BC 생산균 JH232는 BSH 배지를 사용하여 감식초로부터 분리하였고, 비교적 성장이 빠르고 pellicle 형성을 잘 하여 본 연구에 사용되었다. Total genomic DNA를 추출하여 PCR로 16S rRNA 유전자를 증폭하였다. 배양한 JH232를 7 일 동안 여러 조건하에여 배양하여 \( \mathrm{BC} \) 생산을 비교 분석하였고, 생산된 \( \mathrm{BC} \) 는 무게 변화가 없을 때까지 건조하고 원래 배양액에서의 공도(g/l)를 결정하는데 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>Strain JH232의 분리</h2> <p>\( \mathrm{BC} \) 생산균인 세균 \( \mathrm{JH} 232 \) 은 \( \mathrm{BSH} \) 배지를 사용하여 감식초로부터 분리하였다. BSH 배지 \( 50 \mathrm{ml} \) 을 포함하는 \( 250 \mathrm{ml} \) Erlenmeyer flask에 감식초 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 7일간 정치 배양하였다. Pellicle이 형성되 flask의 배양역을 BSH 평판배지에 도말하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 7 일간 배양하여 colony를 분리하였다. 분리된 colony는 BSH 평판배지를 이용하여 2번이상 분리과정을 거쳐 순수 분리하였다. 이렇게 분리된 균 중에서 JH232은 비교적 성장이 빠르고 pellicle 형성을 잘 하였으므로 본 연구에 사용되었다. JH232은 \( \mathrm{BSH} \) 배지에서 3 일 정도 정치 배양하면 배지표면에 pellicle을 형성하였다.</p> <h2>\( 16 \mathrm{~S} \) rRNA을 이용한 균주의 동정</h2> <p>JH232로부터 Total genomic DNA를 추출하여 PCR로 \( 16 \mathrm{~S} \)</p> <p>rRNA 유전자를 증폭하는데 사용하였다. Oligonucleotide들로는 27f와 1492r를 사용하여 total DNA로부터 약 1.5 \( \mathrm{kb} \) 의 \( 16 \mathrm{~S} \) rRNA 유전자를 중폭하였다. 이 PCR 산물은 부산 대학교 기초과학연구소의 Applied Biosystems model 373A DNA sequencer (Foster City, CA)롤 사용하여 부분적으로 염기서열을 결정하였다. 결정되 염기서열은 BLASTN (version 2.2.10)을 이용하여 GenBank database에서 가장 비숫한 염기서열을 찾는데 사용하였다.</p> <h2>배양 조건 및 배지</h2> <p>\( \mathrm{BSH} \) 한천 사면배지에 배양한 JH232를 한 백금이 춰해 50 \( \mathrm{ml} \mathrm{CSL} \) 배지를 포함하는 \( 250 \mathrm{ml} \) Erlenmeyer flask 에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 인간 진탕 배양 \( (200 \mathrm{rpm}) \) 하였다. CSL 배지는 \( \mathrm{BC} \) 생산을 증가하기 위해 \( \mathrm{BSH} \) 배지 성분을 수정한 것이다. CSL 배지(pH 5.5)의 조성은 다음과 같다 (per liter) \( 15 \mathrm{~g} \) glucose (산업용, (주)삼양제넥스), \( 20 \mathrm{~g} \) corn stcep liquor, 2.7 \( \mathrm{ml} \) acetic acid, \( 1.15 \mathrm{~g} \mathrm{~K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}, 0.5 \mathrm{~g} \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \). 배양 후 10 분간 강하게 진탕하어 균체를 \( \mathrm{BC} \) pellicles로부터 유리시켰다. BC pellicles은 면규된 거즈로 여하여 균 현탁액을 회수하였다. 회수된 뉸 현타액은 본 배양에 접종균으로 사용하였으며, 점종농도는 \( 2 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 로 사용하였다.</p> <p>\( \mathrm{JH} 232 \) 은 7 일 동안 여러 즈건(온도, 초기 \( \mathrm{pH} \), 정치배양과 진탕배양, 정치배양시 베지 교면적, 부피, 밎 긴이)하에서 배양하여 \( \mathrm{BC} \) 생산을 비교 분석하였다. JH232의 배양은 달리 명시하지 않는 한 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 CSL 배지 \( (50 \mathrm{ml}) \) 가 들어 있는 \( 250 \mathrm{ml} \) Erlenmeycr flask에서 진탕 배양하였다. Time course 실험을 위해서는, 총 16 flasks를 사용하여 실시하였으며 시간대별로 각 flask롤 사용하여 배양액과 생산된 \( \mathrm{BC} \) 를 분석에 사용하였다.</p> <p>교반기가 장착된 발효소(5 l, B. Braun Biotech Intl. \( \mathrm{GmbH} \), Melsungen, Germany)를 이용하여 JH232를 회분식 또는 유 가식으로 배양함에 따른 \( \mathrm{BC} \) 생산을 분석하였다. 발효조 실험을 위한 전배양을 준비하기 위해 \( 1 \mathrm{ml} \) 의 균 현타액을 CSL 배지 \( (150 \mathrm{ml}) \) 를 포함하는 \( 500 \mathrm{ml} \) Erlenmeyer flask에 접종하여 2 일간 진탕 배양하였다. 균 현탁액은 위에 기술한 것과 같이 준비하여 \( 21 \mathrm{CSL} \) 배지를 포함하는 발효조에 접종균(5\%, \( \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 으로 사용하였다. 발효조의 운전조건은 다음과 같다: 진탕속도, \( 500 \mathrm{rpm} \) 공기유속, \( 0.5 \mathrm{vvm} \); CSL 배지 \( (\mathrm{pH}, 5.5) \), 배양기간, 7 일. 회눈 배양에서 초기 glucose 농도는 20 또는 40 \( \mathrm{g} / 1 \) 이었고, 유가 배양에서는 초기 glucose 농도는 \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 이었으며 동량의 glucose \( (20 \mathrm{~g} / 100 \mathrm{ml}) \) 를 배양 1 일 후 추가적으로 공급해주었다. 배양이 끝난 뒤에는 BC pellicles을 아래에 기술한 것과 같이 수확하였다.</p> <h2>분석 방법</h2> <p>배양액의 glucose 농도는 균체와 \( \mathrm{BC} \) 를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 원심분리 (12,000 rpm, 10 분)하여 제거한 후 Somogyi-Nelson 방법에 의해 결정하였다. 한편 Acetan의 농도는 문헌[4]에 기술된 것과 갇이 phenol-sulfuric method로 결정하였으며, Gluconic acid 농도는 배양액의 상등액을 \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) syringe fil-ter로 여과 후 HPLC로 분석하였다. 사용된 HPLC는 Nova-pak C18 (3.9×150 mm, WATO 086344, Waters) 칼럽이 장착되었고, UV-detector (Waters)를 사용하여 \( 210 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. 이동상은 \( 0.1 \% \mathrm{H}_{3} \mathrm{PO}_{4} \) 블 사용하여 유속을 \( 0.5 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 로 하였다.</p> <h2>BC 의 정제 및 농도결정</h2> <p>배양액을 \( 4,000 \mathrm{rpm}, 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 분간 원심 분리하여 \( \mathrm{BC} \)를 침전시키고 증류수로 세척하였다. 세척된 \( \mathrm{BC} \) 는 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 0.1 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} \) 로 \( 1 \mathrm{~h} \) 처리하여 불순물을 제거하였다. \( \mathrm{pH} \) 가 중성이 될 때까지. \( \mathrm{BC} \) 는 증류수로 더 세척한 후 gel dryer (Model 583, Bio-Rad; Richmond, CA)로 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 더 이상 무게 변화가 없을 때까지 건조하고 무게를 측정하여 원래 배양액에서의 공도(g/l)를 결정하는데 사용하였다 \( [10] \).</p>