B16 F1, 쥐의 melanoma 세포주를 이용해 황칠나무 잎 추출물과 알부틴을 각각 농도별로 처리하였다. 세포 독성 평가는 MTT assay를 사용하여 진행하였고, 이를 위해 세포에 72시간 동안 시료를 처리 후 MTT 용액을 첨가하였다. 이후 formazan이 생성되면 DMSO에 녹여 ELISA를 이용하여 측정하였다. 처리하지 않은 세포를 음성대조군으로 하여 상대적인 세포 생존율을 구하였다.
<p>아무것도 처리를 하지 않은 비조사군을 음성대조군으로 하여 \( 100 \% \) 기준으로 잡아 상대적인 세포 생존율을 구하였다. 시료를 처리하지 않은 조사군을 양성대조군으로 하였으며, 세포의 생존율은 다음의 식에 따라 계산하였다.</p> <p>세포생존율( \%) \( = \frac {\text { 시료 첨가군의 흡광도 } } {\text { 대조군의 흡광도 } } \times 100 \)</p> <h2>멜라닌 생합성 저해능 측정</h2> <p>세포배양: \( \mathrm { B } 16 \mathrm { ~F } 1 \) 은 쥐의 melanoma 세포주로 경희대학교 피부생명공학센터에서 얻어 사용하였다. 세포는 \( 10 \% \) fetal bovine serum(PAA, Austria), 1 \% penicillin-streptomycine (PAA, Austria)를 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지에 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건에서 배양하였다.</p> <p>세포 독성 평가: 세포 독성 평가는 3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenytetrazolium bromide (MTT, Sigma, USA) assay를 이용하여 측정하였다. B16 melanoma 세포를 96 well plate에서 \( 24 \mathrm { ~h } \) 동안 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건으로 항온 배양한 후, 각 농도 별로 황칠나무 잎 추출물과 비교물질로서 알부틴을 처리하였다. 시료 처리 \( 72 \mathrm { ~h } \) 후 MTT 용액 \( (2 \mu \mathrm { g } / \) \( \mathrm { ml } ) \) 을 첨가하여 \( 3 \mathrm { ~h } \) 동안 반응시킨 다음 생성된 formazan을 DMSO에 녹여 ELISA를 이용하여 \( 570 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다.</p> <p>세포의 형태학적 관찰: B16 melanoma 세포를 6 well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well 씩 분주하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건으로 항온 배양하였다. \( 24 \mathrm { ~h } \) 후 세포가 부착한 것을 확인하고 배지를 교환한 후에 \( \alpha \)-melanocyte stimulating hormone \( ( \alpha- \mathrm { MSH } \), Sigma, USA, \( 200 \mathrm { nM } \) )와 황칠나무 잎 추출물을 농도별로 처리하여 \( 72 \mathrm { ~h } \) 동안 배양하였다. 세포의 수지상 돌기의 변화와 멜라닌 배출정도를 위상차도립현미경을 이용하여 관찰하였다.</p>