폐암 세포주인 A549 세포와 자궁암 세포주인 SKOV3를 배양 후 medium을 제거하고 MTT를 사용하여 픕광도를 측정하였다. 그리고 chamber slide 에서 배양하고 DAPI로 DNA를 대조 염색한 후, 형광현미경으로 각 농도에 따른 핵의 형태를 관찰했으며, 5개의 필드를 랜덤으로선택하여 평균치를 구하였다.
<h2>세포배양</h2> <p>A549 세포는 wild-type의 p53 유전자를 가지고 있는 폐암 세포주이며 SKOV3는 p53 유전자가 결실된 자궁암 세포주이다. A549, SKOV3 세포는 한국 세포주 은행(KCLB)으로부터 분양받았고, \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS), \( 100 \mathrm { U } / \mathrm { ml } \) penicillin 그리고 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) streptomycin을 포함하는 RPIM- 1640 배지에 \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 가 공급되는 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) incubator에서 배양하였다. 배양 중인 세포의 배지는 2-3일에 한번 새로운 배지로 교체해주었다.</p> <h2>세포 생존율 측정(MTT assay)</h2> <p>A549, SKVO3 세포를 96-well plates에 각 well 당 \( 4 \times 10 ^ { 3 } \) 으로 \( 100 \mu \mathrm { l } \) 의 medium과 함께 분주하고 \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 가 공급되는 incubator에서 24 시간 동안 배양한 후, 각 well 마다 resveratrol을 \( 20,40,60,80,100( \mu \mathrm { M } ) \) 농도로 처리하고 24,48 시간 배양하였다. Control group에는 resveratrol을 넣지 않고 동일한 양의 DMSO를 넣었다. 배양 후 medium을 제거하고 \( \mathrm { MTT } (0.4 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \) 를 \( 20 \mu \mathrm { l } / \) well 넣고 incubator에서 3 시간 배양한 뒤 iso-propyl alcohol을 \( 100 \mu \mathrm { l } / \mathrm { well } \) 넣어 생성된 formazan을 용해시킨 뒤, infinite reader를 이용하여 \( 595 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정했다. 측정값은 3 번은 반복하여 평균값으로 얻었다.</p> <h2>세포사멸 검출</h2> <p>A549, SKOV3 세포를 chamber slide (Lab-Tak II chamber slider system, USA)에 각 well 당 \( 4 \times 10 ^ { 4 } \) 로 분주한 뒤 24 시간 동안 부착시키고, resveratrol을 각 농도 별로 처리 후 48 시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 \( 4 \% \) para-formaldehyde로 상온에서 10 분간 세포를 고정시킨 후, terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick-end labeling (TUNEL) assays는 Red in situ apoptosis Detection kit (Millipore Corporation, MA, USA)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. DAPI로 DNA를 대조 염색한 후, 형광현미경을 이용하여 각 농도에 따른 핵의 형태를 관찰 하였고, 무작위적으로 5 개의 필드를 선택하여 평균치를 구하였다.</p>