버섯 자실체 조분쇄물을 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)의 증류수에서 4시간 교반하면서 추출하고 여과한 여액을 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에서 동결 건조하여 건조 분말 상태의 열수추출물을 얻었고 투석 과정에서 고분자 침전물만 얻었다. 바이러스와 농도별 열수추출물을 혼합하여 infection 시킨 후 plaque assay를 시행한 결과, 처리해준 시료의 농도가 증가함에 따라 형성되는 plaque의 수가 감소하여, 농도 의존적인 plaque 형성 억제능을 보였다. 그러나, 시료를 농도별로 먼저 HeLa cell에 처리하고 24 시간 전배양시킨 후 시료를 완전히 제거하고 CVB3를 접종하여 plaque assay를 시행한 전배양 시험에서는 처리한 시료의 농도 범위에서는 plaque 형성 억제능이 미약하였으며, 바이러스와 열수추출물을 동시에 혼합하여 처리했을 경우 plaque 형성 억제능이 현저히 높은 것으로 나타났다. 시료와 숙주세포를 전배양하였을 때 plaque 형성 억제능이 작았던 것은, 배양추출물이 숙주세포가 바이러스에 대한 저항성을 주었다는 결과와는 다르게 본 실험의 열수추출물 활성 물질이 숙주 세포의 바이러스 저항성에 영향을 주지 않는 것으로 생각되었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>버섯 열수추출 및 에탄올 침전물의 제조</h2> <p>버섯 자실체 조분쇄물 \( 200 \mathrm{~g} \)을 증류수에서 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4시간 교반하면서 추출하고 여과한 여액을 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에서 동결 건조하여 \( 41 \mathrm{~g} \) (수율 \( 20.5 \%) \)의 건조 분말 상태의 열수추출물을 얻었다. 건조 열수추출물 \( 0.6 \mathrm{~g} \) 으로부터 75% 에탄올 침전 후 원심분리하고 동결건조하여 \( 0.17 \mathrm{~g} \) (수율 \( 28.3 \% \)의 저분자 상등액 건조물 \( (\mathrm{ES}) \)을 얻었고, 침전물은 투석(MWCO 14,000)후 동결건조하여 \( 0.26 \mathrm{~g}( \) 수율 43.3%의 수용성 고분자 침전물 건조물(EP)을 얻었다(Fig. 1). 투석 과정에서 분자량 14,000 이하이면서 에탄올 75%에 침전되는 물질들의 상당 부분 \( (0.17 \mathrm{~g}) \)이 제거되고 고분자 침전물만 얻어진 것으로 사료되었다.</p> <h2>CBV3에 대한 항바이러스 활성</h2> <p>바이러스와 농도별 \( (0.1,0.5,1 \mathrm{mg} / \mathrm{mL}) \) 열수추출물을 각각 혼합하여 infection 시킨 후 plaque assay를 시행한 결과, 처리해준 시료의 농도가 증가함에 따라 대조군에 비해 형성되는 plaque의 수가 11.8%, 22.5%, 42.5% 감소하여, 농도 의존적인 plaque 형성 억제능을 보였다(Fig. 2A). 그러나, 시료를 농도별로 먼저 HeLa cell에 처리하고 24 시간 전배양시킨 후 시료를 완전히 제거하고 CVB3를 접종하여 plaque assay를 시행한 전배양 시험에서는, \( 0.1 \mathrm{mg} \)과 \( 0.5 \mathrm{mg} \)에서는 오히려 다소 plaque 수의 증가를 보이다가 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \)의 농도에서 14% 정도의 낮은 억제 결과를 보여(Fig. 2B), 처리한 시료의 농도 범위에서는 plaque 형성 억제능을 보이지 않거나 미약하였으며, 바이러스와 열수추출물을 동시에 혼합하여 처리했을 경우가 전배양의 경우보다 plaque 형성 억제능이 현저히 높은 것으로 나타났다. 시료와 숙주세포를 전배양하였을 때 plaque 형성 억제능이 상대적으로 미약하였던 결과는, Lentinus edodes 자실체 추출물이나 그 배양추출물이 전배양 동안에 숙주세포에 영향을 주어 세포가 바이러스에 대한 저항성을 갖도록 하였다는 결과와는 달리, 본 실험에 사용된 낙엽진휽버섯 열수추출물의 활성 물질은 숙주 세포 자체의 바이러스 저항성에는 영향을 주지 않는 것으로 생각되었다.</p> <p>한편, HeLa 세포에 있어서 열수추출물 및 에탄올 침전물 (EP)의 세포독성을 MTT reduction assay법으로 조사한 결과 열수추출물의 경우 세포의 성장이 50% 저해되는 처리 시료의 농도 \( \left(\mathrm{CC}_{50}\right) \)는 \( 1.25 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 이었으며(Data not shown), 에탄올 침전물인 고분자 \( \mathrm{EP} \)의 경우, \( \mathrm{HeLa} \) 세포에 대한 세포 증식 저해 정또는 \( 0.1 \mathrm{mg} \)에서 \( 13.5 \%, 1 \mathrm{mg} \)에서 15.6%, \(2.5 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \)에서 57.6% 정도의 세포중식 저해를 보였으며, \( \mathrm{CC}_{50} \)이 \( 2.25 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \)으로 세포독성은 더 낮았다(Fig. 3). 이는 에탄올 침전을 통한 분획 과정에 열수화출물에 포함되어 있던 세포 중식을 저해하는 불순물이 좀 더 제거되었기 때문으로 생각되었다. 한편, 총양세포인 HeLa에 비해, Vero 세포에 대한 \( \mathrm{EP} \)의 세포 독청은 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 까지의 농도에서도 전혀 없는 것으로. 나타나(Data not shown), 낙엽진휽버섯 열수 추 출물로 얻어진 에탄올 침전물 고분자는 세포독성은 매우 미미한 것으로 나타났다.</p> <p>열수추출물로부터 에탄올 침전으로 얻어진 상등액 \( (\mathrm{ES}) \)과 침전물(EP)시료의 \( \mathrm{HeLa} \) 세포에서 CVB3에 대한 항바이러스 활성을 plaque reduction assay로 초사한 결과, 저분자 열수 추출물인 \( \mathrm{ES} \)의 경우, \( \mathrm{HeLa} \) 세포에서 CVB3에 의한 plaque 형성에 대한 억제능은 없는 것으로 나타났다(Fig. 4A). 그러나, 에탄올 침전물인 고분자 \( \mathrm{EP} \)의 경우, \( \mathrm{CVB} \)에 의한 plaque 형성에 대해 농도 의존적으로 현저한 억제능이 있음을 보였다(Fig. 4B). EP를 \( 0.1,0.5,1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 농도로 처리했을 때 처리하지 않은 대조군에 비해 각각 7.0, 56.0, 66.4%까지 plaque 형성을 저해하였다. Fig. 4C에서 시료를 처리해주지 않은 대조군(Fig. 4C-a)부터 \( 0.1 \mathrm{mg}(4 \mathrm{C}-\mathrm{b}), 0.5 \mathrm{mg}(4 \mathrm{C}-\mathrm{c}), 1 \mathrm{mg} / \mathrm{mL}(4 \mathrm{C}-\mathrm{d}) \) 순으로 \( \mathrm{EP} \)의 농도가 높아질수록 plaque의 형성이 감소되는 것을 확인하였다. Plaque 수를 대조군과 비교하였을 때, 바이러스의 증식을 50%까지 억제시키는 \( \mathrm{EP} \)의 농도인 \( \mathrm{EC}_{50} \) 50% effective concentration)은 \(0.45 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 이었다.</p>