하수처리장의 활성슬러지로부터 생물계면활성제를 생산할 수 있는 미생물 중 유화활성이 가장 우수한 균주를 분류 동정하여, P. aeruginosa EMS1으로 명명하고 실험에 사용하였다. P. aeruginosa EMS1의 절삭유 분해능 확인을 위해 nutrient broth에 \(1\%\) 절삭유를 첨가한 배지를 사용하였으며, 절삭유 분해 최적조건을 검토하기 위하여 질소원, 인산염, 마그네슘, 칼슘 등의 배지성분 및 초기 \( \mathrm{pH}\), 배양온도, 동기량, 종균 접종량 등의 배양조건에 따른 실험을 실시하였고, 생균수 측정법으로 생육도를 조사하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주</h2> <p>하수처리장의 활성슬러지로부터 폐기질(폐식용유, 폐윤활유, 유청, 주정폐액)을 이용하여 생물계면활성제를 생산할 수 있는 미생물들을 분리하였으며, 분리균 중 유화활성이 가장 우수한 균주를 공시균주로 선정하고 이의 배양적, 형태학적, 생화학적 특성 및 16S rDNA sequence를 비교하여 분류 동정한 결과, Pseudomonas aeruginosa로 동정되었다. 따라서 본 실험에 사용된 균주를 P. aeruginosa EMS1으로 명명하고 실험에 사용하였다. 본 균주는 olive oil 등의 식이성 오일, Bunker 오일, crude oil 및 n-hexadecanes 등의 alkane 화합물을 이용하여 생육할 수 있었으며, 다양한 기질로부터 생물계면활성제를 생산할 수 있는 능력을 가지고 있었다.</p> <h2>배지</h2> <p>P. aeruginosa EMS1의 절삭유 분해능 확인을 위해 nutrient broth에 \(1\%\) 절삭유를 첨가한 배지를 사용하였다. P. aeruginosa EMS1에 의한 절삭유 분해최적조건을 조사하기 위하여 사용된 기본 무기염배지의 조성은 \( \mathrm{NH}_{4} \mathrm{NO}_{3} \)\( 0.2 \%\), \(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\) \(0.03 \%\), \(\mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\) \(0.03 \%\), \(\mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \( 0.02 \%\), \(\mathrm{CaCl}_{2} \cdot 2 \mathrm{H}_{2}\mathrm{O}\) \(0.025 \%\)\((\mathrm{pH} 7)\)이었으며, 실험에 따라 적당량의 절삭유를 첨가하였다. 사용 절삭유는 H사의 수용성 절삭유이었다. 수용성 절삭유 원액은 흑갈색을 띄고 있었으나, 원액을 \(1\%\)의 농도로 증류수에 현탁했을 때, 맑은 우유빛을 띄었다.</p> <h2>절삭유 분해 최적조건 검토</h2> <p>절삭유 분해 최적조건을 검토하기 위하여 질소원, 인산염, 마그네슘, 칼슘 등의 배지성분 및 초기 \( \mathrm{pH}\), 배양온도, 동기량, 종균 접종량 등의 배양조건에 따른 실험을 실시하였다. 단, 배지성분 최적화 실험 중 절삭유 농도에 따른 COD제거효과에 대한 실험을 제외하고는 \(1\%\)의 절삭유를 첨가하여 실험하였으며, 배지 \( 50\mathrm{m \ell} \) 가 첨가된 \( 300 \mathrm{m \ell} \) 삼각 플라스크에 전배양액을 접종한 후, \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rpm} \)에서 4일 동안 회전진탕배양하였다. 상기에서 결정된 최적배지에서 COD 제거에 미치는 절삭유 농도의 영향을 알아보기 위해 \(1\)~\(5\)\( \%\)의 절삭유를 첨가하여 균체 생육도와 COD 제거율을 조사하였다.</p> <h2>분석방법</h2> <p>본 균주의 생육도는 생균수 측정법으로 조사하였다. 각 시료를 무균적으로 \( 1\mathrm{m \ell} \) 채취하여 \(9\mathrm{~m}\ell \)의 멸균 증류수에 1개의 petri dish에 15~300개의 colony를 얻을 수 있도록 시료를 희석한 다음, Nutrient agar plate에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24h 배양한 후, 생성된 colony의 수를 측정하였다. 생균수는 \(\mathrm{CFU}/\mathrm{m \ell}\)로 표시하였다. 절삭유의 분해정도는 Stan-dard methods13)에 준하여 COD 감소량을 이용하여 조사하였다. 이때, 세포 자체가 COD 유발물질이 되므로 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 후 COD를 측정하였다. \(1\%\) 절삭유가 함유된 기본배지의 COD는 약 \( 2,800 \mathrm{ppm}\)이었으며, 결과는 relative COD(\(\%\))로 나타내었다.</p>