A.niger LK 포자를 배양하여 배양액의 상등액을 제거한 후 건조시켜 균체를 미세 분말로 만들어 생촉매로 이용하였다. 이 생촉매를 이용하여 Regenerated cellulose로 제조된 hollow-fiber로 구성된 비대칭 분할 시스템에서 반응시켜 비대칭 분할반응에서 생기는 epoxide hydrolase 활성 저하를 방지하기 위해서 두번째 hollow-fiber를 부착한 cascade형 비대칭 분할반응기를 구성하여 광학활성 styrene oxide의 광학순도 및 수율을 GC로 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 배양 조건</h2> <p>A. niger LK 포자를 \( 1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) glucose, \( 2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) corn-steep liquor가 포함한 배지에 접종한 후 진탕배양기를 이용하여 교반속도 \( 250 \mathrm{rpm} \) , 온도 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3 일간 배양하였다. 배양액을 원심 분리하여 상등액을 제거한 후 \( 100 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer \( \left(\mathrm{pH}\right. 8.0) \)로 세척하고 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3일간 건조시킨 후 균체를 미세 분말로 제조하여 생촉매로 사용하였다.</p> <h2>유기 용매의 선정</h2> <p>Epoxide hydrolase 활성 저하를 가장 적게 줄 수 있는 유기용매를 선정하기 위하여 여러 종류의 유기용매상에서 라세믹 styrene oxide에 대한 비대칭 광학분할반응을 실시하였다. 유기용매 \( 0.3 \mathrm{ml} \) 에 \( 1 \mathrm{~g} \) 의 균체 분말을 넣고 \( 50 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer \( \left(\mathrm{pH}\right. 8.0) \)로 전체 용량을 \( 1 \mathrm{ml} \) 로 만든 후 \( 20 \mathrm{mM} \) 농도로 라세믹 styrene oxide를 첨가하였다. \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rpm} \) 조건의 진탕배양기에서 반응을 수행하였으며, 유기용매층을 GC 로 분석하였다.</p> <h2>비대칭 분할 반응기 시스렘 구성</h2> <p>Regenerated cellulose로 제조된 hollow-fiber (Alwell, Gambro, Germany)롤 사용하여 비대칭 분할 시스템을 구성하였다. 생촉매 미세분말을 포함한 \( 100 \mathrm{mM} \) po-tassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 8.0,170 \mathrm{ml}) \) 를 water bath 로 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 로 유지시키면서 Masterflex pump를 이용하여 80 \( \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 의 속도로 hollow-fiber membrane의 shell side를 통해 순환시켰다. 라세믹 styrene oxide 기질은 \( 50 \mathrm{ml} \) 의 dodecane에 녹인 후 hollow-fiber membrane의 lumen 부위에서 counter-current로 \( 50 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 의 속도로 순환시켰다. 비대칭 분할반응에서 생기는 phenyl-1,2-ethanediol에 의한 epoxide hydrolase 활성 저하를 막기 위하여 두번째 hollow-fiber를 부착한 cascade 형 비대칭 분할반응기를 구성하였다. Phenyl-1,2-ethanediol을 추출하기 위한 \( 100 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 8.0,200 \mathrm{ml}) \) 는 두번째 hollow-fiber membrane의 lumen 부위로 흘려주면서 세포 현탁액에 포함되어 있는 diol을 추출하여 제거할 수 있도록 구성하였다. 광학활성 styrene oxide의 광학순도 및 수율은 유기용매상의 샘플 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 를 채취하여 chiral GC로 분석하였다.</p> <h2>GC 분석</h2> <p>Chiral styrene oxide의 ee (enantiomeric excess \( =[(\mathrm{S}-\mathrm{R}) / \) \( (S+R)] \times 100 \%) \) 값 및 수율은 불꽃이온 검출기(FID)가 장착된 가스크로마토그래프(Shimadzu GC-17A, Japan)를 사용하여 결정하였다. Silica cyclodextrin capillary \( \beta \)-DEX 120 \( 30 \mathrm{m} \) length, \( 0.25 \mathrm{~mm} \) ID, and \( 0.25 \mu \mathrm{m} \) film thickness) column을 사용하였으며, 분석조건은 기존 문헌치를 이용하였다.</p>