Jurkat cells을 배양하여 ConA 및 HKSMM50, AHCC 시료 용액 처리하고 다시 배양하였다. 이를 원심분리 후 침전물의 NFAT protein 을 측정하였다. 또한 Cell의 Apoptosis 측정을 위하여 세포 DNA 를 PI 염색 후 flow cytometry로 형광측정을 진행하였으며, HKSMM50 시료의 \( \beta \)-glucan, total flavonoids 및 total isoflavonoids 함량 또한 건강기능식품 규격 분석법에 따라 분석하였다.
<h2>Biomakers 및 NFAT protein 측정</h2><p>배양된 Jurkat cells을 24 well plate의 well에 \( 1 \times 10^{5} \) \(\mathrm{cells/}\) \( 900 \mu \mathrm{l} \)를 분주하여 24시간 배양 \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2}\right) \)하고, \( \mathrm{ConA} \) \( (1,000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) 50 \mu \mathrm{l} \) 처리 1시간 후에 HKSMM50 및 AHCC시료 용액 \( (0,500\),\(1,000\),\(2,000\)\( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\) \(50 \mu \mathrm{l} \) 처리하고 3시간 또는 6시간 배양하였다. 배양물을 원심분리 \( (10,000 \mathrm{rpm} \), \( 5 \mathrm{~min} \) )한 후 상등액은 \(\mathrm{IL-2}\), \(\mathrm{IFN-}\) \( \gamma \) 및 COX-2측정에 사용하였고(ELIZSA kit 사용), 3시간 배양하여 얻은 침전물 cells은 NFAT protein 측정에 사용하였다.</p><p>Cells의 NFAT protein은 Jara 등의 방법에 준하여 분석하였다. NE-PER nuclear/cytoplasmic extraction reagent kit를 사용하여 nuclear와 cytosol을 분리하고 lysis buffer로 lysis 시키고 원심분리 \( (12,000 \mathrm{rpm}, 20 \mathrm{~min}) \)하여 protein을 분리 및 정량(Pierce bicinchoninic acid protein assay kit)하 였다. Protein \( (30 \mu \mathrm{g}) \)을 \( 8 \sim 15 \% \) SDS-PAGE로 분리하고, NC membrane으로 transfer하여 \( 5 \%\) BSA로 실온에서 1시간 blocking하였다. Membrane에 NFAT primary antibody (antiNFAT1 antibody)를 처리하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 over night 반응시킨 후 TBS로 3회 세척하였다. 다시 anti-IgG conjugated HRP 항체를 처리하고 1시간 실온에서 반응 시키고 TBS로 3회 세척하였다. ECL을 처리하고 ChemiDoc TM touch imaging system (BioRad, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.</p><h2>Apoptosis 측정</h2><p>Jurkat cell apoptosis는 세포의 DNA를 PI로 염색한 후 flow cytometry (FACSCalibur, BD Biosciences: San Jose, CA, USA를 이용하여 형광을 측정하였다. Jurkat cells 배양 및 시료(ConA 처리 포함) 처리는 상기 Biomarker 측정 과 동일한 방법으로 처리하여 3시간 및 6시간 배양 \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}\right. \), \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) )하였다. 원심분리하여 회수한 세포는 phosphatebufferd saline (PBS)으로 2회 세척하고 세포 \( \left(1 \times 10^{6}\right. \) cells)의 DNA는 PI용액 \( 600 \mu\mathrm{l})\)로 20분 반응시키고 flow cytometry로 분석하였다. 유세포분석에서 얻은 data 분석은 CellQuest Software (Becton Dickinson, San Jose: CA, USA)을 이용하여 분석하였다.</p><h2>\( \beta \)-Glucan, total flavonoids 및 total isolavonoids 함량분석</h2><p>HKSMM50 시료의 \( \beta \)-glucan, total flavonoids 및 total isoflavonoids 함량은 건강기능식품 기준 및 규격의 3-25 베타 글루칸, 3-48 총플라보노이드, 3-53 대두이소플라본 분석 법에 준하여 분석하였다. 그 결과 HKSMM50 시료에 \( \beta \)-Glucan은 \( 15.4 \% \), total flavonoids은 \( 1.98 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) 및 total isoflavonoids는 \( 1.42 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) 함유되어 있었다.</p><h2>통계처리</h2><p>Data는 3반복 결과를 mean \( \pm \mathrm{SD} \) (표준편차)로 표시하였다. Data 분석은 ANOVA를 통하여 분석하고 Duncan's multiple range test 또는 Student's t-test로 유의성을 검증하였다.</p>