Urease 활성은 기질 urea로부터 암모니아가 방출되는 속도를 측정함으로써 결정하였고 단백질 순도는 Laemmli 법에 의한 SDS- polyacrylamide gel 전기영동 (SDS-PAGE)을 시행하여 확인하였다. 그리고 천연분자량 및 nickel 함량 측정을 하였다.
<h2>Urease 활성 측정</h2> <p>Urease 활성은 기질 urea로부터 암모니아가 방출되는 속도를 측정함으로써 결정하였다. 즉, 암모니아가 phenolhypochlorite와 반응하여 생성된 indophenol을 \( 625 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하는 fixed-time point assay를 시행하였다. Assay에 사용된 기질용액은 \( 50 \mathrm{mM} \) urea, \( 25 \mathrm{mM} \) HEPES, \( 0.5 \mathrm{mM} \) EDTA \( (\mathrm{pH} 7.75) \) 로 구성되어 있으며, 반응은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 기질용액에 효소를 첨가함으로써 시작되었고, 방출되는 암모니아 농도는 직선형 상관 회귀 분석에 의해 결정되었다. Urease 활성의 1 unit는 urea를 기질로 하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), 표준 기질 용액에서 매 분당 \( 1 \mu \mathrm{mol} \) 의 urea를 가수 분해하는데 필요한 효소의 양으로서 정의하였다.</p> <h2>SDS-Polyacrylamide 및 Native Gel 전기영동</h2> <p>각 정제단계에서의 단백질 순도는 Laemmli 법에 의한 SDS- polyacrylamide gel 전기영동 (SDS-PAGE)을 시행하여 확인하였다. 각각의 시료는 \(3\%\) SDS, \( 10 \% \) glycerol, \(5\%\) \( \beta \) -mercaptoethanol를 함유하는 \( 0.0625 \mathrm{M} \) Tris 완충액 \( (\mathrm{pH} 6.8) \)에 가하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 변성시킨 후 사용하였다. 이 시료를 두께 \( 1.5 \mathrm{~mm} \)의 \( 4.5 \% \) stacking gel과 \( 15 \% \) polyacrylamide resolving gel에 적용한 후 \( 39 \mathrm{~mA} \)로 4시간 동안 전기 영동하여 \( 0.1 \% \) Coomassie brilliant blue R-250로 염색한 후 탈색하였다. 시료 중 단백질의 농도는 bovine serum albumin 을 표준품으로 하여 Lowry법에 의하거나 \(\mathrm{MicroBCA}^{\mathrm{TM}} \) Protein Assay Kit (Pierce, USA) 를 이용하여 측정하였다.</p> <p>한편 native gel 전기영동은, 시료를 SDS와 \( \beta \)-mercaptoethanol를 가하지 않고 \( 10 \% \) glycerol, \(0.025\%\) bromphenol blue 만을 함유한 \( 63 \mathrm{mM} \) Tris완충액( \( \mathrm{pH} 6.8) \) 에 가하여 끓이지 않고 사용하여, 역시 SDS가 함유되지 않은 \(6.5\%\) polyacrylamide gel과 전개용 완충액을 사용하여 \( 25 \mathrm{~mA} \)로 6시간 전개하여 시행하였다. 전기영동이 완료된 후, gel을 분리하여 \( 50 \mathrm{mM} \) sodium acetate- \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA 완충액 \( (\mathrm{pH} 5.0)\), \( 20 \mathrm{mM} \) sodium acetate-\(1 \mathrm{mM}\) EDTA 완충액 \( (\mathrm{pH} 5.0)\) 및 \( 0.02 \% \) cresol red-\(1 \mathrm{mM}\) EDTA 용액 \( (\mathrm{pH} 5.0)\)에 각각 순차적으로 5분씩 평형화시키고, 최종적으로 \( 1.5 \% \) urea- \( 0.02 \% \) cresol red-\(1 \mathrm{mM}\) EDTA 용액에 gel을 옮겨 진홍색의 활성 band가 나타날 때까지 방치하였다. 활성 band가 나타난 직후 반응을 종결시키고, band를 불용성의 납 침전물로 보존하기 위하여 \(0.1 \mathrm{M}\) lead acetate용액으로 처리하였다.</p> <p>한편, urease를 구성하는 각 subunit를 재확인하기 위한 목적으로, 위에서 제조한 native gel 중의 활성 band를 절편으로 잘라내어 다시 \( 15\% \) SDS- polyacrylamide gel 전기영동을 이전과 같은 방법으로 시행한 후, Bio-Rad 사의 Silver-stain Plus kit를 사용하여 silver staining을 실시하였다.</p> <h2>\( K_{\mathrm{m}} \), 천연분자량 및 nickel 함량 측정</h2> <p>[앞에서의 방법에 의거하여] 정제한 urease를 사용하여 Michaelis 상수를 다음과 같이 측정하였다. 즉, 기질인 urea 의 농도의 역수(\( 1 /[\mathrm{S}] \))가 등간격이 되도록 urea를 \( 2 \sim 20 \mathrm{mM} \)의 범위로서 함유한 assay 완충액 계열을 조제하고 각각 urcase assay를 시행하여 반응속도(v)를 측정하였다. Lineweaver-Burk 법에 준하여 각 \( 1 /[\mathrm{S}] \) 에 대한 \( \mathrm{v} \)값을 plot하고 직선 상관회귀법을 이용하여 기울기와 절편을 구한 다음 이를 토대로 \( K_{\mathrm{m}} \) 값을 산출하였다.</p> <p>한편으로 정제한 urease \( 200 \mu \mathrm{L} \)를 \( 0.15 \mathrm{M} \mathrm{KCl} \)을 함유하는 PEB 완충액 \( (\mathrm{pH} 7.0)\)으로 평형화시킨 Superose \( 6 \mathrm{HR} 10 / 30 \) FPLC column에 적용하여 분당 \( 0.2 \mathrm{~mL} \)의 유속으로 전개시키고, 동일한 조건하에서 thyroglobulin, gammaglobulin, ovalbumin, myoglobin 및 vitamin B12를 함유하는 gel-filtration 표준 용액 (Bio-Rad Labs)을 전개시켜 작성한 검량선을 토대로 S. epidermidis urease의 천연분자량을 측정하였다.</p> <p>정제된 urease \( 100 \mu \mathrm{g} \)에 \( 20 \% \) 질산용액을 가하고 MaxiDry-Lyo 진공회전농축기 (Heto-Holten, Denmark)에서 초순수를 반복적으로 가하며 3회 진공농축하였다. 최종적으로 초순수를 가하여 ICP-mass spectrophotometer (VG Elemental, UK)를 사용하여 S. epidermidis urease의 nickel 함량을 측정하였다.</p>