glutamate에 의한 산화적 스트레스에 의한 뇌세포 손상은 퇴행성 뇌질환의 주요 원인으로 알려져 있기 때문에 본 연구에서는 10종의 한약재 추출물을 6종 균주로 발효하여 글루타메이트로 유발한 세포 독성에 대한 뇌세포 보호 효과를 보았다. 실험결과, 발효된 붉나무와 황련 추출물이 세포 보호효과가 확인되었고, 붉나무의 경우 발효 전 후 효과가 현저히 증가하였으므로 이를 이용하여 다양한 활성 실험을 진행하였다. ROS 억제효과를 측정한 결과 발효된 붉나무 추출물이 농도 의존적으로 ROS 생성억제효과를 나타내었고, HO-1 단백질 발현에 중요한 인자인 Nrf2 전사 효과를 확인한 결과 발효된 붉나무 추출물이 Nrf2를 핵 내로 전사시켜 HO-1을 발현하여 산화적 독성으로부터 세포를 보호함을 확인했다.
<h1>결 과</h1><h2>뇌세포 보호활성 및 활성산소종(ROS) 생성 억제 효과</h2><p>산화적 스트레스에 의한 세포 손상은 파킨슨 증후군, 헌팅턴 증후군, 알츠하이머 증후군 등과 같은 퇴행성 뇌질환의 중요한 요인으로 알려져 있으며, 그 중에서 glutamate에 의한 산화적 스트레스로 유발되는 뇌세포 손상은 퇴행성 뇌질환의 주요한 요인으로 보고되고 있다. 따라서 본 연구에서는 10종(구기자, 금은화, 길경, 단삼, 오미자, 붉나무, 정향, 치자, 황금, 황련) 한약재 메탄올 추출물을 Lactobacillus spp. 균주 6가지로 발효하여 총 70개의 샘플을 이용하여 글루타메이트로 유발한 세포 독성에 대한 뇌세포 보호 효과를 살펴 보았다. 그 결과 Lb. brevis KCTC 3498에 의해 발효된 붉나무의 ethylacetate 추출물은 HT22 세포에 \(50, 200 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)로 처리 시 \(75, 85 \% \)의 세포 보호효과가 있었으며, 발효 전 메탄올 추출물에 비해 증가한 보호효과를 보였다. 또한, 황련 메탄올 추출물과 황련 Lb. brevis KCTC 3545 발효된 추출물의 \( 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도에서 각각 \( 50 \% \)와 \( 69 \% \)의 세포 보호 효과가 있었다. 다른 8종의 한약재는 메탄올 추출물을 비롯한 발효된 추출물 모두에서 보호 효과가 없었다(결과 생략). 양성대조약물로는 \( 50 \mu \mathrm{M} \)의 Trolox를 사용하였다. 이 결과를 바탕으로 붉나무의 경우 발효전 메탄올 추출물에 비해, 발효 후 에틸아세테이트 추출물의 보호 효과가 현저하게 증가 했으므로 붉나무를 이용한 추출물을 가지고 다양한 활성 실험을 진행하였다.</p><p>Lb. brevis KCTC 3498로 발효시킨 붉나무의 ethyl acetate 추출물은 높은 뇌세포 보호활성을 나타내어 처리 농도에 따른 뇌세포 보호활성 및 활성산소종(ROS) 억제 효과를 측정하였다. 그 결과 Fig. 1A와 1B에서 보는 바와 같이 Lb. brevis KCTC 3498로 발효시킨 붉나무의 ethyl acetate 추출물이 유의한 뇌세포 보호활성 및 ROS 생성 억제 효과를 나타내었으며, 이를 바탕으로 처리 농도를 \(25, 50, 100\)과 \( 200 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)로 조절하여 메탄올 추출물과 비교 하였다. Fig. 1C와 1D에서 보는 바와 같이 Lb. brevis KCTC 3498로 발효시킨 붉나무의 ethyl acetate 추출물은 붉나무의 메탄올 추출물보다 뇌세포 보호활성 및 ROS 생성억제 효과가 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.</p><h2>Heme oxygenase-1 발현 및 Nrf2 전사 효과</h2><p>Lactobacillus spp. 균주로 발효한 붉나무의 ethyl acetate 추출물에 의한 HO-1 발현은 western blot analysis를 수행하여 확인하였다. Fig. 2A 에서 보는 바와 같이 Lb. brevis KCTC 3498로 발효한 ethyl acetate 추출물이 발효 전 붉나무 methanol 추출물과 다른 균주로 발효한 붉나무의 ethyl acetate 추출물보다 높은 HO-1의 발현을 확인하였다. HO-1의 발현을 증가시킨 Lb. brevis KCTC 3498로 발효한 붉나무의 ethyl acetate 추출물은 농도를 \(25, 50, 100\)과 \( 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)로 조절하여 HO-1의 발현을 확인하였다. 그 결과 발효한 붉나무의 ethyl acetate 추출물의 HO-1 발현은 Fig. 2B와 2C에서 보는 바와 같이 발효 전 붉나무의 methanol 추출물보다 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. Nrf2는 HO-1 단백질 발현에 관여하는 메커니즘 중 핵 내로의 전사 에서 매우 중요한 인자로 작용한다고 알려져 있다. 전사인자로서의 Nrf2는 HO-1과 같은 항산화 단백질 유전자에 존재하는 antioxidant response element (ARE)에 결합하여 이들 유전자의 발현과 단백질 생성을 항진시킴으로써 산화적 스트레스에 대한 생체방어기전의 핵심적 역할을 담당한다. Lb. brevis KCTC 3498로 발효한 붉나무의 ethyl acetate 추출물에 의한 Nrf2의 핵 내 전사 여부는 추출물을 \( 200 \mu \)\( \mathrm{g} /\mathrm{ml} \) 농도로 하여 시간별로 처리한 후 western blot을 이용하여 확인하였다. 시간이 경과함에 따라 세포질의 Nrf2는 점점 감소하는 반면, 핵 내부의 Nrf2는 증가하는 양상을 보였다. 이러한 결과를 통해 Lb. brevis KCTC 3498로 발효한 붉나무의 ethyl acetate 추출물이 HT22 세포에서 Nrf2를 핵 내로 전사시켜 HO-1을 발현시킴으로써 glutamate로 유도된 산화적 독성으로부터 세포를 보호하는 것으로 사료된다.</p><h2>Heme oxygenase-1 발현에 따른 뇌세포보호 효과 및 ROS 생성 억제 효과 측정</h2><p>Lb. brevis KCTC 3498 로 발효시킨 붉나무의 ethyl acetate 추출물의 뇌세포 보호 효과가 HO-1의 발현유도와 직접적인 관련이 있는지를 확인하기 위해 HO-1 발현 억제제인 SnPP를 처리한 후 세포 생존율 및 ROS 생성 억제 효과를 확인하였다. Fig. 4에서 보는 바와 같이 SnPP를 처리하지 않은 시험군은 Lb. brevis KCTC 3498로 발효한 붉나무 ethyl acetate 추출물의 농도 증가에 비례하여 세포 생존율 및 ROS 생성 억제 효과가 증가하였으며, SnPP를 처리한 군은 Lb. brevis KCTC 3498로 발효한 붉나무의 ethyl acetate 추출물을 단독으로 처리하였을 때보다 감소하였다. 이러한 결과는 Lb. brevis KCTC 3498로 발효한 붉나무의 ethyl acetate 추출물 glutamate로 유도된 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하는데 있어 HO-1 단백질의 발현과 관련이 있음을 나타낸다.</p>