본 절에서는 본 연구에서 실행한 실험 방법에 대해 간략히 설명한다. 첫째로 SDS-PAGE 전기영동 실험에서는 재조합균주를 통해 얻은 세포 파쇄액의 상층액을 전기영동의 재료로 사용하였으며, \( 12 \% \) SDS-PAGE 전기영동을 시행하였고, 단백질 염색을 통한 면역학적 검색을 진행하였다. 둘째로, Styrene oxide 가수분해반응에 대한 동력학적 분할반응 실험에서는 광학활성 및 styrene oxide을 이용해 초기속도 및 기질농도를 구했다. 셋째로 Tween \(20\) 첨가에 대한 영향을 분석에서는 Tween \(20\)을 반응액에 첨가하고 라세믹 styrene oxide를 주입해 가수분해 속도 및 입체선택성을 측정하였다. 넷째로 재조합균주 P. pastris을 이용한 회분식반응 실험에서는 반응액에 Tween \(20\)과 라세믹 styrene oxide를 주입후 초기 가수분해 속도 및 입체선택성을 평가하였으며, 마지막으로 입체이성질체 분석에서는 가스크로마토그래프를 이용해 Styrene oxide의 광학순도 값과 수율을 결정하였다.
<h2>SDS-PAGE 전기영동 및 면역학적 검색법</h2> <p>재조합균주를 BMMY 액체배지에서 발현을 유도한 다음 원심분리하여 언은 세포침전물에 breaking buffer롤 넣어 600 \( \mathrm{nm} \) 에서 혼탁드가 100 이 되게 현탁한 다음 같은 양의 acid-washed glass bead를 넣어 수 회 vortexing 함으로서 세포를 파쇄하여 상층액을 전기영동 시료로 사용하였다. \( 12 \% \) SDS-PAGE 전기영동을 행하였으며 단백질의 염색은 Coomassie blue R-250를 사용하였다. 발현된 (His) 6 -tag 융합단백질을 검색하기 위하여 SDS-PAGE gel 상에 분리된 단백질들을 nitro-cellulose membrane로 전기이동시킨 다음 1 차 항체로 (His) \( 6_{6} \) tag antibody (H-15, Santa Cruz Biotechnology Inc., USA), 2 차 항체로는 peroxidase가 결합된 anti-rabbit IgG antibody (Jackson Immunoresearch, USA)를 이용하였으며 발색시약으로는 CN/DAB(4-chloronaphthol/3,3'-diaminobenzidine) sol-ution (Pierce, USA)를 사용하였다.</p> <h2>입체동력학적 가수분해반응</h2> <p>Styrene oxide 가수분해반응에 대한 동력학적 분할반응을 시험하기 위하여 광학활성 (R)- 및 (S)-styrene oxide를 기질로 하여 초기속도를 측정하였으며 사용한 기질농도는 0-6 \( \mathrm{mM} \) 이었다. 세포 \( 2 \mathrm{mg} \) 건조중량 (dry cell weight, dcw)를 1 \( \mathrm{ml} \) 의 \( 100 \mathrm{mM} \) phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 7.5)에 현탁시킨 후 적정농도의 기질을 주입하고 반응시켰으며 초기속도 측정하기 위하여 반응 2 분 후 cyclohexane으로 추출하여 GC 로 분석하고 초기반응속도를 구하였다. 반응기로는 screw-cap vial을 사용하였으며, \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm} \) 의 진탕배양기에서 반응을 실시하였다.</p> <h2>Tween 20 첨가 및 온도의 영향</h2> <p>유전자재조합 P. pastoris의 epoxide 가수분해효소 활성에 대한 Tween 20 의 효과를 측정하기 위하여 \( 0,0.1,0.5,1 \), 및 \( 5 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 되게 Tween 20을 반웅액에 첨가하고 \( 20 \mathrm{mM} \) 농도의 라세믹 styrene oxide를 주입한 다음 초기 가수분해 속도 및 입체선택성을 측정하여 평가하였다. 또한 epoxide 가수분 해효소 활성에 대한 온도의 영향을 측정하기 위하여 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \), \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 및 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반응을 진행하였으며 기질농도는 \( 20 \mathrm{mM} \) 라세믹 styrene oxide를 사용하였다. 모든 반응에 사용한 재조합균주 P. pastoris의 세포중량은 \( 2 \mathrm{mg} \mathrm{dcw} \) 이었다.</p> <h2>최적조건에서의 회분식반응</h2> <p>R. glutinis EH 유전자를 double copy로 재조합하여 발현시킨 재조합균주 P. pastris을 이용한 회분식반응에서 라세믹 styrene oxide 혼합물로부터 광학순도가 높은 (S)-styrene oxide를 제조하기위한 실험조건을 수립하였다. 반응액에 Tween 20 을 \( 0.5 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 첨가하고 \( 20 \mathrm{mM} \) 농도의 라세믹 styrene oxide를 주입한 다음 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반응을 진행하였으며 초기 가수분해 속도 및 입체선택성을 측정하고 평가하였다.</p> <h2>입체이성질체의 분석</h2> <p>Styrene oxide의 광학순도 \( e e \) 값(enantiomeric exccess) 및 수율 결정을 위한 광학이성질체 분석은 불꽃이온 검출기 (FID)가 장착된 가스크로마토그래프를 사용하였다. 분석용 column으로는 silica cyclodextrin capillary \( \beta \)-DEX \( 120(30 \mathrm{~m} \) length, \( 0.25 \mathrm{~mm} \) ID, and \( 0.25 \mu \mathrm{m} \) film thickness, Supelco Inc., USA) column을 사용하였다. 이동가스로 질소를 사용하였으며 split ratio는 \( 1: 100 \), flow rate는 \( 0.5 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 으로 \( 1 \mu \mathrm{l} \) 의 시료를 주입하여 분석하였고, column, injector, detector 의 온도는 각각 \( 100,220,220^{\circ} \mathrm{C} \) 이었다. 광학순도 \( \% e e=100 \) \( \mathrm{x}[\mathrm{S}-R] /[S+R] \) 로 계산하였다. 기질인 라세믹 및 enantiopure styrene oxide standard는 Aldrich Chemical Inc. (USA) 제품을 사용하였다.</p>