실험조건으로 유류로 오염된 토양 4가지(DS, DSP, DSP-1, DSP-2)와 토양미생물 복원제와 촉진제를 넣은 토양(DSP-3)을 사용하여 실험을 진행하였다. 복원제는 \( \mathrm { pH } 5.5 \)로 제작되었으나 \( 1 \mathrm { ~N } \)의 \( \mathrm { NaOH } \)와 \( \mathrm { HCl } \) 용액을 이용하여 중성 \({ \mathrm { pH } }\)로 보정하여 실험을 진행하였다. 실험조건으로 유류로 오염된 토양 4가지와 토양미생물 복원제와 촉진제를 넣은 토양을 사용하여 실험을 진행하였다. 토양미생물 복원제의 동정은 Denaturing gradient gel electrophoresis를 이용해 진행하였다.
<p>실험조건은 유류로만 오염된 토양(DS), 토양미생물 복원제를 \(20 \% \)( \( \mathrm { w } / \mathrm { w } \))가 되도록 첨가한 유류로 오염된 토양(DSP), 토양미생물 복원제를 넣은 후 \( \mathrm { pH } \)를 중성으로 보정한 유류로 오염된 토양(DSP-1), 토양미생물 복원제와 촉진제를 넣은 유류로 오염된 토양(DSP-2), 토양미생물 복원제와 촉진제를 넣은 후 \( \mathrm { pH } \)를 중성으로 보정한 유류로 오염된 토양(DSP-3)을 조건으로 하여 실험을 진행하였다. 복원제의 제작과정에서 낮은 \( \mathrm { pH } \)( \( \mathrm { pH } 5.5 \))로 제조되어 토양 미생물의 활성에 영향을 줄 수 있다는 가정아래 \( 1 \mathrm { ~N } \)의 \( \mathrm { NaOH } \)와 \( \mathrm { HCl } \) 용액을 이용하여 중성 \( \mathrm { pH } \)로 보정하였다.</p> <h2>Denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)기법을 이용한 토양미생물 복원제의 동정</h2> <p>미생물 복원제에서 추출한 genomic DNA 시료를 template로 하여 PCR(TaKaRa PCR thermal cycle, JAPAN)을 수행하였다. PCR에 사용한 primer는 Br518f(5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3')과 341fGC(5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3')를 사용하였다. PCR 조건은 pre-denaturation은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분, denaturation은 \( 96 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초, Annealing은 \( 56 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초, extension은 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초로 28 cycle 실행한 후에 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분 동안 final extension을 하였다. PCR amplicon 시료를 Bio-Rad(USA) decode 시스템을 이용하여 DGGE를 수행하였다. Gradient gel 의 농도는 각각 \( 35 \% \sim 70 \% \)로 농도 구배가 연속적으로 형성되게 gel을 제작하여 사용하였다. 제작된 gel에 PCR amplicon을 \( 20 \mu \mathrm { L } \) + 6X loding buffer \( 20 \mu \mathrm { L } \) 로딩하여 TAE 1X buffer(Tris-Acetate \( 2 \mathrm { M } \), EDTA \( 50 \mathrm { mM } , \mathrm { pH } 8.0 \))에서 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 200 \mathrm { ~V } \)로 5시간 전기영동 하였다. DGGE fingerprint로부터 대표적인 band 9개를 잘라내어 DNA를 추출한 후, 341f, Br518 primer를 사용해 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 pGEM-T Vector System(Promega, USA)을 이용해 cloning 한 후 E. coli DH5에 형질 전환하였다. 형질전환된 9개의 clone으로부터 plasmid를 추출하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 Basic Local Alignment Search Tool(Blast) algorithm을 사용하여 GenBank database와 비교하였다. 계통수(Phylogenetic Tree)를 그리기 위하여 Bioedit 프로그램으로 염기서열들을 편집한 다음, Clustal X 프로그램으로 염기서열을 정렬하였다. 계통수는 MEGA 4 프로그램을 사용하여 구축하였다.</p>