부산 연근해에서 분리 분리·동정된 K gwangalliensis는 PPES-II 배지에서, 대장균 균주 XL1-blue와 BL21 (DE3)는 Luria-Bertani 배지에서 각각 교반 배양했다. AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit를 사용해 K. gwangalliensis의 genomic DNA를 분리 추출했으며, Sambrook과 Russello의 방법을 일부 변경하여 Cosmid genomic library를 구축했다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>균주 및 배양조건</h2><p>본 연구에 사용된 균주는 부산 광안리 연근해에서 분리·동정된 핑크색 색소를 생성하는 K gwangalliensis을 PPES-II \( [(0.2 \)g Polypeptone, \( 1.0 \mathrm{~g} \) Bacto soytone, \( 1.0 \mathrm{~g} \) Proteose peptone,\( 1.0 \mathrm{~g} \) Bacto yeast extract, \(3\%\) NaCl, \(0.1\%\) Ferric citrate, 1 dis-tilled water (DW)] 배지에서 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 교반 배양 하였으며, 형질전환에 사용된 대장균 균주 XL1-blue [endA1 gyrA96 \( \left(\mathrm{nal}^{\mathrm{R}}\right) \)thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 \( \mathrm{F}^{\prime}\left[:: \operatorname{Tn} 10\right. \) proAB \( { }^{+} \operatorname{lacI}^{q} \Delta(\operatorname{lacZ}) \)M15] hsdR17 \( \left.\left(\mathrm{r}_{\mathrm{K}}^{-}\mathrm{m}_{K}^{+}\right)\right] \)와 BL21 (DE3) \( \left[\mathrm{F}^{-}\right. \)ompT gal dcmlon hsd \(S _{B}\left(\mathrm{r}_{B}{ }^{-} \mathrm{m}_{B}\right) \wedge(\mathrm{DE} 3 \) [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) ]는 Luria-Bertani (LB; \(1\%\) Tryptone, \(0.5\%\) Yeast ex-tract, \( 1 \% \mathrm{NaCl}) \) 배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 교반 배양하여 사용하였다.</p><h2>Genomic DNA 분리 및 Cosmid library구축</h2><p>K. gwangalliensis의 genomic DNA 분리는 AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Korea)을 사용하여 추출하였으며, 그 과정은 다음과 같다. 멸균된 \( 1.5 \mathrm{ml} \) tube에 배양액 \( 1 \mathrm{ml} \) 을 넣고 \( 14,000 \mathrm{rpm} \) 에서 2분간 원심분리하여 침전시킨 후 침전물을 취해 \( 200 \mu 1 \) 의 lysis buffer와 \( 20 \mu 1 \)의 단백질 분해효소 K (proteinase K)를 첨가 후, \( 56^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 반응시켰다. 침전물이 완전히 분해되면 \( 200 \mu l \)의 binding buffer를 넣고 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시킨 후 \( 100 \mu l \)의 이소프로파놀 (isopropanol)을 넣고 섞어준 후, binding column에 옮긴 다음 \( 8,000 \mathrm{rpm} \)에서 1분간 원심 분리 후, \( 500 \mu l \)의 washing buffer을 넣고 \( 8,000 \mathrm{rpm} \)에서 1분간 원심분리 하였으며 이를 2회 실시 하였다. 원심분리가 끝난 후 binding column을 \( 1.5 \mathrm{ml} \) 멸균 튜브에 옮겨 \( 100 \mu l \) elution buffer을 넣고 5분간 상온에서 반응한 후 \( 8,000 \mathrm{rpm} \)에서 1분간 원심 분리하여 genomic DNA을 분리하였다. 또한, Cosmid genomic library 제작은 Sambrook과 Russello의 방법을 일부 변경하여 genomic library를 구축하였다.</p>