세포는 \( 5 \% \)의 \( \mathrm{CO}_{2} \)를 포함한 포화습도 공기조건에서 배양하고 세포증식을 측정하기 위해 RAW264.7 세포를 분주한 후 12시간 배양하였다. 세포 배양액을 얻은 후 Griess reagent system을 이용해 nitrite양과 ELISA kit을 이용하여 배양액 중에 존재하는 TNF-\( a \) 와 IL-6의 양을 제조사의 분석방법에 의해 측정하였다. iNOS 발현 양은 HRP가 부착된 secondary antibodies로 실온에서 2 시간 반응 후 Chromogenic Substrate를 이용하여 결과를 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약</h2> <p>Septicine은 Alexis biochemicals (San Diego, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. LPS 및 \( \beta \)-actin 항체는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 10\% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신 (streptomycin)은 Hyclone (Logan, UT, USA)에서 구입하였다. Cell Titer 96 AQueous One Solution과 Griess reagent system은 Promega (Madison, WI, USA)에서 구입하였고, \( \mathrm{PGE}_{2} \) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit는 R&D Systems (Minneapolis, MI, USA)에서 구입하였다. TNF- \( a \) 와 IL-6 ELISA kit는 eBioscience (San Diego, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. COX-2와 iNOS 항체는 BD Biosciences (San Diego, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>생쥐의 대식세포주인 RAW264.7 세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양 받아 DMEM 배양액에 \( 10 \% \) FBS와 \( 100 \mathrm{Unit} / \mathrm{ml} \) streptomycin과 \( 100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) penicillin을 첨가한 배양액을 사용하였다. 세포는 \( 5 \% \) 의 \( \mathrm{CO}_{2} \) 를 포함한 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 포화습도 공기조건 하에서 배양하였다.</p> <h2>세포증식 측정</h2> <p>세포증식을 측정하기 위해 RAW264.7 세포를 96-well plate에 \( 2 \times 10^{4} \) \(\mathrm{cells/well}\)이 되도록 분주한 후 12시간 배양하였다. 세포배양액을 이용하여 septicine의최고 농도를 \(2,000 \mathrm{nM}\)로 하여 RAW264.7 세포에 처리하여 24시간 배양한 후, Cell Titer 96AQueous One solution assay (Promega)를 이용하여 세포 증식에 미치는 septicine 효과를 MTS 방법으로 측정하였다.</p> <h2>Nitric oxide \( (\mathrm{NO}) \) 측정</h2> <p>RAW264.7 세포로부터 생성되는 \( \mathrm{NO} \) 의 양을 세포 배양액 중 존재하는 \( \mathrm{NO}_{2}{ }^{-} \)의 형태로 Griess reagent 반응법을 이용하여 측정하였다. 즉 RAW264.7 세포를 48-Well plate에 \( 2.5 \times 10^{5} \) \(\mathrm{cells/well}\)이 되도록 분주한 후 12시간 배양한 후에 septicine \( 31.2,62.5,125,250,500,1,000 \mathrm{nM} \) 과 LPS \( (100 \mathrm{ng} / \mathrm{ml}) \) 를 동시 처리 또는 LPS를 단독 처리하여 24시간 배양하였다. 세포 배양액을 얻어 nitrite양의 측정은 Griess reagent system (Promega)을 이용하여 측정하였다.</p> <h2>IL-6 및 TNF-\( a \) 측정</h2> <p>RAW264.7 세포를 48-well plate에 \( 2.5 \times 10^{5} \) cells/well이 되도록 분주하여 12시간 배양한 후에 septicine \(31.2, 62.5, 125, 250, 500, 1,000 \mathrm{nM}\)과 LPS \( (100 \mathrm{ng} / \mathrm{ml}) \) 을 동시 처리 또는 LPS를 단독 처리하여 24시간 배양 후, 배양액 중에 존재하는 TNF-\( a \) 와 IL-6의 양을 각 ELISA kit (eBioscience)을 이용하여 제조사의 분석방법에 의해 측정하였다.</p> <h2>INOS 단백질 발현 양 측정</h2> <p>RAW264.7 세포를 \( 60 \mathrm{~mm} \) 배양접시에 \( 2 \times 10^{6} \) \(\mathrm{cells}\)이 되도록 분주한 후 12시간 배양하였다. Septicine \( 62.5,125,250,500 \)\( \mathrm{nM} \) 과 LPS \( 100 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 을 동시 처리 또는 LPS를 단독 처리하여 24시간 배양한 후, Pro-prep protein extraction solution (iNtRon, Korea)을 이용하여 세포 내 단백질을 얻었다. BCA assay reagent (Thermo, Pierce)로 단백질의 농도를 측정한 후, 동량 \( (40 \mu \mathrm{g}) \) 의 단백질을 \( 8 \% \) SDS-PAGE gel에서 전기영동 후, nitrocellulose membrane (Roche, Indianapolis, IN)으로 옮겼다. 항체의 비 특이적 결합을 억제시키기 위해 membrane을 \( 3 \% \) 탈지분유액이 포함된 TBST (\(50\mathrm{mM}\) Tris-HCl, \(\mathrm{pH} 7.5\), \(150 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}, 0.1 \% \) Tween-20)로 1시간 실온에서 배양하였다. 그 후, iNOS의 항체를 이용하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12 시간 반응시켰다. iNOS 발현 양은 horseradish peroxidase (HRP)가 붙어있는 secondary antibodies (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Ca, USA)로 실온에서 2 시간 반응 후 Chromogenic Substrate (Invitrogen, Carlsbad, California)를 이용하여 확인하였다.</p> <h2>자료의 통계처리</h2> <p>자료의 통계처리는 GraphPad Prism 4.0 (GraphPad software, San Diego, CA)프로그램을 이용하였다. 시험물질 처리군과 대조군의 차이를 비교하기 위하여 t tests를 이용하였다. \( p<0.05 \) 일 때만 통계적 유의성이 있는 것으로 판단하였다.</p>