시료의 free radical 소거 활성은 stable radical인 1,1-di-phenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)에 대한 환원력을 측정하였으며, ABTS radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS cation decolourisation assay방법에 의하여 실시하였다. 활성화된 혈소판의 피브리노겐 또는 콜라겐에의 부착은 Tsuzynski 방법에 따라 측정하였다. 실험은 3-5회 반복 시행되었으며, 결과는 평균 \( \pm \)SEM 또는 SD로 나타냈고, 두 그룹 사이의 유의차는 unpaircd Student's t-test에 의하여 \(\mathrm{p}<0.05\) 수준에서 검정하였다.
<h2>DPPH free radical-scavenging 활성 측정</h2> <p>시료의 free radical 소거 활성은 stable radical인 1,1-di-phenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)에 대한 환원력을 측정한 것으로, 메탄올에 각 시료를 녹여 농도별로 희석한 회석액 \( 0.8 \mathrm{ml} \)와 메탄올에 녹인 \( 0.15 \mathrm{mM} \) DPPH (Sigma Chemical Co. Chicago, IL, USA) 용액 \( 0.2 \mathrm{ml} \)를 가하여 실온에 30분 방치한 후 \( 517 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 추줄물의 유리라디칼 소거활성은 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 \( \mathrm{RC}_{50} \) 값으로 나타내었다. 이때 상대활성의 비교를 위하여 대조군으로 \( 25 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) butylated hydroxyanisole (BHA)를 사용하였으며 모든 실험은 3회 반복 측정하였다.</p> <h2>ABTS free radical-scavenging 활성 측정</h2> <p>ABTS radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS cation decolourisation assay방법에 의하여 실시하였다. \( 14 \mathrm{mM} \) ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) 용액과 \( 4.95 \mathrm{mM} \) 과황산칼륨을 1: 1로 섞고 실온 어두운 곳에서 에서 24시간 보관하여 ABTS radical을 만들고, ABTS radical은 \( 732 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도 값이 \( 0.7 \pm 0.02 \)가 되도록 PBS (phosphate buffer saline, \( \mathrm{pH} 7.4\))로 희석하여 사용하였다. 희석된 용액 \( 990 \mu \)와 \( 10 \mu \mathrm{l} \)의 ABTS radical을 섞고 1분 후 \( 732 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 \( \mathrm{RC}_{50} \) 값으로 나타내었으며, trolox \( (10 \mathrm{mM}) \)를 대조군으로 사용하였다.</p> <h2>혈소판 부착 억제능 측정</h2> <p>활성화된 혈소판의 피브리노겐 또는 콜라겐에의 부착은 Tsuzynski 방법에 따라 측정하였다. 세척하여 얻은 혈소판은 농도별 시료와 (10, 25, 50, 100, \(200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\)) 함께 또는 혈소판 만(대조군)을 \( 100 \mu\mathrm{l}\) 씩 각각의 well에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 보관한 후 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 트롬빈 \( (0.2 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) \)으로 혈소판은 활성화 시켰다. 96-well plate는 콜라겐 \( \left(40 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\right. \) in \(0.05 \%\) \(\mathrm{CH}_{3} \mathrm{COOH}\))이나 피브리노겐 \( (2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) in PBS, \( \mathrm{pH} 7.5) \)으로 상온에서 2-3시간 코팅한 후 PBS로 3회 세척, \( 1 \%\) BSA를 포함한 PBS와 1시간 보관, 3회 세척을 반복하였다. 이에 따라 96-well plate 바닥에 부착하지 않은 혈소판은 세척 과정에서 제거되고, 부착된 혈소판은 \( 200 \mu \)의 bicinchoninic acid working solution (Sigma)에 현탁시켜서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응 후 \( 562 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 Spectramax 340 microplatele reader (Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다.</p> <h2>통계</h2> <p>모는 실험은 3-5회 반복 시행되었으며, 결과는 평균 \( \pm \)SEM 또는 SD로 나타냈으며, 두 그룹 사이의 유의차는 unpaircd Student's t-test에 의하여 \( \mathrm{p}<0.05 \) 수준에서 검정하였다.</p>