한천분해 능력을 가진 선별된 균주들을 조효소액을 이용하여 온도에 따른 한천분해능의 안정성과 효소의 활성을 측정 하였다. 최적 pH와 pH에 따른 한천분해 효소의 활성 측정을 위해 TLC 분석으로 효소 액을 이용한 neoagarohexaose의 분해산물을 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>분리용 시료 및 한천분해 균주의 분리 배양</h2><p>동해안 기장 연안의 해수를 시료액으로 사용하였다. 시료액을 \( 2 \% \mathrm{NaCl} \)이 첨가된 멸균희석수를 이용하여 연속적으로 희석하였고 원액과 희석수 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 씩을 배지 위에 도말하였다. 배지는 한천을 유일한 탄소원 및 에너지원으로 한 무기염 한천배지와 일반적인 해양세균 분리 및 증균용 배지로 사용되는 배지로 Difco (Detroit, USA)에서 구입한 marine broth 2216(Bacto peptone \( 5.00 \mathrm{~g} \), Bacto yeast extract\( 1.00 \mathrm{~g}\), \(\mathrm{Fe}\)(Ⅲ) citrate \( 0.10 \mathrm{~g}\), \( \mathrm{NaCl} 19.45 \mathrm{~g}\), \( \mathrm{MgCl}_{2} \) (dried)\( 5.90 \mathrm{~g}\), \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{SO}_{4} 3.24 \mathrm{~g}\), \( \mathrm{CaCl}_{2} 1.80 \mathrm{~g} \), \( \mathrm{KCl} 0.55 \mathrm{~g} \), \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \)\( 0.16 \mathrm{~g} \), \( \mathrm{KBr} 0.08 \mathrm{~g}\) \(\mathrm{SrCl}_{2} 34.00 \mathrm{mg}\), \(\mathrm{H}_{3} \mathrm{BO}_{3} 22.00 \mathrm{mg} \), \(\mathrm{Na}\)-sillicate \( 4.00 \mathrm{mg}\), \( \mathrm{NaF} 2.40 \mathrm{mg} \), \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right) \mathrm{NO}_{3} 1.60 \mathrm{mg}\), \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \)\( 8.00 \mathrm{mg} \), Distilled water \( 1.0 \mathrm{~l} \)) 고체배지에 도말한 후 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하면서 한천분해활성에 의한 한천분해로 한천무기염평판 배지를 함몰시키는 균주를 선별하였다.</p><h2>한천분해 균주의 선정 및 동정</h2><p>한천분해로 함몰이 일어난 부위의 지름이 \( 3 \mathrm{~mm} \) 이상인 집락을 대상으로 함몰부위의 지름이 큰 집락부터 내림차순으로 15개의 집락을 선택하고 백금이를 이용하여 균을 채취하고 멸균된 무기염 배지로 적절히 희석한 후에 무기염 한천배지에 도말하는 것을 3차례 이상 반복한 후 균주들을 순수 분리하였다. 한천분해능을 가진 분리 균주들을 \( 0.2 \% \)\( (\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 한천을 포함한 marine broth 2216 배지에서 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \), \( 250 \mathrm{rpm} \)에서 60시간 진탕 배양한 후 배양액의 환원당 값을 측정하여 선별된 균주들의 한천분해능을 검토하였다. 이들 균주들의 동정을 위하여 16S rDNA 염기서열분석을 실시하였고, 분석된 염기서열은 Blast를 사용하여 공시균주와 유사도를 검토하였으며, 윈도우 버전의 Clustal 프로그램을(ClustalX ver. 1.8) 이용하여 다중염기배열(multiple alignment)을 수행한 후 neighbor-joining method와 bootstrap method (\( n=1,000\))로 분석하여 계통분류학적 위치를 파악하였다.</p><h2>한천분해 균주의 생육 및 조효소액의 제조</h2><p>Marine broth 2216 배지 \( 50 \mathrm{ml} \)가 들어있는 \( 250 \mathrm{ml} \) 삼각플라스크에 순수분리한 SL-12 균주를 접종한 후 shaking incubator를 이용하여 \( 27^{\circ} \mathrm{C}\), \(250 \mathrm{rpm} \)에서 진탕 배양하였다. 배양 1일 후 배양액을 원심분리하여(\(12,000 \times g\), \(4^{\circ} \mathrm{C}\), \(10 \mathrm{min}\)) 균체를 제거한 후 얻어진 상층액을 조효소액으로 사용하였다.</p><h2>효소활성 측정</h2><p>한천분해 효소의 반응산물인 환원당의 측정은 Somogy-Nelson법으로 실시하였다. 조효소 반응용액 \( 0.5 \mathrm{ml} \)에 \( 2.0 \mathrm{ml} \)의 Somogy 시약(\(10\%\) \( \mathrm{CuSO}_{4} 80 \mathrm{ml}\), \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} 100 \mathrm{ml} \),\( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{SO}_{4} 180 \mathrm{~g}\), \(\mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot 12 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 71 \mathrm{~g}\), \( \mathrm{C}_{4} \mathrm{H}_{4} \mathrm{O}_{6} \mathrm{KNa} \cdot 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 40 \mathrm{~g} \) / D.W. \(1 \mathrm{~l}\))을 첨가하여 효소반응을 중지시키고 10분간 끓였다. 실온으로 냉각된 용액에 arseno-molybdate 시약을 첨가하고 \( 14,000 \times g \)에서 5분간 원심분리한 상층액의 흡광도를 \( 550 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 한천분해 효소의 활성은 1분당 \( 1 \mu \mathrm{mole}\)의 galactose를 생산해 내는 효소의 양을 \(1 \mathrm{unit}\)로 정의하였고 galactose를 이용하여 표준적정곡선을 작성하였다.</p><h2>반응온도에 따른 한천분해 효소의 활성</h2><p>조효소액을 이용하여 온도에 따른 한천분해능의 안정성을 실시하였다. 표준 기질용액으로는 \( 0.2 \%\)(\(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 한천을 포함한 \( 20 \mathrm{mM} \) sodium phosphate ( \( \mathrm{pH} 7.0) \) 완충용액을 이용하였다. 기질용액을 중탕가열한 후 \( 20-80^{\circ} \mathrm{C} \)의 온도별로 냉각하였다. 완충용액 \( 1.0 \mathrm{ml} \)에 조효소액 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 30분간 반응시킨 후 효소활성을 측정하였다.</p><h2>\( \mathrm{pH} \)에 따른 한천분해 효소의 활성</h2><p>최적 \( \mathrm{pH} \)와 \( \mathrm{pH} \)에 따른 한천분해 효소의 활성을 측정하기 위하여 \( 100 \mathrm{mM} \) sodium acetate 완충용액 \( (\mathrm{pH} 3.0-5.0)\), \(20 \mathrm{mM} \) sodium phosphate 완충용액 \( (\mathrm{pH} 5.0-8.0)\), \(50 \mathrm{mM} \)TAPS (3-[tris(hydroxymethyl)methyl amino]-1-propane sulfonic acid) 완충용액 \( (\mathrm{pH} 8.0-9.0\))을 이용하였다. \( 0.2 \%\) \((\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 한천을 포함한 완충용액을 중탕가열하고 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)까지 냉각시킨 후 반응수조를 이용하여 온도를 유지하면서 완충용액 \( 1.0 \mathrm{ml} \)에 조효소액 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 30 분간 반응시킨 후 효소활성을 측정하였다.</p><h2>한천올리고당 가수분해산물의 thin-layer chromatography (TLC) 분석</h2><p>효소액을 이용한 neoagarohexaose의 분해산물을 TLC를이용하여 분석하였다. 조효소액과 neoagarohexaose (Sigma,St. Louis, MO, USA)를 \( 20 \mathrm{mM} \) sodium phosphate (\( \mathrm{pH} 7.0\))완충용액에서 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \), 48시간 반응시킨 후, silica gel 60 TLCplate (Merck, Darmstadt, Germany)로 분석을 행하였다. TLC 분석은 n-butanol/acetic acid/ \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \((2 / 1 / 1 \), by vol.)를 이용하여 전개시켰고, \( 10 \%\) \((\mathrm{v} / \mathrm{v}) \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \)로 가시화 시켰다. 표준물질로 D-galactose (Sigma), neoagarohexaose (Sigma)와 neoagarotetraose (V-Labs Inc., St. Covington, LA, USA)를 사용하였다.</p>