Tyrosinase와 Elastase의 저해활성을 측정하기 위해 L-tyrosine과 potassium phosphate buffer를 혼합하고 37\(^\circ \mathrm{C}\) 10분 동안 항온 배양한 뒤 475nm에서 흡광도를 측정하였다. Tyrosinase 저해활성은 0.1mL tyrosinase의 활성을 50% 감소시키는데 필요한 시료의 농도로 표기하고, MMPs의 저해활성 측정은 피부노화 억제 평가에 대단히 중요하다.
<h2>Tyrosinase 저해활성 측정</h2> <p>L-Tyrosine으로부터 멜라닌 생성과정에서 전체 반응 속도를 결정하는데 작용하는 핵심효소는 tyrosinase다. 따라서 tyrosinase의 저해활성은 미백활성을 측정하는뎨 매우 중요하다. L-tyrosine \( (0.3 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } ) 1.0 \mathrm { ~mL } \), potassium phosphate buffer(0.1 M, pH 6.8) \( 1.85 \mathrm { ~mL } \), 시료 \( 0.05 \mathrm { ~mL } \) 를 혼합한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 10 \mathrm { ~min } \) 동안 항온 배양한 다음, 반응혼합물을 얼음수조에 넣어 반응을 종결시키고, \( 475 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. Tyrosinase 저해 활성은 \( 0.1 \mathrm { ~mL } \) tyrosinase의 활성을 \( 50 \% \) 감소시키는데 필요한 시료의 농도(inhibition concentration, \( \mathrm { IC } _ { 50 } , \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) )로 표기하였다.</p> <h2>Elastase 저해활성 측정</h2> <p>피부노화, 특히 주름 생성에는 활성산소에 의한 작용과 matrix metalloproteinase (MMPs : collagenase, elastase 등)에 의한 세포외 매트릭스의 파괴가 주 원인으로 간주되고 있다. 따라서 MMPs의 저해활성 측정은 피부노화 억제 평가에 대단히 중요하다.</p> <p>Tris- \( \mathrm { Cl } ( \mathrm { pH } \) 8.0) \( 0.12 \mathrm { M } \) 에 elastase 기질인 \( N \)-succinyl-(Ala) \( { } _ { 3 } \)-p-nitroanilide \( 1.0 \mathrm { mM } \) 이 용해된 buffer \( 1,300 \mu \mathrm { L } \) 에 측정시료용액 \( 7.5 \mu \mathrm { L } \) 와 buffer \( 92.5 \mu \mathrm { L } \) 를 첨가하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 10 \mathrm { ~min } \) 동안 pre-incubation 한 뒤 여기에 elastase 용액을 \( 100 \mu \mathrm { L } \) 첨가(최종농도 \( 0.0025 \mathrm { U } / \mathrm { mL } \) )하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 수용상에서 \( 10 \mathrm { ~min } \) 동안 항온배양한 후 \( 410 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 대신 시료용액으로 사용된 용매를 \( 100 \mu \mathrm { L } \) 첨가하였다. Blank는 \( N \)-succinyl-(Ala) \( )_ { 3 } \)-p-nitroanilide가 용해된 완충용액 대신 \( 0.12 \mathrm { M } \) tris-Cl buffer \( 1,300 \mu \mathrm { L } \) 를 첨가하였으며, 농도는 실험군과 동일하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 \( 5 \% \) 유의수준에서 Student's \( t \)-test를 행하였다.</p>