알레르기 단백질과의 아미노산 서열 상동성 비교 분석은 새로 발현된 단백질과 기존 알레르기 단백질의 유사성을 분석하여 알레르기성 여부를 확인하는 것이다. 연속되는 아미노산 서열의 수가 너무 많거나 적으면 위음성 또는 위양성의 결과를 나타낼 가능성이 있고 기존의 알레르기 데이터베이스에서 제공하는 정보가 한정적이기 때문에 다른 평가 결과들을 고려하여 알르레기성을 평가해야 한다. 알레르기성 평가를 위해 시험관 내에서 새로 발현된 단백질에 대해 소화액과 열처리에 대한 감수성 실험을 진행한다. 하지만 유전자변형작물의 경우 발현된 단백질을 직접 추출하여 사용하기가 어려우므로 주로 대장균과 같은 미생물을 이용하여 단백질을 발현, 분리 하여 사용한다.
<h2>2) 알레르기 단백질과의 아미노산 서열 상동성 비교 분석</h2> <p>알레르기 단백질과의 아미노산 서열 상동성 비교 분석은 새로 발현된 단백질과 기존 알레르기 단백질이 어느 정도 유사한지를 분석하여 알레르기성 여부를 확인하는 것이다. 이것은 알레르기 반응을 일으키는 면역 요소(IgE)와 특정 항원이 관계가 있다는 이론에 근거하며, 새로 발현된 단백질이 기존 알레르기 단백질과 동일한 항원을 가진다면 알레르기 반응을 나타낸다는 것이다.</p> <p>아미노산의 상동성 비교는 FASTA나 BLASTP 등 다양한 알고리즘 분석을 통하여 확인한다(Pearson and Lipman 1988; Altschul et al 1997). 기존 알레르기 단백질과의 구조적 유사성은 새로 발현된 단백질의 80개 또는 그 이상의 아미노산 부분이 기존 알레르기 단백질의 아미노산과 \( 35 \% \) 이상의 상동성 여부를 통해 확인한다. 발현 단백질의 선형 항원(Epitope) 가능성은 발현 단백질의 연속되는 8개 아미노산 서열이 기존 알레르기 단백질 아미노산 서열과 일치하는 부분이 있는지를 통해 확인한다. 알레르기 단백질과 구조적 유사성 확인을 위해 설정한 \( 35 \% \) 이상의 상동성 여부 기준은 대표적인 알레르기 단백질인 Betv 1이 일부 채소 알레르기 단백질과 \( 40 \% \) 정도의 아미노산 상동성을 가진다는 연구 결과를 근거로 설정되었다(Scheurer et al. 1999). 연속되는 아미노산 서열 상동성 비교에는 다양한 의견이 제시되었다. FAO/WTO 전문가 그룹(2001)은 6개의 연속적인 아미노산 서열 상동성 비교를, IFBC/ILSI는 8개의 연속된 아미노산 서열 상동성 비교를 제안하였다.</p> <p>연속되는 아미노산 서열의 수가 너무 많거나 적으면 위음성 또는 위양성의 결과를 나타낼 가능성이 있고 기존의 알레르기 데이터베이스에서 제공하는 정보가 한정적이기 때문에 다른 평가 결과들을 고려하여 알르레기성을 평가해야 한다. 기존에 알려진 알레르기 단백질의 아미노산과 새로 발현된 단백질의 아미노산 서열 상동성을 비교하는데 주로 사용되는 데이터베이스는 Table 2와 같다.</p> <h2>3) 발현 단백질의 물리화학적 처리에 대한 감수성</h2> <p>알레르기성 평가를 위해 시험관 내에서 새로 발현된 단백질에 대해 소화액과 열처리에 대한 감수성 실험을 진행한다. 일부 알레르기 단백질들은 펩신과 같은 소화액이나 열에 대해 안정성을 가진다(Breitender and mills 2005). 알레르기성 단백질과 비알레르기성 단백질의 소화액에서의 안정성 비교 연구 결과는 Table 3 과 같고 비알레르기성 단백질의 경우 알레르기성 단백질에 보다 빨리 분해된다(Astwood et al. 1996).</p> <p>그러나 일부 연구 결과는 저장 단백질이나 구조 단백질과 같은 특정 단백질은 세포 환경에서 분해에 안정하기 때문에 단백질의 소화 여부는 알레르기성과 절대적 관계가 아니라고 보고하였다(Fu et al. 2002; Yagami et al. 2000). 하지만 단백질 종류를 적절히 분류하고 소화액에서의 감수성 검정 결과를 검토한다면 소화액 감수성 실험은 알레르기성 평가에 주요 방법이 될 수 있을 것이다(Jiang B et al. 2007).</p> <p>IFBC/ILSI는 \( \mathrm{pH} 1.2 \) 조건에서 펩신 내성 실험을 하도록 정하였고 Codex는 \( \mathrm{pH} 2.0\)조건 사용법을 권고하고 있다. 그리고 발현 단백질의 소화성 실험을 위해 사용되는 단백질량 또한 실제로 유전자변형생물체 내 발현 되는 단백질량을 고려할 필요가 있다. 예를 들어 해충저항성 옥수수 Mon 810 이벤트에서 발현되는 단백질 Cry 1 Ab의 양은 약 \( 0.83 \mathrm{ppm} \)으로 극히 소량이다(Székács et al. 2010). 이에 단백질의 소화액 내성 실험 표준화를 위해 펩신의 \( \mathrm{pH} \), 순도 등 실험 조건 변경에 따른 비교 분석 연구가 보고되었다(Thomas et al. 2004).</p> <p>소화액 감수성 실험에서 유전자변형작물의 경우 발현된 단백질을 직접 추출하여 사용하기가 어렵다. 그러므로 주로 대장균과 같은 미생물을 이용하여 단백질을 발현, 분리 하여 사용한다. 이럴 경우 유전자변형생물체 유래 단백질과 미생물에서 유래한 단백질이 생화학적, 구조적, 기능적으로 동일한지에 관해 확인할 필요가 있다. 이때 주로 이용되는 방법은 N-말단 서열 분석, 펩타이드 질량 분석, SDS-PAGE 및 Western blot을 통한 분자량 분석 등이 있다.</p>