Mueller-Hinton 한천배지를 사용하여 7가지 약제의 감수성 검사를 Clinical and Laboratory Standards Institute의 기준에 따라 실시하였고, TDH 생성은 KAP-RPLA kit을 사용하여 reversed passive latex agglutination 법으로 검출하였으며, tdh, trh1 및 trh2 유전자 검출은 PCR법과 DNA probe hybridization법을 이용하여 수행하였다.
<h2>약제감수성 시험</h2> <p>감수성 검사는 평판희석법에 의하여 Mueller-Hinton 한천배지 (Difco)를 사용하였으며 방법 및 내성균의 판정은 Clinical and Laboratory Standards Institute의 기준에 준하였다. 사용한 약제는 BBL Sensi-Disc Antimicrobial Sus-ceptibility Test Discs (Difco, Becton Dickinson Co, MD.,USA)의 제품으로 tetracycline (Te, \( 30 \mu \mathrm { g } ) \), cefoperazone (Cfp, \( 75 \mu \mathrm { g } ) \), chloramphenicol (C, \( 30 \mu \mathrm { g } ) \), penicillin \( ( \mathrm { P } , 10 \mu \mathrm { g } ) \), ox-acillin \( ( \mathrm { Ox } , 1 \mu \mathrm { g } ) \), gentamicin \( ( \mathrm { Gm } , 10 \mu \mathrm { g } ) \) 및 vancomycin \( ( \mathrm { Va } , 30 \mu \mathrm { g } ) \) 의 7가지를 사용하였다.</p> <h2>TDH 생성 시험</h2> <p>TDH 생성은 reversed passive latex agglutination (RPLA)법으로 KAP-RPLA kit (Denka Seiken)를 사용하여 검출하였다. 실험균주를 KP배지 \((2 \% \) NaCl peptone, \( 0.5 \% \) D-mannitol 및 \( 5 \% \) NaCl 함유한 액체배지, \( \mathrm { pH } 7.8 \))에 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 16시간 진탕 배양한 후 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 12,000 \mathrm { rpm } \) 으로 원심분리하고 그 상청액을 2배 단계로 희석하여, KAP-RPLA kit 사용설명서에 준하여 microplate법으로 실시하였다.</p> <h2>tdh, trh1 및 trh2 유전자 검출</h2> <p>tdh와 trh의 유전자 검출은 PCR법과 DNA. probe hybrid-ization법으로 하였다.</p> <h2>PCR법</h2> <p>Table 1과 같이 primers는 tdh, trh 1 및 trh 2 유전자의 염기배열 중에서 특이영역 oligonucleotides를 합성하여 사용하였다. 실험균주의 DNA 추출과 PCR은 위의 toxR 유전자의 검출과 동일하게 실시하였으며, 증폭과정은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 5분간 예비 가열한 후, 열변성 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } , \) 1분간 실시하고, \(1 \)분간 \(55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 annealing 과정, 1분간 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 신장 과정을 35 cycles을 실시하여 \( 2 \% \) agarose gel에서 확인하였다.</p>