RAW264.7 세포를 24시간 동안 배양한 후, 농도에 따른 처리를 진행하였다. 처리 후 48시간 뒤, PBS로 세척하고, RNeasy Plus Mini Kit를 이용하여 total RNA를 추출하였다. 이 모든 과정은 4℃에서 수행되었으며, total RNA를 정량한 후 1µg를 이용해 cDNA를 합성하였다. 이후 GADPH를 House keeping gene으로 사용하고, 2% agarose gel에서 UV 상에서 band를 확인하였다.
<h2>Total RNA 추출 및 cDNA 합성</h2> <p>RAW264.7 세포를 24시간 배양한 후 농도 별로 시료를 처리했다. 시료 처리 48 시간 후 \( \mathrm { PBS } \) 로 세척한 후, \( \mathrm { RNeasy } ^ {\otimes } \) Plus Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 total RNA를 얻었다. 모든 과정은 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 진행되었으며, Quantus fluorometer RNA system (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 정량하였으며, \( \mathrm { cDNA } \) 합성을 위해 \( 1 \mu \mathrm { g } \) 의 total RNA를 사용하여 ReverTra Ace \( - \alpha \)-(Toyobo, Osaka, Japan)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.</p> <h2>RT-PCR</h2> <p>cDNA상의 타겟 유전자를 증폭시키기 위하여 Quick \( \mathrm { Taq } ^ {\infty } \mathrm { HS } \) Dye Mix (Toyobo, Osaka, Japan)와 합성한 cDNA, forward primer와 reverse primer로 PCR을 수행하였다. \( \mathrm { PCR } \) 의 조건은 다음과 같다. \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 2 분 간 denaturation을 시킨 후, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30초 간 denaturation 후 각 \( \mathrm { Tm } \) 값에 맞추어 30초간 annealing, \( 68 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분 간 extension을 30 cycle 반복하였고 마지막 단계로 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분 간 extension하였다. House keeping gene으로 GADPH을 사용하였고 \( 2 \% \) agarose gel(Affymetrix, Cleveland, OH, USA)로 UV상에서 band를 ChemiDoc(Bio-rad)로 확인하였다. 각 primer의 서열은 다음과 같다. iNOS forward 5'-AAT GGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT-3', reverse 5'-GCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA CTC-3'. COX-2 forward 5'-GGA GAG ACT ATC AAG ATA GT-3', reverse 5'-ATG GTC AGT AGA CTT TTA CA-3'. GADPH forward 5'-AAC TTT GGC ATT GTG GAA GG-3', Reverse 5'-ATG CAG GGA TGA TGT TCT GG-3'.</p>