UPLC-ESI-MS/MS 분석을 진행하기 위해 정량의 건조된 조팝나무 잎을 미세한 분말로 갈고, 초음파 추출기, 원심분리기 및 디스크 필터 과정 등을 거쳐 화합물을 분리하고 기기분석에 사용하였다. 이후 정량분석을 위하여 UPLC가 부착된 \(3200 \) QTRAP mass spectrometer와 컬럼을 사용하고, MS/MS 실험은 API \(3200 \) QTRAP LC/MS/MS system,이온화 방식에는 전기분무 이온화법을 사용해 분석하였다.
<h2>UPLC-ESI-MS/MS 분석</h2> <p>건조된 조팝나무 잎을 볼밀(Retsch MM \(400 \) mixer mill, Haan, Germany)을 이용하여 미세한 분말로 갈았다. \( 2 \mathrm { mL } \) 튜브에 조팝나무 시료 \( 100 \mathrm { mg } \) 과 \( 80 \% \) MeOH 1 \mathrm { mL } \) 을 넣고 초음파 추출기(Bransonic \(3510 \)R-DTH, Branson Ultrasonics Co., Danbury, CT, USA)를 이용하여 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(30 \) 분간 추출을 진행하였다. 원심분리기(HITACHI koki Co. Ltd. Tokyo, Japan)를 이용하여 \( 3500 \times \mathrm { g } \) 에서 \(5 \) 분간 원심분리 하였다. 상등액을 \( 1 \mathrm { mL } \) 튜브에 넣고 회전식 중발기(Eyela NVC- \(2100 \), Tokyo, Japan)를 이용하여 감압 하에서 용매를 제거하였다. 잔사를 \( 1 \mathrm { mL } \) 메탄올에 녹이고, \( 0.2 \mu \mathrm { m } \) 의 \( 13 \mathrm { mm } \) 디스크 필터(Chromdisc Co., Daegu, Korea) 로 여과하여 기기분석에 사용하였다. 분리된 화합물의 정량분석을 위하여, UPLC (Waters ACQUITY I-Class, Waters Corp. Milford, MA, USA)가 부착된 \(3200 \) QTRAP mass spectrometer (AB SCIEX, Framingham, MA, USA)를 사용하였으며, 컬럼은 Waters사의 ACQUITY BEH C \(18 \) \( (2.1 \mathrm { mm } \times 100 \mathrm { mm } , 1.7 \mu \mathrm { m } ) \) 을 사용하였다. 컬럼의 오븐 온도는 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 설정하였다. 이동 상 용매 시스템은 \( 0.1 \% \) formic acid 수용액(A)와 아세토나이트릴(B)로 이루어졌으며 이동상 조건은, 처음 \( 0.34 \) 분간 B 를 \(0-3 \% \) 로 증가, \( 5.78 \) 분간에 걸쳐 B 를 \( 80 \% \) 로 증가시켰으며, \(8 \) 분간에 걸쳐 B 를 다시 \( 3 \% \) 로 회기 하였다. 컬럼 유속은 \( 0.37 \mathrm { mL } / \mathrm { min } \) 이며, 주입량은 \( 10 \mu \mathrm { L } \) 이었다. MS/MS 실험은 Turbo \( \mathrm { V } ^ {\mathrm { TM } } \) source와 Turbo Ion Spray probe가 장착된 API \(3200 \) QTRAP LC/MS/MS system을 이용하여 수행하였다. 질량분석기의 이온화 방식에는 전기분무 이온화(electrospray ionization, ESI)법을 사용하였다. 질량 스펙트럼은 Positive ion과 Multiple Reaction Monitoring (MRM mode)의 분석법을 이용하여 분리된 물질의 선구이온(precursor ion)을 선택 후, 선택된 선구이온에 대하여 충돌 에너지를 적용하고 생성이온(product ion)을 분석하여 정량분석에 적용하였다. 질량분석 스펙트럼은 \( 0.05 \mathrm { amu } \) 의 스텝사이즈로 \( \mathrm { m } / \mathrm { z } \) \(50-1,000 \) 범위에서 측정되었다. 분석 시에 사용된 기기의 중요 parameter 값은 화합물 \( 1 \) 은 \( 319 \rightarrow 139 \), 화합물 \(2 \) 는 \( 285 \rightarrow 179 \) 의 질량 값에서 검출하였고, collision energy는 \( 31 \mathrm { V } \), Ion spray voltage는 \( 5.5 \mathrm { kV } \), Ion source 온도는 \( 450 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 설정하여 분석하였다. 장비 분석 및 데이터 수집에는 AB SCIEX 에서 제공된 BioAnalyst \( { } ^ { TM } \) (Ver. \(1.4.2 \)) 프로그램을 사용하였다.</p>