본 연구에서는 \(10\%\) separating gel과 \(5\%\) stacking gel을 사용하였고, 이를 통해 total cytosol fraction과 SDS load-ing buffer를 혼합하여 단백질을 변성시켰다. 이후 스탠다드 마커와 함께 샘플을 전기영동하고, nitrocellulose membrane에 전사하였다. 다양한 1차 항체를 blocking 용액으로 희석시킨 후 TBS-T 용액으로 세척하였고, 이후 2차 항체를 사용하여 추가 처리를 진행하였다. 마지막으로 ECL substrate 용액에 membrane을 넣고 발색한 후 이미지 분석 시스템을 이용해 스캔하였다.
<h2>SDS-PAGE방법</h2> <p>\( 10 \% \) separating gel ( \( 30 \% \) acrylamide, \( 1.5 \mathrm { M } \) tris \( \mathrm { pH } 8.8,10 \% \) SDS, 10 \% Ammonium persulfate, TEMED)와 5 \% stacking gel(30 \% acrylamide, \( 1 \mathrm { M } \) tris \( \mathrm { pH } \) 6.8, 10 \% SDS, \( 10 \% \) Ammonium persulfate, TEMED)을 만들어 사용하였으며, 원심분리(15,000 rpm, 20분) 한 후, 상층액(total cytosol fraction)과 SDS load-ing buffer (60mM tris pH6.8, 25 \% glycerol, 2 \% SDS, \( 14.4 \mathrm { mM } \) 2-mercaptoethanol, 0.1 \% Bromophennol Blue)을 잘 혼합한 후 \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 10 분간 끓여 단백질을 변성시킨 다음, 얼음에 10분 식힌 후, 다시 원심분리 \( \left (15,000 \mathrm { rpm } , 20 \right . \) 분간, \( \left .4 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \) 하였다. 스탠다드 마커(SDS-PAGE Molecular Weight Strandards, BioRad)와 함께 각 샘플을 Mini-protein I dual-slab apparat us(Bio-Rad, CA, USA)에 준비된 stacking gel well에 총 단백질량이 \( 100 \mu \mathrm { g } \) 이 되도록 분주하고 \( 80 \mathrm { ~V } \) 에서 2 시간 정도 샘플이 바닥에 닿을 때까지 전기영동 하였다.</p> <h2>Western blot 분석방법</h2> <p>Transfer buffer (190 mM glycine, \( 50 \mathrm { mM } \) Tris-base, \( 0.05 \) SDS 20 \% methanol)에 적신 nitrocellulose membrane (Amer- sham), Whatman 3M paper을 차례로 겹친 후, Mini trans-blot module (Bio-Rad)에 장치하고 \( 40 \mathrm { ~V } \) 로 2 시간 전사하였다. Membrane으로 증착이 끝나면 rocker platform 위에서 1시간 동안 membrane을 3 \% skim milk 용 액(in PBS-T: \( 10 \mathrm { mM } \) Tris-base \( \mathrm { pH } \) 8.0, \( 150 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } , 0.05 \% \) Tween-20)으로 block-ing시켰다. 1차 항체인 anti-GLUT-1 (sc-7903, Santa Cruz, CA, USA), anti-PGC-1a (sc-13067, Santa Cruz, CA, USA), anti-Tfam(sc-23588, Santa Cruz, CA, USA), anti-SOD- 1(sc-11407, Santa Cruz, CA, USA) and anti-SOD-2 (sc-30080, Santa Cruz, CA, USA), anti-GAPDH (sc-0357, Santa Cruz, CA, USA)를 1:1,000으로 bolcking (3 \% skim milk) 용액으로 각각 희석시켜 12시간 동안 흔들어 준 다음 TBS-T 용액으로 10 분씩 3차례 세척한 후 2차 항체(horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit 65-6120, ZYMED, CA, USA; horseradish peroxidase-con-jugated rabbit anti-goat 81-1620, ZYMED, CA, USA)를 Blocking 용액으로 1:5,000으로 희석시켜 90분 동안 흔들어 주고 난 후 TBS-T 용액으로 10 분씩 3차례 세척하였다. 마지막 단계로 ECL substrate 용액 Santa cruz Biotechnology, CA, USA)에 membrane을 넣고 5 분간 발색하고 얻어진 membrane을 이미지 분석 시스템(Molecular Imager ChemiDoc XRS System, Bio-Rad, USA)을 이용하여 스캔한 후 Quantity 1-D Analysis Soft ware Bio-Rad, USA)를 이용하여 단백질량을 산출하였다.</p>