미백 소재 개발을 위해 멜라닌 생성 억제 기전과 단백질 발현 연광성을 확인하기 위해 western blot을 이용해 변화를 확인하였다. 개망초 에탄올 추출물을 농도별로 처리한 결과 MITF, TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase 단백질의 발현은 control 대비 60.22%, 54.79%, 67.88%, 47.83%의 발현 억제 효과가 있었으며, mRNA 발현 억제는 86.54%, 85.22 %, 74.26%, 66.66% 의 억제 효과를 보였다. 두 결과 모두 kojic acid와 비교시 유의한 결과를 확인할 수 있었다.
<p>미백 소재개발에 있어 멜라닌 생성을 억제하는 기전과 이 미 생성된 멜라닌 분해를 촉진시키는 단계에서 작용하는 효소의 작용이 중요하며, 단백질 발현과 연관성이 있는지 보기 위해 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 및 상위 단계 유전 자들인 ERK, p-ERK, CREB, p-CREB 항체를 이용한 western blot으로 관련 단백질 발현양 변화에 대해 확인하였다. B16F10 mouse melanoma cell에 개망초 에탄올 추출 물을 \( 25,50,100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도별로 처리한 후 control은 \( \alpha- \mathrm { MSH } \) 를 처리하여 멜라닌을 과발현 시키고, normal 부분에 는 \( \alpha- \mathrm { MSH } \) 를 처리하지 않는 구간으로 설정하였다. 이때 세 포의 여러 조건에서도 그 발현정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 \( \beta \)-actin을 positive control로 사용하였다. 그 결과 Fig. 7, 8 과 같이 개망초 에탄올 추출물을 25,50 , \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도별로 처리한 결과 MITF, TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase 단백질의 발현은 control 대비 60.22%, 54.79%, 67.88%, 47.83%의 발현 억제 효과가 있는 것을 확 인할 수 있었으며, 대조군인 kojic acid와 비교했을 때 유의 한 결과를 확인할 수 있었다. ERK, 인산화된 ERK, CREB, 인산화된 CREB의 단백질 발현양을 측정한 결과 ERK와 CREB의 단백질량의 변화는 미비하지만, 인산화된 ERK는 농도가 증가함에 따라 억제율을 보였으며 멜라닌 생합성에 직접적인 관여하는 상위 유전자인 인산화된 CREB 의 단백 질 발현양이 개망초 추출물의 농도가 증가함에 따라 단백질 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.</p> <h2>RT-PCR을 통한 mRNA 발현 측정 결과</h2> <p>\( \alpha \)-MSH는 tyrosinase의 활성을 자극시키고 멜라닌 합성에 관여하는 효소인 TRP-1, TRP-2에 작용되어 eumelanin을 합 성하도록 유도시켜준다. TRP-1은 DHICA를 indole-5,6carboxylic acid로 전환시키는 효소로서 DHICA oxidase라고 도 하며 tyrosinase의 변성을 막는데 작용하여 간접적으로 tyrosinase 활성에 기여하여 멜라닌의 생성을 조절할 수 있다. 미백 소재의 개발에 있어 멜라닌을 생성을 억제시키 는 작용과 멜라닌의 분해를 촉진시키는 단계에서의 효소의 조절이 매우 중요하며 멜라닌 생성과 연관성이 있는지 보기 위해 mRNA 발현양을 확인하였다.</p> <p>개망초 에탄올 추출물이 melanin 합성에 관계된 인자인 MITF, TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase에 미치는 mRNA 발현 의 영향을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma cell 에 \( 25,50,100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도별로 처리한 후 control은 \( \alpha \)- \( \mathrm { MSH } \) 를 처리하여 멜라닌을 과발현 시키고, normal 부분에 는 \( \alpha- \mathrm { MSH } \) 를 처리하지 않는 구간으로 설정하였다. 24 시간 뒤 mRNA 발현을 RT-PCR로 확인하였다. Positive control 로 GAPDH를 사용하였다. 그 결과 Fig. 9와 같이 개망초 에 탄올 추출물을 \( 25,50,100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도별로 처리하였으며 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase의 mRNA 발현 측정 결과 농도가 증가함에 따라서mRNA 발현을 억제하였고 \( 100 \mu \mathrm { g } / \)ml에서 86.54%, 85.22 %, 74.26%, 66.66 %의 억제율을 나타냈다. 대조군인 kojic acid와 비교했을 때 유의한 결과를 확 인할 수 있었다.</p>