본 실험에서는 마우스 간암 세포주인 Hepa-Ic1c7 세포를 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) streptomycin, \( 2 \mathrm { mM } \) L-glutamine, \( 10 \% \) 우태혈청이 포함된 William's E 배지에 \( 37 \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양환경에서 배양하였다. adw-type HBV을 가지는 pAM 6플라스미드는 1.3-eq HBV genome을 만들어 클로닝해 재조합 HBV 발현 벡터를 제조하였다. 재조합 HBV 발현 벡터의 세포내 도입은 lipofectin 방법을 이용했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료 및 세포배양</h2> <p>본 실험에서 사용된 시약들 중 Williams' E 배지와 우태혈청(fetal bovine serum; FBS)은 GIBCO BRL (Gaithersberg, MD, USA)에서 구입하였으며, 그 외의 특별하게 언급하지 않은 시야들은 모두 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 마우스 간암 세포주인 Hepa-Ic1c7 세포는 American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD, USA)에서 구입하였으며, 100 units/ml penicillin, \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) streptomycin, \( 2 \mathrm { mM } \) L-glutamine, 그리고 \( 10 \% \) 우태혈청이 포함된 William's E 배지에서 \( 37 \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에서 배양하였다.</p> <h2>HBV transfection과 infection</h2> <p>야생형 B형 간염 바이러스 게놈 (adw-type HBV)을 가진 pAM 6플라스미드는 ATCC에서 구입하였으며, DNA 염기서열을 확인하여 발견된 2137-nt 부위의 손실된 부난을 site-directed mutagenesis 방법을 이용하여 복원시킨 후, HBV 게놈의 1.3배 길이의 게놈(1.3-eq HBV genome)을 만들어 Invi-trogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입한 pcDNA3 벡터에 클로닝하여 재조합 HBV 발현 벡터를 제조하였다. 재조합 HBV 발현 벡터의 세포내 도입(transfection)은 lipofectin 방법을 이용하여 수행하였다. 기술된 농도의 재조합 HBV 발현 벡터를 lipofectin 용액 20 \( \mu 1 \) 그리고 무혈청 배지 400 \( \mu 1 \)와 섞어 상온에서 2시간 방치한 후, 3.6 \( \mathrm { ml } \)의 무혈청 배지를 가해 희석하였다. 이 혼합물을 30~50 \% confluency의 농도로 60 \(- \mathrm { mm } \)접시에서 배양된 Hepa-1c1c7 세포에 가하여 18시간 동안 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \), 5 \( \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에서 배양한 후, Hank's balanced salt solution(HBSS)로 5회 세척한 다음 \( 10 \% \) 우태혈청을 함유한 Williams'E 배지 4 \( \mathrm { ml } \)을 가하여 배양하였다. \( \mathrm { HBV } \) 감염 실험은 HBV 비리온(virion)을 포함하고 있는 만성 B형 간염환자의 혈청을 이용하여 수행하였다. Hepa-1c1c7 세포를 \( 30 \sim50% \) con-fluency의 농도로 \( 60- \mathrm { mm } \) 접시에서 배양한 후, 무혈청 배지와 주어진 농도의 환자 혈청을 섞어서 6시간 동안 37 \( ^ {\circ } C, 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에서 배양한 후, HBSS로 5회 세척한 다음 ( 10 \% \) 우태혈청을 함유한 Williams' E 배지 4 \( \mathrm { ml } \)을 가하여 배양하였다. 세포내 도입 및 감염 후의 세포와 세포배양 상충액은 기술된 시간 후에 따로 모아서 각각 mRNA와 HBsAg을 검출하는데 사용하였다.</p>