엽실들깨는 온실에서 재배된 후 형질전환 실험의 대상으로 선택되었다. 재료로 사용된 종자들은 멸균된 필터 페이퍼를 이용하여 건조시킨 후, \( 1 / 2 \) MS 배지에 파종되었으며, 6-8일 동안 배양 후 절단된 배축은 크기가 \( 0.5 - 1 \mathrm{~cm} \) 정도가 되도록 설정되었다. 이들은 이후 형질전환의 출발점인 explant로 사용되었다. 형질전환의 구체적인 방법은 pMOG6-Bar 운반체의 bar 유전자를 HindIII로 절단 후, pCambia 2300에 클로닝하는 것으로, 이를 통해 kanamycin 저항성 npt II와 제초제 저항성 bar 유전자를 포함한 pCK-Bar 운반체를 생성하였다. 이 운반체의 DNA는 Agrobacterium tumefaciens EHA105에 삽입되어, 엽실들깨의 형질전환에 활용되었다. 최종적으로, 형질전환된 들깨의 재분화개체들은 Southern blot을 통해 확인되었으며, 들깨의 genomic DNA는 mCTAB 방법으로 분리되었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물재료</h2> <p>온실에서 재배한 엽실들깨 (Perilla frutescens var japonica H. var Yeupsil)를 형질전환의 재료로 사용하였다. 들깨 (엽실) 종자를 \( 70 \% \) 에탄올에 1 분간 침지하고 멸균수로 3회 세척한 후 \( 50 \% \) 락스에 20 분간 침지한 다음에 멸균수로 3-4회 세척하였다. 종자를 멸균된 filter paper를 이용하여 건조시킨 후 \( 1 / 2 \) MS 배지에 파종하고 6-8일 동안 배양한 후 배축을 \( 0.5 - 1 \mathrm{~cm} \) 정도의 크기로 절단한 것을 explant로 사용하였다.</p> <h2>형질전환에 사용한 운반체</h2> <p>선발 마커로 hygromycin 저항성 유전자 hpt와 제초제저항성 유전자인 bar를 가진 pMOG6-Bar 운반체와 kanamycin 저항성 유전자 npt II와 제초제저항성 bar 유전자를 가진 pCK-Bar 운반체를 이용하였다. pMOG6-Bar 운반체는 연구소에서 사용하던 것을 이용하였으며 pCK-Bar 운반체는 pMOG6-Bar 운반체의 bar 유전자를 HindIII로 절단 한 후 pCambia 2300에 클로닝하여 kanamycin 저항성 npt II와 제초제 저항성 bar 유전자를 가진 pCK-Bar 운반체를 만들었다. 작성된 형질전환용 운반체 DNA는 Agrobacterium tumefaciens EHA105에 삽입하여 들깨 형질전환용으로 사용하였다.</p> <h2>들깨 형질전환</h2> <p>운반체 pMOG6-Bar와 pCKBar 유전자가 들어있는 Agrobacterium tumefaciens EHA 105 를 rifampicin \( (50 ~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 과 kanamycin \( (50 ~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 과 이 포함된 YEP 배지에서 seed culture한 후 \( 1 \% \) 배양액을 접종하여 20 시간 정도 배양하였다. 배양된 Agrobacterium 을 \( \left(\mathrm{OD}_{600}=1\right) 5,000 ~ \mathrm{rpm} \) 에서 5 분 정도 원심 분리하여 배양액을 제거한 후 호르몬이 없는 액체배지로 약 20 배 희석한 후 6-8 일 배양한 들깨 배축과 아그로박테리움을 1 시간 감염시켰다. 세균을 감염 후 멸균된 filter paper에 배축을 놓고 건조 후 공동 배양 배지 (MS 기본배지, \( 3 \% \) sucrose, \( 3 ~ \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) BAP, \( 0.4 \% \) gelrite)에서 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \), 3 일간 Agrobacterium과 식물체를 공동 배양하였다. 공동 배양한 explant에서 표면에 있는 Agrobacterium을 제거하기 위하여 cefotaxime \( 250 ~ \mathrm{mg} / \mathrm{l} \) 가 첨가된 MS 배지에서 세척한 후 멸균된 종이에 올려 외부의 수분을 제거한 뒤 shoot를 유도하는 선발배지 (MS 기본배지, \( 3 \% \) sucrose, \( 3 ~ \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) BAP, \( 0.01 ~ \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) NAA, \( 0.4 \% \) gelrite, \( 125 ~ \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) kanamycin 또는 \( 15 ~ \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) hygromycin, \( 500 ~ \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) carbenicillin, \( \mathrm{pH} ~ 5.6 \))에 옮겨서 형질전환된 배축에만 shoot가 유도되도록 하였다. 선발배지는 2주 또는 3주마다 새로운 배지로 계대배양을 하면서 형질 전환된 shoot 부분만을 절단하여 2차 선발배지 (MS 기본배지, \( 3 \% \) sucrose, \( 3 ~ \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) BAP, \( 0.4 \% \) gelrite, \( 1.2 ~ \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) PPT, \( 500 ~ \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) carbenicillin, \( \mathrm{pH} ~ 5.6 \)) 에서 선발한 후에 뿌리 유도배지 (\( 1 / 2 \) MS 기본배지, \( \mathrm{pH} ~ 5.8 \)) 에서 뿌리의 형성을 유도하였다. 위와 같은 방법들을 이용하여 선발한 재분화개체들 중 뿌리가 발달된 개체들은 배양병에서 꺼내서 뿌리를 물로 잘 수세하여 플라스틱의 순화용기에서 멸균된 질석 (vermiculite)에 이식하여 순화하고 온실에서 재배하였다</p> <h2>형질전환체의 검정</h2> <p>재분화개체의 형질전환여부를 확인하기 위하여 Southern blot을 수행하였으며 들깨의 genomic DNA 는 mCTAB 방법에 따라 분리하였다. 분리된 DNA를 HindⅢ 제한효소로 절단하여 \( 0.8 \% \) agarose gel에 전기영동 하고 전기영동이 끝난 gel은 capillary transfer 방법으로 nylon membrane에 전이시켰다. Membrane을 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 hybridization 용액 (\( 0.5 ~ \mathrm{M} \) \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{PO}_{4} \) \( \mathrm{pH} ~ 7.2 \), \( 1 \% \) BSA, \( 7 \% \) SDS, \( 100 ~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) salmon-sperm DNA)에 3 시간 동안 prehybridization한 후, radioactive probe \( \left(\mathrm{P}^{32}\right) \) 를 이용하여 하루 동안 hybridization 하였다. Probe는 specific primer를 이용하여 hpt, nptⅡ와 bar 유전자를 PCR로 증폭한 후 elution 하여 사용하였다. Hybridization 이 끝난 membrane은 \( 2 \times \) SSC / \( 0.1 \% \) SDS (\( 65^{\circ} \mathrm{C} \)) 용액에서 10 분, \( 1 \times \) SSC / \( 0.1 \% \) SDS용액 (\( 65^{\circ} \mathrm{C} \)) 에서 20 분 세척 한 후 Bio-imaging analyzer (BAS-2000; Fuji Photo Film, Tokyo, Japan)로 분석하였다.</p> <p>유전자의 발현 정도를 확인하기 위하여 Northern blot을 수행하였으며 형질전환된 들깨 잎으로부터 total RNA의 분리는 Smith 등의 방법에 따라 수행하였으며 probe로는 bar 유전자를 사용하였다. 분리된 total RNA \( 10 ~ \mu \mathrm{g} \) 을 \( 1 \% \) formaldehyde agarose gel에 전기영동 한 다음 capillary transfer 방법으로 nylon membrane에 전이시켰다. Hybridization 반응과 membrane의 세척은 Southern 분석과 같은 방법으로 실시하였다.</p> <h2>후대 검정</h2> <p>유전자도입과 발현이 확인된 들깨 형질전환체의 T1 종자를 100 개체씩 온실에 파종하여 잎이 4-6엽 정도 되었을 때 \( 0.3 \% \) 의 바스타 제초제를 살포하였으며 형질전환체의 생존 여부에 따라서 제초제에 대한 저항성개체와 감수성개체로 판별하였으며 분리비는 \( \chi^{2} \) 검정에 준하여 추정하였다.</p>