본 실험연구에 사용된 나우제초 시료는 경상남도 진주시 판문동 일대와 인근 남강해안 일대에서 채집하였다. 원하는 WEEH를 얻기 위해 총 \( 100\mathrm{~g} \)의 Nowzecho를 증류수 \( 1,000\mathrm{~ml} \)에 3시간 이상 끓였습니다. 이어서, 혼합물을 \(3,000 \mathrm{~rpm} \)에서 20분 동안 원심분리하여 침전물을 제거하였다. WEEH는 적절한 농도로 처리 직전에 성장 배지에 도입되어 배지 자체에 용해됩니다. 미생물과 불순물을 확실하게 제거하기 위해 공극 크기가 \( 0.22 ~\mu \mathrm{m} \)인 실린지 필터 장치 또는 일회용 펌프 필터 장치를 사용하여 여과합니다. 그 후, 필터링된 WEEH는 세포 성장 배지를 동시에 교체하면서 직접 투여됩니다. 이어서, AGS 세포 핵을 400x 배율의 형광 현미경(Carl Zeiss) 하에서 형태학적 변화에 대해 조사하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>암세포의 배양 및 TRAIL의 처리</h2> <p>AGS 위암세포는 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)에서 분주 받아 \(90\%\)의 RPMI-1640 배지(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), \(10\%\)의 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 \(1\%\)의 penicillin 및 streptomy-cin (Biofluids, Rockville, MD, USA)이 포함된 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \%~ \mathrm{CO}_{2} \) 조건 하에서 배양하였다. 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 매 48시간마다 \( 0.05 \% \) trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA, Gibco BRL)를 처리하여 세포를 부유시킨 다음 세포배양용 페트리 접시로 옮겨 배양하였다. TRAIL (KOMA Biotech Inc, Seoul, Korea)은 PBS에 적정 농도로 녹여 배지에 희석하여 처리하였다.</p> <h2>지금초 수용액의 추출 및 처리</h2> <p>본 실험에 사용된 지금초는 경상남도 진주시 판문동 및 근처 남강둔치 일대에서 채취하였으며 WEEH을 얻기 위하여 \( 100\mathrm{~g} \)의 지금초를 \( 1,000\mathrm{~ml} \)의 증류수에 3시간 이상 끓인 후, \(3,000 \mathrm{~rpm} \)으로 20분간 원심 분리시켜 침전물을 제거하였다. 이를 다시 \( 0.45 ~\mu \mathrm{m} \)의 여과지를 이용하여 부유 성분을 걸러낸 후 수용성분을 동결 건조하여 사용하였다. WEEH와 TRAIL의 단독 혹은 흔합 처리를 위하여 세포를 \( 0.05 \% \) tryp-sin-EDTA를 이용하여 세포배양용 페트리 접시로부터 부유시킨 다음 새로운 세포배양용 페트리 접시에 \( 6 \times 10^{5} \)개/\(\mathrm{ml}\) 정도로 분주하여 24시간 동안 안정화시켰다. WEEH는 세포에 처리하기 직전 적정 농도로 성장배지에 첨가하여 녹인 다음,\( 0.22 ~\mu \mathrm{m} \)의 pore size를 가진 주사기용 필터 유닛을 사용하거나 1회용 펌프 필터 유닛을 사용하여 미생물 및 불순물을 걸러낸 다음, 세포의 성장배지를 갈아주면서 직접 처리하였다.</p> <h2>MTT assay에 의한 세포 성장억제 조사</h2> <p>세포배양용 6 well plate에 well 당 \( 1 \times 10^{5} \)개의 AGS 세포를 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 다음 WEEH와 TRAIL을 단독 혹은 혼합 처리한 후 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후 배지를 제거하고 tetrazolium bromide salt (MTT, Sigma, St. Louis, MO, USA)를 \( 0.5 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 희석하여 \( 200 \mathrm{~ml} \)씩 분주하여 3시간 동안 반응시켰다. 3시간 후 MTT 시약을 제거하고 DMSO를 \( 100 \mathrm{~ml} \)씩 분주하여 wcll에 생성된 for-mazan을 모두 녹인 후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 정상 배지에서 배양된 암세포와 지금초 추출물이 처리된 배지에서 배양된 세포들의 성장률을 비교하였다. 실험 결과는 3번의 측정값을 평균값과 표준 오차를 Microsoft EXCEL program을 이용하여 분석하였다.</p> <h2>세포형태 관찰 및 DAPI 염색에 의한 핵의 형태 관찰</h2> <p>준비된 세포를 \( 37 \% \) formaldehyde 용액과 PBS를 1:9의 비율로 섞은 fixing solution으로 실온에서 10분 정도 고정한 후, PBS로 2~3회 세척하고 4,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI, Sigma) 용액을 이용하여 암하에서 염색시켰다. 15분 가량 염색시킨 후, PBS로 DAPI 용액을 충분하게 세척하고 1차 증류수로 재빠르게 세척한 다음 absolute ethanol을 이용하여 탈수과정을 거친 slide glass 위에 mounting solution을 처리하고 cover glass를 덮었다. 그 후 형광 현미경(Carl Zeiss)을 이용하여 400배의 배율로 가 조건에 따른 AGS 세포 핵의 형태 변화를 관찰하였다.</p> <h2>DNA flow cytometry에 의한 세포주기 분석</h2> <p>정상 및 WEEH와 TRAIL의 단독 및 혼합 처리된 배지에서 자란 세포들을 PBS로 두세 번 씻어내고, 고정액(\( 70 \% \) eth-yl alcohol, \( 0.5 \% \) Tween 20)을 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 고정시킨 후, 핵산에 특이적으로 결합하는 형광물질인 DNA inter-calating dye propidium iodide (PI, concentration, 50\( \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \); Sigma)와 10 kunit의 RNase (Sigma)를 처리하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간동안 염색하였다. 이를 다시 PBS로 두 번 씻어낸 후, nylon mesh로 세포를 하나씩으로 분리시킨 후 DNA flow cytometry (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 ModiFit LT (Becton Dickinson) 프로그램으로 분석하였다.</p>