DPPH는 메탄올에 녹이면 보라색을 띄지만 항산화 활성을 갖는 물질과 반응하면 색이 손실되는데 이러한 특성을 활용하여 간단하게 항산화 활성을 알아볼 수 있다.linoleic acid를 자동산화 모델로 하여 과산화지질 형성 억제능을 측정하였다. 시료 첨가구 흡광도의 백분율로 나타낸 아질산염 소거능은 각각의 분획은 DPPH 방법을 이용하고, UV/VIS 분광 광도계로 흡광도 파장을 측정하였다. 칼럼 크로마토그래피의 분획을 6개의 분획으로 분류하기 위해 박층 크로마토그래피를 사용하였다.
<h2>DPPH에 의한 수소 공여능 측정</h2> <p>DPPH는 비교적 안정한 라디칼로 메탄올에 녹이면 보라색을 나타내지만 항산화 활성을 갖는 물질과 반응하면 색이 손실된다. 이러한 성질을 이용하여 간단하게 항산화 활성을 측정할 수 있다. 각 용매 별로 분획하여 추출한 시료를 각각 \(4000 \mu \mathrm{g}\), \(7.81 \mu \mathrm{g}\), \(1.95 \mu \mathrm{g} \) 을 취해서 메탄올 \( 4 \mathrm{~mL} \) 에 녹인 후, \( 1.5 \times 10^{-4} \) MDPPH 메탄올 용액 \( 1 \mathrm{~mL} \) 를 첨가하였다. 그 후 대조군 BHA, BHT, \( \alpha \)-tocopherol과 함께 30 분간 실온에서 방치한 후 \(517 \mathrm{nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>과산화 지질 형성 억제능 측정</h2> <p>과산화지질 형성 억제능 측정은 linoleic acid를 자동산화 모델로 하여 측정하였다. 시험액 조제를 위해 \( 20 \mathrm{~mL} \) 유리병에 linoleic acid 용액(linoleic acid \( 2.5 \mathrm{mg} \) 을 메탄올 \( 1 \mathrm{~mL} \)에 용해) \( 0.57 \mathrm{~mL} \) 와 \( 1 \mathrm{M} \) phosphate buffer (\( \mathrm{pH} 7.0)\) \( 2.25 \mathrm{~mL} \) 를 넣고, 메탄올에 각각 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 농도로 희석한 추출물을 \(30 \mu \mathrm{L} \) 씩 첨가하였다. 자동 산화를 진행시키기 위해 시험액을 차광시킨 \(38\sim40 ^{\circ} \mathrm{C} \) 의 배양기에 투입하여 매일 생성되는 과산화물의 양을 ferric thiocyanate 방법으로 측정하였으며, 대조군으로 BHA, BHT, \( \alpha \)-tocopherol를 사용하였다. 즉 배양된 시험액 \( 50 \mu \mathrm{L} \) 와 \( 75 \% \) 메탄올 \( 4.85 \mathrm{~mL} \) 를 시험관에 넣고 잘 섞은 후, \( 30 \% \) ammonium thiocyanate \( 50 \mu \mathrm{L} \) 를 반액에 가한 3 분동안 반응시키고 \( 3.5 \% \) 염산용액에 녹인 \( 20 \mathrm{mM} \) ferrous chlo-ride \( 50 \mu \mathrm{L} \) 를 반응액에 가하여 나타나는 붉은색을 UV/VIS 분광 광도계를 이용하여 \( 500 \mathrm{~nm} \) 에서의 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>아질산염 소거능 측정</h2> <p>Kato 등의 방법으로 \( 1 \mathrm{mM} \mathrm{~NaNO} \) 용액 \( 2 \mathrm{~mL} \) 에 시료(증류수 \( 1 \mathrm{~mL} \) 에 추출물 \( 1 \mathrm{mg} \) 을 용해)를 \( 1 \mathrm{~mL} \) 씩 가하고, \( 0.1 \mathrm{~N} \) \( \mathrm{HCl}\), \(0.2 \mathrm{M} \) 구연산 완충액으로 \( \mathrm{pH} 1.2,3.03,5.970 \) 로 조절한 후 반응 용액의 부피를 \( 10 \mathrm{~mL} \) 로 맞췄다. 이 용액을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 반응시킨 후 각 반응액 \( 1 \mathrm{~mL} \) 를 취해 \( 2 \% \) 초산용액 2 \( \mathrm{mL} \) 와 \( 30 \% \) 초산 용액으로 용해한 griss reagent \( 0.4 \mathrm{~mL} \) 를 가한 후 실온에서 15분 방치한 후 \( 520 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 아질산염 소거능은 무첨가구의 흡광도에 대한 시료 첨가구의 흡광도의 백분율로 나타내었다.</p> <h2>칼럼 크로마토그래피</h2> <p>항산화 활성도가 가장 높음을 나타낸 에틸아세테이트의 추출물을 실리카겔 칼럼(직경: \( 3 \mathrm{~cm} \), 길이: \(67 \mathrm{~cm} \), 입자크기: \( 63\sim 200 \mu \mathrm{m} \))을 사용하여 분리하였다. 용출 용매로는 클로르포름:메탄올:증류수(70:30:5)의 하층을 이용하였다. 칼럼의 맨 위 부분에 소량의 메탄올에 녹인 에틸아세테이트 추출물을 넣고 \( 1.0 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \) 의 속도로 용출 용매를 전개시켜 총 6 개의 분획으로 나누었으며, 용출 용매를 제거하기 위해 회전식 감압 증류장치를 이용하였다. 각각의 분획은 DPPH방법을 이용해 항산화 활성도가 측정되고, UV/VIS 분광 광도계로 흡광도 파장이 측정되었다.</p> <h2>박층 크라마토그래피</h2> <p>박층 크로마토그래피는 칼럼 크로마토그래피의 분획을 6 개의 분획으로 분류하기 위해 사용되었다. 전개 상으로는 클로르포름:메탄올:증류수(70:30:5)의 하층이 사용되었으며 UV light 검출기와 \( 10 \% \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 에 \( 1 \% \) 의 \( \mathrm{Ce}\left(\mathrm{SO}_{4}\right) \) 를 녹인 발색제가 사용되여 Rf값이 구해졌다.</p>