알츠하이머 질환 모델생쥐를 매일 같은 위치에서 출발하여 표적에 도달 연습을 시킨 다음, 표적을 없애 동일한 출발 위치에서 표적에 도달하는 수중 미로 검사 실험을 실시하였다. 이때, 실험결과 값으로 60초 이내에 생쥐가 숨겨진 표적을 찾을 경우만 활용하였으며, 실험모델동물의 뇌 조직을 적출하여, 저울로 측정 후 자른 다음, 얼음 속에 재워 둔 다음, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 원심분리기를 이용하여 상층액을 취하여 단백질을 얻었다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 동물</h2><p>이 연구에서 활용한 알츠하이머 질환 모델동물은 식약청 국립독성 연구소 실험 동물 자원실에서 생산된 12개월 된 수컷 pNSE/hAPPsw 알츠하이머 질환 모델생쥐(Tg: \(n=10\))와 동일한 어미의 같은 배에서 출생한 수컷 비형질전환 생쥐(non-Tg: \(n=10\))를 제공받아 활용하였으며 집단은 non-Tg 비교집단 \( (n=5\), \(23.44 \pm 1.20 \mathrm{~g}) \), non-Tg운동집단 \( (n=5\), \(23.82 \pm 1.16 \mathrm{~g}\)), 알츠하이머 질환 모델생쥐(Tg) 비교집단 \((n=5\), \(24.72 \pm 1.40 \)\( \mathrm{g}) \)과 알츠하이머 질환 모델생쥐(Tg) 운동집단 \( (n=5\), \(23.38 \pm 0.28 \mathrm{~g}) \), 4집단으로 구분하였다.</p><h2>운동 프로그램의 구성</h2><p>알츠하이머 질환 모델생쥐(Tg)와 비형질전환생쥐(non-Tg)를 대상으로 rodent 트레드밀(8Lanes, Dae-myung Scientific Co, Ltd, Korea)을 이용하여 지구성 운동을 시키기 위해 1주일 정도 사전적응 훈련(20분 동안 \( 15 \mathrm{~cm} / \mathrm{sec} \), 주 7 일)을 실시하였으며 본 실험에서는 알츠하이머 질환 모델생쥐의 운동 수행능력을 고려하여 Cho 등의 운동 프로그램을 근거로 수정하여 실온 \( \left(22 \sim 4^{\circ} \mathrm{C}\right) \)에서 주 5일 16주간 실시하였다. 운동 프로토콜은 Table 1 과 같다.</p><h2>수중 미로 검사(Water maze test)</h2><p>12개월 된 hAPPsw 알츠하이머 질환 모델생쥐와 동일 연령의 non-Tg 생쥐를 대상으로 인지 능력의 변화를 알아보기 위해 수중 미로 검사를 실시하였다. 수중 미로 검사는 창문과 공기가 잘 통하고 실험 테이블이 준비된 실험실에서 실시하였다. 장비로는 원형수조 (지름 \(150 \mathrm{~cm} \times\) 높이 \(12 \mathrm{~cm} \) )안에 표적(target)이 보이지 않도록 하기 위해 수조 안에 물 \( \left(22 \sim 25^{\circ} \mathrm{C}\right) \)을 받아 전지분유를 풀어 넣어 용해시킨 후 물표면 바로 \( 1 \mathrm{~cm} \) 정도 떨어진 수조바닥에 표적(지름 \( 12 \mathrm{~cm}) \)을 놓는다. 이들 실험모델동물들의 수영거리(escape distance), 수영속도(escape velocity), 수영시간(escape latency)과 수영유형(swimming pattern)을 수조 바로 위 천정에 설치 연결된 컴퓨터 프로그램인 SMART-CS 프로그램(Panlab, Barcelona, Spain)을 활용하여 실험처치 전과 16주 실험처치 후 2회 측정 · 분석하였다. 수중 미로 검사는 각 회씩 주 5일 동안 실시하였으며 매일 같은 위치에서 출발하여 3회씩 동물이 동일한 위치에 놓인 표적에 도달하도록 연습시킨 후 마지막 6일째 표적을 없앤 후 동일한 출발 위치에서 수영을 시작하여 3회 표적에 도달한 결과를 실험결과 값으로 활용하는데 이때, 실험결과 값으로 60 초 이내에 생쥐가 숨겨진 표적을 찾을 경우에만 활용하였다. 각 검사 실시간에 최소한 5분간의 간격을 두었다.</p><h2>뇌 적출</h2><p>실험모델동물은 16주간 실험처지 24시간 후 pentobarbital \( (0.4 \mathrm{mg} / \mathrm{g}) \)을 이용하여 희생시켜 뇌 조직을 적출하여 무게를 측정하고 PBS로 충분히 세척한 후 액화질소에 냉동시켜 분석 시까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)의 초 냉동기에 보관하였다. 뇌 조직은 Western blot 분석을 위해 저울(balance Ly-200, Ymato, Japan)로 측정하여 자른 다음 lysis buffer \( [0.1 \mathrm{M} \ \mathrm{K} \) phosphate/\( 0.5 \mathrm{M}\) EDTA (\( \mathrm{pH} 7.2) \), 냉장보관] \( 1 \mathrm{ml} \)을 넣어 얼음 속에서 조직을 균질화(homogenizer, PYREX \(7725\sim16\), Corning, USA)하였다. 균질화 된 조직은 미리 얼음에 재워 둔 \( 1.5 \mathrm{ml} \) microtube에 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 원심분리기(microcentrifugc VS-15000CF, Vision Scientific Co. Bio-Rad, USA)를 이용하여 \( 15,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 취하여 단백질을 얻었다.</p>