돌연변이체인 \( v p p C \) 유전자의 삽입을 확인하기 위해 PCR을 수행했다. \( \mathrm { COL } 4 \mathrm { ~F } \)와 COL4R primer를 사용하여 원 권추인 \( V \). parahaemolyticus 04와 돌연변이체인 V. parahaemolyticus CM으로부터 각각 DNA 단편이 증폭되었다. 콜라겐 분해효소는 아미노산 서열 Pro-X-Gly-Pro의 X 다음을 절단하는 효소로 알려져 있으며, type I collagen에 대해서 특히 높은 활성을 보인다.
<h2>V. parahaemolyticus vppC 돌연변이체의 구축</h2> <p>E. coli 7213에 존재하는 \( \mathrm { pVCM } 03 \) 는 접합에 의해 \( V \). para-haemolyticus 04로 전달되어졌고, 이동된 suicide plasmid는 homologous recombination에 의해 \( V \). parahaemolyticus 04 염색체 DNA에 삽입되어졌다(Fig. 2A)[19]. Allele exchange가 이루어진 transconjugant는 kanamycin과 \( 10 \% \) sucrose가 첨가된 TCBS배지에서 선별되었다. 선별된 transconjugant들의 allele exchange 여부는 kanamycin tetracycline 이 각각 들어있는 배지에서의 생육여부로서 확인하였다. 즉, double-crossover에 의해 allele exchange가 일어난 transconjugant는 kanamycin이 있는 배지에서는 자랄 수 있지만 pDMS197 유래의 DNA는 실활과 더불어 tetracycline 저항성 유전자를 유실하게 되어 tetracycline이 첨가된 배지에서는 자랄 수 없다. 이러한 과정을 통하여 확인된 transconjugant를 V. parahaemolyticus \( \mathrm { CM } \) 이라 명명하였다. 이 돌연변이체의 \( v p p C \) 유전자내에 kanamycin 내성 유전자의 삽입을 유전적으로 확인하기 위하여 \( \mathrm { COL } 4 \mathrm { ~F } \) 와 COL4R primer (Table 2)를 이용 하여 PCR로 \( v p p C \) 를 증폭하였나. 그 결과 원 권추인 \( V \). parahaemolyticus 04로부터 \( 2.6 \mathrm { ~kb } \) DNA 단편이 증폭되었거, 돌연변이체인 V. parahaemolyticus CM으로부터 \( 3.8 \mathrm { ~kb } \) DNA 단편이 중폭되었다. \( 3.8 \mathrm { ~kb } \) DNA 단편은 \( \operatorname { vppC } (2.6 \mathrm { ~kb } ) \) 와 kanamycin cassette인 nptll \( (1.2 \mathrm { ~kb } ) \) 를 합친 크기로 예상된 크기와 일치하였나(Fig. 2B). 상기의 걸과들을 종합하여 볼 때, V. parahaemolyticus \( \mathrm { CM } \) 은 홀라건 분해요소 유전자가 불활성화된 돌연변이체임을 최종 확인하였다.</p> <h2>원 균주인 V. parahaemolyticus 04와 돌연변이체인 V. parahaemolyticus \( \mathrm { CM } \) 의 콜라겐 분해효소 할성 비교</h2> <p>콜라겐 분해효소는 콜라겐 의 repeating unit인 아미노산서열-Pro-X-Gly-Pro-에서 X 다음을 절단하는 효소로 알려져 있고, 또한 강한 기질 특이성을 가진다. 콜라겐 분해효소는 특히 type I collagen에 대해서 높은 효소 활성을 보인다.Allelic exchange방법에 의하여 언어진 V. parahaemolyticus CM의 콜라겐 분해 능을 원 균주인 V. parahaemolyticus 04와 비교하였다. 재롤 및 방법에서 설명한 것과 같이 type I collagen-을 기질로 사용하여 콜라겐 분해 능력을 비교한 결과 돌연변이체 \( V \). parahaemolyticus \( \mathrm { CM } \) 은 원균주에 비하여야 4 배 이상 콜라겐 분해능이 감소됨을 보여주었다(Fig. 3).이와 같은 결과는 allelic exchange법에 의한 클라겐 분해효소 유전자가 돌연변이되어 기능적으로 효소가 불활성화 되었다는 것을 의미한다. 고러나 돌연변이체에서 낮은 분해능을 보이긴 하지만 여전히 잔존 콜라겐 분해능이 존재하였는 데, 이는 아마도 V. parahaemolyticus \( \mathrm { CM } \) 에는 vpp C 유전자가 coding하는 콜라겐 분해 효소 외에 다른 종류의 콜라겐 분해효소가 있다고 추정할 수 있다. 효소의 활성을 비교해 보면, 만일 다른 종류의 콜라겐 분해 효소가 존재하더라도 vppC유전자가 coding하는 콜라겐 분해 효소가 V. parahaemolyticus 에는 주요한 활성을 나타낸다.</p>