Collagenase 저해활성을 Wûnsch와 Heindrich 방법에 의해 실험했다. Tris-HCl buffer와 CaCl₂, 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg를 혼합하여 반응 구를 구성하고, 이에 collagenase를 추가하여 20분 동안 반응을 유도한 후 citric acid와 ethyl acetate를 추가해 반응을 종료하고 흡광도를 측정했다. 세포 배양은 10%의 FBS와 1%의 penicillin/streptomycin을 포함하는 DMEM 배지에서, 37℃, 5% CO₂ incubator에서 진행하였다. 또한, RAW 264.7 세포에 다양한 농도의 시료와 LPS를 처리하고 24시간 동안 배양했다. Collagenase 저해활성은 시료의 첨가에 따른 흡광도 감소율로 나타냈다.
<p>저해율 \( ( \%)= \left (1- \frac {\text { 시료첨가군의 흡광도 } } {\text { 무첨가군의 흡광도 } } \right ) \times 100 \)</p> <h2>Collagenase 저해활성 측정</h2> <p>Collagenase 저해활성 측정은 Wûnsch와 Heindrich의 방법에 따라 측정하였다. 즉 반응구는 \( 0.1 \mathrm { M } \) tris- \( \mathrm { HCl } \) buffer \( \left ( \mathrm { pH } \right . \) 7.5)에 \( 4 \mathrm { mM } \mathrm { CaCl } _ { 2 } \)를 첨가하여, 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg \( (0.3 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \)를 녹인 기질액 \( 0.25 \mathrm { ml } \) 및 시료용액 \( 0.1 \mathrm { ml } \)의 혼합액에 collagenase \( (0.2 \) \( \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) 0.15 \mathrm { ml } \)를 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 \( 6 \% \) citric acid \( 0.5 \mathrm { ml } \)을 넣어 반응을 정지 시킨 후, ethyl acetate \( 1.5 \) \( \mathrm { ml } \)을 첨가하여 \( 320 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. Collagenase저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <p>저해율 \( ( \%)= \left (1- \frac {\text { 시료첨가군의 흡광도 } } {\text { 무첨가군의 흡광도 } } \right ) \times 100 \)</p> <h2>세포배양</h2> <p>본 실험에 이용한 각 세포의 배양은 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS)과 \( 1 \% \) penicillin/streptomycin \( (100 \mathrm { U } / \mathrm { ml } ) \)을 첨가한 Dulbeco's modified eagle's medium (DMEM) 배지를 사용하였으며, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에 적응시켜 계대 배양하였다. RAW \( 264.7 \) 세포에 시료용액의 여러 농도(1, 10, 100, 1000 \( \mathrm { ug } / \mathrm { ml } ) \) 또는 양성 대조군을 1시간 전처리한 후 LPS (1 \( \mathrm { ug } / \mathrm { ml } \) )를 처리하고 24시간 배양하였다.</p>