HaCaT, CCD 986sk, B 16F10 세포는 DMEM, 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin 배지에서 37\(^\circ \mathrm{C}\), 5% CO2 조건에서 배양하여 독성, 염증, 보습, 주름개선, 미백 효과 실험에 사용되었고, Real Time PCR 분석을 위해 96 well plate에서 배양하고 FBS를 포함하지 않는 DMEM 배지로 교환하여 RNA 추출 및 cDNA 변환 후 Real Time PCR 분석을 수행하였다.
<p>세포배양. 각각의 피부 세포주를 dulbecco's modified eagle medium (DMEM), \(10 \% \) FBS, \( 1 \% \) penicillin-streptomycin (GIBCO, Grand Island, NY, USA)의 배지에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \)의 조건으로 배양하였다. 독성 실험, 염증 실험 그리고 보습효과 실험에는 HaCaT 세포를 사용하였고 주름개선 효과에는 CCD \(986 \)sk 세포주가 사용되었다. 그리고 미백 효과실험에는 B \( 16 \)F \( 10 \) 세포주가 사용되었다. 위에 사용된 모든 세포는 한국세포주은행에서 분양 받아서 사용하였다.</p> <p>Real time PCR 분석. 세포를 \(96 \) well plate에서 배양하고 FBS를 포함하지 않는 DMEM 배지로 교환하고 시료를 처리하여 \(24 \)시간 동안 추가 배양하였다. 배양 후 SuperPrep \( ^ {\mathrm { TM } } \) Cell Lysis & RT Kit를 이용하여 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 template로 하여 Thunderbird \( ^ {\mathrm { TM } } \) SYBR qPCR Mix (Toyobo, TOQPS- \(201 \))를 사용하여 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR machine으로 real time PCR을 수행하였다. Primer는 QuantiTect \( ^ { Ⓡ } \) Primer Assays (Cat no. QT \(00040586 \), QT \(01005725 \), QT \(00014581 \), QT \(00212996 \), QT \(01192646 \)) (QIAGEN, Valencia, California, USA)를 사용하였다.</p> <p>Melanin 정량 실험. B \(16 \)F \(10 \) cell을 \(6 \) well에 \( 5 \times 10 ^ { 4 } \) cells/well이 되도록 분주하여 \(24 \)시간 뒤, 각각의 well에 딱지꽃 추출물을 농도별로 ( \( 1 \), \(2.5 \), \(5 \% \)) 처리하고 positive control로 kojic acid \( (16 \mu \mathrm { M } ) \)를 \(48 \)시간 동안 처리하였다. 처리 후 phosphate buffered saline로 \(2 \)회 세척한 후 \( 12,000 \mathrm { rpm } \), \(4 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(30 \)분간 원심 분리하여 세포 침전물을 만들었다. \( 10 \% \) DMSO가 첨가된 \( 1 \mathrm { ~N } \) \( \mathrm { NaOH } \) 용액을 \( 150 \mu \mathrm { L } \) 첨가하고 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \(1 \)시간 용해하였으며 \( 405 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정한 후 실험군의 멜라닌 양은 대조군의 멜라닌 양에 대한 백분율로 계산하여 나타내었다.</p>