B. subtilis 168은 37°C에서 60시간 동안 액체 배지에서 배양되었으며, 이를 통해 얻은 박테리오신 시료는 항균성 검사에 사용되었다. B. cereus ATCC 14579에 대해 동결건조한 시료를 이용해 특정 조건에서의 저해력을 조사하였다. 또한, B. subtilis 168 균주는 24시간 동안 LB 배지에서 배양된 후, 얻은 상등액은 여과 후 ammonium sulfate에 의한 침전과 투석 과정을 거쳐 최종 시료로 사용되었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용한 세균들 및 배양조건</h2> <p>본 실험에 사용한 균주들을 Table 1에 표시하였다. Bacilli와 E. coli, Salmonella, 및 Staphylococcus는 Luria-Bertani(LB)(Bacto tryptone \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \), yeast extract \( 5 \mathrm{~g} / \mathrm{L}, \mathrm{NaCl } \) \( 10 \mathrm{~g/L}\) 배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 진탕 배양하였다. 유산균들은 MRS 배지에서 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 정치 배양하였다. Listeria와 Enterococcus는 164 KWON et al.BHI(brain heart infusion) 배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 진탕 배양하였다</p> <h2>생육중 균수와 항균력 변화</h2> <p>B. subtilis 168 생육과 항균 역가 측정을 위해 200 mLLB 액체배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), 60시간 진탕 배양하였다. 시간대별로 배양액을 회수하여 UV-visible spectrophotometer(Shimadzuuv-1601, Kyoto, Japan)을 이용하여 \( \mathrm{OD}_{600} \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 항균력은 회수한 배양액을 원심분리 후 여과(0.45 μ m, Sartorius, Goettingen, Germany)한 상등액을 회수하여 동결건조(Chuo-ku, Tokyo, Tokyo Rikaikat Co.)한 후 20 mM Tris-HClpH 8.0) 완충용액에 현탁하여 항균력을 측정하였다. 항균력 측정 시료를 순차적으로 2배씩 20 mM Tris-HCl(pH 8.0)로 희석하여 접종하고 저해환을 형성하는 최대 희석배수를 확인하였다. 희석배수의 역을 취하고 이 값에 1mg에 대해서 환산해주는 환산계수를 곱하여 mg protein 당 AU(activity unit)로 항균력을 나타내었다</p> <h2>저해 스펙트럼 조사</h2> <p>B. subtilis 168 을 \( 1 \% \) 되게 \( 200 \mathrm{~mL} \mathrm{LB} \) 배지에 접종하여 24 시간 배양 후 얻은 상등액을 여과한 후 동결 건조한 시료를 \( 20 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} \) 8.0)에 녹여서 박테리오신 시료로 사용하였다. 저해 spectrum 확인을 위해 Gram 양성 및 음성균 10종을(Table 1) 사용하여 paper disk method로 실험을 진행하였다. 각 균주를 LB, BHI, 혹은 MRS 평판배지 에 \( 1 \times 10^{5} \) cells로 도말한 후 \( 8 \mathrm{~mm} \) 직경의 paper disk (Advantec, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Japan)를 놓고 그 위에 박테리오신 시료 \( 30 \mu \mathrm{g} \) 을 가한 후에 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 둔 다음 저해환의 직경을 측정하여 저해 정도를 확인하였다.</p> <h2>효소처리가 항균 활성에 미치는 효과</h2> <p>B. cereus ATCC 14579를 \( \mathrm{LB} \) 평판배지에 \( 1 \times 10^{5} \) cells로 도말한 후 \( 8 \mathrm{~mm} \) 직경의 paper disk를 올려놓고 저해 스펙 트럼 조사에 사용한 것과 동일한 B. subtilis 168 박테리오신 시료 \( 2.8 \mu \mathrm{g} \) 을 가하였다. 단백질가수분해 효소액 \( 5 \mu \mathrm{L} \) 를 paper disk 한 쪽 면에 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} 24 \) 시간 배양 후 관찰 하였다. Proteinase K(Takara, B2205A, Japan), protease (Sigma, P5147, Type XIV, from Streptomyces griseus), pepsin(Sigma, P7000, E.C. 3.4.23., from porcine gastric mucosa), trypsin(Fluka Analytical, E.C. 3.4.21.4, from hog pancreas) 4 가지 효소를 사용하였다. Proteinase \( K \) 는 원 상태인 액상 상태, protease, trypsin은 \( 5 \mathrm{mM} \) 인산완충용액 \( (\mathrm{pH} \) 7.0), pepsin은 \( 0.02 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} \) 에 녹여 효소액을 만들어서 protease는 \( 0.042 \) unit, proteinase \( \mathrm{K} \) 는 3 unit, pepsin은 \( 6.7 \) unit, 그리고 trypsin은 \( 21.04 \) unit를 사용하였다.</p> <h2>Tricine-SDS-PAGE</h2> <p>B. subtilis 168 균주를 \( \mathrm{LB} \) 배지 \( (100 \mathrm{~mL}) \) 에서 24 시간 배 양하여 얻은 상등액을 여과하였다. 여과한 상등액을 \( 80 \% \) ammonium sulfate(Amresco, Solon, OH, USA) 침전 후 투 석하여서 \( 20 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} \) 8.0) 완충용액에 녹여 시료로 사용하였다. 단백질 농도를 Bradford법[1]으로 측정하여 50 \( \mu \mathrm{g} \) 을 tricine polyacrylamide gel(16\% acrylamide)에 걸어 주고 \( 30 \mathrm{~mA} \) 에서 전기영동을 행하였다[17]. 전기영동 후 항 균력을 확인 할 gel은 30 분씩 4 회 멸균수로 씻고 30 분간 \( \mathrm{UV} \) 에 쬐인 후 지시균주를 그 위에 중층하였다. 지시균주로 는 L. monocytogenes ATCC 19111와 E. faecalis ATCC 29212 을 각각 \( 1 \times 10^{5} \) cells 사용하였다.</p> <h2>저해기작</h2> <p>B. subtilis 168 박테리오신의 B. cereus ATCC 14579에 대한 저해 기작을 문 등의 방법으로 조사하였다. B.cereus ATCC 14579를 LB 배지에서 배양한 후 원심분리하여 세포를 회수하고 이를 \( 20 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) 완충용액 \( (\mathrm{pH} 8.0) \) 으로 1 회 세척 후 동일 완충용액 \( 2 \mathrm{~mL} \) 에 \( 1 \times 10^{8} \) cells \( / \mathrm{mL} \) 농도로 현탁하였다. 3 시간 후 앞의 tricine-SDS PAGE에 사용한 것과 동일한 박테리오신 시료 \( 50 \mu \mathrm{g} \) 을 첨 가하고 24 시간 두면서 일정 간격으로 시료를 취하여 생균수를 측정하였다.</p>