P28L 치환 트립토판 중합효소 알파 소단위체는 자연형과 비교하여 구조적인 변화를 보이고 있다. CD 분광 분석 결과, P28L 치환체의 2차 구조 양이 감소하였으며, 형광 분석에서는 3차 구조 변화로 인한 형광 강도의 감소를 확인하였다. 칼슘이온은 P28L 치환체의 응집에 영향을 미치지 않았다. 또한, 칼슘이온은 자연형에서 형광의 세기와 안정도를 감소시키는 반면, P28L 치환체에서는 영향을 미치지 않았다. 이 결과는 P28L 치환체가 inclusion body 형성과 관련된 구조적 변화를 나타내고 있으며, 칼슘이온과의 상호작용이 없는 것으로 나타났다.
<h2>Spectrophotometry</h2> <p>Circular dichroism (CD)은 JASCO J-715로 \( 100 \mathrm { nm } / \mathrm { min } \)의 속도로 측정하였으며, 형광은 \( 275 \mathrm { nm } \)에서 excitation 시켰으며, Hitachi사의 모델 F-4500으로 측정하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <p>Inclusion body의 형성이 폴딩과정에서의 중간체들이나 misfolding된 단백질들에 의해 일어난다고 알려져 있어 이들의 형성정도에 따라 in vivo 홀딩의 기작을 변화를 유추해 볼 순 있다.</p> <p>Fig. 1은 트립토판 중합효소 \( a \) 소단위체 자연형과 P28L 치환 단백질을 과량발현하여 수용성 상태와 inclusion body 상태로 분리하여 SDS-PAGE로 전개한 것이다. 자연형은 과량발현시 대부분 수용성(S)으로 발현되었으며, inclusion body(P)로는 거의 나타나지 않았다. 이와는 달리 잔기 28번을 류신으로 치환한 \( \alpha \) 소단위체의 경우는 inclusion body로 나타남을 볼 수 있다(Fig. 1 (A)). Inclusion body를 형성하는 P28L \( a \) 소단위체를 \( 6 \mathrm { M } \) urea 용액에 시킨후 요소의 농도가 \( 0.6 \mathrm { M } \) 되도록 희석하여 구조재형성이 시작되도록 하였다(Fig. 1 (B)). 수용성의 자연형단백질과 구조 재형성된 P28L 돌연변이체 단백질을 이온크로마토그레프로 순수분리하였다.</p> <p>먼저 자연형과 P28L 치환 단백질의 구조 변화 정도를 CD와 형광으로 측정하였다. \( 222 \mathrm { nm } \) 부위의 CD는 2차구조의 함량을 나타냄으로 P28L 잔기 치환체는 상당한 정도로 2차 구조의 양이 감소하였음을 시사한다(Fig. 2). 단백질의 형광은 방향족 잔기에 의해서 나타나는 데 이를 둘러싸고 있는 분자환경에 의해 영향을 받음으로 3차 구조 변화 척도로 쓰여지고 있다. 트립토판 중합효소 알파 소단위체의 형광 성질은 주로 티로신(이 단백질은 트립토판이 없음)에 의한 것이다. P28L 잔기 치환 단백질의 형광의 세기가 자연형에 비해 상당한 정도로 감소되었다(Fig. 3) 이는 또한 3차구조에서도 상당한 구조의 변화가 있을 수 있음을 시사한다. CD나 형광의 감소된 세기는 단백질 양의 차이에 기인할 수도 있다. 또한 단백질 분해 효소 등에 의해서 변화된 단백질에 의할 수도 있다, 이를 확인하기 위하여 SDS-PAGE로 전개하여 양과 단백질 밴드 양상을 비교하였으나 단백질 양이나 크기에 있어 차이를 볼 수 없었다. 따라서 실험적인 에러에 의한 것은 아니다. 그러나 자연형의 구조와는 다른 구조를 갖는 multimer의 가능성은 배제할 수 없다.</p> <p>치매환자에서 나타나는 paired helical filament tau (PHF-tau)의 응집을 칼슘이 촉진할 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 P28L 단백질의 경우에도 \( \mathrm { Ca } ^ { 2 + } \) 이온이 침전에 관여하는 지를 조사하였다. 단백질 용핵에 이온을 첨가한 후 원심분리하여 단백질 침전 여부를 조사하였으나 침전된 단백질을 확인할 수 없었다(데이타 생략). 따라서, P28L 치환 단백질의 응집은 칼슘이온에 의한 것은 아닌 것으로 보인다. 그러나 캍슘이온이 어떻게 구조에 영향을 미치는 지를 살펴보았다. 칼슘 이온이 형광에 미치는 영향을 조사한 결과(Fig. 3), 자연형의 경우는 칼슘이온에 의해 형광의 세기가 약간 감소하였으나 P28L 잔기 치환쳬의 경우는 전혀 변화가 없었다. 이는 자연형의 경우 칼슘이온과의 결합이 일어나고 있으나, P28L 잔기치환체의 경우는 칼슘이온과 결합이 없거나 결합하여도 어떤 이유로 형광에 영향을 미치지 않고 있음을 나타낸다. 또한 이 두 단백질의 안정도 및 평형 상태의 unfolding 성질에 미치는 칼슘이온의 영향을 조사하였다(Fig. 4). 이 또한 칼슘이온이 형광에 미치는 영향과 비슷한 결과를 보여주었다. 자연형의 경우는 칼슘이온에 의해 안정도가 크게 떨어졌다. 반면에 P28L 잔기치환체의 경우는 칼슘이온에 의해 영향을 받지 않았다. 자연형의 경우 3가지 형 즉, unfolded, folded, intermediate의 모델에 잘 맞는 것으로 알려져 있다. 본 데이터도 이 모델에 잡 맞고 있다. 이 모델에 따르면, 칼슘이온이 unfolded형이나 intermediate형과 더 잘 결합하여 이 구조를 안정화시키는 것으로 보인다. 그 결과 전체적으로 안정도를 감소시킨 것으로 보인다. 반면, P28L 잔기 치환체의 경우는 이러한 변화를 보여주지 않고 있음으로 칼슘이온과의 상호결합이 없는 것처럼 보인다. 따라서 치매환자에서 나타나는 paired helical filament tau (PHF-tau)의 응집에서 처럼 칼슘이 P28L 잔기 치환체를 응집시키지는 않으며 오히려 반대로 어떠한 상호작용도 보여주지 않고 있다. 본 실험의 결과는 P28L 잔기 치환 트립토판 중합효소 알파 소단위체가 native, folding, intermediate구조에서 상당한 변화가 있음을 나타낸다. 이러한 변화가 이 단백질의 응집에 관여하는 것으로 보인다.</p> <h1>요 약</h1> <p>28번 잔기가 프롤린에서 류신으로 치환된 트립토판 중합 효소 알파 소단위체는 (P28L) 응집형태로 대부분 발현된다. 본 연구에서는 응집의 원인을 규명하는 일환으로 P28L 단백질의 구조적인 변화를 조사하였다. 이 단백질의 CD와 형광성질은 2차 및 3차 구조가 상당히 변화하였음을 시사하였다. 또한 칻슘 이온이 형광 및 평형 상태의 unfolding 성질에 미치는 영향을 조사한 결과, 자연형의 경우는 칼슘이온에 의해 변화하였으나, P28L 잔기 치환체의 경우는 전혀 변화가 없었다. 구조 변화가 이 단백질의 응집에 관여하는 것으로 보인다.</p>