Huh7 cell에 IFN-\(\alpha\)를 100 unit으로 처리하고 24시간 후 total RNA를 isolation하여 RT-PCR을 수행하여 PCR product를 pcDNA3의 BamHI, XhoI site에 cloning하였다. Rabbit reticulocyte를 이용한 In vitro transcription/translation(TNT)과 reporter assay를 통해 cap dependent translation과 HCV IRES mediated translation에 대한 IFN의 효과를 확인하였고 Lipofectamine \(2000 \) (Invitrogen)을 사용하여 transfection 하였다.
<p>p56 gene을 얻기 위하여 Huh7 cell에 IFN- \( \alpha \) (Sigma)를 \(100 \) unit이 되도록 처리하였고, \(24 \) 시간 후에 앞서와 같은 방법으로 cell을 깨서 total RNA를 isolation 하였고 oligoT primer를 이용하여 같은 방법으로 RT-PCR을 수행하였나. 이렇게 얻어진 PCR product를 pcDNA3의 BamHI, XhoI site 에 cloning 하였다.</p> <p>Rabbit reticulocyte를 이용한 In vitro transcription/translation(TNT)과 reporter assay</p> <p>본 연구에서는 cap dependent translation과 HCV IRES mediated translation에 있어서 IFN의 효과를 보기 위하여 dual luciferase plasmid른 reporter로 하여 assay를 수행하였다. 이 plasmid를 promoter 뒤로 각 gene이 renilla luci-ferase gene, HCV IRES, firefly luciferase gene 순서로 cloning 되어 있어 translation 시 promoter 바로 뒤에 위치한 renilla luciferase gene은 cap mediated translation이 일어나고 firefly luciferase gene은 바로 앞의 \( \mathrm { HCV } \) IRES에 의해 translation이 일어난다. Plasmid DNA(total \( 1.5 \mu \mathrm { g } ), 1 \) \( \mathrm { mM } \) Methionine \( 1 \mu \mathrm { L } \), rabbit reticulocyte(Promega) \( 20 \mu \mathrm { l } \), nuclease free water룬 반응액으로 넣고 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 90분간 incubation 하였나. 반응액 \( 20 \mu \mathrm { L } \)에 firefly luciferase sub-stratc(Dual-lucifcrase \( { } ^ { (1) } \) Reporter assay system, Promcga)를 \( 80 \mu \mathrm { L } \) 넣어준 후 luminometer(Packard Fusion)로 delay time \(1 \)초, counting time \(10 \)초로 하여 firefly luciferase activity를 측정하였으며 측정 후 이 mixture에 바로 Stop \& \( \mathrm { Glo } ^ {\infty } \) substrate(Dual-luciferase \( { } ^ {\infty } \) Reporter assay system, Promega) \( 80 \mu \mathrm { L } \)를 넣고 Renilla luciferase activity를 측정하였다.</p> <p>Hepatoma cell line으로의 transient transfection과 reporter assay</p> <p>Transfection 하기 전 날 Huh7 cell을 \(6 \) well plate에 well당 \( 1 \times 10 ^ { 6 } \) cell로 심고 \(24 \)시간 후에 Lipofectamine \(2000 \) (Invitrogen)을 사용하여 transfection 하였다. Lipofectamine 2000을 serum free media로 dilution 하여 \(5 \) 분 후 준비한 DNA와 섞어서 상온에 \(20 \) 분 방치하였고 이 mixture를 곧바로 Huh7 cell에 뿌려주었다. DNA는 pR/HCV/F, pcDNA4-NS5B, pcDNA-p56, pcDNA3, pcDNA-GST를 사용하였으며 \(48 \) 시간 후에 assay를 하였다. Well 내의 media를 제거한 후 1X PBS로 wash한 후에 \( 1 \mathrm { X } \) passive lysis buffer(Pro-mega)를 각 well당 \( 500 \mu \mathrm { L } \)씩 넣어준 후 실온에서 \(15 \) 분간 rocking 하였다. Cell lysate \( 20 \mu \mathrm { L } \)에 luciferase assay sub-strate(Dual-luciferase \( { } ^ { ( } \)Reporter assay system, Promega)을 \( 80 \mu \mathrm { L } \) 넣어준 후 Luminometer (Packard Fusion)로 fireflyluciferase activity를 측정하였으며 측정 후 이 mixture에 바 로 Stop \& Glo \( ^ {\circledast } \) substrate(Dual-luciferase \( { } ^ {\circledR } \) Reporter assay system, Promega) \( 80 \mu \mathrm { L } \)를 넣고 Renilla luciferase activity를 측정하였다.</p>