본 연구에서는 총 RNA를 formaldehyde가 포함된 agarose gel에서 전기영동한 후, membrane은 cross-linker를 사용하여 RNA를 안정화하고, 프로브를 이용해 hybridization를 실시했다. 배양한 wild type과 돌연변이주는 PBS로 세척한 후, sonicator로 lysis하였다. 그 후 protein 50mg을 immobilized pH gradient strips를 이용해 isoelectric focusing을 수행하였고, protein sample은 urea, CHAPS, DTT, IPG buffer에서 녹여 rehydration loading을 진행했다.
<h2>Northern blotting</h2> <p>Life Technologies, Milan, Italy)를 사용하여 total RNA를 분리하였다. Total RNA \( 20 \mathrm { mg } \) 은 \( 0.22 \mathrm { M } \) 의 formaldehyde가 포함된 \( 1 \% \) agarose gel에서 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 gel은 formaldyhyde을 제거하기 위해 세척한 후 download capillary 방법을 이용하여 Hybond- \( \mathrm { N } ^ { + } \)membrane으로 trans-fer하였다. Transfer가 끝난 membrane은 cross-linker을 사용하여 \( \mathrm { RNA } \) 을 안정화시켰으며 \( f r x A \) 와 \( r d x A \) 의 probe을 사용하여 hybridization 하였다. 각각의 probe는 \( \mathrm { PCR } \) 을 통해 만들어진 \( f r x A \) 와 \( r d x A \) 산물에 \( { } ^ { 32 } \mathrm { P } \) 을 labelling하여 준비하였다. Hybridization이 끈난 membrane은 phosphorimager screen cassette에 노출시키고, Molecular Dynamics Storm \( 860 \) pho-phorImager system을 이용하여 영상화 하였다.</p> <h2>\( 2 \)-D eletrophoresis and MALDI-TOF-MS</h2> <p>\( 2 \) 일간 배양한 wild type과 \( f d x A \) 결손돌연변이주를 har-vest하여 PBS로 washing 후 sonicator를 이용하여 lysis하였다. \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 13000 \mathrm { rpm } \) 으로 \( 30 \) 분간 centrifuge하여 얻은 상층액을 Bradford method를 이용하여 단백질을 정량하였다. 각각 \( 50 \mathrm { mg } \) 의 protein을 immobilized \( \mathrm { pH } \) gradient (IPG)strips pH \( 3 \)- \( 10 \) ( \( 18 \) cm, Amersham biosciences)을 이용하여 isoelectric focusing을 수행하였다. Protein sample은 \( 8 \mathrm { M } \) urea, \( 2 \) \% CHAPS, 20 mM DTT, 0.5 \% IPG buffer (pH \( 3 \)- \( 10 \)) 에 녹여 rehydration loading을 하였다. Total \( 28 \mathrm { kVh } \) 로 fo-cusing을 수행한 후 \( 6 \mathrm { M } \) urea, \( 50 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } ( \mathrm { pH } \mathrm { 8.8 } ) \), \( 2 \% \) SDS, 30 \% glycerol, 0.002 \% bromophenol blue, \( 2 \) \% DTT 로 equilibration 하였다. SDS-PAGE는 \( 12 \% \) polyacrylamide gel을 사용하였으며, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 5 \mathrm { ~mA } / \mathrm { gel } \) 에서 \( 1 \) 시간, \( 10 \mathrm { ~mA } / \) gel에서 overnight으로 running 한 후, silver staining 하였다. 두 균주 사이에 농도의 차이를 보이는 spot들을 잘라 \( 1.5 \) \( \mathrm { ml } \) tube에 옳기고, \( 30 \mathrm { mM } \) potassium ferricyanide와 \( 100 \) \( \mathrm { mM } \) sodium thiosulfate를 \( 1 \): \( 1 \)로 섞은 용액 \( 100 \mathrm { ml } \) 를 넣고 destaining 하였다. Destaining solution을 제거하고 중류수 로 \( 3 \) 번 세척하여 반옹을 중지시키고, 용해된 silver를 제거하였다. \( 100 \mathrm { mg } \) 의 \( 100 \mathrm { mM } \) Ammonium bicarbonate를 넣고 \( 5 \) 분간 반응시킨 후 용액을 버리고 \( 200 \mathrm { mg } \) 의 \( 100 \% \) acetoni-trile \( ( \mathrm { ACN } ) \) 을 넣어 gel을 탈수시켰다. 상둥액을 버리고 speed-vac을 이용하여 gel을 말렸다. Ice에서 \( 12.5 \mathrm { ng } / \mathrm { ml } \) 의 trypsin solution으로 gel을 rehydration 시킨 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 overnight incubation 하였다. Gel slice에 \( 25 \mathrm { ml } \) 의 elution buffer (50 \% ACN/5 \% trifluoroacteic acid (TFA))를 넣고 shaking하는 과정을 반복하여 peptides를 추출하였다. 이렇게 얻어진 peptides는 speed-vac을 통해 완전히 말린 후, \( 50 \% \mathrm { ACN } / 0.1 \% \) TFA로 녹여 a-cyano- \( 4 \)-droxycinnamic acid로 구성된 matrix solution과 \( 1: 1 \) 로 섞어 plate에 올려 상 온에서 건조시켜 Voyager MALDI-TOF (Applied Biosystems)를 이용하여 분석하였다. Peptide mass fingerprint는 UCSF Mass Spectrometry Faculty에서 개발된 MS-FTT program을 사용하여 분석하었다.</p>