본 논문에서는 BiP과 Grp 170 에 대한 BAP의 결합특이성, BAP의 ADP 의존적 BiP과의 결합 등에 대해 연구를 진행하였다. BiP과 Grp 170 에 대한 BAP의 결합특이성 실험결과 소포체 내에 존재하는 Hsp70 homologue인 BiP과 Grp170은 ATPase domain에 상동성을 가지고 있으나 BAP은 Grp170과는 결합을 하지 않는다는 것을 확인하였고 ATP에 의해 BiP-heavy chain 복합체가 분리 되어 면역글로불린 heavy chain만이 protein A와 함께 침전 된 것을 보여주어 recombinant BiP이 기능적으로 정상 단백질임을 확인하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>BiP과 Grp 170 에 대한 BAP의 결합특이성</h2> <p>소포체 내에는 BiP 외에도 다른 Hsp70 homologue인 Grp170이 존재한다. 두 chaperone은 같은 Hsp70 family로서 ATPase domain의 상동성이 높다. 따라서 BAP이 BiP에 결 합하듯이 Grp170에도 결합할 가능성이 높다고 생각할 수 있다. Grp170을 BAP과 함께 HEK293 cell에 co-transfection시키고 세포내에서 형성되었을 단백질 복합체를 안정하게 분리하기 위하여 \( \left[{ }^{35} S\right] \) 로 metabolic labeling을 한 후 DSP를 사용하여 cross-linking을 하고 세포를 파쇄하였다. 토끼 anti-Grp170과 anti-BAP 항체를 사용하여 면역침강되어진 단백질들을 SDS-PAGE로 분리하고 nitrocellulose membrane에 transfer하여 그 membrane을 X-ray film에 노출시켜 BAP과 Grp170이 서로 결합하는지를 알아보았다(Fig. 1). Negative control로 사용한 벡터만을 transfection 한 경우(Fig. 1A. lane 1) endogenous Grp170이 아주 희미하게 나타났으며, Grp170과 BAP만을 각각 transfection시킨 후 anti-Grp170과 anti-BAP 항체를 각각 사용하여 면역침강 하였을 경우(lane 2, 5) Grp170과 BAP이 침강되었다. Grp170과 BAP을 함께 co-transfection시켜 얻은 세포파쇄액을 anti-Grp170 또는 anti-BAP 항체를 각각 사용하여 침강하였을 경우 Grp170과 BAP이 동시적으로 나타나지 않았다(lane 3,4). Fig. 1B에서 보는 것과 같이 western blot 하였을 때 co-transfection한 세포에서 Grp170과 BAP의 발현이 정상임을 확인할 수 있었다. 따 라서 소포체 내에 존재하는 Hsp70 homologue인 BiP과 Grp170은 ATPase domain에 상동성을 가지고 있으나 BAP은 Grp170과는 결합을 하지 않는다는 것을 알 수 있었다. 이는 Grp170의 ATPase는 아마도 BAP과는 다른 조절인자가 필요하다는 가능성을 열어두며 Grp170과 BiP의 기능 및 조절작용이 다름을 생각할 수 있다.</p> <h2>BAP의 ADP 의존적 BiP과의 결합</h2> <p>3개의 histidine이 BiP의 N-terminus에 연결된 recombinant BiP 단백질을 \( \mathrm{Ni}^{2+} \)-agarose bead에 홉착시켜 ATP와 ADP를 BiP의 농도보다 과량으로 첨가하여 BiP이 ATP 또는 ADP와 포화상태로 결합하도록 하였다. ATP-BiP 또는 ADP-BiP에 COS-1 세포파쇄액을 첨가하여 세포내에 존재하 는 BAP이 ATP 또는 ADP가 결합된 어떤 BiP과 더 잘 결합 하는지를 조사하였다. \( \mathrm{Ni}^{2+} \)-agarose bead에 홉착된 단백질을 SDS-PAGE로 분리한 후 anti-BAP 항체를 사용하여 결합 된 BAP의 상대적 양을 비교하였다. \( \mathrm{Ni}^{2+} \)-agarose bead에 흡착된 BiP의 양은 비슷하나 대조적으로 포화 ADP-BiP의 경우가 ATP-BiP의 경우보다 더 많은 BAP과 결합되었다(Fig. 2). 이 결과는 BAP은 BiP에 결합된 ADP를 ATP와 치환하기 위하여 ADP-BiP과 더 잘 결합하는 것으로 생각된다. 이 실험에서 비특이적 단백질이 \( \mathrm{Ni}^{2+} \)-agarose bead에 고농도로 흡착 되었기 때문에 검출된 것으로 여겨진다.</p> <h2>In vitro에서 BAP는 BiP로부터 unfolded 면역글로불린 heavy chain을 해리</h2> <p>Lymphoma Ag8(8) 세포는 면역글로불린 light chain을 생산하지는 못하나 heavy chain을 생산하므로 BiP-heavy chain 복합체를 형성한다. 이 BiP-heavy chain 복합체는 protein A-agarose bead를 사용하여 용이하게 분리할 수 있다. Ag8(8) 세포에서 분리된 BiP-heavy chain 복합체에 ATP, BAP, BiP의 ATP 가수분해율을 촉진시키는 것으로 알려진 ERdj3과 ERdj4를 첨가하여 BiP과 heavy chain 결합의 변화를 보았다. Fig. 3에서 나타난 것처럼 조절인자를 넣지 않은 경우(lane 1)에서는 보고된 결과와 동일하게 BiP과 heavy chain이 복합체를 유지하고 있었다. Negative control로 사용된 bovine serum albumin (BSA)을 넣어준 경우(lane 2) 역시 동일하게 두 개의 band가 나타나 BiP-heavy chain complex 에 아무런 변화가 없음을 알 수 있었다. ATP를 첨가하는 경우 BiP이 ATP와 결합을 하면 결합되어 있던 기질을 방출하는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서도 기존의 보고된 결 과와 동일하게 ATP에 의해 BiP-heavy chain 복합체가 분리 되어 면역글로불린 heavy chain만이 protein A와 함께 침전 된 것을 보여주어 recombinant BiP이 기능적으로 정상 단백 질임을 알 수 있다(lane 4). Hsp70의 ATP 가수분해 촉진조절 인자로 알려진 DnaJ homologue 단백질은 가수분해 산물인 ADP와 Hsp70과의 결합을 안정화시켜 Hsp70과 기질 단백질 복합체를 유지시킨다고 보고되어 있다. ER에 존재하는 DnaJ homologue 단백질인 ERdj3와 ERdj4는 최근에 발견되어 BiP의 ATP가수분해를 촉진시키는 기능을 가진 것으로 알려져 있으나 BiP과 기질단백질 복합체에 끼치는 영향에 관한 연구 결과는 보고되어 있지 않다. BiP-heavy chain complex에 ERdj3와 ERdj4를 넣어준 경우(lane 5와 6) BiP-heavy chain complex가 유지되어 기존의 보고된 결과와도 일치하였다. 그러나 ATP가 존재하지 않고 조절인자 BAP을 첨가한 경우(lane 3) heavy chain만이 protein A에 의해 침전되어 BiP이 반응기간 동안 해리된 것을 알 수 있다. 본 실험에서 ATP에 의한 BiP 해리와 동일한 결과가 BAP에 의해 얻어진 것은 BAP이 in vitro에서 BiP을 unfolded 단백질인 heavy chain으로부터 해리시켰다는 것을 뜻한다. 이 같은 결과를 확인하기 위하여 COS-1 세포에서 동일하게 실험하였 다(Fig. 4). Wild type BiP 또는 ATPase 기능이 상실된 돌연변이 BiP (T37G BiP)[7,18]을 면역글로불린 heavy chain과 함께 COS-1 세포에서 발현시켜 BiP-heavy chain complex를 형성되도록 하고 Ag8(8)세포와 동일한 과정으로 BiP-heavy chain complex를 분리하였다. WT BiP-heavy chain complex 에 아무런 조절인자를 넣지 않았거나 BSA를 넣은 경우 BiP과 heavy chain의 두 밴드가 나타나 BiP-heavy chain 복합체에 아무런 영향을 미치지 않았다. ERdj3와 ADP 역시 BiP과 heavy chain의 결합에 영향을 주지 않았다. 그러나 BAP과 ATP를 첨가하였을 경우 Ag8(8)의 결과와 비슷하게 결합된 BiP의 양이 감소된 것으로 보아 상당한 양의 BiP이 복합체로부터 해리되었음을 알 수 있었다. T37G BiP은 ATPase의 기능 상실과 핵산에 따른 구조변화가 일어나지 않아 기질을 해리할 수 없는 돌연변이로서[7, 18], BSA와 ERdj3 첨가 시에도 wild type과 마찬가지로 복합체에 아무런 변화가 없었으며, ATP에 의해서도 BiP의 해리가 이루어지지 않았다. 그러나 흥미롭게도 BAP에 의해 T37G BiP이 heavy chain으로부터 부분적으로 해리되었다. 이는 BAP이 T37G BiP에 결합되었을 때 약한 T37G BiP의 구조적 변화가 일어나며, 이 구조적 변화로 인하여 T37G BiP이 heavy chain과의 결합력이 약화된 것으로 추정되나 추가적인 실험을 통하여 밝혀져야 한다고 생각한다. 본 연구 결과와 알려져 있는 BiP의 ATP 분해 cycle과 종합하여 새로운 BiP의 ATP 분해 cycle[3]을 BAP과 ERdj 기능을 포함시켜 Fig. 5에 제시하였다. BiP이 ATP와 결합하게 되면 unfolded substrate를 인식하여 약한 결합의 unfolded substrate-BiP-ATP 복합체를 이루게 된다(step 1). ATP 가수분해 촉진인자인 ERdj3가 BiP의 ATP에서 ADP로 가수분해를 촉진시켜 unfolded-BiP-ADP-ERdj3의 복합체를 형성하게 된다(step 2). 이 복합체는 단단한 결합을 하고 있으며 여기에 BAP이 첨가되면 ADP는 방출이 된다(step 3). 방출된 ADP는 ATP로 치환이 일어나게 되면 BAP은 역할을 다하여 방출되고 BiP은 새로운 ATP와 결합을 하게 된다. (step 4). ADP가 방출이 되면서 ERdj3 역시 방출될 것이라 생각되지만 아직 실험적 data는 존재하지 않는다. ATP 치환이 일어날 때 ERdj3가 방출이 되고 단백질 folding이 되는 과정이 ATP로 치환됨과 동시에 일어나는지 치환되기 전인지 후인지는 아직 불확실하다. 본 연구 결과 BAP은 ATP보다 ADP가 결합되어 있는 BiP과 더 잘 결합을 하는 것으로 나타났으며, 이는 BAP이 ADP를 방출하는 기능을 수행하기 위한 것으로 생각된다. In vitro에서 BAP은 BiP에 결합되어 있는 unfolded 단백질인 면역글로불린 heavy chain을 BiP으로부터 해리시킴으로서 세포내에서 단백질의 성숙에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.</p>