선택된 방선균의 항균활성 검정을 위해 MRSA를 한국 항생제내성균주은행, 한국생명공학연구원 생물자원 센터, 한국농업미생물자원센터 및 서울대학교 미생물연구소에서 분양받아 사용하였다. 이들 균주는 Shirling과 Gottlieb의 방법과 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology의 방법을 참고하여 배지에서 14일 동안 배양하면서 생장정도, 기균사의 색, 배면의 색, 멜라닌 색소 형성 여부, 탄소원 활용 실험, NaCl 농도에서의 생장여부 및 최저 생장 pH, 항생제에 대한 저항성 및 화학적 억제제인 cryctal violet, phenol등에서의 생육 여부를 조사하여 동정하였다. BCNU 1030 균주의 16S 리보좀 RNA 염기서열분석을 위해 상동성을 비교분석하고 neighbor joining method를 기반으로 계통수를 작성하였고, MRSA와 그람양성 세균 3종, 그람음성 세균 3종에 대한 항균활성 검증을 조사하였다.
<h2>사용 균주</h2> <p>선택되어 순수분리된 방선균의 항균활성 검정을 위하여 MRSA CCARM 3089, CCARM 3090, CCARM 3091, CCARM 3095와 그람 양성세균 Bacillus subtilis KCTC 10111 (ATCC 465), Micrococcus luteus KACC 10488 (ATCC 4698), Staphylococcus aureus IMSNU 11088 (ATCC 6538), 그람 음성 세균 Escherichia coli IMSNU 10080 (ATCC 10798), Proteus mir-abilis IMSNU 20367 (ATCC 29906) 및 Proteus vulgaris IMSNU 13025 (ATCC 13315)를 각각 한국 항생제내성균주은행(Culture collection of antimicrobial resistant microbes, CCARM)과 한국생명공학연구원 생물자원 센터(Korean col-lection for type culture, KCTC), 한국농업미생물자원센터(Korean agricultural culture collection, KACC) 및 서울대학교 미생물연구소(Institute of microbiology Seoul National University, IMSNU)에서 분양 받아 사용하였다.</p> <h2>항균물질 생산균주의 동정</h2> <p>선발된 균주를 동정하기 위해 Shirling과 Gottlieb의 방법과 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology의 방법을 참고하여 International Streptomyces Project (ISP)에 명시된 배지에서 14일 동안 배양하면서 생장정도, 기균사의 색, 배면의 색, 멜라닌 색소 형성 여부를 관찰하였고 basal me-dium ( \( 2 \% \) pancreatic digest of casein, \( 5 \% \mathrm { NaCl } , 0.3 \% \) dipotas-sium phosphate)을 사용하여 탄소원 활용 실험을 시행하였다. 생리, 생화학적특징으로 \( 5 \% \)~ \( 7 \% \) NaCl 농도에서의 생장여부 및 최저 생장 pH를 조사하였고 streptomycin, ampicillin 등의 항생제에 대한 저항성 및 화학적 억제제인 \( 0.01 \% \) cryctal vio-let, \( 0.1 \% \) phenol등에서의 생육 여부에 대해 조사하였다. 그리고 생리, 생화학적 특성을 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology의 방법에 준하여 조사하였다.</p> <h2>16S 리보좀 RNA 염기서열분석</h2> <p>BCNU 1030 균주의 16S 리보좀 RNA 염기서열분석을 위하여 universal primer인 27F (forward primer, 5'-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3')와 1492R (reverse primer, 5'-GGTT ACCTTGTTACGACTT-3') 2개의 primer를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. GenBank의 database에 등록된 16S 리보좀 DNA 염기서열을 대상으로 상동성을 비교, 분석하였으며 Bioedit (USA), Clustal X2.0 (CLC bio, Denmark), Mega 4 program을 사용하여 neighbor joining method를 기반으로 계통수를 작성하였다.</p> <h2>항균활성 검증 및 항균활성물질의 기초 최적 생산조건 조사</h2> <p>선발된 균주의 항균활성 검증은 MRSA와 그람양성 세균 3종, 그람음성 세균 3종에 대하여 조사하였다. 시험균주의 탁도를 McFarland number 0.5가 되도록 배양하여 시험균주의 최적배지에 \( 0.1 \mathrm { ml } \)를 도말하였다. 선발된 균주의 배양액 10 \( \mu l \)를 paper disk diffusion method에 따라 시험균주가 도말된 배지에 점적한 뒤 시험균주의 최적온도에서 1~2일간 배양하여 결과를 관찰하였다. 선발된 균주의 기초적인 항균물질 생산조건을 검토하기 위하여 nutrient broth (NB), tryptic soy broth (TSB), PDB, ISP 배지 등을 기본으로 하여 pH, 온도 및 배양시간에 따른 최적 생산조건을 조사하였다.</p>