이 연구에서는, 완충액 A로 세척한 세포를 단백질 분해효소 억제제와 함께 세포용해 완충액에 노출시켜 10분 동안 방치하였다. 그 후, 전기영동을 이용하여 겔의 단백질을 nitrocellulose membrane으로 전이시켰으며, 이 membrane을 완충액에 2시간 동안 처리하고, 1차 항체를 하룻밤 동안 반응시켰다. 통계적 유의성은 Student's t-test를 이용하여 검정하였으며, \(p\) 값이 0.05 이하일 경우 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
<h2>Western blotting</h2> <p>배양한 세포 \( \left (2 \times 10 ^ { 7 } \right ) \)를 완충액 A로 세척한 다음 단백질 분해효소 억제제와 \( 50 \mathrm { mM } \), NaF 및 \( 2.5 \mathrm { mM } \, \mathrm { Na } _ { 3 } \mathrm { VO } _ { 4 } \)가 첨가된 세포용해 완충액 \( (1 \% \) Triton X-100, \( 50 \mathrm { mM } \, \mathrm { NaCl } \) 및 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } \), \( \mathrm { pH } 7.4 \))을 이용하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 하에서 10분간 동안 방치하였다. 파괴된 세포를 함유하는 용액을 Eppendorf microcentrifuge를 이용하여 \( 16,000 \times \mathrm { g } \)로 10분간 원심분리하여 핵 분획 및 파괴되지 않은 세포 등을 침전시키고 상층액을 얻어서 단백질 양을 측정한 다음 전기영동에 이용하였다. 약물을 처리한 호중구는 \( 2.5 \% \) mercaptoethanol과 \( 1.2 \% \) sodium dodecyl sulfate를 넣고 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 가열하여 처리한 다음 \( 15 \% \) polyacrylamide 겔에 얹고 전기영동을 시행하였다. Western blot법은 p38 MAPK의 인산화형인 p-p 38 MAPK에 대한 항체나 RhoA에 대한 항체(Santa Cruz, USA)를 이용하여 측정하였다. 전기영동 후겔의 단백질을 nitrocellulose membrane으로 전이시키고 처리한 membrane을 \( 10 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } \), \(0.15 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } \), 및 \( 0.1 \% \) sodium azide로 구성된 완충액에 \( 5 \% \) skim milk을 포함하는 용액으로 2시간 처리하며 1차 항체는 \( 1: 1000 \)으로 희석하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 2차 항체를 실온에서 1시간 반응시키고 세척하였다. 다시 Triton X-100이 들어있지 않는 Tris 용액으로 세척하고 ECL chemiluminescence(Amersham)나 nitroblue tetrazolium과 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate 발색 방법으로 전개시켰다.</p> <h2>통계 처리</h2> <p>세포사멸의 결과는 평균 \( \pm \) 표준편차 mean \( \pm \) SD로 나타내었다. 통계학적 유의성은 자료들의 분포를 확인하고 Student's t-test를 이용하여 검정하였고 \(p \)값이 0.05 이하이면 유의성이 있는 것으로 판정하였다.</p>