독도의 동도와 서도에서 채취한 식물 시료의 뿌리부분에서 내생진균을 분리하여 배양하였다. 동결건조를 수행한 내생진균은 DNeasy Plant mini kit (QIAgen)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였고, universal primer인 ITS1과 ITS4로 rDNA-ITS영역을 증폭하였으며, 증폭된 단편들을 QIAquick PCR purification kit로 정제하여 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit와 ABI 310 DNA sequencer를 이용하여 분석하였다.
<p>독도의 동도와 서도에서 채취한 식물 시료의 뿌리부분을 절단하여 흙을 모두 제거하고, 계면활성제인 Tween 80을 첨가하고 10분간 교반 한 후에 증류수로 세척하였다. 그리고 과염소산(Perchloric acid) \( 1 \% \)에 10 분간 2회 교반 후, 증류수로 세척하였으며 \( 3 \sim 4 \mathrm { ~cm } \)로 절단하여 수분을 제거하였다. 그리고 내생진균를 분리하기 위하여 Hagem medium \( (0.5 \% \) Glucose, \( 0.05 \% \) \( \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } , 0.05 \% \) \( \mathrm { MgSO } _ { 4 } \cdot 7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } , 0.05 \% \) \( \mathrm { NH } _ { 4 } \mathrm { Cl } , 0.05 \% \) \( \mathrm { FeCl } _ { 3 } , 0.1 \% \) Streptomycin, \( \mathrm { pH } \) 5.6) 를 사용하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다. 그리고 PDA medium \( (0.4 \% \) Potato peptone, \( 2 \% \) Glucose, \( 1.5 \% \) Agar)에 옮겨 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 조건에서 계대배양하여 순수 분리하였다.</p> <p>독도식물 뿌리에서 분리한 내생진균를 배양하기 위하여 Czapek's liquid medium \( (1 \% \) Glucose, \( 1 \% \) Bacto-peptone, \( 0.1 \% \) \( \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } , \) \(0.05 \% \) \( \mathrm { KCl } , \) \( 0.05 \% \) \( \mathrm { MgSO } _ { 4 } \cdot 7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } , 0.001 \% \) \( \mathrm { FeSO } _ { 4 } \cdot 7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } , \mathrm { pH } \) 7.3)에 접종하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 180 \mathrm { rpm } \)의 조건으로 7일간 진탕 배양하였으며 filter paper를 사용하여 배양액을 여과하였다. 그리고 배양액은 bioassay시험을 위하여 5일 동안 동결건조 후에 30배 농축하였다. 동결건조를 수행한 내생진균은 DNeasy Plant mini kit (QIAgen)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 추출된 genomic DNA는 universal primer인 ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG \( \left . \mathrm { G } -3 ^ {\prime } \right ) \)과 ITS4 (5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3')를 사용하여 rDNA-ITS영역을 증폭하였다. PCR수행 조건은 최종농도 \( 10 \) \( \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } ( \mathrm { pH } 8.5), 40 \) \( \mathrm { mM } \) \( \mathrm { KCl } , 1.5 \) \( \mathrm { mM } \) \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } , 200 \) \( \mathrm { nM } \) \( \mathrm { dNTPs } \)이고, \( 10 \) \( \mathrm { pmol } \)의 primer와 0.1 unit의 Ex-Taq DNA polymerase (Takara)를 사용하였으며, \( 50 \mathrm { ul } \)로 반응용량을 맞추어 사용하였다. 반응조건은 predenaturation \( \left (95 ^ {\circ } \mathrm { C } , 2 \mathrm { ~min } \right ) \), denaturation \( \left (95 ^ {\circ } \mathrm { C } , 30 \mathrm { sec } \right ) \), annealing \( \left (54.5 ^ {\circ } \mathrm { C } \right . \), \( 1 \mathrm { ~min } \) ), extension \( \left (72 ^ {\circ } \mathrm { C } , 1 \mathrm { ~min } \right ) \), total cycles (35 cycles), final extension \( \left (72 ^ {\circ } \mathrm { C } , 7 \mathrm { ~min } \right ) \)으로 수행하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 보관하였으며, 증폭된 \( \mathrm { PCR } \) 산물은 \( 1.5 \% \) Agarose gel에서 전기영동 후, \( \mathrm { EtBr } \) (Ethidium bromide)로 10 분 염색하여 UV transilluminator에서 밴드를 확인하였다. 그리고 증폭된 단편들은 QIAquick PCR purification kit (Qiagen Inc., Germany)를 사용하여 정제하였고, ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (PE Biosystems, USA)를 사용하였으며, 생산된 DNA 단편들은 ABI 310 DNA sequencer (Perkin elmer, New Jersey, USA)를 사용하여 분석하였다. 그리고 분석된 내생진균 종들 간에 계통분석은 MEGA 4.1프로그램 Neighbor-Joining (1000 bootstrap replicates)방법을 수행하여 분석하였다.</p>