sulforaphane에 의한 NAG-1 의 발현은 p53이 아닌 기타 다른 전사조절인자에 의해 조절된다. p53이 null인 세포주에서도 NAG-1의 발현이 증가하며 sulforaphane에 의한 NAG-1의 발현은 p53 비의존적이다. 이에 본 연구는 sulforaphane에 의한 NAG-1 의 발현에 전사조절인자인 ATF3 가 관여하는지 살펴 sulforaphane의 처리에 의해 NAG-1의 발현됨을 알아냈다.
<h2>Sulforaphane에 의한 NAG-1과 p21유전자의 발현 증가의 p53 의존성 검증</h2> <p>파이토케미칼 genistein, resveratrol에 의한 NAG-1 단백질의 발현은 대표적인 암 억제유전자인 \( \mathrm{p} 53 \) 에 의해 이루어진다는 보고가 있었다. 따라서, 본 연구에서는 p53 유전자가 null인 HCT116세포주를 이용하여, sulforaphane에 의한 NAG-1의 발현이 p53 의존적인지 확인하였다. 그 결과, Fig. 4A 에서 보는 바와 같이 NAG-1 단백질의 발현은 정상적인 세포주와 p53이 null인 세포주와 동일하게 이루어지는 것을 확인하였다. 이러한 연구 결과는 sulforaphane에 의한 NAG-1 의 발현은 \( \mathrm{p} 53 \) 이 아닌, 다른 전사조절인자에 의해 조절된다는 것을 시사한다. 한편, sulforaphane에 의한 p21단백질의 발현 은 p53에 의존적이라는 것을 확인하였다.</p> <p>Sulforaphane처리에 의한 NAG-1의 발현의 p53 의존성을 mRNA 수준에서 검증하기 위하여, HCT116 세포주에 sulfor-aphane을 농도별 \( (10,20,30 \mu \mathrm{M}) \) 로 처리하고, \( \mathrm{p} 53 \) null인 HCT116 세포주에 \( 30 \mu \mathrm{M} \) sulforaphane을 처리한 후 정량적 PCR 을 수행하였다. 그 결과, Western blot의 결과와 동일하게, p53이 null인 세포주에서도 NAG-1의 발현이 증가되는 것으로 확인되어, sulforaphane에 의한 NAG-1의 발현은 p53 비의존적으로 이루어진다는 것을 재 확인할 수 있었다.</p> <h2>Dietary histone deacetylase inhibitor로서의 NAG-1 단백질의 발현 증가 여부 검증</h2> <p>Sulforaphane은 dietary histone deacetylase inhibitor로서 알려져 있으며, p21과 bax와 같은 항암 유전자의 발현을 유도함으로서 일부 항암 기능을 가지는 것으로 알려져 있다. 또한, 일부 세포주에서 대표적인 histone deactylase inhibitor인 TSA (Trichostatin A)에 의해 NAG-1 단백질의 발현이 증가된다는 보고가 있었다. 따라서, 본 연구에서는 TSA를 이용하여 sulforaphane에 의한 NAG-1의 발현이 sulforaphane이 is-tone deacetylase inhibitor로서 발현을 증가시키는 것의 여부 를 간접적으로 확인하였다. 그 결과, TSA에 의해서 p21의 발현은 확실하게 증가하였으나, NAG-1의 발현은 TSA 처리에 의해 매우 미미한 발현 증가를 보여 주었다. 따라서, sulforaphane에 의한 NAG-1의 발현과 sulforaphane의 his-tone deacetylase inhibitor로서의 발현과의 관련은 매우 적은 것으로 판단되나, 직접적인 관련성을 증명하기 위해서는 추가적인 실험이 필요할 것으로 생각된다.</p> <h2>Sulforaphane에 의한 NAG-1 단백질 발현에 있어서 ATF3 유전자의 관련성 검증</h2> <p>일부 파이토케미칼에 의한 NAG-1 단백질의 발현이 전사조절인자인 ATF3 (Activating Transcription Factor 3)에 의해 이루어 질 수 있다는 연구결과들이 보고되었다. 또한, 본 연구그룹의 선행연구 결과에 의하면 \( 30 \mu \mathrm{M} \) sulforaphane 을 24 시간 처리 후 oligo DNA microarray 실험을 한 결과, ATF3 유전자의 발현이 증가됨을 확인하였다(data not shown). 따라서, 본 연구에서는 sulforaphane에 의한 NAG-1 의 발현에 전사조절인자인 ATF3 가 관여하는지를 확인하기 위하여, sulforaphane의 처리에 의해 NAG-1의 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 그 결과, Fig. 6A 에서 보는 바와 같이, sulfor-aphane의 농도별 처리에 따른 ATF3 의 발현증가를 확인한 결과, sulforaphane의 농도 증가에 따라 ATF3의 발현이 증가됨을 확인하였으나, 발현 증가량은 매우 적었다. 그러나, \( 30 \mu \mathrm{M} \) sulforaphane을 시간대 별로 처리한 결과, 2 시간 처리 후부터 ATF3 발현이 증가되었다가 10 시간 째부터 발현이 감소됨을 확인하였다. 이러한 연구결과를 NAG-1의 발현증가가 6시간째부터 이루어지는 결과와 비교해 보았을 때, sulforaphane에 의한 NAG-1의 발현증가는 ATF3에 의해 유도되어질 가능성이 매우 높은 것으로 판단된다. 하지만, 좀 더 정확한 증명을 위해서는 pro-moter assay나 ATF3- siRNA를 이용한 추가적인 실험이 필요할 것으로 판단된다.</p>