본 연구는 WEAS 처리에 따른 apoptosis 유발 메커니즘을 분석하였다. WEAS의 처리는 pro-apoptotic Bax의 발현을 증가시키며, anti-apoptotic인 Bcl-2와 Bcl-xL의 발현을 감소시키는 것으로 나타났다. 또한, WEAS 처리 후 ROS 생성이 증가하며, 이는 처리 후 2시간 동안 계속되었다. 이후 세포주기 관점에서 WEAS 처리와 apoptosis 유발과정의 연관성을 조사하였으며, 결과적으로 WEAS에 의한 apoptosis 유발이 세포주기 G2/M arrest와 관련이 있음을 확인하였다. 이 과정에서 ROS의 생성이 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다.
<h2>U937 세포에서 apoptosis 조절인자들의 발현에 미치는 WEAS의 영향</h2> <p>다음은 WEAS 처리에 의한 apoptosis 유발 기전 해석의 일환으로 주요 apoptosis 조절인자들의 발현에 미치는 WEAS의 영향을 조사하였다. 먼저 조사된 Bcl-2 family에 속하는 인자들 중, pro-apoptotic Bax의 발현이 WEAS 최고 처리 농도에서 다소 증가된 반면, anti-apoptotic 인 Bcl-2 및 Bcl-xL의 발현은 WEAS 처리 농도가 증가할수록 매우 감소되었다. 그리고 본 실험 조건에서 truncation된 tBid 단백질의 발현은 관찰할 수 없었으나, 총 Bid 단백질의 발현은 현저하게 감소되어 Bid가 tBId로 전환되었을 가능성이 높음을 알 수 있었다. Caspase와의 직,간접적인 결합을 통하여 그들의 활성을 막음으로서 apoptosis 억제에 관여하는 IAP family에 속하는 단백질들은 조사된 3가지 모두에서 WEAS 처리에 의하여 농도 의존적으로 매우 감소되었다. 또한 조사된 3가지의 caspase 단백질의 비활성형 발현의 정도도 WEAS 처리에 의하여 현저하게 감소되어 WEAS 처리에 의하여 그들의 활성이 증가되었음을 알 수 있었는데, caspase의 표적 단백질인 PARP 및 \( \beta \)-catenin의 단편화 및 발현 저하는 WFAS 처리에 의하여 caspase가 활성화되었을 것이라는 추측을 됫받침하여 주는 결과이다.</p> <h2>U937세포에서 WEAS 처리에 다른 ROS 생성의 증가에의한 apoptosis의 유발</h2> <p>WEAS의 처리에 의한 U937세포의 apoptosis 유발에 ROS의 생성과 연관성이 있는지의 여부를 조사한 결과, WEAS 처리 30분 후 ROS의 생성량이 WEAS 처리 전에 비하여 1.6배 이상 증가하였으며, ROS 생성은 처리 후 2시간까지 지속적으로 증가하다가 서서히 감소되는 경향성을 보여 주었다. 이러한 ROS 생성의 증가가 WEAS 처리에 의한 것인지의 여부를 조사하기 위하여 ROS의 선택적 scavenger인 NAC을 선처리하여 WEAS에 의한 ROS 생성에 미치는 영향을 조사하였다. NAC 단독 처리의 경우 정상 배지에서 자란 세포에 비하여 ROS의 생성이 거의 되지 않았으며, WEAS 처리군에서는 NAC 처리에 의하여 정상배지에서 배양된 세포에서 생성되는 양 이하로 감소되었다. 따라서 이러한 WEAS 처리에 의한 ROS의 생성이 apoptosis 과정에 관여하는지의 여부를 조사한 결과, Fig.5B에 나타낸 바와 같이 WEAS가 처리된 세포에서 활성화되었던 casapsc-3의 활성이 NAC 선 처리에 의하여 매우 유의적으로 감소되었음을 알 수 있었다. 또한 NAC 처리에 의한 ROS 생성의 저해는 WEAS 처리에 의한 세포의 증식 억제 효능도 매우 유의적으로 차단되었음을 알 수 있었다. 이는 WEAS 처리에 의한 apoptosis 유도 과정에 ROS의 생성이 필수적으로 관여 할 것임을 보여주는 결과이다.</p> <h2>WEAS에 의한 G2/M arrest 유발과 ROS 생성과의 상관성</h2> <p>다음은 WEAS 처리에 의한 암세포의 증식억제와 연관된 apoptosis 유발 과정이 세포주기 조절 측면에서 어떤 연관성이 있는지의 여부를 조사하였다. 이를 위하여 정상 및 WEAS가 처리된 배지에서 배양된 U937 세포를 대상으로 세포주기 분포도 변화를 조사한 결과, S기에 속하는 세포의 빈도의 경우 대조군의 \( 21.81 \%\)에 비하여 약 \( 6.5\% \)정도 증가하였으며, 대조군에서 \( 18.45 \)%에 해당되었던 G2/M기에 속하는 세포의 빈도가WEAS 처리 24시간 후에 \( 34.81 \)% 로 약 1.9배 증가되었고, G1기에 속하는 세포의 빈도는 상대직으로 다소 감소되었음을 알 수 있었다. 그러나 NAC의 선처리에 의하여 ROS의 생성을 차단시켰을 경우 대조군 수준으로 돌아오지는 못하였으나, WEAS에 의한 G2/M arrest를 어느 정도 차단하였음을 알 수 있었다. 이상의 결과는 WEAS에 의한 apoptosis의 유발은 세포주기 G2/M arrest와 연관성이 있었으며, 이때 ROS의 생성이 관여함을 보는 주는 것이다.</p>