본 실험 에서는 느티나무 잎의 항산화능을 측정하였다. 느티나무 잎은 충청북도 괴산군 칠성면에서 채취하여 동결건조 후 분쇄하여 ehtyl acetate 분획물을 얻었다. 항산화능은 DPPH 라디칼 소거활성정도, ABTS 라디칼 소거활성정도, \(\mathrm{Fe^{2+}}\) 킬레이팅 활성 정도를 통해 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>본 실험에 사용된 느티나무 잎은 충청북도 괴산군 칠성면에서 채취하여, 중원대학교 생약자원개발학과에서 분류 및 동정한 것 (voucher number: JWU15-1)을 시료로 사용하였다.</p> <h2>시료 추출 및 용매분획</h2> <p>ehtyl acetate 분획물(EA)을 얻기 위해 느티나무 잎을 동결건조한 후에 분쇄하여 분말화하였다. 분말화한 느티나무 잎을 초음파를 이용하여 \( 80 \% \) methanol에 \( 3 \)일 동안 침출시킨 후, filter paper (Whatman NO. 2, Maidstone, UK)로 여과하였다. methanol 추출물을 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 이하의 중탕에서 감압 환류 냉각장치 (N-1110S, EYELA, Tokyo, JAPAN)로 농축한 후 분별 깔대기를 이용하여 petroleum ether, ethyl acetate 을 이용하여 각각 순차적으로 \( 3 \) 회 분획 하였다. 이 중 ethyl acetate 분획물을 감압 환류 냉각 장치로 농축하여 시료로 사용하였다. 열수 추출물 (HW) 을 얻기위해 느티나무 잎을 동결건조한 후에 분쇄하여 분말화하였다. 분말화한 느티나무 잎을 증류수에 침출시켜 뜨거울 물에 용출하여 filter paper (Whatman NO. \( 2 \), UK) 로 여과하였다. 여과한 추출물을 freeze drier (Ilshin, Donducheon-si, Korea) 를 이용하여 건조시켜 시료로 사용하였다. 모든 시료는 실험 전까지 \( -27^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동 보관하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해하여 실험에 사용하였다.</p> <h2>기기 및 시약</h2> <p>본 연구에 사용된 High-performance liquid chromatography grade 의 methanol, petroleum ether, ethyl acetate 및 DMSO 는 SK chemicals (Seoul, Korea) 제품을 사용 하였고, 나머지 시약은 Sigma-aldrich (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다. \( \phi \mathrm{X} \)-174 RF I plasmid DNA는 Promega (Madison, WI, USA)에서 구입하여 사용하였다. 기타시약 및 기기는 별도 표기하였다.</p> <h2>DPPH 라디칼 소거활성</h2> <p>\( 1 \),1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH)를 이용한 전자 공여능은 Bondet 방법을 참고하여 측정하였다. DPPH solution은 \( 300 \mu \mathrm{M} \) DPPH 를 \( 515 \mathrm{nm} \) 에서 흡광도 값이 \( 1.00 \) 이 되도록 ethanol을 이용하여 희석 준비하였다. 각 농도별 추출물 \( (0.32,1.6,8,40,200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) 40 \mu \mathrm{L} \)에 DPPH solution \( 760 \mu \mathrm{L} \)를 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 20 \)분 반응시켜 UV/Visible spectrophotometer (Human Cop, Xma-3000PC, Seoul, Korea) 를 이용하여 \( 515 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>ABTS 라디칼 소거활성</h2> <p>3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) 라디칼 소거 활성 능력은 Van den Berg 등의 방법을 참고하여 측정하였다. ABTS solution은 \( 7.4 \mathrm{mM} \) \(\mathrm{2,2'} \)-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt와 \( 2.6 \mathrm{mM} \) potassium persulfate를 혼합하여 \( 24 \)시간 ABTS radical 을 형성시킨 후 증류수를 이용하여 \( 734 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도 값이 \( 0.70 \) 이 되도록 희석하였다. 각 농도별 추출물 \( 40 \mu \mathrm{L} \)에 ABTS solution \( 760 \mu \mathrm{L} \)를 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 20 \)분 반응시켜 UV/Visible spectrophotometer를 이용하여 \( 734 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>\( \mathrm{Fe}^{2+} \) 킬레이팅 활성</h2> <p>\( \mathrm{Fe}^{2+} \) 킬레이팅 활성은 Hsu 등의 방법을 참고하여 실험하였다. 각 농도별 추출물 \( 40 \mu \mathrm{L} \)에 \( 1 \mathrm{mM} \mathrm{FeCl}_{2} 40 \mu \mathrm{L} \)와 증류수 \( 700 \mu \mathrm{L} \)를 혼합하여 약 \( 30 \)초간 실온에서 반응하였다. 이 혼합물에 \( 5 \mathrm{mM} \) ferrozine \( 40 \mu \mathrm{L} \)을 첨가하여 \( \mathrm{Fe}^{2+} \)-ferrozine complex를 유도하고 \( 10 \)분 후 UV/Visible spectrophotometer를 이용하여 \( 562 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>