Mannan-Agarose를 사용한 MBL lectin domain의 기능 검증과 wild type과 mutant MBL 단백질의 세포 밖 분비 차이를 관찰하기 위해 HeLa 세포를 배양하고, Lipofectamin 2000 reagent로 형질전환하였다. NP-40 lysing buffer로 cell lysate를 얻고, Mannan-agarose와 반응시켰다. 그리고 SDS-PAGE와 western blot을 실시하여 bead에 결합된 단백질을 확인하였다. COS 세포를 배양해 형질전환 후 세포를 고정한 뒤 1차 항체와 2차 항체를 처리하여 형광을 관찰하여 wild type MBL-A와 triple mutant MBL-A의 단백질 발현을 관찰하였다.
<h2>Mannan-Agarose를 사용한 MBL의 Lectin 기능 검증과 세포 밖 분비 차이 분석</h2> <p>MBL의 lectin domain의 기능 검증과 wild type과 mutant MBL 단백질의 세포 밖 분비 차이를 관찰하기 위해, HeLa 세포를 \( 100 \mathrm { ~mm } \) dish에 \( 2.5 \times 10 ^ { 6 } \) cells/dish 로 배양하였다. 배양 18 시간 후, wild type MBL-A과 triple mutant MBL-A DNA를 Lipofectamin 2000 reagent (Invitrogen)을 사용하여 형질전환 하였으며, 형질전환 48시간 후, NP-40 lysing buffer 처리로 얻은 cell lysate와 각각의 배지를 회수 하였다. 회수한 \( 200 \mu 1 \) cell lysate에는 \( 1 \mathrm { ml } \) loading buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, \( 125 \mathrm { mM } \), NaCl 25 \( \mathrm { mM } \) CaCl \( \mathrm { } _ { 2 } \))를 첨가하고, 회수한 \( 1 \mathrm { ml } \) 배지에 1 M CaCl \( \mathrm { } _ { 2 } \)를 \( 25 \mu 1 \) 넣었다. Mannan-agarose (Sigma)는 loading buffer를 사용하여 3번 씻어준 후, cell lysate와 배지에 각각 \( 50 \mu 1 \)씩 넣어 \( 4 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1시간 동안 회전하면서 반응시켰다. 반응 후, mannan-agarose bead를 회수하여 동일한 loading buffer로 3번 씻어 준 다음, 12 \% polyacrylamide gel을 사용하여 SDS-PAGE 를 실시하고, western blot을 실시하여 mannan-agarose bead에 결합된 단백질을 확인하였다.</p> <h2>COS 세포 내 발현된 MBL 단백질의 Immunohistochemistry</h2> <p>MBL-A의 단백질 발현 관찰을 위해 \( 35 \mathrm { ~mm } \) dish에 \( 24 \times 24 \) \( \mathrm { mm } \) coverslip을 넣은 후, COS 세포를 \( 4 \times 10 ^ { 5 } \) cells/dish로 배양하였다. 배양 18시간 후 wild type과 triple mutant MBL-A를 Lipofectamin 2000 reagent (Invitrogen)를 사용하여 형질전환 하였으며, 형질전환 48 시간 후, 세포를 \( 4 \% \) formaldehyde로 20분 동안 실온에서 고정시켰다. 고정이 끝난 후, PBS를 사용하여 3 번 씻고 blocking buffer (0.1 \% Dry milk \( + 0.1 \% \) sodium azide)로 1시간 처리하였다. 1차 항체로 mouse anti-HA (Roche, 1:200)를 사용하였으며, 실온에서 18시간 반응시킨 다음 blocking buffer로 3 번 씻어 주었으며 2차 항체 goat an-ti-mouse IgG FICT (Rockland 1:200)를 처리하여 실온에서 1시간 반응 시켰다. 2차 항체를 제거하고 PBS를 사용하여 3번 씻었다. Coverslip은 vectashield를 사용하여 mounting 하였으며 Motic AE 31 형광 현미경 이미지 시스템을 통하여 형광을 관찰하였다.</p>