lacZ 유전자를 가진 형질전환체들을 MRS 배지에서 배양한 후 \( \beta \)-Gal 효소역가를 측정한 결과, lactose 배지에서 12시간 배양 시 가장 높은 효소역가(2896.84 units)를 나타났고 glucose, galactose, raffinose, 및 sucrose 배지순으로 역가가 나타났다. pSJE\(6\)c는 다른 유산균주 들에서 외래유전자들의 발현에 도움이되는 발현벡터임을 확인했다. brevis \( 2.14 \) 재조합 균주들을 slot blot을 실시한 결과 raffinose 배양시 가장 강한 시그널을 나타내어서 전사체 농도가 가장 높음을 알수 있었다.Raffinose 다음으로 melibiose, galactose, fructose 순으로 나타났다.
<h2>형질전환체들의 \( \beta \)-Gal 효소역가</h2> <p>\( l a c Z \) 유전자를 지닌 형질전환체들을 lactose를 포함한 \(5\)종의 탄소원을 포함한 MRS 배지에서 배양한 후 생육곡선을 얻었고(Fig. \(4\)), \( \beta \)-Gal 효소역가를 배양 \( 6,12,24,36 \) 및 \(48\)시간대에 측정하였다(Fig. \(5\)). 다른 탄소원 배지에서 생육 정도를 확인한 결과, 앞의 \( a g a \) 형질전환체들의 생육과 유사 한 결과를 확인할 수 있었다. 즉 glucose, raffinose, sucrose 배지에서 빨리 생육하였다. 한편 lactose에서는 완만히 생육 하여서 \(24\)시간 배양 시 정지기에 도달함을 확인할 수 있었다.</p> <p>한편 \( \beta \)-Gal 역가 측정 결과를 보면 lactose 배지에서 \(12\)시간 배양 시 가장 높은 효소역가(2896.84 units)를 나타내었고, \(36\)시간에도 \( 1872.2 \) units로 높게 유지되나 이후 감소 하여 \(48\)시간에는 \( 464.78 \) units로 떨어졌다. 다음으로 glucose, galactose, raffinose, 및 sucrose 배지순으로 역가가 나타났다. Glucose 배지에서는 \(12\)시간 배양 시 \( 1320.74 \) units로 가장 높은 역가를 나타내다가, \(24\)시간부터는 \(149\)units로 현저히 떨어짐을 확인할 수 있었다. Galactose 배지의 경우, \(12\)시간 배양 시 \( 1124.85 \) units로 가장 높은 역가를 나타내었고 glucose와 마찬가지로 \(24\)시간 이후로 역가가 떨어짐을 확인하였다.</p> <p>Raffinose와 sucrose의 경우, \(6\)~\(24\)시간 배양 시 \(150\)~\(300\) units, \(36\)~\(48\)시간 배양 시는 \(1\)~\(50\) units로 모든 시간대에서 전체적으로 낮은 역가를 나타내었다. 그리고 역시 lacZ 유전자가 고유 프로모터에 의해 발현되는 pSJEZ 보다 는 P\(6\)C promoter에 의한 유전자 발현이 일어나는 pSJE\(6\)Z 를 지닌 균주들의 역가가 휠씬 높게 나타남을 확인할 수 있었다. 이 결과는 P\(6\)C promoter도입에 의해 비단 \( a g a \)뿐만 아니라 다른 유전자 발현도 증가됨을 보여주는 결과이다. 이로 미루어 pSJE\(6\)c는 Lactobacillus brevis와 다른 유산균주 들에서 여러 외래유전자들의 발현에 유용한 발현벡터임을 확인할 수 있었다.</p> <h2>Slot blot을 통한 전사체 확인</h2> <p>L. brevis \( 2.14 \) 재조합 균주들에서 \( a g a \) 와 \( l a c Z \) 전사체 생 성 정도를 확인하기 위하여 slot blot을 실시하였다. L. brevis \(2.14\)[pSJE\(6\)caga]와 L. brevis \( \(2.14\)[\mathrm{pSJEaga} \)의 경우, 모든 탄소원에서 전사가 일어남을 확인할 수 있었으나 반면 대조 구인 L. brevis \(2.14\)[pSJE]의 경우에는 시그널이 검출되지 않았다(Fig. \(6\)-a). 한편 전사체 농도는 탄소원에 따라 차이가 나는 것을 확인할 수 있었고 raffinose 배양시 가장 강한 시그널을 나타내어서 전사체 농도가 가장 높음을 알수 있었다. Raffinose 다음으로 melibiose, galactose, fructose 순으로 나 타났으며 한편 glucose와 sucrose에서는 시그널이 약해서 전사 정도가 미미함을 알수 있었다.</p> <p>이는 L. brevis \(2.14\)에서 탄소대사물저해(Carbon Catabolite Repression) 현상이 일어나는 것을 보여준다. 한편 \( a g a \) 고유 프로모터를 지닌 L. brevis \(2.14\)[pSJEaga] 보다는 L. brevis \(2.14\)[pSJE\(6\)caga]에서 큰 차이는 아니지만 약간 더 높은 수준의 전사체 농도를 보여주었다. 이는 \( \mathrm{P} 6 \mathrm{C} \)에 의해 더 많은 전사가 일어나고 그 결과로 \( \alpha \)-Gal 역가도 증가함을 보여주는 결과이다.</p> <p>또한 LacZ 형질전환체인 L. brevis \( 2.14 \) [pSJEZ]와 L. brevis \(2.14\)[pSJE\(6\)Z]에서도 L. brevis \( 2.14 \) [pSJE6c]와는 달리 전사가 일어남을 확인할 수 있었다(Fig. \(6\)-b).Lactose 배지에서 가장 고농도의 전사체가 검출되었고, 다음으로 glucose와 galactose에서 검출되었다. 반면에 raffinose나 sucrose 배지에서는 다른 탄소원들보다 상대적으로 낮은 전사체 농도가 검출되었다. 이는 효소역가 측정 결과와도 비슷한 결과이다. 또한 P\(6\)C 프로모터를 지닌 균주가 자체 프로모터를 지닌 균주보다 조금 더 강한 시그널을 보임을 확인할 수 있었고 이는 \( a g a \) 에서와 마찬가지였다.</p> <p>이상 결과들로 볼 때 Leuconostoc - E. coli shuttle vector 인 pSJE에 Lactococcus lactis 유래의 강력한 promoter인 \( \mathrm{P} 6 \mathrm{C} \) 를 도입한 \( \mathrm{pSJE} 6 \mathrm{c} \) 는 외래유전자 발현에 보다 적합한 발 현벡터임이 입증되었다. pSJE\(6\)c는 앞으로 김치유산균을 숙주로 한 외래유전자 발현실험에서 매우 유용하게 사용될 것 으로 전망된다.</p>