산업용 에탄올 생산에 이용되는 S. cerevisiae는 D-xylulose를 이용하여 에탄올로 발효하므로 xylose를 xylulose으로 전환시키는 외래 경로를 도입하는 것이 S. cerevisiae내에서 xylose 대사를 위한 첫 번째 단계이다. 따라서 박테리아 또는 곰팡이의 오탄당 대사경로를 S. cerevisiae에 도입하여 발현시키고자 하는 연구가 꾸준히 진행되고 있다. 당은 S. cereivsiae의 탄소원 및 중요 에너지원으로써 세포내로 당 섭취를 증가시키는 연구가 꾸준히 진행되고 있으며 외래 xylose 운반기의 발현은 S.cereivsiae 균주의 xylose 활용률을 증가시킬 수 있는 전략을 열었다고 할 수 있다. Sugar porter 계열은 매우 다양한 기능을 가지고 있다.
<h1>Xylose 대사경로</h1> <p>산업용 에탄올 생산에 이용되는 S. cerevisiae는 xylose를 이용하지 못하지만 그 이성질체인 D-xylulose를 이용하여 에탄올로 발효하므로, xylose를 xylulose으로 전환시키는 외래 경로를 도입하는 것이 S. cerevisiae내에서 xylose 대사를 위한 첫 번째 단계이다. 따라서 자연에 존재하는 박테리아 또는 곰팡이의 오탄당 대사경로를 S. cerevisiae에 도입하여 효율적으로 발현시키고자 하는 연구가 꾸준히 진행되고 있다.</p> <p>Xylose 이용 박테리아는 xylose isomerase (XI) (EC 5.3.1.5)를 이용해 D-xylose를 D-xylulose로 변환시키며, xylulose는 다시 xylulokinase(XK) (EC 2.7.1.17)에 의해 xyrulose-5-phosphate로 인산화되고, 인산화 된 당은 pentose phosphate pathway(PPP)를 통해 다시 대사된다. 박테리아에 비해 자연계에 존재하는 xylose 대사 곰팡이는 조효소 NADPH와 \( {NADP})^{+} \)를 포함하는 산화환원반응으로 구성되어 있는 좀더 복잡한 대사경로를 가지고 있다(Fig. 1). Xylose는 NADPH에 의존하는 xylose reductase (XR)(EC 1.1.1.21)에 의해 xylitol로 환원되며, xylitol은 \( {NAD}^{+} \)의존 xylitol dehydrogenase(XDH) (EC 1.1.1.21)에 의해 xylulose로 산화된 후 박테리아에서와 마찬가지로 xylulose는 xylulokinase (XK)에 의해 xylulose-5-phosphate로 인산화된다. S. cerevisiae 는 자체적으로 xylose 대사경로에 이용되는 효소들 (XR, XDH, XK)을 암호화하는 유전자를 가지고 있지만 xylose를 활용하기엔 그 발현양이 너무 적고, 그 유전자들을 과발현해도 xylose만 존재하는 배지 조건하에서는 S. cerevisiae 는 성장하지 않는 것으로 관찰되었다.S. cerevisiae에 존재하는 xylose 대사 효소로 암호화되는 이들 유전자들의 발현 개선만으로는 xylose 발효가 불가능하므로, 박테리아나 곰팡이의 xylose 대사 경로를 S. cerevisiae에 도입하여 발현시키는 연구가 이루어지고 있다. 하지만 단순히 S. cerevisiae에 xylose 대사 경로만 도입시킨 재조합 균주는 산업적으로 에탄올 발효에 이용하기에는 에탄올 발효 능력이 부족하다. 따라서 재조합 S. cerevisiae의 xylose 발효를 통하여 에탄올 생산을 증가시키고자 xylose 초기 이용단계에서의 세포의 산화환원대사와 중심 탄소대사의 흐름 등의 여러 가지 전략적인 대사공학적 연구가 필요하다.</p> <h2>당 운반기(sugar transporter)와 xylose 관계</h2> <p>당은 S. cereivsiae의 탄소원 및 중요 에너지원으로써, 대사적 흐름을 조절하여 세포내로 당 섭취를 증가시키는 연구가 꾸준히 진행되었다. S. cerevisie 에서 오탄당은 육탄당보다 1-2배 낮은 친화력으로 육탄당 운반기를 통해 이동한다고 알려져 있다. 오탄당 운반은 오탄당을 이용한 바이오에탄올 발효에 있어서 중요한 초기 조절 단계이지만, xylose 운반은 극히 낮은 농도의 xylose에서 xylose reductase의 활성이 높은 균주에서만 xylose 전환을 조절하는 것이 대사단계 조절 연구에 의해 증명되었다. 오탄당의 이용이 가능한 재조합 S. cereivsiae에서 오탄당 운반기의 발현에 관한 연구는 거의 보고되어있지 않으며, 사실상 재조합 arabinose 발효 S. cereivsiae에서 galactose permease(Ga12)의 과발현만이 보고되어, 외래 막 단백질을 활발하게 발현하는테 어려움이 있음을 보여주고 있다. 최근 괄목할 만한 성과로, S. cerevisiae에서 Candida intermeda 유래의 glucose/xylose의 확산을 용이하게 하는 운반기와 공동수송기(Symporter)의 이종발현이 처음으로 활성화 되었음이 보고 되었다. 아직 균주의 발효성능은 보고되지 않았지만 외래 xylose 운반기의 발현은 xylose 발효 S.cereivsiae 균주의 xylose 활용률을 증가시킬 수 있는 새로운 대사공학 전략을 열었다고 할 수 있다.</p> <h2>당 운반기(sugar tansporter)의 일반적인 특성</h2> <p>Sugar porter(SP) 계열은 major facilitator superfamily (MFS) 내의 최대 계열로서, 박테리아, 고세균과 진핵생물에 존재하는 다양한 서열의 단백질로 구성되어 있으며, 기능 역시 매우 다양한 것으로 알려져 있다. Transporter Classification(TC) 시스템은 기능과 계통발생적 데이터에 따라 막 이동 운반 단백질을 분류하는데 사용되며, 사실상 특성이 밝혀진 모든 효모내 당 운반기는 이 시스템에 의해 분류된다. 최근, Candida albicans로부터 분리된 95개의 잠재적 MSF 단백질은 포괄적인 생물 정보학을 기반으로 17 개의 다른 TC계열로 정의 분류되었다. Yeast Transport Protein Database(http://rsat. ulb.ac.be/ytpdb/)는 최근까지 확인되거나 예측된 생물막 운반기로 분류되는 효모의 단백질에 대한 유용한 자료를 제공한다.</p> <p>일반적으로 MSF 계열에 속하는 막투과 효소는 친수성 아미노산 고리에 의해 연결되는 여섯 개의 소수성 transmembrane-spanning(TMS) \( \alpha \)-helix가 2 개의 세트로 이루어진 필수 막 단백질로, 그들이 비록 서열의 유사성은 낮을지라도 그 구조의 보존은 강하게 나타난다. 효모에서 대부분의 단당류 운반기는 확산 촉진(facilitated diffusion)에 의해 작동되는데, 이는 막을 통해 저농도로 이동하는 단일 용질분자의 이동을 촉진하여 에너지를 필요로 하지 않는 메커니즘 이다. 반면, 배지 내의 당의 농도가 매우 낮을 때 작동하는 다른 효모 단당류 운반기는 그것의 농도 변화에 대하여 용질을 운반시킬 수 있는 에너지 소비 시스템이며, 전자의 동시 다발적인 이동으로 연결 된다(Fig. 2). 마지막으로 SP subfamily(Snf3p 등)의 몇몇 효모 세포막은 당을 이동시킬 수 없고, 세포 표면에서 당질의 존재를 신호화하면서, 수용체 역할을 하는 것으로 보여지며, 그로 인해 유전자 발현의 수준의 영향을 끼친다.</p> <p>5가지의 구조적으로 유사한 motif가 그들의 메커니즘 또는 기질 특이성에 상관없이 당 운반기에서 발견되었고, 그것은 추정의 신규 당 운반기 유전자의 확인을 상당히 용이하게 했다. 효모에서 SP subfamily는 S. cerevisiae에서는 34개, Candida glabrata에서는 17개, Kluyveromyces lactis에서는 20개, Debaryomyces hansenii에서는 48개, Yarrowia lipolytica에서는 27 개의 운반기를 가지는 가장 가변성 있는 변수이다.</p>