LB, TB, M9 배지를 사용하여 37\(^\circ \mathrm{C}\)에서 48시간 동안 배양하며, DMF로 희석하여 HPLC법으로 indigo 농도를 측정하였다. Rhodococcus sp RHA1 유래의 indole oxygenase 유전자를 클로닝하고, E.coli BL21에 발현하였다. 단백질 추출액을 이용하여 SDS-PAGE를 분석하였는데 indole oxygenase로 추정되는 단백질이 잘 발현되는 것을 확인하였고 이 결과는 indole oxygenase의 분자량과도 잘 일치하였다. 또한 청색색소를 고농도로 농축한 추출물을 이용하여 TLC로 분석하면 청색이 발현되는 spot을 확인하였다.
<h2>인디고 생산 배지 및 배양</h2> <p>재조합 대장균에서 indigo가 생성되는 양을 측정하기 위해서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 호기적인 조건에서 LB(Luria-Bertani) 배지, TB(Terrific Broth) 배지, M9최소배지를 각각 사용하여 위의 효소활성도 측정법에서 기술한 내용과 같이 세포를 배양하면서 48시간까지 세포를 배양하면서 sample을 중간에 취하여 원심분리 및 2희 세척 후 적절히 희석하여 DMF에 녹인 다음 그 상등액을 이용하여 HPLC법으로 indigo 농도를 정량하였다. 트립토판을 첨가할 경우, 배양시간 15시간 후에 \( 2.5 \mathrm { ~mM } \)을 첨가하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Indole oxygenase 유전자의 클로닝 및 발현</h2> <p>Rhodococcus sp. RHA1 유래의 미확인 indole oxygenase 유전자를 함유한 plasmid RF0011FOZ를 주형으로 하여 PCR을 수행하여 얻은 \( 1.2 \mathrm { ~kb } \) DNA 단편과 발현벡터 pTrc99A를 제한효소 \( \mathrm { NcoI } \)과 \( \mathrm { HindⅢ } \)로 이중 절단한 후 ligation 하여 \( E.coli \) \( \mathrm { DH } 5 \alpha \)에 형질전환하여 청색을 나타내는 colony를 선별한 후 제한효소 절단 및 DNA 염기서열을 확인하여 미확인 indole oxygenase를 함유하고 있는 재조합 plasmid pTCAN1을 제작하였다. 유전자의 open reading frame은 \( 1,224 \mathrm { ~bp } \)로 구성되어 있으며, 단백질은 407개의 아미노산으로 이루어져 있었다. 한편, pTCAN1에서 \( \operatorname { lacI } ^ { 9 } \)가 제거되어 IPTG의 첨가 없이도 indole oxygensc가 항시 발현되는 재조합 plasmid를 제작하여 pTCAN2라 명명하였으며, 재조합 plasmid pTCAN1과 pTCAN2의 구조는 Fig. 1에 표시하였다. \( E.~coli \) \( \mathrm { DH } 5 \alpha \)/pTCAN1과 pTCAN2의 단백질 추출액을 이용하여 SDS-PAGE를 분석한 결과, Fig. 2에서 보는 것과 같이 \( 45 \mathrm { kDa } \) 아래에 위치한 indole oxygenase로 추정되는 단백질이 잘 발현되는 것을 확인하였으며, 이 결과는 이론적으로 추정되는 indole oxygenase의 분자량 \( 44 \mathrm { ~kD } \)과 잘 일치함을 알 수 있었다.</p> <h2>인디고 색소의 확인</h2> <p>\( \mathrm { LB } \) 한천 평판배지에서 군락의 색깔을 비교해보면, \( E.~coli \) \( \mathrm { DH } 5 \alpha \)/pTCAN2는 대조균인 \( E.coli \) \( \mathrm { DH } 5 \alpha \)/pTrc99A와는 다른 청색의 군락을 형성하였다. 이 재조합 균주를 LB 액체배지에서 배양 후 추출/정제된 청색색소와 Sigma사에서 구입한 합성 indigo를 표준품으로 하여 각각 DMF 용매에 녹인 다음 분광광도계를 이용하여 \( 400 \sim700 \mathrm { ~nm } \) 까지 scan한 결과, 두 sample 모두 \( 610 \sim611 \mathrm { ~nm } \)에서 최대 흡광도를 나타내며 scanning profile이 동일한 형태임을 확인하였다. 동일한 2가지 sample을 HPLC에 주입하여 분석한 결과, 두 sample 모두 체류시간 12분대에 main peak을 보여주었다. 또한, 청색색소를 고농도로 농축한 추출물을 이용하여 TLC로 분석한 결과, Fig. 3E와 같이 합성된 표준품 indigo와 같은 위치에서 청색을 나타내는 spot을 확인하였다. 이러한 결과는, 재조합 대장균에서 생산된 청색색소는 indigo임을 보여주며, Rhodococcus sp. RHA1 유래의 미확인 indole oxygenase는 기능적으로 활성을 갖는 indole을 산화하여 indigo를 생성하는 효소임을 나타내는 것이다. 한편, TLC상에서 청색 indigo 뿐만 아니라 pink색의 indirubin으로 추정되는 색소를 생성하는 것으로 확인이 되었으며, 이는 본 연구에서 cloning한 indole oxygenase가 indole을 기질로 하여 product로 indigo 뿐만 아니라 indirubin을 생성할 수 있음을 보여주었다.</p>