MCF-7 세포는 American Type Culture Collection 에서 분양되었고 \( 10 \% \) 우태아혈청과 \( 1 \% \) antibiotics 가 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하여 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하였다. MCF-7 세포를 \( 1 \times 10^{5} \) 개/ml로 분주하고 24 시간 동안 안정화 해준 다음, 레스베라트롤 50 \( \mu \mathrm{M}, 100 \mu \mathrm{M}, 200 \mu \mathrm{M} \)을 처리하였다. MCF-7 세포에 Annexin V-fluorescein isothiocyanate와 propidium iodide를 넣고 15 분간 반응시킨 다음 유세포 분석으로 값을 도출하였다. \( 2 \% \) bovine serum albumin (BSA)를 통해 blocking 하고, p-mTOR, COX-2, B-actin의 1차 항체를 하룻밤 동안 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응시킨 다음, 2차 항체를 결합시킨 후 실험 결과를 도출할 수 있었다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>레스베라트롤은 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹인 뒤 \( 100 \mathrm{mM} \) stock으로 만들어 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하여 사용하였다. Hoechst 33342, 3-(4,5-dime thylthiazol-2-yl)-2.5-diphenyltetrazolium bro- mide (MTT)는 Sigma에서 구입하여 멸균된 증류수에 5 \( \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) stock으로 만들어 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하여 사용하였다. Rapamycin은 (San Diego, CA)에서 구입하여 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) stock으로 만들어 사용하였다. Celecoxib는 Sigma에서 구입하여 DMSO에 녹인 후 \( 100 \mathrm{mM} \) stock으로 만들어 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하여 사용하였다.</p><h2>세포배양</h2><p>MCF-7 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받았으며, \( 10 \% \) 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)과 \( 1 \% \) antibiotics \( (100 \mathrm{mg} / 1 \) steptomycin, \( 100 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) penicillin)가 포함된 RPMI 1640 배지(WelGENE Inc, Korea)를 사용하여 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C} \) 조건 하에서 배양하였다. 매 48시간 마다 Trypsin-EDTA (WelGENE Inc, Korea)를 이용하여 세포를 부유상태로 만든 다음, 세포를 \( 1 \times 10^{6} \) 개/ml로 분주하여 계대하였다.</p><h2>MTT assay에 의한 세포생존율 측정</h2><p>세포배양용 12 well plate에 MCF-7 세포를 \( 1 \times 10^{5} \) 개/ml로 분주하고 24 시간 동안 안정화시킨 다음 레스베라트롤을 50 \( \mu \mathrm{M}, 100 \mu \mathrm{M}, 200 \mu \mathrm{M} \)을 각각 처리하였다. Celecoxib와 rapa-mycin 처리시에는 celecoxib와 rapamycin을 30 분 먼저 처리 한 후 레스베라트롤을 처리하였다. 24 시간 후 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 MTT를 처리한 후 1 시간 동안 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양한 다음 MTT 시약이 들어있는 배지를 제거한 뒤에 DMSO 를 \( 150 \mu \) 넣어 well에 생성된 formazan을 모두 녹인 후, 96 well plate에 \( 100 \mu 1 \) 씩 옮겨서 Microplate Reader (BIO-RAD Laboratories, Inc. USA)로 \( 595 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>Hoechst 33342를 이용한 chromatin 염색</h2><p>Cover glass가 놓여진 12 well plate에 MCF-7 세포를 \( 1 \times 10^{5} \)개 \(ml\)로 분주하고 24 시간 동안 안정화시킨 다음 레스베라트롤을 \( 50 \mu \mathrm{M}, 100 \mu \mathrm{M}, 200 \mu \mathrm{M} \) 을 각각 처리하였다. 그 다음 hoechst 33342 시약을 \( 10 \mu mathrm{M} \) 의 농도로 30분 동안 처리한 뒤 \( 3.5 \% \) formaldehyde로 15분간 고정시킨 후에 phosphate buf-fered saline (PBS)으로 두 번 세척하였다. slide glass에 50\% glycerol을 이용해 부착시키고 나서 형광현미경(Olympus Optical, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였다.</p><h2>Apoptosis 측정</h2><p>Apoptosis는 FITC-Annexin \( \mathrm{V} \) apoptosis detection kit (BD Pharmingen \( { }^{\mathrm{TM}} \), San Diego, CA)를 이용해 측정하였다. MCF-7세포를 \( 100 \mathrm{~mm} \) dish에 배양하여 레스베라트롤을 처리한 후 24시간이 지난 뒤 Trypsin-EDTA (WelGENE Inc. Korea)를 이용하여 세포를 부유상태로 만들어 얻은 세포를 원심분리하여 pellet을 얻었다. 그 다음에 차가운 PBS로 washing 한 후 원심분리하여 pellet을 얻은 다음 bind buffer를 이용하여 MCF-7 세포를 \( 1 \times 10^{6} \) 개/ml로 만들었다. MCF-7 세포에 Annexin V-fluorescein isothiocyanate와 propidium iodide를 넣어 15 분간 반응시킨 후 유세포 분석을 통해 측정하였다.</p><h2>Western bloting</h2><p>세포배양용 6 well plate에 MCF-7 세포를 \( 1 \times 10^{6} \) 개/ \( / \mathrm{ml} \) 로 분주하여 24시간 동안 배양한 다음 레스베라트롤을 처리하였다. Celecoxib와 rapamycin 처리시에는 celecoxib와 rapamycin을 30 분 먼저 처리한 후 레스베라트롤을 처리하였다. 모든 물질을 처리한 후 6 시간 동안 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양한 뒤 RIPA lysis buffer [25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1\% NP-40, 0.5\% sodium deoxycholate, \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \) and \( 1 \mathrm{mM} \) phenyl-methylsulfonyl fluoride]를 각 well에 \( 150 \mu \) 씩 첨가하여 단백질을 분리한 뒤 원심분리하여 상등액만 취하였다. 추출한 단백질은 정량 후 \( 8 \% \) acrylamide gel을 이용하여 전기영동을 실시한 후 nitrocellulose membrane에 transfer 하였다. 그 후 \( 2 \% \) bovine serum albumin (BSA)를 이용해 blocking 한 후, p-mTOR, COX-2, B-actin의 1차 항체를 밤새 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응시키고 2차 항체를 결합시킨 후 실험 결과를 측정하였다.</p>