Griess 반응을 이용해 배양액에 존재하는 nitrite 농도를 측정하였으며, RAW \( 264. 7 \) 세포를 특정 농도로 배양한 후, LPS와 참치 심장용매별 분획물을 각각 농도별로 처리하여 세포를 추가 배양하였다. 또한, RAW \( 264. 7 \) 세포의 Pro-inflammatory cytokine 분비 억제 효능을 확인하기 위해, 세포에 LPS와 시료를 농도별로 처리한 후 12시간 동안 재배양하였다.
<p>Proliferation index ( \% of control) \( = \)Absorbance of sample/Absorbance of control \( \times \) 100</p> <h2>Nitric oxide 생성량 측정</h2> <p>Griess 반응을 이용하여 배양액 내에 존재하는 nitrite 농도를 측정하였다. RAW \( 264.7 \) 세포를 DMEM 배지를 이용하여 \( 2.5 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { cells } / \mathrm { ml } \)의 농도로 24 -well plate에 접종하고, \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator (MCO-15AC, Sanyo, Japan)에서 20시간 전 배양하였다. 세포에 \( 1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 LPS와 참치 심장용매별 분획물을 각 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액의 상층액을 얻은 후, 상층액과 griess 시약(1 \%sulfanilamide \( + 0.1 \% \) naphthylendiamine dihydrochloride,1:1)을 실온에서 10 분간 반응시키고, microplate reader(Model 550)를 이용하여 540 \( \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양액 내 NO의 농도는 sodium nitrite \( \left ( \mathrm { NaNO } _ { 2 } \right ) \)의 농도별 표준곡선과 비교하여 산출하였다.</p> <h2>Pro-inflammatory cytokine 분비량 측정</h2> <p>Pro-inflammatory cytokine 분비 억제 효능을 알아보기 위하여, RAW \( 264.7 \) 세포를 \( 2.5 \times 10 ^ { 5 } \) cells/ml로 24-well plate에 접종하고 18시간 동안 전 배양하였다. 세포에 \( 1 \mu \mathrm { g } / \) \( \mathrm { ml } \) 의 LPS와 시료를 각 농도별로 처리하여 12시간 재 배양 하였다. 배양액 내의 IL-6, TNF- \( \alpha \) 및 IL- \( 1 \beta \) cytokine의 분비량을 ELISA kit (Mouse ELISA set, BD Bioscience, USA)를 이용하여 측정하였다. 이를 위해ELISA microplate에 capture antibody로 anti-mouse IL-6, TNF- \( \alpha \) 및 IL-1 \( \beta \)를 분주하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 하룻밤 동안 coating하였으며, 이를 0.05 \( \% \)tween 20을 포함하는 PBST (Phosphate buffered saline with 0.05 \( \% \) tween 20)로 세척하고 10 \( \% \)FBS 용액으로 blocking 하였다. PBST로 세척 후, 각 배양 상층액을 분주하고 실온에서 2 시간 반응시켰다. 다시 PBST로 세척한 후 biotinylated anti-mouse IL-6, TNF- \( \alpha \) detection antibody와 streptavidin-horseradish peroxidase conjugate를 첨가하여 실온에서 1 시간 반응시켰다. IL-13의 경우, biotinylated anti-mouse IL-1 \( \beta \) detection antibody를 첨가하고 1시간 반응 후, streptavidin-horseradish peroxidase conjugate를 첨가하여 30분 반응시켰다. 그 후, 이를 다시 PBST로 세척한 다음, OPD용액을 첨가하여 실온에서 30분 암반응시켰다. \( 2 \mathrm { ~N } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \)로 반응을 종료시킨 후 microplate reader(Model 550)를 이용하여 \( 490 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>