Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법에 따라 측정하고, 항염증 효과 측정은 nitric oxide(\( \mathrm{NO} \))의 농도를 측정하는 방법으로 \( \mathrm{NO} \)의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 griess reagent를 이용하여 측정하였다.
<h2>미백효과 측정</h2> <p>Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 \( 0.175 \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 6.8)\) \( 500 \mu \mathrm{l} \)에 \( 10 \mathrm{mM}\) L-DOPA를 녹인 기질액 \( 200 \mu \mathrm{l} \) 및 시료용액 \( 100 \mu \)의 혼합액에 mushroom tyrosinase (\(110 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) 200 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 \( 475 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. Tyrosinase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 한편, immnunoflurecence를 이용한 미백효과 측정은 B16F10 세포를 Lab-tek chamber 8 well에 세포를 \( 1 \times 10^{6} \)개로 분주하여 24시간 안정시킨 뒤, 시료를 농도 별로 처리한다. 24-48시간이 지난 뒤 차가운 phosphate buffer saline (PBS) 완충용액으로 3회 세척한 뒤 \( 0.5 \% \) triton X-100을 10분간 가하여 세포를 투과하였다. 다시 PBS 완충용액으로 3회 세척한 뒤 \( 1 \% \) bovine serum albumin을 넣어 1시간 동안 방치하였다. Primary anti-body(tyroisnase 1:100, microphthalmia-associated transcription factor (MITF) 1:100)를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 over night하였다. 1차 반응이 끝나면 PBS로 3차 세척 후 alexa flour 568 goat anti-mouse IgG (1: 1,000)을 첨가하고 차광하여 1시간 동안 반응시켰다. 40분 후에 DAPI를 \( 200 \mu \mathrm{l} \) 씩 well에 첨가하였다. PBS 완충용액으로 4회 세척 후 chamber를 제거한 후 slide에 mounting solution을 첨가하여 커버 슬립으로 고정하여 관찰을 하였다.</p> <h2>항염증 효과 측정</h2> <p>항염증 효과 측정은 nitric oxide (\( \mathrm{NO} \))의 농도를 측정하는 방법으로 \( \mathrm{NO} \) 의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 griess reagent를 이용하여 측정하였다. RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 \( 5 \times 10^{1} \mathrm{cells} / \mathrm{ml} \)로 조절한 후 12 well plate에 접종하고, \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24시간 전 배양하였다. 세포에 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 lipopolysaccharide (LPS)를 처리하고 1시간 뒤에 \( 0.01-1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 대추 및 포도 발효물을 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액의 상층액을 얻은 후 griess 시약과 반응시킨 후 ELISA reader로 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 \( \mathrm{NO} \) 생성율을 백분율로 표시하였다.</p>