Helicobacter pylori urease는 metalloenzyme으로써 요소를 가수 분해하여 암모니아를 생성하여 국지적인 pH의 상승을 초래하고, 위 내에서의 H. pylori 생존을 가능케 하는 생존인자로 역할한다. 실험을 위해 재조합 플라스미드와 두 가지의 E.coli 균주를 이용하여, E. coli BL21 은 ampicillin 함유 LB 배지에, E. coli SE5000 는 ampicillin과 chloramphenicol, \( \mathrm { NiCl } _ { 2 } \)를 함유하는 LB 배지에 각각 접종하여 진탕 배양하였다.
<h1>서 론</h1> <p>인간의 위염, 위궤양 및 위암의 원인 균인 Helicobacter pylori는 그람 음성 미세 호기성 나선균으로서 이 세균의 가장 큰 특징은 균체 표면에 전체 세포 단백신의 \( 6 \% \)를 차지하는 고 활성의 urease효소를 갖고 있다는 점이다. Urease는 다수의 미생물과 식물에서 발견되고 있으며 이 중 특히 세균의 urease는 인체와 동물의 질병원인, 반추 동물의 질소대사 및 영양, 농경지를 포함한 자연에서의 질소화합물의 환경적 변환에 중요한 역할을 담당하고 있다. H. pylori urease는 그 천연 분자량이 약 \( 550 \mathrm { ~kDa } \)이고 니켈을 활성부위에 함유하는 metalloenzyme으로서 기질인 요소(urea)를 가수 분해하여 암모니아를 생성함으로써 국지적인 \( \mathrm { pH } \)의 상승을 초래, 강산성인 위 내에서의 H. pylori 의 생존을 가능케 하는 생존인자이자, 중요한 병원성 인자로 작용한다. H. pylori urease는 또한 대부분의 세균 urease가 3개의 subunit로 이루어진 것과는 대조적으로 2개의 subunit, 즉 \( \alpha \) ( \( 66 \mathrm { ~kDa } \), UreB)와 \( \beta \) ( \( 30 \mathrm { ~kDa } \), UreA) subunit로 구성된 heterohexamer \( ( \alpha \beta)_ { 6 } \)로서 존재하며 최근에는 그 3차 구조가 Klebsiella aerogenes 효소에 이어X-선 결정분석에 의하여 밝혀진 바 있다. H. pylori세균은 그 배양조건이 까다로운 관계로 urease 관련 유전자군을 대장균에 도입한 재조합 균주를 이용하여 활성 효소를 다량 발현하여 연구 재료로서 이용하여 왔다. H. pylori urease는 이온 교환, gel-filtration 및 hydrophobic interaction 등의 성질을 이용한 3~4 단계의 크로마토그라피를 거쳐 정제하여 왔는데 본 연구에서는 재조합 대장균에서 대량 발현하여 정제한 H. pylori urease를 이용하여 토끼에 투여하여 제조한 항체 또는 기질인 urea를 coupling 시켜서 제조한 affinity column을 이용하여 최소 한도의 크로마토그라피 과정을 통하여 효소를 고도 정제하는 방법을 모색하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 배양</h2> <p>Helicobacter pylori urease gene cluster 전체(ureA-ureH)를 포함하는 재조합 플라스미드인 pHU1013를 E. coli BL21(DE3) 균주에 transform 시켜서 얻은 E. coli BL21(pHU1013) 또는 double transformant인 E. coli SE5000(pHP808/pHP902)을 각각 재조합 Helicobacter pylori urease의 발현에 사용하였다. E. coli BL21(pHU1013) 균주는 \( 100 ~ \mu / \mathrm { mL } \) ampicillin과 \( 1 \mathrm { ~mM } \) \( \mathrm { NiCl } _ { 2 } \)를 함유하는 LB 배지, E. coli SE5000 (pHP808/pHP902)의 경우는 \( 100 ~ \mu \mathrm { g } \) \( / \mathrm { mL } \) ampicillin, \( 50 ~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) chloramphenicol 및 \( 1 \mathrm { ~mM } \) \( \mathrm { NiCl } _ { 2 } \)를 함유하는 LB 배지에 각각 접종하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 지수 증식기 후반까지 진탕 배양하였다.</p>