그동안 Vibrio 균을 동정하는 방법으로는 첫번째 그람염색에 의한 형태학적 동정, 두번째 API kit 등을 이용한 생화학적 동정, 세번째 항체를 이용한 다양한 면역학적 동정등 있으며 근래에는 16S rRNA와 16S rDNA, 그리고 ISR 등을 이용한 네 번째 분자생물학적 동정법이 일반적으로 사용되고 있다. 본 연구에서는 분자생물학적 동정법을 이용하여 병원성이 있다고 판단되는 V.tapetis에 대해 먼저 유사종들과의 염기서열 분석하고 특이 서열의 확인과 함께 이를 토대로 제작된 PCR specific primer의 효용성을 확인하였다. 그 결과, 본 연구에 사용된 Vibrio 속 세균들 상호간의 16S rRNA의 유전적 유사도가 모두 \(90 \sim 95 \% \) 정도로 유사하되, 앞부분에 해당되는 \( 1 \sim 90~ \mathrm{bp} \) 와 \( 450 \sim 470 \mathrm{bp} \) 영역에서는 그 특이성이 발견되었다. 다만, 16S rRNA는 계통발생학적인 측면에서 그 유전적 다양성이 부족하다고 알려져 있으며, 추후 연구를 통해 특이유전자 영역을 이용한 종 특이 marker에 대한 연구가 활발히 이루어져야한다고 관망하고 있다.
<h1>Vibrio tapetis의 검출을 위한 PCR specific primer의 제작</h1> <p>현재까지 식중독과 패혈증의 주요 원인균으로 인식되어온 Vibrio 속의 세균들은 그람 음성, 호염기성의 간균이며 해양 및 汽水性 세균으로 약 40 여종 정도 알려져 있다. 그동안 병원균으로 언급되는 것은 주로 Vibrio cholerae, V. para-haemolyticus, V. vulnicus 등 3종이지만, 이외에도 V. alginolyticus, V. anguillarum, V. damsela, V. harveyi, V. hollisae, V. ordalli 등을 포함한 다양한 Vibrio 종이 어류, 패류 및 갑각류 등의 다양한 수산생물에 대한 병원균으로 이미 보고된 바 있으며, 이로 인한 양식 수산생물의 폐사로 인해 실제 양식 산업에 상당한 피해를 주고 있다. 특히, 굴, 바지락 등의 조개류는 중요한 단백질 공급원으로서 생식하는 경우가 많은데 이로 인한 비브리오 감염증의 위험이 보고되고 있으며, 더욱이 최근 해마다 신종 해양 비브리오균이 보고되고 있는 가운데 "brown ring disease (BRD)"의 원인체로 알려져 있는 V. tapetis와 같은 새로운 종이 수산물 수출입 관계로 인해 국내에서도 질병 발생 가능성이 있는 것으로 보고됨에 따라 그 위험성은 더욱 커져가고 있다. V. tapetis는 1980년대부터 프랑스, 스페인, 포르투갈 등지에서 양식 바지락 Ruditapes philippinarum에 대해 외투막과 접해있는 패각 내부에 갈색의 병소를 형성하는 등 주로 바지락류의 패각과 내부에 침입하여 폐사를 일으키는 것으로 알려져 있고, 해수 내 일반세균인 V. splendidus와 유사한 종으로 보.고되고 있다.</p> <p>한편, Vibrio 균을 동정하는 방법으로는 그동안 주로 그람염색에 의한 형태학적 동정과 API kit 등을 이용한 생화학적 동정, 그리고 항체를 이용한 다양한 면역학적 동정이 주로 사용되어 오다가 최근에는 16S rRNA와 16S rDNA, 그리고 16S-23S rRNA intergenic spacer region (ISR) 등을 이용한 분자생물학적 동정법이 보편화되어 가는 추세이다.</p> <p>따라서 본 연구에서는 최근 양식 바지락에 대해 병원성을 가진 것으로 보고되어 잠재적인 위험성을 내포하고 있는 V.tapetis에 대해 먼저 관련 유사종들과의 염기서열 분석을 통한 특이 서열의 확인과 함께 이를 토대로 제작된 PCR spe- cific primer의 효용성을 확인하고 이를 신속진단법 개발을 위한 기초자료로 이용하고자 한다.</p> <p>우선 본 연구에 사용된 V. alginolyticus, V. anguillarum, V. harveyi, V. hollisae, V. parahaemolyticus, V. splendidus, V. tapetis 등은 표준균주은행(American Type Culture Collection, ATCC)에서 구입하여 사용하였으며(Table 1), specific primer set의 제작을 위한 기초자료로 사용될 Vibrio 속 세균들의 16S rRNA에 대한 염기서열은 GenBank (NCBI, USA)에 등재된 자료를 이용하였고, 이블 Clustal W (EMBL-EBI, UK)를 이용한 multiple alignment를 통해 가장 변이가 많은 특이서열을 검색하였다. 그 결과, 본 연구에 사용된 Vibrio 속 세균들 상호간의 16S rRNA의 유전적 유사도는 모두 \(90 \sim 95 \% \) 정도였지만, 특이적으로 앞부분에 해당되는 \( 1 \sim 90~ \mathrm{bp} \) 와 \( 450 \sim 470 \mathrm{bp} \) 영역에서는 비교적 낮은 상동성을 나타내었다. 따라서 상기의 multiple alignment 자료를 토대로 Table 2 와 같이 specific primer set를 디자인하여 (주)바이오니아에 의뢰하여 제작하였고, PCR을 수행할 경우, 약 \( 400 \mathrm{bp} \) 크기의 PCR 산물이 나올 것으로 예상하였다.</p> <p>제작된 primer set를 이용하여 PCR을 수행하기 위헤 우선 Marine broth 2216 (Difco, USA)에 접종하여 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 하룻 밤 배양한 균체를 모은 다음, Genomic DNA extraction kit (K-3032, Bioneer, Korea)를 이용하여 PCR에 사용될 template를 준비하였는데, 그 과정은 다음과 같다. 먼저 \( 200 \mu \) 의 PBS로 균체를 현탁한 후, 단벽질 제거를 위해 \( 20 \mu \) 의 proteinase \( \mathrm{K}(25 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 와 \( 200 \mu \) 의 binding buffer를 첨가하여 혼합한 반응액을 filter tube에 옮긴 다음, 원심분리 (\( 12,000 \mathrm{rpm}\), \( 1 \mathrm{~min} \).)를 이용하여 DNA를 filter에 흡착시켰다. 그런 다음, \( 70 \% \mathrm{EtOH} \) 를 넣어 원심분리 (\( 12,000 \mathrm{rpm}\), \(1 \mathrm{~min} \). ) 하여 불순물을 제거하고, 최종 단계에서 멸균 증류수를 넣고 원심 분리 (\(12,000 \mathrm{rpm}\), \( 2 \mathrm{~min} \).)하여 DNA만을 회수하였다. 준비된 DNA의 \( \mathrm{PCR} \) 증폭반응을 위해 \( 100 \mathrm{pM} \) 의 각 primer, \( 0.2 \) \( \mathrm{mM} \) dNTPs, \( 1 \mathrm{U} \) Taq DNA polymerase, \( 2.5 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl} \) 가 포함된 혼합물에 template DNA \( 1 \mu \) 를 첨가한 충 \( 20 \mu \) 의 PCR reaction mixture를 GeneAmp 2400 (Perkin Elmer co.,\( \mathrm{USA} \) 에 넣어 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분, \( 54^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분, 그리고 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분간 30 cycle을 반복하는 조건으로 중폭시켰고, 증폭된 PCR product들은 모두 \( 1.5 \% \) agarose gel 상에서 전기영동을 실시하여 확인하였다. 중폭된 PCR product들을 확인한 결과, V. tapetis에 대해서만 예상되었던 \( 400 \mathrm{bp} \) 크기의 특이 밴드가 검출되었을 뿐 다른 종들에 대해서는 전혀 다른 크기의 non-specific band가 생기거나 또는 product가 전혀 생성되지 않는 것으로 보아 본 연구를 통해 제작된 PCR primer의 특이성을 확인할 수 있었으며, 증폭된 PCR product에 대해 염기서열분석을 실시한 결과, primer 제작 시 기초자료로 이용한 V. tapetis 16S rRNA sequence (accession no. AY129278)와 \( 100 \% \) 동일함을 확인하였다(data not shown).</p> <p>또한 본 PCR primer의 재현성을 검정하기 위해 \( V \). tapetis가 배양된 plate로부터 단일 colony를 따서 \( 5 \mu \) 의 멸균 증류수에 넣어 현탁하고 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 열처리한 다음, 상기의 \( \mathrm{PCR} \) 증폭과 동일한 조건으로 colony PCR을 실시하였다. 증폭된 PCR product들에 대해 \( 1.5 \% \) agarose gel 상에서 전기영동을 실시한 결과, 모두 \( 400 \mathrm{bp} \) 크기의 톡이 밴드를 확인할 수 있었다.</p> <p>현재 비브리오 속 세균은 약 45 종 이상으로 구분되고 있지만, 같은 종이라 할지라도 표현형이나 유전형이 다양하게 나타날 뿐 아니라, 해마다 신종의 해양 비브리오균이 보고되고 있어 실제 분리세균에 대한 정확한 동정을 하기에는 현실적인 어려움이 많다. 특히, 본 연구의 재료로 사용된 V. tapetis의 경우에는 까다로운 배양조건과 함께 생화학적 특성에 있어서도 일반 해수세균인 V. splendidus와 유사한 점이 많아 추후 수입 수산물의 검사나 양식 수산물의 질병발생 시, 많은 어려움이 예상된다.</p> <p>따라서 본 연구에서는 최근 세균 동정에 가장 많이 활용되고 있는 기법 중 하나인 16S rRNA를 이용한 종 동정을 통해 그 특이성을 확인하였으므로 V. tapetis의 신속 진단에 활용할 수 있을 것으로 예상된다. 그러나 16S rRNA는 계통발생학적으로 근연한 종간에는 그 유전적 다양성이 부족하다고 알려져 있으며, 계속적인 신종 비브리오균의 추가로 인해 본 연구에서 개발된 primer의 특이성도 한계가 있을 것으로 판단되어 추후 연구를 통해 16S-23S rRNA ISR이나 다양한 tRNA, 그리고 tet[11]와 \( \operatorname{aroA}[10] \) 같은 특이유전자 영역을 이용한 종 특이 marker의 개발이 계속되어야 할 것이다.</p>