곤약을 첨가하거나 첨가하지 않은 LB 배지에서 36시간 동안 배양하면서 mannanase 생산성과 성장도를 조사한 결과, 곤약을 첨가한 배지에서는 12시간 배양 후 155.7 U/ml로 급격하게 증가하였고 18시간 이후 265 U/ml의 최대 생산성을 보였다. SDS-PAGE를 수행한 결과 38 kDa의 분자량을 보이는 mannanase 활성 단백질이 관찰되었다.
<p>배양시간에 따른 mannanase 생산성을 조사하기 위해 곤약 \( (4 \%) \)을 첨가하거나 첨가하지 않은 LB 배지에서 \( 36 \)시간 동안 배양하면서 mannanase 생산성과 성장도를 조사한 결과, 곤약을 첨가하지 않은 LB 배지에서 \( 9 \)시간 배양 후에 균의 성장이 최대에 이르렀으나 효소 생산성은 \( 1 \mathrm { ~U } / \mathrm { ml } \) 미만으로 매우 낮았다. 곤약을 첨가한 배지에서는 배양시간이 \( 9 \)시간이 되었을 때 mannanase 생산성이 \( 10.2 \mathrm { ~U } / \mathrm { ml } \) 이었으나, \( 12 \)시간에서는 \( 155.7 \mathrm { ~U } / \mathrm { ml } \)로 급격하게 증가되었고 \( 18 \)시간 이후에는 약 \( 265 \mathrm { ~U } / \mathrm { ml } \) 수준의 최대 생산성을 보였으며 \( 36 \) 시간까지 그 생산성이 유지되었다(Fig. \( 1 \)). 한편 LB 배지에서 측정한 배양균액의 흡광도가 \( 12 \)시간 이후부터는 지속적으로 감소하는 것으로 보아 사멸기에 이른 것으로 판단되었는데, 곤약을 첨가한 배지에서는 배지의 점도가 너무 높아 배양초기에 균이 원활하게 성장하지 못하였을 것을 감안하면 사멸기에 이르는 시간이 LB 배지에서 보다 오래 걸릴 것으로 여겨졌다.</p> <p>배양 상등액을 ammonium sulfate로 처리하여 제조한 조효소액을 사용하여 SDS-PAGE를 수행한 후 활성염색을 실시한 결과 Fig. \( 2 \)에 보인 바와 같이 분자량이 약 \( 38.0 \mathrm { ~kDa } \) 정도로 추정되는 mannanase 활성 단백질이 관찰되었으며 이는 SDS-PAGE에서 \( 38-40 \) kDa의 분자량을 보인 B. subtilis \(WY34 \), B. subtilis \( BCC41051 \)과 B. subtilis WL- \( 3 \)의 mannanases와 유사하다고 하겠다.</p> <h1>Mannanase의 반응특성</h1> <p>조효소액을 사용하여 반응 \( \mathrm { pH } \)와 온도가 효소활성에 미치는 영향을 조사하기 위해 반응온도를 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 고정하고 여러 \( \mathrm { pH } \)에서 mannanase 활성을 측정한 결과 \( \mathrm { pH~ } 5.5 \)에서 최대 활성을 보였으며 \( \mathrm { pH~ } 5.0-6.5 \) 범위에서 최대활성의 \( 70 \% \) 이상의 활성을 나타내었다(Fig. \( 3 \)). 또한 반응액의 \( \mathrm { pH } \)를 \( 5.5 \)로 하고 반응 온도에 따른 효소의 활성을 조사한 결과 \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 활성이 가장 높게 나타났다(Fig. \( 4 \)). 따라서 YB- \( 1401 \)의 mannanase는 반응온도 \( 50-70 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 반응 \( \mathrm { pH~ } 5.0-7.0 \)의 범위에서 최대활성을 보이는 대부분의 Bacillus속 균주 유래 mannanases와 유사한 것을 알 수 있다. 반면 B. subtilis BS \( 5 \), B. subtilis G \( 1 \)과 B. halodurans PPKS- \( 2 \)로부터 유래된 mannanases는 최적 반응온도가 낮거나 알칼리 조건에서 최대 활성을 보이는 것으로 각각 보고되었다.</p>