U937 세포를 탈지고초와 탈지3단에 처리해서 6시간 동안 배양한 뒤 MTT시약과 formazin을 제거하고 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 에서의 흡광도를 ELISA reader 로 측정하였다. 세포 고정액으로 고정한 후 4',6-dia-midino-2-phenylindole 용액으로 상온에서 십 분 동안 염색한 세포를 이용해 탈지고초와 탈지3단에 의한 세포핵의 형태 변화를 관찰을 하였다. 단백질 발현의 분석은 세포를 lysis buffer에서 삼십 분간 반응시킨 후 원심분리하여 얻어진 상충액을 사용해서 sodium dodecyl sulphate-polyacryl-amide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시료준비 및 세포배양</h2> <p>본 실험에 사용된 탈지고초(fermented soybeans by Bacillus subtilis, FSB) 및 탈지3단(three-step fermented soybeans, TFS) 산물은 Lee 등의 방법에 준하여 제조된 것을 사용하였다. U937 세포는 생명공학연구소에서 분양 받았으며 \(90 \% \)의 RPMI-1640 배지, \(10 \% \) fetal bovine serum에 \(1 \% \)의 penicillin 빛 streptomycin 이 포함된 배지를 사용하여 \( 5 \%~ CO_ { 2 } , 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 조건하에서 배양하였다.</p> <h2>MTT assay에 의한 세포 성장억제 조사</h2> <p>세포 배양용 6 well plate에 U937 세포를 \( 5 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { 개 } / \mathrm { ml } \)로 분주하고 FSB 및 TFS를 처리한 후 6시간 동안 배양하였다. 6시간 후 배지를 제거하고 tetrazolium bromide salt 를 \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 농도가 되게 배지로 희석하여 \( 2 \mathrm { ml } \) 씩 분주하고 3 시간 동안 \( CO_ { 2 } \) incubator 에서 배양시킨 다음 MTT 시약을 깨끗하게 제거하고 dime-thylsulfoxide를 \( 1 \mathrm { ml } \) 씩 분주하여 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 후 96 well plate에 200 \( \mathrm { ul } \)씩 읆겨서 ELISA reader 로 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 세번을 하였으며, 그에 대한 평균값과 표준 오차를 Microsoft Excel 프로그램으로 구하였다.</p> <h2>DAPI staining에 의한 세포핵의 형태 관찰</h2> <p>FSB 및 TFS 처리에 의한 핵의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 준비된 세포를 모은 다음 \( 3.7 \% \) formaldehyde 및 \( 0.2 \% \)의 Triton X-100 (Amresco) 용액으로 고정 후, 4',6-dia-midino-2-phenylindole 용액으로 상온에서 약 10 분간 염색하였다. 염색된 세포를 PBS로 충분하게 세척하고 absolute alcohol을 이용하여 탈수과정을 거친 후, 형광 현미경을 이용하여 400 배의 배율로 각 공도에 따른 압세포의 핵의 형태 변화를 관찰한 다음 Axio Vision 프로그램을 이용하여 사진 촬영을 하였다.</p> <h2>Western blot analysis에 의한 단백질 밭현의 분석</h2> <p>상기와 동일한 조건으로 준비된 세포들을 PBS로 씻어 내고 적당량의 lysis buffer [25 mM Tris-Cl (pH 7.5), \( 250 \mathrm { mM } \) \( \mathrm{NaCl}, 5 \mathrm { mM } \) EDTA, \(1 \% \) NP-40, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), \( 5 \mathrm { mM } \) dithiothreitol (DTT)]를 첨가하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 분간 반응시킨 후, \( 14,000 \mathrm { ~g } \) 로 30 분간 원심분리하여 그 상층액을 취하였다. 상층액의 단백질 농도를 Bio-Rad 단백질 정량 시약을 사용하여 사용방법에 따라 정량 한 다음 동량의 Laemmii sample buf-fex를 섞어서 sample을 만들었다. 이렇게 만든 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacryl-amide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane 으로 전이시킨 후, \(5 \% \) skim milk를 함유한 PBS-T ( \(0.1 \% \) Tween 20 in PBS)를 처리하여 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하였다. 준비된 membrane에 1 차 항체를 처리하여 상온에서 1시간 이상 또는 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 overnight 시킨 다음 PBS-T 로 세척하고 처리된 1 차 항체에 맞는 2 차 항체를 사용하여 상온에서 1 시간 정도 반응시켰다. 다시 PBS-T로 세척하고 enhanced chemiluminoscence (ECL) 용액을 적용시킨 다음 암실에서 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다. Immunoblotting-을 위해 2차 항체로 사-된 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Life Science에서 구입하였다.</p>