김치 시료를 통해 Leuconostoc와 Weissella 유산균을 분리하는 연구를 진행하였다. 시중의 대형마트에서 구입한 김치로부터 분리한 균주들을 16S rDNA 염기서열 분석을 통해 계통발생학적으로 동정하였다. 총 25종의 김치로부터 동정한 결과, Leuconostoc는 148균주, Weissella는 230균주를 확인하여 총 378균주가 동정되었다.
<h1>김치로부터 Leuconostoc 및 Weissella 속 유산균의 분리, 배양 및 동정</h1> <p>Leuconostoc 및 Weissella 속 유산균의 분리를 위한 김치 시료는 시중의 대형마트에서 구입하였다. 김치시료의 국물은 멸균한 거즈로 여과하였고, 고형물은 무게대비 2배의 멸균수를 가하여 혼합한 후 여과하였다. 각 여액을 동량 혼합한 다음, single colony의 분리가 가능한 농도로 생리식염수로 희석하여 MRS medium(Difco, USA) 및 leuconostocs selective medium(LUSM)[2]에 \( 1.5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 한천을 첨가한 고체배지에 도말하고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \), 미호기 조건에서 24시간 배양하였다. 각 배지에서 생장한 집락들 중, 색깔과 모양이 차이가 나는 다양한 집락을 선발한 다음 동일 배지를 이용하여 순수분리 하였다. 순수분리한 균주들은 MRS medium을 사용하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다.</p> <p>각 배지에서 분리한 bacteria는 16S rDNA 염기서열 분석에 의해 계통발생학적으로 동정하였다. 16S rDNA의 증폭은 DNeasy tissue kit(Qiagen, Germany)을 이용하여 추출된 DNA를 PCR 하거나 colony PCR을 통하여 수행하였고, bacteria의 증폭에 많이 사용되는 eubacterial universal primer \( 27 \mathrm{~F}\left(5^{\prime}\right. \)-AGA GTT TGA \( \mathrm{TCC} \) TGG CTC A-3')와 1492 R(5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3')을 사용하였다. UNOII Thermocycler(Biometera, Germany)를 PCR 반응에 사용하였으며, \( 50 \mu \mathrm{L} \) 반응계에는 template DNA, \( 100 \mathrm{mM} \) dNTP, 1 U Taq polymerase(Roche, Germany), 20 pmol의 primer를 첨가하였다. 반응조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분 예비가열 후, \( 95^{\circ} \mathrm{C} 1 \)분간 변성, annealing \( 57^{\circ} \mathrm{C} 1 \)분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} 1 \)분 중합반응의 과정을 30회 반복하고, 마지막에 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 처리한 후 반응을 중단시켰다. PCR 반응산물은 \( 0.8 \% \) agarose gel을 이용한 전기영동으로 확인하였으며, \( 16 \mathrm{~S} \) rDNA 크기에 해당하는 DNA band를 Gel & PCR purification system(SolGent, Korea)으로 회수, 정제하였다. 정제된 단편의 염기서열결정은 수탁업체(SolGent)에 의뢰하여 수행하였고, 결정된 염기서열은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/)와 EzTaxon server 2.1(http://147.47.212.35:8080/)에 등록된 염기서열 정보를 대상으로 nucleotide blast search를 통해 계통발생학적으로 동정하였다. Database에 등록된 표준균주(type strain)와 가장 높은 상동성을 나타내는 분류군 (Taxon)을 해당 염기서열에 해당하는 bacteria로 결정하였다.</p> <p>총 25종의 김치로부터 순수분리한 균주들을 계통발생학적으로 동정한 결과, Leuconostoc 속은 148균주, Weissella 속은 230 균주가 확보되어, 총 378 균주가 분리 동정되었다.</p>