분리균주의 생산물을 분리정제하기위해 분리균주를 \( 50 \mathrm { ~mL } \) TSB 액체 배지에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 30시간동안 진탕배양 한 후 원심 분리하여 얻은 상등액을 \( 0.2 \mu \mathrm { m } \) membrane filter로 제균하였으며 소수성 column인 \( \mathrm { C } _ { 18 } \) Sep-Pak(Waters Co., Massachusetts, U.S.A.)을 \( 100 \% \) methanol과 3 차 증류수로 미리 soaking한 후에 제균된 상등액을 흡착시킨 후, 3 차 증류수로 수세하고 \( 100 \% \) methanol로 용출하였다.
<h1>항균 물질의 부분 정제</h1> <p>분리균주의 생산물을 분리정제하기위해 분리균주를 \( 50 \mathrm { ~mL } \) TSB 액체 배지에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 30시간동안 진탕배양 한 후 원심 분리 \( \left (9,500 \times g, 15 \mathrm { ~min } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \) 하여 얻은 상등액을 \( 0.2 \mu \mathrm { m } \) membrane filter로 제균하였다. 소수성 column인 \( \mathrm { C } _ { 18 } \) Sep-Pak(Waters Co., Massachusetts, U.S.A.)을 \( 100 \% \) methanol과 3 차 증류수로 미리 soaking한 후에 제균된 상등액을 흡착시킨 후, 3 차 증류수로 수세하고 \( 100 \% \) methanol로 용출하였다. Methanol에 녹아있는 분획을 Speed Vac Concentrator (Centra-Vac VS-802, Vision, Korea)를 이용하여 용매를 제거한 후 멸균수에 녹여 항세균 활성과 항진균 활성 측정 및 Tricine-SDS-PAGE에 사용하였다.</p> <h2>Tricine-SDS-PAGE</h2> <p>\( \mathrm { C } _ { 18 } \) Sep-Pak column으로 부분 정제한 시료의 항세균 및 항진균 활성을 니타내는 물질의 분자량을 Tricine-SDS-PAGE를 통하여 결정하였다. \( 18 \% \) acrylamide gel을 사용하여 전기영동을 시행하였으며, 표준 분자량 물질로는 polypeptide SDS-PAGE standards(Bio-Rad, U.S.A.)를 사용하였다. 전기영동 후 coomassie brilliant blue G(Sigma Co., U.S.A.)로 단백질을 염색 하였고, gel 상에서 항균활성을 나타내는 물질의 band 화인은 direct detection 방법으로 시행하였다. 분리균주의 부분 정제 시료를 전기영동 후 gel을 \( 25 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) isopropanol과 \( 10 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) glacial acetic acid 용액에 담가 상온에서 30 분간 고정시키고 증류수로 1 시간 30 분 동안 세척하였다. 세척한 gel은 1 개의 lane으로 잘라 PDA 평판배지 위에 놓은 후 그 위에 PDA top agar \( (0.7 \%, \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) \( 10 \mathrm { ~mL } \) 를 분주하여 군힌 배지 표면에 C. gossypiicola KF-2를 전면에 도말하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 72 시간 배양한 후 항진균 생육 저해환이 생성되는 부분을 화인하였다. 항세균 활성은 B. subtilis ATCC 6633을 지시균으로 사용하여 1개의 lane으로 자른 gel을 LB 평판배지 위에 놓고 그 위에 LB top agar \( (0.7 \%, \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) \( 10 \mathrm { ~mL } \) 에 B. subtilis ATCC 6633 \( \left (1 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { cfu } / \mathrm { mL } \right ) \) 을 첨가하여 분주하여 굳힌 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 12 시간 배양하여 항세균 생육 저해 활성을 보이는 부분을 화인하였다. 대조구로는 분리균주의 부분 정제한 시료를 첨가 하지 않은 acrylamide gel을 direct detection에 사용된 band gel과 같은 크기로 잘라 동일한 세척 및 활성 측정법을 시행하여 acrylamide 성분에 의한 생육 저해 작용이 없음을 화인하였다.</p>