RT product, RNA 자체 및 증류수를 사용햐 음성 대조군으로 감염시키지 않은 세포, 증류수를 대상으로 ethidium bromide 염색하여 관찰하였다. 웰슬라이드 챔버의 배양액을 인산완충용액을 이용, 세척 후 형광염색키트로 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다. RT-PCR 방법을 사용하여 크립토스포리디움 난포낭의 생사판별에 유용함을 조사하여 열처리한 난포낭과 열처리하지 않은 난포낭 모두 \( 1 \times 10 ^ { 0 } \) 세포수까지 \( 361 \mathrm { bp } \)의 밴드를 생성하였다. 그러나 열처리하여 사멸시킨 난포낭에서는 밴드가 형성되지 않았고, 열처리한 난포낭의 경우 RT-PCR 산물의 양이 더 많아 민감도를 높이기 위해 열처리과정이 필요함을 알 수 있었다.
<p>음성 대조군으로 감염시키지 않은 세포, 증류수를 대상으로 한 RT product, RNA 자체 및 증류수를 사용하였으며, PCR mixture는 \( 2.5 \mathrm { U } \) of AmpliTaq, \( 1 \times \mathrm { } \) PCR buffer, \( 0.25 \mu \mathrm { M } \) each forward and reverse primer, \( 2.5 \mathrm { mM } \mathrm { } \)MgCl, and 200 \( \mu \mathrm { M } \mathrm { dNTP } \) 를 섞어 \( 50 \mu \mathrm { L } \) 용량에서 실시하였다. 증폭된 산물을 agarose gel에 전기영동하여 ethidium bromide 염색하여 관찰하였다.</p> <h2>면역형광염색</h2> <p>웰슬라이드 챔버의 배양액을 파스퇴르 피펫으로 제거하고 인산완충용액을 이용, 세척 후 고순도 메탄올 챔버의 각 웰 에 약 \( 100 \mu \mathrm { L } \)정도 주입하여 10분간 고정시켰다. 메탄올을 제거 후, 다시 인산완충용액으로 웰을 세척하였다. 크립토스포리디움 세포분화과정중에 형성되는 merozoite 및 sporozoite 등에 대한 항체와 형광염색시약이 결합된 형광염색키트 (sporoglo×20, A600FLR, waterborne 사)로 1시간 정도 염색 후, 형광현미경으로 관찰하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <p>크립토스포리디움 난포낭에 열처리(heat induction)과정이 RT-PCR 민감도에 미치는 영향을 조사하기 위해 열처리한 난포낭, 열처리하지 않은 난포낭 및 열처리하여 사멸시킨 난포낭을 단계별로 희석하여 mRNA를 추출한 후, HSP70 유전자에 대한 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 열처리한 난포낭 및 열처리하지 않은 난포낭 모두 \( 1 \times 10 ^ { 0 } \) 세포수까지 \( 361 \mathrm { bp } \)의 밴드를 생성하는 것을 확인하였으나, 열처리하여 사멸 시킨 난포낭에서는 밴드가 형성되지 않아 HSP70 유전자를 대상으로 한 Direct RT-PCR방법이 난포낭의 생사판별에 유용함을 알 수 있었다. 또한, 열처리한 난포낭의 경우가 열처리하지 않은 경우보다 RT-PCR 산물의 양이 훨씬 많은 것으로 나타나 민감도를 높이기 위해서는 열처리과정이 반드시 필요함을 알 수 있었다.</p> <p>Direct RT-PCR의 민감도 조사를 위해 크립토스포리디움 난포낭을 \( 1 \times 10 ^ { 3 } \)세포수부터 \( 1 \times 10 ^ { 0 } \)세포수까지 단계별 희석하여 각 개수별로 5개의 시료를 준비하고 Dynaloligo dT를 사용하여 mRNA를 추출한 다음 HSP70 gene에 대해 direct RT-PCR한 결과, \( 1 \times 10 ^ { 3 } \)세포수의 경우 5개의 시료를 준비하여 모두 양성의 DNA 밴드를 확인할 수 있었으며, \( 1 \times 10 ^ { 2 } \)세포수의 경우에는 5개의 시료를 준비하여 4 개의 양성 DNA 밴드를 확인할 수 있었다. 또 \( 1 \times 10 \)세포수의 경우에는 희미하지만</p>