청목노상 뽕잎 callus의 생육을 위해 다양한 생장조절제의 농도와 종류를 제시하고, 후에 spot접종하여 배양된 배지의 callus를 잘게 자른 후 bioreactor에 접종하여 배양하여 starter를 제조하고 HPLC를 이용하여 H.pylori에 대한 항균활성 물질의 profile을 분석하였으며 실험에 사용한 균주는 위, 십이지장 궤양 원인균인 H. pylori로서 표준균주를 사용하였다.
<h2>청목노상 뽕잎 callus 배양</h2> <p>청목노상 뽕잎 callus의 생육을 위한 배양 조건을 찾기 위해 다양한 생장조절제의 농도와 종류를 제시하였으며, 생장조절제의 경우 \( 1 \sim 3 \mathrm { mg } / \mathrm { l } \)의 농도로 처리하였고, 종류와 조합방법은 Table 1,2 와 같이 실시하였다.</p> <h2>Biomass를 위한 callus starter 제조 및 bioreactor 배양</h2> <p>Spot접종하여 배양된 배지의 callus를 잘게 자른 후, 자른조각을 \( 100 \mathrm { ml } \)의 멸균된 액체 배지에 접종하여 증식시키고, 다시 \( 500 \mathrm { ml } \)의 액체 배지에 접종하여 배양시켜 starter를 제조하고, starter 전량을 2.4D와 BA를 각각 \( 1 \mathrm { mg } / I \)의 농도로 첨가한 101 의 bioreactor에 접종하였다. 접종된 bioreactor는 \( 27 ^ {\circ } \mathrm { C } \)암조건에서 30 일 정도 액체배양 시켰으며, 생육정도는 배양이 끝난 후 bioreactor의 공기주입을 멈추어 bioreactor 안에 가라앉는 callus를 수거하여 생체 중량을 측정하였다.</p> <h2>HPLC 조건</h2> <p>청목노상 뽕잎과 생장 조절제로 유도된 callus로부터 제조 된 추출물들을 HPLC를 이용하여 callus 추출물에 함유된 H.pylori에 대한 항균활성 물질의 profile을 분석하였다. 즉, 뽕잎과 callus 추출물을 \( 0.2 \mu \mathrm { m } \) filter로 여과한 후 여과액 \( 5 \mu \mathrm { l } \)를 HPLC에 주입하여 분석하였다. 분석 조건은 Xterra column (Waters, RP-18, \( 250 \times 4.6 \mathrm { ~mm } \) )을 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 유지하였고, 검출기는 Waters 2487 UV detector를 사용하여 \( 306 \mathrm { ~nm } \)에서 측정하였으며, 이동상은 acetonitile과 formic acid \( ( \mathrm { pH } \) 3.0)이고, 기울기 용리 조건은 5분 동안 acetonitile 10%를 용출시켰고, 그 후 30 분간 농도를 50%로 증가시키고 다시 5분간 10%로 감소시켜 총 45분간 용매를 이동시켰다. 이때 용매의 흐름 속도는 \( 0.5 \) \( \mathrm { ml } \) min 이었다.</p> <h2>Helicobacter pylori 배양</h2> <p>실험에 사용한 균주는 위, 십이지장 궤양 원인균인 H. pylori로서 표준균주인 ATCC 43504를 사용하였다. H. pylori의 배양에는 최적배지(special peptone \( 0.5 \mathrm { ~g } \), agar \( 0.75 \mathrm { ~g } \), \( \mathrm { NaCl } 0.25 \) \( \mathrm { g } \), yeast extract \( 0.25 \mathrm { ~g } \), beef extract \( 0.2 \mathrm { ~g } \) 및 pyruvic acid \( 0.025 \) \( \mathrm { g } ) \)를 사용하여 혐기성 조건을 유지시켜주기 위해서 \( 10 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator를 이용하였으며, incubator의 습도는 항상 \( 95 \% \) 이상으로 유지하였으며, agar plate상에서 배양은 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 48 ~ 72 시간 동안 실시하였다.</p>