T-RFLP 분석은 PCR 반응산물을 Agarose gel로부터 정제한 후, 4가지 염기서열 인식 제한효소를 첨가하여 5시간 동안 반응시킨 후, ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer에 의해 GeneScan mode로 분석하여 T-RF의 크기를 GS-500 ROX standard DNA size marker로 결정하는 방법이다.
<h2>T-RFLP 분석</h2> <p>Agarose gel로부터 정제한 PCR 반응산물에 4염기서열 인식 제한효소 \( Hae \)Ⅲ (TaKaRa), \( Mse \)Ⅰ (NEB, England), \( Msp \)Ⅰ (TaKaRa) 및 \( Tha \)Ⅰ (Roche)을 각각 \( 20 \mathrm { ~U } \) 첨가하여, 최종 \( 25 ~ \mu \mathrm { L } \) 반응계에서 5시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 말단제한단편(T-RF)의 분석은 수탁업체(SolGent)에 의뢰하여 자동염기서열결정장치 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)에 의 해 GeneScan mode에서 수행하였다. T-RF의 크기는 GeneScan 3.1 software의 Local Southern 방법에 의해 결정되었으며, standard DNA size marker로는 GS-500 ROX와 GS-1000 ROX를 사용하였다 (Applied Biosystems). T-RFLP 결과에서 나타난 T-RF peak의 크기(size)는 분류학적 단위 (Operational Taxonomic Unit, \( OTU \))의 다양성을, peak의 높이는 정량성을 의미하는 것으로 간주하였다. 각 T-RF에 해당하는 OTU의 확인은 Ribosomal Database Project Ⅱ (RDP-Ⅱ) web site의 T-RFLP analysis program (TAP)을 이용하거나, 기존의 침채류에서 보고된 미생물 16S rDNA 염기서열을 RDP database와 GenBank database로부터 추출한 다음, webcutter 2.0 software를 이용하여 예상되는 T-RF의 크기를 직접 계산하였다.</p> <h1>결 과</h1> <h2>표준 유산균 T-RFLP 분석</h2> <p>T-RFLP 분석의 결과로 나타나는 T-RF의 실험치와 예상치의 오차 확인 및 제한효소와 16S rDNA 증폭용 primer의 유용성 확인을 위하여 배추김치에서 주로 검출되는 것으로 보고된 8종의 표준 유산균으로부터 추출한 DNA를 적당히 섞어 T-RFLP 분석을 수행하였다. 사용한 제한효소에 따라 6~8개의 서로 다른 크기를 갖는 T-RF peak가 검출되어 본 실험에서 구축한 reverse primer가 김치유산균의 16S rDNA 증폭에 유용하게 작용하는 것으로 나타났고(Fig. 1), 측정된 T-RF의 크기는 TAP과 RDP database의 16S rDNA 염기서열로부터 산출된 해당 균주의 T-RF 크기와 0~6 \( \mathrm { ~bp } \) 정도의 오차가 있는 것으로 나타났다(Table 1). T-RFLP 분석에서 한가지 제한효소를 사용하는 경우, 한 T-RF는 한개 이상의 분류군(taxon)을 대표하는 경우가 발생하여, 다양한 미생물이 공존하는 미생물 군집의 종(species) 수준에서의 다양성 파악에 장애요인이 되고 있다. 따라서 본 연구에서는 RDP database에 축적된 16S rDNA 염기서열을 이용하여 발생 가능한 5'-T-RF의 크기를 검토한 다음, 가능한 종 수준에서의 다양성 파악을 극대화 시킬 수 있는 4종의 제한 효소 \( Hae \)Ⅲ, \( Mse \)Ⅰ, \( Msp \)Ⅰ, \( Tha \)Ⅰ을 선정하였다. \( Hae \)Ⅲ를 제외한 3종의 제한효소로는 8종 유산균의 구분이 한번에 달성되지 않았지만, 제한효소에 의해 획득된 T-RF profile의 상호 비교를 통하여 각 T-RF에 해당하는 균주의 확인이 가능한 것으로 나타났다. 하지만 \( Mse \)Ⅰ을 사용한 경우, 590, 605 \( \mathrm { bp } \) 등의 예상하지 못한 T-RF들이 관측되었다. 이는 PCR 증폭과정에서 생성된 단일가닥 16S rDNA로 제한효소가 작용하지 못한 pseudo-T-RF일 가능성이 있으며, 제한효소가 완벽하게 작용하지 않아 발생한 Leuconostoc citreum 또는 Enterococcus faecalis의 T-RF일 가능성도 있다. \( Tha \)Ⅰ으로 처리한 profile에서 Lc. citreum로 추정되는 T-RF의 상대적인 높이(면적비)가 \( Hae \)Ⅲ에 의해 도출된 결과보다 조금 낮게 나타난 것을 제외하면, 대부분의 T-RF의 상대적 높이는 제한효소에 관계 없이 대체로 일관성 있는 결과가 도출되어 미생물 군집에서의 상대적인 정량성 언급이 가능한 것으로 확인되었다.</p>