ADC 유전자의 발현 플라스미드인 pTXB1-EF_ADCE22를 이용해 대장균 BL21 (DE3)를 형질전환시킨 후, 이를 LB (Amp) broth에서 하룻밤, 그리고 다시 LB (Amp) broth 1L에서 3시간동안 진탕배양하였다. 이후 IPTG를 최종농도 \( 0. 3 \mathrm{mM} \)이 되도록 첨가하여 다시 3시간 진탕배양하였다. 이렇게 만들어진 단백질은 column buffer에서 용출하였으며, 단백질의 양은 BCA protein assay reagent를 이용하여 측정하였다.
<h2>L-aspartate \( \beta \)-decarboxylase 유전자의 발현 및 정제</h2> <p>구축된 ADC 유전자의 발현 플라스미드 pTXB1-EF_ADCE22를 이용하여 대장균 BL21 (DE3)를 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 LB (Amp) broth \( 10 \mathrm{ml} \) 에 접종하고 하룻밤동안 진탕배양 \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm}\right) \) 한 후 배양액을 LB (Amp) broth \(\mathrm{1 ~L} \)에 재접종하여 3시간동안 추가로 진탕배양(37° \( { }^{\circ}, 250 \)\( \mathrm{rpm} \) 하였다. 여기에 IPTG를 최종농도 \( 0.3 \mathrm{mM} \)이 되도록 첨가하여 다시 3시간동안 진탕배양 \( \left(30^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm}\right) \) 하였다. 배양된 균체를 원심분리 \( (4,000 \times g, 10 \) 분 \( ) \) 하여 균체를 회수한 후,여기에 ice-cold column buffer ( \( 20 \mathrm{mM} \) Tris ( \( \mathrm{pH} \) 7.4), \( 0.5 \mathrm{M} \)\( \mathrm{NaCl}, 0.2 \% \) Triton \( X-100,2 \mathrm{mM} \) EDTA) \( 30 \mathrm{ml} \) 를 첨가하여 현탁한 후, 초음파처리로 균체를 파쇄하고 이를 다시 원심분리 \( (20,000 \times g, 20분 \) \( ) \)하여 상층액을 취하여 세포추출액으로 하였다. 세포추출액을 column buffer로 평형시킨 chitin bead column ( \( 20 \mathrm{ml} \) of set volumes, New England Biolabs, MA,USA)에 주입하여 부착시켰다. Column buffer로 column을 세정한 후, cleavage buffer (column buffer with \( 30~ \mathrm{mM} \) DTT)로 평형시키고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤동안 방치하였다. 정제된 단백질은 column buffer \( 50~ \mathrm{ml} \)로 용출시켰다. 단백질의 양은 bovine serum albumin을 표준물질로 하여 BCA protein as- say reagent (Pierce Biotechnology, IL, USA)를 이용하여 측정하였다.</p> <h2>L-aspartate \( \beta \)-decarboxylase의 활성측정</h2> <p>L-aspartate \( \beta \)-decarboxylase의 활성은 효소반응의 결과 L-aspartate에서 유리되는 \( \mathrm{CO}_{2} \)를 압력계 \( \left(\mathrm{CO}_{2}\right. \) gas analyzer,model CD95)를 이용하여 측정, 정량 하는 방법으로 측정하 였다. 시험관에 효소액(Enzyme 15 or \( 128.6 \mu \mathrm{g}, 0.1 \mathrm{M} \) sodium acetate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 5.0), \( 2 \mathrm{mM} \) a-ketoglutaric acid, \( 0.86 \mathrm{mM} \) pyridoxal \( 5^{\prime} \)-phosphate, Bovine serum albumin ( 1 \( \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) ) \( 2.5 \mathrm{ml} \) 를 넣고 반응조에서 온도를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)로 맞춘 후, 여기에 온도를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)로 맞춘 기질액(40 mM L-aspartic acid, \( \mathrm{pH} \) 5.0) \( 0.5 \mathrm{ml} \)를 넣고 섞어 반응시킨 후 발생하는 \( \mathrm{CO}_{2} \)를 압력계를 이용하여 반응 1분 후에 측정하고, 이후 5분 간격으로 측정하였다. 대조구는 효소를 제외하고 실험을 진행하였으며 실험구와 대조구의 차이값을 기록하여 활성으로 하였다.</p> <h2>SDS-PAGE</h2> <p>SDS-PAGE는 \( 11 \% \) polyacrylamide gel을 이용하여 Laemmli의 방법으로 행하였다. 효소용액을 sample buffer와 흔합하여 5분간 꿇인 후 gel에 주입하였다.</p>