미생물 동정 시스템을 이용한 분리균주의 세포지방산 분석을 실시하였다. MA 배지에 25\(^\circ \mathrm{C}\)에서 72시간 배양하고, TSBA40으로 데이터를 검색하였다. 갯지렁이 추출물을 접종한 MA배지에서 순수 배양한 후 동정한 결과 12 균주가 Bacillus속에 포함되었으며, 그 중 공기의 유무에 상관없이 생장가능한 CBW3, 4, 9, 14, 10를 선별하여 균주들 간의 계통관계를 분석하였다.
<h2>세포막의 지방산 분석</h2> <p>분리균주에 대한 세포지방산 분석은 MIDI를 이용하여 수행하였다. 이를 위하여 분리 균주를 MA 배지에서 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 72시간 동안 배양하였다. 분석기기는 미생물 동정 시스템(Microbial Identification System MIDI, Microbial ID. Inc., \( \mathrm { DE } \) )을 사용하였으며, 분석된 데이터는 TSBA40 (Sherlock Version 4.0; Microbial Identification System MIDI, Microbial ID. Inc., DE)에서 검색하였다. 배양제 \( 40 \mathrm { mg } \) 을 루프로 캡튜브에 취한 후 메탄올 : 증류수(methanol : D.W) 1:1 혼합용액에 \( 15 \% \) 수산화나트륨이 포함된 시약 \( 1 \mathrm { ml } \) 을 가하여 \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 25 분간 반응시켜 세포내 지방산을 추출하였다. 추출된 지방산의 메틸화를 위하여 6N HCl \( 2 \mathrm { ml } \)을 첨가하고 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분간 반응 시킨 후 재빨리 냉각시켰으며, 수용성의 상태인 지방산을 유기상으로 전환시키기 위하여 hexane과 methyl - tert buthyl ether를 1:1 혼합한 용액 \( 1.25 \mathrm { ml } \) 을 첨가한 후 10 분 동안 회전시켜주어 상층액만을 취했다. 마지막으로 포화된 수산화 나트륨용액 \( 3 \mathrm { ml } \)로 시료를 씻어준 후 분석기기를 통하여 동정하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>갯지렁이 내생 Bacillus spp.의 계통관계</h2> <p>갯지렁이 추출물을 접종한 MA 배지에서 생장하여 나타난 집락을 선별하여 순수배양한 후 16S rRNA 염기서열에 기초하여 동정한 결과 12 균주가 Bacillus 속(genus)에 포함되는 것으로 밝혀졌다. 그 중 호기성 및 혐기성 조건에서 모두 생장 가능한 5 균주, CBW3, CBW4, CBW9, CBW14 그리고 EBW10을 선별한 후 1295 bp의 16S rRNA 염기서열을 기초로 선별균주들 간의 계통관계를 분석하였다. CBW3와 CBW14는 같은 종으로 B. nanhaiensis JSM082006 \( { } ^ {\mathrm { T } } \), B. arsenicus Con a/3 \( { } ^ {\mathrm { T } } \), 그리고 B. barbaricus V2-BIII-A2 \( { } ^ {\mathrm { T } } \)와 \( 99 \% \) 이상의 높은 상동성을 나타내었고, CBW4는 이미 알려진 Bacillus 균주와 계통관계에서 비교적 거리가 먼 것으로 나타났다. CBW9는 B. algicola KMM 3737 \( { } ^ {\mathrm { T } } \)와 \( 99.8 \% \), B. hwajinponensis SW-72 3737 \( { } ^ {\mathrm { T } } \)와 B. hemicentroti JSM 076093 \( { } ^ {\mathrm { T } } \)와도 \( 97 \% \) 이상의 높은 상동성을 나타내었고, EBW10은 B. thruingiensis ATCC 10792 \( { } ^ {\mathrm { T } } \)와 \( 99.8 \% \) 의 높은 상동성을 보였다.</p>