본 논문에서는 광용혈법을 이용한 세포보호 효과를 측정하고자 건강한 성인 남녀로부터 얻은 적혈구로 현탁액을 만들었다. 적혈구 현탁액의 O.D값은 \( 700 \mathrm { ~nm } \)에서 \( 0.6 \)이었고 적혈구 수는 \( 1.5 \times 10 ^ { 7 } \)cells \( / \mathrm { ml } \)로 나타났다. 이 적혈구 현탁액을 파이렉스 시험관에 넣은 후 추출 조건 별로 지모 뿌리 추출물을 첨가한 후 암소에서 전배양했다. 이후 \( 15 \mathrm { ~min } \)동안 광조사를 하고, 암반응 시간에 따른 적혈구의 용혈 정도를 \( 700 \mathrm { ~nm } \)에서 투광도를 측정했다.
<p>ROS scavenging \( ( \%)= \) \[ \left \{\frac {\left ( \mathrm { Cpm } _ {\text { control } } - \mathrm { Cpm } _ {\text { experiment } } \right ) } {\left ( \mathrm { Cpm } _ {\text { control } } - \mathrm { Cpm } _ {\text { blank } } \right ) } \right \} \times 100 \]</p> <h2>광용혈법을 이용한 세포보호효과 측정</h2> <p>적혈구 현탁액 제조: 적혈구는 건강한 성인 남녀로부터 얻었다. 채혈 즉시 heparin이 첨가 된 시험관에 넣은 후, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 냉장고에 보관하고 \( 12 \mathrm { ~h } \) 이내에 사용하였다. 이를 3,000 \( \mathrm { rpm } \) 으로 5 분 동안 원심 분리하여 적혈구와 혈장을 분리하고, 분리한 적혈구는 \( 0.9 \% \) saline phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } \) 7.4, \( \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } \cdot 12 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } 9.6 \mathrm { mM } , \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } \cdot 2 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } 1.6 \mathrm { mM } \) )로 세척하여 원심 분리하고 흰색의 백혈구 층은 제거하였다. 이를 3 회 반복하여 세척, 분리한 적혈구는 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 냉장고에 보관하면서 사용하였으며, 광용혈 실험은 이미 확립된 방법에 따라 수행하였다. 실험에 사용된 적혈구 현탁액은 O.D. 값이 \( 700 \mathrm { ~nm } \) 에서 \( 0.6 \) 이었으며, 적혈구 수는 \( 1.5 \times 10 ^ { 7 } \) cells \( / \mathrm { ml } \) 이었다.</p> <p>지모 뿌리 추출물의 광용혈 억제 효과: 적혈구 현탁액 \( 3.5 \mathrm { ml } \) 를 파이렉스 시험관(No. 9820)에 넣은 후 추출 조건 별 지모 뿌리 추출물을 \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 를 \( 50 \mu \mathrm { l } \) 씩 첨가한 후 암소에서 30 min동안 pre-incubation시켰다. 그 후 광증감제로 사용된 \( 15 \mu \mathrm { M } \) rose-bengal \( 0.5 \mathrm { ml } \) 를 가하고 파라필름(Whatman laboratory sealing film, UK)으로 입구를 막은 후 \( 15 \mathrm { ~min } \) 동안 광조사하여 광즘감 반응을 일으켰다. \( 15 \mathrm { ~min } \) 의 광조사가 끝난 후 암반응 시간에 따른 적혈구의 용혈 정도를 \( 14.5 \mathrm { ~min } \) 간격으로 \( 700 \mathrm { ~nm } \) 에서 투광도(transmittance, \%)를 측정하였다. 이 \( 700 \mathrm { ~nm } \) 의 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도 증가는 적혈구의 용혈 정도에 비례하였다. 모든 실험은 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 항온을 유지하며 진행하였다. 데이터는 다음 식에 의해 적혈구의 \( 50 \% \) 가 용혈 되는데 걸리는 시간인 \( \tau_ { 50 } \) 을 구하여 비교하였다.</p>