cerevisiae에서 발현시키기 위하여 \(2.3\mathrm{~kb} \) 의 B. macerans IAM 1243 유래 CGTase 유전자(cgtM)을 소유한 pTCGT1 plasmid를 BamHI과 SalI으로 가공하여 \(2.28 \mathrm{~kb} \)의 CGTase 유전자 단편을 획득한다. 1차 선별된 균주들은 효모주를 선별하는 과정을 5회 반복하여 CGTase 고활성 균주를 최종 검별하였다. 숙주세포는 starch 분해활성을 보이지 않지만 재조합 효모균주는 starch 분해활성을 크게 보이며, 발현된 CGTase는 세포 밖으로 분비됨을 확인할 수 있다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>고활성 효모 형질전환주의 선별</h2> <p>CGTase 유전자를 효모 S. cerevisiae에서 발현시키기 위해, \(2.3\mathrm{~kb} \) 의 B. macerans IAM 1243 유래 CGTase 유전자(cgtM)을 가진 pTCGT1 plasmid를 BamHI과 SalI으로 처리하여 \(2.28 \mathrm{~kb} \)의 CGTase 유전자 단편을 얻었다. 이를 BamHI과 XhoI으로 미리 절단한 pVT103-U에 subcloning하여 pVT-CGTM (\(9.15\mathrm{~kb} \))을 구축하였다. 재조합 plasmid는 우선 E. coli DH5\(\alpha \)에 형질전환시켜 CGTase 활성을 나타내는 형질 전환주를 선별한 후 plasmid를 추출하였다. 대장균에서 증폭된 plasmid pVT-CGTM은 다시 uracil 요구성 변이주인 S. cerevisiae 2805 에 형질전환시켜 uracil 결핍 최소배지인 SD배지에서 1차적으로 형질전환주를 선별하였다. 1 차 선별된 균주들을 다시 starch azure 함유배지에서 starch 분해환을 나타내는 효모주를 선별하는 과정을 5회 반복하여 CGTase 고활성 균주를 최종 선별하였다. Fig. 1에서 보는 바와 같이, 숙주세포는 starch 분해활성을 보이지 않으나 pVT-CGTM를 함유하는 재조합 효모균주는 starch 분해활성을 강하게 보이며, 발현된 CGTase는 세포 밖으로 분비 · 생산됨을 알 수 있었다.</p> <h2>탄소원의 영향</h2> <p>효모에서 재조합 CGTase의 발현에 미치는 탄소원의 영향을 검토하기 위하여 YP배지에 dextrose와 starch를 농도별로 첨가하여 48 시간 배양한 후 균체농도와 효소 발현량을 조사하였다. 그 결과, dextrose의 농도가 증가할수록 최종 균체농도는 대체로 증가하였으나 단위 균체농도 당 CGTase의 발현량은 \(2\% \) dextrose일 때 가장 높은 \(9.7\mathrm{mU}/\mathrm{mL}/\mathrm{OD}_{600} \)의 비활성 값을 보였다. \( 10\% \) dextrose의 경우 오히려 균체증식이 낮았는데, 이는 에탄올 생성에 의한 증식저해효과 때문인 것으로 판단된다. 본 발현계에 사용된 ADH1 promoter는 구성적 promoter이기 때문에 균체농도가 높으면 높을수록 발현된 CGTase 량이 많을 것으로 예상되었지만, 균체농도와 유전자 발현량이 정확히 비례하지 않음을 알 수 있었다.</p> <p>CGTase의 기질인 starch가 균체증식 및 효소 발현량에 미치는 영향을 검토하기 위해서 dextrose \( 2\% \)와 \( 3\% \)에 \(1 \% \)의 starch를 첨가하여 조사해 본 결과, starch 첨가에 의해 균체증식과 효소 발현량에는 큰 차이가 관찰되지 않았다. 이 결과와 앞의 starch 분해활성 결과를 종합해 보면, 재조합 CGTase의 발현으로 효모세포는 starch를 분해는 할 수 있으나, 그 분해산물을 탄소원으로 이용하지 않으며, 따라서 그 분해산물이 cyclodextrin 임을 간접적으로 알 수 있었다.</p> <h2>초기 \( \mathrm{pH} \) 의 영향</h2> <p>재조합 CGTase의 발현에 미치는 \( \mathrm{pH} \)의 영향을 조사하기 위해서 배양 초기 \( \mathrm{pH} \)를 4.0에서 6.5까지 변화시키면서 재조합 효모균주를 배양하였다. 48 시간 동안 배양한 결과, 최종 균체농도는 초기 \( \mathrm{pH} \)에 관계없이 모두 \(32 \mathrm{OD}_{600} \) 값으로 비슷하였으며, plasmid 안정성 역시 초기 \( \mathrm{pH} \)에 크게 영향을 받지 않고 모두 \(95\%\) 이상으로 매우 안정하게 유지되었다. \( \mathrm{pH} 5.5\) 일 때 CGTase 발현량이 \( 0.24 \mathrm{U} / \mathrm{mL} \)로 가장 높았으며, 단위 균체농도 당 CGTase 활성인 비활성도 \( 7.3\mathrm{mU}/\mathrm{mL}/\mathrm{OD}_{600} \)로 가장 좋았다.</p> <h2>배양온도의 영향</h2> <p>CGTase의 발현과 분비에 미치는 배양온도의 영향을 조사하기 위해 형질전환 효모균주를, 초기 \( \mathrm{pH} \)는 5.5로 고정하고, YPD 배지에서 온도를 \(20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(35 ^{\circ} \mathrm{C} \)까지 변화시키면서 배양하였다. 48 시간 때의 배양 결과를 보면, \(25 ^{\circ} \mathrm{C} \) 이하와 \(35 ^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 낮은 균체농도를 보이며, \(30 ^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( \mathrm{OD}_{600} \)값이 32 정도로 가장 높았다. CGTase 발현은 배양온도에 크게 영향을 받았으며, \(30 ^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 CGTase 발현량은 \(0.29 \mathrm{U} \)/\( \mathrm{mL} \)로 가장 높았으며, 이 외의 온도에서는 발현량이 크게 감소하였다. 비활성도 \(30 ^{\circ} \mathrm{C} \)에서 가장 높은 \(8.9\mathrm{mU}/\mathrm{mL}/\mathrm{OD}_{600} \)값을 나타내었다.</p> <h2>균체증식과 CGTase 발현의 경시변화</h2> <p>형질전환 효모균주 S. cerevisiae 2805/pVT-CGTM을 초기 \( \mathrm{pH} 5.5\), \(30 ^{\circ} \mathrm{C} \), YPD 배지에서 배양하면서 균체증식과 CG-Tase의 발현량을 조사한 결과, 균체증식은 배양 12 시간부터 시작하여 30 시간까지 활발하게 일어났으며, 30 시간 이후 정지기에 도달하였다. CGTase 발현은 배양 말기까지 계속 일어나며, 배양 48시간에 세포외 최대 활성은 \(0.53 \mathrm{U}/\mathrm{mL} \) 수준이였다. 세포내 CGTase 활성은 최대 \(0.03 \mathrm{U} /\mathrm{mL} \)정도로 나타나 총발현된 CGTase의 \(90\%\)이상이 세포밖 배지로 분비됨을 알 수 있었다. 이와 같이 Bacillus 유래의 단백질 분비신호가 효모에서도 높은 분비 효율성을 보이는 예는 B. amyloliquefaciens 유래의 \( \alpha \)-amylase 유전자 중 S. cerevisiae에서 발현시킨 경우에서도 관찰된 바 있다.</p>