16S rDNA 염기서열을 통해 미생물 균주의 다양성을 분석하고자 하는 연구로, 1% agarose gel 전기영동과 QIAquick PCR purification kit, 3130XL Genetic analyzer DNA sequencing 기기, BioEdit (7.0.0 version), EzTaxon (server 2.1)program, BLAST search를 사용하여 두 연안 양식장의 퇴적물과 피조개 샘플에서 배양 가능한 모든 미생물을 분리·동정하고 16S rDNA 염기서열을 결정하여 미생물 균총의 다양성을 분석하였다.
<h2>16S rDNA sequencing 및 미생물 다양성 분석</h2> <p>16S rDNA 증폭산물의 유무와 크기를 ethidium bromide (EtBr)를 포함하는 1 \% agarose gel 전기영동으로 band를 확인한 뒤, QIAquick PCR purification kit (QIAGEN, German)를 이용하여 PCR 산물을 정제하고 순도 및 농도를 계산하였으며, 3130XL Genetic analyzer (Applied Biotechnology, USA)DNA sequencing 기기를 이용하여 \( 16 \mathrm { ~S } \mathrm { rDNA } \) 의 염기서열을 결정하였다. 획득한 염기 서열은 BioEdit (7.0.0 version)을 이용하여 비교, 분석 및 정리를 하였으며, EzTaxon (server 2.1)program (http://www.eztaxon.org/)과 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) search를 이용한 NCBI (National Center for Biotechnology Infromation)의 GeneBank database를 이용하여 가장 유사도가 높은 미생물을 선정하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>배지에 따른 균주의 다양성</h2> <p>특정 미생물을 다른 미생물과 분리·동정하거나, 미생물 군집의 다양성을 연구하는 방법은 매우 다양하다. 일반적으로 환경 샘플에서 미생물을 분리할 때, 균체의 형태학적 특징 또는 생화학적 특징 등의 표현형질로써 분리하고 있으나, 많은 연구 결과에서 균체의 표현형질로써 균주를 분별하는 방법은 그 위험성이 매우 크다고 알려져 있으며, 이러한 방법은 형태학적 표현형이 같더라도 전혀 다른 균으로 밝혀지거나 특징의 패턴이 알려지지 않았다면 균의 동정이 어렵다고 보고되고 있다. 따라서 본 연구에서는 이러한 문제점을 극복하고자 두 연안 양식장의 퇴적물과 피조개 샘플에서 획득한 배양이 가능한 모든 미생물을 분리, 선별하였고 이러한 균주의 16S rDNA 염기서열을 이용하여 미생물 균총의 다양성을 분석하고자 하였다.</p> <p>미생물 균총 연구를 위한 다양한 배지가 알려져 있으며, 그 중에서 marine 또는 R2A배지는 해양환경유래의 미생물의 연구를 위해 가장 추천되는 배지이다[6]. 따라서 두 종류의 배지를 이용하여 두 해역의 퇴적물 및 피조개 체내에서 배양 가능한 약 2,000 여 점의 미생물을 분리하였으며, 그 중 1,052 개의 개체에서 알파 또는 베타 용혈활성을 확인하였다. 1,052 개의 개체 중 marine배지에서 287개의 알파 또는 베타 용혈활성을 보이는 미생물을, R2A배지에서 765 개의 알파 또는 베타 용혈활성을 나타내는 미생물을 선별하였으며, 선별된 1,052 개의 균주 중에는 1,050 개의 샘플은 다양한 세기의 베타 용혈활성을 보였으며, 단 두 개의 샘플에서만 알파 활성을 확인 할 수 있었다. Marine배지를 이용하여 분리한 균주의 경우 강한 베타용혈활성을 보이는 샘플은 163 개였으며, 알파용혈활성을 보이는 샘플은 없었으나 124 개의 샘플에서 약한 베타 용혈활성을 나타내었다. R2A 배지의 경우 486 개 균주에서 강한 베타 활성을 보이고 두 균주에서 알파활성을 보였으며, 나머지 277 균주의 샘플에서는 약한 베타 활성을 보임을 알 수 있었다.</p>