공시동물인 제주흑우와 한우로 부터 genomic DNA를 제공받거나 말초동맥에서 혈액을 채취하여 DNA를 분리하고 Indel marker의 선정 유전자형의 결정을 단백질 암호화 영역에서 삽입/결실 돌연변이를 보이는 영역을 탐색하였다. 유전자형 결정을 위한 중합효소연쇄반응을 통해 유전자형의 결정을 하고 9 종의 indel marker의 대립인자별 염기서열은 PCR 산물에 대한 sequencing 분석을 통해 결정하였으며 대립인자형의 품종별 출현빈도 분석을 하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>공시동물과 DNA 추출</h2> <p>본 연구에 이용한 제주흑우 \((n=160)\) 와 한우 \((n=152)\) 는 농촌진흥청 국립축산과학원 난지축산시험장(Subtropical Animal Experiment Station, National Institute of Animal Science, RDA; SAES)과 제주도 축산진훙원(Livestock Promotion Institute, Jeju-do)에서 보관중인 genomic DNA를 제공받거나 말초동맥에서 혈액을 채취하여 DNA를 분리하였다. Holstein \((n=54)\), Angus \((n=32)\), Charolais \((n=21)\), Hereford \((n=13)\) 등 은 SAES에서 제공받은 것을 이용하였으며, 한우는 경기도와 제주도에서 수집한 혈액에서 DNA를 분리하였다. 전혈에서 DNA 분러는 Sambrook 등[31]의 방법을 변형하여 수행하였으며, 분리한 DNA는 NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technology, USA)로 홉광도를 측정한 후 \( \mathrm{A}_{260} / \mathrm{A}_{280} \) 와 \( \mathrm{A}_{230} / \mathrm{A}_{280} \) 이 모두 \( 1.8 \) 이상인 DNA들을 \( 50-60 \mathrm{ng} / \) μl로 희석하여 PCR 반응의 주형으로 이용하였다.</p> <h2>Indel marker의 선정 유전자형의 결정</h2> <p>Indel marker의 고안은 National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) data-base 상에 보고된 Bovine Genome Project의 서열을 대상으로 소의 EST 염기서열을 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 이용하여 탐색한 후, 단백질 암호화 영역에서 삽입/결실 돌연변이를 보이는 영역을 탐색하였다. Indel marker는 삽입/결실된 서열의길이가 5-nt 이상, 50-nt 이하인 것만을 선별하였으며, 사전 연구를 통해 한우집단에서 다형성의 빈도가 높은 9 종의 indel marker들을 최종 선발하였다(Table 1). 선정된 indel marker의 유전자형 분석을 위해 Primer3 v.0.4.0 을 이용하여 유전자 증폭을 위한 primer를 고안하였다(Table 1).</p> <h2>유전자형의 결정</h2> <p>유전자형 결정을 위한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 반응은 \( 50 \mathrm{ng} \) 의 genomic DNA 용액에 \( 1 \times \) PCR buffer, \( 125 \mathrm{mM} \) dNTP, \( 0.3 \) unit Taq DNA polymerase (iNtRON Biotechnology, Korea)에 각각의 primer와 멸균 증류수를 첨가하여 최종 \( 20 \mu l \) 가 되게 하여 준비하였다. 준비된 반응액에 대한 PCR 증폭은 PTC-200 thermal cycler (Bio-Rad, \( \mathrm{USA} \) ) 상에서 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3분간 초기변성, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 45초-primer an-nealing 온도에서 45 초-72 \( { }^{\circ} \mathrm{C} \) 45초로 구성된 cycle을 40 회 반복 수행하고 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 최종 신장하였다. PCR 증폭 산물은 ethidium bromide \( (\mathrm{EtBr}) \) 가 함유된 2.0\% agarose 겔 상에서 전기영동하거나 \( 10 \% \) polyacrylamide gel 상에서 전기영동한 후 EtBr로 염색하여 결정하였다.</p> <h2>염기서열 분석</h2> <p>연구에 이용한 9 종의 indel marker의 대립인자별 염기서열은 PCR 산물에 대한 sequencing 분석을 통해 결정하였다. 유전자 PCR 산물에 전기영동 판독 후 결정된 insertion 동형접합자형, deletion 동형접합자형, 삽입-결실 이형접합자형에 해당하는 PCR 산물을 각각 3 개체씩 선발하고, PCR 산물을 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 주형으로 PCR primer를 이용하여 dye-termination 반응을 수행한 후, MegaBase1000(Amersham Pharmacia, USA)을 이용하여 염기서열을 결정하였고, 다시 BLAST 검색을 통해 GenBank database에 보고된서열과 비교하였다.</p> <h2>대립인자형의 품종별 출현빈도 분석</h2> <p>시험에 이용한 indel marker들의 대립인자형 분석에서 산출된 모든 좌위에 대한 적은 대립인자 빈도(minor allele fre-quency, MAF)와 관찰이형접합도(observed heterozygosity), 기대이형접합도(expected heterozygosity, \( \mathrm{He} \) ), 다형정보량(polymorphic information contents, PIC), \( X^{2} \) value, \( P \)-value, Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) 등은 CERVUS 3.0.3을 이용하여 분석하였다. \( x^{2} \) value는 Yates' correction을 이용하였고, \( \mathrm{HWE} \) 의 유의성은 Bonferroni correction을 이용하였다.</p>