약 215g의 물질이 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } : \mathrm { MeOH } (9: 1, \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 혼합용매에 녹아 분액 깔대기에 부어진 뒤, 동량의 \( \mathrm { CH } _ { 2 } \mathrm { Cl } _ { 2 } \)가 첨가되어 24시간 평형화되었다. 한국산 호두는 부산시 건재약방에서 구입하였으며, 다양한 화합물들은 Sigma Chemical Company와 Molecular Probes, Cayman Chemical Company에서 구입하였다. 호두의 핵심 부분은 메탄올로 추출되어 용매별 분획 과정을 Fig. 1에 표시하였다. 그 후, 추출액은 Whatman NO. 2로 여과하였고, rotary vacuum evaporator를 이용해 농축하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>한국산 호두(Juglans sinensis Dode)는 부산시 좌천동 소재 건재약방에서 구입하였다(2002.01.구입).</p> <h2>시약</h2> <p>DPPH, L-ascorbic acid, DL-penicillamine (DL-2-amino-3-mercapto-3-methylbutanoic acid), TBA (Thiobarbarbituric acid), t-BHP (tert-butylhydroperoxide)는 Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DXFH-DA)와 DHR 123(dihydrorhodamine 123) 은 Molecular Probes (Eugene, OR, USA)로부터 구입하였으며, \( \mathrm { ONOO } ^ { - } \)는 Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, USA)으로부터 구입하여 항산화활성 실험을 시행하였다. LDH는 LDH-Lq kit (아산제약, 국내)로 측정하였다.</p> <h2>추출 및 분획</h2> <p>호두 열매의 과피를 벗긴 핵과를 깨뜨려 얻은 씨(Juglan-dis Semen)를 \( \mathrm { MeOH } \) 로 추출하고 각 용매별 분획과정은 Fig.1 에 나타내었다. 건조한 생호두(약 \( 1122 \mathrm { ~g } ) \) 를 마쇄하여 환류냉각기를 부착한 삼각 플라스크( \(5 \mathrm { ~l } \)) 에 담은 후 \(3 \mathrm { ~l } \) 의 \( \mathrm { MeOH } \)을 넣은 후 수욕상에서 3 시간 추출하였다. 그리고 추출액은 Whatman NO. 2로 여과하였으며 rotary vacuum evaporator를 사용하여 농축하였다. 위와 같은 방법으로 다시 2회 더 반복하여 총 \( 106 \mathrm { g } \mathrm { ~MeOH } \) 농축액을 얻었다. 그 중 \( \mathrm { MeOH } \) 추출 농축액 약 \( 5 \mathrm { ~g } \) 은 활성 실험을 위해 vial에 담아 desiccator에 보관하였다.</p> <p>나머지 약 \( 215 \mathrm { ~g } \) 은 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } : \mathrm { MeOH } (9: 1, \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 의 혼합용매로 녹인 다음 분액 깔대기에 부어, 동량의 \( \mathrm { CH } _ { 2 } \mathrm { Cl } _ { 2 } \) 를 넣어 세게 흔든 다음 24시간동안 평형화시켰다. 이후 아래층의 \( \mathrm { CH } _ { 2 } \mathrm { Cl } _ { 2 } \)가용부를 모아 무수 망초(sodium sulate, anhydrous)로 처리한 다음 농축하였다. 이와 같은 방법으로 4 회 더 반복하여 \( \mathrm { CH } _ { 2 } \mathrm { Cl } _ { 2 } \) 획분 \( 22.89 \mathrm { ~g } \) 을 얻었다. 동일한 방법으로 \( \mathrm { EtOAc } \) 를 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 분획층에 가하여 상층의 \( \mathrm { EtOAc } \) 가용부를 모아 \( \mathrm { EtOAc } \) 획분 \( 15.39 \mathrm { ~g } \) 을 얻었다. 또한 n-BuOH에 대해서도 동일한 방법으로 시행하여 상층의 n- \( \mathrm { BuOH } \) 획분 \( 29.38 \mathrm { ~g } \) 과 하층의 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 획분 \( 32.3 \mathrm { ~g } \) 을 얻었다. 모든 획분 약 \( 0.1 \mathrm { ~g } \) 은 활성 실험을 위해 vial에 담아 desiccator에 보관하였다.</p>