각각 Cordycepin에 의한 \( \mathrm{Ca}^{2+} \) 이온 농도 변화는 Fluo-3/AM 형광 염색법, 세포 내 reactive oxygen species (ROS)의 생성은 DCFH-DA 형광 염색법, MMP의 변화는 \( \mathrm{DiOC}_{6} \) 형광 염색법을 이용하여 측정하였고, PC-3의 apoptosis 유도 기전을 알아보기 위하여 western blotting을 이용하여 단백질의 발현변화를 관찰하였으며, 모든 실험의 표시 결과는 3번 수행하여, 통계분석은 mean \( \pm \) S.D로 표시, ANOVA에 의 해 분석, 통계적 유의성은 \( p \leq 0.05 \)로 판정하였다.
<h2>세포 내 \( \mathrm{Ca}^{2+} \) 농도의 측정</h2><p>Cordycepin에 의한 \( \mathrm{Ca}^{2+} \) 이온 농도 변화를 Fluo-3/AM 형광 염색법을 이용하여 측정하였다. PC-3 세포를 \( 1 \times 10^{5} \)이 되도록 6-well plate에서 24 시간 동안 안정화시킨 후, cordycepin을 \( 200 \mu \mathrm{M} \)의 농도로 6 시간 동안 처리하였다. 세포를 분리하여 PBS (\(\mathrm{pH} \mathrm{7.4}) \)로 세척한 뒤, \( 5 \mu \mathrm{M} \) Flu0-3/AM을 처리하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 분간 염색하였다. 염색된 세포는 flow cytometry 를 이용하여 측정하였고, Cell Quest software를 이용하여 \( \mathrm{Ca}^{2+} \) 농도의 변화를 분석하였다.</p><h2>세포 내 reactive oxygen species (ROS) 생성 측정</h2><p>Cordycepin에 의한 세포 내 ROS의 생성을 DCFH-DA 형광 염색법을 이용하여 측정하였다. PC-3 세포를 \( 1 \times 10^{5} \)이 되도록 6-well plate에서 24 시간 동안 안정화시킨 후, cordycepin을 \( 200 \mu \mathrm{M} \) 의 농도로 다양한 시간 동안 처리하였다. 세포를 분리하여 PBS \( (\mathrm{pH} 7.4\))로 세척한 뒤, \( 10 \mu \mathrm{M} \)의 DCFH-DA를 처리하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 염색하였다. 염색된 세포는 flow cytometry를 이용하여 측정하였고, Cell Quest software를 이용하여 ROS 생성을 분석하였다.</p><h2>Mitochondrial membrane potential (MMP)의 측정</h2><p>Cordycepin에 의한 MMP의 변화를 \( \mathrm{DiOC}_{6} \) 형광 염색법을 이용하여 측정하였다. PC-3 세포를 \( 1 \times 10^{5} \) 이 되도록 6-well plate에서 24 시간 동안 안정화시킨 후, cordycepin을 \( 200 \mu \mathrm{M} \)의 농도로 다양한 시간 동안 처리하였다. 세포를 분리하여 PBS (\(\mathrm{pH} 7.4)\)로 세척한 뒤, \( 100 \mathrm{nM} \)의 \( \mathrm{DiOC}_{6} \)를 처리하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 염색하였다. 염색된 세포는 flow cytometry를 이용하여 측정하였고, Cell Quest software를 이용하여 MMP의 변화를 분석하였다.</p><h2>Western blotting을 이용한 단백질의 분석</h2><p>Cordycepin에 의한 PC-3의 apoptosis 유도 기전을 알아보기 위하여 western blotting을 이용하여 단백질의 발현변화를 관찰하였다. PC-3 세포를 \( 1 \times 10^{5} \)이 되도록 6-well plate에서 24 시간 안정화시킨 후, cordycepin을 적정 농도로 24 시간 동안 처리하였다. 세포를 분리하여 PBS ( \( \mathrm{pH} 7.4\) )로 세척하였고 lysis buffer [\(150 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}\), \( 10 \mathrm{mM} \) Tris ( \( \mathrm{pH} 7.4)\), \(5 \mathrm{mM} \) EDTA( \( \mathrm{pH} 8.0\)), \(1\%\)-Triton X-100, \(1 \mathrm{mM} \) PMSF, \( 20 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) aprotinin, \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) leupeptin, \( 1 \mathrm{mM} \) benzaidine, \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) pepstatin]를 이용하여 분해하였다. Bradford 법을 이용하여 정량 한 뒤,\( 40 \mu \mathrm{g} \)의 protein은 \( 12-15 \% \)의 sodium dodecyl sulfate - poly-acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 이용하여 분리하였다. 분리된 protein을 polyvinylidence fluofide (PVDF) membrane으로 transfer 하여 \( 5 \% \) skim milk가 함유 된 TBS-T buffer [ \( 20 \mathrm{mM} \) Tris ( \( \mathrm{pH} 7.4\)), \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}\), \(0.1 \% \) Tween-20]를 이용하여 실온에서 1 시간 동안 blocking 하였고 primary antibody와 horseradish peroxidase (HRP)가 결합 된 secondary antibody를 이용하여 target protein에 결합하였다. 이후, Enhanced Chemiluminescence (ECL) western blotting detection 시약을 이용하여 발색하고, fluorescence scanner (LAS-3000, Fuji Film, Tokyo, Japan)을 이용하여 확인 하였으며, Multi Gauge V3.0 software를 이용하여 분석하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>모든 실험의 표시된 결과는 3번 수행하였으며, 통계분석은 mean \( \pm \) S.D로 표시하였고, ANOVA에 의 해 분석하였다. 통계적 유의성은 \( p \leq 0.05 \)로 판정하였다.</p>