SH21B의 제조 및 표준화를 위해 황금, 행인, 마황, 석창포, 포황, 원지, 하엽 7가지 생약에서 분말상태인 SH21B엑스를 추출 후, thin layer chromatography를 사용하여 생약 물질의 성분을 조사한 결과 바이칼린과 아미그달린이 주요 성분으로 분석되었다. 3T3-L1 세포에 분화 유도 배지와 분화 유지 배지를 첨가할 때 SH21B를 함께 처리하여, Adipogenesis의 진행과정에서 SH21B의 효능을 확인한다. acid-phenol 추출법을 이용한 total RNA는 cDNA로 역전사하고, 표기된 cDNA를 보합결합 및 염색과정을 거친 후 microarray를 분석했다. 표준화 작업을 거친 값들로 fold change 분석, t-test 및 군입분석, 유전자 기능 분석등을 수행했다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>SH21B의 제조 및 표준화</h2><p>SH21B의 제조 및 표준화 과정은 선행 연구논문에서 상세하게 제시되었으며 이를 요약하면 다음과 같다. 원재료가 되는 생약은 구주제약(Hwasung, Korea)에서 구입하였다. 황금, 행인, 마황, 석창포, 포황, 원지, 하엽의 7가지 생약 \(3:3:3:3:3:2:2\)의 비율로 혼합하여 \(30\%\) 에탄올에서 3시간씩 2회 추출한 후, 에탄올과 동일한 부피의 부탄올을 가하여 2시간 동안 추출한 다음 부탄올 층을 따로 분획하였다. 이후 부탄올 분획물을 증발농축기를 이용하여 용매를 증발시키고 분말상태인 SH21B엑스를 얻었다. 최종적으로 얻어진 SH21B엑스의 양은 추출 전 생약 원료 양의 \( 4.9 \% \)였다(w/w) . SH21B의 추출 후, thin layer chromatography를 사용하여 7종류의 생약 물질의 성분을 조사하고 high performance liquid chromatog-raphy를 사용하여 구성 물질의 양을 측정한 결과, \( 11.4 \% \)와 \( 4.2 \% \)를 각각 차지하는 바이칼린(baicalin)과 아미그달린(amygdalin)이 SH21B의 주요 성분으로 분석되었다.</p><h2>세포 배양 및 시약</h2><p>실험에 사용된 3T3-L1 세포(preadipocyte)는 ATCC (American type culture collection, Manassas, VA, USA)에서 구입하여 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에 \( 10 \% \) calf serum, \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) streptomycin, and \(100 \mathrm{units} / \mathrm{ml} \) penicillin과 함께 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 세포 배양기에서 배양하였다. 다른 시약들은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.</p><h2>Adipogenesis 유도</h2><p>3T3-L1 세포는 phosphate buffered saline (PBS) 용액으로 씻어준 후, \( 1 \sim 2 \times 10^{5} \) cells/ \( \mathrm{ml} \)을 6 well-plate에 세포밀도가 \( 100 \% \)가 될 때까지 배양하였다. 2일 후(on day 0), \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS)을 포함한 DMEM에 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) insulin, \( 0.25 \mu\mathrm{M} \) dexamethasone 그리고 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 3-isobutyl-1-methyl-xanthine이 첨가된 differentiation-induction medium (분화유도 배지)로 교체하여 48시간 처리하였다. 그 후 2일 간격으로 \( 10 \% \) FBS를 포함한 새 배지에 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) insulin이 첨가된 differentiation-maintenance medium (분화 유지 배지)로 교체되었다. Adipogenesis의 진행과정에서 SH21B의 효능을 확인하기 위해, 분화 유도 배지와 분화 유지 배지를 첨가할 때 SH21B를 함께 처리하였다.</p><h2>Total RNA 추출</h2><p>Total RNA는 acid-phenol 추출법을 이용한 RNeasy kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 제시된 편람에 따라 분리 정제되었다. 추출된 total RNA는 분광광도계를 이용하여 optical density (OD)값을 측정하고 역전사(reverse transcription) 반응을 진행할 때까지 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다.</p><h2>Microarray 분석</h2><p>\( 300 \mathrm{ng} \)의 total RNA는 cDNA로 역전사하고 GeneChip ⅣT laveling kit (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 표기되었다. 표기된 cDNA는 35,557개의 유전자를 인지할 수 있는 probe들이 포함된 Mouse Gene 1.0 ST array와 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)에서 17시간 동안 보합결합 된 후, GeneChip Fluidics Station 450 (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 non-stringent wash buffer로 세척되었다. 세척 후, Streptavidin-phycoerythrin reagents로 염색과정을 거친 microarray는 GeneChip scanner 3000 (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)을 이용하여 스케닝 하였다. GeneChip Operating Software (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 측정되고 수치화된 형광 발현 정도는 RMA-sketch 알고리즘을 통해 M-A plot을 측정하여 표준화하였다. 표준화 작업에는 Expression Console 1.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) 프로그램이 사용되었다. 표준화된 값들을 이용한 fold change 분석, 통계적 유의성 분석(t-test) 및 군집분석(clustering analysis)은 GenPlex software (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)을 이용하여 수행되었고, 유전자들의 기능 분석은 GO Miner 를 이용하여 수행되었다.</p>