본 논문은 중금속 내성 미생물 분리하고 동정하는 과정을 설명하고 있다. 균주를 분리하고자 습지의 갈대근권토양과 식물이 살고 있는 호수 물에서 질소고정능력이나 식물성장촉진능력이 우수한 균주를 시료로 채취했고 그 균주를 대상으로 중금속이 첨가된 배지에 배양해 중금속에 내성이 강한 균주를 분리했다. 이후 균주의 질소고정 능력과 식물성장 촉진 능력을 평가했다.
<h1>중금속 내성 미생물 분리 및 동정</h1> <p>균주를 분리하기 위한 시료채취는 경기도 A습지의 갈대근권토양 그리고 식물이 서식하고 있는 호수 물로부터 질소고정능력 또는 식물성장촉진능력이 우수한 균주를 분리한후 그 균주를 대상으로 중금속이 첨가된 배지에 배양하여 중금속에 내성이 강한 균주를 분리하였다. 균주의 질소고정 능력 및 식물성장 촉진 능력 평가는 Hong 등의 논문을 참고하여 평가하였다. 분리된 균주는 16S rDNA 부분염기서열을 분석하였다.</p> <p>습지에서 서식하는 갈대를 채취하여 \( 250 \mathrm{~mL} \) 삼각플라스크에 멸균수 \( 90 \mathrm{~mL} \)를 넣고 뿌리 또는 근권토양을 \( 10 \mathrm{~g} \)을 넣은 후 혼합하여 진탕배양기에 15분간 배양하였으며, 진탕 배양기는 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 180 \mathrm{rpm} \)으로 운전하였다. 15분간 진탕 배양된 시료 중 혼탁액 \( 5 \mathrm{~mL} \)을 분취하여 \( 250 \mathrm{~mL} \) 삼각플라스크에 넣은 후 \( 50 \mathrm{~mL} \)의 액체 배지(Burk's, Congo Red 그리고 NFB)에 넣은 후 일주일간 농화배양 하였다. 농화배양은 모두 4번의 새 배지로의 계대배양을 진행하였으며, 이중 수수 분리를 하기에 앞서 각각의 배양액의 질소고정능력을 평가하였다. 질소고정능력을 가지고 있는 배양액을 고체배지(Burk's Agar, Congo Red Agar, NFBA)에 도말 하였다. 균주는 아세틸렌 활성도를 \( 1 \mathrm{nmole}^{-1} \mathrm{mg} \) protein \( { }^{-1} \) 이상 나타냈던 샘플에 대해서 고체배지에 도말 하였다. 배지의 종류에 따라서, Burk's Agar 배지에 도말한 균주의 경우 7일 동안 배양하고, Congo Agar 배지 그리고 NFB ager 배지에 도말한 균주는 3일 동안 배양하였다. 배양된 균주는 색과 모양에 따라 분리되어 새 배지에 도말 하였고, 각 colony의 질소고정 능력을 평가하였다. \( \mathrm{KC}-1 \) 균주는 식물성 호르몬인 인돌아세트산(IAA)의 생산능력과 식물의 스트레스성 물질인 에틸렌 전구체인 카복실레이트(1-aminocyclopropane-1-carboxylate(ACC)) 분해효소인 ACC deaminase생성하였다.</p> <p>분리된 균주는 the National Center for Biotechnology Information(NCBI) website의 basic Local Alignment Search Tool(BLAST) algorithm을 통해 GenBank database와 비교하여 동정하였다. 식물성장촉진능력이 있으면서 동시에 중 금속에 내성을 가지고 있는 미생물인 KC-1균주의 \( 16 \mathrm{~S} \) rDNA 부분 염기서열분석결과, 분석된 \( \mathrm{KC}-1 \)의 DNA 염기 서열은 총 \( 1,501 \mathrm{bp} \)였고, Betaproteobacteria의 Alcaligenes sp. F78(accession no. EU443097)와 유사도가 \( 99 \%(1488 / \) 1501), 해수의 퇴적물에서 분리한 Alcaligenes sp. CO14 (accession no. DQ643040)와 유사도가 \( 99 \%(1486 / 1500) \)로 나타났다. KC-1균주를 Genbank에 등록하였다(accession no. JF303893). Alcaligenes 속의 미생물은 호기성, 그람음성 세균으로 지금까지 보고된 중금속에 내성을 가진 Alcaligenes 속의 미생물로는 쌍떡잎식물인 꽃향유의 근권에서 분리한 2EBS14균주로서 \( \mathrm{Cu} \)에 강한 내성을 가지는 것으로 보고되 었고, \( \mathrm{Cd} \)으로 오염된 토양에서 분리한 Alcaligenes faecalis strain \( \mathrm{J} 08 \mathrm{Cd} \)의 경우는 최종농도가 \( 0.01 \mathrm{mM}, 0.1 \) \( \mathrm{mM} \)과 \( 0.5 \mathrm{mM} \)가 되도록 첨가된 배지에서 48시간 동안 강한 내성을 보이며 성장하였다고 보고되었다.</p>