\( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)가 유발하는 산화적 스트레스로부터 하고초 추출물(PSE)의 구체적인 PC12 세포 보호효과를 확인하기 위해, MTT reduction assay와 동일한 조건하에서 LDH release assay를 실시했다. 그 결과 PSE가 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)의 산화적 스트레스로로 기인한 세포사를 억제한다는 것을 확인했다. 또한 광학 현미경으로 세포독성의 상태에서 PSE가 세포의 형태학적 변화에 미치는 영향을 관찰했다. 이상의 결과들로 PSE는 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)가 유발하는 세포독성 상태에서 PC12 세포를 강력하게 보호하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>PC12 세포를 보호하는 하고초 추출물(PSE)의 효과</h2><p>\( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)는 세포내에서 유전자 발현 변화를 조절하기도 하고, 세포의 행동, 운동, 모양 등을 조절하는 신호전달 물질로 작용하며, 생체의 정상적인 영위에서 \( 10^{-9} \sim 10^{-7} \mathrm{M} \)로 항상 생성되어지고 있다. 하지만 구리\( \left(\mathrm{Cu}^{2+}\right) \)나 철\( \left(\mathrm{Fe}^{2+}\right) \) 이온 존재 하에 hydroxyl radical로 전환되어 산화적 스트레스를 유발함에 따라 세포손상을 일으켜 퇴행성 신경질환, 암 등의 각종 질병을 일으키게 된다. 본 연구에서는 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)가 유발하는 산화적 스트레스로부터의 PC12 세포를 보호하는 PSE의 효과를 확인하기 위해 MTT reduction assay 방법을 이용하여 정상군과 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 처리군 그리고 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)와 PSE 를 농도별로 처리한 실험군을 비교하였다. 그 결과, Fig. 1A와 같이 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 처리군의 세포 생존율은 정상군에 비해 \( 30.6 \% \)로 떨어졌으나 PSE를 \( 50,100,250 \) \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 처리한 PC12 세포의 생존율은 \(46.5, 64.8, 78.7 \% \)로 농도 의존적으로 세포생존율이 회복되는 것을 확인할 수 있었다.</p><p>PSE의 구체적인 PC12 세포 보호효과를 확인하기 위하여 MTT reduction assay와 동일한 조건하에서 LDH(lactate dehydrogenase) release assay를 실시하였다. LDH 의 활성측정은 세포손상 정도를 확인하는 방법 중 하나로 세포외 LDH는 화학적으로나 생물학적으로 안정적 상태이므로 세포배양에서 방출된 LDH의 활성 정도는 세포손상 정도와 비례관계를 가지게 된다. \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)가 처리된 PC12 세포에 PSE를 \( 50, 100, 250 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)를 처리하여 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 처리군과 비교한 결과, \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 단독 처리군에서는 \( 55.7 \% \)의 LDH를 방출하는 것을 확인할 수 있는데 반해 PSE 처리군에서는 LDH 방출량이 \( 37.9, 26.6, 22.9 \% \)로 감소하여 정상군의 수준으로 회복되었다는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1B). \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)가 세포에 손상을 끼침에 따라 세포막 파괴로 인해 LDH 방출량이 높은 것과 대조적으로 PSE 처리군 에서는 농도 의존적으로 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)가 유도하는 산화적 스트레스로 인한 세포손상으로부터 PC12 세포를 보호함에 따라 효과적으로 LDH 방출량을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 PSE가 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)의 산화적 스트레스로부터 유도되는 세포사를 강력하게 억제한다는 것을 시사하고 있다.</p><p>신경세포는 외부 환경에 민감하게 자극을 받으면 신경상해를 입는 것과 동시에 세포사가 유도되어 형태학적인 변화를 나타나게 된다. 따라서 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)로 유도된 세포독성의 상태에서 PSE가 세포의 형태학적 변화에 영향을 미치는지 알아보기 위해 광학 현미경 하에서 관찰하였다(Fig. 1C). 정상군의 PC12 세포에서는 건강하게 뻗은 돌기를 관찰할 수 있었지만 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 처리군은 세포독성으로 인하여 전체적인 세포의 수가 적을 뿐 아니라 돌기가 거의 소멸된 양상을 보여 세포가 형태학적으로 큰 변화가 유도된 것을 확인할 수 있었다. 이때, PSE를 \( 100, 250 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 전처리한 실험군에서는 농도 의존적으로 PC12 세포의 생존을 확인할 수 있었다. 그리고 PSE가 PC12 세포의 colony 형성에 어떠한 영향을 미치는지를 알아보기 위해 colony formation assay를 실시하였다(Fig. 2). 그 결과, \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 처리하였을 때의 colony 생성능에 비해 PSE를 \( 50, 100, 250 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 처리하였을 때 \( 56.1, 65.3, 68.1 \% \)로 높은 colony 생성능을 확인할 수 있었다.</p><p>이상의 결과로부터 하고초 추출물은 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)로 유도되는 세포독성 상태에서 강력하게 PC12 세포를 보호하고 있는 것을 확인할 수 있었다.</p>