젓갈에서 분리한 colony 중 항암활성이 강한 6균주를 선발, 암세포 A549에 가장 강한 세포독성을 나타내는 균주를 선별한 후 해당 미생물을 Bacillus subtilis로 최종 동정하여 Bacillus subtilis SW-1로 명명하였다. Bacillus subtilis SW-1의 항암활성은 배양시간과 농도 의존적으로 A549, SK-0V3 세포의 세포생육을 억제하는 것으로 보이며, 항암물질 생성을 위한 최적배양조건 또한 탐색하였다. 세포에 Bacillus subtilis SW-1 배양상등액을 처리시 ladder모양으로 chromosome이 분해되는 것으로 볼 때, Bacillus subtilis SW-1에서 분비된 항암활성물질은 항암제로서의 이용가능성이 있는 것으로 판단하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>항암성 물질 생산균주의 분리</h2> <p>멸균수로 희석한 한국전통 젓갈을 LB배지에 도말하여 24시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양후 나타난 각 colony를 LB액체배지에 접종하고 24시간 배양하여 그 상등액을 항암활성 측정에 이용하였다.</p> <p>젓갈로부터 분리한 약 2,000개의 colony 중에 1차적으로 항암활성이 강한 6균주를 선발하였고, 그 중 암세포 A549에 강한 세포독성을 나타내는 균주를 선별하여 이 균주를 SW-1이라고 명명하였다.</p> <h2>분리균주의 동정</h2> <p>최종 분리 선정한 미생물 SW-1의 형태학적 규명을 위해 현미경 관찰 및 SEM 촬영 결과를 살펴 볼 때, 그람양성으로써 rod의 형태를 보였으며, 크기는 \( 0.6 \times 1.9 \mu \mathrm{m} \) 였고, 운동성이 있었다. 또한 호기성의 불규칙한 cream형태의 흰색 colony를 생성하였다. 정확한 동정을 위해 \( 16 \mathrm{~s} \) rRNA sequence롤 결정하여 기존의 알려진 미생물과의 비교 결과 Bacillus subtilis와 99\% 유사성을 나타냈다. 이상의 실험 결과로부터 젓갈류에서 분리한 항암 활성을 갖는 미생물을 Bacillus subtilis로 최종 동정하여, Bacillus subtilis SW-1로 명명하였다.</p> <h2>분리 균주의 항암 활성</h2> <p>Bacillus subtilis SW-1의 항암활성을 검토한 결과 A549, SK-0V3 세포의 경우 전반적으로 배양시간과 농도 의존적으로 세포생육을 억제하는 것으로 나타났다. A549인 경우 \( 30 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ml} \) (SW-1 배양상등액/암세포 배양배지)의 배양상등액의 농도에서 \( \mathrm{IC}_{50} \) 를 나타내었으며 SK-OV3인 경우 \( 50 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ml} \) 의 농도에서 그리고 HL60 cell인 경우 거의 세포독성을 나타내지 않았다.</p> <h2>항암물질생성 최적배양조건</h2> <p>배양온도에 따른 항암활성: 배양온도에 따른 항암활성의 변화를 보기 위하여 \( 20,25,30,35,40,45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 각각 배양하여 비교해 본 결과는 Fig. 5와 같았다. \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 그 활성이 가장 우수하였다. 젓갈류에서 분리된 균주는 중온 발효시키기 때문에 대부분의 균주가 \( 30 \sim 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 생육과 활성이 좋은 것으로 나타났고, Bacillus subtilis SW-1은 멸치젓에서 분리된 균주로써 중온인 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 가 최적으로 나타났다.</p> <p>초기 \( \mathrm{pH} \) 에 따른 항암 활성: 초기 \( \mathrm{pH} \) 를 2.0,3.0,4.0,5.0, 6.0,7.0,8.0,9.0으로 조정된 배양 배지에 SW-1 균주를 접종하여 배양 하였을 때 초기 \( \mathrm{pH} \) 가 4~6인 배지에서 항암활성이 가장 우수하였다. 이 결과로 볼때 본 균주는 약산성 쪽에서 활성을 나타내는 호산성 균주인 것으로 생각된다.</p> <p>탄소원에 따른 항암활성: 항암 활성에 미치는 탄소원의 영향을 검토하기 위하여 기본 배지에 탄소원의 종류를 달리하여 첨가한 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 진탕 배양하여 항암 활성에 미치는 영향을 검토한 결과를 Table 2에 제시하였다. 탄소원의 경우, 항암 활성은 Soluble starch을 사용 하였을 때가 가장 좋았으며, 그 최적농도는 \( 3.0 \% \) 이었다.</p> <p>질소원에 따른 항암 활성: 항암 활성에 미치는 질소원의 영향을 검토하기 위하여 기본 배지에 질소원의 종류를 달리하여 첨가한 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 진탕 배양하여 항암활성에 미치는 영향을 검토한 결과 Table 2에 제시하였다. Yeast extract를 \( 0,1,2,3,4,5,6 \% \) 에서 검토한 결과 Yeast extract 의 최적 농도는 \( 1.0 \% \) 이었다.</p> <p>무기염에 따른 항암 활성: 무기염의 경우는 활성에 그다지 영향을 미치지 않았다.</p> <p>배양시간에 따른 항암활성: 이상에서 검토한 최적 배지 조성을 사용하여 \( 1 \% \) 의 접종량으로 균주의 생육과 항암활성의 상관관계는 Fig. 6과 같다. 위에서 조사한 최적조건에서 배양하는 동안 균의 생육과 항암 활성을 검토한 결과, 접종 후 7시간이 경과하면서 대수증식기에 들어갔으며 18시간이 지나면서 정지기 및 사멸기에 도달하였고, 항암물질의 생산은 14시간이 지나면서 증가하기 시작하여 25시간이 경과한 후 최대 활성을 보였다.</p> <p>DNA fragmentation assay 항암제로서의 개발 가능성을 조사하는 실험단계로, DNA fragmentation assay가 있다. 일반적으로 암세포가 항암제에 의해 사멸할 때 apoptosis(계획된 세포죽음)의 현상으로 chro-mosomal DNA의 사닥다리모양으로 단편화가 주로 일어나며 이 관찰로 항암제로서의 이용 가능성을 확인한다. 본 미생물에서 분비된 항암활성물질은 본 실험에서 Fig. 7에서 보여주듯이 Bacillus subtilis SW-1 배양상등액의 \( 50 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ml} \) 의 처리시 ladder모양으로 chromosome이 분해된 것이 확인되었으며 따라서 B. subtilis SW-1이 분비하는 항암활성물질은 항암제로써의 이용가능성이 있는 것으로 판단된다.</p>