항진균 활성 균주를 분리하기 위해 가정에서 제조된 재래형 메주를 분세기로 마쇄하고, 현탁액을 Luria broth(LB), malt extract agar(MEA), potato dextrose agar(PDA) 배지 또는 이에 \( 2 \% \) 의 agar를 첨가한 배지로 \( 100 \mu \mathrm { L } \) 또는 \( 200 \mu \mathrm { L } \) 도말하여 항진균 활성 균주를 분리하였다. 그람 염색 염색 및 형성 관찰과 API 50 CHB system을 이용하여 균주를 동정하였고, 분리 균주의 유당 이용능을 조사하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>항진균 활성 균주의 분리</h2> <p>항진균 활성 균주를 분리하기 위해 가정에서 제조된 재래형 메주를 수집하였다. 수집된 메주는 분세기를 사용하여 마쇄 후 이중 \( 1 \mathrm { ~g } \) 을 취하여 \( 10 \mathrm { ~mL } \) 의 뗠균수에 현탁한 후, 현탁액을 \( 100 \mu \mathrm { L } \) 또는 \( 200 \mu \mathrm { L } \) 를 취하여 평판배지에 도말하였다. 이때 사용된 배지로는 Luria broth(LB, \( 1 \% \) bacto-tryptone, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 1 \% \mathrm { NaCl } \) ) 평판배지, malt extract agar(MEA, Difco Laboratories), potato dextrose agar(PDA, Difco Laboratories) 배지 또는 이에 \( 2 \% \)(w/v) skim milk (Difco Laboratories)를 첨가한 배지를 사용하였다. LB 평판 배지는 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), MEA 평판배지는 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \), PDA 평판배지는 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2~5일 동안 배양하면서 곰팡이 및 세균들에 대해 생육저해 활성을 나타내는 균주를 분리하였다.</p> <h2>분리균주의 동정</h2> <p>분리균주의 동정은 형태학적 특성으로 그람 염색 및 포자 형성 관찰과 API 50 CHB system(BioMérieux, Co., France)을 이용하여 당 이용능을 조사하는 생화학적 특성을 통하여 일차적으로 균주를 동정하였으며, 분리 균주의 16S rRNA gene 염기서열 결정을 통하여 최종적인 동정을 하였다. 분리 균주의 chromosomal DNA를 Genomic DNA purification kit(Q-Biogene, U.S.A.)을 이용하여 분리한 후, Universal primer를 사용하여 1 차 PCR을 수행하였다. 2 차 PCR은 B. subtilis와 B. polyfermenticus의 16s rRNA gene의 염기 서열 중 상동성이 높은 부분을 primer 서열(Ba4-F: 5'-AGCTGCTCCCTGATGTTAG-3'; 4-subRR: 5'-TCGAAG-AATCGAATGATCCT-3')로 합성하여 시행하였다. 증폭된 PCR 산물은 pGEM-T easy vector(Promega Co., U.S.A.)에 cloning한 후 ABI PRISM 3730 DNA analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.)를 이용하여 염기 서열을 분석하였다. 그 결과를 BLASTN 프로그램을 이용하여 GenBank의 ribosomal RNA gene sequence와 비교하였으며 sequence의 상동성은 CLUSTAL X program을 이용하여 비교분석하였다.</p> <h2>분리 균주의 유당 이용능</h2> <p>분리균주의 유당 이용능을 조사하였다. 분리균주를 tryptic soy broth(TSB, Difco Laboratories)에 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 12 시간 전배양한 후 전배양액을 TSB 액체 배지와 유당 \( 1 \% \), \( 2 \% \) 가 각각 첨가된 TSB 엑체 배지에 \( 1 \% \) 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 48 시간 동안 진탕배양 후 12 시간 간격으로 세포 생육 정도를 \( 600 \mathrm { ~nm } \) (Ultrospec 2100 pro, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)에서 흡광도로 측정하였다. 이때 대조구로는 유당을 이용하지 못하는 B. subtilis ATCC 6633을 사용하였다.</p>