장미과 식물인 딱지꽃은 정선과 진주 이노플랜트에서 수급하였고 수급 된 딱지꽃은 건조시킨 후 메탄올 추출하였으며 추출된 추출물은 냉장 보관하였다. 딱지꽃 뿌리 추출물의 독성을 평가 하기 위해 MTT assay를 수행하였고 추출을 위해 딱지꽃 뿌리를 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(2 \)일 동안 건조하였고, 메탄올( \( 2 \mathrm { ~L } \))을 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <p>실험재료. 딱지꽃은 장미과 식물로써 본 실험에 사용된 딱지꽃은 정선 배서영농조합과 진주 영농조합법인 이노플랜트 두 곳에서 수급하여 사용하였다. 수급 된 딱지꽃은 건조시킨 후 메탄올 추출하였으며 추출된 추출물은 냉장보관 하였다.</p> <p>시약 및 기기. 딱지꽃 뿌리 추출물의 독성 평가를 위한 \(3 \)-[ \(4 \), \(5 \)dimethylthiazol- \(2 \)-yl]- \(2 \), \(5 \)-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) 및 dimethylsulfoxide (DMSO)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 또한 MTT assay 수행 시 UV Spectrophotometer (Thermo, Waltham, MA, USA)를 이용하여 \( 540 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광을 확인하였다. 그리고 딱지꽃 뿌리 추출물을 피부세포에 처리 후 특정 단백질의 양을 확인 하기 위해 real time PCR kit을 수행하였다. 이를 수행할 시 Rotor Gene Q Realtime PCR machine (QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 주로 사용하였으며, SuperPrep \( ^ {\mathrm { T M } } \) Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Toyobo, Kita-ku, Osaka, Japan, TOSCQ- \(101 \))를 이용하여 세포의 RNA를 추출하였다. 실험에 사용한 피부세포로는 HaCaT (Keratinocyte), CCD \(986 \)sk (Fibroblast), B \(16 \)F \(10 \) (melanoma cell)를 한국세포주은행에서 분양하여 사용하였다.</p> <p>딱지꽃 뿌리 추출 방법. 추출을 위하여 딱지꽃 뿌리를 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(2 \)일 동안 건조하였고, 메탄올( \( 2 \mathrm { ~L } \))을 사용하여 추출하였다. 추출 시 농도는 \( 2 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \)로 추출한 후, 여과하여 그 액을 실험에 사용하였다.</p> <p>세포독성 실험. 딱지꽃 뿌리 추출물의 독성을 평가 하기 위해 MTT assay를 수행하였다. HaCaT cell을 \(24 \) well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \)개의 세포를 분주하여 배양하였다. \(24 \)시간 후 Fetal bovine serum FBS를 포함하지 않는 배지로 교체하고 \(24 \)시간 동안 starvation하고, 시료를 농도별로 처리하였다. 그 후 \(24 \)시간 동안 배양하고 배지를 제거한 뒤 \( 5 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) 농도의 MTT 시약을 각 \( 40 \mu \mathrm { L } \)씩 처리 후 \(4 \)시간 동안 추가 배양하였다. \(4 \)시간 뒤 배지를 제거하고, DMSO를 \( 1 \mathrm { ~mL } \)씩 넣고 \(10 \)분간 흔들어 준 다음 \( 200 \mu \mathrm { L } \)씩 \(96 \) well에 취하여 UV Spectrophotometer로 \( 540 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>