본 실험에 사용된 실험동물은 수컷 7주령의 SPF NCNga mouse로 실험 당일까지 고형사료와 물을 충분히 공급하고 온도 \( 22 \pm 2 \mathrm{C} \), 습도 \( 55 \pm 15 \%, 12 \) light-dark cycle의 환경에서 1주간 적응시킨 후 인비트로 실험을 위해 conventional 한 조건에서 18주령까지 사육했했다. PGA-HM을 결정화 시켜 사용했으며, 세포독성 측정을 위해 사람피부조직을 coolD-PBS로 3회 세척한 후 작은 조각으로 절단하여 Human fibroblast cells을 채취 및 배양한 후 사용했다. 다음으로 T세포와 B세포의 분리와 배양을 위해서 18주령의 NC/Nga 생쥐의 눈에서 capillary 관을 이용하여 IgE 함량이 50 \(\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml}\) 이상이고 아토피 피부발진이 나타난 NC/Nga 생쥐를 선택하여 실험에 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>실험에 사용된 동물은 수컷 7주령의 SPF(Specific Patho-gen-free) NCNga mouse(15 20g)른 Charles River Japan (Yokhama, Japan)사에서 공급받았다. 실험 당일까지 고형사료(항생제 무첨가, 삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고 온도 \( 22 \pm 2 \mathrm{C} \), 습도 \( 55 \pm 15 \%, 12 \) 시간(light-dark cycle)의 환경에서 1주간 적응시킨 후 in vitro 실험을 위하여 conven-tional한 조건에서 18주령까지 사육하였다. γ-PGA는 바이웰에서 구입하였으며 평균 분자량은 \( 300 \mathrm{kDa} \) 이다.</p> <h2>저분자 γ-PGA (PGA-LM)의 제조</h2> <p>증류수(Distilled water) 에 PGA-HM을 10%(w/v)가 되도록 녹여 sonicator(Branson사)에 60분간 high level(40 khz)로 sonication하여 분자량 30 kDa 이하 분리 가능한 밀리포어필터로 여과하여 여과액을 deep freezer에서 24 hr 동안 냉동시킨 후 freeze dryer(Ilshin사)에 넣어 3~4일 동결건조하고 결정화시켜 사용하였다.</p> <h2>시약</h2> <p>본 실험에 사용된 시약은 diethyl pyrocarbonate(DEPC),chloroform, trichloroacetic acid, isopropanol, Tris-HCl, KCl,MgCl2, 적혈구 용혈액(ACK lysis solution), DMEM 배양액,dulbecco's phosphate buffered saline(D-PBS), SulforhodaminB(SRB), 2-isopropanol, sodium dodecyl sulfate(SDS), PMA,ionomycin, FK506, antibiotics는 Sigma사(U.S.A.) 제품을 사용하였으며, 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 은 Hyclone사(Logan, U.S.A.) 제품을, anti-CD3-PE(phycoerythrin),anti-CD4-FITC(fluorescein isothiocyanate), anti-CCR3-PE,anti-B220-PE, anti-CD8-FITC, anti-B220-FITC, anti-CD49b-FITC, anti-CD40 mAb, rmIL-4, rmIL-10, BD Cytofix/Cyto-perm plus kit, anti-CD3 mAb, anti-foxp3-PE, anti-IFN-γ-PE, anti-CD28 mAb 등은 Pharmingen사(Torreyana, U.S.A.)제품을, CD4+ T cell isolation kit 와 B cell isolation kit 는Miltenyi Biotec사(Bergisch Gladbach, Germany) 제품을, IL-4, IFN-γ, IL-5, IL-13 ELISA kit는 BioSource사(California,U.S.A.) 제품을, IgE, IgG1 ELISA kit는 SHIBAYAGI사(Shibukawa, Japan) 제품을, anti-mouse CCR3 mAb 와anti-mouse CD4 mAb 는 Santa-Cruz사(California, U.S.A.)제품을, LSAB kit는 DAKO사(Glostrup, Denmark) 제품을사용하였으며, 기타 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.</p> <h2>기기</h2> <p>본 실험에 사용된 기기는 CO2 incubator(Forma scientificCo., U.S.A.), deep-freezer(Sanyo, Japan), real time quanti-tative RT-PCR(Applied Biosystems, U.S.A.), homogenizer (OMNI, U.S.A.), VarioMACS(Bergisch Gladbach, Germany),FACScalibur(BD, U.S.A.) 및 ELISA leader(MolecularDevices, U.S.A.) 등을 사용하였다.</p> <h2>세포독성 측정</h2> <p>Human fibroblast cells (hFCs) 배양: 사람피부조직을 coolD-PBS로 3회 세척한 후 작은 조각으로 절단한 다음, conicaltube(15 mL)에 넣어 1,400 rpm에서 5분간 원심분리하고,tube에 DMEM {containing collagenase A(5 mg/mL, BM,Indianapoilis, U.S.A.) 와 DNase type(0.15 mg/mL, Sigma),antibiotics(penicillin 10 4 U/mL, streptomycin 10 mg/mL,amphotericin B 25 μg/mL)}를 넣고 37oC CO 2 배양기에서 2시간 동안 배양하였다. 다음 0.5% trypsin-0.2% EDTA를첨가한 후 30분간 계속 배양하였다. 배양 후 인산완충용액으로 약 2회 1500 rpm에서 원심분리한 후 DMEM-10%FBS에 1주일 동안 배양하였다. 1주일 후 0.5% trypsin-0.2%EDTA로 hFCs 세포를 분리하여 DMEM-5% FBS 배양액에105 cells/mL 농도로 맞추어 96 well plate 에 분주하였다.</p> <p>SRB assay법: 세포독성측정방법은 SRB assay법[15]을 약간 변형하여 실험에 사용하였다. hFCs 세포는 37oC, 5%CO2 배양기에서 1시간 배양한 후 PGA-LM(최종 농도 10mg/mL, 5 mg/mL, 1 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.25 mg/mL)을48시간 동안 처리하였다. 배양종료 후에 배양액을 버리고 인산완충용액으로 2회 세척하였다. 각 well에 50% TCA를 50μL로 가하고 1시간 동안 4oC에 방치하였다. 증류수로 5회세척한 다음 well plate 를 공기 중에서 건조하였다. SRB(0.4%/1% acetic acid) 용액을 100 μL/well로 가하고 실온에서 30분간 염색하였다. 그리고 0.1% acetic acid 용액으로약 45회 세척한 다음 공기 중에서 건조하고 10 mM Trisbase로 100 μL/well로 용해시켰다. 이 plate를 plate shaker(Lab-Line, U.S.A.) 에서 3.5 speed로 5분간 shaking하고ELISA reader(molecular devices, U.S.A.) 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.</p> <p>NC/Nga 생쥐에서 T 및 B세포 분리 및 배양: 일반적인(Conventional) 상태에서 사육한 18주령의 NC/Nga 생쥐의눈에서 capillary 관을 이용하여 100 μL의 혈액을 채혈하여이 중 IgE 함량이 50 μg/mL 이상이고 피부에 발진이 나타난 NC/Nga 생쥐를 선택하여 실험에 사용하였다. 이를 아토피피부발진(atopic dermatitis-like skin) NC/Nga 생쥐라고하였다. 순수한 T 세포와 B 세포를 분리하기 위하여 NC/Nga 생쥐의 비장을 적출하여 100 mesh에서 분쇄하여 비장세포를 얻어 2000 rpm에서 5분간 원심분리로 세포를 회수하였다. 여기에 ACK 용액(8.3 g NH 4Cl, 1 g KHCO3, in1 L of demineralized water + 0.1 mM EDTA)을 실온에서5분 동안 처리하여 적혈구를 제거하였다. 그리고 비장세포를2%의 FBS가 함유된 PBS(PBS/FBS)에 1×108/mL로 현탁시키고 normal rat serum을 5%되게 첨가하여 4oC에서 15분간 blocking한 후, T 세포 분리는 biotinylated antibodycocktail for lineage {CD8, CD14, CD16, CD19, CD36,CD56, CD123, TCR γ/d, CD235a(glycophorin A)} (CD4+T cell isolation kit, Miltenyi Biotec)를 가하였고, B 세포분리는 biotinylated antibody cocktail for lineage {CD43(Ly-48), CD4(L3T4), Ter-119}(B cell isolation kit, MiltenyiBiotec)를 가하여 각각 4oC에서 15분간 반응시켰다. 각각의세포를 PBS/FBS로 세척하여 1×107/mL로 현탁하였고, 20μL의 Anti-Biotin MicroBeads를 가하여 다시 4oC에서 15분간 반응시켰다. 이 세포를 magnetic column(CS column,Milteny Biotech)을 이용하여 PBS로 세척하여 준비해둔VarioMACS(Milteny Bio-tech) 에 장치하고, magnetic bead가 표지된 세포를 통과시켰다. PBS로 column을 충분히 세척한 다음 column을 통과한 부유액을 원심분리하여 lineage음성인 T 세포와 B 세포를 각각 모았다.</p>