Mycobacterium 속은 인간 및 동물에 병원성을 나타내는 다양한 종을 포함하고 있으며, 이로 인해 중요한 의학적 의미를 지니고 있다. 그러나, 느린 세대기간과 세포벽의 높은 지질함량으로 인한 낮은 형질전환 효율 등의 문제가 실험에 어려움을 주고 있다. 이런 문제를 해결하기 위해 돌연변이 제작 과정에서 temperature-sensitive replication origin (TSRO) 및 Bacillus subtilis의 sacB 유전자를 활용한 벡터를 사용하는 방안이 제시되었다. 본 연구에서는 lacZ 유전자를 이용한 벡터 구축 및 유전자 발현 조사를 위한 chromosomal DNA 삽입 과정에 대해 설명하였다.
<h1>서 론</h1> <p>Mycobacterium 속(genus)은 동물과 인간에 병원성을 나타내는 다수의 종을 포함하고 있어 의학적으로 중요한 의미를 지닌다. 대표적인 인체 병원균인 Mycobacterium tuberculosis는 결핵을 일으키는 종으로, 전 세계 약 3분의 1 정도의 인구수가 이 병원균에 감염되어 있다고 추정되고 있다. 따라서 Mycobacterium 속에 대한 병인학적 연구와 세균 종 자체에 대한 기초과학적 연구의 필요성이 대두되어왔으며, 현재까지도 여전히 중요하게 거론되고 있다. 이러한 연구의 필요성은 Mycolacterium 속에 대한 분자생물학적 연구 기법과 유전학적 연구 수단에 대한 다양화를 촉진하였으며, 그 결과 지난 십수년 간 많은 발전이 있었다. 그러나 실험 수행 시, 이들의 느린 세대기간(generation time 혹은 doubling time)으로 인한 큰 시간적 소모와 세포벽의 높은 지질함량으로 인한 낮은 형질전환 효율 등의 여러 가지 실험상 문제가 야기되었다. 따라서 mycobacteria는 다른 세균 종에 적용되는 일반적 실험기법보다는 이들 특성에 맞게 고안된 실험기법과 수단이 필요하다. 세균의 생리학적 특성을 밝히는데 있어 mutagenesis는 가장 유용한 실험 기법으로 활용된다. Mycobacteria에서도 역시 생리학적 특성과 병원성 기작을 연구하는데 있어서 효과적인 mutagenesis 방법이 요구된다. 유전자의 knockout이나 교체는 suicide vector를 사용하는 방법, mycobacter-iophage에 의해 매개되는 방법, incompatible plasmid를 이용하는 방법 등으로 수행된다. 최근, 여러 연구에서 ho-mologous recombination 기반의 유전자 교환을 통해 M. tu-berculosis와 Mycabacterium bovis BCG의 돌연변이를 제작한 사례가 보고되었다. Mycobacteria의 돌연변이 제작과정 중에서도 특히, 낮은 homologous recombination 확률과 형질전환율을 극복하는 것이 가장 중요한 쟁점으로 대두되었으며, 이를 극복하기 위한 방법의 일환으로 temperature- sensi-tive replication origin (TSRO) 과 Bacillus subtilis의 sacB 유전자를 가진 vector를 이용하여 돌연변이를 구축하는 방법이 제시되었다. 이 체계는 두 단계로 이루어지는데, 온도 조건에 따라 vector의 복제여부를 조절함으로써 DNA의 세균 내로의 도입을 증가시켜 유전자 교환이 일어날 확률을 증가시키고, mycobacteria에서 sucrose 존재 시 독성을 나타내는 sacB 유전자 산물을 counterselectable marker로 사용하여 double-crossover의 결과로 형성된 돌연변이 균주에 대한 후보군을 쉽게 선별하도록 하였다. 따라서 본 연구에서는 기존의 suicide vector로 알려진 pKO vector에 TSRO를 삽입함으로써 온도 조건에 따라 vector의 복제가 조절이 가능한 pKOTs를 구축하였다.</p> <p>Mycobacteriophage L5는 mycobacteria에 감염하는 lyso-genic phage로 Mycobacterium smegmatis의 chromosomal DNA의 attB (bacterial attachment site)에 single-copy로 삽입된다. L5가 가지는 integrase는 attP (phage attachment site)와 attB 사이의 site-specific recombination을 촉매하며, 그 결과로써 phage DNA의 삽입이 일어나게 된다. 이러한 삽입 과정은 integrase와 attP site 이외의 다른 phage 유전자들이 존재하지 않아도 충분히 유도된다는 것이 이미 알려져 있으며, 숙주가 가지는 host-factor인 mIHF (mycobacterial IHF)에 의해 조절된다. Mycobacteriophage DNA를 Escherichia coli cosmid로 삽입한 recombinant shuttle vector의 경우 E. coli에서는 plasmid로서 복제되지만 mycobacteria에서는 phage로서 기능을 하여 chromosomal DNA로 삽입된다고 보고되어 있다. 이러한 원리로 L5의 attP site와 integrase 유전자를 포함하는 vector들은 M. smegmatis와 M. tuberculosis 등의 chromosomal DNA로 삽입된다. Promoter가 존재하지 않는 reporter 유전자들은 transcriptional fusion을 통하여 세균들의 유전자 발현 조절 연구에 이용되어 왔고, cat, gfp, lacZ, FFlux, phoA, xylE 등은 mycobacteria에서 작용한다고 알려진 reporter 유전자들이다. 본 연구에서는 이러한 reporter 유전자 중 lacZ 유전자를 L5의 integrase와 attP site를 가지는 삽입 vector인 pMV306에 cloning하여 pMV306lacZ vector를 구축하였다. 이를 이용해 조사하고자 하는 유전자를 lacZ 유전자와 transcriptional fusion시켜 이를 chromosomal DNA로 삽입시키는 과정을 통해 쉽게 유전자 발현 조절의 조사가 이루어질 수 있도록 하였다.</p>