호접란 형질전환체의 선발을 위해 GUS 염색 결과를 바탕으로 개체를 선발하고 해당 식물체로부터 genomic DNA를 추출했다. 이 DNA는 1% agarosegel에서 전기영동하여 관찰했다. 호접란의 PLB 증식에 영향을 미치는 sucrose의 적정 농도를 찾기 위해 실험을 실시한 결과, sucrose가 20g/l과 30g/l 첨가된 처리구가 10g/l 첨가된 처리구보다 PLB 증식율이 높았다. 또한, 호접란 배양시 티아민 처리는 PLB 유도 및 증식에 효과적이었고, 이는 배양기간이 경과함에 따라 PLB 단편으로부터 분비되는 페놀성 화합물의 양이 증가하지만, 활성탄소가 이를 제거하여 PLB 증식에 도움을 주는 것으로 판단된다.
<h2>형질전환체의 선발</h2> <p>호접란 형질전환체의 선발을 위해 GUS 염색을 나타내는 개체를 우선적으로 선발한 뒤 그 대상 식물체로부터 genomic DNA를 추출하였다. Primer는 \( 1.2 mathrm { ~kb } \) 크기의 GUS 유전자를 증폭하기 위하여 5'-GGTGGGAAAGCGCGTTACAA G-3'와 5'-GTTTACGCGTTGCTTCCGCCA-3'를 이용하였다. \( \mathrm { PCR } \) 조건은 Pre- denaturation은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분, denaturation은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초, annealing은 \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초, extention은 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분 30초로 30 cycle을 하였으며 last extention은 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분간 반응하였다. 증폭된 \( \mathrm { DNA } \)는 \( 1 \% \) agarosegel에서 전기영동하여 band 유무를 관찰하였다. 형질전환 식물체의 Southern blot 분석을 하기 위하여 \( 10 \mathrm { ug } \)의 genomic \( \mathrm { DNA } \)를 EcoRI으로 절단하여 \( 0.8 \% \) agarose gel에서 전기영동한 뒤 capillary transfer법을 이용하여 nylon membrane으로 전이시켰다. Membrane은 \( \left [ \alpha- { } ^ { 32 } \mathrm { P } \right ] \mathrm { dCTP } \)로 표지된 GUS-specific DNA를 probe로 하여 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 동안 hybridization되었다. 이후 membrane을 세척한 뒤 X-ray film에 노출시켜 밴드를 확인하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>활성탄소, thiamine 및 sucrose의 첨가가 호접란 PLB 증식에 미치는 영향</h2> <p>호접란 PLB 증식배지에 활성탄소를 첨가하여 PLB 증식에 미치는 영향을 조사한 결과, 활성탄소가 \( 1 \mathrm { ~g } / 1 \) 첨가된 배지에서 배양한 PLB의 경우 활성탄소가 \( 0.5 \mathrm { ~g } / 1 \) 첨가된 배지에 비해 초기 생육 단계에서는 큰 차이가 없었으나 시간이 경과할수록 PLB의 증식에 차이를 보였다. 이는 배양기간이 경과함에 따라 PLB의 단편으로부터 분비되는 페놀성 화합물의 양이 많아지지만 활성탄소가 이를 제거하므로서 PLB 증식에 좋은 영향을 미치는 것으로 생각된다. 호접란의 PLB 증식에 미치는 sucrose의 적정 농도를 규명하기 위해 실험을 실시한 결과, sucrose가 \( 10 \mathrm { ~g } / \mathrm { l } \) 첨가된 처리구가 sucrose \( 20 \mathrm { ~g } / 1 \) 과 \( 30 \mathrm { ~g } / 1 \) 처리구에 비하여 PLB 증식율이 매우 낮았으며 sucrose \( 20 \mathrm { ~g } / 1 \) 과 \( 30 \mathrm { ~g } / 1 \) 처리구 간에는 유의적인 차이가 인정되지 않았다. Nhut 등은 백합을 대상으로 활성탄소와 sucrose가 형질전환체의 재분화에 좋은 영향을 미친다고 보고하였고, 본 연구에서도 비슷한 결과를 나타냈다. 호접란 배양시 티아민의 처리가 PLB 증식에 미치는 영향에 대해 조사한 결과, 티아민 처리가 무처리에 비해 배양 후 3일을 전후하여 PLB 유도 및 증식에 효과적이 것으로 나타났다. 이러한 결과로 보아 초기 PLB 유도에 티아민이 중요한 역할을 하는 것으로 생각되며, Cortina 등은 토마토 형질전환 시 thiamine 처리가 형질전환체 재분화에 큰 영향을 미친다고 보고하였고, 호접란 PLB 증식 시에도 thiamine이 같은 영향을 미치는 것으로 나타났다.</p>