느타리버섯은 국내 버섯산업에 총 생산량과 소비량 상위권을 차지하며, 재배에 따른 고소득이 가능하여 농가에서 선호하는 작물이다. 박테리오파지는 바이러스의 종류 중 하나로서, 최근에는 다양한 항생제에 내성을 가져 세균의 출현에 따라서 기존 항생제에 대한 대체방안으로 연구의 중심이 된다. 또한, 분리한 파지는 파지테라피에 활용하기 위해 숙주균에 대한 민감도를 살펴보았으며 숙주균의 사멸효과가 높아 파지혼합액을 구성하는 파지 종류를 선택했다. 분리 된 저항성균주의 특징을 조사하려면 API kit를 이용해 생화학적 대사특성을 관측했다.
<h1>서 론</h1> <p>느타리버섯은 국내 버섯산업에서 생산량과 소비량 모두에서 상위권을 차지하고 있으며, 재배에 따른 고소득이 가능하여 농가에서 선호도가 높은 작물이다. 그럼에도 불구하고 세균성갈반병의 빈번한 발생은 느타리비섯의 재배를 어렵게 하고 있다. 느타리버섯의 갈반병을 예방하기 위하여 농용 지하수를 철저히 살균하거나, 재배사를 훈증소독하고 비닐멀칭이나 봉지, 병을 이용한 재배 방법 등이 다양하게 개발되어 왔음에도 현재까지 효과적인 예방이나 방제방법은 개발되지 못하였고, 발병시에 대책은 없는 실정이다.</p> <p>박테리오파지(bacteriophage)는 바이러스의 한 종류로서, 최근 다양한 항생제에 내성을 가진 세균의 출현에 따라 기존 항생제의 대체방안으로 연구의 중심이 되고 있다(Housby와 Mann 2009; Lu와 Koeris 2011). 항생제의 과다사용과 항생제 저항성 유전자의 전이, 세균의 진화에 따른 항생제 내성균의 생성과 항생제 저항성의 증가는 새로운 향균물질을 필요로 하고 있고, 박테리오파지나 항세균성 펩티드, 단백질, 나노입자 등이 개발되고 있다. 이들 중 박테리오파지는 기본적으로 자체 독성이 없기에 2000년 이후 미국 및 유럽의 산업체에서 제품화되어 이용되고 있으나(Abedon과 Tho nas-Abedon 2010), 파지의 생태학적, 생물학적 이해가 부족하여 파지테라피에 대한 부정적 견해와 사용상의 약점도 커져왔다(Skurnik와 Strauch 2006). 파지에 대한 꾸준한 연구로 파지의 생태가 밝혀지고 있고, 숙주균 범위의 제한성, 제품화, 임상적 처리방법 등의 발전에 따라 파지관련 생산품들이 FDA, USDA, EPA 등에시 사용허가를 받았고(FDA 2006), 대장균이나 살모넬라 균 등 병원성 세균을 방제하기 위한 파지관련 생산물들이 개발되고 있다(Abuladze 등, 2008).</p> <p>본 연구에서는 갈반병이 발생한 느타리버섯 재배농가에서 병원성 균주들을 분리동정하여 분류하였고(Yun 등, 2013; Mu 등, 2015), 이들을 억제하는 독성파지를 재배사 인근이나 농가 인근의 하수에서 분리하였다. 분리한 파지는 파지테라피에 사용하기 위하여 숙주균에 대한 민감도를 조사하였고, 숙주균의 사멸효과가 높은 파지혼합액을 구성할 파지 종류를 선정하였다. 파지는 갈반병 균주에 매우 특이적으로 작용하였고 살균효과가 뛰어나 파지테라피를 위한 유용한 균주로 확인되었다. 하지만, 파지와 숙주균의 배양시간이 길어짐에 따라 파지에 대하여 저항성을 갖는 균주가 나타났기에, 원래의 숙주균과 여기서 발생한 파지저항성 균주들의 특성조사를 위하여 유전자적, 생화학적, 병원성의 차이를 조사하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>파지저항성 균주의 분리</h2> <p>파지저항성 균주는 갈반병 원인균주 Pseudomonas tolaasii를 Pseudomonas agar F (Bacto-peptone \( 10 \mathrm { ~g } \), Bacto-tryptone \( 10 \mathrm { ~g } \), \( \mathrm { K } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } 1.5 \mathrm { ~g } , \mathrm { MgSO } _ { 4 } 1.5 \mathrm { ~g } \), glycerol \( 10 \mathrm { ~mL } \), agar \( \left .15 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \right ) \) 평판배지 위에 도말한 뒤 파지를 점적하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 48시간 동안 배양하며, 용균반 내부에서 발생한 콜로니에서 분리하였다.</p> <h2>생화학적 대사 측정</h2> <p>분리한 저항성균주의 특성을 조사하기 위하여 API kit(Biomérieux, Paris, France)를 이용하여 생화학적 대사특성을 측정하였다. 측정방법은 제조사의 지침을 따랐으며, 간략히 저항성 균주의 콜로니를 분리하여 현탁하고, \( \mathrm { NO } _ { 3 } \)부터 PNPG까지 8개의 큐플의 아랫부분에 주입하였다. 이 중 GLU, ADH, URE는 무기오일을 첨가하여 혐기성 조건으로 만들어줬다. 나머지 측정의 경우는 균주 균질액을 큐플의 윗부분까지 채워준 후 키트를 \( 29 \pm 2 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간동안 배양하고 지침에 따라 결과를 판정하였다.</p> <h3>버섯조직함몰 검정법</h3> <p>버섯조직 함몰검정(pitting test)은 Gandy (1968)의 방법에 따라 양송이버섯을 이용하여 실시하였다. 양송이버섯은 갓 부분을 절단하여 사용하였다. 비섯의 갓 위 부분 \( 1 / 3 \)을 절단하고, 절단면에 균주의 배양액( \( 10 ^ { 8 } -10 ^ { 9 } \) cfu/mL)이나 tolaasin 주출액 \( 10 \mu \mathrm { L } \) 점적하여 흡수시켰다. 이것을 증류수로 적신 여과지를 깔아준 사각플라스틱는 용기(square dish)에 담아 12-24시간 동안 항온기에서 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 배양하였다. 버섯을 넣은 후에는 밀봉하여 수분 증발을 방지하였다. 최종적인 평가는 점적부위의 변색과 함몰을 관찰하여 이루어졌다.</p>