본 연구에서는 김치에서 유래한 196개의 균주를 이용해 두유에서 curd 형성을 관찰하였다. 이러한 균주들은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 배양된 후, 그들의 genomic DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 염기서열 비교를 위해 Genetyx 프로그램과 GenBank의 BLAST 데이터베이스를 활용하였고, 이를 통해 균주들의 상동성을 파악하였다. 최종적으로, Kimura 2-parameter를 이용한 phylogenetic tree를 구축하여 균주들의 관계를 도출하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시료</h2> <p>부산 지역의 가정에서 수거한 김치 국물 시료 56개를 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하며 사용하였다. 멸균 증류수에 김치 국물을 적절한 배수로 희석한 뒤 MRS (Becton, Dickinson and Company, New Jersey, USA) 한천 평판배지에 도말하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 평판배지에서 서로 다른 형태의 균락을 분리하였다.</p> <h2>젖산균의 분리</h2> <p>국산대두 \( 100 \mathrm{~g} \) 과 증류수 \( 1,000 \mathrm{ml} \) 를 두유제조기(NSM-6200, 엔유씨전자, 대구, 한국)에 넣어 두부 기능(33분)을 작동시키고 게르마늎 컵에 거름망 안에 비지를 제외한 두유를 \( 50 \mathrm{ml} \) 씩 넣어 \( 40 \sim 45^{\circ} \mathrm{C} \) 로 식혔다. MRS 액체배지에 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양한 196개의 김치 유래 분리균주 배양액100 pll \( (0.2 \%) \) 를 준비한 두유에 접종하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 18시간 배양하여 curd를 형성하는 균주들을 선별하였다.</p> <h2>분리균주의 분자생물학적 분석</h2> <p>두유에서 curd를 형성하는 균주를 MRS 액체배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 동안 배양하여 Bacterial Genomic DNA Purification Kit (Dokdo-Prep, ElpisBiotech. Inc., Taejeon, Korea)를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다. 16s rDNA 의 gene은 thermal cycler (My CyclerTM thermal cycler, Bio-Rad, California, USA)를 이용하여 증폭시켰다. 실험을 위 한 PCR mixture는 20 pmol oligonucleotide primer bact_ f (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 1\(\mu \mathrm{l} \)와 20 pmol bact_r (5'-ACGGCTACCTTGTT ACGACTT-3') 1 \(\mu \mathrm{l} \), Taq polymer-ase (ElpisBiotech. Inc., Taejeon, Korea) 1\(\mathrm{U} \), 2.5\(\mathrm{mM} \) deoxy-nucleoside triphosphate (Labo Pass, COSMO co, Ltd., Seoul, Korea) 1 \(\mu \mathrm{l} \), Taq polymerase를 위한 \( 10 \times \) buffer 2 \(\mu \mathrm{l} \), 멸균증류수 \( 14 \mu \mathrm{l} \), 주형 DNA 1\(\mu \mathrm{l} \) 를 넣어 혼합하였다. 16s rDNA의 gene은 thermal cycler (My CyclerTM thermal cycler, Bio-Rad, California, USA)를 이용하여 증폭시켰다. 조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 ini-tial denaturation시킨 다음 30 cycle로 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분 동안 dena-turation, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분 동안 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분 동안 extension하고 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분 동안 extension 시키 고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하였다.</p> <p>염기서열은 Genetyx program으로 pairwise alignment를 하여 GenBank의 BLAST database에서 표준 균주의 DNA 크기가 \( 1,200 \mathrm{bp} \) 이상인 신뢰성 있는 데이터만을 선별하여 se-quence match하였다. Genetyx program과 Bioedit program을 이용하여 선별 균주와 표준 균주의 염기서열간의 multi-align-ment를 수행하여 상동성을 비교하고, Bioedit program과 Mega software ver.4.0을 이용하여 phylogenetic tree를 작성하였다. Distance option은 Kimura 2-parameter를 이옹하였고 replication은 1,000 번하여 Neighbor-joing tree를 작성하였다.</p>