Ammonium sulfate를 이용한 단백질 침전과 FPLC를 이용한 ion exchange chromatography를 통해 망간 산화 단백질을 정제하려 했으나 단백질 농도 측정과 망간 산화능 측정에 방해가 되었고 column이 막히는 문제가 발생했다. 이를 해결하기 위해 얼리고 녹이는 과정 및 원심분리를 수행하여 망간 산화물과 단백질을 분리 및 정제한 결과, ammonium sulfate로 침전시킨 것의 망간산화능은 specific activity는 조효소액에 비해 12.9배 농축되었고, HiTrap Q FF 처리한 것은 21.9배, TSK-G3000sw xL은 37.3배 농축되었다.
<h2>망간 산화 단백질의 정제</h2> <p>조효소액(crude extract)을 정제하기 위한 첫 번째 단계로 ammonium sulfate \( (40 \%) \) 를 이용한 단백질 침전을 실시하였고, 다음 단계로 FPLC를 이용한 ion exchange chromatography를 실시하였다. 그러나 ammonium sulfate를 이용한 단백질 침전물에 다량의 망간산화물이 단백질과 함께 존재하고 있어 단백질 농도 측정과 망간 산화능 측정에 방해가 되었을 뿐만 아니라 ion exchange chromatography의 column이 막히는 결과가 나타났다. 이 문제를 해결하기 위해 시료를 얼리고 녹이는 과정(freeze & thaw)을 수차례 반복한 뒤 원심분리(10,000× \( \mathrm { g } , 40 \mathrm { ~min } ) \)를 하여 망간산화물과 단백질을 분리할 수 있었다. 이 방법을 통해 얻은 상등액을 FPLC에 장착된 HiTrap Q FF column에 통과시켜, column에 붙지 않고 한꺼번에 빠져나오는 부분을 모아서 농축을 하였고, 농축된 단백질을 FPLC에 장착된 HPLC용 TSK-G3000sw XL column을 통과하여 망간 산화 단백질을 정제하였다. 그 결과 ammonium sulfate로 침전된 것의 망간산화능은 specific activity는 조효소액에 비해 12.9배 농축되었고, HiTrap Q FF 처리한 것은 21.9배, TSK-G3000sw xL은 37.3배 농축되었음을 확인하였다(Table 5). 각 단계에서 정제된 단백질을 \( 12 \% \) SDS-PAGE를 전기 영동한 결과(Fig. 4) 단일 밴드가 아닌 여러 개의 밴드가 나타났고, 정제된 단백질을 native gel에 loading한 후 \( 0.5 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { MnCl } _ { 2 } \)이 포함된 \( 10 \mathrm { mM } \) HEPES-\(\mathrm{NaOH}\) (\(\mathrm{pH 7.5}\)) 완충액에서 갈색의 활성 밴드가 나타날 때까지 염색하여 밴드를 확인한 결과 \( 15 \mathrm { kDa }\)(MOP1), \(46.7 \mathrm { kDa }\)(MOP2), \(63.5 \mathrm { kDa } \) (MOP3) 크기를 갖는 3개의 활성 밴드가 확인되었다. 그리고 이 밴드를 각각 잘라내어 LC/ESI-MS를 이용하여 내부서열을 분석한 결과, MOP1은 내부서열이 ADQGEGDLDEFR으로 나타났고, 이 서열을 BLAST에서 비교한 결과 MOP1은 Pseudomonas syringae pv. syringae B 728 a의 outer membrane porin과 Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448 A의 porin D와 각각 \( 83 \% \) 의 상동성을 나타내었다. 또 MOP3의 내부서열은 LVLALTPR로, Geobacter sulfurreducens PCA의 type II secretion system protein 과 Pseudomonas putida KT 2440의 secretion protein, Pseudomonas putida F 1의 general secretion pathway protein D와 관련이 있는 것으로 확인되었다. 그러나 DGQVML로 확인된 MOP2의 내부서열은 너무 짧아 BLAST에서 상동성을 갖는 단백진이 확인되지 않았다.</p>