계피의 열수 추출물을 제조하여 ADH 저해 활성을 Yoo 등과 Do 등의 방법으로 측정하였고 ADH 저해물질의 산과 열에 대한 안정성과 휘발성을 확인하였다. ADH 저해 물질의 추출 온도를 결정하기 위해 \( 40,60,80^{\circ} \mathrm{C} \)의 온도에서 8시간 동안 추출한 다음 ADH 저해 활성을 측정하였다. 그리고 계피 추출물이 아닌 계피 향기 성분의 농도에 따른 ADH 저해활성 또한 측정하였다. 실험 결과는 Excel 프로그램으로 처리, t-test로 통계적 유의성을 검정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 재료</h2><p>육계 (Cinnamomum cassia Presl) 껍질(계피)은 건조된 것을 경동 한약도매시장(Seoul, Korea)에서 구입하여 분쇄기로 분말화한 후 200 mesh 채로 걸러 사용하였다. Ethanol, 효모 유래 alcohol dehydrogenase, \( \beta \)-nicotinamide adenine dinucleotide \( \left(\beta-\mathrm{NAD}^{+}\right) \), cinnamaldehyde, cinnamic acid, eugenol은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)의 제품을, 그 외는 1급 이상의 시약을 사용하였다.</p><h2>계피 열수 추출물의 제조</h2><p>시료 중량에 대해 20배 ( \( \mathrm{w} / \mathrm{w}\))의 증류수를 넣어 호일로 덮고 80\( { }^{\circ} \mathrm{C} \) 의 항온수조(Jeio Tech, Daejeon, Korea)에서 8시간 동안 추출한 후 \( 3,000 \times g \) 에서 10분간 원심분리하여 상등액을 얻고 \( 0.45 \) \( \mu \mathrm{m} \) 여과지(Whatman International, Springfield Mill, England)로 걸러 시료로 사용하였다.</p><h2>계피 추출물의 ADH 저해 활성</h2><p>계피 추출물의 ADH 저해 활성은 변형된 Yoo 등과 Do 등의 방법으로 측정하였다. 증류수 \( 0.5 \mathrm{mL} \) 에 \( 0.1 \mathrm{M} \) 인산 완충액 \( \mathrm{pH}\ 7.0 \) \( 0.5 \mathrm{mL}, 6.25 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 의 \( \mathrm{NAD}^{+} \)용액 \( 0.15 \mathrm{mL} \), 계피추출물 \( 0.1 \mathrm{~mL} \) 과 \( 3 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 의ADH 용액 \( 0.1 \mathrm{mL} \) 를 넣고 \(30 { }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 전처리한 후 기질인 \( 100 \% \) 에탄올을 \( 0.15 \mathrm{mL} \) 넣고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분 동안 반응시킨 다음 \( 340 \mathrm{nm} \) 에서 생성된 NADH의 흡광도를 측정하였다. 이때 대조군은 계피 추출물 대신 완충용액을 \( 0.1 \mathrm{mL} \) 더 첨가하였으며, ADH 저해 정도는 대조군에 대한 상대활성(%)으로 나타내었다.</p><h2>ADH 저해 물질의 안정성과 휘발성</h2><p>ADH 저해 물질의 산에 대한 안정성 확인을 위해 계피 추출물을 \( 1 \mathrm{N} \) \(\mathrm{HCl} \) 로 \( \mathrm{pH} 2.0 \) 으로 조정하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 0.5-4시간 방치한 후 \( 1 \mathrm{N}\) \(\mathrm{NaOH} \) 로 \( \mathrm{pH}\7.0 \) 으로 중화한 다음 ADH 저해 활성을 측정하였다.ADH 저해 물질의 열에 대한 안정성은 육계 추출물을 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 0.5 - 4시간 정치한 후 실온으로 냉각하여 ADH 저해 활성을 측정하였다.</p><p>ADH 저해 물질의 휘발성을 확인하기 위해 계피 추출물을 진공농축기(EYELA SB-1000, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10배 농축되게 증발시킨 후 ADH 저해 활성을 측정하였다.</p><h2>ADH 저해 물질의 추출 조건</h2><p>추출 온도 확립을 위해 계피 중량에 대해 20 배 ( \( \mathrm{w} / \mathrm{w}\))의 증류수를 넣고 각각 \( 40,60,80^{\circ} \mathrm{C} \) 의 항온수조에서 8시간 동안 추출한 후 ADH 저해 활성을 측정하였다. 추출 시간을 결정하기 위해 계피 중량에 대해 20배 ( \( \mathrm{w} / \mathrm{w}\))의 증류수를 넣고 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 의 항온 수조에서 각각 0.5-8시간 동안 추출한 후 ADH 저해 활성을 측정하였다.</p><h2>계피 향기 성분의ADH 저해 활성</h2><p>계피 추출물의 ADH 저해활성 측정법에서 계피 추출물 대신 계피의 향기 성분인 cinnamic acid, cinnamaldehyde, eugenol을 총 반응액 \( 1.5 \mathrm{~mL} \) 에 \( 6.25,12.5,25,50 \mu \mathrm{g} \) 이 되도록 각각 \( 0.1 \) \( \mathrm{mL} \) 씩 넣어 향기 성분의 농도에 따른 ADH 저해 활성을 측정하였다. Cinnamaldehyde의 ADH 에 대한 저해 양상을 확인하기 위해 계피 추출물의 ADH 저해활성 측정법을 활용하되 기질인 에탄올의 농도를 \( 0.01\)-\(0.15\) \(\mathrm{mM} \) 변화시키면서 cinnamaldehyde의 농도를 각각 \( 0\),\(0.05\),\(0.10 \)\(\mathrm{mM} \) 첨가하여 ADH 저해 활성을 측정하였다.</p><h2>통계 처리</h2><p>실험 결과는 Excel 2010 (Microsoft Co., Redmond, WA, USA) 프로그램으로 처리하여 평균 \( \pm \) 표준편차로 나타내었고, t-test를 통해 통계적 유의성을 검정하였다 \( (p<0.05) \).</p>