멜라닌 함량을 B16 melanoma 세포를 6 well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { cells } / \mathrm { well } \) 씩 분주하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건으로 항온 배양하여 \( 24 \mathrm { ~h } \) 후 PBS로 1회 세척 후 phenol red가 들어있지 않은 DMEM으로 교환하였다. 황칠나무 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획의 세포 독성을 측정한 결과, 에틸아세테이트 분획에서는 \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도 이하의 세포 생존율이 \( 80 \% \) 이상을, 아글리콘 분획은 \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도에서 세포 생존율이 \( 29 \% \) 을 나타내었다.
<p>멜라닌 함량 측정: 멜라닌 함량은 Hosoi 등의 방법을</p> <p>변형하여 사용하였다. B16 melanoma 세포를 6 well plate 에 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { cells } / \mathrm { well } \) 씩 분주하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건으로 항온 배양하였다. \( 24 \mathrm { ~h } \) 후 세포가 부착한 것을 확인하고 PBS로 1회 세척 후 phenol red가 들어있지 않은 DMEM으로 교환하였다. \( \alpha \)-melanocyte stimulating hormone ( \( \alpha \)-MSH, Sigma, USA, \( 200 \mathrm { nM } \) )와 황칠나무 잎 추출물을 농도별로 처리하여 \( 72 \mathrm { ~h } \) 동안 배양하였다. 세포 밖으로 배출된 멜라닌은 배양한 후에 각 세포배양 상층액 \( 100 \mu \) 를 96-well에 넣고 ELISA reader로 \( 405 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 세포 내 멜라닌 함량은 남은 세포배양 상층액을 제거하고 \( 1 \% \) triton \( \mathrm { X } -100 \) 용액으로 세포를 수확하여 원심분리하여 상등액은 단백질 함량을 측정하고, pellet은 건조시켜 \( 10 \% \mathrm { DMSO } \) 를 함유한 \( 1 \mathrm { ~N } \mathrm { NaOH } \) 용액 \( 100 \mu \) l에 용해하여 96-well plate에 옮긴 후 ELISA를 사용하여 \( 405 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다. 멜라닌 함량은 멜라닌 표준품으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 산출 하였으며, 단백질 함량은 DC protein assay kit (Bio Rad, USA)를 이용하여 측정 후 보정하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험은 3 회 반복하였고 통계분석은 \( 5 \% \) 유의수준에서 Student's t-test를 행하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>황칠나무 잎 추출물의 세포 독성 평가</h2> <p>황칠나무 잎 추출물의 세포 독성에 미치는 농도를 조사하 고, 실험에 사용될 농도 범위 결정을 위해 MTT assay를 시행하였다. 황칠나무 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획의 세포 독성을 측정한 결과, \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도 이하의 세포 생존율이 \( 80 \% \) 이상이었다. 아글리콘 분획의 경우, \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도에서 세포 생존율이 \( 29 \% \) 로 세포독성을 나타냈다. 따라서 본 연구에서는 황칠나무 잎 추출물의 항산화 활성을 측정하기 위해 황칠나무 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획 및 아글리콘 분획의 농도를 \( 80 \% \) 이상의 세포생존율을 나타내는 최고 농도로 각각 \( 50,25 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 으로 설정하였다(Fig. 2).</p>