\( 10 \mathrm { ~mM } \) acetate buffer \( \mathrm { pH~ } 5.0 \)로 충분히 평형화시킨 Mono S column 활성 분획물을 취하고 투석하여 염을 제거하여 농축하여 사용하였다. Laemmli와 Weber의 방법에 따라 separating gel과 stacking gel을 만들어 SDS-PAGE에 이용하였고 기질 특이성에 대한 비활성은 9종류의 항생물질을 희석하고 효소액과 반응시킨 후 흡광도를 측정하였다.
<h2>Mono S (FPLC) column chromatography</h2> <p>\( 10 \mathrm { ~mM } \) acetate buffer \( \mathrm { pH~ } 5.0 \)로 충분히 평형화시킨 Mono S column을 동일한 buffer로 충분히 세척하였다. 효소액은 \( 0.5 \mathrm { ~ml } / \mathrm { min } \)의 유속으로 단백질을 흡착시키고 미흡착 단백질은 동일한 buffer \( 50 \mathrm { ~ml } \)로서 세척하였다. 용출은 \( 0.2 \mathrm { M } \) \( \mathrm { NaCl } \)이 함유된 동일한 buffer로 행하여 효소활성을 측정하여 활성 분획물을 취하였다. 활성 분획물은 투석에 의하여 염을 제거시킨 다음 농축하여 사용하였다.</p> <h2>SDS-PAGE에 의 한 분자량</h2> <p>SDS-PAGE는 Laemmli와 Weber의 방법에 따라 \( 12 \% \) \( ( \mathrm { w/v } ) \) polyacrylamide와 \( 0.1 \% \) \( ( \mathrm { w/v } ) \) SDS가 포함된 separating gel과 \( 4 \% \) \( ( \mathrm { w/v } ) \) polyacrylamide와 \( 0.1 \% \) \( ( \mathrm { w/v } ) \) SDS가 함유된 stacking gel을 만들어 사용하였다. \( 100 \mathrm { volt } \)에 약 6시간 동안 전기영동한 후 coomassie blue로 gel을 염색량은 Bio-Rad의 low molecularweight standard (lysozyme: \( 14.4 \mathrm { kDa } \), soybean trypsin inhibitor: \( 21.5 \mathrm { kDa } \), carbonic anhydrase: \( 31 \mathrm { kDa } \), ovalbumin: \( 45 \mathrm { kDa } \), bovun serum albu \( \min : 66.2 \mathrm { kDa } \) )를 사용하여 측정하였다.</p> <h2>\( \beta \)-lactam 항생물질들에 대한 효소의 기질 특이성</h2> <p>Penicillin계 6종류, cephalosporin계 3종류의 항생물질을 기질로 하여 항생물질 희석 buffer로 \( 2 \% \)가 되도록 희석한 각 기질 용액 \( 2 \mathrm { ~ml } \)에 \( 0.5 \mathrm { ~mM } \) 효소액 \( 1 \mathrm { ~ml } \)를 첨가하고 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 항온기에서 40분간 반응시킨 후 iodine 시약 \( 5 \mathrm { ~ml } \)를 가하여 실온에서 10분간 방치하였다(cefazolin은 30분간 방치). 그리고 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 파장에서 흡광도를 측정하여 기질 특이성에 대한 비활성을 백분율로 환산하였다.</p>