호중구의 분리 및 배양 방법으로 호중구의 분리는 dextran 침전과 ficoll-hypaque 법으로 분리하고 RPMI 배지에서 \( 5 \% \) 소 혈청을 첨가하여 세포사멸을 유도하여 \( 400 \times 10 \) 배 현미경 시야에서 최소한 300개의 세포 중에서 특이적인 변화가 나타난 세포를 확인하여 \( \% \)로 표시하였다. 사멸된 세포에서 나타나는 조각의 DNA를 전기영동으로 확인하였으며 약물 처리 후 원심 분리하여 인삼염 완충액으로 세척하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>사람 호중구의 분리 및 배양</h2><p>호중구의 분리는 dextran 침전과 ficoll-hypaque 법으로 분리하고 RPMI 배지에서 \( 5 \% \) 소 혈청을 첨가하여 20시간 동안 배양하여 호중구의 세포사멸을 유도하였다. 혈액 \( (100 \mathrm{ml}) \)은 \( 0.1 \mathrm{~M}\) EDTA, \( \mathrm{pH} 7.4 /0.9 \% \mathrm{~NaCl} \)이 들어 있는 수혈용 팩에 채혈하였다. \( 30 \mathrm{~ml} \)의 Hespan을 넣고 1시간 동안 실온 상태에서 방치하여 적혈구를 제거하였다. 호중구를 포함하는 혈장 성분층을 분리하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 상태에서 \( 850 \times \mathrm{g} \)로 15분 동안 원심분리하였다. 침전된 세포를 20 \( \mathrm{ml} \)의 인산염 완충액(\( 8.0 \mathrm{~mM} \mathrm{~Na}_{2} \mathrm{PO}_{4} \), \( 1.5 \mathrm{~mM} \mathrm{~KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \), \( 136 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaCl} \), \(2.6 \mathrm{~mM} \mathrm{~KCl} \), \(0.5 \mathrm{~mM} \mathrm{~MgCl}_{2}\), \(0.6 \mathrm{~mM} \mathrm{~CaCl}_{2} \), \( \mathrm{pH} 7.4 \))에 부유시킨 다음 \( 60 \mathrm{~ml} \)의 증류수를 넣고 잘 섞은 뒤 50초간 방치한 후 \( 20 \mathrm{~ml} \) 의 \( 4 \% (\mathrm{w} / \mathrm{v}) \mathrm{~NaCl} \)을 넣었다. 세포는 \( 850 \times \mathrm{g} \)에서 10분간 원심 분리하고 인산염 완충액에 다시 부유시켰다. 임파구 분리용액인 ficoll-hypaque 용액을 세포층 밑에 넣고 \( 850 \times \mathrm{g} \)에서 30분간 원심분리하여 분리된 과립구층은 다시 RPMI 배양액에 부유하여 사용하였다.</p><h2>호중구 세포사멸의 형태 관찰</h2><p>\( 2 \times 10^{5} \)세포를 약물을 처리하고 20시간 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에 두었다. Cytospin에서 \( 500\mathrm{rpm} \)으로 1분간 원심 분리한 다음 메탄올으로 고정시키고 May- Grunwald Giemsa 염색액으로 염색하였다. 호중구의 세포사멸은 \( 400 \times 10 \) 배 현미경 시야에서 최소한 300개의 세포 중에서 특이적인 변화가 나타난 세포를 확인하여 \( \% \)로 표시하였다.</p><h2>DNA 전기영동</h2><p>사멸된 세포에서 특징적으로 나타나는 조각의 DNA를 전기영동으로 확인하였다. \( 5 \times 10^{5} \)의 호중구를 약물 처리한 다음 \( 13,000 \times \mathrm{g} \)에서 2분간 원심하여 분리한다. 인산염 완충액으로 세척하고 세포용해 완충액( \( 10\mathrm{~mM}\) Tris-HCl, \( \mathrm{pH} 7.5 \), \(1 \mathrm{~mM} \) EDTA, \( 0.2 \% \) Triton X-100)에 proteinase K (\( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \))를 첨가하여 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 처리하였다. \( 28,000\mathrm{rpm} \)에서 2시간 원심분리한 후 상층액을 분리하여 DNA를 phenol/chloroform으로 추출하고 isopropanol로 침전시겼다. RNase A (\( 20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \))를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시킨 다음 \( 1 \% \) 아가로스 겔에서 전기영동(\( 50\mathrm{V} \))을 3시간 시행하였다.</p>