대장암 세포주 HCT116 세포주에서 sulforaphane 처리가 세포 성장에 주는 효과가 무엇인지 연구하기 위해 cell viability assay를 수행했다. 세포 수확 후 RIPA 용액을 첨가하여 sonication을 한 후총 단백질을 분리하여 Western blot하였다.수확한 세포주로부터 total RNA 추출 후 제조사의 메뉴얼을 참고하여 cDNA를 제조하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포주 및 파이토케미칼</h2> <p>대장암 세포주 HCT116 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)에서 구입하였고, p53 null인 HCT116세포주는 Johns Hopkins 의과대학의 Bert Vogelstein 박사로부터 분양 받았다. 세포주 배양은 10\% FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco-BRL, USA), 1\% penicillin 및 streptomy-cin이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco-BRL, USA)을 사용하였다. 파이토케미칼과 대조구로 사용된 DMSO (Dimethyl sulfoxide)는 Sigma사(USA)로부터 구입하여 사용하였다.</p> <h2>Cell viability assay</h2> <p>대장암 세포주 HCT116세포주에서 sulforaphane 처리가 세포 성장에 미치는 영향을 연구하기 위해 cell viability assay를 수행하였다. 먼저 96 well plate에 well당 \( 3 \times 10^{3} \) 개의 세포를 접종하고 24 시간 동안 배양한 후, sulforaphane을 \( 10,20,30 \) \( \mu \mathrm{M} \) 의 농도로 처리하였다. 24 시간 처리 후 MTS 용액 (Promega, USA)을 각 well 당 20 ㅆl씩 첨가하고 세포 배양기에서 4 시간 동안 반응시켰다. 이후 과정은 이전에 보고된 내용과 동일하게 수행하였다.</p> <h2>Western blot analysis</h2> <p>수확한 세포는 RIPA 용액을 첨가하여 sonication을 한 후총 단백질을 분리하였다. 단백질 정량은 Bradford protein assay 용액(Bio-Rad, USA)을 사용하여 측정하였다. 총 \( 30 \mu \mathrm{g} \) 의 단백질을 취하여 \( 4 \sim 12 \% \) acrylamide gel (Invitrogen, USA)에서 전기영동 한 후, nitrocellulose membrane (Invitrogen, USA)으로 electroblotting 하였다. 이후 Western blot 과정은 이전 보고된 방법과 동일하게 수행하였다. 본 실험에서 사용된 1차 항체로는 anti-NAG1, anti-p21, an-ti-ATF3 그리고 anti-ACTIN 항체가 사용되었고, 2차 항체로는 horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit anti-body, horseradish peroxidase-conjugated donkey anti-goat 항체를 사용하였다. Anti-NAG-1 항체를 제외한 1 차 항체는 Santa Cruz사(USA)로부터 구입하였고, 2차 항체는 Cell Signal사(USA)로부터 구입하였다. NAG-1 항체는 이전에 보고된 것을 사용하였다.</p> <h2>정량적 real-time PCR</h2> <p>수확한 세포주로부터 total RNA 추출한 다음, total RNA \( 2 \mu \mathrm{g} \) 을 주형으로, Bio-Rad사(USA)의 iScript cDNA 합성 kit를 이용하여 제조사의 메뉴얼에 따라 cDNA를 제조하였다. 합성된 cDNA \( 20 \mu 11 \) 에 증류수 40 씨를 첨가하여 희석한 후, re-al-time PCR의 주형으로 사용하였다. PCR mixture는 Power SYBR \( ^{\circledR} \) Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA)를 사용하였으며, 반응 조건은 첫 번째 step으로 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 분, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 반응시키고, 두 번째 step으로 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15 초, \( 54^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 33초의 cycle을 40 번 반복하여 수행하였다. 결과는 Microsoft Excel을 이용하여 분석, 정량하였으며, 분석법으로는 comparative \( \mathrm{Ct} \) (threshold cycle) 방법을 이용하였다.</p>