Neuraminidase(NA) 효소 활성 저해 실험에는 노루궁뎅이버섯, 잔나비불로초, 낙엽진흙버섯, 운지버섯, 차가버섯, 상황버섯의 자실체 열수추출물을 제조하여 각 버섯 열수 추출물의 NA 효소 활성 저해를 비교한 결과 낙엽진훍버섯의 열수추출물이 NA 효소 활성을 가장 강하게 저해하는 것으로 나타나 Influenza virus(Flu)에 대한 항바이러스 활성 물질이 있음을 보였으며 EP의 neuraminidase에 대한 저해 활성은 P. pini 자실체의 수용성 고분자 성분인 EP가 현재 인간 인플루엔차 바이러스 A와 B 및 조류인플루엔자 바이러스에 대한 치료제로 사용되고 있는 zanamivir (Relenza \( ^{\mathrm{TM}} \) )나 oseltamivir(Tamiflu \( { }^{\mathrm{TM}} \)와 같이 influenza 바이러스에 대해 매우 선택적이고 강력한 항바이러스 활성을 갖는 물질일 가능성을 보였다.
<h2>Neuraminidase 활성 저해능</h2> <p>Neuraminidase(NA) 효소 활성 저해 실험에는 낙엽진흙 버섯 자실체외에, 노루궁뎅이버섯 \( (H \). erinacium \( ) \), 운지버섯 \( (C \). vesicolor), 상황버섯 \( (P \). linteus), 잔나비불로초( \( G \) applana-tum), 차가버섯 (I. obliquus)의 자실체 열수추출물을 낙엽진흙 버섯의 경우와 동일한 방법으로 제조하여 각 버섯 열수 추출물의 NA 효소 활성 저해를 비교한 결과(Fig. 5), 시료를 넣어주지 않은 대조군(Control)으로 측정한 fluorescence값을 100%로 하였을 때 노루궁뎅이버섯 \( (H \). erinacium \( ) \), 운지버섯 \( ( \) C. vesicolor \( ) \), 상황버섯 \( (P \). linteus \( ) \)의 추출물은 NA 효소 활성 저해능이 없었으나, 잔나비불로초 (G. applanatum) 12%, 차가버섯 (I. obliquas) 18.28%, 낙엽진 흙버섯 \( (P \). pini \( ) \) 58.8%로 낙엽진흙버섯의 열수추출물이 NA 효소 활성을 가장 강하게 저해하는 것으로 나타나, 낙엽진훍버섯의 열수추출물에 Influenza virus(Flu)에 대한 항바이러스 활성 물질이 있음을 보였다. 따라서, 가장 높은 저해 활성을 보인 낙엽진흙 버섯의 열수 추출물로부터 에탄올 침전으로 얻어진 저분자의 상등액(ES)과 고분자 침점물인 EP에 대해 NA에 대한 저해 활성을 조사한 결과(Fig. 6A), ES는 \( 1.7 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 에서도 저해 활성은 나타나지 않았으나, EP는 약 75%의 효소활성 억제효과를 보였다. 열수추출물과 EP의 농도를 각각 \(0.4, 0.8, 1.7, 3.4 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 농도별로 처리하여 효소 활성 저해를 측정한 결과(Fig. 6B), 열수추출물의 경우 33.3, 42.1, 56.4, 68.8%까지 저해활성을 보였으나, EP의 경우, 각각 48.3, 60.2, 74.9, 86.7%까지 저해하여, 열수추출물과 EP모두 농도 의존적으로 NA 효소 활성을 현저히 저해하였으며, 에탄올 침전으로 얻어진 고분자 침전물이 보다 높은 저해 활성을 보였다. 이는 열수추출 후에 75%에탄올 침전 및 투석(MWCO 14,000) 처리가 P. pini 자실체로부터 항바이러스 활성물질의 정제에 유효하였다는 것을 보여 주었다. EP의 neuraminidase에 대한 현저한 저해 활성은 P. pini 자실체의 수용성 고분자 성분인 EP가 현재 인간 인플루엔차 바이러스 A와 B 및 조류인플루엔자 바이러스(AI)에 대한 치료제로 사용되고 있는 oseltamivir(Tamiflu \( { }^{\mathrm{TM}} \)나 zanamivir (Relenza \( ^{\mathrm{TM}} \) )와 같이 influenza 바이러스에 대해 매우 선택적이고 강력한 항바이러스 활성을 갖는 물질일 가능성을 시사하였다. 또한, EP가 외피가 없는 RNA 바이러스(non enveloped RNA virus)인 CVB3 뿐만 아니라, 외피를 갖는 DNA 바이러스인 influenza virus 등에도 광범위하게 항바이러스 활성을 나타낼 수 있음을 보였다.</p> <h2>EP의 성분 분석</h2> <p>항바이러스 활성이 확인된 고분자 에탄올 침전물(EP)의 성분당 조성 및 단백질 함량을 조사하였다. EP 시료를 \( 2 \mathrm{M} \) trifluoroacetic acid(TFA)로 산가수분해 후 PMP로 표식하고, \( \mathrm{C}_{18} \mathrm{ODS} \) column 상에서 HPLC로 분석한 결과(Fig. 7, Table 1), EP는 주로 탄수화물로 이루어져 있으며, 특히 glucose의 함량이 79.8% 로 가장 높았고 galactose 9.1%, xylose 8.3%, mannose와 fucose도 소량 포함되어 있었다.</p> <p>이는, EP가 버섯 자실체의 열수 추출물로부터 에탄올 침전으로 얻어진 고분자물이라는 점에서 EP가 다당류의 일종으로, 특히, glucose가 80% 이상을 차지하는 heteroglycan의 일종이며, EP 건조물이 상온에서 증류수나 항바이러스 실험을 위한 \( \mathrm{HeLa} \) 세포 배양배지에 녹일 경우에도 침전물 형성 없이 잘 녹아 EP가 수용성의 glucan임을 알 수 있었다. 한편, EP에는 적은 량(12.7% in mass)이지만 단백질이 존재하는 것으로 나타났다(Table 1). 이는 EP가 소량의 단백질 또는 작은 펩타이드를 함유한 당단백의 일종일 가능성이 있는 것으로 사료된다. 그러나, 단백질 부분이 탄수화물에 화학적 결합으로 존재하는지는 확실치 않으며, 현재 본 연구실에서는 EP의 완전 정제 및 glucose 분지의 빈도, 분지 사슬의 glucose 함량, 다른 성분당들과의 결합 구조, 탄수화물과 단백질 부분의 화학적 결합 여부 등의 보다 상세한 구조분석 연구와 EP의 항바이러스 활성에 관한 상세한 작용 기작 등에 대한 연구를 진행 중에 있다.</p>