PCR 증폭 및 molecular cloning을 통해 확보된 모든 RLGs의 염기서열은 NCBI의 BLAST를 통해 GenBank의 RLGs 염기서열과 비교하여 상동성을 확인한 후 계통발생학적 분석을 진행하였고, 낙동벼의 볍시 파종후 14일이 지난 식물체에 각각의 stress를 처리 하였다. total RNA의 추출을 위해 분쇄된 잎 조직을 멸균된 \( 1.5 \mathrm{~mL} \) tube에 담고 RNeasy Plant Mini kit를 사용하고, 추출한 total RNA를 사용하여 역전사반응을 수행한 후 internet-based primer 제작 프로그램을 이용하여 염기서열이 결정된 Q-primer를 제작하였으며, NCBI 의 BLAST search를 통해 primer 염기서열의 유일성을 검증하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>유전자 분석과 계통발생학적 분석</h2> <p>PCR 증폭 및 일반적인 molecular cloning을 통해 확보된 모든 receptor like kinase genes (RLGs)의 염기서열은 NCBI의 Basic Local Alignment and Search Tool (BLAST, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)를 통해 GenBank에 등재된 RLGs의 염기서열과 비교하여 상동성을 확인하였다. 분석에 적용된 염기서열의 GenBank accession number는 table 1에 나타내었다. 염기서열이 확인된 RLGs의 단백질 서열은 ClustalX(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html)에서 아미노산 서열을 정렬하고, Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA 3, http://www.megasoftware.net) 프로그램에서 Neighbour-Joining 방법으로 계통발생학적으로 분석하였으며, TreeView 프로그램 (http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html)를 통해 확보한 계통발생학 (Phylogenetic) tree를 확인하였다.</p> <h2>식물재료 및 스트레스 처리</h2> <p>본 실험에서는 국내 재배용 벼인 낙동벼 (Oryza sativa L.cv. Nakdong)를 농촌진흥청 유전체실험실에서 제공받아 사용하였으며, 볍씨 파종 후 14일이 지난 식물체에 각각의 stress를 처리하였다. 환경적인 stress로는 상처와 저온의 온도를 처리하며, 화학적인 stress로는 Salicylic acid (Duchefa, Netherlands) 처리와 Sodium chloride (Daejung, Korea)를 처리함으로써 염에 따른 stress를 처리하였다.</p> <p>상처에 대한 단백질 발현 효과를 위해 멸균된 바늘을 사용하여 잎에 상처를 낸 후 1 시간과 24 시간 후 두 번에 걸쳐 수확하였으며, 대조군은 상처를 내지 않은 잎을 수확하였다. 저온의 처리는 배지를 포함한 식물체를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간과 24시간 후 수확하고, 대조군은 상온에서 배양하였다. 화학적 처리를 위해 \( 25 \mathrm{mM} \mathrm{SA} \) (Salicylic acid)와 \( 100 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \) (Sodium chloride)을 처리하였다.</p> <h2>Total RNA의 추출</h2> <p>식물의 잎 조직을 절단하여 \( 500 \sim 600 \mathrm{mg} \) 씩으로 나눈 후, 조각 낸 시료 절편을 미리 액체 질소로 냉각된 막자 사발에 넣고 시료가 해동되지 않도록 액체 질소를 부어가며 완전한 분말형태가 될 때까지 분쇄하였다. 분쇄된 잎 조직을 멸균된 \( 1.5 \mathrm{~mL} \) tube에 담고 RNeasy Plant Mini kit (QIAGEN, USA)를 사용하여 total RNA를 추출하였다. 실험법은 제조사의 지시를 그대로 따르며, 순수 분리한 total RNA 시료는 spectrophotometer (Eppendorf, Germany)를 이용하여 정량 한 후 RT-PCR에 사용하였다.</p> <h2>First-Strand CDNA 합성</h2> <p>순수 분리한 식물체의 total RNA를 사용하여 cDNA를 합성하기 위해 역전사반응을 수행하였다. 과정은 \( 2 \mu \mathrm{g} \) 의 total RNA 를 oligo \( \mathrm{dT} \) (100 pmole)와 섞어 준 후 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 가열하여, 바로 ice에 정치한 후 \( 10 \times \) Reaction buffer, \( 100 \mathrm{mM} \) DTT, dNTP (각 \( 2.5 \mathrm{mM} \) ), 200unit MMLV 역전사 효소 (Bioneer, korea), 10 unit RNase (Invitrogen, USA)를 이용하여 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 의 최종 부피로 \( 38^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성하였다. 반응이 종료된 cDNA mix는 RNaseH (Fermantas, USA)를 처리한 후 바로 quantitative real-time PCR에 사용하였다. 효소를 이용한 실험은 모두 제조사의 지시를 따랐다.</p> <h2>Quantitative real-time PCR 용 primer의 제작</h2> <p>본 연구에서 발현 분석에 대상이 되는 벼의 receptor like kinase 유전자들은 (RLGs; RLG1, RLG5, RLG6, RLG\#6, RLG8, RLG10, RLG17, RLG18, RLG20) 선행 연구를 통해 유전자 염기서열이 규명되었으며, 그 염기서열을 바탕으로 Real-Time PCR에 사용된 primer (Q-primer)의 염기서열을 결정하였다. 염기서열이 결정된 Q-primer은 internet-based primer 제작 프로그램인 Primer3 v0.2을 이용하여 제작하였으며, NCBI 의 BLAST search를 통해 primer 염기서열의 유일성을 검증하였으며, primer 제작 회사를 통한 주문 (Bionics, korea)에 의해 제작되었다 (Table 1).</p> <h2>Quantitative real-time PCR</h2> <p>먼저 table 1 의 선별된 Q-primer의 최적 annealing 온도를 알아보기 위해 Exicycler Quantitative Thermal Block (Bioneer, Korea)의 gradient 기능을 이용하여 gradient PCR 을 수행하였다. 재조합 pBX-RLG plasmid DNA \( 1 \mathrm{ng} \), 각 RLG-F/R Q-primer 10 pmole에 2x GreenStar PCR premix (Genetbio, Korea) 를 첨가하여 최종 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 반응용액을 사용하였다. 여기서 선정된 annealing 온도는 역전사효소 반응으로 합성된 cDNA 를 주형으로 수행한 Quantitative real-time PCR에 적용되었다. 전사효소 반응액 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 중 \( 1 \mu \mathrm{L} \) 와 10 pmole의 각 RLG-F/RQ-primer로 총 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 반응액으로 하여, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 로 10 분간 전해리를 수행한 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 20 초간 해리, 각 annealing 온도에서 20 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 초간 중합의 과정을 35 cycle 수행하였으며, 용응온도분석 (Melting point analysis)은 \( 50-94{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 구간을 측정하여 \( \mathrm{Tm} \) 값을 결정하였다.</p>