균주에서 효소인 lipase를 분리하여 온도, \( \mathrm{pH} \) 그리고 금속이온에 따른 활성을 조사했다. 효소는 \( 20 \sim 50^{\circ} \mathrm{C} \)의 온도조건, \( \mathrm{pH} 6.0 \sim 10 \) 범위에서 높은 효소 활성을 나타냈다. 금속이온인 \( \mathrm{Ca}^{2+}, \mathrm{Mg}^{2+}, \mathrm{Na}^{+} \)에 의해에 효소 활성이 저해 받지 않았고 \( \mathrm{Cu}^{2}, \mathrm{~Pb}^{2+},\mathrm{Fe}^{3-} \)에 의해 저해받았다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>Lipase의 정제</h2><p>Staphylococcus xylosus SC-22균주는 TPY 배지에서 24 시간 동안 배양하였으며 배양액을 ammonium sulfate( \(30\sim 80 \% \)) 침전, Sephadex G-100 및 DEAE- Sephacel column chromatography (Fig. 1)과정을 거처 효소를 정제하였다. 정제된 효소의 specific activity는 \( 756.6 \) units/mg으로 \( 19.3 \)배 정제되었으며 회수율은 \( 17.2 \% \)였다(Table 1). 정제된 lipase의 SDS-전기영동 결과 분자량이 약 \( 47 \mathrm{kDa} \) 의 band를 얻었다(data not shown). 이러한 결과는 Staphylococcus haemol-yticus 및 Staphylococcus warneri가 생산하는 lipase 의 분자량\(\mathrm{(45kDa)}\)과 비슷하게 나타났다. 특이하게 균주 배양액이나 ammonium sulfate 침전물에서는 lipase와 lipopol-ysaccharide(LPS)로 구성된 큰 분자량의 응집물로 존재하다가 gel filtration과 ion exchange 크로마토그라피에 의하여 LPS와 분리되어 \( 47 \mathrm{kDa} \) 크기의 단일 band를 나타냈다. Staphylococcus warneri와 Pseudomonas aeruginosa PACIR균 배양액에서 단백질과 LPS가 응집물로 존재하는 것으로 보고되었으며 이러한 응집물은 Tris-EDTA buffer나 여러 가지 detergent에 의하여 LPS로부터 lipase가 분리되었다. Lipase에 대한 연구는 주로 Psedomonas에서 이루어 졌으며 분리된 lipase의 분자량은 약 \( 30 \mathrm{kDa} \sim 70 \mathrm{kDa} \) 까지 다양하게 존재하는 것으로 밝혀져 있다. 곰팡이 lipase는 식품공업이나 임상 및 화학공업에 많이 사용되고있으며, Fusarium oxysporum의 lipase는 분자량이 \( 30 \mathrm{kDa} \)으로 specific activity가 \( 6.10 \mathrm{U} / \mathrm{mg} \) 으로 38.1배 정제정도가 보고되었다.</p><h2>Lipase의 활성에 미치는 온도 및 pH의 영향</h2><p>Lipase의 활성에 미치는 온도효과를 측정하기 위하여 col-orimetric 방법에 따라 온도를 \( 20 \sim 60^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 변화시키면서 정제된 효소액을 가하여 활성을 측정하였다. 본 연구에서 분리된 lipase는 \( 20 \sim 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 비교적 높은 활성을 유지하였으며 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 최대 활성을 나타내었다(Fig. 2). S.warneri, S. haemolyticus의 lipase는 각각 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 28^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 최적온도를 나타내었으며, S. xylosus를 이용한 돼지의 li-polysis에서는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 최적활성을 나타내었다. 이러한 결과는 Staphylococcus 속의 lipase의 최적 온도는 균주 및 사용한 기질에 따라서 차이가 있음을 나타내고 있다. Fusarium oxysporum에서 생산된 lipase는 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 최적활성을 나타내었으며, Pseudomonas aeruginosa YS-7 균주는 본 연구에서 분리된 효소와 유사하게 \( 20 \sim 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 lipase 활성이 높게 유지되었다. Pseudomonas의 lipase 활성은 넓은 범위의 최적온도를 나타내는 것으로 알려져 있다.</p><p>Lipase 활성 및 안정성에 미치는 pH 효과를 측정하기 위하여 기질용액과 \( 25 \mathrm{mM} \) sodium acetate buffer \( (\mathrm{pH} 4.0 \) \( \sim 5.0 \) ), \( 25 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} 6.0 \) ), 25 \( \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) buffer \( (\mathrm{pH} 7.0 \sim 9.0), 25 \mathrm{mM} \) sodium car-bonate buffer (pH 10.0)를 각각 혼합한 용액에 정제된 효소액을 가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 lipase 활성을 측정한 결과 \( \mathrm{pH} 8.0 \)에서 최대 활성을 가지는 alkaline lipase로 나타났다(Fig. 3A, 3B). 그런데 균주의 생육은 산성조건에서 오히려 생육이 촉진되었다(data not shown). S. warneri, S. haemolyticus 균주의 최적 \( \mathrm{pH} \) 는 각각 \( 9.0 \) 과 \( 8.5 \) 로 본 연구에서 분리된 효소와 유사한 최적 pH를 보여주고 있다.</p><p>\( \mathrm{pH} \) 안정성은 정제된 효소액에 \( \mathrm{pH} 4.0 \sim 10 \)까지의 완충 용액을 이용하여 \( \mathrm{pH} \)를 달리한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 처리한 후 잔존활성을 측정하여 pH 안정성을 조사하였다. Lipase의 활성은 \( \mathrm{pH} 6.0 \sim 10 \) 범위 내에서 \( 90 \% \) 이상 효소활성을 유지하였다. S. haemolyticus 균주는 \( \mathrm{pH} 5.0 \) 11.0 범위에서 안정하였으며 Pseudomonas pseudoalcaligens F-111균은 \( \mathrm{pH~6.0} \sim \mathrm{10} \) 범위에서 안정하게 활성을 유지하여 본 효소와 유사한 경향을 나타냈다.</p><h2>Lipase 활성에 미치는 금속이온의 영향</h2><p>금속이온들이 lipase에 미치는 영향을 알아보기 위하여 기질을 \( 25 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl} \) buffer \( (\mathrm{pH} \) 7.0)에 녹인 후 각 금속 이온들의 농도를 \( 2 \mathrm{mM} \) 되게 하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분 동안 방치한 후 lipase 활성을 측정하였다(Fig. 4). Lipase 활성은 \( \mathrm{Cu}^{2}, \mathrm{~Pb}^{2+} \) 에 의해 현저히 저해되었으며, \( \mathrm{Fe}^{3-} \) 에 의해 거의 \( 50 \% \) 정도 저해되었으나, \( \mathrm{Ca}^{2+}, \mathrm{Mg}^{2+}, \mathrm{Na}^{+} \)에 의해서는 저해를 받지 않았다(Fig. 4).</p><p>Hoshino 등은 Fusaritum oxysporum 이 생산한 lipase의 활성은 \( \mathrm{Ca}^{2+}, \mathrm{Mg}^{2+}, \mathrm{Na}^{+} \)이온에서 효소활성이 증가되었고, \( \mathrm{Cu}^{2+}, \mathrm{Pb}^{2+}, \mathrm{Fe}^{3+} \) 이온에서는 저해를 받는 것으로 보고하였다. 박 등은 Pseudomonas sp. 54-14이 생산하는 lipase는 \( \mathrm{Ca}^{2+}, \mathrm{Mg}^{2+}, \mathrm{Na}^{+} \)이온에서 활성화되었지만 \( \mathrm{Cu}^{2+}, \mathrm{Pb}^{2+} \), \( \mathrm{Fe}^{3+} \) 이온에서는 Hoshino 등의 결과와 비슷한 저해 정도를 보였다. Shibata 등은 Pseudomonas aeruginosa 간주에서 \( \mathrm{Ca}^{2+} \) 이온이 lipase-modulator의 복합체 형성에 필수적이며, 또한 Pseudomonas lipase의 활성형태는 칼슘이온에 의하여 안정화된다고 보고하였다. 이러한 결과는 본 연구와 유사한 결과를 보여주고 있다</p>