입수되 동물을 제어된 환경 조건에서 사육하며, 매일 1회 일정한 시간 관찰하였으며, 종양조직에 대한 정량적 분석을 위해 RTQ-PCR 방법을 사용하였다.
<h2>사육환경</h2> <p>입수된 동물은 케이지에 5마리씩 분류한 후 온도 \( 20 \sim 22^{\circ} \mathrm{C} \), 상대습도 \( 40 \sim 60 \% \), 조명시간 12시간(07:00 점등 ~ 19:00 소등), 환기횟수 50회/시간, 조도는 \(150 \sim 300 \mathrm{lux}\)로 제어된 환경 조건에서 사육되었다. 동물실의 온도와 습도는 자동 온습도측정기에 의하여 매시간 마다 측정되었으며, 동물실의 환경측정결과 시험에 영향을 미칠 것으로 사료되는 변동은 없었다. 동물의 개체식별은 ear-punching법을 사용하였으며, tag 표시법에 의해서 사육 상자를 구분하였다. 사육 상자는 시험시간, 시험번호, 시험책임자명을 기재한 label을 첨부하였다. 사육실에 반입되는 사료와 깔집, 물(상수도)은 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 고압멸균 하였고, 사료와 음수는 자유섭취 시켰다. 체중계 및 실험도구 등은 알코올 소독 후 자외선 멸균 뒤 반입하였다.</p> <h2>임상증상 관찰 및 체중측정</h2> <p>시험기간 중 모든 동물에 대하여 매일 1 회 일정한 시간에 일반증상의 변화, 빈사 및 사망유무를 관찰하였으며, 체중은 실험시작 후 3주까지 매주 1회 측정 하였다. 시험 중 폐사동물은 없었다.</p> <h2>동물 부검 및 종양조직 채취</h2> <p>종양 세포 주입 3주 후 모든 그룹의 마우스를 \( \mathrm{CO}_{2} \) 가스를 이용하여 안락사하고, 멸균된 수술용 가위와 핀셋을 이용하여 실험동물의 유방지방체(m.f.p.)에서 종양조직을 절제하여 분자생물학적 검사를 수행하기 위해 액체질소에 보관 하였다.</p> <h2>BLI (Bioluminescent imaging)을 통한 종양측정</h2> <p>시험기간 중 1주1회 실시하였다. 측정방법은 firefly lucifer-ase의 기질인 D-luciferin (Caliper, Alameda, CA)을 \( 150 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) B.W. 복강 주입한 뒤 5 분 후 IVIS (Caliper)를 이용하여photon/sec로 크기를 측정하였다. Bioluminescence 결과는 Living Image 3.0 software (Caliper)를 이용해 분석하였다.</p> <h2>종양조직의 RNA 추출 및 Quantitative real-time PCR(RTQ-PCR)</h2> <p>종양조직에서 줄기세포조절유전자(SRG)의 mRNA 발현을 정량적으로 분석하기 위해 RTQ-PCR 방법을 사용하였다. 4T1-luc 세포를 mouse 주입하고 3주 뒤에 종양조직을 절제하여 신선 조직을 액체질소에 보관 하였다. 액체질소에 냉동 보관된 조직 \( 30 \mathrm{mg} \)을 조직분쇄기로 분쇄한 뒤 Rneasy Plus minikit (Qiagen Inc., Valencia, CA)를 이용하여 genomic DNA가 배제된 RNA (total RNA)만을 추출하였다. 전체 RNA 농도는 NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop Tech-nologies, Rockland, DE)를 이용하여 정제도를 확인하고 정량하였다. \( 1 \mu \mathrm{g} \)의 total RNA로부터 random hexamer와 200 unit의 Superscrip Reverse Transcriptase (Invitrogen corporation, Carlsbad, CA)를 이용하여 cDNA (complementary DNA)를 역전사 합성하였다. Oct-4, Nanog, Sox2, c-Myc, Klf4의 발현정도를 정량 하기 위해 RTQ-PCR 분석은 SYBR green dye(ABI Biosystems, Foster City, CA)와 함께 ABI 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems)을 이용하여 평가하였다. 내재 대조(endogenous control) 유전자는 mouse HPRT를 사용하였다. 연쇄반응 시 최종 부피는 \( 50 \mu \mathrm{l} \)가 되도록 하였으며, cDNA의 경우 각 시료의 RNA \( 1 \mu \mathrm{g} \)에서 역전사 되도록 하였다. 연쇄반응 수행절차는 처음 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 변성하고, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초를 주기로 40회 반복 수행 한 후 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 7분간 신장(extension) 하였다. 각 시료의 발현결과 비교분석은 제조사에서 권고한 표준곡선분석법(standard curve method)을 사용하였다. 사용된 primer는 Oct-4: 5'-GCA TTC AAA CTG AGG CAC CA-3'(F), 5'-AGC TTC TTT CCC CAT CCC A-3' (R); Nanog:5'-GCC TTA CGT ACA GTT GCA GCA A-3' (F), 5'-TCACCT GGT GGA GTC ACA GAG T-3' (R); Sox2: 5'-GAG TGGAAA CTT TTG TCC GAG A-3' (F), 5'-GAA GCG TGT ACTTAT CCT TCT TCA T-3' (R); c-Myc: 5'-CGG ACA CAC AACCGT CTT GGA A-3' (F), 5'-AGG ATG TAG GCG GTG GCTTTT-3' (R); KlF4: 5'-GGT GCA GCT TGC AGC AGT AA-3'(F), 5'-AAA GTC TAG GTC CAG GAG GTC GTT-3' (R);HPRT: 5'-GCC TAA GAT GAG CGC AAG TTG-3' (F),5'-TAC TAG GCA GAT GGC CAC AGG-3' (R)이며, 유전자의 발현양을 측정하기 위해 동일시료 cDNA를 사용하여 mouse HPRT 발현양을 측정하여 정량하였다.</p> <h2>통계학적 처리</h2> <p>모든 실험결과는 평균치와 표준오차를 사용하여 나타내고 각 군간 비교는 Prism 5 program (GraphPad, San Diego, USA)을 이용하여 one-way ANOVA에 이은 t-test 분석을 실시하였다. 대조군과 비교하여 P값이 0.05 미만일 때를 통계학적으로 유의성이 있다고 판정하였다.</p>