본 연구는 발아종자 발달단계의 cDNA 합성과 발현유전자의 염기서열 분석을 목표로 진행하였다. cDNA 유전자 은행은 발아종자 cDNA를 Uni-ZAP vector에 삽입한 후 Gigapack III Gold Pack-aging Extract에 패키징하여 제작하였으며, SK 프라이머 등을 이용하여 염기서열 분석을 진행한 후 유전자 염기서열분석기로 벼 발아종자 발현유전자의 염기서열을 결정하였다. 마지막으로, 벼 발아종자의 발현 단일 유전자 unigene의 선발은 SeqMan 프로그램을 이용하여 결정하였다.
<p>본 연구는 발아종자 발달단계의 cDNA 합성과 발아종자에서 발현하는 발현유전자의 대량 염기서열 분석 및 발현유전자 정보종합화를 목적으로 수행하였다. 이러한 발아종자 발현유전자정보의 종합화는 벼 및 식물전반의 구조 및 기능유전체롤 연구하는 연구자들에게 보다 유익한 정보를 제공할 수있을 것이며 발아종자 유전자의 발현특성을 분석함으로써 종자 발아에 관련된 발아율 향상, 수발아 방지 및 농업형질개선 등의 실용화 연구에 기여할 수 있을 것으로 기대되어 진다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>벼 발아종자 유전자은행 제작 및 발현유전자 염기서열결정</h2> <p>본 연구에 사용된 일품 벼 발아종자는 종자의 껍질을 벗긴 후 \( 1 \% \) 과산화수소용액에 5분 소독한 후 멸균 증류수로 세척을 하였으며 물에 침지하여 24시간 홉습시킨 종자를 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 항온기에서 48시간 발아시킨 발아종자를 사용하였다. 일품벼 발아종자 발현유전자은행 (cDNA) 제작을 위한 RNA 분리는 Trizol 시약 (Invitrogen Life Technologies)을 이용하여 total RNA를 분리한 후 PolyA Tract mRNA kit (Promega)를 사용하여 Poly(A) mRNA를 분리하였다. 발아종자 cDNA 은행제작은 ZAP-cDNA Gigapack III 골드클로닝 kit (Clontech)를 사용하였다. 발아종자 cDNA \( 100 \mathrm { ng } \)을 \(\mathrm{1 \mu g}\)의 Uni-ZAP vector에 삽입한 후 Gigapack III Gold Pack-aging Extract에 packaging하여 cDNA 은행제작을 하였다. 개별 유전자 클론의 플라스미드. DNA 분리는 96 well 밀리포어 멀터스크린 (Millipore MANANLY50, MAFBNOB50)을 이용하여 대량으로 플라스미드 DNA를 분리하였다. 발아종자 삽입단편의 크기 확인은 플라스미드. DNA를 EcoRI, XhoI 제한효소로 처리한 후 \( 1.2 \% \) Agarose gel 전기 영동으로 하여 삽입 단편을 확인하였다.</p> <p>발아종자 발현유전자 염기서열 결정은 각 클론의 5' 말단을 BigDye terminator ver 3.1 (Applied Biosystems)과 SK 프라이머 (5'-cgctctagaactagtggatc-3')를 이용하여 염기서열 분석반응을 수행한 후 ABI3100 및 ABI3730 유전자 염기서열분석기 (Applied Biosystems)를 사용하여 벼 발아종자 발현유전자에 대한 염기서열을 결정하였다.</p> <h2>벼 발아종자 발현 단일유전자 선발</h2> <p>발아종자 EST 염기서열 정보분석을 위하여 각 클론의 발현유전자 염기서열을 결정한 후 SeqMan 프로그램 (DNASTAR Inc)을 사용하여 벡터부위를 포함하는 염기서열부분과 불명확한 염기서열을 제거하였다. 발아종자내 발현하는 unigene 선발은 SeqMan 프로그램을 이용하여 \( 100 \mathrm { bp } \)씩 \( 95 \% \)의 상동성으로 유전자 염기서열들을 연결하여 얻어진 singleton 유전자와 두개 이상의 유전자로 cluster된 contig 수를 합하여 얻어진 수를 unigene 수로 결정하였다 (Kikuchi et al. 2003, Yoon et al. 2009).</p>