유전자 \( glmS \)를 템플릿으로 한 \( 2.07 \mathrm { ~kb } \) \( \mathrm { DNA } \) 단편을 PCR로 합성한 후 T-Blunt 벡터에 클로닝하여 플라스미드 T-Blunt-glmS를 생성하였다. 이 플라스미드는 제한 효소 \( N o t \) I와 KpnI로 처리하여 \( 1.2 \mathrm { ~kb } \) DNA 단편을 얻고 이를 pCES208에 서브 클로닝하여 다양한 플라스미드를 제작하였다. 세포 생장은 분광광도계를 이용해 관찰하며, 포도당 농도는 ACCU-CHEK로 측정하였다. 파쇄된 조효소 추출액의 상등액을 단백질 분석에 사용하였으며, 단백질 정량은 Thermo Scientific Pierce \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) BCA Protein Assay Kit를 사용하였다.
<h3>유전자 발현벡터 제작</h3> <p>유전자 \( glmS \)는 \( C \). glutamicum 염색체를 주형 \( \mathrm { DNA } \)로 사용하고 프라이머 P17-P18을 첨가하여 \( \mathrm { PCR } \)을 수행하여 \( 2.07 \mathrm { ~kb } \) \( \mathrm { DNA } \) 단편을 얻어 후, T-Blunt 벡터에 클로닝하여 플라스미드 T-Blunt-glmS를 제작하였다. EcoRI과 \( K p n \mathrm { I } \) 제한효소로 처리하여 다시 \( 2.07 \mathrm { ~kb } \)의 단편을 정제한 후, 이를 \( \mathrm { pCX } \) 시리즈의 발현벡터인 pCXT20, pCXS30, pCXS35, pCXI40, pCXI43, pCXI45를 동일한 제한효소로 처리하고 정제한 플라스미드들과 \( \mathrm { DNA } \) 접합(ligation)하여, 최종적으로 플라스미드 pCXT20-glmS, pCXS30-glmS, pCXS35-glmS, pCXI40-glmS, pCXI43-glmS, pCXI45- \( glmS \)를 각각 제작하였다. \( glm1 \) 유전자의 경우, Saccharomyces cerevisiae 염색체를 주형 \( \mathrm { DNA } \)로 사용하고, 프라이머 P19-P20를 넣고 \( \mathrm { PCR } \)을 수행하여 \( 0.48 \mathrm { ~kb } \) \( \mathrm { DNA } \) 단편을 얻어 T-Blunt와 접합하여 플라스미드 T-Blunt-gnal 을 제작하였다. 제한효소 EcoRI과 HindIII로 처리 후 \( 0.48 \mathrm { ~kb } \) 의 \( \mathrm { DNA } \) 단편을 정제한 다음, \( E c o \mathrm { RI } / \) HindIII 효소처리된 pCXS30, pCXI40, pCXI43, pCXI45와 \( \mathrm { DNA } \) 접합하여, 최종적으로 플라스미드 pCXS30- \( glm1 \), pCXI40- \( glm1 \), pCXI43- \( glm1 \), pCXI45- \( glm1 \)을 각각 제작하였다. 이를 다시 복제원점이 다른 플라스미드 pCES208에 서브 클로닝(subcloning)하기 위하여, 각각 제한 효소 \( N o t \) I과 KpnI으로 처리 후 \( 1.2 \mathrm { ~kb } \)를 회수하여 pCES208/ \( Not \mathrm { I } / Kpn \)I과 접합하여, 최종적으로 pCES30- \( glm1 \), pCEI40- \( glm1 \), pCEI43- \( glm1 \), pCEI45- \( glm1 \)을 제작하였다.</p> <h3>분석 방법</h3> <p>세포 생장은 분광광도계(UV-2550, Shimadzu, 일본)를 사용하여 \( 600 \mathrm { ~nm } \)에서 관찰하였으며, 포도당 농도는 ACCU-CHEK (서울, 한국)을 사용하여 측정하였다. \( \mathrm { GlcNc } \)와 \( \mathrm { GlcN } \)의 농도는 HPLC (Shiseodo, Japan)로 분석하였다. \( 5 \mathrm { ml } \)의 발효 배양액을 \( 10,000 \mathrm { rpm } \) 에서 10분간 원심 분리하고 그 상등액을 acetonitrile로 적절히 희석한 후 \( 0.45 \mathrm { ~mm } \) 막여과기 (membrane filter)로 여과하여 분석용 샘플을 준비하였다. 컬럼(column)은 Asahipak- \( \mathrm { NH } _ { 2 } \mathrm { P50 } \)을, 검출기(detector)는 Shodex RI-104 (Shiseodo, Japan)를 사용하였으며, 이동상으로 \( 80 \% \) acetonitrile을 사용하여 유속 \( 0.5 \mathrm { ml } / \mathrm { min } \), 온도 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 조건에서 분석하였다. 세포 배양액 \( 15 \mathrm { ml } \)을 원심 분리하여 회수 후 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 2회 세척하고, 그 침전물에 PBS \( 1 \mathrm { ml } \)을 넣고 현탁하였다. \( 1.5 \mathrm { ml } \) 튜브에 \( 0.1 \mathrm { ~mm } \) 직경의 glass beads (BioSpec, USA) \( 0.5 \mathrm { ~g } , \mathrm { PBS } 0.5 \mathrm { ml } \)을 넣은 후, 세포 현탁액 \( 0.5-1 \mathrm { ml } \)을 넣고Bead beater (BioSpec, USA)로 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 조효소 추출액을 \( 13,000 \mathrm { rpm } \)에서 10분간 원심 분리한 후 상등액을 취하여 단백질 분석에 사용하였다. 단백질 정량은 Thermo Scientific Pierce \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., USA)를 사용하였다. SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)는 \( 10 \% \) gel에 열처리한 단백질 \( 10 \mu \mathrm { g } \)을 넣고 전기영동하였다.</p>