Corallococcus와 Myxococcus 속 균주들은 호서대학교 점액세균은행에서 분리, 보유하고 있고, P. aeruginosa ATCC 10145, S. aureus ATCC 25923, Candida albicans ATCC18804는 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 구입하였다. 점액세균의 단일 세포와 자실체 형태는 각각 Nikon ECLIPSE E600위상차현미경과 Nikon SMZ1000 입체현미경을 사용하여 관찰하였다. C. coralloides 균주들은 Amberlite XAD16이 함유된 \( 50 \mathrm{ml} \mathrm{CYS} \)에서 5일간 진탕배양한 후, 레진과 세포를 회수하여 증류수로 세척하였다. 또한, C. albicans, P. aeruginosa 또는 S. aureus가 도말된 평판배지 위에는 배양추출액 함유 종이디스크를 놓고, 대조구로는 DMSO를 함유한 종이디스크를 사용하였다.
<h1>실험재료 및 방법</h1> <h2>사용 균주</h2> <p>Corallococcus와 Myxococcus 속 균주들은 모두 호서대학교 점액세균은행에서 직접 분리하여 보유하고 있는 균주들을 사용하였다. P. aeruginosa ATCC 10145, S. aureus ATCC 25923, Candida albicans ATCC18804는 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 구입하였다.</p> <h2>배지 및 배양조건</h2> <p>C. coralloides의 일반적인 배양에는 VY/3 배지를 사용하였으며, 필요에 따라서 CY 또는 CYE 배지를 사용하였다. 배양추출물 제조를 위해서는 CYS 배지를 사용하였다. VY/3 배지는 VY/2 배지를 변형시킨 배지로 \( 0.5 \% \) baker's yeast, \(0.1\% \mathrm{CaCl}_{2} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 10 \mathrm{mM} \) 3-[N-morpholino] propanesulfonic acid (MOPS) (\(\mathrm{pH} 7.6\)), \( 0.5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) cyanocobala-mine을 함유하고 있다. CYS 배지는 \( 0.5 \% \) casitone, \( 0.1 \% \) yeast extract, \( 0.3 \% \) soluble starch, \( 0.1 \% \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.05 \% \mathrm{CaCl}_{2}, 50 \mathrm{mM} \) 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)(\(\mathrm{pH} 7.6\)), \(0.1\%\) 미량원소용액, \( 0.5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) cya-nocobalamine을 첨가하였으며, 미량원소용액은 1 리터당 \( 100 \mathrm{mg} \mathrm{MnCl} \cdot 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 20 \mathrm{mg} \mathrm{CoCl}_{2}, 10 \mathrm{mg} \mathrm{CuSO}{ }_{4}, 10 \mathrm{mg} \mathrm{Na}_{2} \mathrm{MoO}_{4} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 20 \mathrm{mg} \mathrm{ZnCl}_{2}, 5 \mathrm{mg} \mathrm{LiCl}, 5 \mathrm{mg} \mathrm{SnCl}_{2} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 10 \mathrm{mg} \mathrm{H}_{3} \mathrm{BO}_{3}, 20 \mathrm{mg} \mathrm{KBr}, 20 \mathrm{mg} \mathrm{KI}, 8\mathrm{g}\) EDTA \( \mathrm{Na}-\mathrm{Fe}^{3+} \) salt (trihydrate)를 첨가하였다. 자실체 형성 유도를 위해서는 WCE 배지를 사용하였다. WCE 배지는 \( 10 \mathrm{mM} \)MOPS, \( 0.1 \% \mathrm{CaCl}_{2} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 1.5 \% \) 한천으로 구성된 고체평판 배지 표면에 살아있는 대장균 농축액 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 를 올려놓은 배지이다. P. aeruginosa와 S. aureus는 NA 배지에서 배양하였으며, C. albicans는 YM 배지에서 배양하였다. NA 배지는 \( 0.3 \% \) beef extract와 \( 0.5 \% \) peptone을 첨가하였으며, YM 배지는 \( 0.3 \% \) yeast extract, \( 0.3 \% \) malt extract, \( 0.5 \% \) peptone, \( 1 \% \) glucose로 구성되어 있었다.</p> <h2>균주들의 형태적 특성 조사</h2> <p>점액세균 단일 세포의 형태 관찰을 위해서는 VY/3 배지에서 3 일 동안 배양한 영양세포들을 Nikon ECLIPSE E600위상차현미경을 사용하여 관찰하였으며, 점액세균의 자실체 형태는 WCE 배지에서 7일간 배양한 자실체를 Nikon SMZ1000 입체현미경을 사용하여 관찰하였다. 사진은 Nikon DS-Fi1 디지털 카메라를 사용하여 촬영하였다.</p> <h2>배양추출물의 제조</h2> <p>C. coralloides 균주들을 Amberlite XAD16 (Sigma, USA) \( 2 \mathrm{g} \) 이 들어 있는 \( 50 \mathrm{ml} \mathrm{CYS} \) 에서 5일간 진탕배양한 후, 레진과 세포를 회수하여 증류수로 2회 세척하였다. \( 50 \% \) 아세톤으로 2회 추출하고, 다시 \( 100 \% \) 아세톤으로 2회 추출하여 추출액을 모았다. 추출물을 건조시킨 후, \( 1 \mathrm{ml} \) 의 DMSO에 녹여 보관하였다. HPLC 분석을 위해서는 레진만을 증류수로 세척하고 \( 50 \% \) 아세톤과 \( 100 \% \) 아세톤으로 추출하였다. 회전증발기를 사용하여 아세톤만을 제거한 다음, 남은 수용액을 에틸아세테이트로 추출하였고, 건조시킨 후, \( 80 \% \) 메탄올 \( 1 \mathrm{ml} \) 에 용해하였다.</p> <h2>항균 활성 조사</h2> <p>C. albicans, P. aeruginosa 또는 S. aureus가 도말된 평판배지 위에 배양추출액 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 를 함유한 \( 6 \mathrm{mm} \) 종이디스크(Advantec MFS, Japan)를 올려놓았다. 대조구로는 DMSO를 함유한 종이디스크를 사용하였다. \( 32^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2일간 배양한 후, 생장저지환의 지름을 측정하여 항균활성을 측정하였다.</p> <h2>HPLC 분석</h2> <p>배양추출물의 HPLC 분석은 Zorbax SB-C18 컬럼 \( (4.6 \mathrm{mm} \times 150 \mathrm{mm}, 5 \mu \mathrm{m} \) )을 장착한 Agilent \( 1260 \mathrm{VL} \) Infinity Series HPLC 시스템을 사용하였다(Agilent Technologies, USA). 이동상 A와 B는 각각 \( 0.1 \% \) formic acid를 함유한 증류수와 acetonitrile이었으며, 유속은 \( 0.2 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 이었고, 처음 30분간 \(5 \sim 100\%\) B 용매 기울기, 30~40분에는 \( 100 \%\) B 용매, 그리고 40~50분에는 \(5\%\) B 용매로 용리하였다. 용리액은 \( 254 \mathrm{nm} \) 에서 검출하였다.</p>