여뀌 추출물의 향균 활성 측정을 통한 피부 보습 효능 평가를 위해 여드름의 원인균인 Propionibacterium acnes ATCC6919와 비듬균인 Pityrosporum ovale ATCC12078, 호기성 Gram(+) 균주인 Staphylococcus aureus ATCC6538을 배양하여 사용했다. 이때 최소억제농도는 한천배지 확산법을 이용하였다. 여뀌 추출물 함유 크림의 보습 효능 평가를 위해 ethyl acetate 분획 0.25 \%0.25%를 함유하는 크림을 만들어 향온 향습조건에서 수분보유량과 경표피 수분 손실량을 측정하여 평가를 실시하였고, 모든 실험은 3회 반복하고 통계분석은 5% 유의수준에서 Student's t-test를 행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>기기 및 시약</h2> <p>피부 보습 효능 평가를 위해 CK electronic(Germany)사 제품의 Corneometer CM820, Tewameter TM210, Mexa-meter MX16를 사용하였다. 에탄올(\(\mathrm{EtOH} \)), 메탄올(\(\mathrm{MeOH}\)), ethyl acetate(\(\mathrm{EtOAc} \)) 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. 플라보노이드 비교물질로 사용한 quercetin은 Sigma(USA)사에서 구입하였다. 실험 재료인 여뀌는 강원도 홍천군에서 채취한 것을 2008년 6월경 경동시장에서 구입하여 사용하였다.</p> <h2>여뀌의 플라보노이드 분획 추출</h2> <p>건조된 여뀌 \( 200 \mathrm{~g} \)을 잘게 자른 후 \( 50 \% \) 에탄올 \( 2 \mathrm{~L} \)를 이용하여 일주일 동안 침적시킨 후 여과하였다. 이 여액을 감압 건조하여 파우더를 얻고 이를 실험에 사용하였다. 또한 \( 50 \% \) 에탄올 추출물은 감압 농축한 후 물과 hexane을 이용하여 비극성 성분을 제거하고 이후 ethyl acetate 분획을 감압농축하여 파우더를 얻었다.</p> <h3>Ethyl acetate 분획으로부터 aglycone 제조</h3> <p>ethyl acetate 분획에서 얻은 파우더 일부는 산 가수분해 반응을 이용해서 당을 제거시킨 후 얻은 aglycone 파우더를 실험에 사용하였다. 실험 방법은 ethyl acetate 가용분 일정량에 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 및 acetone 용액을 넣고, \( 4 \mathrm{~h} \) 동안 중탕 가열하면서 환류냉각시킨다. 환류시킨 용액을 \( 5 \% \mathrm{~KOH}-\mathrm{MeOH} \) 용액으로 중화 적정한다. 중화 적정 후 다시 ethyl acetate 층을 분흭하고 이를 감압농축하여 실험에 사용하였다.</p> <h2>여뀌 추출물의 항균 활성 측정</h2> <h3>사용균주</h3> <p>본 실험에 사용된 균주는 여드름의 원인균인 Propionibacterium acnes(P. acnes) ATCC6919와 비듬균인 Pityrosporum ovale(P. ovale) ATCC12078, 호기성 Gram(+) 균주인 Staphylococcus aureus(S. aureus) ATCC6538는 한국 미생물 보존센터에서 분양 받아 사용하였다.<h3>배지 및 배양조건</h3>P. acnes의 배양 배지는 Reinforced clostridial(RC) 배지(Merck, Germany)를 사용하였으며 P. acnes는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하면서 실험 \( 72 \mathrm{~h} \) 전에 활성화시켰으며, 균을 배양 배지에 접종한 후 anaerobic jar에서 Gaspack system(Merck Anaerocult Gaspack system, Germany)을 이용하여 밀봉하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 72 \mathrm{~h} \) 동안 혐기성 배양하였다. 호기성 균주인 S. aureus는 Mueller-Hinton 배지(Merck, Germany)를 사용하였으며 균을 접종한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 \( 24 \mathrm{~h} \) 배양하면서 사용하였다. 또한 비듬균인 P. ovale는 Pityrosporum 배지(Malt extract agar \(6 \%\), ox-bile \(2 \%\), tween \( 401 \% \), glycerol mono-oleate \( 0.25 \%) \) 를 사용하였으며 균을 접종한 뒤 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 24 \mathrm{~h} \) 동안 배양하여 사용하였다.</p> <h3>최소억제농도(Minimum Inhibitory Concentration: MIC)</h3> <p>최소억제농도(MIC)는 한천배지 확산법을 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 즉, 각각의 분획물들을 \( 2 \mathrm{~mL} \)씩 함유한 배지 \( 20 \mathrm{~mL} \)를 petri dish에 주입하였고, 시험균을 평판 배지 위에 \( 0.1 \mathrm{~mL} \) 접종하였다. P. acnes는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 72 \mathrm{~h} \)후에, S. aureus는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 24 \mathrm{~h} \) 후에, P. ovale는 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 48 \mathrm{~h} \) 후에 육안으로 관찰하였을 때, 각각의 균들이 증식되지 않는 농도를 MIC로 결정하였다.</p> <h2>여뀌 추출물 함유 크림의 피부 도포에 의한 보습 효능</h2> <p>여뀌 추출물을 함유한 크림의 보습 효능 평가를 위해 추출물 중 ethyl acetate 분획 \( 0.25 \% \)를 함유하는 크림을 제조하고, 이를 20대의 피시험자 10명을 선정하여 항온 항습조건(온도: \( 25 \pm 2^{\circ} \mathrm{C} \), 상대습도: \( \left.43 \pm 2 \%\right) \)에서 평가를 실시하였다. 추출물 함유 크림을 팔 안쪽에 도포한 후, 수분보 유량과 경표피 수분 손실량을 각각 \( 30 \mathrm{~min}, 60 \mathrm{~min} \) 간격으로 \( 180 \mathrm{~min} \) 동안 측정하였다. 수분보유량과 경표피 수분 손실량의 측정은 Corneometer CM820, Tewameter TM210를 사용하였다. 측정된 capacitance value는 0~120 사이의 arbitrary capacitance units(A.U.)으로 전환하였으며, 경표피수분 손실량은 \( \mathrm{g} / \mathrm{h} \cdot \mathrm{m}^{2} \)로 표기하였다. 평가를 실시하기 전에 피시험자들에게 주의 사항을 숙지시켰으며, 시험 동의서를 받았다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 실험은 3회 반복하였고 통계분석은 \( 5 \% \) 유의수준에서 Student's t-test를 행하였다.</p>