가정에서 만들어진 된장 25개를 수집하여 pH 4.5로 조절된 LB 배지에 접종한 후, \(37^{\circ}C\)에서 2일 동안 배양하고, 같은 배지에서 3일 간격으로 3회 추가 계대 배양을 진행하였다. 그 후, 분리된 균주의 형태를 분석하기 위해 그람염색과 포자염색을 실시하였고, API 20E와 API 50 CHB 키트를 이용하여 1일과 2일간의 배양을 통해 균주의 탄수화물 이용능과 생화학적 특성을 평가하였다. 또한, Bacillus속 분리균을 4.0% 곤약이 첨가된 LB 배지에서 1%(v/v)로 접종하여 24시간 진탕 배양하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>Mannanase를 생산하는 내산성 균주의 탐색</h2> <p>가정에서 제조된 된장 \( 25 \)점을 수집하여 \( \mathrm { pH } \)를 \( 4.5 \)로 조절한 \( \mathrm { LB } \) 배지에 접종하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 2 \)일간 진탕 배양한 후 동일한 배지에 \( 3 \)일 간격으로 \( 3 \)회 계대 배양을 추가적으로 실시하였다. \( \mathrm { pH } \)가 \( 4.5 \)로 조절된 LB 평판배지(yeast extract, \( 5 \mathrm { ~g } \); tryptone, \( 10 \mathrm { ~g } \); NaCl, \( 5 \mathrm { ~g } \); agar, \( 15 \mathrm { ~g } \); water, \( 1 \) liter)에 계대 배양액을 도말하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 2 \)일간 배양한 후 형성된 콜로니를 \( 0.5 \% \) locust bean gum (LBG)이 첨가된 중성의 LB 평판배지에 접종하여 하룻밤 배양하고 congo red 용액 \( (0.2 \%) \)으로 염색하여 LBG 분해환을 생성하는 미생물을 mannanase 생산균으로 선발하였다.</p> <h2>분리균주의 동정</h2> <p>분리균의 형태적 관찰을 위해서는 그람염색과 포자염색을 실시하였으며, 배양된 균체 현탁액을 제조사의 지침에 따라 \( \mathrm { API } ~20 \mathrm { E } \)와 API \( 50 \mathrm { ~CHB } \) kits (Bioméreux사, France)에 접종하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하면서 \( 1 \)일과 \( 2 \)일째 각각 관찰하여 탄수화물 이용능과 생화학적 특성을 판별하였다. 분리균의 \( 16 \mathrm { ~S } \) rRNA 유전자 염기서열을 분석하기 위해서 분리균의 총 염색체 DNA를 주형으로 하고, 세균의 16S rRNA 유전자의 보존적 지역의 염기서열을 primers로 사용하여 중합효소 연쇄 반응 \( ( \mathrm { PCR } ) \)을 실시함으로써 얻은 \( \mathrm { PCR } \) 산물을 정제하여 그 염기서열을 결정하였다.</p> <h2>Mannanase 조효소액 제조</h2> <p>Bacillus속 분리균을 LB 배지에서 전배양한 후 \( 4.0 \% \) 곤약이 첨가된 \( \mathrm { LB } \) 배지에 \( 1 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \)가 되도록 접종하여 \( 24 \)시간 동안 진탕 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 얻은 배양상등액을 ammonium sulfate ( \( 30-75% \))로 처리한 후, \( 12,000 \) \( \mathrm { rpm } \)에서 \( 30 \)분 동안 원심분리함으로써 상등액을 제거하였다. 단백질 침전물을 \( 10 \mathrm { mM } \) citrate 완충용액( \( \mathrm { pH } ~5.5) \)에 현탁하여 동일한 완충용액으로 투석한 후 이를 원심분리하고 상등액을 취해 mannanase 조효소액으로 사용하였다.</p>