원형질체의 밀도를 보기 위해 양배추 \( 2 \times 10 ^ { 6 } / \mathrm { mL } \), 무 \( 4 \times 10 ^ { 6 } / \mathrm { mL } \)의 농도를 사용해 원형질체 혼합물 \( 150~ \mu \mathrm { L } \)를 페트리디쉬에 떨어뜨려 융합유도제 \( (30 \% \) PEG 용액 + DMSO) 150 ~ \mu \mathrm { L } \)를 첨가하였다. 융합체를 배양하고 이는 호르몬이 첨가되지 않은체 외부에서 관찰했다.
<h2>원형질 융합</h2> <p>원형질 융합은 PEG (M.W. 8000, \(25 \% \)) 방법을 약간 변형하여 이용하였다 (Yamanaka et al. 1992). 먼저 분리된 원형질체의 밀도는 양배추는 \( 2 \times 10 ^ { 6 } / \mathrm { mL } \)로, 무는 \( 4 \times 10 ^ { 6 } / \mathrm { mL } \)의 농도로 원형질체를 현탁희석용액 CPW + 0.4 M mannitol)으로 조절하고 각각 부피비율 \( 1: 1 \) 로 고르게 섞은 뒤 원형질체 혼합물 약 \( 150~ \mu \mathrm { L } \)를 페트리디쉬에 떨어뜨리고 융합유도제 \( (30 \% \) PEG 용액 + DMSO) 150 ~ \mu \mathrm { L } \)를 첨가하여 잘 섞이게 흔들어 주었다. 이후 High \( \mathrm { pH } \), High \( \mathrm { Ca } ^ { 2 + } \) 용액 \( 150 ~ \mu \mathrm { L } \)를 첨가한 뒤 해부현미경에서 융합을 확인하고 \( 1 \mathrm { ~mL } \mathrm { ~W } _ { 5 } \) 용액을 첨가하여 상등액을 파스퇴르 파이펫으로 제거하였다 (Kelleret al. 1973). 이후 \( \mathrm { W } _ { 5 } \) 용액으로 5회 수세한 후, 마지막 단계에서 배양배지로 수세 후 최종적으로 \( 2 \mathrm { ~mL } \)의 배양배지로 배양을 실시하였다.</p> <h2>융합체 배양</h2> <p>PEG로 융합된 원형질체는 \( 2 \% \) glucose, \( 7 \% \) mannitol, BAP \( 1 \mathrm { ~mg } / \mathrm { L } \), NAA \(1 \mathrm { ~mg } / \mathrm { L } \), 2,4-D \(0.25 \mathrm { ~mg } / \mathrm { L } \)가 첨가된 \( \mathrm { MS } \) 액체배지에서 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 암상태에서 배양을 실시하였다. 약 3~4주의 배양을 지속하면 육안으로 미소괴를 관찰하고 이를 kinetin \( 5 \mathrm { ~mg } / \mathrm { L } \), 2,4-D \(0.5 \mathrm { ~mg } / \mathrm { L } \)가 첨가된 MS 반고체 배지로 옮겨서 \( 16: 8 \) (광:암)의 배양실에서 캘러스의 발달을 유도하였다. 유도된 캘러스는 Zeatin \( 2 \mathrm { ~mg } / \mathrm { L } , \mathrm { GA } _ { 3 } 0.035 \mathrm { ~mg } / \mathrm { L } + \) agar \( 1.6 \% \)가 첨가된 MS 배지에서 신초를 유도하고, 유도된 신초는 호르몬이 첨가되지 않은 1/2 MS 배지에서 뿌리를 유도 후 순화하여 온실에서 외부형태를 관찰하였다.</p>