최신 genome database를 이용하여 EH 단백질 아미노산 서열특성에 기반한 geme mining 방법으로 putative EH 유전자 정보를 대량으로 확보할 수 있다. 이를 통해, PCR로 얻은 유전자를 coupled transcription/translation system을 이용하여 in vitro에서 단백질을 합성한다. 이는 형질전환 및 세포 배양과 같은 과정을 생략하므로 단백질 발현이 효율적이다. 이렇게 생성된 EH 단백질은 에폭사이드를 NBP와 반응시켜 색깔변화를 유도하며, 이를 통해 EH 활성을 측정하고 확인할 수 있다.
<h2>결과 및 토론</h2> <h3>무세포 단백질 합성 cocktail을 이용한 EH 유전자 발현</h3> <p>최근에 genome database로부터 EH 단백질 아미노산 서열특성을 이용한 geme mining 방법을 통해 putative EH 유전자 정보를 대량으로 얻을 수 있다. 그러나 서열 정보만으로는 그 유전자의 특성을 직접 확인할 수는 없으므로, 해당 유전자를 클로닝하고 대장균 등에서 발현하여 효소 활성을 측정 해아만 한다. 이 방법은 유전자들을 형질전환을 통해 숙주에 도입하고 세포를 배양한 다음, 단백질을 분리하여 효소 활성을 분석하므로 많은 시간이 \( \mathrm { f } \), 요구된다는 단점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 무세포 단백질 합성법을 고려할 수 있다. PCR을 통해 얻은 특정 유전자를 coupled transcription/translation system을 이용하여 in vitro에서 단백질을 합성하는 경우, 형질전환 및 세포 배양 둥의 실험과정을 생략할 수 있으므로 효율젹으로 단백질을 발현할 수 있다. 무셰포 단백질 합성법을 통해 입체선택성을 유지시키면서 광학활성 \( \mathrm { EH } \) 유전자를 발현할 수 있는지를 검중하기 위하여, R. glutinis의 \( \mathrm { EH } \) 유전자를 무세포 단백질 합성법을 이용하여 발현시켰다. 단백질 발현을 확인하기 의하여 \( 12 \% \mathrm { SDS } \) -PAGE아 hexahistidine antibody를 이용한 immunoblotting 실험을 실시하였다. Fig. 1에서와 같이 Coomassie blue로 염색하였을 때에는 발현된 단백질 band를 확인할 수 없었으나 (a), 면역학적 염색을 행한 결과 \( 45 \mathrm { kDa } \) 위치에서 hexahis-tidine과 융합된 \( R \). glutinis \( \mathrm { EH } \) 단백질의 발현을 확인할 수 있었다(Fig. 1(b)).</p> <h3>자외선 분광기를 이용하여 발현된 \( \mathrm { EH } \) 의 활성 평가</h3> <p>일반적으로 \( \mathrm { HPLC } \) 나 \( \mathrm { GC } \) 를 이용하여 \( \mathrm { EH } \) 의 활성을 분석하는 경우, 시료의 전처리 및 긴 분석시간 등의 문제점으로 인하여 신속한 분석이 어렵다. EH 활성을 가장 손쉽게 확인하는 방법으로는 에폭사이드를 NBP와 반옹시켜 색깔변화 반응을 유도하고, 그 흡광도번화를 측정하여 EH 활성을 평가할 수 있다. 이 방법에서는 \( \mathrm { EH } \) 의 가수분해 활성에 의해 diol로 분해되고 남은 에폭사이드 기질을 NBP와 반옹시켜 색깔 반응을 유도시킨 다음 \( 560 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하고, \( \mathrm { EH } \) 를 넣지 않은 대조군 실험과 비교하여 흡광도 감소를 측정함으로서 \( \mathrm { EH } \) 활성을 평가할 수 있다. \( \mathrm { EH } \) 의 가수분해반응 후 남은 에폭사이드 기질은 NBP와 반응하여 시간이 경과할수록 흡광도 수치가 증가하므로 negative control과의 대조 실험이 필요하다. 무세포 단백질 합성법을 이용하여 발현시킨 EH 단백질을 포함하고 있는 반응물 용액에 racemic styrene oxide 기질을 넣어 가수분헤 반응을 실시한 다음, \( \mathrm { NBP } \) 반응을 수행하고 흡광도를 측정한 결과, 대조군 대비 \( 560 \mathrm { ~nm } \) 에서의 흡광도가 상대적으로 더 감소되었다. 따라서 무세포 단백질 합성법을 이용하여 발현한 EH 단백질이 에폭사이드 기질에 대하여 가수분해 활성이 있음을 알 수 있었다.</p>