대구의 간 가수분해물을 한외여과막으로 분획한 후, sodium acetate buffer(pH 4.0)로 평형화하고 SP-Sephadex C-25 양이온 교환수지에 넣어 30분간 방치시킨 후, 0.25M, 0.5M, 1.0M NaCl 용액으로 용출하여 ACE 저해활성을 측정한 결과, 0.5M NaCl 용액에서 용출된 부분이 가장 우수한 ACE 저해활성을 보였다.
<h2>ACE 저해 펩타이드의 분리◦정제</h2> <p>한외여과막을 사용하여 분자량별로 분획한 가수분해물 중에서 ACE 저해활성이 가장 높은 것으로 나타난 대구의 간 가수분해물 \( 0.5 \mathrm { g } \)을 \( 20 \mathrm { mM } \) sodium acetate buffer \( ( \mathrm { pH } \) 4.0)로 평형화시킨 SP-Sephadex C-25 양이온 교환수지에 넣어 30분간 방치시킨 후, 비홉착부분을 용출시키고 수지에 흡착된 부분은 \( 0.25 \mathrm { M } , 0.5 \mathrm { M } \) 및 \( 1.0 \mathrm { M } \mathrm { ~NaCl } \) 용액 \( 500 \mathrm { m } \ell \)로 순차적으로 용출한 다음, 전기투석기에서 염을 완전히 제거하고 동결건조하여 ACE 저해활성을 측정하였다. 이온 교환수지에서 분획한 획분중에서 ACE 저해활성이 가장 우수한 획분을 겔 크로마토그래피방법으로 분리하였다. 즉, 겔 여과용 수지 Sephadex G-15를 충진시켜 탈이온수로 평형화시킨 칼럼 \( ( \phi 2.5 \times 62 \mathrm { cm } ) \)에 \( 0.5 \mathrm { g } / \mathrm { m } \ell \)의 가수분해액 \( 0.2 \) \( \mathrm { m } \ell \)를 주입하고, 탈이온수로 용출 (유속, \( 1.0 \mathrm { m } \ell / \mathrm { min } \); 분획량, \( 5 \mathrm { m } \ell \))하였다. 이 분획물을 분광광도계로 \( 280 \mathrm { nm } \)에서 흡광도를 측정하고, 동결건조한 후 일정량을 정평하여 ACE 저해활성을 측정하였다. 가장 뛰어난 ACE 저해활성을 가진 획분을 HPLC상에서 ODS reverse-phase column \( ( \phi 10.0 \times \) \( 250 \mathrm { mm } \))을 이용하여 용리하였다. 이때, 용출속도는 \( 2.0 \mathrm { m } \ell / \) \( \mathrm { min } \), 이동상으로는 \( 0.1 \% \) trifluoroacetic acid를 함유한 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \)와 acetonitrile \( (0 \sim 20 \%, 30 \mathrm { min } ) \)을 사용하여 선형상 농도구배법으로 \( 215 \mathrm { nm } \)에서 흡광도를 측정하여 분획하고, 그 활성을 측정하였다. 최종적인 순도확인은 capillary electrophoresis (Bio Rad Co., USA)를 사용하였다.</p> <h2>아미노산 서열 분석</h2> <p>아미노산 서열은 N-말단으로부터 아미노산을 절단하는 Edman법으로 분해한 후, 기체상 자동서열분석기 (Perkin Elmer, USA, New Jersey)로 분석하였다. 즉, 염기 조건하에서 해리를 억제시킨 아미노산을 phenylisothiocyanate (PICT)에 부착시켜 phenylthiocarbamyl (PTC) 펩타이드로 만들고 과잉시약과 반응 유도체물을 제거한 후, 산성 조건 하에서 절단하여 anilinothiozoline (ATZ) 유도체로 변환시키고, 더 안정한 유도체인 phenylthiohydantoin (PTH) 아미노산으로 변형시켜 동정하였다. 남은 펩타이드의 N-말단에 대해서도 위의 과정을 반복하여 서열을 결정하였다.</p>