상동 재조합을 예방하기 위해 trnV-3 'rps12, trn-trnA, trnfM-trnG 등 16개의 intergenic region을 사용한 엽록체 발현 벡터 개발 연구가 진행되고 있고, aadA (aminoglycoside 3'-adenyltransferase) 유전자에 의한 스펙티 노마이신 저항성은 현재 사용하는 엽록체 형질전환 선발 마커 중 가장 생산적이다.
<p>저자들은 고등식물의 엽록체 형질전환 장점을 인식 하면서 (Chung et al. 2006) 엽록체 형질 전환 연구를 수행하여 왔다. GFP 단백질을 Nicotiana tabacum 과 Nicotiana benthamiana (Jeong et al. 2004; Davarpanah et al. 2009), human serum albumin (HSA) 및 human \( \beta \)-site APP cleaving enzyme \( ( \mathrm { BACE } ) \) 을 담배에서 발현, 생산 하였다 ( \( \mathrm { K } \)o et al. 2006; Youm et al 2010). 또한, 이차 상동 재조합을 방지하는 새소체 형질전환 벡터 (Liu et al. 2006)를 개발하여, 현재 남세균 및 연핵생물 유래 광합성 관련 유전자 등의 여러 유용 유전자들을 담배 및 감자 엽록체에 도입하여 형질전환체의 특성분석을 수행하고 있다. 본 논문에서는 고등식물의 엽록체 발현 형질전환 시스템을 이용하여 현재까지 개발된 농업적 형질의 약품 및 백신 연구 사례를 중심으로 서술하고자 한다.</p> <h2>고등식물의 엽록체 발현 시스템</h2> <h3>엽록체 형질전환 방법</h3> <p>금 또는 텅스텐 입자에 코팅시킨 DNA를 유전자 총을 이용하여 직접 식물체내로 도입시키는 엽록체 형질전환 방법 (biolistic = biological \( + \) ballistic)이 1988년 Chlamydomonas reinhardtii에서 처음으로 성공 (Boynton et al. 1988)한 이래 높은 형질전환 효율과 간편한 사용법으로 인해 현재 고등식물의 엽록체 형질전환에 보편적으로 사용되고 있다.</p> <h3>엽록체 형질전환 벡터 시스템</h3> <p>핵 형질전환과 달리 엽록체 형질전환은 상동 재조합에 의해 외래 유전자가 위치 특이적으로 엽록체 게놈에 삽입되므로, 효율적인 상동 재조합을 위해서는 외래 유전자의 양측에 엽록체 게놈 서열과 동일한 약 \( 1-2 \mathrm { ~kb } \) 크기 의 flanking sequence를 포함하도록 엽록체 발현 벡터를 제작한다. 현재까지 외래 유전자가 삽입된 엽록체 게놈의 intergenic region은 16곳이 보고되었고. (Maliga 2004), 특히 \( \operatorname { trnV-3 } \) 'rps12, \( \operatorname { trn } \)-trnA, \( \operatorname { trnfM } \)-trnG 세가지 부위가 주로 이용되며, 다니엘 연구실에서 개발된 trnI-trnA 부위 (Daniell et al. 1998)가 재조합 단백질을 생산하는 연구에 가장 많이 이용되고 있다.</p> <p>엽록체 게놈은 수많은 카피로 존재하므로 형질전환체를 얻기 위해서는 선발마커 유전자의 선택이 결정적으로 중요하다. 초기 엽록체 형질전환에 사용된 선발마커로는 항생제 스팩티노마이신에 내성을 부여하도록 point mutation 이 있는 16S rRNA (rrn16)를 사용하였으나 선발 빈도가 매우 낮은 단점 (Svab et al. 1990)을 지녔다. 반면, aadA (aminoglycoside 3'-adenyltransferase) 유전자에 의한 스펙티 노마이신 저항성은 현재 사용하는 엽록체 형질전환 선발 마커 증 가장 효을적인 시스템으로 알려져 있다 (Svab and Maliga 1993). 그 외에 항생제 카나마이신 저항성 유전자인 nptII 유전자 (Carrer et al. 1993), 독성물질인 betaine aldehyde 를 비독성 물질인 glycine betaine으로 전환시켜주는 효소인 BADH (betaine aldehyde dehydrogenase) 유전자 (Daniell et al. 2001b)가 사용되었으며, 항생제 저항성 유전자와 \( g f p \) (green fluorescent protein) 유전자를 동시에 사용하기도 하였다 (Maliga 2004; Jeong et al. 2004).</p>