본 논문에서는 \( \alpha \)-MSH로 자극된 B16F10 mouse melanoma cell에서 Luteolin 유도체가 tyrosinase의 활성에 미치는 영향 및 Luteolin 유도체가 멜라닌 합성에 관여하는 인자들의 발현에 미치는 영향을 조사하고자 B16F10 mouse melanoma cell에 \( \alpha \)-MSH (\( 200 ~ \mathrm{nM} \))와 시료(\( 50, 100, 200 ~ \mu \mathrm{M} \))를 처리해 배양해 실험을 진행했다. 단백질 발현량의 면적은 imageJ program로 수치화해 그래프로 나타냈고 모든 실험을 3회 반복해 측정한 결과를 평균값 \( \pm \) 표준편차로 나타냈다.
<h2>Tyrosinase activity 측정</h2> <p>\( \alpha \)-MSH로 자극된 B16F10 mouse melanoma cell에서 Luteolin 유도체가 tyrosinase의 활성에 미치는 영향을 조사하고자 B16F10 mouse melanoma cell를 6-well plate에 \( 4.0 \times 10^{4} \mathrm{cells} / \mathrm{well} \) 농도로 분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24시간 동안 전 배양한 뒤 \( \alpha \)-MSH (\( 200 ~ \mathrm{nM} \))와 시료(\( 50, 100, 200 ~ \mu \mathrm{M} \))를 동시에 처리하여 72시간 동안 배양하였다. Melanin contents와 동일한 방법으로 세포를 lysis한 뒤 원심 분리(\( 13,000 ~ \mathrm{rpm} \), \( 30 \mathrm{~min} \), \( 4^{\circ} \mathrm{C} \))하여 회수한 상등액은 Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit (BCA kit, Bio-rad, Hercules, CA, USA)로 정량 하였으며 정량 된 단백질 \( 20 ~ \mu \mathrm{L} \)에 \( 2 ~ \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \)의 L-DOPA (Sigma-Aldrich) \( 80 ~ \mu \mathrm{L} \)를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 동안 반응 시킨 뒤 \( 490 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Western blot analysis</h2> <p>\( \alpha \)-MSH로 유도된 B16F10 mouse melanoma cell에서 Luteolin 유도체가 멜라닌 합성에 관여하는 인자들의 발현에 미치는 영향을 조사하고자 세포를 6-well plate에 \( 4 \times 10^{4} \mathrm{cells} / \mathrm{well} \) 농도로 분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 48시간 동안 전 배양한 뒤 \( \alpha \)-MSH (\( 200 ~ \mathrm{nM} \))와 시료(\( 50, 100, 200 ~ \mu \mathrm{M} \))를 동시 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 세포를 60분 동안 lysis한 뒤 원심 분리(\( 13,000 ~ \mathrm{rpm} \), \( 30 \mathrm{~min} \), \( 4^{\circ} \mathrm{C} \))하여 상등액을 회수하였으며 상등액의 단백질은 BCA kit (Bio-rad)를 사용하여 정량 하였다. 이후 정량 한 단백질 \( 20 ~ \mu \mathrm{g} \)을 \( 10 \% \)의 polyacrylamide gel를 함유한 SDS-PAGE에서 전기 영동 한 후 polyvinylidene difluoride membrane (Milipore, Burlington, MA, USA)에 transfer 하였다. Transfer된 membrane은 1X TBST (Trisbuffered saline, \( 0.1 \% \) Tween 20)를 용매로 하여 제조된 \( 5 \% \) skim milk를 사용하여 상온에서 2시간 동안 blocking 하였으며 이후 TBST를 사용하여 membrane을 10분 간격으로 4회 세척하였다. 세척 된 membrane은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 overnight동안 1차 항체 반응을 진행하였으며 항체 반응에는 TRP-1 antibody (\( 1 : 1,000 \), Santa cruz biotechnology, Dallus, TX, USA), TRP-2 antibody (\( 1 : 500 \), Santa cruz biotechnology), tyrosinase antibody (\( 1 : 500 \), Santa cruz biotechnology), MITF antibody (\( 1 : 500 \), Cell Signaling technology, Denvers, MA, USA)를 사용하였다. 반응 후 1X TBST를 사용하여 membrane을 10분 간격으로 4회 세척하였으며 2차 항체 반응은 anti-mouse IgG HRP와 anti-rabbit IgG secondary antibody (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)를 1X TBST에 \( 1: 10,000 \) 비율로 희석하여 상온에서 2시간 동안 진행하였다. 이후 TBST를 사용하여 10분 간격으로 membrane을 4회 세척하였으며 세척한 membrane은 ECL (Bio-rad)과 반응하여 imaging densitometer (model GS-700, Bio-rad)로 현상하였다. 단백질 발현량의 면적은 imageJ program (NIH, Bethesda, MD, USA)를 통해 수치화하여 그래프로 나타내었다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험은 3회 반복하여 측정하였으며 그 결과는 평균값 \( \pm \) 표준편차로 나타냈다. 통계적 분석은 각 처리 구간의 유의성(\( { }^{*} p<0.05 \); \( { }^{* *} p<0.01 \); \( { }^{* * *} p<0.001 \))을 검증을 위해 분산분석(analysis of variance, ANOVA)후 student's t-test로 다중 비교를 실시하였다.</p>