이 연구에서는 울릉웰빙식품에서 구입한 곰취, 미역취, 삼나물을 사용하였다. 이들 재료의 추출은 300g 시료를 실온에서 24시간 침지 후, 상층액과 침전물 분리를 3회 반복하였다. 추출물은 원심 분리, 여과, 농축 후 동결건조하여 보관하였다. 한국세포주은행에서 얻은 마우스의 대식세포주 Raw 264.7 cell에 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 배양하였다. 울릉도 자생 식물의 세포에 대한 독성 측정은 MTT 방법을 통해 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시료 재료</h2> <p>본 실험에서 사용한 곰취(Ligularia fischeri), 미역취(Solidago virga-aurea), 삼나물(Aruncus dioicus)은 울릉웰빙식품에서 2009년 4, 5월경에서 건조된 잎을 구입하여 실험재료로 사용하였다.</p> <h2>시료 추출</h2> <p>시료의 추출은 시료 \( 300 \mathrm { ~g } \)을 실온에서 24시간 침지하여 상층액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 추출물은 원심 분리 및 여과, 농축 후 동결건조하여 냉장실에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다.</p> <h2>시약 및 기기</h2> <p>세포 배양액인 dulbeco's modifide eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), streptomycin penicillin 등의 세포배양용 시약들은 invitrogen (Carlsbad, CA, USA)사에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 sodium dodesyl sul-fate (SDS), acrylamide, bis-acrylamide는 Bio-rad사(Hercules, CA, USA)에서 구입하였고, NP-40, protease inhibitor, ripa buffer, griess reagent 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 1차 항체인 iNOS BD bioscience (Sanjose, CA, USA) COX-2 cayman (Ann ar-bor, MI, USA), \( \beta \)-actin과 2차 항체인 anti-rabbit Ig-G horse-radish peroxidase (HRP)-conjugated antibody (Santa cruz, CA, USA)에서 구입하였다. \( PGE_ { 2 } \), cytokine 측정을 위한 ELISA kit는 R&D systems Inc. (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>마우스의 대식세포주인 Raw 264.7 cell은 한국세포주은행 (KCLB)에서 분양 받았으며, 세포배양을 위해 \(10 \% \) FBS과 \(1 \% \) penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지를 사용하였다. 세포는 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건에서 배양하였다.</p> <h2>MTT assay에 의한 세포 생존율 측정</h2> <p>울릉도 자생 식물의 세포에 대한 독성 측정은 MTT 방법으로 분석하였다. Raw 264.7 cell \( 5 \times 10 ^ { 4 } \) cells/ \( \mathrm { ml } \)를 96 well plate에 분주하고 울릉도 자생 식물 추출물을 농도별 (0,1,10,100, \( 1000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \))로 24시간 동안 처리하였다. Well당 \( 20 \mu \mathrm { l } \)의 MTT 용액을 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 4시간 동안 반응시킨 후, microplate reader를 이용하여 \( 540 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율울 백분율로 표시하였다.</p>