해양 미생물 Vibrio sp. YE-101은 TTX를 생성하는 능력을 가지고 있으며, 이는 \(3 \% \)의 \( \mathrm { NaCl } \) 이 첨가된 nutrient 한천 평판에서 계대배양하였다. 또한 TTX생산을 위한 액체 배양은 ORI 기본배지를 사용하여 \( 23 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 48시간 동안 진탕 배양하였다. TTX 독성 시험은 일본 후생성 표준법인 mouse bioassay법을 이용하였고, YE-101의 배양을 위한 탄소원의 영향을 살펴보기 위해 최적 배양 조건에서 48시간 동안 배양한 후 optical density를 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>복어 장내 기생 미생물의 배양</h2> <p>TTX 생성능이 있는 해양 미생물 Vibrio sp. YE-101은 \(3 \% \) \( \mathrm { NaCl } \) 이 첨가 된 nutrient 한천 평판에서 계대배양했고, TTX생산을 위한 액체 배양은 ORI 기본배지 (Proteose peptone \( 2 \mathrm { ~g } \), Phytone peptone \( 2 \mathrm { ~g } \), Yeast extract \( 1 \mathrm { ~g } \), Citric acid \( 0.88 \mathrm { ~g } , \mathrm { NaCl } 30 \mathrm { ~g } \), Distilled water \( 1 \mathrm { ~L } , \mathrm { pH } 8.0 \) )를 사용하여 \( 23 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 48 시간 진탕 배양하였다.</p> <h3>Mouse bioassay</h3> <p>TTX 독성시험은 일본 후생성 표준법인 mouse bioassay법을 이용하였다. 파쇄한 미생물 균체에 \( 0.1 \% \) 초산 용액 \( 25 \mathrm { ml } \) 를 넣고 가열하여 충분히 독소를 추출한 후 여과하고, 잔사는 \( 0.1 \% \) 초산 용액으로 다시 세정하여 여액과 합쳐 약 \( 50 \mathrm { ml } \) 를 만들었다. 이 용액을 증류수로 알맞게 희석하여 ICR (Institute of Cancer Research)계 쥐(수컷, \( 18 \sim 20 \mathrm { ~g } ) \) 의 복강에 \( 1 \mathrm { ml } \) 를 주사하고 치사시간을 측정하여 \( \mathrm { MU } \) (mouse unit) 단위로 독성치를 나타내었다. \( 1 \mathrm { MU } \) 는 주사한 후 30분 이내에 치사시킬 수 있는 TTX 양을 의미한다.</p> <h3>탄소원, \( \mathrm { pH } , \mathrm { NaCl } \) 농도 및 배양온도의 영향</h3> <p>Vibrio sp. YE-101 균체 배앙을 위한 탄소원의 영향을 살펴보기 위하여 기존 문헌치의 최적 배양 조건인 \( \mathrm { pH } 8,5 \) \( \%(w / v) ~ \mathrm { NaCl } \) 및 \( 27 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 48 시간 배양 한 후 \( 600 \mathrm { ~nm } \) 에서 optical density (O.D.)를 측정하였다. \( \mathrm { pH } , \mathrm { NaCl } \) 농도 및 배양온도는 5 9, 1 9 \%(w/v), 19 35' \( \mathrm { C } \) 로 각각 조절한 후 O.D.를 측정하여 그 영향을 분석하였다.</p>