홍삼을 효소 처리하여 DPPH 라디칼 소거능과 총 폴리페놀성 화합물 함량 등 항산화능을 검토하였고, 홍삼유를 제조하여 홍삼유에 용액을 첨가하거나 진탕, 원심분리 등의 과정을 거쳐 홍삼유의 과산화물가(POV)와 홍삼유의 DPPH 라디칼 소거능 등을 측정하고 대조를 위해 동일한 조건에서 홍삼을 첨가하지 않은 대두유 및 올리브유를 사용하여 비교 분석하기도 하였다. 실험결과의 분석에는 Students's t test를 통하여 시료간의 유의차를 \( \mathrm{p}<0.05 \) 수준에서 검정하였고, 결과 값은 평균 \( \pm \) 표준편차로 표시하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>건조된 홍삼은 풍기특산물 영농조합 법인에서 구입하였고, 대두유 및 올리브유는 대형 마트에서 구입하여 사용하였다. 건조된 홍삼은 세절하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하면서 실험에 사용하였다. 그리고 본 실험에 사용된 효소인 cellulase, hemicellulase, carbohydrase, arabanase, beta-glucanase, xylanase를 포함하는 복합cellulase (cellulase)와 a-amylase는 NOVOZYME사(Denmark)로부터 구입하여 사용하였다.</p> <h2>효소 처리에 의한 홍삼의 항산화능 검토</h2> <h3>시료 조제</h3> <p>홍삼 \( 50 \mathrm{~g} \)을 세절해서 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)의 증류수 \( 50 \mathrm{ml} \)에서 1시간 정도 수침하여 부드러워지면, 복합 cellulase \( 0.5 \% \) 또는 \( 1 \% \), 복합 cellulase와 \( \alpha \)-amylase의 혼합 효소 \( 0.5 \% \) 또는 \( 1 \% \)를 각각 첨가하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시킨 후, \( 90^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15분간 효소를 불활성화 시켰다. 이 반응액을 각각 \( 1 \mathrm{ml} \)씩 취하여 메탄올 \( 2 \mathrm{ml} \)을 첨가하여 진탕한 후 \( 1,200 \times \mathrm{g} \)에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취해 DPPH 라디칼 소거능과 총 폴리페놀성 화합물 함량을 측정하였다.</p> <h3>DPPH 라디칼 소거</h3> <p>DPPH 라디칼 소거능은 Blois 등의 방법으로 다음과 같이 측정하였다. 상등액 \( 1 \mathrm{ml} \)를 시료로 취하여 \( 5 \times 10^{4} \mathrm{M} \mathrm{DPPH} \)(1,1-dipheny-2-picrylhydrazyl, Sigma Chem. Co., USA) 용액 \( 1 \mathrm{ml} \)를 첨가한 후 10초간 진탕한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시킨 다음, 이 반응액을 분광광도계(UV/Visible spectrophotometer biospec-1601, Shimadzu, Japan)를 사용하여 \( 520 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 이때 대조구는 시료대신 메탄올을 첨가하여 수행하였고, 양성대조구로 \( \alpha \)-tocopherol (Sigma)의 활성과 비교하였다. Free radical 소거 활성은 시료첨가구와 무 첨가구 의 흡광도를 구하여 다음과 같이 계산하였다.</p> <p>scavenging \( (\%)=\frac{\text { 대조구의흡광도-시료처리구의흡광도 }}{\text { 대조구의흡광도 }} \times 100 \)</p> <h3>총 폴리페놀성 화합물 함량</h3> <p>총 폴리페놀성 화합물 함량은 Folin-Denis법을 응용하여 측정하였다. 상등액 \( 1 \mathrm{ml} \)에 2배로 희석한 Folin 시약 \( 1 \mathrm{ml} \)을 첨가하고 잘 혼합한 다음 3분간 방치한 후 \( 1 \mathrm{ml} \)의 \( 10 \% \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \)를 서서히 가하였다. 이 혼합액을 1시간동안 방치한 후 UV / visible spectrophotometer (UVIKON 922, Kontron, Italy)를 이용하여 \( 700 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 폴리페놀성 화합물은 tannic acid (Sigma)를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.</p> <h2>홍삼유 제조 및 항온저장</h2> <p>홍삼유를 제조하고자 홍삼 \( 50 \mathrm{~g} \)을 세절하여 증류수 \( 50 \mathrm{ml} \) 또는 \( 0.5 \% \) cellulase를 첨가한 증류수 \( 50 \mathrm{ml} \)를 넣어 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시킨 후, \( 90^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 효소를 불활성화 시킨 다음 대두유와 올리브유를 각각 10배 비율로 넣어 빛을 차단한 후 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)의 어두운 곳에서 15일간 숙성시켰다. 이때 홍삼을 첨가하지 않은 대두유 및 올리브유를 대조군으로 동일한 조건에서 보관하였으며, 1일 2회 시료를 \( 150 \mathrm{rpm} \), 20분간 진탕하여 오일 속에 홍삼의 지용성 성분들이 용출되도록 하였다.</p> <h2>홍삼유의 과산화물가(POV)의 측정</h2> <p>위에서 제조한 홍삼유 \( 0.5 \mathrm{ml} \)에 chloroform \( 5 \mathrm{ml} \), acetic acid \( 7.5 \mathrm{ml} \), KI 포화용액 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 를 가하여 1분간 진탕시킨 다음 \(0.01\mathrm{M} \mathrm{~Na}_2 \mathrm{S}_2\mathrm{O}_3\)용액으로 적정하여 \( \mathrm{POV} \) 를 산정하였다. 이때 대조군으로 동일한 조건에서 보관한 홍삼을 첨가하지 않은 대두유 및 올리브유를 사용하여 과산화물가를 비교하였다.</p> <h2>홍삼유의 TBA가 측정</h2> <p>기질용액은 \( 0.1 \mathrm{M} \) phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 7.0)와 에탄올을 \( 4: 1(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 혼합한 용액에 linoleic acid를 \( 0.03 \mathrm{M} \)이 되도록 첨가하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1~2일간 냉장 보관하였다. 이 기질용액 \( 2 \mathrm{ml} \) 와 제조한 홍삼유 \( 2 \mathrm{ml} \)에 각각 \( 25 \% \) TCA \( 2 \mathrm{ml}, 0.67 \% \mathrm{TBA} \) (thiobarbituric acid, Sigma) \( 1 \mathrm{ml} \)를 혼합하여 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 가열한 다음 냉각하고 \( \mathrm{n} \)-butanol \( 5 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 진탕시켜 \( 1,200 \times g \)에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하여 \( 532 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. TBA가는 흡광도 치에 100을 곱하여 표시하였다.</p> <h2>홍삼유의 DPPH 라디칼 소거능</h2> <p>홍삼유의 DPPH 라디칼 소거능은 저장한 오일 각각 \( 0.1 \mathrm{ml} \)와 methylene chloride \( 3.9 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 잘 혼합한 다음 \( 1 \mathrm{ml} \)를 시료로 취하여 \( 5 \times 10^{-4} \mathrm{M} \mathrm{DPPH} \) 용액 \( 1 \mathrm{ml} \)를 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시킨 다음 \( 520 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 또한 양성대조구로 \( \alpha \)-tocopherol을 최종농도가 \( 0.02 \% \)가 되게 대두유 및 올리브유에 각각 첨가하여 빛을 차단한 후 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)의 어두운 곳에서 15일간 숙성시켰으며, 1일 2회 시료를 \( 150 \mathrm{rpm} \) 20분간 진탕하면서 보관한 뒤 비교하였다.</p> <h2>홍삼유의 비타민 \( A \) 와 비타민 \( E \) 의 함량</h2> <p>홍삼유의 비타민 A와 비타민 E의 함량 분석은 식품공전의 HPLC에 의한 정량방법으로 수행하였으며, 기기 분석조건은 Table 1과 같다. 즉 \( 0.2 \mathrm{ml} \)의 시료를 동량의 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} B \mathrm{HA} \)(internal standard, Merck)를 포함하는 에탄올과 잘 섞은 후, \( 1.0 \mathrm{ml} \)의 hexane을 첨가하고 다시 잘 섞었다. 이를 \( 2,400 \times g \) 에서 10분간 원심분리하여 상등액 \( 0.8 \mathrm{ml} \)를 취하여 진공원심농축기로 말린 후 \( 20 \mu \mathrm{l} \)의 BHA를 포함하는 에탄올과 hexane에 각각 잘 섞은 후, ethanol:water (\( 95:5 \)) 또는 hexane:isopropanol( \( 98:2 \))이 총 \( 10 \mathrm{ml} \)가 되게 각각 첨가하여 용해시킨 다음, 여과하여 HPLC에 \( 10 \mu \)씩 주입하여 비타민 A 및 비타민 E를 각각 분석하였다.</p> <h2>통계 분석</h2> <p>실험결과의 분석은 Students's \( t \) test를 이용하여 \( \mathrm{p}<0.05 \) 수준에서 시료간의 유의차를 검정하였고, 결과 값은 평균 \( \pm \) 표준편차로 표시하였다.</p>