본 연구에서 HT22 세포의 폴리페놀함량 측정에는 변경된 Folin-denis 방법이 이용되었으며, ABTS free radical 소거능 측정은 ABTS cation decolourisation assay 방법으로 측정되었고, DPPH free radical 소거능 측정은 DPPH에 대한 환원력 통해 측정되었다. 다음으로 항균활성 측정 agar diffusion법으로, \( \mathrm{pH} \)는 \( \mathrm{pH} \) meter를 통해 측정되었다.
<h3>핵과 세포질 분획의 분리</h3><p>HT22 세포의 균질화는 protease inhibitor cocktail Ⅰ과 \(1\mathrm{mM} \) PMSF를 첨가한 PER-mammalian protein extraction buf-fer를 첨가하여 수행하였으며, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 15,000 \times g \)로 10분간 원심분리 하여 상등액을 회수하였다. 상등액은 세포질 분획으로 사용하기 위하여 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였으며, 나머지 침전물은 PBS로 세척하여 RIPA buffer를 첨가하고 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 혼합한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(16,000 \times g \)에서 15분간 원심분리 하였다. 이후의 과정은 앞에서 설명한 western blotting 방법으로 수행하였다.</p><h3>폴리페놀함량 측정 방법</h3><p>폴리페놀 함량은 Folin-denis 방법을 변경하여 96 well에 적용하여 측정하였다. 발효 한약재와 ethyl acetate 추출물은 증류수로 희석하여 각각 \( 60 \mu \mathrm{l} \)를 2배 희석한 folin reagent \( 60 \mu \mathrm{l} \)에 첨가시켜 3분간 반응시키고, \( 10 \% \) \(\mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \)를 \( 60 \mu \mathrm{l} \)첨가하여 30분간 실온에서 반응시켰다. 반응 용액은 microplate reader를 사용하여 \( 700 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 폴리페놀 함량은 tannic acid를 지표물질로 이용하여 작성한 표준곡선으로 산출하였다.</p><h3>ABTS free radical 소거능 측정 방법</h3><p>ABTS free radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS cation decolourisation assay 방법으로 측정하였다. ABTS radical은 \( 7 \mathrm{mM} \) ABTS 용액과 \( 2.45 \mathrm{mM} \) potassium persulfate 용액을 \( 1: 1 \)로 혼합하여 실온의 암소에서 24시간 반응시킨 후 생성시켰으며, \( 732 \mathrm{nm} \)에서 흡광도 값이 \( 0.7 \pm 0.02 \)가 되도록 PBS로 희석하여 사용하였다. 희석된 \( 20 \mu \mathrm{l} \)의 시료는 ABTS free radical 용액 \( 180 \mu \mathrm{l} \)에 혼합하여 1분간 반응시킨 후 \( 732 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 추출물의 free radical 소거활성은 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 \( 1 / 2 \)로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 \( \mathrm{RC}_{50} \) 값으로 나타내었으며, 대조군으로 Trolox를 사용하였다.</p><h3>DPPH free radical 소거능 측정 방법</h3><p>시료의 free radical 소거능은 안정한 radical인 DPPH에 대한 환원력을 측정 후 확인하였다. Methanol에 용해시켜 농도 별로 희석한 시료 \( 20 \mu \mathrm{l} \)는 methanol에 용해시킨 \( 0.15 \mathrm{mM} \) DPPH 용액 \( 80 \mu \mathrm{l} \)와 혼합하고 실온의 암소에서 30분간 반응시 킨 후 \( 517 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 추출물의 free radical 소거활성은 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 \( 1 / 2 \)로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 \( \mathrm{RC}_{50} \) 값으로 나타내었으며, 대조군으로 BHA를 사용하였다.</p><h3>항균활성 측정 방법</h3><p>항균활성은 agar diffusion법으로 측정하였다. 시험 균주는 Table 2에서 보는 바와 같은 세균과 식물병원균을 사용하였다. 세균은 LB 배지(peptone \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), yeast extract \( 5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), sodium chloride \( 5 \mathrm{~g} / \mathrm{l}, \mathrm{pH} \) 6.8), MB 배지(peptone \( 5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), yeast extract \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), ferric citrate \( 0.1 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), sodium chloride \( 19.45 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), magnesuim chloride \( 8.8 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), sodium sulfate \( 3.24 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), calcium chloride \( 1.8 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), potassium chloride \( 0.55 \mathrm{~g} / 1 \), sodium bicarbonate \( 0.16 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), potassium bromide \( 0.08 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), agar \( 15 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), strontium chloride \( 34 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \), boric acid \( 22 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \), sodium silicate \( 4 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \), sodium fluoride \( 2.4 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \), ammonium nitrate \( 1.6 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \), disodium phosphate \( 8 \mathrm{mg} / \mathrm{l}, \mathrm{pH} \) 7.6)와 Nutrient 배지(beef extract \( 3 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), peptone \( 5 \mathrm{~g} / \mathrm{l}, \mathrm{pH} \) 6.8, Difco Co.)에 계대배양 하였으며, 식물병원균은 PDA 배지(potato starch \( 4 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), dextrose \(20\mathrm{~g} / \mathrm{l} \), agar \( 15 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), \(\mathrm{pH} 5.1\), Difco Co.)에 계대배양한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하면서 사용하였다. 항균활성은 시료 \( 20 \mu \mathrm{l} \)를 paper disc \( (\varnothing=6 \mathrm{~mm} \) Whatman Co.)에 첨가하여 건조시킨 후 검정 균주가 함유된 평판배지 위에 얹고 세균은 1일간 배양, 식물병원균은 7일간 배양한 후 생성된 inhibitory zone의 유무 및 크기를 통해 판단하였다.</p><h3>\( \mathrm{pH} \) 측정 방법</h3><p>한약재 추출액과 ethyl acetate 추출물 그리고 ethyl acetate로 추출하고 남은 물층의 \( \mathrm{pH} \) 측정은 각 시료들의 항균활성에 \( \mathrm{pH} \)가 영향을 미치는지 확인하기 위해 수행하였다. \( \mathrm{pH} \) 측정은 \( \mathrm{pH} \) meter를 이용하였다.</p>