차별화 선별된 클론의 전체 염기서열 결정을 위해 3'-RACE PCR를 사용하였다. PDI 전체 cDNA 유전자를 확보하기 위해 touch down PCR을 수행하고 결과물을 pGEM-T 벡터에 클로닝하였다. 이후 얻어진 염기서열의 상동성을 분석하고 GenBank에 등록하였다. 차별화 클론의 전사체 검정을 위해 정상 배양세포주와 스트레스 유도제 및 호르몬이 처리된 배양 세포주로부터 total RNA를 분리하였다.
<h2>RACE-PCR</h2><p>차별화 선별된 클론의 전체 염기서열을 결정하기 위하여 Clontech 사의 Marathon cDNA Amplification Kit를 사용하여 3'-Rapid Amplication of cDNA ends (RACE) PCR를 실시하였다. Tunicamycin이 처리된 누에 배양세포 (Bm5)로부터 분리한 poly (A)\( { }^{+} \)RNA를 사용하여 1st 및 2nd cDNA를 합성하고, Marathon cDNA Adaptor (5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3')를 ligation 한 후 유전자내의 gene specific primer (GSP1 : 5'-CTGGAACACACCAAGATCACGTCCTTCTCAACGAT-3')와 adaptor primer (AP1: 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3')를 사용하여 touch down PCR을 수행하였다. 증폭된 3'-RACE (GSP1/AP1) PCR 산물은 \( 1.2 \% \) 아가로스겔에 전기영동하여 증폭된 단편의 크기를 확인한 후, pGEM-T 벡터 (Promega Co., USA)에 클로닝하고 염기서열을 확인하여 전체 염기서열을 결정하였다. 그리고 PDI 전체 cDNA 유전자는 유전자내의 GSP2 (5'-GGCACGAGGCCACGTCAAGTTTGGCAAA-3')와 AP1를 사용하여 touch down PCR한 후, 증폭산물을 pGEM-T 벡터에 클로닝하여 protein disulfide isomerase (PDI) 전체 유전자를 확보하였다.</p><h2>부분염기서열 분석 및 데이터베이스 검색</h2><p>차별화 발현되는 클론의 부분 염기서열 분석은 자동염기서열 분석장치 (Perkin Elmer Co., USA, ABI377)를 이용하여 제조회사의 방법에 따라 수행하였다. 각 염기의 표지는 Bigdye ready reaction kit (Applied Biosystems Inc., USA)를 이용하여 반응액을 조제하고 PCR을 수행한 후, 반응산물을 정제하여 \( 4.5 \% \) 아크릴아마이드겔에 전개하였다. 아크릴아마이드겔의 예비통전은 \( 30 \mathrm{~W} \)로 20~30분간하였으며, 시료주입은 정제한 PCR 산물에 formamide \( 5\ \mu \mathrm{\ell} \)와 \( 50\ \mathrm{mM} \) EDTA \( 1\ \mu \mathrm{l} \)를 넣어 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에 2분간 변성하고 급냉한 후 각 well에 \( 2\ \mu \mathrm{\ell} \)씩 점적 (loading)하였으며, 염기서열은 DNA Sequencing Analysis Software (Perkin Elmer Co., USA)에 의해서 분석하였다. 그 후 얻어진 염기서열은 GenBank 데이터베이스를 통하여 상동성을 분석하고 DDBJ 및 GenBank 국제 유전자은행에 등록하였다.<h2>RNA dot blot 분석</h2><p>선발한 차별화 클론에 대하여 전사체 검정을 위하여 정상 배양세포주와 스트레스 유도제 및 호르몬이 처리된 누에 배양 세포주로부터 각각 total RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 가온하여 변성시킨 후 나이론 막에 각각 동일한 \( 5\ \mu \mathrm{g} \)의 RNA를 blotting한 후, Prime-It Ⅱ Random Primer Labelling Kit (Stratagene Co., USA)를 이용하여[ \( \left[\alpha-{ }^{32} \mathrm{P}\right] \) dATP로 표지한 TmInc 131 cDNA 및 18S rRNA CDNA를 탐침으로 RNA dot blot 분석을 수행하였다. 조직별 및 E. coli 주사후 시간 경과별 bPDI 유전자 전사체 검정 역시 위와 동일한 방법으로 수행하였다.</p>