본 연구에서는 분양받은 180 여 종의 방선균을 사용하여 Streptomyces 선별 프라이머와 PCR을 통해 16S rRNA를 확보하고, 염기서열 분석을 수행한 뒤 paper disc를 이용하여 대장균에 대한 항생제 활성을 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>Bacterial strains, isolation of chromosomal DNA</h2> <p>본 연구에서는 한국생명공학원으로부터 분양 받은 계통학적으로 분류되지 않은 180 여 종의 방선균들을 사용하였으며, 모든 방선균은 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) R2YE 액체 배지에서 2~3일 동안 배양하였다. 방선균 염색체 DNA 추출을 위해 Practical Streptomyces genetics에 명시된 방법을 사용하여 total DNA를 추출하였다.</p> <h2>PCR-based streptomycetes genome screening</h2> <p>Streptomycetes 특이적인 \( 16 \mathrm{~S} \sim 23 \mathrm{~S} \) rRNA sequence 정보를 이용하여 Streptomyces 종만을 선별할 수 있는 screening primer 를 제작하였다. 제작된 primer의 염기 서열은 StrF: 5'-CGAAAGTCGGTAACACCCGAA-3', StrR: 5'-TCT-CAAACAACGACCARCC-3'이며, PCR은 각 균주들의 DNA를 주형으로 하여 진행되었다(final volume of \( 20 \mu \mathrm{L} \) con-taining \( 20 \mathrm{pM} \) of each primer, \( 0.25 \mathrm{mM} \) of each of the four deoxynucleosidetriphosphates (dNTPs, TaKaRa, Japan), \( 1 \mu \mathrm{L} \) of extracted DNA, \( 5 \mathrm{U} \) Taq polymerase (TaKaRa) with its recommended reaction buffer, \( 10 \% \) of dimethyl sulf-oxide (DMSO) and pure water up to \( 20 \mu \mathrm{L}) \). BIO-RAD C1000 Thermal Cycler를 이용하여 \( 15 \mathrm{~min} \) at \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) and 30 cycles of \( 45 \mathrm{~s} \) at \( 95^{\circ} \mathrm{C}, 45 \mathrm{~s} \) at \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) and \( 60 \mathrm{~s} \) at \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) followed by \( 10 \mathrm{~min} \) at \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 조건에서 진행되었으며, 얻어진 product는 \( 1.2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) agarose gels(stained with ethidium bromide)을 이용한 전기영동을 사용하여 확인하였다. PCR을 통해 Streptomyces 종으로 추정되는 균주들로부터 증폭 된 \( 387 \mathrm{bp} \) DNA 단편을 확인하였으며, 이 균주들은 희소방선균 선별에서 제외시켰다. 남아있는 방선균주에 대해 추가선균 선별에서 제외시켰다. 남아있는 방선균주에 대해 추가적으로 16S rRNA sequencing 을 진행하였으며, 이때 16S rRNA 증폭을 위해 사용된 primer는 16SF: 5'-AGAGTT-TGATCCTGGCTCAG-3', 16SR: 5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3' 이다. 추가적인 PCR을 통해 확보된 16S rRNA의 단편의 염기서열분석은 Macrogen사(Korea)을 통해 이루어졌다.</p> <h2>Anti-microbial and anti-fungal activity assays</h2> <p>대장균에 대한 항생제 활성을 확인하기 위해, paper disc 를 이용한 agar diffusion 방법을 사용하였다. 사용된 배지는 두 층으로 이루어진 배지로써, 첫 번째 층에는 15 \( \mathrm{mL} \) 의 LB 고체 배지(yeast extract \( 0.5 \% \), tryptone \( 0.5 \% \), \( \mathrm{NaCl} 0.5 \% \), agar \( 1.5 \%) \) 로 페트리디쉬의 아래쪽에 위치한다. 첫 번째 층이 굳으면, 충분히 식은 \( \left(35 \sim 5^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 멸균된 soft agar LB 고체배지에 \( 1 / 200 \) volume의 대장균을 첨가한 뒤 첫번째 배지 위에 부어주었다. 두 번째 층까지 모두 굳으면, 추출된 화합물이 포함된 지름 \( 6 \mathrm{~mm} \) 의 paper disk를 원하는 위치에 올려 놓고 하루 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양한 뒤 저해환의 생성여부를 확인하였다. 이와 유사한 방법으로 Candida albicans 는 YM 고체배지(yeast extract \( 0.3 \% \), malt extract \( 0.3 \% \), peptone \( 0.5 \% \), glucose \( 1.0 \% \), agar \( 1.5 \% \) )에서, Bacillus mycoides 는 Nutrient broth(beef extract \( 0.3 \% \), peptone \( 0.5 \% \), agar \( 1.5 \%) \) 고체배지에서 항생효과를 확인하였다.</p>