지의류 내생 곰팡이의 배양 배지에 C. albicans 배양액 \( \left(\mathrm{OD}_{600} 0. 1\right) \)을 도말하여 활성을 확인하고, 6종의 내생 곰팡이를 액체 배지(Yeast extract \( 3 \mathrm{~g} \), malt extract \( 3 \mathrm{~g} \), glucose \( 10 \mathrm{~g} \), peptone \( 5 \mathrm{~g} \), 벌균증류수 \( 1 \mathrm{~L} \) )에서 배양하여 항진균 활성을 비교하였다. Disc diffusion method를 사용하여 분획과 수층을 분리한 후 YPD 고체배지에서 C. albicans에 대한 항진균 활성을 측정하였다. 마지막으로 Usnea rigidula (2326)와 Parmotrema pseudotinctorum (2202)의 chlo-roform 추출물을 HPLC 및 C18 column을 사용하여 항진균 물질을 추정할 수 있는 peak로 분리하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주의 분양 및 배양</h2> <p>순천대학교 지의류생물 소재은행(KOLABIC)에서 100 종의 지의류 내생 곰팡이를 분양 받아 MYA (Malt Yeast extract Agar: yeast extract \( 3 \mathrm{~g} \), malt extract \( 3 \mathrm{~g} \), glucose \( 10 \mathrm{~g} \), peptone \( 5 \mathrm{~g} \), agar \( 15 \mathrm{~g} \) )배지에 지의류 내생 곰팡이 조각을 올려 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 \( 2 \sim 3 \) 일 정도 배양하였고, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다. 분양받은 100 종 지의류곰팡이의 일련번호는 다음과 같다: EL2081, 2118, 2141, 2146, 2151, 2157, 2170, 2173, 2177, 2202, 2218, 2220, 2228, 2233, 2237,2245,2262,2270,2277,2279,2283-2304,2306-2320, 2323-2338, 2340-2365, 2373.</p> <h2>항진균성 지의류 내생 곰팡이의 선별</h2> <p>지의류 내생 곰팡이를 배양시킨 MYA배지에 C. albicans 의 배양액 \( \left(\mathrm{OD}_{600} 0.1\right) \) 을 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 분주하여 멸균된 면봉을 이용하여 골고루 도말하였다. \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 24 시간 배양 후 투명환의 크기가 큰 지의류 내생 곰팡이 6종을 선별하였고, 배지 조성에 따른 활성도 차이를 비교해보기 위해 선별된 6종을 EMM [potassium hydrogen phthalate \( 3 \mathrm{~g}, \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 2.2 \mathrm{~g}, \mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl} 5 \mathrm{~g} \), glucose \( 20 \mathrm{~g}, 225 \mathrm{mg} / \) \( \mathrm{L} \) supplements (A.A), salts \( 20 \mathrm{~mL}\left(\mathrm{MgCl}_{2} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 52.5 \mathrm{~g}\right. \), \( \mathrm{CaCl}_{2} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.735 \mathrm{~g}, \mathrm{KCl} 50 \mathrm{~g}, \mathrm{Na}_{2} \mathrm{SO}_{4} 2 \mathrm{~g} \) ), vitamins stock. \( 1 \mathrm{~mL} \) (pantothenic acid \( 1 \mathrm{~g} \), nicotinic acid \( 10 \mathrm{~g} \), inosi-tol \( 10 \mathrm{~g} \), biotin \( 10 \mathrm{mg} \) ), minerals stock. \( 0.1 \mathrm{~mL} \) (boric acid \( 5 \mathrm{~g}, \mathrm{MnSO}_{4} 4 \mathrm{~g}, \mathrm{ZnSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 4 \mathrm{~g}, \mathrm{FeCl}_{2} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 2 \mathrm{~g} \), molybdic acid \( 0.4 \mathrm{~g}, \mathrm{KI} 1 \mathrm{~g}, \mathrm{CuSO}_{4} \cdot 5 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.4 \mathrm{~g} \), citric acid \( 10 \mathrm{~g} \), agar \( 18 \mathrm{~g}) \) ] 배지에서도 동일한 방법으로 실험을 하여 항진균 활성을 검정하였다.</p> <h2>Disc diffusion method</h2> <p>지의류 내생 곰팡이가 생성하는 항진균 물질의 활성을 액체배지에서도 알아보기 위해, 선별한 6 종의 지의류 내생 곰팡이의 조각을 MY 액체배지 (Yeast extract \( 3 \mathrm{~g} \), malt extract \( 3 \mathrm{~g} \), glucose \( 10 \mathrm{~g} \), peptone \( 5 \mathrm{~g} \), 벌균증류수 \( 1 \mathrm{~L} \) )에 넣고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) shaking incubator에서 날짜별로 배양하여 각각의 배양액을 얻었다.</p> <p>미리 배양한 C. albicans의 배양액( \( \left.\mathrm{OD}_{600} 0.1\right) \) 을 YPD 고체배지 \( (500 \mathrm{~mL} \) 기준 : Yeast extract \( 5 \mathrm{~g} \), peptone \( 10 \mathrm{~g} \), dextrose \( 10 \mathrm{~g} \), agar \( 8 \mathrm{~g} \) )에 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 분주한 후 멸균된 면봉을 이용하여 도말하였다. 그 위에 날짜별로 배양한 지의류 내생 곰팡이의 배양액을 paper disc에 \( 500 \mu \mathrm{L} \) 씩 분주하여 충분히 말린 후 올려놓고, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 24 시간 배양하여 투명환의 크기를 비교 관찰하였다.</p> <h2>지의류 내생 곰팡이의 용매 추출에 따른 항진균 활성 측정</h2> <p>고체배지에서와 액체배지에서 공통적으로 활성이 있는 3 종의 지의류 내생 곰팡이를 선별하고, 날짜별 배양액을 chloroform, ethyl acetate 용매 순으로 추출하여 농축하였으며, 증착시킨 후 \( 70 \% \) ethanol \( 1 \mathrm{~mL} \) 로 녹여 실험에 사용하였다. Disc diffusion method를 이용하여 각 분획과 분리하고 남은 수층을 YPD 고체배지에서 C. albicans에 대한 항진균 활성도를 비교 - 측정하였다. 또한 액체배지에서의 항진균 활성을 측정하기 위해 RPMI 1640 (Sigma, USA) 배지를 test tube에 \( 3 \mathrm{~mL} \) 넣고, 각각 C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. lusitaniae, Cryptococcus neoformans 균주를 접종하고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) shaking incubator에서 24 시간동안 배양하였다. 각 균주의 배양액을 RPMI 배지로 \( \mathrm{OD}_{600} 0.01 \) 이 되도록 희석 한 후 RPMI 배지가 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 씩 분주된 96 well plate에 \( 10 \mu \mathrm{L} \) 씩 분주하였다. 그리고 선별된 3종의 지의류 내생 곰팡이의 분획별 농축액인 chloroform \( 3 \mu \mathrm{L} \), ethyl acetate \( 6 \mu \mathrm{L} \) 씩을 첨가하였다. \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 배양하며 12 시간 단위로 ELISA reader를 이용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 성장 정도를 측정하였다.</p> <h2>HPLC 를 이용하여 분획물에 따른 항진균 활성 측정</h2> <p>최종적으로 6일 동안 배양한 Usnea rigidula (2326)과 4 일 동안 배양한 Parmotrema pseudotinctorum (2202)의 chlo-roform 추출액을 HPLC, C18 column을 이용하여 항진균 물질로 추정되는 peak의 분획물을 얻었다. 미리 배양한 C. albicans와 C. glabrata를 RPMI 배지에 \( \mathrm{OD}_{600} 0.01 \) 되도록 희석 한 후 RPMI 배지가 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 씩 분주된 96 well plate에 \( 10 \mu \mathrm{L} \) 씩 분주하였다. 그리고 각 peak별 농축액을 \( 5 \mu \mathrm{L} \) 와 20 \( \mu \mathrm{L} \) 로 다르게 하여 지의류의 화학성분 중 가장 널리 분포하는 노란색 결정의 항생물질인 usnic acid와 비교-관찰하였다.</p>