탄소원은 경제적인 glucose와 maltose, 질소원은 yease extract를 선택하였다. 탄소원의 최적 농도는 glucose 2%, maltose 2%로 결정하였다. 탄소원으로 glucose를 2%, 질소원으로 yeast extract 1%를 첨가한 LB 배지로 회분배양을 실시하였고, 배양 8시간 까지 대수기를 보이다가 이후 정지기를 보이나 약간의 증식은 있었다. 발효조 회분배양으로 최대 균체 농도는 15OD 660, 최대 endoxylanase 발현량은 630 unit/ml 에 달하였으며, 배양 말기까지 plasmid 안정성은 70% 이상으로 유지되었고, 세포내 endoxylanase 활성은 33unit/mℓ 수준에 달해 총 발현된 endoxylanase의 95% 이상이 세포외 배지로 분비 및 생산됨을 알 수 있었다. 재조합 Endoxylanase의 SDS-PAGE를 분석한 결과, 본 연구에 사용한 P JH promoter는 이들 발현계를 대처할 수 있으며, 기존의 강력한 구성적 promoter인 P43 promoter 보다 월등히 우수한 것으로 판단되며, 사용한 DB104 숙주세포보다 탄소원 이용능력이 뛰어난 숙주세포를 선택해 고농도 유가배양을 하면 재조합 endoxylanase의 생산성을 크게 향상시킬 것이다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>탄소원 및 질소원의 결정</h2> <p>탄소원의 종류에 따른 균체증식과 endoxylanase 발현에 미치는 영향을 조사하기 위해서 SSM 배지에 각종 탄소원(glucose, cellobiose, maltose, starch, sucrose, xylose, lax-tose)을 \( 2 \% \) 농도 (starch의 경우 \( 1 \% \) )로 첨가하여 24시간 배양하였다. 그 결과 균체증식은 glucose, cellobiose, maltose, sucrose에서 높게 나타났고, endoxylanase 발현은 glucose, cellobiose, maltose, xylose의 경우 다른 탄소원에 비해 약 2배 정도 높게 나타났다 (data not shown). 따라서, 경제적인 endoxylanase 생산을 위한 탄소원으로 glucose와 malt-ose를 선정하였다.</p> <p>질소원의 영향은 yeast extract와 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 를 뺀 SSM 배지에 무기 및 유기 질소원을 \( 1 \% \) 씩 첨가하여 조사하였다. 유기 질소원이 무기 질소원에 비해 4~6배 정도 높은 균체 증식을 보이며, 유기 질소원 중에서 casamino acid보다 yeast extract가 endoxylanase 발현에 약 2배 정도 더 효과 적이였다 (data not shown). 따라서 질소원으로는 yeast extract를 최종 선정하였다.</p> <h2>탄소원과 질소원의 최적 농도 결정</h2> <p>포도당과 maltose 및 yeast extract의 최적 농도 결정은 LB 배지 (yeast extract 1\%)를 기본배지로 사용하여 결정하였다. 먼저 glucose의 첨가 농도에 따른 균체증식과 xyl-anase 발현을 조사한 결과, glucose 농도가 높을 수록 균체농도 \( \left(\mathrm{OD}_{660}\right) \) 는 7.5에서 4.7로 감소하는 경향을 보였고, endoxylanase 활성도 \( 202 \mathrm{unit} / \mathrm{m \ell} \) 에서 \( 137 \mathrm{unit} / \mathrm{m \ell} \) 로 감소하였다. 단위 균체농도당 endoxylanase 활성 (비활성unit/m \( \left.\mathrm{m} \ell / \mathrm{OD}_{660}\right) \) 을 보여 최적 glucose의 농도는 \( 2 \% \) 로 결정하였다. 높은 glu-cose 농도에서의 낮은 균체증식과 endoxylanase 발현은 기질저해 및 atabolite repression에 의한 것으로 추정된다.</p> <p>Maltose의 경우, maltose 농도에 관계없이 균체농도와 endoxylanase 활성은 7.2 7.5 \( \mathrm{OD}_{660} \) 와 181 186 unit/ml로 일정한 수준을 보였으며 비활성은 \( 2 \% \) 에서 가장 높은 \( 25.3 \) \( \mathrm{unit} / \mathrm{m \ell} / \mathrm{OD}_{660} \) 값을 보여 최적 maltose 농도는 \( 2 \% \) 로 결정하였다.</p> <p>최적 질소원인 yeast extract의 첨가 농도 \( (0.5 \% \) 에서 \( 3 \%) \)에 따른 균체증식 및 endoxylanase 발현 양상을 조사하였다. 이때 탄소원으로 maltose를 \( 2 \% \) 첨가하였다. Table 3에서 보는 바와 같이 yeast extract 농도에 비례하여 균체농도와 endoxylanase 발현량이 증가하였으며, 비활성이 \(29.8\mathrm{unit/ml}\) \( \mathrm{OD}_{660} \) 로 가장 높은 \( 1 \% \) 를 최적농도로 정하였다.</p> <p>이상의 플라스크 배양에서 잔존 glucose와 maltose 농도를 측정한 결과, 소모된 양이 \( 2 \sim 6 \mathrm{~g} / \ell \) 수준으로 나타나 숙주세포인 B. subtilis DB104의 탄소원 소모능이 매우 저조함을 알 수 있었다. 이러한 요인으로 제한인자의 존재 가능성을 조사하기 위해 각종 염 (인산염, 마그네슘염, 칼슘염 등), 아미노산 (알라닌, 글루타민산, 아스파라긴산 등), vitamin ( \( \mathrm{B} 1, \mathrm{~B} 2 \), 판토테인산 등) 등을 과량 첨가하여 균체 증식 효과를 조사하였으나 탄소원 소모에는 큰 변화가 없었다 (data not shown).</p> <h2>발효조 회분 배양을 통한 Endoxylanase 발현</h2> <p>탄소원으로 glucose를 \( 2 \% \), 질소원으로 yeast extract를 \( 1 \% \) 첨가한 LB 배지로 발효조 회분배양을 실시하여 그 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 균체증식은 배양 8 시간까지 대수기를 보이다가 이후 정지기에 들어가며, 정지기에도 약간의 증식이 있었다. Endoxylanase 발현은 배양 말기까지계속되었다. 플라스크 배양과 마찬가지로 발효조 배양에서도 glucose는 완전히 이용되지 못하였다. 발효조 회분배양으로 최대 균체농도는 \( 15 \mathrm{OD}_{660} \), 최대 endoxylanase 발현량은 \( 630 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \) 에 달하였으며, 배양 말기까지 plasmid stability는 \( 70 \% \) 이상으로 높게 유지되었고, 세포내 endoxylanase 활성은 \( 33 \mathrm{unit} / \mathrm{m \ell} \) 수준에 달해 총발현된 endoxylanase의 \( 95 \% \) 이상이 세포외 배지로 분비 - 생산됨을 알 수 있었다.</p> <p>회분배양 결과를 플라스크 배양 결과 (Table 1 의 \( 2 \% \) glu-cose 경우, 균체농도는 \( 5.4 \mathrm{OD}_{660} \), endoxylanase 활성은 (166 \( \mathrm{unit} / \mathrm{m} \ell \) )와 비교해 보면 균체농도는 2.8배, endoxylanase 발현량은 3.8배 증가하였다. 탄소원이 포함되지 않은 LB 배지에서의 발현량 (105 \( \mathrm{unit} / \mathrm{m} \ell \) )에 비해서는 발효조 배양이 약 6 배 증가한 발현량을 보였다. 이 발현량은 재조합 endoxylanase의 비활성(859 \( \mathrm{unit} / \mathrm{mg-protein} \) )으로 계산했을 때, 최대 약 \( 0.7 \mathrm{~g} \)-protein/ \( \ell \) 에 해당되어 발효조 회분 배양에서 endoxylanase 단백질이 균체외로 과발현 - 분비 생산됨을 알 수 있었다.</p> <h2>재조합 Endoxylanase의 SDS-PAGE 분석</h2> <p>상기 회분배양의 상등액 \( 6 \mu l \) 를 배양 시간별로 SDS-PAGE \( (12 \% \) gel \( ) \)로 분석한 결과, 배양시간 (균체증식)에 따라 약 \( 20.4 \mathrm{kDa} \) 의 endoxylanase 단백질이 계속 과발현·분비·생산됨을 알 수 있고, band들의 image 분석 결과 세포외 단백질의 \( 65 \% \) 정도를 차지하는 주된 단백질 임을 알 수 있었다. 이는 배양 상등액 중의 총단백질량 (약 \( 2 \mathrm{~g} / \ell) \) 을 고려하면 재조합 endoxylanase 단백질이 약 \(1.3 \mathrm{g} / \ell \) 수준으로 생산됨을 의미한다. 배양시간에 따라 분자 량이 큰 단백질들 \( (25.5,42.2,61.7 \mathrm{kDa} \) 의 bands)도 소수의 band들로 보이지만 gel의 활성염색 결과, endoxylanase 활성을 보이지 않아 숙주세포 (또는 재조합 세포)가 생산하는 세포외 미지 단백질들로 추정되었다.</p> <p>결론적으로, 구성적 발현에 따른 문제들 (plasmid 불안정성, 재조합 단백질의 생산성 저하 등) 때문에 유도성 promoter 발현계나 염색체 삽입 발현계를 많이 활용하고 있음을 감안하면, 본 연구에 사용한 \( \mathrm{P}_{\mathrm{JH}} \) promoter는 이들 발현계를 대체할 수 있을 뿐만 아니라 기존의 강력한 구성적 promoter인 P43 promoter 보다 월등히 우수한 promoter로 판단된다. 또한 본 연구에서 사용한 DB104 숙주세포보다 탄소원 이용능이 뛰어난 숙주세포를 선택하여 고농도 유가배양을 한다면, 재조합 endoxylanase의 생산성을 크게 향상시킬 것으로 사료된다.</p>