CAT와 GPX 효소는 자 엽 10 쌍을 냉각된 mortar와 pestle 내에 \( 4 \mathrm{~mL} \) 의 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer 및 \( 0.3 \mathrm{~g} \)의 sea sand와 함께 넣고 마쇄하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 원심분리해 얻은 상등액을 효소원으로, CAT 총활성도는 Maehly와 Chance 방법으로 측정했다. CAT isozyme 분석을 위한 시료는 자 엽 20 쌍을 냉각된 mortar와 pestle 내에 \( 2.5 \mathrm{~mL} \) 의 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer 및 \(0.3\mathrm{g} \)의 sea sand와 함께 넣고 마쇄하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 원심분리해 얻은 상등액을 사용했고 CAT isozyme 분리는 Trelease와 Kunce 방법으로 진행했다.
<h2>Catalase (CAT)와 Guaiacol peroxidase (GPX) 추출 및 총 활성도 측정</h2> <p>CAT와 GPX 효소는 자 엽 10 쌍을 냉각된 mortar와 pestle 내에 \( 4 \mathrm{~mL} \) 의 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} \) 7.5, \( 2 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{Na}_{2} \)-EDTA, \( 1 \% \) PVPP 포함) 및 \( 0.3 \mathrm{~g} \) 의 sea sand와 함께 넣고 마쇄한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 원심분리 \( (20,000 \mathrm{~g}, 20 \mathrm{~min}) \) 하여 얻은 상등액을 효소원으로 사용하였다. CAT 총활성도는 Chance와 Maehly의 방법을 기초로 하여 측정하였다. 효소 활성도는 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 기질의 분해에 기인되는 \( 240 \mathrm{~nm} \) 의 흡광도 \( \left(\varepsilon 240=39.4 \mathrm{M}^{-1} \cdot \mathrm{cm}^{-1}\right. \) ) 감소 값을 측정 하여 산출하였다. 이 때의 효소 반응은 \( 2.85 \mathrm{~mL} \) 의 \( 50 \mathrm{mM} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 7.0), 0.05 \mathrm{~mL} \) 의 \( 1.75 \% \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 및 \( 0.1 \) \( \mathrm{mL} \) 의 효소 추출액이 포함된 \( 3 \mathrm{~mL} \) 의 반응액 내에서 진행시켰다. GPX 활성도는 Polle 등 (1994)의 방법을 기초로 하여 측정하였다. 효소 활성도는 반응액 내에서 guaiacol 기질이 tetraguaiacol로 산화 될 때 \( 470 \mathrm{~nm} \) 에서의 흡광도 \( \left(\varepsilon 470=25.2 \mathrm{mM}^{-1} \cdot \mathrm{cm}^{-1}\right) \) 증가 값을 측정하여 산출하였다. 이 때 효소 반응은 \( 2.85 \mathrm{~mL} \) 의 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} 6.5,16 \mathrm{mM} \) guaiacol 포함), \( 0.05 \mathrm{~mL} \) 의 \( 0.35 \% \) \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 및 \( 0.1 \mathrm{~mL} \) 의 효소 추출액이 포함된 \( 3 \mathrm{~mL} \) 의 반응액 내에서 진행시켰다.</p> <h2>CAT와 GPX isozyme의 native-PAGE 분리 및 Activity staining</h2> <p>CAT isozyme 분석을 위한 시료는 자 엽 20 쌍을 냉각된 mortar와 pestle 내에 \( 2.5 \mathrm{~mL} \) 의 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 7.0,1 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{Na}_{2} \)-EDTA, \( 5 \mathrm{mM} \) ascorbate, \( 1 \% \) PVPP, \( 10 \mathrm{mM} \) DTT 포함) 및 \( 0.3 \) \( \mathrm{g} \) 의 sea sand와 함께 넣고 마쇄한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 원심분리 \( (20,000 \mathrm{~g} \), \( 20 \mathrm{~min} \) )하여 얻은 상등액을 사용하였다. GPX isozyme 분석을 위한 시료는 자 엽 20쌍을 냉각된 mortar와 pestle 내에 \( 3 \mathrm{~mL} \) 의 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} 7.0,1 \mathrm{mM} \mathrm{Na}_{2} \)-EDTA, \( 5 \mathrm{mM} \) ascorbate, \( 1 \% \) PVPP 포함) 및 \( 0.3 \mathrm{~g} \) 의 sea sand와 함께 넣고 마쇄한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 원심분라 \( (20,000 \mathrm{~g}, 20 \mathrm{~min}) \) 하여 얻은 상등액을 사용하였다. CAT isozyme 분리는 Kunce와 Trelease (1986)방법을 기초로 하여 수행하였다. 7\% polyacrylamide gel및 \( 4 \% \) stacking gel을 이용하여 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 온도 조건과 일정전압 (stacking gel: \( 50 \mathrm{~V} \), seperating gel: \( 100 \mathrm{~V} \) ) 하에서 8시간 동안 Native-PAGE를 실시하였다. 이때 loading 시료는 \( 35 \mu \mathrm{L} \) 부피 내에 동량의 자엽단백질 \( (40 \mu \mathrm{g}) \) 이 포함되도록 하였다. 전기영동 후 gel을 증류수로 10 분간 2회 세척한 후 \( 3.27 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 용액에 25 분간 진탕 배양 후 다시 증류수로 짧게 세척하고, \( 1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) ferric chloride-potassium ferricyanide (III) 용액 내에서 CAT isozyme band가 출현할 때 까지 약 10 분간 activity staining하였다. GPX isozyme 분리를 위해 \( 10 \% \) polyacrylamide gel및 \( 4 \% \) stacking gel을 이용하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 온도 및 일정 전압 (stacking gel: \( 50 \mathrm{~V} \), seperating gel: \( 100 \mathrm{~V} \) )하에서 7시간 동안 Native-PAGE를 실시하였다. 이때 loading 시료는 \( 80 \mu \mathrm{L} \) 부피 내에 동량의 자엽단백질 \( (200 \mu \mathrm{g}) \) 이 포함되도록 하였다. 전기영동 후 \( \mathrm{GPX} \) isozyme 활성도 검출은 Rao 등의 방법을 사용하였다. 즉, 전기영동 후 gel을 \( 50 \mathrm{mM} \) sodium acetate buffer \( (\mathrm{pH} 4.5,2 \mathrm{mM} \) benzidine 포함)에 10 분 동안 배양 한 후 다시 이 용액에 \( 30 \% \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 용액 \( 30 \mu \mathrm{L} \) 을 첨가하고 20 분간 진탕 배양시켰다. 이 후 gel을 증류 수로 짧게 세척하여 효소 반응을 중지시키고 사진 촬영을 하였다.</p>