형질전환 효모를 aureobacidin A와 함께 배양하고 원심분리를 통해 균체를 회수한 후, 그 균체에 Tris-HCl 버퍼를 첨가하여 sonication으로 파쇄하였다. 그 후 상층액을 분리하여 세포추출액으로 이용하였다. 동시에, 원심분리를 통해 플라스미드 DNA를 침전시키고, 차가운 에탄올로 세정한 후 건조시켜 녹였다. 이 세포추출액은 5분간 끓인 후 gel에 주입하였고, Coomassie brilliant blue R-250으로 염색하여 관찰하였다.
<h2>형질전환 효모로부터 플라스미드 DNA의 분리 및 박테리오신 OR-7 유전자 확인</h2> <p>형질전환 효모를 aureobacidin A(Takara, Korea)(최종농도 \( 0.2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 가 첨가된 YPD 배지 \( 4 \mathrm{ml} \) 에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 하룻밤 동안 배양한 후, 원심분리 \( (14,000 \times \mathrm{g}, 5 \) 분)하여 균체를 회수하였다. 여기에 yeast lysis buffer(2\% Triton X-100, \( 1 \% \) SDS, \( 10 \mathrm{mM} \) tris- \( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} 8.0) \) buffer, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA) \( 200 \mu \mathrm{1} \) 를 넣어 균체를 현탁시킨 후, acid-washed glass beads (425-600 \( \mu \mathrm{m} \), Sigma, MO, USA) \( 0.3 \mathrm{~g} \) 과 phenol/ \( \mathrm{CHCl}_{3} \) 용액 \( 200 \mu \mathrm{1} \) 를 넣고 2 분간 vortex하였다. \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 원심분리 \( (14,000 \times \mathrm{g}, 10 \) 분 \( ) \) 를 행하여 상층액을 새로운 tube에 옮기고, 여기에 glycogen \( 1 \mu \mathrm{l}, 5 \mathrm{M} \mathrm{LiCl} \) 용액 \( 20 \mu \mathrm{l} \), 차가운 에탄올 \( 500 \mu \mathrm{I} \) 를 넣은 후, 원심분리 \( (14,000 \times \mathrm{g}, 10 \) 분)를 행하여 플라스미드 \( \mathrm{DNA} \) 를 침전시켰다. 침전된 DNA는 차가운 \( 70 \% \) 에탄올로 세정한 후 건조시키고, 멸균 초순수 \( \left(\mathrm{ddH}_{2} \mathrm{O}\right) 20 \mu \mathrm{l} \)에 녹였다.</p> <p>효모로부터 플라스미드 DNA를 회수한 후에 OR-7 유전자 단편의 확인은 pAUR123 vector에 특이적인 primer set을 이용한 PCR (polymerase chain reaction) 법으로 행하였다. 회수된 플라스미드 DNA \( 50 \mathrm{ng} \) 과 forward primer pAUR123-F (5'-TCTGCACAATATTTCAAGC-3')와 pAUR123-R (5'-TTCGTTTTAAAACCTAAGAGTCAC-3')을 사용하여 \( \mathrm{PCR} \) 반응을 행하였고 염기서열 분석으로 확인하였다. PCR 반응산물은 \( 12 \% \) 의 polyacrylamide gel에서 전기영동하여 그 위치를 확인하였다.</p> <h2>형질전환 효모의 OR-7 단백질의 생산 확인</h2> <p>형질전환 효모를 aureobacidin \( \mathrm{A} \) (Takara, Korea)(최종농도\( 0.2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) )가 첨가된 \( \mathrm{YPD} \) 배지 \( 4 \mathrm{ml} \) 에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 일간 배양 후, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 원심분리 \( (14,000 \times \mathrm{g}, 5 \) 분 \( ) \) 하여 균체를 회수하였다. 여기에 \( 20 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} 7.5) \) buffer를 첨가하여 재현탁시킨 후, sonication을 행하여 균체를 파쇄한 후, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 원심분리 \( (14,000 \times \mathrm{g}, 20 \) 분 \( ) \) 를 행한 후 상층액을 분리하여 세포추출액으로 하였다. SDS-PAGE는 15\% polyacrylamide gel을 이용하여 Laemmli의 방법으로 행하였다. 세포추출액을 5분간 끓인 후 gel에 주입하였고 Coomassie brilliant blue R-250(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)으로 염색한 후 관찰하였다.</p>