본 논문에서는 plasmid DNA를 정제한 뒤 A. niger EH 유전자 존재여부 및 pYES2 vector에 삽입되었는지를 확인하고 S. cerevisiae에 형질전환시켜 A. niger #33의 EH 유전자를 재조합한 pYES2/AnEH#33 plasmid를 가지는 S. cerevisiae로부터 EH 발현 조건을 확인하는 실험에 사용했다. 아미노산 서열 분석을 통해 클로닝한 EH gene의 경우에 Asp, His, Asp가 존재하는 걸 확인했는데, 클로닝한 A. niger의 EH를 고효율로 발현시키는 연구를 진행하며 고기능성 재조합 EH가 나오면 광학활성 phenyl oxirane 제조용 청정 생물공정의 생산성이 크게 향상될 수 있을 것이라 결론지었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>RT-PCR을 이용한 A. niger #33 유래의 EH 유전자 클로닝</h2> <p>A. niger #33으로부터 분리한 total RNA로부터 first strand cDNA 합성하였으며 PCR을 사용하여 얻은 EH DNA를 S. cerevisiae 발현 vector인 pYES2 vector에 sub-cloning하는 과정은 Fig. 1과 같았다. 먼저 PCR product를 pEZ-T vector에 subcloning하여 pEZ-T/AnEH#33가 들어간 형질전환체들을 얻었으며, 제한효소로 가수분해 실험을 통해 EH 유전자가 삽입되었음을 확인하였다. T7 및 SP6 primer를 이용하여 확인된 DNA 서열로부터 유추하여 아미노산 서열을 분석한 결과, 기존문헌에 보고된 A. niger LCP521과 \( 85 \% \) 수준의 sequence identity를 가지고 있음을 확인할 수 있었다. pEZ-T/AnEH#33를 KpnI 및 Notl으로 가수분해하여 전기영동한 다음 \( 1200 \mathrm{bp} \) 정도의 band를 잘라 gel로부터 DNA 조각을 추출하고 같은 효소로 자른 pYES2 vector에 삽입시켰다. pYES2/AnEH#33 plasmid가 들어간 형질전환체들로부터 plasmid DNA를 정제한 후 A. niger EH 유전자 존재여부 및 pYES2 vector에 올바른 방향으로 삽입되었음을 확인하고 S. cerevisiae에 형질전환시켜 발현실험에 사용하였다.</p> <h2>S. cerevisiae에서의 재조합 EH 발현 및 입체특이성 가수분해 반응</h2> <p>A. niger #33의 EH 유전자를 재조합한 pYES2/AnEH#33 plasmid를 가지는 S. cerevisiae로부터 EH 발현 조건은 다음과 같았다. \( 5 \mathrm{ml} \) YNBCAD 배지에 S. cerevisiae 형질전환체를 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간동안 전배양을 행하고 전배양액을 YPD배지(\(1\%\) glucose, \(1\% \) yeast extract, \(2\%\) peptone)로 \( \mathrm{OD} 600=0.25 \) 가 되도록 희석한 다음 6시간 정도 배양하였다. pYES2에 있는 GAL promoter를 이용한 발현을 위하여 galactose가 \( 2 \% \) 되도록 첨가하고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48시간에서 60시간 동안 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 재조합 S. cerevisiae pellet을 생촉매로 사용하여 라세믹 phenyl oxirane 기질에 대한 입체특이성 가수분해 반응을 실시하였다. 재조합 S. cerevisiae 균체 \( 200 \mathrm{mg} \) (dry cell weight)을 \( 100 \mathrm{mM} \) phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 8.0) \) 용액 \( 10 \mathrm{ml} \)에 넣고 \( 10 \mathrm{mM} \) racemic phenyl oxirane을 주입한 후 30 \( { }^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm} \) 에서 반응을 진행하였다. 반응과정 중 일정량을 샘플링하여 cyclohexane으로 추출하고 chiral GC 분석을 통해 입체특이성 가수분해 반응을 모니터링하였다. 효소 반응기에서 약 24시간 반응 후 반응액을 chiral GC로 분석을 한 결과, 재조합 S. cerevisiae는 라세믹 phenyl oxirane에 대하여 가수분해능을 보여주었으며, wild-type의 A. niger 생촉매보다는 낮지만 입체특이성 가수분해 활성을 확인할 수 있었다. 일반적으로 EH의 촉매 활성점은 Asp(192), His(374)와 Asp(348) 등이 catalytic triad를 이루면서 활성점을 구성하고 있는 것으로 밝혀져 있는데, 본 연구에서 클로닝한 EH gene의 경우에서도 Asp, His, Asp가 존재함을 아미노산 서열 분석을 통해 확인하였다. 또한, 효소 활성점에 존재하고 있는 두 개의 tyrosine (Tyr251, Tyr314)의 phenolic hydroxyl 기능기가 oxirane ring과 수소결합을 형성하면서 기질을 촉매 활성점 중심부위에 위치시키면서 기질에 대한 입체선택성을 보이며, 반응의 첫 번째 단계인 nucleophile로 작용할 수 있는 aspartate의 carboxylate기가 에폭사이드 링에 친핵성 공격을 함으로써 에스테르 결합 (covalent enzyme- sub-strate 에스테르 중간체 형성)을 형성하는데 도움을 주는 것으로 예상되고 있다. pYES2/AnEH#33의 EH 유전자에도 이러한 Tyr기 두개가 존재하고 있음을 확인할 수 있었음에도 불구하고 입체특이성이 낮게 나온 결과들로부터 기존의 문헌에서 제시되고 있는 입체특이성을 결정짓는 Tyr 이외에 또 다른 기능기가 존재하고 있음을 예상할 수 있으며, 발현과정에서 숙주세포내에서의 folding 문제점을 생각할 수 있다. 현재 클로닝한 A. niger의 EH를 고효율로 발현시키는 연구는 진행중이며, 결과적으로 나오게 될 고기능성 재조합 EH는 광학활성 phenyl oxirane 제조용 청정 생물공정의 생산성 향상에 크게 기여할 수 있을 것이다.</p>