Southern blot 분석 결과 CTVL2, CTVL4, CTVL6 line에서 \( 4.4 \mathrm { ~kb } \) 밴드가 나타나지 않았고, \( 6.0 \mathrm { ~kb } \) 와 \( 1.4 \mathrm { ~kb } \) band가 검출되어 laccase 유전자 도입이 엽록체 genome에 발생하였음을 확인할 수 있었다. 그러나 PCR 분석과 종합해서 결과를 해석했을 때 유전자 도입이 정상적으로 이루어지지 않는 것으로 생각된다. Northern blot 분석 결과, CTVL4 line에서는 밴드가 검출되지 않았다. 또한 western blot 분석 수행결과, 여러 비특이 밴드가 검출되는 것으로 보아 항체에 문제가 있는것으로 확인되어 새로운 항체를 제작하고 있다.
<p>Southern blot 분석 결과 크기가 서로 다른 두 개의 밴드가 검출 되었는데, 이것은 laccase 유전자의 내부에 1 개의 BglⅡ 제한효소 site가 존재하기 때문이며, 대조구로 사용된 wild-type 식물체에서의 결과와 비교하여 homoplasmy 정도를 확인 할 수 있었다. 즉, CTVL2, CTVL4, CTVL6의 세 line 모두 wild-type에서 나타난 \( 4.4 \mathrm { ~kb } \)의 밴드가 나타나지 않은 결과로부터 homoplasmy 상태를 확인할 수 있었고, CTVL2와 CTVL6 line에서는 \( 6.0 \mathrm { ~kb } \) 와 \( 1.4 \mathrm { ~kb } \) band가 검출되어, laccase 유전자를 포함한 형질전환 vector의 도입부분이 엽록체 genome에도입되었음을 확인할 수 있었다. 그러나 CTVL4 line은 다른 크기의 밴드가 검출되었고, PCR 분석결과와 종합해볼 때, laccase 유전자 도입이 정상적으로 이루어지지 않은 것으로 사료된다 (Figure 4).</p> <h2>Northern blot 분석</h2> <p>PCR 분석과 Southern blot 분석을 통하여 laccase 유전자를 포함한 목표 유전자의 엽록체 genome으로의 도입과 homoplasmy 정도를 확인한 후, 도입된 유전자의 발현 정도를 확인하기 위해서 northern blot을 수행하였다. PCR 분석과 Southern blot분석에 사용된 식물체의 잎에서 total RNA를 추출하여 northernblot 분석에 이용하였고, laccase 유전자의 일부 sequence로 이루어진 primer로 laccase 유전자를 PCR 증폭하여 방사선동위원소로 labeling 한 후 probe로 이용하였다.</p> <p>Northern blot 분석 결과 CTVL2와 CTVL6 line에서 2개의 밴드가 확인되었고, PCR 분석과 Southern blot 분석에서 유전자의 도입이 불확실하게 나타난 CTVL4 line에서는 밴드가 검출되지 않았다 (Figure 5). Northern blot 분석결과에서 여러 개의 밴드가 검출된 것은, 도입한 trn I 부위의 upstream부분에 담배 엽록체의 16S rRNA promoter가 존재하고, 이 부위에서부터 개시된 전사물 (transcripts)과 도입유전자의 rrn promoter 부위에서부터 개시된 전사물이 존재하는 공전사 (co-transcription or read-through transcripts)가 일어나기 때문인 것으로 사료된다 (Alicia et al. 2003).</p> <p>본 연구에서는 엽록체 형질전환 벡터를 제작하여 laccase 유전자를 담배 엽록체의 genome에 도입하였고, PCR 분석과 Southern blot 분석, northern blot 분석을 통하여 도입 여부와 발현 여부를 확인하였다. 그 결과 두 개의 line을 확보하였는데, 이들 line에서의 laccase 단백질의 생산을 확인하기 위해서 western blot 분석을 수행하였으나, 다수의 비특이 밴드가 검출되었다 (data 미제시). Wild-type에서도 다수의 밴드가 검출되는 것으로 보아 목표 단백질 검출을 위해 제작한 laccase 항체에 문제가 있는 것으로 사료된다. 현재 새로운 항체의 제작을 진행 중에 있다.</p>