본 연구에 사용한 효모숙주세포는 invertase 결손 변이주 및 uracil 영양요구성 변이주이며 haploid인데, 효모에서의 유도적 발현을 위한 재조합 plasmid의 구축은 cft유전자를 함유한 pECFTN을 Sacl/XhoI으로처리하고 여기서 얻어진 cft 유전자 단편을 Gel extraction kit로 정제하였다. 균체 농도는 일정시간마다 채취한 배양액을 적당한 비율로 희석하여 분광광도계를 사용하여 측정하였고, 균체 침전물을 Zymolyase 100T와 glass beads를 사용하여 periplasmic space 분획과 전세포분획을 얻어 배양 상등액을 사용하여 각 분획에서의 CFTase활성을 측정하였으며, 본 실험에서 효소반응 생성물은 TLC로 분석 및 CF의 정량에 사용할 목적으로 반응 혼합물로부터 CF 표준물질을 정제하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용균주 및 plasmids</h2><p>본 연구에 사용한 효모숙주세포는 S. cerevisiae SEY2102 (MAT a ura3-52 leu2-3 leu2-112 his4-419 suc2-\(\Delta\)9)로써 invertase 결손 변이주 (suc2-\(\Delta\)9)및 uracil 영양요구성 변이주(ura3-52)이며 haploid이다. Plasmid 구축 및 증폭을 위한 E. coli 숙주세포는 DH5\(\alpha\)를 사용하였다. CFTase 유전자 공여 plasmid는 pET23a에 P. macerans의 CFTase 유전자를 cloning한 pECFTN을 사용하였다. 효모 S. cerevisiae에서 CFTase 발현을 위한 vector로는 E. coli-S. cerevisiae shuttle vector인 pYES2.0 (Invitrogen Co., USA)를 사용하였다. P. polymyxa 유래의 CFTase와의 활성 비교를 위하여 선행 연구에서 제조된 S. cerevisiae SEY2102/pY-GCFT를 이용하였다.</p><h2>재조합 plasmid 제작 및 형질전환</h2><p>효모에서의 유도적 발현을 위한 재조합 plasmid의 구축은 P. macerans의 cft 유전자를 함유한 pECFTN을 Sacl/XhoI으로처리하고 여기서 얻어진 cft 유전자 단편을 Gel extraction kit (Bioprogen Co., Korea)로 정제하였다. 얻어진 cft단편을, GAL1 promoter를 함유한 SacⅠ/XhoⅠ으로 미리 절단된 pYES2.0에 재조합하여 E.coli DH5\(\alpha\)에 형질전환하여 재조합 plasmid pY-GECFTN을 구축하였다. 구축된 재조합 plasmid는 E. coli DH5\(\alpha\)로부터 증폭, 추출하여 \( \mathrm{LiCl} \)법으로 효모 숙주세포 S. cerevisine SEY2102에 형질전환하였다.</p><h2>효모 형질전환체 선별 및 배양조건</h2><p>효모 형질전환체의 선별을 위한 배지로는 SD배지(\(0.67 \% \)Bacto-yeast nitrogen base without amino acids, \( 0.5 \% \) casaminoacids, \(2\%\) dextrose)를 사용하였고, 재조합 CFTase의 생산을 위한 재조합 효모의 배양은 YPDG 배지 (\(1 \% \) yeast extract, \( 2 \% \) polypeptone, \( 1 \% \) dextrose, \( 1 \% \) galactose)를 사용하여 배양하였다. 균체 증식과 유전자 발현에 미치는 초기\( \mathrm{pH} \) 및 배양온도의 영향을 조사하기 위해 YPDG 배지를 \( 100 \mathrm{ml} \) 함유하는 baffled-flask로 실험하였다.</p><p>재조합 효모 균주의 전배양은 SD 배지로 하였으며 flask 및 발효조 배양 시 접종양은 \( 5 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 하였다. Flask 배양은 \( 500 \mathrm{ml} \) baffled-flask (working volume; \( 100 \mathrm{ml} \) )에서 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), \( 170\mathrm{rpm} \)의 배양조건에서 수행하였으며, 재조합 CFTase의 조효소액을 확보하기 위한 발효조(KoBio Tech Co., Korea) 회분배양은 YPDG 배지로 working volume, \( 2 \mathrm{~L} \); 온도, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \); 초기 \( \mathrm{pH} \), 5.5; 교반속도, \(300\sim 500 \mathrm{rpm} \); 통기속도, \( 1 \sim 1.5 \mathrm{vvm} \)의 조건하에서 수행하였다.</p><h2>균체 농도, 잔존환원당 및 Plasmid 안정성</h2><p>균체 농도는 일정시간마다 채취한 배양액을 적당한 비율로 희석하여 분광광도계(Shimadzu UV-160A, Japan)를 사용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도 (\( \mathrm{OD}_{600} \))로 측정하였다. 배양액을 \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 5분 동안 원심분리한 후 배양 상등액을 얻고, dinitrosa-licylic acid 방법을 사용하여 잔존 환원당 농도를 측정하였 다. Plasmid 안정성은 배양액을 적당히 희석하여 YPD 평판배지에 도말한 후 자란 \(100\sim 200\) 개의 colony를 SD 선별배지로 too-thpicking한 다음 형성된 colony 수의 비(백분율)로 측정하였다.</p><h2>균체 분획 및 CFTase 활성 측정</h2><p>균체 침전물을 Zymolyase 100T (Seikagaku Kogyo, Japan)와 glass beads (\(0.4-0.5 \mathrm{~mm}\))를 사용하여 periplasmic space 분획과 전세포분획을 얻었으며, 이들 분획과 배양 상등액을 사용하여 각 분획에서의 CFTase활성을 측정하였다. CFTase의 활성측정은 \( 2 \% \) dahlia tubers inulin (Sigma Co.), \( 2 \% \) chicory root inulin (Sigma Co.), \(2\%\) Jerusalem artichoke inulin (Sigma Co.) 용액(\(50 \mathrm{mM} \) 인산 완충액, \( \mathrm{pH} 8.0\))과 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 0.1 \sim 12 \)시간 반응시킨 후 반응액을 비등수에서 5분간 열처리한 후 반응액을 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) filter로 여과한 후 TLC로 분석하였다. TLC의 spot은 image analyzer (FluorChem 5500, Alpha InnoTech, USA)를 이용하여 분석하였다.</p><h2>재조합 CFTas̄e의 \( \mathrm{pH} \) 안정성 및 열 안정성</h2><p>완충액으로 \( \mathrm{pH}\) \(4.0-5.0 \) 범위에서는 \( 50 \mathrm{mM} \) 초산 완충액, \( \mathrm{pH}\) \(6.0 \sim 8.0 \)에서는 \( 50 \mathrm{mM} \) 인산 완충액, \( \mathrm{pH}\) \(9.0 \sim 10.0 \) 범위는 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) 완충액을 사용하였다. 열 안정성은 \( 30 \sim 65^{\circ} \mathrm{C} \) 범위에서 분석하였다.</p><h2>Thin-layer chromatography에 의한 효소반응생성물의 확인과 CF의 정제</h2><p>본 실험에서 효소반응 생성물은 thin-layer chromatography(TLC)로 분석하였고, CF의 정량에 사용할 목적으로 반응 혼합물로부터 CF 표준물질을 정제하였다.</p>