본 연구에서는 말초 혈액 중의 호중구를 분리하였는데, 분리과정에서는 채혈한 혈액의 혈장 활성 층을 분리하여 원심분리하였다. 그리고 완충액과 등장성 용액을 이용해 혼재된 적혈구를 파괴하였다. 다음으로 임파구 분리용액을 첨가해 원심분리 후 임파구를 버리고 과립구층을 완충액에 띄워 사용하였다. 한편 PLD 효소 활성도 측정은 세포막 에 phosphatidylcholine의 라벨링을 하여 진행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>사람 호중구의 분리 및 배양</h2><p>사람의 말초 혈액 중의 호중구는 Kwak 등의 방법에 의하여 분리하였다. 혈액 \( (100 \mathrm{ml}) \)은 \( 0.1 \mathrm{M} \) EDTA, \( \mathrm{pH} 7.4 / 0.9 \% \mathrm{NaCl} \)이 들어 있는 수혈용 팩에 채혈한 후 이 혈액에 \( 40 \mathrm{ml} \)의 Hespan을 넣고 조심스럽게 섞은 다음 플라스틱 시린더에서 한시간 동안 실온상태에서 방치하여 적혈구를 침전시켰다. 호중구를 포함하는 혈장 성분 층을 분리하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 상태에서 \( 850 \times \mathrm{g} \)로 15분 동안 원심분리하였다. 침전된 세포를 \( 10 \mathrm{ml} \)의 완충액 \( \mathrm{A}(8.0 \mathrm{mM} \mathrm{Na}_{2} \mathrm{PO}_{4}\), \(1.5 \mathrm{mM} \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}\), \(136 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}\), \(2.6 \mathrm{mM} \mathrm{KCl}\), \(0.5 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2}\), \(0.6 \mathrm{mM} \mathrm{CaCl}_{2}\), \(\mathrm{pH} 7.4\))에 부유시킨 다음 \( 30 \mathrm{ml} \)의 증류수를 넣고 20초간 방치한 후. \( 10 \mathrm{ml} \)의 \( 4 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \mathrm{NaCl} \)을 넣어 등장성 용액으로 하여 혼재된 적혈구를 파괴하였다. 세포는 원심분리 \( (850 \times \mathrm{g}\), 10분)한 다음 \( 5.5 \mathrm{mM} \) glucose 가 합유된 완충액 A에 부유시켰다. 임파구 분리용액을 세포 층 밑에 넣고 \( 850 \times g \)에서 30분간 원심하여 중간층에 존재하는 임파구는 버리고 침전된 과립구층은 \( 11 \mathrm{mM} \) glucose와 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) bovine plasma albumin을 첨가한 완충액 B\((25 \mathrm{mM} \) Hepes \( \mathrm{pH} 7.4\), \(125 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}\), \(0.7 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{MgCl}_{2}\), \(0.5 \mathrm{mM} \) EDTA)에 부유시켜 사용하였다.</p><h2>1-O- \( \left[{ }^{3} \mathrm{H}\right] \)-octadecyl-lyso platelet activaitng factor로 세포의 라벨링</h2><p>PLD 효소 활성도를 측정하는 방법으로 transphosphatidylation 측정을 하는데 있어서 세포막 중의 phosphatidylcholine의 라벨링이 필요하며 그 방법은 Billah 등의 방법을 변형하여 사용하였다. Toluene과 ethanol이 \(1:1\)로 된 용매에 녹은 1-O-\( \left[{ }^{3} \mathrm{H}\right] \)-octadecyl-lyso platelet activating factor \( (80 \sim 180 \mathrm{mCi} / \mathrm{mmol}) \)를 질소 가스 하에서 건조시킨 다음 bovine serum albumin을 첨가한 완충액 B \((1 \mathrm{ml}) \)에 잘 혼합시켰다. 이 용액과 세포 성분을 잘 혼합시키고 세포의 밀도는 \( 2 \times 10^{7} \) \( \mathrm{cells/ml} \)이 되게 하고 동위원소는 \( 1.5 \mu \mathrm{Ci} / \mathrm{ml} \)이 되도록 하였다. 세포는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 90분간 배양하여 첨가시킨 지방의 \( 70 \% \) 정도가 세포에 함유되도록하며 이 과정 중에 \( 50 \mathrm{U} / \mathrm{ml}\) DNase를 섞어서 세포들이 엉기지 않도록 하였다.</p>