재조합 플라스미드 DNA에서 클로닝된 \( \beta \)-Lactamase 유전자를 분리하여, 다양한 제한 효소 처리를 통해 \( 6.4 \) kb DNA 단편을 얻었다. 이 단편은 염기서열 분석에 사용되었다. 또한, E. coli에서 \( \beta \)-lactamase의 존재 여부를 판단하기 위해 Neu의 방법을 변형하여 실험하였으며, 이 과정에서 급속해동과 냉동 과정을 2회 반복한 후 원심분리를 진행하였다.
<h2>\( \beta \)-Lactamase 유전자의 subcloning 및 염기서열 분석</h2> <p>\( \beta \)-Lactamase gene이 cloning된 재조합 plasmid DNA를 분리하여 다양한 제한효소를 처리하여 최종 \( \beta \)-lactamase 유전자가 포함된 \( 6.4 \mathrm { ~kb } \mathrm { DNA } \) 단편을 얻었다. 이 단편을 염기서열 분석에 이용하였다. DNA 염기서열 분석은 dideoxynucleo-tide method로 이행하였으며 기질로 plasmid DNA를 사용하였다. 염기서열 분석은 DNASIS (Hitachi Software Engineering America, Ltd., San Bruno, Calif) program과 NIH BLASTA program을 이용하였다.</p> <h2>E. coli 에서 발현된 \( \beta \)-lactamase의 세포 내외 존재 비율 분석</h2> <p>E. coli에서 \( \beta \)-lactamase의 균체 내외의 존재 시험은 Neu의 방법을 변형하여 실험하였다. Ampicillin \( (2 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \)를 함유한 \( 50 \mathrm { ml } \mathrm { LB } \) 배지에 균을 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 18시간 진탕배양 후 원심분리 \( \left (15,000 \times g, 10 \mathrm { ~min } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \)하여 균체를 집균하고 상층액은 따로 보관하였다. 균체를 \( 10 \mathrm { mM } \) Tris-HCl pH 8.0 \( 10 \mathrm { ml } \)로 1회 세척한 후 상기 조건으로 원심분리하여 상층액을 앞의 상층액과 합하여 균체외 효소액으로 하였다. 균체는 10 \( \mathrm { mM } \) Tris-HCl (pH 8.0), \( 1 \mathrm { mM } \) EDTA, \(0.1 \% \) (w/v) lysozyme 혼합용액 \( 5 \mathrm { ml } \)에 현탁하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30분간 방치 후 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1시간 냉동하였다. 이것을 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20분간 급속해동 시킨 후 냉동과 해동의 과정을 2회 반복한 후 원심분리 \( (25,000 \times \mathrm { g } , 20 \) \( \left . \min , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \)로 상층액을 회수하여 세포 내 효소액으로 하였다.</p>