미토콘드리아는 apoptosis 유도 신호가 발생할 때 가장 먼저 손상을 받는데 apoptosis를 촉진하는 다양한 미토콘드리아 내 물질들을 세포질로 방출시킨다. WEEH나 TRAIL 단독 처리군의 경우 MMP 대조군에 비해서 손실이 다소 증가하였으나, WEEH 및 TRAIL의 혼합 처리군에서는 대조군에 비하여 3배 가까이 증가했다. WEEH와 TRAIL의 혼합 처리에 의한 모든 caspase에서 활성형 단백질의 발현이 뚜렷하게 증가했으며, 이러한 효소들의 활성 정도를 정량적으로 조사한 결과에서도 WEEH와 TRAIL 혼합 처리군에서 단독 처리군에 비해 유의적으로 증가했다. WEEH와 TRAIL의 단독 및 혼합 처리에 의해서는 Bax 단백질의 발현 수준에서는 큰 변화가 없었지만, anti-apoptotic Bcl-2 및 Bcl-xL 단백질은 단독 처리군에 비하여 WEEH 및 TRAIL 혼합 처리군에서 유의적인 발현감소가 발견되었다. WEEH나 TRAIL의 대조군에 비하여 단독 처리군에서는 발현의 유의한 변화가 없었지만, 혼합 처리군에서는 특허 XIAP 및 CIAP-1의 발현이 매우 감소되었다.
<h2>WEEH와 TRAIL의 혼합 처리에 의한 미토콘드리아 기능 손상</h2> <p>세포의 생존에 가장 중요한 소기관인 미토콘드리아는 apoptosis 유도 신호가 발생할 경우 가장 먼저 손상 받음으로서 apoptosis를 촉진하는 다양한 미토콘드리아 내 물질들을 세포질로 방출시킨다. 따라서 WEEH 및 TRAIL의 단독 및 혼합 처리에 의한 apoptosis 유발이 미토콘드리아의 기능 손상과 연관성이 있는지를 JC-1 염색에 의한 MMP 손실의 정도를 flow cytometry analysis를 통하여 조사하였다. Fig. 4에 나타낸 바와 같이 MMP 손실의 정도가 WEEH 또는 TRAIL의 단독 처리군의 경우 대조군에 비해서 약간 증가되었으나, WEEH 및 TRAIL의 혼합 처리군에서는 대조군에 비하여 약 3배 이상 증가되었음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 WEEH와 TRAIL의 단독 처리 보다는 혼합 처리에 의한 AGS 세포의 apoptosis 유도는 미토콘드리아의 기능 손상과 연관성이 있음을 보여주는 것이다.</p> <h2>Caspases 및 PARP의 발현에 미치는 WEEH와 TRAIL의 영향</h2> <p>Cysteine-related protease인 caspase들은 세포의 apopto-sis 유발에 핵심적인 역할을 하는 효소로서 핵과 미토콘드리아의 외막에 불활성 상태로 존재하다가 apoptosis를 유도하는 자극에 의하여 활성화 될 수 있다. 이러한 caspase들은 활성화 되어 정상적인 세포의 DNA repair나 genomic sta-bility의 유지에 중요한 역할을 하는 poly (ADP-ribose) pol-ymerase (PARP)를 포함한 세포의 생존에 중요한 다양한 기질 단백질들을 분해함으로써 apoptosis 를 유발하게 된다. Fig. 4의 결과에서 WEEH와 TRAIL 혼합 처리에 의한 apoptosis 유도는 미토콘드리아 기능 소실과 연계성이 있었기 때문에, 지금까지 알려진 caspase 중 apoptosis가 유발된 세포에서 높은 활성도를 보여주는 caspase-3, caspase-8 및 caspase-9의 활성에 미치는 WEEH와 TRAIL의 단독 및 혼합 처리의 영향을 비교 조사하였다. Fig. 5A의 결과에서 보여주듯이 WEEH와 TRAIL의 단독 처리에 비해서 흔합 처리에 의한 3 종류의 caspase 모두에서 활성형 단백질의 발현 증가가 뚜렷하게 관찰되었으며, 이러한 효소들의 활성 정도를 정량적으로 조사한 결과에서도 WEEH와 TRAIL 혼합 처리군에서 단독 처리군에 비하여 유의적으로 증가되었음을 알 수 있었다.</p> <p>Apoptosis가 일어나는 대부분의 경우 PARP 단백질은 caspase-3의 활성에 의하여 부분적으로 잘리는 분해과정이 나타나는데, 정상세포의 경우는 \( 116 \mathrm{~KDa} \)의 분자량을 가지지만 apoptosis가 일어난 경우는 \( 85 \mathrm{~KDa} \) 크기의 단편을 관찰할 수 있다. 따라서 PARP 단백질의 단편화는 apopto-sis가 유발된 세포에서 특이적으로 관찰되는 대표적인 bio-marker 중의 하나이다. Fig. 5A에 나타낸 결과에서 알 수 있듯이 WEEH와 TRAIL 단독 처리군에 비하여 혼합 처리에 의한 caspase-3 효소의 가장 중요한 표적 단백질인 PARP의 분해 현상이 뚜렷하게 관찰되어 AGS 세포에서 WEEH와 TRAIL 혼합 처리에 의한 apoptosis의 유발은 caspase-3 의존적인 현상임을 알 수 있었다.</p> <h2>Bcl-2 family의 발현에 미치는 WEEH와 TRAIL의 영향</h2> <p>Apoptosis 조절에 관여하는 대표적인 유전자군의 하나가 Bcl-2 family에 속하는 인자들인데, 이중 Bcl-2 member에 속하는 Bcl-2 및 Bcl-xL 등은 apoptosis 유발을 억제하는 an-ti-apoptotic 분자이며, Bax member에 속하는 Bax, Bad 및 Bak 등은 apoptosis 유발을 촉진하는 pro-apoptotic 분자이다. Bcl-2 member에 비하여 Bax member의 상대적 발현이 증가될 경우 미토콘드리아에서 cytochrome c를 유리시켜 caspase의 활성화 및 DNA의 단편화와 연관된 endonu-clease 등의 활성을 증가시킨다. Bcl-2/Bcl-xL과 Bax는 서로 dimer를 이루며, 만일 Bax가 주종단백질로 hetrodimer를 만들면 apoptosis를 촉진시키고, Bcl-2/Bcl-xL이 주종이면 apoptosis가 억제된다. 따라서 이들 두 유전자의 발현에 미치는 WEEH 및 TRAIL의 단독 및 혼합 처리 영향을 조사하기 위하여 WEEH와 TRAIL의 단독 및 혼합 처리된 배지에서 배양된 AGS 세포의 단백질을 대상으로 Western blot analysis를 실시하였다. Fig. 6에 나타낸 바와 같이 WEEH와 TRAIL의 단독 및 혼합 처리에 의해서는 Bax 단백질의 발현 수준에서는 큰 변화가 없었지만, anti-apoptotic Bcl-2 및 Bcl-xL 단백질의 발현은 WEEH 및 TRAIL 혼합 처리군에서 단독 처리군에 비하여 매우 유의적으로 감소되었다. 또한 BID의 단백질의 발현도 WEEH 및 TRAIL 혼합 처리군에서 매우 감소되었다. 본 실험의 조건에서 BID의 분절에 의한 tBID 형태의 발현은 검출이 되지 않았으나, BID 자체의 감소는 tBID의 발현을 증가시켰을 것으로 추정되며, 이는 아마도 미토콘드리아로 이동되어 apoptosis 유발 촉진 인자로 작용되었을 것으로 추정된다.</p> <h2>IAPs family의 발현에 미치는 WEEH와 TRAIL의 영향</h2> <p>Apoptosis 유발 조절에 관여하는 또 다른 유전자군인 IAPs family는 곤충 세포에서 바이러스 감염에 의한 apopto-sis를 억제하기 위한 baculoviral 단백질 군으로 알려졌으며, 외부 신호에 의한 세포 내 anti-apoptotic 활성을 지니는 것으로 알려져 있다. 그들은 caspase의 활성과 연관된 조절인자이며, caspase와 직접적인 결합을 통하여 그들의 활성을 억제할 수 있다. 따라서 WEEH와 TRAIL의 단독 및 혼합 처리에 의한 apoptosis 유도에 이들 인자들이 관여하는지의 여부를 XIAP, cIAP-1 및 cIAP-2를 대상으로 Western blot analysis로 조사하였다. Fig. 6의 결과에서 알 수 있듯이 WEEH 또는 TRAIL의 단독 처리군에서는 대조군에 비하여 큰 유의적인 발현의 변화를 관찰할 수 없었으나, 혼합 처리군에서 특허 XIAP 및 CIAP-1의 발현이 매우 감소되었다.</p>