BeWo 세포들의 증식 정도는 배양액의 thymidine이 세포 내 증가하는 양으로 측정하였고 배양한 BeWo 세포 \( \left(2 \times 10^{7}\right) \)를 인산염 완충액으로 세척한 다음 세포 용해 완충액 하에서 1 시간 동안 방치하였으며, Western blot법은 ERK의 인산화형인 p-ERK에 대한 항체, PLCy1에 대한 항체, PLCv2에 대한 항체, phosphotyrosine에 대한 항체를 이용하여 측정하였고, 통계학적 유의성은 Student's t-test를 이용하여 \( \mathrm{p} \) 값이 \( 0.05 \) 이하이면 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>BeWo 세포의 배양 및 세포 증식 조사 \( \left(\left[{ }^{3} \mathrm{H}\right)\right. \) thymidine incorporation assay)</h2> <p>세포의 증식 정도는 배양액의 thymidine이 세포 내 증가하는 양으로 측정하였다. BeWo 세포들은 한국 세포 주 은행으로부터 제공받았으며 Dulbeco's modified Eagle's medium(DMEM)/F-12 배지(Hyclone, USA)에서 10\% fetal bovine serum(Hyclone, USA), 100 units/ml penicillin 및 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) streptomycin을 함유시키고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하였다. VEGF(R\&D, USA)나 sodium nitroprusside (SNP) (Sigma, USA)처리를 위하여 세포는 24-well 플레이트에 \( 5 \times 10^{4} \) cells/well로 분주시켰다. 배지는 혈청이 들어 있지 않은 것으로 바꾸어서 24 시간 배양하였고 여러 약물을 처리하고 \( \left[{ }^{3} \mathrm{H}\right] \) thymidine \( (1 \mu \mathrm{Ci} / \mathrm{ml})\)(NEN, USA) 을 넣고 다시 24 시간 더 배양하였다. 배양액을 버리고 차가운 \( 5 \% \) tri-chloroacetic acid 용액으로 15 분간 처리한 후 \( 1 \mathrm{M} \mathrm{NaOH} \) 로 1 시간 처리하여 녹이고 여기에 \( 1 \mathrm{M} \mathrm{HCl} \) 로 중화한 다음 liquid scintillation counter(Beckman, USA)로 측정하였다.</p> <h2>면역침전</h2> <p>배양한 BeWo 세포 \( \left(2 \times 10^{7}\right) \) 를 인산염 완충액으로 세척한 다음 단백질 분해 효소 억제제와 \( 50 \mathrm{mM} \mathrm{NaF} \) 및 \( 2.5 \mathrm{mM} \mathrm{Na}_{3} \mathrm{VO}_{4} \) 가 첨가된 세포 용해 완충액(1\% Triton X- 100,50 \( \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \) 및 \( 20 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}, \mathrm{pH} \) 7.4)을 이용하여 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 하에서 1 시간 동안 방치하였다. 파괴된 세포를 함유하는 용액을 Eppendorf microcentrifuge를 이용하여 \( 16,000 \times g \) 로 10 분간 원심분리하여 핵 분획 및 파괴되지 않은 세포 등을 침전시키고 상층액을 얻어서 단백질 양을 측정한 다음 PLC \( \mathrm{v}_{1} \) 이나 \( \mathrm{PLCY}_{2} \) 항체(포항공대 류성호 박사로부터 제공)를 \( 5 \mu \mathrm{g} \) 정도 첨가하고 1 시간 동안 반응시켰다. 여기에 충분히 세척된 protein A-Sepharose를 \( 30 \mu \mathrm{L}(50 \% \) slurry) 넣고 다시 실온에서 1 시간 반응시킨 후 인산염 완충액으로 Seph-arose bead를 6회 이상 세척한 다음 sodium dodecyl sulfate (SDS) sample buffer를 첨가하여 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 처리하였다.</p> <h2>Western blot법</h2> <p>세포로부터 얻은 세포 추출물에 \(2.5\%\) mercaptoethanol 과 \( 1.2 \% \mathrm{SDS} \) 를 넣고 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 가열하여 처리한 다음 \( 10 \% \) polyacrylamide 겔에 없고 전기영동을 시행하였다. Western blot법은 ERK의 인산화형인 p-ERK에 대한 항체(Santa Cruz, USA), PLCy1에 대한 항체, PLCv2에 대한 항체, phosphotyrosine(PY)에 대한 항체(Santa Cruz, USA)를 이용하여 측정하였다. 전기영동 후 겔의 단백질을 nitro-cellulose membrane으로 전이시키고 nitrocellulose mem-brane을 \( 10 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}, 0.15 \mathrm{M} \mathrm{NaCl} \), 및 \( 0.1 \% \) sodiumaide로 구성된 완충액에 \( 5 \% \) skim milk을 포함하는 용액으로 2 시간 처리하였으며 1 차 항체는 \( 1: 1,000 \) 으로 희석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 2차 항체를 실온에서 1 시간 동안 반응시키고 nitrocellulose membrane(Bio-Rad, USA)을 세척하였다. 다시 Triton X-100이 들어있지 않는 Tris 용액으로 세척하고 ECL chemiluminescence(Amer-sham, USA)로 전개시켰다.</p> <h2>통계 처리</h2> <p>세포 증식의 결과는 평균 \( \pm \) 표준편차 \( (\operatorname{mean} \pm \mathrm{SD}) \) 로 나타내었다. 통계학적 유의성은 자료들의 분포를 확인하고 Student's t-test를 이용하여 검정하였고 \( \mathrm{p} \) 값이 \( 0.05 \) 이하이면 유의성이 있는 것으로 판정하였다.</p>