본 연구에서는 TBARS는 Burge와 Aust의 방법에 따라 측정했으며, Xanthine oxidase 활성저해 측정은 Stirpe와 Corte 의 방법에 준해 측정했다. Angiotensin converting Enzyme 저해 활성 측정 다음으로 Pancreatin \( \alpha \)-amylase 저해 활성은 agar diffusion method를 이용해 측정했다. 더불어 Helicobacter pylori의 항균 활성을 측정하였다.
<h2>Thiobarbituric acid reactive substances(TBARS) 측정</h2> <p>TBARS는 Burge와 Aust의 방법에 따라 측정하였다. \( 1 \% \) linoleic acid와 \(1\%\) Tween 40으로 emulsion을 만들고 emul-sion \( 0.8 \mathrm{ml} \)와 시료 \( 0.2 \mathrm{ml} \)를 섞은 후 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) water bath에서 10시간 반응시켰다. 반응 후 반응액 \( 1 \mathrm{ml} \)에 TBA reagent \(2 \mathrm{ml} \)를 가하고 15분간 중탕한 다음 10분간 냉각시킨 후 15분간 \( 1,000 \mathrm{rpm} \)으로 원심분리 하였다. 원심분리 한 액을 실온에서 10분간 방치 한 후 상징액을 취해 \( 532 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였으며, TBARS값은 (흡광도 수치× \( 0.0154 \) )로 \( 1 \mathrm{ml} \) 반응혼합물에 대해서 생성된 1,1,3,3 tetraethoxy propane (TEP)의 \( \mu \mathrm{M} \) 로 표시하였다.</p> <h2>Xanthine oxidase 저해 활성 측정</h2> <p>Xanthine oxidase 활성저해 측정법은 Stirpe와 Corte 의 방법에 준하여 측정하였다. \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buf-fer(\(\mathrm{pH} \) 7.5)에 xanthine \( 2 \mathrm{mM} \)을 녹인 기질액 \( 3 \mathrm{ml} \)에 효소액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)와 추출용액 \( 0.3 \mathrm{ml} \)를 넣고 대조구에는 추출용액 대신 증류수를 \( 0.3 \mathrm{ml} \) 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시키고 \( 20 \% \) trichloroacetic acid (TCA) \( 1 \mathrm{ml} \)를 가하여 반응을 종료시킨 다음 \( 3,500 \mathrm{rpm} \)에서 15분간 원심분리하여 단백질을 제거한 후 반응액 중에 생성된 uric acid를 \( 292 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 구한 뒤 표준곡선에서 양을 환산하여 다음 식으로 저해율을 계산하였다.</p> <p>저해율 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 반응구의 uric acid 생성량 }}{\text { 대조구의 uric acid 생성량 }}\right) \times 100 \)</p> <h2>Angiotensin converting Enzyme (ACE) 저해 활성 측정</h2> <p>ACE 저해 활성 측정은 \( 0.3 \mathrm{M}\) \(\mathrm{NaCl} \)을 함유하는 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer(\( \mathrm{pH}~8.3\))에 \( 2.5 \mathrm{mM} \) hippuryl-his-tidyl-leucine을 녹인 기질액 \( 0.15 \mathrm{ml} \)에 ACE(\(0.125 \mathrm{U} / \mathrm{ml}\)) \( 0.1\mathrm{ml} \)와 시료액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 가하고 대조구에는 시료액 대신 증류수를 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시키고 \( 1 \mathrm{~N}\)-\(\mathrm{HCl}\) \(0.35 \mathrm{ml} \)를 가하여 반응을 종료시킨 뒤 ethyl acetate \( 3 \mathrm{ml} \)를 가하고 ethyl acetate 층만을 취하여 evaporating한 뒤 그 잔사에 증류수 \( 2 \mathrm{ml} \)를 가하여 효소에 의해 기질로부터 분리되어 추출된 hippuric acid를 녹여 \( 280 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 구한 뒤 표준곡선에서 양을 환산하여 아래의 식에 의해 저해율을 계산하였다.</p> <p>저해율 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 반응구의 hippuric acid 생성량 }}{\text { 대조구의 hippuric acid 생성량 }}\right) \times 100 \)</p> <h2>Pancreatin \( \alpha \)-Amylase 저해 활성 측정</h2> <p>Pancreatin \( \alpha \)-amylase 저해 활성 측정은 agar diffusion method를 이용하여 측정하였다. plate는 \( 1 \% \)의 agar와 \( 1 \% \)의 soluble starch를 증류수에 녹여 끓인 후, \( 121^{\circ} \mathrm{C} \)로 15분간 멸균하고 \( 15 \mathrm{ml} \)씩 petri dish에 붓고 굳혀서 plate를 제작하였다. 시료액 \( 0.8 \mu\mathrm{l}\)와 효소액 \( 0.2 \mu \mathrm{l}\)(\(1,000 \mathrm{U} / \mathrm{ml}\))를 섞어 plate위에 놓인 disc paper 위에 각각 분주하고 대조구에는 시료액 대신 증류수를 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일간 배양한 후 \( \mathrm{I}_{2} / \mathrm{KI}\)(\(5 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{I}_{2} \) in \( 3 \% \) \(\mathrm{KI}\)) \( 5 \mathrm{ml} \)를 가하여 15분간 발색시킨 후 다음의 식으로 저해율을 계산하였다.</p> <p>저해율 \( (\%)=\left(\frac{\text { 대조구의 면적-반응구의 면적 }}{\text { 대조구의 면적 }}\right) \times 100 \)</p> <h2>Helicobacter pylori 항균활성 측정</h2> <p>실험에 사용한 균주는 위, 십이지장 궤양 원인균인 H. pylori로서 표준균주인 ATCC 43504를 사용하였다. 균의 배양에는 최적배지(special peptone \( 0.5 \mathrm{~g} \), agar \( 0.75 \mathrm{~g}\), \(\mathrm{NaCl} 0.25 \mathrm{~g} \), yeast extract \( 0.25 \mathrm{~g} \), beef extract \( 0.2 \mathrm{~g} \) 및 pyruvic acid \( 0.025 \) \( \mathrm{g} \))를 사용하였으며, 미호기성 조건을 유지시켜주기 위해서 \( 10 \% \) \(\mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 습도는 \(95\%\) 이상으로 유지하며 배양 하였으며, agar plate 상에서 배양은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)로 \(48\sim72\)시간 동안 실시하였다. 또한 항균 활성 측정은 H. pylori 최적배지 plate에 균분산액 \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 분주하여 멸균 유리봉으로 도말한 다음, 멸균된 disc paper ( \( \phi 8 \mathrm{~mm} \) )를 올리고 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) membrane fil-ter로 제균한 추출물을 vacuum evaporator로 농축한 후 멸균수로 희석하여 phenol 함량이 \( 50\sim 200\mu \mathrm{g} / 100 \mu \mathrm{l} \)가 되도록 조절한 후 각 추출물 \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 disc paper에 흡수시키고, 대조구로는 멸균수를 흡수시킨 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)의 미호기성 조건에서 48시간 동안 incubation한 다음, disc 주위의 clear zone 생성 유무를 확인하였다.</p>