본 실험은 노간주나무를 추출시료로 사용하여 에탄올 추출물과 열수 여과지를 이용하여 여과한 후 EYELA evaporator로 감압 농축하여 용매를 완전히 제거한 후 동결 건조하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였으며, 효소 실험 후 활성이 우수한 에탄올 추출물을 이용하여 세포실험을 실시하였다. Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법에 따라 측정하였는데 반응구는 \( 67 \mathrm{mM} \) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 6.8) \( 80 \mu \mathrm{l} \)에 \( 10 \mathrm{mM} \) L-DOPA를 녹인 기질액 \( 40 \mu \mathrm{l} \) 및 시료용액 \( 40 \mu \mathrm{l} \) 의 혼합액에 mushroom tyrosinase (\( 200 \mathrm{U}/\mathrm{ml}\)) \( 40 \mu \mathrm{l} \) 을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 \( 492 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. Tyrosinase 저해활성은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 저해율 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\text { 무첨가군의 흡광도 }}\right) \times 100 \) 와 같이 나타내었다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료 및 시료 추출</h2><p>본 실험에 사용된 노간주나무(Juniperus rigida Sieb.)는 충북 괴산에서 2012년 봄에 생산 된 건채를 구입하여 추출시료로 사용하였다. 시료의 에탄올 추출물은 \( 70 \% \) 에탄올 10 배의 양을 가하여 실온에서 24 시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였고, 열수 추출물은 증류수 10 배의 양을 가하여 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3 시간 가량 환류냉각 추출해 실온에서 24 시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일 한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 시료 추출물은 여과지(Whatman No.2)를 이용하여 여과한 후 EYELA evaporator로 감압 농축하여 용매를 완전히 제거한 후 동결 건조하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였으며, 효소 실험 후 활성이 우수한 에탄올 추출물을 이용하여 세포실험을 실시하였다.</p><h2>시약 및 기기</h2><p>미백효과 측정에 사용된 시약인 tyrosinase mushroom, di-methyl sulfoxide (DMSO), L-3,4-dihydroxy-phenyl-alanine (L-DOPA) 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)에서 구입하였으며, MMP-1, tyrosinase, TRP-1, TRP-2, GAPDH, primary antibody와 mouse-anti-goat, rabbbit-anti-mouse 등 secondary antibody는 Santacruz (CA, USA) 에서 구입하였으며, MITF는 Abcam (USA)에서 구입하였다. Real-time PCR에 사용된 HotStart-IT SYBR Green qPCR Master Mix (2X)는 USB Products Affymetrix (Inc, Cleveland, Ohio USA)에서 구입하였다.</p><p>실험에 사용된 기기는 ELISA Reader (Tecan, Austria), PCR (C-100, Bio-Rad, USA), Real-time PCR (StepOnePlus, Applied Biosystems, Germany), Multilabel plate Reader (VICTOR X5, PerkinElmer, USA), Multi Shaker (FINEPCR, Korea), ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden), Semi-Dry Transfer unit (TE77XP, Hoefer, USA)을 사용하였다.</p><h2>Tyrosinase 저해활성 측정</h2><p>Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 \( 67 \mathrm{mM} \) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 6.8) \( 80 \mu \mathrm{l} \)에 \( 10 \mathrm{mM} \) L-DOPA (sigma, USA)를 녹인 기질액 \( 40 \mu \mathrm{l} \) 및 시료용액 \( 40 \mu \mathrm{l} \) 의 혼합액에 mushroom tyrosinase (\( 200 \mathrm{U}/\mathrm{ml}\)) (sigma, USA) \( 40 \mu \mathrm{l} \) 을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 \( 492 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. Tyrosinase 저해활성은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p><p>저해율 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\text { 무첨가군의 흡광도 }}\right) \times 100 \)</p>