Enterovirus의 유전자 검출을 위해 \(5^{\prime}-\mathrm{NCR}\) region에 2 step RT-PCR을 수행했고 바이러스 유전자형 확인을 위해 VP1 region에 2 step RT-PCR을 수행했다. RT 반응은 reverse primer와 MMLV reverse transcriptase를 사용했고 PCR 수행은 온도별 3단계로 35회 수행 후 ex-tension을 실시했다. 증폭산물은 전기영동으로 5'-NCR region \(436\mathrm{bp}\), VP-1 region \(358\mathrm{bp}\)의 band 유무를 알아봤다.
<h2>RT-PCR 시험</h2> <p>Enterovirus의 유전자 검출을 위하여는 보존성이 높은 것으로 알려진 \( 5 ^ {\prime } - \mathrm { NCR } \) region을 target으로 2 step RT-PCR을 수행하였으며, 바이러스 유전자형 확인을 하기 위하여는 바이러스 capsid 중 VP1 region을 target으로 2 step RT-PCR을 수행하였다. 각각의 2 step RT-PCR에서 사용된 primer는 Table 1에 제시하였다. RT 반응은 reverse primer와 MMLV reverse transcriptase (Promega, USA)를 사용하였다. RT 반응액은 \( 5 \mu \mathrm { l } \) nucleic acid elute, \( 3 \mu \mathrm { l } 5 \times \) buffer, \( 3 \mu \mathrm { dNTP } , 1 \) \( \mu \mathrm { l } \) reverse primer, \( 0.5 \mu \mathrm { MMLV } \) reverse transcriptase를 포함하여 총 \( 15 \mu 1 \) 가 되게 멸균증류수를 첨가하였다. Reverse tran-scription 반응은 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } 10 \) 분, \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } 90 \) 분으로 실시하였다. PCR 반응액의 조성은 cDNA \( 1 \mu \mathrm { l } \) 에 \( 2.5 \mu \mathrm { l } 10 \times \) buffer, \( 3 \mu \mathrm { l } \mathrm { } \),dNTP \( 0.5 \mu \mathrm { l } \) forward primer, \( 0.5 \mu \mathrm { l } \) reverse primer, \( 0.5 \mu \mathrm { l } \mathrm { Taq } \mathrm { } \)DNA polymerase (Takara, Japan)를 혼합하였고 멸균증류수를 첨가하여 총 \( 25 \mu 1 \) 로 조정하였다. \( \mathrm { } \) PCR 수행은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } 5 \) 분간 pre-denaturation한 후 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } / 30 \) 초, \( 56 ^ {\circ } \mathrm { C } / 30 \) 초, 그리고 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } / 30 \) 초 씩 3단계로 35 cycles 수행한 후 마지막으로 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } 3 \) 분간 ex-tension을 실시하였다. 증폭산물은 \( 1.5 \% \) agarose gel을 사용하여 전기영동하여 5'-NCR region \( 436 \mathrm { bp } \), VP-1 region \( 358 \mathrm { bp } \) 의 band 유무를 확인하였다.</p>