본 논문에서 정지기 이후 효모의 세포 용해에 의해 표면 발현된 효소가 함께 실험되는 것으로 생각된다. 그리고, 재조합 균주 S. cerevisiae EBY100/pYDCGTS 를 초기 \( \mathrm{pH}6.0\),\( 25^{\circ} \mathrm{C} \), YPDG 배지에서 회분 배양한 후, 세포를 2% soluble starch와 같이 효소반응시킨 후 전술의 방법에 따라 TLC로 반응생성물을 비교했다.
<h2>CGTase 표면 발현을 위한 최적 배양 조건</h2> <p>재조합 균주 S. cerevisiae EBY100/pYDCGTS의 최적 배양 조건을 알아보기 위해 YPDG배지, \( \mathrm{pH} 4.0 \sim 10.0,25^{\circ} \mathrm{C} \) 와 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 회분 배양 하면서 균체증식과 CGTase 발현량을 조사한 결과, Fig. 5와 같이 glucose가 완전히 소모되고, galactose에 의해 유도, 발현되는 12시간부터 CGTase의 활성이 증가하기 시작하여 배양 36시간째 최대 활성에 도달하였다. 최대 활성은 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 배양 시 \( 21.3 \) unit/l, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 배양 시 \( 16.5 unit/l\)로 나타났으며, 효소의 비활성 및 plasmid 안정성은 Table 1 에서와 같이 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 배양 시 \( 1.7 unit/g-DCW\)와 \(86\%\)로 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 배양 때보다 높게 나타났다. 최적 \( \mathrm{pH} \) 는 B. macerans CGTase 포면발현 경우와 같은 \( \mathrm{pH} 6.0 \) 이였다(data not shown). 결론적으로 배양 온도가 낮은데서 활성이 높게 나오는 것은 배양 온도가 높을 때는 endoplasmic reticulum (ER)에서의 정체와 단백질 접힘 효과가 떨어지기 때문으로 사료된다. 또한, 정지기 이후 배양 36시간 이후부터 효소 활성이 급격히 감소하였다. 이는 정지기 이후 효모의 세포 용해에 의해 표면 발현된 효소가 함께 실활되는 것으로 사료된다.</p> <h2>TLC를 이용한 효소 반응 생성물의 비교</h2> <p>재조합 균주 S. cerevisiae EBY100/pYDCGTS를 초기 \( \mathrm{pH}6.0\),\( 25^{\circ} \mathrm{C} \), YPDG 배지에서 48시간 회분 배양한 후 세포를 2% soluble starch와 함께 효소 반응시킨 후 전술의 방법에 따라 TLC로 반응 생성물을 비교하였다. 그 결과 배양 12시간째부터 효소활성이 나타났고, 반응 10분 이후부터 CD가 생성되어 시간이 지남에 따라 CD 및 G1 (glucose), G2 (maltose), G3 (maltotriose) 등의 생성양이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 반응 12시간까지도 CD의 생성량이 계속 증가하였다. a-agglutinin를 사용하여 Kim 등은 B. macerans CGTase를 표면발현시켰고, 기질인 soluble starch와 CGTase가 표면 발현된 형질전환체를 60시간이상 반응하여 a-CD를 생산하였다. 그 연구 결과에 따르면 episomal 발현에 의한 CGTase는 a-CD, glucose, maltose 분해 시 intermolecular transglycosy-lation에 의해 maltooligosaccharide 농도는 증가하고, 부수적으로 a-CD는 감소하는 반면, 표면발현에 의한 CGTase는 반응 49시간까지 coupling, disproportionation에 의해 저농도의 maltooligosaccharide로 분해되다가 감소되어져 a-CD만 남게 된다. 결론적으로 보다 순도가 높은 a-CD를 생산할 수 있는 것과 그에 따른 안정성이 높은 것으로 나타났다. 이는 목적 단백질이 효모 세포표면의 glucan 구조와 공유결합에 의하여 결합되어 있어 반응 중 추출되지 않아 life time이 길어지기 때문이다. 따라서, 생촉매제(biocatalyst)는 전통적인 고정화에 의한 발효과정과는 달리 효소의 안정성 및 회수가 용이하여 생산성 저하 문제를 피할 수 있어 산업적 응용에 유리할 것으로 사료된다.</p>