본 연구에서는 참고바이러스 9종의 RNA 또는 cDNA를 확보하고 이를 바탕으로 PRMV만을 특이적으로 증폭하는 LAMP primer를 개발하였다. LAMP 프라이머는 6개의 특이 부위를 어닐링함으로써, RT-PCR 및 nested PCR 검사법과 비교했을 때 더욱 높은 특이성을 보였다. 또한, 기존 분석법에서 소요되던 시간을 약 3시간으로 단축시키는 등 효율성이 높아진 것을 확인하였다.
<p>PRMV 및 핵산 또는 기주와 관계된 참고바이러스 9종 [CLRV, GFLV, PDV, RpRSV, SLRSV TBRV, ToRSV, TRSV 및 Tomato spotted wilt virus (TSWV)]의 RNA 또는 \( \mathrm{cDNA} \) 를 유관기관, 식물바이러스은행 및 구매를 통해 확보하였으며, ReverTra Ace- \( \alpha-{ }^{\circledR} \) (Toyobo, Japan)로 cDNA 합성을 수행하였다. LAMP 증폭을 위한 조성은 주형 cDNA \( 1.5 \mu \mathrm{l} \), LAMP primer [F3과 B3 (10 pmole) 각각 \( 0.6 \mu \mathrm{l} \), \( \mathrm{FIP} \) 와 \( \mathrm{BIP} \) (10 pmole) 각각 \( 1.4 \mu \mathrm{l} \), Bst-polymerase (8 unit/ \( \mu \mathrm{l}) 1.5 \mu \mathrm{l} \), dNTP \( (10 \mathrm{mM}) 2 \mu \mathrm{l} \) 및 \( 10 \mathrm{X} \) buffer \( 2 \mu \mathrm{l} \) 로 총 \( 11 \mu \mathrm{l} \) 로 반응하였다. LAMP 증폭 조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분, \( 4^{\circ} \mathrm{C} 1 \) 분 이후, \( 62^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 반응하였다.</p> <p>LAMP primer의 특이적 검정 결과, PRMV에 특이적 밴드인 ladering이 나타났으며 참고바이러스 9 종에서는 특이적 반응이 나타나지 않아, PRMV만을 특이적으로 증폭할 수 있는 LAMP primer 조합으로 추론되었다(Fig. 1). 또한 현재 활용되고 있는 RT-PCR 및 nested PCR 검사법과 비교하기 위하여, PRMV cDNA를 \( 10^{-9} \) 까지 단계 희석하였다. 희석한 \( c \mathrm{DNA} \) 를 주형으로 현재 PRMV를 진단하는 방법인 RT-PCR과 nested PCR [11]을 사용하여 조성과 조건을 동일하게 수행하였다. 그 결과 RT-PCR에서는 원액에서만 밴드가 형성되었으며(Data not shown), nested PCR 분석 결과 \( 10^{-2} \) 에 서 흐리게 밴드를 형성하였다(Fig. 1). 이번 연구에서 개발한 LAMP 분석법 역시 \( 10^{-2} \) 까지 밴드를 형성하여 기존의 nested \( \mathrm{PCR} \) 와 동일한 검출 감도가 나타났다(Fig. 1). 그러나, LAMP 분석법은 RNA 추출 이후 약 10 시간 이상[RT-PCR \( (4 \mathrm{H}) \), 전기영동 \( (1.5 \mathrm{H}) \), nested PCR (3H) 및 전기영동(1.5H)] 소요되던 시간을 약 3 시간[cDNA 합성 ( \( \geqq 30 \mathrm{~min} \) ) 및 LAMP (70 min) 및 전기영동 \( (1.5 \mathrm{H})] \) 으로 단축시킬 수 있으며, SYBR 또는 hydroxynaphthol blue를 사용하면 약 1 시간 40 분까지로 단축시킬 수 있다. LAMP 프라이머는 6 개의 부위를 특이적으로 어닐링 하므로 기존의 conventional PCR 보다 더욱 특이적으로 해당 병원체만을 검출할 수 있다.</p>