국내에서 사육중인 말 192두를 대상으로 경정맥으로부터 Heparin tube로 채혈한 혈액에서 Tozaki 등의 방법에 의해 추출한 genomic DNA를 사용하여 Microsatellite DNA형 분석을 위해 17개의 marker를 선정하고 denaturation, annealing, extension을 수행하여 말의 Microsatellite DNA형 분석을 실시하였다. Data는 GeneScan 이용하여 각 marker별 대립유전자의 크기(base pair)를 결정하였고 microsatellite DNA다형 좌위의 대립유전자 출현빈도를 추정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>공시재료</h2> <p>국내에서 사육중인 말 192두[제주마(Korean native horse) 84두, 제주경주마(Jeju racing horse) 37두, 몽고마(Mongolian horse) 25두, 더러브렛 말(Thoroughbred horse) 26두, 웜브리드 말(Warmblood horse) 11두, 미니츄어 말(Miniature horse) 9두]를 대상으로 하였다. 재료는 말의 경정맥으로부터 Heparin tube (Becton Dickson, USA)로 채혈한 혈액에서 Tozaki 등의 방법에 의해 추출한 genomic DNA를 사용하였다.</p> <h2>Microsatellite DNA marker 선정 및 중합효소연쇄반응(PCR)</h2> <p>Microsatellite DNA형 분석을 위한 marker는 국제 panel 중에서 17개를 선정하여 Bozzini 등과 Dimsoski의 방법에 준하여 DNA를 GeneAmp PCR system 9700(Applied Biosystems, 미국)으로 증폭하였다. 사용된 primer는 multiplex-PCR을 수행하였으며 PCR 과정은 다음과 같다. 먼저 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분간 가열하여 변성을 유도하고, \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초간 denaturation, \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분간 annealing 그리고 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분간 extention의 3단계를 총 30회 반복하였으며 마지막으로 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 60분간 final extention 과정을 거쳤다. 증폭된 DNA는 \( 2.5 \% \) agarose gel로 전기영동하여 증폭산물을 확인한 후 microsatellite DNA다형 분석에 이용하였다.</p> <h2>Microsatellite DNA다형 및 통계 분석</h2> <p>Microsatellite DNA형 분석은 PCR 산물 \( 1 \mu \mathrm { l } \), GeneScan \( { } ^ {\circledR } 500 \)RIZ size standard (Applied Biosystems, 미국) \( 0.4 \mu \mathrm { l } \), deionized Hi-Di formamide (Applied Biosystems, 미국) \( 12 \mu \mathrm { l } \)을 혼합하여 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 3분간 denaturation 시킨 후 ice 위에서 3분간 침지한 다음, 유전자형 자동분석기(ABI Prism 3100 analyzer, 미국)에 loading하여 POP4 (Applied Biosystems, 미국)상에서 \( 15 \mathrm { kV } \)로 전기영동하였다. 그 후 Data는 GeneScan Software Ver.3.7과 Genotyper Software Ver.3.7 (Applied Biosystems, 미국)을 이용하여 각 marker별 대립유전자의 크기(base pair)를 결정하였고, 대립유전자의 명명은 국제기준에 준하였다. 또한 microsatellite DNA다형 좌위의 대립유전자 출현빈도를 추정하고 이를 토대로 이형접합성(Het), 다형정보량(PIC), 부권부정율(PE), 그리고 집단간의 유연관계는 Cervus Ver.2.0 program과 Saitou와 Nei 의 방법에 따라 분석하였다.</p>