MCF-7세포와 SK-N-SH세포는 \( 10 \% \) FBS와 penicillin/streptomycin이 함유된 DMEM/F-12 배지에서, PC-3와 H9c2세포는 \( 10 \% \) FBS와 penicillin/streptomycin이 함유된 RPMI 1640배지에서 \( 5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2}\)가 공급되는 배양기 \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}\right) \)에서 배양하였다. 시료의 세포독성은 Rakib 등의 방법에 준하여 MTT assay로 측정하였다. 이를 새로운 96-well plate의 well당 \( 100 \mu \mathrm{l}\)옮겨 Anthos 2020 model microplate reader (Anthos Labtech Instruments,Wals, Austria)로 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 세포의 생육 정도를 계산하였다. Protein을 \(7.5 \%\)SDS-PAGE를 이용하여 분리하고, PVDF membrane에 옮겨 caspase-3 protein을 primary antibody와 secondary antibody를 처리하고 ECL detection reagent로 감광하여 caspse-3를 측정하였다. 시료의 항산화성은 DPPH라디칼소거능으로 측정했다.
<h2>세포독성 및 caspase-3 발현 측정</h2> <h3>세 포배 양</h3> <p>MCF-7 세포와 SK-N-SH 세포는 \( 10 \% \) FBS와 penicillin/streptomycin이 함유된 DMEM/F-12 배지에서, PC-3와 H9c2 세포는 \( 10 \% \) FBS와 penicillin/streptomycin이 함유된 RPMI 1640 배지에서 \( 5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2}\)가 공급되는 배양기 \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}\right) \)에서 배양하였다. 세포가 \(80\%\)정도 자라면 배지를 제거한 후 PBS 세척(3회), \( 0.25\%\) trypsin-EDTA 용액 처리(\( 1 \mathrm{~ml} \), 5분), 원심분리 (\(1,500\mathrm{~rpm}\), 15분)하여 분리한 세포를 세포독성과 caspase-3 발현에 사용하였다.</p> <h3>세포독성 검중</h3> <p>시료의 세포독성은 Rakib 등의 방법에 준하여 MTT assay로 측정하였다. 세포를 24-well plate \( (1 \times 10^{5} \mathrm{cells}\)/ \(0.5 \mathrm{~ml}\) / \(\mathrm{well}\))에서 24시간 배양하였다. 이들로부터 배지를 제거하고 PBS로 세척(3회) 후 serum free media (SFM)를 넣고 시료를 농도 별 (0, 50, 250, \(500 \mu \mathrm{g}\) / \(\mathrm{ml}) \)로 처리하여 48시간 배양하였다. 다시 세포의 배지를 제거하고, PBS로 세척(3회)하고, MTT 시약 (\(5 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml}\)) PBS을 well당 \(100 \mu\mathrm{l}\) 가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 배양하였다. 그 후 MTT 용액을 제거, PBS 세척(3회), DMSO 처리(well당 \(200 \mu\mathrm{l}\))하여 formazan crystal을 녹였다. 이를 새로운 96-well plate의 well당 \( 100 \mu \mathrm{l}\) 옮겨 Anthos 2020 model microplate reader (Anthos Labtech Instruments,Wals, Austria)로 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 세포의 생육 정도를 계산하였다.</p> <h3>Caspase-3의 발현</h3> <p>방법에 준하여 분석하였다. 세포를 culture dish \( (100 \mathrm{~mm}) \)에 seeding \(3 \times 10^{6}\) cells 한 후 24시간 배양하였다. 배지제거, PBS 세척(3회), serum free media (SFM) 첨가, 시료 농도 별 ( 0, 50, 250, \(500 \mu \mathrm{g}\) / \(\mathrm{ml} \))로 처리하고 48시간 배양하였다. \( 0.25 \% \) tryp-sin -EDTA (\(1 \mathrm{~ml}\))를 처리하고, 회수하여 PBS로 세척(3회)하였다. 이 세포의 protein읕 lyses buffer인 RIPA로 추출하고 Bradford 시약으로 함량을 측정하였다. Protein을 \(7.5 \%\) SDS-PAGE를 이용하여 분리하고, PVDF membrane에 옮겨 caspase-3 protein을 primary antibody와 secondary antibody를 처리하고 ECL detection reagent로 감광하여 caspse-3를 측정하였다.</p> <h2>항산화능 측정</h2> <p>시료의 항산화성은 DPPH 라디칼 소거능으로 측정하였다. DPPH 용액(\(0.3 \mathrm{~mM}\) DPPH/\( \mathrm{ml} \) methanol)에 시료를 농도별(0.5, 1, 2, \(3 \mathrm{~mg}\))로 첨가하고 methanol로 \( 3 \mathrm{ml} \)로 보정하였다. Vitamin C의 DPPH 소거능도 시료처리와 같이 vitamin C를 농도 별 (0.5, 1, 2, \(3 \mu \mathrm{g}\))로 첨가하여 측정하였다. 처리시료의 흡광도 \( (\lambda \max 517 \mathrm{~nm}) \)를 Beckman DU-8 spectrophotometer (Brea, CA)로 측정하여 시료의 \( \mathrm{SC}_{50} \) (scavenging activity)를 계산하였다. \( \mathrm{SC}_{50} \)은 DPPH 용액에 시료 첨가 1분 후의 DPPH의 농도(흡광도)가 \(50 \%\) 감소하는데 필요한 시료의 농도로 계산하였다.</p>