탱자 및 매실의 항균활성 검정을 위하여 사용된 V. parahaemolyticus 균주는 기초배지로는 Mueller Hinton agar에 2 \% ~ \mathrm{NaCl}2% NaCl이 첨가된 배지,균주의 계대 및 활성화를 위한 배지로는 Nutrient agar & broth를 사용하였다. 추출한 각 물질의 항균력 검정은 Zaika의 paper disk법으로 측정하였고 추출은 열수추출과 알칼리 첨가 추출로 최적조건을 확인하였다.
<h2>균주 및 배지</h2> <p>탱자 및 매실의 항균활성 검정을 위하여 사용된 V. parahaemolyticus 균주는 부산광역시 보건환경연구원에서 환자로부터 분리한 것을 분양 받았으며, 기초배지로는 Mueller Hinton agar에 \( 2 \% ~ \mathrm{NaCl} \)이 첨가된 배지를 사용하였으며, 균주의 계대 및 활성화를 위한 배지로는 Nutrient agar & broth를 사용하였다.</p> <h2>항균력 검정</h2> <p>추출한 각 물질의 항균력 검정은 Zaika의 paper disk법으로 측정하였다. 즉, 항균성 시험용 평판배지의 조제는 각각의 생육배지로 멸균된 기층용 배지를 petri dish에 \( 15 \mathrm{ml} \)씩 분주하여 응고시키고, 중층용 배지를 각각 \( 5 \mathrm{ml} \)씩 시험관에 분주하여 멸균한 후, \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 수욕상에서 보관하면서, 시험균액(멸균식염수로 균 현탁액을 만들어 균 농도를 \( 660 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도가 0.3이 되게 조제한 것) \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 무균적으로 첨가하여 잘 혼합 한 후 기층용 배지위에 분주한 뒤 고르게 응고시켜 2중의 시험용 균접종 평판배지를 만들어 사용하였다. 각 추출물을 \( 0.45 ~ \mu \mathrm{m} \) membrane filter(Millipore Co. USA)로 여과하여 멸균된 filter paper disk (Toyo seisakusho, \( 8 \mathrm{~mm} \))에 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 흡수시킨 후, 시험용 평판배지 표면에 놓아 밀착시키고 냉장고(\( 4^{\circ} \mathrm{C}\))에서 1시간 동안 방치시킨 다음 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) in-cubator에서 \( 24 \sim 48 \)시간 동안 배양한 다음 disc 주변의 clear zone 직경(\(\mathrm{mm}\))을 측정하여 항균력을 비교하였다.</p> <h2>추출조건</h2> <h3>열수추출</h3> <p>추출용매로 물을 이용할 경우, 탱자와 매실의 최적 추출조건을 검토하기 위하여, 파쇄하고 제핵한 각 시료 \( 200 \mathrm{~g} \)을 \( 6,000 \mathrm{rpm} \)의 전기믹서(신일산업, SFM-1000DLI)에서 각 추출온도로 예열한 \( 400 \mathrm{ml} \)의 물과 함께 2분간 마쇄한 후 20(실온), 40, 60, 80 및 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)의 각 온도로 예열한 다단오푼식 항온수조에 담가 \( 10\), \(20\), \(30\), \(40 \) 및 50분간 가열한 후 Büchner여과기와 \( 4.5 ~ \mu \mathrm{m} \)의 membrane filter로 여과하여 항균활성을 측정하였다.</p> <h3>알칼리 첨가 추출</h3> <p>식품첨가물 중 알칼리로 사용되는 수산화나트륨(\(\mathrm{NaOH}\)), 탄산칼륨 (\(\mathrm{K}_{2} \mathrm{CO}_{3}\)) 및 탄산수소나트륨 (\(\mathrm{NaHCO}_{3}\)) 3종을 \( 0.125 ~ \mathrm{N} \) 농도로 첨가하고 미리 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)로 예열한 \( 400 \mathrm{ml} \)의 용액에 제핵한 시료 \( 200 \mathrm{~g} \)을 각각 첨가하고 열수추출과 같이 마쇄한 후 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)의 항온수조에서 30분간 가열한 후 여과한 여액의 항균활성을 알칼리를 첨가하지 않은 대조구의 항균활성과 비교하여 가장 효과가 좋은 알칼리를 선정하였다. 또한, 앞서의 실험결과에서 선정된 알칼리를 첨가할 경우 최적의 첨가량 및 적정온도를 확인하기 위하여, 열수추출 결과를 토대로 설정한 추출온도로 예열한 \( 400 \mathrm{~ml} \)의 물에 선정된 알칼리를 \( 0\), \(0.4\), \(0.6\), \(0.8\), \(1.0 \) 및 \( 1.2 \mathrm{~g} \)씩과 각 시료 \( 200 \mathrm{~g} \)씩을 첨가하고 80과 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)의 항온수조 및 \( 120^{\circ} \mathrm{C} \)의 고압중탕조(한일 엠이, EXT-300A)에서 30분간 가열추출을 시행하였다. 추출한 각 시액은 앞서의 경우와 동일하게 항균활성을 측정하여 알칼리 첨가시 최적조건을 확인하였다.</p>