막걸리 시료에 존재하는 미생물들을 분석하기 위하여 전기영동으로 중폭된 단편을 확인한 다음 각각의 밴드들을 멸균된 면도칼로 잘라넨 후 시료로부터 추출한 DNA에 대하여 세균과 진균을 상층액을 취하였다.
<h2>Touchdown-PCR</h2> <p>막걸리 시료에 존재하는 미생물들을 분석하기 위하여 막걸리 시료로부터 추출한 DNA에 대하여 세균과 진균의 rDNA 유전자를 증폭시키는 universal primer를 이용하여 touch down-PCR을 수행하였다. 세균의 경우는 6S rDNA 의 V3 영역의 염기서열을 증폭하기 위하여 GC clamp가 부착된 gc338f (5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3'와 518r (5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3')을 primer로 사용하였다. 진균의 경우는 28S rDNA 의 염기서열을 증폭하기 위하여 GC clamp가 부착된 GCNL-1 (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3')과 LS-2 (5'-ATT CCC AAA CAA CTC GAC TC-3')를 primer로 사용하였다. PCR 반응은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3분간 초기 열처리한 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초 동안 변성시키고 annealing 온도에서 30초, \( 74^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초간 신장 반응을 총 35회 수행한 후, \( 74^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 7분간 수행하였다. 초기 10회 동안의 annealing 온도는 \( 64^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 시작하여 매 cycle마다 \( 1^{\circ} \mathrm{C} \) 씩 감소되도록 설정하였고, 이후부터는 annealing 온도를 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 로 고정하였다. PCR 증폭산물은 \( 0.3 \% \) agarose gel을 이용한 전기영동으로 중폭된 단편을 확인한 다음, gel purification kit (EPLIS Co., Korea)를 이용하여 정제하였다.</p> <h2>Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) 분석</h2> <p>Touchdown-PCR을 수행하여 얻은 PCR 증폭산물은 BioRad Dcode System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA)을 이용한 DGGE를 수행하여 분석하였다. Denaturing gradient gel은 \( 8\% \) polyacrylamide 용액에 \( 100 \% \) 변성제(7 Murea (Bio-Rad, Hercules, USA), \( 40\% \mathrm{(v} \)/\( \mathrm{v}) \) formamide(Bio-Rad, Hercules, USA))를 \( 30 \% \) 에서 \( 50 \% \) 까지의 농도구배가 연속적으로 형성되도록 첨가하여 제작하였다. 제작된 denaturing gradient gel에 touchdown-PCR을 수행하여 얻은 증폭산물 \( 30 \mu 1 \) 를 loading하여 1× TAE 완충용액\( (40 \mathrm{mM} \) Tris, \( 20 \mathrm{mM} \) acetic acid, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( \mathrm{pH} 8.0) \)에서 \( 60^{\circ} \mathrm{C}, 80 \mathrm{~V} \) 조건으로 13시간 동안 전기영동을 수행하였고, ethidium bromide로 염색한 후, UV 상에서 DNA 단편을 확인하였다.</p> <h2>염기서열 분석</h2> <p>Denaturing gradient gel 상에서 이동거리가 다른 밴드들로부터 DNA 단편들을 회수하기 위하여 각각의 밴드들을 멸균된 면도칼로 잘라넨 후 멸균된 3차 중류수를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 하룻밤 동안 방치한 다음 원심분리 \( (10,000 \times g, 5 \mathrm{~min}) \) 하여 상층액을 취하였다. 각 밴드에서 회수한 DNA에 대하여 세균의 경우는 gc338f 와 518r을, 진균의 경우는 GCNL-1와 LS-2를 primer로 사용하여 touchdown-PCR을 수행한 후 증폭된 PCR 산물을 PCR clean-up kit를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물들은 DNA 염기서열 결정을 의뢰하였고(Cosmo Gene Tech, Korea), 결정된 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI, USA)의 BLAST를 사용하여 분석하였다.</p>