Benzyl chloride 방법을 사용하여 Chromosomal DNA를 분리한 후, 이를 \( 16 \mathrm{~S} \) rDNA 증폭의 기질로 사용하였다. fD1과 rP2 primer를 이용해 \( 16 \mathrm{~S} \) rDNA gene을 PCR로 증폭하였으며, 이를 위해 특정 조건 하에서 각 시험균의 chromosomal DNA를 변성시킨 후 PCR을 수행하였다. 그리고 얻어진 \( 16 \mathrm{~S} \mathrm{rDNA} \)의 염기서열 상동성을 DDBJ/NCBI/GenBank database의 Blast program을 통해 비교하였다.
<h2>16S rDNA 분리 및 염기서열 분석</h2> <p>\( 16 \mathrm{~S} \) rDNA 증폭을 위한 기질로 사용될 Chromosomal DNA 분리는 benzyl chloride 방법으로 수행하였다. 균체에 \( 500 \mu \mathrm{L} \) TE buffer \( (100 \mathrm{mM} \) Tris \( \mathrm{HCl}, 40 \mathrm{mM} \) EDTA \( \mathrm{pH} \) \( 8.0 \) )를 첨가하여 현탁 시킨 후 \( 10 \% \) sodiumdodecylsulfate(SDS) \( 100 \mu \mathrm{L} \) 와 benzyl chloride(Katayama chemicals Co.) 300 \( \mu \mathrm{L} \) 를 첨가하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 반응시켰다. 이 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), \( 13,000 \mathrm{rpm} \) 에서 15 분간 원심 분리한 상등 액에 \( 3 \mathrm{M} \) sodium \( \operatorname{acetate}(\mathrm{pH} \) 5.2) \( 10 \mu \mathrm{L} \) 를 첨가하여 잘 혼합한 후 2회에 걸쳐 phenol/chloroform/isoamyalcohol(25:24:1)로 추출하였다. 최종적으로 얻어진 상등액에 동량의 2-propanol을 첨가한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 30 \) 분간 원심분리 하여 DNA를 침전시키고 \( 70 \% \) ethanol로 2회 세척한 뒤 진공건조 시켰다. 최종적으로 50 \( \mu \mathrm{L} \) 의 멸균수를 첨가하여 \( \mathrm{DNA} \) 를 용해하였으며 \( 0.8 \% \) agarose gel에서 전기영동(Mupid-2, Takara Co.)하여 확인하였다. 분리한 각 시험균의 chromosomal DNA로부터 \( 16 \mathrm{~S} \) rDNA gene을 증폭하기 위하여 fD1(5'-AGAGTTTGATCC-TGGCTCAG-3')과 \( \mathrm{rP2} \) (5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-\( \left.3^{\prime}\right) \) primer를 이용하여 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 변성시킨 뒤 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분 30 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 분간, 34 cycle로 PCR을 수행하였다. PCR 증폭산물 중 1.5-1.6 Kb에 해당하는 단편을 \( 0.8 \% \) agarose gel, \( 0.5 \times \mathrm{TAE} \) buffer에서 \( 100 \mathrm{~V} \) 로 30 분간 전기영동 한 후 PCR Purification Kit(Qiagen Co.)로 정제하였다. 분리된 DNA단편은 PCR \( 2.1 \) Topo TA Vector system(Invitrogen Co.)에 subcloning하여 ABI 3700(Perkin Elmer Co.) 기기로 염기서열 분석을 수행하였다.</p> <p>얻어진 \( 16 \mathrm{~S} \mathrm{rDNA} \) 들의 염기서열 상동성은 \( \mathrm{DDBJ} / \mathrm{NCBI} / \) GenBank database의 Blast program을 이용하여 비교하였다. 이들의 alignment는 DNA plus version \( 3.0 \) sequence alignment program(Scientific and Educational Software)을 이용하여 병렬로 정렬하였고, MEGA version \( 3.0 \) 근린 결합법에 의거하여 선발된 실험균의 계통분류학적 위치를 결정하였다.</p>