실험에 사용된 세포는 \( 90 \% \) RPMI 1640(GIBCO, USA)과 \( 10 \% \) FBS(fetal bovine serum)로 구성된 배지에서 배양하였다. 멜라닌 생성량을 측정하기 위해 시료별로 B16F10 흑색종 세포를 사용하였다. positive control인 arbutin을 \( 2.5 \%, 5.0 \% \), \( 10.0 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)의 농도로 처리하여 미백 활성을 평가하였고 용출된 멜라닌의 함량을 측정하기 위해 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 \( 400 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 또한 데이터는 모든 측정을 세 번 반복하여 통계적으로 처리되었다. 실험값은 SAS(Statistical Analysis System) 프로그램을 이용하여 평균을 도출했고, 통계학적 분석은 각 처리군에서 최소유의차 \( (p<0.05) \)를 사용하여 수행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 확보 및 배양조건</h2> <p>본 연구에서 사용된 유산균 Lactobacillus rhamnosus (KCCM40069)와 보편적으로 사용되는 프로바이오틱스인 Lactobacillus casei (KCCM12452)를 초기균수 \( 10^{5} \mathrm{CFU} / \) \( \mathrm{ml} \) 로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간동안 \( 1 \mathrm{~L} \) MRS broth에서 각각 혐기 배양을 한 후, 항산화 활성 및 미백활성을 측정하기 위하여 균주와 볼밀용 볼(직경 \( 1 \mathrm{~mm} \))을 볼밀(HK-BA01, SAMHAW CERAMIC COMPANY, KOREA)에 넣어 하루동안 파쇄 시킨 후 파쇄물을 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) 필터에 여과한 후 여과물을 가지고 실험을 진행하였다.</p> <h2>세포주 및 세포 생육 배지</h2> <p>실험에 이용된 세포주로 human fibroblast CCD-986sk (KCLB 21947, KOREA), melanoma cell B16F10 (KCLB 80008, KOREA)를 사용하였으며, 세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640 (GIBCO, USA)을 사용하였고 그 밖의 세포 배양에 필요한 시약으로 hepes buffer (SIGMA, USA)와 fetal bovine serum (GIBCO, USA), gentamycin sulfate (SIGMA, USA), trypsin-EDTA (SIGMA, USA)를 사용하였다. 실험에 사용된 세포는 RPMI 1640 (GIBCO, USA) 배지 \( 90 \% \) 에 FBS 를 \( 10 \% \) 로 적용시켜 배양하여 실험에 이용하였다.</p> <h2>세포 독성 측정</h2> <p>Mosmann 방법을 변형시켜 세포 생존율을 측정하였다. CCD-986sk 세포를 96 well plate에 \( 1.5 \times 10^{4} \) cells/well 농도로 접종한 후, \( 80 \% \) 정도의 배양시점에서 각 well에 시료를 투여하고 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24시간 동안 배양하였다. \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도의 MTT 용액을 각 well에 첨가하고 4시간 후 상층액을 제거하고, \( 10 \mu \mathrm{l} \) 의 acid-isopropanol ( \( 0.04 \mathrm{~N} \mathrm{~HCl} \) in isopropanol)을 첨가한 후 microplate reader (Tecan, USA)로 \( 565 \mathrm{~nm} \) 의 파장에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>DPPH 자유라디칼 소거활성 측정</h2> <p>DPPH ( \( \alpha, \alpha \)-diphenyl- \( \beta \)-picrylhydrazyl) radical에 대한 소거활성은 Dietz 등의 방법을 약간 변형하여 실험하였다. 96-well plate에 용매를 ethanol로 하여 제조한 \( 0.1 \mathrm{mM} \) DPPH용액 \( 200 \mu \mathrm{l} \) 와 \( 2.5 \%, 5.0 \%, 10.0 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 농도로 조절된 Lactobacillus rhamnosus와 Lactobacillus casei, postive control인 ascorbic acid \( 80 \mu \mathrm{l} \) 을 각각 혼합하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20분동안 암실에 방치한 후 \( 525 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도 측정하였다. 측정값은 아래의 DPPH radical scavenging activity (\%)로 계산하였다.</p> <p>DPPH radical scavenging activity (%) \[ =\frac{\text { control O.D. }-\text { sample O.D. }}{\text { control O.D. }} \times 100 \]</p> <h2>환원력 측정</h2> <p>환원력은 sample 및 postive control를 각각 \( 2.5 \%, 5.0 \% \), \( 10.0 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 농도 \( 2.5 \mathrm{~ml} \) 에 \( 200 \mathrm{~mM} \) sodium phosphate buffer (SIGMA, USA) \( 2.5 \mathrm{~ml} \) 와 \(1\%\) potassium ferricyanide (HAYASHI PURE CHEMICAL, JAPAN) \( 2.5 \mathrm{~ml} \) 을 혼합시키고, \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20분간 incubation시킨 다음 \( 2.5 \mathrm{~ml} \) trichloroacetic acid (SIGMA, USA) \( (10 \%, \mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 를 첨가하여 \( 3500 \mathrm{~rpm} \) 에서 10분간 원심분리 하였다. 상층액 \( 5 \mathrm{~ml} \) 에 탈이온수 \( 5 \mathrm{~ml} \) 와 \( 1 \% \) ferric chloride (SIGMA, USA) \( 1 \mathrm{~ml} \) 를 첨가시킨 후 UV-vis Spectrophotometer (352A Diode Array Spectrophotometer, Hewlett Packard)를 이용하여 \( 700 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Tyrosinase 억제 효과 탐색</h2> <p>dopachrome법을 이용하여 tyrosinase 억제 효과를 측정하였다. mushroom tyrosinase-150 unit \( 150 ~\mu \mathrm{l} \) 와 \( 2.5 \mathrm{~mM} \) L-tyrosine \( 225~ \mu \mathrm{l}, 0.4 \mathrm{~M} \) hepes buffer ( \( \mathrm{pH~} 6.0\)) \( 225~ \mu \mathrm{l} \), ethanol 용액 또는 \( 1 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) 농도의 시료 \( 300~ \mu \mathrm{l} \) 를 혼합한 후 배양 전, 15분간 배냥 후의 각각의 흡광도를 \( 475 \mathrm{~nm} \) 의 파장에서 측정하였다.</p> <p>Tyrosinase Inhibition \( (\%)=(\mathrm{D}-\mathrm{C})-(\mathrm{B}-\mathrm{A}) /(\mathrm{D}-\mathrm{C}) \times 100 \)</p> <p>\( \mathrm{A} \) 와 \( \mathrm{B} \) 는 각각 시료가 첨가된 용액의 배양 전과 배양 후의 흡광도이며, \( \mathrm{C} \) 와 \( \mathrm{D} \) 는 각각 시료를 넣지 않은 용액의 배양 전과 배양 후의 흡광도이다. 이들 tyrosinase 억제 효과는 100으로 나타날 때 완전한 억제를 의미하며, 0일 때 전혀 억제를 하지 못하는 것을 의미한다.</p> <h2>Melanoma cell를 이용한 멜라닌 생성량 측정</h2> <p>멜라닌 생성량 측정을 위해 melanoma cell B16F10을 각각의 시료와 positive control인 arbutin을 \( 2.5 \%, 5.0 \% \), \( 10.0 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 농도로 처리하여 미백활성을 측정하였다. Melanoma cell B16F10을 96-well plate에 \( 1.5 \times 10^{4} \) cells/ well 농도로 접종한 후 시료를 3일간 처리하였다. 3일 후에 각 well의 배지를 제거한 후에 PBS로 세척하고, 각 well 당 \( 1 \mathrm{~ml} \) 의 \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{~NaOH} \) 를 가한 다음 교반시켜 멜라닌 성분이 용출되도록 하였다. 용출된 멜라닌의 함량을 측정하기 위하여 microplate reader를 이용하여 \( 400 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>데이터의 통계처리는 모두 3회 반복으로 행해졌으며, 실험값의 통계는 SAS (Statistical Analysis System) 프로그램을 사용하여 평균을 구하였으며, 각 처리구간의 최소유의차 \( (p<0.05) \) 수준에서 통계처리 하였다.</p>