녹농균 야생형 균주로 PAO 1을 사용하여 이번 실험을 진행하였다. 본 실험에 사용된 플라스미드를 포함하는 녹농균의 선택적 배양을 위해서는 LB배지에 \( 150 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 carbenicillin이 첨가되었으며, 배양 시간에 따라 \( 200 \mu l \)씩 배양액을 채취하여 세포의 OD 및 \( \beta \)-galactosidase 활성을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>녹농균 균주 및 배양 조건</h2> <p>본 실험에서는 녹농균 야생형 균주로 PAO \(1 \)을 사용하였다. 대부분의 실험에서 녹농균은 Luria-Bertani(LB) 배지에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 호기적 진탕배양을 통해 배양되었다. 실험에 사용된 플라스미드를 포함하는 녹농균의 선택적 배양을 위해서는 LB 배지에 carbenicillin이 \( 150 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 농도로 첨가되었다. 프로테아제 활성 측정과 생물막 형성 실험을 위해서는 다른 조성의 배지가 사용되었는뎨, 이에 대하여는 아래에 따로 설명하였다.</p> <h2>녹농균에서 QS 신호 수용체 단백질의 활성 측정</h2> <p>녹농균의 주된 QS 신호물질인 \(3 \)OC \(12 \)-HSL에 대한 수용체 단백질인 LasR과 QscR의 활성을 리포터 유전자를 이용하여 측정하였다. LasR 활성 측정을 위하여 \(3 \)OC \(12 \)-HSL에 의해 활성화된 LasR이 특이적으로 결합하여 발현을 증가시키는 lasI 유전자에 lacZ 유전자를 리포터로 결합시킨 pSC \(11 \) 플라스미드를 사용하였으며, QscR 활성 측정을 위하여는 \(3 \)OC \(12 \)-HSL에 의해 활성화된 QscR이 특이적으로 발현을 유도하는 P \(1897 \) 유전자의 프로모터에 lacZ를 결합시킨 pJL \(101 \) 플라스미드를 사용하였다. 리포터 유전자인 lacZ로부터 발현되는 \( \beta \)-galactosidase의 양은 각각 LasR과 QscR의 활성을 의미한다. 이 플라스미드들을 각각 녹농균 야생형 균주인 PAO \(1 \)에 형질전환을 통해 도입한 후, 이를 LB(Luria-Bertani) broth에 접종하여 그림에서 표시된 것과 같이 다양한 농도의 저해제들과 함께 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다. 배양 시간에 따라 \( 200 \mu l \)씩 배양액을 채취하여 아래에 기술한 방법에 따라 세포의 OD(optical densities)와 \( \beta \)-galactosidase 활성을 측정하였다</p> <h2>B-galactosidase 활성 측정</h2> <p>\( \beta \)-galactosidase 활성 측정은 Galacto-Light Plus \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) kit(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 이전에 보고된 바와 같이 수행되었다. 배양 시간에 따라 \( 200 \mu l \)씩 덜어낸 녹농균 배양액 중 \( 100 \mu l \) 로 \( 600 \mathrm { nm } \)에서 OD를 측정하였다(Tristar LB941, Berthold, 독일). 한편 나머지 \( 100 \mu l \)에는 \( \mathrm { CHCl } _ { 3 } \)을 \( 10 \mu l \) 넣고 voltex를 이용해 강하게 섞어준 후, \(15 \)분간 가만히 놓아두어 첨가해 준 \( \mathrm { CHCl } _ { 3 } \)을 완전히 분리시키고 상층의 \( 10 \mu l \)만을 취하여 \(96 \)-well plate에 옮겼다. 여기에 Galacto-light plus \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) 기질 \( 0.6 \) \( \mu l \)를 diluents buffer \( 100 \mu l \)에 희석한 용액을 각 well에 넣고 어두운 곳에서 \(1 \)시간 동안 반응시켰다. 이어 accelerator \(2 \) 용액 \( 150 \mu l \)을 각 well에 넣고 발생되는 luminescence를 측정하였다(Tristar LB \(941 \), Berthold, 독일). 측정된 luminescence 값을 앞에서 측정한 OD \( { } _ { 600 } \) 값으로 표준화(luminescence/OD \( { } _ { 600 } \))하여 제시하였다.</p>