16S rRNA 유전자를 증폭하기 위해 27와 1492R primer를 사용하였고, 결정된 16S rRNA 유전자와 gyrB 유전자 염기서열의 종간 유사도는 BLAST을 이용하여 GenBank 데이터베이스와 비교 - 검색하였으며, 계통수의 신뢰도는 1000회 반복을 통한 bootstrap 분석을 실시하여 확인하였고, 분리균의 항생제 감수성 조사는 각각의 항생제가 함유된 디스크를 사용하였으며, Hodge 변법과 imipe-nem-EDTA 디스크 상승 효과 시험을 통해 분리균이 MBL을 생성하는지 여부를 확인하였다.
<h2>계통분류학적 연구</h2> <p>16S rRNA 유전자를 증폭하기 위해 27 (5'-AG AGTTT GATCMTGGCTCAG-3')와 1492R (5'-GGYTACCT TGTTA CGACTT-3') primer를 사용하였다. PCR 반응액의 조성 및 증폭조건은 Baik 의 방법을 이용하였다. DNA gyrase (gyrB) 유전자를 증폭하기 위해 UP-1 (5'-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CAY GCN GGN GGN AAR TTY-3')와 UP-2r (5'-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GCC RTC NAC RTC NGC RTC NGT CAT-3') primer 를 사용하였다. PCR 반응액의 조성 및 증폭 조건은 Yamamoto 등의 방법으로 PCR thermal cycler TP600 (TAKARA Bio Inc., Japan)을 이용하여 증폭하였다. 염기서열 분석은 제노텍(Korea)에 의뢰하였다.</p> <p>결정된 16S rRNA 유전자와 gyrB 유전자 염기서열의 종간 유사도는 BLAST을 이용하여 GenBank 데이터베이스와 비교 - 검색하였다. 계통수 작성은 neighbor-joining방법을 이 용하였으며 진화거리는 Jukes와 Cantor 의 식을 이용하였다. 계통수의 신뢰도는 1000회 반복을 통한 bootstrap 분석을 실시하여 확인하였다.</p> <h2>항생제 감수성 검사</h2> <p>분리균의 항생제 감수성 조사는 각각의 항생제가 함유된 디스크(Table 4)를 사용하여 실시하였다. McFarland 0.5관에 맞춘 세균현탁액을 MHA배지에 접종한 후 항생제 디스크를 올려놓고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 16-18시간 배양한 후 억제대의 직경을 측정하였다. 감수성, 중간내성, 저항성 기준은 CLSI 기준으로 하였으며 매 시험마다 대조 균주로 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853를 사용하였다. 항생제의 최소억제 농도 측정은 Vitek GNS-433 card (bioMeriex, France)로 측정 하였다.</p> <h2>Metallo- \( \beta \)-lactamase \( (\mathrm{MBL}) \) 검증</h2> <p>분리균이 MBL을 생성하는지 여부는 Hodge 변법과 imipe-nem-EDTA 디스크 상승 효과 시험을 통해 확인하였다. Hodge 변법의 시험은 다음과 같다. E. coli ATCC 2592를 생리식염수에 희석하여 McFarland 0.5관 탁도로 맞추어 MHA평판배지에 접종하였다. 물기가 마른 후 배지 중앙에imipenem 디스크를 올려놓은 후 중앙으로부터 배지 접시 가장 자리를 향해 시험 세균을 획선 접종 하였다. \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 16-20시간 배양하여 시험 균주 접종 선 중앙쪽 말단부가 다른 부위에 비해 더 넓게 증식 되면 양성으로 판정 하였다.</p> <p>Imipenem-EDTA 디스크 상승 호.과 시험에서는 시험 균주를 생리식염수에 McFarland 0.5관 탁도로 맞추어 MHA배지에 접종한 후 \( 10 \mu \mathrm{g} \) imipenem 디스크와 \(0.5 \mathrm{mM}\) EDTA \(10 \mu \mathrm{l} \)가 함유된 디스크를 \(10 \mathrm{mm}\) 거리가 되게 올려놓고 16-18시간동안 배양한 후 억제대의 확장현상이 관찰되면 양성으로 판정하였다.</p>