적당량의 용해 완충액을 준비된 세포들에 첨가하여 만들어진 샘플은 SDS-PAGE 과정을 통해 단백질을 별도로 분리 후, Western blot analysis를 이용하여 단백질 발현을 확인 및 분석하였다. 또한, Bio-Rad 단백질 정량 시약과 Laemmli sample buffer로 샘플을 만들고, SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 분리한 후 Western blot analysis로 단백질 발현 분석을 시행 하였다.
<h2>Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석</h2> <p>준비된 세포들에 적당량의 lysis buffer [ \(25 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { Cl } \) \( \mathrm { pH } 7.5) \), \( 250 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } \), 5 \( \mathrm { mM } \) EDTA, \( 1 \% \), NP-40, \( 1 \mathrm { mM } \) phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), \( 5 \mathrm { mM } \) dithiothreitol (DTT)]를 첨가하여 단백질을 분리한 후, Bio-Rad 단백질 정량 시약 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 그 사용방법에 따라 정량 한 다음 동량의 Laemmli sample buffer (Bio-Rad)를 섞어서 sample을 만들었다. 이렇게 만든 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel 을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA) 으로 electroblotting에 의해 전이시킨 후, 적정 항체 를 이용하여 해당 단백질의 발현 변화를 비교하였다. 본 실험 에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 및 Calbiochem (Cambridge, MA, USA)과 Amersham Corp.에서 구입하였으며, enhanced chemiluminescence (ECL) 용액은 Amersham Life Science Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다.</p> <h2>MMPS 활성 분석을 위한 gelatin zymographic analysis</h2> <p>AGS 세포에서 matrix metalloproteinase (MMP)-2 및 MMP-9의 활성을 관찰하기 위하여 gelatin zymography를 시행하였다. ABG가 48 시간 동안 처리된 AGS 세포의 배양액을 \( 0.25 \% \) gelatin이 포함된 \( 10 \% \) polyacrylamide gel에서 전기영동을 시행하였다. 전기영동 후 \( 2.5 \% \) Triton X- 100 용액에서 15분간 수세하고 \( 50 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } ( \mathrm { pH } 7.8), 10 \mathrm { mM } \mathrm { CaC } { } _ { 2 } \)를 지닌 완충액으로 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 반응시켰다. 이후 Coomassie blue R-250 (Bio-Rad)으로 염색하고 MMP-2 및 MMP-9 활성 에 의하여 분해된 gelatin band를 관찰하였다. 전기영동을 시행한 시료의 양은 전체 단백질의 양으로 보정 후 사용하였다.</p>