마우스 해마로부터 유래한 HT22를 분양 받아 세포를 배양하고, 보호활성을 측정하였다. 활성산소종 소거능을 측정하기 위해 HT22 세포의 형광도를 측정하였고, Western blot analysis를 통해 HT22 세포를 배양하고 처리하였다.
<h2>세포배양 및 뇌 세포 보호활성 측정 방법</h2><p>마우스 해마 유래 HT22 세포주는 묵인희 교수(서울대학교)로부터 분양받아 사용하였다. HT22 세포는 \( 10 \% \) heat-in-activated FBS, penicillin \( \mathrm{G}(100 \mathrm{IU} / \mathrm{ml}) \)와 streptomycin \( (100 \) \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)을 함유한 DMEM배지에 분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2} \) 배양기 내에서 24시간 배양하였다. HT22 세포주는 96 well plate에 well당 \( 1 \times 10^{5} \) cells 밀도로 분주하여 24시간 배양 후 각각의 시료 용액과 \( 5 \mathrm{mM} \) glutamate를 처리한 후 12시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \) \(\mathrm{CO}_{2} \) 배양기 내에서 배양하였다. 세포 생존율은 MTT법을 통해 확인하였으며, 양성대조약물은 \( 50 \mu \mathrm{M} \)의 Trolox를 사용하였다. 보호활성은 ELISA reader를 사용하여 \( 540 \mathrm{nm} \)의 측정파장을 기준으로 하여 흡광도를 측정하여 확인하였다.</p><h2>활성산소종 소거능 측정 방법</h2><p>HT22 세포 \( \left(2 \times 10^{4}\right. \) cells \( / \mathrm{ml} \) in 24 -well plate\( )\)를 시료용액과 \( 5 \mathrm{mM} \) glutamate를 처리한 후 12시간 동안 \( 5 \%\)\( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기 내에서 배양하고, PBS로 세척한 후, \( 10 \mu \mathrm{M} 2^{\prime}\), \(7^{\prime} \)-dichlofluorescein diacetate (DCFDA, 35845)를 포함하는 Hank's balanced salt 용액에서 30분 동안 암실에서 반응시켰다. 반응 후 PBS로 두번 세척하고 \( 1 \% \) Triton X-100이 포함된 PBS에 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 방치 후 세포의 형광도(Spectramax Gemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 측정하였다(excitation wave length: \( 490 \mathrm{nm} \); emission wave length: \( 525 \mathrm{nm} \) ).</p><h2>Western blot analysis 방법</h2><p>HT22 세포는 \( 60 \mathrm{mm} \) dish에 \( 3 \times 10^{5} \) cells/well의 밀도로 24시간 배양하였으며, 각각의 시료는 농도와 시간을 달리하여 처리하였다. 시료 처리 후 HT22 세포는 RIPA buffer를 첨가한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(14,000 \times g \)에서 25 분간 원심분리하여 제거하고, 상등액은 Bradford 방법을 통해 Quick Start Bradford Protein Assay Kit (500-0201, Bio-Rad Co.)를 이용하여 단백질을 정량하였다. 단백질을 정량한 시료는 \( 12 \% \) SDS-PAGE로 전기영동하고, NC membrane으로 전사하였다. 전사된 NC membrane은 \(5\%\) 무 지방유가 포함된 blocking buffer \( (0.1 \% \) Tween 20 in Tris-buggered saline)로 blocking하여 HO-1 antibody를 \( 1: 1,000 \)으로 희석한 후 첨가하여 1시간 동안 반응시켰으며, 2차 antibody (Anti-mouse \( \operatorname{IgG} \) )를 \(1:1,000\)으로 희석하여 첨가한 후 1시간 동안 반응시켰다. 발현 분석은 항체를 처리한 NC membrane위에 ECL용액을 \(1:1\)로 가하여 발광시키고 암실에서 X선 필름에 감광한 후 현상하여 수행하였다. Actin은 동일한 방법으로 actin antibody를 이용하여 측정하였다.</p>