아미노산은 생리적 역할 뿐 아니라 맛과 영양을 가지고 있어 의약용, 합성원료용, 식품용 등으로 많이 사용되고 있으나 이중 부가가치가 높은 의약용 아미노산은 대부분 일본과 유럽 회사들이 독점 생산하고 있다. 아미노산의 생산은 산 분해 후의 추출법, 균주를 활용한 발효법, 효소를 활용한 효소법, 화학적으로 합성하는 화합법 등이 있는데 L-alanine의 생산에는 주로 세균을 이용한 미생물 발효법과 ADC를 사용하여 저가의 L-aspartic acid로부터 고가의 L-alanine을 생산하는 효소법이 있다. 본 연구에서는 새로운 ADC 유전자를 얻기 위해 전체 유전체 염기서열이 밝혀져 있지만 아직 ADC 유전자에 대한 연구가 이루어져 있지 않은 Enterococcus faecalis 균주로부터 새로운 ADC 유전자를 찾아내고 ADC를 생산하는 재조합 균주를 제조하고자 하했다.
<p>아미노산은 생리적 역할 외에도 맛과 영양을 가지고 있어 식품용, 사로용, 의약용, 미용원료, 합성원료용 등으로 널리 이용되며 이중 부가가치가 높은 의약용 아미노산은 대부분 일본과 유럽 회사들이 독점 생산하고 있는 실정이다. 알라닌(L-alanine)은 감미료의 개질(改質)제, 화장품 및 의약원료로도 사용되어 전세계적으로 1998년 현재 11,000톤이 생산되었고 향후 그 수요가 증가될 전망이지만[19] 현재 국내에서는 L-alanine의 산업적 생산이 어려워 주로 일본으로부터 전량 수입되고 있는 실정이다.</p> <p>아미노산의 생산은 산(acid) 분해 후의 추출법, 균주를 이용한 발효법, 효소를 이용한 효소법, 화학적으로 합성하는 화합법 등이 있는데 L-alanine의 생산에는 주로 세균을 이용한 미생물 발효법과 ADC (L-aspartate \( \beta \)-decarboxylase)를 이용하여 저가의 L-aspartic acid로부터 고가의 L-alanine을 생산하는 효소법이 있다. 이중 세균을 이용하는 미생물 발효공정은 낮은 생산수율과 D-form과 L-form의 이성질체가 동시에 생성되어 상품성이 떨어지는 문제가 있어 ADC를 이용한 효소적 전환공정이 채택되어 사용되고 있다. 알라닌 생산 균주를 확보하기 위한 시도가 계속되고 있어 Tetrag-enococcus halophila, Thermococcus profundu, Clostridiumspecies, Thermococcus profundus, Pyrococcus furiosus, Pseudomonas speceis, Lactococcus lactis[6] 등의 균주가 보고되어 있으며, 이들은 고부가가치의 L-alanine 생산을 위한 재조합균주와 효소의 유전자원으로 사용될 수 있다.</p> <p>따라서 ADC를 이용한 L-alanine의 산업적 생산을 위해서는 기존 균주가 아닌 새로운 균주를 이용하는 것이 필요하다고 판단된다. 이에 본연구에서는 새로운 ADC 유전자를 얻기 위하여 전체 유전체 염기서열이 밝혀져 있지만 아직 ADC 유전자에 대한 연구가 이루어져 있지 않은 Enterococcus faecalis 균주로부터 새로운 ADC 유전자를 찾아내고 ADC를 생산하는 재조합 균주를 제조하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주, plasmid 및 배양</h2> <p>새로운 ADC 유전자원으로 Enterococcus faecalis 균주(KCTC 2011)를 이용하였고 nutrient broth 배지를 사용하여 진탕배양하였다 \( \left (30 ^ {\circ } \mathrm { C } , 250 \mathrm { rpm } \right ) \). 유전자의 cloning과 발현을 위하여 각각 E. coli DH5a (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 \( \mathrm { BL } 21 \) (DE3) (Invitrogen)를 이용하였고, Luria-Bertani (LB) 배지틀 사용하여 진탕배양하였다 \( \left (37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 250 \mathrm { rpm } \right ) \). 필요에 따라서 LB 배지에 항생제 ampicillin \( (100~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \)을 첨가하여 사용하였다. pGEM-T Easy vector (Promega, Madison, WI, USA)와 pTXB1 (New England BioLabs Inc., Beverly, MA,USA)을 각각 cloning 및 발현용 plasmid로 사용하였다.</p> <h2>Primer의 설계</h2> <p>Enterococcus faecalis 균주의 유전체 전체 서열을 확보한 후 MacVector (Accelrys, USA)를 이용하여 유전자 분석을 행하였고, 그 결과를 토대로 L-aspartate \( \beta \)-decarboxylase 유전자의 증폭을 위해 forward primer EF_ADC02-F (-27/-6 relative to the start codon ATG, 5'-TGA CTG TGT GTG CTT CAG GAG G-3') 및 reverse primer EF_ADC02-R( + 1866/ + 1847, 5'-TGC TTT GTC TCT TGC GGA CC-3')을 제작하여 사용하였다. 클로닝된 유전자를 발현 plasmid에 십 입하기 위한 단편의 증폭을 위해서는 EF_ADC_E2-F ( + 1/ + 21), 5'-CAT ATG ATA ACA AGT GAT GAA TTG-3', 밑줄 은 NdeI site)와 EF_ADC_E2-R ( + 1608/ + 1585, 5'-CTC GAG TTT AAT TGC TTG GCG CTT TTG GCG-3', 밑줄은 Xhol site)을 제작하여 사용하였다. 클로닝에 사용한 primer들은 (주) 바이오니아(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 제작하였다.</p>