시험 동물은 5주령의 특정병원체 부재(specific pathogen free, SPF) F344 랫드를 분양받아 특정 과정을 거친 뒤 검사해서 실험에 사용하였다. 시험물질로 이황화메틸을 사용했는데, Merck 사에서 구입한 것을 기화시켜 사용하였으며 대조물질로 정화된 청정공기를 사용하였다. 시험물질의 노출 경로는 흡입경로로 하였고 흡입노출한 결과 수컷에서는 \( 300 \mathrm{ppm} \) 용량에서 체중증가의 억제와 사료섭취량의 감소를 일으켰고 암컷에서는 \( 33 \mathrm{ppm} \) 이상에서 체중증가의 억제와 \(100 \mathrm{ppm} \) 이상에서 사료섭취량의 감소가 나타났다. 통계적 분석으로는 GraphPad InStat v. 3.0를 이용하여 실시하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시험동물 및 사육환경</h2> <p>본 시험에서는 5주령의 특정병원체 부재(specific pathogen free, SPF) F344 랫드를 Charles River Japan에서 분양받아 1주일간의 순화 및 검역을 거친 뒤 건강하다고 판단된 것을 선발하여 시험에 공시하였다. 순화 후 측정된 체중을 기준으로 하여 군별 체중 편차가 최소화 되도록 각 군에 무작위로 분배하였다. 차폐시설(barrier system)내의 동물실에 설치된 4대의 흡입쳄버(inhalation chamber)를 대조군과 저용량군, 중간용량군 및 고용량군으로 구분하여 사용하였고, 5연식 스테인레스 철망케이지에 동물을 개체별로 수용하였다. 사육 조건은 온도 \( 22 \pm 3^{\circ} \mathrm{C} \), 상대습도 \( 50 \pm 20 \% \) (단, 시험물질 투여 시는 제외), 환기회수 \( 12 \sim 15 \)회/시간, 조명 \(150\sim300 \mathrm{Lux}\)로 12시간(인공조명, 오전 8시~오후 8시)으로 하였으며, 사료는 실험동물용 멸균사료 LabDiet 5002 (PMI Nutrition, USA)를, 물은 자외선 유수 살균기로 소독시킨 상수도수를 자유롭게 섭취토록 하였다.</p> <h2>시험물질</h2> <p>시험물질인 이황화메틸은 Merck 사에서 구입한 시약용 1급(Lot No. S36367344)을 가스발생기로 기화시켜 사용하였으며, 대조물질은 Hepa filter 및 온습도 조절을 통해 정화된 청정공기를 사용하였다.</p> <h2>시험물질 노출 및 환경모니터링</h2> <p>시험물질의 노출은 사람에서의 주요 노출경로인 흡입경로로 하였으며, 내부용적 \( 1 \mathrm{~m}^{3} \) 의 흡입쳄버(Sibata Co., Japan)와 흡입시험시설을 이용하여 전신노출에 의한 흡입노출로 하였다. 시험물질은 gas generator (Sibata Co., Japan)를 이용하여 가열 \( \left(40^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 기화시킨 후 일정량을 청정공기와 혼합하여 설정농도로 조절한 후 흡입쳄버 내로 공급하여 실험동물에 전신 노출시켰다. 시험물질 노출 중 각 군별 흡입쳄버 내의 온도, 습도, 압력, 환기량은 쳄버 내에 부착된 센서와 환경제어장치(Sibata Co., Japan)를 이용하여 30 분에 1회씩 측정하였고, 시험물질의 농도는 자동 sampling 장치가 부착된 가스분광기(gas chromatography, Shimadzu, Japan)를 이용하여 노출 기간(6시간/1일)중 15 분에 1회씩 확인하였다. 시험기간 중 측정된 결과는 설정치의 \( \pm 5 \% \) 이내의 범위에서 실험동물에 투여되었음을 확인하였다.</p> <h2>시험군의 구성 및 용량설정 근거</h2> <p>용량설정을 위한 예비시험에서 0, 33, 100 및 \( 300 \mathrm{ppm} \) 의 농도로 2주간 반복 흡입노출한 결과, 수컷에서는 \( 300 \mathrm{ppm} \) 용량에서 체중증가의 억제와 사료섭취량의 감소가 관찰되었고, 암컷에서는 \( 33 \mathrm{ppm} \) 이상에서 체중증가의 억제와 \(100 \mathrm{ppm} \) 이상에서 사료섭취량의 감소를 유발하였다. 따라서 2주간 반복 노출에 의한 이황화메틸의 무해용량(no-observed-adverse-effect level)은 수컷의 경우 \( 100 \mathrm{ppm} \) 이고, 암컷의 경우 \( 33 \mathrm{ppm} \) 이하인 것으로 나타났다. 상기 결과를 근거로 하여 본 시험에서는 독성소견이 나타나지 않는 무해 용량과 명확한 독성소견이 나타나는 확실중독량을 산출하기 위해 최저용량은 \( 5 \mathrm{ppm} / 6 \mathrm{hrs} / \mathrm{day} \) 로 설정하였고, 공비 5 를 적용하여 25 및 \( 125 \mathrm{ppm} / 6 \mathrm{hrs} / \)day의 중용량 및 최고용량과 부형제대조군(vehicle control)을 추가하였다. 각 시험군당 동물수는 암수 각각 20마리로 하였고, 투여개시 후 4일 및 21일째에 각 군당 암수 5마리씩을 부검하였다.</p> <h2>일반증상 및 사망의 관찰</h2> <p>검역 및 순화기간에는 매일 1회씩 모든 동물에 대해 관찰하였고, 시험물질 노출기간에는 매일 투여 전과 후에 1회씩 일반증상 및 사망의 유무에 관하여 관찰하였다. 단, 이상 증상이 발현되면 증상의 종류, 발현일 및 증상의 정도를 개체별로 기록하였다.</p> <h2>체중측정</h2> <p>동물 입수시와 순화 종료 후 시험군 분리시에 체중을 측정하였고, 시험기간 중에는 주 1회 이상 개체별로 측정하였다.</p> <h2>사료섭취량 측정</h2> <p>사료 섭취량은 주 1회씩 측정하였다. 체중측정일에 정량을 급여하고 익일에 잔량을 측정하여 개체별 일일 사료섭취량(\(\mathrm{g}\)/rat/day)을 산출하였고, 이를 이용하여 군별 마리당 일일 평균 사료섭취량으로 환산하였다.</p> <h2>부검</h2> <p>투여 개시 후 4일 및 21일째에 각 군당 암수 5마리씩을 sodium pentobarbital (중외제약, 서울)으로 경마취한 후 부검하여 모든 주요 장기 및 조직의 이상유무를 육안적으로 관찰하였다.</p> <h2>혈액학적 검사</h2> <p>투여 개시 후 4일 및 21일째에 각 군당 암수 5마리씩을 하룻밤 절식시키고, 익일 오전에 부검하여 후대정맥으로부터 채혈하였다. 혈액검체는 혈액 응고방지제로 EDTA-2K가 들어 있는 CBC 채혈병에 채집하였으며, 자동혈구 계수기(Hemavet 850, CDC Technology, USA)를 이용하여 백혈구수(white blood cell, WBC), 적혈구수(red blood cell, RBC), 혈색소농도(hemoglobin concentration, HGB), 적혈구 용적(hematocrit, HCT) ), 평균 적혈구용적(mean corpuscular volume, MCV), 평균 적혈구혈색소량(mean corpuscular hemoglobin, MCH), 평균 적혈구혈색소농도(mean corpuscular hemoglobin con-centration, MCHC), 혈소판수(platelet or thrombocyte count, PLT), 적혈구 분포대(RBC distribution width, RDW) 및 평균 혈소판용적(mean platelet volume, MPV)을 측정하였다.</p> <h2>혈청생화학적 검사</h2> <p>부검시 후대정맥으로부터 채혈된 혈액을 혈청분리관(Iatron Laboratoies, Inc., Japan)에 넣고 15 분간 상온에 방치하였다가 \(2,800 \mathrm{rpm}\)으로 10분간 원심분리하였다. 얻어진 혈청은 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)의 저온 냉동기에 분석할 때까지 보관하였다. 혈청생화학분석기(TBA20-FR, Toshiba Co., Japan)를 이용하여 AST(aspartate aminotransferase), ALT (alanine aminotransferase), 총단백질(total protein), BUN (blood urea nitrogen), 크레아티닌(creatinine), 혈당(glucose), 총빌리루빈(total bilirubin), 총콜레스테롤(total cholesterol), ALP (alkaline phosphatase) 및 LDH (lactate dehydrogenase) 항목에 대해서 분석하였다.</p> <h2>통계학적 분석</h2> <p>시험자료에 대한 통계분석은 GraphPad InStat v. 3.0(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)을 이용하여 실시하였다. 시험결과는 가능한 한 평균값과 표준편차로 표기하였으며, 체중과 사료섭취량, 혈액학치 및 혈액생화학치는 일원배치분산분석(one-way analysis of variance, ANOVA)을 실시한 후 유의성이 인정되면 군간 차이를 조사하기 위해 Dunnett 다중비교법으로 유의차를 조사하였다. 전체적으로 검정의 유의수준은 \( 1 \% \) 혹은 \( 5 \% \) 에서 검사하였다.</p>