암세포주 PC-3와 LNCaP 세포를 세포 배양 플레이트에 분주하고 안정화 및 cordycepin을 다양한 농도로 24 또는 48 시간 동안 처리한 후 MTT assay를 이용하여 세포독성을 측정하였다. PC-3 세포에서 cordycepin의 apoptosis 유도 여부를 확인하기 위하여 FITC Annexin-V Apoptosis Detection kit를 이용하여 측정하고 염색된 세포는 flow cytometry 를 이용하여 측정, 이후 apoptosis가 유도된 세포는 Cell Quest software를 이용하여 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용시약</h2><p>3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), propidium iodide (PI), 2',7'-dichlorodihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA), 3,3-dihexyloxacarbocyanine \( \left(\mathrm{DiOC}_{6}\right) \), Fluo-3/AM 그리고 N-acetyl-L-cystein (NAC)은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 1,2-bis-(0-Aminophenoxy) ethane-tetra-acetic acid tetra-(acetoxymethyl) ester (BAPTA/AM)는 Calbiochem (Merck, Darmstadt, Germany)에서 구입하였으며, Annexin-V-Fluo Staining Kits는 BD Bioscience (San Jose, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Western blotting 에 사용한 antibody로 Bax, Caspase-3, PARP 그리고 \( \beta \)-Actin은 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Ca, USA)에서 구입하였고, Bcl-2는 Cell Signaling (Beverly, MS, USA)에서 구입하였다.</p><p>본 실험에서 사용한 cordycepin은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여, methanol로 \( 50 \mathrm{mM} \)의 농도로 녹여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하여 실험에 사용하였다.</p><h2>세포의 배양</h2><p>인간 전립선 암세포주인 PC-3와 LNCaP cell은 각각 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)과 Korea Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea)로부터 분양 받아 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS) (WelGene Inc., Korea)과 \( 100 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) penicillin, \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) streptomycin (WelGene Inc., Korea)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)과 RPMII640 (WelGene Inc., Korea) 배지에서 \( 5 \% \)의 \( \mathrm{CO}_{2} \)가 포함된 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 배양하였다. 모든 실험에서 항산화제인 NAC와 \( \mathrm{Ca}^{2+} \)chelator인 BAPTA/AM은 cordycepin을 처리하기 1시간 전에 전처리하였다.</p><h2>MTT assay를 이용한 세포독성의 측정</h2><p>세포 배양용 48-well plate를 이용하여 \( 1 \times 10^{4} \) cells/well의 농도로 전립선 암세포주인 PC-3와 LNCaP 세포를 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후, cordycepin을 다양한 농도로 24 또는 48 시간 동안 처리하였다. 이후 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도가 되게 MTT 시약을 처리하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4시간 반응하였다. 생성된 보라색의 formazan을 dimethyl sulfoxide (DMSO)로 녹인 후 ELISA reader (VERSA A max microplate reader, Molecular Devices, Toronto, Canada)로 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 이 흡광도는 MTT가 세포에 의해서 환원된 양으로, 각 well에 존재하는 세포의 생존 수와 비례한다.</p><h2>Annexin V / Pl assay를 이용한 apoptosis 유도 세포의 측정</h2><p>PC-3 세포에서 cordycepin의 apoptosis 유도 여부를 확인하기 위하여 FITC Annexin-V Apoptosis Detection kit를 이용하여 측정하였다. PC-3 세포를 \( 1 \times 10^{5} \)이 되도록 6-well plate에서 24 시간 동안 안정화시킨 후, cordycepin을 적정 농도로 24 시간 동안 처리한 후, 세포를 분리하여 phosphate buffered saline (PBS, \(\mathrm{pH} 7.4\))으로 세척하고, cell pellet을 Annexin-V/PI 시약과 \( 1 \times \) binding buffer를 이용하여 조심스럽게 현탁 후, 상온에서 15 분간 염색하였다. 염색된 세포는 flow cytometry (FACS Calibur, BD Biosciences)를 이용하여 측정하였고, Cell Quest software (Becton Dickinson Co.)를 이용하여 apoptosis가 유도된 세포를 분석하였다.</p>