임상적으로 중요한 캔디다들에 대한 S. baicalensis 수용성 추출물의 항진균 활성을 resazurin을 이용한 미량희석법으로 분석했다. S. baicalensis는 24시간 동안 노출시킨 바이오필름을 효과적으로 제거하며, 실험군에서는 대조군에 비해 둥글고 팽창된 세포가 많이 관찰되었다. 이러한 세포의 형태적 변화는 FUN-1과 Calcofluor white를 동시에 사용하여 형광 현미경으로 관찰하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <p>임상적으로 중요한 캔디다인 C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis 에 대하여 S. baicalensis 수용성 추출물의 항진균 활성을 resazurin을 적용한 미량희석법에 의해 분석하였다(Table 1). 식물 추출물은 다양한 화합물을 포함하므로 단일 성분보다 높은 시너지 항진균 효과를 내는 장점을 가지지만, 많은 식물 추출물이 진한 색을 띠거나 실험을 할 때 불용성 침전물을 형성하는 경우가 많아 결과에 대한 해석을 방해하는 경우가 많다. 따라서 본 실험에서는 resazurin을 포함시켜 탁도에 의존하는 CLSI A27-3의 기존 방법을 보완하였다. resazurin은 무독성의 염료로서 살아있는 세포에 의해 resorufin으로 환원되어 무형광의 파란색에서 형광의 분홍색으로 변하므로, 색변화가 나타나지 않는 최저 농도가 MIC이며 보다 객관적인 결과를 보여준다. S. baicalensis의 C. albicans ATCC 18804 에 대한 MIC는 \( 1.56 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 이었고, 분석에 이용한 다른 Candida sp. 보다 높은 MIC 값을 나타냈다. S. baicalensis의 10가지 C. albicans 임상분리 균주에 대한 MIC 또한 표준 C. albicans로 사용된 C. albicans ATCC 18804 와 모두 동일한 \( 1.56 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 을 나타냈다(Table 1).</p> <p>임상 C. albicans 분리 균주들이 3시간 동안 형성한 각 바이오필름에 대해 S. baicalensis의 바이오필름 제거효과를 조사하였다. 24시간 동안 S. baicalensis에 노출된 바이오필름은 MIC에서 \( 57.7 \pm 17.3 \% \), 2MIC에서 \( 79.7 \pm 8.2 \% \)가 제거되었고, Paired-t test로 분석한 대조군과의 차이는 대부분 \( 95 \% \) 또는 \( 99 \% \) 수준에서 유의성을 나타냈다(Table 2).</p> <p>C. albicans의 폴리스티렌 표면 부착에 대한 S. baical-ensis의 영향을 알아보기 위해 3시간 동안 형성된 바이오필름에 S. baicalensis를 처리한 후의 바이오필름 변화를 위상차 현미경을 통해 분석하였다. 3시간과 24시간 후 관찰된 S. baicalensis의 바이오필름 제거효과는 우수했으며 전형적인 난원형의 대조군에 비해 실험군에서는 둥글고 팽창된 모습을 나타내는 세포가 많이 관찰되었다(Fig. 1).</p> <p>S. baicalensis를 처리한 실험군의 세포형이 대부분 둥글고 안정적으로 부착되지 않은 형태에 착안하여 효모 세포벽의 \( (1,3)-\beta \)-D-glucan polymer 형성에 관여하는 \( (1,3)-\beta \)-D-glucan synthase 활성에 미치는 S. baicalensis의 효과를 분석하였다. Fig. 2에 보여지는 바와 같이 \( 1.56 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 S. baicalensis의 존재하에서 형성된 \( (1,3)-\beta \)-D-glucan polymer의 양은 대조군에 비해 \( 67.4 \pm 3.1 \% \) 로 감소되었으며 \( 3.12 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 S. baicalensis 존재하에서는 \( 42.4 \pm 1.0 \% \) 로 1,3 - \( \beta \)-D-glucan polymer의 형성량이 급감하였다. 또한 (1,3)- \( \beta \)-D-glucan synthase의 활성은 S. baicalensis의 존재하에서 농도-의존적으로 감소하였다.</p> <p>S. baicalensis의 C. albicans 세포에 대한 형태적 변화 효과를 관찰하기 위해 FUN-1과 Calcofluor white를 동시에 염색시켜 triple pass filter가 장착된 형광현미경을 통해 관찰하였다. Calcofluor white는 살아있거나 죽은 세포의 세포벽을 형광의 파란색으로 염색시킨다. FUN-1은 세포막을 통과할 수 있는 형광 probe로서 대사적으로 활발한 효모는 세포질에 붉은 CIVS(cylindrical intravacuolar structure)를 나타내지만 죽은 세포의 세포질은 옅은 담황색의 형광으로 염색시키므로 효모의 대사와 생존여부를 관찰하기에 적합하다. Fig. 3A에 보여지는 바와 같이 대조군의 현미경적인 이미지는 정상적인 출아 형태를 나타내고 있으며 붉은 색의 세포내 CIVS를 보여줌으로써 이들 세포가 대사적으로 활발함을 시사한다. S. baicalenis를 처리한 실험군(Fig. 3B)은 대부분 둥글고 부풀어 확장된 풍선형을 나타냈으며, 붉은 색의 CIVS를 함유하는 세포는 소수로 발견되었다. 실험군은 또한 C. albicans의 밀도가 낮았고, 세포 주변의 외액을 흡수한 듯 팽창된 형태를 나타내는 세포가 많았다. 이들은 또한 Calcofluor white에 의해 진하게 세포벽이 염색되는 특징을 나타냈다. C. albicans의 생존여부와 세포형태를 관찰하기 위한 다른 방법으로 C. albicans를 neutral red로 염색한 후 위상차 현미경으로 관찰하였다. Neutral red는 생체염료로서 죽은 세포는 세포질 전체가 붉게 염색되나 살아 있는 세포는 세포질 내의 vacuole만이 붉게 염색된다. Fig. 3C의 대조군은 정상적인 난원형이며 세포질 내에 붉은 vacuole이 관찰되었으나, Fig. 3D에 보여지는 바와 같이 실험군에서는 세포질 전체가 어둡게 염색된 세포가 발견되거나 세포벽이 파열되어 흩어져 있는 cell debris가 여러 곳에 관찰되었고, 사진은 그 중 하나를 나타낸다.</p>