A549 세포들에서 분리한 RNA를 정량하여 RT-PCR을 이용하여 증폭한 후 그 산물(DNA)를 agarose gel에 loading하여 전기영동하여 양적 차이를 확인하였다. 분리가 끝난 gel을 염색한 후 UV 하에서 GAPDH를 control로 하여 발현 차이를 확인하였다. Piceatannol이 처리된 세포들에 lysis buffer를 첨가한 후 원심분리하여 상층액을 취하고 그로부터 얻은 단백질을 SDS-PAGE를 이용하여 분리하고 이를 membrane으로 옮겨 western blot 분석하였다. 그리고 Piceatannol 처리에 의한 caspase 활성 변화를 측정하기 위해서 단백질을 추출, 정량하여 기질이 함유된 extraction buffer에 혼합하고 그를 희석한 후 ELISA reader를 이용하여 반응의 정도를 측정하였다. A549 세포에서 생성되는 NO의 농도는 \( \mathrm{NO}_{2}{ }^{-} \)를 인지하는 Griess 시약을 이용하여 검출하였다. 각각의 실험 측정 결과값은 평균표준편차 표시하고 Student \( t \)-test로 통계적 유의성을 얻었다.
<h2>Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 분석</h2> <p>동일한 조건에서 배양된 A549 세포들에 TRIzol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA)를 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간동안 처리하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, 각각의 primer (Table 1), DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭하였다. 각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하여 1X TAE buffer로 \( 1 \% \) agarose gel을 만들고 well 당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 loading 한 후 \( 50 \mathrm{~V} \) 에서 전기영동을 행하였다. 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 ethidium bromide (EtBr)을 이용하여 염색한 후 UV 하에서 발현의 차이를 확인하였으며, glycer-aldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 를 internal control로 사용하였다.</p> <h2>단백질의 분리, 전기영동 및 Western blot 분석</h2> <p>Piceatannol이 처리된 세포들에 적정량의 lysis buffer [\(25 \mathrm{mM}\) Tris-Cl (\( \mathrm{pH} \) 7.5), \( 250 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{NaCl}, 5 \mathrm{mM} \) EDTA, \(1\%\) NP-40, \( 1 \mathrm{mM} \) phenylmethylsulfonyfluoride, \( 5 \mathrm{mM} \) dithiothreitol] 를 첨가하여 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 반응시킨 후, \( 14,000 \mathrm{rpm} \) 으로 30 분 원심분리하여 그 상층액을 취하였다. 상층액에서 얻은 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, \( \mathrm{NH}) \) 으로 전이시킨 후, 적정 항체를 처리하여 enhanced cheiluminoscence (ECL) 용액 (Amersham Life Science Corp., Arlignton Heights, IL)을 적용시킨 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다. 본 실험에 사용 된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc. 에서 구입하였으며, immunoblotting을 위한 peroxidase-labeled 항체는 Amersham에서 구입하였다.</p> <h2>In vitro caspase 활성 변화 측정</h2> <p>Piceatannol 처리에 의한 caspase의 활성화 정도를 알아보기 위하여 준비된 세포를 모은 뒤 단백질을 추출하고 정량하여 각각 \( 150 \mu \mathrm{g} \) 의 단백질을 fluorogenic peptide 기질 \( 100 \mu \mathrm{M} \)이 함유된 extraction buffer [40 mM HEPES ( \( \mathrm{pH} \) 7.4), \( 20 \% \) glycerol \( (\mathrm{v} / \mathrm{v}), 1 \mathrm{mM} \) EDTA, 0.2\% NP-40 and \( 10 \mathrm{mM} \) DL-DTT] 50 씨에 혼합하였으며, microtiter plate에 다시 extraction buffer에 희석하여 각 sample 당 총 volume이 100 \( \mu 1 \) 가 되게 하였다. 실험에 사용된 기질은 caspase-3의 경우에는 Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-p-nitroaniline (pNA)이었고, caspase-8의 경우에는 Ile-Glu-Thr-Asp (IETD)-pNA이었으며, caspase-9는 Leu-Glu-His-Asp (LEHD)-pNA였다. 준비된 plate를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3시간동안 incubation 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 \( 405 \mathrm{~nm} \) 의 흡광도를 이용하여 반응의 정도를 측정하였다.</p> <h2>NO의 측정</h2> <p>A549 세포로부터 생성되는 NO의 농도를 세포 배양액에 존재하는 \( \mathrm{NO}_{2}{ }^{-} \)를 인지하는 Griess 시약을 이용하여 검출하였다. 이를 위하여 A549 세포를 6-well culture plate에 24시간 동안 배양한 후 다양한 농도의 piceatannol을 48 시간 처리한 뒤 세포 배양액을 수거하고 배양액에 동량의 Griess 시약 \( (0.1 \% \) naphthylethylenediamine \& \( 1 \% \) sulfanilamide in \( \left.5 \% \mathrm{H}_{3} \mathrm{PO}_{4}\right) \) 을 넣어 실온에서 반응 시켰다. 반응액을 micro-plate reader를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \) 흡광도에서 측정하였으며, 세포로부터 생성된 NO의 양은 \( \mathrm{NaNO}_{2} \) 표준액의 농도를 기준으로 계산하였다.</p> <h2>통계 처리</h2> <p>모든 실험결과는 평균표준편차로 표시하였고 SigmaPlot을 이용하여 Student \( t \)-test를 이용하여 통계적 유의성을 얻었다.</p>