본 연구에서는 M. aeruginosa의 무균분리를 위해 멸균증류수 세정법, phenol 처리법, penicillin G 항생물질 첨가법 그리고 phenol과 penicillin G 혼합법을 통해 시료에 부착된 세균을 제거하였으며, 이후 항생제를 첨가해 aeruginosa의 증식은 가능하게 하나 오염세균은 억제하며 배양을 진행하였다. 이렇게 무균분리된 M. aeruginosa에 대해 DNA 추출이 진행되었으며, 현장시료에 많이 분포하는 primer 작성을 위해 남조류의 16s rRNA종을 비교 분석하였다. 이후 PCR 진행하여 PCR 산물 획득하였고, 전기 영동을 통해 \( 943 \mathrm{bp} \) band 형성 유무를 확인했다. 염기서열분석은 위 산물에서 plasmid DNA를 추출하여 DNA Analyzer를 통해 결정하였다.
<h2>M. aeruginosa의 무균분리</h2> <p>먼저 Microcystis sp. 이외의 다른 부유물질을 제거하기 위해 \( 60 \mu \mathrm{m} \) 망목으로 시료를 거른 후 현미경으로 군체의 형태 및 세포의 크기, 이형세포의 위치 등을 분류 key로 하여 관찰한 결과 조류 우점종은 Microcystis aeruginosa로 동정되었다. 배양 배지는 CB배지로 \( \mathrm{pH} \)를 9.0으로 조정하여 사용하였다.</p> <p>시료중의 M. aeruginosa에 부착되어 있는 세균들을 많이 탈락시키기 위하여 우선 멸균증류수 세정법, phenol 처리법, penicillin G 항생물질 첨가법 그리고 phenol과 penicillin G 혼합법을 사용하여 암실에서 1시간 방치하였다. 그리고 많은 수의 집락들을 서로 분리하기 위하여 vortex, ho-mogenize 그리고 lysozyme (\(20 \mathrm{mg} / \mathrm{m \ell}\)) 처리를 시간별로 비교하였다.</p> <p>이렇게 전처리한 시료는 각종 항생제에 의한 M. aeruginosa의 증식에는 영향을 미치지 않으면서 오염세균들은 억제시킬 수 있는 농도를 조사하기 위하여, 전 배양한 M. aeruginosa \( 10 \mathrm{m} \ell \)를 multi-well plate에 분주한 후 항생제 종류별로 \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m} \ell \) 농도까지 첨가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), \(40 \mu \mathrm{mol}\) \(\mathrm{m}^{-2} \mathrm{~s}^{-1} \) 광 조건으로 1일간 정치 배양한 후 \( m \ell \)당 세포수를 측정하였다. 각 항생제 농도에 따른 성장곡선에서 MNLC (maximum non-lethal concentration, 즉 생육에 영향을 미치지 않는 범위 내에서의 최대농도), \( \mathrm{LC}_{50} \) (lethal concentration 50, 즉 \( 50\% \) 생육 저지농도), MLC (minimum lethal concentration, 즉 \( 100 \% \) 생육저지 범위 내에서의 최소농도) 농도를 결정하였다.</p> <p>무균상태의 M. aeruginosa 집락을 분리하기 위하여 사용된 고체배지는 CB배지에 6종류의 고형화 gelling agent를 농도별로 비교하여 가장 집락 형성에 좋은 gelling agent를 엽록소 \( \mathrm{a} \) 함량 측정으로 비교 선정하였다. 형성된 집락을 최종적으로 무균 상태 인지의 여부확인은 우선 백금이로 각 집락을 취해 CB액체배지 (\(5 \mathrm{~m} \ell\))에서 같은 조건으로 2주 동안 배양하였다. 오염여부를 현미경으로 확인한 후 액체배지 (\(100 \mathrm{m \ell}\))에 다시 접종하여 동일한 조건으로 대량 배양하였다. 배양된 M. aeruginosa를 Nutrient agar, Potato dex-trose agar와 Tryptone broth agar 고체배지에도 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\), 10일 동안 배양한 후 최종적으로 세균 오염여부를 확인하였다.</p> <h2>DNA의 추출 및 정제</h2> <p>무균적으로 분리한 Microcystis aeruginosa의 DNA를 추출하기 위하여, 배양한 Microcystis aeruginosa 세포 \( \left(2 \times 10^{5} \sim\right. \)\( \left.10^{7}\right) \)를 \( 6000 \mathrm{rpm} \)으로 원심분리하여 수거하였다. 이를 Lysis Buffer (\( 0.01 \mathrm{M} \) Tris(\( \mathrm{pH} ~7.8 \)), \( 0.005 \mathrm{M} \) EDTA, \(0.5\%\) SDS) \( 500 \mu \ell \)에 Proteinase \( \mathrm{K}\)(\(20 \mathrm{mg} / \mathrm{m} \ell\))를 최종농도 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m} \ell \)이 되도록 넣고 잘 섞은 후 \( 56^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간이상 반응시켰다. 반응 후 각 튜브에 동량의 phenol을 넣고 30초간 조심스럽게 inver-ting하고, 30초간 정치시켰다. \( 12,000 \mathrm{rpm}\), 15분간 원심 분리하여 상등액을 조심스럽게 새로운 튜브로 옮겨, 여기에 \(1:1\)이 되도록 phenol과 chroloform을 첨가하여 잘 섞은 후 \( 12,000 \mathrm{rpm}\), 15분간 원심 분리하여 상등액을 새로운 튜브로 옮겼다. 동량의 chroloform을 첨가하여 잘 섞은 후 \(12,000 \ \mathrm{rpm}\), 15분간 원심분리 하였다. 상등액을 취하여 \( 1 / 10 \)부피의 3M sodium acetate를 넣고, 2.5배의 ethanol을 넣고 1시간이상 침전시켰다. \( 12,000 \mathrm{rpm}\), 10분간 원심 분리하여 상등액을 제거하고 \( 70 \% \) ethanol을 넣고 세척하여 이를 PCR의 주형으로 사용하였다.</p> <p>남조류의 염기서열분석을 위한 primer쌍은 현장시료에 많이 분포하는 특이적인 primer를 작성하기 위하여, Gene Bank상에 나와있는 20여 가지의 남조류의 16s rRNA종을 비교 분석하여 primer를 작성하고, 이를 CJM198F, CJM1141R로 명명하였다. 이 두 가지의 primer를 PCR에 사용하였다.</p> <h2>PCR 증폭</h2> <p>PCR 반응액은 총 \( 100 \mu \ell \) volume {DNA (\( 1\)-\(100 \mathrm{ng} \)), 10x re-action buffer, \( 1.5 \mathrm{mM} \) \(\mathrm{MgCl}_{2} \), primers (CJM198F, CJM1141R 각각 \( 50 \mathrm{pmol} / \mu \ell\)), \(5 \mathrm{U}/\mu \ell \) Taq polymerase (Takara사)이 되도록 하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 56^{\circ} \mathrm{C} \)에서 45 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 45초 동안 40번을 반복시켜 PCR 산물을 얻었다. PCR 반응 결과 생겨난 산물을 \( 1 \% \) agarose gel에 전기 영동하여 약 \( 943 \mathrm{bp} \) band 형성 유무를 확인하였다.</p> <h2>염기서열분석</h2> <p>위에서 얻은 PCR 산물을 pT7-blue T Vector (Takara)에 cloning하고 plasmid DNA를 추출하여 DNA autoseque-ncer ABI PRISM 3700 DNA Analyzer를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 염기서열의 분석은 Gene Bank에 의뢰하여 기존에 알려진 남조류들의 염기서열과 그 유사성을 비교하였다.</p> <h2>균주보관</h2> <p>무균적으로 분리한 M. aeruginosa는 \(-70^{\circ} \mathrm{C} \)에 동결 보존시켜 두었다가 실험시 계대 배양하여 사용하였다.</p>