본 논문에서는 특정 열처리조건에 맞춘 상등액과 담체를 제작하여 실험에 사용하여다. 기질농도에 대한 전환율을 제외한 CE 효소 반응에 대해서 측정하였고 유당, 락툴로오스 epilatose의 정량분석을 수행하였다.
<h2>열처리조건</h2><p>재조합 E. coli BL21을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 6000 \times \mathrm{g} \)으로 20분동안 원심분리기를 이용하여 회수한 뒤, \( 20 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\) \( (\mathrm{pH} \mathrm{7.4)} \) 완충액을 이용하여 균을 현탁시키고 초음파분쇄기를 이용하여 균을 파쇄시켰다. 파쇄시킨 현탁액을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 13,000 \times \mathrm{g} \)으로 20분 동안 원심분리 하여 상등액만 취하였다. 회수된 상등액을 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)와 \( 75^{\circ} \mathrm{C} \) 항온수조에서 40분 동안 정치시킨 뒤, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 13,000 \times g \)으로 20분 동안 원심분리하여 변성된 단백질을 제거한 후 상등액을 회수하였다.</p><h2>담체 제조</h2><p>\( \mathrm{CS}-\mathrm{H}^{\mathrm{R}} \mathrm{C}^{\mathrm{E}} \)를 발현시킨 E. coli BL21의 배양액을 \( 5000 \times g \)에서 20 간 원심분리 한 뒤, 상등액을 제거하고 wet cell weight (wcw)를 측정해서 각각 5, 10, 15, 20, 25 \(\%\) \((\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 비율로 세포를 \( 0.01 \mathrm{M} \) calcium acetate 용액에 현탁시켰다. 각 비율로 혼합시킨 용액과 \( 3 \% \) sodium alginate를 \(55:45\)\((\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 비율로 혼합한 용액을 \( 170 \mathrm{mM} \) calcium acetate 용액이 담긴 비커에 혼합용액을 한 방울씩 떨어뜨려 바늘의 크기를 조절하여 지름 2.0, 2.8, 5.0 \(\mathrm{~mm} \)의 담체를 제조하였다. 제조된 담체는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 경화시키고 반응 실험에 사용하기 전 멸균 증류수로 1-2회 세척한 뒤 사용하였다.</p><h2>효소반응 및 담체를 이용한 락툴로오스 회분식 반응</h2><p>CE 효소 반응은 기질농도에 대한 전환율 실험을 제외하고 \( 50 \mathrm{mM} \) PIPES \( (\mathrm{pH} 7.5) \)에 용해된 \( 20 \mathrm{~g} /\mathrm{l} \)의 유당을 이용하여 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간동안 반응시켜 분석하였다. 같은 조건에서 기질농도에 대한 전환율 실험에서는 기질의 농도를 \(20 - 200\mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 범위에서 변화시켜 전환율을 측정하였다.</p><p>담체를 이용한 회분식 반응은 \( \mathrm{CS}-\mathrm{H}^{\mathrm{R}} \mathrm{C}^{\mathrm{E}} \) 효소를 함유한 재조합 균주를 이용하여 제조된 \( 15 \% \) 의 세포 고정화 담체를 \( 50 \mathrm{mM} \) PIPES (\(\mathrm{pH} 7.5\))에 \(200 - 300\mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 유당을 용해시킨 기질용액과 부피비로 \( 1: 1 \) 로 혼합하여 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1-4시간 동안 반응시켰다. 담체를 이용한 반복식 회분식 반응은 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 기질용액 \(200\mathrm{~g} / \mathrm{l} \)를 4시간 동안 배양 후 반응액을 회수하고 담체의 재사용을 위해 멸균증류수로 세척하고 다시 동일 조건에서 반응시키는 방법으로 6회 반복 실험을 진행하였다.</p><h2>당분석방법</h2><p>Alliance 2690 HPLC system과 Waters 2410 refractiveindex detector (Waters, USA)를 이용하여 유당과 락툴로오스, epilatose의 정량분석을 수행하였다. 분석에 사용된 컬럼은 HILICpak VG-50 4E column (Shodex, Japan)을 사용하였고, \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 전개용매 \( (75 \% \) acctonitrilo과 \( 20 \% \) methanol, \( 5 \% \) 물)를 \( 1 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \)의 유속으로 20분 동안 흘려 분석하였다.</p>