TAR cloning 법은 인간 및 마우스 게놈에서 불리한 positive 클론의 크기를 조사하기 위해 PCR, YAC DNA 분리, Noti 효소 처리, CHEF gel electrophoresis를 이용하여 HPRT 영역의 크기를 확인하는 데 사용된다. HPRT 유전자를 모델로 인간과 마우스 게놈에서 상호의 염기서열로 유전자의 분리빈도를 조사하고, \(orthologue \) 유전자의 분리빈도를 조사하는 것은 기존에 알고 있는 유전자 염기서열 정보로 미지의 다른 종으로부터 상동성 유전자의 효과적 분리의 가능성을 보여준다.
<h2>\(CHEF gel \)을 이용한 삽입된 \(HPRT \) 영역의 크기 확인</h2> <p>본 실험을 통해 인간 및 마우스의 게놈에서 불리한 \(pos-itive \) 클론의 크기를 조사하기 위하여, PCR 방법으로 \(pos-itive \)로 확인된 효모의 형질전환체로부터 \(YAC DNA \)를 분리하여, \(Noti \) 효소로 처리한 후 \( \mathrm { CHEF } \) \(gel electrophoresis \)를 수행하였다. 각 클론에 삽입된 게놈 \(DNA \)의 크기는 \( 11 \mathrm { HPRT } \) 특이적인 \(exon9 \) 영역을 \(probe \)로 사용하여 \(southern blot-ting \)하여 확인하었다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1>h2>\(TAR cloning \) 법에 의한 상동성 유전자의 분리</h2> <p>\(TAR cloning \)법이 유전체 연구에 유용한가를 확인하기 위하여, 플라스미드 모델이 아닌 유전체 내에 존재하는 \(single-copy \) 유전자를 선별하였다. 본 실험에 사용된 인간 및 마우스의 \(HPRT \) 유전자는 유전체 프로젝트에 의해 \(Canis fa-miliaris \)(개), \(Rattus norvegicus \)(시궁쥐), \(Gallus gallus \)(오골계), \(Caenorhabditis elegans \)(꼬마선충), \(Plasmodium falciparum 3D7 \)(말라리아)에서 상동성 유전자가 분리되어 그 염기서열이 결정되었다 \((http://wwW.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query. fcgi? \) \( \mathrm { CMD } = \) \(search \&DB=homologene) \). 이러한 염기서열을 기초로 상동성 \(HPRT \) 유전자를 인간에서 말라리아에 이르기까지 분석하여 보면, 아미노산 수준과 \(DNA \) 염기서열에 있어서 매우 높은 상동성을 나타낸다. 인간과 개를 비교하였을때 아미노산 수준에서 \( 96.8 \% \), \(nucleotide \) 수준에서 \( 95.7 \% \) 의 상동성을 나타내고, 인간과 마우스는 아미노산 수준에서 \( 96.3 \% \), \(nucleotide \) 수준에서 \( 93.3 \% \) 그리고 말라리아와의 비교에서도 아미노산 수준에서 \( 50.2 \% \), \(nucleotide \) 수준에서 \( 57.6 \% \)의 매우 높은 상동성을 나타내었다. 이렇게 높은 수치의 상동성을 보여주는 유전자들은 \( H P R T \) 유전자와 같이 생물체의 기능에 필수적으로 매우 중요한 기능을 갖는 것들로서, 서로 다른 이종 간의 유전체에서도 매우 높은 비율로 보존되어 있으리라 사료된다. 그러므로 이 HPRT 유전자를 모델로 인간과 마우스 게놈에서 상호의 염기서열을 사용하여 유전자의 분리빈도를 조사하여, \(orthologue \) 유전자의 분리빈도를 조사하였다.</p> <p>본 실험에서는 먼저 \(TAR vector \)의 구축을 위하여 \(sin-le-copy \) 유전자인 \(HPRT \)를 이용하여 \( 96 \mathrm { bp } \)의 마우스 유래의 \(3'-Unique hook \)과 인간 유래의 \(93 bp \)의 \(3'-Unique hook \)을 각각 제작하였다. 네 종류의 \(TAR vector \) 중 \( h H P R T + A l u \) 와 \( m H P R T + A l u \) 는 인간 \( H H P R T \) 유전자를 분리하는데 사용하였고, \( h H P R T + B 1 \) 과 \( m H P R T + B 1 \) 는 마우스 \(mHPRT \) 유전자를 분리하는데 사용하였다. 각 \(TAR vector \)를 차용하여 얻은 형질전환체 수는 \(plate \) 당 약 \(400 \) 개로 \(vector \) 간의 형질전환 빈도의 차이는 크게 나타나지 않았다. 네 종류의 \(vector \)를 이용하여 얻어진 형질전환체 중 각각 \(2,500, 900 \) 개의 형질전환체에 대하여, 각 \(exon \) 영역의 \(primer \)를 이용하여 각각의 \(positive clone \)을 확인하였다. \( h H P R T + A l u \)와 \( m H P R T + A l u \)의 \(vector \)와 인간 게놈 \(DNA \)를 기용하여 \( h H P R T \) 분리 빈도를 비교한 결과, 인간의 \(hook \) 정보를 이용한 \( \mathrm { hHPRT } + \mathrm { Alu } \) 와에서는 총 \(2,500 \) 형질전환체 중에 \(10 \)개의 \(positive \)를 분리하여 \( 0.4 \% \)를 나타내었고, \( m H P R T -Alu \)를 사용한 경우에도 총 \(3,900 \) 형질전환체 중에서 \(13 \)개의 \(positive \)를 얻어 \( 0.33 \% \) 를 나타내었다. 이러한 분리빈도는 이종 간의 유전체의 차이에도 불구하고 유사한 빈도를 보여준다. 또한 반대로 마우스 게놈에서 \( \mathrm { hHPRT } + \mathrm { B } 1 \)와 \( \because P R T + B 1 \) 를 비교분석한 결과에서도 각각 \( 0.3 \%(7 / 2,500 \), \( / 2,700) \)를 나타내어 이종간의 상동성 \(HPRT \) 유전자를 분리하는 데에는 두 종의 \(hook \)이 상호 사용될 수 있음을 시사한다. 그러므로, 이 결과는 기존에 알고 있는 유전자 염기서열 정보블 이용하여 미지의 다른 종으로부터 상동성 유전자의 분리에 효과적으로 사용될 수 있을 가능성을 보여준다. 그러므로 본 연구 결과는 비교유전체학 연구에 있어서 좋은 도구로 \(TAR cloning \) 기술이 이용된 수 있을 가능성을 시사한다.</p>