Wang 등의 방법을 이용하여 rubisco와 rubisco activase가 함유된 용액을 분리하였고, 액체 질소를 가하여 마쇄한 잎 분말에 grinding buffer를 첨가하여 교반과 여과, 원심분리 과정을 거친 후, 상등액에서 다시 침전물을 얻고, 그 침전물을 현탁한 후 원심분리하는 과정을 반복하여 상등액에서 가장 높은 rubisco 활성을 가지는 분획물을 분리한다. Rubisco activase도 원심분리하여 얻은 침천물에서 원심분리와 현탁하는 과정을 반복하여 ATP hydrolysis assay에 의해 가장 높은 rubisco activase 활성을 가지는 분획을 분리한다. 두 분획은 \( -70 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 저장하였으며, 모든 분리과정은 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 수행하였다.
<p>Chlorophyll b ( \( \mathrm { mg/g fr. wt. } \) \( )=20.70 \) \( \mathrm { ~A } _ { 647 } \)-4 .62 \( \mathrm { ~A } _ { 647 } \)</p> <p>Total chlorophyll ( \( \mathrm { mg/g fr. wt. } \)) \( =17.90 \mathrm { ~A } _ { 647 } + 8.08 \mathrm { ~A } _ {\text { 664.5 } } \)</p> <h2>Rubisco와 rubisco activase의 분리</h2> <p>Wang 등의 방법을 이용하여 rubieco와 rubisco activase가 함유된 용액을 분리하였다. 액체 질소를 가하여 마쇄한 잎 분말에 grinding buffer ( \( 50 \mathrm { mM } \) BTP \( ( \mathrm { pH } 7.0), 10 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { NaHCO } _ { 2 } , 10 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } _ { 2 } , 1 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 0.5 \mathrm { mM } \) ATP, 10 \( \mathrm { mM } \) DTT, \( 1 \mathrm { mM } \) PMSF, \( 1 \mathrm { mM } \) benzamidine, \( 10 \mu \mathrm { M } \) Leupeptin, \(1.5 \% \) PVPP, \( 3 \mathrm { mM } \) MBT)를 첨가하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 교반하면서 overnight시킨 후 4겹의 거즈와 1겹의 miracloth로 여과한 후 \( 16,000 \mathrm { rpm } \) 에서 40분간 원심분리하였다. 상등액에 powder \( \left ( \mathrm { NH } _ { 4 } \right )_ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \) 를 saturation 농도가 \( 35 \% \) 가 될 때까지 천천히 가하면서 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 분간 교반한 다음, \( 8,000 \mathrm { rpm } \) 에서 8분간 원심분리하여 침전물과 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액에 powder \( \left ( \mathrm { NH } _ { 4 } \right )_ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \) 를 saturation 농도가 \( 55 \% \) 가 될 때까지 천천히 가하면서 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30분간 교반한 다음, \( 8,000 \mathrm { rpm } \)에서 8분간 원심분리하여 얻어진 침전물에 DBR ( \( 50 \mathrm { mM } \) Tricine ( \( \mathrm { pH } 8.0 \) ), \( 10 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } _ { 2 } 10 \mathrm { mM } \mathrm { NaHCO } , 10 \mathrm { mM } \) DTT, \( 2 \mathrm { mM } \)MBT을 가하고, 여기에 최종 농도가 \( 18 \% \)가 되게 \( 50 \%(w / v) P E G-10 \mathrm { ~K } \) 을 첨가하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5분간 교반하였다. \( 8,000 \mathrm { rpm } \) 에시 8분간 원심분리하여 얻이진 침전물은 DBR로 다시 현탁한 후, \( 8,000 \mathrm { rpm } \) 에서 8 분간 원심분리하였다. 원심분리로 얻어진 상등액을 \( 20 \mathrm { mM } \) BTP \( ( \mathrm { pH } 7.2), 1 \mathrm { M } \) \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } , 10 \mathrm { mM } \mathrm { NaHCO } \) 로 평형화된 Q-Sepharose column에 loading 하여 \( 0.15-0.6 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } \) linear gradicnt로 \( 2.5 \mathrm { ml } / \mathrm { min } \)의 유속으로 \( 6 \mathrm { ml } \) 씩 용출하여 분획하였다. 가장 높은 rubisco 활성을 가지는 분획을 \( -70 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 저장하였다.</p> <p>Rubisco activase는 앞의 \( 35 \% \left ( \mathrm { NH } _ { 4 } \right )_ { 3 } \mathrm { SO } _ { 4 } \) 를 \( 8,000 \mathrm { rpm } \) 에서 8분간 원심분리하여 얻어진 침전물에 DBA(20 \mathrm { mM } \) BTP \( ( \mathrm { pH } 7.0), 0.2 \mathrm { mM } \mathrm { ATP } , 10 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } , 2 \mathrm { mM } \) MBT)로 현탁하고, 최종농도가 \( 18 \% \) 가 되게 \( 50 ^ {\mathrm { M } } ( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) PEG-10k를 첨가하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5분간 교반하였다. 교반 후 \( 8,000 \mathrm { rpm } \) 에서 8 분간 원심분리하여 얻어진 침전물을 DBA로 현탁하고 \( 10,000 \mathrm { rpm } \)에서 10분간 원심분리하여 얻어진 상등액과 그 침전물을 다시 DBA로 현탁하고, \( 10,000 \mathrm { rpm } \)에서 10분간 원심분리 후 얻어진 상등액을 합하여 rubisco activase를 분리하기 위한 용액으로 사용하였다. 이를 Q-Sepharose column에 loading하여 \( 0.0 .4 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } \) linear gradient로 \( 1 \mathrm { ml } / \mathrm { min } \)의 유속으로 \( 3 \mathrm { ~m } \)씩 용출하여 분획하였다. ATP hydrolysis assay에 의해 가장 높은 rubisco activase 활성을 가지는 분획은 \( -70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 저장하였다. 모든 분리과정은 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 수행하였다.</p>