본 연구에서는 체외단백질분해효소 생성 균 분리에 사용되는 액체배지와 고체평판배지를 제조하였으며, 이를 위해 MBS와 MBSA 배지를 각각 활용하였다. 특히, 2005년 7월부터 2006년 3월까지 동해 심층수를 활용하였는데, 해당 심층수는 강원도 고성군에 위치한 한국해양심층연구센터에서 제공받았다. 효소의 활성에 대한 pH의 영향을 분석하기 위해 다양한 완충용액을 사용하였으며, 이를 30℃에서 반응시켰다. 또한, 무균적으로 채취한 심층수를 MSBA에 도말한 후 17℃에서 5일 이상 배양하여 독립 콜로니를 얻었고, 순수 분리를 위해 고체평판배지에서 단일균주로 판명될 때까지 획선법을 적용하였다. 효소 활성의 단위는 30℃에서 1시간 후의 흡광도 440nm의 0.01 증가를 1unit/ml로 정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>배지 및 시약</h2> <p>체외단백질분해효소를 생성하는 균을 분리하는데 사용한 액체배지는 \( 0.5 \mathrm{~X} \) marine broth (Difco, USA) 에 \( 0.01 \% \) skim milk (Difco, USA)를 첨가하여 만든 MBS배지를 사용 하였으며, 고체평판배지의 경우는 \( 1 \% \)의 skim milk와 \( 1.5 \% \) Bacto \( \operatorname{agar} \) (Difco, USA)를 첨가하여 만든 MBSA를 사용하였다. 체외단백질 분해효소의 활성측정을 위한 기질은 azocasein (Sigma, USA)을 사용하였다.</p> <h2>체외단백질분해효소를 생산하는 균 분리 및 생육 특성조사</h2> <p>본 실험에 사용된 동해의 심층수는 2005 년 7 월에서 2006 년 3 월 까지 강원도 고성군에 소재한 한국 해양심층연구센터로부터 수심 \( 200 \mathrm{~m} \)에서 \( 500 \mathrm{~m} \) 사이의 동해 심층수를 제공받아 사용하였다. 무균적으로 채취된 심층수 \( 0.1 \mathrm{~ml} \)을 MSBA에 도말 한 후 \( 17^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5 일 이상 배양하여 콜로니 주변에 투명환을 형성하는 독립 콜로니를 얻었다. 이 콜로니를 순수 분리하기 위하여 고체평판배지에서 단일균주로 판명될 때까지 3 회 이상 획선법을 사용하였다.</p> <p>선별된 균주의 온도별 생육곡선은 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48 시간 동안 종배양한 균을 \( 200 \mathrm{~ml} \)의 MBS 배지에 \(1\%\)가 되도록 접종하였다. 균체 성장은 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 3 시간 간격, \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 2 시간 간격, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)와 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 1 시간 간격으로 각각의 온도 조건에서 배양된 액을 spectrophotometer (Biochrom, England)를 이용하여 흡광도 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. 세대시간은 대수기인 흡광도 \( 600 \mathrm{~nm} \) 값이 0.1 이상에서 1.0 이하를 나타내는 구간의 값을 최소 5 개 이상 선택하여 보정한 일차함수의 기울기를 구한 다음, 0.301/ 기울기로 표시하였다.</p> <h2>체외단백질분해효소 활성측정</h2> <p>체외단백질분해효소 활성은 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 시간 동안 종배양한 균을 \( 200 \mathrm{~ml} \)의 MBS에 최종농도가 \( 1 \% \)가 되도록 접종하여 \( 10^{\circ} \mathrm{C}, 20^{\circ} \mathrm{C}, 30^{\circ} \mathrm{C} \), 그리고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다. 효소활성 측정은 배양 상등액을 사용하여 Windle과 Kelleher의 방법에 따라 다음과 같이 실행하였다. 배양 개시부터 6 시간 간격으로 배양액을 취하여 균의 성장을 흡광도 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하고 균체 배양액을 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(15,000 \times \mathrm{g} \)에서 5 분간 원심 분리하여 균을 제거한 상등액을 조효소액으로 사용하였다. 조효소액 \( 100\ \mu \mathrm{l} \)에 \( 50 \mathrm{~mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\) \((\mathrm{pH} ~8.0) \)에 녹인 동량의 \( 0.5 \%\) (w/v) azocasein을 가하여 vortex mixer 혼합하고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응을 정지시키기 위해 \( 10 \% \) (w/v) trichloroacetic acid \( 400\ \mu \mathrm{l} \)을 효소 반응액에 가하여 최종 농도는 \( 6.7 \% \)를 맞추었다. 2 분간 정치한 다음 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(19,000 \times \mathrm{g} \)에서 5 분간 원심 분리하여 상등액에 \( 525 \mathrm{~mM}\ \mathrm{~NaOH} \ 700\ \mu \mathrm{l} \)을 가하여 혼합한 후 흡광도 \( 440 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광을 측정하였다. 효소 활성의 단위는 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 시간 지난 후 흡광도 \( 440 \mathrm{~nm} \)의 0.01 증가를 \( 1 \mathrm{~unit} / \mathrm{ml} \)으로 정하였다. 효소의 활성은 3 회 측정의 평균값과 표준편차로 표시하였다.</p> <p>효소의 최적온도와 \( \mathrm{pH} \)를 알아보기 위해 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 시간 배양한 균의 조효소액을 사용하여 \( 0^{\circ} \mathrm{C} \)부터 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \)간격으로 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)까지 반응온도를 달리하여 측정하였다. 이때 대조군으로는 심층수에서 분리한 균 중에서 체외단백질분해효소 활성을 가지지 않는 균주 HJ 56의 조효소액과 함께 측정하였다. 효소의 활성에 대한 \( \mathrm{pH} \)의 영향을 보기위하여 \( \mathrm{pH} ~5 \)에서 6까지는 0.1 M citrate 완충용액을 사용하였고, \( \mathrm{pH} ~6\)에서 8까지는 0.1 M phosphate 완충용액, \( \mathrm{pH} ~8\)에서 9까지는 0.2 M Tris-HCl 완충용액을 사용하였으며 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응시켰다.</p>