본 논문에서는 실험에 사용한 균주와 배지, 플라스미드를 나타냈다. E.coli는 플라스미드 DNA의 복제나 접합에 사용되었고, Luria-Bertani배지에, 고체배양은 \( \mathrm { LB } \)배지에 \( 1.5 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) agar이 첨가된 배지를 사용해 균주를 배양했다. 사용한 시약과 효소는 Oligonucleotide primer, Oligonucleotide primer이다. 콜라겐 분해효소 유전자를 PCR한 후 TAE EDTA, buffer를 사용한 \( 0.8 \% \) agarose gel에 전기영동 하고 결과를 분석했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용균주와 배지 및 플라스미드</h2> <p>실험에 사용된 균주와 플라스미드는 Table 1에 나타내었다. E. coli는 플라스미드 DNA의 복제나 접합에 사용되었고, 액체배양은 Luria-Bertani (LB, Difco, Detroit, USA)배지에, 고체배양은 \( \mathrm { LB } \) 배지에 \( 1.5 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) agar이 포함된 배지에서 각각 수행되었다. V. parahaemolyticus 04는 LB배지에 \( 2.0 \% \) \( \mathrm { NaCl } \) 이 첨가된 LBS 배지나 tryptic soy broth (TSB medium, Accumedia manufacturer, Inc.) 배지를 사용하여 배양하였다. 돌연변이체의 선별은 TCBS (thiosulfate citrate bile salts, Difco, Detroit, USA)에 sucrose \( 10 \% \) 를 첨가한 배지에서 수행하였으며, 항생제를 필요로 하는 경우 ampicillin, tetra-cycline 또는 kanamycin을 각각 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } , 15 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } , 50 \) \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 씩 첨가하여 배양하였다.</p> <h2>사용시약 및 효소</h2> <p>Oligonucleotide primer는 Bioneer Co. (Cheongwon, Korea)에서 제작하였고, 사용된 oligonucleotide의 염기서열은 Table 2에 나타내었다. 제한효소와 Taq polymerase는 Kosco Biotech Co. (Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였고, 콜라겐분해효소의 활성을 보기 위하여 사용된 콜라겐은 bo-vine achielles tendon에서 추출한 insoluble collagen (type I,Sigma)을 구입하여 사용하였다.</p> <h2>골라겐 분해효소 유전자 \( (v p p C) \) 의 subcloning</h2> <p>V. parahaemolyticus 04 의 콜라겐 분해효소 유전자 vpp \( C \) 는 V. parahaemolyticus 04 chromosomal DNA를 주형으로 COL3F와 COL3R primers를 이용하여 \( \mathrm { PCR } \) 방법으로 증폭하여 \( 2.6 \) \( \mathrm { kb } \) 의 DNA 단편을 얻었다. PCR은 PerkinElmer Cetus Thermal cycle (Gene Amp PCR 9600)을 사용하여 AccuPower \( \mathrm { PCR } \) premix (Bioneer) \( 20 \mu \mathrm { l } \) 에 첨가하여 \( \mathrm { PCR } \) 을 시행하였다. 얻어진 PCR 산물은 TAE (40 mM Tris-acetate, \( 1 \mathrm { mM } \) EDTA, \( \mathrm { pH } \) 8.0)buffer를 사용한 \( 0.8 \% \) agarose gel에 전기영동을 통해 확인하였다. 증폭된 \( 2.6 \mathrm { ~kb } \) 콜라겐분해효소 유전자단편을 ClaI 과 HindIII 제한효소로 절단 후 클로닝벡터인 \( \mathrm { pGEM } 7 \mathrm { Zf } ( + ) \)에 클로닝하였다.</p>