특정 지역 내 흙을 시료로 사용하여 배양 후 분리하고, 효소생산용 액체배지에서 진탕 배양하며 chitinase 생산균주를 분리하였다. 진탕배양한 용액을 원심분리 후 얻은 상층액을 조효액으로 사용하여 chitinase의 활성을 측정하였다. 단백질 정량은 bovine serum albumin을 표준 단백질로 하여 Lowry 법을 사용하였다. 이후, 분리 균주의 분류 및 동정을 조사하고 여러 조건을 고려하여 효소 생산의 최적 조건을 검토하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>Chitinase 생산균주의 분리</h2> <p>부산, 경남 일원의 논밭의 흙, 퇴비 및 바닷가 근처의 흙 등을 채집하여 시료로 사용하였다. 멸균수에 적당히 희석한 시료를 colloidal chitin을 함유한 고체배지에 도말한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 3일간 배양한 다음 colloidal chitin을 분해해서 투명환을 생성하는 colony를 순수 분리하였다. Colloidal chitin을 만들기 위해서 Jeuniaux의 방법을 따랐다. 1차로 순수 분리된 colony를 \( 1 \% \) colloidal chitin, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 0.5 \% \) peptone, \( 0.2 \% \) beef extract, \( 0.1 \% \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \), \( 0.1 \% \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 0.05 \% \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 를 함유한 효소생산용 액체배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rpm} \) 의 조건하에서 2~3일간 진탕 배양한 후 chitinase 활성을 측정하여 활성이 높은 균주를 2차로 분리하였다.</p> <h2>Chitinase 활성 측정 및 단백질 정량</h2> <p>Chitinase 활성 측정을 위해서 효소 생산 배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 200 \mathrm{rpm} \) 으로 48 시간동안 진탕배양한 호에 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심분리하여 상등액을 조효소액으로 사용하였다. 효소 반응은 \( \mathrm{pH} 7.0,100 \mathrm{mM} \) phosphate buffer에 현탁한 \( 1 \% \) colloidal chitin \( 1 \mathrm{ml} \) 에 조효소액 \( 1 \mathrm{m \ell} \) 을 가하여 총부피 \( 2 \mathrm{ml} \), 최종농도 \( 0.5^{\circ} \) 가 되도록 하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 동안 \( 150 \mathrm{rpm} \) 으로 진탕하면서 효소 반응을 시킨 후 끓는 물에 5분간 처리하여 반응을 정지시켰다. 반응 후 남아 있는 colloidal chitin을 제거하기 위허서 \( 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10분간 원심분리하여 DNS (dinitrosalicylic acid) 법으로 유리된 환원당을 정량하였다. 효소 1 unit는 1시간 동안 \( 1 \mu \mathrm{M} \) 의 N-acetyl-D-glucosamine을 생산하는 효소의 양으로 정하였다. 단백질량은 bovine serum albumin을 표준 단백질로 하여 Lowry 법으로 정량하였다.</p> <h2>분리균주의 분류 및 동정</h2> <p>분리 균주의 분류학적인 위치를 검토하기 위하여 형태학적, 배양학적, 생화학적인 제반 특성을 조사하였으며, 16S rDNA의 염기서열을 통해 National Center for Bio-technology Information (NCBI)의 gene bank database와 비교 분석하여 동정하였다.</p> <h2>효소생산 최적조건</h2> <p>분리 균주의 chitinase 생산을 위한 최적조건을 검토하기 위하여 탄소원, 유기질소원, 무기질소원, 무기염, 금속이온의 영향 및 각각의 농도와 초발 \( \mathrm{pH} \), 배양온도의 영향을 검토하고 최적조건에서 배양시간에 따른 균의 증식 및 효소 생산성을 검토하였다.</p> <h2>조효소액의 조제</h2> <p>효소생산 최적 조건에서 48시간 동안 배양한 배양액을 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 원심분리하여 상등액을 조효소액으로 사용하였다.</p>