Collagenase 는 분리 균주의 형태학적, 배양학적, 생화학적 특징 및 GPI Card 분석과 partial 16S rDNA sequencing 결과 등을 비교해 볼 때 Staphylococcus aureus로 동정되었으며 최종적으로 S. aureus JJ-11를 분리 균주로 명명하고 이후의 실험에 사용하였다. 배양 조건에 따른 Collagenase 생산능 검토 실험에서 collagenase 활성의 최적 배양 시간은 18시간으로 결정했으며 이후의 효소 정제 실험에서는 배양 상등액을 대상으로 정제를 실시하였다. Collagenase은 높은 온도에 의해 변성되며 pH의 안정성에서는 염기성보다 산성 쪽에서 더 안정한 특징을 갖는다. 또한 Ninhydrin법으로 활성을 측정한 결과 대부분의 금속에 대해 존재할 때 활성이 증가하며 효소 저해제에 대한 활성을 검토한 결과 metalloproteinase의 특징을 보였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Collagenase 생산 균주의 분리 및 동정</h2> <p>이차 선별된 분리 균주의 형태학적인 특성을 검토한 결과 전형적인 그람양성의 구균이고 포도송이와 같은 배열을 형성하였으나 포자는 형성하지 않았다. 또한, 배양학적 특성을 관찰한 결과 황색이나 레몬색의 불투명한 colony를 형성하였다. 분리균주의 생화학적 특성은 Table 1에서 보는 바와 같이 대부분 Staphylococcus aureus와 흡사한 결과를 보였다. 그람염색법을 통하여 그람양성으로 확인된 분리 균주를 GPI Card로 분석해 본 결과, S. aureus와 \( 99 \% \) 상동성을 가졌으며, S. auretus의 대표적인 특징인 coagulase test 결과 혈장 응고 능력이 있는 것으로 밝혀져 S. aureus와 유사하다는 결론을 내릴 수 있었다. 분리 균주의 세포로부터 genomic DNA를 분리하여 AccuPower PCR PreMix kit (Bioneer Co.,Korea)를 이용해 16S rDNA 부위를 PCR로 증폭시킨 후 자동 염기 서열 결정을 Gene bank database와 비교한 결과 S.aureus ATCC 25923와 \( 100 \% \)의 상동성을 보였다. 이러한 분리 균주의 형태학적, 배양학적, 생화학적 특징 및 GPI Card 분석과 partial 16S rDNA sequencing 결과 등의 제반 분류학적 특징로 비교해 볼 때 Staphylococcus aureus로 동정되었으며 최종적으로 분리 균주를 S. aureus JJ-11 균주로 명명하고 이후의 실험에 사용하였다.</p> <h2>배양 조건에 따른 Collagenase 생산능 검토</h2> <p>효소 생산의 최적 배양 시간을 결정하기 위해 효소 생산용 배지에서 배양 시간에 따른 효소의 활성을 검토하고 생육 특성을 살펴본 결과, Fig. 1에서 보는 바와 같이 collagenase 효소 생산에 있어서는 약 18시간을 전후하여 최고의 생산량을 나타내고 있있다. 따라서 18시간을 collagenase 활성의 최적 배양 시간으로 결정하고 탄소원, 질소원, 염, 금속 이온에 따른 최적 생산 배지 조성을 검토한 결과 \( \mathrm{pH} 7.0\), \(37^{\circ} \mathrm{C} \)로 나타났다. 균의 생육도는 효소 생산용 배지 조건과 유사한 대수 증식기와 사멸기를 보였으나 효소의 활성은 두 배이상 중가하였으며 \( \mathrm{pH} \)는 7.0에서 약 6.5까지 감소하는 것을 볼 수 있었다. 또한, 배양 상등액과 세포 추출액을 가지고 collagenase 활성을 조사해 본 결과 배양 상등액에서 더 높은 collagenase 활성을 보임에 따라 이후의 효소 정제 실험에서는 배양 상등액을 대상으로 정제를 실시하였다.</p> <h2>Collagenase의 정제</h2> <p>조효소액을 Amberlite IRA-900 column chromatography를 실시한 결과, Fig. 2에서 보는 바와 같이 활성 부위가 \( 50 \sim 70 \)까지 비교적 넓게 분리되어 용출되었으며, 활성 부위에 있는 두 개의 peak를 분리하기 위해 \( 50 \sim 70 \)까지의 20개 분획을 다시 ultrafiltration (YM10 membrane, Amicon Co., USA)으로 농축하여 다시 한번 더 Amberlite IRA-900 column (\(1.8 \mathrm{cm} \times 15 \mathrm{~cm} \) )을 사용하여 \( 0.1 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \)의 유속으로 흡착시킨 다음 완충액을 충분히 흘려 안정화시킨 후 높은 활성을 보이기 시작한 \(0.6 \sim 1.2 \mathrm{M}\)까지 \( \mathrm{NaCl} \) 농도구배를 실시하여 \( 250\mu \ell \)로 용출시켰다. 이 때 첫 번째 정제의 경우 효소의 비활성은 약 \(216 \mathrm{units}/ \mathrm{mg} \)이었고 회수율은 \(5\% \)정도였으며, 두번째 정제의 경우 효소의 비활성은 처음 정제의 약 2배인 \(407 \mathrm {units} / \mathrm{mg} \) 정도로 증가하였고, 회수율은 \( 2.8 \% \)이었다.</p> <p>전 단계의 활성부분인 \( 60 \sim 75 \) 부분의 분획을 ultrafiltration (YM10 membrane, Amicon Co., USA)으로 농축시켜 Sephacryl S-300 HR column \( (1.8 \mathrm{~cm} \times 53 \mathrm{~cm}) \) 을 사용하여 \( 250 \mu \ell / \mathrm{min} \)의 유속으로 용출시켰다. 이 때 얻어진 효소의 비활성은 \(598 \mathrm{units} /\mathrm{mg} \)이였고, collagenase 회수율은 \( 1.37 \% \)였다.</p> <h2>Collagenase의 특성 검토</h2> <p>Gel electrophoresis를 행하여 분자량을 측정한 결과, Fig.5에서 보는 바와 같이 분자량은 약 \( 62 \mathrm{kDa} \)이었다. 온도에 대한 효소의 안정성은 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)까지 \( 80 \% \)이상의 활성이 있어 안정하였고, \( 60 ^{\circ} \mathrm{C} \) 이후에는 활성이 급격히 떨어져 효소가 높은 온도에 의해 변성됨을 알 수 있었다. 온도의 영향은 효소가 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)이상일 때는 활성이 조금씩 떨어지다가 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)이후에는 활성이 급격히 떨어지는 것을 알 수 있었다</p> <p>\( \mathrm{pH} \)의 안정성을 알아보기 위하여, 잔류 활성을 측정한 결과 Fig. 8에서 보는 바와 같이 \( \mathrm{pH} 8.0 \)까지 안정하였고, 염기성보다 산성 쪽에서 더 안정한 것으로 확인되었다. 최적 활성 \( \mathrm{pH} \)를 알아보기 위하여 각각의 완충용액에 30분간 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응시킨 후 활성을 측정하였을 때는 Fig. 9에서 보는 것과 같이 \( \mathrm{pH} 7.0 \)에서 가장 높은 활성을 보였고, 효소 활성에도 \( \mathrm{pH} \) 안정성과 마찬가지로 산성 쪽에서 더욱 높은 활성을 보였다.</p> <p>조효소액에 각각의 금속 이온을 \( 2 \mathrm{mM} \)과 \( 5 \mathrm{mM} \) 되게 가하여 Ninhydrin법으로 활성을 측정한 결과, Table 5에 나타난 것처럼 대부분의 금속에 대해 존재할 때 활성이 증가하여 전형적인 metalloproteinase의 성질을 가졌다. 특히 \( \mathrm{Fe}^{2+} \), \( \mathrm{Co}^{2+}\), \(\mathrm{Ba}^{2+} \) 존재하에서는 \( 5 \mathrm{mM} \) 농도에서도 높은 활성을 나타내었다. 특히 \( \mathrm{Sr}^{2+}\) \(\mathrm{Hg}^{2+} \)에서는 \( 30 \% \)정도의 저해를 받는 것으로 확인되었다. 일반적인 효소 저해제에 대한 효소의 활성을 검토한 결과 EDTA와 O-phenanthroline에 의해 \( 65 \% \)이상이 저해되는, 일반적인 collagenase의 특징인 metalloproteinase의 특징을 보였다. 그리고, 일반적으로 collagenase가 분해할 수 있는 다양한 기질에 대해 효소의 활성을 검토한 결과 Table 7에서 보는 바와 같이 본 효소는 기질로써 insoluble collagen (type I)을 가장 잘 이용하였다.</p>