단백질의 발현 양을 분석하기 위해 1차 항체와 2차 항체를 처리한 후, ECL 용액을 사용하여 X-ray film에 감광하였다. 세포 내 ROS의 양적 변화를 조사하기 위해 PBS로 세포를 세척한 후, fluorescent probe인 H2DCFDA로 염색하고 DNA flow cytometer를 이용하여 분석하였다. Caspase-3 활성을 측정하기 위해 colorimetric assay kit를 사용하고, 단백질을 추출하여 fluorogenic peptide 기질이 함유된 extraction buffer에 혼합하였다. 이후, 2시간 동안 반응 후 흡광도를 측정하였다. 마지막으로, apoptosis 유발 과정에서 MMP의 변화 여부를 조사하기 위해 dual-emission potential-sensitive probe인 JC-1 염색을 실시하였다.
<h2>Mitochondrial membrane potential (MMP) 변화의 측정</h2> <p>WEAS 처리에 따른 apoptosis 유발과정에서 MMP \( (\Delta \Psi \mathrm{m}) \)의 변화 여부를 조사하기 위하여 dual-emission potential-sensitive probe인 5,5 V, 6,6 V-tetrachloro-1 ,1 V, 3,3 V-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide (JC-1, Sigma) 염색을 실시하였다. 이를 위하여 정상 및 WEAS가 처리된 배지에서 배양된 세포들을 원심분리를 이용하여 모으고, PBS로 수세 후, \(2\mathrm{mg}/\mathrm{L}\)의 JC-1을 배지에 희석하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 염색하고 수세 후, flow cytometer를 이용하여 분석하였다.</p> <h2>Lactate dehydrogenase (LDH) assay에 의한 세포독성의 분석</h2> <p>정상 배지에서 배양된 세포를 제거하고 배지를 모아 Triton X 100을 20분전 선처리하여 음성 대조군으로 준비하고, 정상 및 WEAS가 처리된 배지에서 24시간 배양된 세포를 제거하고 배지만 따로 모았다. 여기에 LDH 처리 시약(Roche, Swiss)을 배지에 처리한 후 직정 시간이 경과하며 ELISA reader를 이용하여 \( 492 \mathrm{nM}\) 및 \( 690 \mathrm{nM}\)에서 측정한 후 음성 대조군과 비교 계산하여 그래프로 나타내었다.</p> <h2>Western blot 분석에 의한 단백질 발현의 분석</h2> <p>준비된 세포들을 적정량의 lysis buffer 를 첨가하여 단백질을 추출한 후 SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 분리하고, nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 전이시켰다. 그 후 membrane의 비특이적 단백질에 대한 blocking을 위해 \( 10 \%\) skim milk를 함유한 PBS-T (\(0.1 \%\) Tween 20 in PBS)에 1시간 반응시키고 PBS-T로 수회 수세하였다. 준비된 membrane에 각각의 항체를 처리하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 이상 반응시킨 다음 PBS-T로 수회 수세과정을 거쳤다. 그 후, 처리 된 1차 항체에 대응하는 2차 항체를 처리하고 실온에서 1시간 반응시킨 후 enhanced chemiluminoesence (ECL) 용액 (Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 처리한 다음 암실에서 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 발현 양을 분석하였다.</p> <h2>ROS 생성 변화 측정</h2> <p>세포 내에 축적된 ROS의 양적 변화를 조사하기 위하여 준비된 세포들을 PBS로 수세 후 fluorescent probe인 2', 7'-di-chlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA, Molecular Probes, Leiden, Netherlands) \( 10 \mu \mathrm{M} \)로 20분간 염색 후 DNA flow cytometer (Becton Dickinson)를 이용하여 분석을 하였다. ROS 생성 억제블 위한 ROS scavenger인 N-acetylcysteine NAC의 처리는 WEAS를 처리하기 1시간 전에 전처리 하였다.</p> <h2>In vitro caspase-3 activity 측정</h2> <p>Caspase-3의 활성 측정을 위해 colorimetric assay kit(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하였으며, 제시된 방법에 준하여 준비된 세포에서 단백질을 추출하고 정량하여 각각 \( 20 \mu \mathrm{g} \)의 단백질을 fluorogenic peptide 기질 \(100 \mu \mathrm{M} \)이 함유된 extraction buffer [\( 40 \mathrm{mM}\) HEPES (\(\mathrm{pH} 7.4 \)), \( 20 \% \) glycerol (\(\mathrm{v}/\mathrm{v}\)), \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 0.2\%\) NP-40 and \( 10 \mathrm{mM} \) DL-dithiothreitol] \( 50 \mu \mathrm{l} \)에 혼합하였으며, microtiter plate에 다시 extraction buffer에 희석하여 각 sample 당 총 volume이 \( 100 \mu\mathrm{l} \)가 되게 하였다. 실험에 사용된 기질은 Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-p-nitroaniline (pNA)였다. 준비된 plate를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간동안 반응시킨 후 \( 405 \mathrm{nM} \)의 흡광도를 이용하여 반응의 정도를 측정하였다.</p>