Lactobacillus와 세균 M9에 대한 연구를 진행하였다. \( \mathrm{OD}_{600}=0.1(\mathrm{M}9,1\mathrm{ml}) \)에서 Lactobacillus에 세균 M9을 \( 40 \mu \mathrm{g} \)씩 처리한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3, 6, 12시간 동안 배양하였으며, 이 동안 흡광도를 측정하였다. Colony Forming Unit (CFU) assay를 통해 항균활성을 측정하였으며, 이를 통해 L. plantarum의 생장속도와 항균활성의 증가를 유도하는 세균 M9 유래 물질의 특성을 분석하였다. 이 모든 측정값들은 평균 및 표준편차로 표현되었으며, SPSS 프로그램을 사용하여 통계 처리를 하였다.
<h2>세균 M9과 반응시킨 Lactobacillus spp.의 생장속도 측정</h2> <p>Lactobacillus의 \( \mathrm{OD}_{600}=0.1(\mathrm{M} 9,1 \mathrm{ml}) \)에 각 세균 M9을 \( 40 \mu \mathrm{g} \)씩 처리한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3, 6, 12시간동안 배양하는 동안 spectrophotometer (Optizen nano bio, Mecasys, Korea)로 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 생육곡선을 도출하였다. 실험은 3회 이상 실시하고, 평균값을 분석하였다.</p> <h2>항균활성 측정</h2> <p>Colony Forming Unit (CFU) assay: Lactobacillus (spp.) M9을 이용하여 항균활성을 측정하였다. 측정은 시험 균주의 \( \mathrm{OD}_{600}=0.1( \) Nutrient broth의 \( 1 \mathrm{ml} \) )에 Lactobacillus spp. M9을 \( 10,25,50 \mu \mathrm{g} \)의 농도로 처리하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간동안 반응시킨 후 Nutrient agar plate에 도말하여 병원균의 생균수\( (\mathrm{CFU} / \mathrm{ml}) \)를 측정하여 확인하였다. 실험은 3회 평가 평균값을 결과로 도출하고, 대조군의 CFU를 \( 100 \% \)으로 하여 상대적인 값을 분석하였다.</p> <p>Disc diffusion assay: Lactobacillus M9의 항균활성은 시험 세균을 대상으로 disc diffusion assay로 측정하였다. 병원균은 Nutrient broth에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 배양한 후, 각각의 균은 \( \mathrm{OD}_{600}=0.1,100 \mu \mathrm{l} \) 를 Nutrient agar 평판배지에 도말한다. Lactobacillus M9의 \( 25 \mathrm{~mg} \) 가 함유된 멸균 disc paper(지름 \( 5 \mathrm{~mm} \), Whatsman No.2)를 시험 세균이 도말된 평판배지에 올린 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간동안 배양하였다. 결과는 생육저해환의 크기를 측정하여 항균활성을 평가하였다. 대조군으로서는 ampicillin의 \( 5 \mathrm{~mg} / \mathrm{disc} \)를 사용하였으며, 생육저해환의 크기는 지름 \( \mathrm{mm} \) 단위로 측정하여, 3회 평가 평균값을 결과로 도출하였다.</p> <h2>세균 M9의 특성 분석</h2> <p>L. plantarum의 생장속도와 항균활성의 증가를 유도하는 세균 M9 유래 물질의 특성을 분석하기 위해 S. typhimurium M9(St M9)을 준비하고 아래와 같은 조건으로 반응시켰다.</p> <p>(1) 각종 효소에 대한 영향을 측정하기 위해 St M9의 \( 40 \mu \mathrm{g} \)에 \( \alpha \)-amylase (EC 3.2.1.1 Type VIII, Sigma), lipase (EC 3.1.1.3 Type VII, Sigma), lysozyme (EC 3.2.1.17, Sigma), proteinase K (EC 3.4.21.64, Sigma)를 \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분 동안 반응시켰다.</p> <p>(2) St M9의 \( \mathrm{pH} \) 안정성을 측정하기 위해 \( \mathrm{pH} 2.0-4.0 \)은 \( 0.1 \mathrm{~M} \) glycine-\( \mathrm{HCl} \) 완충용액, \( \mathrm{pH} 4.0-6.0\)은 \( 0.1 \mathrm{~M} \) sodium acetate 완충용액, \( \mathrm{pH} 6.0-8.0\)은 \( 0.1 \mathrm{~M} \) sodium phosphate 완충용액, \( \mathrm{pH} 8.0-10.0\)은 \( \mathrm{Tris-HCl} \) 완충용액을 사용하여 \( \mathrm{St} \) \( \mathrm{M} 9 \) 의 \( \mathrm{pH} \) 를 조절하고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간동안 반응하였다.</p> <p>(3) 온도안정성에 대한 측정은 St M9를 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응한 후 항균물질의 잔존활성을 측정하였다.</p> <p>각각의 요소로 처리한 St M9는 배양중인 L. plantarum에 첨가하여 반응시키고 L. plantarum M9를 분리하여 시험 균주에 대한 항균활성을 생균수를 측정하여 확인하였다.</p> <h2>통계분석</h2> <p>모든 실험의 측정값은 평균\( \pm \)표준편차로 나타냈고, SPSS \( 20.0 \) (SPSS, Chicago, IL, USA) 프로그램으로 통계처리 하였다. 유의한 차이 \( (p<0.05) \) 는 일원배치 분산분석법(one-way ANOVA)의 Turkey 다중범위검정(Turkey's multiple range test)으로 결정하였다.</p>