본 논문은 P1-P2, P3-P4 프라이머 세트를 사용해 PCR을 통해 nagA, nagB 유전자의 0.4kb DNA 단편을 얻고, 다시 P1-P4를 사용해 overlap PCR을 통해 0.8kb 단편을 얻은 후 HindIII와 EcoRI으로 처리하였다. 이를 벡터 pK19mobsacB/HindIII \( / \) EcoRI에 클로닝하고 플라스미드 \( \mathrm { pK } 19- \Delta nagAB \)를 제작하였다. \( C \). 이후 glutamicum KG110 균주에 플라스미드를 도입하고 1, 2차 상동성 재조합을 유도하여 \( \operatorname { nanE } \) 유전자가 결손된 KG208을 만들었다.
<h3>염색체내 유전자 결손 \( C \). glutamicum 제작</h3> <p>\( C \). glutamicum ATCC 13032를 주형 \( \mathrm { DNA } \)로, P1-P2와 P3-P4 프라이머 세트(primer set)를 사용하여 \( \mathrm { PCR } \)을 통해 \( \operatorname { nag } A \) 유전자의 상류부위(upstream region)와 \( \operatorname { nag } B \) 유전자의 하류부위(downstream region)의 \( 0.4 \mathrm { ~kb } \) \( \mathrm { DNA } \) 단편들을 각각 얻은 다음, 다시 P1-P4를 사용하여 중칩(overlap) \( \mathrm { PCR } \)하여 \( 0.8 \mathrm { ~kb } \) 단편을 얻어 정제한 후 HindIII와 EcoRI으로 처리하였다. 이를 벡터 pK19mobsacB/HindIII \( / \) EcoRI 에 클로닝하여, 최종적으로 플라스미드 \( \mathrm { pK } 19- \Delta nagAB \)를 제작하였다. 이를 전기천공법으로 \( C \). glutamicum ATCC 13032에 도입하여 1차 상동성 재조(homologous recombination)을 통해 염색체에 삽입된 kanamycin 내성 형질전환주를 얻었다. 염색체내에서 \( \operatorname { nagA } \) 상류부위 또는 \( \operatorname { nagB } \) 하류부위로 삽입되었는지는 P5-P6, P7-P8로 \( \mathrm { PCR } \)하여 확인하였으며, 삽입이 확인된 균주를 \( \mathrm { LB } \) 액체배지에서 16시간 배양하여 희석한 다음 \( 10 \% \) sucrose \( \mathrm { LB } \) 한천배지에 도말하여 2차 상동성 재조합을 유도하고 kanamycin 내성이 없는 균을 선별하였다. \( nagAB \)가 결손 되었는지는 P5-P8 프라이머를 사용하여 \( \mathrm { PCR } \)한 후 전기 영동으로 확인하여, 최종적으로 균주 KG110을 제작하였다. 한편, \( C \). glutamicum ATCC 13032를 주형 \( \mathrm { DNA } \)로, P9-P10, P11-P12를 프라이머 세트로 사용하여 \( \mathrm { PCR } \)하여 \( \operatorname { nanE } \) 유전자의 상류부위와 하류부위 \( 0.4 \mathrm { ~kb } \) \( \mathrm { DNA } \)단편들을 얻고, P9-P12를 이용하여 다시 중첩 \( \mathrm { PCR } \)하여 \( 0.8 \mathrm { ~kb } \) \( \mathrm { DNA } \) 단편을 정제하였다. 이를 HindIII와 EcoRI으로 효소처리 후 pK19mobsacB/HindIII/EcoRI에 클로닝하여, 최종적으로 플라스미드 pK19- \( \triangle \) nanE 를 제작하였다. \( C \). glutamicum KG110 \( ( \triangle n a g A B) \) 균주에 제작된 플라스미드를 도입하고, 위에서 기술한 동일한 방법으로 1차, 2차 상동성 재조합을 유도하여 \( \operatorname { nanE } \) 유전자가 결손된 KG208을 제작하였다. 1차 상동성 재조합을 통해 염색체내 \( \operatorname { nanE } \) 상류부위 또는 하류부위로 삽입되었는지는 프라이머 P13-P14, P15-P16를 사용하여 \( \mathrm { PCR } \)하여 확인하였으며, 2차 상동성 재조합을 통해 \( \operatorname { nanE } \) 유전자가 결손된 것은 P13-P16 프라이머를 사용하여 \( \mathrm { PCR } \)하여 확인하였다.</p>