분리된 미생물은 DAVIS 액체배지에서 72시간동안 배양한 후, 원심분리를 진행하여 조효소액을 얻었다. 또한, 키틴 분해효소의 활성을 colloidal chitin을 기질로 하여 DNS 환원당 정량법을 사용하여 측정하였다. 미생물의 형태적, 생화학적 동정은 각각 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology와 API 50 CHB kit을 사용하였고, 유전학적 동정은 16S ribosomal DNA 염기서열 분석으로 수행하였다.
<h2>효소활성 측정</h2> <p>분리미생물은 최소배지인 DAVIS 액체배지 \( (0.2 \% \) colloidal chitin, \( 0.07 \% \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}, 0.03 \% \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 0.05 \% \mathrm{MgSO}_{4} \). \( 5 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, \quad 0.001 \% \quad \mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, \quad 0.001 \% \quad \mathrm{ZnSO}_{4}, 0.01 \mathrm{~g} \) \( \mathrm{MnCl}_{2}, 0.2 \% \) yeast extract)에서 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 72 \) 시간동안 배양하였으며 배양액을 원심분리 \( \left(10,000 \times g, 4^{\circ} \mathrm{C}, 10 \mathrm{~min}\right) \) 한 후, 상등액을 조효소액으로 사용하였다.</p> <p>키틴 분해효소의 활성측정은 Thamthiankul 등의 방법을 변형하여 \( 1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) colloidal chitin \( (0.1 \mathrm{M} \) sodium acetate buffer, \( \mathrm{pH} 5.0) \) 을 기질로 사용하여 DNS 환원당 정량법으로 수행하였다. \( 1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) colloidal chitin solution (0.1 M sodium acetate buffer, \( \mathrm{pH} \) 5.0) \( 500 \mu \mathrm{l} \) 에 조효소액 \( 500 \mu \mathrm{l} \) 을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 시간동안 반응시킨 후, \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분동안 열처리하여 효소반응을 중지시켰다. DNS solution (3,5-dinitrosalicylic acid) \( 1 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 분동안 반응시키고 원심분리 \( \left(10,000 \times g, 4^{\circ} \mathrm{C}, 10 \mathrm{~min}\right) \) 하여 상등액을 취한 후, spectrophotometer (VersaMax \( { }^{\mathrm{TM}} \) ELISA microplate reader; Molecular Devices Co., USA) 를 이용하여 \( 550 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 효소 활성 \( 1 \mathrm{U} \) (unit)는 1 분 동안에 \( 1 \mu \mathrm{mole} \) 의 N-acetylglucosamine (GlcNAc)을 유리시키는데 필요한 효소의 양으로 나타내었다.</p> <h2>미생물의 동정</h2> <p>분리 미생물의 형태적 동정은 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 따라 분류하였다. 분리 미생물의 생화학적 동정은 API 50 CHB kit (bioMerieux Co., France)로 49개 탄소원에 대한 이용성을 조사하였고 결과는 API web database (http://apiweb.biomerieux.com)을 이용하여 동정하였다.</p> <p>분리 미생물의 유전학적 동정은 \( 16 \mathrm{~S} \) ribosomal DNA 염기서열 분석을 통해 수행하였다. 분리 미생물로부터 분리한 chromosomal DNA를 universal primer인 27 forward primer (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')와 1492 reverse primer (5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3')를 사용하였다. PCR (Minicycler TM; MJ research Inc., USA) 증폭은 순차적으로 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분간 denaturation, \( 51^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분간 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분 30 초 동안 extension을 30 cycles 실시하였고 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 최종 extension을 실시하였다. 증폭된 약 \( 1.4 \mathrm{~kb} \) 의 fragment를 \( \mathrm{T} \) vector (Invitrogen, USA)에 결합시킨 후 형질전환하여 \( \mathrm{T} \) vector sequencing primer를 이용하여 Applied Biosystems 3730 DNA analyzer (Applied Biosystems, USA)로 염기서열을 분석하고 GenBank (NCBI, USA)의 database에 등록된 \( 16 \mathrm{~S} \) rDNA 염기서열의 정보와 BLAST program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)을 이용하여 분리 미생물을 동정하였다.</p>