24종의 천연물을 이용하여 항염증 및 항산화 활성을 검색하고자 하는 연구로서 기존의 항염증제들은 출혈성 위장관 궤양, 신장기능 저하, 혈압상승 등의 부작용과 함께 심근경색 및 혈전형성 등의 순환계 질환도 유발할 수 있기에 본 연구에서는 부작용이 적은 천연물을 사용하여 항염증 및 항산화 활성을 검색하고자 하며 RAW 264.7 세포주를 사용하여 \( 10 \% \) FBS, \( 1 \% \) antibiotics, DMEM 배지를 이용하여 \( 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \)가 존재하는 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) incubator에서 1주일에 2~3회 계대 배양하였다.
<p>현재까지 치료에 사용했던 대부분의 항염증제들이 장기복용 할 경우 출혈성 위장관 궤양, 신장기능 저하, 혈압상승 등의 부작용과 함께 심근경색 및 혈전형성 등의 순환계 질환도 유발할 수 있다고 보고되었다. 효능과 안전성이 우수한 새로운 항염증제 개발에 관심을 가지게 되었으며, 다양한 분야에서 새로운 항염증제 개발을 위한 많은 연구들이 수행되었다. 따라서 본 연구에서는 비교적 부작용이 적은 천연물을 이용하여 항염증 및 항산화 활성을 검색하고자 한다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>시료 제조</h2> <p>24종의 건조 상태 시료 \( 1 \mathrm { ~kg } \)을 구입하여 가볍게 수세하여 건조한 후, 시료 무게의 10 배량 \( ( \mathrm { W } / \mathrm { v } ) \) 의 \( 70 \% \) 메탄올을 가하여 실온에서 24시간 동안 정치하여 총 3회 반복 추출하였다. 추출액을 여과지(Whatman No. 3, Maidstone, England)를 사용하여 2회 여과하고, 상등액은 rotary vacuum evaporator (EYELA UNI TRAP UT-1000, Tokyo, JAPAN)로 \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 농축한 후 동결 건조하여 사용하였다.</p> <h2>세포주 배양</h2> <p>대식세포 계열(murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포주는 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양 받았으며, \( 10 \% \) FBS (fetal bovine serum)와 \( 1 \% \) antibiotics (penicillin/ streptomycin)를 첨가한 DMEM (Gibco-BRL, Rockville, MD) 배지를 이용하여 \( 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \)가 존재하는 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) incubator에서 1주일에 2~3회 계대 배양하였다.</p> <h2>세포독성 측정</h2> <p>시료의 세포독성을 측정하기 위해 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5diphenyltetrazoliumbromide) assay를 green 등의 방법으로 측정하였다. RAW \( 264.7 \) 세포 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well을 96 well plate에 분주하고, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양한 RAW \( 264.7 \) 세포는 serum free 배지로 교체한 후 LPS \( (100 \mathrm { ng } / \mathrm { ml } ) \) 와 시료를 처리하여 각각 24 시간 배양하여 \( 5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 의 MTT 용액 \( 10 \mu 1 \)를 각 well에 넣고 incubator에서 4시간 동안 배양하였다. 배양종료 후 상등액을 제거하고 각 well에 \( 100 \mu 1 \)의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 microplate reader로 \( 550 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였고, 세포독성은 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.</p>