Kim 등의 방법에 따라 참치뼈로부터 추출한 hydroxyapatite 소결체를 이용하여 독성 테스트를 진행하였다. 참치뼈에서 유기물을 제거한 후, 습식 밀링으로 가공한 hydroxyapatite를 다양한 농도로 희석하여 Sprague-Dawley 랫드에게 투여하였다. 이때 hydroxyapatite는 인공뼈 소재로서 치과와 정형외과에 적용이 가능하다. 투여 후, 사망한 동물의 병리학적 변화를 관찰하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <p>시험방법은 식품의약품안전본부의 의약품 등의 독성시험기준 (식품의약품 안전본부, 고시 제 96-8호)에 준하여 실시하였다.</p> <h2>재료</h2> <p>참치뼈는 (주)동원산업 (창원)의 수산가공 공장에서 참치 의 어육가공 처리 훈 남은 부산물을 구입하여 사용하였다.</p> <h2>시험물질의 제조</h2> <p>시험물질로 사용한 hydroxyapatite 소결체는 강도가 가장 우수한 것으로 Kim 등의 방법에 따라 참치뼈를 \( 1 \% \) \( \mathrm{NaOH} \) 수용액에 첨가한 후 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \)에서 7시간 반응시켜 참치뼈에 포함되어 있는 유기물 등을 제거한 후, 2시간 흐르는 물에서 수세하여 건조하였다. 이를 \( 850^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 하소(calcination)하여 추출한 hydroxyapatite를 체가름 (200 mesh, \( 75 \mu \mathrm{m} \) )하여 3일 동안 습식밀링 (wet milling)한 것을 사용하였다. 피하독성시험을 위한 시험물질은 실험당일 생리식염수 \( 10 \mathrm{ml} \) 당 \( 5000 \mathrm{mg} \) 의 농도로 현탁시켜 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20분간 멸균한 후 랫드의 체중 (kg) 당 \( 5000,2500,1250,625 \), \( 312.5 \mathrm{mg} \)의 농도로 각각 멸균 처리된 생리식염수로 희석하여 사용하였다. 대조군은 주사용 생리식염수만을 주사하였다.</p> <h2>실험동물 및 사육조건</h2> <p>본 실험에 사용한 동물은 한국화학연구소 안전성 연구부 실험동물육종실 (대전)로부터 입수한 Sprague-Dawley 랫드를 사용하였다. 5~6주령의 암 ◦ 수 각각 40마리를 입수한 후 1주일간 검역과 순화 사욱을 거쳐 건항한 암 ◦ 수 각각 30마리를 선별해 시험에 사용하였다. 본 실험은 온도 \( 23 \pm \) \( 2^{\circ} \mathrm{C} \), 상대습도 \( 50 \pm 5 \% \), 환기 회수 \( 10 \sim 12 \) \(\mathrm{times/hr} \), 조명시간 12시간 및 조도 150~300 \(\mathrm{Lux} \)로 설정된 동물실에서 실시하였다. 사료는 실험 동물용 고형사료 (삼양사료주식회사,친안)를 사용하였으며, 물은 상수도수를 자유 섭취시켰다.</p> <h2>시험군의 구성</h2> <p>시험군의 구성은 Table 1과 같이 6~7주령의 암 ◦ 수 각 30마리의 동물을 군간 체중이 고르게 배치한 후, 대조군 및 hydroxyapaptite 소결체 5개 용량군으로 군당 암 ◦ 수 각 5마리씩 분리하였다. 체중범위는 암컷은 체중이 \( 130 \sim 160 \mathrm{~g} \), 수컷은 \( 150 \sim 180 \mathrm{~g} \) 정도였다.</p> <h2>주사방법 및 주사시간</h2> <p>Hydroxyapatite 소결체는 경구내 치아와 정형외파의 인조뼈로서 이식 가능하므로 임상적용 경로와 가까운 피하경로를 택하여 주사하였다. 주사액량은 hydroxyapatite가 랫드의 체중 (kg) 당 \(5000, 2500, 1250, 625, 312.5, 0 \mathrm{~mg} \)의 농도로 포함되게 주사용 생리식염수로 희석하여 \( 10 \mathrm{~ml} \)가 되게 하였으며, 실험개시 시의 체중측정 결과에 따라 hydroxy-apatite의 양을 산출하였다. 주사는 동배부의 일정부위에 1회 실시하였다.</p> <h2>일반상태 및 폐사의 관찰</h2> <p>주사 딩일은 12시간까지 매시간 일반상태를 관찰하고, 주사 다음날부터 1 일까지는 매일 1회씩 일반상태의 변화, 중독증상, 운동성, 외관, 자율신경 및 사망동물의 유무를 주의 깊게 관찰하였다.</p> <h2>체중변화</h2> <p>투여직전과 투여 7일 후 및 부검직전인 14일에 3회 체중을 측정하였다.</p> <h2>부검</h2> <p>실험종료시 랫드는 에테르 마취로 방혈치사시킨 다음 육안적으로 모든 장기를 검사하였다.</p> <h2>사망한 동물에 대한 병리조직적 소견</h2> <p>사망한 동물에 대한 병리조직학적 소견은 모든 장기를 \( 10 \% \) 중성포르말린액에 고정시킨 후 일반적인 파라핀 절편을 만들어 Hematoxylin & Eosin 염색을 한 후 그 소견을 관찰하였다.</p> <h2>통계학적 분석</h2> <p>체중에 대한 유의성 검정법으로 one-way analysis of varience (AVOVA)에서 유의차가 인정되는 F값이 관찰될 때 대조군과 각 용량군과 비표하기 위하여 Dunnett's t-test 를 실시하였으며, 발생병변의 빈도는 \( X^{2} \) (chi-square) 검정을 하였다.</p>