이 연구에서는 12개월 및 27개월령의 동물을 사용하여 SDH 및 TPI 유전자의 비육 전·후기 발현양상을 분석하였으며, 유전자 발현양상과 근내지방함량 간의 관련성을 확인하기 위해 28~30개월령의 동기우 50두를 사용하였다. 유전자 발현분석을 위해 추출된 RNA는 RNeasy MiniElute cleanup kit을 사용하여 정제한 후 cDNA 합성에 사용되었다. 또한, ANOVA(analysis of variance) 모델을 활용하여 유전자 발현량과 근내지방함량 간의 관계를 분석하였으며, 사용한 모형은 R statistical program에서 구현되었다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>공시재료</h2><p>SDH 및 TPI 유전자의 비육 전·후기 발현양상 분석을 위하여 12개월 및 27개월령 각 3두를 공시하였고, 유전자의 발현양상과 근내지방함량과의 관련성 분석을 위하여 국립축산과학원에서 동일한 조건으로 사양된 28~30개월령의 동기우 50두(체중 \( 664 \pm 32 \mathrm{kg} \))를 분석에 사용하였다. 모든 등심사료는 도축후 30분 이내에 채취하여 액체질소를 이용 즉시 동결하고, 사용 전 까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하면서 실험에 이용하였으며, 지방함량 측정은 시료 \( 1 \mathrm{g} \)을 이용 Folch 등의 방법에 기초하여 수행하였다.</p><h2>총 RNA 추출 및 cDNA 합성</h2><p>등심 육으로부터 총 RNA는 TRIzol을 이용하여 다음과 같이 진행하였다. 액체질소를 이용하여 곱게 마쇄한 시료 \( 0.1 \)\( \mathrm{g} \)에 TRIzol reagent \( 1 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 잘 혼합한 후 10분간\( 13,000 \mathrm{rpm} \)에서 원심분리한 후 상등액을 취하였다. 얻어진 상등액에 chloroform \( 0.2 \mathrm{ml} \)를 첨가하고 혼합한 후 \( 13,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리하여 다시 상등액을 취하고, 상등액에 동량의 isopropanol 첨가 후 원심분리하여 RNA pellet를 획득하였다. 획득된 RNA pellet은 \( 70 \% \) 에탄올을 이용하여 세척한후 건조하고, DEPC를 처리한 멸균증류수에 녹여 사용하였다.유전자 발현분석을 위하여 추출된 총 RNA는 RNeasy MiniElute cleanup kit(Qiagen Co., Ltd., USA)을 이용하여 정제 후 cDNA 합성에 이용하였다.</p><p>조직으로부터 추출된 총 RNA는 유전자 발현분석을 위한 cDNA 합성에 이용하였다. 총 RNA \( 2 \mu \mathrm{g} \)에 random primer(Promega, USA)\( 1 \mu \mathrm{l}, 2.5 \mathrm{mM} \) dNTP \( 1 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하고, DEPC를 처리한 증류수로 총 \( 12 \mu \mathrm{l} \)가 되도록 하였다. \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 변성 후 즉시 얼음 위에서 냉각한 후 \( 5 \times \) buffer \( 4 \mu 1,0.1 \mathrm{M} \) DTT \( 2 \mu \mathrm{l} \), RNase inhibitor(Promega) \( 0.5 \mathrm{U} \) 및 reverse transcriptase(SuperScript II Reverse Transcriptase, Invitrogen, USA) \( 1 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하여 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60분간 반응시킨 후, \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 반응시켜 reverse transcriptase를 불활성화 시킨 후 real-time PCR의 주형으로 사용하였다.</p><h3>Real-time PCR을 통한 유전자 발현분석</h3><p>유전자의 발현양상을 분석하기 위하여 Real-time RT-PCR법을 이용하였다. 시료로부터 추출된 총 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하고, 합성된 cDNA \( 0.2 \mu \mathrm{g} \)을 주형으로 2X Power SYBR Green PCR Master mix(Applied Biosystems,UK)와 각각의 primer set을 이용하여 7500 Real time PCR system(Applied Biosystems)을 통하여 분석하였다. SDH(5'TCCTGCAGACCCGGAGATAAAGTT-3', 5'-TCGCAGTTCCGATGTCCTTATGCT-3') 및 TPI(5'-AACAGGCCCAGGAAGTACACGAAA-3', 5'-TCAACGAACTCAGGCTTGAGGGAA-3') 유전자 분석에 사용된 primer는 GenBank에 등록된 염기서열(NM_174178, NM_001013589.2)을 기준으로 제작되었다. 각 PCR 반응은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 예비 변성한 후 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분간 40회 반복하여 수행하였다. PCR 반응 종결 후 melting curve 작성을 통하여 유전자 증폭의 정확성을 재확인하였다. 유전자 발현량의 내부 보정을 위하여 Genbank에 등록된(BC102589) house keeping 유전자인 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 이용하였고, 유전자 발현량은 2-\( \Delta \mathrm{Ct}\)값을 이용하여 계산하였다. 내부 보정용 유전자로 사용된 GAPDH 유전자의 발현은 5'-GGGTCATCATCTCTGCACCT-3'와 5'-GGTCATAAGTCCCTCCACGA-3'의 primer를 이용하여 분석하였고, 발현량(\(\mathrm{Ct}\))은 25~26의 범위로 각 개체별 유사한 값을 가짐을 확인 후 사용하였다.</p><h2>통계분석</h2><p>유전자의 발현량이 근내지방함량에 미치는 영향을 분석을 위하여 R statistical program의 ANOVA(analysis of variance) 모델을 활용하여 분석하였고, 분석에 사용한 모형은 다음과 같다.</p><p>Fat\( _{\mathrm{i}}=\mu+ \) Expression\( _{\mathrm{i}}+ \) Age \( _{\mathrm{ij}}+e_{\mathrm{i} \mathrm{j}} \)</p><p>여기서, Fat\(_{\mathrm{i}} \)는 근내지방함량, \( \mu\)는 전체 평균, Expression\(_{\mathrm{i}}\)은 각 유전자의 발현량(2-\( \Delta \mathrm{Ct})\), Age\(_{\mathrm{ij}} \)는 도축연령(개월) 및 \(e_{\mathrm{ij}} \)는 임의의 오차를 나타낸다.</p>