잘 자란 담배를 액체 질소로 처리하여 분쇄하고, extraction buffer를 첨가한다. 원심분리하여 상등액을 모으며, Microsome을 얻기 위해 샘플을 원심분리한다. 상등액을 제거하고 resuspend buffer로 침전물을 처리하며, Spectro-photometer를 사용하여 \(340\mathrm{~nm}\)에서 흡광도를 측정한다.
<h2>C4H 효소활성 측정</h2> <p>잘 자란 담배 \( 0.5 \mathrm { ~g } \) 을 액체 질소에 넣고 막자사발을 이용해 곱게 마쇄한 후 extraction buffer ( \( 50 \mathrm { mM } \) tricine ( \( \mathrm { pH } 7.5 \)), \( 1 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 0.3 \mathrm { M } \) mannitol, \(0.1 \% \) BSA, \(10 \% \) PVP) \( 1 \mathrm { ml } \) 을 첨가한다. 이를 e-tube에 옮겨 vortexing한다. \(10,000 \mathrm { rpm } \) 에서 5분간 원심분리한 후 pipet을 이용하여 상등액을 새로운 tube로 옮긴다. 이를 다시 위와 같은 방법으로 원심분리하여 상등액을 모은다. Microsome을 얻기 위해 sample을 \( 18,000 \mathrm { rpm } \) 1 시간동안 원심분리한다. 상등액을 제거하고 아래의 침전물을 resuspend buffer ( \( 10 \mathrm { mM } \) potassium phosphate/ \( \mathrm { pH } 7.5 \)/, \( 0.3 \mathrm { M } \) mannitol, \( 5 \mathrm { mM } ~ \mathrm { MgCl } _ { 2 } \), \(10 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { KCl } \), \(15 \% \) glycerol)를 넣고 pipet을 이용하여 녹인다. 이때 모든 sample의 양이 동일하게 Bradford 방법을 이용하여 양을 조절한다. 이렇게 얻은 sample에 reaction buffer \( 50 \mathrm { mM } \) tricine/ \( \mathrm { pH } 7.5 \)/, \( 1 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 10 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { KCl } \), \(0.1 \mathrm { mM } \) ascorbic acid, \( 2 \mathrm { mM } \) trans-cinnamic acd, \( 0.5 \mathrm { mM } \) NADPH) \( 1 \mathrm { ml } \) 을 넣고 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30분간 반응시킨다. reaction을 멈추기위해 \( 6 \mathrm { M } \) HCl \( 100 \mu \mathrm { l } \)를 넣고 섞은 후, \( 6 \mathrm { M } \) NaOH \( 100 \mu \mathrm { l } \)를 더 넣어 \( \mathrm { pH } \) 를 맞춘다. Spectro-photometer를 이용하여 \( 340 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정한다.</p>