한국생명공학연구소에서 분주받은 유방암세포와, 기장군에서 채집한 톳을 사용하여 암세포를 배양하였다. MTT assay를 실시하여 각 농도에 따른 세포의 형태 변화를 관찰하였고, PBS 및 증류수로 DAPI 용액을 세척한 후 각 농도에 따른 유방암 세포핵의 형태를 관찰하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>암세포 배양 및 EAHF의 처리</h2><p>MDA-MB-231 및 MCF-7 유방암세포는 한국생명공학연구소(KRIBB, Taejeon, Korea)에서 분주 받았으며, 세포 배양을 위해 90\(\%\) 의 RPMI-1640(Gibco BRL, Grand Island, NY),\( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL)에 1\(\%\)의 penicillin 및 streptomycin(Gibco BRL)이 포함된 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건 하에서 배양하였다. 본 실험에 사용된 톳은 2006년 7월 기장군에서 채집된 것을 동정하여 사용하였으며, EAHF를 얻기 위하여 톳을 흐르는 물로 24시간 동안 세척하여 소금기를 제거하고 깨끗한 물로 수회 세척한 후 그늘에서 5일 동안 건조시켰다. 건조된 톳을 잘게 분쇄하여 \( 80 \% \) ethyl alcohol에 24시간 동안 담가 유효성분을 추출한 다음, \( 3,000 \mathrm{rpm} \)으로 20분간 원심 분리시켜 침전물을 제거하였다. 이를 다시 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \)의 여과지를 이용하여 부유 성분을 걸러낸 후 동결 건조한 후 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma Chemical Co., St Louis, MO)를 이용하여 \( 100 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 녹여 stock solution을 만든 다음 적정 농도로 배지에 희석하여 사용하였다.</p><h2>MTT assay에 의한 세포증식억제 및 형태변화 조사</h2><p>세포 배양용 6 well plate에 유방암 세포를 \( 5 \times 10^{4} \)개/ \( \mathrm{ml} \)로 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 다음 EAHF를 배지에 희석하여 적정 농도로 처리한 후 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후 배지를 제거하고 tetrazolium bromide salt(Sigma)를 이용한 MTT assay를 실시하였으며, 세 번의 실험을 통한 평균값과 표준 오차를 산출하였다. 아울러 48시간 EAHF 처리 후 도립 현미경(inverted microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 200배의 배율로 각 농도에 따른 세포의 형태 변화를 관찰하였다.</p><h2>DAPI staining에 의한 세포핵의 형태 관찰</h2><p>EAHF 처리에 의한 apoptosis 유발 확인을 위한 핵의 형태적 변화 관찰을 위하여 준비된 세포를 모은 다음 \( 37 \% \) formaldehyde 용액과 PBS를 \( 1: 9 \)의 비율로 섞은 fixing solution으로 세포를 상온에서 10분 동안 고정하고 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI, Sigma) 용액을 이용하여 암 조건·상온에서 15분간 염색시킨 후, PBS 및 증류수로 DAPI 용액을 세척한 다음 absolute alcohol을 이용하여 탈수과정을 거친 slide glass 위에 mounting solution을 처리한 후 형광 현미경(Carl Zeiss)을 이용하여 400배의 배율로 각 농도에 따른 유방암 세포의 핵 형태변화를 관찰하였다.</p>