반하를 전처리한 실험군의 경우 저산소증에서 \( 2.5\ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)까지 세포생존율이 증가되었으며 그 이상의 농도에서는 감소된 것으로 나타났다. MMP는 세포 손상과 직접적으로 관련되는데, 반하에 의하여 미토콘드리아 내막의 MMP는 높게 유지된다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>저산소증에서 반하가 신경세포사에 미치는 영향</h2><p>LDH는 세포의 손상을 측정하는 효소로, LDH를 내포한 조직이 파괴될 때 혈중으로 흘러나와 혈중 농도가 상승되며, 특히 심근경색, 간질환, 중추신경 계통 등의 진단과 세포독성의 확인 등에 사용되고 있다. DIV 12에 반하를 \( 0.25, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0\ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도별로 전처리하고 2 일간 더 배양한 후 저산소증 \( (2 \%\ \mathrm{O}_{2} / 5 \%\ \mathrm{CO}_{2}\), \(37^{\circ} \mathrm{C}\), 3 hr)을 유발하고, 3 일후에 LDH assay 방법으로 세포 생존율을 조사하였다. 그 결과 실험군은 \( 1.0, 2.5\ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도에서 각각 \( 110.7 \% \) 및 \( 115.9 \% \)의 생존율을 보여 대조군에 비해 매우 유의한 증가 \( (\mathrm{p}<0.01) \)를 보였다. 저산소증에서 시간에 따른 반하의 효과를 알아보기 위하여 같은 방법으로 \( 2.5\ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 반하를 전처리 하고 저산소증을 유발 직전과 유발 후 1 시간, 3 일, 5 일에 세포 생존율을 tryphan blue staining 방법으로 조사하였다. 저산소증 유발 직전의 경우 실험군은 생존율이 \( 85.2 \% \)로서 대조군 \( 76.2 \% \)에 비하여 매우 유의한 증가 \( (\mathrm{p}<0.01) \)를 보였다. 저산소증 유발 후 1 시간에는 별 차이를 보이지 않았지만 3 일, 5 일 후에는 각각 \( 10.2 \%\), \(17.8 \% \)로 매우 유의한 증가\( (\mathrm{p}<0.01) \)를 보였다.</p><p>이상의 결과에서 살펴보면 반하를 전처리한 실험군에서 저산소증에서 \( 2.5\ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)까지 농도 의존적으로 세포생존율이 증가되었으며\((115.9\%)\), 그 이상의 농도에서는 감소되었다. 또한 저산소증 유발 후 1 시간에는 대조군과 차이가 없다가, 시간이 흐르면서 점점 반하의 효능이 높게 나타남을 보여주었다. 저산소증 유발 직후 곧바로 사망하는 세포들은 괴사에 의한 것으로 알려져 있기 때문에 반하는 괴사에 의한 급성 세포사는 억제할 수 없지만 고사 과정에 의한 지연성 세포사에는 유의한 효능을 나타내는 것으로 해석된다. 이러한 해석을 뒷받침하는 증거로서 저산소증 유발 3 일 및 5 일 후에는 핵이 농축되어 작아진 세포들을 흔히 볼 수 있었다. 이는 세포고사의 특징으로 반하를 전처리한 실험군에서는 이러한 세포수가 현저히 낮았다.</p><h2>저산소증에서 반하가 MMP에 미치는 영향</h2><p>MMP는 미토콘드리아의 내외막의 이온 구성 차이에 따라 가지게 되는 일정한 전압차를 말한다. 높은 MMP는 미토콘드리아에서 ATP를 생산하는 원동력으로 MMP의 소실은 곧 세포 손상과 직결된다. 또한 근래에는 미토콘드리아의 ATP 생산 외에도, 세포내 \( \mathrm{Ca}^{2+} \)의 항상성 유지와 ROS 및 RNS 생산 등의 역할들이 밝혀지면서 세포사에 있어서 미토콘드리아의 중요성이 부각되고 있다. 뇌신경세포 손상으로 세포내 \( \mathrm{Ca}^{2+} \)의 과량유입, oxidant chemicals의 불균형이 발생하면 MMP 소실, 전자전달계인 호흡사슬의 와해, ROS 과잉 생산, 미토콘드리아 막 사이 단백질 융해 및 세포내 \( \mathrm{Ca}^{2+} \)과 glutathion 과다유입 등 미토콘드리아의 복합적인 기능부전이 발생하여 세포사가 유발된다. 미토콘드리아에서 생산된 ROS 및 RNS는 미토콘드리아에 작용하여 새로운 산화 스트레스로 작용하게 된다. 따라서 세포사 과정에서 ROS 및 RNS의 생성을 감소시켜 산화적 스트레스와 질산화적 스트레스를 억제하게 되면 MMP가 유지될 것이며, 이는 세포사를 방지하는 하나의 방법으로 제시될 수 있을 것이다.</p><p>JC-1은 낮은 농도에서는 monomer로 존재하여 녹색형광(green fluorescence)을 내며, 높은 농도에서는 J-aggregate를 형성하여 넓은 범위의 흥분스펙트럼(broad excitation spectrum)을 나타내기 때문에 MMP를 측정하는 민감한 색소로 이용되고 있다. 에너지가 높은 MMP는 JC-1을 바탕질(matrix)로 유입한 후 J-aggregate를 형성하여 적색형광(red fluorescence)을 낸다. 따라서 MMP가 높게 유지되는 높은 활성도의 미토콘드리아는 형광현미경으로 관찰하면 적색형광을 낸다. DIV 12에 반하 \( 2.5\ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)를 전처리하고 2 일간 배양한 후 DIV 14에 저산소증을 유발하였다. 저산소증 유발직전과 유발 후 1 일, 3 일, 5 일에 JC-1으로 염색하고 미토콘드리아의 염색강도를 측정하였다. 적색형광의 경우 반하는 전반적으로 대조군에 비하여 강하게 염색되는 미토콘드리아의 비율을 증가시켰다. 반면에 녹색형광의 경우 실험군은 대조군과 뚜렷한 차이를 보이지 않았다. 이는 반하에 의하여 미토콘드리아 내막의 MMP가 높게 유지되고 있음을 의미한다.</p>