Rubidium chloride 용액으로 처리한 E. coli competent 세포들을 heat-shock을 통해 형질전환하였다. PCR 증폭을 통해 유전자 클로닝에 필요한 DNA 단편을 얻었으며, 이를 염색체상의 돌연변이 확인에도 활용하였다. 6개의 histidine 잔기로 표식된 \( \mathrm { OmpW } \) 단백질을 대량 생산하기 위해, 대장균 기반의 인공 단백질 과발현 체계를 사용하였다. pGEM-T vector를 통해 얻은 \( 0. 6 \mathrm { ~kb } \) 의 DNA를 재조합하여 pBP22 플라스미 드를 생성하였으며, \( 1 \mathrm { mM } \) 의 IPTG가 포함된 배양 조건에서 E. coli BL21 (DE3) 배양을 통해 \( \mathrm { OmpW } \) 단백질의 과발현을 확인하였다.
<h2>일반적인 DNA 조작</h2> <p>본 연구에서 이루어진 대부분의 DNA 조작은 Sambrook 등에 의해 기술된 방법에 준하여 수행하였다[10]. Rubidium chloride 용액에 의해 제조된 E. coli competent 세포들은 heat-shock 방법으로 형질전환 시켰다. 유전자 클로닝에 사용하기 위한 DNA 단편을 얻기 위해서 PCR 증폭기법을 사용하였고, 이는 염색체상의 돌연변이를 확인하는데도 사용하였다.</p> <h2>SDS-PAGE</h2> <p>단백질 시료들을 2× digestion buffer에 용해하였다[11]. 용해된 단백질 시료들을 95oC에서 5분 동안 가열한 후, 비연속적 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electro-phoresis (SDS-PAGE)에 의해 분리하였다. 분리된 단백질들을 Coomassie brilliant blue G-250 (Sigma)을 통한 염색과 2 시간 동안의 탈색 과정을 통해 밴드로서 확인하였다.</p> <h2>\( \mathrm { OmpW } \) 단백질의 과발현을 위한 재조합 플라스미드의 구축</h2> <p>6개의 histidine \( \left ( \mathrm { His } _ { 6 x } \right ) \) 잔기들로 표지되어진 \( \mathrm { OmpW } \) 단백질을 대량 생산하기 위해서 대장균을 활용한 인위적인 단백질 과발현 체계를 이용하였다. ompW 유전자는 S. typhimu-rium X3339 염색체 DNA를 주형으로 하고 primer 쌍[5'-gcggatcccacgaagccggagaa-3'과 \( \quad 5 ^ {\prime } \)-gcaagcttagaaacgatagcc-3']을 이용한 PCR을 통해 \( 0.6 \mathrm { ~kb } \) 의 DNA를 증폭한 후, 그 DNA를 pGEM-T vector (Promega)에 클로닝하여 중간단계의 재조합플라스미드를 구축하였고, 이로부터 얻은 \( 0.6 \mathrm { ~kb } \)BamHI-HindIII DNA 단편을 단백질의 발현에 사용되는 발현 vector인 \( \mathrm { pP } _ {\mathrm { RO } } \mathrm { EX } ^ {\mathrm { TM } } \mathrm { HTb } \) (Invitrogen)에 삽입하여 재조합 플라스미드 pBP22을 구축하였다(Fig. 1A). pBP22을 가지는</p> <p>E. coli BL21 (DE3)을 \( 1 \mathrm { mM } \) 의 IPTG가 들어있는 배양 조건에서 배양하였을 경우, 과량의 \( \mathrm { OmpW } \) 단백질이 발현되는 것을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다.</p> <h2>S. typhimurium x3339에 ompW 유전자를 결손시키기 위한 재조합 suicide 플라스미드의 구축</h2> <p>\( \mathrm { ompW } \) 유전자의 5' flanking DNA를 S. typhimurium 염색체 DNA를 주형으로 하여 primer 쌍[5'-gctctagagtcacggtaaacggactt-3'과 5'-gcggatccgtcattatgttaacgccagtgc-3'을 사용한 PCR 증폭에 의해 얻었다. \( 0.9 \mathrm { ~kb } \) 의 증폭된 DNA 단편을 pGEM-T vec-tor (Promega)에 클로닝하였다. 같은 방법으로 ompW 유전자의 3' flaking DNA를 primer 쌍[5'-gcggatccggggtcgactcgcgtgatgttgtg-3'과 5'-gcgcggccgcctgccgc-3']을 사용한 PCR을 통해 증폭하여 얻은 DNA 조각을 \( 5 ^ {\prime } \) flanking이 들어있는 plasmid에 클로닝하여, 그 결과 \( 0.6 \mathrm { ~kb } \) 의 완전한 \( o m p W \mathrm { ORF } \) 가 결손되고 \( o m p W \) 유전자의 5' flanking DNA와 3' flanking DNA가 붙어있는 형태의 재조합 DNA 단편을 가지는 플라스미드 \( \mathrm { pBP } 29 \) 이 구축되었다. pBP29로부터 얻은 \( 1.8 \mathrm { ~kb } \) 의 XbaI-NotI DNA 단편을 suicide 플라스미드인 pMEG375의 MCS에 클로닝 하였으며, 이 재조합 suicide 플라스미드를 \( \mathrm { pBP } 31 \) 로 명명하였다(Table 1).</p>