본 연구에서는 국내산 방풍 및 식방풍 10종을 구입하여 UPLC-QTOF/MS, Waters ACQUITY I-Class UPLC, Waters Xevo G2-S QTOF MS, Waters UPLC I-Class 등을 사용하여 대사체 프로파일링 분석을 수행하였다. 건조분쇄된 방풍,식방풍 및 표준 생약 시료를 볼밀을 이용해 미세분말로 분쇄하였고, 시료를 50%MeOH 1mL로 추출하여 원심분리기를 통해 상등액을 얻은 후 0.2\(\mu\mathrm{m}\) 필터로 여과한 뒤 20배 희석하여 분석에 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>본 연구에서는 시중에서 건조된 상태로 유통되고 있는 국내산 방풍 및 식방풍을 각각 10 종을 구입하였으며, 국립원예특작과학원 약용작물과 박춘근 박사가 동정 및 기원을 확인하였다. 표본 시료(NIHHS19 -B1 , B2)는 국립원예특작과학원 인삼특작부에 보관되어 있다. 유통되는 시료를 확인하고자 식약치에서 분양받은 방풍(SADI 2008) 및 식방풍(PEJA 2012)을 분쇄하여 검증 시료로 사용하였다.</p> <h2>시약 및 기기</h2> <p>방풍과 식방풍의 대사체 프로파일링 분석은 UPLC-QTOF/MS를 이용하였다. UPLC 분석은 Waters ACQUITY I-Class UPLC (Waters Co., Milford, MA, USA)를 사용하였으며, TOF MS는 Waters Xevo G2-S QTOF MS (Waters Co.)를 사용하였다. 방풍과 식방풍의 지표성분 분석법 검증에 사용된 UPLC는 Waters UPLC I-Class (Waters Co.)를 사용하였다. 지표성분으로 사용된 표준물질, 5 -O-methylvisammioside (순도 99.6 \( \% \) )와 peucedanol (순도 98 \( \% \) ) 은 Chem Faces (Hubei, China)에서 구입하여 사용하였다. 분석을 위한 증류수, Methanol( \( \mathrm { MeOH } \)) 및 Acetonitrile 은 HPLC급 (Fisher Scientific Inc., Hampton, NH, USA)을 사용하였으며(순도 99.9 \( \% \) ), 그 외 사용된 시약 및 용매는 모두 일급 이상으로 사용하였다.</p> <h2>시료추출</h2> <p>건조 및 조분쇄 된 방풍, 식방풍 및 표준 생약시료를 볼밀(Retsch MM400 mixer mill, Haan, Germany)을 이용하여 미세분말로 분쇄하였다. 최적 추출 용매 조건을 위해 50, 70, 100 \( \% \) \( \mathrm { MeOH } \)를 이용하여 시료를 추출하고 물질들의 패턴을 비교하여 50 \( \% \) \( \mathrm { MeOH } \)의 조건을 최종 용매 조건으로 선정하였다. 시료 100 \( \mathrm { mg } \) 씩 \( \mathrm { mL } \) 튜브에 취하고 50 \( \% \) \( \mathrm { MeOH } \) 1 \( \mathrm { mL } \)을 더 한 후 초음파추출기를 이용하여 상온조건에서 60 분 동안 추출하였다. 이후 원심분리기를 이용하여 상등을 분리한 다음 (13,500 rpm, 5 min) 상등액을 0.2 \( \mu \mathrm { m } \)필터를 이용하여 여과한 후, 20배 희석하여 분석에 사용하였다.</p> <h2>대사체 프로파일링</h2> <p>방풍과 식방풍의 대사체 프로파일링 분석은 UPLC-QTOF/MS를 이용하였다. UPLC와 Q-TOF/MS는 각각 Waters ACQUITY I-Class UPLC에 Waters Xevo G2-S Q-TOF/MS가 부착된 장비를 사용하였다. UPLC 분석에 사용된 컬럼은 ACQUITY BEH C 18 column \( (2.1 \mathrm { ~mm } \times 100 \mathrm { ~mm } , 1.7 \mu \mathrm { m } ) \) 의 역상 컬럼을 사용하였으며 분석 시에 컬럼 오븐 내부의 온도는 30 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)를 유지하였다. 증류수(A)와 Acetonitrile (B)을 이동상으로 사용하였으며 기울기 조건은 5 \( \% \) 의 B를 10분 동안 20 \( \% \) 로 증가시키고, 이어서 7 분동안 70 \( \% \) 로 증가시키고, 이후 5분 동안 B 를 100 \( \% \) 까지 증가시킨 후 4분간 다시 5 \( \% \) 로 감소시켜 2분간 유지하였다. 이동상의 유속은 0.4 \( \mathrm { ~mL } / \mathrm { min } \) 을 유지하고 주입량은 2 \( \mu \mathrm { L } \) 이었다. Q-TOF/MS 분석은 ESI 소스의 Negative Mode조건하에서 실험하였으며 Capillary 전압과 Cone 전압은 각각 3.5 \( \mathrm { kV } \), 40 \( \mathrm { ~V } \) 로 분석하였다. Ion source와 Desolvation 온도는 각각 120,550 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 설정하였고, Desolvation 밋 Cone 가스의 유속은 각각 800 , 30 \( \mathrm { ~L } / \mathrm { h } \) 로 유지하였다. 대사체 분석을 위한 질량값 Scan 범위는 100-2,000 \( \mathrm { ~m } / \mathrm { z } \)이며, 질량값의 정확성을 위해 Leucine-enkephalin [ \( \mathrm { ~m } / \mathrm { z } \) 554.262 (ESI-)]을 내부 표준용액으로 사용하였다. 모든 MS 데이터는 \( \mathrm { MS } ^ {\mathrm { E } } \) mode로 분석하였으며 Masslynx (WatersCo.)를 이용하여 수집하였다.</p>