물푸레나무과에 속하는 올리브 나무는 열매를 절여 먹거나 기름으로 만들어 사용하는 것으로 잘 알려져 있다. 뿐만아니라 올리브 잎의 지표성분인 oleuropein는 항산화, 항노화, 항염증, 항암, 항바이러스 활성, 항미생물과 항죽상동맥혈증와 혈당 저하 효과, 지질 저하 효과, 피부 보호 효능이 있다고 보고되어진다. 본 연구에서는 부가가치가 높은 올리브 잎 표준화를 목적으로 올리브 잎 추출물 대사체 확보를 위해 UPLC-QTOF/ \( \mathrm{MS} \)를 사용해 실험하였다. 또한 ultra-performance liquid chromatography to photodiode array (UPLC-PDA)와 charge of aerosol detector (CAD) 검출기를 이용하여 분석하고 이를 바탕으로 oleuropein 함량이 표시된 상업용 올리브 잎 추출물 분말 10 종에 대해 지표성분 oleuropein 정량분석을 진행하여 품질관리를 실시하였다.
<h1>상업용 올리브 잎 추출물의 화합물 특성과 이들의 oleuropein 함량 비교분석</h1> <h2>서 론</h2> <p>올리브 나무(Olea europaea L.)는 물푸레나무과(Oleaceae)에 속하며 열매를 절여 먹거나 압착을 하여 기름으로 만들어 사용하는 것으로 잘 알려져 있다. 올리브 열매는 주로 지중해 지역에서 많이 소비 되고 있으며 전세계적으로도 19-20년 소비량은 약 \( 3,234,000 \) 돈으로 전년대비 \( 5.8 \% \) 가 상승된 값으로, 점점 소비량이 늘어나는 추세이다. 이러한 세계적인 소비로 인해 연간 약 3 백만톤 이상의 올리브 열매가 수확되는데, 열매 \( 1.25 \mathrm{~kg} \)가 수확 되는 기준으로 약 \( 25 \mathrm{~kg} \) 의 올리브 잎이 부산물로 생산된다. 올리브 잎은 동물의 기능성 사료의 원료로 사용되고 있으며 건조하여 차의 형태로 이용되고 있다. 또한 올리브 잎의 주정 추출물은 화장품의 원료로 쓰이며 건강기능식품으로도 유통되고 있다. 국내에선 올리브 잎 주정 추출물에 대해서 기능(지표)성분을 oleuropein으로 지정하고 높은 혈압 감소에 도움을 주는 건강기능식품 기능성 원료로 인정하여(인정번호 제2006-25호, 제2014-9호) 고시하였다[4]. Michel 등의 선행연구에 따르변 올리브 잎 또한 올리브 열매에서 가지고 있는 secoiridoid, flavonoid, coumarins, triterpenic acids, caffeoyl phenyl ethanoid derivatives, phenylethanol derivatives 계열의 생리활성물질을 포함하고 있으며 항산화, 항미생물, 항바이러스, 항암 활성, 혈소판 활성화 억제 등의 셍리활성이 보고 되어있다. 올리브 잎의 지표성분인 oleuropein 또한 추출물과 유사한 항산화, 항노화, 항염증, 항암, 항미셍물, 항바이러스 활성과 항죽상동맥혈증, 지질 저하 효과와 혈당 저하 효과, 피부 보호 효과가 보고되어 있다. 올리브에 대한 대부분의 선행연구는 열매 중심으로 다양하게 보고 되어 있고 잎에 관한 연구는 잎 추출물의 셍리활성에 대한 연구가 많이 보고되고 있지만 상업용 원료 표준화에 대한 연구 부분이 상당히 미흡하였다. 본 연구에서는 부산물로 부가가치가 높은 올리브 잎 표준화를 위해 ultra-performance liquid chromatography to quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-QTof/MS)를 이용하여 올리브 잎 추출물 대사체 프로파일링과 정량성 확보를 위해 ultra-performance liquid chromatography to photodiode array (UPLC-PDA)와 charge of aerosol detector (CAD) 검출기를 이용해 신속하고 합리직인 분석법으로 정확성을 확립하고자 하였다. 또한 구축된 분석법을 바탕으로 oleuropein 함량이 표시된 상업용 올리브 잎 추출물 분말 10 종에 대해 지표성분 oleuropein 정량분석을 진행하여 폼질관리를 실시하였다.</p> <h2>재료 및 방법</h2> <h3>시약 및 기기</h3> <p>올리브 잎 추출물의 대사체 프로파일링은 ACQUITY UPLC system (Waters Co., Milford, MA, USA)과 Micromass QTof premier \( ^{\mathrm{TM}} \) mass spectrometer (Waters Co.) 검출기를 사용한 UPLC-QTof/MS를 이용하였다. 정량분석에서는 ACQUITY UPLC \( ^{\mathrm{TM}} \) system (Waters Co.)과 Corona \( { }^{\mathrm{TM}} \mathrm{veo}^{\mathrm{TM}} \) charged aerosol detector (CAD, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, \( \mathrm{MA}, \mathrm{USA} \) ) 검출기를 사용하였다. 활성 물질 oleuropein (순도 \( \geq 98 \% \) 은 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 분석시료 전 치리에서 사용된 methanol (Honeywell International Inc., Charlotte, NC, USA)은 HPLC 등급을 사용하였다. 분석에서 사용된 acetonitrile은 Merck \( \mathrm{KGaA} \) (Darmstadt, Germany)의 HPLC 등급을 사용하였고 water purification system (Milli-Q Academic, Merck Millipore, Burlington, MA, USA)를 이용하여 얻어진 증류수를 사용하였다.</p> <h3>분석시료 전처리</h3> <p>상업용으로 건조된 올리브 잎 추출물 분말 10 종(A-J)을 각각 20 \( \mathrm{mg} \) 에 \( 80 \% \) methanol \( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 비율의 혼합용액으로 15 분동안 초음파추출을 시행하여 원심분리기 \( (4,500 \mathrm{rm}) \) 로 5 분동안 침전시켜 상층액을 이용하여 분석하였다. Oleuropein의 표준정량곡선을 위해 oleuropein을 methanol에 녹여 5 개의 농도 조건 ( \( 156.25, 312.5, 625,1,250, 2,500 \mathrm{ppm}) \) 으로 표준용액을 준비하였다.</p> <h3>UPLC-QTof/MS 분석조건</h3> <p>올리브 잎 추출물의 대사체 프로파일링 분석은 UPLC-QTOF/ \( \mathrm{MS} \) 를 이용하였고 분석컬럼 ACQUTTY BEH C18 column (2.1 \( \mathrm{mm} \times 100 \mathrm{~mm}, 1.7 \mathrm{~mm} \), Waters Co.)의 역상칼럼을 사용하였다. 이동상으로는 증류수(A)와 acetonitrile (B)을 이용하여 B용매를 \( 0.0-2.0 \) 분 2-2%, 2.0-2.5분 2-10%, 2.5-13.5분 10-20%, 13.5-\( 18.0 \) 분 20-100%, 18.0-19.0분 \( 100-100 %, 19.0-19.1 \) 분 100-2%, 19.1-20.0분 2-2%으로 총 20 분 동안 유속은 \( 0.4 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \) 으로 이동상의 기울기를 주어 분석하였다. 분석컬럼 오븐은 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 를 유지하였고 시료주입량은 \( 2 \mu \mathrm{L} \) 주입하였다. Q-Tof/MS는 전기 분 무법 (Electrospray Ionization: ESI)을 이용하여 negative mode에서 실혐하였다. Ion source와 desolvation의 온도는 각각 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 와 \( 350^{\circ} \mathrm{C} \) 로 설정하였고 capillary와 cone 전압은 각각 \( 2.3 \mathrm{kV} \) 와 \( 50 \mathrm{~V} \) 로 분석하였다. 농도 \( 400 \mathrm{pg} / \mathrm{mL} \) 의 leucine-enkephalin (Sigma-Aldrich, MO, USA) \( [\mathrm{m} / \mathrm{z} 554.2615(-)] \) 을 내부 표준용액으로 사용하였고 주입 유속은 \( 2 \mu \mathrm{L} / \mathrm{min} \) 로 설정하였다. 정확한 질량값과 \( \mathrm{MS} / \mathrm{MS} \) 및 원소 조성은 기기에 통합된 MassLynx software (Waters Co.)을 사용하여 수집하였다.</p> <h3>Oleuropein 지표성분 함량분석</h3> <p>Oleuropein의 검량선을 위한 분석과 올리브 잎 추출물에서의 oleuropein의 함량분석은 UPLC-PDA-CAD를 이용하였고 분석 컬럼 ACQUITY BEH C18 column \( (2.1 \mathrm{~mm} \times 100 \mathrm{~mm}, 1.7 \) \( \mathrm{mm} \), Waters Co.)의 역싱칼럼을 사용하였다. 이동상으로는 증류수 \( (\mathrm{A}) \) 와 acetonitrile \( (\mathrm{B}) \) 을 이용하여 B용매를 \( 0.0-2.0 \) 분 2-2%, \( 2.0-2.5 \) 분 2-10%, 2.5-13.5분 \( 10-20 %, 13.5-18.0 \) 분 20-100%, 18.0-19.0분 100-100%, 19.0-19.1분 100-2%, 19.1-20.0분 2-2% 으로 총 20 분 동안 유속은 \( 0.4 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \) 으로 대사체 프로파일링 분석과 간은 이동상의 기울기조건으로 분석하였다. 분석컬럼 오븐은 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 를 유지 하였고 시료주입량은 \( 2 \mu \mathrm{L} \) 주입하였다. CAD는 gas requlation moder analytical 로 filter는 \( 1.0 \), 데이터 수집 비율은 \( 20 \mathrm{~Hz} \), control evaporator 온도는 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 로 분석하였다. Oleuropein의 5 개 농노 범위 \( (156.25-2,500 \mathrm{mg} / \mathrm{mL}) \) 안에서 3회 반복하여 UV \( 230 \mathrm{~nm} \) 파장과 \( \mathrm{CAD} \) 에서의 피크 면적 값과 oleuropein의 농노를 통해 결정계수 \( r^{2} \) 값이 \( 0.99 \) 이상인 검량선을 결정하였다. 검출한계 (limit of detection, LOD)와 정량한계 (limit of quantification, LOQ)는 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근기하는 방법으로 \( \mathrm{LOD}=3.3 \times \mathrm{S} / \mathrm{S} \) 와 \( \mathrm{LOQ}=10 \) \( \times \mathrm{s} / \mathrm{S} \) 의 식으로 결정하였다. 여기서 \( \mathrm{s}^{2} \) 반응의 표준면차이고 \( \mathrm{S} \) 검량선의 기울기를 말한다. 이러한 특이성, 직선성, 검출현계, 정량현계, 정밀성으로 분석법을 검증하고자 하였다.</p>