효소법(Enzyme method) - histamine 농도를 측정하기 위해 특이적인 효소분해방법을 사용하였다. LB broth로 배양한 균주로부터 DNA를 PCR 반응과정을 거쳐 추출하여 ABI 310 Automatic Sequencer를 이용한 염기서열 분석을 통해 NCBI World Wide Web Blast DNA database search service를 이용하여 검색하였고, Nutrient broth와 histamine dihydrochloride로 만든 배지에 시험균주를 접종하여 미생물의 농도를 탁도측정법으로 측정하고 효소법으로 histamine 농도를 측정하여 균주의 생육곡선과 histamine의 분해와의 관계를 관찰하였다.
<h2>\( 16 \mathrm { ~S } \) rDNA 염기서열 분석에 의한 동정</h2> <p>균주를 LB broth (Luria-bartani broth, \( 10 \mathrm { ~g } \) of Tryptic digest of casein (Tryptopane); \( 5 \mathrm { mg } \) of Yeast extract; \( 10 \mathrm { ~g } \) of \( \mathrm { NaCl } \); pre-adjusted to \( \mathrm { pH } \) 7.0)에서 \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } , 18 \) 시간 동안 증균 배양한 후, 반응과정을 거쳐 DNA를 추출하였다.</p> <p>PCR 반응은 DNA thermal cycler (Perkin-Elmer Cetus)를 사용했으며, primer는 6F 5'GRAGTTTGATCMTGGC; corre-sponding to positions 6 to 23 of Escherichia coli 16S rRNA) 와 1492R (5'GGTTA CCTTGTTACGACTT; corresponding to positions 1472 to 1492 of E. coli)를 사용하였다.</p> <p>염기서열 분석은 ABI 310 Automatic Sequencer (Perkin elemer co., U.S.A.)와 Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin elemer co., USA)를 사용하여 실시하였고, 확보된 염기서열은 NCBI (National center for bi-otechnology information)에서 제공하는 World Wide Web Blast DNA database search service (blastn 2.0)를 이용하여 검색하였다.</p> <h2>Histamine 분해능 재확인</h2> <p>자반고등어에서 분리한 시험균주의 histamine 분해능을 다시 확인하기 위하여 Nutrient broth \( 1 \mathrm { l } , 3 \% \mathrm { NaCl } , 1.4 \% \) hista-mine dihydrochloride (Sigma)의 조성으로 배지를 제조하여 사용하였다. 이 배지에 시험균주를 각각 접종하여 배양하면서 탁도측정법으로 미생물의 농도를 측정하였고, 효소법으로 histamine 농도를 측정하였다. 이러한 방법으로 균주의 생육곡선과 histamine의 분해와의 관계를 관찰하였다.</p> <p>탁도측정법(Turbidometry determination) - 시험균주의 생육곡선을 관찰하기 위하여 미생물의 농도를 분광광도계(Ul-trospec 3000, Pharacia biotech)를 사용하여 \( 600 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다.</p> <p>효소법(Enzymic method) - Histamine의 농도 측정은 Lerkeet al.[13]과 Summer and Taylor[17]의 효소법에 의하였다. 시약은 Diamine oxidase (DAO, Sigma) \( 0.35 \mathrm { IU } / \mathrm { ml } \), Hydrogen peroxidase (HRP, Sigma) \( 17.24 \mathrm { IU } / \mathrm { ml } \) 로 탈 이온화 된 물에 녹여 준비하였다. Leuco crystal violet (LCV, Aldrich)은 0.5 \% \( \mathrm { HCl } \) 에 용해시켜 준비하고 phosphate buffer는 \( \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } \) 와 \( \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } \) 혼합물 \( 0.15 \mathrm { M } \) 용액을 사용하며 \( \mathrm { pH } \) 6.8로 보정하였다. 일단 준비한 모든 시약은 \( 0 \sim 2 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에, 특히 LCV용액은 냉암소 저장하여 사용하였다.</p>