성체줄기세포와 대식세포 공배양은 trans-well culture 방법을 사용하여 \(0.4\mu\mathrm{m}\) pore 크기의 insert와 lower well에 24시간 배양하고, LPS를 자극하여 대식세포를 모아 다음 실험에 사용한다. 엑소좀의 분리는 ExoQuick kit을 사용하여 상층액을 원심 분리하고 \(4^\circ \mathrm{C}\)에서 24시간 반응시킨 뒤 \(350\mathrm{×g}\)에서 원심 분리하여 분리한다. 면역 조절인자 분석은 RNeasy mini kit을 사용하여 RNA를 추출하고 qPCR을 이용하여 GAPDH 발현을 reference gene으로 사용하여 분석한다.
<h2>성체줄기세포와 대식세포 공배양</h2> <p>성체줄기세포와 대식세포의 공배양은 trans-well culture 방법을 이용한다. \( 0.4 \mu \mathrm { m } \) pore 크기의 insert와 lower well 에 성체줄기세포와 대식세포를 각각 24 시간 배양하고, insert 와 lower well을 결합한 다음 \( 1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) LPS (Sigma, USA)를 이용하여 대식세포를 자극하고 24 시간 경과 후 대식세포를 모아 다음 실험에 사용한다. 또한, 성체줄기세포 상층 배양액(cultured medium; CM)을 얻고자 성체줄기세포를 12-36 시간 동안 배양하여 상층액을 수집한 다음 원심 분리하여 세포 등을 제거하고 다음 실험에 사용한다.</p> <h2>엑소좀(exosome)의 분리</h2> <p>ExoQuick kit (SBI, USA)를 사용하여 성체줄기세포 유래 엑소좀을 분리한다. 성체줄기세포를 배양한 세포 상층액을 원심 분리하여 준비한 다음, 제조사의 안내 방법에 따라 ExoQuick exosome precipitation solution을 넣고 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 시간 동안 반응시킨 뒤 \( 350 \times g \) 에서 원심 분리하여 엑소좀을 분리하고 다음 실험에 사용한다.</p> <h2>정량적 중합효소연쇄반응(quantitative real-time RT-PCR)을 이용한 면역 조절인자 분석</h2> <p>RNeasy mini kit (Qiagen, USA)를 이용하여 RNA를 추출하고, Nano-drop 1000 (Thermo, USA)을 사용하여 RNA 상태와 농도를 측정하며, cDNA 합성을 위해 \( \mathrm { GoScript } ^ {\mathrm { TM } } \) Reverse Transcriptase (Promega, USA)를 사용한다. Quantitative real-time RT-PCR (qPCR)은 96 well plate 에 LightCycler \( { } ^ {\infty } 480 \) SYBR Green I Master Mix (Roche Diagnostics, USA)를 사용하여 predenaturation \( \left (95 ^ {\circ } \mathrm { C } , 10 \right . \) 분), annealing ( \( 62 ^ {\circ } \mathrm { C } , 10 \) 초), elongation \( \left (72 ^ {\circ } \mathrm { C } , 10 \right . \) 초)을 45 cycle 반복한다. 그리고 \( 2 ^ { -△ } \mathrm { Ct } \) 계산법을 이용하여 melting curve를 분석하고, GAPDH 발현을 reference gene으로 이용하여 \( \mathrm { qPCR } \) 결과를 분석한다.</p> <h2>통계학적 분석</h2> <p>독립적인 3 회 \( (n=3) \) 의 실험을 수행하였으며, 결과는 평균과 표준편차 \( ( \operatorname { mean } \pm \mathrm { SD } ) \) 를 표시하여 나타내었다. 두 실험군 사이의 유의성은 Student's \( t \)-test \( left( \mathrm { JMP } ^ {\circledR } 6.0 \right . \); SAS Institute Inc., USA) 및 one-way ANOVA (analysis of variance)를 사용하여 검정하였으며, 유의성있는 결과 \( (p< \) \( 0.05 \) )를 판정한다.</p>