본 연구에서는 xylose 대사 능력이 있는 P. stipitis 효모에 적응진화를 적용하여, 섬유소계 바이오매스로부터 유래한 xylose와 cellobiose를 효율적으로 대사하는 균주 개발을 목표로 한다. P. stipitis 단일 콜로니를 YPD 배지에 접종하여 \(30^{\circ}C\)와 \(250 \, \mathrm{rpm}\)에서 교반 속도로 배양하고, cellobiose 환경에서 지속적인 계대배양을 통해 P. stipitis의 cellobiose 대사 효율을 향상시켰다. 이를 통해 cellobiose와 xylose를 동시에 대사하는 P. stipitis 균주 개발을 추진하였다.
<p>따라서 본 연구는 자연적인 xylose 대사 효모인 P. stipitis에 적응진화를 유도하여 섬유소계 바이오매스 유래의 혼합당인 xylose와 cellobiose를 호과적으로 대사하는 균주를 개발하고자 하였다. 이를 위해 cellobiose 환경에서 지속적인 계대배양을 통해 P. stipitis의 cellobiose 대사효율이 향상되도록 유도하였으며, 이를 통해 cellobiose와 xylose를 동시에 대사할 수 있는 P. stipitis를 개발하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주, 적응진화 및 진화된 균주의 선별</h2> <p>본 연구에서 적응진화를 통한 cellobiose 대사의 향상을 위해 P.stipitis CBS6054 균주가 사용되었다.</p> <p>적응 진화 실험을 위해 P. stipitis 단일 콜로니를 \( 5 \mathrm { ml } \) 의 YPD 배지( \( 10 \mathrm { ~g } / 1 \) yeast extract, \( 20 \mathrm { ~g } / 1 \) peptone, \( 20 \mathrm { ~g } / 1 \) glucose \( ) \)를 포함한 테스트 튜브에 접종하고 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 250 \mathrm { rpm } \) 의 교반 속도로 전배양하였다. 전배양 중 대수중식기 후반에 호모 세포를 회수한 후 \( 25 \mathrm { ml } \) 의 YPC 배지 \( (10 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \) yeast extract, \( 20 \mathrm { ~g } / 1 \) peptone, \( 20 \mathrm { ~g } / 1 \) cellobiose)를 포함하는 플라스크에 세포 흡광도 \( \left ( \mathrm { OD } _ { 600 } \right ) \) 가 \( 0.1 \) 이 되도록 접종하고 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 90 \mathrm { rpm } \) 의 교반 속도로 본배양을 진행하였다. 본배양 중 대부분의 cellobiose가 소모되어 잔여 농도가 약 \( 1 \mathrm { ~g } / 1 \) 내외까지 이르렀을 때 호모를 회수하여 새로운 YPC 배지에 세포 흡광도가 \( 0.1 \) 이 되도록 접종하였으며 이 과정을 총 10 회에 걸쳐 수행하였다.</p> <p>계대배양을 통해 얻어진 10 번째 배양액을 \( 20 \mathrm { ~g } / \mathrm { glucose } \)를 포함한 YPD 고체배지에 적절하게 희석하여 도말한 후 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 약 2 일간 배양하여 단일 콜로니를 확보하였다. 이후 무작위로 40 개의 콜로니를 선별하여 \( 20 \mathrm { ~g } / 1 \) 의 cellobiose가 함유된 \( \mathrm { YPC } \) 배지에 세포 흡광도가 \( 0.1 \) 이 되도록 접종하고 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 90 \mathrm { rpm } \) 조건으로 배양을 진행하여 cellobiose 소모 속도와 ethanol 생산수율이 높은 균주를 1 차 선별한 후, \( 40 \mathrm { ~g } / \) 의 cellobiose가 함유된 YPC 배지에서 동일한 조건으로 배양을 진행하여 cellobiose 소모 속도와 ethanol 생산 속도가 높은 균주를 최종 선별하였다. 돌연변이 균주의 선별을 위한 회분식 발효는 한 번씩 수행하였다.</p>