본 연구에서는 폐수에서 얻은 시료를 교반하여 잘 섞은 후에 시료 \( 5.0 \mathrm{ml} \)씩을 멸균된 희석수가 담긴 falcon tube 넣었으며, 희석수로는 호기성 및 혐기성 희석수를 사용하였으며 이후 세균탈착과정을 진행하였다. 다음으로 세균탈착액을 희석 후 호기성 및 혐기성 종속영양세균의 농도를 측정하였다. 한편 시료의 세균 농도 측정과 대사지문 분석에서는 Anaerocult A나 GasPak EZ anae-robe container system을 Anaerobic jar에 놓아 혐기성 조건이 유지되도록 하였으며, BBL을 anaerobic jar에 넣어 혐기성 배양을 확인하였다. 한편 위에서 얻은 결과를 통계 처리하기 위해 SPSS를 이용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>처리 시스템</h2><p>분석대상 식품폐수처리장은 경상북도 소재로 돈◦도축 및 육가공 폐수를 처리하며 하루 처리 용량은 \( 1300 \mathrm{m}^{3} \) 규모이고 간략한 시스템은 Fig. 1에 나타내었다. 폐수는 생물막인 RABC, 포기조(aeration tank) 1-2-3 순서로 지나가며 용존산소(DO) 농도는 생물막에서 \( 0.5 \sim 1.0 \mathrm{ppm} \) 사이이며 포기조에서는 점감식으로 하여 \(#1\) 포기조에서 \( 1.0 \sim 0.5 \mathrm{ppm} \), \(#2\) 포기조에서 \( 0.4 \sim 0.5 \mathrm{ppm} \), \(#3\) 포기조에서 \( 0.1 \sim 0.2 \mathrm{ppm} \) 정도이다. \(#3\) 포기조에서 \(#1\) 포기조로 일부가 재순환하며 슬러지의 일부가 생물막과 \(#1\) 포기조로 유입되는 것을 Fig. 1로 알 수 있다.</p><h2>시료 채취와 세균 탈착</h2><p>2008년 4월에 생물막, \(#1\) 및 \(#3\) 포기조 시료를 채취하였다. \(#2\) 포기조와 침전지(settling reservoir) 시료는 채취할 수 없었다. 시료를 손으로 3분 이상 아주 세게 흔들면서 교반하여 잘 섞은 후에 시료 \( 5.0 \mathrm{ml} \)씩을 멸균된 \( 45.0 \mathrm{ml} \)의 희석수가 담긴 falcon tube에 넣었다. 호기성 희석수로서 \( 0.85 \%\) \(\mathrm{NaCl} \)이 함유된 증류수를 사용하였고 혐기성 희석수로는 증류수 \( 1 \mathrm{L} \)에 \( \mathrm{NaCl}\) \(2.25 \mathrm{g}\), \(\mathrm{KCl}\) \(0.105 \mathrm{g}\), \(\mathrm{CaCl}_{2} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \(0.12 \mathrm{g}\), \(\mathrm{NaHCO}_{3}\) \(0.05\mathrm{g} \)이 들어 있었으며, 최종농도 \( 0.0001 \% \)가 되게 resazurin을 첨가하여 분흥색으로 혐기성을 확인할 수 있도록 하였다. 대사 지문 조사를 위한 혐기성 희석수는 resazurin을 첨가하지 않아 흡광도(OD)의 측정을 방해하지 않게 하였다. 세균탈착과정은 교반(vortexing) 1분, 얼음에 꽂아두기 1분, 초음파세척 (Branson sonicator 7150, USA) 1분, 얼음에 꽂아두기 1분의 총 4단계로 거쳤다. 세균탈착과정을 연속적으로 3회 실시한 후에 불순물을 제거하기 위하여 \( 3,000 \times g \)에서 2분간 원심분리함으로써 시료 침전물과 세포가 함유된 상층액을 분리하였다.</p><h2>세균 농도 측정과 대사지문(metabolic fingerprinting)</h2><p>세균탈착액을 희석수로 연속희석한 후에 호기성 및 혐기성 종속영양세균의 농도를 측정하였다. 연속희석된 시료를 TSA 한천배지(Tryptic Soy agar media, Difco)와 증류수 대신 혐기성 희석수를 이용한 혐기성 TSA 한천배지에 도말하였다. 멸균된 증류수에 적신 Anaerocult A (Merck)나 GasPak EZ anae-robe container system (Becton, Dickinson and company, USA)을 Anaerobic jar (Merck)에 놓아 두어 혐기성 조건이 유지되도록 하였고 dry anaerobic 100 indicator strip (BBL)을 anaerobic jar에 넣어 흰색이 유지되는지 점검하여 혐기성 배양을 확인하였다.</p><p>\( 10^{-3} \)으로 희석된 호기성 희석수와 resazurin이 첨가되지 않은 혐기성 희석수 시료를 채취한 후 Biolog GN2 plate (Biolog, Hayward, CA, USA)의 각 탄소원에 시료 \( 180 \mu \mathrm{l} \)씩 접종하였고, 혐기성 희석수를 접종한 것은 mineral oil \( 20 \mu\mathrm{l} \)씩 접종하여 공기의 접촉을 차단하였다. 공기를 차단할 때까지 세균 농도 측정용으로 사용된 resazurin 첨가 혐기성 희석수들의 색깔이 분홍색임을 확인하였다. 항습배양기\( \left(25^{\circ} \mathrm{C}\right) \)에서 7일간 배양하면서 매일 microtiter plate reader (model Vmax; Molecular Devices Corp., Menlo Park, CA, USA)를 이용하여 \( 540 \mathrm{nm} \)에서 흡광도(OD)를 측정하였다. 대사지문은 duplicate로 세균농도 측정은 triplicate로 하였다.</p><h2>통계 처리 및 측정값 분석</h2><p>생물막과 포기조의 활성도를 조사하기 위하여 매일 측정한 흡광도값을 이용하여 대조구보다 높은 값들만 취한 다음에 각 탄소원의 일별변화량 \( \left(\mathrm{OD}_{\mathrm{n}}-\mathrm{OD}_{\mathrm{n}-1},\mathrm{n}=\right. \) day of incubation)을 구하였고 통계분석을 위해 표준화를 한 후에 'SPSS \( 14.0 \mathrm{K}\)'로 분석하였다.</p><p>대조구로 보정한 흡광도(OD) 평균값인 AWCD (average well color development)는 \(\left.\mathrm{AWCD}=\sum\left(\mathrm{OD}_{\mathrm{i}}-\mathrm{OD}_{\mathrm{c}}\right)\right] / 95 \)로 (\( \mathrm{OD}_{\mathrm{i}:} \mathrm{i} \) 번째 탄소원의 \( \mathrm{OD} \),\( \mathrm{OD}_{c} \): 대조구의 \( \mathrm{OD}\), \(95 \pm \)탄소원의 갯수) 하였다. 각 탄소원의 일별변화량을 \( \mathrm{AWCD} \)로 나누고 기질다양성(substrate diversity, \( \mathrm{H}^{\prime} \) )과 탄소원 편중성 (Eveness, J')을 구하였다. \( \mathrm{OD}_{\mathrm{i}-} \mathrm{OD}_{\mathrm{c}} \) 를 \( \mathrm{OD}_{\mathrm{k}} \) 로 하고 \( \mathrm{H}^{\prime}=-\sum \) \( P i \ln P i\left(P i=\mathrm{i}\right. \)번째 탄소원의 \( \mathrm{OD}_{\mathrm{k}}\) / 모든 탄소원의 \( \mathrm{OD}_{\mathrm{k}} \) 합)이고 \( \mathrm{J}^{\prime}=\mathrm{H}^{\prime} / \ln S \) (S: 이용한 탄소원의 총 개수)이다.</p>