조다당의 pronase 처리는 조다당 30 mg 을 10mM CaCl 가 함유된 50 mM tris-HCl buffer(pH 7.9) 50 ml 에 용해시킨 후 10 mg 의 pronase 를 가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 48 시간 동안 반응시킨 후, 5 분간 가열하여 효소를 불활성화하고, 반응액을 원심분리하여 불용성 침전을 제거하고 상등액을 투석, 동결건조하여 조다당의 pronase 분해물을 얻었다.
<h3>조다당의 pronase 처리</h3> <p>조다당 30 mg 을 10mM CaCl 가 함유된 50 mM tris-HCl buffer(pH 7.9) 50 ml 에 용해시킨 후 10 mg 의 pronase 를 가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 48 시간 동안 반웅시켰다. 5 분간 가열하여 효소를 불활성화한 후 반응액을 원심분리하여 불용성 침전을 제거하고 상등액을 투석, 동결건조하여 조다당의 pronase 분해물을 얻었다.</p> <h3>조다당의 과요오드산 산화</h3> <p>조다당 30 mg 을 50 mM acetate buffer(pH 4.5) 50 ml 에 용해시킨 후 50mM sodium periodate를 가하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 암소에서 3 일간 교반, 방치하였다. 이 반응액에 ethylene glycol 5 ml 을 가하여 잔존 과요오드산을 제거하고 1 시간 동안 실 온에서 방치한 후 3일간 투석하여 얻은 투석내액을 약 10 ml 정도로 농축하였다. 이 농축액에 sodium borohydride 를 20 mg 가하고 실온에서 12 시간 교반하여 환원시킨 후 0.1 M acetic acid로 중화하고 methanol 첨가와 증발을 반복하여 잔존 boric acid를 제거하였으며 투석 후 비투석획분을 동결건조하여 조다당의 산화물을 조제하였다.</p> <h3>보체계 활성화 경로 파악</h3> <p>조다당의 보체계 활성경로를 파악하기 위해 GVB \( ^ { 2 + } \), Ca \( ^ { 2 + } \) 이온을 제거한 Mg \( ^ { 2 + } \)-EGTA-GVB \( { } ^ { 2 } \)를 사용한 경우와 2가 금속이온을 모두 제거한 10 mM EDTA-GVB \( { } ^ { 2 } \) 에서의 항보체 활성을 비교하였다.</p> <h3>교차 면역전기영동</h3> <p>GVB \( ^ { 2 + } \)buffer, 10 mM EDTA 및 1% gelatin을 함유한 veronal buffer (EDTA-GVB \( { } ^ { 2 } \) ) 및 Mg \( ^ { 2 + } \)-EGTA-GVB \( { } ^ { 2 . } \) buffer에 각각 희석된 시료액과 정상인의 혈청을 혼합하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30 분간 반웅시킨 후 barbital buffer(pH 8.6)에 용해한 1% agarose 상에서 2시간 동안 1차원 전기영동을 하고0.5% goat anti-human C3 serum이 함유된 1% agarose 상에서 2차원 전기영동 (15 mA/plate, 15 시간) 을 행하였다. 전기영동 후 gel은 고정 및 탈 단백과정과 bromophenol blue로 염색하여 C3의 분해산물을 관찰하였다.</p>