염생식물 뿌리에서 내생균류를 분리하기 위해 칠면초와 해홍나물를 부안갯벌에서 채취하였다. 뿌리는 토양을 제거하고 스트렙토마이신이 포함된 Hagem minimal (HM)배지에 배양하였다. 이 후 potato dextrose agar(PDA)에 계대배양하여 순수분리하였다. 동결건조한 내생균류의 균체에서 genomic DNA를 추출하였다. 그리고 DNA 단편들은 ABI 310 DNA sequencer를 사용해 내생균류들의 염기서열을 결정하였다.
<h2>내생균류의 분리 및 배양조건</h2> <p>부안갯벌에서 채취한 칠면초와 해홍나물의 뿌리에 토양을 제거하고, 계면활성제(Tween 80)를 10분 처리한 후에 멸균 증류수(sterile distilled water)로 세척하였으며, 과염소산(Perchloric acid \(1 \% \))을 10분간 2회 처리하였다. 그리고 염생식물의 뿌리는 전처리 후, \( 3 \sim 4 \mathrm { ~cm } \) 길이로 절단하여 수분을 제거하였다. 내생진균의 순수분리와 배양을 위하여 스트렙토마이신(Streptomycin \( 80 \mathrm { ppm } \)이 포함된 Hagem minimal (HM) 배지를 사용하였고, 염생식물의 뿌리를 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 조건에서 배양하였다. 배양된 염생식물 뿌리의 끝 단면에서 내생진균을 HM배지에 획선도말법(Streaking)을 이용하여 다시 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 조건에서 배양하고, potato dextrose agar (PDA)에 계대배양하여 순수 분리하였다. 염생식물의 뿌리에서 순수 분리한 내생균류들을 potato dextrose broth (PDB) 배지에 \(7 \sim 14 \)일 동안, \( 120 \mathrm { rpm } , 28 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 조건으로 진탕배양(Shake culture) 하였으며, 내생균류의 균체(Mycobiont)를 여과하여 5일 동안 동결건조하여 동정을 위한 시료로 사용하였다.</p> <h2>Genomic DNA의 추출과 PCR 조건</h2> <p>동결건조로 인하여 수분이 승화된 내생균류의 균체는 DNeasy Plant mini kit (QIAgen)를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다. 그리고 Polymerase Chain Reaction(PCR) 수행을 위한 templete 조건은 \( 10 \mathrm { ~mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } ( \mathrm { pH } 8.5) \), \( 1.5 \mathrm { ~mM } \mathrm { ~MgCl } _ { 2 } \), \(200 \mathrm { ~nM } \) dNTPs, \( 40 \mathrm { ~mM } \mathrm { ~KCl } \), \(10 \mathrm { ~pmol } \)의 primer와 \( 0.1 \mathrm { ~unit } \)의 Ex-Taq DNA polymerase (Takara, Japan)를 사용하였다. PCR 반응조건은 predenaturation \( (2 \mathrm { ~min } \), \(95 ^ {\circ } \mathrm { C } ) \), denaturation \( (30 \mathrm { ~sec } \), \(95 ^ {\circ } \mathrm { C } ) \), annealing \( (1 \mathrm { ~min } \), \( 54.5 ^ {\circ } \mathrm { C } ) \), extension \( (1 \mathrm { ~min } \), \(72 ^ {\circ } \mathrm { C } ) \), total cycles ( 35 cycles), final extension \( (7 \mathrm { ~min } \), \(72 ^ {\circ } \mathrm { C } ) \) 으로 수행하였다. 그리고 PCR반응을 위하여 universal primer, ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')과 ITS4 (5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3')를 사용하여 rDNA-ITS 영역을 증폭하여 PCR을 수행하였다. 그리고 증폭된 PCR 산물은 \( 1.5 \% \) agarose gel에서 전기영동 후, ethidium bromide(EtBr)을 사용하여 15분 염색 후, UV transilluminator로 전기영동밴드를 확인하였다. 전기영동 단편들은 QIAquick PCR purification kit (Qiagen Inc., Germany)를 사용하여 정제하였다. 그리고 염기서열 결정을 위하여 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (PE Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하였고, DNA 단편들은 ABI 310 DNA sequencer (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA)를 사용하여 내생균류들의 염기서열들을 결정하였다.</p>