\( 10 \% \) 마혈청과 \( 5 \% \) 우혈청이 포함되어 있는 RPMI 1640배지에서 PC12 cell을 배양하였다. Hypoxia 유도약물과 ER stress 유도약물을 각각 \( \mathrm{CoCl}_{2} \), DFA 용매와 tunicamycin 용매를 이용하여 처리하고 유도하였다. RT-PCR을 통해 cDNA를 증폭시키고 SDS-PAGE를 통해 sample을 전기영동하였다. 처리된 PC12 cell을 PBS로 세척한 후에 형광현미경을 통해 핵의 파편화를 관찰하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포 배양</h2><p>PC12 cell를 \( 10 \% \) 마혈청과 \( 5 \% \) 우혈청(GIBCO)을 포함하고 있는 RPMI 1640 (JBI)배지 내에서 배양하였다. 배양조에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \) 이산화탄소, 그리고 충분한 습한 조건으로 \(2-3\)일 간격으로 배지를 교체하며 배양하였고, 1주일에 한번씩 계대배양하였다. 실험에 사용한 세포는 현미경하에서 \( 70-80 \% \) 정도의 세포 충실도를 보이는 것을 사용하였다.</p><h2>Hypoxia 및 ER stress 유도</h2><p>Hypoxia 유도약물 처리는 각각의 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) (0.1 mM, Sigma), DFA \( (0.4 \mathrm{mM} \), Sigma)를 12시간 배양세포에 처리하였으며, ER stress 유도약물은 3시간 동안 tunicamycin ( \( 2 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} ; N \) 당 쇄형성 억제, Sigma)을 배양세포에 처리함으로써 유도하였다.</p><h2>Total RNA 분리</h2><p>각각의 실험별로 처리된 PC12 세포를 cold PBS로 한번 세척해 낸 후, RNA isolation reagent (TRI-REAGENT)을 \( 500 \mu l \) 넣고 2~3분 지난 후 scrapper로 긁어 모아 \( 1.5 \mathrm{ml} \) tube에 넣고 \( 100 \mu l \)의 chloroform을 첨가하여 충분히 섞어준 다음 \( 12,000 \mathrm{rpm}, 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분 동안 원심분리 하였다. \( 500 \mu l \)의 상등액을 취하여 새로운 tube로 옮기고 동량의 isopropanol 넣고 상온에서 10분 정도 처리한 후 \( 12,000 \mathrm{rpm} \)으로 10분 동안 원심분리하고 tube의 바닥에 얻어진 pellet에 \( 75 \% \) ethanol을 초기 RNA isolation reagent 양과 동일한 \( 500 \mu l \) 넣고 \( 12,000 \mathrm{rpm} \)으로 5분 동안 원심분리하여 최종적으로 total RNA를 얻었다. Total RNA는 DEPC가 처리된 sterilized distilled water에 녹여서 자외선 분광계로 정량하여 이후의 실험에 사용할때까지 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에 보존하였다.</p><h2>RT-PCR</h2><p>Total RNA \( (3 \mu g) \)를 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 가열하여 변성시킨후, ice에서 5분 이상 급랭하였다. \( 3 \mu l \)의 \( 5 \times \) RT buffer, \( 2.5 \mu l \)의 dNTP mixture (\( 2.5 \mathrm{mM} \) each), \( 0.6 \mu l \)의 oligo-dT (300ng), 1.6 U의 RNase inhibitor, 200 U의 reverse transcriptase(M-MLV)를 가하고, 총 반응액이 \( 15 \mu l \)가 되도록 조절한 후 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 그리고 \( 30 \mu l \)의 DEPC가 처리된 증류수를 첨가하여 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분 반응하여 spin down하였다. 이렇게 얻은 cDNA에 \( 35 \mu l \)의 DEPC가 처리된 증류수를 가하여 최종 \( 50 \mu l \)를 만들고, cDNA를 증폭하기 위하여 \(2 \times \) Dyemix (Enztnomics)를 이용하여 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초 denaturation, \( 57^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 40초 ex-tension한 다음 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 final extension하여 30회 반복시키는 PCR을 수행하였다. 각각의 PCR을 수행한 primer는 table 1로 정리하였다. PCR 산물 \( 3 \sim 5 \mu l \)를 \( 2 \% \) agar-ose gel 상에서 전기영동시킨 후 밴드를 확인한 후, TOMOROScopeEye 3.5 프로그램을 이용하여 PCR band를 정량화하여 그래프로 나타내었다. XBP1의 PCR 증폭 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분 denaturation, \( 68^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분 ex-tension한 다음 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 final extension하여 35회 반복시켰다. 이 후 PCR 산물 중에 \( 5 \mu l \)를 취하여 \( 1 \mu l \)의 \(10 \times \) restriction buffer와 5 U의 PstI 제한효소(Takara, Japan)를 가하여 총 반응액 \( 10 \mu l \)가 되도록 하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시킨 후, \( 2 \% \) agarose gel에서 전기영동 시키고 UV 상에서 밴드를 확인하였다.</p><h2>Westem blot</h2><p>Protein electrophoresis kit (ATTO Co., Japan)를 사용하여 \( 12 \% \) SDS-PAGE에 준비된 sample을 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 후 transfer kit (Bio-RAD, USA)를 사용하여 gel의 protein을 PVDF cell membrane (PALL corporation, USA)에 transfer buffer (\( 20 \mathrm{mM} \) Tris-HCl, \( 150 \mathrm{mM} \) glycine, \( 20 \% \) meth-anol, \( \mathrm{pH} \) 8.3))를 사용하여 transfer하였다. Transfer가 끝난 후membrane을 PBST (PBS, \( 0.0.5 \% \) Tween 20)와 \( 5 \% \) skim milk를 사용하여 상온에서 1시간 동안 blocking 하였다. Blocking이 끝난 후 1차 반응 시킬 때에는 PBST와 \( 5 \% \) skim milk에 \(1:500\sim1:2,000\)의 비율로 희석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 동안 반응시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 후 membrane을 PBST로 10분씩 5회 상온에서 shaker를 사용하여 세척하였다. 세척이 끝난 후 2차 항체를 반응 시킬 때에는 PBST에 \( 1: 2,000 \)의 비율로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응 시켰으며, 반응이 끝난 후 mem-brane을 PBST로 10분씩 5회 상온에서 shaker를 사용하여 세척하였다. 세척이 끝난 후 West save (Lab Frontier, Korea)을 사용하여 발색반응을 유도한 후 X-ray film에 감광하여 결과를 분석하였다.</p><h2>Hoechst 33342 staining</h2><p>각각의 실험별로 처리된 PC12 세포를 찬 PBS로 세 번 세척해 낸 후, \( 4 \% \) paraformaldehyde로 실온에서 30분간 고정하였다. 다시 PBS로 10분씩 세 번 세척해 낸 후, \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 Hoechst 33342 solution (Invitrogen)을 PBS에 \(1:1,000\)으로 희석하여 실온에서 10분간 암처리하여 염색하였다. 염색이 끝난후 PBS로 10분씩 세 번 세척한 후에 형광현미경(OlympusIX71)을 이용하여 핵의 파편화를 관찰하였다.</p>