본 논문은 Nitric oxide(NO)는 상층액에서 nitrite와 nitrate로 측정하며, griess reagent를 사용하여 6well plate에 confluence가 80%인 celt을 PBS로 2번 washing해 배양한 후 LPS를 넣어 측정했음을 보여준다. Western blot는 원심 분리를 통해 얻은 단백질을 bradford assay로 정량하고 \( 60 \mu \mathrm { L } \)의 단백질을 전기 영동한 후, 항체의 비특이적 결합을 억제시키기 위해 PVDF membrane에 옮긴 다음 transfer하였다.
<p>세포 독성 \( ( \%)= \left (1- \frac {\text { 시료첨가군의 흡광도 } } {\text { 무첨가군의 훕광도 } } \right ) \times 100 \)</p> <h2>Nitric oxide 저해활성 측정</h2> <p>Nitric oxide \( ( \mathrm { NO } ) \) 측정은 세포의 상층액에서의 nitric oxide \( ( \mathrm { NO } ) \) 의 양을 nitrite와 nitrate로서 측정을 하였다. Nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 griess reagent(Sigma, USA)를 사용하였으며, 6 well plate에 \( 2 \times 10 ^ { 6 } \) 개의 celt을 confluence가 \( 80 \% \) 일 때, PBS로 2 번 washing한 후에 무혈청 배지를 사용하여 12 시간 이상 배양시킨 후에 lipopolysaccharide(LPS) \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 을 대조군을 뺀 모든 well 에 다 넣어서 자극시켰다. 2시간 후에 시료를 농도별로 처리하여 실험하였다. \( \mathrm { NO } \) 생성량은 24 시간 후에 상층액를 모아 griess 시약으로 10 분간 반응시킨 후에 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도로 측정하였다. LPS만 첨가한 군에서 생성된 \( \mathrm { NO } \) 의 양을 \( 100 \% \) 로 하여 시료가 첨가된 경우에 측정된 흡광도를 환산하여 표기하였다.</p> <h2>Western blot을 통한 단백질의 발현 측정</h2> <p>Raw \( 264.7 \) 세포를 \( 60 \mathrm { ~mm } \) tissue culture dish에 \( 2 \times 10 ^ { 4 } \) cells/well에 되도록 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 섬쑥부쟁이 헥산층, 에틸아세테이트층 분획물을 농도별로 처리한 배지로 교환하고 24시간 배양한 후 PBS로 세척하였다. Lysis buffer \( 100 \mu \mathrm { L } \) 을 첨가하여 세포를 용해시키고 원심분리하여 \( \left (4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 12,000 \mathrm { rmp } , 20 \mathrm { ~min } \right ) \) 세포막 성분들을 제거하였다. 원심 분리하여 얻은 단백질은 bradford assay로 정량하였으며, \( 60 \mu \mathrm { L } \) 의 단백질을 \( 10 \% \) 의 SDS-PAGE를 이용하여 전기 영동한 후, 항체의 비특이적 결합을 억제시키기 위해 PVDF membrane에 옮긴 다음 30 40 V에서 2 시간 이상 transfer하였다. Transfer가 끝나면 ponceau에 담근 후 band를 확인하고 TBST로 2회 이상 씻은 후 꺼내서 \( 5 \% \) skim milk로 overnight 시켜 background는 제거시켰다. 3 회 washing 후 1 차 antibody(1:1000)를 1 시간 동안 붙인 후 다시 2차 antibody(1:1000)를 붙이고 ECLkit(Amersham Pharmacia, England)를 이용하여 film에 옮겨 측정하였다. Band density는 Gel doc(Bid-rad, America)으로 확인하였다.</p>