진핵생물 내에서 합성되는 HSP는 크게 HSP100, HSP90, HSP70, HSP60 및 저 분자량 HSP(small HSP)로 나뉘며, 식물에서는 small HSP가 가장 많이 발현한다. 본 연구에서는 엽록체에서 발현하는 small HSP의 기능을 밝히기 위해 형질전환 식물을 제조하고, small HSP가 식물에 내열성을 부여하는지 검토하였다. 이를 위해 벼로부터 분리한 small HSP의 full-length cDNA인 Oshsp26를 발현 벡터인 pIG121Hm에 도입하여 plGhsp26 벡터를 구축하였다. 결과적으로, Oshsp26 유전자가 형질전환 식물체의 genome에 성공적으로 도입되고, 후대에 전달됨을 확인하였다.
<h1>서 론</h1> <p>생물체에 있어서 내열성 또는 치사될 수 있는 고온환경 내에서 생존할 수 있는 능력은 heat shock protein (HSP)이라 불리는 단백질이 세포 내에서 유도발현됨으로써 주어진다. 진핵생물 내에서 합성되는 주요 HSP에는 각각의 단백질의 분자량의 크기에 따라 크게 5종류로 분류되어지는데, 주로 HSP100, HSP90, HSP70, HSP60 및 분자량 \(15 \sim30 \mathrm { kDa } \)의 저 분자량 HSP(small HSP)로 분류된다. 이들 중 식물에 있어서 가장 많이 발현되는 것이 small HSP들이며 분자량 \(20 \mathrm { kDa } \) 내외의 HSP20 super family를 형성한다.</p> <p>식물에 있어서 small HSP 유전자들은 핵에 code되어 있으며, 그들 단백질이 존재하는 세포 내의 부위에 따라 cytosol, chloroplast, endoplasmic reticulum (ER) 및 mitochondrium에 존재하는 형태로 나누어진다. 포유동물과 효모의 small HSP에서 알려진 바와 같이 식물의 small HSP들도 그 단백질의 C-말단에 약 100개의 아미노산으로 구성되는 consensus Ⅰ 및 Ⅱ라 불리는 상동성이 높은 보존영역을 가지고 있다. 한편, 엽록체에 존재하는 small HSP는 세포질에서 precursor 단백질로 합성된 후 최종적으로 엽록체로 수송되어 기능한다. 이 단백질의 특징으로는 다른 small HSP가 공통으로 가지는 consensus Ⅰ, Ⅱ외에 N-말단 쪽에 consensus Ⅲ라 불리는 methionine 잔기가 많은 또 하나의 보존영역을 가진다. 그러나 아직까지 이 단백질의 기능에 대해서는 확실히 밝혀져 있지 않다. 최근의 연구에 의하면 small HSP는 heat stress 하에서 분자량 \( 200 \sim 800 \mathrm { kDa } \)의 복합체를 형성하여 세포 내 단백질의 변성방지 및 단백질간의 응집 등을 방지하는 molecular chaperone으로서 기능하는 것이 밝혀져 있다. 또한 특정한 HSP들의 세포 내 축적과 식물의 내열성 획득 사이에 상관관계가 있음이 보고되고 있다. 이러한 결과들은 small HSP가 식물의 내열성 획득에 있어서 중요한 기능을 담당하고 있음을 의미한다. 따라서 본 연구에서는 엽록체에 존재하는 small HSP의 기능을 밝히고자 이 유전자를 발현하는 형질전환 식물체를 제조하여 상온에서 축적된 small HSP가 식물체에 내열성을 부여할 수 있는지 여부를 조사하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <p>벼로부터 분리한 엽록체 small HSP의 full-length cDNA(Oshsp26)를 발현 vector인 pIG121Hm에 도입하여 발현 vector plGhsp26을 구축하였다. 구축한 발현 vector을 Agrobacterium에 도입한 후 담배의 leaf disc에 형진전환하여 총 32개의 1차 형질전환 식물체 \( \left ( \mathrm { T } _ { 1 } \right ) \)를 얻은 후, 종자를 채종하여 파종과 kanamycin 또는 hygromycin 배지에서의 선발 및 Northern 분석과정을 반복하여 최종적으로 Oshsp26의 발현량이 서로 다른 3종류의 순계 \( \left ( \mathrm { T } _ { 3 } \right ) \)를 확립하여 실험에 이용하였다. Oshsp26 유전자가 형질전환 식물체의 genome내로 도입되었는지 여부를 확인하기 위하여 genomic DNA를 분리한 후 Southern blot 분석(결과 미제시) 또는 PCR분석을 통하여 확인하였다. 그 결과 Fig. 1B에 나타낸 바와 갈이 wild-type의 경우 증폭산물이 관찰되지 않았으나, 각각의 형질전환 식물체의 genomic DNA로부터 \( 0.9 \mathrm { ~kb } \)의 DNA 단편이 증폭되었다. 이러한 결과는 발현벡터의 Oshsp26 유전자가 형질전환 식물체의 genome에 성공적으로 도입되었으며 반복적인 자가수정에도 불구하고 후대에 전달되었음을 나타낸다.</p>