일당귀를 건조하여 분쇄하여 만든 시료로 용매 추출 및 다용매 분획한 후, 일당귀 에탄올 추출물 분획들의 DPPH에 대한 수소공여능, 항산화 지수 그리고 아질산염 소거능을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>일당귀는 국내에서 유통되는 것을 구입하여 수세하고 음건한 것을 Blender (Braun. MR 350. CA. USA)로 조분쇄 후 시료로 사용하였다.</p> <h2>용매 추출</h2> <p>건조된 일당귀는 시료 \( 100 \mathrm{~g} \) 을 \( 80 \% \) 에탄올 \( 500 \mathrm{ml} \) 에 넣어 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 환류냉각관을 부착한 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 의 heating mantle에서 3시간 동안 3회 추출한 다음 Whatman filter paper (No. 2)로 여과하였다. 여액을 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 수욕 상에서 rotary vacuum evaporator로 용매를 제거하고 감압 농축한 후 동결 건조시켜 고형물 함량을 산출한 다음, 시료의 산화방지를 위하여 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 냉동 보관하면서 사용하였다.</p> <h2>다용매 분획</h2> <p>\( 80 \% \) 일당귀 에탄올 추출물을 Fig. 1과 같이 separating funnel에 의한 용매별 분획으로 n-hexane, chloroform, ethylacetate 및 n-butanol로 연속 추출한 후 각 분획물을 rotary vacuum evaporator로 감압\(\cdot\)농축한 다음 동결 건조시켜 항산화 활성 측정용 시료로 사용하였다.</p> <h2>DPPH radical 소거 활성</h2> <p>시료의 전자공여능 측정을 Blois의 방법에 준하여, 일당귀 에탄올 추출물 분획들의 DPPH에 대한 수소공여능을 측정하였다. DPPH \( 16 \mathrm{mg} \) 을 에탄올 \( 100 \mathrm{ml} \) 에 용해하고 20초간 진탕한 후 \( 517 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도가 \( 0.93 \sim 0.97 \) 이 되도록 적당량의 에탄올을 가하여 DPPH 용액으로 하였다. DPPH 용액 \( 2 \mathrm{ml} \) 와 일당귀 에탄올 추출물 분획 \( 2 \mathrm{ml} \) 를 시험관에 취하고 vortex mixer로 5초간 진탕하여 \( 517 \mathrm{~nm} \) 에서 반응시간에 따른 일당귀 에탄올 추출물 분획의 환원력을 측정하였다. DPPH radical을 \( 50 \% \) 소거시키는 시료의 농도를 \( \mathrm{RC}_{50} \) 으로 하였으며 양성대조군으로 합성항산화제인 BHT를 사용하였다.</p> <p>DPPH radical 소거 활성 \((\%)=\left(A_{\text {control- }} A_{\text {sample }}\right) \times 100 \\ \mathrm{A}_{\text {control}}:\) 음성대조군(분획 미첨가)의 흡광도 \(\\ \mathrm{A}_{\text {sample}}:\) 실험군(분획 첨가)의 흡광도</p> <h2>항산화 지수 측정</h2> <p>항산화 지수(antioxidant index, AI) 는 Joo 등의 방법에 의하여 Rancimat (Metrohm model 679, Herisan, Switzerland)을 이용하여 측정하였다. 일당귀 에탄올 각 분획물에 포함된 용매를 완전히 제거한 후 각 분획물의 함량이 \( 600 \mathrm{ppm} \) 이 되도록 soybean oil (Sigma Co., USA)에 첨가하고, 초음파(Ultrasonic processor, UCX-750, USA)를 이용하여 각각의 유기 용매 분획 시료와 유지가 잘 혼합되도록 하였다. Rancimat의 측정 조건은 시료 \( 3.0 \mathrm{~g} \) 을 반응용기에 취하고 증류수 \( 70 \mathrm{ml} \) 를 측정용기에 넣은 후 \( 110^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 air flow rate \( 201 / \mathrm{hr} \) 로 하여 산화안정성을 비교하였다. 항산화 지수는 분획물을 첨가한 실험군의 유도시간을 분획물을 첨가하지 않은 대조군의 유도시간으로 나눈 값을 구하였고, 모든 측정치는 3회 반복 실험하여 얻은 값의 평균치로 표시하였다. 기존의 상업용 항산화제인 BHT를 유지에 대해 첨가하여 양성대조군으로 비교 실험하였다.</p> <h2>아질산염 소거능</h2> <p>아질산염 소거능(nitrite scavenging ability, NSA) 측정은 Kato 등의 방법에 준하여 \( 1 \mathrm{mM} \mathrm{~NaNO} \) 용액 \( 1 \mathrm{ml} \) 에 분획 \( 0.02 \mathrm{ml} \) 를 가하고 \( 0.1 \mathrm{~N} \mathrm{HCl}\) \((\mathrm{pH} 1.2)\), \(0.2 \mathrm{M} \) citrate phosphate buffer \((\mathrm{pH} 4.2\), \(\mathrm{pH} 6.0)\)로 각각 \( \mathrm{pH} \) 를 보정한 다음 반응액의 부피를 \( 10 \mathrm{ml} \) 로 정용하였다. 용액을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 반응시킨 후 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 취하고 \( 2 \% \) 초산 \( 5 \mathrm{ml} \) 와 \( 30 \% \) 초산에 용해한 Griess 시약\((1\%\) sulfanylic acid : \( 1 \% \) naphthylamine =1: 1) \( 0.4 \mathrm{ml} \) 를 가하여 15 분간 방치한 다음 \( 520 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 증류수를 가하여 상기와 동일한 방법으로 측정하였으며, 아질산염 소거능은 분획을 첨가하기 전과 후의 아질산염 백분율\((\%)\)로 표시하였다.</p> <p>아질산염 소거율 \( (\%)=1-\frac{(A-C)}{B} \times 100 \)</p> <p>A: \( 1 \mathrm{mM} \,\mathrm{NaNO}_2 \) 용액에 분획을 첨가하여 1 시간 방치 시킨 후의 흡광도</p> <p>B: \( \mathrm{NaNO}_{2} \) 용액의 흡광도</p> <p>C: 분획 자체의 흡광도</p>