두유 curd가 형성 시 10개의 균주를 제외한 균주들은 무른 curd가 형성되거나, 막이 형성되면서 부패되는 것이 관찰되었다. 그리고 선별 균주와 표준 균주의 염기서열간 상동성을 비교한 결과, 선변된 균주들은 2개의 group으로 동정되었다. 균주들을 분류, 동정하기 위해 일부 탄수화물 발효 양상을 제외하고는 일치하여비교적 정확한 동정이 가능하였다. 반면에 L. sake로 확인된 선별 균주의 경우 탄수화물 발효 양상에서 차이를 보여 분자생물학적 결과와 AP test가 일치하지 않았으며,균주 목록에 포함되어 있지 않음을 확인할 수 있었다. 한편, 165 rDNA를 이용한 동정에서는 L sakei로 확인된 균주 중\(CO_{2} \) gas가 발생하는 차이를 확인하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>두유 curd 형성 균주의 분리</h2> <p>김치로부터 분리하여 균락의 색깔, 모양이 서로 다른 196개의 단일 균주 중 10개의 균주(strain No. 2-2-2, 2-15-2, 2-18-1, 2-19-2, 3-4-1, 3-4-2, 3-8-1, 3-8-3, 3-17-1, 4-39-5)에서 순두부와 같이 비교적 단단한 두유 curd를 형성하였다. 10개의 균주를 제외한 다른 균주들은 두유에 접종 시 무른 curd가 형성되거나, 두유의 위층에 막이 형성되면서 그대로 부패되는 것이 관찰되었다.</p> <h2>두유 curd 형성 균주의 분자생물학적 분류와 동정</h2> <p>두유 curd를 형성하는 10 의 균주(strain No. 2-2-2, 2-15-2,2-18-1, 2-19-2, 3-4-1, 3-4-2, 3-8-1, 3-8-3,3-17-1, 4-39-5)에서 얻어진 genomic DNA를 template으로 하여 16S rDNA 를 PCR한 결과 \( 1.5 \mathrm{~kb} \) 의 PCR 산물을 얻을 수 있었다(data not shown). 선별 균주와 표준 균주의 165 rDNA염기서열간의 상동성을 비교한 결과, 선변된 균주들은 Leuconosto mesenteroides와 Lactobacillus saki 등 2개의 group으로 동정되었다.</p> <p>그러나 L sakei group와 선별된 4개의 균주(strain No. 2-2-2, 3-8-1, 3-8-3, 3-17-1)의 homology는 \( 99 \sim 100 \%\)로 나타났으나, L. sakei subsp. carnosus, L. sakei subsp. sakei 등과 같이 165 rDNA 염기서열들간의 차이가 나타나지 않아 아종 수준의 정확한 동정이 되지 않았다. 또한 L. mesenteraides group (strain No. 2-15-2, 2-19-2, 2-18-1, 3-4-1, 3-4-2, 4-39-5)의 경우에도 L. mesenteroides subsp. cremoris, L mesenteroides subsp. dextranicum 등 아종 간의 16S rDNA에 의한 염기서열들의 차이가 거의 없거나 전혀 없는 경우가 많아 구별이 쉽지않을 뿐만 아니라 L. mesenteroides 가 Lactococcus lactis, Leuconostoc kimchi 등과도 비슷한 염기서열로 되어있어 정확한 균주의 동정을 위해 분자생물학적인 방법 이외의 추가 실험이 필요하였다.</p> <h2>두유 curd 형성 균주의 생화학적 분류와 동정</h2> <p>분리된 균주들을 분류, 동정하기 위해 API test를 한 결과, 165 rDNA 염기서열분석에서 L. mesenteroides로 동정된 선별 균주의 경우, Table 2와 같이 API test 결과 strain No. 2-19-2에서 보여지는 일부 탄수화물 발효 양상을 제외하고는 대체적으로 일치하여 API test로도 비교적 정확한 동정이 가능하였다. 반면에 16S rDNA에 의한 염기서열분석에서 L. sake로 확인된 선별 균주의 경우에는 rhamnose, mannitol, a-methyl-D-glu-coide, salicin, maltose, trehalose, affinose, gentiobiose 등의 탄수화물 발효 양상에서 차이를 보여 분자생물학적 결과와 AP test가 일치하지 않았으며(Table 3), API 50 CHL에서 확인할 수 있는 균주 목록에 포함되어 있지 않음을 확인할 수 있었다. 동일 균주일 경우에도 상태에 따라 탄수화물 발효가 일어나는 조건이 조금씩 다름을 고려해 본다면 API test만으로 10개의 선별 균주가 모두 다른 균주라고 단정짓는 것은 어려울 것이라 사료된다. 김치 젖산균의 경우 대표적인 몇몇의 균이외의 균들은 연구가 많이 행해지지 않았으며 표준화된 동정방법이 부족한 실정이며 최근 일부 연구에서 API test로 동정되지 않는 젖산균이 상당수 존재하는 것으로 밝혀졌다. 또한 김치 젖산균의 경우 동정 기준이 모호하고 균의 특성에 대한 연구가 부족하여 동정하는데 어려움이 많은 것으로 여겨진다. 특히 L. sakei의 경우 API test로도 확인할 수 없는 균주임을 감안할 때 젖산균의 탄수화물 발효연구와 같은 생화학적 방법의 연구가 더 많이 이루어져야 하며, 앞으로 명확한 젖산균 동정을 위한 분자 생물학적 동정과 생화학적 분석이 필요할 것으로 여겨진다.</p> <p>\(CO_{2} \) 생성 실험에서는 API test와 16S rDNA 동정에서 L. mesenteroides로 확인되었던 6개의 균주(strain No. 2-15-2, 2-19-2, 2-18-1, 3-4-1, 3-4-2, 4-39-5)에서 모두 \(CO_{2} \)가 활발하게 발생하였다(data not shown). 한편, 165 rDNA 를 이용한 동정에서 .L sakei로 확인된 균주 중 strain No. 3-8-1, 3-17-1은 \(CO_{2} \) gas가 생성되지 않은 반면, strain No. 2-2-2, 3-8-3의 경우 소량의 \(CO_{2} \) gas가 발생하는 차이를 확인하였다(data not shown).</p>