건조된 사자발쑥 100 g 을 잘게 자른 후 50% 에탄올 2L 를 이용하여 일주일 동안 침적시킨 후 여과하였다.다시 이 여액을 감압 건조하여 파우더를 얻고 이를 실험에 사용하였다.에틸아세테이트 분획으로부터 아글리콘 제조하는 방법으로는 에틸아세테이트 분흭에서 얻은 파우더 일부는 산 가수 분해 반응을 이용해서 당을 제거시킨 후 얻은 아글리콘 파우더를 실험에 쓰는 방법을 사용하였다. 3 가지 형태의 사자발쑥 추출물은 모두 화장품의 원료로 이용 가능한 형태의 추출물로 이들의 활성을 측정하여 그 응용 가능성을 검토하였는데 특히 에틸아세테이트 분획은 활성을 나타내는 플라보노이드 등의 성분이 다수 포함되어 있으며, 아글리콘 분획은 피부 흡수를 증진시켜 효능을 향상시키는뎨 적합한 물질이다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>기기 및 시약</h2> <p>UV-VIS spectrophotometer는 Varian (Australia)사의 Cary 50, HPLC는 Dionex사, LC/ESI-MS/MS는 Thermo Finniga 사의 LCQ 제품을 사용하였고, 적혈구 광용혈에 사용한 Spectronic 20D는 Milton Roy Co. (USA) 제품, 화학발광기는 Berthold (Germany)사의 6-channel LB9505 LT를, pH meter는 Hanna (Korea)사 제품을 사용하였다.</p> <p>(+)-\( \alpha \)-토코페롤, L-아스코르빅산, 알부틴, EDTA, luminol, 광증감제로 사용된 rose-bengal, free radical 소거 활성에사용한1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical은 Sigma 사 (USA)에서 구입하여 사용하였다. 기타 \( \mathrm{FeCl}_{3} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 는 Junsei Chemical Co. (Japan) 제품을, \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 는 Dae Jung Chemical & Metals (Korea)사 제품을 사용하였다. 완충용액 제조에 사용된 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot 12 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, \mathrm{NaCl} \), 그리고 에탄올, 메탄올, 에틸아세테이트 n-헥산 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. 기질로 사용된 L-타이로신과 효소로 사용된 타이로시네즈\( (9.3 \mathrm{~mg~solid}, 5,370 \mathrm{~units/mg~solid)} \)는 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다. 플라본이드의 분석에 사용한 thin layer chromatography (TLC)는 aluminum sheet silica gel 60 F254\( (0.2 \mathrm{~mm}) \)로 Merck시(USA)에서 구입하였다.</p> <h2>사자발쑥의 분획 및 추출</h2> <p>본 연구에서 사용한 사자발쑥은 강화군 농업기술센터로부터 제공받아 사용하였다. 사자발쑥은 Fig. 1과 같은 방법으로 분획 및 추출하였다. 건조된 사자발쑥 \( 100 \mathrm{~g} \) 을 잘게 자른 후 \( 50 \% \) 에탄올 \( 2 \mathrm{~L} \) 를 이용하여 일주일 동안 침적시킨 후 여과하였다. 이 여액을 감압 건조하여 파우더를 얻고 이를 실험에 사용하였다. 또한 \( 50 \% \) 에탄올 추출물은 감압 농축한 후 n-헥산을 이용하여 엽록소 등의 비극성 성분을 제거하였고, 이후 에틸아세테이트 분흭을 감압◦농축하 파우더를 얻은 다음 이를 실험에 사용하였다.</p> <p>에틸아세테이트 분획으로부터 아글리콘 제조하는 방법으로는 에틸아세테이트 분흭에서 얻은 파우더 일부는 산 가수 분해 반응을 이용해서 당을 제거시킨 후 얻은 아글리콘 파우더를 실험에 사용하였다. 산 가수분해 방법으로 에틸아세테이트 가용분 일정량에 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 및 아세톤 용액을 넣고, 4시간 동안 중탕 가열하면서 환류◦냉각시킨 후, 환류 시킨 용액을 \( 5 \% \mathrm{KOH} / \mathrm{MeOH} \) 용액으로 중화 적정하였다. 중화 적정 후 다시 에틸아세테이트 층을 분획하고 이를 감압◦농축하 당이 제거된 아글리콘 파우더(deglycosylated 분획)를 실험에 사용하였다. 3 가지 형태의 사자발쑥 추출물 \( (50 \% \) 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획 및 아글리콘 분획)은 모두 화장품의 원료로 이용 가능한 형태의 추출물로 이들의 활성을 측정하여 그 응용 가능성을 검토하였다. 특히 에틸아세테이트 분획은 활성을 나타내는 플라보노이드 등의 성분이 다수 포함되어 있으며, 아글리콘 분획은 피부 흡수를 증진시켜 효능을 향상시키는뎨 적합하다.</p> <h2>사자발쑥 추출물의 항산화 효과 측정</h2>DPPH법을 이용한 free radical 소거 활성: 자유라디칼(free radical)은 홀 전자를 가지고 있는 원자단으로써, 짝을 짓지 않은 활성 전자를 가지고 있기 때문에 불안정하며, 매우 큰 반응성을 갖는다. Free radical의 이러한 큰 반응성으로 피부 뿐만 아니라, 신체 구성 성분들에 손상을 주며 결과적으로 노화를 가속화시킨다. DPPH 실험법은 이러한 라디칼의 소거능을 확인하는 대표적인 실험으로 DPPH에 대한 전자공여효과(electron donating ability)를 통하여 추출물에 대한 환원력을 측정한다. 이는 짧은 시간에 결과를 알 수 있으며, 비교적 간단하다. 그러므로, 사자발쑥 추출물을 통해 free radical 소거활성을 DPPH법으로 확인하였으며, 실험빙법은 메탄올에 용해시킨 \( 0.2 \mathrm{~mM}) \) DPPH 용액 \( 1 \mathrm{~mL} \) 에 에탄올 \( 1 \mathrm{~mL} \) 를 첨가하고 여러 농도의 추출물 \( 1 \mathrm{~mL} \) 을 첨가하여 섞은 다음 실온에서 10 분 동안 방치 후, spectrophotometer로 \( 517 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 그 활성의 크기는 시료를 넣지 않은 경우를 대조군(control)으로 하고, 시료를 넣은 것을 실험군(experiment)으로 하였다. DPPH 소거 활성은 아래의 식에 의하여 계산되었으며, DPPH 소거 활성에 따른 추출물의 항산화능은 DPPH의 농도가 \( 50 \% \) 감스되는데 필요한 시료의 농도(free radical scavenging activity concentration, \( \mathrm{FSC}_{50}, \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 로서 표기하였다.</p> <p>Inhibition \( (\%)=1-\frac{\left(\mathrm{A}_{\text {Experiment }}-\mathrm{A}_{\text {Blank }}\right)}{\left(\mathrm{A}_{\text {Control }}\right)} \times 100 \)</p> <p>Luminol 발광법을 이용한 \( \mathrm{Fe}^{3+}-\mathrm{EDTA} / \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 계에 있어서 활성 산소 소거 활성(총항산화능): Luminol 빌광법은 사자발쑥 추출물의 총 항산화능을 평가하기에 적절하다. \( \mathrm{Fe}^{3+}-\mathrm{EDTA} / \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 계에 의해서 각종 \( \mathrm{ROS}\left(\mathrm{O}_{2}^{\cdot-} \cdot \mathrm{OH}\right. \) 그리고 \( \left.\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \) 가 생성되며, 철은 이러한 반응을 촉매한다. 따라서 이 계를 이용하면 각종 ROS의 소거 활성을 측정할 수 있으며, 이 총 항산화능에는 활성산소의 생성을 막아주는 킬레이트 작용도 포함된다. 추출물의 총 항산화능은 luminol이 횔성산소종에 의해 산화되어 나타나는 빛을 화학발광기로 검출하여 측정하였으며 방법은 다음과 같다. 먼저 화학발광 측정용 튜브에 증류수 \( 1.78 \mathrm{~mL} \) 를 넣고 사자발쑥 추출물을 농도별로 넣었다. 여기에 \( 2.5 \mathrm{~mM} \mathrm{~EDTA~} 40 \mu \mathrm{L} \) 및 \( 5 \mathrm{~mM~} \mathrm{FeCl_{3}} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ~10 \mu \mathrm{L} \) 를 가한 후 \( 35 \mathrm{~mM} \) luminol \( 80 \mu \mathrm{L} \) 를 넣고 흔들어 섞어 주었다. 이어서 화학발광기의 각 채널의 holder에 튜브를 넣고 5 분 동안 항온시킨 후 \( 150 \mathrm{~mM} \mathrm{~H}_{2} \mathrm{O}_{2} ~40 \mu \mathrm{L} \) 를 넣고 화학발광을 25 분 동안 측정하였다. 대조군(control)은 추출물 대신에 증류수를 넣고, 공시험(blank)은 시료군과 조건이 동일하나 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 와 \( \mathrm{FeCl}_{3} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 를 첨가하지 않고 증류수를 넣은 것으로 하였다. 화학발광기 6-channel LB9505 LT의 각 채널은 실험 전에 보정하여 채널 간의 차이가 거의 없도록 하 였다. 화학발광으로 측정한 소거 활성은 다음 식에 의해 계산되었고, 각종 활성산소 소거 활성에 의한 총 항산화능은 화학발광의 세기가 \( 50 \% \) 감소되는네 필요한 시료의 농도 (reactive oxygen species scavenging activity concentration, \( \mathrm{OSC}_{50} \mathrm{~\mu g} / \mathrm{mL} \) 로서 표기하였다.</p> <p>Inhition \( (\%)=\frac{\left(\text { Control의 } \mathrm{cpm}-\text { Sample의 } \mathrm{cpm}\right)}{\text { (Control의 } \mathrm{cpm}-\text { Blank의 } \mathrm{cnm})} \times 100 \)</p>