본 연구에 활용된 목적단백질의 표면 반현을 위한 운반체 단백질로 효모세포벽에 N말단이 공유결합 된 a-agglutinin을 사용하였다. 이 단백질은 Aga1과 Aga2 외 소단위체로 구성되어 있고 Aga1 단백질이 \( \beta \)-glucan 결합으로 세포벽에 고정 돼 Aga2는 목적 유전자와 융합 발현되어 Aga1과 disulfide 결합을 하고 있다. 그러므로, Aga2 단백질의 C 말단에 B. stearo-thermophilus NO. 2 CGTase를 유전적으로 융합해 효모 S. cerevisiae의 세포 표면에 CGTase 효소가 고정 부착된 생체촉매제 개발을 통해 전분 으로부터 CD를 생산함으로써, 유용 산업효소를 S. cerevisiae 세포 표면에서 발현시킬 표면 발현 시스템을 구축하려 한다.
<p>최근 세포표면에 다양한 생리활성효소나 금속이온 결합단백질의 고정화률 통하여 고부가가치의 물질생산을 위한 전세포 생물촉매(whole cell biocatalyst)는 그 이용성이 매우 다양하다. 표면발현에 대한 연구는 bacteriophage나 원핵세포인 대장균 및 그람양성 세균 동에서 다양한 표면단백질을 매개로 이용하는 기술이 개발되었으며 산업적으로 응용성을 넓혀 나가고 있는 추세이다. 그러나 bacteriophage의 경우 고밀도 표면 발현이 가능한 경우는 약 50 amino acids로서 display 할 수 있는 단백질의 크기에 한계가 있으며 대장균이나 그람양성세균의 경우에는 효소와 같은 분자량이 큰 단백질을 display할 수 있으나 포면발현의 밀도가 매우 낮은 문제점 등이 단점으로 지적되고 있다. 뿐만 아니라 식품이나 인체를 대상으로 하는 의약품 생산을 위한 효소 반응의 경우 인체에 대한 안전성 문제(GMO)도 심각하게 대두되고 있다. 따라서 최근에는 이러한 원핵세포를 이용한 표면발현의 단점을 보완할 수 있는 새로운 표면발현 시스템으로서 진핵세포인 효모 Saccharomyces cerevisiae 를 이용하려는 시도가 활발히 진행되고 있다.</p> <p>제빵 효모 S. cerevisiae는 GRAS (generally recognized as safe)이며 오랫동안 많은 전통 생물공학산업에 이용되어 왔기 때문에 분자 유전학 연구가 많이 되어 왔고 또 세포의 고농도 발효기술이 축적되어 있다. 뿐만 아니라 효모는 진핵세포로서 고등생물과 유사한 유전자 구조 및 당쇄부과(glycosy-lation)을 포함하는 번역후 단백질 수식(post-translational modification) 과정을 가지기 때문에 고등세포 유래의 단백질을 활성상태로 발현할 수 있다. 유용 효소유전자의 포면발현의 측면에서 효모는 다음과 같은 장점을 제공한다. 첫째, 효모는 다른 미생물에 비하여 외래단백질의 분비기구가 잘 발달하여 있으므로 표면발현의 전제조건인 목표단백 질의 분비가 용이하다. 둘째, 효모는 다른 미생물에 비하여 세포벽이 매우 단단하며 표면에 부착되는 단백질들이 세포표면의 glucan 구조와 공유결합에 의하여 결합되므로 반응 중 추출되지 않는 장점을 있어 산업적 응용에 있어서 life-time이 길다. 셋째, 표면발현 시 단백질의 표면밀도 측면에서도 효모의 agglutinin 경우 효모 세포 1개당 \( 10^{4} \) 분자수로써 원핵세포 시스템에 비하여 매우 높다.</p> <p>Cyclodextrin glucanotransferase (EC 2.4.1.19; CGTase)는 전분이나 아밀로오즈, 아밀로펙틴, altooligosaccharide 등의 기질에 작용하여 환상의 비환원성(non-reducing)인 cyclo-dextrin (CD)을 합성하는 분자내 당전이 반응인 cyclization반응과 분자 간 당전이 반응인 coupling 반응 및 dispropor-tionation 반응을 매개하는 다기능 효소이다. 하지만 CGTase 의 주작용은 CD합성 반응으로 전분으로부터 포도당 6~8개가 a-1,4- glucosidic 결합으로 환상 연결된 비환원성의 \( \alpha-, \beta-, \gamma \) -CD를 생산한다. CD의 화학적 구조는 환상의 고리구조로인해 안쪽에 동공(cavity) 을 갖고 있으며 각 포도당의 외부로 노출되어 있는 C6 위치의 hydroxyl group이 친수성을 나타내는 반면, 내부는 수소결합과 ether 결합으로 인하여 소수성을 띄게 된다. 따라서 외부에서 소수성을 가진 물질이 첨가되면 CD의 동공 내로 이 물질을 포접하여 복합체률 형성하게 되며, 이러한 특성에 따라 포접된 물질을 보호하고 안정화시키는 역할을 함으로써 휘발성 물질의 불휘발화, 불안정한 화학물질의 안정화 등 포접된 물질의 물리적, 화학적 성질(용해도, 색, 맛, 향기 등)을 변화시킬 수 있다. CD를 이용하여 식품, 의약, 능약, 화장품 등의 산업에서 유효 성분의 안정화, 가용화 및 유화 등 물성개선의 첨가제로 이용 고 있다.</p> <p>본 연구에 사용된 목적단백질의 표면 반현을 위한 운반체 단백질로서 효모세포벽에 N말단이 공유결합된 형태로 존재하는 a-agglutinin은 사용하였다. 이 단백질은 Aga1과 Aga2 외 소단위체(subunit)로 구성되어 있으며 Aga1 단백질이 \( \beta \)-glucan 결합으로 세포벽에 고정되고 Aga2 (69개 amino acid)는 목적 유전자(CGTase 유전자)와 융합 발현되어 Aga1과 disulfide 결합을 하고 있다.</p> <p>따라서, 본 연구에서는 Aga2 단백질의 C 말단에 B. stearo-thermophilus NO. 2 CGTase를 유전적으로 융합시켜 효모 S. cerevisiae의 세포 표면에 CGTase 효소가 고정 부착된 새로운 생체촉매제(biocatalyst)를 개발하여 전분 으로부터 CD를 생산함으로써, 유용 산업효소를 S. cerevisiae 세포 표면에서 발현하는 표면 발현 시스템을 구축하고자 한다.</p>