토마토 주스로부터 분획한 ascorbate 및 phenolic 획분을 첨가량을 달리하였을 때 NDMA 생성에 미치는 영향을 알아보기 위한 실험을 진행한 결과, ascorbate 획분이 phenolic 획분보다 NDMA 억제 효과가 좋았다. 다음 실험으로는 phenolic 획분을 머무름 시간 별로 여러 fraction으로 분취하여 NDMA 생성에 미치는 영향을 알아보았는데, \( \mathrm{pH} 4.2 \)로 진행한 fraction2가 NDMA 생성 억제 효과가 가장 좋았다. 해당 fraction을 분석한 결과 o-coumaric acid의 존재가 NDMA 생성을 억제하는 데 가장 큰 역할을 한 것으로 생각된다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>Phenolic 획분이 NDMA 생성에 미치는 영향</h2><p>Sep-pak \( C_{18} \) cartridge를 이용하여 토마토 주스로부터 분획한 ascorbate 및 phenolic 획분을 \( \mathrm{pH}1.2\)의 반응조건에서 첨가량을 달리하였을 때 NDMA 생성에 미치는 영향을 실험한 결과는 Fig. 1과 같았다. 시료를 첨가하지 않은 대조구의 NDMA 생성량을 \( 100\% \) 로 하였을 때, ascorbate 및 phenolic 획분의 NDMA 생성 억제 효과는 시료의 첨가량이 많아질수록 증가하였으며, ascorbate 획분이 phenolic 획분보다 억제 효과가 높았다. 모델계 실험에서 phenolic 획분을 \(2 \mathrm{ml} \) 첨가했을 때 NDMA 생성 억제 효과는 \(36.7 \% \) 였으나, 여타 실험구에서는 모두 \(50\% \) 이상의 억제효과를 보였으며, 10\( \mathrm{ml} \) 첨가 시에는 ascorbate 획분에서 \( 81.37\pm 0.25\% \), phenolic 획분에서 \(72.03\pm 0.25 \% \)였다.</p><p>Fig. 2는 토마토 주스로부터 얻은 phenolic 획분을 prep-HPLC를 이용하여 머무름 시간별로 4 개의 fractions(1~4)으로 나누어 분취하였으며, fraction 2 는 다시 4개(2a~2d)의 단일 peak로 재분취하였다. 각 분획물이 NDMA 생성에 미치는 영향을 실험한 결과는 Table 1 및 2와 같았다. 분획된 fractions의 NDMA 생성 억제율은 fraction 1은 \( \mathrm{pH} 1.2\)에서 \( 37.57\pm 0.45 \% \), \(\mathrm{pH} 4.2\)에서 \(26.07\pm 0.21 \% \), fraction 4는 \(49.73 \pm 0.32 \% \)와 \(29.83 \pm 0.25 \% \) 였다. 특히 fraction2 는 \(\mathrm{pH} 1.2\)에서 \(50.10 \pm 0.46 \%\), \(\mathrm{pH} 4.2 \)에서 \(64.30\pm 0.20 \% \)를 보여 \( \mathrm{pH} 4.2 \)에서 NDMA 생성 억제 효과가 가장 높았다. 따라서 fraction2를 subfractions 2a, 2b, 2c 및 2d로 각각 분취하여 NDMA 생성 억제 효과를 시험한 결과, \(\mathrm{pH} 1.2\)에서 subfraction 2a는 \(68.80 \pm 0.50 \% \), subfraction 2d 는 \(67.15 \pm 0.25 \% \)였으며, subfraction 2b에서는 \(70.62 \pm 0.45 \%\) \((\mathrm{pH} 1.2)\) 및 \(75.30 \pm 0.45 \%\) \((\mathrm{pH} 4.2)\)로 억제율이 가장 높았다.</p><p>Lee 등은 \( \mathrm{pH} 1.2 \)에서 매실주스를 \(10 \mathrm{ml} \) 첨가하여 반응시킨 결과 NDMA 생성 억제율이 \(99.0 \% \)였는데, 이는 시료에 함유된 ascorbic acid나 페놀 화합물보다 유기산의 작용이 더 큰 것으로 보고하였다. 토마토가 NMOR 생성을 감소시킬 수 있는 것은 토마토에 함유된 ascorbic acid 외에 phenolic 화합물 등의 항산화 물질이 존재하기 때문이라는 연구보고도 있다.</p><p>본 실험에서 토마토 주스로부터 분획한 phenolic 획분의 NA생성 억제 활성은 ascorbate 획분에 거의 근접하고 있다. 따라서 NDMA 억제효과가 가장 높은 토마토의 phenolic fraction 2를 prep-HPLC로부터 활성이 가장 높은 물질을 분취하였다.</p><h2>토마토 phenolic 획분 2b의 구조</h2><p>NDMA 생성 억제 활성이 가장 높은 subfraction 2b를 정제하여 GC-Mass spectrum으로 분석한 결과 분자이온 \( \left[\mathrm{M}^{+}\right] \)의 peak가 \( m / z=166 \) 에서 관찰되었고, \( { }^{1} \mathrm{H}-\mathrm{NMR} \) spectrum에서는 \( \delta 7.23(\mathrm{H}, \mathrm{d}, J=7.8 \& 0.6 \mathrm{~Hz}) \) 과 \( \delta 7.38(\mathrm{H}, \mathrm{d}, J=7.8 \& 0.9 \mathrm{~Hz} \))의 signal은 coupling constant와 multi-plicity로 보아 2치환 aromatic ring의 proton들이 ortho, meta coupling함을 알 수 있으며, \( \delta 7.05(\mathrm{H}, \mathrm{td}, J=8.3 \&8.3\& 1.3 \mathrm{~Hz}) \) 와 \( \delta 6.89(\mathrm{H}, \mathrm{td}, J=7.5 \& 7.5 \& 1.2 \mathrm{~Hz}) \) 는 benzene ring의 proton이 ortho, ortho, meta-coupling하는 것으로 추정할 수 있었다. 이상의 분광학적 자료와 문헌치를 종합해 볼 때 화합물은 \( \mathrm{C}_{9} \mathrm{H}_{8} \mathrm{O}_{3} \) 의 분자식을 갖는 o-coumaric acid임을 알 수 있었다. 토마토 주스에는 phenolic acid ester 및 glucoside가 \(2\sim71 \mathrm{mg}/ \mathrm{kg} \) 정도 함유되어 있으며, 그 중 유리 상태의 coumaric acid는 \(1.9 \mathrm{mg} \)/\(100 \mathrm{g} \) 정도이다. 따라서 본 실험 결과 상기의 subfraction 2b의 NDMA 생성 억제 효과가 다른 subfraction에 비해 뛰어난 것으로 보아 토마토 phenolic 화합물 중 o-coumaric acid가 NDMA 생성 억제에 주된 작용을 한 것으로 판단된다.</p>