말을 대상으로 시료를 채취하여 개체별로 멸균된 swab을 실시하여 소독을 진행한 후 scrapping을 실시하여 시료를 채취하였다. 이후 S. aureus의 분리를 위해 TSB에서 16시간동안 배양하였다. 이후 이를 생화학 성상 시험을 통하여 생화학적 특성을 분석하였다. PCR을 진행하여 동정을 하고, 혈장응고효소 생산능 시험과 항생제 감수성 시험을 추가 진행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>공시 재료</h2> <p>2006년 1월부터 2006년 12월까지 제주와 과천의 말 전문 동물병원과 승마장, 말 생산 목장으로부터 148 두의 말을 대상으로 시료를 채취하였다. 각 개체별로 비강, 생식기, 외상부로부터 멸균된 swab을 이용하여 swab을 실시하기 전 주위 오염물질 및 오염 균의 제거를 위해 소독액으로 깨끗이 닦아낸 후 최소 30 초간 호흡기 및 생식기로 삽입하여 시료를 채취하였으며, 화농성 병변 및 외상부는 모세관 출혈 현상이 나타날 때까지 scrapping을 실시하여 시료를 채취하였다.</p> <h2>균 분리 및 동정</h2> <p>S. aureus의 분리를 위해서 \( 7.5 \% \) \(\mathrm{NaCl} \) 이 첨가된 Tryptic soy broth (TSB)에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 16시간동안 배양하고 배양액을 egg yolk emulsion과 sulfamethazine이 첨가된 Baird parker agar (MERCK. Germany)에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 16시간동안 배양하였다. 전형적인 집락을 선택하여 blood agar에 순수분리하고, \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 16 시간 배양 후 \( \beta \)-hemolysis 현상이 일어나는 균을 TSA에 재도말 함과 아울러 coagulase test, DNase 시험으로 1차 동정을 하였고 미생물 자동 동정 기기 (BIOLOG, USA)를 이용하여 2차 동정을 실시하였으며, 최종적으로 PCR을 이용하여 동정하였다.</p> <p>생화학 성상 시험은 용혈성 시험, mannitol 발효 시험, mal-tose 발효 시험, aesculin hydrolysis, alkaline phosphatase test, urease test, 색소 생성시험, DNase 생성시험, 당분해 (glucosem sucrose 외 20 여종) 시험 등을 실시하여 국내 말에서 분리되는 S. aureus의 생화학적 특성을 분석하였다.</p> <h2>S. aureus의 동정을 위한 PCR</h2> <p>S. aureus로부터 DNA의 추출은 boiling lysis법을 이용하여 실시하였으며, 추출된 DNA는 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동고에 보관하며 실험에 사용하였다.</p> <p>본 연구에 이용한 primer (F-AATCTTTGTCGGTACACG ATATTCTTCACG, R-CGTAATGAGATTTCAGTAGATAAT ACAACA)는 Schuenck 등의 염기서열을 기초로 제작 (Applied Biosystems, USA)하여 사용하였다.</p> <p>PCR을 위한 조성은 PCR reaction mixture (Thermo sci-entific, USA)는 \( 12.5 \mu \), template DNA \( 2 \mu \mathrm{l} \), primer \( 2 \mu \mathrm{l} \) (10 pmole \( / \mu \mathrm{l}) \), DW \( 8.5 \mu \mathrm{l} \) 를 각 PCR tube에 넣어 total volume이 \( 25 \mu \) 가 되도록 조정한 후 GeneAmp PCR system 2720 (Applied Biosystems, USA)으로 증폭하였다. PCR은 먼저 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 가열하여 변성을 유도하고, \( 92^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초간 denaturation, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 초간 annealing, 그리고 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 40 초간 extension의 3단계를 총 30 희 반복하였으며, 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 final extension 과정을 거쳤다. PCR 산물은 \( 1.5 \% \) agarose gel (SeaKem \( { }^{\circledR} \) ME agarose, USA)상에서 전기 영동한 후 \( 5 \mu \mathrm{g} / 100 \mathrm{ml} \) 농도의 Ethidium Bromide (Applied biosystems, USA)에 20분간 염색하여 Eagle Eye \( ^{\mathrm{TM}} \) II (Strata gene, USA)로 확인하였다.</p> <h2>혈장응고효소 생산능 시험</h2> <p>최종 분리 - 동정된 S. aureus를 Nutrient broth에 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(18\sim 24\)시간 동안 배양한 후 균액을 멸균된 시헙관에 \( 0.5\mathrm{ml} \) 을 넣고 여기에 멸균 생리식염수로 토끼의 신선 혈장을 \( 1 \sim 5 \)배 희석하여 각각 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 넣어 잘 혼합한 후 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양시킨 후 시간별 응고 여부를 관찰하였다.</p> <h2>항생제 감수성 시험</h2> <p>분리된 58주의 S. aureus는 30종의 항균제를 대상으로 na-tional committee for laboratory standard (NCCLS)의 기준에 따라 디스크 확산법으로 항생제 감수성 시험을 실시하였다. 분리된 세균은 Muller-Hinton broth (MHB)에 접종하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 2 \sim 8 \)시간 증균시킨 후 McFarland \(\mathrm{No.} 0.5 \) \((1.5× \left.10^{8} / \mathrm{ml}\right) \)의 농도로 조절한 다음 Muller-Hinton agar (MHA) plate에 도말하여 항균제 disc (BBL, USA)를 접종한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 18 \sim 24 \)시간 배양한 다음 disc 주위의 complete in-hibition zone의 크기롤 측정하여 항균제에 대한 감수성 유무를 결정하였다.</p> <p>본 연구에 사용한 항생제는 BBL사의 제품으로 Amikacin (AN), Amoxicillin/clavuramic acid (Amc), Ampicillin (AM), Aparamycin (APR), Ceftiofur (Cef), Cephalothin (CF), Cefoxitin (FOX), Chloramphenicol (C), Ciprofloxacin (CIP), Clindamycin (CC), Enorfloxacin (ENO), Erythromycin (E), Gentamycin (GM), Kanamycin \( (\mathrm{K}) \), Mecillinam (MEL), Neomycin \( (\mathrm{N}) \), Nitrofurantoin (F/M), Norfloxacin (NOR), Ofloxacin (OFX), Florfenicol (FFC), Oxacillin (OX), Penicillin (P), Streptomycin (S), Sulfonamides (S3), Spectinomycin (SPT), Tetracyclin (Te), Tiamulin (Tia), Trimethoprim / Sulfamethoxazole (SXT), Tylosin (Tyl), and Vancomycin (Va) (BBL, USA) 등 30종의 항생제에 대해 항균제 감수성 시험을 실시하였다.</p>