일반적으로 Epitope tag이 없는 단백질을 정제하기 위하여 여러 가지 생화학적 정제 방법이 사용된다. 그러나 \( \mathrm { pET } \) 시스템을 사용하게 되면 대장균에서 발현하는 전체 수용성 단백질 중 약 \( 1 / 4 \) 정도가 \( \mathrm { MIF } \) 이다. 따라서 본 연구를 통하여 pET-MIF 시스템을 사용하여 tag가 없는 MIF의 많은 양을 발현 시켜 L-dopachrome tautomerase 활성을 전보다 간편하고 빠르게 측정할 수 있는 방법을 확립했다. Serine protease인 HtrA2의 경우 GST-HtrA2의 융합단백질에서 GST-HtrA2를 thrombin으로 잘라 GST를 제거하게 된 HtrA2 에서 또한 동일한 효소활성을 관찰하였다.
<h2>세포 추출물을 이용한 MIF의 tautomerase 활성 측정 방법의 정립</h2> <p>Epitope tag이 붙지 않은 단백질을 정제하기 위해서는 일반적으로 여러 가지 생화학적 정제 방법이 쓰인다. 그러나 pET 시스템을 이용하면 대장균에서 발현되는 전체 수용성 단백질의 약 1/ 4 정도가 MIF 이다. 또한 MIF 의 경우 진핵세포 내에서 glycosylation이 일어나지 않는 것으로 보고된다[5]. 즉, 대장균에서의 MIF 발현이 MIF의 활성에 큰 영향을 주지 않는 것으로 여겨진다. 이에 따라 본 연구에서는 대장균에서 발현하여 정제하지 않은 수용성 세포 추출물 상태 로 MIF의 L-dopachrome tautomerase 활성 여부를 직접 측정하였다(Fig. 2). 농도를 알고 있는 BSA를 기준으로 하여 세포 추출물에 존재하는 MIF 의 농도를 결정하였다. MIF의 활성은 10분 동안 \( 475 \mathrm { ~nm } \) 의 파장에서 약 \( 1 \sim 5 \mathrm { nM } \) 농도 범주의 MIF 단백질을 포함하는 반응시료의 흡광도 변화로 측정하였다(Fig. 2). MIF의 L-dopachrome tautomerase 활성을 통하여 오렌지색의 L-dopachrome이 무색의 DHICA로 전환되므로 \( 475 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도의 감소는 MIF의 효소활성이 증가하는 것을 의미한다. MIF의 L-dopachrome tautomerase 활성은 MIF 단백질의 농도에 따라 증가하고 있으며, \( 5 \mathrm { nM } \) 에서 활성이 가장 높은 것으로 나타났다. L-dopachrome tautomer-ase 활성이 MIF 에 의해 톡이적으로 나타나는 것 인지블 확인하기 위해 대조군으로 pET plasmid만을 가지고 있는 세포의 추출물을 이용한 결과 흡광도의 변화를 관찰할 수 없었다. 상기의 실험을 통하여 생화학적 정제 방법을 이용하지 않고도 세포 추출물 상태에서 MIF의 L-dopachrome tautomerase 활성을 측정할 수 있으며, 이 MIF의 효소 활성은 대장균 내재성 단백질들의 영향을 받지 않음을 알 수 있다. 따라서 본 연구에서는 pET-MIF 시스템을 이용하여 tag이 없는 MIF를 대량으로 발현 시켜 L-dopachrome tautomerase 활성을 보다 간편하고 신속하게 측정할 수 있는 방법을 확립하였다.</P><h2>N-말단 GST가 MIF의 tautomerase 활성을 저해</h2> <p>Serine protease인 HtrA2의 경우 GST-HtrA2의 융합단백질에서나 GST-HtrA2를 thrombin으로 절단하여 GST를 제거한 HtrA2 에서도 동일한 효소활성을 나타내는 것을 관찰할 수 있다[19]. 또한, 대장균에서 발현된 GST-융합 단백질은 glutathione-Sepharose 4B bead 정제법으로 고순도의 단백질을 대량으로 회수할 수 있으므로 MIF도 pGEX 시스템을 이 용하여 GST-MIF 용합단백질로 발현하여 affinity column 법으로 정제 하였다(Fig. 1B).</p>