중국 광동성에서 2002년 최초로 발생하여 인류의 생존을 위협한 신종 폐렴인 사스의 확산 이후, 2003년에 SARS-Coronavirus가 발견되었다. 이는 숙주 세포 표면에 흡착한 이후 침입하여 대량으로 스스로 증폭되고, 다시 숙주 세포 밖으로 방출되는 방식으로 확산된다. 이 과정에서 바이러스의 복제 및 전사 과정에 주요한 영향을 미치는 효소들이 있는데, 그 중에서 본 논문에서는 SARS-3CL protease의 구조와 기능을 분석하여 이를 저해하는 저해활성 물질 탐색에 필요한 활성형 3CL protease 최적 생산 방법을 고안하고자 했다.
<h1>서 론</h1> <p>사스(Severe acute respiratory syndrome, SARS)는 사람의 신종 폐렴인 중증 급성 호흡기 질환으로 2002년에 중국의 광동성에서 최초로 발생하여 아시아를 중심으로 세계 여러 나라로 급속히 확산되어 인류의 생존을 위협했다. 세계보건기구의 보고에 의하면 2003년 8월까지 약 8500명 이상의 사스 감염자가 발생하였으며 그 중 800명 이상이 사망했다. 그 후,이 질병을 일으키는 원인으로 신종의 RNA 바이러스인 SARS-Coronavirus (SARS-CoV)가 2003년에 발견되었다. SARS-CoV는 나도바이러스목 코로나바이러스과에 속하는 positive-sense, single-stranded RNA 바이러스로 사람이외의 동물의 소화기관 및 호흡기관에서 염증을 일으키는 바이러스가 돌연변이를 일으켜 사람에게 전염된 것으로 감염경로는 동물의 분비물이나 배출물의 접촉에 의한 것으로 밝혀졌다. 원인 바이러스인 SARS-CoV에 노출된 후 2∼7일 정도의 잠복기가 지나면 발열, 무력감, 두통, 근육통 등의 신체 전반에 걸친 증상이 나타난다. 심한 경우에는 증상이 2주이상 지속되며 호흡 기능이 크게 나빠지고 급성 호흡곤란 증후군 및 다기관 부전증으로 진행되어 사망에 이르는 경우도 있다.</p> <p>SARS-CoV가 숙주 세포 표면에 흡착하면 세포 내 전송 및 막 융합 과정을 거쳐 숙주 세포 내부에 침입하게 되며, 침입한 바이러스는 대량으로 복제\( \cdot \)증폭되고, 복제된 바이러스는 다시 숙주 세포 밖으로 방출되어 확산 된다. 이런 SARS-CoV의 복제, 전사 및 단백질 합성 과정은 2개의 복제효소 복합 단백질, pp1a (\(486 \mathrm{kDa}\))와 pp1ab (\(790 \mathrm{kDa}\))에 의해 결정되는데, pp1a와 pp1ab는 불활성형으로 합성된 후 3C-like protease (3CLprotease) 및 papain-like protease (PL2 protease)에 의해 특정 절단부위가 절단됨으로써 여러 가지 활성형 단백질로 전환되어 바이러스의 복제를 개시한다. 따라서, SARS-CoV의 3CL protease와 PL2 protease는 SARS-CoV의 복제, 전사 및 단백질 합성 과정을 조절하는 복제효소 복합체의 프로세싱에 결정적인 역할을 담당하는 효소들이며 이들 효소의 활성을 저해함으로써 바이러스의 복제 및 증식을 차단할 수 있다. 특히 3CL protease의 효소활성을 저해하면 복제효소 복합체의 특정 절단부위 14 곳 중 11곳 이 절단되지 않아활성형 복제효소관련 단백질들이 생산되지 않으며 그 결과, SARS-CoV가 숙주 세포 내부에 침입하여도 세포 내부에서 바이러스의 복제반응이 개시되지 않고 바이러스의 증식이 억제되어 사스의 치료에 크게 효과를 나타낼 수 있다. 이러한 이유로 3CL protease는 사스 치료제 개발의 중요한 표적으로 주목받고 있다. 사스가 출현한 2003년 이후 현재까지 SARS-3CL protease의 저해제 개발을 위해 여러 연구자들이 High-Throughput Screening (HTS) 법을 이용한 compoundlibrary screening법 및 In silico screening법을 이용하여 SARS-3CL protease의 효소활성을 저해하는 다양한 종류의 화합물을 발견하였다. 그러나 신약 후보 물질로 이용할 수 있는 높은 저해활성과 안정성을 가지면서 인체에 안전한 물질은 현재까지 발견되지 않고 있다. SARS-3CL protease의 저해활성물질의 스크리닝 뿐만 아니라 효소활성발현 메커니즘의 명확한 해명은 유사 바이러스성 질환의 치료제 개발을 위해서도 중요하다.</p> <p>본 연구에서는 SARS-3CL protease의 구조 및 기능 상관에 관한 연구 및 저해활성물질 탐색에 필요한 활성형 3CLprotease를 생산하는 최적 방법을 고안하고자 하였다. 다양한 발현계를 작성하여 효소 생산에 최적인 발현 벡타 및 단백질 발현 방법을 검토하였다. 그 결과 pET29a/3CLP 발현 벡타를 이용한 무세포 단백질 합성방법이 SARS-3CL protease의 단백질 발현 및 생산에 최적인 것으로 확인되었다. 또한 발현된 SARS-3CL protease의 정제를 위해 High Q column, Mono P column, 및 Sephacryl S-300 겔 여과법을 이용한 3단계의 간단한 정제방법을 확립하였다.</p>