본 실험에서는 잦은 장바비 발생 및 약물의 경구투여가 합병증을 일으킬 수 있어 생리식염수를 복강내로 12시간 마다 주입하여 실험을 하였다. 또한 가장 적합한 척도로 알려져 있는 BBB척도로 척수손상 흰쥐의 하지기능을 평가하였으며 보행 시 하지와 발가락 움직임을 관찰하고 피리의 조절정도를 관찰해서 움직이는 범위 및 체중지지 여부를 평가하기 위한 것이었다. 아울러 실험에는 protease inhibitor가 포함된 버퍼를 넣어 세포을 융해한 후 10분간 원심 분리하고 영하70도에서 보관하여 전기영동을 한 후 실시하였다.
<h3>미노싸이클린의 투여</h3> <p>미노싸이클린(Sigma, St Louis, MO, USA)을 무균적 생리식염수에 용해시키고 척수손상 1시간 후에 \( 90 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \) 의 용량으로 희석한 \( 10 \mathrm { ml } \) 의 생리식염수들 백서의 우하복부를 통하여 복강 내로, 그 후 12시간마다 \( 45 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \)로 희석된 생리식염수 \( 5 \mathrm { ml } \)를 5일간 복강 내 주입하였다. 미노싸이클린 투여방법으로 복강 내에 주입을 선택한 이유는 빈번한 장바비(paralytic ileus)가 발생하고 수일간 지속되므로 약물의 경구투여는 합병증을 발생시킬 수 있으며, 흡수가 일정하지 못하다는 것과 신경손상 모델에서 미노싸이클린을 사용한 대부분의 논문에서 약물의 투여 경로로 복강 내에 주입방법을 선택했기 때문이다.</p> <h3>운동기능의 평가</h3> <p>BBB 척도(Basso, Bresttle, Bresnahan locomotor ratin scale)는 1995년 Basso 등에 의해 고안된 척도로 초기회복기, 중간회복기, 후기회복기의 3단계로 나누어 평가하며 총 21점으로 구성된다. BBB 척도는 척수손상 흰쥐의 하지기능을 평가하기 위한 가장 적합한 척도로 알려겨 있으며 보행할 때 하지의 움직임과 발가락의 움직임 및 피리의 조절정도를 관찰하여 움직이는 범위와 체중지지의 여부 등을 중심으로 평가하였다. BBB 척도의 변화는 척수손상 후 1, 4, 7, 10, 14일에 실시하여 운동기능의 회복울 측정하였다.</p> <h3>Western blot 분석</h3> <p>조직에서 단백질을 분리하기 위해서 protease inhibitor (Roche, in, USA)가 포함된 mammalian tissue lysis buffer (Sigma, Mo, USA) \( 400 \mu \mathrm { l } \)를 넣고 세포를 융해시키고 12000 \( \mathrm { rpm } , 10 \)분간 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 원심 분리하여 상충액만을 깨끗한 e-tube에 옮기고 사용하기 전까지 \( -70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 보관하였다. Western 실험을 시작하기 전 BCATM protein assay kit (PIERCE, IL, USA)로 단백질을 정량한 다음 15% SDS-PAGE (SDS-poly-acrylamide gel electrophoresis)에 한 well당 \( 60 \mu \mathrm { g } \)을 로딩하여 전기영동을 하고 PVDF (polyvinylidene difluoride) mem-brane에 옮긴 후 \( 5 \% \) skim milk로 blocking하였다. 1차 항체 Bcl-2 (Santacruz, CA, USA)(1:200)를 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 하룻밤 반응하였다. 2차 항체 mouse (Amersham, NJ, USA)(1:3,000)을 실온에서 1시간 반응한 뒤 Western detection kit (Amersham, NJ, USA)를 이용하여 항원-항체 복합체를 확인했다.</p>