Edwardsiella tarda CK41 균주는 국립 수산과학원에서 에드와드증에 걸린 넙치에서 분리한 야생균주이며 균주는 Luria-Bertani 액체배지 또는 1.5% agar를 첨가한 고체 배지를 사용하여 37' C 에서 배양했다. 반 고체 배지는 agar농도를 0.4% 로 바꾸어 사용했으며 대부분의 DNA 조작은 Sambrook 등에 의해 기술된 방법으로 수행하였다. Rubidium chloride 용액처리법으로 만든 E. coli competent 세포들은 heat-shock으로 형질전환 시켰으며 유전자 조작에 필요한 DNA 단편은 PCR 증폭기법을 사용하여 얻었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주, 플라스미드, 사용배지 및 균주배양조건</h2> <p>본 연구에서 사용한 Edwardsiella tarda CK41 균주는 국립 수산과학원에서 에드와드증에 걸린 넙치에서 분리한 야생균주이다. Escherichia coli BL21 균주는 재조합 단백질의 과발현을 위한 균주로 사용하였다. 재조합 단백질 PFAP (Putative E. tarda Flagellin Associated Protain)을 발현하는 재조합 플라스미드 \( \mathrm { pBP } 793 \) 은 \( \mathrm { pProEX } { } ^ {\mathrm { TM } } \) THb(Invitrogen) 발현 벡터에 \( 1.2 \mathrm { ~kb } \) 의 EFAP DNA 단편을 클로닝하여 제조하였다. 균주는 Luria-Bertani (LB) 액체배지 또는 \( 1.5 \% \) agar를 첨가한 고체 배지를 사용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양하였고, 운동성 검사를 위한 반 고체 배지는 agar농도를 \( 0.4 \% \) 로 바꾸어 사용하였다. 해수조건과 유사한 염농도를 위하여 \( \mathrm { NaCl } \) 함유량을 \( 3.5 \% \) 로 추가하여 사용하였으며, 생리적 조건의 경우 \( \mathrm { NaCl } \) 함유량을 LB 배지와 동일하게(1 \%) 사용하였다. E. tarda는 모든 실험에서 Salmonella Shigella agar 배지에서 접종하여 집락의 중앙이 검은 특징을 형성하는지 확인하였다. 항생제가 필요할 경우 각각의 배양조건에 ampicillin을 \( 100 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) 의 농도로 첨가하였다. 단백질 과발현을 위한 배양에서는 \( 600 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도 \( 0.7 \) 까지 배양한 후 \( 1 \mathrm { mM } \) 의 \( \mathrm { IPTG } \) 를 첨가하여 발현을 유도하였다.</p> <h2>일반적인 DNA 조작</h2> <p>본 연구에서 이루어진 대부분의 DNA 조작은 Sambrook 등에 의해 기술된 방법에 준하여 수행하였다. Rubidium chloride 용액처리법으로 제조된 E. coli competent 세포들은 heat-shock으로 형질전환 시켰다. 유전자 조작에 필요한 DNA 단편은 PCR 증폭기법을 사용하여 얻었으며, 이때 사용된 primer는 HY523F (5'-ggatccatggcacaagtaatt -3')와 HY533R (5'- aagccttaacgcagcagaga \( \left .-3 ^ {\prime } \right ) \) 이다. PCR은 다음과 같은 조건으로 수행하였다; \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초간 변성, primer \( \mathrm { Tm } \) 값에 의한 \( 52 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초간 primer annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 분간 중합반응, 그리고 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 7 분간 마지막 합성을 실시하였다.</p>