AYS는 열처리를 하게되면 항효모 활성이 단시간 내에 감소하는 열에 불안정한 물질이고, trehalose는 세포를 보호하며 단백질에 대한 열보호작용을 하는 물질이다. 따라서 AYS에 trehalose를 첨가하면 안정화할 수 있다고 생각하여 조건 별로 trehalose의 농도에 따라 AYS의 작용이 어떻게 변하는지 확인하기 위해 열처리를 하여 trehalose 농도와 열처리 온도 그리고 열처리 시간에 따라 AYS 안정성을 측정하였다. trhalose 농도에 따라 항효모 활성이 의존적이고, 열처리 온도에 따라서도 trhalose가 첨가된 것이 항효모 활성이 높았으며, 열처리 시간에서 역시 잔존량이 많았으므로 trehalose는 AYS에 열보호 작용을 하는 것을 알 수있다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>AYS 활성에 대한 Trehalose 의 영향</h2> <p>전보에서 기술한 바와 같이 AYS는 열에 불안정한 물질이며 비교적 고온 \( \left(50^{\circ} \mathrm{C}, 2 \mathrm{hr}\right) \)에서 열처리하면 항효모 활성이 단시간 내에 감소되었다. 한편 trehalose는 세포를 보호하는 antifreezing agent로서 효과뿐만 아니라 단백질에 대한 열보호 작용도 있다. 따라서 AYS의 열에 대한 불안정성을 trehalose를 사용함으로서 안정화 시킬 수 있을 것인지를 알아보기 위하여 trehalose를 AYS와 혼합하여 열처리 \( \left(50^{\circ} \mathrm{C}, 2 \mathrm{hr}\right) \)를 행하였다. 그 결과 Table 1 에서 보는바와 같이 trehalose를 함유하지 않은 AYS의 경우는 항효모 활성이 크게 약화되었으나, trehalose \( (0.6 \mathrm{M}) \)가 함유된 AYS의 경우에는 열처리 \( \left(50^{\circ} \mathrm{C}, 2 \mathrm{hr}\right) \) 를 행하였어도 항효모 활성이 잘 유지되었으며, trehalose \( (0.13 \mathrm{M}) \)과 \( 0.1 \% \) BSA가 함유된 AYS의 경우에도 AYS만 열처리한 그룹 보다 항효모 활성이 높게 나타났다. 또한 대조구로 amphotericin B에 대한 \( \mathrm{MIC} \) 는 \( 0.47 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 였으며, \( 0.6 \mathrm{M} \) trehalose 단독으로는 효모생육에 영향을 미치지 않았다. 따라서 AYS에 trehalose를 첨가하여 열처리를 행하면 AYS의 항효모 활성이 감소되는 현상을 방지시킬 수 있다고 생각된다.</p> <p>Nguyen 등은 \( 0.13 \mathrm{M} \) trehalose와 \( 0.1 \% \mathrm{BSA} \) (bovine serum albumin)를 사용-하여 ELISA(Enzyme linked Immuno-assay)측정을 행한 결과 오래 동안 항체가 안정성을 유지하였다고 기술하였으며, Carninci 등은 \( 0.6 \mathrm{M} \) trehalose를 열에 불안정한 효소에 사용한 결과 열에 안정한 효소로 작용하였다고 기술하고 있다. 전보에서 기술한 바와 같이 AYS는 1) 열에 불안정하며, 2) thiol reagent에 의한 활성소실 및 3) 이온교환수지에 의한 glycan 다량 함유부분과 단백질 다량 함유부분의 분리에 의한 항효모 활성의 소실 등의 특징을 가지고 있다. 또한 AYS는 Sephacryl S400 gelfiltration을 행하면 항효모 활성을 나타내는 분획이 곧 바로 용출되었으며 당과 단백질이 야 \( 3: 1 \) 로 구성된 일종의 proteoglycan 으로 추정되었다. 뿐만 아니라 최근 연구에 의하면 AYS는 여려 가지 당 가수분해효소(cellulose, inulin-ase, pectinase, invertase) 처리로는 항효모 활성에 변화가 없었으나, 단백질 분해효소(proteinase \( \mathrm{K}) \) 처리로 항효모 활성이 소실되었다(data 미제출). 따라서 AYS의 항효모 활성에 직접 관련된 물질은 단백질 일 가능성이 있다.</p> <h2>Trehalose 농도에 따른 AYS의 열안정성</h2> <p>열안정성상기에서 기술한 바와 같이 trehalose가 AYS의 항효모 활성을 열처리로부터 보호하는데 trehalose의 적정농도를 측정하기 위해 AYS에 첨가한 trehalose의 농도를 달리하여 AYSTable를 열처리 \( \left(50^{\circ} \mathrm{C}, 2 \mathrm{hr}\right) \) 시킨 후 그 잔존 활성을 측정하였다. 그 결과 Fig. 1에서 보는 바와 같이 trehalose를 첨가하지 않은 AYS에 비해 trehalose가 첨가된AYS의 저농도 \( (7.8 \mu \mathrm{g} / \)\( \mathrm{mL}-31.3 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) )에서 뚜렷한 활성의 차이를 나타내었으나, trehalose 농도(\( 0.3-0.9 \mathrm{M} \))에 따른 AYS의 활성차이는 뚜렷하게 나타나지 않는 경향을 나타내었다. 특히, trehalose를 첨가하지 않은 AYS경우는 AYS의 농도가 \( 31.3 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 이하에서 모두 항효모 활성이 나타나지 않았지만, trehalose를 첨가한 AYS 경우는 AYS의 농도가 7.8-31.3 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)에서도 AYS에 의한 항효모 활성이 농도 의존적이었다. 따라서 이는 AYS가 저농도인 경우에는 열에 의해 항효모 활성 소실이 더욱커서 효모의 저해율을 측정하기가 어렵지만, trehalose를 첨가한 AYS인 경우에는 저 농도에서도 그 활성이 유지되어 AYS에 의한 효모의 생육 저해율을 측정하기가 용이하다고 생각된다.</p> <h2>열처리 온도에 따른 AYS의 안정성</h2> <p>상기에서 기술한 바와 같이 \( 0.6 \mathrm{M} \) trehalose가 첨가된 AYS는 열처리를 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)까지 행한 후 잔존하는 AYS의 활성을 측정하였다. 그 결과 Fig. 2에서 보는 바와 같이\( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 열처리에서도 trehalose 함유 AYS는 trehalose를 함유하지 않은 AYS에 비해 S. cerevisiae에 대한 항효모 활성이 남아 있음을 확인하였다. 특히 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 열처리에서 trehalose 함유 AYS는 고농도에서 보다 저농도에서 AYS의 잔존활성이trehalose를 함유하지 않은 AYS 에 비해 크게 차이를 나타내었으며(약 \( 30 \% \) 의 차이), \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 이상에서도 trehalose 함유 AYS의 항효모 활성에 대한 잔존활성이 trehalose를 함유하지 않은 AYS의 잔존 활성 보다 비교적 높게 나타나는 경향이 있었다. 결론적으로 AYS의 열처리에서 trehalsoe가 함유된 AYS는 trehalose가 함유되지 않은 AYS에 비해 항효모활성이 높았음으로 AYS에 trehalose의 첨가는 열에 대한AYS의 항효모 활성을 유지하는데 효과가 있다고 생각된다. 장차 본인 등은 AYS를 완전히 정제하여 AYS의 항효모 활성과 관련되는 성분을 더욱 명확히 조사하고, AYS의 효모에대한 메커니즘도 규명해야 할 과제라고 생각한다.</p> <h2>열처리 시간에 따른 AYS의 안정성</h2> <p>AYS의 열처리를 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 시간 별로 행하여 잔존하는 항효모 활성을 측정하였다. 즉, trehalose \( (0.6 \mathrm{M}) \)가 첨가된 AYS와 trehalose가 첨가되지 않은 AYS를 각각 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1-3시간까지 시간 별로 열처리를 행한 후 잔존하는 AYS의 활성을 측정하였다. 그 결과 Table 2에서 보는 바와 같이 trehalose가 함유되지 않은 AYS의 MIC값이 trehalose가 함유된 AYS에 비해 높게 나타났음으로 trehalose는 AYS에 열보호 작용을 나타낸다고 생각된다.</p>