플라스미드를 이용해 GNA1 효소를 생성하는 미생물 숙주 간의 차이를 분석하였다. 이 효소는 fructose-6-phosphate와 glutamine의 반응을 촉매하여 GlcNA와 GlcNAc의 합성에 필요한 glucosamine-6-phosphate를 생성한다. 제작된 벡터를 C. glutamicum ATCC 13032에 도입하고, 생산된 단백질을 SDS-PAGE를 통해 비교 분석하였다.
<h3>\( C \). glutamicum에서 \( glmS \) 및 \( gna1 \) 유전자의 발현</h3> <p>Glucosamine-6-phosphate synthase는 기질인 fructose-6-phosphate에 글루타민(glutamine)의 아미노기를 전달하여glucosamine-6-phosphate를 생합성하는 반응을 촉매하는 효소로, \( \mathrm { GlcNA } \)과 \( \mathrm { GlcNAc } \)의 생합성에 필수적인 효소이다. \( C \). glutamicum 유래의 glucosamine-6-phosphate synthase를 암호화하는 \( glmS \) 유전자를 잘 발현하기 위하여 \( C \). glutamicum에서 작동하는 6가지 종류의 발현벡터에 각각 클로닝하였다. 제작된 벡터들을 각각 \( C \). glutamicum ATCC 13032에 도입하고, 조효소액을 제조하여 SDS-PAGE를 통해 단백질의 생산을 비교 분석하였다. 그 결과 이론적인 단백질 분자량인 67,214 Da보다 약간 높은 위치에서 pCXI40- \( glmS \) , pCXI45- \( glmS \) 플라스미드를 함유한 재조합 \( C \). glutamicum에서 \( glmS \) 단백질이 잘 생산된 것으로 추정되며, 특히 pCXI40- \( glmS \)를 함유한 균주에서 가장 높은 수준의 단백질이 생산되는 것으로 추정된다. 따라서, ilvC 프로모터 (promoter)에 결합된 \( glmS \) 유전자를 함유한 플라스미드 pCXI40- \( glmS \)를 다음 연구에 사용하였다. Glucosamine-6-phosphate \( N \)-acetyltransferase는 glucosamine-6-phosphate에 아세틸(acetyl)기를 전달하여 \( N \)-acetylglucosamine-6-phosphate를 생합성하는데 관여하는 효소로, \( C \). glutamicum에는 존재하지 않기 때문에 이종의 미생물에서 도입하여야 한다. 본 연구에서는 \( S \).cerevisiae 유래의 \( gna1 \) 유전자를 \( \mathrm { PCR } \)로 증폭하여 4가지 종류의 발현벡터에 각각 클로닝하였다. \( GNA1 \) 효소가 잘 생산되는지를 확인하기 위하여, 제작된 벡터를 \( C \). glutamicum ATCC13032에 도입하고, SDS-PAGE를 통해 \( GNA1 \) 단백질의 합성 정도를 분석하였다. 이론적인 분자량인 \( 18,134 \mathrm { Da } \) 부위에서 대조균의 조효소액과 비교하여 특별한 차이를 확인할 수 없었다. 효소가 불용성의 봉입체(inclusion body) 형태로 생산되는지를 확인하기 위하여 원심분리하여 얻은 조효소액의 침전물을 SDS-PAGE로 분석한 결과에서도 발현의 차이를 확인할 수 없었다(결과는 제시하지 않음). \( GNA1 \) 효소 생산이 미생물 숙주 차이에 기인되는지를 확인하기 위하여 제작된 플라스미드를 \( E \). coli에 형질전환하여 제조된 조효소액을 이용하여 SDS-PAGE로 분석하였다. 그 결과, 플라스미드 pCXI40-gnal과 pCXI45-gnal 을 함유한 \( E \). coli에서 \( GNA1 \) 효소 생산이 잘되는 것을 확인하였다. 따라서, \( GNA1 \) 효소는 숙주세포의 차이에 기인하여 \( C \). glutamicum에서는 잘 생산이 안 되는 것으로 추정된다. SDS-PAGE 실험에서 가장 우수한 \( GNA1 \) 생산을 나타내는 플라스미드를 선택할 수 없어, \( \mathrm { GlcN } \)과 \( \mathrm { GlcNAc } \)의 생산능력을 평가하는 실험에는 4가지 재조합 플라스미드를 모두 이용하였다.</p>