미생물의 분리를 위하여 볏짚과 청국장 시료를 각각 취하여 멸균 생리식염수에 1:9 비율로 혼합한 후, homogenizer를 사용하여 10분 동안 균질화한 후, 현탁액을 제조하였다. 이 현탁액을 멸균 생리식염수로 십진희석한 후 tryptic soy agar plate에 도말하여 배양한 후 미생물 집락의 형태에 따라 서로 다른 미생물을 순수 분리하였다. 분리미생물이 생산하는 단백질 분해 효소활성의 측정은 isolated soy protein을 기질로 하는 Anson 개량법을 사용하여 측정하였고 혈전분해 효소활성의 측정은 Astrup and Mullertz법으로 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>미생물 분리 및 배지</h2><p>본 실험에서 사용된 청국장과 볏짚 시료들은 한국 전통식 방법으로 제조하고 있는 풀목산농원(경기도 여주군 북내면), 미륵산농원(강원도 원주시 귀래면), 전통 흥업토속된장(강원도 원주시 흥업면), 원조 김점례할머니(전라북도 순창군 순창읍), 서일농원(경기도 안성시 일죽면)에서 각각 구입하여 실험에 사용하였다. 미생물의 분리를 위하여 볏짚과 청국장 시료를 각각 취하여 멸균 생리식염수에 1:9 비율로 혼합한 후, homogenizer (Stomacher 400, Seward, England)를 사용하여 10분 동안 균질화한 후, 현탁액을 제조하였다. 이 현탁액을 멸균 생리식염수로 십진희석한 후 tryptic soy agar(TSA; Difco, Detroit, MI, USA) plate에 \( 100 \mu \mathrm{l} \)씩 도말하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 14시간 동안 배양한 후 미생물 집락의 형태에 따라 서로 다른 미생물을 순수 분리하였다.</p><h2>효소활성 측정</h2><p>분리미생물이 생산하는 단백질 분해 효소활성의 측정은 isolated soy protein (ISP)을 기질로 하는 Anson 개량법을 사용하여 측정하였다. 분리미생물은 액체배지(\(1\%\) ISP, \( 1 \% \) glucose, \( 1 \% \) peptone, \( 0.5 \% \) yeast extract)에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), 24시간 동안 배양하였다. 배양액은 원심분리 \( (10,000 \times \mathrm{g} / 10 \mathrm{min}) \)한 후, 상등액을 조효소액으로 사용하였다. \( 3 \% \) ISP 기질용액(\( 0.1 \mathrm{M} \) phosphate buffer, \( \mathrm{pH} 7.0 \)) \( 150 \mu \mathrm{l}\)에 조효소액 \( 35 \mu \mathrm{l} \)을 첨가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분 동안 반응시킨 후, \( 0.4 \mathrm{M} \) trichloroacetic acid를 가하여 반응을 중지시키고 원심분리\( (5,000 \times \mathrm{g} / 15 \mathrm{~min}) \) 하여 상등액을 취하였다. 상등액 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 와 \( 0.4 \mathrm{M} \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} 150 \mu \mathrm{l} \) 그리고 phenol reagent \( 50 \mu \mathrm{l} \)를 혼합하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분 동안 발색한 후 \( 650 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p><p>분리미생물이 생산하는 혈전분해 효소활성의 측정은 Astrup and Mullertz법을 변형하여 측정하였다. \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer (\( \mathrm{pH} 7.0 \)) \( 5 \mathrm{ml} \)에 fibrinogen (bovine; MP biochemicals, France)을 \( 0.6 \% \) 가 되도록 용해시키고 thrombin ( \( 100 \mathrm{NIH} / \mathrm{ml} \) ) (bovine; MP biochemicals, France) \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하였다. 위와 동일한 완충용액에 녹인 \( 1 \% \) agarose 용액 \( 5 \mathrm{ml} \)을 첨가하여 충분히 혼합한 후, petri dish에 붓고 실온에서 \( 10 \mathrm{~min} \) 동안 방치, 고형화시켜 fibrin plate를 제조하였다. Fibrin plate에 paper disc \( (8 \mathrm{~mm} \), Toyo Roshi, Japan)를 올려 놓고, TSB 배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), 24시간 동안 배양하고 원심분리 \( (10,000 \times \mathrm{g} / 10 \mathrm{~min}) \)한 배양상등액 \( 10 \mu \mathrm{l} \)를 적가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 동안 배양한 후, 생성된 투명환의 크기로 혈전분해 효소활성을 측정하였다. 효소활성 unit은 plasmin (5 unit/ml) (bovine, Roche, Germany)을 2배씩 희석하여 \( 0.6 \% \) fibrin plate에 \( 10 \mu \mathrm{l}\) 씩 적가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 동안 반응시킨 후, 생성된 투명대의 크기로 나타내었다.</p>