본 연구에서는 한국에서 자생하는 층층나무 7개 집단에 대한 유연관계와 유전적 다양성을 체계적으로 분석하였다. 이를 위해 각 집단에서 20개의 식물체의 잎을 채집하고, RAPD marker를 이용하여 집단 간의 유전적 차이를 분석하였다. 실험에는 미리 선택된 13개의 RAPD primer가 사용되었으며, DNA 추출에는 Plant DNA Zol Reagent를 사용하였다.
<p>본 연구의 목적은 우리나라에서 자생하고 있는 층층나무 7개 집단에 대해 RAPD marker를 이용하여 집단들 간의 유연관계와 유전적 다양성을 체계적으로 분석해 보고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료와 Genomic DNA 추출</h2> <p>한국에 자생하는 층층나무 7집단을 각 집단 당 20개체로 부터 잎을 채집하였다. 수령 3년 이상의 식물체에서 신선한 잎 (1.2 \( \mathrm { ~g } \))을 사용하여 DNA 추출에 이용하였다. 집단간 분석을 위하여 한 개체 당 하나의 잎에서 각각 DNA를 추출하여 집단간 차이를 비교하는데 사용하였다. 같은 층층나무속의 다른 종인 산수유(Cornus officinalis Sieb. et Zucc)를 대조군으로 사용하였다.</p> <h2>RAPD 분석</h2> <p>각 식물체로부터 DNA를 추출하기 위하여 DNA 추출 시약(Plant DNA Zol Reagent: Life Technologies, Grand Island, New York, USA)를 사용하였는데 지침서에 의거하여 추출하였다. 신선한 생체 잎을 약 1.2 \( \mathrm { ~g } \)를 계량한 다음 액체질소에 넣고 잘 마쇄하였다. DNA Zol을 튜브에 넣고 조직용해를 위해 교반시켰다. 이소아밀 알코올(isoamyl alcohol)과 클로로포름(chloroform)의 흔합 용액을 넣어 섞고 원심분리를 실시하여 DNA를 침전시켰다. 이후 DNA 침전반응, 세척과정, 용해 반응 등을 실시하였다. 건조시킨 후 TE 100 \( \mathrm { ul } \)에 용해하였다. 3일간 냉장보관한 후 DNA정량을 체크하였다. 이 때 DNA양이 많아 농도가 높은 시료는 TE buffer로 희석하였으며, 낮은 시료는 원심분리로 침전시켜 농도를 조정하여 전체 시료의 DNA가 균질하게 조정하였다.</p> <p>RAPD primer는 Operon Technologies (Alameda, Co.)로 부터 구입하였다. 각 개체에서 DNA를 분석하기 위하여, 10개의 서열을 가진 20개씩의 시발체(kit C, OPC01 to 20)와 kit D (OPD01 to 20)를 사용하였다. 그 중 예비 실험을 통해 RAPD band가 잘 나타나는 13개 RAPD primer를 선정하여 본 실험에 적용하였다.</p> <p>DNA증폭 반응들은 25 \( \mu \)1의 reaction buffer를 함유하는 0.6 \( \mathrm { ml } \)tubes에 주입하였다. 즉 10 \( \mathrm { mM } \) Tris-Hcl, \( \mathrm { pH } \)8.8,50 \( \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } _ { 2 } , 100 \mu \mathrm { M } \)각각의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 0.2 \( \mathrm { mM } \) primer, 2.1units Taq DNA polymerase, 25 \( \mathrm { ng } \) ge-nomic DNA이다. 증폭된 반응물질들은 1.5 \( \% \) agarose gel에서 전기영동으로 분리하였다. 이때 절편들의 상대적 크기를 비교하기 위해 100 \( \mathrm { bp } \) ladder DNA marker (Pharmacia)를 같이 loading시켰다. 이 젤을 ethidium bromide로 30분간 염색하여 밴드를 현상하였다. 증류수로 세척 후 Alpha Image TM (Alpha Innotech Co, USA)을 사용하여 밴드 양상을 분석하였다. 두 번의 실험을 통해 일치되고 명확한 결과만 본 분석에 사용하였다.</p>