하고초에 추출해 만든 시료에 수컷 SD-rat을 마취하고, 항응고제를 혈액과 일정비율로 채혈하여 APTT와 PT에 미치는 영향을 조사함으로써 시료의 혈액 응고 시간 지연 및 단축 효과를 확인하고자 하였다. 또한 혈전 용해능 측정과, 혈소판의 응집에 따라 형성되는 두 전극 사이의 전지적 저항의 변화를 나타내었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험동물</h2> <p>실험에 사용한 8주령의 수컷 Spague-Dewley (SD) rat은 (주)오리엔트바이오에서 구입하여 1주 이상 본 실험 사육장환경에 적응시킨 후 사용하였다. 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였고 사육장 실내의 온도는 \( 22 \pm 2^{\circ} \mathrm{C} \), 습도는 \( 50 \pm 10 \% \), 조경은 12 시간 명/암 주기가 되도록 조절하였다.</p> <h2>시료 및 추출</h2> <p>본 실험에 사용한 하고초는 (주)옴니허브에서 구입하여 한국한의학연구원 한약자원연구센터에서 검정하고 정선한 것을 사용하였다. 각 약재 \( 200 \mathrm{~g} \) 에 5 배량의 물을 가한 다음 2시간씩 2회 환류 냉각 추출하여 여과한 후 농축하고 동결건조하여 그 분말을 얻어 진행한 모든 실험에 사용하였다. 시료의 농도는 동결 건조 분말의 중량을 기준으로 표시하였다. 각각 실험에 사용된 시료는 혈전용해는 \( 20 \% \) dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma, Louis, MO, USA), PT와 APTT는 \( 10 \% \) DMSO, 혈소판응집은 phosphate-bufffered saline (PBS, \(\mathrm{pH} 7.4\))에 녹여 실험에 사용하였다.</p> <h2>시약</h2> <p>혈전용해 실험에 사용한 시약은 fibrinogen from human plasma, thrombin from human plasma, plasmin from human plasma를 Sigma (Louis, MO, USA)에서 구입하였고, PBS는Gibco (USA)에서 구입하였다. 응고타임에 사용된 calibration plasma, normal control, low abnormal control, PT-fibrinogen HS, SynthASil, calcium chloride \( 0.020 \mathrm{M} \), reference emulsion 시약은 Instrumentation Laboratory (Italy)로부터 구입하여 사용하였다. 혈소판응집 유발물질인 adenosine diphosphate (ADP)와 collagen은 Chrono-Log (Havertown, USA)의 제품을 사용하였다.</p> <h2>혈액 준비</h2> <p>응고타임 실험에 사용된 혈액은 수컷 SD-rat을 동물사육실에서 1주일간 순화시킨 다음 ethyl ether로 마취하고, 항응고제 \( 0.15 \mathrm{M} \) sodium citrate (Vacutainer, Becton dicknson, UK)를 혈액과 \( 1: 9(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 비율이 되도록 주사기로 복대동맥으로부터 채혈하였다. Low speed centrifuge (Gyrozen, Incheon, Korea) \( 1,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10분간 원심분리하여 상등액의 platelet rich plasma (PRP)은 버리고, 계속하여 \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리하여 platelet poor plasma (PPP)를 얻어 실험에 사용하였다. 혈소판 응집실험에 사용된 혈액은 수컷 SD-rat을 동물사육실에서 1주일간 순화시킨 다음 경동맥만 분리하여 Polyethylene Tube (Becton dicknson, UK) 를 삽입해서 Heparin coated tube (Green vac tube, Standardplus & medical Co., Ltd, St. Ingberg, Germany)로 옮겨 혈액을 담아 전혈을 사용하였다.</p> <h2>혈액 응고 시간 APTT, PT 측정</h2> <p>시료의 혈액 응고 시간 지연 및 단축 효과를 확인하고자 시료가 APTT와 PT에 미치는 영향을 조사하였다. 혈액응고억제 활성 중 내인성 경로(intrinsic pathway)에 기인하는 활성 트롬빈 플라스틴 시간 APTT와 외인성 경로(extrinsic pathway)에 기인하는 프로트롬빈 시간 PT를 자동혈액응고 분석기 ACL-7000 (Instrumentation Laboratory, Milano, Italy)를 사용하여 측정하였다. SD rat을 원심분리하여 얻은 platelet poor plasma (PPP)와 시료를 정해진 농도로 3:1의 비율로 섞어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 미리 배양한 후 자동 혈액 응고 분석기와 ACL assay reagent kit를 이용하여 시약과 반응시켜 응고될때까지의 혈액 응고 시간을 측정하였다.</p> <h2>혈전 용해능 측정</h2> <p>PBS로 fibrinogen의 최종 농도가 \( 0.6 \% \) 가 되도록 완전히 용해시킨 용액 \( 50 \mathrm{ml} \) 를 직경 \( 14 \mathrm{~cm} \) 의 petri dish에 옮기고 PBS에 녹인 thrombin 용액 50 NIH units를 30분 이상 상온에 방치하여 고화시켰다. 약재시료를 직경 \( 6 \mathrm{~mm} \) filter paper disc \( 20 \% \) DMSO에 각 농도로 약재시료 녹인 것을 fibrin plate 상에 점적하여 사용하였으며, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15시간 동안 반응시킨 후 fibrin plate가 용해되어 형성된 투명환의 넓이를 측정하였다.</p> <h2>혈소판 응집능 측정</h2> <p>혈소판 응집능은 전혈의 혈소판 응집을 측정하는 im-pedance방법으로, 혈소판의 응집에 따라 형성되는 두 전극사이에 형성된 전기적 저항(ohm)의 변화로 나타내었다. 시험물질을 PBS에 녹여서 Chrono-Log aggregometer model 700-2(Chrono-Log, Havertown, USA)을 사용하여 혈액을 stir bars(Chrono-Log, Havertown, USA)를 넣은 plastic cuvettes (Chrono-Log, Havertown, USA)에 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 반응시키고, 시험물질을 가하여 5분간 반응시켰다. 2분 정도 baseline을 확인 후, 혈소판응집 촉진물질을 일정량 넣고 \( 1,200 \mathrm{rpm} \)으로 교반하면서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 최대 10 분간 측정하였다. 혈소판 응집촉진물질은 ADP와 collagen을 첨가하여 응집을 유도 하였고, 대조군에 대한 응집억제 정도를 비교하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 측정 결과는 3반복 이상의 독립적인 실험에서 도출된 대표값의 평균(mean)과 표준편차(standard deviation; SD)로 나타내었다. 각 실험군 간의 차이는 t-test를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였으며, \( p< 0.05 \)값인 경우에 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.</p>