3T3-L1 지방전구세포를 배양한 후 OJSE를 농도별로 처리하고 14시간 후 에탄올로 고정하여 ribo-nuclease A를 추가한 뒤 유동 혈구 계산 분석을 이용하여 OJSE가 세포주기에 미치는 영향을 측정하였다. 또한 단백질 변화량 측정을 위하여 회수한 세포를 PBS로 세척한 후 CSK 완충액이 첨가된 용액에 현탁하여 15분간 용출시킨 후 초음파 파쇄기로 파쇄하여 \(14,000 \mathrm{rpm}\)에서 20분간 원심 분리하였다.
<h3>세포주기 변화 측정(flow cytometric analysis)</h3> <p>Mitotic clonal expansion 단계에서 OJSE가 세포주기에 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포를 배양한 후 분화유도제인 MDI가 들어있는 배지로 교환할 때 OJSE를 농도별 \( (1,5,10,50,100,200 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \)로 처리하였다. 3T3-L1 지방전구세포의 doubling time인 14시간 후에 세포를 회수하여 PBS로 세척하고 \( 100 \% \) ethanol을 이용하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 고정시켰다. 고정된 세포는 분석 전에 PBS로 세척하고 ribo-nuclease \( \mathrm { A } \) 를 최종농도 \( 1 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) 이 되도록 첨가한 다음 실온에서 30 분간 반응시켰다. PI/RNase staining buffer \( ( \mathrm { BD } \) Pharmingen \( ^ {\mathrm { TM } } \) ) 용액을 \( 500 \mu 1 \) 첨가한 후 유세포분석기(FACS, Becton Dickinsin, San Jose, CA)로 분석하였으며 결과는 Cell Quest program을 이용하여 분석하였다.</p> <h3>단백질 변화량 측정(western blot analysis)</h3> <p>회수한 세포를 PBS로 세척한 후 CSK 완충액[ \( 100 \mathrm { mM } \) PIPES ( \( \mathrm { pH } \) 6.8), \( 100 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } , 1 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } 2,1 \mathrm { mM } \) EGTA, \( 1 \mathrm { mM } \) dithiothreitor (DTT)]에 0.1 \% Triton X-100, \( 1 \mathrm { mM } \) ATP와 Protease inhibitor Cocktail (BD Pharmingen \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) )이 첨가된 용액에 현탁하여 15 분간 용출시킨 후, 초음파 파쇄기로 파쇄하여 \( 14,000 \mathrm { rpm } \mathrm { 20 } \) 분간 원심 분리하였다. 상등액을 BCA법으로 정량하여 동량의 단백질 \( (20 \mu \mathrm { g } ) \)을 sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel에서 전기영동 하였다. 전기영동 후 gel 내의 단백질을 PVDF membrane에 전이시킨 후, blocking solution [0.15 M NaCl, \( 1 \mathrm { M } \) Tris-HCl (pH 7.5), 0.1 \% Triton \( X-100,5 \% \mathrm { BSA } ] \) 을 사용하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 16 \)시간 반응시켰다. Membrane을 세척하고 1 차 항체를 처리한 후 처리한 1 차 항체 에 맞는 2차 항체를 사용하여 반응시켰다. 면역반응 단백질은 화학발광시스템(Chemi-luminescence system ; SuperSignal West Femto Maxium sensitivity Substrate, Pierce, USA)으로 검출하였다. 본 실험에 사용된 \( \mathrm { C } / \mathrm { EBP0 } \) 및 \( \mathrm { C } / \mathrm { EBP \beta } \) 의 1 차 항체는 Cell signaling (Cell signaling Technology, USA)에서 구입하였으며 PPAR \( \gamma \), p21, Cyclin E, Cdk2, Rb, Phospho-Rb, \( \mathrm { E } 2 \mathrm { ~F } -1 \) 등의 1 차 항체 및 2 차 항체로 사용된 anti-mouse IgG-HRP와 anti-rabbit IgG-HRP는 Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.</p>