장기간의 세포 생존률과 안정 바이오센서 활동도는 고정화 matrix의 다공질 구조와 세포의 생리적 상태 및 다른 요인들에 의해 영향을 받을 수 있기에, agarose 농도와 세포 밀도, 기질 농도가 바이오센서 고정화에 어떤 영향을 미치는지 확인하였다. 기질과 바이오센서 세포를 \( 0. 1 \mu \mathrm{M} \sim 10 \mathrm{mM} \) phenol에 노출시켰고 고정되지 않은 세포와 비교하였을 때 기질과 동시에 고정할 경우 민감도는 떨어지지만 간단하고 한꺼번에 많은 시료를 측정할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 시료가 적게 소요되므로 환경적, 경제적 이득이 있다. 고정된 바이오센서의 반응이 고정되지 않은 자유 바이오센서보다 조금 느리고 약함을 확인하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>고정화 최적 조건</h2> <p>장기간의 세포 생존률과 안정한 바이오센서 활동도는 세포의 생리적 상대, 고정화 matrix의 다공질 구조 및 다른 실험요인들에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서 agarose 농도, 세포 밀도 및 기질 농도가 바이오센서 세포의 고정화에 미치는 영향을 조사하였다. 본 연구실에서 제작한 pLZCapR plasmid를 포함하는 미생물 바이오센서 세포를 96-well plate에 agarose gel로 고정하였다. Agarose는 비교적 큰 다공질큰 분자도 확산시키며 agarose 또는 agar-ose/agaropectin 혼합물은 실험실 세포의 중/단기 보관용으로 사용 많은 고정화 matrix 중에서 agarose를 선택하였다. 다양한 농도의 agarose로 세포를 고정시키고 \( 1 \mathrm{mM} \) phenol에 노출시킨 후 \( \beta \)-galactosidase activity를 \( \mathrm{OD}_{570 \mathrm{nm}} \) 에서 측정하였을 때, \(0.2\%\) agarose에서 가장 좋은 반응을 보였다. 이는 낮은 농도의 에서 미생물이 성장하는 데 필요한 산소나 다른 기질들이 보다 더 잘 확산되기 때문인 것으로 사료된다. 다른 과정 없이 을 넣은 후 CPRG 기질 분해로부터 붉은 색이 관찰되었다. 비교적 좋은 반응과 견고한 고정화로 인해 이후 모든 실험에서 \( 0.2 \% \) agarose로 바이오센서 세포를 고정하였다.</p> <p>발색되기 위해 \( \beta \)-galactosidase 기질과 페놀 화합물들이 세포 안으로 들어가야 하며 분해된 부산물이 세포 밖으로 배출되어야 한다. 그러므로, 바이오센서 시스템으로부터의 결과는 세포의 생리적 상태와 다른 실험 조건들에 의해 또한 영향을 받을 수 있다. 세포 밀도와 기질 농도가 고정된 바이오센서 시스템에 미치는 영향을 실험하였다. 발색에 미치는 바이오센서 세포 수 실험에서 최대 발색은 \( 0.8 \sim 1 \times 10^{8} \)cells/\(\mathrm{ml}\) 세포의 수를 사용할 때 보여주었다. \( \beta \)-galactosidase 기질의 경우, \( 5 \mathrm{mM} \) CPRG에서 흡광도가 최대로 증가되었다. 기질 CPRG는 그 자체가 노란색을 띄며 흡광도에 영향을 미칠 수 있으므로 모든 데이터는 각 조건(다양한 농도의 CPRG 및 그 외 조건)에서 그리고 아직 CPRG의 분해가 되지 않은 0 시간대에서의 흡광도 값을 가감 없이 그대로 나타내어 이를 관찰하도록 하였다. 눈으로 확인되는 좋은 발색과 \( 570 \mathrm{~nm} \) 에서 직선적인 정량 관계를 보여주는 \( 3 \mathrm{mM}\) CPRG을 이후 모든 실험에서 사용하였다.</p> <h2>고정된 바이오센서의 민감도</h2> <p>Agarose 고정은 기질이 세포로 자유롭게 확산되어 가는 것을 막이 바이오센서의 민감도에 영향을 줄 수 있다. 이러한 가능성과 현장에서 기질을 넣어야 하는 수고를 피하기 위하여 기질과 바이오센서 세포를 동시에 agarose gels로 96-well plates에 고정하여 \( 0.1 \mu \mathrm{M} \sim 10 \mathrm{mM} \) phenol에 노출시키고 그 결과를 고정되지 않은 세포와 비교하였다. 비록 고정되지 않은 바이오센서에 비해 전반적으로 다소 낮은 강도의 반응을 보여주었지만, 기질과 동시에 고정된 바이오센서 세포는 그렇지 않은 세포와 비슷한 반응 양상을 보여주었다. 두 바이오센서 모두 약 \( 5 \mu \mathrm{M} \sim 10 \mathrm{mM} \) phenol에서 흡광도가 증가하였다. 이전 논문에서 bioluminescence reporter를 가지는 CapR 바이오센서 시스템으로 \( 1 \mathrm{mM} \) phenol에서 최고의 값을 나타내며 그 이후 감소하는 것을 보고하였다. 이는 세포를 깨어 bioluminescence을 측정한 반면 이 실험에서 사용한 두 바이오센서 시스템(3-galactosidase reporter 근거 고정 및 고정되지 않은 자유 바이오센서) 모두 세포를 깨지 않고 \( \beta \)-galactosidase의 활성을 측정하여 \( 10 \mathrm{mM} \) 의 높은 농도에서도 반응을 보였다. 페놀 \( 100 \mu \mathrm{M} \) 부터 \( 10 \mathrm{mM} \) 까지의 \( \beta \)-galactosi-dase 활성 흡광도를 이용하여 검정선 \((y=0.0577 x+0.495, R^{2}= 0.8706 \))을 정하고 같은 세포를 사용하여 측정하는 미지시료의 표준으로 사용하였다. 96-well plate에 기질과 동시에 고정할 경우 약간의 민감도는 멀어지는 단점은 있으나 훨씬 간단하고 한꺼번에 96개의 시료를 측정할 수 있는 장점이 있다. 또한, \( 1 \mathrm{ml} \) 이상의 측정 부피를 필요로 하는 고정되지 않은 바이오센서와 비교해 \( 100 \mu \mathrm{l} \)보다 적은 시료를 측정하므로 사용되는 시약과 시료 및 발생되는 폐수가 감소되어 환경적으로 경제적으로 이득이 될 것으로 사료된다.</p> <h2>다양한 페놀계 화합물에 대한 반응</h2> <p>고정된 바이오센서의 특이성을 \( 1 \mathrm{mM} \) 의 다양한 페놀계 화합물로 시험하고 그 결과를 고정되지 않은 바이오센서 결과와 비교하였다. 고정 또는 고정되지 않은 바이오센서 세포는 2-methylphenol, 2-chlorophenol, catechol에 강하게, 2-ni-trophenol과 m-cresol에 중간 정도 반응하며, 4-nitrophenol에 반응하지 않았으며 이는 우리의 이전 보고와 일치된다. 그러나 고정된 바이오센서의 강도가 고정되지 않는 바이오센서보다 약함을 보여주었으며 화합물에 따라 다소 반응성의 차이 또한 나타난다. 이는 페놀과 비슷한 구조와 크기를 가지는 화합물은 페놀 인지 조절 단백질 CapR과 반응할 수 있을 것으로 사료된다. 하지만 이를 정확하게 설명하기 위해서는 조절 단백질 구조와 기능에 대한 보다 정밀한 실험이 요구된다. 이 결과는 agarose gels의 다공구조가 페놀계 화합물을 세포로 확산되는 데 충분히 큼을 보여준다. 그럼에도 불구하고, 고정된 바이오센서의 반응이 고정되지 않은 자유 바이오센서보다 조금 느리고 약함은 페놀계 화합물이 agarose로 인해 세포로 확산되는 속도가 어느 정도 감소됨을 나타내고 있다.</p>