본 실험에서 Dynabeads oligo \( (\mathrm{dT})_{25} \)를 이용하여 영양결핍된 토마토 잎으로부터 RNA를 분리했고, 이를 통해서 RT-PCR을 진행헀다. 이는 증폭산물이 500bp 정도이며, Accupower RT-PCR premix kit를 이용해서 RT-PCR을 수행했다.
<h2>RT-PCR</h2><p>RT-PCR를 위한 RNA 분리는 Dynabeads oligo \( (\mathrm{dT})_{25} \)를 이용하여 다음과 같이 분리하였다. \(200 \mu \mathrm{l}\) Oligo\( (\mathrm{dT})_{25} \)를 E-tube에 취한다음 Dynal MPC에 부착시켜 부유액을 제거하고 \(200 \mu \mathrm{l}\) lysis/binding buffer(\(100 \mathrm{mM} \) Tris-\( \mathrm{HCl} \) \( \mathrm{pH} 7.5\), \(500 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{LiCl}\), \(10 \mathrm{mM} \) EDTA \( \mathrm{pH} 8.0\), \(1\% \) LiDS, \(5\mathrm{mM} \) dithiothreitol)를 첨가한 다음 혼합하여 다시 MPC로 제거한다. 영양결핍된 토마토 잎을 액체질소 하에 막자사발로 분쇄한 \( 0.1 \mathrm{~g} \)를 ly-sis/binding buffer \( 1 \mathrm{ml} \)에 부유하고 1 ~ 2분간 철저히 혼합하고 1분간 원심분리한 상등액을 oligo(dT)25와 혼합한다. 혼합물을 상온에서 3 ~ 5분간 반응한 후 \(1 \mathrm{ml} \) washing buffer A(\(10 \mathrm{mM} \) Tris-\( \mathrm{HCl}\), \(\mathrm{pH} 7.5\), \(150 \mathrm{mM} \mathrm{~LiCl}\), \(1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 0.1 \% \) LiDS)로 두 번 씻고 \(1 \mathrm{ml} \) washing buffer B (\( 10\mathrm{mM} \) Tris-\( \mathrm{HCl} \), \( \mathrm{pH} 7.5\), \(150 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{LiCl}\), \(1 \mathrm{mM}\) EDTA)를 넣고 철저하게 씻은 다음 마지막으로 \(0.5 \mathrm{ml} \) wasing buffer B로 씻은 후 \(20 \mu \mathrm{l}\) \(10\mathrm{mM} \) Tris-\( \mathrm{HCl} \)를 가하여 \(65\sim80^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분간 처리한 후, 즉각 MPC 에 부착시켜 상등액을 취하여 RT-PCR를 위한 시료로 사용하였다. BAK1 primer는 애기장대 유전자(GenBank Accession No. NM_119497)를 이용하여 BAK1-5 5'-CACCGCCTCCTA TCTCTCCT-3', BAK1-3 5'-AGGCAACACTTCCATTAGCC-\( 3^{\prime} \)를 디자인하여 증폭산물이 \(500 \mathrm{bp} \)가 되도록 만들었다. RT-PCR는 Accupower RT-PCR premix kit(Bioneer Co.)를 이용하여 Reverse transcriptase 반응은 \(45^{\circ} \mathrm{C}\): \(60\mathrm{~min}\), \(72^{\circ} \mathrm{C} \): \(10\mathrm{~min} \), \(94^{\circ} \mathrm{C}\): \(4\mathrm{~min} \) 으로 수행하였고, PCR 증폭은 35 cycle (\(94^{\circ} \mathrm{C}\):\(45\mathrm{sec} \), \(50^{\circ} \mathrm{C}\):\(30\mathrm{sec} \), \(72^{\circ} \mathrm{C}\): \(1\mathrm{~min} \)) \(72^{\circ} \mathrm{C}\):\(10\mathrm{min} \) 으로 증폭하였다.</p>