Exophiala sp. \( \mathrm{LH} 2 \) 균주를 사용하여 중금속 처리 연구를 진행하였다. 특정 성분으로 이루어진 Biosorption 배지를 활용하고, 배지의 \( \mathrm{pH} \) 를 \( 5.5 \) 로 보정하였다. 퇴적토를 접종원으로 사용하고, 중금속 농도를 \( 10 \mathrm{ppm} \) 에서 \( 200 \mathrm{ppm} \) 까지 증가시키며 배양하였다. 마지막으로 균체의 분자생물학적 동정을 위해 \( 18 \mathrm{~S} \) rDNA sequencing 방법을 활용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 배지 조성</h2> <p>본 연구에서 사용한 중금속 처리 균주는 Exophiala sp. \( \mathrm{LH} 2 \) 이다. 이 균주는 Biosorption 배지를 이용하였으며, 조성은 증류수 \( 1 \mathrm{~L} \) 에 \( 20 \mathrm{~g} \) 의 glucose, \( 3 \mathrm{~g} \) 의 \( \mathrm{CaCO}_{3}, 2 \mathrm{~g} \) 의 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{HPO}_{4}, 1 \mathrm{~g} \) 의 \( \mathrm{K}_{2} \mathrm{HPO}_{4}, 0.5 \mathrm{~g} \) 의 \( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \), \( 0.5 \mathrm{~g} \) 의 KCl, \( 0.01 \mathrm{~g} \) 의 \( \mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 이 포함되었으며, \( 1 \mathrm{M} \) \( \mathrm{HCl} \) 을 이용하여 이 배지의 \( \mathrm{pH} \) 를 \( 5.5 \) 로 보정하였다. 또한, \( \mathrm{CuSO}_{4} \cdot 5 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, \mathrm{PbSO}_{4}, \mathrm{CrK}\left(\mathrm{SO}_{4}\right)_{2} \cdot 12 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, \mathrm{ZnSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \), \( \mathrm{NiSO}_{4} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 를 각각 \( 1,000 \mathrm{ppm} \) 으로 제조하였다. 이후 필요에 의하여 \( 10,50,100,150,200 \mathrm{ppm} \) 으로 희석하여 사용하였다. 각 배지 및 실험 시 사용되는 실험 재료는 Autoclave (TOMY, SS-325, Japan)를 사용하여 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15 분간 멸균한 후 사용하였다. 멸균 시 배지와 glucose는 따로 분리하여 각각 멀균하였다.</p> <h2>균주의 분리 및 동정</h2> <p>경안천 유역에서 채취한 퇴적토를 \( 10 \% \) 접종원으로 하여 혈청병에 Biosorption 배지를 넣고 첨가된 중금속의 농도를 \( 10 \mathrm{ppm} \) 에서 최대 \( 200 \mathrm{ppm} \) 까지 점차적으로 증가시켜주며 계대 배양하였다. 약 20 여회의 계대배양이 진행되면서 최종적으로 배양액 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 \( 9 \mathrm{ml} \) 종류수와 섞어 10 배 희석법을 이용하여 \( 10^{-4} \sim 10^{-10} \) 의 시료를 만들어 중금속이 함유되어진 고체 배지에 도말하였다. 도말한 plate를 일부는 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 호기적으로 배양하였으며, 일부는 혐기조에 넣은 뒤에 질소가스로 혐기조를 채운 후에 뚜껑을 닫아 공기가 들어가지 않도록 기밀하여 incubator를 이용하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에 서 약 10 일간 배양한 뒤 군락체 형태, 색깔, 크기에 따라 선별하여 다시 plate에 접종하여 한차례 더 순수분리를 시도하였다.</p> <p>균의 분자생물학적 동정을 위해서 plate에서 배양한 균체를 Bionics에 의뢰하여 \( 18 \mathrm{~S} \) rDNA sequencing 방법에 의거하여 동정하였다.</p> <p>이 후 CLUSTAL W[16]를 사용하여, 염기서열을 조합하여 NCBI(The National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih)에서 제공하는 Advanced Blast search를 이용하여 Genebank의 염기서열과 비교함으로써 곰팡이의 분자 동정을 하였다.</p>