Indigo는 indole을 기질로 사용하여 다양한 oxygenases 촉매를 통해 oxidation된 후 dimerization에 의해 생합성되는데, Pseudomonas putida, Acinetobacter sp., Bacillus megaterium, Burkholderia cepacia 등의 대표적인 효소들이 관여한다. 또한 metagenome에서 발굴된 Rhodococcus sp. strain T104, Rhodococcus strain ATCC21145, JEC54, Bacillus stearothermophilus 등의 single component로 구성된 효소들도 indigo 생성 효소로 알려져 있다. 그래서 연구를 통해 Rhodococcus sp. RHA1 유래의 indole oxygenase로 추정되는 유전자를 cloning하고 그 효소를 알아내어, indigo 생산 생물공정을 확립하기 위한 기초를 다진다.
<h1>서 론</h1> <p>염색에 널리 사용되는 청색 색소인 indigo는 indole은 기질로 사용하여 여러 다양한 형태의 oxygenases 촉매에 의해서 indoxyl로 oxidation된 후 자발적인 반응으로 indoxyl 2분자의 dimerization에 의해서 indigo가 생합성된다. 이러한 반응에 관여하는 대표적인 효소들로는 Pseudomonas putida 유래의 naphthalene dioxygenase와 toluene dioxy-genase, Acinetobacter sp. 유래의 phenol hydroxylase, Bacillus megaterium 유래의 변이된 cytochrome P450 monooxygenase, Burkholderia cepacia 유래의 toluene monooxygenase 등이 보고 되어있다. 이들은 oxygenase, oxidoreductase, 전자전달 단백질등으로 이루어진 multicomponent system으로 구성된 mono-, di-oxygenase 들이다. 일 부 FAD-dependent monooxygenase도 indigo를 합성하는 기능이 알려져 있는대, 이는 앞에서 언급한 효소들과는 달리 single component로. 구성된 단백질이다. 한편, metagenome에서 발굴된 uncultured bacterium JEC54, Rhodococcus sp. strain T104, Rhodococcus strain ATCC21145 유래의 indole oxygenases와 Bacillus stearo-thermophilus 유래의 phenol hydroxylase는 single com-ponent로서 indigo 생성 효소활성을 나타내며, multicomponent oxygenase system과 FAD-dependent monooxygenase와는 단백질 상동성이 거의 없는 부류에 속하는 효소들로 밝혀져있다.</p> <p>Rhodococcus는 특히 hydrophobic xenobiotics와 같은 특이한 광범위한 범위의 유기화합물를 분해할 수 있는 Gram \(( + ) \), 호기성 토양미생물이다. Rhodococcus sp. RHA1(현재 R. jostii라 명명)는 환경오염물질인 polychlorinated biphenyls를 분해할 수 있는 특수한 미생물로 최근 그 유전체의 전체염기서열이 밝혀졌다. 그 중에는 일부 Rhodococcus genus에서 실험적으로 그 기능이 확인된 기존의 효소와는 낮은 단백질 identity \( (25 \sim 30 \%) \)를 갖는 indole oxygenase로 추정되는 유전자가 확인이 되었다.</p> <p>본 연구는 Rhodococcus sp. RHA1 유래의 indole oxy-genase로 추정되는 유전자를 cloning하고 그 효소의 기능을 규명하여, 향후 보다 더 실용적으로 indigo 생산 생물공정을 확립하기 위한 기초를 마련하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주와 플라스미드</h2> <p>Rhodococcus sp. RHA1 유래의 미확인 indole oxygenase 유전자를 함유하고 있는 Escherichia coli RF0011 FOZ를 캐나다의 British Columbia 대학의 Lindsay D. Eltis 교수로부터 분양받아 사용하였다. 형질전환 및 발현숙주로는 \( E.~coli \) \( \mathrm { DH } 5 \alpha \)를 사용하였다. 유전자 클로닝 및 발현목적으로 플라스미드 pTrc99A(Pharmacia Biotech., Uppsala, Sweden)를 사용하였다.</p> <h2>Indole oxygenase 유전자의 클로닝, 발현 및 상동성 분석</h2> <p>Rhodococcus sp. RHAl 유래의 미확인 indole oxygenase 유전자를 플로닝하기 위해 GenBank에 등록되의 있는 염기서열(YP_709118, NC008271)을 바탕으로 primer를 제작하였다. Forward primer의 5' 말단에는 \( N c o \mathbf { I } \), reverse primer의 5' 말단에는 \( Hind \mathbf { Ⅲ } \) 제한효소 인식서열을 삽입하였다(forward primer: ATCTTCCATGGCTCAGACGCTCGA-ACCCA, reverse primer: ATCATAAGCTTATACATCCAT-CGTGAGTG). Pfu-X polymerase(Solgent)를 이용하여 \( E.~coli \) RF0011-FOZ에서 정제한 plasmid를 주형 DNA로 사용하여 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } ~20 \)초, \( 57 ^ {\circ } \mathrm { C } ~40 \)초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } ~40 \)초의 조건으로 30cycle의 polymerase chain reaction(PCR)을 수행하였다. 획득한 indole oxygenase 유전자 단편과 클로닝 벡터 pTrc99A를 각각 \( N c o \mathbf { I } \) 및 \( Hind \mathbf { Ⅲ } \) 제한혀소로. 이중절난하고 ligation하여 재조합 plasmid를 제조하였다. 재조합 plasmid를 \( E.~coli \) \( \mathrm { DH } 5 \alpha \)에 형질전환하여 ampicillin이 첨가된 LB agar plate로부터 형질전환체를 선별하였다. 제한효소절단 및 DNA 염기서열을 확인하여 형질전환체내의 vector 내에 미확인 indole oxygenase 유전자 단편이 삽힙되었음을 확인하였다. 한편, 제작된 재조합벡터내의 유전자를 항시 발현시키기 위해서 forward primer(CGGGGTACCTTTTTGCGCCGACAT-CATAA) 및 reverse primer(CGGGGTACCTAAGGAGAA-AATACCGCATCAGG)를 사용하여 PCR을 수행한 후 \( Kpn \mathbf { I } \) 제한효소로 절단, 정제 및 self ligation하여 \( l a c 1 ^ { a } \)가 제거되어 IPTG의 첨가 없이도 indole oxygenase가 항시 발현되는 재조합 plasmid를 제작하였다. 각 과정에서 PCR후 유전자의 서열은 제노텍(주)에 의뢰하여 염기서열분석을 통해 확인하였다. 단백질 발현을 확인하는 과정은 세포배양액 \( 30 \mathrm { ~mL } \)을 K-Pi Buffer( \( \mathrm { pH } 7.4 \))로 2회 세척한 후 다시 완충액 \( 5 \mathrm { ~mL } \)을 첨가한 다음 초음파분쇄기(pulse on \( 1 \mathrm { ~sec } \), pulse off \( 8 \mathrm { ~sec } , 10 \mathrm { ~min } \)간)를 사용하여 세포를 파쇄하였다. \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , \) \(14000 \mathrm { ~rpm } \)에서 30분간 원심분리하여 그 상등액을 취하여 Bradford시약으로 단백질을 정량한 다음 \( 10 \sim 30 ~ \mu \mathrm { g } \)의 단백질을 가지고 SDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행하여 단배질 발현을 확인하였다. 단백질의 상동성은 NCBI의 BLAST program을 이용하여 분석하였다.</p>