EMCP에 의한 apoptosis 유발이 ROS 생성 의존적이며, 생성 증가도 깊이 관여되어 있고 산화적 스트레스에 대응하기 위한 \( \mathrm{HO}-1 \) 의 발현은 pNrf2의 핵으로의 이동에 의해 조절된다.
<h2>EMCP 처리에 의한 ROS 생성의 증가</h2> <p>EMCP의 처리에 의한 U937 세포의 apoptosis 유발에 ROS 생성과 연관성의 여부를 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{DCFDA} \) probe를 이용하여 유세포 분석기로 조사하였다. \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{DCFDA} \) 는 형광 염색시약으로 세포 내의 esterase에 의해 \( \mathrm{DCFH} \) 로 가수분해되는데, DCFH 는 ROS 가 존재하는 경우DCF 로 산화되어 형광을 나타내므로 ROS의 생성량은 DCF 의 발현량에 상응하는 것으로 생각할 수 있다. Fig. 4A에서 나타낸 바와 같이 ROS 생성은 EMCP 처리 후 30 분부터 증가하여 6 시간 후에는 약 10 배 이상 증가되었으며, 이러한 ROS 생성의 증가가 ROS scavenger인 NAC의 전처리에 의하여 완벽하게 억제되었다. 따라서 EMCP 처리에 의한 ROS 생성이 apoptosis 유발에 직접적으로 관여하는지를 조사한 결과, Fig. \( 5 \mathrm{~A} \) 에서 알 수 있듯이 EMCP 가 처리된 세포에서 NAC의 전처리에 의하여 Sub-G1에 해당되는 세포의 빈도가 유의적으로 감소되었으며, caspase-3의 표적 단백질인 PARP의 단편화 감소 및 pro-apoptotic 단백질인 Bax의 발현 저하가 뚜렷하게 나타났다. 이상의 결과는 EMCP에 의한 apoptosis 유발이 ROS 생성 의존적임을 보여주는 것이다.</p> <h2>EMCP 처리에 의한 HO-1 및 \( \mathrm{Nrf2} \) 의 발현과 ROS 생성과의 연관성</h2> <p>HO 는 세포내의 heme의 양을 적절히 유지하도록 하는 중요한 효소로 3 가지의 동형단백질로 존재한다. 대부분의 세포에서 기본적인 대사활동에 관여하는 \( \mathrm{HO}-2 \) 및 \( \mathrm{HO}-3 \) 와는 다르게, \( \mathrm{HO}-1 \) 은 산화적 스트레스, 지질다당류, 멜라토닌 및 아데노 신과 같은 다양한 자극에 의해 유도되는 형태이다.</p> <p>\( \mathrm{HO}-1 \) 은 산화적 손상 억제, 염증 반응 감소 및 세포 증식 조절을 통해 조직의 항상성 유지에 주용한 역할을 수행한다. 따라서 EMCP에 의한 U937 세포의 apoptosis 유발에서 HO-1의 역할을 조사하기 위하여 \( \mathrm{HO}-1 \) 의 발현 정도를 Western blot 분석법으로 조사하였다. 그 결과 EMCP 가 처리한 세포에서 현저히 증가되었던 \( \mathrm{HO}-1 \) 의 발현은 NAC 의 전처리에 의해 EMCP 를 처리하지 않은 대조군과 비슷한 수준으로 감소되었다. 또한 \( \mathrm{HO}-1 \) 의 발현을 조절하는 전사인자인 \( \mathrm{Nrf2} \) 의 세포길에서 핵으로의 이동을 조사한 결과, 인산화되어 핵으로 이동하였던 \( \mathrm{Nrf2} \) 가 전처리한 NAC 에 의해 이동이 억제되었다. 이상의 결과는 EMCP에 의한 apoptosis 유발에는 ROS의 생성 증가가 깊이 관여되어 있으며, 이러한 산화적 스트레스에 대응하기 위한 \( \mathrm{HO}-1 \) 의 발현이 pNrf2의 핵으로의 이동에 의해 조절 받고 있음을 보여 주는 것이다.</p>