수원시의 재래시장에서 침채류 시료를 수집하여 Chlorogenic acid를 가수분해하는 cinnamoyl esterase 활성을 보유한 유산균을 분리하는 연구를 수행하였다. 분리한 세균은 16S ribosomal RNA 유전자를 통해 동정하였고, 이를 위한 PCR 산물은 정제 후 염기서열 결정을 위해 SolGent에 의뢰하였다.
<h2>Cinnamoyl esterase 활성 보유 유산균 분리 및 배양</h2> <P>Chlorogenic acid 가수분해를 위한 cinnamoyl esterase 활성 보유 유산균 분리를 위한 침채류 시료(배추김치, 부추김 치, 고춧잎김치, 고들빼기, 깻잎김치, 오이소박이, 파김치)는 경기도 수원시 소재 재래시장에서 구입하였고, 멸균한 거즈로 여과하여 얻어진 침채류 여액을 bacteria 분리가 가능한 농도로 생리식염수로 희석한 다음, cinnamoyl esterase 활성 보유 유산균 선발을 위한 배지에 도말하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 3일간 배양하였다. \( 1 \mathrm { ~L } \) 당 casein acid hydrolysate \( 5 \mathrm { ~g } \), yeast extract \( 4 \mathrm { ~g } \), glucose \( 5 \mathrm { ~g } \), fructose \( 5 \mathrm { ~g } \), DL-malic acid \( 10 \mathrm { ~g } , \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } \) \( 0.6 \mathrm { ~g } , \mathrm { KCl } 0.45 \mathrm { ~g } , \mathrm { CaCl } _ { 2 } 0.13 \mathrm { ~g } , \mathrm { MgSO } _ { 4 } 0.13 \mathrm { ~g } , \mathrm { MnSO } _ { 4 } \) \( 0.003 \mathrm { ~g } \), agar \( 20 \mathrm { ~g } , 1 \mathrm { ~mL } \) tween 80을 조성으로 하는 FT80 agar로부터 glucose와 fructose를 제거하고 \( \mathrm { pH } ^ { 2 } \) 를 5로 조정한 기본배지에 활성 확인을 위한 기질 ethyl ferulate를 최종농도 \( 1 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \)가 되게 첨가한 고체배지를 유산균 선발에 사용하였다. Ethyl ferulate는 methanol에 녹인 후, membrane filter \( (0.2 \mu \mathrm { m } ) \) 로 여과하여 멸균한 기본배지에 후 첨가하였다. 균주의 순수분리 및 배양에는 MRS 배지(Difco, USA)를 사용하였다.</P><h2>선발 균주의 동정</h2> <P>선발된 bacteria는 16S ribosomal RNA 유전자(16S rDNA) 염기서열 분석에 의해 계통발생학적으로 동정하였다. 분리 된 bacteria의 16S rDNA 증폭은 DNeasy tissue kit (Qiagen, Germany)을 이용하여 추출된 DNA를 PCR 하거나 colony PCR을 이용하여 수행하였다. PCR 증폭에 사용된 primer는 다양한 미생물의 증폭에 사용되는 eubacterial universal primer 27F (5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3') 와 1492R (5'- GGT TAC CTT GTT AGG ACT T-3')을 사용하였다. PCR 반응은 T3000 Thermocycler (Biometra, Germany)를 사용하였고, \( 50 \mu \mathrm { L } \mathrm { PCR } \) 반응계에는 template DNA 또는 미량의 colony, \( 100 \mathrm { mM } \) dNTP, 1 U Taq polymerase (Roche, Germany), \( 20 \mathrm { pmol } \) 의 primer를 첨가하였다. PCR 반응은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5분간 예비가열 후, \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분간 변성, \( 57 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분 annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분 중합반응의 과정을 30회 반복하였고, 마지막에 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5분간 처리한 후 반응을 중단시켰다. 증폭된 PCR 산물은 PCR product purification kit (SolGent, Korea)을 사용하여 정제한 후, 수탁업체(SolGent)에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)와 EzTaxon server \( 2.1 \)에 등록된 염기서열 정보를 대상으로 nucleotide blast search를 통해 계통발생학적 분석을 수행하였다. Database에 등록된 표준균주(type strain)와 가장 높은 상동성을 나타내는 분류군을 해당 염기서열에 해당하는 bacteria 로 동정하였다.</P><h2>Chlorogenic acid 분해활성 측정</h2>