세포배양을 위해 PPAECs을 Kim 방법에 따라 소화시켜 분리하였고 항체를 이용한 면역형관 염색방법으로 확인한다. 이후 혈관내피세포의 발아 Assay를 진행하고, 분비된 MMPs에 대한 Enzyme lmmunoassay를 측정한다. MMPs 및 플라스민의 기질 분해 활성을 위해 젤라틴과 피브린을 이용해 진행 한 뒤 유의성은 Student-NewmanKeuls test로 검사한다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약</h2> <p>재조합 hFGF-2와 \( \alpha_{2} \)-antiplasmin은 R & D System (Minneapolis, MN)로부터 구입하였다. MMPs 및 플라스민 스탠다드는 Cal-Biochem (La Jolla, CA)과 Boehringer Mannheim (Mannheim, Germany)으로부터 구입하였으며 MMP-1, MMP-2, MMP-3와 MMP-9 enzyme immunoassay 키트는 Fuji Chemical Industries (Toyama, Japan)로부터 구입하였다. BB94는 British Biotechnology (Oxford, UK)로부터 구입하였고, IS20I는 Dupont Pharmaceuticals (Bilerica, MA)로부터 구입하였다. 배지 및 혈청은 Life Technology Inc. (Gaitherburg, MD)로부터, 그외 특별히 적시하지 않은 시약은 Sigma사(St. Louis, MO) 로부터 구입하여 사용하였다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>Porcine pulmonary artery endothelial cells (PPAECs)은 Kim 등의 방법에 따라 porcine pulmonary artery를 collagenase로 소화시켜 분리하였으며, 배양된 세포가 내피세포에서 유래됐다는 것은 anti-von Willebrand factor 항체를 이용한 면역형광 염색방법으로 확인하였다. 이렇게 얻어진 혈관내피세포를 \(20\%\) FBS (v/v) 첨가 Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건으로 배양하였다. 본 연구에 사용된 primary 세포의 계대 수는 \( 2 \sim 6 \) 사이였다.</p> <h2>혈관내피세포의 발아 Assay</h2> <p>혈관내피세포의 발아 assay는 Kim 등의 방법을 따라 행하였다. 즉, PPAECs 세포를 microcarrier beads (직경 \(175 \mu \mathrm{m} \); Sigma)상에서 융합상태로 성장시킨 다음 \( 2.0 \% \) 의 FBS와 지시된 만큼의 FGF-2 및 시약이 포함된 \( 2.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) fibrinogen 젤에 방치시켰다. 피브린 젤을 DMEM 배지에서 24시간마다 동량의 FGF-2 및 지시된 시약을 첨가하면서 배양한 다음, 3일째에 도립현미경을 이용하여(100X) 발아된 세포의 수를 세었다.</p> <h2>분비된 MMPs에 대한 Enzyme lmmunoassay</h2> <p>PPAECs 세포를 24-well plate에 세포밀도가 \( 5 \times 10^{4} \) cell/ \( \mathrm{cm}^{2} \) 이 되도록 접종한 다음, \( 20 \% \) FBS (v/v) 첨가 DMEM 배지에서 24시간 배양한 후 융합된 PPAECs 세포를 무-혈청 및 무-phenol red 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 세포를 새로운 배지로 세척한 다음 대조완충용액 혹은 지시된 시약을 지정된 시간만큼 처리하였다. 분비된 MMPs의 실제양은 제조회사의 지시에 따라 enzyme immunoassay 키트(Fuji Chemical Industries, Toyama, Japan)로 측정하였다.</p> <h2>Zymography</h2> <p>MMPs 및 플라스민의 기질 분해 활성은 젤라틴 및 피브린 zymography를 행하여 확인하였다. PPAECs 세포를 24well plate에 세포밀도가 \( 5 \times 10^{4} \mathrm{cell} / \mathrm{cm}^{2} \) 이 되도록 접종한 다음, \( 20 \% \mathrm{FBS}(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 첨가 DMEM 배지에서 24시간 배양하였다. 이후, 새로운 배지로 세척한 다음 PPAECs 세포를 무혈청 및 무-phenol red 배지에서 대조완충용액 혹은 FGF-2 및 지시된 시약을 처리한 후 12시간 동안 배양하였다. 젤라틴 zymography는 MMPs의 기질인 젤라틴을 SDS-PAGE의 running 젤에 첨가한 후 환원조건에서 전기영동한 다음 \( 1 \% \) Triton X-100 완충용액에서 재변성시킨 후 배양 완충용액 (\(0.05 \mathrm{M}\) Tris- HCl, \(\mathrm{pH} 7.5\), \( 0.02 \mathrm{M} \mathrm{~NaCl}\), \(5 \mathrm{mM} \mathrm{~CaCl} \) 와 \( 0.02 \% \) Brij-35)에서 16시간 반응시켰다(\(37^{\circ} \mathrm{C} \)). 이후 \( 0.5 \% \) Coomassie brilliant blue R250으로 3시간 염색시킨 다음, \( 10 \% \) acetic acid, \( 30 \% \) 메탄올에서 투명한 밴드가 나타날 때까지 탈색시켰다. 플라스민 활성은 기질로서 피브린을 첨가하여 피브린 zymography를 행하여 확인하였다.</p> <h2>Western hybridization</h2> <p>단백질을 \( 10 \% \) SDS-polyacrylamide 젤 상에서 분리한 다음, nitrocellulose 막으로 옮긴 후, 막을 \(2\%\) skim milk 함유 TBS 완충용액에 넣어 막의 비특이성 부위들을 차단하였다. 완충용액을 제거한 다음, 막을 anti-integrin Mac-1 (eBioscience, San Diego, CA)을 이용하여 제조회사의 지시에 따라 immunoblotting을 행하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>자료는 평균 \( \pm \mathrm{SD} \) 로 나타냈으며, 유의성은 Student-NewmanKeuls test에 의한 one-way ANOVA를 이용하여 검사하였다. 통계적 유의성은 \( P<0.05 \) 를 기준으로 하였다.</p>