Rat2세포를 다양한 형질전환 및 배양을 통해 실험하였다. 이는 Schering-Plough 연구소의 Dr. Pai로부터 제공받은 MV7 control plasmid, MV7-H-RasV12, MV7-K-RasV12, MV7-N-RasN12를 이용한 것이다. 세포의 모양을 비교하기 위해 YH3938 및 YH3945를 이용하여 5일 동안 처리한 후 사진을 촬영하였다. 이 과정에서 MTT assay, Plasmid 제작, Transfection, SRE promoter assay 등의 방법을 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>세포 배양을 위한 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) 배지, fetal bovine serum (FBS) 및 기타 세포 배양에 사용된 다른 시약들은 Gibco-BRL사(Gaithersburg, MD, USA)로부터 구입하여 사용하였다. Cos7에 유전자를 이입하여 사용하기 위해서는 Qiagen사(Hilden, Germany)의 SuperFect를 사용하였다. MTT assay 킷트는 Roche사(Mannheim, Germany)의 제품을 사용하였고, Luciferase assay를 위한 시약들은 Promega사(Madison, WI, USA)의 제품을 사용하였다. YH3938 및 YH3945는 CAAX motif중 Cys-lle-Ile-Met을 tem-plate peptide로서 사용하여 유한양행에서 합성한 것을 제공 받아 DMSO에 녹여 사용하였다. Immunoblotting용 nito-cellulose membrane은 Schleicher & Schuell사(NH, USA)의 것을 사용하였고 enhanced chemiluminescence (ECL) 킷트와 Horseradish peroxidase가 붙어있는 mouse IgG는 Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden) 것을 사용하였다. Anti-pan-Ras antibody는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>Rat2세포에 MV7 control plasmid, MV7-H-RasV12, MV7-K-RasV12, MV7-N-RasN12로 형질전환시킨 세포(Rat2, Rat2-H-Ras, Rat2-K-Ras, Rat2-N-Ras) 는 Dr. Pai (Schering-Plough 연구소, Kenilworth, NJ, USA)로부터 제공받았으며, 각 세포의 배양은 DMEM (\(10\% \) FBS, \( 4 \mathrm{mM} \) L-glutamine, \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) gentamicin, \( 1 \mathrm{~mM} \) non-essential amino acid, \( 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ge-neticin 포함)에서 배양하였다. Cos7세포는 American Type Culture Collection (Rockville, Maryland, USA)에서 구입하여 배양하였다.</p> <h2>MTT assay</h2> <p>Rat2, Rat2-H/K/N-Ras를 well당 배지의 부피가 \( 100 \mu l \)가 되도록 하여 96 well에서 24시간 배양한 후 YH3938 및 YH3945를 지시된 농도가 되도록 처리하였다. 5일 후에 MTT assay를 킷트 제조회사의 지시에 따라 실시하였다. 간단히 설명하면, \( 10 \mu \) 의 MTT labeling reagent (최종농도 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) )를 각각의 well에 가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 0.5 \% ~\mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 4시간 배양하였다. 그 후에 각각의 well에 \( 100 \mu l \) 의 solubilization solution을 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 0.5 \%~ \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 16시간 동안 배양하였다. 생성된 formazan의 흡광도를 \( 570 \mathrm{~nm} \) 에서 plate read-er) 를 이용하여 측정하였다.</p> <h2>세포 모양 관찰과 Western blotting</h2> <p>세포의 모양을 비교하기 위하여 각각의 세포를 6 well에서 24시간 배양한 후 DMSO에 녹인 YH3938 및 YH3945가 최종 농도가 \( 0.1 ~\mu \mathrm{M}, 1 ~\mu \mathrm{M} \)이 되도록 DMSO로 농도를 조절하여 처리한 후 계속 관찰하면서 5일 후에 사진을 찍었다. 그 후에 세포를 ice-cold PBS로 한 번 세척한 후에 RIPA buffer 250 \( \mu l \) 에 녹였다. 단백질의 양을 측정하여 약 \( 10 \mu \mathrm{g} \) 의 cell lysate를 sample buffer에 녹여 \( 14 \% \)의 sodium dodecyl sulfate poly-acrylamide gel (SDS-PAGE)로 전기영동하여 단백질 분리 후, anti-pan-Ras antibody를 \(2\% \) skim milk/TTBS에 1:400으로 희석하여 immunoblotting을 수행하고 ECL 킷트를 이용하여 확인하였다.</p> <h2>Plasmid 제작, Transfection, SRE promoter assay</h2> <p>발암원성 H-rasV12, K-rasV12, N-rasN12, H-rasV12-CVLL들의 cDNA들은 N-말단부위에 HA tag를 첨가하기 위해 XbaI, BamHI site를 이용하여 mammalian expression vector인 pCGN에 subcloning하였다. 이 실험을 위해 PCR을 통해 subcloning된 모든 cDNA들은 염기배열을 통해 확인하였다. Cos7 세포에 이들 plasmid를 transfection하기 위해 12-well plate에 \( 0.8 \times 10^{5} \) 세포를 넣고 24시간 배양하였다. SRE-Luc의 reporter vector \( 50 \mathrm{~ng} \) 과 pCGN에 삽입된 ras 유전자 각 100 \( \mathrm{ng} \)을 SuperFect를 이용하여 3시간 배양하고 starvation용 DMEM으로 갈아주었다. FTI에 의한 영향을 살펴보기 위해서는 DMSO 또는 YH 3938 및 H945이 포함된 starvation용 DMEM으로 갈아주었다. 20시간 후에 세포를 \( 250 \mu \mathrm{l} \) 의 re-porter lysis buffer로 녹인 후 원심분리하고 그 상등액 \( 10 \mu l \)를 luciferrin \( 50 \mu l \)와 섞어서 luminometer (Tuner Designs Instruments, CA, USA)로 측정하여 luciferase의 활성을 측정하였다.</p>