본 연구에서는 10kg의 카카오를 70% 아세톤으로 상온에서 1주 동안 3회 추출한 후, 여과하여 아세톤 추출물을 얻었다. 동일한 방법으로 에틸아세테이트층, 부탄올층, 물층을 차례로 추출하여 각각의 분획물을 생성하였다. 폴리페놀의 양은 AOAC 방법에 따라 측정하였고, 전자공여능은 Blois의 방법을 수정하여 측정하였다. 이 후 얻은 추출물은 압력을 적용하고 농축 후 동결 건조하여 용매를 제거한 후 실험에 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>본 실험에 사용한 카카오(Theobroma cacao L.)는 가나산 카카오를 (주)롯데 식품사업부에서 시판되고 있는 원료를 롯데 그룹 중앙 연구소에서 공급받아 실험재료로 사용하였다.</p> <h2>시료 추출 및 용매분획</h2> <p>카카오 \( 10 \mathrm{~kg} \)을 \( 70 \% \)아세톤을 가하여 상온에서 1주일간 3회 추출한 다음 filter paper (Whatman No. 2)로 여과하였고, 얻어진 여액은 감압 농축하여 아세톤 추출물을 얻었다. 이 아세톤 추출물의 극성 차를 이용해 서로 다른 용매를 첨가하여 단계적으로 분획하였다. 카카오 아세톤 추출물과 클로로포름을 \( 1: 1 \)비율로 분획 깔대기에 넣고 클로로포름층과 물층을 분획하였고, 클로로포름층을 다시 감압 농축하여 분획물 \( 21.92 \mathrm{g} \)을 얻었다. 동일한 과정을 통해 에틸아세테이트층\(( 35.44 \mathrm{g}) \), 부탄올층 \( (40.08 \mathrm{~g}) \), 물층 \( (46.55 \mathrm{~g}) \)을 순차적으로 가하여 각 분획물을 얻었다. 이들 분획물들을 감압, 농축 후 동결 건조하여 용매를 제거한 후 실험에 사용하였다.</p> <h2>총 폴리페놀 함량 측정</h2> <p>폴리페놀 정량은 AOAC에 준하여 정량하였다. 즉, 100배 희석한 시료용액 \( 3\mathrm{ml} \)에 folin-ciocalteu phenol reagent 시약 \( 1 \mathrm{ml} \)를 가하고, \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} 0.2 \mathrm{ml} \)을 넣은 후, 포화용액 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \)\( 1\mathrm{ml} \)를 가하여 혼합한 후 1시간 실온에서 방치하고, \( 640 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정한 후, 표준물질인 tannic acid로 미리 작성한 표준곡선의 흡광도 값과 비교하여 폴리페놀 함량을 산출하였다.</p> <h2>전자공여능 측정</h2> <p>전자공여능(electron donating ability, EDA)은 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다. 각 시료용액 \( 2 \mathrm{ml} \)에 \( 0.2 \mathrm{mM} \)의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) \( 1 \mathrm{ml} \) 넣고 교반한 후 30분간 방치한 다음 \( 517 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나 타내었다.</p> <p>전자공여능 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\text { 무첨가군의 흡광도 }}\right) \times 100 \)</p> <h3>Superoxide anion radical 소거능 측정</h3> <p>Superoxide anion radical소거능은 nitroblue tetrazolium (NBT)환원방법에 의해 측정하였다. 각 시료용액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)와 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 7.5) 0.6 \mathrm{ml} \)에 xanthine \( (0.4 \mathrm{mM}) \)과 \( \mathrm{NBT}(0.24 \mathrm{mM}) \)을 녹인 기질액 \( 1 \mathrm{ml} \)를 첨가하고 xanthine oxidase \( (0.049 \mathrm{U} / \mathrm{ml})\) \(1\mathrm{ml} \)를 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 반응시킨 후 \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{HCl}\) \(1 \mathrm{ml} \)를 가하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액 중에 생성된 superoxide anion radical의 양을 \( 560 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <p>저해율 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 superoxide anion radical 생성량 }}{\text { 무첨가군의 superoxide anion radical 생성량 }}\right) \times 100 \)</p>