락툴로오스의 산업적 생산에서 효소기반의 락툴로오스 합성이 연구되고 있다.락툴로오스의 생산성을 증대시켜야 효소의 산업적 적용이 가능하다. 따라서 사용되는 효소의 열안정성과 효소반응의 특이성을 조절하여 생산에 적합하도록 개선되어야 한다. 이를 위해서는 효소의 열내성을 증가시켜 고온에서 효소에 의한 전환 반응을 일으켜야 한다. 본 연구에서는 최적조건에서 회분식 반응을 통해 고농도의 유당을 활용할 수 있는 열내성 CE를 선별하였다.
<h1>서 론</h1><p>락툴로오스(lactulose)는 갈락토스(galactose)와 과당(fructose)으로 구성된 합성 이당류로 유당(lactose)의 포도당(glucose)부분이 이성질화되어 과당(fructose)으로 대체된 것으로, 천연에는 거의 존재하지 않으며 유제품의 처리, 보존 중에 2차적으로 생성되는 것으로 알려져 있다. 최근 락툴로오스는 비피더스(Bifidus)균의 증식을 촉진하는 작용이 있기 때문에 유아용 분유 등에 첨가되거나 probiotics 제품, 일반장개선의약품, 삼투성 변비약 등 다양한 분야에서 사용되고있다. 락툴로오스는 소화되지 않는 당으로 섭취시 대장까지 분해되지 않은 형태로 이동하여 당분해세균(saccharolyticbacteria)에 의해 젖산을 생성하여 장내 pH를 저하시킴으로써 장운동을 자극하며 삼투효과를 높여 연동운동을 촉진하므로 배변을 촉진하거나, 또 장내 암모니아 생성균의 증식을 억제해 암모니아의 체내흡수를 억제하는 기능을 나타내는 것으로 알려져 있다.</p><p>락툴로오스의 산업적 생산은 여전히 화학적 이성화법에 의해 이루어지고 있지만 환경과 복잡한 정제 공정으로 인해 효소기반의 락툴로오스 합성이 대두되고 있다. 주로 락툴로오스의 효소기반의 합성은 \( \beta\ \)-galactosidase를 이용한 합성방법이 연구되어 왔으나, 최근 다양한 균주로부터 Cellobiose 2-epimerase (CE: EC 5.1.3.11)가 분리되면서 유당로부터의 락툴로오스 전환 공정에 활용하는 방법이 연구되고 있다. CE는 반추위 혐기성 미생물인 Ruminococcus albus에서 처음 동정되었으며, 이 효소는 \( \beta \)-1,4-mannobiose, cellobiose와 유당(lactose)을 포함한 \( \beta \)-1,4-linked oligosaccharide의 환원 말단의 포도당(glucose)부분을 과당(fructose)을 거쳐 만노스(mannose)로 전환시키는 활성을 가지고 있기 때문에, 유당[galactose-glucose]의 경우 락툴로오스[galactose-fructose]를 거쳐 epilactose[galactose-mannose]로 전환시킬 수 있다. 락툴로오스는 CE에 의한 유당의 이성화반응에서 epilactose로 전환되기 전단계의 중간체로서 반응조건과 기질과 결합하는 효소내 잔기의 결합력약화에 따라 생산될 수 있다. 대부분의 non-anomerichydroxyl기에 configuration을 전환시키는 일반적인 epimerase는 인산기 혹은 핵산이인산기를 가진 기질에 주로 작용하지만, CE의 경우 환원말단에 위치한 당의 C-2 위치를 이성화한다. 기질과 효소간 상호작용은 R. albus에서 유래한 CE(RaCE)와 Rhodothermus marinus에서 유래한 CE(RmCE)의 3차원 입체 구조의 분석을 통해 알려졌다. CE의 기본적인 형태는 12개의 \( \alpha \)-helices가 원통형으로 배열된 \( (\alpha / \alpha)_{6} \) barrel 구조를 이루고 있으며, 활성부위(active site)는 3개의 histidine으로 이루어진 histidine center가 barrel 내부에 위치하고 있는 것으로 알려져 있다.</p><p>락툴로오스가 미생물 CE의 촉매반응을 통해 생산이 시도되고 있지만, 효소의 산업적 적용을 위해서는 고농도 유당기질에서 중간체인 락툴로오스의 생산성을 증대시킬 필요가있다. 따라서 사용되는 효소의 열안정성과 효소반응의 특이성을 조절하여 생산에 적합하도록 개선되어야 한다. 이를 위한 접근방법으로, 고온에서의 락툴로오스 전환반응은 기질의 용해도 상승효과 외에도 고온에서 가속화된 반응속도로 인해 부분적으로 CE의 특이성을 상실하게 되어 최종산물인 epilactose보다 중간산물인 락툴로오스를 더 용이하게 생성될 수 있다는 가설을 세울 수 있다. 즉, CE에 의한 락툴로오스 생산은 유당의 포도당부위가 완전히 만노스로 전환되지 않은 중간체 형태인 과당단계에서 효소로부터 탈리가 일어나야만 효율적인 락툴로오스의 생산이 가능하기 때문에, 효소반응의 특성상 고온조건에서 효소의 반응속도가 빨라지면서 불완전한 효소반응이 유발되어 중간체인 락툴로오스의 생성을 촉진시킬 수 있다. 특히 고온조건에서 효소에 의한 전환반응을 일으켜야 하므로 효소의 열내성을 증진시킬 필요가 있으며 반응의 안정성을 위하여 효소 혹은 세포 고정화를 통해 단일 효소전환반응보다 락툴로오스 생산의 경제성을 높일 수 있다. 효소 또는 미생물을 고정화하는 방법은 결합법, 가교법, 포괄법 등 여러 고정화 방법이 사용되고 있으며 적용 산물에 따라 다양하다. 고정화 방법은 생물촉매를 이용한 전환반응에서 안정성을 높이고 반복적인 운전을 통해 경제성을 높일 수 있는 유용한 방법이며, 고정화된 담체는 Packed-Bed Reactor (PBR)나 회분식 교반 반응기등에서도 활용할 수 있다.</p><p>본 연구에서는 고농도의 유당을 활용할 수 있는 열내성 CE를 선별하기 위해 고온조건에서 열처리된 조효소액의 활성비교 스크리닝법을 통해 선별하였고, 선별된 효소를 발현할수 있는 세포를 이용하여 포괄법으로 효소를 포함한 재조합 균주 담체를 제조하였고, 최적조건에서 회분식 반응을 통해 락툴로오스 생산에 관한 시험과 안정성에 관하여 시험을 수행하였다.</p>