Taxus chinensis 잎에서 추출한 세포주를 이용해 식물 세포 배양액을 준비하였다. 이 세포주는 \( 24^{\circ} \mathrm{C} \)의 암조건에서 \( 150 \mathrm{rpm} \)으로 교반하며, 성분으로는 수정된 Gamborg's B5 배지, \( 30 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) sucrose, \( 10 \mu \mathrm{M} \) NAA (naphthalene acetic acid), \( 0. 2 \mu \mathrm{M} \) BA (6-benzylamino purine), \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) casein hydrolysate, \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{L} 2 \) -[N-morpholino]ethansulfonic acid (MES)를 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물재료와 배양조건</h2> <p>본 실험에 사용된 식물세포배양액은 Taxus chinensis의 잎으로부터 얻은 세포주(cell line)를 이용하여 배양하였다. Taxus chinensis로부터 기원된 현탁액 세포는 \( 24^{\circ} \mathrm{C} \) 암조건에서 \( 150 \mathrm{rpm} \) 으로 교반하여 배양하였다. 현탁(suspension) 세포는 수정된 Gamborg's B5 배지, \( 30 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) sucrose, \( 10 \mu \mathrm{M} \) NAA (naphthalene acetic acid), \( 0.2 \mu \mathrm{M} \) BA (6-benzylamino purine), \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) casein hydrolysate, \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{L} 2 \) -[N-morpholino]ethansulfonic acid (MES)에서 배양하였다. 세포 배양은 2 주마다 새로운 배지로 갈아주었으며 생산과 배양을 연장시키기 위해 7 일과 21 일 째 되는 날에 \( 1-2 \% \) 의 maltose를 첨가해 주고 elicitor로서 배양 초기에 \( 4 \mu \mathrm{M} \) 의 \( \mathrm{AgNO}_{3} \) 를 첨가해 주었다[3]. 식물세포배양(생물반응기 부피: \( 32 \mathrm{M}^{3} \), 배양 부피: \( 25 \mathrm{M}^{3} \) ) 후 배양액으로부터 \( 4,500 \mathrm{~g} \) decanter (Westfalia, CA150 Claritying Decanter)와 10,000 g 고속원심분리기( \( \alpha \)-Laval, BTPX205GD-35CDEEP)를 이용하여 식물세포와 세포조각(cell debris)을 연속 조업으로 회수하였다. 회수한 식물 세포와 세포조각(cell debris)을 합하여 바이오매스라 하였다. 본 연구에 사용된 바이오매스는 (주)삼양제넥스로부터 제공받았다.</p>\<h2>Paclitaxel 분석</h2> <p>Paclitaxel 함량 분석을 위해 HPLC system (Waters, USA)과 Capell Pak \( \mathrm{C}_{18}(250 \times 4.6 \mathrm{~mm} \), Shiseido, Japan) 칼럼을 사용하였다. 이동상은 아세토니트릴과 증류수 혼합 용액(35/65-65/35, v/v, gradient mode)을 flow rate \( 1.0 \mathrm{ml} / \) \( \min \) 으로 흘려주었다. 시료 주입양은 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 이며 \( 227 \mathrm{~nm} \) 에서 \( \mathrm{UV} \) 에 의해 검출하였다. HPLC 분석은 표준정량곡선을 이용하였으며 표준시료는 Sigma-Aldrich 제품(순도: 95\%)을 사용하였다.</p> <h2>흡착제 처리를 위한 시료준비</h2> <p>식물세포배양액으로부터 회수한 바이오매스와 메탄올의 비율을 \( 1 / 1(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 로 하여 실온에서 30 분 동안 추출하여 여과하고, 바이오매스에 새로운 메탄올을 첨가하여 동일한 방법으로 4 회 반복하여 추출을 수행하였다. 추출 여액을 모아 농축기(CCA-1100, EYELA, Japan)에서 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \), 감압상태에서 농축(원액의 \( 30 \%) \) 하고 농축액에 메틸렌 클로라이드를 첨가(농축액의 \( 25 \% \) )하고 실온에서 30 분 동안 액-액 추출을 3 회 반복 수행하였다. 액-액 추출 후 상 분리(phase separation)를 통해 극성불순물은 상층인 메탄올 층으로 제거하고, paclitaxel은 하층인 메틸렌 클로라이드 층으로 회수하여 실온, 감압상태에서 농축/건조하였다. 건조된 시료를 흡착제 처리에 사용하였다. 흡착제 처리에 사용된 시료의 순도는 \( 10.6 \% \) 이었다.</p>