단백질 응집은 의학과 생명공학에서 중요한 문제로, 이는 치매 등의 질병 및 유전공학적 단백질 과량 생산 과정에서 흔히 발생한다. 본 연구에서는 트립토판 중합효소의 구조 및 특성을 분석하고, 응집의 원인을 탐색하기 위해 P28L 단백질의 구조적 변화를 조사하였다.
<h1>서 론</h1> <p>단백질 응집은 의학 및 생명공학의 주요한 문제 중의 하나이다. 치매 등의 질병들은 정상적으로는 수용성인 단백질이 비수용성인 단백질로 응집되면서 일어난다. 이는 또한 유전공학적인 방법으로 단백질을 과량 생산하는 과정에서도 흔히 일어난다. 트립토판 중합효소는 \( a_ { 2 } \beta_ { 2 } \) 복합체로 존재하며, 다음 반응( \( \alpha~ \beta \) 반응)을 촉매하여 L-tryto-phan를 합성한다.</p> <p>indole 3-glycerol phosphate \( + \) L-serine \( \leftrightarrow \) D-glyceraldehyde 3-phosphat \( + \) L-tryptophan \( + \mathrm { ~H } _ { 2 } \mathrm { O } \)<p> <p>\( \alpha \) 소단위체 \( ( \) 분자량 \( = 28,600 \mathrm { Da } ) \)는 트립토판 생합성에서 indole 3-glycerol phosphate를 indole과 D-glyceraldehyde 3-phosphat로 분해 \( (a \) 반응)하며, 조효소나 이황화결합을 가지고 있지 않아 폴딩 연구에 좋은 재료가 되고 있다. 트립토판 중합효소 \( a \) 소단위체는 잔기 1-188의 N-domain과 잔기 189-286의 C-domain으로 나누어진 두개의 폴딩 domain \( ( \alpha 1 \)과 \( \alpha \) 2)으로 구성되어 있다. 이를 밝혀진 barrel motif의 3차구조와 비교하면 N-domain은 N-말단으로부터 helix 5개와 sheet 6개로 이루어져 있고, C-domain( \( \alpha \) 2)은 3개의 helix와 2개의 sheet로 구성된다. 대장균의 트립토판 중합효소 알파 소단위체는 대장균내에서 유전공학적인 방법으로 과량 발현시켰을 때 수용성인 상태로 발현되나, 28번 잔기가 프롤린에서 류신으로 치환되었을 때 (P28L) 단백질이 응집형태로 대부분 존재한다. 본 연구에서는 응집의 원인을 규명하는 일환으로 P28L 단백질의 구조적인 변화를 조사하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약, 박테리아 및 플라스미드</h2> <p>모든시약은 순도가 높은 것을 Sigma사로부터 구입하여 사용하였다. 트립토판 중합효소 알파 소단위체의 대량발현은 trpA (tryptophan synthase \( \alpha \)-subunit) 유전자를 포함하는 플라스미드 ptactrpA를 사용하였다. 이 플라스미드는 D-젖당에 의해 대량발현하는 tac 전사조절인자를 가지고 있다.</p> <h2>단백질의 과량생산 및 정제</h2> <p>단백질의 과량발현은 플라스미드를 가진 대장균을 \( 20 \mathrm { ml } \) TYS (1 \% bactotrypton, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 0.5 \% \) NaCl) 배지에서 약16시간 배양한 후, 이를 새로운 \( 1 \ell \) TYS매재에 옮겨 2시간 후 젖당 (최종농도 \( 1 \% \))을 녛고 24시간 더 배양하였다. 대장균을 원심분리하여 용액을 제거하는 방법으로 2회 반복하여 여분의 배지성분을 제거하였다. 수확한 대장균을 같은 용액 \( 5 \mathrm { ml } \)에 현탁하고 초음파 파쇄기로 세포를 깬 후 원심분리 \( (24,000 \times \mathrm { g } , \) 20분 \() \)로 inclusion body인 침전물을 얻었다. 침전물을 같은 용액으로 3회 씻었다. inclu-sion body인 침전물을 얻은 후 \( 50 \mathrm { mM } \) TrisHCl, ph = \( \mathrm { pH } 7.8 \), \( 6 \mathrm { M } \) urea 용액에 용해시켰다. 용해되지 않은 것은 원심분리로 제거하였다. 용해된 단백질을 \( 10 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { KPO } _ { 4 } \) \(( \mathrm { pH } 7.8), 5 \) \( \mathrm { mM } \) EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), \( 10 \mathrm { mM } ~ \beta \) - mercaptoethanol, \( 0.2 \mathrm { mM } \) PMSF (phenylmethylsulfony-lfluoride) 용액에 투석하여 구조가 재형성되도록 하였다. 이로부터의 단백질 정제는 자연형의 단백질의 분리와 같은 방법으로 하였다. 정체 순도는 SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophosis) 방법으로 확인하였다.</p>