Fluka제품, Difco 사 제품을 시약으로 사용하였으며, 새우젓으로부터 분리된 미생물 중 지질 분해균을 분리, 동정한 후 조효소액을 사용하여 균주를 보존하고 효소활성 측정하였다. p-nitrophenyl palmitate를 사용한 비색 방법으로 효소 활성을 측정하였고, 정제된 효소액으로 리파아제를 정제하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>시약</h2><p>시약으로 p-nitrophenyl palmitate (PNPP), p-nitrophenol (PNP), sephadex G-100, DEAE-Sephacel, bovine serum albumin 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, U.S.A) 제품을, Sodium deoxycholate (Na-DOC)은 Fluka제품을 사용하였다. 균주 배양 및 보존용 시약은 Difco 사 제품을 사용하였으며 기타 다른 시약은 특급을 사용하였다.</p><h2>균주의 분리 및 동정</h2><p>새우젓으로부터 분리된 미생물 중 지질 분해균의 선별을 위한 기질로 tributyrin을 사용하였으며 plate assay 법으로 lipase 활성이 높은 균주를 선별하였다. 지질분해균 선별배지에 균을 접종하여 colony 주위에 clear zone을 형성하는 것을 lipase 활성 양성균으로 하였으며, 이중 \( \mathrm{HC} \) ratio(clear zone의 크기/colony의 크기)가 높은 균을 선별하여 사용하였다. 분리된 미생물 중에서 효소의 활성이 높은 SC-22 균주의 동정은 Microbial Identification System을 이용하여 분석하였다. SC-22 균주를 TSBA배지 [Trypticase soy broth (BBL사, 미국), \( 30 \mathrm{~g} \); granulated agar (BBL사, 미국), \( 15 \mathrm{~g} \); 증류수 \( 1000 \mathrm{ml} \) ]에 생육시킨 후 Manual Instructor 에 따라 처리하여 gas chromatography에 의하여 지방산을 분석하고 분석된 chromatogram을 data base와 비교하여 균주를 동정하였다.</p><h2>균주배양 및 조효소액 조제</h2><p>균주의 보존 및 효소활성 측정을 위한 배지는 Bacto-tryptone \( 5 \mathrm{~g} \), Bacto-peptone \( 5 \mathrm{~g} \), yeast extract \( 3 \mathrm{~g}, \mathrm{NaCl} 30 \mathrm{~g} \)의 고체 및 액체배지(TPY, \( \mathrm{g} / \ell) \)를 사용하였다. 조효소 생산은 효소 생산배지(TPY)에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 24 \) 시간 진탕배양( 200 \( \mathrm{rpm}) \) 한 다음, 배양액을 원심분리 \( (6,000 \mathrm{rpm}, 10 \mathrm{~min}) \) 하여 균체를 제거하고 그 상등액을 조효소로 사용하였다.</p><h2>Lipase 활성측정 및 단백질 정량</h2><p>효소 활성측정은 표준물질로서 p-nitrophenyl palmitate 를 사용한 colorimetric 방법에 의하여 수행되었다. p-nitrophenyl palmitate (PNPP) 30\(\mathrm{mg}\)을 2-propanol 10\(\mathrm{ml}\)에 녹인 용액과, sodium deoxycholate (Na-DOC) 207\(\mathrm{mg}\) 및 gum arabic \( 100 \mathrm{mg} \) 을 \( 25 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) buffer (pH 7.0) \( 90 \mathrm{~m} \ell \) 에 녹인 용액을 혼합한 용액 \( 2 \mathrm{m \ell} \) 에 효소액 \( 0.1 \mathrm{m \ell} \) 을 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15분간 반응시킨 다음 \( 2 \mathrm{M} \mathrm{Na} \mathrm{NO}_{3} \) 용액 \( 0.9 \mathrm{~m} \ell \)를 가하여 반응을 중지시켰다. Lipase 활성은 생성된 p-nitr-ophenol의 양을 \( 410 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였으며, 효소활성은 37 \( { }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분 동안 \( 1 \mu \) mole의 유리 palmitic acid를 생성하는 효소량을 1 unit로 나타내었다.</p><h2>Lipase 정제</h2><p>배양액을 \( 30 \% \) ammonium sulfate로 포화시켜 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 방치시킨 후 원심분리 \( (8,000 \mathrm{~g}, 10 \mathrm{~min}) \) 하였다. 상등액을 다시 \( 80 \% \) ammonium sulfate로 포화시켜 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 방치시킨 다음 원심분리 \( (10,000 \mathrm{~g}, 30 \mathrm{~min}) \)한 후 침전물을 \( 25 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) buffer ( \( \mathrm{pH} \) 7.0)에 녹여 조효소로 사용하였다.</p><p>Sephadex G-100을 25mM Tris-HCl buffer ( \( \mathrm{pH} \) 7.0)로 상온에서 72 시간 동안 포화시킨 후 column \( (15 \times 1,200 \mathrm{~mm}) \)에 충전시키고 \( 25 \mathrm{mM} \) Tris-HCl buffer \( (\mathrm{pH} \) 7.0)로 평형시킨 다음 ammonium sulfate \( (30 \sim 80 \%) \)로 포화시켜 부분 정제된 조효소를 \( 25 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) buffer \( (\mathrm{pH} \) 7.0)로 용출시켰다. 유출속도는 \( 21.6 \mathrm{m \ell} / \mathrm{h} \) 이었고 분획한 용액은 \( 280 \mathrm{~nm} \)에서 단백질을 확인한 후 \( 410 \mathrm{~nm} \)에서 효소 활성도를 측정하였다. 활성이 높은 분획만을 모아 냉동건조기로 농축시킨 다음 이온교환 chromatography에 의하여 효소를 정제하였다. DEAE-Sephacel을 \( 1 \mathrm{mM} \) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \)6.7)로 씻은 다음 column \( (30 \times 250 \mathrm{~mm}) \)에 충전시키고 Sep-hadex G-100에 의하여 정제된 시료를 column에 흡착시킨 후 \( 1 \mathrm{mM} \)과 0.5M sodium phosphate buffer로 농도구배시켜 활성이 높은 분획을 모아 정제된 효소액으로 사용하였다.</p>