본 연구에서는 MYA배지와 EMM배지에서 Candida albicans를 배양한 후, 활성이 좋은 6 종의 지의류 내생 곰팡이를 선별하였다. 이후, 선별된 6 종의 액체배지에서 생성된 항진균 물질의 활성을 disc diffusion 방법을 통해 조사하였다. 마지막으로, 6일 동안 Usnea rigidula (2326) 및 4일 동안 Parmotrema pseudotinctorum (2202)을 배양한 후, HPLC와 C18 컬럼을 사용하여 항진균 물질이 포함된 peak를 분리하였다. 이 과정에서 2326의 6일 배양액과 2202의 4일 배양액에서 각각 2개의 peak 분획물을 얻었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>항진균성 지의류 내생 곰팡이의 선별</h2> <p>지의류 내생 곰팡이를 배양한 MYA배지와 EMM배지에 Candida albicans 의 배양액 \( \left(\mathrm{OD}_{600} 0.01\right) \) 을 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 분주 도말하여 배양한 결과 분양받은 100 종 중 활성이 좋은 6 종의 지의류 내생 곰팡이를 1 차적으로 선별하였다. 이 결과 고체배지에서 지의류 내생 곰팡이가 활성물질을 생성하여 진균인 C. albicans의 성장을 저해한다는 것을 알 수 있었다. 전체적으로 EMM배지에서 지의류 내생 곰팡이의 성장이 MYA배지에서보다 좋지 않은 것으로 보아 환경에 따라 지의류 내생 곰팡이의 성장이 다르다는 것을 알 수 있었다. 또한 MYA배지에서 활성이 좋은 6 종의 지의류 내생 곰팡이는 EMM배지에서도 활성이 좋은, 반면에 MYA배지에서 활성이 좋지 않은 종들은 EMM배지에서도 활성이 좋지 않게 나타났다. Parmotrema pseudotinctorum (2202)과 Dirinaria applanata (2312) 는 성장이 좋지 않음에도 불구하고 투명환이 크게 형성되었고, 반면에 Ramalina sp. (2228) 는 성장이 좋았으나 투명환의 크기가 앞의 두 균주에 비하여 작게 나타나는 것으로 보아 지의류 내생 곰팡이의 성장과 생산하는 항진균 물질의 활성도가 비례하지 않다는 것을 알 수 있었다.</p> <h2>Disc Diffusion Method</h2> <p>선별된 6 종의 지의류 내생 곰팡이의 액체배지에서 생성하는 항진균 물질의 활성을 알아보기 위해 disc diffusion method를 이용하였다. 미리 배양한 C. albicans의 배양액</p> <p>\( \left(\mathrm{OD}_{600} 0.01\right) \) 을 도말한 YPD 고체배지에 6 종의 지의류 내생 곰팡이의 배양일수별 배양액을 얻어 \( 500 \mu \mathrm{L} \) 씩 분주하여 농축된 paper disc를 올려놓고, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 24 시간 배양하여 투명환의 크기를 관찰하였다. 그 결과 Usnea rigidula (2326)가 C. albicans에 대한 항진균 활성이 가장 좋았으며, 다음으로는 Parmotrema pseudotinctorum (2202), Myelochroa sp. (2292) 순으로 활성이 좋게 나타났다. 이 결과 지의류 내생 곰팡이가 고체배지 뿐만 아니라 액체배지에서도 항진균 활성 물질을 생성함을 알 수 있었다.</p> <h2>지의류 내생 곰팡이의 용매 추출분에 따른 항진균 활성 측정</h2> <p>고체배지에서와 액체배지에서 공통적으로 활성이 높게 나타난 지의류 내생 곰팡이 3종의 배양일수별로 수집하고 chloroform, ethyl acetate 용매 순으로 추출하여 50 배 농축 시킨 후 \( 70 \% \) ethanol로 각각 녹였다. Disc diffusion method 를 이용하여 각 추출물에 따른 고체배지(YPD)에서의 Candida albicans의 항진균 활성도를 측정한 결과, 3 종 모두 chlo-roform추출물에서 더 높은 활성도를 보여, 지의류 내생 곰팡이 추출물의 항균 활성은 추출에 이용되는 용매에 따라 다르다는 것을 알 수 있었다. 또한 추출하고 남은 수층에서는 항균 활성을 거의 볼 수 없었는데, 아마도 지의류 내생 곰팡이의 항진균 활성 물질의 대부분이 비극성 성분으로 구성되었으리라 추정된다.</p> <p>또한 C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. lusitaniae, Cryptococcus neoformans 5 종의 진균을 96 well plate를 이용하여 액체배지에서의 항진균 활성 조사한 결과 3 종의 chloroform, ethyl acetate 추출물 모두 C. albicans와 Cryp-tococcus neofomans에서 약 \( 96 \% \) 의 저해율을 보였지만, C. glabrata, C. tropicalis, C. lucitaniae에서는 2202와 2292의 추출물이 2326 의 추출물 보다 높은 약 \( 90 \% \) 의 저해율을 보였다. 이 결과 3종의 지의류 내생 곰팡이가 생성하는 항진균 활성 물질이 각각 다를 것으로 추정되며, 저해하는 진균의 종도 다른 것을 알 수 있었다.</p> <h2>\( \mathrm{HPLC} \) 를 이용하여 분획물에 따른 항진균 활성 측정</h2> <p>최종적으로 6 일 동안 배양한 Usnea rigidula (2326)과 4 일 동안 배양한 Parmotrema pseudotinctorum (2202)의 chloroform 추출액에 대하여 HPLC, \( \mathrm{C}_{18} \) column을 이용하여 항진균 물질이 포함되리라 추정되는 peak를 분취하였으며, 그 결과 2326 의 6일 배양액과 2202 의 4 일 배양액에서 각각 2 개씩의 peak 분획물을 얻었다. 주요 peak 분획물을 농축하고 96 well plate를 이용하여 C. albicans와 C. glabrata에 대한 항진균 활성을 검토하기위해 농축액을 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 분주 한 경우 control sample (usnic acid \( 0.01 \% \) )에 비해 항진균 활성이 높게 나타난 반면, \( 5 \mu \mathrm{L} \) 씩 분주한 경우에는 활성이 매우 낮았다. 한편, HPLC 분획물이 나타낸 peak의 머무름시간(retension time)과 HPLC peak 양상으로 보아 C. albicans 와 C. glabrata에 대한 항진균 활성을 나타낸 분획물은 지의류의 항생 물질 중 가장 널리 알려진 노란색 결정의 usnic acid 또는 usnic acid계열의 성분을 함유한 것으로 추정되었으며, 항진균 활성을 나타넨 분획물이 비교적 비극성이라는 것을 알 수 있었다.</p>