분리균의 형태적 관찰을 위해 그람염색과 포자염색을 이용하며, 분리균체의 탄수화물 이용능과 생화학적 특성을 API 20E와 API 50 CHB kits를 이용하여 조사한다. 분리균의 \( 16 \mathrm { ~S } \)rRNA 유전자 염기서열 분석을 위해 총 염색체 DNA를 주형으로 사용하고, primer로 E. coli의 \( 16 \mathrm { ~S } \mathrm { rRNA } \)유전자의 특정 지역 염기서열을 이용하여 PCR을 실시한다. 분리균 B. licheniformis YB-1105를 LB 배지에서 배양한 후, 특정 조건에서 효소 반응을 관찰하고, 반응 종결 후 흡광도를 측정한다.
<h2>분리균주의 동정</h2> <p>분리균의 형태적 관찰을 위해서는 그람염색과 포자염색을 실시하였으며, 배양균체 현탁액을 API 20E와 API 50 CHB (Biomereux사, France)kits에 제조사의 지침을 따라 접종하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하면서 1 일과 2일째 각각 관찰하여 탄수화물 이용능과 생화학적 특성을 판별하였다. 분리균의 \( 16 \mathrm { ~S } \)rRNA 유전자 염기서열을 분석하기 위해서 분리균의 총 염색체 DNA를 주형으로 하고, 세균의 \( 16 \mathrm { ~S } \mathrm { rRNA } \)유전자의 보존적 지역의 염기서열 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- \( 3 ^ {\prime } \) (E. coli 16S rRNA 유전자 염기서열 8 27), 5'-GGTTAC-CTTGTTACGACTT-3'. coli 16S rRNA 유전자 염기서열1492 1510)을 primer로 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 증폭된 PCR 산물을 정제하여 ABI PRISM BigDye terminator cycle sequencing kit와 373A automatic DNA sequencer(Perkin Elmer Co., USA)를 사용하여 염기서열을 결정하고 이를 NCBI database와 비교하였다.</p> <h2>\( \beta \)-Galactosidase 조효소액 제조</h2> <p>분리균 B. licheniformis YB-1105를 LB 배지에서 하룻밤 배양한 후 배양액을 \( 1 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \)가 되도록 동일 성분의 본 배양액에 접종하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24-26시간 동안 진탕배양 하였다. 배양액을 원심분리하여 얻은 배양상등액을 ammonium sulfate \( (20 ~ 75 \%) \) 로 처리하고 침전된 단백질을 \( 10 \mathrm { mM } \)인산완충용액 \( ( \mathrm { pH } \) 6.5)에 현탁하여 동일 완충용액으로 투석한 후 조효소액으로 사용하였다. 또한 배양균체를 \( 10 \mathrm { mM } \)인산 완충용액 \( \left ( \mathrm { pH } \right . \) 6.5)으로 현탁하고 lysozyme을 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30분간 방치한 후 초음파 파쇄하고, 원심분리하여 얻은 균체파쇄상등액도 조효소액으로 사용하였다.</p> <h2>\( \beta \)-Galactosidase 활성 측정</h2> <p>\( 1 \mathrm { mM } \) pNP- \( \beta \mathrm { Gal } \)와 \( 50 \mathrm { mM } \) sodium phosphate 완충용액 \( \left ( \mathrm { pH } \right . \) 6.5)을 포함한 반응액에 효소를 첨가하여 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분간 반응시킨 후 반응액의 2배 부피의 \( 1 \mathrm { M } \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { CO } _ { 3 } \) 용액을 첨가하여 반응을 종결시키고 \( 405 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 활성도 1 unit는 1분 동안 \( 1 \mu \mathrm { mol } \)의 paranitrophenol을 유리시키는 효소량으로 정의하였다.</p>