Genomic DNA는 약간 수정된 표준 절차에 따라 HDFs(인간 피부 섬유아세포)에서 추출하였다. Fenton 반응으로 생성된 hydroxyl radical에 노출된 DNA의 산화는 이전의 실험 방법을 따랐다. DNA 1\(\mu \mathrm{g}\)를 포함하는 반응 혼합물 20 1를 \(1 \%\) agarose gel에서 100\(\mathrm{V}\)로 30분간 전기영동하였다. 용출 완충용액을 섬유아세포에 첨가하여 4도에서 30분간 처리한 후, nitrocellulose membrane에 10% skim milk를 전처리하고 다양한 1차 항체를 처리한 다음 2차 항체 처리 후, chemiluminescent ECL kit를 이용하여 단백질을 검출하였다.
<h2>Hydroxyl radical에 의한 DNA 손상을 전기영동법으로 분석</h2> <p>Genomic DNA는 약간 변형된 표준 과정에 따라 \( \mathrm { HDFs } \) (human dermal fibroblasts) 세포로부터 추출 하였다. Fenton 반응에 의하여 발생된 hydroxyl radical에 노출된 DNA 산화는 기존에 실험된 방법에 따라 수행되었다. 먼저 \( 100 \mu 1 \) 의 DNA 용액에 시험농도의 spermidine, \( 200 \mu \mathrm { M } \) \( \mathrm { FeSO } _ { 4 } , 1 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 및 \( 50 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) genomic DNA를 첨가하였다. 반응 혼합물을 \( 30 \mathrm { ~min } \) 동안 상온에서 반응시킨 후 \( 10 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { EDTA } \)를 첨가하여 반응을 종결시킨다. \( 1 \mu \mathrm { g } \) 의 DNA를 포함하는 20 1의 반응혼합물을 \( 1 \% \) agarose gel에서 \( 100 \mathrm { ~V } \) 로 \( 30 \mathrm { ~min } \) 동안 전기영동 하였다. Gel은 \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) ethidium bromide로 염색하여 물로 세척하여 UV로 LAS3000 \( { } ^ {\circledR } \) image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.</p> <h2>Western blot analysis</h2> <p>사람피부섬유아세포에 용출 완충용액 \( (50 \mathrm { mM } \) Tris - \( \mathrm { HCl } \), pH 7.5, 0.4 \% Nonidet P-40, \( 120 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } , 1.5 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl2 } \), \( 2 \mathrm { mM } \) phenylmethylsulfonyl fluoride, \( 80 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) leupeptin, \( 3 \mathrm { mM } \mathrm { NaF } \) and \( 1 \mathrm { mM } \mathrm { DTT } ) \)을 첨가하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 30 \mathrm { ~min } \) 동안 처리하였다. \( 10 \mu \mathrm { g } \) 의 세포용출액을 \( 10 \% \) Tris - \( \mathrm { HCl } \) gel에서 전기영동 후 단백질을 전기적으로 nitrocellulose membrane 으로 전이시켰다. 그 다음 \( 10 \% \) skim milk를 nitrocellulose membrane에 전 처리하고 목적 단백질에 대한 1 차 항체(an-ti-Nrf2, anti-SOD-1, anti-SOD-2, anti-SOD-3, anti-beta-actin)를 처리한 다음 2차 항체를 처리 후, chemiluminescent ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 목적단백질을 검출하였다. Western blot의 band는 LAS3000 \( { } ^ {\circledR } \) image ana- lyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.</p>