Nanofiber에 효소를 고정화 시키기 위해서 Polyaniline nanofibers를 만들고 자석으로 분리가 가능한 nanofiber 제조하며 최종적으로 다양한 용액들의 첨가와 반응 등을 통해 효소반응에 사용하기 위한 nanofiber를 만든다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험재료</h2><p>Starch 분해효소인 amylase, 및 \( p \)-nitrophenyl-\( \beta \)-D-glucoside (pNPG)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) 에서 구입하였으며 ironoxide nanoparticle의 size는 평균 \( 20-100\mathrm{nm}\)을 사용하였으며 표면을 \( \mathrm{HCl} \)을 이용 개질 한 후 사용하였다. \( 25 \% \) glutaraldehyde는 Sigma-Aldrich에서 구입하였으며 실험에 사용된 시약은 시중에서 구할 수 있는 시약 중에 높은 등급의 시약을 사용하였다.</p><h2>Polyaniline nanofiber (PANI) 제조</h2><p>Polyaniline nanofibers를 제조하기 위해서 ammonium peroxydisulfate \( 0.1 \% \) (질량분율)와 일정한 농도의 aniline 용액(\(1 \mathrm{M}\) \( \mathrm{HCl} \) 용액)을 격렬하게 섞는다. 고분자 중합 반응에 의해 nanofiber가 만들어지면 nanofiber 내에 있는 \( \mathrm{HCl} \) 용액을 제거하기 위해 4번 이상 증류수로 씻어낸다. 제조된 시료는 사용을 위해 4도에 냉장 보관하여 두었다.</p><h2>자석으로 분리가 가능한 nanofiber 제조</h2><p>자석으로 분리가 가능한 polyaniline nanofiber의 제조를 위해서 ironoxide 나노입자를 고분자 중합 시 첨가하여 반응을 시켜 polyaniline 중합시 nanoparticle 등이 끼워 들어가는 형태 또는 nanoparticle 표면에 polyaniline이 coating 되는 형태의 자석에 의해 분리가 가능한 나노입자 또는 nanofiber의 제조가 가능하였다. 이렇게 제조된 나노 fiber는 증류수로 4번 이상 씻은 다음 효소의 고정화를 위해 냉장고에 보관하여 두었다.</p><h2>Nanofiber에 효소 고정화</h2><p>효소를 고정화 시키기 위해서 \( 2 \mathrm{mg} \)의 nanofiber와 \( 2 \mathrm{mg} \)의 \( \alpha \)-amylase를 \( 1 \mathrm{ml} \) (\( 20 \mathrm{mM} \) phosphate buffer, \( \mathrm{pH} 6.5\))에 넣어 효소와 nanofiber가 잘 섞이도록 상온에서 30분 동안 \( 200 \mathrm{rpm} \)으로 흔들어 준다. 잘 섞인 상태의 용액을 냉장고에 넣어 30분 동안 추가로 \( 30 \mathrm{rpm} \)으로 흔들어주고 냉장고에 2시간 동안 보관하여 둔다. Glutaraldehyde 용액을 첨가하여 \( 0.5 \% \)가 되도록 하여 냉장고에서 17시간 동안 \( 30 \mathrm{rpm} \)으로 흔들면서 반응을 시킨다. 효소가 고정화 된 nanofiber를 20 \( \mathrm{mM} \) sodium acetate buffer \( (\mathrm{pH}6.5 \))와 \( 100 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}\) \((\mathrm{pH} 7.9\) )로 고정화 되지 않은 효소와 반응되지 않은 glutaraldehyde를 제거한다. 이 과정을 반복함으로써 고정화 되지 않은 효소가 충분히 제거될 때까지 반복한다. 제조된 효소가 고정화된 nanofiber를 효소의 활성도를 측정한 후에 효소반응에 사용하기 위해 4도에서 냉장 보관하여 두었다.</p>