T. thermophilus HJ6 염색체로부터 클로닝한 유전자가 trehalose synthase(TtTS)를 암호화한다는 가정하에 생물정보학 분석이 수행되었다. 해당 유전자의 존재는 초음파로 파쇄한 세포를 SDS-PAGE로 분석함으로써, 대략 \(110 \mathrm{kDa}\) 크기의 밴드에서 확인되었다. 또한, 균주 HJ6의 동정은 16s rRNA 염기서열(Genebank accession no. DQ647385)의 분석과 NCBI의 BLAST 프로그램을 이용한 상동성 분석 결과, \(99.7\%\)의 신뢰도로 Thermus thermophilus로 결정되었다. 이 균주의 생리 및 생화학적 성질은 T. thermophilus의 유연균으로 분류되어, 이를 바탕으로 균주를 Thermus thermophilus HJ6으로 최종적으로 동정하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>고온성 균주의 분리 및 동정</h2> <p>일본 Arima 온천지대에서 채취한 시료의 온도는 \( 92.8^{\circ} \mathrm{C} \)이고 \( \mathrm{pH} \) 는 6.8이었다. 시료는 재료 및 방법에서 언급한 것과 같이 배양하여 한 종류의 균주(HJ6)를 얻을 수 있었다. 분리균주 HJ6은 호기성으로 고체배지 상에서의 colony 형 태는 원형에 가깝고 색깔은 노란색이었으며 표면은 볼록하고 매끄러운 상태였다. 이 균주는 Fig. 1의 전자현미경 사진에서 제시된 것과 같이 길이 \( 2 \sim4 \mu \mathrm{m} \), 직경 \( 0.4 \mu \mathrm{m} \) 의 간균이고, 그람음성, 편모가 없으며 포자를 형성하지 않았다. 분리균주 HJ6의 생리적 특징은 Table 1에서와 같이, 생육가능 \( \mathrm{pH} \) 가 6.0~7.5(최적 \( \mathrm{pH} \) 6.5)이고 생육가능온도는 \( 80 \sim 95^{\circ} \mathrm{C}( \) 최적온도 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) )이며, galactose, ribose, lactose, raffinose와 같은 당을 이용하지 못하여 Thermus thermophilus HB8 균주 [3]과 유사한 특징을 나타내었다. 균주 HJ6을 동정하기 위하여 16s rRNA 염기서열(Genebank accession no. DQ647385) 을 분석하고 NCBI의 BLAST program을 이용하여 상동성을 분석한 결과 \( 99.7 \% \)의 신뢰도로 Thermus thermophilus 로 동정되었고, 생리 및 생화학적 성질이 T. thermophilus의 유연균으로 분류되어, 최종적으로 본 균주를 Thermus thermophilus HJ6으로 동정하였다.</p> <h2>Trehalose synthase 유전자의 클로닝</h2> <p>T. thermophilus HJ6 균주로부터 trehalose synthase의 유전자를 클로닝 하기 위하여 이미 게놈 염기서열이 밝혀진 \( T \). thermophilus HB8과 T. thermophilus HB27의 trehalose synthase 유전자 염기서열을 바탕으로 primer를 설계하고, PCR 기법을 이용하여 trehalose synthase를 암호화 하는 것으로 예상되는 유전자를 클로닝 하였다. 클로닝 된 유전자의 open reading frame(ORF)는 \( 2898 \mathrm{bp} \) 의 길이로 975 아미노산을 암호화하고 있었다. 예상된 분자량은 110,560 Dalton이고, 둥전점은 5.68이었다. Fig. 3에서는 클로닝 된 유전자로부터 예상되는 아미노산 서열과 상동성을 가지는 단백질을 대상으로 alignment를 작성하였다. 클로닝 된 유전자는 Thermus caldophilus 유래의 trehalose synthase(NCBI accession No. AAD50660)와 높은 상동성(99\%)을 나타냈고, Meiothermus ruber의 것(No. ACA35051)과는 83\%의 비교 적 높은 상동성을 나타냈다. 또한, Salinibacter ruber DSM 13855 유래의 trehalose synthase(No. ABC44183)와는 \( 72 \% \), Candidatus Desulforudis audaxviator MP104C 유래의 것(No. ACA59364)과는 \( 65 \% \) 의 상동성을 나타냈다. 이와 같은 생물정보학 분석을 통하여 T. thermophilus HJ6의 염색체로부터 클로닝 한 유전자는 trehalose synthase (TtTS)를 암호화하는 것으로 예상되었다.</p> <h2>E. col로부터 trehalose synthase의 생산</h2> <p>온도 감수성 프로모터(Tandem promoter)를 포함하는 pJLA503 벡터시스템을 이용하여 TtTS 유전자를 클로닝 하고 plasmid pJLA-TS로 명명하였다. 여기서 효소 생산을 위한 숙주균으로는 E. coli BL21(DE3) codon plus 균주를 사 용하였다. TtTS 유전자에는 대장균에서 잘 사용되지 않는 rare codon을 다수 가지고 있기 때문에 rare tRNA 합성효소 가 보강된 codon plus 균주를 사용하였다. Plasmid pJLA-TS로 E. coli \( \mathrm{BL} 21(\mathrm{DE} 3) \) codon plus를 형질전환하고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하여 세포성장이 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도가 0.5~0.6에 도달하였을 때 온도를 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 로 올려 단백질의 생산을 유도하 였다. 배양한 세포를 초음파로 파쇄하고 SDS-PAGE로 분석 한 결과, 약 \( 110 \mathrm{kDa} \) 부위에서 trehalose synthase의 밴드가 확인되었다. 이 밴드의 분자량은 trehalose synthase의 아미노산 서열에서 계산된 분자량과도 일치하였다. 초음파 파쇄액은 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20분간 열처리한 후, 재료 및 방법에서 서술한 바와 같이 정제하고 SDS-PAGE 상에서 단일 밴드를 확인하였다. 이렇게 정제된 trehalose synthase는 효소의 특성 분석에 사용하였다.</p>