Quantitative RT-PCR과 Western blot을 통해 KCNJ11 mRNA와 Kir6.2 단백질의 발현양상을 조사하였다. 4mM과 1mM의 칼륨 완충용액에 노출된 환자와 정상 세포에서 단백질 발현 수준을 분석하였고, 4mM 칼륨 농도에서 환자와 정상 세포 모두에서 mRNA 발현과 단백질 발현 양상이 일치하였다. 또한, 이러한 조건에서 환자 세포의 Kir6.2가 정상적인 K_AIP 채널 기능을 수행하고 있음을 확인하였다.
<h2>Quantitative RT-PCR을 이용한 KCNJ11 mRNA의 발현 양상 및 Western blot을 통한 세포질과 세포막상의 Kir6.2 단백질의 발현양상 확인</h2> <p>생리적 정상 세포외 칼륨 농도 \( (4 \mathrm { mM } ) \) 와 환자 세포의 탈분극을 유발하는 저칼륨 농도인 \( 1 \mathrm { mM } \) 의 칼륨 완충용액을 30분간 환자와 정상인의 골격근 세포에 노출시킨 후 각각의 세포에서 \( \mathrm { mRNA } \) 를 추출하여 \( \mathrm { KCNJ } 11 \) 의 발현수준을 확인한 결과, 환자와 정상 세포 모두 \( 4 \mathrm { mM } \) 에서는 \( \mathrm { mRNA } \) 발현수준 의 변화를 보이지 않았다(Fig. \( 1 \mathrm { ~A } , \mathrm { ~B } ) \). 그러나 환자세포의 탈분극을 유발하는 \( 1 \mathrm { mM } \) 의 지칼름 완충용액에 노출된 경우 정상 세포에서는 mRNA 발현수준이 감소하였고(Fig. 1C), 환자 세포에서는 mRNA 발현수준의 변화가 관찰되지 않았다(Fig. 1D).</p> <p>KCNJ11 mRNA발현수준이 Kir6.2 단백질 발현양상과 일치하는지 확인하기 위해 환자 세포와 정상 세포를 \( 4 \mathrm { mM } \) 과 1 \( \mathrm { mM } \) 칼륨 완충용액 모두에 30분간 노출시킨 뒤 세포질과 세포 막 분획의 단백질을 분리하여 Kir6.2 단백질의 발현수준을 확인하였다. 그. 결과 환자와 정상 세포 모두 \( 4 \mathrm { mM } \) 의 칼륨 농도에서는 mRNA 발현양상과 동일하게 세포질과 세포막에서 Kir6.2 단백질의 정량적 차이가 나타나지 않았다(Fig. 2). 그러나 \( 1 \mathrm { mM } \) 의 저칼륨 농도에 노출된 경우, 정상 세포에서는 세포질 내 Kir6.2 단백질의 정량적 변화는 없었던 반면 (Fig. 3A) 세포막상의 Kir6.2 단백질 양이 감소하였다(Fig. 3B). 환자 세포의 경우 세포질과 세포막 모두에서 Kir6.2 단백질의 정량적 차이가 관찰되지 않았다(Fig. 3C, D).</p> <p>정상 세포외 칼륨 농도에서는 환자와 정상 세포 모두 KCNJ11 mRNA 발현 및 세포질과 세포막상의 Kir6.2 단백질의 정량적 변화를 나타내지 않아 \( 4 \mathrm { mM } \) 칼륨 농도 조건에서는 환자 세포의 Kir6.2가 정상적인 \( \mathrm { K } _ {\mathrm { AIP } } \) 채널 기능을 위헤 사용되고 있음을 확인하였다. 그러나 정상 세포를 \( 1 \mathrm { mM } \) 의 저칼륨 완충용액에 노출하였을 때 KCNJ11 mRNA 발현과 Kir6.2 단백질의 세포막 분포 감소가 관찰되었다. \( 1 \mathrm { mM } \) 의 저칼륨 용액에 노출된 정상 세포는 과분극을 나타내는데, 정상인의 골격근 세포에서 Kir6.2가 SUR 단벡질과 결합하여 칼륨 채널을 폐쇄하는 기능을 수행하는 것을 고려할 때, 이는 기존에 알려진 칼륨 이온의 농도 구배에 따른 확산 이동 이외에도 이번 연구에서 확인된 \( \mathrm { K } _ {\mathrm { ATP } } \) 채널의 Kir6.2단위체 발현 감소와 세포막 상의 분포 감소가 세포막의 막전위 변화와 관계있음을 알 수 있다. 반면 환자의 골격근 세포가 \( 1 \mathrm { mM } \) 의 저칼륨 상태에 노출되면 막전압은 탈분극 되는데, 정상 세포의 경우, 재분극을 위해 같은 \( \mathrm { K } _ {\mathrm { ATP } } \) 채널을 구성하는 SUR2A 단위체의 세포질 내로의 이동이 일어나며, 과분극시에는 Kir6.2 유전자 인 KCNJ11의 발현이 감소되고 세포막내 분포가 감소하는 등 막전위의 변화에 따른 유전자 발현 및 세포막상의 분포 변화 가 일어나지만, 환자 세포의 경우 이 같은 생리적 보상기전이 일어나지 않아 세포막에 저류된 \( \mathrm { K } _ {\mathrm { ATP } } \) 채널의 폐쇄가 유지되어 세포내부의 칼륨 이온이 세포 외부로 방출되지 못하고 이로 인해 지속적인 탈분극을 유도하며 결국 안정적인 휴지막 전위 를 유지하지 못하게 됨으로써 임상적인 마비 증상을 초래하는 것으로 생각된다.</p>