DNA polymerase는 아미노산 서열에 따라 family A, B, C, D, X로 분류된다. PCR이 가능한 DNA polymerase는 내열성을 가진 호열성 세균과 초호열성 고세균 내에 있고, 진정세균 유래는 Pol I family, 고세균 유래는 \( \alpha \)-family에 속한다. 본 연구에서는 일본의 Arima 온천수에서 분리한 Thermus thermophilus \( \mathrm { HJ } 6 \) 균주에서 DNA polymerase 유전자를 클로닝하고 염기서열을 결정했고, 온도 감수성 프로모터를 가지는 pJLA503 벡터시스템으로 고가 유도기질 없이 재조합 DNA polymerase를 생산하고 본 효소의 DNA 중합 활성을 분석했다.
<h1>서 론</h1> <p>DNA polymerase는 그 기능상 모든 생물이 가지고 있는 것으로 생각되고 아미노산 서열이 밝혀짐에 따라 최근에는 family A, B, C, D, X의 5종류로 분류 되고 있다. 그 중 Family A는 대장균 DNA polymerase I으로 대표되는 Pol I family이고, B는 cukaryotic DNA polymerase \( \alpha \) 로 대표되는 \( \alpha \)-family로 분류된다. Family는 대장균 DNA polymerase III, D는 고세균 DNA polymerase II, X는 eukaryotic DNA polymerase \( \beta \) 와 Terminal transferase로 각각 대표된다. 같은 family에 속하는 것은 공통의 아미노산 서열을 가지고 있고 효소의 생화학적 성질, 예를 들면 DNA 합성속도, 합성되는 nucleotide의 수, 주형-primer 종류에 대한 선호성이나 저해제에 대한 감수성에 있어서 유사하다. 한편, Polymerase Chain Reaction (PCR)에 사용할 수 있는 DNA polymerase의 절대 조건은 내열성이므로 호열성 세균 및 초호열성 고세균이 가지고 있는 DNA polymerase가 대상이 되고, 진정세균 유래는 Pol I family에 속하고 고세균 유래는 \( \alpha \)-family에 속한다.</p> <p>내열성 DNA polymerase고 처음 특성이 밝혀진 Taq DNA polymerase은 Thermus aquaticus로부터 분리되었고 이후 많은 Thermus 속 세균으로부터 Tfl polymerase, Tth polymerase, Tca polymerase, Tfi polymerase, Top polymerase 등이 분리되어 PCR에 적용되고 있다. 현재 PCR을 사용하는 적용분야는 점점 증가하는 추세에 있어 그에 따른 다양한 종류의 내열성 DNA polymerase에 대한 요구도 커지고 있다.</p> <p>본 연구에서는 온천수에서 분리한 호열성 Thermus thermophilus \( \mathrm { HJ } 6 \) 균주로부터 DNA polymerase 유전자를 클로닝하고 염기서열을 결정하였다. 또한 온도 감수성 프로 모터를 포함하는 pJLA503 벡터시스템을 이용하여 isopropyl- \( \beta \)-D-thiogalactopyranoside(IPTG)와 같은 고가 유도기질의 사용 없이 재조합 DNA polymerase를 생산-정제하고 본 효소의 DNA 중합 활성을 분석하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 플라스미드</h2> <p>본 연구에 사용된 Thermus thermophilus HJ6 균주는 일본의 Arima 온천수에서 분리한 것을 사용하였다. 분리균주 \( \mathrm { HJ } 6 \) 은 ATCC medium 697(8 g polypeptone, \( 4 \mathrm { ~g } \) yeastextract, \( 4 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \mathrm { NaCl } , \mathrm { pH } 7.5 \) )를 사용하여 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양 하였다. 대장균 DH5와 BL21(DE3) codon plus(Novagen, Inc., San Diego, CA, USA)는 각각 클로닝 및 발현을 위한 균주로 사용하였다. 플라스미드 pGEM-T vector(Promega, Madison, WI, USA)는 유전자 클로닝과 염기서열 분석을 위해 사용하였고, \( \mathrm { p } \pi A 503 \) 플라스미드는 일본 오사카대학 Kanaya연구실에서 분양 받은 것으로 단백질 발현을 위해 사용하였다.</p>