ELISA를 실시하여 알팔파 형질전환체를 대상으로 재조합 t-PA 및 t-PA 파생 단백질들의 항원력 검증과 발현양의 측정하였다. 측정된 단백질들의 피브린 분해능의 측정은 피브린 플레이트법 (fibrin-plate method)을 이용하였고, 재조합 단백질의 발현 여부 및 분자량의 측정은 t-PA에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 Western blot 분석을 실시 하였다.
<h2>ELISA</h2> <p>PCR 분석으로 확인된 형질전환체 중 그룹별 8-27개의 알팔파 형질전환체를 대상으로 재조합 t-PA 및 t-PA 파생 단백질들의 항원력 검증과 발현양을 측정하고자 ELISA를 실시하였다. 수용성 t-PAELISA 키트(CalBiochem, 독일)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 형질전환체내의 재조합 t-PA 및 t-PA 파생 단백질들의 발현양을 측정하였다. ELISA 키트를 이용하여 PBS-0.5\% Tween 20 로 추출된 시료 \( 1 \mu \mathrm{g} / 100 \mu l \) 와 상온에서 1 시간 반응 후, PBS-0.5\% Tween 20으로 3회 세척 후, HRP (horseradish peroxidase)가 붙어 있는 이차항체를 사용하여 상온에서 2 시간 반응 후, PBS- \( 0.5 \% \) Tween으로 3회 세척 후, \( 100 \mu \mathrm{l} \) 의 TMB (tetramethyl-benzidine)를 처리 후 450\( \mathrm{nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Fibrinolytic activity 분석</h2> <p>알팔파 형질전환체에서 재조합 t-PA 및 t-PA 파생 단백질들의 피브린 분해활성을 측정하고자 피브린 플레이트법 (fibrin-plate method)을 이용하여 재조합 효소들의 피브린 분해능을 측정하였다 (Astrup and Mullertz 1952). 0.8\%의 피브리노겐 (fibrinogen) 용액 \( 40 \mathrm{ml} \) 과 5 units의 트롬빈을 혼합한 후 플레이트에 붓고 30 분간 상온에 방치하여 피브린을 형성시켰다. ELISA 결과 단백질 함량이 높은 형질 전환체 각각13-32개의 알팔퐈 형질전환체를 대상으로 \( \mathrm{PBS}-0.5 \% \)Tween 20 추출물 \( 1 \mu \mathrm{g} \) 을 점적한 후 습도가 높은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 하룻밤 방치한 후 피브린 분해활성을 용해된 부분의 직경으로 표시하였다.</p> <h2>Western blot 분석</h2> <p>발현된 재조합 단백질의 발현 여부 및 분자량을 측정하고자 t-PA에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 Western blot 분석을 실시하였다. 형질전환체 시료 \( 200 \mathrm{mg} \) 에 완충용액 (50 mM Tris-Cl, \( \mathrm{pH} 8.0,100 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 5 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 0.5 \% \) Triton X-100) \( 0.5 \mathrm{ml} \) 을 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 60 분간 방치하여 균질화한 후, \( 13,000 \mathrm{rpm} \) 에서 30 분간 원심분리 하여 상층액을 분리하였다. 분리된 단백질을 Bradford방법으로 정량한 후, \( 50 \mu \mathrm{g} \) 의 단백질을 Western blot 분석에 사용하였다. 1 차 항체로는 t-PA에 대한 polyclonal 항체 (Abcam, 미국)를 사용하여 하롯밤 동안 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하였고, PBS- \( 0.2 \% \) Tween 20 용액으로 5 회 세척한 후, HRP가 붙어 있는 이차 항체 (Pierce, 미국)와 상온에서 2 시간 배양 후 5 회 세척하였으며 마지막으로 ECL (enhanced chemiluminescence) 용액을 이용하여 X-ray 필름에 감광시켜 발현을 확인하였다.</p>