본 연구에서는 BPV DNA 정량을 위한 real-time PCR 방법의 민감도, 재현성, 특이성을 검증하였다. 여러 날에 걸쳐 수행된 실험에서 추출된 DNA를 이용해 real-time PCR을 수행하였으며, 이를 통해 BPV log titer와 crossing point 값 간의 표준 회귀식을 도출하였다. 그 결과, 이 값들 간의 회귀성이 매우 높게 나타났다.
<h2>Real-time PCR의 신뢰성 검증</h2> <p>BPV DNA 정량을 위한 real-time PCR 방법의 신뢰성(reliability)을 보증하기 위해 화립된 실험법의 민감도(sensitivity), 재현성(reproducibility), 특이성 (specificity) 등을 검증하였다. 민감도를 측정하기 위해 Titer가 \( 1.3 \times 10 ^ { 5 } \) \( \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \) 인 BPV를 순차적으로 10 배씩 희석한 후 real-time PCR을 수행하였다. 각 시료에 대해 real-time PCR cycle 수에 따른 fluorescence값의 증가를 관찰한 결과 민감도는 \( 1.3 \times 10 ^ { -1 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \) 임을 확인할 수 있었다. Melting curve 분석 결과 BPV DNA에 특이적인 부분과 primer dimer 등 비특이적인 부분으로 나뉘었으며, 완충용액 대조군에서는 BPV DNA에 특이적인 peak를 확인할 수 없었다. 증폭된 PCR 산물을 \( 1.5 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) agarose gel을 사용하여 전기 영동한 결과 각 MVM 양성시료에서 예상 크기의 밴드를 확인할 수 있었지만, 완충용액 대조구에서는 PCR 산물을 확인할 수 없었다(자료 미제시).</p> <p>확립된 BPV DNA 정량법의 재현성 검증을 위해 서로 다른 날에 BPV 표준시료에서 DNA를 추출하고 real-time PCR을 수행한 후 crossing point 값을 비교하였다. BPV log titer( \( \left . \log _ { 10 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } ; \mathrm { x } \right ) \) 에 대한 crossing point 값 \( ( \mathrm { y } ) \) 간의 표준 회귀식은 첫째 날의 경우 \( \mathrm { y } = -3.436 \mathrm { x } + \) \( 24.41 \) (결정계수 \( r ^ { 2 } =0.996 \) ), 둘째 날의 경우 \( y=-3.386 x + \) \( 24.23 \left ( \mathrm { r } ^ { 2 } =0.993 \right ) \), 셋째 날의 경우 \( \mathrm { y } =-3.498 \mathrm { x } + 24.48 \left ( \mathrm { r } ^ { 2 } =0.997 \right ) \)로 BPV log titer와 crossing point 값 간의 회귀성이 매우 높았다.</p>