SH21B가 유도하는 지방세포형성 억제효과를 확인하기 위해 Microarray를 수행한 결과 세포질 내에 지질 방울(lipid droplet)이 형성되는 것을 이번 연구에서도 동일하게 확인 할 수 있었으며, 지방세포 분화 시 변화되는 유전자를 분석하기 위해 hierarchical clustering을 진행하고 보다 자세히 분석하고자 Hierarchical clustering을 수행한 결과 cluster 4 , cluster 6 및 cluster 9이 포함됨을 확인하였다.
<h1>결 과</h1><h2>Microarray 초기 분석</h2><p>SH21B가 유도하는 지방세포형성 억제(anti-adipogenesis)에 대한 연구는 이미 본 연구진의 선행 논문에서 상세히 규명된 바 있다. 선행 연구에서 진행된 대로 3T3-L1 전지방세포에 지방세포형성 유도물질을 첨가하여 충분히 분화를 유도했을 때, 세포질 내에 지질 방울(lipid droplet)이 형성되는 것을 이번 연구에서도 동일하게 확인 할 수 있었다. 또한 SH21B의 첨가가 세포 내 지질 축적을 현저히 저해함도 확인되었다. 전지방세포(on day 0), 7일간 분화된 세포(on day 7) 그리고 7일간 분화 유도 시 SH21B가 첨가된 세포(on day + SH21B )에서의 전체 유전자 발현 변화를 분석하기 위하여 microarray 분석을 진행하였다. 세 종류의 시료에 대하여 total RNA를 정제하고 cDNA로 역전사 후 표식화 작업을 진행하였다. 그 후, Affymetrix Mouse Gene 1.0 ST array에 시료들을 적용하여 분석을 수행하였다. Microarray 결과는 보정(normalization)을 진행하여 실험에 사용된 재료 및 시약의 특성 등에 따른 각종 변이 등에 의한 오차를 최소한으로 줄였다(Fig. 1). 보정된 유전자 발현 결과는 각 시료 간에 비교 분석 후, 2배 이상 유의하게 증가 혹은 감소된 값을 가지는 유전자를 분류하는 differentially expressed gene (DEG) 분석에 적용되었다. 그 결과, 'on day 0' 시료와 비교하여 2배 이상 유의하게 증가 혹은 감소한 유전자의 수는 'on day 7' 시료에서 1,590개(증가; 949개, 감소; 641개), 'on day 7 + SH21B '시료에서 898개(증가;443개, 감소; 455개)였다(Table 1). 또한, SH21B 를 처리하지 않은, 'on day 7' 시료 와 처리한 'on day SH21B '시료의 비교에서, 2배 이상 증가 혹은 감소한 유전자 수는 1,516 개(증가; 746개, 감소; 770개)였다. 이러한 결과는 지방세포가 분화될 때, 수많은 유전자들의 발현이 변화되고 서로 작용함을 제시하며, SH21B의 첨가가 이러한 유전자들의 발현을 억제하거나 유도하면서 지방세포형성에 영향을 주는 것을 의미한다.</p><h2>Hierarchical clustering과 K-means clustering을 통한 유전자 발현 양상의 분석</h2><p>지방세포 분화 시, SH21B에 의해 변화되는 유전자들의 특징을 분석하기 위해 Table 1의 유의 유전자들에 대해 군집 분석을 수행하였다. Table 1의 유의 유전자, 총 2,568개에 대하여 hierarchical clustering 을 진행한 결과, 전지방세포에서 지방세포로 분화 될 때와 SH21B의 첨가 유무에 따라 다양한 발현양상이 나타났다(Fig. 2.) Hierarchical clustering에서 나타나는 유전자 발현 양상을 좀 더 자세히 분석하고 분류하기 위하여 K-means clustering 을 수행하였다(Fig. 3.). K-means clustering을 통해 분류된 군집들은 지방세포가 분화될 때 그리고 SH21B의 첨가 유무에 따라 완전히 다른 양상을 보였다. 9개의 군집 중 지방세포형성이 유도될 때 증가했다가 SH21B의 첨가에 의해 크게 감소하는 양상을 보이는 군집들(cluster 4, cluster 6, cluster 9)과 이와는 반대로 지방세포형성이 유도될 때 감소되었다가 SH21B 에 의해 크게 증가하는 양상을 보이는 군집들(cluster 7, cluster 8)을 따로 선별하였다. 지방세포형성시, 유전자 발현이 증가되었다가 SH21B에 의해 억제되는 양상을 보이는 cluster 4 , cluster 6 및 cluster 9에는 지방세포형성유도인자(pro-adipogenic factor) 및 세포증식(cell proliferation) 억제인자가 다수 포함되었다. 반대로 지방세포형성 시, 유전자 발현이 억제되다가 SH21B에 의해 증가되는 양상을 보이는 cluster 7과 cluster 8에는 지방세포형성 억제인자(anti-adipogenic factor) 및 세포증식 유도인자가 다수 포함되었다. 이러한 군집에 포함되는 유의 유전자들은 Table 2에 자세히 표기되었다.</p>