동도의 야생 까마중 군락지에서 채취한 까마중의 뿌리를 세척 후, 식물근권의 포자형성세균종류 분리를 위해 뿌리와 뿌리를 씻은 물을 마이크로피펫으로 영양배지인 tryptic soy 한천 배지에 도말하였다. NBRIP배지에 분리균을 획선접종해 배양시키면서 배지에 clearzone의 형성을 관찰하였다. 식물병원균의 길항 기작중의 하나인 siderophore 생산성여부 확인을 위해 CAS blue 한천 배지에 분리 균을 획선 접종해 배양시키면서 배지의 푸른색이오렌지색으로의 변화를 관찰했다. 이를 고추에 적용하여 분리균들의 식물생장촉진 및 ISR 효과의 검증을 위해 실험을 수행하였다. 독도 야생 까마중에서 분리한 균들이 고추의내병성에 미치는 영향을 조사하기위해 ISR 활성 테스트를 수행했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>독도의 야생 까마중 근권세균의 분리</h2> <p>동도의 야생 까마중 군락지 4곳으로부터 채취한 까마중의뿌리를 멸균증류수로 세척한 후, 식물근권의 포자형성세균종류를 분리하기 위하여 뿌리와 뿌리를 씻은 물을 마이크로피펫을 이용해 영양배지인 tryptic soy 한천 배지로 옮겨 도말하였다. \(60^{o}C\)에서 30분간 배양하여 포자 형성을 유도한후, \(37^{o}C\)에서 48시간 이상 배양하였다. 질소고정세균을분리하기 위하여 까마중의 뿌리를 세척한 물을 마이크로 피펫을 이용해 1.5% 한천이 첨가된 질소원이 부족한 배지로옮겨 도말한 후 \(30^{o}C\)에서 48시간 이상 배양하였다. 세균의 순수 분리를 위하여, 배지 상에 나타난 군락을 형태적으로 분류, 선별하여 각각의 한천 배지에 획선 도말하였다.</p> <h2>식물생장호르몬 생산능 조사</h2> <p>분리균들에 대한 옥신 호르몬 생산 능력을 실험하고자King B(KB) 배지를 사용하였다. 100 mL의 KB배지에옥신 전구체인 L-tryptophan을 0.1% 첨가하고 분리균을 접종하여 \(30^{o}C\)에서 16시간 이상 배양하였다. 배양액을 \(4^{o}C\)에서 \(10,000\mathrm{rpm}\)으로 15분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 분리한 상층액을 salkowski 용액(35% HClO 4 50mL, 0.5 M FeCl 3 1 mL)과 1:2로 30분간 암실에서 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이를 옥신 표준 물질과 비교하여 분리균이 생산하는 옥신의 농도를 측정하였다.</p> <h2>인 가용능 조사</h2> <p>분리균들의 인 가용 능력을 실험하고자 NBRIP(nationalbotanical research institute's phosphate growth) 한천 배지[1 L당 glucose 10 g, Ca 3(PO4)2 5 g, MgCl2·6H2O 5 g,MgSO4·7H2O 0.25 g, KCl 0.2 g, (NH 4)2SO4 0.1 g, agar15 g, pH 7.0] 를 이용하였다. NBRIP배지에 분리균을 획선접종하여 30oC에서 7일 이상 배양시키면서 배지에 clearzone이 형성되는 것을 관찰하였다.</p> <h2>Siderophore 생산능 조사</h2> <p>식물병원균의 길항 기작중의 하나인 siderophore 생산성여부를 확인하기 위해 siderophore 생산 균주 감별 배지인CAS(chrome azurol S) blue 한천 배지[1 L당 chromeazurol S(CAS) 60.5 mg, hexadecyltrimetyl ammoniumbromide (HDTMA) 72.9 mg, Piperazine-1,4-bis(2-ethane-sulfonic acid)(PIPES) 30.24 g, and 1 mM FeCl 3·6H2O in10 mM HCl 10 mL. agarose 0.9%] 에 분리 균을 획선 접종하여 30oC에서 48시간 이상 배양시키면서 배지의 푸른색이오렌지색으로 바뀌는 것을 관찰하였다.</p> <h2>담배에서 식물생장촉진 효과 및 전신유도저항성(ISR) 효과검증</h2> <p>담배 종자를 1.2% NaClO 용액에 10분간 살균하여 멸균수로 3차례 헹구고 종자를 MS 배지(1 L당 murashige andskoog salt 0.22%, sucrose 1.5%, plant agar 0.8%, pH5.8)에 흩뿌린 후 20oC에서 발아시켰다. 발아된 담배 종자를 가운데가 나뉘어진 I-Plate 한쪽 면에 5개체를 옮겨 심어 분리균이 생성하는 휘발성 물질만이 담배에 영향을 줄 수있도록 하였다. 또 다른 쪽 면에는 멸균된 paper disc(size:8 mm)를 I-Plate의 벽면 가장자리에 놓고, 일정한 거리(2 cm)마다 종자를 3개씩 옮겨 심어 분리균이 생성하는 2차 대사산물, 즉 배지상에서 직접 확산되는 물질에 의한 영향을 볼수 있도록 하였다. Paper disc 위에 균주 현탁액(108 CFU/mL) 20 μL를 떨어뜨리고 밀봉하여 20~25oC growthchamber에서 2주 동안 생장 시킨 후, 담배의 크기를 비교하였다. 또한 분리균들에 의한 ISR 유도효과 검증을 위해 107CFU/mL 농도의 담배짓무름병균(Erwinia carotovora subsp.carotovora strain SCC1) 현탁액을 전체 담배 잎 위에 5 μL씩 떨어뜨리고 병원균 처리 24시간 후 개체 당 발병 잎 수를 조사하였다. 식물의 저항성에 관여하는 강력한 화학적 유도 물질인 0.5 mM Benzothiadiazole(BTH) 처리구와ISR 유도 균주로 알려진 Bacillus subtilis GB03 처리구를 양성대조군으로 사용하였고 멸균증류수 처리구를 음성대조군으로 사용하였다.</p> <h2>고추에서 식물생장촉진 효과 및 전신유도저항성(ISR) 효과검증</h2> <p>다른 가지과식물인 고추에 적용하여 분리균들의 식물생장촉진 및 ISR 효과를 검증하고자 실험을 수행하였다. 고추 종자(부강고추, 흥농종묘)를 정 등의 방법에 따라 재배하였다. 고추의 본엽이 3~4장이 되었을 때 고추 뿌리에 분리균 현탁액을 108-9 CFU/mL의 농도로 각 개체마다 10 mL씩분주하였다. 고추 생장에 대한 영향을 보기 위한 양성대조군으로 0.5 mM BTH 용액과 GB03 현탁액, 음성대조군으로멸균증류수를 각각 10 mL씩 고추 뿌리에 처리하였으며 각처리구는 5개체씩 3회 반복 실험하였다. 고추의 생장을 비교하기 위해 분리균 현탁액을 처리한 후 24일 동안 키를 측정하였다. 24일 후 고추의 뿌리를 깨끗이 씻어 토양을 제거한 다음 고추의 생체중량과 건조중량을 측정하여 비교하였다.</p> <p>독도 야생 까마중에서 분리한 균들이 간접적으로 고추의내병성에 어떤 영향을 미치는가를 조사하기 위하여 ISR 활성 테스트가 수행되었다. 앞과 같이 분리균 현탁액을 뿌리에 처리하고, 7 일 후 고추의 본엽이 5~6장이 되었을 때 세균성점무늬병원균(Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria)을 고추에 주입하여 식물체에서 일어나는 면역반응을 관찰하였다. 5 mL LB 배지(bactotryptone 1%, yeast extract 0.5%, sodium chlroride 0.5%, D-glucose 0.1%) 에 X. axo-nopodis를 접종하여 105 CFU/mL이 되도록 배양하여 정 등의 방법에 따라 세포부유액을 만들었다. 이를 고추 잎에접종하여 7일 후 병징을 관찰하였다.</p>