RA2 배지를 희석하고 DNB 평판배지 위에 형성된 집락체로부터 토양세균을 순수분리하여, NB 배지에 접종하여 28\(^\circ \mathrm{C}\) 1주일간 배양한 후 증식 능력을 판정하여 저영양 세균을 순수분리하고 20% 글리세롤이 첨가된 배지에 넣어 -80\(^\circ \mathrm{C}\)에서 장기 보존하였다. R2A 저영양 배지에 2일 동안 배양한 다음, Nitrate 질소 배지에 희석하였다. 이 과정에서 탈질소 기능을 가진 세균을 선별할 수 있었다.
<h2>저영양 세균의 분리</h2> <p>RA2 배지를 \( 10 ^ { -1 } \)배 희석한 배지 또는 \( 10 ^ { -4 } \)배 희석된 DNB 평판배지 위에 형성된 집락체로부터 토양세균을 각각 순수분리 하여, 동일 농도의 DNB \( 10 \mathrm { ~mL } \) 액체배지에 분리 균주를 전 배양한 후 통상농도의 \( 10 ^ { -1 } \)NB, \( 10 ^ { -2 } \)NB, \( 10 ^ { -3 } \)NB 및 \( 10 ^ { -4 } \)NB 배지에 접종하여 \( 28 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 1주일간 배양 후 증식 능력을 판정하였다. 통상농도의 NB 배지에서 증식하지 못하는 세균 중 \( 10 ^ { -1 } \sim 10 ^ { -4 } \)배로 희석한 배지에서 증식하는 세균을 저영양 세균으로 순수분리 하였다. 순수 분리된 저영양세균은 \( 20 \% \) 글리세롤이 첨가된 배지에 넣어 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 장기 보존하였다.</p> <h2>탈질소 세균의 선발</h2> <p>탈질소 세균은 nitrate 질소 배지에서 질소 기포를 형성하며 동시에 nitrate reductase 활성이 양성일 경우를 최종 탈질 균으로 판정하였다. 분리된 저영양 세균을 R2A 저영양 배지에서 이틀 동안 \( 28 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 동안 충분히 배양한 뒤, 일정량을 Nitrate 질소 배지(Peptone \( 5 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \), Meat extract \( 3 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } , \mathrm { KNO } _ { 3 } \) \( 1 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } , \mathrm { pH } \) 7.0)에 희석하여 nitrate를 제거하면서 동시에 질소가스가 발생하는 과정을 관찰하여 탈질소 기능을 가진 세균을 선별하였다. 먼저 nitrate 질소 배지를 멸균 처리 후 저영양 세균을 접종하기 위하여 접종 전에 \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 끓는 물에서 5분간 처리하여 용존 산소를 제거한 뒤, nitrate 배양액의 \(1 \% \) (v/v)되는 seed culture를 접종하였다. 산소와의 접촉을 피하기 위하여 배지의 표면에 멀균한 mineral oil \((1 mL) \)을 도포하고, 발생한 질소 가스를 포획하기 위해 미리 멸균한 Durham tube를 배지에 뒤집어 seed culture와 같이 정치 배양 하였다. 이 상태에서 \( 28 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 27일간 질소 기포 발생을 관찰하였다. 저영양 세균이 충분히 성장한 뒤 배지에 잔류하는 산소가 소모된 뒤, 세균이 anaerobic 호흡을 수행하여 질소 가스가 기포로 보이는 균을 탈질소 기능을 가진 균으로 1차 판정하였다.</p>