흰쥐에 자보양영환의 열수추출물을 경구 투여하고 대조군의 경우 사염화탄소를 복강 투여하여 간독성을 유발시켰다. 그리고 채취한 혈액의 혈청을 분리하여 간 지표 효소를 측정하였다. 또한 간 조직의 Microsome을 분리하고 단백질 농도를 측정하여, 간 조직의 TBA 반응성물질의 함량측정 및 간의 이물질대사효소의 활성을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시험물질의 제조</h2> <p>실헙에 사용된 자보양영환의 한약재 조성은 동의보감에 준하였으며 건조된 약재는 서울 경동시장에서 구입하였다. 한약재의 형태가 완전한 것만을 선별하여 물로 세척한 다음 음건하여 사용하였고 자보양영환의 구성약재 조성 및 분량은 Table 1과 같다. 일반적으로 자보양영환은 환제로 제조하여 복용하는데, 본 연구에서는 환제로의 제조 및 실험상의 편리함을 고려하여 자보양영환에 사용되는 약재들을 cutting mill로 세절한 다음 \( 2 \mathrm{~L} \)의 증류수로 3시간 동안 열수추출하였다. 추출액은 거즈로 거른 다음 원심분리 및 여과지로 여과하였으며, 추출액은 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 회전농축기로 농축하였다. 농축된 시료는 동결건조기로 완전 건조를 하였으며 얻어진 자보양영환 열수추출물(JAE)의 수율은 \( 15 \% \)이다.</p> <h2>실험동물의 사육조건</h2> <p>실험동물은 생후 6주 경과한 \( 180 \sim 200 \mathrm{~g} \)의 Sprague-Dawley (SD)계 횐쥐 수컷만을 선별하여 사용하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 \( 23 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 55 \pm 5 \% \), 배기 \( 10 \sim 18 \)회/hr, 형광등 명암 \( 12 \mathrm{hr} \) cycle,조도 \( 300 \sim 500 \) Lux의 사육환경에서 rat 용 폴리카보네이트 사육상자 \( (240 \mathrm{~W} \times 400 \mathrm{~L} \times 180 \mathrm{H} \mathrm{mm}) \)에 2마리씩 넣어 사육하였다. 실험동물의 사료는 신촌사료(주) 제품의 고형사료를 사용하였으며 깔짚은 (주)삼육 제품의 버드나무송으로 만든 것을 사용하였다. 음수는 멸균된 수돗물을 자유롭게 섭취하도록 하였다.</p> <h2>시험물질 투여 및 실험군</h2> <p>정상군은 독성물질 투여나 시헙물질의 균질액을 급여하지 않고 생리식염수만을 경구 투여하였으며, \( \mathrm{CCl}_{4} \) 단독 투여군인 대조군은 생리식염수를 경구투여하면서 독성물질인 사염화탄소를 복강 투여하였다. 자보양영환의 열수추출물 투여군인 JAE300, JAE600, 그리고 JAE1200은 각각 체중\( \mathrm{kg} \) 당 \( 300 \mathrm{mg}, 600 \mathrm{mg}, 1200 \mathrm{mg} \) 에 해당하는 농도로 1일 1회씩 7일 동안 경구투여하였다. 검액의 최종 투여 후 사염화탄소롤 체중 \( \mathrm{kg} \) 당 \( 1 \mathrm{ml} \)의 용량을 복강주사로 투여하였다. 사염화탄소 투여 후 24시간 사육한 횐쥐를 \( 20 \% \) ure-thane으로 마취한 다음 심장천자로 혈액을 채취하였다. 채혈 후 개복하여 간을 적출하였으며 실험군의 동물 수는 각 각 6마리씩 사용하였다.</p> <h2>간 독성 유발</h2> <p>건조된 추출물 \( (300,600,1200 \mathrm{mg} / \mathrm{kg}) \) 혹은 생리식염수를 7일 동안 매일 경구 투여한 횐쥐에 사염화탄소를 복강 투여하여 간손상을 유도하였다. 사염화탄소는 corn oil에 1:1 (V/V)의 비율로 혼합하여 체중 \( \mathrm{kg} \) 당 \( 1 \mathrm{ml} \)의 용량을 1회 복강 투여하여 간 독성을 유발시켰다.</p> <h2>혈청의 간 기능 지표효소 측정</h2> <p>채취한 혈액은 실온에서 30분간 방치한 후 \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청의 asp-artate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase(ALT), 그리고 alkaline phosphatase (ALP)는 혈청 자동분 석기(Hitachi-7150, Hitach medical Co.)로 측정하였다.</p> <h2>간 조직의 Microsome 분리</h2> <p>Bansal 등의 방법에 따라 적출한 횐쥐의 간을 잘게 썰고, \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{KCl} \)을 함유한 \( 30 \mathrm{mM} \) Hepes 완충액( \( \mathrm{pH}~7.4) \)으로 5배 희석하여 균질화한 다음 원심분리관에 넣고 700\( \mathrm{g} \)로 20분 동안 원심분리하였다. 상등액은 원심분리 및 초고속원심분리과정을 거쳐 최종 pellet을 얻었으며 Hepes 완충액으로 재균질화하여 microsome 분획을 얻었다. Micro-some을 분리하는 전 과정은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)하에서 수행하였으며 시료는 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하면서 각종 실험에 사용하였다</p> <h2>단백질 정량</h2> <p>Bovine serum albumin (BSA)을 표준물질로 사용하여 Lowry 등의 방법에 따라 단백질 농도를 측정하였다.</p> <h2>간 조직의 TBA 반응성물질의 함량측정</h2> <p>Microsomal membrane의 지질과산화 정도를 비교하기 위하여 시험관에 microsome을 넣은 후 \( 0.1 \mathrm{mM}\) NADPH와 \( \mathrm{ADP}^{-\mathrm{Fe}^{2+}}\left(0.5 \mathrm{mM} \mathrm{~ADP}, 0.02 \mathrm{mM} \mathrm{~Fe}{ }^{2+}\right) \)를 첨가하고 37\( { }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시켰다. 반응액은 Suematsu 등의 방법에 따라 \( 532 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정으로 thiobarbituric acid 반응성물질의 함량을 결정하였다.</p> <h2>간의 이물질대사효소 활성측정</h2> <p>Cytochrome P450의 함량은 Omura와 Sato의 방법을 따랐으며 간 microsome 단백질이 \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도가 되도록 \( 30 \mathrm{mM} \) Hepes 완충액 \( (\mathrm{pH} 7.4) \)으로 희석하여 측정하였다. Cytochrome P450은 파장 \( 450 \mathrm{~nm} \)와 \( 490 \mathrm{~nm} \)에서의 흡광도 차이로 환산하였으며, cytochrome P450 reductase의 활성도는 William와 Kamin의 방법에 따라 \( 550 \mathrm{~nm} \)에서 3분간 흡광도 변화를 측정하여 밀리몰흡광계수 21 \( \mathrm{mM}^{-1} \mathrm{~cm}^{-1} \)를 이용하여cytochrome c의 환원속도로 계산하였다.</p> <h2>통계학적 분석</h2> <p>실험결과는 각 군의 평균(Mean) \( \pm \) 표준편차(SD)로 표기 하였으며, 정상군 및 대조군과 JAE 투여군과의 상호비교는 Student's t-test로 유의성을 검정하여 \( \mathrm{P}<0.05 \) 이하의 경우 유의한 차이가 있다고 판정하였다.</p>