조효소액을 Ammonium sulfate 침전 과정을 거쳐 농축시킨 후, Model 491 Prep Cell을 이용한 Native-PAGE 정제를 수행하였다. 정제된 단백질의 순도 검정을 위해 native-PAGE를 실시한 후 확인된 band가 chitinase 활성 band인지 확인하였다. 이 후 SDS-PAGE로 정제된 효소의 분자량을 측정하고, IEF에 따라 정제효소의 pl을 측정하였다. 다음으로 정제효소의 온도와 pH에 대한 안정성과 최적 조건을 검토하였다.
<h2>Ammonium sulfate 침전</h2> <p>조효소액을 ammonium sulfate \( 30 \sim 70 \% \) 농도로 포화시킨 다음 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 12,000 \mathrm{rpm} \) 에서 원심분리하여 침전된 단백질을 최소량의 \( 100 \mathrm{mM} \) phosphate buffer에 녹인 다음 동일한 완충액으로 3회 투석하고 polyethylene glycol (PEG) 6,000으로 농축하였다.</p> <h2>Model 491 Prep Cell을 이용한 Native-PAGE 정제</h2> <p>Native-PAGE의 조건은 Table 1 과 같이 \( 10 \% \) resolving (separating) gel \( 5 \mathrm{~cm} \) 에 \( 4 \% \) stacking gel \( 1 \mathrm{~cm} \) 의 원통형 gel을 만들었다. 조효소액 \( 240 \mu l \) 에 5배 농축된 sample buffer \( 600 \mu \) 를 첨가한 다음 원통형 gel에 loading 하였다. \( 15 \mathrm{~W} \) 의 일정한 전력으로 전기영동을 실시한 다음 선단지시약(bromophenol blue; BPB)이 바닥까지 모두 내려간 다음 이후에 용출되는 용출액을 fraction collector를 통해서 회수하였다. 각 fraction을 \( 280 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였고, chitinase 활성을 측정하였다.</p> <h2>Native-PAGE와 활성 band 측정</h2> <p>정제된 단백질의 순도를 검정하기 위하여 \( 7 \% \) 의 poly-acrylamide gel을 사용하여 Laemmli의 방법에 따라 native-PAGE를 실시하였다. Native-PAGE로부터 확인된 band가 chitinase 활성 band인지 확인하기 위해서 petri dish에 효소의 기질인 colloidal chitin을 \( 1 \% \) 함유한 고체 agar plate를 만들어서 전기영동을 실시한 acrylamide gel을 plate 위에 얹고 효소 반응 온도인 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 동안 반응시 킨 후 투명환을 확인하였다. 활성 band와 비교하기 위해 동일한 조건으로 전기영동한 것을 Coomassie blue R-250으로 염색하여 서로의 band를 비교하였다.</p> <h2>SDS-PAGE</h2> <p>정제된 효소의 분자량을 측정하기 위하여 Laemmli의 방법에 따라 SDS-PAGE로 측정하였으며, \( 10 \% \) poly-acrylamide gel과 Tris-glycine 완충액(25 mM Tris, \( 192 \mathrm{mM} \) glycine, \( 0.1 \% \) SDS, \( \mathrm{pH} \) 8.3)을 사용하였다.</p> <h2>|soelectric point pI 측정</h2> <p>정제효소의 pI (isoelectric point)는 isoelectric focusing (IEF)에 따라 ampholyte (pH 3.5 10)의 \( \mathrm{pH} \) 구배로 실험하였다.</p> <h2>정제효소의 온도와 \( \mathrm{pH} \) 에 대한 안정성 최적 활성 측정</h2> <p>각각의 온도와 각각의 \( \mathrm{pH} \) 완충액에 정제 효소를 30분 동안 방치한 후에 잔존활성을 측정하여 상대활성으로 안정성을 검토하였고 각각의 효소 반응 온도, \( \mathrm{pH} \) 별로 효소활성을 측정하여 최적온도와 \( \mathrm{pH} \) 를 검토하였다.</p>