세포내 GST 활성 검사는 Habig 등의 방법을 활용하여 검사한다. Griffith의 방법을 바꿔 세포내 총 GSH 생성량을 검사하였다. Mouse epidermal cells, line 308을 24-well tissue culture plate에 well당 \( 2 \times 10^{5} \mathrm{~cells/ml}\) 세포를 주입하고, 해양심층수, 그리고 양성대조군으로 \( 0.01 \mathrm{~mM} \) DFMO을 처리하여 6시간 동안 배양한다. 세포내 총 단백질 양은 BCA protein kit를 활용하여 BSA를 표준 단백질 용액으로 사용한 표준검량선을 통해 그 양을 산출하였다.
<h2>GST 활성</h2> <p>세포내 GST 활성 측정은 Habig 등의 방법을 응용하여 측정하였다. Hepa 1c1c7 세포를 96-well plate에 \( 0.5 \times 10^{4} \mathrm{~cells/well}\)로 접종시키고 24시간 배양 후, 해양심층수를 경도별로 포함한 새 배양액 \( 200 ~\mu \mathrm{l} \)을 각 well에 처리하였다. 48시간 배양 후, 세포를 세척하고 용해시켰다. 배양된 세포내에서 유도된 GST 활성 측정을 위해 \( 0.1 \mathrm{~M} \) potassium phosphate buffer (\( \mathrm{pH} ~6.5\))에 \( 2.5 \mathrm{~mM} \) glutathione (GSH), \( 1 \mathrm{~mM} \) chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB)를 첨가한 혼합액을 \( 100 ~\mu \mathrm{l} \)씩 각 well에 가하고 1분간 plate shaker에서 교반한 후, 3분간 흡광도의 증가를 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA), \( 380 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다.</p> <h2>GSH 함량</h2> <p>Griffith의 방법을 변형하여 세포내 총 GSH 생성량을 측정하였다. 즉, \( 0.5 \times 10^{4} \)개의 Hepa 1c1c7세포를 \( 200 ~\mu \mathrm{l}\) MEM 배지에 부유시켜 96-well plate에 접종하였다. 24시간 배양 후, 배양액을 제거하고 해양심층수를 경도별로 처리하였다. 48시간 뒤, PBS로 세척하고 freeze-thaw cycle을 3회 반복하여 세포를 용해시킨 후, \( 40 ~\mu\mathrm{l} \) stock buffer (\(125 \mathrm{~mM}\) Na-phosphate, \( 6.3 \mathrm{~mM}\) Na-FDTA, \( \mathrm{pH} ~7.5\))를 가하고 \( 170 ~\mu \mathrm{l} \) 반응혼합물[\(6 \mathrm{~mM}\) 5,5'-dithiois-(2-nitrobenzoic acid), gluta-thione reductase solution (\(5 \mathrm{~units}\)/ \(\mu \mathrm{l}\)), NADPH-generating system {\(0.5 \mathrm{~M}\) Tris-HCl (\(\mathrm{pH} ~7.4\)), \( 150 \mathrm{~mM} \) glucose-6-phos-phate, \( 50 \mathrm{~mM} \mathrm{~NADP}^{+}\), \(100 \mathrm{~units}\) glucose-6-phosphate de-hydrogenasel}]과 반응시켰다. 상온에서 5분간 교반하면서 반응시킨 후, \(450\mathrm{~nm}\)에서 흡광도를 측정하였다. GSH 함량은 GSH 표준곡선으로 계산하였고, GSH 함량의 비는 대조군에 의한 GSH 양과 해양심층수에 의해 생성된 GSH양의 비율로 측정하였다.</p> <h2>ODC 활성</h2> <p>Mouse epidermal cells, line 308을 24-well tissue culture plate에 well당 \( 2 \times 10^{5} \mathrm{~cells/ml}\) 세포를 접종시키고, 18시간 후에 해양심층수(경도 0, 100, 200, 400, 600, 800 및 1,000), 그리고 양성대조군으로 \( 0.01 \mathrm{~mM} \) difluoromethyl- ornithine (DFMO)을 처리하여 6시간 동안 배양하였다. 세포를 \( \mathrm{Ca}^{2+} \), \( \mathrm{Mg}^{2+} \)-free PBS (\(\mathrm{pH} ~7.4\))로 두 번 세척한 후 frecze-thaw cycle을 실시하여 세포액의 ODC 활성은 L-[1-\(^{14} \mathrm{C}\)]ornithine에서 \([^{14} \mathrm{C}] \mathrm{CO}_{2} \) 방출에 의하여 측정하였다. 즉 L-[1-\(^{14} \mathrm{C}\)]orni-thine (\(200 \mathrm{~nCi}\)), \(0.2\mathrm{~M}\) sodium phosphate buffer (\(\mathrm{pH} ~7.2\)), \(12.5\mathrm{~mM}\) EDTA, \(50 \mathrm{~mM}\) dithiothreitol, \(5 \mathrm{~mM}\) pyridoxal phosphate와 unlabelled L-ornithine을 포함한 \( 200 ~\mu \mathrm{l} \) 반응액을 각 well에 첨가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 반응시키며, 방출되는 \( \mathrm{CO}_{2} \)가스를 paper disk로 모아서 radioactivity를 liq-uid scintillation counting (Beckman LS 6500, USA)으로 측정하였다. ODC 활성 억제는 TPA만 처리한 조절군에 대한 각 시료들의 저해도 정도를 percentage로 나타내었다.</p> <h2>세포내 총 단백질 검량</h2> <p>세포내 총 단백질 양은 bicinchoninic acid (BCA) protein kit를 사용하여 BSA를 표준 단백질 용액으로 이용한 표준검량선을 구하여 그 양을 산출하였다.</p>