MG-63 세포를 배양하여 석회화를 유도하였다. 세포는 \( 5 \times 10^{4} \mathrm{cells} / \mathrm{ml} \) 농도로 조절되었고, 분화 유도 배지와 추출물이 첨가된 상태에서 14일 동안 배양되었다. alizarin red 용액과 TRAP 염색을 이용하여 세포를 염색하였으며, 염색 후 증류수와 PBS로 세척 후 현미경으로 관찰하였다.
<h2>골 석회화 형성도 측정</h2> <p>배양한 MG-63 세포를 \( 5 \times 10^{4} \mathrm{cells} / \mathrm{ml} \) 로 조정하여 96 웰 플레이트에 배양한 후 석회화 유도를 위해 분화 유도 배지와 추출물을 농도별로 첨가하여 3 일마다 배지를 갈아주며 14 일 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 증류수로 세척한 뒤 고정 용액(citrate 용액 + acetone + formaldehyde)으로 1 시간 고정시켰다. alizarin red 용액은 alizarin red (Sigma Co.)를 증류수에 녹여 \( 40 \mathrm{mM} \) 로 농도를 맞추고 \( \mathrm{pH} \) \( 4.2 \) 로 조정하였다, 고정된 세포에 alizarin red 용액으로 실온에서 10 분간 염색하고 증류수로 5 번 세척한 뒤 \( \mathrm{PBS} \) 를 가하고 15 분간 방치하였다. \( \mathrm{PBS} \) 를 제거한 뒤 현미경으로 석회화 형성 정도를 관찰하고 \( 10 \% \) cetylpyridinium chloride를 첨가한 \( 10 \mathrm{mM} \) sodium phosphate(pH 7.0) 용액을 \( 200 \mu \mathrm{l} / \) well로 첨가하여 15 분간 녹이고 얻은 흡광도를 \( 570 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. 골 석회화 형성 능은 대조군의 흡광도를 기준으로 계산하였다.</p> <h2>파골세포의 배양</h2> <p>쥐의 대식세포에서 유래한 RAW \( 264.7 \) 세포는 서울대학교 한국 세포주 은행(KCLB 40071)에서 분양받았으며 DMEM 배지(Welgene Co.)에 \( 10 \% \) FBS(Hyclone, Co.)와 \( 1 \% \) penicillin 및 streptomycin(GIBCO Co.)을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 \( 2-3 \) 일 마다 계대배양하면서 실험에 사용하였으며 분화 유도를 위해 RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand) \( 50 \mathrm{ng} / \mathrm{ml}, 10 \mu \mathrm{M} \) PD98059를 첨가하여 분화 유도 배지로 사용하였으며, 3 일마다 배지를 교환하였다.</p> <h2>파골세포의 TRAP(tartrate resistant acid phosphatase) 활성과 염색</h2> <p>RAW \( 264.7 \) 세포를 \( 5 \times 10^{4} \) cells \( / \mathrm{ml} \) 로 조정하여 96 웰 플레이트에 분주하여 24 시간 배양하였다. 배지를 제거하고 DMEM 배지에 분화 인자인 RANKL \( 50 \mathrm{ng} / \mathrm{ml}, 10 \mu \mathrm{M} \) PD98059와 시료를 농도별로 처리하여 4 일간 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후 고정 용액(citrate 용액 + acetone + formaldehyde)으로 세포를 고정하였고 기질 용액으로는 \( 1.36 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 4-nitrophenyl phosphate disodium salt, \( 10 \mathrm{mM} \) tartrate를 포함하는 \( 50 \mathrm{mM} \) citrate buffer \( (\mathrm{pH} \mathrm{4.6}) \) 를 제조하여 고정한 세포에 분주하였다. \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 30 분간 반응 후 효소 반응액을 \( 0.1 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} \)로 반응을 중지시키고 ELISA reader로 \( 405 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. TRAP 활성은 시료의 흡광도를 대조군에 대한 백분율로 표시하였다.</p> <p>TRAP 염색은 기질로 \( 50 \mathrm{mM} \) tartrate acid를 포함하는 \( 50 \mathrm{mM} \) sodium acetate buffer에 naphthol AS-BI phosphate (Sigma Co.)를 사용하였고, 염색제로는 fast garnet \( \mathrm{GBC} \) (Sigma Co.) 용액을 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 염색 후 현미경으로 관찰하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>실험 결과는 통계 처리하여 평균치와 표준편차를 계산하였으며, 각 군 간의 유의성 검정은 SPSS 18.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램을 이용하여 분산분석(ANOVA) 법을 실행하였으며, 실험군 간의 유의성은 Duncan의 다중범위 시험법(Duncan's multiple range test)으로 \( p<0.05 \) 수준에서 유의적 차이를 검증하였다.</p>