본 시험은 초생추 99마리를 대조군과 CS61 배양액 \( 0.1 \% \) 및 \( 1 \% \) 의 3개 군으로 시험사료를 제공하여 일반증상 및 사망률, 체중 및 사료 섭취량 측정, 부검 및 병리소견 관찰, 혈액 및 혈청생화학 검사, 일산화질소 생성억제 시험을 시행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>공시동물 및 사양관리</h2> <p>본 시험에 공시된 시험동물은 농촌진흥청에서 재래토종닭으로 복원한 맛닭 초생추 99마리(1일령, 평균체중 \( 38 \mathrm{~g} \) )를 우슬재 농장(전북 부안)으로부터 구입하여 완전 무작위로 3개 군에 배치하였다. 사양관리는 이전에 시험한 육계사양시험과 같이 온도 21-32 \( \mathrm{C} \), 습도 60-70\%, 명암 12시간 주기(조명: 08:00-20:00) 및 환기가 잘 되는 평사계사에서 육계의 사양방법에 준하여 3개 시험군을 동일하게 하였으며, 사료(육계전기, 대한사료)와 물은 자유급식 시켰다. 본 연구의 동물실험계획서는 전남대학교의 동물실험윤리위원회의 승인을 받았으며, 모든 실험은 전남대학교의 동물실험규정에 따라 수행되었다.</p> <h2>CS61 배양액의 준비</h2> <p>Bacillus subtilis CS61 균주를 MRS 고체 배지(증류수 11 에 universal peptone \( 10 \mathrm{~g} \), meat extract \( 5 \mathrm{~g} \), yeast extract \( 5 \mathrm{~g} \), \( \mathrm{D}(+) \)-glucose \( 20 \mathrm{~g} \), dipotassium hydrogen phosphate \( 2 \mathrm{~g} \), dia-mmonium hydrogen citrate \( 2 \mathrm{~g} \), sodium acetate \( 5 \mathrm{~g} \), magne-sium sulfate \( 0.1 \mathrm{~g} \) 및 manganous sulfate \( 0.05 \mathrm{~g}, \mathrm{pH} \) 6.5)에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 조건으로 배양하였다. 24 시간 배양 후 한 개의 균주 집락을 취하여 Maltose \( 1 \% \), Yeast extract \( 1 \% \) 를 함유한 \( 50 \mathrm{ml} \) 액체배지에서 배양 하였다. 약 24 시간 후 배양한 액체배지는 전배양액과 같은 조성의 배지 \( 250 \mathrm{ml} \) 가 들어있는 21 플라스크에 배지 부피의 \( 2 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 수준으로 접종하고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 180 \mathrm{rpm} \)으로 2-3일간 배양한 배양액을 실험에 사용하였다.</p> <h2>시험군의 구성 및 시험물질 급여</h2> <p>시험군은 대조군과 CS61 배양액 \( 0.1 \% \) 및 \( 1 \% \) 의 3개 군으로 구성하였으며, 각 군당 시험동물은 33수로 하였다. 시험사료는 육계의 성장 시기별로 적절한 종류를 선택하여 대조군에는 기본사료를 급여하였으며, 시험군에는 기본사료에 무게 대비 \( 0.1 \% \) 와 \( 1 \% \) 의 농도로 CS61 배양액을 사료에 첨가한 후 배합기를 이용하여 균질하게 혼합한 후 28일간 자유급여 하였다.</p> <h2>일반증상 및 사망률</h2> <p>시험기간 중 매일 1회 이상 공시동물의 일반증상과 사망동물을 관찰하여 CS61 배양액의 질병예방기능을 평가하였다.</p> <h2>체중 및 사료섭취량 측정</h2> <p>체중은 각 시험군의 전 동물을 대상으로 시험개시일과 2주 및 4주째에 개체별로 측정하여 성장촉진기능을 평가하였다. 시험기간 중 총 급여량에서 잔량을 제하여 마리당 사료섭취량을 측정하였으며, 마리당 사료섭취량과 시험기간 중의 증체량을 이용하여 사료요구율과 사료효율개선기능을 평가하였다.</p> <h2>부검 및 병리소견 관찰</h2> <p>시험물질 투여개시 후 29일째에 \( \mathrm{CO}_{2} \) 로 마취하여 방혈치사시켰다. 안락사시킨 동물을 부검하여 주요 장기의 육안적 병리소견을 관찰하였고, 혈액검사를 수행하여 시험물질의 안전성을 평가하였다.</p> <h2>혈액 및 혈청생화학 검사</h2> <p>CS61 배양액 첨가사료를 28일간 급여한 후 부검 전날 각 군당 10마리를 무작위로 선발하여 하룻밤 동안 절식한 다음 익하정맥에서 채혈하여 헤파린 튜브에 혈액을 수집하였다. 혈액 검사는 Hemavet blood analyzer (Drew Scientific Co. USA)를 이용하여 적혈구(red blood cells)와 혈색소(hemoglobin),적혈구용적(hematocrit), 백혈구(leukocyte), 호중구(neutrophil),단핵구(monocyte), 호산구(eosinophil), 호염기구(basophil) 및 혈소판(platelet)을 측정하였다. 혈청은 채혈된 혈액을 혈청분리관(Iatron Laboratoies, Inc., Japan)에 넣고 15분간 상온에ㅡ방치하였다가 \( 2,800 \mathrm{rpm} \) 으로 10분간 원심분리하여 얻었다. 혈청생화학검사는 혈청생화학 자동분석장치(Dri-chem 4000i ,Fujifilm Co., Japan)를 이용하여 알부민(albumin), 알카리성포스파타제(alkaline phosphatase), 혈중요소질소(blood ureanitrogen), 칼슘(calcium), 콜레스테롤(cholesterol), 크레아티닌(creatinine), 혈당(glucose), 알라닌 아미노전이효소(alanine aminotransferase), 젓산탈수소효소(lactate dehydrogenase),비에스테르화지방산(non-esterified fatty acid) 및 총단백질(total protein) 농도를 측정하였다.</p> <h2>일산화질소(nitric oxide) 생성억제 시험</h2> <p>먼저 CS61 배양액에서 항균 펩타이드를 정제하기 위하여 Bacillus subtilis CS61 균주를 71 발효조를 이용하여 Maltose \( 1 \% \) Yeast extract \( 1 \% \) 의 배지조건으로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} 1 \mathrm{vVm}, 70 \mathrm{rpm} \) 의 조건으로 2-3일간 배양 하였다. 배양액은 원심분리기를 사용하여 균사체와 배양여액으로 분리하였다. 배양여액은 약 41 였으며 \( 60 \% \) 황산암므늘을 사용하여 활성 단백질을 침전시켰다. 활성분획의 충분한 회수를 위해 \( 60 \% \) 황산암므뉴를 처리 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12시간 동안 교반하였으며, 원심분리 \( (6,000 \mathrm{rpm}, 60 \) 분)하여 상등액은 제거하였다. 침전물을 \( 10 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} \) 8.0)로 녹여 아미콘을 사용하여 \( 1 \sim 10 \mathrm{kDa} \) 사이의 분획으로 농축하였고 농축한 분획을 Sepharose CL-6B 컬럼(1.5X100 \( \mathrm{cm} \) )을 이용하여 활성분획을 용출시켰다. 이 활성 분획을 다시 Sephadex G50 \( (1 \times 60 \mathrm{~cm}) \) 컬럼을 이용하여 순수한 펩타이드 (분자량 약 \( 1 \mathrm{kDa} \) )를 얻었다. Raw 264.7 세포를 분주한 96 well plate에 lipopolysaccharide (LPS, \( 1 \mathrm{ug} / athrm{ml}) \) 와 정 제한 CS61 펩타이드를 농도별 \( (0.05-1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 로 처리한 후 12시간 배양하였다. 세포배양액에서 생성된 일산화질스의 양을 측정하기 위해 동량의 Griess 시약(Sigma Chemical Co., MO, USA)을 첨가하여 반응시킨 후 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>통계분석</h2> <p>얻어진 시험결과에 대한 통계분석은 GraphPad InStat v. 3.0 (GraphPad Software, Inc., CA, USA)을 이용하여 일원배치분산분석(one-way analysis of variance)을 실시하였고, 유의차 검정은 Student's \( t \)-test를 이용하여 \( 5 \% \) 및 \( 1 \% \) 에서 검정하였다.</p>