단백질 과발현 체계로 대장균을 이요하여 PFA 단백질을 과발현하고 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 정제된 PFA 단백질은 브래드포드 방법으로 정량한다. immunoblot analysis를 통해 면역혈청은 PFAP 단백질의 확인에 사용된다. SDS-PAGE를 통해 단백질 시료를 넣어 용해한 후 transfer로 단백질을 분리하는데 항체와 반응및 참착물 생성을 확인한다. 최종적으로 증류수 세척으로 반응을 중지한다.
<h2>재조합 단백질 PFAP의 과발현과 정제 및 PFAP 특이적인 다클론성 항체의 제조</h2> <p>PFAP 단백질을 대량 생산하기 위해서 대장균을 이용한 인위적인 단백질 과발현 체계를 사용하였다. 단백질 발현을 위한 PFAP의 유전자는 E. tarcla CK41 염색체 DNA를 주형으로 하여 HY532F와 HY533R primer 쌍을 이용한 PCR을 통해 1.2 \( \mathrm { kb } \) 크기의 DNA단편을 증폭한 후 단백질 발현 벡터인 \( \mathrm { pProEX } { } ^ {\mathrm { TM } } \mathrm { HTb } \) (Invitrogen)에 삽입하여 재조합 플라스미드 \( \mathrm { pBP793 } \) 을 구축하였다. \( \mathrm { pBP } 793 \) 을 가지는 E. coli BL21을 1 \( \mathrm { mM } \) IPTG가 들어있는 배양조건에서 배양하여 과량의 46 \( \mathrm { kDa } \) 크기의 단백질이 발현되는 것을 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다. 재조합 단백질이 과발현된 \( E \). coli \( \mathrm { BL } 21 \) 을 수거하여 French Pressure (Thermo Electron Cooperation)을 사용해 균주를 파쇄하고 원심분리를 통하여 분획을 나누어 재조합 단백질 PFAP 분획을 수거하였다. 재조합 단백질 PFAP의 정제근 \( \mathrm { Ni } ^ { 2 + } \)-sepharose (GE Healthcare)를 이용한 친화성 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 최종적으로 정제된 PFAP 단백질은 SDS-PAGE를 통하여 단일 단백질 밴드로 확인할 수 있었으며, 단백질의 농도를 브래드포드 방법을 사용해 정량하였다. PFAP 특이적인 다클론성 항체를 얻기 위해서 \( 500 \mu \mathrm { g } \) 의 정제된 재조합 PFAP 단백질을 실험토끼에 동량의 Freund's adjuvant (Sigma)와 함께 3 주 간격으로 2회 주사하였다. 실험토끼로부터 얻은 면역혈청은 immunoblot analysis를 통하여 PFAP 단백질의 확인에 사용되었다.</p> <h2>SDS-PAGE 및 immunoblot analysis</h2> <p>단백질 시료들을 \( 2 \times \) digestion buffer [20 \% (v/v) glycerol, \( 4 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) SDS, 0.2 \% (w/v) bromophenol blue, \( 200 \mathrm { mM } \beta \) -mercaptoethanol, \( 100 \mathrm { mM } \) Tris-HCl buffer, pH6.8]에 용해하였다. 용해된 단백질을 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분간 가열한 후, 비연속적 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에 의해 분리하였다. 분리된 단백질은 Coomassie brilliant blue G-250 (Sigma)을 통한 염색과 탈색으로 시각화하였다. SDS-PAGE를 통해 단백질 시료를 분리한 후 transfer 장치(BioRad)를 사용하여 단백질을 nitrocellulose membrane (BioRad)으로 이동시켰다. Towbin 등에 의해 기술한 바와 같이 blocking solution [5% skim milk를 함유하는 Towbin's Saline Buffer (TSB)]에서 3시간 membrane을 blocking 시킨 후, 1 차 항체를 \( 1: 400 \) 으로 blocking solution에 희석하여 2시간 반응시켰다. TBS로 수 회 세척한 membrane에 2차 항체인 peroxidase conjugated goat anti-Rabbit IgG (Sigma)를 1:1,000의 비율로 blocking solution에 희석하여 2시간 반응시켰다. TSB로 수 회 세척한 membrane의 단백질 밴드는 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) (Sigma)와 4-chloro-1-naphthol (Sigma)이 포함된 용액에서 자주색의 침착물이 생성되는 것으로 확인하고, 다량의 증류수 세척을 통하여 반응을 중지시켰다.</p>