시료의 추출은 다음과 같은 방법으로 진행되었습니다. 열수 추출물의 경우, 시료에 증류수 10 배 양을 첨가한 후 \( 85^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 동안 환류 냉각 추출을 수행하여 상등액과 침전물을 분리하였습니다. 이 과정을 3번 반복하였습니다. 또한, 에탄올 및 아세톤 추출물의 경우, 시료 중량의 10 배 양에 \( 70 \% \) 에탄올과 아세톤을 첨가한 후 실온에서 24시간 동안 침지시켜 상징액과 침전물을 분리하였습니다. 이 과정도 동일하게 3번 반복하였습니다. 각 추출물은 원심분리 및 여과된 후 농축하고, 이후 동결건조하여 냉장실에 보관하였습니다. 이러한 과정을 통해 실험에 사용할 시료를 준비하였습니다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시료 제조</h2> <p>본 실험에 사용된 율피는 충청남도 공주에서 채집하여 사용하였다. 시료의 추출은 열수 추출물의 경우 시료에 증류수 10 배 양을 가하여 \( 85^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3 시간 환류 냉각 추출하여 상등액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였으며, 에탄올 및 아세톤 추출물의 경우 \( 70 \% \) 에탄올과 아세톤을 시료 중량의 10 배 양을 가하여 실온에서 24 시간 침지하여 상징액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 추출물은 원심분리 및 여과, 농축 후 동결건조하여 냉장실에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다.</p> <h2>Elastase 저해활성 측정</h2> <p>Elastase 저해활성 측정은 Cannell 등의 방법에 따라 측정하였다. 율피 추출물을 일정 농도가 되도록 조제하여 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 씩 시험관에 취하고, \( 50 \mathrm{mM} \) tris- \( \mathrm{HCl} \) buffer ( \( \mathrm{pH} \) 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase \( (2.5 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) \) 용액 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 을 가한 후 \( 50 \mathrm{mM} \) tris- \( \mathrm{HCl} \) buffer \( (\mathrm{pH} \) 8.6)에 녹인 기질 N-succin-yl-(L-Ala)3-p-nitroanilide \( (0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 을 첨가하여 20 분간 반응시켜 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 405 \( \mathrm{nm} \) 에서 측정하였다. Elastase 저해 활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <h2>Collagenase 저해활성 측정</h2> <p>Collagenase 저해활성 측정은 Wünsch 등의 방법에 따라 측정하였다. 즉 반응구는 \( 0.1 \mathrm{M} \) tris- \( \mathrm{HCl} \) buffer \( (\mathrm{pH} \) 7.5)에 \( 4 \mathrm{mM} \mathrm{CaCl} \) 를 첨가하여, 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg \( (0.3 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 를 녹인 기질액 \( 0.25 \mathrm{ml} \) 및 시료용액 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 의 혼합액에 collagenase \( (0.2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) \( 0.15 \mathrm{ml} \) 를 첨가하여 실온에서 20 분간 정치한 후 \( 6 \% \) citric acid \( 0.5 \mathrm{ml} \) 을 넣어 반응을 정지 시킨 후, ethyl acetate \( 1.5 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 \( 320 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. Collagenase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <h2>Tyrosinase 저해활성 측정</h2> <p>Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 \( 0.175 \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 6.8) \( 0.5 \mathrm{ml} \) 에 \( 10 \mathrm{mM} \) L-DOPA를 녹인 기질액 \( 0.2 \mathrm{ml} \) 및 시료용액 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 의 혼합액에 mushroom tyrosinase \( (110 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) 0.2 \) \( \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 \( 475 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. Tyrosinase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>실험 결과는 3회 반복 측정 후 평균 \( \pm \mathrm{SD} \) 로 나타내었다. 통계 분석은 SAS program (SAS Institue, Cary, NC, USA)을 이용하여 분석한 후 Duncan의 다중검정을 실시하였으며, 상관관계를 분석하였다.</p>