ammonium persulfate 및 TEMED는 Sigma Aldrich사로부터 구입하여 사용하였다. 이 연구에서는 쏘가리 골격근 조직에서 LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소를 정제하여 역학특성과 대사생리학적 특성을 알아보고 항체를 생성하여 여러 가지 병증의 진단에 유용하게 사용하기 위한 연구를 실시하였다. 실험 재료로는 충청북도 괴산군 청천면에서 채집한 쏘가리, Samtako사로부터 구입한 뉴질랜드 화이트 순종토끼, 등과 TEMED를 사용하였다. LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소를 정제하여 역학특성과 대사생리학적 특성을 알아보고 항체를 생성하여 여러 가지 병증의 진단에 유용하게 사용하기 위한 연구를 실시하였다.
<p>따라서 본 연구에서는 LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소가 많고 정제가 용이한 쏘가리 골격근 조직에서 \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소를 정제하여 역학특성을 조사 대사생리학적 특성을 알아보고 여러 가지 병증의 진단에 유용하게 사용할 목적으로 \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소에 대한 항체를 생성하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료</h2> <p>쏘가리(Siniperca scherzeri)는 충청북도 괴산군 청천면에서 채집하였고, 뉴질랜드 화이트 순종토끼는 Samtako사로부터 구입하여 사용하였다. Pyruvic acid, acrylamide, N,N'-meth-ylene-bis-acrylamide, \( \mathrm { N } , \mathrm { N } , \mathrm { N } ^ {\prime } \), \( \mathrm { N } ^ {\prime } \)-tetramethylethylenediamine (TEMED), DL-lactic acid, nitro blue tetrazolium (NBT), phenazine methosulfate (PMS), nicotinamide adenine dinu-cleotide \( \left ( \mathrm { NAD } ^ { + } \right ) \), NAD reduced form (NADH), w-amino-hexyl-agarose, potassium oxalate, N-(3-dimethylamino-propyl)- \( \mathrm { N } ^ {\prime } \)-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC), sodium dodecyl sulfate (SDS), Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant 및 anti-rabbit IgG(peroxidase conjugate)는 Sigma사의 제품을 사용하였고, Coomassie brilliant blue G-250 및 R-250은 Fluka사 제품을 사용하였으며, 나머지 시약은 GR (guaranted reagent)급을 사용하였다.</p> <h2>조직 추출액의 준비</h2> <p>쏘가리의 골격근, 심장, 신장, 간, 눈 및 뇌조직을 적출한 후 증류수로 씻어 혈액을 제거한 다음 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 유지시킨 \( 0.1 \mathrm { M } \) potassium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } \) 6.85)를 3배 \( ( \mathrm { v } / \mathrm { w } ) \) 가한 후 얼음에 채운 Dounce homogenizer 및 Potter-Elvehjem ho-mogenizer로 파쇄하여 조직파쇄액을 얻었다. 이 파쇄액은 20,000× \( g \) (Refrigerated centrifuge, Hitachi 20 PR-52D)에서 1시간씩 2번 원심분리하여 상등액을 시료로 사용하였다.</p> <h2>LDH의 활성 측정</h2> <p>LDH 동위효소의 활성은 \( 1.50 \mathrm { mM } \) 피루브산과 \( 0.14 \mathrm { mM } \) NADH 를 포함한 \( 0.1 \mathrm { M } \) potassium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } \)6.85) \( 3 \mathrm { ml } \)에 시료를 가한 다음 NADH로부터 \( \mathrm { NAD } ^ { + } \)로 산화되는 정도를 spectrophotometer (Shimadzu UV-160A)로 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } , 340 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다. 효소활성의 단위는 기질 \( 1 \mu \) mole을 생성물로 전환시키는데 필요한 효소의 양을 1 \( \mathrm { unit } \)로 하였다.</p>