Parkin 단백질의 N-말단과 C-말단 tag를 인지하는 antibody로 HEK293 세포에서 발현되는 Parkin을 immunoblot 한 결과, 48 \( \mathrm { kDa } \) fragment가 N-말단이 절단된 Parkin 단백질임을 알 수 있었다. Protease의 공격에 민감한 반응을 보이는 Parkin의 ULD.
<p>N-말단이나 C-말단 tag을 인지하는 antibody로 HEK293 세포에서 발현되는 Parkin을 immunoblot 한 후, 단백질의 크기를 비교 분석한 결과 48- \( \mathrm { kDa } \) fragment는 N-말단이 절단된 Parkin 단백질임을 알 수 있었다. 이는 Parkin의 N-말단으로부터 10 \( \mathrm { kDa } \) 떨어진 ULD에 존재하는 아미노산 부위에서 절단된 fragment임을 알 수 있다. 또한 대장균에서도 Parkin을 발현하여 Glutathione 4B bead로 결합시킨 후 전기 영동을 한 결과 여러 fragment 중 38 \( \mathrm { kDa } \) 크기의 밴드가 많은 양 관찰된다. 따라서 이 38- \( \mathrm { kDa } \) fragment는 GST의 C-말단에 Parkin의 N-말단의 10- \( \mathrm { kDa } \) fragment가 결합되어 생성된 것이라는 것을 추론할 수 있다. 이는 대장균에서나 포유류 세포에서 Parkin의 ULD가 protease의 공격에 민감하게 반응할 수 있다는 것을 시사한다.</p> <p>PEST 부위(proline (P), glutamate (E), serine (S), threo-nine (T)) 를 많이 가진 단백질들은 proteolysis signal을 전달 하는데, Parkin의 경우도 이런 부위로 인해 절단될 가능성이 높다. 이를 알아보기 위해 PEST find program (https://emb1.bcc.univie.ac.at/toolbox/pestfind/pestfind- analy-sis-webtool.htm)을 이용하여 Parkin 아미노산 서열을 분석하였다. 그 결과 Parkin 단백질 내에 7군데의 poor PEST se-quence가 존재하는데, Parkin의 N-말단(76 89 아미노산 잔기)에 위치하는 PEST sequence가 protease에 의해 공격을 받으면 약 10 \( \mathrm { kDa } \) 크기의 fragment가 생성될 가능성이 있다.</p> <p>또한 대장균 내에서 Parkin을 발현 시키는 경우 온도 변화에 따른 38- \( \mathrm { kDa } \) fragment의 양적 변화는 PEST 부위가 온도에 민감하게 작용할 수 있다는 가능성을 제시한다. 대장균 내 여러 protease 중 50 \( \% \) 가 세포질에 존재하고 있는데, 세포질 내에서 발현되는 Parkin은 이러한 효소에 쉽게 노출되어 일반 호소활성 온도인 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 poor PEST 부위가 공격을 받아 쉽게 분해될 수 있다. 이를 증명하기 위해 분해 가능성 있는 부위의 아미노산의 돌연변이를 통해 Parkin의 절단부위와 protease와의 상관관계를 규명하는 연구가 필요하다. 최근 Parkin의 1에서 6의 아미노산 잔기가 Parkin 유전자의 발현에 중요한 역할을 하고, ULD가 없는 경우 E3 ligase 기능에는 영향을 미치지는 않지만 ULD가 있는 경우보다 발현 양이 증가한다는 보고가 있다. 따라서 외부 자극에 의해 Parkin에 존재하는 PEST sequence 부위가 절단되는 현상은 세포 내 Parkin의 발현과 기능을 조절하는 또 다른 기전으로 작용할 수 있는 가능성을 제시한다.</p>