실험의 시료로 2005년 양산시 서창지역에서 채취한 노루발풀을 사용하였으며, 그람 양성균 B. 항균실험에 사용한 균주는 그람 양성균 B. subtilis와그람 음성균 Escherichia coli를 항균실험에 균주로 사용하여 활성을 측정하였다. 건조된 노루발풀을 침출시켜 추출한 후, 여과하여 불순물을 제거하고 감압 농축하여 ethanol 추출물을 얻었다. aper disc diffusion assay 방법으로 노루발풀의 추출물과 각 분획물의 항균활성을 측정했으며, 활성을 나타낸 hexane 분획물로부터 유효성분을 검색할 목적으로 silica gel chromatog-raphy를 실시하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>본 실험에서 사용된 노루발풀은 2005년 9월, 양산시 서창지역에서 채취하여 가볍게 수세한 뒤 물기를 제거하고, 건조시킨 후 상온에서 보관하여 시료로 사용하였다. 시료 추출용 유기용매는 \(99\%\)이상의 1급 시약(Daejung Chemical, Ltd, Korea) 으로 ethanol, hexane, diethyl ether, ethyl acetate 등 을 사용하였고, HPLC 분석용매는 Baker사(USA)의 특급용매를 사용하엿다.</p> <h2>사용균주 및 배지</h2> <p>항균실험에 사용한 균주는 식품을 변질시키는 균으로 알려진 대표적인 그람 양성균 B. subtilis와 오염의 지표 균이면서 부패세균인 그람 음성균 Escherichia coli를 사용하여 활성을 측정하였다. 균의 생육 배지로는 두 균주 모두에 대하여 nutrient broth를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 9 10시간 배양하였다. 항균활성 측정을 위한 고체배지로는 nutrient agar 배지를 사용하였다.</p> <h2>추출물 제조 및 용매분획</h2> <p>건조된 노루발풀 \( 100 \mathrm{~g} \) 에 \( 80 \% \) ethanol 5 l를 가하여 3일동안 상온에서 침출시켜 추출 한 후, 여지(5C. \( 110 \mathrm{~mm} \), Advantec, Tokyo Roshi Kaisha, Ltd.,Tokyo, Japan)로 여과하여 불순물을 제거하고, 이 여액을 감압농축기(EYELAN-1000, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 감압 농축하여 \( 80 \% \) ethanol 추출물을 얻었다. Ethanol 추출물은 서로 극성을 달리하여 hexane, diethyl ether, ethyl acetate로 순차적으로 용매분획 하였다. 즉, hexane과 물을 같은 비율로 하여 분획여두에서 hexane 층을 분획하고, 동일한 방법으로 남은 수용액 층에 diethyl ether, ethyl acetate, 물 층으로 분획하여 각각의 용매 분획물을 얻었다. 각 분획물의 항균활성을 확인하고, 활성 분획물은 감압 농축하여 적당한 농도로 희석해서 사용하였다.</p> <h2>항균활성 측정</h2> <p>본 실험에서는 노루발풀의 추출물과 각 분획물의 항균활성을 확인하기 위해서 paper disc diffusion assay 방법을 사용하였다. 평판배지에 배양된 각각의 균주를 1 백금이 취하여 nutrient broth 배지에 접종하고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 incubator에서 9 \sim 10시간 동안 배양하여 사용하였다. 항균활성 시험용 평판 배지의 조제는 nutrient agar배지를 멸균하여 적절하게 식힌 후 상기 배양액 \( 1 \% \) 를 혼합하여 petridish에 분주하여 응고시킨 후 사용하였다. \( 80 \% \) ethanol 추출물 및 각 용매 분획물을 각각 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{disc}, 20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{disc}, 30 \mu \mathrm{g} / \mathrm{disc}, 40 \mu \mathrm{g} / \mathrm{disc}, 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{disc} \)씩 paper disc (\(8\mathrm{mm}\), Advantec)에 천천히 흡수시켜 완전히 말린 후 배지 위에 밀착되도록 올린 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 overnight 시킨 후 paper disc 주변의 생육저해환의 직경(mm) 을 통해 활성을 측정하였다.</p> <h2>항균활성 물질 분리</h2> <p>노루발풀의 \( 80 \% \) ethanol 추출물로부터 얻은 분획물들의 항균활성을 측정 비교한 후, 활성을 나타낸 hexane 분획물로부터 유효성분을 검색할 목적으로 silica gel chromatog-raphy를 실시하였다. 즉, hexane 분획물 \( 1 \mathrm{~g} \) 을 얻은 후, silicagel이 충전된 컬럼에 넣어 \( \mathrm{CHCl}_{3}: \mathrm{MeOH}=50: 1 \) 의 전개용매를 이용하여 column chromatography를 실시하여 100 개의 fraction을 얻었다. 활성 층으로부터 prep. TLC를 실시하기 위해 silica gel TLC plate \( (20 \mathrm{~cm} \times 20 \mathrm{~cm} \times 0.5\mathrm{~cm} \),Merck)에 시료를 loading하여 hexane:ethyl acetate \( =4: 1 \) 용매로 전개 시켜 10 개의 소분획으로 나누었고, 이 중 항균력이 우수한 fraction No. 3를 단일분리하기 위해 Table 1의 조건으로 HPLC 분석을 실시하였다.</p>