mRNA 분리와 cDNA합성을 위해 뇌하수체를 살아있는 돌돔에서 분리하여 마이크로 튜브에 넣어 사용전 냉동 보관 하였다. 젠뱅크에 등록되어 있는 SL 염기서열을 이용하여 3'과 5' 말단SL cDNA을 증폭하였다. 증폭된 말단들을 cDNA를 cloning하기 위해 PCR 산물을 프로토콜에 따라 분리하고 \( 16^{\circ} \mathrm{C} \)도에서 24시간동안 ligation 하였다. plasmid DNA를 염기서열을 분석한것은 완전한 SL DNA를 갖고 있는지 확인하기 위함이다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>mRNA 분리와 cDNA합성</h2> <p>살아있는 돌돔을 마취시켜 뇌하수체를 분리하여 멸균된 microcentrifuge tube에 넣고 사용하기 전까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보 관하였다. Messenger RNA는 Micro-FastTrack (TM-rRNA) isolation kit (Invitrogen, USA)을 이용하여 분리하였다. 분리된 mRNA를 이용하여 first-strand cDNA를 double strand cDNA synthesis kit (Promega, USA)의 protocol에 따라 합성하였다.</p> <h2>Rapid amplification of cDNA ends (RACE)를 이용한 3'과 5' 말단SL cDNA의 증폭</h2> <p>돌돔 SL cDNA를 클로닝하기 위해 GenBank에 등록되어 있는 경골어류에서 밝혀진 SL 염기서열을 이용하여 multiple alignment를 수행하고 SL염기서열중 가장 잘 보존된 영역에서 PCR 증폭을 위한 forward primer인 SL-F (5'-CTC AAC AAG ACY(T/C) AAG TGG GT-3')와 re-verse primerol SL-R (5'-ACC ACT TR(G/A) CTC TTG TTG AG-3')을 제작하였다. 돌돔 SL cDNA 3' 말단 부위를 증폭하기 위한 PCR 반응은 \( 50 \mathrm{ng}\) 의 first strand cDNA, \(1 \mu \mathrm{M} \) SL-F와 oligo \( (\mathrm{dT})_{18}\) primer, dNTPs, \( 10 \times\) pfu poly-merase buffer,2.5 unitof cloned pfu polymerase (Strata-gene, USA) 혼합액에 멸균된 증류수를 가하여 최종 부피를 \( 50 \mu \ell\) 로 맞추고 DNA minicycler (PTC-150; Mj Re-search)를 사용하여 PCR 증폭하였다. 3' 말단 돌돔 SL cDNA 증폭은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분간 predenaturation, \( 94^{\circ} \mathrm{C}\) 에서 30초간 denaturation, \( 45^{\circ} \mathrm{C}\) 에서 30초간 primer annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C}\) 에서 1분간 extension을 30회 반복하고, 최종 \( 72^{\circ} \mathrm{C}\) 에서 10분간 extension 하였다.</p> <p>5' 말단 SL cDNA를 증폭하기 위해 first strand cDNA의 3' 말단에 dGTP, \( 5 \times \mathrm{TdT}\) reaction buffer, terminal de-oxynucleotidyltransferase (Amersham Pharmacia, UK) 혼합액을 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\) 에서 30분간 반응하여 poly(G) tail을 부착하였다. 이 DNA를 주형으로 SL-R과 oligo \( (\mathrm{dC})_{18}\) primer를 이용하여 PCR 증폭하였다. PCR 반응은 \( 72^{\circ} \mathrm{C}\) 에서 30초를 제외하고 3' 말단 증폭조건과 동일하게 수행하였다. 증폭된 5' 과 3' 말단 PCR 산물을 \( 1.2 \% \) agarose gel 전기영동을 수행하여 증폭된 산물의 크기를 확인하였다.</p> <h2>SL cDNA의 클로닝과 DNA 염기서열 분석</h2> <p>증폭된 3' 말단과 5' 말단 cDNA를 cloning하기 위해 PCR 산물을 AccuPrep TM gel purification kit (Bioneer, Ko rea) protocol에 따라 분리하고, HincII로 잘린 pBluescript II SK (-) vector에 T4 DNA ligase (Takara, Japan)를 이용하여 \( 16^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 하루동안 ligation 하였다. 다음날 E. coli DH5a에 형질전환하고 a-complementation 선택배지에 도말하여 배양하였다. 이중 white colony를 선택하여 ampicillin이 첨가된 LB broth에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\) 에서 하룻밤 배양하였다. 배양액을 \( 1.5 \mathrm{ml} \) microcentrifuge tube에 담아 원심분리하여 bacteria pellet을 수집하고, AccuPrep \( { }^{TM}\) plasmid extraction kit (Bioneer, Korea)을 이용하여 plasmid DNA를 분리하였다. 분리된 plasmid내 SL cDNA 염기서열 분석은 dye terminator cycle sequencing kit과 ABI 377 DNA sequencer를 사용하고, sequencing 을 위한 primer는 pBS II SK(-) vector내 multiple cloning site의 SK와 T7을 이용하여 (주)마크로젠에 의뢰하여 분석하였다.</p> <h2>E. coli BL21(DE3)에서 SL 단백질 발현</h2> <p>돌돔 SL을 암호화하는 open reading frame \( (\mathrm{ORF}) \) 을 클로닝하기 위해 분석된 돌돔 SL cDNA염기서열에 기초하여 각각 제한효소 Nde \( \mathrm{I} \) 과 BamII 부위를 포함하는 OFSL-N (5'-GAG ACA TAT GCA CAT AAT GAC AGC CAT G-3') 과 OFSL-C (5'-GAG AGG ATC CTT ATG CGC AGT IGT ATT TCT CAG-3') primer를 제작하여 ORF의 증폭에 이용하였다. 증폭된 산물은 HincII로 잘린 pBluescript II SK (-) vector에 subcloning한 다음 제한효소 NdeI과 BamHI으로 double digestion하여 SL ORF를 분리하고 동일 제한호소로 잘린 pET-11a vector (Novagen, USA)에 클로닝하였다. 이를 E. coli DH5a에 형질전환하고 ampicillin이 첨가된 LB agar에 배양하여 자란 colony를 ampicillin이 함유된 LB broth에 접종후 plasmid DNA를 분리하였다. 분리된 plasmid DNA가 완전한 SL DNA를 갖고 있는지 염기서열을 분석하였다.</p> <p>pET-11a에 cloning된 SL cDNA를 E. coli BL21(DE3)에 형질전환한 후 얻은 colony를 ampicillin이 들어있는 LB broth \( 5 \mathrm{ml} \) 에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 밤새 배양하였다. 이를 다음날 새로운 LB-ampicillin broth \( 5 \mathrm{ml} \) 에 \( 1 / 10 \) 희석하여 접종하고 \( \mathrm{OD}_{600}=0.6 \) 까지 배양하였다. 여기에 \( 100 \mathrm{mM} \) IPTG(Isoprophy thiogalactophyranoside)를 최종농도 \( 0.4 \mathrm{mM} \) 이 되도록 넣어 재조합 SL 단백질의 발현이 유도되도록 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3 시간동안 배양하였다. 이 배양액을 원심분리하여 cell을 수집하고 \( 50 \mathrm{mM} Tris\) - \( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} 8.0\)), \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA buffer에 부유한 후. \( 2 \times \) SDS sample buffer를 가하여 lysis 시켰다. Cell lysate는 \( 12 \% \) SDS-PAGE에 전기 영동하여 발현된 SL 단백질의 band를 확인하였다.</p>