금앵자(Rosae laevigatae fructus) \(100g\)을 분말화한 뒤, \( 30 \%~\mathrm{EtOH}~1\mathrm{~L} \) 에 넣고 \(75^{\circ} \mathrm{C}\)에서 3시간 동안 3회 추출하였다. 3T3-L1 지방전구세포를 DMEM에 \(10\%\) bovine calf serum와 antibiotics을 첨가하여 \(37^{\circ} \mathrm{C} ~ 5\% ~ \mathrm{CO}_{2} \)의 조건에서 배양하였다. 이후, 35-mm dish에 \(5 \times 10^{4} \) cells/dish의 농도로 세포를 배양하고, 10% fetal bovine serum와 penicillin/streptomycin solution을 DMEM 배지에 첨가하여 세포를 분화시켰다. 금앵자 추출물을 첨가하여 지방세포 분화에 미치는 영향을 확인하였다. 끝으로, 염색 후 \( 100 \% \) isopropanol에 용출하여 흡광도를 spectrophotometer를 이용하여 \(500 \mathrm{~nm}\)에서 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>금앵자 추출</h2> <p>금앵자(Rosae laevigatae fructus) \( 100 \mathrm{~g} \)을 분말화 한 다음, \( 30 \% \mathrm{EtOH} 1 \mathrm{~L} \)를 넣고 \( 75^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 동안 3회 반복하여 추출하였다. 추출액은 ADVANTEC filter paper 2(ADVANTEC, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan)로 여과하여 불순물을 제거하고 감압 농축하여 추출물 \( 29.75 \mathrm{~g} \)을 얻었다. 이후 금앵자 \( 30 \% \) EtOH 추출물을 RLE(Rosae laevigatae fructus \( 30 \% \mathrm{EtOH} \) extracts)로 표기하고자 한다.</p> <h2>3T3-L1 지방전구세포의 배양</h2> <p>3T3-L1(mouse embryonic fibroblast cell line) 지방전구세포는 ATCC(American type culture collection)에서 구입하여 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, WelGene Biopharmaceuticals, Daegu, Korea)에 \( 10 \% \) bovine calf serum(BCS, WelGene Biopharmaceuticals, Daegu, Korea), antibiotics(penicillin/streptomycin 100 units/ml, Bioshop, Burlington, Ontario, Canada)를 첨가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 세포 배양기에서 배양하였다.</p> <h2>지방세포로의 분화</h2> <p>지방전구세포인 3T3-L1을 지방세포로 분화시키기 위하여 35-mm dish(SPL Life Sciences, Seoul, Korea)에 \( 5 \times 10^{4} \)cells/dish의 농도로 세포를 seeding한 후, \( 10 \% \) fetal bovine serum(FBS), penicillin/streptomycin solution(100 units/ \( \mathrm{ml} \))이 첨가된 DMEM 배지로 confluence 상태가 될 때까지 배양하였다(Fig. 1, Day 0). 그 후, 지방세포 분화 유도제인 MDI \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) insulin(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), \( 0.25 \mu \mathrm{M} \) dexamethasone(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), \( 0.5 \mathrm{mM} \) 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)]를 첨가한 DMEM 배지를 세포에 처리하여 2일간 배양하였다(Day 2). 이후, 지방세포로의 분화를 촉진하기 위해 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) insulin이 포함된 DMEM으로 배지를 교환하여 4일간 배양하였고(Day 6), 완전 분화를 위해 DMEM에 \( 10 \% \) FBS, antibiotics를 첨가하여 2일간 더 배양하였다(Day 8). RLE가 지방세포 분화에 미치는 영향은 MDI나 insulin 처리시, RLE를 함께 처리하여 확인하였다.</p> <h2>Oil Red O 염색</h2> <p>RLE가 지방세포 분화에 미치는 영향을 확인하기 위해 MDI와 insulin 처리 및 완전분화를 위한 배지에 RLE를 함께 처리하였다. \( 0.5 \% \mathrm{DMSO} \)를 처리한 대조군이 \( 100 \% \) 분화가 되었을 때, 배지를 제거하고 차가운 phosphate buffered saline(PBS, Gibco, Grand Island, NY, USA)으로 cell을 washing 한 후, \( 10 \% \) formalin(Junsei Chemical, Tokyo, Japan)을 처리하여 실온에서 1시간 고정시켰다. Formalin을 완전히 제거한 다음 \( 60 \% \) isopropanol(Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA)로 헹군 뒤 Oil Red O working solution 을 넣고 실온에서 10 분간 염색을 하였다. 이 때 Oil Red O working solution은 \( 0.35 \mathrm{~g} \) Oil Red O powder(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)를 \( 100 \mathrm{ml} \) isopropanol에 녹인 뒤 증류수에 \( 6: 4 \)의 비율로 희석한 다음 여과하여 사용하였다. 염색 후 Oil Red O working solution을 완전히 제거하고 증류수로 4 번 washing한 뒤 현미경으로 세포의 염색 상태를 확인하였으며, 흡광도 측정을 위하여 \( 100 \% \) isopropanol에 용출시켜 spectrophotometer를 이용하여 \( 500 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>