전기영동으로 단백질을 분리하고 nitrocellulose membrane에 이차 항체반응을 실시하여 enhanced chemiluminoesence 용액을 적용하여 X-ray film에 감광하여 특정 단백질의 발현 양을 분석하였다. \( 200 \mu 1 \) lysis reagent에 \( 1 \times 10 ^ { 6 } \) 개의 세포를 모아 균질하게 용해한 후 telomere repeat amplification protocol (TRAP) assay로 telomerase activity를 측정하였다.
<h2>단백질의 분리, 전기영동 및 Western blotting</h2> <p>정상 및 봉독이 처리된 배지에서 자란 세포들을 lysis buf-fer로 용해한 후, 동량의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 전이시킨 후, 특정 단백질에 대한 항체와 그에 대한 이차 항체반응을 실시한 후 enhanced chemiluminoesence (ECL) 용액 (Amersham Life Science)을 적용시킨 다음 X-ray film 에 감광시켜 특정 단백질의 발현 양을 분석하였다.</p> <h2>Telomerase 활성 측정</h2> <p>정상 및 봉독이 처리된 배지에서 배양된 세포들을 모아 \( 200 \mu 1 \) lysis reagent에 \( 1 \times 10 ^ { 6 } \) 개의 세포를 섞어서 30분간 얼음 위에서 lysis를 실시하였다. TRAP 반응을 위하여 \( 2 \mathrm { mg } \)의 단백질이 함유된 \( 2 \mu \mathrm { l } \) 의 세포 추출액을 \( 25 \mu \mathrm { l } \) 의 reaction mixture에 혼합후, 증류수를 첨가하여 최종 volume이 \( 50 \mu \)가 되도록 하였다. PCR은 primer elongation \( \left (25 ^ {\circ } \mathrm { C } \right . \) 에서 30분간), telomerase in-activation \( \left (94 ^ {\circ } \mathrm { C } \right . \) 에서 5분간), product amplification \( \left (94 ^ {\circ } \mathrm { C } \right . \) 에서 30초, \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30초 및 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 90초를 30 cycles)의 순서로 진행이 되었으며, 이를 이용하여 hybridization 과 ELISA re-action 반응을 시켰다.</p> <h2>Prostaglandin E2의 측정</h2> <p>봉독 처리에 따른 \( \mathrm { PGE } _ { 2 } \) 생성량의 변화를 조사하기 위하여 준비된 세포를 96-well plate에 well 당 \( 160 \mu \)의 배지에 \( 10 ^ { 4 } \) cell/well 정도로 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 봉독을 농도별로 배지에 희석하여 처리하였다. 이때 마지막 배지의 양을 모두 \( 180 \mu \) 로 통일시켰다. 48시간 후 배지에 2.5%의 dode-cyltrimethylammonium bromide가 함유된 buffer를 \( 20 \mu \) 첨가하여 총 배지의 양이 \( 200 \mu \mathrm { l } \) 되게 한 후 lysis가 잘 일어나도록 pipetting을 수회 실시하였다. 상온에 약 10분간 incubation한 후 trypan blue를 이용하여 암세포의 수를 계수하였다. 약 \( 50 \mu \)의 lysate를 취하여 kit에 준한 protocol에 따라 EIA를 실시한 후 \( 450 \mathrm { ~nm } \)의 파장에서 얻어진 값을 기준으로 \( \mathrm { PGE } _ { 2 } \)의 양을 추정하였다.</p>