TMP21 cDNA를 발현할 수 있는 CMV/hTMP21 벡터를 제작하여 B35세포에서 과발현시킨 후, \( \gamma \)-secretase의 구성단백질과 NGF 수용체 신호전달과정의 영향을 분석하였다. 그 결과, TMP21의 과발현은 \( \gamma \)-secretase의 구성단백질의 발현을 억제하고 p75NTR/RhoA의 발현과 TrkA/ERK의 인산화를 감소시켰다.
<p>따라서, 본 연구에서는 TMP21 cDNA를 발현할 수 있는 \( \mathrm { CMV } / \mathrm { hTMP } 21 \) 벡터를 제작하고 이를 B35 세포에서 과발현시 킨 후 \( \gamma \)-secretase의 구성단백질과 NGF 수용체 신호전달과정 에 미치는 영향을 분석하고자 하였다. 그 결과, TMP21의 과발 현은 \( \gamma \)-secretase의 구성단백질의 발현을 억제하였으며, \( \mathrm { p } 75 ^ {\mathrm { NTR } } / \) RhoA의 발현과 TrkA/ERK의 인산화는 감소를 유도하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>CMV/hTMP21 벡터제조</h2> <p>TMP21 cDNA는 인간의 neuroblastoma인 SH-SY5Y세포의 total RNA를RNAzol B (Tel-Test Inc., Friendswood, TX, USA)을 이용하여 분리한 후 두 종류의 primers (forword pri-mer; 5'-GCAAG GTTGA GCTAG CACCA TATCT GGTTT GTCTG-3', reverse primer; 5'-GCTCT AGAGA CTCGA GGCAC CTCAT TCATT ACTCA ATC \( -3 ^ {\prime } \) )를 이용하여 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 30 초, \( 62 ^ {\circ } \mathrm { C } 30 \) 초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 45초 조건에서, 32 cycle로 반응하여 합성하였다. 합성된TMP21 cDNA는 pGEM-T easy 벡터 (Promega, Madison, WI, USA)에 클로닝한 후 HindIII와 XbaI 으로 절단하여 DNA 단편을 준비하였고, 동일한 제한효소로 절단된 \( \mathrm { pEGFP-C1 } \) 벡터(Clontech, Palo Alto, CA, USA)와 결합하여 CMV/hTMP21 벡터를 제조하였다. 제조된 CMV/ hTMP21 벡터는 제한효소 절단과 automatic sequencing을 통해 정확한 유전자 서열의 삽입을 확인하였다.</p> <h2>세포배양 및 Transfection</h2> <p>TMP21의 기능을 연구하기 위하여 사용한 렛드 neuro-blastoma인 B35 세포는 10 \% fetal bovine serum (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA), L-glutamine, penicillin 및 streptomycin (Cambrex)을 함유한 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, Gibco)에 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건의 incubator에서 배양 하였다. SH-SY5Y 세포는 인간에서 기원된 neuroblastoma 세포로서 \( 10 \% \) 의 열처리된 FBS와 penicillin/streptomycine 이함유된 Minimum Essential Medium (MEM, Gibco) 복합 배지로 동잍한 조건에서 배양하였다. Transfection을 위하여 \( 10 \mathrm {\mu g } \)의 vehicle (pEGFP-C1) 벡터와CMV/hTMP21 벡터를 각각Lipofectamin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)과 실온에서 20분간 혼합하여 준비하고, \( \mathrm { B } 35 \) 세포는 항생제가 없는 배지에서24 시간 배양하여 \( 2 \times 10 ^ { 7 } \) 세포가 되도록 준비하였다. 세포를 OptiMEM (Invitrogen)으로 한 번 세척한 후 준비된 DNA/ Lipofectamin 혼합물을 세포 위에 천천히 첨가한 후 5 시간 동안 유전자가 주입되도록 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 배양기에서 배양한다. 5 시간 경 과 후 항생제가 있는 정상배지로 교환하여 24 시간 동안 배양 하여 분석에 사용하였다.</p>