K. gwangalliensis genomic DNA로부터 cosmid genomic library를 제작하고, conserved domain에서 degenerate primer을 이용하여 PCR을 수행하여 600bp 정도의 부분 염기서열을 얻었다. target specific primer를 디자인하여 DNA walking을 수행하여 GGPP synthase (crtE) 유전자를 2.2 kb 길이로 분리하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>K. gwangalliensis GGPP synthase (crtE) 유전자 클로닝</h2> <p>K. gwangalliensis로부터 분리한 genomic DNA를 이용, cos-mid genomic library를 제작하였으며 분리한 genomic DNA와 cosmid genomic library를 주형으로 사용하여 PCR을 수행하였다. 또한 GGPP synthase (crtE) 클로닝을 위한 oligonu-cleotide 제작은 이미 밝혀진 다양한 세균 GGPP synthase의 염기서열을 비교 분석하여 conserved domain에서 degener-ate primer을 제작하였다. 이들을 기반으로 하여 PCR을 수행한 결과 약 \( 600 \mathrm{bp} \) 정도의 부분 염기서열을 얻을 수 있었다. 이렇게 밝혀진 부분 염기서열을 토대로 target specific primer를 디자인하여, DNA walking kit 을 이용하여 약 \(1.3 \mathrm{kbp}\) 정도의 PCR product를 증폭하였고, 이를 TA 클로닝 한 후 유전자 염기서열 분석기를 이용하여 K. gwangalliensis GGPP synthase (KgcrtE) 유전자의 서열을 밝혔다. 클로닝된 KgcttE의 ORF는 \( 1,158 \mathrm{bp} \), 총 386개의 아미노산으로 구성되어 있으며 \(1,159-1,161 \mathrm{bp}\)에 종결 코돈인 TAA 서열이 존재하고 있었다. 개시 코돈을 결정하기 위하여 Shine-Dalgarno 서열과 Morran 등에 의해 밝혀진 그람 양성 세균에서의 ribosome binding site를 검색하였다. 그 결과 원핵 생물에서 공통적으로 나타나는 AGGA 서열이 개시 코돈 상단\( 6 \mathrm{bp} \)에 존재하고 있었다. 또한, KgcrtE에 의해 발현되는 GGPP synthase의 예상 분자량(M.W.) 및 등전점(pI)은 각각 41.0 \(\mathrm{kDa} \)과 약산성의 5.73을 가지는 것으로 분석되었다.</p> <h2>GGPP synthase (KgcrtE)의 아미노산 서열 분석</h2> <p>KgCrtE 의 아미노산 서열을 토대로 예상되어지는 단백질의 2차 구조는 SABLE website (http://sable.cchmc.org)를 활용, transmembrane domain의 검색은 TMpred (Prediction of Transmembrane Regions and Orientation) algorithm (http://www.ch.embnet.org)을 사용하여 분석하였다. KgCrt단백질의 2차 구조는 1개의 \( \beta \)-sheet, 17개의 a-helix 및 18개의 random coil로 구성되어 있었다. Transmembrane do-main은 3부분이 존재하는 것으로 분석되었으며, transmembrane domain의 위치는 N-terminus를 inside로 하여 163-183 아미노산, 192-209 아미노산, 323-342 아미노산 위치에서 transmembrane helices가 존재하는 것으로 추정되었다.</p> <p>KgCrtE의 보존된 영역과 계통학적 유연관계를 밝히기 위하여 GenBank에 등록된 기존 세균에서 밝혀진 GGPP syn-thase의 아미노산 서열을 대상으로 multiple alignment를 작성하였다. 또한, 작성된 multiple alignment를 바탕으로 KgCrtE의 계통학적 유연관계를 알아보기 위하여 phylo-genetic tree 분석을 하여 Fig. 5에 나타내었다. Protein blast(BLASTP) 분석 결과, GGPP synthase는 테르페노이드 생합성에 있어서 중요한 분지점 효소이며 단백질 prenylation 뿐만 아니라 diterpenes 생합성에 작용하는 효소로, 공통적으로 두 개의 아스파르트산이 풍부한 영역[DDXX(XX)D]이 존재하는 것으로 알려져 있고, 이들 두 부분의 아스파르트산이 풍부한 지역이 allylic 기질과 isopentenyl diphosphate(IPP)의 결합 자리로 작용하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에 밝혀진 KgCrtE 의 multiple alignment 분석에서 살펴보면 5군데의 conserved region을 찾을 수 있었으며 Fig. 4에 Domain I-V로 표시하였다. Domain Ⅱ와 Ⅴ는 아스파트산이 풍부한 부분으로써 motif를 포함하고 있었다. Domain II의 motif인 DDvvD는 세균 GGPP synthase에서 확인 가능하였고, 이들의 기능은 기질의 결합에 관여하는 것으로 여겨지며, Domain V 에 존재하는 \( \mathrm{DD}(\mathrm{XX})_{6} \mathrm{D} \) motif는 Ashby et al.에 의해 밝혀진 allyl isoprenoid binding site로 추정된다. 두 영역의 motif는 촉매 활성에 중요한 역할을 담당하는 것으로 여겨진다.</p> <p>KgCrtE의 계통학적 유연 관계를 밝히기 위하여 bac-teria-type의 GGPP synthase의 아미노산 서열을 multiple alignment 분석한 결과 Kocuria rhizophila( \(59\%\), accession no.NC010617), Micrococcus luteus ( \(15\%\), accession no.ZP06502819), Arthrobacter arilaitensis ( \(38 \% \), accession no.YP003916548), Clavibacter michiganensis ( \(46 \% \), accession no.YP001711260), Sanguibacter keddieii ( \(39 \% \), accession no.YP003314051), Agromyces mediolanus ( \(30\%\), accession no.AAM94362), Beutenbergia cavernae ( \(32\%\), accession no.YP002880993), Brevibacterium linens ( \(35\%\), accession no.ZP05914711), Corynebacterium efficiens ( \(25\%\), accession no.NP737253), Paracoccus haeundansis ( \(33 \% \), accession no.AY957386)로 밝혀졌다. 이들 서열 중 상동성이 가장 높은 것은 같은 속(Genus)에 속하는 K rhizophila의 GGPP synthase였으며, 가장 낮은 것은 Micrococcus luteus가 생합성하는 GGPPsynthase로 밝혀졌다.</p>