본 논문에서는 Puma 품종을 Agrobacterium으로 형질전환시킨 뒤 kanamycin이 함유된 MS 기본배지 배양하며 \(1\)차 선발을 진행하였으며, PCR 및 Real-Time PCR을 이용해 최종 형질전환체를 선발하였다. 이후 최종 형질전환체에 대해 온도별 생육과 저온에서의 상해정도에 따른 유전자 발현에 따른 저항성 정도를 분석하였으며, 저온처리 조건에서 기공의 형태를 SEM을 통해 분석하였다. 한편, 형질전환체의 생리적 특성을 조사를 위해 엽록소 함량변화를 SPAD meter를 통해 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>형질전환체 육성</h2><p>국화 (Dendranthema grandiflorum) 는 Puma 품종을 Agrobacterium으로 형질전환시킨 뒤 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) kanamycin이 함유된 MS 기본배지에서 4~6주 동안 배양하여 1차 선발하였다. 형질전환용 식물체 양성은 sucrose가 \( 3 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 첨가된 MS기본 배지에서 배양하였다. Callus 형성 및 공동배양은 \( 3 \% \) sucrose가 첨가된 MS기본배지에 \( 1.0 \mathrm{mg}\) LBA와 \( 0.3 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 2,4-D 생장조정제를 첨가하여 재조합한 후 \( 0.8\sim 1.0 \mathrm{cm}^{2} \) 잎 절편을 핀으로 상처 접종하였다. 공동배양을 위한 Agrobacterium은 LB와 MM(Minimal Media)에서 각각 12시간, IM(Induction Media)+As(Acctosyringone)에서 6시간 배양하여 국화잎에 접종하였다. 형질전환에 사용된 저온관련 유전자 BN115는 Brassica napus에서 분리된 것으로 binary vector에 도입하여 pBin 19:: BN 115 로 재조합한 다음 disarmed Ti-plasmid를 함유하고 있는 A. tumefaciens MP90에 도입한 것을 경희대학교로부터 분양받아 사용하였다 (Choi et al. 1996, Fu et al. 1999; Jeong et al. 2000, Weretilnyk et al. 1993, White et al. 1994). 1차 선발배지에서 재분화된 형질전환체는 PCR 및 Real-Time PCR을 이용하여 최종 형질전환체(T2, T56, T63, T96, T111)로 선발하였다. nptⅡ genc의 증폭을 위한 PCR primer는 \( 700 \mathrm{bp} \) 의 산물을 증폭하는 forward primer ATGGGGAGC GGCGATACCGTA와 reverse primer GAGGCTATTCGGCTA TGACTG를 사용하였다. 또한 Real-Time PCR은 Real-Time PCR 7500 system(Applied Biosystems, USA)을 이용하였으며, PCR 반응을 위한 TaqMan BN115 probe는 Applied Biosystems에서 합성하였다 (Han et al. 2006).</p><h2>형질전환체 온도별 생육</h2><p>최종 선발된 형질전환체의 온도별 생육과 저온에서의 상해정도를 관찰하여 유전자 발현에 따른 저항성 정도를 검토하였다. 온도별 생육관찰은 \( 5,10,15,25^{\circ} \mathrm{C} \) 등으로 나누어 \( 2,000\mathrm{ lux } \), 광 16시간과 암 8시간으로 설정된 growth chamber에서 30일 동안 생육하여 조사하였다. 이때 growth chamber 내의 각 처리별 식물체는 MS(+3 \% \) sucrose 기본배지의 유리 배양병에서 생육중인 형질전환체를 사용하였다. 저온처리에서의 상해정도는 위에서 각기 다른 온도별로 30일 동안 생육된 형질전환체를 또다시 \( 2^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4일간 처리하여 관찰하였다. 이때 상해정도 관찰은 배지가 제거된 식물체를 멸균수가 절반정도 채워진 음료수형 종이컵에 고정하여 유지하였다.</p><h2>저온조건하에서의 기공형태, 엽록체 함량, Ion leakage test</h2><p>국화 형질전환체가 저온처리 조건에서 외부환경요인에 적응하기 위하여 어떻게 반응하는지 식물체 잎 기공의 형태를 SEM (scanning electron microscopy)으로 관찰하였다. SEM 관찰을 위해서는 형질전환체와 비형질전환체를 \( 5{ }^{\circ} \mathrm{C} \), \( 2000\mathrm{ lux } \), 광 16시간과 암 8시간으로 설정된 growth chamber에서 30일 동안 생육하였다. 한편 형질전환체의 생리적 특성을 조사하고자 식물체내의 엽록소 함량변화를 SPAD (soil plant analysis development, Minolta, spad-502) meter를 사용하여 측정하였다. 엽록체 함량 측정은 형질전환체를 각각 온도별로 30일 동안 배양한 후 잎의 상, 중, 하를 각각 3반복씩 조사하였다. 또한 저온처리에서의 세포내 상해정도를 조사하고자 Ion leakage test를 수행하였다. Ion leakage test를 위한 저온처리 방법은 형질전환체를 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 7일, \( 0^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3일간 배양한 후 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12시간 다시 배양하였다. 또한 \( 0.5 \mathrm{~cm} \) 크기의 잎 절편 \( 1,000 \mathrm{mg} \) 을 만들어 \( 50 \mathrm{ml} \) 시료병에 넣고 \( 20 \mathrm{ml} \)의 멸균증류수를 첨가하여 \( 200 \mathrm{rpm} \)에서 3시간 동안 흔든 후 전기전도도 (EC)를 측정하였다.</p>