본 논문은 chemiluminescent substrate 용액을 이용하여 항체를 검출 하고 UVP로 분석하였으며, 단백 발현의 결과는 각 total 단백 및 \( \beta \)-actin으로 비교 정랑화하였다. 실험에 사용된 zebrafish 는 일정 환경 조건을 유지하면서 순환하는 여과 시스템의 수조에 10-15마리 정도 넣은 후 제브라피쉬용 먹이를 주면서 사육하였으며, 같은 조건에서 당섭취능 실험을 진행한 후, COE 추출물을 노출시켰고 그후 형광현미경으로 촬영하고 관찰 하였다. 사후검정은 Dunnett's test를 이용하여 각 군 간의 차이의 비교하였다.
<h2>Western blot</h2> <p>실험이 종료된 세포를 PBS 용액으로 2회 세척한 후 lysis buffer (PRO-PREP protein extraction solution, 인트론바이오테크놀로지, 서울, 한국)를 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 용해시킨다. 세포를 수거하여 \( 13,000 \mathrm{rpm}, 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 원심분리하여 상청액을 회수하여 단백질을 정량하였다. 각각의 상청액에서 단백질 \( 30 \mu \mathrm{g} \)를 취하여 SDS loading buffer ( \( 60 \mathrm{mM} \) Tris, \( 25\% \) glycerol, \( 2\% \) SDS, \( 0.5\% \) 2-mercaptoethanol, \( 0.1\% \) bromophenol blue)와 혼합 후 \( 10 \% \) SDS polyacrylamide gel에 loading하여 전기영동하고 nitrocellulose membrane에 전이시켰다. 이후에 membrane은 \( 5 \% \) 무지분유가 첨가된 TTBS (\( 10 \mathrm{mM} \) Tris, \( 100 \mathrm{mM}~NaCl, 0.1 \% \) tween 20) 용액에 넣고 상온에서 1시간 동안 blocking 시킨다. TTBS 용액으로 10분간 3회 세척한 후 일차 항체(p-IRS1, IRS1, p-AKT, AKT, GLUT4, p-AMPK, AMPK 1:1000)로 2시간 동안 반응시킨 다음에 다시 TTBS 용액으로 3회 세척하였다. 그 다음에 peroxidase가 포함된 2차항체(goat anti mouse 1:2000, goat anti rabbit 1:2000)로 1시간 동안 반응시켰고 항체의 검출은 chemiluminescent substrate 용액을 이용하여 가시화하고 UVP (Image acquisition and analysis software, Visionwork \( { }^{TM} \) LS)로 분석하였다. 단백 발현의 결과는 각각의 total 단백 및 \( \beta \)-actin으로 비교 정랑화하였다.</p> <h2>제브라피쉬 사육 및 당 흡수능</h2> <p>서울과학기술대학교 환경독성보건연구실로부터 분양 받은 wild type의 성체 zebrafish는 \( 14 \mathrm{~h} \mathrm{~light}/ 10 \mathrm{h} \) darkness의 cycle 주기, \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 수온과 \( \mathrm{pH~} 7.0 \)을 유지하면서 순환하는 여과 시스템 (Zebtec Stand Alone, Italy)의 수조에 10-15마리 정도 넣은 후 제브라피쉬용 먹이 Gemma Micro ZF 300 (Skretting Zebrafish; Tooele, UT, USA)를 하루에 3번 주면서 사육하였다. Embryo 채취는 성체 zebrafish 암수를 실험 24시간 이전에 embryo 채취용 수조에 넣고 다음날 광주기 시작 2시간 이내에 embryo을 채취하였다. 채취된 embryo는 수정 후 약 6hpf (hours post-fertilization) 일 때 96-well plate 각각의 well에 \( 200 \mu \mathrm{L} \) 의 E2 배지(zebrafish embryo medium)를 넣은 후 well당 1마리의 embryo를 옮긴 후 7 dpf (day post-fertilization)까지 성장시켰다. Zebrafish larvae에 COE 추출물을 24시간 동안 노출시킨 후 생존율과 기형 정도를 관찰하였다. 당 섭취능도 동일한 조건에서 실험을 진행한 후, well당 \( 600 \mu \mathrm{M} \) 2-NBDG 용액을 3시간 동안 노출시킨 후 E2 배지를 이용하여 3번 정도 세척한 다음에 COE 추출물을 노출시킨 다음에 디지털 카메라가 장착된 형광현미경(Leica, Wetzlar, Germany)으로 관찰하고 촬영하였다. Zebrafish larvae의 형광 강도는 ImageJ program을 사용하여 정량화하였다.</p> <h2>통계 분석</h2> <p>모든 실험결과는 3회 이상 반복하였으며, 평균 \( \pm \) 표준오차(standard error, SE)로 표현하였다. 각 군 간의 차이는 Graphpad Prism의 One way-ANOVA (analysis of variance) 처리 후 사후검정은 Dunnett's test를 이용하였으며, \( p<0.05 \) 수준에서 유의성 있는 것으로 판정하였다.</p>