Apoptosis 유발의 추가적인 지표인 DNA 단편화를 분석하기 위해, 준비된 세포에 lysis buffer를 첨가하여 lysis를 시킨 후 원심 분리하여 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액에 proteinase K 솔루션을 처리하고 phenol : chloroform : isoamyl alcohol 혼합 용액을 첨가하여 분리한 후, Hep3B 세포의 MMP 변화 정도를 측정하기 위해 JC-1 처리를 시행하였다. 이후 세포를 분리하여 FACSCalibur에서 MMP의 변화 정도를 분석하였다.
<h2>\( \mathrm{DNA} \) 단편화 분석</h2> <p>Apoptosis 유발의 또 다른 증거인 DNA 단편화 현상의 분석을 위하여 준비된 세포에 lysis buffer \( 5 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}(\mathrm{pH} \) 7.5), \( 5 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 0.5 \% \) Triton X-100]를 첨가하여 상온에서 30 분간 lysis 시킨 다음 \( 14,000 \mathrm{rpm}, 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액에 proteinase K sol-ution (Sigma)을 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 농도로 처리하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3시간 동안 반응시킨 후 phenol : chloroform : isoamyl alcohol 혼합 용액(25:24:1, Sigma)을 첨가하고 30 분간 회전교반시킨 다음 \( 14,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심 분리하였다. 여기서 얻어진 상층액에 적정량의 isopropanol (Sigma)과 \( 5 \mathrm{M} \mathrm{NaCl} \)를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 동안 반응시킨 후, \( 14,000 \mathrm{rpm} \), \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 원심 분리시켜 상층액을 제거하고 DNA pellet을 추출하였다. DNA pellet에 RNase A가 적당량 들어있는 TE buffer를 이용하여 녹인 후, \( 6 \mathrm{X} \) gel loading dye (Bioneer, Daejeon, Korea)를 섞어 주었다. 마지막으로 \( 1.6 \% \) agarose gel 을 만들어서 1시간 동안 \( 50 \mathrm{~V} \) 로 전기영동 시킨 후 ethidium bromide (EtBr, Sigma)로 염색하여 DNA 단편화 현상을 확인하였다</p> <h2>Mitochondrial membrane potential (MMP, \( \Delta \psi_{\mathrm{m}} \) ) 분석</h2> <p>다양한 조건에서 배양된 Hep3B 세포의 MMP 변화 정도를 측정하기 위하여 \( 2,000 \mathrm{rpm} \) 으로 5분간 원심 분리하여 상층액을 버리고 세포들만 모은 다음 \( 500 \mu 1 \) 의 PBS를 첨가하여 충분히 섞은 후, \( 10 \mu \mathrm{M} \mathrm{JC}-1 \) 을 처리하여 20분 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반응시켰다. 반응시킨 세포를 \( 2,000 \mathrm{rpm} \) 으로 원심 분리하여 상층액을 버리고 다시 \( 500 \mu \mathrm{l} \) 의 차가운 \( \mathrm{PBS} \) 를 첨가하고 \( 35 \mathrm{~mm} \) mesh를 이용하여 단일세포로 분리한 후 FACSCalibur에 적용시켜 MMP의 변화정도를 분석하였다.</p> <h2>Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석</h2> <p>준비된 세포에 적당량의 lysis buffer [ \( 25 \mathrm{mM} \) Tris-Cl (pH 7.5), \( 250 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 5 \mathrm{mM} \) EDTA, 1\% NP-40, \( 1 \mathrm{mM} \) phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), \( 5 \mathrm{mM} \) dithiothreitol (DTT)]를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 동안 반응시킨 후, \( 14,000 \mathrm{rpm} \) 으로 30분간 원심 분리하여 상층액에 있는 총 단백질을 분리하였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약 (Bio-Rad, Hercules, CA)의 사용방법에 따라 정량 한 다음 동량의 Laemmli sample buffer (Bio-Rad)를 섞어서 sample을 만들었다. 동량의 sample을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리한 후, nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, \( \mathrm{NH}) \) 으로 electroblotting에 의해 전이시켰다. 분리된 단백질이 전이된 nitrocellulose membrane을 5\% skim milk를 처리하여</p> <p>비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하고 1차 항체를 처리하여 상온에서 2시간 이상 또는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 over night 시킨 다음 PBS-T로 세척하고 처리된 1차 항체에 맞는 2차 항체 (PBS-T로 1:1500으로 희석하여 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 정도 반응시켰다. 반응이 끝난 후 암실에서 Enhanced Chemiluminoesence (ECL) slution (Amersham Life Science Corp.)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 발현 변화를 분석하였다.</p>