고정화 효소의 흡착 특성에 대한 연구가 부족한 상황에서, amylase 효소의 흡착 특성 연구를 통해 Langmuir 흡착 등온식이 Freundlich 흡착 등온식보다 더 정확한 흡착 특성을 보여주었다. 그럼에도 불구하고, 고정화 효소는 높은 온도에 대한 용이한 운전성과 뛰어난 온도 안정성을 자랑한다. 이는 고정화 효소의 기울기가 자유 효소에 비해 완만함을 통해 알 수 있다. 또한, 고정화 효소와 자유 효소 사이에서 최대 속도인 \( \mathrm{V}_{\mathrm{m}} \)은 유사하게 관찰되었다. 이는 연속적인 생산 가능성에 의해 더욱 강조되며, 이를 통해 생산성과 안정성이 모두 탁월함을 확인할 수 있다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>효소의 담체에 대한 흡착 특성</h2> <p>효소의 농도를 \( 0.2 \mathrm{~mg} \mathrm{~ml}^{-1} \)에서 \( 2.0 \mathrm{~mg} \mathrm{~ml}^{-1} \)의 범위에서 변화시키면서 담체에 고정화되는 효소의 양을 측정하였다. 흡착된 효소의 양은 초기 효소농도에서 상등액(supernatant)에 남아있는 효소의 양 사이의 차이에 의해 결정되었다. 효소의 농도가 증가할수록 흡착되는 효소의 양이 완만한 포화곡선을 보이면서 증가함을 알 수 있다. 실험에서 구한 흡착 결과를 Langmuir와 Freundlich 흡착 등온식을 사용하여 비교하여 보았다. 비선형회귀에 의한 최적의 매개변수 값을 결정하였는데 Freundlich 등온식의 \(\mathrm{k}\)와 \(\mathrm{n}\)값은 각각 11.7과 0.52로 결정되었고 Langmuir 등온식의 \( Y_{\max } \)와 \( \Theta \) 값은 각각 22.3과 0.79였다. Langmuir 등온식이 실험 결과를 Freundlich 보다 잘 나타내고 있음을 보여주었다. Cellulase에 대한 고정화 흡착 특성을 나타낸 문헌은 없지만 효소 amylase의 담체에 흡착 특성을 연구한 결과에 의하면 Langmuir 흡착 등온식이 Freundlich 흡착 등온식보다 흡착 특성을 잘 나타냄을 보여주었다.</p> <h2>고정화 cellulase의 특성</h2> <p>자유 효소와 고정화 효소의 활성을 \( \mathrm{pH} \)에 대한 함수로서 조사하였다. 자유 효소와 고정화 효소의 활성은 \( \mathrm{pH} ~4.6 \)에서 최적을 나타내었다. 고정화에 의해 최적 \( \mathrm{pH} \)가 변하지 않았다. 고정화 효소의 활성은 그림에서 알 수 있듯이 모든 조사된 \( \mathrm{pH} \) 범위에서 자유 효소의 활성보다 높음을 알 수 있다. 이것은 고정화에 의해 효소의 안정성이 증가되었기 때문이다. 효소 활성에 대한 온도의 영향을 조사하였다. 모든 온도 범위에서 고정화 효소의 활성이 자유 효소에 비해 높게 나타났다. 그리고 고정화 효소의 활성이 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)에서 최적을 보였는데 이것은 자유 효소보다 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \) 높게 나타났다. 고정화 효소는 자유 효소에 비해 온도에 대한 안정성이 높아 높은 온도에서 운전할 수 있는 유리한 점이 있다는 것을 보여 준다. Duolite 담체에 고정화된 cellulase의 경우에는 \( \mathrm{pH} \)보다 온도에 대한 안정성이 넓고 높이 나타났다. 이것은 일반적으로 고정화 효소의 경우 담체 내부에 효소가 고정화됨으로 인해 열에 의한 효소의 구조적인 변형이 어렵기 때문이다.</p> <h2>고정화 효소의 반응 속도</h2> <p>자유 효소와 고정화 효소의 셀룰로스 가수 분해에 대한 반응 속도를 조사하였다. 기질로는 용해성 셀룰로스인 CMC를 사용하였다. CMC는 셀룰로스에서 glucopyranose에서 수산화기를 carboxymethyl기로 치환한 셀룰로스의 용해성을 부여한 유도체이다. 자유 효소와 고정화 효소의 가수분해는 Michaelis-Menten 식을 잘 따르고 속도 상수인 \( \mathrm{K}_{\mathrm{m}} \)과 \( \mathrm{V}_{\mathrm{m}} \)은 Lineweaver-Burk plot에서 절편과 기울기에서 구하고 이것을 초기값으로 하여 비선형 회귀로 최적의 상수를 결정하였다. 고정화 cellulase의 Michaelis 상수인 \( \mathrm{K}_{\mathrm{m}} \)값은 \( 30.1 \mathrm{~mg}\mathrm{~ml}^{-1} \)로 자유 효소의 값인 \( 20.9 \mathrm{~mg} \mathrm{~ml}^{-1} \)에 비해 약 1.5배 정도 높음을 알 수 있다. 이것은 일반적으로 고정화 효소의 경우 기질에 대한 친화도가 자유 효소에 비해 감소하기 때문이다. 문헌에 제시된 결과와 비슷한 값을 보여 주고 있다. 최대 속도인 \( \mathrm{V}_{\mathrm{m}} \)은 자유 효소나 고정화 효소 비슷하게 나타났다.</p> <h2>열 안전성</h2> <p>열에 대한 안정성을 평가하기 위해 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 시간에 따른 효소의 활성을 측정하였다. 효소의 열에 대해서 활성을 잃는 속도식은 1차식을 따른다고 알려져 있다. 효소 활성을 로그 스케일로 나타내었는데 선형적으로 감소하는 하는 것을 알 수 있고 이것으로부터 열에 대한 효소 활성 감소는 1차식과 부합한다는 것을 알 수 있다. 고정화 효소가 자유 효소에 비해 높은 완만한 기울기에서 알 수 있듯이 열 안정성이 우수함을 알 수 있다. 반감기는 고정화 효소의 경우 \( 250 \mathrm{~min} \)이었고 자유 효소는 \( 143 \mathrm{~min} \)으로 계산되었다. 고정화 효소의 열 안정성이 우수한 것은 효소가 담체에 고정화되면서 구조적 안정성을 유지하기 때문으로 문헌들이 보고하고 있다.</p> <h2>충진층 반응기 운전</h2> <p>충진층 반응기에서 기질인 셀룰로스를 재순환시키면서 포도당의 생산을 계속적으로 측정하였다. 투입되는 기질의 농도를 달리하면서 셀룰로스의 가수분해를 조사하였는데 기질의 농도를 증가시킬수록 포도당의 생산은 증가하였다. 기질을 재순환시키지 않는 연속 운전을 충진층 반응기에서 실시하였다. 투입되는 유량과 기질인 셀룰로스의 농도 변화에 따른 포도당 생산량을 측정하였다. 유량이 증가할수록 포도당의 생산은 감소함을 알 수 있다. 이것은 기질과 효소의 접촉시간이 단축되기 때문에 포도당의 생산은 감소하지만 생산성을 증가시키기 위해서는 투입 유량을 높여야 한다. 이 결과는 문헌과 잘 일치하며 포도당 생산을 늘리기 위해서는 단일 반응기보다는 다단 반응기가 유리하다고 판단된다. 담체에 고정화한 효소의 유당 분해에 대한 운전 결과를 수학적 모델링에 의해 충진층 반응기에서 투입되는 유량이 증가할수록 기질의 전환율은 감소하였고 이것은 실험 결과와 잘 일치함을 알 수 있다.</p> <p>고정화 효소의 운전 안정성을 평가하기 위해 장시간 연속 운전을 실시하여 효소의 활성 변화를 측정하였다. 시간이 경과하면서 효소의 활성이 감소함을 알 수 있다. 고정화 cellulase의 활성이 반으로 감소하는 반감기는 운전 7일 후에 도달하였다. 기존 문헌들은 회분식 반응을 반복하면서 반복 회분식 반응에 따른 효소 활성을 측정하여 반감기를 결정하였다. 대부분 10회 반복 이내에서 반감기에 도달하였는데 반복회분식에서 고정화 효소를 10회 이내로 재활용할 수 있음을 보여준다. 이에 비해 연속식 운전은 계속적으로 생산이 가능하기 때문에 생산성과 안정성 면에서 모두 우수함을 알 수 있다.</p>