본 논문에 의하면 \( \alpha \)-glucosidase 저해 활성 검정은 이미 보고된 바대로 4-nitrophenol- \( \alpha \)-D-glucopyranoside (Sigma-Aldrich, USA)를 기질로 사용하여 4-nitrophenol의 생성을 microplate reader model 550 (Bio-Rad, USA)으로 측정했다. 4-nitrophenol- \( \alpha \)-D-glucopyranoside를 기질로 사용하여 96 well plate에 phosphate buffer, 시료, yeast \( \alpha \)-glucosidase, 기질을 혼합하여 37\(^\circ \mathrm{C}\)에서 30분 반응시킨 후 microplate reader model 550로 4-nitrophenol 생성을 측정하였다.
<p>\( \alpha \)-glucosidase 저해 활성 검정은 이미 보고된 바대로 4-nitrophenol- \( \alpha \)-D-glucopyranoside (Sigma-Aldrich, USA)를 기질로 사용하여 4-nitrophenol의 생성을 microplate reader model 550 (Bio-Rad, USA)으로 측정하였다. 96 well plate에 phosphate buffer (25 mM, pH 6.8) \( 25 \mu \mathrm{l} \), 시료 \( 20 \mu \), yeast \( \alpha \)-glucosidase (Sigma-Aldrich, \( 1 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) ) \( 10 \mu \mathrm{l} \), 기질 \( (20 \mathrm{mM}) 20 \mu \mathrm{l} \)을 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시킨 뒤 \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{NH} \mathrm{N}_{4} \mathrm{OH} 50 \mu \mathrm{l} \)을 첨가하여 반응을 종료시킨 후 \( 405 \mathrm{~nm} \)에서 방출된 p-nitrophenol 양을 흡광계수 16,300 \( \mathrm{M}^{-1} \mathrm{~cm}^{-1} \)을 이용하여 계산하였다. \( \alpha \)-glucosidase 저해 활성은 \( (1-\mathrm{B} / \mathrm{A}) \times 100, \mathrm{~A} \)는 시료 대신 buffer를 첨가한 대조구의 \( \mathrm{p}- \) nitrophenol 생성량, \( \mathrm{B} \)는 시료 첨가 후 생성된 p-nitrophenol 양을 나타내며, 시료 농도에 따른 저해율의 분석에 의해 \( \mathrm{IC}_{50} \) (50\% 효소 활성 저해에 필요한 시료 양)을 결정하였다. 분리한 compound 1-4의 \( \mathrm{IC}_{50} \) 값은 각각 \( 25.3 \mu \mathrm{M}, 17.1 \mu \mathrm{M} \), \( 47.3 \mu \mathrm{M} \) 와 \( 35.1 \mu \mathrm{M} \) 로 모두 acarbose (115 \( \mu \mathrm{M}) \)보다 강한 활성을 나타내었다. Positive control로 사용한 acarbose와 활성 비교에 사용된 myricetin과 apigenin 등의 모든 제품들은 Sigma-Aldrich 회사에서 구매하여 사용 하였다.</p> <p>활성물질 compound 1-4의 구조는 UV spectrum (Shimadzu model UV-160, Japan), HRFAB-MS (JEOL JMS-AX505 HA, Japan), \( { }^{1} \mathrm{H} \) NMR, \( { }^{13} \mathrm{C} \) NMR, 2D COSY (Brucker AV 500 , USA) spectra 등을 근거로 결정하였다, compound 내 glycone moiety는 아래와 같이 산 가수분해 후 TLC을 실시하여 확인하였다. 시료 \( (1-2 \mathrm{mg}) \)을 \( 2 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} 1 \mathrm{ml} \)에 녹여 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 반응시킨 후 감압 건조하고 증류수 \( 1 \mathrm{ml} \)을 더해 ethyl acetate로 추출하였다. ethyl acetate층을 농축하여 TLC (silica gel \( 60 \mathrm{RP}-18 \mathrm{~F}_{254} \mathrm{~s} \), Merck, methanol: \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}=1: 1 \) )을 행하여 aglycone부분을 확인하고, 물 층은 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \)로 중화시킨 후 \( \mathrm{n} \)-butanol:acetone:pyridine: \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) (2:2:1:1, v/v/v/v) 용매계에서 Sigma-Aldrich에서 구입한 glucose, galactose, Xylose, arabinose와 fructose 등의 표준 당 시료와 함께 TLC (silica gel \( 60 \mathrm{~F}_{254} \), Merck)을 행한 후 aniline phthalate reagent로 발색하여 동정하였다,</p> <p>활성 compound 1은 HRFAB-MS에서 \( m / z 287.23[\mathrm{M}+\mathrm{H}]^{+} \) ion peak와 NMR data에 의해서 분자식이 \( \mathrm{C}_{15} \mathrm{H}_{10} \mathrm{O}_{6} \)로 동정되었다. \( { }^{1} \mathrm{H} \) NMR spectrum에서 aromatic methane signal \( \delta 8.06\left(2 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=9.2 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-2^{\prime}, \mathrm{H}-6^{3}\right) \)와 \( 6.89(2 \mathrm{H}, \mathrm{d} \), \( \left.J=9.2, \mathrm{H}-3^{\prime}, \mathrm{H}-5^{\prime}\right) \) 는 ring \( \mathrm{B} \) 의 1', 4'-disubstituted와 \( \delta \) \( 6.36(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=2.0 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-8) \)과 \( 6.16(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=2.0 \mathrm{~Hz} \), \( \mathrm{H}-6) \) signal들은 ring \( \mathrm{A} \)의 특징적인 meta coupled pattern을 나타내었다. \( { }^{13} \mathrm{C} \) NMR spectrum에서는 15 개의 carbon signal이 확인되었으며, DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) \( { }^{13} \mathrm{C} \) NMR 실험에 의해 carbon의 multiplicity, 즉 methyl, methylene, methine과 quarternary carbon 등을 확인하였다. \( \delta 178.0 \) peak는 conjugated ketone function이고 oxygenated quaternary carbon인 \( \delta 164.2 \) (C-7), \( 161.1 \) (C-5), \( 159.5 \) (C-4'), \( 156.7 \) (C-9), \( 147.2 \) (C-2)와 \( 134.0 \) (C-3), 2 quaternary carbons \( \delta 122.0 \) (C-1')와 \( 103.5 \) (C-10), 그리고 6 methine carbon \( \delta 129.9 \) (C-2'/6') \( 115.4 \)(C-3'/5'), \( 99.1 \) (C-6)와 \( 93.9 \) (C-8)으로 모든 carbon peak의 배정이 이루어졌다. 이상의 spectral 결과와 문헌 상 의 data와 비교하여 Compound 1은 3,5,7-trihydroxy-2-(4hydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one (kaempferol)로 동정 되었다.</p>