본 연구에서는 전세포 생물촉매 시스템의 장점, 즉 세포투과 과정이 불필요하여 효소 불활성화 방지, cytoplasm 내 경쟁적 부반응으로 인한 생산성 저하 문제 회피, 세포막 물질수송 문제 회피, 효소의 재사용 가능성 등을 활용하여 Aga2 단백질의 C 말단에 P. macerans 유래 CFTase를 subcloning하였다. 이를 통해, 효모 S. cerevisiae의 세포표면에 CFTase 효소가 고정부착된 새로운 생체촉매제를 제작하였으며, 이를 통해 CF를 생산하였다. 이 결과, 유용 산업효소를 S. cerevisiae 세포표면에 발현하는 표면 발현 시스템을 성공적으로 구축하였다.
<h1>서 론</h1><p>Cycloinulooligosaccharide fructanotransferase (CFTase)는 inulin을 이용하여 분자내 당전이 반응에 의해 주로 fructose 분자 \(6 \sim 8\)개가 \( \beta-(2 \rightarrow 1) \) 결합으로 연결된 비환원성의 cycloinulohexaose (CF6), cycloinuloheptaose (CF7), 그리고 cycloinulooctaose (CF8)을 생산하는 효소이다. CFTase의 효소적 특성은 inulin과 같은 fructan 기질에 작용하여 CF를 합성하는 분자내 당전이 반응인 cyclization 반응과 \( \beta-(2 \rightarrow 1) \) fructooligosaccharide 사이의 당전이 반응인 coupling 반응, disproportionation 반응 또는 hydrolyzing 반응을 매개하는 다기능 효소(multifunctional enzyme)이다.</p><p>CFs의 구조는 bowl-shape 구조로 되어있고, 외부는 hydroxyl group이 친수성을 나타내며, 내부는 에테르 결합으로 인하여 소수성을 띄고 있다. 즉 CFs는 cyclodextrin과 물리적, 화학적으로 유사한 구조로 되어 있다. CF6은 crystal 구조 분석에서 18-crown-6-skeleton 구조로 밝혀졌으며, 또한 금속 양이온과 복합체를 형성한다. CFs의 물리적, 화학적 특성은 식품, 의약, 농업, 화학공업 등의 여러 분야에서 응용될 수 있다. CFs는 여러 물질의 동결, 해동에 안정적 효과를 나타내기 때문에 빵 제조에서 밀가루 반죽이나, 화장품 또는 의약분야에서 liposome 등에 사용 되어질 수 있을 뿐만 아니라 산업적으로 널리 이용될 수 있을 것으로 기대된다.</p><p>한편, 최근 연구가 활발히 진행중인 유용단백질의 표면발현 시스템은 비교적 최근에 발달한 유전공학 기술로서 자연적으로 미생물의 표면에 존재하는 단백질 유전자에 외래 유전자를 연결하여 발현함으로써 외래단백질을 세포의 표면에 부착시키는 방법이다. 세포 표면은 내부와 외부사이의 상호 작용으로 인해 기능을 하게되는데 어떤 표면 단백질들은 plasma membrane을 지나서 기능을 하며, 또 다른 것들은 공유결합이나 비공유결합에 의한 세포표면 구성요소에 의해 결합한다. 이러한 표면발현기술은 초기에는 미생물의 표면에 다양한 항원성 또는 항체성의 polypeptide를 노출시켜 항원 항체의 스크리닝에 목적을 두고 개발되었으며 각종 peptide 항원 library의 제조, 다양한 생백신(live vaccine)의 제조에 이용되고 있다. 뿐만 아니라 세포표면에 다양한 생리활성효소나 금속이온 결합단백질의 고정화를 통하여 고부가가치의 물질생산을 위한 전세포 생물촉매(whole cell biocatalyst)의 개발 등 그 이용성이 매우 다양하다. 이러한 산업효소를 미생물의 표면에 발현한 전세포 생물촉매 시스템 경우의 장점은 다음과 같다. 첫째, 전통적 전세포 촉매제의 사용에서 기질과 생산물의 세포막 수송의 장벽을 제거하기 위하여 사용해야 했던 세포투과공정이 필요 없고, 이에 의하여 야기되었던 효소의 불활성화를 방지할 수 있다. 둘째, 전세포 촉매제의 경우 cytoplasm 내에서 반응하므로 발생되었던 경쟁적 부반응에 의한 생산성 저하의 문제를 피할 수 있다. 셋째, 세포외에서의 반응으로 반응물과 생산물의 세포막 통과의 물질수송 문제를 피할 수 있다. 넷째, 표면발현은 세포표면에 고정으로 반응 후 반응액으로부터 사용한 생체촉매제의 재사용이 가능하다.</p><p>표면발현에 대한 연구는 bacteriophage나 원핵세포인 대장균 및 그람양성 세균 등에서 다양한 표면단백질을 매개로 이용하는 기술이 개발되었으며 산업적으로 응용성을 넓혀나가고 있는 추세이다. 그러나 bacteriophage의 경우 고밀도 표면 발현이 가능한 경우는 약 \( 50 \sim 60 \) amino acid로서 display할 수 있는 단백질의 크기에 한계가 있으며 대장균이나 그람양성세균의 경우에는 효소와 같은 분자량이 큰 단백질을 display할 수 있으나 표면발현의 밀도가 매우 낮은 문제점 등이 단점으로 지적되고 있다. 뿐만 아니라 식품이나 인체를 대상으로 하는 의약품 생산을 위한 효소반응의 경우 인체에 대한 안전성 문제도 심각하게 대두되고 있다. 따라서 최근에는 이러한 원핵세포를 이용한 표면발현의 단점을 보완할 수 있는 새로운 표면발현 시스템으로서 진핵세포인 효모 S. cerevisiae 를 이용하려는 시도가 활발히 진행되고 있다. 제빵효모 S. cerevisiae는 GRAS (generally recognized as safe)이며 진핵세포로서 고등생물과 유사한 유전자 구조 및 당쇄부과 (glycosylation)를 포함하는 번역 후 단백질 수식 (post-translational modification) 과정을 가지기 때문에 고등세포 유래의 단백질을 활성상태로 발현할 수 있다. 그리고 표면발현시의 단백질의 표면밀도의 측면에서도 효모에서 현재 알려진 agglutinin의 경우 효모세포 1 개당 \( 10^{4}-10^{5} \)으로서 원핵세포 시스템에 비하여 매우 높다는 장점을 가지고 있다. 본 연구에 사용된 단백질은 효모세포벽에 N말단이 공유결합된 형태로 존재하는 \(\alpha\)-agglutinin을 사용하였다. 이 단백질은 Aga1과 Aga2의 소단위체로 구성되어 있으며 Aga1 단백질이 \(\beta\)-glucan 결합으로 세포벽에 고정되고 69개의 amino acid로 이루어진 Aga2가 disulfide 결합을 하고 있다.</p><p>따라서, 본 연구에서는 Aga2 단백질의 C 말단에 P. macerans 유래 CFTase를 유전적으로 subcloning하여 효모 S. cerevisiae의 세포표면에 CFTase 효소가 고정부착된 새로운 생체촉매제로부터 CF를 생산함으로서, 유용 산업효소를 S. cerevisiae 세포표면에 발현하는 표면 발현 시스템을 구축하고자 한다.</p>