폐글리세롤을 입수한 후, 탈이온 증류수와 4:1비율로 혼합하고 염산을 첨가하여 \( \mathrm { pH } \) 3.0으로 조절하여 12시간 방치하여 지방산 제거하고, \( \mathrm { NaOH } \) 로 중화한 후 PT-otsBA 플라스미드를 도입하여 재조합 대장균을 제작하고 Erlenmeyer 플라스크에 \( 100 \mathrm{mg}\)엠피실린이 첨가된 \( 50 \mathrm{ml} \) 배지를 넣어 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 150 \mathrm {rpm}\)으로 배양하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>주식회사 M 에너지 사(Pyeong-taek, Korea)로 부터 폐글리세롤을 입수하였다. 포도당, 효모추출액(yeast extract), 트립톤(tryptone)은 Difco 사(USA)로부터 구입하였고 IPTG, 엠피실린(ampicillin), 및 기타 시약들은 Sigma-Aldrich 사(USA)에서 구입하였다. 발리다마이신(순도, \( 66 \% \) )은 (주)한농 (Korea)에서 입수하였다. 대장균 발현 벡터인 pTrc99A (Amersham Bioscience, USA)에 대장균 트레할로스 생합성 오페론 (otsBA)이 삽입된 재조합 플라스미드(PT-otsBA)는 본 실험실에서 제작되었다.</p> <h2>폐글리세롤의 전처리</h2> <p>Pyle 등이 제안한 방법에 따라 폐글리세롤 용액으로부터 지방산 염을 제거하였다. 폐글리세롤 용액에 산을 첨가하여 용액의 \( \mathrm { pH } \) 를 낮추면 지방산 염이 지방산으로 전환된다. 이를 저온에 방치 시 용해도가 낮은 지방산이 침전되는데, 여과 또는 원심분리에 의해 폐글리세롤 수용액과 지방산을 분리할 수 있다. 본 연구에서는 폐글리세롤을 탈이온 증류수와 4: 1 비율로 혼합한 후, 염산( \(37 \% \))을 첨가하여 혼합 용액의 \( \mathrm { pH } \) 를 \( 3.0 \) 으로 조절하였다. 이를 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 12시간 방치한 후 생성된 침전물을 제거하기 위하여 진공펌프를 이용하여 세공크기가 \( 0.2 \mathrm { ~mm } \) 인 멤브레인 필터 (OD \(47 \mathrm { ~mm } \), Whatman, Germany)에 용액을 통과시켰다. 필터를 통과한 여액(filtrate)은 지방산이 제거된 폐글리세롤 용액이 된다. 전처리 폐글리세롤 용액의 \( \mathrm { pH } \) 가 낮아서 이를 \( \mathrm { NaOH } \) 로 중화( \( \mathrm { pH } \ 7.0 \))시킨 후 미생물 배양용 기질로 사용하였다.</p> <h2>균주, 배지 및 배양 방법</h2> <p>호스트 균주로 사용된 E. coli DH 5 \( \alpha \) 에 PT-otsBA 플라스미드를 도입시킨 재조합 대장균을 제작하고 이를 트레할로스 생산균주로 사용하였다. 재조합 플라스미드 및 재조합 균주 제작 방법은 참고문헌에 자세히 기술되어 있다. 모든 실험에서 \( 500 \mathrm { ml } \) Erlenmeyer 플라스크에 엠피실린(최종농도, \( 100 \mathrm { mg } / l) \) 이 첨가된 \( 50 \mathrm { ml } \) 배지를 넣고 이를 진탕배양기 (Jeio Tech Co., Ltd., Korea)에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 150 \mathrm { rpm } \) 으로 배양하였다.</p>