본 논문에서는 혈청과 글루타민의 단독 및 동시 결핍에 의한 HUVECs에서 apoptosis 유발의 차이를 조사했으며, 글루타민이 결핍된 조건에서는 배양된 세포에서는 각 caspase 활성형의 발현이 더욱 증가함을 관측했으며, 혈청과 글루타민이 동시에 결핍된 조건에서 어느 caspase의 활성 증가도 관측되지 않았다. 다음으로 위 조건에서 Bcl-2 및 IAP family 단백질의 발현에 미치는 영향을 관측했는데, 이 결과 글루타민이 결핍될 경우 세포막 수용체 경로의 활성에 의하여 caspase-8의 활성이 증가되고, 증가된 caspase-8에 의하여 Bid가 tBid로 전환되면서 미토콘드리아 경로 활성이 이루어졌음이 추측되었으며, 혈청과 글루타민이 동시에 결핍되는 경우 글루타민의 영향으로 형성된 경로가 차단되어 apoptosis가 억제되는 현상이 관측되었다.
<h2>HUVECs의 caspase 활성에 미치는 글루타민 및 혈청 결핍의 영향</h2><p>이상에서 관찰된 혈청과 글루타민의 단독 및 동시 결핍에 의한 HUVECs에서 apoptosis 유발의 차이에 대한 기전의 해석을 위하여 세포 내 apoptosis 유발에 중요한 역할을 하는 3 가지 종류의 caspase (caspase-3,-8 및 -9)의 발현 및 활성 변화를 조사하였다. Fig. 4에서와 같이 Harfouche et al. 및 Date et al.의 선행결과에서와 유사하게 혈청이 결핍된 조건에서 배양된 HUVECs에서 조사된 3가지 caspase의 활성형 단백질의 발현을 모두 관찰할 수 있었으며, 글루타민이 결핍된 조건에서는 배양된 세포에서는 각 caspase 활성형의 발현이 더욱 증가하였다. 이를 정량적으로 비교하기 위하여 in vitro caspase 활성 정도를 해당 기질을 사용하여 비교한 결과, 글루타민이 결핍된 조건에서 각 caspase의 활성이 혈청 결핍조건에서 보다 상대적으로 다소 높게 나타나 Western blotting 결과와 일치된 경향성을 보여 주었다. 아울러 활성화된 caspase-3의 기질 단백질인 poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)의 단편화 현상도 글루타민 결핍 조건에서 다소 강하게 나타났다. 그러나 혈청과 글루타민이 동시에 결핍된 조건에서 배양된 HUVECs에서는 3가지 caspase의 활성 증가 및 PARP의 단편화는 전혀 관찰되지 않았다. 따라서 혈청과 글루타민이 동시에 결핍된 조건에서 배양된 HUVECs의 증식율 저하 현상이 현저하게 증가하였음에도 apoptosis가 유발되지 않았음은 Fig. 4의 결과에서와 같이 caspase의 활성 변화와 밀접한 연관성이 있음을 알 수 있었다.</p><h2>HUVECs에서 Bcl-2 및 IAP family 단백질의 발현에 미치는 글루타민 및 혈청 결핍의 영향</h2><p>이상의 결과에서 비록 혈청과 글루타민이 동시에 결핍된 조건에서 배양된 HUVECs의 증식율이 상대적으로 더 억제되었으나 apoptosis가 유발되지 않았음이 caspase의 활성 여부와 연관성이 있음을 확인하였기 caspase의 활성을 조절하는 다양한 인자들의 발현에 미치는 혈청과 글루타민의 영향을 조사하였다. 이를 위하여 먼저 미토콘드리아를 중심으로 각 caspase의 활성을 조절하는 Bcl-2 family 인자들의 변화 여부를 조사하였는데, 혈청이 결핍된 조건에서 배양된 HUVECs에서 anti-apoptotic Bcl-2 인자에 속하는 Bcl-2 및 Bcl-xL의 발현이 다소 감소한 반면, 대표적인 pro-apoptotic 인자인 Bax의 발현은 약간 증가되었음을 알 수 있었다. 그러나 이러한 단백질들의 발현 변화는 글루타민 결핍 조건에서는 더욱 더 크게 나타났으며, 특히 caspase-8의 활성에 의한 Bid 단백질의 truncation된 형태인 tBid의 발현이 글루타민 결핍 조건에서 매우 증가되었다. 한편 caspase 단백질들과 직-간접적인 결합을 통하여 그들의 활성을 억제함으로서 apoptosis를 억제하는 역할을 하는 IAP family 단백질들의 발현 역시 혈청 결핍 조건보다 글루타민 결핍 조건에서 배양된 HUVECs에서 더 감소되었다. 그러나 혈청과 글루타민이 동시에 결핍된 조건에서 배양된 HUVECs에서는 이러한 변화 현상이 관찰되지 않았다.</p><p>이상의 결과를 종합하여 보면, HUVECs의 배양 조건에서 글루타민이 결핍될 경우 세포막 수용체 경로의 활성에 의하여 caspase-8의 활성이 증가되고, 증가된 caspase-8에 의하여 Bid가 tBid로 전환되면서 미토콘드리아 경로 활성을 촉진하였을 것으로 생각된다. 이로 인하여 caspase-9의 활성화에 따른 caspase-3의 활성 및 기질 단백질들의 분해로 연결되는 caspase cascade 경로의 활성이 촉진됨으로 apoptosis가 유발되었을 것으로 추정된다. 그러나 이러한 경로가 혈청이 결핍된 조건에서는 글루타민 결핍에 비하여 다소 약하게 일어나는 것으로 추정된다. 그러나 혈청과 글루타민이 동시에 결핍되었을 경우에는 오히려 이러한 경로가 차단되어 apoptosis가 억제되는 현상이 관찰되었는데, 이에 대한 정확한 이유를 현재의 결과로서는 추정할 수 없는 상태이며 이에 관한 추가적인 연구가 이루어져야 할 것으로 생각된다.</p>