UV(235nm, 30초) 조사로 변이주를 유도한 후, 홍국 천연색소의 생산량이 높은 균주를 MK2-2로 명명하고 실험에 사용하였다. Monascus sp. MK2-2의 배양은 Lin's medium을 사용하고, 다양한 배지조성의 영향을 조사하였다. 이를 위해 Glucose, MSG, \(\mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\), \(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\), \(\mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(\mathrm{KCl}\), \(\mathrm{ZnSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(\mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(\mathrm{MnSO}_{4}\) 등을 기본 배지로 사용하고, 홍국 천연색소 생성 정도를 측정하였다. 배양액의 색소 측정은 UV-VIS spectrophotometer를 이용하였고, 홍국추출물의 항혈전능 조사를 위해 thrombin 저해활성을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>균주의 분리 및 선발</h2><p>홍국천연색소를 분비하는 균주를 선발하기 위하여 한국식품연구원에서 분양받은 균주 및 자연계의 각종 식품관련 균원 시료를 삼단희석법으로 희석하여 YPD (yeast extract \( 0.5 \% \), peptone \( 0.5 \% \), glucose \( 1.0 \% \) ) 배지에 도말하고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5일간 배양하면서 색소를 분비하며 유색의 집락을 형성하는 균주를 선발하였다. 분리균주는 UV(\(235 \mathrm{nm}\), 30 second) 조사하여 변이주 형성을 유도하였으며, 집락의 크기와 색소의 분비상태를 모균주와 비교하여 홍국천연색소의 생산량이 높은 변이주를 선발하여 MK2-2라 명명하고 이를 본 실험에 사용하였다.</p><h2>균주의 보존</h2><p>균주의 장기적인 활성유지 및 보존을 위해서 MK2-2 균주를 \( 25\% \) (v/v) glycerol 용액에 현탁하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에 냉동 보관하였다. 또한 단기보존을 위해 YPD 배지에 한천을 첨가한 고체배지에 접종하여 \(30^ {\circ} \mathrm{ C } \) 에서 5일 동안 배양하여 균의 증식유무를 확인 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하면서 사용하였다.</p><h2>균주의 배양</h2><p>색소 생산을 위해 Monascus sp. MK2-2의 전배양은 색소 생산용 배지로 널리 알려진 Lin's medium (rice powder \(5\%\), \(\mathrm{NaNO}3\) \( 0.15\%\), \(\mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \(0.1 \% \) 및 \( \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\) \(0.25 \%\) )을 사용하였으며, 종배양은 전배양액 \( 1 \% \)(v/v)을 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 120 \mathrm{rpm} \) 의 속도로 5 일간 진탕 배양하였고, 본 배양은 종 배양 배지와는 다른 별도의 배지에 종 배양액을 \( 1 \% \)(v/v) 로 첨가한 후 초기 \( \mathrm{pH} 5.0 \), 배양온도 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 120 \mathrm{rpm} \)으로 5일간 진탕 배양하였다.<h2>홍국 천연색소 생산을 위한 액체배양조건 조사</h2><p>Monascus sp. MK2-2의 홍국 천연색소 생산에 영향을 미치는 배지조성의 영향을 조사하기 위하여 Glucose \( 20 \mathrm{~g} \), MSG (monosodium glutamate) \( 12.6 \mathrm{~g}\), \(\mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\) \(2.4 \mathrm{~g}, \) \( \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\) \(2.4 \mathrm{~g}\), \(\mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \(1 \mathrm{~g}\), \(\mathrm{KCl}\) \(0.5 \mathrm{~g}\), \(\mathrm{ZnSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) \( 0.01 \mathrm{~g}\), \(\mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \(0.001 \mathrm{~g} \) 및 \( \mathrm{MnSO}_{4}\) \(0.003 \mathrm{~g} \) 을 기본 배지로 하여 탄소원, 질소원의 종류 및 농도의 영향을 조사하고, 최적 배지 조건과 배양 조건하에 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \), 5일 동안 배양하면서 일정 간격으로 배양액을 취하여 홍국 천연색소 생성 정도를 측정하였다.</p><h2>홍국 천연색소 생산을 위한 고체배양조건 조사</h2><p>쌀을 침지세척한 후, 배양 용기에 넣어서 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분간 증자하였다. \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 부근으로 온도가 떨어지면 최적배지에서 배양한 배양액을 \( 2 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 가 되도록 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하였고, 홍국균 배양체의 덩어리를 간헐적으로 흔들어 주어 덩어리 형성을 방지시켰다.</p><h2>색소의 정량</h2><p>색소의 측정을 위하여 배양액을 \( 12,000 \mathrm{rpm} \) 으로 15분간 원심분리하여, 그 상등액을 UV-VIS spectrophotometer(Hewlett Packard 8453, Germany)를 이용하여 \( 400 \mathrm{~nm} \) 와 \( 500 \mathrm{~nm} \) 에서 측정한 흡광도 값을 각각 황색색소와 적색색소의 값으로 나타내었다. 이때, \( 500 \mathrm{~nm} \) 에서의 흡광도 1.0 은 \( 0.38 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 조색소에 상당하였다.</p><h2>항혈전능 조사</h2><p>홍국추출물의 항혈전능을 조사하기 위하여 thrombin 저해활성을 측정하였다. \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 0.5 \mathrm{U} \) thrombin (Sigma Co.,USA) \( 50 \mu \mathrm{l}\) 와 \( 20 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{CaCl}_{2}\) \( 50 \mu \mathrm{l}\), 다양한 농도의 시료 추출액 \(10 \mathrm{l}\)를 Amelung coagulometer KC-1A (Baxter Co., Japan)의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하여 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조구로는 aspirin (Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO 를 사용하였다. DMSO 의 경우 32.1초의 응고시간을 나타내었다. Thrombin 저해활성은 3회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값에 100 을 곱하여 저해율(\(\%\))로 나타내었다.</p>