Yeast two-hybrid assay에서는 bait로 사용될 full length REF-1 cDNA를 pBHA vector에 ligation하였고, 그 후 HB101에 transformation하여 재조합 plasmid를 확인하였다. HF7C yeast strain을 사용하여 Ref-1의 DNA binding domain만으로도 reporter gene의 발현을 유도하는지 검사하였다. 이어서 prey cDNA library의 insert 크기를 조사하였다. 그 후, Ref-1과 binding하는 단백질을 탐색하기 위해 Mouse 11-day Embryo MATCHMAKER cDNA library와 함께 HF7C yeast strain에 cotransform을 실시하였고, 세 가지 서로 다른 크기(0.4, 0.7, 1.0 kb)의 insert DNA 염기서열을 분석하였다. 이중, 0.4 kb insert DNA 염기서열은 Thioredoxin (TRX)과 일치하였다.
<h1>결 과</h1><h2>Yeast two-hybrid를 이용한 REF-1 binding cDNA clone의 탐색 및 분리</h2><p>Yeast two-hybrid assay에서 bait로 사용할 full length REF-1 cDNA를 pBHA vector의 EcoRI/BamHI 자리에 ligation한 후 HB101에 transformation하고 ampicillin 저항성 transformant 5개를 무작위로 선발하여 EcoRI/BamHI digestion을 통하여 재조합 plasmid를 확인하였다. 그 결과 5개 plsamid 모두 full length REF-1 insert를 가지고 있음을 확인하였다. 다음 bait로 사용할 Ref-1이 DNA binding domain만으로도 reporter gene의 발현을 유도하는지의 여부를 조사하기 위해 HF7C yeast strain을 사용하여 self-activation test를 실시하였다. HF7C에 bait DNA와 GAL4 activation domain만을 가지는 벡터인 pBHA와 pGBT9을 각각 transformation 시킨 뒤, histidine growth와 \( \beta \)-galactosidase 활성을 조사하였다. 그 결과 full-length REF-1 bait DNA를 포함하고 있는 vector와 GAL4 activation domain 만을 가지는 vector 만으로는 self-activation 효과가 전혀 없음을 확인하였다(data not shown).</p><p>그리고 증폭한 prey cDNA library의 insert를 조사하기 위하여 transformant 6개를 무작위로 선택하여 plsamid DNA를 추출한 다음, EcoRI과 XhoI으로 잘라서 insert의 크기를 조사하였다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 \( 1 \mathrm{~kb} \)에서 \( 0.5 \mathrm{~kb} \) 정도의 insert가 확인이 되어 cDNA library의 제조상태가 양호함을 확인하였다.</p><p>Ref-1 단백질과 binding하는 단백질을 탐색하기 위하여 bait인 Ref-1을 포함하는 plsamid와 Mouse 11-day Embryo MATCHMAKER cDNA library (Clontech)를 HF7C yeast strain에 cotransform하여 histidine, leucin, tryptophan이 결핍된 SD plate에 도말하고, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다.</p><h2>\( \boldsymbol{\beta} \)-Galactosidase assay를 통한 REF-1과의 상호작용 조사</h2><p>REF-1과 cotransform된 gene product가 Ref- 1 단백질과 binging하면 Gal4 activation domain에 의해 \( \beta \)-galactosidase가 발현되게 된다. 발현된 \( \beta \)-galactosidase에 의해 배지에 함유된 5-bromo-3-indolyl- \( \beta \)-D-galactopyranosid (X-gal)이 분해되어 colony가 푸른색을 띠게 된다. 이러한 방법을 이용하여 yeast transformant를 nitrocellulose filter membrane에 transfer하고, X-gal를 함유하는 Z buffer \( (60 \ \mathrm{mM} \ \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\), \(40 \mathrm{mM} \mathrm{NaHPO}_{4}\), \(10\ \mathrm{mM}\ \mathrm{MgCl}_{2}\), \(50\ \mathrm{mM} \ \mathrm{KCl}) \)에 적셔놓은 \( 3 \mathrm{M} \) paper에 올려 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 또는 상온에서 방치시킨다. 1-2시간내에 푸른색으로 변하는 16개의 colony들을 1차적으로 선택하였다.</p><h2>Positive clone의 insert 확인</h2><p>푸른색을 띠는 colony에서 bait vector를 제거하기 위해 leucine이 결핍된 SD 액체배지에 넣어 배양시킨 후 cell을 모은 다음 glass bead를 넣고 vortex하여 yeast cell을 파쇄시키고 상층액속에 포함되어 있는 plasmid를 electrocompetent cell(HB101)에 electroporation시키고 LB-ampicillin plate에 spreading하였다. Transformant들로부터 plasmid를 추출하여 EcoRI/XhoI digestion으로 insert의 크기를 확인하였다. 그 결과 insert의 크기가 0.4, 0.7, 1.0 \(\mathrm{~kb} \) 세 종류로 분류되었다. 또한 이들 세 종류의 insert들을 갖는 plasmid들을 각각 REF-1 plasmid와 HF7C yeast strain에 cotransform하여 \( \beta \) -galactosidase 활성을 보임을 다시 확인하였다(data not shown).</p><h2>DNA sequencing을 통한 탐색한 cDNA clone의 분석</h2><p>Ref-1 protein과 binding하는 clone으로 확인된 0.4, 0.7, 1.0 \( \mathrm{kb} \) insert의 DNA 염기서열을 결정하고 그 염기서열을 Gene-Bank에서 검색한 결과 \( 0.7 \mathrm{~kb} \) insert와 \( 1.0 \mathrm{~kb} \) insert는 알려지지 않은 염기서열이었으나, \( 0.4 \mathrm{~kb} \) insert (p-clone1)의 염기서열은 Thioredoxin (TRX)과 일치함을 확인하였다.</p>