혈관확장기능 평가를 위해 \(\mathrm{NO}\), nNOS, cGMP, 와 PGE\(_{2} \)를 분석했고 그 중 \(\mathrm{NO}\) 평가를 위해 균질화한 해면체 상등액을 \(\mathrm{NO}\) assay kit를 사용했다. 채혈 된 혈액을 원심분리하여 assay buffer로 희석시켜 DHT,SHBG,17\(\beta\)-HSD,테스토스테론을 성기능 평가를 위해 평가했다. 정자 수 및 운동성 측정을 위해 실험동물의 부고환을 적출한 후 정자를 체쥐했다. 이번 실험에서 얻은 결과는 분산분석하여 대조군과 실험군 간의 유의성 \( p<0.05 \) 수준에서 확인했다.
<h2>Nitrite oxide (\(\mathrm{NO}\))의 in vitro 평가</h2> <p>In vitro 연구를 위해 인간제대혈유래혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)를 LONZA (Walkersville, MD, USA)에서 구입하여 LONZA에서 구입한 \( 2 \% \) 소태아혈청(fetal bovine serum), \( 0.04 \% \) hydrocortisone, \( 0.4 \% \) 인간 섬유 모세포성장인자-B (human fibroblastic growth factor-B), \( 0.1 \% \) 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor), \(0.1\%\)인슐린유사성장인자-1 (insulin-like growth factor- 1 ), \( 0.1 \% \) 아스코르브산, \( 0.1 \% \) 인간상피세포성장 인자(human epidermal growth factor), \( 30 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 젠타마이신, \( 15 \mathrm{ng} / \mathrm{mL} \) amphotericin, 및 \( 1 \% \) 헤파린이 추가된 EGM-2에서 배양되었다. 모든 배지에 \(100 \mathrm{units}\)/ \( \mathrm{mL} \)의 페니실린과 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)의 스트렙토마이신을 보충했다. HUVEC는 well 당 \( 1 \times 10^{6} \)의 농도로 6 -well plate 상에 분주한 다음 24 시간 후에 새로운 배지로 씻어낸다. 포공영의 농도를 달리하여 처리한 후 24시간 후에 상층액을 채취하여, 같은 양의 Greiss 용액(Sigma, St. Louis, MO, USA)과 혼합한 후, microplate reader (BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 \( 450 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite standard의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액의 \(\mathrm{NO}\) 농도를 결정하였다.</p> <h2>\(\mathrm{NO}\), nNOS, cGMP 및 PGE\(_{2} \)의 in vivo 평가</h2> <p>혈관확장기능 평가를 위해 \(\mathrm{NO}\), nNOS, cGMP, 와 PGE\(_{2} \)를 분석하였다. \(\mathrm{NO}\) 평가를 위해 균질화한 해면체 상등액을 \(\mathrm{NO}\) assay kit (Sigma)로 평가하였다. NOS 평가를 위해 균질화 된 해면체를 \( 1 \mu \mathrm{M} \) ionomycin으로 처리하고 2시간 동안 incubation 하였다. 그 후, 상층액을 \( 516 \times \mathrm{g} \)에서 원심분리하여 수집한 다음 새 tube에 옮겨 neuronal nitric oxide synthase (nNOS) 키트(R&D, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 제조업체의 지시대로 측정하였다. cGMP 평가 역시 균질화된 해면체에 에탄올을 \( 1: 4(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)의 비율로 첨가하고 \( 516 \times \mathrm{g} \) 에서 10 분간 원심분리하여 비특이적 단백질을 제거하였다. 비특이적 단백질이 제거된 상등액을 감압건조 시키고, 동일한 부피의 PBS로 용해시킨 후 cGMP EIA kit (Cayman, Ahn Arbor, MI, USA)를 사용하여 제조업체의 지시대로 측정하였다. PGE\(_{2} \) 평가를 위해 원심분리 된 해면체상등액을 취하여 prostaglandin EIA kit (Cayman)로 측정하였다.</p> <h2>DHT, testosterone, SHBG 및 \( 17 \beta\)-HSD의 in vivo 평가</h2> <p>Dihydrotestosterone (DHT), 테스토스테론, sexually-hormone-binding globulin (SHBG)과 17-beta hydroxysteroid dehydrogenases (\( 17 \beta\)-HSD)를 성기능 평가를 위해 평가하였다. 채혈 된 혈액을 원심분리한 후 각각의 assay buffer로 희석시킨 후 사용하였다. DHT, 테스토스테론 및 \( 17 \beta\)-HSD의 농도는 Mybioscience에서 구입 한 ELISA 키트로 측정 하였다. SHBG의 농도는 SHBG ELISA 키트(Cusabio, Temecula, CA, USA)에 의해 측정되었다.</p> <h2>정자 수 및 운동성 측정</h2> <p>실험동물의 부고환을 해부현미경을 사용하여 적출한 후 수술용 가위로 잘게 자르고 이를 \( 0.5 \%\) BSA를 포함하는 M199 media에 넣어 준 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\) 10분간 incubation하여 정자를 채취하였다. 채취된 정자를 체내와 유사한 환경으로 유지하기 위해 \( 32{ }^{\circ} \mathrm{C} \) M199 media로 1차 희석하였다. 희석액에서 \( 100 \mu \mathrm{L} \)를 취하고 media \( 900 \mu \mathrm{L} \)을 넣어 2차 희석을 해주었다. 이후 2차 희석액에서 \( 10 \mu \mathrm{L} \)를 취하여 hemocytometer에서 counting하였다. 정자의 운동성은 위에서 counting한 것에서 활동하는 정자 수의 비율을 측정하여 계산하였다.</p> <h2>통계 분석</h2> <p>모든 분석 자료는 평균 \( \pm \) 표준오차 (mean\(\pm\)SE)로 나타냈으며 실험결과 분석은 Graph pad Prism 5.0 프로그램(GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)을 통해 진행하였다. 이번 실험에서 얻은 결과에 대해 일원배치 분산분석(one way ANOVA)을 실시하였으며, Tukey test를 이용하여 대조군과 실험군 간의 유의성을 \( p<0.05 \) 수준에서 사후 확인하였다.</p>