Agrobacterium를 사용하여 형질 전환하고, Hygromycin 저항성을 보이는 식물체만을 선별하여 사용했다. PCR을 통해 SID2 promoter를 얻고, pGL1300 vector에 연결한 후 T4 ligase로 연결했다. 연구에서 사용한 식물은 애기장대로, 배지 조건은 MS salt, \(2\%\) sucrose, \(1.2\%\) agar로 설정했다. 연구 환경은 \(22\(\pm\)2^\circ \mathrm{C}\), long day 조건을 사용하였다. 이를 통해 SID2의 발현을 조사하고 SA의 합성과 신호전달을 이해하는 데 기여했다.
<p>본 연구에서는 SA의 합성과 신호전달 연구를 위해 SID2 promoter에 B-GLUCURONIDASE (GUS)와 LUCIFERASE (LUC) 리포트 유전자들을 연결시킨 construct를 아생형과 siz1-2 돌연변이체에 도입하여 SID2의 발현 조절을 조사하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물 재료 및 생육 조건</h2> <p>pGL1300 vector와 pGL1300 vector에 SID2 promoter를 넣은 construct을 Agrobacterium tumefaciens GV3101에 전기충격요법으로 형질 전환하였다. 형질 전환된 GV3101을 6주된 애기장대 야생형 (Arabidopsis thaliana, Columbia-0)와 siz1-2 돌연변이체 (SALK_065397)에 Floral dipping (Bent 2006)을 통하여 형질 전환하여 1세대 형질전환 식물체 \( \left ( \mathrm { T } _ { 1 } \right ) \)에서 Hygromycin \( (30 \mathrm { ~mg } ) \)에 저항성을 보이는 형질전환 식물체만을 선별하여 식물의 재료를 준비하였다. 애기장대의 종자를 \( 70 \% \) 에탄올을 사용하여 표면을 멸균한 후, \( 5 \% \) \( \mathrm { NaOCl } \)에 10분에서 15분 동안 처리하여 소독하고 멸균수를 이용하여 종자의 표면에 \( \mathrm { NaOCl } \)가 묻어있지 않도록 7번 씻어 주었다. 식물 배지는 MS salt, \( 2 \% \) sucrose, \( 1.2 \% \) agar ( \( \mathrm { pH } ~5.7\))가 들어간 것을 사용하였다. 식물을 발아시키기 전, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 암 상태로 4일 동안 춘화처리를 하였다. 식물 배양실 내의 온도는 \( 22 \pm 2 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 빛 양은 long day조건 (낮 16시간, 밤 8시간)으로 조정된 것을 사용하였다.</p> <h2>SID2 promoter:GUS::LUC 벡터 구축</h2> <p>\( -1862 \mathrm { bp } \sim + 301 \mathrm { bp } \)의 SID2 promoter 부위를 애기장대의 genomic DNA를 주형으로 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 얻었다. 이때 forward primer에 Kpn Ⅰ 제한 효소 site를 넣어준 5'-CTCGGTACCTATCTAAATTCAACTAACGT-3'와 reverse primer로써 Hind Ⅲ 제한 효소 site를 넣어준 5'-TCTAAGCTTAGCAGTCATAGTCCTTGTCTCC-3'를 사용하였다. PCR 조건은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 먼저 5분 반응시킨 후, \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초, \( 54 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분 20초씩 30번 반복 반응시킨 후, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분 마지막 반응을 시켰다. 이 PCR 생성문을 Kpn Ⅰ, Hind Ⅲ 제한효소로 자른 후 앞의 것과 동일한 제한효소로 자른 pGL1300 vector와 함께 T4 ligase로 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 12시간 반응시켰다.</p>