본 연구에서는 유산균 발효 전후의 흰목이버섯 추출물이 3T3-L1 세포에 미치는 영향을 분석하였다. 세포 독성 평가는 세포에 의해 생성되는 formazan을 측정하는 MTT assay를 사용하였으며, 세포 생존율은 처리하지 않은 3T3-L1 전지방세포를 대조군으로 설정하여 계산하였다. 다음으로, 지방분화유도 단백질의 활성을 확인하기 위해 세포를 cold PBS로 세척하고 protease inhibitor cocktail과 phosphatase inhibitor cocktail을 첨가한 RIPA buffer를 넣어 5분 간격으로 voltex한 후 얼음에 30분간 방치하였다. 그 후, enhanced chemiluminoesence (ECL) solution을 처리하여 chemidoc를 이용하여 특정 단백질의 발현 양을 분석하였다. 모든 실험은 3회 반복하였으며, 결과 값은 평균과 표준편차로 표시하였다. 이러한 접근을 통해 유산균 발효에 의한 흰목이버섯 추출물의 효과에 대한 깊이 있는 이해를 얻을 수 있었다.
<h2>지방세포 분화 유도 및 시료 처리</h2> <p>6-well plate의 well 당 \( 1.2 \times 10^{6} \) 개의 3T3-L1 세포를 \( 10 \% \mathrm{BCS} \)가 첨가된 DMEM 배지에 분주, 배양한 후 \( 100 \% \) confluent 한 상태에서 MDI \( (0.25 \mu \mathrm{M} \) dexamethasone (Sigma-Aldrich Co.), \( 0.5 \mathrm{mM} \) 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX, Sigma-Aldrich Co.), \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 insulin (Welgene Inc.)을 포함한 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS, Gibco)가 첨가된 지방분화유도 DMEM 배지로 변경 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 72시간 동안 배양하였다. 그 후, 동일 농도 \( (10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)의 insulin을 첨가한 \( 10 \% \mathrm{FBS} \)를 포함한 DMEM 배지로 48시간 간격으로 변경하였다. 시료 추출물은 \( 100,250,500 \), \( 1000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 지방유도 배지 변경 시 동시에 처리하였다.</p> <h2>세포독성평가</h2> <p>유산균 발효 전과 발효 후 흰목이버섯 추출물의 3T3-L1 세포에 대한 독성 평가는 세포에 의해 생성되는 formazan 측정을 통한 tetrazolium bromide salt (MTT) assay를 이용하여 진행하였다. 24 well plate에 3T3-L1 전지방세포를 well 당 \( 0.5 \times 10^{5} \)개씩 분주하고, confluent 된 상태에서 \( 400,500,600,700,800,900,1000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도의 흰목이 버섯 추출물을 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 24시간 동안 처리 하였다. 24시간 후, 흰목이버섯 추출물이 포함된 배지를 완전히 제거하고 phosphate-buffered saline (PBS)에 \( 5 \mathrm{mg} \) / \( \mathrm{ml} \)의 농도로 용해된 MTT 시약을 Serum-free 배지에 농도 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)로 희석하여 처리한 후, 4시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 배지를 완전히 제거하고 \( 200 \mu \mathrm{l} \) 의 DMSO를 첨가하여 살아있는 3T3-L1 세포에서 생성된 formazan을 용해시켰다. 용해된 formazan은 96-well plate에 각 well 당 \( 90 \mu 1 \)씩 넣어 microplate reader를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율(\% of Control)은 흰목이버섯 추출물을 처리하지 않은 3T3-L1 전지방세포를 대조군으로 하여 계산하였다.</p> <p>Cell viability \( (\%) \) =\[\mathrm{OD}_{540 \mathrm{~nm}}\left(\text { sample) } / \mathrm{OD}_{540 \mathrm{~nm}}(\text { control }) \times 100\right.\]</p> <h2>Oil-red-O 염색</h2> <p>지방세포로의 분화 후, 세포 내 지방구 생성 확인은 Oil red \( \mathrm{O} \) 염색을 통해 실시하였다. 세포를 배양한 배지를 완전히 제거하고 phosphate-buffered saline (PBS)로 세척한 후 \( 4 \% \) formalin으로 10분간 세포를 고정하였다. 고정 후, deionized water로 세척하고 Oil red \( \mathrm{O} \)를 넣어 실온에서 30분간 염색한 후 염색액을 제거하고 deionized water로 3회 세척하여 염색된 지방구를 microscopic image (Olympus, Japan)로 관찰하였다. 그 후, \( 100 \% \) isopropyl alcohole를 가하여 염색된 지방을 추출하고 microplate reader를 이용하여 \( 510 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 정량 분석하였다.</p> <h2>Western blot</h2> <p>지방분화유도 단백질의 활성을 확인하기 위하여 cold PBS로 세척 후 수거한 세포에 protease inhibitor cocktail (Roche, Swizerland)과 phosphatase inhibitor cocktail (Roche)을 첨가한 RIPA buffer ( \( 150 \mathrm{mM} \) sodium chloride, \( 1 \% \) Triton X-100, 1\% sodium deoxycholate, \( 0.1 \% \) SDS, \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-HCl, \( \mathrm{pH} \) 7.5, and \( 2 \mathrm{mM} \) EDTA) (Bioseang, Korea)를 넣고 5 분 간격으로 voltex하여 얼음에 30분간 방치하였다. 그 후 \( 12,000 \mathrm{rpm}, 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분 동안 원심분리하고 상등액을 취하여 \( \mathrm{SMART}^{\mathrm{TM}} \) bicinchoninic assay (BCA) protein assay kit (iNtRON Biotechnology, Korea)를 사용하여 단백질 양을 정량하였다. 정량한 각 단백질 lysate \( 100 \mu \mathrm{g} \)을 취하여 SDS loading buffer와 섞고 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 반응시킨 후, 얼음에 넣고 10분간 방치하였다. 각 단백질은 \( 10 \% \) sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에 loading을 하고 \( 80 \mathrm{~V} \)에서 30분, \( 120 \mathrm{~V} \)에서 1시간 30분 동안 전기 영동을 통해 단백질을 분리시켰고 PVDF (polyvinylidendifluoride) membrane (Amersham, UK)에 1시간 동안 전이시킨 후, \( 5 \% \) skim milk를 처리하여 상온에서 1시간 동안 반응시켜 비 특이적인 단백질을 blocking하였다. 그리고 각각의 1차 항체를 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12시간 이상 반응시키고 PBS-T로 세척한 후, 1차 항체에 따른 2차 항체를 처리하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, enhanced chemiluminoesence (ECL) solution을 처리하고, chemidoc을 이용하여 특정 단백질의 발현 양을 분석하였다.</p> <h2>통계 분석</h2> <p>본 실험에서 사용된 모든 실험은 3회 반복하여 진행하였으며, 결과 값은 mean \( \pm \) standard deviation (SD)로 나타내었다. 각 그룹 간 평균은 SPSS (SPSS Inc., USA)를 이용한 비 모수적 Kruskal-Wallis 및 Mann-Whitney 분석을 사용하여 비교하였으며, \( p<0.01 \) 과 \( p<0.05 \) 수준에서 유의성을 검정하였다.</p>