정확한 hemolytic 활성측정을 위하여 Honda 등의 방법을 이용하여 정량하였고, 정제된 단백질의 정제도와 분자량을 측정하기 위해 Laemmli의 방법으로 SDS-PAGE를 실시하였다. VFH 의 hemolytic 활성에 대한 온도의 영향을 조사하기 위해, \( 20^{\circ} \mathrm{C} \sim 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5~60분간 반응을 시켜 온도에 대한 활성을 측정하였다.
<h2>Hemolytic activity 측정</h2> <p>정확한 hemolytic 활성측정은 Honda 등의 방법을 이용하여 정량하였다. 평판에서 활성이 확인된 분획을 모아 \(\mathrm{10~mM}\) Tris buffered saline (TBS: \( \mathrm{pH}~7.5 \))로 세척한 토끼 적혈구세포를 \( 4 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 농도로 맞추어 hemolysin과 \(37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응시킨 후 \( 1000 \times \mathrm{g} \)에서 5분간 원심분리하여, 적혈구의 파쇄 시 발생하는 hemoglobin의 양을 spectrophotometer를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. \( 0.1 \% \) Triton X-100 처리시에 적혈구로부터 방출되어 나오는 hemoglobin의 양을 \( 100 \% \) 파쇄로 정의하고, \( 50 \% \)의 hemoglobin이 방출시의 흡광도를 \(1\mathrm{HU}\)(hemolytic unit)로 정의하였다.</p> <h2>SDS-PAGE의 측정</h2> <p>정제된 단백질의 정제도와 분자량을 측정하기 위해 Laemmli의 방법으로 SDS-PAGE를 실시하였다. Standard protein marker는 Amersham Biotech사로부터 구입하여 사용하였으며, \( 12 \% \)의 separating gel을 사용하여 \(\mathrm{120~voltage}\)에서 약 2시간 동안 전기영동을 실시한 후 Comassie brilliant R-250으로 염색 후 탈색하여, 전기영동된 단백질 band를 확인하였다.</p> <h2>온도에 대한 영향</h2> <p>VFH의 hemolytic 활성에 대한 온도의 영향을 조사하기 위해, 여러 온도에서의 활성을 측정하였다. TBS 완충액에 \( 4 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)가 되게 토끼 적혈구세포를 조제하고 조제된 적혈구 현탁액과 \( 2 \mathrm{HU} \)의 VFH 용액을 각각 \( 0.2 \mathrm{ml} \)씩 혼합하여 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \sim 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5~60분간 반응을 시켰다. 그 후 위에 기술한 방텁과 동일한 방법으로 파쇄된 적혈구로부터 방출되어 나온 hemoglobin의 양을 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다.</p> <h2>VFHdml 세포독성 측정</h2> <p>Hemolysin이 어류유래세포에 미치는 영향을 조사하기 위하여, rainbow trout gonadal fibroblast cello인 RTG-2 세포주(Oncorhynchus mykiss: CCL-55 ATCC)를 \(10\%\) fetal bovine serum, \( 1 \% \) penicillin-streptomycin, \( 0.2 \% \) fungizone, \( 0.035 \% \) sodium biscarbonate/L가 함유된 Eagle's MEM 배지에서 전배양하였다. \( 300 \mu \mathrm{l}\left(3 \times 10^{5}\right. \)cell\()\)의 세포를 48 well multiplate에 다시 배양한 후 정제된 VFH를 최종농도가 \( 10 \sim 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)되게 첨가하여 9시간 동안 반응시키고, 이후 파쇄된 세포로부터 나오는 LDH의 양을 Vitros DT II chemistry system (Johnson \& Johnson)을 이용하여 측정하였다. 대조구로 Triton X-100을 사용하여 RTG-2 세포가 모두 파쇄시킨후 LDH의 양과 비교 측정하였다. 또한 \(50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 VFH 를 RTG-2 세포주에 혼합하여 4시간 후에 세포의 형태 변화를 도립현미경(Olympus IX70)으로 100배 배율에서 관찰하였다.</p>