BL21이 형질전환된 \( 1.5 \mathrm{~L} \mathrm{~TB} \) 배지를 배양하여 14.2g의 균을 얻고, 초음파 분쇄 후 100ml(9.8mg/ml)의 crude extract를 얻었다. N-말단 hexahistidine을 포함한 표적 단백질인 human CGL은 nickel chelating column에 imidazole (1M)을 흘려주어 68.8mg의 단백질을 용출하고 TEV protease 처리 후 다시 nicke chelating column에 흡착하여 10.2mg의 human CGL 단백질을 얻었다. 또한 기질 L-SeMet의 human CGL 효소반응 생성물은 CG/MS를 통해 분석했따.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Human CGL 단백질의 발현과 정제</h2> <p>\( 1.5 \mathrm{~L} \mathrm{~TB} \) 배지(50 ug/ml kanamycun 포함)에 형질전환 된 BL21을 배양하여, \( 14.2 \mathrm{~g} \) 의 균을 얻었고, 초음파 분쇄 후 원심분리하여 \( 100 \mathrm{ml}(9.8 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 의 crude extract를 얻었다. 표적 단백질인 human CGL은 N-말단에 hexahistidine을 포함하고 있어 nickel과 강한 친화성을 갖게 된다. 균의 crude extract를 흡착시킨 nickel chelating column에 고농도의 imidazole \( (1 \mathrm{M}) \) 를 흘려주어 \( 68.8 \mathrm{mg} \) 의 단백질을 용출하였고, 이 분획을 TEV protease 처리 후 다시 nickel chelating column chromatography를 수행하여 human CGL에서 분리된 hexahistidine을 제거하였다. Hexahistidine이 제거된 단백질은 nickel과의 친화성이 낮아져 세척단계인, 낮은 농도의 imidazole ( \( 60 \mathrm{mM}) \) 에 의해 용출되고, 총 \( 14.45 \mathrm{mg} \) 의 human CGL 단백질을 얻었다. 각 단계의 시료를 이용하여 SDS-PAGE를 수행한 결과 첫 번째 chromatography 수행 이후의 시료에서 \( 47 \mathrm{kDa} \) 정도의 단일 띠를 관찰할 수 있었고, hexahistidine 제거 후 \( 44 \mathrm{kDa} \) 정도로 기존 문헌과 일치하는 크기의 띠를 관찰할 수 있었다. 또한 SDS-PAGE에 서 polyvinylidene fluoride (PVDF) 막으로 옮겨진 단백질들을 human CGL과 특이한 결합을 하는 항체로 처리하고 발색시킨 결과 형질전환된 균에서 human CGL이 과발현 되었고, nickel chelating column chromatography를 통해 human CGL이 순수하게 정제됨을 확인할 수 있었다. 정제된 단백질의 UV-visible 흡수 스펙트럼 측정에서 단백질 내의 tyrosine과 tryptophan에 의한 \( 280 \mathrm{~nm} \) 에서의 흡광과 단백질과 PLP 간의 Schiff base 결합으로 인한 \( 427 \mathrm{~nm} \) 에서의 흡광의 비가 \( 5.5: 1 \) 정도로 관찰되었고, 다른 \( \mathrm{UV} \)-visible 흡광이 관찰되지 않았다. 이는 보고된 자료의 \( 280 \mathrm{~nm} / 427 \mathrm{~nm} \) 흡광계수와 유사한 값이다. 따라서 정제 된 단백질과 PLP 간의 Schiff base 결합하고 있음을 의미하고, 순수하게 정제되었음을 나타낸다.</p> <h2>Methylselenol의 GC/MS 분석</h2> <p>\( \mathrm{CH}_{3} \mathrm{SeH} \) 는 불안정하므로 \( \mathrm{CH}_{3} \mathrm{SeH} \) 의 유도체를 준비하여 authentic 물질로 이용하였다(Fig. 3). 분석결과 \( 14.6 \mathrm{~min} \) 에서 단일 GC peak가 관찰되었고, MS 분석을 통하여 dinitrophenyl selenoether로 확인하였고, 이를 기준 물질로 사용하였다(Fig. 4A). 기질 L-SeMet의 human CGL 효소반응 생성물은 기준 물질과 동일하게 유도체화 하여 \( \mathrm{GC} / \mathrm{MS} \) 로 분석하였다(Fig. 4B).</p>