메탄 산화세균과 벤젠/톨루엔 산화세균을 정량적으로 분석하기 위해 qRT-PCR 방법을 이용하였다. 메탄 산화세균과 벤젠/톨루엔 산화세균의 군집 구조를 분석하고자 T-RFLP 기법을 이용하였다. 바이오커버의 깊이별로 혼합가스의 농도를 측정하여 메탄, 벤젠 및 톨루엔이 제거되는 특성을 조사하였는데 바이오커버의 깊이별로 존재하는 메탄과 벤젠/톨루엔 산화세균을 정량화를 위해 qRT-PCR 을 이용하여 ( \mathrm{pmoA} \) gene 과 \( t m o A \) ene 을 정량분석했다. 캐나다Quebec의 매립지에 pilot규모의 바이오커버를 설치하여 운전시간 경과에 따라 바이오커버 깊이별로 메탄 산화 세균을 정량화하여 비교결과 운전 초기에는 메탄산화세균수가 \( 10^{6} \) cellsg-dry weight \( { }^{-1} \)이었는데 3개월 후는 \( 10^{7 \sim} 10^{8} \) cellsg-dry weight \( ^{-1} \)로 증가하고, 바이오커버 상부층의 메탄산화세균수가 하부층보다 10배 정도 많았고 메탄 산화 세균 수가 많은 상부층의 잠재 메탄산화속도는 하부층보다 높다는 결론이 나왔다.
<p>메탄 산화세균과 벤젠/톨루엔 산화세균을 정량적으로 분석하기 위해 qRT-PCR 방법을 이용하였다. 메탄 산화세균을증폭하는데 사용한 primer set는 A189f(5'-GGN GAC TGG GAC TTC TGG-3')와 mb661r(5'-CCG GMG CAA CGT CYT TAC C-3')이고, 벤젠/톨루엔 산화세균 검출에 사용한 primer set은 TMOAf(5'-CGA AAC CGG CTT YAC CAA YAT G-3')과 TMOAr(5'-ACC GGG ATA TTT YTC TTC SAG CCA-3')이었다. qRT-PCR의 검량선을 작성하고자, pmoA gene은 Methylobacter luteus(NCIMB11914)를 tmoA gene은 Pseudomonas stutzeri \( \mathrm{OX} 1 \)을 대표 균주로 이용하였다. PCR mixture조성과 PCR 조건은 위와 동일하다. 총 \( 200 \mu \mathrm{L} \)의 PCR product를 \( 1 \% \) 한 천 젤에 loading하고 사이즈(\(510\) or \( 505 \mathrm{~bp}) \)에 맞춰 젤을 잘랐다. 자른 젤로부터 QIAquick Gel extraction Kit (Qiagen, Valencia, USA)을 이용하여 DNA를 추출하였고, 추출된 DNA를 qRT-PCR 검량선 작성을 위한 시료로 사용하였다. Gene copy number와 \( \mathrm{C}_{\mathrm{t}} \) (Threshold cycle)의 상관관계를 알아보고자 standard 시료를 \( 10^{-12} \)까지 희석하였고, 희석된 시료를 3 반복으로 qRT-PCR을 수행하였다. PCR mixture 조성은 template \( 2 \mu \mathrm{L}, \mathrm{dH}_{2} \mathrm{O}\) \( 7 \mu \mathrm{L} \), Power SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems, USA) \( 10 \mu \mathrm{L}, 10 \mathrm{~mM} \) primer 각 \( 0.5 \mu \mathrm{L} \)이고, PCR 조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 6분, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 40초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 40초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 40초를 40 cycles 반복하였고 마지막에 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 6분간 유지시켰다. 데이터 수집온도는 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 이루어졌다. 작성된 검량선으로부터 각 시료의 메탄 산화세균 및 벤젠/톨루엔 산화세균 gene copy number를 계산하였다.</p> <p>메탄 산화세균과 벤젠/톨루엔 산화세균의 군집 구조를 분석하고자 T-RFLP 기법을 이용하였다. 추출된 초기 토양 시료와 바이오커버의 깊이조건별 토양 시료 DNA를 template로 하여 PCR을 수행하였다. 메탄 산화세균을 증폭하는데 사용한 primer set는 FAM (6-carboxyfluorescein)을 부착한 A189f와 mb661r이고, 벤젠/톨루엔 산화세균 검출에 사용한 primer set은 FAM을 부착한 TMOAf과 TMOAr 이었다. PCR mixture는 DNA template를 \( 2 \mu \mathrm{L}, 10 \times \) Buffer를 \( 5 \mu \mathrm{L} \), Bovine serum albumin을 \( 5 \mu \mathrm{g} \), dNTP를 \( 200 \mu \mathrm{M} \), primer를 각각 \( 20 \mathrm{~pmol}, 1.25 \mathrm{~U} \) Takara Ex Taq DNA polymerase(TaKaRaBioInc., Shiga, Japan)을 넣고 총 부피가 \( 50 \mu \mathrm{L} \)가 되도록 \( \mathrm{dH}_{2} \mathrm{O} \)로 채웠다. PCR은 다음과 같은 조건으로 수행되었다. \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 pre-denaturation 시킨 후, \( 96^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분간 denaturation, \( 58^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분간annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분간 extension 시키는 과정을 40 cycles 반복하였다. 그 후 final extension을 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 유지하였고, 증폭이 끝난 후에는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지되도록 하였다. PCR 기기는 GeneAmp \( ^{\circledR} \) PCR system Model 2700 (Applied Biosystems Inc., Foster City, USA)을 이용하였다. 증폭된 PCR products는 Qiagen PCR purification kit (Qiagen, USA)을 이용하여 정제하였고, 정제된 product를 digestion하였다. Digestion 조건은 PCR product \( 7 \mu \mathrm{L} \)에 buffer \( 1.5 \mu \mathrm{L} \), 제한효소 \( 5 \mathrm{U} \) 첨가 후 \( \mathrm{dH}_{2} \mathrm{O} \)로 \( 15 \mu \mathrm{L} \)를 맞췄고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 4시간 배양하였다. 제한효소는 메탄 산화세균 군집 분석에 \( M s p I \) (5'-C \( \downarrow \mathrm{CGG}- \) 3', Beams Biotech. Co., Ltd, Korea)을 벤젠/톨루엔 산화세균 군집 분석에는 HhaI (5'-GCG \( \downarrow C-3 \) ', Beams Biotech. Co., Korea)을 사용하였다. 각 시료의 terminal restriction fragment (T-RF) size 분석은 ABI 377 DNA auto sequencer (GMI Inc., Ramsey, USA)를 이용한 denaturing polyacrylamide gel (6 M urea and \( 5 \% \) polyacrylamide)에서의 electrophore-sis를 통하여 이루어졌다. 선택된 T-RFs는 GENESCAN analytical software (Applied Biosystems Inc., Foster, USA)를 이용하여 분석된 피크의 면적을 통해 정량적으로 분석되었고, 50 relative fluorescent units (RFU) 이상의 피크 높이만을 사용하였다. 전체 피크 면적에 대한 각 시료의 피크 면적을 통해 상대적인 미생물 군집의 양\(\%\)을 계산하였다.</p> <p>Moon et al.은 산림 토양과 지렁이 분변토를 각각 100:0, 50:50 그리고 75:25의 비율로 혼합한 토양을 이용하여 바이오커버를 운전한 결과, 75: 25의 혼합 비율에서 메탄의 제거효율이 가장 좋은 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에서도 산림 토양과 지렁이 분변토를 75:25(중량비) 비율로 혼합한 토양을 바이오커버에 채워넣었다. 바이오커버 운전 초기 1주일 동안 메탄 제거 효율은 \( 40 \% \)이었으나 운전시간이 경과할수록 메탄 제거효율이 증가하여 2주일 경과 이후부터 메탄 제거효율은 \( 90 \% \) 이상 있었다(결과 미제시). 벤젠과톨루엔 제거 효율은 운전 초기부터 \( 99 \% \) 이상 이었다. 혈청병을 이용하여 메탄 분해용 미생물 consortium에 의한 메탄, 벤젠 및 톨루엔 혼합가스 생분해 특성을 조사한 결과, 이들 세가지 가스는 동시에 생분해 되었다. 본 연구에서는 바이오커버 시스템에서 이들 3종의 혼합가스가 동시에 생분해 됨을 확인할 수 있었다.</p> <p>바이오커버의 깊이별로 혼합가스의 농도를 측정하여 메탄, 벤젠 및 톨루엔이 제거되는 특성을 조사하였다. 메탄은 바이오커버 하단에서는 거의 제거되지 않았고, \( -0.4 \sim-0.1 \mathrm{~m} \)에서 급격하게 메탄이 제거되었다. 또한, 메탄이 제거되는 상부층에서 산소 농도도 급격하게 감소되었다. 이와 같이 메탄이 바이오커버의 상부층에서 감소되는 것은 여러 연구자들에 의해 보고되고 있다. Park et al.은 바이오커버에 매립지 복토 토양과 지렁이 분변토를 혼합한 시료를 채워넣고 메탄 분해를 조사한 결과, 본 연구 결과와 동일하게 메탄은 바이오커버 상단층에서 분해되었다. 실험실 규모의 lysimeter에 숙성 퇴비를 채워 놓은 후 메탄을 공급한 결과, 상부 \( 0 \sim-30 \mathrm{~cm} \) 층에서 메탄 제거가 관찰되었고, 이러한 층에서 산소 농도도 급격하게 감소하였다. 바이오커버에서 메탄 분해에 영향을 미치는 가장 중요한 무생물적 인자는 온도와 산소 이용성이다. 본 연구에서 메탄이 바이오커버 상부층에서 제거되는 것은 바이오커버 표면 위 공기층으로부터 바이오커버 상부층으로 확산되어 공급된 산소를 메탄 산화세균이 이용하여 메탄을 산화할 수 있었기 때문이다. 한편, 벤젠과 톨루엔은 바이오커버 하단부분( \( -1.0\sim-0.8 \mathrm{~m} \) )에서 거의 대부분 제거 되었다.</p> <p>바이오커버의 깊이별로 존재하는 메탄 및 벤젠/톨루엔 산화세균을 정량화 하고자 qRT-PCR을 수행하여 \( \mathrm{pmoA} \) gene과 \( t m o A \) gene을 정량분석 하였다. 메탄 산화에 관여하는 \( p m o A \) gene은 윗단과 아랫단에서의 gene copy number의 차이가 현저하게 다르게 나타났다. 즉 \( -0.4 \sim-0.1 \mathrm{~m} \)인 윗쪽 구간에서 \( p m o A \) gene이 더 높게 검출되었는데, 이는 메탄이 주로 제거되었던 구간과 일치하였다. 캐나다 Quebec의 매립지에 pilot 규모의 바이오커버를 설치하여 운전 시간 경과에 따라 바이오커버 깊이 별로 메탄 산화 세균을 정량화하여 비교한 결과, 운전 초기에는 메탄 산화 세균 수가 \( 10^{6} \) cellsg-dry weight \( { }^{-1} \)이었는데 3달 후에는 \( 10^{7 \sim} 10^{8} \) cellsg-dry weight \( ^{-1} \)로 증가하였고, 바이오커버 상부층의 메탄 산화 세균 수가 하부층보다 10배 정도 많았다. 또한, 메탄 산화 세균 수가 많은 상부층의 잠재 메탄산화속도도 하부층보다 높았다.</p>