HGF와 bFGF의 흔합처리에 의해 유도된 시각기관에서 시각계 특이적인 분자들의 발현을 관찰하기 위해 25F5와 monoclonal antibody 40A11를 사용하여 조직면역화학법을 진행했으며 monoclonal antibody 40A11를 사용한 정상배와 혼합처리한 분리편에서도 렌즈층은 약하게 반응했고 망막색소상피에는 강하게 염색된 것을 관찰했다. Xenopus의 동물극분리편에 HGF와 activin\( \mathrm { A } \)를 복합처리한 기관분화 경향에 대한 실험에서 activin A 단독처리 보다 시멘트선, 뇌, 눈, 청낭흥 두부기관의 발생이 높은 비율로 분화했다. 그러나 bFGF의 복합처리에 의한 기관분화에 대한 연구는 확인된 바 없어 이 연구에서는 bFGF를 HGF와 함께 처리하여 분리편내 유도경향 및 기관분화를 관찰했다.
<h2>면역조직화확적 방법에 의한 시각계의 분화 확인</h2> <p>\( \mathrm { HGF } \) 와 \( \mathrm { bFGF } \) 의 흔합처리에 의해 유도된 시각기관에서 시각계 특이적인 분자들의 발현을 확인하기 위해 monoclonal antibody 40A11과 25F5를 사용하여 조직면역화학법을 행하 였다. \( 40 \mathrm { ~A } 11 \) 과 25F5는 눈의 색소 상피중에 존재하는 눈자량 65KDa 정도의 RPE65 (Retinal Pigment Epithelium 65)를 인식하는 것으로 밝혀진 단일 클론 항체이다. 먼저 정상배와 동물극분리배양에서 \( \mathrm { bFGF } \) 와 \( \mathrm { HGF } \) 혼합처리로 유도된 눈 조직의 대조구에서는 AP 반웅이 나타나지 않았다. Monoclonal antibody 25F5를 사용한 정상배와 혼합처리한 분리편에서는 렌즈충이 다소 약하게 반웅하였지만. 망막색소상펴는 AP 반웅이 뚜렷하며 RPE65의 국재를 확인 할 수 있었다. 또한 monoclonal antibody 40A11를 사용한 정상배와 흔합처리한 분리편에서도 렌즈충 은 약하게 반응하였고 망막색소상피에는 강하게 염색된 것을 관찰하였다.</p> <h1>고찰</h1> <p>Xenopus의 동물극분리편에 activin \( \mathrm { A } \) 와 HGF 를 복합처리 한 기관분화 경향에 대한 실험은 본 연구진에 의해 이루어진바 있으며 activin A 단독처리시 보다 시멘트선, 뇌, 눈, 청낭흥 두부기관의 발생이 높은 비율로 분화하였다. 뿐만 아니라 activin A에 HGF가 고농도로 복합처리 되었을 때 배양 분리 견에서는 특히 신관이 잘 분화하였다. 그러나 HGF 와 중배엽유도활성이 강한 bFGF의 복합처리에 의한 기관분화에 대한 연구는 이루어진 바 없어 본 연구에서는 HGF를 bFGF와 함께 처리하여 분리편내 기관분화 및 유도(induction)경향을 관찰하였다. HGF와 \bFGF의 복합처리에 의한 기관분화의 경향은HGF 와 activin \( \mathrm { A } \) 복합처리시 보다 대부분의 기관 분화율이 높았으며, 반면 신관의 분화경향은 보다 저하되었다. 이러한 현상은 HGF mRNA의 발현이 포배기 동물극세포에서bFGF나 activin A와 반응하여 이루어지며 activin \( \mathrm { A } \) 보다는 mathrm { bFGF와의 반응에서 더 강한 활성이 있다는 보고와 관련이 있는 것으로 생각된다. 이렇듯 HGF 는bFGF } 와 밀접하게 관련되어 있으며 HGF가 기관분화에 미치는 영향을 밖 히기 위해서는 HGF 단독으로는 배양분리편에서 기관분화가 일어나지 않으므로 FGF 와 같은 중배엽 유도인자의 복합처리가 필요하다. 결과에서 나타난 바와 같이 먼저 두부 감각기의 분화율이 높아지는 두화현상이 두드러지는데, 특히 눈의 분화비율이 그러하였다. 이러한 결과는 Kolk등 의 연구와 일치하는 내용이다. 이들의 연구 결과에서는 bFGF 가 쥐의 눈에서 렌즈를 유도하고 분화된 렌즈는 insulin과 IGF-1에 의해 유지된다고 하였다. McAvoy등은 bFGF가 농도 의존적으로 세포증식, 섬유분화, 세포이주에 관여하며 렌즈형태발생과 성장을 유도하는데 중요한 역할을 하고 분 리편으로부터 렌즈표피세포를 자극하며, insulin/IGF family 와 bFGF의 작용으로 정상적인 렌즈블 유지, 형성한다고 하 였다. 그리고 Del Rio-Tsonis등은 도롱농의 눈에서도 bFGF 가 렌즈재생과 발생에 관여한다고 하였다. 본 연구에서 분 리편으로부터 눈의 분화는 bFGF 단독처리시의 최고 \( 19 \% \) 분 화율보다 \( \mathrm { HGF } \) 의 첨가에 의해 분리편에서 최고 \( 46 \% \) 까지 눈이 분화하였다. 이는 activin A와의 복합처리시 보다 높은 비 율로서 뉸의 유도에 관한 한,HGF 는 activin \( \mathrm { A } \) 보다는 bFGF 와의 반웅에서 더욱 강한 유도 활성을 가진다고 할 수 있겠다. 다음은 bFGF와 HGF 의 신경계 발달과의 관계 규명에 관한 것이다. Xenopus receptor-type tyrosine kinase는 초기의 세포운명을 결정하는 중요한 역할을 한다. 즉 외배엽세포로 부터 신경계통의 조직을 유도하거나 표피를 분화시키는데[1], 본 연구의 결과와 관련해 볼 때 \( 0.5 \mathrm { ng } / \mathrm { ml } \) 의 bFGF 에서는 HGF 의 첨가에 의해 신경조직의 분화 상승효과가 거의 없 었고, \( 1 \mathrm { ng } / \mathrm { ml } \) 와 \( 10 \mathrm { ng } / \mathrm { ml } \) 의 \( \mathrm { bFGF } \) 에 HGF 를 각 각 첨가한 경우는 신경조직의 높은 분화효과를 나타내다가 \( 50 \mathrm { ng } / \mathrm { ml } \) 의 고농도bFGF처리부터는 오히려 신경조직의 분화감소가 일어났다 Xenopus에서 알려진 신경유도체로는 6가지의 pro-tein이 있는데 noggin, FGF, folliostatin, chordin, Xnr3, cerberus가 그것이며, 그 중 nog-gin, chordin, cerberus는 BMP4에 직접 결합하여 포피세포들 유도하고 신경조직 형성은 억제한다고 알려져 있다. 신경조직은 몸의 앞쪽 특성을 가지는 외배엽으로부터 위의 나머지 단백질들에 의해 유도되며, 톡히FGF 는 몸의 앞쪽과 뒤쪽부분 모두의 신경조직을 발현한다. 이것은 FGF 가 저농도에서는 앞쪽 neural marker genes을 유도하며, 고농도에서는 뒷쪽 neural marker genes을 유도한다는 보고 와 관련이 있다. 바로 이러한 특징이 bFGF 의 단독 처리 중 고농도에서 두부신경조직이 고빈도로 유도되지 못한 이 유로 생각된다. 또 한가지의 특징은 근육이 bFGF 의 단독처 리 시 농도가 높아질수록 높은 비율로 분화한 것이다. 반면 HGF와의 흔합처리에서는 분화율이 조금 증가하거나 오히 려 저해되었다. 이는 Godsave등의 실험내용과 일치하는 데 이들의 연구결과를 보면 동물극 분리편에 bFGF 를 처리 하였더니 고농도에서 중배엽의 대표적 조직인 근육이 많이 분화하였으며, 초기 배에서 동물극세포 보다 marginal zone 세포부위에서bFGF 의 농도가 높게 나타남을 확인하였다. 또한 bFGF는 후복축 중배엽 유도에 관여하며, 강력한 유도효과를 가진 activin \( \mathrm { A } \) 는 전배측 중배엽 유도에 관여한다고 하였다.</p>