real-time PCR을 생의약품 제조공정 검증 적용가능성을 분석하기 위해 CHO 세포주 배양배지에 BPV를 감염시킨 후 배양하고, phosphate buffered saline로 3번 세척한 뒤 계대 배양한 후 real-time PCR을 이용하여 BPV 검출을 실시하였다. 또한 소유래 콜라겐에 BPV를 spiking하고 real-time PCR을 사용하여 BPV 검출을 실시하였다. 각각의 음성 대조군으로는 바이러스를 첨가하지 않은 각 물질을 사용하였다.
<h2>CHO 세포에서 real-time PCR을 이용한 BPV 검출</h2> <p>확립된 real-time PCR을 생물의약품 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BPV를 오염 시킨 CHO 세포주에서 BPV 검출 시험을 실시하였다. CHO DG44 세포를 \( 5 \% \) 우혈청을 첨가한 Iscove's modified Dulbecco's medium(IMDM: Gibco BRL, USA) 배지 에 \( 100 \times \) Hypoxanthine-Thyminidine suppliment(HT suppliment; Gibco BRL, USA) \( 1 \% \) 를 첨가하여 배양하였다. T- 25 flask에 배양된 CHO DG44에 BPV를 감염시킨 후 4 일 동안 배양하였다. 세포 배양액을 제거한 후 세포 배양액에 남아있을 수 있는 BPV을 완벽히 제거하기 위해 phosphate buffered saline으로 3번 세척한 다음 CHO DG44를 계대 배양하였다. 4일 동안 배양한 후 다시 계대 배양한 다음 4일 후에 현미경으로 CHO DG44의 모양을 관찰한 후 세포 배양액과 세포를 따로 수거하였다. 확립된 real-time PCR 방법을 이용하여 세포 배양액과 세포에 BPV가 존재하는지 여부를 확인하였다. Real-time PCR 양성 대조군으로는 titer가 \( 1.3 \times 10 ^ { 2 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \) 인 BPV를 사용하였으며, 음성 대조군으로는 CHO 세포주 배양배지 또는 비감염된 CHO 세포주를 사용하였다.</p> <h2>소유래 콜라겐에서 real-time PCR을 이용한 BPV 검출</h2> <p>확립된 real-time PCR을 소유래 콜라겐 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BPV를 오염시킨 콜라겐에서 BPV 검출 시험을 실시하였다. Titer가 \( 1.3 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \) 인 BPV를 순차적으로 10 배씩 희석한 후 각 희석액 \( 0.2 \mathrm { ~mL } \) 을 소유래 콜라겐 \( 1.8 \mathrm { ~mL } \) 에 spiking 한다음 확립된 real-time PCR 방법을 사용하여 BPV를 검출하였다. Real-time PCR 음성 대조군으로는 바이러스를 첨가하지 않은 콜라겐을 사용하였다.</p> <h1>결 과</h1> <h2>Primer의 선별</h2> <p>PCR 방법을 사용하여 특정 바이러스 존재를 확인하고, 정량분석하기 위해서는 바이러스 내에서 유전적인 변이가 심하지 않은 conserved sequence를 가진 부위를 선택하여야 한다. 선택된 sequence는 특정 바이러스에만 존재하여 특이성이 높아야 한다. 생물의약품의 원료물질, 공정 중간물질, 최종제품 등에 미량으로 오염될 수 있는 바이러스 검출을 위한 정량 PCR의 경우 높은 민감도가 요구된다. 위와 같은 조건을 만족하는 PCR을 확립하기 위해 Primer3 Software를 이용하여 BPV 특이적인 primer 5쌍을 디자인하였다. 일반 PCR을 실행하여 각각의 primer 쌍들의 민감도를 확인하였다. Titer가 \( 1.3 \times 10 ^ { 3 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \) 과 \( 1.3 \times 10 ^ { 1 } \) \( \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \) 인 BPV를 시료로 PCR을 수행한 결과 primer 쌍BPV-F4, BPV-R4가 가장 민감도가 우수하였다(자료 미제시). PCR 조건을 최적화 한 결과 annealing temperature와 \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \) 농도는 각각 \( 52 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 와 \( 4 \mathrm { mM } \) 이었다. 최적 조건에서 PCR의 민감도를 측정하였다. Titer가 \( 1.3 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \) 인 BPV를 순차적으로 희석하여 PCR 한 결과 \( 1.3 \times 10 ^ { -1 } \) \( \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \) 까지 PCR 산물을 확인할 수 있었다. PCR 산물을 sequencing한 후 blast searching(www.ncbi. nlm.nih.gov/BLAST/) 한 결과 PCR 산물이 BPV 유전자임을 확인할 수 있었다(자료 미제시).</p>