본 논문에서는 분리균의 생리적, 생화학적 특성을 조사하였다. 형태적 특징은 투과전자현미경으로 확인하고 Gram 양성/음성은 Gram stain kit를 사용하여 판정하였다. 온도가 분리균의 생육에 미치는 영향은 TSA 배지에 분리균을 도말한 후 배양하여 조사하였고, 신진대사능인 생화학적 특성은 Bacillus ID kit와 VITEK 2 system을 사용하여 검사하였다. 분리된 genomic DNA를 주형가닥으로 중합효소연쇄반응을 실시한 후 분리균의 16S rDNA 염기서열을 분석했고 Nakano 방법에 따라 분리균이 생성하는 항균물질을 분리하였다.
<h2>분리균의 생리적 특성 및 생화학적 특성 조사</h2> <p>최종 선발된 균주는 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 36시간 동안 배양한 다음 \( 1 \% \) phosphotungstic acid로 negative stain한 후 투과전자현미경(JEM 1010, Germany)으로 형태적 특징을 확인하였으며 Gram 양성/음성은 Gram stain kit (BD, USA)를 사용하여 염색한 후 현미경으로 관찰하여 판정하였다. 온도가 분리균의 생육에 미치는 영향은 TSA 배지에 분리균을 도말한 후 \(10, 20, 30, 40, 50, 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 2일 동안 배양하면서 조사하였으며 분리균의 신진대사능인 생화학적 특성은 Bacillus ID kit (Microgen \( { } ^ {\mathrm { TM } } \), UK)와 VITEK 2 system (bioMérieux, USA)을 사용하여 조사하였다.</p> <h2>분리균의 16S rDNA 염기서열 분석</h2> <p>최종 선발된 분리균의 분자생물학적 동정을 위해 분리균의 genomic DNA를 i-genomic BYF DNA extraction kit(iNtRON Biotechnology, Korea)를 사용하여 분리한 후 분리된 genomic DNA를 주형가닥으로 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction)을 수행하였다. 중합효소연쇄반응은 universal primer 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 와 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')를 사용하여 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5분간 변성시킨 뒤 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분, \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분 30초의 조건으로 30 cycle을 반복한 다음 마지막으로 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10분 동안 수행하였다. 증폭된 PCR 산물 중 1.5kb에 해당하는 단편은 PCR purification kit (Qiagen, USA)를 사용하여 정제한 다음 Macrogen (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 165 rDNA 염기서열을 분석하였으며 그 결과는 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 GeneBank database에 등록하였다(JN848829). 분석된 16S rDNA 염기서열의 상동성은 NCBI에서 제공하는 BLAST 프로그램을 이용하여 GeneBank database에 등록된 균주들의 16S rDNA 염기 서열과 계통학적 유연관계를 비교·분석하였으며 그 결과를 근거로 DNAMan analysis system (Lynnon Biosoft, Canada)에 의해 계통도를 작성하였다.</p> <h2>분리균이 생성하는 항균물질의 분리</h2> <p>Bacillus 속 균주는 대부분 펩타이드성 항균물질을 생산하므로 Nakano 등의 방법에 따라 분리균이 생성하는 항균물질을 분리하였다. 분리균을 No. 3 배지(polypeptone \( 10 \mathrm { ~g } \), glu-cose \( 10 \mathrm { ~g } ^ {\prime } , \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } 1 \mathrm { ~g } , \mathrm { MgSO } _ { 4 } \cdot 7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } 0.5 \mathrm { ~g } , \mathrm { pH } \) 6.8)에 서 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 3일 동안 배양한 다음 배양액을 원심분리하여 상등액만을 얻었다. 상등액에 6N HCl를 가하여 pH를 2.0으로 조절한 후 \( 6,000 \mathrm { rpm } \) 에서 15분 동안 원심분리하여 펠렛만을 취한 다음 메탄올에 추출하여 사용하였다. 메탄올에 추출된 산 침전물은 thin layer chromatography (TLC; silicagel 60F 254 , Merck, Germany)에서 chloroform/methanol/water (6.5 / 2.5 / 0.5)의 용매조건으로 전개한 후 \( 10 \% \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \)로 발색하여 확인하였으며 high performance liquid chromatography (HPLC; Agilent 1100 series, USA)를 이용하여 펩타이드성 항균물질을 분리하였다. HPLC 분석에 사용된 column은 C18 reverse column이며 용매는 \( 3.8 \mathrm { mM } \) trifluoroacetic acid/water \( (1 / 4 = \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \), flow rate는 \( 1 \mathrm { ml } / \mathrm { min } \)이고 흡광도는 \( 210 \mathrm { ~nm } \)에서 측정하였다. Reference 물질로 사용한 iturin A는 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) 로부터 구매하여 사용하였다.</p>