SMYEE의 세포질 내 iNOS, COX-2 및 NF- \( \kappa \)B p65 발현 영향을 분석하였다. RAW 264. 7 세포 배양 후, PBS로 세척하고 cytosol lysis buffer를 첨가하여 4℃에서 30분간 lysis한 뒤, 원심분리로 세포막 성분을 제거하였다. 이후, BCA protein assay kit를 이용해 단백질을 정량하고 Laemmli의 방법으로 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF membrane에 전사시킨 후, skim milk가 포함된 TBSS용액으로 blocking하였다. 이어서, iNOS, COX-2 및 NF- \( \kappa \)B의 발현 양을 확인하기 위해 해당 항체를 사용하여 상온에서 반응시킨 후 세척하였다. 또한, MAPKs의 발현량을 알아보기 위해 RAW 264. 7 세포를 배양하고 SMYEE를 처리하여 p38, ERK, JNK 및 p-p38, p-ERK, p-JNK의 발현량을 항체를 이용하여 검토하였다.
<h2>Western blot에 의한 단백질 발현 분석</h2> <p>SMYEE가 세포질 내 생성되는 iNOS, COX-2 및 NF- \( \kappa \)B p65의 발현량에 미치는 영향을 알아보기 위하여 RAW 264.7 세포를 배양하였다. 배양이 끝난 세포를 수집하여 3회 PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 후, Sheeba와 Asha의 방법에 따라 cytosol lysis buffer [ \( 50 \mathrm { mM } \) HEPES( \( \mathrm { pH~ } 7.4 \)), \( 150 \mathrm { mM } \mathrm { ~NaCl } , 5 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 1 \% \) deoxycholate, \( 5 \mathrm { mM } \) phenylmethylsulfonyl fluoride, \( 1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) aprotinin, \( 1 \% \) Triton X-100, \(0.1 \% \) NP-40]를 첨가하여 30 분간 \( 4 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 lysis 시킨 후, \( 15,520 \times g \) 에서 20 분간 원심분리 하여 세포막 성분 등을 제거하였다. NF- \( \kappa \)B p65의 경우 nucleus lysis buffer ( \( 10 \mathrm { mM } \) HEPES, \( 100 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } , 1.5 \mathrm { mM } \mathrm { ~MgCl } _ { 2 } , 0.1 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 0.1 \mathrm { mM } \) dithiothreitol)를 첨가하여 30 분간 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 lysis시킨 후 \( 15,520 \times g \) 에서 20 분간 원심분리 하여 세포막 성분 등을 제거하였다. BCA protein assay kit(Pierce, USA)를 사용하여 단백질을 정량하였으며 \( 30 \mu \mathrm { l } \) 의 lysate를 Laemmli의 방법을 사용하여 \( 10 \% \) SDS-PAGE로 분리하였다. 분리된 단백질은 Towbin 등의 방법을 참고하여 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane (Bio-Rad)에 1 시간 동안 전사시켜 \( 5 \% \) skim milk가 포함된 TBSS(tris buffered saline; \( \mathrm { pH~ } 7.5 \) ) 용액으로 상온에서 2 시간 동안 blocking 하였다. iNOS, COX-2 및 NF- \( \kappa \)B의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS, COX-2 및 NF- \( \kappa \)B (Santa Cruz Biotechnology, Inc., USA)를 사용하여 \( 1: 500 \) 으로 희석하고 상온에서 2 시간 반응시킨 후 TBSS로 3 회 세정하였다. 2 차 항체로 HRP (horseradish peroxydase)가 결합된 anti-mouse IgG 및 anti-rabbit IgG를 \( 1: 2,000 \)으로 희석하여 상온에서 1 시간 반응시킨 후, TBSS로 3 회 세정하여 ECL 기질과 1-3분간 반응 후 각각의 단백질 밴드는 Gene tool (GeneGnome5, Syngene, UK)을 이용하여 가시화하였다. MAPKs의 발현량을 알아보기 위하여 RAW 264.7 세포를 \( 1 \times 10 ^ { 6 } \mathrm { cells } / \mathrm { ml } \) 으로 18 시간 전 배양하고 SMYEE를 처리하여 30 분 동안 본 배양한 후 p38, ERK, JNK 및 p-p38, p-ERK, p-JNK의 발현량을 검토하기 위하여 anti-mouse p-p38, p38, p-ERK, ERK, p-JNK 및 JNK (Cell Signaling Technology Inc., USA) 항체를 \( 1: 500 \)으로 희석하여 사용하였다. 이후의 실험은 iNOS, COX-2 실험법과 동일하게 진행하였다.</p>