섬유아세포인 CCD-986Sk는 \( 100 \mathrm{~mm} \) tissue culture dish에 \( 1 \times 10^{6} \) cells/dish로 seeding하여 하루 동안 배양하였고 추출물을 농도별로 하루 동안 배양하였다. 항주름 인자인 MMP-1, MMP-2, MMP-3의 mRNA 발현양을 측량하기 위해서 RT-PCR을 진행하였다.
<h2>RNA 추출 및 cDNA 합성</h2> <p>섬유아세포인 CCD-986Sk는 \( 100 \mathrm{~mm} \) tissue culture dish에 \( 1 \times 10^{6} \) cells/dish로 seeding하여 24시간 동안 배양하였고 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 배지 상등액을 제거하여 trizol lysis buffer를 dish에 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 분주하여 각각의 세포를 lysis한 후 lysate를 e-tube에 옮겨주었다. 수거한 lysate에 chloroform을 \( 200 \mu \mathrm{l}\) 씩 첨가한 후 30 초간 inverting 하였으며 centrifuge를 이용해 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 13,200 \( \mathrm{rpm} \) 으로 20 분간 원심분리하였다. 상층액 \( 400 \mu \mathrm{l} \) 를 새로운 e-tube에 옮겨 isopropanol \( 400 \mu \mathrm{l} \) 를 1:1의 비율로 혼합하여 inverting한 뒤 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하여 over night한 후 앞의 과정과 동일한 조건으로 원심분리하고 상층액을 제거하여 tube 바닥에 precipitation된 RNA pellet을 획득하였다. \( 75 \% \) EtOH-diethylpyrocarbonate (DEPC) water를 각 tube에 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 분주하여 세척한 후 동일 조건에서 5 분간 원심분리 하였다. 그 후 상층액을 따라내고 실온에서 모두 증발 시킨 뒤 DEPC를 처리한 water를 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 씩 분주하여 RNA pellet을 녹여주었다. A260/A280의 비율을 사용하여 1.8 ~ 2.0 순도의 total RNA를 추출하였으며 microvolume spec-trometer를 이용해 total RNA 값을 측정하였다.</p> <h2>Reverse transcription-PCR</h2> <p>항주름 관련 인자인 MMP-1, MMP-2, MMP-3의 mRNA 발현양을 측정하기 위하여 reverse transcription-ploymerase chain reaction (RT-PCR)을 실시하였다. 실험에 사용된 pri-mer의 sequences는 Table 1 과 같다. PCR tube에 합성한 cDNA와 primer, 5x green buffer, \( \mathrm{MgCl}_{2}\), \(10 \mathrm{mM} \) PCR nu-cleotide mix, \( \mathrm{GoTaq}^{\circledR} \) DNA polymerase, nuclease free water를 첨가하여 혼합한 후 PCR을 진행하였다.</p> <p>Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 는 \( 96^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 초, \( 64^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 60 초로 총 30 cycles, MMP-1은 \( 96^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 초, \( 58^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 60 초로 총 40 cycles, MMP-2는 \( 96^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 초, \( 63^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 60 초로 총 40 cycles, MMP-3 는 \( 96^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 초, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 60 초로 총 40 cycles로 구성하여 진행하였으며, PCR로 합성시킨 후 \( 0.002 \% \) ethi-dium bromide \( (\mathrm{EtBr}) \)을 첨가한 \( 1.5 \% \) agarose gel에 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 씩 \( 100 \mathrm{~V} \) 에서 30 분간 전기영동 후 UV transilluminator를 이용해 밴드를 확인하여 분석 정량하였다.</p>