세포생존율은 시험액을 처리한 세포의 생존율을 측정하는 Carmichael 방법을 이용하여 평가하였다. 세포 생존율 측정은 처리되지 않은 대조군 세포의 흡광도를 샘플로 처리된 세포의 흡광도와 비교하여 수행됩니다. \(100\%\) 값은 샘플 처리 그룹의 상대적인 세포 생존율을 나타내기 위해 할당되며 항체는 1:500의 비율로 희석하고 TBST의 3% 탈지유에 희석하였다. 샘플을 \( 3 \% \) skim milk in TBST에 희석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 over night한 후 항체를 1:2,000의 비율로 희석하고 실온에서 90분 동안 배양하였다. 그런 다음 Davinch-Chemi \( { }^{\mathrm{TM}} \) Imager CAS-400SM system을 이용하여 밴드를 확인하였다.
<h2>세포 배양</h2> <p>본 연구에서 사용된 섬유아세포인 CCD-986Sk는 \( 10 \% \) FBS와 \( 1 \% \) penicillin/streptomycin \( (100 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) \) 을 첨가한 DMEM 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 온도와 \( 5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 조건의 incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.</p> <h2>MTT assay에 의한 세포 생존율 측정</h2> <p>시험용액 처리에 따른 세포 생존율 측정은 Carmichael 의 방법에 따라 실시하였다. 96-well plate에 CCD-986Sk cell을 \( 1 \times 10^{6} \) cells/well이 되도록 \( 200 \mu \mathrm{l} \) 씩 분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) incubator에서 24 시간 배양하였고, 농도별로 희석한 시료용액을 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 씩 첨가하여 동일 조건에서 24 시간 동안 배양하였다. 여기에 MTT 용액을 \( 2.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 농도로 제조하여 \( 40 \mu \mathrm{l} \) 씩 첨가하여 3 시간 배양하였다. 그 후 배양액을 제거하고 형성된 formazan에 DMSO \( 100 \mu \mathrm{l} \) 씩 각 well에 가하여 실온 조건에서 10 분간 반응시킨 뒤 ELISA reader를 이용해 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율 측정은 시료를 처리하지 않은 구의 흡광도를 \(100\%\)로 하여 시료첨가구의 상대적인 세포 생존율을 나타내었다.</p> <p>세포 생존율 \( (\%)=( \) 시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도) \( \times 100 \)</p> <h2>Western blot을 통한 단백질의 발현 측정</h2> <p>주름 생성과 관련된 MMPs (MMP-1, MMP-2, MMP-3)에 대한 항주름 활성을 알아보기 위해 Western blot을 통한 단백질 발현 정도를 알아보았다. 섬유아세포인 CCD-986 Sk cell을 \( 100 \mathrm{~mm} \) tissue culture dish에 \( 1 \times 10^{6} \) cells/dish가 되도록 seeding한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) incubator에서 24시간 동안 배양하였으며, 배지를 제거한 후 각 추출물을 농도별로 처리한 배지로 24 시간 배양하였다. 그 후 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척하여 다음 과정을 진행하였다. Complete mini 1 tab을 radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer \( 10 \mathrm{ml} \) 에 가한 용액 \( 80 \mu \mathrm{l} \) 를 각 dish에 분주하여 세포를 lysis한 후 centrifuge를 이용해 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(13,200 \mathrm{rpm} \) 에서 20 분간 원심 분리하였다. 그 후 BCA protein assay kit를 사용해 상층액을 정량하였으며, \( 20 \mu \mathrm{l} \) 단백질을 \( 10 \% \) SDS-PAGE 상에서 전기영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane에 transfer한 후 blocking buffer (\(5\%\) skim milk in TBST)에 1 시간 동안 blocking 을 진행하였다. Primary antibody를 1:500의 비율로 \( 3 \% \) skim milk in TBST에 희석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 over night한 후, 10 분 간격으로 tris-buffered saline and tween 20 (TBST) 로 3회 세척하였다. Secondary antibody는 1:2,000으로 희석하여 실온에서 90 분간 반응시켰으며 다시 TBST로 10 분씩 3회 세척하여 Davinch-Chemi \( { }^{\mathrm{TM}} \) Imager CAS-400SM system을 이용하여 밴드를 확인하였다.</p>