본 논문에서는 전처리 후 배지의 교환여부가 배의 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 배의 생산 갯수는 배지 교환 후 늘어났는데, 고온처리 기간이 길어질수록 효과가 크게 나타났다. 배의 상태 역시 배지 교환 후 크기가 컸으며 구형배 뿐만 아니라 심장형배도 발생하였다. 한편, 전처리 배지를 따로 사용하지 않는 Brassica 속 식물들에 대해서도 실험한 결과 배의 발생과 발달이 크게 향상되는 것을 확인하였다. 이러한 개선 효과는 conditioned medium의 소실이나 원심분리에 의한 소포자의 물리적 상해에 의한 영향 보다는 toxin제거 효과가 더 크게 작용하였기 때문이라고 추측된다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>전처리 후 배지의 교환이 배의 생산에 미치는 영향</h2><p>전처리 후 배지의 교환여부가 배의 생산에 미치는 영향을 조사하기 위해 나출소포자를 1~3일간 고온처리한 후 사용한 전처리 배지를 새 배양배지로 교환하거나 배지의 교환 없이 배양배지를 첨가하여 4주 간 배양한 후에 배의 발생 및 발달을 조사하였다. 1개의 배양접시에서 발생한 배의 전체 수는 전처리 기간이 1, 2 및 3일인 경우 모두 첨가의 경우에 비해 교환의 경우에 많았다. 배지의 교환여부가 배의 생산에 미치는 영향은 고온처리 기간에 따라 달랐다. 즉 고온처리 1일의 경우 첨가 시에는 17.3개이었으나 교환 시에는 65.5개로 약 3배 이상 많았으며, 고온처리 2일의 경우 첨가 시에는 7.3개이었으나 교환 시에는 74.3개로 약 10배 이상 많았다. 또 고온처리 3일의 경우 첨가 시에는 6.3개였으나 교환 시에는 136.0개로 약 21배나 많았다. 따라서 배지의 교환 효과는 고온처리 기간이 길어질수록 큰 것으로 나타났다. 배지의 교환 여부에 따라 고온처리 기간에 대한 반응도 달랐는데 1, 2 및 3일 처리 시 1개의 배양접시에서 발생한 배의 수가 첨가의 경우 각각 17.3, 7.3 및 6.3개로 처리 기간이 길어질수록 감소하였으나 교환의 경우에는 각각 65.5, 74.3 및 136.0개로 처리 기간이 길어질수록 크게 증가하였다.</p><p>배의 발달도 배지의 교환 여부에 따라 크게 차이가 나서 배지의 교환 없이 배양배지를 첨가한 경우 colony와 proembryo가 많았으며 발생한 구형배들도 크기가 매우 작아 계수되지 않은 것들이 많았다. 계수한 배들도 크기가 작은 구형배와 2개 이상의 구형배가 붙어있는 ELS가 대부분이었다. 이에 비해 배지를 교환한 경우에는 첨가 시에 비해 배의 크기가 컸으며 구형배 뿐만 아니라 심장형배도 발생하였다. 교환 시 배의 발달은 고온처리 기간이 길어질수록 좋았다. 즉 교환의 경우 고온 전처리 1일에서는 크기가 작은 구형배와 2개 이상의 구형배가 붙어있는 ELS가 대부분 이었으나 고온처리 기간이 길어질수록 배의 크기가 커졌으며 3일 고온처리에서는 크기가 커진 구형배, 심장형배 뿐만 아니라 배축이 신장된 ELS가 발생하였으며 드물기는 하지만 자엽의 발달이 시작된 것들도 있었다. 따라서 전처리가 끝난 후에는 사용한 전처리 배지를 새 배양배지로 교환하여 배양하며, 고온처리는 1일보다는 3일을 하는 것이 소포자 배의 유기 및 발달에 효과적인 것으로 나타났다.</p><p>전처리 배지를 따로 사용하지 않는 Brassica 속 식물들에서는 대부분의 경우 소포자들을 NLN 배양배지에 치상하여 \( 32{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 수일간 고온처리 한 후 배지의 교환없이 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에 옮겨 배양하며, 전처리 시 기아배지를 사용하는 보리나 (Li and Devaux 2003) 밀의 경우에서는 전처리 시 사용한 배지를 배양 배지로 교환한 후 배양한다. 그러나 전처리 배지를 따로 사용하지 않는 Brassica 속 식물들에서도 고온 처리 후의 배지 교환 여부에 따라 배의 발생이 달라지는데 유채의 경우 NLN 배지에 현탁되어 있는 소포자들을 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1일 간 배양한 후 배지를 교환하면 배의 발생과 발달이 크게 향상된다. 실험에 따라 배지 교환 후 전체 배의 수가 감소하는 경우도 있으나 배의 질은 항상 좋아진다. 순무에서도 배지 교환 시 배의 발생이 증가하는데, 배양 3일 후 배지 교환 시 소포자배양에 대한 반응이 높은 품종인 Gry 사용 시에는 2배 증가하며 반응이 낮은 품종인 Stenhaug 사용 시에는 8배나 증가한다. 그러나 이와는 달리 Tronchuda cabbage의 경우 치상 후 1일에서부터 5일까지 시기를 달리하여 배지를 교환한 후 배의 발생을 조사하면 교환 시기와 상관없이 사용한 4품종 중 3품종에서 배의 발생이 감소한다. 또 유채(Brassica napus L.)의 소포자 배양 시 1일간 고온처리 한 후 배지의 교환과 첨가가 배의 발생에 미치는 영향을 비교하면 배의 발생 비율이 첨가 시에는 \( 15.4 \% \)이나 교환 시에는 \( 8.7 \% \)로 크게 감소한다. 이와 같이 고온처리 후 배지의 교환이나 첨가가 배의 발생에 미치는 영향은 식물 종에 따라 또 같은 식물종도 실험이나 품종에 따라 달라진다. 본 연구에서 고온처리 후 배지의 교환과 첨가 효과를 비교한 결과 순무와 유채에서와 같이 배지교환 시에 배의 발생과 발달이 좋았다. 따라서 고추의 소포자 배양 시에는 고온처리 후 사용한 전처리 배지를 새 배양배지로 교환하여 배양하는 것이 배의 생산에 효과적임을 밝힐 수 있었다.</p><p>소포자 배양 시 배지 교환에 의해 배의 발생과 발달이 좋아지는 것은 배양소포들로부터 발생한 독소가 제거되기 때문이며, 배의 발생이 감소하는 것은 conditioned medium이 제거되거나, 배지를 교환하기 위해 원심분리 하는 중 세포가 상해를 받거나, 또는 크기가 커지고 좀 더 잘 부유하게 된 배발생적 소포자들이 원심분리 하는 과정에서 pellet을 생성하지 못하고 소실되기 때문이다. 따라서 본 실험에서 배지의 교환 시 배의 발생이 좋았던 것은 배지 교환에 의한 conditioned medium의 소실이나 원심분리에 의한 소포자의 물리적 상해에 의한 영향 보다는 toxin제거 효과가 더 크게 작용하였기 때문인 것으로 생각된다.</p><p>배의 발생은 배양배지 내 삼투압에 따라서도 달라지는데 밀의 경우 maltose를 \( 9 \% \) 첨가한 배지의 삼투압은 \( 300 \mathrm{mOsmol} \mathrm{kg}{ }^{-1} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)로 배의 발생이 많으나 maltose의 농도가 이보다 낮아 삼투압이 낮은 경우 또는 \( 9 \% \) maltose와 mannitol을 모두 첨가하여 삼투압이 더 높은 경우에는 배의 발생이 크게 감소한다. 보리의 경우에도 배양배지 내 삼투압이 \( 350 \mathrm{mOsmol} \mathrm{kg}{ }^{-1} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)일 때 까지는 배상체가 증가하나 이보다 높아지면 오히려 감소한다. 본 연구에서는 전처리 배지로 \( 0.37 \mathrm{M} \) mannitol + NLNS을 사용하였으며 배양배지는 \( 10 \% \) sucrose가 포함된 NLNS를 사용하였다. 따라서 전처리 후 배지의 교환 없이 배양배지를 첨가하는 경우 배지 내에는 삼투압조절제 \( 0.37 \mathrm{M} \) mannitol과 sucrose가 모두 포함 되게 되고 이로 인해 배지 내 삼투압이 지나치게 높아지게 되었므로 배의 발생이 억제되었던 것으로 생각된다.</p><p>고추의 약배양 시 소포자 배의 발생에 효과적인 전처리는 고온처리이며, 소포자 배양 시에도 나출 소포자를 \( 31 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일간 고온처리 함으로서 다수의 배를 획득하는데 성공하였다. 또 \( 32^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1~6일간 약을 전처리 한 후 소포자를 나출하여 배양하면 고온처리 기간이 길어질수록 배의 발달이 좋다. 따라서 본 연구에서도 처리기간을 1~3일로 달리 하여 고온처리를 하였으며, 고온처리 후 배지를 교환하여 배양한 결과 고온처리 기간이 길어질수록 배의 발생과 발달이 크게 향상되었다. 이와 같이 고추의 소포자배양 시 배의 발생과 발달은 전처리 기간에 따라서도 크게 영향을 받으므로 다수의 정상배를 생산하는 배양 시스템을 확립하기 위해서는 배의 생산에 적합한 고온전처리 기간을 밝힐 수 있는 연구가 이루어져야 할 것으로 생각된다.</p>