본 논문에서는 혈전용해효소에 대해 연구하기 위해 청국장과 장류공장에서 혈전용해능이 있는 균주를 분리하였고, 이 중 혈전용해효소를 많이 생산하는 기능성 청국장을 만드는 적합한 균주를 선택했다. 이 청국장의 제조 및 발효조건을 알기 위해 최적 발효온도와 시간을 검토하기 위해 온도와, 시간을 변경하며 발효 조건을 설정하였고, 각 발효조건별로 제조한 청국장의 pH를 측정하였다. 이렇게 배양한 청국장 균주의 혈전용해효소의 안정성과, 혈전용해활성을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>원료대두</h2><p>경남 남해군 서면 농협에서 2001년 가을 수확한 백태를 구입 사용하였다.</p><h2>균주의 분리 및 동정</h2><p>서부경남 일대의 재래시장에서 유통되는 청국장과 장류공장에서 분리한 균주 중 혈전용해능이 있는 균주를 분리하였다. 분리한 균주로 청국장을 제조하여 청국장의 냄새와 맛, 색택, 점질물 생성량, 암모니아취가 등을 조사하였다. 특히 혈전용해효소를 많이 생산(Fig. 1)하는 기능성 청국장제조에 적합한 균주를 선택하였다. 분리된 균주의 생화학적 특성을 Bergey's의 방법에 준하여 동정하였다. 형태학적 특성은 gram 염색법으로 염색 후 현미경으로 검경하였으며, 운동성과 아포형성 유무를 확인하였다.</p><h2>청국장제조 및 발효조건</h2><p>분리균주를 TSA (Trypticase Soy Agar, Difco, France)에 계대 후 TSB (Trypticase Soy Broth, Difco, France)에 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), 24시간, 진탕 배양한 것을 종균으로 이용하였다. 남해산 대두를 정선하여 이물을 제거하고 3회 세척 후 실온에서 12시간 침지 하였다. 물빼기는 1시간 실시하여 과잉의 수분을 제거하였다. \( 121^{\circ} \mathrm{C} \)에서 50분간 증자 한 후 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)까지 방냉하여 전배양한 종균을 원료 \( \mathrm{g} \) 당 \( 10^{6} \) 되게 접종하여 통기 가능한 용기에 넣어 발효시켰다. 최적 발효온도와 시간을 검토하기 위해 선발된 종균을 접종한 증자 대두를 25에서 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)까지 범위의 여러 온도별 항온기에서 발효 72시간까지 6시간마다 시료를 채취하였다. 각 발효조건별로 제조한 청국장의 \( \mathrm{pH} \)는 시간별로 채취한 시료를 동량의 증류수에 현탁하여 \( \mathrm{pH} \) meter(ORION 420A, USA)로 측정하였다. 청국장 발효 중 균수변화는 직접도말법으로 측정하였다. 즉, 각 시간별 시료 \( 10 \mathrm{~g} \)을 멸균증류수 \( 90 \mathrm{ml} \)에 넣고 30분간 교반하여 시험액으로 사용하였다. 시험액을 10배씩 희석하여 NA (Nutrient Agar, Difco, France)에 도말하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12시간배양 후 생성된 colony를 계수하였다.</p><h2>혈전용해효소활성 측정 및 그 안정성</h2><p>혈전용해효소의 활성은 fibrin plate 법을 변형하여 lysed zone으로 측정하였다. fibrin plate는 0.06% fibrinogen (Sigma, USA)을 \(0.01 \mathrm{M}\) PBS buffer (\(\mathrm{pH} 7.25\))에 용해시킨 후 샤레에 \( 10 \mathrm{ml} \)를 분주하고 thrombin (Mochida, Japan) \(20\mathrm{unit}\)를 가하여 균일한 두께의 fibrin clot을 형성시킨 후 실온에서 30분방치 후 혈전용해효소 활성 측정에 사용하였다. 시료 중의 혈전용해효소를 \(0.01 \mathrm{M}\) PBS buffer에 용출시킨 후 여과 (Whatman No. 2)하여 여액을 조효소로 사용하였다. 활성측정은 조효소액 \( 20 \mu \ell \)를 paper disc ( \( \phi 8 \) \(\mathrm{mm}\), Toyo Roshi, Japan)에 흡수시킨 후 제조한 fibrin plate 올려 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4시간 동안 반응 후 생성된 투명한 부위의 직경을 측정하였다. 혈전용해효소의 열안정성을 조사하기 위해 제조한 청국장을 증류수 현탁 (\(1:1\), \(\mathrm{w/v}\))하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 범위의 항온수조에서 30분간 중탕처리 후 잔존하는 혈전용해활성을 측정하여 열안정성을 확인하였다. 또 청국장 중의 혈전용해효소활성에 식염의 영향을 조사하기 위해 발효가 끝난 청국장을 멸균식염수 \( (2 \% \sim 20 \%) \)에 용출 (\(1:4\), \(\mathrm{w/v}\)) 하여 혈전용해활성을 측정하였다.</p>