3T3-L1 세포를 96 well plate에 \( 5 \times 10^{3}\) cells/well 농도로 분주하여 24시간 배양한 후에 세포 생존율 측정을 위해, PBS에 용해시킨 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) MTT 시약을 첨가하여 2시간 배양한 다음 DMSO를 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 첨가하여 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였고,실험결과에 대한 통계처리는 Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) software package를 이용하여 평균과 표준편차로 나타내며, 각 처리군 간의 유의성에 대한 검증은 분산분석(ANOVA: analysis of variance)를 이용하여 유의성을 확인한 후, t-test를 이용한 다중비교를 실시하여 유의수준 \( p<0.05 \)에서 분석하였다.
<h2>세포 생존율 측정</h2><p>3T3-L1 세포에서 한방복합물에 의한 세포독성을 평가하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. 3T3-L1 세포를 96 well plate에 \( 5 \times 10^{3}\) cells/well 농도로 분주하여 24시간 배양하였다. 그 후, 시료의 최종농도가 \( 25,50,75,150,300 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 되도록 처리한 후 \( 5 \% \mathrm{~CO}_{2}\), \(37^{\circ} \mathrm{C} \) 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 세포 생존율을 측정하기 위하여 PBS에 용해시킨 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) MTT 시약을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 배양한 다음 상층액을 제거한 후 DMSO를 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 첨가하여 ELISA reader를 사용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>Oil Red O 염색</h2><p>한방복합물이 3T3-L1 지방전구세포에서 지방세포로의 분화를 억제시키는지 확인하기 위하여 Oil Red O 시약을 이용하여 염색을 실시하였다. 지방전구세포를 8일 동안 분화시킨 후에 배지를 제거하여 \( 10 \% \) formaldehyde 용액으로 상온에서 30분 동안 세포를 고정한 다음 용액을 제거하였다. PBS로 2회, \( 70 \% \) 에탄올로 2회 세척한 후 Oil Red O 용액을 처리하여 염색하였다. 염색된 세포는 현미경으로 관찰 후 사진을 촬영하였고, 촬영이 끝난 세포는 iso-propyl alcohol에 \( 4 \% \) NP−40가 첨가된 용액을 이용하여 용해시킨 후 ELISA reader (PowerWave XS, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)로 \( 510 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>Western Blot</h2><p>한방복합물이 adipogenic transcription factors의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Western blot analysis를 실시하였다. 분화가 완료된 세포를 harvest 한 후, RIPA buffer를 well 당 \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하여 1시간 동안 냉장하여 세포를 용해시키고 그 후 원심분리 하여(\(12,000 \mathrm{rpm}\), \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), 10 min) 세포막 성분들을 제거하였다. 원심 분리하여 얻은 단백질은 bradford assay로 정량하였으며, \( 10 \mu \mathrm{l} \)의 단백질을 \( 10 \% \) 의 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis를 이용하여 전기 영동한 후, 항체의 비특이적 결합을 억제시키기 위해 PVDF membrane에 옮긴 다음 transfer하였다. Transfer가 끝나면 \( 5\% \) skim milk 에 12시간 동안 방치하여 background를 제거 시켰다. \( 1 \times \)TBST}로 3회 washing 후 1차 antibody (1: 1,000) 를 24시간 붙인 후 \( 1 \times \) TBST 로 3회 washing 후 2차 antibody (1: 1,000) 를 2시간 반응한 후 ECL kit (Amersham Pharmacia, England)를 이용하여 film에 옮겨 측정한 후 Image Quant LAS-4000 (GE life sciences, Taiwan)으로 band density를 확인하였다.</p><h2>Total RNA 추출 및 Reverse transcription-PCR</h2><p>Total RNA는 High Pure RNA Isolation Kit (Roche, Basel, Switzerland)을 이용하여 제조사의 실험방법에 준하여 추출한 후, \( 1 \mu \mathrm{g} / \mu \mathrm{l}\)의 농도로 정량하였다. 정량화한 total RNA는 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche)로 역전사를 일으켜 cDNA를 합성하였다. CEBP- \( \alpha \), SREBP-1c, PPAR- \( \gamma \) 의 mRNA 발현을 확인하기 위하여 Fast start Essential DNA Green Master kit (Roche) 을 이용하여 Reverse transcription-PCR을 진행하였고, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 internal control로 사용하였다. PCR의 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60초 동안 30 cycle을 증폭시키고 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 65초 동안 진행하였다. 증폭 과정에서 만들어진 DNA를 \( 0.5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 ethidium bromide를 첨가한 \( 1.5 \% \) metaphor agarose gel에서 전기영동을 진행하여 cooled CCD camera system EZ-Capture II 시스템과 CA analyzer ver.3.00 software를 사용하여 mRNA의 발현 정도를 확인하였다.</p><h2>Real-time PCR</h2><p>분화가 완료된 3T3-L1 전지방세포의 상층액을 제거하고 Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)으로 2회 세척한 후, TRI-Solution을 가하여 세포벽을 깨고 Chloroform을 첨가하여 수용액층과 유기용매층을 분리하여 phenol 성분을 제거하였다. Isopropanol로 RNA 침전을 시킨 다음 \( 75 \% \) 에탄올로 세척하고 RNA pellet만 남겨 air-dry한 후 RNase free D.W를 넣어서 pellet을 녹여 최종적으로 total RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Nano drop (microdigital, Seongnam, Korea)을 이용하여 정량하고, RT master mix를 이용해 역전사 반응하여 cDNA를 합성하였다. 지방세포 분화에 관련된 인자인 CEBP- \( \alpha \), SREBP-1c, PPAR- \( \gamma \), FAS의 mRNA 발현은 TB Green 8 Premix Ex Taq II를 이용하여 증폭시켜 확인하였다. PCR 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 초(denaturation), \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초(annealing), \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초(extension)를 40회 반복하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>실험결과에 대한 통계처리는 Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) software package (Version 22.0; IBM, USA)를 이용하여 평균과 표준편차로 나타내었고, 각 처리군 간의 유의성에 대한 검증은 분산분석(ANOVA: analysis of variance)를 이용하여 유의성을 확인한 후, t-test를 이용한 다중비교를 실시하여 유의수준 \( p<0.05 \)에서 분석하였다.</p>