실험동물에서 채혈 분리한 혈청 \(\alpha\)-amylase 활성은 amylase 활성 측정용 kit (Phadebas kit, Magle Life Sciences, Sweden)를 이용하여 흡광도 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 효소활성을 측정하였다. 세포 내의 산화적 스트레스에 의해 생성되는 활성산소종을 무독화시키는 항산화 효소인 SOD활성도 측정은 SOD Assay Kit-WST (Sigma-Aldrich)로 사용하여 흡광도 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 효소활성을 측정하여 superoxide redical을 \( 50 \% \) 저해활성 하는데 필요한 SOD}량을 효소활성의 1 단위로 표현하었다. GSH-Px는 체내 대사 산물이나 산화적 스트레스로 생성된 활성산소종의 하나인 과산화수소 \( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \)와 phospholipid hydroperoxide 등을 분해하는 체내 항산화기전의 중요한 효소인 GSH-Px활성 측정은 Glutathione Peroxidase Cellular ActivityAssay Kit (Sigma-Aldrich)에 의해 흡광도 \( 340 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 세포나 조직에서 산화적 스트레스의 지표로 사용되는 지질과산화물(Lipid peroxidation, LPO) 생성은 TBARS Assay Kit(Cayman, MI, USA)에 의하여 흡광도 \( 530 \sim 540 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 즉 지질과산화로 생성된 malondialdehyde와 thiobarbituric acid의 반응으로 생성된 thiobarbituric acid reactive substrate를 측정하여 MDA 표준곡선에 의하여 산출된 수치를 단백질 \( 1 \mathrm{mg} \) 당 \( \mathrm{nmol} / \mathrm{l} / \mathrm{mg} \)으로 표현하였다. [6]-gingerol이 산화스트레스성 cerulein 유도 급성췌장염에서 췌장세포 방어기전으로 효소계 산화방어 기전인 SOD 및 GSH-Px의 전사량에 얼마나 영향력을 미치는지 연구하기 위하여 췌장조직에서 RNA를 분리 역전사 중합효소연쇄반응을 시행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험동물 사육 및 [6]-gingerol 투여</h2> <p>10주령 Swiss Webster 마우스 암컷( n=5/group)을 기본고형사료(Samyang Corp., Jeollabuk-do, Korea)로 일정한 조건(온도 \( 22 \pm 2^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 45 \sim 55 \% \), 명암: 12 시간 light/dark cycle)에서 일주일간 적응시킨 후, 완전 임의배치 방법으로 대조군, cerulein 투여군, cerulein과 [6]-gingerol 투여군으로 나누었다. Cerulein 유도 급성췌장염 유발 전 4일 동안 [6]-gingerol (\( 0.1\mathrm{mg} / \)day, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 \(0.9\%\) 생리식염수에 녹여 하루에 한번 경구 투여하였다. 선행 실험에서 실험동물 사료 \( 100 \mathrm{~g} \) 당 \( 0.002 \% \)를 초과하는 경우 동물의 체중과 식이섭취량에 영향을 미치는 결과(not shown data)를 보여 본 실험에서 [6]-gingerol이 사료 \( 100 \mathrm{~g} \) 당 \( 0.002 \%(\mathrm{w} / \mathrm{w}) \)를 초과하지 않는 량으로 실험동물 체중 \( 20 \mathrm{~g} \) 당 \( 0.1 \mathrm{mg} \) 용량으로 하루에 한번 경구투여 하였다. 대조군에는 동량의 \( 0.9 \% \) 생리식염수를 경구투여 하였다.</p> <h2>급성췌장염 유발 및 혈청분리</h2> <p>실험동물에 \( 50 \mathrm{\mu g} / \mathrm{kg} \) cerulein (Sigma-Aldrich)을 복강주사하여 급성췌장염을 유발하였으며 실험 대조군에 동량의 \( 0.9 \% \) 생리식염수를 복강 투여하였다. 실험동물은 첫 번째 주사 후 10시간째에 희생시켜 혈액을 채취하여 \( 1,500 \times g\left(4^{\circ} \mathrm{C}\right), 20 \)분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 실험동물의 췌장조직을 적출하여 조직의 무게를 측정하고 액체질소로 급속 동결하여 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하여 실험에 사용하였다.</p> <h2>\(\alpha\)-amylase 활성 측정</h2> <p>실험동물에서 채혈 분리한 혈청 \(\alpha\)-amylase 활성은 amylase 활성 측정용 kit (Phadebas kit, Magle Life Sciences, Sweden)를 사용하여 흡광도 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 효소활성을 측정하였다.</p> <h2>SOD 활성 측정</h2> <p>세포 내의 산화적 스트레스에 의해 생성되는 활성산소종을 무독화시키는 항산화 효소인 SOD활성도 측정은 SOD Assay Kit-WST (Sigma-Aldrich)로 사용하여 흡광도 \( 450 \mathrm{~nm} \)에서 효소활성을 측정하여 superoxide redical을 \( 50 \% \) 저해활성 하는데 필요한 SOD}량을 효소활성의 1 단위로 나타내었다.</p> <h2>GSH-Px 활성 측정</h2> <p>GSH-Px는 체내 대사 산물이나 산화적 스트레스로 생성된 활성산소종의 하나인 과산화수소 \( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \)와 phospholipid hydroperoxide 등을 분해하는 체내 항산화기전의 중요한 효소인 GSH-Px활성 측정은 Glutathione Peroxidase Cellular ActivityAssay Kit (Sigma-Aldrich)에 의해 흡광도 \( 340 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. \(1 \mathrm{unit}\)는 GSH-Px가 1분 동안 NADPH를 \(\mathrm{NADP}^{+} \)로 산화시키는 양을 기준으로 아래와 같이 계산되었다.</p> <p>Activity per extract \( (\mathrm{mmol} / \mathrm{min} / \mathrm{ml}= \mathrm{Units} / \mathrm{ml})=\left(\mathrm{DA} 340^{*}\right. \) dilution factor \( ) /\left(6.22^{*} \mathrm{~V}\right) \)</p> <p>\( DA_{340}=A_{340} / \min \left(\right. \) blank) \( -A_{340} / \mathrm{min} \) (sample); \( 6.22=\varepsilon^{\mathrm{mM}} \) for NADPH; \( \mathrm{V}= \) sample volume in \( \mathrm{ml} \) )</p> <h2>Lipid peroxidation (LPO) 생성 측정</h2> <p>세포나 조직에서 산화적 스트레스의 지표로 사용되는 지질과산화물(Lipid peroxidation, LPO) 생성은 TBARS Assay Kit(Cayman, MI, USA)에 의하여 흡광도 \( 530 \sim 540 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 즉 지질과산화로 생성된 malondialdehyde (MDA)와 thiobarbituric acid (TBA)의 반응으로 생성된 thiobarbituric acid reactive substrate (TBARS)를 측정하여 MDA 표준곡선에 의하여 계산된 수치를 단백질 \( 1 \mathrm{mg} \) 당 \( \mathrm{nmol} / \mathrm{l} / \mathrm{mg} \) 으로나타내었다.</p> <h2>RNA 분리 및 역전사 중합효소연쇄반응</h2> <p>[6]-gingerol이 산화스트레스성 cerulein 유도 급성췌장염에서 췌장세포 방어기전으로 효소계 산화방어 기전인 SOD 및 GSH-Px의 전사량에 미치는 영향을 알아보기 위하여 췌장조직에서 RNA를 분리하여 역전사 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR을 수행하였다. 실험동물에서 적출한 췌장은 즉시 RNA 안정화 용액인 RNAlater (Quagen, CA,USA)에 처리 후 Trizol reagent (Invitrogen, CA, USA) 용액을 가하여 RNA를 추출하고, UV spectrophotometer (Lambda35, Perkin Elmer, USA)로. \( 260 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 조사하여 총 RNA를 정량하였다. 총 RNA를 분리한 후cDNA합성 Kit(Invitrogen)로 역전사(reverse transcription, RT)를 수행하여 cDNA를 합성하였다. 만들어진 RT product (template cDNA)에 \( 2.5 \mathrm{mM}\) dNTP, \(10 \times \) buffer, DEPC water, premixed primer(GenoTech, Korea) 및 Taq DNA polymerase를 넣고 Master-cycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하였다. 사용한 primer의 서열은 SOD (Forward: 5'-GTGTGCGTGCTGAAGGGCGA-3'; reverse: 5'-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3') 및 GSH-Px (Forward: 5'-TATGTCTGCTGCTCGGCTCT-3'; reverse: 5'-TCTGCGCAC-TGGAACACCGT-3')이다. PCR 반응은 \(94^{\circ} \mathrm{C} \) 1분간 cycle 반응 후 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 45초, \( 58^{\circ} \mathrm{C} \) 45초간, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 1분간 40회 반복반응시켰으며, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 extension을 시행한 후 반응을 완료하여 증폭된 산물은 \( 1.5 \% \) agarose gel에 전기영동하고 ethidium bromide (EtBr, Sigma-Aldrich)로 염색한 후, Gel Doc (Vilber Lourmet, Marnela-Vallaee Cedex, France)을 이용하여 DNA band를 확인하였다. mRNA발현양은 L Process (Version 2.01, Fujifilm, Stamford, CT, USA)와 Multi Gauge software (Version 2.01, Fuififilm)를 이용하여 정량하였다.</p> <h2>분자면역단백질분석(Western blot analysis)</h2> <p>분리한 췌장조직에 차가운 단백질 lysis RIPA buffer를 첨가하여 균질화시켜 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시킨 후 원심 분리하여 그 상층액의 단백질 농도를 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 정량하여 단백질 시료를 만든 후 전기영동을 하였다. 분리된 단백질을 함유한 gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH,USA)에 전이시킨 후, 상온에서 \( 5 \%\)\((\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) nonfat dry milk를 함유한 TBS-T (\(0.1\%\) Tween 20 in TBS)에서 1시간 incubation하여 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하고 TBS-T로 15분 세척하였다. 준비된 막에 1차 항체[beclin-1, LCI/Ⅱ (PharMingen, San Diago CA, USA) 및 \(\beta\)-actin Sigma-Aldrich)]를 각각 처리하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 overnight 시킨 다음 TBS-T로 세척하고 처리된 1차 항체에 맞는 2차 항체를 사용하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 다시 TBS-T로 세척하고 enhanced chemiluminoesence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp. Arlington Heights, IL, USA)을 처리하여 암실에서 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 양을 분석하였다. 단백질 발현양은 L Process (Version 2.01, Fuijifilm, Stamford,CT, USA)와 Multi Gauge software (Version 2.01, Fujifilm)를이용하여 정량하였다.</p> <h2>통계분석</h2> <p>모든 실험결과에 대한 통계처리는 GraphPad Prism 5 program (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)를 사용하여 \( p<0.05 \) 수준에서 Student's t-test를 실시하여 대조군에 대한 유의성을 검정하였다. 본 실험은 독립적으로 3번 이상 실시하였다.</p>