2009년 7월부터 12월까지 전남 순천의 한 병원에서 내원 및 입원환자로부터 혈액, 객담, 농, 소변 등 4가지 검체를 채취하여 세균을 분리하였다. 분리된 세균은 tryptic soy agar (TSA) 배지를 이용하여 배양하였으며, 세균 집락의 DNA를 추출하여 냉동 보관하였다. mecA 및 독소 유전자의 검사는 multiplex PCR 조건으로 증폭하였고, 분리된 세균의 항생제 감수성 조사는 디스크 확산법을 사용하여 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>Methicillin 내성 Staphylococcus aureus 분리</h2> <p>2009년 7월부터 12월까지 전남 순천 소재 1개 병원의 내원 및 입원환자로부터 채취한 4가지 검체(혈액, 객담, 농, 소변)로 부터 세균을 분리하였다(Table 1). 세균의 분리는 혈액한천( \( 6 \% \) 혈액 함유) 배지를 이용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 16 - 18시간 배양하여 사용하였다. 분리된 세균 중 coagulase 및 catalase시험에 양성을 나타내는 균주들을 선별하였다. 선별된 균주들을 Vitek 32 GPI kit (BioMerieux, France)를 이용하여 동정하였다. 대조균주로는 Staphylococcus aureus ATCC 29213을 사용하였다. 이 때 동일 환자로부터 반복 분리된 균주는 제외하였다. Methicillin 내성 균주(MRSA)의 판정은 디스크 확산법과 Vitek 2 kit (BioMerieux, France)를 이용한 최소억제 농도(MIC) 판정을 이용하여 실시하였다. 디스크 확산법에서의 판정 기준은 CLSI를 따랐으며, oxacillin \( (1 ~ \mathrm {\mu g } ) \)에 의한 억제대 직경이 \( 10 ~ \mathrm { mm } \) 이하이면 내성, \( 13 ~ \mathrm { mm } \) 이상이면 감수성인 균주(MSSA)로 판정하였다. Oxacillin에 대한 MIC 판정기준은 \( 4 ~ \mathrm { ug } / \mathrm { ml } \) 이상을 사용하였다. MRSA로 판명된 균주 중 mecA가 검출되지 않은 2개 균주를 제외한 75개 균주를 MRSA로 최종 확인하였다. 순수 분리된 세균의 계대 배양은 tryptic soy agar (TSA, Becton Dickinson) 배지를 이용하였다.</p> <h2>DNA 추출, mecA 및 독소 유전자 분석</h2> <p>TSA 배지에 자란 세균 집락으로부터 Choe 등의 방법을 이용하여 DNA를 추출하였으며 실험에 사용할 때까지 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 냉동 보관하였다.</p> <p>mecA 및 독소 유전자의 검사는 기존에 알려진 primer(Table 2)을 이용하여 multiplex PCR 조건으로 증폭하였다. PCR 반응은 PCR thermal cycler TP 600 (TaKaRa, Japan)를 이용하였으며, PCR 산물은 \( 2 \% \) agarose gel에 전기영동한 후 확인하였다.</p> <p>증폭된 산물이 기존에 알려진 독소 유전자와 동일한 염기서열인지 확인하기 위해 염기서열을 분석하였으며 결정된 독소 유전자 염기서열의 유사도는 Genbank (NCBI)에 등록된 기존의 독소 유전자의 염기서열과 비교하였다.</p> <h2>항생제 감수성 검사</h2> <p>분리균의 항생제 감수성 조사는 디스크 확산법을 사용하여 측정하였다. McFarland 0.5관에 맞춘 세균현탁액을 Mueller Hinton II agar (MHA; Becton Dickinson) 배지에 접종한 후 각각의 항생제가 함유된 디스크를 올려놓고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 16-18시간 배양한 후 억제대의 직경을 측정하였다. 감수성, 중간내성, 저항성 기준은 CLSI 기준으로 하였으며 매 시험마다 양성 대조 균주로 Staphylococcus aureus ATCC 25923을 사용하였다.</p>