이 연구는 엽록 스테비아에서 제조된 스테비아추출물 발효액을 재료로 사용했다. 세균들과 젖산균류를 배양하기 위해 Nutrient broth와 MRS broth를 사용했으며, 순수 배양된 세균들로부터 염색체 DNA를 분리하기 위해 세포를 액체배지에서 원심분리로 회수했다. 또한, 순수 배양된 유효 미생물들의 분류학적 위치를 결정하기 위해 CLUSTAL W 프로그램과 neighbor-joining method를 이용해 계통수를 작성했다. 스테비아추출물 발효액에서 분리된 세균들과 효모균의 항균 및 항진균 활성을 측정하기 위해 agar well diffusion 방법을 사용했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 배지</h2> <p>본 연구의 재료로는 (주)엽록 스테비아에서 제조된 스테비아추출물 발효액을 사용하였다. Ribosomal DNA (rDNA)의 클로닝을 위한 숙주세포로는 \(Escherichia\) \(coli\) DH5\(a\)를 사용하였고, 항균활성 측정을 위한 공시균들은 생명공학연구소 유전자원 센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)와 서울대학교 미생물연구소 미생물균주센터 (Institute of Microbiology, Seoul National University, IMSNU)에서 분양받아 본 실험실에서 보관하고 있던 균주들을 사용하였다. 항진균 실험에 사용한 작물병원성 진균은 농촌진흥청 농업생명공학연구원 한국농업미생물지원센터 (Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에서 분양받아 사용하였다.</p> <p>\(Bacillus\) 속들의 배양을 위해서는 Nutrient broth (Difco, Detroit, USA)를, 젖산균류를 위해서는 MRS broth (Difco)를 사용하였다. 효모균은 YPG \( (0.5 \% \) yeast extract, \( 1.0 \% \) peptone, \( 2.0 \% \) glucose) 배지에서 배양하였다. 고체배지를 위해서는 각각의 배지에 \( 1.5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \mathrm{agar} \) 를 첨가하였다. 진균의 배양을 위해서는 Potato dextrose agar (Difco) 배지를 사용하였다.</p> <h2>균주의 분리 및 일차 동정</h2> <p>스테비아추출물 반혀액을 멸균된 생리식염수로 희석하여 Nutrient agar, MRS, YPG 평판배지 위에 각각 도말한 후 배양기에 넣어 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 의 온도에서 이틀간 배양하였다. 얻어진 콜로니들의 모양 및 색깔, 크기를 기준으로 한 육안판정으로 균주들을 선발하여 여러 번 고체배지에 계대 배양하여 순수 배양된 간주들을 얻었다. 순수 배앙된 균주들은 \( 15 \% \) 의 glycerol이 첨가된 액체배지에 넣어 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하였다.</p> <p>순수 배양된 분리균들의 동정을 위한 형태적, 생화학적 특성들은 미생물학실험서에 기술되어있는 방법에 준하여 조사하였으며 얻어진 결과를 Bergey's manual of determinative bacteriology에 기술되어있는 기존에 알려진 균주들의 톡징과 비교하여 1차적인 동정을 실시하였다. 분리된 효모들의 1차적인 동정을 위해서는 API 20C AUX kit (BioMerieux, France)를 사용하였다.</p> <h2>DNA 추출 및 ribosomal DNA의 PCR 증폭</h2> <p>순수 배양된 세균들로부터 염색체 DNA를 분리하기 위하여 액체배지에서 배양한 세포를 원심분리로 회수하였다. 회수된 세포로부터의 염색체 DNA는 G-Spin \( { }^{\mathrm{TM}} \) Genomic DNA Extraction Kit for Bacteria (iNtRON Biotechnology, Inc., Korea)를 사용하여 분리한 후 agarose gel 전기영동으로 확인하였다. 호모의 염색체 DNA는 Molecular Cloning에 기술된 방법에 의해 분리하였다.</p> <p>분리세균의 16S rDNA 조각은 박테리아 특이적인 27f (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 685r (5'-TCTACGCATTTCACCGCTAC-3')의 두 primer를 이용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)으로 증폭하였다. PCR 반응은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 DNA를 변성시킨 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 분간, \( 58^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분간, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분간의 단계를 35회 반복하여 실시하고 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 최종 증폭하였다. 효모의 18S rDNA 조각의 증폭을 위해서는 NS1 (5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')과 NS2 (5'-GGCTGCTGGCACCAGACTTG-3')의 두 primer를 사용하였고 위와 동일한 조건으로 PCR 증폭을 실시하였다. 증폭된 PCR산물들은 \( 1.0 \% \) agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다.</p> <h2>rDNA의 염기서열 분석 및 계통분류</h2> <p>증폭된 PCR산물들은 GENEALL \( { }^{T M} \) PCR Purification Kit (generalbiosystem, Korea)를 사용하여 정제한 후 pGEM-T Easy vector (Promega, Madison, USA)에 삽입시켜 \(E. coli\) DH5\(a\) 에 형질전환하였다. 클로닝된 rDNA의 염기서열은 Basestation (MJResearch, Watertown, USA) 장비를 사용하여 dideoxy chain termination 방법으로 결정하였다. 결정된 rDNA 유전자 조각의 염기서열은 BLAST 프로그램을 이용하여 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 database에 있는 알려진 염기서열들과 비교하여 종(species) 수준의 분류를 시행하였다. 순수 배양된 유효 미생물들의 분류학적 위치를 결정하기 위한 계통수 (phylogenetic tree)를 작성하기 위해서는 CLUSTAL W 프로그램(version 1.81)과 neighbor-joining method를 이용하였다.</p> <h2>분리균의 항균 및 항진균 활성의 측정</h2> <p>스테비아추출물 발효액에서 분리된 세균들과 효모균의 항균 및 항진균 활성을 측정하기 위해서는 agar well diffusion 방법을 사용하였다. 항미생물 실험을 위한 시료로는 스테비아추출물 발효액에서 분리된 균주들의 배양액을 원심분리로 세포들을 제거한 후 사용하였다. 바실러스속의 균주들과 \(Moraxella\)속의 균주는 Nutrient broth에서, 젖산균류는 MRS broth에서, 효모는 YPG 배지에서 배양하였고, 모두 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양하였다. 길항작용 검색에 사용한 공시균들은 각 균주를 위한 액체배지에 접종하여 하룻밤 배양한 후 동일한 고체배지에 \( 0.2 \mathrm{ml} \)씩 도말하였다. 배지를 말린 후 배지 위에 직경 \( 6 \mathrm{~mm} \)의 구멍을 뚫고, 여기에 시료를 각각 \( 50 \mu l\) 씩 첨가한 다음 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 방치하여 확산 시킨 후, 각 공시균들의 성장에 적당한 온도에서 하룻밤 키워 형성된 억제환의 크기 \( (\mathrm{mm}) \)로 항균력을 측정하였다. 작물병원성 진균들의 균사생장 억제력은 PDA 평판배지에서 자란 진균의 균사체와 포자를 멸균된 생리식염수를 이용해 회수하여 고체배지에 도말하여 말린 후 위와 동일한 방법으로 분리균의 배양액을 접종하여 5~7일간 배양하면서 구멍주위의 균사생장 억제정도를 관찰하였다.</p>