본 연구에서는 GGPP synthase를 암호화 하는 crtE 의 클로닝 및 KgCrtE 단백질의 1, 2차 구조 분석으로 효소의 구조특성을 분석하고 효소활성의 검증을 위해 BL21 (DE3)에서 GGPP과 라이코펜 의 생합성을 이끌어내 CrtE의 활성을 HPLC 분석법으로 표준물질과 비교 및 분석하였다.
<h2>대장균에서 GGPP synthase (KgCrtE)의 발현과 확인</h2><p>대장균에서 KgGGPP synthase의 발현 유무를 확인 위하여 pColdI vector 의 NdeI/HindIII site에 KgcrtE 유전자를 클로닝 하였으며, 이를 위해 N-말단과 C-말단에 NdeI/ HindⅢ site를 가지는 primer를 제작하여 KgcrtE 유전자를 PCR로 증폭한 후 제한효소를 처리하여 pColdI vector에 sub-cloning하여 재조합 DNA 구축하고, 이를 pCCrtE로 명명하였다. 그리고, 대장균에서 라이코펜의 생합성을 유도하기 위하여 대장균 동시 발현벡터인 pRSFDuet-1 vector의 mul-tiple cloning site (MCS) 1과 MCS2에 각각 P. haeundaensis의 CrtB (Phytoene synthase), CrtI (phytoene desaturase) 유전자를 클로닝 하였다. MCS1에 CrtB 유전자를 삽입하기 위해서 N-말단과 C-말단에 각각 EcoR I과 Not I 제한효소 자리를 MCS2에는 CrtI 유전자를 삽입하기 위해서 N-말단과 C-말단에 각각 NddI과 XhdI 제한효소 자리를 이용하여 재조합 DNA, pRSCrtBI 를 구축하였다.</p><p>대장균에서 KgcrtE 유전자의 발현을 위해 pCCrtE 재조합 DNA를 대장균 BL21 (DE3)에 형질전환 하였으며, 선별된 균주를 암피실린(ampicillin) \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)가 함유된 LB 배지에 \(O.D._{600}=0.5 \) 일 때까지 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 교반 배양한 후, IPTG 최종 농도 \( 0.1 \mathrm{mM} \)을 첨가한 후 \( 16^{\circ} \mathrm{C} \)에서 교반배양 하여 과발현을 유도하였고, \( 12 \% \) SDS-PAGE에서 단백질 발현 패턴을 분석하였다. 대장균 BL21 (DE3)에서 발현되는 KgGGPP synthase의 최적 발현시간은 IPTG 첨가 후 약 17시간 정도였으며, 이들의 분자량은 앞서 아미노산 서열로 예측 분석한 약 41KDa과 일치하였다. 또한, 대장균 BL21 (DE3)에서 과발현된 KgGGPP synthase는 Western blot 분석법을 이용하여 검증 확인하였으며 이를 Fig. 7B에 나타내었다.</p><h2>공발현 시스템을 통해대장균에서생산된 카로티노이드의추출 및 분석</h2><p>대장균 BL21 (DE3)에서 발현된 KgCrtE 효소의 활성을 검증 위하여, 먼저 대장균에서의 라이코펜 생합성 유무를 확인하였다. 대장균의 경우 메발론산 경로를 통하여 FPP와 IPP를 생합성 하지만 crtE, crtB, crtI 유전자가 없기 때문에 라이코펜을 생합성 하지는 못한다. 이러한 특징을 이용하여 대장균 BL21 (DE3)에 앞서 구축된 두 재조합 DNA을 형질전환 시켜 이들을 공발현 시켰다. 그리고 형질전환된 균주에서 생산되는 라이코펜은 실험 방법에서 서술한 것처럼 추출하여 HPLC 분석법을 이용하여 생합성 유무를 확인하였다. 카로티노이드는 종류에 따라 각각의 서로 다른 최대 흡수(absorption maxima) 파장대를 가지고 있다. 파이토엔(Phytoene) 등의 absorption maxima는 \( 280 \mathrm{~nm} \)이며, 라이코펜의 경우 absorption maxima는 \( 470 \mathrm{~nm} \)로 알려져 있다. 본 연구에서 생산된 이들 카로티노이드는 표준물질과 더불어 HPLC 분석을 통하여 각각의 absorption maxima인 \( 280 \mathrm{~nm} \)와 \( 470 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였으며, 분석된 결과는 Fig. 8에 나타냈었다. Fig. 8A는 표준물질 라이코펜과 GGPP이며, 라이코펜의 경우 absorption \( 470 \mathrm{~nm} \) 에서 retention time 22분(peak 1)에서 분리되었으며, GGPP는 ab-sorption \( 280 \mathrm{~nm} \), retention time 13분(peak 2)에서 분리되어짐을 확인할 수 있다. Fig. 8B는 pCCrtE 재조합 DNA가 형질전환된 대장균에서 생산된 추출물을 HPLC 로 분석한 결과로서, 표준물질을 활용한 분석 결과(Fig. 8A)와 비교하였을 때 동일한 시간대의 retention time에서 GGPP가 생산됨을 확인 할 수 있다. 또한 peak 3 (retention time 8 분)의 경우 대장균에서 생산되는 FPP 또는 IPP로 추정되며, 본 연구에서는 대장균에서 생산되는 카로티노이드를 중점으로 연구하였기 때문에 따로 이들을 비교 분석하지는 않았다. 마지막으로 Fig. 8C의 결과는 pCrtE와 pRSCrtBI 재조합 DNA를 공발현 시켜 생산된 카로티노이드계 물질을 추출하여 HPLC 분석을 실시한 결과로서, 표준물질의 분석 결과와 비교한 결과 absorption 470\( \mathrm{nm} \)에서 retention time 22 분대에서 라이코펜이 생산됨을 확인 할 수 있었고 absorption \( 280 \mathrm{~nm} \), retention time 8 분(peak3 ), 13 분(peak 2), 27 분(peak 4)에서 각각 FPP (or IPP), GGPP,Phytoene이 생산됨을 확인 할 수 있었다. 이상의 결과들을 종합하여 추론하면, 대장균 형질전환체에서 생합성된 KgCrtE는 그 효소적 특성을 잃지 않고 정상적으로 기능을 수행하고 있음을 확인할 수 있었다.</p><p>본 연구에서는 K gwangalliensis로부터 카로티노이드 생합성 경로의 첫 번째 물질을 생합성하는 GGPP synthase를 암호화 하는 crtE 의 클로닝과 KgCrtE 단백질의 1, 2차 구조 분석을 통한 이 효소의 구조적 특징을 분석, 효소활성의 검증을 위해 BL21 (DE3)에서 GGPP 및 라이코펜 의 생합성을 유도하여 CrtE의 기능적 활성 유무를 HPLC 분석법을 통해 표준물질과 비교 검증하였다. 따라서, 본 연구의 결과는 새로운 카로티노이드 생합성 유전자의 발굴과 비카로티노이드 생합성 균주에서의 다양한 카로티노이드 생산을 위한 기초 데이터로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.</p>