항바이러스성, 항균 그리고 항암 효과를 가지는 생리활성 물질인 Ascochlorin (ASC)은 이것을 통한 면역세포에 의해 조절되는 세포 내 단백질에 대한 연구는 부족한 실정이다. 따라서 이 논문에서는 이 연구를 위해 대식세포에 LPS 및 LPS와 ASC을 함께 처리한 후 단백질의 발현 차이가 있는 단백질을 확인하였다.이 중 두드러진 변화를 보인 단백질 중 vimentin, ERP60, rabaptin-5, Bcl-2, annexin A11은 염증 작용과 세포 사멸과 관련됨이 알려졌다. 본 연구를 통해서 대식세포주인 RAW264.7 세포가 ASC가 항염증 작용을 중심으로 하여 생리 활성 조절기능을 확인하였다. 이로써 ASC는 항염증 및 항암활성을 갖는 약물로 개발될 것으로 기대된다.
<h1>결과 및 고찰</h1><p>Ascochlorin (ASC)은 항바이러스성, 항균 그리고 항암 효과를 가지는 생리활성 물질로 알려져 있으나 면역세포에 ASC에 의해 조절되는 세포 내 단백질에 대한 연구는 미비한 실정이다. 본 연구에서는 LPS를 처리한 RAW264.7세포에 ASC에 대한 단배질 변화 양상을 확인하기 위해 이차원 전기영동을 이용한 프로테오믹스 연구를 수행하였다. 프로테오믹스는 프로테옴을 체계적으로 연구하는 학문으로 지놈을 연구하는 지노믹스와는 구별되며 프로테옴은 특정 조건에서 지놈으로부터 발현되는 다양한 단백질을 선별할 수 있는 학문의 영역으로 최근에는 프로테오믹스의 개선된 방법으로 단백질들을 효과적으로 분리하거나 제거하는 기술이 개발되고 있다.</p><p>대식세포주인 RAW264.7 세포에 LPS 및 LPS와 ASC을 함께 처리한 후 이차원 전기영동을 한 결과 단백질 발현 차이가 있는 100개의 단백질을 확인할 수 있었으며, 이들은 \( \mathrm{pH~3-10} \) 범위에서 60개, \( \mathrm{pH~4-7} \) 범위에 40개의 단백질이 존재 하였다(Fig. 2).</p><p>확인된 단백질들을 기능 밎 세포 내 위치별로 분류해 본 결과 기능에서는(cell growth and maintenance) 단백질이 \( 20 \% \)를 차지하였으며, 위치에서는 세포질에 존재하는 단백질이 \( 20 \% \)를 차지하였다. 그러나 아직 기능이나 세포내 위치가 알려 지지 않은 단백질도 많이 존재함을 확인할 수 있었다(Fig. 3).</p><p>두드러진 발현 변화를 보인 단백질 중 vimentin, ERP60 (calreticulin), rabaptin-5, Bcl-2, annexin A11은 염증 작용과 세포 사멸과 관련된 것으로 알려져 있다.</p><p>항염증 반응과 관련된 단백질 중 ERP60은 유전자 발현과 분화조절, 그리고 세포의 항상성 유지에 중요한 칼슘 결함 단백질로 알려져 있으며, 또한 자가 면역 조절에서 표적 단백질로 보고되어져 있다. 아울러 항염증 작용에도 ERP60이 관여하는 것으로 알려져 있다. Table 2와 Fig. 5에 나타난 바와 같이 염증 반응에서 증가된 ERP60의 단백질과 유전자의 발현은 ASC의 처리에 의해 감소되었다. 이 결과는 염증 반응에서 ASC가 ERP60 단백질과 mRNA 발현 수준을 조절 하며 ASC가 항염증 작용을 조절하는 것으로 생각된다.</p><p>Heat shock protein (HSP)은 외부의 환경과 산화적 스트레스에 대해 세포를 보호하며, 염증반응에도 관련된 것으로 보고되고 있다. 세포가 정상적인 범위 이상의 온도에 노출되면 HSP가 세포를 보호하는 역할을 하는 것뿐만 아니라, 염증이 진행되는 과정에 관여하는 것으로 알려져 있는데, 본 연구 결과에서는 LPS에 의해 증가한 단백질 발현이 ASC 처리 시 감소되는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 ASC가 항염증 작용에 관여하는 것으로 사료된다. LPS는 염증 반응과 아울러 세포사멸을 유도 하는 것으로 알려져 있다. 세포사멸(apoptosis)은 DNA에 손상을 주는 산화적 스트레스, UV 또는 독성물질과 같은 외부자극에 대해 세포가 이를 극복하지 못하고 스스로 죽음을 선택하는 것을 가리키며, 이러한 외부자극으로 인해 정상적인 대사를 하지 못하는 세포의 자살을 유도하여 개체의 항상성을 유지하는 것이다. 그러나 정상적으로 세포사멸이 유도되지 않을 경우, 암 발생 및 바이러스 감염 등에 의한 면역질환이 야기될 수 있다. 감염(infection)에 의해 면역체계 활성화시 사이토카인의 분비와 림프구의 세포사멸이 증가 하는데, 염증의 확산을 막고 조직과 각 기관의 기능을 유지하는 방어기전인 세포사멸 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다. 본 연구에서는 몇몇의 세포사멸 과정에 관련된 단백질을 확인 할 수 있었다. 그 중 Vimentin은 세포 사멸시 발현이 감소하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 LPS를 처리하여 염증 반응을 일으킨 RAW264.7 세포에 ASC의 처리 시 LPS에 증가된 vimentin이 ASC 처리 시 감소되는 것을 확인 하였다. 또한 Table 2에 나타난 것과 같이 세포사멸을 조절하는 단백질군인 Bcl-2 family 단백질 발현이 변화 하는 것을 확인 할 수 있었다.</p><p>Bcl-2 단백질은 세포사멸을 억제하는 antiapoptotic 유전자로 알려져 있으며, 이 단백질은 미토콘드리아 형체를 보존하여 세포사멸을 억제한다고 보고되었다. 본 연구에서는 LPS를 처리한 RAW264.7 세포에 ASC의 처리 시 Bcl-2를 발현을 감소시컸으며, 이 결과는 ASC가 세포사멸에도 관여하는 것으로 사료된다.</p><p>다음으로 Rabaptin-5 (RABPT5)는 자가 면역 질환에서 autoantigen으로 작용하여 세포 사멸에 관여하며, 이는 rabaptin-5 gamma와 rabaptin-5 delta 등으로 구성된 rabaptin-5의 family이며, 세포내 막 결합/융합(docking/fusion) 반응 안에 관여하는 GTP-binding 단백질 군이다. Table 2에 나타난 바와 같이 LPS를 처리한 RAW264.7 세포에 ASC의 처리 rabaptin-5를 증가시켰으며, 이 결과는 ASC가 Bcl-2 뿐만 아니라 rabaptin-5를 조절하여 세포사멸에 관여하는 것으로 생각된다.</p><p>결론적으로 본 연구를 통해 RAW264.7 세포를 이용한 면역세포 모델에서 ASC가 항염증 작용을 중심으로 하여 생리 활성 조절기능을 확인 할 수 있었다. 향후 분자 기능 조절 연구와 전 임상 연구를 통해 ASC의 생리활성 조절 가능을 규명한다면 ASC는 항염증 및 항암활성을 갖는 약물로 개발될 것으로 기대된다.</p>