Escherichia coli BL21(DE3)와 Escherichia coli XL1 Blue는 각각 재조합 단백질 발현과 재조합 플라스미드 보관의 숙주로써 활용되었으며, pGEM T 벡터와 pET-22 벡터는 클로닝 벡터와 발현 벡터로서 기능하였다. PCR 과정에서는 전체 리파아제 단백질과 촉매활성도메인의 생산을 위해 각각 Total-lipase F, Total-lipase R, Catalytic-domain F, 그리고 Catalytic-domain R의 프라이머가 사용되었다. 생성된 세 가지의 재조합 플라스미드는 각각 E. coli BL21(DE3)에 형질전환된 후, \( 200 \mathrm{~mL} \)의 배지에 접종하여 \( 18^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주, 플라스미드 및 배양조건</h2> <p>한국생명공학연구원으로부터 사람 췌장리파아제 유전자 (6-1-A-D04, pINCY)를 구입하였다. Escherichia coli BL21(DE3) 를 재조합 단백질 발현의 숙주로, Escherichia coli XL1 Blue를 재조합 플라스미드의 보관 숙주로 사용하였고, pGEM T 벡터와 pET-22 벡터를 클로닝 벡터와 발현 벡터로 각각 사용하였다. 형질전환 E. coli BL21(DE3)는 Luris-Bertani 배지 \( (10 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 트립톤, \( 5 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 효모추출물, \( 5 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 염화나트륨) 에서 암피실린 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 을 첨가한 후, \( 18^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하였다. 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위해서 배지에 이소프로필- \( \beta \)-D-치오갈락토피라노시드(thiogalactopyranoside isopropyl- \( \beta \)-D-thiogalactopyranoside, IPTG)를 최종농도가 1 \( \mathrm{mM} \)이 되도록 첨가하였다.</p> <h2>발현 플라스미드 구축</h2> <p>사람 췌장리파아제 유전자(6-1-A-D04, pINCY)를 주형 DNA로 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR에 사용한 프라이머는 다음과 같다. 전체 리파아제 단백질을 생산하기 위해서 Total-lipase F(F1, 5'-TAGACATATGCTGCCACTTTGGACT-3′) 와 Total-lipase R(R1, 5'-TACAAGCTTACACGGTGTG-AGGGTGAG-3')을 사용하였으며, 촉매활성도메인을 생산하기 위해서 Catalytic-domain F(F1, 5'-AGACATATGCTGC-CACTTTGGACT-3')와 Catalytic-domain R(R2, 5'-GCC-AAGCTTTGCAAAATTACTGGCATC-3')을 사용하였다. 코리파아제 결합도메인을 생산하기 위해서 Colipase-binding-domain F(F2, 5'-CTCCATATGCGTTGGAGGTATAAGGTA-3') 와 Colipase-binding-domain R(R1, 5'-TACAAGCTTACA-CGGTGTGAGGGTGAG-3') 을 사용하였다.</p> <p>PCR 반응조건은 다음과 같다. 초기 DNA변성을 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 수행하고 변성 (\( 95^{\circ} \mathrm{C} \), 1분), 냉각 (\( 41^{\circ} \mathrm{C} \), 1분), 합성 반응 (\( 72^{\circ} \mathrm{C} \), 1분)을 30회 반복하였다. 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 합성반응을 수행하였다. 전기영동을 통해서 PCR 반응을 통해 합성된 3가지 DNA를 크기에 따라 분리하고 AxyPrep DNA gel extraction kit(Axygen Scientific, Inc., Union City, CA)를 사용하여 3가지 DNA를 젤로부터 각각 추출하였다. pGEM T벡터를 사용하여 3가지 DNA를 각각 클로닝한 후, Ndel과 HindIII 제한효소로 처리하여 pET22b의 T7 프로모터 후위에 서브클로닝하였다.</p> <h2>재조합 단백질의 발현</h2> <p>제조된 3종류의 재조합 플라스미드를 각각 E. coli BL21 (DE3) 균에 형질전환 시킨 후 \( 200 \mathrm{~mL} \) 배지에 접종하여 \( 18^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다. 흡광도 \( (600 \mathrm{~nm}) \) 가 0.5로 중가될 때까지 진탕배양기 \( (230 \mathrm{rpm}) \)에서 배양한 후, IPTG를 최종 농도가 1\( \mathrm{mM} \)이 되도록 첨가하고, 20시간 동안 발현유도배양을 수행 하였다. 배양액을 원심분리 \( (5,000 \times \mathrm{g}, 10 \) 분 \( ) \)하여 균체를 모은 후, 인산완충액 \( (10 \mathrm{mM}, \mathrm{pH} \) 7.5) \( 5 \mathrm{~mL} \)로 현탁하였다. 현탁된 균체를 초음파분해법을 통해 파쇄한 후, 원심분리 \( (10,000 \times \mathrm{g}, 10 \) 분 \( ) \)를 통해 세포추출액과 침전물을 각각 얻었다. 침전물은 동일 부피 \( (5 \mathrm{~mL}) \)의 증류수에 현탁하여 사용하였다.</p>