SDS-PAGE에서 CGTase들은 주로 불용성 형태로 발현되며, chaperone과의 공동발현 및 저온 배양은 가용성 형태로의 전환을 촉진시킨다. 단독 배양에 비해 chaperone과 공동발현시킨 경우 25℃에서 더 많은 가용성 CGTase가 생산되는 것을 확인했다. 이는 GroEL/ES와의 공동발현과 저온 배양이 불활성형 효소를 활성형으로 전환시키고 가용성을 증가시키는데 유리하다는 것을 나타내며, 이는 E. coli에서 재조합 단백질 생산에 유용하게 활용될 수 있다는 시사점을 제공한다.
<h2>가용성 분획의 분석 및 가용화 정도의 측정</h2> <p>SDS-PAGE에서 대부분의 CGTase들이 불용성 형태로 대량 발현되어 있으며 chaperone과의 공동발현과 저온 배양 시 가용성 형태로의 전환정도를 눈으로 쉽게 확인 할 수 있 었다. 단독 배양 시 37℃보다 25℃의 분획에서 더 많은 양의CGTase band를 볼 수 있으며 chaperone과 공동발현 시킨 경우 역시 25℃에서 37℃보다 더 많은 가용성 CGTase가 생산됨을 확인 할 수 있었다(Fig. 2).</p> <p>SDS-PAGE bands를 Image Analyzer로 분석한 결과,pTCGT1만을 지닌 대장균을 37℃에서 단독 배양시킬 경우 불용성에서부터 가용성으로의 전환 수율이 20%, specific activity는 0.12 unit/ml․OD600(Table 1)을 나타내는 반면, 25℃에서 GroEL/ES와 공동발현시켰을 경우 전체 CGTase의69%가 넘는 양이 가용성 분획에서 발견되었으며 specific activity는 0.25 unit/ml.․OD600로 훨씬 더 높게 나타났다. 이는 37℃에서의 단독배양보다 가용성 CGTase 생산은 3.5배, specific activity는 2배 증가된 값으로 가용성 CGTase 생산증가에 비해 specifc activity가 크게 증가하지 못한 것은 GroEL/ES와 공동발현 시킬 경우 발현된 전체 CGTase의 양이 단독배양보다 10% 이상 감소했기 때문인 것으로 사려되어진다. 이전 연구에서 GroEL/ES(pGro7)와 CGTase를 37℃에서 공동발현시켜 27.9%의 가용성 CGTase를 생산한 경우와 비교할 때 같은 조건에 단순히 온도만 낮춘 25℃배양으로 더 높은 33%(Table 1)의 soluble 형태의 CGTase를 생산해냈다. 이 역시 가용성 효소 생산에는 저온배양이 유리함을 증명하며 GroEL/ES와의 공동발현이 병행될 때 가용성CGTase의 생산에 훨씬 더 유리하다는 것을 본 실험결과로 확인할 수 있었다.</p> <p>25℃에서 가용성 CGTase의 높은 발현양상은 저온에서는 세포내에서 CGTase의 생성속도가 낮아지기 때문이다. 일반적으로 과생산된 단백질의 빠른 축적은 봉입체의 생성을 증가시키는 경향을 보이는 것으로 알려져 있다. 온도를 낮춰 25℃에서 배양 할 경우 CGTase 단백질의 생산 속도가 37℃에서 보다 훨씬 느려지게 되고, 그만큼 생성된 단백질의 양도 줄어들게 되어 세포 내 단백질 농도가 낮아지게 되는데,이러한 환경은 세포내 insoluble protein들이 응집체를 형성하는데 불리한 조건으로 작용해 긍극적으로 봉입체의 형성을 방지하는 역할을 하는 것으로 판단된다.</p> <p>\( \beta \)-Glucosidase를 목적 단백질로 사용한 실험의 경우 GroEL/ES와 함께 25℃ 배양 시 68%가 넘는 양이 가용성 형태로 발현되었고, 대조군에 비해 20배가 넘는 활성을 보였으며,D-carbamoylase를 18℃에서 GroEL/ES와 함께 발현 시 목적 단백질 전체의 80%가 가용성 형태로 발현됐으며 4∼5배 증가된 활성을 나타냈다. 그리고 human C1 inhibitor을 20℃에서 GroEL/ES와 공발현시킨 경우 soluble 형태의 생산이 5배나 증가했으며 활성 역시 4.5배 정도 향상됐음이 실험으로 보고된 바 있다.</p> <p>이와 같이 GroEL/ES와의 공발현과 저온 배양의 공동작용은 불활성형 효소를 활성형으로 전환시켜 활성형 CGTase의가용화(solubilization)에 영향을 미치는 것으로 나타났으며,이러한 연구결과는 E. coli에서 활성형, 가용화 형태로 상업적 재조합 단백질 생산 시 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 사료된다.</p> <h1>요 약</h1> <p>E. coli에서 B. macerans 유래 cyclodextrin glucanotransferase (CGTase)의 활성형 생산에 GroEL/ES chaperone과의 공발현과 저온 배양의 공동작용 효과에 대해 조사하였다. 실험에사용된 cgt와 groEL/ES 유전자를 발현하는 pTCGT1과 pGro11은 각각 T7 promoter와 Pzt-1 promoter에 의해 조절되고 이들을 E. coli에 도입시켰다. 대수증식기 초기(2 hr)와 대수증식기 중기(3 hr)에 tetracycline 10 ng/ml 과 IPTG 1 mM을첨가하여 각각의 유전자를 발현시켰다. CGTase 활성과 specific activity 측정 시 37℃에서 pTCGT1 단독 발현 보다 25℃에서 chaperone과 함께 발현시킨 경우 2배나 높은 활성이측정됐으며, SDS-PAGE 분석결과 37℃에서 단독 발현 시킬경우 20% 정도 가용성 형태로 발현되던 것이 25℃에서 chaperone과 공발현 시에는 거의 3.5배가 넘는 69%가 가용성으로 전환됨을 알 수 있었다. 이와 같이 분자 chaperone과 25℃에서의 저온 배양은 E. coli에서 활성형질 가용성 CGTase의 생산 증가에 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다.</p>