균주의 선별을 위해 퇴적층으로부터 분리된 균주를 이용하여 실험에 사용한다. 다당 분해효소를 생산하는 균종을 분리하여 다당 분해능 측정 실험에 사용하고, 이를 이용하여 분리균주의 생화학적 특성을 분석한다. 분리된 균주는 염기서열 분석법을 통하여 염기서열을 결정한다. 마지막으로 amylase 활성 측정을 위해 온도별로 배지를 나누어 활성을 측정하고, 같은 방법으로 산도에 따라서도 측정을 진행한다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주의 선별</h2> <p>본 연구에 사용된 균주는 제주도 양식장(표선, 성산) 배출수연안에 형성된 퇴적층으로부터 분리되었으며, 멸균된 모종삽을 이용하여 멸균 위생팩에 시료를 넣고 채집 후, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)를 유지하면서 실험실로 운반하여 실험에 이용하였다. 채집된 퇴적층 \( 1 \mathrm{g} \)를 멸균해수 \( 9 \mathrm{ml} \)에 넣고 충분히 섞어준 후, 이 시료를 원액으로 10의 지수로 희석한 후, 각각의 멸균된 배지에 \( 100 \mu \mathrm{l}\)씩 접종하고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 7일간 배양하였다.</p> <p>종속영양세균의 분리 및 배양은 marine agar (MA; Difco. Co. USA)배지, 성장속도가 느린 세균의 배양은 R2A agar (Difco. Co. USA) 배지, 영양이 풍부한 일반적인 배지로 일반 세균의 배양을 nutrient agar (NA; Difco. Co. USA)배지, 효모, 곰팡이 또는 내산균의 배양은 YM agar (Difco. Co. USA) 배지를 사용하여 균주를 분리하였다.</p> <h2>Amylase 생산 미생물 분리</h2> <p>높은 다당 분해효소를 생산하는 균종을 분리할 목적으로 연안 퇴적층에서 분리된 200 균주를 이용하여 다당 분해능 측정 실험에 이용하였다.</p> <p>본 실험의 경우 soluble starch (Difco. Co. USA) \( 1 \% \)를 첨가한 NA (nutrient agar)배지를 멸균해수를 이용하여 제조한 후, 각각의 분리된 균종을 백금이를 이용하여 도말하고, \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)배양기에서 48시간 동안 배양한 후, 배지에 \( 1 \mathrm{M} \) 요오드용액을 떨어뜨려 전분이 가수분해 되어 투명환(clear zone or halo)을 보이는 균주를 분리하여 본 연구에 이용하였다. 또한 본 균주 의 보관을 위하여 멸균된 glycerol stock solution을 사용하여 냉동 보관하였으며, 실험은 전분분해능의 활성유지를 위해 \( 1 \% \) soluble starch가 첨가된 NA배지에서 계대 배양하면서 실험에 이용하였다.</p> <h2>분리균주의 생화학적 특성 분석</h2> <p>분리균주의 생화학적 특성 분석은 \(3\%\)로 \( \mathrm{KOH} \)를 이용하여 간이그람동정을 한 후, Biolog사(BIOLOG Inc., USA)의 GN2, GP2 plate를 이용하여 95가지의 기질이용 특이성을 시험하였 으며, 분석은 MicroLog \(^{TM}\) system (release 4.05) program을 이용하였다.</p> <p>순수 분리된 균주를 BUGM (Biolog Inc., USA) 사면배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 배양 한 후, 현탁하여 탁도계(Biolog 21907, USA)를 이용하여 균주 현탁액을 각각 GP의 경우 \( 20 \% \), GN의 경우 \(52 \sim 59\%\)가 되도록 조절한 후 GP2와 GN2 micro olate의 각 well에 \( 150 \mu \mathrm{l} \)씩 접종한 후, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양 후, 보라색을 발색되는 well을 양성으로 판정하였다.</p> <p>이때 현탁액은 \( \mathrm{NaCl} ~150 \mathrm{g}\), \(\mathrm{MgCl}_{2} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 51 \mathrm{g}\), \(\mathrm{KCl} 3.7 \mathrm{g} \)을 증류수 \( 912 \mathrm{ml} \)에 녹인 MCS stock solution 을 증류수로 10 배 희석한 후, 멸균하여 사용하였다.</p> <h2>16S ribosomal DNA 염기서열 분석</h2> <p>분리 균주의 동정을 위해 16S ribosomal DNA 염기서열을 이용하였으며, 16S rDNA 유전자 단편을 PCR 반응으로 증폭하여 염기 서열을 결정하였다. PCR 반응에 사용된 primer는 27F (forward primer; AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)와 1492R (reverse priver; GGTTACCTTGTTACGACTT)을 사용 하였고, ABI 3730XL capillary DNA sequencer를 이용하여 sequencing 분석을 하였으며, 염기조성, 상호비교(pairwise comparisons)를 위한 염기치환 양상, codon usage 및 각 개체 - 개체군의 유전자 차이는 MEGA 3.0 프로그램으로 계산되었으며, 미생물 군집 분석에 이용된 계통수는 distance 방법으로 MEGA 3.0 프로그램의 pair-distance를 이용하여 작성하였다. 결정된 염기서열을 NCBI BLAST를 이용하여 Genbank에 보고된 균주와의 상동성을 조사하였으며, Genbank에 분리균주의 유전자 염기서열을 등록한 후, Accession number를 각각 부여 받았다.</p> <h2>다당분해 효소 생산 미생물의 온도별 생육도 및 amylase 활성 측정</h2> <p>Amylase 활성이 확인된 균주를 MB broth (Difco. Co. USA) 에 배양 후, 각각의 시간대별로 균주 배양액을 \( 1 \mathrm{ml} \)씩 취하여 분광광도계를 이용하여 \( 660 \mathrm{~nm} \)에서 각각의 성장도를 측정하였으며, 분리균주의 증식과 amylase 생산의 최적 조건을 알기 위하여 증식 온도와 초기 배지의 \( \mathrm{pH} \)에 변화를 주면서 효소활성을 조사하였다. 기본배지로 MB broth를 사용하였으며, 배양온도를 \( 20 \sim 40^{\circ} \mathrm{C} \)까지 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) 간격으로 각각 액체 배양하였다. 초기 배지의 \( \mathrm{pH} \)는 4~10 까지 조성하여 실험을 수행하였다.</p> <p>선별된 균주는 MB broth(Difco, USA)에 배양 후, 시간대별로 배양액을 \(9,600 \times \mathrm{g}\)에서 3분간 원심분리하여, 상등액을 조효소액으로 사용하였다.</p> <p>분리된 균주의 amylase 활성은 \( 1 \% \) soluble starch \( 0.1 \mathrm{ml} \)에 조효소액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 넣고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 반응시킨 후, 생성된 환원당을 DNS법을 변형하여 \( 700 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도에서 당 분해능을 측정하였다.</p>