본 연구에서는 간세포의 LPO 형성, 세포 손상, 그리고 단백질의 thiol group을 측정하였다. 각각의 측정은 malondealdehyde의 양, LDH 활성, 그리고 Ellman 시약을 이용하여 이루어졌다. 이들의 결과는 각각 spectroflurometry, LDH assay kit, 그리고 glutathione을 표준으로 한 수치를 사용하여 표현하였다. 이들 측정 과정을 위해 세포를 수확하고 원심분리 후 PBS로 세척하였으며, 측정된 수치는 각각 \( \mathrm { nmol } / \mathrm { mg } \)protein, Wroblewski 단위, 그리고 nmole로 표시하였다.
<h2>Lipid peroxide formation</h2> <p>간세포에서 LPO 형성은 Ohkawa 등의 방법에 따라 malondealdehyde의 양으로 측정하였으며, 간략히 요약하면 다음과 같다. 세포들을 수확한 후 초음파로 세포를 분쇄한 후, 반응용액 [8 \% SDS \( 100 \mu \mathrm { l } , 0.8 \% \) 2-thiobarbituric acid (TBA) \( 200 \mu \mathrm { l } , 20 \% \) acetic acid \( 200 \mu \mathrm { l } ] \)을 넣은 후 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 60분간 반응시켰다. 이후, 얼음으로 차게한 물에 식힌 후, 비특이적인 적색 색소를 제거하기 위하여 n-butanol-pyridine 혼합액 \( (15: 1, \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \)을 첨가한 후 \( 4,000 \times g \)에서 10분간 원심분리하여 상충액을 수합하였다. 이 시료를 spectroflurometry (emission 파장 \( 553 \mathrm { ~nm } \), excitation 파장 \( 515 \mathrm { ~nm } \) )로 측정하여 \( \mathrm { nmol } / \mathrm { mg } \)protein으로 표시하였다.</p> <h2>Lactate dehydrogenase (LDH) 측정</h2> <p>세포 손상은 LDH 활성으로 측정하였다. 배지에서의 LDH 활성은 LDH assay kit를 이용하여 측정하였으며, LDH활성은 Wroblewski 단위로 표시하였다.</p> <h2>Glutathione (GSH)의 측정</h2> <p>단백질의 thiol group은 Albano 등의 방법에 의거 Ellman 시약을 이용하여 측정하였다. 세포를 수확한 후에 원심분리를 한 후 PBS로 세척하였다. 세포 pellet은 \(5 \% \) trichloracetic acid 및 \( 5 \mathrm { mM } \)의 EDTA가 들어 있는 용액으로 처리하여 단백질을 침전시켰다. 이 후 같은 용액으로 두 번 세척하였다. 침전된 단백질은 \( 5 \mathrm { mM } \) EDTA 및 \( 0.5 \% \mathrm { SDS } \)가 함유되어 있는 \( 0.1 \mathrm { M } \) Tris- \( \mathrm { HCl } \) 완충액으로 다시 녹였다. 이 후 이 용액을 Ellman 시약과 반응시켰다. 수치는 glutathione을 표준으로 잡아서 SH 당량을 nmole로 표시하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>실험결과의 통계적 처리는 Student's t-test 및 Analysis of Variance (ANOVA)로 하였으며, \( P \)-value \(<0.05 \)를 유의한 차이의 한계로 하였고, 실험결과의 표현은 means \( \pm \mathrm { SE } \)로 하였다.</p>