증폭된 DNA절편이 삽입된 방향을 DNA sequencing 으로 확인 후 pCRII-TOPO 재조합 plasmid를 in vitro transcription하였다. ISH를 수행하고 염색된 세포관찰 후 digital image를 획득하였으며 Mann-Whitney \( U \) test로 검증하였다.
<h2>유전자 cloning</h2> <p>중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 기법으로 합성 \( \operatorname{primer}\left(\mathrm{F:} \quad 5^{\prime}\right. \)-tgattctgcgaatctgca-3'/R: 5'-catg-gagcctgggatct-3', amino acid 269-344)를 이용하여 RARa 단백질의 아미노말단에 해당하는 \( 413 \mathrm{bp} \)를 증폭하였다. 증폭된 DNA 절편을 pCRII-TOPO transcription vector(Invitrogen Life Science)에 삽입하고, 삽입된 방향을 DNA sequencing 으로 확인하였다.</p> <h2>In vitro transcription에 의한 riboprobe의 제조</h2> <p>유전자가 포함된 pCRII-TOPO 재조합 plasmid를 제한효소를 사용하여 선형화하고 (insert의 삽입방향과 선형화할 때 사용한 효소는 각각의 해당그림에 표시하였다.) T7(Roche Molecular Biotechemicals, Indianapolis, IN) 혹은 SP6 RNA polymerase(Invitrogen)를 이용하여 in vitro transcription하였다. 이 때 digoxigenin(DIG)으로 표지된 UTP (DIG-UTP) (Roche)를 첨가하여 cRNA를 DIG로 표지하였다.</p> <h2>In situ hybridization (ISH)</h2> <p>InnoGenex in situ hybridization(ISH) Kit(Komabiotech,서울)를 이용하여 ISH를 수행하였다. 면역염색이 끝난 세포에 hybridization buffer \( 100 \mu \) l를 넣고 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 처리 한 다음, DIG-labeled cRNA를 첨가하고 \( (20 \mathrm{ng} / \mathrm{ml}) 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 16~18 시간 처리하였다. PBS로 세척 후 biotin-conjugated anti-DIG 항체를 넣고 실온에서 30 분간 반응시켰다. 다시 PBS로 세척한 다음 alkaline phosphatase-conjugated streptavidin을 넣고 실온에서 20 분간 반응시킨 후, BCIP/NBT를 넣어 발색시켰다.</p> <h2>이미지 처리 및 signal intensity 측정</h2> <p>염색된 세포를 CCD camera (Photometrics Inc., Germany)가 장착된 형광현미경 (Leica Re search Microscope DM IRE, Germany)으로 관찰하고, QFluoro version V1.0b soft-ware(Leica Microsystems AG, Wetzlar, Germany)를 이용하여 digital image를 획득하였다. IC의 signal intensity를 측정하기 위하여 digital image는 Photoshop \( 5.0 \mathrm{~K} \) (Adobe) soft-ware를 이용하여 흑백으로 전환(gray scale 0 255)하고 명암을 반전한 다음, \( \mathrm{NIH} \) Scion Image (version beta 4.02; Scion Corporation, Frederick, Maryland, USA)로 분석하였다. ISH image의 가지돌기에 형성된 RNA granule의 수를 측정하기 위하여 ISH 흑백 image를 NIH Scion Image soft-ware를 이용하여 분석하였다. 이때 gray scale intensity 50 을 threshold로 하여 그 이상을 유효 signal로 보았으며, 반점의 크기는 \( 10 \sim 100 \) pixel로 정의하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험은 최소 8 배수로 시행하였고, 세포의 생존율은 대조군에 대한 백분율 (\(\%\) of control)로 표시하였다. 통계학적 유의성은 Mann-Whitney \( U \) test로 검증하였다.</p>