말오줌나무 추출물은 \( 500~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 농도에서 \( 108 \% \)의 높은 세포 생존율을 확인할 수 있었으며, 따라서 이하의 western blot과 RT-PCR의 실험은 \( 500~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도 이하에서 실험을 진행하였고, ( 1,000~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 \( 29.0 \% \)의 저해율을 나타낸 것을 확인하였다. RAW 264.7 세포에서 염증발현을 억제시키는 것에 말오줌나무 추출물이 효과가 있음을 확인 가능하였고, 염증발현 인자인 iNOS와 COX-2의 단백질 발현 억제 효과를 측정하기 위해 western blot을 통해 실험하였다. 대식세포인 RAW 264.7에 말오줌나무 추출물을 50, 100, 500\( ~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도별로 처리하여 24시간 뒤에 단백질 발현 억제 효과를 측정한 결과를 나타내었고, 말오줌나무 추출물을 저농도로 처리하였을 때 iNOS 단백질의 발현이 소폭 억제된 것과 유사하다고 판단하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>MTT assay에 의한 세포 생존율 측정</h2> <p>세포 생존율을 확인하기 위하여 진행한 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 담황색의 기질로 생 세포의 미토콘드리아 내의 호흡연쇄 효소에 의해 환원되어 암적색의 formazan을 생성한다. 죽은 세포에서는 반응이 일어나지 않고 생 세포에서 생성된 formazan의 생성량을 측정하는 시험법이다. 말오줌나무 추출물의 세포생존율을 대식세포인 RAW 264.7에서 MTT assay로 확인한 결과 Fig. 1과 같이 나타내었다. 말오줌나무 추출물은 \( 500~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 농도에서 \( 108 \% \)의 높은 세포 생존율을 확인할 수 있었으며, 따라서 이하의 western blot과 reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)의 실험은 높은 생존율을 보인 \( 500~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도 이하에서 실험을 진행하였다.</p> <h2>Nitric oxide (NO) 저해활성 측정</h2> <p>활성산소 중 하나이며 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO 생성에 대한 말오줌나무 추출물의 효과를 알아보았다. 그 결과 Fig. 2와 같이 LPS 처리군은 LPS 무처리군에 비해 높은 NO 발현량을 나타내었으며 말오줌나무 추출물을 처리한 군은 NO 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. \( 1,000~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 \( 29.0 \% \)의 저해율을 나타낸 것을 확인하였으며, RAW 264.7 세포에서 염증발현을 억제시키는 것에 말오줌나무 추출물이 효과가 있음을 확인할 수 있었다.</p> <h2>iNOS 및 COX-2 단백질 및 mRNA 발현 억제 효과 측정</h2> <p>염증반응이 일어나면 염증매개물질인 nitric oxide (NO), prostaglandin \( \mathrm{E}_{2}\left(\mathrm{PGE}_{2}\right) \), 염증성 cytokine 등이 분비된다. 그 중 염증반응의 지표물질인 NO는 L-arginine에서 NO synthase (NOS)에 의해 합성되며, NOS에는 endothelial NOS, neuronal NOS, inducible NOS (iNOS)의 세가지 형태가 존재한다. 이들 중 iNOS에 의한 NO형성은 병리학적으로 중요한 역할을 한다.</p> <p>다른 염증인자 중 하나인 cyclooxygenase COX는 arachidonic acid를 prostaglandins로 전환하는 효소로 COX-1과 COX-2가 존재하며, 이는 다양한 세포에서 다른 경향을 나타낸다. COX-1은 정상적인 세포에서 정상적인 생체 기능을 하지만 COX-2는 염증반응 부위에서 발현이 된다. COX-2에 의해 생성되는 \( \mathrm{PGE}_{2} \)는 통증, 발열 등에 관여하는 염증 매개체로서 염증반응, 면역반응에 관여하고 혈관신생을 촉진시키는 것에 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 염증발현 인자인 iNOS와 COX-2의 단백질 발현 억제 효과를 측정하기 위해 western blot을 통해 실험하였다. 대식세포인 RAW 264.7에 말오줌나무 추출물을 50, 100, 500\( ~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도별로 처리하여 24시간 뒤에 단백질 발현 억제 효과를 측정한 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 이 때, 세포의 종류나 환경에서도 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 \( \beta \)-actin을 positive control로 사용하였다. 그 결과 Fig. 3과 같이 말오줌나무 추출물을 50, 100, 500\( ~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 처리한 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 증가된 iNOS와 COX-2 단백질 발현양이 농도가 높아짐에 따라 억제됨을 확인하였으며, \( 500 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 에서 각각 \( 31 \% \), \( 54 \% \)의 효과를 나타내었다. 또한 대조군인 비타민 C와 비교하였을 때 대조군보다 감소하는 것으로 보아 단백질 발현 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었다.</p> <p>또한 iNOS, COX-2의 mRNA 발현 억제 효과를 측정하기 위하여 reverse transcription-PCR을 이용하여 확인하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였다. 말오줌나무 추출물을 \( 50,100,500~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도 별로 처리한 후 LPS에 의해 증가된 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현양의 감소를 측정하여 Fig. 4과 같이 나타내었다. Fig. 4 에서 보는 바와 같이 mRNA 발현이 농도가 높아짐에 따라 억제되는 것을 확인하였고, 대조군인 비타민 C와 비교하였을 때 iNOS는 대조군에 비해서는 감소하지 않았지만 유사한 결과를 나타냈고 COX-2는 대조군에 비해 현저히 감소한 결과를 나타내어 iNOS와 COX-2에서 유의한 억제 효과를 확인하였다.</p> <p>Kim 등의 말오줌나무 추출물의 항염증 활성에 대한 과거 연구에서 \( 50~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도에서 말오줌나무 추출물은 NO 생성을 \( 46.75 \% \) 억제시켰다. 본 연구결과에서 말오줌나무 추출물을 저농도로 처리하였을 때 iNOS 단백질의 발현이 소폭 억제된 것과 유사하다고 판단되며, 말오줌나무의 항염증 활성에 대하여 더 많은 연구가 진행된다면 기능성 화장품 소재로서의 활용 가능성이 높아질 것이라고 판단된다.</p> <p>Kim 등의 말오줌나무 추출물의 항염증 활성에 대한 과거 연구에서 \( 50~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도에서 말오줌나무 추출물은 NO 생성을 \( 46.75 \% \) 억제시켰다. 본 연구결과에서 말오줌나무 추출물을 저농도로 처리하였을 때 iNOS 단백질의 발현이 소폭 억제된 것과 유사하다고 판단되며, 말오줌나무의 항염증 활성에 대하여 더 많은 연구가 진행된다면 기능성 화장품 소재로서의 활용 가능성이 높아질 것이라고 판단된다.</p>