참깨 (Sesame indicum L. cv. Danbaek) 종자를 작물 시험장에서 공급받아서 파종하여 실험재료를 확보하였다. 참깨 종자 2 \mathrm{~g}2 g 을 액체 질소로 마쇄한 후 5 배 (10 \mathrm{ml})(10ml) 의 핵산 추출액을 가하여 추출하였다. primer단편을 이용하여 CDNA library부터 plaque hybridization방법을 통해 참깨의 MIPS cDNA를 분리하였다. 선택된 cDNA의 염기서열을 분석하기 위해 자동 염기서열기인 ALFexpress (Pharmacia)를 이용하였다. 완숙종자, 잎, 줄기 뿌리로부터 각각 분리된 20 \mu \mathrm{g}20\(\mu\mathrm{g}\) 의 RNA을 15 \%15% formadehyde가 포함된 0.8 \%0.8% 아가로스젤에서 전기영동한 후에 nylon membrane에 흡착시켜 사용하였다. SH306 균주는 YPD 배지에서 배양 후 사용하였으며, 형질전환체는 vector의 selection marker (URA3)를 통해 선별하였으며, inositol 합성 여부는 inositol assay medium system (Difco)배양에 의해서 확인되었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물 재료</h2> <p>참깨 (Sesame indicum L. cv. Danbaek) 종자를 작물 시험장에서 공급받아서 파종하여 실험재료를 확보하였다. 종자발육단계별로 종자를 수확하기 위하여 참깨 개화 후 12일째부터 3일 간격으로 종자를 채취하였으며, 잎과 줄기 및 뿌리 등의 다른 조직은 한창 생장하는 참깨로부터 수확하였다. 수확된 종자와 식물 조직은 즉시 액체질소에 급냉 시킨 후 초저온 냉동고에 보관하여 사용하였다.</p> <h2>참깨 MIPS cDNA의 분리</h2> <p>참깨 종자 \( 2 \mathrm{~g} \) 을 액체 질소로 마쇄한 후 5 배 \( (10 \mathrm{ml}) \) 의 핵산 추출액을 가하여 추출하였다. Total RNA와 DNA의 분리는 정 등에 의해서 개발된 참깨의 핵산 추출 방법으로 분리되었다. Oligo-dT cellulose를 이용하여 분리된 mRNA \( 5 \mu \mathrm{g} \) 을 사용하여 Stratagene사의 cDNA synthesis kit로 cDNA library를 구축하였다. 이 library를 사용하여 MIPS cDNA를 찾기 위해, 분리된 mRNA로 부터 RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) 방법으로 약 \( 600 \mathrm{bp} \) 의 MIPS cDNA 단편을 얻었다. Degenerate primer의 sense prime로는; 5'-TGGAC(T/G)GC (A/T)AA(C/T)AC(T/A)GA(A/G)(A/C)G(G/T/A)TA(C/T)-3'를 사용하였고, antisense primer로는; 5'-(G/A)GC(A/C/T)A(G/A) (G/T/A)A(G/A)(T/A)GA(G/A)TC(C/T)TC(A/G)TC(A/G)CA-3'를 사용하였다. 이 primer단편을 이용하여 CDNA library부터 plaque hybridization방법을 통해 참깨의 MIPS cDNA를 분리하였다.</p> <h2>DNA 염기 서열 결정과 서열정보 분석</h2> <p>선택된 cDNA의 염기서열을 분석하기 위해 자동 염기서열기인 ALFexpress (Pharmacia)를 이용하였다. 염기서열은 ClustalW 프로그램 제공 웹사이트(http://www.clustalw.genome.ad.jp)를 이용하여 다른 종에서 분리된 MIPS 단백질 서열과의 유사성을 비교 - 분석하였다. 사용한 단백질은 GenBank에 등록된 자료를 이용하였으며, 자료로 이용된 종들은 다음과 같다. sesame (AF284065), tobacco (AB009881), rice (AB012107), maize (AF056326), human (AF220530). 그 외 단백질의 구조와 특성 분석 등 bioinformatics data는 http://www.cbs.dtu.dk와 http://pedant.gsf.de 및 http:// blocks.fhcrc.org 등의 웹사이트를 통해 분석하였다.</p> <h2>Northern analysis</h2> <p>완숙종자, 잎, 줄기 뿌리로부터 각각 분리된 \( 20 \mu \mathrm{g} \) 의 RNA을 \( 15 \% \) formadehyde가 포함된 \( 0.8 \% \) 아가로스젤에서 전기영동한 후에 nylon membrane에 흡착시켜 사용하였다. 사용한 probe는 분리된 SeMIPS cDNA 전체를 이용하였고, hybridiztion buffer의 조성은 \( 2 \times \) PIPES, \( 50 \% \) formamide, \( 1 \% \) SDS, \( 2 \% \) blocking reagent (Roche Diagnostics GmbH) 로 조성된 버퍼를 사용하였다. hybridization은 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서, 그리고 washing은 \( 0.2 \times \mathrm{SSC} \) 를 이용하여 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 실시하였다.</p> <h2>Yeast 돌연변이체를 이용한 활성 검증</h2> <p>분리된 SeMIPS cDNA의 EcoR I - Xho I 단편과 EcoR I - Cla I 단편을 각각 yeast expression vector pRS426GPD 에 삽입 후에 inositol 요구주 돌연변이체인 SH306 균주 (ino1, ura)에 형질전환시켜 그 효소활성 여부를 확인하였다. SH306 균주는 YPD 배지에서 배양 후 사용하였으며, 형질전환체는 vector의 selection marker (URA3)를 통해 선별하였으며, inositol 합성 여부는 inositol assay medium system (Difco)배양에 의해서 확인되었다.</p>