투과전자현미경을 사용하여 분리균주 \( \mathrm{HJ} 6 \)의 형태를 음성염색으로 관찰하였다. ABI Prism 3700 genetic analyzer를 이용하여 클로닝 된 DNA 단편의 염기서열을 분석하였다. SDSPAGE를 통해 용출된 단백질의 정제도를 확인하였고, Coomassie staining를 이용하여 전기영동 밴드를 확인하였다. Trehalose synthase의 활성은 TLC 및 HPLC 분석법을 사용하여 정제된 효소를 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응하고 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 끓여서 반응을 정지시킨 후 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 분리 및 동정</h2> <p>본 연구에 사용된 Thermus thermophilus HJ6 균주는 일본의 Arima 온천수에서 분리하였다. 분리방법으로는 온천수에 \( 0.1 \% \) yeast extract를 첨가하여 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 일간 배양한 후, \( 0.7 \% \) Gelrite를 포함하는 ATCC medium 1598 (bactotryptone \( 2.5 \mathrm{~g} \), yeast extract \( 2.5 \mathrm{~g} \), nitrilotriacetic acid \( 100 \mathrm{mg}, \mathrm{CaSO}_{4} \times 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 4 \mathrm{mg}, \mathrm{MgCl}_{2} \times 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 200 \mathrm{mg} \), \( 0.01 \mathrm{M} \) Fe-citrate \( 0.5 \mathrm{~mL}, 0.5 \mathrm{~mL} \) trace element solution, \( \mathrm{Na}-\mathrm{K} \) phosphate buffer( \( \mathrm{pH} 7.2,0.16 \mathrm{M}) \), per liter) 고체 배지에 접종하고, \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 1.5 \) 일간 배양하여 단일 콜로니를 분리하였다. 분리된 균주는 ATCC medium 697(8 g poly-peptone, \( 4 \mathrm{~g} \) yeast extract, \( 4 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \mathrm{NaCl}, \mathrm{pH} 7.5 \) )를 사용하여 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 정기적으로 계대배양 하였다. 분리균주 \( \mathrm{HJ} 6 \) 의 형태는 투과전자현미경(JEM 1200 EX-II electron micro-scope, JEOL)을 이용하여 음성염색으로 관찰하였다. 생리학적 특징은 Santos 등의 방법을 이용하여 조사하였고 \( 16 \mathrm{~s} \) rRNA sequence 분석은 Kim 등의 방법에 따라 실시하였다.</p> <h2>유전자 클로닝 및 염기서열 분석</h2> <p>Thermus thermophilus HJ6 균주의 염색체 는 GeneAll \( { }^{\mathrm{R}} \) GENEx Genomic kit(GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea)를 이용하여 추출하였다. Trehalose synthase(TtTS)의 유전자를 클로닝 하기 위하여 게놈 염기서열이 밝혀진 Thermus thermophilus HB8 과 HB27의 trehalose synthase 유전자 염기서열을 바탕으로 각각 개시코돈의 상류와 종결코돈의 하류에 해당하는 두가지 primer(Primer 1: 5'-cgacccactagcctt-taggcc-3', primer 2: 5')-ggctgaagggctaccgggcgc-3')를 사용하여 polymerase chain reaction(PCR)을 수행하였다. PCR은 Taq DNA polymerase를 사용하여 약 \( 3.0 \mathrm{~kb} \) 의 DNA 단편을 증폭하였고 pGEM-TTS 벡터에 클로닝한 후, pGEM-TTS 라고 명명하였다. 클로닝 된 DNA 단편의 염기서열은 ABI Prism 3700 genetic analyzer(Perkin-Elmer Applied Biosystems, USA)를 사용하여 분석하였다.</p> <h2>효소 생산 및 정제</h2> <p>온도 감수성 프로모터(PR, PL)를 포함하는 발현 벡터 pJLA503에 trehalose synthase 유전자를 클로닝하기 위하여 pGEM-TTS plasmid를 주형으로 Primer 3(5'-CCT-TTAGCATATGGACCCCCTCTGG-3', 밑줄은 Nde I 부위)과 Primer 4(5'-CGGAATTCCTAGGCTTTTCCGGCCT-3',밑줄은 Eco RI 부위)를 이용하여 PCR 을 수행하였다. 중폭 된 \( 3.0 \mathrm{~kb} \) 의 DNA 단편은 \( N d e \) I과 Eco RI으로 절단한 후 같은 효소로 절단한 pJLA503 벡터에 연결하고 E. coli \( \mathrm{DH} 5 \alpha \) 에 형질전환 하였다. 클로닝 된 plasmid를 pJLA-TS로 명명하고 E. coli BL21(DE3) codon plus에 다시 형질전환 한 후 \( 2 x \) YTA 배지(tryptone \( 16 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \), yeast extract \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \), \( \mathrm{NaCl} 5 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \), ampicillin \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) )에서 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 로 20시간 전 배양 하였다. 전배양액의 \( 1 \% \) 를 새로운 \( 2 x \mathrm{YTA} \) 배지에 접종 한 후, 훕광도 \( \left(\mathrm{A}_{600}\right) \) 가 0.6이 되었을 때 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 로 온도를 올려 5시간 동안 유도배양 하였다. 배양된 균체는 원심분리를 통 하여 집균하고 buffer \( \mathrm{A}(50 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}, \mathrm{pH} 8.0,1 \mathrm{mM} \) dithiothreitol)에 녹인 다음 초음파로 파쇄하였다. 초음파 파쇄 후 세포추출물은 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20분간 열처리한 후 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 상등액은 ÄKTAprime(GE Healthcare)을 이용하여 buffer A로 평형화시킨 Hitrap Q column(GE Healthcare)에 로딩한 후 \(0 1.\sim 0 \mathrm{M}\)의 \( \mathrm{NaCl} \) 로 농도구배를 주어 결합된 단백질을 용출하였다. 용출된 획분은 trehalose synthase 활성을 측정한 후 활성이 있는 획분을 모 아 Amicon(Milipore) filter로 농축한 다음 buffer B \( (50 \mathrm{mM} \) Tris-HCl, pH 8.0, \( 150\mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 1 \mathrm{mM} \) dithiothreitol)로 투석하였다. 투석액은 buffer B로 평형화된 HiPrep Sephacryl S-200 HR 26/60 column(GE Healthcare)에 로딩하고 buffer B를 이용하여 용출하였다. 용출된 단백질의 정제도는 SDSPAGE(12\% acrylamide gel)를 통하여 확인하였고, 전기영동 밴드는 Coomassie staining으로 확인하였다.</p> <h2>효소활성 측정</h2> <p>Trehalose synthase의 활성은 정제된 효소 \( (0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{mL}) \) 를 \( 50 \mathrm{mM} \) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 7.5) \) 에서 \( 50 \mathrm{mM} \) 맥아당을 기질로 하여 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응하고 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 끓여서 반응을 정지시킨 후 TLC 및 HPLC 분석법을 이용-하였다. TLC plate로는 silica gel 60 TLC(Merck, 20× \( 20 \mathrm{~cm} \) aluminium sheet)를 사용하였으며, plate에 효소반응 산물 \( 1 \mu \mathrm{L} \) 를 점적하여 \( \mathrm{n} \)-butanol : pyridine : water(7:3: 1) 혼합용매로 2 번 전개하고 건조한 후 발색제 ( \( 10 \% \) 황산)를 뿌려 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 가열하여 발색시켰다. 효소 반응산물의 정량화는 Carbohydrate analysis column(Waters, \( 300 \mathrm{~mm} \times \) \( 3.9 \mathrm{~mm} \) )을 사용하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 410 detector와 HPLC(Waters alliance 2690) system에 의해 분석되었다. 이동상 용매는 acetonitrile : water(75 : 25)의 두 가지 혼합용액으로 분당 \( 1 \mathrm{~mL} \) 의 유속으로 전개되었다.</p>