본 연구에서는 PCE와 TCE의 탈염소화에 관여하는 미생물군집을 탐색 및 혐기성 상호대사에 의한 탄염소능을 확인하며 이로부터 미생물 혼합균주 확보 및 군집분석을 수행한다. 시료는 혐기성 조건의 하천, 해양의 저질의 저니에 채취하였으며, 탈염소화능을 가진 혐기성 미생물 배양 및 탐색은 회분식 실험 통해 실시하였다.
<h1>실험재료 및 방법</h1><p>하천의 퇴적물과 해양준설토로부터 염소계 유기화합물인 PCE와 TCE의 탈염소화에 관여하는 미생물군집을 탐색하고 혐기성 상호대사에 의한 탄염소능을 확인하며, 이로부터 안정화된 미생물 혼합균주 확보 및 군집분석을 수행하였다.</p><h2>시료채취 및 보관</h2><p>탈염소화에 관여하는 미생물들은 주로 저니에서 발견된다고 보고되고 있으며, 혐기성 조건의 하천, 해양의 저질에 존재한다고 보고되었다. 또한, 이전에 PCE 및 TCE로 오염된 지역의 저질에 분포할 가능성 크기 때문에 이를 근거로 하천, 해양의 저니에서 시료를 채취하였으며, 광양(준설토) \( \left(34^{\circ} 55^{\prime} 47^{\prime \prime} 127^{\circ} 40^{\prime} 40^{\prime \prime}\right) \), 하남(퇴적토)( \( \left.35^{\circ} 14^{\prime} 25^{\prime \prime} 128^{\circ} 38^{\prime} 47^{\prime \prime}\right) \), 여천(토양) \( \left(34^{\circ} 48^{\prime} 54^{\prime \prime} 127^{\circ} 37^{\prime} 53^{\prime \prime}\right) \)등 전국에서 시료를 채취하였다. 시료 채취는 라이너 토양채취기(SJD-1600, \(50 \times 300 \) \( \mathrm{mm} \) )(Sinjung, Changwon, Korea)와 PVC pipe를 이용하여 약 \( 30-40 \mathrm{cm} \) 정도의 깊이에서 채취하였다. 채취한 토양은 기밀용기(Wheaton, NJ, USA)에 넣은 다음 질소포기를 약 3분간 실시하여 토양의 산소를 제거하고 외부공기와 접촉을 차단시킨 후, ice box를 이용하여 \( 0 \sim 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 시료를 운반하였다.</p><h2>혐기성 배양 조건</h2><p>탈염소화능을 가지고 있는 혐기성 미생물을 탐색하기 위해 회분식 실험(batch experiment)을 실시하였다. 실험에 사용된 배지는 Sung 등이 사용한 무기염 배지를 사용하였으며, PCE와 TCE를 전자 수용체로 하고, 아세테이트를 전자 공여체로 사용하여 배양 하였다. 무기염 배지의 조성은 \( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.5 \mathrm{g}\) ; \(\mathrm{NH}_{4} \mathrm{SO}_{4}, 0.3 \mathrm{g}\) ; \(\mathrm{K}_{2} \mathrm{SO}_{4}, 0.3 \mathrm{g}\) ; \(\mathrm{CaSO}_{4} \). \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.015 \mathrm{g}\); resazurin, \( 0.0025 \mathrm{g} \); \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{S} \cdot 9 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.048 \mathrm{g} \); \( L \)-cysteine, \( 0.035 \mathrm{g} \); \( \mathrm{NaHCO}_{3}, 2.52 \mathrm{g} \); trace element solution(A) \( 1 \mathrm{mL} \), trace element solution(B), \( 1 \mathrm{mL} \); yeast extract \( 0.2 \mathrm{g} \)와 같다. 무기염 배지는 질소 flushing \( \left(\mathrm{N}_{2}: \mathrm{CO}_{2}=\right. \) \( 80: 20 \) )을 통해 산소를 제거하였다.</p><p>회분식 실험을 위해 총 용량 \( 160 \mathrm{mL} \)의 혈청병에 채취한시료 \( 1 \mathrm{g} \)(습중량)과 무기염 배지 \( 50 \mathrm{mL} \), 전자 공여체로는 2\( \mathrm{mM} \) 아세테이트를 주입하였고, \( 2 \mathrm{mM} \)의 TCE와 PCE를 각각 기질로 함께 주입한 다음, 테프론 재질의 Gray Butyl Septa (Wheaton, NJ, USA)를 사용하여 완전히 밀폐시켰다. 밀폐된 혈청병은 암조건의 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \)에서 정치 배양하였으며, 3반복으로 진행되었다. 4주에 한번 새로운 배지로 3회에 걸쳐 집적배양 하였다. 새로운 배지로의 접종은 전체 용량에 \( 10 \% \)로 하였고, 계대 배양 시 마다 혈청병내에 존재하는 PCE 및 TCE를 측정하여 탈염소화능을 확인하였다.</p>