본 논문은 Transwell invasion 방법과 TER 측정을 통해 AGS 세포의 침윤성 억제 가능성과 ABG가 TJ의 tightness 증가에 미치는 영향을 조사하였다. Transwell insert는 matrigel로 코팅하여 침윤을 유도하고, FBS가 첨가되지 않은 RPMI-1640 배지로 희석한 AGS 세포를 \( 5 \times 10 ^ { 4 } \) 개/well 씩 첨가하여 48 시간 동안 배양하였다. 다양한 농도의 ABG를 배양 세포에 48 시간 처리하여 TER을 측정하고 세포 tight junction과 paracellular 투과성에 미치는 ABG의 영향을 평가하였으며, TRIzol B를 이용하여 total RNA를 분리하였다.
<h2>In vitro invasiveness assay</h2> <p>ABG 에 의한 AGS 세포의 침윤성 억제 가능성의 여부를 알아보기 \( 8 \mu \mathrm { m } \) pore size의 갖는 transwell insert (Corning Costar Corp.)를 이용한 transwell invasion 방법을 적용하였다. Transwell insert는 matrigel \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 Matrigel로 코팅하여 침윤을 유도하였다. Matrigel 코팅이 끝난 transwell은 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에 24 시간 동안 건조하였으며, FBS가 첨가되지 않은 RPMI-1640 배지로 희석한 AGS 세포를 \( 5 \times 10 ^ { 4 } \) 개/well 씩 첨가하여 48 시간 동안 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에서 배양하여 내피세포를 바닥에 부착시켰다. 그 후 materigel에 침윤된 세포의 수를 200배 현미경 시야에서 계수하여 비교하였다.</p> <h2>Transepithelial electrical resistance (TER) 변화 조사</h2> <p>ABG 에 의한 AGS 세포의 침윤성억제가 TJ의 tightness 증가와 연관이 있는지의 여부를 조사하기 위하여 12-well poly-carbonate membranes \( \left (1 \mathrm { ~cm } ^ { 2 } \right . \) surface area, \( 0.4 \mathrm { ~mm } \) pore size, Costar, Corning, NY, USA)에 \( 2 \times 10 ^ { 5 } cells/ml \)개의 AGS 세포를 처리하여 일정시간 배양하여 이때 세포막에 걸리는 전류의 전기 저항치(transepithelial electrical resistance, TER)를 EVOM Epithelial Tissue Voltohmmeter (World Precision Instruments, FL)로 측정하여 단층 세포(monolayer)의 integrity를 비교하였다. 다양한 농도의 ABG를 배양 세포에 48 시간 처리하여 TER을 측정하여 세포 tight junction과 paracellular 투과성에 미치는 ABG의 영향을 평가하였다. 측정 시 4군데 각각 다른 영역을 측정하여 평균하여 사용하였다.</p> <h2>RT-PCR에 의한 mRNA 발현의 분석</h2> <p>동일 조건에서 준비된 AGS 세포를 대상으로 TRIzol B (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Biotechnology, Korea)를 이용하여 \( 2 \mu \mathrm { g } \)의 RNA에서 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 template로 사용하여 관찰 대상 유전자를 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 증폭하였다. 이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자를 internal control로 사용하였다. 각 PCR 산물들을 \( 1 \% \) agarose gel을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide \( ( \mathrm { EtBr } \), Sigma)로 염색한 후 ultra violet (UV) 하에서 확인하였다.</p>