실험에서 사용한 당귀는 일당귀, 중국당귀,구당귀 및 국내 자생하는 참당귀 및 세발당귀의 식물체 또는 종자를 수집, 계통별로 식물체, 종자 및 한약재 재료 등을 액체질소에 급속 냉동시킨 후 갈아서 얻은 분말을 이용하여 ExgeneTM Plant SV 키트를 이용하여 염색체 DNA를 분리하였고 ITS 유전자 내의 SNP를 확인하고자 유전자 단편의 증폭을 위하여 유전자의 염기서열정보를 사용하여 각각의 프라이머를 제작, 확인된 ITS 유전자의 유연관계 분석은 Mega 6.0 프로그램을 이용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>실험에서 사용한 당귀 계통은 국내 자생하는 참당귀(Angelica gigas Nakai) 및세발당귀(A. gigas Jiri), 그리고 일당귀(A. acutiloba), 중국당귀(A. sinensis), 및 구당귀(Levisticum officinale)의 식물체 또는 종자를 수집하여 조사 하였다(Table 1). 각각의 구입 경로를 살펴보면 참당귀는 국립원예특작과학원(인삼특작부), 경남농업기술원(안의), 경북농업기술원(봉화) 및 경남 생약농업협동조합에서 수집하였다. 세발당귀는 경남농업 기술원(안의) 그리고 일당귀는 충북농업기술원(오창), 경남 농업기술원(안의)에서, 중국당귀는 (주)현진제약사의 수입품 또는 현지에서 입수한 한약재상태로 수집하였다. 구당귀는 충북대학교, 특용작물학과 이이교수님 연구실에서 분양 받았으며 이의 원구입처는 미국, Horizon Herbs (Williams,OR)에서 구입한 것이며, 또한 경남 산청군에 소재하는 한약재 수입회사인 (주)자연애제약으로부터 수집하였다.</p> <h2>DNA 분리</h2> <p>수집된 계통별로 일정량의 식물체, 종자 및 한약재 재료 등을 액체질소에 급속 냉동시킨 후 곱게 갈아서 얻은 분말을 이용하여 GeneAll사의 ExgeneTM Plant SV 키트를 이용하여 회사에서 제공한 실험방법에 따라 염색체 DNA를 분리하였다. 정제된 DNA는 \( 1 \% \) agarose gel에서 전기영동을 실시하여 DNA의 분리 과정에서의 분해 정도를 확인한 후 Microspectrometer (BioPrince, SD-2000, Gangwon, South Korea)를 이용하여 \( 234 \mathrm{~nm}\), \(260 \mathrm{~nm}\), \( 280 \mathrm{~nm} \) 에서 각각 흡광도를 측정하여 A 260/A 280 값이 1.8-2.2 범위 그리고 A234/A260 값이 0.5-0.8 범위 내 포함 여부를 조사하여 RNA 및 단백질 등의 오염 정도를 확인하여 순수한 DNA를 확인하였다.</p> <h2>ITS의 증폭 및 염기서열 분석</h2> <p>ITS 유전자 내의 SNP를 확인하고자 유전자 단편의 증폭을 위하여 Table 2에 표시된 유전자의 염기서열정보를 사용하여 각각의 프라이머를 제작하였다. 유전자의 증폭은 iNtRON 회사(Gyeonggi Province, South Korea)에서 제공하는 PCR 반응용 완충 용액 및 i-pfu DNA polymerase를 사용하여 중합반응과정에서 야기될 수 있는 돌연변이를 최소화하였다. 제조사에서 제공하는 실험방법에 따라 순수 분리한 DNA \( 50 \mathrm{ng} \)과 프라이머를 각각 \( 10 \mathrm{pmole} \)을 혼합한 후 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 DNA를 변성시킨 후 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초를 1 cycle로 하여 35 cycle 반복 후 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 연장반응을 시킨 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응을 종료하고 증폭된 DNA밴드는 \( 2.0 \% \) agarose gel을 이용하여 전기영동 하여 그 결과를 확인하였다. 증폭되어진 각 유전자 단편의 클로닝 과정에서 돌연변이가 일어날 수도 있으므로 클로닝을 하지 않고 증폭된 DNA단편을 ExpinTM PCR SV (GeneAll, Seoul, South Korea) Kit를 사용하여 순수 정제한 후 직접 염기서열분석을 의뢰하였다. 또한 최종적으로 확인된 SNP는 최소 5반복 이상 수행하여 검정하였다.</p> <h2>유연관계 분석</h2> <p>확인된 ITS 유전자의 유연관계 분석은 Mega 6.0 프로그램을 이용해 진행하였다. 비교 군들간의 유전적 거리의 계산은 Tamura-Nei distance 방법을 이용하였으며, neighbor-joining 방법을 이용해 유연관계를 분석하였다(Tamura et al. 2013).</p> <h2>ARMS-PCR</h2> <p>공시된 종들에 대한 ITS 유전자 단편을 PCR로 증폭하여 확인한 염기서열분석을 바탕으로 SNP를 확인한 다음 참당귀 및 세발당귀를 판별하기 위하여 ARMS-PCR을 수행하였다. 종 특이 프라이머는 ITS 유전자의 SNP를 나타내는 염기를 3'-말단에 위치하게 하고, 5'-말단 쪽으로 세 번째의 염기를 각각 다른 3 개의 염기로 치환 시킨 primer를 제작하였다. PCR 증폭실험에 사용된 forward 및 reverse primer는 각각 동일한 염기로 치환된 프라이머들을 한 조합으로 하여 각 종에 대한 판별 특이성을 조사하였다(Table 2). PCR 증폭 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5 분간 DNA를 변성 시킨 후 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, 각 프라이머 조합별 Tm값으로부터 계산한 온도에서 10초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초를 1 cycle로 하여 25 cycle 반복 후 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 연장반응을 시킨 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응을 종료하고 증폭된 DNA밴드는 \( 2.0 \% \) agarose gel을 이용하여 전기영동 하여 그 결과를 확인하였다.</p>