전염증성 사이토카인의 생성과 억제활성을 측정하기 위해 세포를 24-well plate에 8.0 \times 10 ^ { 4 }8.0×10 4 cells/well의 농도로 CO 2 ​ incubator 조건에서 하루동안 배양후 HCW0811와 LPS를 같이 처리하여 염증을 유발시켰다. 이후 원심분리를 통해 분리해낸 전염증성 사이토카인의 함량을 여러 실험방법을 통해 측정하였다. 그중 Western blot analysis방법을 이용했다. 그 방법은 cell을 6-well plate에서 CO 2 ​ incubator에서 하루동안 배양을 하고 HCW0811와 LPS를 같이 처리하여 염증을 유발시켰다.그 후 세포를 2회 세척한 후 lysis buffer를 처리하여 lysis를 진행, 원심분리를 통해 븐리하였다. 그후 SDS-PAG로 전기영동을 한 후 1차 항체반응, 2차항체반응을 실시하였다.
<h2>전염증성 사이토카인 (TNF- \( \alpha \), IL-6, IL-1 \( \beta \)) 생성 억제 활성 측정</h2> <p>264.7 세포를 24-well plate에 \( 8.0 \times 10 ^ { 4 } \) cells/well의 농도로 분주하여 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator \( \left (37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \right ) \) 조건에서 24 시간 배양한 후, 희석한 HCW0811 \( (12.5,25,50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \) 와 LPS \( (1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \)를 동시 처리하여 동일한 조건하에 24시간 동안 염증을 유도하였다. 이후 회수한 세포배양 상층액을 원심분리( \( 10,000 \mathrm { rpm } , 3 \) \( \mathrm { min } ) \) 하여 침전물을 제거하였으며 회수한 상등액 내에 존재하는 전염증성 사이토카인의 함량을 Mouse \( \mathrm { TNF } - \alpha \) ELISA Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), Mouse IL-6 ELISA Kit (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), Mouse \( \mathrm { IL } -1 \beta \) ELISA Kit (R \&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용해 측정 하였다.</p> <h2>Western blot analysis</h2> <p>RAW 264.7 cell을 6-well plate에 \( 4 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well의 농도로 분주하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 24시간 동안 전 배양 한 후, 희석 된 HCW0811 \( (12.5,25,50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \) 와 LPS (1 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) )를 동시 처리하여 동일한 조건하에 24시간 동안 염증을 유도하였다. 이후 세포를 PBS를 이용하여 2회 세척한 뒤, lysis buffer [1×RIPA (Upstate Cell Signaling Solution, NY, USA) \( 1 \mathrm { mM } \) phenylmethylsulfonyl fluoride, \( 1 \mathrm { mM } \mathrm { Na } _ { 3 } \mathrm { VO } _ { 4 } , 1 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { NaF } , 1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) aprotinin, \( 1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) pepstatin, and \( 1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) leupeptin를 처리하여 1시간 동안 lysis를 진행 하여 이후 원심 분리 \( (12,000 \mathrm { rpm } , 30 \mathrm { ~min } ) \) 과정을 거쳐 상층액과 pellet을 분리하였다. BCA kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 정량 한 \( 20 \mu \mathrm { g } \) 의 단백질을 \( 10 \% \) polyacrylamide를 함유한 \( 10 \% \) SDS-PAG에서 전기영동 한 뒤, poly-vinylidene difluoride membrane (Milipore, Burlington, MA, USA)에 전이하였으며, 전이가 종료된 membrane은 \( 5 \% \) skim milk (sol. TBST)에 넣고 상온에서 1시간 30분 동안 blocking을 시행하였다. 이후 TBST로 10분간 3회 세척한 뒤, 1차 항체 반응은 TBST로 희석된 iNOS antibody (1:1,000, Bio-Rad), COX-2 antibody (1:1,000, Rocklanc Immunochemicals, Inc. USA), phospho-ERK 1/2 antibody phospho-SAPK/JNK (Thr180/Tyr185) antibody, phospho-p38 antbody, \( \mathrm { I \kappa B } - \alpha \) antibody, phospho- \( \mathrm { NF } - \kappa B \) antibody (1:1,000, Cell signaling Tech, Danvers, MA, USA), \( \beta \)-actin antibody clone AC-74 (1:1,000, Sigma),에 담구어 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 하루 밤 동안 반응 하였다. 반응 후 TBST 용액으로 4회 세척한 membran을 horseradish peroxidase가 결합된 2차 항체 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)를 1:5,000 비율로 희석하여 90분동안 반응한 뒤 TBST로 10분간 3회 세척하여 ECL kit (Bio-Rad)로 반응시켰으며 imaging densitometer (model GS-700, Bio-Rad)를 통해 현상하였다. 또한 현상된 단백질 발현량은 imageJ program (NIH, Bethesda, MD, USA)을 통해 면적을 수치화하여 그래프로 나타내었다.</p>