HPLC 분석을 통해 Luteolin의 biorenovation 전환물에서 신규 peak가 발견되었으며, 이를 L7G로 명명하였다. 이에 대한 세포 생존율 평가에서 Luteolin은 모든 농도에서 \(25\%\) 이하의 생존율을 보였으나, L7G는 모든 농도에서 \(90\%\) 이상의 생존율을 나타냈다. 또한, L7G는 \( 50, 100, 200 ~ \mu \mathrm{M} \) 농도에서 melanin 합성을 각각 \( 16.2, 35.4, 47.8 \% \) 억제하는 것으로 나타났다. 특히, L7G는 B16F10 mouse melanoma cell에서 \(\alpha\)-MSH에 의해 증가된 tyrosinase의 생성을 농도에 따라 억제하였다. 이 결과는 L7G가 MITF와 tyrosinase의 발현을 억제하며, 이를 통해 melanin 합성을 저해하여 미백 기능성 소재로서의 가능성을 보여준다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Biorenovation 전환물의 HPLC 및 LC-MS 분석</h2> <p>Luteolin과 Luteolin의 biorenovation 전환물 및 대조군인 JD3-7을 HPLC를 통하여 분석한 결과 Luteolin의 biorenovation 전환물에서 신규 peak가 검출되었다(Fig. 1). 이전 연구에 따르면 biorenovation 을 적용한 \( 15 \mathrm{~min} \)에 검출 된 가장 큰 peak를 정제하여 HPLC 및 LC-MS 분석을 진행한 결과 Luteolin-7-O-glucoside (L7G)와 동일한 것으로 나타났다(Fig. 2). 최종적으로 biorenovation 통해 합성된 Luteolin의 유도체는 L7G인 것으로 확인되었으며 이후 L7G의 미백활성을 평가하고자 melanin 합성 및 tyrosinase 생성 억제 활성을 조사하였다.</p> <h2>세포 독성 평가</h2> <p>본 실험에서는 Luteolin과 L7G가 B16F10 mouse melanoma cell의 생존에 미치는 영향을 알아보기 위하여 \( \alpha \)-MSH (\( 200 ~ \mathrm{nM} \))와 시료(\( 50, 100, 200 ~ \mu \mathrm{M} \))을 동시에 처리한 뒤 세포의 생존율을 측정하였다. 그 결과, Luteolin은 모든 측정 농도에서 \( 25 \% \) 이하의 세포 생존율을 보인 반면 L7G는 모든 측정 농도에서 \( 90 \% \) 이상의 세포 생존율을 나타내는 것을 확인하였다(Fig. 3). 이러한 결과는 L7G이 Luteolin의 높은 독성을 개선하였음을 시사하며 세포 독성 측정 결과를 바탕으로 L7G의 미백 기능성을 평가하고자 melanin 합성 및 tyrosinase의 억제 활성을 조사하였다.</p> <h2>Melanin 합성 억제 활성 평가</h2> <p>\( \alpha \)-MSH로 자극된 B16F10 mouse melanoma cell에서 L7G가 melanin 합성에 미치는 영향을 조사하고자 \( \alpha \)-MSH (\( 200 ~ \mathrm{nM} \))와 L7G (\( 50, 100, 200 ~ \mu \mathrm{M} \))를 동시에 처리하여 배양하였다. 이후 최종적으로 생성된 melanin의 양을 측정한 결과, L7G는 \( 50, 100, 200 ~ \mu \mathrm{M} \) 농도에서 melanin의 합성을 각각 \( 16.2, 35.4, 47.8 \% \) 억제하였다(Fig. 4). 이는 L7G가 세포 내에서 다양한 melanin 합성 효소들의 작용을 하향조절 함으로써 최종적으로 melanin의 합성을 저해한다는 것을 시사하며 이후 melanin의 합성을 저해하는 인자와 그 조절 기작을 조사하고자 초기 melanin 합성에 큰 영향을 미치는 tyrosinase의 생성 억제 활성 평가를 진행하였다.</p> <h2>Tyrosinase 생성 억제 활성 평가</h2> <p>Tyrosinase는 melanin 초기 합성 단계의 속도 결정에 작용하는 핵심 효소로 tyrosine을 dihydroxy-L-phenylalnine (L-DOPA)로, L-DOPA를 DOPAquinone으로 변환시키는 작용을 한다. 이러한 tyrosinase의 효소활성은 tyrosinase 단독으로도 melanin의 합성을 가능하게 하기 때문에 tyrosinase의 활성 저해는 현재 많은 미백소재 개발 연구에서 큰 비중을 차지하고 있다. 이에 본 실험에서는 L7G가 B16F10 mouse melanoma cell에서 tyrosinase의 생성에 미치는 영향을 조사하기 위해 수행되었으며 \( \alpha \)-MSH (\( 200 ~ \mathrm{nM} \))와 L7G (\( 50, 100, 200 ~ \mu \mathrm{M} \))을 동시 처리하여 배양한 후 tyrosinase의 생성량을 측정하였다. 측정 결과, L7G는 B16F10 mouse melanoma cell에서 \( \alpha \)-MSH로 인해 증가된 tyrosinase의 생성을 농도의존적으로 억제하였다(Fig. 5). 이는 melanin 합성 억제와 상응하는 결과로 이후 melanin의 합성에 관련된 유전자의 발현을 확인하고자 western blot을 수행하였다.</p> <h2>Western blot</h2> <p>본 연구에서는 L7G가 \( \alpha \)-MSH로 자극된 B16F10 mouse melanoma cell에서 TRP-1, TRP-2, tyrosinase, MITF의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 western blot을 진행하였다. 실험 결과 \( 50 ,100, 200 ~ \mu \mathrm{M} \) 농도에서 TRP-1과 TRP-2의 발현에는 유의한 억제경향이 나타나지 않았으나 tyrosinase와 MITF의 발현에는 유의한 억제 활성을 보였다(Fig. 6). 이는 L7G가 MITF와 tyrosinase의 발현을 억제하여 최종적으로 melanin의 합성을 저해하는 미백 기능성 소재로써 사용될 수 있음을 시사한다.</p> <p>본 연구에서는 Luteolin 기질로 biorenovation 생물전환 반응을 수행하여 유도체의 합성을 유도하였으며 HPLC 및 LC-MS 분석을 통해 생성 된 유도체가 Luteolin-7-O-giucoside (L7G)임을 확인하였다. 이후 L7G의 미백 활성을 평가하고자 진행된 실험 결과 L7G는 \( \alpha \)-MSH로 유도된 B16F10 mouse melanoma cell에 대하여 Luteolin의 높은 세포독성을 개선하였으며 독성을 보이지 않는 농도에서 멜라닌과 tyrosinase의 합성을 유의하게 억제하였다. 반면 TRP-1과 TRP-2에 대해서는 유의한 억제 효능이 확인되지 않았는데 이는 미백 기능성 성분으로 알려진 arbutin이 TRP-1, TRP-2의 발현을 억제하지 않으나 melanin, tyrosinase에 대하여 저해 활성을 나타내는 것과 상응하는 결과로 L7G 또한 p-extracellular signal-regulated kinase, p-Jun Nterminal kinase, p-p38를 포함한 스트레스 반응성 MAPK 신호 전달 경로 또는 여타 멜라닌 합성 관련 기전을 억제함으로써 미백 활성을 나타내는 것으로 판단된다. 이러한 결과를 근거로 L7G가 미백 기능성 화장품 원료로서 활용될 수 있는 가능성을 입증하였으며 추후 활용 가치를 더욱 높이기 위하여 추가적인 기전에 대한 연구가 진행되어야 할 것으로 판단된다.</p>