수집된 간장 시료를 멸균 생리식염수에 10배씩 희석해 MRS 한천배지에 도말하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 집락이 만들어 질 때까지 배양했다. 일차적으로 분리한 균주를 배양하여 원심분리로 얻은 상등액으로 항균활성을 조사하였다. 당 발효, 이용성을 확인해 박테리오신 생산균주의 생화학적 특성을 조사했고 유전학적 동정을 위해 분자계통학적 분류도 하였다. 분리균주를 다양한 배양 온도와 PH에서 박테리오신 역가와 분리균주의 생육에 주는 영향을 실험했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>간장에서 미생물의 분리</h2> <p>수집한 간장 시료를 멸균된 생리식염수에 10배씩 단계별로 연속 희석하여 Lactobacilli De Man, Rogosa and Sharpe (MRS) 한천배지에 도말한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 집락이 형성될 때까지 배양하였다. 나타난 집락을 형태학적 특성에 따라 일차적으로 분류하였다.</p> <h2>박테리오신 생산균의 선정 및 활성조사</h2> <p>일차적으로 분리한 균주를 \( 5 \mathrm{ml} \) 의 MRS 액체배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양하여 원심분리로 상등액을 회수하였다. 상등액의 항균활성을 검증하기 위해 paper disc method를 사용하였다. \( 0.5 \% \) yeast extract가 함유된 \( 2.0 \% \) agar plate 위에 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15시간 배양한 Micrococcus luteus 배양액을 \( 0.8 \% \) 한천을 함유한 enriched nutrient broth (NB) soft agar에 \( 1 \% \) 접종하고 여기에 \( 1 \mathrm{M} \) phosphate buffer (\( \mathrm{pH} 7.0 \))를 1/10 부피로 첨가 및 혼합하여 plate당 \( 10 \mathrm{ml} \) 씩 분주하여 test plate를 제조하였다. 분리 균주의 배양 상등액을 paper disc (Tokyo, \( 8 \mathrm{~mm} \) )에 \( 30 \mu l \) 씩 loading하여 UV로 10분간 조사한 후, test plate 위에 paper disc를 올려 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 배양하여 paper disc 주위의 지시균주에 대한 저해환의 생성유무를 관찰하였다. 저해환을 생성하는 균주들의 박테리오신 확인은 상등액을 pro-teinase K로 처리하여 항균활성이 사라지는지 여부로 하였다. 박테리오신 역가는 activity unit (AU)로 표기하였고 상등액을 순차적으로 2배씩 희석하여 저해환을 형성하는 최대 희석배수의 역수를 취하고, 이 값에 \( 1 \mathrm{ml} \) 에 대해서 환산해 주는 환산 계수를 곱하여 \( \mathrm{AU} / \mathrm{ml} \) 로 나타내었다.</p> <h2>박테리오신 생산 균주의 동정</h2> <p>박테리오신 생산균주의 생화학적 특성을 조사하기 위해 API 50 CHB kit(Bio-Merieux, France)를 이용하여 당 발효 및 이용성을 확인하였으며, 유전학적 동정을 위해서 16S rRNA의 염기서열을 분석한 후, 염기서열을 기초로 하여 분자계통학적 분류도 병행하였다.</p> <h2>박테리오신 생산균주의 배양조건</h2> <h3>배양온도의 영향</h3> <p>분리균주를 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 30^{\circ} \mathrm{C}, 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 50 \mathrm{ml} \) 의 MRS 액체배지에서 48시간 배양하면서 4시간 간격으로 분리균주의 생육과 박테리오신 역가에 미치는 영향을 조사하였다. \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 배양액의 흡광도를 측정하여 균주의 생육도를 조사하였다.</p> <h3>초기 \( \mathrm{pH} \) 의 영향</h3> <p>MRS 액체배지 초기 \( \mathrm{pH} \) 를 5.0, 6.0, 7.0 및 8.0로 보정하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48시간 배양하면서 4시간 간격으로 분리균주의 생육도와 박테리오신 역가에 미치는 영향을 조사하였다.</p>