효소 고정화 효율은 투입된 효소에 따라 효소활성을 보여주는데 고정화 효소가 자유 효소에 비해 온도에 덜 민감하게 작용해서 열에 대한 안정성이 높다. 또한 충진층 반응기에서 이온결합에 의한 약한 결합으로 유속이 낮을수록 효소활성이 높아진다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>효소 고정화 효율</h2> <p>사용된 5가지 담체에 대한 효소의 고정화 효율을 비교하였다. 고정화 효율은 고정화 효소활성에 대한 투입된 효소활성과 여액으로 나가는 효소활성의 차를 나누어 주어 그것의 백분율로 결정하였다. 이온교환수지인 Duolite A568에 대한 고정화 효율이 \( 24.7 \% \)로 가장 늪았다. 따라서 본 실험에서는 Duolite A568을 고정화 담체로 선정하여 실험하였다. 무기담체인 Silica gel 60과 Celite R640에서도 효소 고정화 효율이 Dowex에 비해 높음을 알 수 있다.</p> <h2>자유 효소와 고정화 효소의 최적 \( \mathrm{pH} \) 비교</h2> <p>\( \mathrm{pH} \) 변화에 자유효소와 Duolite 담체에 고정화된 효소의 활성을 비교하였다(Fig. 2). 자유효소의 경우는 \( \mathrm{pH} 8 \)에서 최대활성을 보였고 고정화 효소는 \( \mathrm{pH} \) 9에서 최대 활성을 보였다. 고정화 효소의 최적 \( \mathrm{pH} \)가 자유효소와 달리 변화하는 이유는 담체에 효소가 고정화에 의해 효소의 미세 환경이 변화하기 때문이다. 일반적으로 고정화 효소는 담체와 효소의 전하적인 결합에 의해 수소이온의 변화가 유발된다고 설명된다. 전체적인 \( \mathrm{pH} \) 범위에서 자유효소에 비해 고정화 효소의 활성이 보다 넓게 분포됨을 알 수 있다. 이것은 고정화 효소의 활성이 \( \mathrm{pH} \) 변화에 대해 덜 민감하게 작용하고 있음을 알 수 있다.</p> <h2>\( \mathrm{pH} \)에 대한 안정성</h2> <p>\( \mathrm{pH} \)에 대한 안정성을 평가하기 위해 각각 \( \mathrm{pH} \)에서 2시간 동안 반응한 후 효소 활성을 측정하였다. 고정화 효소가 각 \( \mathrm{pH} \)에서 자유효소에 비해 안정성이 높음을 알 수 있다. 이것은 조업 조건에서 고정화 효소가 외부의 \( \mathrm{pH} \)에 변화에 대해 덜 민감하게 작용하여 조업에 유리할 수 있다는 것을 제시 한다.</p> <h2>자유 효소와 고정화 효소의 최적 온도 비교</h2> <p>온도 변화에 따른 자유효소와 고정화 효소의 활성을 비교하였다. 온도가 증가할수록 자유 효소와 고정화 효소의 활성은 같은 경향으로 증가하였고, 두 경우 모두 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 최대 활성을 보였다. \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 이상으로 증가시킬 때 효소활성은 감소하였는데 자유효소의 활성이 고정화 효소에 비해 훨씬 더 빨리 감소하는 것을 알 수 있다. 이것은 고정화 효소가 온도에 도 덜 민감하게 작용하는데 이것은 고정화에 의해 열에 대한 안정성이 증가하였음을 나타낸다.</p> <h2>열 안정성</h2> <p>각각의 온도에서 30분 동안 효소반응을 진행한 후 자유 효소와 고정화 효소의 활성을 측정하여 열 안정성을 평가하였다. 고정화 효소가 자유 효소에 비해 높은 열 안정성을 나타냄을 알 수 있다. 이 결과는 담체와 효소의 이온결합에 의해 안정화되기 때문인데 자유 효소에 비해 고정화 효소 공 정을 채택하는 이유이기도 하다.</p> <h2>재사용 회분식 운전</h2> <p>고정화 효소의 반복적인 재사용은 실제 공정의 응용에서 중요하다. 고정화 효소를 회분식 효소반응으로 2시간 반응을 시킨 후 고정화 효소를 세척하고 다시 효소반응을 반복적으로 실시하여 10 cycle 동안 효소 안정성을 측정하였다. 10 cycle 후에 고정화 효소는 초기 활성의 \( 86 \% \)를 유지하였다. 이 결과는 재사용 회분식 운전에서 고정화 효소가 안정적으로 효소활성을 유지하는 것을 보여준다. 일반적 경우 공유결합에 의한 고정화 효소의 활성이 물리적인 이온결합의 활성보다 높다고 보고되어 있지만, 이온결합에 의한 고정화 효소는 연속 조업에서 고정화 효소활성이 낮아지면 담체를 회수하여 효소를 고정화하여 재사용할 수 있기 때문에 담체의 가격이 높은 경우는 장점이 될 수 있다.</p> <h2>충진층 반응기 연속공정</h2> <p>충진층 효소 반응기에서 온도 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 그리고 \( \mathrm{pH} \) 9에서 연속적으로 casein 용액을 공급하면서 유속을 \( 30 \mathrm{ml} / \mathrm{hr} \) 부터 \(110 \mathrm{ml} / \mathrm{hr} \) 변화시키면서 부피 유속 변화에 대한 고정화된 효소의 활성을 96시간 연속 조업 후 측정하였다. 유속이 낮을수록 효소의 활성이 높음을 알 수 있는데 이것은 유속이 낮을수록 충진층 반응기에서 체류시간이 증가함으로 효소활성이 높게 나타난다. 연속 운전에서 유속이 증가할수록 초기에 비해 활성이 감소됨을 알 수 있다. 이것은 고정화 담체가 이온결합으로 인한 약한 결합력으로 유속이 증가할수록 효소의 washout이 되기 때문으로 생각된다. 연속 조업에서 부피유속을 \( 30 \mathrm{ml} / \mathrm{hr} \)로 하여 casein과 난황 단백질을 사용하여 원료에 대한 고정화 효소의 활성에 대한 영향을 조사하였다. 96시간 후 casein을 사용했을 경우 고정화 효소의 활성이 초기 활성의 \( 83 \% \)를 유지하였지만 난황 단백질의 경우 는 초기 활성의 \( 61 \% \)를 유지하였다. 이것은 난황 단백질 원료에는 여러 물질이 혼합되어 있기 때문에 연속 조업에서 고정화 효소의 비 활성화를 촉진하는 것으로 판단된다.</p>