유전자 검사는 머리카락 모근에서 추출된 샘플에 PCR을 이용해 유전자를 증폭시키고, 대량의 SNP 분석은 MALDI-TOF를 사용하여 진행되었다. SNP 분석을 위한 프라이머는 분자량 5000-7500, Tm은 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \)이상, 염기 수는 약 20개를 기준으로 디자인되었다.
<h1>연구 방법</h1> <h2>유전자 검사를 위한 샘플 준비</h2> <p>유전자 검사는 머리카락 모근을 이용하여 실시하였다. 유전자 검사를 위해 피시험자의 모근을 포함한 머리카락을 2-3개 뽑은 후 모근을 포함한 \( 5 \mathrm { ~mm } \) 도를 잘라 튜브에 넣고 \( 5 \% \) chelax를 \( 100 \mu \mathrm { l } , 10( \mathrm { X } ) \) Taq buffer \( 10 \mu \mathrm { l } \) 와 proteinase \( \mathrm { K } \)5 Unit \( (100 \mu \mathrm { g } / \mu \mathrm { l } ) \) 을 넣고 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분간 처리한 후 \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10 분간 끓여서 효소를 불활성화 시킨 후 상등액을 새튜브로 옮겨 샘플로 사용하였다.</p> <h2>유전자 증폭과 염기서열분석</h2> <p>염기서열 분석을 위해서 위에서 준비된 샘플은 PCR을 통해 유전자를 증폭하였다. 기존의 연구에 기초하여 IL-4의 promoter region 에서 \( -590 \mathrm { C } / \mathrm { T } ,-34 \mathrm { C } / \mathrm { T } \) 와 IL-4R a chain의 coding region에서 I75V, Q576R, E375A, C406R, S411L, S761P, S727A의 염기서열을 분석함으로써 SNP 여부를 확인하기 위해 PCR과정에 필요한 primer를 디자인 했다. 유전자 주형으로 위에서 준비된 샘플 5 \( \mu \mathrm { l } \)를 전체 PCR 반응 \( 25 \mu \mathrm { l } \)에 넣어 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } 15 \)초, \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } , 20 \)초, 72 \( { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 1분으로 40 cycle을 통하여 검사하고자 하는 유전자 부분을 증폭하였다. 증폭한 유전자는 염기서열 분석을 위하여 PCR purification kit (Solgent, 한국)을 이용하여 분리하였다. 염기서열은 Big Dye terminator kit (Perkin-Elmer, 미국)으 로 반응을 하여 \( 377 \mathrm { } \)ABI automated 96-lane sequencer (Perkin-Elmer)로 분석을 하였다.</p> <h2>MALDI-TOF을 통한 SNP 분석</h2> <p>대량으로 유전자의 SNP를 분석하기 위해 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization time of flight)을 이용하였다. MALDI-TOF를 통한 SNP 분석에 사용하는 주형(template)으로는 보통 혈액에서 분리된 genomic DNA를 이용하지만 본 실험에서는 머리카락을 이용하였다. 머리카락에서 genomic DNA를 분리하여 실험할 수 없기 때문에 SNP 분석을 위해서 분석하고자 하는 유전자 영역을 Table 1의 primer를 이용하여 위와 같은 조건으로 PCR 증폭하여 이것을 주형으로 이용하였다. MALDI-TOF를 통한 SNP 분석을 위해 사용한 프라이머의 분자량은 5000-7500, Tm은 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \)이상, 염기 수는 대략 20개 내외를 기준으로 하여 ex-tension primer를 디자인 했다.</p>