스펙트럼의 분석 결과와 이미 있는 문헌의 데이터를 비교했을 때 compound2는 quercetin이라는 것을 알아냈다. 이후 당의 configuration이 D form의 형태로 확인이 되었고 이로인해 compound3의 구조가 2-(3,4dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-4-oxo- \( 4 H \)-chromen-3-yl\( \beta \)-D-glucopyranoside (quercetin-3-O- \( \beta \)-D-glucopyranoside)라는 걸 알 수 있었다. compound 4의 구조는 이를 산 가수분해 한 다음에 화학적 처리를 거쳐 아세틸화를 한 다음 표준 당 시료와 같이 TLC를 했더니 glycone moiety가 arabinose로 확인되어 이를 통해 quercetin-3-O- \alpha-3\(\alpha\)−3 "-acetyl-arabinofuranoside이라고 구할 수 있었다. 이렇게 이 연구에서는 화살나무 가지에서 activity-based fractionation을 이용해 \( \alpha \)-glucosidase의 저해 활성물질을 떼어냈고 DEPT, 2D NMR등과 문헌의 데이터를 기반으로 compound1, compound2, compound3, compound4의 구조를 정했다. 이미 저해 활성에 관한 연구는 많이 있었지만 compound4에서 acetylglycosyl 기를 가지는 flavonoids가 워낙 드물기 때문에 화살나무 성분으로서는 처음으로 이 연구에서 보고되었다.
<p>Compound 2는 HRFAB-MS에서 \( m / z 303.236[\mathrm{M}+\mathrm{H}]^{+} \) ion peak와 NMR data에 의해 분자식이 \( \mathrm{C}_{15} \mathrm{H}_{10} \mathrm{O}_{7} \) 임을 알 수 있었으며, UV absorption spectrum에서 \( \lambda 256 \mathrm{~nm} \) (band B)와 \( \lambda 372 \mathrm{~nm} \) (band A)의 최대 흡수를 보여 compound 2 역시 flavonol compound로 추정되었다. \( { }^{1} \mathrm{H} \) NMR spectrum 상의 두 doublet proton signal \( \delta 6.13 \) \( (1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=2.1 \mathrm{~Hz}) \) 와 \( \delta 6.35(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=2.1 \mathrm{~Hz}) \) 는 A ring 의 \( \mathrm{H}-8 \) 와 \( \mathrm{H}-6 \) 이고, \( \delta 7.53(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=2.0 \mathrm{~Hz}), \delta 6.84(1 \mathrm{H} \), \( \mathrm{d}, J=8.5) \) 와 \( \delta 7.52(1 \mathrm{H}, \mathrm{dd}, J=2.0,8.5) \) 의 3 proton signals는 각각 B ring의 H-2', H-5', H-6'으로 A ring의 5 와 7 그리고 B ring의 3'과 4' carbon이 hydroxylate 되어 있음 을 나타내었다. \( { }^{13} \mathrm{C} \) NMR spectrum에서는 \( \delta 145.4 \) 와 \( \delta 149.0 \) 은 benzene B ring의 hydroxyl group을 갖는 carbon signal C-3'와 C-4'이고, A ring의 oxygenated quaternary carbon인 \( \delta 164.3 \) (C-7), \( \delta 161.5 \) (C-5), \( 156.6 \) (C-9)임을 확인할 수 있었다(Table 2). 이상의 \( { }^{1} \mathrm{H} \) 와 \( { }^{13} \mathrm{C} \)NMR spectra 분석과 문헌 상의 data와 비교한 결과 compound 2 는 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy\( 4 H \)-chromen-4-one (quercetin)으로 동정되었다.</p> <p>Compound 3의 경우 TLC plate (silica gel \( 60 \mathrm{RP}-18 \) \( \left.\mathrm{F}_{254}, \mathrm{MeOH}: \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}=1: 1, \mathrm{rf} 0.5\right) \) 와 HPLC \( \left(\mathrm{C}_{18}\right. \) Bondapak,\( \mathrm{CH}_{3} \mathrm{CN}: \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}=2: 8(\mathrm{v} / \mathrm{v}), \mathrm{UV} 254 \) detection, \( \mathrm{t}_{\mathrm{R}} 32 \mathrm{~min} \) )에서 single peak로 분리되었으며, UV 254 와 \( 352 \mathrm{~nm} \) 에서 최대 흡수를 보여 flavonoid 물질임을 시사하였다. HRFAB-MS spectrum에서 \( m / z 465.38[\mathrm{M}+\mathrm{H}]^{+} \)ion peak와 NMR data 등에 의해 분자식 \( \mathrm{C}_{21} \mathrm{H}_{20} \mathrm{O}_{12} \)이 밝혀졌다. \( { }^{1} \mathrm{H} \) NMR spectrum 에서 compound 2와 같이 A ring의 H-6와 H-8의 meta-coupled pattern과 B ring의 1', 3', 4'-trisubstitution 구조가 확인되어 quercetin을 포함하고 있음을 알 수 있었으며, 그 외에 anomeric proton signal \( \delta 5.10 \)과 \( \delta \) 3.8-3.4의 midfield signals들, 그리고 \( { }^{13} \mathrm{C} \mathrm{NMR} \) spectrum의 \( \delta 104.3 \)의 anomeric methine carbon과 \( \delta 78.2-62.5 \mathrm{ppm} \) 사이의 5개 signal들에 의해 sugar moiety 존재가 확인되어 quercetin glycoside임을 알 수 있었다. FAB-MS spectrum의 molecular ion에서 162 mass unit의 loss와 DEPT에서 \( \delta \) \( 62.5 \) signal이 \( \mathrm{CH}_{2} \)을 나타내어 glycone 부분이 hexose임을 확인하였으며, 또한 acid hydrolysis 후 실시한 TLC 분석에 의해서도 aglycone moiety는 quercetin, glycone은 glucose (rf 0.44)임이 확인되었다. Glucose anomeric proton \( \delta 5.10 \) (H-1") 과 \( \delta 134.0 \) (C-3) 간의 HMBC correlation에 의해 quercetin의 C-3에 glycosylate 되었으며, anomeric proton의 \( { }^{3} {\mathrm{H}-1^{\prime \prime}, \mathrm{H}-2^{n}} \) coupling constant \( (J=7.5 \mathrm{~Hz}) \)에 의해 \( \beta \)-linkage임을 알 수 있었다. 당의 configuration은 \( { }^{3} J_{\mathrm{H}-2 ", \mathrm{H}-3 "} \)와 \( { }^{3} J_{\mathrm{H}-3 ", \mathrm{H}-4 "} \) coupling constant (8-9 Hz)와 NOESY spectra에 의해 D form [11]으로 확인되어 compound 3 구조는 2-(3,4dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-4-oxo- \( 4 H \)-chromen-3-yl\( \beta \)-D-glucopyranoside (quercetin-3-O- \( \beta \)-D-glucopyranoside)로 밝혀졌다.</p> <p>Compound 4는 HRFAB-MS에서 \( m / z 477.1016[\mathrm{M}+\mathrm{H}]^{+} \) peak와 \( \mathrm{NMR} \) data에 의해 분자식 \( \mathrm{C}_{22} \mathrm{H}_{21} \mathrm{O}_{12} \)으로 확인되었다. \( { }^{1} \mathrm{H} \) NMR spectrum에서 \( \delta 6.19(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=2.4 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}- \) 6), \( 6.39(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=2.4 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-8), 7.48(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=2.4 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}- \) \( \left.2^{\prime}\right), 6.88\left(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=8.2 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-5^{\prime}\right), 7.55(1 \mathrm{H}, \mathrm{dd}, J=8.4 \), \( \left.1.8 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-6^{\prime}\right) \) peak 등에 의해 compound 4 역시 quercetin moiety를 포함하고 있음을 알 수 있었다. anomeric proton \( \delta 5.27\left(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=1.4 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-1^{\prime \prime}\right) \)과 다른 glycosidic protons \( 4.44 \) (m, H-2") \( 4.81 \) (d, \( J=3.8, \mathrm{H}-3 \) "), \( 3.70 \) (d, \( J=3.8, \mathrm{H}- \) 4")와 \( 3.42(2 \mathrm{H}, \mathrm{m}, \mathrm{H}-5 \) ") 이외에 methyl proton signal \( \delta 1.88 \) (s, 3H)과 \( { }^{13} \mathrm{C} \) NMR spectrum에서 \( \delta 20.9\left(\mathrm{CH}_{3}\right) \)와 \( 170.4(\mathrm{COO}) \) signal 등에 의해서 glycone moiety가 acetylated arabinofuranoside이며 acetyl group의 위치는 H-3" ( \( \delta \) 4.81)와 acetoxyl carbonyl carbon \( \left(\delta 1_{170.4)}\right. \)의 HMBC cross peak에 의해 C-3"로 밝혀졌다. Quercetin의 glycosylation 위치는 anomeric proton \( \delta 5.27 \) (H-1")과 \( \delta 134.0 \) (C-3) 간의 \( \mathrm{HMBC} \) long range correlation으로 C-3임을 알 수 있었고 coupling constant \( J=1.4 \)에 의해서 \( \alpha \)-anomeric configuration이 확인되었다. 또한 compound 4을 산 가수분해 후 \( 0.02 \mathrm{~N} \) sodium methoxide로 처리하여 deacetylation을 행한 다음 표준 당 시료와 함께 실시한 TLC에서도 glycone moiety는 arabinose (rf 0.53)로 확인되었다. 따라서 compound 4의 구조는 quercetin-3-O- \( \alpha-3 \) "-acetyl-arabinofuranoside로 결정 되었다.</p> <p>본 연구에서 activity-based fractionation에 의해 화살나무 가지로부터 \( \alpha \)-glucosidase 저해 활성물질을 분리하였고, \( { }^{1} \mathrm{H} \), \( { }^{13} \mathrm{C} \) NMR, DEPT, 2D NMR과 MS spectrum 등과 문헌 상의 data을 근거로 하여 compound 1 (Kaempferol), compound 2 (quercetin), compound 3 (quercetin-3-O- \( \beta \)-glucopyranoside),compound 4 (quercetin-3-O-\(\alpha\)-3"-acetyl-arabinofuranoside) 의 구조를 결정하였다. 화살나무의 butanol 용매 추출 층에서 분리한 활성물질 1,2,3과 4 는 모두 5,7-dihydroxy flavonol 물질이다. 다양한 천연물 소재에서 flavonol 물질의 분리가 이루어졌으며, flavonol compound의 \( \alpha \)-glucosidase 저해 활성과 항산화 작용 등에 관해 다수의 연구가 보고된 바 있다[14]. 그러나 화살나무의 \( \alpha \)-glucosidase 효소 저해의 유효성분으로서는 보고된 바가 없다. 또한 compound 4 의 경우는 acetylglycosyl 기를 포함하는 드문 flavonoids로 화살나무 성분으로 본 연구에서 처음 보고되었다.</p>