DNA methylation은 포유동물의 후천적인 기작으로서 세포의 분화, genomic imprinting, X-염색체불활성화, 노화 등의 조절에 관여하고 있다. promoter영역 내에는 CpG의 빈도가 정상적인 빈도보다 높은 CpG island가 있는데, 이는 발암과정에 깊이 연관되어 있다. 이에 본 연구에서는 인간의 유방암 세포주에서 암억제 유전자로 추정되는 유전자의 염기서열분석법을 통해 암세포에서 Dab2의 발현의 억제가 promoter의 CPG의 methylation과 관련되어 있는지를 조사하고자 하였다.
<p>DNA methylation은 포유동물 세포 내의 유전자 발현을 조절하는 후천적인 기작(epigenetic mechanism)이다. 인간을 비롯한 대부분의 포유동물에서 methylation은 CpG의 cytosine에서만 관찰된다. DNA methylation은 세포의 분화, genomic imprinting, X-염색체불활성화(X-chromosome in-activation), 노화(aging) 그리고 발암과정(carcinogenesis)과 같은 다양한 세포 기능의 조절에 관여하고 있는 것으로 알려 져 있다. 암세포에서는 DNA의 CpG의 methylation은 methyl-CpG binding protein (MeCP) 과 histone deacetylase(HDAC) 그리고 공동억제자인 mSin3A를 그 부위로 끌어들여 복합체를 형성하여 전사인자(transcription factor)의 복합체의 형성을 차단하게 함으로서 유전자의 전사(gene tran-scription)를 억제시키는 것으로 알려져 있다.</p> <p>유전자의 promoter영역 내에는 CpG의 빈도가 정상적인 빈도 \( (\sim 6 \%) \) 보다 현저하게 높게 관찰되는 CpG island가 존재 하고 인간의 유전자의 \( 60 \% \) 이상이 CpG island를 가지고 있는 것으로 알려겨 있다. 이 CpG island가 methylation되면 그 유전자는 영구적으로 불활성화되고 이 불활성화 상태는 유사분열을 통하여 딸세포로 전달되게 된다.</p> <p>인간의 CpG site의 \( 70 \sim 80 \% \) 는 methylation이 되어 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 이런 methylation의 대부분은 CpG의 빈도가 낮은 부위나 Alu element와 같은 반복서열이 존재하는 부위에서 일어나고 대부분의 CpG island는 methylation되어있지 않다. 그러나 암세포주에서는 다양한 암억제 유 전자(tumour suppressor genes)의 promoter 영역내의 CpG island가 hypermethylation되어 있고 이들 유전자의 전사가 일어나지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서 이런 유전자들의 CpG island의 methylation이 발암과정(carcinogenesis) 에 깊게 연관되어 있는 것으로 추정되고 있다.</p> <p>포유류의 Disabled-2 (Dab2)는 mitogen에 의해서 인산화되는 단백질(phosphoprotein)이다. Dab2는 유방과 난소의 정상세포에서는 발현이 되지만, 약 \( 85 \% \) 의 유방과 난소의 종양세포에서는 발현이 줄어들거나, 발현이 완전히 억제되는 것으로 알려져 있다.</p> <p>최근 연구에서 Dab2는 adaptor protein인 Grb2의 proline-rich domain (SH3 domain)과 결합하는 것으로 알려져 있으며, Dab2는 Grb2와 결합하기 위해 Sos와 경쟁하여 Grb2-Dab2 복합체를 형성한 후, growth factor/Ras 신호전달경로를 조절하는 것으로 추정되고 있다. Extracellular signal-regulated kinases (Erk)로 알려진 mitogen-activated kinases (MAPK)는 Ras의 신호전달 경로에 있어서 중요한 하류의 표적이다. MAPK 전달경로는 세포 성장, 분화 그리고 발생 및 신경전달 경로에서 이용되고 있는 중요한 신호전달 체계중 하나이다. Ras와 MAPK는 혈청(serum)과 성장인자(growth factor)에 의해 활성화되고 이들 MAP kinase의 인산화에 의해서 c-Fos가 발현된다. 암세포에서 Dab2의 발현은 c-Fos의 발현을 억제하여 세포성장을 억제하는 것으로 알려져 있다. 그렇지만 놀랍게도 Dab2는 MAPK의 활성을 억제하지는 않는 것 으로 나타나 Ras/MAPK 신호전달체계에 의해서 c-Fos가 발현되는 경로와는 다른 경로를 통하여 c-Fos의 발현을 억제하 여 세포성장을 조절하는 것으로 보인다. 따라서, Dab2 는 유방암과 난소암 세포에서 암 억제 유전자로 추정되어 지고 있다. 이미 알려진 Rb, p15, p16, p53, p73, VHL, maspin과 같은 암억제 유전자는 여러 종류의 세포주에서 모두 promoter부위의 많은 CpG에 methylation이 되어있음이 이미 보고되어 있다.</p> <p>따라서, 본 연구에서는 인간의 유방암 세포주에서 암억제 유전자로 추정되는 human Dab2유전자의 promoter부위를 bisulfite 반응에 의한 염기서열분석법과 methylation-specific PCR (MSP) 방법 등을 이용하여 유방암세포주인 MDA MB-231 세포에서 분석하여 암세포에서 Dab2의 발현이 억제되는 현상이 promoter의 CPG의 methylation과 관련되어 있는지를 조사하고자 하였다.</p>