본 연구에서는 subcloning된 프라즈미드 pKL11- \( \Delta 4. 6 \)을 통해 \( \beta \)-lactamase의 염기서열을 결정하였다. 이 \( \beta \)-lactamase 유전자의 upstream 170bp 염기서열은 B. thur-inginesis와 B. cereus 유래의 \( \beta \)-lactamase 유전자와 97% 일치하였다. NCBI BLAST program을 활용하여 아미노산 서열 분석 역시 B. thuringinesis와 B. cereus의 \( \beta \)-lactamase와 각각 97%, 94% 일치하였다. 또한, E. coli에서 재조합 \( \beta \)-lactamase의 발현과 세포 내외 존재 비율을 분석하였다.
<h2>DNA 염기서열 분석</h2> <p>최종적으로 subcloning된 프라즈미드 pKL11- \( \Delta 4.6 \)을 분리하여 \( \beta \)-lactamase의 염기서열을 결정하였다. 약 \( 6.4 \mathrm { ~kb } \)단편 내에 309개의 아미노산을 코딩하는 \( 927 \mathrm { bp } \)의 유전자를 포함하고 있었다. 클로닝된 \( \beta \)-lactamase 유전자의 upstream을 포함하는 \( 170 \mathrm { bp } \)의 염기서열을 분석한 결과, B. thur-inginesis와 B. cereus 유래의 \( \beta \)-lactamase 유전자의 upstream 부위와 \( 97 \% \)의 일치를 보였다(data not shown). 이 upstream 부위에서 \( 13 \mathrm { bp } \)의 inverted repeated sequences가 존재 하였는데, 이 서열은 hairpin loop 구조를 이룰 수 있다. 일반적으로 promoter 부위에 A + T rich 부위가 존재하는데, 이들은 두 가닥 DNA가 한 가닥으로 쉽게 분리되는 것을 도와주어 전사가 잘 일어나도록 한다. 본 연구 결과에서도 \( 29 \mathrm { bp } \)로 이루어진 A + T rich 부위를 확인 할 수 있었다. 본 연구에서 클로닝된 \( \beta \)-lactamase의 아미노산을 서열을 NCBI BLAST program을 이용하여 분석해 본 결과 B. thuringinesis와 B. cer-eus의 \( \beta \)-lactamase와 각각 \( 97 \% \)와 \( 94 \% \)의 일치를 보였다. 또한 Fig. 6에 나타낸 바와 같이 계통도 분석결과 역시 본 연구에서 클로닝된 \( \beta \)-lactamase의 아미노산을 서열은 B. thuringinesis와 B. cereus와 유적학적으로 아주 밀접한 관계를 보여주고 있다.</p> <h2>E. coli HB101에서 \( \beta \)-lactamase 유전자 발현 및 세포 내외 존재 비율 분석</h2> <p>E. coli에서 재조합 \( \beta \)-lactamase (pKL11/ pKL11- \( \Delta \mathrm { B } / \)pKL11- \( \Delta 4.6) \)의 발현 확인과 세포 내외 존재 비율을 분석하였다. 존재 비율 분석은 Neu의 방법을 변형하여 실험하였고 재조합 plasmid를 보유한 E. coli HB101균주를 LB 배지에서 18시간 배양한 뒤 세포외와 세포 내에서의 활성을 비교하여 Bacillus유래의 유전자가 E. coli에서의 발현될 때 세포 내외에 있어서 존재비율을 비교하여 Table 2에 나타내었다. 모든 recombinant plasmid (pKL11, pKL11- \( \Delta \mathrm { B } \), pKL11- \( \Delta 4 \).6)가 E. coli \( \beta \)-lactamase를 발현시켰으며 대부분의 \( \beta \)-lactamase가 cytoplasm에 존재하였고 약 \( 4 \sim 5 \% \)만이 분비되어 세포외에 존재하는 것으로 밝혀졌다. Bacillus유래의 단백질이 E. coli에서 분비될 때의 분비경로의 차이 혹은 signal peptide의 인식부위 차이에 의해서 대부분의 재조합 \( \beta \)-lactamase가 E. coli 세포내에 존재하는 것으로 생각된다. 그리고 E. coli에서 \( \beta- \)lactamase (pKL11, pKL11- \( \Delta \mathrm { B } \), pKL11- \( \Delta \) 4.6)의 발현 확인은 먼저 재조합 plasmid를 보유한 E. coli HB101 균주를 LB 배지에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 18 \)시간 배양한 뒤 Neu의 방법으로 세포를 파쇄한 뒤 세포내 단백질을 SDS-PAGE를 통하여 재조합 \( \beta \)-lacta-mase 단백질의 발현을 조사하였으며 Fig. 7에서 나타내었다. 전기영동 사진에서 재조합 \( \beta \)-lactamase 유전자를 포함하고 있는 pKL11, pKL11- \( \Delta \) B, pKL11- \( \Delta 4.6 \) 모두 Bacillus sp. J105균주에서 생산되는 \( \beta \)-lactamase와 동일한 \( 31 \mathrm { kDa } \)의 위치에서 \( \beta \)-lactamase가 발현되고 있음을 확인하였다.</p>