levansucrase 유전자(levU)를 효모에 발현하기 위해 exoinulinase 분비신호를 갖지 않는 것과 갖는 것 등 2가지의 발현계를 구축하였다. 그리고 SD배지, \(2\%\) sucrose agar plate, YPDG배지로 1~3차 선별하여 균체증식과 활성이 가장 좋은 효모의 형질전환체 No. 4 균주를 선발하였다. 시험관 배양 결과로 선택된 재조합 levansucrase의 활성을 측정하여 발현량이 증가됨을 확인할 수 있었고, subcellular translocation을 진행하였다. 또한 전기영동 분석을 통해 효모에서 생산되는 재조합 levan-sucrase의 당쇄 부가 양상을 조사하기 위해 배양 상등액과 균체 분획의 재조합 levansucrase를 SDS-PAGE로 분석하고 전기영동을 통해 확인하였으며, 정확한 분자량 확인은 불가능하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Levansucrase (levU) 발현 vectors의 구축</h2> <p>효모에서 levansucrase 유전자(levU)를 발현시키기 위해 exoiulinase 분비신호를 갖지 않는 것과 갖는 것 등 2가지의 발현계를 구축하였다. levU 유전자는 pZL8을 template로 하여 PCR 증폭을 위한 primers로 LEV-1, LEV-2를 사용하였으며, 각각의 서열은 LEV-1: 5' - TGAAGAATTCAGATCTATGTTGAATAAAGC - 3' 와 LEV-2: 5' - TTCAAAGCTTGTCGACTTATTTATTCAATA - 3'로서 (각각 양 말단에 BglⅡ 와 SalⅠ 부위가 만들어지도록 설계) PCR 증폭한 후, BglⅡ 와 SalⅠ으로 처리하여 levU 단편을 분리하였다. 분리한 단편을 pYES 2.0의 GAL1 promoter 하류에 subcloning하여 자체분비신호를 갖는 발현 cassette를 가지는 pYES-levU \(( 7.2\mathrm{kb}) \) 를 구축하였다. 그리고 K. marxianus exoinulinase의 분비 신호 서열(INU1 ss; 23개 아미노산 잔기로 구성; MKLAYSLLLPLAGVSASVINYKR) 하류에 levU를 in-frame으로 연결하기 위해 pYInu-AT의 \( \alpha_{1} \)-antitrypsin 유전자를 BglⅡ-SalⅠ 처리로 잘라내고 levU로 치환하여 GAL10p-INU1 ss-levU-GAL7t의 발현 cassette를 가지는 pYInu-levU \( (7.4 \mathrm{~kb}) \) 를 구축하였다.</p> <h2>효모 형질전환체의 선별</h2> <p>구축된 발현 plasmids (pYES-levU, pYInu-levU)를 효모에 형질전환하여 SD배지에서 1 차 선별하고, \( 2 \% \) sucrose가 포함된 agar plate에서 TTC 염색법으로 적색환을 형성하는 colony를 2차 선별하였다. 2차 선별된 colony 중 5 개를 시험관 \( (2.3 \times 20 \mathrm{~cm}) \) 에서 YPDG배지에서 48 시간 배양한 결과, 균체증식과 활성이 가장 좋은 형질전환체 No. 4 균주를 각각 3 차 선발하였다(data not shown). 숙주세포인 S. cerevisiae SEY2102 경우 균체증식은 형질전환체와 비슷했지만, levan-sucrase 활성은 거의 나타나지 않았다\((0.5 \mathrm{U}/\mathrm{ml}\) 이하).</p> <h2>재조합 levansucrase 발현과 subcellular translocation</h2> <p>시험관 배양 결과로 선택된 No. 4 형질전환체를 플라스크 배양하여 재조합 levansucrase의 활성을 측정한 결과를 Fig.3과 Table 2에 나타내었다. pYES-levU와 pYInu-levU 모두 비슷한 균체증식을 보이며, 잔존 환원당 소모도 비슷하였다. LevU 발현은 dextrose 소모 후 galactose를 이용하는 12 시간 이후부터 발현되어 48 시간까지 계속 발현량이 증가하는 양상을 나타내었다. 12 시간 이후 48 시간까지의 정지기 구간에서 균체농도의 감소가 관찰되지 않았고, 따라서 세포 용해(lysis)는 일어나지 않은 것으로 판단된다. pYES-levU 함유 형질전환 효모는 48 시간 배양 시 균체농도인 \( \mathrm{OD}_{600} \) 가 \( 38.7 \) 이고, levansucrase 활성은 세포 밖 배지에 \( 0.44 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \), periplasmic space에 \( 3.51 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \), cytoplasm에 \( 3.22 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) 로 나타났다. pYInu-levU 함유 형진전환 효모는 48 시간 배양 시 균체농도가 \( \mathrm{OD}_{600} 40.6 \) 이고, levansucrase 활성은 세포 밖 배지에 \( 0.91 \) \( \mathrm{U} / \mathrm{ml} \), periplasmic space에 \( 2.34 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \), cytoplasm에 \( 3.36 \) \( \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) 로 나타났다. 즉, levansucrase 자체 분비신호든 exo-inulinase 분비신호든 배지와 periplasmic space까지의 분비효율은 약 \( 50 \% \) 로 나타나 분비신호에 따른 분비능에 큰 차이를 보이지 않았다.</p> <p>INU1 signal peptide 사용하여 Chung 등은 human lipocortin-1를 효모에서 \( 80 \% \) 정도 분비시켰고, Kang 등은 human \( \alpha \)-antitrypsin를 \( 70 \% \) 의 분비효율로 생산하였고, human serum albumin도 효과적으로 분비시켰다. Scotti 등은 다양한 signal peptides ( \( \alpha \)-factor, invertase, acid phosphatase, Bacillus amyloliquefaciens \( \alpha \)-amylase)를 사용하여 B. subtillis 유래의 levansucrase에 대한 효모에서의 분비 효율를 조사한 바 있다. 그 연구결과에 따르면 invertase signal peptide (MLLQAFLFLLAGFAAKISA) 하류에 mature levan-sucrase의 N-말단 아미노산 서열을 GSKETNQKPY에서 GSTQTNQTPY으로 치환하여 negative net charge를 neutral net charge로 바꾸었을 때 endoplasmic reticulum (ER)의 lumen으로 levansucrase가 효과적으로 수송되지만 배지 내로의 분비는 미약하였다. 성숙 단백질 N-말단의 net charge와 효모 signal peptide의 소수성 core 영역은 효모 분비경로의 첫 단계인 ER로의 수송과 signal peptide 절단에는 효과적으로 기능을 하나, Golgi체로의 이동 및 균체 외로의 분비에는 불충분한 것으로 나타났다. 본 연구에서의 levan-sucrase signal peptide (MLNKAGIAEPSLWTRADAM)도 levansucrase를 세포질에 \( 45 \% \) 정도 존재시켰고, INU1 signal peptide (M KLAYSLLLP LAGVSASVINYKR)의 경우도 균체 외로의 분비는 약간 증가되었으나 세포질에 약 \( 51 \% \) 정도 분포되는 양상을 보였다. 따라서 이는 성숙 단백질 N-말단의 net charge와 signal peptide의 소수성 core영역 외에 성숙 단백질 전체의 net charge 등이 개선되어야만 ER에서 Golgi체로, Golgi체에서 분비과립으로, 분비과립에서 세포 밖으로의 일련의 분비경로 중 율속 단계를 해결하여 분비능을 향상시킬 수 있을 것으로 여겨진다.</p> <h2>재조합 levansucrases의 전기영동</h2> <p>전기영동 분석을 통해 효모에서 생산되는 재조합 levan-sucrase의 당쇄 부가 양상을 조사하기 위해 S. cerevisiae SEY2102/pYES-levU과 SEY2102/pYInu-levU의 배양 상등액과 균체 분획의 재조합 levansucrase를 SDS-PAGE로 분석하였다. Coomassie 염색에서는 정확한 levansucrase의 band를 확인할 수 없었고, non-denaturing PAGE 후 활성 염색에서 넓고 분산된 밴드를 나타내어 전형적인 당단백질임을 확인하였지만, 정확한 분자량 확인은 불가능하였다. Levansucrase에는 3개의 N형 당쇄 부가부위(140Asn-Asp-Thr, 327Asn-Gly-Ser, 335Asn-Pro-Ser)가 존재하는데, 이 세 부위의 Asn에 당쇄가 부가되어 넓은 스펙트럼 밴드를 나타내는 것으로 생각된다. 당쇄 부가된 levansucrase는 생화학적 변화(열안정성 증가)로 인해 반응온도를 높일 수 있어 고농도의 sucrose를 기질로 levan의 생산성 향상를 기대할 수 있다. 실제로 당쇄부가에 의해 열안정성이 크게 증가된 효소로는 Bacillus endoglucanase, Bacillus cycloinulo -oligosaccharide fructanotransferase[8], Bacillus cyclodextrin glucanotransferase, Bacillus \( \alpha \)-amylase 등 다양하다.</p>