Glucose를 탄소원으로 사용하고 3종류의 보조탄소원을 농도별로 첨가하여 배양을 진행하였다. MLEH를 탄소원으로 사용하거나 propionic acid를 보조탄소원으로 첨가한 경우 42hr 배양 후 3HV%가 증가하였다. 반면, valeric acid나 levulinic acid를 보조탄소원으로 첨가하였을 때는 3HV%가 감소하거나 변동하지 않았다. 이 결과는 배양액 속의 탄소원이 고갈됨에 따라 생합성된 고분자를 탄소원 및 에너지원으로 사용하였다는 것을 시사한다.
<p>대조군으로 glucose \( (20 \mathrm { ~g } / l) \) 를 탄소원으로 하고 3종류의 보조탄소원을 농도별로 첨가하여 동일한 조건으로 배양을 진행하였다(Table 3). 배양 결과 MLEH를 탄소원으로 사용한 경우에 비해 보조탄소원의 농도가 높아질수록 세포 생장이 현격히 감소하는 경향을 보였으며 보조탄소원을 \( 1.0 \mathrm { ~g } / l \) 농도로 첨가한 경우 세포 생장이 불가능함을 확인하였다. 또한 MLEH를 탄소원으로 사용하는 경우와 동일하게 보조탄소원으로 propionic acid를 첨가한 경우에서 42hr 배양 후 \( 3 \mathrm { HV } \% \) 가 증가하는 것을 확인하였으며 다른 보조탄소원인 valeric acid 또는 levulinic acid를 농도 별로 첨가하여 배양한 경우 \( 3 \mathrm { HV } \% \) 가 감소하거나 변동이 없는 것을 확인하였다.</p> <p>앞서 언급했듯이 3-hydroxyvaleryl-CoA를 합성하기 위해서 propionyl-CoA가 필요하며 PHBV를 생합성하는 균주에 따라 propionyl-CoA가 3-ketovaleryl-CoA로 전환된 뒤 생합성경로를 따라 3-hydroxyvalerayl-CoA를 형성하거나, valeric acid를 보조탄소원으로 이용하여 이를 valerayl-CoA로 변환 한 뒤 이를 \( \beta \)-oxidation 경로를 통해 3-hydrox-yvaleryl-CoA로 전환하는 것으로 알려져 있다[27]. Bacillus sp. EMK-5020는 탄소원으로 MLEH와 glucose를 각각 사용하는 경우 모두 propionic acid의 농도가 증가함에 따라 \( 3 \mathrm { HV } \% \) 가 증가하는 것을 확인할 수 있으며 이를 통하여 Bacillus sp. EMK-5020가 \( 3 \mathrm { HV } \) 생합성의 전구체로 pro-pionic acid를 선호하는 것을 확인하였다. Bacillus sp. EMK-5020은 valeric acid를 \( \beta \)-oxidation 경로를 통해 3-hydrox-yvaleryl-CoA로 전환하는 과정보다 propionic acid를 pro-pionyl-CoA로 변환하여 3-hydroxyvalerayl-CoA를 형성하는 경로를 선호하는 것으로 사료된다. 따라서 Bacillus sp. EMK-5020의 생장 및 \( 3 \mathrm { HV } \% \) 가 높은 PHBV 생합성을 위해서 MLEH를 주 탄소원으로 사용하고 propionic acid를 보조탄소원으로 사용하는 것이 \( 3 \mathrm { HV } \% \) 가 높은 PHBV 생합성에 유리하다는 것을 확인하였다. 또한 propionic acid의 농도가 증가할수록 \( 3 \mathrm { HV } \% \) 가 증가하는 것을 확인하였으며 propionic acid의 농도에 따라 \( 3 \mathrm { HV } \% \) 가 조절될 수 있을 것으로 사료된다(Fig. 3).</p> <h2>Fermentation</h2> <p>대량 배양 조건을 확립하기 위하여 주 탄소원으로 20 \( \mathrm { g } / l \) 의 환원당 MLEH과 보조탄소원으로 \( 1 \mathrm { ~g } / l \) 의 propionic acid를 첨가하여 \( \mathrm { pH } 7,37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 72시간 동안 fermentation을 진행하였다(Fig. 4). Fermentation이 진행됨에 따라 배지 내 환원당(glucose)이 지속적으로 소비되었으며 배양 30hr에서 총 glucose의 \( 87.5 \% \) 가 소비되어 \( 2.5 \mathrm { ~g } / l \) 의 glucose가 잔류하는 것을 확인하였다. 배지 내 환원당(glucose) 소비와 함께 세포 생장이 증가하여 배양 30hr에서 \( 6.25 \mathrm { ~g } / l \) 의 DCW를 확인하였으며 배양이 끝나는 72hr에서 \( 6.6 \mathrm { ~g } / l \) DCW를 얻을 수 있었다. 질소원은 18hr까지 급격한 소비되는 양상을 보였으며 배양 종료 후 \( 2.6 \mathrm { ~g } / l \) 가 잔류함을 확인하였다. PHBV는 배지 내 질소원의 존재와 관계없이 배양 시작과 동시에 꾸준히 합성되어 48hr에서 최대 \( 50 \% \) \( ( \mathrm { w } / \mathrm { w } ) \) 의 PHBV 생합성을 확인하였으며 배양 54hr까지 유지되었으나 배양이 진행될수록 감소하여 배양이 종료되는 72hr에서 \( 30 \%( \mathrm { w } / \mathrm { w } ) \) 의 PHBV가 축적됨을 확인하였다. 이는 배양액 속의 탄소원이 고갈됨에 따라 생합성한 고분자를 탄소원 및 에너지원으로 사용하는 것으로 사료된다. 또한 배양액 내 propionic acid 소비와 맞물려 PHBV 내 3HV 함량은 배양 6hr까지 급격히 증가하는 양상( \( 40 \% \)) 을 보였으나 배양이 진행 될수록 배양액 내 propionic acid의 감소 경향과 비슷하게 3HV 함량은 감소하는 경향을 보여 배양 36hr 이후 \( 8.9 \% \) 의 3HV를 함유한 PHBV가 생합성됨을 확인할 수 있었다.</p>