스크리닝을 통한 A. niger 감염을 이용한 RT-PCR를 통해 10개의 DEGs 중 3개의 유전자(lysozyme, enbocin, unknown gene)가 누에에서 발현이 증가한다. 6개의 유전자는 약한 발현 증가만 보여주고, DEG 4는 미약하게 발현이 감소되는 것으로 확인되었다. Seegene의 ACP 기술을 기반으로 Differential Display-PCR법을 통해 A. niger에 의해 유도 발현되는 누에의 유전자를 분리, 동정하고자 하는 연구이다. 본 연구로부터 곤충의 혈림프에 존재하는 세균성 펩타이드인 lysozyme가 확인되었는데 높은 상동성을 보이고 A. niger에 의해 유도발현이 높은 DEG 9 는 보고되지 않은 유전자로 새로운 항 진균성 단백질의 발견 가능성을 기대해본다.
<p>1 차 스크리닝을 통해서 A. niger 감염에 의해서 발현이 증가 혹은 감소되는 상기 10 개 DEGs에대해서 RT-PCR을 수행하여 A. niger에 의한 유도 발현을 검증하였다. 여기에 사용된 primer는 Table 3과 같다. Internal control 유전자로 사용한 \( \beta \)actin의 발현량을 기준으로 하여 A. niger 처리 누에와 미처리 누에 사이의 RT-PCR 산물의 감도를 비교해서 보면, DEG 1 (lysozyme), DEG 2 (enbocin) 및 DEG 9 (unknown gene) 등 3개의 유전자가 A. niger의 감염에 의해서 누에에서 발현이 크게 증가하는 유전자로 최종 확인되었다. 하지만, DEG 3, 5, 6, 7, 8 및 10 등, 6 개의 유전자는 A. niger에 의한 유도발현이 미 처리군에 비해서 약한 발현 증가만을 보여주었다. 또한, A. niger에 의해 발현이 억제되는 DEG 4 (internal transcribed spacer 1)의 RT-PCR 결과는 미약하게 발현이 감소되는 것으로 확인되었다.</p> <p>본 연구는 PCR법을 이용하여 누에에 A. niger을 감염시킬 때 유도 발현되는 유전자를 동정하여 지금까지 보고되지 않은 항 진균성 단백질 또는 이와 관련한 유전자를 탐색하는 것이다. 유전자의 유도성 발현 차이를 확인하는 방법으로 최근에 많이 사용되는 DNA chip은 시험의 비용과 통계적 분석등 아직까지 연구에 적용하기 위한 접근성이 떨어지는 반면에 PCR을 응용한 방법은 발현의 차이를 직접 agarose gel에서 직접 비교할 수 있기 때문에 기존의 방법이 갖는 낮은 재현성과 높은 위양성율을 극복할 수 있는 장점이 있어 현재도 다양한 방법으로 응용되는 기술이다. 따라서 본 연구는 PCR 기법 중에서 Seegene사의 ACP 기술을 기초로 한 GeneFishing DEG Kit를 이용한 Differential Display-PCR법을 통해서 A. niger에 의해서 유도 발현되는 누에의 유전자를 분리, 동정하고자 하였다.</p> <p>본 연구로부터 분리 확인된 DEG 1은 곤충의 혈림프에 존재하는 \( 11 \sim 12 \mathrm { kDa } \) 의 분자량을 갖는 항 세균성 펩타이드인 lysozyme으로 H. cecropia의 lysozyme과 높은 상동성(E-value: 5e-83)을 보였다. Jolles 등은 H. cecropia에 서 분리한 lysozyme이 120개의 아미노산으로 구성되며 곤충의 다양한 체액성 면역기구를 구성하도록 attacin과 cecropin과 함께 상호 보안 작용을 한다고 보고하고 있다. 따라서 누에의 lysozyme이 A. niger에 의해서 유도 발현되는 것으로 보아 lysozyme이 세균에 의한 체액성 면역 뿐 아니라 곰팡이 감염에 대한 체액성 면역 기전에도 중요한 역할을 하는 것으로 추정할 수 있었다. 또한, A. niger에 의해서 과 발현이 유도되는 enbocin (DEG 2)은 cecropin family에 속하는 항 세균성 펩타이드로서 cecropin이 그람 음성 세균에 강한 활성이 있는데 반해 enbocin은 그람 양성 균에 강한 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 하지만, enbocin이 A. niger에 의해서 유도되어 과발현되며 항진균 활성이 있다는 보고는 현재까지 없는 바, 향후 enbocin에 대한 in vivo 항 진균 활성에 대한 검증이 필요할 것으로 생각한다. 마지막으로 RT-PCR을 통해서 A. niger에 의 한 유도발현이 가장 높은 DEG 9 는 현재까지 보고되지 않는 유전자로 앞으로 이 유전자에 대한 기능 연구를 통해 새로운 항 진균성 단백질의 발견 가능성을 기대해 본다.</p>