알칼리 이온수 ENA-A를 사용한 실험에서, 세포의 배양과 시료 및 시약을 사용한 실험과정을 거쳐 조골세포의 성장 속도와 흡광도를 측정하고 세포의 증식률을 백분율로 나타낼 수 있었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>ENA-A 시료 조제</h2> <p>본 실험에 사용한 ENA actimineral resource A (ENA-A)는 알칼리 이온수로 식용의 오징어 (Sepia esculenta)와 두 종류의 해조류 (Phymatolithon calcareum, Lithothamnion cor-allioides)를 혼합하여 제조한 것으로 (주)진주바이오푸드에서 제공받아 사용하였다. ENA-A의 제조과정은 먼저 오징어의 뼈는 제거하고 해초와 함께 열을 가해 정련한 다음, 다시 \( 1,000 \sim 1,100^{\circ} \mathrm{C} \) 가량의 열을 가해 한 시간동안 더 정련한다. 정련 후 이온수로 사용할 원료들은 상온에서 냉각하고 증류수에 녹여 water pump를 사용하여 압력 ( \( >10 \mathrm{bar}) \)을 가하여 무기질화한 다음, 24시간 동안 침전시킨 뒤 상등액을 여과시킴으로써 알칼리 이온수를 얻을 수 있다( \(\mathrm{pH} \mathrm{~12.5)} \).</p> <h2>ENA-A 이온수를 이용한 조골세포 활성검색</h2> <h3>세포배양</h3> <p>Mouse calvaria osteoblast cello MC3T3-E1 cell은 ATCC (CRL-2593, USA)로부터 분양받아 사용하였다. 최 등의 방법을 참고하여 \(\alpha\)-MEM (Gibco BRL, Grand island, N.Y., USA)배지에 \( 10 \% \) FBS (Gibco)와 \(1\%\) antibiotics (Gibco)를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)의 \( 5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 배양기에서 2-3일 마다 계대배양을 하였으며, 분화유도를 위해 \( 5 \mathrm{mM} \)-glycerol phosphate (Sigma Chem. Co., St. Louis. Mo., USA)와 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \)의 Vitamin C (Sigma)를 첨가하여 분화유도배지로 사용하였으며, 3일마다 배지를 교환하였다.</p> <h3>조골세포 증식유도 측정</h3> <p>시료의 농도별 처리에 따른 조골세포의 성장 정도는 Green 등의 방법에 따라 3-(3,4-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT; Sigma) 시약의 환원정도를 측정하는 MTT assay로 측정하였다. 먼저 배양한 cell을 \( 0.4 \% \) trypan blue(Sigma)를 사용하여 계수한 후 \( 1 \times 10^{5} \) cells/well로 조정하여 분주한 다음 각 시료를 최종농도 1, 10, 100 및 \( 1,000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 되게 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 씩 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)의 5\( \% \mathrm{~CO}_{2} \) 배양기에서 48시간 배양하였다. 이때 대조군은 시료 대신 배지를 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 첨가하여 동일하게 배양하였다.</p> <p>배양 후 MTT 시약을 \( 5 \mathrm{~mg} / \mathrm{mL} \)농도로 \( 10 \mu \mathrm{L} \)를 각 well에 첨가하여 4시간 더 배양한 후 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 DMSO를 \( 100 \mu \mathrm{L} \)씩 첨가하여 생성된 불용성의 formazan 결정을 용해시켜 ELISA reader (Spectra MAX 340 pc, Molecular Device, USA)로 \( 550 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 증식률은 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.</p>