마늘 추출물로 Reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)에 의한 mRNA의 분석을 위한 실험을 원심분리, 역전사 및 증폭, 전기영동 등을 통해 하였고 Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석을 위한 실험으로 원심분리를 통한 총 단백질 분리, 전기영동, blocking, 1차 항체 처리, 세척, 2차 항체 처리 등의 반응으로 특정 단백질 발현 양을 분석하였다.
<h2>Reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)에 의한 mRNA의 분석</h2> <p>마늘 추출물을 처리하면서 분화시킨 3T3-L1 지방전구세포에 TRIzol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA) \( 1 \mathrm{ml} \)을 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 반응시킨 후 \( 200 \mu \mathrm{l} \)의 chloro-form을 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분 동안 반응시켰다. \( 14,000 \mathrm{rpm} \), \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15 분간 원심분리시켜 \( 400 \mu 1 \) 의 상층액을 분리하여 동량의 isopropanol을 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분 동안 반응시킨 후 \( 14,000 \mathrm{rpm}, 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분간 원심분리시켜 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 DEPC water를 이용하여 녹이고 정량한 후, 각각의 primer, DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 넣고 Mastercycler gra-dient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 역전사 및 증폭하였다. 각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하여 1× TAE buffer로 \( 1 \% \) agarose gel을 만들고 well 당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 loading 한 후 \( 100 \mathrm{~V} \) 에서 전기영동을 하였다. 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 ethidium bromide (EtBr)을 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하였으며, housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 를 internal control로 사용하였다.</p> <h2>Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석</h2> <p>동일한 방법으로 준비된 3T3-L1 지방전구세포에 적당량의 lysis buffer [25 mM Tris-Cl (pH 7.5), \( 250 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 5 \mathrm{mM} \) EDTA, 1\% NP-40, \( 1 \mathrm{mM} \) phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), \( 5 \mathrm{mM} \) dithiothreitol (DTT)]를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 동안 반응시킨 후, \( 14,000 \mathrm{rpm} \) 으로 30 분간 원심분리하여 상층액에 있는 총 단백질을 분리하였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 그 사용방법에 따라 정량 한 다음 동량의 Laemmli sample buffer (Bio-Rad)를 섞어서 sample을 만들었다. 동량의 sam-ple을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리한 후, nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, \( \mathrm{NH} \), USA)으로 electro-blotting에 의해 전이시켰다. 분리된 단백질이 전이된 nitro-cellulose membrane을 5\% skim milk를 처리하여 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하고 1 차 항체를 처리하여 상온에서 2시간 이상 또는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 over night 시킨 다음 PBS-T로 세척(15분간 1 번, 5 분간 5 번)하고 처리된 1 차 항체에 맞는 2차 항체(PBS-T로 \( 1: 1,500 \) 으로 희석하여 사용)를 사용하여 상온에서 1 시간 정도 반응시켰다. 반응이 끝난 후 암실에서 Enhanced Chemiluminoesence (ECL) solution (Amersham Life Science Corp.)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 발현 양을 분석하였다.</p>