호중구의 세포사멸은 염색법으로 측정해볼 수 있는데 AEBSF를 처리했을 때 세포사멸의 정도가 아주 많이 감소하였으므로 AEBSF는 호중구의 세포사멸을 억제한다고 할 수 있다. 호중구의 세포사멸 동안 활성이 증가하는 caspase는 zVAD-fmk와 AEBSF 둘 모두에 의해 억제되고, serine protease는 AEBSF 처리 에서만 활성이 억제되었으며, GM-CSF 처리는 세포 사멸에 큰 영향을 주지 못했다. 따라서 AEBSF이 호중구의 세포 사멸 억제에 가장 효과적이라고 할 수 있다.
<h1>결 과</h1> <h2>호중구의 자연 세포사멸예 대한 AEBSF의 영향</h2> <p>호중구의 세포사멸을 관찰할 수 있는 방법은 여러 가지가 있으나 가장 특징적이고 간단하게 확인할 수 있는 방법은 Giemsa 염색을 통한 형태학적 관찰 방법이다. 이 방법은 세포사멸이 일어나는 동안 핵이 농축되고 그 후 분획되며 세포질에 액포가 나타나는 것이 다른 세포와 비교해 확연히 나타나는 호중구의 특징을 이용한 것이다[22]. 호중구를 분리하여 배양 상태에서 20 시간이 지나면 \(60\sim70\%\)의 세포는 핵의 응축 등 세포사멸의 형태를 보이나 \( 800 \mu \mathrm{M} \) 의 AEBSF를 처리하였을 때 형태적으로 \( 80 \% \) 의 세포가 대부분 정상으로 유지되었다(Fig 1A). Fig. 1B에서와 같이 이러한 세포사멸의 정도를 annexin V와 PI 염색으로 관찰하였을 때도 AEBSF를 처리한 경우에는 처리하지 않은 대조군에 비하여 세포사멸의 정도가 현저히 감소하는 것으로 나타났다 \( (78.0 \pm 0.5 \% \) vs. \( 4.0 \pm 0.5 \%, P<0.005) \). 이러한 결과는 호중구의 자연 세포사멸이 AEBSF에 의하여 억제된다는 것을 제시한다.</p> <h2>AEBSF에 의한 호중구의 자연 세포사멸 유도에서 caspase와 serine protease 활성의 변화</h2> <p>호중구의 자연 세포사멸 동안에는 caspase와 serine protease 활성이 증가한다[12]. 따라서 pancaspase 억제제인 zVAD-fmk와 serine protease 억제제인 AEBSF를 각 \( 100 \mu \mathrm{M} \) 과 \( 800 \mu \mathrm{M} \)의 농도로 처리하고 20시간 배양한 후, Giemsa 염색을 통한 세포 수, protease의 활성과 caspase-3의 활성을 비교하였다. zVAD-fmk와 AEBSF를 처리하고 함께 배양하였을 때 사멸된 세포는 모두 \( 10.0 \pm 0.5 \% \) 로 현저하게 감소함으로써 두 억제제는 20시간 배양한 세포에서 거의 같은 정도의 세포사멸 억제 효과를 나타내었다(Fig. 2A). 말초 혈액으로부터 분리한 신선한 호중구는 caspase-3와 protease의 활성을 거의 나타내지 않았지만 20시간 배양 후에는 두 가지 활성 모두 증가하였다. 이들 배양 세포들에서 나타나는 caspase- 3 의 활성은 zVAD-fmk와 AEBSF에 의하여 모두 억제되는 것과 비교하여 protease의 활성은 AEBSF에 의해서만 효과적으로 억제되었다(Fig. 2B).</p> <h2>GM-CSF와 AEBSF에 의해 세포사멸이 지연된 호중구에서 수지상 세포 표면 마커의 발현</h2> <p>세포사멸을 지연시킬 뿐만 아니라 수지상 세포로의 분화제로 가장 많이 사용되어 지고 있는 GM-CSF[1,7,11]와 AEBSF의 세포사멸과 수지상 세포의 표면 마커의 발현 정도에 대한 영향을 비교하여 측정하였다. Fig. 3에서 나타낸 바와 같이 GM-CSF나 zVAD-fmk를 단독 처리하였을 때 배양 후 1일에는 세포사멸이 \( 30 \% \) 정도로 억제되었으나 배양 3 일 후부터는 대부분의 세포는 세포사멸이 일어나 형태적으로 관찰되어지는 정상 세포는 극히 적었다. 그러나 AEBSF 단독 처리만으로도 배양 3일과 5일에도 호중구의 세포사멸은 \(20\sim30\%\) 로 억제되었다. AEBSF와 zVAD-fmk를 처리한 배양 조건에서 GM-CSF를 함께 처리한 세포에서 세포사멸 정도룰 비교하여 보았을 때 AEBSF와 zVAD-fmk에 의한 세포사멸의 정도는 GM-CSF에 의하여 큰 영향을 받지 못하였다. 따라서 serine protease를 사용한 억제 조건이 호중구의 세포사멸을 지속적으로 억제한다는 것을 알 수 있다.</p> <p>다음으로 AEBSF와 GM-CSF에 의해 세포사멸이 효과적으로 억제되는 1 일 그리고 비교적 세포사멸 억제능이 감소하지만 여전히 \( 80 \% \) 이상 살아 있는 호중구가 존재하는 3 일째와 5 일째 배양한 세포에서 수지상 세포 표면 마커의 발현 정도를 측정하였다. 배양 1 일과 3 일째 모두에서 CD80, CD83 및 MHC class II의 발현이 모두 증가하였는데 이들 중 MHC class II의 증가는 CD80과 CD83에 비교하여 낮은 정도의 발현 증가를 보였다. 그러나 배양 후 5일에는 배양 후 3일째와 비교하여 이들의 발현은 모두 감소하였다. 수지상 세포 표면 마커가 가장 많이 발현되는 3일째에 AEBSF의 단독 처리와 GM-CSF와 AEBSF의 병용 처리하였을 때 마커의 발현 정도를 비교하였다. AEBSF 단독 처리한 세포들에서 수지상 세포 표면 마커의 발현은 신선한 호중구와 비교하여 그다지 높지 않았으나 AEBSF와 GM-CSF를 함께 처리한 세포에서는 모두 높게 발현되었다(Fig 4B). AEBSF와 GM-CSF를 처리한 세포에 추가적으로 IL-4, IFN \( \gamma \), 및 TNF- \( \alpha[25] \) 를 함께 처리하였을 때도 발현의 정도는 AEBSF와 GM-CSF를 처리했을 때와 거의 유사하였다(결과 미제시).