pES1은 DasA를 코딩하는 R2YE 배지는 방선균 형질전환시 재생을 위해 사용하여 Thiostrepton은 필요시에 방선균 배지에 첨가하여 효소를 처리하지 않은 반응물을 DNA 오염 판별을 위한 RNA 샘플을 고체 배양으로부터 회수된 균체로부터 ISOGEN을 사용하여 추출하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 배양조건</h2> <p>pES1은 DasA를 코딩하는 유전자인 dasA를 pIJ486 벡터에 삽입하여 제작하였다. Streptomyces griseus IFO 13350 야생주에 pES1을 형질전환하여 dasA가 과발현된 S. griseus/pES1을 제작하였고 대조균주로서 pIJ486 벡터가 형질전환된 S. griseus/pIJ486 형질전환체를 제작하였다. 방선균 균주들은 YMPD 고체배지 \( (0.2 \% \) yeast extract, \( 0.2 \% \) Meat extract, \( 0.4 \% \) Bacto peptone, \( 0.5 \% \mathrm{NaCl}, 0.2 \% \) \( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 1 \% \) glucose, \( 2 \% \) agar, pH7.2) 및 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 의 조건에서 배양되었다. R2YE 배지는 방선균 형질전환시 재생을 위해 사용하였다. Thiostrepton \( (50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)은 필요시에 방선균 배지에 첨가하여 사용하였다.</p> <h2>Total RNA 추출 및 DNA microarray 분석</h2> <p>DNA microarray 분석을 위한 total RNA 준비는 다음과 같은 방법을 통하여 준비하였다. 우선, S. griseus/pES1 형질전환체와 대조균주 S. griseus/pIJ486 형질전환체의 total RNA는 YMPD 고체배지에 cellophane지를 깔고 그 위에 접종하여 배양한 후 균체만을 긁어 회수하여 RNAqueous (Ambion, USA)을 이용하여 추출하였다. 추출된 RNA 샘플은 DNA microarray를 수행하기 전에 Agilent 2100 Bio-analyzer (Agilent Technologies, USA)를 사용하여 순도를 측정하였다. DNA 탐침은 \( 6 \mu \mathrm{g} \)의 RNA 샘플로부터 aminoallyl dUTP (GE Healthcare, USA)의 존재하에서 역전사효소를 이용하여 생합성하였으며, Ohnishi 등에 의해서 서술된 방법에 따라 Cy3와 Cy5로 표지하였다. 마지막으로, \( 50 \mathrm{pmol} \) 의 Cy3-labeled cDNA probe와 Cy5-labeled DNA probe를 모든 hybridization 반응에 사용하였다. 총 7,138 개의 유전자가 포함된 microarray 및 실험절차와 데이터 분석 등은 모두 Ohinishi 등의 방법에 따랐다. 참고로 microarray 분석결과, 발현량이 2배 이상 증가한 유전자만을 선별하여 다음 단계의 연구를 진행하였다.</p> <h2>RT-PCR을 위한 역전사 반응</h2> <p>DNA microarray 결과 선택된 유전자들의 오페론 형성 유무를 알아보기 위해서, Table 1의 프라이머들을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. Total RNA 시료는 YMPD 고체배지에 배양된 S. griseus/pES1 형질전환체로부터 준비하였다. DNase 처리를 통해 DNA가 완전히 제거된 RNA 샘플로 SuperScript III RT-PCR system (Invitrogen, USA)을 이용하여 다음과 같은 방법으로 cDNA를 합성하였다. \( 1 \mu \mathrm{g} \)의 total RNA와 random hexamer를 포함하는 총 부피 \( 14 \mu \)의 혼합물을 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 열을 가하고 얼음에서 식힌 후 역전사 효소를 첨가하였다. 혼합물의 총 부피는 \( 20 \mu \)가 되도록 하며 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응 후 RNase H를 처리하여 RNA를 제거하였다. 합성된 cDNA로부터 \( 1 \mu \mathrm{l} \)를 취하여 RTPCR 반응의 주형으로 사용하였다. 이 때 역전사 효소를 처리하지 않은 반응물을 DNA 오염 판별을 위한 standard로 사용하였다. 증폭된 DNA 단편은 \( 1 \% \) 아가로스 겔에 전기영동하여 관찰하였다.</p> <h2>Low resolution S1 nuclease mapping</h2> <p>RNA 샘플은 고체 배양으로부터 회수된 균체로부터 ISOGEN (Nippon gene, Japan)을 사용하여 추출하였다. 탐침용 DNA 단편을 얻기 위해서 Table 1 의 프라이머와 S. griseus IFO13350 야생주의 염색체 DNA를 주형으로 하는 PCR 반응을 수행하였으며 증폭된 DNA 단편은 \( 1.2 \% \) 아가로스 겔에 전기영동 후 정제하여 준비하였다. hrdB (SGR1701)는 사용된 RNA의 양과 순도를 측정하는 standard로 사용하였다. 방사성 동위원소로 수식된 탐침을 제작하기 위해 T4 polynucleotide kinase를 처리하여 DNA 단편의 5 ' 말단에 \( \left[\gamma-{ }^{32} \mathrm{P}\right] \mathrm{ATP}(220 \mathrm{TBq} / \mathrm{mmol}) \) (Amersham Bioscience, USA)를 표지하고 agarose gel 전기영동 후 정제하여 준비하였다. Low-resolution S1 nuclease mapping은 Kato 등에 의해서 서술된 방법에 따라 수행되었다. S1 nuclease 분해로 생성된 DNA fragment는 Maxam-Gilbert 법에 따라 \(6\% \) polyacrylamide DNA sequencing 겔에 전기영동하여 분석하였다.</p>