이 연구에서는 6종류의 배지를 이용해 멸치젓과 새우젓에서 분리한 총 610개의 세균 콜로니의 16S rDNA를 분석하고, 젓갈에 존재하는 세균의 다양성을 평가했다. 결과적으로 42속, 104종의 세균이 발견되었으며, 멸치젓에서는 Bacillus 속, 새우젓에서는 Staphylococcus 속이 우세한 것으로 확인되었다. 젓갈 숙성에 영향을 미치는 세균의 역할을 밝히기 위해, 단백질 분해 활성을 보이는 고염 환경에서 성장하는 세균을 분리하고, 우점균의 고염 환경에서의 성장을 검토했다.
<p>본 연구그룹은 최근에 6종류의 배지를 이용하여 멸치젓과 새우젓으로부터 분리한 총 610 colony의 16S ribosomal RNA 유전자(16S rDNA) 분석에 의한 계통발생학적 동정을 통해 두 젓갈에 존재하는 bacteria의 다양성을 평가하였다. 총 42속, 104종(species) bacteria의 존재가 밝혀졌고, 멸치젓에서는 Bacillus 근연 속이, 새우젓에서는 Staphylococcus 속이 우점하는 것으로 나타났다.</p> <p>본 연구에서는 젓갈의 숙성에 미치는 bacteria의 역할 규명을 목표로 고염에서 생장하며 단백질 분해활성을 나타내는 bacteria를 분리하여 젓갈 숙성에 가장 큰 영향을 미칠 것으로 추정되는 우점균의 고염환경에서의 생장을 검토하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>젓갈 시료 및 고염에서 생장하는 bacteria 선발</h2> <p>호염성 또는 내염성 bacteria 분리를 위한 멸치젓과 새우젓은 수원시 소재 재래시장에서 각각 4종씩 구입하였고, 멸균한 거즈로 걸러 분리한 젓갈시료의 여액을 bacteria 선발에 사용하였다. 여액은 멸균한 생리식염수를 이용하여 bacteria의 분리가 가능한 농도로 희석한 다음, 고체배지에 도말하여 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 48시간 이상 배양하며 관찰하였다. Bacteria 분리에 사용한 배지는 1.5%(w/v) 한천을 첨가한 nutrient medium(Difco, USA)과 marine medium(MBcell, Korea)을 사용하였고, 각 배지의 NaCl 최종농도는 8%(w/v) 또는 15%(w/v)가 되도록 첨가하였으며, 단백질 분해활성 보유 균주 선발을 위해 2%(w/v)의 skim milk(Difco)를 각 배지에 추가로 첨가하였다. 가능한 다양한 colony의 선발을 위하여 각 배지에서 생장한 colony들 중, 외관상 크기, 색, 모양 그리고 skim milk 분해에 의한 투명환(clear zone) 생성 여부 등의 형태학적 특성에 따라 각 시료 당 5개 정도의 colony를 선발하였고, colony 선발과정과 동일한 배지를 사용하여 순수분리하였다. 여액의 NaCl 농도는 식품공전에 따라 측정하였고, pH는 pH meter를 사용하여 측정하였다.</p> <h2>선발 균주의 동정</h2> <p>선발된 bacteria는 16S rDNA 염기서열 분석에 의해 계통발생학적으로 동정하였다. 분리된 bacteria의 16S rDNA 증폭은 DNeasy tissue kit(Qiagen, Germany)을 이용하여 추출된 DNA를 PCR 하거나 colony PCR 을 이용하여 수행하였다. PCR 증폭에 사용된 primer는 다양한 미생물의 증폭에 사용되는 eubacterial universal primer 27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)와 1492R(5'-GGT TAC CTT GTT AGG ACT T-3’)을 사용하였다. PCR 반응은T3000 Thermocycler (Biometra, Germany)를 사용하였고, 50 \( \mu \mathrm { L } \) PCR 반응계에는 template DNA 또는 소량의 colony, 100 mM dNTP, 1 U Taq polymerase(Roche, Germany), 20 pmol의 primer를 첨가하였다. PCR 반응은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5분간 예비가열 후, \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서에서 1분간 변성, \( 57 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서에서 1분 annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서에서 1분 중합반응의 과정을 30회 반복하였고, 마지막에 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서에서 5분간 처리한 후 반응을 중단시켰다. 증폭된 PCR 산물은 PCR product purification kit(SolGent, Korea)을 사용하여 정제한 후, 수탁업체(SolGent)에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)와 EzTaxon server 2.1에 등록된 염기서열 정보를 대상으로 nucleotide blast search를 통해 계통발생학적 분석을 수행하였다. Database에 등록된 표준균주(type strain)와 가장 높은 상동성을 나타내는 분류군을 해당 염기서열에 해당하는 bacteria로 동정하였다.</p>