DNA topoisomerase는 DNA 전사나 복제중, 이중나선이 풀리는 복제 분기점 앞의 주형가닥의 꼬임을 완화시키는 역할을 하는데, type I과 typeII로 구분된다. Topoisomerase 억제제를 통하여의 효소의 기능인 DNA cleaveage complex를 억제하여 항암효과를 얻을 수 있는데, 이에 대한 연구가 미미한 실정이다. 세포 독성 및 oligo microarray 발현 결과를 분석하여 이에 대한 연구를 진행할 예정이다.
<h1>서 론</h1> <p>인체 DNA topoisomerase는 그 촉매 기전에 따라 크게 두 형태인 type I과 type Ⅱ로 분류되며, type I은 양과 음의 su-percoiling plasmid에 대한 활성도, DNA상의 결합 방식, \( \mathrm{Mg}^{2+} \)의 요구 성에 따라 다시 세 개의 subfamily인 type IA (topoisomerase \(\mathrm{Ⅲ} \alpha \) and \(\mathrm{Ⅲ} \beta \)), type IB(topoisomerase \(\mathrm{I}\)) 그리고 type ⅡA(topoisomerase \( \mathrm{Ⅱ} \alpha, \mathrm{Ⅱ} \beta) \)로 나누며, 최근까지 밝혀진 생물들을 포함한 다양한 원핵생물과 진핵생물의 top-oisomerase들을 각각 분류하고 있다. Type I은 DNA du-plex의 한 가닥을 phosphodiester bond에서 끊고, 절단된 한 끝을 상대편 DNA 가닥을 축으로 한 바퀴 회전시킨 후, 끊어졌던 부분을 다시 연결하며, type Ⅱ는 DNA의 두 가닥을 거의 동시에 끊고, DNA duplex의 다른 부분이 절단된 곳을 통과한 후 절단 부위를 재 봉합하는데, 촉매과정에서 ATP 가수분해를 필요로 하는 것이 type I과 다른 점이다. 이 효소들의 공통된 작용기전은 DNA의 phosphodiester bond를 절단한 후 효소 내 tyrosine기의 \( \mathrm{OH} \)에 의해 DNA와 phospotyrosine bond를 형성하여 "cleavable complex"를 이룬 후에 다시 끊어졌던 DNA 부위를 재 봉합하는 특징을 가지고 있는데, 이 효소의 억제제들은 세포독성과 합깨 DNA cleavable complex를 안정화시킴으로서 항암제의 표적 효소로서 널리 알려져 있다.</p> <p>Topoisomerase I의 억제제로는 1960년대에 중국의 Camptotheca acuminata라는 나무에서 추출한 amptothecin (CPT)의 항암 활성이 알려져 현재 irinotecan, topotecan 등의 camptothecin 유도체들이 있고, eukaryotic DNA top-oisomerase Ⅱ 억제제로는 mAMSA, doxorubicin, actino-mycin D, idarubicin, daunorubicin, mitoxantrone, ellipti-cinc, epipodophyllotoxin 계열의 VP-16과 VM-26, genistein 등이 있으며 이들 유도체를 이용한 다양한 억제제의 개발과 임상적 응용에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 그리고 이러한 억제제들이 topoisomerase의 작용 과 관련된 DNA 복제, 선사, 재조합과 유사분열 과정에 영향을 미치게 되면 세포내 유전자들의 발현 변화를 유도하게 될 것이고 특히 억제제의 1차 표적소인 topoisomerase의 유전자 발현에도 영향을 미칠 것으로 추정된다. 그러나 top-oisomerase 억제제들의 유전자 발현에 미치는 영향에 대한 연구로는 c-myc과 같은 일부 유전자에 대한 연구들과 이들 억제제들의 작용에 따른 표적 효소인 top-oisomerase의 유전자 발현에 대한 연구 및 microarray 법에 의한 세포 유전자 발현 양상에 대한 연구는 부족한 실정이다.</p> <p>이와 같은 연구 배경에 따라 본 실험에서는 topoisomerase type I과 type Ⅱ의 대표적 억제제인 10-hydroxycamptothecin(10-CPT)과 doxorubicin을 투여한 인체 백혈병 HL-60 세포에서 유전자의 발현 양상을 조사하고, topoisomerase 기능 활성에 영향을 미치는 topoisomerase type별 유전자 발현의 차이를 비교 검토하여 topoisomerase 억제제들의 세포내 작용기전을 밝히는데 기초 자료롤 얻고자 본 연구를 수행하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약 및 재료</h2> <p>Doxorubicin과 10-CPT는 Sigma (Sigma-Aldrich Co, St. Luis, MO, USA)에서, fetal bovine serum, gentamicin과 RPMI 1640은 Gibco (Invitrogen Co, Grand Island, NY, USA)에서, \( 10 \mathrm{k} \) oligo chip과 관련 kit 시약들은 Macrogen (Seoul, Korea)에서 구입하였다. Total RNA정제용 kit는 RNAzol \( ^{\mathrm{TM}} \mathrm{B} \) (Tel-Test Inc, Friendswood, Texas, USA)를, HL-60세포는 KCTC HC18103 (한국생명공학연구원, Daejeon, Korea)을, 그 외의 일반적인 시약은 분석용을 사용하였다.</p> <h2>Cell cytotoxicity 측정법</h2> <p>\( 10 \% \) fetal bovine serum이 함유된 RPMI 1640 배지를 사용하여 \( \mathrm{ml} \) 당 \( 2 \times 10^{4} \) 세포의 농도로 희석한 배지 \( 10 \mathrm{ml} \)에 10-CPT와 doxorubicin을 각각 농도별 첨가하여 28시간(cell doubling time)동안 처리한 후 원심분리하고 phosphate buf-fered saline으로 씻어 약물을 제거하고, 56시간(two dou-bling time)동안 새 배지에 배양한 후 인체 백혈병 HL-60 세포 수를 hemocytometer로 측정하였다.</p> <h2>Oligo chip에 의한 microarray hybridization</h2> <p>HL-60 세포를 약물을 처리하지 않은 정상 HL-60 세포와 10-CPT 또는 doxorubicin을 처리한 세포에서 각각 total RNA를 추출하여 RT-PCR 과정에서 Cy3 (control), Cy5 (test)의 형광물질로 표지하고 \( 10 \mathrm{K} \) human oligo chip상에서 하룻밤 hybridization 하였으며, 세정 후 Affymetrix 428 Array Scanner (Affymetrix Inc, Santa Clara, California, USA)로 scan하고, 형광 감도 해석 프로그램을 사용하여 얻은 Cy3과 Cy5의 감도 값을 house keeping gene의 감도 값, 외부 유전자의 감도 값을 가지고 보정한 후 통계 처리하여 topoisomerase 유전자를 포함한 \( 10 \mathrm{K} \) 유전자의 발현 양상을 분석하였다.</p> <h2>Gene Bank 검색 및 동정</h2> <p>Oligo microarry 분석 결과 발현의 뚜렷한 증가 또는 감소를 나타내는 유전자를 NCBI (National Center for Biotech-nology Information, USA) Gene Bank 검색을 통하여 유전자의 기능을 동정하였다.</p>