분리한 genomic DNA를 HindIII로 절단해 유전자의 copy 수를 확인하기 위하여 항생제 유전자(hygromycin, kanamycin)를 probe로 사용해서 1차로 hybridization을 실시하였고, 같은 membrane 을 deprobing한 후 bar 유전자를 probe로 2차 hybridization을 실시하였는데, 여기서의 발현양 차이는 genome 내의 도입유전자의 재배열, 도입유전자의 수, 삽입위치 등 많은 요인이 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있으며 형질전환체의 형태적 차이는 없는 것으로 보였다. pCK-Bar 운반체를 이용한 형질전환체의 경우 1개체가 kanamycin 유전자가 single copy로 삽입되었고, 12개체가 2 copy이상의 multicopy로, 4개체가 유전자 삽입이 확인되지 않았다.
<h2>형질전환체의 분자생물학적 분석</h2> <p>재분화된 식물체의 유전자 도입여부를 확인하기 위하여 \( 0.3 \% \) 바스타 제초제 처리시 생존개체를 대상으로 genomic DNA를 추출하여 Southern blot을 실시하였다. 분리한 genomic DNA를 HindIII로 절단한 후에 유전자의 copy 수를 확인하기 위하여 항생제 유전자 (hygromycin, kanamycin)를 probe로 사용하여 1차로 hybridization을 실시하였으며 같은 membrane 을 deprobing한 후 bar 유전자를 probe로 2차 hybridization을 실시하였다.</p> <p>pMOG6-Bar 운반체를 이용한 형질전환체의 Southern blot의 결과 hygromycin 유전자가 single copy로 삽입이 확인된 개체가 4개체이고 여러 copy의 유전자 삽입이 확인된 8개체와 유전자의 삽입을 확인할 수 없는 개체가 5 개체 (3,11,12,14,17번)였다. 이와 같이 Agrobacterium 을 매개로 한 형질전환시 one copy가 들어간 것이 일반적이나 실제 실험에서는 여러 copy가 들어간 경우도 다수 발견되는 것으로 보고 되고 있다. 같은 계통을 bar 유전자를 이용한 Southern blot 결과는 형질전환체와 positive control 모두에서 예상과 같은 약 \( 2 \mathrm{~kb} \) 정도 크기의 band를 확인할 수 있었으며 bar 유전자가 정상적으로 삽입됨을 확인하였다. Hygromycin 유전자는 삽입되지 않고 bar 유전자가 삽입된 5 개체는 1 차로 hygromycin선발 후 2차 선발시에 hygromycin을 사용하지 않았기 때문에 선발과정에서 유전자가 제거 된 것으로 생각되었다.</p> <p>형질전환체의 유전자 발현을 확인하기 위하여 형질전환체에서 total RNA를 분리하고 bar 유전자를 이용하여Northern blot 을 실시한 결과 발현양이 상대적으로 많은 개체와 (3,12,14 번) 발현양이 적은 개체(5,10,11 번)를 볼 수 있었으며 발현양에 상관없이 모두가\( 0.3 \% \) 바스타 제초제 살포 시에 생존하였다. 이런 발현양의 차이는 도입유전자의 수, 삽입위치, genome 내의 도입유전자의 재배열 등 많은 요인이 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있으며 형질전환체의 형태적 차이는 보이지 않았다.</p> <p>pCK-Bar 운반체를 이용한 형질전환체의 경우 kanamycin 유전자가single copy로 삽입된 것이 확인된 개체는 1 개체 였으며, 2 copy이상의 multicopy로 삽입된 12개체와 유전자 삽입이 확인되지 않는 개체가4개체였다. 그 중에서 53번과 54번, 64번과 66번 개체는 서로 같은 밴드 패턴을 지니고 있어서 형질전환시에 같은 shoot에서 유래할 수도 있음을 알 수 있다. 그러나 보다 정확한 정보를 얻기 위해서는 후대에서 도입유전자의 확인이 필요할 것으로 생각된다.</p> <p>형질전환체의 total RNA를 이용한 Northern blot결과, bar 유전자의 발현량은 52, 61, 62, 68 네 개체에서 높았으며 상대적으로 발현량이 적은 53, 56, 63, 67번 개체도 제초제 선발 권장 농도인 \( 0.3 \% \) 바스타에서 생존하였다.</p>