CNBr-activated Sepharose 4B 수지를 HCI 용액으로 습윤 및 세척 후, 치환되지 않은 활성 부위를 Tris-HCl 용액으로 차단한다. 이후, 서로 다른 pH의 acetate 완충액과 Tris-HCl 완충액을 이용하여 교대로 세척하고, Pharmacia XK16/20 column에 충진한다. 마지막으로, \(20 \mathrm { ~mM } \) \( \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } 4 \), \(1 \mathrm { ~mM } \) EDTA, \( 1 \mathrm { ~mM } \) DTT를 함유한 완충액으로 평형화시킨다.
<h2>CNBr-activated Sepharose-Anti-H. pylori urease lgG column 의 제조</h2> <p>CNBr-activated Sepharose 4B 수지 (Pharmacia, Sweden) 동결 건조 분말 \( 2 \mathrm { ~g } \)을 Buchner funnel에 가하여 실온에서 \( 1 \mathrm { ~mM } \) HCI용액 \( 400 \mathrm { ~mL } \)로 습윤 및 세척하고 소량의 coupling 완충액 ( \( (0.1 \mathrm { ~M } \) \( \mathrm { NaHCO } _ { 3 } \), \( 0.5 \mathrm { ~M } \) \( \mathrm { NaCl } \), \( \mathrm { pH } ~8.3 \))에 현탁시켰다. 여기에 전보에서 보고한 바대로 protein A-Sepharose column으로 정제한 \( 40 \mathrm { ~mg } \)의 rabbit anti-H. pylori urease IgG를 함유한 \( 10 \mathrm { ~mL } \) coupling 완충액을 가하고 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 16 시간 서서히 교반 하였다. Coupling 되지않은 과잉의 항체를 제거하기 위하여 gel 부피의 5배량 ( \(35 \mathrm { ~mL } \) )의 coupling 완충액으로 세척하고, \( 0.1 \mathrm { ~M } \) Tris-HCI \( ( \mathrm { pH } ~8.0) \) 용액을 가하여 실온에서 2 시간 방치함으로써 치환되지 않은 CNBr-activated Sepharose 수지의 잔여 활성 부위를 차단하였다. 이를 \( 0.5 \mathrm { ~M } \) NaC1을 함유하는 \( 0.1 \mathrm { ~M } \) acetate 완충액 \( ( \mathrm { pH } ~4.0) \) 및 \( 0.5 \mathrm { ~M } \) NaC1을 함유하는 \( 0.1 \mathrm { ~M } \) Tris-HCI 완충액 \( ( \mathrm { pH } ~8.0 \)) 각 \( 50 \mathrm { ~mL } \)로 교대로 세척한 다음 Pharmacia XK16/20 column에 충진하고 5배 column부피의 \( 20 \mathrm { ~mM } \) \( \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } 4 \), \(1 \mathrm { ~mM } \) ethylenediaminetetraacetate(EDTA), \( 1 \mathrm { ~mM } \) dithiothreitol (PED, \( \mathrm { pH } ~7.2 \)) 완충액으로 평형화시켰다.</p>