뇌세포 내 아세틸콜린에스테라아제(AChE) 활성은 Galgani 등과 Hallak, Giacobini의 방법에 따라 측정하였다. 측정 과정에서 \( 0.1 \mathrm{M} \) acetylthiocholine chloride \( 10 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하고, Microplate reader(ELISA reader)를 활용하여 \( 405 \mathrm{nm} \)에서 5분 동안 흡광도 변화를 관찰하였다. 이를 통해 AChE의 활성(\(\mathrm{unit}/ \mathrm{min}/\mathrm{mg}\) protein)을 측정하였다. 또한, 시험관을 항온수조에서 꺼낸 후 \( 1.8 \mathrm{mM} \) 2,2'-azino-bis (3-ethyl benzthiazoline-6-sulfonic acid) \( 500 \mu \mathrm{l} \)와 5 units horse-radish peroxidase \( 50 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하고 5초간 잘 혼합하였다. 아세틸콜린(ACh)의 측정은 Galgani 등의 방법을 따라, alkaline hydroxyl-amine이 포함된 0-acyl 유도물의 반응을 기반으로 진행하였다. 모든 실험 결과는 통계적으로 처리하여 평균치와 표준편차를 계산하였고, 실험군 간 유의성 검정은 Student's t-test를 활용하였다.
<h2>아세틸콜린의 함량 측정</h2><p>아세틸콜린(acetylcholine: ACh)의 측정은 Galgani 등의 방법에 따라 alkaline hydroxyl-amine을 가진 0-acyl 유도물의 반응을 기초로 측정하였다. 모든 hydroxamic acid는 산용액에서 ferric ion과 결합하여 자주색을 나타낸다. 뇌획분 \( 50 \mu \mathrm{l} \)를 취하여 \( 1 \% \) hydroxylamine \( 50 \mu \mathrm{l} \)를 첨가, 혼합하여 \( \mathrm{HCl} \)을 이용하여 \( \mathrm{pH} \)를 \( 1.2 \pm 0.2 \) 조절하였다. \( \mathrm{FeCl}_{3}(10 \% \) in \( 0.1 \mathrm{N}\) \(\mathrm{HCl}) \)을 \( 500 \mu \mathrm{l} \)를 첨가 후 혼합하여 분광광도계를 이용하여 파장 \( 530 \mathrm{nm} \)에서 acetylcholine (\(\mathrm{ng}/ \mathrm{mg}\) protein)의 활성을 측정하였다.</p><h2>아세틸콜린 (ACh) 관련효소의 활성 측정</h2><ul><li>콜린아세틸트란스퍼라아제(ChAT)의 활성</li></ul><p>Ellman 등의 방법에 의한 DTB(5,5'-dithiobis-2-nitro-benzoate)에 의한 기질로서 acetyl-CoA을 이용하여 반응을 생성하여 이 기질시약의 흡수가 감소하는 것을 이용한 방법으로 뇌세포의 획분의 콜린아세틸트란스퍼라아제(cholineacetyltransferase: ChAT)의 측정은 \( 0.2 \mathrm{mM} \) acetyl-CoA, \(10 \mathrm{mM} \) choline chloride, \( 0.2 \mathrm{M}\) \(\mathrm{KCl}\), \(10 \mathrm{mM} \) potassium phosphate with \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA를 각각 \( 0.2 \mathrm{ml} \)씩 첨가◦혼합 하여 총 \( 0.8 \mathrm{ml} \)의 부피로 만든 다음 choline acetyltrans-ferase을 \( 1 \mu \mathrm{l} \), cytosol \( 100 \mu \mathrm{l} \), \(1.0 \mathrm{M} \) Tris buffer \( 190 \mu \mathrm{l} \), DTB를 \( 5 \mu \mathrm{l} \), \(20 \% \) TCA (trichloroacetic acid) \( 250\mu \mathrm{l} \)의 양으로 각각 첨가◦혼합하여 분광광도계를 이용해 파장 412\(\mathrm{nm}\)에서 2분 간격으로 ChAT의 활성을 측정하였다.</p><ul><li>아세틸콜린에스테라아제 (AChE)의 활성 측정</li></ul><p>뇌세포에서 아세틸콜린에스테라아제(acelylcholinesterase: AChE) 활성 측정은 Galgani 등와 Hallak와 Gi-acobini의 방법을 조합하여 측정하였다. 각 microplate well에 \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris buffer, \( \mathrm{pH}8.0 \) (Trizma \( \mathrm{HCl}+ \) Trizma base)을 \( 300\mu \mathrm{l} \), \(0.01 \mathrm{M} \) dithionitrobenzoic acid(DTNB) \( 20 \mu \mathrm{l} \), enzyme suspension(상충액) \( 10 \mu \mathrm{l} \)을 연속적으로 첨가한다. 그리고 흡광도 측정직전에 기질시약인 \( 0.1 \mathrm{M} \) ace-tylthiocholine chloride \( 10 \mu \mathrm{l} \)을 첨가한다. Microplate reader(ELISA reader)를 이용하여 \( 405 \mathrm{nm} \)에서 흡광도 변화를 5분동안 관찰하여 AChE의 활성(\(\mathrm{unit}/ \mathrm{min}/\mathrm{mg}\) protein)을 측정하였다.</p><h2>모노아민옥시다아제 (MAO)의 활성 측정</h2><p>모노아민옥시다아제 (monoamineoxidase: MAO-B)의 활성 측정은 Kalaria 등의 방법에 따라 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)의 생성능을 기초로 측정하였다. 각 시험관에 \( 100 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{Na-Pi}\) buffer(\(\mathrm{pH} 7.4\))용액 \( 460 \mu \mathrm{l}\), \(30 \mathrm{mM} \) sodium azide용액 \( 70 \mu \mathrm{l} \), brain homogenates (mitochondria) \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 넣은 후 기질시약인 \( 10 \mathrm{mM} \) benzylamine을 \( 70 \mu \mathrm{l} \)을 넣으면서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 항온수조에서 30분간 가온시킨다.</p><p>그리고 항온수조에서 시험관을 꺼내면서 \( 1.8 \mathrm{mM} \) 2,2'-azino-bis (3-ethyl benzthiazoline-6-sulfonic acid) \( 500 \mu \mathrm{l} \)을 넣는다. 5초 후 저온상태로 보관되어 있는 5 units horse-radish peroxidase \( 50 \mu \mathrm{l} \)을 넣는 동시에 5초간 잘 혼합시킨다. 10초가 지난 후 \( 0.75 \mathrm{M} \) hydrochloric acid containing \( 5 \%\) \( \mathrm{NaDodSO}_{4} \) (sodium dodecyl sulfate) \( 250 \mu \mathrm{l} \)을 각 시험관에 넣으면서 다시 5초간 잘 혼합시킨다. 기질시약인 \( 10 \mathrm{mM} \) benzylamine을 넣지 않은 blank를 대조로 하여 분광광도계를 이용하여 \( 414 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하여 MAO-B 활성을 측정하였다.</p><h2>분석결과의 통계처리</h2><p>본 연구의 모든 실험결과는 통계 처리하여 평균치와 표준편차를 계산하였으며, 각 실험군간의 유의성 검정은 Stu-dent's t-test로 실시하였다.</p>