본문에서 다양한 미생물 및 산화적 스트레스를 준 후 BmTf의 전사체 수준에서의 조직별 발현양상을 확인했을 때, 미생물의 종류와 상관없이 과발현됨을 확인하였고, 산화적 스트레스제에 의해서는 거의 정상상태와 비슷한 수준의 발현을 보이는 것을 확인했다. 다음으로 BmTf의 생체방어적 역할이 포유동물의 면역 신호전달과정에 관련되어져 있는지 여부를 조사했을 때, BmTf는 Bm5 세포내에서 ERK, PLC, PKA, PI3K, MAPK, 및 JNK에 의해 발현이 down-regulation됨을 추정할 수 있다. 또한 본 연구에서는 누에가 철과 미생물에 반응을 한 이후 체내 유리 철 양을 확인을 했고, 다양한 결과를 통해서 곤충 Tf의 또 다른 생체방어 메커니즘의 가능성을 제시한다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <p>다양한 미생물 및 산화적 스트레스 부가 후 BmTf의 전사체 수준에서의 조직별 발현양상을 확인하기 위해 real-time PCR을 수행하였다. BmTf의 조직별 발현양상은 정상누에 및 E. coli나 \( \mathrm{FeCl}_{3} \)를 각각 주사(injection) 및 경구감염(oral infection) 시킨 후 12시간 경과한 누에를 사용하였다. 그 결과 E. coli를 주사한 경우에만 표피와 포유동물의 간에 해당하는 지방체(fat body)에서만 특이적으로 정상누에에서 보다 BmTf가 과발현 됨을 확인할 수 있었고, E. coli 및 \( \mathrm{FeCl}_{3} \)의 경구감염과 \( \mathrm{FeCl}_{3} \)를 주사한 경우에는 BmTf의 전사체에서 과발현을 확인할 수 없었다. 앞서 BmTf가 그람양성 및 음성세균, 곰팡이 및 바이러스의 주사에 의해 정상에 비해 과발현됨을 확인한 연구 결과와 마찬가지로 그람음성세균인 E. coli를 경구감염한 경우에는 주사한 경우와 다르게 BmTf가 과발현되지 않으므로 세균이 혈림프 내에 들어왔을 때와 입을 통해 장으로 들어올 때 BmTf의 발현양상에서 큰 차이가 있음을 알 수 있었다.</p> <p>선행 연구를 통해서 BmTf가 미생물의 종류와 상관없이 세균, 곰팡이 및 바이러스 주사에 의해 과발현됨을 확인하였으므로, 본 연구에서는 다양한 유도원으로 미생물뿐만 아니라 산화적 스트레스제를 주사한 후 BmTf의 발현양상을 체액성 면역에서 중요한 역할을 수행하는 항생펩타이드의 발현과 비교해 보았다. 기존에 누에로부터 보고된 cecropin계 항생펩 타이드인 enbocin, attcin계 항생펩타이드인 nuecin과 BmTf의 발현양상을 RT-PCR에 의해 비교해 보았다. 그 결과, nuecin과 enbocin은 세균의 벽성분인 lidopolysaccharide(LPS)와 peptidoglycan에 의해서만 발현이 유도되는 반면, BmTf는 발현량 및 발현시기의 정도의 차이는 있지만 앞선 보고와 같이 세균뿐만 아니라 곰팡이 및 바이러스에 의해 과발현이 유도되었으나, \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}, \mathrm{FeCl}_{3} \) 및 \( \mathrm{Cu} \)에 의한 산화적 스트레스에 의해서는 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 주사 후 발현이 다소 증가되었지만 거의 정상상태와 비슷한 수준의 발현을 보였다. 따라서 BmTf는 곤충 혈림프 내에 미생물의 종류와 상관없이 방어작용을 수행함을 추정할 수 있었고, 산화적 스트레스에 대해서는 Fig. 1에서와 유사하게 정상 상태에서와 거의 비슷한 수준의 발현을 나타내었다. 또한 항생 펩타이드인 enbocin과 nuecin은 미생물을 주사하지 않은 정상 상태에서는 거의 발현되지 않았지만, BmTf는 미생물이나 산화적 스트레스 유도제를 주사하지 않은 정상 상태에서도 일정량 발현이 유지됨을 확인 할 수 있었다.</p> <p>다음으로 BmTf의 생체방어적 역할이 포유동물의 면역 신호전달과정에 관련되어져 있는지 여부를 조사하기 위해 누에 난소 유래 Bm5 세포주에 다양한 protein kinase inhibitor 처리 후 30분 및 2시간 경과시 BmTf 전사체 발현 양상을 조사하였 다. Bm5 누에 세포주에 각각의 protein kinase (ERK, PLC, PKA, PI3K, MAPK, JNK) inhibitor 처리 후 30분 경과시에는 BmTf 전사체 발현수준이 정상 세포에 비해 대부분의 inhibitor를 처리한 경우 거의 정상세포주와 비슷한 수준을 유지하였다. 그러나 2시간 경과시에는 모든 처리구에서 BmTf 발현량이 증가하였으며 그 중 ERK inhibitor를 처리한 경우 정상에 비해 약 \( 7.2 \)배로 가장 발현량이 증가되었고 PLC inhibitor를 처리한 경우에 약 5.7배로 가장 적게 발현량이 증가되었음을 확인하였다. 이거한 결과를 통해서 BmTf는 Bm5 세포내에서 ERK, PLC, PKA, PI3K, MAPK, 및 JNK에 의해 발현이 down-regulation됨을 추정할 수 있었다.</p> <p>Tf의 주요 역할은 철 운반이지만 최근 곤충 Tf의 면역적 기능에 대한 많은 보고가 있었다. 체내에 존재하는 유리 철(free iron)은 펜턴반응(Fenton reaction)으로 과산화 자유기(superoxide radical) 형성을 통해 산화적 스트레스로 작용하여 세포 독성이 있으므로, Tf는 철 결합 단백질이어서 \( \mathrm{Fe}^{3+} \)와 결합을 통해 체내 유리 철 농도를 감소시켜 세포 독성을 줄이는 역할을 한다. 또한 체내에 유입된 병원균이 복제를 위해서 숙주의 철을 이용하는 것을 Tf가 \( \mathrm{Fe}^{3+} \)와 강하게 결합하여 병원균의 철 이용을 제한함으로써 세균발육을 저지(bacteriostatic)할 수 있는 환경을 만들어 병원균의 체내 생존을 힘들게 함으로써 생체방어 역할을 수행하는 것으로 추정되고 있으므로, 본 연구에서는 누에가 철과 미생물에 반응 후 체내 유리 철 양을 확인해 보았다. 누에 5령 유충기잠 때 철 대사 및 산화적 스트레스 유도원으로 \( \mathrm{FeCl}_{3}(50 \) \( \mathrm{mM}) \)를 이용하고 면역반응의 유도원으로는 E. coli \( \left(1 \times 10^{6}\right. \) cells \( / \mathrm{ml}) \)를 이용해서 각각 주사 및 경구감염 후 \( 0, 2, 4, 8 \), 24 및 48시간 경과시 누에 혈림프를 채취하여 혈림프 내 유리 철 양을 분석해 본 결과 E. coli를 경구감염 혹은 주사하였을 경우에는 혈림프 내 유리 철 양이 정상과 비슷한 수준이었다. 반면 \( \mathrm{FeCl}_{3} \)를 주사하거나 경구투여한 경우에는 고농도의 \( \mathrm{FeCl}_{3} \)를 투여하여서인지 일시적으로는 혈림프 내 유리 철 양 이 정상상태보다 60-80배 정도 증가하였으나 경구투여의 경우 에는 투여 후 4시간 째부터 감소되었는데 이는 체내 철 양의 항상성 유지 때문으로 추정된다. \( \mathrm{FeCl}_{3} \)를 주사한 경우에는 48시간째에는 누에가 모두 치사하였으므로 철 양을 측정하지 못하였으나 치사 전 \( 2 \sim 24 \)시간 경과시까지 계속 철 양이 감소되지 못하고 혈림프 내에서 \( 840 \mathrm{~\mu g} / \mathrm{dl} \) 이상이었다. 이러한 결과는 체내 도입한 철의 양이 매우 고농도여서 스스로 처리할 능력의 한계를 넘어섰기 때문에 체내에서 감소되지 않은 것으로 추정되고, 이러한 감소되지 않은 과다한 유리 철이 형성하는 과산화 자유기(superoxide radical)에 의한 산화적 스트레스로 인한 세포 독성 때문에 48시간 째 누에가 모두 치사된 것으로 추정된다. BmTf의 고유 기능이 철 운반 인데도 불구하고 체내에 존재하는 유리 철에 의해서는 BmTf의 발현은 거의 증가되지 않음을 알 수 있었고, 미생물의 주사시 정상에 비해 체내 유리 철 양의 변화는 거의 없었지만 BmTf는 세균, 곰팡이 및 바이러스 모두에 반응하여 과발현됨을 알 수 있었다.</p> <p>이상의 실험을 통해서 곤충 Tf의 고유기능인 철 운반 및 산화적 스트레스에 대한 방어 기능은 생존을 위해 필수적이지만 기본적인 발현수준으로 수행하는 것으로 추정되고, 미생물 침입시에는 미생물의 종류와는 무관하게 비특이적으로 과발현 되어 혈림프 내 미생물의 증식을 억제하는 역할을 수행하는것으로 추정할 수 있다. 이 결과는 곤충 Tf의 또 다른 생체방어 메커니즘의 가능성을 제시한다.</p>