크루드 EPS 정제를 위해 배양액에 trichloroacetic acid를 최종농도 \(4\%\)로 첨가하고, 균체와 침전된 단백질을 제거하기 위해서저온에서 처리한 후 원심분리를 적용하였습니다. EPS 가수분해물의 구성 당을 분석하기 위해 HPLC (Waters Co.사 장비)를 사용하였고, 분리한 유산균을 혈액 한천배지에 도말하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 동안 배양한 후 투명환의 생성 여부를 확인하여 용혈성을 판단하였습니다. 균체 주위에서 투명환 형성이 관찰되었다면 용혈성이 확인되었습니다.
<h2>EPS 분리, 정제 및 정량</h2><p>분리균주를 슈크로오스 배지(\(1\%\) tryptone, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 0.5 \% \) dipotassium phosphate, \( 0.5 \% \) diammonium citrate, \( 5 \% \) sucrose, \( \mathrm{pH} 7.0) \)에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 배양하여 EPS를 생성시켰다. 이 배양액을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 원심분리 \((10,000 \times \mathrm{g}\), \(25 \mathrm{~min}\), \(4^{\circ} \mathrm{C}) \)하여 균체를 제거하고, 회수된 상징액에 2배 냉각된 \( 95 \% \) 에탄올을 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15시간 침전시켰다. 이 침전물을 다시 원심분리 \( (10,000 \times \mathrm{g}\), \(25 \mathrm{~min} \), \( \left.4^{\circ} \mathrm{C}\right) \)하여 회수하고, 남은 에탄올을 건조시킨 다음 동결건조하여 이를 crude EPS로 하였다.</p><p>crude EPS를 정제하기 위해 배양액에 trichloloacetic acid를 최종농도 \( 4 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)가 되도록 첨가하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 처리한 후 원심분리 \( (10,000 \times \mathrm{g}\), \(25 \mathrm{~min}\), \(4^{\circ} \mathrm{C}) \)하여 균체와 침전된 단백질을 제거하였다. 상징액은 회수한 후 \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) filter로 여과하여 남은 단백질을 제거하고, 회수된 상징액에 2배량의 \( 95 \% \) 에탄올을 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15시간 침전시켜 분리하였다. 침전물은 원심분리 \( (10,000 \times \mathrm{g}\), \(25 \mathrm{~min}\), \(4^{\circ} \mathrm{C}) \)하여 회수하였고, 남은 에탄올을 건조시킨 후 3차 증류수에 용해하여 dialysis sack에 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 투석한 다음, 동결 건조하였다. 배양액에 대한 EPS의 생성량은 \(\mathrm{g/L}\)로 나타내었다.</p><h2>EPS 구성 당 분석</h2><p>EPS의 구성 당은 EPS 가수분해물을 HPLC (Waters Co., USA)로 분석하였다. EPS를 \( 2 \mathrm{~N} \) 황산으로 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 6시간 동안 가수분해하고, \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} \)로 중화한 다음 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) filter로 여과하여 EPS 가수분해물 시료로 사용하였다. 분석 컬럼은 탄수화물 분석용 컬럼(carbohydrate analysis column)( \( 3.9 \mathrm{~mm} \times 300 \mathrm{~mm} \), Waters Co., USA)을 사용하였으며, 이 동상으로는 \( 75 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 아세토니트릴(acetonitrile)을 사용하였다. 이동상의 유속은 \( 1.5 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \)으로 하였으며, 시료는 auto-sampler를 이용하여 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 주입하여 RI (Refractive Index) 검출기로 검출하였다.</p><h2>용혈성 및 젤라틴 액화시험</h2><p>혈액 한천배지(tryptic soy agar에 \( 5 \% \) sheep blood 첨가)에 분리한 유산균을 도말하고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 배양한 다음 균체 주위에 투명환의 생성여부로 용혈성을 판단하였다. 젤라틴 영양 배지(beef extract \( 0.3 \% \), peptone \( 0.5 \% \), gelatin \( 12 \% \) )에 분리 균주를 접종한 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 배양한 후 젤라틴 영양배지를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에 약 4시간 동안 냉장 방치하여 배지의 응고 여부를 확인하였다. 배지가 응고되지 않으면 액화 반응 양성으로 판정하였다.</p>