본 절에서는 LDH의 면역화학적 분석 방법을 소개한다. Western blotting은 LDH를 polyacrylamide gel 전기영동 후 semidry blotting system과 nitrocellulose membrane를 사용하여 진행되었으며, 항체 특이성 분석에서는 각 동물의 LDH 관련인자에 항혈청을 가해 원심분리 및 전기영동을 거쳐 Catfish와의 동위효소 확인을 진행하였다. 한편 ADH, NDH 분석에는 전기영동과 염색과정을 수행하였으며, LDH의 기질의존성은 기질농도를 달리하며 측정하였다.
<h2>면역화학적 분석</h2><h3>Western blotting</h3><p>LDH를 polyacrylamide gel 전기영동한 후 gel상의 단백질을 semidry blotting system (Trans-blot SD, Bio-rad)에서 \( 15 \mathrm{mM} \) Tris-glycine buffer ( \( \mathrm{pH} 8.3)\)를 사용하여 \( 25 \mathrm{~V} \)에서 30분 동안 nitrocellulose membrane에 transfer시켰다. Membrane을 \(3\%\) BSA/TBS (\(0.01\mathrm{M}\) Tris buffered saline, \( \mathrm{pH} 7.5) \) 용액에 넣고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 동안 blocking시킨 후 TBS용액에서 10분간씩 3회 세척하였다. \( 0.5 \%\) BSA/TBS를 사용하여 anti-LDH \(\mathrm{A}_{4}\)는 1:1,000, 나머지 항체는 1:500으로 희석한 1차 항체용액에 membrane을 넣고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 shaking 시킨 후 TBS용액으로 10분간씩 2회 세척하여 membrane에 결합하지 않은 1차 항체를 씻어주었다. 실험에 사용된 1차 항체는 anti-LDH \( \mathrm{A}_{4}\), \(\mathrm{B}_{4}\), liver-specific \( \mathrm{C}_{4}\) 및 eye- specific \( \mathrm{C}_{4}\) 혈청을 사용하였다. Anti-rabbit IgG (2차항체)를 \( 0.5 \%\) BSA/TBS를 사용하여 1:1,500으로 희석시킨 용액에 membrane을 넣고 1시간 동안 shaking시킨 후 항원과 결합하지 않은 2차 항체를 TBS용액으로 10분간씩 3회 세척하였다. Chloronaphtol 및 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)의 혼합액으로 반응시킨 후 증류수로 세척하여 반응을 정지시킨 다음 관련정도를 확인하였다.</p><h3>항체 특이성</h3><p>Catfish (H. plecostomus) 조직의 동위효소를 확인하기 위하여 눈조직에 대해 소 심장 \( \mathrm{LDH} \mathrm{~B}_{4} \), 생쥐 신장 \( \mathrm{LDH} \mathrm{~B} \), 대구 간 \( \mathrm{LDH} \mathrm{~C}_{4} \) 및 조피볼낙 눈 \( \mathrm{LDH} \mathrm{~C}_{4} \)에 대한 항혈청을 각각 가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 분, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 방치시킨 다음 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), \( 20,000 \mathrm{~g} \)에서 원심분리 하였으며 상등액을 전기영동 하였다.</p><h2>Alcohol dehydrogenase (ADH) 및 nothing dehy-drogenase (NDH) 분석</h2><p>전기영동 후 \( \mathrm{ADH}^{2} \mathrm{NAD}^{\dagger} \), ethanol, PMS, NBT의 혼합물을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 염색하였으며, NDH 반응은 기질을 사용하지 않고 \( \mathrm{NAD}^{+}\), PMS, NBT의 혼합물을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 염색하였다. 염색된 gel은 \( 15 \% \) acetic acid로 고정하였다.</p><h2>LDH의 기질의존성 측정</h2><p>각 조직별 LDH의 활성이 기질농도에 의해 저해되는 정도를 알아보기 위해 catfish 두 종의 골격근, 심장, 신장, 간, 눈 및 뇌조직 LDH를 각각 피루브산 농도 \( 100 \mu \mathrm{M} \)에서 \( 10 \mathrm{mM} \)까지 증가시키면서 활성의 변화를 측정하였다.</p>