선별한 차별화 클론에 대해 전사체 검정을 위해 스트레스 유도체 처리에 의한 소포체 내 비정상 단백질이 생성된 배양세포주와 정상배양세포주에서 total RNA를 분리하고, 자동염기서열 분석장치를 이용하여 차별화 발현되는 클론의 부분 염기서열 분석을 실시하였다. 그 후 해당 염기서열을 토대로 상동성을 분석하고 국제 유전자은행에 등록하였다. 최종적으로, PCR을 진행한 후, PCR로 증폭한 단편의 크기를 전기영동을 통해 확인 후 클로닝을 하였다.
<h2>Northern blot 분석</h2> <p>선발한 차별화 클론에 대하여 전사체 검정을 위하여 정상 배양세포주와 각종 스트레스 유도제 처리에 의해서 소 포체 내 비정상 단백질이 생성된 배양세포주로부터 각각 total RNA를 분리하였다. 분리한 total RNA는 \( 1.2 \% \) formaldehyde agarose 겔에 각각 동일한 \( 5 \mu \mathrm{g} \)의 RNA를 전기영동하고 나일론 막에 전이시킨 후, Stratagene (La Jolla, CA, USA)의 Prime-It II Random Primer Labelling Kit를 이용하여 \( \left[\alpha^{32} \mathrm{P}\right]\) dATP 로 표지한 cDNA를 탐침으로 Northern blot 분석을 수행하였다.</p> <h2>염기서열 분석 및 데이터베이스 검색</h2> <p>차별화 발현되는 클론의 부분 염기서열 분석은 Perkin Elmer (Wellesley, MA, USA)의 자동염기서열 분석장치 (ABI 377)를 이용하여 제조회사의 방법에 따라 수행하였다. 각 염기의 표지는 Applied Biosystems (Foster, CA, USA) 의 Bigdye Ready Reaction Kit를 이용하여 반응액을 조제 하고 PCR을 수행한 후, 반응산물을 정제하여 \( 4.5 \% \) 아크릴 아마이드겔에 전개하였다. 아크릴아마이드겔의 예비통전 은 \( 30 \mathrm{~W} \)로 20~30분간하였으며, 시료주입은 정제한 PCR 산물에 formamide \( 5 \mu \ell \) 와 \( 50 \mathrm{mM} \) EDTA \( 1 \mu \ell \)를 넣어 100 \( { }^{\circ} \mathrm{C} \)에 2분간 변성하고 급냉한 후 각 well에 \( 2 \mu \) 씩 점적 (loading)하였으며, 염기서열은 Perkin Elmer (Wellesley, MA, USA)의 DNA Sequencing Analysis Software에 의해서 분석하였다. 그 후 얻어진 염기서열은 GenBank 데이터 베이스를 통하여 상동성을 분석하고 GenBank 및 DDBJ 국제 유전자은행에 등록하였다.</p> <h2>\( 5^{\prime} \)-RACE-PCR</h2> <p>차별화 선별된 클론의 전체 염기서열을 결정하기 위하여 Clontech (East Meadow Circle Palo Alto, CA, USA)의 Marathon cDNA Amplification Kit를 사용하여 5'-Rapid Amplication of cDNA ends (RACE) PCR을 실시하였다. Tunicamycin이 처리된 누에 배양세포(Bm5)로부터 분리한 poly(A)+RNA를 사용하여 1st 및 2nd cDNA를 합성하고, Marathon cDNA Adaptor (5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3')를 ligation 한 후 유전자내의 gene specific primer (GSP1: 5'-GATTTACTTGATTAGACCCTTCGCCTTGAAAAGATC-3')와 adaptor primer (AP1 : 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3')를 사용하여 touch down PCR을 수행하였다. 증폭된 5'-RACE (GSP1/AP1) PCR 산물은 \( 1.2 \% \) 아가로스겔에 전기영동하여 증폭된 단편의 크기를 확인한 후, Promega (Madison, WI, USA)의 pGEM-T 벡터에 클로닝 하고 염기서열을 확인하여 전체 염기서열을 결정하였다.</p>