대상균주의 내성유전자발현을 조사를 목적으로 plsmid DNA에 존재하는 SHV-12 gene만을 형질전환 시켜 사용하기 위해 , LB 평판배지에서 자란 백색 집락을 선택하여 LB 액체배지에 배양시켜서 plasmid DNA를 추출하여 제한효소로 처리한 후 전기영동을 실시하였고, insert DNA의 염기서열이 T-vector promoter 발현방향으로 insertion 되었는지를 확인하였으며 double disk synergy test로 ESBL gene의 발현이 되었는지를 확인하였다.
<h2>클로닝(Cloning of SHV-12 gene)</h2><p>대상균주의 plsmid DNA에 존재하는 SHV-12 gene만을 Teasy Vector System I(Promega, USA)를 사용하여 E. coli DH 5\( \alpha \)에 형질전환 시켜서 내성유전자발현을 조사하였다. Cloning insert 준비를 위한 PCR primer는 Bioneer (Korea) 사에 의뢰하여 제작하였으며 각각의 primer는 Table 1에 나타내었다. PCR amplification은 Mycycler \( { }^{\mathrm{PM}} \) ThermalCycler (Bio-rad. USA)를 사용하였다. PCR의 생성물을 전기영동 후 band를 확인하였고, gel로부터 원하는 DNA band를 잘라내어 QIAquick Gel extraction Kit (QIAGEN, Germany)를 사용하여 DNA를 정제하였다. Teasy vector \( 0.5 \mu \mathrm{l}\)를 넣은 E-tube에 상기에서 정제한 DNA \( 1.5 \mu \mathrm{l} \)를 넣고 \(10\times\)ligation buffer [\( 500 \mathrm{mM}\) Tris-HCI \(\mathrm{pH} 7.8\), \(100\mathrm{mM} ~\mathrm{MgCl_2}\), \(200 \mathrm{mM} \) DTT (dithiothreitol), \( 10 \mathrm{mM} \) ATP] \( 2.5 \mu \mathrm{l}\) 와 ligase \( 0.5 \mu \mathrm{l} \) \( (5 \mathrm{U}) \) 를 넣은 후 \( 22^{\circ} \mathrm{C} \) water bath에 30 분 동안 반응시켰다. 이렇게 제작한 ligation mixture DNA \( 5 \mu \mathrm{l}\) 를 competent cell (E. coli DH5a) \( 100 \mu \mathrm{l}\) 에 첨가한 후 vortexing하였다. 이것을 얼음 위에 30 분 동안 보관한 후 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) water bath에 30 초 동안 tube를 넣어두었다. Heat shock 직후 2 분 동안 얼음에 tube를 보관 한 뒤 LB 액체배지 \( 900 \mu \mathrm{l}\) 씩 첨가하고, \(37^{\circ} \mathrm{C} \) shaking incubator에 약 1 시간 동안 배양시켰다. Ampicillin 항생제 \( (100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 가 함유되어 있는 LB 평판배지에 X-Gal (\( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{ml})\) \(20 \mu \mathrm{l} \) 를 도말한 후 배양액 \( 20 \mu \mathrm{l}\) 씩 분주하여 도말 하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 18 시간 이상 배양하였다.</p><p>LB 평판배지에서 자란 백색 집락을 선택하여 LB 액체배지에 배양시켜서 plasmid DNA를 추출하여 제한효소 PstI으로 처리한 후 전기영동을 실시하여 insert DNA의 염기서열이 T-vector promoter 발현방향으로 insertion 되었는지를 확인하였다. 또한 항생제 감수성 검사와 생화학 검사를 실시하여 균의 특성을 확인하였으며, 특히 double disk syn-ergy test로 ESBL gene의 발현이 되었는지를 확인하였다.</p>