홍마늘은 경남 남해산의 깐마늘을 동결건조 시키고 밀폐용기에 숙성시킨뒤 건조한 특허 출원한 방법으로 만들었다. 분쇄한 홍마늘 시료에 매탄올과 2회 환류냉각 기법을 사용하여 매탄올 조추출물을 얻고 회전식 진공증발기, 재용해 그리고 일련의 추출 과정을 2회씩 거쳐 5종 용매 분획기물을 추출하였다. 추출수율은 건조와 추출 전,후의 시료 중량 값으로 계산하였다. 용매 분획물의 갈색도는 각 용매 분획물의 농도를 조정하여 분광광도계로 측정한 흡광도 값을 표기하였다. 홍마늘 용매 분획물에 대한 페놀과 플라보노이드의 정량은 각 시약들과 혼합하여 1시간 반응 후 흡광도의 반응을 계산하였다. 그리고 DPPH 라디칼 소거능 측정, ABTS 라디칼 소거능 측정, FRAP법에 의한 항산화능 방식들로 흡광도를 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>시료의 제조</h2><p>홍마늘은 경남 남해산 깐마늘을 이용하여 본 연구진이 특허 출원한(제 10-2011-0109281호) 방법에 따라 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동결건조 시킨 후 뚜껑이 있고 밀폐가 되는 용기에 넣어 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \)의 항온항습기에서 36시간 숙성시켰다. 이어 온도 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \), 습도\( 60 \% \)의 조건에서 12시간 숙성시킨 다음 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5시간 동안 건조시켜 완성하였다.</p><h2>용매 분획물의 제조 및 추출수율 측정</h2><p>분쇄한 홍마늘 시료에 약 10배의 메탄올을 가하여 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)의 수욕상에서 환류냉각하면서 2회 반복 추출하여 메탄올 조추출물을 얻었다. 이것을 회전식 진공증발기로 추출용매를 제거한 다음 메탄올과 물 흔합액 \( (1: 9\),\( \mathrm{v} / \mathrm{v}) \)에 재용해하고, 순차적으로 hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol을 각각 가하여 2회씩 반복 추출해 각각의 용매 분획물을 얻었으며, 잔사를 물분획물로 하였다. 5종의 용매분획물은 회전식 진공증발기로 완전건고 시킨 다음 일정량을 취하여 항산화 활성 측정용 시료로 사용하였다. 흥마늘 용매 분획물의 추출수율은 건조 및 추출 전 · 후의 시료 중량을 측정하여 계산하였다.</p><h2>용매 분획물의 갈색도 측정</h2><p>갈색도는 각 용매 분획물의 농도를 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)로 조정하여 분광광도계(Optizen 2120UV, Mecasys Co. Ltd., Korea)로 \( 420 \mathrm{nm} \)에서 증류수를 대조로 하여 측정한 흡광도 값으로 나타내 었다.</p><h2>총 페놀 및 플라보노이드 정량</h2><p>총 페놀 함량은 \( 1,000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도의 홍마늘 용매 분획물 \( 1 \mathrm{ml} \)에 Foline-Ciocalteau 시약 및 \( 10 \% \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 용액을 각각 \( 1 \mathrm{ml} \)씩 차례로 가하여 실온에서 1시간 반응시킨 후 \( 700 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드는 분획물 \( 1 \mathrm{ml} \)에 \( 10 \% \) aluminum nitrate \( 0.1 \mathrm{ml}\), \(1 \mathrm{M} \) potassium acetate \( 0.1 \mathrm{ml} \)및 ethanol \( 4.3 \mathrm{ml} \)를 차례로 혼합하고 실온에서 40분간 반응시킨 다음 \( 415 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 홍마늘 용매 분획물의 총 페놀 및 플라보노이드 함량은 표준물질로 각각 caffeicacid 및 quercetin (Sigma Co., St. Louis, MO, USA)을 이용한 검량선에 의해 계산하였다.</p><h3>DPPH 라디칼 소거능 측정</h3><p>DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) 라디칼 소거능은 일정 농도별로 조정된 홍마늘 용매 분획물 \( 1\mathrm{ml} \)에 메탄올에 용해하여 \( 5 \mathrm{mg} / 100 \mathrm{ml} \)의 농도로 제조한 DPPH 용액 \( 1 \mathrm{ml} \)을 가하여 혼합한 다음 실온에서 10분간 반응시킨 후 \( 525 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 소거능은 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도 비(\(\%\))로 나타내었다.</p><h3>ABTS 라디칼 소거능 측정</h3><p>ABTS (2,2'-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonicacid) 라디칼 소거능은 \( 7 \mathrm{mM} \) ABTS 용액에 potassium persulfate를 \( 2.4 \mathrm{mM} \)이 되도록 용해시킨 다음 암실에서 \( 12 \sim 16 \)시간동안 반응시킨 후 이를 \( 414 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도가 1.5가 되도록 증류수로 조정하여 사용하였다. 농도 조정된 ABTS 용액 \( 3 \mathrm{ml} \)에 농도별 분획물 각 \( 1 \mathrm{ml} \)를 가하여 실온에서 10분간 반응시킨 후 \( 414 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도 비(\(\%\))로 나타내었다.</p><h3>FRAP법에 의한 항산화능</h3><p>홍마늘 용매 분획물에 대한 FRAP (ferric reducing antioxidant power) 측정은 \(\mathrm{pH} 3.6\)의 \( 300 \mathrm{mM} \) acetate buffer, \( 40\mathrm{mM} \mathrm{HCl} \)에 용해한 \( 10 \mathrm{mM} \) TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine)용액 및 \( 20 \mathrm{mM} \mathrm{FeCl}_{3} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)를 각각 \( 10:1:1\)(\( \mathrm{v} / \mathrm{v} / \mathrm{v}) \)의 비율로 미리 혼합한 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)의 수욕상에서 가온한 뒤 FRAP 측정용 기질로 사용하였다. 96 well plate에 시료액 \( 40 \mu \mathrm{l} \), FRAP 기질액 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 및 증류수 \( 40 \mu \mathrm{l} \)를 차례로 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4분간 반응시킨 후 \( 593 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였으며, \( \mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)를 표준물질로 하여 얻은 표준검량선으로부터 계산하였다.</p>