향균 처리된 배지에서 자란 세포들을 용해한 후, 그 단백질을 gel 전기영동으로 분리한 후 분리된 단백질을 니트로셀루로즈 막으로 전이시킨 후 특정 단백질에 대한 항체와 이차 항체반응을 실시한 후 ECL 용액을 적용시키고 X-ray film에 감광시켜 단백질의 발현정도를 분석하였다. 다양한 농도의 resveratrol이 처리된 배지에서 48시간 자란 암세들을 모아 단백질을 정량한 다음 적정량을 취하여 protein A-Sepharose와 혼합하고 섭씨4도에서 1시간동안 반응시키고, 다시 protein A-Sepharose를 넣고 동일 온도에서 2시간 반응 후, 원심 분리하여 pellet를 모아 세척하고 완충액을 혼합하여 섭씨37에서 30분간 반응시켰다. sample buffer 를 섞어 겔을 이용하여 전기영동으로 분리한 후 gel을 말려 autoradio-graphy로 반응의 정도를 비교하였다. 준비된 폐암 세포를 배지에서 24동안 배양한 후 resveratrol을 농도별로 희석하여 처리하였다가 48시간 후 배지에서 도데실트리메틸암모늄 브로마이가 함유된 완충액을 첨가하여 용해가 잘 일어나도록 pipetting을 여러 번 실시하였다. 상온에 약 10분간 배양후 trypan blue를 이용하여 암세포의 수를 계수하고 그 중 일부에 EIA를 실시한 다음 450nm의 파장에서 얻어진 값을 기준삼아 PGE2 의 양을 추정하였다.
<h2>단백질의 분리, 전기영동 및 Western blotting</h2> <p>상기와 동일 방법으로 준비된 암세포들을 선행 방법에 준하여 정상 및 resveratrol이 처리된 배지에서 자란 세포들을 lysis buffer로 용해한 후, 세포 내 잔사물을 분리시키고 동량의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 전이시킨 후, 특정 단백질에 대한 항체와 그에 대한 이차 항체 반응을 실시한 후 en-hanced chemiluminoesence (ECL) 용액 (Amersham Life Sci-ence Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 단백질의 발현정도를 분석하였다. 본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 및 Calbiochem (Cambridge, MA, USA)에서 구입하였으며, 이차 항체로 사용된 horseradish peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulin 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다.</p> <h2>In vitro immunocomplex kinase assay</h2> <p>Choi et al. 의 방법에 준하여 정상 및 다양한 농도의 resveratrol이 처리된 배지에서 48시간 자란 암세포들을 모은 다음 단백질을 정량한 후, 적정량의 단백질을 취하여 protein A-Sepharose (Sigma)와 혼합한 후 \(4^{\circ}\mathrm{C}\)에서 1시간동안 반응시켰다. 이를 \(1,500\mathrm{rpm}\)으로 10분간 원심분리하여 상층액만 모은 다음 Cdk2 및 Cdk4 항체를 첨가하고 다시 \(4^{\circ}\mathrm{C}\)에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 protein A-Sepharose를 넣고 \(4^{\circ}\mathrm{C}\)에서 2시간동안 반응시킨 후, 원심 분리하여 pellet을 모은 다음 세척한 후 \(\left[\gamma-^{32} \mathrm{P}\right] \mathrm{ATP}\)(ICN, Irvine, CA, USA) 및 histone H1 (Sigma)이 들어있는 reaction buffer를 혼합하여 \(37^{\circ}\mathrm{C}\)에서 30분간 반응시켰다. 동량의 \(2\times SDS\) sample buffer를 넣어 혼합한 후, \(10\%\) SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 이렇게 분리된 gel을 말린 후 autoradio-graphy로 반응의 정도를 비교하였다.</p> <h2>Prostaglandin E2 생성율의 측정</h2> <p>COX-2의 대사산물인 prostaglandin E2 (PGE2)의 생성에 미치는 resveratrol의 영향을 측정하기 위하여 사용된 enzyme immunoassay (EIA) kit는 Amersham Corp. 에서 구입하였다. 먼저 준비된 A549 폐암 세포를 96-well plate에 well 당 \(160\mu \mathrm{l}\)의 배지에 \(10^{4}\)cell/well 정도로 분주하여 24시간 동안 배양한 후, resveratrol을 농도별로 배지에 희석하여 처리하였다. 이때 마지막 배지의 양을 모두 180 씨로 통일시켰다. 48시간 후 배지에 \(2.5\%\)의 dodecyltrimethyl-ammonium bro-mide가 함유된 buffer를 \(20\mu \mathrm{l}\) 첨가하여 총 배지의 양이 \(200\mu \mathrm{l}\)되게 한 후 용해가 잘 일어나도록 pipetting을 수회 실시하였다. 상온에 약 10분간 incubation 한 후 trypan blue를 이용하여 암세포의 수를 계수하였다. 약 \(50\mu \mathrm{l}\)의 lysate를 취하여 kit에 준한 protocol에 따라 EIA를 실시한 후 \(450\mathrm{~nm}\) 의 파장에서 얻어진 값을 기준으로 PGE2의 양을 추정하였다.</p>