카페인 투여한 군과 정상 흰쥐 뇌 조직절편을 PBS로 세척한 후 proteinase K,TE buffer,acetic acid를 차례로 반응시키고 SSC로 세척한 후 1시간 동안 prehybridization step를 거쳐 prehybridization buffer에 준비된 RNA probe를 첨가하여 습윤 상자에 넣고 24시간 반응시킨 후 post hybridization과정을 시행한다. 그 후 RNase A를 1시간 처리한 후 2×SSC로 30분간 세척하고 탈수과정을 거친 후 autoradiography X-ray film으로 1주일 감광 시킨 후 현상시킨다. 그 후 autoradiographic emulsion으로 coation시킨 후 probe의 방사선이 감광되도록 노출시킨 후 D-19 developer로 현상시키고 rapid fixer로 고정한 후 광학현미경과 암시야현미경에서 관찰하였다.
<h2>In situ hybridization</h2> <p>Deep freezer에 보관되어 있던 카페인 투여한 군과 정상 흰쥐 뇌 조직절편을 phosphate buffered saline(PBS, \( 0.1 \mathrm { M } \), \( \mathrm { pH } 7.4 \))으로 세척한 후 \( 0.001 \% \) proteinase K로 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 반응시킨 후 TE buffer( \( \mathrm { pH } 8.0 \) \(10 \mathrm { mM } \) Tris, \( 1 \mathrm { mM } \) EDTA)로 2분간 처리한 후 \( 0.025 \% \) acetic acid에서 10분간 반응시켰다. \( 0.2 \times SSC(1 \times SSC: 150 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } , 15 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { Na } \) citrate, \( \mathrm { pH } 7.0 ) \)로 세척한 다음 실온에서 1시간 동안 prehybridization step을 거치고 이어서 prehybridization buffer [ \(65 \% \) deionized formamide, \( 10 \% \) \(5 \mathrm { M } \) NaCl, \(1 \% \) 50 Denhardt's solution, \( 0.5 \% \) \(1 \mathrm { M } \) Tris ( \( \mathrm { pH } ~ 8.0 \)), \(0.1 \% \) \(0.5 \mathrm { M } \) EDTA( \( \mathrm { pH } ~ 8.0 \)), \(23 \% \)의 Dextran sulfate \( 0.4 \% \) \(1 \mathrm { M } \) DTT, \( 1 \% \) yeast tRNA ( \( 10 \mathrm { mg } / \mathrm { m } \ell)] \)에 준비된 RNA probe \( \left (1 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { cpm } / \mathrm { slide } ) \right . \)를 첨가하여 조직절편 위에 직접 점적시켜 cover glass를 덮고 습윤 상자에 넣고 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응 후 post hybridization 과정을 시행하였는데 \( 4 \times \mathrm { SSC } \), \(0.5 \times \mathrm { SSC } \)에 DTT가 함유되게 한 후 각각 20씩 세척하였다. 그 후 RNase A ( \( 20 \mu \ell / \mathbb { m } \ell \))를 1시간 처리한 후 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 2 \times \mathrm { SSC } \)로 30분간 세척하고 탈수과정을 거친 후 autoradiography X-ray film(amersham)으로 1주일 동안 감광 시킨 후 현상시켰다. 그 후 autoradiographic emulsion(NTB2, Kodak)으로 coation시킨 후 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 14일 동안 표지된 probe의 방사선이 감광되도록 노출시켰다. 그 후 D-19 developer로 현상시키고 rapid fixer로 고정한 후 광학현미경과 암시야현미경에서 관찰하였다.</p>