정상 상태, 인슐린 비의존형 당뇨병, 인슐린 의존형 당뇨병, 비만환자에 있어서 섬유아세포의 수는 각각 \( 3.8 \pm 0.7 \times 10^{4}, 4.5 \pm 0.7 \times 10^{4}, 4.1 \pm 0.6 \times 10^{4} \), 그리고 \( 3.8 \pm 0.7 \times 10^{4} \) cells \( / \mathrm{cm}^{2} \)로 세포 증식에 차이가 없으며, 정상 대조군과 당뇨쥐의 세포 수는 각각 \( 19.4 \pm 0.5 \times \) \( 10^{4}, 18.7 \pm 1.0 \times 10^{4} \) cells \( / \mathrm{cm}^{2} \) 로 유의적인 차이가 없었다. 고농도 glucose 배양 조건에서 30kDa의 intact IGFBP-5가 저농도에 비해 약간 감소했으며, 고농도 glucose 배양 조건에서 IGFBP-5의 단백질 분해가 촉진됨을 확인했다. 따라서, 본 실험에서 고농도 glucose 배양 조건에서 볼 수 있는 IGFBP-5의 감소는 protease가 그 원인으로 보이며 그 중에서도 serine protease에 의해 분해되는 것으로 여겨진다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Glucose 농도가 세포 증식에 미치는 영향</h2> <p>GM10 세포를 저농도 glucose와 고농도 glucose 배지에 배양하였을 때 세포 증식에 미치는 영향을 살펴보았다. 그 결과, 저농도와 고농도 glucose 배지에 배양하였을 때 세포수는 각각 \( 45.1 \pm 4.3 \times 10^{4}, 47.9 \pm 5 \times 10^{4} \) cells/ \( \mathrm{cm}^{2} \) 으로 glucose 농도에 따른 세포 증식에는 유의직인 차이가 나타나지 않았다.</p> <p>이와 유사한 연구들을 살펴보면 정상 상태, 인슐린 비의존형 당뇨병, 인슐린 의존형 당뇨병, 비만환자에 있어서 섬유아세포의 수는 각각 \( 3.8 \pm 0.7 \times 10^{4}, 4.5 \pm 0.7 \times 10^{4}, 4.1 \pm 0.6 \times 10^{4} \), 그리고 \( 3.8 \pm 0.7 \times 10^{4} \) cells \( / \mathrm{cm}^{2} \) 로 세포 증식에 차이가 없다고 하였으며, 정상 대조군과 당뇨쥐의 세포 수는 각각 \( 19.4 \pm 0.5 \times \) \( 10^{4}, 18.7 \pm 1.0 \times 10^{4} \) cells \( / \mathrm{cm}^{2} \) 로 유의적인 차이가 없었다고 하여, 본 연구 결과와 동일한 경향을 보여주었다. 이는 두 그룹에 있어서 glucose 농도 차이 외에 기초영양소는 모두 조건이 동일하기 때문에 짧은 시간 동안의 glucose 농도만으로는 세포 증식에 큰 영향을 미치지 못하는 것으로 보여진다.</p> <h2>Glucose 농도가 IGFBP-5에 미치는 영향</h2> <p>GM10 세포를 저농도 glucose와 고농도 glucose 배지에배양하였을 때, glucose 농도에 따른 IGFBP-5의 단백질 발현수준을 western blot analysis로 살펴보았다. 그 결과, 고농도 glucose 배양 조건에서 IGFBP-5 단백질 발현이 감소하는 것을 관찰하였다. 앞선 실험에서 IGFBP-5의 단백질 수준이 고농도 glucose 배양 조건에서 감소하였으므로 분자적 수준에서의 IGFBP-5 발현정도를 살펴보았다. 그 결과, 고농도와 저농도 glucose 배양 조건, 그리고 고농도 glucose 배양 조건 하에서 IGF-I과 인슐린을 첨가하여 배양한 GM10세포에 있어서 IGFBP-5 mRNA 발현은 유의적인 차이를 보이지 않는 것으로 나타났다.</p> <p>IGFBP-5의 발현이 정상인의 피부 섬유아세포에 IGF-I 첨가 시 IGFBP-5 mRNA 합성에는 protease활성의 저하로 IGFBP-5 수준이 증가한 반면, smooth muscle cell, chondrocytes 그리고 osteoblast에서도 IGF-I 첨가 시 IGFBP-5 mRNA 발현이 현저히 증가한다고 보고하였다. 이와 같이 정상상태의 섬유아세포에 있어서 IGF-I 첨가는 단백질 수준에 서뿐만 아니라 분자적 수준에서도 IGFBP-5의 합성을 증가시키지만 고농도 glucose 상태에서는 IGF-I을 첨가하더라도 IGFBP-5를 감소시킨다고 하였다. 정상상태와 비교할 때 인슐린 의존성 당뇨병, 인슐린 비의존성 당뇨병 환자의 피부섬유아세포에 있어서 IGFBP-5는 저하되는 것으로 보고되고있다. 즉, 앞선 실험에서 IGFBP-5 단백질 수준이 약간의 감소를 보였고, IGFBP-5 mRNA의 발현은 고농도와 저농도 glucose에서 유의적인 차이가 없음을 확인하였다.</p> <h2>Glucose 농도가 IGFBP-5 protease에 미치는 영향</h2> <p>성인 혈청에서는 대부분 IGFBP-3가 IGF-IGFBP 복합체간 IGFs의 분포를 변화시켜 순환하는 IGFs의 대사회전과 이용도를 변화시키는 것으로 알려져 있다. 그러나 순환하는 IGFs는 IGFBPs에 의해 조절될 뿐 아니라 혈청이나 세포 수준에서 작용하는 특이적 IGFBPs protease에 의해서도 조절되는데, 이러한 IGFBP protease의 작용에 의해 생긴 단편은 IGFs에 대한 친화력을 크게 감소시킨다. 사람의 섬유아세포의 cell lysates에는 IGFBP-3와 IGFBP-5 mRNA가 풍부하게 존재하는 반면, 회수한 배양액에서는 intact IGFBP-5가 나타나지 않고 22kDa 의 non-IGF-I binding fragment만이 존재하였는데, 배양액 중에 IGFBP-5를 분해하는 protease가 존재하기 때문인 것으로 나타났다. 본 연구에서도 IGFBP-5가 확인되었으며, glucose 농도에 따라 IGFBP-5의 발현이 달라짐을 확인하였다. 이에 고농도 glucose 배양 조건에서 IGFBP-5의 감소가 protease에 의한 것인지 확인하기 위해 glucose 배양 조건에 따른 IGFBP-5 protease 활성을 살펴보았다. 그 결과, 고농도 glucose 배양 조건에서 30kDa 의 intact IGFBP-5가 저농도에 비해 약간 감소했으며, 22kDa부근의 IGFBP-5 가수분해물이 많이 생성되고 있음을 볼때, 고농도 glucose 배양 조건에서 IGFBP-5의 단백질 분해가 촉진됨을 확인하였다.</p> <p>Nam 등은 사람의 섬유아세포가 IGFBP-5를 분해하는 두 종류의 protease를 분비한다고 하였는데, 그 중 하나는 aprotinin, 3,4-DCI, PMSF 등에 저해되는 92kDa의 serin protease와 EDTA, 1,10-phenanthroline 등에 의해 저해되는 72-, 69-, 55-kDa의 metalloprotease로 알려져 있다. 특히, 사람의 섬유아세포에서는 92kDa 의 serine protease가 우세하게 작용하여 intact IGFBP-5를 22-, 17-, 16-kDa의 fragment로 분해시킨다고 하였다. 따라서, 본 실험에서 고농도 glucose배양 조건에서 보여지는 IGFBP-5의 감소는 protease에 기인한 것으로 보이며 그 중에서도 serine protease에 의해 분해될 것으로 추정하였다.</p>