HKSMM 시료 100g가 수용성 ethanol 용액 1.01에 용해되는 물질을 추출하고 동결건조 한 결과, 증류수 24.9%, 50% ethanol 43.6%, 70% ethanol 43.0%, 95% ethanol 23.1%가 나타났고 RAW 264.7 세포에 HKSMM50(50% 수용성 ethanol 추출물)을 최대 5,000\(\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml}\) 처리하여 NO를 Griess assay로 측정, LPS 처리에 비해 모든 HKSMM 수용성 ethanol 추출물이 NO를 유의성있게 감소시켰다. 또한 CCK-8방법으로 cell viability를 측정하여 LPS 처리에 비해 HKSMM50 시료 5,000\(\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml}\)에서도 세포 생육에 크게 영향을 미치지 않았다는 것을 확인하였다. 따라서 RAW 264.7 세포에 처리할 HKSMM 수용성 ethanol 추출물은 50% 수용성 ethanol 추출물(HKSMM50)이 가장 적당하고, 이 시료는 \(\beta\)-glucan 15.4%, total flavonoid 1.98mg/g, total isoflavonoid 1.42mg/g를 함유하고 있었다.
<h1>결 과</h1> <h2>RAW 264.7 세포에 처리할 HKSMM의 수용성 ethanol 추출물 선정</h2> <p>Fig. 1은 HKSMM 시료 \( 100 \mathrm{~g} \)이 수용성 ethanol 용액 1.01에 용해되는 물질을 추출하고 동결건조 한 결과를 나타내고 있다. HKSMM의 수용성 ethanol 용액에 용해되는 물질은 증류수 \( (0 \% \) ethanol)에 \( 24.9 \%, 50 \% \) ethanol에 \( 43.6 \% \), \(70\%\) ethano1 용액에 \( 43.0 \% \) 그리고 \(95\%\) ethanol 용액에 \( 23.1 \% \) 였다. HKSMM 수용성 ethanol 추출물의 동결건조물 색깔은 증류수 추출물은 황갈색이었고, 나머지 수용성 ethanol 추출물은 갈색이었다.</p> <p>RWA 264.7 세포에 처리할 HKSMM 수용성 ethanol 추출물을 선정하기 위하여 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에 HKSMM 수용성 ethanol 추출물 \( 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)을 처리하여 생성된 NO를 Griess assay로 측정하였다. LPS 처리에 비해 모든 HKSMM 수용성 ethanol 추출물은 NO를 유의성있게 감소시켰지만 \( (p<0.001), 50 \% \) ethanol 추출물이 가장 많은 NO를 감소시켰다. 따라서 RAW 264.7세포에 처리 할 HKSMM 수용성 ethanol 추출물은 \( 50 \% \) 수용성 ethanol 추출물(HKSMM50)이 가장 적당하였다. HKSMM 50에는 \( \beta \)-glucan \( 15.4 \% \), total flavonoid \( 1.98 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) 및 total isofla-vonoid \( 1.42 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) 함유되어 있었다.</p> <h2>HKSMM50 시료의 cell viability</h2> <p>LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에 HKSMM50 시료를 최대 \( 5,000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 처리하고 24 시간 배양한 후 CCK-8방법으로 세포 viability를 측정하였다. LPS 처리에 비해 HKSMM50시료 \( 5,000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 에서도 세포 생육에 크게 영향을 미치지 않았다. Positive control인 AHCC도 \( 5,000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)농도에서 세포 생육에 크게 영향을 미치지 않았다. 이 결과는 LPS로 활성화된 RAW 264.7세포 실험에 HKSMM50을 최대 \( 5,000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 처리할 수 있음을 의미한다.</p> <h2>\( \mathrm{HKSMM50} \) 의 \( \mathrm{NF- \kappa B} \)의 활성 억제</h2> <p>RAW 264.7세포의 염증반응에서 가장 중요한 인자는 \( \mathrm{NF}-\mathrm{kB} \)이다. LPS로 활성화한 RAW 264.7세포에 HKSMM50 시료 \( (0,20,100,500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)를 처리하고 24시간 배양한 후 배양액의 \( N F-\kappa B \) 함량을 ELISA kit를 사용하여 측정하였다. Positive control인 AHCC는 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)을 처리하였다.</p> <p>LPS 처리에 비해 HKSMM50 처리는 농도 의존적으로 유의성 있게 NF- \( \kappa B \)함량을 감소시켰다 \( (p<0.01 \sim p<0.001) \). HKSMM50 시료의 \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)처리는 Control 수준으로 \( N F-\kappa B \의 함량을 감소시켰다 AHCC시료 \( 100 \mathrm{ug} / \mathrm{g} \) 과 유사한 결과를 나타내었다. 이 결과는 HKSMM50 시료가 LPS로 활성화한 RAW \( 264.7 \) 세포에서 \( \mathrm{NF}-\kappa B \) 활성을 down regulation함을 의미한다.</p> <h2>HKSMM50 시료의 염증 mediator인 NO 및 \( \mathrm{PGE}_{2} \) 함량 감소</h2> <p>LPS로 활성화한 RAW 264.7 세포에 HKSMM50 시료 0 , \( 20,100,500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 를 처리하고 24 시간 배양한 후 배양액의 NO와 \( \mathrm{PGE}_{2} \) 의 함량을 ELISA kit를 사용하여 측정하였다. Positive control로 AHCC \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)를 처리하였다. LPS 처리에 비해 HKSMM50 시료 처리는 NO와 \( \mathrm{PGE}_{2} \)의 함량을 농도 의존적으로 유의성 있게 감소시켰다 \( (p< \) \( 0.01 \sim p<0.001 \) ). HKSMM50 시료 \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 처리는 NO와 \( \mathrm{PGE}_{2} \)함량을 Control 수준으로 감소시켰다. \( \mathrm{AHCC} 100 \mu \mathrm{g} / \) \( \mathrm{ml} \)도 동일한 농도의 HKSMM50 시료 효과와 유사하였다.</p> <p>HKSMM50 시료에 의한 NO와 \( \mathrm{PGE}_{2} \)의 함량 감소를 감소</p> <p>LPS로 활성화한 RAW \( 264.7 \) 세포에 HKSMM50 시료(0, \( 20,100,500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)를 처리하고 24 시간 배양한 후 배양액의 NO와 \( \mathrm{PGE}_{2} \) 의 함량을 ELISA kit를 사용하여 측정하였다. Positive control로 AHCC \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)를 처리하였다. LPS 처리에 비해 HKSMM50 시료 처리는 NO와 \( \mathrm{PGE}_{2} \)의 함량을 농도 의존적으로 유의성 있게 감소시켰다 \( (p< \) \( 0.01 \sim p<0.001 \) ). HKSMM50 시료 \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)처리는 NO와 \( \mathrm{PGE}_{2} \) 함량을 Control 수준으로 감소시켰다. AHCC \( 100 \mu \mathrm{g} / \) \( \mathrm{ml} \)도 동일한 농도의 HKSMM50 시료 효과와 유사하였다.</p> <p>HKSMM 50 시료에 의한 NO와 \( \mathrm{PGE}_{2} \)의 함량 감소를 검증하기 위하여 LPS로 활성화한 RAW 264.7세포에 HKSMM50 시료 \( (0,20,100,500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)를 처리하고 24시간 배양한 후 세포에 함유된 iNOS와 COX-2 protein 발현을 Western blotting으로 분석하였다. Positive control인 AHCC 시료도 HKSMM 시료와 동일한 농도 \( (0,20,100 \), \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) )를 처리하였다. LPS 처리에 비해 HKSMM50 처리는 iNOS와 COX-2 protein의 발현을 유의성 있게 감소시켰다 \( (p<0.001) . \mathrm{iNOS} \) 와 COX-2 protein의 발현은 HKSMM 50 시료 농도 의존적으로 유의성 있게 감소되었다 \( (p<0.001)\). HKSMM50 시료는 AHCC 시료보다 iNOS 및 COX-2 protein 발현을 더 강하게 억제하였다.</p> <p>이들 결과는 HKSMM50은 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 iNOS와 COX-2 protein 발현을 억제하여 NO와 \( \mathrm{PGE}_{2} \) 함량을 감소시켰음을 의미한다.</p> <h2>HKSMM50 시료의 pro-inflammatory cytokines 감소</h2> <p>LPS로 활성화한 RAW 264.7 세포에 HKSMM50 시료(0, \( 20,100,500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) )를 처리하고 24시간 배양한 후 배양액의 IL-1 \( \beta, \mathrm{TNF}-\alpha, \mathrm{IL}-4 \) 및 IL-6의 함량을 ELISA kit를 사용하여 측정하였다. Positive control로 AHCC \( 100 \mu \mathrm{g} / \) \( \mathrm{ml} \) 을 처리하였다.</p> <p>LPS 처리에 비해 HKSMM50 시료 처리는 IL-1 \( \beta, \mathrm{TNF}-\alpha \), IL-4 및 IL-6의 함량을 농도 의존적으로 유의성 있게 감소시켰다 \( (p<0.05-p<0.001) \). HKSMM50 시료 \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 처리는 Control 수준으로 \( \mathrm{TNF}-\alpha \)와 IL-6의 함량을 감소시켰다. AHCC \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 처리도 HKSMM50 시료 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)처리효과와 유사하였다. 이 결과는 HKSMM50 시료가 LPS로 활성화한 RAW 264.7세포에서 IL-1 \( \beta, \mathrm{TNF}-\alpha, \mathrm{IL}-4 \) 및 IL-6 의 함량을 감소시켰음을 의미한다.</p> <h2>HKSMM50 시료의 항산화효소 SOD 및 CAT 활성 증가</h2> <p>Fig. 8에서는 LPS로 활성화한 RAW 264.7 세포에 HKSMM50 시료 \( (0,20,100,500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)를 처리하고 24시간 배양한 후 배양액의 SOD와 CAT의 활성을 나타내고 있다. LPS 처리는 SOD 효소 활성을 Control 처리에 비해 유의성 있게 감소시켰다 \( (p<0.001) \). 그러나 HKSMM50 처리는 SOD 활성은 Control 수준으로 증가시켰다. AHCC처리 역시 유사한 결과를 보였다. CAT 효소 활성에서도 LPS 처리는 Control 수준으로 감소시켰지만 \( (p<0.001) \), HKSMM50 처리는 농도 의존적으로 CAT 활성을 Control수준으로 증가시켰다. AHCC 처리 결과도 동일한 HKSMM50처리 농도와 유사하였다.</p> <p>이 결과는 HKSMM50 시료는 LPS로 활성화된 RAW 264.7세포에서 SOD와 CAT의 활성을 증가시켜 항산화효과가 있음을 의미한다.</p>