위 논문은 벼유전자를 바탕으로 유전자분석 및 계통발생학적 분석, 기관별 분석, 저온 상태 분석을 진행하였다. 우선 첫번째로 벼 유전자의 RLKs의 아미노산 서열분석을 통해 단백질간의 차이를 규명하였다. kinase 도메인과 N-terminal 도메인에서 큰 차이를 보이는데 전자는 높은 유사성을 보이나, 후자에서는 극히 낮은 유사성을 보인다. 이는 후자의 아미노산 서열의 다양성을 보여준 것이다. 또한 계통발생학적으로 보아, 미량의 차이는 있으나 크게 보면 3그룹으로 분류할 수있었다. 다음은 기관별 분석을 보겠다. RLGs는 대조군인 actin과 반대로 잎, 뿌리, 줄기 순서대로 많은 발현량을 보았다. 그러나 RLG1은 뿌리에서 다른 RLGs보다 더 낮은 결과를 보였다. 이를 통해, RLGs는 기관별로 다르게 발현되며, 각 기관별로 RLGs의 기능이 다름을 암시한다. 마지막으로 저온상태에서 4시간, 24시간 배양한 RNA의 RLGs발현량을 비교하였는데 초기발현량에는 큰 차이가 없었으나, 시간이 지날수록 대조군인 상온상태 RNA와의 차이가 커졌다. 이는 또한 RLGs가 저온 상태일 때 더 많이 발현하여 식물의 적응에 도움을 준다고 볼 수있을 것이다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Receptor like kinase genes (RLGs)의 유전자 분석 및 계통발생학적 분석</h2> <p>Receptor like kinase genes (RLGs)의 분석을 통해 유전자 간의 특징을 확인하고자 하였다. 유전자 분석을 위해 molecular cloning을 통해 전체 ORF를 포함하는 유전자를 확보하였으며, 유전자 분석 프로그램을 적용하여 유전자의 정확성을 확인하였다. 확인된 각 RLGs를 이용하여 단백질의 기능을 결정하는 요소인 아미노산 서열을 기준으로 하여 각 단백질 간의 차이를 확인하였다.</p> <p>벼의 receptor like kinase (RLK)의 아미노산 서열 분석 결과에서 kinase 도메인으로 해석되는 약 390 아미노산 잔기부터 610 아미노산 잔기까지 비교적 높은 유사성을 보였으나, 신호 분자와 접촉이 예상되는 N-terminal 도메인을 포함한 부분은 그 유사성이 매우 낮은 것으로 확인되었다 (Fig. 1). 이 결과는 RLK의 구조상 다양한 신호를 인지 할 것으로 예상되는 N-terminal 도메인의 아미노산 서열상의 다양성을 보여준 것이라 하겠다.</p> <p>RLKs 의 단백질 서열들에서 그 다양성을 확인하였고, 이들을 자료로 유전자 분석 프로그램을 통해 계통발생학적 분석을 수행하였다. 이 분석에서는 단백질 전체 서열에 대한 분석과 상동성이 높은 부분 즉, kinase 도메인을 중심으로 하는 부분만을 선정하여 분석하였으며 두 실험에 대한 결과로 계통발생학 (Phylogenetic) 연관성을 살펴보았다 (Fig. 2).</p> <p>결과적으로, 형성된 두 종류의 phylogenetic tree에서 각기 세부적이 차이는 보였으나, 공통적으로 3 개의 그룹이 형성됨을 확인할 수 있었다. RLG6, RLG18, RLG20, RLG8이 한 그룹으로 지정 되었고, RLG10, RLG5, RLG1, RLG17등이 또 하나의 그룹으로 지정되었으며, RLG\# (sharp로 대체 표기함)6은 이들과는 별도의 각각의 그륩임을 보여 주었다(Fig. 2).</p> <h2>기관별 Receptor like kinase genes (RLGs)의 quantitative real-time PCR</h2> <p>식물은 각 기관에 따라 특정 유전자 발현에 차이를 나타낸다고 보고된 연구 결과 (Jinn et al. 2000)에 의거하여 약 14일간 성장시킨 벼를 임의로 잎 (leaf), 줄기 (stem), 뿌리 (root)의 세 부분으로 구분하였으며, RNA 추출 kit를 사용하여 벼의 각 기관에서 추출된 total RNA각 기관에 따른 receptor like kinase gene (RLGs)의 발현 차이를 확인 하였다. quantitative real-time PCR (QRT-PCR)에 사용되기 위해 제작된 Q-primer들의 annealing 온도를 결정하기 위한 gradient PCR에 주형으로 사용되었다. Q-primer의 annealing 온도는 RLG1, RLG5, RLG8가 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 이며, RLG6, RLG\#6, RLG17, RLG18, RLG20는 \( 57^{\circ} \mathrm{C} \) 로 결정되었다. 결정된 annealing 온도를 기반으로 QRT-PCR을 수행하였다.</p> <p>Receptor like kinase gene 1 (RLG1)을 포함한 RLGs의 줄기에서 나타난 발현은 잎과 뿌리에 비교하여 threshold cycle \( \left(\mathrm{C}_{\mathrm{T}}\right) \) 값이 최대 2.0 cycle에서 0.83 cycle까지 증가하는 것으로 확인되었다. \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값이 증가하는 것은 유전자의 발현이 작은 것을 의미하므로, 모든 RLGs의 발현이 줄기에 비교하여 잎과 뿌리에서 상대적으로 많은 것으로 해석되었다. 이러한 결과는 대조군인 actin 유전자가 줄기에서 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값이 약 3 cycle 정도 앞당겨지는 것과 비교됨을 보여 주었다 (Fig. 3). Actin 의 경우 줄기에서 가장 많은 발현을 확인 하였고 (줄기>뿌리>잎), RLGs들은 잎에서 가장 많이 발현되었으며, 다음으로는 뿌리에서 발현 되는 것을 확인하였다 (잎>뿌리>줄기).</p> <p>식물의 RLK는 다양한 기능에 연관되어 있으며, 동물과 비교하여 거대한 그릅을 갖고 있기 때문에 (Morris and Walker 2003) 각 RLGs를 독립적으로 분석해야 할 것으로 판단되었다. 본 연구에는 모든 기관에서 RLG6의 발현이 가장 많았으며, 다음으로 RLG20, RLG18, RLG#6, RLG17, RLG8, RLG5, RLG10 순으로 발현의 차이를 보였다. RLG1의 경우 다른 RLGs와 비교하여 특히 뿌리에서 발현이 더 낮아지는 결과를 보여주었다. RLG1을 제외한 RLGs는 뿌리의 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값을 기준으로 잎보다는 약 0.4 cycle이 큰 것을 보여주었으며, 줄기보다는 약 2.5 cycle이 작은 것으로 확인되었다. 결과적으로 잎과 줄기에서의 RLG 발현은 거의 차이를 나타내지 않았다. 그에 비교하여 RLG1의 발현은 줄기와 잎에 비교하여 각각에서 1 cycle이상의 차이를 보였다. 즉 다른 뿌리에서 RLG1 의 발현이 작아졌다는 것을 의미하며, 이러한 결과는 식물체의 각 기관에서 RLGs의 기능이 다르게 작용한다는 것을 간접적으로 제시하는 것이라 하겠다.</p> <p>본 실험의 결과를 바탕으로 이후 스트레스에 따른 벼의 RLK 유전자의 발현 변화를 확인하기 위한 실험에서는 모든 RLGs의 발현 형식이 같은 잎과 줄기를 사용하여 실험을 수행하였다.</p> <h2>저온에서의 Receptor Like Kinase Genes (RLGs)의 quantitative real-time PCR</h2> <p>저온의 처리를 통해 receptor like kinase gene (RLGs)의 발현 변화를 확인 하기 위해서 파종 후 14 일 배양된 낙농벼를 저온 \( \left(4^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 에서 각 4 시간과 24 시간 배양한 후에 RNA 를 추출하였다. 역전사 반응을 통해 cDNA 를 제작하였으며, 이 DNA를 주형으로 사용하여 낙농벼의 염기서열을 바탕으로 설계된 primer 쌍을 quantitative real-time PCR (QRT-PCR)에 적용하였다.</p> <p>QRT-PCR 에서 얻어진 각 RLGs 의 threshold cycle \( \left(\mathrm{C}_{\mathrm{T}}\right) \) 의 수치를 상온에서 배양된 대조군의 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값과 비교하였으며, 대조군 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값에 비교하여 수치가 모두 증가 한 것을 확인하였다. 정확한 비교를 위해 대조군 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값에서 저온 처리를 한 벼의 각 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값을 빼고 그 차 (대조군 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) - 저온처리 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) )를 확인하였다 (Fig. 4).</p> <p>각 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값의 차가 양수를 나타내므로 대조군과 비교하여 각 RLK 유전자의 발현이 증가하였다. RLG5를 제외한 모든 유전자에서 4 시간과 24 시간에서의 발현 변화에는 차이가 있지만, 시간이 지날수록 발현이 증가하는 것을 확인하였다. RLG5의 경우 4시간 후와 24 시간 후에서 발현의 차이가 없었으나 대조군에 비교하여 발현이 증가한 것은 확인 하였다. 이는 저온의 환경에서 RLGs의 발현이 증가하는 것을 말한다. 즉 저온의 환경에서는 RLGs 발현이 증가되어야 식물체가 유지될 수 있다는 것으로 해석 할 수 있었다. 따라서 식물이 저온의 환경에서 적응할 수 있도록 하는 RLGs기능에 대한 가능성을 의미한다고 하겠다.</p>