이 연구는 RLKs(Receptor-Like Kinases)의 단백질 서열을 분석하고, RLKs를 암호화하는 RLGs(Receptor-Like Genes)의 발현 변화를 mRNA 수준에서 확인하여, 벼의 RLK 유전자가 다양한 스트레스(저온, 염, 호르몬 처리, 인위적 상처 등)에 대응하는 분자적 특성을 파악하였다. 특히, RLGs가 저온 스트레스에 대한 저항성을 보임으로써, 이 결과는 냉해에 대한 저항성을 갖는 신 품종 개발에 분자생물학적 근거를 제공할 수 있을 것이다.
<h2>상처 처리 후 Recptor like kinase genes (RLGs)의 quantitative real-time PCR</h2> <p>식물의 상처는 자연적인 바람, 재배를 위한 인간의 행동 그리고 곤충에 의해서 입게 되며, 이러한 상처는 식물의 생산성에 영향을 주는 요인으로 작용한다 (Kreps et al. 2002). 따라서 상처에 따른 receptor like kinase genes (RLGs) 발현 변화를 확인 하기 위해, 벼에 인위적인 상처를 줌으로써 RLGs발현 변화를 확인하였다.</p> <p>파종 후 14일 배양된 낙농벼에 멸균된 바늘을 사용하여 잎에 상처를 주고 이전 실험과 같이 각 4 시간과 24 시간 배양한 후 RNA를 추출하였다. 추출된 total RNA를 사용하여 역전사 반응을 통해 cDNA 를 제작하였으며, 이 cDNA 를 주형으로 낙농벼의 염기서열을 바탕으로 설계된 Q-primer쌍을 사용하여 quantitative real-time PCR (QRT-PCR)을 수행하였다.</p> <p>본 과정에서도 QRT-PCR 에서 얻어진 각 RLGs의 threshold cycle \( \left(\mathrm{C}_{T}\right) \) 의 수치를 상온에서 배양된 대조군의 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값과 비교하고, 대조군의 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값에서 각 RLG 의 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) 값을 빼어(대조군 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) - 상처 처리 \( \mathrm{C}_{\mathrm{T}} \) ) 발현 변화를 확인하였다 (Fig. 7).</p> <p>상처에 대한 발현 변화는 몇 몇의 RLGs에서 확인 가능하였다. RLG 1, #6, 18, 20 의 경우 4 시간 후에는 뚜렷한 변화를 보이지 않았으나, 24시간 후에 발현이 감소하는 것으로 나타났다. 4개의 RLGs를 제외한 유전자에서는 4시간과 24시간 후에는 대조군과 같은 수준의 발현을 보였다. 이는 상처에 대한 기준이 확실 하지 않아 얻어진 결과로 판단되었으며, 따라서 이에 따른 추가적인 실험을 수행해야 할 것으로 사료된다.</p> <p>식물의 Receptor like kinase (RLK) 단백질들은 signal sequence, single transmembrane region, cytoplasmic kinase 도메인으로 구성되어 있으며, RLK genes (RLGs)은 호르몬 반응 경로, 세포 분열, 식물의 성장과 발달, 자가 불수분 그리고 공생과 병원균 인식과 연관 되어 있다는 가능성은 이전 연구들에 의해서 보고되고 있으나, 주요 작물의 하나인 벼의 RLK에 대한 연구는 미비한 실정이다.</p> <p>본 연구에서는 RLKs의 단백질 서열을 기반으로한 분석을 수행하여, 단백질간의 차이를 확인하였으며, 또한 RLKs를 암호화하는 RLGs의 발현 변화 mRNA 수준에서 확인하였다. 실험을 통해 확보된 RLGs (RLG1, RLG5, RLG6, RLG#6, RLG8, RLG10, RLG17, RLG18, RLG20)의 발현 변화를 real-time PCR을 사용하여 분석하였으며, threshold cycle \( \left(\mathrm{C}_{T}\right) \) 수치의 비교를 통해 발현 변화를 비교하였다. RLGs의 발현 변화는 벼의 기관을 나누어 확인하였으며, 식물의 생장 및 생산성에 영향을 주는 주요 스트레스 (저온, 염분, 미생물 감염, 상처)에 의한 변화를 확인함으로써 그 기능에 대한 정보를 분석하였다.</p> <p>벼의 receptor like kinase (RLK)의 아미노산 서열 분석 결과에서 일부 도메인으로 판단되는 위치를 제외한 부분에서 상당히 낮은 유사성을 보였으며 (Fig. 1), 유전자 분석 프로그램을 통해 제작된 phylogenetic tree에서도 3 개의 그룹으로 분리되는 성향을 보여 (Fig. 2), 단백질 간의 차이 확인이 가능하였다. 이러한 결과에서 각각의 RLGs가 상당히 다양한 신호를 인지 할 것으로 예상되었으며, 이를 통해 단백질 서열 상에서도 큰 차이를 보이는 벼 유래 RLKs에 대해 그 각각의 기능을 분석하기 위한 연구가 분자수준에서 연구되어야 할 것으로 판단되었다.</p> <p>Real-time PCR 을 적용한 RLGs의 발현 분석 결과에서 각 유전자는 잎에서 가장 많이 발현되는 것으로 확인 되었으며, 다음으로는 뿌리에서 발현 되는 것을 확인하였다 (잎>뿌리>줄기, Fig. 3). 실험의 결과를 통해 이 후 스트레스에 따른 RLK 유전자 발현 변화 실험은 잎을 사용하여 수행하였다.</p> <p>식물체가 성장하면서 받는 스트레스는 식물의 성장에 큰 영향을 미치며, 특히 주요작물의 수확량의 \( 50 \% \) 를 감소시킨다고 보고 되었다. 따라서 현재 스트레스에 대한 저항성을 갖는 식물체를 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에서는 벼에 존재하는 RLK 유전자가 외부 스트레스에 대하여 어떠한 분자적인 특징을 갖는지 알아보고자 하였다. 스트레스로는 물리적 스트레스인 저온 (low temperature), 화학적 스트레스에 해당되는 염 (salts, NaCl ) 그리고 병원체의 침입에 따른 스트레스에 관여되는 호르몬 처리 (salicylic acid, SA), 인위적 상처 (artificial wound)를 선정하였으며, real-time PCR을 사용하여 각 유전자의 발현을 측정하여 결과를 확인하였다.</p> <p>저온의 환경에서 RLG5를 제외한 모든 유전자가 4 시간과 24 시간에서의 발현 변화에는 차이가 있지만, 시간이 지날수록 발현이 증가하였다 (Fig. 4). 이 결과로 저온에서 벼의 항상성을 유지하기 위해 RLGs가 과발현 된다는 사실을 확인하였으며, RLGs가 과발현된 벼는 저온에 대한 저항성을 갖게 될 수 있을 것이라 예상되었다. 다음으로 염에 대한 반응은 NaCl 을 처리함으로써 확인하였으며, 처리에 따라 RLGs 모두 발현이 감소되었으나 4시간 후와 비교하여 24시간 후에는 어느 정도의 발현양이 회복되는 것을 확인하였다 (Fig. 5). 저온에서 RLGs발현이 증가한 것은 온도 저항성을 갖는다는 가능성 보여 주었으나, 염에 대해서는 반대로 발현이 감소하는 것으로 보아 이는 RLGs가 염에 대해서 저항성을 갖지 않는 다는 것으로 해석 되었다.</p> <p>병원균 감염에 대한 반응을 나타내는 호르몬인 SA 와 인위적인 상처에 대해서는 각 RLGs에 따라 발현 변화가 다르게 나타났다. 두 스트레스에 대해 먼저 4시간 후 각 RLGs의 발현은 감소하였으나, 24 시간 후에 SA에 대해서는 감소됐던 발현이 회복되는 것을 확인 할 수 있었으나 (Fig. 6) 상처에 대해서는 더 억제되는 양상을 보이는 유전자가 많았다 (Fig. 7).</p> <p>따라서 본 실험 결과 RLGs중에서도 외부 영향에 따라 발현이 증가 또는 감소에 대한 반응이 다르게 나타냈으며, 이는 RLGs에 따라 인식하고 반응하는 것이 다르다는 것을 나타낸다는 것을 의미한다 하겠다.</p> <p>본 연구 결과 스트레스에 의한 RLGs는 다양한 스트레스 중 저온에 대한 저항성을 가진다는 가능성을 제시하며, 냉해 등에 대한 저항성을 갖는 신 품종 개발을 위한 분자생물학적 자료로서 본 연구의 결과가 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.</p>