leucocin A 유전자의 합성과 leucocin A 발현 유전자가 도입된 형질전환 효모를 얻는 것에 성공하였으며, 이것이 고초균의 생육을 효과적으로 억제하는 것을 확인했다. 형질전환 효모에서 분리된 플라스미드에서 leucocin A유전자를 확인하였고, 이 연구를 통해 식품 보존성 향상제 및 항생제로 사용되는 박테리오신을 대량생산할 수 있는 효모세포를 제작했다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>Leucocin A 유전자의 합성</h2><p>Leucocin A 유전자의 일차구조는 이미 보고되어 있지만 이 유전자를 클로닝하려면 leucocin A를 생산하는 Leuconostoc gelidum UAL 187 균주를 구입하고 배양한 후 이 균주로부터 추출한 DNA를 주형으로 leucocin A의 유전자 부위를 인식하는 primer DNA를 합성하여 PCR법으로 증폭하거나 Southern hybridization법으로 이 유전자부위를 검출해내어야 한다. 이러한 방법은 매우 번거롭고 힘든 작업이라 할 수 있다. 하지만 다행히도 이 박테리오신은 아미노산 37개로 구성된 짧은 펩티드이기 때문에 이를 DNA로 환산하면 \( 111 \mathrm{bp} \) 정도의 길이에 지나지 않는다. 최근 oligo DNA의 합성기술의 발달로 \( 100 \mathrm{bp} \) 정도의 길이의 DNA는 쉽게 합성이 가능하기 때문에 박테리오신 유전자의 전후 부위를 \( 60 \mathrm{bp} \) 정도씩 나누어서 합성한 후, 이들을 서로 DNA 연결효소로 연결하여 이 유전자를 클로닝할 수 있다. 합성된 두 가닥의 oligo DNA를 서로 annealing하여 얻어진 이중쇄 DNA를 효모발현 벡터인 pAUR123의 제한효소 XhoI-XbaI 부위에 삽입하여 효모발현 플라스미드를 얻었다. 이러한 방법으로 유산균의 일종인 L. gelidum UAL 187 유래의 leucocin A 유전자의 합성에 성공하였다. Leucocin A 는 모두 \( 117 \mathrm{bp} \) 길이의 염기로 되어 있으며 아미노산 37개로 구성되어 있다.</p><h2>Leucocin A를 생산하는 형질전환 효모의 제작</h2><p>효모(Saccharomyces cerevisiae)를 YPD 배지 \( 4 \mathrm{ml} \)에 배양한 후, TE로 효모를 세정하여 집균한 후, leucocin A의 효모발현 플라스미드로 형질전환시켰다. 이렇게 제작된 leucocin A를 생산하는 효모는 선별배지인 aureobacidin A (최종농도 \( 0.2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)를 포함하는 YPD 배지에서 선별하였다. 그 결과, leucocin A 발현 유전자가 도입된 형질전환 효모를 얻었다. 형질전환 효모의 효과적인 선별을 위하여 선별 마커로 사용되는 aureobacidin A의 최종농도를 \( 0.1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서 \( 0.5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 까지 다양하게 하여 형질전환 효모 콜로니의 형성효율을 검토하였다. 그 결과, 이 연구에서 사용한 효모의 경우는 aureobacidin A의 최종농도가 \( 0.2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 에서 가장 효과적으로 형질전환 콜로니를 형성하였다. Aureobacidin A의 최종농도가 너무 낮으면 콜로니 형성은 원활하지만 형질 전환되지 않은 야생효모의 콜로니의 형성빈도가 높아지고, 최종농도가 너무 높으면 콜로니 형성이 되지 않거나 형성에 많은 시간을 요한다는 사실을 확인할 수 있었다.</p><h2>형질전환 효모의 leucocin A 생산능의 확인</h2><p>부패균의 일종인 고초균(Bacillus subtilis)을 액체배지에 배양한 후, 이를 aureobacidin A (최종농도 \( 0.2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) )를 포함하는 YPD 괴체배지 전체에 접종하였다. 여기에 야생효모와 형질전환 효모를 일정부위에 접종하여 항균활성에 의해 생성된 생육억제환(clear zone)을 비교 · 분석한 결과, 플라스미드가 도입된 효모만이 고초균의 생육을 효과적으로 억제하는 것이 확인되었다.</p><h2>형질전환 효모로부터 분리된 플라스미드로부터 leucocin A유전자의 확인</h2><p>형 질 전환된 효모로부터 leucocin A 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA를 분리하였고, 이를 이용하여 leucocin A 유전자에 특이적인 primer를 이용하여 PCR을 행한 결과, leucocin A 유전자에 해당하는 약 \( 120 \mathrm{bp} \)의 유전자 단편이 확인되었다. 이 결과로 형질전환 효모가 나타내는 고초균에 대한 항균활성이 효모 자체에 의한 항균활성이 아닌 형질전환에 의해 도입된 leucocin A 발현 플라스미드에 의한 것이라는 사실을 확인할 수 있었다.</p><p>이 연구의 결과로 부패하기 쉬운 식품들의 보존성을 향상시키거나, 내성이 생긴 병원균의 생육을 저해하기 위한 항생제로 사용할 수 있는 박테리오신을 산업적으로 대량생산할 수 있는 효모세포를 제작하였다. 재조합 DNA 기술을 이용하여 유용 유전자 산물의 효율적인 생산을 위해서는 대상 유전자 산물인 단백질의 특성에 따라 사용하는 숙주(host)롤 잘 선택해야 한다. 이 연구의 대상인 leucocin A는 세균의 생육을 억제하는 항균활성을 가지는 단백질이기 때문에 대장균과 같은 세균세포를 생산숙주로 이용할 경우 생산이 불가능한 경우가 많다. 이 연구에서 사용한 생산숙주인 효모의 경우는 박테리오신에 의해 생육 저해를 받는 원핵생물과는 달리 진핵생물이지만 배양이 용이하며 생육속도가 비교적 빠르기 때문에 특수한 유전자 산물을 생산하는데 자주 사용되는 숙주세포이다.</p>