원형질체 형성율은 \( ( \%) = \frac {\mathrm { A } \left ( \mathrm { t } _ { 0 } \right )- \mathrm { A } ( \mathrm { t } ) } {\mathrm { A } \left ( \mathrm { t } _ { 0 } \right ) } \)으로 측정하였다. 효모 융합은 Wilson의 방법을 기초로 효모의 원형질체를 원심분리를 통해 얻어 \( 3 \times 10 ^ { 8 } \) cell \( / \mathrm { mL } \)이 되도록 현탁하여 사용하였다.
<p>원형질체 형성율 \( ( \%) = \frac {\mathrm { A } \left ( \mathrm { t } _ { 0 } \right )- \mathrm { A } ( \mathrm { t } ) } {\mathrm { A } \left ( \mathrm { t } _ { 0 } \right ) } \)</p> <p>\( \mathrm { A } \left ( \mathrm { t } _ { 0 } \right ) \) : 초기 세포현탁액 흡광도 \( \left ( \mathrm { A } _ { 570 } \right ) \) \[ \] \( \mathrm { A } ( \mathrm { t } ) \) : 원형질체 형성후 흡광도 \( \left ( \mathrm { A } _ { 570 } \right ) \)</p> <h2>원형질체 융합 및 total DNA 함량측정</h2> <p>효모융합은 Wilson 등의 방법을 기초로 하였다. 효모융합에 사용한 polyethylene glycol solution(PEG)은 polyethylene glycol 4,000(Yakuri, Japan)을 \( 0.01 \mathrm { M } ~\mathrm { CaCl } _ { 2 } \)와 \( 1.2 \mathrm { M } \) sorbitol이 함유되어 있는 \( 0.05 \mathrm { M } \) Tris-\( \mathrm { HCl } \) buffer \( (\mathrm { pH }~7.5 \))에 용해시켜 \( 40 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } )\) PEG solution으로 제조하여 사용하였다. 각 효모의 원형질체를 원심분리 \( (1,000 \times \mathrm { g } ,\mathrm{3 ~min}\) )하여 획득한 원형질체를 protoplast buffer에 \( 3 \times 10 ^ { 8 } \) cell \( / \mathrm { mL } \) 되도록 현탁하였다. 세포 현탁액을 1:1로 혼합한 후 원심분리 \( (1,000 \times \mathrm { g } , 3 \mathrm { ~min } ) \)하여 상등액을 제거한 뒤, 침전물에 PEG solution을 \( 1.5 \mathrm { ~mL } \) 첨가하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 30분간 방치하였다. 처리된 현탁액을 원심분리 \( (1,000 \times \mathrm { g } , 3 \mathrm { ~min } ) \)하여 상등액을 제거하고 protoplast buffer로 세척한 후 희석하여 원형질체 재생배지에 도말한 뒤 colony 형성 유무를 확인하였고 융합 유무는 효모중의 total DNA 함량측정 비교를 통해 확인하였다. 융합체를 YPD 배지에서 배양한 후 \( 0.5 \mathrm { ~N } \) perchloric \( \operatorname { acid } \left (244252 \right . \), Sigma, USA) \( 10 \mathrm { ~mL } \)에 현탁한 후 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 20분 간 2회 처리하여 DNA를 추출한 뒤 \( 1 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) diphenylamine (33149, Sigma, USA)과 \( 2.75 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) sulfuric acid가 함유되어 있는 diphenylamine solution에 의한 흡광도 값을 이용하여 다음 식에 의해 계산하였다.</p>