본 실험에 사용된 실험 재료는 민간요법으로 사용되는 약재를 한의학 처방에 따라 혼합하고 추출하였다. Flavonoid glycoside를 용해, 여과하여 HPLC 분석 하였다. 전자공여능은 시료를 농도별로 희석하여 시료가 없는 대조그룹과의 흡광도차를 비교하여 프리라디칼의 제거활성을 백분율로 나타냈다. \(\mathrm{NO}\) 생성은 비색법으로 세포 상등액에 축적되는 nitrite 양을 측정하였고, \(\mathrm{NO}\)의 활성은 ELISA 판독기로 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 실험은 macrophage를 추출물이 함유된 배지에서 배양하고 흡광도를 측정하여, 추출물이 세포생존율에 미치는 영향을 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>시료 채취 및 추출</h2><p>본 실험에 사용된 실험 재료들은 경상남도 거창 농가와 한약재 판매상으로부터 구입하였으며, Table 1에 나타낸 수치에 따라 첨가하여 추출시켰다. 이는 민간요법으로 그 효능이 전해져 내려오고 있는 약재를 한의학적으로 처방하고 있는 수치에 따라 혼합하여 추출하였다. 추출은 채취한 시료를 동결 건조시킨 후 분쇄기로 분쇄하고 30 mesh 이하의 것을 추출용 시료로 사용하였다. 에탄을 추출물은 분쇄된 시료에 \( 80 \% \) 에탄올\( 1\mathrm{l}\) 를 첨가하여 실온에서, 열수 추출물은 증류수 \( 1\mathrm{l}\) 를 첨가하여 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \)에서 각각 24시간 추출한 후 여과한 다음 rotary evaporator로 농축한 후, 동결 건조하여 얻었다. 그리고 추출 시료들은 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동 보관하며 실험재료로 사용하였다.</p><h2>HPLC 분석</h2><p>Flavonoid glycoside 분석을 위한 표준용액 \( (1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) quercetin, kaemferol, myricetin, apigenine, luteolin, rutin을 메탄올에 용해시켜 사용하였고, 시료 \( (10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)는 메탄올에 용해한 후 Sea-pak C18 cartridge와 \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) filter로 여과하여 HPLC 분석용 시료로 사용하였다. 분석용 column은 Octadecylsilane (ODS) C18 \(( 4.6 \times 25 \mathrm{~cm}, 5 \mu \mathrm{m}) \)을 사용하였고, 용매는 \( \mathrm{MeOH} / \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)/Acetic acid \( (5 / 93 / 2, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \)와 \( 60 \% \mathrm{~MeOH} \)를 사용하여 linear gradient해서 55분간 용출 시킨 후 15분간은 \( 60 \% \mathrm{~MeOH} \) 로서 용출하였다. Total flow rate은 \( 1 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \)로 하였고, detector는 UV \( 370 \mathrm{~nm} \)에서, column temp. oven은 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)로 하여 Shimadzu LC-10AD으로 분석하였다.</p><h2>전자공여능(Electron donation ability, EDA) 측정</h2><p>전자공여능 측정은 Blois의 방법[2]에 따라서 각 시료의 DPPH (1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl)에 대한 수소공여 효과로 측정 하였다. 추출시료를 DMSO에 녹여 농도별로 희석하여 시료 \( 40 \mu \mathrm{l} \) 와 \( 1.5 \mathrm{mM} \) DPPH용액 \( 160 \mu \mathrm{l} \)를 섞은 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분 동안 반응시킨 다음 ELISA reader를 이용하여 \(520 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능(Electron donating ability, EDA)은 \(EDA(\%\))=\((대조구흡광도-시료첨가구흡광도)/대조구흡광도\times\)\(100\) 으로 계산하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조그룹과 흡광도차를 비교하여 프리라디칼의 제거활성을 백분율로 나타내었다.</p><h2>세포배양</h2><p>마우스대식세포주인 RAW264.7 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA. USA)에서 구입하였으며, 세포배양에 사용된 배지인 RPMI 1640 media (Eagle's MEM) 과 fetal bovine serum (FBS), Hank's balanced salt solution (HBSS) 등은 모두 Hyclone (Logan, UT, USA)의 제품을 구입하여 사용하였다. RAW264.7 세포주는 \( 10 \% \) FBS와 100 unit의 penicillin과 streptomycin이 함유된 RPMI 1640 media를 사용하여 \( 5 \% \) 의 이산화탄소를 포함한 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 포화습도 공기조건 하에서 배양하였다.</p><h2>Nitric oxide (\(\mathrm{NO}\)) 생성량 측정 및 cell viability 측정</h2><p>\(\mathrm{NO}\)의 생성은 비색법으로 세포 상등액에 축적되는 nitrite 양을 측정하였다. 대식세포를 세포 배양판에 \( 5 \times 10^{5} \) cells \( / \mathrm{ml} \)의 세포가 되도록 재부유하여 LPS의 자극하에 24시간 배양하고 그 배양 상층액 내의 \(\mathrm{NO}\)를 Griess 시약과 반응시켜 측정하였다. \( 100 \mu \mathrm{l} \)의 세포배양 상층액을 취하여 동량의 Griess 시약[\(1\%\) sulfanilamide ( \( 30 \% \) acetic acid)와 \(0.1\%\) N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride ( \( 60 \% \) acetic acid) 혼합액]을 가하여 상온에서 20분간 반응시켰다. \(\mathrm{NO}\)의 활성 정도는 ELISA 판독기를 사용하여 \( 800 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도 범위에서 \( 540 \mathrm{~nm} \) 흡광도를 측정하였다.</p><p>세포독성 실험은 mitochondrial dehydrogenase activity의 index를 나타내는 MTT colorimetric reduction assay 법으로 추출물이 세포생존율에 미치는 영향을 분석하였다. 96-well microtiter plate (Nunc, Vangaard, Neptune, NJ)에 RAW 264.7 macrophage를 \( 1 \times 10^{5} \) cells/well의 농도로 분주하였다. 분주 24시간 후 각 추출물이 함유되어 있는 배지를 \( 100 \mu \mathrm{l}\) 씩 넣어 48시간 동안 배양하였다. Plate에 MTT \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT, Sigma, USA) 용액을 \( 20 \mu \mathrm{l}\) 씩 첨가하여 4시간 동안 배양시키고 formazan을 형성시킨 후 조심스럽게 상등액을 제거하였다. DMSO \( 150 \mu \mathrm{l}\)을 첨가하여 formazan을 녹인 후 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>