온주밀감인 홍진조생과 길전네블오렌지의 미성숙 배주조직을 배양하고 캘러스를 사용하여 원형질체를 분리하였다. 기본적인 원형질체 배양방법으론 액체배양법이 주로 사용되나 plating efficiency에 미치는 영향을 살펴보기 위해 다양한 배양법을 비교해 보았다. EME 배지, 1500 EME, MT \(+ \) gal/sor/\(\mathrm{GA}_{3} \)을 이용하여 자엽형의 배를 유기시키기에 적당한 배지를 선발하고자 하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>원형질체 분리 및 배양</h2><p>우리나라의 대표적인 온주밀감인 홍진조생 (Citrus unshiuMarc.)과 길전네블오렌지 (C. simensis Osbeck)의 어린 미성숙 배주조직을 배양하여 주심조직으로부터 유기시킨 캘러스를 사용하여 원형질체를 분리하였다. 캘러스는 \( 5 \% \) sucrose와 \( 500 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) malt extract가 첨가된 Murashige \(\&\) Tucker 배지(1969)에서 \( 2 \sim 3 \)주 간격으로 계대배양을 하여 식물체 재분화능을 유지시켰다. 캘러스원형질체의 분리과정은 Grosser et al. (1990)의 방법을 약간 변형한 방법으로 이루어졌다. 캘러스를 조직배양시 사용하는 칼로 잘게 자른후 효소용액 (\( 1 \% \) cellulase RS \( +0.5 \% \) macerozyme R 10 \(+0.5 \% \) driselase \( +24.5 \mathrm{mM}\ \mathrm{CaCl}_{2}+6.15 \mathrm{mM} \) MES \( +0.92 \mathrm{mM}\ \mathrm{N_{2 }} \mathrm{CH}_{2} \mathrm{PO}_{4}+0.7 \mathrm{M} \)mannitol)과 \( 0.7 \mathrm{M} \mathrm{BH}_{3} \) 배지를 \(1:3\)의 비율로 혼합한 용액에 배양 \( (29^{\circ} \mathrm{C}\), \(50 \mathrm{~rpm}) \)하였다. \( 12 \sim 16 \)시간 배양후 나일론 체\( (45 \mu \mathrm{m}) \)를 사용하여 배양액을 여과하고, 모아진 용액은 원심분리 \( (100 \times \mathrm{g}, 10 \) 분)하여 상징액을 제거하였다. 남아있는 pellet에 \( 25 \% \) sucrose가 첨가된 CPW 배지를 \( 5 \mathrm{~mL} \) 첨가하여 pellet과 잘 섞이게 피펫팅하고, 그 위에다 \( 13 \% \) mannitol이 첨가된 CPW 배지를 층이 생기도록 \( 2 \mathrm{~mL} \) 첨가하였다. 준비된 이 용액을 다시 원심분리 \( (100 \times \mathrm{g}\), 10분)하면 농도구배에 의해 \( 25 \% \) sucrose 용액과 \( 13 \% \) mannitol 용액사이에 원형질체들만이 모인 층이 생기게 된다. 원형질체 층을 조심스럽게 분리하여 새로운 원심분리용 튜브에 옮기고 \( 10 \mathrm{~mL} \)의 새로운 배지를 첨가한 후 원심분리하는 방법으로 원형질체를 정제하였다. Hemocytomcter를 이용하여 정제된 원형질체를 \( 5 \times 10^{5} \) \(\mathrm{cells}/\mathrm{mL}\)로 원형질체 수를 조절하고, \( 0.6 \mathrm { M}\ \mathrm{BH}_{3} \) 배지 (Grosser and Gmitter 1990)를 첨가하였다.</p><h2>미소괴 형성에 효과적인 배양방법</h2><p>원형질체를 배양하는 기본 배양방법으로는 주로 액체배양법이 사용되고 있으나 원형질체 배양방법이 세포분열율과 plating efficiency에 미치는 영향을 살펴보기 위해 고체배양, 액체배양, solid over solid 배양, liquid over solid 배양법을 비교해 보았다. 액체배양법은 분리한 원형질체의 농도들\( 5 \times 10^{5} \mathrm{cells} / \mathrm{mL} \)로 조절한 후 \( 0.6 \mathrm{M}\ \mathrm{BH}_{3} \) 액체배지에 현탁하여 페트리디쉬 \( (60 \times 15 \mathrm{~mm}) \)에 배양하였다. 고체배양은 \( 0.6 \mathrm{M}\ \mathrm{BH}_{3} \) 배지에 \( 0.2 \% \) agarose를 첨가한 후 agarose가 적당히 식었을때 농도를 조절해 놓은 원형질체를 배지에 섞어 페트리디쉬에 분주하여 배양하였고, liquid over solid 배양법은 \( 0.1 \% \) gelrite를 첨가한 \( 0.6 \mathrm{M}\ \mathrm{BH}_{3} \) 고체배지위에 원형질체 현탁액을 spread하여 배양하였다. Solid over solid 배양법은 \( 0.1 \% \) gelritc \( 0.6 \mathrm{M}\ \mathrm{BH}_{3} \) 고체배지위에 \( 0.2 \% \) agarose에 원형질체를 섞은 것을 spread하여 배양하였다.</p><h2>배유기 배지</h2><p>유기된 미소괴로부터 배형성과정을 거쳐 자엽형의 배를 유기시키기에 적당한 배지를 선발하고자 ① EME 배지 : MT macro, MT micro, MT vitamin, \( 0.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) malt extract, \( 0.146 \mathrm{M}\) sucrose, ② 1500 EME : MT macro, MT micro, MT vitamin, \( 1.5 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) malt extract, \( 0.146 \mathrm{M} \) sucrose 와 ③ MT \(+ \) gal/sor/\(\mathrm{GA}_{3} \) : MT basic medium, MT vitamin, \( 0.1 \mathrm{M} \) galactose, \( 0.1 \mathrm{M} \) sorbitol, \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{L}\) \(\mathrm{GA}_{3} \) 배지를 비교하였다. 각각의 배지에는 \( 0.3 \% \) gelrite가 첨가되었고, 배양후 생성된 자엽형 배의 수를 조사하였다.</p><h2>신초 재분화 배지</h2><p>생성된 자엽형 배로부터 배발아를 유도하여 신초를 재분화시킬 수 있는 적정배지 선발시험을 수행하였다. 시험에 사용된 배지조성은 ① SI-1 : MS basic medium, MS vitamin, \( 3 \% \) sucrose, ② SI-2 : MS basic medium, MS vitamin, \(3\%\) sucrose, \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{L}\) \(\mathrm{GA}_{3} \) 와 ③ SI-3\( \left(\mathrm{B}^{+}\right) \): MT macro, MT micro, MT vitamin, \( 20 \mathrm{~mL} \) coconut water, \( 14.6 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) coumarin, \( 0.02 \mathrm{mg}/ \mathrm{L} \) NAA, \(2.5 \% \) sucrose 배지이다. 각각의 배지에 자엽형 배를 배양하여 발근과 함께 정상적으로 분화된 신초의 수를 조사하였다.</p>