본 연구에서 사용된 균주인 Bacillus sp. EML-5020은 안동시 송천동 신여골에서 채취한 토양 시료를 3일동한 배양한 이후에 이를 순수분리함과 더불어 균주의 염색체 DNA를 분리 동정하였다. ML의 가수분해를 위해 \( \alpha \)-amylase와 glucoamylase를 첨가하여 반응시킨 후 상등액을 MLEH라고 명명한 이후에 이를 탄소원으로 이용하였다. Bacillus sp. EML-5020의 최적 배양 조건을 확립한 이후 PHBV 생합성을 위한 보조탄소원의 종류 및 농도를 확인하는 것을 목적으로 하여 propionic acid, valeric acid, levulinic acid를 첨가한 이후에 이를 배양함으로써 균주의 생장과 더불어 PHBV 축적을 확인하였다. 또한 생합성된 PHBV의 조성과 수율은 GC 분석방법을 이용하여서 결정하였으며, 물성분석은 DCS 분석을 사용함으로써 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 배지</h2> <p>본 연구에서 사용된 균주인 Bacillus sp. EML-5020은 안동시 송천동 신여골에서 채취한 토양 시료를 \( 20 \mathrm{~g} /l\) glucose가 포함된 basal medium에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rpm} \) 으로 3 일 배양한 뒤 순수분리 하였다. 균주의 보관을 위해 nutreint broth에서 24시간 배양 후 배양액 \( 400 \mu l\) 와 \( 50 \% \) glycerol \( 600 \mu l \) 를 섞어 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하였다. Basal medium1 l 의 조성은 다음과 같다: \( (\mathrm{NH} 4)_{2} \mathrm{SO}_{4} 4.00 \mathrm{~g}, \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} 1.00 \mathrm{~g} \), \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{PO}_{4} 1.70 \mathrm{~g}, \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.10 \mathrm{~g}, \mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \quad 0.01 \)\( \mathrm{g}, \mathrm{CaCl}_{2} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.02 \mathrm{~g} \), 및 microelement solution \( 2 \mathrm{ml} \). Microelement solution은 \( \mathrm{ZnSO}_{4} 0.20 \mathrm{~g}, \mathrm{H}_{3} \mathrm{BO}_{3} 0.60 \mathrm{~g} \), \( \mathrm{MnCl}_{2} \cdot 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.06 \mathrm{~g}, \mathrm{CoCl}_{2} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.40 \mathrm{~g}, \mathrm{CuSO}_{4} \cdot 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) \( 0.02 \mathrm{~g} \), 및 \( \mathrm{NaMoO}_{4} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.06 \mathrm{~g} \) 을 distilled water (DW)1 1 에 녹여 제조하였다.</p> <h2>16S rDNA sequencing</h2> <p>분리 균주의 동정을 위해 Bacillus sp. EML-5020 균주의 염색체 DNA를 G-spinTM Total DNA Extraction Kit (Intron Biotechnology, Korea) 을 이용하여 분리하였다. 분리된 염색체 DNA의 증폭을 위해 \( \mathrm{T} 100^{\mathrm{TM}} \) Thermal Cycler PCR machine (Bio-Rad Laboratories, CA, USA)와 TaKaRa Ex Taq \( { }^{\circledR} \) DNA polymerase (Takara, Shiga, Tokyo), 그리고 8F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1492R (5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3') primer를 사용하였다. 염기서열을 확인한 뒤 BALST search를 이용하여 균주를 동정하였다.</p> <h2>ML 효소 가수분해</h2> <p>ML은 국순당(Hoeng seong, Korea)에서 제공받은 대박 막걸리 주박을 사용하였다. ML의 가수분해를 위해 flask 에 ML과 DW를 1:1 로 첨가한 뒤 \( 3 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} \) 를 이용하여 \( \mathrm{pH} 6 \) 으로 조정 후 \( \mathrm{ML} \mathrm{g} \) 당 \( 20 \mathrm{U} \) 의 \( \alpha \)-amylase를 첨가하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 200 \mathrm{rpm} \) 으로 shaking incubator에서 3hr 반응시켰다. 반응이 끝난 후 \( 3 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} \) 을 이용하여 \( \mathrm{pH} 4.5 \) 로 조정한 후 \( \mathrm{ML} \mathrm{g} \) 당 \( 13 \mathrm{U} \) 의 glucoamylase를 첨가하여 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 200 \mathrm{rpm} \) 으로 shaking incubator에서 3hr 반응시켰다. 이후 centrifugal separator를 이용하여 \( 1,632 \mathrm{~g} \) 에서 10 min centrifugation 한 후 상등액을 MLEH라고 명명한 뒤 탄소원으로 이용하였다.</p> <h2>Flask 배양 조건</h2> <p>배양배지는 YPM과 basal medium을 이용하였다. Bacillus sp. EML-5020을 YPM media에서 배양하여 optical density(OD) 값이 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서0.6에 도달하였을 때 접종량이 \( 10 \% \) \( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 가 되도록 MLEH에 포함된 환원당(환원당 MLEH, reduced sugar MLEH 20\( \mathrm{~g} / l \)가 포함된 \( 100 \mathrm{ml} \) 의 basal medium으로 옮겼다. 모든 실험은 \( \mathrm{pH} 7.0,37^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rpm} \) 의 기본 조건으로 3회 수행하였다. 배양시간, \( \mathrm{pH} \), 온도, 질소농도는 Bacillus sp. EML-5020 을 각각 12~72hr, \({pH} 4 \,, 25 \sim 40^{\circ} \mathrm{C} \), \( 0.04 .0 \mathrm{~g} / l \) 의 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 를 처리한 조건에서 배양하여 확립하였다. 최적 배양 조건 확립 후 PHBV 생합성을 위한 보조탄소원의 종류 및 농도를 확인하기 위해 propionic acid, valeric acid, levulinic acid를 각각 \( 0.4 \sim 1.0 \mathrm{~g} / l \) 를 첨가한 뒤 배양하여 균주의 생장과 PHBV 축적을 확인하였다.</p> <h2>Fermentation 조건</h2> <p>Lane-Eynone 방법을 이용한 glucose 소비량을 측정하여 ML 및 MLEH에 포함된 환원당의 농도를 측정하였다. 질소는 Kjeldahl method의 분해 방법을 통해 질소원을 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 로 변환 후 ammonia Nessler's method를 수행하여 측정하였다. ML의 수분함량은 건조 전 ML의 무게를 측정한 후 ML을 \( 105^{\circ} \mathrm{C} \) 건조오븐에서 \(24\mathrm{hr}\) 동안 건조하여 나온 ML의 무게를 측정하여 건조 전 후의 무게를 비교하여 수분함량을 측정하였다.</p> <h2>ML, MLEH 성분 분석</h2> <p>Lane-Eynone 방법을 이용한 glucose 소비량을 측정하여 ML 및 MLEH에 포함된 환원당의 농도를 측정하였다. 질소는 Kjeldahl method의 분해 방법을 통해 질소원을 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 로 변환 후 ammonia Nessler's method를 수행하여 측정하였다. ML의 수분함량은 건조 전 ML의 무게를 측정한 후 ML을 \( 105^{\circ} \mathrm{C} \) 건조오븐에서 \(24\mathrm{hr}\) 동안 건조하여 나온 ML의 무게를 측정하여 건조 전 후의 무게를 비교하여 수분함량을 측정하였다.</p> <h2>Gas chromatography (GC) 분석</h2> <p>PHBV 측정은 flame ionization detector (FID)가 장착된 GC-2010 plus Capillary GC (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan) 이용하였으며 column은 HP-1 \( (25 \mathrm{~m} \times 0.2 \mathrm{~mm} \times 0.5 \mu \mathrm{m}) \)을 이용하였으며, PHBV standard는 Sigma-Aldrich (Missouri, MO, USA)사의 PHBV (natural origin, 3 HV content \( 8 \% \) 를 사용하였다. PHBV 조성과 수율은 GC 분석을 통해 결정하였으며, 내부 표준물질(internal standard)로 \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 benzoic acid를 사용하였다. GC 측정 전처리를 위하여 시료 \( 20 \mathrm{mg} \) 에 GC base solution (1 1당 methanol \( 850 \mathrm{ml}, 98 \% \) \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} 150 \mathrm{ml} \), benzoic acid \( \left.2 \mathrm{~g}\right) 538 \mu l \) 와 chloroform 538 \( \mu l \) 를 첨가하여 \( 88^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 18hr 반응시켰다. 증류수 \( 200 \mu l\)를 첨가하여 층 분리한 후 chloroform 층만 GC vial에 옮겨 GC를 측정하였다.</p> <h2>PHBV 물성분석</h2> <p>물성분석은 thermogravimetric analysis (TGA), differential scanning calorimetry (DSC), gel permeation chromatography (GPC)를 사용하여 진행하였으며 TGA는 TG-DTA 8122 (Rigaku Inc., Tokyo, Japan)을 사용하여 확인하였으며, PHBV 시료 \( 20 \mathrm{mg} \) 을 질소 \( 40 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 와 승온속도 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) \( / \mathrm{min} \) 으로 \( 900^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 상승시켜 무게 감량 변화를 확인하였다. DSC 분석은 DSC 200 Phox (Natzsch, Selb, Germany)를 사용하여 수행하였으며, \( 20 \mathrm{mg} \) 의 정제된 \PHBV를 분석온도 \( 10^{\circ} \mathrm{C} / \mathrm{min} \) 의 속도로 \( 20 \sim 300^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 증가시켜 분석하였다. GPC는 detector-RI가 장착된 Refractive Index detector Alliance e2695 (Waters Inc., Milford, MA, USA)을 사용하였으며 정제된 PHBV 시료 \( 20 \mathrm{mg} \) 을 유출용매 \( \mathrm{CHCl}_{3} 10 \) \( \mathrm{ml} \) 을 사용하여 \( 1 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 의 속도로 주입시켜 분석하였다.</p>