본 연구에서는 산림토양에서 선발된 저영양미생물자원, EP15224 균주(한국농용미생물센타 기탁균주 KACC91872P)를 활용하여 보라색소인 비올라세인을 생산하는 과정을 탐구하였다. 액체배지에서 5일 간 배양한 후 배양액 내 비올라세인의 함량을 주기적으로 측정하였으며, 이를 통해 최적 배지조성에 대한 경제적 평가를 진행하였다. EP15224 균주는 \( 200 \mathrm{ml} \)의 MM2-B 액체배지에 배양하였고, 배양 조건은 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm} \)으로 3일 동안 진행하였다. 이후 원심분리(\( 8,000 \mathrm{rpm} \), 10분)로 상층액을 제거하고 남은 균체에 \( 200 \mathrm{ml} \) 에탄올을 첨가하여 보라색소를 추출하였다. 추출 과정은 균체에서 보라색이 완전히 추출될 때까지 10분 이상 초음파처리를 수행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>미생물</h2> <p>본 연구에 사용된 EP15224 균주(한국농용미생물센타 기탁균주 KACC91872P)는 산림토양에서 분리한 저 영양미생물자원에서 선발된 보라색소를 생산하는 균주이다.</p> <h2>배지 및 배양</h2> <p>EP15224 균주의 계대와 일반적 배양은 R2A (Difco사) 배지를 사용하였고 비올라세인을 생산하는 최적 조성을 찾기 위해서 MM2 합성배지 조성(MM2-B: 리터당 glucose \( 2 \mathrm{~g} \), \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} 1 \mathrm{~g}, \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 4 \mathrm{~g}, \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} 2 \mathrm{~g}, \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.1 \mathrm{~g}, 1 \mathrm{mM} \) tryptophane; \( \mathrm{pH} 6.8\))을 이용하였다. 플라스크 진탕배양은 균 접종량 \( 10 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \), 배양온도 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \), 진탕 속도 \( 250 \mathrm{rpm} \) 에서 3일간 실시하였다. 최적배지 조성을 찾기 위한 MM2 합성배지의 조성표는 Table 1과 같다. 이들 액체배지에서 5일간 배양하면서 주기적으로 채취한 배양액 내 비올라세인의 함량을 측정하여 가장 경제적인 생산의 최적 배지조성을 조사하였다. 비올라세인의 정량은 배양액 \( 1 \mathrm{ml} \)에 메탄올 \( 3 \mathrm{ml} \) 을 부가하여 30분간 진탕시키고 원심분리한 상층을 \( 585 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하고 \( \mathrm{OD}_{585 \mathrm{~nm}}=0.12 \)일 때 \( 2.1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 로 환산하여 정량하였다.</p> <h2>비올라세인 추출, 분리</h2> <p>EP15224 균주를 \( 200 \mathrm{ml} \) 의 MM2-B 액체배지(1리터 삼각 플라스크)에 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm} \) 으로 3일간 진탕 배양한 뒤 원심분리하여(\( 8,000 \mathrm{rpm} \), 10분) 상층액을 버리고 남은 보라색 균체에 \( 200 \mathrm{ml} \) 에탄올을 첨가하여 균체에서 보라색이 추출 될 때까지 초음파처리를 10분 이상 실시하였다. 에탄올 추출액은 다시 원심분리하여(\( 8,000 \mathrm{rpm} \), 10분) 균체를 제거하고 진공감압 농축하여 메탄올 \( 20 \mathrm{ml} \) 로 최종 용해한 뒤, 이를 실리카겔 칼럼(직경 \( 25 \mathrm{~mm} \times \) 길이 \( 500 \mathrm{~mm} \) )에 로딩하고 메탄올로 보라색소를 분획하였으며 다시 진공감압 농축한 뒤 \( 5 \mathrm{ml} \)의 메탄올로 최종 용해하여 이를 LC/MS/MS의 분석시료로 사용하였다.</p> <h2>LC/MS/MS 분석</h2> <p>보라색소 물질은 역상칼럼(Mightysil RP-18 GP, \( 250 \mathrm{~mm} \times 4.6 \mathrm{~mm} \), Kanto Chemical, Tokyo, 일본)을 이용한 HPLC-PDA (Shimadzu, Japan; SPD-M20A)로 분리하였으며 \( 580 \mathrm{~nm} \)파장에서 피크를 검출하였다. 분리된 피크는 Water사의 고해상 QTOF-ESI/MS [ACQUITY (UPLC, Waters Corp., USA) SYNAPT G2-S (Waters Corp., USA)]을 사용하여 MS/MS 분석을 수행하였다.</p> <h2>16S rRNA 염기서열 및 근연 관계 분석</h2> <p>선발된 EP15224의 분자생물학적 동정을 위해 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 및 1492R(5'-GGCTAC CTTGTTACGACTT-3') primer로 PCR을 수행하여 16S rRNA 유전자를 증폭하였다(\( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 변성시킨 뒤 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분간, 34 사이클). 분리된 DNA는 PCR 2.1 Topo TA Vector system (Invitrogen사)에 클로닝하고 이를 ABI 3700 (Perkin Elmer, Co.) 기기로 염기서열분석을 수행하였다. 상동성은 GenBank DB의 Blast 프로그램을 이용하여 비교하였으며, 염기서열은 DNA Plus Version 3.0 Sequence Alignment 프로그램(Scientific and Educational Software)을 이용하여 병렬로 정렬하였다. EP15224 균주의 계통분석도(phylogenetic tree) 작성은 16S rRNA 유전자 염기서열 분석에서 비올라세인을 생산하는 것으로 보고된 다른 세균이나 이와 상동성이 높은 세균 종의16S rRNA 유전자 염기서열과 비교 분석해서 MEGA version 5.0의 근린결합법으로 작성하였다.</p>