K gwangalliensis 의 cosmid genomic library에서 GGPP synthase (crtE) 유전자의 클로닝을 위해 계통학적으로 유연관계가 높은 균주들로 GGPP synthase의 보존된 영역을 NCBI conserved domains site에서 검색해 이를 통해 degen-erate primer을 디자인 하였다. K. K. gwangalliensis 유래 CrtE 효소의 1차 구조 및 염기서열 분석은 NCBI GeneBank database의 BLAST algorithm을 사용하여 기존 세균에서 알아낸 bacteria type의 phytoene desa-turase의 아미노산 서열을 확보 후, 아미노산 서열을 비교 분석해 상동성을 조사했다. 확보된 crtE 유전자를 대장균에서 과발현시키기 위해 pColdI vector (Takara, Shiga, Japan)의 NdeI과 HindIII site를 활용하여 crtE 유전자를 클로닝 했다. 대장균에서 생합성된 라이코펜은 HPLC를 이용하여 분석했다.
<h2>GGPP synthase (crtE) 클로닝 및 염기서열 결정</h2><p>K gwangalliensis 의 cosmid genomic library로부터 GGPP synthase (crtE) 유전자의 클로닝을 위하여 계통학적으로 유연관계가 높은 균주들로부터 GGPP synthase의 보존된 영역을 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA) conserved domains site에서 검색하여 이를 기반으로 degen-erate primer을 디자인 하였다. Degenerate primer을 이용 PCR을 수행하여 부분 단편을 증폭하였다. crtE 유전자의 open reading frame (ORF)을 클로닝 하기 위하여 DNA walk-ing speedup premix kit (Seegene, Seoul, Korea)을 이용하였다. DNA walking kit을 이용하여 증폭된 유전자는 pGEM-Teasy vector (Promega, Madison, WI, USA)에 각각 클로닝 하였으며, 각 클론들의 DNA 염기서열을 분석하여 최종적으로 crtE 서열을 확보하였고, 이를 NCBI GeneBank에 등록하였다.</p><h2>K. gwangalliensis GGPP synthase (CrtE) 염기서열 분석</h2><p>K. gwangalliensis 유래 CrtE 효소의 1차 구조 및 염기서열 분석은 NCBI GeneBank database의 BLAST algorithm을 이용하여 기존 세균에서 밝혀진 bacteria type의 phytoene desa-turase의 아미노산 서열을 확보한 후, 아미노산 서열을 비교 분석하여 상동성을 조사하였다. 아미노산의 multiple se-quence alignment는 Clustal W 프로그램을 사용하였으며, 계통수(phylogenetic tree) 분석을 위해서는 neighbor-joining method를 이용하는 프로그램인 NEIGHBOR (Mega, version \( 4.0) \)를 사용하여 작성하였다.</p><h2>대장균 발현 벡터의 구축 및 라이코펜 생합성을 위한 재조합 DNA 구축</h2><p>확보된 crtE 유전자를 대장균에서 과발현시키기 위해서 pColdI vector (Takara, Shiga, Japan)의 NdeI과 HindIII site를 이용하여 crtE 유전자를 클로닝 하였다. 이를 위해서 T-vector에 클로닝 된 crtE 유전자의 5'- 말단과 3'-말단에 각각 NdeI 과 HindⅢ site를 가지는 primer를 이용하여 PCR로 증폭하였다. PCR product 및 pColdI vector를 NdeI과 HindIII 제한효소로 처리한 후 대장균 발현벡터에 클로닝하여 pCcrtE 재조합 DNA를 구축하였으며, 이를 대장균 BL21(DE3)에 도입하여 형질전환된 균주를 선별하였다. 선별된 균주는 ampicillin \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)가 함유된 LB 배지에 \(O.D._{600}=0.5\) 일때까지 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양한 후, \( 0.1 \mathrm{mM} \) IPTG (isopropyl- \( \beta \)-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 \( 16^{\circ} \mathrm{C} \)에서 과발현을 유도하였고, \( 12 \% \) sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel elec-trophoresis (SDS-PAGE)를 이용하여 분석하였다. 재조합 단백질의 대장균 내 발현 유무 확인을 위하여 Western blot 분석법 이용하였으며, \( 12 \% \) SDS-PAGE gel에 의해 분리된 C-말단부위에 6X-histidine tag을 가진 재조합 단백질을 electro-transfer을 이용하여 nitrocellulose (NC) membrane로 이동 시켰으며, 이들 재조합 단백질의 확인을 위해 1 차 항체는 goat antiserum against 6-His tag를 사용하였으며, 2차 항체는 al-kaline phosphate가 결합된 goat antibody against goat \( \mathrm{IgG} \)항체를 사용하였다. 또한, 이들 항체의 결합에 의한 NC mem-brane 상에서의 발색을 위한 시약은 BCIP/NBT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 시약을 사용하여 대장균 내 재조합 단백질인 KgCrtE의 발현 유무를 확인하였다. 또한, 대장균 BL21 (DE3)에서 라이코펜(lycopene) 생합성을 위해 P. haetundaensiso의 CrtB (Phytoene synthase), CrtI (Phytoene de-saturase) 유전자를 대장균 동시 발현벡터인 pRSFDuet1 vec-tor (Novagen, Quincy, MA, U.S.A.)에 클로닝하여 pRScrtBI 재조합 DNA를 구축하였다. 이를 대장균 BL21 (DE3)에 형질 전환하여 선별하였다. 대장균에서 라이코펜을 생합성 하기 위해서 위의 두 재조합 DNA (pCcrtE와 pRSCrtBI)를 BL21(DE3)에 공발현(co-expression)시켜 \( 16^{\circ} \mathrm{C} \) 및 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양하여 라이코펜 생합성을 유도하였다.</p><h2>대장균에서 생합성 된 라이코펜의 추출 및 분석</h2><p>대장균에서 생합성된 라이코펜은 HPLC를 사용하여 분석하였다. 형질전환된 대장균 균주에서 색소를 추출하기 위하여 \( 90 \% \) acetone으로 3분간 homogenizer 하여 색소를 추출하고, \( 13,000 \mathrm{rpm} \)로 2분간 원심분리하여, 상층액만 주사기 필터\( (0.22 \mu \mathrm{m} \) nylon filter)를 이용해 여과하였다. HPLC 분석을 위하여 \( 20 \mu l \)의 샘플을 주입하고 분리시간은 30분 동안 진행 하였다. HPLC는 Bio-rad (Hercules, CA, U.S.A.) 사의Automated Biologic HR system (#750-0047)를 이용하였다. Column은 Nova-Pak HR 6 U C18 column \( (3.9 \times 300 \mathrm{~mm}) \)을 사용하였고 column 온도는 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)이다. 색소 추출을 위한 용매는 \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris- \( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} 8.0) \), acetonitrile, methanol, ethyl ace-tate가 이용되었다. HPLC 작동 중 용매의 농도는 다음과 같다: \( 14 \% \) \(0.1 \mathrm{M}\) Tris-\( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} 8.0) \), \( 84 \% \) acetonitrile, \( 2 \% \) methanol (0-15 min), \(68 \% \) methanol과 \(32\%\) ethyl acetate (15-20 min).Post-running은 10분간 이루어졌으며 사용된 용매의 농도는 시작할 때의 용매 농도와 같다. 컬럼 내의 유속은 분당 \( 1 \mathrm{ml} \)이 되게 하였다. 분리된 각각의 카로티노이드들은 photo-diode array detector를 이용하여 absorption maxima인 \(280 \mathrm{nm} \)와 \( 470 \mathrm{~nm} \)에서 측정하여 표준물질과 비교 분석하였으며, 라이코펜 및 GGPP standard는 Sigma-Aldrich (St. Louis,MO, USA )에서 구입하였다.</p>