라세믹 styrene oxide 기질은 수용액에서의 용해도가 낮기 떄문에 유기 용매에서의 비대칭 광학분활 반응을 활용한다. epoxide hydrolase에 대한 활성 저해가 낮은 물질을 선별하기 위해 여러 유기 용매들을 대상으로 비대칭 광학분활을 진행한다. epoxide hydrolase 활성을 가진 미생물 생촉매가 존재하는 유기용매층을 막으로 분리한 상태의 hollow-fiber membrane을 이용한 비대칭 분할 시스템을 고안한다. 이는 가수분해 반응에서의 여러 문제점들을 극복할 수 있는 시스템으로 활용될 수 있다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>유기용매 반응시스템 개발 필요성</h2> <p>라세믹 styrene oxide 기질은 소수성 분자구조로 인하여 수용액상에 대한 용해도가 낮은 편이다. 또한, 수용액상에서는 용매인 물분자 자체가 친핵성 반응을 유도하여 styrene oxide 기질에 대한 단순 가수분해 반응이 일어나 수율을 저하시킬 수 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위한 방법으로 유기 용매에서의 비대칭 광학분할 반응을 이용할 수 있으며, 기질의 용해도 증가 및 styrene oxide 기질의 안정화를 통해 생산성 향상을 기대할 수 있다. 그러나, 많은 경우에 있어서 유기용매 자체가 epoxide hydrolase의 활성을 저해시키는 단점이 있으므로 이를 극복할 수 있는 방법 개발이 요구되고 있다.</p> <h2>유기용매 스크리닝</h2> <p>우선 epoxide hydrolase에 대한 활성 저해 효과가 가장 적은 유기용매를 선발하기 위하여 여러 종류의 친수성 및 소수성 유기용매들을 이용하여 라세믹 styrene oxide에 대한 비대칭 광학분할 반응을 실시하였다. \( 50 \mathrm{mM} \) Phosphate buffer에서의 반응을 대조군으로 사용하였으며, 수용액과 섞이지 않는 유기용매를 \( 30 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 비율로 혼합한 2성분 반응용매 시스템에서 비대칭 분할 반응을 진행하였다. Table 1에 제시되어 있는 결과와 같이 유기용매의 소수성을 나타내주는 \( \log \mathrm{P} \) 값이 3이상인 유기 용매의 경우 수용액상에서의 반응 대비 \( 37 \% \) 이상의 epoxide hydrolase활성을 보여주었으나, \( \log \mathrm{P} \) 값이 3이하에서는 수용액상 반응대비 \( 30 \% \) 이하의 수준을 보여주었다. 이러한 결과들로부터 유기용매상에서의 epoxide hydrolase 활성은 사용한 유기용매의 구조와 극성에 따라 많은 활성 차이를 보여줌을 알 수 있었다. 유기용매 및 수용액 2성분 시스템에서의 epoxide hydrolase 활성은 decane, dodecane 등의 소수성 유기용매에서의 활성이 dimethylformamide, diethylsulfoxide 등과 같은 극성용매에 비해 높은 활성을 보임을 알 수 있었다. 특히 유기용매 중 가장 높은 epoxide hydrolase 활성을 유지시켜준 dodecane의 경우 수용액 대비 약 \( 51 \% \) 수준의 활성을 보여주어 비대칭 분할용 hollow-fiber 반응기 시스템 개발에 사용할 유기용매로 선정하였다.</p> <h2>Hollow-fiber membrane을 이용한 비대칭 분할 시스템 개발</h2> <p>유기용매 및 수용액으로 구성된 2성분계에서 생촉매를 이용한 비대칭 분할반응을 수행하는 경우, 유기용매 사용에 따른 기질 농도 중가 및 기질 안전성 향상이라는 장점 이외에 유기용매 사용으로 인한 생촉매활성 감소가 동시에 존재함으로 이러한 상반된 문제점을 동시에 극복하기 위하여 epoxide hydrolase 활성을 가진 미생물 생촉매가 있는 수용액층과 styrene oxide 기질이 녹아있는 유기용매층을 막으로 분리한 상태에서 가장 효율적인 styrene oxide 물질전달을 기대할 수 있는 hollow-fiber membrane을 이용한 비대칭 분할 시스템을 개발하기로 하였다. 무극성의 유기용매가 생촉매가 있는 수용상으로 확산되어 들어와 epoxide hydrolase 활성을 저하시키는 현상을 예방하고, 또한, 유기용매 결손으로 인한 비대칭 분할 반응의 수율 저하를 방지하기 위하여 hollow-fiber membrane의 재질은 친수성 성질을 가진 regenerated cellulose를 사용하였다.</p> <p>라세믹 styrene oxide에 대한 비대칭 광학분할 반응을 위해 구성한 수용액과 유기용매 2성분 hollow-fiber membrane 반응기 시스템이 Fig. 1에 제시되어 있다. 생촉매로 사용한 epoxide hydrolase 활성이 우수한 A. niger 세포는 100 \( \mathrm{mM} \) phosphate 완충용액 \( (\mathrm{pH} 8.0 \))에 현탁시켜 hollow-fiber 의 shell 부위를 통과하면서 lumen 부위에서 공급되는 라세믹 styrene oxide 기질에 대한 입체선택적 가수분해 반응을 하였다. Fig. 3에서와 같이 \( 100 \mathrm{mM} \) 농도의 기질에 대하여 약 8 시간의 반응기 운전을 통해 광학순도 \( 100 \% \) 수준의 chiral styrene oxide를 제조할 수 있음을 알 수 있었다.</p> <p>이러한 비대칭 분할 시스템에서는 가수분해 반응 산물인 phenyl-1,2-ethanediol에 의해 epoxide hydrolase 활성이 저하되는 현상으로 인하여 보다 높은 기질 농도에서는 효율적인 결과를 보여주지 못하였다 (data not shown). 따라서, 수용액상에 존재하는 diol 부산물을 추출 제거하기 위하여 2 번째 hollow-fiber 반응기를 연결한 cascade형 시스템을 사용하여 \( 200 \mathrm{mM} \) 라세믹 styrene oxide 기질에 대한 비대칭 분할 반응을 실시하였다. 첫 번째 반응기에서 생 촉매를 포함한 수용액상은 두 번째 hollow-fiber의 lumen 부위를 통과하게 되며, 이때 반응 생성물로써 생촉매 활성 저해 작용을 하는 diol은 shell 부위를 흐르는 diol 추출용 완충용액에 의해 추출 제거된다.</p> <p>고농도의 라세믹 에폭사이드에 대한 비대칭 분할을 위해 구성한 cascade형 hollow-fiber 시스템을 이용하여 200 \( \mathrm{mM} \) 의 라세믹 styrene oxide 기질에 대한 epoxide hydrolase 활성을 이용한 입체선택적 가수 분해 반응을 수행하였다. 8시간 정도의 반응을 통해 광학적으로 순수한 (ee >\( 99 \% \)) (S)-styrene oxide를 \( 19.5 \% \) (이론 수율 대비 \( 39\% \))의 수율로 얻을 수 있었다. 따라서, cascade형 hollow-fiber 반응기 시스템은 단순 수용액상에서 epoxide hydrolase 활성을 이용한 입체선택적 가수분해 반응에서의 문제점들을 극복할 수 있는 비대칭 분할 시스템으로 활용될 수 있음을 알 수 있었다.</p>