Multiplex PCR을 사용하면 한 번의 PCR로 B. subtilis AH18 등의 특정미생물을 확인할 수 있으며, B. subtilis AH18을 cell 그대로 사용하면 template DNA와 동일한 결과를 얻을 수 있어 비용과 시간 측면에서 효율적이다. 이 연구에서 B. subtilis AH18균주의 monitoring에 사용된 3쌍의 primer은 phenotype 및 genotype을 나타내는 균주인 auxin, siderophore와 cellulase를 생산하는 균주의 monitoring에도 응용된다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>B. subtilis AH18의 PCR fragment 및 sequencing</h2><p>B. subtilis AH18의 chromosomal DNA를 정제하여 이를 주형으로 Pfu DNA polymerase를 이용해서 PCR을 수행하였으며, 그 결과 약 \( 800 \mathrm{bp}\)(sid), \(1.0 \mathrm{~kb}\(aec),\( 1.6 \mathrm{~kb}\)(cel)의 fragment를 확인하였고, 각 fragment를 insert로 pUC 18,19 vector를 이용해서 host cell인 E. coli DH5a에 cloning하였으며, 그 결과 recombanant DNA pSH \(7\)(pUC \( 19+ \) sid product), pAL \(5\)(pUC \( 18+ \)aec product), pCM \(4\)1(pUC \( 18+\) cel product)를 획득하였다.</p><p>각각의 recombinant plasmid를 정제하여 sequencing한 결과 sid\((794 \mathrm{bp}\)), ae\((1,062 \mathrm{bp})\), cel\((1,582 \mathrm{bp}) \)의 sequences를 확인하였으며 NCBI의 Genbank에 등록하였다(Genbank accession sid: No. EF408238, aec: No. EF408239, cel: No. blastx를 통해 비교한 결과 sid gene는 B. subtilis의 siderophore의 생합성 key enzyme인 2,3-dihydro-2,3-dihydroxy benzoate dehydrogenase [EC:1. 3. 1. 28]에 \( 97 \% \)의 상동성을 나타내었으며(data not shown), aec gene는 B. subtilis의 auxin efflux carrier와 \(99\%\), B. licheniformis ATCC 14580의 auxin efflux carrier와 \( 77 \% \)의 상동성을 나타내었고(data not shown), cel gene는 Bacillis spp. 들이 생산하는 cellulase와 \( 98 \% \)이상 일치하였다. 본 연구에 사용된 primer들을 이용하여 PCR을 수행 후 agarose gel 상에서 확인하면, \( 794 \mathrm{bp}\), \(1,062 \mathrm{bp} \) 및 \( 1,582 \mathrm{bp} \)의 PCR products를 확인할 수 있으며, 이는 siderophore, auxin 및 cellulase의 생산하는 B. subtilis AH18이 존재함을 토양 내에서 그 고유의 특정유전자들을 확인함으로써, 미생물제제로 투여한 미생물의 토양내 존재를 간접적으로 나타내는 결과이다.</p><h2>Multiplex PCR을 통한 B. subtilis AH18의 확인</h2><p>B. subtilis AH18의 PCR을 통한 monitoring을 위해 합성된 primers들로 PCR을 수행하여 확인하였으며, 이들 3종의 primer들을 동시에 넣은 multiplex PCR법으로 3종의 유전자와 동일한 위치의 triplex band를 확인하였다. 이는 별개의 유전자를 각각 PCR하는 대신에 동일시간 동일 공간 내에서 동시에 PCR 함으로써 한번의 PCR로 간편하고 정확하게 B.subtilis AH18과 같이 토양 내 투입된 특정미생물을 손쉅게 확인가능하다는 것을 의미한다. 뿐만 아니라 B. subtilis AH18을 cell 그대로 PCR의 template로 사용 시 multiplex PCR을 통해 비교한 결과 DNA를 template로 사용한 PCR 경우와 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 이 방법은 미생물의 template DNA를 정제하는 비용과 시간을 많이 줄여 효율적으로 PCR을 이용해 환경내 미생물을 신속하고 간편하게 검출하는데 많은 활용될 것이다. Multiplex PCR은 PCR에 비해 특정 유전자를 동시에 증폭함으로써 다른 미생물로 인한 비 특이적 증폭을 배제할 수 있으며, triplex band의 동시 증폭만이 토양내 B. subtilis AH18의 존재를 확인 할 수 있었다.</p><p>지금까지 많은 종의 PGPR균주들이 보고되었고, 이중에서 Bacillus sp. 균주들만 수십 종에 달한다. 그리하여 본 연구에 사용된 B. subtilis AH18균의 monitoring용으로 제작된 3쌍의 primers를 이용하여 11종의 Bacillus spp.의 chromosomal DNA를 대상으로 PCR 및 multiplex PCR 수행 결과 우리가 원하는 size의 band를 확인할 수 없었다. 뿐만 아니라 phenotype에서 auxin, siderophore, 그리고 cellulase의 생산능이 확인된 3종의 Bacillus subtilis에 대해서도 어떠한 증폭도 확인되지 않았다. 이로보아 본 연구에 사용된 3쌍의 primer는 B. subtilis AH18균주의 monitoring에 사용되며, 본 균주와 동일한 phenotype 및 genotype을 나타내는 균주 즉, auxin, siderophore, 그리고 cellulase를 생산하는 균주의 monitoring에도 활용될 것이다.</p>