칼슘은 식물의 세포 내 신호전달 과정에서 이차매개체로서 다양한 생리학적 빈응을 유발하는 중요한 기능을 수행하며 그 중 액포는 세포 내 칼슘을 포함하는 이온들의 주요 저장소로서 중요한 역할을 하고, 액포로부터 세포질로의 유입된 칼슘은 high-affinity \( \mathrm{Ca}^{2+} \)-ATPase와 low-affinity \( \mathrm{Ca}^{2+} / \mathrm{H}^{+} \)antiporter에 의해서 신호전달 후 세포질 내 낮은 농도의 칼슘을 유지하기 위해서 세포질로부터 외부 혹은 특정부위로 칼슘의 방출이 일어나게 한다. 식물의 원형질막뿐만 아니라 다양한 세포 내 소기관들에 위치하고 있는 ACA-type \( \mathrm{Ca}^{2+} \)-ATPase들은 세포 내 소기관에서 특이적인 신호전달에 관여할 것으로 예상할 수 있기에 본 연구에서는 애기장대의 액포막에 존재하는 \( \mathrm{Ca}^{2+} \)-ATPase를 암호화하는 유전자에 대한 연구를 수행하였다.
<h1>서 론</h1> <p>칼슘은 세포 내 신호전달 과정에서 이차매개체로서 식물 외부의 발달신호나 환경변화에 반응하여 다양한 생리학적 반응을 유발하는 중요한 기능을 수행한다. 세포질의 칼슘 농도의 변화는 많은 외부의 자극들에 의해서 유발되며, 식물의 다양한 생리학적인 반응은 이러한 칼슘의 변화와 관련된다 (Bush 1995; Sanders et al. 1999; Berridge et al. 2000). 식물에서 액포는 세포 내 칼슘을 포함하는 이온들의 주요 저장소로서 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있다. 액포는 \( 1 \mathrm{mM} \) 이상의 높은 농도의 칼슘을 포함하고 있으며, 반면에 세포질은 \( 100-200 \mathrm{nM} \) 이하의 낮은 농도의 칼슘을 유지하고 있다. 액포로부터 세포질로의 칼슘의 유입은 여러 칼슘 채널들에 의해서 매개되며, 신호전달 후 세포질 내 낮은 농도의 칼슘을 유지하기 위해서 세포질로부터 외부 혹은 특정부위로 칼슘의 방출이 일어나야 하는데 이는 high-affinity \( \mathrm{Ca}^{2+} \)-ATPase와 low-affinity \( \mathrm{Ca}^{2+} / \mathrm{H}^{+} \)antiporter에 의해서 이루어진다 (Muir and Sanders 1997; Marty 1999; Sze et al. 2000; Hetherington and Brownlee 2004).</p> <p>애기장대에는 14 개의 \( \mathrm{Ca}^{2+} \)-ATPase들이 존재하며 이들은 단백질의 구조와 효소조절 메커니즘에 기초해서 크게 autoinhibited \( \mathrm{Ca}^{2+}- \) ATPases (ACAs)와 ER-type \( \mathrm{Ca}^{2+} \)-ATPases (ECAs)로 나뉘어 진다. 애기장대의 ACA-type \( \mathrm{Ca}^{2-} \)-ATPase 들은 10개가 존재하며, 이들은 세포 내 위치에 따라 크게 4 개의 하위그룹으로 나뉘어진다. 원형질막에 ACA8, ACA9, ACA10의 3 개의 \( \mathrm{Ca}^{2+} \)-ATPase 들이 있으며, 소포체 막에는 ACA1, ACA2, ACA7의 3개의 \( \mathrm{Ca}^{2-} \)-ATPase 들이 위치하고 있다 (Hong et al. 1999; Bonza et al. 2000; Baxter et al. 2003; Schiott et al. 2004; Gcorge et al. 2008). 또한 액포막에는 ACA4, ACA11의 2개의 \( \mathrm{Ca}^{2+} \)-ATPase 들이 존재하며 (Geisler et al. 2000b; Lee et al. 2007), 아직 세포 내 존재위치가 알려져 있지 않은 \( \mathrm{ACA} 12, \mathrm{ACA} 3 \) 의 2 개의 \( \mathrm{Ca}^{2+} \)-ATPase 들이 존재한다. 식물의 \( \mathrm{ACA}- \) type \( \mathrm{Ca}^{2+} \)-ATPase는 동물의 \( \mathrm{CaM} \)-stimulated plasma membrane \( \mathrm{Ca}^{2+} \) - ATPases (PMCAs)와 유사한 특징을 보이지만, 동물의 \( \mathrm{Ca}^{2+}-\mathrm{ATPase} \) 가 원형질막에 독점적으로 분포하는데 비해 식물에서는 원형질막 뿐만 아니라 다양한 세포 내 소기관에 존재하는 것으로 알려져 왔다. 또한 식물의 ACA-type \( \mathrm{Ca}^{2+} \)-ATPase는 N-terminus에 calmodulin 의 결합에 의해서 조절되는 부분이 있는데 반해 동물의 \( \mathrm{Ca}^{2+} \) - ATPase는 C-terminus에 calmodulin의 결합에 의해서 조절되는 부분이 존재한다 (Evans and Williams 1998; Geisler et al. 2000a). 현재까지 식물에서 \( \mathrm{Ca}^{2+}-\mathrm{ATPase} \) 들의 분자생물학적인 특징들은 보고되었지만, 그들의 생물학적 기능들은 상세히 밝혀져 있지 않다.</p> <p>동물과 달리 식물의 ACA-type \( \mathrm{Ca}^{2+} \)-ATPase들은 원형질막뿐만 아니라 다양한 세포 내 소기관들에 위치하고 있기 때문에 이러한 세포 내 소기관에서 특이적인 신호전달에 관여할 것으로 예상할 수 있다. 원형질막에 존재하는 것으로 밝혀진 ACA9 단백질은 주로 화분에서 발현되며, ACA9 유전자에 T-DNA 삽입 돌연변이 식물체는 성장이 줄어들며, 씨앗의 생성이 상당히 감소하는 것으로 보고되었다 (Schiott et al. 2004). 이러한 원인은 ACA9의 유전자가 파괴되었을 때 부분적인 웅성불임을 유발함으로써 수정이 제대로 이루어지지 못해 발생되었다. 또한 원형질막에 위치할 것으로 예상되는 ACA10 유전자에 T-DNA 삽입 돌연변이 식물체는 잎의 발달이 저해되며 화서 마디가 제대로 성장되지 않아 꽃이 다발을 이루는 표현형이 보고 되었다 (George et al. 2008). 이제까지 밝혀진 \( \mathrm{Ca}^{2+} \)-ATPase들의 생물학적인 기능은 식물에서 신호전달에 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고되고 있지만 아직까지 그들의 생물학적인 기능은 많이 보고되어져 있지 않다. 특히 세포 내 \( 80 \% \) 이상의 공간을 차지하며, 칼슘의 주요 저장기관인 액포의 \( \mathrm{Ca}^{2+} \)-ATPase는 특히 세포 내 신호전달에서 중심적인 역할을 할 것으로 예상할 수 있다.</p> <p>본 연구에서는 애기장대의 액포막에 존재하는 \( \mathrm{Ca}^{2+} \)-ATPase를 암호화하는 유전자에 대한 연구를 수행하였다. 애기장대의 \( \mathrm{Ca}^{2+} \)-ATPase인 ACA11을 암호화하는 유전자를 식물에 도입하여 형질전환된 식물의 표현형을 조사해본 결과 식물체의 잎에서 세포사멸을 관찰할 수 있었다. 이러한 세포사멸 표현형이 ACA11 유전자의 gene silencing에 의해서 발생한다는 것을 형질전환된 식물에서 막 단백질을 분리하여 Western blot 분석을 통해서 밝혔다. 또한 이러한 세포사멸의 원인이 형질전환된 식물의 잎에서 과도하게 축적되는 활성산소종 (ROS)에 의한 것임을 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) 염색을 통해서 확인하였다.</p>