Yeung (1999)의 방법에 따라 체세포배의 발달 정도에 따른 조직검경을 GMA section을 하였고, 그 결과는 통계분석용 프로그램을 이용해 Duncan 다중비교로 유의성을 비교하였다. 가장 효율적인 초기 세포 접종밀도를 초기 접종량을 기준으로 배양 3주 후 증가된 세포의 비율을 비교하였으며 초기 접종밀도가 \( 0.1 \) \( \mathrm { g } / 100 \mathrm { ml } \) 이하인 처리구에서는 세포분열이 잘 이루어지지 않아 낮은 세포 생장률을 나타냈고, \( 0.1 \mathrm { ~g } / 100 \mathrm { ml } \) 이상의 배양밀도에서는 세포 밀도가 지나치게 높아 세포 생장률이 낮아진 결과를 보였다.
<h2>체세포배 조직 관찰</h2> <p>체세포배의 발달 정도에 따른 조직검경을 위하여 Yeung (1999)의 방법에 따라 GMA section 을 하였다. 접종 밀도에 따라 발달된 체세포배를 채취하여 \( 0.05 \mathrm { M } \) 의 phosphate buffer pH 6.8로 \( 2.5 \% \) 의 glutaraldehyde와 \( 1.6 \% \) 의 paraformaldehyde가 포함된 고정액에 \( 24 \sim 48 \)시간 동안 \( 4 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 고정하였다. 그 다음 에탄올을 \( 30,50,70,80,90 \), \( 95,100 \% \) 로 12 시간 단위로 교환하여 탈수 시킨 후 진공 처리하여 식물체내의 공기를 제거하였고 에탄올과 Technovit 7100 (Heraeus Kluzer, Germany)을 \( 2: 1,1: 1,1: 2 \) 의 비율로 각각 24 시간씩 3차례 조직 내에 침투용액을 침투 포매시킨 후, 포매시킨 블록을 microtome (RM 2165 , Leica, Nussloch, Germany) 으로 \( 3 \mu \mathrm { m } \) 두께로 단면을 절단 하였다. Slide에 3 차 증류수를 스포이드로 적당량 떨어뜨린 후 그 위에 절단된 조직을 올려놓고 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 건조 고정시켰다. 염색은 \( 0.1 \% \) 의 periodic acid와 shiff (PAS)용액에 각각 30 분간 처리한 후 흐르는 물에 5 분 세척하고, toluidine-blue O (TBO) 용액에 5 분간 염색 후 흐르는 물로 5 분 세척하여 광학현미경 (DM R, Leica, Wetzlar, Germany) 하에서 50 배로 체세포 배의 단면 조직을 관찰하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>실험 결과는 통계분석용 프로그램 (SAS Institute, Cary, NC, U.S.A)을 이용하여 \( 5 \% \) 유의수준에서 Duncan 다중비교로 유의성을 비교하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <p>음나무 배발생 세포 생장에 적합한 초기 세포 접종 밀도를 조사한 결과 접종밀도가 증가할수록 배양 3 주 후 최종 증식된 세포의 양이 증가하였다 (Table 1). 그러나 \( 0.1,0.5,1.0 \mathrm { ~g } / 100 \mathrm { ml } \) 세 처리구 사이에는 건물중 의 경우 \( 5 \% \) 수준에서 유의 차가 나타나지 않았다. 따라서 가장 효율적인 초기 세포 접종밀도를 알아보고자 초기 접종량을 기준으로 배양 3 주 후 증가된 세포의 비율 (세포 생장률)을 비교하였다. 그 결과 \( 0.05 \mathrm { ~g } / 100 \mathrm { ml } \) 에서 \( 0.1 \mathrm { ~g } / 100 \mathrm { ml } \) 까지는 세포 접종밀도와 비례하여 세포 생장률이 증가하여 \( 0.1 \mathrm { ~g } / 100 \mathrm { ml } \) 처리구에서 \( 0.89 / \mathrm { day } \) 로 가장 높은 값을 나타낸 후 감소하였다(Table. 1). 따라서 음나무 세포배양의 경우 세포분열에 필요한 임계밀도는 \( 0.1 \mathrm { ~g } / 100 \mathrm { ml } \) 로 추정되었다. 초기 접종밀도가 \( 0.1 \) \( \mathrm { g } / 100 \mathrm { ml } \) 이하인 처리구에서는 세포분열이 활발히 이루어지지 않았고 이로 인해 낮은 세포 생장률을 나타낸 것으로 생각되었다. 반면 \( 0.1 \mathrm { ~g } / 100 \mathrm { ml } \) 이상의 배양밀도에서는 배양액 내의 세포 밀도가 지나치게 높아 배양세포의 생장과 노화가 빨리 이루어져 세포 생장률이 낮아진 것으로 추정되었다.</p>