본 실험에 사용한 독활(A. continentalis Kitagawa)은 대구광역시 약령시장에서 원산지는 중국인 건조된 것을 구입하여 사용했다. Rat를 ethyl ether로 마취후, 항응고제 \( 0.15 \mathrm{M} \) sodium citrate를 혈액과 \( 1: 9(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)의 비율이 되도록 함유한 주사기로 복대동맥으로부터 채혈했다. 총 폴리페놀 함량의 경우, 널리 사용되는 Folin-denis법을 응용해서 계측했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료</h2> <p>본 실험에 사용한 독활(A. continentalis Kitagawa)은 대구광역시 약령시장에서 원산지는 중국인 건조된 것을 구입하여 사용하였다.</p> <h2>추출 및 분획</h2> <p>건조된 독활 \( 1 \mathrm{~kg} \)을 10배(\(\mathrm{w}\)/\(\mathrm{v}\))의 \( 80 \% \) 메탄올로 3회 추출, 여과(Whatman NO.3, England)하고 vacuum evaporator (R-3000, Buchi, Switzerland)로 농축한 후 동결 건조하여 메탄올 추출물 \( (161.7 \mathrm{g}) \)로 사용하였다. 이 추출물을 물에 현탁 시킨 후 \( \mathrm{n} \)-hexane, \( \mathrm{CHCl}_{3}\), EtOAc 및 BuOH로 순차적으로 3회 반복 추출하였다. 각 분획들을 감압 농축한 후 동결 건조하여 hexane 분획(\(4.3 \mathrm{g}\)), \( \mathrm{CHCl}_{3} \) 분획( \(2.4\mathrm{g}\)), EtOAc 분획(\(2.6 \mathrm{g}\)), BuOH 분획 (\(15.6\mathrm{g})\) 및 남은 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 층 \( (82.5 \mathrm{g}) \)을 얻었다.</p> <h2>실험동물</h2> <p>본 실험에 사용된 Sprague-Dewlcy rat은 (주)오리엔트바이오에서 분양 받아 1주 이상 실험실 환경에 적응시킨 후 스트레스를 최소화하고, 몸무게 \( 250\sim300 \mathrm{g} \) 의 male을 실험에 사용하였다.</p> <h2>Washed platelet의 조제</h2> <p>Rat를 ethyl ether로 마취하고, 항응고제 \( 0.15 \mathrm{M} \) sodium citrate를 혈액과 \( 1: 9(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)의 비율이 되도록 함유한 주사기로 복대동맥으로부터 채혈하였다. Platelet rich plasma (PRP)는 \( 200 \times \mathrm{g}\)에서 10분간 원심분리하여 상등액의 PRP를 얻었고, 계속하여 \( 800 \times \mathrm{g}\)에서 15분간 원심분리하고, 침전된 혈소판을 washing buffer ( \( 137\mathrm{mM}\mathrm{~NaCl} \), \( 2.9 \mathrm{mM} \mathrm{~KCl}\), \(1 \mathrm{mM} \mathrm{~MgCl}_{2} \), \( 5 \mathrm{mM}\) glucose,\(12 \mathrm{mM} \mathrm{~NaHCO}_{3}\), \(0.34 \mathrm{mM} \mathrm{~Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\), \(1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 20 \mathrm{mM} \) HEPES, \(0.25\%\) BSA, \(\mathrm{pH} 7.4\))로 2회 세척한 후 washing buffer (\(137 \mathrm{mM} \mathrm{~NaCl}\), \(2.9 \mathrm{mM} \mathrm{~KCl}\), \(1 \mathrm{mM} \mathrm{~MgCl}_{2}\), \( 5 \mathrm{mM}^{2} \) glucose, \(12 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaHCO_3}\), \(0.34 \mathrm{mM} \mathrm{~Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\), \(20 \) \( \mathrm{mM} \) HEPES, \( 0.25 \% \) BSA, \(\mathrm{pH} 7.4\))에 suspension 시켜서 washed platelet로 하였다. 현소판 응집 억제능에 사용한 washed platelet는 cell counter (Hema-vet HV950FS, Drew scientific, USA)를 이용하여 혈소판 수를 계측하고 buffer로 희석하여 혈소판이 \( 3 \times 10^{8} \) \(\mathrm{platelet}\)/\(\mathrm{ml}\)이 되도록 조정하였다. 혈소판은 저온에서 응집되므로 이상의 실험은 상온에서 실행하였다.</p> <h2>혈소판응집 억제능 측정</h2> <p>Rat의 혈소판 응집 억제능은 Aggregometer (Chrono-Log Co., Ltd., Havertown, PA. USA)를 이용한 탁도 측정법으로 측정하였다. Washed platelet를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 incubation 시킨 후 농도별로 시료를 처리하고 2분 후 혈소판 응집을 유도하는 물질 ADP \( (6 \mu \mathrm{M}) \)으로 응집을 유도하였으며, 10분간 측정한 후 억제정도를 계산하였다. 억제정도(\(\%\))는 시료를 처리하지 않은 것을 control로 하여, 아래와 같은 방법으로 구하였다.</p> <p>Inhibition \( =\frac{A-B}{A} \times 100 \)</p> <p>A: control의 aggregation \(\%\)</p> <p>B: sample 처리시의 aggregation \(\%\)</p> <h2>총 폴리페놀 함량 측정</h2> <p>총 폴리페놀 함량은 널리 사용되고 있는 Folin-denis 법을 응용한 방법에 따라 측정하였다. 먼저 시료 \( 1 \mathrm{mg} \)을 증류수 \( 1 \mathrm{ml} \)에 녹이고, 10배 100배 희석한 희석액 \( 2 \mathrm{ml} \)에 2배로 회석한 Folin 시약 \( 2 \mathrm{ml} \)을 첨가하고 3분간 반응 시킨 후 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \)를 서서히 가하였다. 이를 실온에서 1시간 반응한 후 spectrophotometer들 사용하여 \( 700 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 tannic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로 함량은 구하였다.</p>