본 실험에서 고추의 밀양재래 품종을 사용하고 화분에 파종하여 3~4 주 동안 생육시켜 본엽이 2~3매 출연했을 때 생육정도가 비슷한 유묘들을 선별하여 다른 화분에 이식하였으며, 모식물은 온도가 \( 25 / 20^{\circ} \mathrm{C} \) (명/암), 광주기가 \( 16 / 8 \mathrm{~h} \) (명/암)을 유지하여 생육시켰다. 소포자 전처리 시에는 배양접시에 분주하여 parafilm으로 밀봉하였고, 약전처리 시에는 50~180개의 약을 액체상태의 전처리 배지가 들어있는 배양접시에 50~60개 씩 치상하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 재료</h2><p>본 실험에서는 고추 (Capsicum anmuum L.)의 밀양재래 품종을 사용하였다. 전년도에 채종한 종자를 직경 \( 20 \mathrm{~cm} \) 화분에 파종하여 3~4 주 동안 생육시켜 본엽이 2~3매 출연했을 때 생육정도가 비슷한 유묘들을 선별하여 직경이 \( 25 \mathrm{~cm} \) 인 화분에 이식하였으며 매주 파종하여 연중 재료 채취가 가능하도록 하였다. 유묘 이식 시 흙은 시판되고 있는 원예용 상토 (부농원예상토)에 화분 전용 복합비료로 시판되고 있는 파워스톤 (실험식물센터, 질소 \( 10 \% \), 인산 \( 5 \% \), 수용성 가리 \( 10 \% \) )을 1 개의 화분에 \( 8 \mathrm{g} \)씩 섞어 사용하였다.</p><p>모식물은 온도가 \( 25 / 20^{\circ} \mathrm{C} \) (명/암), 광주기가 \( 16 / 8 \mathrm{~h} \) (명/암)인 생장실에서 생육시켰다. 생장실의 광도는 형광등과 메탈렘프를 이용하여 \( 200 \mu \mathrm{mol} \mathrm{m}^{-2} \mathrm{~s}^{-1} \) 가 되도록 하였고, 상대습도는 \( 60 \% \) 로 유지하였다. 식물의 생장을 위해 관수는 1~2일마다 실시하였으며, 수세가 약화되는 것을 막기위해 관수 시 마다 적기가 지난 꽃봉오리를 제거하였다. 모식물은 정식 8주 후부터 12주까지만 사용하였다.</p><p>꽃봉오리는 꽃받침과 꽃잎의 길이가 거의 같은 것을 취하여 약의 \( 2 / 4 \sim 3 / 4 \) 이 보라색으로 착색되어 있는 것을 확인 한 후 사용하였다. 이와 같은 약내에는 배의 발생에 적기로 알려진 후기 1핵성 소포자나 초기 2핵성 화분이 내포되어 있는 것으로 알려져 있다. 꽃봉오리는 실험 직전에 채취하여 \( 2 \% \) sodium hypochlorite 용액으로 10 분간 소독하고, 멸균수로 3 회 수세하였다.</p><h2>소포자의 나출 및 수확</h2><p>소포자 전처리 시 약 30 개의 꽃봉오리를 micro-blender cup (steel waring blender container \( 20 \mathrm{ml} \), Eberbach Corporation, MI, USA)에 넣고 전처리 배지 (소포자 전처리 참고) \( 10 \mathrm{ml} \)을 첨가한 후 10 초씩 2회 blending \( (16,000 \sim 18,000\mathrm{rpm}\))하여 소포자를 나출 시킨 후 \( 50\mathrm{ml} \) centrifuge tube에 모았다. 약 내의 남아있는 소포자를 꺼내기 위해 전처리 배지 \( 10\mathrm{ml} \)을 첨가하여 고속 (약 \( 5,000\mathrm{rpm}) \)에서 15 초씩 2 회 vortexing하였다. 구멍의 크기가 \( 75 \mu \mathrm{m} \)와 \( 35 \mu \mathrm{m} \)인 채를 이용해 크기가 큰 체세포 조직 파편들을 제거한 후 소포자 현탁액을 다시 \( 50 \mathrm{ml} \) centrifuge tube로 옮기고 전처리 배지를 첨가하여 \( 30 \mathrm{ml} \)로 맞춘 후 \( 1,000 \mathrm{rpm} \)에서 5분 동안 원심분리하여 소포자들을 모았다. 상등액을 제거한 후 전처리 배지 \( 30 \mathrm{ml} \)을 첨가하여 vortexing 한 후 \( 1,000 \mathrm{rpm} \)에서 5분간 원심 분리 하였으며, 이와 같은 수세과정을 2회 실시하였다. Blender와 전처리 배지는 \(4^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관되었던 것을 실험 직전에 꺼내 사용하였다. 약전처리 시에는 전처리한 약을 blender cup에 넣고 전처리 배지 \( 4 \mathrm{ml} \)을 첨가한 후 10초씩 2회 blending 하였으며 이후 소포자의 수확 및 수세는 소포자 전처리 시와 동일하게 하였다.</p><h2>전처리</h2><p>소포자 전처리 시에는 소포자 밀도가 \( 1 \mathrm{ml} \)에 약 \( 2 \times 10^{5} \)이 되도록 hemocytometer를 사용하여 조정한 후 \( 90 \times 20 \mathrm{~mm} \) 배양접시에 \( 8 \mathrm{ml} \)씩 분주하여 parafilm으로 밀봉하였다. 약전처리 시에는 30개의 꽃봉오리로부터 꺼낸 150~180개의 약을 액체상태의 전처리 배지 \( 3 \mathrm{ml} \)이 들어있는 \(60 \times 15 \mathrm{~mm} \) 배양접시에 50~60개 씩 치상하였다. 소포자 현탁액이나 약이 들어있는 배양접시는 배지가 증발하는 것을 막기 위해 멸균수로 적신 filter paper가 들어있는 \( 140 \times 20 \mathrm{~mm} \) 배양접시에 넣은 후 다시 parafilm으로 밀봉하였다. 이와 같이 준비된 소포자와 약은 \( 32 \pm 1{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 고온 처리하였으며, 전처리 배지는 \( 0.37 \mathrm{M}\) mannitol + NLNS를 사용하였다.</p><p>전처리 후 배지의 교환 여부가 (소포자 배양 참고) 배의 발생에 미치는 영향을 조사한 실험 에 서는 1~3일 간 고온처리 하였으며 이외의 실험에서는 3일 간 고온처리 하였다. 또 소포자 현탁액의 분주는 \( 60 \times 15 \mathrm{~mm} \) 배양접시 각각에 첨가 시에는 \( 1.5 \mathrm{ml} \) 씩 교환 시에는 \( 3 \mathrm{ml} \) 씩 하였다.</p><p>배양 중 첨가시기를 달리한 새 배지의 첨가가 배의 발생에 미치는 영향을 조사한 실험에서는 소포자 및 약 전처리를 하였으며 이외의 실험에서는 소포자 전처리를 하였다.</p>