균질화된 토마토 주스를 원심분리하여 Sep-pak에 통과시켜 분리한 분획물로 NDMA 생성 억제용 시료를 만들었다. 이 중 NDMA 생성 억제 효과가 가장 뛰어난 것으로 Phenolic 획분의 구조를 Duncan's multiple test에 따라 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험재료</h2><p>선도 좋은 완숙 토마토(Lycopersicon esculentum cv. Naomi F1)를 경남 진주시 중앙시장에서 구입하여 흐르는 물에 깨끗이 씻은 후 단시간에 물기를 제거하여 균질화시켜 실험에 사용하였다.</p><h2>Sep-pak \( C_{18} \) cartridge를 이용하여 phenolic 화합물의 분리</h2><p>균질화된 토마토 주스 \( 100\mathrm{g} \)을 원심분리(\( 8000 \mathrm{rpm}\), \( 20 \mathrm{min} \))하여 얻은 상등액을 Seo와 Morr의 방법에 따라 \( 2 \mathrm{~N} \)\( \mathrm{HCl} \)로 \( \mathrm{pH} 2.5\)로 조정한 후 \( 5\mathrm{ml} \)의 메탄올, 3차 증류수 및 \( 0.01\mathrm{~N} \mathrm{~HCl} \)로 미리 활성화시킨 Sep-pak \( \mathrm{C}_{18} \) cartridge에 통과시켰다. 이때 Sep-pak을 통과한 물질을 ascorbate 획분, Sep-pak에 잔존하는 물질을 \(0.01\mathrm{~N} \mathrm{~HCl} \)로 세척한 후 \( 75\% \) 메탄올 \( 5\mathrm{ml} \)에 용리시켜 얻은 것을 phenolic 획분으로 하였다. 각 분획물은 회전식 진공 농축기로 완전건고한 후 3차 증류수에 용해시켰다. 이를 HPLC(LCC 2252, Pharmacia LKB, Sweden)에 주입하여 phenolic 화합물을 분리하였으며, HPLC의 분석조건은 \( \mu \) Bondapak \( C_{18} \) column(\( 3.9 \mathrm{mm} \times 300 \mathrm{mm} \), Waters, USA), 이동상 용매로 A (\(2\%\) acetic acid)와 B (\(40\%\) acetonitrile)를 이용하여 처음 50분 동안 \(10 \% \) B에서 \( 80 \% \) B까지 되게 하고, 이후 30분간 이를 유지하였으며, 100분까지 \( 0\% \)가 되도록 조건을 설정하였으며, 이때 유속은 \( 1.0 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \)로 하였다. Phenolic 화합물의 분획은 prep-HPLC를 사용하였으며, column은 pre-column인 Shim-pack G-ODS(\(8 \times15 \mathrm{~mm} \), Shimaduz Co., Japan)가 장착된 prep-ODS(\(8 \times 15 \mathrm{~mm} \), Shimaduz Co., Japan), \( 254 \mathrm{~nm} \)에서 UV detector(Pharmacia LKB VWM Detector, Sweden)로 검출하였으며, 유속은 \( 5.0 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \)로 하였다.</p><h2>NDMA 생성 억제에 대한 모델계 실험</h2><p>토마토 주스로부터 Sep-pak을 이용하여 분리한 ascorbate, phenolic 획분 및 prep-HPLC에 주입시켜 얻은 각 분획물을 모아 회전식 진공증발기로 이동상 용매를 제거한 후 증류수에 용해시켜 NDMA 생성 억제용 시료로 하였다. 반응계는 \(100 \mathrm{mM} \) 아질산나트릅 용액 \( 1 \mathrm{ml} \) 에 ascorbate 및 phenolic 분획물을 첨가한 후 \( 0.1\mathrm{~N} \mathrm{~HCl} \) 및 \( 0.2\mathrm{M} \) 구연산 완충액( \( \mathrm{pH}1.2\) 및 \( \mathrm{pH} 4.2)\)으로 각각 조제한 \( 200\mathrm{mM} \) dimethylamine(DMA)용액 \(0.5\mathrm{ml} \)를 가하고 상기 완충액으로 총 부피를 \( 10\mathrm{ml} \)로 한 후 \(37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 ammonium sulfamate를 가하여 반응을 정지시키고 dichloromethane (DCM) \(1\mathrm{ml} \)를 가하여 반응용액 중의 NDMA를 추출한 후 회수한 DCM층을 무수황산나트륨으로 탈수시켜 GC(5890A, Hewlet-Packard, USA)-TEA(543, Thermo Electron Corp., USA)로 NDMA를 분석하였다. GC-TEA의 분석조건은 \( 10\% \) carbowax \( 20 \mathrm{M}\)/ 80~100 chromosorb WHP로 충전한 column을 이용하였고, He 가스의 유속은 \(25 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \), injection port의 온도는 \(180^{\circ} \mathrm{C} \), pyrolizer 온도는 \(550^{\circ} \mathrm{C} \), interface 온도는 \(200^{\circ} \mathrm{C} \), 압력은 \(1\mathrm{mmHg} \)로 하였다. 대조구는 시료액 대신 동량의 증류수를 사용하였으며, NDMA 생성 억제 효과는 대조구에 대한 peak의 백분율(\(\%\))로써 환산하였다.</p><h2>Phenolic 획분의 구조 분석</h2><p>토마토 주스로부터 분획한 phenolic 획분 중 NDMA 생성억제 효과가 가장 뛰어난 획분(subfraction 2b)을 prep-HPLC로 분취하여 회전식 진공증발기로 이동상 용매를 제거한 다음 \( 75\% \) 메탄올, \(5\% \mathrm{~H}_{2} \mathrm{SO}_{4}\) \(5\mathrm{ml} \)를 가하여 \(70^{\circ} \mathrm{C} \) 수욕상에서 5시간 가열한 후 완전 건고시켰다. 이것을 3차 증류수에 녹인 다음 분액여두를 이용하여 에테르 및 애틸 아세테이트를 차례로 가하여 에테르 및 에틸 아세테이트 획분을 모아 TLC(ethylacetate : acetone =5:1, \( \mathrm{v} / \mathrm{v}) \)를 행하였다. 이를 GC-MS(Shimadazu QP-1000EX), NMR(Bruker DRX \(500 \mathrm{MHz} \) )을 사용하여 구조를 분석하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>본 실험 결과는 3회 반복 측정 후 평균\(\pm\)표준편차로 나타내었으며, SPSS 12.0을 이용하여 각 실험군간의 유의성을 검증한 후 \( \mathrm{p}<0.05 \) 수준에서 Duncan's multiple test에 따라 분석하였다.</p>