달천강과 밀양강에서 꺽지와 모래무지의 성체를 채집하여 순응 실험을 실시하였다. 환경요인의 변화에 따른 결과를 확인하기 위해 수조는 온도 \(20 \pm 1^{\circ} \mathrm{C}\), \(\mathrm{pH} 5 \pm0.5\), DO \(6 \pm 1 \mathrm{ppm}\) 로 설정하여 \(15\)일간 순응 시킨 후, DO를 \(18 \pm 1 \mathrm{ppm}\)로 증가시켜 \(30\)분,\(1, 2, 4, 6\)시간 동안 다시 순응시켜 변화를 확인하였다. 꺽지와 모래무지의 각 조직을 파쇄하여 추출액을 얻고, LDH 활성 정도를 측정하였다. 또한 Polyacrylamide gel 전기영동을 실시하고 LDH 동위효소의 확인 및 활성을 분석하고 그 밀도를 측정하였다.
<h1>재료 밎 방법</h1><h2>실험재료 및 환경조건</h2><p>꺽지(Coreoperca herzi)는 충청북도 괴산군 달천강 상류와 경상남도 밀양시 밀양강에서 채집하여 \(90\sim140\) \( \mathrm{mm} \) 정도 크기의 성체를 사용하였고, 모래무지(Pseudogobio esocinus)는 달천강 상류에서 채집하여 \(130\sim180\) \( \mathrm{mm} \) 정도 크기의 성체를 사용하였다. 휴대용 전기기포발생기를 사용하여 살아있는 상태를 유지하면서 실험실의 순환식 수조에 운반하였다. 온도는 온도조절기가 부착된 히터(Sungsin SSE 9000)와 냉각수순환장치(Eyela CA-1100)를 사용하여 조절하였고, \( \mathrm{pH} \) 는 \( \mathrm{pH} \) 상승제와 하강제로 조절하였으며 \( \mathrm{pH} \) 미터(TOA HM-\(11\)P)로 측정하였다. DO는 전기기포발생기(Daekang DK-8000)와 조절기가 장착된 고압 산소 탱크를 사용하여 조절하였고 DO미터(TOA DO-\(14\)P)로 측정하였다. 온도와 DO는 매 시간 측정하고 \( \mathrm{pH} \) 는 \(2\)시간마다 측정하였다. 채집지인 달천강 상류의 환경조건을 \(2\)년간 매월 측정한 결과 수온은 \( 1 \sim 28^{\circ} \mathrm{C} \) 이고, DO는 \(8.4\sim17.5\) \( \mathrm{ppm} \), \( \mathrm{pH} \)는 \(5.6\sim9.0\)으로 조사되었으며, 여러 환경요인이 서로 관련되어 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 단기간 순응 실험의 경우 일반적으로 일주일에서 여러주 동안 실시하므로 각각의 환경요인의 변화에 따른 결과를 얻기 위해 온도 \( 20 \pm 1^{\circ} \mathrm{C}\), \(\mathrm{pH} 5 \pm 0.5 \), DO \( 6 \pm 1 \mathrm{ppm} \) 조건에서 꺽지와 모래무지를 15일간 순응시킨 후, \( 20+1^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{pH} \) \( 5 \pm 0.5 \), DO \( 18 \pm 1 \mathrm{ppm} \)으로 DO를 증가시킨 조건에 갑작스럽게 \(30\)분 \( 1,2,4 \) 및 \(6\)시간 동안 순응시켜 시간별로 변화를 확인하였다.</p><h2>조직추출액의 준비</h2><p>DO 조건을 증가시킨 후 꺽지와 모래무지를 갑작스럽게 \(6\)시간까지 시간별로 순응시킨 후 즉시 해부하여 골격근, 심장, 신장, 간, 눈 및 뇌 조직을 때어 내어 증류수로 혈액을 제거 한 후, 시료 조직에 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 로 유지시킨 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} 6.8) \)를 3배\( (\mathrm{v} / \mathrm{w}) \) 가하여 얼음에 채운 glass homogenizer (Wheaton)로 파쇄 하였다. 조직파쇄액은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), \( 20,000 \times g \) refrigerated centrifuge (Hitachi 20 PR-52D)에서 1시간씩 2회 원심분리 하였고, 상등액을 시료로 사용하였다.</p><h2>LDH 활성의 측정</h2><p>LDH의 활성은 \( 1.50 \mathrm{mM} \) 피루브산 및 \( 0.14 \mathrm{mM}\) NADH를 함유한 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 6.8)\) \(3 \mathrm{ml} \)에 시료를 가한 다음 spectrophotometer (Shimadzu UV-160A)를 사용하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C}\), \(340 \mathrm{~nm} \)에서 NADH 로부터 \( \mathrm{NAD}^{+} \)로 전환되는 정도를 측정하였다.</p><h2>Polyacrylamide gel 전기영동과 동위효소 활성의 분석</h2><p>전기영동은 polyacrylamide vertical slab system (Hoefer SE250)으로 Davis의 방법에 따라 실시하였다. Slab gel은 \( 7.5 \% \) acrylamide separation gel 및 \( 2.5 \% \) acrylamide stacking gel이 되도록 만들었다. 시료에는 \( 50 \% \) sucrose와 \( 0.05 \% \) bromo-phenol blue 용액을 \( 1: 1\)\((\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 가하였고, Tris-glycine buffer \( (\mathrm{pH} 8.3\))를 사용하여 전기영동 하였다. LDH 동위효소는 Whitt의 방법에 따라 DL-lactate, nitroblue tetrazolium, phenazine methosulfate 그리고 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 포함한 용액으로 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 염색한 후, \( 15 \% \) 초산용액으로 고정하였다. LDH 동위효소의 확인 및 동위효소 활성은 PAGE gel상에서 확인하고 image analyzer (Vilber Lourmat) Bio Profil 프로그램으로 사진을 찍은 후 BIO-1D++ 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 밀도계에 의해 정량한 동위효소들의 밀도 또는 양은 각 동위효소 밴드를 구성하는 모든 점들의 합, \( \mathrm{V}=\sum_{\mathrm{n} i} \mathrm{I}_{i} \)로 계산되었으며, 각 동위효소의 밀도는 동위효소들을 이룬 모든 점들의 합을 기준으로 하여 상대농도(\( \% \))로 측정하였다.</p>