SB 1493균주로부터 생산된 fucoidanase 활성을 측정하기 위해, 원심분리한 상층액을 여과한 후 조효소액으로 활용하였다. 활성은 다양한 \( \mathrm{pH} \) 조건에서 조사되었으며, 조형소액의 활성은 여러 완충용액에 fucoidan을 용해하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반응시킨 후 환원당으로 측정하였다. fucoidanse 활성은 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) , \( \mathrm{pH} 8 \) 에서 가장 높았으며, TLC 크로마토그램을 통해 분해산물의 변화를 관찰하였다. 이 결과 뚜렷한 oligo-saccharide \( \left(\mathrm{R}_{f} 0. 3\right) \) 만이 관찰되었다.
<h2>Fucoidan 분해특성</h2> <p>SB 1493균주로부터 생산된 fucoidanase 활성에 미치는 온도, \( \mathrm{pH} \) 에 대한 특성은 최적조건으로 2 일간 배양한 후 원심분리한 상층액을 \( 0.2 \mathrm{um} \) pore size의 여과지로 여과한 여과액을 조효소액으로 하여 조사하였다. Fucoidanase 활성을 위한 온도는 \( 1 \% \) fucoidan이 첨가된 \( 0.1 \mathrm{M} \) citric acid - sodium citric buffer \( (\mathrm{pH} \) 6.0) \( 1 \mathrm{ml} \) 과 조효소액 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 30,35 ,\( 40,45,50,55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 반응하였다. \( \mathrm{pH} \) 에 따른 조형소액의 활성은 \( \mathrm{pH} 4,5,6(0.1 \mathrm{mM} \) acetate buffer \( ), \mathrm{pH} 7 \) (0.1 M phosphate buffer), \( \mathrm{pH} \) 과 9 (0.1 M Tris-HCl buffer)로. 조정 된 완충용 액에 \( 1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) fucoidan을 용해한 기질용액 \( 1 \mathrm{ml} \) 과 조효소액 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 반응하였으며 이후 상기 기술된 방법에 의해 환원당을 정량하여 상대적 활성으로 표현하였다. SB 1493 균주의 조효소액을 대상으로 시간에 따른 효소활성과 TLC를 이용한 분해산물을 분석하였다. 반응조건은 \( 1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) fucoidan이 첨가된 \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris-HCl buf-fer 용액 \( 4 \mathrm{ml} \) 과 조효소액 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 첨가한 후 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 0,1 ,\( 2,4,6,12,24 \)시간 반응한 후 효소활성을 측정하였다. 반응액을 대상으로 한 산물의 확인을 위한 TLC분석은 Ryu 등의 방법에 따라 silica gel plate에 시료를 점적한 후 전개용매(n-bu-thanol:acetic acid: \( \left.\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}=2: 1: 1\right) \) 로 전개하였다. 전개한 plate는 전개용매를 건조시킨 후 \( 20 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \)-methanol 용액으로 분무하여 \( 150^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 건조한 후 나타나는 band를 비교하였다.</p> <p>조효소액의 온도와 \( \mathrm{pH} \) 에 따른 fucoidanase 최적활성을 확인한 결과는 Fig. 2에 도식화하였다. 조효소액에서 fucoidanse 활성은 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) (활성영역: \( 45^{\sim} 55^{\circ} \mathrm{C} \) ), \( \mathrm{pH} 8 \) (활성영역: \( \mathrm{pH} \) 7 9)로 결정되었다. 기존보고에 따르면 endo- 또는 exo-fucoida-nase의 주된 보고는 Pseudoalteromonas, Alterominas, Vibrio, Sphinomonas, Fucobacteria, Gelidibacter, Vibrio속 등으로 해양 세균에서 발견되어져 왔으며[2,5,9,13-14,24-28,30,33] 특히, Pseudalteromonas, Gelidibacter, Sphinomonas 및 Alterominas 가 생산하는 형소는 endo-type으로 fucoidan으로부터 다양한 형태의 저분자량인 oligosaccharide를 생산하는 것으로 보고하였다. SB 1493 균주가 생산하는 조효소액과 fucoidan을 반응하였을 때 Fig. \( 3 \mathrm{~A} \) 에서 보는 것과 같이 fucoidanase에 의해 환원당은 4시간 \( (0.54 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)까지 급격히 증가하였 고 이후 24시간 까지 \( (0.71 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 완만히 증가하였다. TLC 크로마토그램을 통한 분해산물의 변화를 관찰한 결과 하나의 뚜렷한 oligo-saccharide \( \left(\mathrm{R}_{f} 0.3\right) \) 만이 관찰되었다). 이러한 결과로 SB 1493균주는 endo-type의 oligosaccharide로 가수분해된 반면 fucose는 검출되지 않았다.</p>