배발생 캘러스의 초기 접종 밀도를 조사하기 위해 배지를 분주하여 초기 세포 접종밀도(wet weight 기준)를 \( 0.05,0.1,0.5,1.0,5.0,10.0 \mathrm { ~g } / 100 \mathrm { ~mL } \)으로 각각 처리하였고, 생체중에 대한 건물중 비율 \( = \) 건물중 / 생체중 \( * 100 \) 의 식을 통해 비율을 계산하였다. 이후 배발생 세포의 생장 변화를 확인하기 위해 삼각 플라스크에 배지(\(\mathrm{0.1g}\) 배발생 세포)를 넣어 현탁배양하였다.
<h2>배발생 캘러스 초기 접종 밀도 실험</h2> <p>배발생 캘러스의 생장에 적합한 초기 접종 밀도를 조사하기 위하여 \( 500 \mathrm { ml } \) 삼각플라스크에 \( 100 \mathrm { ml } \) 의 배지를 분주하여 초기 세포 접종밀도 (wet weight 기준)를 \( 0.05,0.1,0.5,1.0,5.0,10.0 \mathrm { ~g } / 100 \mathrm { ~mL } \)으로 각각 처리하였다. 배지는 2,4-D \( 1.0 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \)와 sucrose \( 3 \% \)가 첨가된 MS (Murashige and Skoog 1962)를 사용하여 \( 100 \mathrm { rpm } \)으로 현탁배양하였다. 배양 3주 후 vaccum pump를 이용하여 세포 내 수분을 모두 제거한 뒤 생체중을 측정하였으며, \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 하에서 24시간 건조 후 건물중을 측정하였다. 생체중에 대한 건물중 비율 (\(\%\) dry weight)은 Kim (2002)의 방법에 따라 아래식을 이용하여 계산하였다.</p> <p>생체중에 대한 건물중 비율 \( = \) 건물중 / 생체중 \( * 100 \) 초기 접종한 양을 기준으로 배양 3주 후에 증가한 세포 생장률 (growth rate)을 구하고자 Zhong 등 (1996)의 방법에 따라 아래 식을 이용하여 계산하였다.</p> <p>세포 생장률 \( =[( \) 최종 생장한 세포의 양) - (초기 접종한 세포의 양) \( )] \) (초기 접종한 세포의 양) / (생장 기간) \( * \) 생장기간 \( = \) 생장일수(day)</p> <p>본 실험의 배양 및 이하의 실험에서 배양환경은 광은 냉백색 형광등 (오스람 코리아, 안산, 한국) 하에서 \( 25-30 \mu \mathrm { mol } ~\mathrm { m } ^ { -2 } \mathrm { ~s } ^ { -1 } \)의 광량 자속 밀도로 1일 16시간 일장을 유지하였으며, 온도는 \( 25 \pm 1 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 유지되는 배양실에서 수행하였다.</p> <h2>배발생 캘러스의 생장 패턴</h2> <p>상기의 실험 결과를 바탕으로 배양기간별 배발생 세포의 생장 변화를 확인하고자 위 실험과 동일한 조건으로 \( 500 \mathrm { ml } \) 삼각후라스크에 \( 100 \mathrm { ml } \)의 배지(\(\mathrm{0.1g}\) 배발생 세포)를 넣어 \( 100 \mathrm { rpm } \)으로 40일간 액체 현탁 배양하였다. 배양과정에서 5일 간격으로 배양세포를 수확하여 생체중과 세포 주기를 분석하였으며 다음의 식을 사용하여 specific growth(\(\mu\))와 doubling time(\(T_d\))를 구하였다.</p>