기관분화나 체세포 배발생 과정에서 DNA methylation정도가 발생 단계에 따라 변화할 때 전반적인 유전자들의 발현 현황에 대한 연구를 위해 벼 캘러스 형성부터 재분화 단계까지 5-azaC에 의한 유전자 발현 양상을 각 발달 단계별로 재료를 채취하여 Gene-Fishing \( { }^{\mathrm{TM}} \mathrm{DEG} \) 스크리닝 하였다. 그 결과 벼 캘러스 유기 및 재분화 단계에 약 41 개 정도 유전자에서 5-azaC로 인한 발현차이가 있었으며, 발현의 차이를 보이는 밴드를 분리하고 클로닝하여 유전자를 확인한 결과 5-azaC 첨가로 발현양이 증가 및 감소된 유전자들을 확인하였다.
<h2>Demethylation 처리에 의한 유전자 발현 분석</h2> <p>현재까지 기관분화나 체세포 배발생 과정에서 DNA methylation정도가 발생 단계에 따라 변화한다는 결과는 많은 보고가 되어 있으나 전반적인 유전자들의 발현 양상에 관한 연구는 미흡하다고 할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 벼 캘러스 형성부터 재분화 단계까지 5-azaC에 의한 유전자 발현 양상을 알아보기 위하여 각 발달 단계별로 재료를 채취하여 Gene-Fishing \( { }^{\mathrm{TM}} \mathrm{DEG} \) 스크리닝을 하였다. N6 배지와 5-azaC가 첨가된 N6A 배지에서 형성된 캘러스와 이 캘러스를 각각 MSR 재분화 배지와 5-azaC가 첨가된 MSRA 재분화 배지로 옮긴후 10 일, 21일 정도 배양한 캘러스를 이용하여 GeneFishing \( { }^{\mathrm{TM}} \) DEG스크리닝을 하여 유전자 발현 양상을 보았다. 그 결과 벼 캘러스 유기 및 재분화 단계에서 5-azaC로 인한 유전자 발현에 차이가 있는 것을 알 수 있었고 약 41 개 정도 유전자에서 발현차이가 있는 것을 확인하였다. Figure 2 는 대표적인 예를 보여주는 것으로서 figure 2, I 유전자의 경우 5-azaC가 첨가된 캘러스 유기배지 (B-2)와 재분화 배지 (A-3, B-4)에서 발현양이 증가하는 것을 알 수 있었다. II의 경우에는 5 -azaC가 첨가된 캘러스 유기배지 (B-2)에서 발현양이 뚜렷하게 증가되고 재분화 배지에서는 발현양이 많지 않은 것으로 보아 캘러스 형성 시에 발현되는 유전자이면서 methy-lation에 영향을 받는 유전자로 추측된다. Figure 2 의 Ⅲ 은 5-azaC로 인해 유전자 발현이 감소되는 것을 나타낸 것으로 5 -azaC가 첨가된 배지 (A-3, B-2, B-4)에서 발현양이 현저히 낮아진 것을 보였다. 이렇게 발현 차이를 보이는 밴드를 분리, 클로닝하여 유전자를 확인한 결과 putative splicing factor 3a (I), Glutathione-S-transferase (II), alcohol dehydrogenase, germin-like protein, phosphoglycerate kinase, protein translocase등의 유전자들은 5-azaC 첨가로 발현양이 증가된 것으로 나타났고, AT-hook DNA binding protein (III), metallothionein-like protein, putative cystein proteinase inhibitor 등은 발현양이 감소하였다. \( \mathrm{Xu} \) 등 \( (2004) \) 은 장미 조직배양의 여러 분화 단계에서 AFLP 방법으로 methylation과 관련되는 것으로 나타난 밴드들 중에서 조직 특이적으로 나타난 밴드를 클로닝하여 분석하여 본 결과 DET 1와 \( \mathrm{Ca} 2+ \) dependent, solute carrier -like protein 이었다고 하였다.</p> <p>최근에 들어 유전자 발현 양상 분석에 DNA chip을 이용한 microarray 방법이 널리 이용되고 있다. Chang과 Pikaard (2005)는 애기장대에서 DNA methylation과 histone acetylation 상태에 따른 유전자 발현을 알아보기 위하여 애기장대를 demeth-ylation 물질인 5-azaC와 histone deacetylation을 억제하는 hostatin A (TSA)로 각각 또는 동시에 처리하여 배양 후 microarray 분석을 하였다.</p>