대장암 세포주 HCT116 및 p53-null HCT116에 대해 allicin 농도(\(25, 50, 100 \mu \mathrm{M}\)에 따른 24시간 처리 후 세포형태의 변화를 관찰하였다. 모든 세포주에서 allicin 처리에 따른 농도 의존적인 세포사멸이 확인되었다. 또한, allicin 처리에 따른 ATF3와 NAG1 유전자 발현에 대한 연구에서, ATF3는 allicin 농도에 따라 증가하였고, NAG1은 \(50 \mu \mathrm{M}\) allicin 처리에서 최고 발현을 보였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Allicin 처리에 의한 대장암 세포주 형태 변화 관찰</h2> <p>대장암 세포주 HCT116와 p53-null HCT116에 allicin 처리에 의한 세포의 형태적 변화를 확인하기 위하여 allicin을 농도별로(25, 50, 100 μM) 24시간 동안 처리한 후, 형태적 변화를 관찰하였다. 그 결과 두 세포주 모두 allicin 처리에 의해 농도 의존적으로 세포가 사멸됨을 확인하였다(Fig. 1A, B).</p> <h2>Allicin에 의한 HCT116 세포의 생존율 연구</h2> <p>Allicin 처리에 따른 대장암 세포주 HCT116의 생존율을 정량화 하기 위하여, MTT 용액을 이용하여 cell viability assay를 수행하였다. 즉, allicin의 최종 처리농도가 25, 50, 100 \( \mu \mathrm { M } \)이 되도록 처리한 후, 3시간, 6시간, 12시간 그리고 24시간 동안 배양하였다. Fig. 2A 에서와 같이, allicin을 대조군과 비교 하였을 때 모든 allicin 처리군에서 세포 생존율이 낮아짐을 확인하였다. 이러한 결과는 Fig. 1에서와 같이 allicin의 처리 농도가 증가됨에 따라 배양 dish에 고착되어 있는 세포 수가 줄어드는 것과 일치하는 결과이다. 한편, MTS 용액을 이용한 cell viability assay의 결과에서는 전혀 세포생존율의 변화가 관찰되지 않았다(data not shown). 이러한 연구결과는 allicin혹은 이의 대사물이 MTS 용액의 발색에 방해를 하는 것으로 생각된다. 한편, 이러한allicin에 의한 세포 생존율의 감소 원인을 확인하기 위하여 Hoechst 염색을 수행하였다. 그 결과 allicin 처리군에서 apoptosis 의대표적인 현상인 핵 condensation을 확인할 수 있었다(Fig.2B). 이러한 결과를 바탕으로 allicin 처리에 따른 암 세포 생존율의 감소의 원인을 유전자 발현 차원에서 확인하기 위하여 oligo DNA microarray 실험을 수행하였다.</p> <h2>DNA microarray를 이용한 유전체 전체 수준에서의 유전자 발현분석</h2> <p>HCT116 대장암 세포주에 allcin처리에 따른 차별적으로발현되는 유전자군을 선별하고자 oligo DNA microarray 실험을 수행하였다. HCT116 세포주에 \( 50 \mu \mathrm { M } \) Allicin을 24시간 동안 처리한 후, total RNA를 추출하여 사용하였다. 그결과 allicin 처리에 따른 발현양의 차이를 보인 유전자 중, 2배 이상 up-regulation된 유전자는 7,840개, 2배 이상 down-regulation 된 유전자는 10,010개로 각각 분류 되었다. Up-regulation된 유전자 중 일부를 Table 2에 나타내었다. 이중 ATF3(Activation Transcription Factor 3)는 전사조절인자로서 세포사멸과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다.</p> <h2>RT-PCR을 이용한 유전자 발현 분석</h2> <p>DNA microarray 결과를 입증하기 위하여 allicin에 의해 2배 이상 up-regulation된 유전자 중 ATF3 유전자와 항암 유전자인 NAG1 를 선택하여 RT-PCR을 수행하였다. Fig. 3에서 allicin을 농도 의존적으로 처리한 후, ATF3 와 NAG1 유전자 발현을 확인한 결과, ATF3 유전자는 처리한 allicin의 농도 의존적으로 증가됨을 확인하였고, 이에 반해 NAG1 유전자는 \( 50 \mu \mathrm { M } \) allicin의 처리구에서 가장 높은 발현을 보여주었다(Fig. 3).</p>