Sprague-Dawley계 웅성흰쥐를 분양 받아 온도, 습도, 명암이 일정한 조건 하에 2주 가량 적응시켜 사육하고, Potassium bromate \( \left ( \mathrm { KBrO } _ { 3 } \right ) \) 를 음료수에 첨가하여 6개월간 섭취케하였다. 마취한 동물에서 복부대동맥에서 혈액을 채취하여 혈청을 분리하고, 간장, 신장 및 폐를 적출하여 생리식염수로 씻은 다음 glass teflon homogenizer로 마쇄하고, 냉장 원심분리기로 원심분리하여 핵 및 미마쇄 부분을 제거한 상징액을 \( 10,000 \times g \)에서 20분간 원심분리하여 얻어진 상징액을 조효소액으로 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>동물 및 처치</h2> <p>실험동물은 (주) bio-Link(충북, 음성)로부터 분양 받아 동물사의 일정한 조건(온도 : \( 20 \pm 2 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 습도 : \( 40 \sim 60 \% \), 명암 : 12시간 light/dark cycle)하에서 2주 가량 충분하게 적응시켜 사육한 체중 100~120 \( \mathrm { g } \)의 Sprague-Dawley계 웅성흰쥐를 사용하였고, 실험 시작 전 24시간 동안 물만 주고 절식하였다. 이때 효소 활성의 일중 변동을 고려하여 실험동물을 일정 시간(오전 10:00~12:00) 내에서 처치하였다. Potassium bromate \( \left ( \mathrm { KBrO } _ { 3 } \right ) \) 를 음료수에 \( 0.1,0.2,0.4 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) 되게 첨가하여 실험동물에 물 대신 임의대로 6개월간 섭취케하였다.</p> <h2>조효소액의 조제</h2> <p>동물을 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) gas로 가볍게 마취시킨 후, 복부 정중선을 따라 개복하고 복부대동맥에서 혈액을 채취하여 혈청을 분리하고, 간장, 신장 및 폐를 적출하여 생리식염수로 씻은 다음, 여지로 간에 남아 있는 혈액 및 기타 이물질을 제거한 후, 각조직 \( 1 \mathrm { ~g } \) 당 4배량의 \( 0.1 \mathrm { M } \) phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } 7.4) \)를 가하여 빙냉상에서 glass teflon homogenizer로 마쇄하였다. 이 마쇄액을 냉장 원심분리기로 \( 600 \times \mathrm { g } \)에서 10분간 원심분리하여 핵 및 미마쇄 부분을 제거한 상징액을 \( 10,000 \times g \)에서 20분간 원심분리하여 얻어진 상징액을 조효소액으로 사용하였다.</p> <h2>\( \gamma \)-Glutamylcysteine synthetase 활성도 측정</h2> <p>\( \gamma \)-Glutamylcysteine synthetase 활성도는 Meister 등의 방법에 의해서 측정하였다. 효소반응액 \( (50 \mathrm { mM } \mathrm { KCl } \), \( 10 \mathrm { mM } \) ATP, \( 5 \mathrm { mM } \) glycin, \( 20 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } _ { 2 } , 2 \mathrm { mM } \) EDTA 및 \( 50 \mathrm { mM } \) L- \( \gamma \)-glutamyl-L- \( \alpha \)-aminobutyrate(GAB)를 함유한 \( 100 \mathrm { mM } \) Tris-HCl buffer( \( \mathrm { pH } ~7.8) \)에 조효소 용액을 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30분간 반응시킨 후, \(10 \% \) 5-sulfosalicylic acid(SSA) \(0.02 \mathrm { ~m } \ell \)를 가하여 반응을 정지시켜 생성된 ADP를 \( 0.5 \mathrm { mM } \) phosphoenolpyruvate, \( 1 \mathrm { unit } \) pyruvate kinase, \( 0.2 \mathrm { mM } \mathrm { NADH } , 50 \mathrm { mM } \mathrm { KCl } \) 및 \( 40 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } _ { 2 } \)를 함유한 \( 250 \mathrm { mM } \) phosphate buffer \( 0.9 \mathrm { ~m } \ell \)를 가하고 LDH \(1 \mathrm { unit } \)를 가하여 \( 340 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 효소활성도는 NADH 흡광계수 \( 6.22 \mathrm { mM } / \mathrm { cm } \)을 이용하여 단위시간당 산화되는 NADH의 \( \mu \mathrm { mol } \) 수로 표시하였다.</p>