Xenopus laevis를 사용하여 HCG로 산란을 시키고, cystein hydrochloride로 난의 젤리층을 제거하고 Steinberg 생리식염수로 세척한 후 3% agar plate 위에서 stage 9의 난만을 선별해 동물극을 절단하여 분리하고 bFGF와 HGF를 농도별로 조합하여 처리한 뒤 stage 43에 도달할 때까지 20\(^\circ \mathrm{C}\)에서 배양하였다. Bouin's solution에 3시간 고정 후 70%, 90%, 100% ethanol로 탈수하고 hematoxylin-eosin으로 염색하여 관찰하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>Xenopus 초기배의 준비 및 동물극 분리배양</h2> <p>Xenopus laevis는 성적으로 성숙된 암수개체를 사용하였으 며, 산란을 위해 암수 공히 \( 500 \sim 800 \mathrm { IU } \) 씩 HCG (Human Chorionic Gonadotrophin)를 주사하여 수정란을 얻고 3 \% cystein hydrochloride \( ( \mathrm { pH } \) 7.8)로 난의 젤리층을 제거한 뒤 에 멸균된 Steinberg 생리식염수 \( ( \mathrm { pH } 7.4) \) 로 세척하였다. 멸균 된 3 \% agar plate 위에서 발생단계상 stage 9의 난만을 선별 하여 난막을 제거하고 텅스텐 니들로 동물극을 절단하여 분 리한 후 Steinberg 생리식염수에서 정상배가 stage 43에 도달 할 때까지 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양하고 이를 대조구로 하였다. 처리구는 0. 0.5, 1, 10, \( 50 \mathrm { ng } / \mathrm { ml } \) 농도의 \( \mathrm { bFGF } \) (in 0.1 \% \( \mathrm { BSA } \) in Steinberg's solution)와 0, 1, 10,50, \( 100 \mathrm { ng } / \mathrm { ml } \) 농도의 HGF 를 농도별로 조합하여 동물극분리편에 처리한 뒤 역시 정상 배가 stage 43에 이를 때까지 배양하였다. 배양용기는 포면 처리 안 된 멸균제 96-well plate를 사용하였고, 분리편은 농 도 조합 당 20개 정도씩 하였으며 1 well당 1개씩, 대조구 및 처리배양액은 \( 120 \mu l \) 씩 분주하였다[16]. 발생단계는 Nieuw-koop과 Faber를 따랐다.</p> <h2>조직관찰</h2> <p>Stage 43 에 이른 정상배와 대조구 및 처리구의 배양조직 은 Bouin's solution에 3시간 고정 후 70 \%, 90 \%, 100 \% eth-anol로 탈수하고 파라핀에 포매하여 \( 6 \sim 8 \mu \mathrm { m } \) 로 절편한 후 xylene으로 파라핀을 제거하고 \( 100 \%, 90 \%, 70 \%, 50 \% \) eth-anol로 탈수한 다음, hematoxylin-eosin으로 염색하였다. 다시 \( 50 \%, 70 \%, 90 \%, 100 \% \) ethanol 탈수과정을 거친 후 봉입하여 관찰하였다.</p> <h2>조직면역화학법</h2> <p>Stage 43 에 이른 정상배와 대조구 및 처리구의 배양조직을 PLP(poly-lysin-paraformaldehyde) 고정 액으로 2시간 고정한 후 PBS로 세척하고, \( 10 \%, 20 \%, 30 \% \) sucrose에 각 30 분씩 치환하였다. 그리고 \( \mathrm { OCT } \) compound 로 포매하여 \( 10 \mu \mathrm { m } \)두께로 동결절편한 후 실온에서 건조시킨 다시 \( 4 \% \) form-aldehyde solution으로 5분간 조직을 고정하고 \( \mathrm { PBS } \) 로 세척하였다. Blocking solution으로 30 분 처리한 후 단일클론항체40A11, 25F5(일본 동경대 의과학연구소 Hiroshi Sagara로부터 제공받음)를 사용하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 overnight 하고, \( \mathrm { PBS } \) 로 세척한 후 다시 blocking solution으로 처리하고 2 차 antibody<p>로 AP conjugate (Mouse IgG, AP conj.)된 것을 사용하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 overnight 하였다. 다음날 PBS로 세척한 다음 AP re-action kit를 이용하여 발색하였으며, PBS로 세척하고 \( 50 \%, 70 \%, 90 \%, 100 \% \) ethanol과 xylene 탈수과정을 거친 후 봉입하여 현미경 관찰하였다.</p>