형질전환 식물체에서 SID2 promoter에 의해 조절 받는 LUCIFERASE의 발현정도 확인을 위한 식물배지에서 키운 10된 식물체를 이용한 Luciferase imaging system과 훍에서 키운 14일 된 식물체를 이용한 Luciferase assay system. 두 가지 system을 사용한 결과 SID2 유전자 조절 연구를 위한 네 가지 형질전환 식물체를 구축하였다.
<h2>형질전환 식물체에서 SID2 promoter에 의해 조절 받는 LUCIFERASE의 발현정도 확인을 위한 Luciferase imaging system.</h2> <p>식물배지에서 키운 10일된 식물체에 \( 0.01 \% \) Triton X-100에 녹인 \( 1 \mathrm { mM } \) Luciferin을 뿌린 후 10분 동안 암반응을 시킨다. Andor MCD program을 이용하여 Charge Coupled Device (CCD) 카메라 (ANDOR technology, UK)로 5분간 노출시켜 찍는다. 이때 카메라 센서의 온도는 \( -55 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 유지하여 빛의 산란을 최소화 시켜준다 (Ishitani et al 1997).</p> <h2>형질전환 식물체에서 SID 2 promoter에 의해 조절 받는 LUCIFERASE의 발현정도 확인을 위한 Luciferase assay system.</h2> <p>훍에서 키운 14일된 \( T_ { 2 } \)세대의 Vector/WT, SID2 promoter/WT, Vector/siz1-2,SID2 promoter/siz1-2 각각의 30개의 독립적인 형질전환 식물체의 있을 따서 얼린 상태에서 곱게 간 후 GUS extraction buffer를 \( 100 \mu \mathrm { L } \) 넣어서 단백질을 뽑은 후 bradford 용액을 이용하여 파장 \( 595 \mathrm { ~nm } \)로 정량을 한 다음 Luciferase assay system (Promega)을 사용하였다. \( 2 \mu \mathrm { g } \) 단백질을 1회분의 Luciferin이 분주된 E-tubu에 넣어서 \( 20 / 20 ^ {\mathrm { n } } \) Luminometer (Turner Biosystems, CA)로 LUC의 활성을 측정하였다 (Yoo et al. 2005).</p> <h1>결 과</h1> <h2>SID2 유전자 조절 연구를 위한 형질전환 식물체의 구축</h2> <p>siz1-2는 T-DNA 삽입으로 인해 SUMO E3 ligase의 기능을 상실하였으며 SA 합성 효소 발현과 SA에 반응하는 저항성 유전자들의 발현이 높은 돌연변이체이다. 애기장대 아생형과 비교하였을 때 스트레스가 없는 상태에서도 높은 SA 축적을 보이는 siz1-2 돌연변이체에서 SA 합성 조절에 주요하게 작용하는 SID2의 발현이 어떻게 조절 되는지 알아보기 위하여 리포트 유전자들로써 GUS와 LUC를 가지고 있는 pGL1300 vector를 이용하였다. SID2 promoter ( \( -1862 \mathrm { bp } \sim + 301 \mathrm { bp } ) \)를 pGL1300 vector 리포트 유전자의 상단에 넣어 GUS와 LUC가 SID2 promoter 조절을 받게 만든 construct를 아생형과 siz1-2 돌연변이체에 형질 전환하여 Vector/WT, SID2 promoter:Gus::Luc/WT, Vector/siz1-2, SID2 promoter:Gus::Luc/siz1-2, 네 가지 형질전환 식물체를 구축하였다 (Figure 2A).</p>