Kawamoto 교수로부터 분양받은 Aldh2 (-/-) 마우스를 대상으로 실험을 진행하였다. 마우스의 꼬리 부분에서 genomic DNA를 추출하여 PCR-amplification 방법으로 Aldh2 genotype을 결정하였으며, n-Butanol을 추가한 후 원심분리하여 상층액을 HPLC 방법으로 분석하였다. 이러한 실험과정의 통계분석은 윈도우용 SPSS (Version 12.0)를 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 동물</h2> <p>Aldh2 (-/-) 마우스[13]를 일본의 Kawamoto 교수로부터 분양받아 실험에 사용하였다. 12 주령의 수컷 Aldll2 \( (+/+) \) 및 Aldh2 ( \( -1- \) ) (C57BL/6J strains)를 plastic mouse cages에서 12시간(07:00 19:00)은 밝게, 나거지 12시간(19:00 07:00)은 어두운 상태로 유지시켰으며 배양실의 온도는 \( 23 \sim 25^{\circ} \mathrm{C} \) 를 유 지하였다. 동물실험과 관련된 모든 조작은 미국 보건원이 발간한 '실험동물의 사용과 관리에 관한 규정'에 따라 시행하였다.</p> <h2>Aldh2 genotyping 및 ethanol 투여</h2> <p>마우스 꼬리부분에서 genomic DNA를 추출하여 PCR-amplification 방법으로 Aldh2 genotype을 결정하였다. 각 군에 5 마리씩의 마우스를 배정하여 알코올 투여군에는 \( 20 \% \) ethanol \( (2 \mathrm{~g} / \mathrm{kg} / \) day \( ) \) 을 8주간 매일 1회 경구 투여하였다.</p> <h2>Thiobarbituric acid reactive substances(TBARS) 농도 측정</h2> <p>TBARS 농도는 Ohkawa 등[16]의 방법을 다소 수정하여 사용하였다. 마우스로부터 분리한 뇌조직 \( 0.1 \mathrm{~g} \) 정도를 \( 20 \mathrm{mM} \) Tris-HCl buffer (pH 7.4) \( 1 \mathrm{ml} \) 에 넣어 초음파로 분쇄하고 \( 3,000 \times g, 4 \mathrm{C} \) 에서 15분간 원심분리 한 다음 상층액 50 \( \mu 1 \)를 취하여 \( 0.05 \% \mathrm{BHT} 50 \mu \mathrm{l}, 0.1 \mathrm{~N} \mathrm{HNO} 150\lfloor\mathrm{l}, 42 \mathrm{mM} \) TBA 150 씨를 넣고 30 초간 잘 섞어주었다. \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 동안 방치한 후 5 분간 ice에 방치하였다. n-Butanol 300 \( \mu 1 \) 를 넣고 30 초간 잘 섞어준 후 \( 12,000 \times g \) 에서 5 분간 원심분리하고 상층액 250 μ1를 고압액체크로마토그래피(HPLC) 방법으로 분석 하였다. 한편, 마우스에서 채취한 24 시간 소변 50 씨를 취하여 \( 0.05 \% \) BHT 50 \( \mu 1 \), \( 0.1 \mathrm{~N} \mathrm{HNO}_{3} 150 \) \( \mu 1 \), \( 42 \mathrm{mM} \) TBA 150 \( \mu 1 \) 를 넣고 30 초간 잘 섞어준 다음 조직에서와 동일한 방법으로 분석하였다. HPLC는 Model SP930D 펌프(Young Lin, Anyang, Korea)와 Model SIL-10ADvp 자동시료주입기(Shimadzu, Kyoto, Japan), 그리고 Model SPD-10Avp 자외선 검출기 (Shimadzu), Autochro-3000 Data system (Young Lin) 등으로 구성된 것을 사용하였다. 컬럼은 Tosoh사(Tokyo, Japan)의 TSK gel ODS-80, 4.4×15 mm 역상 컬럼을 이용하였다. 이동상 용액으로는 \( 50 \mathrm{mM} \) potassium monobasic phosphate: acetonitrile : methanol (65:15:20, pH 6.8) 용액을 사용하였으 며, 분당 \( 1 \mathrm{ml} \) 의 속도로 흘려주었다. 자외선 검출기 파장은 \( 532 \mathrm{~nm} \) 를 사용하였다.</p> <h2>통계분석</h2> <p>통계분석은 윈도우용 SPSS (Version 12.0)를 사용하였다. 군간의 TBARS 농도는 Wilcoxon signed rank test와 반복측정분 산분석(repeated measures ANOVA)을 이용하여 분석하였으 며 p-값이 \( 0.05 \) 이하인 경우를 유의한 것으로 판정하였다.</p>