본 실험은 목초액을 통한 항균 활성을 보기 위함으로 정제된 참나무 목초액을 사용하였다. 균주는 Escherichia coli 등 식중독 원인 균주를 주로 사용하고 disc diffusion 법으로 측정 항균활성을 측정하였다. 더불어 추출물의 DPPH에 대한 수소 공여 효과로 전자공여능 측정, 과산화수소 \(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\) 로 전환시키는 반응을 촉매하는 pyrogallol의 생성량을 보는 SOD 유사활성 측정, 비색법을 통한 \(\mathrm{NO}\) 양 측정, MTT assay를 통한 세포 활성 측정 역시 같이 진행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험재료</h2><p>본 실험에 사용한 목초액은 경상남도 김해시 소재 숯가마에 참나무를 넣고 탄화시킬 때 발생하는 연기와 수증기를 냉각, 응축시킨 것을 정제하여 만든 참나무 목초액을 사용하였으며 실험에 사용된 시약들은 Sigma사, Aldrich사, Merck사 등 모두 특급 이상을 사용하였다.</p><h2>균주 및 배양조건</h2><p>본 실험에 사용된 균주는 식중독 원인균주인 Escherichia coli, Proteus vulgaris, Staphylococcus. aureus 는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), Pseudo-monas. oleovoranse 는 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \) LB 배지에서 배양하였으며 치주 질환 병인균주인 Prevotella intermedia ATCC 25611 는 \( 1 \mu \mathrm{g} / \) \( \mathrm{ml} \) menadione과 \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) hemin을 포함하고 있는 enriched tryptic soy agar를 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 혐기성 조건 \( \left(5 \% \mathrm{H}_{2}, 5 \%\right. \) \( \mathrm{CO}_{2}, 90 \% \mathrm{~N}_{2} \) )에서 배양하였다.</p><h2>항균활성</h2><p>항균활성은 paper disc \( (\phi 8 \mathrm{~mm}) \) 를 이용하여 disc dif-fusion 법으로 측정하였다. 식중독 균주는 LB agar 배지에 24시간 배양한 균 \( 100 \mu l \) 를 도말한 후 목초액을 각 농도별로 흡수시킨 paper disc를 평판배지위에 놓고 균주의 배양조건에 따라 배양하여 disc 주위의 clear zone 직경으로 활성을 측정하였다.</p><h2>전자공여능(Electron donation ability : EDA) 측정</h2><p>전자공여능 측정은 Blois의 방법에 따라서 각 추출물의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)에 대한 수소공여 효과로 측정 하였다. 추출시료를 DMSO에 늑여 농도별로 희석하여 시로 \( 40 \mu l \) 와 \( 0.15 \mathrm{mM} \) DPPH 용액 160 jl를 섞은 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분 동안 반응시킨 다음 ELISA reader률 이용하여 \( 520 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능(Electron do-nating ability, EDA)은 EDA \(\%\)= \) (대조구흡광도-시료첨가 구흡광도)/대조구흡광도 \( \times 100 \) 으로 계산하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조그룹과 흡광도차를 비교하여 프리라디칼의 제거활성을 백분율로 나타내었다.</p><h2>SOD 유사활성(Superoxide dismutase -like activity : SODA) 측정</h2><p>추출물의 SOD 유사활성은 Marklund 와 Marklund의 방법에 따라 과산화수소 \( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \) 로 전환시키는 반응을 촉매하는 pyrogallol의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성으로 나타내었다. 각 추출시료를 DMSO에 녹여 농도별로 희석하여, 시료 \( 10 \mu \mathrm{l}\) 에 \( \mathrm{pH} \) \(8.5\)로 보정한 Tris-\(\mathrm[HCl}\) buffer \( (50 \mathrm{mM} \) tris [hydroxymethyl] aminomethane, \( 10 \mathrm{mM} \) EDTA, \(\mathrm{pH}\ 8.5\)) \( 150 \mu \) 와 \( 7.2 \mathrm{mM} \) pyrogallol \( 10 \mu l \) 를 첨가하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분 간 반응 후 \( 1 \mathrm{N}\) \( \mathrm{HCl} \ 50 \mu l \) 를 가하여 반응을 정지 시켰다. 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양은 ELISA reader를 사용하여 \( 420 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. SOD 유사활성은 추출물 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율\( \%\)로 나타내었다.</p><p>\( \operatorname{SODA}(\%)=\left(1-\frac{A}{B}\right) \times 100 \)</p><p>\( \mathrm{A} \) : 추출물 첨가구의 흡광도, \( \mathrm{B} \) : 추출물 무첨가구의 흡광도</p><h2>NO Assay 및 cell viability 측정</h2><p>NO의 생성은 비색법으로 세포 상등액에 축적되는 nitrite 양을 측정하였다. 대식세포를 세포 배양판에 \( 5 \times 10^{5} \) \( \mathrm{cells} \)/\( \mathrm{ml} \) 의 세포가 되도록 재부유하여 LPS의 자극하에 24시간 배양하고 그 배양 상층액 내의 NO를 Griess 시약과 반응시켜 측정하였다. \( 100 \mu \) l의 세포배양 상층액을 취하여 동량의 Griess 시약 \( [1 \% \) sulfanilamide ( \( 30 \% \) acetic acid)와 \(0.1\%\) N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride\( 60\%\) ace-tic acid) 혼합액] 을 가하여 상온에서 20분간 반응시켰다. NO의 활성 정도는 ELISA 판독기를 사용하여 \( 800 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도 범위에서 \( 540 \mathrm{~nm} \) 흡광도를 측정하였다.</p><p>세포활성은 MTT assay에 의하여 측정하였다. 96-well microtiter plate (Nunc, Vangaard, Neptune, NJ)에 RAW 264.7 macrophage를 \( 1 \times 10^{5} \) \(\mathrm{cells/well}\)의 농도로 분주하였다. 분주 24시간 후 각 추출물이 함유되어 있는 배지를 \( 100 \mu l \) 씩 넣어 48시간 동안 배양하였다. Plate에 MTT \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyl -tetrazolium bro-mide (MTT, Sigma) 용액을 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 씩 첨가하여 4시간 동안 배양시키고 formazan을 형성시킨 후 조심스럽게 상등액을 제거하였다. DMSO \( 150 \mu l \) 를 첨가하여 formazan을 녹인 후 \( 570 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다, 추출물의 농도는 희석하여 \( \left(5 \times 10^{-5} \sim 10^{-2} \mu \mathrm{l} /\right. \) well \( ) \) 사용 하였다.</p>