본 실험에서 다양한 균주를 사용하며, pga 유전자 증폭 및 발현 벡터 제작을 위해 E. coli ATCC 11105 로부터 게놈 DNA를 추출하여 pga 유전자의 공여체로 사용하였고,유가 배양 조건에서는 본배양은 \(5 \mathrm{L}\) 발효기에서 \(2 \mathrm{L}\) 배양액으로 시작하여 전 배양균의 접종량은 \( 1 \% \) , 배양액의 \(\mathrm{pH}\)는 7.0을 유지, 처음에는 배양온도 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)부터 시작하여, \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도가 18일 때 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 로 낮추어, 흡광도가 28일 때 \( 22^{\circ} \mathrm{C} \) 로 변화시켰다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용 균주 및 plasmid</h2><p>본 실험에 사용한 균주는 E. coli ATCC 11105 (KTCC), E. coli JM 109(Stratagene, USA), E. coli BL21(DL3) (Novagen Inc., USA) 이였다. pET-24a(+) 벡터는 Novagen 사(USA)로부터 구입하였고 제한효소와 Taq 중합효소는 TaKaRa 사(Japan)의 제품을 사용하였다. SDS-PAGE의 분자량 크기 및 DNA 크기 마커는 Promega사(USA) 제품이였다.</p><h2>pga 유전자 증폭 및 발현 벡터 제작</h2><p>E. coli ATCC 11105 로부터 게놈 DNA를 추출하여, pga 유전자의 공여체로 사용하였나. Forward primer는 pga gene의 translation initiation codon 부위에 상보적이고, 고염기 서열은 GAG GAT CAT ATG AAA AAT AGA AAT(NdeI site 밑줄)이며, reverse primer는 pga gene의 translation stop codon 부위에 상보적이고, 그 염기 서열은 TTT CGG CTC GAG TTA TCT CTG AAC GTG(Xhol site 밑줄)이였다. 이 두가지 primer를 사용하여 PCR 기기 (GeneAmp PCR system 2700, Applied Biosystems, CA,USA)로 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 초간, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초간, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 서 25초간을 1회전으로 하여 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. PCR product를 NdeI, XhoI enzyme으로 절단하여 Genec-lean Spin Kit(BIO 101)로 electroelution 하였다. pET-24a(+) vector 역시 NdeI, XhoI enzyme으로 절단하여 \(5.2 \mathrm{kbp}\) DNA 단편을 electroelution 하였다. 이 두가지 DNA fragment를 ligation 시켜서 E. coli JM109에 transformation 하였다. Transformant로부터 plasmid를 miniprep 하여 NdeI, XhoI enzyme으로 절단하여 \(2.6 \mathrm{kbp}\)의 insert와 \(5.2 \mathrm{kbp}\)의 vector fragment를 확인하였다. 이 plasmid를 pET-pga라고 명명하고 다시 E. coli BL21(DE3)에 형질 전환시켰다.</p><h2>고농도 회분배양</h2><p>E. coli BL21(DE3)/pET-pga 균주를 \( 0.02 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) kanamycin 과 \( 2.5 \% \) lactose가 포함되어 있는 회분 배양용 배지\( \left[\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} 3 \mathrm{~g} / \mathrm{L}, \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} 7 \mathrm{~g} / \mathrm{L}\right. \), \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} 3\mathrm{~g} / \mathrm{L} \), yeast extract \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \), glycerol \( 50 \mathrm{~g} / \mathrm{L}, \mathrm{MgSO}_{4} 1 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \), sodium citrate \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \), trace metal elements]를 사용하였고 배양온도는 최초 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 로 시작하여 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도가 8일 때 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 로 낮추고 흡광도가 18일 때 \( 22^{\circ} \mathrm{C} \) 로 변화시켰다. 진탕 배양기에서 \(\mathrm{RPM}\)은 300에서 700까지 용존 산소 양에 따라 점차 높였으며 41시간 동안 \( 5 \mathrm{~L} \) mini-jar에서 배양시켰다.</p><h2>유가 배양 조건</h2><p>E. coli 전배양 배지 조성은 \( 5 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) yeast extract, \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) \( \mathrm{NaCl}\), \(10 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) tryptone, \( 0.02 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) kanamycin이였다. PGA 발현을 위한 본배양 배지의 조성은 glucose \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \), yeast extract \( 5 \mathrm{~g} / \mathrm{L}\), \(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\) \(3 \mathrm{~g} / \mathrm{L}\), \(\mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4}\) \(7 \mathrm{~g} / \mathrm{L}\), \(\mathrm{MgSO}_{4}\) \(5 \mathrm{g} / \mathrm{L} \), trace metal elements, \( 0.02 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) kanamycin과 \( 2.5 \% \) lactose이였다. 전 배양은 \( 500 \mathrm{~mL} \) flask에 \( 50 \mathrm{~mL} \) 전배양 배지를 넣고 본균주를 접종하여 배양하였으며 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(250 \mathrm{RPM}\) 으로 5~7시간 배양하였다. 본배양은 \(5 \mathrm{L}\) 발효기(한국발효기, 한국)에서 \(2 \mathrm{L}\) 배양액으로 시작하여 수행하였으며 전 배양균의 접종량은 \( 1 \% \) 였고 배양액의 \(\mathrm{pH}\)는 7.0을 유지하였다. 기질은 \(\mathrm{pH}\) 고정에 기초한 포도당 농도 최소화 전략으로 첨가하였다. 배양액 내의 포도당 농도는 \( 0.04 \% \) 의 낮은 함양을 유지하였다. 배양온도는 최초 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 로 시작하여 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도가 18일 때 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 로 낮추고 흡광도가 28일 때\( 22^{\circ} \mathrm{C} \) 로 변화시켜 배양하였다.</p>