유기용매 추출물 정제 시 시험군 현미시료의 가루시료에 \( 70 \% \) 에탄올을 첨가하여 진탕추출한 다음 filter paper로 정제하여 감압농축하였다. 폴리페놀 화합물 함량 측정 시 분석용 시료는 희석농도 \( 0.6 \mathrm{ml} \)에 \( 2.4 \mathrm{ml} \)을 넣은 다음 20분간 암실보관 후 반응액의 흡광도 값을 분광광도계를 이용하여 측정하였고, 표준물질인 ascorbic acid를 사용하여 검량선을 작성하였고, 플라보노이드와 DHHP free radical 함량 측정 시 물질만 다를 뿐 방법은 동일하다. 안토시아닌 함량 측정 시, 내부표준용액은 \( 5 \% \) formic acid 희석액으로 제조되었고, 용출된 안토시아닌 여과액은 \( \mathrm{N}_{2} \) 가스로 농축 후, \( 1 \mathrm{ml} \)의 \( 5 \% \) formic acid 희석액으로 재용해하여 분석하였다. 자색미 색도 측정은 가루형 현미를 색차계에 3회 반복 측정 후 hunter's value를 구해 항산화물과의 상관관계를 비교하였다. 미립특성은 현미 길이, 폭, 두께를 버니어 캘리퍼스를 이용하여 조사하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시험재료</h2> <p>본 연구에 사용된 시험재료는 2011년 하계에 경북대학교 GM 실습격리포장에서 MGI079의 조직배양에서 유래된 체세포 돌연변이 계통의 자색미 7계통과 표준품종인 흑남은 국립 식량과학원 신스재연구개발과 분양 받았다. 재식밀도는 \( 30 \times 15 \mathrm{~cm} \), 주당 1본으로 시비량은 \( \mathrm{N}_{2} \mathrm{P}_{2} \mathrm{O}_{5}-\mathrm{K}_{2} \mathrm{O}=9.0-4.5-5.7 \mathrm{~kg} \) · \( 10 a^{-1} \)로 재배하였다. 이앙 후 140일에 각 시험구별로 수확하고 자연 건조시켜 정조의 수분함량이 \( 12 \sim 15 \% \) 일 때 항산화화합물에 대한 실험을 수행하였다.</p> <h2>유기용매 추출물 정제</h2> <p>시험군 현미시료의 가루낸 시료 \( 5 \mathrm{~g} \)에 \( 70 \% \) 에탄올을 10배량 첨가하여 18시간 동안 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에 진탕추출(Shaker Incubator, DF-94F))한 다음 filter paper로 정제한 후 감압농축(EYELA, COOLACE CCA-1100) 하였다. 동일한 방법으로 3반복 3일 동안 동결 건조(Freeze Dryer, ILSHIN FD5505)하여 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 1일 보관한 후 추출물 회수량 무게를 측정하였다. 회수한 시료를 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동 보관(Ultra Low Temperature Freezer, DF9010)하면서 폴리페놀 화합물, 플라보노이드, DPPH free radical 분석용 시료로 사용하였다.</p> <h2>폴리페놀(polyphenol) 화합물 함량 측정</h2> <p>분석용 시료는 \( 10 \mathrm{mg} / 5 \mathrm{ml} \)로 용해하여 희석한 농도 \( 1 \mathrm{ml} \)에 \( 200 \mu \mathrm{ll} \) Folin-Ciocalten's phenol reagent, 2N을 넣은 다음 순간 진탕(Vortex Mixer, KMC-1300V)한 후 실온에 6분 방치 후 \( 2 \mathrm{ml} \) \(7\%\) \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 넣으면 서서히 청남색 변화하는데 1시간 30분 실온에 방치하였다. 반응액의 흡광도 값은 분광광도계 (mecasys optizen2120UV)를 이용하여 \( 750 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였고, 표준물질인 gallic acid (Sigma-Aldrich)를 사용하여 검량선을 작성하였으며, 시로 % 중의 mg gallic acid로 나타내어 \( \mathrm{ppm} \) 단위로 환산하였다.</p> <h2>플라보노이드(flavonoid) 함량 측정</h2> <p>분석용 시료는 \( 10 \mathrm{mg} / 5 \mathrm{ml} \)로 용해하여 희석한 농도 \( 1 \mathrm{ml} \)에 \( 300 \mu\) \(15 \%\) \(\mathrm{NaNO}_{3} \)을 넣은 다음 순간 진탕한 후 5분 동안 실온에 방치한 후 \( 300 \mu\) \(110 \%\) \(\mathrm{AlCl}_{3} \)을 넣은 후 6분 동안 실온에 방치한 후 순간진탕한 다음 \( 2 \mathrm{ml}\) \(\mathrm{1M}\) \(\mathrm{NaOH} \)을 넣어 순간 진탕한 후 반응액의 흡광도 값을 분광광도계를 이용하여 \( 510 \mathrm{~nm} \) (mecasys optizen 2120UV)에서 측정하였고, 표준물질인 cat-echin (Sigma-Aldrich)를 사용하여 검량선을 작성하였으며, 시료 % 중의 mg catechin으로 나타내어 \( \mathrm{ppm} \)단위로 환산하였다.</p> <h2>DPPH (1,1-Diphenyl-2-pilcrylhydrazyl) free radical함량 측정</h2> <p>분석용 시료는 \( 10 \mathrm{mg} / 5 \mathrm{ml} \)로 용해하여 희석한 농도 \( 0.6 \mathrm{ml} \)에 \( 2.4 \mathrm{ml} \) (\(100 \mathrm{ml}\) 에탄올에 \( 5 \mathrm{mg} \) DPPH 용해물)을 넣은 다음 20분 동안 암실보관한 후 반응액의 흡광도 값을 분광광도계를 이용하여 \( 517 \mathrm{~nm} \) (mecasys optizen 2120UV)에서 측정하였고, 표준물질인 ascorbic acid (Sigma-Aldrich)를 사용하여 검량선을 작성하였으며, 시료 % 중의 mg ascorbic acid로 나타내어 \( \mathrm{ppm} \) 단위로 환산하였다.</p> <h2>안토시아닌(anthocyanin) 함량 측정</h2> <p>자색미 변이계통의 안토시안 함량은 국립농업과학원 농식품자원부에 의뢰하여 안토시아닌 함량을 측정하였다. 현미 \(2 \mathrm{g} \)의 powder 시료를 \( 5 \% \) formic acid 희석액을 넣어 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)의 진탕항온수조에서 24시간 동안 추출한 후, 원심분리하여 \(3,000 \mathrm{rpm}\), 10분, \( \left.4^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 상층액 \( 1 \mathrm{ml} \)을 취하였다. Sep-pak \( \mathrm{C}_{18} \) classic cartridge를 \( \mathrm{MeOH} 2 \mathrm{ml}\), \(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 2 \mathrm{ml} \)의 순으로 흘려주어 활성화시킨 다음, 안토시아닌 추출 상층액 \( 1 \mathrm{ml} \) 및 내부표준물질(cyanidin \( 100 \mathrm{ppm}\)) \(1 \mathrm{ml} \)을 각각 loading 후, \( 2 \mathrm{ml} \) 증류수로 세척하여 \( 1 \mathrm{ml} \) 메탄올로 희석시켰다. 내부표준용액의 경우, \( 5 \% \) formic acid 희석액으로 제조되었으며, 정량을 위해 용출된 안토시아닌 여과액은 \( \mathrm{N}_{2} \) 가스로 농축한 다음, \( 1 \mathrm{ml} \)의 \( 5 \% \) formic acid 희석액으로 재용해하여 LC-PDA-ESI/MS으로 안토시아닌 함량은 분석하였다. Synergi Polar-RP 80A (4.6×250 \( \mathrm{mm} \) I.D., \(4 μm\); Phenomenex, USA) 역상컬럼과 2998 photo-diode array detector (PDA)를 장착한 Alliance e2695 HPLC system (Waters Co. Milford, MA, USA) 및 Micromass ZQ MS (Waters Co. Milford, MA, USA)를 이용하여 분석하였다. 검출 파장은 \( 250 \sim 600 \mathrm{~nm} \) (대표파장 \( 530 \mathrm{~nm} \) )에서 수행되었으며, oven 온도는 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \), 유속은 \( 1 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 이었다. 분석에 사용된 표준물질은 cyanidin-3-glucoside (C3G), peonidin-3-glu-coside (P3G)은 Extrasynthèse (France,)사에서 구입하여 사용하였다.</p> <h2>자색미 색도 측정</h2> <p>가루형태의 \( 3 \mathrm{~g} \) 현미를 색차계(color techno system JS555)에 3반복 측정한 후 Hunter's value (\(\mathrm{L}. \mathrm{a}. \mathrm{b})\)를 구하여 항산화물과의 상관관계를 비교하였다.</p> <h2>미립특성</h2> <p>미립의 특성은 현미의 길이, 폭, 두께를 Vernier Caliper (MITUTOYO, CD-15CP)를 이용하여 계통별로 50립씩 5반복 조사하였다. 현미와 백미의 무게는 전자저울(ARD 120)을 이용하여 100립씩 3반복 조사한 후 그 평균치를 천립중으로 환산하였다. 현미의 아밀로스, 단백질, 지질 및 아연을 근적외분광분석(NIRS, Foss 6500)으로 3반복 분석하여 평균치를 구하였다. 배유의 전분립은 대조군인 흑남의 현미를 포함한 시료를 국립식량과학원 신소재연구개발과 의뢰하여 Scanning Electron Microscope (SEM:HITACHI S-3000N) 측정하여 배유의 전분립 단면을 비교하였다.</p>