국내 자생지로부터 얻어진 국내종과 네덜란드 국립 구근 연구소와 육종 연구소에서 수집 보관중인 종과 종보 회사로부터 구입한 기타종으로부터 구입하여 재배한 식물에서 얻은 어린잎과 뿌라를 채취하여 신헌 재로로 활용하고, NCBI의 유전자은행에 등록되어 있는 유전자의 상동성 및 염기 배열을 고려하여 \( 10 \mathrm{mer} \) 정도를 기준으로 100 개의 primer를 제작하여 MRC사의 DNAzol TMESDNA 분리과정에서의 오차를 줄이기 위한 RAPD 분석을 수행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물 재료</h2> <p>국내종인 석산, 개상사화, 백양꽃, 상사화 등은 국내 자생지로부터 연구가 이루어졌고, 기타 종은 네 덜란드 국립 구근 연구소와 육종 연구소에서 수집 보관중인 종과 종보 회사로부터 구입하여 실험 퐂장에서 재배하였다. 이 개체로부터 얻어진 어린잃과 뿌라를 채취하여 신헌 재로로 활용하였다.</p> <h2>Random amplified polymorphic DNA (RAPD) 분석</h2> <p>RAPD 분석을 위한 primer는 NCBI의 유전자은행에 등록되어 있는 유전자의 상동성 및 염기 배열을 고려하여 \( 10 \mathrm{mer} \) 정도를 기준으로 100 개의 primer를 제작하였다. 또한 이 pri-mer의 제작은 전문 회사인 UBC 에 의뢰하여 합성하였다. 식물의 성장이 가장 활발한 시기에 그 식물의 어린잎 \( 0.5 \mathrm{~g} \) 으로부터 DNA 분리과정에서의 오차를 줄이기 위하여 MRC(Molecular Research Center)사의 DNAzol TMES (plant ge-nomic DNA isolation reagent)를 사용하여 DNA를 분리하였다. 각각의 품종으로부터 얻은 각각 DNA를 정량한 후 50 \( \mathrm{ng} / \mu \mathrm{l} \)이 되도록 희석하였다. 선별된 primer를 이용하여 각각의 주형을 대상으로 primer (UBS) \( 200 \mu \mathrm{M}(1 \mu \mathrm{l}) \), Template \( 6 \mathrm{ng} / \mu \mathrm{l} \), Taq pol TaKaRa rTaq \( 1 \mathrm{U}, 2.5 \mathrm{mM} \) dNTP 2 씨를 첨가하여 Stratagene사의 gradient PCR 기를 이용하여 처음 2 cycle은 predenaturation 단계는 \( 93^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4 분, denaturation 단계는 \( 93^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 초, annealing단계는 \( 36^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45 초, elongation단계는 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 초 동안 수행한 후, 나머지 43 cycle은 denaturation 단계는 \( 93^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초, annealing단계는 \( 36^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45초, elongation 단계는 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 45 초 동안 수행하고 post-elongation 단계를 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분 동안 수행한 후 반응을 멈춘다. 이러한 반응으로 얻어진 중폭된 DNA를 \( 2 \% \) TBE gel에서 \( 100 \mathrm{~V} \) 로 전기 영동한 후 EtBr 로 염색한 후 UV에서 관찰 한 후 디지털 사진기로 사진을 찍어 분석한다. 분석은 Hewlett packard사의 Scanjet \( 6100 \mathrm{C} \) scaner를 이용하여 확대 한 후 명암을 반전시킨 후 기초가 되는 band를 선택하여 그 band의 존재 여부를 표로 만들었다.</p> <h2>RAPD 자료 분석</h2> <p>A는 a라는 종의 band 수, B는 b라는 종의 band 수, AB는 a와 b종의 공통 band 수로 놓아 이둘의 상관관계를 \( 2 \times \mathrm{AB} / \mathrm{A}+\mathrm{B}) \) 의 공식으로 계산하여 band의 상관관계를 행렬표로 각각의 primer에 대하여 제작하였다. 각각의 행렬표에서 같은 위치에 있는 결과를 합산 한 후 primer의 수로 나누어 평균을 값을 얻어 평균 행렬표를 작성하였다. 이를 이용하여 MiniTab 프로그램으로 집단 유연관계에 대한 dendrogram 을 그려 분석하였다.</p>