세척이 끝난 plug를 1mM 두께로 절단한 후 SfiI, NotI 제한효소를 사용하여 50\(^\circ \mathrm{C}\) 25시간, 37\(^\circ \mathrm{C}\) 15시간 반응을 시행한 후 TE buffer로 교체하고 1% Seakem gold agarose gel에 을려놓았다. 이후 CHEF Mapper PFGE로 0.5xTBE buffer로 Sfil 2.2s/35.1s, Notl 5.0s/100s 6 Volt/cm (200V), 14\(^\circ \mathrm{C}\), 25시간 실시하여 ethdium bromide \( (0.5 \mu \mathrm { g } / ml) \) 에서 30 분간 염색하였으며 Molecular Analyst Fingerprinting Software로 dendrogram을 작성하여 비교 분석하였다.
<h2>Restriction enzyme 처리</h2> <p>세척이 끝난 plug를 1mM 두께로 절단한 후 1.5ml micro-centritube에 옮겨 제한효소 SfiI과 NotI(NEB, England) 각각의 반응혼합액(10x restriction enzyme buffer \( 10 \mu \mathrm { l } \), 100xBSA \( 1 \mu \mathrm { l } , \), Sfil 3 unit, Notl 3 unit, 멸균증류수로 최종 부피를 맞춤) \( 100 \mu \mathrm { l } \) 를 첨가하여 SfiI은 50℃ 에서 25 시간, NotI은 37℃ 15 시간 반응을 시켰다. 반응이 끝나면 바로 반응혼합액을 제거하고 TE buffer로 교체한 다음 PFGE를 실시하거나, 4℃에서 보관하였다.</p> <h2>Gel Running</h2> <p>제한효소 처리가 끝난 plug를 gel commb에 을려놓고 물기를 제거한 다은 틀에 넣어 고정한 후1% Seakem gold agarose를 부어 굳혔다. agarose solution을 조금 남겨서 50℃ 항온 수조에 보관하였다가, gel이 굳으면 comb를 제거하고 이 때 생긴 빈 well에 남겨 두었던 agarose solution으로 채웠다. 이렇게 만들어진 gel은 CHEF Mapper PFGE (Bio-Rad, USA)를 사용하여 0.5xTBE buffer로 Sfil일 경우 initial sec. 2.2s, second sec. 35.1s, 6 Volt/cm (200V), 14℃, 25시간 실시하였으며, Notl일 경우 initial sec. 5.0s, second sec. 100s, 6 Volt/cm (200V), 14℃, 25시간 실시하였다. 전기영동이 끝난 후 ethdium bromide \( (0.5 \mu \mathrm { g } / ml) \) 에서 30 분간 염색하고 증류수로 30분씩 2회 탈색하여 Image Visualizer (Vilber Lourmat, France)로 관찰하였다.</p> <h2>PFGE 결과 분석</h2> <p>PFGE 결과는 Molecular Analyst Fingerprinting Software (Bio-Rad, USA)의 dice coefficient를 기초로 dendrogram을 작성하여 비교 분석하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>PFGE 결과</h2> <p>2001년부터 2003년까지 부산지역의 냉각탑수에서 분리하여 레지오넬라균으로 동정된 95균 중에서 혈청학적으로 L. pneumophila serogroup 1로 확인된 39주와 표준균주 L. pneu-mophila ATCC 33152에 대하여 PFGE를 실시하였다. 제한효소 SfiI 처리한 경우 DNA 가 9~12개의 절편으로 절단되었으며 (Fig. 1), 제한효소 NotI 처리한 경우 DNA가 3~8개의 절편으로 절단되어(Fig. 2), Lee 등이 국내에서 분리한 레지오넬라균 99개 균주에 대한 PFGE 패턴 분류와 유사한 결과를 보였으며, 레지오넬라균의 PFGE 패턴 분석에는 NotI 을 사용하는 것보다 Sfil 을 사용하는 것이 세분화된 분류를 하기에는 더 변별력이 있을 것으로 사료되었다.</p> <h2>PFGE 패턴 분석</h2> <p>Fig. 3과 Fig. 4는 pulg를 Sfil과 NotI으로 각각 처리한 후 실시한 PFGE 결과률 clustering 한 것이다. 제한효소 Sfil 처리에 의한 PFGE 양상은 dice coefficient<65%의 유사성을 가진 band를 A J로 10개의 pulsotype으로 나누었고, 다시 dice coefficient >84% 의 유사성을 가진 band를 기준으로 A는 A1~A3, C는 C1~C3, E는 E1~E4, F는 F1~F3의 subtype으로 각각 분류하였다. 제한효소 NotI 처리에 의한 PFGE 양상은 dice coefficient<60%의 유사성을 가진 band를 a~h로 8 개의 pulsotype으로 나누었고, 다시 dice coefficient 100%의 유사성 을 가진 band를 기준으로 a는 a1~a4, d는 d1~d3, e는 e1~e4 의 subtype으로 각각 분류하였다.</p>