체중 \( 150 \pm 10 \mathrm{~g} \)의 female rat을 실험실에서 1 주일간 적응시킨 후 정상군과 노화모델로서 난소를 절제한 노화군, 난소를 절제하고 각각 ascorbic acid, tocopherol, ascorbic acid와 tocopherol을 함께 투여한 군의 총 5군으로 나누어 고형사료를 사용하고 물은 자유롭게 섭취하도록 하며 3 일 후 부터 난소를 절게하지 않은 정상군과 난소를 절제한 노화군은 \( 0.9 \% \) saline, 난소를 절제한 각각의 rat에 kg당 100mg의 ascorbic acid, tocopherol,ascorbic acid+tocopherol을 이틀에 한 번 두달간 복강내로 각 물질을 투여하여 실험하였고 실험 종료 후 실험 동물을 ether 마취 하에서 개복하여 심장에서 채혈하여 30 분 후 \( 3000 \mathrm{rpm} \)에서 10 분간 원심 분리하여 혈청을 분리하여 간, 신장은 적출 후 \( 0.9 \% \) 생리 식염수용핵으로 세척하여 vial에 담아 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) freezer에 보관하였으며, 간 조직 중 catalase의 활성 측정을 위하여 phosphate buffer \( (0.05 \mathrm{M} \) \(\mathrm{pH 7.0}) \) \( 1.9 \mathrm{m \ell} \) 에 sample (간 homogenate를 \( 3000 \mathrm{rpm} \)에서 20 분간 원심분리한 상등액 \( 100 \mu \ell \) 를 buffer로 80배 희석) \( 0.1 \mathrm{m \ell} \) 와 과산화수소 용액 \(1 \mathrm{m \ell} \)를 혼합하여 \( 240 \mathrm{~nm} \) 에서 1 분 30 초 동안 흡광도 감소측정을하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 동물 및 식이</h2> <p>실힘 동물은 체중 \( 150 \pm 10 \mathrm{~g} \)의 female rat을 실험실에서 1 주일간 적응시킨 후 Table 1과 같이 정상군과 노화모델로서 난소를 절제한 노화군, 난소를 절제하고 각각 ascorbic acid, tocopherol, ascorbic acid와 tocopherol을 함께 투여한 군의 총 5군으로 나누었다. 고형사료를 사용하고 물은 자유롭게 섭취하도록 하며 3 일 후 부터 난소를 절게하지 않은 정상군(nonovariectomized group)과 난소를 절제한 노화군(ovariectomized group)은 \( 0.9 \% \) saline, 난소를 절제한 각각의 rat에 kg당 100mg의 ascorbic acid, tocopherol,ascorbic acid+tocopherol을 이틀에 한 번 두달간 복강내로 각 물질을 투여하였다.</p> <h2>혈액 및 장기 채취</h2> <p>실험 종료 후 실험 동물을 ether 마취 하에서 개복하여 심장에서 채혈하여 30 분 후 \( 3000 \mathrm{rpm} \)에서 10 분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였으며, 간, 신장은 적출하여 \( 0.9 \% \) 생리 식염수용핵으로 세척하여 vial에 담아 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) freezer에보관하여 실험에 사용하였다.</p> <h2>간(신장) 조직 중의 과산화지질 정량</h2> <p>간(신장) \( 1 \mathrm{g} \) 을 취하여 간(신장)무게의 5 배 용량인 \( 5 \mathrm{m \ell} \) 의 1/20 M phosphate buffer (\(\mathrm{pH 7.4}\))에 homogenation 시켜 TBA (thiobarbituric acid)와 반응시킨 후, sodium dodecyl sulfate 가용화법을 바탕으로 butanol을 이용하여 malone-dialdehyde 성분을 추출헤서 \( 535 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>혈청 중 콜레스테롤 함량 분석</h2> <p>혈청 중 콜레스테롤 함량은 총 콜레스테롤 측정용 시약(영동제약 kit 시약)을 사용하여 분석하였다. 검체용, 표준용, 시약 Blank에 각각 시료 \( 0.02 \mathrm{~m \ell} \) 씩 취한 다음 효소 시약\( 3.0 \mathrm{~m \ell} \) 씩을 첨가하고 잘 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 방치한 다음 시약 blank를 대조로 하여 60 분 이내에 파장 \( 500 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>혈청 중 HDL-콜레스테롤 함량 분석</h2> <p>혈청 중 HDL-콜레스테롤 함량은 HDL-콜레스테롤 측정용 시약(영동제야 kit 시약)을 사용하여 분석하였다. 혈청 \( 1.0 \mathrm{~m \ell}\)를 원심분리용 시험관에 넣고 침전시약 \( 0.1 \mathrm{~m \ell} \) 를 넣어 혼합하여 실온에서 5 분간 방치한 후 10 분간 원심 분리하여 상등액 \( 0.02\mathrm{~ml} \) 효소용액 \( 3.0 \mathrm{~m \ell} \) 를 혼합한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15 분간 반응시킨 후 1 시간이내에 맹검을 대조로 하여 \( 500 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>간 조직 중 단백질 함량 분석 (protein assay)</h2> <p>단백질의 정량은 Lowry등의 방법에 의해서 \( 750 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하고 표준단백 시료를 bovine serum albumin으로하여 같은 방법으로 측정하여 단백질량을 계산하였다.</p> <h2>간 조직중의 superoxide dismutase(SOD)의 활성측정</h2> <p>\( 0.2 \mathrm{M} \quad \) K-phosphate buffer(\(\mathrm{pH 7.4}) \)를 \( 672 \mu l, 1 \mathrm{mM} \) xanthine \( 100 \mu \ell, 1 \% \) sodiume deoxychlorate \( 30 \mu \ell, 1.5 \mathrm{mM} \) \(\mathrm {KCN}\) \( 30 \mu \ell, 0.2 \mathrm{mM} \) cytochrome C \( 150 \mu \ell \) 를 넣은 mixture에 sample \( 5 \mu k \) 를 넣고, xanthine oxidase원핵을 \( 10 \mu \ell \)를 넣어 mixing한 후 U.V. visible spectroscopy를 이용하여 \( 550 \mathrm{~nm} \)에서의 흡광도 변화를 2 분 동안 측정하였다. sample의 효소활성도를 알아보기 위한 표준액으로서는 Sigma사의 superoxide dismutase standard를 사용하였다.</p> <h2>간 조직 중 catalase의 활성 측정</h2> <p>phosphate buffer \( (0.05 \mathrm{M} \) \(\mathrm{pH 7.0}) \) \( 1.9 \mathrm{m \ell} \) 에 sample (간 homogenate를 \( 3000 \mathrm{rpm} \)에서 20 분간 원심분리한 상등액 \( 100 \mu \ell \) 를 buffer로 80배 희석) \( 0.1 \mathrm{m \ell} \) 와 과산화수소 용액 \(1 \mathrm{m \ell} \)를 혼합하여 \( 240 \mathrm{~nm} \) 에서 1 분 30 초 동안 흡광도 감소측정을하였다.</p> <h2>간 조직 중 GSH(glutathione reduced form), GSSG(glutathione oxidized form)의 정량</h2> <h3>◦GSH</h3> <p>Homogenate \( 100 \mu \)에 \( 25 \% \mathrm{HPO}_{3} 25 \mu \ell \) 를 섞어 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 12,000 \) rpm에서 10 분간 원심분리하여 96 well에 상등액 \( 10 \mu \)와 phosphate buffer (\(1 \mathrm{mM} \) EDTA 함유, \(\mathrm{pH 7.4}\)) \( 200 \mu \ell \) 와 o-phthalaldehyde \( 10 \mu \ell\)를 넣어 shaking 후 15 분 방치 후 형광측정 \( (\mathrm{Ex} .350 \mathrm{~nm} / \mathrm{Em} .420 \mathrm{~nm}) \)하였다.</p> <h3>◦GSSG</h3> <p>Homogenate \( 100 \mu \ell \)에 \( 25 \% \mathrm{~HPO}_{3}25 \mu \ell \)를 섞어 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), \( 12000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심분리하여 microtube에 상등액 \( 50 \mu l \) 와 N-ethylmalemide \( 20 \mu \ell \)를 섞은 후 20 분 방치하고 \( 0.1 \mathrm{~N} \mathrm{~NaOH} 430 \mu \ell \)를 가하여 혼합한 후 96well에 앞에서 혼합한 sample \( 200 \mu l \) 와 opt \( 10 \mu \ell \) 를 섞어 shaking 후 15 분 방치 후 형광측정 \( (\mathrm{Ex} .350 \mathrm{~nm} / \mathrm{Em} .420 \mathrm{~nm}) \) 하였다.</p> <h2>간 조직 중 GPX(GSH-peroxidase)의 활성 측정</h2> <p>\( 0.1 \mathrm{M} \) phosphate buffer (4mM EDTA) \( 400 \mu l, 0.01 \mathrm{M} \)\( \mathrm{~NaN}_{3} 70 \mu \ell, 0.01 \mathrm{M} \) GSH \( 70 \mu \ell, 1.5 \mathrm{mM} \) NADPH \( 70 \mu \ell, \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) \( 360 \mu \ell \) GSSG-reductase \( (1.8 \mathrm{U} / \mathrm{m} \ell) 20 \mu \ell \), sample (20%원액) \( 10 \mu \) 를 혼합하여 상온에서 1 분간 방치한 후 \( 2 \mathrm{mM} \) 의 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} 100 \mu \ell \)를 가해 잘 석은 후 \( 340 \mathrm{~nm} \)에서 1 분 30 초간 흡광도 감소 측정을 하였다.</p> <h2>통계 처리</h2> <p>모든 결과의 자료는 student's t-test로 통계 처리하였다.</p>