대장간이 주로 재조합 단백질 생산이나 유전자 조작을 위해 사용되지만, native 상태로 접히지 못하는 단백질들이 쌓여서 봉입체를 형성한다는 문제가 있다. GroEL/ES, DnaK/DnaJ/GrpE 등 molecular chaperone을 이용해 단백질의 접힘을 더 활성화시키는 방법이 제시되었고, 이러한 mloecular chaperone 돌과 목적단백질이 공동발현하는 것은 단백질 접힘을 할 수 있도록 도와서 환성형 형태의 단백질 생산에 큰 영향을 미친다.
<p>재조합 단백질을 생산하거나 유전자 조작을 위한 숙주세포로 대장간이 주로 이용되지만 재조합 단백질 생산 시 native 상태로 접히지 못한 단백질들이 축적되어 봉입체(inclusion body)를 형성하는 문제점이 있다. 이러한 문제점들의 해결책으로 GroEL/ES나 DnaK/DnaJ/GrpE 같은 molecular chaperone을 이용해 생산된 단백질의 접힙을 촉진시키는 방법이 제시되어져 왔다. DnaK/DnaJ/GrpE는 nascent polypeptide와 반응하여 비가역적인 aggregation을 막고, partial folding을 촉진시키는 것으로 알려졌으며 GroEL/ ES는 이미 접혀진 단백질과 부분적으로 반응하여 접힘을 보다 완벽하게 할 수 있도록 도와주는 역할을 한다. 이와 같은 mloecular chaperone 돌과 목적단백질의 공동발현은 protein folding을 도와 환성형 형태의 단백질 생산에 큰 영향을 미친다.</p> <p>본 실험에서 사용한 목적 단백질은 Bacillus macerans 유래의 cyclodextrin glucanotransferase (E.C. 2.4.1.19, CGTase)로 starch로부터 cyclodextrins을 생산하는 효소이다. Cyclodex-rin은 개수에 따라 여러 가지 복합체를 형성할 수 있는 능력을 가졌기 때문에 산업적으로 아주 유용한 물질로 식품, 의약품, 농산품, 화장품 등 여러 분야에서 활용도가 높은 물질이다. CGTase를 E. coli에서 발현시켰을 때 불용성의 봉입체로 생성된다는 것이 이전 연구에서 밝혀졌다. 이러한 봉입체 형성의 주요단계는 peptide translation, protein folding, 그리고 부분적으로 접혀진 단백질들의 응집체 형성이 그 원인일 것으로 보고 있으며, 전체단계는 translational rate, peptide concentration, diffusion kinetics에 의존하고, 그리고 이러한 parameter들 역시 chaperone처럼 pH, 염농도, 온도 같은 환경적 요인에 영향을 받는다. 이전 연구에서 CGTase와 GroEL/ES를 공동발현 시켰을 때 가용성 형태로 CGTase가 생산됨을 보고한 바 있다. 다른 연구에서는 배양 온도와 봉입체 형성간의 관계가 가용성 단백질 생산 증대의 다른 방안으로 제시되기도 했는데, 그 중 -glucosidase는 GroEL/ES 발현 생산과 함께 25℃에서 저온 배양했을 때, 37℃에서 단독 발현시킨 것에 비해 20배나 향상된 단백질 활성도를 보였다. 이는 낮은 배양 온도에서 생장속도의 감소에 따른 단백질 생산속도 감소로 세포 내 저농도 단백질 환경에서 봉입체의 형성이 억제되기 때문이라고 설명되고 있다. 본 연구에서는 B. macerans CGTase를 기존 배양 온도(37℃)보다 낮은 저온(30℃ 또는 25℃)에서 배양하는 동시에 chaperone과 공동발현시켜 가용성효소 생산에 미치는 효과를 검토하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주와 plasmids</h2> <p>재조합 단백질의 날현을 위한 숙주세포로 E. coli BL21<p>\( ( \mathrm { DE } 3) \left [ \mathrm { F } \right . \), omp \( T, \mathrm { r } _ { B } { } ^ {\circ } , \mathrm { m } _ { B } \), (DE3)] \( ] \) 를 사용하였다. B. macerans 유래의 cgt가 subcloning 되어있는 pTCGT1 plasmid는 T7 promoter, ribosome-binding site (SDsequence)와 분비신호서열을 가지고 있다. groEL/ES를 지니고 있는 pGro11은 \( \mathrm { pACYC184 } \) 가 기본 plasmid로 chloramphenicol 내성유전자를 가지며 groEL/ES 발현은 Pzt-1 promoter에 의해 조절된다.</p>