대부분의 xylanase는 Bacillus의 영양세포 단계에서 생합성되어 분비되는데, 이는 영양세포단계의 유전자 발현에 관여하는 RNA 중합효소의 \( \sigma^{A} \) 인자와 관련이 있다. B. alcalophilus AX2000의 xylanase와 다른 xylanase들은 특정 위치에 glutamic acid를 가지고 있으며, 이는 해당 xylanase의 활성부위와 관련이 있을 것으로 추측된다. 본 연구에서 사용된 xylanase는 B.alcalophilus AX2000의 영양세포에서 생산되며, xynT 유전자의 염기배열에서 Bacillus의 \( \sigma^{A} \) 인자가 인식하는 promoter 구역을 확인할 수 있다. xynT 유전자의 번역 개시 codon은 AUG로 일반적으로 사용되는데, 이는 B. subtilis의 대부분의 유전자에서 주로 사용되는 codon이다. 본 xylanase는 leucine이 가장 많은 함량을 가지고 있다.
<p>대부분의 xylanase는 Bacillus의 영양세포 단계에서 생합성되어 분비되므로 영양세포단계의 유전자 발현에 관계하는 RNA 중합효소의 \( \sigma^{A} \) 인자가 유전자의 전사과정에 과여하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서 사용된 xylanase 역시 B.alcalophilus AX2000의 영양세포에서 생산되므로 xynT 유전자의 염기배열에서 Bacillus의 \( \sigma^{A} \) 인자가 인식하는 promoter 구역을 검색해 본 결과 Fig. 1에서와 같이 ATG 개시 codon으로부터 각각 259와 282 base 상류에 \(-10\) box와 \(-35\)box로 추정되는 공통염기배열의 존재를 확인하였다. TACAAT의 염기서열을 가진 \(-10\) box의 경우는 B. subtilis의 \( \sigma^{A} \) 인자가 인식하는 promoter의 공통염기배열인 TATAAT와 5개의 염기가 일치하였고, \(-35\) box의 GTCACA는 공통염기배열인 TTGACA 와 6개 중 4개의 염기가 일치하여 비교적 잘 보존되어 있음을 알 수 있었다. 또한 \(-10\)box와 \(-35\)box 사이의 간격도 17 \(\mathrm{bp}\)로 매우 효율적인 promoter 구조임을 알 수 있었다.</p><p>또한 본 유전자의 3'말단의 하류에는 13base로 이루어진 상보적 역반복 서열이 10개의 염기를 사이에 두고 존재하여 mRNA로 전사될 때 stem-loop 구조가 형성될 수 있음을 확인하였다. 그러나 stem-loop 구조 내에 GC-rich한 부위가 존재하지 않았기 때문에 이 구역은 p-factor 의존성 전사 terminator로 작용할 것으로 추측되었다.</p><p>본 xylanase 유전자에는 AUG개시 codon으로부터 \(6\mathrm{bp} \) 상류에 16S rRNA 의 3' 말단 부위와 상보적으로 결합할 수 있는 5'-AGGAGU-3' 염기배열을 지니고 있어, 이 부위가 ribosome 결합부위인 것으로 판단하였다. 개시 codon은 B . subtilis의 대부분의 유전자에서 AUG가 가장 많이 사용되며 GUG는 spoE 유전자와 spoVG 유전자 등에서 일부 사용되고 있으며 UUG는 Staphylococcus aureus의 \( \beta \)-lactamase 유전자와 Bacillus phage인 SPO1의 middle gene 등 극히 제한적으로 사용되고 있는데, 본 xynT 유전자의 번역 개시 codon은 AUG로 가장 일반적인 개시 codon을 사용하고 있었다.</p><p>한편 본 xylanase는 B. alcalophilus AX2000에서 세포 밖으로 분비되므로 signal peptide가 존재한 것으로 예상되었다. 본 xylanase의 hydropathy plot을 살펴본 결과 N 말단 부분에 소수성 부위가 존재하는 것으로 나타나 첫 번째 아미노산으로부터 23 번째 아미노산인 alanine까지의 부위가 signal peptide인 것으로 추측되어지며 signal peptidase의 전형적인 절단 부위인 23번째와 24번째에 존재하는 alanine과 alanine사이에서 절단이 이루어지는 것으로 사료되었다(data not shown). 정확한 signal peptide의 위치를 알기 위해서는 세포외로 분비된 효소를 정제한 후 N 말단 아미노산서열 결정 실험이 요구된다. 본 xylanase의 amino acid의 함량은 Table에서 보는 바와 같이 leucine이 9.41\( \% \)로 가장 많았았다. 다음이 glutamic acid로 8.82\( \% \)였으며 lysine과 aspartic acid가 7.35\(\% \)를 나타낸 반면 cysteine 잔기는 존재하지 않았다.</p><p>Xylanase는 구조와 아미노산서열에 기초한 glycoside hydrolase의 분류상 GH10 GH11 family로 분류된다. GH10 family에 속하는 xylanase는 모두 \( (\beta / a)_{8} \) 구조를 지니는 촉매 부위를 지니고 있으며 평균 분자량은 \(40 \mathrm{kDa} \)이다. GH11 family에 속하는 xylanase는 GH10 xylanase보다 분자량이 더 작으며(약 \( 20\mathrm{kDa} \) ) \( \beta \)-jelly 구조를 보여준다. 본 xylanase의 아미노산 서열을 NCBI Blastp 프로그램을 이용하여 database 를 검색한 결과 GH10에 속하는 xylanase로 확인되었으며 다른 생물 유래의 xylanase와의 유사성을 알아보기 위하여 CLUSTALW program을 이용하여 homology alignment를 작성한 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 여러 xylanase 중에서 본 연구에 사용된 B. alcalophilus AX2000의 xylanase와 가장 유사성이 높은 xylanase는 Bacillus sp. N137 유래의 xylanase로 61\(\% \) 의 아미노산이 동일하였으며 그 다음으로 B.stearothermophilus 21(59%)과 B. stearothermophilus T-6(57 %) 유래의 xylanase 순으로 유사성이 높았다. 현재까지 xylanase의 활성부위에 관한 연구가 여러 연구진들에 의해 보고되었는데, Wakarchuk 등은 B.circulans가 생산하는 xylanase의 활성부위에는 \( \mathrm{Glu}^{78} \)과 \( \mathrm{Glu}^{172} \)가 관여한다고 보고하였고 Clostridium thermocellum, Dictyoglomus thermophilum, Thermotoga neapolitana 등에서도 glutamic acid 부위가 xylanase의 활성부위에 존재한다고 보고된 바 있다. B. alcalophilus AX2000의 xylanase의 48번째와 137번째 glutamic acid는 B. circulans xylanase의 \( \mathrm{Glu}^{78} \) 과 \( \mathrm{Glu}^{172} \)에 해당하는 아미노산이며 Fig. 2에서 비교한 모든 xylanase가 이 위치에 glutamic acid를 지니고 있어 이 부위의 아미노산이 본 xylanase의 활성부위와 관련되었을 것으로 판단되었다.</p>