이 연구에서는 E. coli, M. smegmatis 균주와 plasmid를 사용하여 LB 배지 37\(^\circ \mathrm{C}\)에서 배양하고, 항생제 ampicillin, kanamycin, hygromycin을 처리하여 선별하였으며, M. smegmatis 균주들은 7H9 액체배지에 0.2%(w/v) glycerol을 첨가하여 배양하였다. 그리고 형질전 환은 CaCl2를 이용하여 실시하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용된 균주, plasmid, 균주의 생장조건, 그리고 균주의 형질전환</h2> <p>본 연구에서 사용된 균주와 plasmid에 대한 정보는 Table1 에 표기하였다. E. coli 균주들은 \(37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 Luria-Bertani (LB) 배지를 이용하여 배양하였고, 선별이 필요한 경우에는 항생제인 ampicillin을 \(100~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \), kanamycin을 \(50~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \), 그리고 hygromycin을 \(200~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 농도로 처리하였다. M. smegmatis 균주들의 경우에는 \( 7 \mathrm { H } 9 \) 액체배지(Difco, MD, USA)에 \(0.2 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) glucose와 \(0.02 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) Tween 80을, 고체배지에 \(0.2 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) glucose를 첨가하고, 이를 이용하여 \(37 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였으며, TSRO가 존재하는 vector를 이용하는 실험과정에 있어 필요한 온도조건은 해당 실험과정에 대한 설명과 함께 상세 기술하였다. 선별이 필요한 경우에는 ka-namycin을 \(30~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \), hygromycin을 \(50~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 농도로 처리하여 배양하였다. E. coli 균주의 형질전환과정과 M. smeg-matis 균주의 형질전환과정은 각각 그 과정들이 기술되어 있는 서적을 참고하였다.</p> <h2>pKOTs를 이용한 돌연변이 제조 및 선별</h2> <p>돌연변이 제조를 위해 M. smegmatis chromosomal DNA를 주형으로 MSMEG_2600_F (5'-AACGGGATCCGACCAGAC CTGGTCGGCG-3')와 MSEMG_2660_del_R (5'-TCCTCGGTGTCGCGGGCGGCTATGCGTGCATCGTCGTGCA-3')을 primer로 사용하여 MSMEG_2660의 start codon을 중심으로 \(445 \mathrm { ~bp } \)의 DNA 단편을, MSMEG_2660_R (5'-AACGAAGCTTCCAAGCCCACGCTGACGA-3')과 MSEMG_2660_del_F (5'-TGCACGACGATGCACGCATAGCCGCCCGCGACACCGAGGA-3')를 primer로 사용하여 MSMEG_2660의 stop codon을 중심으로 \(435 \mathrm { ~bp } \)의 DNA 단편을 얻었다. \(20 \mathrm { ~bp } \)가 겹치도록 MSMEG_2660_del_F와 MSMEG_2660_del_R primer를 고안하였기 때문에 이 두 단편은 \(40 \mathrm { ~bp } \)가 겹치게 된다. 두 단편을 주형으로 MSMEG_2660_F와 MSMEG_2660_R을 primer로 사용하여 \(270 \mathrm { ~bp } \)가 결실(deletion)된 MSMEG_2660을 얻었다. 이렇게 결실된 MSMEG_2660을 포함하는 \(840 \mathrm { ~bp } \)의 DNA를 HindII로 절단하여, HindII와 EcoRV로 자른 pKOTs suicide vector에 cloning하였다(pKOTs \( \triangle \mathrm { MS } 2660) \). M. smegmatis를 (pKOTs \( \triangle \mathrm { MS } 2660 \)으로 형질 전환 시킨 후 hygromycin을 \(50~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)로 가지는 \( 7 \mathrm { H } 9 \) 고체배지에 도말하여 \(30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 4일간 배양하였다. 성장한 colony를 다시 삼분도말(streaking)한 후 형성된 colony를 hygromycin이 \(50~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)의 농도로 포함된 \( 7 \mathrm { H } 9 \) 액체배지에 접종하여 30 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2일간 완전히 배양한 다음, 배양액을 10 배 희석하여 30 \( \mu \mathrm { g } \)를 항생제가 들어있는 \( 7 \mathrm { H } 9 \) 고체배지에 도말하여 42 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 3일간 배양하였다. 성장한 colony를 다시 삼분도말한 후 형성된 colony를 항생제가 없는 \( 7 \mathrm { H } 9 \) 액체배지 \(20 ~ \mathrm { ml } \)에 접종한 다음 \(42 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다. 4일동안 배양한 후 배양액 \(10~ \mu \mathrm { g } \)를 \(10 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) sucrose가 첨가된 \( 7 \mathrm { H } 9 \) 고체배지에 도말하여 \(37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 3일간 배양하였다. 성장한 colony를 다시 삼분도말한 후 형성된 colony 일부를 항생제가 들어있는 \( 7 \mathrm { H } 9 \) 고체배지와 항생제가 들어 있지 않은 \( 7 \mathrm { H } 9 \) 고체배지에 각각 삼분도말하여 \(37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다. 항생제가 들어있지 않은 배지에서 성장하고 항생제가 들어있는 배지에서는 성장하지 못한 colony를 돌연변이 후보군으로 선정하여, 돌연변이 후보군을 각각 \(20 ~ \mathrm { ml } \) \( 7 \mathrm { H } 9 \) 액체배지에서 3일간 배양한 다음 chromosomal DNA를 추출하여 MSMEG_2660_F와 MSMEG_2660_R의 primer를 이용하여 PCR로 돌연변이를 확인하였다.</p>