연구에서는 약용과 식용으로 사용하고 있는 오미자의 분획물에서 활성분획추적법을 통하여 활성 성분을 분리하고, 혈관내피세포 증식, 생존 조절과 항염증 효과를 검증하여, 허혈성질환의 예방과 치료에 사용 가능한 활성분획, 효능성분을 추출하고자 한다. LPS를 통하여 자극한 HUVEC에서 세포부착분자(cell adhesion molecule)의 발현을 감소시키는 오미자 hexane 추출물을 발견하기 위하여, HUVEC에 LPS (200 ng/ml) 처리 2시간 전, 오미자 분획물을 6시간 동안 처리하고, RT-PCR을 통하여 염증반응의 매우 중요한 매개인자이자 대표적인 세포부착분자인 in-tracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) 및 vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)의 발현정도를 관찰하였다.
<p>따라서 본 연구에서는 약용 및 식용으로 사용되는 오미자의 분획물에서 활성분획추적법에 의해 활성 성분을 분리하고, 혈관내피세포 증식, 생존 조절 및 항염증 효과를 검증함으로써,허혈성질환의 예방 혹은 치료에 이용될 수 있는 활성분획과 효능성분을 발굴하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>오미자로부터 활성물질의 분획화</h2> <p>문경에서 재배한 오미자 열매를 동로농협으로부터 구입하여 사용하였으며, 시료의 추출 및 분리 용매로는 특급 또는 일급의 hexane, chloroform, methyl chloride, methanol 및 acetone 등을 사용하였다. 물질의 순수분리는 open column chromatography를 사용하였으며, 분획을 확인하기 위한 thin layer chromatography (TLC)는 TLC silica gel \( 60 \mathrm { ~F } _ { 254 } (20 \times 20 \) \( \mathrm { cm } \), Merk)를 사용하였다.</p> <h2>오미자 분획물에 의한 혈관내피세포의 증식조절효과 분석</h2> <p>오미자 hexane 추출물이 사람배꼽정맥내피세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs, Lonza, Walkersville, MD, USA)의 증식률에 미치는 효과를 분석하기 위해서, HUVEC에 오미자 분획물을 \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도로 처리 후 24시간 또는 48 시간 배양하여 WST-1 assay를 실시하였다.</p> <h2>오미자 분획물에 의한 혈관내피세포의 생존조절효과 분석</h2> <p>오미자 hexane 추출물이 HUVEC의 생존률에 미치는 효과를 분석하기 위해, HUVEC을 혈청이 포함되지 않은 배지로 교환하여 \( 1 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) 의 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)와 오미자 분획물을 \( 50 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) 의 농도로 처리하고 24 시간 배양하였다. 24시간 후 WST-1 assay로 세포의 생존률을 측정하였다.</p> <h2>LPS로 자극한 혈관내피세포에서 오미자 분힉물의 세포부착분자 및 사이토카인 mRNA 발현 조절 효과</h2> <p>LPS로 자극한 HUVEC에서 세포부착분자(cell adhesion molecule)의 발현을 감소시키는 오미자 hexane 추출물을 찾기 위하여, HUVEC에 LPS (200 ng/ml) 처리 2시간 전에 오미자 분획물을 6시간 처리한 다음, RT-PCR을 이용하여 염증반응의 매우 중요한 매개인자이며 대표적인 세포부착분자인 intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) 및 vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)의 발현수준을 조사하였다.</p> <p>그리고 SCKH1 분획으로부터 분리한 SCKH1PAIBPB를 \( 25 \mu \mathrm { g } \) /ml의 농도로 처리한 다음 염증성 사이토카인인 inter-leukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), monocyte chemo-attractant protein-1 (MCP-1)의 유전자를 증폭하기 위해 각각 의 primer를 제작하여 사용하였다. PCR 반응 조건은 cycle 시작 전 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분간 가열 한 뒤 매 cycle 마다 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초 간 denaturation 시키고, \( 57 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초 동안 annealing 한 뒤 \( 72 ^ {\circ } \mathrm{ C } \) 에서 30 초 동안 extension하는 과정을 28 회 반복하였고 cycle 종료 후 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분 동안 생성된 가닥을 extension하는 과정을 거쳤다. PCR 반응이 끝난 후에는 중폭된 유전자를 \(1.5 \%\) agarose gel을 이용하여 전기영동 후 ethidium bromide로 염색하여 유전자를 확인하였다.</p>