본 논문은 Eye-specific LDH \( C_{4} \) 동위효소의 정제 정도와 분자량 측정은 SDS-PAGE로 이루어졌으며 \( 12.5 \% \mathrm{~T}\), \(2.67 \% \mathrm{C} \) acrylamide separation gel과 \( 5 \% \mathrm{~T}, 2.67 \% \mathrm{C} \) acrylamide stacking gel이 되도록 slab gel을 만들어 전기영동을 진행하였다. 이 동위효소의 최적 \( \mathrm{pH} \) 측정을 위해 LDH 활성을 구하였고, 동위효소의 기질의존성을 측정하고자 최대 활성을 기준으로 상대적 활성\((\%)\)을 구해 최적 \( \mathrm{pH} \)를 확인하였고, Eye-specific LDH \( C_{4} \) 동위효소의 최적 \( \mathrm{pH} \)를 구하였다.
<h2>SDS-polyacrylamide gel 전기영동(SDS-PAGE) 및 분자량 측정</h2> <p>Eye-specific LDH \( C_{4} \) 동위효소의 정제정도와 분자량의 측정은 SDS-PAGE로 이루어졌다. 전기영동은 Laemmli의 방법에 따라 \( 12.5 \% \mathrm{~T}\), \(2.67 \% \mathrm{C} \) acrylamide separation gel과 \( 5 \% \mathrm{~T}, 2.67 \% \mathrm{C} \) acrylamide stacking gel이 되도록 slab gel을 만들었다. 시료와 \( 0.06 \mathrm{M} \) Tris- \( \mathrm{HCl}\) \((\mathrm{pH} \) 6.8), \( 25 \% \) glycerol, \( 2 \% \) SDS, \( 5 \% \) 2-mercaptoethanol, \( 0.1 \% \mathrm{BPB} \) 용액을 4:1(v/v)로 섞어 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 가열한 후 1 초 정도 원심분리 한 다음 상등액을 전기영동 시료로 사용하였다. 전기영동은 \( 0.1 \% \mathrm{SDS} \)를 포함하는 \( 0.025 \mathrm{M} \) Tris-glycine buffer \( (\mathrm{pH} \) 8.3)를 사용하여 \( 44^{\circ} \mathrm{C}\), \( 100 \mathrm{~V} \)에서 2시간 동안 실시하였다. 단백질 염색은 \( 45 \% \) 메탄올과 \( 10 \% \) 초산에 녹인 \( 0.1 \% \) Coomassie brilliant blue R-250에서 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 10 \)분간 염색한 후 \( 10 \% \) 메탄올, \( 10 \% \) 초산용액에서 탈색시켰다. 분자량 측정 시 표준 단백질로는 bovine se-rum albumin (MW 66,000), ovalbumin (MW 45,000), glycer-aldehyde-3-phosphate dehydrogenase (MW 36,000), cabonic anhydrase (MW 29,000), trypsinogen (MW 24,000), trypsin inhibitor (MW 20,000) 및 a-lactalbumin (MW 14,200)을 사용하였다.</p> <h2>Eye-specific LDH \( C_{4} \) 동위효소의 최적 \( \mathrm{pH} \) 측정</h2> <p>정제된 eye-specific LDH \( C_{4} \) 동위효소는 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium ace-tate buffer \( (\mathrm{pH} 4.0,4.5,5.0), 0.1 \mathrm{M} \) sodium citrate buffer \( (\mathrm{pH}  5.5)\), \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 6.0,6.5,7.0), 0.1 \) M Tris-HCl buffer \((\mathrm{pH} 7.5, 8.0, 8.5)\), \( 0.1 \) M Tris-glycine buffer \( \mathrm{pH} 9.0\)  및 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium carbonate buffer \( (\mathrm{pH} 9.5, 10.0, 10.5)\) 에서 LDH 활성을 측정하였고 최대 활성을 기준으로 상대적 활성\((\%)\)을 구하였으며 최적 \( \mathrm{pH} \)를 확인하였다.</p> <h2>Eye-specific LDH \( C_{4} \) 동위효소의 기질의존성 측정</h2> <p>Eye-specific LDH \( C_{4} \)동위효소의 기질 농도에 의한 효소활성 저해정도를 알아보기 위해 피루브산 농도를 \( 100 \mu \mathrm{M} \)에서 \( 10 \mathrm{mM} \)까지 증가시키면서 활성의 변화를 측정하였다. \( K_{\mathrm{m}}{ }^{\text {PYR }} \) 값은 피루브산 농도 \( 10 \mu \mathrm{M} \)에서 \( 80 \mu \mathrm{M} \)까지 LDH 활성을 측정 한 후 Lineweaver-Burk plot을 이용하여 구하였다.</p>