apoptosis에 미치는 genistein의 영향을 알아보기 위해 Hep3B 세포에 genistein을 다양한 농도로 투입한 뒤 flow cytometry 분석을 해보았다. 세포독성이 보여지지 않는 범위 내에서 Hep3B에 genistein 농도를 처리하였더니, 이는 TRAIL에 의한 apoptosis 유도를 효과적으로 증가시킴을 알아낼 수 있었다. 1에서 발견한 촉진 효과와 연관된 PI3K 및 MAPKS pathway의 역할을 조사하기 위해 해당 세포에 genistein, 그리고 TRAIL 처리 전에 특이적 억제제와 경로 억제제를 선처리한 후에 해당 세포의 생존율을 비교하였더니 p38 MAPK 신호 경로가 동시 처리로 인한 apoptosis 유도에 큰 영향을 미침을 알 수 있었다.
<h1>결과</h1> <h2>Hep3B 세포에서 genistein에 의한 TRAlL 유도 apoptosis 의 촉진</h2> <p>TRAIL에 의하여 유도되는 apoptosis에 미치는 genistein의 영향을 조사하기 위하여 \( 100 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 의 TRAIL이 처리된 Hep3B 세포에 다양한 농도의 genistein을 처리한 후 flow cytometry 분석을 실시하였다. Fig. \( 1 \mathrm{~A} \) 에 나타낸 결과에서 알 수 있듯이 \( 100 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 의 TRAIL이 단독 처리된 경우 apoptosis가 유발된 세포의 빈도에 해당되는 sub-G1기에 속하는 세포의 빈도가 약 \( 7.1 \% \) 정도였으나, 12 및 \( 25 \mu \mathrm{M} \) 의 genistein을 동시에 처리하였을 경우, \( 19.2 \) 및 \( 32.1 \% \) 로 apoptosis 유도의 정도가 매우 증가되었다. 그러나 \( 25 \mu \mathrm{M} \) 의 genistein이 단독으로 처리된 경우 apoptosis 유도의 정도는 \( 2.0 \% \) 정도로서 대조군과 매우 유사하여 Hep3B에 세포독성을 보이지 않는 genistein 처리 농도 범위에서 genistein은 TRAIL에 의한 apoptosis 유도를 매우 효과적으로 증가시켰음을 알 수 있었다. 또한 이러한 현상은 DAPI 염색에 의한 세포 핵의 형태변화 관찰에서도 유사한 결과를 얻었다(Fig. 1C). 한편 미토콘드리아는 apoptosis 유도 과정에 가장 중심이 되는 세포 내 소기관으로서 세포 내 - 외 신호 전달의 매개체로 작용하며, 다양한 인자들의 발현 변화에 의하여 apoptosis 유도에 직접적으로 관여한다. 이러한 genistein의 TRAIL에 의한 apoptosis 유도 증대에 미토콘드리아 기능 손상이 연관되어 있는지의 여부를 조사하기 위하여 MMP의 손실 정도를 조사한 결과, \( 100 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 의 TRAIL이 단독 처리된 경우 MMP 손실의 정도가 \( 8 \% \) 정도였음에 비하여 \(12 \) 및 \( 25 \mu \mathrm{M} \) 의 genistein이 동시에 처리된 경우 MMP 손실 정도가 \(22 \) 및 \( 41 \% \) 로 매우 증가되었으나, genistein 단독 처리군에서의 MMP 손실정도는 대조군과 유사하게 나타났다(Fig. 1B).</p> <h2>Genistein에 의한 TRAlL 유도 apoptosis의 촉진에 미치는 PI3K/Akt 및 MAPKs pathway의 영향</h2> <p>Fig. 1에서 관찰된 genistein에 의한 TRAIL 유도 apoptosis의 촉진 효과와 연관된 phosphoinositide-3 kinase (PI3K)/Akt 및 MAPKs pathway의 역할을 조사하기 위하여, Нep3B 세포에 genistein과 TRAIL의 복합 처리 1 시간 전에 c-Jun \( \mathrm{N} \)-termi-nal kinase (JNK), extracellularly responsive kinase (ERK) 및 p38 MAPK 특이적 억제제인 SP600125, PD98059 및 SB203580과 Akt 경로 억제제인 LY294002를 선처리한 후, Hep3B 세포 의 생존율을 비교하였다. Fig. \( 2 \mathrm{~A} \) 에서 알 수 있듯이 Hep3B 세포의 생존에 큰 영향을 미치지 않는 4가지 억제제의 선처리 조건에서, JNK, ERK 및 AKT 억제제인 SP600125, PD98059 및 LY294002는 TRAIL과 genistein 동시 처리에 의한 생존율의 저하에 큰 영향을 미치지 않았다. 그러나 p38 MAPK 저해 제인 SB203580이 동시에 처리된 경우, Нep3B 세포의 생존율이 매우 저하되었다(Fig. 2A). 따라서 p38 MAPK 활성 저하가 TRAIL과 genistein 동시 처리에 의한 apoptosis 유도를 더욱 증가시킬 것으로 추정되어 동일 조건에서 apoptosis 유도의 정도를 비교한 결과, SB203580이 선처리된 조건에서 TRAIL과 genistein이 처리된 배지에서 배양된 Hep3B 세포의 apoptosis가 매우 높게 유발되었다(Fig. 2B). 이러한 p38 MAPK 활성 억제제와 TRAIL 및 genistein 동시 처리에 의한 apoptosis 유도 증가의 정도를 재확인하기 위하여 전형적인 apoptosis가 유도된 세포에서 관찰되는 DNA 단편화 및 염색질 응축의 정도를 관찰하였다. Fig. \( 3 \mathrm{~A} \) 및 B에서 알 수 있듯이 SB203580과 TRAIL 및 genistein의 동시 처리에 의하여 apoptosis가 거의 유발되지 않는 조건에서 배양된 Hep3B 세포에 SB203580, TRAIL 및 genistein 3가지를 동시에 처리하였을 경우, DNA의 단편화와 염색질 응축 현상 및 전체적인 세포의 형태변형이 동반되었음을 관찰할 수 있었다. 이는 TRAIL과 genistein 동시 처리에 의한 apoptosis 유도에 p38 MAPK 신호 경로가 매우 중요하게 관여하고 있음을 보여 주는 결과이다.</p>