CRP 단백질의 구조 변화를 측정하기 위해 Jasco \( \mathrm { J } 715 \mathrm { CD } / \) ORD spectrapolarimeter를 사용하여 야생형과 돌연변이 CRP의 CAMP에 의한 구조 변화를 protease digestion, 분광 광도계를 이용하여 관찰하였다. 일정한 온도상승에 의한 단백질의 열적 변섬은 분광 광도계를 이용하여 관찰하였고, 그리고 고온에서 일정한 값, 혹은 급격히 감소하는 경향을 보였다. 이와 같이 변성에 의한 CRP 단백질의 침전에 의한 것임을 알수 있다.
<p>Circular dichroism</p> <p>Jasco \( \mathrm { J } 715 \mathrm { CD } / \) ORD spectrapolarometer를 사용하여 측정하였다. \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { m \ell } \) 의 농도로 조점된 야생형, \( \mathrm { S83G } \)와 S128A \( \mathrm { CRP } \) 의 \( \mathrm { CD } \) spectra는 각각 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 와 \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 온도에서 측정하였으며, 퐈장 범위는 \( 190 \mathrm { ~nm } \sim 330 \mathrm { ~nm } \) 이였다. 측정할 때 사용 한 용액은 앞에서 언급한 전사 완충액에서 실험하였다.</p> <h1>결 과</h1> <p>전사과정을 조절하는 CRP 단백질은 CAMP의 결합으로 국부적인 구조변화가 DNA 결합부위인 helix-turn-helix에 전달되어 DNA의 프로모터 형역에 결합하여 전사과정을 조절한다. 본 연구에서 다양한 온도에서 야생형과 돌연변이 CRP의 CAMP에 의한 구조 변화를 protease digestion으로 관찰하였으며, \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 와 \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 단백질의 2 차 구조는 CD spectrapolarimeter를 이용하여 확인하혔다. 그리고 일정한 온도상승에 의한 단백질의 열적 변섬은 분광 광도계를 이용하여 관찰하였다.</p> <p>분광광도계에 의한 측정</p> <p>분광 광도계의 셀 홀더(cell holder)에 온도조절 순환장치부착하여 일정한 비율로 온도를 상승시켜서 \( \left (0.3 ^ {\circ } \mathrm { C } / \mathrm { min } \right ) \) 온도중가에 따른 단백질의 구조변화를 일정한 파장에서 관찰하였다. 온도가 증가할수록 CRP 변성이 일어나 구조가 변화함으로 CRP 내부의 아미노산이 밖으로 노출되는 등의 구조 변화가 일어난다. 이런 점차적인 욘도증가는 홉광도의 증가를 수반하며 그리고 고온에서 일정한 값, 혹은 급격히 감소하는 경향을 보인다. 고혼에서 이런 급격한 흡광도의 감소는 변성에 의한 CRP 단백질의 침전에 의한 것으로 여겨진다.</p> <p>본 연구에서는 야생형과 돌연변이(S83G, S128A) CRP에 대하여 \( \mathrm { CAMP } \) 가 결합한 상태와 결합하지 않은 상태에서 흡광도 변화를 관찰하였다. 그림 1-(A), 1-(B), 그리고 1-(C)<p>에서 보둣이, 먀생형 \( \mathrm { CRP } \) 의 \( \mathrm { Tm } \) 값은 \( 61.7 ^ {\circ } \mathrm { C } , \mathrm { S83G } \) 는 \( 57.9 \) \( { } ^ {\circ } \mathrm { C } , \mathrm { S } 128 \mathrm { ~A } \) 는 \( 59.2 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 인 것으로 보아 햐생형 CRP와 돌연변이 CRP 사이에 열 안정성이 크게 차이를 보이지는 않았다. 그러나 \( \mathrm { CAMP } \) 가 결합한 형태에서는 야생형 \( \mathrm { CRP } \) 의 \( \mathrm { Tm } \) 값이 \( 68.8 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 이고 변이형 \( \mathrm { S83G } \) 와 \( \mathrm { S128 } \) 는 각각 \( 60.7 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 와 \( 59 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로서 CRP가 CAMP와 결합함으로서 열에 대한 안정성이 크게 증가했음을 알 수 있었다. 5128A에서 cAMP 존재가 CRP의 열 안정성에 영향을 미치지 않는 것으로 보이며 CAMP의 binding affinity에서 야생혐 CRP와 같지 않음을 알 수 있다. 이는 CRP에서 아미노산 128 이 cAMP의 결합에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다.</p>