감태를 이용하여 ethanol 추출물을 얻고 난소 절제 여부에 차이를 둔 실험동물의 혈액을 얻어 원심분리 및 혈청을 분리했다. ALP 활성, 혈청 osteocalcin 그리고 collagen 함량 등을 측정하였고 기술통계치를 산출하여 결과 값을 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>추출물의 제조</h2> <p>본 실험에서 사용한 감태는 2007년 10월 제주전역 해안일대에서 채취된 것을 태림상사에서 구입하여 물로 \( 4 \sim 5 \)회 씻어 염분과 불순물을 제거하고, 자연 건조시커 분쇄하여 분말화하여 실험에 사용하였다. 건조된 감태는 \( 80 \% \) ethanol 21를 가해 3회 열 추출하여 감압농축기로 농축하고 동결 건조한 ethanol 추출물을 \( 0.9 \% \) 생리식염수로 희석한 후 동물실험에 사용하였다.</p> <h2>실험동물, 사육조건 및 식이조성</h2> <p>\(180-190\mathrm{g}\)인 9주령의 암컷(Sprague-Dawley) 쥐를 오리엔트 바이오에서 분양받아 1주일간 적응시킨 후 난소 절제 수술을 하였고 비 난소절제 대조군에게는 sham-operation을 실시하였다. 수술 후 1주일간 고형 사료를 주어 상처가 회복되면, 난괴법(randomized complete block design)에 의해 4군으로 나누었다. 즉 실험동물은 난소절제는 하지 않고 같은 수술의 스트레스를 준 비 난소절제 대조군(SHAM), 난소를 절제한 대조군 (OVX-CON), 난소절제 후 감태 추출물 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 투여 군 (OVX-EC50), 난소절제 후 감태 추출물 \( 200 \mathrm{mg} /\mathrm{kg} \) 투여군 (OVX-EC200)으로 각 7마리씩 4군으로 나누어 \( 1 \mathrm{ml} \)의 시료를 매일 경구 투여하며 6주간 사육하였다(Table 1).</p> <p>실험기간 동안 식이 섭취량과 체중은 매일 일정한 시간에 측정하였다. 동물실헙실의 사육조건은 은도 \( 24 \pm 2^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 50-55 \% \)를 유지시켰고, 물과 식이는 제한 없이 제공하였으며, 실험 시료는 \( 0.9 \% \) 생리식염수로 용해하여 사용하였고 대조군은 동일 용량의 생리식염수를 투여하였다.</p> <h2>혈액 및 장기 채취</h2> <p>혈액은 실험동물을 해부 전 24시간 절식시킨 후 에테르 마취 하에 개복한 후 복대동맥에서 채혈하고 실온에서 30분간 방치한 후 \( 3,000 \mathrm{rpm}\), \(4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였고 실험 시까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다. 혈청 분리 후 \( 0.9 \% \) 생리식염수 용액으로 관류시킨 후 물기를 제거하였고, 늑골과 연골은 경계면에서 분리하였으며 피부는 털을 잘라내고 표피 위의 지방을 제거하여 무게를 잰 후 실험 시 까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다.</p> <h2>분석방법</h2> <p>골격 형성 지표인 serum alkaline phosphatase (ALP) 활성은 측정용 kit를 사용하여 자동생화학분석기 DRY CHEM 3600i (Fuji, Japan)를 사용하여 분석하였다. 혈청 osteocalcin은 rat 전용 osteocalcin ELASA kit (Biomedical Technologies Inc., USA)를 이용하여 ELASA reader로 분석하였다. 골 용해지표인 혈청 중 콜라겐 가교 C-terminal telopeptide (CTx) 농도는 RatLaps ELASA kit (Nordicbioscience diagnostic)를 이용하여 측정하였으며 원리는 Type I collagen의 C-terminal telopeptide \( \alpha 1 \) 사슬에 특징적인 polyclonal antibody의 항원 biotinylated EKSQDGGR에 대한 경쟁적 결합을 기본으로 하였다. 조직 중의 collagen 함량 측정을 위하여 골, 연골, 피부 및 폐 조직은 각각 \( 200 \mathrm{mg} \)씩 취하여 가수분해 (6 NHCI, \(110^{\circ} \mathrm{C} \), \( 20 \mathrm{hr} \) )하고 여과, 농축하여 실험에 사용하였다. 시료 중의 col-lagen은 Woessner의 방법으로 colorimetric method로 hydroxyproline (Hyp)량을 측정한 후, collagen의 아미노산 조성으로부터 collagen량을 환산하였다. Collagen 중의 Hyp의 비율은 평균 \(110\)잔기/\(1000\)잔기 이므로 조직중의 collagen량은 다음의 식에 따라 산출하였다. 표준검체로는 4-hydroxy-L-proline을 \( 0,2,4,8 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)로 하여 검량선을 작성하였다.<p>collagen \( (\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml})=100 / 11 \times \) Hyp \( (\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)</p> <h2>통계처리</h2> <p>연구결과 얻어진 자료를 SPSS Version 14.0 통계 프로그램을 사용하여 하위그룹 각각의 기술통계치(mean, SD)를 산출하였다. 집단 간의 차이를 알아보기 위해 일원변량분석(one-way ANOVA)를 이용하여 분석하였고, 사후검증은 Tukey를 적용하였다. 유의수준은 \( \alpha<0.05 \) 수준으로 검증하였다.</p>