UPLC가 부착된 QTRAP mass spectrometer를 사용하여 두 가지 화합물의 정량 분석을 최적화하였다. +ESI(positive mode)에서 m/z 287과 319으로 선택되었고, MRM 모드로 정량 분석했을 때, 최적의 fragment 에너지를 형성하였고 감도가 좋은 생성이온 을 선택하여(화합물 \(1 \):m/z \(179 \), 화합물 \(2 \):m/z \(139 \)) 정량분석을 실시, 신경세포의 구조적 특성을 이용하여 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 로 유도된 산화스트레스에 의한 신경 세포막 손상 정도를 세포 외로 방출된 LDH 의 활성 수치 측정을 통해 확인하였으며 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 처리군은 정상 대조군 \( (100 \%) \) 과 비교하여 약 \( 219.6 \% \) 의 LDH 활성 수치를 나타내었으며, 화합물 \(1 \) 및 \(2 \)의 처리군은 각각 \( 195.0,190.3 \% \) 의 수치를 보였다.
<p>분리된 화합물 \(2 \)종의 정량분석을 위해 UPLC가 부착된 QTRAP mass spectrometer (AB SCIEX)를 사용하여 질량스펙트럼과 크로마토그램을 분석하였다. 최적화된 기기분석조건을 고려하여 머무름 시간을 비교하였을 때, 화합물 \(1 \)은 \( 1.01 \) 분 및 화합물 \(2 \) 는 \( 2.41 \) 분에서 검출되었다. 화합물 \(1 \) 과 \(2 \) 에 대하여 \( [ \mathrm { M } + \mathrm { H } ] ^ { + } \)이 선구이온(precursor ion)으로 선택되었는데 + ESI (positive mode)에서 화합물 \(1 \)은 m/z \(287 \) 및 화합물 \(2 \) 는 m/z \(319 \) 로 선택되었다. MRM 모드로 정량 분석했을 때, 최적의 fragment 에너지를 형성하였고 가장 감도가 좋은 생성이온 (products ion)을 선택하여(화합물 \(1 \):m/z \(179 \), 화합물 \(2 \):m/z \(139 \)) 정량분석을 실시하였다. 검량 곡선은 표준물질의 \(5 \) 농도 범위 안에서 측정된 값을 회기 분석을 통해 작성하였다. 회기 방정식은 \( \mathrm { y } = \mathrm { ax } + \mathrm { b } \) 을 사용하였는데, 여기서 \( \mathrm { y } \) 와 \( \mathrm { x } \) 는 각 화합물의 피크 면적과 농도를 나타낸다. 상관계수 \( \left (r ^ { 2 } \right ) \) 는 화합물 \(1 \) 및 \(2 \) 에 대해 각각 \( 0.9997 \) 및 \( 0.9999 \) 으로서 매우 높은 값을 보여주었다. 조팝나무 잎에 있는 각 화합물의 함량 분석한 결과, 화합물 \(1 \) (isosalicin)은 \( 0.65 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \) 으로 함량이 낮았으며 화합물 \(2 \) (crenatin) 의 함량은 \( 9.53 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \) 으로 상대적으로 함량이 높았다.</p> <p>조팝나무 잎에서 분리한 두가지 단일 화합물의 신경세포에 대한 독성을 평가하기 위해 MTT assay를 수행한 결과, 화합물 \(1 \) 및 \( 2 \) \((100 \mathrm { mM } ) \) 모두 세포 생존율이 정상 대조군(control)과 유사한 결과값을 나타내었으며, SK-N-MC 세포에 대한 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다. SK-N-MC 세포에 활성산소종인 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 를 처리하여 산화스트레스 유발에 따른 신경세포의 손상 또는 세포 사멸에 대한 화합물 \(1 \) 및 \(2 \)의 신경세포 보호효과를 확인하기 위해 신경세포의 형태학적 변화 관찰, MTT 및 LDH assay를 실시하였다. \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 처리에 따른 신경세포의 형태학적 변화에 미치는 영향을 확인해본 결과, \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 처리군은 세포체 웅축, 신경돌기 소실, 세포막수포현상 등 세포 사멸의 형태적인 특징을 나타내었다. 그러나, \( 100 \mu \mathrm { M } \) 농도의 화합물 \(2 \) 를 처리한 경우 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 처리에 의한 형태학적 변화가 감소하였으며, 동일 농도의 화합물 \(1 \) 의 처리군 보다 더 효과적으로 감소하는 것을 확인하였다. \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 처리에 따른 세포 생존율의 변화를 확인한 결과, \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 처리군은 정상 대조군 \( (100 \%) \) 과 비교하여 세포 생존율이 약 \( 48.6 \% \) 까지 감소하였다. 그러나, 화합물 \(1 \) 및 \(2 \) 의 처리군은 각각 \( 57.4,71.6 \% \) 의 세포 생존율을 나타내었고, \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 처리군과 비교 시 각각 \( 15.3,32.2 \% \) 의 증가율을 보였다. 특히 화합물 \(2 \) 의 처리군은 양성대조군인 NAC \((500 \mathrm { mM } ) \) 처리군의 세포 생존율 \((75.2 \%) \)과 유사한 결과값을 나타내었다. 이러한 결과는 화합물 \(2 \)가 산화스트레스에 의한 신경세포 사멸을 억제하여 세포 생존율을 증가시킨 것으로 생각된다. 화합물 \(1 \) 및 \(2 \)의 신경세포 보호효과를 추가적으로 확인하기 위해 LDH 활성을 측정하였다. 신경세포의 경우 산화 스트레스에 취약한 지질 성분을 많이 함유하고 있다고 알려져 있다. 이러한 신경세포의 구조적 특성을 이용하여 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 로 유도된 산화스트레스에 의한 신경 세포막 손상 정도를 세포 외로 방출된 LDH 의 활성 수치 측정을 통해 확인하였다. 그 결과 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 처리군은 정상 대조군 \( (100 \%) \) 과 비교하여 약 \( 219.6 \% \) 의 LDH 활성 수치를 나타내었으며, 화합물 \(1 \) 및 \(2 \)의 처리군은 각각 \( 195.0,190.3 \% \) 의 수치를 보였다. 이러한 결과를 통해, 화합물 \(2 \)가 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 에 의한 신경세포 손상을 억제하여 세포 외로 LDH 방출량이 감소한 것으로 생각된다. Choi 등 연구에 의하면 조팝나무 MeOH 추출물은 높은 항산화 활성을 가지며 조팝나무 구성 성분 중 높은 폴리페놀 함량과 항산화 활성과의 연계성이 크다고 보고하였으며, Jeong 등 연구에서는 구아바 잎 열수 추출물이 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 로 유도된 신경세포 사멸을 억제하고 LDH 방출량 감소에 따른 산화스트레스로부터 신경세포 보호효과가 있는 것으로 보고하였다. 따라서, 조팝나무에서 분리한 phenolic glucoside중 화합물 \(2 \) (crenatin)는 항산화 활성으로 인해 산화 스트레스에 의한 신경세포의 형태학적 변화, 신경세포 손상 및 세포 사멸을 억제 시킴으로써 산화스트레스로부터 신경세포 보호효과를 나타내는 것으로 판단된다. 또한 화합물 \(2 \)의 신경세포 보호효과의 작용기작 규명을 위해서 분자생물학적인 접근방법을 통한 기전 연구 및 퇴행성 뇌신경계 질환 동물 모델을 이용한 in vivo 연구가 필요할 것으로 사료된다. 본 연구 결과를 종합해 볼 때, 조팝나무 잎에서 분리 및 동정된 화합물은 함유량도 높으며(crenatin의 경우) 산화 스트레스로부터 신경세포 보호효과를 나타내어 향후 보다 심도 깊은 연구를 통해 퇴행성 뇌신경계질환 등의 예방 및 개선을 위한 건강식의약소재의 기능성 지표성분으로 개발될 가능성이 높다고 할 수 있깄다.</p>