Leuconostoc gelidum UAL 187 유래의 leucocin A 유전자 클로닝에 성공하였다. 발현유도된 AGA2-Leucocin A 단백질은 숙주인 EYB100 효모의 세포벽을 통과하여 세포표면에 고정된다. 그리고 형질전환 효모와 Leucocin A의 발현이 유도된 효모의 항균활성을 비교 분석하였고, Leucocin A 발현 플라스미드가 도입된 효모만이 괴초균의 생육을 억제하는 것을 확인하였다. 따라서, 형질전환 효모의 항균활성은 Leucocin A 발현 플라스미드에 의해 발생한다는 사실이 확인되었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Leucocin A 유전자의 클로닝</h2> <p>Leucocin A는 38개의 아미노산으로 구성된 짧은 펩타이드로 유전자의 일차구조가 이미 보고되어 있다. \( 111 \mathrm{bp} \)의 짧은 길이의 Leucocin A 유전자를 클로닝하기 위하여 Leucocin A 유전자의 전후 부위를 \( 55 \mathrm{bp} \) 정도씩 나누어서 합성한 후, 이들을 서로 DNA 연결효소(ligase)로 연결하여 이 유전자를 클로닝하였다. 합성된 oligo DNA를 서로 annealing하여 얻어진 이중쇄 DNA를 효모 발현 벡터(vector)인 pYD1의 제한효소 XhoⅠ-ApaⅠ 부위에 삽입하여 효모 발현 플라스미드를 얻었다. 이러한 방법으로 유산균의 일종인 Leuconostoc gelidum UAL 187 유래의 leucocin A 유전자의 클로닝에 성공하였다. 클로닝에 사용한 Leucocin A 유전자의 염기서열과 아미노산 서열을 Table 1에 나타내었다.</p> <h2>Leucocin A를 생산하는 형질전환 효모의 제작 및 유전자의 발현</h2> <p>발현 플라스미드 pYD1-LeucoA를 효모(EYB100(+Ura))세포에 형질전환하기 위하여 electrophoration 방법을 이용하였다. 이 방법을 이용한 결과, lithium acetate 법을 이용한 방법보다 10배 이상의 콜로니(colony)를 확보할 수 있었다. 형질전환 효모의 선별을 위하여 효모의 일반적인 선택마커인 영양요구성 마커를 이용하였으며, 형질전환이 이루어진 효모세포는 SD-Ura-Trp배지에서 배양 3일 후 콜로니를 형성하였다.</p> <p>pYD1-LeucoA 형질전환 효모를 이용한 Leucocin A의 생산을 위하여 PYD1 운반체의 유전자 발현에 관여하는 GAL1 promoter를 galactose를 이용하여 발현을 유도하였다. pYD1-LeucoA가 형질전환된 효모를 glucose가 함유된 SD-Ura-Trp 배지에서 배양한 후 회수된 균체를 galactose가 함유된 SD-Ura-Trp ( \( 2 \% \) galactose)배지에 접종하여 배양하는 방법으로 Leucocin A의 발현을 유도할 수 있었다. 발현 플라스미드 pYD1-LeucoA은 Leucocin A 유전자를 pYD1운반체의 AGA2 카세트 상에 존재하는 AGA2 유전자 산물과 융합 단백질을 생산할 수 있도록 삽입하였다. 그 결과, 발현유도에 의해 생산된 AGA2-Leucocin A 단백질은 숙주(host)세포로 사용된 효모인 EYB100의 세포벽을 통과하여 세포 표면에 부착되어 존재하는 AGA1 단백질과 결합하여 세포표면에 고정된 상태로 존재하게 된다.</p> <h2>형질전환 효모의 Leucocin A 생산능의 확인</h2> <p>고초균(Bacillus subtilis)을 액체배지에 배양한 후, 이를 YPD 고체배지 전체에 접종하였다. 여기에 pYD1 형질전환 효모와 Leucocin A의 발현이 유도된 pYD1-LeucoA 형질전환 효모를 일정부위에 접종하여 항균활성에 의해 생성된 생육억제환(clear zone)을 비교 • 분석한 결과, pYD1-LeucoA 플라스미드가 도입된 효모만이 괴초균의 생육을 효과적으로 억제하는 것이 확인되었다.</p> <h2>pYD1-LeucoA 형질전환 효모로부터 분리된 플라스미드로부터 Leucocin A 유전자의 확인</h2> <p>pYD1-LeucoA가 형질전환된 효모로부터 Leucocin A 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA를 분리하였고, 이를 이용하여 Leucocin A 유전자에 특이적인 primer를 이용하여 PCR을 행한 결과, Leucocin A 유전자에 해당하는 약 \( 120 \mathrm{bp} \)의 유전자 단편이 확인되었다. 이 결과로 형질전환 효모가 나타내는 고초균에 대한 항균활성이 형질전환에 의해 도입된 Leucocin A 발현 플라스미드에 의한 것이라는 사실을 확인할 수 있었다.</p> <p>이 연구의 결과로 부패하기 쉬운 식품들의 보존성을 향상시키거나, 내성이 생긴 병원균의 생육을 저해하기 위한 항생제로 사용할 수 있는 박테리오신을 산업적으로 대량생산할 수 있는 효모세포를 제작하였다. 재조합 DNA 기술을 이용하여 유용 유전자 산물의 효율적인 생산을 위해서는 대상 유전자 산물인 단백질의 특성에 따라 사용하는 숙주(host)를 잘 선택해야 한다. 이 연구의 대상인 Leucocin A는 세균의 생육을 억제하는 항균활성을 가지는 단백질이기 때문에 대장균과 같은 세균세포를 생산숙주로 이용할 경우 생산이 불가능한 경우가 많다. 이 연구에서 사용한 생산숙주인 효모의 경우는 박테리오신에 의해 생육 저해를 받는 원핵생물과는 달리 진핵생물이지만 배양이 용이하며 생육속도가 비교적 빠르기 때문에 특수한 유전자 산물을 생산하는데 자주 사용되는 숙주세포이다.</p>