호두추출물은 여러 가지 방법으로 측정되었다. 전자공여능 측정은 Blois의 방법에 준하였고, ABTS radical cation decolorization 측정은 Pellegrin 방업으로 측정되어 었다. 이 밖에도 antioxidant protection factor, Thiobarbituric acid reactive substances, iNos 및 COX-2, 등의 방법으로 측정하였다. ABTS은 ABTS radical 저해율 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 반응구의 흡광도 }}{\text { 대조구의 흡광도 }}\right) \times 100 \)의 방법으로 저해율을 확인할 수 있고 Antioxidant protection factor의 흡광도는 \(\mathrm{PF}=\frac{\text { 반응구의 흡광도 }}{\text { 대조구의 흡광도 }} \)으로 계산할 수 있다.
<h2>전자공여능 측정</h2> <p>호두추출물의 전자공여능(electron donating abilities, EDA)은 Blois의 방법에 준하여 측정하였다. 각 시료용액 \(1.0 \mathrm{ml}\)에 \(60 \mathrm{\mu M}\)의 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) \(3.0 \mathrm{ml}\)를 넣고 교반한 후, 15분간 방치한 다음 \(517 \mathrm{nm}\)에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 다음 식에 의해 나타내었다.</p> <p>\( \begin{array}{c}\text { DPPH radical } \\ \text { 소거능(\%) }\end{array}=\frac{\text { 대조구의 흡광도-반응구의 흡광도 }}{\text { 대조구의 흡광도 }} \times 100 \)</p> <h2>ABTS radical cation decolorization의 측정</h2> <p>ABTS radical cation decolorization의 측정은 Pellegrin 등의 방법에 의해 측정하였다. 즉, \(7\mathrm{mM}\) ABTS \(5\mathrm{ml}\)와 \(140 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{K}_{2} \mathrm{S}_{2} \mathrm{O}_{8} \) \(88\mathrm{\mu l}\)의 비율로 섞어 어두운 곳에 \(14\sim16\)시간 방치시킨 후, 이를 absolute ethanol과 \( 1: 88 \)의 비율로 섞어 \(734\mathrm{nm}\)에서 대조구의 흡광도 값이 \( 0.7 \pm 0.002 \)가 되도록 조절한 ABTS solution을 사용하였다. 시료용액 \(50\mathrm{\mu l}\)와 ABTS solution \(1\mathrm{ml}\)를 30초 동안 섞은 후 2.5분간 incubation하여 \(734\mathrm{nm}\)에서 흡광도를 측정하여 아래의 식에 의해 저해율을 계산하였다.</p> <p>ABTS radical 저해율 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 반응구의 흡광도 }}{\text { 대조구의 흡광도 }}\right) \times 100 \)</p> <h2>Antioxidant protection factor (PF) 측정</h2> <p>PF는 Andarwulan과 Shetty의 방법으로 측정하였다. \(10\mathrm{mg}\)의 \(\beta\)-carotene을 \(50\mathrm{ml}\)의 chloroform에 녹인 용액 \(1\mathrm{ml}\)를 evaporator용 수기에 넣고 \(40\mathrm{^\circ C}\) water bath에서 chloroform을 증류시킨 후 \(20\mathrm{\mu l}\) linoleic acid, \(184\mathrm{\mu l}\) Tween \(40\)과 \(50\mathrm{ml}\) \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 가하여 emulsion을 만들고, \(5\mathrm{ml}\)의 emulsion에 시료 용액 \(100\mathrm{\mu l}\)를 혼합하여 vortex로 잘 섞어준 뒤 \(50\mathrm{^\circ C}\)에서 30분간 반응시켜 냉각시킨 다음, \(470\mathrm{nm}\)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <p>\( \mathrm{PF}=\frac{\text { 반응구의 흡광도 }}{\text { 대조구의 흡광도 }} \)</p> <h2>Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) 측정</h2> <p>TBARS는 Burge와 Aust의 방법에 따라 측정하였다. \(1\%\) linoleic acid와 \(1\%\) Tween 40으로 emulsion을 만들고 emulsion \(0.8\mathrm{ml}\)와 시료 \(0.2\mathrm{ml}\)를 섞은 후 \(50 \mathrm{^\circ C}\) water bath에서 10시간 반응시켰다. 반응 후 반응액 \(1\mathrm{ml}\)에 TBA regent \(2\mathrm{ml}\)를 가하고 15분간 boiling한 다음 10분간 냉각시킨 후 15분간 \(1,000\mathrm{rpm}\) (vision, VS-5500N)으로 원심분리하여 실온에서 10분간 방치 후 상징액을 \(532\mathrm{nm}\)에서 흡광도를 측정하였으며, TBARS 값은 흡광도 수치\( \times 0.0154 \)로 \(1\mathrm{ml}\) 반응혼합물에 대해서 생성된 1,1,3,3-tetraethoxypropane (TEP)의 \( \mu \mathrm{M} \)로 표시하였다.</p> <p>저해율(\%)= \( \left(1-\frac{\text { 반응구의 TBARs } \mu \mathrm{M}}{\text { 대조구의 TBARs } \mu \mathrm{M}}\right) \times 100 \)</p> <h2>Nitric oxide 저해활성</h2> <p>Nitric oxide (\( \mathrm{NO} \))측정은 cell의 supernatant에서의 nitric oxide (\( \mathrm{NO} \))의 량을 nitrite and nitrate로서 측정을 하였다. Nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 griess reagent (Sigma, USA)를 사용하였으며, 6 well plate에 \(2 \times 10^6\)개의 cell을 confluence가 \(80\%\)일 때, PBS로 2번 washing한 후에 무혈청 배지를 사용하여 12시간 이상 배양시킨 후에 lipopolysacchride (LPS) \( 10\mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)를 control군을 뺀 모든 well에다 넣어서 자극시켰다. 1시간 후에 시료를 농도별로 처리하여 실험하였으며, (\( \mathrm{NO} \)) 생성량은 시간별로 supernatant를 모아 griess reagent로 10분간 반응시킨 후에 \(540\mathrm{nm}\)에서 흡광도로 측정하였다.</p> <p>저해율 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\text { 무첨가군의 흡광도 }}\right) \times 100 \)</p> <h2>Western blot을 이용한 iNOS 및 COX-2 활성 측정</h2> <p>iNOS protein 활성측정을 확인하기 위하여 대식세포주인 Raw 264.7 세포의 suspension을 \(100 \pi \) tissue culture dish에 각 well당 \(2 \times10^4\) cell로 가한 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화 시켰다. 배지를 제거한 후 아세톤 추출물, 발효 상징액, 발효 후 아세톤 추출물을 농도별(\(10\mathrm{\mu g}/\mathrm{ml} \), \( 100\mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \))로 처리한 배지로 24시간 배양한 후 또 다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척한 후 Lysis buffer (RIPA buffer \(10\mathrm{ml}\)에 complete mini \( 1 \mathrm{tab} \)을 가함) \(100\mathrm{ul}\)로 용해해서 \(4\mathrm{^\circ C}\) \(12,000\mathrm{rpm}\)에서 20분간 원심분리하였다. 상징액만을 모아 새 튜브로 옮긴 후 단백질 정량을 하거나 또는 차후 사용하기 위해 \(-20\mathrm{^\circ C}\)에 보관하였다. 원심 분리하여 얻은 상징액은 Bradford assay로 정량하여 \(20\mathrm{\mu l}\)의 단백질을 \(10\%\)의 SDS-PAGE사에서 전기 영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 semidry transfer cell 기기(Bio Rad)를 이용하여 PVDF membrane에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking buffer (\(5\%\) skim milk in TBST)에서 in-cubation 시켰다. 10분 간격으로 TBST로 3회 washing하고 iNOS (BD Biosience \(1:1,000 \)), COX-2 (cayman \(1:1,000 \)), GAPDH (Santacruz \(1:1,000 \)) 1차 항체를 희석하여 \(4\mathrm{^\circ C}\)에서 over night한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 washing하고 mouse anti-rabbit IgG HRP, bovine anti-goat IgG HRP (santacruz \(1:1,000 \))의 각각의 2차 항체를 \(1:1,000 \)으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 배양 후 3회 washing한 뒤 암실에서 ECL (Millipore)용액으로 반응시키고 X-ray film에 노출시켜 각각의 band를 Molecular Imager (Bio-Rad)를 이용하여 band를 정량화하였다.</p> <h2>Tyrosinase 저해(미백) 활성 측정</h2> <p>Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 \(0.175\mathrm{M}\) sodium phosphate buffer (\( \mathrm{pH}\) \(6.8\)) \(0.5\mathrm{ml}\)에 \(10\mathrm{mM}\) L-DOPA를 녹인 기질액 \(0.2\mathrm{ml}\) 및 시료용액 \(0.1\mathrm{ml}\)의 혼합액에 mushroom tyrosinase (\(110\mathrm{unit} / \mathrm{ml} \)) \(0.2\mathrm{ml}\)를 첨가하여 \(25\mathrm{^\circ C}\)에서 2분간 반응시킨 후 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 \(475\mathrm{nm}\)에서 측정하였다. Tyrosinase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 다음의 식에 의해 계산하였다.</p> <p>저해율 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 반응구의 흡광도 }}{\text { 대조구의 흡광도 }}\right) \times 100 \)</p> <h2>Astringent activity (수렴성) 측정</h2> <p>원심분리관 용기에 각각의 시료용액과 헤모글로빈 용액을 \(1:1\)의 비율로 넣어 진탕 혼합한 다음 \(1,500 \mathrm{rpm}\)에서 3분간 원심분리 후 \(576\mathrm{nm}\)에서 흡광도를 측정하여 흡광도 감소율로 수렴성을 측정하였다.</p>