N6배지와 5-azaC가 첨가된 N6A 배지에서 유도된 캘러스의 유전자 발현 차이를 조사하였다. 결과적으로, 5-azaC 처리에 의해 384개의 유전자가 3배 이상 증가하였으며, 재분화 배지에서는 116개의 유전자 발현이 증가하였다. 이를 통해 methylation이 유전자 발현 전반에 중요한 영향을 미침을 확인하였고, 캘러스 유기에 관여하는 유전자들은 전자전달, 핵산대사 유전자들과 관련이 있음을 확인하였다. 5-azaC 처리에 의한 demethylation으로 인한 유전자 발현 양상 분석은 식물 분화 발달 기작 연구에 중요한 정보를 제공한다.
<p>정상적인 N6배지와 5-azaC가 첨가된 N6A 배지에서 유기된 캘러스에서 DNA chip을 이용하여 유전자 발현 차이를 본 결과 N6배지에서 캘러스 유기 시 5-azaC 처리에 의해 384개의 유전자가 3 배 이상 발현 증가를 보였으며 재분화 배지에서 5-azaC 처리 효과는 116 개의 유전자 발현이 증가되었다. 이는 캘러스 유기 시에 재분화 상태보다 5-azaC 처리에 의한 유전자 발현에 많은 영향을 주는 것으로 추측되며 마찬가지로 5-azaC 처리에 의해 3 배 이상 발현이 감소하는 유 전자도 캘러스 유기 상태시가 재분화 상태시보다 701 개와 295 개 유전자로 2 배 이상 많았다. TIGR annotation에 따르면 기능이 밝혀지지 않은 유전자들의 발현양이 높았으며 epige-netic regulation, 전자전달에 관여하는 유전자들, 핵산대사 유전자들, 스트레스 반응 유전자들의 발현이 높아지는 것을 알 수 있었다 (Figure 3 A). 이러한 현상은 정상적으로 N6 배지에서 유기된 캘러스를 5-azaC가 첨가된 재분화 배지 MSRA로 치상하였을 때도 같은 현상을 나타내었다 (Figure 4 A ).또한 발현양이 낮아지는 유전자 종류도 비슷한 경향을 나타내었다 (Figure 3 B 4 B ). 이러한 결과로 볼 때 methylation이 epigenetic regulation에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었고 유전자 발현 전반에 영향을 주는 것으로 추측되며 또한 캘러스 유기에 관여하는 유전자들 군으로는 전자전달,핵산대사 유전자들이 관련돼 있다는 것도 알 수 있었다.Causevic 등 (2005)은 다른 발달 형태를 보이는 사탕수수 organogenic line과 nonorganogenic line에 5-azaC를 처리한 결과 soluble peroxidase 활성이 상당히 증가하였다고 하였으며 Southern 분석 결과 methylation 양상이 다르게 나타났다고 하였나. 본 실험에서도 DNA chip 분석 결과 peroxidase family protein 관련 유전자 발현이 상당히 증가한 것을 보여 주었다 (Table 1). Table 1은 microarray 분석 후 발현양에 따른 대표적인 유전자늘의 목록을 나타낸 것이다. 각 분화 단계에서 분리된 total RNA를 사용하여 GeneFishing \( { }^{\mathrm{TM}} \) 스크리닝과microarray 분석에서 공통적으로 발현차이를 보이는 유전자들을 RT-PCR 및 northern 분석을 통하여 발현 차이를 확인하였다. Agamous like MADS protein과 germin like protein 경우 5-azaC 첨가 시, 즉 demethylation 시 유전자 발현이 증가 된다는 것을 알 수 있었다 (Figure 5 A, D, Figure 6 A,C ).특히 germin like protein 경우 5-azaC 처리 시 재분화 상태에서보다는 캘러스 유기 상태에서 발현양이 높다는 것이 RT-PCR과 northern 분석으로 확인되었다 (Figure 5 D , Figure 6C), Glutathione-S-transferase의 경 우에도 5-azaC 처리에서 발현양이 약간 높게 나타났다 (Figure 5 E , F , Figure 6 B ).Metallothionein like protein의 경우 5-azaC 처리 훙 캘러스 형성과 재분화 상태에서 모두 발현양이 약간 낮아지는 것으로 나타났다 (Figure 5 C, Figure 6 D ). 벼 캘러스 형성 및 재분화 단계에서 5-azaC 처리에 의한 demethylation으로 인한 유전자 발현 양상 분석은 처음 있는 시도라고 할 수 있고 위의 확인된 유전자 이외에 많은 유전자들의 발현양에 차이가 있는 것을 확인하였다. 벼 종자로부터 캘러스 형성, 캘러스로부터 재분화까지에는 수많은 유전자가 발현이 조절되면서 관여하는데 본 연구에서 발현양에 뚜렷한 차이가 있는 개개의 유전자 분석은 DNA methylation에 의한 식물 분화 발달 기작 연구에 중요한 역할을 할 것으로 사료된다.</p>