DPPH 라디칼 소거법을 통해 항산화 활성을 측정하였다. 시료의 농도는 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 에서 \( 1000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m} \) 까지 되도록 제조하였고, 흡광도를 microplatereader spectrophotometer VERSAmax (Molecular Devices,CA, USA)로 측정하였다. 또한, DCF-DA를 사용하여 fluorescence microplate상에서 활성산소량을 측정하였다. 토끼의 신피질을 준비하여 흡광도를 측정하였다.
<h2>DPPH (2, 2-Di (4-tert-octylphenyl)-1-picrylhy-drazyl) free radical 소거작용에 의한 항산화활성 실험</h2> <p>각 분획을 Fujita 등의 방법에 의한 DPPH 라디칼 소거법에 의해 항산화 활성을 측정하였다. 여러 농도의 시료를 ethanol (\(\mathrm{EtOH}\)) 에 녹여 \( 2 \mathrm{ml} \) 가 되게 하고, \( 2 \times 10^{-4} \mathrm{M} \mathrm{~DPPH} \)/\( \mathrm{EtOH} ~1 \mathrm{ml} \) 에 첨가한 후, 30 분간 실온에 방치한 후 \( 517 \mathrm{~nm} \) 에서의 흡광도를 측정하였다. 전체 \( 3 \mathrm{ml} \) 내에서 시료의 농도는\( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 에서 \( 1000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m} \) 까지 되도록 제조하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 1/2로 감소시키는데 필요한 시료의 농도를 \( \mathrm{IC}_{50} \) 으로 나타내었고 흡광도는 microplatereader spectrophotometer VERSAmax (Molecular Devices,CA, USA)로 측정하였다.</p> <h2>활성산소(ROS) 소거 활성 측정</h2> <p>활성산소량을 형광물질 dichlorofluorescine diacetate (DCF-DA)를 사용하여 fluorescence microplate상에서 직접 측정할 수 있게 되었다. 본 연구에서는 사람의 간세포주인 \( \mathrm{AC}_{2} \mathrm{F} \) 세포주를 fluorescence microplate에 배양하여 DCF-DA를 처리한 후 호두박의 추출물을 처리하고 활성산소 변화량을 Em.485, Ex. \( 530 \mathrm{~nm} \) 파장에서 흡광도로 측정하였다.</p> <h2>Peroxynitrite \( \left(\mathrm{ONOO}^{-}\right) \)소거 활성 측정</h2> <p>\( \mathrm{ONOO}^{-} \) 소거 활성은 dihydrorhodamine 123(DHR 123)의 산화되는 정도를 측정하여 검색하였다. DHR 123\((5 \mathrm{mM}) \)은 dimethyformamidefh 녹여서 stock 용액은 질소로 purge하여 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하고, DHR123용액의 희석은 암실의 얼음 위에서, 사용하기 전에 조제하였다. Buffer는 \( 90 \mathrm{mM} \) sodium chloride, \( 50 \mathrm{mM} \) sodium phosphate \( (\mathrm{pH} 7.4)\)와 \( 5 \mathrm{mM} \) pota-ssium chloride, DTPA (diethylenetriaminepenta acetic acid) \( 100 \mu \mathrm{M} \) 을 혼합하여 조제하며 사용하기 전에 냉장보관하였다. 이 buffer의 용액에 DHR 123용액을 혼합한 뒤 시료와 peroxynitrite를 첨가하고 실온에서 5분간 방치하였다. 그리고 microplate fluorescence reader FL500(Bio-Tek Instruments Inc.)으로 측정하였다. 그리고 \( \mathrm{ONOO}^{-} \)의 바탕용액은 \( 0.3 \mathrm{~N} \)\( \mathrm{NaOH} \) 를 사용하였고, 평균값으로 소거율을 계산하였다.</p> <h2>토끼 신피질 절편 준비</h2> <p>토끼의 신장을 채취한 뒤 동맥으로 \( 140 \mathrm{mM} \mathrm{~NaCl}\), \(10 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{~KCl} \) 과 \( 1.5 \mathrm{mM} \mathrm{~CaCl} \)가 포함된 식염수를 주사하여 혈액을 제거한다. Stadie-Riggs microtome을 이용하여 신피질부위를 \( 0.4 \mathrm{~mm} \) 정도의 두께로 절편을 만든다.</p> <h2>산화적 세포 손상 유발</h2> <p>준비된 신피질 절편을 \( 115 \mathrm{mM} \mathrm{~NaCl}\), \(5 \mathrm{mM} \mathrm{~KCl}\), \(25\mathrm{mM} \) \( \mathrm{~NaHCO}_{3}\), \(2 \mathrm{mM} \mathrm{~NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\), \( 1\mathrm{mM} \mathrm{~MgSO}_{4}\), \(1 \mathrm{m~MCl}_{2} \) and \( 5 \mathrm{mM} \) glucose ( \(\mathrm{pH} 7.4)\)을 포함한 Hanks' balanced salt solu-tion (HBSS)에 \( 1 \mathrm{mM}\) tBHP (t-Butylhyroperoxide)와 함께 \(37 { }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 시간 반응시켰다.</p> <h2>LDH (Lactate dehydrogenase)의 방출 측정</h2> <p>배양된 신피질 절편을 \( 2 \mathrm{ml} \) 의 증류수에서 분쇄하여 원심분리한 후 얻은 상층액과 배양한 배지를 LDH kit를 사용하여 LDH 의 활성을 \( 490 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도 UV-visible spectro-meter (hp8453, Germany)로 측정하였다.</p> <h2>지질과산화(Lipid peroxidation) 측정</h2> <p>지질과산화는 조직의 malondialdehyde (MDA)의 양으로 측정하였다. 신피질을 \( 0.16 \mathrm{M} \mathrm{~KCl} \) 이 포함된 \( 1.15 \% \mathrm{KCl} \) 완충용액 \( (\mathrm{pH} 7.4)\)으로 분쇄시켜서 \( 1 \% \) phosphoric acid \( 3 \mathrm{ml} \) 과\( 0.6 \% \) thiobarbituric acid \( 1 \mathrm{ml} \) 을 완전히 섞어 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 의 수조에서 45 분간 반응시킨다. 그 후 n-butanol \( 4 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 섞는다. \( 1,000 \times \mathrm{g} \) 에서 10 분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 UV-visible spectrometer (hp8453, Germany)에서 파장 \(535 \mathrm{nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p>