정상 및 DADLE 처리한 U937 인체 혈구암세포를 각각 배지에서 배양하여, DMSO 처리 후 생성된 formazan 용해한 후 ELISA reader를 이용하여 540\( \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 각각 측정하였다. 또한 각각을 염색하여 DNA flow cytometer를 이용해 형광반응에 따른 histogram을 DALE 처리농도별로 분석하였다. 또한, 정상 U937 인체 혈구암세포와 DADLE 처리한 세포의 total RNA를 분리하고, 각각의 PCR product를 전기영동하여 염색 후 UV 하에서 mRNA 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>DADLE 및 세포배양</h2><p>본 실험에 사용된 DADLE는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며 최대 10\( \mu \mathrm{M} \) 의 농도로 세포에 처리하였다. U937 인체 혈구암세포는 한국세포주은행(KRIBB, Taejeon, Korea)에서 분양 받았으며, 세포의 배양을 위해 RPMI-1640 배지(Gibco BRL, Grand Island, NY USA)와 10\( \% \) 의 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS, Gibco BRL)과 1\( \% \) 의 pen-icillin-streptomycin (Gibco BRL) 등이 포함된 배지를 사용하였다. 세포는 37\( ^{\circ} \mathrm{C}\), 5\( \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건하에서 배양하였고, 배지는 매 48시간마다 교환 해주었고, 세포수의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 성장배지에 세포를 부유시킨 다음 적정한 수의 배지를 분주하여 재 배양하였다.</p><h2>MTT assay를 이용한 세포 증식률의 측정</h2><p>세포 배양용 6 well plate에 \( 5 \times 10^{5} \) 개\(\mathrm{/ml}\)로 암세포를 분주하고 DADLE를 배지에 희석하여 10\( \mu \mathrm{M} \) 의 농도까지 처리하였다. 72시간 동안 처리한 후 배지를 제거하고 tetrazolium bro-mide salt (MTT, Amresco, Solon, Ohio, USA)를 0.5\( \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 농도가 되게 성장 배지로 희석하여 반응시킨 후 MTT 시약을 원심분리기를 이용하여 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO, Amresco)를 처리하여 생성된 formazan을 녹인 후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540\( \mathrm{~nm} \) 에서 각각의 흡광도를 측정하였다.</p><h2>DNA flow cytometer에 의한 세포 주기의 분석</h2><p>정상 및 DADLE를 처리한 배지에서 72시간 동안 배양시킨 U937 암세포주를 phosphate-buffered saline (PBS)로 씻어 내고 CycleTEST Plus DNA Reagen Kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하여 고정 및 propidium iodide (PI) 염색을 실시하였다. 염색 후 DNA flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 대조군 및 DADLE 처리군을 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 ModiFit LT (Becton Dickinson) program을 사용하여 각 처리농도별로 분석하였다.</p><h2>Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)에 의한 mRNA발현의 분석</h2><p>정상 및 DADLE가 처리된 U937 인체 혈구암세포를 원심분리한 후 TRIzol B (Invitorgen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, ONE STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Biotechnology, Korea)를 이용하여 2\( \mathrm{ug} \)의 RNA에서 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 template로 사용하여 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 증폭하였다. 이때 house keeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 internal control로 사용하였다. 각 PCR product를 1\(\%\) agarose gel을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide (EtBr, Sigma)로 염색한 후 ultra violet (UV) 하에서 확인하였다.</p>