R4누룩이 항혈전 활성을 갖는다는 것을 확인한 본 연구에서는, 혈소판의 비정상적 응집을 저해하는 데 중요한 역할을 하는 R4누룩의 항혈전 활성을 조사하였다. 특히, R4누룩의 열수 및 ethanol 추출물을 활용하여 만든 유기용매 분획물에서 ethylacetate 분획이 우수한 항응고 활성을 보였으며, 동시에 인간 적혈구 용혈활성은 나타내지 않았다. 이는 R4누룩이 향후 항응고 및 혈소판 응집저해 개발의 유용한 자원으로 이용될 수 있음을 보여준다. 앞으로 R4누룩의 활성물질 정제 및 항혈전 작용 메커니즘 연구가 요구된다.
<p>R4누룩의 항혈전 활성 평가를 위해 혈소판 응집 저해활성을 평가하였으며, 그 결과는 Table 3에 나타내었다. 혈소판은 내피세포의 손상으로 노출된 collagen 등과 결합하여혈전생성을 개시하는 중요한 세포로, 혈소판의 비정상적인 응집은 혈전 생성을 촉진시켜 정상적인 혈액순환을 저해 한다. 본 연구에서의 혈소판 응집저해 활성은 미세전극에 혈소판이 부착되어 응집됨에 따라 발생하는 전기 저항값의 변화를 측정하는 impedance 법을 사용하여 평가하였다. 인간 농축 혈소판(platelet rich plasma: PRP)은 적십자로부터 공급받았으며 PRP 의 전처리 및 수세과정은 기존의 보고와 동일하게 하였으며, 최종 혈소판 농도가 5 \( \times \)10 \( ^ { 8 } / \mathrm { ml } \)이 되도록 조정한 후 , Whole Blood Aggregometer (Chrono-log, PA, USA)를 사용해 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 측정하였으며, \( 10 \mathrm { mM } \mathrm { CaCl } _ { 2 } \) \( 50 \mu \mathrm { l } \), suspending buffer 147.5 \( \mu \mathrm { l } \), 시료 \( 5 \mu \mathrm { l } \)가 포함된 반응 cuvette에 혈소판 50 \( \mu \mathrm { l } \)을 넣은 후 3분 동안 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 가온 후 응집유도제로 collagen (1 \( \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \))을 2.5 \( \mu \mathrm { l } \)를 넣고 혈소판응집을 측정하였다. 응집반응은 collagen 첨가 후 12분간 측정하였으며 amplitude, slope, area under를 측정하여 평가하였다. 이때, amplitude (ohm)는 혈소판에 응집유도제를 첨가하였을 때 일어나는 최대 응집정도를 나타내며, slope는 응집유도제를 첨가한 직후부터 1분 동안의 응집곡선의 기 울기를 나타내며, area under는 전체적인 혈소판 응집 정도 를 표시하는 것으로 전기저항 증가에 따른 slope 곡선의 하 강면적을 나타낸다. R4 누룩의 혈소판 응집 저해 활성은 시료 대신 DMSO를 첨가한 대조구와의 상대적인 area under 값의 비를 백분율로 나타내었다. 대조구로 사용된 혈소판 응집저해제인 아스피린은 농도의존적인 혈소판 응집저 해 활성을 나타내었으며, (0.25 \( \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \)농도에서 무첨가구에 비해 65.9 \( \% \)의 응집율을 나타내었다. R4 누룩의 ethanol 추출물 및 분획물 (0.25 \( \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \)은, butanol 분획물을 제외한 모든 시료에서 유의적인 혈소판 응집저해 활성은 나 타나지 않았으며, 오히려 응집 촉진이 나타났다. 한편 R4 누 룩의 열수 추출물 및 분획물 중에서는 ethylacetate 및 butanol 분획에서 혈소판 응집 저해활성을 나타내었다. 따라서 R4누룩은 다양한 성분의 혈액응고효소, 혈액응고인자 및 혈소판 응집 저해활성물질을 포함하고 있음을 확인하였다. 한편 인간 적혈구에 대한 용혈활성을 평가하였으며, 인간 적 혈구4 \( \% \)100 \( \mu \mathrm { l } \)를 96-well microplate에 가하고 다양한 농도의 시료용액 100 \( \mu \)1를 가한 다음 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30 분간 반응시 켰으며, 이후, 반응액을 10분간 원심분리 1,500rpm하여 상등액 100 \( \mu \mathrm { l } \)를 새로운 microtiter plate로 옮긴 후 용혈에 따른 헤모글로빈 유출 정도를 414 \( \mathrm { nm } \)에서 측정하여 평가하였다. 그 결과, ethanol 추출물 (0.5 \( \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \))에서 23 \( \% \)이상의 용혈활성이 나타났으며, 특히 hexane 및 ethylacetate 분획물에서는 용혈활성이 강하게 나타났다. 본 연구 결과는 R4 열수 추출물의 ethylacetate 분획은 향후 항응고 및 혈소판 응집저해 개발의 유용자원으로 이용가능함을 제시하고 있다. 향후 R4 누룩으로부터 활성물질의 정제 및 이의 항혈전 기작 연구가 필요하다고 판단된다.</p> <h1>요약</h1> <p>누룩은 전 세계적으로도 독특한 우리만의 발효제로, 전분당화 및 발효미생물의 접종원으로 이용된다. Rhizopus oryzae KSD-815로 제조된 개량누룩(R4로 명명)은 발효제 특성 이외에 암세포 생육억제, 항비만 활성 등이 알려져 있다. 본 연구에서는 R4누룩의 열수 및 ethanol 추출물과 이들의 순차적 유기용매 분획물을 조제하여 항혈전 활성을 평가한 결과, ethylacetate 분획에서 우수한 항응고 활성을 확인하였으며, 열수 추출물의 ethylacetate 및 butanol 분획은 인간 적혈구 용혈활성을 나타내지 않으면서 혈소판 응집저해 활성을 나타내었다. 본 연구결과는 R4누룩이 항응고 및 혈소판 응집저해 개발의 유용자원으로 이용 가능함을 제시하고있다.</p>