본 논문은 NO 생성 억제 활성을 측정하고자 RAW 264.7 세포를 24-well plate에 \(8.0\times10^{4}\mathrm{cells}/\)well의 농도로 분주하여 하루 동안 전 배양한 후 희석한 HCW0811와 LPS를 동시 처리해 동일한 배양 조건에서 24시간 동안 염증을 유도했다. 또한 같은 과정을 거친 후 회수한 상등액에 존재하는 \(\mathrm{PGE}_{2}\)의 함량은 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay kit를 활용해 측정했다.
<h2>\( \mathrm { NO } \) 생성 억제 활성 측정</h2> <p>RAW 264.7 세포를 24 -well plate에 \( 8.0 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { cells } / \) well의 농도로 분주하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 24시간 동안 전 배양한 후 희석한 HCW0811 \((12.5,25,50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \) 와 LPS \( (1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \)를 동시 처리하여 동일한 배양 조건하에 24시간 동안 염증을 유도하였다. 이후 세포배양 상층액 \( 100 \mu \mathrm { L } \) 와 Griess 시약 \( [1 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) sulfanilamide, \( 0.1 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) naphylethylenediamine in \( 2.5 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) phosphoric acid] \( 100 \mu \mathrm { L } \) 을 96-well plate에서 동량 혼합하여 10분간 암반응 시킨 후 ELISA reader를 사용하여 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 파장에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Prostaglandin \( \mathrm { E } _ { 2 } \left ( \mathrm { PGE } _ { 2 } \right ) \) 생성 억제 활성 측정</h2> <p>RAW 264.7 cell 을 24 -well plate에 \( 8.0 \times 10 ^ { 4 } \) cells/well 농도로 분주한 뒤 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 24시간 동안 전 배양 한 후 LPS \( (1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \) 와 희석된 HCW0811 \( (12.5,25,50 \) \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) )를 동시 처리하여 동일한 조건하에 24시간 동안 염증을 유도하였다. 반응 종료 후 세포배양 상층액은 centrifuge \( (10,000 \) \( \mathrm { rpm } , 3 \mathrm { ~min } \) ) 하여 침전물을 제거하였으며 회수한 상등액에 존재하는 \( \mathrm { PGE } _ { 2 } \) 의 함량은 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R \&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 측정하였다.</p>