SNP genotyping 실험을 위해 알러지 겪었던 사람, 임의의 사람들 DNA 및 negative sample로 예비실험을 실시한 결과, SNP 분석을 통해 extension primer에 예측한데로 염기가 추가되었고 pooled DNA sample은 SNP의 대략적인 빈도를 파악할 수 있었다. 96명의 샘플을 MassArray 시스템 384 well plate로 옮기고 7개의 SNP별로 나누어 PCR로 증폭하고 SAP 처리, hME 반응 및 desalting 과정을 거쳐 MALDI-TOF를 이용한 mass spectrometric genotyping 방법으로 SNP genotyping을 실시하였다.
<p>실험 대상자 96명의 SNP genotyping을 실시하기 이전에 디자인한 extension primer를 사용하여 실험가능성을 분석 하기 위해 염기서열 결과를 알고 있는 시료 하나(과거 알러지를 앓았던 사람)와 pooled DNA sample (100명의 임의의 사람들 DNA) 하나, negative sample (DNA 대신 물을 넣은것)로 예비실험을 실시했다. 그 결과 염기서열을 알고 있는 시료는 SNP 분석을 통해 extension primer에 예측한데로 염기가 추가되었으며 pooled DNA sample은 SNP의 대략적인 빈도를 파악할 수 있었다. 예비실험 결과를 기초로 96개의 샘플을 선정하고 이들을 MassArray 시스템(Sequenom, Inc) 384 well plate로 옮긴 후 7개의 SNP별로 나누어 SNP를 알아볼 특정 영역을 PCR로 증폭했다. PCR 과정에서 남은 dNTP의 인산기를 제거하여 불활성화 시키기 위해 SAP (shrimp alkaline phosphatase)을 처리하고, 알아보고자 하는 SNP 의 바로 앞의 primer를 넣어주고 hME (homologous mass ex-tend) 반응을 통해 primer extension을 했다. 다음으로 desal-ting 과정을 거쳐 384-well microchip (SpectroCHIP)에 옮긴 후, MALDI-TOF (Bruker BiFlex III)를 이용한 mass spec-trometric genotyping 방법으로 SNP genotyping을 했다.</p> <p>SNP 영역의 PCR 증폭은 아래와 같이 수행하였다. 하나의 샘플을 \( 5 \mu \mathrm { l } \)로 맞추고, DDW \( 2.24 \) \( \mu \mathrm { l } \), 10X PCR buffer \( 0.5 \mu \mathrm { l } \), \( 25 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } 20.2 \mu \mathrm { l } , 10 \mathrm { mM } \) dNTP \( 0.04 \mu \mathrm { l } \), Taq \( (5 \mathrm { U } / \mu \mathrm { l } ) \) \( 0.02 \mu \mathrm { l } , \mathrm { PCR } \) primer mix \( 1 \mu \mathrm { l } \)을 첨가한 후, \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } 20 \) 초, \( 56 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 30 초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 1분으로 45 cycle을 PCR 수행했다.</p> <p>SAP 반응은 SAP Enzyme Solution을 총 \( 2 \mu \mathrm { l } \)로 맞추고 DDW \( 1.53 \mu \mathrm { l } \), hME buffer \( 0.17 \mu \mathrm { l } \), SAP \( 0.3 \mu \mathrm { l } \)을 첨가하여 37 \( { } ^ {\circ } \mathrm { C } 20 \) 분, \( 85 ^ {\circ } \mathrm { C } 5 \) 분, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 무한대로 설정하여 Thermocycle을 수행했다.</p>