생쥐 간 cDNA Library에서 Polymerase 연속반응에 의해서 분리된 CAR1 cDNA를 염기서열분석한 결과, CAR1 단백질의 codon 염기서열임이 확인되었다. 유방암세포를 배양하기 위해서는 각 세포에 적합한 배양액을 선택하고, 계대배양을 유지하여 배양할 수 있다. Firefly Luciferase와 Renilla Luciferase를 측정한 후, 각 시료에 대해 Firefly Luciferase 값을 Renilla Luciferase 값으로 나누어 transfection 효율 차이에 따른 변이를 제거하여 각 샘플의 Renilla Luciferase value의 표준화를 시행할 수 있다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>Ligand 및 Plasmid 조합구성</h2> <p>Constitutive Androstane 수용쳉의 리간드인 TCPOBOP는 B. Kemper로부터 졔공받았고, estrogen receptor의 리간드 17-beta-estradiol과 Mox-estrol, SXR의 리간드 rifam-picin, 그리고 PPAR \( y \) 의 리간드 prostaglandin 등은 Sigma (U.S.A.)로부터 구입되었다. 생귀의 간 cDNA Library로부터 Polymerase 연속반응에 의해서 mouse CAR1 CDNA를 분리한 다음 염기서얼분석에 의해 CAR1 단백질의 codon 염기서열임을 확인하였다. 포유동믈 세포 내에서의 CAR의 발현을 위해서, CAR CDNA를 함유한 BamH1/EcoR1 PCR fragment를 pGEX2TK (Pharmacia Corp. U.S.A.) vector에 주입하여 PGEXZTK-mCAR1을 구성한 다음, PGEX2TK-\( \mathrm{mCAR1} \) 오로부터 BamH1과 Eor1으로 분리된 CAR1 \( \mathrm{cDNA} \) 를 동일한 제한효소들로 자른 pcDNA3 (Invitrogen)에 결합시켜 pcDNA3-mCAR1을 합성하였다. 포유동물세포 내 발현plasmid인 pCMXSXR, pSG5-PPARr, pCMVhER \( a \) 와 보고유전자 plasmid, 4(ERE)tk-luciterase등은 J.K. Kemper로부터 제공받았다.</p> <h2>세포 배양</h2> <p>두 가지 유방암세포, MCF-7과 MDA-MB-231에 대하여 각각의 성장에 적합한 배양액을 선택하여 계대배양을 유지하고 transfection에 적절한 빼양조건을 확립하였다. 먼저 Estrogen 수용제를 발현하는 MCF-7-K1 세포의 배양유지에는 Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) 배양액을 기본으로 하여 \( 10 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) Phenol Red, \( 5 \% \) charcoal-dextran striped calf serum (CDCS), 10) units/ml Penny-cillin, \( 100 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) Streptomycin, \( 25 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) Gentamycin 및 \( 6 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) Bovine insulin을 첨가하고, Estrogen 수용체를 발현하지 않는 MDA-MB-231 세포의 배양을 위해서는 Leibovitz's L-15 기초배양액에 \( 10 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) Phenol Red, 5% Charcol-dextran으로 처리된 Calf Serum, \(100 \mathrm{units/ml}\) Pennycillin, \( 100 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) Streptomycin, \( 25 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) Gen-tamycin, \( 3.75 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) Hydrocortisone, \( 6 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) Bovine insulin, \( 16 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) Glutathione을 첨가하여 배양하였다. Human HepG2 세포배양에는 \( 10 \% \) charcoal-dextran-stripped fetal calf serum, 100 units/ml penicillin 과 \( 0.01 \% \) streptomycin을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's me-dium (DMEM)을 사용하였다. 각 세포의 transfection을 위해서는 위의 세포유지배양 후 약 \( 70 \sim 80 \% \) confluency에 도달했을 때 Phenol Red, Hydrocortisone, insulin, Gluta-thione을 제거한 배양액에서 35일간 Wearing시킨 다음 24-well plate에 옮겨 \( 80-95 \% \) 이상 confluency에 도달할 때까지 배양하였다.</p> <h2>Transfection</h2> <p>Transfection은 이미 보고된 LipofectAMINE 2000 (Invitrogen) 방법을 따랐으며, 24-well에서 배양된 80 \( 95 \% \) 이상의 confluency에 도달한 세포에 대해서, \( 250 \mathrm{ng} \) (Hep G2) 혹은 \( 500 \mathrm{ng} \) (MCF-7, MDA-MB-231)의 4 (ERE) tkLuc reporter plasmid, transfection의 효율에 따른 nor-malization을 위한 \( 10 \mathrm{ng} / \) wello pRL-SV40 plasmid, \( 2.5 \) \( \mathrm{ng} \) (Hep G2) 혹은 \( 30 \mathrm{ng} \) (MDA-MB-231)의 hER \( \alpha \) ex-pression plasmid (pCMV-hER \( \alpha \) ), 그리고 다양한 양 (10 \( 250 \mathrm{ng} \) )의 xenobiotic 핵 수용체 CAR, SXR, PPARr의 ex-pression plasmid (pcDNA3-CAR, pCMXSXR, pSG5-PPARr)를 첨가하였다. 수용체에 대한 리간드의 영향을 조사하기 위해서 \( 10 \mathrm{nM} \) 17-beta-estradiol (MCF-7, MDA-MB-231) 혹은 Mox-estrol (Hep G2), 5 uM TCPOBOP, \( 10 \mathrm{uM} \) rifampicin, \( 20 \mathrm{uM} \) prostaglandin, 등을 각각의 수용체 \( \mathrm{ER} \), CAR, SXR, 그리고 PPARr에 대하여 첨가하였다. DNA를 transfection한 후 18-24시간이 지난 뒤 각각의 리간드가 함유된 신선한 배양액으로 교체한 다음 추가로 24시간 동안 배양시켰다.</p> <h2>Dual Luciferase 활성측정</h2> <p>Promega Biotech. (U.S.A.)에서 제공되는 Dual Lucif-erase Assay Protocol에 따라서 Firefly Luciferase와 Re-nilla Luciferase를 측정한 다음 가 시료에 대해 Firefly Luciferase의 값을 Renilla Luciferase의 값으로 나누어 transfection의 효율차이에 따른 변이를 제거합으로써 각 sample의 Renilla Luciferase value에 대한 표준화를 시행하였다.</p>