Somogy-Nelson법을 활용하여 한천분해 효소의 반응 산물인 환원당을 측정함으로서 효소의 활성을 측정하였다. 또한 한천의 농도와 생육온도를 달리하며 한천분해효소 활성이 어떻게 달라지는지도 측정하였다. 조효소액을 이용하여 온도 바꿔가며 효소활성의 변화를 확인하였고, 마찬가지로 pH에 따른 효소활성의 변화도 확인하였다. 분해산물은 TLC를 이용하여 분석하였다.
<h2>효소활성 측정</h2> <p>한천분해 효소의 반응산물인 환원당의 측정은 Somogy-Nelson법으로 실시하였다. 조효소 반응용액 \( 0.5 \) \( \mathrm{ml} \)에 \( 2.0 \) \( \mathrm{ml} \)의 Somogy 시약 (\( 10 \% \) \(\mathrm{CuSO}_{4}\) \(80 \mathrm{~ml}\), \(1 \mathrm{~N}\) \(\mathrm{NaOH}\) \(100 \mathrm{~ml}\), \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{SO}_{4}\) \( 180 \mathrm{~g}, \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot 12 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 71 \mathrm{~g}, \mathrm{C}_{4} \mathrm{H}_{4} \mathrm{O}_{6} \mathrm{KNa} \cdot 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) \( 40 \mathrm{~g} \) / D.W. \( 1 \mathrm{l}) \)을 첨가하여 반응을 중지시키고 10분간 끓였다. 실온으로 냉각된 용액에 arseno-molybdate 시약을 첨가하고 \( 14000 \times g \)에서 5분간 원심분리한 상층액의 흡광도를 \( 550 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 한천분해 효소의 활성은 1분당 \( 1 \mu \) mole의 galactose를 생산해 내는 효소의 양을 1 unit로 정의하였고 galactose를 이용하여 표준적정곡선을 작성하였다.</p> <h2>생육온도 및 한천농도에 따른 분리균주의 생육 및 한천분해 활성</h2> <p>한천의 농도를 \( 0,0.1,0.2,0.3 \% \)로 달리한 \( 5 \mathrm{~ml} \)의 marine broth 2216 배지를 \( 50 \mathrm{~ml} \) 용량의 시험관을 이용하여 배양하면서 \( (27^{\circ} \mathrm{C}, 37^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{~rpm})\) 생육양상과 한천분해효소 활성을 측정하였다.</p> <h2>온도에 따른 한천분해 효소의 활성</h2> <p>조효소액을 이용하여 온도에 따른 한천분해능의 안정성을 실시하였다. 표준 기질용액으로는 \( 0.2 \% \)의 \( \operatorname{agar}(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)가 포함된 \( 20 \mathrm{~mM} \) sodium phosphate \( (\mathrm{pH} 7.0) \) 완충용액을 이용하였다. 기질용액을 중탕가열한 후 \( 20 \sim 80^{\circ} \mathrm{C} \)의 온도별로 냉각하였다. 완충용액 \( 1.0 \mathrm{~ml} \)에 조효소액 \( 0.5 \mathrm{~ml} \)을 첨가하여 30분간 반응시킨 후 효소활성을 측정하였다.</p> <h2>\( \mathrm{pH} \)에 따른 한천분해 효소의 활성</h2> <p>최적 \( \mathrm{pH} \)와 \( \mathrm{pH} \)에 따른 한천분해 효소의 활성을 측정하기 위하여 \( 100 \mathrm{~mM} \) sodium acetate 완충용액 ( \( \mathrm{pH} \) 3.1-4.9), 20 \( \mathrm{mM} \) sodium phosphate 완충용액 \( (\mathrm{pH} \) 4.4-7.8), \( 50 \mathrm{~mM} \) TAPS 완충용액 \( (\mathrm{pH} \) 7.8-9.0)을 이용하였다. 한천이 포함된 \( (0.2 \% \mathrm{~w} / \mathrm{v}) \) 완충용액을 중탕가열한 후 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)까지 냉각 후 반응수조를 이용하여 온도를 유지하면서 완충용액 \( 1.0 \mathrm{~ml} \)에 조효소액 \( 0.5 \mathrm{~ml} \)을 첨가하여 30분간 반응시킨 후 효소활성을 측정하였다.</p> <h2>한천올리고당 가수분해산물의 thin-layer chromatog-raphy (TLC) 분석</h2> <p>효소액을 이용한 neoagarohexaose의 분해산물을 TLC를 이용하여 분석하였다. 조효소액과 neoagarohexaose (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 \( 20 \mathrm{~mM} \) sodium phosphate ( \( \mathrm{pH} 7.0) \) 완충용액에서 \( 40^{\circ} \mathrm{C}\), 48시간 반응시킨 후, silica gel 60 TLC plate (Merck, Darmstadt, Germany)로 분석을 행하였다. TLC 분석은 n-butanol/acetic acid/ \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) (2:1:1, by vol.)를 이용하여 전개시켰고, \( 10 \%\) \((\mathrm{v} / \mathrm{v})\) \(\mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \)로 가시화시켰다. 표준물질로 neoagarohexaose (Sigma)와 neoagarotetraose (V-Labs Inc., St. Covington, LA, USA)를 사용하였다.</p>