\(5\mathrm{g}\)의 토양시료를 실험에 적합한 형태로 분리한 후 토양 genomic DNA의 농도와 물리적 손상도 측정 및 humic acid를 제거하였고 여러 가지 제한 효소를 처리하여 분자생물학적 기술의 적용 가능성을 검토하였다. 또한 분리된 토양 DNA의 PCR 적용 여부 확인을 위해 토양 미생물의 GAPDH 유전자를 기초로 primer를 디자인 하였다.
<h2>변형된 방법에 의한 토양 genomic DNA의 분리 (Me-thod III)</h2> <p>\( 5 \mathrm{~g} \)의 토양시료를 extraction buffer (\( 100 \mathrm{mM} \) Tris-HCl \( [\mathrm{pH} 8.0], 1.5 \mathrm{M} \mathrm{NaCl}, 100 \mathrm{mM} \) sodium EDTA \( [\mathrm{pH} 8.0], 1 \% \) CTAB, \( 100 \mathrm{mM} \) sodium phosphate \( [\mathrm{pH} \) 8.0]) \( 13.5 \mathrm{ml} \)과 50 \( \mu l \) proteinase \( \mathrm{K}(10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)로 현탁한 후, 30 분 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 교반하여 혼합해 주고, \( 10 \% \ \mathrm{SDS} 3 \mathrm{ml} \)을 넣고 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 반응시켰다. 원심분리 \( \left(4,000 \mathrm{rpm}, 10 \mathrm{~min}, 4^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 후, humic acid를 제거하기 위해서 \( 30 \% \) PEG 8,000 이 포함된 \( 1.6 \)\( \mathrm{M} \ \mathrm{NaCl} \) 용액을 전체 양의 1 / 2만큼 넣고 상온에서 2시간 반응시켰다. 원심분리 후 TE buffer \( 1 \mathrm{ml} \)로 현탁하고 3 M potassium acetate \( 200 \mu l \)를 넣어 얼음 안에서 5 분 동안 정치하였다. 원심분리 후, 동량의 phenol/chloroform/isoamylalcohol (25/24/1)를 넣고 vortex 한 뒤, 원심분리하여 상등액에 대해 0.6 volume의 isopropanol을 넣고 상온에서 2시간동안 침전시킨다. 원심분리 후, 침전물을 중류수 \( 500 \mu l \)에 녹이고 DNA의 농도를 측정하였다.</p> <h2>토양 genomic DNA의 농도 측정</h2> <p>각 방법을 통해 분리된 토양 DNA의 농도를 확인하기 위해 각 시료에 대해 증류수로 20 배 희석한 다음, UV-VIS spectrophotometer (Shimadzu UV-1201)를 사용하여 \( 230 \mathrm{~nm} \),\( 260 \mathrm{~nm}, 280 \mathrm{~nm} \)에서 각각 흡광도를 측정하였으며, 특히 방법 I에 의해 분리된 토양 DNA는 농도를 고려하여 \( 10^{2} \)배 혹은 \( 10^{3} \)배까지 희석하여 측정하였다.</p> <p>또한 토양에서 분리한 DNA 시료의 농도와 humic acid 제거 및 물리적 손상도를 측정하기 위하여 \( 0.8 \% \) agarose gel에서 전기영동을 실시하였다. 대조구로서 pWHM 3 vector \( 500 \mathrm{ng} \)을 1 / 3씩 희석하여 사용하였고 방법 I, II, III으로 각각 분리한 토양 DNA를 역시 증류수로 1 / 3씩 희석하여 확인하였다.</p> <h2>제한효소 처리</h2> <p>각 분리방법에서 분리한 genomic DNA를 여러 가지 제한 효소로 처리하여 분자생물학적 기술의 적용 가능성을 검토하였다. 각각의 DNA를 BamHI, EcoRI, HindIII 등의 제한효소를 처리하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 반응하여 절단되는지 여부를 \( 0.8 \% \) agarose gel에서 전기영동을 실시하여 확인하였다.</p> <h2>Polymerase Chain Reaction (PCR)</h2> <p>각 분리방법에서 분리한 토양 DNA의 PCR 적용 여부를 확인하기 위하여 토양에 존재하는 다양한 미생물의 Glyceraldehyde-3-phophate dehydrogenase (GAPDH) 유전자를 기초로 하여 primer를 디자인 하였다. PCR은 각각의 토양 DNA를 \( 10^{-2} \sim 10^{-5} \)의 농도로 1 / 10씩 희석하여 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 57^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분의 조건으로 30 cycle을 수행하였으며, 각 product를 \(2\%\) agarose gel에서 전기영동을 실시하여 product를 확인하였다.</p>