생촉매인 시료 R. toruloides SJ-4를 배양하기 위해 YPD 배지를 사용한다. 유기용매로는 생촉매 불활성이 적은 유기용매를 선정한다. 본 논문에서는 라세믹 phenyl oxirane를 사용하여 실험을 진행했다. 이후 Phenyl oxirane의 광학순도 값 및 수율 결정을 위해 가스크로마토그래피를 활용한다. 광학선택적 가수분해 반응기 구성을 할 수 있도록 Hollow-fiber membrane을 이용하여 항온조를 이용해 shell side를 통해 순환시킨다. 이후 세포 현탁액에 포함되어 있는 diol을 추출하여 제거한 뒤 희석 작업 진행 후 chiral GC를 통해 분석한다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포 배양</h2><p>생촉매인 R. toruloides SJ-4를 배양하기 위한 배지로는 \( 1 \%\)\((\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) yeast extract, \( 1 \%\) \((\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) glucose를 포함하는 YPD 배지(Peptone \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{l}\), \(\mathrm{NaCl} 2 \mathrm{~g} / \mathrm{l}\), \(\mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.147 \mathrm{g} / \mathrm{l}\), \(\mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4} 1.3 \mathrm{~g} / \mathrm{l}\), \(\mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 4.4 \mathrm{~g} / \mathrm{l}\)를 사용하였으며, 배양온도 \( 27^{\circ} \mathrm{C}\), \(250 \mathrm{rpm} \)에서 48 시간 진탕 배양하였다. 배양된 세포는 원심분리 후 \( 100 \mathrm{mM} \) phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 8.0\) )로 두 번 세척 후 생촉매로 사용하였다.</p><h2>입체선택성 가수분해반응</h2><p>세포 \( 2 \mathrm{~g} \) (wet cell 기준, dry cell로 환산시 약 \( 23 \mathrm{mg} \) )을 \( 8 \mathrm{ml} \) 의 \( 100 \mathrm{mM} \) phosphate buffer(\(\mathrm{pH} 8.0\))에 현탁시킨 후 \( 20 \mathrm{mM} \) 농도가 되도록 라세믹 phenyl oxirane를 주입하였다. 반응기로는 screw-cap vial을 사용하였으며, \( 35^{\circ} \mathrm{C}\), \(250 \mathrm{rpm} \)의 진탕배양기에서 30분 동안 가수분해 반응을 실시하여 초기반응속도를 결정하였다. 반응 종료 후 반응액을 cyclohexane으로 추출한 후, 유기용매 층을 GC로 분석하여 초기 가수 분해속도와 광학순도(enantiomeric excess, \( \mathrm{ee}= \) \( [S-R] /[S+R] \times 100 \%) \)를 결정하였다.</p><h2>유기용매 선정</h2><p>생촉매 불활성이 가장 적은 유기용매를 선정하기 위하여 여러 종류의 유기용매를 \( 20 \%\)\((\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)으로 첨가한 반응용매에서 라세믹 phenyl oxirane 기질에 대한 입체선택적 가수분해 반응을 실시하였다. 또한, \( 20 \%\)\((\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) cosolvent 시스템에서 일정 시간 간격으로 EH 활성을 측정하여 유기용매 및 수용액 시스템에서의 EH 활성 안정성을 평가하였다.</p><h2>Chiral GC 분석</h2><p>Phenyl oxirane의 광학순도 값 및 수율 결정을 위한 GC 분석은 불꽃이온 검출기(FID)가 장착된 가스크로마토그래피를 사용하였다. 분석용 column으로는 silica cyclodextrin capillary \( \beta \)-DEX \( 120(30 \mathrm{~m} \) length, \( 0.25 \mathrm{~mm}\) ID, and \( 0.25 \mu \mathrm{m}\) film thickness)를 사용하였다. 이동가스로 질소를 사용하였으며 split ratio는 \(1:100\), flow rate는 \( 0.5 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \)으로 \( 1 \mu \mathrm{l} \)의 시료를 주입하여 분석하였고, column, injector, detector의 온도는 각각 100, 220, 220\(^{\circ} \mathrm{C} \)였다.</p><h2>광학선택적 가수분해 반응기 구성</h2><p>사용한 Hollow-fiber membrane (diameter \( 200 \mu \mathrm{m} \), length \( 21 \mathrm{~cm} \))의 총 표면적은 약 \( 1.0 \mathrm{~m}^{2} \)이며, housing은 acrylonitrile-butadiene-styrene(ABS) 공중합체로 되어있다. 세포 현탁액 \( (10 \mathrm{~g} \) DCW)을 포함한 \( 100 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer는 항온조를 이용하여 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지시키면서 \( 60 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \)의 속도로 hollow-fiber membrane의 shell side를 통해 순환시켰다. 라세믹 phenyl oxirane 기질은 선정된 유기용매에 녹인 후 hollow-fiber membrane의 lumen side에서 counter-current로 \( 30 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \)의 속도로 순환시켰다 (Fig. 1에서 왼쪽 hollow-fiber 반응기로만 시스템을 구성한 경우). 가수분해반응에서 생기는 diol을 제거하기 위하여 같은 모듈의 hollow-fiber membrane을 직렬로 연결하여 사용하였다 (Fig. 1에서 왼쪽 및 오른쪽 hollow-fiber 반응기 모두로 구성한 경우). Diol 추출용 \( 100 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 8.0\), \(160 \mathrm{ml}) \)를 두 번째 hollow-fiber membrane의 lumen side로 흘려주어 세포 현탁액에 포함되어 있는 diol을 추출하여 제거하였다. 광학활성 phenyl oxirane의 광학순도 및 수율 측정을 위하여 일정한 간격으로 유기용매상의 샘플 \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 채취하여 10배 정도 희석시킨 후 chiral GC로 분석하였다.</p>