쥐의 뇌 피질 층 구조를 연구하기 위해 전 신경세포를 thionin으로 염색하고, HRP 염색을 통해 melanopsin-IR 신경세포의 층별 분포를 살펴 본 결과, melanopsin은 시각피질의 전 층에서 발견되었으나, thionin에 비해 적게 염색 되었다. 보다 정확하게 melanopsin-IR 신경세포의 수를 세고 thionin 염색된 세포의 수를 비교한 결과 역시 시각피질에 존재하는 melanopsin-IR은 전체 신경세포 중 일부에만 존재한다는 사실을 뒷받침한다.
<h2>Fluorescence immunocytochemistry</h2> <p>Immunocytochemistry는 본 연구실에서 발표된 다른 논문에 자세히 나와 있다. Double labeling된 조직은CB, PV와 NOS 그리고 melanopsin이다. CB, PV는 monoclonal antibody (Sigma, St. Louis, MO, USA), 그리고 NOS는monoclonal antibody (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하였다. Mealnopsin은 polyclonal antibody (Abcam)을 사용하였다. Primary antiserum으로 PV, CB, NOS 그리고melanopsin은 각각 \( 1: 500 \) 으로 희석하여 사용하였다.Secondary antibody로 melanopsin을 탐지하기 위해 \( \mathrm { Cy } 2 \) conjugated with anti-rabbit igG (Jackson Immuno Research Laboratories, West, PA, USA)를 사용하였다. CB, PV, NOS를탐지하기 위해 Cy3 conjugated with anti-mouse igG (JacksonImmuno Research Laboratories)를 이용하였다.</p> <h2>Quantitative analysis</h2> <p>양 적 분석을 위해, 3 마리의 mouse에서 각각 3 개의 조직을 선택했다. Melanopsin-IR 신경세포의 수를 세기 위해서 총 9개의 조직을 Zeiss Axioplanmicroscope의 \( 20 X \) 를 이용하여 관찰하였다 조직의 폭은 \( 500 \mu \mathrm { m } \) 로 설정했다. 9개의 조직에서 각각 melanopsin-IR 신경세포를 수를 세고, 다른 9 개의 조직에서 각각 thionin 염색된 세포의 수를 세어 그 평균값을 도출하여 비교하였다. 그리고 시각 피질의 층별 melanopsin-IR 신경세포 수의 비율을 구하였다.</p> <h1>결 과</h1> <h2>Melanopsin-IR 신경세포의 분포</h2> <p>Mouse 뇌 피질의 층 구조를 알아보기 위해 모든 신경세포를 염색하는 thionin으로 염색하였다. 그리고 melanopsin-IR 신경세포의 층별 분포를 알아보기 위해 HRP 염색을 이용하였다. Melanopsin은 시각피질의 모든 층에서 염색되었으며 thionin에 비해 적은 비율로 염색되었다. 즉, 시각피질에 존재하는 melanopsin-IR 신경세포는 전체 신경세포 중 일부에만 존재한다. Thionin 염색된 세포와melanopsin-IR 신경세포의 수를 비교하기 위해 각각 9개의조직을 선택하여 폭 \( 500 \mu \mathrm { m } \) 안에 존재하는 세포의 수를 세었다. Fig. 2A는 각 층별 melanopsin-IR 신경세포의 분포비율을 보여준다. I층은 \( 3.7 \% \), Ⅱ /Ⅲ 층은 \( 37.2 \% \), Ⅳ층은 \( 14.8 \% \), Ⅴ층은 \( 16.2 \% \), Ⅵ 층은 \( 28.1 \% \) 의 비율로 관찰되었다. Fig. 2B 는 9 개의조직에서 각 층별로 염색된 세포 수의 평균값으로 비고한 것이다. I층의 경 우 thionin 68.5개 melanopsin 16.3 개, Ⅱ/Ⅲ층의경우 thionin 588개 melanopsin173개, Ⅳ 층의 경우 thionin294개 melanopsin 70.5개, Ⅴ 층의 경우 thionin 338개 melanopsin 78개, Ⅵ층의 경우 thionin 508개 melanopsin 134 개로 각 층별 thionin 염색된 세포의 수는 melanopsin-IR 신경세포의 숫자보다 월등히 많았다.</p>