본 연구에서는 한국형종문화집단(KCTC)과 실험실의 culture collection에서 받은 50여종의 Trichoderma 균주를 이용하였다. 이 균주들은 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 항온기에서 일주일 간 도말 이후 배양하였으며, 이 과정에서 길항균에 의해 생긴 균사 생장 억제 거리를 관찰하였다. 또한, 효소의 활성을 표현하는 단위는 1시간 동안 \( 1 \mu \mathrm{mol} \)의 N-acetylglucosamin (NAGA)를 생성하는 효소량으로 측정하였다. 이러한 방법을 통해 Trichoderma 균주의 효소활성과 생장 억제 특성을 파악하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용 균주 및 배양조건</h2><p>본 실험실의 culture collection 및 유전자은행 (KCTC, Korean Collection for Type Cultures)에서 분양받은 Trichoderma 균주 50 여종을 실험에 사용하였다. Malt extract \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \), peptone \( 5 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \)으로 구성된 배지를 사용하였으며, \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), \(250 \mathrm{rpm} \) 조건에서 배양하였다.</p><h2>Inhibition zone 실험</h2><p>PDA(potato dextrose agar) 평판 배지 중앙에 R. solani 균사가 있는 직경 \( 5 \mathrm{~mm} \) 정도의 디스크를 올려놓고, 이 디스크를 중심으로 일정한 거리를 유지하여 배지 가장자리에 백금이를 사용하여 길항작용이 있는 균주들을 도말하였다. 도말 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 항온기에서 일주일 정도 배양하면서 길항균에 의해 형성된 균사 생장 억제거리를 측정하였다.</p><h2>Glucanase 활성 분석</h2><p>세포 배양액 \( 3 \mathrm{~m} \ell \)를 \( 12,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리하고, 상등액 \( 1 \mathrm{~m} \ell \)와 기질용액(laminarin, \( 20 \mathrm{mg} / \mathrm{m \ell} \) ) \( 100 \mu \ell \)를 섞은 다음 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 항온조에서 1시간 반응시켰다. 반응액 \( 300 \mu \ell \)와 DNS용액 \( 1 \mathrm{~m} \ell \)를 혼합하고, 끓는 물에서 5분간 중탕한 다음 상온에서 식히고, \( 550 \mathrm{~nm} \)에서 홉광도를 측정하여 생성된 환원당량을 표준곡선을 이용하여 측정하다. 이 때, 각 세포 배양액에 존재하는 포도당 양을 제외시키기 위하여 각각의 균주 배양액에 기질 대신 증류수 \( 1 \mathrm{m \ell} \) 를 넣은 것과, 기질에 있는 포도당 양을 측정하기 위해서 증류수에 기질을 넣은 것을 각각 대조구로 사용하였다.</p><h2>Chitinase 활성 분석</h2><p>\( 10 \mathrm{mM} \) Sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 5.8) \)에 \( 25 \mathrm{mg} \)의 colloidal chitin을 현탁시킨 기질용액 \( 1 \mathrm{~m} \ell \)와 \( 12,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리한 세포 배양액 \( 1 \mathrm{~m} \ell \)를 혼합하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시켰다. 이 반응액을 끓는 물에서 15분간 중탕한 다음, 남아있는 기질을 제거하기 위하여 \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 20분간 원심분리하고, 반응 상등액 \( 0.5 \mathrm{m \ell} \)와 photassium borate buffer \( (\mathrm{pH} 9.1) \) \( 0.1 \mathrm{~m} \ell \)를 혼합하여 다시 끓는 물에서 3분정도 중탕하고 식혔다. 이 반응액에 \( 3 \mathrm{ml} \) DMAB ( \( \rho \) -dimethylaminobenzaldehyde)용액을 혼합하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 항온조에서 20 분간 발색시킨 다음 식혔다. \( 585 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 생성된 N-acetylglucosamin (NAGA)양을 표준곡선을 이용하여 측정하였다. 이 때, 세포배양액에 포함된 NAGA양을 측정하기 위하여 기질 대신 증류수를 넣은 대조구과 기질에 들어있는 NAGA양을 측정하기 위하여 세포 배양액 대신 증류수를 넣은 것을 각각 대조구로 사용하였다. 효소 활성 1 \(\mathrm{unit}\)는 1시간 동안 \( 1 \mu \mathrm{mol} \)의 NAGA를 생성시키는 효소량으로 나타내었다.</p>