본 연구에서는 동일 균주 내에 존재하는 내성유전자들을 접합과 열처리에 의한 형질전환을 실시하고 유전자가 재조합 된 균주들의 항생제 내성 결과를 비교하였다. 그 결과 접합에 의해 재조합 된 conjugant 균주의 MIC는 원 균주의 MIC와 큰 차이가 없었으나 형질전환 시킨 transformant 균주 보다 낮았고, 교차접합 시킨 conjugant 균주의 MIC 보다도 낮았다. ceftazidime과 ceftriaxone에는 가수분해 능력을 갖고 있고, cefotaxime 항생제에 대한 가수분해 능력은 가지고 있지 않은 균주는 SHV-12 gene만을 가지고 있는 균주이다. CTX-M-15형을 가진 균주가 최근 많이 검출되어 형질전환을 시도했으나 실패하였고, CTX-M-15 유전자가 cefotaxime항생제에 대한 가수분해에 영향을 주는지 여부는 향후 추가실험을 통해 밝혀내야 할 과제이다.
<h2>Result of MIC (minimum inhibitory concentration) by agar dilution method</h2><p>Ceftazidime, cefotaxime, ceftriaxone 세 가지 항생제를 한천희석법으로 최소억제농도를 측정한 결과는 임상에서 분리되어 TEM, SHV, CTX-M의 세 가지 유전자를 갖고 있던 원균주인 Klebsiella pneumoniae (NO. 60031)의 MIC는 ceftazi-dime \( (30 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \), cefotaxime \( (30 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \), ceftriaxone \( (30 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \))이 각각 \( \geq 256 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), \(128 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), \(128 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 이었고, 교차접합시험을 위해 수여균주로 사용되었던 E. coli RG176 \( { }^{\mathrm{Na}} \) 의 MIC는 \( 0.25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), \(0.12 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), \(0.12 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 이었고, 형질전환을 위해 competent cell로 사용 되었던 E. coli DH 5\( \alpha \) 의 MIC는 \( 0.25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), \(0.06 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), \(0.12 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 이었다. 그리고 세 가지 유전자를 갖고 있던 Klebsiella pneumoniae 균주 (NO. 60031)를 공여균주로 하여 E. coli RG176 \( { }^{\mathrm{Na}} \) 교차접합 시킨 conjugant 균주의 MIC는 ceftazidime, cefotaxime, cef-triaxone이 각각 \( \geq 256 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), \(64 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), \(128 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 이었다. 세 가지 유전자를 갖고 있던 Klebsiella pneumoniae 균주 (NO. 60031)로부터 plasmid DNA를 분리하여 E. coli DH 5\(\alpha \) 에 heat shock 방법으로 형질전환 시킨 transformant 균주의 MIC는 ceftazidime, cefotaxime, ceftriaxone이 각각 \( 128 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), \(32 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), \(32 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 를 나타내었고, 또한 Klebsiella pneumoniae 균주 (NO. 60031)로부터 SHV-12 gene 만을 분리하여 vector를 이용하여 E. coli DH 5\( \alpha \) 에 클로닝 시킨 균주는 ceftazidime, cefotaxime, ceftriaxone이 각각 \( 128 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), \(8 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), \(32 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 을 나타내었다. 본 연구에서는 동일 균주 내에 존재하는 내성유전자들을 접합과 열처리에 의한 형질전환을 실시하였다. 또한 이렇게 유전자가 재조합 된 균주들의 항생제 내성 결과를 비교하였다. 접합에 의해 재조합 된 conjugant 균주의 ceftazidime, cefotaxime, ceftriaxone의 MIC는 cefo-taxime을 제외하고는 원 균주(Klebsiella pneumoniae, NO. 60031)의 MIC와 큰 차이가 나타나지 않았다. 하지만 형질전환 시킨 transformant 균주(E. coli DH 5\( \alpha \) 의 MIC는 원 균주 (Klebsiella pneumoniae, NO. 60031)보다 낮았고, E. coli \( \mathrm{RG} 176^{\mathrm{Na} } \) 에 교차접합 시킨 conjugant 균주의 MIC 보다도 낮았다. 이는 접합의 방법으로 플라스미드에 있는 내성유전자가 다른 세포로 이동 할 때는 염색체에 존재하는 내성유전자도 함께 다른 세포로 넘어갈 수가 있는 반면 인위적인 열처리에 의해 형질전환 시킨 transformant 균주는 환형 플라스미드에 존재하는 내성 유전자만이 수여균주로 옮겨 간 결과가 아닌 가 생각된다. 원 균주(Klebsiella pneumoniae, NO. 60031)로부터 SHV-12 gene 만을 분리하여 E. coli DH 5\( \alpha \)에 클로닝 시킨 균주는 ceftazidime과 ceftriaxone에는 내성을 나타내었으나 cefotaxime에는 내성을 나타내지 않았다. 이는 SHV-12 gene이 주로 ceftazidime에 내성을 일으키며 cef-triaxone에도 어느 정도 영향을 일으키는 젓을 나타내었다. TEM-1 유전자는 ampicillin은 잘 분해하지만 제 3 세대 ceph-alosporin은 잘 분해하지 못하므로 엄밀하게 이야기하면 ESBL효소를 생산한다고 보기는 어렵다. 그러므로 TEM-1 유전자가 존재한다고 해도 제 3세대 cephalosporin의 대표격인 eftazidime, cefotaxime, ceftriaxone 항생제의 MIC에는 별 영향이 없을 것 같다. 다만 원 균주에 존재하는 CTX-M-15 유전자는 cefotaxime항생제에 특이한 내성을 일으킨다고 하였는데 SHV-12 gene 만을 cloning 한 균주가 cefotaxime항생제에 대해서 다른 항생제보다 상대적으로 낮은 MIC를 나타내는 것은 이러한 이론을 잘 증명해 주는 것 같다. 즉, 다시 말해서 SHV-12 gene만을 가지고 있는 균주는 ceftazidime과 ceftriaxone에는 가수분해 능력을 가지고 있지만 cefotaxime 항생제에 대한 가수분해 능력은 가지고 있지 않다는 것이다. 그리고 근래에 우리나라에서 가장 많이 나타났던 ESBL 유전자는 SHV-12 형이다. 또한 최근에는 CTX-M형 ESBL을 가지고 있는 균주의 등장이 급증한다는 보고가 있다. 특히 CTX-M-15형을 가진 균주가 많이 검출된다고 하였는데 본 연구의 균주도 CTX-M-15형을 가지고 있었다. 그래서 CTX-M-15 유전자만을 클론하여 형질전환을 몇 차례 시도하였으나 실패하였다. 다만 CTX-M-15 유전자를 배제한 형질전환체가 cefotaxime항생제에 대한 가수분해능력을 나타내지 않은 것으로 보아서 CTX-M-15 유전자가 cefotaxime항생제에 대한 가수분해에 큰 영향을 주지 않을까하고 생각된다. 이러한 것은 향후 추가실험에서 밝혀내어야 할 과제로 남겨져 있다.</p>