무균의 잎을 얻기 위하여 각 종자를 알콜에 소독후 멸균수로 3회 수선하여, 토마토는 MS 기본배지에 \( 0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \mathrm{BA} \)와 \( 0.35 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) IAA 그리고 \( 30 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) sucrose, \( 8 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) agar를 넣어 만든 배지를 배양병에 넣고 30일간 배양했다. 추출한 mtRNA는 mtDNA에서 PCR을 수행한 결과 중 가장 band가 확실한 것을 이용해 RT-PCR을 수행하여 mtRNA인을 관찰했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <p>식물의 재료는 원예시험장에서 분주 받은 토마토의 종자를 이용하였다. 무균의 잎을 얻기 위하여 각각의 종자를 \( 1 \% \)\( \mathrm{NaOCl} \) 에 30분 과 \( 70 \% \) 알콜에 30초로 소독한 다음 멸균수로 3회 수선하여, 토마토는 MS 기본배지에 \( 0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \mathrm{BA} \)와 \( 0.35 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) IAA 그리고 \( 30 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) sucrose, \( 8 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) agar를 넣어 만든 배지를 \( 30 \mathrm{ml} \)씩 배양병 \( (\Phi 15 \mathrm{~cm}) \)에 넣고 \( 26 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30일간 배양하였다.</p> <p>각각의 어린잎을 채취하여 mitochodria \( (\mathrm{mt}) \) 분리와 mtDNA 추출은 Scotti 등 방법을 응용하였고, mtRNA의 추출은 Chomeczynski 와 Sacchi의 방법을 응용하여 아래와 같이 수행하였다. Homogenization buffer A \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-HCl (pH 8.0), \( 1.3 \mathrm{M} \mathrm{NaCl}, 25 \mathrm{mM} \) EDTA (pH 8.0), 0.2\% BSA. \( 0.05 \% \) cysteine 과 \( 56 \mathrm{mM} \)-mercaptoethanol)와 Homogenization buffer B (100 mM Tris- \( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} \) 8.0), \( 2.6 \mathrm{M} \)\( \mathrm{NaCl}, 50 \mathrm{mM} \) EDTA ( \( \mathrm{pH} \) 8.0), 0.4\% BSA. \( 0.1 \% \) cysteine 과 \( 56 \mathrm{mM} \beta \)-mercaptoethanol)를 신선한 잎을 채취하여 호모게 나제이션 할 때 이용하였다. Lysis buffer (25 mM Tris- \( \mathrm{HCl} \) \( (\mathrm{pH} 8.0), 20 \mathrm{mM} \) EDTA (pH 8.0), 0.5\% SDS), \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) Proteinase K, \( 2 \mathrm{M} \) Ammonium acetate, \( 10 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) ( \( \mathrm{pH} \) 8.0), \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA, TE-saturated phenol/chloroform (50:50), Water-saturated phenol/chloroform/isoamyl alco-hol (50:49:1). 10 mg/mL RNase A, RNA extraction buffer (4 M Guanidine thiocyanate, \( 25 \mathrm{mM} \) Sodium citrate (pH 7.0), \( 0.5 \% \) sarcosyl, \( 0.1 \% \beta \)-mercaptoethanol), \( 4 \mathrm{M} \mathrm{LiCl} \)등의 시약을 만들어 이용하였다.</p> <p>토마토의 잎에서 분리 정제한 \( \mathrm{mt} \)임을 확인하기 위하여 \( \mathrm{mt} \)를 염색하는 MitoTracker (Molecular Probes)를 이용하였다. 추출한 \( \mathrm{mtDNA} \)는 \( \mathrm{mt} \)와 관련된 유전자의 \( \mathrm{PCR} \) primer를 만들어 PCR을 수행하여 mtDNA임을 확인하였다.</p> <p>추출한 \( \mathrm{mtRNA} \)는 \( \mathrm{mtDNA} \)에서 \( \mathrm{PCR} \)을 수행한 결과 중 가장 band가 확실한 것을 이용하여 RT-PCR (AccessQuickTM RT-PCR System, Promega)을 수행하여 mtRNA인을 확인하였다. RT-PCR의 PCR 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에 2분간 predenaturation을 하였고, denaturation은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에 5 초간, annealing은 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에 20초간 polymerization은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10초간 30회 실시하고 final extension은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 7분간 수행 후 \( 0.5 \% \) 아크닐아마이드에 전기영동 후 silver staining하여 유전자발현 정도를 확인하였다. PCR에 사용한 기종은 PCR system 2,700 (Biometra, USA) 이였다.</p>