크로마틴 내 특정 DNA 부분의 결합 상태와 근접성을 조사하는 3C 기법은 고정된 크로마틴의 DNA를 제한효소로 절단 후 재연결하여 DNA 부분들의 연결 빈도를 측정한다. 이 연결 빈도는 real-time PCR을 이용하여 정량화되며, 이는 DNA의 위치 관계와 결합 상태를 이해하는 데 중요한 역할을 한다.
<h1>3C 기법의 실험 원리</h1> <p>3C기법은 살아있는 세포를 포름알데히드(formaldehyde)로 고정시킨 후, 크로마틴 상태에서 두 DNA 부분들 사이의 물리적 근접성을 측정하는 것이다. 세포를 \( 1 \% \) 내외의 포름알데히드 용액에 10분 정도 처리하면 핵 내의 DNA와 단백질, 그리고 단백질과 단백질 사이의 결합은 그대로 고정되고, 일반적인 실험 조건에서 안정적으로 유지된다. 이때 고정된 복합체는 특정 DNA 한 부분과 단백질들로 이루어질수도 있고, 두 개 이상의 DNA 부분을 포함하고 있을 수도 있다. 따라서 고정된 복합체를 분석하면 세포 내에서 특정 DNA부분이 어떤 단백질과 결합하고 있는지(항체를 이용한 분석 기법이 chromatin immunoprecipitation, ChIP임), 또 어떤 DNA 부분과 가까운 거리에 위치하고 있는지 밝혀낼 수 있다.</p> <p>3C 기법은 고정된 크로마틴의 DNA를 제한효소(restriction enzyme)로 자르고 다시 연결함으로써 특정 DNA 부분 사이의 연결 빈도를 측정하여 이들 DNA 부분의 물리적 근접성 또는 결합 상태를 조사한다. 점착성 말단(stick end)을 생성하는 제한효소로 고정된 크로마틴의 DNA를 자른 후 연결효소(ligase)를 이용하여 다시 붙이면 한 복합체 내에 고정된 DNA절편들은 높은 빈도로 연결될 것이다. 그러나 복합체 안에 고정되지 않은 DNA는 절단된 후 흩어져버리기 때문에 복합체에 포함된 DNA 부분과 염기서열 상에서 가깝게 위치하더라도 다시 연결될 가능성이 희박하다. 즉 염기서열 상에서 멀리 떨어진 인핸서와 표적유전자의 프로모터가 크로마틴 상에서 물리적으로 가까이 위치할 경우, 제한효소에 의한 절단 후,직접 연결될 가능성은 중간에 끼인 DNA 절편들보다 훨씬 높다. 이렇듯 염기서열 상의 거리와 상관없이 공간적 개념에서 근접성을 반영하는 DNA 절편들의 결합 빈도는 고리 구조를 포함한 크로마틴의 입체적 조직적 구성을 보여줄 수 있다.</p> <p>3C 기법은 절단 후 연결된 DNA들을 PCR 기법으로 확인하며, real-time PCR을 통해 연결 빈도를 정량적으로 측정한다. 각 제한효소는 특정한 DNA 절편들을 생성하며, 각 절편의 안에 프라이머를 디자인하여 PCR을 수행하면 특정 두 DNA 절편이 연결되어 게놈상에는 존재하지 않는 새로운 DNA가 만들어졌는지 확인할 수 있다. 이때 특정 제한효소에 의해 생성되는 모든 점착성 말단은 염기쌍 형성이 가능한 동일한 구조를 가지고 있음으로 각 DNA 절편의 모든 말단들은 서로 연결될 수 있는 가능성을 가지고 있다. 따라서 각 DNA 절편들의 기본적인 연결 빈도는 일반적으로 분석하고자 하는 유전자 또는 좌위가 포함된 플라스미드(plasmid) DNA를 고정하지 않고 제한효소로 자른 후 다시 연결하여 대조군(control)으로 사용함으로써 보정된다. 또한 각 실험상의 연결 효율 차이는 대조군 유전자에 PCR 프라이머를 디자인하여 연결 빈도를 측정함으로써 보정한다. 따라서 측정된 연결 빈도는 특정 두 DNA사이의 공간적 거리를 반영하며, 입체적 근접성을 보여 준다.</p>