토양시료 내의 황산염환원 세균 수를 most probable numbers (MPN) 방법으로 실험하고, 결과를 계산하였다. \(30^{\circ}C\)에서 배양하며, 디지털 압력계와 가스 크로마토그래피를 사용하여 황화수소 생성량을 조사하였다. 시험병에 토양시료, 초산 아연, BCYT 배지를 넣고 황산염을 환원시킨 후, 염산과 염화크롬을 추가하여 환원된 황산염을 포획하였다. 방사성 동위원소를 측정하여 황산염 환원율을 조사하였다.
<h2>황산염환원 세균 수 조사</h2> <p>토양시료 내에 기질로 초산과 젖산을 이용하는 황산염환원 세균의 수를 most probable numbers (MPN) 방법으로 실험한 후, 그 결과를 most probable numbers calculator (version4.04; United States Environmantal protection agency, Ohio) 프로그램을 이용하여 산정하였다.</p> <h2>황화수소 발생량 측정</h2> <p>\( 1 \mathrm { ~g } \)의 토양을 \( 9 \mathrm { ml } \)의 혐기성 BCYT 배지가 들어있는 혐기배양 시험관(Bellco Glass Inc., Vineland, N.J.)에 넣고 고무마개로 닫은 후, aluminum seals로 밀봉하였다. 이 시험관에 멸균된 주사기를 이용하여 \( 20 \mathrm { ~mM } \)의 초산과 젖산을 각각 주입하였고, 모든 시험관에는 \( 2 \mathrm { ~mM } \)의 황산나트륨을 환원제 및 황원으로 첨가하였다. 이를 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 항온 배양기에서 정치배양 하면서, 매주 5주 동안 디지털 압력계(DPI 705; Druck)를 이용하여 압력을 측정하였고, GC-14B 유리 컬럼(Shimadzu)과 불꽃광검출기(FPD)가 부착된 가스크로마토그래피(GC-14B, Shimadzu, Japan)를 이용하여 황화수소 생성량을 조사하였다. 이 때, 실험조건은 운반가스로 질소를 사용하였으며 유속은 \( 13 \mathrm { ~psi } \)로 하였고, 공기와 수소는 각각 \( 5 \mathrm { ~kgf } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \)로 조정하였다. 컬럼 오븐의 온도는 \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 시료 주입부는 \( 150 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 검출기는 \( 150 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 조정 하였고, 혐기시험관 내의 가스를 \( 25 ~ \mu 1 \)씩 주입한 후 생성하는 피크 면적 값을 표준 황화수소 가스를 이용한 표준곡선을 이용하여 황화수소 생성량으로 환산하였다.</p> <h2>황산염 환원율 측정</h2> <p>\( 2.5 \mathrm { ~ml } \)의 \( 10 \% \) 초산 아연이 들어있는 시험관을 장착한 시험병에 토양시료 \( 1 \mathrm { ~g } \)과 \( 1 \mathrm { ~ml } \) 의 BCYT 배지를 질소가스 충진 하에 첨가한 후, \( 2 \mathrm { ~uCi } ^ { ~35 } \mathrm { S } - \mathrm { SO } _ { 4 } { } ^ { 2- } \)를 주입하고 암소에서 2시간 배양하며 황산염을 환원시켰다. 그 후 주사기를 통해 혐기상태의 \( 6 \mathrm { ~M } \) 염산 \( 8 \mathrm { ~ml } \)과 \( 0.5 \mathrm { ~M } \) 염산에 용해된 \( 1 \mathrm { ~M } \) 염화크롬(Ⅱ) \( 8 \mathrm { ~ml } \)을 주입하고 48시간 동안 환원된 황산염을 포획한 후, trap 내에 포획된 방사성 동위원소와 시험병 내에 남아있는 환원되지 않은 \( { } ^ { 35 } \mathrm { SO } _ { 4 } ^ { ~2- } \) 동위원소 량을 액체섬광계수기(LS 6500, Beckman Coulter, Fullerton, CA)로 측정한 후, 황산염 환원율을 조사하였다.</p>