Paenibacillus macerans 유래 CFTase 유전자(cft)를 Saccharomyces cerevisiae SEY2102에 발현하기 위해 pECFTN를 이용하여 cft 유전자 단편을 얻고, 이를 pYES2.0의 GAL1 promoter 하류에 subcloning하여 pYGECFTN \(8.6 \mathrm{kb}\)를 생성하였다. CF의 생성능과 균체증식이 뛰어난 S. cerevisiae SEY2102/pYGECFTN를 최종적으로 선별하였다. 재조합 균주를 초기 \( \mathrm{pH}5.5 \), \(30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 동안 YPDG 배지에서 배양한 후, 배양상등액, periplasmic space, cystoplasm으로 분획하였고, periplasmic space와 cystoplasm에서만 5분 후부터 CF 생성이 확인되었으며, 배양 상등액에서는 inulobiose(F2)가 생성되었다. 따라서, 대장균과 효모의 shuttle vector인 pYES2.0에 subcloning하여 구축한 pYGECFTN를 이용하여 S. cerevisiae SEY2102에서 Paenibacillus macerans 유래 CFTase를 발현하는데 성공하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>재조합 plasmid의 구축 및 효모 형질전환체 선별</h2><p>효모에서 CFTase 유전자(cft)를 발현시키기 위해 유도적 발현계를 구축하였다. cft 유전자를 포함하는 pECFTN를 SacⅠ/XhoⅠ으로 처리하여 cft유전자 단편을 얻고, 이를 pYES2.0 의 GAL1 promoter 하류에 subcloning하여 pYGECFTN \(8.6 \mathrm{kb}\)를 구축하였다. 구축된 cft 발현 plasmid (pYGECFTN)를 효모에 형질전환하여 SD배지에서 1차 선별하고, 1차 선별된 균주는 시험관에서 배양한 후 cell lysates와 \( 2 \% \) inulin을 반응시켜 반응산물을 TLC로 분석하였다. CF의 생성능과 균체증식이 높은 재조합균주(S. cerevisia SEY2102/pYGECFTN)를 최종선별하였다.</p><h2>재조합 CFTase 발현과 분비 국재성</h2><p>재조합 균주 S. cerevisiae SEY2102/pYGECFTN를 초기 \( \mathrm{pH}5.5 \), \(30^{\circ} \mathrm{C} \), YPDG 배지에서 48시간동안 flask 배양한 다음 배양상등액, periplasmic space와 cystoplasm으로 분획 후 inulin과 반응 결과, periplasmic space, cystoplasm에서만 효소반응 5분째부터 CF가 생성되었고, 배양 상등액에서는 inulobiose (F2)가 생성되었다. CF는 cystoplasm 보다 periplasmic space에서 많이 생성되었다. CF는 배양 상등액에서는 생성되지 않은것으로 미루어보아 CFTase는 세포외로 분비되지 않는 것 같다. S. cerevisiae SEY2102/pYGECFTN를 회분배양한 결과, 효모에서 P. polymyxa CFTase를 발현시켰을 때는 30시간 이후부터 발현된 결과와는 달리, dextrose 소모 후 galactose를 이용하는 12시간 이후부터 발현되어 48시간까지 계속 발현량이 증가하는 양상을 나타내었고, 배양 48시간에서 \( \mathrm{OD}_{600}= 44.7\)의 균체농도에 도달하였다. Plasmid 안정성은 형질전환체의 배양초기부터 \(96\%\) 이상의 수준으로 유지되다가 48시간에서도 \( 87 \% \) 이상을 나타내어 비교적 높게 유지되었다.</p><p>또한 효소 반응시간에 대한 결과로서 P. polymyxa CFTase은 3시간 이후부터 CF의 생성이 보였고, P. macerans CFTase는 반응 5분 후부터 CF가 생성됨을 알 수 있었다. Image analyzer에 의한 TLC 상의 CF spot을 비교해 보면, P. macerans CFTase의 CF spot의 signal이 P. polymyxa의 CF spot보다 4.7배 더 강했다. 배양 시간과 반응 시간 측면에서 비교 해봐도 P. polymyxa CFTase 보다 P. macerans CFTase가 더 빠르게, 더 많이 CF를 생성시킴을 알 수 있었다. P. macerans CFTase와 P. polymyxa CFTase 유전자를 BLAST program을 이용하여 상동성을 비교 검토한 결과 \( 96 \% \)의 아주 높은 상동성을 나타내었다. 그러나 구축한 pYGECFTN은 P. macerans CFTase 전체 유전자(N-말단에 3개의 repeat region과 C-말단에 1개의 repeat region 그리고 그 사이에 invertase와 같은 coreregion으로 구성) 중 N-말단의 3개 repeat region가 제거된 유전자만 발현하였고, pYGCFT는 P. polymyxa CFTase 전체 유전자를 발현시킨 차이로 CF의 생성에 차이점이 있다고 사료된다. 즉 N-말단에 3개의 repeat region의 제거로 효소활성이 증가됨을 추측할 수 있었다.</p><p>자체 signal peptide을 사용하여 Nam 등은 Bacillus ma-cerans cyclodextrin glucanotransferase (CGTase)를 효모에서 발현시켜 \( 90 \% \) 이상의 분비효율을 얻었고, Han 등은 Bacillus의 endoglucanase를 효모에서 발현시켰다. 위 연구결과들은 효모의 분비경로에 Bacillus 자체 분비신호가 적용될 수 있음을보여주었다. 또한, \(\alpha\)-factor 분비신호 (MF\(\alpha\)1)를 이용하여 Kanai 등은 S. cerevisiae에서 B. circulans MCI-2554 유래의 CFTase를 발현시켜 재조합 CFTase를 생산하였다. 그 연구결과에 따르면 전체 CFTase 유전자를 N-말단의 3개 repeat region를 제거한 약 \( 3 \mathrm{kb} \) 단편과 \(\alpha\)-factor 분비신호를 연결하고 그 사이에 Kex2 protease 인식서열을 삽입함으로써 높은 효소활성을 가지는 CFTase를 효과적으로 분비시켰다. 그러나, 다양한 signal peptides (\(\alpha\)-factor, invertase, acid phospatase, Bacilltes amyloli-quefaciens \(\alpha\)-amylasc)를 사용하여 B. subtilis 유래의 levansucrase에 대한 효모에서의 분비효율를 조사한 Scotti 등의 연구결과에 따르면 성숙 단백질 N-말단의 net charge와 signal peptide의 소수성 core 영역 외에 성숙 단백질 전체의 net charge 등이 개선되어야 ER에서 Golgi체로, Golgi체에서 분비과립으로, 분비과립에서 세포밖으로의 일련의 분비능을 향상시킬 수 있는 것으로 나타났다. 따라서, 본 연구에 사용된 P. macerans CFTase의 N-말단 부분의 repeat region이 제거된 유전자와 여러 signalsequence를 이용하여 효모에서 발현시킨다면 분비효율이 더 높은 재조합 CFTase를 생산할 수 있을 것으로 사료된다.</p><h2>반응 최적 \( \mathrm{pH} \)와 최적온도</h2><p>재조합 CFTase의 효소반응의 최적활성 \( \mathrm{pH}\)를 \( \mathrm{pH} 4.0 \sim 10.0 \)의 범위에서 측정한 결과, Fig. 5에서 보는 바와 같이 \( \mathrm{pH} 8.0 \)에서 최적활성을 보였다. \(\mathrm{pH}\) \(6.0\sim 8.0\)에서 반응시 효소활성이 남아있는 것으로 보아 효모에서 발현된 CFTase는 중성의 \( \mathrm{pH} \)에서 비교적 안정한 것으로 나타났다. 재조합 CFTase의 효소반응의 최적온도를 \( 30 \sim 65^{\circ} \mathrm{C} \)의 범위에서 측정한 결과 Fig. 6에서와 같이 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)에서 최적활성을 보였다. 또한, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)이상에서도 효소 활성이 보였으나, \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)이상에서는 효소활성이 나타나지 않았다. 이는 Kim 등이 P. macerans 유래 CFTase를 사용하여 대장균에서 발현시켰을 때의 결과와 차이점을 보이지 않았다. 본 연구에서 사용한 CFTase에서는 약 6개의 N-형 당쇄부가 가능 부위[-Asn-Xaa-Thr (or Ser)-]가 존재하나 당쇄부가에 의한 열안정성의 결과를 얻지 못한 것으로 보아 효모에서 발현된 재조합 CFTase의 당쇄부가는 이루어지지 않은 것으로 사료된다. Lim 등의 약 10개의 N-형 당쇄부가 가능 부위를 가지는 P. polymyxa 유래의 CFTase 또한 S. cerevisiae에서 발현시켰으나 \(55^{\circ} \mathrm{C} \)이상의 고온에서 효소활성이 감소하는 것을 알 수 있었다. Kanai 등은 S. cerevisiae에서 B. circulans MCI-2554 유래의 CFTase를 \(\alpha\)-factor 분비신호(MF\(\alpha\)1)를 이용하여 발현시켜 온도에 대한 안정성이 높은 재조합 CFTase를 생산하였다. 그 연구의 효모에서 발현된 CFTase는 5군데의 당쇄부가 부위가 존재하며, endo-H 처리로 확인된 당쇄부가 정도가 크게 나타나지는 않았으나 온도에 대한 안정성이 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분 처리시에도 약 \( 62 \% \)의 잔존활성이 남아 있었다. 그러나, 당쇄부과되지 않은 재조합 CFTase는 약 \( 10 \% \)의 잔존활성이 남아 있었고, 이와 같은 결과에서 CFTase는 당쇄부가에 의해 열안정성이 증가되는 것으로 사료된다.</p><h2>Inulin에 대한 반응 생성물의 비교</h2><p>Inulin의 종류(dahlia tubers, chicory root, Jerusalem artichoke)에 따른 효소반응의 차이점을 비교하였다. 반응생성물의 분석결과 모두 효과적으로 CF를 생성하였고, Jerusalem arti-choke와 dahlia tubers가 효과적이었다. Kim 등의 연구 결과에 따르면 CFTase의 기질특이성이 dahlia tubers, Jerusalem artichoke에 상대적으로 높게 나타났다. 따라서 이 결과는 기질인 dahlia tubers, Jerusalem artichoke의 fructose 평균 중합도가 chicory root 보다 높기 때문에 상대적으로 CF의 생성이 좋은것으로 사료된다.</p><h1>요약</h1><p>Paenibacillus macerans 유래의 cycloinulooligosaccharide fruc-tanotransferase (CFTase) 유전자(cft)를 Saccharomyces cerevisiae SEY2102에 발현시키기 위해 대장균과 효모의 shuttle vector인 pYES2.0에 subcloning 하였다. 구축된 pYGECFTN(\( 8.6 \mathrm{~kb} \)) plasmid를 S. cerevisiae SEY2102에 형질전환하였고, uracil이 결핍된 SD 배지에서 선별하였다. cft 유전자는 선별된 형질전환체(S. cerevisiae SEY2102/pYGECFTN)에서 GAL1 promoter 조절하에 성공적으로 발현되어 cyclofructan (CF)을 생성함을 TLC로 확인하였다. 그러나, 균체 외로의 효소 분비는 이루어지지 않았고 cytoplasm보다 periplasmic space에 많이 존재하였다. S.cerevisiae에서 발현된 P. polymyxa 유래 CFTase 보다 P. macerans 유래 CFTase의 CF 생성이 image analyzer로 확인한 결과, 더 많음을 알수 있었다. 효소반응 5분째부터 CF가 생성됨을 확인하였고, 최적온도와 최적 \( \mathrm{pH} \)는 각각 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)와 \( \mathrm{pH} 8.0 \)로 나타났으며, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)까지 효소활성이 안정적으로 유지 되었다. Dahlia tubers, chicory root, Jerusalem artichoke 등의 inulin 기질에 따른 반응산물 분석 결과, 모든 기질로부터 CF가 생산되었으며, dahlia tubers와 Jerusalem artichoke로부터 가장 효과적으로 생성되었다.</p>