난용성 인삼염의 분해능을 조사하기 위해 Pikovskaya(PVK) agar 배지 중앙에 전배양 분리주를 접종 후 난용성 인산 가용화능을 측정하였다. 식물병원균의 siderophore 생성능 여부를 확인 하기 위해 CAS 평판 배지에 접종후 orange halo zone 형성 유무를 관찰하였다. 분리주들의 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능을 조사하였고 분리주 동정을 위해 16S rRNA 유전자 분석또한 실시하였다. 세포외 효소활성을 측정하기 위해 nutrient broth에 균주를 접종후 배양하여 여러 처리를 거친후 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였고 API ZYM kit를 이용한 분석도 진행하였다. 모든 분석은 3회 이상 수행하고 유의성 검증을 신뢰구간 p< 0.05에서 완료하였다.
<h2>인산 가용화능 조사</h2> <p>난용성 인산염의 분해능을 조사하기 위해 \( 0.5 \% \) calcium phosphate \( \left(10 \mathrm{CaO} \cdot 3 \mathrm{P}_{2} \mathrm{O}_{5} \cdot \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\right) \) 가 첨가된 Pikovskaya(PVK) agar 배지를 이용하였다. 고체배지 중앙에 cork borer를 이용하여 잘라낸 뒤 순수 분리된 전배양 분리주를 접종 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4일간 배양하면서 균체주위의 clear zone 형성 유무를 조사하여 난용성 인산 가용화능을 측정하였다.</p> <h2>Siderophore 생성능 조사</h2> <p>식물병원균의 길항 기작 중의 하나인 siderophore 생성능 여부를 확인하기 위해 siderophore 생성 분리주 감별 배지인 chrome azurole S (CAS) blue agar plate assay 방법을 이용하였다. CAS 평판 배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4일간 배양한 후 orange halo zone 형성 유무를 관찰하였다.</p> <h2>분리주의 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능 조사</h2> <p>분리주들의 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능을 조사하기 위하여 Botrytis cinerea KACC 40574, Colletotrichumacutatum KACC 40801, Corynespora cassiicola KACC44719, Fusarium sp. KACC 40241, Phytophthora capsiciKACC 40180, Rhizoctonia solani AG-2-1 KACC 40124,Sclerotinia sclerotiorum KACC 40457 등으로 총 7종을 대상으로 검정하였다. 식물병원성 곰팡이에 대한 길항능은 PDA를 이용한 well diffusion법을 이용하였으며, PDA 배지에 분리 분리주를 접종하여 검정 분리주와 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 대치배양하였다. 식물병원성 곰팡이와 유용 미생물 간의 거리를 측정하여 억제율(inhibition rate)로 환산하였다. Inhibition rate \( (\%)=\frac{(R-r)}{R} \times 100 \)</p> <h2>16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통한 분리주의 동정</h2> <p>분리주를 동정하기 위해서 16S rRNA 유전자 분석을 실시하였다. 분리주의 동정을 위하여 균체를 TSB에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2일간 배양 후 회수하였다. 회수한 균체의 DNA는 Wizard \( ^{\mathbb{Ⓡ}} \) Genomic DNA purification kit (Promega, USA)를 이용하여 추출하였다. 16S rRNA 유전자 구간을 증폭시키기 위해서 universal primer인27F (5’-AGA GTT TGATCC TGG CTC AG-3’)와 1492R (5’-GGT TAC CTT GTTACG ACT T-3’)를 사용하여 PCR로 30 cycles ( \( 94.0^{\circ} \mathrm{C}-5 \) 분, \( 55.0^{\circ} \mathrm{C}-30 \) 초, \( 72.0^{\circ} \mathrm{C}-1 \) 분)을 실행하였다(TP600 Takara BioInc., Japan). 증폭된 PCR 산물은 PCR/Gel combo kit (Cat. No. 3412, NucleoGen, Korea)를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 \( 1 \% \) agarose gel을 이용하여 확인하였다. 염기서열 분석은 Solgent Co. Ltd.에 의뢰하였으며, 염기서열은 NCBI의 BLASTN에서 분석하였다. 분석결과를 MEGA프로그램(version 7.0, MEGA software)을 이용하여 계통도를 작성하였다. 또한 분리주를 형태학적으로 조사하기 위하여 주사전자현미경(SEM, scanning electron microscope)을이용하여 관찰하였다.</p> <h2>분리균주의 가수분해효소 생산</h2> <p>세포외 효소활성을 측정하기 위해서 각 starch, carboxymethyl cellulose (CMC), skim milk, xylan이 들어있는 nutrient broth에 균주를 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2일간 배양 하였다. Amylase 활성은 Miller의 방법을 일부 변형하여 시험을 진행하였으며, 배양 상등액과 \( 1 \% \) starch solution (\(50\mathrm{mM}\) sodium phosphate buffer)을 1:1로 혼합 하여 반응시켰다. 반응시킨 후 color reagent solution과 혼합하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 열처리 후 얼음에 냉각시킨 다음 분광광도계를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. Cellulase와 xylanase 활성을 Shin과 Cho의 방법을 이용하여 시험을 진행하였다. 원심분리한 상등액은 각 \( 1 \% \mathrm{CMC} \) solution (\(50\mathrm{mM}\) sodium phosphate buffer)과 \( 1 \% \) xylan solution (\(50\mathrm{mM}\) sodium phosphate buffer)을 혼합하여 \( 50{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 반응시켰다. 그 다음 dinitrosalicylic acid 시약을 첨가하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 열처리 후 냉각시켰다. 흡광도는 분광광도계를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. Protease는 Oh 등의 방법을 일부 변형하여 시험을 진행하였으며, 원심분리한 상등액은 \( 0.65 \% \) casein (\(50\mathrm{mM}\) sodium phosphate buffer)를 혼합한 뒤 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 반응시켰다. 그 후 \( 0.44 \mathrm{M} \) trichloroacetic acid를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분간 단백질을 응고시켰다. 응고된 단백질을 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) filter를 이용하여 여과한 후 여과액과 3배 희석시킨 Folin-Ciocalteu's phenol reagent를 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응시켰다. 흡광도는 \( 660 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. 또한 생리학적 특성을 분석하기 위해서 API ZYM kit (Biomérieux,France)를 이용하여 분석하였으며 제조사의 매뉴얼에 따라진행하였다.</p> <h2>통계분석</h2> <p>모든 분석은 3회 이상 수행하였으며, 평균 \( \pm \) 표준편차 (Mean \( \pm \) SD)로 표현하였다. 평균값의 유의한 차이는 SPSS (version 20.0 for Windows, SPSS Inc., Chicago, IL,USA)를 이용한 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)의Duncan’s multiple range test를 사용하였다. 유의성 검증은신뢰구간 \( p<0.05 \) 에서 분석하였다.</p>