R. glutinis EH 단백질이 잘 발현됐는지 판단하기 위해 double expression cassette를 제작하고, P. pastoris을 배양하고 methanol로 단백질 발현을 유도한 후 SDS-PAGE 전기영동 및 면역학적 검색을 실행하였다. 또한 P. pastoris를 이용한 styrene oxide를 분해한 초기가수분해속도를 평가하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>R. glutinis EH 유전자를 가지는 double expression cassette 발현벡터 제작</h2> <p>효모 발현에 이용되는 vector에는 숙주세포 내에 plasmid DNA 형태로 존재하는 vector와 숙주세포의 염색체내에 상동성재조합 방식으로 삽입되는 vector들이 있다. 효모 중에서도 P. pastoris에 사용되는 발현 vector들은 대부분 숙주세포 염색체의 AOX promoter 부위 \( \left(\mathrm{P}_{\mathrm{AOXI}}\right) \) 또는 HIS 유전자 부위에 상동성재조합이 일어나 외래유전자가 삽입되도록 제작된 vector들이다. 본 연구에서는 Fig. 1 에서와 같이 pPICZ vector DNA 내에 \( \mathrm{ P }_{\mathrm{ AOxI }}-\mathrm{ RgEH }-\mathrm{TT}_{\mathrm{AOX} 1} \) expression cassette가 두 번 들어가도록 벡터를 제작하여, 숙주세포에서 RgEH 유전자가 두 배로 전사될 수 있도록 의도하였다. Double expression cassette를 제작하기 위해서 PCR 방법으로 BglII 자리를 돌연변이 시켰으며 Fig. 2와 같이 확인하였다. B panel의 lane 2에서와 같이 주형으로 사용하였던 pPICZ B/ RgEH #2의 경우, BamHI로 절단하였을 때 \( 4.6 \mathrm{~kb} \) band가 보였으나 BglII으로 절단하면 C panel의 lane 2에서와 같이 \( 2.6 \) \( \mathrm{kb} \) 와 \( 2 \mathrm{~kb} \) band 를 볼 수 있었으며 이는 RgEH 유전자내에 BglⅡ 자리가 있기 때문이다. BglII 자리를 돌연변이 시킨 pPICZ C/ RgEH mut (single)는 C panel의 lane 3 에서와 같이 BglII로 제한하면 \( 4.5 \mathrm{~kb} \) 의 band만 보여 돌연변이 된 것을 확인할 수 있었다. BglII 및 BamHI 를 이용하여 pPICZ C/ RgEH mut 로부터 \( \mathrm{P}_{\mathrm{AOXI}}-\mathrm{RgEH}-\mathrm{TT}_{\mathrm{AOX1}} \) 가 들어 있는 \( 2.6 \) \( \mathrm{kb} \) 정도의 DNA 조각을 잘라내어 BamHI으로 잘라 선형으로 만든 single copy plasmid DNA (linearlized pPICZ C/ RgEH mut (single)) 에 삽입시켜 얻은 pPICZ C/ RgEH (double) 의 경우 BglII 와 BamHI로 제한하였을 때 D panel의 lane 4 에서와 같이 \( 5.2 \mathrm{~kb} \) 및 \( 1.9 \mathrm{~kb} \) 조각으로 절단되었으므로 올바른 방향으로 double expression cassette plasmid DNA가 제작되었음을 확인할 수 있었다.</p> <p>R. glutinis EH 단백질이 제대로 발현되었는지 확인하기 위하여 double expression cassette 재조합 P. pastoris 및 single expression cassette 재조합 P. pastoris을 배양하고 methanol로 단백질발현을 유도한 후 SDS-PAGE 전기영동 및 면역학적 검색을 실행하였다. Fig. 3A에서와 같이 Coomassie Blue로 염색한 SDS-PAGE 전기영동 gel에서는 pPICZ C vector, pPICZ B/RgEH (single) 및 pPICZ C/ RgEH (double) (double)이 삽입된 재조합균주들 사이에서 RgEH 단백질(46 kDA) 의 발현의 차이를 확인할 수 없었으나 면역학적 검색법으로는 pPICZ C/RgEH (double) 재조합균주에서 RgEH 단백질이 발현이 되었음을 확인할 수 있었다. E. coli를 숙주세포로 사용하는 경우 plasmid DNA의 자가복제로 발현시키고자 하는 단백질을 세포 전체 단백질의 약 \( 30 \% \) 이상 발현시킬 수 있으나 불용성으로 발현되는 경우가 많은 반면 염색체에 상동성재조합으로 삽입되는 P. pastoris의 경우 발현양은 적으나 알맞은 접힘으로 인한 활성형 단백질로 발현된다. 적은 양의 단백질 발현을 검색하기 위하여 Fig. 3B 에서 각 lane에 사용한 단백질의 양은 Fig. 3A에 사용한 단백 질의 양보다 6 배가 많은 양이었다. Fig. 3B에서와 같이 double ex-pression cassette로 발현시킨 재조합균주가 single expression cassette로 발현시킨 pPICZ B/ RgEH 보다 훨씬 더 진한 band를 볼 수 있는 것은 double expression cassette 로 제작되어서 이기도 하지만 시작 codon 앞쪽에 Kozak sequence를 넣어서 제작한 것도 발현량을 향상시켰을 것이다.</p> <h2>Double expression cassette 재조합 P. pastoris를 이용한 styrene oxide의 동력학적 가수분해</h2> <p>Fig. 4는 double expression cassette 재조합 P. pastoris를 이용하여 광학활성 이성질체인 (R)- 및 (S)-styrene oxide를 분해한 초기가수분해속도를 평가한 결과이다. 두 이성질체에 대한 가수분해속도는 낮은 농도에서 직선으로 높아지다가 점차 일정한 최대속도가 되는 Michaelis-Menten 속도식을 따르는 것으로 나타났다. 최대속도 \( \mathrm{V}_{\max } \) 와 Michaelis 상수인 \( \mathrm{K}_{\mathrm{m}} \) 값은 Lineweaver-Burke plot으로부터 구하였다. Double copy 재조합 P. pastoris의 경우, (R)-styrene oxide에 대한 \( V_{\max } \) 와 \( K_{m} \) 은 \( 2.2 \mu \mathrm{mol} \mathrm{min}^{-1}(\mathrm{mg} \mathrm{dcw})^{-1} \) 및 \( 3.2 \mathrm{mM} \) 이었으며 (S)-styrene oxide에 대한 \( \mathrm{V}_{\max } \) 와 \( \mathrm{K}_{\mathrm{m}} \) 은 \( 1.3 \mu \mathrm{mol} \) \( \min ^{-1}\left(\mathrm{mg} \mathrm{dcw}^{-1}\right. \) 및 \( 3.7 \mathrm{mM} \) 이었다. 전보에 보고한 single copy 재조합 P. pastoris의 경우 \( 358.4 \mathrm{nmol} \mathrm{min}{ }^{-1}(\mathrm{mg} \mathrm{dcw})^{-1} \) 와 비교하면 double copy 재조합 P. pastoris의 (R)-styrene oxide에 대한 \( \mathrm{V}_{\max } \) 값이 약 6 배 향상되었다. Single copy 재조합인 경우 (R) - 및 (S)-styrene oxide에 대하여 \( \mathrm{K}_{\mathrm{m}} \) 이 각각 4.7과 \( 7.3 \mathrm{mM} \) 이었으며, double copy 재조합 P. pastoris도 (R)- 및 (S)-styrene oxide에 대하여 각각 3.18과 \( 3.65 \) \( \mathrm{mM} \) 로 single copy 재조합 P. pastoris와 유사한 수준을 보였다. \( \mathrm{K}_{\mathrm{m}} \) 은 발현된 EH 효소의 고유한 특성이므로 발현량에 관계없이 유사한 값을 보인 반면, \( \mathrm{V}_{\max } \) 값은 생촉매의 양에 비례하기 때문에 double expression cassette를 삽입시키므로서 발현효율을 높인 생촉매가 보다 높은 값을 보임을 알 수 있다.</p>