본 실험에서 마황, 창출, 석고, 카카오닙스로 이루어진 한방복합물을 이용해서 추출과 농축 및 동결건조를 진행하여 시료를 만들고, 이를 이용해서 항산화능과 세포 독성을 확인했다. DDPH radical 소거능과 ABTS radical 소거능을 통해서 항산화능을 확인했고, xanthine oxidase 저해활성을 통해서 세포 독성을 확인했다. 마지막으로 지방세포 배양 및 분화에 한방복합물 추출물이 영향을 주는지 확인하기 위해 8일째 지방세포 분화 정도를 관찰했다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 재료</h2><p>항산화능을 확인하기 위하여 사용된 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazy (DPPH)와 2,2'-azini no-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)-diammonium salt (ABTS\({}^{+})\), Xanthine, Xanthine oxidase와 세포 독성을 확인하기 위한 3-[4,5-dimethylthiazol2yl]-2,5-diphenyl-tetraz olium-bromide (MTT)는 Sigma-Aldrich Co. (Saint Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. Bovine serum albumin, insulin, dex amethasone, 3-isobutyl-methyl xanthine (IBMX), oil red Oreagent는 Sigma (St. Louis, MO, USA), 단백질 발현에 사용된 anti-PPAR \( \gamma \), anti-C/EBP \( \alpha \), anti-GAPDH는 Cell signaling (MA, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. 분석기기는 ELISA reader (Power Wave XS, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)를 이용하였다.</p><h2>한방복합물 제조</h2><p>본 실험에서 한방복합물에 사용한 마황, 창출, 석고, 카카오닙스는 한약재시장에서 구매하여 실험에 사용하였다. 한방복합물의 추출물 제조과정은 마황, 창출, 석고, 카카오닙스를 4:3:2:7.2의 비율로 혼합한 후 중량 \( 1,620 \mathrm{~g} \)에 \(30 \mathrm{~l} \)의 water를 가하여 \( 108^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 추출하였다. 추출물은 여과하여 농축하고 동결건조를 진행한 후 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하면서 실험에 사용하였다.</p><h2>DPPH radical 소거능</h2><p>시료의 DPPH radical 소거능은 Blois의 방법에 의해 전자공여능(EDA; electron donating ability)으로 측정하였다. 농도별로 제조한 시료용액 \( 100 \mu \mathrm{l} \)에 \( 0.2 \mathrm{mM} \) 의 1,1-di-phenyl-2-picrylhyd razyl (DPPH) 용액을 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 넣고 교반한 후 차광하여 30분 반응시킨 다음 \( 517 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능의 효과는 시료용액을 첨가한 군과 시료용액을 첨가하지 않은 군의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p><h2>ABTS radical 소거능</h2><p>한방복합물의 ABTS\(^{+} \)radical 소거능은 ABTS\(^{+} \)radical cation decolorization assay을 이용하여 측정하였다. \( 7.4 \mathrm{mM} \) 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)와 \( 2.6 \mathrm{mM} \) potassium persulfate를 1:1 로 혼합한 후 차광하여 실온에서 24시간 동안 반응하였다. 그 후 ABTS\(^{+} \)용액은 \( 734 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도가 \( 0.706 \pm 0.001 \) 이 되도록 에탄올에 희석하여 사용하였다. ABTS\(^{+} \)radical 소거능은 DPPH radical 소거능과 동일한 방식으로 계산하였다.</p><h2>Xanthine oxidase 저해활성</h2><p>시료의 xanthine oxidase 저해활성 평가는 Stirpe의 방법에 따라 측정하였다. 각 농도별로 제조된 시료용액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)에 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 7.5 \) ) \( 0.6 \mathrm{ml} \)를 혼합하고 \( 2 \mathrm{mM} \)의 xanthin을 녹인 기질액 \( 0.2 \mathrm{ml} \)를 가한다. \( 0.2 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) xanthine oxidase \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 가하여 15분간 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응시킨 다음 \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{~HCl} ~1 \mathrm{~ml} \)를 첨가하여 반응을 정지시킨 후 반응액 중에 생성된 uric acid의 양을 \( 292 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. Xanthine oxidase 저해는 시료 첨가군와 무첨가군의 uric acid의 양을 백분율로 나타내었다.</p><h2>3T3-L1세포 배양 및 분화</h2><p>세포 배양과 분화실험에 사용된 세포주는(mouse embryonic fibroblast cell line)인 3T3-L1지방전구세포로 ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)로부터 구입하였고, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, WelGene Biopharmaceuticals, Daegu, Korea) 배지에 \( 10 \% \mathrm{~FBS} \)를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{~CO}_{2} \)의 조건에서 배양하였다. 3T3-L1 지방전구세포의 분화 유도를 위해 24 well plate에 \( 5 \times 10^{4} \) cells/well의 농도로 분주한 후 \( 100 \% \) confluency 상태가 되면 2일간 더 배양시킨 다음 MDI \( (0.5 \mathrm{mM} \) IBMX, \( 1 \mu \mathrm{M} \) dexamethasone, \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)) insulin를 포함하는 배지로 교체하여 2일간 지방세포 분화를 유도하였다. 배양 후 48시간마다 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) insulin이 함유된 분화배지로 교환하여 배양시켰다. 지방세포 분화를 유도하는 동안 추출물을 각 농도별로 배양액에 처리하였고, 분화가 완성되는 8일째 지방세포 분화 정도를 관찰하였다.</p>