맥문동은 밀양지역에서 재배된 괴근으로 전통적인 방법으로 맥문동 괴근을 찌고 햇볕에 말리기를 9회 반복 후 제조한 구증구포 재료를 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 관리해 시료로 사용했고 실험에 사용된 OLETF랫드는 유전적으로 늦게 나타나는 경증의 비만과 제2형 당뇨의 변화를 나타내 비만, 당뇨의 약물치료 실험에 많이 사용되는 모델이다. Specified pathogen-free상태의 OLETF랫드를 오츠카제에서 공급받아 방사선이 조사된 사료를 자유롭게 먹이를 급여했고, 12시간의 조명주기로 SPF상태인 부산대학교 청정실험동물센터, 상대습도에서 사육했다. 랫드의 혈당량은 경구투여 전,부검 전에 실험동물의 꼬리정맥을 잘라서 혈당측정기로 관측했다. 반응종결에서 상태의 변화는 ELISA-reader로 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 측정했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>맥문동의 표제 및 추출</h2> <p>맥문동은 2009년 5월에 밀양지역에서 재배된 괴근으로 밀양 한약재 판매상으로부터 구입하여 전통적인 방법으로 맥문동 괴근을 찐 다음 햇볕에 말리기를 9회 반복하여 제조한 구증구포 재료(LP9)를 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하면서 시료로 사용하였다. 구증구포한 괴경 \( 1 \mathrm{~kg} \)을 \( 80 \%\) MeOH로 3회 반복 추출한 \( 80 \% \) MeOH 추출물을 회전증발기로 MeOH를 증발한 다음 남은 물층에 \( 1,200 \mathrm{~ml} \)의 hexane을 가한 다음 분획여두로서 hexane 추출물을 3회 분획하여 hexane 추출물 \( 0.410 \mathrm{~g} \)의 LP9M80-H을 얻었다.</p> <h2>동물실험 설계</h2> <p>실험에 사용된 OLETF 랫드는 유전적으로 늦게 발현되는 경증의 비만과 제2형 당뇨의 변화를 나타내어 비만, 당뇨의 약물치료 실험에 많이 이용되는 모델이다. Specified pathogen-free (SPF) 상태의 OLETF 랫드(20주령, \( 300 \pm 30 \mathrm{~g}) \)를 오츠카제약(주)(Japan)에서 제공받았으며, 방사선이 조사된 사료(Purina, Seoungnam, Korea)를 자유급식하도록 하였고, 12시간의 조명주기(08:00 12:00)로 SPF 상태인 부산대학교 청정실험동물센터(온도 \( 22 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \), 상대습도 \( 50 \pm 5 \% \) )에서 사육하였다. 또한 본 연구는 부산대학교 동물실험윤리위원회(PNUIACUC)로부터 과학성과 윤리성에 대한 심사를 거쳐 승인(승인번호: PNU-2010-00098)을 받아 수행되었다.</p> <p>실험동물을 5마리씩 3군(LETO군, OLETF-Vehicle군, OLETF-LP9M80-H 처리군)으로 무작위로 배정하였다. LETO군은 LETO 랫드에 아무것도 처리하지 않았고, Vehicle처리군은 OLEIF 렛드에 olive oil 만을 격일로 2주 동안 \( 2 \mathrm{~ml} \)/회씩 경구 투여하였고, LP9M80-H 처리군은 OLETF 렛드에 LP9M80-H를 \( 40 \mathrm{~mg} / \mathrm{kg} \)의 농도로 olive oil에 희석하여 격일로 2주동안 \( 2 \mathrm{~ml} \)/회씩 경구 투여하였다. 2주 경과 후 모든 랫드는 \( \mathrm{CO}_{2} \) 가스를 이용해서 안락사하여 혈액과 조직들을 적출하였다.</p> <h2>체중 및 지방무게 측정</h2> <p>랫드의 체중은 경구투여 전과 부검 전에 화학저울(Mettler toledo, Greifensee, Switzerland)을 이용하여 측정하였다. 지방의 무게는 2주 동안 물질을 처리한 후 \( \mathrm{CO}_{2} \) 가스를 이용해서 안락사하여 복부지방을 적출하여 측정하였다.</p> <h2>혈당량 측정</h2> <p>랫드의 혈당량은 경구투여 전과 부검 전에 실험동물의 꼬리정맥을 절단하여 혈당측정기(CareSens II, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다.</p> <h2>인슐린 분비량 측정</h2> <p>LP9M80-H에 의한 인슐린 분비량은 Mercodia사의 Insulin ELISA kit (Cat.10-1113-01)를 이용하여 권장법에 따라 측정하였다. 먼저 렛드의 혈액을 상온에서 30분간 방치한 후 원심분리하여 혈청을 분리한다. 분리된 혈청은 ELISA kit의 각 well에 \(25\ \mu\mathrm{l}\)씩 넣고, \(100\ \mu\mathrm{l}\)의 enzyme conjugate solution을 첨가하여 plate shaker에 1시간 동안 방치하여 항원-항체반응을 유도하였다. 1시간 후 상층액을 제거하고, wash buffer (\(350\ \mu\mathrm{l}\))를 이용하여 비특이적으로 결합된 단백질이나 결합되지 않은 단백질을 세척하였다. 여기에 \(200\ \mu\mathrm{l}\)의 substrate (TMB)을 첨가하여 실온에서 15분 동안 효소반응을 유도한 뒤 \(50\ \mu\mathrm{l}\)의 stop solution을 첨가하여 반응을 종결하였다. 반응종결에 따라 나타난 변화는 ELISA-reader (VERSA max, micro-reader, MDS. Co, USA)를 이용하여 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다.</p>