본 연구에서는 로즈마리를 이용해 시료를 제작하고 이에 대한 DPPH radical 소거 활성, FRAP, ABTS radical 소거 활성에 대해 측정하였다. 또한 ATCC \(43888\) 균주 및 KCTC \(1621\) 균주를 배양해 항균활성 측정을 진행하였으며, 이외에도 최소저해농도 측정 및 손 세정 효과, 우유를 이용한 식품의 저장성 등을 분석하였다. DPPH radical 소거 활성 측정은 시료의 DPPH에 대한 환원력을 측정하여 이루어졌으며, \( 517 \mathrm{nm} \)에서 흡광도 측정을 통해 이를 분석할 수 있었고, FRAP assay에서는 Benizie와 Strain 방법을 통해 수행되었다. ABTS radical 소거 활성 측정은 ABTS와 potassium persulfate를 혼합한 용액에 대해 \( 734 \mathrm{~nm} \)에서의 흡광도를 측정하여 분석하였다. 한편 항균활성 측정에는 disc diffusion method법을 사용했으며, 최소저해농도는 broth-dilution method를 사용해 수행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시료 제조</h2> <p>본 실험에 사용한 로즈마리는 대구시 약령시장에서 건조 상태의 것을 구입하여 사용하였다. 시료는 불순물 제거를 위하여 수세한 후 건조하여 사용하였고, 무게의 10배량\((\mathrm{w}/\mathrm{v}\))의 \( 80 \% \) 메탄올을 가하여 24시간 동안 정치하여 총 3회 반복 추출하였다. 추출액은 여과지(Whatman No. 3, Whatman International Ltd., Maidstone, England)로 여과한 다음 rotary evaporator (UT-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 \( 55{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 농축한 후 동결 건조하여 메탄올 추출물로 사용하였다. 동결 건조한 로즈마리 메탄올 추출물은 20배\((\mathrm{w}/\mathrm{v}\))의 증류수에 녹인 후 hexane (hexane), chloroform \( \left(\mathrm{CHCl}_{3}\right) \), ethylacetate (\(\mathrm{EtOAc}\)) 및 butanol (\(\mathrm{BuOH}\))로 순차적으로 3회 반복 추출하여 각 용매별로 계통적으로 분획을 하였고 남은 수용성 층은 water 분획으로 감압농축 하여 speed vacuum으로 남은 유기용매를 휘발시킨 뒤 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하면서 사용하였다. 또한 로즈마리의 단일 물질은 \(\alpha\)-pinene, rosmarinic acid, cineol, carnosol, carnosic acid, limonene, camphor, camphene을 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.</p> <h2>\(\alpha\)-\(\alpha\)-Diphenyl-\( \beta \)-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거 활성</h2> <p>시료의 free radical 소거 활성은 stable radical인 \(\alpha\)-\(\alpha\)-diphenyl-\( \beta \)-picrylhydrazyl (DPPH)에 대한 환원력을 측정한 것으로 \( 99 \% \) 메탄올에 각 시료를 녹여 농도별로 희석한 희석액 \(160 \mu \mathrm{l}\)와 메탄올에 녹인 \( 0.15 \mathrm{mM}\) DPPH 용액 \(40 \mu \mathrm{l}\)를 가하여 실온에 30분 방치한 후 \( 517 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 추출물의 유리라디칼 소거활성은 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 \(1/2\)로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 \(\mathrm{RC}_{50}\) 값으로 나타내었다. 이때 활성비교를 위하여 BHA와 ascorbic acid를 사용하였다.</p> <h2>Ferric reducing/antioxidant power (FRAP) 측정</h2> <p>FRAP assay는 Benizie와 Strain 방법을 96 well plate에 맞게 수정하여 실시하였다. 반응액은 \( 300 \mathrm{mM} \) acetate buffer (\(\mathrm{pH} 3.6\)) : \( 10 \mathrm{mM} \) TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine) : \( 20 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{FeCl}_{3} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)를 \(10:1:1\)의 비율로 실험 직전에 만들어 사용하였다. 반응액과 시료를 혼합하여 4분간 반응시킨 후 \( 593 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 환원력은 \( 0.1{\sim} 1 \mathrm{~mM}\) \(\mathrm{FeSO}_4 \) \( 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)로 표준곡선을 작성하여 추출물 \( 1 \mu \mathrm{g} \)당 \( \mathrm{Fe}^{2+} \mu \mathrm{mole} \)로 표시하였다.</p> <h2>ABTS radical 소거 활성</h2> <p>\( 7 \mathrm{mM} \) 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)와 \( 2.45 \mathrm{mM} \) potassium persulfate를 최종 농도로 혼합하여 실온인 암소에서 24시간 동안 방치하여 ABTS+\(\cdot \) 을 형성시킨 후 96 well에 \( 734 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도 값이 \(0.70 (\pm 0.02\))이 되게 phosphate buffer saline (PBS, \(\mathrm{pH}=4 \))로 희석하였다. 희석된 용액 \(180 \mu \mathrm{l}\)에 sample \(20\mu \mathrm{l}\)를 가하여 정확히 1분 동안 방치한 후 흡광도를 측정하였다. 각 시료 추출물과 단일 물질의 유리 라디칼 소거 활성은 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 \(1/2\)로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 \(\mathrm{RC}_{50} \)값으로 나타내었다.</p> <h2>사용 균주 및 배지</h2> <p>본 실험에서 사용한 Escherichia coli O157:H7의 표준균주인 ATCC 43888는 미국균주보존센터로부터, Staphylococcus aureus의 표준균주인 KCTC 1621는 한국생명공학연구원 생물자원센터로 분양 받아 각각의 균들을 tryptic soy broth (TSB, Difco, Detroit, USA)에 1백금이 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 shaking하여 3회 계대 배양 후 성장 최적조건에서 배양 시켰다. 또한, 생균수 측정을 위한 배지는 tryptic soy broth agar (TSA, Difco)를, 세균을 희석하기 위한 희석수로는 멸균 증류수를 사용하였다.</p> <h2>항균활성 측정</h2> <p>추출물의 항균력 검색은 disc diffusion method법을 실시하였다. 균주를 \( 100 \mathrm{ml}\) TSB에 접종하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 shaking하면서 24시간 배양하여 활성화시키고 3일 계대 배양 후 spectrophotometer (UNIKON922, Kontron, Milan, Italy)를 이용하여 \( 560 \mathrm{~nm} \)에서 O.D값이 0.2가 되게 하여 균수를 \( 1 \times 10^{7} \mathrm{cfu} / \mathrm{ml} \) 로 사용하였다. 고체배지에 멸균된 glass spreader로 균을 고르게 spread 한 후, \( 8 \mathrm{~mm} \) paper disc (diamerter \( 8 \mathrm{~mm} \), Adantec co., Tokyo, Japan)를 올려놓은 다음 추출물을 최종농도가 2.5, 5 \(\mathrm{mg} / \mathrm{disc} \)가 되도록 DMSO에 용해시키고 \(50 \mu \mathrm{l}\)를 주입하여 완전히 흡수시킨 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 24시간 배양시켜 paper disc 주위의 inhibition zone (mm)의 직경을 측정하였다.</p> <h2>최소저해농도 측정(Minimum Inhibitory Concentration)</h2> <p>시료 추출물에 대한 최소저해농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 분석은 broth-dilution method를 사용하여 수행하였다. 추출물을 DMSO에 \( 1 \sim 10 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 희석하였다. 각각의 균주는 농도를 \(\mathrm{O.D.}_{560}=0.2\)로 조절한 후 본 실험에 사용하였다. 96 well plate에 균 희석액 \(180 \mu \mathrm{l}\), 시료 추출물의 조제액 \(20 \mu \mathrm{l}\)를 농도별로 첨가한 뒤 24시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다. 균의 생육 곡선 상에서 균의 생장(turbidity)이 검출되지 않는 최소 농도를 MIC로 설정 하였다.</p> <h2>손 세정 효과</h2> <p>추출물에 대한 항균력 응용은 Hand Plate (Komed Co Ltd., SeongNam-City, Korea)를 이용하였다. 로즈마리 MeOH 추출물 \( 1,5 \% \) 농도의 희석액 \( 1 \mathrm{ml} \)과 대조군 3차 멸균 증류수 \(1 \mathrm{ml} \)을 각각 손에 바른 후 Hand Plate 표면에 가볍게 접촉시켜 3-5초 경과 뒤 손을 땐 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) incubator에서 24시간 배양 후 세균의 집락의 색깔과 수를 관찰하였다.</p> <h2>식품의 저장성 연장</h2> <p>시료 추출물에 대한 우유의 신선도 측정은 시간적 소요를 줄여 주는 Resazurin 환원시험을 사용하였다. 시료유 \(10 \mathrm{ml} \)를 멸균공전시험관에 취하고 Resazurin 용액 \( 1 \mathrm{ml} \)를 가한 후 마개를 잘 막은 뒤 조용히 3회 전도 혼합하고, 즉시 차광한 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)의 항온조에 넣어 30분간 방치 하였다. 방치 후 시험관을 꺼내어 3회 정도 전도 혼합하고 다시 항온조에 넣어서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)로 30분간 유지 한 다음(배양시작 후 60분), 시험관을 꺼내어 아래로부터 \(4/5\)의 색깔을 직사일광을 피해서 표준색표와 비교하였다.</p>