Microsatellite DNA형 분석을 위한 좌위는 국제표준항목이 포함된 StockMarks (Applied Biosystems, USA)에서 증폭이 용이하고 다형성이 높은 8개를 선정(Table 1)하여 manu-facturer의 protocol에 따라 DNA를 GeneAmp PCR system2720 (Applied Biosystems, USA)으로 증폭하였다. 증폭된 DNA는 2.5 \( \% \) agarose gel로 전기영동하여 증폭산물을 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>공시 재료</h2> <p>경주지방에서 사육중인 경주개(동경이) 51두로부터 채혈한 혈액에서 Tozaki 등의 방법에 준하여 DNA를 분리하였다.</p> <h2>Marker 선정 및 PCR</h2> <p>Microsatellite DNA형 분석을 위한 좌위는 국제표준항목이 포함된 StockMarks (Applied Biosystems, USA)에서 증폭이 용이하고 다형성이 높은 8개를 선정(Table 1)하여 manu-facturer의 protocol에 따라 DNA를 GeneAmp PCR system2720 (Applied Biosystems, USA)으로 증폭하였다. 사용된primer는 multiplex-PCR을 수행하였으며 PCR과정은 다음과 같다. 먼저 95 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10분간 가열하여 변성을 유도하고,95 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30초간 denaturation, 58 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30초간 annealing 그리고 72 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분간 extension의 3단계를 총 20회한 후, 95 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30초간 denaturation, 56 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30초간 annealing 그리고 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분간 extension의 3단계를 총 15회 반복하였으며 마지막으로 72 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30분간 final extension 과정을 거첬다. 증폭된 DNA는 2.5 \( \% \) agarose gel로 전기영동하여 증폭산물을 확인하였다.</p> <h2>Microsatellite DNA 다형 분석</h2> <p>증폭된 DNA는 D.W와 1:5로 희석한 후 희석액 1 \( \mu \mathrm { l } \), Hi-Di formamide 11.5 \( \mu \mathrm { l } \)와 GeneScan-500 LIZ size standard (Applied Biosystems, USA) 0.5 \( \mu \mathrm { l } \) 를 혼합한 후 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 3분간 denaturation과 ice에서 3분 동안 침지한 다음, 유전자형 자동분석기(ABI PRISM 3130 Analyzer, Applied Biosystems, USA)에 의해 전기영동하고, 검출된 각 유전좌위의 대립유전자는 GeneMapper Software Version 4.0(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 2005/2006년 국제동물유전학회(ISAG) 개 비교동정시험(Canine Comparison Test) 결과를 표준으로 각 marker별 대립유전자의 크기(bp)를 결정하였다.</p> <h2>통계 및 혈통 분석</h2> <p>Microsatellite DNA형 유전좌위별 대립유전자의 출현빈도를 추정하고 이를 토대로 Heterozygosity (Het)와 Polymorphic information contents (PIC)를 CERVUS Ver.2.0 program (Version 1.0, The University of Edinburgh, 1988; http://helios.bto.ed.ac.uk/evolgen/cervus/) 을 이용하여 산출하였고, 멘델의 유전양식에 따라 동경이의 혈통을 분석하였다.</p>