퍼옥시레독신의 Pro41의 피롤리딘 고리에 의해 용매와 과산화물은 접근 가능성이 제한되어 과산화물에 의한 초과산화(overoxidation)가 막아진다. 이 안정화되어있는 십량체 구조에서 아직 연구되지 않은 아스파트산과 세린 잔기를 다른 아미노산을 치환했을 경우 변화가 있는지 알아보는 실험을 했고, 이들 잔기를 변이 시켰을 때 십량체 형성 및 샤페론 활성에 변화가 나타나는 것으로 확인이 되었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>정형 2-Cys 퍼옥시레독신에서 잘 보존된 잔기</h2> <p>정형 2-Cys Prx군에 속하는 퍼옥시레독신 참고서열 1,024개 중 부분적인 서열 등을 제외한 967개 서열을 정렬하였을 때 \(99\%\) 이상 보존된 잔기는 모두 10개였다. 여기에는퍼옥시레독신 촉매 활성에 필요한 아미노말단 및 카복시말단 쪽의 시스테인 잔기(이하 효모 TSA1의 아미노산 잔기 위치, Cys48 및 Cys169)와 효소 활성에 가장 중요한 잔기인 Cys48 주변의 두 개의 프롤린 잔기(Pro41 및 Pro49), 두 개의 트레오닌/세린 잔기(Thr45, Thr50), 그리고 글루타민산잔기(Glu51)가 있었고, 보존된 두 시스테인 잔기 사이에 두개의 아스파트산 잔기(Asp75, Asp103)과 카복시말단 쪽의두 개의 아르기닌 잔기(Arg124, Arg154)가 있었다.</p> <p>Cys48, Pro41, Thr45와 Arg124 잔기는 정형 2-Cys Prx군 뿐만 아니라 모든 퍼옥시레독신에 잘 보존된 것으로 알려졌다. 촉매 활성에 필요한 아미노 말단의 시스테인 잔기는 잘 보존되어 있는 Pro41, Thr45 및 Arg124에 의해 둘러쌓여 있다. 용매와 과산화물은 Pro41의 피롤리딘 고리에 의해 접근 가능성이 제한되어 과산화물에 의한 초과산화(overoxidation)를 막아준다. Thr45는 아미노 말단의 시스테인 잔기와 \(3.0 \mathring{A}\)의 짧은 수소 결합을 이루고 있어 양성자 공여에 유리하다. Arg124의 염기성 구아니딘 그룹의 질소원자와 아미노 말단 시스테인의 황 원자간의 거리가 \(7.4 \mathring{A}\)으로비교적 가깝게 위치하고 있어 활성 자리 시스테인의 pKa 값을 낮추어 이온화 양상을 안정되게 한다고 보고되었다.</p> <p>Asp75와 Asp103 잔기는 각각 \(100\%\), \(99.7\%\) 보존되고 있음을 확인하였고 Ser73은 \(97\%\) 보존되었다. 사람 Prx의 결정구조 연구에 의하면 75 및 103의 아스파트산 잔기는 이량체가 모여 만들어지는 십량체 구조에서 이량체와 이량체의접촉면에 존재하며 활성자리로부터 \(14.0 \mathring{A}\)정도 떨어져 있음을 보고하였다.</p> <p>지금까지 정형 2-Cys Prx군에 속하는 퍼옥시레독신에 잘보존되어 있으나 전혀 연구되지 않은 아스파트산 잔기와 세린 잔기의 기능을 알아보기 위해 발린 및 아스파라진으로 치환하여 음이온이 활성에 미치는 영향을 살펴보고, 세린을 알라닌으로 치환하여 아스파트산과 세린이 효모 TSA1의 퍼옥시다아제 활성 및 샤페론 활성에 미치는 영향을 살펴보았다.</p> <h2>재조합 효모 TSA1과 변이 단백질의 정제</h2> <p>아스파트산의 음전하의 중요성을 알아보기 위해 75번 및103번 아스파트산 잔기를 아스파라진으로 치환시킨 D75N와 D103N과, 아스파트산의 극성의 중요성을 알아보기 위해 발린으로 치환시킨 D75V와 D103V 단백질을 준비하였다. 세린 잔기의 수산기의 기능을 알아보기 위해 세린은 알라닌으로 대체하였다.</p> <p>정제된 재조합 TSA1과 변이 단백질을 SDS-PAGE로 분석하였다. 환원조건에서 TSA1와 모든 변이단백질은 23 kDa의단일체 형태로 나타났다. D103 변이 단백질의 경우 다른 변이단백질에 비해 이동이 약간 늦은 위치에서 나타났는데 이는 C48 변이 단백질의 이동이 늦게 나타난 것을 보고한 경우와 비슷한 결과였다. 비환원 조건에서 전기영동 하였을 때 S73A, D75V와 D75N은 TSA1과 동일하게이량체 형태로 나타났고, D103V와 D103N은 소량의 단량체및 이량체를 포함하여 매우 다양한 형태로 나타났다. 이 결과 73번의 세린 잔기와 75번의 아스파트산 잔기는 단량체 간의 이황화 결합 형성에 영향을 미치지 않는 것으로보여지며, 103번의 아스파트산 잔기는 비정상적인 이황화 결합을 형성함을 추정할 수 있었다. 103번의 아스파트산 잔기변이 단백질의 경우 정제과정에서 \(70\%\) 이상 불용성 단백질로 생성되었는데 이는 103번 변이 단백질의 비정상적 이화학적 결합에 의한 응집 때문일 것으로 생각된다.</p> <h2>티오레독신 퍼옥시다제 활성</h2> <p>TSA1는 티오레독신, 티오레독신 환원효소, NADPH로 구성된 티오레독신 시스템의 환원력을 이용하여 과산화물을제거하는 활성을 가지고 있다. 잘 보존된 아미노산이 티오레독신 퍼옥시다제 활성에 미치는 영향을 살펴보았다.</p> <p>TSA1과 비교하였을 때 D75N는 \(50\%\)의 활성도, S73A와D75V는 \(25\%\)의 활성도를 나타냈으며, D103V과 D103N는티오레독신 퍼옥시다제 활성을 보이지 않았다. 티오레독신 퍼옥시다제의 활성에 있어 75번 아스파트산의 음전하 및 극성 잔기가 요구됨을 확인하였고 103번 아트파트산의 경우 음전하가 활성에 중요한 영향을 미치는 것을 알 수있었다. 변이 단백질의 낮은 활성이 과산화수소 혹은 티오레독신과의 기질 친화력 차이에 의한 것인지 최대반응속도 변화에 의한 것인지는 추후 연구가 필요하다.</p> <h2>분자 샤페론 활성</h2> <p>분자 샤페론 활성에 있어 잘 보존된 잔기의 영향을 알아분자 샤페론 활성에 있어 잘 보존된 잔기의 영향을 알아보기 위해 \( 43^{\circ} \mathrm{C} \)에서 시트르산 합성효소의 열변성에 의한 응집을 방어하는 활성도를 측정하였다. TSA1 및 변이 단백질과 시트르산 합성효소의 비율을 4:1로 반응시켰을 때 D75V은 TSA1와 같은 정도 활성을 보였고, S73A 와 D75N는TSA1보다 활성도가 좋았으며, D103V와 D103N은 TSA1과 비교할 때 \(50\%\)의 활성을 나타내었다.</p> <p>효모 TSA1에 의존적인 분자 샤페론 활성을 살펴보기 위해 TSA1 및 변이 단백질과 시트르산 합성효소의 비율을 8:1로 반응하여 측정하였다. D103V와 D103N를 제외한 모든 단백질이 43°C에서 시트르산 합성효소의 열 변성에 의한 응집을 억제하였다. D103V과 D103N을 제외한 다른 변이 단백질은 분자 샤페론 활성을 가지고 있었다. 샤페론 활성을 나타내는데 십량체 형성이 중요하다고 보고되었다.고속 액체 크로마토그래피용 젤 여과관을 이용하여 중합체형성을 살펴본 결과 TSA1, S73A, D75V 및 D75N은 고중합체를 형성하였으며 이는 샤페론 활성 결과와 일치하였다. 퍼옥시레독신은 2개의 이량체가 모여 십량체를 형성하는데 이량체와 이량체의 접촉면에 네 개의 아스파트산 잔기가 근접되어 있는 구조를 나타낸다. 이들 잔기를 변이시키는 경우십량체 형성 및 샤페론 활성에 변화를 나타내는 것으로 보아 정상적 십량체 형성에 잘 보존된 아스파트산 잔기가 기여하는 것으로 판단된다.</p>