DPPH 라디칼 제거능과 수산화 라디칼 제거 활성, \( \mathrm { Fe } ^ { 2 + } \)-chelating 활성을 측정하기 위해 각각의 용액과 국화 추출물을 혼합하여 반응 시킨 후 흡광도를 통해 국화추출물의 항산화활성 측정했다. NIH 3T3 마우스 섬유아 세포를 DMEM과 10% FBS를 첨가한 배지에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C }, 5 % \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에서 세포를 배양하고 96-well cell plate에 분주한 후 시료를 농도별로 처리하여 배양하고 MTT를 처리하여 반응시킨 다음 세포 내 염색액을 용출시킨 후 흡광도를 측정하여 생존율을 확인 하였다.
<h2>국화추출물의 항산화활성 측정</h2> <p>DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 라디칼 제거능의 측정은 Hsu 등[5]의 방법에 따라 DMSO (dimethyl sulfoxide, Sigma-Aldrich, USA)로 희석한 농도별 국화추출물 \( 40 \mu 1 \)와 \( 300 \mathrm { mM } \mathrm { DPPH } 760 \mu 1 \)를 혼합하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 반응시킨 후 \( 515 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 또한 수산화 라디칼 제거 활성은 \( 1.5 \mathrm { mM } \mathrm { FeSO } 4 \) (Sigma-Aldrich, USA) \( 250 \mu 1,6 \mathrm { mM } \mathrm { H } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) (Sigma-Aldrich, USA) \( 175 \mu l \)와 농도별 시료 \( 75 \mu l \)를 혼합하여 반응시킨 후 \( 560 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. \( \mathrm { Fe } ^ { 2 + } \)-chelating 활성은 시료에 \( 2 \mathrm { mM } \mathrm { FeCl } \) (Sigma-Aldrich, USA) \( 15 \mu l \)와 \( 5 \mathrm { mM } \) fer-rozine (Sigma-Aldrich, USA) \( 30 \mu l \)를 혼합하여 상온에서 15분 반응시킨 후 \( 562 \mathrm { ~nm } \)에서 \( \mathrm { Fe } ^ { 2 + } \)-ferrozine 용액의 흡광도를 측정하였다. 각 실험 항목에서 농도에 따른 추출물의 항산화활성은 다음의 식으로 %를 계산하였다.</p> <p>소거능 \( ( \%) = \{ 1-( \) 추출물 처리군의 흡광도/추출물 무처리군의 흡광도) \( \} \times 100 \)</p> <h2>세포배양</h2> <p>본 연구에 사용한 NIH 3T3 마우스 섬유아 세포주는 한국세포주은행(KRIBB, Taejeon, Korea)에서 분양 받았으며 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM, Gibco Inc., USA)에 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco Inc., USA)을 첨가한 배지를 이용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 5% \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) 배양기에서 배양하였다.</p> <h2>세포 생존율 측정</h2> <p>국화추출물의 NIH 3T3 세포 생존에 미치는 영향은 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bro-mide) 분석을 통해 실시하였다. NIH 3T3 세포 \( \left (5 \times 10 ^ { 3 } \right . \) cells/ well)를 96-well cell plate에 분주한 후 시료, \( \mathrm { FeSO } _ { 4 } , \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)를 각각 농도별로 처리하여 24시간 배양 후 MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 용액 \( (1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \)을 처리하여 4시간 반응 시킨 다음 DMSO로 세포 내 염색액을 용출시킨 후 microplate reader (Infinite 200, Tecan Trading AG, Switzerland)를 이용하여 \( 570 \mathrm { ~nm } \) 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이 측정치는 시료의 세포에 대한 독성을 나타내며 생존율은 시료 처리군을 대조군에 대한 백분율(%)로 나타내었다.</p>