세포질 유전을 하기 때문에 교배로 전이시키기 어려운 웅성 불임 인자는 원형질체 융합 기술를 통해 전이되어 십자화과 작물의 육종에 사용될 수 있다. 논문이 쓰여질 당시까지 한국에서는 상업적 웅성불임 계통이 없었고, 따라서 농우바이오는 NWB-CMS 인자를 십자화과 작물에 전이시킨 육성 소재를 제작하고자 했다. 이를 위해 원심분리를 진행하여 순수한 원형질체를 분리하고, 혈구측정기로 농도를 확인했다.
<h1>서 론</h1> <p>십자화과 (Brassicaceae)는 양배추, 배추, 브로콜리, 유채 등 많은 엽·양채류를 포함하고 있는 중요한 분류군이다. 일반적으로 십자화과는 \( F_ { 1 } \) 육종이 중요한 작물로, 많은 육종적인 연구가 진행되고 있으며, 대부분의 육종회사에서는 고순도의 \( F_ { 1 } \) 종자를 채종하기 위해 자가불화합성과 웅성불임 (Cy-toplasmic Male Sterility: CMS)을 이용하고 있다. 이중 웅성불임 육종 시스템은 십자화과 식물에서 Ogura, Polima, Anand 등이 웅성불임 소재로 이용되고 있다. 그런데 웅성 불임 인자는 세포질 유전의 특성을 가지고 있어 현실적으로 교배를 통해서는 이 특성의 전이가 어려웠다. 1980년대 초에 원형 질체 융합 기술의 발달로 세포질 웅성불임 형질의 전이가 이루어졌으며 (Pelletier et al. 1983), 이 기술을 통하여 전이된 웅성불임인자는 이후 십자화과 작물의 육종에 이용되어왔다 (L'Homme and Brown 1993; Handa et al. 1995; Cardiand Earle 1997; Walters et al. 1992). 현재도 많은 종자회사와 대학에서 지속적으로 웅성 불임의 개발 및 개량에 힘쓰고 있고, 최근에는 마커 검색, 염기서열 분석 등을 바탕으로 웅성불임을 이해하는 연구와 (Murayama et al. 2003; Brown etal. 2003; Singh et al. 1996) 인위적인 유전자의 형질전환을 통해 웅성불임기작 연구가 진행되고 있다 (Kim et al. 2007).</p> <p>우리나라에서는 최근까지 독자적인 웅성불임작물의 개발에 필요한 상업적 웅성불임 계통이 존재하지 않았다. 최근 (주)농우바이오에서는 무에서 NWB-CMS라는 독자적인 웅성 불임계통을 개발하여 이를 특허등록 하였고 ( Nahm et al.2005) 이를 무의 육성프로그램에 적용하고 있다. 현재 (주)농우바이오는 개발한 NWB-CMS 인자를 십자화과 작물에 전이시켜 십자화과 전체작물의 육종에 이용하기 위한 육성 소재를 개발하고자 한다. 이를 위하여 먼저 양배추와 무의 원형질체를 대칭융합을 통하여 식물체를 확보하고 세포융합 시스템이 정상적으로 진행되는지를 확인하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>실험재료로 사용한 종자는 (주)농우바이오에서 육성한 양배추 순계인 HNA과 NWB-CMS 형질을 가진 \( F_ { 1 } \) 계열의 무를 무균발아하여 사용하였다.</p> <h2>원형질 분리</h2> <p>무균발아 후 5 21일이 지난 양배추의 하배축과 무의 잎을 메스로 잘게 썬 후 원형질 분리를 위한 효소 Cellulase Onozuka RS (SERVA Electrophoresis, Germany) \(1 \sim2 \% \), Macerozyme (SERVA Electrophoresis, Germany) \( 0.1 \sim 0.5 \% \), Pectolyase (YAKULT, Japan) \( 0.1 \% \)를 여러 농도로 조합하여 \( 0.4 \mathrm { M } \) mannitol 용액에 첨가하고, \( 28 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 암상태에서 12시간가량 \( 30 \sim 40 \mathrm { ~RPM } \) 으로 진탕하였다. 각 처리구별로 효소처리가 끝난 조직을 \( 125 ~ \mu \mathrm { m } \)와 \( 80 ~ \mu \mathrm { m } \)의 pore size 스텐레스망을 통과시킨 후, \( 15 \mathrm { ~mL } \) conical tube에 원형질체만 모아 \( 100 \mathrm { xg } \)에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 침강한 원형질체를 CPW + 0.4 M mannitol 용액에 희석한 뒤 (Frearson et al. 1973), CPW \( + 21 \% \) Sucrose 용액을 이용하여 \( 100 \mathrm { xg } \)에서 5분간 밀도구배 원심분리하여 상층부에 형성된 밴드에서 순수한 원형질체만을 분리하고 \( \mathrm { W } _ { 5 } \) 용액으로 3회 수세하여 CPW + 0.4 M mannitol 용액에 원형질체를 현탁 한 뒤 혈구측정기를 이용하여 농도를 측정하였다.</p>