최근 다양한 세균에 대한 연구에 활용시킬 수 있는 transposon이 많이 알려져 있다. 하지만 대부분의 transposon은 자체의 크기가 크고, 이들이 가지고 있는 항생제 내성 유전자는 특정균에는 활용되지 않는 경우도 있으며, 많은 transposon이 숙주의 chromosomal DNA 상으로 임시 transposition을 하지 않고 특정 DNA 서열로의 transposition하는 등의 실험 효율상의 문제가 발생한다. 이런 제한을 극복하기 위해 여러 minitransposon이 개발되어 왔으며, in vitro에서 합성된 minitransposon은 transposon 내부에 항생제 내성 유전자 등과 같은 selectable marker를 연구 방향에 맞게 다른 종류의 marker로 교체할 수 있다는 장점을 가진다.
<p>Transposon은 mycobacteria를 포함하여, 세균의 유전학적 분석을 위한 수단으로 이용되고 있다. 현재까지 다양한 세균에 대한 연구에 적용시킬 수 있는 transposon이 많이 알려져 있다. 그러나 대부분의 transposon은 자체의 크기가 매우 크고, 이들이 가지고 있는 항생제 내성 유전자는 특정균에는 적용되지 않는 경우도 있으며, 많은 transposon이 숙주의 chromosomal DNA 상으로 임의적 transposition을 하지 않고 특정 DNA 서열로의 transposition하는 등의 실험 효율상의 문제가 발생한다. 이러한 한계점을 극복하기 위하여 다양한 minitransposon이 개발되어 왔다. Transposon이란, 스스로의 위치를 다른 DNA 로 옮길 수 있는 DNA 서열 단위체를 의미하며, 양쪽 끝에 역반복 서열(inverted repeat)을 가지고 있고, 일반적으로 transposon 자체가 transposition을 촉매 하는 효소인 trasposase를 암호화하고 있다. Transposase가 transposon 영역을 정의하고 있는 두 개의 역반복 서열 사이에 존재하지 않도록 DNA 서열 상에서 재조합 된 것을 mini-transposon이라고 한다. 이러한 배열로 인해 mini-transposon이 숙주의 chromosomal DNA로 transposition할 때 transposase가 함께 이동하지 않게 되므로 다른 DNA 영역으로의 2차 transposition이 일어날 가능성은 배제된다. 따라서 transposase가 없는 transposon이 안정적으로 trans-position된 상태를 유지하게 한다. 또한 이렇게 in vitro에서 합성된 minitransposon은 transposon 내부에 항생제 내성 유전자 등과 같은 selectable marker를 연구 방향에 맞게 다른 종류의 marker로 교체할 수 있다는 장점을 가진다. 본 연구에서 사용된 minitransposon은 대장균에서 기능을 하는 복제시작점을 가진다. Chromosomal DNA로 transposition이 일어난 chromosomal DNA를 분리하여, 제한효소를 처리하고 self-ligation을 시켜 이를 E. coli로 도입하면, 세포 내에서 plas-mid형태로 복제될 수 있도록 구성되어 있다. 이 점은 trans-poson이 삽입된 유전자를 발굴하기 위한 빠른 cloning 작업을 가능하게 하므로 여러 측면에서 다양한 활용이 가능하다. Tn5에 기초를 두어 구축된 pTnMod-OKm은 Gram-negative 세균에서의 효율적인 유전적 분석을 위한 self-cloning mini-transposon vector이다. pTnMod-OKm은 Tn5에서 유래한 내부 역반복 서열과 외부 역반복 서열, pUC19 vector에서 유래한 pUC ori (pMB1 narrow-host-range 복제시작점), 그리고 kanamycin 내성 유전자인 kanamycin 3'-phosphotransferase (aminoglucoside phosphotransferase)를 암호화하고 있는 유전자로 이루어져 있다. 그리고 transposon 바깥쪽에, Gram-negative 세균에서의 DNA transfer에 이용되는 RP4 transfer 시작점과 Tn5 transposase를 암호화하고 있는 유전자를 포함하고 있다. Tn5 transposase는 숙주와 목적 DNA 서열에 대한 낮은 특이성을 가진다. 또한 이 vector는 cloning에 이용될 수 있는 비교적 드물게 존재하는 제한효소자리를 가지고 있는데 GC함량이 높거나 낮은 DNA 서열 각각을 모두 인지하는 제한효소들의 인식부위이므로 숙주 genome의 GC함량율로 비롯되는 실험적 한계를 고려하지 않아도 된다는 장점을 가지고 있다. pTnMod-OKm이 Gram-negative 세균 연구를 위해 고안된 vector이나, 위에서 기술한 특성들은 이 vec-tor 체계를 Gram-positive한 성격을 가지고 있으면서도 높은 genome의 GC 함량율을 보이는 Mycobacterium 속에 적용시킬 수 있는 가능성을 제시하고 있기 때문에 이를 mycobacteria에 적용할 새로운 minitransposon vector 개발의 기반으로 이용하였다. 여기에 형질전환의 효율이 높지 않은 mycobacteria에서의 random mutagenesis의 효율을 높이고자 TSRO인 pAL500Ts를 cloning하여 pTnMod-OKmTs를 구축하였다. 상기된 vector들의 사용은 mycobacteria에서의 효율적인 돌연변이 구축과 유전자 연구 기반을 제시할 것으로 기대된다.</p>