Neospora에 자연 감염된 임신한 소로부터 유산된 태아의 혈액과 어미소의 혈액을 채취하여 실험을 진행했다. 혈청학적 검사를 수행하고 Neospora 항체 양성우로부터 유산된 태아를 부검하여 육안적으로 관찰한 후, 조직낭포의 존재를 알기 위해서 조직을 광학현미경으로 관찰하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>공시 동물 및 시료</h2> <p>충남 공주시와 연기군의 목장 4 곳에서 2008년 3월부터 2010 년 2월까지 2년 동안 Neospora에 자연 감염된 임신우로부터 유산된 태아 7 두와 함께 이들의 혈액과 어미소의 혈액을 채취하여 실험에 공하였다. 유산된 태아에서 혈액은 심장에서 채취하였으며 여의치 않을 경우에는 흉수를 채취하여 실험에 공하였다.</p> <p>이들 목장은 부르셀라병과 결핵검사에서 모두 음성이었으며, 예방접종 프로그램에 따라 Infectious Bovine Rhinotracheitis virus, Bovine Viral Diarrhea virus, Myxovirus Parainfluenza3, Bovine Respiratory Syncytial virus, Haemophilus somnus 가 포함된 소 호흡기 5종 종합백신(Bar Vac Elite 4-HS, Boehringer Ingelheim, St. Joseph, MI)으로 매년 예방접종해왔었다.</p> <p>임신 진단은 직장을 통한 초음파 임신진단기로 인공수정 후 5-7주경에 임신진단한 후, 임신 10-12주경에 재검사하여 확진하였다.</p> <p>유산한 경우에는 어미소의 결핵 및 부르셀라 감염 여부를 충남가축위생시험소 공주지소에 의뢰하여 재차 확인하였다.</p> <h2>혈청학적 검사</h2> <p>Neospora caninum antibody Test Kit (CHEKIT Neospora ELISA, IDEXX Laboratories, Liebefeld-Bern Switzerland)를 사용하여 조사하였다. 모든 혈청 시료는 혈청 희석액으로 10배 희석하여 항원이 도포된 마이크로플레이트에 \( 100 \mathrm{\mu l} / \mathrm{well} \)씩 중복 분주한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 배양한 다음, 4 회 세척하였다. 이어서 anti-ruminant-IgG-PO conjugate를 \( 100 \mathrm{\mu l} / \mathrm{well} \)를 분주한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 배양, 세척과정을 거쳐, \( \mathrm{TMB} \) sub-strate를 \( 100 \mathrm{\mu l} / \mathrm{well} \)씩 분주하여 실온에서 15 분 배양한 후 stop solution을 \( 100 \mathrm{\mu l} / \mathrm{well} \) 첨가하고 \( 450 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도 OD를 측정하여 아래와 같이 S/P값을 계산하였다.</p> <p>S/P 값 \( (\%)=( \) sample mean OD-negative control mean OD / positive control mean OD-negative control mean OD)\(\times \)100</p> <p>제조사의 설명서에 따라 S/P 값이 \( 40 \% \) 이상은 양성, \( 30 \% \) 이상 \( 40 \% \) 미만은 의양성, \( 30 \% \) 미만은 음성으로 판정하였다.</p> <h2>병리조직학적 관찰</h2> <p>Neospora 항체 양성우로부터 유산된 태아를 부검하여 육안적으로 관찰한 후, 각종 조직을 절취하여 \( 10 \% \) 중성 포르말린 용액으로 고정하여 통상적인 방법에 따라 paraffin 포매절편을 만들어 Hematoxylin-Eosin 염색 및 N. caninum의 조직낭포(tissue cyst)를 관찰하기 위한 Periodic acid Schiff 염색을 실시하여 광학현미경적으로 관찰하였다.</p> <h2>전자현미경적 관찰</h2> <p>파라핀 포매한 뇌조직을 탈파라핀한 다음 탈수시켰다. 뇌조직을 대략 \( 1 \mathrm{~mm}^{2} \)로 잘게 세분한후 \( 1 \% \) osmium tetroxide에 2시간 동안 후고정하였다. 점진적으로 알콜농도를 높이면서 탈수한 후, 조직을 propylene oxide에 침습시킨 후 Epon(Embed 812; Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)으로 포매하였다. 조직닝포의 존재를 알기 위해서 조직을 toluidine blue로 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다. 조직낭포가 확인된 조직을 ultramicrotome (Leica EM UC6, Wetzlar, Germany)으로 \( 70 \mathrm{~nm} \) 두께로 초박절편하였다. 초박절편한 조직을 grid판에 올린 다음 uranyl acetate와 lead citrate로 이중 염색하여 투과전자현미경[EM1200EX-IItransmission electron microscope (JEOL, Tokyo, Japan)]을 이용하여 \( 80 \mathrm{kV} \) 에서 관찰하였다.</p>