HAase의 저해 활성 측정을 위해 sodium-hyaluronic acid (HA)로 부터 형성된 N-acetylglu-cosamine을 glucoxazoline 유도체로 변형시킨 후 DMAB로 발색시켜 흡광도를 측정하였다. 본 실험에서 배양된 세포를 이용하여 Camichael 등의 방법에 따라시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내어지는 세포독성을 측정하였으며, 반감기가 짧아 실제적으로 측정이 불가한 유리 라디컬인 NO의 측정은 Raw 264.7 cell에서 nitric oxide synthase 을 발현시키고 생성된 supernatant에 포함된 NO의 양을 nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 griess reagent (Sigma,USA)를 사용하여 이루어졌다. 또한 Western blot을 통해 iNOS 단백질의 발현을 측정하였다.
<h2>Hyaluronidase 저해능 측정</h2> <p>HAase 저해 활성 측정은 Reissig 등의 방법에 의하여 sodium-hyaluronic acid (HA)로 부터 형성된 N-acetylglu-cosamine을 glucoxazoline 유도체로 변형시킨 후 DMAB로 발색시켜 흡광도를 측정하였다. \( 0.1 \mathrm{M} \) acetate buffer (\(\mathrm{pH}~3.5 \))에 녹인 HAase (\(7,900 \mathrm{U} / \mathrm{ml}\)) \(0.05 \mathrm{ml} \)와 시료용액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 반응시켰다. \( 12.5 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{CaCl}_{2} \) \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 가하고 혼합 후 다시 20분간 배양하였다. 기질로서 \( 0.1 \mathrm{M} \) acetate buffer (\(\mathrm{pH} \) 3.5)에 녹인 HA \( (12 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)을 첨가하여 다시 40분간 배양하여 \( 0.4 \mathrm{~N} \) potassiumtetraborate \( 0.1 \mathrm{ml} \) 및 \( 0.4 \mathrm{N}\) \(\mathrm{NaOH} \) 용액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)를 반응 흔합물에 첨가하여 3분 동안 수욕 상에서 가열한 후 완전히 냉각시켰다. 냉각시킨 반응물에 발색제로 DMAB 시약 \( 3 \mathrm{ml} \)를 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 반응시킨 후 \( 585 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 저해 활성을 산출하였다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>본 실험에 이용한 각 세포의 배양은 \( 10 \% \) fetal bovine se-rum (FBS)과 Dulbeco's modified eagle’s medium (DMEM)배지를 사용하였으며, \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.</p> <h2>MTT assay에 의한 세포 생존율 측정</h2> <p>세포독성 측정은 Camichael 등의 방법에 따라 측정하였다. Raw 264.7 cell를 96 well plate에 \( 0.6 \sim 8 \times 10^{3} \) cells/well이 되게 \( 0.18 \mathrm{ml} \) 분주하고 24시간 동안 세포를 안정시킨 후 각각의 시료를 농도별로 조제하여 \( 0.02 \mathrm{ml} \) 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \)\( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24시간 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 제조한 MTT 용액 \( 0.02 \mathrm{ml} \)을 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO:Ethanol (\( 1: 1 \)) \( 0.15 \mathrm{ml} \)를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 \( 550 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성 측정은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <p>세포독성 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\text { 무첨가군의 흡광도 }}\right) \) \( \times 100 \)</p> <h2>Nitric oxide 저해능 측정</h2> <p>NO는 반감기가 5초~4분 밖에 되지 않는 매우 불안정한 유리 라디컬이기 때문에 NO의 측정은 실제적으로 불가능하다. 따라서 Raw 264.7 cell에서 nitric oxide synthase 을 발현시키고 생성된 supernatant에 포함된 NO의 양을 nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 griess reagent (Sigma,USA)를 사용하여 측정하였으며, 6 well plate에 \( 2 \times 10^{6} \)개의 cell을 confluence가 \( 80 \% \)일 때, PBS로 2번 washing한 후 무혈청 배지를 사용하여 12시간 이상 배양시킨 다음 lip-opolysaochnide (LPS) \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)을 control 군을 뺀 모든 well에 다 넣어서 자극시켰다. 2시간 후에 R. multiffora root 추출물을 농도별로 처리하여 실험하였다. NO 생성량은 24시간 후에 su- pernatant를 모아 griess regent로 10분간 반응시킨 후에 형성된 분홍색 생성물을 ELISA reader를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도로 측정하였다.</p> <h2>Western blot을 통한 iNOS 단백질의 발현 측정</h2> <p>Raw 246.7 cell를 \( 60 \mathrm{~mm} \) tissue culture dish of \( 2 \times 10^{6} \)cell/well이 되도록 분주하여 24시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2} \) in-cubater에 배양하고 confluence가 \( 80 \% \) 일 때 DMEM 배지를 무혈청 배지로 교환한 다음 LPS (\(10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\))를 처리하여 2시간 동안 배양 후 R. multiflara root 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 상층액를 제거하고 PBS로 2회 세척하였다. Lysis buffer를 첨가하여 cell을 용해시켜 \( 12,000 \mathrm{rpm} \)에서 20분 원심분리하여 얻은 protein은 bovine serum albumin (BSA)을 표준물질로 하여 Bradford assay로 정량 하였으며, \( 10 \% \) SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 \( 120 \mathrm{V} \)에서 1시간 전기영동한 후, polyvinylidenedi-fluoride (PVDF)을 사용하여 \( 30 \sim 40 \mathrm{V} \)에서 2시간 이상 transfer 하였다. Transfer가 끝나면 ponceau S에 담근 후 band를 확인하고 TBST로 2회 washing, \( 5 \% \) skim milk로 overnight 시켜 background는 제거시켰다. 3 회 washing 후 1차 antibody \( (1: 1,000) \)를 1시간 동안 붙인 다음 2차 antibody \( (1: 1,000) \)를 붙이고 ECL kit (AmershamPharmacia, England)을 이용하여 film에 옮겨 측정하였다. Band density는 gel doc (Bio-rad, America)로 확인하였다.</p>