ML과 MLEH 조성 비교를 통해 ML은 glucose 22g/l, total-N 41g/l, starch 74g/l 등이 함유된 전분성 복합물로 분석되었고, 가수분해를 통해 glucose 용액인 MLEH 함량이 103g/l로 증가하고 27g/l의 total-N이 포함되어 있음을 확인하였다. PHBV를 생합성하는 균주를 토양에서 분리해서 Bacillus sp. EMK-5020으로 이름지었다. MLEH를 탄소원으로 하는 Bacillus sp. EMK-5020의 최적 성장 및 PHBV 생합성 조건을 맞추기 위해 질소 농도, 배양시간, \( \mathrm{pH} \), 온도 등 배양 조건을 변화시킨 후 DCW와 PHBV 생합성량의 최대치를 관찰하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>ML과 MLEH 조성 비교</h2> <p>ML의 가수분해 과정은 ML \( 100 \mathrm{mg} \) 당 \( 2,000 \mathrm{U} \) 의 \( \alpha \) -amylase와 1,300 U의 glucoamylase를 사용하여 액화와 당화의 두 단계로 진행하였다. ML은 수분함량이 약 \( 85 \% \)로 가장 많은 부분을 차지하였으며, glucose \( 22 \mathrm{~g} / l \), total-N \( 41 \mathrm{~g} / l \), starch 및 다양한 성분 \( 74 \mathrm{~g} / l \) 등이 함유되어 있는 전분성 복합물로 분석되었다. ML에 함유된 glucose의 함량이 낮기 때문에 ML을 탄소원으로 사용하기 위해 효소를 이용하여 가수분해를 진행하였다. 가수분해 결과 glucose 용액으로 적정한 MLEH에 포함된 환원당(환원당 MLEH 함량이 \( 103 \mathrm{~g} / \) 로 ML에 비해 약 5배가량 증가한 것을 확인하였으며 약 \( 27 \mathrm{~g} / l \) 의 total-N이 포함되어 있음을 확인하였다. 본 연구에서는 환원당 MLEH 함량이 \( 103 \mathrm{~g} / l \) 로 증가한 MLEH를 탄소원으로 사용하였다.</p> <h2>균주 분리 및 동정</h2> <p>PHBV를 생합성하는 균주를 분리하기 위해 안동시 송천동 신여골의 토양 시료를 채취하여 glucose \( 20 \mathrm{~g} / l\) 가 포함된 basal medium에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rpm} \) 에서 3일간 배양한 결과 \( 3 \mathrm{HV} \) 를 함유하는 PHBV를 생합성하는 1종의 균주를 분리하였다. 분리된 균주는 보조탄소원의 첨가없이 glucose를 탄소원으로하여 48시간 배양한 결과 \( 1.5 \mathrm{~g} / l \) 의 DCW를 보였으며 GC 분석으로 DCW의 \( 33 \% \) 를 PHBV로 축적함을 확인하였다. PHBV의 조성은 \( 8 \% \) 의 3HV를 함유하는 standard PHBV와 비교하여 3HB (retention time, RT: \( 5.77 \mathrm{~min} \) )와 \( 3 \mathrm{HV}(\mathrm{RT}: 7.35 \mathrm{~min} \) )의 peak가 동일함을 확인 하였다. 16S rDNA 염기서열 분석과 BLAST search를 통해 Bacillus species와 \( 96 \% \) 의 similarity를 확인하여 분리균주를 Bacillus sp. EMK-5020으로 명명하였다.</p> <h2>MLEH를 탄소원으로 이용한 flask 배양 PHBV 생합성을 위한 최적 배양조건 확립</h2> <p>MLEH를 탄소원으로 사용하여 Bacillus sp. EMK-5020의 생장 및 PHBV 생합성 양상을 평가하기 위해 \( 20 \mathrm{~g} / l \) glucose와 \( 20 \mathrm{~g} / l\) 환원당 MLEH 을 각각 단일 탄소원으로 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48시간 배양하였다(Table 1). 대조군인 glucose를 단일 탄소원으로 하여 배양한 결과 DCW와 \( 0.5 \% \) 3HV를 함유하는 PHBV가 각각 \( 1.4 \mathrm{~g} / 1 \) 와 \( 40.6 \%(\mathrm{wt} / \mathrm{wt}) \) 로 측정되었다. 반면 \( 20 \mathrm{~g} / l \) 환원당 MLEH을 단일 탄소원으로 사용한 배양에서 \( 1.7 \mathrm{~g} / l \) DCW와 \( 1.3 \% \) 3HV를 함유하는 PHBV를 \( 8.9 \%(\mathrm{wt} / \mathrm{wt}) \) 생합성 하였으며, 이는 대조군에 비해 DCW는 \( 20 \% \) 증가하였으나 PHBV} \) 축적이 \( 80 \% \) 감소하는 양상을 보였다. 일반적으로 PHAs의 생합성은 배지 내 질소원의 고갈 등 불균형 생장조건에서 이루어지며 따라서 C/N ratio가 낮아질수록 PHAs 축적률이 감소하는 것으로 보고된 바 있다. 또한 Gang 등의 연구에 의하면 MLEH에는 glucose와 protein 등이 함유되어 있어 높은 DCW를 달성할 수 있지만 MLEH에 존재하는 protein에 의해 낮은 PHAs 축적률을 보인다고 보고된 바 있다. 따라서 MLEH에 존재하는 다양한 영양소와 질소원의 영향으로 Bacillus sp. EMK-5020 균주의 생장은 활발히 이루어지나 PHBV 축적률이 낮아지는 결과를 보였으며, MLEH를 탄소원으로 사용하는 경우 질소원의 조절이 필요할 것으로 사료된다.</p> <p>MLEH를 탄소원으로 하여 Bacillus sp. EMK-5020의 최적 성장 및 PHBV 생합성 조건을 확립하기 위해 질소 농도, 배양시간, \( \mathrm{pH} \), 온도 등 배양 조건을 변화시킨 후 DCW와 PHBV 생합성을 확인하였다(Fig. 2). MLEH에 포함된 total-N외에 여분의 질소원이 세포의 생장과 PHBV 축적에 필수인가를 평가하기 위해 환원당 MLEH 함량을 \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 로 고정한 뒤 질소원인 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 의 농도를 \( 0.0 \sim .0 \mathrm{~g} /l \) 로 다양하게 조절하여 최적 \( \mathrm{C} / \mathrm{N} \) ratio \( (\mathrm{g} / \mathrm{g}) \) 를 확인하였다. 배양 결과 배지 내 첨가한 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 의 농도가 증가할수록 DCW와 PHBV 축적률이 급격히 감소하는 양상을 보였으며 질소원을 첨가하지 않은 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} 0.0 \mathrm{~g} / l\) 에서 가장 높은 DCW인 \( 2.5 \mathrm{~g} / l\) 와 \( 35 \%(\mathrm{w} / \mathrm{w}) \) 의 PHBV 축적을 확인하였다(Fig. 2A). 이는 MLEH에 포함된 total-N이 질소원으로 사용된 것으로 사료되며 실험 결과를 바탕으로 추후 모든 연구에서 질소원을 추가하지 않는 조건으로 배양을 진행하였다.</p> <p>Fig. \( 2 \mathrm{~B} \) 는 최적 배양시간을 평가한 것으로 36시간에서 가장 높은 \( 2.2 \mathrm{~g} / \) DCW를 확인할 수 있었으며 36시간 이후 DCW가 감소하는 것을 확인하였다. PHBV 축적률은 시간이 지날수록 증가하여 72시간에서 \( 43 \%(\mathrm{w} / \mathrm{w}) \) 까지 축적하였으나 PHBV 생합성량은 배양 42시간 이후 꾸준히 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 \( 2.2 \mathrm{~g} / l \) 의 DCW와 가장 높은 PHBV 생합성량 \( (0.6 \mathrm{~g} / l) \) 을 확인한 42시간을 최적 배양시간으로 확립하였다.</p> <p>최적 \( \mathrm{pH} \) 조건을 확인하기 위하여 \( \mathrm{pH} \) 를 4, 5, 6, 7, 8,9로 조정하여 Bacillus sp. EMK-5020 균주를 배양한 결과를 Fig. 2C에 나타내었다. Bacillus sp. EMK-5020균주는 \( \mathrm{pH} 4 \) 에서 생장하지 않았으며 \( \mathrm{pH} \) 가 증가할수록 세포의 생장과 PHA 축적룰이 증가하는 경향을 보였으며 \( \mathrm{pH} \) 7에서 가장 높은 \( 2.6 \mathrm{~g} / l \) 의 DCW와 \( 37 \%(\mathrm{w} / \mathrm{w}) \) 의 PHBV 축적 및 \( 0.96 \mathrm{~g} / \) 의 PHBV 생합성량을 확인하여, \( \mathrm{pH} \) 7을 균주의 생장 및 PHBV 생합성을 위한 최적 \( \mathrm{pH} \) 로 선정하였다.</p> <p>\( 25,30,35,37,40^{\circ} \mathrm{C} \) 의 조건에서 배양한 Bacillus sp. EMK-5020 균주의 DCW와 PHBV 축적률을 측정한 결과 온도가 증가할수록 DCW와 PHBV 축적률이 증가하는 것을 확인했으며 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 가장 높은 DCW \((2.6 \mathrm{~g} / l) \) 와 \( 32 \% \) \( (\mathrm{w} / \mathrm{w}) \) 의 PHBV 축적을 확인하였다. \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양한 경우 세포의 생장을 일어났으나 \PHBV 축적은 확인되지 않았다. 따라서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 를 최적 배양 온도로 확립하였다.</p>