EMCP의 적정 농도 처리에 따른 U937 세포의 성장억제 정도를 확인하였으며, 이는 apoptosis의 유발과 연관성이 있는 것으로 예상되었다. 따라서 EMCP 처리에 의한 인체 백혈병세포의 증식억제는 apoptosis과 직접적인 연관이 있음을 확인하였다. 추가적으로, apoptosis와 관련된 단백질의 발현을 검증하였으며, 이를 통해 EMCP 처리에 의해 caspase 단백질의 활성이 증가된 것을 확인하였다. 이 결과는 EMCP가 apoptosis 유발에 효과적인 것으로 보여졌다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>EMCP가 U937 세포의 증식에 미치는 영향</h2> <p>EMCP 의 처리에 따른 U937 세포의 성장억제 정도를 알아보기 위하여 적정 농도의 EMCP를 24 시간 동안 처리한 후 MTT assay를 실시하였으며, Fig. 1A 에 나타낸 바와 같이 EMCP 처리 농도 의존적으로 U937의 세포 증식이 억제되었음을 확인하였다. 동일 조건에서 U937 세포의 전체적인 형태변화를 관찰한 결과, EMCP 처리농도가 증가할수록 전체적인 세포의 밀도가 유의적으로 감소함을 알 수 있었으며, membrane blebbing 현상과 같은 apoptosis 유발 시 특이하게 관찰되는 형태적 변형이 관찰되었다. 이러한 결과를 바탕으로 EMCP에 의한 U937 세포 증식억제가 apoptosis의 유발과 관계가 있을 것으로 예상되어 추후 실험을 진행하였다.</p> <h2>EMCP 처리에 의한 apoptosis의 유발</h2> <p>EMCP 의 처리에 의한 U937 세포의 증식 억제가 apoptosis 유발과 관련성이 있는지의 여부를 조사하기 위하여 핵의 형태적 변화와 flow cytometry 분석을 실시하였다. 우선 apoptosis 의 직접적인 증거를 제시하기 위하여 정상 및 EMCP가 처리된 배지에서 24 시간 동안 배양한 U937 세포를 대상으로 핵산에 특이적으로 결합하는 DAPI 염색을 통하여 핵의 형태학적 변화를 관찰하였다. Fig. 2A의 결과에서 알 수 있듯이 정상 조건에서 배양된 세포와는 다르게 EMCP가 처리된 배지에서 배양된 세포에서는 apoptosis가 일어난 세포에서 전형적으로 관찰되는 DNA 단편화에 의한 apoptotic body의 형성이 처리 농도의존적으로 증가되었음을 확인하였다. 다음은 propi-dium iodide (PI) 염색을 통한 세포주기 빈도 변화를 조사하였으며, Fig. 2B에 나타낸 바와 같이 apoptosis 유발 집단에 해당하는 sub-G1기의 세포 빈도가 EMCP 처리 농도 의존적으로 유의적으로 증가하였음을 알 수 있었다. 따라서 EMCP 처리에 의한 인체 백혈병세포의 증식억제는 apoptosis과 직접적인 연관성이 있음을 알 수 있었다.</p> <h2>Apoptosis 유발 단백질의 발현에 미치는 EMCP의 영향</h2> <p>이상의 결과들을 바탕으로 하여 EMCP 처리에 의한 apop-tosis 유발 현상과 연관된 몇 가지 기본적인 기전 해석의 일환으로 apoptosis 유발과 관련된 단백질의 발현을 Western blot-ting으로 확인해 보았다. Bax는 Bcl-2 family에 속하는 유전자 중, 대표적인 pro-apoptotic 유전자로 anti-apoptotic Bcl-2와 dimer를 이루고 있지만, Bax의 발현이 증가 또는 Bcl-2의 상대적인 발현 감소는 mitochondria로부터 cytochrome \( c \) 의 유리를 촉진시켜 종양 억제 유전자인 p53, caspase 및 DNA 단편화와 연관된 endonuclease 등의 활성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. Fig. 3에 나타낸 결과에서와 같이 대조군에 비하여 EMCP 처리군에서는 Bax 의 발현이 EMCP 농도 의존적으로 현저하게 증가되었다. Caspase는 세포의 apoptosis 유발에 핵심적인 역할을 하는 인자로서 불활성 상태로 세포내의 핵과 mitochondria의 외막에 존재하다가 apoptosis를 유도하는 여러 자극에 의하여 활성화된다. 따라서 caspase의 활성화는 apoptosis 유도에 대한 증거로써 많은 선행연구에서 검증되어 왔으며, 본 실험에서 조사된 3가지의 caspase 단백질의 비활성형 발현이 모두 현저하게 감소되어, EMCP 처리에 의해 그들의 활성이 증가되었음을 알 수 있었다. 또한 활성화 된 caspase-3의 대표적인 표적 단백질인 PARP 및 \( \beta \)-catenin의 단편화 및 발현 저하는 EMCP 처리에 의하여 caspase가 활성화되었을 것이라는 추측을 뒷받침하여 주는 결과이다.</p>