본 연구에서는 전라남도 나주시의 (주) 영산포 식품에서 구입한 홍어를 완전히 해동하고 여러번 세척한 후, \(4,10,20 ^ {\circ } \mathrm { C }\)에서 각각 습도를 \(60-90 \% \)로 설정하여 16일 동안 발효시킨다. 발효된 홍어는 동결건조하고, 그 후 마쇄하여 일반성분 분석을 실시한다. 분석은 조지방은 Soxhlet법, 조단백질은 micro-Kjeldahl법, 회분은 \(600 ^ {\circ } \mathrm { C }\) 직접회화법으로 수행되며, 시료 액의 \( \mathrm { pH } \) 와 암모니움의 농도는 각각 pH meter와 ammonium electrodes, Phenali법으로 측정한다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>본 실험에 사용된 홍어(Raja kenojei Muller et Henle)는 전라남도 나주시 (주) 영산포 식품에서 냉동 보관한 상태로 실험실로 운반하여서 완전해동한 후 표면을 수돗물로 두 번, 증류수로 한 번 세척하였다. 이를 멸균한 거즈로 표면의 물기를 제거한 다음 \( 4,10,20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 각 각 습도를 \( 60-90 \% \)로 설정하여 최장 16일 동안 발효시켰다. 발효시간은 낮은 온도일수록 발효의 진행이 느리므로, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)는 16일간으로, \( 10 ^ {\circ } \mathrm { C } \)는 8 일간, \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)는 6일간 발효하여 부패취가 나기 전까지 발효 하였다. 열수 추출 시료는 발효기간에 따라 부위별(가식부, 내장, 뇌)로 나누어 마쇄하고(HMF-340,Han-Il, Korea), 시료 \( 1 \mathrm { ~g } \) 당 \( 30 \mathrm { ~mL } \)의 증류수를 넣고 환류냉각기를 부착시킨 후 플라스크에 30분간 \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 3회 반복 추출한 액을 여과지(Whatman No.2)로 여과하고, 여과된 액을 다시 동결 건조하여 홍어 각 부위별 열수 추출물(hot water extracts)로 하였으며, 연골은 (주)영산포식품에서 분말을 직접 가져와 열수추출한 후 실험에 사용하였다.</p> <h2>일반성분 분석</h2> <p>발효된 홍어를 동결건조하여 마쇄한 후 일반성분 분석 을 실시하였다. 일반성분 분석은 A.O.A.C. 방법에 따라 조지방은 Soxhlet법, 조단백질은 micro-Kjeldahl법, 회분은 \( 600 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 직접회화법으로 분석하였다.</p> <h2>\( \mathrm { pH } \) 및 암모니움 농도 측정</h2> <p>온도에 따른 \( \mathrm { pH } \) 및 암모니움 농도의 측정은, 홍어를 발효시키면서 침출되는 액 \( 20 \mathrm { ~mL } \)을 취하여 증류수 \( 180 \mathrm { ~mL } \)로 희석하였다. 시료 액의 \( \mathrm { pH } \) 는 \( \mathrm { pH } \) meter(Model 735P,Isteck INC, Korea)로 측정하였고, 암모니움의 농도는ammonium electrodes(Model 735P, Isteck INC, Korea)와 Phenali법으로 측정하였다.</p> <h2>항균효과 측정</h2> <p>항균성 측정을 위한 홍어 각 부위별 열수 추출물의 최종농도는 \( 0.5 \% \), \(1 \% \), \(2 \% \)가 되도록 각 각NB (Nutrient Broth,Difco Lab, USA)배지에 첨가한 후 멸균 하였고, 항균효과를 관찰하기 위해 E.coli(KCTC No.1039)를 최종농도가 \( 3.6 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { cfu } / \mathrm { mL } \)로 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(120 \mathrm { rpm } \)에서 22시간 동안 shaking water bath에서 배양하면서 미생물의 생육정도를 spectrophotometer(UVS-30NP, Sunil optron, Korea)를 사용하여 2시간 간격으로 흡광도 \( (660 \mathrm { ~nm } ) \)를 측정하였다.</p> <h2>항산화성(수소 공여능)측정</h2> <p>\( \alpha \), \( \alpha ^ {\prime } \)-diphenyl- \( \beta \)-picrylhydrazyl (DPPH) \( 16 \mathrm { mg } \)을 \(100 \mathrm { mL } \) 에탄올에 녹인 후 여기에 \(100 \mathrm { ~mL } \) 증류수를 혼합하여 Whatman filter paper No.2로 여과하였다. 이 여액 \( 5 \mathrm { ~mL } \)에 조제된 시료를 \( 1 \mathrm { ~mL } \) 혼합한 후 \( 528 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도의 감소를 측정하였다. 대조군은 기존의 항산화제로 알려져 있는 BHA(t-buthyl hydroxy anisole, Sigma chemical Co.USA)로서 농도는 \( 0.02 \% \)로 조제하여 비교하였으며 blank는 3차 증류수로 하였다.</p> <h2>항암성 평가</h2> <p>MTT assay를 실시하였다. MTT는 (3-[4,5-dimethyl thiazol]-2,5-Diphenyltetra zolium bromode)으로서 오직 살아있는 세포내의 mitochondria 내에 있는 dehydrogenase enzyme에 의해 불용성의 formazan이 생성되므로, 생존암 세포의 효소활성을 측정하는 방법이다. 암세포로는 HepG2 (Hepatocellular carcinoma, human, ATCC) cell을 96 well에 weIl당 \( 1 \times 10 ^ { 4 } \) cells이 되도록 분주하고 24시간 동안 부착 시켰다. 홍어 각 부위별 열수추출물의 시료를 최종 농도가 \( 125 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \), \(250 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \), \(500 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \), \(1,000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \)이 되도록 medium에 첨가하고 72시간 배양하였다. 여기에 MTT용액 \( 20 \mathrm { ~L } \)를 첨가하고 동 배양조건에서 4시간 더 배양하였다. 4시간 후에 isopropanol \( 150 \mathrm { ~L } \)를 넣어 불용성 formazan을 녹이고 microplate reader(Benchmark, Biorad Co.,Germany), \( 570 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하여 암세포의 사멸성을 다음과 같이 나타내었다.</p> <p>Anticancer activity \( = \) (대조구의 흡광도-시료 처리구의 흡광도/대조구의 훕광도) \( \times 100 \)</p>