세포액 \( 1 \mathrm{ml} \)을 24 well plate (NUNC, Denmark)에 분주하여 \( 37 \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 세포 배양기에서 2시간 동안 배양한 후 항생제와 FBS가 함유된 배지를 교환하였다. 세포수의 확인은 Tryphan blue dye를 이용해서 새포 염색제를 10배 희석하여 세포 수를 계산하였다. 그 다음 마이크로플레이트의 각 well에 \( 1 \times 10^{6} \)의 세포가 들어가도록 분주한 후 10\( \mathrm{ug} \) \( / \mathrm{ml} \) 농도의 Concanavalin \( \mathrm{A} \)를 처치하고 24시간 뒤에 Bio Plex을 이용하여 IL-1Q, IL-6, TNF- \( a \)를 측정하였다.
<h2>비장세포 분리 및 배양</h2> <p>실험동물울 희생시키고 비장을 무균적으로 적출하여 RPMI 1640 배양액으로 씻은 후 멸균 유리솜으로 가볍게 분쇄하여 세포를 유리시켰다. 분리된 세포 현탁액을 \( 70 \mathrm{um} \) Nylon Cell Strainer (BD Falcon, USA)에 통과시킨 현탁액을 5분간 원심분리 \( (12,000 \mathrm{rpm}) \) 하여 상층액 제거 후, Red Blood Cell Lysing Buffer (Sigma, UK)를 이용하여 적혈구를 제거하고 적혈구가 제거된 세포는 3번의 세척 후 \( 10 \% \)의 heat inactivated FBS (fetal bovine serum, GIBCO Laboratories Life Technologies, Inc., NY, USA)에 \( 25 \mathrm{mM} \) N-2-hydrox-yethylpiperazine-N-2 ethanesulphonic acid (HEPES) buffer를 포함하고, 항생제인 100 units ml-1 penicillin, \( 0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) streptomycin, \( 1 \mathrm{mM} \) L-glutamine and \(0.1 \mathrm{M}\) 2-mercaptoetha-nol (GIBCO Laboratories Life Technologies, Inc., NY, USA)을 함유한 RPMI 1640배지를 사용하여 \( 1 \times 10^{6} \) cells\(\mathrm{/ml}\) 농도로 회석하였다.</p> <p>세포액 \( 1 \mathrm{ml} \)을 24 well plate (NUNC, Denmark)에 분주하고 \( 37 \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 세포 배양기에서 2시간 배양 후 항생제와 FBS가 함유된 배지를 교환하였다. 세포수의 확인은 Tryphan blue dye를 이용하여 세포액 10배에 새포 염색제인 Tryphan blue \( 90 \mathrm{ul} \))를 혼합하여 10배 회석하여 세포 수를 계산하였다.</p> <h2>사이토카인 측정</h2> <p>마이크로플레이트(Cornig Laboratory Science Co., NY,USA)의 각 well에 \( 1 \times 10^{6} \)의 세포가 들어가도록 분주한 후 \(10 \mathrm{ug} \) \( / \mathrm{ml} \) 농도의 Concanavalin \( \mathrm{A} \)를 처치한 24시간 후 Bio Plex(Bio rad)을 이용하여 IL-1Q, IL-6, TNF- \( a \)를 측정하였다. 측정방법을 간단하게 소개하면, \( 1 \% \) BSA가 함유된 PBS \(100 \mathrm{ul} \)로 각 well을 적신 후, standard, sample, reference와 blank 시약을 각 \(100 \mathrm{ul} \)씩 분주한 후 상온에서 30분간 shaking을 하며 배양하였다. \( 1 \% \) BSA화 \( 0.05 \% \) Tween 20이 함유된 PBS 150\( \mathrm{ul} \)로 3번 세척한 후, 혼합된 Biotinylated Abs를 well당 \(50 \mathrm{ul} \)씩 분주하고, 30분간 shaking을 하며 상온에서 배양하였다. 3번 세척 후 streptavidin-PE를 넣어준 후 10분간 배양하고, 3 번 세척후 \( 1 \% \) BSA와 \( 0.05\% \) Tween 20이 함유된 PBS \(120 \mathrm{ul} \)를 분주한 후 Bio-Plex array reader를 이용하여 측정하였다.</p>