운반체인 35S-GFP는 kanamycin 저항성 유전자가 포함되어 있으며, 이를 XhoI과 Spel 제한 효소로 절단하여 ACA11 유전자를 연결하였다. 애기장대의 잎을 액체 질소로 냉각하여 분쇄한 후, Western blot 분석을 위해 막 단백질을 추출하였다. 또한, 활성산소종 발생 여부를 확인하기 위해 3, 3'-diaminobenzidine 시약을 이용하여 식물의 잎을 염색하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>형질전환에 사용한 운반체</h2> <p>식물 형질전환용 vector를 제작하기 위하여 먼저 ACA11 cDNA를 Xho I과 Spe I의 제한효소로 절단시켰다. 운반체는 선발 마커로 kanamycin 저항성 유전자를 가진 35S-GFP 운반체를 이용하였다. 35~SGFP 운반체는 pRT 운반체에 CaMV-35S promoter가 도입된 pBIN19 운반체로부터 유래되었다 (Hong et al. 1999). 35S-GFP 운반체를 XhoI과 Spel의 제한 효소로 절단한 후 이미 절단되어진 ACA11 유전자를 그 사이에 연결하였다. 35S-ACA11-GFP를 Agro-acterium tumefaciens (GV3101)에 형질전환 시킨 후, 형질전환된 A. tumefaciens 를 애기장대의 형질전환용으로 사용하였다. 형질전환된 애기장대의 \( \mathrm{T}_{0} \) 씨앗을 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 의 kanamycin과 \( 3 \% \) sucrose가 함유된 MS배지에 뿌려 3주 후 kanamycin에 저항성을 가져 살아나오는 식물을 흙으로 옮겨 심었다 (Clough and Bent 1998). 실험에 사용되어진 ACA11-GFP가 형질전환된 식물은 모두 \( \mathrm{T}_{2} \) 세대의 식물을 사용하였다.</p> <h2>막 단백질의 분리</h2> <p>막 단백질의 모든 분리과정은 냉각된 용액을 이용하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 가 유지되는 저온실에서 수행하였다. 식물의 막 단백질을 분리하기 위해서 흙에서 4주 동안 자란 애기장대의 잎을 액체 질소로 냉각된 막자 사발에 넣고 동결상태로 완전하게 분말이 되도록 분쇄하였다. 분쇄된 조직을 \( 290 \mathrm{mM} \) sucrose, \( 2 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 250 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) (pH 8.5), \( 2 \mathrm{mM} \) PMSF, \( 76 \mathrm{mM} \beta \)-mercaptoethanol으로 구성된 용액에 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분 동안 교반하였다 (Hong et al. 1999). 교반된 시료들을 촘촘한 천을 이용해서 찌꺼기를 제거하고 원심 분리기를 이용하여 \( 5000 \mathrm{xg} \) 에서 원심분리하여 세포벽과 나머지 찌꺼기를 제거하였다. 원심분리된 상층액을 이용하여 \( 100,000 \mathrm{xg} \) 에서 1 시간 동안 다시 원심분리하였다. 침전된 막 단백질들은 앞서 사용한 용액을 넣고 유리 동질화기구 (homogenizer)를 사용하여 다시 녹여내었다. 다시 녹여낸 막 단백질을 Western blot 분석을 위해 사용하였다.</p> <h2>3, 3'-diaminobenzidine (DAB) 염색</h2> <p>식물의 잎에서 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)이 발생하는지 조사하기 위해서 3, 3'-diaminobenzidine 시약을 이용하여 식물의 잎을 염색하였다. DAB 용액은 DAB \( 1 \mathrm{mg} \) 당 멸균된 물 \( (\mathrm{pH} \) 3.8) \( 1 \mathrm{~mL} \) 에 완전히 녹여 만든다. 애기장대의 잎을 Silwet \( (0.05 \%) \) 이 첨가된 멸균수 \( (\mathrm{pH} 3.8) \) 에 담그고 5분 동안 vacuum infilteration 을 수행한다. 다음으로 멀균수를 제거한 후 DAB 염색용액을 넣고 4-12시간 엄색한다. 염색이 끝나면 Lacto-phenol 용액으로 염색을 제거한 후 현미경으로 관찰한다.</p>