B. pumilus TX703 균주를 이용하여 조효소액을 생산하였고, 생산한 조효소액을 가공하여 정제효소로 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>균주와 효소생산</h2><p>본 연구에 사용된 내열성 xylanase를 생산하는 균주로는 본 연구진에 의해 토양으로 분리된 B. pumilus TX703을 사용하였다. B. pumilus TX703은 LB 한천 고체배지에서 계대 배양하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였고 필요할 경우 사용하였으며, 효소생산을 위해 LB 한천 고체배지에서 생육한 colony를 \( 5 \mathrm{~ml} \)의 기본배지 \( \left(1 \%\right. \) birchwood xylan, \( 1 \% \) soytone, \( 0.1 \% \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \), \( 0.02 \% \mathrm{~MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(\mathrm{pH} 6.8 )\)에 접종한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 250 \mathrm{~rpm} \)으로 16시간 배양하였다. 이 배양액을 \( 500 \mathrm{~ml} \)의 기본배지에 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)가 되도록 접종한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 250 \mathrm{~rpm} \)으로 24시간 배양한 후 \( 5,000 \mathrm{xg} \)에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액은 효소정제를 위한 조효소액으로 사용하였다.</p><h2>효소정제</h2><p>모든 정제과정은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 수행하였다. 조효소액에 냉각 에탄올을 \( 80 \% \) 포화도가 되도록 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤 방치한 후 원심분리하여 얻어진 단백질 침전물을 \( 50 \mathrm{~mM} \) citratephosphate \( (\mathrm{pH} ~6.0)\) 완충용액으로 용해하였다. 이를 CM-cellulose column \( (4 \times 25 \mathrm{~cm}) \)에 \( 50 \mathrm{ml} / \mathrm{hr} \)의 속도로 통과시킨 후 \( 0.2 \sim 0.4 \mathrm{~M} \mathrm{~NaCl} \) 용액으로 농도구배를 걸어 흡착된 단백질을 용출시켰다. 용출되는 단백질 용액은 \( 9 \mathrm{~ml} \) 씩 분획하여 xylanase 효소활성이 있는 분획을 모아 한외여과에 의해 농축시킨 다음 \( 50 \mathrm{~mM} \) citrate-phosphate \( (\mathrm{pH} ~6.0) \) 완충용액으로 평형화되어 있는 Sephadex G-50 column \( (1.8 \times 90 \mathrm{~cm}) \)에 \( 15 \mathrm{~ml} / \mathrm{hr} \)의 속도로 통과시켜 \( 3 \mathrm{~ml} \)씩 분획하였다. 활성분획을 모아 농축시킨 다음 \( 10 \mathrm{~mM} \) sodium phosphate 완충용액\(( \mathrm{pH} ~6.8 )\)로 평형화된 hydroxylapatite column \( (1.5 \times 8 \mathrm{~cm}) \)에 통과시키고 \( 0.01 \sim 0.4 \mathrm{~M} \) sodium phosphate 완충용액\(( \mathrm{pH} ~6.8 )\)으로 농도구배를 걸어 용출되는 활성분획을 모아 농축시킨 후 \( 50 \mathrm{~mM} \) citrate-phosphate \(( \mathrm{pH} ~6.0 )\) 완충용액을 이용하여 투석하여 정제효소로 사용하였다. 효소의 정제도는 Laemmli의 방법을 이용하여 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis를 수행한 후 Coomassie brilliant blue R-250로 염색하여 확인하였다.</p>