thermophilus \( \mathrm { HB } 27 \)의 DNA polymerase 유전자 염기서열을 바탕으로 primer를 설계하고, PCR기법을 이용해서 DNA polymerase를 암호화한 것으로 예상되는 유전자를 pGEM-T 벡터에 클로닝한 후 효소 생산을 위하여 다시 pJLA503 벡터에 서브클로닝하였다. 온도 감수성 프로모터(Tandem promoter)를 포함한 pJLA503 벡터시스탬을 사용하여 Tod 유전자를 클로닝하고 plasmid pJLATOD로 이름붙였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>DNA polymerase 유전자의 클로닝</h2> <p>Thermus thermophilus HJ6 균주로부터 DNA polymerase의 유전자를 클로닝 하기 위하여 이미 게놈 염기서열이 밝혀진 T. thermophilus HB8과 T. thermophilus HB27의 DNA polymerase 유전자 염기서얼을 바탕으로 primer를 설계하고, PCR 기법을 이용하여 DNA polymerase른 암호화하는 것으로 예상되는 유전자를 pGEM-T 벡터에 클로닝한 후 효소 생산을 위해 다시 pJLA503 벡터에 서브클로닝 하였다. 클로닝 된 유전자의 open reading frame ORF는 \( 2505 \mathrm { bp } \)의 길이로 834 아미노산을 암호화하고 있었다. 예상 된 분자량은 93,795 Dalton이고, 등전점은 6.3이었다. Fig. 1에서는 클로닝 된 유전자로부터 예상되는 아미노산 서열과 상동성을 가지는 단백질을 대상으로 alignment를 자성하였다. 클로닝 된 유전자는 Thermus thermophilus HB8(NCBI accession No. BAD70877) 유래와 Thermus caldophilus (No. AAB81398)의 DNA polymerase와는 각각 \( 98 \% \) 와 \(97 \%\)의 높은 상동성을 나타냈다. 또한, Thermus aquaticus 유래의 DNA polymerase(No. BAA06775)와는 \(86 \%\), Thermus filiformis 유래의 것(No. AAC46079)과는 \(79 \%\)의 상동성을 나타넸다. 이와 같은 생몰정보학 분석을 통하여 T. ther-mophilus HJ6의 염색체로부터 클로닝 한 유전자는 Pol I family에 속하는 DNA polymerase(Tod, Top Of DNA polymerase)(NCBI accession No. EU708319)를 암호화하는 것으로 예상되었다.</p> <h2>Tod DNA polymerase의 생산</h2> <p>온도 감수성 프로모터(Tandem promoter)를 포함하는 pJLA503 벡터시스탬을 이용하여 Tod 유전자를 클로닝하고 plasmid pJLATOD로 명명하였다. 여기서 효소 생산을 위한 숙주균으로는 E. coli BL21(DE3) codon plus 균주를 사용하였다. Tod 유전자에는 대장균에서 잘 사용되지 않는 rare codon을 다수 가지고 있기 때분에 rare tRNA 합성효소가 보강된 codon plus 균주를 사용하였다. Plasmid pЛATOD로 E. coli BL21(DE3) codon plus를 형질전환하고 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양하여 세포성장이 \( 600 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도가 \( 0.5 \sim 0.6 \) 에 도달하였을 때 온도를 \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 올려 단백질의 생산을 유도하였다. 배양한 세포를 초음파로 파쇄하고 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20분간 열처리한 후, HiTrap \( ^ {\mathrm { TM } } \) Q 컬럼 및 HiPrep \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) Sephacryl S-200 컬럼으로 정제하였다. 정제된 딘백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과, 약 \( 94 \mathrm { kDa } \) 부위에서 DNA polymerase의 밴드가 확인되었다(Fig. 2). 이 밴드의 분자량은 DNA polymerase의 아미노산 서열에서 계산된 분자량과도 잘 일치하였다.</p>