오징어 부산물인 오징어내장을 이용하여 MTT방법 assay로 암예방효과를 검토하기 위해 암세포 성장 억제 효과와 QR 유도 활성 증가 효과를 측정하여 발암 억제 효과를 가진 기능성 식품으로의 개발 가능성을 알아보고자 하였다. 실험 재료로는 오징어내장, NP-40, MTT, menadione, FAD, dicumarol, glucose-6-phosphate dehydrogenase, MEM, DMEM, PBS 등을 사용하였고, 일반성분분석은 상압가열 건조법, 건식 회화법, Soxhlet법, semi micro kjeldahl법 등을 이용하여 측정하였다. 시료 추출 및 분획물 제조를 위해 paste형태로 동결 건조하고 시료와 메탄올을 1:5 (W/V)의 비율로 첨가한 후 상온에서 2회 추출하고, 극성과 비극성으로 선별물질을 추출하여 분획물을 제조하였다. 세포배양은 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 monolayer로 배양하였으며 4~5일마다 계대배양하여 실험에 사용하였다.
<p>본 연구에서는 저이용 되고 있는 오징어 부산물인 오징어내장을 이용하여, 암세포 성장 억제 효과를 MTT방법 assay를 이용하여 알아보았고, 암 예방 물질 탐색에 사용되어지는 qui-none reductase (QR) 유도 활성 증가 효과를 측정하여 암 예방효과를 검토하여 발암 억제 효과를 가진 기능성 식품으로서의 개발 가능성을 알아보고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료</h2> <p>본 실험에 사용된 오징어내장(internal organs of Todarodes pacificus, TP)은 2006년 동우산업(주)에서 paste 형태로 제공받아 시료로 사용하였다.</p> <p>세포실험에 사용된 시약 중 NP-40과 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)와 menadione은 Sigma사 제품을 구입하였고 flavin adenine dinucleotide(FAD), dicumarol 및 glucose-6-phosphate dehydrogenase는 Amresco사 제품을 구입하였으며, minimum essential medium (MEM), Dulbeco's Eagle modified medium (DMEM)과 phosphate buffered saline (PBS) 등은 Gibco-BRL (USA)에서 구입하였다. 그 외 연구에 사용된 용매 및 시약은 특급을 사용하였다.</p> <h2>일반성분의 분석</h2> <p>오징어내장의 일반성분은 식품공전(2005)의 일반성분시험법에 의하여 측정하였다. 수분은 상압가열 건조법, 회분은 건 식 회화법, 조지방은 Soxhlet법(Extraction system B-811, BuCHK, Switzland), 조단백질은 semi micro kjeldahl법(Auto Kjeldahl Unit K-370, BuCHK)으로 측정하였다.</p> <h2>시료의 추출 및 분획물 제조</h2> <p>시료로 사용된 오징어내장은 paste형태로 동결 건조 후 시료와 메탄올을 1:5 (W/V)의 비율로 첨가한 후 상온에서 2회 추출하고, 극성과 비극성으로 선별물질을 추출하기 위하여 우선 메탄올과 다이클로로메탄 \( \left ( \mathrm { CH } _ { 2 } \mathrm { Cl } \right ) \) 을 \(1:1 \)로 섞은 용액에 2회 추출한 후 회전식 진공농축기로 일정시간 감압 농축시켜 동결 건조한 후 오징어내장 methanol추출물(TPM)을 얻었다. 이 추출물을 hexane층(TPMH), methanol층(TPMM), butanol층 (TPMB) 및 aqueous층(TPMA)으로 나누어 비극성에서 극성으로 계통 분획하고 각 분획층을 감압 농축 후 동결 건조하여 분말로 만들어 시료로 사용하였다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>본 실험에 사용한 암세포주는 인체 간암 세포인 HepG2 (Human hepatocellular carcinoma), 유방암 세포인 MCF-7 (Human breast adenocarcinoma pleural effusion) 및 대장암 세포인 HT-29 (Human colon adenocarcinoma)로서 2005년 6월 한국세포주은행으로부터 분양받아 사용하였다.</p> <p>HepG2, MCF-7 세포주는 DMEM medium을 사용하였고 HT-29 세포주는 RPMI1640을 사용하였으며 medium에 \( 10 \% \)의 fetal bovine serum (FBS)와 \(1 \% \) \(100 \mathrm { units/ml } \)의 penicillin streptomycin이 함유된 것으로 T-75 flask에 이식한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 monolayer로 배양하였다. 위의 3종의 세포주는 일주일에 2~3회 정도 새로운 배지로 교환하고 flask에 암세포주가 \( 5 \times 10 ^ { 4 } \) cells/ \( \mathrm { ml } \) 정도 증식되면 phosphate buffered saline (PBS, pH 7.0)으로 2번 세척한 후 trypsin-EDTA를 처리하여 바닥에서 세포를 분리한 후, 배양액으로 암세포가 골고루 분산되도록 희석하여 T-75 flask에 \( 10 \mathrm { ml } \) 씩 분할하여 주입하고 \( 4 \sim 5 \) 일마다 계대배양하면서 실험에 사용하였다. 계대 배양시 각각의 passage number가 10회 이상일 때는 액체질소탱크로부터 새로운 세포를 꺼내어 다시 배양하여 실험하였다.</p>