세계적으로 석유자원을 대체할 수 있는 바이오 연료에 대한 관심이 급증하고 있는데 bioethanol은 생산성과 생산수율이 높아 경제적으로 생산할 수 있고, 인화성이 좋을 뿐만 아니라 가솔린과 혼합하여 이용할 수 있기 때문에 석유자원의 대체연료로 각광받고 있다. 따라서 본 연구에서는 산업용 및 실험실용 효모의 생장속도, ethanol stress에 대한 내성 및 생존능력을 정량적으로 비교하고, ethanol 생산에 관련된 특성을 비교 분석함으로써 산업적인 ethanol의 생산에 도움을 주기 위한 기초연구를 수행하였고, JHS100과 JHS200은 internal transcribed spacer (ITS) region의 염기서열을 분석하여 S. cerevisiae임을 확인하였다.
<h1>서 론</h1> <p>세계적으로 화석연료의 고갈과 이산화탄소 배출에 의한 지구온난화로 인해 석유자원을 대체할 수 있는 바이오 연료에 대한 관심이 급증하고 있다. 이 중, bioethanol은 생산성과 생산수율이 높아 경제적으로 생산할 수 있고, 인화성이 좋을 뿐만 아니라 가솔린과 혼합하여 이용할 수 있기 때문에 석유자원의 대체연료로 각광받고 있다. 이러한 분위기 속에서 미국과 브라질은 전분계 바이오매스를 이용한 bioethanol의 생산기술을 가장 먼저 상용화하였다. 하지만 주요식량자원인 옥수수와 사탕수수 등이 bioethanol 생산의 원료로 이용되면서 가격이 급등하였고 개발도상국의 기아문제와 맞물려 윤리적 갈등을 야기하였다. 따라서 이를 대체할 수 있는 바이오매스를 찾고자 연구가 활발히 진행되고 있다. 카사바(Manihot esculenta)는 열대성 덩이뿌리 작물로 가격이 매우 저렴하고 재배와 당화가 용이할 뿐만 아니라 식량자원으로의 이용도가 낮기 때문에 여러 나라에서 bioethanol의 원료로 이용하기 위한 연구들이 시도되고 있다.</p> <p>한편, 원료수급 이외에도 또 하나의 중요한 요소인 생산 균주의 측면에서 ethanol 발효성능이 가장 뛰어나다고 알려진 알코올효모 Saccharomyces cerevisiae를 이용하여 ethanol의 수율과 생산성을 향상시키기 위해 방대한 양의 유전적 생리학적 연구들이 진행되어 왔다. 실제로 이러한 연구들을 통해 ethanol, 고온, 고농도의 당에 대한 내성 및 ethanol 생산능력이 향상된 다수의 효모들이 개발되었으나 이 효모들은 세포를 재사용하는 산업적인 조건에서는 향상된 발효능력이 소실되었기 때문에 산업적으로 이용할 수 없었다. 그에 따라 현재 산업적인 bioethanol의 생산에는 무작위 돌연변이를 통하여 ethanol 발효성능을 향상시킨 S. cerevisiae 변이주가 주로 이용되고 있는뎨, 아직까지 이러한 산업용 알코올 효모에 대한 연구는 미미한 실정이다. 따라서 본 연구 에서는 산업용 및 실험실용 효모의 생장속도, ethanol stress에 대한 내성 및 생존능력을 정량적으로 비교하고, 카사바 당화액을 이용한 회분식 발효공정을 통해서 ethanol 생산에 관련된 특성을 비교 분석함으로써 산업적인 ethanol의 생산에 도움을 주기 위한 기초연구를 수행하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 배양조건</h2> <p>실험실용 효모인 S. cerevisiae CEN.PK2-1D와 (주)진로로부터 제공받은 산업용 효모인 S. cerevisiae JHS100과 JHS200을 이용하였다. JHS100과 JHS200은 internal transcribed spacer (ITS) region의 염기서열을 분석하여 S. cerevisiae임을 확인하였다. 모든 균주는 \(70 \% \mathrm { (v/v) } \) YPD배지 \( (20 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) peptone, \( 10 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) yeast extract, \( 20 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) glucose)와 \( 30 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) glycerol으로 구성된 혼합용액에서 \( -70 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 보관하였고, \( 5 \mathrm { ~mL } \) YPD 배지가 담긴 시험관에서 20시간 동안 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)와 \( 250 \mathrm { rpm } \)의 조건에서 진탕 배양시킨 후 종균으로 이용하였다. 플라스크 발효는 \( 300 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) glucose가 함유된 \( 100 \mathrm { ~mL } \) YP배지가 담긴 \( 500 \mathrm { ~mL } \) baffled flask 이용하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)와 \( 90 \mathrm { rpm } \)의 조건에서 실시하였고, 이 때 종균은 초기 세포 농도 \( \left ( \mathrm { OD } _ { 600 } \right ) \)가 약 20이 되도록 접종하였다. 발효기를 이용한 발효실험에는 (주)창해에탄올로부터 제공받은 카사바 당화액만을 배지로 이용하였고 질소원을 따로 추가하지 않았다. 종균 배양된 효모를 \( 200 \mathrm { ~mL } \) YPD배지가 담긴 \( 500 \mathrm { ~mL } \) 플라스크에서 30시간 동안 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)와 \( 250 \mathrm { rpm } \)의 조건으로 전배양을 한 후 초기 \( \mathrm { OD } _ { 600 } \)가 약 20이 되도록 \( 0.5 \mathrm { ~L } \)의 카사바 당화액에 접종하였다. \( 1 \mathrm { ~L } \) 배양기가 장착된 발효기(Kobiotech KL-11, Korea)를 이용하였고 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)와 \( 200 \mathrm { rpm } \)의 조건과 공기를 주입하지 않는 조건에서 발효하였으며 \( \mathrm { pH } \)는 \( 2 \mathrm { ~N } \) \( \mathrm { NaOH } \) 용액과 \( 2 \mathrm { ~N } \) \( \mathrm { HCl } \) 용액을 이용하여 5.5로 유지하였다.</p>