Two-hybrid bait vector 및 library를 HF7C에 transform하기 위한 cotransformation 방법을 이용, cDNA는 full lenth REF-1 cDNA를 DNA binding domain을 가지는 pGBT9 vector 에 insertion 시켰으며 Ref-1이 DNA binding domain만으로 reporter gene의 발현을 유도에 대한 조사를 위해 HF7C yeast strain을 사용하여 self-activation test를 실시하였다. cDNA clone으로 mouse REF-1의 full length cDNA를 PCR을 수행하여 증폭한 후, pBHA plsamid에 subcloning하고 DNA sequencing과 restriction enzyme mapping으로 확인, \( \beta \)-Galactosidase 활성을 띠는 transformant에서 leucine이 결핍된 SD 액체배지에 넣은 후에 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 16시간 이상 배양시킨다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>Mouse REF-1 full length cDNA의 subcloning</h2><p>Mouse의 REF-1 gene을 갖고 있는 cDNA clone(provided by Dr. David J Chan, Entrez accession number U12273)으로 mouse REF-1의 full length cDNA를 PCR을 수행하여 증폭한 후, pBHA plsamid에 subcloning하고 restriction enzyme mapping (EcoRI, BamHI)과 DNA sequencing으로 확인하였다. PCR은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \cdot 1 \mathrm{~min}\), \(55^{\circ} \mathrm{C} \cdot 1 \mathrm{~min}\), \(72^{\circ} \mathrm{C} \cdot 1 \mathrm{~min} \)로 30 cycles 시행하였으며 사용한 cDNA는 \(5-50\mathrm{ng}\), 각 primer는 \(30 \mathrm{pmole}\) 농도로 하였다. 사용한 primer의 각 염기서열은 pREF-S (sense): 5'-GAATTCATGCCAAAGCGGGGAAAGAAAGC-3', pREF-As(antisense): 5'-GGATCC TCACAGTGCTAGGTAAAGGGTG-3'이다.</p><h2>Ref-1 bait 제작과 bait의 Self-activation test</h2><p>bait로 사용할 cDNA는 full lenth REF-1 cDNA (1 bp-954\( \mathrm{bp} \) )를 DNA binding domain을 가지는 pGBT9 vector (GAL4 system : Clontech)에 insertion 시켰다. 먼저 bait로 사용할 Ref-1이 DNA binding domain만으로도 reporter gene의 발현을 유도하는지의 여부를 조사하기 위해 HF7C yeast strain을 사용하여 self-activation test를 실시하였다. HF7C에 bait DNA와 GAL4 activation domain만을 가지는 벡터인 pBHA와 pGBT9을 각각 transformation시킨 뒤, histidine이 결핍된 최소배지에서의 성장여부 (histidine growth)와 \( \beta \)-galactosidase 활성을 조사하였다.</p><h2>Prey로 사용할 cDNA library의 준비</h2><p>Mouse 11-day Embryo MATCHMAKER cDNA library(Clontech)를 library titering과정을 통해 independent colony들의 수가 \( 3.5 \times 10^{6} \)개 되도록 large scale로 증폭하였다.</p><h2>Library 및 Ref- 1 bait vector의 yeast Transformation</h2><p>Two-hybrid bait vector 및 library를 HF7C에 transform하기 위하여 cotransformation 방법을 이용하였다. YPD \((2\%\) pepton, \(1\%\) yeast extract, \(2\%\) glucose)에 yeast를 \(2\sim3\)시간 동안 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하여 적당한 농도 \( \left(\mathrm{OD}_{600}=0.2\right) \)가 되게 한 후, cell을 모았다. 이렇게 모인 cell을 증류수로 washing하고 TE\( / \mathrm{LiAc} \)에 resuspension한다. 이렇게 준비된 competent cell에 bait vector와 herring sperm carrier DNA, library vector, PEG \(/ \mathrm{LiAc} \)를 섞어 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 배양한다. \( 10 \%\) DMSO를 첨가하여 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 heat shock을 준 후 ice 상에서 \( 1 \sim 2 \)분 배양하여 다시 cell을 모아 증류수나 TE에 resuspension하여 histidine, leucin, tryptophan이 결핍된 SD plate (\(6.7\%\) nitrogen base, \( 2 \% \) glucose, 선택된 아미노산)에 spreading하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일간 배양시켰다.</p><h2>\( \beta \)-Galactosidase assay</h2><p>plate에서 자란 yeast transformant를 nitrocellulose filter membrane에 transfer하여 이 filter를 액체질소에 30초간 담궜다. 이 filter를 5-bromo-3-indolyl- \( \beta \)-D-galactopyranoside (\(0.32 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) (X-gal)를 함유하는 Z buffer \( 60\ \mathrm{mM} \mathrm{NaHPO}_{4}\), \(40 \mathrm{mM} \mathrm{NaHPO}_{4}\), \(10 \ \mathrm{mM}\ \mathrm{MgCl}_{2}\), \(50\ \mathrm{mM} \ \mathrm{KCl}) \)에 적셔놓은 3M paper에 올려 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 또는 상온에서 방치시킨다. \(1 \sim 2\)시간 내에 푸른색으로 변하는 colony를 선택하였다.</p><h2>Positive cDNA clone의 recovery와 E. coli electroporation</h2><p>\( \beta \)-Galactosidase 활성을 띠는 transformant에서 bait vector를 제거하기 위해 leucine이 결핍된 SD 액체배지에 넣어 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 16시간 이상 배양시킨다. 이렇게 배양된 yeast를 모아서 lysis buffer에 resuspension시키고, 동량의 phenol/chloroform 및 \( 1 / 3 \)의 glass bead를 첨가한 후 vortex하여 yeast cell를 파쇄시킨다. 상층액에 \( 100 \% \) 에탄올을 첨가하여 yeast DNA를 분리하였다. 분리된 yeast DNA를 desalting solution (\(100\ \mathrm{mM}\) glucose \( \cdot 1 \% \) agarose)에 \( 5 \mu\mathrm{l}\) loading하고 얼음에서 1시간 30분동안 반응시켜 salt를 없앤다. 이후 미리 제작한 electrocom-petent cell (HB101) \( 40 \mu\mathrm{l} \)와 DNA를 섞는다. 이 mixture를 electroporation용 cuvette에 넣은 뒤, electroporator에서 \( 2.5 \)\( \mathrm{kV} \)의 pulse를 10초 동안 주고, 이 반응물에 \( 1 \mathrm{ml} \)의 LB media를 넣고 1시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 regeneration 시켜준 뒤 LB-ampicillin plate에 spreading 하였다.</p>