이러한 목표 달성을 위해 본 연구에서는 체계적으로 배추 원형질체 분리로부터 초기 세포분열 유도, micro-callus 형성, callus colony 생장, 그리고 callus colony로부터 신초 재분화 유도에 이르는 각 단계에 다양한 처리를 함으로써 그 효과에 대한 정보를 얻는 한편 배추 단독 원형질체로부터 얻어진 callus를 배양함으로써 재분화 신초 획득 효율을 향상시키고자 하였으며 발아한 배추 실생으로부터 파종 후 1주일에 하배축, 2주일에 떡잎 및 3주일에 본잎을 채취하여 세절한 후 \( \mathrm { CaCl } _ { 2 } \cdot 2 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } ~50 \mathrm { mM } \) 과 mannitol \( 0.3 \mathrm { M } \)이 첨가된 \( \mathrm { pH } 5.8 \) 용액에서 16 시간 동안 암상태로 전처리 하였다.
<p>이러한 목표 달성을 위해 본 연구에서는 체계적으로 배추 원형질체 분리로부터 초기 세포분열 유도, micro-callus 형성, callus colony 생장, 그리고 callus colony로부터 신초 재분화 유도에 이르는 각 단계에 다양한 처리를 함으로써 그 효과에 대한 정보를 얻는 한편 배추 단독 원형질체로부터 얻어진 callus를 배양함으로써 재분화 신초 획득 효율을 향상시키고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물재료</h2> <p>농촌진흥청 원예연구소에서 보유한 Ogura CMS 서울배추 (Fig. 3A), 가임 서울배추 내혼 계통, TuMV 저항성 원예 20021 내혼 계통 및 시판 일대잡종 4개 품종을 사용하였다. 배추 종자를 Han과 Kim (1990)의 방법에 따라 표면살균한 후 하배축 채취용은 \( \mathrm { CaCl } \cdot 2 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } ~30 \mathrm { mM } \) 이 첨가되고 agar \( 1.5 \% \)로 굳힌 배지에, 떡잎 및 본잎 채취용은 sucrose \( 10 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \)가 첨가되고 agar \( 0.8 \% \)로 굳힌 MS배지 (Murashige and Skoog 1962)에 각각 파종하였으며 배지의 \( \mathrm { pH } \) 는 고압멸균 전에 5.8로 조정하여 사용하였다. 파종한 종자는 16 시간 명 \( (50 \mu \) \( \left . \mathrm { mol } \cdot \mathrm { m } ^ { -2 } \cdot \mathrm { s } ^ { -1 } \right ) \), 8 시간 암의 일장 하에서 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 배양하여 발아시켰다.</p> <h2>원형질체 분리</h2> <p>발아한 배추 실생으로부터 파종 후 1주일에 하배축, 2주일에 떡잎 및 3주일에 본잎을 채취하여 세절한 후 \( \mathrm { CaCl } _ { 2 } \cdot 2 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } ~50 \mathrm { mM } \) 과 mannitol \( 0.3 \mathrm { M } \)이 첨가된 \( \mathrm { pH } 5.8 \) 용액에서 16 시간 동안 암상태로 전처리 하였다. 전처리된 절편을 효소 조합을 달리한 NN69 무기염 (Nitsch and Nitsch 1969), sucrose \( 0.1 \mathrm { M } \), mannitol \( 0.7 \mathrm { M } \) (하배축) 또는 \( 0.3 \mathrm { M } \) (떡잎과 본잎), MES (Sigma-Aldrich, USA) \( 10 \mathrm { mM } \), albumin bovine (Sigma-Aldrich, USA) \( 0.2 \% \), pH \( 6.2 \) 용액에 넣어 50 rpm으로 진탕하면서 \( 27 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 암상태에서 최장 20 시간까지 배양하였다. 효소는 효소액 A (cellulose R-10 \(1 \% \); Yakult Honsha Co., Japan, macerozyme R-10 \( 0.5 \% \); Yakult Honsha Co., Japan)와 효소액 B (cellulose R-10 \( 1 \% \), macerozyme R-10 \( 0.4 \% \), pectolyase \( 0.1 \% \); Sigma-Aldrich, USA)로 구분하여 사용하였다. 모든 용액은 pore size \( 0.2 \mu \mathrm { m } \) membrane filter로 멸균후 사용하였으며, 처리당 5개 플라스크를 사용하여 매 시간마다 각 플라스크로부터 2개 표본을 취한 후 haemacytometer를 이용하여 현미경 하에서 분리된 원형질체의 수를 계산하였다. 효소처리가 완료된 현탁액은 \( 250 \mu \mathrm { m } \) 채로 거른 후 그 여과액에 NN69 무기염과 sucrose \( 0.6 \mathrm { M } \) 이 첨가된 \( \mathrm { pH } 5.8 \) 용액 등량을 혼합한 후, 혼합액을 \( 15 \mathrm { ~mL } \) conical tube에 담아 \( 100 \times \mathrm { g } \)에서 7분간 분획하였다. 원형질체가 포함된 상징액을 취하여 W5 용액 \( \left ( \mathrm { CaCl } _ { 2 } \cdot 2 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } ~125 \mathrm { mM } , \mathrm { NaCl } ~154 \mathrm { mM } , \mathrm { KCl } ~5 \mathrm { mM } \right . \), glucose \( 5 \mathrm { mM } , \mathrm { pH } \) 5.6) (Menczel and Wolfe 1984)으로 희석한 후 \( 100 \times g \) 에서 5 분간 원심분리하는 방법으로 원형질체를 2회 세척하였다.</p>