GABA를 분비하는 Lactobacillus brevis \( \mathrm{BH}-21 \)를 배양 후 균체를 bead에 고정시킨 후에 배양액을 주입하면서 연속 발효시켜 column형 반응조에서 사용한다. MRS배지에서 배양한 균체가 자체로는 GABA를 얼마나 함량하는지 측정한다. 산완충용액과 반응시키고 끓인 후 생성된 GABA도 측정한다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주</h2> <p>본 연구에 사용된 균주는 GABA를 분비하는 Lactobacillus brevis \( \mathrm{BH}-21 \)를 사용하였다.</p> <h2>균체의 고정화</h2> <p>Lactobacillus brevis \( \mathrm{BH} \)-21을 MRS 배지로 \( 5 \mathrm{~L}, 30^{\circ} \mathrm{C}, 24 \)시간 배양시킨 다음 원심분리하고 균체를 멸균 증류수로 2회 씻은 후 각종 담체와 균체를 1:1로 희석한 다음 23 gauze의 주사 바늘로서 이미 만들어 멸균된 \( 0.1 \mathrm{M} \) 염화칼슘 용액에 떨어뜨려 생성된 bead를 멸균 증류수로 2회 씻은 다음 \( 0.025 \mathrm{M} \) 염화 칼슘 용액에 담군 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 방치한 다음 사용하였 다[2].</p> <h2>담체내 균체 농도의 측정방법</h2> <p>담체내의 생균수의 측정은 인산완충용액( \( \mathrm{pH} \). 7.2)에 용해 시킨 후 생균수를 측정하였다.</p> <h2>\( \mathrm{GABA} \) 함량의 측정</h2> <p>Lactobacillus brevis \( \mathrm{BH}-21 \)를 MRS배지에서 배양한 후 원심분리 \( (3,000 \times \mathrm{g}, 15 \mathrm{~min}, 4 \mathrm{C}) \) 한 후 상등액을 원심분리 \( \left(12,000 \times \mathrm{g}, 15 \mathrm{~min}, 4^{\circ} \mathrm{C}\right) \)하였다. 침전물에 멸균증류수를 가하여 남아있을지도 모르는 GABA를 2차 추출하였고, 1,2 차 원 심분리로부터 얻은 상등액을 합하여 냉동 - 건조하였다. 이어 소량의 물로 용해한 후 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) PVDF 필터(milipore)로 여과하여 분석에 사용하였다. GABA 및 아미노산의 형광 유도체화를 위해 \( 3.9 \times 150 \mathrm{AccQ} \cdot \mathrm{Tag}^{I M} \) (Nova- \( \mathrm{pak}^{T M} \mathrm{C}_{18} \), Waters) column을 사용하였다. Column으로부터 유도체를 용출시키기 위해서는 AccQ - Tag Eluent A와 69\% acetonitrile을 98:2의 비율로 분당 \( 1 \mathrm{~mL} \) 의 유속으로 흘려주었다. GABA 및 아미노산 함량은 표준 GABA 분석 결과와 비교하여 산출하였다.</p> <h2>균체의 glutamic acid decarboxylase 활성의 측정</h2> <p>Lactobacillus brevis BH-21를 MRS 배지에서 배양한 후 배양액은 \( 30 \mathrm{~mL} \)를 10분간 원심분리한 후 그 균체를 \( 20 \mathrm{mM} \)인 산완충용액( \( (\mathrm{pH} \mathrm{7.2)} 30\mathrm{~mL} \)로 2회 세정한 다음 최종액량을 \( 10 \mathrm{~mL} \)로 하여 초음파 파쇄기로 균체를 분쇄한 후 원심분리 하였다. 그 상등액을 \( 5,000 \mathrm{rpm} \) 에서 다시 10 분간 원심분리하여 측정용 효소액으로 하였다. 기질 용액으로는 \( 20 \mathrm{mM} \) (MSG), \( 0.4 \mathrm{M} \mathrm{NaCl}, 0.2\mathrm{M} \)-pyridine \( \mathrm{HCL} \cdot(\mathrm{pH} \) 4.5)용액 \( 1.3 \) \( \mathrm{ml} \) 와 \( 4 \mathrm{M} \) 황산암모니움 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 및 효소액 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 를 흔합한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 60분간 반응시켰다.</p> <p>5분간 끓인 후 반응을 정지시킨 다음 생성된 \( \mathrm{GABA} \) 를 측정하였다. 상기 조건하에서 1 간에 \( 1 \mu \mathrm{mol} \)의 GABA를 생성하는 효소량을 1단위(U)로 하였다[18].</p> <h2>Column형 reactor의 장치</h2> <p>GABA를 연속적으로 생산하기 위하여 아크릴제로 만든 column형(높이 \( 100 \mathrm{~cm} \), 직경 \( 6 \mathrm{~cm}, 3 \) 단식, 용량 \( 0.8 \mathrm{I}) \) 의 column 반응조에 고정화된 균체를 총 용량의 \( 50 \% \) 되게 무균적으로 충진한 다음 peristalic pump로 사용하여 밑에서 위로 배양액을 주입하면서 연속 발효하였다(Fig. 1).</p>