노간주나무 추출물이 멜라닌 생성 관련 유전자에 끼치는 영향을 평가하기 위해 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2의 단백질 및 mRNA 발현에 대한 영향을 측정하였다. 결과적으로 노간주나무 에탄올 추출물은 B16F10 흑세포종의 멜라닌 생성을 억제하고 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2 의 억제 효과를 가지고 있음을 확인할 수 있었으며, 이들 효소의 mRNA 발현 또한 억제함을 확인하여 노간주나무 에탄올 추출물은 미백개선용 화장품 소재로써 효능이 높을 것으로 판단하였다.
<h2>멜라닌 합성에 관여하는 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2의 단백질 발현 및 mRNA 발현억제 효과 확인</h2><p>생체 내 tyrosine으로부터 멜라닌 생성은 주로 산화적 반응에 의해서 일어나는데 이와 관련된 효소로는 tyrosinase, ty-rosinase related protein-1 (TRP-1)과 tyrosinase related pro-tein-2 (TRP-2) 등이 있다. TRP-1은 TRP-2에 의해 생성된 5,6-dihydroxy indole-2-carboxylic acid (DHICA)를 oxidation 시켜 indole-2-carboxylic acid (IQCA)를 생성하는데, IQCA는 흑갈색을 나타낸다. MITF는 microphthalmia transcription factor로서 tyrosinase 발현을 조절하므로 MITF의 억제는 tyrosinase의 발현억제를 통하여 melanin 색소 생성을 억제할 수 있다.</p><p>본 연구에서는 노간주나무 추출물이 멜라닌 생성에 관여하는 유전자들에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2 의 단백질과 mRNA 발현에 미치는 영향을 측정하였다(Fig. 3~Fig. 6의 A, B). 노간주나무 에탄올 추출물이 melanin 합성에 관계된 효소인 tyrosinase에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma 세포에 농도별로 \( 5, 25, 50 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 처리 한 후 24 시간 후에 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2 protein 발현을 western blotting으로 확인하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였다. Fig. 3~Fig. 6 의 각 A결과에서 보는 바와 같이 노간주나무 에탄올 추출물을 농도별로 \( 5, 25, 50 \mathrm{~\mu g} / \mathrm{ml} \) 을 처리한 B16F10에서는 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2 protein의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 노간주나무 에탄올 추출물이 melanin 합성에 관계된 key enzyme인 tyrosinase, MITF, TRP- 1, TRP-2 mRNA에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma 세포에 농도별로 \( 5,25, 50 \mathrm{~\mu g} / \mathrm{ml} \) 처리한 후 24 시간 후에 polymerase chain reaction (PCR)으로 mRNA 발현양을 측정하였다. 이때 house keeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였다. Fig. 3~6의 각 B결과에서 보는 것과 같이 노간주나무 에탄올 추출물을 농도별로 \(5,25, 50 ~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 을 처리한 B16F10세포에서는 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2 mRNA 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과로 노간주나무 에탄올 추출물이 B16F10 흑세포종에 대하여 멜라닌 색소 생성 억제 및 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2의 억제 효과를 가지고 있는 것으로 보임에 따라 미백 관련 기능성 화장품 소재로서의 가능성이 있음을 보여준다.</p><h2>Real-time PCR 검증</h2><p>Real-time polymerase chain reaction (PCR)은 thermal cylcer로 분광 형광 광도계가 일체화된 장치로, 실시간으로 PCR 증폭산물의 생성과정을 모니터링하여 target DNA의 양을 분석하는 실험이다. 본 실험에서 tyrosinase, MITF, TRP-1, TRP-2의 mRNA를 노간주나무 에탄올 추출물을 처리하여 실시간으로 분석한 결과 농도 의존적으로 mRNA발현이 줄어듦을 확인할 수 있었다(Fig. 7~Fig. 10).</p><p>이러한 결과로 미루어 보아 노간주나무 에탄올 추출물이 tyrosinase, MITF, TRP-1 및 TRP-2 단백질 발현 및 mRNA 발현량 등에서 효능이 있음을 확인할 수 있었으며, 미백개선용 화장품 소재로 응용이 가능할 것으로 판단된다. 차후 화장품 제형에서 노간주나무 추출물이 얼마나 안정하게 피부에 적용이 되는지에 대한 연구가 계속된다면 우수한 미백개선용 화장품 천연 소재가 될 것으로 생각된다.</p>