다양한 표준 균주를 한국 유전자은행 및 ATCC에서 분양받아, Marine Broth 배지에서 1-2일 동안 배양한 후 DNA를 추출하였다. 이 DNA는 PCR 반응의 주형으로 사용되었다. 16S rDNA의 증폭은 27f와 1492r의 primer 쌍을 사용하였으며, 증폭된 DNA는 agarose gel을 이용해 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용 균주 및 배지</h2> <p>본 실험에서 사용한 균주는 모두 표준 균주(Type strain)로 V. algindyticus KCTC2472 \( ^ {\mathrm { T } } \) ( = ATCC17749 \( { } ^ {\mathrm { T } } \)) 와 V. fluvialt KCTC2473 \( ^ {\mathrm { T } } \) (=ATCC33809 \( { } ^ {\mathrm { T } } \))는 한국 유전자은행(Korea Collection for Type Clutures, Korea Research Institute of Bioscienc and Biotechnology, Daejon, Korea)에서, V. parahaemolyticu ATCC17802 \( ^ {\mathrm { T } } \), V. protedyticus ATCC15338 \( { } ^ {\mathrm { T } } \), V. vulnificu ATCC27562 \( ^ {\mathrm { T } } \), V. mimicus ATCC 33653 \( ^ {\mathrm { T } } \), Grimontia hollisa ATCC33564 \( ^ {\mathrm { T } } \) 는 ATCC (American Type Cultrue Collection Rockville, MD. USA)로부터 분양 받았으며 균주는 MB(Marine Broth, Difco, Detroit, USA) 배지를 이용하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1-2일간 배양하여 DNA 추출에 사용하였다.</p> <h2>DNA추출 및 16S rDNA의 PCR증폭</h2> <p>염색체 DNA는 배양된 세균 균주의 각 colony로부터 gDNA extraction kit (Solgent, Korea)를 사용하여 분리하였으며 분리된 DNA를 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. 16S rDNA의 증폭에는 27f (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'와 1492r (5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG AC-3')의 primer 쌍을 사용하였다. 최종 반응량 \(100 \mu \mathrm { l } \) 되도록 \(10 \mathrm { mM } \) Tris-HCl (pH8.3), \(1.5 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } _ { 2 } \), \(50 \mathrm { mM } \mathrm { KCl } \), \(100 \mu \mathrm { g } \mathrm { gelatin } / \mathrm { ml } , 200 \mu \mathrm { M } \) dNTP, 각 oligonucleotide primer \(200 \mathrm { nM } , 2.5 \mathrm { U } \) 의 Taq polymerase (Takara, Japan), \( 100 \mathrm { ng } \) 의 주형 DNA를 혼합하여 PCR 반응을 수행하였다. Perkin-Elmer DNA thermocycler (DNA thermal cycler 480, Perkin-Elmer Co., USA)를 이용하여 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 3분간 초기 변성시킨 후, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 분간 변성, \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 분간 냉각, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2 분간 신장, 이 과정을 30 cycle 반복 수행한 후 최종적으로 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 7 분간 신장시켰다. 증폭된 DNA의 확인을 위해서 PCR 반응액 \(3 \mu \mathrm { l } \) 를 취하여 \( 1 \% \) agarose gel (Bio-Rad, USA)을 이용하여 Mupid-ex (ADVANCE, Japan)로 \( 100 \mathrm { ~V } \), 25분간 \(1 \times \) TAE buffer ( \(40 \mathrm { mM } \) Tris-acetate, \( 1 \mathrm { mM } \) EDTA, pH 8.0)에서 전기영동 후, ethidium bromide (EtBr, \( 50 \mathrm { ng } / \mathrm { ml } ) \) 에 10 분간 염색하여 UV 하에서 \( 1.5 \mathrm { ~kb } \) 의 DNA 단편을 확인하였다. 증폭된 DNA의 크기를 측정하기 위한 marker로는 \( 1 \mathrm { ~Kb } \) ladder를 사용하였다.</p>