뽕잎추출물을 첨가한 동충하초 균사체 배양액의 ty-rosinase 활성억제율을 측정하기 위해 배양액의 농도를 조절하여 반응시킨 후 ELISA reader를 활용해 흡광도를 측정하였다. 또한 배양액이 세포 생존에 미치는 영향을 측정하기 위해 crystal violet assay법을 활용하였다. 배양액을 crystal violet 염색하고 세포를 추출하여 흡광도를 측정함으로써 세포의 생존율을 비교하였다. 마지막으로 B16BL6 mouse mela-noma cell을 활용하여 배양액의 멜라닌 생합성 억제 효능을 평가하였다.
<h2>In vitro tyrosinase 활성억제</h2> <p>뽕잎추출물을 이용한 동충하초 균사체 배양액의 ty-rosinase 활성 억제율을 측정하기 위하여, 96 well plate(SPL. Korea)에 \( 10 \mathrm{mM} \) L-tyrosine \( 25 \mu \) 를 첨가한 후, 뽕잎추출물과 뽕잎추출물을 이용한 동충하초 균사체 배양액을 각각 \( 0,1,3,5,7,10,20,30,40,50 \% \) 씩 각각 첨가하여, mush-room tyrosinase (2,500 unit, Sigma Chemical Co., USA) 3 \( \mu 1 \) 를 넣고 \( 50 \mathrm{mM} \) 인산완충용액으로 최종 \( 200 \mu \) 가 되게 조절하여 반응시켰다. 그 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분 동안 1 분 간격으로 ELISA reader를 사용하여 \( 490 \mathrm{~nm} \) 에서 홉광도를 측정하여 tyrosinase 활성억제율을 다음의 식에서 구할 수 있었다.</p> <p>* tyrosinase 활성억제율(IC rate \%)\( =100 \) - [시료용액의 반응 후 흡광도/대조군(시료무첨가구)의 반응 후 흡광도] \( \times 100 \)</p> <p>IC rate은 inhibition concentration rate의 야어이다.</p> <h2>세포독성측정</h2> <p>뽕잎추출물을 이용한 동충하초 균사체 배양액의 세포 생존에 미치는 영향을 축정하기 위하여, crystal violet assay법을 응용하여 사용하였다. MEM 배지를 사용하여 6 well plate 에 \( 5 \times 10^{4} \) cells/ \( \mathrm{ml} \) 을 각각 \( 5 \mathrm{ml} \) 씩 넣고 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 배양 후에는 \( 1 \% \) FBS가 첨가된 MEM 배지로 교환하였다. 뽕잎 추출물과 동충하초 균사체 배양액을 \( 0,1,3,5,7,10 \), \( 20,30,40,50 \% \) 농도로 각각 처리하여 24시간동안 배양한 후, 배양 상등액을 제거하였다. 그 후 PBS buffer \( (\mathrm{pH} 7.2) \) 로 세척하여 \( 0.1 \% \) crystal violet (in 10\% ethanol)용액으로 5분 동안 상온에서 염색 하였다. 염색 되지 않은 crystal violet을 완전히 제거하기 위하여 PBS buffer ( \( \mathrm{pH} 7.2) \) 로 3회 세척하였다. 염색된 세포로부터 crystal violet의 추출은 95\% ethanol을 1 시간동안 상온에서 처리하였으며, 추출액을 \( 540 \mathrm{~nm} \) 파장에서 측정한 흡광도를 통하여 세포의 생존율을 비교하였다.</p> <h2>멜라닌 생합성 억제</h2> <p>뽕잎추출물을 이용한 동충하초 균사체 배양액의 멜라닌 생합성 억제 효능을 평가하기 위하여 B16BL6 mouse mela-noma cell \( (5 \times 104 \) cells/ ml)을 6 well plate에 각각 \( 5 \mathrm{ml} \) 씩 넣고 24시간 배양하였다. 배양 후 \( 1 \% \) FBS가 첨가된 MEM 배지로 교환 한 후, 뽕잎추출물과 뽕잎추출물을 이용한 동충하초 균사체 배양액을 각각 \( 0,1,3,5,7,10,20 \% \) 의 농도로 처리하였다. 시료처리 4 일 후 \( 0.25 \% \) trypsin-EDTA 용액을 처리하여 세포를 수확한 후, 원심분리하여 cell pellet의 색을 육안으로 판정하였다. 그 후 \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} \) 용액 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 을 넣고 세포를 \( 100^{\circ} \mathrm{C}, 2 \) 시간 처리하여 세포 내 멜라닌을 녹인 다음 \( 490 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여, 배양액을 처리하지 않은 세포의 멜라닌 양과 비교하여 배양액이 멜라닌 생성에 미치는 영향을 알아보았다.</p>