본 논문은 점액세균을 배지에서 4일 동안 배양하고 아생균주를 제거해 점액세균 균주를 선발해 실험을 준비하였다. 활성조사는 추출물을 흡수시키고 건조한 \( 6\mathrm{~mm} \) paper disc를 C. acutatum 포자가 도말된 PDA 배지에서 배양해 성장이 억제되는 정도를 측정했으며, 분리 탐색된 야생 점액세균들의 경우 세포, 포자, 자실체, 집락의 형태 및 색, 색소의 생성 여부, 영양 및 16S rRNA 염기서열 비교에 의해 동정한 후 현미경을 사용해 자실체 집락과 세포, 포자를 관찰하였다.
<h2>생육억제활성올 보이는 점액세균 균주 선발</h2> <p>점액세균을 PDCY 배지 상에서 4일간 배양한 후, 아생균주를 멸균된 주걱으로 긁어 제거하였다. 그리고 점액세균이 제거된 배지의 중앙에 C. acutatum 균사체를 갖는 한천조각을 올려놓고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 7일 동안 배양한 후, C.acutatum의 집락의 크기를 관찰함으로써 성장이 억제되는 정도를 측정하였다.</p> <h2>배양추출물의 제조 및 활성조사</h2> <p>Amberlite XAD-16(Sigma, USA) \( 5 \mathrm{~g} \) 이 들어있는 \(250 \mathrm{mL} \) CTS 배지에서 점액세균을 5 일간 배양한 후, resin을 회수하여 흡착된 물질들을 100% methanol \( 25 \mathrm{~mL} \)로 추출하였으며, 추출한 용액은 건조한 후 다시 100% methanol \(100 \mu \mathrm{L} \)에 녹였다. 활성조사는 추출물 \( 12 \mu \mathrm{L} \)를 흡수시킨 \( 6 \mathrm{~mm} \) paper disc를 건조시킨 후 \( 1 \times 10^{6} \)개의 C. acutatum 포자가 도말된 PDA 배지 중앙에 올려놓고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3~5일간 배양하면서 성장이 억제되는 정도를 측정하였다.</p> <h2>점액세균의 분리 동정</h2> <p>분리 탐색된 야생 점액세균들은 이미 알려진 방법 및 기준에 따라 세포, 포자, 자실체, 집락의 형태 및 색, 색소의 생성 여부, 영양 및  16S rRNA 염기서열 비교에 의해 동정 하였다. 16S rRNA 유전자의 대부분 \( (1,530 \mathrm{bp}) \)을 포함한 DNA 조각은 점액세균으로부터 분리한 유전체 DNA를 주형으로 하고, 두개의 oligonucleotides, 5'-GAGTTT-GATCCTGGCTGAG-3'(27f)과 5'-AGAAAGGAGGTG-ATCCAGCC-3'(1525r)률 primer로 사용하여, Taq poly-merase(SolGent Co., Korea)로 증폭한 DNA 중합효소연쇄반 응(PCR)을 통해 얻어졌다. 얻어진 PCR 조각은 PCR purification kit(Bioneer Co., Korea)를 사용하여 분리한 후, PCR에서 사용된 두 primer 및 다음 primer들을 사용하여 염기서열을 결정하였다. 5'-CTGCTGCCTCCCGTA-3'(343r), 5'-TACGGGAGGCAGCAG-3'(357f), 5'-GWATTA-CCGCGGCKGCTG-3'(519r), 5'-CAGCMGCCGCGGTAA-TWC-3'(536f), 5'-ATTAGATACCCTGGTAG-3'(803f), 5'-CCGTCAATTCATTTGAGTTT-3'(907r), 5'-GCAACGAGC-GCAACCC-3'(1114f), 5'-CGGTGTGTRCAAGGCCC-3'(1385r). 그리고, 얻어진 염기서열은 NCBI의 Genbank에 등록하였으며, 각 균주들의 accession number는 EU 262648 (KYC1013), EU271853 (KYC1101), EU262649 (KYC1105), EU262650 (KYC1126), EU262651 (KYC1136), EU262652 (KYC1154), EU262653 (KYC1183), EU262654 (KYC1190), EU262655 (KYC1198), EU262656 (KYC1200) 이다. 염기서열은 Clustal W와 미국 NCB의 BLASTN 프로그램을 이용하여 분석하였다.</p> <h2>세포 및 자실체의 관찰</h2> <p>영양세포 및 집락의 관찰은 야생 점액세균을 PDCY 평판 배지에 접종 한 후, \( 32^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 4일 동안 배양한 후 이루어졌으며, 자실체와 포자의 관찰은 Escherichia coli MC4100이 도말된 WCX 평판배지에 야생점액세균을 접종한 뒤, \( 32^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 5 일간 배양하여 자실체 형성을 유도한 후 이루어졌다. 자실체 및 집락의 관찰은 Nikon SMZ1000 실체현미경(Nikon Co., Japan)을 사용하였으며, 세포와 포자의 관찰은 Nikon Eclipse E 600 위상차현미경 (Nikon Co., Japan)을 사용하였다.</p>