Trans-LT1 transfection reagent를 이용한 세포에 대한 transfection이 진행되었으며, 이를 이용하여 Firefly와 대조구인 renilla luciferase를 정량했다. 추가적으로, stable cell lines를 생성하기 위해 \( 1,000 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \mathrm { G } 418 \) 선별을 실시하였고, 특정 화합물 처리 후 \( 50 \mathrm { ml } \) MTS와 \( 100 \mathrm { ml } \) DMSO 반응을 통해 홉광도를 측정하였다. 마지막으로, Luciferase 활성은 dual-mode luminometer를 이용하여 측정하였다.
<h2>Transient / stable transfection</h2> <p>세포는 Trans-LT1 transfection reagent (Mirus, Madison, WI) 를 이용해서 제조자 프로토콜에 따라 transfection을 수행하였다. Luciferase reporter gene의 transfection을 위해서 각 well 당 \( 1.5 \mathrm { mg } \) firefly luciferase reporter plasmid와 \( 0.15 \) \( \mathrm { mg } \) renilla luciferase, pRL-null vector (Promega, Madison, WI)를 \( 4.5 \mathrm { ml } \) Trans-LT1 reagent에 흔합하여 6 well culture plate에 처리하였다. Transfection 후 24 시간 뒤 세포는 화합물에 24시간 노출하였다. Firefly 와 대조구인 renilla luciferase를 동시에 transfection 하는 Dual-luciferase reporter assay system (Promega)을 이용해서 정량하였다. 모든 tranfection 효율은 50 내지 \( 60 \% \) 정도를 유지하였고 이 효율은 pMX enhanced GFP vector를 이용해서 transfection 후 동시에 확인하였다. Stable cell lines을 추가로 만들기 위하여 48 시간 뒤 \( 1,000 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \mathrm { G } 418 \) (Invitrogen, Carlsbad. CA)로서 선별을 가하였다. 선별은 monolayer colonies가 형성 될 때까지 하며 안정된 transfectants는 \( 500 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \mathrm { G } 418 \) 의 일반 배양액에서 유지한다.</p> <h2>Luciferase Assay</h2> <p>세포는 차가운 PBS로 세척 후 수동 분해 버퍼(Promega)로 분해물을 준비하였다. \( 12,000 \times g \) 에서 4 분간 원심분리 후 상충 효소액을 assay에 이용하였다. 상층액은 이후 실험을 위해서 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 보관하였다. Luciferase activity는 dual-mode luminometer (Model TD-20/20, Turner Designs Co., Sunnyvale, CA)를 이용해서 측정하였다. Firefly luciferase activity은 renilla luciferase activity에 대해서 일반화 하였고 활성은 다음의 상대치로 표시하였다(firefly luciferase activity/renillaluciferase activity).</p> <h2>세포활성 측정(MTS assay)</h2> <p>3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxy methox-yphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS)을 이용하여 발색반응을 분석 하였다. 세포주 \( \left (2 \times 10 ^ { 4 } / \right . \) well) 롤 96-well plat에서 화합물을 처리하였고 처리 시간이 경과한 후 각 well 당 \( 50 \mathrm { ml } \) MTS를 투입하여 2시간 반응 시킨 후 배지를 버려내고 각 well에 DMSO \( 100 \mathrm { ml } \) 을 넣고 20 분간 반응 시킨 후 \( 490 \mathrm { ~nm } \) 에서 홉광도를 측정하였다.</p>