사과 쓰가루 품종의 1년생 가지를 이용하여 무병묘를 생산하고자 열처리 및 접목을 이용하였다. 중앙 과수묘목관리센터에서 채취한 가지를 피트모스, 코코피트, 제오라이트를 혼합한 상토에 심고, MM111 무병대목에 접목하였다. ASGV 바이러스에 감염된 9개체를 선발하여 열처리 온도에 따라 3개체씩 사용하였다. 휴면기 동안 \(60 \%\) 습도와 \(36^{\circ} \mathrm{C}, 38^{\circ} \mathrm{C}, 40^{\circ} \mathrm{C}\)의 온도 조건에서 4주간의 열처리를 수행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물 재료</h2> <p>열처리와 경정 접목을 이용한 무병묘를 생산하기 위해 중앙 과수묘목관리센터에 재식되어 있는 5년생 사과 쓰가루 품종의 1 년생 가지로부터 접수를 채취하였으며, 유기물 원료인 피트모스 및 코코피트와 무기물 원료인 제오라이트를 혼합한 상토(슈퍼두배나 상토 2호, 흥농씨앗, Korea)로 채워져 있는 사각심경포트(상부: \( 140 \times 140 \mathrm{~mm} \), 하부: \( 100 \times 100 \mathrm{~mm} \), 높이: \( 400 \mathrm{~mm} \) )에 재식된 MM111 무병대목에 가지접 하였다. 접목 폿트묘는 비가림 육묘장에서 1년간 생육 후 RT-PCR을 이용하여 ASGV에 감염된 9개체가 선발되었으며, 열처리 온도에 따라 각각 3 개의 폿트묘가 시험 재료로 사용하였다.</p> <h2>열처리 및 경정 접목</h2> <p>육묘장 생육한 휴면기의 1년생 폿트묘를 이용하여 \( 60 \% \) 습도와 \( 36^{\circ} \mathrm{C}, 38^{\circ} \mathrm{C}, 40^{\circ} \mathrm{C} \) 가 유지되는 항온·항습장치에서 16 시간 주간, 8 시간 야간 조건으로 4 주간 열처리 과정을 수행하였다. 각각의 온도에서 3 개의 폿트묘가 처리되었으며, 주지로부터 생성된 신초의 길이를 1 주 간격으로 4 주까지 측정하여 신초의 생육을 조사하였다. 무병묘 생산을 위해 열처리 4주 후 생성된 신초의 경정부위를 \( 1 \sim 2 \mathrm{~cm} \) 크기로 절취하였으며, 경정접목을 위한 대목으로 M9, M26 보다 세력이 강한 왜성무병대목 MM111에 접목하였다. 접목된 부위는 수분 손실에 의한 고사를 방지하기 위해 빛이 투과되는 플라스틱 캡을 씌워 밀봉하였으며, 항온·항습장치에서 \( 26^{\circ} \mathrm{C}, 60 \% \) 습도를 유지하며 16 시간 주간, 8 시간 야간 조건으로 7일간 육묘하였다. 7 일 후 밀봉된 캡을 개방하고 \( 26^{\circ} \mathrm{C}, 60 \% \) 습도를 유지하며 16 시간 주간, 8 시간 야간 조건에서 2 개월간 생육 후 생존율 및 바이러스 제거율을 조사하였다. 열처리 온도에 따른 신초생장률 성적은 GraphPad Prism (PRISM 5.0, GraphPAD Software Inc, San Diego, CA, USA) 프로그램을 이용하여 회귀 분석을 하였다.</p> <h2>바이러스 검정</h2> <p>열처리 온도와 기간에 따라 폿트묘에서 발생한 신초의 바이러스 제거율을 조사하기 위해 열처리 3,4 주 후 신초의 하단부와 중간부 및 상단부의 잎을 채취하여 바이러스 검정에 사용하였다. Total RNA를 추출하기 위해 조직파쇄기(TissueLyser II, Takara, Japan)를 이용해 샘플을 마쇄하였으며 \( 6 \mathrm{M} \) Guanidine \( \mathrm{HCL} 1 \mathrm{ml} \) 첨가하였다. 실온에서 5 분간 반응 후 \( 13,000 \mathrm{rpm} \), \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 10 \mathrm{~min} \) 간 원심분리하여 상등액을 취하였으며 자동핵산추출기(NucliENS EasyMAG, bioMérieux, Netherlands)를 사용하여 제조사의 추출 방법에 따라 수행하였다. 추출된 Total RNA 는 One-step \( \mathrm{P} \cdot \mathrm{CHECK}^{\mathrm{TM}} \) Virus/Viroid kit Detection kit (Nexbio, Korea)를 사용하여 cDNA합성 후 PCR을 수행하였다. RT-PCR 대조구로 Dehydrogenase subunit 5 (Nad5)유전자 증폭이 사용되었으며, PCR 증폭은 2X RT-PCR Mix \( 15 \mu \), Oligo mix \( 10 \mu \), Total RNA \( 1 \mu \mathrm{g} \) 를 혼합하였다. \( \mathrm{ASGV} \) 를 검출하기 위한 primer 조합은 Table 1와 같다. 증폭반응은 cDNA 합성을 위해 \( 50^{\circ} \mathrm{C} 30 \) 분, \( 95^{\circ} \mathrm{C} 1 \) 분 과정을 1 회 반응시켰으며 \( \mathrm{PCR} \) 반응을 위해 \( 95^{\circ} \mathrm{C} 30 \) 초, \( 58^{\circ} \mathrm{C} 30 \) 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} 5 \) 분을 35 회 반복하였다.</p>