저해물질의 정제 단계에서는 먼저 상등액을 회수하고 염석, 투석하여 얻은 조효소액을 DEAE-sephadex A-50 ion exchange chromatography를 행하고 활성부위만을 모아 sephadex G-200 gel filtration column chromatography를 행하고 다시 정제도를 높이기 위하여 sephadex G-50 gel filtration column chromatography를 거쳐 최종적으로 \( 2.9 \% \)의 수율을 얻을 수 있었으며 40.8배의 정제된 효소를 얻을 수 있었다. 정제된 저해물질의 최적 온도는 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \), 최적 반응 \( \mathrm{pH} \)는 8.0 분자량은 약 \( 48 \mathrm{kDa} \)으로 확인되었다. 금속이온의 효과에 있어서는 \( \mathrm{CoCl}_{2}\), \(\mathrm{HgCl}_{2}\), \(\mathrm{ZnSO}_{4}\), \(\mathrm{AgNO}_{3} \)에서는 저해되는 양상을 나타내었고 \( \mathrm{MgSO}_{4}\), \(\mathrm{MnSO}_{4} \)에서 미미한 효소활성의 증가를 나타내었으며 V. anguillarum 의 생육을 약 \( 78 \% \) 저해 하는 것으로 나타났다.
<h1>결 과</h1> <h2>저해물질의 정제</h2> <p>최적 배양조건에서 배양된 배양액을 원심 분리하고 전체 정제과정은 Table 1에 요약하였다. 먼저 상등액을 회수하고 이를 염석, 투석하여 얻은 조 효소액을 Fig. 1에서 보는 바와 같이 DEAE-sephadex A-50 ion exchange chromatography를 행하고 활성부위만을 모아, Fig. 2에서 보는 바와 같이 sephadex G-200 gel filtration column chromatography를 행하고 다시 정제도를 높이기 위하여 Fig. 3에서 보는 바와 같이 sephadex G-50 gel filtration column chromatography를 거쳐 최종적으로 \( 2.9 \% \)의 수율을 얻을 수 있었으며 40.8배의 정제된 효소를 얻을 수 있었다. 이상의 과정으로 본 생육저해 물질이 효소임을 알 수 있었다.</p> <h2>정제물질의 분자량</h2> <p>정제물질을 SDS-PAGE를 이용하여 전기 영동하여 Fig. 4에서 보는바와 같이 단일 band를 확인하였으며, mid-range marker와 저해물질의 gel 상의 이동거리를 이용하여 Rf치를 측정한 결과 분자량은 약 \( 48 \mathrm{kDa} \)으로 확인되었다(Fig. 5).</p> <h2>정제물질의 최적온도, \( \mathrm{pH} \)와 안정성</h2> <p>정제된 저해물질의 최적 온도는 Fig. 6에서 보는 바와 같이 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 18 \% \)의 잔존활성을 나타내어 급격히 실활 되어 가는 것을 알 수 있었으나 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)이하에서는 시간이 지나도 활성이 유지되는 것을 알 수 있었고 저해 반응에 대한 최적 온도는 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)를 나타내어 반응 최적 온도를 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)로 결정하였다. B. amyloliquefaciens H41 균주가 생산하는 정제물질의 \( \mathrm{pH} \)에 대한 안정성을 검토한 결과 Fig. 7에서 보는 바와 같이 \( \mathrm{pH} 6.0-8.0\)까지의 범위에서 비교적 안정하며 활성이 유지되었지만 \( \mathrm{pH} 5 \) 미만, \( \mathrm{pH} 9 \)이상에서는 활성이 급격히 소실되었으며 최적 반응 \( \mathrm{pH} \)는 8.0이었다.</p> <h2>각종 금속이온 및 EDTA 안정성, 염 농도</h2> <p>여러 가지 금속이온과 EDTA가 정제물질에 미치는 영향을 비교해 본 결과 Fig. 8 에서 나타난 바와 같이 대부분의 금속 이온들이 정제물질에 저하를 가져오거나 미미한 효과만 나타내는 것으로 나타났다. 금속이온의 효과에 있어서는 \( \mathrm{CoCl}_{2}\), \(\mathrm{HgCl}_{2}\), \(\mathrm{ZnSO}_{4}\), \(\mathrm{AgNO}_{3} \)에서는 저해되는 양상을 나타내었고 \( \mathrm{MgSO}_{4}\), \(\mathrm{MnSO}_{4} \)에서 미미한 효소활성의 증가를 나타 내었다. Fig. 9에서 보는 바와 같이 염 농도는 \( 2.5 \% \) 범위 내에서는 별다른 차이를 나타내지 않았으나 그 이상에서는 활성의 저해를 나타내었다.</p> <h2>정제물질과 화학 처리제, 항생제와의 활성 비교</h2> <p>정제된 저해물질을 현재 상업적으로 사용하고 있는 화학 처리제, 항생제와 함께 효율성을 비교해 보았을 때 Fig. 10에서와 같이 정제된 저해물질은 V. anguillarum 의 생육을 약 \( 78 \% \) 저해 하는 것으로 나타났다.</p> <h2>정제 저해물질의 독성 검사</h2> <p>독성 검사를 위해 정제물질을 투여한 넙치 중 어떤 넙치도 30일 간의 관찰기간 동안 단 한 마리의 폐사도 일어나지 않는 것으로 나타났다.</p>