aadA는 엽록체 형질전환체의 선발 효율이 높다는 것으로 알려져 있어서 토마토의 엽록체 형질전환 선발 마커로 사용하고자 적절한 항생제 농도 실험을 수행했다. 이 실험에서는 Homologous recombination에 의해 엽록체 형질전환을 일으키는 메커니즘에 따라 필요한 토마토 엽록체 게놈 주변 영역을 분리하여 염기서열을 결정했다. 그리고 해당 영역의 토마토 엽록체 DNA 서열과 담배 엽록체 DNA 서열을 비교 분석했다. 또한, 토마토 엽록체 형질전환 벡터인 pKRT22-AG를 토마토 조직에 bombardment 할 때의 조건을 조사했다.
<h3>엽록체 형질전환을 위한 선발 항생제 농도</h3> <p>엽록체 형질전환체 선발 효을이 높다고 알려져 있는 aadA (aminoglycoside 3"-adenylyltransferase)는 spectinomycin과 streptomycin에 내성 (Svab and Maliga 1993)을 보이는 특성을 가지고 있으며 이 유전자를 토마토 엽록체 형질전환 선발 마커로 사용하고자 적정 선발 항생제 농도 실험을 수행하였다 (Fig. 2). 본 실험에서는 spectinomycin을 재분화배지에 첨가한 후 토마토 자엽에서의 재분화능을 조사한 결과, spectinomycin \( 20~25 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) 첨가배지에서 재분화가 거의 이루어지지 않는 것으로 나타났기에 토마토 엽록체 형질전환체 선발 항생제 농도로 spectinomycin \( 25 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \)이 적합하다고 사료되었다. Ruf 등 (2001)은 토마토 엽록체 형질전환체를 spectinomycin \( 500 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \)에서 선발하였다고 보고한 바 있다. 이러한 결과는 품종에 따른 항생제 민감도에서 기인한 것으로 생각되어지며, 추후 부가적인 실험을 할 예정이다.</p> <h1>토마토 엽록체 게놈 flanking sequence 분석</h1> <p>Homologous recombination에 의한 엽록체 형질전환 메카니즘 에 의해 토마토 엽록체 형질전환 벡터 작성 시 필요한 토마토 엽록체 게놈 flanking region을 분리하여 염기서열 (Fig. 3)을 결정하고 해당부위의 담배 엽록체 DNA sequence와 비교 분석하였다 (Staub and Maliga 1992; Maliga1993; Maliga et al. 1994; Wakasugi 1998; Kavanagh et al. 1999). 그림 3 에서 16S rRNA 와 tRNA (trnI and trnA) 유전자 sequence는 토마토와 담배 모두 동일하였으며 단, trnI 유전자 내에 존재하는 intron의 크기가 토마토에서는 723 \( \mathrm { bp } \), 담배에서는 \( 707 \mathrm { bp } \) 였으며, trnA 유전자 내에 존재하는 intron의 크기는 토마토가 \( 809 \mathrm { bp } \), 담배에서는 \( 709 \mathrm { bp } \)로 토마토 엽록체 DNA의 intron의 크기가 담배보다 크다는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 Palmer 등 (1987,1988)이 보고한 바와 같이 엽록체 DNA sequence 간의 homology가 높았으며, 톡히 structural gene의 homology가 매우 높다는 것을 알 수 있었다.</p> <h2>토마토 엽록체 형질전환을 위한 유전자총 조건</h2> <p>엽록체 형질전환 벡터 pKRT22-AG (Fig. 4)를 토마토 자엽에 bombardment 할 때의 조건을 구명하고자 DNA농도, particle gold양, target distance를 달리하여 처리한 후, 48 시간이 지난 후 자엽으로부터 원형질체를 나출하여 GFP 발현여부를 조사한 결과, DNA 농도가 \( 0.5 \mu \mathrm { g } \)/shot에서는 GFP 발현 엽록체 개수가 1-2개로 저조한 반면, DNA 농도가 \( 2 \mu \mathrm { g } \) / shot 에서는 gold와 엉키어서 세포를 손상시켜 죽게 하는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 5). 그리고 GFP가 정확하게 엽록체 내에서만 발현되는 것을 관찰하였고, 이를 통해 토마토 엽록체 형질전환용 벡터가 잘 만들어졌음을 알 수 있었다. 또한 gold 양을 증가하였을 때 DNA 농도 증가와 비슷한 경향을 나타내었다 (data not shown). Target distance가 \( 6 \mathrm { cm } \)인 경우 거의 터져서 죽는 것이 관찰되었고, \( 12 \mathrm { cm } \)인 경우 GFP 발현이 거의 관찰되지 않았다 (data not shown). 따라서 토마토 엽록체 형질전환을 위한 적정 유전자총 조건으로는 1 bombardment의 경우 DNA 농도 \( 1 \mu \mathrm { g } , 0.6 \mu \mathrm { m } \) gold particle \( 1 \mathrm { mg } \), target distance \( 9 \mathrm { cm } \)가 효과적이었다고 사료되었으며, 이 결과는 담배 엽록체 형질전환의 유전자 총 조건 (Lee et al. 2003; Roh et al. 2006)과 같음을 알 수 있었다. 본 실험을 통해 얻어진 토마토 엽록체 형질전환용 벡터 및 형질전환 조건은 토마토 엽록체 형질전환체를 생산하는데 매우 효과적일거라 사료되었다.</p>