젓갈로부터 항암물질 생산 미생물의 탐색을 위해 해당의 식품 균주의 분리를 위하여 한국전통식품, 젓갈을 멸균수로 시험관에 희석하여 정해진 실험으로 배양한다. 세포독성측정도 인체암 세포를 이용하여 측정한다. 인체암 세포는 따로 구입하여 배양후 실험에 투입한다. 세포수의 측정에는 hemacytometer와 trypan blue염색법을 이용한다. 분리한 세포배양액 \( 10 \mu l \) trypan blue so-lution ( \( 0.4 \% \) trypan blue, \( 0.8 \% \mathrm{NaCl}, 0.06 \% \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 0.05 \% \) methyl-p-hydroxybenzoate, pH7.2) \( 10 \mu \mathrm{l} \) 를 잘 혼합한 후 혼합액의 \( 10 \mu l \) 를 hemacytometer에 취해 inverted microscope를 이용해 세포수롤 측정한다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>젓갈로부터 항암물질 생산 미생물의 탐색</h2> <p>균주의 분리를 위하여 한국전통식품, 젓갈을 멸균수로 시험관( \( 180 \mathrm{~mm} \times 18 \mathrm{~mm}) \) 에 순차적으로 희석하여 Luria Bertani (LB) plate에 도말하여 single colony를 유도한 다음 각각의 colony들을 LB broth \( 5 \mathrm{ml} \) 에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 배양하였다. 그 배양액을 항암활성이 높은 균주를 선발하기 위해 사용하였다.</p> <h2>암세포 배양</h2> <p>세포독성 측정을 위해 사용한 인체암세포인 A549 (lung cancer cell line, ATCC CLL-185), SK-OV3 (ovarian cancer cell line, ATCC HTB-77) 그리고 HL60 (promyelocytic leu-kemia, ATCC CCL-240)를 ATCC에서 구입하여 사용하였고, 이들 세포주는 Dulbecco's Modifide Eagles Medium (DMEM) (Gibco, Rockville, MD, USA)에 10\%(v/v) Fetal Bovine Serum (Gibco), 0.37\% sodium bicarbonate (Sigma, St. louis, MO, USA)을 혼합한 배지에 100unit의 streptomycin/penicillin 을 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 배양하였다. 세포를 배양용기에서 분리하기 위한 trypsin 용액은 Hank's bal-anced salts solution (HBSS)에 \( 0.05 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) trypsin과 \( 0.53 \) \( \mathrm{mM} \) EDTA가 첨가된 것을 사용하였고 배양세포의 세척 등 에는 HBSS를 사용하였다.</p> <h2>세포독성 측정</h2> <p>세포수의 측정에는 hemacytometer와 trypan blue 염색법을 이용하였다. 분리한 세포배양액 \( 10 \mu l \) trypan blue so-lution ( \( 0.4 \% \) trypan blue, \( 0.8 \% \mathrm{NaCl}, 0.06 \% \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 0.05 \% \) methyl-p-hydroxybenzoate, pH7.2) \( 10 \mu \mathrm{l} \) 를 잘 혼합한 후 혼합액의 \( 10 \mu l \) 를 hemacytometer에 취해 inverted microscope 를 이용해 세포수롤 측정하였다.</p> <p>세포독성은 1 차적으로 세포의 형태변화를 관찰하여 항암활성을 확인하였고, 암세포에 대한 시료의 세포독성을 측정하기 위하여 Carmichael의 방법에 따라 MTT assay를 실시하였다. 암세포를 96 well plate에 \( 1 \times 10^{4} \) cell/well이 되게하여 \( 160 \mu 1 \) 씩 분주하고 배양상등액 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 배양기로 24 시간 배양하였다. 여기에 인산생리식염수에 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 농도로 제조한 MTT 용액 \( 20 \mu 1 \) 를 첨가하고 동 배양조건에서 4 시간 더 배양하였다. 이를 \( 2,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심분리하여 상등액을 제거하고, 각 well당 DMSO \( 150 \mu \) 를 가하여 30 분간 교반한 후 ELISA reader (Molecular Device Co.)로 550nm에서 흡광도를 측정하여 성장억제효과(Growth inhibitory effect(\%)=[(대조구의 흡광도- 시료처리구의 흡광도)/대조구의 흡광도) \( ] \times 100) \) 를 구하여 세포독성 활성의 지표로 하였다. 또한, 암세포의 성장을 대조구에 비하여 \( 50 \% \) 억제하는 시료의 농도를 \( \mathrm{IC}_{50} \) 으로 나타내었다. 대조구는 시료대신 대장균의 배양액을 첨가한 것으로 하였다.</p>