파 추출물이 독성을 나타내지 않는 조건에서 준비된 파 추출물을 각각 단독으로 처리한 후 MTT assay를 항염증효과를 조사하기 위하여 우선적으로 실험을 수행하였다. 각 추출물의 최고 농도와 LPS를 동시에 처리한 결과, 생존율이 \(90\%\) 이상으로서 BV2 세포에 대한 독성을 나타내지 않았기 때문에 이를 항염증효능 실험 조건으로 선정하였는데 이를 통하여 파 추출물이 iNOS와 COX-2 유전자의 발현을 억제하면서 항염증효능이 있을 것임을 알 수 있었다. 또한, WEWA와 EERA 처리군은 비슷한 수준의 \(\mathrm{NO}\) 생성 억제 효과를 보였으며, WERA 처리군의 효과가 상대적으로 적게 나타났으며, 이러한 결과들은 iNOS의 mRNA 및 단백질 발현 억제 수준과 그 경향성이 유사하였는데, 전사 후 번역 과정과 번역 후 조절 과정에서 유전자의 발현 과정에서의 변화가 생겼을 것으로 예상되어지며, 이에 대하여 지속적으로 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료되어진다.
<h1>결 과</h1> <h2>파 추출물의 BV2 세포에 대한 세포독성 여부</h2> <p>다양한 파 추출물이 BV2 세포에 독성을 나타내지 않는 조건에서 항염증효과를 조사하기 위해 준비된 파 추출물을 각각 단독 처리한 후 MTT assay를 먼저 실시하였다. Fig. 1A에 나타난 바와 같이 파 추출물 처리 24시간 후 WEWA, EEWA 및 WERA 처리군에서는 \(250\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml}\)까지, EERA 단독 처리군에서는 \(40\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml}\)까지는 BV2 세포가 각각 \(90\%\) 이상의 생존율을 보였으나, 그 이상의 처리 농도에서는 처리 농도 의존적으로 세포독성을 나타내었다. 이상의 결과를 바탕으로 WEWA, EEWA 및 WERA 처리군은 \(250\mathrm{\mu g}/\mathrm{ml}\)을, EERA 처리군은 \(40 \mathrm{\mu g}/\mathrm{ml}\)을 최고농도로 선정하여 몇 가지 농도별로 1시간 선처리한 후 LPS \((500\mathrm{ng}/\mathrm{ml})\)를 처리하여 24시간 경과 후에 생존율을 측정하였다. Fig. 1B의 결과에서 알 수 있듯이 각 추출물의 최고 농도와 LPS를 동시에 처리하여도 생존율이 \(90\%\) 이상으로서 BV2 세포에 대한 독성을 나타내지 않았기에 이를 항염증효능 실험 조건으로 선정하였다.</p> <h2>LPS로 유도한 BV2 세포의 iNOS 및 COX-2 발현 증가에 미치는 파 추출물의 영향</h2> <p>이상에서 설정된 조건에서 LPS 처리에 의하여 활성화된 BV2 세포에서 파 추출물의 항염증 효과를 조사하기 위하여 LPS에 의해 유도된 대표적인 염증 매개 유전자인 iNOS와 COX-2의 발현에 미치는 파 추출물의 영향을 전사 및 번역 수준에서 조사하였다. 그 결과 LPS에 의해 유도된 iNOS와 COX-2 유전자의 mRNA 및 단백질 발현이 전체적으로 파 추출물의 처리 농도 의존적으로 감소되었는데, iNOS 발현 억제의 효과는 EEWA 처리군과 EERA 처리군에서 강하게 나타났으며, COX-2 발현의 경우 WEWA 처리군과 EERA 처리군에서 효과적으로 억제시켰음을 알 수 있었다. 아울러 EEWA 처리군은 iNOS의 발현을 현저히 억제한 반면에 COX-2의 억제능은 비교적 낮게 나타났으며, WERA 처리군은 mRNA 수준에서는 두 유전자의 발현을 억제하였으나 단백질수준에서의 억제능은 다소 약하게 나타났다. 따라서 파 추출물의 종류에 따라 정도의 차이는 있지만, 파 추출물이 iNOS와 COX-2 유전자의 발현을 억제함으로서 항염증효능이 있을 것임을 알 수 있었다.</p> <h2>LPS로 유도된 BV2 세포의 \(\mathrm{NO}\) 생성 증가에 미치는 파 추출물의 영향</h2> <p>이상의 결과에서 관찰된 파 추출물의 iNOS 발현 억제 효능이 iNOS의 반응 산물인 \(\mathrm{NO}\)의 생성 억제와 연관되어 있는지의 여부를 조사하였다. 이를 위하여 파 추출물을 각각 단독 처리하거나 1시간 선처리한 후 LPS를 처리하여 \(\mathrm{NO}\) 생성량을 측정하기 위하여 Griess assay를 실시하였다. 그 결과는 Fig.4 에 나타난 바와 같이 LPS 처리 후 현저히 증가했던 \(\mathrm{NO}\)의 생성량이 파 추출물 처리에 의해 처리 농도 의존적으로 감소되었는데, 특히 EEWA 처리군에서는 거의 대조군 수준까지 감소하여 가장 탁월한 효과를 보였다. 아울러 WEWA와 EERA 처리군은 비슷한 수준의 \(\mathrm{NO}\) 생성 억제 효과를 보였으며, WERA 처리군의 효과가 상대적으로 적게 나타났으며, 이러한 결과들은 iNOS의 mRNA 및 단백질 발현 억제 수준과 그 경향성이 유사하였다.</p> <h2>LPS로 유도된 BV2 세포의 염증성 cytokine 발현 증가에 미치는 파 추출물의 영향</h2> <p>다음은 microglia가 활성화되었을 때 분비되는 대표적인 염증성 cytokine인 TNF-\(\alpha\), IL-1\(\beta\) 및 IL-6의 발현에 미치는 파 추출물의 영향을 조사하였다. Fig. 5 의 결과에서 알 수 있듯이 LPS 처리에 의하여 조사된 3 가지 cytokine의 발현이 전사 수준에서 모두 증가되었으나, 파 추출물 처리에 의하여 전체적으로 감소되는 경향성을 보였다. 특히 IL-1가 4 가지 파 추출물 처리에 의해 3 가지 유전자의 발현을 가장 현저하게 감소시켰으며, IL-6은 파 뿌리 추출물인 WERA와 EERA에 의해서만 감소하는 경향을 보였다. 그리고 TNF-a 발현의 경우 WEWA 처리군에서 약간 감소하였으며, 다른 파 추출물에 의해서 억제되는 효과가 약하게 나타났다. 그러나 전반적으로 LPS로 유도된 전구염증 cytokine의 mRNA 수준을 억제하는 경향을 보여 파 추출물이 iNOS 및 COX-2와 함께 cytokine들의 발현 억제를 통하여 염증반응을 억제할 수 있을 가능성을 보여주었다.</p> <h2>LPS에 의하여 증가된 BV2 세포의 TNF-\(\alpha\) 및 lL-6 생성에 미치는 파 추출물의 영향</h2> <p>Fig. 5 에서 관찰된 파 추출물의 염증성 cytokine의 발현 억제 효과가 cytokine의 생성 억제 효과와 연관성이 있는지의 여부를 조사하기 위하여 동일 조건에서 배양된 BV2 세포에서의 TNF-\(\alpha\)와 IL-6의 양적 변화를 조사하였다. 먼저 TNF-\(\alpha\) 생성의 경우, Fig. 5A에 나타낸 바와 같이 LPS 처리에 의하여 증가된 TNF-\(\alpha\) 생성이 EEWA 처리에 의하여 유의적인 감소를 보였고, WEWA와 EERA 처리군에서도 TNF-\(\alpha\) 생성량을 다소 감소되었으나 통계적으로 유의할 수준은 아니었다. IL-6의 경우도 LPS 단독 처리에 의하여 매우 증가되었으며, 파 추출물의 처리에 의하여 부분적으로 감소되었으나 통계적으로 유의한 수준은 아니었다. 이들 결과는 Fig. 5 에서 보여준 TNF-\(\alpha\) 와 IL-6의 mRNA 발현 변화와는 다소 차이가 있었음을 알 수 있었는데, EERA 처리군에서 TNF-\(\alpha\)의 mRNA는 큰 변화가 없었으나 실제 TNF-\(\alpha\)의 생성은 감소하였다는 점과, WERA 처리군에서 IL-6의 mRNA 수준은 감소하였으나 실제 IL-6의 생성은 오히려 다소 증가하였다는 점 등이다. 이들은 유전자의 발현 과정에서 전사 후 번역 과정이나 번역 후 조절 과정에서 변화가 생겼을 것으로 추측되며, 이에 관한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.</p>