본 실험의 소재인 울릉도 만병초와 운금 만병초는 경기도산림환경연구소에서 받아 공정에 따라 추출하였고, 세포 배양 및 세포 독성 측정에 사용된 fibroblast cell line인 CCD-986Sk는 세포 배양에 사용하였다. 또한 미백 활성,주름 개선 활성측정, 세포 생존율 측정 등을 위해 여러 시약과 기기를 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료 및 시료 추출</h2> <p>본 실험의 소재인 울릉도 만병초와 운금 만병초는 경기도산림환경연구소에서 받아 다음의 공정에 따라 추출하였다. 건조된 시료를 각각 파쇄한 후 10 배의 \( 70 \% \) ethanol을 가하여 실온에서 24 시간 침지하였다. 그 후 침전물과 상등액을 분리하여 반복 추출하였으며 각 시료의 추출물은 여과지(Whatman No.2)를 이용하여 여과하였다. EYELA evaporator을 사용해 감압 농축하여 용매인 ethanol을 완전히 제거한 후 동결 건조를 통해 수분을 제거한 파우더 상태로 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하며 실험의 시료로 사용하였다.</p> <h2>세포주</h2> <p>본 연구에서 세포 배양 및 세포 독성 측정에 사용된 fibroblast cell line인 CCD-986Sk는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)에서 구입하여 사용하였다. Dul-becco's Modified Eagle Medium (DMEM), penicillin/strep-tomycin, fetal bovine serum (FBS), trypsin, phosphate buf-fered saline (PBS) 는 Thermo Fisher Scientific (HyClone \( { }^{\mathrm{TM}} \), USA) 및 GIBCO BRL Co. (Grand Island, USA)에서 구입하여 세포 배양에 사용하였다.</p> <h2>시약 및 기기</h2> <p>미백 활성 측정 시약인 tyrosinase from mushroom, 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) 등은 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 주름개선 활성 측정에 사용된 시약은 elastase from porcine pancreas, collagenase from clostridium histolyticum, \( \mathrm{N} \)-succinyl-L-ala-ala-ala-p-nitroanilide는 Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고 Pz-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-OH tri-fluoroacetate salt는 Bachem Holding AG (Bubendorf, Switzerland)에서 구입하여 사용하였다.</p> <p>세포 생존율 측정 실험에 사용된 시약인 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)는 Sigma-Aldrich Corp. 'St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고 dimethylsulfoxide (DMSO)는 BioShop Inc. (Ontario, Canada)에서 구입하여 사용하였다. 주름 개선 활성에 대한 단백질 발현 측정 실험에 사용된 primary antibody인 \( \beta \)-actin, MMP-1, MMP-2, MMP-3와 secondary antibody로 사용한 anti-mouse 는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, USA)에서 구입하였으며 mRNA 발현 측정 실험에 사용된 primer인 GAPDH, MMP-1, MMP-2, MMP-3는 BIONICS Co. (Seoul, Korea)에서 구입하였고 GoScript \( ^{\mathrm{TM}} \) Reverse Transcription system은 Promega Sorp. (Madison, WI, USA)에서 구입하였다. (-)-Epigallocatechin gallate (EGCG)는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 대조군으로 사용되었다.</p> <p>실험에 사용된 기기는 autoclave (JS Research Inc., Ko-rea), rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan), freeze drier (IlShinBioBase Co., Ltd., Korea), pH meter (Mettler-Toledo AG, Switzerland), vortex (Scientific Industries, Inc., USA), microplate reader (TECAN, Austria), ELISA (Biotek Co., USA), UV/VIS spectrophotometer (Hitachi, Japan), \( \mathrm{CO}_{2} \) in-cubator (Vision Scientific, Korea), centrifuge (Hanil Science Inc., Korea), microcentrifuge (Gyrozen, Korea), digital shaker (Daihan Scientific, Korea), microscope (Olympus, Japan), microvolume spectrometer (Colibri, Germany), Mini Trans-Blot \( ^{\mathbb{8}} \) Cell (Bio-Rad, USA), Mini-PROTEAN \( { }^{\mathbb{8}} \) tetra cell (Bio-Rad, USA), Davinch-Chemi \( { }^{\mathrm{TM}} \) Imager CAS-400SM System (Davinch-K Co., Korea), PCR (ASTEC Co., Japan), UV transilluminator (BioTop, Switzerland)를 사용하였다.</p>