RAW \(264.7\) 세포주를 \(1 \times 10 ^ {5}\) cells/well로 96 well plate에 분주하여 24시간 배양한 후, LPS와 농도별 샘플 처리하여 24시간 배양하였다. 이를 통해 NO생성량을 측정하였고, 세포 배양액 내의 cytokines의 양을 측정하기 위해 ELISA를 수행하였다. 또한 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법을 사용하여 측정하였다. 각 메탄올 추출물 시료를 증류수에 녹인 후 희석액에 folin 시약을 첨가하여 혼합한 후 \(10\% \mathrm{Na}_{2}\mathrm{CO}_{3}\)을 넣고 1시간 반응 시킨 후, \(700 \mathrm{~nm}\)에서 흡광도를 측정하여 폴리페놀 함량을 구하였다.
<h2>Nitric oxide(NO) 생성량 측정</h2> <p>NO생성량 측정은 Griess Reagent System의 방법에 따라 RAW \( 264.7 \) 세포주를 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well로 96 well plate에 분주하여 24시간 배양한 후 LPS \( (100 \mathrm { ng } / \mathrm { ml } ) \) 와 농도별 sample 처리하여 24시간 배양하였다. 세포배양 상등액 \( 100 \mu 1 \)를 96 well plate에 취하고, 여기에 동량의 Griess 시약을 넣어 10분간 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite의 농도 \( ( \mu \mathrm { M } ) \) 는 sodium nitrite \( \left ( \mathrm { NaNO } _ { 2 } \right ) \)를 사용하여 얻은 표준 직선과 비교하여 산출하였다.</p> <h2>Tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) 생성량 측정</h2> <p>세포 배양액 내의 cytokines의 양을 측정하기 위해 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits (invitrogen corporation, Carlsbad, CA, USA)을 수행하였다. 각 시료의 추출물 혹은 LPS를 처리한 배양액을 이용하여 TNF- \( a \) 측정에 사용하였다. 배양액을 적절한 농도로 희석한 후, cytokine으로 coating된 96 well plate에 50 씨씩 첨가하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 overnight시켰다. Washing buffer로 3회 세척한 다음, \( 100 \mu 1 \) 의 streptavidine-HRP solution을 처리하여 1 시간 동안 상온에서 반응시킨 후 다시 washing buffer로 3회 세척하였다. 여기에 di(2-ethylhexyl)-2,4,5-trimethoxybenzalmalonate (TMB) substrate를 \( 100 \mu \mathrm { l } \)씩 처리하여 5-30분간 반응시킨 후 100 ㅆ1의 stop solution을 처리한 후 \( 450 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>총 폴리페놀 함량</h2> <p>총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법을 응용하여 측정하였다. 즉 각 메탄올 추출물 시료 \( 1 \mathrm { mg } \)을 증류수 \( 1 \mathrm { ml } \)에 녹이고 10배 희석한 희석액 \( 2 \mathrm { ml } \)에 배 희석한 folin 시약 \( 2 \mathrm { ml } \)을 첨가하고 잘 혼합한 후 3분간 방치한 후 \( 10 \% \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { CO } _ { 3 } 2 \mathrm { ml } \)을 넣고 1시간 반응 시킨 후 \( \mathrm { UV } / \) Visible spectrophotometer (UVIKON 922, Kontron, Italy)를 사용하여 \( 700 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다. 이 때 tannic acid를 이용한 표준곡선은 10,25,50,75,100 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)가 되도록 하여 위와 같은 방법으로 \( 700 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>