감 품종간 유연관계분석을 위해 경남단감육종연구소(창원)에서 보존 중인 총 48점을 선발하였다. 단감 DNA를 추출하기 위해 단감 잎을 액체질소로 곱게 간 후 buffer를 이용하여 반응시켰다. 이후 추출용액을 혼합 및 반응, 원심분리 후 섹척 및 건조 등의 과정을 거쳐 얻은 DNA pellet을 TE buffer에 녹인 뒤 분광광도계와 전기영동으로 정량 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>식물 재료</h2><p>SSR 마커를 이용한 감 품종간 유연관계분석을 위해 경남단감육종연구소(창원)에서 보존 중인 국내품종 14 점, 중국품종 1점, 일본품종 33점을 포함하여 총 48점을 선발하여 이용하였다(Table 1).</p><h2>DNA 추출</h2><p>\( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 동결 보존한 단감 잎 \(3-5 \mathrm{g} \)을 잘게 썰어 막자사발에 넣고 액체질소를 사용하여 곱게 간 분말에 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)의 ex-traction buffer \( 15 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 잘 혼합한 다음, \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) water-bath에 넣고 15분 간격으로 혼합하면서 60분 동안 반응시켰다. 그 다음 chloroform-isoamyl alcohol (24:1)용액 \( 10 \mathrm{ml} \)를 첨가한 후 10분간 잘 혼합한 후, \( 12,000 \times g \)에서 15분간 원심분리 하였다. \( 13 \mathrm{ml} \) 정도의 상층액을 새로운 tube에 옮긴 다음 iso-prophanol 용액 \( 13 \mathrm{ml} \)를 첨가 후 잘 혼합하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이를 \( 12,000 \times g \) 에서 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)로 15 분간 원심분리 시키고 난 뒤 생긴 pellet을 \( 70 \% \) ethanol 용액 \( 3 \mathrm{ml} \)로 세척하였다. Pellet을 5분간 완전히 건조 시킨 후 TE buffer (Tris \( 1 \mathrm{M} \), EDTA \( 0.5 \mathrm{M}) \) 용액 \( 0.7 \mathrm{ml} \)를 넣어 녹인 뒤 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \mathrm{RNase} \) 용액 \( 5 \mathrm{ul} \)를 첨가한 뒤 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에 30분간 반응 시켰다. 반응 시킨 용액을 \( 1.5 \mathrm{ml} \) microcentrifuge tube에 옮겨 담고, phenol 25:24:1 용액 \( 0.65 \mathrm{ml} \)를 첨가한 후 5 분간 흔들어 준 다음 \( 12,000 \times g \)에서 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)로 15분간 원심분리 하였다. 가라 앉은 pellet을 제외한 상층액 \( 0.6 \mathrm{ml} \)를 새로운 tube로 옮기고 chilled isoprophanol 용액을 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 첨가한 후 몇 번 흔들어 주고, DNA pellet이 생기는지 확인 한 뒤 \( 12,000 \times g \)에서 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)로 15분간 원심분리 하였다. 상등액을 버리고 난 뒤 DNA pellet을 \( 70 \% \) ethanol 용액 \( 1 \mathrm{ml} \)로 세척한 다음, 5 분간 건조 시킨 뒤 \( 12,000 \times g \)에서 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)로 5 분간 원심분리 한 후 ethanol을 완전히 제거 하고 15 분간 실온에 건조 시켰다. \( 1\sim0.7 \mathrm{ml} \)의 TE buffer에 DNA pellet을 녹인 뒤 Nano-drop 1000 (Thermo Scientific, USA) 분광광도계와 전기영동으로 DNA를 정량 분석하였다.</p>