해양으로부터 채취한 해수 sample을 marine broth 2216 agar plate에 도말하여 27\(^\circ \mathrm{C}\)에서 24시간 동안 배양하여 Agarolytic bacteria의 screening을 수행하였다. 균주 AS-1을 분리하고 VITEK 2 compact version으로 생화학적 기질을 이용한 colorimetry 분석을 통해 동정하였다. 분리된 균주의 배양조건에 따른 특성은 pH, 온도, salt 농도를 달리하여 확인하였다.
<h2>Agarolytic bacteria의 분리 및 동정</h2> <p>Agarolytic bacteria의 screening을 위해 해양으로부터 해수 sample을 채취하여 희석한 후, marine broth 2216 agar plate에 도말하여 \( 27 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 agar plate의 표면에 colony를 중심으로 움푹 파이거나 clear zone을 형성하는 균주를 분리하였다. 분리된 균주는 AS-1 으로 명명하였으며, 균주의 동정은 VITEK 2 compact version으로 생화학적 기질을 이용한 colorimetry 분석을 통해서 확인하였다.</p> <h2>분리된 균주의 생육특성 조사</h2> <p>분리된 균주의 배양조건에 따른 균주의 톡성은 온도, salt 농도, \( \mathrm { pH } \) 를 달리하여 \( 27 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간동안 진탕배양한 후 \( 550 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 배양조건은 온도 \( (15,23 \), \( \left .27,37 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \), salt농도 \( (0.5,1,2,3,5 \%), \mathrm { pH } (4.0 .5 .0,6.0,7.0,8.0 \), \( 9.0,10.0 \))에 따른 생육특성을 조사하였다.</p> <h2>Agarase 정제</h2> <p>Agarase 정제를 위한 모든 실험은 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 수행하였으며 균주는 \( 27 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 72시간동안 \( 180 \mathrm { ~rpm } \)의 조건에서 진탕 배양하였다. 배양액을 \( 6,000 \times \mathrm { g } \)에서 30분 동안 원심분리 한 상등액을 조효소액으로 사용하였다. 분리된 상등액은 \( 70 \% \) am-monium sulfate로 포화시킨 후 24시간 동안 침전시킨 다음 \( 6,000 \times g \) 에서 30 분 동안 원심분리 하였다. 침전물을 \( 25 \mathrm { mM } \) Tris-HCl buffer \( \mathrm { pH } ~8.0 \)로 용해한 후 동일한 buffer로 투석하였다. 투석된 용액은 HiPrep 16/10 DEAE FF column에 loading하고 \( 25 \mathrm { mM } \) Tris-HCl buffer \( \mathrm { pH } ~8.0 \)로 equilibrat-ing 하였으며, flow rate는 \( 1 \mathrm { ~ml } / \mathrm { min } \)으로 조절하였다. 단백질은 \( \mathrm { NaCl } \) gradient \( (0 \sim 1.0 \mathrm { M } ) \)를 포함하는 동일한 buffer로 elution한 후 fraction을 회수하여 효소활성을 측정하였다. 효소활성이 높은 fraction을 회수하여 HiPrep \( ^ {\mathrm { TM } } \) 26/60 Sephacryl \( ^ {\text { TM } } \) S-200 HR column을 loading하여 \( 25 \mathrm { mM } \) Tris-HCl buffer ( \( \mathrm { pH } ~8.0 \))로 equilibrating 하였으며, flow rate는 \( 0.5 \mathrm { ~ml } / \mathrm { min } \) 으로 조절하였다. 활성이 높은 fraction을 회수하여 단백질 전기영동으로 효소정제를 확인하였으며, agarase 효소 특성조사를 위한 정제효소 사용하였다.</p>