생육속도가 빠른 클로렐라 균주를 순수 분리하여 최적 조건에서 액체 배양 후 전자현미경으로 클로렐라 균주의 형태를 관찰하고, 농축기 내에 장착된 membrane filter를 통과시키면서 농축하였다. 또한 이 추출물의 이화학적 분석을 진행하고 실험에서 얻은 결과치를 one-way ANOVA를 통하여 평균치 및 표준오차로 나타냈다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h3>실험 재료</h3> <p>본 연구에 사용된 클로렐라 균주는 경남 김해시에 위치한(주)클만사의 클로렐라 옥외 배양장에서 분리하였다. 클로렐 라 배양액을 \( 1 \mathrm{ml} \) 취하여 희석한 후에 배양장 배지에 \( 1.5 \% \)agar 를 첨가한 고체배지에 도말하고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 colony가 육안으로 보일 때까지 배양한 후, 형태가 우수하고 생육이 빠른 단일 colony를 순수 분리하여 클로렐라 종균으로 사용하였다.</p> <h3>클로렐라 균주의 동정</h3> <p>순수 분리한 클로렐라 colony의 genomic DNA를 추출하여 18S rRNA sequencing은 한양대학교 자연과학대학 식물 공학연구실에 의뢰하여 동정하였다.</p> <h3>클로렐라 균주의 전자 현미경 사진 검경</h3> <p>순수 분리한 클로렐라 균주를 액체 배양한 후 전자현미경으로 클로렐라 균주의 형태를 관찰하였다. 이때 전처리 방법 은 배양액을 윈심분리 한 후, 상징액을 제거하고 \( 2.0 \% \) gluta-raldehyde를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 처리하여 pre-fixation하였다.Pre-fixation한 용액을 제거한 후에 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) osmiun tetr-oxide를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 시간 처리하여 fixation 하였다. Fixation 용액을 제거한 후, 각각 50,70,90,95 및 \( 100 \% \) 에탄올을 사용하여 탈수하였다. 탈수할 때의 온도는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 이며, 10 분간 2회처리하였다. 탈수한 클로렐라를 hexadiemthyl disilazane을 사용하여 건조하였다. 클로렐라의 형태를 관찰하기 위하여 전자현미경의 확대 비율을 각각 3,500배 및 20,000배로 하였다[11].</p> <h3>클로렐라 배양액의 농축 및 열수 추출</h3> <p>옥외 배양장에서 생육속도가 빠른 클로렐라 균주를 순수 분리하여 최적 배지 조성과 배양조건에서 대량배양 한 후 \( \mathrm{M} / \mathrm{F} \) 농축기(Membrain Filter System, PHILOSEP RCM 60,PHILOSE Co., Ltd., Korea) 및 PHILOSEP RCM 60 내에 장착된 membrane filter를 통과시키면서 농축하였다. 클로렐라 농축액을 고압 멸균기(Autoclave)로 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분간 열처리한 후 규조토를 혼합하여 Filter Press (Korea Filter Co.,Ltd., Korea)로 여과하였다. 여과된 추출물에 클로렐라 세포파쇄물의 잔존여부를 확인한 후, 완전히 여과된 상태의 최종 클로렐라 열수 추출물을 \( 100 \mathrm{~kg} \) 용량의 동결건조기(Freeze Dryer, Ilshin Lab, Korea)를 이용하여 열수추출물 건조 분말을 얻어 실험 재료로 사용하였다.</p> <h3>클로렐라 추출물의 이화학적 분석</h3> <p>클로렐라 추출물 분말 시료의 조단백질 및 조지방 분석은 AOAC (1995) 방법에 따라 단백질분석기(Tecator, Kjeltec 1030 Analyzer, Sweden) 및 조지방분석기(Tecator, Soxtec System 1046, Sweden)를 이용하여 각각 함량을 측정하였다. 클로렐라 추출물의 무기질은 ICP (Inductively Coupled Plasma Spectrometer, Perkin Elmer Optima 4300V ICP-OE, USA를 이용하여 CA, P, K, NA, Mg, Fe 의 무기물을 분석하였다. 클로렐라 추출물의 구성 및 유리 아미노산은 아미노산 전용분석기(Sykam, amino acid analyzer S433, Germany)를 이용하여 분석하였다.</p> <h3>통계 처리</h3> <p>실험으로부터 얻어진 결과치는 one-way ANOVA에 의한 평균치와 표준오차 \( (\mathrm{mean} \pm \mathrm{SE}) \) 로 표시하였다.</p>