먼저 hemocyte의 수에 있어서는 전체적으로 유사한 수준을 보였지만, hemocyte 조성에 있어 무과립(hyaline), 반과립(semi-granular), 과립(granular) 세포의 비율에서는큰 편차를 보이고 있다. 이는 바이러스 감염 시 감염 전과 비교하여 hemocyte의 조성에 있어 과립 세포와 반과립 세포는 감소, 무과립 세포는 증가한다는 결과를 알 수 있고 함께 면역증강 물질을 투여할 경우 서로 상반된 결과를 나타낸 이전의 보고에 대한 결과를 재확인하였고 사료첨가제에 대한 면역증강 관련물질로서 사용 가능함을 확인하였다. 특이적으로 증가한 단백질들에 대해 ALA의 경우, 각종 유기체의 tetrapyrrole 생합성 과정에서 발견되는 중간물질의 하나로서, 각종 효소나 porphyrin 중간물질, 비타민 등의 제조에서 전구물질로 사용되고 있다는 점과, 한약재 열수 추출물의 경우에도 녹용과 감초 등이 포함되어 있다는 점이 본 연구에서 나타난 결과에 대한 근거될 수 있다. 각 시험구별로 Vibrio 균의 배양 결과를 확인해 본 결과, 일반사료 급이구에서는 평균 \( 3 \times 10^{3} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 인데 비해 나머지 3개 사료첨가제 시험구에서는 모두 낮은 수치를 나타내었고, 이는 사료첨가제를 투여함에 따라 새우 체내에서 면역 혹은 방어능력이 향상되고 있음을 간접적으로 시사한다. 그러므로 새우양식산업에서 대하의 면역력을 향상시킬 수 있는 물질을 탐색하는 시스템을 확립해야하고 이를 위해 hcmocyte를 중심으로 연구를 진행하였고, 시스템 개발에 대한 기초 차료로 이용하고자 한다.
<p>채혈된 hemolymph로부터 hemocyte의 수와 조성을 확인하기 위해 Kondo 등의 방법에 따라 \( 5,000 \ rpm \)으로 5분간 원심분리하고 동량의 medium 199과 혼합한 다음, Giemsa 용액으로 염색하여 광학현미경 상에서 관찰하였다. 먼저 hemocyte의 수에 있어서는 전체적으로 평균 \( 3 \sim 3.5 \times 10^{5} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 정도의 유사한 수준을 보였지만, hemocyte 조성에 있어 무과립(hyaline), 반과립(semi-granular), 과립(granular) 세포의 상대적인 비율에서는 시험구별로 다소 큰 편차를 보이고 있다. 일반사료 투여구에서는 전체적으로 무과립(hyaline) 형태의 세포가 많이 관찰된 데 비해 ALA와 키토산, 그리고 한약재 열수 추출물 첨가사료 투여구의 경우, 반과립(semi-granular) 혹은 과립(granular) 형태의 세포가 상대적으로 많이 관찰되었다. 이는 바이러스 감염 시 전체 hemocyte의 수는 감염 전과 비교하여 큰 차이가 없지만 hemocyte의 조성에 있어 과립 세포와 반과립 세포는 \( 62 \% \)에서 \( 46 \% \)로 감소하기 무과립 세포는 \( 38 \% \)에서 \( 54 \% \)로 증가한다는 결과와 함께 면역증강 물질을 투여할 경우, 일반 사료를 투여한 시험구와 비교하여 hemocyte의 수는 거의 유사하지만, 조성에 있어 과립 세포와 반과립 세포는 \( 10 \% \)이상 증가하지만 무과립 세포는 오히려 \( 10 \% \) 이상 감소한다는 서로 상반된 결과를 나타낸 이전의 보고에 대한 결과를 재확인함과 동시에 본 실험에서 사용된 ALA와 키토산, 그리고 한약재추출물 등의 사료첨가제에 대한 면역증강 관련물질로서의 사용 가능성을 나타내는 것이기도 하다.</p><p>또한 각 시험구의 차이를 확인하기 위한 방법으로 hemolymph 내 단백질의 변화를 확인하기 위해 SDS-poly-acrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 실시하였다. 우선 시료는 PBS로 수세한 다음, SDS sample buffer로 처리하였고, \( 1 \% \) polyacrylamide gel로 전기영동 후, \( 0.5 \% \) Coomassie brilliant blue R-250 solution으로 염색하여 molecular weight standard marker(Roche, Germany)와 비교하면서 확인한 결과, 각 시험구별로 툭정 위치에서 단백질량의 변화를 나타내었다. ALA-사료첨가제 투여구의 경우 에는 60 kDa 위치에서, 그리고 한약재 열수추출물 사료첨가제 투여구의 경우에는 75 kDa 위치에서 각각 일반사료롤 투여한 대조구에 비해 높은 수준의 단백질 함량을 보이고 있는 데 이 중 75 kDa 크기의 단백질은 이전의 연구에서 보고되었던 것처럼 hemocyanin으로, 60 kDa 크기의 단백질의 경우 미확인된 hemolymph protein 중 한 종류일 것으로 각각 추정된다. 특이적으로 증가한 이들 단백질들에 대해 ALA의 경우에는 각종 유기체의 tetrapyrrole 생합성 (porphyrin, chlorophyll, heme 및 vitamin \( B_{12} \) 등) 과정에서 발견되는 중간물질의 하나로서, C-5의 지방족 화합물이며 heme 구조를 가진 각종 효소나 porphyrin 중간물질, 비타민 등의 제조에서 전구물질로 사용되고 있다는 점과, 한약재 열수 추출물의 경우에도 주로 보혈작용을 하는 것으로 알려진 녹용과 감초 등이 포함되어 있다는 점이 본 연구에서 나타난 결과에 대한 근거가 될 수 있을 것으로 예상된다.</p><p>한편, 상기의 이러한 시험구별 차이에 대해 간접적인 외부병원체에 대한 지표로서 Vibrio 균의 존재 여부를 확인하기 위해 혈액채취 후 각 시험구별로 3미씩 남은 시료의 간췌장과 아가미 등 내부 장기를 시료로 하여 TCBS agar plate (DIFCO, USA)에 접종한 다음, \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일간 배양하였다. 각 시험구별로 Vibrio 균의 배양 결과를 확인해 본 결과, 일반사료 급이구에서는 평균 \( 3 \times 10^{3} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 인데 비해 나머지 3개 사료첨가제 시험구에서는 모두 \( 1 \times 10^{2} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 미만의 낮은 수치를 나타내었다. 이는 상기의 hemocyte의 조성이나 hemolymph 단백질의 패턴과 더불어 일반 사료와 비교하여 사료첨가제를 투여함에 따라 새우 체내에서 면역 혹은 방어능력이 향상되고 있음을 간접적으로 시사해 주는 것으로도 볼 수 있다.</p><p>그러므로 본 연구에서는 현재 새우양식산업에 있어 질병에 따른 폐사와 관련하여 가장 시급한 것은 면역과 관련하여 기존에 보고되어 있는 다양한 천연물 중 대하의 체내 면역력을 강화시킬 수 있는 물질을 탐색할 수 있는 시스템을 확립하는 것이라 예상하여 이를 위해 새우의 체내 요스 중 면역과 직접적인 관련이 있는 hcmocyte를 중심으로 연구를 진행하였으며, 면역관련물질의 투여를 통해 hemocyte의 조성과 hemolymph 단백질, 그리고 병원성 지표로서 Vibrio 균의 배양결과에 대한 특이성을 확인하였으므로 이를 새우의 체내 면역력을 검증할 수 있는 시스템 개발에 대한 기초 차료로 이용하고자 한다. 또한 ALA와 한약재 열수 추출물을 투여했을 경우, 새우의 hemolymph 내에서 hemocyanin으로 추정 되는 75 kDa 크기의 단백질과, 미확인된 hemolymph protein의 일종인 60 kDa 크기의 단백질이 각각 특이적으로 발현된 데 대해 추가적인 연구를 통해 hemocyte를 중심으로 한 해양 무척추동물의 면역기작을 규명해 나갈 예정이다.</p>