분비형 agarase 활성 확인을 위해서 한천분해 활성의 정량적 분석과 여과나 원심분리한 상층액으로 agarase의 활성을 확인한다. 한천 분해 활성의 정량적 분석을 위해서 세균 군락을 형성하여 clear zone이 형성될 때 agarase 활성이 있는 집락으로 파악한다. 여러 정량적 확인 방법중 Kazlowski는 high-performance size exclusion chromatography와 refractive index decetor, ELSD를 결합한 방법이 가장 이상적이라고 보고했지만 비용상의 단점이 있다. 특히 박막크로마토그래피법에서는 한천의 효소 분해산물과 표준물질을 전개시켜 가시화함으로써 agarase의 유형과 spot의 농도를 통한 정량적 측정이 가능하다.
<h1>Agarase의 활성 확인법</h1><h2>분비형 agarase의 활성 확인법</h2><p>한천배지에서의 생장양상으로 agarase가 분비형인지 아닌지의 여부를 판단할 수 있지만, 한천분해 활성의 정량적 분석과 액체배양에서의 분비형 여부를 확인하기 위해서는 후보세균을 배양한 후 pore size \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) 필터를 통과시킨 여과액의 agarase 활성을 확인하거나, 배양액을 원심분리한 상층액으로 agarase 활성의 확인이 가능할 것이다. 내재형 agarase의 경우는 여과액을 제거하여 세포를 모으고 이를 파쇄 후 활성의 확인이 가능할 것이다.</p><h2>정성적 활성 확인법</h2><p>간편하게는 세균이 생장하는 배지를 육안으로 관찰하여 집락 주위의 함몰로 활성을 파악할 수 있다. 한천분해 활성의 정성적 활성 확인을 위해서는 세균이 생장하는 배지위에 Lugol 시약 \( \left(5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{w}) \mathrm{I}_{2}, 10 \%(\mathrm{w} / \mathrm{w}) \mathrm{KI}\right) \)이나 Gran's iodine 용액(0.05 Miodine in \( 0.12 \mathrm{M} \mathrm{KI}) \)으로 5분간 처리한 후 clear zone이 생성되는 세균군락을 agarase 활성이 있는 집락으로 판단하고 있다. 한천분해산물의 확인은 TLC (thin layer chromatography)나 mass spectrometry 등을 이용하는 방법이 있다.</p><h2>정량적 활성 확인법</h2><p>Kazłowski 등은 한천분해 활성의 정량적 확인법으로 Somogyi-Nelson법, Miller의 DNS법, Davidson의 ferricya-nide법 등을 비교한 결과, high-performance size exclusion chromatography와 refractive index detector 및 ELSD(evaporative light scattering detector)를 결합한 방법이 가장 이상적이라고 보고하였지만, 고가의 기계를 구입해야 하는 단점이 있다.</p><p>일반적인 보고들에서 한천분해 활성의 정량적 확인법으로 spectrophotometry 법을 이용하는데, agarase와 기질이 반응하여 환원당 생성, 생성된 환원당과 검출시약과의 반응, 반응 중단, 생성된 환원당의 정량 등의 단계를 거치며 표준물질로는 galactose가 이용된다. 환원당은 반응성 있는 알데히드기 및 케톤기를 가지고 있으며, 금속염 알칼리용액을 환원시키는 성질이 있는 당의 총칭이다. Somogyi-Nelson 법은 당과 구리 시약의 반응으로 생성된 산화제일구 \( \left(\mathrm{Cu}_{2} \mathrm{O}\right) \)를 산성\( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4}\right) \) 조건에서 인몰리브덴산\( \left(\mathrm{H}_{3} \mathrm{CPO}_{4}\left(\mathrm{Mo}_{12} \mathrm{O}_{36}\right) \mathrm{nH}_{2} \mathrm{O}\right) \)과 반응시켜 몰리브덴청으로 발색시킨 후에 발색된 정도를 측정한다. 또 다른 방법으로는 구리용액으로 효소반응을 종료시킨 후에 neocuproine-\( \mathrm{HCl} \)을 첨가하고 중탕으로 끓인 다음 \( 460\mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하는 Dygert 등의 방법과, \( 0.25 \%(\mathrm{w}/\mathrm{v}) \) agarose를 함유하는 기질과 반응시킨 후 DNS (3,5-dinitrosali-cylic acid)로 반응을 중단하고 10분간 중탕으로 끓여서 520\( \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하는 Somogyi의 DNS법 등이 있다. Sadasivam과 Manickam은 탄수화물을 파악하는 여러 시약과 방법을 자세히 정리하고 있어 참고가 될 것이다. 또 다른 agarase 활성의 정량법으로 ANDS(monopotassium 7-amino-1,3-napthalenedisulfonic acid)와 sodium cyanoborohydride를 사용하는 FACE (fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis)법이 있는데, 한천분해산물의 정성적 분석도 가능한 장점이 있지만 아직 비색법에 비해 널리 사용되지는 않고 있다.</p><h2>박막크로마토그래피(TLC)법</h2><p>한천의 효소분해산물과 표준물질을 박막에서 전개시킨 후 가시화시켜 확인하는 방법을 이용하는데, 이를 통하여 agarase가 \( \alpha\)-agarase인지 \( \beta \)-agarase인지의 확인이 가능하고 가시화시킨 후의 각 spot의 농도로 개략적인 정량도 가능하다. 방법으로는 먼저 정제된 효소 혹은 조효소와 \( 0.25 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 이하의 agarose 혹은 agar가 함유된 기질용액을 반응시킨다. TLC로 전개할 때에는 전개시약으로 주로 n-buta-nol:acetate:\( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}=2:1:1 \) 용액이 사용되며, 전개가 완료된 후에 는 검출을 위해 \( 10 \%\) \(\mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \)를 뿌리고 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \)에서 가열하는 방법, diphenylamine-aniline 시약을 뿌리고 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 가열하는 방법 ethanolic sulfuric acid:naphtolresorcinol\(=2: 1\) 용액으로 검출하는 방법, diphenylamine/ani-line/phosphate 용액으로 가시화하는 방법 및 napthor-esorcinol 용액을 뿌리고 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 가열하여 가시화하는 방법 등이 보고되어 있다.</p>