Bryostatin-1 처리가 세포 내 베타-catenin 단백질 수준을 감소시키는 것이 mRNA의 감소에 의한 것인지를 알아보았다. 결과적으로, 이 감소는 프로테아좀 의존적임을 확인하였으며, 프로테아좀 저해제인 MG-132를 처리하면 Bryostatin-1에 의한 베타-catenin 감소 효과가 사라지는 것을 확인하였다.
<p>Bryostatin- \(1 \)의 처리에 의한 세포 내 \( \beta \)-catenin 단백질 수준의 감소가 mRNA 양의 감소에 의한 것인지를 확인하기 위하여 반정량적 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. HEK \(293 \) 표지세포를 \( 60 \mathrm { ~mm } \) 배양접시에 배양한 후 Wnt \(3 \)a 배지와 다양한 농도의 bryostatin- \(1 \)을 처리하였다. TRIzol 용 액(Invitrogen)을 이용하여 \( \mathrm { RNA } \) 를 추출하고 \( \mathrm { M } - \mathrm { MLV } \) (Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 \( \beta \)-catenin 특이적 프라이머(Forword: \(5 \)'-GGG ATG TTC ACA ACC GAA TTG TTA TC- \(# \)', Reverse: \(5 \)'-ACC AGA GTG AAA AGA ACG ATA GCT AGG A- \(3 \)')를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과 \( \beta \)-catenin 단백질 수준에서 얻은 결과와는 상반되게 \( \beta \)-catenin mRNA의 양은 다양한 농도의 bryostain- \(1 \) 에 의해 변하지 않았다(Fig. \(2 \)B).</p> <p>기존의 연구결과에 의하면 세포 내 \( \beta \)-catenin의 단백질 양은 프로테아좀 분해 경로에 의해 조절 된다고 알려져 있다. Bryostatin- \(1 \)에 의한 \( \beta \)-catenin 단백질 수준의 감소가 프로 테아좀에 의존적인지를 확인하기 위하여 프로테아좀 저해제인 MG- \(132 \)을 처리한 후 세포 내 \( \beta \)-catenin 단백질 수준을 western blot을 이용하여 확인하였다. 지속적으로 HEK \(293 \) 표지 세포에 bryostatin- \(1 \)을 처리하였을 경우 Wnt \(3 \)a 배지에 의해 증가된 세포 내 \( \beta \)-catenin 단백질 수준이 감소됨을 관찰할 수 있었다. 이 조건에서 MG- \(132 \)을 처리한 결과 bryostatin- \(1 \)에 의한 \( \beta \)-catenin 감소 효과가 없어짐을 관찰할 수 있었다(Fig. \(2 \)C). 이 결과로부터 bryostatin- \(1 \)이 프로테아좀 의존적으로 세포 내 \( \beta \)-catenin 단백질의 수준을 감소 시키는 것을 알 수 있었다.</p> <p>기존의 연구를 통하여 Wnt/B-catenin 신호전달체계의 비 정상적인 활성화는 \( \beta \)-catenin 의존적 전사를 증가시킬 뿐 아니라 이를 통하여 대장암을 비롯한 다양한 암의 발생 및 진 신호전달체계는 암 예방 및 항암제에 대한 좋은 표적으로 인 식되고 있다. 본 연구에서는 HEK \(293 \) 표지 세포를 이용한 분석법을 이용하여 Wnt//-catenin 신호를 저해하는 bryostatin \(1 \)을 발굴하였다. 분자기전을 연구한 결과 bryostatin- \(1 \)이 세포 내 \( \beta \)-catenin 단백질의 프로테아좀 의존적 분해를 촉진한다는 사실을 밝혔다. 연구 결과로부터 bryostatin-1이 비정상적인 Wnt/β-catenin 신호전달체계 활성화로 인해 발생된 대장암을 비롯한 다양한 암에 대한 예방 및 치료제로 개발 될 수 있을 것이다.</p> <h1>요 약</h1> <p>Wnt/ \(3 \)-catenin 신호전달체계는 세포 증식, 분화, 그리고 기 관 발생과 같은 다양한 생명현상에 중요한 역할을 한다. 본 catenin 신호전달체계를 저해하는 bryostatin- \(1 \)을 발굴하였다. Bryostain \(1 \)은 \( \beta \)-catenin의 mRNA 수준에는 영향을 미 치지 않는 반면 세포 내 \( \beta \)-catenin 단백질 수준을 감소시킴 으로 Wnt \(3 \)a-CM에 의해 활성화 된 \( \beta \)-catenin response transcription (CRT)을 억제하였다. 또한 프로테아좀의 활성을 저해하였을 경우 bryostatin- \(1 \)에 의한 \( \beta \)-catenin 수준 감소가 억제되었다. 본 연구의 결과들로부터 bryostatin- \(1 \)이 프 로테아좀에 의한 \( \beta \)-catenin 단백질 분해를 촉진함으로써 Wnt/ \(beta \)-catenin 신호전달체계를 저해함을 확인하였다.</p>