피부감작성 시험에서 기니피그를 감작시킨 후 얻은 혈청을 실험용 쥐에 투여하여 시험 물질이 야기 되었는지 확인한 결과 혈청의 최종 항체역가와 anaphylaxis와 관련이 있는 IgE가 생성되는 것임을 판정하였으며, 2마리의 기니피그 모두 피부괴사가 일어나지 않은 최고 농도를 감작항원량으로 판단하였다.
<h2>Guinea pig-rat를 이용한 heterologous passive cuta-neouse anaphylaxis (PCA) 시험</h2> <h3>Guinea pig을 이용한 항혈청 생산</h3> <p>Anaphylaxis 시험에서 감작시킨 guinea pig으로부터 최종감작 1 주 후 채혈하고 실온에 3시간 응고시킨 후 원심분리하여 \( (3,000 \times \mathrm{g}\), \(10 \mathrm{~min}) \) 혈청을 얻었다. 분리한 혈청은 다음 시험까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하여 사용하였다.</p> <h3>항혈청 감작 투여</h3> <p>Sprague-Dawley (♂, 6주령, \(250\sim350 \mathrm{g}\)) rat에 개체별로 분리된 혈청을 멸균 생리식염수로 공비 2 배로 10 단계 희석하였다. 군당 3마리씩 배부위에 일정한 간격으로 1 회용 주사기(26 G, \(1 \mathrm{ml}) \) 로 \( 100 \mu\mathrm{l} \) 씩 피내주사 후 주사부위를 표시하였다.</p> <h3>시험 물질 야기</h3> <p>피내투여 24시간 후, 야기항원과 Evan's blue 1:1 혼합액(5\( \mathrm{mg} / 1 \mathrm{ml} / \)body) 을 꼬리정맥내로 투여하였고, 30분 경과 후 \( \mathrm{CO} 2 \) 가스로 마취시킨 후 경동맥 부위를 가위로 잘라 실혈치사시켰다. 치사시킨 guinea pig을 배부위 피부를 절취하여 뒷면으로부터 청색반점(Blue spot)을 확인하였다.</p> <h3>관찰 자료의 해석 및 평가</h3> <p>주사부위에 출현한 청색반점의 생성여부를 관찰하여 청색반점의 직경 ((장경+단경) / 2)이 \( 5 \mathrm{~mm} \) 이상이면 양성으로 간주하고, 양성을 나타내는 가장 마지막 혈청 희석액의 희석배수를 최대 희석배수로 하였으며, 그 혈청의 최종 항체역가로 정하여 anaphylaxis와 관련이 있는 IgE가 생성되는 것으로 판정하였다.</p> <h2>피부감작성 시험</h2> <h3>실험 동물</h3> <p>실험동물은 한림실험동물(주)(경기도 화성, 한국)에서 Hartley계 guinea pig 6주령 \( (250 \sim 350 \mathrm{~g} \), ♂)을 구입하여 1주일간 순화시킨 후 시험에 사용하였다. 사육실은 실험동물 환경조건인 온도 \( 22 \pm 3^{\circ} \mathrm{C} \), 상대습도 \( 55 \pm 5 \% \), 환기횟수 10-12회\( \mathrm{/hr} \), 명암주기 12시간으로 유지하였다. 순화시기 및 시험기간 중 실험동물은 고형사료와 비타민의 공급을 위해 양배추를 사료와 동시에 자유 급여하였고, 음수도 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.</p> <h3>피내주사 시 감작항원량</h3> <p>시험물질인 WC은 \( 80 \mu \mathrm{g} / 100 \mu \mathrm{l}\), \(40 \mu \mathrm{g} / 100 \mu \mathrm{l}\), \(20 \mu \mathrm{g} / 100 \mu \mathrm{l}\), \(10 \mu \mathrm{g} / 100 \mu \mathrm{l} \)의 농도로 urease는 \( 80 \mu \mathrm{g} / 100 \mu \mathrm{l}\), \(40 \mu \mathrm{g} / 100 \mu \mathrm{l}\), \(20 \mu \mathrm{g} / 100 \mu \mathrm{l} \)의 농도별로 희석하여 제모 된 guinea pig 등부위 피내에 \( 100 \mu \mathrm{l} \)씩 주사한다. 피내주사 후 주사부위를 관찰하여 2마리 guinea pig 모두 다 피부괴사가 나타나지 않는 최고 농도를 감작항원량으로 정하였다.</p> <h3>통계학적 분석</h3> <p>본 실험에서 얻은 측정치에 대한 통계처리는 SPSS (SPSS 12.0 KO for Windows)를 이용하여 평균치와 표주편차를 구하였고, 유의성검증은 Duncan's multiple range test를 이용하여 유의수준 \( \mathrm{p}<0.05 \) 일 때 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.</p>