정제된 liver-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소를 이용해 칠성장어 간조직 LDH의 특성을 분석하고 그와의 진화적 관련성을 조사하였다. Chromatofocusing을 통해 간조직 LDH를 분리한 후, 이는 여러 유전자에 의해 생성된 동위효소임을 확인하였다. 또한, 칠성장어 간조직 추출물의 LDH 동위효소는 피루브산에 의한 저해 정도가 대구 \( \mathrm{C}_{4} \)와 유사하였으며, 정제된 \( \mathrm{pH} 7.45 \) 분획의 LDH 동위효소는 \( \mathrm{A}_{4} \)보다 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소와 더 유사하였다.
<h3>DEAE-Sephacel chromatography</h3><p>DEAE-Sephacel chromatography결과 대구 간조직 LDH는 20-80번 분획까지 확인되었으며 liver-specific \( \mathrm{C}_{4} \)는 21-28번 분획에서 확인되었다. Liver-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 양하전을 띠어 음극쪽에 위치하였고 순수하게 정제된 것으로 확인되었으며, 칠성장어 간조직 LDH 도 정제된 것으로 확인되었다. 정제된 liver-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소를 ultrafiltration에 의해 농축하여 항원 및 시료로 사용하였다.</p><h3>Chromatofocusing</h3><p>칠성장어는 LDH 동위효소의 진화에서 중요한 위치를 차지하는 어류군으로 조상 유전자인 Ldh-A에 의한 단일 동위 효소 band를 보유하고 있는 것으로 보고 되었으나, polyacrylamide gel isoelectric focusing (PAGIEF) 결과 칠성장어 간조직의 LDH 동위효소는 \(\mathrm{pI} 7.55,7.63 \), 골격근의 LDH 동위효소는 \(\mathrm{pI} 4.85,4.80,4.95,5.05 \), 심장의 LDH 동위효소는 \( \mathrm{pI} 4.25,4.32 \)로 나타나 2개 이상의 동위효소 band를 가지고 있는 것으로 보고 되었다.</p><p>본 실험에서 칠성장어 간조직 LDH의 특성 및 liverspecific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소와의 진화적 관련성을 살펴보기 위하여 간조직의 LDH를 chromatofocusing에 의해 분리하였다. 많은 수의 단백질이 확인되었지만 LDH\( \ \mathrm{pH} 7.45 \) 분획에서 활성이 크고 \( \mathrm{pH} 7.25 \) 분획에서 활성이 낮게 용출되는 2 개의 peak를 확인하여 2개의 동위효소를 보유하고 있는 것으로 볼 수 있다. 따라서 칠성장어 간조직의 LDH는 한 개 이상의 유전자에 의해 만들어진 동위효소들이라 할 수 있다. 골격근 조직은 chromatofocusing하여 \(\mathrm{pH} 5.2, 5.1, 5.0, 4.8\)의 분획이 LDH인 것으로 보고 되었으므로 두 조직의 LDH 동위효소는 차이가 있음을 확인 할 수 있었다. 따라서 간조직을 chromatofocusing한 결과 활성이 높은 \( \mathrm{pH} 7.45 \) 분획만 농축하여 시료로 사용하였다.</p><h2>LDH 동위효소의 기질의존성</h2><p>피루브산에 대한 역학적 실험은 하부단위체의 분자적 구조를 이해 하는데 유용하다. \(\mathrm{LDH} \mathrm{~A}_{4} \) 동위효소는 고농도의 피루브산에 의해서도 저해 정도가 낮고 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위 효소는 저농도의 피루브산에 대해서 저해 정도가 크게 나타난다. 피루브산 \( 10 \mathrm{mM} \)에서 칠성장어 간조직의 정제된 LDH는 \( 41.3 \% \), chromatofocusing에 의해 정제된 \( \mathrm{pH} 7.45 \) 분획의 LDH 동위효소는 \( 29.5 \% \)의 활성이 남아 있었다. 피루브산 \( 10 \mathrm{mM} \)에서 Coreopera herzi의 \( \mathrm{LDH} \mathrm{A}_{4} \) 동위 효소는 \( 72 \% \), Bos taurus의 \( \mathrm{B}_{4} \)는 \( 22 \% \)의 활성이 남았고, 대구의 liver-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 \( 50 \% \)의 활성이 남아 있어 \( \mathrm{A}_{4} \) 와 \( \mathrm{B}_{4} \)의 중간 저해형으로 나타났다. 따라서 본 실험에서 칠성장어 간조직 추출액의 LDH 동위 효소의 피루브산에 의한 저해는 대구 \( \mathrm{C}_{4} \)의 저해 정도와 유사하였고 정제된 \( \mathrm{pH} 7.45 \) 분획의 LDH 동위 효소는 \( \mathrm{A}_{4} \) 보다 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위 효소에 더 유사하였다. Gadus morhua의 하부단위체 C는 기질에 대한 저해 정도가 하부단위체 B와 유사하며, \( \mathrm{Km} \)과 최적 기질 농도는 하부 단위체 A 와 유사하여 본 실험 결과와 일치하였다.</p>