볏짚에 따른 효소 활성을 보기 위해 cellulase, hemicellulase 및 xylanase를 사용하였고, DNS (3,5-Dinitrosalicylic acid)를 이용한 환원당 비색 정량법을 이용해 탄수화물을 측정하였다. 볏짚 농도에 따른 효소 활성을 보기 위해 OFAT 방법, Box Behnken design을 통해 실험을 설계하였으며, 통계 분석으로 SPSS의 일반 선형 모형의 다변량분석, 사후 검정으로 Duncan's method, MINITAB을 통한 Box Behnken design 분석을 하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시료의 전처리</h2> <p>실험에 사용된 볏짚은 전라북도 김제지역에서 재배 후에 수확된 볏짚을 사용하였으며, \(80\sim120 \mathrm{~mesh}\)의 크기로 분쇄한 후 건조하여 실험에 이용하였다.</p> <h2>효소</h2> <p>볏짚으로부터 수용성 탄수화물을 생산하기 위하여 cellu-lase, hemicellulase 및 xylanase를 사용하였다. Cellulase (Sigma)는 \( 1,000 \mathrm{U} / \mathrm{g} \)의 활성을 나타내는 것을 사용하였고, Hemicellulase는 \( 3,000 \mathrm{U} / \mathrm{g} \)의 활성을 나타내는 것을 사용하였다. Xylanase는 \( 2,500 \mathrm{U} / \mathrm{g} \)의 활성을 나타내는 것을 사용하였다. 각 효소에서 \( 1 \mathrm{~U} \) 는 각각의 기질이 한 시간 동안 분해되어 생성된 glucose \( 1 \mu \mathrm{mol} \) 을 의미하며, 반응 조건은 cellulase의 경우 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 와 \( \mathrm{pH} \) 5.0, hemicellulase의 경우 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 와 \( \mathrm{pH} \mathrm{~5.0} \) 그리고 xylanase의 경우 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 와 \( \mathrm{pH} \mathrm{~4.0} \) 이었다. Hemicellulase와 xylanase는 \( 37 \mathrm{~mM} \) acetic acid buffer \( \mathrm{pH} \mathrm{~4.8} \)에 10배 희석하여 사용하였다.</p> <h2>효소처리 조건</h2> <p>볏짚과 효소의 처리조건은 \( 37 \mathrm{~mM} \) acetic acid buffer \( (\mathrm{pH} \mathrm{~4.8}\))에 기질인 볏짚과 효소용액을 첨가한 후에 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) water bath에서 \( 150 \mathrm{~rpm} \) 의 교반 속도로 12시간 동안 반응시켰다. 반응에 사용된 기질의 농도는 실험 설계에 따라서 \( 10 \mathrm{~g} / 1 \)에서 \( 100 \mathrm{~g} / 1 \)로 다양하게 하였다. 반응에 이용된 각 효소들의 첨가 농도 또한 실험 설계에 따라서 \( 0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{~ml} \) 에서 \( 1 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) 로 다양하게 하였다.</p> <h2>수용성 탄수화물의 측정</h2> <p>반응이 완료된 기질 효소 혼합용액은 \( 10,000 \mathrm{~rpm} \) 에서 5분 동안 원심분리한 후에 얻은 상등액을 수용성 탄수화물 측정용 시료로 사용하였다. 수용성 탄수화물은 DNS (3,5-Dinitrosalicylic acid)를 이용한 환원당 비색 정량법을 이용하여 측정하였으며, 이때 glucose를 표준용액으로 사용하였다. 효소반응에 의하여 생성된 수용성 탄수화물의 양을 측정할 때에 효소를 첨가하지 않고 반응 시킨 후에 얻어진, 즉 자연적으로 buffer내로 용출된 수용성탄수화물을 background 수치로 적응하여 계산하였다.</p> <h2>볏짚의 농도에 따른 각 효소들의 활성 평가</h2> <p>기질로 사용된 볏짚의 농도에 따른 각 효소들의 수용성 탄수화물 생성량 평가는 OFAT 방법을 이용하여 평가하였다. 볏짚의 농도는 \( 10 \mathrm{~g} / 1 \) 에서 \( 100 \mathrm{~g} / 1 \)까지 다양하게 하였으며, cellulase는 총 반응 부피에 대하여 \( 1 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \), hemicellulase와 xylanase는 원액을 10배 희석한 용액을 \( 1 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) 의 농도로 사용하였다.</p> <h2>Box Behnken design (BBD) 실험설계 및 평가</h2> <p>총 3 가지의 변수에 대하여 각 변수들의 3 가지 수준을 사용하였으며, 3개의 중앙점을 포함하는 총 15개의 실험(run)으로 구성된 BBD를 설계하였다. 각 실험들은 고정변수(fixed varia-ble)로 cellulase \( (1 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml}) \)를 포함하고 있으며, 변수들로는 볏짚, hemicellulase 및 xylanase의 수준들이 이용되었다. 각 실험들에 할당된 볏짚의 함량(수준)들은 \( 20 \mathrm{~g} / 1(-1), 50 \mathrm{~g} / 1 \) (0) 및 \( 100 \mathrm{~g} / 1(+1) \)이며, hemicellulase와 xylanase는 모두 \( 0.1 \) \( \mathrm{mg} / \mathrm{ml}(-1), 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}(0) \) 및 \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}(+1) \)으로 동일하게 사용하였다.</p> <p>각 실험들로부터 얻어진 결과들은 반응표면모형(response surface model, RSM)을 이용하여 계산하였고, RSM에 사용된 모형은 다음과 같다.</p> <p>\( \mathrm{Y}=\beta_{0}+\sum \beta_{i} X_{i}+\sum \beta_{i} X_{l}^{2}+\sum \beta_{i j} X_{i} X_{j} \)</p> <p>위 식에서 \( \mathrm{Y} \)는 예측반응값이며, \( \beta_{0} \)는 상수, \( \beta_{i} \) 와 \( \beta_{j} \)는 회귀계수를 의미한다. \( X_{i} \)와 \( X_{j} \)는 각각 독립변수 \( (i \neq j) \)를 의미한다.</p> <h2>통계적 방법</h2> <p>OFAT 실험결과의 통계분석은 SPSS (version \( 18.0 .0 \) )의 일반선형모형(General linear model)의 다변량분석법을 사용하였으며, 사후검정은 Duncan's method를 사용하였다. 총 15개의 실험으로 구성된 BBD의 설계 및 분석은 MINITAB(version 14)를 사용하였다.</p>