RNA를 추출하기 위해 NGF 유전자 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위해 B35 세포주와 마우스 뇌조직에서 RNAzol를 이용해 homogenizer로 RNA를 추출하고 chloroform과 isopropanol을 이용하여 단백질을 추출하고 \( 260 \mathrm{~nm} \) 흡광도로 양을 측정하여 \( 5 \mu \mathrm{g} \) 를 RT반응에 사용하여 3-5개의 전사를 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 로 분할하여 RT-PCR을 실시하였다.마우스 뇌조직에서 NGF receptor signaling pathway의 변화를 관찰 하였고 조직 \( 100 \mathrm{mg} \) 을 PRO-PREP Protein Extraction Solution을 첨가하여 분쇄한 후 원심분리로 단백질을 분리하고 이를 정량하여 분석했다.
<h2>Reverse transcription (RT)-PCR</h2> <p>맥문동 추출물이 NGF 유전자 발현에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 각각의 맥문동 추출물이 처리된 B35 세포주와 마우스의 뇌조직으로부터 RNA를 분리하여 RT-PCR을 실시하였다. 세포주의 경우, 세포주로부터 배지를 모두 제거한 후 RNAzol (Tel-Test Inc., CS104)을 이용하여 세포로부터 RNA를 추출하였다. 마우스의 경우, 뇌조직 \( 100 \mathrm{mg} \) 을 적출하여 ho-mogenizer를 이용하여 분쇄한 후 RNA를 추출하였다. RNAzol 추출물에 포함된 단백질은 chloroform을 이용하여 추출한 후 isopropanol을 이용하여 RNA를 침전시켜 수확하였다. 분리된 전체 RNA는 \( 260 \mathrm{~nm} \) 흡광도에서 양을 측정하고, \( 5 \mu \mathrm{g} \) 을 RT반응에 사용하였다. RT반응은 먼저 3-5 \( \mu \mathrm{g} \) 의 RNA에 \( 0.5 \mathrm{\mu g} \) 의 oligo \( \mathrm{dT} \) (Invitrogen, 18418-012)를 처리하고, \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10 분 동안 반응하여 oligo \( \mathrm{dT} \) 를 RNA에 결합시켰다. 여기에 \( 5 \mathrm{X} \) 완충용액, \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{dNTP}, 0.1 \mathrm{M} \) DTT, Superscript II (Invitrogen, 18064-014, \( 200 \mathrm{U} / \mu 1 \) )를 첨가하여 실온에서 10 분 동안 방치 후 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 50 분 동안 RT반응을 수행하였다. RT반응이 끝나면 RNaseH (Invitrogen, 18021-071)를 \( 3.2 \mathrm{U\mu l } \) 처리하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 분 동안 반응하여 RNA를 분해하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 \( 94^{\circ} \mathrm{C}(45 \mathrm{sec}), 62^{\circ} \mathrm{C}(30 \mathrm{sec}), 72^{\circ} \mathrm{C} \) (45 sec) 32 cycle로 NGF 특이적인 서열(sense primer: 5'-CAT GTT GTT CTA CAC TCT GAT CAC-3', anti-sense primer: 5'-CTC CTT GCC CTT GAT GTC TGT GG)과 actin 특이적 서열(sense primer:5'-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CAG GGC-3', anti-sense primer: 5'-CTC CTT AAT GCT ACG (AC GAT TTC-3')을 이용하여 PCR을 실시하였다. 증폭된 유전자는 \( 1 \% \) agarose gel에서 전기영동을 실시한 후 UV에서 관찰하였다. PCR 산물이 전기영동에서 나타내는 band의 den-sity는 Kodak Electrophoresis Documentation and Analysis System 120 을 이용하여 3 회 반복 실험한 결과를 통계처리하여 분석하였다.</p> <h2>동물실험</h2> <p>실험에 사용된 실험동물은 specified pathogen-free (SPF) 상태의 C57BL/6 마우스(8주령, \( 20 \pm 5 \mathrm{~g}) \) 로서 샘타코(Osan, Korea)에서 구매하여 사용하였다. 모든 마우스는 방사선 조사된 사료(Purina Com., Seongnam, Korea)를 자유급식 하도록 하였고, 12 시간의 조명주기(08:00 20:00)로 SPF 상태인 부산대학교 청정실험동물센터(온도 \( 22 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \), 상대습도 \( 50 \pm 5 \% \) )에서 사육하였다. 또한 본 연구는 부산대학교 동물실험윤리위원회(PNU-IACAU)로부터 과학성과 윤리성에 대한 심사를 거쳐 승인(승인번호: PNU-2009-0056)을 받아 수행되었다. 먼저, 마우스를 6마리씩 2군(Vehicle 처리군, LP-M 처리군)으로 무작위로 배정하였다. Vehicle 처리군은 olive oil 용액만을, LP-M처리군은 맥문동 추출물인 LP-M을 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 농도로 2 주 안 6회에 걸쳐 경구투여하였다. 2주 후, 마우스는 Zoletil 1 \( \mathrm{ml} / \mathrm{kg} \) 을 투여하여 마취하고, 조직을 적출하였다.</p> <h2>Western blot analysis</h2> <p>마우스 뇌조직에서 NGF receptor signaling pathway의 변화를 관찰하기 위하여 조직 \( 100 \mathrm{mg} \) 을 PRO-PREP Protein Extraction Solution (iNtRON Biotechnology, 17081)을 첨가하여 분쇄한 후 \( 13,000 \mathrm{rpm} \) 에서 5 분 동안 원심분리하여 단백질을 분리하고, SMARTTM BCA Protein Assay Kit (iNtRON Biotechnology, 21071)을 이용하여 단백질을 정량하여 west-ern blot analysis에 사용하였다. 4-20\% SDS-PAGE gel에 \( 50-100 \mu \mathrm{g} \) 의 단백질을 전기영동 한 후 ECL membrane (Amersham Life Science, RPN2020D)에 전이하고, \( 3\%\) skim milk에서 2시간 동안 블로킹하였다. 각 membrane은 다음과 같은 anti-p75 \( { }^{\mathrm{NTR}} \) antibody (\#4201, Cell Signaling Technology), anti-RhoA antibody (\#2117, Cell Signaling Technology), anti-Akt antibody (\#9272, Cell Signaling Technology), anti-p-Akt antibody (\#4058, Cell Signaling Technology), anti-ERK antibody (sc-94, Santa Cruz Biotechnology), anti-p-ERK antibody (sc-7383, Santa Cruz Biotechnology), anti-actin antibody (A5316, Sigma-Aldrich)로 \( 4 \mathrm{C} \) 에서 밤새 배양한 후 HRP-conjugated된 secondary an-tibody를 첨가하여 ECL Kit (RPN2108, Amersham Life Science)를 이용하여 develop하였다.</p> <h2>통계분석</h2> <p>실험군과 vehicle 처리군 간의 실험 결과에 대한 유의성은 One way ANOVA를 이용하여 분석하였고, P-value<0.05를 유의성이 있는 값으로 인정하였으며, 실험 결과는 \( \mathrm{means} \pm \mathrm{SD} \) 로 제시하였다.</p>