배추 유래 phytocystatin 유전자를 분리하기 위해 NCBI data 분석을 통해 primer Br1과 Br2를 합성하여 RT-PCR 분석한 결과 \( 171 \mathrm { bp } \) 단편을 얻었고, RACE 방법을 통해 full-length cDNA 단편을 얻었다. 이를 통해 Brcpi1 유전자의 구조를 분석한 결과, 609개의 염기로 구성하는 ORF 영역으로 203개의 아미노산으로 이루어져있으며, Brcpi1 유전자와 GenBank에 보고된 식물 유래의 phy-tocystatin 유전자들 간의 계통수를 구축하기위해 아미노산 배열을 나열하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Brcpi1 유전자의 분리 및 구조분석</h2> <p>배추 유래 phytocystatin 유전자를 분리하기 위해 NCBI data 분석을 통해 primer Br1 (5'-CAGGAGGTTGTTCATG CTAA-3')과 Br2 (5'-AGTTTTGCGCTTCAGGCA-3')를 합성하였다. 이들 두 primer을 사용하여 RT-PCR 분석한 결과 \( 171 \mathrm { bp } \) 단편을 얻었으 며, 애기장대 유래 AtCYSB 유전자와 상동성이 \( 98 \% \) 이었다. 따라서 RT-PCR에서 얻어진 단편은 배추 유래의 phytocystatin 라고 생각되어진다. 따라서 이 단편의 염기서열을 이용하여 RACE 방법을 통해 full-length을 얻은 결과 3' RACE에서 \( 575 \mathrm { bp } \) cDNA 단편을 5' RACE에서 \( 531 \mathrm { bp } \)의 단편을 얻었다. 또한 3' RACE 얻어진 단편에는 17개 A tail이 존재하며, 209 개의 염기가 UTR (untranslated region)으로 존재하며, 처음 분리한 단편과 125개 염기가 중복되었다. 5' RACE 얻어진 단편에서 처음 분리한 단편과 \( 62 \mathrm { bp } \)가 중복되었다. 따라서 분리한 유전자는 \( 881 \mathrm { bp } \) 크기로서 Brcpi1으로 명명하고, NCBI에 GeneBank EF079953로 등록하였다. Brcpi1 유전자의 구조 분석은 DNA star 프로그램 (코 아바이오)에 의해 분석한 결과 개시코돈은 63번째 염기,종지코돈은 673번째 염기에 존재하였고, 그 후에 poly A가 존재하는 full-length cDNA이었다. 따라서 Brcpi1 유전자는 609개의 염기로 구성하는 ORF 영 역으로 203개의 아미노산으로 이루어졌으며, \( 15.5 \mathrm { kDa } \) 의 크기로 \( \mathrm { pI } = 4.6 \)을 예측할 수 있었다.</p> <h2>아미노산 alignment와 phylogenetic tree 분석</h2> <p>Brcpi1 유전자와 GenBank에 보고된 식물 유래의 phy-tocystatin 유전자들 간의 계통수를 구축하기위해 아미노산 배열을 나열하였다. 아미노산 레벨수준에서 BrCPI 단백질은 Brassica oleracea (BoCPI-1), Arabidopsis thaliana (AtCYSB), Glycine max (GmCPI), Oryza sativa (OsCYS-2) 및 Zea may (ZmCPI)와의 상동성이 각각 95, 94, 81, 80 및 \( 78 \% \) 를 보였다. BrCPI1 단백질은 \( \mathrm { Q } \times \mathrm { V } \times \mathrm { G } \) motif 가 존재하고 있으며, 이들 배열은 cysteine protease inhibitor에 특이적으로 보이고 있다. BrCPI1 단백질을 구성하는 아미노산은 disulfide 결합을 형성하는 것으로 모든 papain계의 유전자에서 보고되었다. 또한 C 말단 영역에는 2개의 매우 유사한 보존영역이 존재하며 이들 영역은 토마토, 사탕수수, 키위, Arabidopsis 등 에서도 잘 알려져 있다.</p>