트립토판 합성효소의 이동과 반응은 매우 드물며 \( \alpha \)소단위체에서 생성된 인돌이 터널구조물을 통해 \( \beta \)소단위체로 이동하여 세린과 반응하여 트립토판을 만들어내는 과정이다. 박테리아 균주 및 플라스미드를 형질전환하여 단백질을 과량 발현하고 흡광도를 분광광도계로 측정하여 \( \beta \)반응 및 \( \alpha \)소단위체의 특이 리간드인 glycerophosphate의 영향을 조사하고 그 연관성을 조사하였다.
<p>트립토판 합성효소는 기질의 채널이동이 일어나는 매우 드문 예이다. 전체적인 구조는 두 개의 \( \beta \)소단위체가 결합되어 있고, 양쪽으로 1개씩의 \( \alpha \)소단위체가 결합되어 있는 \( \alpha_ { 2 } \beta_ { 2 } \)구조이다. \( \alpha \)소단위체와 \( \beta \)소단위체간에는 25~30 \( \mathring { A } \) 되는 터널구조가 있으며 \( \alpha \)소단위체와 \( \beta \)소단위체의 활성자리가 서로 25 \( \mathring { A } \) 떨어져 있다. 이 효소에 의해 일어나는 반응은 다음과 같다.</p> <p>indole-3-glycerol-phosphate \( \rightleftarrows \) indole \( + \) D-glyceraldehyde-3-phosphate<caption>( \( \alpha \)반응)</caption></p> <p>indole \( + \) L-serine \( \rightleftarrows \) L-tryptophan \( + \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \)<caption>( \( \beta \) 반응)</caption></p> <p>indole-3-glyceol-phosphate \( + \) L-serine \( \rightleftarrows \) D-glyceraldehyde-3-phosphate \( + \) L-tryptophan \( + \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \)<caption>\( ( \alpha \beta \) 반응)</caption></p> <p>\( \alpha \)소단위체에서 생성된 인돌(indole)은 터널구조물을 통과하여 \( \beta \)소단위체로 이동하여 이곳에서 세린(serine)과 반응하여 트립토판을 만들어내게 된다. Ⅰ단계에서 생성된 aminoacrylate가 \( \alpha \)소단위체에서 터널을 통해 전달되어진 인돌과 결합하여 트립토판이 만들어지는 Ⅱ단계 반응이 일어난다[2].</p> <p>본 연구에서는 \( \beta \)반응에 심한 결함이 있는 D56N와 D56G 잔기치환체를 대상으로 \( \beta \) 반응 Ⅱ단계에 \( \mathrm { Na } ^ { + } \), \( \mathrm { K } ^ { + } \) 그리고 \( \mathrm { NH } _ { 4 } { } ^ { + } \) 등의 일가 양이온들과 \( \alpha \)소단위체의 특이 리간드인 glycerophosphate의 영향을 조사하여 그 연관성을 조사하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>박테리아 균주 및 플라스미드</h2> <p>야생종 또는 돌연변이 \( \operatorname { trpA } \)와 \( \operatorname { trpB } \) 유전자를 포함한 플라스미드 ptactrpA를 대장균 균주 RB797 (F' lacl proL8/arg Nal' Rif recA sup lac proXⅢ) 에 형질전환하여 이로부터 단백질을 과량 발현하였다.</p> <h2>효소와 시약</h2> <p>모든 시약은 순도가 높은 것(ultrapure)을 Sigma사로부터 구입하여 사용하였다.</p> <h2>단백질의 대량생산 및 분리방법</h2> <p>야생형 및 잔기치환 단백질들을 대량 발현시키고 분리한 방법은 이미 보고된 방법에 따랐다. 황산암모늄 ( \(( \mathrm { NH } _ { 4 } )_ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } ) \) 침전법과 이온크로마토그래피 HPLC로 분리하였다. 정제된 단백질의 순도는 SDS-PAGE을 실시하여 Coomassie Brilliant Blue R로 염색하여 확인하였다. 순수 정제된 야생형의 \( \alpha \) 소단위체의 농도는 \( E ^ { 1 \% } { } _ { 278 \mathrm { nm } } = 4.4 \), \( \beta \) 소단위체의 경우 \( E ^ { 1 \% } { } _ { 278 \mathrm { nm } } \) \( =6.5 \)를 사용하여 결정하였다. 잔기치환 단백질의 경우에는 야생형을 표준으로 microbiuret 방법을 사용하였다.</p> <h2>분광광도 축정</h2> <p>50 \( \mathrm { mM } \) TEA buffer를 사용하여 \(200 \sim 820 \mathrm { ~nm } \) 의 범위에서 흡광도를 분광광도계(Varian 4E)로 측정하였다. 단백질의 농도는 30 \( \mu \mathrm { M } \)를 사용하였으며 TEA 50 \( \mathrm { mM } ( \mathrm { pH } 7.8) \), indoline 4.5 \( \mathrm { mM } \), L-Ser 40 \( \mathrm { mM } \), \( \mathrm { NaCl } 100 \mathrm { mM } \), \( \mathrm { KCl } 100 \mathrm { mM } \), \( \mathrm { NH } _ { 4 } \mathrm { Cl~ } 50 \mathrm { mM } \), 그리고 DL- \( \alpha \)-glycerol 3-phosphate (GP) \( 100 \mathrm { mM } \)의 농도에서 관찰하였다. 각 데이타는 \( 550 \mathrm { ~nm } \)의 값을 기준으로 보정하였다.</p>