rm { PCR } \) 생성물은 \( \mathrm { EcoRI } \) 및 \( \mathrm { XhoI } \) 사이클로플라즈마 효과를 이용하여 pGEX-4T-1 expression vector와 자동 연결되어 plasmid인 pGEX-MIF를 제조하였다. 인간 MIF cDNA를 5' MIF primer와 3' MIF primer를 이용하여 PCR로 증폭하여, EcoRI 및 XhoI 사이클로플라즈마 효과를 이용하여 pGEX-4T-1 expression vector와 자동 연결하여 pGEX-MIF를 제조하였다. MIF 단백질의 발현을 1mMIPTG를 넣어 대장균을 수거하여 buffer A (50mM Tris- \mathrm { HCl } , \mathrm { pH }HCl,pH 7.4, 15 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } ) 4 \mathrm { ml }15mMNaCl)4ml 에 용해시킨후 초음파로 용해하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>Plasmid 제조</h2> <p>대장균에서 MIF를 GST 융합' 단백질로 발현하기 위하여, 선행연구에서 제작한 C-말단에 FLAG epitope tag을 갖고 있는 pGEX-4T-1 expression vector를 이용하였다19]. 인간 MIF complementary DNA (cDNA, GenBank accession number AF 469046)는 인간 brain cDNA library를 주형으로 하여 \( 5 ^ {\prime } \mathrm { MIF } \) primer (5'-GOGCGAATTCGCCATGCOGATGITCATCGTA-3')와 3' MIF primer (5'-GCGCAGATCTGGTACCGGCGAAGGT \( \left . \mathrm { GGAGTT } -3 ^ {\prime } \right ) \) 를 이용하여 \( \mathrm { PCR } \) 로 증폭하였다. 이 \( \mathrm { PCR } \) 에는 pfu DNA polymerase (Stratagene, La Jolla, USA)를 이용하였다. 증폭된 full-length MIF의 \( \mathrm { cDNA } \) 를 \( \mathrm { EcoRI } \) 과 \( \mathrm { KpnI } \) 제한효소로 잘라 pGEX-4T-1 plasmid에 삽입시켜 pGST-MIFFLAG plasmid를 재조하였다. DNA sequencing으로 cloning된 \( \mathrm { MIF } \) 의 염기서열의 정확성을 확인하였다. \( \mathrm { pET11b-MIF } \) 는 R. Bucala로부터 제공 받았다.</p> <h2>MIF 단백질들의 발현 및 정제</h2> <p>MIF 단백질은 특정 protease를 가지고 있지 않은 BL21 (DE3) [F ompT hsdS \( \left . \left (r_ { B } m_ { B } \right ) \mathrm { gal } \mathrm { dcm } \right ] \) 균주에서 \( 1 \mathrm { mM } \) isopropyl-1-thio-B-D-galactoside (IPTG, AMRESCO, Solon, USA) 조건 하에서 발현을 유도하였다. pET11b-MIF plasmid를 함유하고 있는 대장균을 \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도의 ampicillin을 포함하는 LB 배지 \( 20 \mathrm { ml } \) 에서 12 시간 동안 배양한 후 \( 180 \mathrm { ml } \) 의 LB 배지로 회석하여 \( 600 \mathrm { ~nm } \) 파장에서 흡퐝도가 \( 0.48 \) 이 될 때까지 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 더 배양하였다. MIF 단백질의 발현을 유도하기 위하여 \( 1 \mathrm { mM } I \mathrm { PTG } \) 를 넣은 다음 3 시간 30 분 동안 더 키운 후, 2,500 rpm으로 25 분간 원심 분리하여 대장균을 수거하였다. 이렇게 모아진 대장균은 \( 1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 aprotinin과 leupeptin을 포함하고 있는 buffer A \( (50 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } , \mathrm { pH } \) 7.4, \( 15 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } ) 4 \mathrm { ml } \) 에 용해시킨 후 5분 동안 vortexing하고 5분 동안 얼음에 놓아두었다. 이 과정을 한 번 더 반복한 후 초음파로 용해하였다. 세포 찌꺼기는 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 12,000 \mathrm { rpm } \) 으 로 10분 동안 원심 분리하여 제거하고 상층액은 \( 1.5 \mathrm { ml } \) 새 튜브로 옮긴 후 \( -70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 보관하였다.</p>