본 실험에서는 소태아혈청(FBS), Cleaved caspase-3, cIAP-2, Bcl-2, \(\beta\)-actin 항체, 그리고 마우스 배아줄기세포(ES-E14TG2a) 등을 사용하였다. 이들을 혼합하여 \(37^{\circ}C\)의 \(5\% \mathrm{~CO}_{2}\) 인큐베이터에서 배양하였다. PBS로 세포를 세척한 후, 공초점 레이저 현미경을 이용하여 세포를 관찰하였다. 마지막으로 합성된 cDNA는 제시된 프라이머를 이용해 증폭시키고, 이를 \(1\%\) 아가로스겔을 사용하여 전기영동으로 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약</h2> <p>본 실험에 사용된 시약 중, 소태아혈청(Fetal bovine serum, FBS)은 GIBCO-BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였으며, Cleaved caspase-3, cIAP-2, Bcl-2, \( \beta \)-actin에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Paso Robles, CA)에서 구입하였다. 이외의 모든 시약은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)의 제품을 구입하여 사용하였고, 그 외 사용된 시약은 순도가 높은(순도 \( 99 \% \) 이상) 등급을 구입하여 사용하였다.</p> <h2>배아줄기세포 배양</h2> <p>마우스 배아줄기세포(ES-E14TG2a)는 American Type Culture Collection (Manassas, VA)에서 구입하였으며, 고포도당 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지에 \( 15\% \) FBS, \( 1.7 \mathrm{mM} \) L-glutamine, \( 0.1 \mathrm{mM} \) \( \beta \)-mercaptoethanol, 5 \( \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \mathrm{~LIF}, 100 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) penicilline, \( 100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) streptomycin를 혼합한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 \( 5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) incubator에서 배양하였다. 실험에 앞서 FBS가 들어 있지 않은 배지로 교환하여 24시간 동안 배양하였다. 저산소 상태 환경을 만들어 주기위해, 공기의 밀봉이 용이하고 빠른 gas 교환기능을 가진 저산소 챔버(MIC-101, Billups-Rotheberg, Del Mar, CA)를 이용하였고 이곳에 마우스 배아줄기세포를 넣고, 저산소 상태 가스 \( \left(2.2 \% \mathrm{O}_{2}, 5.5 \%\right. \) \( \mathrm{CO}_{2}, 92.3 \% \mathrm{~N}_{2} \) )를 \( 20 \mathrm{l} / \mathrm{min} \)으로 30분 동안 흘려 준 후, 챔버를 밀봉하여 비유동적 저산소환경(non-fluctuating hypoxic environment)을 만든 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)의 세포 배양기에 넣어 지정된 시간동안 배양하였다.</p> <h2>Alkaline phosphatase 염색</h2> <p>배아줄기세포를 Phosphate buffered saline (PBS)로 두 번 세척한 후 \( 4 \% \) formaldehyde로 15분간 상온에서 고정한다. 고정 후 PBS로 다시 두 번 세척한 후, alkaline phosphatase 혼합용액 \( (200 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) naphthol AS-MX phosphate, \( 2 \% \mathrm{~N}, \mathrm{~N} \)-dime-thylformamide, \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris, \( \mathrm{pH} \) 8.2, \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) Fast Red TR salt)을 상온에서 10-15분간 처리하였다. PBS로 세척 한 후 공초점 레이저 현미경(Olympus FluoView 300 confocal micro-scope, Tokyo, Japan)을 이용해 400배 배율로 세포를 관찰하였다.</p> <h2>RNA 추출 및 Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) 분석</h2> <p>Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 Maxime RT PreMix Kit (iNtRON Biotechnology, Sungnam, Kyungki, Korea)을 사용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA를 Table 1에 제시한 프라이머를 이용하여 증폭시켰으며, 증폭된 RT-PCR 산물은 \( 1 \% \) 아가로스겔을 사용하여 전기영동으로 확인하였다.</p>