재조합 단백질의 발현을 보기 위해서 숙주세포로 B. subtilis DB431을 활용하였고 stearothermophilus NO2 의 CGTase 유전자의 증폭은 Perkin Elmer PCR System 2400을 이용하여 실험하였다. subtilis DB431에 형질전환 시킨 후 kanamycin \( (10 \mathrm{lg} / \mathrm{ml}) \) LB agar 배지에서 1차 선별로 얻어진 형질전환 균주들을 CS배지에서 배양했고 그 후에 고활성 균주를 2차 선별하였다. 균체농도는 분광광도계를 이용하였고 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 탁도 \( \left(\mathrm{OD}_{600}\right) \) 로 실험했다. 균체 침전물을 lysozyme 을 차용해서 celllysate 분획을 얻고 분획과 배양 상등액을 통해 각각의 분획에서의 CGTase활성을 계산했다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용균주와 plasmids</h2><p>재조합 단백질의 발현을 위한 숙주세포로 B. subtilis DB431 (trpC npr apr epr bpr isp1 isp11)을 사용하였다. 또한 plasmid 구축 및 증폭을 위한 E. coli 숙주세포는 DH5a를 사용하였다.</p><p>CGTase 유전자 공여 plasmid는 pVT103-U에 B. stearother-mophilus NO2의 CGTase 유전자를 cloning한 pVT-CGTS 를 사용하였다. B. subtilis에서 CGTase 발현계 구축을 위해 \( \mathrm{P}_{\mathrm{JH}} \) promoter를 함유하는 E. coli-B. subtilis shuttle vector인 pBE1 을 사용하였다.</p><h2>Polymerase Chain Reaction</h2><p>B. stearothermophilus NO2 의 CGTase 유전자의 증폭은 Perkin Elmer PCR System 2400을 사용하여 행하였다. 반응 조건은 denaturing \( 95^{\circ} \mathrm{C} \), annealing \( 55^{\circ} \mathrm{C} \), polymerization \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 의 조건에서 35 cycles을 행하였다. CGTase 유전자 \( (\operatorname{cgtS}) \) 증폭을 위한 primers는 PS-1, PS-2를 사용하였으며, 각각의 서열은 [PS-1] 5' -TGA GAA TTC AAG CTT ATG AGA TGG CTT-3', [PS-2] 5'-TCT AAG CTT GGA TCC ATT AGT TCT GCC AAT-3'로서 5'쪽에 EcoRI, HindIII를, 3'쪽에 HindIII, BamHI 부위를 가진다. 주형 DNA로 B. stearothermophilus NO2 의 \( \mathrm{cgtS} \) 유전자를 함유한 pVT-CGTS을 사용하여 \( 2.1 \mathrm{~kb} \) 의 성숙 단백질 유전자 단편 \( (\mathrm{cgtS}) \) 만을 대량 증폭하였다.</p><h2>Bacillus 형질전환체 선별</h2><p>B. subtilis DB431에 형질전환시켜 kanamycin \( (10 \mathrm{lg} / \mathrm{ml}) \) LB agar 배지에서 1차 선별하여 얻어진 형질전환 균주들을 CS배지에서 배양후 iodine법으로 colony 활성염색을 통해 고활성 균주를 2차 선별하였다. 즉, 전분이 함유된 CS 배지 (\(1\%\) soluble starch, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 0.1 \% \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} .0 .02 \% \) \( \mathrm{MgSO}_{4} \) )에 숙주세포인 DB431 과 형질전환체를 도말하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 시간 배양하여 iodine 증기로 colony 활성 염색을 하였다.</p><h2>배지 및 배양조건</h2><p>2차 선별된 형질전환 균주를 \( \mathrm{LB}, 2 \times \mathrm{LB}, \mathrm{LBG}(0.5 \% \sim 5 \% \) glucose), CS (\(1\%\) soluble starch, \(0.5\%\) yeast extract, \( 0.5 \% \) peptone, \( \left.0.1 \% \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}, 0.2 \% \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\right) \), [\(5\%\) molas-ses+\(2\%\) CSL (corn steep liquor)] 배지를 \( 50 \mathrm{ml} \) 함유하는 baffled-flask에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 170 \mathrm{rpm} \) 조건으로 배양하였다. 발효조(KoBiotech. Co., Korea) 회분배 양은 LB와 [ \( 10 \% \) molasses \( +5 \% \) CSL] 배지로서 배양부피는 \( 1.01 \), 배 양온도는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), 배양중의 \( \mathrm{pH} \) 조절은 \( 50 \% \mathrm{NH}_{4} \mathrm{OH} \) 와 \( 3 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} \) 를 사용하여 \( \mathrm{pH} \) \( 7.0 \) 으로 조절하였다. 교반속도(300~600 \( \mathrm{rpm} \) )의 조절로 용존 산소(DO)를 공기포화의 \( 30 \% \) 이상으로 유지하였고, 통기속도는 \( 1.5 \mathrm{vvm} \) 을 유지하였다. 2차 선별된 형질전환체는 \( \mathrm{LB} \) 배지(\(0.5\%\) yeast extract, \( 0.5 \% \mathrm{NaCl}, 1 \% \) tryptone \( ) \) 를 \( 50 \mathrm{ml} \) 함유하는 baffled-flask에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 180 \mathrm{rpm} \) 조건으로 전배양 하였다. 전 배양액 \( 50 \mathrm{ml} \) 을 발효조(KoBiotech., Co., Korea)에 접종하여 회분배양 하였다. 회분배양 배지는 \( \operatorname{LBG}(1 \% \) glucose)이며, 배양부피는 \( 1.01 \), 배양온도는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), 배양액중의 \( \mathrm{pH} \) 조절은 \( 50 \% \mathrm{NH}_{4} \mathrm{OH} \) 와 \( 3 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} \) 를 사용하여 \( \mathrm{pH} 7.0 \)으로 조절하였다. 교반속도(300~600 \( \mathrm{rpm} \))의 조절로 용존산소(DO)를 공기포화의 \( 30 \% \) 이상으로 유지하였고, 통기속도는 \( 1.5 \) vvm을 유지하였다.</p><h2>균체농도, 잔존환원당, 및 plasmid 안정성</h2><p>균체농도는 일정시간마다 채취한 배양액을 적당한 비율로 희석하여 분광광도계(Shimadzu UV-160A, Japan)를 사용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 탁도 \( \left(\mathrm{OD}_{600}\right) \) 로 측정하였다. 배양액을 3,000 \( \times \mathrm{~g} \) 에서 5분 동안 원심분리한 후 배양 상등액을 얻고, dinitrosalicylic acid 방법을 사용하여 잔존환원당 농도를 측정 하였다. Plasmid 안정성은 배양액을 \( \mathrm{LB} \) 평판배지에 도말한 후 자란 colony를 kanamycin \( (10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 이 함유된 \( \mathrm{LB} \) 배지에서 toothpicking한 다음 형성된 colony 수의 비로 측정하였다.</p><h2>균체 분획 및 CGTase 활성 측정</h2><p>균체 침전물을 lysozyme (Sigma, USA)을 사용하여 celllysate 분획을 얻고 이들 분획과 배양 상등액을 사용하여 각 분획에서의 CGTase활성을 측정하였다. CGTase 활성측정은 methyl orange method로 측정하였다. 효소 반응 조건은 \( 0.03 \mathrm{mM} \) methyl orange, \( 1 \% \) soluble starch, 효소 용액 \( 50 \mu \mathrm{l} \)을 \( 50 \mathrm{mM} \) 인산 완충액( \( \mathrm{pH} \) 6.0)에 전체 양이 \( 1.5 \mathrm{ml} \) 이 되게 잘 섞은 다음 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반응시켜 \( 505 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정 하였다. 효소의 \( 1.0 \) unit는 1 분당 \( 1 \mu \mathrm{mol} \) 의 \( a \)-cyclodextrin 을 생산해 내는 효소의 양으로 정하였다.</p>