C2C12 myoblast를 사용하여 10% FBS가 포함된 DMEM 배양, 2% horse serum이 포함된 DMEM으로 교환하여 분화 유도, TSA 5ng/ml로 처리하고 배지를 교환하는 등의 작업을 통해 세포배양을 하였다. 분화배지로 세포를 키운 후 배지를 농축하고 hematoxylin으로 염색하여 cell fusion의 측정을 하였다. 근육소관내 핵의 수가 3개 이상이면 융합이라고 판단하였으며 300개 이상의 무작위 선택영역에서 평균을 내었다. 원심분리를 한 뒤 상등액만 모아서 희석하였고 이를 32 P-end labeled 22-mer double-stranded NF- \kappaκ B oligonucleotide (5-AGTTGAGGGGATT-TTCCCAGGC-3) 17.5 \mathrm{fmol}17.5fmol과 반응시켰다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>세포배양</h2><p>C2C12 myoblast를 사용하였으며 성장을 위해서는 \( 10 \% \) FBS (fetal bovine serum)를 함유하고 있는 DMEM으로 배양 했으며 \( 80 \sim 90 \% \) 정도의 밀도가 되었을 때 분화를 유도하기 위해서 \( 2 \% \) horse serum을 함유하고 있는 DMEM으로 교환하여 주었다. 그런 후 이틀에 한 번씩 배지를 교환하였다.</p><h2>TSA처리</h2><p>TSA (Trichostatin A)는 dimethylsul oxide (DMSO)에 녹였으며 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다. 처리는 분화 배지로 교환할 때 \( 5 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 이 되도록 넣어주었으며 배지를 교환할 때마다 같이 처리하였다.</p><h2>배지농축</h2><p>분화배지로 세포를 키운 후 이틀간격으로 배지를 모아 이것을 ultrafree-15 centrifugal filter device (Millipore)에 넣고 지침서에 따라 배지를 농축하였다.</p><h2>Cell fusion의 측정</h2><p>배양된 세포를 차가운 PBS로. 두 번 씻은 후 methanol로 5분간 고정화 시켜주고 hematoxylin으로 5분간 염색하였다. 그런 후 물로 씻어주었다. 핵은 광학현미경으로 계수하였다. 근육소관내에 핵의 수가 최소 3개 이상일 때 융합이 되었다고 생각하였으며 각각의 값은 최소 10번 이상의 무작위적인 선택영역에서 전체수가 300 이상인 것만 계수하여 평균을 내었다.</p><h2>Nuclear extracts의 준비</h2><p>세포를 모아 차가운 PBS로 씻고 \( 50 \mu \) 의 lysis buffer (\( 10 \mathrm{mM}\) HEPES, \(\mathrm{pH} 7.9\), \( 1.5 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{MgCl}_{2}, 10 \mathrm{mM} \) \(\mathrm{KCl}\), \(0.5 \mathrm{mM} \) dithiothreitol[DTT], \( 0.5 \mathrm{mM} \) PMSF 로 섞은 후 10분 동안 얼음에 꽂아두었다. 10분 뒤에 \( 0.05 \% \) Nonidet P40을 넣은 lysis buffer를 \( 30 \mathrm{\mu l}\) 넣어서 섞어주고 vortex기계로 10초간 3번 강력하게 섞어주었다. 핵을 모으기 위해서 10분간 \( 2500\times g \) 로 원심분리하였다. 상등액은 벌고 nuclear pellet을 \( 40 \mathrm{\mu l}\) 의 차가운 nuclear-extraction buffer ( \( 20 \mathrm{mM} \) HEPES, \( \mathrm{pH} 7.9,25 \% \) lycerol (v/v), \( 420 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{NaCl}, 1.5 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{MgCl}_{2} \) \( 0.2 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 0.5 \mathrm{mM} \) DTT, \( 0.5 \mathrm{mM} \) PMSF)을 넣고 30분간 얼음에 꽂아두었으며 중간에 한번씩 섞어주었다. 이것을 다시 \( 24000 \times g, 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20분간 원심분리하였다. 상등액만 모아서 buffer D (20 mM HEPES, \( 50 \mathrm{mM} \) \(\mathrm{KCl}\), \(\ 0.2 \mathrm{mM} \) EDTA, \(20 \% \)) glycerol, \( \mathrm{pH} 7.5\))로 1:2가 되도록 희석하였다. 단백질 정량을 하고 이것을 바로 사용하거나 나중에 사용하기 위해서는 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다.</p><h2>Electrophoretic mobility shift assays (EMSA)</h2><p>Nuclear extract \( 5 \mu \mathrm{g} \) 을 \( { }^{32} \mathrm{P} \)-end labeled 22-mer double-stranded NF- \( \kappa \) B oligonucleotide (5-AGTTGAGGGGATT-TTCCCAGGC-3) \(17.5 \mathrm{fmol}\)과 함께 실온에서 제작사(Prom-ega)의 지침서에 준하여 20분간 반응시켰다. 전기영동을 한 후 젤을 말려서 X-ray film에 하루나 이틀정도 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 노출시켰다.</p>