배추 품종 간의 차이를 비교하기 위해, 각 EST에 고유 번호를 부여하고 양 끝 염기 서열을 이용해 포워드 프라이머와 리버스 프라이머를 제작하였다. 고온 스트레스에 약한 '지부'와 강한 '권심' 두 품종의 배추 종자를 양성하고, 어린 잎을 수확한 후 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동고에 보관하였다. 이 후 CTAB 방법을 통해 DNA를 추출하고, 디자인한 프라이머를 이용해 PCR 증폭을 진행하였다. 이렇게 얻은 DNA는 쏠젠트(주)에 염기서열 분석을 요청하였으며, 분석 결과 동일한 염기서열을 가진 EST는 제거하고, 최종적으로 28개의 trehalose 유전자 관련 EST 후보군을 확보하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>배추의 trehalose 합성 관련 유전자 검색</h2> <p>애기장대의 trehalose 합성관련 유전자는 크게 두 그룹으로 나누어지는데 trehalose phosphate synthase (TPS) 11개 유전자(at1g78580, at1g16980, at1g17000, at4g27550, at4g17770,at1g68020, at1g06410, at1g70290, at1g23870, at1g60140,at2g18700)와 trehalose phosphate phosphatase (TPP) 10개 유전자(at1g22210, at1g35910, at1g78090, at2g22190, at4g12430,at4g22590, at4g39770, at5g10100, at5g51460, at5g65140)이다. NCBI에서 확보된 총 21개의 애기장대 trehalose 합성관련 유전자의 염기서열을 이용하여 NCBI에서 제공하는 B. rapaEST 데이터베이스를 검색하였다. 검색된 EST중 염기서열이 동일한 EST는 제거하였고 남은 총 28개의 trehalose 유전자관련 EST 후보군을 확보하였다(Table 1). 확보한 EST에 각각의 고유번호를 부여하였으며, 확보한 염기서열을 이용하여 배추 품종간의 차이를 비교하기 위해 각 EST에 양 끝 염기서열을 대상으로 하여 포워드 프라이머와 리버스 프라이머를 각각 제작하였다(Table 1).</p> <h2>식물 DNA 정제</h2> <p>한국배추게놈소재은행으로부터 분양받은 고온 스트레스에 약한 품종 '지부'('Chiifu')와 비교적 강한 '권심'('Kenshin') 두 종의 배추 종자를 발아시켜 키운 후 어린잎을 수확하여 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동고에 보관한 후 CTAB method를 이용해 DNA를 추출하였다. 곱게 마쇄된 시료에 CTAB buffer를 \( 750 \mu \mathrm{l} \)을 가하고 30초 vortexing하여 추가로 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 배양하였다. \( 750 \mu \mathrm{l} \) phenol:chloroform:isomyl alchol (25:24:1)을 넣고 15초 vortexing, 5분 원심분리 하였다. 얻은 상층액을 \( 2 \mathrm{ml} \) tube로 옮긴 후 두 번에 걸쳐 chloroform:isomyl alcohol (24:1) 용액으로 세척한 후 EtOH를 \( 900 \mu \mathrm{l} \) 넣고 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 보관 후에 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 원심분리 하였다. DNA 펠렛을 확인한 후 상층액을 버리고 자연건조를 시켰다. 추출된 DNA는 증류수 50\( \mu \mathrm{l} \)로 현탁시켰다.</p> <h2>중합효소연쇄반응(PCR)과 gel 전기영동</h2> <p>\( \mathrm{CTAB} \) method를 이용하여 얻은 지부와 권심 DNA를 각각 디자인한 프라이머를 이용하여 PCR증폭을 하였다. PCR에 사용된 모든 시약은 솔젠트 회사의 e-taq kit를 사용하였다. 지부 와권심의 DNA는 \( 15 \mathrm{ng} \), total volume은 \( 15 \mu \mathrm{l} \)로 \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{dNTP} \) \( 0.3 \mu \mathrm{l}, 10 \times \) buffer는 \( 1.5 \mu \mathrm{l} \), taq polymerase는 0.4 unit으로 \( 0.08 \mu \mathrm{l}, 100 \mu \mathrm{M} \) 의 foward primer, reverse primer 각각 \( 1 \mu \mathrm{l} \), 지부와 권심의 DNA는 \( 15 \mathrm{ng} \)을 사용하였다. PCR은 \( 93^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3분 후 \( 93^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30초, \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분, \( 68^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분 과정을 40회 반복하고, \( 72^{\circ} \mathrm{C}\) 7분 후 종료 또는 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관되었다. 증폭된 DNA는 \( 2 \% \) 아가로스 gel에서 전기영동을 이용해 DNA 조각의 크기를 확인하였다.</p> <h2>염기서열분석과 유전자 다형성분석</h2> <p>PCR 증폭을 해 얻은 DNA를 쏠젠트(주)에 염기서열분석을 의뢰하였다. 얻어진 염기서열분석 결과는 staden package 프로그램(http://staden.sourceforge.net/)을 이용하여 지부와권심 간 염기서열을 비교하였다.</p>