특정한 시간(day)동안 체세포의 생장을 조사하여 specific growth rate \( ( \mu) \) 와 doubling time \( \left (T_ { d } \right ) \) 을 구하였다. 500ml의 삼각플라스크에 100ml의 배지를 넣고, 특정한 시간동안 체세포의 생장을 조사함으로써 Specific Growth Rate과 Doubling Time을 구하였다. Maximum Growth Rate과 Doubling Time은 각각 $\mu_{\max}$과 $\ln2/\mu_{\max}$로 계산된다. 배발생 캘러스의 생장 주기 별 세포의 활력을 조사하고 세포의 주기를 5일 간격으로 채취하고 핵을 추출한 후 여과하여 실온에서 3 분간 방치 후 Flow cytometry를 이용하여 세포주기를 분석하였다.
<p>여 specific growth rate \( ( \mu) \) 와 doubling time \( \left (T_ { d } \right ) \) 을 구하였다.</p> <p>Specific growth rate \( ( \mu)=1 / \mathrm { X } \cdot \mathrm { dX } / \mathrm { dt } ( \mathrm { X } = \) fresh weight, \( \mathrm { t } = \) time (day) \( ) \) Maximum growth rate \( ( \mu \max ) \), Doubling time \( T_ { d } = \operatorname { In } 2 / \mu \max \)</p> <h2>체세포 배 발달을 위한 세포 접종 밀도</h2> <p>배양 초기의 접종 밀도가 체세포배 발달에 미치는 영향을 조사하고자 \( 500 \mathrm { ml } \) 의 삼각플라스크에 \( 100 \mathrm { ml } \) 의 배지를 분주하여 초기 접종 밀도를 \( 0.5,1.0,5.0,10.0,30.0 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) (생체중 기준)으로 각각 준비하였다. 배지는 MS배지에 \( 0.41 \mu \mathrm { M } \) abscisic acid, \( 0.02 \%(w / v) \) 활성탄 (activated charcoal), \( 5 \%(w / v) \) sucrose, \( 5 \%(w / v) \) polyethylene glycol (PEG, MW 3350)를 각각 첨가하여 사용하였다. 배양 5주 후 체세포배 발달 단계별 (세포단계, 구형/심장형 및 어뢰형 단계)로 구분하여 각 처리에 따른 배 발달 정도를 조사하였다. 한편 접종 밀도에 따라 각각 유도된 체세포배가 차후 발아에 미치는 영향을 조사하기 위하여 각 처리 별로 일정량 \( (0.25 \mathrm { ~g } / \) Petri dish)의 체세포배를 채취하여 \( 1 / 2 \mathrm { MS } + 8.66 \mu \mathrm { M } \mathrm { GA } _ { 3 } , 2 \% \) sucrose, \( 0.3 \% \) gelrite 배지에서 2 주간 배양 후 발아된 체세포배를 조사하였다.</p> <h2>세포주기 분석</h2> <p>배발생 캘러스의 생장 주기 별 세포의 활력을 조사하고자 세포의 주기를 분석하였다. 5 일 간격으로 세포를 채취하여 petri-dish 에 HR-A용액 (High resolution plant staining kit, Partec \( \mathrm { GmbH } \), Münster, Germany)을 \( 0.5 \mathrm { ~mL } \) 첨가한 후, 칼로 잘게 절단하여 핵을 추출한 다음 \( 30 \mu \mathrm { m } \) filter (Cell TricsTM, Partec GmbH, Münster, Germany)를 사용하여 여과하였다. 실온에서 3 분간 방치 후, HR-B용액 (High resolution plant staining kit, Partec GmbH, Münster, Germany)을 \( 2 \mathrm { ~mL } \) 첨가하여 염색한 후 Flow cytometry (PAS, Partec GmbH, Münster, Germany)를 이용하여 세포주기를 분석하였다.</p>