E. coli DH5\alpha\(\alpha\) 는 재조합 DNA 조작을 위해 host 균주로 사용했고, 효모 S. cerevisiae EBY100 은 P. macerans CFTase의 발현과 surface display를 위해 사용했다. P. macerans의 cft 유전자는 template로서 pECFTN을 사용하여 PCR 증폭 한 후에 cft 유전자는 재조합 plasmid pCTECFTN을 구축하였다. 구축된 재조합 plasmid pCTECFTN는 DH5\alpha\(\alpha\)로부터 증폭, 추출하여 LiCl법으로 효모 숙주세포 S.cerevisiae EBY100에 형질전환한 이 형질전환체는 EBY 100 / pCTECFTN라 이름 붙였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용균주 및 배지</h2><p>E. coli DH5\(\alpha\) (recA1 endA1 gyrA96 thi1 hsdR17 supE44 relA1 lacZ \( \Delta\)M15)는 재조합 DNA 조작을 위해 host 균주로서 사용되었고, 효모 S. cerevisiae EBY100 (MATa ura3-52 trp1 leu2-\( \Delta\)1 his3\(\Delta\)200 pep4:: HIS3 prb1 \( \Delta\)1.6 R can1 GAL1)은 P. macerans CFTase의 발현과 surface display를 위해 사용되었다. E. coli는 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ampicillin을 포함하는 LB 배지 \(1\%\) tryptone, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 0.5 \% \) \( \mathrm{NaCl} \) )에서 배양하였다. YNBCAD \( (0.67 \% \) yeast nitrogen base without amino acids, \( 2 \% \) glucose, and \( 0.5 \% \) casamino acids) 배지는 효모 형질전환의 선별과 seed culture를 위해 사용되었다. 그들의 표면에 display된 효모 형질전환체는 YPDG (\(1\%\) yeast extract, \( 2 \% \) peptone, \( 1 \% \) glucose, and \( 1 \% \) galactose) 배지를 사용하여 \( 20^{\circ} \mathrm{C}\), \(\mathrm{pH} 6.0 \)에서 발효조 (KoBiotech Co., Korea)에서 회분배양을 수행하였다.</p><h2>발현 plasmid의 구축</h2><p>P. macerans의 \( 2.8 \mathrm{~kb} \)의 cft 유전자는 template로서 pECFTN을 사용하여 PCR 증폭하였다. 두 개의 primer는 [(forward primer) : (5'-3') ACGGCTAGCATGTTCCA AGC AAGTGATAGG와 (reverse primer) : (5'-3') GGGATCCGT TGTTAGT TTTCTTCTTTACCTGAACAGGTAC]로 제작하였다. Forward primer 부위에는 NheI 제한효소 인식부위를 가지며, reverse primer에는 BamHI 제한효소 인식부위를 가지고 있다. PCR 증폭후에 cft 유전자는 NheI 와 BamHI 제한 효소로 처리하여 surface display vector인 pCTcon에 재조합하여 재조합 plasmid pCTECFTN \( (9.0 \mathrm{~kb}) \)을 구축하였다.</p><h2>효모 형질전환 및 선별</h2><p>구축된 재조합 plasmid pCTECFTN는 DH5\(\alpha\)로부터 증폭, 추출하여 LiCl법으로 효모 숙주세포 S. cerevisiae EBY100에 형질전환 하였다. 형질전환체는 EBY 100 / pCTECFTN라 명명하였다. 효모 형질전환체는 SD 배지 \( (0.67 \% \) Bacto-yeast nitrogen base without amino acids, \( 0.5 \% \) casamino acids, \( 2 \% \) dextrose)를 사용하여 선별되었다.</p><h2>Immunofluorescence Microscopy</h2><p>최적 배양 조건인 YPDG 배지\( (1 \% \) yeast extract, \( 2 \% \) poly-peptone, \( 1 \% \) dextrose, \( 1 \% \) galactose), \( 20^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{pH} \) 6.0에서 48시간 배양한 균체를 원심분리 \( (8000 \mathrm{rpm}\), 10분 하여 균체를 phosphate-buffered saline \((\mathrm{pH 7.4}\), PBS)에서 두 번 세척한 후 균체를 PBS에 \( \mathrm{OD}_{600}=20 \) 로 희석하였다. 면역항체염색은 c-myc monoclonal antibody mAb 9E10 (Covance Inc., U.S.A.)를 1 차 항체 (\(1: 500\))로 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), 1.5시간 반응 후 세척하고 fluorecein - isothiocyanate (FITC)-labeled anti-mouse IgG \(\ (H+L)\) (KPL Co., U.S.A.)를 2차 항체 (\(1:100\))로 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), 1 시간 반응 후 세척하였다. 면역항체 염색한 균체의 형광 분석은 confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, LSM 510 META, Germany)를 이용하였다.</p>