본 절에서는 실험에 사용한 재료 및 방법을 소개한다. 본 실험에 사용된 균주는 Acetobacter sp. V이며, 본 실험에서 사용되는 당밀 용액은 총당 \( 4 \%\) \((\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 로 희석한 당밀 용액을 사용하였다. 이후 당밀 용액에서 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \)를 첨가한 후 상등액을 회수하여 \( \mathrm{NaOH} \)와 \( \mathrm{HCl} \)로 pH를 조정하는 황산 및 tricalcium phosphate (TP) 처리를 진행하였다. 또한 당밀 기본용액에 \( \mathrm{HCl} \) 및 PF, EDTA 첨가하여 PF 및 EDTA 처리를 진행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용균주 및 배양조건</h2><p>본 연구에 사용된 균주는 한국의 전통 식초로부터 분리, 동정된 Acetobacter sp. V이었다. 이 균주는 BC 생산능이 우수하며, 진탕배양에서도 BC를 생산할 수 있음이 이미 확인되었다. 전배양은 \( 50 \mathrm{ml} \) 의 Hestrin \(\&\) Schramm (HS) 배지가 함유된 250-\(\mathrm{ml} \) 용량의 conical flask에 평판한천배지에서 보존중인 균주 한 백금이를 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 72 시간동안 배양하였다. 형성된 pellicle 속에 존재하는 세포를 유리시키기 위하여 10 분간 강하게 진탕한 후, 멸균된 거즈로 여과하여 유리된 세포를 회수하였다. 이 세포현탁액 \( 5 \%\) \((\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)를 기본배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), \(200 \mathrm{rpm} \)에서 7일간 진탕배양하였다. 일부 물리화학적 특성 비교를 위한 대조구로서 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 7일간 정치 배양하여 생성된 BC를 사용하였다.</p><p>이때 사용한 HS 배지의 조성은 glucose \( 2 \% \), yeast extract \( 0.5 \% \), polypeptone \( 0.5 \%\), \(\mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot 12 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.675 \% \) 및 citric acid monohydrate \( 0.115 \%\) \((\mathrm{pH}6.5 \))이었으며, 기본배지의 조성은 glucose \( 4 \% \), yeast extract \( 0.1 \% \), polypeptone \( 0.7 \% \), \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot 12 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.8 \% \) 및 ethanol \(1.5\%\) \((\mathrm{pH}6.5 \))이었다.</p><h2>당밀 용액 조제</h2><p>본 실험에 사용된 당밀(cane molasses)은 유원당밀(주)에서 구입하였다. 총당 \( 4 \%\) \((\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 로 희석한 당밀 용액을 \( 17,418 \times \mathrm{g}\)에서 30분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였으며, 이 상등액을 전처리를 위한 기본용액으로 사용하였다. 아래의 방법으로 전처리된 당밀 용액을 총당 \( 4 \%\) \((\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 의 농도로 glucose가 첨가되지 않은 HS 배지에 첨가하여 배양하였다.</p><h2>황산 및 tricalcium phosphate (TP) 처리</h2><p>상기에서 조제한 당밀 기본용액에 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \)를 첨가하여 \( \mathrm{pH} 3.0 \)으로 조정하여 실온에서 24시간 동안 방치한 후, \( 17,418 \times \) \( \mathrm{g} \)에서 30분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였다. \( 5 \mathrm{~N} \) \( \mathrm{NaOH} \)를 이용하여 상등액의 \( \mathrm{pH} \)를 6.5로 조정하였다. 또한 상기에서 조제한 상등액에 \( \mathrm{HCl} \)을 첨가하여 \( \mathrm{pH} 7.0 \)로 조정하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15 분 동안 가열한 후, TP를 \( 1 \% \)가 되도록 첨가하여 다시 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 가열하였다. 실온에서 24시간 동안 고반한 후, \( 17,418 \times \mathrm{g} \)에서 30분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였으며, \( \mathrm{HCl} \)을 이용하여 상둥액의 \( \mathrm{pH} \)를 6.5로 조정하였다.</p><h2>Potassium ferrocyanide (PF) 및 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 처리</h2><p>상기에서 조제한 당밀 기본용액을 \( \mathrm{HCl} \)을 이용하여 \( \mathrm{pH} 6.5 \)로 조정하고 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분 동안 가열한 후, PF를 \( 0.5 \% \), EDTA를 \( 0.5 \% \)가 되도록 각각 첨가하여 다시 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15분간 가열하였다. 실온에서 24시간 동안 교반한 후, \( 17,418 \times \mathrm{g} \)에서 30분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였으며, 이 상등액의 \( \mathrm{pH} \)를 \( 6.5 \)로 조정하였다.</p>