본 실험에서 Neurophil과 신경세포에서의 exocytosis를 저해하는 결과를 볼때, FS11052의 작용이 세포독성에 기인함을 알 수 있다. Vescular-ATPase 저해제가 세포내 단백질의 막 수송을 저해하는 것, 특히 바피로마이신 A1이 프로락틴의 분비를 tans-golgi 이후의 과정에서 저해하고 있는 것이 기정 사실이다. 따라서 본 실험에서 신경전달 물질의 방출과정에 저해반응을 나타내고 있는 FS11052 물질이 PC12 세포 및 rat의 primary hippocampal neuron의 형태에 대해 어떤 영향을 미치는지 조사했다.
<h1>결 과</h1><h2>몰모트 neurophil의 탈과립에 대한 작용</h2><p>Neurophil은 cytochalasin B의 존재 하에서의 케미칼메디에이터의 일종인 FMLP에 의한 자극에 따라 분비과립에 축적된 glucuronidase를 exocytosis에 의해 방출한다. 상청에 방출된 glucuronidase를 측정함으로써 neurophil의 탈과립에 대한 FS11052 물질의 작용을 검토했다. FMLP은 \( 1 \mu \mathrm{M} \)와 cytochalasin B는 \( 10 \mu \mathrm{M} \)의 농도로 처리했을 때, 좋은 유도반응을 나타냈다. FS11052는 고농도 \( \mathrm{K}^{+} \)이온에 의한 탈분극자극에 의해 방출되는 신경전달물질로서 노르에피네피린과 ATP의 exocytosis를 저해반응을 나타냈으며(in press), neurophil의 FMLP와 cytochalasin B의 자극에 의한 탈과립에 대한 검토 결과에서도 glucuronidase의 exocytosis에 대해서도 대조군에 비해 현저한 저해반응을 나타냈다. 이 neurophil과 신경세포에서의 exocytosis를 저해하는 결과로부터 FS11052의 작용이 세포독성에 의한 가능성을 확인했다. \( 0.4 \% \) trypan blue와 세포의 형태학적 관찰을 통하여 검토한 결과, 처리농도 \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서는 세포수나 세포의 형태학적인 변화는 검출되지 않았다(data not shown). PC12 세포를 가지고 FS11052 물질이 세포독성과 세포증식에 미치는 영향을 cell vitality를 나타내는 MTT reduction activity와 세포의 형태학적 변화를 관찰한 결과, 처리한 \( 0.1,1,10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서는 유의한 세포독성과 세포의 형태적인 변화를 보이지 않았다.</p><h2>세포내 산성 organelle의 acridine organ 염색</h2><p>Vescular-ATPase 저해제가 세포내 단백질의 막 수송을 저해하는 것, 특히 바피로마이신 A1이 프로락틴의 분비를 tans-golgi 이후의 과정에서 저해하고 있는 것이 알려져 있다. 방선균 대사산물로부터 탐색하여 얻어진 FS11052가 이와 동일한 작용기작을 통하여 신경세포에서 \( \left[{ }^{3} \mathrm{H}\right]-\mathrm{NE} \) 및 ATP, neurophil에서 FLMP와 cytochalasin B의 자극에 의한 glucuronidase의 조절성분비를 저해하고 있는가를 세포내 산성화 organelle을 acridine orange 염색 방법에 의해서 검토했다. PC12 세포를 FS11052, 또는 organelle 산성화 저해제를 처리한 대조군으로서 concanamycin A \( (1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)로 1시간 전처리하여, acridine orange에 의한 염색 후 형광 현미경으로 관찰했다. 대조군에서는 세포 내 orange색의 소과립이 많이 보였다. Acridine orange는 산성화한 organelle에 축적하여 형광을 띠기 때문에, 이들 과립이 리소조옴 등이라고 생각되어 진다. Concanamycin A의 처리 시에는 예상했던 것처럼 이들 orange색의 세포내 과립이 소실되어, 산성화의 저해가 일어나고 있는 것이 확인되었다. 그러나 \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 FS11052를 처리한 경우에 있어서는 concanamycin A와 같은 산성화 저해제를 처리한 경우에서 보이는 과립의 소실은 관찰되지 않았으며 아무것도 처리하지 않은 대조군과 유사한 결과를 나타냈다. 사진 상의 약간의 색깔의 변화는 검경 후에 사진을 찍기까지의 시간경과에 의한 것이다.</p><h2>PC12 세포 및 primary hippocampal neuron의 형태에 대한 작용</h2><p>신경전달물질 방출에 관여하고 있는 신경계특이단백질 SNAP-25와 synapsin이 신경세포의 돌기신장에도 관여하고 있는 것이 밝혀졌다. 그래서 본 실험에서 신경전달 물질의 방출과정에 저해반응을 나타내고 있는 FS11052 물질이 PC12 세포 및 rat의 primary hippocampal neuron의 형태에 대하여 어떤 작용을 가지고 있는가를 검토했다. PC12 세포는 \( 50 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \)의 nerve growth factor (NGF)를 첨가함에 따라 신경세포처럼 긴 돌기의 신장을 유도했다. \( 50 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \)의 NGF를 처리한 PCl2 세포에 FS11052 물질을 이 세포에서 \( \left[{ }^{3} \mathrm{H}\right]-\mathrm{NE} \)의 방출을 저해한 \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 처리하여 2일 동안 배양한 결과, PC12 세포의 NGF에 의해서 유도되는 돌기 신장에 대하여 현저한 저해작용을 나타냈다. 또 rat의 primary hippocampal neuron은 primary culture medium에서 배양 일수, day 0의 대조군, 배양 1일째와 배양 3일째의 시간 경과 따라 신경돌기의 신장을 보였다. 이 primary hippo-campal neuron에서의 FS11052 물질의 역할을 알아보기 위해 신경전달물질로서 ATP의 exocytosis에 대해서 저해반응을 보인 FS11052 물질을 배양 1일째에 처리하였다. Primary hippocampal neuron에 FS11052 물질 \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)을 2일 동안 처리 배양 3일째의 대조군과 비교하여 세포변화를 관찰한 결과, 신경돌기의 신장을 현저하게 억제하는 결과를 보였다.</p>