Bioreactor에서 식물세포배양 시에는 먼저 생장속도를 고려해야 한다 식물세포는 미생물, 효모, 동물보다 느리고 생장속도는 산소소비속도에 의해 좌우되므로 최소임계 용존산소량을 유지해주어야 한다. 또한 배양 중 배지로 분비되는 단백질 분해효소는 목적 단백질의 생산성에 큰 영향을 미치므로 다양한 첨가제를 사용하여 이를 억제하지만 이 첨가제들은 대부분 고가이기 때문에 최근에는 산업적 적용이 가능한 배양 중 pH 제어 또는 생산과 동시에 분리하는 연구가 진행되고 있다. 배양중 세포벽의 다당류에 의해 형성되는 세포응집체는 영양분과 산소 농도의 구배를 형성하고 불균일한 환경을 야기하기 때문에 이를을 제거하기 위해서 배양시 점도, 혼합, 물질전달, 전단속도와 생장 속도의 상관관계를 이해하고 최적화해야 한다. 거품은 발효 및 배양공정에서 나타나는 일반적인 현상이나 거품층에 갇힌 세포는 영양분과 산소 결핍으로 인해 부산물을 분비하거나 각종 내부장치에 눌러붙어 생산성에 영향을 미친다. 따라서 이를 제거하기 위해 교반과 통기를 조절하거나 거품판을 이요하여 거품을 줄일 수 있지만 과도한 거품시에는 거품생성억제제를 사용해야 한다. bioreactor 배양의 경우에는 hydro-dynamic 환경으로 인해 세포에 영향을 끼치기 때문에 플라스크 결과의 재현이 어렵다. 따라서 교반 및 통기속도를 산소를 포함한 물질 전달이 충분히 이루어지는 최소범위에서 수행하는 것이 좋으며, 성공적인 scale-up을 위해서는 세포주 및 세포으집체 등의 크기 및 형태차이에 대한 이해가 필요하다.
<h1>Bioreactor에서 식물세포배양 시 고려사항</h1><h2>생장속도</h2><p>바이오의약 단백질을 상업적으로 생산하는 경우, 식물 세포의 느린 생장속도와 생산된 단백질이 배지로 분비된 단백질 분해효소에 의해 분해되는 것은 반드시 해결되어야 할 문제이다. 일반적으로 식물세포의 doubling time은 20~100시간으로 알려져 있으며, 미생물의 30분~1시간, 효모의 2~3시간, 동물세포의 24시간보다 상대적으로 느린 편이다. 식물세포의 생장속도는 배양기간을 결정하므로, 생장속도가 빠른 담배 BY-2세포가 재조합 단백질 생산을 위해 많이 쓰이고 있다 (Shinmyo et al. 1998). 벼 세포의 경우에는 doubling time이 1.5~6일으로 상대적 으로 느림에도 불구하고 식물세포 중 생산성이 가장 높은 시스템으로 많은 연구가 진행되고 있다 (Terashima et al. 1999; Lee et al. 2007). 생장속도는 주로 산소소비속도 (oxygen uptake rate, OUR)에 의해 크게 좌우된다. 배양생 장기에 따라 세포당 산소소비속도도 다르기 때문에 세포가 생장에 저해를 받지 않도록 최소임계 용존산소량 \(15\sim 20\%\) 이상을 유지해주는 것이 중요하다.</p><h2>단백질 분해</h2><p>세포 밖으로 분비된 목적 단백질은 여러 가지 기작에 의해 그 안정성이 낮아져 생산성에 커다란 영향을 끼친다. 이런 단백질의 안정성에 영향을 미치는 요인으로는 발현되어 배지로 분비된 단백질 자체의 구조적 특징에 의한 불안정성이나 단백질의 응집에 의한 불안정성이 있으며, 특히 배지내의 단백질 분해효소에 의한 목적 단백질의 분해는 생산성에 가장 큰 영향을 미치게 된다 (Wang et al. 2002). 식물세포의 경우 단백질 분해효소에 의해 생산된 단백질이 분해되므로 젤라틴과 같은 몇몇 gelling agent나 dimethyl sulphoxide (DMSO), 알부민, polyvinylpyrrolidone (PVP) 등 다양한 첨가제를 이용하여 분해를 억제한 보고가 있다 (Doran 2006). 또한 단백질 분해효소 억제제를 이용하여 단백질 분해효소 활성을 낮춤으로써 목적 단백질의 생산성을 높이는 연구도 보고되었다 (Gotoh et al. 2001). 그러나 젤라틴이나 알부민의 경우 동물유래 물질이고 단백질 분해효소 억제제들은 대부분 고가이므로 산업적 적용이 어렵다. 최근 bioreactor 배양 중 pH 제어를 이용하여 단백질 분해효소의 활성을 낮추거나, 생산과 동시에 분리하는 in situ protein recovery와 같은 산업적 적용이 가능한 연구가 진행 중에 있다 (Huang et al. 2009; Doran 2006).</p><h2>세포응집화 (aggregation) 및 rheological 특성</h2><p>대부분의 식물세포배양시, 작게는 \(50\mathrm{mm }\)에서 크게는 \(1\mathrm{cm}\) 수준까지, 다양한 크기의 세포응집체 (aggregate)를 형성하게 된다. 세포응집체는 생장 시 분열된 세포가 분리되지 못하여 형성되며, 이는 세포밖에 존재하는 세포벽의 다당류에 의해 형성된다고 여겨지고 있다 (Taticek et al. 1991). 일단 세포응집체가 만들어질 경우 내부에 영양분 농도구배가 형성되어, 세포의 분화를 촉진하거나 이차대사산물의 생산을 유도한다. 재조합 단백질 생산 측면에서, 세포응집화는 영양분 및 산소구배 형성과 bioreactor 하부의 세포침전은 불균일한 환경을 야기하기 때문에 불리하다. 세포의 분리를 위해 교반속도를 높이거나, pectinase나 cellulase를 첨가한 보고가 있었으나, 각각 세포사멸 유발과 고가로 인해 산업적 적용이 어렵기 때문에, 이에 대한 개선이 필요한 실정이다.</p><p>세포응집화를 비롯한 식물세포의 형태학적 특성, 세포 농도, 배양액의 삼투압이나 분비된 다당류는 배양액의 유동학적 특성에 영향을 미친다. 이런 특성은 세포배양 공정을 개발하거나 고려해야하는 중요한 특성이며 bioreactor 배양시 배양액의 점도, 혼합, 물질전달, 전단속도와 생장 속도간의 상관관계를 이해함으로써 최적의 배양 및 생산조건을 확립해야한다 (Williams et al. 2000; Raposo and Lima-Costa 2006).</p><h2>거품형성과 wall growth</h2><p>거품의 생성은 발효 및 배양 공정에서 일반적인 현상이다. 거품유발물질로는 단백질이나 지방, 다당류 등이 있으며 거품생성정도는 통기속도, 배양액 점도, 세포농도, 배지성분 등에 의해 좌우된다. 식물세포의 경우 거품은 배양초기와 후반에 주로 형성되며 배양초기에는 높은 당농도와 세포분열 중에 생성된 다당류로 기인하고, 배양후반에는 주로 세포가 죽으면서 나오는 단백질, 지질, 다당류에 의한 것으로 알려져 있다 (Williams et al. 2000). 생성된 거품층에 갇힌 세포는 영양분 및 산소결핍으로인해 단백질 분해효소나 부산물을 분비할 수 있으며 죽은 세포가 두꺼운 층을 형성하여 bioreactor 내부벽면이나 교반기, 거품 분쇄판 (foam breaker), 각종 전극이나 포트 표면에 늘러 붙게 된다. 이는 공정 전반적으로 세포의 생장이나 생산성에 영향을 미치게 되므로, 거품의 형성을 억제하는 것이 중요하다 (Zhang et al. 1992).</p><p>거품의 형성을 억제하기 위해서 주로 화학적인 실리콘 계열 거품생성억제제 (antifoam)들이 사용되며 이는 거품의 표면장력을 완화시켜 제거하게 된다. 과도한 거품생성억제제는 기체의 표면적을 증가시켜주지만 액체 상에서의 물질전달을 크게 감소시켜, 전체적으로는 산소전달계수 \( \left(k_{\mathrm{L}} \mathrm{a}\right) \) 의 감소를 초래하므로 세포생장에 안 좋은 영향을 미칠 수 있다. 거품을 억제하기 위한 다른 접근 방법으로는 물질전달에 문제없는 최소한의 교반과 통기를 하거나, 배양액 상부로 산소를 공급하거나, 순산소의 넣어주는 방법도 적용되고 있다. 또한 배양액 상부에 기계적 거품 분쇄판의 설치하는 방법으로 거품생성을 줄일 수 있지만 과도한 거품생성시에는 거품생성억제제의 사용도 병행되어야 한다 (Bohme et al. 1997; Abdullah 2000).</p><h2>전단력 민감성</h2><p>플라스크에서 얻은 생장 및 생산결과를 stirred tank bioreactor에 적용할 경우 재현성 있는 결과를 얻기 어려우며 가장 큰 이유는 bioreactor 배양의 경우에는 hydro-dynamic 환경이 세포에 영향을 주기 때문이다. 일반적으로 bioreactor에서는 생산수율이 낮아지고 세포 생장기간이 단축되는 결과를 보여주는데, 특히 식물세포에 경우에는 단단한 세포벽이나 세포응집체의 형성, 대수증식기 후반이나 정체기 초반에 비대해진 세포내 액포에 의해 다른 세포주보다 에 더 민감하다고 알려져 있다. 이는 주로 교반기의 기계적 교반과 공기분사기 (sparger)에 의한 통기에 의한 것이다. 교반속도와 통기속도는 물질 전달 및 산소전달이 충분히 이루어지는 범위에서 최소화하는 것이 좋다. 일반적으로 세포배양에서 알려진 전단력에 의한 세포 손상은 bioreactor 내 형성된 난류 (tur-bulent flow) 맴돌이, 세포와 세포, 교반기, 방해판 (baffle) 등과의 충돌, 배양액 표면의 기포의 파열, 공기분사기로부터 나오는 기포의 흐름 등에 의해서 이루어진다. 식물세포의 경우 세포주마다 세포응집체의 크기 및 형태 차이가 있을 뿐 아니라, 같은 세포주이더라도 생장 중에 크기가 바뀌기 때문에 전단력이 식물세포에 미치는 영향에 대한 기작은 아직 정확히 알려지지 않았다. 몇몇 연구에서 전단력에 대한 세포수준에서의 반응 (세포 생존도, 호흡률 측정, 세포 형태변화)을 확인하였으며 (Sowana et al. 2001), 식물세포를 이용하여 바이오의약 단백질을 생산할 경우 성공적인 scale-up을 위해서는 이에 대한 명확한 이해가 필요하다.</p>