본 연구는 감자의 RING finger protein을 암호화하는 \( S t A C R E \) 유전자를 분리하고, 해당 유전자의 생물학적 기능과 풋마름병에 대한 저항성을 조사하였다. \( S t A C R E \) 유전자는 전신획득저항성 유도물질인 SA 처리에 의해 그 발현이 촉진되며, 또한 풋마름병균인 \( R_ { s } \)에 의해서도 발현 증가가 관찰되었다. 이러한 결과를 바탕으로, 본 연구는 \( S t A C R E \) 유전자의 과발현을 유도한 형질전환 감자를 제작하였고, 이를 통해 풋마름병에 대한 저항성을 검증하였다. 검증 결과, \( S t A C R E \) 유전자가 과발현된 감자 형질전환체는 야생형에 비해 풋마름병에 대해 높은 저항성을 나타내었다. 이러한 결과를 통해 \( S t A C R E \) 유전자의 풋마름병 저항성 관련 기능이 확인되었다.
<p>본 연구에서는 감자에서 RING finger protein을 암호화하는 \( S t A C R E \) 유전자를 분리하고 풋마름병 저항성관련 기능 검정한 결과를 보고 하고자 한다. 감자 StACRE는 전신획득저항성을 유도하는 물질로 알려진 SA 처리에 의해 발현이 유도되었을 뿐만 아니라 풋마름병균인 \( R_ { s } \) 에 의해서도 발현이 증가하였다. 따라서 StACRE 유전자의 생물학적 기능을 검정하기 위해 이 유전자를 과발현 시킨 형질전환 감자를 제작하였으며 형질전환체의 풋마름병 저항성 효과 여부를 조사하였다. 그 결과 이 유전자가 과발현된 감자 형질전환체가 야생형에 비해 풋마름병에 대해 저항성을 보였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물 재료 및 생육 조건</h2> <p>형질전환 및 대조구로 실험에 사용된 감자 품종은 수미(Solanum tubersoum L. cv. Superior)와 풋마름병 저항성으로 알려진 CT206-10으로 16 시간 광/8시간 암 주기로, \( 23 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 조건에서 배양기에서 4 주간 배양하였다. 대조구 감자와 형질전환체는 MS 배지에 계대 배양하여 배양기에서 2주간 배양 후 양액 또는 배양토로 옮겨 심어 약 2 3주간 더 키운 후 생물학적 검정 또는 분자생물학적 분석에 이용하였다. 감자 형질전환용 균주는 Agrobacterium tumefaciens (LBA4404)를 사용하였으며, 유전자 조작을 위한 균주는 Escherichia coli (DH5a 계통, RBC Science, Taiwan)를 사용하였다.</p> <h2>유전자 분리 및 발현분석</h2> <p>MS배지에서 2주간 계대 배양한 감자를 양액에서 2주간 더 배양하여 실험에 이용하였다. \( 2 \mathrm { mM } \) salicylic acid (SA, Sigma,</p> <p>Saint Louis)를 spray하여 \( 1,3,6,12,24,48 \) 시간 후 시료를 채취하여 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 보관하면서 RNA를 RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen, Hiden)를 이용해 분리하였다. 병원균인 Ralstonia sol-anacearum (Rs, KACC10722)은 CPG 한천 배지에 \( 2 \sim 3 \) 일간 배양한 후 \( 10 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } _ { 2 } \) 에 \( \mathrm { OD } 600 \) 에서 \( 0.5 \) 가 되게 희석 한 후에 뿌리를 \( 5 \mathrm { ~cm } \) 씩 절단 한 후 침지하여 1,3,6,12,24,48 시간 후 시료를 채취하여 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 보관하면서 RNA를 분리하였다. 사용한 primer 서열은 Table 1에 나타내었다. RT-PCR 조건은 \( 5 \mu \mathrm { g } \) 의 total RNA, \( 100 \mathrm { pmol } \) 의 oligodT (Bioneer, Daejeon), \( \mathrm { ddH } _ { 2 } \mathrm { O } \) 로 전체 반응액이 \( 20 \mu 1 \) 되게 혼합하여 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5분간 가열 후 얼음 위에서 식히고 \( 4 \mu l \) 의 \( 5 x \) first strand buffer(Invitrogen, CA), \( 4 \mu l \)의 \( 0.1 \mathrm { M } \) DTT (Invitrogen, CA), \( 4 \mu l \)의 \( \mathrm { dNTP } (2.5 \mathrm { mM } / \mu \mathrm { l } \), Invitrogen, CA), \( 1 \mu l \)의 RNaseOUT re-combinant RNase Inhibitor (40 units/ \( \mu \) l, Invitrogen, CA)와 \( 1 \mu l \) SuperScriptIII (200 units/ ㅆl, Invitrogen, CA)를 섞고 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 시간 반응시킨 후 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분간 효소를 불활성화 시키고 여기에 RNaseH (2 units/ ll, Invitrogen, CA)를 1 \( \mu 1 \) 첨가하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 20 분간 반응 후 다시 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분간 불활성화 시킴으로써 First strand 합성을 하였다. 목표 유전자 의 발현은 \( 1 \mu 1 \) 의 First strand 반응액, Table 1에 나타낸 20 pmol의 StTUB-forward primer와 StTUB-reverse primer, 20 pmol의 StACRE-forward primer와 StACRE-reverse primer를 각각의 tube에 넣고 여기에 \( 0.5 \) l의 rTaq polymerse (5 units/ \( \mu 1 \), Takara, Shiga), 2 ㅆl 의10x PCR buffer (Takara, Shiga), \( \mathrm { ddH } _ { 2 } \mathrm { O } \) 로 최종 \( 20 \mu 1 \) 되게 혼합하여 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2분 예열, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초, \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분 동안 25 cycle을, \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분간 최종 연장반응 수행 후 \( 1 \% \) agarose gel에 전기영동하여 확인하였다.</p>