돼지감자의 구근에서 RT-PCR를 사용해 fructan 생합성 1-sst 및 1-fft 유전자를 분리하고 식물발현 vector를 통해 벼의 callus에 형질전환하여 식물체를 재분화시킨 결과, 배반에서 유기된 캘러스 중에서 둥글고 딱딱하며 연 노란색을 띄는 캘러스들을 형질전환하였을 때 재분화가 잘되는 경향을 보였고 육안과 현미경으로 배발생 캘러스를 구분할 수 있었다. 형질전환 벼를 확인한 결과, 1-sst 및 1-fft 유전자가 도입된 T2 형질전환 계통들에서 안정적으로 벼 게놈에 single copy로 integration되었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>돼지감자 유래 fructan 생합성 유전자의 분리 및 형질전환 벼의 육성</h2> <p>Fructan 생합성 관련 1-sst 및 1-fft 유전자의 분리는 Ingrid et al (1998) 등과 같이 돼지감자 구근으로부터 RT-PCR에 의해 full length cDNA 를 분리하였다. 분리한 유전자는 염기서열이 보고된 유전자와 동일한 것을 선별하여 Ti-plasmid vector를 구축하였다 (Fig. 1).</p> <p>1-sst 및 1-fft 유전자를 sense 방향으로 각각 도입한 식물발현 vector인 KJG V-B2를 Agrobacterium tumefaciens LBA4404를 이용하여 벼의 callus에 형질전환하여 식물체를 재분화시킨 결과는 Fig. 2와 같다. 벼 종자를 2N6 고체 배지에 치상하여 배양하였을 때, 배반으로부터 왕성한 캘러스가 유기되었으며, \( 2 \sim 3 \mathrm{~mm} \) 크기의 체세포 배 발생 캘러스를 선발하여, 재조합 유전자를 함유한 Agrobacterium과 접종하여 3일 동안 배양한 후 hygromycin이 첨가된 배지에서 선발하였다. 배반에서 유기된 캘러스 중 둥글고 딱딱하며 연 노란색을 띄는 캘러스들을 형질전환하였을 때 재분화가 잘되는 경향을 보여 육안과 현미경으로 배발생 캘러스를 구분할 수 있었다. 항생제인 hygromycin이 첨가된 선발배지에서는 형질전환된 캘러스들이 왕성하게 증식되었으나, 비형질전환 캘러스들은 더 이상 증식되지 않고 갈변하여 고사하였다. 형질전환된 캘러스를 hygromycin이 포함된 MS 배지 상에 치상시 배양 3주 후부터 embryogenic callus의 왕성한 생장을 보였고, 5주 후부터 callus에 녹색의 반점이 보이기 시작하였으며, 이들 callus를 MS기본배지에 옮겨 재분화를 유도하여 1-sst와 1-fft 유전자가 도입된 형질전환 재분화 식물체를 획득하였다.</p> <h2>형질전환 벼의 확인</h2> <p>형질전환 실험에서 얻어진 재분화 식물체는 먼저 1-sst 및 1-fft 유전자의 primer set에 의해 PCR 분석을 통해 1차적으로 형질전환 벼 유무를 확인하였다. 그 결과 얻어진 대부분의 재분화식물체는 유전자가 도입되어 band를 확인할 수 있었다 (데이터 미기재). 확인된 형질전환 벼는 순화과정을 통해 온실에서 T1 종자를 계통별로 수확하였다. 수확된 종자들은 hygromycin 배지에 파종하여 계통별 10개체씩 선발하였으며, 이들 계통들을 포장에 옮겨 후대를 육성하였다. 1-sst 및 1-fft 유전자를 도입한 형질 전환 벼에서 도입유전자의 도입 여부 및 copy수를 확인하기 위하여 Southern hybridization 방법에 의해 수행하였다. 그 결과 1-sst 및 1-fft 유전자가 도입된 T2 형질전환 계통들에서 안정적으로 벼 게놈에 single copy로 integration되었다(Fig. 3). Single copy로 1-sst 및 1-fft 유전자가 도입된 T2세대의 형질전환 계통들의 표현형은 거의 변화가 없었으며, 몇몇 계통에서 초장 및 엽색이 wild type에 비교해 볼 때, 왜성 및 진한 초록 등의 변화를 보였다. 이런 결과는 형질전환실험에서 세포가 기관 분화과정에서 흔히 볼 수 있는 표현형으로 생각된다.</p> <h2>형질전환 후대에서 유전자 발현</h2> <p>선발한 형질전환 계통들 중에서 정상적 표현형을 보인 계통을 대상으로 1-sst 및 1-fft 유전자의 발현을 RT-PCR 및 SDS-PAGE 분석으로 수행하였다. 1-Sst 유래 6 형질전환계통 및 1-fft 유래 3 형질전환계통으로부터 RT-PCR 분석한 결과 계통간의 발현량에서 약간의 차이를 보였으나, 조사한 모든 계통에서 발현 되 었다 (Fig. 4). 또한 1-sst와 1-fft 유전자가 강하게 발현 된 2계통 (S2, F3)을 선택하여 단백질 발현을 관찰한 결과 유전자가 삽입되지 않은 vector만을 발현시킨 대조구에서는 특이 밴드가 관찰되지 않았지만, 1-sst와 1-fft 유래 형질전환 벼 계통들 (S2, F3)에서 모두 특이 단백질이 관찰되었다 (Fig. 4).</p> <p>RT-PCR 및 SDS-PAGE 분석에 의해 1-sst 및 1-fft 유전자가 벼에 도입되어 안정적으로 발현하고 있는 양상을 볼 수 있었으나, 도입된 계통들간 유전자의 발현량을 조사하기 위해 semi-quantitative RT-PCR분석을 실시하였다. 1-sst 유전자 유래 형질전환계통들 (S1, S2, S5 및 S6)과 1-fft 유전자 유래 형질전환계통들(F1 및 F3)에서 도입 유전자의 발현량이 각각 다른 양상을 보였다. 1-sst 유전자 유래 형질전환 S2 계통은 대조구에 비해 약 12배, 형질전환 계통들에 비해 2~3배 정도 높게 발현되었다. 또한 1-fft 유전자 유래 형질전환 F3 계통은 대조구에 비해 약 18배, 형질전환 F1 계통에 비해 4배 정도 높게 발현되었다 (Fig. 5). 이런 결과로 미루어 볼 때 도입된 유전자가 벼 세포내에서 안정적으로 mRNA 및 protein으로 발현되고 있음을 시사한다. 특히 1-fft로 도입된 형질전환 벼의 경우 강하게 발현하고 있는 것으로 미루어 볼 때 벼에서 fructan polymer가 도입식물체에서 많이 만들어져 외부의 signal 에 저항성을 보일 것으로 생각되었다.</p>