\( \beta \)-Lactamase 유전자를 LB 배지(ampicillin \( 2 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \))에 접종하여 18시간 배양한 후 원심분리하여 균체를 회수하고, Tris-HCl pH 8.0, EDTA, Triton X-100으로 섞고 4\(^\circ \mathrm{C}\)에서 10분 동안 가해주어 조효소액을 조제하였다. Micro-iodometric assay를 이용해 \( \beta \)-Lactamase 활성을 측정했다. 효소액과 acetic acid buffer를 혼합하여 효소를 활성화 시키고, 요오드 용액을 pH 4.0의 acetic acid buffer로서 50배 희석한 요오드 용액 \( 5 \mathrm { ml } \)를 첨가하여 반응을 정지시킨 다음 실온에서 10분간 방치 후 \( 540 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다.
<h2>조효소액의 조제</h2> <p>\( \beta \)-Lactamase 유전자를 보유한 E. coli HB101 (pBK11 - \( \Delta \)4.6)을 LB 배지(ampicillin \( 2 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) )에 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 18시간 배양하고 원심분리(20,000× \( \left . \mathrm { g } , 10 \mathrm { ~min } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \)하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체를 \( 10 \mathrm { mM } \) Tris-HCl (pH 8.0) \( 10 \mathrm { ml } \)로 1회 세척한 후 \( 10 \mathrm { mM } \) Tris-HCl pH 8.0, \( 1 \mathrm { mM } \) EDTA, \( 0.1 \% \)(w/v) lysozyme 혼합용액 \( 5 \mathrm { ml } \)에 현탁하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30분간 방치 후 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1시간 냉동하였다. \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20분간 급속해동 시킨 후 냉동과 해동의 과정을 2회 반복한 후 원심분리 \( \left (25,000 \times g \right . \), \( \left .20 \mathrm { ~min } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \)로 상층액을 회수하여 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris-HCl pH 8.0 buffer로 2일간 충분히 투석 후 조효소액으로 사용하였다.</p> <h2>\( \beta \)-Lactamase 활성 측정</h2> <p>\( \beta \)-Lactamase 활성 측정은 Micro-iodometric assay 방법을 이용하였다. 효소액 \( 1 \mathrm { ml } \) 와 \( 10 \mathrm { mM } \) acetic acid buffer pH 5.0 \( 1 \mathrm { ml } \)를 혼합하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 가온하여 효소를 활성화시켰다. 동일 완충용액에 용해한 \( 0.4 \% \)의 ampicillin용액 \( 1 \mathrm { ml } \)을 첨가하여 반응을 시작하였다. \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 각각 시간별로 반응시킨 후 요오드 용액(0.16 M iodine, \( 1.2 \mathrm { M } \) potassium io-dine)을 pH 4.0의 acetic acid buffer로서 50배 희석한 요오드 용액 \( 5 \mathrm { ml } \)를 첨가하여 반응을 정지시킨 다음 실온에서 10분간 방치 후 \( 540 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 요오드 용액으로 반응을 정지시킨 후 동량의 효소액을 첨가하였다. 측정된 흡광도로 효소활성의 unit 계산에는 다음의 수식을 이용하였다.</p>