나노에멀젼의 경표피 투과 실험은 암컷 쥐에서 적출한 피부의 피하지방과 조직을 제거하여 Franz diffusion cell을 이용하여 진행하였다. KCCM에서 분양받은 피부상재균을 이용하여 항균활성 측정은 disc diffusion assay로 측정하였으며, 각 균주에 따라 배지 및 배양온도와 시간을 달리하여 사용하였다.
<h2>Franz Diffusion Cell을 이용한 나노에멀젼의 경표피 투과 실험</h2><p>Franz diffusion cell을 이용하여 피부 투과 실험을 진행하였다. 피부 투과 실험에 사용한 쥐의 피부는 경추탈골로 치사시킨 ICR outbred albino mice (8주령, 암컷)의 등에서 적출하여 사용하였다. 적출한 피부는 피하지방과 조직을 제거한 후 사용하였다. Receptor chamber에 receptor phase (HCO-60:Ethanol:PBS=2:20:78 (w/w/w %)) \(5\ \mathrm{ml} \)를 채운 후 각질층이 위로 향하도록 donor와 receptor phase 사이에 피부를 고정시켰다. 실험이 진행되는 동안 항온수조를 이용해 온도를 \( 37 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지하였다. 각 시료 \( 0.2 \mathrm{ml} \)를 donor를 통하여 피부 표면에 가한 후 시간에 따라 매 회 \( 0.5\ \mathrm{ml} \)의 receptor phase를 sampling port를 통하여 채취하였다. 채취 직후 동량의 receptor phase를 receptor chamber에 보충하였다. 채취한 시료 속 담쟁이덩굴 줄기 추출물의 양은 최대 흡수 파장\( (280 \mathrm{~nm})\)에서의 흡광도를 이용하여 정량하였다. 24 h 후 각질층과 피부에 남아있는 담쟁이덩굴 줄기 추출물의 양을 측정하기 위해 쥐의 피부를 PBS로 3회에 걸쳐 세척하였다. 세척 후 receptor phase와 닿지 않은 부분을 잘라내고 남은 부분에 대해 tape stripping 법을 이용해 각질층에 남아있는 담쟁이덩굴 줄기 추출물의 양을 따로 측정하였다. 각질층에 남아있는 담쟁이덩굴 줄기 추출물의 양을 측정하기 위해 테이프를 이용하여 피부의 각질층 부분을 3회 벗겨내었으며 이렇게 얻어진 테이프에 \( 10\ \mathrm{ml} \)의 에탄올을 넣고 1 h 동안 초음파 세척기를 이용하여 담쟁이덩굴 줄기 추출물을 추출하였다. 그 후 회전 증발기를 이용하여 에탄올을 증발시키고 추출된 담쟁이덩굴 줄기 추출물을 \( 0.5\ \mathrm{ml} \)의 receptor phase에 녹여내었다. Tape stripping법을 거친 후 각질층이 제거 된 피부는 수술용 가위를 이용해 세절하였고 세절한 피부의 처리는 Tape와 동일하게 진행하였다. 이렇게 얻어진 시료 속 담쟁이덩굴 줄기 추출물의 양은 흡광도를 이용하여 측정하였다.</p><h2>담쟁이덩굴 줄기 추출물의 항균활성 측정</h2><h3>사용균주</h3><p>본 실험에 사용된 균주는 피부상재균으로서 여드름의 원인균인 P. acnes ATCC6919와 비듬균인 P. ovale ATCC12078, 호기성 Gram (+) 균주인 S. aureus ATCC6538, B. subtilis ATCC19659, 호기성 Gram (-) 균주인 E. coli ATCC23736를 한국 미생물 보존센터(KCCM)에서 분양받아 사용하였다.</p><h3>배지 및 배양조건</h3><p>P. acnes의 배양 배지는 Reinforced clostridial (RC) 배지(Merck, Germany)를 사용하였으며 P. acnes는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하면서 실험 72시간 전에 활성화 시켰으며, 균을 배양 배지에 접종한 후 anaerobic jar에서 Gaspack system (Merck Anaerocult \( { }^{\circledR} \) Gaspack system, Germany)을 사용하여 밀봉하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 72시간 동안 혐기성 배양하였다. 호기성 Gram (+) 균주인 S. aureus, B. subtilis와 Gram (-) 균주인 E. coli는 Mueller-Hinton 배지 (Merck, Germany)를 사용하였으며 균을 접종한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 24시간 배양하였다. 또한 비듬균인 P. ovale는 Pityrosporum 배지(Malt extract agar \( 6 \% \), ox-bile \( 2 \% \), tween \( 40\ 1 \% \), glycerol mono-oleate \( 0.25 \% \) )를 사용하였으며 균을 접종한 뒤 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 배양하여 사용하였다.</p><h3>Disc Diffusion Assay에 의한 항균활성 측정</h3><p>각 추출물의 항균활성은 각 균주를 대상으로 disc diffusion assay로 측정하였다. 배양된 균주는 \( 1 \times 10^{7}\ \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \)으로 조절한 후 본 실험에 사용하였다. 평판배지에 배양된 각 균주를 멸균 면봉을 이용하여 \( 100 \mathrm{~L} \)씩 도말하여 준비하였고, 시료를 disc당 \( 0.5,2.5\ \mathrm{mg} \)이 되도록 paper disc (diamerter \( 8 \mathrm{~mm} \), Roshi kaisha. Ltd., Tokyo, Japan)에 천천히 흡수시킨 뒤, 건조과정을 거쳐 용매를 휘발시켰다. 각각의 시료가 흡수된 paper disc를 도말한 평판배지 위에 밀착시킨 상태로 배양한 후 disc 주변에 생성된 저해환(clear zone, mm)을 측정하여 항균활성을 비교하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 \( 5 \% \) 유의수준에서 Student's t-test를 행하였다.</p>