항암활성을 갖는 미생물의 동정을 위해 Scanning Electron Microscope로 표면 형태, 크기, sclerotia의 형태, 유무등으로 관찰하고, 한국 미생물보존센터 의뢰하여 유전자 간의 상동성 비교하였다.
<h2>항암물질 생산균주의 동정</h2> <p>항암활성을 갖는 미생물의 동정을 위하여 균의 형태학적 생리학적 특성을 조사하였다. 형태학적 특성은 Scanning Electron Microscope (SEM)로 표면형태, 크기, sclerotia의 형태, 유무등으로 관찰하였고, 정확한 동정을 위해 한국 미생물보 존센터에 의뢰하여 16srRNA sequence를 분석하여 유전자 간의 상동성을 비교하여 동정하였다.</p> <h2>최적 배지조성 및 배양조건의 결정</h2> <p>미생물 생육 최적 탄소원은 최소배지인 \( \mathrm{M} 9[\mathrm{Na} 2 \mathrm{HPO} 40.6 \% \), KH2PO4 0.3\%, \( \mathrm{NH} 4 \mathrm{Cl} \mathrm{0.1 \%}, \mathrm{NaCl} \mathrm{0.05 \%}, \mathrm{MgSO} 4 \cdot 7 \mathrm{H} 2 \mathrm{O} \) solution \( (246.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L}) 0.1 \% \), Thiamine \( \cdot \mathrm{HCl} \) solution \( (\mathrm{g} / \mathrm{L}) \) \( 0.1 \%, \mathrm{CaCl} 2 \) solution (14.7g/L) 0.1\%] 배지에 각종 탄소원을 \( 1.0 \% \) 로 첨가하였고, 최적 질소원은 각종 질소원을 \( 1.0 \% \) 로 첨가하여 생균수를 관찰하여 결정하였다. 또한 각각의 탄소원, 질소원 농도를 변화시키면서 균의 배양 상등액의 항암활성을 관찰하여 최적 배지조성을 결정하였다. 최적 배지 초기 \( \mathrm{pH} \) 는 위에서 결정된 최적 배지의 \( \mathrm{pH} \) 를 3.0 11.0으로 변화시키면서 결정하였고, 최적 배양온도는 온도를 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 변화시키면서, 그 활성을 측정하여 결정하였다.</p> <h2>분리 균주의 항암 활성</h2> <p>암세포는 폐암세포(A549)와 난소암(SK-OV3) 및 백혈구 암세포(HL-60)를 사용하였으며 항암제 Control로 현재 병원에서 사용중인 taxol \( (1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 을 사용하여 활성을 비교하였다. 암세포는 95\% 습도, \( 5 \% \mathrm{CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C} \) 온도 조건에서 배양하였으며, 배지는 \( 10 \% \mathrm{FBS} \) 가 든 \( \alpha \)-DMEM을 사용하였고 48시간 간격으로 배지를 교체하였다. 배양액 처리 전 24 시간에 \( 1 \% \) FBS로 바꿨으며 Cell 수는 \( 5 \times 10^{4} \) cell/ \( \mathrm{ml} \) 일때를 사용하였으며 농도별, 시간별 암세포의 사멸율을 typhan blue로 염색후 counting 하였다.</p> <h2>DNA fragmentation assay</h2> <p>암세포에 대한 항암활성미생물의 apoptosis(계획된 세포 죽임)를 조사하기 위하여 암세포배양액에 항암 활성 미생물의 배양 상등액을 농도별 \( 0,10 \mu l / \mathrm{ml}, 30 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ml}, 50 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ml} \) 되게 처리하고 24시간 후 chromosomal DNA를 분리하여 agar-ose gel electrophoresis를 실시하여 DNA분해 양상을 조사하였다.</p>