capsaicin을 대장암 세포주 HCT116에 농도별로 1일 동안 시행하여 cell viability assay, Oligo DNA microarray, Western blot analysis를 통해 세포 생존율과의 상관관계를 연구하였다. 그 결과 capsaicin의 처리에 의해 발현이 2배 이상 증가 또는 감소되는 유전자군을 분석하였으며, NAG-1 항체를 사용하여 Western blot analysis를 시행하였다.
<h2>세포 생존율 연구</h2> <p>대장암 세포주 HCT116에 capsaicin을 처리하여 세포 생존율에 미치는 영향을 연구하기 위해 cell viability assay를 수행하였다. 먼저 96 well plate에 well당 \( 3 \times 10 ^ { 3 } \) 개의 세포를 접종하고 24 시간 동안 배양한 후, capsaicin을 농도별 \( (0,25,50,100 \), \( 200 \mu \mathrm { M } ) \) 로 처리하였다. 24시간 처리 후 MTS 용액(Promega,USA)을 각 well 당 \( 20 \mu \) 씩 첨가하고 세포 배양기에서 4 시간동안 반응시켰다. 이후 과정은 이전에 보고된 내용과 동일하게 수행하였다.</p> <h2>Oligo DNA microarray</h2> <p>Oligo DNA microarray 실험은 미국 Microarrays사의 48.5 K Human Array-Illumina HEEBO oligo microarray를 사용하였으며, 지노믹트리사(GenomicTree, Inc, Korea)에 위탁하여 수행하였다. 결과분석은 Genespring program 7.0 (Agilent, USA)을 이용하였으며, capsaicin의 처리에 의해 발현이 2배 이상 증가되는 유전자군과 감소되는 유전자군을 분석하였다.</p> <h2>Western blot analysis</h2> <p>Capsaicin을 농도별로 \( (0,25,50,100 \mu \mathrm { M } ) \) 24 시간 동안 처리한 후, 세포를 수확하였다. 수확한 세포는 RIPA 용액을 첨가하여 총 단백질을 분리하였다. 단백질 정량은 Bradford protein assay 용액(Bio-Rad, USA)을 사용하여 측정하였다. 총 \( 30 \mu \mathrm { g } \) 의 단백질을 취하여 \(4 \sim12 \% \) acrylamide gel (Invitrogen, USA)에서 전기영동 한 후, nitrocellulose membrane (Invitrogen,USA)으로 electroblotting 하였다. 이후 Western blot 과정은 이전 보고된 방법과 동일하게 수행하였다. 본 실험에서 사용된 1차 항체로는 anti-NAG1, anti-ACTIN 항체가 사용되었고, 2차 항체로는 horseradish peroxidase-conjugated goat an-ti-rabbit antibody, horseradish peroxidase-conjugated don-key anti-goat antibody를 사용하였다. NAG-1 항체를 제외한 모든 항체는 Santa Cruz사(USA)로부터 구입하였고, NAG-1 항체는 이전에 보고된 것을 사용하였다.</p> <h2>RT-PCR 및 real-time PCR</h2> <p>수확한 세포주로부터 추출한 total RNA \( 3 \mu \mathrm { g } \) 을 주형으로, M-MLV reverse transcriptase (Bioneer, Korea)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 cDNA를 제조하였다. 합성된 cDNA \(20 \mu \mathrm { l } \) 에 증류수 \(60 \mu \mathrm { l } \) 를 첨가하여 희석한 후, PCR (polymerase chain reaction)의 주형으로 사용하였다.</p> <p>합성된 cDNA를 주형으로 하여 유전자 특이적인 oligo primer를 이용하여 PCR (polymerase chain reaction) 과정을 수행하였다. PCR mixture 는 2 X PCR master mix (SeeGene, Korea)를 이용하였으며, PCR 반응은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분 enaturation시키고, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초, \( 58 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초의 cycle을 25번 반복한 후, 마지막으로 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분간 반응시켰다. PCR product는 전기영동하여 확인하였다. 정량적 real-time PCR은 ABI Prism 7500 cycler (Applied Biosystem, USA)를 이용하여 수행하였다. Primer의 각각의 Tm 값은 Primer express 1.5 software program (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 확인하였다.</p>