ITS Ⅰ 영역의 PCR 산물은 전기영동하여 나타나는 DNA band를 확인한 후, QIA-quick PCR purification kit를 사용하여 정제하였으며, PCR 실험 시 RAPD를 위해 사용한 primer는 버섯과 식물들에 대한 유전적 유연관계 및 다양성 분석에 사용되는 상업용 kti primer를 사용했다. 그리고 RAPD thermal cycle의 program은 Park 등의 방법으로, 증폭반응은 MJ Reserch PTC 150 mini-cycler을 사용하여 수행됐다.
<p>ITSP 1과 2와 PCR 반응 조건은 template DNA 변형을 위해 \( 94 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초간 denature, \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30 초 annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 extension을 1분씩 처리하여 DNA를 증폭시키는 것을 1 cycle로 하여 40 cycle로 수행하였다. ITSP3과 ITSP4 primer를 이용한 PCR 반응은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초간 변성시키고, \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초간 annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분간 extension 것을 1 cycle로 하여 40 cycle로 수행하였다.</p> <h2>PCR product의 정제 및 ITS 염기서열 분석</h2> <p>ITS Ⅰ 영역의 PCR 산물은 전기영동하여 나타나는 DNA band를 확인한 후, QIA-quick PCR purification kit (Qiagen Inc., USA)를 이용하여 정제하였다.</p> <p>정제된 PCR산물을 이용하여 Perkin-Elmer applied bio-systems ABI 377A (Perkin-Elmer Co.,USA)를 이용하여 PRISM Dye Dideoxi Terminator Cycle Sequencing로 분석하였다. 얻어진 염기서열을 Gene Bank 데이터베이스에 등록된 것들과 상동성을 비교하였다.</p> <p>염기서열은 Sequencher (Gene codes Co., USA), Clustal X를 이용하여 alignment 시킨 후, 최종 세부 정열은 수작업으로 보정하였다.</p> <h2>RAPD primer와 PCR</h2> <p>본 연구의 PCR 실험 시 RAPD를 위해 사용한 primer는 식물과 버섯들에 대한 유전적 다양성 및 유연관계 분석에 활용되는 상업용 kti primer (OPA 01~20, OPB 01~20) (Operon Technologies, USA)를 사용하였다. code name과 sequence \( \left (5 ^ {\prime } \right . \) to \( 3 ^ {\prime } \) )는 Table 2에 나타내었으며, G + C의 함량은 \( 60-70 \% \)이었다.</p> <p>PCR을 위한 reaction mixture의 조성은 Bioneer PCR kit를 사용하였다. PreMix kit에 genomic DNA \( 1.0 \mu \mathrm { l } \), primer \( 1.0 \mu \mathrm { l } \)를 넣고, 전체 반응 용액이 \( 20 \mu \mathrm { l } \)가 되도록 3차 증류수를 첨가하였다.</p> <p>본 실험의 RAPD 증폭반응은 MJ Reserch PTC 150 mini-cycler에서 thermal cycle의 program은 Park 등의 방법에 따라 수행하였다. Template DNA 변형을 위해 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 3분간 predenaturation한 다음, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 30초간 denaturation, \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분간 annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 elongation 을 5분씩 처리하여 DNA를 증폭시키는 것을 1 Cycle로 하였으며, 이 실험에서는 45 cycle로 수행하였다. DNA 증폭이 끝난 후 최종적인 합성을 위해 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5 분간 안정화한 다음, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 보관 사용하였다. 이때 각각의 primer에 대한 상기의 PCR 과정을 통한 screening을 실시하여, 선택된 primer 별로 3회 이상의 반복실험을 수행하여 재현성이 뚜렸한 것만을 유용한 primer로 결정하였다.</p>