위 논문의 실험에서는 3T3-L1과 지방 세포에 각각 미역 에탄올 추출물을 농도를 다르게하여 첨가하였다. 이를 24시간 동안 배양을 진행한 후 결과를 관측해 보았다. 먼저 MTT assay를 이용하여서 세포독성을 측정해 보았다. 그 이후 Oil Red O staining을 이용하여서 이의 지방함량을 측정하여 보았다. 마지막으로 ELISA reader를 이용하여 상대적인 세포 생존율과 더불어 물질에 포함되어 있는 지방의 함량을 분석하여 보았다.
<h2>세포 독성 확인</h2> <p>3T3-L1과 지방세포에서 미역 에탄올 추출물의 세포독성은 MTT assay로 분석하였다. 6 well plate에서 confluent 상태가 될 때까지 배양된 3T3-L1 지방전구세포에 미역 에탄올 추출물을 \( 0,10,20,30,40,50,60,80,100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도로 첨가하여 24시간 배양하였다. Tetrazolium bromide salt (MTT, Sigma Aldrich)를 \( 300 \mu 1 \) 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 4 \) 시간 동안 배양한 후 배양액을 제거하였다. DMSO (Sigma Aldrich)를 \( 100 \mu 1 \) 첨가하여 생성된 formazan을 녹였다. ELISA reader (EL800, BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 \( 630 \mathrm { ~nm } \) 의 흡광도에서 상대적 세포 생존율을 측정하였다.</p> <h2>Oil Red O 염색</h2> <p>지방전구세포 분화 시에 형성된 지방의 함량은 Oil Red O staining을 이용하여 측정하였다. 미역 에탄올 추출물은 분화 과정의 각 단계마다 분화배지에 \( 0,10,20,30,40,50 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) 의 농도로 첨가하였다. 분화과정 8 일째에 성숙지방세포의 배양액을 제거한 후 \( 10 \% \) 의 formalin으로 1 시간 동안 지방세포를 고정하였다. \( 60 \% \) isopropyl alcohol을 이용하여 세척한 후 Oil Red O solution (Sigma Aldrich)을 넣고 실온에서 10분간 염색하였다. Oil Red O solution을 제거하고 증류수로 4 회 세척하여 완전히 건조하였다. \( 100 \% \) isopropyl alcohol을 사용하여 염색된 지방을 추출하였으며, ELISA reader를 이용하여 490 \( \mathrm { nm } \) 의 흡광도에서 지방함량을 분석하였다.</p> <h2>단백질 추출 및 Western blot</h2> <p>단백질을 추출하기 위해 Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer [150 mM NaCl, 1.0 \% Triton X-100, 0.5 \% Sodium deoxycholate, \( 0.1 \% \) Sodium dodecyl sulfate (SDS), \( 50 \mathrm { mM } \) Tris \( \left ( \mathrm { pH } \right . \) 8.0)]를 지방세포에 첨가하였다. \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 분간 반응시킨 후 \( 14,240 \times g \) 에 20 분간 상등액을 원심 분리하였다. 상등액의 총 단백질량은 Bicinchoninic acid (BCA) method에 따라 Bio-Rad protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 정량하였다. 동량의 단백질을 \( 12 \% \mathrm { SDS } \) - poly-acrylamide gel에서 전기영동 하였으며, 전기 영동 후 gel 내의단백질을 Nitrocellulose membrane (PALL, Washington, NY, USA)으로 \( 100 \mathrm { ~V } \) 에서 1 시간 동안 전사시켰다. Tris-buffered saline (TBS) [0.02 M Tris- \( \mathrm { HCl } , 0.5 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } , \mathrm { pH } \) 7.5]에 \( 3 \% \) bovine serum albumin을 첨가한 blocking solution을 사용하여 실온에서 2시간동안 blocking을 실시하였다. Blocking한 membrane을 10 분 동안 3회 Tris-buffered saline with tween-20 (TTBS) [0.02 M Tris- \( \mathrm { HCl } , 0.5 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } , 0.05 \% \) Tween-20, \( \mathrm { pH } \) 7.5]로 세척한 후 \( 1 \% \mathrm { BSA } \) 를 포함한 TTBS에 1:1,000으로 희석시킨 1차 항체를 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. TTBS로 3회 세척한 후, \( 1 \% \mathrm { BSA } \) 를 포함한 TTBS에 1:1,000으로 희석시킨 2차 항체를 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 2차 항체가 부착된 membrane은 TTBS로 세척하였고, 2차항체와 결합한 단백질은 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitro blue tetrazolium (BCIP/NBT, Sigma Aldrich)로 발색시켰다.</p>