본 연구에서는 DCF-DA을 probe로 이용한 뇌세포의 mitochondria와 microsome획분에서 기초활성산소(BOR)의 생성량을 측정하기 위해서 산화적 스트레스의 유무를 확인하는 실험을 진행했다. 뇌획분 중 과산화지질의 함량은 분광광도계를 사용하여 정량하였고, 산화단백질의 생성량은 carbonyl group의 생성량으로 정량했으며, 이 양을 통해 흡광도의 파장에서 분자흡광계수을 이용하여 계산하여 산소라디칼을 정량하였다.
<p>\( 50 \mathrm{mM} \) 인산완충용액 \( (\mathrm{pH} \) 7.2, \( 2,750 \mu l) \), 증류수 \( (250 \mu l) \), 시료 \( (100 \mu \ell) \) 를 첨가◦혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 항온 수조에서 5 분간 방치한 다음, probe인 \( 0.167 \mathrm{mM} \) TMA-DPH[1-(4-trimethylammoniumphenyl)-6-phenyl-1,3,5-hexa-triene, \( p \)-toluene-sulfonate] 용액을 \( 6.67 \mu \ell \)를 첨가◦혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 항온 수조에서 shaking하면서 30분간 반응시킨 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)을 유지하면서 형광광도계를 이용하여 \( 360 \mathrm{~nm} \) (excitation)와 \( 430 \mathrm{~nm} \) emission)에서 측정하였다.</p><h2>기초 및 유도산소라디칼의 정량</h2><p>뇌획분중에 있어서 산화적 스트레스(oxidative stress)의 유무를 확인하기 위해서 DCF-DA \( \left(2^{\prime}, 7^{\prime}\right. \)-dichlorofluorescein diacetate)을 probe로 이용한 뇌세포의 mitochondria와 microsome획분의 기초활성산소(basal oxygen radical : BOR)의 생성량의 측정은 Lebel 등의 방법에 따라 측정하였다. BOR의 측정은 기저상테와 라디칼 생성을 유도하기 위해 ascorbic acid와 \( \mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)로 자극한 유도상태의 두 가지 조건에서 비교 측정하였다. 기저상태와 라디칼 유도의 경우 모두 시료 \( 500 \mu \ell \)를 환충용액 \( (40 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) buffer \( \mathrm{pH} \) 7.4)으로 10배 희석하고, probe인 \( 5 \mu \mathrm{M} \mathrm{DCF}- \) DA (Molecular probe, USA) \( 12 \mu \)를 첨가, \( 10,000 \mathrm{rpm} 8 \)분간 원심분리한다. 잔사를 \( 40 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} 3.0 \mathrm{ml} \)에 녹인 후 라디칼 유도상태의 경우에는 \( 1.0 \mathrm{mM} \) ascorbic acid \( (300 \mu \ell) \)와 \( 100 \mu \mathrm{M} \mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}(150 \mu \ell 1) \)를 혼합하였고 기저상태의 경우는 아무것도 첨가하지 않았다.</p><p>이후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시킨 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 유지하면서 형광 강도의 변화를 형광광도계를 이용하여 \( 488 \mathrm{~nm} \) (excitation)와 \( 525 \mathrm{~nm} \) (emission)에서 측정하였다. 이 때 형광강도의 변화를 \( 2^{\prime}, 7^{\prime} \)-dichiorofluorescein diacetate (DCF-DA)을 표준품으로 해서 표준검량선에 의하여 생성된 DCF의 양( \( (\mathrm{nmol} / \mathrm{mg} \) protein/min)으로 환산하고, 이 양으로써 기초산소라디칼 (basal oxygen radical: BOR) 및 유도산소라디칼(induced oxygen radical: IOR)의 산소라디칼 생성량으로 정량하였다.</p><h2>산화적 스트레스의 분석</h2><p>뇌획분중의 과산화지질의 함량은 저자 등이 사용한 방법에 따라 분광광도계를 사용하여 TBA법으로 말론디알데히드(malondialdehyde: MDA) )의 함랑을 측정하여 과산 화지질(lipid peroxide : LPO)의 함량으로 정량하였다. 또한 뇌조직획분으로서 mitochondria와 microsome의 산화단백질(oxidized protein: OP)의 생성량은 Levine 등의 방법에 따라 carbonyl group의 생성량을 측정하여 OP의 함량을 정량하였다. carbonyl group의 양은 \( 360 \mathrm{~nm} \) 와 370 \( \mathrm{nm} \)사이에 있는 흡광도의 파장에서 분자흡광계수 \( (E=22,000) \)를 이용하여 계산하였다.</p><h2>분석결과의 처리</h2><p>본 연구의 모든 실험결과는 통계 처리하여 평균치와 표준편차를 계산하였으며, 각 실험군간의 유의성 검정은 Student's t-test로 실시하였다.</p>