세포 독성을 측정하기 위해 Carmichael 등의 방법을 따랐다. B16F10 멜라노마 세포를 96 well plate에 특정 밀도로 분주하고, 농도에 맞춰 시료를 첨가해 \(37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \)에서 24시간 배양하였다. 이후 MTT 용액을 첨가하여 4시간 동안 추가로 배양하였고, 배양액을 제거한 후 DMSO와 EtOH의 혼합물을 첨가하여 실온에서 30분 반응시켰다. ELISA reader를 사용해 \(550 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였고, 이를 통해 시료의 세포 독성을 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 표현하였다.
<h2>MTT assay에 의한 세포 독성 측정</h2> <p>세포 독성 측정은 Carmichael 등의 방법에 따라 측정하였다. Melanoma (B16F10)을 96 well plate에 \( 0.6 \sim 0.8 \times 10 ^ { 3 } \)cells/well이 되게 \( 0.18 \mathrm { ml } \) 분주하고, 시료를 농도 별로 조제하여 \( 0.02 \mathrm { ml } \) 첨가한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 24시간배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 \( 5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 농도로 제조한 MTT 용액 \( 0.02 \mathrm { ml } \)를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO:EtOH(1: 1) \( 0.15 \mathrm { ml } \)를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 \( 550 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 측정은 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <p>세포 독성 \( ( \%)= \left (1- \frac {\text { 시료첨가군의 흡광도 } } {\text { 무첨가군의 흡광도 } } \right ) \times 100 \)</p> <h2>Western blot을 통한 미백 관련 단백질의 발현 측정</h2> <p>Raw 264.7 세포를 \( 60 \mathrm { ~mm } \) tissue culture dish에 \( 2 \times 10 ^ { 4 } \)cells/well에 되도록 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 섬쑥부쟁이 EtOAc층 분획물을 농도별로 처리한배지로 교환하고 24 시간 배양한 후 PBS로 세척하였다. Lysisbuffer \( 100 \mathrm { ul } \)를 첨가하여 세포를 용해시키고 원심분리하여 \( \left (12,000 \mathrm { rpm } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 20 \mathrm { ~min } \right ) \) 세포막 성분들을 제거하였다. 원심분리하여 얻은 단백질은 brad ford assay로 정량하였으며, 60 \( \mathrm { ul } \)의 단백질을 \( 10 \% \)의 SDS-PAGE를 이용하여 전기 영동한 후, 항체의 비특이적 결합을 억제시키기 위해 PVDF membrane에 옮긴 다음 30~40 \( \mathrm { V } \)에서 2시간 이상 transfer하였다. Transfer가 끝나면 ponceau에 담근 후 band를 확인하고 TBST로 2회 이상 씻은 후 꺼내서 5 \( \% \) skim milk로 overnight시켜 background는 제거시켰다. 3회 washing 후 1차 antibody (1: 1,000)를 1 시간 동안 붙인 후 다시 2차 antibody (1: 1,000) 를 붙이고 ECL kit (Amersham Pharmacia, England)를 이용하여 film에 옮겨 측정하였다. Band density는 Gel doc (Bid-rad, America)으로 확인하였다.</p>