부탄올을 포함한 바이오 알코올의 경제성을 갖는 생산기술 개발을 위해서는 호기적인 조건에서의 빠른 성장과 용이한 유전자 조작, 그리고 높은 부탄올 내성을 지닌 미생물의 스크리닝과 내성균 개발이 중요하다. 따라서 대사공학을 통한 부탄올을 포함한 바이오알코올류를 고농도로 생산하기 위해서는 고농도 부탄올에 내성을 갖는 호기성균 또는 통성혐기성균을 탐색하고 개발하는 연구가 필요하다. 이에 따라 본 연구는 \( 99 \% \) 이상의 순도를 갖는 부탄올 용매안에 존재하는 미생물이 \(12.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L}\)의 부탄올에 내성을 나타내는 Staphylococcus sp.를 분리, 동정하고, 인공변이를 통해 \(17.5\mathrm{~g} / \mathrm{L} \)까지 내성을 나타내는 부탄올 내성균을 개발하고자 한다. 아울러 여러 알코올류에 대한 내성정도를 E.coli와 비교하여 그 특성을 조사해본다.
<h1>서 론</h1> <p>석유자원 등의 화석연료의 고갈과 가격의 급등, 이산화탄소의 증가에 기인한 지구 온난화 문제 등으로 인해 석유자원을 사용하지 않고 재생 가능한 바이오매스로부터 에탄올과 부탄올과 같은 바이오 알코올류를 생성하는 연구가 매우 활발히 진행되고 있다. 특히, 부탄올의 경우 에탄올에 비해 높은 에너지 밀도, 낮은 증기압, 가솔린과 비슷한 옥탄가, 가솔린과의 높은 혼합성, 연료수송 인프라에 대한 낮은 부식성 등의 장점을 가지고 있어 에탄올을 대체할 수 있는 바이오 에너지로 각광을 받고 있는 유기용매이다.</p> <p>생물학적인 방법으로 부탄올을 생산하는 방법은 Clostridium acetobutylicum과 C. beijerinckii와 같은 Clostridium 속 미생물을 이용하여 2 분자의 acetyl-CoA 의 condensation에 의해서 생성되는 acetoacetyl-CoA로부터 4 단계의 환원을 거치면서 부탄올, 아세톤, 에탄올이 동시에 생성되는 방법으로 생산되고 있다. 그러나 Clostridium sp. 균은 성장 속도가 매우 느리며 혐기적인 조건에서 발효해야 하는 배양적인 측면에서의 단점과 대사경로의 유전자 조작의 어려움으로 인한 고농도 생산균주 개발의 지체, 부탄올이 미생물의 세포막에 영향을 미쳐서 세포를 죽이는 높은 독성 등으로 인해서 매우 낮은 농도/ 수율/ 생산성을 나타내는 문제점이 있다. 특히, 부탄올에 의한 세포독성이 가장 큰 문제로 Clostridium sp. 균의 배양액에 \( 7-13 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 의 부탄올을 첨가하면 세포성장이 \( 50 \% \) 저해 받는 것으로 알려져 있으며, 균주 측면에서 이를 해결하기 위해 전통적인 화학변이법을 통해서 \( 1.8 \% \) 부탄올에서 성장이 가능한 균을 개발한 보고가 있지만 부탄올 생산농도는 아직 \( 15-20 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 의 낮은 수준에 있다. 최근, 대사공학을 통해 쉽게 생산 미생물을 개발할 수 있고, 많은 환원력을 요구하는 기존의 acetyl-CoA 대사경로를 거치지 않고 아미노산 생합성 및 분해 대사 경로를 이용하여 2-keto acid decarboxylase와 alcohol dehydrogenase를 암호화하는 유전자들을 Escherichia coli 및 Corynebacterium glutamicum에 도입하여 다양한 알코올 형태인 1-프로판올, 이소부탄올, 1-부탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 2-페닐에탄올 등을 생산할 수 있는 기술을 개발하여 보고하였다. 그러나, E. coli 와 C. glutamicum 또한 이들 용매에 대한 내성이 매우 약하여 바이오 알코올류가 생산되면 세포의 성장이 정지되면서 비성장 단계에서 축적이 되며, 아직 그 농도도 매우 낮은 수준 상태에 있다. 따라서, 부탄올을 포함한 바이오 알코올의 경제성을 갖는 생산기술을 개발하기 위해서 호기적인 조건에서 성장이 빠르며, 유전자 조작이 용이하며, 높은 부탄올 내성을 지닌 미생물의 스크리닝과 내성균 개발이 매우 중요하다.</p> <p>지금까지 Clostridium sp. 균 이외의 미생물에서 부탄올 내성균에 관한 연구는 주로 Enterococcus faecium, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Pediococcus pentosaceus, Leucnostoc pseudomesenteroides 를 포함하는 젖산균에 한정되어 있으며, 이들은 \( 2.5 \% \) 의 부탄올에 내성을 나타내는 것으로 확인이 되었다. 즉, 부탄올 내성균의 분리 및 고농도 부탄올 내성균의 개발은 절대혐기성 또는 내기성혐기성균 등에 주로 한정되어 있으며, 호기성균의 경우 일부 Bacillus subtilis에서 \( 2 \% \) 부탄올 내성을 나타내는 것으로 알려져 있는 것 외에는, 다양한 종류의 균의 분리 및 그 특성규명 연구가 매우 미비한 상태이다. 따라서 대사공학을 통한 부탄올을 포함한 바이오알코올류를 고농도로 생산하기 위해서는 고농도 부탄올에 내성을 갖는 호기성균 또는 통성혐기성균을 탐색하고 개발하는 연구가 매우 필요하다고 사료된다. 본 연구는 \( 99 \% \) 이상의 순도를 갖는 부탄올 용매안에 존재하는 미생물이 \( 12.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 의 부탄올에 내성을 나타내는 Staphylococcus sp.를 분리, 동정하였으며, 인공변이를 통해 \( 17.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 까지 내성을 나타내는 부탄올 내성균을 개발하고 여러 알코올류에 대한 내성정도를 E. coli와 비교하여 그 특성을 조사한 결과를 보고하고자 한다.</p>