V. fluvialis는 장염, 식중 독 및 패혈증의 원인균으로 본 연구에서는 독성물질 생성세포로 알려져 병원성의 지표로 여겨지는 hemolysin에 관하여 연구하였다. 이를 위해 V. fluvialis로부터 hemolysin인 VFH를 정제하고 무지개 송어 유래 RTG-2 세포주에 처라함으로써 세포 형태 및 세포에 미치는 영향을 탐구했다.
<h1>서 론</h1> <p>Vibrio sp.는 해수 및 담수에서 발견되는 대표적 병원성 미생물로 어패류, 인체의 장에서 발견되는 gram 은성 세균이다. 인체에 감염되는 것으로 알려진 12종의 Vibrio sp. 가운데 잘 알려진 것이 Vibrio cholerae 이며, 장염, 식중 독 및 패혈증의 원인균으로 알려져 있는 V. parahaemolyticus, V. mimicus, V. vulnificus, V. fluvialis 등이 잘 알려겨 있다. 이들 Vibrio로부터 여러 병원성 인자들이 발견 보고 되어 있고, 특히 심한 탈수가 주요 증상인 콜레라를 일으키는 V. cholerae와 V. parahaemolyticus, V. vulnificus,V. mimicus에 관한 연구에 집중되어 왔다. 탈수와 설사 등의 공통성을 가지고 있는 이들 병원균에서 여러 공통적인 pathogenic factor가 발견되어 왔으며, phospholipase, protease, hemagglutinin, TDH (Thermostable direct hemolysin), TRH (TDH related hemolysin), Cholera Toxin (C) 등의 세포 상해성 인자들이 보고 되었다.</p> <p>V. fluvialis는 1978년 Lee 등에 의해 보고된 병원성 세균으로 감염시의 증상이 열, 탈수, 복통, 설사 등의 V. cholerae와 유사한 증상을 일으키며, 면역학적으로 V. cholerae의 CT와 동일한 독성이 보고된 바 있다. V. fluvialis도 pathogenic에 관여하는 것으로 생각되는 여러 독성물질을 생산하고 있으나, 본 연구에서는 병원성의 지표로 여겨지는 hemolysin에 관하여 연구하였다. 일반적으로 hemolysin 은 V. parahaemolyticus의 존재 유무를 확인하는 KP(Kanagawa phenomenon)의 지표로 사용되며 환자의 검체 에서 발견된 KP-negative V. parahaemolyticus에서도 TRH (TDH related hemolysin)가 발견되어서 이는 중요한 세포 상해성 인자로 연구 보고된 바 있다.</p> <p>V. fluvialis hemolysin 역시 이 균이 유발하는 증상으로 미루어 다른 Vibrio sp.에서와 같은 역할을 할 것으로 기대된다. 이러한 사실을 증명하기 위해 V. fluvialis로부터 hemolysin인 VFH를 정제하였고, 이를 무지개 송어 유래 RTG-2 세포주에 처리하여 세포 형태와 세포에 미치는 영향을 조사하였다.</p> <h2>사용 균주 및 plasmid</h2> <p>Hemolysin을 분리정제하기 위해 ATCC 균주인 V. fluvialis (ATCC 33809)를 유전자 은행(KCTC : Korean Collection of Type Culture) 으로부터 분양을 받아 실험에 사용하였다. 사용 균주의 보관은 \( 20 \% \) glycerol을 첨가하여 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하였으며, 평판에 배양하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 배양후 액체배양의 종균으로 사용하였다.</p> <p>V. fluvialis에서 hemolysin을 정제하기 위한 배지는 Difco사의 BHI (Brain Heart Infusion) 배지롤 사용하였다.</p> <h2>Hemolysin의 정제</h2> <p>V. fluvialis로부터 hemolysin을 정제하기 위해 \( 1 \mathrm{~L} \)의 BHI에 전배양액을 약 \( 1 \% \) 접종한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(140 \mathrm{cyle}/\mathrm{min}\)의 조건에서 24 시간동안 진탕 배양하였다. 균체를 배양액에서 분리하기 위해 \( 7,000 \times \mathrm{g} \)에서 30분간 원심분리하여 상층액을 분리하였으며, 분리된 상층액에 \( 591 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \)의 황산 암모늄을 첨가하여 \( 80 \% \) 포화도에서 8시간동안 정치한 후 다시 \( 7,000 \times \mathrm{g} \)에서 30분간 원심분리하여 침전된 단백질을 회수하여 약 \( 60 \mathrm{ml} \)의 \( 10 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} 7.5) \)에서 하루동안 투석을 실시하였다. 투석한 시료는 동결건조를 통해 농축하여 분말상태의 시로로 만든 후 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 다음 실험까지 보관하였다. 분말 시료를 \( 10 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} 7.5) \)로 미리 평형시켜둔 DEAE-cellulose \( (2 \times 5 \mathrm{~cm}) \)에 주입하여 흡착시키고 비흡착된 시료는 같은 완충용액으로 충분히 씻어주었다. 이 column을 \( \mathrm{NaCl} \)이 함유된 Tris- \( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} 7.5) \) 완충용액을 사용하여 단계적으로 \( (0 \sim 0.5 \mathrm{M} \mathrm{NaCl}) \)로 용출하여 hemolysin 활성이 있는 분획을 모아 투석하여 농축하였다. 농축된 시료는 다시 같은 완충액으로 평형화되어 있는 Mono Q HR 10/10 column (Pharmacia)를 이용하여 \(0 \sim 0.5 \mathrm{M}\)\( \mathrm{NaCl} \)을 linear gradient로 용출시켰다. 활성측정은 BBL사의 TSA II (\(5\%\) sheep blood)에 paper disk를 사용하 여 용출된 분획을 주입한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 후 나타나는 hemolytic zone으로 판정하였고, 정제된 단백질의 양은 BSA를 표준물질로 사용하여 Bradford법을 이용하여 측정하였다.</p>