Landrace, Yorkshire, Duroc, 한국재래돼지, Hampshire, Berkshire 등 총 320마리의 돼지에서 혈액을 채취했다. 돼지의 mtDNA D-loop 지역의 전체 염기서열을 분석하기 위해 이전에 보고된 mtDNA 염기서열을 참고하여 D-loop-F (16594-16613) 및 D-loop-R (1176-1195) 프라이머를 제작했다. PCR 제품을 TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, USA)을 사용하여 리게이션한 후 Top 10 F' 접근 가능한 세포 내로 형질전환이 수행되었다. 또한, 11-bp 중복 영역을 증폭하기 위해 분석된 서열을 기반으로 프라이머를 제작하고, 중복 영역을 포함한 약 150-bp 크기의 조각을 증폭하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>공시동물 및 DNA추출</h2> <p>Landrace, Yorkshire, Duroc 각각 80두와 한국재래돼지 20두, Hampshire 5두, Berkshire 55두의 총 320두의 혈액으로부터 혈액을 채취하였다. Genomic DNA 추출은 sucrose-protei-nase K 방법을 일부 변형하여 수행하여 sucrose-proteinase K 완충액을 첨가하고 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 over-night 진탕하였다. 추출액에 RNase를 처리한 후, phenol-chloroform을 이용하여 정제하고, ethanol 침전법으로 DNA를 회수하여 TE buffer에 용해하였다. 준비한 DNA 용액은 NanoDrop ND-1000 spec-trophotometer로 흡광도를 측정한 후 \( \mathrm{A}_{260} / \mathrm{A}_{280} \) 1.8 이상인 DNA 용액들을 \( 50 \mathrm{ng} / \mu\mathrm{l} \)로 희석하여 PCR 증폭을 위한 주형으로 이용하였다.</p> <h2>돼지 mtDNA D-loop 전체영역 증폭</h2> <p>돼지 mtDNA D-loop 지역의 전체 염기서열을 분석하기 위하여 기존에 보고된 mtDNA 염기서열(GenBank accession number: NC_000845)을 토대로 D-loop-F (16594-16613) 및 D-loop-R (1176-1195) primer를 제작하였다. 예상되는 증폭산물의 크기는 \(1,215 \mathrm{bp}\)이며, tRNA-Pro 및 tRNA-Phe 서열 일부를 포함하고 있다. 각 primer 서열은 다음과 같다.</p> <ul> <li>D-loop-F: 5'-TCT AAC TAA ATT ATT CCC TG-3'</li> <li>D-loop-R: 5'-ATA ATT TAA GCT ACA TTA AC-3'</li></ul> <p>PCR 반응은 genomic DNA \( 50\mathrm{ng}\), \(10 \times \)buffer (TaKaRa, Japan) \( 2.5 \mu \mathrm{l}\), \(0.2 \mathrm{mM} \) dNTP, \( 10 \mathrm{pmol} \) primer 각각 \( 1.5 \mu \mathrm{l} \), Taq DNA polymerase (TaKaRa, Japan) 2 unit, 증류수 \( 14.8 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하여 전체 \( 25 \mu \mathrm{l} \)의 반응액을 제조하였다. PCR 반응 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분간 처리한 후 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분을 1 cycle로 하여 총 30 cycle을 수행하였으며, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 최종 신장반응을 수행한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하였다.</p> <h2>유전자 cloning 및 염기서열 분석</h2> <p>TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, USA)를 사용하여 PCR product를 ligation 시킨 후 Top 10 F' competent cell 내부로 형질전환을 수행하였다. DNA sequencing은 Applied Biosystems 3700 DNA sequencer (PE Applied Biosystems,USA)를 이용하여 실시하였으며, 얻어진 염기서열은 Clustal X version 1.83을 이용하여 다중비교하였다.</p> <h2>11-bp 중복부위 증폭 및 PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) 분석</h2> <p>11-bp 중복부위를 증폭하기 위해서 분석된 서열을 이용하여 primer를 제작하였으며, 중복부위를 포함하여 약 150-bp 크기의 절편을 증폭하였다. 제작된 primer의 서열은 다음과 같다.</p> <ul> <li>150-F: 5'-CAC ACC CTA TAA CGC CTT GC-3</li> <li>150-R: 5'-TAA GTG CCT GCT TTC GTA GC-3'</li></ul> <p>PCR 조건은 D-loop 전체영역 증폭방법과 동일하게 수행하였으며, PCR 반응조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분간 처리한 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20초, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초를 1 cycle로 하여 총 35 cycle을 실행하였으며, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 최종 신장반응을 수행하였다. 증폭된 PCR product는 \( 8 \% \) polyacrylamide gel 상에서 전기영동을 실시하였으며, 이 때 \( 100 \mathrm{~V} \)에서 6시간 동안 반응시켰다. 그 후 ethidium bromide로 염색하고 UV 하에서 확인하였다.</p>