P. aeruginosa균에 감염된 CF 환자는, 아세틸알긴산과 염증 반응으로 증가하는 DNA와 actin이 결합해 호흡기에 바이오필름을 형성한다. KS-408 알긴산 분해효소는 아세틸기가 붙은 기질을 분해하기 어려우나, AcAlgE를 이용해 아세틸기를 제거 후 분해효소를 가하면 효과적으로 분해가 가능하다. 그러나 Sphingomanas sp. MJ-3의 AcAlgE 유전자는 다양한 vector에 발현시켜도 inclusion body만 생성되어, site-directed mutagenesis나 transmembrane domain 제거 등을 이용해 높은 온도에서 활성을 가지는 단백질을 얻기 위한 연구가 진행중이다.
<p>CF 환자들이 P. aeruginosa균에 감염되었을 경우 P. aeruginosa균들이 생산하는 아세틸알긴산들과 염증반응 때문에 증가하는 중성백혈구 유래 DNA와 actin 등이 당단백질과 결합하여 호흡기에 바이오필름을 형성하게 된다. Alipour 등에 의하면 DNase 및 알긴산 분해효소와 함께 aminoglycoside를 처리한 경우 항생제 활성이 증가한다고 하였으며 Hatch와 Schiller는 알긴산 분해효소의 처리가 P. aeruginasa가 생성하는 세포외 다당류 속으로. 항생제를 확산시키는데 도움이 된다고 하였다. 본 실험의 결과로 보아 알긴산 분해효소 만으로 박테리아가 분비하는 점성이 높은 세포외 다당류를 분해하기는 십지 않고 아세틸알긴산 분해효소인 AcAlgE와 알긴산 분해효소를 함께 처리하는 것이 항생제의 활성을 더욱 높여줄 것으로 생각된다.</p> <h2>아세틸알긴산 효소분해물의 FPLC 분석</h2> <p>\( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \)-NMR 스펙트럼을 측정하기 위하여 \( 0.5 \% \) ( \( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) 고분자 아세틸알긴산에 \( \mathrm { Ni } \)-sphepharose 친화력 크로마토그라피로 정제한 알긴산 분해효소만을 가한 것과 아세틸분해효소 및 알긴산 분해효소를 함께 가하고 반응시켜 얻은 생성물을 FPLC로 분석한 결과는 Fig. 5 와 같았다. Fig. 5A는 정제한 KS-408 알긴산 분해효소를 가한 것으로 점성이 높고 아세틸기가 붙어있는 기질을 분해하기 어려워 tetramer 이상의 분자량이 큰 올리고머들이 적은 양 생성될 수 있었던 것으로 보인다. MJ-3 AcAlgE를 가하여 아세틸기를 먼저 제거한 후 알긴산 분해효소를 넣어 반응시킨 생성물의 FPLC 분석 결과는 Fig. 5B와 같았다. AcAlgE를 넣지 않고 KS-408 알긴산 분해효소만 넣었을 경우 생성되는 올리고머들의 함량에 비하여 AcAlgE와 KS-408 알긴산 분해효소를 함께 넣어서 생성되는 dimer, trimer, tetramer 등 적은 분자량의 올리고머 함량을 계산하면 20배 이상 생성되었음을 알 수 있었다. 이들 결과들로 보아 병원성균 P. aeruginosa가 생산하는 바이오필름의 구성성분인 고분자 아세틸알긴산을 효과적으로 분해하기 위해서는 아세틸기 분해효소인 AcAlgE와 알긴산 분해효소를 함께 처리하는 것이 좋을 것이다.</p> <p>그러나 Sphingomanas sp. MJ-3에서 얻은 AcAlgE 유전자를 thioredoxin protein 이나 glutathione S-transferase 등과 융합시켜 soluble 한 형태로 발현시키고자 하였으나 pET21, pET32 또는 pET42 vector 들에 발현시켰을 때 다량의 inclusion body만을 얻을 수 있었다(data not shown). Maltose binding protein (MBP)과 융합되어 재조합 단백질을 발현시킬 수 있 pMal-c2X vector에 cloning 하여 MBP-AcAlgE 단백질을 얻었을 때에는 soluble 형태로 얻을 수 있었으나 낮은 온도인 \(22 \text { - } 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 최적 활성을 보여 CF 환자들에게 응용하기에는 문제가 있을 것으로 생각되었다. 따라서 site-directed mutagenesis 또는 transmembrane domain 제거 등을 통한 방법을 이용하여 높은 온도에서 활성을 가지는 재조합 단백질을 얻을 수 있도록 연구를 진행하고 있다.</p>