본 논문은 E. coli를 사용한 재조합 R.glutinis EH 유전자를 가진 Rosetta seed culture를 주배양액에 넣고 \( \mathrm { OD } _ { 600 } \) 값이 0.5가 될 때까지 배양한 후 IPTG를 넣어 다시 배양했다. 원심분리한 cell pellet을 효소활성과 전기영동의 시료로 써 SDS-PAGE, Coomassie Blue 염색, immunoblotting을 통해 발현된 상용단백질을 분석했다. 또한 입체선택적 가수분해 반응과 GC를 분석하고자 유전자 재조합 E. coli 생촉매를 \( 10 \mathrm { ml } \)의 인산완충액에 현탁시키고 \( 0.5 -20 \mathrm { mM } \) 농도로 라세믹 에폭사이드 기질을 주입했다.
<h2>E. coli를 이용한 재조합 EH의 발현 및 분석</h2> <p>R. glutinis의 EH 유전자를 가지고 있는 재조합 Rosetta seed culture를 주배양액에 넣고 \( \mathrm { OD } _ { 600 } \) 값이 0.5가 될 때까지 배양한 후 IPTG를 최종농도 \( 1 \mathrm { mM } \) 이 되도록 첨가하고 3시간 30분 동안 더 배양하였으며 대조군으로는 IPTG를 첨가하지 않고 배양한 균을 사용하였다. 배양액을 원심분리하여 얻은 cell pellet을 효소활성과 전기영동의 시료로 사용하였다. 발현된 세포현탁액과 Laemmli buffer의 혼합액을 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5분간 가열, 변성시키고 \( 12 \% \) gel상에서 SDS-PAGE를 행하여 세포단백질을 분리하였으며, Coomassie Blue 염색 및 immunoblotting analysis를 행하여 발현정도를 비교하였다. Immunoblotting 분석에 사용한 1차 항체로는 anti-hexahistidine polyclonal antibody (H-15, Santa Cruz Biotechnology Inc., USA), 2차 항체로는 peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG polyclonal antibody (Jackson Immunoresearch, USA)를 사용하였고, CN/DAB (4-chloro-1-naphthol/ 3,3'-diaminobenzidine, Pierce, USA)을 발색시약으로 사용하였다.</p> <h2>입체선택적 가수분해 반응 및 가스크로마토그라피(GC) 분석</h2> <p>유전자 재조합 E. coli 생촉매 \( 40 \mathrm { mg } \) (dry cell weight)을 \( 10 \mathrm { ml } \) 의 \( 100 \mathrm { mM } \) 인산완충액 \( ( \mathrm { pH }~8.0 \))에 현탁시킨 후 \( 0.5 - 20 \mathrm { mM } \) 농도로 다양한 라세믹 에폭사이드 기질을 주입하였다. 반응기로는 screw-cap 플라스크 또는 jacketed glass 효소반응기를 사용하였으며, \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } , 250 \mathrm { rpm } \) 에서 교반시키면서 반응을 진행시켰다. 반응용액을 cyclohexane으로 추출한 후, 유기용매 층을 GC로 분석하여 enantiomeric excess (ee = \( \left . \frac { (S-R) } { (S + R) } \times 100( \%) \right ) \) 값 및 EH 활성을 평가하였다. 기질인 라세믹 styrene oxide 및 광학적으로 순수한 (R)- 및 (S)-styreneoxide 표준품은 시약 등급을 구입하여 사용하였다. 광학활성 styrene oxide의 \( e e \) 값 및 수율을 계산하기 위하여 \( (R) \)-이성질체와 (S)-이성질체에 대한 분리능이 있는 Supelco사 (Pennsylvania, USA)의 B-Dex 120\((0.25 \mathrm { ~mm } \) ID, \( 30 \mathrm { ~m } \) length, \(25 \mu \mathrm { m } \) film thickness) 컬럼을 사용하였으며 split ratio는 \(1:100\), flow rate는 \( 0.5 \mathrm { ml } / \mathrm { min } \) 으로 \( 1 \mathrm { ml } \) 의 시료를 주입하여 분석하였고, column, injector 및 detector의 온도는 각각 \(100 , 220 , 220 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 이었다.</p>