폐포 세척액의 세포를 \( 1,000 \mathrm{rpm} \) cytospin centrifuge로 처리하여 도말 표본을 만든 후 Diff-Quik으로 염색고 호산구, 호중구, 림프구 등의 세포수를 광학현미경의 400배로 관찰하여 조사하였다. 폐포 세척액에서 세포를 분리하고, 폐를 적출하여 \( 0.01 \mathrm{~g} \)까지 chemical balance로 측정하고 폐조직을 잘게 절편하였다. 얻어진 단핵구 세포를 \( 5 \times 10^{5} \mathrm{cells} / \mathrm{well} \)로 조정한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 면역 형광염색을 실시하여 flow cytometer의 cell Quest 프로그램을 이용하여 백분율(\(\%\))로 분석하였다. CELLQUEST 프로그램으로 \( \mathrm{CD} 3 \mathrm{e}^{+} \) 외 3개의 비율을 산출했다.
<h2>혈액 및 기관지 폐포 세척액 분리</h2> <p>실험 종료 후 생쥐는 \( 10 \% \) chloral hydrate(Fluka, USA)를 복강 내에 투여한 후 혈액을 심장 천자법으로 채혈하고, \( 3,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10분 동안 원심분리하여 혈청을 얻었으며 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 냉동 보관하면서 실험에 사용하였다. 혈액성분과 효소들의 활성도 측정은 바이오톡스텍 (주)(Biotoxtech Co., Ltd.Cheongwon, Korea)에 의뢰하였다.</p> <p>기관지 폐포 세척액 (bronchoalveolar labage fluid; BALF) 은 \( 10 \%\) FBS가 함유된 DMEM 배양액 (1회, \( \left.1 \mathrm{~mL}, 37^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 이 준비된 주사기로 기도에 반복하여 넣고 흡입시켜 얻었으며, 이 과정을 3회 반복하였다. 이 폐포 세척액의 세포를 \( 1,000 \mathrm{rpm} \) cytospin centrifuge(Cellspin, Hanil, Korea)로 처리하여 도말 표본을 만든 후 Diff-Quik으로 염색하였고 호산구, 호중구, 림프구 등의 세포수를 광학현미경(Nicon, Japan) 하에서 400배로 관찰하여 조사하였다.</p> <h2>폐 적출 및 폐세포 분리</h2> <p>폐포 세척액에서 세포를 분리하고, 폐를 적출하여 \( 0.01 \mathrm{~g} \)까지 chemical balance로 측정한 후 폐조직을 잘게 절편하였다. 여기에 \( 2 \% \) FBS이 포함된 RPMI 1640 배양액으로 5분간 \( 1,800 \mathrm{rpm} \) 배지에서 원심분리하고, \( 5 \mathrm{~mL} \) 의 RPMI 1640 배양액에 \( 50 \mu \mathrm{L} \) 의 collagenase \( \operatorname{IV}(100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \) 를 가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) shaking 배양기에서 30분 동안 배양하였다. 배양 후 2분간 방치한 후 상층액을 분리하고 \( 10 \% \)FBS이 포함된 RPMI 1640 배양액에 세포를 포집하였다. 이를 5회 이상 조직을 분해하여 폐세포를 분리하였다.</p> <h2>말초혈액 내 단핵구 분리</h2> <p>말초혈액 단핵구(peripheral blood mononuclear cell;PBMC)를 분리하기 위해 heparin이 들어있는 주사기로 심장천자법으로 채혈하여 원심분리기에 넣고 \( 2,000 \mathrm{rpm} \) 에서 20분 동안 원심분리하였다. 분리된 혈장은 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하고, 적혈구 위의 세포 층만 걷어서 Ficoll-Hypaque(Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, U.S.A) 위에 섞이지 않도록 올려주고 \( 2,000 \mathrm{rpm} \) 에서 30분간 원심분리를 하였다. 단핵구층을 분리한 후 PBS로 희석하여 \( 1500 \mathrm{rpm} \) 으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 PBS로 2회 수세하였다. 얻어진 단핵구 세포를 \( 5 \times 10^{5} \mathrm{cells} / \mathrm{well} \) 로 조정한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 면역 형광염색(immuno fluorescence staining)을 실시하여 flow cytometer의 cell Quest 프로그램을 이용하여 백분율(\(\%\))로 분석하였다.</p> <h2>형광 유세포 분석</h2> <p>폐, BALF 및 PBMC으로부터 분리한 각각의 세포를 24 well plate에 \( 5 \times 10^{5} \mathrm{cells} / \mathrm{well} \)로 분주하고 배양 후 각각의 세포를 염색완충용액(\(1\% \)bovine serum albumin(BSA), \( 0.1\% \mathrm{NaN}_{3} \) in \( \left.\mathrm{PBS}\right) \) 으로 2회 수세한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 면역 형광염색을 실시하였다. 각각에 PE-anti-CD3e, FITC-anti-CD19, PE-anti-CCR3, FITC-anti-CD4, FITC-anti-CD8, PE-anti-CD23, FITC-anti-CD69, PE-anti-B220, FITC-anti-IgE, PE-anti-Gr-1, FITC-anti-CD11b를 넣고 30분간 얼음에서 반응시켰다. 반응 후 3회 이상 인산완충용액으로 수세한 후 세포 표면 분자들의 발현을 FACScan Flow cytometer(Becton Dickinson)로 CD3e,CD4, CD8, CD69, CCR3, B220, CD23 그리고CD69 의 발현을 분석하였다. 분석 프로그램은 CELLQUEST 프로그램(Becton Dickinson)으로\( \mathrm{CD} 3 \mathrm{e}^{+} / \mathrm{CD} 19^{+} ,\mathrm{B} 220^{+} / \mathrm{CD} 23^{+} ,\mathrm{CD} 3 \mathrm{e}^{+} / \mathrm{CCR} 3{ }^{+} \),\({\mathrm{CD} 11 b^{+} / \mathrm{Gr}-1^{+}} \)의 비율(gated, \(\%\))을 산출하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean \( \pm \) standard error로 기록하였고, 유의성 검증은 Student's T분석 방법을 이용하여 결정하였다.</p>