EH 단백질의 발현 여부를 확인하기 위해 12% SDS-PAGE 전기영동과 immunoblotting을 수행하였다. immunoblotting은 polyclonal anti-hexahistidine antibody와 peroxidase conjugated polyclonal secondary antibody를 이용하였다. EH 활성 분석에는 4-(p-nitrobenzyl)pyridine 시약을 사용하였고, 무세포 단벽질 발현 반응물은 100 mM potassium phosphate (pH 8.0)에 현탁시켜 2 mM styrene oxide를 기질로 사용하였다. 이후 30°C, 250 rpm에서 3시간 반응시켰으며, GC 분석조건은 split ratio 1:20, flow rate 0.5 ml/mim으로, column, injector, detector의 온도는 각각 100, 220, 220°C였다.
<h3>무세포 단백질 합성 반응을 통한 \( R \). glutinis \( \mathrm { EH } \) 발현 확인</h3> <p>\( \mathrm { EH } \) 단백질의 발현 여부를 알아보기 위하여 \( 12 \% \) SDS-PAGE 전기영동 및 항체를 이용한 immunoblotting을 수행하였다. SDS-PAGE에서 분리한 단백질을 nitrocellulose paper에 전기적으로 이행시킨 후 polyclonal anti-hexahistidine antibody 몇 peroxidase conjugated polyclonal secondary antibody를 사용하여 immunoblotting을 수행하였다.</p> <h3>자외선 분광기를 이용한 \( \mathrm { EH } \) 활성 측정 방법</h3> <p>EH 활성 분석에 사용한 4-(p-nitrobenzyl)pyridine (NBP) 시약은 methoxyethanol에 녹인 \( 230 \mathrm { mM } \) stock solution을 사용하였다. 무세포 단백질 발현 시스템을 이용하여 얻은 반응물 용역 150 씨와 213 씨의 LB배지에 styrene oxide \( (60 \mathrm { mM } \) stock solution)을 \( 33.4 \) 씨 첨가하여 최종농도가 \( 2 \mathrm { mM } \) 이 되게 하였다. NBP용역 300 µㅣ를 첨가하고 triethylamine \( 300 \mu \) 를 첨가한 다음 진탕배양기 (39' \( \mathrm { C } , 250 \mathrm { rpm } ) \) 에서 시간대별로 \( \mathrm { UV } / \) vis spectrophotometer를 이용하여 \( 560 mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도 변화를 측정하였다. 대조군으로는 무세포 단백질 발현 cocktail 용액 만을 넣어 동일한 조건에서 반응시킨 것을 사용하였다.</p> <h3>입체선택적 가수분해 반응 및 GC 분석</h3> <p>무세포 단벽질 발현 반응물 150 씨를 \( 100 \mathrm { mM } \) potassium phosphate ( \( \mathrm { pH } \) 8.0)에 현탁시킨 후, \( 2 \mathrm { mM } \) styrene oxide를 기질로 사용하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } , 250 \mathrm { rpm } \) 에서 3시간 반응시켰다. 대조군으로는 \( 2 \mathrm { mM } \) styrene oxide 기질과 무세포 다백질 합성용 cocktail 용액을 넝어 동일한 조건에서 반응시킨 것을 사용하였다. 무세포 단백질 합성과정을 통해 제조된 EH 단백질 용액의 입체선택적 가수분해 활성을 평가하기 위하여 chiral \( \mathrm { GC } \) 분석을 수행하였다. \( (R) \)-과 (S)-styrene oxide에 대한 분리능이 있는 Supelco -Dex 120 ( \( 25 \mu \mathrm { m } \) film thinckness)칼럼을 사용하였다. 이동가스로는 질소를 사용하였으며, GC 분석조건으로는 split ratio는 1:20, flow rate는 \( 0.5 \mathrm { ml } / \mathrm { mim } \) 으로 2 씨의 시료를 주입하여 분석하였고, column, injector, detector의 온도는 각각 \( 100,220,220 \) C 이었다.</p>