본 연구는 MVM 검출을 위한 real-time PCR 시험법을 활용하여 CHO 세포주에서 MVM을 효과적으로 검출하는 방법을 제시한다. Real-time PCR은 감염역가 시험법에 비해 민감도가 17배 높고 시험시간이 10배 단축됨을 보여준다. 이 시험법은 생물의약품 안전성 보증, 세포주 검증, 바이러스 제거 공정 검증 등에서 빠르고 정확한 결과를 제공함으로써 감염역가 시험법을 대체할 수 있는 유용한 기술로 확인되었다.
<p>본 연구를 통해 확립된 MVM 검출 시험법을 CHO 세포주에서 MVM 검출 시험에 활용하였을 때, MVM에 오염된 CHO 세포주와 세포주 배양 상등액에서 MVM을 효과적으로 검출할 수 있었다. 따라서 MVM real-time PCR 시험법은 동물세포주 검증과 생산공정 검증에서 MVM 오염 여부를 정성적 또는 정량적 검출할 수 있는 우수한 시험법임을 확인할 수 있었다.</p> <p>Real-time PCR을 활용한 바이러스 정량 검출 방법은 크로마토그래피 공정과 필터 공정 같은 단백질 분리 정제 공정에서 미량의 바이러스를 실시간에 정량화 할 수 있기 때문에, 생물의약품 제조공정에서 바이러스 제거 검증 실험 시 감염역가시험과 함께 적용할 수 있는 유용한 평가기술이다. 본 연구를 통해 확립된 MVM real-time PCR 시험법을 Viresolve NFP 바이러스 필터 공정에 적용하여 감염역가 시험법과 비교하였을 때, 바이러스가 첨가된 factor Ⅸ 용액에서의 총역가는 각각 \( 5.32 \log _ { 10 } \mathrm { TCID } _ { 50 } \) equivalents와 \( 5.34 \log _ { 10 } \mathrm { TCID } _ { 50 } \)로 동일한 결과를 나타내었다. 또한 바이러스 필터 여과액과 인산완충용액 여과액에서는 두 시험법 모두 MVM을 검출할 수 없었다. 이러한 결과는 Viresolve NFP에 의해 MVM이 완벽하게 제거됨을 보여준다. 하지만 계산된 바이러스 감소인수는 real-time PCR 시험법으로 검증한 결과가 더 높게 나타났다. 감염역가시험에서는 MVM이 첨가된 factor Ⅸ 용액이 MVM 감염성 세포인 A9 세포에 나타내는 cytotoxicity와 interference를 나타내지 않는 범위까지 희석을 해야 하므로 검출한계가 희석배수만큼 높아진다. 또한 real-time PCR 시험법이 감염역가 시험법보다 17배 정도 민감도가 좋기 때문에 real-time PCR 시험법으로 검증한 바이러스 감소인수가 감염역가시험법으로 검증한 값보다 훨씬 더 높게 나타났다. 감염역가시험법은 10일 이상의 시험기간이 소요되는데 반해, real-time PCR 시험법은 1일안에 시험결과를 얻을 수 있어 시험시간이 10배정도 단축되었다. 따라서 MVM real-time PCR 시험법은 동물세포배양 유래 생물의약품 제조 공정에서 바이러스 제거 검증에 유용하게 사용될 수 있는 시험법으로 판단된다.</p> <h1>요 약</h1> <p>세포배양 유래 생물의약품 생산 공정에서 다양한 바이러스가 오염된 사례가 있기 때문에 바이러스 안전성 검증이 필수적이다. MVM은 동물 세포주와 동물 세포 배양 공정에 오염되는 대표적인 바이러스이다. 세포배양 유래 생물의약품의 MVM 안전성을 확보하기 위해, 세포주, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 MVM을 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 MVM 제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 real-time PCR 시험법을 확립하였다. MVM에 특이적인 primer를 선별하였으며, 형광염료 SYBR Green Ⅰ을 사용하여 MVM DNA 정량 검출 시험법을 최적화하였다. 세포배양법에 의한 감염역가와 비교한 결과 real-time PCR 민감도는 \( 6 \times 10 ^ { -2 } \mathrm { ~TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \)이었다. 확립된 시험법의 신뢰성(reliability)을 보증하기 위해 시험법 검증을 실시한 결과 특이성(specificity)과 재현성(reproducibility)이 우수함을 확인하였다. 확립된 real-time PCR을 생물의약품 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 MVM을 오염시킨 CHO 세포에서 MVM 검출 시험을 실시한 결과 MVM을 감염시킨 CHO 세포와 세포배양 상청액에서 MVM을 정량적으로 검출할 수 있었다. 또한 바이러스 필터 공정에서 MVM 제거 효과를 감염역가 시험법과 비교 검증한 결과 더 높은 민감도로 빠른 시간에 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 위와 같은 결과에서 확립된 MVM real-time PCR 시험법은 생물의약품 안전성 보증을 위한 세포주 검증, 생물의약품 생산 공정 검증, 바이러스 제거 공정 검증 등에서 감염역가 시험법을 대신할 수 있는 신속하고, 특이성과 민감성이 우수한 시험법임을 확인하였다.</p>