양송이버섯에서 얻은 tyrosinase과 tyrosinase 저해제인 생미 고구마 추출액을 이용하여 흡광도를 통한 tyrosinase 활성 측정법으로 투석 후의 고구마 추출액의 저해활성을 측정하고, 다양한 온도와 \( \mathrm{pH} \)에서 저해활성을 측정하며 안정성을 확인하고, 다른 식물에도 저해제가 있는지 알아보았다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>본 실험에 사용한 고구마(Ipomoea batatas var. edulis) 품종 "생미"는 울산광역시에서 재배·수확한 것을 사용하였고, tyrosinase 추출용 국내산 양송이버섯은 부산광역시에서 구입하였으며, L-tyrosine 과 투석막 (Cellulose membrane; molecular weight cutoff: 12,000)은 Sigma Chemical Co. 제품을 사용하였다.</p> <h2>Mushroom tyrosinase의 조제</h2> <p>양송이버섯 \( (100 \mathrm{~g}) \) 을 수돗물에 깨끗이 씻은 후 잘게 썰고, \( 100 \mathrm{ml} \) \(50 \mathrm{mM} \) phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 6.6)를 첨가하여 믹서기로 5 분간 마쇄하고 cheesecloth로 여과한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 의 \( 12,000 \times \) \( g \) 에서 15 분간 원심 분리하여 그 상등액을 모아 \( 5.0 \mathrm{ml} \) 씩 나눈 것을 냉장 보관하여 사용하였다.</p> <h2>고구마 추출액의 조제</h2> <p>고구마 품종 "생미" \( 100 \mathrm{~g} \) 을 껍질을 벗기지 않은 상태에서 깨끗이 씻어 잘게 썰고, 동량의 \( 50 \mathrm{mM} \) phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 6.6) \) 을 첨가하여 믹서기로 5분간 마쇄하고 cheesecloth로 여과한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 의 \( 12,000 \times g \) 에서 15 분간 원심 분기하여 그 상등액을 사용하였다.</p> <h2>Tyrosinase 활성 측정</h2> <p>Tyrosinase의 활성 측정은 L-tyrosine을 기질로 하여 흡광도(Ultrospec 3000, Parmacia Biotech, England)를 측정하였다. 측정 방법은 우선 \( 0.03 \% \) 의 L-tyrosine, \( 1.0 \mathrm{ml} \) 에 \( 50 \mathrm{mM} \) phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 6.6), \( 0.9 \mathrm{ml} \) 를 넣고 \( 1.0 \mathrm{ml} \) 의 저해제와 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 의 효소액(mushroom tyrosinase)을 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 교반항온수조(Stirrer Water Bath, N-Biotech, Korea)에서 반응시킨 후 흡광도 \( 475 \mathrm{~nm} \) 에서 시간에 따른 효소 활성을 측정하였다.</p> <h2>Tyrosinase 저해제 검색</h2> <p>다양한 식물성 식품을 \( 1.0 \mathrm{ml} \) 씩 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 교반항온수조에서 20 분간 반응시킨 후 대조군에 비하여 mushroom tyrosinase에 대한 저해 효과를 백분율(\%)로 나타내었다. 대조군은 저해제를 첨가하지 않고 증류수 \( 1.0 \mathrm{ml} \) 를 첨가하여 측정하였으며, 대조군의 효소 활성을 100.0으로 환산하여 식물성 식품의 tyrosinase 저해 효과를 백분율(\%)로 나타내었다.</p> <h2>저해제의 열안정성</h2> <p>고구마 추출물을 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 가열기(Thermomixer 5436, Eppendorf, Germany)로 20 분간 가열한 후 잔존하는 저해활성을 측정하였다. 열에 대한 안정성은 열처리 전과 20분간 열처리 후의 저해활성을 비교하였다.</p> <h2>저해제의 \( \mathrm{pH} \) 안정성</h2> <p>고구마 추출물의 \( \mathrm{pH} \) 에 대한 안정성을 검토하기 위하여 추출액을 다양한 \( \mathrm{pH}(\mathrm{pH} \) 2.0-10.0)에서 20 분간 처리한 후 잔존하는 고구마 추출액의 mushroom tyrosinase에 대한 저해정도를 확인하였다. 저해제의 \( \mathrm{pH} \) 에 대한 안정성은 다양한 \( \mathrm{pH} \)에 처리 전 대조군의 활성을 \( 100.0 \) 으로 환산하여 백분율 \( (\%) \)로 나타낸 것이다.</p> <h2>고구마 추출물의 투석</h2> <p>Cellulose 삼투막 (molecular weight cut-off value: 12,000)에 고구마 추출물 \( 10.0 \mathrm{ml} \) 을 넣고, \( 2.0 \mathrm{~L} \) 의 \( 50 \mathrm{mM} \) Potassium phosphate buffer (pH 6.8)에서 1시간 동안 투석한 후, 다시 새로운 \( 2.0 \mathrm{~L} \) 의 \( 50 \mathrm{mM} \) Potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 6.8)에 24시간 동안 투석하였다. 투석 후 수집한 고구마 추출액의 mushroom tyrosinase에 대한 저해활성은 tyrosinase 활성 측정법과 동일하게 수행하였다.</p>