녹두로부터 MBTI를 Sephadex G50을 이용하여 차례로 분리, 정제했으며, 전기영동 결과 하나의 밴드가 나타나 순수하게 정제되었다. MBTI의 부분 아미노산 서열을 분석한 결과 Cys-Arg-Cys-Leu-Asp-Thr-Asp-Asp-Phe-Cys-Tyr-Lys-Pro으로 나타났으며 여러 종류의 serine protease에 대한 MBTI는 trypsin을 가장 강하게 저해했고 plasmin은 약하게 저해했다. pseudomonal elastase만을 정맥주사 했을 때 저혈압이 뚜렷하게 나타나지만 MBTl를 P.E.투여 1분 전에 전처치하여 severe hypotension이 억제되는 것으로 나타났다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>MBTl의 분리 및 정제</h2> <p>녹두로부터 MBTI를 Sephadex G50을 이용한 gel filtrationchromatography (Fig. 1A), DEAE-cellulose ion exchangechromatography (Fig. 1B), trypsin affinity chromatography(Fig. 1C) 등을 행하여 차례로 분리, 정제하였으며, 전기영동 결과 하나의 밴드가 나타나(Fig. 1D) 순수하게 정제되었음을 알 수 있었다.</p> <h2>MBTI의 분자량 및 아미노산 서열 결정</h2> <p>MBTl의 분자량은 SDS-PAGE 전기영동 결과 약 8,000\( \mathrm{Da} \)의 monomer 임을 알 수 있었다. 또한 MBTI의 부분 아미노산 서열을 분석한 결과는 Cys-Arg-Cys-Leu-Asp-Thr-Asp-Asp-Phe-Cys-Tyr-Lys-Pro 으로 나타났다. 이는 Wilson 및Zhang 등에 의하여 보고된 MBTI의 부분 서열 중 59-71의 아미노산 서열과 동일함으로 보고된 MBTI와 같은 물질인 BBI type의 MBTI임을 알 수 있었다.</p> <h2>MBTl의 trypsin 저해활성 및 trypsin에 대한 저해형결정</h2> <p>일정한 농도의 trypsin에 대해 MBTI의 농도를 증가시키면서 저해능을 측정한 결과 Table 1와 같이 나타났다.</p> <p>Trypsin \( (1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \) 활성에 대해 \( 50 \% \) 저해능을 나타내는 농도는 \( 0.154 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 이다. 한편, MBTI의 저해형을 결성하기 위해 먼저 trypsin의 BAPNA에 대한 가수분해 반응속도를 측정한 다음 Lineweaver - Birk graph를 도식하여 결과를 얻었다. 그 결과 \( \mathrm{Km} \) 값은 \( 0.92 \mu \mathrm{M} \)이었으며 \( \mathrm{Vmax} \) 는 \( 0.25 \mu \mathrm{M} / \mathrm{min} \) 이었다. 저해형을 알아보기 위해 MBTl를 반응용핵에 함께 첨가한 후 반응속도를측정한 결과를 Fig. 2에 나타내었다.\( \mathrm{Vmax} \) 값은 \( 0.10 \mu \mathrm{M} / \mathrm{min} \) 으로 변화하였지만 \( \mathrm{Km} \) 값은 불변임을 볼 수 있다. 이 실험결과로부터 MBTI는 trypsin에 대하여 비경쟁적 저해률 하는 것으로 추정할 수 있다. 그러므로 경쟁적 억체작용을 하는 inhibitor와는 다론 조절작용을 하는 것으로 추정된다.</p> <h2>각종 protease에 대한 MBT의 저해도 측정</h2> <p>여러 종류의 serine protease, 즉 trypsin, chymotrypsin,elastase, plasmin 및 thrombin 에 대한 MBTI의 저해능을 조사하기 위하여 기질로 N-Benz-Arg-MCA, Suc-Leu-Leu-Var-Tyr-MCA, Suc-Ala-Pro-Ala-MCA, Boc-Val-Lcu-Lys-MCA,Boc-Val-Pro-Arg-MCA을 각각 사용하여 실험한 결과는MBTI는 실험에 사용한 serine protease들 중 trypsin을 가장 강하게 저해하는 것으로 나타났으며 plasmin은 약하게 저해하였다. 그리고 chymotrypsin, elastase및 thrombin에 대한 억제환성은 측정범위내에서는 나타나지 않았다. BBI (from Soybean)는 chymotrypsin에 억제효과를 나타내는데 비하여 본 실험에서 분리, 정제한 MBTI는 억제활성을 나타내지 않는 것은 chymotrysin affinitycolumn을 사용하여 chymotrypsin inhibitor를 별도로 분리하지 않은 것에 기인되는 것으로 사료된다.</p> <h2>MBT1의 pharmacological effect 측정</h2> <p>MBTI의 약물학적 효과를 평가하기 위하여 guinea pig에 pseudomonal elastase induced septic shock의 병태 모델을 작성하고 MBTI를 전처치하여 그 효과를 평가하였다.그 결과를 Fig. 3 에 나타내었다. pseudomonal elastase (P.E.)만을 경맥주사 하였을 때 뚜렷한 저혈압이 나타나지만 MBTl \( (10 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) of body weight \( ) \) 올 P.E.투여 1분전에 전처치하므로써 severe hypotension이 억제되는 것으로 나타났다. Trypsin iinhibitor를 약물로 응용하고자하는 연구는 매우 활발히 진행되고 있다. 그 대표적으로 추천되고 있는 물질은 kunitz type의 soybean trypsininhibitor이다. 이는 kallikrein 억제 활성이 매우 크므로 kinin cascade에 작용하여 serine protease의 생체 내 불균형에 기인되는 칠환 즉, MOF (multi organ failure), septicshock, DIC (disseminated intravascular coagulation) 등에 응용하고자하는 것이다. 한편 BBI type의 serine proteaseinhibitor는 암질환 치료에 적용할 목적으로 많이 검토되고있다. 본 연구에서는 BBI type 인 MBTI를 pseudomonalelastase에 의해 유발되는 septic shock의 대한 약물효과를 평가하여 보았으며 그 결과 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 의 농도에서 septicshock유발 동물의 hypotension을 억제함을 알 수 있었다. 나아가 BBI type trypsin inhibitor의 septic shock 억제작용에 대한 작용메카니즘 등을 구명하고자 한다.</p>