본 시험에선 충청북도농업기술원 시험포장에 재식된 사과 왜성 대목 M.9 및 M.26을 재료로 사용하여 고온처리, 화학처리, 생장점 배양을 통해 바이러스(ACLSV, ASPV, ASGV) 제거 시험을 수행하였고, RT-PCR 및 ELISA로 무병묘 생산 효율을 확인하였다. 사과 왜성대목 M.9 및 M.26의 식물체의 바이러스 제거 시험은 클린벤티 안에서 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite)에 표면살균 후 세척해 생장점(Meristem)을 채취하고 기내 배지에 치상해 배양하였다. 배지의 조성은 MS배지에 고압멸균기 (AC-60, Daihan scientific, Korea)로 멸균하고 배양식에서 명배양해 신초의 발생 양상을 관찰하고 배양된 신초 잎으로 바이러스 검정을 하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물재료</h2> <p>본 시험에서는 충청북도농업기술원 시험포장에 재식된 사과 왜성 대목 5 년생 M.9 및 M.26을 재료로 사용하였다. 고온처리, 화학처리 및 생장점 배양의 바이러스 제거효과를 구명하기 위하여 바이러스(ACLSV, ASPV, ASGV) 감염이 확인된 왜성대목을 각각 20 개체씩 선발하였다. 최종적으로 생산된 식물체에 대하여 바이러스 3종(ACLSV, ASPV, ASGV)의 제거 여부를 RT-PCR 및 ELISA로 진단하여 무병묘 생산 효율을 확인하였다.</p> <h2>바이러스 제거 처리</h2> <p>사과 왜성대목 M.9 및 M.26의 식물체를 이용하여 고온처리, 화학처리, 생장점 배양을 통하여 바이러스 제거 시험을 수행하였다. 고온처리는 각 처리별 20 개 식물체를 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 습도 \( 65 \% \) 로 유지되는 항온항습기(WGC-450, Daihan scientific,Korea)에서 6주간 처리하였으며, 화학처리는 Ribavirin (1-B-D-ribofuransvl-1,2,4-triazole caboxamide, MBcell. USA) \( 40 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \)이 첨가될 배지에서 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 4주간 신초를 배양하였다. 생장점 배양은 신초가 신장한 마디를 잘라 흐르는 물에 약 30 분간 깨끗하게 세척한 후 \( 70 \% \) 에탄올에 침지하여 약 30 초간 표면 살균한 다음 멸균수로 1 회 세척하였다. 이후, 클린벤치 안에서 \( 2 \% \) 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite)에 20 분간 침지하여 2 차 표면살균 후, 멸균수로 3 회 세척하고 실체 현미경 하에서 \( 0.1 \pm 0.2 \mathrm { ~mm } \) 크기로 생장점(Meristem)을 채취하여 기내배지에 치상하여 6 주간 배양하였다. 배지의 조성은 MS배지에 \( 30 \mathrm { ~g } / \ell \) sucrose (Junsei,Tokyo, Japan), agar (Junsei Chemical, Tokyo, Japan)를 \( 8 \mathrm { ~g } / \ell \) 첨가한 다음, \( 250 \mathrm { ml } \) 배양병에 \( 50 \mathrm { ml } \) 씩 분주하였고 고압멸균기 (AC-60, Daihan scientific, Korea)를 이용해 \( 121 ^ {\circ } \mathrm { C } \) , \(1.2 \) 기압 하에서 20 분간 멸균하여 사용하였다. 배양 조건은 \( 23 \pm 1 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 온도가 유지되는 배양실에서 명배양(광주기 \( 16 \mathrm { D } : 8 \mathrm { H } , \mathrm { cool } \) white 형광등 \( \left .30 \mu \mathrm { mol } \cdot \mathrm { m } ^ { -2 } \cdot \mathrm { s } ^ { -1 } \right ) \) 하였다. 배양 과정 중 신초의 발생 양상을 관찰하였고 배양 6 주 후에 형성된 신초 잎을 이용하여 바이러스 검정을 하였다.</p>