생후 8주령 ICR 마우스를 귀 부종 실험에, 10주령 Balb/c 마우스는 단기 독성 평가 실험에 사용되었고, RAW 264.7 세포주를 배양 후 실험에 사용하였으며, 시료의 세포독성을 평가하기 위한 실험으로 MTT assay를 실시하였다. MTT assay 실험은 배양된 대식세포주에 밀배아유를 첨가한 후 다시 배양하여 원심분리 후 상층액을 제거하고 DMSO를 첨가하여 \(540 \mathrm{nm}\)에서 흡광도를 측정하였으며, Proliferation index (\(\%\)) = sample 흡광도/control 흡광도 \( \times 100 \) 식에 의해 결과값을 계산하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>본 실험에 사용한 밀배아유(Gooworl, Korea)는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 저장하며 실험 전 상온에 방치 후 사용하였다. 사용한 밀배아유의 지방산 조성의 함량은 palmitic acid (C16) \( 9.47 \% \), stearic acid (C18) \(3.79\%\), oleic acid (C18:1) \(27.16\%\), linoleic acid (C18:2) \(52.3\%\), linolenic acid (C18:3) \(3.6\%\)이였다.</p> <h2>실험동물</h2> <p>생후 8주령의 수컷, ICR 마우스를 오리엔트바이오(Orient Co., Korea)로부터 구입하여 귀 부종 실험에 사용하였으며, 생후 10 주령의 암컷, \( \mathrm{Balb} / \mathrm{c} \) 마우스는 단기 독성 평가 실험에 사용하였다. 마우스는 온도 \( 20 \pm 2{ }^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 50 \pm 10 \%, 12 \) 시간 명암주기가 유지되는 동물실에서 1 주일간 예비 사육한 후 실험에 사용하였다. 본 실험은 부경대학교 동물윤리실험윤리위원회로부터 동물실험 승인을 받아 수행하였다(승인번호 2014-01).</p> <h2>세포배양</h2> <p>마우스의 대식세포주인 RAW \( 264.7 \) 세포는 한국세포주은행(KCLB40071)에서 분양받아 사용하였으며, DMEM (GIBCO, USA)에 \( 10 \% \) inactivated fetal bovine serum (FBS)와 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 배지를 배양액으로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator (MCO-15AC, Sanyo, Japan)에서 배양하였다. 실험과정의 모든 세포는 \( 80-90 \% \) 정도의 밀도로 자랐을 때 계대 배양하였고, 20 passages를 넘기지 않은 세포만 사용하였다.</p> <h2>세포독성측정</h2> <p>시료의 세포독성을 평가하기 위해 MTT assay를 실시하였다. RAW \( 264.7 \) 세포를 \( 1 \times 10^{6} \mathrm{cells} / \mathrm{ml} \) 농도로 96-well plate에 분주하고 20 시간 전 배양 후, 밀배아유 \( (0.1,1,10 \), \( 50,100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) )를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 22 시간 배양하였다. 배양 후, \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도의 MTT 시약을 첨가하여 2 시간 재 배양하고 이를 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 2,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심분리(UNION 32R, Hanil Co., Korea)하여 상층액을 제거하였다. 그 후, 각 well에 \( \mathrm{DMSO} \) 를 첨가하고 이를 microplate reader (Model 550, Bio-Rad, USA)를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 결과 값은 다음 식에 의해 계산하였다.</p> <p>Proliferation index (\(\%\)) = sample 흡광도/control 흡광도 \( \times 100 \)</p>