감물염색은 코튼과 레이온을 자연발효된 감물원액에 dipping, 건조, 수세의 과정을 3회에 거쳐 반복하여 완성했다. 이 염색직물에서 다시 감물염색을 추출하여 시료로 하였다. 마우스는 DNFB를 아세톤과 올리브오일에 녹여 희석시킨 것을 이용해 감작시켰다. 이후 마우스의 각 조직을 절개하여 면역세포의 형태과 면역화학적 측면을 관찰하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>감물염색 재료와 재추출</h2> <p>감물염색의 재료는 경북 청도군 각남면 소재의 느티나무공방에서 구입하였으며, 감물로 염색한 직물의 종류는 (cotton), 인견(rayon)의 2종류이었다. 감물원액은 zelkova ate-lier에서 청도 인근 농가에서 반시를 수확하고 파쇄하여 즙액을 모으고 \( 18^{\circ} \mathrm{C} \) 정도의 서늘한 곳에서 자연발효로 최소 1년이상 정치시켜 수분이 \( 20 \% \) 이상 증발한 감물원액을 감물염색의 재료로 사용하였다. 감물염색을 시킬 2가지 직물을 각각 선정한 후, 이들 직물을 자연발효된 감물원액에 1차 dipping하고 자연 건조를 시켰으며, 물로 2-3회 spraying하여 수세하고 건조 후, 다시 1차 dipping 과정과 동일한 반복과정을 2회 더 거쳐서 감물염색 직물을 완성하였다(zelkova atelier). 이염색직물을 각각 \( 5 \mathrm{~cm} \times 5 \mathrm{~cm} \)로 절취하고 이를 증류수 10\( \mathrm{ml} \)과 같이, \( 50 \mathrm{ml} \) cornical tube에 넣어서 24시간 동안 rotator를 이용하여 교반추출하고 이를 동결건조시켜, 최종 powder를 얻었고 이를 \( 1 \mathrm{ml} \)에 녹인 것을 감물염색으로부터 추출한 시료로 하였다.</p> <h2>동물실험</h2> <p>동물실험은 Guiding Principles in the Care and Use ofAnimals (National Research Council, 1996)과 경북대학교 실험동물 윤리위원회의 기준을 엄격히 준수하였다. 실험에 사용한 동물은 \(22\)-\(25.0\mathrm{g} \)의 체중인 마우스를 선별하였으며 C57BL/6 (수컷, 샘타코, 오산)로, 각 그룹 당 5마리로 하였다. 동물은 지정된 수돗물과 사료를 급이하였으며, \( 23^{\circ} \mathrm{C} \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \) and \( 50 \pm 5 \% \) 습도를 유지시키고, 12시간 간격으로 점등하였다. Dinitrofluorobenzene (DNFB, Sigma Chemicals, St. Louis,\( \mathrm{USA}) \)는 최종 \( 0.5 \% \)가 되도록 아세톤과 올리브오일(\( 4:1 \))에 녹였으며 이를 마우스 등에 감작시켰다. 5일 후에 다시 \( 0.2 \% \)로 농도를 낮추어 2일마다 5회 재감작시켰으며 마지막 재감작 후 7일 뒤에 조직면역화학 분석을 수행하였다. 샘플처리는 재감작시키는 과정 중 DNFB를 처리하지 않는 날짜에 3회 처리하였다.</p> <h2>염색과 조직면역화학 분석</h2> <p>마우스를 희생시키고 조직을 절개하여 \( 10 \% \) paraformalde-hyde (in \( 0.1 \mathrm{M} \) PBS, \(\mathrm{pH}~7.4 \))로 고정하였으며, 파라핀으로 \( 4\)-\(6\mathrm{mm} \) section으로 잘라서 embed하였고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 슬라이드 온열기에서 하릇밤 세팅하였다. 파라핀은 자이렌 용액에 10분간 3회 적시어 제거하였고, xylene 제거를 위해서는 조직을 1시간 동안 \( 70\)-\(100 \% \) 에탄올에서 연속적으로 적시었다. 수세 후에 per-oxidase bleaching은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 \( 1 \% \) PBS/PBST 용액에서 수행하였다. 각 section은 Hematoxylin-eosin (HE)로 염색하여 일반적인 면역세포의 형태를 관찰하는 지표로 삼았다. 조직의 면역화학적 관찰을 위해서는 조직을 24시간 고정하였고, 파라핀 section을 Probe-On slide에 놓고 peroxidase 활성을 억제하기 위하여 \(3\%\) hydrogen peroxide를 함유하는 메탄올로 반응시킨 다음, 이 조직 절편을 \( 10 \% \) normal goat serum으로 1시간 처리하고 rabbit anti-MMP-2 antibody와 rabbit an-ti-MMP-9 antibody (Santa Cruz Biotechnology; \(1:200\))로 반응시켰다.</p>