BV2 세포를 \(37^{\circ}\mathrm{C}\), \( 5\% \mathrm{~CO}_{2} \) 조건에서 DMEM 배지에 \(10\%\mathrm{FBS}\)와 \(1\%\) penicillin-streptomycin을 첨가하여 배양하고, LPS \((500\mathrm{ng/ml})\)를 처리하여 24시간 배양하여 mRNA 발현 분석과 단백질 발현 분석을 수행하였다. MTT assay에 의한 세포독성 조사, RT-PCR에 의한 mRNA의 분석, Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석, NO 농도 및 Cytokine를 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료</h2> <p>본 실험에 사용된 파(A. fistulosum) 추출물은 인제대학교 식품영양학과에서 공급받았으며, 세포 배양에 사용된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fatal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin은 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. mRNA 발현 분석을 위해 사용된 primer (Bioneer, Taejeon, Korea)는 Table 1에 표기하였으며, 단백질 발현 분석에 쓰인 모든 1차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 제품을 사용하였고, anti-rabbit 및 anti-mouse 2차 항체는 Amersham Life Science Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다. 별도 표기하지 않은 모든 시약은 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.</p> <h2>세포 배양</h2> <p>본 실험에 사용된 BV2 세포는 인제대학교 의과대학 면역학 교실로부터 제공받아, DMEM 배지에 \(10\%\mathrm{FBS}\)와 \(1\%\) penicillin-streptomycin을 첨가하여 \(37^{\circ}\mathrm{C}\), \( 5\% \mathrm{~CO}_{2} \) 조건에서 배양하였다. 모든 실험에서 BV2 세포는 다양한 파 추출물을 각각 1시간 선처리한 후 LPS \((500\mathrm{ng/ml})\)를 처리하여 24시간 배양하였다.</p> <h2>MTT assay에 의한 세포독성 조사</h2> <p>세포 배양용 6 well plate에 BV2 세포를 \(6\times 10^{5}\mathrm{cells/well}\)로 분주하여 24시간 안정화시킨 후, 파 전체 열수 추출물(water extract from the whole A. fistulosum, WEWA), 파 전체 에탄올 추출물(ethanol extract from the whole A. fistulosum, EEWA), 파 뿌리 열수 추출물(water extract from the root of A. fistulosum, WERA) 및 파 뿌리 에탄올 추출물(ethanol extract from the root of A. fistulosum, EERA)을 각각 농도별로 1시간 선처리 후 LPS를 후처리하여 24시간 배양하였다. 그 후 배지를 모두 제거하고, tetrazolium bromide salt (MTT)를 \(0.5\mathrm{mg/ml}\) 농도로 희석하여 well 당 \(1\mathrm{ml}\) 씩 분주하였다. 2시간 배양 후 상층액을 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO)로 formazin을 모두 용해시켜 96 well plate에 \(200\mathrm{\mu l}\) 씩 옮긴 다음 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>RT-PCR에 의한 mRNA의 분석</h2> <p>상기와 동일 조건에서 배양된 세포를 모아서 TRIzol re-agent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)에 lysis 시켜 total RNA를 분리하고, 정량을 통해 동량의 RNA를 준비한 후 iNOS, COX-2, TNF-\(\alpha\), IL-\(1\beta\), IL-6 및 glyceraldhyde-3-phos-phate dehydrogenase (GAPDH)의 primer, EPC water, ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 각각 혼합하여 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)로 증폭시켰다. 그 후 \(1\%\) agarose gel에 ethidium bromide (EtBr)를 첨가하여 굳힌 다음, 각 sample을 동량 loading하여 \(100\mathrm{~V}\)에서 전기영동시킨 후, UV 하에서 mRNA 발현의 차이를 비교하였다.</p> <h2>Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석</h2> <p>준비된 세포들을 모아서 lysis buffer [\(25 \mathrm{mM}\) Tris-Cl (\(\mathrm{pH} 7.5\), \(250\mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}\), \(5\mathrm{mM}\) EDTA, \(1\%\) NP-40, \(1\mathrm{~mM}\) pheny-methylsulfonyl fluoride (PMSF), \(5\mathrm{~mM} \) dithiothreitol (DTT)]에 1시간 가량 lysis시켰다. 그 후 Bio-rad 단백질 정량 시약과 그 사용방법을 따라 정량 후, Laemmli sample buffer (Bio-rad)를 동량으로 섞어 SDS-polyacrylamide gel에 loading한 후 \(90\mathrm{~V}\)로 전기영동으로 분리하고, electroblotting을 통해 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)에 옮긴 다음, \(5\%\) skim milk로 1시간 동안 blocking하고 \(4^{\circ} \mathrm{C}\)에서 1차 항체를 붙여 1시간 이상 반응시켰다. 그 후 PBS-T로 수차례 세척하고 상온에서 1시간 동안 2차 항체를 붙인 후 다시 PBS-T로 세척하고 암실에서 Enhanced Chemilunimoecence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp.)에 반응시킨 후 X-ray 필름에 감광시켰다.</p> <h2>NO의 측정</h2> <p>Griess assay를 통하여 \(\mathrm{NO}\) 생성량을 측정하였다. 이를 위해 세포 배양용 6 well plate에 상기한 방식으로 세포를 배양한 후, 각 well에서 상층액을 \(100\mathrm{\mu l} \)씩 회수하여 각각 Griess reagent [\(1\%\) sulfanilamide, \(0.1\%\) N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride, \(2.5 \%\) \(\mathrm{H}_{3}\mathrm{PO}_{4}\)] \(100\mathrm{\mu l}\)와 혼합하여 96 well plate에 분주하였다. ELISA reader \((540\mathrm{~nm})\)를 사용하여 흡광도를 측정한 후, sodium nitrite \((\mathrm{NaNO}_{2})\)의 standard curve를 바탕으로 \(\mathrm{NO}\) 농도를 계산하였다.</p> <h2>Cytokine의 측정</h2> <p>세포 배양용 6 well plate에 상기한 방식으로 세포를 배양한 후, 각 well에서 상층액을 회수하였다. 상층액 내 TNF-\(\alpha\)와 IL-6의 양은 각각 R&D System Inc (Minneapolis, MN, USA)에서 구입한 Fluorokine MAP Mouse IL-6 kit와 Fluorokine MAP Mouse TNF-\(\alpha\) kit를 사용하여 제시된 방법에 따라 처리한 다음, ELISA reader로 흡광도를 측정한 후 standard curve를 바탕으로 TNF-\(\alpha\)와 IL-6의 생성량을 계산하였다.</p> <h2>통계 처리</h2> <p>모든 실험결과는 평균\(\pm\)표준편차로 표시하였고 SigmaPlot을 이용하여 Student \(t\)-test를 이용하여 통계적 유의성을 얻었다.</p>