관련 생화학적 반응과 관련된 역학적 분석을 수행하였다. Park 등의 방법을 변형하여 RAW 264.7 cello을 24-well tissue culture plate에 well 당 \( 1.0 \times 10 ^ { 5 } \) cellod을 분주하여 부착시킨 후 LPS를 처리하여 NO 생성을 유도하고, Griess reaction을 통해 식물 추출물에 의한 NO 생성 저해능을 분석하여 항염증 활성의 기전을 분석하였다.
<h2>NO 생성 억제능 분석</h2> <p>대표적인 free radical 중 하나인 NO는 중요한 세포신호 전달물질로서 작용하나 과잉 생산 시 산화적 스트레스의 유발을 통해 염증 및 세포 손상의 원인이 된다. 이러한 NO 생성 억제능의 분석은 Park 등의 방법을 변형하여 다음과 같이 수행하였다. RAW 264.7 cello을 24-well tissue culture plate에 well 당 \( 1.0 \times 10 ^ { 5 } \) cellod을 분주하여 부착시킨 후 \( 1 \mu \mathrm { g } / \) \( \mathrm { ml } \)의 LPS를 처리하여 NO 생성을 유도하고 식물 추출물에 의한 NO 생성 저해능을 Griess reaction을 통해 분석하였으며 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.</p> <h2>항염증 활성 기전 분석</h2> <p>각 소재가 보유한 NO 생성 억제능의 기전을 밝히기 위해 NO 생성 유전자인 iNOS의 단백질 발현을 분석하였다. 또한 각 추출물에 의한 NO 생성 및 iNOS의 발현 저해능이 NF- \( \kappa \mathrm { B } \) 및 AP-1에 의해 조절될 가능성을 알아보기 위해 LPS로 \( \mathrm { NF } - \kappa \mathrm { B } \) p65와 inhibitory \( \kappa \mathrm { B } \alpha( \mathrm { I } \kappa \mathrm { B } \alpha) \), 그리고 AP-1의 subunit인 c-Jun의 인산화에 각 추출물이 미치는 영향을 분석하였다. Western blot hybridization을 위한 iNOS, p- \( \mathrm { p } 65, \mathrm { p } - \mathrm { I } \kappa \mathrm { B } \alpha \), 그리고 p-c-Jun의 일차항체는 Cell Signaling Technology (MA, USA)로 부터 구입하여 사용하였다. 시료 처리가 끝난 배양 세포에서 단백질을 추출하여 Bradford assay로 단백질 농도를 결정한 후 \( 50 \mu \mathrm { g } \) 의 단백질을 \( 10 \% \) SDS-PAGE로 전기영동하고 nitrocellulose membrane에 blotting한 후 대상 단백질의 항체와 hybridization하였다. Membrane 수세 후 HRP가 tagging된 이차항체로 한 시간 동안 반응시키고 chemiluminescence detection system을 이용하여 단백질 발현을 분석하였다. 실험의 결과는 3회 반복 실험을 통해 유의적인 단백질 발현 변화를 확인한 후 대표적인 데이터를 제시하였다.</p> <h2>통계 분석</h2> <p>실험의 결과는 평균(mean) \( \pm \) 표준편차(standard deviation, SD)로 나타내었고, 각 데이터의 통계 분석은 SPSS \( 20.0 \) software를 이용한 unpaired Student's \( t \)-test를 통해 \( p \) 값이 \( 0.05 \) 미만 \( (p<0.05) \) 인 경우 유의성이 있는 것으로 판단하였다.</p>