Snake Skin Dialysis Tubing을 이용하여 배양액을 원심분리한 후, Tris-\(\mathrm{HCl}\) \(( \mathrm { pH } ~7.0) \)를 첨가하고 \(\mathrm{4^\circ C}\)인 냉장실에서 2시간마다 갈아주는 것을 2번 반복한 후 3번째에는 12시간 이상 투석을 시행하여 조효소액을 제조하였다. 그 활성은 DNS법을 이용하여 측정하였고, 1분당 \(\mathrm{1\mu M}\)의 galactose를 생산하는 한천분해 효소의 양을 1 unit(\( \mathrm { U } \))으로 나타냈다.
<h2>조효소액의 제조</h2> <p>배양액을 원심분리하여 \( \left (3,000 \times g, 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 15 \mathrm { ~min } \right ) \) 균체를 제거한 후 얻어진 상층액 \( 15 \mathrm { ml } \)를 Snake Skin Dialysis Tubing (Thermo Scientific, USA)에 넣고 \(1 \mathrm { L } \) 비커에 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris-\(\mathrm{HCl}\) ( \( \mathrm { pH } ~7.0 \))를 \( 900 \mathrm { ~ml } \) 첨가하고, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)인 냉장실에서 2시간마다 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris-\(\mathrm{HCl}\) \(( \mathrm { pH } ~7.0) \)를 갈아주는 것을 2번 반복한 후 3번째에는 12시간 이상 투석을 시행하였다. 투석이 완료된 조효소액은 membrane filter (\(0.45 \mu \mathrm { m } \), Milipore, USA)를 통과시킨 후에 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 냉장 보관하였다.</p> <h2>효소활성 측정</h2> <p>Agarase 활성은 DNS법을 이용하여 측정하였다. DNS법은 3,5-dinitrosalicylic acid method의 변형법으로 환원당을 측정하는 방법이다. DNS solution은 \( \mathrm { NaOH } ~13.2 \mathrm { ~g } ,\) 3,6-dinitrosalicylic acid \( 7.07 \mathrm { ~g } \), sodium sulfate \( 5.53 \mathrm { ~g } \), potassium tartrate (Rochelle salt) \( 204 \mathrm { ~g } \), phenol \( 5.07 \mathrm { ~g } \)을 증류수 \( 1 \mathrm { ~L } \)에 녹여서 제조하였다. \( 1 \mathrm { ~ml } \)의 효소 반응액에 \( 3 \mathrm { ~ml } \)의 DNS solution을 첨가하여 \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분간 가열한 후 \( 550 \mathrm { ~nm } \)의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준적정곡선으로 D-galactose를 사용하였다. 한천분해 효소의 활성은 1분당 \( 1 \mu \mathrm { M } \)의 galactose를 생산하는 한천분해 효소의 양을 1 unit(\( \mathrm { U } \))으로 나타내었다.</p> <h2>pH에 따른 한천분해 효소의 활성측정</h2> <p>\( \mathrm { pH } \)에 따른 한천분해 효소의 활성을 측정하기 위하여 \( 20 \mathrm { mM } \) sodium acetate 완충용액( \( \mathrm { pH } ~4.0-5.0\)), \( 20 \mathrm { mM } \) Tris-\(\mathrm{HCl}\) 완충용액( \( \mathrm { pH } ~5.0-8.0\)), \( 20 \mathrm { mM } \) GTA (3,3-dimethyl-glutamic acid, Tris (hydroxymethyl)-aminomethane, 2amino-2-methyl-1,3-propanediol) 완충용액(\(\mathrm{pH ~8.0-9.0}\))을 이용하였다. \( 0.2 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \)의 agarose가 포함된 모든 완충용액을 중탕 가열한 후 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)를 유지하면서 완충용액 \( 1 \mathrm { ml } \)에 조효소액 \( 0.5 \mathrm { ml } \)을 첨가하여 30분간 반응시킨 후 효소활성을 측정하였다.</p>