실험에 사용된 인자인 MITF, TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase의 mRNA 발현 억제율을 알아보기 위하여 reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)을 진행하였다. 그리고 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)을 이용하여 전자공여능을 측정하였다.
<h2>Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)</h2> <p>본 실험에 사용된 인자인 MITF, TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase의 mRNA 발현 억제율을 알아보기 위하여 reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)을 진행하였다. 실험에 사용한 primer sequences는 Table 1 과 같다. PCR tube에 \( 5 \mathrm { X } \) green GoTaq flexi buffer, PCR nucleotide mix (10 mM), \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \), primer, nuclease free water, GoTaq DNA polymerase, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞어준 후 PCR을 실행하였다. GAPDH은 \( 96 ^ {\circ } \mathrm { C } 2 \) 분, \( 96 ^ {\circ } \mathrm { C } 10 \) 초, \( 64 ^ {\circ } \mathrm { C } 30 \) 초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } 1 \) 분(40 cycles), TRP-1, TRP-2, MITF는 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } 30 \) 초, \( 58 ^ {\circ } \mathrm { C } 45 \) 초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } 1 \) 분(40 cycles), tyrosinase는 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 30초, \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 45초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 45초(40 cycles)을 하였다. 그 후 PCR로 합성시켜 \( 10 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) solution의 ethidium bromide를 첨가한 \( 1.5 \% \) agarose gel에 \( 100 \mathrm { V } \) 에서 35 분간 전기영동하여 \( \mathrm { UV } \) transilluminator를 사용하여 밴드를 확인, 분석 정량하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>전자공여능 측정 결과</h2> <p>산화를 억제하는 목적으로 사용되는 전자공여능은 인체 내에서 노화 억제 작용으로 이용되어지고 있다. 이에 따라 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 을 사용하여 전자공여능을 측정하였으며, (DPPH)는 환원되지 않은 상태에서는 자줏빛을 띄고 flavonoid 화합물, peptide에 의해 환원되어 자색이 탈색된 후 발색 정도에 따라 효과를 측정하는 원리를 갖고 있으며 환원된 후에는 노란색을 띈다.</p>