\( 20 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \)의 전처리 폐글리세롤이 첨가된 M9배지로 \( \mathrm { NaCl } \), 발리다마이신, IPTG의 최적 농도를 정하기 위해 Box-Behnken design 실험계획법을 사용했다. 세포현탁액을 세포파세기로 세포를 파쇄한 후 가열블럭으로 세포 내 트레할로스 분해 효소를 불활성화 시키고, 트레할로스 에세이 킷으로 상등액의 트레할로스 농도를 측정했다.
<p>\( -70 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 보관된 생산균주의 glycerol stock \( 400 \mu \mathrm { l } \) 를 LB배지에 접종하였다. 세포밀도를 나타내는 \( \mathrm { OD } _ { 600 } \) 가 \( 0.6-0.8 \) 에 도달하였을 때, 접종균 \( 2.5 \mathrm { ml } \) 를 본 배양용 배지에 접종하였다. 일반적으로 대장균은 \( 20 \mathrm { ~g /l}\) 글리세롤에서 세포생장이 저해받지 않으므로 본 배양 배지의 전처리 폐글리세롤 농도를 \( 20 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \) 로 고정하였다. 초기실험에서 본 배양을 위하여 M9 배지에 \( 20 \mathrm { ~g } / l \) 의 전처리 폐글리세롤, \( 300 \mathrm { mM } \) 의 \( \mathrm { NaCl } \) 및 \( 0.1 \mathrm { mM } \) 의 발리다마이신을 첨가하였고 otsBA 발현을 유도하기 위하여 \( \mathrm { OD } _ { 600 } \) 가 \( 0.6-0.8 \) 에 도달하였을 때 IPTG(최종 농도 \( 0.1 \mathrm { mM } ) \) 를 첨가하였다. 그러나 최종적으로 \( 20 \mathrm { ~g } / \) 의 전처리 폐글리세롤이 첨가된 M9 배지를 기준배지로 하여 \( \mathrm { NaCl } \), 발리다마이신 및 IPTG의 최적 농도 결정을 위한 실험을 수행하였다.</p> <h2>배양 조건 최적화</h2> <p>배지에 첨가되는 \( \mathrm { NaCl } \), 발리다마이신 및 IPTG의 최적농도를 결정하기 위하여 Box-Behnken design(BBD) 실험계획법을 사용하였다. 실험이 종료된 후 버전 9.1 SAS 프로그램(SAS Institute, USA)을 이용하여 실험데이터의 회귀분석을 수행하여 통계적으로 의미있는 계수 값들을 선별하였고 이를 이용하여 이차다항식 모델을 수립하였다. 엑셀 프로그램을 이용하여 모델 방정식의 해를 구하고 Sigma plot 프로그램을 이용한 반응표면분석을 수행하여 세 성분들의 최적 농도를 구하였다.</p> <h2>분석방법</h2> <p>세포 내에 축적된 트레할로스의 정량분석을 실시하였다. \( 1 \mathrm { ml } \) 배양액을 채취하여 \( 9,800 \times g \) 로 10분간 원심분리한 후 세포 펠릿(cell pellet)과 상등액(supernatant)을 분리하였다. 상등액 중의 잔류 글리세롤 농도를 측정하기 위하여 글리세롤 에세이 킷(K-GCROL, Megazyme, Ireland)을 사용하였다. 세포 펠릿을 \( 1 \mathrm { ml } \) 탈이온 증류수에 현탁시켰다. 현탁액을 포함하는 튜브를 얼음통에 넣고 세포파쇄기(ultrasonic homogenizer, Sonics & Materials, USA)의 팁을 세포현탁액에 담근 후 sonication(10초 파괴, 30초 쉬기를 두 번 반복)에 의해 세포를 파쇄하였다. 가열블럭(heating block)을 이용하여 세포 파쇄액(lysate)을 \( 90 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10분간 가열처리함으로써 세포 내에 존재하는 트레할로스 분해 효소들을 불활성화시켰다. 세포 파쇄액을 \( 9,800 \times \mathrm { g } \) 로 10분간 원심하여 세포 잔사물(cell debris)을 분리한 후, 상등액만을 채취하였다. 상등액 중의 트레할로스 농도를 측정하기 위하여 트레할로스 에세이 킷(K-TREH, Megazyme, Ireland)를 이용하였다.</p>