원산지 특이적인 녹용의 염기서열을 찾기 위해 미토콘드리아 D-loop 영역의 염기서열 분석을 수행하였다. 중국산 녹용의 D-loop 영역의 결실부위가 중국산 녹용을 하나의 그룹으로 묶어주는 특성이 있는지 확인하였고, 결과적으로 중국산 녹용은 하나의 그룹으로, 다른 국가의 녹용은 혼재되어 그룹화되었다. 중국산 녹용의 PCR 산물이 다른 국가의 녹용보다 약 \( 60 \sim 70 {bp} \) 작은 크기로 나타나 PCR법을 통한 중국산 녹용의 원산지 추정이 가능함을 확인하였다.
<h1>결 과</h1> <p>녹용은 매년 수요가 증가하는 고가의 한약재로 간주되고 있다. 하지만 국내 수요량의 많은 부분을 수입 녹용에 의존하는 실정이다. 이러한 상황에서 저가의 녹용이 고가로 둔갑 판매되거나 10여년 전부터 수입이 금지된 북미 산 녹용이 유통되는 문제는 과학적인 녹용의 감별 기술 개발을 요구하고 있다.</p> <p>본 연구는 변이 축적 율이 가장 높아 종간의 분류 지표로 주로 사용되고 있는 미토콘드리아 D-loop 영역의 염기서열 분석을 통해서 원산지 특이적인 녹용의 염기서열을 탐색하고자 수행하였다. NCBI의 GenBank에서 북미산 사슴 (AY970666.1, Cervus elaphus Canadensis)과 러시아산 사슴 (AF058371.1, Cervus elaphus sibericus)의 미토콘드리아 DNA의 D-loop 영역을 선정하고 이들의 염기서열 비교를 통해서 이들 영역을 증폭하기 위한 PCR용 primer를 합성하여 약 1,100 1200 bp로 예상되는 크기의 PCR 산물을 얻었다. 아가로스 겔 전기영동을 통해서 증폭이 확인된 PCR 산물은 direct 염기서열 결정법을 통해서 염기서열을 확보한 후 BLAST 상동성 분석을 수행하였다. BLAST 상동성 분석 결과를 보면 각 10개의 러시아산, 북미산, 뉴질랜드산 녹용의 미토콘드리아 D-loop의 염기서열은 C. elaphus cana-densis와 가장 높은 염기서열 상동성을 보여주었다. 전체적으로 녹용 미토콘드리아 DNA의 D-loop 영역에 대한 BLAST 상동성은 \(97\%\) \(99\%\)정도로 본 연구에서 해석한 염기서열이 D-loop 영역임을 알 수 있었다. 하지만 BLAST 상동성 결과에서 보면 러시아산, 북미산 및 뉴질랜드산 녹용이 C. elaphus canadensis에서 유래하는 미토콘드리아 D-loop 유전자와 가장 유사하게 나타났다. 일반적으로 C. elaphus cana-densis는 북미를 서식처로 하는 녹용 사슴으로 분류되는데 반해서 BLAST 분석에서는 다른 녹용 사슴과 높은 상동성을 보이는 일부의 결과로 볼 때 미토콘드리아 DNA를 이용한 BLAST 상동성 분석은 녹용의 원산지 판별에 유용하지 않음 을 알 수 있었다. 또한, 중국산 녹용의 경우는 러시아산, 북미산, 뉴질랜드산의 경우보다 낮은 \(94\%\) \(95\%\)의 상동성 결과를 나타냈으며 구체적으로 보면 중국산 10개 시료 중에서 3개의 시료(C02, C03, C07)는 Cervus elaphus macneilli와, 나머지 7개의 시료(C01, C04, C05, C06, C08, C09, C10)는 Cervus ela-phus red deer의 D-loop 유전자와 가장 높은 상동성을 보여주었다. 따라서 중국산의 경우도 BLAST 분석을 통해서는 정확한 원산지 확인이 어려운 것으로 분석되었다. 결국, 이러한 BLAST 상동성 분석 방법은 미토콘드리아의 D-loop 영역의 염기서열 유사성을 통해서 해당하는 유전자가 녹용사슴으로부터 유래한 것을 확인하는 데에는 유용할 수는 있지만 녹용사슴의 원산지를 확인 또는 동정하는 데에는 유용한 방법이 아님을 알 수 있었다.</p> <p>한편, Fig. 1에서 보는 것과 같이 중국산 녹용의 PCR 산물이 러시아산, 북미산, 뉴질랜드산의 것보다 크기가 작게 검출되어 중국산 녹용의 D-loop 영역 내에 결실 부분의 존재를 예상 할 수 있었다. 이러한 D-loop 영역의 결실 부위는 DNA 염기서열 결정 후 ClustalW2 프로그램을 이용한 multiple alignment를 통해서 확인할 수 있었다. Fig. 2는 원산지 별로 각 10개의 녹용 시료, 즉 40개의 미토콘드리아 D-loop 영역의 multiple alignment 결과 중에서 D-loop의 결실 부위를 포함하는 일부분을 나타낸 것으로 중국산 녹용의 D-loop 영역에 약 \( 60 \sim 70 {bp} \)의 결실이 있음을 확인할 수 있었다.</p> <p>녹용의 유연관계에 분석을 통해서 중국산 녹용의 D-loop영역의 결실부위가 중국산 녹용을 하나의 그룹으로 묶여주는 특성이 되는지를 확인해 보고자 neighbor joining 방법을 통한 phylogenetic tree 분석을 수행하였다. 그 결과 10개의 중국산 녹용은 하나로 그룹화 됨을 볼 수 있는 반면에 러시아산, 북미산 및 뉴질랜드산 녹용들은 수입 국가별 분류와는 다르게 혼재되어 분지되어 그룹화되어 있었다. 이러한 결과로부터 녹용의 D-loop 영역 내 결실 부분은 중국산 녹용을 동정하기 위한 유용한 분자마커가 될 수 있을 것으로 생각된다. 하지만 미토콘드리아 D-loop 영역의 multiple alignment 분석에서는 러시아산, 뉴질랜드산, 북미산 녹용을 특정하는 원산지 특이적인 염기서열 또는 Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLPs)을 보이는 단일 염기변이성 마커 등을 확인할 수 없었다. 한편, D-loop 영역의 결실 특성을 이용하여 중국산 녹용의 분자 동정이 가능한 지를 검증해 보고자 D-loop 영역의 결실을 확인할 수 있는 DL-F1과 DL-R1 primer를 선정하여 각 3개의 러시아산, 중국산, 뉴질랜드산 녹용 시료를 대상으로 PCR 검증을 실시하였다. 결과적으로 Fig. 3에서처럼 중국산 녹용의 PCR 산물이 러시아산, 북미산 및 뉴질랜드산에서 보다 약 \( 60 \sim 70 {bp} \)작은 크기로 나타나 PCR법을 통한 중국산 녹용의 원산지 추정이 가능함을 확인할 수 있었고 최종적으로 중국산 녹용에 존재하는 결실 부위의 해석은 이들 9개의 PCR 산물을 pGem T vector에 클로닝 한 후 염기 서열 분석을 통해서 확인할 수 있었다.</p>