본 실험에서는 세포를 특정 농도의 trypan blue 염료를 사용하여 광학현미경으로 살아있는 세포수를 카운팅하는 방법으로 세포 생존률을 측정하였다. agarose gel에서 전기영동 시켰으며, DNA 분자량 측정을 위해서 Boehringer Mannheim을 marker로 사용하였다. 세포주의 밀도를 조정하고, 특정 비율의 균을 접종시킨 후 배지에서 배양액을 채취하여 섭씨 영하 70도에 보관한다. 검체가 적정량이 모인 이후 ELISA 방법으로 정량분석을 진행하였다.
<h2>세포주의 균 감염</h2><p>RPMI 1640 배지(Sigma)에 sodium bicarbornate(\( 0.2 \% \))와 우태아 혈청(\( 10 \% \))를 첨가한 것을 Jurkat 세포주 배양을 위한 완전배지로 사용하였다. 균은 \( 2500 \mathrm{rpm} \) 으로 20분간 원심하고 침사를 우태아 혈청이 들어있지 않은 RPML-1640배지로 2회 세척하여 \( 2 \times 10^{6} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \)이 되게 농도를 맞춘 다음 Jurkat 세포주에 접종하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건하에서 배양하였다.</p><h2>Cell viabulity</h2><p>세포를 \( 0.25 \% \) 의 trypan blue (Sigma)로 염색하고 5분간 방치한 다음 hemocytometer를 이용하여 광학현미경으로 살아있는 세포수를 세었다.</p><h2>DNA fragmentation 확인을 위한 DNA추출 및 전기 영동</h2><p>Jurkat 세포주를 원심하여 회수하고 침사는 \( 2.5 \mathrm{ml} \)의 NET (\( 150 \mathrm{mM} \mathrm{~NaCl}\), \(1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 50 \mathrm{mM} \) Tris \( \cdot \) HCl[\(\mathrm{pH} 7.5\)]) 완충액으로 현탁시킨 다음 proteinase K와 SDS를 각각 \(200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 및 \( 1 \% \) 되도록 첨가하여 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 수조에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 포화된 \( \mathrm{NaCl} \)을 \( 675 \mu \mathrm{l} \) 넣고 15초 동안 진탕 한 후 \( 8000 \mathrm{rpm} \)으로 20분간 원심하여 상청액을 따로 모았다. Tris 완층액으로 포화시킨 phenol을 \( 2.5 \mathrm{ml} \) 넣고 1시간동안 흔들어서 잘 섞이게 하고 \( 3000 \mathrm{rpm} \)으로 20분간 원심분리한 다음 상층액에 \( 2.5 \mathrm{ml} \)의 phenol-chloroform-isoamyl alcohol 25:24:1로 15분간 재처리하였다. 상층액에 2배 용량의 냉 ethanol을 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤 동안 방치하여 DNA를 침전시키고 \( 14,000 \mathrm{rpm} \)으로 원심하여 침사를 모아 TE 완충액에 녹였다. \( 260 \mathrm{~nm} \)와 \( 280 \mathrm{~nm} \)에서 \( \mathrm{OD} \) 값이 1.7 이상인 시료만을 RNase로 1시간 처리하여 전기 영동 완충액과 잘 섞어 ethidium bromide가 첨가된 \( 2 \% \) agarose gel에서 1시간 동안 전기 영동하였다. DNA 분자량 측정을 위한 marker로는 DNA molecular weight marker VIII (Boehringer Mannheim)를 사용하였다.</p><h2>Cytokine의 정량적 분석</h2><p>Jurkat 세포주를 well당 \( 2 \times 10^{6} \) cell이 되게 맞추고 균(bacterium/cell ratio of 500:1)을 접종하였다. 세포 배양 배지에서 정해진 시간에 배양액을 채취하여 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다가 적정량의 검체가 모이면 ELISA 방법으로 정량적 분석을 실시하였다. 사람 cytokine에 대한 항체를 96 well plate에 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하루밤 동안 부착하고 PBS-T로 2회 세척한 후 \( 3 \% \) BSA를 포함한 PBS로 실온에서 2시간동안 blocking하였다. 정량적 측정을 위해 정해진 농도로 2배 계단 희석한 standard cytokine이나 검체를 각 well에 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 씩 넣고 실온에서 4시간 반응시킨 다음 PBS-T로 4회 세척하였다. Biotin이 부착된 2차 항체를 각 well에 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 씩 넣고 실온에서 1시간 반응시킨 다음, streptavidin-HRP를 첨가하여 1시간 반응 시킨 후 PBS-T로 5회 세척하였다. 여기에 TMB (1,1' trimethylene-bis(4-formylpiridinium bromide) dioxime)를 넣어 어두운 곳에서 30분간 반응시키고 \( 0.15 \mathrm{M} \mathrm{~H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 를 첨가하여 반응을 정지시킨 후 spectrophotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하고, 표준곡선을 이용하여 생산된 cytokine의 양을 산출하였다.</p>