MBTI의 아미노산의 서열정렬은 분리정제한 MBTI를 Fuller등의 방법[6]에 따라 환원반응후 S-pyridyl화 반응을 하였다.S-pyridylated MBTI를 trypsin으로 가수분해한 다음 Cl8-reverse phase HPLC column 으로각각의 겝타이드들을 분리하였다. Trypsin affinity column을 퉁과한 sample의 trypsin inhibition activity를 측정하기 위해 \( \mathrm{N} \alpha \)-benzoyl-L-arginine-7-amido-4-methylcoumarin (Bz-Arg-MCA)을 기질로 사용하여 반응시 나타내는 형광의 세기를 측정하여 계산하였다. BTI가 trypsin에 대하여 어떤 형태의 저해 반응을 일으키는지 알아보기 위하여 기질인 BAPNA의 농도 및inhibitor의 농도를 변화시켜 효소의 활성을 측정하였다. Serine protease인 chymotrypsin, elastase와 plasmin,thrombin에 대해 MBTl의 저해정도를 측정하기 위하여 기질로 Bz-Arg-MCA, Suc-Leu-Leu-Var-Tyr-MCA, Suc-Ala-Pro-Ala-MCA, Boc-Val-Leu-Lys-MCA, Boc-Val-Pro-Arg-\( \mathrm{MCA} \) 을 각각 사용하여 실험하였다. MBTI의 pharmacological effect 측정은 펜토바르비탈 나트륨을 복강주사 (30 \mathrm{mg} / \mathrm{kg})(30mg/kg) 하여 마취한 guinea pig의 경정맥에 주사후 실험한다.
<h3>MBTI의 아미노산 서열결정</h3> <p>분리정제한 MBTI를 Fuller등의 방법[6]에 따라 환원반응후 S-pyridyl화 반응을 하였다. S-pyridylated MBTI를 trypsin으로 가수분해한 다음 Cl8-reverse phase HPLC column 으로각각의 겝타이드들을 분리하였다. 이를 환원 조건에서 SDS-PAGE에 적용하여 얻어진 밴드를 Polyvinylidene difluoridemembrane (PVDF membrane, Millipore)에 blotting 하여자동 아미노산 서열분석기로 아미노산 서열을 결정하였다. 단백질 함량은 Lowry 등의 방법에 따라 측정하였다.</p> <h3>MBTI 의 저해활성 측정</h3> <p>Inhibition concentration \( 50 \%\left(\mathrm{IC}_{50}\right) \) 의 측정</p> <p>Trypsin affinity column을 퉁과한 sample의 trypsin inhibition activity를 측정하기 위해 \( \mathrm{N} \alpha \)-benzoyl-L-arginine-7-amido-4-methylcoumarin (Bz-Arg-MCA)을 기질로 사용하여 반응시 나타내는 형광의 세기를 측정하여 계산하였다. Sample을 \( 50 \mu \) 취했을 때 최종 농도가 각각 \( 1,0.6 \),\( 0.2,0.1,0.05 \mu \mathrm{g} \)이 되도록 희석하여 각각에 trypsin \( (25 \mu \mathrm{g} / \)ml) \( 40 \mu \ell \) 를 첨가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 incubation 시킨후, 기질액으로 디메칠설폭사이드에 용해한 \( 5 \mathrm{mM} \mathrm{Bz} \)Arg-MCA \( 10 \mu l \)를 첨가하고 다시 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간incubation 시킨다. 반응 정지를 위해 \( 17 \% \) acetic acid를\( 1 \mathrm{ml} \) 첨가한다. 생성된 7-amino-4-methyl coumarine (AMC)을 여기파장 \( 380 \mathrm{~nm} \), 발광파장 \( 460 \mathrm{~nm} \) 에서 형광세기를 측정하여 트립신의 활성을 \( 50 \% \) 억제하는 농도( \( \left(\mathrm{IC}_{50}\right) \)를 구하였다.</p> <h3>MBTI의 trypsin에 대한 저해형 결정</h3> <p>MBTI가 trypsin에 대하여 어떤 형태의 저해 반응을 일으키는지 알아보기 위하여 기질인 BAPNA의 농도 및inhibitor의 농도를 변화시켜 효소의 활성을 측정하였다. 먼저 trypsin의 BAPNA에 대한 가수분해 반응속도를 측정하였다. 즉, BAPNA의 농도를 여러가지로 변화시켜 저해활성 실험을 한 후 그 반응속도(10분 동안 반응용액에서생성된 p-nitroaniline의 mmole 수)를 측정하여 Lineweaver-Birk방법으로 도식하여 trypsin의 BAPNA에 대한 Vmax와\( \mathrm{Km} \) 값을 결정하였다. MBTl의 저해형을 결정하기 위하여정제한 MBTI 일정량을 위의 각 반응용액에 함께 첨가하여고 때의 반응속도를 측정한 후 마찬가지 방법으로 \( \mathrm{Vmax} \)와\( \mathrm{Km} \) 값을 구하여 결정하였다.</p> <h3>각종 protease에 대한 MB'T의 저해도 측정</h3> <p>Serine protease인 chymotrypsin, elastase와 plasmin,thrombin에 대해 MBTl의 저해정도를 측정하기 위하여 기질로 Bz-Arg-MCA, Suc-Leu-Leu-Var-Tyr-MCA, Suc-Ala-Pro-Ala-MCA, Boc-Val-Leu-Lys-MCA, Boc-Val-Pro-Arg-\( \mathrm{MCA} \) 을 각각 사용하여 실험하였다. \( 50 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \)(containing \( 20 \mathrm{mMCaCl}_{2} \) ) \( 400 \mu l \) 에 chymotrypsin, elastase,plasmin, thrombin 각각 \( 50 \mu \ell \)와 MBTI \( 40 \mu l \)를 가하고 3\( 7 \mathrm{C} \) 에서 10분간 incubation시킨다. 여기에 각각의 기질액을\( 10 \mu \) 가하고 다시 \( 37 \mathrm{C} \) 에서 10분간 incubation시킨 후\( 30 \% \) acetic acid로 반응을 중지시킨다. 생성된 7-amino-4-methyl coumarine을 여기파장 \( 380 \mathrm{~nm} \), 발광파장 460\( \mathrm{nm} \) 에서 형광세기를 측정하여 사용한 각각의 효소의 활성을 \( 50 \% \) 억제하는 농도 \( \left(\mathrm{IC}_{50}\right) \) 를 구하였다.</p> <h3>MBTI의 pharmacological effect 측정</h3> <p>Septic shock caused by pseudomonal elastase inguinea pig</p> <p>펜토바르비탈 나트륨을 복강주사 \( (30 \mathrm{mg} / \mathrm{kg}) \) 하여 마취한 guinea pig의 경정맥을 약물주입을 위하여 PE-50 튜브로 케뉴레이션하고, MABP (Mean Arterial Blood Pressure)측정을 위해 경동맥을 케뉴레이션하여 blood pressuretransducer (Nihon Koden, TP-400T)에 연결하였다. 경정맥에 연결된 케뉴라에 대조군으로 생리식염수, 시료로서 분리정제한 MBTI를 생리식염수에 용해하여 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 로전처치 한 후, 1분 후 pseudomonal elastase (P.E., \( 0.3 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) )를 투여하여 MABP의 변화를 관찰하였다.</p>