미생물이 생산해내는 혈전분해 효소를 분리 및 정제하기 위해 최적 배지에 배양하는 등의 실험을 진행하였다. 이후 SDS-PAGE 분석을 이용하여 정제된 효소의 분자량을 측정하였다. 또, Gibrinogen과 정제된 효소 단백질과 zymogram sample buffer를 혼합하여 Fibrin zymography 분석을 실시하였다.
<h2>효소의 분리 및 정제</h2><p>미생물이 생산하는 혈전분해 효소를 정제하기 위하여 최적 배지 [\(0.5\%\) maltose, \( 0.5 \% \) soytone, \( 0.7 \% \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}, 0.15 \% \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 0.004 \% \mathrm{MnCl} \cdot 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.05 \% \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.03 \% \mathrm{CaCl}_{2} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.00025 \% \mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.0002 \%\left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{MoO}_{4} \)]에 \( 1 \% \) 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 배양하였다. 배양액은 원심분리 \( (10,000 \times \mathrm{g} / 15 \mathrm{~min}) \)하여 배양상등액을 조효소액으로 사용하였다. 조효소액에 황산암모늄을 \(20-80\%\) 포화시킨 후, 침전분리한 조효소액을 소량의 \( 10 \mathrm{mM} \) sodium acetate buffer (\( \mathrm{pH} 6.0 \))에 용해한 후, 동일한 완충용액에 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 동안 dialysis (\( 6-8 \mathrm{kDa} \) cut-off)를 수행하였다. 양이온 교환수지인 CM Sepharose Fast Flow (Pharmacia, Biotech. AB Uppsala, Sweden) column \( (25 \times 400 \mathrm{~mm}) \) 을 \( 10 \mathrm{mM} \) sodium acetate buffer (\( \mathrm{pH} 6.0 \))로 평형화 시킨 후, 투석한 농축 조효소액을 loading하여 ion exchange chromatography를 수행하였다. 용출은 \( 0-1 \mathrm{M} \mathrm{NaCl} \)를 linear gradient하게 \( 1 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 유속으로 용출하여 \( 5 \mathrm{ml} \)씩 분획하였다. 활성을 나타낸 분획을 모아 동결건조하여 농축시킨 후, sephacryl S-200HR (Pharmacia, AB Uppsala, Sweden) column (\( 15 \times 960 \mathrm{~mm} \) )을 사용하여 gel filtration을 실시하였다. \( 10 \mathrm{mM} \) sodium acetate buffer \( (\mathrm{pH} 6.0) \)로 평형화 시킨 후, 용출속도는 \( 0.5 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 으로 \( 3 \mathrm{ml} \) 씩 분획하여 활성을 나타내는 분획을 모아 동결 건조하였다.</p><h2>SDS-PAGE에 의한 분자량 측정</h2><p>정제한 효소의 분자량을 측정하기 위하여 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 분석을 실시하였다. Ion exchange chromatography와 gel chromatography에 의해 얻어진 시료는 sample buffer [\( 12.5 \mathrm{mM} \) Tris \( \cdot \) HCl buffer ( \( \mathrm{pH} 6.8\)), \( 2 \% \beta \)-mercaptoethanol, \( 2 \% \) SDS, \( 20 \% \) glycerol, \( 0.02 \% \) bromophenol blue]을 혼합하여 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분 동안 열처리한 후, \( 80 \mathrm{~V} \) 에서 2시간 동안 전기영동을 하였다. 전기영동 후 gel은 coomassie brilliant blue (Elpis Biotech Inc., Korea)로 1시간 동안 염색한 후 증류수로 탈색하였고, pre-stained protein marker (Elpis Biotech Inc., Daejeon, Korea)를 이용하여 분자량을 측정하였다.</p><h2>Fibrin zymography 분석</h2><p>\( 0.12 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) fibrinogen과 thrombin \( 100 \mu \mathrm{l} \) (10 NIH unit \( / \mathrm{ml}) \)을 함유한 \( 10 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) polyacrylamide gel에 정제한 효소단백질 \( 20 \mu \mathrm{g} \) 과 zymogram sample buffer [\(10\%\) SDS, \( 20 \% \) glycerol, \( 0.03 \% \) bromophenol blue, \( 0.5 \mathrm{M} \) Tris \( \cdot\) HCl (\(\mathrm{pH} 6.8\))]을 혼합하여 열처리하지 않고 \( 80 \mathrm{~V} \) 에서 2시간 전기영동을 수행하였다. 전기영동한 후, 상온에서 \( 2.5 \% \) Triton \( \mathrm{X}-100 \) 이 함유된 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris \( \cdot \) HCl buffer (\(\mathrm{pH} 7.4\))에 30분 동안 고정하였고, Triton X-100을 제거하기 위하여 증류수로 30분 동안 세척한 후, zymogram reaction buffer [\( 30 \mathrm{mM} \mathrm{NaN}_{3}, 30 \mathrm{mM} \) Tris \( \cdot \) HCl (\(\mathrm{pH} 7.4\))] 에 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12시간 동안 반응시켰다. Polyacrylamide gel은 coomassie brilliant blue로 1시간 동안 염색한 후, 증류수로 탈색하여 확인하였다.</p>