고부가가치 광학활성 중간체로 의약품, 농약, 기능성 식품 등에 널리 사용되고 있는 광학활성 에폭사이드는 반응성이 매우 우수하여 최근에는 EH의 선택적 분해능 차이를 이용하여 단일 광학이성질체만을 제조하는 입체선택적 광학분할 방법이 개발되었다. 본 논문에서는 epoxide hydrolase가 있는 yeast인 Rho-dosporidium toruloides SJ-4를 생촉매로 사용하여 고부가가치 광학활성 phenyl oxirane을 경제성 있게 생산할 수 있는 회분식 생산을 최적화하는데 목표를 두고 반응표면분석법을 이용, 화분식 생산조건을 최적화하였다. Rhodosporidium toruloides SJ-4를 배양하기 위한 배지로는 YPD배지를 사용, 배양온도 \( 27 ^ {\circ } \mathrm { C } , 250 \mathrm { ~rpm } \)에서 48시간 진탕 배양하였다.
<h1>서 론</h1> <p>Oxirane ring의 불안정성 및 산소 원자의 전기음성도에 기인한 극성 때문에 에폭사이드 (epoxide)는 반응성이 대단히 우수하여 친전자성반응, 친핵성반응, 산 염기반응, 산화 환원반응 등 다양한 반응을 유도할 수 있다. 이러한 다양한 반응성과 함께 광학 성질을 가지는 광학활성 에폭사이드(chiral epoxide)는 광학활성 의약품, 농약 및 기능성 식품의 합성용 중간체로 널리 사용되는 고부가가치 광학활성 중간체이다. 광학활성 에폭사이드는 여러 종류의 키랄화학촉매를 이용한 asymmetric chemocatalysis 또는 monooxygenase 및 epoxide hydrolase 등의 생촉매를 이용하여 제조할 수 있다. 최근에는 라세믹 에폭사이드 기질들의 광학이성질체에 대한 에폭사이드 가수분해효소 (epoxide hydrolase, EH)의 선택적 분해능 차이를 이용하여 단일 광학이성질체만을 제조하는 입체선택적 광학분할 (enantioselective resolution) 기술을 이용한 광학활성 에폭사이드 제조기술의 상업화에 대한 관심이 증대되고 있다. 상업용 촉매로써의 EH 특성을 분석해보면, monooxygenase 등의 산화효소에 비하여 1) cofactor 가 요구되지 않고, 따라서, 2) 세포 자체를 생촉매로 쉽게 이용할 수 있으며, 3) 일반적으로 유도 (induction) 과정을 거치지 않아도 효소가 constitutive 하게 발현되며, 4) monooxygenase에 비해 안정된 구조를 가지고 있어 상업적 응용성이 큰 생촉매로 평가 할 수 있다. 본 논문에서는 epoxide hydrolase가 있는 yeast인 Rho-dosporidium toruloides SJ-4를 생촉매로 사용하여 고부가가치 광학활성 phenyl oxirane을 경제성 있게 생산할 수 있는 회분식 생산을 최적화하고자 하였다. 원료인 라세믹 (R, S)-phenyl oxirane으로부터 epoxide hydrolase의 enan-tioselectivity를 이용하여 (R)-phenyl oxirane만을 입체선택적으로 가수분해시켜 제거합으로써 광학순도 \( 98 \% \) 이상의 (S)-phenyl oxirane을 제조하는 경제성 있는 청정생산공정을 개발하고자 하였다. 각 광학이성질체에 대한 epoxide hydrolase의 비대칭 가수분해 (asymmetric hydrolysis) 반응을 이용하여 단일 광학이성질체만을 제조하는 방법은 이론적 수율은 \( 50 \% \)이므로 반응조건 최적화에 널리 사용되고 있는 실험계획법인 반응표면분석법을 이용하여 회분식 생산조건을 최적화하였다.</p> <h1>실험재료 및 방법</h1> <h2>세포 배양</h2> <p>Rhodosporidium toruloides SJ-4를 배양하기 위한 배지로는 \( 1 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) yeast extract, \( 1 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) glucose를 포함하는 YPD배지(Peptone \( 10 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } , \mathrm { NaCl } ~2 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } , \mathrm { MgSO } _ { 4 } \cdot 7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } ~0.147 \) \( \left . \mathrm { g } / 1, \mathrm { NaH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } ~1.3 \mathrm { ~g } / 1, \mathrm { ~K } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } ~4.4 \mathrm { ~g } / 1 \right ) \)를 사용하였으며, 배양온도 \( 27 ^ {\circ } \mathrm { C } , 250 \mathrm { ~rpm } \)에서 48시간 진탕 배양하였다. 배양된 세포는 원심분리 후 \( 100 \mathrm { ~mM } \) phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } ~8.0) \)로 두 번 세척 후 생촉매로 사용하였다.</p> <h2>입체선택성 가수분해반응(enantioselective hydrol-ysis)</h2> <p>세포 \( 400 \mathrm { ~mg } \) (dry cell weight)을 \( 10 \mathrm { ~ml } \)의 \( 100 \mathrm { ~mM } \) phosphate buffer \(( \mathrm { pH } ~8.0 \))에 현탁시킨 후 \( 20 \mathrm { ~mM } \) 라세믹 phenyl oxirane를 주입하였다. 반응기로는 screw-cap vial을 사용하였으며, \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } , 250 \mathrm { ~rpm } \)의 진탕배양기에서 30분동안 가수분해 반응을 실시하여 초기반응속도를 결정하였다. 반응 종료 후 반응액을 cyclohexane으로 추출한 후, 유기용매 층을 GC로 분석하여 초기 가수분해속도와 광학순도(enantiomeric excess, ee \( = [ \mathrm { S } - \mathrm { R } ] /[ \mathrm { S } + \mathrm { R } ] \times 100 \%) \)를 결정하였다. 기질인 라세믹 phenyl oxirane 및 enantiopure ep-oxide standard는 시약 등급을 구입하여 사용하였다.</p> <h2>Chiral 화합물의 GC 분석</h2> <p>Phenyl oxirane의 ee 값 및 수율 결정을 위한 GC 분석은 불꽃이온 검출기(FID)가 장착된 가스크로마토그래피를 사용하였다. 분석용 column으로는 silica cyclodextrin cap-illary \( \beta \)-DEX 120 \((30 \mathrm { m } \) length, \( 0.25 \mathrm { ~mm } \) ID, and \( 0.25 ~ \mu \mathrm { m } \) film thickness) column을 사용하였다. 이동가스로 질소를 사용하였으며 split ratio는 1:100, flow rate는 \( 0.5 \mathrm { ~ml } / \mathrm { min } \)으로 \( 1 ~ \mu \mathrm { l } \)의 시료를 주입하여 분석하였고, column, injec-tor, detector의 온도는 각각 \( 100,~220,~220 ^ {\circ } \mathrm { C } \)였다.</p>