단핵의 근원세포가 다핵의 골격근 세포로 분화하는 과정에서 IGF-I을 시간에 따라 처리하였을 때, plectin 유전자의 단백질 발현에 어떠한 변화가 나타나는지 형광 염색(immunocytochemistry) 기법을 사용하여 관찰하였다. 단백질 발현의 경우 24-48시간 동안에는 IGF-I에 의한 plectin 발현이 통제군과 차이를 보이지 않았고 72-96시간 분화배지 조건에서 IGF-I을 처리한 세포에서는 통제군과 비교하였을 때 세포 골격인 튜불린과 plectin의 발현이 선명하게 나타난 것으로 볼 때, IGF-I이 세포의 형태가 변화하는 과정에서 plectin의 발현을 유지시켜 줌으로써 세포골격을 유지시켜 주는 것으로 해석된다. 동일 조건에서 IGF-I에 의한 plectin 유전자의 mRNA가 발현을 측정해 본 결과 mRNA가 발현된 후에 단백질의 안정화 및 번역(translation) 능력 및 효율성 증대와 같은 번역 전(pre-translational) 단계에서의 유전자 발현 조절 메커니즘에서 비롯된 것으로 헤아려진다.
<h1>결 과</h1> <h2>단백질 발현</h2> <p>단핵의 근원세포가 다핵의 골격근 세포로 분화하는 과정에서 \( 20 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \)의 IGF-I을 각각의 처리 시간(24, 48, 72,96 시간)에 따라 처리하였을 때, plectin 유전자의 단백질 발현에 어떠한 변화가 나타나는지 관찰하기 위해 면역 형광 염색(immunocytochemistry) 기법을 사용하여 세포를 관찰하였다. Fig. 1에 제시된 바와 같이 성장 배지(growth medium, GM) 조건에서 IGF-I을 처리하지 않고 배양하자 분화가 진행되지 않은 상태의 근원세포의 형태를 관찰 할 수 있었다. 이후, 분화 배지(differentiation media, DM)로 배양액을 갈아주고 분화를 유도하며 \( 20 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 의 IGF-I을 처리하였을 때 24 시간에서 plectin의 발현 정도가 눈에 띄게 변화하지 않았지만 보다 명확한 myotube의 형태를 관찰 할 수 있었다. 동일한 조건으로 24시간을 더 관찰하여본 결과 48 시간 동안 IGF-I을 처리하였을때에는 myotube의 형태가 더 많이 관찰 되었으며, 세포의 더 많고 넓은 부분에 걸쳐 plectin의 발현이 증가되어 나타났음을 볼 수 있었다. 계속해서 72 시간, 96 시간 동안 장시간 IGF-I을 처리하였을 때에는 앞서 24-48 시간 동안의 변화와 매우 다른 변화를 관찰 할 수 있었는데, 72 시간 동안 IGF-I을 처리하지않은 세포에서는 plectin의 발현이 희미하게 감소하는 경향을 관찰하였으나 IGF-I을 처리한 세포에서는 myotube가 더욱 굵어졌을 뿐만 아니라 plectin의 발현이 myotube 형태 전반에 걸쳐 더욱 뚜렷하게 나타났음을 관찰할 수 있었다. 96 시간동안 IGF-I을 처리하였을 때는 보다 더 뚜렷한 차이를 볼 수있었는데, 그림에서 보여주듯이 IGF-I을 처리하지 않은 세포에서는 plectin의 발현이 형태적으로 흐릿하게 거의 보이지 않는데 비하여 IGF-I을 처리한 세포에서는 장시간 분화배지 조건에서 배양되었음에도 불구하고 myotube의 형태와 거의 유사한 형태로 선명하게 plectin 유전자가 발현되고 있음을 관찰 할 수 있었다.</p> <p>근원세포를 골격근의 성질을 가진 다핵의 myotube 형태로 분화시키는 실험 기법으로 성장인자인 혈청액의 함유량을 낮춰 배양액하는 방법이 널리 사용되고 있는데, 배양액에서 세포 성장인자의 농도가 낮아짐으로 인해 분화가 유도되지만 세포는 시간이 지날수록 충분한 영양공급을 받지 못해 스트레스를 받게 된다. 그러나 장시간(72, 96 시간) 분화배지 조건에서 IGF-I을 처리한 세포에서는 IGF-I을 처리하지 않은 세포와 비교하였을 때 세포 골격인 튜불린과 plectin의 발현이 보다 선명하게 나타난 것으로 미루어 볼 때, IGF-I이 세포의 형태가 변화하는 과정에서 plectin의 발현을 유지시켜 줌으로써 세포골격을 유지시켜 주는 것으로 해석된다.</p> <h2>mRNA 발현</h2> <p>동일한 조건으로 IGF-I 처리에 따른 plectin 과 MACF-1 유전자의 mRNA 발현을 측정해 본 결과 Fig. 2A에 제시된 바와 같이 plectin의 경우 24 시간 동안 IGF-I을 처리한 그룹이 같은 시간 동안 IGF-I을 처리하지 않은 그룹에 비해 약 \( 136 \% \) \( (p=0.000)\), 48 시간 에서는 약 \( 184 \%\)\((p<0.01) \) plectin의 mRNA 발현이 유의하게 증가하였으며 \( (p<0.05)\), 72 시간에서는 약 \( 12 \% \) 가량 증가하였으나 통계적으로 유의하지 않았으며, 96 시간에서는 발현이 오히려 감소하였다. MACF1 유전자의 mRNA 는 24 시간 동안 IGF-I을 처리하자 약 \( 86 \% \) ( \( p< 0.05) \), 48 시간에서는 \( 89 \% \) \((p=0.000) \), 72시간에서는 \( 25 \% \) 발현이 증가하였으나 통계적으로 유의하지 않았으며, 96 시간에서는 plectin과 마찬가지로 발현이 오히려 감소하였다(Fig. 2B).</p> <p>앞서 단백질 발현의 경우 24-48시간 동안에는 IGF-I에 의한 plectin 발현이 통제군과 차이를 보이지 않았고, 72-96 시간인 늦은 시간에서 차이를 보였던 결과와는 차이가 있지만, 이러한 현상은 IGF-I에 의한 plectin 유전자의 mRNA가 발현된 후에 단백질의 안정화 및 번역(translation) 능력 및 효율성 증대와 같은 번역 전(pre-translational) 단계에서의 유전자 발현 조절 메커니즘에 기인한 것으로 사료된다.</p>