찔레나무 뿌리를 여러 용매로 추출한 결과, 아세톤 추출물에서 가장 높은 폴리페놀 함량인 \(67.05 \pm 0.56 \mathrm{mg} / \mathrm{g}\)를 확인하였다. 또한 모든 추출물이 SOD 유사활성의 20% 이상 효능을 보여주었다. 찔레나무뿌리 추출물의 superoxide anion radical 소거능은 xanthine oxidase와 반응시키는 방식으로 측정되었다. MTT assay를 통해 찔레나무뿌리 추출물의 macrophage cell에 대한 독성이 확인되었다. 더불어, 찔레나무뿌리 추출물의 NO 생성 억제능도 griess 시약을 이용하여 측정하였으며, 에탄올 추출물에서 40%의 NO 생성 억제능을 확인하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>시료의 추출 및 수율</h2> <p>찔레나무 뿌리의 수율은 Table 1과 같이 열수, 에탄올, 메탄올, 아세톤 추출물의 수율이 각 \( 17.75 \%\), \(14.13 \%\), \(15.74 \% \), \( 17.82 \% \)로 열수와 아세톤 추출물의 수율이 더 높은 것을 확인할 수 있었다.</p> <h2>찔레나무 뿌리의 총 폴리페놀 함량 측정</h2> <p>대부분 식물들의 항산화능 화합물은 주로 polyphenol 물질들이며 천연 항산화제로서의 기능이 잘 알려져 있다.</p> <p>폴리페놀계 물질들은 식물체에 특수한 색깔을 부여하고 산화환원반응에서 기질로 작용하며, 한 분자 내에 2개 이상의 phenolic hydroxyl (OH)기를 가진 방항족 화합물들을 가리키며 항산하, 항암 등의 다양한 생리활성을 가진다. 찔레나무 뿌리에 존재하는 총 폴리페놀 함량의 경우 Table 2와 같이 열수, 에탄올, 메탄올, 아세톤 추출물에서 각각 \( 57.48 \pm 0.88 \mathrm{mg} / \mathrm{g}\), \(61.2 \pm 0.04 \mathrm{mg} / \mathrm{g}\), \(61.5 \pm 0.01 \mathrm{mg} / \mathrm{g}\), \(67.05 \pm 0.56 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \)으로 아세톤 추출물에서 폴리페놀 함량이 제일 높게 나타났다.</p> <h2>전자공여능확인</h2> <p>찔레나무뿌리의 전자공여능 측정결과 Fig. 1과 같이 찔레나무뿌리 열수 추출물의 경우 \( 50 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)에서 \( 40 \% \) 이상의 효능을 보였고, 에탄올, 메탄올 및 아세톤 추출물의 경우 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서 \( 80 \% \) 이상의 효과를 나타내어 같은 농도의 양성대조군 vit-C보다 우수한 radical 소거능을 나타내었다. 이는 Jung 등의 괴화, 녹차, 작약, 생강 메탄올 추출물의 전자공여능이 \( 1,000 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 농도에서 각 \( 76.9 \%\), \(64.6 \%\), \(57.1 \%\), \(48.3 \% \)의 활성을 나타낸 결과와 비교하면 쪌레나무 뿌리의 라디컬 소거능이 더 우수함을 확인 할 수 있었다.</p> <h2>ABTS radical cation decolorization 측정결과</h2> <p>찔레나무뿌리의 ABTS radical cation 소거활성 결과 Fig.2에 나타낸 바와 같이, 찔레나무뿌리 메탄올 및 아세톤 추출물의 경우 \( 50 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)에서 양성대조군 vit-C와 유사한 \( 80 \% \) 이상의 radical 소거능을 확인하였으며, 열수 및 에탄올 추출물에서는 \( 75 \% \) 이상의 radical 소거능을 나타내었다. 또한, DPPH법에 의한 전자공여능에서 찔레나무뿌리 아세톤 추출물 \( 50 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 농도에서 \( 78 \% \) 정도의 항산화력을 보인 반면 ABTS 양이온 소거능에서는 \( 90 \% \)로 더 우수한 효능을 확인하였다. 이것은 radi-cal 소거능이라는 점에서는 같으나 DPPH 경우는 free radical이지만 ABTS는 cation radical이라는 점에서, 또는 페놀성 물질의 종류가 다름에 따라 두 기질에 결합하는 정도가 다르고, radical을 제거하는 기작이 다르다는 점에서 활성이 더 높게 나타난 것으로 판단된다.</p> <h2>Superoxide dismutase (SOD) 유사활성 측정결과</h2> <p>피부 노화방지와 밀접한 관련이 있는 SOD 유사활성을 측정한 결과 Fig. 3와 같이 찔레나무뿌리 열수, 에탄올, 메탄올,아세톤 추출물 \( 1,000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서 모두 \( 20 \% \) 이상의 효능을 확인하였다. 이는 An 등가 보고한 산사자 열수 추출물과 에탄올 추출물이 \( 12 \% \)의 SOD 유사활성능을 나타낸다는 연구결과와 비교하면 찔레나무뿌리 추출물이 더 우수한 SOD 유사활성능이 있음을 확인할 수 있다.</p> <h2>Superoxide anion radical 소거능 확인</h2> <p>Superoxide anion radical 소거능 측정은 xanthine oxidase가 xanthine을 기질로 하여 uric acid를 생성하는 과정에 생성되는 superoxide anion radical을 찔레나무뿌리 추출물과 반응시켜 nitro blue tetrazolium로 superoxide anion radical 소거능을 확인하는 방법이다. Xanthine oxidase에 의해 생성되는 superoxide anion radical의 생성저해 효과는 Fig. 4에 나타내었다. 찔레나무뿌리 열수, 메탄 및 아세톤 추출물 \( 50 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)에서 \( 50 \% \) 이상의 효능을 보였으며, 에탄올 추출물은 같은 농도에서 양성 대조군인 vit-C보다 우수한 \( 80 \% \) 이상의 높은 효과를 보였다. 이는 Jeong이 보고한 프로폴리스에서 분리한 플라보노이드 화합물 quercetin quercetin \( 8 \mu \mathrm{mol} \)에서 \( 50 \% \) 이상의 소거활성을 보임과 유사한 superoxide anion radical 소거능을 확인할 수 있었다.</p> <h2>Hyaluronidase 저해능 확인</h2> <p>본 실험에 사용한 HAase는 hyaluronic의 glucuronic acid와 N-acetyl-glucosamine의 \( \beta\)(\(1 \rightarrow 4\)) 결합을 가수분해하는 것으로 알려져 있다. 이는 결국 고분자 HA의 분해 효소인 HAase의 저해에 의해 HA의 고분자 형태를 유지하게 함으로서 항염증 효과를 기대할 수 있다. 찔레나무뿌리의 HAase 저해능을 측정한 결과 Fig. 5와 같이 나타났다. 찔레나무뿌리 에탄올, 메탄올, 아세톤 추출물 \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서 \( 60 \% \) 이상의 높은 HAase 저해 효과를 확인 할 수 있었으며, 양성대조군인 vit-C가 같은농도에서 \( 20 \% \) 미만의 효능을 보인 것과 Choi 등의 오가피, 황기 및 두충 에탄올추출물의 HAase 저해능 측정 결과 \( 1,000 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)에서 \( 60 \%\), \(61 \%\), \(63 \% \)의 저해능을 보인 것을 비교할 때 찔레나무 뿌리의 HAase 효능 효과가 저농도에서 더 우수함을 확인할 수 있다.</p> <h2>MTT assay에 의한 세포 생존율</h2> <p>찔레나무뿌리 추출물의 세포독성 또는 변성으로 인한 cellpopulation의 저하에 기인하는 결과인지 적용실험 대한 활성 또는 저해능에 대한 정확한 결과 값 인지를 확인하기 위한 과정으로 찔레나무뿌리 추출물에 의한 macrophage cell의 독성을 MTT assay에 의해 확인한 결과, Fig. 6와 같이 나타내었다. 찔레나무뿌리 열수, 에탄올, 메탄올, 아세톤추출물 \( 1,000\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)을 첨가한 군에서 각 \( 52.7 \%\), \(42.0 \%\), \(52.1 \%\), \(58.9 \% \)의 세포독성을 보임으로서 세포독성이 없는 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 이하의 농도로 실험에 적용하였다.</p> <h2>Nitric axide 저해능 확인</h2> <p>NO의 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만 과도한 NO의 형성은 염증을 유발시키게 되며, 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경손상 등을 유발한다. NO 생성에 대한 찔레나무뿌리 추출물의 효능을 griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 \( \mathrm{NO}^{2-} \)의 형태로 측정하였다. LPS를 처리하지 않은 control군에서는 \( 20 \% \) 미만의 NO가 생성 되었고, LPS를 처리한 군에서는 에탄올 추출물이 가장 높은 \( 40 \% \)의 NO 생성 억제능을 확인할 수 있었다. 열수, 메탄올, 아세톤 추출물에서도 농도 의존적으로 NO생성이 억제되었으며, 각 추출물 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 \( 30 \% \) 이상의 높은 NO생성 억제효과를 확인하였다. 이는 Byun 등의 연구에서 현삼 메탄올 추출물의 NO 생성 억제효과를 나타낸 Fig. 7의 결과와 비교해 보면 찔레나무뿌리 추출물의 NO 생성 억제능과 유사한 결과를 나타내었고 농도 의존적으로 NO생성이 억제됨을 확인하였다.</p> <h2>INOS 단백질의 발현 측정 결과</h2> <p>찔레나무뿌리의 iNOS 단백질의 저해 효과를 확인하기 위해 Raw 246.7 cell에 LPS (\(10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\))을 처리하고 1시간 뒤, 찔레나무뿌리 에탄올 추출물을 농도별로 처리 한 후 western blotting으로 확인하였다. Fig. 8와 같이 LPS를 처리하고 찔레나무뿌리 에탄올추출물을 처리하지 않은 control 군에서는 산화적 스트레스가 유발되어 염증 반응을 매개하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 iNOS protein 발현이 \( 130 \mathrm{kDa} \)에서 상당 수준으로 나타났다. 대조적으로 찔레나무뿌리 에탄올 추출물을 농도별로 처리 한 부분에서는 LPS에 의해 증가된 iNOS 단백질 발현을 감소 시켰으며, 특히 에탄올 추출물 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\)에서 \( 40 \% \)의 iNOS protein 발현 감소효과를 확인할 수 있었다. 따라서 찔레나무뿌리 추출물이 LPS로 유발된 NO 생성과 iNOS 발현을 억제함으로 항염증 반응에 관여 한 것으로 사료된다.</p>