환원당 생성량과 점도 측정으로 분리해낸 colony를 16S rDNA 염기서열을 구해 NCBI blast로 동정하고, 분리동정된 cellulose 분해미생물의 최적 생육조건은 각 조건하에서의 흡광도로 반복 측정 확인하며, cellulose 분해 조효소액의 특성은 \( \mathrm{pH} \)와 온도 및 CMC 농도 그리고 CMC분해능을 측정 이후, 실험결과는 SAS program를 이용하여 통계처리 분석 후 항목들 간의 유의적 차이를 p값이 0.05미만인 수준에서 검정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>본 실험에 사용한 기질은 carboxyl methyl cellulose (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하였으며, 배지는 marine broth (MB, Difco, Detroit, MI, USA) 및 marine agar (MA, Difco)를 사용하였다.</p> <h2>Cellulose 분해 미생물의 분리 및 동정</h2> <p>Cellulose 분해 미생물은 부산의 송정 연안에서 분해중인 해조류 및 그 주변 해수를 채집하였으며, 멸균된 \( 2 \% \mathrm{NaCl} \) phosphate buffer (\(\mathrm{pH}7.4\))를 이용하여 해수 및 해조류를 희석하였다. 희석액은 MA 배지에 분주. 도말 후, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 배양하였으며, 생성된 colony를 확인하고 형태적으로 다른 colony를 선택하였다. 선택된 균주는 cellulose 분해 활성 측정을 위하여 균체 배양액과 carboxyl methyl cellulose (CMC)를 1:1로 혼합하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양 후, 환원당 생성량 및 점도 측정으로 cellulose 분해능을 확인하였다. 이 중 cellulose 분해능이 우수한 단일 colony는 염기서열 분석을 (주)마크로젠(Seoul, Korea)에 의뢰하여 16S rRNA sequence analysis로 분석하여 16S rDNA 염기서열을 구하여 NCBI blast를 통해 동정하였다.</p> <h2>분리·동정된 Cellulose 분해 미생물 생육조건 확인</h2> <p>분리·동정된 알긴산 분해 미생물의 최적 \( \mathrm{pH}, \mathrm{NaCl} \) 농도, 배양온도 및 배양 시간 조건을 확인하기 위해, 각 조건에서 균을 배양한 후, \( 600 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 2회 반복 측정하였다. MB 배지를 기본 배지로 사용하였으며, 균은 \( 10^{6} \mathrm{cfu} / \mathrm{ml} \) 농도로 배지 \( 5 \mathrm{ml} \)당 \( 100 \mu \mathrm{l} \)씩 접종하였다. \( \mathrm{pH} \) 확인을 위해 MB 배지를 \( 0.1 \mathrm{N} \) 및 \( 1 \mathrm{N} \mathrm{HCl} \)과 \( 0.1 \mathrm{N} \) 및 \( 1 \mathrm{N} \mathrm{NaOH} \)로 \( \mathrm{pH} 2-10 \)으로 조정하였으며 균을 접종 후, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양하였다. 최적 \( \mathrm{pH} \)로 조정한 MB 배지의 \( \mathrm{NaCl} \) 농도를 \(2-7\%\)로 조정한 후, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양하여 \( \mathrm{NaCl} \) 농도 조건을 확인하였고, 또한 최적 \( \mathrm{pH} \) 및 \( \mathrm{NaCl} \) 농도로 조정한 MB 배지에 균을 접종 후, 배양 온도를 \( 10-40^{\circ} \mathrm{C} \)로 달리하고 24 시간 배양하여 최적 온도 조건을 확인하였고, 최적 \( \mathrm{pH}, \mathrm{NaCl} \) 농도 및 온도조건에서 균을 72시간까지 배양하며 최적 배양 시간조건을 확인하였다.</p> <h2>Cellulose 분해 조효소액 제조</h2> <p>분리 - 동정된 cellulose 분해균을 최적 생육 조건으로 대량 배양 후, 원심분리기(SUPRA 22K, Hanil Science Co., Seoul, Korea)로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 12,000 \times \mathrm{g}, 30 \mathrm{min} \) 조건으로 원심 분리하여 상층액을 조효소액으로 하였다.</p> <h2>Cellulose 분해 조효소액의 특성 확인</h2> <p>분리◦동정된 cellulose 분해균으로부터 얻은 cellulose 분해 조효소액의 초기 \( \mathrm{pH} \), 온도, CMC 농도 및 배양 시간 특성을 확인하였으며, CMC 분해능은 점도 및 환원당 함량을 측정하였다. 점도 측정은 점도계(LVLTDV-II, Brookfield Co., Middleboro, MA, USA)를 이용하여 Stevens와 Levin의 방법을 참고하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 각 조건별로 측정하였다. 환원당은 Somogyi-Nelson법[16]으로 \( 520 \mathrm{nm} \)에서 표준당 (glucose)으로 작성한 검량곡선으로부터 환원당 함량을 측정하였다. 최적 \( \mathrm{pH} \) 조건을 확인하기 위해 \( 0.1 \mathrm{N} \) 및 \( 1 \mathrm{N} \mathrm{HCl} \)과 \( 0.1 \mathrm{N} \) 및 \( 1 \mathrm{N} \mathrm{NaOH} \)를 이용하여 \( \mathrm{pH} 2-10\)까지 조정하였으며, CMC 와 조효소액을 1:1 혼합 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양하여 실험하였다. 최적 \( \mathrm{pH} \) 조건에서 온도를 \( 10-40^{\circ} \mathrm{C} \) 로 달리하여 CMC와 조효소액 1:1 혼합물을 24시간 배양한 후 최적 온도 조건을 확인하였으며, 최적 CMC 농도를 확인하기 위해 \(1-11\%\) 농도의 \( \mathrm{CMC} \) 를 \( \mathrm{pH} 8 \) 및 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 조건에서 24시간 배양하여 실험하였다. 또한 최적 시간 조건을 확인하기 위해 최적 \( \mathrm{pH} \), 온도 및 CMC 농도 조건으로 72시간까지 배양하며 실험하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>실험 결과의 통계처리는 SAS program (Statistical analytical system V8.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 분산 분석한 후 Ducan의 다중검정법으로 \( p<0.05 \) 수준에서 항목들 간의 유의적 차이를 검정하였다.</p>