미생물 동정은 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 따라 분류하였으며, 16S rDNA 염기서열을 CLUSTAL_X program으로 multiple sequence alignment한 후 phylogenetic tree를 작성하였다. 단밸질 함량은 정량법에 따라 실시했으며, 표준 단백질로는 bovine serum albumin 이용하여 흡광도를 측정하였다.
<h2>미생물의 동정</h2><p>분리 선발한 미생물의 동정은 Gram 염색법과 현미경 관찰을 통해 형태학적 특성을 관찰하여 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 따라 분류하였다. 생화학적 동정을 위하여 API 50 CHB kit (bioMerieux Co., France)으로 49개의 탄소원에 대한 이용성을 조사하고 이 결과를 API 50 CHB database V3.0 (http://apiweb.biomerieux.com)을 이용하여 잠정적으로 동정하였다. 보다 더 정확한 동정을 위하여 16S ribosomal DNA gene sequencing을 통하여 동정하였다. 선발미생물의 chromosomal DNA는 DNeasy tissue kit(Qiagen, Valecia, CA, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 16S rDNA gene 증폭을 위하여 일반적으로 사용하는 27F (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')와 1492R (5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3') primer를 사용하였다. PCR 반응시 \( 0.4 \mathrm{mM} \) dNTP, \( 0.5 \) units Taq polymerase, \( 4 \mathrm{mM} \mathrm{Mg}^{2+} \)이 함유된 Takara Perfect Premix (Takara, Japan) \( 10 \mu \mathrm{l} \)에 DNA template \( (20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) 1 \mu \mathrm{l} \), forward primer (\(1.0 \mu \mathrm{M}\))와 \( 1 \mu \mathrm{l} \) reverse primer (\(1.0 \mu \mathrm{M}\)) 를 각각 \( 1 \mu \mathrm{l} \)씩 넣고 나머지는 증류수를 첨가하여 총 부피가 \( 20 \mu \mathrm{l} \)가 되도록 제조하였다. PCR 증폭은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분간 denaturation, \( 51^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분간 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분 30초 동안 extension을 30 cycles 실시하였고, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 최종 extension을 실시하는 조건에서 PCR (Minicycler \( { }^{\mathrm{TM}} \), MJ research Inc., Waltham, MA, USA)로 증폭하였다. 증폭된 약 \( 1,400 \mathrm{bp} \) 의 fragment를 T vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 결합시킨 후 형질전환하였다. T vector sequencing primer를 이용하여 염기서열 결정을 수행하였으며 그 결과는 BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) program을 이용하여 GENBANK (NCBI, Bethesda, MD, USA)의 ribosomal DNA gene sequence와 비교하여 동정하였다.</p><p>분리된 미생물의 16S rDNA 염기서열을 CLUSTAL_X program으로 multiple sequence alignment한 후 phylogenetic tree를 작성하였다. 해당 분석은 neighborhood-joining 알고리즘을 바탕으로 수행되었다.</p><h2>단백질 함량 측정</h2><p>단백질 함량은 Ohnishi 등의 정량법에 따라 실시하였다. 시료용액 \( (50 \mu \mathrm{l}) \)에 \( 550 \mu \mathrm{l} \)의 biuret reagent \( (0.75 \mathrm{mM} / \mathrm{L} \) cupric sulfate, \( 94 \mathrm{mM} / \mathrm{L} \) sodium hydroxide)를 넣어 혼합한 후, 실온에 10분 동안 방치하였다. 그 후에 \( 25 \mu \mathrm{l} \)의 folin-ciocalteu's phenol reagent (Sigma, catalog No. 690-2)를 넣고 실온에 30분 동안 방치한 후 \( 725 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 표준단백질로는 bovine serum albumin (Sigma, catalog No. 690-10)을 사용하여 \( 725 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>