본 연구는 공기 중 노출 시 염증작용이 의심되는 기전을 분석하기 위해 인체 폐포 상피세포에서의 염증성 인자들 즉, 항진성 염증인자로서 IL-8및 COX-2를 분석하고 염증 억제성 및 세포증식 억제 인자로서 MIC-1의 조절을 평가하고자 한다. 이에 대한 재료 및 방법에 대한 설명이다.
<p>본 연구는 재조합 단백질 생산에 흔히 사용되는 P. fluorescens에 대한 공기 중 노출 시 염증작용이 의심되는 기전을 분석하기 위하여 인체 폐포 상피세포에서의 염증성 인자들 특히 IL-8, COX-2, MIC-1의 발현을 분석하고자 한다. 즉, 항진성 염증인자로서 IL-8및 COX-2를 분석하며, 염증 억제성 및 세포증식 억제 인자로서 MIC-1의 조절을 평가하고자 한다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포배양, 유전자 및 시약</h2> <p>A549 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD)에서 구매하여 RPMI 1640media ( \(10 \% \) FBS, 50 unit/ml penicillin (Sigma, St. Louis, MO)), 50 \( \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) streptomycin (Sigma)에 \(5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) humidified in-cubator \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양하였다. 세포수와 생존활성(viability)은 trypan blue (Sigma) dye exclusion을 이용해서 hemacy-tometer 상에서 측정하였다. 화합물 노출 실험 중에는 혈청이 없는 배지를 이용하였다. 저해제 등은 Calbiochem (EMD biosciences, Inc. La Jolla, CA)에서 구매하였다.</p> <h2>Western Immunoblot Analysis</h2> <p>Cell lysate 는 RIPA buffer \( (1 \times \) PBS, \( 1 \% \) NP-40, \( 0.5 \% \) sodium deoxycholate, \( 0.1 \% \) SDS, \( 100 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) PMSF, \( 1 \mathrm { mM } \) sodium orthovanadate, Protease Inhibitor Cocktail (Sigma))로 준비하고 2-3초 정도의 sonication 후 lysate protein은 BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL)를 이용해서 정량하였다. 각각 \( 50 \mathrm { mg } \) 단백질을 소형 전기 영동기를 이용해서 분리한 후 단백질을 PVDF membrane (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)에 이동하였다. 블롯은 1 시간 동안 5 \% skim milk Tris-buffered saline plus Tween \( 0.05 \% \) (TBST)로 blocking 후 각각의 일차항체로 2 시간 상온에서 반응 후 3회 TBST로 세척 후 horseradish-conjugated secondary antibody로 1 시간 상온 반응 후 3회 세척 후 ECL Chemiluminescent substrate (Amersham Pharmacia Biotech)로 발색 현상하였다. 각 일차항체는 rabbit polyclonal anti-human Actin antibody (Santacruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), 토끼 polyclonal anti-p-MAPKs, anti-Egr-1 항체 (Cell signaling technology, Beverly, MA)를 사용하였다.</p>