5주령의 암컷 ICR 마우스 5마리씩을 한 군으로 하여, 시료를 마우스 체중 \( \mathrm{kg} \)당 각각 \(10, 50, 250 \mathrm{mg} \)씩 투여한 군과 시료를 투여하지 않은 대조군으로 나누어 실험하였다. 마우스 간 조직의 사이토졸 부유액에서의 QR 활성을 측정하였으며, 마우스 간 조직의 마이크로좀 분획에서의 총 glutathione 함량을 측정하였다. 또한, 사이토졸 용액 및 마이크로좀 분획 내의 단백질의 양은 표준 단백질 BSA의 표준검량선을 토대로 산출하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>시 약</h2><p>Minimum essential medium eagle's (MEM), antibiotics, flavin adenine dinucleotide (FAD), 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), \( \beta \)-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate ( \( \beta-N A D P) \), glucose-6-phos-phate, glucose-6-phosphate dehydrogenase, menadione, so-dium dodecyl sulfate, dicuomarol, crystal violet, NADP \( ^{+} \), chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB), glutathione reductase, \( \beta \) -naphtoflavone, triton X-100, Na-EDTA, bovine serum al-bumin (BSA), tween-20, 5, 5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB), Tris-HCl, bicinchoninic acid protein kit는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, fetal bovine serum (FBS)은 JBI사 (Daegu, Korea)제품을 사용하였다. 기타 세포 배양용 시약 및 추출용 유기용매는 특급시약을 사용하였다.</p><h2>실험동물 및 실험군의 분류</h2><p>본 실험에 사용한 동물은 5주령의 암컷 ICR 마우스 (체중 \(25-30g\))를 대한실험동물센터(충북, 음성)에서 구입하여 본 대학 동물사육실에서 일정한 조건 (온도 \( 20 \pm 2^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \(40-60\%\))하에서 7일간 안정시킨 후 실험에 사용하였으며, 실험기간 중 사료와 물은 자유로이 먹게 하였다. 실험군은 마우스 5마리를 한 군으로 하여, 시료를 투여하지 않은 대조군(control), \( 70 \% \) \(\mathrm{EtOH}\) 추출물을 마우스 체중 \( \mathrm{kg} \) 당 \(10, 50, 250 \mathrm{mg} \) 으로 각각 투여한 군으로 나누었다. 시료투여는 마우스당 \( 0.2 \mathrm{ml} \) 씩을 하루 1회로 하여 14일간 관류법(gastrointuba-tion)으로 투여하였다.</p><h2>세포배양</h2><p>계대 보존 중인 생쥐의 간암세포 Hepa1c1c7 세포를 \( 10 \% \) FBS가 포함된 MEM을 배양액으로 하여 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기 (\(5\%\) \( \mathrm{CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C} \) )에서 배양하였고, 배양액은 3 또는 4일 간격으로 교환해 주었다. 세포는 액체질소에 보존해 두었다가 같은 passage 번호를 가진 세포를 녹여서 사용하였으며, 세포의 생존은 trypan blue dye exclusion 방법으로 확인하였다.</p><h2>단삼추출물 시료의 제조</h2><p>실험에 사용한 국내산 단삼은 경주시 소재 건재상에서 구입하였으며 단삼 \( 1.7 \mathrm{~kg} \) 중 \( 500 \mathrm{~g} \) 은 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \(1.5 l) \)로 6시간씩 3회 추출하여 그 추출액을 rotary vacuum evapo-rator (BUCHI RE121, Switzerland)로 농축하여 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 추출물 약 \( 166.9 \mathrm{~g} \) 을 얻었고, 단삼 \( 1.2 \mathrm{~kg} \)은 상온에서 \( 70 \% \mathrm{EtOH} \) (\(2 l\))로 3일간 3회 추출하여 그 추출액을 여과 농축하여 \( 70 \% \) ethanol \( (\mathrm{EtOH}) \)추출물 \( 222.1 \mathrm{~g} \)을 얻었다. 여기에 물 \(1 l\) 를 가해 녹인 다음 다시 \( \mathrm{n} \)-hexane (\(1 l\))를 가하여 분획깔대기로 \( \mathrm{n} \)-hexane과 수충으로 분획한 다음 수충은 \( \mathrm{CH}_{2} \mathrm{Cl}_{2} \)\(1 l \)를 가하여 분획깔대기로 \( \mathrm{CH}_{2} \mathrm{Cl}_{2} \) 와 수충으로 분리한 다음 \( \mathrm{CH}_{2} \mathrm{Cl}_{2} \)층을 감압농축하여 \( \mathrm{CH}_{2} \mathrm{Cl}_{2} \) 추출물 \( (0.96 \mathrm{~g}) \)을 얻었고, 수층은 상기와 같은 방법으로 ethyl acetate (\(1 l\)), n-BuOH (\(1 l\))순으로 추출하여 EHOAc 추출물 \( 7.19 \mathrm{~g}, \mathrm{n}\)-BuOH 추출물 \( 8.34 \mathrm{~g} \) 과 water layer 추출물 \( 163.5 \mathrm{~g} \) 을 얻었다.</p><h2>마우스 간으로부터 사이토졸과 마이크로좀의 분리</h2><p>\( 70 \% \mathrm{EtOH} \) 추출물의 투여가 완료되고 24시간이 지난 후 마우스를 질식시킨 다음 복피를 절개하여 간조직을 취하였다. 간은 무균상태에서 \( 0.15 \mathrm{M} \mathrm{KCl} \) buffer ( \( \mathrm{pH} 7.0) \) 로 perfu-sion시킨 후 적출하고, 다시 여러번 세척한 다음 홉습지로 수분을 제거하였다. Cytosol 부유액과 microsome의 분리는 Phol과 Fouts의 방법을 응용하여 간 조직은 \( 0.25 \mathrm{M} \mathrm{su}- \) crose 용액 \( ( \) 조직 \( \mathrm{g} \) 당 \( 5.0 \mathrm{ml}) \) 으로 빙냉상태에서 조직균질기를 사용하여 마쇄하였다. 이 마쇄액을 원심분리(15,000 rpm, 20 분)시킨 후 침전물은 제거하였으며, 상층액은 \( 1 \mathrm{ml} \) 당 \( 0.25 \)M sucrose 용액에 녹인 \( 0.1 \mathrm{M} \mathrm{CaCl}_{2} \)를 \( 0.2 \mathrm{ml} \)의 부피로 첨가 하여 빙냉상태에서 30 분간 방치하였다. 다시 2 차 원심분리 (36,000 rpm, 1시간) 시켜 상층액은 cytosol 부유액으로 사용 하고 형성된 침전물은 \( 0.25 \mathrm{M} \) sucrose에 재현탁하여 microsome 분획으로 실험에 사용하였다. 이상의 모든 과정은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 실시하였다. 정량된 분획은 일정량씩 나누어 실험에 사용할 때까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 냉동보관하였다.</p><h2>QR 활성 측정</h2><p>시료를 48시간 처리한 Hepa1c1c7 세포와 마우스 간 조직의 cytosol 용액에서의 QR 활성 유도 효과는 Prochaska와 Santamaria의 방법을 수정하여 사용하였다. QR 활성은 분당 환원된 MTT의 흡광도와 crystal violet의 흡광도에 의해 산출하였고, QR의 활성 유도는 대조군의 QR 활성에 대한 시료에 의한 활성의 비로 계산하였으며, 이때 도입된 \(3,247 \mathrm{nmol} / \mathrm{mg} \)은 crystal violet과 MTT의 홉광계수를 결정하는 비례상수이다.</p><p>Specific activity \( = \)\( \frac{\text { Absorbance change of } \mathrm{MTT} / \mathrm{min}}{\text { Absorbance of crystal violet }} \times 3,247 \mathrm{nmol} / \mathrm{mg} \)</p><h2>GST 활성 측정</h2><p>시료를 48시간 처리한 Hepa1c1c7 세포와 마우스 간 조직의 cytosol 용액에서의 GST 활성 측정은 윤 등의 방법으로 실시하여 3분간 흡광도의 증가를 \( 380 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. GST 활성은 \(\mathrm{slop} / \mathrm{min} / \mathrm{mg}\) protein으로 계산하여 시료를 처리하지 않은 대조군의 GST 활성에 대한 시료를 처리한 GST 활성의 비로 나타내었다.</p><h2>GSH 함량 측정</h2><p>시료를 48시간 처리한 Hepa1c1c7 세포와 마우스 간 조직의 microsome 분획의 총 glutathione 함량은 윤 등의 방법으로 측정하였다. GSH 함량은 GSH 표준곡선으로 계산하였고, \( \mathrm{nmol} / \mathrm{mg} \) protein으로 표시하였으며, GSH 함량의 비는 대조군에 의한 GSH 양과 시료에 의해 생성된 GSH 양의 비율로 측정하였다.</p><h2>단백질 검량</h2><p>세포내 총 단백질 및 cytosol 부유액과 microsome분획 단백질은 bicinchoninic acid (BCA) protein kit를 사용하여 BSA 를 표준 단백질 용액으로 이용한 표준검량선을 구하여 그 양을 산출하였다.</p><h2>통계학적 처리</h2><p>실험결과는 평균표준편차(standard deviation, SD)로 나타내었으며, 실험에 대한 유의성 검정을 위해 student's t-test 를 수행하여 결과치는 p 값이 0.05 미만을 통계학적으로 의미있는 것으로 간주하였다.</p>