본 연구에서는 산 촉매를 사용하여 거대해조류 중 홍조류의 하나인 E. cottonii로부터 발효가능당 생산을 목표로 산 가수분해 반응조건을 최적화하기 위하여 실험계획법 중 반응표면분석법을 이용하여 연구를 수행하였다. E. cottonii로부터 산 가수분해 반응을 통한 반응인자들이 환원당 생성에 미치는 영향을 종합하여 보면, 실험범위 내에서 낮은 반응온도, 낮은 촉매농도, 짧은 반응시간의 조건에서 많은 양의 환원당이 생성되었다. 결과적으로 \( 160^{\circ} \mathrm{C}, 1 \% \) 황산, 20분의 조건에서 가장 높은 \( 20.63 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 환원당이 생성되었으나, \( 190^{\circ} \mathrm{C}, 3 \% \) 황산, 50분의 가혹한 조건에서는 \( 1.84 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 환원당만이 생성된 반면에, 과분해산물인 레불린산이 \( 9.83 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 생성되었음을 실험을 통해 알 수 있었다. E. cottonii로부터 산 가수분해에 의한 갈락토오스 생성에 미치는 반응인자들의 영향을 알아 본 결과 실험범위 내에서 낮은 반응온도, 낮은 촉매농도, 짧은 반응시간의 조건에서 많은 양의 갈락토오스가 생성되어 환원당과 같은 경향을 나타내었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>E. cottonii로부터 발효가능당의 생성조건의 최적화</h2> <p>본 연구에서는 산 촉매를 사용하여 거대해조류 중 홍조류 중 하나인 E. cottonii로부터 발효가능당을 생산하고자 하였다. 산 가수분해 반응조건을 최적화하기 위하여 실험계획법 중 반응표면분석법을 이용하여 반응조건의 최적화 연구를 수행하였다. 디자인한 실험변수의 조건과 얻은 실험결과를 Table 1에 나타내었다. \( 160^{\circ} \mathrm{C}, 1 \% \) 황산, 20분의 조건에서 가장 높은 \( 20.63 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 환원당이 생성되었다. 이 조건에서는 단당으로서 \( 2.85 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 글루코오스와 \( 16.86 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 갈락토오스가 생성되었으며, \( 1.96 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 5-HMF와 \( 3.14 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 레불린산이 과분해물로서 생성되었다.</p> <p>반응조건의 변수(반응온도, 촉매량, 반응시간)를 독립변수로 설정하고, 당(환원당, 글루코오스, 갈락토오스)과 부산물(5-HMF, 레불린산)의 생성량을 종속변수로 설정하여 다중회기분석으로부터 다음과 같이 환원당, 글루코오스, 갈락토오스에 대한 모델식을 얻었다 \( \left(A\right. \)는 반응온도 \( \left({ }^{\circ} \mathrm{C}\right), B \)는 촉매 농도\( (\mathrm{wt} \%) \), 그리고 \( C \)는 반응시간(\( \mathrm{min} \))).</p> <p>환원당 \( =457.803-4.157 \mathrm{~A}-19.782 \mathrm{~B}-1.534 \mathrm{C} +0.074 \mathrm{AB}+0.006 \mathrm{AC}+0.007 \mathrm{BC}+0.010 \mathrm{~A}^{2} +1.034 \mathrm{~B}^{2}+0.005 \mathrm{C}^{2} \left(\mathrm{R}^{2} =0.953\right) \)</p> <p>갈락토오스 \( =403.196-3.694 \mathrm{~A}-19.123 \mathrm{~B}-1.222 \mathrm{C} +0.075 \mathrm{AB}+0.005 \mathrm{AC}-0.008 \mathrm{BC}+0.009 \mathrm{~A}^{2} +1.035 \mathrm{~B}^{2}+0.004 \mathrm{C}^{2}\left(\mathrm{R}^{2}=0.963\right) \)</p> <p>글루코오스 \( =16.388-0.075 \mathrm{~A}-0.294 \mathrm{~B}-0.033 \mathrm{C} \) \( \left(\mathrm{R}^{2}=0.899\right) \)</p> <p>환원당, 글루코오스, 갈락토오스는 \( 90 \% \) 이상의 높은 적합도의 모델식을 얻을 수 있었다. 반면에 5 - HMF는 \( 86.2 \% \)의 적합도를 보였으나, 전반적인 농도가 낮았다. 레불린산은 \( 65.7 \% \)의 낮은 적합도를 나타내어 모델식으로부터 최적값을 추정하는데 어려움이 있었다.</p> <p>Table 2에 실험 결과를 ANOVA 분석을 통하여 얻은 결과를 나타내었다. 분석 결과의 p-values가 \( 0.05 \) 이하일 때, 중요성이 있다고 판단하였다. 환원당 생성의 경우에서는 모델식의 F-value가 22.40으로 모델의 신뢰도가 높았으며, 또한 3개의 1차식의 계수\( (A, B, C) \)와 1개의 2차식의 계수 \( \left(A^{2}\right) \)가 중요한 인자로 확인되었다. 갈락토오스의 경우에서는 모델 식의 F-value가 30.02로 중요하였고, 분석하여 얻은 모델 식은 3개의 1차식의 계수\( (A, B, C) \)와 3개의 2차식의 계수 \( (A^{2}, B^{2},  C^{2} \) )가 중요한 인자로 확인되었다. 글루코오스의 경우에서는 모델 식의 F-value가 47.45이었으며, 모델 식은 3개의 1차식의 계수 \( (A, B, C) \)가 중요 인자였다.</p> <p>Fig. 1에 E. cottonii의 산 가수분해에 모델에 미치는 적용된 반응인자의 영향을 나타내었다. 산 가수분해를 통한 당 (환원당, 글루코오스, 갈락토오스)의 생성 모델에서 반응온도(\( A \)), 촉매농도(\( B \)), 그리고 반응시간(\( C \))이 부정적인 영향을 미쳤다. 특히 반응온도가 미치는 영향이 크게 나왔다. 이는 갈조류인 모자반을 대상으로 한 연구 결과와도 유사한 결과이다. 반면에, \( AB, AC, A^{2}, B^{2}, C^{2} \)는 긍정적인 영향을 미쳤다.</p> <p>Fig. 2에 E. cottonii로부터 산 가수분해에 의한 환원당 생성에 미치는 반응인자들의 상호관계를 나타내었다. Fig. 2A에 일정한 시간에서 환원당 생성에 미치는 반응온도와 촉매농도의 상호관계를 나타내었다. 일정 반응온도에서 산 촉매농도의 증가에 따라 환원당 생성이 감소하는 경향을 보였다. 높은 반응온도보다 낮은 반응온도에서 촉매농도 증가에 따른 환원당 생성율의 감소가 크게 나타났다. 이는 낮은 온도에서 높은 촉매농도에 의해 해조류의 탄수화물이 단당으로 전환된 이후 단당이 가용가능한 촉매의 수소이온에 의해 과분해반응(탈수반응 등)이 일어난 것으로 판단된다. 높은 반응온도에서는 촉매 농도에 상관없이 낮은 환원당을 생성하였는데, 이 역시 고온반응에 의해 생성된 환원당이 과분해반응을 일으킨 것으로 판단된다. 일정한 촉매 농도에서는 반응온도가 증가할수록 환원당의 생성이 감소하였다. 이러한 조건에서는 반응온도와 촉매농도가 낮은 조건에서 환원당이 가장 많이 생성되었다. 이러한 결과와 비교할만한 것으로는 모자반으로부터 산 가수분해를 통한 환원당 생성 연구에서도 비슷한 결과가 보고되었다.</p> <p>Fig. 2B는 일정 농도의 촉매 조건에서 반응온도와 반응시간이 환원당의 생성에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 일정한 반응시간에서 반응온도가 감소할수록 환원당 생성이 증가하였다. 이는 높은 반응온도에서 생성된 환원당이 과분해되었기 때문으로 판단된다. 일정 반응온도에서의 환원당 생성은 반응시간이 길어질수록 낮아지는 경향을 나타내었다. 전체적으로 낮은 반응온도와 짧은 반응시간의 조건에서 환원당의 생성이 증가하였다. 이러한 결과는 모자반으로부터 산 가수분해를 통한 환원당 생성에서도 비슷한 결과가 보고되었다.</p> <p>Fig. 2C는 일정한 반응온도에서 촉매농도와 반응시간이 환원당의 생성에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 촉매농도가 증가할수록, 반응시간이 증가할수록 환원당의 생성이 감소하였다. 이는 높은 촉매 농도하에서 반응시간이 지남에 따라 E. cottonii로부터 생성된 환원당이 여분의 촉매(\( \mathrm{H}^{+} \))에 의해 과분해반응(탈수반응(dehydration) 또는 재수화반응(rehydration))을 일으켜 5-HMF 또는 레불린산으로 전환됨에 따라 환원당 생성량이 감소한 것으로 판단된다.</p> <p>E. cottonii로부터 산 가수분해 반응을 통한 반응인자들이 환원당 생성에 미치는 영향을 종합하여 보면, 실험범위 내에서 낮은 반응온도, 낮은 촉매농도, 짧은 반응시간의 조건에서 많은 양의 환원당이 생성되었다. 이는 Table 2의 결과에서 나타낸 것과 같이 \( 160^{\circ} \mathrm{C}, 1 \% \) 황산, 20분의 조건에서 가장 높은 \( 20.63 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 환원당이 생성되었으나, \( 190^{\circ} \mathrm{C}, 3 \% \) 황산, 50분의 가혹한 조건에서는 \( 1.84 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 환원당만이 생성된 반면에, 과분해산물인 레불린산이 \( 9.83 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 생성되었다. 이는 가혹한 조건에서는 생성된 당이 레불린산과 같은 과분해산물로 전환된 결과로 판단된다.</p> <p>Fig. 3은 E. cottonii로부터 산 가수분해에 의한 갈락토오스 생성에 미치는 반응인자들의 영향을 나타낸 것이다. Fig. 2의 환원당 생성과 같은 갈락토오스의 생성 경향을 나타내었다. 실험범위 내에서 낮은 반응온도, 낮은 촉매농도, 짧은 반응시간의 조건에서 많은 양의 갈락토오스가 생성되었다. 실험조건 범위 내에서 반응표면분석법을 통한 모델식으로부터 E. cottonii로부터 산 가수분해에 의해 환원당의 생성을 위한 반응변수 최적화 결과 다음과 같은 반응조건을 얻었다. 반응온도 \( 160.1^{\circ} \mathrm{C}, 1.0 \% \) 황산, 13.1분의 조건에서 \( 25.8 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 환원당의 생산이 예측되었다. 이는 갈조류인 모자반의 산 가수분해 최적화 조건(\( 160^{\circ} \mathrm{C}, 1.0 \% \) 황산, 20.2분의 조건에서 \( 15.28 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 환원당 생산)과 유사하나 환원당의 생성량이 보다 높았다. 또한 김 등은 녹조류인 창자파래(Enteromopha intestinalis)를 열수 전처리(\( 170^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분) 후 효소 가수분해를 거쳐 \( 20.1 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)의 환원당을 얻었다. 이는 해조류의 구성성분 중 탄수화물의 종류, 결합구조, 함량 등의 차이에 기인한 결과로 판단된다. 이러한 결과로부터 해조류 종류에 따른 직접적인 비교는 쉽지 않다고 판단된다.</p> <h2>Combined severity factor가 환원당 생성에 미치는 영향</h2> <p>Combined severity factor는 반응의 가혹도를 나타내는 것으로 반응온도, 반응시간, 그리고 반응액의 \( \mathrm{pH} \)로 구성된 함수이다. 주로 목질계 바이오매스의 전처리 공정에 적용되어 전처리 조건을 평가하는데 사용되고 있으나, 최근에는 일부 해조류 연구에서도 적용되고 있다. Fig. 4는 combined severity factor가 E. cottonii로부터 환원당과 과분해산물(5-HMF, 레불린산)의 생성과의 관계를 나타낸 것이다. 환원당과 글루코오스, 갈락토오스의 경우에서는 CSF의 증가에 따른 선형적인 감소 경향이 나타났다. CSF 3.2 이상의 조건에서는 당의 생성이 매우 낮게 나타났다. 당의 과분해산물인 5-HMF의 생성은 초기에 CSF 2.4 조건까지는 증가하다가 이후에서는 매우 낮게 유지되었다. 이는 당으로부터 생성된 5-HMF가 고온 조건에서 산 촉매에 의해 재수화(rehydration)되어 레불린산과 포름산으로 전환되었기 때문으로 알려져 있다. 레불린산은 반응의 CSF가 증가함에 따라 증가하다가 CSF 3.2 이상에서는 일정하게 유지되었으며, 이는 레불린산으로 전환될 수 있는 당이 고갈되었음을 나타낸 것이다. 