의 발현 정도를 Egr-1 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅법으로 Egr-1의 단백질 변화량을 분석하였다. 웨스턴 블롯팅을 위해서\( \mathrm{HCT} 116 \) 세포를 60-mm 배양접시에 분주하고, DMEM 세포배양액에서 배양한 후, 암세포에 처리하였으며 PMA를 양성 대조군으로 이용했으며, GAPDH 항체는 SDS-PAGE 젤에 첨가한 시료의 단백질 양을 상대적으로 보정하기 위하여 사용된다. 영양 세균의 생화학적 분류, 동정을 위해 API 20NE, ID 32GN, API ZYM kit를 이용하였으며 시험균을 메뉴얼에 따라 반응시킨뒤, API사의 웹 database를 통해 분석했다.
<h2>Western blotting</h2> <p>Egr-1의 발현 정도는 Egr-1 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅법으로 Egr-1의 단백질 변화량을 분석하였다. 웨스턴 블롯팅을 실시하기 위하여 \( 5 \times 10^{5} \) 개의 인간 대장암 세포주인 \( \mathrm{HCT} 116 \) 세포를 60-mm 배양접시에 분주하고 10% 소의 혈청이 첨가된 DMEM(Dubcco's modified eagle's medium) 세포배양액에서 24 시간 배양한 후, 각각의 균주 배양액 2 \( \mu \mathrm{L} \) 를 암세포에 처리하였다. 이때 Egr-1의 발현을 증가시킨다고 알려져 있는 \( 20 \mathrm{nM} \) PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)를 양성 대조군으로 사용하였다. 처리 1 시간 후 원심 분리하여 세포를 수확하고, \( 1 \% \) Triton X-100, \( 0.15 \mathrm{M} \mathrm{NaCl} \), \( 50 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}, 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 10 \% \) glycerol이 함유된 세포용해 완충액으로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응시킨 후, \( 15,000 \times \mathrm{g} \)에서 15 분간 원심분리하여 세포질 용액을 추출하였다. 15 \( \mu \mathrm{g} \) 의 세포질 용액을 8% SDS-polyacrylamide(SDS-PAGE) 겔에서 전기영동하고, 분리된 단백질을 Hybond \( { }^{\mathrm{TM}}-\mathrm{P}( \) Amersham Biosciences Co.) 막에 전기적으로 부착시킨 후, \( 5 \% \) 탈지분유에 30 분간 반응시켰다. Egr-1을 특이적으로 인지하는 항체(Santa Cruz Biotechnology Co)를 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 의 농도가 되도록 희석한 후, 단백질이 이동 부착된 막에 각각 첨가하여 상온에서 2시간 이상 반응시켰다. GAPDH 항체(Santa Cruz Biotechnology Co.)는 SDS-PAGE 젤에 첨가한 시료의 단백질 양을 상대적으로 보정하기 위하여 사용하였다. \( 25 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} 7.5), 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 0.05 \% \) Tween-20이 함유된 TTBS 완충액으로 10 분간 3회 세척 후, 고추냉이 페록시 다아제(Horseradish peroxidase)가 결합되어 있는 anti-rabbit \( \mathrm{IgG} \) 항체를 가하고 1 시간 30 분 동안 반응시켰다. TTBS 완충액으로 10 분간 5 회 세척 한 후 ECL(enhanced chemilu-minescence; Amersham-Pharmacia Biotechnol. Co.) 기질 용액을 1 분간 처리한 후 \( \mathrm{X} \)-선 필름에 노출시켜 세균 배양액에 의해 발현되는 Egr-1 단백질 양을 분석하였다.</p> <h2>생화학적 분석에 의한 균 동정</h2> <p>선발된 저 영양 세균의 생화학적 분류, 동정을 위해 상업적으로 생산되는 API 20NE, ID 32GN, API ZYM kit를 이용하였다. 또한, 선발된 길항균의 생리, 생화학적 실험을 위한 표준균주로써 2003년 본 연구원에서 신종으로 최초로 보고한 Pseudomonas koreensis(KACC10848)를 한국 농업미생물자원센터 \( (\mathrm{KACC}) \) 로부터 분양 받아 사용하였다. tryptic soy 고체배지에 시험균을 streaking하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 키운 균의 집락을 한 loop씩 따서 \(0.85 \% \mathrm{NaCl} 40 \mathrm{~mL} \) 에 현탁하여 각 키트 plate에 제공된 매뉴얼에 따라 반응시킨 뒤, 그 생화학적 반응 결과를 API사에서 제공하는 웹(www.API.com)의 database를 통해 분석하였다.</p>