Mannanase 활성은 \( 0.5 \% \) LBG, \( 50 \mathrm { ~mM } \) sodium citrate 완충액( \( \mathrm { pH } \mathrm { ~5.5 } ) \)에 효소를 첨가하여 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 15분간 반응한 후 3,5-dinitrosalicylic acid 방법으로 측정하였고, 반응 온도와 \(\mathrm { pH }\)의 영향을 조사하여 반응 최적 조건을 확립하였다. Mannanase에 의한 가수분해 산물을 분석하기 위해서 상등액을 얻어 chloroform, acetic acid와 증류수 혼합용액을 전개용액으로 하여 silica gel-precoated thin layer plate에서 박층 크로마토그래피를 수행했다.
<h2>Mannanase 활성 측정과 반응특성 분석</h2> <p>Mannanase 활성은 \( 0.5 \% \mathrm { ~LBG } \)와 \( 50 \mathrm { ~mM } \) sodium citrate 완충액( \( \mathrm { pH } \mathrm { ~5.5 } ) \)을 포함한 반응액에 효소를 첨가하여 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 15 \)분간 반응을 실시한 후 유리된 환원당을 \( 3,5 \)-dinitrosalicylic acid 방법으로 측정하였으며, 효소 활성도 \( 1.0 \) unit는 위의 조건에서 \( 1 \)분 동안 \( \mathrm { LBG } \)로 부터 \( 1 \mu \mathrm { mol } \)의 mannose에 상응하는 환원당을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. Mannanase 활성에 미치는 반응 온도와 \( \mathrm { pH } \)의 영향을 조사하기 위하여 \( 30-65 ^ {\circ } \mathrm { C } \)와 pH \( 4.0-8.0 \)의 범위에서 각각 효소 활성을 측정하였다. 효소 내열성은 \( 30-60 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 mannanase 조효소액을 \( 1 \)시간 동안 방치한 후 잔존활성을 측정하여 결정하였고, \( \mathrm { pH } \) 안정성을 조사하기 위해서는 \( \mathrm { pH~ } \) \( 3.0-12.0 \) 범위의 완충용액을 최종농도가 \( 50 \mathrm { mM } \)이 되도록 조효소액과 혼합하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 1 \)시간 동안 방치한 후 mannanase 잔존활성을 측정하였다. 이때 \( \mathrm { pH } \)를 조절하기 위해서 citrate 완충용액(pH \( 3.0-6.0 \)), phosphate 완충용액( \( \mathrm { pH~ } 6.0-8.0 \)), Tris 완충용액(pH \( 8.0-9.0 \)), KCl-borate 완충용액(pH \( 9.0-10.0 \)), carbonate 완충용액(pH \( 10.0-11.0 \))과 phosphate \( / \mathrm { NaOH } \) 완충용액(pH \( 11.0-12.0 \))이 각각 사용되었다. Mannanase에 의한 가수분해 산물을 분석하기 위해서는 \( 0.5 \% \) 함량의 LBG, guar gum 또는 중합도가 \( 2-6 \)인 MOS를 각각 기질로 사용하였으며, 이들 기질과 \( 20 \mathrm { ~mM } \) citrate 완충액( \( \mathrm { pH~ } \mathrm { 5.5) } \)을 포함한 반응액에 과량의 효소를 첨가하여 \( 45 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 5 \)시간 반응시킨 후 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 5 \)분간 열처리하고 원심분리한 다음 상등액을 적정량 취해 chloroform, acetic acid와 증류수( \( 4.3 \) : \( 5: \) \( 0.7,( \mathrm { v } / \mathrm { v } )) \) 혼합용액을 전개용액으로 하여 silica gel-precoated thin layer plate (Merck, Kiesegel, No. \( 5748 \))에서 박층 크로마토그래피를 수행하였다. 전개된 물질을 발색시키기 위해서는 ethanol \( 9 \mathrm { ~ml } , p \)-anisaldehyde \( 0.5 \mathrm { ml } \), sulfuric acid \( 0.5 \mathrm { ~ml } \)와 glacial acetic acid 몇 방울을 혼합한 발색제 용액을 뿌린 후, \( 120 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 10 \)분간 방치하였다.</p>