절굿대와 엉겅퀴의 건조 및 분쇄된 식물체를 methanol 첨가 후 원심 분리 시킨 상등액으로 mycobacteria에 대한 증식억제능을 시험하는 데에 사용하였고, 건조된 엉겅퀴의 잎으로부터 genomic DNA를 추출하여 정제 후 PCR 증폭 및 cloning 하여 3개 선택한 흰색의 colony들로부터 plasmid DNA를 추출하였으며, agarose gel electrophoresis를 통해서 예상되는 크기의 insert DNA가 포함되이있는 것을 확인한 후 GenBank의 BLAST 및 ClustalW1.83를 통해서 염기서열 분석을 실행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물재료</h2> <p>본 연구에 사용된 절굿대와 엉겅퀴는 강원도 정선 지역에서 채취된 것들을 사용하였다. 항균력 시험에는 Mycobacterium smegmatis \( \mathrm{mc}^{2} 155 \) 균주 및 Mycobacterium fortuitum ATCC 19542 균주를 사용하였다.</p> <h2>메탄올 추출</h2> <p>절굿대와 엉겅퀴의 건조된 식물체를 A11 basic analytical mill (IKA Works, Inc.)을 이용하여 15-30 초 동안 분쇄하였다. 분쇄된 식물체 \( 0.5 \mathrm{~g} \) 에 methanol \( 10 \mathrm{~ml} \) 를 첨가하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 overnight 동안 유지시키고, bletop centrifuge로 5분간 원심 분리 시킨 후에 상등액을 취해서 mycobacteria에 대한 증식억제능을 시험하는 데에 사용하였다.</p> <h2>Anti-mycobacterial 활성 측정</h2> <p>Mycobacterium fortuitum 및 Mycobacterium smegmatis는 Middlebrook 7H9 medium에서 하루 정도 배양하였다. 이것을 1/10의 같은 medium으로 희석한 후, 희석된 배양액 \( 1 \mathrm{~ml} \)를 Middlebrook 7H9 agar에 spreading하고, 액체가 보이지 않을 때까지 공기로 건조시켰다. 메탄올 추출물의 희석하지 않은 원액 \( 50 \mu \mathrm{l} \), 1/2로 희석된 액 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 그리고 1/4로 희석된 액 \( 50 \mu \mathrm{l} \)를 각각 직경이 \( 8 \mathrm{~mm} \)인 filter disc에 떨어뜨리고 건조시켰다. 이렇게 준비된 filter disc를 세균이 도말된 agar plate에 떨어뜨리고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 세균들을 배양하며 inhibition zone 의 형성 여부를 관찰하였다. 이때에 추출물이 포함되지 않은 methanol도 \( 50 \mu \mathrm{l} \)를 filter disc에 떨어뜨리고 건조시켜서 con-trol로 사용하였다.</p> <h2>식물체로부터 genomic DNA 추출</h2> <p>건조된 엉겅퀴의 뿌리로부터 genomic DNA를 추출하려 시도 하였으나 고분자량의 DNA를 추출하는 데에 실패하였다. 따라서 건조된 엉겅퀴의 잎으로부터 genomic DNA를 추출하였다. 막자사발로 분쇄한 건조된 엉겅퀴 잎 \( 30 \mathrm{~mg} \) 을 OMEGA Bio-Tek (www.omegabiotek.com)의 EZNA \( { }^{\mathrm{TM}} \) SQ Plant DNA Kit를 사용하여 genomic DNA를 정제하였다.</p> <h2>PCR 증폭</h2> <p>PCR 반응은 DNA template \( 18 \mathrm{~ng} \), ITS1 primer \( 2.5 \mathrm{pmol} \), ITS4 primer \( 2.5 \mathrm{pmol} \), dNTPs mixture \( 2 \mu \) ( \( 10 \mathrm{~nM} \) each) 그리고 DyNAzyme EXT DNA polymerase (New England BioLabs) \( 1 \mu \mathrm{l}(1 \mathrm{U}) \)를 포함하는 \( 50 \mu \mathrm{l} \)의 반응액에서 진행하였다. PCR에는 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')과 ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')가 primers로 사용되었다. 반응조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2 분간 한 cycle, 그리고 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 초, \( 53^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 분씩 30 cycle을 진행시킨 후, 최종적으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5 분간 유지시켰다. PCR에는 proofreading 기능을 가지고 있는 DyNAzyme EXT DNA pol-ymerase를 사용함으로써 DNA 합성 반응 중에 error가 발생하는 것을 최소화 하였다. 이렇게 얻이진 PCR 산물을 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Corp.)으로 정제하였다.</p> <h2>Cloning 및 염기서열 분석</h2> <p>위와 같이 정제된 PCR 산물을 ethanol을 사용하여 침전시키고, 정제된 DNA는 Sma I 으로 절단된 pBluescript SK II plasmid와 섞어서 ligation 반응을 진행시킨 후, Escherichia coli DH5a competent cell을 transformation 시키는 데에 사용하고, transformed cells는 ampicillin \( (10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)을 함유하는 MacConkey agar plate에 도말하였다. 흰색의 colony들 중에서 3개를 선택하고, 이들로부터 plasmid DNA를 추출하고, agarose gel electrophoresis를 통해서 예상되는 크기의 insert DNA가 포함되이있는 것을 확인한 후, 염기서열 분석을 수행하였다. 염기서열 분석을 위해서는 T3 및 T7 promoter pri-mers를 사용하여 양쪽 strand를 모두 분석하여 서로 비교하였다. 염기서열 분석은 (주)바이오닉스(서울특별시 구로구 구로 3동 235번지)에 의뢰하였다. 염기서열의 비교분석은 GenBank의 BLAST 및 ClustalW1.83를 통해서 수행하였다.</p>