RNA 추출, cDNA 합성 및 PCR을 사용하여 RAW 264.7 세포로부터 mRNA 발현 수준을 정량화하고 Immunofluorescence를 이용하여 264.7세포를 배양한 뒤 일정한 처리를 한 다음 LPS를 30분 동안 처리했다. 또한 p-p65 및 iNOS 항체를 부착한 세포를 CKX53 현미경으로 촬영하였다.
<h2>RNA 추출, cDNA 합성 및 polymerase chain reaction (PCR) 수행</h2> <p>세포내 RNA는 NucleoSpin RNA Plus를 사용하여 RAW 264.7 세포에서 추출 되었다. cDNA는 합성을 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 ReverTra Ace- \( \alpha \)-를 사용하여 합성 되었다. PCR은 iNOS, COX-2 및 GAPDH primer와 함께 Quick Taq \( { } ^ {\infty } \) HS DyeMix를 사용하여 수행되었다. 합성된 cDNA는 Quanti Tect \( { } ^ {\circledR } \) SYBR Green PCR kit를 사용하여 PCR을 위한 주형으로 사용되었다. mRNA 발현을 정량화 하기 위해 7500 Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems, CA, USA)에서 qPCR 분석을 수행 했다. 각 primer는 Primer 3 프로그램을 사용하여 설계되었다. ABI 7500 소프트웨어 2.3(Applied Biosystems)을 사용하여 데이터 세트를 분석했다. 다음 2- \( \Delta \Delta \mathrm { Cq } \) 공식은 mRNA 발현 수준을 분석하는 데 사용되었다.</p> <p>\( \Delta \Delta \mathrm { C } _ {\mathrm { q } } = \left ( \mathrm { C } _ {\mathrm { qtarget } } - \mathrm { C } _ {\mathrm { qGAPDH } } \right )_ {\text { sample } } - \left ( \mathrm { C } _ {\mathrm { qtarget } } - \mathrm { C } _ {\mathrm { qGAPDH } } \right )_ {\mathrm { control } } \)</p> <h2>Immunofluorescence</h2> <p>RAW 264.7 세포를 24 시간 동안 coverslip에 배양한 뒤, 세포를 WF, IF, PF, GF 로 1시간 동안 전처리한 다음 LPS \( (1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \) 를 30 분 동안 처리 했다. 처리된 세포를 실온에서 \( 4 \% \) paraformaldehyde를 사용해서 15 분 동안 고정하고 \( 3 \% \) BSA 및 \( 0.1 \% \) Triton X-100으로 차단한 후 투과화 및 비 특이적 단백질 상호작용을 차단하기 위해 1 시간 동안 반응 시켰다. p-p65 및 iNOS 항체를 부착한 세포를 \( 4 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 밤새 반응 시킨 후, 형광 2 차 항체와 함께 암실에서 추가로 1 시간 동안 반응 시켰다. 반응시킨 coverslip을 DAPI로 염색한 후 슬라이드를 장착하고 CKX53 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 이미지를 촬영했다.</p>