실험에 사용한 적혈구는 모두 건강한 성인 남녀로부터 추출하였으며, 현탁액은 \( 700 \mathrm{~nm} \) 에서 O.D가 0.6 이었으며, 적혈구 수는 \( 1.5 \times 10^{7} \) \( \mathrm{cells/ml} \) 이었다. 실험 결과, Rose-bengal을 첨가하고 광조사를 하지 않은 경우, rose-bengal을 첨가하지 않고 광조사만 한 경우 모두 암반응 \( 120 \mathrm{~min} \) 까지는 용혈이 거의 발생하지 않았고, 상대적인 광용혈 보호효과는 식 Relative protective effects \( =\frac{\text { Sample } \tau_{50}}{\text { Control } \tau_{50}} \) 와 같이 나타내었다.
<h3>Photohemolysis법을 이용한 세포보호 효과 측정 적혈구 현탁액 제조:</h3> <p>적혈구는 건강한 성인 남녀로부터 얻었다. 채혈 즉시 헤파린이 첨가된 시험관에 담은 후, \( 3,000 \mathrm{rpm} \) 으로 \( 5 \mathrm{~min} \) 동안 원심분리 하여 적혈구와 혈장을 분리하였다. 분리한 적혈구는 \( 0.9 \% \) saline phosphate buffer \( \left(\mathrm{pH} ~7.4, \mathrm{~Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot 12 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ~9.6 \mathrm{~mM}, \mathrm{~NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ~1.6\right. \)\( \mathrm{~mM}) \) 로 세척하여 원심분리 하고 흰색의 백혈구 층은 제거하였다. 3회 반복하여 세척, 분리한 적혈구는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 의 냉장고에 보관하면서 사용하였고, 모든 실험은 채혈 후 \( 12 \mathrm{~h} \) 이내에 행하였다. 광용혈 실험은 이미 확립된 방법에 따라 수행하였다. 실험에 사용된 적혈구 현탁액은 \( 700 \mathrm{~nm} \) 에서 O.D.가 0.6이었으며 이 때 적혈구 수는 \( 1.5 \times 10^{7} \) \( \mathrm{cells/ml} \) 이었다.</p> <h3>목형 잎 추출물의 광용혈 억제 효과:</h3> <p>적혈구 현탁액 \( 3.5 \mathrm{ml} \) 를 파이렉스 시험관(No. 9820)에 넣은 후, 추출물을 농도 별로 각각 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 씩 첨가하여 암소에서 \( 30 \mathrm{~min} \) 동안 pre-incubation 시켰다. 광증감제 rose-bengal \( (13 ~\mu \mathrm{M}) ~0.5 \mathrm{~ml} \) 을 가하고 파라필름 (Whatman laboratory sealing film, UK)으로 입구를 막은 후 \( 15 \mathrm{~min} \) 동안 광조사 하였다.</p> <p>광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 \( 50 \mathrm{~cm} \times \) \( 20 \mathrm{~cm} \times 25 \mathrm{~cm} \) 크기의 상자 안에 \( 20 \mathrm{~W} \) 형광등을 설치하고, 형광등으로부터 \( 5 \mathrm{~cm} \) 거리에 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열되게 하였다. 광조사 후 암반응 (post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 파괴정도를 \( 15 \mathrm{~min} \) 간격으로 \( 700 \mathrm{~nm} \) 에서 투광도 (transmittance, %)로부터 구하였다. 이 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도의 증가는 적혈구의 용혈정도에 비례한다. 모든 실험은 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 항온실에서 행하였다. 목형 추출물의 광용혈에 미치는 효과는 post-incubation 시간과 용혈정도를 구성된 그래프로부터 적혈구의 \( 50 \% \) 가 용혈되는 시간인 \( \tau_{50} \) 을 구하여 비교하였다.</p> <p>대조군 (control)은 \( \tau_{50} \) 이 \( 30 \mathrm{~min} \) 으로 오차범위 \( \pm 1 \mathrm{~min} \) 이내로 모든 경우의 실험에서 재현성이 양호하게 나타났다. Rose-bengal을 첨가하고 광조사를 하지 않은 경우와 rosebengal을 첨가하지 않고 광조사만 했을 경우는 모두 암반응 \( 120 \mathrm{~min} \) 까지는 용혈이 거의 일어나지 않았다. 상대적인 광용혈 보호효과는 아래와 같이 나타내었다.</p> <p>Relative protective effects \( =\frac{\text { Sample } \tau_{50}}{\text { Control } \tau_{50}} \)</p>