DMSO와 STC 및 STD를 첨가하여 수확한 세포를 PBS 완충용액으로 세척한 후 유세포분석기를 사용하여 Mitochondrial Membrane Potential을 측정하였다. 그리고 원심 분리를 통해서 세포질과 미토콘드리아 단백질을 추출하고 western blot 분석을 진행하였다.
<h2>Mitochondrial Membrane Potential (MMP; \( \Delta \psi m \) ) 측정</h2> <p>\( 0.1 \% \) DMSO와 \( 0.5 \mu \mathrm{M} \) STC 및 \( 1.0 \mu \mathrm{M} \) STD를 첨가하여 반응시킨 세포를 수확하여 PBS 완충용액으로 세척한 후, \(50 \mathrm{nM} \) \( \mathrm{DiOC}_{6} \)를 처리한 RPMI1640 배지를 \( 1 \mathrm{ml} \) 가하여 빛을 차단하고 30분 동안 \( 37^{ \circ} \mathrm{C} \)에 반응 후 세포를 수확하여 유세포 분석기(FACScan, Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하여 분석하였다. \( \Delta \Psi \mathrm{m} \)은 3회에 걸쳐 측정하였다.</p> <h2>세포질과 미토콘드리아 단백질의 분리</h2> <p>\( 0.1 \% \) DMSO와 \( 0.5 \mu \mathrm{M} \) STC 및 \( 1.0 \mu \mathrm{M} \) STD를 첨가하여 반응시킨 세포를 수확하여 PBS 완충용액으로 세척한 후, \( 1\mathrm{M} \) \( \mathrm{NaCl} \), \( 10 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \), \( 100 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \), \( 100 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 1 \mathrm{M} \) sucrose, \( 6.15 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) digitonin 그리고 25x cocktail이 포함된 완충용액을 첨가한 다음 잘 섞어주고, 상온에서 30분간 배양하였다. \( 13,000 \mathrm{rpm} \)에서 1분간 원심 분리하여 상층액(세포질 단백질)을 추출하고, 나머지 세포 pellet에 세포용해 완충용액을 넣어 미토콘드리아 단백질을 추출하였다</p> <h2>Western blot analysis</h2> <p>\( 0.1 \% \) DMSO와 \( 0.5 \mu \mathrm{M} \) STC 및 \( 1.0 \mu \mathrm{M} \) STD 혹은 다른 시약을 첨가하여 반응시킨 세포를 수확하여 PBS 완충용액으로 세척한 후, \( 20 \mathrm{mM} \) Tris \( (\mathrm{pH} 8.0) \), \( 137 \mathrm{mM} \mathrm{~NaCl} \), \( 10 \% \) glycerol, \( 1 \% \) NP-40, \( 10 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 100 \mathrm{mM} \mathrm{~NaF}\), \(1 \mathrm{mM} \) PMSF 그리고 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) leupeptin이 포함된 세포용해 완충용액을 첨가한 다음 \( 13,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심 분리하여 단백질을 추출하고, Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad Lab., Richmond, CA)를 사용하여 단백질 양을 측정한 다음 \( 8 \% \) 또는 \( 10 \% \) SDS-PAGE로 단백질을 분리하고, PVDF membrane (Amersham Life Science, Inc., Piscataway, NJ)에 분리된 단백질을 전사한 후, \( 5 \% \) skim milk가 첨가된 PBS-T로 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 측정하고자 하는 단백질에 대한 일차 항체로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤 동안 반응시킨 다음 membrane을 PBS-T로 세 번 세척한 후, 이차 항체인 horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG나 anti-mouse IgG로 2시간 동안 상온에서 반응시키고, 역시 PBS-T로 세 번 세척한 다음 ECL detection kit (Amersham, Buckinghamshire, UK)를 사용하여 현상하였다. 그리고 anti-B-actin antibody (Sigma, St Louis, MO, USA)를 internal control로 사용하였다.</p>