세포 배양액 내 콜라겐 생합성 정도는 procollagen type-C peptide (PIP) EIA kit를 사용하여 propeptide의 양을 측정하였다. MMP-1 저해 활성 측정은 matrix metalloproteinase-1 ELISA kit을 이용하여 측정하였다. 다음으로, Hosoi 등의 방법에 따라 피부 melanoma 세포로부터의 melanin 생합성 저해 측정도를 알아보았다. 다음으로, Cellular tyrosinase 저해 활성 즉정은 B16F10 melanoma 세포들을 배양하고, 24시간 뒤 각 well에 시료를 48시간 동안 처리하였다. 다음으로, Western blot을 통한 단백질의 발현을 측정해 보았다. 이상의 모든 실험은 모든 실험은 3회 이상 반복하여 실시하였으며 평균치와 표준편차로 나타내었다. 유의성 검증은 SPSS statistics 20 software package program을 이용하여 Duncan's multiple range test와 t-test를 실시하고 동계적 유의수준 p\(<\)0.05, 0.01에서 검증하였다.
<h2>Procollagen type 생합성 및 MMP-\(1\) 저해 활성 측정</h2> <p>CCD-986sk 세포를 \( 5 \times 10^{4} \) cells/well 농도로 12 well plate에 접종한 후, UVB \( \left(20 \mathrm{~mJ} / \mathrm{cm}^{2}\right) \) 를 조사한 후 시료를 농도별로 처리 하여 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 48 시간 배양하였다. 이렇게 실험한 세포의 상등액을 모아서 실험에 사용하였다. 세포 배양액 내 콜라겐 생합성 정도는 procollagen type-C peptide (PIP) EIA kit(Takara, Shiga, Japan)를 사용하여 propeptide의 양을 측정하였으며, MMP-1 저해 활성 측정은 matrix metalloproteinase-1 ELISA kit (Abcam, Cambridge, MA, USA)을 이용하여 측정하였다.</p> <h2>Melanin 생합성 및 cellular tyrosinase 저해 활성 측정</h2> <p>피부 melanoma 세포로부터의 melanin 생합성 저해 측정은 Hosoi 등의 방법에 따라 측정하였다. DMEM 배지로 배양된 melanoma 세포를 \( 100 \mathrm{~mm} \) culture dish에 \( 2 \times 10^{6} \mathrm{cel} / \mathrm{dish} \) 가 되게 분주하고, 24 시간 배양 후 \( \alpha-\mathrm{MSH}^{2} \) 처리한 후 시료를 농도 별로 조제하여 \( 2 \mathrm{~mL} \) 첨가하고, 48 시간 후에 인산완충액 (pH 7.4)으로 세척하였다. 그 다음 0.25 M trypsin-EDTA 용액으로 세포를 탈착한 후 수확한 세포를 \( 1 \times 10^{6} \) cell 당 \( 1 \mathrm{~mL} \) 의 \( 5 \% \) TCA로 처리하고, \( 2,500 \mathrm{rpm} \) 으로 2회 원심분리한 후 분리된 melanin을 인산완충액으로 세척한 뒤 ether:ethanol (1: 3) \(1 \mathrm{~mL} \) 를 가하여 2 회 원심분리 한 후 ether \( 1 \mathrm{~mL} \) 로 세척 건조시킨다. 건조된 melanin에 1 N NaOH를 \( 1 \mathrm{~mL} \) 가하여 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 반응시킨 후 분광 광도계 \( 405 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. Cellular tyrosinase 저해 활성 즉정은 B16F10 melanoma 세포들 6 well에 \( 5 \times 10^{4} \) cell이 되도록 접종하여 배양하고, 24시간 뒤 각 well에 시료를 48 시간 동안 처리하있나. 처리 후 PBS로 2회 세척한 후 각 well의 세포에 lysis buffer (1\% triton X-\( 100,0.1 \mathrm{M} \) Sodium phosphate buffer, \( 50 \mathrm{mM} \) PMSF, pH 6.8)를 가하였다. 얼음 위에서 세포를 파괴시키고 원심 분리한 후 \( \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 농도로 0.1M sodium phosphate buffer (pH 6.8)에 녹여 기질을 준비하고 기질 \( 160 \mu \mathrm{L} \) 에 효소용액 \( 40 \mu \mathrm{L} \) 를 가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 가온하고 생성된 DOPA chrome의 양을 490 \( \mathrm{nm} \) 에서 측정하였다. Melanin 생합성 저해와 Cellular tyrosinase 활성은 시료 용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도비로부터 산출하였다.</p> <h2>Western blot을 통한 단백질의 발현 측정</h2> <p>MMP-1, MMP-9, Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, microphthalmia transcription factor 저해활성을 보기 위하여 각각의 세포를 60 \( \mathrm{mm} \) tissue culture dish에 cell seeding 후 24시간 동안 배양하여 세포를 안정화 시컸다. 배지를 제거한 후 UVB \( \left(20 \mathrm{~mJ} / \mathrm{cm}^{2}\right) \)로 조사하고 추출물을 농도 별로 처리한 배지로 24-48시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척해주었다. RIPA buffer \( 10 \mathrm{~mL} \) 에 complete mini 1 tab를 가함 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 로 용해해서 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 20 분간 원심 분리 하였다. 원심 분리하여 얻은 상층액은 bradford assay로 정량하여 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 의 단백질을 \( 10 \% \) 의 SDS-PAGE를 이용하여 진기 영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 semi dry transfer cell 기기(Hofer, Holliston, MA, USA)를 이용하여 PVDF membrane (EMD millipore, billerica, MA, USA)에 읆긴 다음 실온에서 \(1\)시간 blocking buffer \((5\% skim milk in TBST)\)에서 incubation 시켰다. 1차 항체를 희석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 over night한 다음, 다시 \(10\) 분 간격으로 TBST로 3회 세척하고 mouse anti-rabbit IgG HRP (Santa Cruz Biotechnology Inc, Dallas, TX, USA), bovine anti-goat IgG HRP (Santa Cruz Biotechnology Inc)의 각각의 2 차 항체를 1: 1,000 로 희석하여 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 3 회 세척 한 뒤 LAS 4,000(GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험은 3회 이상 반복하여 실시하였으며 평균치와 표준편차로 나타내었으며, 유의성 검증은 SPSS statistics 20(IBM, Armonk, NY, USA) software package program을 이용하여 Duncan's multiple range test와 t-test를 실시하였으며 동계적 유의수준 p<0.05,0.01 에서 검증하였다.</p>