형질전환 후에 유전자가 도입된 형질전환 셀라인으로 도입 miraculin 유전자의 발현을 확인하기 위해 RT-PCR과 Western blot 분석을 실시하였고, Bradford 가 보고한 방법을 이용하여 단백질의 농도를 조절하였으며, 대조구로 소혈청알부민을 사용하여 검출하였다.
<h2>형질전환세포 발현 분석</h2> <p>형질전환 후, 유전자가 도입된 형질전환 셀라인으로부터 도입 miraculin 유전자의 발현을 확인하기위해 RT-PCR과 Western blot 분석을 수행하였다. Total RNA는 FavorPrep \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) Plant Total RNAMini Kit (Favorgen, Korea)를 사용하여 추출하였고, Inclone \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) One-step RT-PCR kit (Inclone Biotech, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. PCR 조건은 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 pre-denaturation 시킨 후, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 분간 denaturation, \( 57 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분간 annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분간 extension을 30 cycles로 수행하였고, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 extension을 실시하였다. PCR산물을 \( 2 \% \) agarose gel 상에 영동 한 후, ethidium bromide로 염색하여 band를 확인하였다. Western blot 분석을 위한 단백질 추출은 miraculin 유전자가 도입되어 mRNA의 발현양이 높은 셀라인과 wild type의 callus로부터 extraction buffer \( 2.0 \mathrm { M } ~ \mathrm { KPO } _ { 4 } \) ( \( \mathrm { pH } \) 7.8), \(0.5 \mathrm { M } \) EDTA, Triton X-100, \( 1.0 \mathrm { M } \) dithiothreitol (DTT), \( 80 \% \) glycerol 및 \( \mathrm { dH } _ { 2 } \mathrm { O } 200 \mu \mathrm { l } \)를 용해 완충액으로 사용하여 추출하였다. Bradford (1976)가 보고한 방법을 통해 단백질의 농도를 조절하였고, 대조구로 소혈청알부민을 사용하여 검출하였다. Western blot 분석은 각각의 셀라인으로부터 총 단백질 \( 50 \mu \mathrm { g } \) 을 \( 12 \% \) SDS polyacrylamide gels에서 분리하였다. Anti-FLAG용 단일 항체(Sigma-Aldrich, USA)는 \(1: 1000( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \)로 희석하여 사용하였고, 단백질 검출은 Roche 회사에서 제공하는 매뉴얼에 따라 수행하였다.</p>