TRAIL은 암세포에서 apoptosis를 유발할 수 있는 최근 알려진 인자 중 하나로, 항암전략으로 활용되고 있으나 인체간암세포에서 TRAIL 저항성이 보고되고 있다. 본 연구에서는 genistein이 TRAIL에 의한 apoptosis 유도를 촉진함을 제시하고자 하며, 세포독성을 나타내지 않는 범위의 genistein 처리 조건에서 apoptosis 활성, caspase-3/7 활성 및 TRAIL 립프론 방출 등의 생리학적 변이를 실험적으로 검증하였다. 본 연구의 결과로 p38 MAPK 신호계가 TRAIL 저항성에 연관된 apoptosis 조절에 직접 관계함을 내포하여 주는 것을 알수 있다.
<h1>고 찰</h1> <p>TRAIL은 최근 알려진 apoptosis 유도 인자 중의 하나로서 정상세포에서는 세포독성을 보이지 않는 반면, 암세포, 형질전환된 세포 또는 바이러스에 감염된 세포 등에서 apoptosis를 유발할 수 있기 때문에 이를 활용한 항암전략이 큰 관심을 모으고 있다. 그러나 인체간암세포를 포함한 몇몇 암세포에서 TRAIL에 대한 저항성을 가지는 것으로 보고되면서 TRAIL의 활용에 관한 새로운 접근이 요구되어지고 있는데, 이러한 TRAIL 저항성의 원인으로 많은 apoptosis 조절 유전자들의 돌연변이나 과발현 등으로 추정되고 있다. 본 연구에서는 TRAIL 저항성 Hep3B 세포에서 대두의 대표적인 생리활성 물질로 알려진 isoflavonoid의 일종인 genistein이 TRAIL에 의한 apoptosis 유도를 매우 촉진할 수 있음을 제시하고자 한다. 이를 위하여 세포독성을 나타내지 않는 범위의 genistein 처리 조건에서 TRAIL에 의한 apoptosis가 genistein의 처리 농도 증가에 따라 큰 폭으로 상승하였음을 제시하였고(Fig. \( 1 \mathrm{~A} \) 및 \( \mathrm{C}) \), 이는 미토콘드리아 기능의 손상과 연관이 있음을 알 수 있었다(Fig. 1B). TRAIL 저항성 극복을 위한 genistein의 활용 방안에 관한 연구 중, Lee 등은 자궁경부암세포에서 genistein에 의한 TRAIL 저항성 극복이 ERK 경로의 비활성화와 연관되어 있음을 보고한 바 있으며, TRAIL 저항성 폐암세포에서 genistein은 Akt의 비활성화를 유도함으로서 TRAIL 유도 apoptosis 활성을 상승시킬 수 있는 것으로 보고된 바 있다. 본 연구실의 선행 결과에서 genistein에 의한 간암세포의 TRAIL 저항성 극복에 p38 MAPK 연관 가능성을 제시하였지만, MAPKs 또는 PI3K/Akt 경로 관련 총괄적인 비교 연구는 이루어진 바 없다. 따라서 동일 조건에서 이들 경로의 연관 가능성에 대한 비교를 하기 위하여 3 가지 MAPKs 저해제 및 Akt 활성 저해제가 genistein 및 TRAIL 복합처리에 미치는 영향을 조사한 결과, p38 MAPK 활성을 저해하였을 경우, genistein과 TRAIL 복합 처리에 의한 Hep3B 세포의 생존율을 극단적으로 저해하였으며, 이러한 p38 MAPK 활성의 저해는 genistein 및 TRAIL 복합처리에 의한 apoptosis 활성을 매우 증가시켰음을 확인하였다(Fig. 2 및 3). 즉 최소한 genistein 및 TRAIL 복합처리에 의한 apoptosis 유도활성에는 Hep3B 세포에서 \( \mathrm{p} 38 \mathrm{MAPK} \) 경로가 중요하게 작용하고 있음을 알 수 있었다.</p> <p>한편 그동안 보고된 genistein에 의한 암세포의 apoptosis 유도에는 현재까지 잘 알려진 apoptosis의 extrinsic 및 intrinsic 두 가지 주요 경로를 모두 경유하는 것으로 보고되어지고 있는데, Bid의 truncation (tBid)은 두 경로의 연결에 필수적으로 관여하는 pro-apoptotic 단백질이다. 따라서 genistein과 TRAIL의 동시 처리에 의한 apoptosis 유도에서도 \( \mathrm{p} 38 \mathrm{MAPK} \) 의 경로를 차단할 경우 두 경로가 동시에 관여할 것으로 기대되어 Bid의 발현 변화를 조사한 결과, p38 MAPK 저해제, genistein 그리고TRAIL이 동시에 처리된 조건에서 배양된 Hep3B 세포에서 total Bid의 발현이 완벽하게 사라져 tBid로 전환되었을 가능성을 보여주었다(Fig. 4A). 아울러 동일 조건에서 관찰된 Bax의 발현 증가와 Bcl-2의 발현 감소는 미토콘드리아의 MMP 손실에 대한 원인으로 작용하였을 것으로 생각되며, 이러한 MMP의 손실로 정상적인 미토콘드리아의 기능을 저해함으로서 cytochrome \( c \) 아 미토콘드리아에서 세포질로의 유출이 촉진되었음을 알 수 있었다(Fig. 4). 또한 genistein과 TRAIL이 동시에 처리된 조건에서 p38 MAPK 활성의 차단으로 인한 apoptosis 유발 과정에 extrinsic 및 intrinsic 경로가 모두 관여하였다면, 각각의 경로를 촉진시키는데 관여하는 caspase의 활성이 증가되었을 것이므로 몇 가지 주요 caspase의 발현 변화를 조사한 결과, p38 MAPK 저해제, genistein 및 TRAIL이 복합 처리된 조건에서 배양된 Hep3B 세포에서 extrinsic 및 intrinsic의 개시에 담당하는 caspase-8 및 -9의 활성이 증가되었음을 확인하였고, 아울러 두 caspase의 down-stream caspase인 caspase- 3 활성형의 발현이 매우 증가되었다(Fig. 5). 또한 caspase-3의 표적 단백질이며 apoptosis가 일어난 세포에서 단편화가 관찰되는 PARP 단백질 역시 동일 조건에서 단편화가 유도되었음을 확인하였다(Fig. 5). 최근 면역세포, 신경교세포, 혈구암세포, 자궁경부암세포, 간암세포 및 대장암세포 등을 이용한 연구들에서 TRAIL에 의하여 유도되는 apoptosis에 MAPKs 신호 전달계 중, \( \mathrm{p} 38 \) MAPK 경로가 직접적으로 관여하고 있음이 보고되어져 왔다. 특히 TRAIL 저항성 유방암세포에서 TNF에 의하여 유도되는 apoptosis 활성이 p38 MAPK의 활성 억제로 매우 증가되는 것으로 나타났으며, endotoxin에 의한 혈장 용해성 TRAIL의 발현을 증가에 p38 MAPK가 관여하고 있음이 보고된 바 있다. 이러한 결과들과 본 연구의 결과는 암세포의 종류에 따른 약간의 차이는 있겠지만, p38 MAPK 신호계가 TRAIL 저항성에 연관된 apoptosis 조절에 직접 관여하고 있음을 암시하여 주는 것이다. 그러나 일반적으로 genistein에 의한 암세포의 증식억제는 세포주기 G2/M arrest와 연관성이 있는 점으로 미루어, 세포주기 교란과 연관된 p38 MAPK의 역할에 대해서는 추후 더 구체적인 연구가 요구된다.</p>