클러스터로 존재하는 동물세포의 miRNA들이 ply-cistronic하게 전사된다고 알려져있다. 두 곳에 클러스터를 이루며 위치하는 EBV miRNA들도 마찬가지로 전사되는 지 RT-PCR로 조사한 결과, B95-8에서 PCR 생성물이 약 223 dp 확인되었고, 전사체를 증폭할 수 있는 유전자를 사용하여 RT-PCR을 실시한 결과, DNA와 동일한 크기의 전사체가 확인되었다. pre-miRNA 검출을 위해 작은 RNA로 분리하여 사용하였고, pri-miRNA가 검출되지 않았으므로, 작은 RNA로부터 특이 primer로 증폭된 RT-PCR 산물은 pre-miRNA가 증폭된 것이라고 판단된다.
<h2>EBV miRNA들의 polycistronic 한 발현 가능성 조사</h2> <p>클러스터로 존재하는 많은 동물세포의 miRNA들이 poly-cistronic하게 전사된다고 알려겨 있으므로 두 곳에 클러스터를 이루며 위치하는 EBV miRNA들도 poly-cistronic하게 전사가 일어나는지를 RT-PCR로 조사하였다. 먼저 BHRF1 유전자의 3 ' UTR 부분에 위치하는 두 개의 EBV miRNA들인 BHRF1-2와 BHRF1-3 부분을 포함하는 전사체를 중폭할 수 있는 BHRF1-2의 sense primer와 BHRF1-3의 reverse primer를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다. 그 결과 B95-8에서 \(223 \mathrm { ~bp } \)의 기대되는 PCR 생성물이 확인되었다. 더 나아가 BHRF1 유전자의 5 ' UTR 부위에 위치하는 BHRF1-1 EBV miRNA와 3 ' UTR에 위치하는 BHRF1-2 및 BHRF1-3을 모두 포함하는 전사체를 증폭할 수 있는 BHRF1-1의 sense primer와 BHRF1-3의 reverse primer를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다. 그 결과 DNA와 동일한 크기의 전사체가 확인 되었다. BART1과 BART2 EBV miRNA도 poly-cistronic하게 발현되는지 확인하기 위해 BHRF의 miRNA들과 유사한 방법으로 RT-PCR을 실시하였다. B95-8에서 분리된 DNA를 사용한 경우 BART1과 BART2를 포함하는 \(1.6 \mathrm { ~kb } \)의 PCR 생성물이 검출되었으나 RNA를 사용한 RT-PCR에서는 전혀 증폭된 산물이 없었다.</p> <h1>고 찰</h1> <p>EBV 양성 B 세포주인 B95-8과 EBV 음성 세포주인 BJAB을 이용하여 Northern blot을 실시한 결과 기대했던 것처럼 B95-8에서는 최근 보고된 5 가지의 EBV miRNA들이 확인되었기 BJAB에서는 전혀 검출되지 않았다. 일부 EBV miRNA가 2 또는 3 개의 서로 다른 크기에서 검출되는 것은 Dicer에 의한 double stranded RNA 절단의 특성 때문일 것이며 이러한 예는 동물세포 miRNA에서도 그 예를 쉽게 찾아 볼 수 있다. 일반적으로 pri-miRNA는 수백 뉴클레오타이드 이상의 긴 염기서열을 가지므로 EBV의 pri-miRNA를 검출하기 위해서는 B95-8에서 추롤한 total RNA를 사용하였다. 동일한 total RNA를 \( 60 \sim 80 \) 뉴클레오타이드 길이의 pre-miRNA를 검출하니 위해서 사용하면 증폭된 산물이 pri-miRNA에서 유래한 것인지 혹은 일부 mRNA에서 유래한 것인지 구분하기에 어려움이 있다. 따라서 pre-miRNA를 검출하기 위해서는 200 뉴클레오타이드 이하의 작은 RNA 만을 따로 분리하여 사용하였고 이 작은 RNA로 부터는 pri-miRNA가 검출되지 않는 젓을 확인할 수 있었다. 그러므로 200 뉴클레오타이드 이하의 작은 RNA로부터 pre-miRNA 특이적인 primer에 의해 중폭된 RT-PCR 산물은 mRNA나 pri-miRNA 전사체들에서 기인한 것이 아니라 pre-miRNA가 증폭된 것이라고 판단된다.</p>