TSA1 변이 단백질의 제조를 위해 TSA1의 플라스미드를 주형으로 하여 각 잔기를 변이시킨 프라이머를 이용하여 변이 단백질 유전자를 제조하였고, 티오렉독신 의존성 과산화효소 활성은 과산화효소 반응에 의하여 측정하고, TSA1 단백질 정제는 콜로니를 배양하여 수확하고, 샤페론 활성은 구연산 생성효소를 사용하여 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>2-Cys 퍼옥시레독신군 단백질 서열 정렬</h2> <p>아미노산 서열자료는 NCBI의 PubMed Protein 중 퍼옥시레독신 참고서열(reference sequence)을 검색하여 정형 2-Cys Prx를 선택하였고, CLUSTAL W 프로그램(http://www.genome.jp/tools/clustalw/)을 이용하여 서열 정렬하여보존된 잔기를 조사하였다.</p> <h2>유전자 클로닝 및 발현</h2> <p>TSA1에 해당하는 DNA는 효모 cDNA를 주형으로 하여 PCR법에 의해 제조하였다. 아미노말단의 프라이머는 \(Nde\) Ⅰ 제한효소 자리(밑줄)와 개시코돈을 도입한 5’-AAACATATGGTCGCTCAAGTTCAAAAGCAAGCT-3’을 사용하였고, 카복시말단의 프라이머는 종결코돈과 \(Bam\)H Ⅰ 제한효소 자리(밑줄)를 도입한 5’-GGATCCTTATTTGTTGGCAGCTTCGAAGTATTC-3’를 사용하였다. 세린을 알라닌, 아스파트산을 발린과 아스파라진으로 변이시킨 TSA1 변이 단백질(S73A, D75V, D75N, D103V 및 D103N) 제조를 위해 TSA1의 플라스미드를 주형으로 하여 각 잔기를 변이시킨 프라이머를 이용하여 1차 PCR 한 후, PCR 산물을 주형으로 아미노말단과 카복시말단 프라이머를 가하여 2차 PCR을 하여 변이 단백질 유전자를 제조하였다. 1차 및 2차 PCR은 효모 cDNA \( 100 \mathrm{ng} \), 각 \( 20 \mathrm{pmole} \)의 프라이머와 5X Taq-PCRMix (Genotech Ltd)을 넣어주고 반응시켰다. 얻어진 PCR 산물은 pCR 2.1 vector에 삽입하였으며 한국기초과학연구소광주분원에 의뢰하여 염기서열 분석하여 확인하였다. \(Nde\) Ⅰ과 \(Bam\)H Ⅰ 제한효소로 처리한 TSA1 및 변이 단백질 유전자를 대장균 발현벡터 pET 14b에 도입하였으며 BL21(DE3)대장균 발현 시스템에 형질도입하였다.</p> <h2>재조합 단백질의 정제</h2> <p>TSA1 단백질을 정제하기 위해 LB 배지에 발현이 확인된 콜로니를 배양하여 \( 1 \mathrm{mM} \) isopropyl-1-thio-D-galactoside (IPTG)로 단백질 발현을 유도하여 균체를 수확하였다.</p> <p>초음파 분쇄기를 이용하여 파쇄한 His-tag TSA1와 His-tag 돌연변이 단백질을 포함한 조추출물을 Ni-NTA chelating agarose CL-6B관에 주입하고 \( 300 \mathrm{mM} \) imidazole 완충용액 \( (\mathrm{pH} \) 8.0)으로 용출시켜 분획하였다. SDS-PAGE로 분석하여 목적 단백질을 포함하는 분획들을 모았으며 사용 시까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다.</p> <h2>과산화효소 활성 측정</h2> <p>티오레독신 의존성 과산화효소 활성은 과산화효소 반응에 의하여 산화된 티오레독신이 티오레독신 환원효소에 의해 다시 환원될 때 NADPH가 산화되는 속도를 기준으로 측정하였다. \( 0.2 \mathrm{mM} \), NADPH, \(6 \mu \mathrm{M} \) 티오레독신, \( 0.3 \mu \mathrm{M} \) 티오레독신 환원효소, \( 1 \mu \mathrm{M} \) 의 각각 단백질 시료, \( 50 \mathrm{mM} \) HEPES 완충용액 \( (\mathrm{pH} 7.0) \) 을 포함하는 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 의 반응용액을 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 가 되도록 예열한 후, 과산화수소를 \( 1 \mathrm{mM} \) 이 되도록 가하고 반응을 시작하여 분광광도계 (U2800 UV-Vis Double Beam Spectrophotometer, Hitachi, Japan)를 이용하여 \( 340 \mathrm{~nm} \) 에서 NADPH의 흡광도 감소를 측정하였다.</p> <h2>샤페론 활성 측정</h2> <p>열변성에 의한 단백질의 응집을 막는 샤페론 활성은 Schizosaccharomyces pombe 구연산 생성효소(citrate synthase, CS) 를 사용하여 \( 43^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 단백질의 응집으로 인한 빛의 산란 증가를 억제하는 활성으로 측정하였다. 시트르산 생성효소 \( 1 \mu \mathrm{M} \) 을 포함하는 \( 50 \mathrm{mM}\) HEPES완충용액 \( (\mathrm{pH} 7.0) \) 에 단백질 시료를 가하고 분광광도계를 이용하여 \( 43^{\circ} \mathrm{C} \)를 유지하면서 시간의 흐름에 따른 \( 360 \mathrm{~nm} \) 에서 빛의 산란 정도를 측정하였다.</p>