본 연구에서는 Escherichia coli JM109와 DH10B라는 bacterial strain을 이용해 plasmid를 cloning하였다. 또한, Huh7이라는 Human hepatoma cell line을 이용하여, reporter의 translation을 관찰하였다. 이를 위해 Huh7 cell은 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 Dulbecco's Modified Eagles Media(DMEM, Gibco BRL)를 사용하여 배양하였으며, seeding과 subculture 과정을 거쳤다. 최종적으로 세포 수를 haemocytometer를 이용하여 측정하였다.
<h2>재료 및 방법</h2> <p>Bacterial strains, plasmids 및 cell line</p> <p>본 실험에 사용된 plasmid를 cloning 하는 사용된 bacterial strain은 Escherichia coli JM109와 DH10B였다. Human hepatoma cell line인 Huh7 cello은 cell culture 상에서 reporter의 translation을 보기 위해 transient trans-fection에 사용되었다.</p> <p>Hepatoma cell line culture</p> <p>Huh7 cell은 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 \( 10 \% \) fetal bovine scrum(Hyclone)을 포함한 Dulbecco's Modified Eagles Media(DMEM, Gibco BRL)로 키웠으며 cell을 seeding \( \left (4 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { cell } / \mathrm { mL } \right ) \) 한 후 4일마다 subculture하였다. 이 때 \( 1 \mathrm { X } \) Trypsin-EDTA(1 L당 \( 8.2 \mathrm { ~g } \mathrm { NaCl } , 0.2 \mathrm { ~g } \mathrm { KCl } , 1.14 \mathrm { ~g } \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } \), \( 0.2 \mathrm { ~g } \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } , 0.29 \mathrm { ~g } \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { EDTA } ^ { 2 } \cdot 2 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } , 1 \mathrm { ~g } \) Trypsine, pH 7.35, Gibco BRL)를 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2분간 처리하여 cell을 때어낸 후 serum이 들어있는 DMEM을 처리하여 trypsin을 불할성화시켰다. \( 1200 \mathrm { rpm } \) 에서 10분간 원심 분리하여 cell을 가라앉히고 trypsin, DMEM mixture를 제거한 후 다시 serum이 들어 있는 DMEM media로 cell을 풀어주었다. 이중 \( 100 \mu \mathrm { L } \)를 취하여 Cell 수를 haemocytometer로 세었다.</p> <p>Plasmid construct의 제작</p>