유전재재조합 DNA를 발현시키고자 숙주로는 Pichia pastoris GS115 균주(Mut \( { }^{+} \)his4)를 사용하고 DNA 클로닝 숙주로는 E.coli DH5a 균주를 사용한다. Double expression cassette 재조합균주를 획득하기 위하여 pPICZ B/RgEH #2 DNA 를 모형으로 사용하고 발현이 잘 되도록 5RgEHF (EcoRI) primer를 설계한다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포배양</h2> <p>유전자재조합 DNA를 발현시키기 위한 숙주로는 Pichia pastoris GS115 균주(Mut \( { }^{+} \)his4)를 사용하였으며 DNA 클로닝 숙주로는 E. coli DH5a 균주를 사용하였다. 유전자재조합 균주를 선별하기 위한 항생제로는 zeocin을 사용하였으며 유전자재조합 P. pastoris를 선별하는 배지로는 YPDS/zeocin 고체 배지(1\% yeast extract, \( 2 \% \) peptone, \( 2 \% \) glucose, 1M sorbitol, \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) zeocin 및 1.5\% agar)를 사용하였으며 유전자재조합 P. pastoris를 배양하기 위한 배지로는 \( 1 \% \) yeast extract, \( 1 \% \) peptone을 포함하는 BMGY 배지(100 mM sodium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 6.0), \( 1 \% \) glycerol, \( 4 \times 10^{-3} \% \) biotin)와 BMMY 배지 (100 mM sodium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 6.0), 0.5 \% \) methanol, \( 4 \times 10^{-3} \% \) biotin)를 사용하였다. \( 5 \mathrm{ml} \) 의 BMGY 배지가 있는 \( 100 \mathrm{ml} \) 플라스크에 고체 배지의 단일 colony을 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm} \) 에서 18-20 시간 배양한 후 이를 \( 25 \mathrm{ml} \) 의 BMGY 배지가 함유되어 있는 \( 500 \mathrm{ml} \) 플라스크에 접종하여 배양하였다. 6-8 시간 배양 후 배양액을 원심분리 \( (3,000 \times \mathrm{g}) \) 하여 얻은 세포를 BMMY 배지 \( 25 \mathrm{ml} \) 에 다시 접종하여 배양하였다. 24 시간 동안 세포를 배양한 후 EH 발현 유도를 위하여 24 시간 간격으로 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) methanol을 3 회 공급하였다.</p> <h2>R. glutinis EH 유전자재조합 P. pastoris 제조</h2> <p>Double expression cassette 재조합균주를 얻기 위하여 전보에서 보고한 pPICZ B/RgEH #2 DNA 를 주형으로 사용하였으며 발현이 잘 될 수 있도록 시작 codon인 ATG 앞과 뒤의 염가서열이 Kozak sequence ((G/C)NNATGG)를 가지도록 5RgEHF (EcoRI) primer를 제작하였다. 또한 원래의 RgEH 염기서열 1076-1081 bp 위치에 BglII 제한자리가 있어 먼저 PCR 방법을 이용하여 BgIII 제한자랴를 돌연변이 시킨 다음 Fig. 2에서와 같이 RgEH 유전자가 두 번 들어가도록 유전자재조합 발현벡터를 제작하였다. BglII 제한자리를 없애기 위한 1차 PCR의 primer들로는 5RgEHF (EcoRI) (5' - gatcgaattcaaaatggcgacacacacattc - 3')와 3RgEHMR(5'- ag- tagatttcgcctgggtaaagcgagagggcaaag - 3') 및 5RgEHMF (5' - ctttgccctctcgcttacccaggcgaaatctact - 3') 와 3RgEHR ( XhoI no stop codon) (5'-tcctcgagcttctcccacatgacgccaa - 3')를 이용하였으며 1차 PCR 결과로부터 얻은 약 \( 1.1 \mathrm{~kb} \) 와 \( 170 \mathrm{bp} \) 정도의 DNA조각을 주형으로 하고 5RgEHF 및 3RgEHF 을 primer 로 하여 2차 PCR을 행한 다음 pGEM-T easy vector에 삽입하고 염기서열을 확인하였다. BglII 자리를 돌연변이 시킨 pGEM-T/RgEH mut \( (AGATCT \rightarrow AAATCT) \) DNA를 EcoRI 및 XhoI으로 제한하여 얻은 RgEH 유전자를 pPICZ C vector 에 삽입하였으며 pPICZ C/RgEH mut (single copy)를 얻었다. Invitrogen의 실험지침서 [8]에 따라 BgIII 및 Bam HI 를 이용하여 pPICZ C/RgEH mutant로부터 \( P_{\mathrm{AOx} 1}-RgEH^{RETT} \mathrm{AOX}_{\mathrm{AO}} \) 가 들어 있는 \( 2.6 \mathrm{~kb} \) 정도의 DNA 조각을 잘라낸 다음 BamHI 으로 잘라 선형으로 만든 pPICZ C/RgEH mut (single) DNA에 연결하여 double copy 재조합 DNA를 제작하였다. pPICZ C/ RgEH (double) DNA를 P. pastoris com-petent cell에 형질전환시켜 광학활성을 가진 에폭사이드를 제조하는데 생촉매로 사용하였다.</p>