쥐의 각막 상피세포에서 \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 의 세포 독성을 알기 위해 다양한 농도의 \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 를 24시간 처리한 다음 CCK-8 assay kit로 세포 생존율을 연구했다. \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 처리에 따른 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) 의 발현 변화를 조사하기 위하여 24 시간 동안 다양한 농도의 \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 가 처리된 세포를 모아 PBS로 세척했고 염증성 반응에 미치는 \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 의 영향에 대해서는 대표 염증성 매개인자인 nitric oxide (NO)와 tumor ne-crosis factor- \( \alpha(\mathrm{TNF}-\alpha) \), interleukin- \( 1 \beta(\mathrm{IL}-1 \beta) \)와 IL-6과 같은 전염증성 사이토카인의 생성 양을 조사하였다. Microarray 유전자 발현은 nCounter Sprint platform을 사용해 조사했고 실험은 최소 세 번씩 진행되었다.
<h2>미세먼지의 처리 및 세포독성 평가</h2> <p>본 연구에 사용된 미세먼지 \( \left(\mathrm{PM}_{2.5}, \mathrm{SRM} 1650 \mathrm{~b}\right) \) 는 National Institute of Standards and Technology (Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO; Invitrogen-Gibco, Carlsbad, CA, USA)에 녹여 \( 25 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 stock solution으로 제조 후, 처리 직전에 배양액 또는 생리 식염수에 희석하였다. 쥐의 각막 상피세포에서 \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 의 세포 독성을 평가하기 위해 다양한 농도의 \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 를 24시간 처리한 후 CCK-8 assay kit (Abcam Inc., Cambridge, UK) 을 사용하여 제조사의 지침에 따라 세포 생존율을 조사하였다.</p> <h2>단백질의 분리 및 immunoblotting</h2> <p>\( \mathrm{PM}_{2.5} \) 처리에 따른 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) 의 발현 변화를 조사하기 위하여 24 시간 동안 다양한 농도의 \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 가 처리된 세포를 모아 PBS로 세척하였다. 준비된 세포로부터 총 단백질을 추출하기 위하여 protein ex-traction solution (Intron Biotechnology, Sungnam, Republic of Korea)을 사용하였다. 동량의 단백질을 sodium dodecy1 sulfate-polyacrylamide gel을 이용한 전기영동으로 분리한 후, Immun-Blot \( { }^{\circledR} \) polyvinylidene difluoride membrane (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)으로 전이시켰다. 단백질이 전이된 membrane에 PARP 대한 항체 및 2 차 항체를 반응시킨 후, enhanced chemiluminescence detection kit (Thermo Fisher Scientific) 및 Chemi-Smart (Vilber Lourmat, France)를 이용하여 단백질의 발현을 시각화하였다.</p> <h2>염증성 지표 인자의 정량적 분석</h2> <p>염증성 반응에 미치는 \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 의 영향을 조사하기 위하여 대표적인 염증성 매개인자인 nitric oxide (NO)와 tumor ne-crosis factor- \( \alpha(\mathrm{TNF}-\alpha) \), interleukin- \( 1 \beta(\mathrm{IL}-1 \beta) \) 및 IL-6과 같은 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)의 생성 양을 조사하였다. 이를 위하여 대조군 및 \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 가 24 시간 동안 처리된 세포를 대상으로 Griess reagent (Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 사용하여 NO의 생성 양을 측정하 였으며, 사이토카인의 생성 양은 R&D system (Minneapolis, MN, USA)에서 구입한 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit를 사용하여 제조사의 지침에 준하여 조사하였다.</p> <h2>NanoString nCounter \( { }^{\circledR} \) 분석</h2> <p>Microarray 유전자 발현은 nCounter Sprint platform (NanoString Technologies, Inc., Seattle, WA, USA)을 사용하여 분석하였다. 이를 위하여 대조군 및 \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 가 24시간 동안 처리된 세포에서 총 RNA를 TRIzol 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 분리하였다. \( \mathrm{PM}_{2.5} \) 처리에 따른 면역 및 신호전달계 포함한 유전자들의 발현 변화를 조사하기 위하여 분리된 RNA를 AATI fragment analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) 및 DS-11 spectrophotometer (DeNovix Inc., Wil-mington, DE, USA) 를 사용하여 품질 평가 및 정량 분석을 수행하였다. 표적 mRNA와 reporter-capture probe pairs를 solution-phase hybridization 후, probe/target complexes를 nCounter cartridge (NCT-120)에 정렬하고 고정화한 다음 디지털 분석기(digital analyzer)를 이용하여 이미지 수집 및 데이터 처리를 수행하였다. 디지털 분석 후 얻은 결과를 housekeeping 유전자에 대한 각각의 유전자 발현 변화는 대조군 세포와 비교하여 log2배 변화 값으로 표현하였다.</p> <h2>통계 처리</h2> <p>통계 처리를 위한 실험은 최소 세 번 수행되었으며, 결과는 평균 \( \pm \) 표준 편차(standard deviation, SD)로 제시하였다. 통계 분석에는 GraphPad Prism \( 5.03 \) (GraphPad Soft-ware Inc., La Jolla, CA, USA)을 사용하였으며, 유의미한 차이는 분산 분석(ANOVA)에 이어 Tukey 테스트를 사용하여 분석하였고, \( p<0.05 \) 의 확률 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.</p>