약침액은 수제 알콜침법에 의하여 조제하고, 계대 보존 중인 생쥐의 간암세포인 Hepa 1c1c7 를 \( 10 \% \) FBS가 포함된 MEM을 배양액으로 하여 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 배양하였고, QR 생성 유도효과는 Prochaska등의 방법을 수정하여 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약</h2> <p>Minimum essential medium eagle (MEM), antibiotics, dimethylsulfoxide (DMSO), \(99\%\) ethyl alcohol anhydrous, \( \mathrm{NaCl}, \mathrm{KCl}, \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \), bovine serum albumin (BSA), tween-20, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), flavin adenine dinucleotide (FAD), dicumarol, glucose-6-phosphate, \( \beta \)-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate \( (\beta \)-NADP), glucose-6-phosphate dehydrogenase, menadione, crystal violet, chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB), glutathione reductase, triton \( X-100 \), Na-EDTA, 5, 5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB), bicinchoninic acid protein kit는 Sigma사(St. Louis, MO, U.S.A.)에서 구입하였고, fetal bovine serum (FBS)는 Gibco사 (Grand Island, NY, U.S.A.) 제품을 사용하였다. 기타 시약은 세포 배양용 및 특급시약을 사용하였다.</p> <h2>약침액 제법</h2> <p>약침액은 수제 알콜침법에 의하여 조제하였다. 포공영 \( 60 \mathrm{~g} \) 을 조말하여 정류수 \( 400 \mathrm{~m} \ell \) 을 가한 뒤 rotary evaporator (BUCHI RE121, Switzerland)에서 3시간 전탕하여 추출하고 여과한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 2,500 \mathrm{rpm} \) 에서 10분간 원심분리하여 얻은 상층액 \( 200 \mathrm{m} \ell \) 을 감압농축하였다. 이 농축된 용액에 \( 99.9 \% \) ethanol로 가하여 \( 75 \%, 85 \%, 95 \% \) 의 ethanol 용액이 되게하여 침전물을 여과하고, \( \mathrm{pH} ~7.4\)로 적정한 후 저온에서 24시간 방치하여 membrane filter \( (0.22 \) \( \mu \mathrm{m} \), Whatman, Germany)로 여과하고, 3차 증류수를 가하여 \( 200 \mathrm{m} \ell \) 이 되게 하여 \( 1 \times \) 의 약침액 \( (25 \mathrm{mg} / \mathrm{m} \ell) \) 으로 사용하였으며, \( 3 \times \) 약침액은 \( 1 \times \) 의 약침액을 감압농축하여 사용하였고, 증류수를 첨가하여 \( 0.1 \times, 0.5 \times \) 농도를 조제하였다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>계대 보존 중인 생쥐의 간암세포인 Hepa 1c1c7 를 \( 10 \% \) FBS가 포함된 MEM을 배양액으로 하여 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기 \((5 \%\mathrm{~CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C} \) )에서 배양하였고, 배양액은 3 또는 4일 간격으로 교환해 주었다. 세포는 액체질소의 기체상태 \( \left(-150^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 에 보존해 두었다가 같은 passage 번호를 가진 세포를 녹여서 trypan blue dye exclusion 방법으로 세포의 생존을 확인한 후 사용하였다.</p> <h2>Quinone reductase 생성 측정</h2> <p>QR 생성 유도효과는 Prochaska등의 방법을 수정하여 사용하였다. \( 1 \times 10^{4} \) 개의 Hepa 1c1c7 세포를 \( 200 \mu l \) 의 MEM 배지에 부유시켜 96-well plate에 접종시켜 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 24 시간 배양한 후, 배양액을 버리고 새 배양액 \( 190 \mu \ell \) 와 포공영약침액 \( (0.1 \times, 0.5 \times, 1 \times, 3 \times) \) 을 \( 10 ~\mu \ell \) 씩 각 well에 가하였다. 48 시간 배양 후, freeze-thaw cycle을 3회 반복하여 세포를 용해시켰다. \( 0.5 \mathrm{M} \) Tris- HCl \(\mathrm{pH} 7.4)\), BSA \( 100 \mathrm{mg} \), \(1.5\%\) Tween-20, \( 7.5 \mathrm{mM} \) FAD, \( 150 \mathrm{mM} \) glucose-6-phosphate, \( 50 \mathrm{mM} \) NADP, \( 300 \mathrm{U} \) glucose-6-phosphate dehydrogenase, \( 45 \mathrm{mg} \) MTT, \( 50 \mathrm{mM} \) menadione을 혼합한 반응액을 \( 200 \mu\ell \) 씩 각 well에 넣고 5분간 반응시켰다. \( 5 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer와 \( 0.5 \% \) DMSO에 녹인 \( 0.3 \mathrm{mM} \) dicuomarol를 첨가한 용액 \( 50 \mu \ell \) 를 각 well에 가하여 반응을 중지시킨 후, microplate reader를 이용하여 \( 630 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 또한 세포수에 대한 QR 생성량을 측정하기 위하여 앞에서와 동일한 방법으로 96-well plate에 Hepa 1c1c7 세포를 접종시키고 포공영약침액을 처리하였다. 48시간 배양한 후, 배지를 버리고 \( 0.2 \% \) ethanol에 녹아 있는 \( 0.2 \% \) crystal violet 용액에 10분간 담근 후, 세포가 떨어지지 않게 주의하여 2분간 흐르는 물에 씻어 주었다. \( 0.5 \%\) SDS를 \( 50 \% \) ethanol에 녹여 각 well에 \( 200 \mu \ell\) 씩 첨가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 반응시킨 뒤 \( 630 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. QR specific activity 는 분당 환원된 MTT의 흡광도와 crystal violet의 흡광도에 의해 산출하였고, QR 의 활성유도는 대조군의 활성과 포공영약침액에 의한 활성의 비로 계산하였다.</p>