Millipore filter로 여과하여 \(5 \mathrm{ml}\)을 주입하고, \(1 \mathrm{ml}/\mathrm{min}\)의 유속으로 \(75 \mathrm{ml}\)의 \(0 \)에서 \( 1 \mathrm { M } \) 까지의 \( \mathrm { NaCl } -10 \mathrm { mM } \) HEPES-NaOH (pH 7.5)완충용액을 홀려주면서 linear gradient elution을 실시하였다. Silica-type SEC(size-exclusion chromatography)를 이용하여 TSK-G3000sw xL col-umn에 \(200 \mu\)l로 농축하고, Laemmli 방법에 따라 \(12 \%\) sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide 전기영동장치를 사용하여 망간산화 단백질의 분자량을 확인하였다.
<p>millipore filter로 여과하여 \( 5 \mathrm { ml } \) 을 주입하였다. 그리고 유속을 \( 1 \mathrm { ml } / \mathrm { min } \).로 하여 \(75 \) 분 동안 \( 75 \mathrm { ml } \) 의 \(0 \)에서 \( 1 \mathrm { M } \) 까지의 \( \mathrm { NaCl } -10 \mathrm { mM } \) HEPES-NaOH (pH 7.5)완충용액을 홀려주면서 linear gradient elution을 실시하였다. 단백질의 용출은 \( 280 \mathrm { ~nm } \) 에서 홉광도로 측정하였으며 각 분획마다 망간산화 단백질의 활성을 측정하여 활성을 갖는 분흭을 모두 모아서 cenrifugal filter 장치를 이용허여 \( 200 \mu \) l로 농축 후 다음 단계에 사용하였다.</p> <h2>Gel Filtration Chromatography</h2> <p>Silica-type SEC (size-exclusion chromatography)으로 충진된 TSK-G3000sw xL (TOSOH BIOSIENCE LLC, USA) col-umn \( (7.8 \mathrm { ~mm } \) I.D. \( \times 30 \mathrm { ~cm } ) \) 을 FPLC에 장착하여 \( 10 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { HEPES } - \mathrm { NaOH } ( \mathrm { pH } \) 7.5) 완충용액으로 평형화한 후, \( \mathrm { HiTrap } \) Q FF column에서 얻은 시료를 \( 200 \mu \) 를 주입하였다. 유속은 \( 0.5 \mathrm { ml } / \mathrm { min } \) 로 \( 48.5 \) 분간 총 \( 23.5 \mathrm { ml } \) 의 완충액을 홀려주었고, 각 분획마다 망간 산화 단백질의 활성율 측정하였다.</p> <h2>SDS-PAGE 전기영동</h2> <p>망간산화 단백질의 분자량은 Laemmli 방법에 따라 \( 12 \% \) sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide 전기영동장치(PROTEIN II xi cell, Bio-Rad, USA)를 이용하여 확인하였고, 이때 표준 단백질로는 BioRad사의 Precision Plus Protein \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) Standard (10 to \( \left .250 \mathrm { KDa } \right ) \) 를 사용하였다. 각 실험중의 단백질 정량은 Bradford 분석법을 이용하였으며, 표준 용액으로는 bovine serum albumin (BSA)를 사용하였다.</p> <h2>단백질 서열분석</h2> <p>망간 산화능이 있는 단백질만을 얻기 위해 FPLC를 통해 정제한 시료를 12 \% SDS-PAGE에 전기영동한 후, 망간이 \(500 \) \( \mu \mathrm { M } \) 첨가된 \( 10 \mathrm { mM } \mathrm { HEPES } - \mathrm { NaOH } ( \mathrm { pH } 7.5) \) 완충액에서 갈색으로 변하는 활성 밴드가 나타날 때 까지 염색을 하였다. 활성 밴드에서 단쌕질을 추출하기 위해 활성 밴드만을 순쇄하여 완충액 \( (10 \mathrm { mM } \mathrm { HEPES } - \mathrm { NaOH } , \mathrm { pH } 7.5) \) 에서 현탁시켜 \( 12 \% \) \( \mathrm { SD } - \mathrm { PAGE } \) 에 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 gel은 trans-fer buffer ( \( 20 \mathrm { mM } \) Tris-base, \( 192 \mathrm { mM } \) glycine, 20 \% meth-anol)를 사용하여, polyvinylidene difluoride (PVDF) 막으로 Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell (BioRad, USA)-을 이용하여 transfer(25 V, \( 30 \mathrm { ~min } ) \) 하였다. Transfer가 끝난 PVDF membrane으로부터 단백질 밴드를 잘라 상온에서 세척 및 건조한 후 액체 크로마토그래푀 전기분무이온화 탄뎀질량분석기(ESI-MS/MS, QTOF2 Micromass, Micromass)를 이용하여 단백 실의 내부서열을 확인하였고, \( \mathrm { N } \)-말단 단백질 서열분석기(Perkin 491A, Perkin-Elmer, USA) 를 이용하여 단백질의 \( \mathrm { N } \)-말단의 서열을 분석하였다.</p>