AH18의 chromosomal DNA를 분리할 때 DNeasy Tissue Kit(QIAGEN Inc., U.S.A.)를 사용하였다. primer를 제작할 때 2,3-dihydro-2,3-dihydroxy benzoate dehydrogenase[EC:1. 3. 1. 28] gene (sid) 그리고 cellulase structure gene (cel)의 유전자를 포함하도록 하였다.
<h2>Multiplex PCR의 template DNA 준비.</h2><p>B. subtilis AH18의 chromosomal DNA 분리는 DNeasy Tissue Kit(QIAGEN Inc., U.S.A.)를 사용하였다. Colony-PCR시 주형은 본 균주를 nutrient broth에 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48시간 배양 후 원심분리하여 균체만 모아 멸균 증류수로 2회 세척 하여 멸균증류수로 일정량 희석하여 사용하였다. 토양권역별 monitoring을 위한 template DNA는 토양 내에서 PowerSoil \( ^{\text {TM }} \) DNA Kit(Mo Bio Laboratories, Inc., U.S.A.)를 이용하여 DNA를 분리하여 사용하였다. Rhizosphere구는 근권, 즉 식물뿌리에 묻어있는 흙에서 DNA를 분리하였으 며, non-rhizosphere구는 hizosphere 이외의 식물뿌리로부터 근권영역의 2배 가량 떨어져 있는 상부와 뿌리 하부위치의 훍에서, endophytic구는 식물뿌리에 묻은 흙(rhizosphere)을 멸균 증류수로 2회 수세 후 식물뿌리를 마쇄한 후 동일한 kit를 이용하여 template DNA를 분리하였다.</p><h2>Monitoring을 위한 PCR primer 및 multiplex PCR 조건</h2><p>PCR용 primers는 Table 2에 나타내었으며, B. subtilis의 genomic sequences들을 기초로 제작하였다. 각 primer들 은 B. subtilis AH18이 생산하는 것으로 확인된 auxin의 방출에 관여하는 auxin efflux carrier (aec), siderophore의 생합성에 관여하는 2,3-dihydro-2,3-dihydroxy benzoate dehydrogenase[EC:1. 3. 1. 28] gene (sid) 그리고 cellulase structure gene (cel)의 유전자를 포함하게 제작하였다. Multiplex PCR 용 Taq DNA polymerase는 Prime Taq DNA polymerase(Genet Bio Co., Ltd., Korea)를 사용하였으며, PCR 조성은 template DNA \( 2 \mu \mathrm{L} \)에 \( 10 \times \) reaction buffer \( 5 \mu \mathrm{L} \), 각각의 \( 10 \mathrm{pM} \) primer \( 1 \mu \mathrm{L} \), dNTP \( (10 \mathrm{mM}) 3 \mu \mathrm{L} \), Taq DNA polymerase \( (5 \mathrm{unit} / \mu \mathrm{L}) 0.5 \mu \mathrm{L} \)와 멸균증류수 \( 33.5 \mu \mathrm{L} \) 를 가하여 총 final volume \( 50 \mu \mathrm{L} \) 가 되도록 하였다. PCR 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 5분(pre-denaturation) 후 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 60초(denaturation), \( 60^{\circ} \mathrm{C}\) 60초(annealing), \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 90초(polymerization), 29 cycle를 수행 한 후 \( 72^{\circ} \mathrm{C}\) 5분(post-polymerization)을 행하였다.</p><h2>Gene cloning, DNA sequencing 그리고 상동성 확인</h2><p>각각의 PCR fragment들의 cloning방법은 우 등의 방법과 동일하게 실시하였다. 형질전환 후 선별배지에 도말하여 white-colony를 분리하였으며, 분리된 균주를 colony PCR을 통해 형질전환 균주를 선발하였나. 형질전환 균주에서recombinant plasmid를 정제 후 Solgent Co., Ltd. Korea 사에 의뢰하여 sequencing 하였으며 sequencing 결과는 NCBI의 BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 에서 blast 및 blastx를 통해 비교 확인하였다. 그 결과는 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)에 등록하였다.</p>