잿빛 곰팡이병, 잎마름병 등의 식물병원성 균주에 강한 항균활성을 보인 KJ-9를 최종 분리균주로 선정하였다. 이를 토대로 동정 및 분석한 결과 KJ-9는 \( 98 \% \)정도로 Bacillus licheniformis와 유사하여 Bacillus licheniformis KJ-9로 명명하였다. Bacillus licheniformis KJ-9은 균체 성장을 위해 탄소원 중에서는 Soluble starch를 가장 잘 이용하였으며, 최적 농도는 \( 1.5 \% \)였다. 질소원 중에서는 yeast extract를 가장 잘 이용하였으며, 최적 농도는 \( 0.5 \% \)였다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>미생물의 순수분리</h2><p>톱밥을 주원료로 제조되고 있는 퇴비의 효율적인 발효 균주를 탐색하기 위하여 carboxy methyl cellulase (CMCase)가 함유된 CY평판배지 상에서 clear zone의 크기가 크고, \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)의 고온에서도 생육속도가 빠른 20여종의 미생물을 1차 분리한 후 액체 배양하여 CMCase, protease 및 chitinase 효소활성이 비교적 높게 나타난 8균주를 Table 1에 나타내었다. CMCase 활성은 KJ-09, KJ-37, KJ-33균주의 순으로, protease활성은 KJ-09, KJ-02, KJ-50균주의 순으로 그리고 chitinase활성은 KJ-9, KJ-2, KJ-33균주의 순으로 높게 나타났다.</p><h2>식물병원성균주에 대한 항균활성</h2><p>2차 순수 분리한 미생물이 식물 병원성균에 대한 항균활성을 검토하여 Fig. 1에 나타내었다. 분리한 미생물 중에서는 clear zone의 크기가 크고 효소활성이 높아도 전혀 항균활성을 나타내지 않는 미생물이 있었으며, 또한 미생물의 종류에 따라서도 항균활성은 많은 차이를 나타내었다. 분리균주 중에서 KJ-9는 잿빛 곰팡이병을 유발하는 Botrytis cinerea, 잎마름병의 원인균인 Corynespora cassicola, 시들음병을 유발하는 Fusarium oxysporum, 잘록병의 원인균인 Rhizoctonia solani의 식물병원성 균주에 강한 항균활성을 보였다. 이상의 결과로 효소의 활성이 높으면서 4종류의 식물병원성 미생물에 대하여 강한 항균활성을 가지고 있는 KJ-9를 최종 분리균주로 선정하였다.</p><h2>항균미생물의 동정</h2><p>최종 선정한 항균미생물인 KJ-9의 형태학적 및 생태학적 특성을 검토하여 Table 2와 3에 나타내었다. 분리한 KJ-9균주는 Gram 양성이며 편모 및 내생포자를 가지는 간균 (\(0.9-1.2 \times 2.0-3.2 \mu \mathrm{m}) \)으로 나타났다. 생화학적 특성은 oxidase, catalase 및 urease반응은 양성이었으나, indol 생성은 음성이었다. 이러한 결과를 토대로 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 및 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology에 준하여 동정한 결과 Bacillus 속(genus)인 것으로 추정되었으며 Table 3의 API kit(API, France)를 사용한 당 발효실험의 결과를 ATB indentification program에 입력하여 분석하고 그리고 16S rDNA 분석(Fig. 2)을 행한 결과 분리한 KJ-9균주는 \( 98 \% \)정도 Bacillus licheniformis와 유사한 것으로 판명되어 최종분리 선정한 균주를 Bacillus licheniformis KJ-9로 명명하였다.</p><h2>탄소원의 영향</h2><p>탄소원의 종류가 분리한 B. licheniformis KJ-9의 생육에 미치는 영향을 검토하여 Fig. 3에 나타내었다. B. licheniformis KJ-9 은 soluble starch, glucose 및 fructose 등의 순으로 잘 이용하였으나, lactose, raffinose 및 sorbose 등은 잘 이용하지 못하는 것으로 나타났다. 이상의 결과로 B. licheniformis KJ-9의 최적 탄소원은 soluble starch로 결정하고 그 최적 첨가농도를 검토하여 Fig. 4 에 나타내었다. Soluble starch의 첨가농도를 \( 1.5 \% \)까지 증가시킴에 따라 균체의 성장은 거의 직선적으로 증가하였으나 그 이상의 농도에서는 거의 영향이 없는 것으로 나타나 soluble starch의 최적 첨가농도는 \( 1.5 \% \)로 결정하였다. Yun등은 고추역병에 항균활성을 갖는 Chryseomonas luteola 5042 를 선발하여 최적 탄소원을 검토한 결과 \( 0.5 \% \) D(\(+\))-cellobiose가 최적으로 보고하였으며, Jung 등은 키토산 분해효소를 생산하는 Baciilus sp.를 분리하여 최적 탄소원을 검토한 결과 \( 0.5 \% \) xylose를 첨가하였을 때 최적이라고 보고한 것과는 다소 상이하였다. 그리고 Kim은 Baciilus sp.의 생육을 억제하는 방선균의 경우 xylose를 \( 2 \% \) 첨가했을 때 균의 증식이 가장 우수한 것으로 보고하였다. 이상의 결과로 분리균주에 따라 이용하는 탄소원의 종류 및 첨가농도는 다소 차이가 있는 것으로 사료된다.</p><h2>질소원의 영향</h2><p>질소원의 종류가 항균미생물인 B. licheniformis KJ-9의 생육에 미치는 영향을 검토하여 Fig. 5에 나타내었다. M9 minimal medium에 soluble starch를 \( 1.5 \% \) 첨가하고 여러 종류의 질소원을 각각 \( 0.5 \% \)씩 첨가하여 배양한 결과 \( \mathrm{NH}_{4} \mathrm{NO}_{3}\), \(\mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl} \), 및 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{HPO}_{4} \)와 같은 무기질소원 보다는 yeast extract, peptone 및 beef extract와 같은 유기질소원을 잘 이용하는 것으로 나타났다. 그 중에서도 yeast extract를 첨가한 시험구에서 균체 성장이 가장 왕성하였기 때문에 최적 질소원을 yeast extract로 결정하고, 그 첨가 농도를 검토한 결과 \( 0.5 \% \)까지 증가 할수록 균체의 성장이 왕성하였으나 그 이상의 농도에서는 균체 성장에 영향을 미치지 못하는 것으로 나타나 yeast extract의 최적 첨가 농도를 \( 0.5 \% \)로 결정하였다(Fig. 6). Kim이 분리한 Baciilus sp. WRD-1은 질소원으로 yeast extract를 \( 1.0 \% \) 첨가했을 때 균의 생육이 가장 왕성하였다고 보고한 내용과 비교할 때 질소원의 종류는 동일하지만 첨가농도는 다소 상이하였다.</p>