neurophil 부유액을 이용해 얻은 상청은 glucuronidase의 활성도 측정에 사용되었고, 활성도 측정은 효소 반응을 정지시킨 후에 형광광도계를 이용하여 이루어졌다. ㅊCover glass에 PC12 세포를 배양한 후에 acridine orange를 이용해 염색을 하고 형광현미경을 사용하여 관찰하였으며, 세포증식 assay는 Mosmann의 방법대로 수행되었다. Rat hippocampal neuron 배지 및 배양을 위하여 임신 18개월된 rat을 단두하여 태아를 추출하고 대뇌반구를 잘라내었고, 핀셋으로 수막을 떼어 피질 부분을 잘라내었다.
<h2>Neurophil에서의 탈과립 유도</h2><p>\( 1.2 \times 10^{6} \mathrm{cell} /\mathrm{ml} \)의 neurophil 부유액 \( 150 \mathrm{ml} \)를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 배양했다. \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 FS11052을 가해 5분 후에 FMLP에 cytochalasin B (Sigma)를 첨가한 용액 \( 45 \mu \mathrm{l}\)를 첨가했다. 5분 후에 얼음 위에서 반응을 멈추게 하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(1,500 \mathrm{rpm}\)으로 2분간 원심분리했다. 얻은 상청 \(100\mu \mathrm{l}\)를 사용하여 glucuronidase의 활성을 측정했다.</p><h2>Glucuronidase 활성도 측정</h2><p>상청에 \( 0.1 \mathrm{M} \) 초산완충액 \( (\mathrm{pH} 4.6)\) \(300 \mu \mathrm{l} \) 를 가해 \( 37 \mathrm{C} \)에서 15분간 배양하여, 기질로서 \(50 \mathrm{l}\)의 \( 1 \mathrm{mM} \) 4-methyl-umbelliferyl-D-glucuronide를 첨가했다. 15분 후에 \( 0.1 \mathrm{M} \) 글리신완충액 \( (\mathrm{pH} 10.3)\) \(20 \mu \mathrm{l}\)를 첨가하여 효소반응을 멈추게 했다. 형광광도계의 여기파장을 \( 365 \mathrm{~nm} \), 형광파장을 \( 450 \mathrm{~nm} \)에 맞추어 유리한 4-methylumbelliferone의 fleuroscence density를 측정했다. 별도로 neurophil 부유액을 \( 0.2 \% \) Triton X-100로 세포를 용해하여, 원심상청액 중의 glucuronidase 활성을 \( 100 \% \)의 과립 방출량으로 했다.</p><h2>산성 organelle의 acridine orange 염색 및 세포독성</h2><p>PC12 세포를 24 well plate에 부착시킨 원형 cover glass (\(13 \mathrm{~nm} \) : 아세톤, 에탄올 등에 씻은 후, polyethylenimine(PEI)로 코팅한 것을 사용) 위에서 배양하여, FS11052 또는 concanamycin A (\(1 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ml}) \)에 의해 전처리를 1시간 행했다. 배지에 \( 10 \mathrm{mM} \) acridine orange를 1/2000 양을 더해(final conc. \( 5 \mu \mathrm{M})\), 15분간 배양했다. Cover glass를 회수하여, 클랩스링카액 (KR:\(120 \mathrm{mM} \mathrm{~NaCl}\), \(4.8 \mathrm{mM} \mathrm{~KCl}\), \(1.26 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{CaCl}_{2}\), \(1.22 \mathrm{mM} \mathrm{~MgSO}_{4}\), \(25 \mathrm{mM} \) Hepes- \( \mathrm{NaOH}\) \(\mathrm{pH} 7.4) \)에 몇번 세정하여, cover glass의 세포가 붙어있지 않은 측의 수분을 잘 닦은 후 건조시켜 KR으로 슬라이드글라스 상에 마운팅했다. 형광현미경에 의한 관찰은 Olympus BH-2 현미경을 사용, U 큐브, 보조흡수필터 Y455, 100배의 대물렌즈에 유침 상태에서 관찰했다. 세포증식 assay는 PC12 B3 세포를 콜라겐코팅한 96-well plate에 \( 2 \times 10^{4} \mathrm{cells}/\mathrm{well}\)의 농도로 접종하였다. 배양 24시간 후 FS11052 를 \( 0.1,1,10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 처리하였다. 처리 48시간 후에 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay를 Mosmann 의 방법에 따라 행했다.</p><h2>Rat hippocampal neuron 배지 및 배양</h2><p>본 실험에서 사용한 모든 세포는 DMEM 배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 10 \% \mathrm{CO}_{2} \) 탄산가스 incubator 내에 습기를 공급한 상태에서 배양했다. 임신 18일의 rat을 단두하여, 전신을 \( 70 \% \) ethanol 로 세정 후 복부로부터 태아를 자궁과 함께 추출했다. 태아를 자궁으로부터 분리하여, 두피 두 개를 해부하여 선단이 완곡한 완충액 속에 넣어 해부현미경하에서 메스로 좌우의 대뇌반구를 잘라냈다. 핀셋으로 수막을 떼어 피질부분을 예리한 핀셋으로 잘라내어 메스로 잘게 잘라서 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 파파인(Worthington, Lakewood, NJ, USA)을 함유한 파파인 희석액 \( 5 \mathrm{ml} \)에 현탁하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시켰다. 끝에 tip을 끼운 피펫으로 피펫팅 함으로써 세포를 분산시켜, \( 0.002 \% \) DNase I (Sigma)를 첨가 후 10분간 더 반응시켰다. \( 5 \%\) HS 를 포함한 DMEM을 첨가하여 다시 한번 피펫팅 한 후 autoclave 해둔 lens paper로 여과하여 세포를 분산 시킨후 \( 1000 \mathrm{rmp} \)에서 5분간 원심분리를 2회 반복하여 세포를 세정했다. 세포 수를 카운트 한 후, primary culture용 배지에 현탁하여 24-well plate (Nunc Co., LA Abcoude, Netherlands)에 접종하여 배양했다.</p>