유제품, 김치, 돼지와 소의 장 내용물, 채소류, virginal tract, 유아분변, 청국장 등에서 각각 시료 \( 1 \mathrm{~g} \) 을 채취하여 노란색을 띠는 집락의 형태에 따라 서로 다른 미생물을 분리하였다. \( \alpha \)-Galactosidase 및 \( \beta \)-glucosidase를 생산하는 미생물을 분리하기 위하여 대두를 원료로 한 soy medium을 제조하여 사용하였다. 효소 활성 측정에서 원심 분리하여 회수한 상등액을 extracellular 조효소액으로 사용하고, 효소 활성은 Yeo 등의 방법에 따라 수행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>미생물 분리 및 사용배지</h2> <p>유제품, 김치, 돼지와 소의 장 내용물, 채소류, virginal tract, 유아분변, 청국장 등에서 각각 시료 \( 1 \mathrm{~g} \) 을 채취하여 멸균 생리식염수롤 이용하여 순차적으로 십진희석한 후 soy agar medium에 도말하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간동안 배양한 후, 노란색을 띠는 집락의 형태에 따라 서로 다른 미생물을 분리하였다. 혐기성 미생물의 분리를 위해 anaerobic system Gaspack(BBL, Becton Dickinson, USA)을 이용한 혐기 배양기에 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간동안 배양하였다. 표준균주와 분리 균주는 효소 생산용 soy medium을 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간동안 계대배양하여 실험에 사용하였다. \( \alpha \)-Galactosidase 및 \( \beta \)-glucosidase를 생산하는 미생물을 분리하기 위하여 대두를 원료로 한 soy medium을 제조하여 사용하였다. Soy medium 제조는 대두(충북 괴산군 2005산)와 증류수 \( (1: 4) \) 를 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15 분간 열처리한 후, 여과망을 이용하여 대두를 제거하고 그 여과액의 \( \mathrm{pH} \) 를 3.5 로 조절한 다음, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 6시간 정치하여 침전된 단백질을 filter paper(Whatman, England)로 제거하였다. 그 여과액의 \( \mathrm{pH} \) 를 6.5 로 재조정하여 제조하였다. 고체배지는 여기에 \( 1.5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) agar와 \( 0.005 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) bromocresol purple(Yakuri chemicals Co., Japan)을 첨가하고 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15 분간 멸균하여 제조하였다.</p> <h2>효소활성 측정</h2> <p>효소 생산용 액체배지에서 배양한 후에 원심분리 \( (10,000 \times \mathrm{g} \), \( 5 \mathrm{~min} \) )하여 회수한 상등액을 extracellular 조효소액으로 사용하였다. 균체를 회수하여 phosphate buffered saline(PBS)으로 2회 수세한 후, 균체는 초음파 세포파쇄기 (Sonosmasher, Ulsso Hitech Co., Korea)를 이용하여 5 분간 sonication을 실시하였다. 그리고 다시 원심분리 \( (10,000 \times \mathrm{g}, 5 \mathrm{~min}) \) 하여 회수한 상등액을 intracellular 조효소액으로 사용하였다. 효소 활성은 Yeo 등의 방법에 따라 수행하였다. 기질은 50 \( \mathrm{mM} \) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 6.5)에 \( \rho \)-nitrophenyl- \( \alpha- \) D-galacto-pyranoside(PNPG, Sigma, USA)와 \( \rho \)-nitrophenyl-\( \beta \)-D-gluco-pyranoside(PNPG, Sigma, USA)를 \( 10 \mathrm{mM} \) 이 되도록 각각 제조한 후, \( 100 \mu \mathrm{L} \) 의 기질용액에 조효소액을 각각 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 씩 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 반응시킨 후 \( 0.5 \mathrm{M} \) \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 용액 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 를 첨가하여 반응을 중지시켜 유리된 \( \rho \)-nitrophenol(PNP, Sigma, USA)의 양을 \( 400 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도로 측정하였다. 효소활성 단위는 1 분 동안에 1 mole의 PNP를 유리시키는데 필요한 효소량을 1 unit으로 정의하였다.</p>