균주의 보관 및 배양은 각 pH 별 배지의 셀로판 디스크 위에서 배양한 균주를 동량의 methanol로 2일간 추출한 후 추출물을 정량적으로 비교 분석한 회전식 증발기 표준실험 방법을 따랐으며, 고체배지에서의 pH shock 실험은 선행연구 방법을 따라 수행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 배양조건</h2> <p>본 연구에서는 프로디지닌 생산 균주 S. coelicolor M511을 Warwick 대학의 Dr. Greg Challis로부터 분양 받아 사용하였다. 균주의 보관 및 배양은 표준실험 방법을 따랐으며, 고체배지에서의 pH shock 실험은 선행연구 방법을 따라 수행하였다. 동량의 균주를 접종하여 배양하기 위해 glycerol 포자 저장 용액 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 를 셀로판 디스크 위에 접종하여 실험하였다. 배지의 pH 조성이 초기 균주의 성장에 영향을 미칠 수도 있으므로, 배양 균주가 붉은색을 생산하기 시작할 때까지는 R2YE 배지의 셀로판 디스크 위에서 배양한 후, 균주가 배양된 셀로판 디스크만 각기 다른 pH 배지에 각각 무균적으로 옮긴 후 6일을 더 배양하였다. 대조군(control)으로는 R2YE 배지에서 키운 균주를 사용하였다.</p> <h2>분석방법</h2> <p>각 pH 별 배지의 셀로판 디스크 위에서 배양한 균주를 동량의 methanol로 2일간 추출한 후 추출물을 정량적으로 비교 분석하기 위하여 회전식 증발기(BÜCHI Rotavapor R-200 , Switzerland)를 이용하여 농축시키고 이를 \( 200 \mu \mathrm{L} \) methanol로 용리하였다. 용리한 시료 \( 10 \mu \mathrm{L} \) 를 미리 준비된 산성화된 methanol \( 990 \mu \mathrm{L} \) 에 넣고 자외/가시선 분광광도계 (Varian Cary 5000, USA)를 사용하여 파장 \( 530 \mathrm{~nm} \left (\varepsilon_{530}=\right. \) \( \left.100, 500 \mathrm{M}^{-1} \mathrm{~cm}^{-1}\right) \) 의 흡광도를 정량분석에 사용하였다. 추출물의 정성적 분석은 HPLC를 사용하였으며, 컬럼은 Supelco Discovery \( HSC_{18} \) 컬럼 \( (5 \mu \mathrm{m}, 4.6 \times 250 \mathrm{~mm} \), Supelco, USA), 이동상은 A: methanol:acetonitrile:water(40:10:50, \( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \%) / {B}: \) methanol \( (100,(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \%) \) 을 이용하여 60 분까지 기울기 용리법으로 수행하였고 유속은 \( 0.5 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \), 검출은 \( 530 \mathrm{~nm} \) 에서 확인하였다. 대조군(control)으로는 R2YE 배지 에서 자란 균주 추출액을 사용하였다.</p> <h2>항진균 활성 측정</h2> <p>각 pH 에서 배양한 세포로부터 추출된 전체 프로디지닌의 항진균 활성 변화를 알아보기 위해 Trichophyton mentagrophytes 를 사용하여 활성 실험을 수행하였다. T. mentagrophytes 는 Sabourauds agar 배지(Peptone \( 10 \mathrm{~g} \), dextrose 40 \( \mathrm{g} \), agar \( 20 \mathrm{~g} \), 증류수 \( 1 \mathrm{~L} \) )에 곰팡이 포자를 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 6 \mathrm{hr} \) 정도 배양한 후, 정량분석에 사용하였던 추출물 10 \( \mu \mathrm{L} \) 를 종이 디스크에 흡수시켜 올려놓고 1-2일 더 배양한 다음 항진균 활성을 측정하였다. 대조군(control)으로는 R2YE 배지에서 자란 균주의 추출액을 사용하였다.</p>