HKSMM의 \( 50 \% \) 수용성 ethanol 추출물 (HKSMM50)을 RAW 264.7 세포 처리 시료로 사용했으며, RAW 264.7 세포는 \( 10 \% \) FBS와 penicillin \( (100 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) \), streptomycin \( (100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 이 함유된 RPMI 1640 배지에서 배양했다. 시료의 세포독성 측정과 Biochemical markers 및 SOD, CAT 활성 측정을 진행했으며, COX-2 및 iNOS protein 발현은 Western blotting으로 분석했다. 또한, HKSMM50 시료의 \( \beta \)-glucan, 총 플라보노이드 및 총 이소플라보노이드 함량은 건강기능식품 기준 및 규격의 3-25 \( \beta \) -glucan, 3-48 total flavonoid, 및 3-53 대두 isoflavonoid 분석법에 준해 분석했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료 및 시약</h2> <p>HKSMM은 (주)HK바이오텍(경남 진주시), AHCC는 KCFKOREA (서울)로부터 제공받았다. RAW 264.7 cells은 ATCC (Koram Biotech Corp, 서울)에서 구입하였다. Fetal bovine serum (FBS), penicillin (100 U/ml), streptomy-cin \( (100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \), RPMI 1640, fetal bovine serum (FBS)은 Gibco사(MA, USA)에서 구입하였다. Sulfanilamide, phos-phoric acid, N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride(NED), sodium nitrate와 LPS는 Sigma-Aldrich사(MO, USA)에서 구입하였다. Cell counting kit-8 (CCK-8) (Enzo Life Sciences, MN, USA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) assay kits (TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \), IL-6, IL-4, NF-kB, SOD, CAT) 는 Abcam 사(Cambridge, UK)로부터 구입하였다. RIPA buffer (Thermo Scientific, MA, USA), Western blotting de-tecting reagents (GE Healthcare Life Sciences, Buckingham-shire, UK), Pierce bicinchoninic acid protein assay kit와 polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Millipore, MA, USA). Primary antibody rabbit anti-iNOS, COX-2 goat polyclonal, \( \beta \)-actin mouse polyclonal, anti-goat IgG horse-radish HRP conjugate secondary antibody 는 Santa Cruz사(CA, USA)로부터 구입하였다. Enhanced chemilumi-nescence kit (ECL)는 Bio-Rad사(CA, USA)로 구입하여 사용하였다. 그 외 사용된 시약은 reagent grade 이상이었다.</p> <h2>HKSMM 시료의 ethanol 수용액 추출물 제조</h2> <p>HKSMM \( (100 \mathrm{~g}) \) 을 ethanol 수용액 \( (0,30,50,70,95 \%) \) 1.01에 첨가하고 충분히 혼합한 다음 하룻밤 방치하였다. 혼합기로 균질화하고 원심분리 \( \left(7,000 \mathrm{rpm}, 4^{\circ} \mathrm{C}, 30 \mathrm{~min}\right) \)하여 얻은 상등액의 ethanol을 진공농축하여 제거하였다 \( (50 \)\( { }^{\circ} \mathrm{C} \) ). Ethanol을 제거한 HKSMM 농축물은 동결건조하여 분말화하였다. HKSMM의 \( 50 \% \) 수용성 ethanol 추출물 (HKSMM50)을 RAW 264.7 세포 처리 시료로 사용하였다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>RAW 264.7 세포는 \( 10 \% \) FBS와 penicillin \( (100 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) \), streptomycin \( (100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 이 함유된 RPMI 1640 배지에서 배양 \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2}\right. \) incubator)하였다. RPMI 1640 배지에서 배양된 RAW 264.7 세포 \( 1 \times 10^{5} \) cells/200 \( \mu 1 \)을 96 well plate의 well에 분주 후 다시 24시간 배양하고 배양액을 제거하였다. 여기에 LPS \( 1 \mu \mathrm{g} / 100 \mu 1 \)을 분주한 다음 1시간 후에, HKSMM50 시료를 함유한 RPMI 1640 배지 일정량을 분주하고 24시간 배양하였다. AHCC도 HKSMM50 시료와 동일한 방법으로 처리하고 배양하였다. Griess assay를 위한 시료 농도는 \( 0,40 \mu \mathrm{g} / 100 \mu 1 \) 였고, CCK-8 assay를 위한 시료 농도는 \( 0,8,40,200,1,000 \mu \mathrm{g} / 90 \mu 1 \) 였고, biochemical markers를 위한 시료 농도는 \( 0,4,20,100 \mu \mathrm{g} / 100 \mu 1 \)였다.</p> <h2>RAW 264.7 세포 처리용 HKSMM 수용성 ethanol 추출물 선정(Griess assay)</h2> <p>RAW 264.7 세포에 LPS와 시료를 처리하고 24시간 배양한 배양액 \( 100 \mu 1 \)를 96 well plate의 well에 분주하였다. 여기에 sulfamilamide solution (1\% sulfanilamide \( / 5 \% \) phos-phoric acid) \( 50 \mu 1 \)를 분주하고 10분 후 NED solution (0.1\% 수용액) \( 50 \mu 1 \)분주하여 10분간 반응시켜(상온, 암실), ELSA microreader (SpectraMax i3, Molecular devices, CA, USA)로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준용액 \( \left(\mathrm{NaNO}_{2}\right. \) 용액)도 시료와 동일한 방법으로 처리하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>시료의 세포독성 측정(CCK-8 assay)</h2> <p>LPS와 시료가 처리된 RAW 264.7 세포를 24 시간 배양한 well에 CCK-8 용액 \( 10 \mu 1 \) 첨가하고 2 시간 배양한 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Biochemical markers 및 SOD 및 CAT 활성 측정</h2> <p>LPS와 시료가 처리된 RAW 264.7 세포를 24시간 배양한 배양액은 biochemical marker assay (ELISA kit 사용)에 사용하였다. 각 biochemical marker assay는 ELISA kit 제조사의 분석방법에 준하여 분석하였다.</p> <h2>Western blotting</h2> <p>COX-2 및 iNOS protein 발현은 Raha 등의 방법에 준하여 Western blotting으로 분석하였다. RAW 264.7 세포는 60mm plate의 well에 \( 5 \times 10^{5} \) cells을 seeding하였다. LPS와 시료(HKSMM50 및 AHCC)를 처리하고 24시간 배양하였다. 이들 세포를 RIPA buffer로 lysis한 후 원심분리 \( \left(14,000 \mathrm{rpm}, 30 \mathrm{~min}, 4^{\circ} \mathrm{C}\right) \)하였다. 배양액의 protein 함량은 Pierce bicinchoninic acid protein assay kit로 분석하였다. Protein \( (10 \mu \mathrm{g}) \)을 \( 10 \% \) SDS-PAGE로 분리한 후 PVDF membrane (Immunobilon-P, \( 0.45 \mathrm{~mm} \) )으로 transfer하였다. 분리된 protein band는 iNOS, COX-2, 및 actin 항체와 반응시켰다. Membrane을 ECL kit와 Western blotting detecting reagent로 처리하고 나타난 밴드는 ImageJ software (http:// imagej.nih.gov)로 정량화 하였다.</p> <h2>\( \beta \)-Glucan, total flavonoid 및 total isoflavonoid 함량분석</h2> <p>HKSMM50 시료의 \( \beta \)-glucan, total flavonoid 및 total iso-flavonoid 함량은 건강기능식품 기준 및 규격의 3-25 \( \beta \) -glucan, 3-48 total flavonoid, 및 3-53 대두 isoflavonoid 분석법에 준하여 분석하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>Data는 3 반복 결과를 mean \( \pm \mathrm{SD} \) (표준편차)로 표시하였다. Data 분석은 ANOVA를 통하여 분석하고 Duncan's multiple range test 또는 Student's t-test로 유의성 검증을 하였다.</p>