Naringenin에서 Isokaempferide의 생합성이 가능하였으나, 생산량은 높지 않았다. MetJ 결실을 가진 B-MetJ-PR 균주가 BL-PR 균주에 비해 약 1.83배 높은 Isokaempferide 생합성능력을 보였다. 최적의 생물전환 조건을 찾기 위해, 세포 밀도와 기질 농도를 조절하였고, 이 중 세포 밀도가 OD \( _ { 600 } =5. 0 \) (약 \( 49. 8 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \))일 때 가장 높 은 생산을 보였다.
<h2>Isokaempferide 생합성을 증가를 위한 대장균 engineering</h2> <p>Isokaempferide는 naringenin으로부터 생합성이 가능하였지만, 생산량은 높지 않았다. 생물전환 시간을 증가하면 제공한 기질이 전부 kaempferol로 생물전환이 되어도 isokaempferide로의 생물전환은 전부 일어나지 않았다. 이러한 결과는 이전의 연구에서도 보고되었다. 이는 대장균 생체내에서 공급되는 메칠 도너인 SAM의 공급이 isokaempferide의 생합싱에 영향을 미칠 수 있다는 것을 암시한다. 이전에 연구에 의하면 대장균내 SAM synthase의 과발현은 SAM의 생합성을 크게 증가시키지 못하는 것으로 나타났다. 이는 대장균에서 SAM의 생합성이 증가하면 리간드 반응 전사조절인자인 MetJ에 의해서 SAM생합성과 관련된 9개의 프로모터로부터 적어도 12개의 유전자를 억제 하는 것으로 알려져 있다. Isokaempferide의 생합성에 Met의 영향을 알아보기 위하여 quick and easy conditional knockout kit (Gene Bridges, Heidelberg, Germany)를 이용하여 MetJ를 제거하였으며, 이 균주는 B-MetJ로 명명하였다. B-MetJ에 PFLS와 ROMT-9을 도입하였으며, 이 균주를 B-MetJ-PR로 명명하였다. B-MetJ-PR과 BL-PR균주의 isokaempfride의 생합성능력을 알아보았다. BL-PR균주는 \( 9.8 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \)를 생산한 반면 B-MetJ-PR 균주는 \( 17.9 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \)를 생산하여 약 1.83배 정도 증가된 생합성능력을 보였다. 이러한 결과는 대장균내의 MetJ 결실이 isokaempferide의 생합성에 많은 영항을 미쳤다는 것을 알 수 있다.</p> <p>B-MetJ-PR균주를 이용하여 최적의 생물전환조건을 탐색하기 위하여 생물전환시의 세포의 밀도 및 기질의 농도를 최적화 하였다. 먼저 세포 밀도의 최적화를 알아보기 위하여 OD \( _ { 600 \mathrm { ~nm } } \)에서 세포밀도를 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 8.0으로 조절하였다. Isokaempferide의 생산은 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 12시간 배양 후 HPLC를 이용하여 분석하였다. 테스트한 세포밀도들 중에서 OD \( _ { 600 } =5.0 \) (약 \( 49.8 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) )에서 가장 높은 생산을 보였으며 다음으로 8.0으로 약 \( 27.9 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \)를 이었다. 그에 반하여 세포의 밀도가 낮아지면 생물전환효율이 현저하게 감소하는 경향을 보여다(Fig. 3). 다음으로 기질 공급농도의 최적화를 알아보기 위하여 기질로 사용된 naringenin의 최종 공급농도를 \( 100 \mu \mathrm { M } (27.2 \mathrm { mg } / \mathrm { L } ) \), \( 200 \mu \mathrm { M } (54.4 \mathrm { mg } / \mathrm { L } ) \), \( 300 \mu \mathrm { M } (81.6 \mathrm { mg } / \mathrm { L } ) \), \( 500 \mu \mathrm { M } (136 \mathrm { mg } / \mathrm { L } ) \), \( 700 \mu \mathrm { M } (81.6 \mathrm { mg } / \mathrm { L } ) \), \( 1000 \mu \mathrm { M } (272 \mathrm { mg } / \mathrm { L } ) \)로 생물전환 배지에 첨가하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 12시간 배양 후 isokaempferide의 생산성을 분석하였다. 테스트한 농도 중에서 \( 300 \mu \mathrm { M } \)에서 isokaempferide의 최적의 생산성을 보인데 반하여 그 이상의 기질 공급농도에서는 생합성능력은 현저히 저하되는 경항을 보였다(Fig. 4). 최적화된 조건을 이용하여 naringenin으로부터 isokaempferide의 생산을 \( 30 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 교반배양기에서 48시간 동안 모너터링 하였다. Isokaempferide배양 후 2시간부터 생합성이 관찰되는데 반하여 naringenin의 농도는 급격하게 감소하기 시작하여 배양 후 12시간에 아주 소량만 이 관찰되었다. 중간물질인 aromadendrin과 kaempferol은 배양초기에 증가하였다가 배양 후 24시간에 대부분이 isokaempferide로 전환되는 것을 보였다. 이 시점에 약 약 \( 87 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \)의 isokaempferide 생산성을 보였으며, 배양 후 48시간에 isokaempferide 생산성은 약간 감소하는 경항을 보였다(Fig. 5).</p>