본 연구에서는 두 품종의 튤립, 'Apeldoorn'과 'Golden Apeldoorn'의 꽃잎을 사용하여 실험을 수행하였으며, 꽃잎은 4월 10일부터 개화 단계에 따라 6단계로 채취하였다. 세포 추출액을 얻기 위해 꽃잎을 여과지로 거른 뒤, \(80\%\) 아모늄 황산을 첨가하여 0.1M 인산염 완충액(pH 7.0)에서 24시간 동안 농축하였다. 이후 단백질을 조효소액으로 사용하여 반응을 진행시키고, 원심분리(\(4^{\circ}C, 1200 \, \text{crpm}\), 5분)를 통해 상징액과 증류수를 혼합한 후, UV 분광광도계를 이용하여 260nm에서 흡광도를 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료의 재배 방법 및 시료 채취</h2> <p>본 실험에서는 2품종의 튤립(Tulipa gesneriana L.), 'Apeldoorn' (붉은 색의 꽃잎)과 'Golden Apeldoorn' (노란색의 꽃잎)을 사용하여 실험을 수행하였다. 개화구는 정식 하루 전에 배노람 수화제 500 배액에 1 시간 침지한 다음 그늘에서 완전히 건조시킨 후 본교 실험 포장에 10 월 28 일경 \( 10 \times 12 \mathrm{~cm} \) 간격으로 정식하였다. 시비량은 \( 10 \mathrm{a} \) 당 N 17 \( \mathrm{kg}, \mathrm{P}_{2} \mathrm{O}_{5} 10 \mathrm{~kg}, \mathrm{~K}_{2} \mathrm{O} 24 \mathrm{~kg} \), 퇴비 1톤을 시용 하였고, 질소 \( 1 / 3 \) 량은 추비로 구 비대기인 3월 5일에 시용하였으며 기타 재배 방법은 관행에 준하였다. 시료로 사용된 꽃잎의 채취 시기는 꽃이 피기 시작하는 4 월 10 일부터 개화의 진행 정도에 따라 6단계로 나누어 실시하였다. 꽃잎이 착색된 날을 1 단계로 하여 2 일 간격으로 5 단계까지 시료를 채취하였고, 6 단계는 꽃이 만개 이후 6 일 경과하여 꽃잎이 떨어질 때 채취하였다.</p> <h2>식물체 꽃잎으로부터 조효소의 추출 및 농축</h2> <p>'Apeldoorn'과 'Golden Apeldoorn'의 각 꽃잎 조직을 \( 10 \mathrm{~g} \) 씩 채취하여 액체 질소를 사용하여 마쇄한 후, \( 0.1 \mathrm{M} \) phosphate buffer(PH 7.0)를 \( 50 \mathrm{~mL} \) 넣고 polytron으로 조직을 재차 마쇄하였다. 이후 추출물을 원심분리 \( \left(4^{\circ} \mathrm{C}, 14000\right. \) \( \mathrm{rpm}, 20 \mathrm{~min}) \) 하여 상징액을 취하였다. 이를 여과지로 걸러 얻은 세포추출액에 \( 80 \% \) ammonium sulfate를 첨가하여 24시간 동안 0.1M phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 7.0) \) 에서 투석, 농축한 단백질을 조효소액으로 사용하였다.</p> <h2>RNase, POD, PPO, Protease의 효소 활성 측정</h2> <p>RNase활성은 yeast rRNA (Sigma Co.)를 기질로 사용하여 가수분해한 yeast RNA를 측정하였다. \( 2.5 \mathrm{mg} \) 의 yeast rRNA를 함유한 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium phosphate \( (\mathrm{pH} \) 7.0) \( 500 \mu \mathrm{L} \) 를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분 동안 pre-incubation한 후, 조효소액 \( 10 \mu \mathrm{L} \) 을 넣어서 30 분간 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반응시켰다. 조효소액과 기질의 반응을 25\% perchloric acid와 \( 0.75 \% \) uranyl acetate를 stop buffer로 사용하여, 30 분 동안 얼음에 보관하면서 정지시켰다. 반응이 종료된 시료를 원심분리 \( \left(4^{\circ} \mathrm{C}, 1200 \mathrm{crpm}\right. \), \( 5 \mathrm{~min}) \) 하여 취한 상징액 \( 50 \mu \mathrm{L} \) 과 증류수 \( 950 \mu \mathrm{L} \) 을 혼합한 후, UV spectrophotometer (Pharmacia Co.)를 사용하여 \( 260 \mathrm{~nm} \) 파장에서 흡광도를 측정하였다.</p>