본 실험에서 시료로 사용된 적채(Brassica oleracea L., BO)를 추출 분획하여 암세포 중식억제 효과 및 유도 활성 물질 검색에 사용하였다. 계통분획 추출물의 항균성 검색은 paper disc method를 이용하였고, 적채 추출 분획물의 암세포 증식억제 효과는 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) assay assay를 사용하였다. QR 생성 유도 효과는 Prochaska 와 Santamaria의 방법으로 측정하였고, 단백질량은 동일한 crystal violet 염색 방법으로 정량하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료</h2> <p>본 실험에 사용된 적채(Brassica oleracea L., BO)는 2003년 5월 부산 엄궁 농수산물시장에서 구입하여 음건하였다. 이 시료를 추출 분획하여 각 균주에 대한 항균효과와 암세포주에 대한 암세포 중식억제 효과(cytotoxicity) 및 quinone reductase (QR) 유도 활성 물질 검색에 사용하였다.</p> <p>항균실험에 사용한 균주는 충치 유발균인 Streptococcus mutans [KCTC3065], 곡류 부패균인 Bacillus substilis [KCTC1021], 대장균인 Escherichia coli [KCTC1929], 식품 부패균인 Pseudomonas aeruginosa [KCTC2004] 및 황국균인 Aspergillus oryzae [KCTC6983]균이었으며 각 균의 생육 및 보존을 위해 사용한 배지는 Nutrient agar (Difco), Yeast extract, Malt extract를 사용하였다.</p> <p>암세포 증식억제 실험에 사용된 시약 중 NP-40과 menadione은 Sigma사(St, Louis. USA) 제품을 사용하였고 flavinadenine dinucleotide (FAD), dicumarol 및 glucose-6-phosphate dehydrogenase는 Amresco사(USA) 제품을 구입하였으며, minimum essential medium (MEM), Dulbeco's Eagle modified medium (DMEM) 과 phosphate buffered saline (PBS), Trypsin-EDTA, Penicillin-Streptomycin, FBS (Fetal Bovine Serum)등은 Gibco-BRL (Grand Island Biologic Co. USA)에서 구입하였으며, 그 외 연구에 사용된 용매 및 시약은 특급을 사용하였다.</p> <h2>시료의 추출 및 분획물 제조</h2> <p>시료로 사용된 적채(BO)는 건조 후 분말화하여 메탄올을 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 진탕한 후 4시간 동안 3회 반복 추출하고 회전식 진공 농축기로 감압 농축시킨 후 동결 건조하여 적채의 methanol 추출물(BOM)을 얻고, 이 추출물을 각 용매 별로 분획하여 hexane층(BOMH), ethyl ether충(BOMEE), ethyl acetate층(BOMEA), butanol층(BOMB) 및 수층분획물(BOMA)로 각각 분획하고 각 층을 감압 농축 후 동결 건조하여 분말로 만들어 시료로 사용하였다.</p> <h2>용매 분획별 항균활성 측정</h2> <p>계통분획 추출물의 항균성 검색은 paper disc method를 이용하였다. 항균성 시험용 평판 배지는 멸균 후 petridish에 \( 20 \mathrm{ml} \)씩 분주하여 응고시키고 전 배양한 각종 시험균을 무균적으로 첨가하여 기층용 배지 위에 다시 \( 0.1 \mathrm{ml} \)씩 분주하여 이중의 평판배지를 만들었다. 각 용매 분획별 추출물의 농도를 \( 500\)에서 \( 2000 \mathrm{\mu g} / \mathrm{disc} \)까지 시료의 농도를 증량시키면서 멸균된 disc (직경 \( 8 \mathrm{mM} \), Toyo Roshi Kaisha, Ltd.)에 흡수, 건조시켜 균주가 도말된 plate 표면에 올려놓은 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 24시간 배양하여 disc 주위에 생 성된 clear zone의 직경 \( (\mathrm{mM}) \)으로부터 각 분획물의 항균활성을 측정하였으며 이 실험을 5회 반복하여 평균치를 나타내었다.</p> <h2>암세포 배양</h2> <p>본 실험에 사용한 암세포주는 인체 간암 세포인 HepG2(human hepatocellular carcinoma), 자궁 경부암 세포인 HeLa (human cervices adenocarcinoma), 유방암 세포인 MCF-7 (human breast adenocarcinoma pleural effusion) 및 정상세포인 liver cell을 2003년 7월 부산대학교 의과대학 생화학교실에서 제공받았다. HepG2, HeLa, MCF-7 및 liver 정상 세포주는 DMEM medium에 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS) \( 100 \mathrm{ml} \)와 \( 1 \% ~100 \mathrm{~units/ml}\)의 penicillin streptomycin \( 10 \mathrm{ml} \)이가 함유된 배지를 사용하여, \( 37^{\circ} \mathrm{C} ~5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) incubator에서 monolayer로 배양하였다.</p> <h2>암세포 증식억제 효과측정(Cytotoxicity)</h2> <p>적채 추출 분획물의 암세포 증식억제 효과는 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) assay assay를 사용하여 행하였다.</p> <p>이를 위해 각 세포주를 \( 1 \times 10^{5} \) cells/well의 농도로 맞추고 24 well에 각각 \( 1 \mathrm{ml} \)씩 첨가하여 24시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) incubator에서 배양한 후 용매 종류별 분획물을 각각 일정량의 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여서 \(50, 100, 150, 200\) 및 \( 250 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 첨가하였다. 48시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT 용액 \( (3 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)을 \( 100 \mu \mathrm{l} \)씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO와 ethanol을 1:1로 흔합한 용액 \( 1 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 천천히 녹인 후 UV-visible spectrophotometer를 이용하여 \( 570 \mathrm{~nm}, 690 \) \( \mathrm{nM} \)에서 각각 흡광도를 측정하여 대조군 세포수를 \( 100 \% \)로 하였을 때의 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다. 같은 방법을 이용하여 정상세포인 liver cell을 이용하여 적채 분획물의 세포 독성효과 실험을 하였다.</p> <h2>Quinone reductase (QR) 유도 활성 측정</h2> <p>QR 생성 유도 효과는 Prochaska 와 Santamaria의 방법 및 박[17]의 방식을 참조하여 측정하였다. 즉 T-75 flask에서 배양중인 HepG2 세포가 \( 80 \% \) 이상 중식하게 되면 24 well plate의 각 well에 \( 1 \times 10^{4} \) cells/ml 되도록 HepG2세포를 분주하여, \( 37^{\circ} \mathrm{C} ~5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) incubator에 24시간 동안 배양한 후 적채 추출물을 각각 DMSO에 녹여 \( 40,60,80 \) 및 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 첨가하고, 다시 24시간 동안 배양한 다음 배양액을 제거하였다. 배지가 제거된 각 well에 \( 250 \mu \mathrm{L} \)의 lysis buffer \( \left(10 \mathrm{mM}\right. \) Tris-HCl, pH 8.0, \(14 \mathrm{mM}\) NaCl, \( 15 \mathrm{~mM} \mathrm{~MgCl}_{2} \)를 혼합하여 well에 \( 1 \mathrm{~mM} \) 씩 첨가하여 5분 동안 반응시킨 후, 반응 정지 용액인 \( 10.3 \mathrm{~mM}\) dicumarol, \(0.5\%\) pyridine, \( 5 \mathrm{mM} \) potassium phosphate (pH 7.4) 흔합액을 250 \(\mu \mathrm{l}\) 씩 첨가하여 효소반응을 정지시키고 UV-visible spectrophotometer롤 이용하여 \( 610 \mathrm{nM} \) 에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 그리고 단백질량은 동일한 set의 well plate에 대한 crystal violet 염색 방법으로 정량하였다.</p>