PTGV real-time PCR 검출 방법의 신뢰성을 보장하기 위해, 이 방법의 특이성, 검출 한계 및 완건성을 검증하였다. 추가적으로, 이 방법이 생물의약품 제조 공정 검증에 적용될 수 있는지를 평가하기 위해, 인위적으로 PTGV로 오염된 CHO-K1 세포주를 사용하여 PTGV 검출 시험을 수행하였다. 그리고, 세포 배양액 내부에 PTGV가 존재하는지는 real-time PCR을 사용해서 확인했다.
<h2>Real-time PCR의 신뢰성 검증</h2> <p>확립된 PTGV real-time PCR 검출시험법의 신뢰성 (reliability)을 보증하기 위해 확립된 실험법의 특이성 (specificity), 검출한계(detection limit), 완건성(robustness)을 검증하였다. Real-time PCR 검증은 식품의약품안전처의 '핵산증폭검사법 검증 가이드라인'에 따라 실시하였다.</p> <p>특이성 검증을 위해 Bovine herpesvirus type 1 (BHV, ATCC VR-188), Bovine viral diarrhea virus (BVDV, ATCC VR-534), Bovine parainfluenza 3 virus (BPIV-3, ATCC VR-281), Hepatitis A virus (HAV, ATCC VR-1402), Mimute virus of mice (MVM, ATCC VR-1346), Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV, KVCC-VR0000188), Porcine parvovirus (PPV, ATCC VR-742), Porcine rotavirus (PRoV, KVCC-VR0000176), Pseudorabies virus (PRV, ATCC VR-00129), Reovirus 3 (Reo-3, ATCC VR-824)에 대한 cross-reactivity를 측정하였다. 시험에 사용한 바이러스의 titer는 각각 \( 7.76 \times 10^{8} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml}, 7.44 \times 10^{8} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \), \( 6.07 \times 10^{7} \operatorname{TCID}_{50} / \mathrm{ml}, \quad 7.44 \times 10^{8} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml}, \quad 7.34 \times 10^{8} \) \( \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml}, 8.08 \times 10^{8} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml}, 8.08 \times 10^{8} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \), \( 1.33 \times 10^{9} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml}, \quad 5.33 \times 10^{6} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml}, \quad 6.60 \times 10^{7} \) \( \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \) 이었다. 음성 대조군으로는 phosphate buffered saline (PBS)을 사용하였다.</p> <p>검출한계 값 검증을 위해 Titer가 \( 1.10 \times 10^{4} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \)인 PTGV를 10배씩 순차적으로 \( 1.10 \times 10^{0} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \)까지 희석한 샘플을 독립적으로 준비하여 각 희석 배수 당 8회에 걸쳐 총 24회 검출시험을 실시하였다. 총 24회 시험 중 23회 이상 양성 값이 나온 농도를 검출한계로 결정하였다. 각 시험 결과를 토대로 정량을 위한 표준곡선을 작성하고 PTGV \( \log \) titer \( \left(\log _{10} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} ; \mathrm{x}\right) \) 에 대한 Ct 값 \( (\mathrm{y}) \) 간의 표준 회귀식과 결정계수를 구하였다. 결정계수 값이 \( 0.99 \) 이상인 경우 직선성이 있다고 판단하였다.</p> <p>제조사를 달리한 primer에 따른 real-time PCR 방법의 완건성을 검증하기 위해 PTGV를 \( 1.10 \times 10^{4} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \)부터 \( 1.10 \times 10^{0} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \)까지 10배씩 순차적으로 희석한 후 3곳의 primer 제조회사가 제조한 primer로 3회의 real-time PCR을 실시한 후 평균 Ct 값을 비교하였다. \( \mathrm{MgCl}_{2} \)의 농도에 따른 real-time PCR 시험법의 완건성 검증을 검증하기 위해 PTGV를 \( 1.10 \times 10^{4} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \)부터 \( 1.10 \times 10^{0} \mathrm{TCID}_{50} / \) \( \mathrm{ml} \)까지 10배씩 순차적으로 희석한 후 \( \mathrm{MgCl}_{2} \)의 농도를 \( 3 \mathrm{mM} \), \( 4 \mathrm{mM}, 5 \mathrm{mM} \)로 변화시켜서 3회의 real-time PCR을 실시한 후 평균 Ct 값을 비교하였다.</p> <h2>CHO 세포주에서 real-time PCR을 이용한 PTGV 검출</h2> <p>확립된 real-time PCR을 생물의약품 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 PTGV를 오염시킨 CHO-K1 (ATCC CCL-61) 세포주에서 PTGV 검출 시험을 실시하였다. CHO-K1 세포를 \( 10 \% \) 우혈청을 첨가한 Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI-1640; Gibco BRL, USA) 배지에 1X Antibiotic Antimycotic Solution (Hyclone, USA)을 첨가하여 배양하였다. T-25 flask에 배양된 CHO-K1에 PTGV를 감염시킨 후 2일 동안 배양하였다. 세포 배양액을 제거한 후 세포 배양액에 남아있을 수 있는 PTGV를 완벽히 제거하기 위해 phosphate buffered saline으로 2번 세척한 다음 CHO-K1를 2회 계대 배양하였다. 각 계대 배양 시 현미경으로 CHO-K1의 모양을 관찰한 후 세포가 포함된 세포 배양액를 수거하였다. 확립된 real-time PCR 방법을 이용하여 세포 배양액에 PTGV가 존재하는지 여부를 확인하였다. Real-time PCR 양성 대조군으로는 titer가 \( 1.10 \times 10^{2} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml}\)인 PTGV를 사용하였으며, 음성 대조군으로는 비 감염된 CHO 세포주 배양액을 사용하였다.</p>