담배 유식물의 엽록소 함량이 카드뮴에 의해 억제되는지 실험하였다. Inskeep and Bloom의 방법을 통해 담배의 잎을 원심분리하여 만든 상등액으로부터 엽록소 a와 b의 함량을 측정하였다. 상등액에 solid \( \left(\mathrm{NH}_{2}\right) \mathrm{SO}_{4} \)을 천천히 부어 포화 농도가 35%가 되었을 때 rubisco가 함유된 상등액과 rubisco activase가 들어있는 침전물을 분리하였다. 상등액에 solid \( \left(\mathrm{NH}_{2}\right) \mathrm{SO}_{4} \)을 천천히 부어 포화 농도가 55%가 되었을 때 원심분리를 통해 buffer A로 현탁한 후, 이 현탁액에서 가장 높은 rubisco의 활성을 가지고 있는 분획을 저장하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>담배 신초 절편으로부터 기내 성장</h2> <p>\( 70 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 에탄올과 \( 3 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) sodium hypochlorite 용액으로 살균시킨 담배(Nicotiana tabacum L.) 종자를 MS 한천 \( (0.8 \%) \) 배지에서 \( 26 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \)의 암상태에서 무균적으로 발아시켰다. 4주간 성장시킨 \( 2 \mathrm{~cm} \) 크기의 신초 절편 5개를 3가지 실험 조건[1) 대조구(카드뮴 비처리구), 2) 카드뮴 처리구 \( \left(0.2 \mathrm{~mM} \mathrm{~CdCl}_{2} \cdot 2.5 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\right)\), 3) 카드뮴\(\left(0.2 \mathrm{~mM} \mathrm{~CdCl}_{2} \cdot 2.5 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\right) \)과 질산염 \( \left(180 \mathrm{mM} \mathrm{KNO}_{3}\right) \) 혼합 처리구]의 MS 배지가 들어있는 페트리접시에 옮겼다. 1)과 2)의 MS 배지에는 \( \mathrm{KNO}_{3} \)가 376 \( \mathrm{mM} \) 함유되어 있다. 16 시간의 광주기 \( \left(800 \mu \mathrm{M} / \mathrm{m}^{2} / \mathrm{s} \mathrm{~PFD}\right) \)와 8 시간의 암주기로 \( 26 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3주 동안 생장시켰다. 완전히 펴진 잎을 본 실험에 사용하였으며, 모든 실험은 각각 2번 반복하였다.</p> <h2>엽록소 함량 측정</h2> <p>Inskeep and Bloom의 방법을 사용하여 엽록소 함량을 측정하였다. 냉동시킨 잎을 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \)의 암 상태에서 DMF 용액에 담가 하루 밤 동안 둔 후, 추출물을 \( 8,000 x g \)에서 5 분간 원심 분리 하였다. 상등액의 흡광도를 \( 664.5 \mathrm{~nm} \)와 \( 647 \mathrm{~nm} \)에서 측정한 다음 아래의 식을 이용하여 엽록소a 와 b의 함량을 계산하였다.</p> <p>Chlorophyll a \( (\mathrm{mg} / \mathrm{g} \mathrm{~fw})=12.70 \mathrm{~A}_{664.5}-2.79 \mathrm{~A}_{647} \)</p> <p>Chlorophyll b \( (\mathrm{mg} / \mathrm{g} \mathrm{~fw})=20.70 \mathrm{~A}_{647}-4.62 \mathrm{~A}_{664.5} \)</p> <h2>Rubisco와 rubisco activase의 분리</h2> <p>기내 배양된 담배의 잎에서 Wang 등의 방법에 따라 rubisco와 rubisco activase를 분리하였다. Liquid nitrogen을 가하여 마쇄한 잎 \( (100 \mathrm{~g}) \)의 powder에 extraction buffer\((50 \mathrm{~mM} \) BTP(pH 7.0), \( 10 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaHCO} _{3},10 \mathrm{~mM} \mathrm{~MgCl}_{2}, 1 \mathrm{~mM} \) EDTA, \( 0.5 \mathrm{~mM} \) ATP, \( 10 \mathrm{~mM} \) DTT, \( 1 \mathrm{~mM} \) PMSF, \( 1 \mathrm{~mM} \) benzamidine, \( 0.01 \mathrm{~mM} \) leupeptin, \(1.5\%\) PVPP and \( 3 \mathrm{~mM} \) \( \mathrm{MBT}) \)를 첨가하여 \( 0^{\circ} \mathrm{C} \) 이상으로 온도가 증가될 때까지 저어준 다음, 4겹의 거즈와 1겹의 miracloth로 여과한 여과액을 \( 30,000 x g \)에서 40분간 원심분리 하였다.</p> <p>상등액에 solid \( \left(\mathrm{NH}_{2}\right)\mathrm{SO}_{4} \)를 천천히 가하여 포화 농도가 \( 35 \% \)가 될 때까지 30분 간 저어준 다음, \( 8,000 x g \)에서10분간 원심분리하여 rubisco가 함유된 상등액과 rubisco activase가 들어있는 침전물을 분리하였다.</p> <p>상등액에 solid \( \left(\mathrm{NH}_{2}\right) \mathrm{SO}_{4} \)를 천천히 가하여 saturation 농도가 \( 55 \% \)가 되게 한 다음, \( 10,000 x g \)에서 10분간 원심분리하여 얻어진 침전물에 buffer A [\(20 \mathrm{~mM}\) BTP(pH 7.0), \(0.2 \mathrm{~mM} \) \( \mathrm{ATP}, 10 \mathrm{~mM} \mathrm{~MgCl}_{2} \) and \( 2 \mathrm{~mM} \mathrm{~MBT} \) (buffer A)]를 가하고, 여기에 최종농도가 \( 18 \% \) 되게 \( 50 \% \) (w/v) PEG- 10,000 을 첨가하여 10분간 저어주었다. \( 8,000 x g\)에서 10분간 원심분리하여 얻은 침전물을 buffer A로 현탁한 다음, 이 현탁액을 \( 20 \mathrm{~mM} \) Tris(pH 7.5), \( 10 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaHCO}_{3}, 10 \mathrm{~mM} \mathrm{~MgCl}_{2} \) 로 평형된 Q-Sepharose colomn상에 loading하여 \( 0.1 \mathrm{~M} \mathrm{~NaCl} \)이 들어있는 동일 buffer로 세척시킨 후, \( 0.1-0.5 \mathrm{~M} \mathrm{~NaCl} \)로 분당 \(1 \mathrm{~mL} \)의 속도로 용출시켰다. 가장 높은 rubisco의 활성을 가지고 있는 \( 3 \mathrm{~mL} \) 분획을 모아 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에 저장하였다.</p> <p>위에서 얻어진 rubisco activase가 들어있는 침전물을 buffer A로 현탁하고, 여기에 최종농도가 \( 18 \% \)되게 \( 50 \% \) (w/v) PEG-10,000을 첨가하여 5분간의 저어준 다음, \( 8,000 xg \)에서 10분간 원심분리하였다. 얻은 침전물을 buffer A로 현탁하고 \( 20,000 x g\)에서 10분간 재 원심분리 하였다. 상등액을 Q- Sephrose column상에 loading하여 \( 20 \mathrm{~mM} \) BTP \( (\mathrm{pH} 7.0) \) 용액으로 세척한 후, \( 0-0.5 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaCl} \)용액으로 분당 \( 1 \mathrm{~mL} \)의 속도로 용출시켰다. 가장 높은 rubisco activase의 활성을 가지고 있는 \( 3 \mathrm{~mL} \) 분획을 모아 \(-80^{\circ} \mathrm{C} \)에 저장하였다. 모든 분리과정은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 수행하였다.</p>