미생물의 대사산물이나 합성으로 개발된 기존의 콜레스태롤 생합성 저해물질들과 달리, 본 연구는 천연물의 콜레스테롤 생합성 억제 작용 효능을 알고자 여러 천연물들을 추출하여 SQS 저해활성을 측정하였다. 실험 결과 32종의 천연 추출물들 중 가장 높은 저해활성과 저해효과의 재현성을 가진 녹차의 SQS에 대한 저해기전을 조사하고자 녹차 추출물의 유기 용매들을 실험하였고, \( 72.0 \% \)로 가장 높은 저해활성을 나타낸 catechins의 효능임을 추정하였다. 이에 catechins 표준품의 SQS 저해활성을 실험하였고, 그 중 가장 큰 저해효과를 가진 (-)-Epigallocatechin gallate를 기존의 SQS 저해물질들과 비교한 결과, 상대적으로 저해효과는 낮지만 비교적 낮은 농도에서 효능을 발휘하는 (-)-Epigallocatechin gallate의 고지혈증 예방책으로서의 가능성을 제시하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>천연물 추출물의 SQS 저해활성</h2> <p>지금까지의 콜레스태롤 생합성 저해물질은 미생물의 대사산물이나 합성에 의하여 개발된 것으로 본 연구에서는 천연물을 대상으로 그 효능을 검색하고자 하였다. SQS 저해활성을 검색하기 위하여 동물, 식물, 버섯, 미생물, 식품소재와 같은 다양한 천연물을 수집하였다. 수집된 32종의 천연물을 \( 80 \% \) 수용성 methanol 또는 물로 추출하여 콜레스테롤 생합성 억제 작용에 미치는 영향을 알아보기 위하여 SQS 저해활성을 측정하였다. 일반적으로 탐색 과정에서는 실험 시료의 어떤 특정 성분을 목적으로 할 것인지 정해져 있지 않기 때문에 여러 가지 화합물에 대한 추출능이 크고 추출조작이 용이한 물 혹은 메탄올을 자주 이용하고 있다. 예비실험을 통하여 물 또는 \(80\%\) 수용성 methanol 등의 2가지 추출용매를 사용하여 비교해 본 결과(data not shown), 추출용매에 따른 수율의 차이는 크게 나타나지 않아 본 실험에서는 열수추출 방법을 이용하여 추출하였다. Table 1에서와 같이 천연물을 열수로 추출하여 얻은 추출물을 이용하여 SQS에 대한 저해활성을 조사한 결과, 크게 저해율 \( 25 \% \) 이하, 저해율 \( 25-50 \% \), 저해율 \( 50-75 \% \), 저해율 \( 75 \% \) 이상으로 분류할 수 있었다. 32 종의 시료 중, 9종이 \( 50 \% \) 이상의 저해효과를 나타냈으며 그 중, 녹차, 된장, 울금 추출물이 \( 75 \% \) 이상의 높은 저해효과를 나타냈다. 특히 주목할 만한 것은 식품소재에 의한 높은 저해효과가 관찰되었으므로 식품소재를 이용하여 심혈관실환을 에방할 수 있다면 비용이나 안전성 측면에서 효과적이기 때문에 그 의의가 크다고 할 수 있다. 최종적으로 저해활성이 가장 높고 저해효과의 재현성을 나타내는 녹차를 선발하여 squalene synthase에 대한 저해기전을 조사하고 자 하였다.</p> <h2>녹차 추출물의 유기용매 추출성 및 crude catechin의 분리</h2> <p>녹차 열수추출 시료를 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, 1-butanol을 사용해 각각 3회 반복 추출하여 나온 유기 용매 충의 squalene synthase 저해활성을 측정한 결과, n-hexane, chloroform, ethyl acetate, 1-butanol 추출물의 저해활성은 각각 4.3, 12.3, 71.3, 77.7 \(\% \)를 나타냈으며 특히 ethyl acetate와 butanol 층에서 높은 저해활성을 보였다(Fig. 2). Ethyl acetate 보다는 1-butanol에서의 추출율이 더 높았지만 butanol 층의 경우, 추출물의 농축이 어렵고 또한 1-butanol 층으로 여러 가지 화합물이 함께 추출되는 단점이 있기 때문에 수율에서는 약간 차이가 있지만 비점이 낮아 농축 및 분리를 하는데 장점이 있는 ethyl acetate를 이용하여 추출하는 것이 유리할 것으로 판단되었다. 녹차 추출물의 유기용매 추출에 따른 squalene synthase 저해물질의 특성이 crude catechin의 추출 및 분리 방법과 유사하여, Fig. 1의 방법에 따라 녹차 추출물로부터 crude catechin 분획을 얻었다. 녹차 추출물로부터 chloroform으로 추출하여 caffeine 성분을 제거한 후, ethyl acetate를 이용하여 crude catechins 분획을 얻어 squalene synthase 저해활성을 검토한 결과, \( 72.0 \% \)의 저해활성을 나타내어 녹차 추출물의 squalene synthase 저해활성은 crude catechins에 의한 것으로 추정되었다. 녹차는 혈압 저하 및 혈소판응집 감소 뿐 만 아니라 항균, 항바이러스, 항암 작용, 위액분비촉진, 이뇨작용, 항염증 효과와 같은 다양한 약리학적 효과를 가지는 것으로 보고되고 있으며 그 중에서도 catechin에 대한 생리학적 연구가 다방면으로 이루어지고 있다. 또한 녹차의 섭취가 지방 및 콜레스테롤의 흡수를 저하시키거나 혹은 내분비계에 영향을 미쳐 식이섭취를 감소시킴으로써 혈중 콜레스테롤 저하효과를 나타낸다고 보고되기도 하였다.</p> <h2>녹차 catechins에 의한 squalene synthase 저해활성</h2> <p>녹차의 주요한 생리활성 성분인 catechins 분획에서 SQS 저해활성을 나타냈으므로 catechin 표준품을 이용하여 SQS 저해활성을 조사하였다. (+)-Catechin, (-)-epicatechin, (-)-epicatechin gallate, (-)-epigallocatechin, (-)-epigallocatechin gallate 등 catechin 표준용액의 농도에 따른 squalene synthase 저해작용을 조사하였다. 그 결과, Table 2에 나타난 바 와 같이 (-)-epigallocatechin gallate, (-)-epicatechin gallate, (-)-epigallocatechin, (-)-epicatechin, (+)-catechin의 순으로 저해활성이 강한 것으로 나타났다. (+)-Catechin과 (-)epicatechin의 경우, \( 1,000 \mu \mathrm{M} \) 농도에서 각각 35.3, 39.7 \(\% \)의 저해율을 나타냈으나 그 이하의 농도에서는 큰 저해효과를 보이지 않았다. (-)-Epigallocatechin을 각 농도별로 처리하여 squalene synthase 저해작용을 살펴본 결과, 500, 1,000 \(\mu \mathrm{M} \)에서 각각 53.7, 65.3\(\%\)의 저해율을 보였으며, (-)-epicatechin gallate과 (-)-epigallocatechin gallate의 경우, \( 100 \mu \mathrm{M} \)에서 각각 42.3, 54.7 \(\% \)의 저해활성을 나타내어 비교적 낮은 농도에서도 squalene synthase에 대한 저해작용을 확인할 수 있었다. 또한 가장 강한 squalene synthase 저해활성을 나타내는 (-)-epigallocatechin gallate의 저해양상을 살펴보기 위하여 (-)-epigallocatechin gallate의 농도를 달리하여 저해활성을 측정한 결과, squalene synthase에 대한 (-)-pigallocatechin gallate의 \( \mathrm{IC}_{50} \) 값은 \( 90 \mu \mathrm{M} \)로 나타났다. Squalen synthase는 4차 구조를 가지는 효소로서 효소의 \( \mathrm{IC}_{50} \) 값을 측정할 경우, 4차 구조일때 S자 형태의 반응곡선을 보이므로 curve-fitting을 통하여 \( \mathrm{IC}_{50} \) 값을 구할 수 있었다(Fig. 3). 지금까지 알려진 squalene synthase 저해물질에는 기질인 FPP analogue와 phosphorous-containing inhibitor, carbocation intermediate analogue, natural product 등으로 크게 세 가지로 나누어지고 있으며 유기 합성에 의한 저해물질에 비해 미생물 배양액으로부터 분리된 저해물질들이 활성이 더 높은 것으로 알려져 있다. FPP analogue인 phosphinylmethyphosphonates (PMP)와 그 유도체는 rat liver-squalene synthase에 대하여 \( 12.2 \mu \mathrm{M} \) 의 \( \mathrm{IC}_{50} \) 값을 나타내었으나 polyanion의 세포막침투가 어려워 rat hepatocytes에서는 콜레스테롤생합성 저해효과를 나타내지 못하였다. Phosphinylformate는 rat-squalene synthase에 대하여 \( 8.7 \mu \mathrm{M} \) 의 \( \mathrm{IC}_{50} \) 값을 나타내는 것으로 보고되었다. Carbocation intermediate analogue인 aza analogue는 yeast-squalene synthase에 대하여 \( 20 \sim 25 \mu \mathrm{M} \) 범위의 \( \mathrm{IC}_{50} \) 값을 나타내었다. 한편 Merck사의 zaragozic acid \( \left(\mathrm{IC}_{50}=39 \mathrm{nM}\right) \)및 Glaxo사의 squalestatin \( \left(\mathrm{IC}_{50}=5.9 \sim 15.2 \mathrm{nM}\right) \) 등의 저해물질은 미생물로부터 분리된 것으로 rat liver와 fungal squalene synthase 등의 두 가지 효소에 대해 강한 저해활성을 보이는 것으로 알려겼다. (-)-Epigallocatechin gallate의 경우, 지금까지 알려진 squalene synthase 저해물질에 비해 저해효과는 낮았지만 비교적 낮은 농도에서 squalene synthase에 대하여 저해효과가 나타내는 것으로 확인되어 본 결과를 통해 고지혈증에 대한 예방효과의 가능성을 제시하고 있다.</p>