쥐노래미에서 적출한 조직들의 조직 파쇄액을 얻고 원심분리하여 상등액을 얻어서 LdH 동위효소 활성을 측정하고, 단백질을 정량하기 위해 \( 0.1 \mathrm { M } \) potassium phosphate buffer ( \( \mathrm { pH } \) 6.85), \( \mathrm { NAD } ^ { + } \), NADH, BSA, NBT, SDS, TEMED, PMS, anti-rabbit IgG, Coomassie brilliant blue G-250 등이 필요하다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료</h2> <p>횟대목 쥐노래미과(Scorpaeniformes, Hexagrammidae)에 속하는 쥐노래미(Hexagrammos otakii)는 충청남도 보령시 대천항에서 구입하였고, 뉴질랜드 화이트 순종토끼는 Samtako사로부터 구입하여 사용하였다. Pyruvic acid, nicotinamide ad-enine dinucleotide \( \left ( \mathrm { NAD } ^ { + } \right ) \), NAD reduced form (NADH),bovine serum albumin (BSA), acrylamide, N,N'-methyl-ene-bis-acrylamide, \( \mathrm { N } , \mathrm { N } , \mathrm { N } ^ {\prime } \), \( \mathrm { N } ^ {\prime } \)-tetramethylethylenediamine (TEMED), bromophenol blue (BPB), DL-lactic acid, nitro blue tetrazolium (NBT), phenazine methosulfate (PMS), sodium dodecyl sulfate (SDS), Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant 및 anti-rabbit IgG (peroxidase con-jugate)는 Sigma사의 제품을 사용하였고, Coomassie brilliant blue G-250 및 R-250은 Fluka사 제품을 사용하였다.</p> <h2>조직 파쇄액의 준비</h2> <p>쥐노래미의 골격근, 심장, 신장, 간, 눈 및 뇌조직을 적출한 후 증류수로 씻어 혈액을 제거한 다음 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 유지시킨 \( 0.1 \mathrm { M } \) potassium phosphate buffer ( \( \mathrm { pH } \) 6.85)를 3-7배 \( ( \mathrm { v } / \mathrm { w } ) \) 가한 후 얼음에 채운 Dounce homogenizer 및 Potter-Elvehjem ho-mogenizer로 파쇄하여 조직 파쇄액을 얻었다. 이 파쇄액은 20,000× \( g \) (20 PR-52D, Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japan)에서 1 시간씩 2번 원심분리 하여 상등액을 시료로 사용하였다.</p> <h2>LDH의 활성측정</h2> <p>LDH 동위효소의 활성은 \( 1.50 \mathrm { mM } \) 피루브산과 \( 0.14 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { NADH } \) 를 포함한 \( 0.1 \mathrm { M } \) potassium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } \) 6.85) \( 3 \mathrm { ml } \)에 시료를 가한 다음 \( \mathrm { NADH } \)로부터 \( \mathrm { NAD } ^ { + } \)로 산화되는 정도를 spectrophotometer (UV-160A, Shimadzu Co. Ltd., Kyoto, Japan)로 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 340 \mathrm { ~nm } \)에서 측정하였다. 효소활성의 단위는 기질 \( 1 \mu \mathrm { M } \)을 생성물로 전환시키는데 필요한 효소의 양을 1 unit로 하였다.</p> <h2>단백질 정량</h2> <p>단백질은 Bradford 의 방법으로 정량하였다. 정량시약은 Coomassie brilliant blue G-250 \( 100 \mathrm { mg } \) 을 \( 85 \% \) \( \mathrm { H } _ { 3 } \mathrm { PO } _ { 4 } \) \( 100 \mathrm { ml } \)에 세게 저어주면서 섞은 후 \( 95 \% \) 에탄올 \( 50 \mathrm { ml } \) 를 첨가한 다음 증류수로 11를 만든 후 사용하였다. 표준단백질로 BSA를 사용 하여 분광광도계로 \( 595 \mathrm { ~nm } \) 에서 정량하였다.</p>