아토피피부발진 생쥐에서 분리한 B 세포를 PGA-LM처리하여 anti-CD40 mAb와 rmIL-4를 넣고 6시간 동안 배양하였다. rmIL-10을 양성대조군을 사용하였고, 배양 종료 후 배양 상층액을 제거한 뒤 RNAzolB 500 \(\mu\mathrm{L}\)를 넣고 용해될때까지 분쇄하였다. Real time quantitative PCR은 Applied Biosystems 7500Real-Time PCR system을 이용하였고, Cytokine 유전자 발현은 SYBR Green PCR Master mix사용하였다. 그리고 primer의 최종농도가 200 nM이 되게 반응시키도록 하였다.
<h3>NC/Nga 생쥐에서 유전자 발현 분석</h3> <p>1) B 세포에서 RNA 분리 및 cDNA 합성</p> <p>아토피피부발진 NC/Nga 생쥐에서 분리한 B 세포를 24well plate에 1×106 cell/well로 분주하고 PGA-LM(100 μg/mL)을 처리하였고, 약물처리 1시간 후 anti-CD40 mAb(500 ng/mL)와 rmIL-4(recombinant mouse interleukin-4,500 U/mL, PharMingen)를 넣고 6시간 동시 배양하였다. 그리고 rmIL-10(recombinant mouse interleukin-10, 50 ng/mL, Endogen)을 양성대조군으로 사용하였다. 배양 종료 후배양 상층액을 제거한 후 RNAzolB 500 μL를 넣고 용해될때까지 분쇄하였다. 이 혼합 부유액에 chloroform(CHCl3)50 μL를 첨가한 후 15초간 다시 혼합하였다. 이를 얼음에 15분간 방치한 후 13,000 rpm에서 원심분리한 후 약 200 μL의 상층액을 회수하여 2-propanol 200 μL와 동량 혼합 후천천히 흔들고 얼음에서 15분간 방치하였다. 이를 다시13,000 rpm에서 원심분리한 후 80% EtOH로 수세하고 3분간 vaccum pump에서 건조하여 RNA를 추출하였다. 추출한RNA는 diethyl pyrocarbonate(DEPC)를 처리한 20 μL의 증류수에 녹여 heating block 75 oC에서 불 활성화시킨 후 firststrand cDNA 합성에 사용하였다[22]. 역전사(reverse trans-cription) 반응은 준비된 total RNA 2 μg을 DNase I(10 U/mL) 2 U/tube를 37oC heating block에서 30분 동안 반응한후 75oC에서 10분 동안 변성시켰다. 이에 2.5 μL 10 mMdNTPs mix, 1 μL random sequence hexanucleotides(25pmole/25 μL), RNA inhibitor로서 1 μL RNase inhibitor(20 U/μL), 1 μL 100 mM DTT, 4.5 μL 5×RT buffer(250mM Tris-HCl(pH 8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl 2)를 가한 후, 1 μL의 M-mLV RT(200 U/μL)를 다시 가하고DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20 μL가 되도록 하였다. 이 20 μL의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000 rpm에서5초 동안 원심침강하여 37oC heating block 에서 60분 동안반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 다음, 95 oC에서 5분동안 방치하여 M-mLV RT를 불활성화시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 PCR에 사용하였다.</p> <p>2) Real time quantitative PCR RT-PCR</p> <p>Real time quantitative PCR 은 Applied Biosystems 7500Real-Time PCR system(Applied Biosystems, U.S.A.)를 이용하여 수행하였다. 사용된 primers는 아래와 같다. Cytokine 유전자 발현은 SYBR Green PCR Master mix(ABI)를 사용하였고, internal standard로 G3PDH를 사용하였고, primer의 최종농도가 200 nM이 되게 반응시켰다.Quantitative real-time RT-PCR의 RQ(relative quantita-tive) 값은 Witney 등의 다음과 같은 공식에 의하여 측정하였다.y = x(1+e)n(x; starting quantity, y; yield, n; number of cycles, e;efficiency)IFN-γ+와 foxp3+ T 세포의 Intracellular Staining 분석: 18주령의 NC/Nga 생쥐의 비장에서 순수 분리한 CD4+ T 세포를 미리 α-CD3/α-CD28 Ab(1 μg/mL)가 coating된 24well plate 에 분주하여 자극, 활성화시킨 후 대조군(control,CT)으로 사용하였으며, 분주 후 면역억제제인 cyclosporin A(CsA) 5 μg/mL와 PGA-LM 100 μg/mL 등을 가하고 48시간 동안 동시 배양하여 각각 양성대조군(positive Control,PC)과 실험군으로 사용하였다. 또한 α-CD3/α-CD28 Ab(1μg/mL)로 자극하지 않은 only CD4+ T 세포는 정상군으로사용하였다. 배양 종료 후 BD Cytofix/Cytoperm Plus kit(with BD GolgiPlug, 555028)와 mouse CD4+CD25+foxp3+flow cytometry kit(from BioLegend)를 이용하여 각각 세포내 염색을 통하여 CD4+IFN-γ+ 세포와 CD4+CD25+foxp3+Treg cell의 형광염색을 실시하였다. 반응 후 3회 이상 인산완충용액으로 수세한 후 형광 유세포분석기(Cytometry, BD,U.S.A.)로 분석하였다. 분석프로그램은 CellQuest 프로그램으로 활성세포(%) 비율을 산출하였다.</p> <h3>통계처리</h3> <p>다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean ± standard error로 기록하였고, 유의성 검증은 Student's t-test분석방법을 이용하여 결정하였다.</p>