본 논문에서 정제한 P. aeruginosa 탈아세틸화 알긴산 NMR 스펙트럼을 조사한 결과, 해조류에서 유래한 polyM-block의 NMR 스펙트럼과 유사하였다. 이를 통해 아세틸기가 결합한 mannuronan으로부터 P. aeruginosa 탈아세틸화 알긴산이 유래한 것으로 판단되었다. 또한 이를 바이오연료로 응용하기 위해서는 acetylxylan을 먼저 xylan acetylesterase로 분해해야 하며, 병원성균 P. aeruginosa가 분비하는 아세틸 알긴산도 아세틸기를 제거한 이후 알긴산 분해효소를 처리해야 효율적으로 분해할 수 있다는 것을 확인하였다.
<h2>정제한 P. aenuginosa ATCC 39324 아세틸알긴산의 \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \)-NMR 분석</h2> <p>P. aeruginosa로부터 정제한 아세틸알긴산은 \( 400 \mathrm { kDa } \) 정도의 높은 분자량을 가지며 Fig. 1B와 같이 아세틸기를 가지고 있어 점성이 아주 높다. Fig. 2A는 고분자 아세틸알긴산의 NMR 스펙트럼으로 \( 2.2 \mathrm { ppm } \) 정도에서 아세틸기를 확인할 수 있었으나 점성이 높아 구성성분인 mannuronate에 의한 signal은 구별할 수가 없었다. 점성을 낮추고 NMR의 해상도를 높이기 위하여 산가수분해를 행한 결과 Fig. 2B와 같이 mannuronate의 \( \mathrm { C } \)-1에 결합된 proton signal ( \( \mathrm { M } \)-1, \( 4.8 \text { - } 4.6 \mathrm { ppm } \)), mannuronate의 \( \mathrm { O } \)-아세틸기(- \( \mathrm { OCOCH_3 } \))가 결합된 \( \mathrm { C } \)-2와 \( \mathrm { C } \)-3의 proton signal ( \( \mathrm { M } \)-2' 및 \( \mathrm { M } \)-3')을 확인할 수 있었으며 \( 2.2 \mathrm { ppm } \)에서 아세틸기도 확인할 수 있었다. ATCC39324 아세틸 알긴산으로부터 알칼리 가수분해를 행하여 얻은 탈아세틸 알긴산의 NMR 스펙트럼은 Fig. 2C와 같이 \( \mathrm { O } \)-2 및 \( \mathrm { O } \)-3 에 결합되어 있던 아세틸기가 제거되어 \( \mathrm { M } \)-2' 및 \( \mathrm { M } \)-3' peak가 없어지고 \( 2.2 \mathrm { ppm } \)에서 보이던 아세틸기도 나타나지 않았다. 또한 P. aeruginosa 탈아세틸화 알긴산은 Fig. 2D에 보이는 해조류 유래 polyM-block의 NMR 스펙트럼과 유사하였으며 이로 부터 P. aeruginosa ATCC 39324유래 알긴산은 아세틸기가 결합한 mannuronan임을 알 수 있었다. 알긴산을 생성하는 또 다른 박테리아인 A. vinelandif는 P. aeruginosa와는 달리 guluronate가 \(67 \text { - } 93 \% \) 함유되어 있고 아세틸기는 mannuronate에만 결합되어 있다고 하였다.</p> <h2>MJ-3 AcAlgE와 KS-408 lyase에 의한 아세틸알긴산의 분해</h2> <p>본 실험실에서는 Sphingomonas sp. MJ-3 균주의 genomic DNA library로부터 알긴산 오페론 유전자를 분리하였으며 염기서열을 분석한 결과 아세틸자일란 가수분해효소(acetylxy-lan esterase)와 상동성을 가지는 유전자가 포함되어 있었고 이 유전자로부터 발현된 효소(AcAlgE)는 실험결과 4-methylumbelliferyl acetate를 가수분해하는 esterase 활성을 가지며 아세틸알긴산의 아세틸기를 가수분해하는 효소활성이 있음을 보고한 바 있다. AcAlgE의 활성을 측정하기 위하여 기질은 고분자 아세틸알긴산과 저분자 아세틸알긴산을 사용하였으며 효소액은 MJ-3 AcAlgE와 KS-408 알긴산 분해효소 유전자를 과발현 시킨 대장균의 lysozyme 균질액을 사용하였다. Fig. 3에서와 같이 고분자 아세틸알긴산은 점성이 너무 높아 효소의 접근성이 떨어져 D-mannuronate 와 D-mannuronate의 \( \beta \)(1-4) 결합을 분해하는 KS-408 알긴산 분해효소만 처리하였을 때(KS-408 only) 불포화 oligouronate의 생성이 낮은 것에 비해 산가수분해로 얻은 저분자 아세틸알긴산은 KS-408 알긴산 분해효소에 의해 2.6배의 불포화 oligouronate가 생성되었다. KS-408 알긴산 분해효소는 아세틸기가 결합되지 않은 \( \mathrm { M } \text { - } \mathrm { M } \) 결합을 분해하므로 아세틸기가 결합되어 있는 Ac \( \mathrm { M } \)-Ac \( \mathrm { M } \)은 분해하지 못한다. 먼저 MJ-3 AcAlgE 효소로 아세틸알긴산의 아세틸기를 제거한 다음 KS-408 알긴산 분해효소로 10분 동안 반응시켰을 경우(AcAlgE + KS-408) KS-408분해효소만 처리하였을 때 보다 알긴산의 분해가 잘 되었음을 알 수 있었다. 또한 고분자 아세틸알긴산은 점성이 높아 저분자 아세틸알긴산보다 AcAlgE에 의한 아세틸기 제거가 쉽지 않고 따라서 이후의 KS-408 첨가 결과 불포화 oligouronate의 생성도 낮은 것을 알 수 있었다. 과일의 pectin이나 식물의 세포벽 구성성분인 xylan 등은 acetylgalacturonan methylester 또는 acetylxylan 등으로 되어있다. Biely 등은 acetylxylan을 xylanase로 완전히 분해할 수 없어 바이오연료로 응용하기 위해서는 먼저 xylan acetylesterase로 분해하여 당분해효소(xylan 분해효소)의 효율을 높일 수 있다고 하였다. 또한 과일에 병을 일으키는 균들이 pectin을 에너지원으로 사용하기 위하여 pectin acetylesterase, pectin methylesterase, galacturonan lyase 등을 가지고 있다고 하였다. Acetylxylan을 효율적으로 분해하기 위하여 xylan 아세틸기 가수분해효소를 처리하는 것과 같이 병원성균 P. aeruginosa가 분비하는 아세틸 알긴산도 먼저 아세틸기를 제거한 다음 알긴산 분해효소를 처리하였을 때 효율적으로 분해되었음을 알 수 있었다.</p>