본 논문에서는 Southern blot과 Northern blot을 사용하여 감자의 유전자 발현 분석을 수행했다. Plant Genomic DNA prep kit과 RNeasy Plant Mini kit을 사용하여 genomic DNA와 total RNA를 각각 1% agarose gel과 1.2% formaldehyde agarose gel에 전기영동하여 분석했다. 또한 감자 형질전환용 과발현 vector를 만들고자 Gateway system을 사용했으며, StACRE-attB1과 StACRE-attB2 primer를 이용하여 1차 PCR을 실시한 뒤 attB1 and attB2 adaptor primer를 이용하여 2차 PCR을 수행했다. 이후 증폭된 PCR 산물을 pB7WG2D 벡터에 넣어 pB7WG2D/StACRE 벡터를 만들었다.
<h2>Southern blot 및 northern 분석</h2> <p>배양된 감자의 전체 조직을 액체질소와 막자 사발을 이용하여 잘 마쇄한 후 Plant Genomic DNA prep kit (Solgent, Daejeon)를 이용하여 분리한 genomic DNA \( 10 \mu \mathrm { g } \) 을 BanH1, EcdR1, HindIII (Enzynomics, Daejeon) 등의 제한효소로 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 12 시간 반응 시킨 후 정제하여 \( 1 \% \) agarose gel에 전기영동하여 분석하였다. 유전자 발현분석을 위해 야생형과 형질전환된 감자에서 Northern blot을 수행하였으며 RNeasy Plant Mini kit (Qiagen, Hiden)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 \( 10 \mu \mathrm { g } \) 의 total RNA는 \( 1.0 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) form-aldehyde-agarose gel에서 전기영동을 수행한 후, gel 위에 HyBond N + membrane (Amersham Biosciences, Bucks)을 놓고 membrane에 RNA를 전이시켰다. UV cross-linker를 이용하여 RNA를 고정 시킨 후, StACRE 유전자에 a- \( \left [ { } ^ { 32 } \mathrm { P } \right ] \mathrm { dCTP } \) 의 방사선 동위원소로 표지 한 probe를 \( 0.5 \mathrm { mM } \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } ( \mathrm { pH } \) 7.2), \( 1 \mathrm { mM } \) EDTA, 1 \% BSA, 7 \% SDS를 포함하는 hybrid-ization buffer에서 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 18 시간 동안 혼성화시킨 후, \( 0.1 \% \) SDS가 함유된 \( 2 x \) SSC washing buffer로 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 15분간 1번 세척하고, \( 0.1 \% \) SDS가 함유된 \( 1 x \) SSC washing buffer로 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10분간 1 번 더 세척하였다. 세척한 membrane은 BAS cassette (Fuii, Kanagawa)에서 스크린에 전이시킨 후 스캔하여 확인하였다.</p> <h2>식물형질전환용 Vector 제작 및 감자 형질전환</h2> <p>감자 형질전환용 과발현 vector를 제작하기 위하여 Gateway system (Invitrogen, CA)을 이용하였으며, Table 1의 StACRE-attB1과 StACRE-attB2 primer를 이용하여 1차 PCR을 수행한 후 Table 1의 attB1 and attB2 adaptor primer를 이용하여 2차 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 BP Clonase II(Invitrogen, CA)를 이용하여 pDONR201 vector에 클로닝하고 LR Clonase II (Invitrigen, CA)를 이용하여 35S 프로모터와 bar 표지를 포함하고 있는 pB7WG2D 벡터에 삽입하여 pB7WG2D/StACRE 벡터를 제작하였다. 제작된 pB7WG2D/StACRE 벡터를 Agrobacterium tumefaciens LBA4404 에 도입한 다음 감자(품종: 수미)에 형질전환 하였다. MS 배지에서 4주간 배양한 수미감자의 분열조직을 제외한 줄기를 \( 5 \mathrm { ~cm } \) 씩 절단하여 PreM 배지에서 1 일간 전 배양한 후 \( 50 \mathrm { ppm } \) 의 Spectinomycin (Duchefa, Haarlem)이 함유된 YEP broth에서 pB7WG2D/StACRE 를 함유한 Agrobacterium tumefaciens LBA4404를 OD \( 600 = 2.0 \) 되게 배양하여 30분간 감염 시킨 후 물기를 제거하고 PreM 배지에서 4 일간 배양 후 cefotaxim(Duchefa, Haarlem)이 함유된 증류수로 줄기에 자란 균을 제거하고 callus 유도배지에서 3주간 배양하여 callus를 유도하고 유도된 callus를 잘라내어 새로운 phosphinothricin(Duchefa, Haarlem)이 함유된 callus 유도 배지에 옮겨 2주간 배양한 후 phosphinothricin이 함유된 줄기 유도배지로 옮겨 10주간 배양하여 줄기를 유도하였다. 유도된 줄기를 phosphi-nothricin이 함유된 뿌리유도 배지에 옮겨 4 주간 배양하여 뿌리를 유도하면서 형질전환체를 선별하였다.</p>