total RNA isolation system (Prome-ga)을 사용하여 RNA를 분리하였으며, 얻어진 PCR product는 전기영동 후 ethidium bromide로 염색하여 유전자의 발현 정도를 확인하였다. 꽃송이버섯 추출물의 암 억제 효과를 검증하기 위해, mouse에 B16F10 세포를 주입하여 암을 유발시킨 후, 이 mouse에 일일 \( 200 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \)의 꽃송이버섯 추출물을 7일 전부터 먹여 tumor volume을 21일 동안 측정하였다.
<h2>RNA 분리 및 RT-PCR 분석</h2> <p>RNA 분리를 위해서는 total RNA isolation system (Prome-ga)을 사용하였다. 분리한 RNA를 \( 260 \mathrm { ~nm } \)에서 UV-visible spectrophotometer를 이용하여 정량 한 후 Maxime RT-PCR Premix kit (Intron, Korea)를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 세포에서 분리한 total RNA \( 250 \mathrm { ng } \)에 각각의 유전자에 특이적인 primer를 20 pmole씩 첨가한 후 RNase-free water로 전체 volume이 20 \( \mu \mathrm { l } \)가 되게 하였다. 이 혼합물을 Maxime RT-PCR Premix와 섞은 후 \( 45 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30 분간 reverse transcription 반응 후 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분 간 가열하여 reverse transcriptase의 활성을 없애고 PCR 반응을 수행하였다. \( \mathrm { PCR } \)은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 45초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 45초로 25회 반복 반응하였다. 얻어진 PCR product를 \( 1.5 \% \)agarose gel에서 전기영동 한 후, ethidium bromide로 염색하여 각 유전자들의 발현 정도를 확인하였다. 실험에 사용한 각 유전자에 특이적인 primer sequence는 Table 1에 기술하였다.</p> <h2>Transfection 및 NF-kB luciferase activity 측정</h2> <p>Transfection 24 시간 전에 \( 2 \times 10 ^ { 5 } \)개의 Raw \( 264.7 \)cell을 6-well plate에 분주한다. Fugene 6를 이용하여 NF-kB Luciferase Reporter 유전자를 세포에 transfection하고, 24시간 후 medium을 교체하면서 여러 가지 농도의 베타-글루칸을 처리하고 24시간 후 luciferase activity를 측정하였다.</p> <h2>Tumor growth 측정</h2> <p>꽃송이버섯 추출물에 의한 tumor growth 억제를 확인하기 위해 \( 1 \times 10 ^ { 6 } \)개의 murine \( \mathrm { B } 16 \mathrm { ~F } 10 \) melanoma세포를 C57BL/6J mouse의 복강에 주사하여 암을 발생시켰으며, B16F10 세포를 주사하기 7일 전부터 매일 \( 200 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \)으로 꽃송이버섯 추출물을 먹이면서 mouse의 tumor volume을 21일 간 측정하였다.Tumor volume은 가로 \( \times \)세로 \( \times \)높이 \( \times \)1/2로 측정하였다.</p>