송정 연안의 Ulva pertusa를 2% NaCl phosphate buffer(pH 7.4)로 희석하여 MA 배지에 분주하고 30\(^\circ \mathrm{C}\)에서 24시간 배양하여 형태적으로 다른 colony를 선택하여 MB 배지로 재배양하고 30\(^\circ \mathrm{C}\)에서 24시간 배양하여 알긴산 분해능을 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>본 실험에서 alginic acid sodium salt from brown algae(Aldrich Chemical Co., USA)를 사용하였으며, marinebroth (MB, Difco, USA) 및 marine agar (MA, Difco, USA)를 사용하였다.</p> <h2>알긴산 분해 미생물의 분리 및 동정</h2> <p>부산의 송정 연안에서 분해중인 해조류 Ulva pertusa를 채집한 후 멸균된 \(2 \% \) NaCl phosphate buffer \(( \mathrm { pH } ~7.4 \))을 이용하여 희석하였다. 희석액은 MA 배지에 분주 \( \cdot \)도말 한후 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 배양하였으며, 생성된 colony 중에서 형태적으로 다른 colony를 선택하였다. 선택한 colony는 알긴산 분해능을 확인하기 위해 \( 4 \% \) 알긴산과 \( 10 ^ { 6 } \mathrm { cfu } / \mathrm { ml } \) 농도의 균배양액을 1:1 혼합 하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 반응 후 점도 및 환원당 함량을 측정하였다. 이 중 알긴산 분해능이 높은colony는 (주)마크로젠에 의뢰하여 16S rRNA sequenc eanalysis로 분석하였고 이후 16S rDNA 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 blast server를 사용하여 염기서열을 비교 분석하여 균들을 동정하였다.</p> <h2>분리 \( \cdot \) 동정된 알긴산 분해 미생물의 생육 특성 확인</h2> <p>분리 \( \cdot \) 동정된 알긴산 분해 미생물의 최적 생육 조건( \( \mathrm { pH } \), \( \mathrm { NaCl } \), 배양 온도 및 배양 시간)을 확인하기 위해 MB 배지를 기본 배지로 사용하였고, 균은 \( 10 ^ { 6 } \mathrm { cfu } / \mathrm { ml } \) 농도로 접종하여 각 실험 조건에서 배양한 후 \( 600 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 먼저, \( \mathrm { pH } \) 확인을 위해 MB 배지를 \( 0.1 \mathrm { ~N } \) 및 \( 1 \mathrm { ~N } \) HCl과 \( 0.1 \mathrm { ~N } \) 및 \( 1 \mathrm { ~N } \mathrm { ~NaOH } \)로 \( \mathrm { pH } ~2-10 \)으로 조정하였으며,균을 접종 후 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 배양하였다. 최적 \( \mathrm { NaCl } \) 농도를 확인하기 위해 최적 \( \mathrm { pH } \)인 \( \mathrm { pH } ~9 \) 로 조정한 MB 배지의 \( \mathrm { NaCl } \) 농도를 \( 2-8 \% \)로 조정한 후 균을 접종하고 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 배양하였다. 최적 \( \mathrm { pH } \) 및 \( \mathrm { NaCl } \) 농도인 \( \mathrm { pH } ~9 \) 및 \( 2 \% \mathrm { ~NaCl } \)로 조정한 MB 배지에 균을 접종 후 배양 온도를 \( 10 - 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 조정하고 24시간 배양하여 최적 온도 조건을 확인하였고, \( \mathrm { pH } ~9 \), \( 2 \% \mathrm { ~NaCl } \) 및 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 조건에서 균을 36시간까지 배양하며 3시간 간격으로 균체량을 측정하여 최적 배양 시간 조건을 확인하였다.</p>