표적 세포로 사용된 림프종 세포는 생쥐에서 발생된 T 세포 림프종인 Yac-1 세포주로부터 유래되었다. 준비된 비장세포를 \(10 \%\) FCS가 포함된 RPMI 1640 배지에 넣고, 시료추출물을 추가하여 \(37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2}\) incubator에서 24 시간 동안 배양하였다. 이후 ANOVA를 이용하여 자료를 분석하고, Duncan's mutiple range test로 통계 검정을 수행하였다.
<h2>세포생존율 실험</h2> <p>표적세포로 사용된 림프종 세포는 Yac-1 세포주로서 \( \mathrm{A} / \mathrm{Sn} \) 계통 생쥐에서 moloney leukemia virus에 의해 유발된 T 세포 림프종으로부터 유래된 세포주이다. 마우스 비장 세포 \( \left(4 \times 10^{6}\right. \mathrm{cells/ml}) \) 를 96 well에 부유시킨 다음 포적세포인 Yac- \( 1\left(1 \times 10^{4}\right. \) cells \( \left./ \mathrm{ml}\right) \) 을 첨가하고 시료 추출물 \( (1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 을 처리하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양하였다. 배지는 RPMI 1640이었으며 FCS \( 10 \% \) 추가하여 사용하였다. 4 일 배양시킨 후 MTT assay로 세포생존율을 결정하여 아래의 식에 따라 dead cell (\%)로 표시하였다.</p> <p>Dead cell \( (\%)=\left\{1-\left(\mathrm{OD}_{\mathrm{S}+\mathrm{r}}-\mathrm{OD}_{\mathrm{S}}\right) /\left(\mathrm{OD}_{\mathrm{T}}-\mathrm{OD}_{\mathrm{M}}\right)\right\} \times 100 \)</p> <p>여기서 \( \mathrm{OD}_{\mathrm{T}} \) 는 표적세포의 \( \mathrm{OD}, \mathrm{OD}_{\mathrm{M}} \) 은 표적세포와 시료가 없을 경우의 \( \mathrm{OD}, \mathrm{ODs}_{s} \) 는 비장세포의 \( \mathrm{OD} \) 이며 \( \mathrm{OD}_{\mathrm{s}+\mathrm{t}} \) 는 표적세포와 비장세포의 \( \mathrm{OD} \) 이다.</p> <h2>Interleukin-2 (IL-2) assay법</h2> <p>비장세포 배양 상층액은 Weir 등의 방법에 의해 준비하였다. 준비된 비장세포를 \( 10 \% \) FCS를 포함한 RPMI 1640 배지로 \( 4 \times 10^{6} \) cells/ml의 농도로 조절하고 시료추출물을 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24 시간 배양하였다. 이들을 \( 300 \mathrm{~g} \) 에서 10 분간, \( 10,000 \mathrm{~g} \) 에서 30 분간 원심분리 시킨 후 그 상층액을 취하여 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동기에 보관하면서 IL-2 assay에 사용하였다. IL-2 의존성 세포주인 CTLL-2 세포를 이용한 방법을 변형하여 IL-2 활성을 측정하였다. 한국 세포주 은행으로부터 분양받은 CTLL-2 세포는 \( 10 \% \mathrm{FCS} \) 와 \( 20 \mathrm{IU} / \mathrm{ml} \) 의 IL-2가 함유된 RPMI 1640 배지에서 3일간 배양한 후 try-pan blue 염색액으로 세포의 생존율을 확인하고 \( 1 \times 10^{4} \) cells/ml 세포의 농도로 계대배양하면서 실험에 사용하였다. \( 10 \% \) FCS가 함유된 PRMI 1640 배지에서 CTLL-2 세포 \( \left(1 \times 10^{5}\right. \) cells \( \left./ \mathrm{ml}\right) \) 가 부유된 세포액 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 를 96 well plate에 가한 후 다시 비장세포 배양 상층액 \( 50 \mu 1 \) 를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 18시간 배양시킨 다음 MTT assay로 IL-2를 측정하였다.</p> <h2>통계분석</h2> <p>대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 자료로부터 ANOVA를 구한 후 Duncan's mutiple range test를 이용하여 통계 분석하였다.</p>