실험동물은 자동 유지되는 온도, 습도, 소음, 조명의 사육실에서 무균음료와 멸균사료를 자유롭게 섭취하였고, 훈련군은 1주의 수영 적응훈련 후 9주 동안 일주일에 5일, 하루에 60분씩 수영훈련을 받았다. 체중은 CAS 사의 Computing scale 체중계로 측정하였고, 체중 측정 1시간 전에 음식과 음료 섭취를 제한하여 식이섭취에 의한 체중 변화를 막았다. 또한, Becton Dickinson의 유세포 분석기를 이용하여 샘플의 대식세포 활성화를 측정하였고, win MDI software ver. 2.8을 이용하여 분석하였다.
<h2>사육, 훈련 및 투여방법</h2> <p>실험동물의 사육실 내부는 온도 \( 22 \pm 2 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 습도 \( 50 \pm 5 \% \), 소 음( \( 40 \sim 50 \mathrm { Phon } \) 이하) 및 조명(12시간 명/암)이 자동적으로 유지되도록 하였으며, 무균음료 및 멸균사료를 자유롭게 섭취시켰다. 훈련군으로 분류된 모든 실험동물은 1 주간의 수영 적응훈련기간을 가진 후 적응여부를 가려, 9주간 주당 5일씩 60분간 수영훈련을 실시하였다. 사용된 풀은 \( 70 \times 70 \times 60 \mathrm { ~cm } \) 규격을 사용하였으며, 수온은 실험동물이 수영을 하기에 적당한 \( 25 \sim 27 ^ {\circ } \mathrm { C } \)를 유지하였다. 투여군으로 분류된 그룹은 Sigma chemical 사 (미국)의 L-arginine을 무균 음료에 \( 2 \% \) 농도로 용해하여 ad-libitum 방법으로 투여하였다.</p> <h2>체중, 심박수 및 혈압의 측정</h2> <p>체중은 일정한 시간에 CAS 사 (한국)의 Computing scale 체중계를 이용하여 측정하였으며, 식이섭취에 의한 체중 변화를 막기 위해 체중 측정 1 시간 전에 사료와 음료의 섭취를 제한하였다.</p> <p>심박수 및 혈압의 측정은 Muromachi kikai 사 (일본)의 BP Monitor MK-1100을 사용하였다. 체중에 맞는 크기의 코팅 플라스틱 홀더(animal holder)를 선택하여, 몸체를 씌우고 움직임이 없도록 고정시켰으며, 고정된 실험동물은 \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 유지되는 플라스틱 체임버에서 최대한 안정을 취할 수 있게 한 후, 측정기에 홀더를 고정시킨 다음, 꼬리에 커프를 연결시켜 측정을 하였다. 측정은 총 6회로 하였으며, 최고치와 최저치를 소거한 후, 4개 결과의 평균치를 자동 계산하였다.</p> <h2>혈액 및 조직채취</h2> <p>본 실험의 부검은 수영훈련으로 인한 일시적으로 운동 효과를 배제하기 위해, 훈련군의 경우 훈련종료 48시간 경과 후에 실시하였고, 사료는 부검 12시간 전에 공급을 중단하였지만, 음수는 계속 제공하였다. 실험동물들은 동물 수술실 도착 후, 충분한 안정을 취한 뒤 마취제 에틸에테르를 이용하여 마취시킨 후, 복부를 절개하여 대동맥에서 채혈하였다. 채혈 후 간 조직 \( 0.5 \mathrm { ~g } \)을 채취하였고, 훈련군 역시 안정을 취한 뒤 같은 방법으로 채취하였다.</p> <h2>분석방법</h2> <p>우선 eNOS는 R&D 사 (미국)의 eNOS Quantikine Immunoassay kit를 사용하여, Hewlette Packard 사 (미국)의 Elisa를 이용한 UV 법으로 분석하였다. 간세포를 slide glass를 이용하여 균질화시킨 다음, \( 300 \times \mathrm { g } \) 의 속도로 5분간 원심분리 후, lysis buffer (세포 \( 1 \times 10 ^ { 6 } / \mathrm { ml } \) 당 \( 1 \mathrm { ml } \) 의 buffer 용액)에 넣고, \( 2 \sim 8 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1시간 동안 방치하였다. Microcoatingplate strips에 100 \( \mu \mathrm { l } \)의 희석 시약, 표준시약과 모든 검체를 분주하고, 세척한 다음, 각 well에 \( 200 \mu \mathrm { l } \)의 conjugate를 넣고, 다시 세척한 후, 각 well에 \( 200 \mu \mathrm { l } \) 의 substrate solution을 넣고, 실온에서 빛이 차단된 채로 30분간 배양시켰다. 배양 후 \( 50 \mu \mathrm { l } \)의 stop solution을 넣은 다음, 흡광도 \( 450 \mathrm { ~nm } \) 에서 분석하였다. 대식세포 분석은 Pharmingen 사 (미국)의 R-PE anti-rat Macrophage Subset monoclonal antibody를 사용하였다. 이 항체는 affinity chro-matography에 의해 조직의 상층(supernatant)으로부터 분리하여 정제한 것으로 최적의 상태조건에서 R-PE와 결합되어 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 보관하여 사용하였다. 분리한 혈액을 헤파린 처리된 용기에 보관한 후, Lysis buffer \( 2 \mathrm { ml } \) 을 넣어 5 분간 반응시킨 다음, 원심분리 하였다 \( \left (1500 \mathrm { RPM } , 10 \mathrm { ~min } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \). 원심 분리 후 pellet을 RPMI 1640으로 2번 washing 한 다음 림프구 \( 100 \mu \mathrm { l } \)와 \( \mathrm { m } \mathrm { Ab } 10 \mu \mathrm { l } \)를 혼합하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 항온 항습기에서 20분간 배양 하였다. 반응시킨 샘플에서 대식세포의 활성화를 보기 위해 Becton dickinson 사 (미국)의 유세포 분석기(FACscan)를 이용하여 측정하였고, 측정한 값의 정확한 분석을 위하여 Window Multiple Document Interface for Flow Cytometery (win MDI) software ver. 2.8을 이용하였으며, mean fluo-rescence index 값을 이용하였다.</p>