청주시 무심천 토양에서 채취한 시료에서 항생물질을 생산하는 PS 균주를 분리하였다. 해당 균주는 특정 배지와 조건에서만 항생물질을 생성하였으며, 최대 항생물질 생성 시점은 접종 후 16시간이었다. 또한, 배양액을 추출하고 분획한 결과 소수성 분획에서 생육 저해능이 나타났으며, 이 화합물은 고온에도 안정하였다.
<p>우선 미생물의 생육을 억제하는 항생물질 생산 균주를 찾기 위하여 충북 청주시 무심천 주변 토양에서 시료를 채취하였고, 멸균한 \( 0.85 \% \mathrm{NaCl} \) 용액 \( 10 \mathrm{ml} \) 에 시료 \( 1 \mathrm{~g} \) 을 넣어 섞은 후 LB 평판배지에 도말하여 형태적으로 다른 균주들을 순수 분리하였다. LB 및 YM 평판배지 중앙에 분리 균주를 획선 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 일간 배양한 다음, 양쪽에 대상 균주들을 접종하고 다시 1일간 배양하면서 Staphylococcus aureus KCTC 1621과 Bacillus cereus KCTC 1012 등의 Gram 양성세균 생육을 효과적으로 억제하는 PS 균주를 선발하였다. 분리한 PS 균주는 API 20NE kit (Biomérieux, France)를 이용하여 동정시험을 하였고, \( 16 \mathrm{~S} \mathrm{rRNA} \) 유전자 염기서열 분석 결과를 EzBiocloud database에서 BLAST search하였을 때 type strain인 P. otitidis MCC 10330과 1458 염기 중 1 염기가 다른 \( 99.93 \% \) 의 상동성을 보여 \( P \). otitidis PS로 명명하였고, NCBI Genbank에 제출하였으며 accession number는 MG 589936이다.</p> <p>Soybean meal과 glucose로 조성된 배지에서 \( 32^{\circ} \mathrm{C}, 240 \mathrm{rpm} \)으로 20 시간 진탕 배양하면 PS 균주는 항생물질을 생산하였으나, LB 배지에서는 전혀 생산을 보이지 않았다. 배양시간 별로 균 생장을 조사하기 위해 시료를 채취하여 \( 0.85 \% \) saline에 희석하고 이를 \( \mathrm{LB} \) 평판배지에 도말하여 24 시간 배양 후의 생균수(colony forming unit \( / \mathrm{ml} \) )를 측정하였다. 그리고 생산된 항생물질의 농도를 비교하기 위하여 이중 평판법에 따라 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 의 \( 1.5 \mathrm{ml} \mathrm{PCA} \) 상층배지에 미리 전 배양한 S. aureus \( \mathrm{KCTC} 1261 \) 균액 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 를 섞어서 \( \mathrm{PCA} \) 하층 평판 배지 위에 붓고 \( 8 \mathrm{~mm} \) stainless cylinder를 놓은 다음, 시간 별로 채취한 배양 상등액 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 를 가하고 24 시간 배양하면서 나타나는 생육 억제환의 직경을 조사하여 Fig. 1 과 같은 결과를 얻었다. 접종 후 8 시간이 지나 PS 균주의 생장이 대수기 후반부를 지나면서 항생물질의 생산이 보이기 시작하여 16 시간에서 최대가 되었고 더 이상 크게 증가하지 않았으며, PS 균주가 생산하는 항생물질은 2 차 대사산물임을 알수 있었다. Soybean meal과 glucose 양을 다양하게 조정하여 배양한 결과(Table 1) soybean meal의 농도를 \( 1.0 \% \) 로 하고 glucose를 첨가하지 않은 배지에서는 항생물질의 생산이 적었으나 \( 0.5 \% \) 첨가하였을 때 생육 억제환의 크기가 \( 22 \mathrm{~mm} \) 를 넘어 최대 생산을 보였다. Glucose와 soybean meal의 농도를 더 높이면 항생물질 생산은 오히려 억제되었으며, 배지에 \( \mathrm{FeCl}_{3} \) 를 첨가하면 생산량은 증가하였고 반대로 철분을 흡착하는 \( 2,2^{\prime} \)-dipyridyl을 \( 0.2 \mathrm{mM} \) 이상 첨가하면 항생물질 생산을 전혀 보이지 않는 것으로 보아 \( \mathrm{Fe}(\mathrm{III}) \) 와의 연관성을 알 수 있었다. 효과적으로 항생물질을 생산하는 조건에서 PS 균주를 배양한 다음, \( 10,000 \times g \) 에서 15 분간 원심 분리하여 얻은 상등액을 농축하기 위하여 ethyl acetate를 동량 가하여 추출하였으며, 감압 하에서 용매를 제거하고 소수성 분획은 ethanol로, 그리고 친수성 분획은 증류수로 용해시켰다. 대상균의 생육 저해 여부를 조사한 결과 소수성 분획에서만 저해능이 나타났으며, \( 121^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 분간 가열하여도 생육 저해능은 유지되어서 내열성이 있는 안정된 화합물로 판단하였다. PS 균 배양액 \( 100 \mathrm{ml} \) 를 ethyl acetate로 추출하여 최대 \( 100 \mathrm{mg} \) 의 건조 중량을 얻어서 약 \( 0.1 \% \) 의 수율을 보였으며, 이를 ethanol에 용해하여 \( 40 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 조정하였다. Ethyl acetate로 추출한 소수성 분획의 성분 분포를 알아보기 위하여 HPLC (LC- \( 20 \mathrm{~A} \), Shimadzu, Japan)를 통하여 분석하였다.</p>