본 연구는 김치의 다양한 맛과 유통기간 연장을 위해 미생물 제어 시스템을 개발하고, 김치 발효에 필요한 미생물학적 기초 자료를 제공하기 위해 T-RFLP 분석을 사용하여 김치 발효 관련 미생물을 평가하고 식품 미생물 분야에서의 T-RFLP 적용 가능성을 평가하였다. 실험에서는 KCTC, KCCM으로부터 구입한 표준 유산균을 사용하였고, Lactobacilli MRS 액체배지 또는 1.5% 한천을 첨가한 고체배지에서 30°C에서 배양되었다. 16S rRNA 유전자의 증폭을 위해 eubacterial universal primer 27F와 16R을 사용하였다. 김치시료는 포기김치를 적절한 크기로 자르고 혐기상태를 유지하기 위해 밀폐하여 실험에 사용되었다. PCR 반응산물은 agarose gel 전기영동으로 확인되었고, 16S rDNA에 해당하는 DNA band를 정제하여 보존하였다.
<p>본 연구에서는 다양한 맛 또는 일관된 맛의 김치 생산을 위한 미생물 제어시스템 개발 그리고 유통기간 연장을 목표로 한 김치의 저장 및 유지법 개발, 전통발효식품의 과학화 등에 필요한 미생물학적 기초자료 제공을 위하여 최근 들어 미생물 군집의 다양성 및 역동성의 모니터링에 빠르게 적용되고 있는 T-RFLP 분석을 김치발효 유산균 연구에 적용하여 김치발효 관련 미생물을 재평가하고, 식품미생물 분야에서의 T-RFLP 적용 가능성을 평가하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 배양조건</h2> <p>본 실험에 사용한 표준 유산균은 Korean Collections for Type Cultures (KCTC), Korean Culture Center for Micro-organisms (KCCM)으로부터 구입하였고(Table 1), Lactoba-cilli MRS 액체배지(Difco, USA) 또는 \( 1.5 \% \) (w/v) 한천을 첨가한 고체배지를 사용하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 미호기성 조건에서 배양하였다.</p> <h2>김치시료 및 DNA 추출</h2> <p>김치발효 관련 유산균 군집의 평가를 위한 김치시료는 수원시 소재 풍기식품으로부터 담근 즉시 구입한 포기김치를 적당한 크기로 잘라, 배추의 각 부위가 고르게 분포되도록 혼합하여 \( 300 \mathrm { ~ml } \) 용기에 소포장 하였으며, 가능한 혐기상태가 유지되도록 밀폐시켰다. 김치는 \( 15 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 및 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 발효시켰으며, \( 15 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 발효시킨 김치는 7일과 15일째, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 발효시킨 김치는 5주와 10주째에 멀균된 거즈를 이용하여 김치국물을 회수하였다. 김치국물을 원심분리하여 균체를 회수한 다음, DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Germany)을 사용하여 DNA를 추출하였고, 추출한 DNA는 spectrophotometer를 이용하여 정량하였다.</p> <h2>T-RFLP 분석을 위한 16S ribosomal RNA 유전자 증폭</h2> <p>T-RFLP 분석에 필요한 16S rRNA 유전자(16S rDNA) 증폭에는 기존의 T-RFLP 분석에서 많이 사용된 eubacterial universal primer 27F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC A-3')와 본 연구그룹에서 bacteria의 16S rDNA 증폭을 위해 제작한 16R (5'-TGA CGG GCG GTG TGT ACA AG-3')을 사용하였다. 대장균의 16S rDNA 염기서열 8-27 부분에 해당하는 forward primer 27F의 5'-말단은 phosphoramidite dye인 6'-carboxyfluorescein (6-FAM)으로 표식하였다(TaKaRa, Japan).</p> <p>PCR 반응에는 PCR thermal cycler (TaKaRa)를 사용하였으며, \( 100 ~ \mu \mathrm { L } \) 반응계에는 \( 300 \mathrm { ~ng } \) DNA, \( 0.25 \mathrm { ~mM } \) dNTP, \( 1 \mathrm { U } \) \( Taq \) polymerase (Roche, Germany), \( 20 \mathrm { ~pmol } \)의 primer를 첨가하였다. 반응조건은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분 예비가열 후, \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 1분간 변성, \( 66.5 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 1분 annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 1분 중합반응의 과정을 30회 반복하고, 마지막에 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 처리한 후 반응을 중단시켰다. PCR 반응산물은 \( 0.8 \% \) agarose gel 전기영동으로 확인하였으며, 16S rDNA 크기에 해당하는 DNA band를 Gel purification system (SolGent, Korea)으로 회수, 정제한 후 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 보존하였다.</p>