인체 피하지방 조직의 줄기세포를 배양하여 배양액을 확보하였다. 이 배양액을 활용하여 항체 발현 분석, PGF2\alpha\(\alpha\)의 농도 측정, siRNA에 의한 FP 유전자의 발현감소여부를 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>시약</h2><p>본 연구에 사용된 \(\alpha\)-minimum essential medium (\(\alpha\)-MEM), Hank's buffered salt solution, trypsin, fetal bovine serum, Lipofectamine 2000은 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)사에서 구입하여 사용하였다. 인간유래 재조합 TGF-\(\beta\)1 단백질은 R\(\&\)D (Minneapolis, MN, USA)사에서 구입하여 사용하였다. PGF2\(\alpha\) enzyme immunoassay (EIA) kit, U46619, SQ29548은 Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA)사에서 구입하여 사용하였다. Trizol, LPS, lysophosphatidic acid (LPA), Ki16425와 \(\alpha\)-SMA, calponin에 대한 항체는 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)사에서 구입하여 사용하였다. Smooth muscle-myosin heavy chain (SM-MHC), smoothelin, GAPDH 항체는 Millipore (Billerica, MA, USA)사에서 구입하여 사용하였다.</p><h2>세포 배양법</h2><p>인체 피하지방 조직을 수술적 방법을 통하여 환자에게서 채취하였으며 부산 대학교 병원 IRB에 의해 승인 받은 환자의샘플을 이용하였다. 인체 중간엽 줄기세포를 분리하기 위하여 환자의 지방 조직을 멸균된 생리식염수에 세 번 세척한 후 collagenase type Ⅰ을 처리하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 한 시간 방치한다. \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리 한 후 상층액은 버리고, 침전물만 모아 \( 10 \% \) fetal bovine serum이 포함된 \(\alpha\)-MEM배지에 배양한다. 세포 밀도가 \( 70 \% \) 정도가 되면 계대 배양을 하도록 한다. Raw 264.7 대식세포는 \( 10 \mathrm{~mm} \) petri-dish에서 \( 10 \% \) fetal bovine serum가 포함된 DMEM배지에 배양한다. \( 80 \% \) 밀도가 되면 계대 배양 하도록 한다. LPS를 처리하여 활성화된 대식 세포로부터 배양액을 얻기 위해서 대식세포에 \( 2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도의 LPS를 함유한 DMEM배지를 48시간 동안 처리한 후 배지를 \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 5분간 원심분리하여 상층액을 채취한다. 이런 과정을 통해 확보된 LPS 배양액은 e-tube에 분주한 후 실험을 위해 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동고에 저장하여 보관한다.</p><h2>Western blot analysis</h2><p>\( 60 \mathrm{~mm} \) dish에 \( 5 \times 10^{4} \) 개수의 중간엽 줄기세포를 \( 50 \% \) 정도의 밀도가 되도록 배양하였다. 기존의 배양액을 제거하고 LPS 배양액을 농도 별로 처리하여 96시간 동안 배양하였다. 세포내 단백질 발현양을 조사하기 위해 세포 배양액을 제거한 후 \( 1 \mathrm{ml} \)의 lysis buffer를 넣고 세포를 scraper로 긁어 모아 초음파 분쇄기를 이용해 세포를 파쇄한다. 세포 용해액을 e-tube에 옮긴 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 15,000 \mathrm{rpm} \)으로 15분간 원심분리 하여 단백질을 분리하였다. 추출한 단백질은 정량하여 \(5\times\) sample buffer와 함께 섞어 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 가열한 후 \( 10 \% \) SDS-PAGE gel로 전기 영동하고, nitrocellulose membrane위로 전기적으로 이동시켰다. 다양한 일차 항체와 반응시키고, 이차 항체를 각각 반응시켰다. 항체들의 발현 분석은 horseradish peroxidase가 결합된 이차항체에 의해 발현되는 ECL western blot analysis 시스템을 이용하여 결과를 분석하였다.</p><h2>PGF2\(\alpha\) 측정법</h2><p>Raw 264.7 대식세포를 \( 10 \mathrm{~mm} \) petri-dish에서 \( 80 \% \) 밀도가 되도록 키운다. 배양액을 버리고, Hank's balance salt solution으로 두 번 세척한 후, \( 2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) LPS를 넣거나 넣지않은 \(10 \mathrm{ml} \) DMEM배지를 각각 48시간 배양한다. 48시간 이후 배양액을 \( 15 \mathrm{ml} \) tube에 모은 뒤 원심분리 하여 상층액을 회수한다. PGF2\(\alpha\)의 농도 측정은 PGF2\(\alpha\) EIA Kit를 이용하여 LPS 배양액에 존재하는PGF2\(\alpha\)의 농도를 측정하였다. 각 시료들은 ELISA reader에서 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서의 O.D.값을 측정하였다.</p><h2>Transfection with small interference RNA (siRNA)</h2><p>중간엽 줄기세포를 회수하여 세포수가 \( 1 \times 10^{5} \)가 되도록 분주하여 \( 1.5 \mathrm{ml} \) tube에 모아 둔다. siRNA와 Lipofectamine 2000를 섞어 15분간 상온에서 방치한 후 \( 100 \mathrm{nM} \) 농도로 중간엽 줄기세포에 처리한다. 4시간 후 \( 10 \% \) fetal bovine serum이 포함된 \(\alpha\)-MEM으로 교환해준 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 조건에서 24시간 동안 배양한다. siRNA에 의한 FP 유전자의 발현감소여부는 RT-PCR 방법으로 확인하였다.</p><h2>RT-PCR</h2><p>Total cellular RNA는 TRIzol 시약을 사용하여 제조사의 지침에 따라 분리하였다. 분리된 total RNA \( 2 \mu \mathrm{g} \)에 200 \(\mathrm{UM}\)-MLV reverse transcriptase, \( 0.5 \mu \mathrm{g} \) Oligo (dT) 15 primer(Promega, Madison, WI)를 섞어 cDNA를 제조하였다. cDNA는 아래의 primer들을 이용한 PCR 방법으로 증폭되었다. GAPDH 5'-TCCATGACAACTTTGGTATCG-3' (sense), 5'-TGTAGCCAAATTCGTTGTCA-3' (anti-sense) ; prosta-glandin \( \mathrm{F}_{2 \alpha} \) receptor (FP) 5'-CTTCATGACAGTGGGAATCT(sense), 5'-CCAAAAATACTGCAAAGGAC (anti-sense).</p><h2>통계분석</h2><p>반복실험 결과는 mean\( \pm \)SD로 나타내었으며 다변량분석결과(multivariate data)의 경우 ANOVA test를 이용해 유의성 여부를 판정하였다. \(p\)값이 0.05 이내인 경우 유의성이 있다고 판정하였다.</p>