Agro-bacterium EHA105를 이용하여 알팔파 어린 잎을 이용하여 형질전환을 실시하였고, PCR을 이용하여 합성 t-PA유전자 및 t-PA 파생 유전자들의 삽입을 확인하였으며, Total RNAs는 형질전환된 알팔파 잎에서 TRIzol reagent를 이용하여 정제하였고, 증폭된 PCR 산물은 아가로스 젤을 이용한 전기영동 후 관찰하였다.
<h2>알팔파 형질전환</h2> <p>합성 t-PA 및 t-PA 파생 유전자들의 발현벡터를 포함하는 Agro-bacterium EHA105를 이용하여 Austin 등의 방법에 따라 알팔파 어린 잎을 이용하여 형질전환을 실시하였다 (Austin et al. 1995). 형질 전환된 알팔파 어린잎으로부터 체세포배를 통하여 재분화된 어린식물체는 MS 배지에서 배양, 순화 과정을 거친 후, 온실에서 재배 하였다. 형질전환체를 구분하기 위하여 유모에 4 일 간격으로 \( 0.3 \% \) 바스타를 두 번 살포 후 저항성을 갖는 형질전환체를 선별하였다.</p> <h2>Gemonic DNA PCR 및 RT-PCR</h2> <p>알팔파 형질전환체 genomic DNA에 t-PA 및 t-PA 파생 유전자들의 삽입 유무를 확인하기 위하여 바스타 처리 후 생존하는 식물체의 잎에서 genomic DNA를 분리하여 PCR을 이용하여 합성 t-PA유전자 및 t-PA 파생 유전자들의 삽입을 확인하였다. PCR 조건은\( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 전처리 후 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 분간 30 회 반복한 다음 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 7 분간 연장 (extension)하였다. p221a-t-PA, p221a-t-PAER, p221a-t-PAHis 6 , p221a-rbc-t-PA에 의해 형질전환된 알팔파에서는 정방향 프라이머로 (5'-TCTTACCAAGTGATCTGCAGAG-3')와 역방향 프라이머로 (5'-TCACGGTCGCATGTTGTCACG-3')를 사용하였고, p221a-st-PA, p221a-rbc-st-PA에 의해 형질전환된 알팔파에서는 정방향 프라이머로 (5'-TCCTACCAAGTCATATGTCGAGA-3')와 역방향 프라이머로 (5'-TT-AAGGA CGCATATTGTCACGTAT-3')를 사용하였다.</p> <p>Total RNAs는 형질전환된 알팔파 잎 \( (200 \mathrm{mg}) \) 에서 제조회사의 방법에 따라 TRIzol reagent를 이용하여 정제하였다 (Invitrogen, Breda, Netherlands). Reverse transcription (RT)-PCR 분석을 하기위해서, total RNA 는 DNase 처리 후 다음과 같이 RT-PCR을 실행하였다. 반응물은 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 30 \mathrm{~min} \) 반응 후 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 분간 reverse transcriptase의 활성을 억제 하였다. 그런 후 RT 반응물을 이용하여 PCR 반응을 다음과 같은 조건으로 실행하였다. \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초, 그리고 \( 72^{\circ} \mathrm{C} 2 \) 분간 30 회 실행하였다. 반응 후 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 1 회 실행하여 반응을 완결하였다. 증폭하기 위해서 사용된 프라이머는 PCR에서 이용된 것을 사용하였다. 증폭된 PCR 산물은 \( 1 \% \) 아가로스 젤을 이용한 전기영동 후 관찰하였다.</p>