HCT-8과 intestine-407 세포주는 ATCC에서 구매하여 RPMI 1640 배지에 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \)를 함유한 상태에서 37도의 온도에서 배양하였다. 세포의 수와 생존활성은 tryphan blue를 이용한 hema-cytometer에서 측정하였으며, 세포는 Trans-LT1 transfection reagent를 활용하여 제조사의 지시에 따라 transfection을 실행하였다. 세포는 PBS로 세척 후 수동 분해 버퍼로 분해물을 제작하였고, Luciferase 활동은 dual-mode lumin-ometer를 이용하여 측정하였다.
<h2>재료 및 방법</h2> <h3>세포배양, 유전자 및 시약</h3> <p>HCT-8 및 intestine-407 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구매하여 Royal Park Memorial Institute (RPMI) 1640 배지에 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) humidified incubator at 37도에서 배양하였다. 세포수와 생존활성(viability)은 tryphan blue (Sigma)을 이용해서 hema-cytometer 상에서 측정하였다. 화합물 노출 실험 중에는 혈청이 없는 배지를 이용하였다. 저해제 등은 Calbiochem (EMD biosciences, Inc. La Jolla, CA, USA)에서 구매하였다.</p> <h3>Western analysis</h3> <p>Cell lysate 는 RIPA buffer (1x PBS, 1\% NP-40, 0.5\% sodium deoxycholate, \( 0.1 \% \) sodium dodecyl sulfate (SDS), 100 \( \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) phenyl methane sulphonyl fluoride (PMSF), \( 1 \mathrm{mM} \), sodium orthovanadate, 단백질 저해제 칵테일)로 준비하고 2-3초의 초음파 분쇄 후 lysate 단백질은 bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용해서 정량하였다. 각각 \( 50 \mathrm{mg} \) 단백질을 소형 전기영동기를 이용해서 분리한 후 단백질을 Polyvinylidene Fluoride (PVDF) membrane (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)에 이동하였다. 블롯은 1 시간 동안 \( 5 \% \) skim milk Tris-buffered saline Tween 0.05\% (TBST) 로 blocking 후 각각의 일차항체로 2 시간 상온에서 반응 후 3회 TBST로 세척 후 horseradish-conjugated secondary antibody로 1 시간 상온 반응 후 3회 세척 후 ECL Chemiluminescent substrate (Amersham Pharmacia Biotech)로 발색 현상하였다. 각 일차항체는 토끼 polyclonal anti-human Actin antibody (Santacruz Biotech-nology, Santa Cruz, CA, USA), 토끼 polyclonal anti-p-MAPKs, anti-EGR-1 항체(Cell signaling technology, Beverly, \( \mathrm{MA}, \mathrm{USA}) \) 를 사용하였다.</p> <h3>Transient / stable transfection</h3> <p>세포는 Trans-LT1 transfection reagent (Mirus, Madison, WI, USA)를 이용해서 제조자 프로토콜에 따라 transfection을 수행하였다. Luciferase reporter gene의 transfection을 위해서 각 well 당 \( 1.5 \mathrm{mg} \) firefly luciferase reporter plasmid와 \( 0.15 \) \( \mathrm{mg} \) renilla luciferase, pRL-null vector (Promega, Madison, WI, USA)를 \( 4.5 \mathrm{ml} \) Trans-LT1 reagent에 혼합 하여 6 well culture plate에 처리 하였다. Transfection후 24 시간 뒤 세포는 화합물에 24 시간 노출하였다. Firefly와 대조구인 renilla luci- ferase를 동시에 transfection 하는 Dual-luciferase reporter as- say system (Promega)을 이용해서 정량하였다. 모든 trans-fection 효율은 50내지 \( 60 \% \) 정도를 유지하였고 이 효율은 \( \mathrm{pMX} \) enhanced GFP vector를 이용해서 transfection 후 동시에 확인하였다. pSilence 벡터에 GTTACTACCTCTTATCCA 타겟으로 하는 shRNA를 삽입하여 제조하였다. 대조구 벡터와 pSiEGR1을 세포주에 transfection 하여 stable cell lines을 추가로 만들기 위하여 48 시간 뒤 \( 1,000 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \mathrm{G} 418 \) (Invitrogen, Carlsbad. CA, USA)로서 선별을 가하였다. 선별은 콜로니가 형성 될 때까지 하며 안정된 발현 세포주는 500 \( \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \mathrm{G} 418 \) 의 일반배양액에서 유지한다.</p> <h3>Luciferase assay</h3> <p>세포는 차가운 PBS로 세척 후 수동 분해 버퍼(Promega)로 분해물을 준비하였다. \( 12,000 \mathrm{~g} \) 에서 4분간 원심분리 후 상층 효소액을 assay에 이용하였다. 상층액은 이후 실험을 위해서 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다. Luciferase activity는 dual-mode lumin-ometer (Model TD-20/20, Turner Designs Co., Sunnyvale, CA, USA)를 이용해서 측정하였다. Firefly luciferase activity 은 renilla luciferase activity에 대해서 일반화 하였고 활성은 다음의 상대치로 표시하였다(firefly luciferase activity / re-nillaluciferase activity).</p>