가시오가피 추출액을 대호양행(Daeho Co.)에서 구입하여 \( 3 \mathrm{~g} \)를 \( 50 \mathrm{ml} \mathrm{dH}_{2} \mathrm{O} \)에 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 진탕하여 추출하고, 원심분리하여 사용하였다. BAEC (Bovine aortic endothelial cells)는 소의 대동맥에서 추출한 6 9차 계대 배양된 일차세포를 \( 20 \% \) 소태아혈청과 0.5\% 항생 제가 첩가된 DMEM 배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 배양하였다. THP-1은 RPMI 1640 배지에 \( 10 \% \) 소태아혈청과 \( 0.5 \% \) 항생 제가 첨가된 T-flask를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 배양하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>본 실험의 재료 물질인 가시오가피 추출액은 대호양행(Daeho Co.)에서 구입하여 사용하였다. 추출방법올 간략하게 요약해 보면, 가시오가피를 \( 3 \mathrm{~g} \) 을 \( 50 \mathrm{ml} \mathrm{dH}_{2} \mathrm{O} \) 에 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 진탕(shaking)하여 추출한 후, 원심분리 \( (5,000 \mathrm{rpm}, 15 \) \( \mathrm{min}) \)하여 상층액을 얻고, 상층액을 여과하여 사용하였다.</p> <h2>세포 배양(cell culture)</h2> <p>BAEC (Bovine aortic endothelial cells)은 세포외 기질에 부착하여 성장하는 세포(adhesion cell)로, 소의 대동맥에서 추출한 후 6 9차 계대(passage) 배양된 일차세포(primary cell)를 본 실험을 위해 사용했다. 배양 방법은 \( 20 \% \) 소태아혈청(fetal bovine serum, Wel GENE Inc, Korea)과 0.5\% 항생 제(streptomycin/penicillin)가 첩가된 DMEM (glucose \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) Wel GENE Inc, KOREA)올 배지로 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건에서 배양하였다.</p> <p>THP-1은 액체 배지에 부유 상태로 성장하는 부유세포 (suspension cell)이다. 배양 용기는 배양 접시(culture dish)가 아닌 T-flask를 사용하였으며 배양 배지는 RPMI 1640 (Wel GENE Inc, Korea)에 \( 10 \% \) 소태아혈청(fetal bovine sc-rum)과 \( 0.5 \% \) 항생 제(streptomycin/penicillin)가 첨가된 배지에서 세포를 배양하였다. 기타 배양 조건은 BAEC의 배양 조건과 동일하였다.</p> <h2>세포 성장(cell proliferation) 실혐</h2> <p>세포 성장은 \( \left[{ }^{3} \mathrm{H}\right] \)-Thymidine 편입정도를 측정하여 평가하였다. \( \left[{ }^{3} \mathrm{H}\right] \)-Thymidine 편입실험을 수행하기 위해 세포를 DMEM에 \( 0.5 \% \mathrm{FBS} \) 가 첨가된 배지에서 24 시간 동안 배양한 후, 다양한 농도의 가시오가피 추출액을 24 시간 처리한 뒤, \( \left[{ }^{3} \mathrm{H}\right] \)-Thymidine \( (3.3 \sim 4.8 \mathrm{TBq} / \mathrm{mM}) \) 을 1 시간 동안 전처리하였다. 그 후 5\% trichloroacetic acid (TCA)로 세척한 후, 세포를 \( 0.2 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH}, 2 \% \) SDS로 분해하여 얻은 분해액을 Liquid scintillation counter로 방사능을 측정하였다. 세포 분해액의 단백질량은 Lowry 분석법으로 정량하여 세포 수의 변이를 보정하였다.</p> <h2>세포 사멸(apoptosis) 실험</h2> <p>전면 성장한 BAEC을 4 시간 동안 혈청기아(serum starva-tion)시킨 후 다양한 농도의 오가피 추출액을 처리하였다. 처리는 0 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간 동안 처리하였고, 시간경과에 따른 변화를 현미경을 이용해 사진 촬영하여 기록했으며, 세포사멸 세포(둥글며 부유 상태에 있는 세포)를 계산하여 세포사멸 비율을 결정하였다.</p> <h2>세포 이동(cell migration) 측정</h2> <p>In vitro 세포 이동 분석은 세포의 성장을 중지시킨 조건 하에서 수행하였다. 세포 성장의 첫 번쪠 중지는 BAEC에 2\( \mathrm{mM} \) thymidine을 18시간 처리 후 PBS (phosphate buffered saline)로 2회에 걸쳐 세척하고, 9시간 동안 배양한 후, 두 번째 성장 중지 \( (2 \mathrm{mM} \) thymidine, 17 시간 배양)를 수행하였다. 그리고 스크레이펴 찰과기(scrapcr)로 창상선을 만든 후 가시오가피 \( (200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 롤 처리한 실험군과 처리하지 않는 실험군에서 가시오가피 처리 시간 별로 세포 이동 정도를 측정하였다. 세포 이동 정도는 이동한 세포 수를 일정한 시야에서 계산하여 평가하였다.</p> <h2>산화질소 \( (\mathrm{NO}) \) 측정</h2> <p>세포를 \( 35 \mathrm{~mm} \) 배양접시에 분주한 후 24시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조전으로 배양을 한 후, 혈청기아 배지로 16 시간 동안 배양한 후, HEPES 완충액(140 mM NaCl, \( 5 \mathrm{mM} \mathrm{KCl}, 2 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{CaCl}_{2}, 5 \mathrm{mM} \) Glucose, \( 5 \mathrm{mM} \) HEPES, \( 1 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl} \) )으로 세척을 2회 수행하여 HEPES 완충액으로 치환한 후, 가시오가피를 처리 하였다. 그 후 세포를 수화한 후 초음놔 바쇄로 분해하였다. 세포 분해액을 \( 13,000 \mathrm{rpm} \) 으로 5 분간 원심분리를 하여 상층액을 언어서 산화질소를 측정하였다. 산화실소 측정에는 DAF-2 (diaminofluoresceins, 100nM, calbiochem)믈 15 분간 상온에서 반응시킨 후에 Spectrofluorophotometer (RF-5301 PC, SHIMADZU)를 이용하여 형광스펙트럼(EX: 495, EM: 515 )을 측정하여 분석하였다.</p> <h2>세포 부착(cell adhesion) 측정</h2> <p>BAEC을 전면 성장시킨 후에 혈청기아 배지로 16 시간 동안 추가 배양시켰다. 한편 THP-1은 배양 후 \( 15 \mu \mathrm{M} \) 의 Calccin AM (Sigma) 을 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조전에서 45 분간 반응시키고, 동일배지로 5번 세척하였다. Calcein \( \mathrm{AM} \) 으로 염색 시킨 THP-1을 BAEC이 부착된 기판 위에 동량으로 첨가하여 부착된 THP-1 세포를 현미경으로 관찰하였다. 이 방법은 Takeda 등의 방법을 변형한 것으로, 현미경 상에 보이는 부착이 일어난 세포를 세어서, 전체 세포들 중에 부착된 세포의 비율을 계산하여 정량화하였다.</p> <h2>THP-1 응집(aggregation) 측정</h2> <p>THP-1을 72 시간 동안 배양한 후, 혈청기아 배지 (RPMI1640에 0.5\% 소태아혈청과 0.5\% streptomycin/pen-<p>icillin롤 첨가한 배지)에 \( 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 가시오가피 추출액를 처리하여 8 시간까지 시간변로 진행되는 응집 현상을 현미경으로 관찰하였다.</p> <h2>Western blot</h2> <p>BAEC을 혈청기아 배지에서 16 시간 배양한 후, \( 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 가시오가피 추훌액을 1 시간 동안 처리한 후 세포를 분해 완충액(50 mM HEPES, \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 0.1 \mathrm{mM} \) PMSF, \( 1.0 \) \( \mathrm{mM} \mathrm{Na} \) Vanadatc, 1.0\% Trition X-100. 10\% Glycerol, pH 7.4)으로 분해하였다. 세포 분해액을 원심 분리하여 상층액과 침전물을 언었다. 세포 분해액의 단백질 함량을 측정하여 동일한 양의 분해액을 SDS-PAGE에 의해 단백질을 분리시켰다. 분리된 단백질올 PVDF 막으로 전달시킨 후, 1 차 항체와 2차 항체로 처리를 한 후, 엑스선(X-ray) 필름으로 현상하여 개별적인 단백질을 검출하였다.</p>