Sulforaphane이 LPS에 의한 MMP-9 활성 증가를 억제하는 데 NF-kB와 AP-1의 중요한 역할을 함을 보여주며, Raw 264.7 세포의 invasion 능력도 sulforaphane 전처리 시 급격하게 감소하는 것을 확인하였다. Fig 3A에서 알 수 있듯이 LPS 처리 후에 정상 MMP-9 프로모터 활성이 향상함에 비해서 전사조절유전자들의 결합부위가 변이된 MMP-9 프로모터 활성은 뚜렷히 감소했다.
<h2>Sulforaphane이 전사조절 인자 NF-kB와 AP 활성에 미치는 영향</h2> <p>Sulforaphane이 LPS에 의해 증가하는 MMP-9 활성을 억제하는 조절 기전을 명확히 규명하기 위해서 MMP-9 promoter에 존재하는 전사조절유전자들 (NF-kB, AP-1) 의 결합부위를 돌연변이 시킨 promoter를 사용하여 luciferase 활성정도를 조사하였다. 정상 MMP-9-Luc vector (WT-MMP-9)와 다양한 돌연변이 MMP-9-Luc vector를 각각 transfection 한 후 LPS (50 \( \mathrm { ng } / \mathrm { ml } ) \)을 24시간 동안 처리 한 후 luciferase 활성을 측정하였다. Fig. 3A에서 나타낸 결과에서 알 수 있듯이 LPS를 처리한 후 정상 MMP-9 프로모터 활성이 증가한 것에 비해서 전사조절유전자들의 결합부위가 변이된 MMP-9 프로모터 활성은 확연히 감소하였다. 이 결과는 LPS 유도에 의해 증가하는 MMP-9의 프로모터 활성에 전사조절유전자인 NF-kB와 AP-1이 중요한 역할을 하고 있음을 나타낸다. Sulforaphane에 의한 MMP-9 promoter 활성 억제효과에 NF-kB 와 AP-1의 관련성을 더 확인하기 위하여 NF-kB와 AP-1 basal element를 함유한 각각의 luciferase vector를 transfection 한 후 sulforaphane과 LPS를 앞선 조건과 동일하게 처리하였다. 그 결과, LPS에 의해서 NF-kB와 AP-1의 promoter 활성이 증가함을 확인 할 수 있었다. NF-kB와 AP-1의 promoter 활성 증가는 sulforaphane 농도 의존적으로 억제됨을 알 수 있었다. 이상의 결과는 sulforaphane이 LPS에 의한 MMP-9 활성 증가에 중요한 역할을 하는 전사조절요소인 NF-kB와 AP-1을 효과적으로 억제함으로써 MMP-9의 활성을 조절함을 의미하는 것이다.</p> <h2>In vitro 상태에서 Raw 264.7 세포의 침투력에 sulforaphane이 미치는 영향</h2> <p>Invasion assay를 이용하여 sulforaphane이 Raw 264.7의 세포 침투력에 미치는 영향을 알아보았다. Fig. 4에서 보는 바와 같이 LPS에 의해 invasion 능력이 2.5배 증가하였으며, sulforaphane를 전처리 시 급격한 감소를 확인 할 수 있었다. 이러한 sulforaphane의 invasion 억제효과는 MMP-9 활성 억제효과와 밀접한 관련이 있을 것이라 생각된다.</p> <h1>고 찰</h1> <p>Type Ⅳ collagenase인 MMP-2와 MMP-9은 암세포의 전이와 침윤 시 ECM 및 기저막을 분해하여 암세포의 전이, 침윤, angiogenesis를 활성화시켜 암세포 성장에 중요한 역할을 하는 금속이온을 cofactor로 요구하는 효소이다. MMP-9 단백질 분해효소의 발현은 다양한 성장인자, cytokine, 그리고 12-myristate 13-acetate (PMA)와 같은 xenobiotics에 의해 조절되어 진다.</p> <p>본 연구에서는 대식세포에서 LPS에 의해 증가하는 MMP-9 활성에 sulforaphane이 미치는 영향과 sulforaphane의 처리에 의한 세포 invasion 능력 억제 여부에 대해서 조사하였다. 먼저 LPS 유도에 의한 MMP-9 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해서 대식 세포에 sulforaphane을 전처리 한 후 LPS를 처리하여 zymography를 실시하였다. LPS에 의해 증가하였던 MMP-9 활성이 sulforaphane의 농도 의존적으로 억제가 됨을 확인 할 수 있었고, LPS 뿐 아니라 다른 종류의 cytokine (IL-1 \( \beta \)와 TNF- \( \alpha \))에 의한 MMP-9 활성 증가 역시 sulforaphane이 효과적으로 억제시킴을 관찰 할 수 있었다. Sulforaphane의 MMP-9 활성 억제 기전을 조사하기 위해서 RT-PCR 및 MMP-9 luciferase reporter assay를 통해서 조사한 결과 sulforaphane의 MMP-9의 활성을 억제는 MMP-9의 전사단계에서 조절됨을 알 수 있었다. mRNA stability 실험을 통해서 sulforaphane이 mRNA 안정성을 조절과는 무관함을 확인 하였다. MMP-9 발현 조절에 mitogen- activating protein kinase (MAPK)의 신호전달계가 관련되어 있으며 이중에 ERK와 JNK 활성이 MMP-9 발현의 증가를 유도 한다. Simon etal.는 p38 MAPK의 억제가 12-myristate 13-acetate (PMA)에 의해 증가되는 MMP-9의 발현을 감소시킨다는 결과를 보고하였다. MMP-9의 발현을 조절하는 전사인자의 발현 기전은 명확하게 밝혀지지는 않았으나, 최근 chemopreventive agent로 잘 알려진 resveratrol이 PMA에 의해 증가하는 MMP-9의 활성을 억제하는데 있어서 전사조절인자 AP-1, NF-kB 활성 조절이 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. Sulforaphane 의 MMP-9 활성 억제에 전사조절인자들의 관련 여부를 확인 하기 위해서 MMP-9의 promoter 활성을 wild type과 mutant AP-1 및 mutant NF-kB 비교 분석한 결과 mutant에서 현저히 감소됨을 확인하였다. 이는 MMP-9의 promoter 활성에 AP-1과 NF-kB 전사인자의 결합이 매우 중요한 요소임을 시사한다. LPS와 sulforaphane을 혼합 처리하였을 때 AP-1과 NF-kB의 basal 활성도를 확인해 본 실험에서도 LPS에 의해서 증가한 AP-1과 NF-kB의 luciferase 활성이 sulforaphane에 의해서 현저히 감소되었다. 이는 sulforaphane이 전사조절 인자인 AP-1과 NF-kB의 활성 억제를 통해서 LPS 유도에 의한 MMP-9의 활성 증가를 감소시킴을 의미하는 결과이다. Sulforaphane이 LPS 유도에 의해 증가하는 MMP-9 활성 억제 효과에 관련하여 세포 invasion 또한 감소시킴을 확인하였다. Human brain microvascular endothelial cell과 human breast cancer cell에서 sulforaphane이 MMP-9 억제를 통해 세포 이동과 tubulogenesis, 세포 침윤을 방해하는 데 유의한 효과가 있음이 밝혀지고 있지만 그 기전을 명확히 제시하지는 못하였다. 이상의 결과에서 sulforaphane이 MMP-9의 활성을 억제하고 세포 침윤 능력을 억제하는 기전에 대해 설명하였고, 이는 더 나아가 암세포의 전이 억제를 통한 암치료제 개발에 중요한 근거를 제시하는 바이다.</p>