본 연구는 위암세포인 AGS에 대한 대두 추출물과 아가콩 \(3\) 호 추출물의 영향을 알아보기 위해 진행되었다. FS 및 FYA의 처리에 따른 암 세포 생존율을 확인하기 위해 추출물과 AGS가 섞인 배지에 MTT를 반응시켰고, DMSO를 각 well에 분주하고 이에 따른 formazan를 제거 후 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 그리고 추출물 처리에 따른 암 세포의 전체적인 변화를 관측하기 위해 도립현미경를 사용했으며, apoptosis 시의 핵 형태변화 관찰을 위해 DAPI를 이용한 염색과정을 거쳤고 이를 형광현미경으로 관찰하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포배양</h2> <p>본 연구에 사용된 AGS 인체 위암세포는 한국생명공학연구소(KRIBB, Taejeon, Korea)에서 분주 받아 사용하였으며, 세포의 배양을 위해 \( 90 \% \) 의 RPMI-1640배지(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 10\% fetal bovime serum (FBS, Gibco BRL)에 \( 1 \% \)의 penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL)이 포함된 성장배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, \) \( 5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) 조건 하에서 배양하였다.</p> <h2>시료준비 및 처리</h2> <p>본 실험에 사용된 시료는 시중에서 판매되는 대두(Soybean)와 경북대학교에서 품종 육성되어진 아가콩 3 호(Yellow Agabean)를 제공받아 사용하였다. 시료 준비를 위해 각각의 콩을 수세하고 24 시간 동안 침지시킨 뒤 가압증자한 후 실험실에서 따로 분리된 Bacillus sp. sm26 균주 배양액을 증자된 시료의 \( 3 \%(\mathrm{w} / \mathrm{w}) \)가 되도록 접종하고 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)에서 72 시간 발효하였다. 그 후 제조된 발효물을 \( 70 \% \) ethanol로 추출하여 여과한 후 감압 농축하여 각각, 발효 대두 추출물 (Fermented Soybean, FS), 발효 아가콩 3 호 추출물 (Fermented Yellow Agabean, FYA)을 얻어 사용하였다.</p> <h2>MTT assay에 의한 세포 성장억제 조사</h2> <p>FS 및 FYA의 처리에 따른 세포 생존율 비교를 위하여 6 well plate에 AGS 세포를 \( 1 \times 10^{5} \) 개/ml로 분주하고 FS 및 FYA를 처리한 후 48 시간 동안 배양 후 배지에 tetrazolium bromide salt (MTT, Amersco, Solon, Ohio, USA) 시약을 \( 0.5 \) \( \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 희석하여 분주하여 2 시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 시약을 깨끗하게 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO, Amersco)를 각 well에 동량으로 분주하여 well에 생성된 formazan을 모두 녹인 후 96 well plate에 \( 200 \mu 1 \)씩 옮겨서 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 세 번을 하였으며 그에 대한 평균값과 표준오차를 마이크로소프트 엑셀 프로그램으로 구하였다.</p> <h2>세포의 형태변화 관찰</h2> <p>FS 및 FYA 처리에 의한 AGS 세포의 전체적인 변화를 관찰하기 위하여 세포에 48 시간 동안 농도별로 처리 후 도립현미경(inverted microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 200 배의 배율로 각 농도에 따른 세포의 형태 변화를 관찰하였다. 또한 암세포에서 apoptosis 유발 시 특이적으로 나타나는 핵의 형태변화를 관찰하기 위하여 동일 조건으로 처리한 세포를 모은 다음 \( 37 \% \) formaldehyde 용액과 phosphate buffered saline (PBS)를 1:9의 비율로 섞은 fixing solution으로 세포를 상온에서 10 분 동안 고정하고 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma) 용액을 이용하여 상온에서 암조건으로 15 분간 염색시켰다. 염색된 세포를 PBS 및 증류수로 세척한 다음 absolute alcohol로 탈수과정을 거친 slide glass 위에 mounting solution을 처리한 후 형광 현미경(Carl Zeiss)을 이용하여 400배의 배율로 FS 및 FYA 각각 농도에 따른 AGS 세포의 핵 형태변화를 관찰하였다.</p>