먼저 추출한 plasmid DNA가 Lactobacillus strain의 16S - 23S rRNA intergenic species re-gion이 cloning된 plasmid DNA임을 확인한 다음 absorbance \( 260 \mathrm{~nm} \) 와 \( 280 \mathrm{~nm} \)에서 DNA 농도를 측정하였다. 이때 각각의 농도를 이용하여 copy number를 계산하였고, 10진 희석법을 이용하여 \( 10^{10} \) copy부터 \( 10^{2} \) copy까지 희석하여 RT PCR 법을 통해 검출한계를 분석하였다. 이렇게 plasmid DNA의 농도까지 결정한 후, DNA를 추출한 생균제 제품을 LbLMA-1과 R16-1을 이용하여 증폭하였다.
<h3>Plasmid DNA purification</h3> <p>Solgent plasmid mini prep kit (Solgent, KOREA)를 사용하여 plasmid DNA를 추출하였다. \( 5 \mathrm{ml} \)의 배양액을 원심분리하여 cell pellet을 얻은 후 \( 250 μl \)의 Buffer SP1으로 cell pellet을 현탁 시킨다. \( 250 μl \)의 Buffer SP2를 넣고 4 ~ 6회 정도 부드럽게 흔들어 혼합 후 \( 350 μl \)의 Buffer SGP3을 같은 방법으로 혼합하여 상온에서 10분간 원심분리 하였다. Spin column을 2ml collection tube에 장착시키고, 원심분리로 얻어진 상층액을 장착된 spin column으로 옮긴 후 30초간 \( 10,000 \mathrm{rpm} \)으로 원심분리하여 DNA를 얻었다. spin column에 \( 500 μl \)의 Buffer WB를 넣고 원심분리하고, \( 750 μl \)의 Buffer WB를 넣고 원심분리를 하였다. collection tube로 내려간 용액은 버리고 2분간 다시 한번 원심분리 한 후 30 ~ \( 50 μl \)의 buffer EB를 spin col-umn의 membrane 중앙에 바로 떨어뜨린 후, 상온에서 1분간 놓아둔 후에 원심분리 하여 정제된 DNA solution을 얻었다.</p> <h3>Cloning 된 plasmid DNA copy number에 따른 detection limit</h3> <p>Lactobacillus strain의 16S - 23S rRNA intergenic species re-gion이 cloning된 plasmid DNA를 확인한 후 Spectrophotometer(Hitachi, Japan)를 이용하여absorbance \( 260 \mathrm{~nm} \) 와 \( 280 \mathrm{~nm} \)에서 DNA 농도를 측정하였다. 각각의 농도를 이용하여 copy number를 계산하고, 10진 희석법을 이용하여 \( 10^{10} \) copy부터 \( 10^{2} \) copy까지 희석하여 각 DNA 용액을 Real-time PCR 법을 통해 검출한계를 분석하였다.</p> <p>\( \mathrm{DNA} \) 농도 \( =260 \mathrm{~nm} \) 흡광도 측정 값 \( \times \) 희석비율 \( (\%) \times \mathrm{DNA} \) 측정 상수 값(50)</p> <h3>SYBR Green 1 방법을 이용한 RT PCR</h3> <p>plasmid DNA의 농도를 결정한 후, 단계별로 희석 한 standard 샘플과 Wizard Genomic DNA purification kit (Promega, USA)를 이용하여 DNA를 추출한 생균제 제품을 Lactobacillus genus specific primer인 LbLMA-1 (reverse)와 R16-1 (forward)를 사용하여 증폭하였다. RT PCR 반응액은 template DNA \(10 μl \), Quantace (UK)사의 2x sensimix noref \( 25 \mu l, 50 \times \) SYBR \( 1 \mu l, \operatorname{Mgcl} 2 \mu l,10 \mu \mathrm{M} \) forward 및 reverseprimer 각각 \( 2 μl \)를 넣은 후 최종 부피가 \( 50 μl \)가 되도록 멸균된 3차 증류수를 첨가하여 Chromo4 Detector (Bio-Rad)에 반응시켰다. Real-time PCR 조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 실시 후, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15초, \( 57^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초를 35 cycle 수행하였으며 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5 분간 반응하였다. Ct (threshold)값은 형광커브와 역치선이 만나는 cycle 값으로 MJ opticon monitor (Bio-rad)로 분석하였다.</p> <h3>Probe 방법을 이용한 RT PCR</h3> <p>plasmid DNA의 농도를 결정한 후, 단계별로 희석 한 standard 샘플과 Wizard Genomic DNA purification kit(Promega, USA)를 이용하여 DNA를 추출한 생균제 제품을 Lactobacillus genus RT PCR primer인 alllact-F (forward)와 alllact-R (reverse), alllact-P (probe)를 사용하여 증폭하였다. Real-time PCR 반응액은 template DNA \( 10 μl \), Quantace (UK)사의 2x sensimix noref \( 25 \mu l \), probe \( 2 \mu l, \operatorname{Mgcl} 1 \mu l, 5 \mu \mathrm{M} \), forward 및 reverse primer 각각 \( 2 \mu l \)를 넣은 후 최종 부피가 \( 50 \mu l \)가 되도록 멸균된 3차 증류수를 첨가하여 Chromo4 Detector (Bio-Rad)에 반응시켰다. Real-time PCR 조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 실시 후, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 45초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초를 45 cycle 수행하였으며 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초간 반응하였다. Ct (threshold)값은 형광커브와 역치선이 만나는 cycle값으로 MJ opticon monitor (Bio-rad)로 분석하였다.