실험을 위해 해양 세균을 배지에 생육시키고, 한천분해 효소 유도배지는 여기에 한천을 첨가하여 사용하였다. 분리균은 병반조직을 보이는 김에서 분리하였고 육안으로 관찰하여 동정하였다. 또한 공시 균주 김의 병원성을 조사하고 세포벽분해효소 분리 및 활성을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>배지</h2> <p>해양 세균은 배지 A (peptone \( 10 \mathrm{~g} \), yeast extract \( 1 \mathrm{~g} \), \( \mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 0.1 \mathrm{~g}, \mathrm{FeCl}_{3} 0.6 \mathrm{mg} \), sea water \( \left.750 \mathrm{ml} / \ell\right) \)에 생육시켰으며 한천분해효소 유도배지는 배지 A에 한천을 \( 0.2 \% \) 첨가하여 사용하였다.</p> <h2>균의 분리 및 동정</h2> <p>분리균은 병반 조직이 보이는 김에서 분리하였으며 배지 A에 \( 1.5 \% \) 한천을 함유한 한천평판배지를 사용하여 20\( { }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하였다. 한천평판배지 상에서 한천율 분해하는 정도를 육안으로 관찰하여 순수 분리하였다. 선정균의 형태학적, 배양학적 및 생리학적 특성은 Dye방법, 및 Bergey's Manual에 준하였으며 생화학적 특성을 조사하기 위해 API ID 32 GN Kit (bioMerieux, France)를 사용하였다.</p> <h2>병원성 검정 및 광학 현미경 조사</h2> <p>공시 균주의 김에 대한 병원성 조사를 위해 고체배지에서 7일간 배양한 세균을 약 \( 10^{8} \) cell/ \( / \mathrm{m\ell} \) 농도가 되도록 현탁하여 표면 살균된 김 조직에 균을 접종하고 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양 후 관찰하였다. 김에서의 침투현상을 관찰하기 위해 분리균을 김에 접종하여 시간 별로 시료를 채취하여 meth-ylene blue 염색으로 관찰하였다.</p> <h2>세포벽분해효소 분리 및 활성 측정</h2>분리균의 세포벽분해효소의 활성 측정은 효소생성 유무가 육안으로 관찰될 수 있는 한천 확산법 (agar diffusion method)을 이용하였다. CMCase 활성은 배지 A에 carboxy-methylcellulose를 \( 0.5 \% \) 첨가하여 측정하였으며, xylanase 활성은 배지에 \( 0.5 \% \) xylan을 기질로, protease 활성은 \( 20 \% \) 탈지분유 용액을 최종 농도가 \( 1 \% \) 가 되게 만들어 사용하였다. 한천분해효소 분리를 위하여 \( 0.2 \% \) 의 한천을 첨가한 1 \( \ell \)배지 A에 분리균 JY38을 접종하여 \( 10^{8} \) cells \(/ \mathrm{m\ell} \)까지 생육시키면서 한천분해효소 생성을 유도하였다. 이 배양액 을 원심 분리한 후 상등액에 황산암모늄을 \( 85 \% \) 포화시켜 생성된 침전물을 \( 10 \mathrm{mM} \) citric acid buffer \( (\mathrm{pH} 7) \)에 녹여 투석막을 사용하여 멸균증류수를 3-4회 교환하면서 투석한 액을 조효소로 사용하였으며, 고체한천 배지 상에서 효소 활성율 확인하고 냉동 건조시켜 냉장고에 보관하면서 필요에 따라 사용하였다. 한천분해호소 활성은 \( 0.1 \% \) 한천을 \( 1 \mathrm{M} \)-phosphate-citric acid buffer \( (\mathrm{pH} \) 7)에 녹인 후 이를 기질로 하여 조효소액을 첨가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 60 분간 반응시 킨 후 유리되는 당을 Miller 등의 방법에 의해 측정하였다. 최적 \(\mathrm{pH} \) 및 최적 온도는 각 구간 별 효소활성을 측정하고 최고치를 100으로 하여 상대적인 활성도롤 비교하여 구하였다.