벼 cDNA library로부터 분리한 small HSP cDNA를 Agrobacterium tumefaciens LBA4404에 형질전환 시킨 후, Leaf disc를 이용한 담배의 형질전환을 통해 재분화된 형질전환 식물체를 선발하고, 자가수정을 통해 종자를 채종하여 각각의 분화본을 생산하였다. genomic DNA를 분리한 후 Southern blot 분석을 통해 형질전환 식물체에 유전자가 도입되었는지를 확인하고, Northern blot 분석으로 도입된 유전자가 구성적으로 발현하는지, 또한 guanidine thiocyanate 법으로 Total RNA를 분리하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>형질전환 식물체의 제작</h2> <p>벼 (Oryza sativa L., cv. Nackdongbyeo)의 cDNA library로부터 분리한 엽록체 small HSP cDNA를 식물 발현 vector인 plG121Hm에 도입한 후, Agrobacterium tumefaciens LBA4404에 형질전환 시켰다. Leaf disc를 이용한 담배 (Nicotiana tabacum L. cv. SR-1)의 형질전환은 Lee 등의 방법으로 하였다. 재분화된 형질전환 식물체 \( \left ( \mathrm { T } _ { 1 } \right ) \)는 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 kanamycin이 함유된 MS배지에서 선발한 후 자가수정을 통하여 종자 \( \left ( \mathrm { T } _ { 2 } \right ) \)를 채종하였다. \( \mathrm { T } _ { 2 } \) 종자를 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { m } \)의 kanamycin이 함유된 MS배지에 무균 파종하여 kanamycin 내성개체를 선발하여 생장시켜 종자 \( \left ( \mathrm { T } _ { 3 } \right ) \)를 채종한 후, 다시 선발배지에 파종하여 전 개체가 kanamycin 내성을 가지는 순계를 선발하여 실험에 사용하였다.</p> <h2>Southern blot, Northern blot 및 PCR 분석</h2> <p>형질전환 식물체에 유전자가 도입되었는지를 확인하기 위하여 Lee 등의 방법에 준하여 genomic DNA를 분리한 후 Southern blot 분석으로 확인하였다. 도입된 유전자가 구성적으로 발현하는지를 Northern blot 분석으로 확인하였다. Total RNA는 guanidine thiocyanate 법으로 분리하였다. Total RNA \( (5 \mu \mathrm { g } ) \) 를 \( 0.6 \mathrm { M } \) formaldehyde를 함유한 \( 1 \% \) agarose gel로 전기영동 후, nylon membrane (Biodyne A, Pall BioSupport, NY)에 transfer하여 \( { } ^ { 32 } \mathrm { P } \) 로 labeling한 Oshsp26 cDNA의 5'-영역의 specific probe로 hybridization하였다. Hybridization은 \( 50 \% \) formamide가 포함된 hybridization buffer에서 \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 16시간 동안 실시하였다. Membrane은 \( 0.2 \times \mathrm { SSC } \) 와 \( 0.1 \% \mathrm { SDS } \) 로 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1시간 washing후 X-ray film 또는 imaging plate에 노출시켜 image analyzer (BAS2000, Fuji Film, Tokyo)로 분석하였다. PCR분석은 forward primer로는 CaMV 35S promoter의 3'-영역의 sequence인 Pfw primer (5'-CCCACCCACGAGGAGCATC-3') 및 Oshsp26 CDNA의 coding region의 sequence인 Prv primer (5'-CACGCCGTTCTTGAGCTCG-3')를 각각 사용하였다. 증폭된 산물은 \( 1.0 \% \) agarose gel 전기영동으로 분석하였다.</p>