HPLC 분석을 통해 \( 99.5 \% \) 이상의 순도인 실험에 사용한 hederagenin 3-O-b-D-glucopyranosyl \((1 \rightarrow 3) \)-a-L-rhamnopyranosyl \((1 \rightarrow 2) \)-a-L-arabinopyranoside (HDL)으로 세포 증식 억제 조사와 U2OS 세포를 6-well plate에 \( 4 \times 10 ^ { 4 } \) \( \mathrm cells/well \) 밀도로 세포를 분주하여 Hydrogen peroxide 생성 측정을 하였다.
<h2>재료 및 시약</h2> <p>실험에 사용한 hederagenin 3-O-b-D-glucopyranosyl \((1 \rightarrow 3) \)-a-L-rhamnopyranosyl \((1 \rightarrow 2) \)-a-L-arabinopyranoside (HDL) (Fig. 1A)의 구조는 Kalinovskii의 \( { } ^ { 13 } C \) \(NMR \) 데이터를 기준으로 결정하였으며, HPLC 분석을 통해 \( 99.5 \% \) 이상의 순도를 확인하였다. 분리된 HDL은 영남대학교의 장현욱 교수로부터 제공받아 실험에 사용하였다. Dimethyl sulfoxide (DMSO), 3-[4,5-dim-enthylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltera-zolium bromide, xanthine, phenylmethylsulfonyl fluoride, dithiothreitol, xan-thine, \( \mathrm { KCl } \), DCFH-DA (2',7'-dichlorodihydrofluorescein diac-etate), HEPES, standard horse ferritin, \( \alpha \)-chloronaphthol, hy-droquinone, o-phenanthrolene, ferrous sulfate, perchloric, 2-vinylpyridine, yeast glutathione reductase, 5,5' dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid), NADPH, thiobarbituric acid, trichloro-acetic acid, propidium iodide, NP-40, RNase A 등의 시약은 Sigma chemical Co. (MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 그리고 기타시약은 분석용 고순도 특급 시약을 사용하였다.</p> <h2>세포증식 억제조사</h2> <p>96 well tissue culture plate (Falcon, USA)에 U2OS 세포를 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) \( \mathrm ~cells/ml \)의 농도로 각 well 당 \( 100 \mu 1 \)씩 분주하여, 24시간동안 배양 후 실험에 사용하였다. U2OS 세포에 \( \mathrm { CoCl } _ { 2 } \) 및 HDL을 단독 혹은 함께 처리하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) 조건 하에서 배양하였다. 12시간 또는 24시간 후 약물이 포함되어 있는 배양액에 MTT reagent (3-[4,5-dim-enthylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltera-zolium bromide)를 처리하여 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 4시간 후 MTT reagent가 혼합되어 있는 배양액을 제거하고 DMSO를 처리하여 마이크로플레이트리더기 \(( \mathrm { VICTOR } ^ {\mathrm { TM } } \times 3 \) Multilabel Plate Reader, PerkinElmer Life Sciences, USA)로 \( 540 \mathrm { ~nm } \)의 파장 하에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존율은 대조군의 흡광도에 대한 실험군의 흡광도를 백분율로 환산하여 나타내었다.</p> <h2>Hydrogen peroxide 생성 측정</h2> <p>U2OS 세포를 6-well plate에 \( 4 \times 10 ^ { 4 } \) \( \mathrm cells/well \) 밀도로 세포를 분주하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) 세포 배양기에서 배양하였다. U2OS 세포에 \( \mathrm { CoCl } _ { 2 } \)를 단독 혹은 HDL과 함께 처리한 후, DCFH-DA를 \( 10 \mu \mathrm { M } \) 농도로 처리하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) 세포배양기에서 1시간 반응시켰다. 세포를 ice-cold PBS로 3회 수세 후, lysis buffer (protease inhibitor cocktail tablets (Roche, Germany) 1 tablet/50 \( \mathrm { ml } \) TNES buffer (1 M Tris- \( \mathrm { HCl } \), \( \mathrm { pH } \) 7.4, \(1 \% \) NP-40, 0.5 M EDTA, 5 M \( \mathrm { ~NaCl } \))를 \( 100 \mu \)씩 첨가하여 단백질을 추출한 다음 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 12,000 \( \mathrm { rpm } \)에서 10분간 원심 분리하여 상등액을 모았다. 단백질 정량은 Bio-Rad protein assay system (Bio-Rad Laboratories)을 이용하여 수행되었다. 동일한 양의 단백질을 마이크로플레이트리더기를 이용하여, emis-sion \( 535 \mathrm { ~nm } \), excitation \( 485 \mathrm { ~nm } \) 의 파장에서 형광측정 하였다.</p>