본 연구에서는 재조합 CGTase의 표면 발현을 위해 PYD1 vector를 포함하는 GAL1 promoter를 사용한 재조합 효모의 배양과정을 소개한다. 이는 YPDG 배지를 이용하여 수행되었다. 또한, 균주의 전배양은 SD 배지에서 이루어졌으며, flask와 fermentor 배양 시 접종양은 \(5\) ~ \(6.5\%(v/v)\)로 설정되었다. 균체 농도는 흡광도를 이용해 측정하였고, 균체 침전물과 배양 상등액으로 CGTase 활성을 측정하였다. 이후 효소 반응 생성물은 thin-layer chromatography를 사용하여 분석하였다.
<p>재조합 CGTase의 표면 발현를 위해 재조합 효모의 발효조 배양은 유도적 promoter인 GAL1 promoter를 가진 PYD1 vector와 재조합된 유전자의 발현를 위해 YPDG 배지( \(1 \% \) yeast extract, \(2 \% \) polypeptone, \(1 \% \) dextrose, \(1 \% \) galactose)를 사용하여 배양하였다.</p> <p>재조합 효모 균주의 전배양은 SD 배지로 하였으며 flask 배양 및 fermentor 배양시 접종양은 \(5 \) ~ \(6.5 \%(v/v) \)로 하였다. Flask 배양에서는 \( 500 \mathrm { ml } \) baffled-flask (working volume; \( 100 \mathrm { ml } ) \) 로 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } , 170 \mathrm { rpm } \) 에서 수행하였으며, 재조합 CGTase의 조효소을 확보하기 위한 발효조(KoBiotech Co., Korea) 회분배양은 YPDG 배지로 working volume, 21 ; 온도, \( 25 \sim 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \); 초기 \( \mathrm { pH } 6.0 \); 교반속도, \(300 \sim 500 rpm \) ; 통기속도, \(1 \sim 1.5 \mathrm { vvm } \)의 조건하에서 수행하였다.</p> <h2>균체 농도 및 plasmid 안정성</h2> <p>균체 농도는 일정시간마다 채취한 배양액을 적당한 비율로 희석하여 분광광도계(Shimadzu UV-160A, Japan)를 사용하여 \( 600 \mathrm { ~nm } \) 에서의 흡광도 \( \left ( \mathrm { OD } _ { 600 } \right ) \) 로 측정하였다. 보정곡선에 의해 \( \mathrm { OD } _ { 600 } \) 값은 건조균체농도(g-dry cell weight/l)로 환산하였다 \( \left (1.0 \mathrm { OD } _ { 600 } = 0.28 \mathrm { ~g } - \mathrm { DCW } / 1 \right ) \).</p> <p>Plasmid 안정성은 배양액을 적당히 희석하여 YPD 평판배지에 도말한 후 자란 100개의 colony를 SD 선별배지로 tooth-picking한 다음 형성된 colony 수의 비(백분율)로 측정하였다.</p> <h2>균체 분획 및 CGTase 활성 측정</h2> <p>균체 침전물과 배양 상등액을 사용하여 각 분획에서의 CGTase 활성을 측정하였다. CGTase의 활성은 Fujiwara 등에 의해 제안된 methyl orange 법으로 측정하였다. 효소반응은 \( 1.5 \mathrm { ml } \) 의 \( 50 \mathrm { mM } \) 인산 완충액( \( \mathrm { pH } \) 6.0)에 soluble starch와 methyl orange 최종농도가 각각 \(1 \% \)와 \( 0.035 \mathrm { mM } \) 이 되도록 첨가하여 잘 섞고 이 혼합액에 효소 용액을 가하여 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 3시간 반응시켰다. 반응 후 6 N HCl을 가하여 반응을 정지시키고 반응액을 \( 16 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 15분간 방치한 후 \( 500 \mathrm { nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다. 효소활성은 위와 같은 조건에서 분당 \( 1 \mu \)mole의 a-CD를 생성하는 효소량을 1 unit로 정의하였다. 비활성도(specific activity)는 가 혀소 활성을 건조균체농도 g-DCW/l 값으로 나누어서 계산하였다.</p> <h2>Thin-layer chromatography에 의한 효소반응생성물의 확인</h2> <p>효소반응 생성물은 thin-layer chromatography로 분석하였다. 효소반응은 \( 50 \mathrm { mM } \) 인산 완충액에 녹인 \(2 \% \) soluble starch와 형질전환체 세포를 1:1로 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 반응시켰다. 반응액은 비등수에서 5분간 열처리 한 후 각각의 반응액 \( 5 \mu 1 \) 씩을 TLC plate (MERCK)에 점적한 후 nitromethane : n-pro-panol : water (4: 10: 3, v/v)를 전개 용매로 3회 전개하였다. 생성물은 methanol/sulfuric acid (95:5)로 \( 110 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10분간 가열하여 발색시켰다. 표준물질은 시판되고 있는 a-CD (Sigma Co.)를 \( 10 \mathrm { mM } \) 의 농도로 사용하였다.</p>