유도결합 플라즈마 질량 분석기를 통해 초단파 용해장치로 전처리한 조직의 \( \mathrm{Cd} \) 함량을 분석하였다. 붕어의 조직들을 homogenation buffer에서 완전히 균질화 시킨 뒤, 원심 분리하여 상등액만을 얻어 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다. SOD 활성은 \( 50 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} 7.8\) ), \( 0.1 \mathrm{M} \) cytochrome C, \( 50 \mathrm{mM} \) xanthine, \( 0.1 \mathrm{mM} \) EDTA 및 효소액이 포함된 용액을 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 놓아 둔 다음 xanthine oxidase를 첨가하여 반응을 일으켜 측정하였다. CAT 활성은 \( 50 \mathrm{mM} \) phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 7.0) \)와 시료액을 넣고, 기질을 혼합하여 \( 240 \mathrm{~nm} \)에서 2분동안 흡광도의 변화를 측정하였다. GPX활성은 반응액에 효소 시료액을 혼합하고 \( 4 \mathrm{mM} \) cumene hydroperoxide를 첨가하여 \( 340 \mathrm{~nm} \)에서 1분간 흡광도의 변화를 측정하는 방식으로 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료 및 노출 실험</h2> <p>본 실험에 사용한 붕어(Carassius auratus)는 경북 의성군 비안면에 위치한 약수 양어장에서 사육한 것으로 7일간 순치과정을 거친 후 체장 \( 6.5 \pm 0.5 \mathrm{~cm} \), 무게 \( 3.5 \pm 1.1 \mathrm{~g} \)인 건강한 개체만을 선별하여 실험에 사용하였다. 실험은 \( 30 \times 60 \times 45 \mathrm{~cm} \) 크기의 수조에 각 10마리씩 분배하였고, \( \mathrm{Cd} \)의 농도는 \( \mathrm{CdCl}_{2} \)로 표준액을 제조한 후 농도에 따라 희석하여 사용하였다. 수조의 수온은 \( 18 \sim 20^{\circ} \mathrm{C} \)를 유지하여 96시간 동안 실시하였으며 반수치사 농도는(\( 50 \% \) lethal concentration) 96시간에서 APHA의 probit 값으로 구하였다. \( \mathrm{Cd} \)에 대한 \( 96 \mathrm{hr}-\mathrm{LC}_{50} \)의 값이 \( 0.564 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \)로 나타나 중금속 노출농도는 급성실험을 통해 구한 \( 96 \mathrm{hr}-\mathrm{LC}_{50} \) 농도를 고려하여 \( \mathrm{Cd} 0.3 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \) 농도로 결정하였다(Fig. 1). 또한 노출기간은 5일, 10일 및 20일 간격으로 설정하였고, 각 실험구당 70마리씩 사용하였다. 대조군은 \( 0.3 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \)의 \( \mathrm{Cd} \)에 노출 실험 전 0일을 대조군으로 하여 노출기간에 따른 실험군과 비교하였다.</p> <h2>조직 내 \( \mathrm{Cd} \)의 함량 측정</h2> <p>붕어의 아가미, 뼈, 근육 조직의 표면에 부착된 미세입자 및 이물질은 초음파세척기(5210, Branson, USA)를 이용하여 최대한 제거하였다. 미세입자와 이물질을 제거한 조직은 액체 질소로 처리하여 재차 냉동건조기에서 완전히 건조 후 건조중량을 측정하였다. 각 조직 내 \( \mathrm{Cd} \)의 함량을 측정하기 위해 전처리는 초단파 용해장치(Ethos Plus, Mileston, USA)를 이용하였다. 전처리된 조직 내 \( \mathrm{Cd} \)의 함량은 유도결합 플라즈마 질량 분석기(Elan DRC-e, Perkin Elmer, USA)를 이용하여 측정하였다.</p> <h2>항산화효소 활성 측정</h2> <h3>시료 추출</h3> <p>붕어의 아가미, 신장, 간, 근육 조직을 적출하여 \( 100 \mathrm{mM} \) phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 7.2) \)에 혈액 및 기타 이물질 등을 세척한 후 조직의 무게를 측정하였다. 무게를 측정한 시료는 homogenation buffer (5 \( \mathrm{mM} \) tris, \( 38 \mathrm{mM} \) glycine, \( \mathrm{pH} 8.4\))에서 완전히 균질화 시킨 후 시료는 \( 13,000 \mathrm{rpm}\), \(4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 원심 분리하여 지질층을 제외한 상등액만을 모아 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다.</p> <h3>Superoxide dismutase (SOD)</h3> <p>SOD 활성은 \( 50 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} 7.8\) ), \( 0.1 \mathrm{M} \) cytochrome C, \( 50 \mathrm{mM} \) xanthine, \( 0.1 \mathrm{mM} \) EDTA 및 효소액이 포함된 용액을 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 예치한 다음 xanthine oxidase를 첨가하여 반응을 개시하였다. 효소의 활성은 \( 550 \mathrm{nm} \) 에서 10초 단위로 150초간 흡광도를 측정하였고, xanthine oxidase 첨가량은 효소액을 함유하지 않은 반응액의 흡광도 흡수가 분당 0.025가 되도록 조절하였다. 효소의 활성은 cytochrome C의 환원 속도를 \( 50 \% \) 억제하는 양을 \(1 \mathrm{unit}\)로 하여 \(\mathrm{unit}/\mathrm{mg}\) protein으로 나타냈다.</p> <h3>Catalase(CAT)</h3> <p>CAT 활성은 \( 50 \mathrm{mM} \) phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 7.0) \)와 시료액을 넣은 후 기질로 \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 용액을 가하여 잘 혼합한 후 \( 240 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도의 변화를 2분간 측정하였다. 대조실험으로는 기질인 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 용액 대신에 \( 50 \mathrm{mM} \) phosphate buffer\( (\mathrm{pH} 7.0) \)을 가하고 위와 동일한 방법으로 흡광도의 변화를 측정하였다. CAT의 활성은 1분 동안에 \( 1 \mu \mathrm{mol} \) 의 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 분해하는 효소의 양을 \(1 \mathrm{unit}\)로 하였다.</p> <h3>Glutathione peroxidase (GPX)</h3> <p>GPX 활성은 \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA가 함유된 \( 100 \mathrm{mM} \) phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} 7.6\))에 \( 0.25 \mathrm{mM}\) GSH, \(0.12 \mathrm{mM}\) NADPH, \(20 \mathrm{mM} \) glutathione reductase \( 0.72 \mathrm{U}\)가 포함된 반응액을 제조하였다. 이 반응액에 효소 시료액을 혼합한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 방치한 다음 \( 4 \mathrm{mM} \) cumene hydroperoxide를 첨가하여 \( 340 \mathrm{~nm} \)에서 1분간 흡광도의 변화를 측정하였다. GPX의 활성은 1분 동안에 \( 1 \mu \mathrm{mol} \)의 NADPH를 NADP로 산화하는 효소의 양을 \(1 \mathrm{unit}\)로 하였다.</p>