화영식품(주)에서 구매한 대두(US number 1 soybean)를 다양한 극성을 가진 용매를 사용하여 항돌연변이 및 항암활성 물질을 분획하였다. 실험에서 얻은 억제율은 \( 100 \times[(a-b) /(a-c)] \) 식을 이용해 계산하였다. 대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 자료를 바탕으로 분산분석(ANOVA)를 수행하고, 결과에 대한 통계적 해석은 Duncan's mutiple range test를 사용하여 진행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>대두의 용매 추출 및 분획</h2> <p>대두(US number 1 soybean)는 화영식품(주)으로부터 구입하였고 대두의 항돌연변이 및 항암활성 물질을 추출하기 위해 극성이 다른 용매로 더욱 분획하였다. 대두 \( (10 \mathrm{~kg}) \) 를 분말화하고 헥산으로 3회 추출(hexane extract)하고 얻어진 잔사물 \( (9715 \mathrm{~g}) \) 을 2배 메탄올로 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 환류 냉각기를 사용하여 3 회 추출 \( (686 \mathrm{~g}) \) 하였다(methanol extract). 회전식 진공 농축기를 이용하여 농축한 후, 다시 디클로로메탄(dichloromethane fraction), 에틸아세테이트(ethylacetate fraction) 및 부탄올 (butanol fraction) 순서로 분획깔때기를 이용하여 분획한 후 회전식 진공 농축기로 용매를 제거하기 각각 디클로로메탄분획물 \( (230 \mathrm{~g}) \), 중간 분획물(intermcdiate fraction, \( 113 \mathrm{~g}) \), 에틸아세테이트 분획물 \( (6 \mathrm{~g}) \) 및 부탄올 분획물 \((36 \mathrm{~g})\) 및 물 분획물 \((302 \mathrm{~g})\) 을 얻었다. 각각의 분획물들은 회전식 진공 농축기로 완전히 용매를 제거한 후 dimethylsulfoxide (DMSO)에 녹여 실험에 사용하였다.</p> <h2>Ames 돌연변이 유발실험</h2> <p>Salmonella typhimurium TA100은 S. typhimurium LT-2의 histidine auxotroph로서 미국 California 대학의 B.N. Ames 박사로부터 제공받아 정기적으로 histidine 요구성, deep rough (rfa) 돌연변이, uvrB 돌연변이, \( \mathrm{R} \) factor 등의 유전형질을 확인하면서 실험에 사용하였다. 간접 돌연변이 유발물질인 alflatoxin \( \left(\mathrm{AFB}_{1}\right. \))은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 DMSO에 녹여 실험에 사용하였고 직접 돌연변이원인 N-methyl- \( \mathrm{N}^{\prime} \)-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG)는 Sigma Chemical Co.에서 구입하여 증류수에 녹여 실험에 사용하였다. 간접돌연변이원인 \( \mathrm{AFB}_{1} \) 의 경우 활성화를 위하여 Maron과 Ames의 방법에 따라 S9 mixture를 첨가하였다. 항돌연변이 실험은 미리 건열 멸균시킨 glass cap tube에 S9 mix 혹은 phosphate buffered saline (PBS) \( 0.5 \mathrm{ml} \), 하룻밤 배양된 균주 \( 0.1 \mathrm{ml}(1 \sim 2 \times 10^{9} \mathrm{cells}/\mathrm{ml})\) 와 돌연변이 유발물질 \( (50 \mu \mathrm{l}) \) 을 가한 후, 시료를 \( 1.25 \mathrm{mg} / \mathrm{plate} \) 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 분간 예비 배양한 다음 histidine/biotin이 첨가된 top agar ( \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)) \( 2 \mathrm{ml} \) 씩을 가하고 vortex하여 minimal glucose agar plate에 도말하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48 시간 배양한 후 revertant 숫자를 계수하였다. 돌연변이 억제효과의 정도(inhibition ratc)는 아래식에 의해 계산하였다.</p> <p>Inhibition rate \( (\%)=100 \times[(a-b) /(a-c)] \)</p> <p>여기서 \( a \) 는 돌연변이원에 의해 유도된 복귀돌연변이원수, \( b \) 는 시료를 처리하였을 때의 복귀돌연변이의 수이며, \( c \) 는 돌연변이원과 시료가 없을 경우의 자연복귀돌연변이원의 수이다.</p> <h2>Sulforhodamine (SRB) assay법</h2> <p>인체 위암세포(AGS gastric adenocarcinoma cells), 인체 간암세포(Hep 3B hepatocellular carcinoma cells) 및 인체 결장암세포(HT-29 colon cancer cells)는 한국 세포주 은행(서울의대)으로부터 분양받아 배양하였다. SRB assay를 위하여 암세포를 96 well plate에 well당 \(40,000 \mathrm{cells}/\mathrm{ml}\)이 되도록 seeding하고 24시간 배양 후 세포가 plate에 부착되면 시료추출물 \( 100 \mu \mathrm{l}\) 를 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양하였다. 이때 blank에는 시료와 \( 10 \% \) fetal calf serum(FCS)를 함유한 배지만 넣고 대조군에는 세포와 시료대신에 DMSO 를 첨가하였다. 배양 48 시간 후에 배지를 제거한 후 PBS 로 한번 씻은 후 \( 50 \% \mathrm \mathrm{l}\) TCA 를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 냉장 방치하였다. 1 시간 후 Trichloroacetic acid (TCA)를 제거하고 증류수로 5 번 씻은 후 실온에서 건조시킨 후 \( 0.4 \% \) sulforhodamine B \( 100 \mu \mathrm{l}\) 첨가하여 30분간 염색시켰다. 다음 \( 1 \% \) acetic acid로 5번 씻은 후 다시 실온에서 건조시킨 후 \( 0.01 \mathrm{M} \) tris base를 \( 150 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가한 후 \( 510 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>통계분석</h2> <p>대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 자료로부터 ANOVA를 구한 후 Duncan's mutiple range test를 이용하여 통계 분석하였다.</p>