항진균성 물질 생성에 영향을 미치는 배양온도와 pH를 조사하기 위해 길항균을 다양한 조건의 배지에 접종하여 배양하고, 그 후 무균 여과액을 이용해 항진균 활성을 살펴보았다. 배양온도 조사를 위해서는 길항균을 TS broth와 PD broth에 접종한 후 \(20^{\circ}C\)에서 \(60^{\circ}C\)까지의 다양한 온도에서 배양하였고, pH 조사를 위해 \(1N\) NaOH와 \(1N\) HCl을 이용하여 \(pH 3\)에서 \(pH 11\)까지 조정된 PD broth에 접종하여 균사 생장 억제 여부를 관찰하였다. 배양시간에 따른 균 생육도 조사를 위해 PD broth를 최적 pH로 조정하고, 길항균을 \(1\%\) 접종한 후 최적온도에서 배양하였다. 이후, 3시간 간격으로 배양액을 회수하여 원심분리(\(70,000 \times g\), \(4^{\circ}C\), \(20min\))하였고, 이를 통해 얻은 배양 상등액을 \(0.22 \mu m\) membrane filter로 무균 여과하여 항진균 활성을 측정하였다. 또한, steam 살균을 통해 제거된 배양배지를 이용하여 큰 규모의 배양도 실시하였으며, 이를 위해 \(5\ell\) jar fermenter에 \(3\ell\)의 배양액을 접종하여 배양하였다. 마지막으로, 동일한 배양배지를 사용한 jar fermenter 배양에서는 삼각플라스크 배양액을 이용해 접종하였다.
<h2>질소원의 영향</h2><p>최소배지에서 yeast extract를 제외시키고 최적 탄소원을 넣어 준 후 yeast extract, peptone, tryptone, corn steep liquor, \( \mathrm{CO}\left(\mathrm{NH}_{2}\right)_{2}\),\(\left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4}\), \(\mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl}^{2}\), \(\mathrm{KNO}_{3} \) 등 각종 질소원을 \( 0.3 \% \)씩 첨가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일간 균을 배양한 후 탄소원의 경우와 동일한 방법으로 항진균 활성물질 생산에 대한 질소원의 종류 및 농도를 결정하였다.</p><h2>무기염의 영향</h2><p>최소배지에서 무기염을 제외시키고 앞에서 결정한 탄소원과 질소원을 최적농도로 첨가한 후 \( \mathrm{BaCl}_{2}\), \(\mathrm{MgCl}_{2}, \mathrm{MnCl}_{2} \), \( \mathrm{ZnCl}_{2}\), \(\mathrm{HgCl}_{2}\), \(\mathrm{CuSO}_{4}\), \(\mathrm{FeCl}_{3}\), \(\mathrm{CaCl}_{2}\) 등 8종의 무기염을 \( 0.1 \% \) 농도로 넣고 상기와 같은 방법과 동일하게 항진균성 물질 생산에 미치는 무기염의 종류 및 농도의 영향을 조사하였다.</p><h2>배양 온도 및 초기 \(\mathrm{pH}\) 의 영향</h2><p>길항균의 항진균성 물질생성에 미치는 배양온도의 영향을 조사하기 위하여 길항균을 TS broth (\( \mathrm{pH} 7.0\))와 PD broth (\(\mathrm{pH} 6.8\))에 접종하여 배양온도 \( (20,25,30,32,35 \), \(37,40,45,50,55,60^{\circ} \mathrm{C} \))를 달리하여 배양한 다음 배양 상등액으로부터 무균 여과액을 조제하여 항진균 활성을 조사하였다. 길항균의 항진균성 물질생성에 미치는 \( \mathrm{pH} \)의 영향을 조사하기 위하여 \( 1 \mathrm{N}\) \(\mathrm{NaOH} \)와 \( 1 \mathrm{N}\) \(\mathrm{HCl} \)로 \( \mathrm{pH}\) \(3\sim 11\)로 조정된 PD broth에 접종하여 배양한 후 각각의 배양상등액으로부터 회수한 무균여과액으로 모잘록병균의 균사 생장억제 유무를 관찰하였다.</p><h2>배양 시간의 영향</h2><p>배양시간에 따른 균 생육도를 조사하기 위하여 PD broth를 최적 \( \mathrm{pH} \)로 조정한 후 길항균을 \( 1 \% \) 접종하고 최적온도에서 진탕 배양하면서 3시간 간격으로 배양액을 회수하고 원심분리 (\( 70,000 \times \mathrm{g}\), \(4^{\circ} \mathrm{C}\), \( 20 \mathrm{min} \))하여 얻어진 배양 상등액을 \( 0.22 \mu \mathrm{m} \) membrane filter로 무균여과한 다음 항진균 활성을 조사하였다.</p><h2>Jar fermenter (\(5 \ell\)) 배양</h2><p>Jar fermenter ((주)한국발효기상사, 용량 \( 5 \ell \), 원지름 \( 20 \mathrm{cm} \), 높이 \( 25 \mathrm{cm} \), baffle \( 10 \times 2 \mathrm{cm} \)개 부착, impeller \( 1 \times 5 \) \( \mathrm{cm} \) *형) 배양은 상기 플라스크 배양에서와 동일한 배지를 살균하여 사용하였고, \( 3 \ell \) 배지에 종균은 삼각플라스크 배양액 (\(50\mathrm{m \ell}\), \(1.4 \times 10^{8} \mathrm{cfu}\) / \(\mathrm{m} \ell\))을 사용하였다. 공기 주입량은 각각 \( 1 \sim 3 \mathrm{vvm} \), 교반 속도는 각각 \( 100 \sim 400 \mathrm{rpm} \)으로 등구간 설정하여 72시간 동안 배양 기간별 균체 성장 및 길항물질 생산능을 조사하였다.</p><h2>대량배양 (\(2,000 \ell\))</h2><p>대량배양기(제작, 용량 \( 2,000 \ell \), 원지름 \( 2.0 \mathrm{m} \), 높이 \( 2.5 \mathrm{m} \), baffle \( 30 \times 90 \mathrm{cm} \) 4개 부착, impeller \( 10 \times 1.5 \mathrm{m} \) *형) 배양은 토양미생물제제 생산을 대량생산할 목적의 일환으로 배양하였다. 배양조건은 상기와 같은 배양배지 \( 1,800 \ell \)를 steam 살균한 후 상기 \( 5 \ell \) jar fermenter 배양액 (\(3 \ell\), \( 2.0\times10^{8} \mathrm{cfu} / \mathrm{m} \ell \))을 종균으로 접종하여 배양하였다. 이때 공기 주입량은 \(30\mathrm{vvm}\), agitater 교반 속도는 \(200 \mathrm{rpm}\)으로 임의 설정하였고 초기 \( \mathrm{pH} \)는 \( 8.0 \), 배양온도는 \( 32^{\circ} \mathrm{C} \)로 하여 10일간 배양 기간별 균의 성장 및 길항물질 생산능을 조사하였다.</p>