나타마이신의 생산을 위해 균주 Streptomycesnatalensis ATCC 27448를 사용하였고, 배지는 soy flour, clucose, lactose, yeast extract를 사용하였다. 나타마이신 시료은 HPLC를 이용해 정량분석하고 표준곡선을 작성하였으며, 이후 열안정성과 저장안정성을 시험하여 정제와 보존과정에서 발생할 수 있는 나타마이신의 활성변화를 검토하였다. 나타마이신을 추출하고 정제한 후, 정제수율과 순도를 검사하였다. 최종적으로 나타마이신의 결정을 얻어 중량을 측정해 수율을 계산하고, methanol을 이용해 순도를 검사하였다.
<h1>재료 밎 방법</h1><h2>사용균주 및 나타마이신의 생산</h2><p>나타마이신의 생산을 위해 사용한 균주는 Streptomycesnatalensis ATCC 27448이며, 물질 생산용 배지조성은 \( 1.4 \% (w/v)\) soy flour, \( 1 \% (w/v) \) glucose, \( 3 \%(w / v) \) lactose 및 \( 0.3 \% \) (w/v) yeast extract \((\mathrm{pH} 7.0)\)이다. 나타마이신의 정제는 \( 5 \mathrm{~L} \) 발효조(Best Korea Co. Ltd., KOREA)를 사용하여 \(30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 300 \mathrm{rpm} \)의 교반속도로 7-8일간 배양하여 얻은 배양액을 \(4^{\circ} \mathrm{C} \) 냉장고에 보관해 두고 사용하였다.</p><h2>나타마이신의 정량분석</h2><p>본 연구에서 이용된 모든 나타마이신의 정량분석은 아래와 같은 조건에서 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)를 이용하였다. 모든 시료는 methanol (HPLC 8., J. T. Baker, USA)로 추출 및 적절히 희석하여 \(4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 12,000 \mathrm{rpm} \)으로 10분간 원심분리(MICRO 17R, Hanil Science industrial Co. Ltd., KOREA)한 후 HPLC에 의해 정량분석 하였다. 본 연구에 이용된 HPLC는 독일 KNAUER사의 HPLC 펌프 K-1001과 UV detector가 장착되어 있으며 TOSOH사(JAPAN)의 \(\phi ~4.6 \times 150 \mathrm{~mm} \)의 칼럼을 사용하였다. 용매는 \( 80 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)의 methanol을 사용하였고 칼럼의 온도는 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \), 유속은 분당 \( 1 \mathrm{ml} \), 주입량은 \( 20 \mu \mathrm{l}\)로 하였다.</p><p>HPLC에 의한 나타마이신의 정량분석을 위해 나타마이신 표준물질(Minimum \(95\%\), Sigma, USA)을 사용하여 표준곡선을 다음과 갈이 작성하였다. \( 5 \mathrm{mg} \)의 나타마이신을 \( 5 \mathrm{ml} \)의 methanol에 완전히 녹인 후 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, \(100 \mu\mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도가 되도록 각각 methanol로 희석한 후 원심분리하고 HPLC를 통해 정량분석하여 표준곡선을 작성하였다.</p><h2>저장안정성</h2><p>배양액의 보존과 정제과정 동안 발생할 수 있는 나타마이신의 활성 변화를 검토해보기 위해 저장안정성 및 열안정성 시험을 실시하였다. 저장안정성 시험을 위해 나타마이신이 함유된 배양액과 그 배양액을 \( 12,000 \mathrm{rpm}\), \(4^{\circ} \mathrm{C}\)에서 30분간 원심분리하여 얻은 침전물을 각각 \(4^{\circ} \mathrm{C}\)와 실온에서 보관하고 0, 3, 8, 14, 21, 28, 35일째마다 나타마이신의 정량적인 분석을 실시하였다.<h2>나타마이신의 추출 및 정제</h2><h3>1) 나타마이신의 추출</h3><p>나타마이신 배양액 \( 300 \mathrm{ml}\) \((2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(12,000 \mathrm{rpm}\)으로 30분간 원심분리(Hitachi CR21F, JAPAN) 한 후 상징액은 버리고 남은 침전물에 methanol을 \( 300 \mathrm{~mL} \) 첨가하였다. 침전물을 methanol에 완전히 현탁시킨 후 진한 염산용액을 이용하여 \( \mathrm{pH} \) 를 3.0으로 맞추어 10분간 교반하여 추출하였다.</p><h3>2) 농축</h3><p>나타마이신을 추출한 methanol 용액을 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)에서 결정이 생기지 않도록 적절하게 진공감압농축(EYELA, Rotary evaporator N-1000, JAPAN)하였다.</p><h3>3) Diaion \( \mathrm{HP}-20 \) column chromatography</h3><p>Diaion HP-20의 평형화를 위해 \( 50 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) acetone을 첨가하고 10분간 천천히 교반한 후, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 정치하였다. 평형화된 Diaion HP-20에서 \( 50 \% (v/v)\) acetone을 제거하고 증류수로 수세한 후 적절한 양의 증류수를 첨가하여 천천히 칼럼에 충진하였다. Diaion HP-20이 충진된 칼럼에 진공감압에 의해 농축된 시료를 주입한 후 불순물을 제거하기 위해 증류수 \( 600 \mathrm{ml}\), \(30 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) methanol \( 300 \mathrm{ml} \), 그리고 \( 50 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)의 methanol \( 300 \mathrm{ml} \)는 순차적으로 칼럼에 주입하여 천천히 용출시켰다. 불순물이 제거된 칼럼에 \( 80 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)의 methanol \( 600 \mathrm{ml} \)로 나타마이신을 용출하였다. 용출액을 진공감압 농축하여 생성된 나타마이신 결정을 가지고 정제수율과 순도를 조사하였다.</p><h2>나타마이신의 정제수율 및 순도 검사</h2><p>나타마이신의 정제수율은 각 정제과정마다 HPLC 분석에 의해 조사되었고 최종적으로 얻은 나타마이신 결정의 중량을 측정하여 수율을 계산하였다. 최종적으로 얻은 나타마이신 결정의 순도는 적정량의 나타마이신을 채취하여 methanol에 적절히 희석한 후 원심분리하여 HPLC 분석을 통해 결정하였다.</p>