3T3-L1 전지방세포는 ATCC에서 구입하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C~ } , 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \)로 배양하였다. Adipogenesis 유도를 위해 3T3-L1 세포는 PBS 용액으로 씻어주고 6 well-plate에 배양하였고 2일 후 분화 유도 배지를 교체하는 것을 시작으로 2일간격으로 교체관리 하였고 이후에 RNA 단백질들을 추출하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포 배양 및 시약</h2> <p>실험에 사용된 3T3-L1 전지방세포(preadipocyte)는 ATCC(American type culture collection, Manassas, VA, USA)에서 구입하여 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에 \( 10 \% \) calf serum, \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) streptomycin, \( 100 \mathrm { units } \ / \mathrm { ml } \) pen-icillin과 함께 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C~ } , 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) 배양기에서 배양하였다. 세포 배양에 사용된 모든 제품은 Life Technologies Inc. (Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 구입하여 사용하였고, 다른 시약들은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.</p> <h2>Adipogenesis 유도</h2> <p>3T3-L1 세포는phosphate buffered saline (PBS) 용액으로 씻어준 후, \( 1 \sim 2 \times 10 ^ { 5 } \) \( \mathrm { cells } / \mathrm { ml } \)를 6 well-plate에서 세포밀도가 \( 100 \% \)가 될 때까지 배양하였다. 2일 후(day0), \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS)이 첨가된 DMEM에 \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) insulin, \( 0.25 \mathrm { mM } \) dexamethasone 그리고 \( 0.5 \mathrm { mM } \) 3-isobutyl-1-methylxanthine이 처리된 분화 유도 배지(differentiation-induction medium)로 교체하여 48시간 처리하였다. 그 후 2 일 간격으로 \( 10 \% \) FBS가 첨가된 새 배지에 \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) insulin이 처리된 분화 유지 배지(differentiation-maintenance medium)로 교체되었다.</p> <h2>si-RNA transfection</h2> <p>세포밀도가 \( 100 \% \)로 배양이 되고 2일 후, 3T3-L1 세포를 1시간 동안 serum-free medium에 배양하고 lipofectamine RNAiMAX transfection reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 \( \beta \)-catenin, LRP6, DVL2 siRNA 및 control siRNA (Santa Cruz, CA, USA)를 각각 \( 60 \mathrm { nM } \)의 농도로 transfection하였다. 6시간 후, 분화 유도 배지로 교환하여 지방세포의 분화를 유도하였다. 분화 유도 6일에 real-time RT-PCR과 Western blotting에 필요한 total RNA와 단백질을 추출하였다.</p> <h2>Total RNA 추출</h2> <p>Total RNA는 acid-phenol 추출법을 이용한 RNeasy kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 제시된 편람에 따라 분리 정제되었다. 추출된 total RNA는 분광광도계를 이용하여 optical density (OD) 값을 측정하고 역전사(reverse tran-scription)반응을 진행할 때까지 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 보관하였다.</p>