본 연구실의 경험에서도 4 DIV 대뇌피질 신경세포에 대한 TCDD의 세포독성을 조사한 결과, \(\mathrm100{ml}\)의 배지 96-well culture plate에서 500, 800, 1000, 1500 cells\(/\mathrm {mm}^{2}\)의 세포밀도 가운데서도, 1,000 cells/\(\mathrm{mm}^{2}\)에서 가장 높은 치사율 \(\mathrm14.9\%\) cell death을 나타내었는데, 이것으로 본 연구에서는 1,000 cells\(/\mathrm{ mm}^{2}\)의 밀도에서 4DIV세포를 이용하여 TCDD의 세포독성을 조사하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>대뇌피질 신경세포에 대한 TCDD의 세포독성</h2> <p>신경세포배양에서 세포의 생존률은 plating한 세포의 밀도에 따라 차이가 난다. 본 연구실의 경혐에서도 4 DIV 대뇌피질 신경세포에 대한 TCDD의 세포독성을 조사한 결과 100 \( \mathrm { ml } \) 의 배지 96-well culture plate에서 500, 800, 1000, 1500 cells \( / \mathrm { mm } ^ { 2 } \) 의 세포밀도 가운데 1,000 cells/ \( \mathrm { mm } ^ { 2 } \)에서 가장 높은 치사율14.9% cell death)을 나타내었다. 따라서 본 연구에서는 1,000 cells \( / \mathrm { mm } ^ { 2 } \) 의 밀도에서 4DIV세포를 이용하여 TCDD의 세포독성을 조사하였다. 5,10,20,50 \( \mathrm { nM } \) 의 TCDD 가 포함된 배지에서 배양할 경우 TCDD가 포함되지 않온 대조군에 비하여 각각 88.8,83.6,78.5,78.6% 의 생존율을 나타내었다(MTT assay, \( \mathrm { n } \) = 8 ) (Fig. 1). 한편 TCDD stock 용액의 용매인 toluene을 첨가한 대조군 [최종농도 \( = \) 배지의 1.6 %( \( \mathrm { v } / \mathrm { v } )] \) 도 6.2 % 의 치사율을 나타내었으나, 아무 처리도 하지 않은 대조군가 비교할 경우 통계학적 의미는 없었다(Fig. 1, Veh.). vehicle을 대조군으로 하여 각각의 생존율의 통계학적 유의성을 조사한 결과 10 \( \mathrm { nM } \) 농도에서는 약간 유의하였으며(p=0.059, n=8 , Mann-Whitney U test), 20 및 50 \( \mathrm { nM } \)에서의 치사율은 매우 유의하였다 \( ( \mathrm { p }<0.01) \). 이 결과는 \( 0 \sim 50 \mathrm { nM } \) 의 농도에서 TCDD가 농도 의존적 세포독성이 있음을 보여준다.</p> <h2>배양한 대뇌세포의 CNP \(1,2 \)의 면역염색반응</h2> <p>세포독성물질은 신경세포에 뿐만 아니라 신경교세포에도 영향을 미칠 것으로 예상되기 때문에 oligodendrocyte의 표지 단백질로 알려진 2',3'-Cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNPase; E.C. 3.1.4.37) 발현의 변화를 조사하였다. CNPase는 in vitro에서 2',3'-cyclic nucleotides의 3'-phosphodiester bond를 가수분해하여 2'-nucleotide를 생성한다. 생체 내에서는 oligodendrocyte에서 많이 발현 되나 기능에 대하여는 알려진 바가 없다. CNPase의 두가지 isoform인 CNP1 과 CNP2 는 하나의 유전자에서부터 alternative splicing에 의하여 만들어진다. CNP2 는 N-말 단에 20개의 아미노산이 더 있으며 in vivo에서 인산화된다. 본 연구에서는 CNP1과 2를 동시에 인식하는 항체를 사용하였다. 흰쥐의 대뇌세포들을 배양하여 CNP1과 2에 대한 면역염색한 결과들 Fig. 2에 나타내었다. CNP1과2의 면역염색반응올 강하게 나타내는 세포는 전체 세포 수의 10%가량 되었으며, axon은 보이지 않았고. 가지들이 여러 방향으로 많이 분지되는 양상을 보였다(Fig. 2, arrows). 이러한 형태는 CNPase가 oligodendrocyte의 표지 단백질이라는 사실과 더불어 이 세포돌이 oligodendrocyte일 가능성을 보여준다. 그러나 astrocyte도 이와 매우 유사한 형태를 보이기 때문에 이 결과만으로는 확정적으로 동정하기에는 미흡한 점이 있다. 한편 신경세포도 약하지만 양성반응을 보였다. 신경세포에서는 soma와 dendrite에 상대적으로 강한 면역염색반응을 나타내었다(Fig. 2, arrowhead N). 신경세포에서 CNPase의 발현에 관한 보고는 아직 없으나 본 연구결과는 CNPase가 신경세포에서도 발현됨을 시사한다.</p>