본 연구에 사용된 진귤은 제주특별자치도 제주시 애월읍에서 채취하였고 열수 추출물을 여과한 후 그 여과액과hexane를 1:1로 혼합하고 hexane 분획물을 농축한 후 동결 건조하여 실험에 사용하였으며 분화를 유도를 위하여 3T3-L1 preadipocyte를 0.5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthine, DMEM/10% fetal bovine serum, 1 \(\mu\mathrm{m}\) dexamethasone로 구성된 MDI 배지에서 2일 동안 배양,PRF의 세포 독성은 EZ-Cytoxkit 을 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였으며 반응이 끝난 membrane은 0.1% TBST로 세척하여 Westar ECL kit로 반응시킨 후x-ray 필름을 이용하여 현상하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시료 채집 및 분획물 제조</h2> <p>본 연구에 사용된 진귤(Citrus sunki Hort. ex Tanaka)은2021년 2월 제주특별자치도 제주시 애월읍에서 채취하였다. 진귤 잎으로부터 polymethoxyflavones-rich fraction(PRF)의 제조는 진귤 과피에서 PRF를 분리한 KO 등[26]의 방법에 따라 수행하였다. 진귤 잎은 세척하여 60°C에서 24시간 건조 후 50 mesh 이하의 입자로 미세하게 분쇄한 후, 건조분말과 증류수를 1:10 비율로 넣고 5시간 동안열수 추출하였다. 열수 추출물을 여과한 후 그 여과액과hexane를 1:1로 혼합한 후 hexane 분획물을 농축한 후 동결 건조하여 실험에 사용하였다. Hexane 분획물은 nobile-tin (15.81 mg/g), tangeretin (50.34 mg/g), sinensetin (1.10mg/g) 등 9종의 PMFs로 구성된 혼합물로 확인된 바 있다.</p> <h2>세포배양 및 분화유도</h2> <p>Mouse 유래 3T3-L1 세포(American type culture collec-tion, USA)는 100 U/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin,10% bovine calf serum (BCS, Gibco, USA)이 포함된 Dul-becco’s minimal essential medium (DMEM, Gibco, USA)을사용하여 5% CO2 및 37°C가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 지방세포로 분화를 유도하기 위해서 post-confluence상태에 있는 3T3-L1 preadipocyte를 [10 μg/ml insulin (INS,Sigma-Aldrich, USA), 1 μM dexamethasone (DEX, Sigma-Aldrich, USA), 0.5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX,Sigma-Aldrich, USA), DMEM/10% fetal bovine serum (FBS,Gibco, USA)]로 구성된 MDI 배지에서 2일 동안 배양하였다. 다시 2일 후에 세포는 10 μg/ml insulin이 포함된 DMEM/10% FBS 배양액으로 교환하였고, 이후 2일 간격으로DMEM/10% FBS 배양액으로 교환하여 총 8일 동안 배양하였다.</p> <h2>세포 생존율 및 독성 분석</h2> <p>3T3-L1 전구지방세포를 96 well cell culture plate (1×104cells/well)에 24시간 배양하였다. 배양된 세포에 시료를 처리하여 3일 동안 더 배양한 후 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphyenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma-Aldrich, USA)용액을 400 μg/ml의 농도로 처리하여 37°C에서 4시간 동안 반응 하였다. 반응 후 용액을 제거하고 MTT에 의해환원된 formazan 침전물을 dimethyl sulfoxide (DMSO)에녹여 microplate reader (Bio-Tek, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. PRF의 세포 독성은 EZ-Cytoxkit (DogenBio, Korea)을 이용하여 490 nm에서 흡광도를측정하였다. 각 시료는 3회 반복 실험하여 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포 생존율 및 독성을 평가하였다.</p> <h2>Oil Red O 염색 및 지질함량 분석</h2> <p>성숙한 지방세포의 지방함량을 특정하기 위해서 세포를 phosphate buffered saline (PBS) 용액으로 세척 후 4%formalin용액에 1시간 고정한 후 증류수로 세척하여 0.6%Oil Red O (Sigma-Aldrich, USA)용액으로 1시간 염색하여현미경(Olympus IX71)으로 관찰하였다. 세포의 지질 함량은 염색된 지방소적을 4% nonidet P-40 (Amresco, USA)용액에 녹인 후 520 nm 흡광도를 측정하여 정량 하였다.</p> <h2>Free glycerol 함량 측정</h2> <p>완전히 분화된 지방세포를 DMEM/2% BSA (Sigma-Aldrich, USA) 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 여기에양성대조군(IBMX)과 PRF (10, 20, 40 μg/ml)를 DMEM/2% BSA에 혼합하여 2일간 배양한 후 분비된 glycerol 함량을free glycerol assay kit (Biomax, Korea)를 이용하여 측정하였다.</p> <h2>Western blot</h2> <p>단백질을 분리하기 위하여 배양이 끝난 세포를 RIPAlysis buffer [1×RIPA (Millipore Germany), 1 mM PMSF(Sigma-Aldrich, USA), 1 mM Na3VO4 (Sigma-Aldrich, USA),1 mM NaF (Merck, Germany), 1 μg/ml aprotinin (Amresco,USA), 1 μg/ml lupeptin (Millipore, Germany), 1 μg/ml pep-statin (Amresco, USA)]에서 균질화하였다. 균질화된 세포용액을 14,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 분리하여 Bio-Rad protein assay reagent (Bio-Rad, USA)를 이용하여 단백질을 정량하였다. 단백질은 sodium dodecylsulfate- polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로100 V에서 2시간 동안 분리한 후 polyvinylidene difluoride(PVDF, Millipore, USA) membrane으로 전이하였다. 전이된 membrane은 blocking 용액(5% skim milk/0.1% TBST)으로 blocking 한 후, PPARγ, FAS, SREBP1, β-actin, aP2에대한 항체(Santacruz Bio, USA), 그리고 phospho-AMPK,AMPK, phospho-ACC, ACC, phospho-HSL, HSL, p-ACC에대한 항체(Cell signaling, USA)을 3% bovine serum albumin(BSA, Viologen, Australia) 또는 skim milk로 희석하여 4°C에서 24시간 반응시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 membrane은 0.1% TBST로 세척하여 horseradish peroxidase (HRP)가결합된 mouse, rabbit 또는 goat 2차 항체(Vector laboratories,USA)를 blocking buffer에 희석하여 1시간 동안 실온에서반응하였다. 반응이 끝난 membrane은 0.1% TBST로 세척하여 Westar ECL (Cyanagen Srl, Italy) kit로 반응시킨 후x-ray 필름(Agfa, Belgium)을 이용하여 현상하였다.</p> <h2>통계 처리</h2> <p>모든 실험 결과는 평균 ± 표준편차로 표현하였으며, 처리군 간의 유의성 검정은 SPSS 프로그램(IBM SPSS sta-tistics 21, USA)을 이용하여 t-test로 분석하여 검증하였고,통계적 유의성은 p<0.05 이하를 유의한 것으로 간주하였다.</p>