까마중 식물체의 잎 절편을 건조한 후 공동배양배지에서 2일간 배양한 후 재분화 선발배지로 옮겨 8주간 배양해 신초를 형성시켰다. 형성된 신초는 \( \operatorname { merB } \) 유전자가 확인된 신초들만 뿌리 유도 배지로 이식해 발근시켰고, 발근된 까마중 식물체의 잎으로부터 genomic DNA를 추출해 \( \operatorname { merB } \) 유전자 증폭 밴드 유무를 확인했다. 또한 RNA 발현을 확인하기 위해 RNA를 추출해 RNA \( 30 \mu \mathrm { g } \) 을 \( 1 \% \) formaldehyde 겔에 전기영동하여 나일론 membrane으로 전이하여 NBT/BCIP에 의한 발색 정도를 관찰했다.
<h2>형질전환</h2> <p>공동배양을 위해 \( 0.85 \% \mathrm { NaCl } \) 로 세척한 Agrobacterium tumefaciens 현탁액에 \( 0.5 \mathrm { ~cm } \times 0.3 \mathrm { ~cm } \) 크기로 자른 잎 절편을 넣고 10 분간 공동배양 한 후 잎 절편을 멸균된 여과지에서 10 분간 건조 시겼다. 건조된 잎 절편을 공동배양배지에서 (MS, sucrose 3 \%,2 mg/L 2,4-D) 2일간 배양한 후 재분화 선발배지 (MS, sucrose \( 3 \%, 40 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) hygromycin, \( 500 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) carbenicillin, \( 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \mathrm { NAA } , 1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \mathrm { BA } ) \) 로 옮기고 8주간 배양하여 신초를 형성시켰다. 형성된 신초는 PCR로 \( \operatorname { merB } \) 유전자를 확인하고 유전자가 확인된 신초돌만 뿌리 유도배지(1/2 MS, sucrose \( 1 \%, 40 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) hygromycin, \( 500 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) carbenicillin, \( 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \mathrm { IBA } \) 에 이식하여 발근시켰다.</p> <h2>유전자 발현 확인</h2> <p>항생제가 포함된 선발배지에서 자라는 식물체에 \( \operatorname { merB } \) 유전자가 도입되어 발현되는지 확인하기 위하여 PCR과 northern blot analysis를 실시하였다. 발근된 까마중 식물체의 어린잎으로부터 genomic DNA를 추출하였다. PCR 조선은 I단계: \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } 2 \) 분, 2 단계: \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } 20 \) 초, 3단계: \( 58 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 40초, 4 단계: 7 \( 2 ^ {\circ } \mathrm { C } 80 \) 초, 5 단계: \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } 10 \) 분이며, 2, 3, 4단계가 34 번 반복되도록 하였다. PCR 반응에 사용된 merB 유전자의 primer는 merB-F: 5'-CGT CGA GGA AGT TAA GCA AGT CC-3', merB-R: 5'-AAC GCT CGA CTC AGG GTG TTG G-3'을 사용하였다. PCR 산물은 \( 1 \% \) 아가로스 겔에 로딩 (loading)하여 merB 유전자 증폭 밴드 유무를 확인하였다. 또한 RNA발현을 확인하기위하여 충 RNA를 추출하여 정량한 RNA \( 30 \mu \mathrm { g } \) 을 \( 1 \% \) formaldehyde 겔에 전기영동하여 나일론 membrane (Schleicher \& Schuell, Japan)으로 전이시켰다 (Turbo blotter system, Schleicher \& Schuell). 전이된 RNA를 고정시키기 위하여 UV crosslink \( \left (1200 \times \mu / \mathrm { cm } ^ { 2 } \right ) \) 를 2 회 실시하고 이 membrane을 DIG easy hybridization solution (Roche, Germany)으로 6 \( 8 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1시간 정도 pre-hybridization 한 다음 PCR Dig Labeling Mix (Roche)와 제공된 제작방법에 따라 만든 probe로 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 6 시간 이상 hybridization시켰다. Membrane을 \( 2 \times \mathrm { SSC } , 0.1 \% \) SDS-buffer로 세척한 다음 Dig detection kit(Roche)와 제공된 방법으로 NBT/BCIP에 의한 발색 정도를 관찰하였다.</p>