HEAB 배양농축액 동결건조물을 다양한 용매를 이용하여 분획하고, 각각의 분획물을 이용하여 a-glucosidase 활성저해효과를 확인한 결과, EA 분획의 \( \alpha \)-glucosidase의 활성 저해가 가장 우수하였다. 따라서 EA 분획으로부터 활성물질을 분리하기 위해 silica gel column chromatography를 수행하여 subfraction을 얻은 뒤, 이들의 활성저해율을 측정하고 DAP 발색 및 \( \mathrm{C}_{18} \) reversed-HPLC column으로 분석한 결과, 저해활성이 가장 우수한 2번에 포함된 물질은 당이 isoflavone과 conjugation된 isoflavone 배당체로 사료된다. 추가적으로 Isoflavone과 그 배당체의 활성저해율을 확인한 결과 배당체의 활성이 더 낮았는데, EA subfraction에서는 isoflavone과 당 conjugate의 복합효과로 높은 저해활성을 보인것으로 추정된다.
<h1>결 과</h1><h2>\( \beta \)-Glucan-free HEAB 분획물의 \( a \)-glucosidase 활성저해 효과</h2><p>HEAB 배양농축액(Brix 50)의 동결건조물 시료 \( 50 \mathrm{~g} \)의 \( 80 \% \) ethanol 침전물(\(\beta\)-glucan, 약간의 다른 다당체 포함 됨) \( 10.4 \mathrm{~g} \)을 제외한 나머지 상등액을 hexane, chlorofrom, EA, butanol 순으로 분획하여 각각 고형분 0.6, 4.8, 7.9, 12.1 \(\mathrm{~g} \)과 수용성 분획 고형분 \( 14.2 \mathrm{~g} \)을 얻었다. 이들 \( \beta \)-glucan-free HEAB 용매분획물의 \( \alpha \)-glucosidase 저해 활성은 EA 분획 \( 10 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) 농도에서 \( 61.6 \% \)로 가장 강하게 저해되었고, hexane 분획(\(59.0\%\)), butanol 분획(\(37.9\%\)), chloroform 분획(\(17.0\%\)) 순으로 \( \alpha \)-glucosidase의 활성이 저해되었다. HEAB 농축물인 crude sample과 \( 80 \% \) ethanol 침전물의 \( \alpha \)-glucosidase 활성 저해율은 각각 \( 32.9 \% \)와 \( 14.9 \% \)였다. \( \beta \)-Glucan-free HEAB 전체 고형분(crude)의 \( \alpha \)-glucosidase 제해활성은 \( 32.9 \% \)로 chloroform 분획, \( 80 \% \) ethanol 침전물 보다 높았다. Acarbose의 \( \alpha \)-glucosidase \( (5 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml}) \) 저해활성은 \(39.5\%\)로 나타났다. 따라서 분획물 중 EA 분획이 \( \alpha \)-glucosidase 활성을 가장 강하게 저해하였다.</p><h2>\( \alpha \)-Glucosidase 활성저해물질의 분리</h2><p>\( \alpha \)-Glucosidase 저해 활성이 가장 높았던 EA 분획으로부터 활성물질을 분리하였다. EA 분획을 silica gel column chromatography (chloroform\(:\)methanol, gradient)를 이용하여 얻은 8개의 분획 중 \( \alpha \)-glucosidase 저해활성이 높았던 Fr. Ⅳ, Fr. Ⅴ를 합쳐 다시 acetonitrile: \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) (\(12: 1\), \(\mathrm{v} / \mathrm{v}\))를 전개용매로하여 silica gel column chromatography로 분리한 후 11개의 EA subfraction을 얻었다. 이들 각 subfraction \( 5 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) 농도에서 \( \alpha \)-glucosidase 활성 저해율을 측정한 결과 acarbose \( (5 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml}) \)가 \( 31.5 \% \)인 것에 비하여 \(1 \sim 3\)번 subfraction이 각각 \( 30.8 \%\), \(80.4 \%\), \(41.1 \% \)였고, 특히 2번 subfraction이 \( 80.4 \% \)로 acarbose (\(31.5\%\))보다 2.5배 이상의 활성저해율을 나타내었다. \( \alpha \)-Glucosidase 저해율이 높았던 \(1 \sim 3\)번 subfraction의 UV/Vis 흡수 패턴을 확인한 결과 \(267 \sim 268 \mathrm{nm}\)에서 최대 흡광을 나타내었으며, 이는 isoflavone류 중 genistein, genistin의 흡광범위와 동일하였다. 그 중에서 \( \alpha \)-glucosidase 활성 저해율이 가장 높았던 2번 subfraction은 0.8679로 가장 높은 흡광도를 나타내었으며, 1번(0.5439), 3번(0.4343) 순이었다. 또한 이들 EA subfraction 1, 2 및 3번을 TLC를 이용하여 분리하고 DAP로 발색시킨 결과 당이 함유된 것으로 확인 되었다. 따라서 EA 분획물에서 \( \alpha \)-glucosidase 활성을 저해하는 물질은 isoflavone 배당체로 추정할 수 있었고, 가장 강력한 \( \alpha \)-glucosidase 저해활성을 갖는 EA subfraction 2번을 \( \mathrm{C}_{18} \) reversed-HPLC column으로 분석하였다. EA subfraction 2번에는 genistin과 daidzin이 함유되어 있었고, 또한 이들 보다 극성 큰 물질들이 다소 함유되어 있었다. 극성이 강한 이들 물질은 동정되지 않았지만, TLC 분석에서 당이 함유되어있었고, UV 흡광도에서 isoflavone과 유사한 것으로 확인되어 이들은 당이 isoflavone과 conjugation된 isoflavone 배당체로 생각된다. 이들은 genistin이나 daidzin보다 훨씬 빨리 유출되었기에 isoflavonoide에 glucose가 하나 결합된 배당체가 아니라 AB가 배양되는 과정에서 효소반응에 의해 합성된 분자량이 genistin이나 daidzin보다 큰 glycoside 결합의 isoflavone 배당체로 추정된다.</p><h2>EA 분획물의 \( \alpha \)-glucosidase 활성저해 물질</h2><p>Isoflavone인 genistein, genistin (genistein의 glycoside)과 daidzin (daidzein의 glycoside) (각각 \( 0.5 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) ), 그리고 EA subfraction 2의 \( \alpha \)-glucosidase 활성 저해율을 측정한 결과 배당체가 아닌 genistein이 배당체인 daidzin, genistin보다 저해율이 높게 나타났다. \( 0.5 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) genistein은 \( 78.5 \% \)의 저해율을 보여 \( 5 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) 농도의 acarbose (\(27.2\%\))보다 약 2.8배 이상의 \( \alpha \)-glucosidase 활성 저해율을 나타내었다. 그러나 EA subfraction에 함유된 isoflavone 배당체인 genistin과 daidzin의 활성은 상대적으로 높지 않았지만 EA subfraction 2 \((5 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml}) \)는 약 \( 80 \% \)의 저해활성을 나타내었다. 이와 같은 결과는 EA subfraction 에 함유된 genistin과 daidzin 및 이들 당 conjugate의 복합적인 효과로 추정된다.</p>