Anoikis 검사는 CytoSelect 96-well anoikis 검사 키트를 사용하여 수행하였으며, A549과 SKOV3 세포를 Resveratrol이 포함된 매체에서 분주했다. 또한, A549 세포에는 p53 특이적인 siRNA와 control siRNA를 이용한 siRNA transfection이 이루어졌다. Nitrocellulose membranes에 전달된 단백질은 non-fat skim milk로 blocking된 후, 항체와 화학 발광 시약을 이용하여 시각화하였다.
<h2>부착성 상실 세포사멸 실험(anoikis assay)</h2> <p>Anoikis assay는 CytoSelect 96 -well anoikis assay kit (Biolab Diagnostics, South Africa)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. Resveratrol을 농도별로 포함하는 medium에 A549, SKOV3 세포를 부유시킨 뒤, 각 well 당 \( 0.5 \times 10 ^ { 5 } \) 으로 hydrogel이 코팅된 96-well plate에 분주했다. Resveratrol 처리 48 시간 후, 각 well에 MTT reagent를 첨가하고 3 시간 반응시킨 뒤, detergent solution를 첨가하였다. 3 시간 배양 후, infinite reader를 이용하여 \( 570 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>siRNA를 이용한 p53 유전자 일시적 침묵</h2> <p>A549 세포에서 siRNA transfection은 p53에 특이적인 siRNA (p53 siRNA)와 양성대조군인 scrambled control siRNA (control siRNA)를 이용하여, 각각의 siRNA를 lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA)과 섞어 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. Transfection시킨 뒤, resveratrol을 농도 별로 48 시간 처리하였고, 단백질 발현 분석을 통해 siRNA의 효율성을 검증하였다.</p> <h2>Western blot 분석</h2> <p>각 실험조건에 따라 resveratrol을 농도 별로 처리한 A549, SKOV3 세포를 lysis buffer에 용해한 뒤, \( 15,000 \mathrm { rpm } \) 에서 10 분간 원심분리 하여 상층액에 있는 전체 단백질을 얻었다. \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분간 가열하여 sample을 얻었고 동일한 양의 단백질을 sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel에 의해 분리시켰다. 분리된 단백질을 Nitrocellulose membranes 에 전달시킨 뒤, TBST에 용해시킨 5 \% non-fat skim milk를 이용하여 blocking하였다. 그 후, 1 차 항체를 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 overnight 후, enhanced chemiluminescence reagent (GEHealthcare, UK)를 membrane에 도포하고 X-ray film에 노출시켜 시각화하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Resveratrol이 A549, SKOV3 세포의 생존과 성장에 미치는 영향</h2> <p>Resveratrol이 A549, SKVO3 세포의 생존에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 시행하였다. Resveratrol 을 농도 별 \( (0,20,40,60,80,100 \mu \mathrm { M } ) \) 로 각각 24,48 시간 처리한 후 세포 생존율을 측정한 결과, resveratrol은 A549 세포의 생존을 농도, 시간의존적으로 억제하였다. 반면에 SKOV3 세포의 생존에는 영향을 미치지 않았다(Fig. 1A, B). Resveratrol이 세포의 성장에도 영향을 미치는지 알아보기 위해, BrdU incorporation assay를 시행하였다. 그 결과 A549 세포의 증식 비율은 resveratrol 처리 농도에 따라 점차적으로 감소하였다. 반면에 SKOV3 세포의 증식에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(Fig. 1C). 이러한 결과를 통해 resveratrol이 농도 의존적을 A549 세포의 생존과 증식을 억제하고, SKOV3 세포에는 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다.</p>