실험에 사용된 누에 분말은 순천영농 법인(순천, 전남)에서 직접 구입하여 실험 재료로 활용되었으며 열풍 건조된 누에 분말을 각각 \( 50 \mathrm{~g} \)을 \( 500 \mathrm{ml} \) 비이커에 넣고 중량 대비 \( 1.5 \)배의 증류수를 첨가하여 분말이 완전히 흡수되도록 하였습니다. 그 후, \( 121^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분 동안 멸균을 수행한 뒤, 실온으로 냉각시킨 후 B. subtilis 배양액을 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{w}) \) 수준으로 누에 분말에 첨가하고 잘 섞은 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12일간 발효시켰습니다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h3>실험재료 및 누에분말 발효 조건</h3> <p>실험 재료인 누에 분말은 열풍 건조 시킨 것으로 순천영농 법인(순천, 전남)에서 직접 구입하여 실험재료로 사용하였다.열풍 건조 누에 분말의 발효를 위하여 Bacillus subtilis (KACC<p>91157) 및 Aspergillus kawachii (KCCM 32819) 균주를 한국미생물보존센터로부터 분양 받아 사용하였다. 열풍 건조 누에 분말 각 \( 50 \mathrm{~g} \) 씩을 \( 500 \mathrm{ml} \) 비이커에 넣고 중량 대비 \( 1.5 \) 배의 증류수를 가하여 분말에 모두 흡수 시킨 후 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15 분간 멸균한 후, 실온이 되었을 때 전배양 시킨 B. subtilis 배양액을 누에 분말에 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{w}) \) 수준으로 잘 섞은 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12 일간 발효시켰다. 또한 전배양 한 A. kawachii 균사체도 누에 분말에 \( 5 \%(\mathrm{v} / \mathrm{w}) \) 수준으로 섞은 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12 일간 발효시켰다.이때 발효과정 중에 건조를 막기 위하여 멸균된 증류수를 일정량씩을 뿌려주면서 발효를 진행시켰다. 두 균주를 사용하여 최장 12 일까지 발효시키면서 3일 간격으로 시료를 각각 취하여 완전히 건조시킨 후 분석에 사용하였다.</p> <h3>발효 누에분말의 PH및 단백질 농도 측정</h3> <p>발효 누에분말을 각각 증류수에 \( 1 \% \) 농도로 첨가하여 교반 후 PH meter (Methrohm 691, Swiss)로 직접 PH 를 측정하였다. 발효 누에분말의 단백질 농도는 Lowry 방법[18]으로 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 분광광도계로 흡광도를 측정하고, bovine serum albumin을 표준시약으로 사용하여 단백질 량을 측정하였다.</p> <h3>발효 누에분말의 구성 아미노산 측정</h3> <p>발효 누에분말의 단백질 패턴은 Davis 방법[7]에 따라 분석하였으며, slab-type native-PAGE의 gel 농도는 \( 7.5 \% \) 를 사용하였다. 즉 분리 gel은 7.316\% acrylamide, \( 0.814 \% \) bis-acryl-amide, \( 376 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) buffer ( \( \mathrm{pH} 8.8), 0.03 \% \) TEMED 및 \( 0.07 \% \) 과산화암모늄을 혼합하여 \( 1 \mathrm{~mm} \) 두께로 만들어 사용하였다. 분리 gel 위에는 농축 gel을 \( 2.7 \% \) acrylamide, \( 0.625 \% \)bis-acrylamide, \( 61.4 \mathrm{mM} \) Tris-HCl buffer \( (\mathrm{pH} \) 6.8) 를 만들어\( 40 \% \) sucrose-buffer용액에 혼합한 시료를 농축 gel내에 성형된 well에 일정량씩 주입하였다. 전기영동은 Tris-glycine 완충 액(25 mM Tris, \( 192 \mathrm{mM} \) glycine, \( \mathrm{pH} \) 8.8) 하에서 \( 1.5 \mathrm{~mA} / \mathrm{gel} \)\( (\mathrm{cm}) \) 의 정전류를 통하여 행하고, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 저온에서 2 시간 전기영 동 시켰다. 전기영동이 완료된 gel은 \( 7 \% \) 초산 용액에 용해한\( 1 \% \) coomasie brilliant blue R-250으로 염색 후 7\% 초산 용액으로 충분히 탈색시켜 건조 및 사진 촬영을 하였다.</p>