PCR 및 유전자 클로닝과정은 다음과 같다. 먼저 S. aureus (strainCOL)의 genomic DNA를 주형으로 이용하여 SA FtsZ 유전자를 증폭한 후에 GeneAllR ExpinTM Combo GP(GeneAll Biotechnology社) kit를 이용하여 DNA를 정제하였다. 정제해서 나온 DNA에 BamHI(Fermentas社)과 XhoI(Fermentas社) 제한효소를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)항온 수조에서 한 시간 동안 제한효소 처리 후 GeneAllRExpinTM Combo GP (GeneAll Biotechnology社) kit를 이용하여 DNA를 정제하였다. 그 후 Ligation 반응시킨 뒤 대장균 XL1 Blue 세포에 형질전환하여 Agarose gel 상에서 클로닝이 확인된 colony를 kanamycin(50 \(\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml}\)) \( 4 \mu \mathrm{L} \)가 포함되어 있는 Luria-Bertani (LB) 배지 \( 4 \mathrm{mL} \)에 접종한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 배양하였고 GeneAllRExprepTM Plasmid SV (GeneAll biotechnology社) kit를 이용하여 플라스미드를 분리 및 정제를 하였다. 마지막으로 colony PCR 을 통해 클로닝이 확인된 플라스미드는 DNA sequencing을 통하여 유전자 서열을 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>PCR 및 유전자 클로닝</h2> <p>SA FtsZ 유전자를 증폭하기 위해서 S. aureus (strainCOL)의 genomic DNA를 주형으로 이용하였으며, PCR 을위해 사용한 primer의 DNA 서열은 다음과 같다. Forwardprimer: 5'-GCTATATGGATCCCGAAAACCTGTATT-TTC-AGGGCATGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAATCATT-3' (밑줄은 BamHI 제한효소 절단부위, 굵은 글씨는 TEV 인식 부위), reverse primer: 5'-GCTAATTCTCGAGTCAAC-GTCTTGTTCTTCTTGAACGTCTTTC-3' (밑줄은 XhoI 제한효소 절단부위). Forward primer의 경우, 단백질 발현 후의정제 과정에서 TEV (Tobacco Etch Virus) protease를 이용한polyhistidine tag 제거를 목적으로 5'-말단에 TEV protease 인식 서열 (ENLYFQG, CGAAAACCTGTATTTTCAGGGC)을 삽입하였다. PCR 반응을 위해서 MaximeTM PCRPreMix (Intron Biotechnology社) kit를 사용하였다. SAFtsZ 유전자의 PCR 후에는 GeneAllR ExpinTM Combo GP(GeneAll Biotechnology社) kit를 이용하여 DNA를 정제하였다. 정제해서 나온 DNA에 BamHI(Fermentas社)과 XhoI(Fermentas社) 제한효소를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)항온 수조에서 한 시간 동안 반응을 시켰다. 제한효소 처리가 끝난 후, GeneAllRExpinTM Combo GP (GeneAll Biotechnology社) kit를 이용하여 DNA를 정제하였다. 발현 벡터의 경우, pRSFDuet-1(Novagen社)에 BamHI (Fermentas社)과 XhoI (Fermentas社) 제한효소를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 항온 수조에서 한 시간 동안 처리하여 제조하였고, GeneAllR ExpinTM Combo GP (GeneAll Biotech-nology社) kit를 이용하여 gel extraction 방법으로 정제하였다. 정제 후에 alkaline phosphatase (New England Biolab社)를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 항온 수조에서 1시간 동안 반응을 시키고, GeneAllRExpinTM Combo GP (GeneAll Biotechnology社) kit를 이용하여 정제 하였다.</p> <p>Ligation 반응은 \( 2 \mu \mathrm{L} \) SA FtsZ DNA (\( \sim 30 \mathrm{ng} / \mu \mathrm{L} \)), \( 1.5 \mu \mathrm{L} \) 발현 벡터 (\( \sim 100 \mathrm{ng} / \mu \mathrm{L} \)), \( 1 \mu \mathrm{L} \) 10X T4 DNA ligase 완충용액 (New England Biolab社), \( 0.5 \mu \mathrm{L} \) T4 DNA ligase(New England Biolab社), \( 5 \mu \mathrm{L} \) 증류수를 혼합한 후 \( 22^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 ligation 혼합물 \( 10 \mu \mathrm{L} \)를 이용하여 대장균 XL1 Blue 세포에 형질전환 하였다. 클로닝 성공 여부는 colony PCR 을 통해 확인하였다. Agarose gel 상에서 클로닝이 확인된 colony를 kanamycin(50 μg/mL) \( 4 \mu \mathrm{L} \)가 포함되어 있는 Luria-Bertani (LB) 배지 \( 4 \mathrm{mL} \)에 접종한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 배양하였고 GeneAllRExprepTM Plasmid SV (GeneAll biotechnology社) kit를 이용하여 플라스미드를 분리 및 정제를 하였다. 클로닝이 확인된 플라스미드는 DNA sequencing을 통하여 유전자 서열을 확인하였다.</p>