본 연구에서는 Free radical scavenging activity, Reducing power activity, Hydrogen peroxide scavenging activity의 측정을 각각 Brand-Williams method, Oyaizu method, Miller method를 활용하여 수행하였다. 각각의 방법을 통해 추출물의 항산화 효능을 산출하였으며, 반응 액에 필요한 특정 물질을 첨가하고 특정 온도에서 반응 시킨 후 흡광도를 측정하였다.
<h2>Free radical scavenging activity</h2> <p>Free radical scavenging activity의 측정은 Brand-Williams method을 이용하여 측정 하였다. \( 6 \times 10^{-5}\) M DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) MeOH용액 \( 195\mu \mathrm{l} \)와 증류수로 희석한 추출물 \( 5 \mu \mathrm{l} \)를 96-microwell plate에 혼합하였다 이때, 혼합용액 중의 추출물 최종 농도는 \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)가 되도록 하였다. 실온에서 30 분간 방치한 후 \( 515 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였고 기존의 항산화제로 알려진 BHA (butylated hydroxy anisole), BHT (butylated hydroxytoluene), ascobic acid를 대조구로 사용하였다. 시료의 항산화 효능은 시료 무첨가구에 대한 시료 첨가구의 흡광도비로 산출하였다.</p> <h2>Redcing power activity</h2> <p>Reducing power activity의 측정은 Oyaizu method을 이용하여 측정하였다. 시료 \( 50 \mu \mathrm{l} \)에 Phosphate buffer ( \( 200 \mathrm{mM}, \mathrm{pH} \) \( 6.6\ \)) \( 50\mu \mathrm{l} \)와 \( 1 \% \) potassium ferricyanide \( 50 \mu \mathrm{l} \)를 넣고 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 반응시켰다. 이때, 혼합용액 중의 추출물 최종 농도는 \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)가 되도록 하였다. 반응 종료 후 반응액에 \( 10 \% \) trichloroacetic acid 용액 \( 50\mu \mathrm{l} \)를 가하고 5,000 rpm에서 10분간 원심분리 한 후 상등액을 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 취하여 증류수 \(100 \mu \mathrm{l} \)와 \( 1 \% \) ferric chloride \( 20 \mu \mathrm{l} \)을 혼합한 후 10분간 반응시킨 뒤 \( 700 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>\( \beta \)-carotene-linoleic acid activity</h2> <p>\( \beta \)-carotene-linoleic acid activity는 Miller method을 이용하여 측정하였다. \( 0.1 \mathrm{mg} \)의 \( \beta \)-carotene을 chloroform \( 500 \mu \mathrm{l} \)에 용해시킨 후 \( 20 \mathrm{mg} \)의 linoleic acid 및 \( 100 \mathrm{mg} \)의 Tween 40을 첨가하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 chloroform을 감압 농축하여 제거하고 얻어진 잔류물에 증류수 \( 50 \mathrm{ml} \)를 가하여 정용한 것을 기질액으로 사용하였다. 기질액 \( 10 \mu \mathrm{l} \)와 시료 \(200\mu \mathrm{l} \)를 96-microwell plate 가하여 혼합하였다. 이때, 혼합용액 중의 추출물 최종 농도는 \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)가 되도록 하였다. \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 반응시킨 후 \( 470 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였으며, 시료의 항산화 효능은 시료 무첨가구에 대한 시료 첨가구의 흡광도비로 산출하였다.</p> <h2>Hydrogen peroxide scavenging activity</h2> <p>Hydrogen peroxide scavenging activity의 측정은 Miller method을 이용하여 2,2-azinobis(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonicacid (ABTS)-peroxidase system에서 측정하였다. 96-microwell plate에 시료 \( 80 \mu \mathrm{l}, ~10 \mathrm{~mM} \mathrm{~H}_{2} \mathrm{O}_{2} ~20 \mu \mathrm{l} \), phosphate buffer (\( \mathrm{pH} \) \( 5.0 \), \( 0.1 \mathrm{M}) 100\mu \mathrm{l} \)를 넣고 혼합하였다. 이때, 혼합용액 중의 추출물 최종 농도는 \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)가 되도록 하였고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 반응하였다. 반응액에 \( 1.25 \mathrm{mM} \) ABTS \(30\mu \mathrm{l} \)와 \(1 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) peroxidase \( 30 \mu \mathrm{l} \)를 가하고 혼합한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응하여 \( 405 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였으며 시료의 항산화 효능은 시료 무첨가구에 대한 시료 첨가구의 흡광도비로 산출하였다.</p>