성장기의 정상 흰쥐를 개복하여 적출한 간을 생리식염수로 씻고 물기를 제거한 후 일정량을 취하여 homogenizer로 소독하였다. 항산화 활성은 shaking water bath에서 60분 동안 in-cubation 하여 과산화를 이끌어냈다. Osawa의 방법에 따라 stock solution을 만들었다. 시료용액을 시험관에 넣고 혼합한 후 증류수를 가열하여 incubation 하면서 일정 간격으로 측량하였다.
<h2>간 microsome 분획의 조제</h2> <p>성장기의 정상 횐쥐로부터 개복하여 적출한 간을 냉각된 생리식염수로 즉시 씻고 여과지로 물기를 제거한 후 일정량 을 취해\( 1.15 \% ~KCl-10 \mathrm{mM} \) phosphate buffer (\( \mathrm{pH} 7.4 \)) \( 4\mathrm{ml} \)을 넣고 homogenizer로 균질화시켰다. 이 용액을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \),\( 12,000 \mathrm{~rpm} \) 에서 20분간 원심분리 한 후 상층액을 4겹의 가아제로 여과하고, 여액을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 로 설정 된 초원심분리기에서 \( 45,000 \mathrm{~rpm} \) 으로 45 분간 원심분리 하여 얻어진 침전물에 \( 1.15 \% ~KCl-10 \mathrm{mM} \) phosphate buffer (\( \mathrm{pH} 7.4 \)) \( 10 \mathrm{ml} \) 은 넣은 후 micro-some 분획으로 하였다.</p> <h2>간 microsome 분획을 이용한 항산화 활성 조사</h2> <p>항산화 활성은 Wong 등의 방법에 따라 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-HCl buffer ( \( \mathrm{pH} 7.5\) ) \( 1.5 \mathrm{ml} \) 에 시료 용액 \( 0.2 \mathrm{ml} \), 간 micro-some 분획 \( (1 \mathrm{ml} \) 중 \( 1 \mathrm{mg} \) 의 단백질 함유) \( 0.1 \mathrm{ml}, 0.1 \mathrm{mM} \) as-corbate \( 0.1 \mathrm{ml} \) 및 \( 5 \mathrm{mM} \mathrm{~FeSO_4} ~0.1 \mathrm{ml} \) 를 차례로 가하여 반응액을 잘 혼합한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 shaking water bath에서 1 시간 in-cubation 시켜 과산화를 유도시켰다. 이때 대조구는 시료를 첨가시키지 않고 위에서와 동일한 방법으로 실시하였다. In-cubation이 끝나면 Esterbauer 등의 방법에 준하여 \( 3 \mathrm{M} \) trichloroacetic acid와 \( 2.5 \mathrm{~N} \) HCl의 혼합용액 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 를 가하고 \(3,000 \mathrm{rpm}\)으로 10분간 원심분리 한 후 상층액 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 취하여 \( 0.67 \%\) TBA \(1 \mathrm{ml} \) 를 가하여 혼합하고 꿇는 물 속에서 30분간 가열하여 발색시켰다. 냉각 후 \( 535 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였으며, 지질과산화의 억제율은 대조구의 흡광도에 대한 저해율 (\(\%\))로 비교하였다.</p> <h2>Thiocyanate에 의한 항산화 할성 조사</h2> <p>Osawa의 방법에 따라 먼저 linoleic acid (\(25 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) in \(EtOH)\), ferrous chloride (\( 2.45 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) in \( 3.5 \% \) hydro-chloric acid), ammonium thiocyanate (\(0.3 \mathrm{~g} / \mathrm{ml}\) in \( \mathrm{ H_2O}\)) \( 0.2 \mathrm{M} \) phosphate buffer (\( \mathrm{pH} 7.0\))를 만들어 이것을 stock solution으로 사용하였다. 혼합용액은 시료용액 \( 0.2 \mathrm{ml} \), linoleic acid \( 0.2 \mathrm{ml} \) 을 시험관에 넣고 혼합한 후 phosphate buffer \( 0.4 \mathrm{ml} \) 와 증류수 \( 0.2 \mathrm{ml} \) 를 가하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 incubation 하면서 일정간격으로 측정하였다. 측정방법은 혼합용액에서 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 을 취하여 시험관에 넣고 \( 70 \% \) ethanol \( 3 \mathrm{ml} \) 과 ammonium thiocyanate 용액 \( 0.1 \mathrm{ml} \), ferrous chloride 용액 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 를 혼합한 후 정확히 3분 후에 \( 500 \mathrm{~nm} \) 에서 홉광도를 측정하였다. 이때 활성의 비교를 위하여 BHT를 \( 0.05 \% \) 농도로 사용하여 BHT 첨가구로 하였다.</p> <h2>TBA (2-thiobarbituric acid)에 의한 항산화 활성 조사</h2> <p>시료용액 \( 1 \mathrm{ml} \), linoleic acid \( (25 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) in EtOH) \( 1 \mathrm{ml} \) 을 시험관에 넣고 혼함한 후 \( 0.2 \mathrm{M} \) phosphate buffer (\( \mathrm{pH} 7.0\)) \(2 \mathrm{ml} \)와 증류수 \( 1 \mathrm{ml} \)를 가하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 incubation 하면서 일정간격으로 측정하였다. 측정방법은 시료액 \( 0.5 \mathrm{ml} \)를 원심분리관에 넣고 \( 35 \% \) trichloroacetic acid \( 0.25 \mathrm{ml} \) 와 \( 0.75 \% \) aqueous TBA \( 0.5 \mathrm{ml} \)를 가하여 흔합한 후 boiling water bath에서 가끔 흔들면서 15분간 처리하여 흐르는 물에 냉각시킨 후 \( 70 \% \) trichloroacetic acid \( 0.5 \mathrm{ml} \) 를 가한 다음 20 분 후 \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 15 분간 원심분리 하고, 그 상층액을 \( 532 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>