BPV 유전자를 증폭하기 위해 올리고 핵산의 primer 염기서열을 디자인하였다. 일반 PCR 반응으로 디자인한 primer 5 의 특이성을 확인하고 \( \mathrm { MgCl }_{2}\) 와 annealing temperature 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화하였다. BPV DNA를 분리하고 PCR 반응산물을 확인하였다.
<h2>Primer의 선별</h2> <p>BPV 유전자를 증폭하기 위해 사용한 올리고핵산 primer 염기서열은 NCBI data base에 보고된 BPV complete genome(NC 001540)을 기초로 Primer3 Software를 이용하여 디자인하였다. Corbett Research사(Australia)의 PALM-CYCLER를 이용한 일반 PCR 반응을 통해 디자인 한 primer 5 쌍들의 특이성을 확인하고, annealing temperature와 \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \) 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화하였다. 또한 증폭된 DNA가 목적하는 산물인지를 확인하기 위하여 PCR product의 DNA sequencing을 실시하였다.</p> <p>BPV DNA는 GENE ALL \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) Blood SV mini Kit(General Biosystem, Korea)을 사용하여 분리하였다. PCR 반응을 위해 바이러스 genomic DNA \( 2 \mu \mathrm { L } , 10 \mathrm { pmol } \) forward primer \( 1 \mu \mathrm { L } , 10 \) pmol reverse primer \( 1 \mu \mathrm { L } , 2 \mathrm { X } \) GoTaq \( { } ^ {\circledR } \mathrm { Green } \) Master Mix(Promega, USA) \( 12.5 \mu \mathrm { L } \) 혼합액에 Nuclease-free water \( 8.5 \mu \mathrm { L } \) 를 첨가하여 최종부피를 \( 25 \mu \mathrm { L } \) 로 맞추었다. 핵산증폭은 pre-incubation은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2 분, denaturation은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(30 \)초, annealing은 \(30 \)초 (annealing 온도 최적화를 위해 \( 48 ^ {\circ } \mathrm { C } , 50 ^ {\circ } \mathrm { C } , 52 ^ {\circ } \mathrm { C } , 54 ^ {\circ } \mathrm { C } , 56 ^ {\circ } \mathrm { C } , 58 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 PCR 수행), extention은 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(1 \) 분으로 하여 40 cycle을 수행하였다. 40 cycle PCR 후 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(5 \)분 반응시킨 후 \( 1.5 \% \) agarose gel(Sigma Co., USA)을 사용하여 \( 100 \mathrm { ~V } \) 전압으로 \(30 \)분정도 전기영동한 후 ethidium bromide로 염색하여 PCR 반응산물을 확인하였다.</p>