실험에 따르면 FGF-2는 혈관내피세포에서 발아를 유도해 혈관신생을 증가시키는데 그 이유는 FGF-2가 MMP-2, 플라스민 분비를 증가시키고 인테그린 Mac- 1의 발현을 증가시키기 때문이다. 이는 인테그린 억제제인 IS20I를 사용하면 FGF-2에 의한 발아 유도효과가 거의 완벽하게 억제되는 것을 보면 알 수 있다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>발아에 미치는 FGF-2의 효과</h2> <p>혈관내피세포의 발아는 혈관신생의 시작단계이다. 혈관내피세포의 발아에 미치는 FGF-2의 효과를 확인하고자 microcarrier beads에 PPAECs 세포를 2~3일간 배양하여 bead 당 약 \( 25 \sim 30 \) 세포가 융합된 상태의 단일층을 형성하도록 한 다음, 이들 beads를 3차원-피브린 젤에 매몰시켜 배양 하였다. 24시간마다 FGF-2를 첨가 \( (0.1 \sim 10 \mathrm{ng} / \mathrm{ml}) \)하면서 조사한 결과, \( 10 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \)에서 약 3.5배 증가되는 등 농도-의존적으로 발아율이 증가되었다. 이러한 결과는 angiopoietin-1을 이용한 Kim 등의 결과와 일치하는 것으로, FGF-2가 혈관내피세포에서 발아를 유도하여 혈관신생을 증가시킨다고 생각되었다.</p> <h2>MMPs 및 플라스민의 분비에 미치는 FGF-2의 효과</h2> <p>In vivo에서 내피세포가 이동하기 위해서는 인접한 세포외기질을 분해하여야만 한다. 이 과정에 주된 역할을 하는 효소로 MMPs 및 플라스민이 알려져 있다. 따라서 FGF-2에 의해 유도된 발아는 MMPs 및 플라스민의 분비증가에 의한 세포외기질의 재구성에 의한 것이라 생각할 수 있다. 이를 확인하기 위해, PPAECs 세포에 FGF-2를 처리한 다음, PPA-ECs 세포로부터 분비되는 배양배지를 이용하여 몇 종류의 MMPs에 대한 erizyme immunoassay를 행한 결과, MMP-2의 분비만 약 1.9배 증가되었다. MMP-1 및 MMP-3는 FGF-2에 의해 유의할만한 증가가 나타나지 않았으며, 특이하게 MMP-3는 혈관신생인자의 처리 없이도 많은 양이 분비되었다. MMP-9은 \( 0.6 \sim 1.2 \mathrm{ng} / 10^{6} \) cells 정도로 분비량이 적었다. 이러한 결과는 정상 조직의 지속적인 성장과정 및 혈관신생시에 MMP-2가 중요한 역할을 할 것이란 결과와 일치한다.</p> <h2>Zymography에 의한 MMPs 및 플라스민의 FGF-2-유도 분비 증가효과</h2> <p>MMPs의 활성을 정확히 확인하기 위해서는 젤라틴 zymography가 요구된다. 젤라틴 zymography를 이용하여 FGF-2 에 의한 MMPs의 분비량을 조사한 결과, 대조군에 비해 pMMP-2(약 \( 68 \mathrm{kDa} \))는 약 1.9배 증가하였으며, MMP-9은 검출이 불가능하여 enzyme immunoassay 결과와 유사한 양상을 보여주었다. 또한 pMMP-2보다 약간 큰 젤라틴 분해 밴드(약 \( 74 \mathrm{kDa}) \) 도 관찰되었다. 광범위 MMPs 억제제인 BB-94(\(20 \mathrm{ng}/\mathrm{ml}\))를 전처리한 경우, MMP-2의 분비가 거의 완벽하게 억제되었으며, pMMP-2의 활성화에 관여한다고 알려진 플라스민의 억제제 \( \left(\alpha_{2}\right. \)-antiplasmin, \( \left.100 \mathrm{mU}\right)\)는 MMP-2의 분비에 거의 영향을 미치지 못하였다. 인테그린 억제제인 IS20I는 MMP-2의 분비를 부분적으로 억제하였다. 이러한 결과는, FGF-2에 의한 내피세포의 발아 촉진 효과가, 부분적으로는 MMP-2의 분비증가를 통하여 이루어진다고 볼 수 있으며 Hofmann 등의 결과와 일치하였다. 그러나 본 연구에서 검출된 MMP-2는 불활성형이므로 세포외기질의 재구성 및 이를 통한 발아에는 MMP-2의 활성화가 반드시 요구되므로, 추후 MMP-2의 활성화에 관여하는 또 다른 인자의 탐색을 통해 보다 정확한 발아기작을 이해하고자 한다.</p> <p>한편, in vitro 피브린 젤에서 FGF-2에 반응하여 발아되기 위해서는 내피세포가 피브린 분해효소를 분비하여야 한다. 피브린 분해활성을 조절할 수 있는 내피세포의 능력은 주로 플라스민에 의한다고 알려져 있다. 예상한대로 FGF-2에 의해 플라스민의 분비가 약 2.6배 증가하였으며, MMPs 억제제 및 인테그린 억제제에 의해 유의할만한 감소가 나타났다. 또한 플라스민 억제제인 \( \alpha_{2} \)-antiplasmin에 의해서 플라스민의 분비가 완전히 억제되었다. 이러한 결과는 플라스민의 분비기작에 MMPs 및 인테그린-의존적 경로가 존재할 가능성을 제시하고 있다.</p> <h2>인테그린 Mac-1의 발현이 sprouting에 미치는 효과</h2> <p>생리적인 상태와 병리적인 상태 모두에서 세포내 침윤은 세포외기질의 분해, 세포간 부착 및 탈착 그리고 세포외기질 구성성분에 대한 세포의 부착 및 탈착 등이 요구된다. 이러한 모든 과정은 단백질분해효소 및 부착분자의 상호조절된 발현에 좌우되며, 기능적으로 활성을 띤 MMP-2의 세포 표면에의 축적은 인테그린에 의해 조절된다고 알려져 있다. 또한 melanoma 세포의 침윤에는 인테그린 \( \alpha_{\mathrm{v}} \beta_{3} \) 의 협동적 발현이 필요하다는 사실이 밝혀지기도 했다. 따라서 본 연구에서도 FGF-2에 의한 발아 증가, MMP-2 및 플라스민의 증가가 인테그린과 관계가 있는지를 확인한 결과, FGF-2에 의해 인테그린 Mac-1의 발현이 농도-의존적으로 증가되었다. 또한 인테그린 억제제인 IS20I를 전처리한 결과, 인테그린 Mac-1의 발현이 완전히 억제되었다. IS20I는 많은 종양세포 및 내피세포에서 혈관신생을 억제하며 동시에 유사분열 억제 및 항이동 효과를 나타냈고, 고농도의 IS20I는 내피 세포 및 종양세포의 apotosis를 유도한다고 알려져 있다. 본 연구에서도 유사한 결과를 얻었는데, FGF-2에 의한 발아 유도효과는 IS20I 처리에 의해 거의 완벽하게 억제되었으며, MMP-2 및 플라스민의 분비도 유의할만하게 감소되었다. 이상의 결과를 요약하면, FGF-2에 의해 유도된 혈관내피세포의 발아 증가는 MMP-2 및 플라스민의 분비증가와 인테그린 Mac- 1 의 발현증가에 의한 것이라 생각된다.</p>