길경 추출물은 여과하여 수용성분만을 동결 건조하였다. 인체 폐암세포를 여러 농도의 길경 추출물 배지에서 배양 후 MTT assay로 세포 성장률을 측정하였다. 길경 추출물에 의한 암세포의 apoptosis 유발을 확인하기 위해 DAPI 염색법으로 핵 형태를 관찰하였다. 대조군과 길경 배지에서 자란 세포들을 처리하여 DNA flow cytometry 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>암세포의 배양 및 길경 수용액의 추출</h2><p>본 실험에 사용한 A549 인체 페암세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)에서 구입하였으며 Lee et al.의 방법에 준하여 배양하였다. 길경은 동의대학교 한의과대학 부속 한방병원에서 공급받았으며 \( 100 \mathrm{~g} \) 을 \( 1,000 \mathrm{ml} \) 의 증류수에 3시간 이상 끓인 후, \( 3,000 \mathrm{rpm} \) 으로 20분간 원심 분리시켜 침전물을 제거하였다. 이를 다시 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \)의 여과지를 이용하여 부유 성분을 걸러낸 후 수용성분을 동결 건조하여 사용하였다.</p><h2>MTT assay를 이용한 세포 성장률의 측정</h2><p>A549 폐암세포를 분주하여 24시간 동안 안정화시킨 후, 다양한 농도로 희석된 길경 추출물이 함유된 배지로 교체하였다. 48시간 후 배지를 제거하고 tetrazolium bromide salt (MTT, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{m \ell} \) 농도가 되도록 성장배지로 희석하여 3시간 동안 배양한 다음, MTT 시약을 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma)를 첨가하여 각 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA, \( 540 \mathrm{~nm} \) )를 이용하여 흡광도를 측정하였다.</p><h2>DAPI 염색을 통한 핵의 관찰</h2><p>길경 추출물의 처리에 의한 암세포의 apoptosis 유발 여부를 확인하기 위한 핵의 형태변화 관찰을 위하여 길경 추출물이 처리된 세포들을 PBS로 수세하고 \(3.7 \%\) paraformal-dehyde로 상온에서 10분간 고정시킨 후 형광 염색물질인 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma) 용액을 이용하여 10분간 염색하였다. 이들 세포를 다시 PBS로 2회 수세한 후 fluorescence microscope를 이용하여 핵의 형태 변화를 정상군과 비교하였다.</p><h2>DNA flow cytometry 분석</h2><p>정상 및 길경 추출물이 함유된 배지에서 자란 세포들을 PBS로 두세 번 씻어내고, 고정액 (\(70\%\) ethyl alcohol, \(0.5\%\) Tween 20)을 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 고정시킨 후, 핵산에 특이적으로 결합하는 형광물질인 DNA intercalating dye pro-pidium iodide (PI, concentration, \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m} \ell \); Sigma)와 10 kunit의 RNase (Sigma)를 처리하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간동안 염색하였다. 이를 다시 PBS로 두 번 씻어낸 후, nylon mesh로 세포를 하나씩으로 분리시킨 후 DNA flow cytometry (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 적용시켜 형광 반응에 따른 histogram을 ModiFit LT (Becton Dickinson) 프로그램으로 분석하였다.</p>