pBluescript SK(+) 벡터에 원하는 cDNA insert를 클로닝하고 M13K07 감염된 competent E. coli를 통해 재조합하여 장환형 단일가닥 센스 DNA를 생산하였고, 이 센스 DNA로 암관련 유전자로 알려진 284개의 유전자에 대한 마이크로어레이를 제작하며, WI38VA13 및 A549의 RNA에 Cy3-dUTP와 Cy5-dUTP를 각각 표지시킨 후 유전자 발현정도를 측정하였다. 또한, 이것들을A549 세포와 WI38VA13에 transfection하여 암세포의 성장에 어떠한 영향을 미치는지 살펴보았다..
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>장환형 단일가닥 센스 DNA 생산</h2> <p>원하는 cDNA insert를 pBluescript SK(+) 벡터에 클로닝하고 M13K07가 감염된 competent E.coli에 재조합시켜 장환형 단일가닥 센스 DNA가 생산되게 하였다 \( 100 \mathrm{mL} \)의 배양상청액에서 약 \( 150 \mu \mathrm{g} \)의 장환형 단일가닥 센스 DNA를 생산하였다.</p> <h2>장환형 단일가닥 센스 DNA와 cDNA를 이용한 마이크로어레이</h2> <p>장환형 단일가닥 센스 DNA로 암관련 유전자로 알려진 284개의 유전자에 대한 마이크로어레이를 만들어 WI38VA13 및 A549의 RNA에 Cy3-dUTP와 Cy5-dUTP를 각각 표지시킨 뒤 유전자 발현정도를 측정하였다. 측정결과 6개의 유전자가 과발현되고(AI814383, H07878, NM000214, AA598517, NM021102, AA464849) 7개의 유전자 발현이 낮은 것을(AA136983, R62603, AA59874, N72115, AA862371, AA156802, AA447797) 알게 되었다. 과발현된 유전자 중 일부는 기존 연구에서 폐암 등에서 과발현되는 것으로 보고 되었고, 저발현된 유전자 일부도 기존 연구에서 저발현됨이 보고되었다. 이러한 마이크로어레이 결과로 얻어진 유전자 발현의 증감이 실제 유전자 발현의 증감과 비례하는지를 비교하기 위해 발굴된 과발현 유전자, 저발현 유전자 및 변화 없는 유전자(NM000404.2, NM004964.2)에 대해 real-time PCR를 시행하였고 그 결과 두 실험의 증감이 훌륭한 상관관계를 나타냄을 알 수 있었다.</p> <h2>5K 마이크로어레이를 통한 유전자 발현분석</h2> <p>장환형 단일가닥 센스 DNA로 대량 유전자분석이 가능한 지를 알아보기 위해 5079개의 인간유전자를 탑재한 칩을 제작하였다. WI38VA13과 A549의 RNA에 Cy3-dUTP와 Cy5-dUTP를 각각 표지시킨 뒤 유전자 발현정도를 비교하였다. 마이크로어레이의 재현성을 알아보기 위해 반복 실험을 수행하였고, Cy3-dUTP와 Cy5-dUTP를 바꾸는 dye-swap 테스트를 시행하였다. 반복 실험과 dye-swap 모두 신뢰할 만한 상관관계를 나타내었다.</p> <p>이러한 좋은 상관관계를 나타내는 이유 중의 하나는 장환형 단일가닥 센스 DNA가 강한 신호강도를 나타내기 때문으로 생각되며 이는 흔성화시 cDNA에서처럼 상보가닥 복원에 의한 효과가 없고 충분히 긴 구조를 가지기 때문으로 생각된다. 또한 장환형 단일가닥 센스 DNA를 이용한 마이크로어레이는 보다 강한 신호강도를 보이기 때문에 보다 적은 양의 Cy3 및 Cy5가 필요할 것이고 보다 적은 양의 RNA 샘플을 이용하여 유전자 발현 분석이 가능할 것이다. 장환형 단일가닥 센스 DNA를 이용한 마이크로어레이는 박테리아 배양 상청액에서 상대적으로 저렴한 비용으로 대량생산이 가능하고 이중가닥의 cDNA보다 신호강도가 높아 실용성이 있을 것으로 사료된다.</p> <h2>장환형 단일가닥 안티센스 DNA를 이용한 기능적 유전자 분석</h2> <p>장환형 단일가닥 센스 DNA를 이용한 유전자 분석에서 과발현되는 유전자를 클로닝을 통해 pBluescript SK(-)에 옮겨 장환형 단일가닥 안티센스 DNA를 만들었다. 이들을 A549 세포와 WI38VA13에 transfection하여 암세포의 성장에 어떠한 영향을 미치는지 관찰하였다. 암세포의 성장을 현미경으로 관찰하고 MTT assay 를 통해 성장정도를 정량적으로 측정하였다. 360개의 안티센스 가운데 49개의 안티센스가 용량 의존적으로 A549 암세포의 성장을 억제하였고 이 안티센스들은WI38VA13의 성장을 거의 (>80\(\%\)) 저해하지 않았다. 본 실험에서 발굴한 유전자 가운데 XIAP(AI628066)는 이미 siRNA를 이용한 항암치료제로 개발 중 이고, Lyn(R83837) 유전자의 발현을 억제하는 siRNA도 암세포의 성장과 전이를 억제하는 것으로 보고되었다. 앞으로 다른 유전자에 대하여서도 그 가치를 중명해야 할 것이다.</p> <p>암세포에서 과발현된 유전자가 있다면 이는 암조직의 병리적 성장에 중요할 역할을 할 가능성이 있고 이는 치료제 개발의 목표가 될 수 있다. 이를 증명하기 위해서는 개별적으로 안티센스 올리고핵산체나 siRNA 등으로 각각의 유전자의 발현을 저해하여 세포의 성장을 관찰하여야 한다. 암조직이나 암세포의 유전자 발현분석을 통해 의미 있는 결과를 도출하는 것은 진단 마커 개발이나 치료제의 개발을 위해 매우 중요한 일이지만 또한 시간과 비용이 드는 일이기도 하다. 본 연구에서는 과발현된 유전자를 클로닝을 통해 대량으로 안티센스를 제작하여 동시에 여러 개의 관련 유전자를 발굴할 수 있었다. 하지만, 이러한 연구는 세포주를 이용한 실험으로 그 한계가 있으므로, 보다 의미 있는 결과를 얻기 위한 in vivo 실험 등의 후속연구가 필요할 것이다.</p> <p>결론적으로 장환형 단일가닥 센스 DNA로 제작한 마이크로어레이는 실제 유전자 발현정도와 잘 일치하는 신뢰할 만한 결과를 보여주었고 대량 유전자 분석에서도 재현성 있는 결과를 나타내었다. 또한 장환형 단일가닥 센스 DNA와 안티센스 DNA를 이용하면 단시간에 대량으로 효과적인 목표 유전자를 발굴할 수 있음을 보여주었다.</p>