본 연구는 7주령의 수컷 C57BL/6N 마우스를 구입하여 일주일 순환시킨 후 사용하였고 무작위 배정하여 No그룹은 normal diet, HFD처리그룹은 HFD을 16주 동안 급여하였다. 혈청은 \( \mathrm{CO}_{2} \)가스로 안락사된 실험동물의 복부정맥으로부터 혈액을 채취하여 원심분리하여 확보하였으며, Image J 소프트웨어를 사용하여 지방세포의 크기를 분석하였다. 전립선암 관련 단백질의 발현은 Western blot을 이용하였고 One way ANOVA를 이용하여 No그룹과 HFD처리그룹 간의 실험 결과에 대한 유의성을 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험동물</h2> <p>본 연구에 수행된 동물실험은 부산대학교 동물실험윤리위원회(PNU-IACAU)로부터 동물실험의 윤리성과 과학성에 대한 승인(승인 번호: PNU-2019-0086)을 받아 수행하였다. 7주령의 수컷 C57BL/6N 마우스(\(21\sim23\mathrm{g}\))는 Samtako BioKorea Co. (Osan, Korea)에서 구입하여, 일주일 순환시킨 후 사용하였다. 사료와 물은 자유 급식하였으며, 실험동물은 12시간의 조명주기(08:00 20:00)로 Specific pathogen free (SPF) 상태에서 AAALAC International (승인번호: 001525)의 인증과 식품의약품안전처에 등록된(등록번호: 000231) 부산대학교 청정실험동물센터(온도 \( 23 \pm 2 \)\( { }^{\circ} \mathrm{C} \), 상대습도 \( 50 \pm 10 \% \) )에서 사육하였다.</p> <h2>동물실험 설계</h2> <p>7주령의 수컷 C57BL/6N 마우스( \( (\mathrm{n}=20) \)는 No그룹\( (\mathrm{n}=10) \), HFD처리그룹\( (\mathrm{n}=10) \)으로 분류하여 무작위로 배정하였다. No그룹은 \( 10 \% \) 지방을 함유한 normal diet (D12450K;Research Diets Inc., New Brunswick, New Jersey, USA)을 16주 동안 급여하였고, HFD처리그룹은 \( 60 \% \) 지방을 함유한 HFD (D12492; Research Diets Inc.)을 16주 동안 급여하였다. 마우스는 부검 전 12시간 동안 절식하고, \( \mathrm{CO}_{2} \)를 사용하여 안락사시킨 후 혈액을 채취하고, 장기를 적출하였다.</p> <h2>체중 및 장기 무게 측정</h2> <p>실험동물의 체중은 해부 전에 화학저울(OHAUS Corporation, NJ, USA)을 이용하여 측정하였고, 간, 지방, 전립선의 무게는 \( \mathrm{CO}_{2} \)를 사용하여 안락사시킨 후 적출하여 화학저울을 이용하여 측정하였다. 전립선은 anterior prostate(AP), dorso-lateral prostate (DLP), ventral prostate (VP), seminal vesicle (SV)의 4개 엽들(lobes)로 구분하여 적출한 후 무게를 측정하였다.</p> <h2>혈청 생화학적 분석</h2> <p>혈청은 \( \mathrm{CO}_{2} \)가스로 안락사된 실험동물의 복부정맥으로부터 혈액을 채취하여 실온에서 30분간 방치하고, \( 1,500 \times \)\( \mathrm{g} \)로 15분간 원심분리하여 확보하였다. 혈청에 함유된 total cholesterol (TC), triglyceride (TG), high density lipoprotein (HDL), low density lipoprotein (LDL)의 농도는 automatic serum analyzer (HITACHI 747, Tokyo, Japan)을 이용하여 분석하였다.</p> <h2>조직병리학적 분석</h2> <p>각 실험군에서 적출한 간, 지방, 전립선 조직은 \( 10 \% \) formalin 용액에서 48시간 고정한 뒤, 병변 조직 부위가 관찰될 수 있도록 적당한 크기로 절단하여 카세트에 넣었다. 전립선 조직은 고정시키기 전에 4 개의 엽들(AP, DLP, VP, SV)로 분리시켰다. 카세트에 담긴 조직은 조직처리기(STP-DO, SM Medical Co., Gyeonggi-do, Korea)를 이용해서 \( 70,80,90,95,100 \% \) alcohol에 각각 1-2시간 정도 처리하고, xylene으로 4시간 처리하였다. 고정된 조직은 paraffin embedding station (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 사용하여 embedding한 후, rotary microtome(Leica Microsystems)을 사용하여 블록(block)을 \( 4 \mu \mathrm{m} \) 두께로 박절하였다. 박절한 간, 지방, 전립선 조직은 H/E(Hematoxyling and Eosin) 용액(Sigma-Aldrich Co., MO, USA)로 염색한 후 광학현미경(Optical microscope)을 사용하여 100, 400, 1,000배에서 관찰하였고, AP의 두께 \( (\mu \mathrm{m}) \)와 지방세포의 크기를 Leica Application Suite (Leica Microsystems)를 사용하여 측정하였다. 지방세포의 크기를 Image J 소프트웨어(National Institutes of Health, Maryland, USA)를 사용하여 분석하였다.</p> <h2>Western blot 분석</h2> <p>전립선암 관련 단백질의 발현은 Western blot을 이용하여 분석하였다. 먼저, No그룹과 HFD 처리그룹의 전립선 조직 \( (30 \mathrm{mg}) \)은 PRO-PREP protein extraction solution(iNtRON Biotechnology, Sungnam, Korea)에 첨가하여 분쇄한 후, \( 13,000 \mathrm{rpm} \)에서 5분 동안 원심분리하여 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질의 농도는 SMARTTM BCA Protein Assay Kit (iNtRON Biotechnology)을 이용하여 정량 하였으며, \( 30 \mu \mathrm{g} \)의 단백질을 전기영동에 사용하였다. \(8-10\%\) SDS-PAGE gel에 전기영동된 단백질은 Enhanced Chemiluminescence (ECL) 막(Amersham Life Science, Piscataway, NJ)에 전이하고, \( 5 \% \) skim milk에서 1시간 동안 블로킹하였다. 단백질이 전이된 막은 anti-\( \beta \)-actin (Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA), anti-PI3K (Cell Signaling Technology Inc.), anti-p-PI3K (Cell Signaling Technology Inc.), anti-AKT (Cell Signaling Technology Inc.), anti-p-AKT (Cell Signaling Technology Inc.), anti-GSK-3 \( \beta \) (Cell Signaling Technology Inc.), anti-p-GSK-3 \( \beta \) (Cell Signaling Technology Inc.) 등의 1차 항체로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 밤새 배양한 후, HRP-conjugated된 secondary anti-rabbit antibody를 첨가하여 ECL Kit (Amersham Life Science, Piscataway, NJ)를 사용하여 발광정도를 검출하였다.</p> <h2>통계분석</h2> <p>No그룹과 HFD처리그룹 간의 실험 결과에 대한 유의성은 One way ANOVA (SPSS for windows, Release 10.10,Standard Version, Chicago, IL, USA)를 이용하여 분석하였다. 분석된 결과는 모든 값을 평균 \( \pm \mathrm{SD} \) (Standard deviation)로 표기하였고, \( p \)-value \(<0.05 \)를 유의성 있는 값으로 제시하였다.</p>