박테리오신 유전자를 도입한 효모의 항균활성 개선을 위해, 항균활성 플라스미드 DNA에 GPD 프로모터 유전자를 삽입하였으며, 이를 기존의 재조합 효모와 비교하여 Bacillus subtilis와 Escherichia coli에 대한 항균활성을 비교하였다. 효모의 플라스미드 DNA 형질전환을 위해 S. cerevisiae KCTC 7913 세포를 사용하였고, GPD 프로모터 유전자를 PCR법으로 증폭하였다. 이로부터 제작된 pBT-GPDp 플라스미드 DNA를 이용하여 E. coli DH5a 세포를 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 추출하여 염기서열 분석을 실시하였다.
<p>본 연구에서는 박테리오신 유전자가 도입된 효모의 항균활성을 개선하기위해 선행연구에서 얻어진 항균활성 플라스미드 DNA (pAUR-OR-7, pAUR-SubpA 및 pAUR-SubpB에 GPD 프로모터 유전자 단편을 삽입하여 기존에 개발된 항균활성 효모의 활성 증진을 시도하였으며, 그람양성 대표세균인 Bacillus subtilis 및 그람음성 장내세균인 Escherichia coli에 대한 기존의 재조합 효모와의 항균활성을 비교하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약 및 배지</h2> <p>제한효소, DNA ligation kit, Pyrobest DNA polymerase, Taq DNA polymerase는 Takara Korea (Seoul, Korea)에서 구입하였다.</p> <p>효모의 발현 플라스미드 DNA는 alcohol dehydrogenase(ADH) 프로모터에 의해 발현이 유도되는 pAUR123 (Takara Korea, Seoul, Korea)을 사용하였다.</p> <p>유전자 클로닝을 위한 숙주로는 대장균 (E. coli DH5a)세포를 사용하였다. 대장균은 LB 배지 ( \(1 \% \) bacto tryptone, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 0.5 \% ~ \mathrm { NaCl } ) \)를 이용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다. 대장균 형질전환체의 선별을 위해서는 LB 배지에 ampicillin을 최종농도가 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)가 되게 첨가하여 사용하였다. 고체배지는 LB 배지에 한천(agar)을 \(1.5 \% \)가 되도록 첨가하여 제작하였다.</p> <p>효모의 발현 플라스미드 DNA의 형질전환을 위한 숙주로는 효모(S. cerevisiae KCTC 7913) 세포를 사용하였다. 효모는 YPD 배지( \(1 \% \) yeast extract, \(2 \% \) polypeptone, \( 2 \% \) D-glucose)를 이용하여 배양하였다. YPD 고체배지는 YPD 배지에 한천을 \( 1.5 \% \)가 되도록 첨가하여 제작하였다.</p> <h2>GPD 프로모터 유전자의 획득 및 염기서열 분석</h2> <p>GPD 프로모터 유전자의 획득을 위하여 S. cerevisiae의 염색체 DNA로부터 forward primer GPDp4-F(5'-CCGGTACCCCAGAGCTCCGATCTCGAGC-3')와 reverse primer GPDp2-R(5'-GGTACCTCGAAACTAAGTTCTTGG-3')을 사용하여 GPD 프로모터 유전자 부위를 PCR법으로 증폭하였다. 각각의 primer에는 클로닝을 위하여 5' 말단에 제한효소 KpnI의 인식부위를 도입하였다. PCR 반응 조건으로 초기해리는 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 시행하였고, 해리 \( (94 ^ {\circ } \mathrm { C } , \) 1분), 혼성화 ( \(55 ^ {\circ } \mathrm { C } , \) 1분) 및 중합 \( (72 ^ {\circ } \mathrm { C } , \) 1분)의 세 과정을 30회 반복하고, 추가적인 중합 \( \left (72 ^ {\circ } \mathrm { C } \right . \), 10분)을 수행하였다. PCR법으로 증폭된 DNA 단편은 서브클로닝을 위해 pBT-1.1 vector (Bio-solution, Gyeonggi-do, Korea)에 연결하여 pBT-GPDp를 제작하였다. 제작된 pBT-GPDp 플라스미드 DNA를 이용하여 대장균 세포(E. coli DH5a)를 형질전환시켰으며, 이로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다. GPD 프로모터 유전자를 확인하기 위하여 추출된 플라스미드 DNA를 제한효소 KpnI으로 절단하고 \( 0.8 \% \) agarose gel에서 전기영동을 수행하여 DNA 단편을 확인하였다. 한편, 염기서열 분석을 위해 추출된 플라스미드 DNA를 (주) 바이오니아(Seoul, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 밝히고, 밝혀진 염기서열을 DS Gene 1.5 program (Accelrys Inc., Seoul, Korea)을 이용하여 제한효소 절단부위 등을 확인하였다.</p>