이 실험은 식물체가 토양으로부터 칼슘흡수에 제한을 받은 결과인지 또는 세포수준에 영향이 있는지를 간접적으로 확인하기 위해 \( s C A X 1 \) 발현 토마토와 비형질전 환체와의 접목을 통해 알아보고, tip-burn과 BER이 억제될 수 있는지를 확인하기 위해 C R T형질 전환 토마토를 얻은 후 \( s C A X 1 \) 형질전환체와 공동발현토록 교배를 하였다. ( \mathrm{T}_{1} \) 분리세대 종자에 \( s C A X 1 \) 유전자가 1 copy 삽입된 재료를 이용하여 실험하였다.
<p>언급한 두 유전자의 보고된 기능을 염두에 두고 sCAX1발현 토마토의 tip\(-\)burn과 BER 표현형을 종자가 발아하는 시점부터 관찰하는 한편, sCAX1 발현 토마토와 비형질전 환체와의 접목을 통해 그 원인이 식물체 수준에서 토양으로부터 칼슘흡수에 제한을 받은 결과인지 또는 세포수준에 기인하는지를 간접적으로 확인하는 것과 C R T형질 전환 토마토를 획득한 후 sCAX1형질전환체와 공동발현토록 교배를 통해 두 유전자를 집적함으로써 tip-burn과 BER이 억제될 수 있는지를 확인하는 것에 목적을 두고 본 연구를 수행하였다.</p> <h2>재료 및 방법</h2> <h3>식물재료와 형질전환</h3> <p>토마토 내혼계통 'FM9' 에 sCAX1 유전자가 1 copy 삽입된 \( \mathrm{T}_{1} \) 분리세대 종자를 미국 Kansas 주립대학교 S. Park으로 부터 분양받아 고정 ( \( \mathrm{T}_{2} \) 세대)한 후 tip-bum과 BER 표현형 관찰 재료로 사용하였다. CRT 유전자형질전환은 국립원예특작과학원에서 욕성한 내혼계통 '탐나라 (Tamnara)' 종자를 기내파종하여 하배축을 절취한 후 Park 등 (2003,2005) 의 방법에 따라 아그로박떼리움 공동배양법으로 수행하였다.</p> <h3>Agrobacterium 균주와 플라스미드</h3> <p>sCAX1 발현 'FM9'은 \( \mathrm{pBI121} \) 벡더의 원T\(-\)DNA 대신 sCAX1유전자가 클로닝된 T\(-\)DNA 로 재조합된 벡터를 A . tumefaciens LBA4404균주에 도입한 후 형질전환함으로써 획득되었다. pE1775 벡터의 다중 클로낭 부위에 C R T 유전자가 삽입된 pE1775\(-\)CRT 벡터를 미국 Kansas 주립대학교 S. Park으로부터 분양받아 freeze\(-\)thaw method를 통해 A. tumefaciens LBA4404주에 도입한 후 이를 토마토 내혼계통 '탐나라'의 형질 전환에 사용하였다.</p> <h3>형질전환체의 핵산분석</h3> <p>DNeasy Plant Mini Kit을 이용하여 제조사의 안내에 따라 어린잎으로부터 DNA를 추출한 후 모든 시료롤 \( 10 \mathrm{ng} / \mu \mathrm{L} \)로 각각 희석한 후 중합 효소연쇄반응 (PCR) 분석에 이용하였다. PCR은 PerfectShot Ex Tag Kit \( 25 \mu \mathrm{L} \) 에 희석한 시료 DNA \( 4 \mu \mathrm{L} \), 탈이온 멸균수 \( 13 \mu \mathrm{L} \) 및 forward primer와 reverse primer를 각각 \( 4 \mu \mathrm{L} \) 씩 혼합하여 수행하였다. 각primer 조합의 염기서열은 sCAX1\(:\) 5'-TGCCGCCATTATTTGCACCT\(-\)3'와 5'\(-\)TGTCATCCCAACCAACCATG\(-\)3' (640 bp증폭), NPTII\(:\) 5'\(-\)GAGGCTATTCGGCTATGACTG\(-\)3'와 5'\(-\)ATCGGGAGCGGCGATACCGTA\(-\)3' (700 bp 증폭), CRT: 5'\(-\)TGAGTTCAGCAACAAGGATA\(-\)3'와 5'\(-\)CTCATCCTCTAGGTCATCATCCTCAT-3' (910 bp 증폭), HPTII: 5'-AGTCAATGACCGCTGTTATG\(-\)3'와. 5'\(-\)ACAGCGTCTCCGACCTGATG\(-\)3'(594 bp 증폭)로 설계하였다. 한편, CRT 형질전환체의 전사분석을 위해 RT\(-\)PCR 분석을 수행하였다. PCR 분석을 통해 CRT 유전자 단편이 증폭된 개체 중에서 생육에 이상이 없는 개체에서 무작위로 4개체를 선택하여 RNeasy Plant Mini Kit 를 이용하여 제조사의 지시에 따라 어린잎으로부터 총 RNA를 추출한 후 SuperScript III First-Strand Synthesis System을 이용하여 cDNA 를 합성하였다. cDNA 합성 전 각각의 RNA는 DNA 오염을 제거하기 위하여 DNase I (Invitrogen)으로 2회 처리하였으며 분광광도계로 정량한 후 cDNA 합성 최종혼합물 \( 20 \mu \mathrm{L} \) 에 \( 0.2 \mu \mathrm{g} \) 이 첨가되도록 하였다. 합성된 cDNA 는 DNA PCR 분석에서와 동일한 primer를 사용하여 목표 유전자 단편을 증폭하였다.</p> <h3>xCAX1 \( \mathrm{~T}_{2} \) 고정집단 선발, sCAX1 형질전환체 표현형 검정, 비형질전환체와의 접목</h3>