토양으로부터 total genomic DNA를 분리하기 위해 오래된 나무뿌리나 인적이 드문 큰 바위 밑의 지표 아래 30~50cm아래로부터 2개의 토양시료를 채취하여 거즈로 걸러서 사용하였다. Tiedje 등의 방법으로 토양 genimic DNA를 분리하였는데, 그 방법으로는 원심분리 후 상등액에 동량의 chloroform/isoamylalcohol (25/24/1) 첨가 후 vortex 하여, 수용액층에 2배의 70% ethanol을 첨가하여 침전시켰다. 그리고 Yeates 등에 의한 토양 genomic DNA분리 방법으로 원심분리 후 phenol/chloroform/isoamylalcohol(25/24/1)를 넣은 후 vortex하여 원심분리 하였고, 상등액에 대해 0.6volume의 isopropanol을 첨가하여 상온에서 2시간동안 침전하였다.
<h1>실험재료 및 실험방법</h1> <h2>토양시료의 채취</h2> <p>토양으로부터 total genomic DNA를 분리하기 위하여 2003년 12월에 금정산에서 각각 다른 장소의 인적이 드문 큰 바위 밑, 오래된 나무뿌리 근처 등 지표에서 \( 30 \sim 50 \mathrm{~cm} \) 아래로부터 2개의 토양시료를 채취하여 건조시키지 않고 거즈에 걸러서 사용하였고, 2004년 3월에는 금정산의 4곳의 다른 장소에서 동일한 방법으로 토양시료를 채취하여 그늘지고 통풍이 잘 되는 곳에서 하루 건조시킨 후, 거즈로 작은 돌과 나무뿌리, 나뭇잎 등의 이물질을 제거하여 사용하였다.</p> <h2>Tiedje 등의 방법에 의한 토양 genomic DNA의 분리(Method I)</h2> <p>\( 5 \mathrm{~g} \)의 토양시료를 extraction buffer (\( 100 \mathrm{mM} \) Tris-HCl[\( \mathrm{pH} 8.0 \)], \( 1.5 \mathrm{M} \mathrm{NaCl}, 100 \mathrm{mM} \) sodium EDTA [\( \mathrm{pH} 8.0 \)], \(1\%\)CTAB, \( 100 \mathrm{mM} \) sodium phosphate \( [\mathrm{pH} 8.0] \) ) \( 13.5 \mathrm{ml} \) 와\( 50 \mu l \) proteinase \( \mathrm{K}(10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)로 현탁한 후, 30분 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 교반하여 혼합해 주고, \( 10 \% \mathrm{SDS} 3 \mathrm{ml} \)을 첨가하여 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 반응시켰다. 원심분리 \( \left(4,000 \mathrm{rpm}, 10 \mathrm{~min}, 4^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 후, 상등액에 동량의 chloroform/isoamylalcohol (25/24/1)을 넣고 vortex한 후, 수용액층에 2배량의 \( 70 \% \) ethanol을 첨가하여 침전시켰다. 원심분리 후 침전물을 상온에서 10분간 건조시킨 다음, 증류수 500\( \mul \)에 녹여 DNA의 농도를 측정하였다.</p> <h2>Yeates 등에 의한 토양 genomic DNA의 분리(Method II)</h2> <p>\( 5 \mathrm{~g} \)의 토양시료를 extraction buffer (\(100\mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) \( [\mathrm{pH} 8.0], 1.5 \mathrm{M} \mathrm{NaCl}, 100 \mathrm{mM} \) sodium EDTA \( [\mathrm{pH} 8.0]) 10 \)\( \mathrm{ml} \)와 \( 10 \% \) SDS \( 1 \mathrm{ml} \)를 넣고 현탁한 후, \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간동안 반응시켰다. 원심분리 \( \left(4,000 \mathrm{rpm}, 10 \mathrm{~min}, 4^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 후, humic acid를 제거하기 위해 \( 30 \% \) PEG 8,000을 포함한 \( 1.6 \mathrm{M} \mathrm{~NaCl} \) 용액을 전체 양의 절반만큼 넣고 상온에서 2시간 반응시켰다. 원심분리하여 침전물을 TE buffer \( 1 \mathrm{ml} \)에 현탁하고 \( 3 \mathrm{M} \) potassium acetate \( 200 \mu \mathrm{l} \)를 넣어 5분 동안 얼음 위에 두었다. 원심분리 후, 상등액에 대해 동량의 phenol/chloroform/ isoamylalcohol (25 / 24 / 1)를 넣고 vortex 한 뒤, 원심분리하여 상등액에 대해 \( 0.6 \) volume의 isopropanol을 넣고 상온에서 2시간동안 침전시킨다. 원심분리 후, 증류수 \( 500 \mu \mathrm{l} \)에 녹이고 \( \mathrm{DNA} \) 의 농도를 측정하였다.</p>