NWB-CMS 무의 잎과 하배축 원형질체를 PEG 8000을 이용한 화학적 융합 방법으로 융합하여 10분 침지과정 후, 3~4일 후 1분열이 시작되어 2~3주 후 미소괴로 발달하고 4~6주 후 캘러스로 발달하였다. 재분화된 218개의 신초 중 208개의 독립 개체를 DNA 분석하여 NWB-CMS에 특이적인 PCR 산물을 확인하지 못하고 ISSR Primer를 이용하여 무와 양배추에 특이적인 밴드를 모두 가지고 있는 개체를 확인하여 원형질 융합이 정상적으로 일어났음을 확인하였다. PCR 분석 결과무와 양배추간의 핵의 융합이 발생했으나 발근과 개체의 발달 과정의 특이사항은 없었다.
<h2>원형질 융합과 융합체의 재분화</h2> <p>양배추의 하배축과 NWB-CMS 무의 잎으로부터 분리된 원형질체 (Fig. IA, B)를 PEG 8000을 이용하여 화학적 융합 방법으로 원형질 융합을 수행하였다. 분리된 각각의 원형질을 부피비 \( 1: 1 \) 비율로 섞은 후 약 10 분 정도의 원형질 침지과정을 거친 후 PEG 융합 용액을 첨가하면 각각의 원형질체의 간극이 서서히 줄어들면서 융합이 되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 1C). PEG를 이용한 원형질체 융합은 해부현미경하에서 수행하였으며 약 5~10분 정도의 시간이 소요되었다. 융합이 진행된 후 원형질체는 배양 3~4일 후에 제 1 분열이 시작되었으며 약 2~3주 후에는 미소괴로 발달하였다 (Fig. 1D). 약 4~6 주경에는 육안으로 확인할 수 있는 캘러스로 발달하였다 (Fig. 1E). 정상적으로 발달한 캘러스 약 3500 개를 재분화배지로 옮겨 (Fig. 1F) 재분화를 유도하여 218 개의 신초를 얻어 재분화율은 약 \( 6.2 \% \)이였다 (Fig.1G). 재분화된 신초는 호르몬이 첨가되지 않은 \( 1 / 2 \mathrm { ~MS } \) 배지에서 발근을 유도한 후 순화하여 (Fig. \( 1 \mathrm { H } \) ) 온실에서 재배하였다 (Fig. 1I).</p> <h2>융합 유래 식물체의 마커 분석</h2> <p>218 개의 신초 중에 순화하여 온실에 옮긴 원형질융합 유래 재분화체 중, 정상적으로 발달한 208개의 독립적인 개체로부터 융합여부를 확인하기 위하여 본엽이 2~3매 출현한 시기에 각각 본엽을 채취하여 DNA를 추출하였다. NWB-CMS특이 Primer를 이용하여 PCR 반응을 한 결과 NWB-CMS에 특이적인 PCR 산물을 확인 할 수 없었다 (Fig. 2A). 따라서, 원형질융합을 통하여 무의 세포질의 유전물질의 전이가 일어나지 않은 것으로 추정할 수 있었다. 이에 원형질체 융합 이 통해 정상적으로 세포융합이 일어났는지를 확인하기 위해 각각 무와 양배추에서 게놈에 특이적인 밴드를 보이는 ISSR Primer (834, 853)를 이용하여 PCR 반응 결과 208개의 독립 개체 중 3개체에서 무와 양배추에 특이적인 밴드를 모두 가지고 있는 개체를 확인할 수 있었다 (Fig. 2B, C). 따라서 PEG 융합을 통하여 재분화된 개체 중 \( 1.4 \% \)에서 원형질 체간의 융합이 일어났음을 확인할 수 있었다.</p> <h2>융합 개체의 형태 및 개화</h2> <p>PCR 분석 결과 NWB-CMS 무와 양배추간의 핵의 융합이 일어난 것으로 확인된 3개의 독립개체는 발근과 개체의 발달 과정에서는 특이할 만한 사항은 없었다. 그러나 형태적으로 정도의 차이는 있었으나 무와 양배추의 중간형태의 잎을 가지고 있는 것으로 나타났다 (Fig. 3A, B, C). 이들 세포 융합체들은 2달간의 저온처리를 하는 춘화처리로 개화를 유도하였다. 일반적인 양배추의 화색은 노란색인데 반해 세포 융합체의 화색은 흰색으로 전형적인 무의 꽃색과 같았으며 형태적으로도 무의 꽃과 상당히 유사한 형태를 취하고 있었도하였다. 일반적인 양배추의 화색은 노란색인데 반해 세포 융합체의 화색은 흰색으로 전형적인 무의 꽃색과 같았으며 형태적으로도 무의 꽃과 상당히 유사한 형태를 취하고 있었다 (Fig. 3D, E). 이들 3 개의 융합체 모두 매우 소량의 화분이 생성되었고 실험에 사용하였던 원재료 양배추의 화분을 이용하여 역교배를 실시하였으나 2개의 개체에서는 종자 채종이 불가능하였고 나머지 1개체에서 3개의 종자를 얻을 수 있었다. 그러나 종자 형성이 가능하였던 1개체에서도 단지 3개의 꼬투리에서 각각 1 개의 종자가 결실되었을 뿐 (Fig. 3F) 대부분의 꼬투리 (pod)에서는 종자 결실에 실패하여 빈상태인 것이 확인되었다. 이와 같은 결과는 유채와 서래풀의 종간 잡종의 결과에서 종자의 결실이 매우 어렵고 역교 배를 통해 일부 종자를 얻었다는 결과와 유사하였다 (Hu etal., 2002).</p>