현미, 발아현미 및 상황버섯발아현미를 믹서기(Waring blender)로 grinding한 후 100 mesh로 거른 시료 \( 5 \mathrm{~g} \)을 \( 70 \% \) \( \mathrm{EtOH} 25 \mathrm{ml} \)을 혼합하여 shaking한 다음 시료용액을 \( 3,000\mathrm{rpm} \) 로 20분간 원심분리하여 상등액 \( 1 \mathrm{ml} \)를 취하여 감압 상태에서 완전히 건조한 후 \( 0.5 \mathrm{ml} \)lithium citrate buffer에 녹여 PDVF filter로 거른 다음 아미노산 자동분석기(Biochrom, England)로 분석하였다. 전자공여능 측정은 Blois의 방법에 따라서 각 추출물의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)에 대한 수소공여 효과로 측정하였다. 추출물의 SOD유사활성은 Marklund 와 Marklund의 방법에 따라 과산화수소 \( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \)로 전환시키는 반응을 촉매하는 pyrogallol의 생성량을 측정하여 SOD유사활성으로 나타내었다. 대식세포를 세포 96-well microtiter plate에 \( 5 \times 10^{5} \mathrm{cells} / \mathrm{ml} \)의 세포가 되도록 재부유하여 LPS의 자극하에 24시간 배양하고 그 배양 상층액 내의 \( \mathrm{NO} \)를 Griess시약과 반응시켜 측정하였다. 세포활성은 MTT assay에 의해 측정했다.
<h1>재료 밎 방법</h1> <h2>실험 재료 및 시료 추출</h2> <p>실험에 사용한 현미, 발아현미 및 상황버섯 발아현미는 풀엔필바이오사로부터 구입하여 사용하였다. 분쇄한 시료분말에 \( 80 \% \) 메탄을을 넣고 실온에서 추출 - 여과하는 과정을 3회 반복하였다. 현미, 발아현미, 상황버섯 발아현미의 총 메탄추출물은 rotary evaporator로 감압농축한 후 동결 건조하여 시료로 사용할 때까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하였다.</p> <h2>유리 아미노산 함량 측정</h2> <p>현미, 발아현미 및 상황버섯발아현미를 믹서기(Waring blender)로 grinding한 후 100 mesh로 거른 시료 \( 5 \mathrm{~g} \) 을 \( 70 \% \) \( \mathrm{EtOH} 25 \mathrm{ml} \) 을 혼합하여 shaking 한 다음 시료용액을 3000 \( \mathrm{rpm} \) 으로 20분간 원심분리하여 상등액 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 취하여 감압 상태에서 완전히 건조한 후 \( 0.5 \mathrm{ml} \) lithium citrate buffer에 녹여 PDVF filter로 거른 다음 아미노산 자동분석기(Biochrom, England)로 분석하였다.</p> <h2>전자공여능(Electron donation ability : EDA) 측정</h2> <p>전자공여능 측정은 Blois의 방법에 따라서 각 추출물의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)에 대한 수소공여 효과로 측정 하였다. 추출시료를 DMSO에 녹여 농도별로 희석하여 시료 \( 40 \mu 1\) 와 \( 1.5 \times 10^{-4} \mathrm{M} \mathrm{DPPH}\) 용액 \( 160 \mu 1 \) 를 섞은 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C}\) 에서 30분 동안 반응시킨 다음 ELISA reader를 이용하여 \( 520 \mathrm{~nm}\) 에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능(Electron donating ability, EDA은 \( \mathrm{EDA}(\%)= \) (대조구흡광도-시료첨가구흡광도)/대조구흡광도 \( \times 100\) 으로 계산하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조그룹과 흡광도차를 비교하여 프리라디칼의 제거활성을 백분율로 나타내었다.</p> <h2>Superoxide dismutase -like activity (SODA) 측정</h2> <p>추출물의 SOD 유사활성은 Marklund 와 Marklund의 방법에 따라 과산화수소 \( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \) 로 전환시키는 반응을 촉매하는 pyrogallol의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성으로 나타내었다. 각 추출시료를 DMSO에 녹여 농도별로 희석하여, 시료 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 에 \( \mathrm{pH}\) 8.5로 보정한 Tris- HCI buffer ( \( 50 \mathrm{mM}\) tris [hydroxymethyl] aminomethane, \( 10 \mathrm{mM} \) EDTA, pH 8.5) \( 150 \mu 1 \) 와 \( 7.2 \mathrm{mM}\) pyrogallol \( 10 \mu \) 를 첨가하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C}\) 에서 10 분 간 반응시킨 후 \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} 50 \mu 1 \) 를 가하여 반응을 정지 시켰다. 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양은 ELISA reader를 사용하여 \( 420 \mathrm{~nm}\) 에서 흡광도를 측정하였다. SOD 유사활성은 추출물 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다.</p> <p>\[\operatorname{SODA}(\%)=\left(1-\frac{A}{B}\right) \times 100\] \( \mathrm{A} \) : 추출물 첨가구의 흡광도, \( \mathrm{B} \) : 추출물 무첨가구의 흡광도</p> <h2>Nitric oxide assay 및 cell viability 측정</h2> <p>\( \mathrm{NO} \) 의 생성은 비색법으로 세포 상등액에 축적되는 nitrite 양을 측정하였다. 대식세포를 세포 96-well microtiter plate에 \( 5 \times 10^{5} \mathrm{cells} / \mathrm{ml} \) 의 세포가 되도록 재부유하여 LPS의 자극하에 24시간 배양하고 그 배양 상층액 내의 \( \mathrm{NO} \) 를 Griess 시약과 반응시켜 측정하였다. \( 100 \mu 1 \) 의 세포배양 상층액을 취하여 동량의 Griess 시약 \( 1 \% \) sulfanilamide ( \( 30 \% \) acetic acid)와 \( 0.1 \% \quad \mathrm{~N} \)-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydro- chloride \( (60 \% \) acetic acid) 혼합액을 가하여 상온에서 20분간 반응시켰다. \( \mathrm{NO} \) 의 활성 정도는 ELISA 판독기를 사용하여 \( 800 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도 범위에서 \( 540 \mathrm{~nm} \) 흡광도를 측정하였다.</p> <p>세포활성은 MTT assay에 의하여 측정하였다. 96-well microtiter plate (Falcon, USA)에 RAW 264.7 macrophage를 \( 1 \times 10^{5} \) cells/wello 농도로 분주하였다. 분주 24시간 후 각 추출물이 함유되어 있는 배지를 \( 100 \mu 1 \) 씩 넣어 48시간 동안 배 양하였다. Plate에 MTT \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} 3 \)-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT, Sigma) 용액을 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 씩 첨가하여 4시간 동안 배양시키고 formazan을 형성시키 후 조심스럽게 상등액을 제거하였다. DMSO \( 150 \mu \) 1를 첨가하여 formazan을 녹인 후 \( 570 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p>