GSH과 GSSG의 함량은 perchloric \( (20 \mu \mathrm { l } / \mathrm { ml } ) \)로 침전시킨 cell lysate를 yeast gluta-thione reductase, 5,5' dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) 그리고 NADPH를 이용하여 흡광도 \( 290 \mathrm { ~nm } \) 하에서 마이크로플레이트리더기로 측정하고 GSSG은 2-vinylpyridine를 사용하여 측정하였다. Lipid peroxidation은 MDA의 함량을 TBARS 방법으로 측정하였다. 한편, U2OS 세포를 분주하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) 세포 배양기에서 배양하였다.
<h2>Glutathione (GSH) 함량 측정</h2> <p>세포 내 전체의 GSH 및 oxidized glutathione (GSSG)은 cell lysate를 perchloric \( (20 \mu \mathrm { l } / \mathrm { ml } ) \)로 침전시킨 후, yeast gluta-thione reductase, 5,5' dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) 그리고 NADPH를 이용하여 흡광도 \( 290 \mathrm { ~nm } \) 하에서 마이크로플레이트리더기로 측정하였다. GSSG은 2-vinylpyridine를 이용하여 GSH와 동일한 방법으로 측정하였다. GSH의 함량은 전체의 GSH 및 GSSH의 값과 GSSG의 차이 값으로 계산하였다.</p> <h2>Lipid peroxidation 측정</h2> <p>세포 내 지질 과산화효소(lipid peroxidation)는 MDA (malondialdehyde)로 대표되는 thiobarbituric acid와 반응하는 TBARS (thiobarbituric acid reactive substances)의 생성 비율을 이용하여 측정하였다. Cell lysate에 대해 0.5 부피의 TCA (trichloroacetic acid, \( 150 \mu \mathrm { g } / \mu \mathrm { l } \))를 첨가하여 \(2,000× \mathrm { g } \)의 속도로 10분간 원심분리하였다. 원심분리된 상등액에 0.5 부피의 thiobarbituric acid \( (0.7 \mu \mathrm { g } / \mu \mathrm { l } ) \)를 혼합하여 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 10분간 반응시켰다. 샘플을 냉각한 후, \( 535 \mathrm { ~nm } \) 하에서 마이크로플레이트리더기로 측정하였다. MDA의 농도는 상수 \( \varepsilon \left (1.56 \times 10 ^ { 5 } \right . \) \( \mathrm { mol } / 1 \cdot \mathrm { cm } \) )를 사용하여 계산하였다.</p> <h2>Western blot 분석</h2> <p>U2OS 세포를 6-well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 6 } \) cells/well 밀도로 세포를 분주하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) 세포 배양기에서 배양하였다. 안정화된 U2OS 세포에 \( \mathrm { CoCl } _ { 2 } \)를 단독 혹은 HDL과 함께 처리하였다. 세포를 ice-cold PBS로 3회 수세 후, lysis buffer (protease inhibitor cocktail tablets (Roche, Germany) 1 tablet/50 \( \mathrm { ~ml } \) TNES buffer (1 M Tris-HCl, pH 7.4, 1 \( \% \) NP-40, 0.5 M EDTA, 5 M \( \mathrm { NaCl } ) \)를 \( 100 \mu \mathrm { l } \)씩 첨가하여 단백질을 추출한 다음 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 12,000 \mathrm { rpm } \)에서 10분간 원심 분리하여 상등액을 모았다. 단백질 정량은 Bio-Rad protein assay system (Bio-Rad Laboratories)을 이용하여 수행되었다. cell lysate (30 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { lane } ) \)를 10 \( \% \) SDS-PAGE로 전기영동 한 후 Immobilon-p-membrane (Millipore, USA)으로 트랜스퍼 시켰다. Membrane은 anti-p53, anti-p21, anti-p27, \( \beta \)-actin 1차 항체(Santa Cruz, CA, USA)와 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 12시간 이상 교반기에서 반응하였다. 1차 항체를 반응시킨 Immobilon-p-membrane을 TBS-T 용액 에 10분간 3회 세척하고, 상온에서 2차 항체 (peroxidase conjugated, goat anti-rab-bit or anti-mouse immunoglobulins, Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL, USA)를 1시간 동안 반응시킨 후 TBS-T 용액에 10분간 3회 세척하였다. 블롯은 ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL, USA)를 사용하여 현상하였다.</p>