본 실험에서 사용하는 total RNA는 마우스의 정소조직으로부터 추출한다. DNA microarray 실험은 추출된 total RNA로부터 cDNA를 합성하고 이를 hybridization 용액에 녹인후 microarray에 직접 처리하는 과정을 거친다. 데이터분석은 Hybridization을 마친 microarray을 scan 한 다음, GeneSpringGX 7.3을 통한 분석을 통해 이루어진다. 다음으로 Reverse transcription-PCR은 온도 및 시간을 달리하여 PCR 과정을 거쳐 진행된다.
<h2>Total RNA 추출</h2><p>마우스의 정소조직으로부터 microarray 실험과 RT-PCR 실험을 수행하기 위하여 total RNA를 추출하였다. 우선 trizol 시약 (Life technologies, Inc., USA)을 이용하여 total RNA를 정제한 후, 이차적으로 Qiaquick RNeasy mini kit (Qiagen, USA)을 이용하여 정제하였다.</p><h2>DNA microarray 실험</h2><p>전체적인 microarray 실험의 수행 및 데이터 분석은 대전에 위치한 (주)지노믹트리에 위탁하여 수행하였다. 사용된 DNA chip 은 미국 Microarrays Inc. (Nashville, TN, USA) 에서 제작한 38,500개의 유전자가 집적되어 있는 mouse whole genome chip을 사용하였다. 실험의 간단한 절차는 다음과 같다. 먼저 1차 cDNA 합성을 위하여 추출한 total RNA \( 2 \mu \mathrm{g} \)을 사용하였다. RNA 주형으로부터 reverse transcriptase를 이용하여, 2시간 동안 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 역전사반응을 수행하였다. 1 차 cDNA 합성액을 주형으로 하여 DNA polymerase I 을 이용하여 2차 cDNA를 합성하였다. 반응 후 \(0.5\mathrm{M}\) EDTA 용액으로 반응을 중지하고 반응 산물을 Qiaquick purification kit (Qiagen, USA) 으로 정제하였다. 그 다음, 단일 가닥의 cDNA 증폭을 위하여, \( 3 \mu\mathrm{l} \) \(10\times\)polymerase buffer, \( 1 \mu\mathrm{l}\) \( 10 \mathrm{mM} \) AA-dUTP/dNTP mix, \( 1 \mu \mathrm{l}\) High-Heel primer, 그리고 \( 2 \mu\mathrm{ l}\) Taq polymerase를 이중가닥의 DNA 용액에 섞어 반응하였다. 증폭 cycle은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분 동안 반응한 다음, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2분 과정을 30 cycle 반복 후, 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 extention 과정을 수행하였다. 증폭된 cDNA는 Microcon YM-30에 의해 농축하여 최종 부피를 \( 8 \mu \mathrm{l}\) 로 하였다. 그다음, cyanine- 3 혹은 cyanine- 5 dye를 이용하여 cDNA를 표지하였다. 정제된 cDNA는 hybridization 용액 \( 100 \mu \mathrm{l}\) 에 녹인 후, \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2분간 열을 가한 후, microarray에 직접 처리하였다. Hybridization은 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12-16시간 실시한 후, microarray는 \(2\times\)SSC/\( 0.1 \%\) 용액에서 5분간, \(0.1\times\)SSC/\( 0.1 \%\) SDS에서 10분간, 마지막으로 \(0.1\times\)SSC 용액에서 2분간 2번 세척하였다. 세척을 마친 microarray는 원심 분리하여 즉시 말렸다.</p><h2>데이터 분석</h2><p>Hybridization을 마친 microarray는 Axon GenePix 4000B scanner를 이용하여 scan 한 다음, Agilent사의 GeneSpringGX 7.3을 이용하여 분석하였다. Normalization 방법은 intensity dependent (LOWESS) normalization 방법을 사용하였다. 유전자의 filtering은 median 값의 합이 1,000이상이 되는 유전자를 선별하였다.</p><h2>Reverse transcription-PCR</h2><p>\( 1 \mu \mathrm{g}\) RNA sample에 15 pmol oligo dT primer를 첨가하여 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 반응한 후 얼음에서 식혔다. 각 sample에 \( 7.5 \mu\mathrm{l}\) reaction mixture (\(50 \mathrm{mM} \) Tris-Cl\( \left(\mathrm{pH} 8.3\right. \) at \( \left.25^{\circ} \mathrm{C}\right) \), \( 3~ \mathrm{mM}\) \(\mathrm{MgCl}_{2}, 75 \mathrm{mM} \) \(\mathrm{KCI}\), \( 10 \mathrm{mM} \) DTT), \(200\mathrm{unit}\) reverse transcriptase (Finzyme, Finland), \(5\mathrm{unit}\)의 RNase inhibitor (RNasin; Promega) 와 \( 0.25 \mathrm{mM}\) dNTP mixture를 첨가한 후 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 역전사 반응을 수행하였다. 반응 후 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 반응하여 중지하였다. PCR 반응은 \( 3 \mu\mathrm{l} \) CDNA, \( 2.5 \mu\mathrm{l} \) dNTP mixture,\( 1 \mu\mathrm{l} \) \(10\mathrm{pmole} / \mu\mathrm{l}\) Primer-Sense, 그리고 \( 1 \mu\mathrm{l} \) \(10\mathrm{ pmole} / \mu\mathrm{l}\) Primer-Antisense를 넣은 다음 최종 부피를 \( 25 \mu l \) 만든 다음 수행하였다. PCR 반응 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 5 \mathrm{min} \) 간 denaturation, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 45 \mathrm{sec}, 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 45 \mathrm{sec}, 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 45\mathrm{sec} \) 간 25 cycle을, 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 5 \mathrm{~min} \) 간으로 하였다. PCR 반응물은 \( 2 \% \) agarose gel에서 전기영동 후 ethidium bromide 용액에서 염색 후 자외선에서 사진촬영을 하였다.</p>