HCT116 대장암 세포에서 sulindac sulfide의 처리로 DNA microarray 실험을 한 결과, 2배 이상 up-regulation 된 유전자 23개와 down-regulation 된 유전자 33개가 선별되었다. RT-PCR과 quantitative real-time PCR을 이용하여 3개의 유전자 (NAG-1, DDIT3, PCK2)의 발현 변화를 검증한 결과 NAG-1은 4.26배, DDIT3은 2.6배, PCK2는 2배로 증가하였다.
<h2>Sulindac sulfide에 의해 차별적으로 발현되는 유전자군의 분석</h2> <p>HCT116 대장암 세포에서 sulindac sulfide의 처리에 의해 차별적으로 발현되는 유전자 군을 선별하기 위하여 oligo DNA microarray 실험을 수행하였다. 대조군에서 추출한 total RNA는 Cy3-dUTP로, \( 10 \mathrm { ~ \mu M } \)의 sulindac sulfide를 처리한 실험군에서 추출한 total RNA는 Cy5-dUTP로 각각 labeling 하여 DNA microarray 실험을 실시하였다.</p> <p>그 결과, sulindac sulfide의 처리에 의해 2배 이상 up-regulation 된 유전자는 23개, 반대로 2배 이상 down-regulation 된 유전자는 33개가 선별되었다. 이 중 각각 상위 10 개의 높은 발현차이를 보이는 유전자를 표에 나타냈다. Table 2에서 보는 바와 같이 up-regulation 된 유전자 중 NAG-1 유전자가 4.26으로 가장 큰 변화를 나타냈다.</p> <h2>RT-PCR과 quantitative real-time PCR을 이용한 DNA microarray 결과의 검증</h2> <p>Sulindac sulfide의 처리에 의해 up-regulation 되는 유전자들 중 3개 (NAG-1, DDIT3, PCK2)를 선택하여 RT-PCR과 quantitative real-time PCR을 수행하여 DNA microarray 실험 결과를 검증하였다. Fig 2A에서 보는 바와 같이 microarray 실험에서 증가되는 것으로 확인된 3개의 유전자의 발현이 RT-PCR의 결과에 의해서도 up-regulation 되는 것을 확인하였다. 이에 반해 internal control 유전자로 사용한 GAPDH 유전자의 발현의 변화는 관찰되지 않았다.</p> <p>이러한 3개의 유전자의 발현 변화를 정량화 하기 위하여 quantitative real-time PCR을 수행하였다. 그 결과, Fig. 2B에서와 같이 up-regulation 된 유전자중 NAG-1의 경우 2.7배, DDIT3 유전자는 2.6 배, PCK2 유전자는 2배씩 각각 증가되는 것을 확인하였다. 이 결과는 DNA microarray 실험 결과와 매우 일치하였다.</p> <p>한편, 선택한 세가지 유전자에 대한 현재까지 보고된 연구결과는 다음과 같다. NAG-1 (NSAID-activated gene-1)유전자는 항암유전자로 알려져 있으며, 여러 가지 화학요법제제에 의해 발현이 증가되는 것으로 알려져 있다. 또한 최근에는 NAG-1 transgenic 쥐를 이용한 실험에서 항암 기능이 보고된 바 있다. DDIT3 (DNA-damage-inducible transcript 3) 유전자는 CHOP 혹은 GADD153 유전자라고도하며, 이 유전자의 과대발현은 세포주기 억제나 세포사멸을 유도하는 것으로 보고되었다. 또한 최근에는 resveratrol에 의해 유도되는 세포사멸에 관련이 있는 것으로 보고되었다. PCK2 (Phosphoenolpyruvate carboxykinase 2) 유전자는 미토콘드리아 효소로서 gluconegenesis에 관련되어 있다. 하지만 암세포의 세포주기 조절이나 세포사멸과의 기능은 아직 알려져 있지 않다.</p> <h2>NAG-1 발현과 세포사멸과의 관련성 검증</h2> <p>DNA microarray 실험 결과와 real-time PCR의 결과 sulindac sulfide에 의해 가장 많이 발현되는 항암유전자 NAG-1의 발현이 가장 높게 확인되었다. 이러한 NAG-1 유전자와 대장암 세포주 사멸과의 관련성을 검증하기 위하여 \( 10 \mathrm { ~ \mu M } \)의 sulindac, sulindac sulfone 그리고 sulindac sulfide를 처리 후, RT-PCR과 real-time PCR을 수행하여 NAG-1 유전자의 발현 정도를 확인하였다. Fig. 3A에서와 같이 RT-PCR의 결과, sulindac sulfide의 처리에 의해 가장 많은 양의 NAG-1 transcript가 발현되는 것을 확인하였다. 정량적인 real-time PCR의 결과에서도 NAG-1의 발현이 sulindac 처리 경우 2.1배, sulindac sulfone 처리의 경우 3.1배, sulindac sulfide 처리에 의해 3.3배 각각 증가됨을 확인할 수 있었다. 따라서 quantitative RT-PCR의 결과에 의해서도 sulindac sulfide에 의한 NAG-1의 발현이 가장 높게 증가되는 것을 확인하였다. 이러한 연구결과는 세포생존율의 실험 결과에서 sulindac sulfide 처리에 의한 암세포 생존율이 가장 낮았으므로, NAG-1의 높은 발현과 대장암 세포의 사멸과의 관련성을 간접적으로 암시한다. 직접적인 NAG-1의 발현과 세포사멸과의 관련성을 확인하기 위해서는 siRNA-NAG-1을 이용한 추가적인 실험이 필요하다고 생각된다.</p>