본 실험에서 사용된 인삼은 국내산 고려인삼으로 충남 금산 지역에서 재배된 4년생 인삼을 구매하여 실험실에서는 2차 증류수로 2~3회 세척한 후 자연 건조하여 일반성분 분석을 위해 식품공전[18]에 기재된 방법을 사용하여 다음과 같이 측정하였습니다: 수분은 \( 105^{\circ} \mathrm{C} \) 상압가열건조법을, 조단백질은 semi-micro Kjeldahl법을, 조지방 함량은 Soxhlet법을, 조회분은 \( 550^{\circ} \mathrm{C} \) 직접 회화법을 이용하여 측정하였습니다. 이때, 추출액을 첨가하지 않고 동일한 조건에서 일정 시간 동안 배양된 시험 균액을 대조구(control)로 설정하여 비교 분석하여 대조구로는 추출물 대신 maintenance medium을 희석된 FCV와 혼합하여 비교 분석하였으며, 바이러스 감염가는 Reed-Muench method를 사용하여 CPE가 나타난 well의 희석 단계를 산정하여 \( \log \)\( \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \)로 표기하였습니다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료</h2> <p>본 실험에 사용된 인삼은 국내산 고려인삼으로 충남 금산 지역에서 재배된 4 년생 인삼을 구입하여, 실험실에서 2차 증류수로 2~3회 세척 후 자연 건조하였다. 건조된 인삼은 세근만을 분리하여 분쇄기로 마쇄하여 분말로 만들어 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하며 실험에 사용하였다.</p> <h2>사용 균주 및 전 배양</h2> <p>인삼 세근 발효를 위해 인삼의 배당체 분해에 적절한 세균 6 종, 곰팡이 1종, 효모 1종을 사용하였으며 이를 Table 1에 나타내었다. 본 실험에 사용된 곰팡이와 효모는 Potato dextrose broth (Difco, U.S.A.)와 Yeast Mold broth (Difco, U.S.A.)를 사용하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 150 \mathrm{rpm}, \) 48시간 동안 교반 배양 하였다. 유산균은 MRS broth (Difco, U.S.A.), 그 외 모든 세균은 Nutrient broth (Difco, U.S.A.)를 이용하여 \( 35^{\circ} \mathrm{C}, 150 \mathrm{rpm} \), 24 시간 동안 교반 배양 하였다.</p> <h2>일반성분 분석</h2> <p>일반성분 분석을 위해 식품공전[18]에 나와 있는 방법을 사용하여, 수분은 \( 105^{\circ} \mathrm{C} \) 상압가열건조법, 조단백질은 semi-mi- cro Kjeldahl법, 조지방 함량은 Soxhlet법, 조회분은 \( 550^{\circ} \mathrm{C} \) 직접 회화법으로 측정하였다. 탄수화물은 총 100 에서 수분, 조단 백질, 조지방 및 조회분을 뺀 값으로 계산하여 구하였다.</p> <h2>인삼 세근 발효를 위한 균주 선별 및 배지 제조</h2> <p>인삼 세근의 발효에 적합한 균주를 선별하기 위해 세근 분말 배지(DW \( 100 \mathrm{ml} \), 세근 분말 \( 5 \% \) 를 제조하여 Table 1에 표시된 각각의 발효 균주를 \( 1 \%(6.0 \log \mathrm{CFU} / \mathrm{ml}) \) 접종하고 전 배양과 동일한 조건으로 72 시간 배양하며 생균수 및 배양액의 항균성(paper disc)을 비교 분석하였다. 또한, 선정된 균주의 최적 발효를 위하여 세근 분말을 배지에 각각 \( 2.5 \sim 30 \% \) \( (\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 로 첨가하여 균주 선정과 동일한 방법으로 배양하며 생균수 및 배양액의 항균성(paper disc)을 평가하였다.</p> <h2>항균성 물질 추출법</h2> <p>발효 된 세근 분말 배지를methanol과 1:10 비율로 혼합하고 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3시간 동안 3회 교반 추출하여 이를 여과한 뒤 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 항온수조에서 rotary evaporator로 감압 농축하였다. 이를 di-methyl sulfoxide (DMSO; Kanto, Japan)에 녹인 후 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하여 항균성 및 항바이러스 활성 실험에 사용하였다.</p> <h2>추출물의 항균성 측정</h2> <p>추출물의 항균성 분석은 paper disc법과 shaking flask 법을 이용하여 Escherichia coli와 Staphylococcus aureus를 대 상으로 측정하였다. Paper disc법은 disc (\(8\ mm\); Tokyo, Japan)에 추출물을 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{disc} \) 로 흡수시켜 \( 35^{\circ} \mathrm{C}\), 24 시간 배양 후 clear zone의 직경을 측정하여 항균성을 평가하였다. Shaking flask법은 중화용액 (\( 0.2 \% \) Nutrient broth) 에 각각 5 \( \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 추출물과 초기 균수 \( 5.0 \log \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 정도의 시험균 (E. coli, S. aureus)을 접종하여 \( 35^{\circ} \mathrm{C}, 150 \mathrm{rpm} \) 으로 12시간 단위 로 두번 반응 시킨 후 pour-plate 법으로 균의 감소율을 확인하 였다. 감소율은 아래의 식으로 계산하여 항균활성을 측정하였다. 이때 추출액을 첨가하지 않고 동일 조건에서 일정시간 배양된 시험 균액을 대조구(control)로 비교 분석하였다. 모든 실험은 3회 이상 실시하여 이의 평균값을 도출하였다.</p> <p>Bacterial reduction rate \( (\%)=\{1-(\mathrm{Me} / \mathrm{Mc})\} \times 100 \) Me: Microorganism number of experiment Mc: Microorganism number of control.</p> <h2>추출물의 항바이러스 활성</h2> <p>추출물의 항바이러스 활성 분석을 위하여 \( 50 \% \) tissue culture infectious dose \( \left(\mathrm{TCID}_{50}\right) \) 방법으로 Feline calicivirus (FCV)의 감염가를 측정하였다. 숙주세포인 Crandall-reese Feline kidney cell (CrFK cell, ATCC CCL-94)은 2\% Fetal bovine serum (FBS), \( 100 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) Penicillin과 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) Streptomycin 이 포함된 Dulbecco modified eagle medium (DMEM)을 이용하여 96 well plate에 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2}, 48 \) 시간 배양하여 mono-layer를 얻었다. \( 5.0 \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \) 로 희석된 \( \mathrm{FCV} \) 와 추출물을 \( 1: 1 \) 로 혼합하고 실온에서 \( 1,6,12,24 \) 시간별로 반응하여 \( 50 \mu 1 \) 씩 4개의 well에 접종하고 90 분간 방치하여 \( \mathrm{FCV} \) 를 \( \mathrm{CrFK} \) cell에 감염시켰다. 그 후 growth medium을 aspirate로 제거하고 \( 100 \mu 1 \) 의 maintenance medium (DMEM \( +2 \% \) FBS)을 다시 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건으로 3 4일 배양하며 세포병변효과(cytopathic effects)를 현미경으로 관찰하였다. 배양이 완료되면 \( 3.4 \% \) formaldehyde 용액으로 cell을 고정하고 \( 0.1 \% \) crys-tal violet으로 가시화하였다. 이때 대조구로는 추출물 대신 maintenance medium을 희석된 \( \mathrm{FCV} \) 와 흔합한 것으로 비교 분석 하였고, 바이러스 감염가는 Reed-Muench method로 \( 50 \% \) 이상 CPE가 나타난 well의 희석단계를 산정하여 \( \log \)\( \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{ml} \) 로 표기하였다.</p> <h2>추출물의 HPLC 분석</h2> <p>인삼 세근 추출물의 분석을 위해 HPLC (High Performance Liquid Chromatography) 분석법을 사용하였다. HPLC장비는 Agilent 1100 (Agilent Tech, U.S.A.)를 이용하였으며, Column은 Shiseido \( \mathrm{C}_{18}(5 \mu \mathrm{m}, 4.6 \mathrm{~mm} \times 250 \mathrm{~mm} \), Japan)를 사용하였고, column 온도는 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 이다. 각각의 시료는 \( 10 \mu 1 \) 를 주입하였고, 이동상으로는 acetonitrile과 water를 사용하여 Table 2 와 같은 gradient 조건에 의해 \( 1 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 의 유속으로 총 65 분간 분리하였다. 분리된 추출물은 UV detector로 \( 203 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하여 표준물질과 비교 분석하였으며 표준물질인 ginseno-side Rg1, Re, Rb1, Rc, Rb2, Rd는 Extrasynthese S.A (France)에서 구입하였다.</p>