FRTL-5 cell을 Coon's 배지로 30분 starvation한 후 \( { } ^ { 35 } \) S-Met labeling, Cys/Met이 포함된 chase 배지에 0~60분간 chase한 후 lysis buffer로 모은 배지를 SDS-PAGE로 분석하였다. 갑상선배양세포를 정상조건하에서 배양할 때에 Tg는 1시간 이내에는 세포외로 분비되지 않으므로 Tg가 mRNA에서 번역되어 ER내에서 posttranslational step과 Golgi complex를 거치는 시간이 적어도 1시간정도 필요하다.
<p>FRTL-5 cell이 confluent상태가 되었을 때에 각종 호르몬이 들어있지 않은 Coon's배지로 30분간 starvation하였다. Tg를 \( { } ^ { 35 } \) S-Met (DuPont-New England Nuclear Expre \( { } ^ { SS } \) )으로 5분동안 labeling한 다음에 대량의 Cys/Met이 포함된 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) chase 배지(cysteine-free 배지)에서 0, 15, 20, 30, 40, 60분동안 각각 chase한 후에 모은 배지를 SDS와 DTT가 들어있지 않는 lysis buffer \( (0.1 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } , 25 \mathrm { mM } \) Tris, \( \mathrm { pH } \) 6.8, \( 5 \mathrm { mM } \) EDTA, 0.1 \% Triton X-100)에 녹인 다음에 \( 5 \% \)의 native gel에 전기영동 한다. 전기영동이 끝나면 gel상에서 Tg를 포함하고 있는 band를 면도칼로 cut off하여 lysis buffer에 \( 4 \% \) SDS와 \( 50 \mathrm { mM } \) DTT가 들어있는 \( 4 \% \) gel을 사용하여 2D SDS-PAGE를 실시한다. Gel을 건조시켜서 X-ray필름 사이에 끼워서 \( -80 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 하릇밤 지낸 뒤에 developing하여 나타난 spot를 각각 unfolded-monomer Tg, folded-monomer Tg, homodimer Tg로 구분한다. 이들 Tg spot를 scanning densitometry (Heofer GS-350)를 사용하여 정량화한 다음에 그래프를 작성한다. 명시하지 않은 시약은 모두 Sigma회사의 제품을 사용하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <p>갑상선배양세포(FRTL-5 cell)롤 정상조건하에서 배양할 때에 Tg는 1시간 이내에는 세포외로 분비되지 않는다. 즉, 신생 Tg가 mRNA에서 번역되어 ER내에서 posttranslational step과 Golgi complex를 거치는 시간이 적어도 1시간정도 필요하며 그 동안에는 완전하게 만들어진 Tg-dimer가 만들어지지 않았다는 것을 의미한다. Tg가 ER내의 dimer-ization의 kinetics에 관한 보고는 전무한 상태이다. 갑상선 호르몬의 전구체인 Tg의 생합성과정을 분명하게 규명하는 것은 갑상선질환연구의 가장 기본적이고 유익한 정보를 제공할 것이다. 그런 이유로, 본 실험에서는 갑상선세포가 거의 \( 100 \% \) 정도의 confluent상태를 보일 때에 30분동안 starvation후에 5분동안 \( { } ^ { 35 } \mathrm { ~S } - \) Met으로 신생 Tg를 labeling한다. 다량의 Cys/Met는 포함되었지만 TSH는 포함되지 않은 배지로 충분히 씻는다. \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 정해진 시간동안(0, 15, 20, 30, 40, 60분) 다량의 Cys/Met이 포함된 배지로 chase하여 collection한 Tg (세포외분비)를 SDS와 DTT가 들어있지 않는 lysis buffer에 녹인다. Native gel \(5 \% \)에 전기영동 후에 \(4 \% \) SDS 와 \( 50 \mathrm { mM } \) DTT가 들어있는 2D SDS-PAGE를 실시하였다. 필름 상에서 확인된 세포외로 분비된 Tg spot는 결국 정상적으로 ER내에서 unfolded monomer, folded monomer 그리고 homodimer과정을 거쳤다는 것을 의미한다.</p>