현재 화석 연료의 매장량이 한정되고 오염물질을 배출하여 환경문제를 야기하고 있다. 미래 청정에너지원으로 주목받는 생물학적으로 생산되는 수소는 높은 에너지 효율을 가지고 오염물질을 배출하지 않는다. 그리고 혐기성 세균의 유기물 발효를 이용한 방법이 있으며, 이를 통해 수소생산이 가능하다. 본 연구에서는 새로운 혐기성 미생물을 분리하고, 동정하고 배양조건에 따른 수소생산을 검토하였다. 또한 발효산물로 생산되는 다양한 유기산은 혐기성 발효와 광합성 배양을 연속적으로 진행하고, 수소생산을 최대화 할 수 있으며, 본 연구에서는 혐기성 발효에 의한 수소생산의 일환으로 혐기성 미생물을 분리하고 배양조건에 대해 검토하였다. 자연계에서 수소생산 균주를 분리하기 위해 담수시료를 채취해 균 분리원으로 사용하고 질소가스를 채운 혐기성 chamber에서 균주 분리용 시료를 배지에 주입해 배양하고 평판배지에 도말하여 생성된 colony를 순수 분리하여 혐기적 조건에서 배양하여 수소생산능이 있는 단일 균주를 선별하였다.
<h1>서 론</h1> <p>현재 인류의 에너지원인 석유, 석탄, 가스 등과 같은 화석 연료는 그 매장량이 한정되어 있고 연소 시에 \( \mathrm { CO } _ { 2 } , \mathrm { SO } _ {\mathrm { x } } \), \( \mathrm { NO } _ {\mathrm { x } } \), 미세먼지 등의 오염물질을 배출하여 지구온난화를 비롯한 심각한 환경문제를 야기하고 있다. 이와 같은 문제점을 해결하기 위한 바이오매스 자원은 화석원료와는 달리 무공해 에너지이고 재생성이 무한한 산업원료이다. 바이오매스 자원으로부터 생물학적으로 생산되는 수소는 높은 에너지 효율 \( (122 \mathrm { ~kJ } / \mathrm { g } ) \)을 가지고 오염물질을 배출하지 않는 미래 청정에너지원으로 주목 받고 있다. 기존의 수소 생산 방법은 물의 전기분해나 탄화수소의 열분해 등 공정상에 많은 에너지가 소비되는 단점을 가지고 있어, 현재는 미생물을 이용한 수소 생산연구가 활발히 진행되고 있다. 현재 수소생산을 위한 생물학적인 방법으로는 조류의 광합성을 이용하는 방법과 혐기성 세균의 유기물 발효를 이용하는 방법이 있다. 이 중 혐기성 세균에 의한 방법은 태양광 유무에 관련 없이 지속적이며, 소규모로 수소생산이 가능하다는 장점을 가지고 있다. 또한 발효산물로 생산되는 다양한 유기산은 수소생산의 기질로 재활용하여 혐기성 발효와 광합성 배양을 연속적으로 진행하거나, 해당 미생물을 동시 배양할 때 유기물로부터 수소생산을 최대화 할 수 있다. 혐기성 세균에 의한 수소생산은 환경조건에 따른 대사경로의 변화에 민감하게 반응하는데, 특히 탄소원의 종류나 \( \mathrm { pH } \) 등의 환경요인에 크게 지배 받는 것으로 알려져 있다. 현재, 가장 잘 알려진 혐기성 발효 수소생성 세균으로는 Clostridium butyricum, Clostridium pasteurianum, Klebsiella pneumoniae, Clostridium kluyveri 및 Entero bacter aerogenes 등이 있고, 이들을 이용한 수소생산 연구가 활발히 진행되고 있다.</p> <p>본 연구에서는 혐기성 발효에 의한 수소생산의 일환으로 우수한 수소생산균주를 자연계로부터 확보하기 위하여 새로운 혐기성 미생물을 분리하였으며, 분리된 균주를 동정 하고, 균주의 특성 및 수소생산에 미치는 배양조건에 대하여 검토하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 선별</h2> <p>자연계에서 수소생산 균주를 분리하기 위해 부산 소재 동의대학교 연못에서 담수시료를 채취하여 균 분리원으로 사용하였다. 균주 분리 및 수소생산에 사용된 배지는 다음과 같다. 배지조성은 1 liter당 yeast extract \( 5 \mathrm { ~g } \), ethanol \( 0.5 \mathrm { mL } \), disodium succinate \( 1 \mathrm { ~g } \),( \(0.1 \% \)) ferric citrate solution \( 5 \mathrm { ~mL } \), \( \mathrm { ~K } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } \) \(0.5 \mathrm { ~g } \), \( \mathrm { MgSO } _ { 4 } \) \(0.4 \mathrm { ~g } \), \( \mathrm { NaCl } \) \(0.4 \mathrm { ~g } \), trace element solution \( 0.1 \mathrm { ~mL } \) ( \( \mathrm { ZnSO } _ { 4 } \) \(7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) \(0.1 \mathrm { ~g } \), \( \mathrm { MnCl } _ { 2 } \) \(4 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) \(0.03 \mathrm { ~g } \), \( \mathrm { CoCl } _ { 2 } \) \(6 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) \(0.02 \mathrm { ~g } \), \( \mathrm { CuCl } _ { 2 } \) \(2 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) \(0.01 \mathrm { ~g } \), \( \mathrm { NiCl } _ { 2 } \) \(6 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) \( 0.02 \mathrm { ~g } \), \( \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { MoO } _ { 4 } \) \(2 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) \(0.03 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) ), \( \mathrm { CaCl } _ { 2 } \) \(2 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) \(0.05 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \)), \( \mathrm { pH } \) 7.5이다. 여기에 \( 0.1 \% \) resazurin \( (1 \mathrm { ~mL } / \mathrm { L } ) \)를 첨가하였다. 질소가스를 채운 혐기성 chamber에서 균주 분리용 시료를 상기 배지 \( 50 \mathrm { ~mL } \)이 든 \( 125 \mathrm { ~mL } \) serum 병에 \( 5 \% \)(v/v)가 되게 접종하고 혐기적 조건으로 \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 수 일간 진탕 배양했으며 이 현탁액 \( 1 \% \)(v/v)를 다시 새로운 배지에 주입하여 배양하였다. 이와 같은 방법으로 2회 계대배양한 후, 평판배지에 도말하여 생성된 colony를 순수분리 하였다. 순수분리 된 미생물은 다시 \( 2 \% \)의 glucose가 첨가된 액체배지에 접종하고 혐기적 조건에서 배양하였으며, 균체 성장과 발생된 수소가스를 분석하여 최종적으로 수소생산능이 있는 단일 균주를 선별하였다.</p>