CBS 시스템의 DGGE를 사용하여 LB 액체배지를 이용해 \( 10 ^ { -3 } -10 ^ { -7 } \)으로 연속희석을 한 홍어회 현탁액의 PCR 산물 분석을 분석하였다. PCR 산물의 계통수 분석은 neighborjoining method를 이용하였다. NCBI의 BLAST를 이용하여 63개의 삽입 DNA 플라스미드의 상동성을 조사한 결과, 홍어회에 서식하는 미생물들을 동정할 수 있었으며 총 12종류의 DNA 염기서열을 발견할 수 있었다.
<h2>변성 구배 젤 전기영동 (DGGE)</h2> <p>CBS 시스템의 DGGE를 사용하여 PCR 산물을 분석하였다. \( 7 \mathrm { M } \) urea와 \( 40 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) formamide를 변성제 \( 100 \% \)로 정하고, \( 8 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \)의 폴리아크릴아마이드 젤에 urea와 formamide 농도구배가 \( 40 \%-80 \% \)로 형성되도록 하였다. 1X TAE를 사용하여 \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 80 \mathrm { ~V } \)로 16시간 동안 전기영동한 후 EtBr로 DNA를 염색하여 분석하였다.</p> <h2>평판배양</h2> <p>홍어회 현탁액을 LB 액체배지를 이용하여 \( 10 ^ { -3 } -10 ^ { -7 } \)으로 연속희석을 하였다. 각각의 희석배수에서 희석액을 MacConkey 한천평판배지( \( \mathrm { pH } 7.1 \)), MRS 한천평판배지 \( \mathrm { pH } 6.5 \)), Plate Count agar(PCA, \( \mathrm { pH } 7.0 \)) 평판배지에 도말한 후 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 36시간 동안 배양하였다. 평판배지에서 형성된 집락을 338F와 518R 프라이머 세트로 PCR 반응을 수행하였다. 증폭된 산물의 염기서열을 결정한 후 BLAST를 이용하여 동정하였다.</p> <h2>계통수 분석</h2> <p>PCR 산물을 DNA 염기서열 분석을 하여 얻은 서열을 BLAST와 EZtaxon server version 2.1을 이용하여 균주를 확인하였다. 서열 정렬은 Bioedit를 사용하였다. 갭과 모호한 부분은 분석에서 제외했다. 계통수 분석은 neighborjoining method를 이용하여 수행하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>16S rDNA 절편 라이브러리 분석에 의한 홍어회 서식 미생물의 분석</h2> <p>16S rDNA의 서열을 분석하여 미생물의 존재를 확인할 수 있는 배양 비의존적 방법은 실험실 조건에서 미생물을 분리하고 유지시키며 또한 증식시키는 과정 없이 특정한 생태계에 존재하는 미생물들을 확인할 수 있는 장점을 갖고 있다. 따라서 발효된 홍어(홍어회)에 존재하는 박테리아 집단의 다양성을 확인하기 위해, 338F와 518R 프라이머 세트를 이용한 PCR 반응에 의해 \( 181 \mathrm { bp } \) 크기의 박테리아 16S rDNA 절편들을 증폭하였고, 이를 pUC18에 클로닝하여 라이브러리를 구축하였다. 또한 X-Gal과 IPTG가 첨가된 LB 한천 배지에서 흰색 집락을 형성하는 72개의 클론을 라이브러리로부터 무작위로 선별하여, 이들 클론으로부터 플라스미드를 각각 분리하였다. 72개의 클론으로부터 분리한 플라스미드들을 염기서열을 분석한 결과 63개의 플라스미드는 삽입된 절편 DNA가 들어 있었으나, 9개의 플라스미드에는 삽입된 절편 DNA가 없이 pUC18 자체가 분리되었다. 따라서 63개의 삽입 DNA 서열에 대해 NCBI의 BLAST를 이용하여 상동성을 조사함으로써 홍어회에 서식하는 미생물들을 동정하였다. 63개의 플라스미드들을 분석한 결과, 12종류의 DNA 염기서열을 발견하였다. 12종류의 염기서열들이 동일한 확률로 존재하는 것은 아니었다. 예를 들어 특정한 염기서열 은 63개의 염기서열 중 36개의 클론에 동일한 삽입체가 들어 있어서 전체 라이브러리에서 \( 36 / 63 = 57.1 \% \)의 비율로 존재하고 있음을 알 수 있었다. 이들 36개의 클론들(클론 3, 4, 6, 10, 11, 14, 15, 16, 20, 25, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 37, 38, 41, 42, 43, 45, 46, 50, 51, 56, 57, 58, 60, 62, 63, 64, 68, 69, 71, 72)의 염기서열을 BLAST를 이용하여 분석한 결과, \( 95 \% \)의 유사성을 갖고서 uncultured bacterium clone 054E11.b로 동정되었다. 6종류의 클론들(클론 7, 8, 21, 22, 54, 59)이 동일한 서열을 갖고 있었으며, 이들은 전체 라이브러리에서 \( 6 / 63=9.5 \% \)의 비율로 존재하고 있었다. BLAST 분석한 결과 이들은 \( 100 \% \)의 유사성을 갖고 uncultured bacterium clone 13/4/10H로 동정되었다.</p>