LPS)는 Escherichia coli (serotype 026:B6)에서 분리정제 된 제품(Sigma-Aldrich Corp., USA)과 흑마늘 추출물을 최종농도가 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 과 \( 2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 가 되게 각각 처리하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \)배양기에서 6, 24, 48, 72시간 배양 하였다. 이 때 흑마늘 추출 물 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 에서 비장세포의 세포독성은 없었으므로 이 농도를 처리농도로 하였다. 배양한 배양액은 \( 300 \times g \) 에서 10분간 원심분리한 후 그 상층액을 취하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하여 사용하였다</p> <p>마우스 복강 대식세포부터 분비되는 마우스 cytokine 의 측정은 ELISA MAXTM Deluxe set kit (BioLegend, San Diego, (CA,USA)를 사용하여 cytokine IL-2, 4, 6, 10, TNF-a, IFN- \( \gamma \)를 각각 측정하였다. 측정은 96 wells microplate에 마우스 cy-tokine IL-2, 4, 6, 10, TNF-a, IFN- \( \gamma \) 의 capture 항체를 coating buffer에 희석하여 \( 100 \mu 1 \) 를 분주하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 16-18시간 방치하였다. capture 항체를 코팅한 plate는 Washing buffer (1 M Phosphate buffer containing \( 0.5 \% \) Tween 40)으로 4회 wash-ing한 후 assay diluent \( 200 \mu 1 \) 를 분주하여 실온에서 1시간 shaking하였으며, 다시 washing buffer으로 세척한 후 세포배양 상등액을 \( 100 \mu 1 \) 분주하여 2시간 동안 반응하였다. 반응 후 washing buffer으로 세척하여 detection 항체를 \( 100 \mu 1 \) 분주하여 1시간 동안 반응하였으며, 다시 washing buffer으로 세척 후 avidine-horseradish peroxidase를 \( 100 \mu 1 \) 분주하여 30분간 반응하였다. 반응한 plate를 washing buffer으로 세척하여 tetramethylbenzidine액을 넣은 후 20분간 정치하여 반응한 후 stop solution \( \left(0.5 \% \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4}\right) \) 을 분주하여 반응을 정지시켰으며, optical density는 microplate reader (Bio-Rad, Richmond, VA, USA)를 이용하여 \( 450 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다.</p> <p>측정 결과 분석은 동일 실험을 3회 반복하여 실시하였으며 실험성적은 평균±표준편차로 나타내었고 각 군의 통계학적 검정에는 Student's t-test를 사용하여 P값이 \( 0.05 \) 미만 수준에서 통계적 유의성을 검토하였다.</p>