RAW264.7 세포에서 생성된 질산화물(NO)은 griess 시약을 사용하여 측정하였으며, 이 과정에서 LPS(10㎍/㎖) 처리 후 24시간 배양한 세포배양액에서 흡광도를 540nm에서 측정하였다. 또한, iNOS와 COX-2의 활성을 확인하기 위해 RAW 264.7 세포주를 이용하여 세포를 배양하여 안정화시키고, 이후 분리된 단백질을 전이하여 PVDF 막에 배치하였다. 이후 1시간 동안 blocking buffer(5% skim milk in TBST)에서 실온으로 배양하였다.
<h2>Nitric oxide (NO) 생성 억제 활성 측정</h2> <p>RAW264.7 cell로부터 생성된 \( \mathrm { NO } \)의 양은 Green 등의 방법에 따라 griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 \( \mathrm { NO } _ { 2 } \)의 형태로 측정하였다. 6 well plate에 Raw 264.7 cell을 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cell/well로 분주하였다. \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 24시간 배양한 이후 1X phosphate buffered saline (PBS)로 2번 세척한다. LPS \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \)을 normal을 제외하고 처리한 후 2시간 이후 농도 별로 조제한 시료용액을 처리하여 24시간 배양한 후 상등액을 얻은 후, 동량의 griess 시약을 첨가하여 96 well plate에서 10분 반응시킨 후 \( 540 \mathrm { ~nm } \)에서의 흡광도를 측정하였다. \( \mathrm { NO } \) 억제 활성 측정은 시료첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <p>\( \mathrm { No } \) 억제능 \( ( \%)= \left (1- \frac {\text { 시료첨가군의 흡광도 } } {\text { 무첨가군의 흡광도 } } \right ) \times 100 \)</p> <h2>Western blot을 통한 단백질 발현 측정</h2> <p>iNOS, COX-2의 활성을 확인하기 위하여 cell line Raw 264.7을 100 mm tissue culture dish에 \( 1 \times 10 ^ { 6 } \) cells/well로 cell seeding 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화시켰다. 배지를 제거한 후 LPS를 \( 1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도로 2시간 처리해준 후 추출물을 농도별로 처리한 배지로 24-48시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척해주었다. Complete mini 1 tab을 가한 \( 100 \mu \mathrm { l } \)로 Radio-immuno- precipitation assay (RIPA) buffer \( 10 \mathrm { ml } \)에 용해하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 16,110 \( \times g \)에서 20분간 원심분리 하였다. 원심분리하여 얻은 상층액은 BCA protein assay kit로 정량하였으며, \( 20 \mu \mathrm { l } \)의 단백질을 \( 10 \% \) acrylamide gel에서 전기영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 transfer 기기(BIORAD)를 이용하여 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking buffer ( \(5 \% \) skim milk in TBST)에서 배양시켰다. iNOS, COX-2, \( \beta \)-actin의 1차 항체를 희석하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 overnight한 다음, 다시 10분 간격으로 tris-buffered saline and tween 20 (TBST)로 3회 세척하였다. iNOS와 COX-2 의 2차 항체는 anti-rabbit, \( \beta \)-actin의 2차 항체는 anti-mouse를 사용하고 1: 1,000으로 희석하여 실온에서 2시간 배양하였다. 3회 washing한 후 LAS 4,000 기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량하였다.</p>