재조합시스템을 사용하여 선발표지를 제거하기 위한 기본 실험방법은 목표유전자 카세트와 lox-P35S-hpt-lox와 같은 유전자 구조가 포함된 T-DNA를 식물체에 항생제 선발표지를 이용하여 도입하고, Cre 유전자를 다른 선발표지 \(( n p t \mathrm { II } \)) 유전자와 함께 재형질전환 (re-transformation) 하거나 교배하는 방법이 이용되며 Cre 재조합효소의 일시적 발현과 음성표지 (negative marker) 시스템을 사용하면 lox 부위의 재조합을 유도하기 위한 Cre 유전자의 재형질전환이나 교배 없이도 선발표지를 제거할 수 있다.
<p>재조합시스템을 사용하여 선발표지를 제거하기 위한 기본 실험방법은 목표유전자 카세트와 lox-P35S-hpt-lox와 같은 유전자 구조가 포함된 T-DNA를 식물체에 항생제 선발표지를 이용하여 도입하고, Cre 유전자를 다른 선발표지 \(( n p t \mathrm { II } \)) 유전자와 함께 재형질전환 (re-transformation) 하거나 교배하는 방법이 이용된다. Cre 유전자가 도입되어 lox 인식부위의 재조합으로 선발표지 유전자 \( (h p t) \) 가 제저된 개체들은 후대의 유전자분리를 이용하여 Cre 유전자와 다른 선발표지 유전자 \(( n p t \mathrm { II } \))를 함께 제거 할 수 있다.</p> <p>Cre 재조합효소의 일시적 발현과 음성표지 (negative marker) 시스템을 사용하면 lox 부위의 재조합을 유도하기 위한 Cre 유전자의 재형질전환이나 교배 없이도 선발표지를 제거할 수 있다. 목표유전자와 lox-nptII-codA-lox와 같은 구조를 가진 T-DNA가 형질전환된 담배개체들은 비독성 5-fluorocytosine (5-fc)가 첨가된 배지에서 cytosine deaminase (codA) 가 (5-fc) 를 독성 5-flurouracil로 전환시키기 때문에 생존할 수 없다. 그러나 형질전환체 엽절편을 Cre 재조합효소 발현 아그로박테리음과 공동배양하여 무항생제 첨가배지에서 유도된 신초의 \( 0.25 \% \)는 선발표지와 함께 \( \operatorname { codA } \) 유전자가 제거되어 5-fc에 대한 내성을 보였다.</p> <p>부위 특이적 재조합효소 시스템을 사용하여 무선발표지 식물체를 만드는 기본방법은 목표유전자와 함께 사용된 선발표지를 제거하기 위하여 교배나 재형질전환의 과정이 필요하다. 또한 Cre 재조합 효소의 일시적 발현과 음성 선밥표지를 같이 사용하는 방법은 선발표지 제거 효욜이 낮고 식물 종에 따른 음성 선발표지의 저항성차이로 폭넓은 식물체에 적용하기 어렵다. 이러한 문제를 극복하기 위한 대체 방안으로 자가-절단 방법이 개발되었다. 자가-절단 방법은 재조합효소 유전자를 선발표지와 함께 T-DNA내의 두 재조합효소 인식부위 사이에 위치시켜 식물체내로 도입하는 방법이다.</p> <p>자가-절단 방법의 개발초기에는 식물체에서 재조합효소를 발현시킬 목적으로 꽃양배추모자이크 바이러스 유래의 CaMV35S 프로모터 (Califlower mosaic virus 35S promoter)가 많이 사용되었다. 그러나 재조합효소가 항시발현 프로모터에 의해 같은 양으로 계속 발현되면 식물체에서 완전히 선발표지 유전자가 제저되지 않아 선발표지 유전자가 남아있는 세포와 혼재되는 키메릭 (chimeric) 현상이 발생할 수 있다. 따라서 이를 해결하고자 화합물 유도성 프로모터나 조직특이적 프로모터를 사용하여 형질전환 단계나 식물의 특정분화 세포 단계에서 재조합효소의 발현이 일어나 선발표지가 제거되도록 하는 연구가 수행되었다.</p> <p>Cre 재조합효스 유전자가 사용된 대표적인 자가-절단 방법은 CLX (Cre/lox DNA excision) 운반체 시스템으로 Cre 재조합효소의 발현이 화합물 처리로 유도되도록 설계되었다. 운반체 T-DNA의 두 loxP 인식부위 사이에 선발표지인 \(( n p t \mathrm { II } \)) 유전자와 Cre 유전자 및 Cre 유전자 전사를 유도하기 위한 XVE 전사인자 (transcription factor) 유전자를 위치시켰다. Cre 재조합효소의 발현은 \( \mathrm { O } ^ {\text { LexA } } \) 프로모터에 의해 배지성분으로 포함시킨 동물호르몬 \( \beta \)-estradiol로 유도된다. 따라서 CLX 운반체 시스템에서는 kanamycin을 이용하여 선발된 형질전환체에서 생산된 종자를 \( \beta \)-estradiol이 첨가된 배지에서 발아시키면 발아과정에서 Cre 가 활성화되어 두 loxP 인식부위가 절단의 결과로 선발표지유전자가 제거된 무선발표지 형질전환체를 얻을 수 있다. 선발표지 제거를 위해 애기장대, 벼 및 토마토에 CLX 윤반체 시스템이 적용되었다. 그러나 이 방법은 \( \beta \)-estradiol이 첨가된 배지에서 자란 식물체가 키메라가 될 가능성이 높고, 작물에 따라 선발표지제거 효욜의 차이가 크게 다르며, 영양번식식물에서는 사용하기 어렵다.</p>