일반 PCR을 통해 확립된 PCR 조건을 기초로 해서 AccuPower Greenstar PCR Premix Ex Taq를 사용해 real-time PCR 조건을 확립한 뒤 수행했을 때 52\(^\circ \mathrm{C}\)가 최적 온도임을 알 수 있었다. 최적 온도에서 염화마그네슘의 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화했을 때 2mM에서 crossing point가 가장 낮게 나타나 2mM이 최적의 염화마그네슘 농도임을 알 수 있었다.
<h2>BPV DNA 정량을 위한 real-time PCR 최적화</h2> <p>일반 PCR을 통해 확립된 PCR 조건을 기초로 AccuPower Greenstar PCR Premix Ex Taq(Bioneer, Korea)을 사용하여 real-time PCR 조건을 확립하였다. Forward primer로 BPV-F4를 reverse primer로 BPV-R4를 사용하여 PCR 반응의 annealing temperature를 최적화하였다. Titer가 \( 1.3 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } , 1.3 \times 10 ^ { 3 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } , 1.3 \times 10 ^ { 1 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \) \( \mathrm { mL } \) 인 BPV를 시료로annealing temperature 를 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } , 52 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 54 ^ {\circ } \mathrm { C } , 56 ^ {\circ } \mathrm { C } , 58 ^ {\circ } \mathrm { C } , 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 변화시키며 real-time PCR을 수행하였을 때 \( 52 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 crossing point가 가장 낮게 나타나 \( 52 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 가 최적 온도임을 알 수 있었다.</p> <p>최적 온도에서 \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \) 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화하였다. Titer가 \( 1.3 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } , 1.3 \times 10 ^ { 3 } \) \( \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } , 1.3 \times 10 ^ { 1 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \) 인 BPV를 시료로 \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \) 농도를 \( 2 \mathrm { mM } , 3 \mathrm { mM } , 4 \mathrm { mM } , 5 \mathrm { mM } \) 로 변화시켜가며 real-time PCR을 수행하였을 때 \( 2 \mathrm { mM } \) 에서 crossing point가 가장 낮게 나타나 최적 \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \) 농도는 \( 2 \mathrm { mM } \) 임을 알 수 있었다.</p>