실험의 재료는 차나무에서 추출한 하동지역 5종류(야생 천년녹차, 야생 녹차, 시배지녹차, 2종류의 재배녹차), 보성지역 1종유(재배녹차)로 준비하고, 비교를 위해 중국 용정차와 일본 재배녹차를 같이 준비하였다. 실험에 사용된 녹차 게놈 DNA는 DNeasy Plant Kitn를 사용하여 녹차 잎에서 추출한다. PCR 최종 불륨은 \( 25 \mu \mathrm{l} \) , 게놈 DNA는 \( 50-100 \mathrm{ng} /\mu \mathrm{l} \), 프라이머는 \( 0.5 \mu\mathrm{M} \)씩, dNTP는 \( 200 \mu \mathrm{M} \)씩 사용한다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물재료</h2> <p>실험에 이용된 재료는 차나무(var. sinensis)에서 수집한 신선한 잎을 사용하였으며, 하동지역 5종류(야생 천년녹차, 야생 녹차, 시배지녹차, 2종류의 재배녹차), 보성 지역에서 1종류(재배녹차)를 선발하였다. 한국 야생녹차 군집의 유전적 다양성 분포를 결정하기 위하여 중국에서 1종의 재배녹차인 용정차 (Longjing), 일본에서 2종류의 재배녹차(Yabukita, Tsukigase)를 선발하여 비교 분석하였다. 하동 야생 천년 차나무는 수령이 800년 된 것으로 국내에서는 현재까지 알려진 최고령 차 나무이며, 하동 야생녹차 군집은 지리산 저지대의 \( 20 \mathrm{~m}^{2} \)에 분포한 것을 수집하였고, 하동 시배지녹차는 보다 넓은 \( 500 \mathrm{~m}^{2} \) 지역에 분포한 것을 수집하였다. 보성 지역 녹차는 지역 재배 농장에서 수집되었다. 중국차 용정차는 중국 항저우(Hangzhou)의 녹차 농장에서 수집되었으며, 일본 차는 Tsukigase와 국내에서 상업적 생산을 위하여 주로 재배한다고 알려진 Yabukita를 일본 교토(Kyoto)의 Ujitawara에 있는 한 농장으로부터 수집하여 사용하였다.</p> <h2>PCR 및 제한효소 처리 산물의 분석</h2> <p>실험에 사용된 녹차의 게놈 DNA는 DNeasy Plant Kitn(QIAGEN, Hilden, Germany)을 사용하여 싱싱한 녹차 잎으로부터 추출되었다. 각각의 녹차 잎은 액체질소를 첨가한 후에 막자사발을 이용하여 가늘게 분쇄하였으며, 가늘게 분쇄된 녹차 잎으로부터 \( 100 \mathrm{mg} \)의 녹차 잎이 1회 추출에 사용되었다. 추출 방법은 제조사에서 제공한 매뉴얼을 따라 수행되었다. PCR은 최종 볼륨 \( 25 \mu \mathrm{l} \)으로 수행되었으며, 게놈 DNA는 \( 50-100 \mathrm{ng} / \mu \mathrm{l} \), 프라이머는 각각 \( 0.5 \mu \mathrm{M} \)씩, dNTP는 \( 200 \mu \mathrm{M} \)씩 사용하여, 0.5 unit의 ExTaq polymerase (Takara, Shinga,Japan)을 이용하여 BIO-RAD thermocycler modle iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA)에서 수행되었다. PCR 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 초기의 denaturation step을 수행한 후 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1.5분을 순서대로 32 cycle 반복했으며 최종 elongation step을 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 수행하였다. STS-RFLP법에 사용된 PCR 프라이머는 Table 1에 기술하였다. RFLP분석을 위하여 \( 3 \mu \mathrm{l} \)의 PCR 산물을 사용하여 Table1에 서술된 제한효소(Takara, Shiga, Japan; BioLab, USA)를 이용하여 절단하였다. 제한효소처리를 위한 처리온도로는 \( \mathrm{Taq} \mathrm{I} \)를 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응시킨 것을 제외하고는 모든 제한효소는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응되었다.</p>