SmMDH 유전자를 BamHI, HindIII 제한효소로 처리한 후 pET-21a 발현벡터에 삽입하여 pETSmMDH를 얻었다. 이렇게 얻은 것을 E. coli BL21에 형질전환하여 재조합체를 얻어내고 LBA 액체배지에 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다. 또한 IPTG를 첨가하여 SmMDH 효소의 발현량이 최대가 될 때까지 추가로 배양하였다.
<h2>재조합 효소 유전자의 발현 및 정제</h2> <p>SmMDH 유전자를 BamHI과 HindIII 제한효소로 처리하고, pET-21a (Novagen, Merk, Germany) 발현벡터에 삽입하여 pETSmMDH를 얻었다. pETSmMDH를 E. coli BL21 (DE3)에 형질전환하여 재조합체를 얻은 후, LBA ( \( 1 \% \) bacto-tryptone, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 1 \% \mathrm { ~NaCl } , 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) ampicillin) 액체배지에 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다. 배양액의 흡광도 \( (600 \mathrm { ~nm } ) \) 가 0.4-0.6에 도달한 후, 최종농도가 \( 0.1 \mathrm { ~mM } \)이 되도록 IPTG (isopropyl- \( \beta \)-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, 이후 SmMDH 효소의 발현량이 최대가 될 때까지 16시간 동안 추가로 배양하였다.</p> <p>원심분리로 회수한 균체는 lysis buffer \( \left (50 \mathrm { ~mM } \mathrm { ~NaH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } \right . \), \( 300 \mathrm { ~mM } \mathrm { ~NaCl } , 10 \mathrm { ~mM } \) imidazole, \( \mathrm { pH~ } 7.0) \)에 현탁하고, ultrasonicator (VCX750, Sonics & Materials, Inc., Newtown, CT, USA)로 파쇄하였다. 원심분리 \( \left (4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 17,000 \times \mathrm { g } , 15 \right . \)분)을 통해 불용성 침전물을 제거하고 얻은 상층액을 Ni-NTA (nickel-nitrilotriacetic acid) 컬럼에 통과시킨 후, wash buffer \( \left (50 \mathrm { ~mM } \mathrm { ~NaH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } \right . \), \( 300 \mathrm { ~mM } \mathrm { ~NaCl } , 20 \mathrm { ~mM } \) imidazole, \( \mathrm { pH~ } 7.0) \)로 세척하고, 최종적으로 elution buffer \( (50 \mathrm { ~mM } \mathrm { ~NaH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } , 300 \mathrm { ~mM } \mathrm { ~NaCl } , 250 \mathrm { mM } \) imidazole, \( \mathrm { pH~ } 7.0) \)를 흘려 정제된 효소를 회수하였으며, 농축 후 최적 buffer로 투석하여 이후의 실험에 사용하였다.</p>