HiII 계통 옥수수식물체로부터 10~13일째에 1.5~2.0mm 크기의 미숙배를 무균적으로 분리하여 CIM에 배양하여 Agrobacterium을 이용한 형질전환용 배양재료로 이용하였으며, ApxIIA유전자 발현 벡터로 pMYV611, pMYV613, pMYV 616, V621, V622와 V623을 사용하였으며, A. pleuropneumoniae apxIIA 유전자가 생산한 ApxII toxin은 다양한 혈청형에서 만들어지며 각 벡터는 다른 크기의 apxIIA 유전자 fragment를 운반한다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물재료</h2> <p>HiII 계통 옥수수식물체로부터 수정 후 10~13일째에 \( 1.5 \sim 2.0 \mathrm { mm } \) 크기의 미숙배를 얻었다. 미숙배를 무균적으로 분리하여 캘러스 유도배지 (CIM: MS salts, Eriksson's vitamins, \( 0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) Thiamine-HCl, \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) 2,4-D, \( 3 \mathrm { mM } \) MES, \( 25 \mathrm { mM } \) L-proline, \( 2 \% \) sucrose, \( 100 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) myo-inositol, \( 100 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) casamino acid vitamin assay, 0.7 \% BBL agar, and \( 1.7 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) AgNO3 ; \( \mathrm { pH } \) 5.8, Murashige and Skoog 1962)에 치상한 후 \( 24 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 6주 이상 암 배양 하면서 Type II 배발생 캘러스를 유도하였다. 유도한 Type II 배발생캘러스를 4주 간격으로 계대 배양하면서 충분하게 증식한 후 Agrobacterium을 이용한 형질전환용 배양재료로 이용하였다.</p> <h2>유전자 발현벡터</h2> <p>ApxIIA유전자 발현 벡터로 pMYV611, pMYV613, pMYV 616, V621, V622와 V623을 사용하였으며, 각 벡터는 Agrobacterium tumefaciens strain C58C1에 각각 freeze-thaw 방법으로 형질전환하여 균주로 사용하였다. 각 벡터의 T-DNA에는 2 개의 cassettes가 위치한다. A. pleuropneumoniae apxIIA 유전자는 ApxII toxin을 생산하는데 이 독소는 A. pleuropneumoniae의 다양한 혈청형에서 만들어지며 각 벡터는 다른 크기의 apxIIA 유전자 fragment를 운반한다. 즉 pMYV611과 V621은 CO1-apx5-2 \((0.75 \mathrm { ~kb } ) \) 를, pMYV613, V622와 V623은 CTB5-2 \((0.93 \mathrm { kb } ) \)를, pMYV616은 full-length의 apxIIA 유전자 \( (1.7 \mathrm { kb } ) \) 를 각각 운반하도록 재조합하여 구축하였다. pMYV611의 경우 3'에 ER retension signal과 5'에 Col ( M cell binding ligand) sequence를 재조합하여 구축한 반면, V621은 3'ER retention signal대신 식물유래 BIP signal sequence로 구축하였다. 그리고 pMYV613은 pMYV611에서 Col대신 CTB 단백질이 fusion된 것이고, V622는 V621에서 Col대신 CTB 단백질이 fusion된 것이다. V623은 V622에서 plant 유래 BIP signal sequence대신 Cab signal sequence를 재조합하여 각각 구축하였다.</p>