혐기성 환경에서 질소가스로 채워진 chamber를 이용하여 균주의 접종을 진행하였으며, 분리균주 ES392의 형태는 전자현미경을 이용해 관찰하였다. 배양 과정 중 발생한 가스는 acetic acid buffer에 포집하여 수소함량을 가스 크로마토그래피로 분석하였다. 또한 균체농도는 일정 시간 간격으로 UV-visible spectrophotometer를 이용하여 파장 \(660 \mathrm{~nm}\)에서의 흡광도로 측정하였다.
<h2>균주 배양</h2> <p>균주의 접종은 배지 내 용존산소량을 최소화하기 위해 질소가스를 채운 혐기성 chamber에서 실시하였다. 전배양은 \( 50 \mathrm { ~mL } \)의 배지가 든 \( 125 \mathrm { ~mL } \) serum 병에 분리된 ES392 균주를 접종하고 \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } , 120 \mathrm { rpm } \)에서 2일간 혐기적으로 배양시켰다. 본배양은 Fig. 1에서 나타낸 것처럼 \( 1 \mathrm { ~L } \) serum 병에 배지를 \( 800 \mathrm { ~mL } \) 첨가한 후 전배양액 \( 1 \% \)(v/v)를 접종하여 전배양과 같은 조건에서 배양하였으며, 배양 중 \( \mathrm { pH } \)는 조절하지 않았다.</p> <h2>균주 동정</h2> <p>분리균주 ES392의 형태는 투과전자현미경(JEM 1200 EX II electron microscope, JEOL)을 이용하여 음성염색으로 관찰하였다. 균주의 생화학적 특징은 API 20E Kit를 사용하여 조사하였고, 16S rRNA sequence 분석은 Kim 등 의 방법에 따라 실시하였다. 16S rRNA 유전자 분석은 BLAST 프로그램을 사용하여 수행하였으며, Clustal W(1.6.6 Version) 프로그램을 사용하여 계통도를 작성하였다.</p> <h2>가스분석</h2> <p>배양 중 발생되는 전체가스는 acetic acid buffer(pH 3.0)를 담은 gas collector에 포집하였고, 수소함량은 head space 가스를 gas tight syringe로 \( 100 \mu \mathrm { L } \) 취하여 gas chromatography(Shimadzu, Japan)로 분석하였다. 사용된 column은 \( (6 \mathrm { ft } \times 1 / 2 \mathrm { in } ) \) glass로 molecular sieve \( 5 \mathrm { ~A } \)(80/100 marh; Alltech, Deerfield, USA)를 충진 물질로 사용하였으며, thermal conductivity detector(TCD)로 분석하였다. 수소분석의 조건은 column 온도 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \), injector 온도 \( 90 ^ {\circ } \mathrm { C } \), detector 온도 \( 120 ^ {\circ } \mathrm { C } \)이었으며, carrier gas는 argon을 이용하고 flow rate는 \( 35 \mathrm { ~mL } / \mathrm { min } \)으로 유지하였다.</p> <h2>기타 분석</h2> <p>균체농도는 일정 시간 간격으로 채취한 배양액을 UV-visible spectrophotometer(OPTIZEN 2120UVPlus, Korea)를 사용하여 파장 \( 660 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 배양액의 \( \mathrm { pH } \)는 \( \mathrm { pH } \) meter(Mettler Toledo, USA)를 사용하여 실온에서 측정하였다.</p>