결정된 염기서열은 BLAST search를 통해 분석하였고 미생물간의 상동성과 유전적 계통분류를 수행하였다. 또한 미생물의 군집 크기를 정량적으로 평가하기 위해 qPCR을 수행하였다. 염기서열이 확인된 plasmid DNA는 real-time PCR 기기를 이용해 melting curve 분석 후 정량분석을 위한 표준 유전자로 사용하였으며 정량을 위해 표준 유전자를 serial dilutions하여 Real time-PCR을 수행하였다.
<h3>염기서열분석</h3> <p>DG-DGGE gel 상에서 다른 위치에 존재하는 \( \mathrm { DNA } \) 단편들을 회수하기 위하여 각각의 band를 선택한 후, 잘라내어 3차 DW \( 50 \mu \mathrm { l } \) 를 첨가하고 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 하룻밤 동안 방치하여 상등액을 취하였다. Band에서 회수한 \( \mathrm { DNA } \)를 주형으로 nested \( \mathrm { PCR } \)에 사용한 primer를 이용하여 재증폭하였으며, \( \mathrm { PCR } \) 산물은 agarose gel에서 전기영동하여 \( \mathrm { DNA } \) recovery kit (Biofact)로 정제한 후 cloning 하였다. Cloning은 All-in-one vector (Biofact)을 이용하였고, 제조사가 제시한 방법을 따라 수행하였으며, 삽입된 \( 16S \\mathrm { rRNA } \) 유전자의 염기서열은 3730xl DNA Analyzer (ABI)를 이용하여 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)의 GenBank database를 이용하여 BLAST search를 통해 분석하였다. 또한, Phylogenetic tree는 ClusterX를 이용하여 미생물간의 상동성을 분석하고, MEGA \( 5.0 \) 의 neighbor-joining method를 이용하여 유전적 계통분류를 수행하였다.</p> <h3>미생물 군집 비교를 위한 정량 Real time PCR</h3> <p>각 시료별 미생물의 군집의 크기를 정량적으로 평가하기 위해 \( \mathrm { qPCR } \)을 수행하였다. 미생물 군집을 정량하기 위해서 27F와 518R (5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3') primer를 이용하였고, E. coil \( \mathrm { DH } 5 \alpha \)의 total DNA를 주형으로 \( \mathrm { PCR } \)을 수행하여 \( 491 \mathrm { bp } \)의 \( \mathrm { PCR } \) 산물을 얻었다. 또한, 곰팡이 군집의 정량을 위해 SR-4F (5'-AG CCG CGG TAA TTC CAG CT-3')와 SR-7R (5'-TCC TTG GGC AAA TGC TTT CGC-3')을 이용하였고, Aspergillus total DNA를 주형으로하여 \( 388 \mathrm { bp } \)의 \( \mathrm { PCR } \) 산물을 얻었다. 각각의 \( \mathrm { PCR } \) 산물은 All-in-one vector (Biofact, Korea)에 cloning하였으며, plasmid \( \mathrm { DNA } \)는 LaboPass Mini Kit (CosmoGen, Korea)를 이용하여 추출하였다. 염기서열분석은 M13-20F and M13-20R(All-in-one Vector Systems manual)을 이용하여 분석하였고, BLAST search를 통해 확인하였다. 염기서열이 확인된 plasmid \( \mathrm { DNA } \)는 real-time \( \mathrm { PCR } \) 기기를 이용하여 melting curve (Bio-Rad, USA) 분석 후 정량분석을 위한 표준 유전자(artificial standard clone)로 사용하였다. 정량 \( \mathrm { PCR } \)을 위해 CFX96 Touch \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) Real-Time \( \mathrm { PCR } \) Detection System (Bio-Rad)과 iTaq \( ^ {\text { TM } } \mathrm { SYBR } ^ {\circledR } \) Green Supermix with ROX (Bio-Rad)을 이용하였다. 미생물 \( 16 \mathrm { ~S } \) \( \mathrm { rRNA } \) 유전자 정량 \( \mathrm { PCR } \)은 각각의 primer를 이용하였으며 반응조건은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 15 \mathrm { ~min } \)동안 pre-denaturation 시켜, \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 30 \mathrm { sec } \) denaturation, \( 67 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 30 \mathrm { sec } \) annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 30 \mathrm { sec } \) extension후 fluorescence를 측정하고 45 cycles을 수행하였다. 그리고 final extension은 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 5 \mathrm { ~min } \)동안 수행하였다. Melting curve 분석은 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \)부터 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)까지 \( 0.2 ^ {\circ } \mathrm { C } \)씩 증가시키면서 fluorescence를 측정하였다. 곰팡이 군집의 정량을 위해서 앞서 사용된 \( \mathrm { PCR } \) program을 이용하였으며, annealing 온도는 \( 69 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 수행하였다. 정량을 위해서 표준 유전자를 serial dilutions하여 Real time-PCR을 수행하였으며, \( \mathrm { DNA } \) 농도는 NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific, USA)을 이용하여 \( 1 \mathrm { ng } / \mu \) 를 분석에 이용하였다.</p>