여과된 상등액은 배양된 세포주에 36일 동안 접종된다. 세포는 바이러스와 함께 배양했고 14일 동안 CPE를 관찰했다. CPE는 마우스 모노클로널 항체와 항마우스 IgG/FITC 용액으로 세포를 염색함으로써 간접 면역 형광을 사용하여 식별된다. 바이러스의 존재는 MPN 프로그램을 사용하여 정량화되었다. 검출한 바이러스의 정량은 양성과 음성시료의 결과를 기록지에 기입한 후 US EPA에서 공급한 MPN program을 사용하여 결과를 분석하였다.
<h3>세포배양 및 정량</h3> <p>여과시킨 상등액을 3 6일간 배양된 BGM 세포주에 접종하였다. 접종량은 바닥 면적당(cm") \( 0.04 \mathrm { ~m } \ell \) 가 넘지 않게 조절하여 결정하였다. 음성대조구 및 양성대조구는 각각 \( \mathrm { pH } \) 7.4의 \( 0.15 \mathrm { M } \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } \cdot 7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 용액과 순화된 polio-virus type 3 을 \( 0.15 \mathrm { M } \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } \cdot 7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } ( \mathrm { pH } 7.4) \) 용액으로 희석하여 시료 접종량과 동일하게 접종하였다. 바이러스 흡착을 위해 \( 80 \sim 120 \) 분간 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에 정치시키고, 15 \( \sim 20 \) 분 간격으로 흔들어 주었다. 세포 배양플라스크에 \( 2 \% \)혈청이 함유된 MEM/L-15 배지를 적절하게 분주한 후 37 \( { } ^ {\circ } \mathrm { C } \mathrm { CO } 2 \) 배양기에 배양하면서 14일간 CPE (Cytopathic \( \mathrm { Effect } \) 를 관찰하였다. 검출된 바이러스의 정량은 양성과 음성시료의 결과를 기록지에 기입한 후 US EPA에서 공급한 MPN program을 사용하여 결과를 분석하였으며, 원수는 \( 100 \mathrm { ~L } \), 수돗물은 \( 1,000 \mathrm { ~L } \) 를 기준으로 환산하였다.</p> <h3>면역형광 분석</h3> <p>2차 세포배양에서 CPE가 확인된 바이러스의 동정을 위해 간접적인 면역형광법으로 시헙하였다[26]. 먼저 슬라이드에 CPE가 확인된 monolayer의 세포를 PBS로 부유시켜 원심분리 한 후 cell pellet을 \( 0.2 \mathrm { ~m } \ell \) 의 PBS로 현탁하여 슬라이드에 cell spot (약 \( 2 \times 10 ^ { 4 } \) cell/m)을 만들고 공기중에서 완전하게 건조시켰다. 건조가 다 되면 \( 2 \sim 8 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 acetone으로 10 분간 슬라이드를 고정시켰다. 고정 후 형광염색은슬라이드를 상온에 두고 탐지하고자 하는 바이러스에 대한 mouse monoclonal antibody (CHEMICON Cat. No. 3303,3311, 3321, 3336, 3360)를 cell spot에 접종하여 습기가 충분한 chamber에 슬라이드를 넣고 37℃, 30분간 배양을 하였다. monoclonal antibody를 제거하고 PBS로 10～15초동안 조심스럽게 씻은 후 anti-mouse IgG/FITC (LightDiagnostics Catalog No. 5013)를 접종하였다. 다시 동일하게 습기가 충분한 chamber내에 슬라이드를 넣고 37℃, 30분간 배양하고 수용성 mounting media (pH 8.5)를 사용하여 커버슬립을 덮은 후 형광 현미경으로 FITC의 applegreen 색의 형광을 확인하였다.</p>