간잎돌김을 대상으로 삼투압 안정제를 농도와 pH별로 처리한결과 \( \mathrm{pH}\) \( 6.0 \) 의 \( 25\) \( \mathrm{mM} \) MES 완충용액을 사용하였을때 원형질체의 수율이 가장 높고, \( \mathrm{pH}\)가 높아질수록 원형질체의 수율이 낮았다. 긴잎돌김으로 부터의 원헝질체 분리를 위하여 효소농도별로 실험한 결과 agarase \(2\%\) 및 hemicellulase \(2\%\) 의 효소 조합이조합이 가장 좋았다. 세포융합 실험에서는 15분 후에 두 종류의 원형질체가 모이고 25분 후 긴잎돌김과 오카무라돌김의 원형질체들이 접합했다.
<h1>결과</h1> <h2>삼투압 안정제 및 \( \mathrm{pH} \) 별 원형질체 분리</h2> <p>원형질체의 분리는 제거되는 세포벽에 상당하는 압력을 보상해 줄 수 있는 등장액에서 진행되어야 하므로 설탕, 솔비톨, 만니톨을 삼투압안정제로 비교하여 보았다.</p> <p>우선 긴인놀김을 대상으로 하여 원형질채 분리에 적합한 삼투압안정제와 최적농도를 알아보기 위하여 각 삼투압 안정제를 농도별 및 효소용액 \( \mathrm{pH} \) 별로 처리하여 원형질체가 분리된 수율을 구하였다. \( 25 \mathrm{mM} \) MES 완충용액 \( \mathrm{pH} \) 6.0에서 \( 1 \% \) agarase와 \( 3 \% \) hemicellulase를 처리해 주었을 때, \( 0.4,0.5,0.6 \mathrm{M} \) 만니톨 용액에서의 원형질체 수율은 김 생체량 \( 1 \mathrm{~g} \) 당 각각 \( 8.4 \times 10^{5} \) 개, \( 10.2 \times 10^{5} \) 개, \( 6.7 \times \) \( 10^{5} \) 개였으며, 솔비돌을 처리하였을 때의 경우는 각가 \( 7.6 \times \) \( 10^{5} \) 개, \( 13.4 \times 10^{5} \) 개, \( 6.1 \times 10^{5} \) 개였고, 설탕의 경우는 \( 5.5 \times 10^{5} \)개, \( 8.2 \times 10^{5} \) 개, \( 5.9 \times 10^{5} \) 개였다. 삼투압안정제에 따른 원형질체 수율을 비교해보았을 때, 만니톨, 솔비톨, 설탕 용액의 농도가 모두 \( 0.5 \mathrm{M} \) 일 때 가장 안정적이었다. 효소용액의 \( \mathrm{pH} \) 가 원형질체 분리에 미치는 영향을 조사한 결과가 Fig. 2 에 나타나 있다. \( 0.5 \mathrm{M} \) 솔비톨 용액에 \( 1 \% \) agarase와 \( 3 \% \) hemicellulase를 첨가하여 김엽체에 처리해주었을 때, \( \mathrm{pH} \)에 따른 원형질체 수율은 \( 25 \mathrm{mM} \) MES 완충용액 \( (\mathrm{pH} 6.0) \), HEPES 완충용액( \( \mathrm{pH} 7.0) \), Tris 완충용액( \( (\mathrm{pH} 8.0 \) 및 9.0)에서 김생체량 \( 1 \mathrm{~g}^{\text {당 }} \) 가각 \( 13.4 \times 10^{5} \) 개, \( 9.6 \times 10^{5} \) 개, \( 7.5 \times 10^{5} \)개, 그리고 \( 4.3 \times 10^{5} \) 개로 나타나, \( \mathrm{pH} 6.0 \) 의 \( 25 \mathrm{mM} \) MES 완충용액을 사용하였을때 원형질체의 수율이 가장 높았으며, \( \mathrm{pH} \)가 높아질수록 원형질체의 수율이 낮아졌다.</p> <h2>효소종류별 원형질체분리</h2> <p>긴잎돌김으로 부터의 원헝질체 분리를 위하여 \( 0.5 \mathrm{M} \) 솔비톨을 \( 25 \mathrm{mM} \) MES 완충용액 \( (\mathrm{pH} \) 6.0)에 넣은 후 효소종류와 농도는 agarase \( 4 \%(\mathrm{~W} / \mathrm{V}) \) 단독, hemicellulase \( 4 \%(\mathrm{~W} / \mathrm{V}) \) 단독, agarase \( 2 \%(\mathrm{~W} / \mathrm{V}) \) 및 hemicellulase \( 2 \%(\mathrm{~W} / \mathrm{V}) \), agarase \( 3 \%(\mathrm{~W} / \mathrm{V}) \) 및 hemicellulase \( 1 \%(\mathrm{~W} / \mathrm{V}) \) 등으로 4 가지 실험구를 설정하여 시험한 결과 각각 김 생체량 \( 1 \mathrm{~g} \) 당 \( 9.1 \times 10^{5} \) 개, \( 7.8 \times 10^{5} \) 개, \( 16.2 \times 10^{5} \) 개, \( 11.7 \times 10^{5} \) 개로 나타나 agarase \( 2 \% \) 및 hemicellulase \( 2 \% \) 의 효소 조합이 가장 좋은 원형질 분리 결과를 나타내었다.</p> <h2>세포융합</h2> <p>긴잎돌김으로부터 \( 2 \% \) agarase \( 2 \% \) hemicellulase 의 효소를 \( 0.5 \mathrm{M} \) 솔비톨이 함유된 \( 25 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) 완충용액내에서 2 시간 동안 처리하여 원형질체를 분리하였다. 그리고 오카무라돌김으로부터도 동일조건하에서 원형질체를 분리한후 \( 0.5 \mathrm{M} \) 솔비톨이 함유된 \( 0.05 \% \) neutal red로 20 분 동안 염색하였으며 잔여의 neutral red를 \( 0.5 \mathrm{M} \) 솔비톨 용액으로 세척하였다(Fig. 3B). 이들의 각 긴잎돌김에 원형질체들을 흔합한 후 \( 30 \% \) 의 Polyethylene glycol (Sigma Mol.Wt. : 8,000)넣은 후 5분 간격으로 관찰하였다. 15 분 후에 두 종류의 원형질체가 모이는 모습이 관찰되었으며 25분 후 긴잎돌김과 오카무라돌김의 원형질체들이 접합하는 모습이 관찰되었다.</p>