Agilent Protein 80 Kit과 2100 Bioanalyzer를 이용하여 Lab-on-a-chip 측정과 시료 전처리를 진행한 후 단백질 분리 패턴을 비교·분석하였다. 우유의 초고압 처리(HPP) 시 단백질 변성 정도를 파악하기 위해, 다양한 조건에서 처리한 HPP 우유와 다른 방식으로 처리한 우유의 주요 단백질 함량을 on-chip 전기영동 방법으로 측정하고 비교하였다. 또한 우유의 lipase, protease, alkaline phosphatase, lactoperoxidase 활성 변화를 측정하기 위해 원심분리기를 이용하여 지방층을 제거한 우유를 사용하였으며, Lipase 저해활성은 Park 등의 방법을 변형하여 측정하였다.
<h2>우유의 유단백 변성도 측정</h2> <p>우유의 HPP 처리 시 단백질 변성 정도를 알아보기 위하여 원유와 각각 570,590 및 \( 600 \mathrm { MPa } \) 의 조건에서 3 분 또는 5 분간 처리한 HPP 우유, 대조군으로 LTLT, HTST, UHT 처리 우유의 \( \alpha \)-casein, \( \beta \)-casein, K-casein, \( \alpha \)-la, \( \beta \)-lg의 함량을 Nitsche의 방법을 변형하여 on-chip 전기영동 방법으로 측정하여 비교하였다. 시료의 단백질은 \( 13,000 \times g \) 에서 1 시간 동안 원심분리 하여 지방층을 제거하고 남은 상등액을 이용하여 측정하였다. Lab-on-a-chip 측정과 시료 전처리는 Agilent Protein 80 Kit Quick Start Guide에 따라 처리하였으며, 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)을 이용하여 전기영동 한 후 단백질 분리 패턴을 비교·분석하였다.</p> <h2>효소활성 측정</h2> <p>초고압 처리에 따른 우유 lipase, protease, alkaline phos-phatase 및 lactoperoxidase 활성 변화 측정은 실험항목에 따라 vortex mixer를 이용한 균질 및 원심분리기를 이용한 지방층 제거 등의 전처리 과정을 거친 우유를 사용하여 측정하였다. Lipase 저해활성은 Park 등의 방법을 변형하여 측정하였다. \( 10 \mathrm { nM } \) p-nitrophenyl phosphate 용액 \( 0.1 \mathrm { ml } \) 과 \( 50 \mathrm { mM } \) potassium phosphate \( ( \mathrm { pH } 7.5) \) 완충액 \( 0.8 \mathrm { ml } \) 를 혼합하고 여기에 \( 0.1 \mathrm { ml } \) 의 우유를 가한 뒤 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 15 분간 반응시킨 후 유리된 p-nitrophenol의 양을 \( 405 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. Protease 활성은 Gupta 등과 Gutelben 등의 방법을 변형하여 측정하였다. \( 0.5 \% \) casein 용액 \( 0.1 \mathrm { ml } \) 을 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분간 반응시킨 후 \( 0.1 \mathrm { ml } \) 의 우유를 가한 뒤 다시 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분간 반응시켰다. 여기에 \( 0.4 \mathrm { M } \) trichloroacetic acid 용액 \( 0.2 \mathrm { ml } \) 을 가해 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 25 분간 방치시킨 뒤 침전물을 \( 0.4 \mu \mathrm { m } \) syringe filter로 여과하였다. 여과액 \( 0.1 \mathrm { ml } \) 에 \( 0.4 \mathrm { M } \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { CO } _ { 3 } 0.5 \mathrm { ml } \) 과 Folin-Ciocalteu's phenol reagento 액 (Sigma-Aldrich, St. Luis, MO, USA) \( 0.1 \mathrm { ml } \) 을 가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20 분간 발색시킨 뒤 냉각하여 생성된 tyrosine의 양을 \( 660 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다. Alkaline phosphatase의 활성은 Alkaline Phosphatase Assay Kit (Abcam, Cambridge, MA, USA)를 제조사의 방법에 따라 측 정하였고, lactoperoxidase의 활성은 Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit For Lactoperoxidase (CloudClone Co., Houston, TX, USA)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 측정하였다.</p>