가정에서 제조된 식초와 감, 사과, 감귤, 포도 등의 과일을 BC 생산균주를 분리하기 위한 시료로 사용하였고 HS 배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양함으로써 막 형태의 BC 생성 유무를 관찰하였다. 또한 농도가 다른 \( \mathrm{AgNO}_{3} \)가 함유된 HS 배지에 접종하여 배양함으로써 BC 생산이 가능한 \( \mathrm{AgNO}_{3} \)의 농도를 확인하였다. 실험에 사용된 HS 배지는 glucos, peptone, yeast extract 등으로 구성되었다. BC의 구조적 특성 조사를 위하여 동결건조된 BC 를 금으로 코팅한 후 주사전자현미경을 이용하여 3차원적 미세구조를 관찰하였다. 또한 실험균주에 의한 은 나노입자 합성을 확인하기 위하여 \( 0.1 \mathrm{mM} \) 의 \( \mathrm{AgNO}_{3} \) 가 함유된 최적배지에 실험균주를 접종하여 배양하면서 배양액의 색깔변화를 관찰하는 방법을 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험균주의 분리 및 동정</h2> <p>가정에서 전통적인 방법에 의하여 제조된 식초와 감, 사과, 감귤, 포도 등의 과일을 BC 생산균주를 분리하기 위한 시료로 사용하였다. 각 시료를 HS 배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하면서 막(membrane) 형태의 BC 생성 유무를 관찰하였다. 생성된 BC 를 생리식염수에 넣어 강하게 교반한 후, 현탁액을 HS 평판배지( \( 0.0022 \% \) bromocresol green 함유)에 접종하여 배양하면서 배지의 색깔을 녹색에서 노란색으로 변화시키는 집락을 BC 생산균주로 선정하였다. 이 균주들을 대상으로 다양한 농도의 \( \mathrm{AgNO}_{3} \) 가 함유된 HS 배지에 접종하여 배양함으로써 BC 생산이 가능한 \( \mathrm{AgNO}_{3} \) 의 농도를 확인하였다. 실험에 사용된 HS 배지의 조성은 glucose \( 2 \% \), yeast extract \( 0.5 \% \), polypeptone \( 0.5 \%, \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot 12 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) \( 0.675 \% \) 및 citric acid monohydrate \( 0.115 \%(\mathrm{pH} 6 \) )이었다. 분리균주를 동정하기 위하여 \( 16 \mathrm{~S} \) rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다. \( 16 \mathrm{~S} \mathrm{rRNA} \) 유전자를 증폭하기 위하여 사용된 primers는 27F (5'-AGAGTTTGATCM TGGCTCAG-3') primer와 1492R (5'-TACGGY TACCTTGTTACGACTT-3') primer이었다. 16S rRNA 유전자의 염기서열을 결정한 후, GenBank DB의 유사균주들과 비교하였으며, Clustal X (version 1.81) program package를 이용하여 염기서열을 정 렬한 후, neighbor-joining method에 의거하여 분리균주의 계통분류학적 위치를 확인하였다.</p> <h2>BC 생산 조건 조사</h2> <p>BC 생산에 영향을 미치는 배지성분을 조사하기 위하여 탄소원, 질소원 및 보조탄소원에 따른 BC 생산량을 조사하였다. 전배양은 HS 평판배지에서 계대배양 후, 냉장보관 중인 실험균주를 한 백금이(one loop) 취하여 \( 50 \mathrm{ml} \) 의 HS 배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4 일동안 정치배양하였다. 생성된 BC 로 부터 세포를 유리시키기 위하여 5 분간 강하게 진탕한 후, 멸균된 거즈로 여과하여 세균 현탁액을 조제하였다. 이 세균 현탁액 \( 5 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 를 상기에서 보는 바와 같은 배양변수들이 각각 조절된 HS 배지 \( 50 \mathrm{ml} \) 에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 7 일간 정치배양하였다.</p> <h2>BC 의 구조적 특성 조사</h2> <p>동결건조된 BC 를 금으로 코팅한 후, 주사전자현미경 (JEOL JSM-6390, JEOL TECHNIC Ltd., Japan)을 이용하여 3차원적 미세구조를 관찰하였다. BC 의 화학적 구조를 조사하기 위하여 FT-IR spectrophotometer (IRAffinity-1, Shimadzu Corp., USA)를 이용하여 \( 400-4000 \mathrm{~cm}^{-1} \) 에서 측정하였다. BC 의 결정 구조는 X-ray Diffractometer (Rigaku III, Rigaku Corp., Japan)를 이용하여 측정하였다. 즉 BC 를 \( 40 \mathrm{kV} \), \( 30 \mathrm{~mA} \) 조건에서 \( \mathrm{Cu} \mathrm{K} \alpha \) radiation에 의한 반사식 측정법으로 \( 2 \theta=5^{\circ}-40^{\circ} \), scan speed는 \( 10 \% \mathrm{min} \) 로 측정하였다. 결정화지수(crystallite index)는 \( \left[\left(\mathrm{I}_{002}-\mathrm{I}_{\mathrm{am}}\right) / \mathrm{I}_{002}\right] \times 100 \) 에 의하여 산출하였다. 여기서 \( \mathrm{I}_{002} \) 는 \( 2 \theta=22.6^{\circ} \) 에서 (002)면에 상응하는 회절 peak의 최대 강도(intensity)이며, \( \mathrm{I}_{\mathrm{am}} \) 은 \( 2 \theta=18^{\circ} \) 에서 회절 강도이다.</p> <h2>실험균주에 의한 은 나노입자 합성 확인</h2> <p>\( 0.1 \mathrm{mM} \) 의 \( \mathrm{AgNO}_{3} \) 가 함유된 최적배지에 실험균주를 접종하여 배양하면서 배양액의 색깔변화를 관찰하였다. 7 일동안 배양한 후, 배양액을 원심분리 \( (9,200 \times g, 5 \) 분)하여 회수된 상등액의 은 나노입자 합성 유무를 조사하였다. 이때, 은 나노 입자 고유의 색깔 발현과 고유 흡수파장을 조사하여 은 나노입자의 합성을 확인하였다. 또한, BC 막에 은 나노입자가 생성되었는지를 주사전사현미경을 통하여 관찰하였다.</p> <h2>분석방법</h2> <p>배양액 내에 생성된 BC를 거즈를 이용하여 여과하여 회수한 후, 배양액 성분을 제거하기 위하여 수돗물로 세척하였다. 세척된 BC 를 \( 0.5 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} 200 \mathrm{ml} \) 에 넣어 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에 서 1 시간 30 분 동안 가열하여 세포를 용해시킨 후, \( 0.5 \mathrm{~N} \) \( \mathrm{HCl} \) 을 이용하여 중성이 될 때까지 중화시켰다. 최종적으로 회수된 BC 를 \( 105^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 항량이 될 때까지 건조한 후, 데시 케이터에서 방냉하여 건조중량을 측정하였다.<p>