대부분의 조직에서 관찰되는 DC의 분화는 대개 미성숙 상태로 이루어지는데, 이를 확인하기 위해 CD11\( \mathrm{c}^+ \) 의 발현 정도를 분석하였다. CD11\( \mathrm{c}^+ \) 가 \( 64 \% \) 이상의 세포에서 발현되어 있어 DC의 적절한 분화가 이루어졌음을 확인하였다. 미성숙 DC는 T세포나 다른 면역세포의 활성을 유도할 능력이 약하다. 하지만 항원을 인지하고 uptake하면 성숙단계로 발전하게 된다. 또한, 사리장의 처리로 인해 세포독성이 약간 관찰되었으나, co-stimulatory molecules인 CD80과 CD86, 그리고 MHC II의 발현 증가를 위한 사리장의 적용은 대조군인 LPS 처리군에 비해 매우 유의적임을 확인하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>DC의 분화 유도 확인</h2> <p>DC는 거의 모든 조직에서 관찰되지만 대부분 미성숙 상태로 관찰된다. 따라서 사리장이 DC의 성숙에 미치는 영향을 조사하기 위한 DC의 분화 여유를 확인하기 위하여 CD11\( \mathrm{c}^+ \) 의 발현 정도를 분석한 결과, 약 \( 64 \% \) 이상의 세포에서 CD11\( \mathrm{c}^+ \) 가 발현되어 DC로의 분화가 적절히 유도되었음을 확인하였다. 이러한 조건에서 사리장 및 LPS의 처리가 이들 세포증식에 미치는 영향을 조사하기 위하여 분화 유도 6 일째, 적정농도의 사리장 및 LPS \( (500 \mathrm{ng} / \mathrm{ml}) \) 를 처리하여 24 시간 배양하였다. 이들 세포를 대상으로 MTT assay 및 flow cytometry를 실시한 결과, LPS 처리군 및 사리장 농도 \( 10 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ml} \) 이하의 조건에서는 유의적인 세포 증식의 억제 및 세포사멸의 증가현상은 관찰되지 않았으나, \( 15 \mathrm{\mu l} / \mathrm{ml} \) 처리군에서는 약간의 세포독성이 관찰되었다.</p> <h2>사리장이 DC의 수용체 CD80 및 CD86 의 발현에 미치는 영향</h2> <p>DC가 미성숙 단계인 경우, 비교적 적은 형태의 돌기를 가지고 있고 T세포나 다른 면역세포의 활성을 유도할 수 있는 능력이 약하지만 항원을 인지하고 uptake하게 되면 성숙단계로 발전하게 된다. 성숙된 DC는 lymph node로 이동하게 되며 강력한 돌기 모양을 형성하고 표면 단백질 표시 인자(CD marker)의 극단적인 증가를 보이고 여러 가지 cytokine을 분비한다. 그 후 T 세포나 B 세포와의 상호작용을 통하여 이들 세포를 자극하여 활성을 유도한다. 따라서 본 연구에서는 사리장이 DC의 성숙에 미치는 정도를 조사하기 위하여 DC의 성숙 정도를 판단할 수 있는 수용체의 발현에 어떠한 영향을 미치는지에 대하여 조사하였다. 이를 위하여 준비된 DC를 대상으로 normal rat serum, Fc gamma receptor blocker, anti-CD11c+-APC, anti-CD80-PE 및 anti-CD86-PE로 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 분간 염색하여 flow cytometry 분석을 실시하였다. Fig. 2A 의 결과에서 알 수 있듯이, 사리장의 처리농도 의존적으로 DC의 표면 수용체 CD80의 발현양이 유의적으로 증가하였다. 특히 \( 10 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ml} \) 과 \( 15 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ml} \) 사리장 처리군에서는 대조군으로 사용된 LPS 처리 \( (500 \mathrm{ng} / \mathrm{ml}) \) 군보다 CD80 발현양이 더욱 높게 증가하였다. 한편 DC의 또 다른 표면 수용체인 CD86의 발현양도 사리장의 처리 농도 의존적으로 증가하는 것을 알 수가 있었지만 대조군으로 사용된 LPS에 의한 CD80의 발현보다는 다소 낮게 나타났다.</p> <h2>사리장이 DC의 수용체 MHC Ⅰ 및 MHC Ⅱ 의 발현에 미치는 영향</h2> <p>Immature DC (iDC) 는 virus나 bacteria와 같은 병인(pathogen)들을 찾기 위해 끊임없이 체내의 조직 곳곳을 순환한다. 이러한 과정은 pattern recognition receptors (PRRs)와 toll- like receptors (TLRs)에 의해 실행되어지며, TLRs는 pathogens의 특정부분에 있는 화학적 신호를 이용하여 patho-gen이라는 것을 인지한다. iDC는 항원과 접촉하였을 때 활성을 가지게 되고 성숙하여 phagocytosis하였던 pathogen 을 세포내에서 processing하여 major histocompatibility com-plex (MHC) molecule에 결합시켜 세포 표면으로 보낸다. 또한 이와 동시에 CD80, CD86 등 세포표면에 있는 Co-stimu-lated molecule의 발현이 증가되면서 이로 인해 비장(spleen) 에서 혈액을 통해 lymph node로 이동할 수 있게 되므로 DC성숙의 중요한 marker로 MHC의 발현양은 매우 중요하다. 예를 들어, 류마티스 관절염 같은 자가면역질환의 경우 활성화된 DC의 숫자가 증가되어 있고, DC 에 의한 자가항원 (self antigen)의 제시는 자가면역 질환에 결정적인 역할을 하기 때문에 DC의 성숙에 대한 조절은 면역학적 치료에 있어 중요한 부분이다. 이에 본 연구에서는 사리장에 의한 DC의 성숙에 대한 직접적인 증거를 제시하기 위하여 사리장을 처리한 후 유도된 DC를 대상으로 세포표면 수용체인 MHC I 및 MHC Ⅱ 의 발현 정도를 관찰하였다. Fig. 3A에서 알 수 있듯이 사리장이 처리된 DC에서 MHC I의 발현양은 변화가 없었으며 LPS 대조군에서도 이와 비슷한 결과를 얻었다. 그러나 DC 의 또 다른 표면 수용체인 MHC II의 발현양은 사리장의 농도 의존적으로 현저하게 증가하는 것을 알 수가 있었으며, 사리장의 최저농도 \( (2.5 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ml}) \) 에서도 대조군으로 사용된 LPS 처리 군 보다 MHC II의 발현이 훨씬 높게 나타났음을 확인할 수가 있었다. 이상의 결과에서 고농도의 사리장 처리군에서 약간의 세포독성이 관찰되었던 점을 고려하여도 대조군으로 사용된 LPS 처리군에서보다 co-stimulatory molecules인 CD80 및 CD86 뿐만 아니라 MHC II의 발현 증가를 위한 사리장의 적용이 매우 유의적임을 알 수 있었다.</p> <p>본 연구에서는 사리장이 DC의 성숙에 미치는 영향을 검토하기 위하여 GM-CSF와 IL-4를 이용하여 마우스의 BM세포에서 유래된 iDC를 이용하여 DC의 성숙에 관여하는 주요 인자들의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. LPS 대조군과 비교한 결과 사리장은 처리농도 의존적으로 CD80, CD86 및 MHC II의 발현을 현저하게 증가시킴으로 인하여 DC의 성숙에 관여함을 알 수 있었으며, 이는 면역활성 증가를 위한 사리장의 적용 가능성이 매우 높음을 의미한다. 그러나 이를 보완하기 위한 생리활성 성분의 탐색과 그들의 특징 조사에 관한 선행 연구가 동시에 이루어져야 할 것이다.</p>