중금속 저항성 비교 균주는 Enterobacter cloaceae KCTC2519, 형질전환 균주는 Escherichia coli DH5a를 사용균로 택했다. 또한, 실험에 사용된 중금속은 \( \mathrm{Cd}\left(\mathrm{NO}_{3}\right)_{2} \cdot 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)와 \( \mathrm{Cu}\left(\mathrm{NO}_{3)2} \cdot 3 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\right. \)이고 생육도는 분광광도계를 사용해 \( 600 \mathrm{~nm} \)의 파장에서 흡광도를 측정함으로써 생육도를 비교하였다. 다음으로 형질 전환된 E. coli DH5a 균체를 이용한 구리와 카드뮴 흡착평형실험은 흡착강도 결정을 위해 건조균체를 이용해 시료를 채취했으며 상등액에 희석한 후 원자 흡광광도계를 사용해 잔존 중금속 이온 농도를 확인했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주 및 배지</h2> <p>본 실험의 사용균주는 담수식물인 수초의 근계에서 분리된 여러 균종을 대상으로 각종 중금속을 농도별로 첨가하여 저항성을 나타내는 1 균주를 선택하여 자동 동정 시스템 분석기(E-10136, Biolog Microstation, Biolog, USA)를 사용하여 유사값 0.5 이상의 신뢰도 값의 균을 확인 후 생화학 동정과정을 거친 후 표준 균주와 비교하였다. 중금속 저항성 비교 균주로는 표준균주인 Enterobacter cloaceae KCTC2519를 사용하였으며 형질전환 균주로써 Escherichia coli DH5a (이하 E. coli DH5a)를 사용하였다. 본 실험에 사용한 균주를 배양하기 위한 기본배지로는 LB, Nutrient broth (NB) 배지를 사용하였으며, 분리 균의 생육 최적 조건 설정을 위하여 탄소원, 질소원 등을 검토하였다. 모든 배양은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), 24시간 배양하였으며 액체는 진탕배양 \((150 \mathrm{~rpm})\) 하였다. 중금속 저항성 확인은 구리와 카드뮴의 농도를 달리하여 생육이 확인 되는 경우에만 적용하였다.</p> <h2>사용 중금속 및 정량법</h2> <p>본 실험에 사용된 중금속의 종류는 \( \mathrm{Cd}\left(\mathrm{NO}_{3}\right)_{2} \cdot 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)과 \( \mathrm{Cu}\left(\mathrm{NO}_{3)2} \cdot 3 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\right. \)였으며 이들을 2차 탈 이온 수에 녹여 일정 농도\((10 \sim 300\mathrm{~rpm})\) 로 맞추어 사용하였다. 중금속 이온 농도는 원자 흡광광도계(Atomic adsorption spectrometry, Shimazu AA6500series, Japan)를 사용하여 정량하였다. 정량을 위하여 각각의 구리, 카드뮴을 표준 용액으로 희석하여 표준 검량선을 작성하였고 예비 측정을 거쳐 검량선의 측정 가용 농도 범위를 정하였고 시료도 검량선의 측정 범위에 들어가도록 희석하여 측정, 정량하였다.</p> <h2>생육도 측정법</h2> <p>생육도 측정은 균을 최적 배양 조건의 배지에 중금속을 첨가한 후 접종 하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 전 배양을 행하고, 본 배양을 위하여서는 \( 1 \% \) 전 배양액을 본 배양액 \( 200 \mathrm{~ml} \)에 진탕 배양하면서 배양시간에 따라 \( 5 \mathrm{~ml} \)을 취하여 단계적 희석을 하고 분광광도계(Shimazu UV-160A, Japan)를 사용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \)의 파장에서 흡광도를 측정함으로서 생육도를 비교하였다. 최소 생육저해농도는 고체 배양 배지 내에 각각의 중금속 농도를 \( 100 \mathrm{~ppm} \) 단위로 점점 높혀가면서 농도 범위가 정해지면 다시 \( 10 \mathrm{~ppm} \) 단위로 첨가한 후 균을 접종한 후 생육 여부를 관찰하였다. 생 세포에 대한 영향을 알아보기 위한 생균수의 측정을 위하여서는 고체배지에 각각의 중금속 농도를 MIC를 기준으로 희석하여 \( 100 ~\mu \mathrm{l} \) 을 첨가하고 균을 도말 후 배양하고 중금속이 균의 생육에 영향을 미치지 않는 농도(MIC)를 기준으로 CFU (Colony forming unit/\(\mathrm{ml}\))을 확인 하였으며 모든 과정은 3번 이상 반복 실험 하였다. 최소 생육저지 농도 및 생 세포에 미치는 영향은 생균수 측정을 하여 정량하였고 MIC가 결정된 후에는 흡광도 법으로 생육을 정량하였다.</p> <h2>형질 전환 균주 선택 및 유전자 재조합 기술</h2> <p>대장균 host중 중금속 내성이 낮은 균주를 선별하여 Nu-trient broth에 중금속을 농도별로 첨가하여 최소생육저해 농도를 측정, 비교하였다. DNA분리, 형질전환 및 유전자 재조합 기술은 Sambrook등의 방법을 사용하였다.</p> <h2>중금속 흡착 실험</h2> <p>형질 전환된 E. coli DH5a 균체를 이용한 구리와 카드뮴 흡착평형실험은 흡착강도 결정을 위하여 건조균체를 이용하여 표준 금속농도 \( 1000 \mathrm{~mg} / 1 \) 인 용액 \( 100 ~\mathrm{ml} \)과, 건조균체 \( 0.1 \mathrm{~g} \)을 \( 500 \mathrm{~ml} \) 삼각플라스크에 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 진탕기 내에서 \( 150 \mathrm{~rpm} \)으로 교반 시키면서 일정 시간별로 \( 1 \mathrm{~ml} \) 의 시료를 채취하였다. 채취한 시료는 원심분리(\( 12000 \mathrm{~rpm} \), 10분)하여 상등액을 적절히 희석한 후 원자 흡광광도계를 사용하여 각각의 잔존 중금속 이온의 농도를 측정하였다.</p>