내피세포는 Jaffe 등의 방법에 의해 사람의 탯줄에서부터 분리하여 단층 나화 실험과 Boyden-chamber를 이용한 실험으로 평가하였다.
<h2>세포 배양 및 분리</h2> <p>내피세포는 Jaffe 등의 방법에 의해 사람의 탯줄에서부터 분리하였다. 탯줄의 정맥을 PBS로 세척한 후, collagenase 를 \(0.2\%\) 농도로 넣어준 M199 으로 채워서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에 15 분 동안 반응시켰다. 그 후, \( 20 \mathrm{ml} \) 의 M199배지로 정맥을 세척하여 분리되어 떨어져 나온 세포들을 원심 분리하여 collagenase를 제거한 후, 혈청이 첨가된 M199 (M199, \(20\%\) FBS, \( 90 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) heparin, \( 30 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ECGS)에 현탁시켰다. 이것을 gelatin이 도포되어있는 T25 flask에 넣고, \( 5 \% \mathrm{CO}_{2}\), \(37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 배양하였다.</p> <h2>내피세포를 이용한 이동 실험</h2> <p>bFGF 로 자극된 내피세포의 이동에 대한 PK5의 효과는 단층 나화 실험과 Boyden-chamber를 이용한 실험에 의해서 평가되었다. 우선 단층 나화 실험은 내피 세포를 \( 1 \% \) gelatin이 도포된 6 well 배양 접시에 EGM-2를 첨가하여 confluency 될 때까지 배양하였다. Confluent하게 성장한 내피 세포를 \(\2\sim200 \mu \mathrm{l}\) pipette tip으로 긁어서 well에 상처를 만들었다. 배양된 세포는 세포 잔해를 제거하기 위하여 PBS로 2 회 세척하였다. 그리고 정제된 PK5를 여러 농도로 가해 30 분간 전처리 한 후, \( 5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 조건하 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 배양하였다. 30 분 후, \( 0.1 \% \) fetal bovine serum (FBS), \( 3 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) bFGF를 첨가하고 8 시간 동안 배양하였다. 대조군은 bFGF 없이 \( 1 \% \) FBS 가 첨가된 EBM-2 배지에서 배양하였다. 8 시간 후에 나화된 지역으로 이동된 세포는 Olympus C-5050 디지털 카메라로 촬영하였고, 이동한 세포 수를 계수하였다.</p> <p>Boyden-chamber를 이용한 내피세포 이동 실험은 혈청이 첨가되지 않은 EBM-2 배지에서 내피세포를 4 시간동안 배양하고 PK5를 30 분간 전처리 하였다. 혈청이 첨가되지 않은 EBM-2 배지나 VEGF를 \( 2 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 농도로 가한 배지를 보이든 챔버의 아랫부분에 \( 27 \mu \mathrm{l} \) 씩 넣어주었다. Boyden-chamber의 아랫부분과 윗부분 사이에 세포가 통과할 수 있도록 \( 8 \mu \mathrm{m} \) 의 구멍 크기의 막을 넣고 조립하고, 챔버의 윗부분에 준비한 세포들을 \( 2 \times 10^{4} \) 개씩 \( (56 \mu \mathrm{l}) \) 넣어주었다. \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 존재 하 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 약 4 시간에 걸쳐 세포 이동을 실시하였으며 이동이 끝난 막은 H&E 염색을 실시하여 웰 마다 5 시야를 무작위로 촬영하여 이동한 세포 수를 계산하였다.</p> <h2>Western blot</h2> <p>\( 1 \% \) gelatin이 피복된 \( 60 \mathrm{~mm} \) 배양접시에 내피세포를 sub-confluency 될 때까지 배양하였다. 성장한 내피세포에 \(500 \mathrm{nM} \) 의 PK5를 30 분간 전처리 한 후 다시 bFGF \( 3 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 을 30 분간 처리하였다. 처리가 끝난 세포들을 차가운 PBS로 세척하여 모든 반응을 중단시킨 후 세포를 긁어서 tube에 모은 후 원심분리 하여 pellet을 얻었다. 세포의 단백질을 얻기 위하여 pasive lysis buffer (Promega, Madison, WI)를 첨가하여 10 분마다 한번씩 vortex하며 30 분간 ice에서 반응시켰다. \( 14,000 \mathrm{rpm} \) 에서 30 분간 \( \left(4^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 원심분리 하여 얻은 세포 추출액을 Brad-ford 단백질 정량법을 이용하여 정량 한 후 동량의 단백질을 \( 5 \times \) SDS-PAGE gel sample buffer와 잘 섞어준 후, 10 분간 끓여주었다. SDS-PAGE 실시 후, \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) 니트로셀룰로오스 막에 전기적으로 이동시켰다. 니트로셀룰로오스 막을 30 분간 blocking 완충액 (\(5\%\) skim milk in TBST; \( 10 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}\), \(\mathrm{pH} 8.0\), \(150 \mathrm{mM} \mathrm{~NaCl}\), \(0.1 \% \) Tween 20)으로 처리한 후, TBST로 10 분씩 3 회 세척하였다. phospho-ERK1/2 antibody (Cell Signaling, Danvers, MA)를 1:1000의 비율로 blocking 완충액에 희석하여 하루 동안 반응시킨 후, 이 막을 TBST로 10 분씩 3 회 세척하고 blocking 완충액으로 1:1000 희석한 anti-rabbit IgG-HRP (Cell signaling)를 2차 항체로 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 TBST로 10분씩 3회 세척한 후 ECL solution (Amersham,UK) 으로 처리 후 X선 필름에 노출시켰다.</p> <h2>면역형광 분석</h2> <p>HUVEC을 gelatin이 coating 되어진 cover slip위에 seed-ing하고 배양하였다. 세포는 혈청이 첨가되지 않은 EBM-2 배지로 4 시간 동안 배양한 후 PK5를 30 분간 전처리 하여주고, \( 3 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) bFGF 를 30 분간 더 처리하였다. 세포는 \( 4 \% \) paraformaldehyde로 고정하고 \( 1 \%\) BSA로 비특이적 결합을 없애주었다. Anti-vinculin antibody는 1:1000으로 실온에서 3 시간 동안 반응하였고, FITC가 결합된 2 차 항체를 1:500으로 희석하여 반응시켰다. Rhodamin이 결합된 phalloidin으로 actin을 염색하고 핵 염색을 위해 DAPI를 사용하였다. Coverslip은 \( 0.05 \% \) tween-20이 포함된 PBS로 세척하고 마운틴 용액을 이용하여 형광 해상력을 증가시켰다. 형광 이미지는 OLYMPUS AX70 (OLYMPUS, Tokyo, Japan) fluo-rescence microscope을 통해 관찰하였고 DP70 camera via DP Manger version 2, 1, 1, 163 software (OLYMPUS)를 사용하여 사진 촬영을 실시하였다.</p>