소라의 장내세균 다양성 조사를 위해, 내장에서 세균을 채취하였고, CFU 기준으로 세균 수를 환산하였다. 분리된 세균들은 글리세롤과 DMSO에 현탁하여 깊은 냉동 보관하였고, 이후 DNA 추출과 염기서열 결정을 위한 실험에 사용하였다. 세균 DNA는 Accuprep Genomic DNA extraction kit를 이용하여 추출하였고, 증폭된 16S rDNA의 염기서열은 제노텍에 의뢰하여 결정하였다. 그리고 이 염기서열은 NCBI의 BLAST program Genbank database를 참고하여 기존에 등록된 미생물 염기서열과 비교 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>소라 채집</h2> <p>이번 연구에 사용된 소라는 제주도 서귀포시 법환동 \( \mathrm{mm} \), 패각 포함 평균 무게 \( 182.6 \pm 1.19 \mathrm{~g} \), 패각을 제거한 육중량 평균 무게 \( 69.06 \pm 1.08 \mathrm{~g} \)로 총 \(3\)개체를 실험에 사용 하였다.</p> <h2>소라 장내세균 분리 및 배양</h2> <p>소라 장내세균의 다양성을 조사하기 위하여, 멸균시킨 해부도구로 패각을 제거하고 내장 \( 1 \mathrm{~g} \)을 적출하였다. 적출한 검체는 \( 0.85 \% \) 생리식염수에 혼탁하여 homogenizer (UB32-50, Korea)로 분쇄 및 균질화 시킨 후, \( 10^{-1} \sim 10^{-4} \) 배로 단계희석을 하였다. 단계희석한 희석액을 \( 100 \mathrm{ul} \) 씩 평 판배지에 적하하여 도말한 후, \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에 최대 \(3\)주간 incubactor (JSGI-100T, JSR, Korea)에서 일 반 배양을, \( \mathrm{CO}_{2} \) incubactor (MC5-15AC, Sanyo, Japna)에서 혐기 배양하였다.</p> <p>배지는 일반 미생물 증식 영양배지인 Brain Heart Infusion Agar (Difco, USA), Tryptone Soy Agar (Difco, USA), 저온 일반세균 배지인 Reasoner's \( 2 \mathrm{~A} \) agar (Difco, USA), 유산균 분리 및 배양 전용 배지인 Lactobacilli MRS Agar (Difco, USA), 장내 Vibrio 균 검출을 위해 Thiosulfate-Citrate-Bile salt-Sucrose agar Agar (Difco, USA)배지를 사용하였다. 소 라의 서식환겅을 고려하여 각 배지마다 \( \mathrm{NaCl} \) (Sigma, USA)를 \( 1 \% \) 씩 첨가하였으며, 추가로 해양 미생물 증식배 지인 Marine agar (Difco, USA)를 사용하였다.</p> <p>각 배지에서 생육한 세균의 크기, 색깔, 모양 등 형태학적 특성을 육안으로 관찰한 후, 동일 배지에 계대배양을 반복하여, 순수 분리 하였다. 세균수는 \( \mathrm{CFU}^{-\mathrm{g}^{-1}} \) (ColonyForming unit)으로 환산하였으며, 분리된 균주는 \( 24 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) Glycerol (Sigma, USA)에, Vibrio sp. 는 DMSO (Sigma, USA)에 현탁한 뒤, \( -85^{\circ} \mathrm{C} \) Deep freezer (Ilshinbiobase, Korea)에 냉동 보관하여 추후 실험에 사용하였다.</p> <h2>분리균주의 DNA 분리 및 PCR 증폭</h2> <p>각각의 분리균주를 평판배지와 같은 성분의 액체배지 에서 동일한 조건으로 베양하였다(VS-\(8480\), Korea). 추후, 배양액을 \( 12,000 \mathrm{rpm} \)에서 \(2\)분간 원심분리하여 균체를 분 리하고 Accuprep Genomic DNA extraction kit (Bioneer, Korea)을 사용하여 Genomic DNA를 추출하였다. 추출된 Genomic DNA \(1\) ul, 27 Forward primer (\(5\)'-AGAGTTTGAT CMTGGCTCAG-\(3\)'), \(1492\) Reverse primer (\(5\)'-TACGGYTA CCTTGTTACGACTT-\(3\)') 각각 \( 0.5 \mu \mathrm{M} \)씩, \(20\) ul Premix (DNA polymerase, dNTPs, reaction buffer) (Bioneer, Korea)를 사용 하여 PCR (US/MYGein\(32\), MJ RESEARCH, USA)반응을 수행하였다. 반응 주기는 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(7\)분간 initial denaturation, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(30\)초간 denaturation, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(30\)초간 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(45\)초간 extension 과정을 총 \(30\)회 반복하 였으며, 최종적으로 다시 한번 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(10\)분간 extension 시켰다. 각 분리균주의 증폭된 \( \mathrm{PCR} \) 산물은 정제 및 \( \mathrm{DNA} \)의 공도를 측정한 후, \( 1.5 \% \) agarose gel (Lonza, SWISS)에 \( 0.5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ethidium bromide (EtBr) (Sigma, USA)로 염색한 뒤 전기영동을 수행하여 band를 확인하였다.</p> <h2>\(16\)S rDNA 염기서열 분석 및 계통수 작성</h2> <p>증폭된 \(16\)S rDNA PCR 산물은 (주)제노텍(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. 염기서열은 미국 국립생물정보센터 NCBI (National Center for BiotechnologyInformation)의 BLAST (Basic Local Alignment SearchTool) program Genbank의 database를 참고하여 기존 등록된 미생물들의 염기서열과 비교 분석하였다. 계통수 작성은 ClustalW software로 Multiple alignment를 한 후 Mega\(6.0\) program을 이용하였다. Bootstrap을 \(1,000\)회 반복실행하여 신뢰도를 확보하였다</p>