본 절에서는 혈전용해 활성, 단백질 농도, pH 및 온도 안정성, 금속이온 및 저해제의 영향, 분자량 측정에 대한 방법을 소개한다. 혈정 용해능은 시험관법으로 진행되었으며, plasmin을 표준물질로 사용하였다. 단백질 측정은 Bradford 등의 방법으로 진행되었으며, 온도 안정성 평가등에서는 온도에 따른 효소의 잔존활성을 분석하였다. 금속이온 및 저해제와 관련하여서는 관련용액을 효소에 첨가해 효소활성도 측정을 진행하였고, 분자량 측정은 Laemmli의 방법의 준하여 진행되었다.
<h2>혈전용해 활성 측정</h2> <p>혈전 용해능은 Astrup의 방법을 수정하여 시험관법으로 측정하였다. 즉, sodium borate 완충용액에 fibrinogen (from bovine plasma, Sigma, USA)을 \( 0.006 \mathrm{~g} / \mathrm{m} \ell \)되게 하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 완전히 잘 용해시킨 후, 시험관에 분주하였다. 동일 완충용액으로 희석한 200 unit thrombin(from bovine plasma, 10,000 units, Sigma, USA)을 가하고 균일하게 섞어 실온에서 30분간 방치하였다. 이 fibrin 배지에 시료를 \( 30 \mu \ell \)씩 가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5시간 반응시킨 후, fibrin이 분해된 액상율 여과지로 흡수시켜 그 무게를 정량화하고 pla-smin (bovine plasmin, Sigma, USA)을 표준물질로 하여 활성을 나타내었다. 단백질 정제과정 중의 단백질획분은 \(280 \mathrm{nm} \)에서의 흡광도로 조사하였고 이때 효소의 활성은 초기속도 구간에서 1분당 0.001의 흡광도 증가를 1unit로 정의 하였다.</p> <h2>단백질 농도측정</h2> <p>혈청알부민 (Bovine serum albumin)을 표준 단백질로하여 Bradford 등의 방법으로 측정하였다.</p> <h2>\(\mathrm{pH}\) 안정성</h2> <p>\(\mathrm{pH} ~3.0\)에서 \(\mathrm{pH} ~6.0\)까지는 \( 0.1 \mathrm{M} \) citrate-phosphate 완충액을, \(\mathrm{pH} ~7.0\)에서 \(\mathrm{pH} ~9.0\)까지는 \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\) 완충액을, \(\mathrm{pH} ~10.0\)에서 \(\mathrm{pH} ~11.0\)까지는 \( 0.1 \mathrm{M} \) carbonate-bicar-bonate 완충액을 사용하였으며, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 incubation 후 혈전용해 활성을 측정하였다.</p> <h2>온도안정성</h2> <p>\( 0.1 \mathrm{M}\) \(\mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3}\)-\(\mathrm{NaHCO}_{3} \) 완충액( \( \mathrm{pH} \mathrm{10.0} \))에 효소액을 가용화한 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \)까지 각 온도별로 30분간 반응시킨 후 곧 얼음물에 냉각하고 효소의 잔존활성을 측정하여 상대활성도로 나타냈다.</p> <h2>금속이온 및 저해제의 영향</h2> <p>\( \mathrm{BaCl}_{2}\), \(\mathrm{CaCl}_{2}\), \(\mathrm{CoCl}_{3}\), \(\mathrm{CuSO}_{4}\), \(\mathrm{FeCl}_{2}\), \(\mathrm{MgSO}_{4}\), \(\mathrm{MnSO}_{4}\), \(\mathrm{NaCl} \), \( \mathrm{KCl}\), \(\mathrm{Pb}\)(\(\mathrm{CH} 3 \mathrm{COO}\))\(_{2}\), \(\mathrm{ZnCl}_{2} \) 및 PMSF, EDTA, 2-mercapt-oethanol, SDS를 \( 5 \mathrm {mM} \)되게 효소액에 가하고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 incubation한 후 효소활성도를 측정하였다.</p> <h2>SDS-PAGE에 의한 분자량 측정</h2> <p>혈전용해효소의 분리 정도와 분자량을 측정하기 위하여 Laemmli의 방법에 준하여 sodium dodecylsulfate pol-yacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 수행하였고, 이때 stacking gel과 separating gel의 농도는 각각 \(4 \%\), \(12 \%\)를 사용하였으며, 표준품은 Sigma사로부터 구입한 pre-staining marker를 사용하였다.</p> <p>Gel 상의 단백질 밴드는 ethanol 및 acetic acid에 녹인 \(0.125 \%\) Coomassie brillint blue R-250용액으로 염색하였으며 \(30\%\) methanol 용액으로 탈색하였다.</p>