본 실험은 임신 18일의 Sprague-Dawley계 흰쥐 대뇌피질신경세포를 Brewer 등의 방법에 따라 배양후 Culture plate를 \( \mathrm{CO}_{2} \) Water Jacketed Incubator를 이용하여 \( 2 \%\) \(\mathrm{O}_{2}\) / \( 5 \% \) \(\mathrm{CO}_{2} \) 환경에서 3시간 처리하여 저산소증을 유도하였다. 저산소 처리가 끝나면 배양세포를 정상산소 환경 배양조에 옮기고 계속 배양후 발색시야을 \( 20 \mu \mathrm{l}\)씩 가하고 상온에서 20분간 흔든 후, \( 0.4 \mathrm{N}\) \( \mathrm{NaOH} \)를 \( 100 \mu \mathrm{l}\)씩 가하고 상온에서 15분간 더 흔든 다음 흡광를 측정하였고, ROS 생성세포는 형광 색소인 \( \mathrm{H}_{2}\)DCF-DA를 사용하여 관찰하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>약재 및 물추출액 제조</h2> <p>실험에 사용된 황련은 대한약전 및 대한약전 외 한약 규격주해에 근거하여 동국대학교 경주 한방병원에서 구입하였다. 황련 \( (2 \mathrm{g}) \)에 \( 20 \mathrm{ml} \)의 증류수를 넣어 균질화하고 상온에서 4시간, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 18시간 진탕하였다. 이를 \( 15,000 \mathrm{rpm} \)에서 15분간 원심분리하여 상등액을 얻고 여과멸균 \( (0.2 \mu \mathrm{m}) \)한 후 소량씩 분주하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다. 건조물의 량은 \(1 \mathrm{ml} \) 추출액 3 튜브를 동결건조한 후 평균치를 사용하였다.</p> <h2>신경세포 배양</h2> <p>임신 18일(embryonic day 18: \( \left.\mathrm{E}_{18}\right) \)의 Sprague-Dawley계 흰쥐 대뇌피질신경세포를 Brewer 등의 방법에 따라 배양하였다. 즉, \( \mathrm{E}_{18} \)의 흰쥐를 dry ice가 들어있는 통 속에 \( 3 \sim 5 \)분간 넣어 마취하고, 자궁을 가른 후 흰쥐 태아를 취하고 뇌를 잘라내었다. 대뇌피질 조직을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 \( 0.25 \% \) trypsin으로 처리하고 \( 1 \mathrm{mM} \) sodium pyruvate와 \( 10 \mathrm{mM} \) HEPES \( (\mathrm{pH} \) 7.4)가 첨가된 HBSS용액(Invitrogen Life Technology, Carsbad, CA, USA) \( 5 \mathrm{~ml} \)로 \(4\sim 5\)회 세척하여 반응을 중단시켰다. 조직을 \( 1 \mathrm{~ml}\) Hank's용액으로 옮기고, 끝을 불에 달구어 구멍을 작게 한 pasteur pipette으로 \(6\sim 7\)회 통과시켜 신경세포를 분산시켰다. 이 후 분산된 세포를 모으고 세포수를 측정한 다음 약 1,500 \( \mathrm{cells}/ \mathrm{mm}^{2} \)가 되도록 B27을 첨가한 plating neurobasal media (Invitrogen Life Technology) (\(100 \mathrm{ml} \) neurobasal, \( 2 \mathrm{ml} \) B27 supplement, \( 0.25 \mathrm{ml} \) glutamax I,\( 0.1 \mathrm{ml}\) \( 25 \mathrm{mM} \) glutamate, \( 0.1 \mathrm{ml}\) \( 25 \mathrm{mM} \) 2-mercaptoethanol)에 접종하여 \( 5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2} \) 배양조에서 배양한 다음 \(2 \sim 3\)일 간격으로 배양액을 feeding neurobasal media \( (100 \mathrm{ml} \) neurobasal, \( 2 \mathrm{ml} \) B27 supplement, \( 0.25 \mathrm{ml} \) glutamax I)로 \( 1 / 3 \)씩 교환하였다.</p> <h2>저산소증 유발</h2> <p>Culture plate를 \( \mathrm{CO}_{2} \) Water Jacketed Incubator (Forma Scientific Inc., Maretta, \( \mathrm{OH}\), USA)를 이용하여 \( 2 \%\) \(\mathrm{O}_{2} / 5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) 환경에서 3시간 처리하여 저산소증을 유도하였다. 저산소 처리가 끝나면 배양세포를 정상산소 환경 배양조에 옮기고 계속 배양하였다.</p> <h2>LDH 측정</h2> <p>배양 10일(10 day in vitro: DIV)에 황련 \( 1.0 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도로 처리하고 3일간 배양한 후, 저산소증을 유도하였다. 저산소 처리가 끝나면 배양세포를 정상산소 환경 배양조에 옮기고 계속 배양한 다음 3일째에 각각 배양액 \( 20 \mu \mathrm{l} \)를 96-well plate 에 옮기고 pyruvate substrate (NADH \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)를 \( 20 \mu \mathrm{l} \)씩 가한 다음, 상온에서 2분간 흔든 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 더 흔들었다. 발색시야(color reagent, Sigma 505-2)을 \( 20 \mu \mathrm{l}\)씩 가하고 상온에서 20분간 흔든 후, \( 0.4 \mathrm{~N}\) \( \mathrm{NaOH} \)를 \( 100 \mu \mathrm{l}\)씩 가하고 상온에서 15분간 더 흔든 다음 ELISA reader로 흡광도 \( \left(\mathrm{OD}_{450}\right) \)를 측정하였다.</p> <h2>활성산소(ROS) 생성세포 염색</h2> <p>ROS 생성세포는 형광 색소인 \( \mathrm{H}_{2}\)DCF-DA (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 사용하여 관찰하였다. DIV 10에 황련 \( 1.0 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)로 처리하고 3일간 배양한 후 저산소증을 유발하기 직전, 유발 후 1시간과 유발 후 1, 3일에 각각 염색 하였다. \( \mathrm{H}_{2}\)DCF-DA 처리 전에 세포를 feeding neurobasal media로 씻어주었다. \( \mathrm{H}_{2}\)DCF-DA를 최종 농도 \( 10 \mathrm{nM} \)이 되도록 배양액에 넣고 10분 동안 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양조에서 배양시킨 후 feeding neurobasal media로 두 번 씻어준 다음 형광현미경으로 관찰하였다. \( \mathrm{H}_{2}\)DCF-DA는 dimethylsulfoxide (DMSO)로 \( 5 \mathrm{mM} \)의 stock을 만들고 이를 feeding neurobasal media로 500배 희석하여(최종농도 \( 10 \mathrm{nM} \) ) 세포에 처리하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험은 최소 8배수로 시행하였고, 세포의 생존율은 대조군에 대한 백분율(\(\%\) of control)로 표시하였다. 통계학적 유의성은 Mann-Whitney U test로 검증하였다.</p>