본 연구에서는 S. cerevisiae SEY2102, E. coli DH5 \( \alpha \) 를 사용하여 Levansucrsase 유전자를 PCR로 증폭하고 pYES 2.0, pYInu-AT에 subcloning 하였으며 LiCl법을 사용하여 효모 형질전환체를 선별하였고 Levansucrase 활성염색은 nondenaturing-PAGE gel을 \( 2 \% \) sucrose를 포함하는 \( 50 \mathrm{mM} \) 초산 완충액 에 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반응시킨 후 TTC 염색을 통해 활성 밴드를 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주 및 Plasmids</h2> <p>본 연구에 사용한 숙주세포와 plasmids를 Table 1 에 정리하였다. 사용한 효모숙주세포는 S. cerevisiae SEY2102로써, invertase 결손 변이주(suc2-49) 및 uracil 영양요구성 변이주(ura3-52)이며 haploid이다. Plasmid 구축 및 증폭을 위한 숙주로 E. coli DH5 \( \alpha \) 를 사용하였다. Levansucrsase 유전자는 pZL8로부터 PCR (Perkin Elmer PCR System 2400, USA)로 denaturation \( 95^{\circ} \mathrm{C} \), annealing \( 55^{\circ} \mathrm{C} \), polymerization \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 의 조건에서 증폭하였다. 증폭.분리된 유전자는 E. coli-S. cerevisiae shuttle vector인 pYES 2.0 (Invitrogen Co., USA)과 pYInu-AT (GAL10 promoter+exoinulinase signal sequence)에 각각 subcloning하였다.</p> <h2>효모 형질전환체 선별 및 배양조건</h2> <p>효모로의 형질전환은 LiCl법을 사용하였다. 효모 형질전환체의 선별을 위한 배지로는 SD 배지 \( (0.67 \% \) Bacto-yeast nitrogen base without amino acids, \( 0.5 \% \) casamino acids, \( 2 \% \) dextrose)를 사용하였고, 1 차 선별한 효모 형질전환체들로부터 levansucrase의 발현유무를 신속히 조사하기 위해 2,3,5 -triphenyl tetrazolium chloride (TTC) 염색법을 사용하여 2차 선별하였다. 즉, \( 2 \% \) sucrose 함유 YP \(1 \% \) Bacto-yeast extract, \( 2 \% \) Bacto-peptone) agar 배지에서 48 시간 자란 효모 형질전환체 colony들을 증류수로 세척한 후 TTC \( (0.1 \% \) in \( 0.5 \mathrm{~N}\) \(\mathrm{NaOH}) \) 용액으로 20 분간 반응시켰다. \( 10 \% \) 초산으로 세척한 후 나타나는 colony 주위의 적색환은 효모에서 발현된 levansucrase에 의해 sucrose가 fructose와 glucose으로 가수분해되었음을 나타낸다.</p> <p>효모 형질전환체의 배양은 YP 배지에 \( 1 \% \) dextrose와 \( 1 \% \) galactose를 첨가한 YPDG 배지에서 행하였다.</p> <h2>균체농도, 잔존환원당 및 Plasmid 안정성</h2> <p>균체농도는 일정시간마다 채취한 배양액을 적당한 비율로 희석하여 분광광도계(Shimadzu UV-160A, Japan)를 사용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도 \( \left(\mathrm{OD}_{600}\right) \) 로 측정하였다. 배양액을 \(3,000 \mathrm{rpm}\)에서 5분 동안 원심분리한 후 배양 상등액을 얻고, dini-trosalicylic acid (DNS) 방법을 사용하여 잔존 환원당 농도를 측정하였다. Plasmid 안정성은 배양액을 적 당히 희석하여 YPD 평판배지에 도말한 훟 자란 100-200개의 CFU (colony forming unit)를 SD 선별배지로 tooth picking한 다음 생육한 CFU를 백분율로 측정하였다.</p> <h2>균체 분획 및 효소 환성 측정</h2> <p>균체 침전물을 Zymolyase 100T(Seikagaku Kogyo, Japan)를 사용하여 균체의 세포벽을 파쇄한 후 원심분리(\(13,000 \mathrm{rpm}\), 10 분)하여 얻은 상등액를 periplasmic space 분획으로 얻었고, 침전물을 glass beads (0.4-0.5\(\mathrm{~mm}) \) 를 사용하여 파쇄하여 cytoplasm 분획을 얻었다. 이들 분획과 배양상등액을 사용하여 각 분획에서의 levansucrase 활성을 측정하였다. Le-vansucrase 활성은 DNS법을 이용하여 \( 2 \% \) sucrose 기질로 \( \mathrm{pH} 4.7 \) (50 \(\mathrm{mM}\) 초산 완충액), \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 분당 \( 1 \mu \mathrm{mol} \) 의 환원당(fructose equivalent)을 생성하는 효소의 양을 \(1 \mathrm{unit}\) 로 정의하였다. 비활성은 각 효소 활성을 균체농도 \( \left(\mathrm{OD}_{600}\right) \) 로 나누어서 계산하였다. 각 효소들의 분비효율은 전체 효소활성(균체외 활성 \( + \) 균체내 활성)에 대한 균체외 효소 활성비를 백분율로 나타내었다.</p> <h2>Polyacrylamide gel electrophoresis</h2> <p>재조합 levansucrase의 효소학적, 생화학적 제특성을 조사하기 위해 Laemmli 법에 따라 \( 0.1 \% \) sodium dodecyl sul-fate (SDS)의 존재하에서 \( 10 \% \) polyacrylamide gel electro-phoresis (PAGE)를 수행하였다. 전기영동 후 gel은 Coom-assie brilliant blue R-250으로 염색하였다.</p> <p>Levansucrase 활성염색은 nondenaturing-PAGE gel을 \( 2 \% \) sucrose를 포함하는 \( 50 \mathrm{mM} \) 초산 완충액 \( (\mathrm{pH} 4.7) \) 에 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반응시킨 후 TTC 염색을 통해 활성 밴드를 확인하였다.</p>