mecA 유전자 검출은 Genomic DNA extraction kit을 이용하여 DNA를 추출하고, multi-plex colony PCR 로 mecA와 16s rRNA 유전지를 동시에 검출하는 방법으로 확인하였다. PBP 2a 단백질 확인 시험은 MRSA-Screen을 이용하여 균을 부유시킨 후 extraction reagent Ⅰ과 Ⅱ를 첨가하고 원심분리하여 Sensitized Latex 응집반응을 실시하여 확인하였다.
<h2>mecA 유전자 검출</h2> <p>헐액한천배지에 24시간 배양한 3~5개의 집락을 멸균증류수에 현탁하여 Genomic DNA extraction kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 DNA를 추출하여 template로 사용하였다. mecA 유전자 검사는mecA와 16s rRNA 유전지를 동시에 검출할 수 있는 primer [5'-CTCAGGTACTGCTATCCACC-3' (mecA-1), 5'-CACTTGGTATATCTTCACC-3' (mecA-2), 5'-GGAATTC-AAATGAATTGACGGGGG-3'(rRNA-1), 5'-CGGGATCCCA GGCCCGGGAACGTATTCAC-3' (rRNA-2)]를 이용한 multi-plex colony PCR 로 확인하였다. 이때 PCR 최적반응 조건은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 1분, \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 1분, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 1분으로 28 cycle 반응시켰다.</p> <h2>PBP 2a 단백질 확인 시험</h2> <p>혈액한천배지에 24시간 배양한 균을 MRSA-Screen (Denka-Seiken, Japan)을 이용하여 extraction reagent Ⅰ \( 200 ~ \mu \mathrm { I } \) 를 넣고 집락 4~5개 정도를 따서 ( \(1.5 \times 10 ^ { 9 } \) cell/tube)균을 부유시켜 \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \) heating block에서 3분간 가열 후 식힌 다음 extraction reagent Ⅱ \( 250 ~ \mu \mathrm { l } \)를 첨가하여 혼합한 후 \( 1,500 \times g, \) 5분간 원심분리하여 침전액을 Sensitized Latex 응집반응을 실시하였다.</p> <h2>장독소 유전자 시험</h2> <p>장독소 유전자 시험은 S. aureus Multiplex PCR Kit (Rappigen, Korea)를 가지고 enterotoxin A, B, C, D, E, G를 대상으로 시험하였다. tryptic soy broth (Difco) \( 3 \mathrm { ~ml } \)에 검체 \( 1 \mathrm { ~g } \)을 첨가하고 12시간 동안 \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 증균 배양하고, 증균한 검체 \( 1 \mathrm { ~ml } \)을 \( 1.5 \mathrm { ~ml } \) tube에 옮긴 후 9,000× g에서 3분간 원심분리 하였다. 상층액을 버리고 멸균증류수 \( 500 ~ \mu \mathrm { l } \)로 현탁시키고 다시 9,000× g에서 3분간 원심분리 하였다. 상층액을 버리고 DNA 추출액 \( 100 ~ \mu \mathrm { l } \)를 첨가하고 vortexing하여 완전히 균체를 현탁시킨다. DNA 추출엑(kit 내 포함)을 \( 100 ~ \mu \mathrm { l } \)첨가하여 끓는 물에서 10분간 가열한 뒤 실온끼지 식힌 다음, 가볍게 vortexing 후에 9,000× g에서 5분간 원심 분리하여 상층액 \( 10 ~ \mu \mathrm { l } \)를 multiplex PCR 반응에 사용하였다. 양성대조군은 S. aureus ATCC 29213과 toxin이 확인된 분리수를 대조 균주로 사용하였다.</p>