본 연구에서는 YPD 배지에 담긴 glucose 20g/의 효모 균주를 취하여 YPCX 배지에 cellobiose와 xylose를 각각 20g/, 30g/ 및 40g/ 함유하도록 세포 흡광도가 0.1이 될 때까지 접종하고 30도에서 90rpm의 조건으로 혼합당 발효를 시행하였다. 선별된 P. stipitis 진화 균주의 유전적 안정성을 확인하기 위해 같은 조건으로 배양을 진행하고 24시간 후 세포를 회수, 새로운 YPD 배지에 10회 계대배양을 진행하였다. 발효 중 대사산물의 분석은 원심분리 후 세포를 제외한 상등액을 회수하고 액체크로마토그래프(HPLC)를 이용하여 분석하였다.
<h2>혼합당 발효</h2> <p>\( 20 \mathrm { ~g } / \) 의 glucose를 함유한 YPD 배지에서 전배양 한 효모 균주들을 회수한 후 cellobiose와 xylose를 각각 \( 20 \mathrm { ~g } /, 30 \mathrm { ~g } / 1 \) 및 \( 40 \mathrm { ~g } / 1 \) 씩 함유하는 YPCX 배지에 세포 흡광도가 \( 0.1 \) 이 되도록 접종한 후 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 90 \mathrm { rpm } \) 조건으로 혼합당 발효를 진행하였다. 혼합당 발효는 각각 2 회에 걸쳐 반복 실험을 수행하였다.</p> <h2>진화된 효모 균주의 안정성 확인</h2> <p>적응 진화를 통해 선별한 P. stipitis 진화 균주가 유전적으로 안정한지 확인하기 위해 \( 20 \mathrm { ~g } / \mathrm { glucose } \) 를 포함한 YPD 배지에서 세포 흡광도 \( 0.1 \) 이 되도록 접종하고 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 90 \mathrm { rpm } \)의 교반 속도로 배양을 진행하였으며, 24 시간 후 세포를 회수하여 새로운 YPD 배지에 10회에 걸쳐 계대배양을 진행하였다. 아울러 각 배양 단계의 종료 시점에서 효모 세포를 회수한 후 \( 20 \mathrm { ~g } / \) 의 cellobiose를 포함한 YPC 배지에 세포 흡광도 \( 0.1 \) 이 되도록 접종하고 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 90 \mathrm { rpm } \) 조건으로 회분식 발효를 진행하여, 적응진화를 통해 선별한 균주의 cellobiose 대사가 glucose 조건에서의 계대배양에 의해 변화하는지 확인하였다. P. stipitis 진화 균주의 유전적 안정성을 확인하기 위한 회분식 발효는 한 번씩 수행하였다.</p> <h2>분석방법</h2> <p>발효 중 세포 성장을 확인하기 위해 배양액을 적당히 희석한 후 UV-visible spectrophotometer (Biomate, Thermo, USA)를 사용하여 \( 600 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 발호 중 대사산물의 분석을 위해 배양액을 원심분리하여 세포를 제외한 상등액을 회수한 후 refractive index detector (RID)가 장착된 액체크로마토그래프(HPLC US/e2695, Waters, USA)를 이용하여 농도를 분석하였다. 컬럼은 Rezex ROA-Organic Acid H + (Phenomenex, USA)를 사용하였으며, 이동상으로는 \( 0.01 \mathrm { ~N } \) 황산 용액을 \( 0.6 \mathrm { ml } / \mathrm { min } \) 의 유속으로 흘려주었다.</p>