본 실험에서는 균 Bacillus sp. LP03을 LB-broth 배양하여 사용하고, gasoline이 포함된 Gold Soil 토양에 완두콩을 심어 13일간 배양하였다. 균 수의 측정과 작물 생육 정도를 파악하기 위해 2일간 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\)에서 배양된 균을 원심분리하고 0.1% \(\mathrm{HgCl}_{2} \) 용액으로 멸균한 씨앗들을 화분에 심어 뿌리와 줄기 길이를 관찰하였다. hydrocarbons 분해 측정을 위하여 hydrocarbons양은 각 날짜 별 토양 샘플들을 구하여 toluene과 같은 부피로 섞어 토양에서의 hydrocarbon를 추출하였다. 또한 itu gene의 발현 정도의 측정을 위하여는 Detector \( ^{\mathrm{TM}} \) PCR DNA Biotinylation Kit의 biotinylated probe를 사용하였다. 통계적으로 분석해보면 실험은 각 토양 0,2,4,6,8,10 and 13 day 간격으로 각 처리당 2번 반복하여 처리하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용 균주 및 Sample 준비</h2> <p>본 실험에 사용된 균 Bacillus sp. LP03(이하 LP03)은 이미 발표된 균주로 배양온도 및 배지조건은 LB-broth (Gelix, Korea)를 사용하여 최적온도인 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2일 동안 배양하여 사용 하였다.</p> <p>본 포장실험에 사용된 토양은 비옥한 토양(Gold Soil)으로 시중 원에상가에서 구입하였으며 이렇게 구입된 토양 \( 100 \mathrm{g} \)에 gasoline을 \(1\%\) 또는 \(2\%\)의 비율로 혼합한 후 원예상가에서 구입한 규조토로 2분의1정도의 공간을 충진 하였으며 이렇게 준비된 gasoline 혼합 토양에 발아 상태로 유도한 완두콩(중류수에 하루 동안 침지)을 심은 후 배양된 균을 첨가하여 실험날짜에 따라 실험에 사용하였다. 모든 pot 실험은 실내의 자연상태에서 실시 하였으며 작물과 함께 gasoline이 포함된 pot는 gasoline의 자연손실로부터 보호하기 위하여 빛이 투과하는 비닐로 밀봉하였다.</p> <h2>균 수의 측정 및 작물생육 정도 파악</h2> <p>Gasoline으로 오염된 토양에 심어진 작물(완두콩) pot는 자연상태에서 13일 동안 배양하였다. 이때 2일간 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양된 균을 원심분리 후 3차 증류수에 현탁 후 접종 하였으며 pot의 duplicated sets중 하나는 각 2, 4, 6, 8, 10, 13일째에 총 bacteria의 수를 측정하고, 다른 하나는hydrocarbon 분해 정도와 토양 속에 포함된 total RNA 추출에 사용하였다</p> <p>Bacillus sp. LP03 균 수의 측정은 pot에서 배양 날짜 별로 추출한 토양을 증류수에 현탁 한 후 LB-broth 액체배지에 배양하고 배양액에서 취한 균을 희석하여 LB agar plates 위에 도말 한 후 \( 30{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양 후 모든 colonies 의 수를 계측하고 각 배양 날짜 별 계측 균 중 각각 5개의 colonies를 임의로 선택하여 P.C.R 법에 의해 LP03임을 확인 하였다. 시험에 사용된 작물인 완두콩(green gram)의 씨앗들은 시중 원예상가에서 구입하였으며 씨앗들을 증류수에 적셔주고 씨앗들로부터 부유물들을 제거하였다.</p> <p>같은 크기의 씨앗들의 표면을 \(0.1\%\) \(\mathrm{HgCl}_{2} \) 용액으로 2-3분 동안 멸균하고, 실험용 gasoline 혼합토양 pots에 심어 13일 동안 생육 시킨 후 뿌리와 줄기 길이를 관찰하였다.</p> <h2>Hydrocarbon 분해측정 및 total RNA의 분리</h2> <p>총 hydrocarbons양은 각 날짜 별 토양 samples을 취해서 toluene과 같은 부피로 섞어 토양에서의 hydrocarbon를 추출하였다. 추출한 hydrocarbon는 UV spectrophotometer를 사용하여 \( 420 \mathrm{nm} \)에서 확인하였다. gasoline의 농도는 standard curve를 사용하여 토양 samples의 hydrocarbon의 양으로 판단하였고, 감소는 3일째 되는 토양 samples로부터 총 hydrocarbon의 차이에 의해 결정했다. 각 실험 날짜는 2, 4, 6, 8, 10, 13일로 하였다.</p> <p>토양 samples로부터 중 RNA의 추출과 조절을 위해, 이 실험에 사용한 모든 실험도구는 \(0.1\%\) diethylpyrocarbonate(DEPC)을 처리한 후 autoclave 하여 RNase를 제거하였다. 모든 물과 solutions는 \(0.1\%\) (DEPC)를 처리하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤 autoclave 하였으며 \( 1 \mathrm{g} \)의 토양 samples에 \( 1 \mathrm{ml} \)의 lysis buffer (\( 10 \mathrm{mM} \) Tris, \( \mathrm{pH} 8.0 \), \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \(20\%\) sucrose, \(50\mathrm{mM} \mathrm{~NaCl}\), \(10 \mathrm{ \mu g} / \mathrm{ml} \) proteinase K, \(0.1\%\) SDS)를 첨가하여 충분히 섞어 주고 난 후 samples은 1시간 동안 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 incubation하였다. \( 0.5 \mathrm{ml} \)의 각 혼합액의 상등액에 \( 1 \mathrm{ml} \)의 easyBlue \( ^{\mathrm{TM}} \) total RNA extraction kit (iNtRon \( { }^{\mathrm{TM}} \), Korea)를 첨가하고 이하 extraction kit에 준하여 RNA를 추출하였다.</p> <h2>Iturin gene의 발현 정도 측정</h2> <p>itu gene의 발현양의 측정을 위해 Detector \( ^{\mathrm{TM}} \) PCR DNA Biotinylation Kit (KPL, U.S.A)의 biotinylated probe를 사용하였으며 primers ItuF (5'-GAGCGATGCGATCTCCTTG-3')와 ItuR (5'-GGCGTGCAGTGACATTTTG-3')을 각 \( 0.15\mu \mathrm{M} \)씩 \( 0.1 \mu l\)의 Bacillus. sp LP03의 chromosome을 주형으로 하여 증폭시켰다. Probe 작성은 thermocycler (Px2 thermal cycler, Thermo Electron Co. U.S.A.)PCR기를 사용하였으며 생성된 probe 혼합액(\( 200 \mu l\))는 AccuPrep PCR Purification Kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 순수분리 하였다.</p> <p>앞에서 추출한 RNA samples을 positive charged nylon membrane (Roche Diagnostics GmbH, UK) \( 2 \mu l\)씩 올려놓고 RNA는 UV \( 254 \mathrm{nm} \)에서 10분 동안 membrane에 고정하였다. 그리고 작성된 itu gene (iturin D)을 probe하여 hybridization하였으며 과정은 RNA Detector \( { }^{\mathrm{TM}} \) Northern Blotting Kit (KPL, U.S.A.)에 준하여 사용하였다.</p> <h2>통계적 분석</h2> <p>각 토양 0,2,4,6,8,10 and 13 day 간격으로 각 처리당 2번 반복하여 처리하였으며 모든 수치의 결과의 측정된 값은 Microsoft® Excel 2002를 이용하여 평균값 및 표준 편차를 구하여 이를 그래프로 나타내었다.</p>