RAW 264.7 세포를 배양한 후 COHEE를 처리하여 MAPKs의 발현량을 측정하기 위해 anti-mouse JNK, p-JNK, ERK, p-ERK, p38, p-p38 항체를 사용하였고, COHEE의 항염증 효과를 알아보기 위해 귀부종 측정 실험을 실시하였다. SAS 소프트웨어를 사용하여 모든 실험 결과에 대한 유의차 검정을 수행하였다. 평균값을 분산분석한 후 Duncan's multiple range test를 사용하여 유의수준 \( p<0.05 \)에서 검정하였다.
<h2>MAP kinase (JNK, ERK, p-38) 발현량 측정</h2> <p>MAPKs의 발현량을 알아보기 위하여 RAW \( 264.7 \) 세포를 \( 1 \times 10^{6} \) cells/ml으로 18 시간 전 배양하고 COHEE를 처리하여 30 분 동안 본 배양한 후 MAPKs의 발현량을 알아보기 위해 anti-mouse c-Jun N-terminal kinase (JNK), p-JNK, extracellular signal-regulated kinase (ERK), p-ERK, p38 protein kinase (p38) 및 p-p38 (Cell Signaling Technology Inc., USA) 항체를 사용하여 1:500으로 희석해서 사용하였다. 이후의 실험은 iNOS, COX-2 실험법과 동일하게 진행하였다.</p> <h2>귀부종 측정 및 조직 관찰</h2> <p>COHEE의 항염증 효과를 in vivo 상에서 알아보기 위하여 Kim 등 과 Saraiva 등 의 방법에 의거하여 귀부종 측정 실험을 실시하였다. 생후 8 주령의 수컷, ICR 마우스에 COHEE를 10, 50 및 \( 250 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) ·body weight 농도로 \( 200 \mu \mathrm{l} \)씩 단회 경구 투여하고 한 시간 후, 오른쪽 귀에 \( 2.5 \% \) croton oil을 \( 20 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ear} \) 농도로 도포하였다. 도포 5 시간 후 귀 두께를 측정하였고 croton oil의 처리로 귀 두께가 증가한 것을 부종의 형성으로 간주하였다. 귀 조직 관찰은 ICR 마우스의 오른쪽 귀에 진두발 에탄올 추출물을 \( 100 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 씩 도포하고 15 분 뒤, \( 5 \% \) croton oil을 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 씩 도포하였다. 6시간 뒤, diethylether로 마취사 시키고, 귀 조직을 절제하여 \( 10 \% \) formaldehyde에 72 시간 고정하였다. 고정 후 파라핀 블록을 만들어 박편을 제조하고 hematoxylin-eosin과 toluidine-blue 염색을 하여 조직을 관찰하였다. 부종 생성율은 다음과 같은 식에 의해 계산하였다.</p> <h2>통계 처리</h2> <p>모든 실험 결과에 대한 유의차 검정은 SAS software (ver. 9.3, SAS Institute, Inc., USA)에서 평균값을 분산분석한 후, Duncan's multiple range test 법에 따라 \( p<0.05 \) 수준에서 검정하였다.</p>