SDS-PAGE analysis 분석은 SDS를 포함하는 polyacrylamide gel을 이용한 Laemmli의 방법을 통해 진행되었으며, 이를 위해 Separating gel, Running gel, Stacking gel을 제조 및 sample buffer와 원심분리를 이용해 Sample을 제작하였다. 다음으로 아미노산 분석에서는 분석시료 준비를 위해 시료를 원심분리하고, hexane을 처리해 지방을 처리하였다.
<h2>SDS-PAGE analysis</h2><p>Protein sample은 SDS를 포함하는 polyacrylamide gel을 이용한 Laemmli의 방법에 따라서 전기영동을 하였다. Separating gel은 \( 10 \% \) acrylamide gel을 준비하였고, Running gel은 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\ 1.9 \mathrm{ml}\), \(30 \% \) acrylamidemix \( 1.7 \mathrm{ml}\), 1.5M Tris \((\mathrm {pH} 8.8 \)) \( 1.3 \mathrm{ml}\), \(10 \% \) SDS \( 0.05 \mathrm{ml}\), \(10 \% \) ammonium persulfate \( 0.05 \mathrm{ml}\), N, N, N', N'-tetramethylethylenedi-amine (TEMED) \( 0.002 \mathrm{ml} \)의 조성으로 제조하였으며, Stacking gel은 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\ 0.68 \mathrm{ml}, 30 \% \) acrylamidemix \( 0.17 \mathrm{ml} \), \( 1.0 \mathrm{M} \) Tris \( (\mathrm{pH} 6.8\)) \( 0.13 \mathrm{ml}\), \(10 \% \) SDS \( 0.01 \mathrm{ml}, 10 \% \) ammonium persulfate \( 0.01 \mathrm{ml}\), N, N, N', N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) \( 0.001 \mathrm{ml} \)의 조성으로 제조하였다. Sample은 \(5 \times\) sample buffer [\(60 \mathrm{mM}\) Tris-\(\mathrm{HCl}\) buffer \( (\mathrm{pH} 6.8\)), \(14.4\mathrm{mM}\) \(\beta\)-mercaptoethanol, \(2\%\) (w/v) SDS, \(25\%\) (v/v) glycerol, \(0.1\%\) (w/v) bromophenol blue]와 섞어서 10분간 끓인 다음 \( 12,000 \times \mathrm{g} \)으로 1분간 원심분리 시켜서 충분리를 시킨 후 아래층을 gel에 loading하였다. 전기영동은 \( 150 \mathrm{~mA} \)로 분리했으며, staining buffer (coomassie blue R-250 \( 1.0 \mathrm{~g} \), methanol \( 450 \mathrm{ml}, \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \ 450 \mathrm{ml} \), glacial acetic acid \( 100 \mathrm{ml} \) )와 destaining buffer (methyl alcohol \( 100 \mathrm{ml} \), acetic acid \(100 \mathrm{ml}\), \(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\ 800 \mathrm{ml} \) )를 사용해서 염색과 탈색을 하였다.</p><h2>아미노산 분석</h2><p>시료 \( 30 \mathrm{mg} \)을 \( 300 \mu l \)의 \( \mathrm{ddH}_{2} \mathrm{O} \)에 녹인 후 \( 10 \% \) TCA solution을 \( 1: 1 \)의 비율로 첨가하고 10분간 원심분리 \( (12,000 \times g) \)하여 단백질을 침전 시켰다. 지방을 제거하기 위해 hexane을 \( 1: 1 \)의 비율로 첨가하여 지방을 녹인 후 5분간 원심분리 \( (12,000 \times g) \)를 하고 침전된 침전물을 아미노산 분석시료로 사용하였다. Sample은 \( 0.4 \mu \mathrm{m} \)의 filter로 여과한 후 Amino Acid Analyzer (Hitachi L-8900, Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>모든 실험은 3회 이상 반복 측정하고 SAS V8.02 (SAS Institute, Inc. 2002)를 사용하여 분산 분석 및 Duncan 다범위 검증(Duncan's multiple range test)을 실시하였다.</p>