호흡기 질환자의 상기도 도말물로부터 M. pneumoniae로 분리 동정된 116 균주와 M. pneumoniae (ATCC 29342) 표준균주를 사용하여 실험하였다. 분리된 Mycoplasma pneumoniae 116 균주의 각 항생물질에 대한 감수성 검사를 실험하였고, 분리된 M. pneumoniae 123균주에서 tetracy-cline에 저항성인 tetM 유전자의 존재 유무와 23S rRNA의 V영역에서 erythromycin에 대한 저항성 변이의 발생 유무를 PCR법으로 확인하였다. 그 결과에 따라 tetracycline, erythromycin 각각에만 저항성을 가진 균주, tetracycline과 erythromycin에 모두 감수성인 균주와 모두 저항성을 가진 균주들로 나누어 다제 저항성 유무를 검토하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주</h2> <p>부산시내 종합병원 3곳의 내과와 소아과 및 소아과 의원과 가정의학과 의원 3곳에 내원하는 호흡기 질환자의 상기도 도말물로 부터 M. pneumoniae로 분리 동정된 116 균주와 M. pneumoniae (ATCC 29342) 표준균주를 사용하였다.</p> <h2>사용된 항생물질</h2> <p>항생물질은 sparfloxacin (SF; Cheil Food & Chem. Co., Seoul), ofloxacin (OF; Cheil Food & Chem. Co., Seoul), ciprofloxacin (CF; Bayer Korea), moxifloxacin (MF; Bayer Korea), levofloxacin (LF; Jeil Pharm. Co, Seoul), clari-thromycin (CM; Daiichi Pharm. Co., Korea), erythromycin (EM; Sigma, USA), tetracycline (TC; Sigma, USA), minocycline (MC; Cheil Food & Chem. Cd., Seoul), josamycin (JM; Yamaguchi Pharm. Co., Tokyo)를 사용하였다.</p> <h2>분리된 Mycoplasma pneumoniae 균주의 각 항생물질에 대한 감수성 검사</h2> <p>환자로부터 분리 동정된 M. pneumoniae 116균주를 각각 \( 10 \mathrm{ml} \)의 Chanock's glucose 배지에 3일간 배양하여 균수가 \( 1 \times 10^{6} \) (Color Changing Unit (CCU)/\(\mathrm{ml}\) 되도록 조정한 후에 각 농도의 항생물질이 함유된 배지 \( 2.0 \mathrm{ml} \)에 각각의 균액 \( 20\mu \mathrm{l} \) 씩을 접종하여 2주간 균의 증식 유무를 배지의 색깔 변화에 따라 육안적으로 확인하였다. Clarithromycin과 levofloxacin은 각 배지에는 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.12, 1.56, 0.78, 0.39, 0.19, 0.09 \(\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)되도록 첨가하였다. Erythromycin, tetracxycline, minocycline, josamycin, moxifloxacin, sparfloxacin, ciprofloxacin, ofloxacin 각 배지에 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.06, 0.03 \(\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)되도록 첨가하였다. 각 항생물질의 최저발육저지농도(minimum inhibitory concentration: MIC)의 판정은 항생물질이 들어있지 않는 대조군 계열에서 균의 증식이 확인된 시기(배양 7일 전후)에 항생물질 회석 계열에서 균의 증식이 억제되는 최저 항생물질 농도를 초기 MIC(F-MIC)로 판정하였다. 이후 1주일간 관찰하여 더 이상 균의 증식이 일어나지 않은 농도를 최종 MIC(F-MIC)로 판정하였다. 각 항생물질에 대한 저항성의 기준은 MIC\(\geqq 1.0 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 이상으로 하여 각 균주의 다제 저항성 유무를 검토하였다.</p> <h2>PCR 법에 의한 tetM과 erythromycin 저항성 변이 균주의 확인 방법</h2> <p>국내에서 분리한 M. pneumoniae 123 균주를 Chanock's glucose 배지 \( 5 \mathrm{ml} \)에 배양한 후 \(12,000\mathrm{rpm} \)으로 15분간 원심한 다음 인산완충액(PBS)으로 2번 세척하였다. 침전물의 최종 부피를 \( 50 \mu \mathrm{l} \)로 조정하여 \( 110^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 가열한 후 \( 12,000 \mathrm{rpm} \)으로 15분간 원심하여 그 상층액을 PCR 반응의 template로 사용하였다. Template DNA가 들어 있는 용액에 Taq polymerase (TaKaRa Taq, Japan)와 \(10\times\) PCR buffer, deoxyribonucleotide triphosphates, \( 1.5 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2} \)를 첨가하고, 해당 primer를 각각 가한 후 MiniCycler (MJ research, USA)에서 반응 시켰다(Table 1). 먼저 \( 94^{\circ}\mathrm{C}\) 10분간 전 처리한 후 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 분, \(60^{\circ} \mathrm{C}\left(\right. \)erythromycin 저항성 균은 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) )에서 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분의 시간으로 40회 반복 반응시키고 마지막에 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 연장 반응시켰다. Erythromycin 저항성 균주의 경우에는 annealing 온도만 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분간 반응시킨 것이 이외에는 위와 동일한 방법으로 반응시켰다. 이들 산물을 \( 1.5 \% \) agarose gel에서 전기영동한 후 ethidium bromide에서 염색하여 결과를 관찰하였다. 결과가 확인 된 산물은 자동염기분석기인 ABI 377 DNA Sequencer (Perkin-Elmer Biosystem, USA)의 유전자 염기서열을 분석하였다. 각 primer 부위의 PCR 산물의 유전자 염기서열을 분석하여 erythromycin에 감수성인 M. pneumoniae M129 균주와 비교분석하여 돌연변이 부위를 확인하였다. 분리된 M. pneumoniae 123균주에서 Chang 등이 tetracy-cline에 저항성인 tetM 유전자의 존재 유무와 23S rRNA의 V영역에서 erythromycin 에 대한 저항성 변이가 일어났는지를 PCR법으로 확인한 결과에 따라 tetracycline에만 저항성을 가진 36균주, erythromycin에만 저항성을 가진 39균주, tetracycline과 erythromycin에 모두 저항성을 가진 21균, tetracycline과 erythromycin에 모두 감수성인 27균주들의 다제 저항성 유무를 검토하였다.</p>