실험을 위한 간장 발효균은 대구, 경북 지역의 재래간장 6종을 사용하였으며, 치아 우식 등 구강질환 원인균을 배양하여 이를 억제하는 길항균을 선별하여 방제미생물을 선발하였다. Streptococcus sanguis의 방제미생물 선발은 원심분리 후 상등액을 NA 배지에 올려놓아 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2일간 배양한 후 clear zone을 형성하는 길항균을 선별하는 식으로 진행하였으며, 다른 원인균도 비슷한 방식을 이용하였고, 최종적으로 길향력이 높은 방제미생물 균주 2종을 선별하였다. 선별균의 분류학적 동정은 Bergey's manual of systematic bacteriology의 세균 분류 동정 지침에 따라 진행하였다.
<h1>실험재료 및 방법</h1><h2>재래간장 발효균의 분리</h2><p>균 분리원인 간장은 대구, 경북지역의 일반 가정에서 재래식으로 전통적으로 제조한 간장 6종을 사용하였다. 균주의 분리방법은 시료 원액 \( 0.5 \mathrm{~ml} \) 와 멸균된 생리식염수 \( 4.5 \mathrm{ml} \)를 섞어 \( 10^{-4} \)까지 단계별로 희석하였으며, 이들을 Nutrient agar배지(nutrient \(0.8\%\), agar \(1.5\%\))에 \( 0.1 \mathrm{~ml} \) 씩을 유리봉으로 도말하여, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1일간 배양하여 생성되는 colony를 분리하였다.</p><h2>치아우식 방제미생물의 평판배양에 의한 선발</h2><p>치아우식등 구강질환 원인균 Streptococcus sanguis, S. salivarius, S. mutans를 BHI 액체 배지(Brain Heart Infu-sion, Bacto \( { }^{\text {Ⓡ}} \) DIFCO. USA)에 전배양한 배양액 \( 0.1 \mathrm{~ml} \)를 NA(Nutrient agar)배지에 유리봉으로 도말하고 plate의 가장자리에서 \( 2.5 \mathrm{~cm} \) 떨어진 곳에 분리균을 획선 접종하여 3일간 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에 배양한 후 구강질환 원인균의 생육을 억제하는 clear zone을 형성하는 길항균을 선별하였다.</p><h2>치아우식 방제미생물의 액체배양에 의한 선발</h2><p>구강질환 원인균 Streptococcus sanguis의 방제미생물 선발은 BHI 액체배지에 전배양한 배양액 \( 0.1 \mathrm{~ml} \)를 NA배지에 유리봉으로 도말하고, 평판배양으로 선별한 구강질환 방제 미생물을 Nutrient broth 배지에 하루 전 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(180\mathrm{rpm}\)으로 shaking 배양한 후 \( 10,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리 후 상등액을 filtration해서 \( 6\mathrm{mm} \) 크기의 paper disc에 묻혀 S. sanguis을 도말한 NA 배지에 올려놓아 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2일간 배양한 후 clear zone을 형성하는 길항균을 선별하였다.</p><p>구강질환 원인균 S. salivarius 방제미생물의 선발은 LB 배지(tryptone \(1\%\), yeast extract \(0.5\%\) \(\mathrm{NaCl}\) \(0.5\%\))를 \(250 \mathrm{ml} \) flask에 \(50\mathrm{ml}\)씩 담고 평판배양으로 선별한 구강질환 방제미생물을 접종하여 2일간 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(180\mathrm{rpm}\)으로 shaking incubator에서 배양한 후 \( 10,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리 후 상등액을 회수한 후 BHI 액체 배지 \( 45 \mathrm{ml} \)와 filter된 상등액 \( 5 \mathrm{ml} \)에 S. salivarius 를 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 접종하고, 대조군은 BHI 액체 배지 \( 45 \mathrm{ml} \)에 LB배지 \( 5 \mathrm{ml} \) 섞어 S. salivarius을 접종하였다. 3일간 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에 배양한 후 배양액 \( 3 \mathrm{ml} \) 를 분광광도계를 사용하여 \( 600 \mathrm{nm} \)의 파장에서 얻은 흡광도 값으로 대조군과 분리균의 균체량 차이를 측정하였다.</p><p>치아우식균 S. mutans 방제미생물의 선발은 LB 배지에 방제미생물을 접종하여 2일간 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 180 \mathrm{rpm} \)으로 배양한 후 상등액을 회수하여 BHI 액체배지 \( 45 \mathrm{ml} \)와 filter된 상등액 \( 5 \mathrm{ml}\)에 S. mutans를 \( 0.1 \mathrm{ml}\) 접종하고, 대조군은 BHI 액체 배지 \( 45 \mathrm{ml} \)에 LB배지 \( 5 \mathrm{ml} \) 섞어 S. mutans을 접종하였다. 3일간 \(30^{\circ} \mathrm{C} \)에 배양한 후 배양액을 \( 600 \mathrm{nm} \)의 파장에서 얻은 흡광도 값으로 대조군과 방제 미생물의 상등액을 첨가한 균체량 차이를 측정하였다.</p><h2>선별한 구강질환 원인균 방제미생물의 동정</h2><p>최종적으로 구강질환균에 길항력을 높게 나타내는 균주 2종을 선별하였다. 선별균의 분류학적 동정을 위해서는, Bergey's manual of systematic bacteriology의 세균 분류 동정 지침서의 시험 항목을 기준으로 하여 각 항목을 실험하였고, 최종적으로 Biolog사의 동정시스템(MicroLog \( { }^{\mathrm{TM}} 3 \) )을 사용하여 검정실험 하였다. 각 실험에 사용한 배지조성과 실험방법은 Bergey's manual of systematic bacteriology을 참조하였다.</p>