본 실험에서는 비교물질로서 CLA(Materya사: State College, PA, USA)와 5가지 성분으로 구성된 생리활성물질을 사용하였다. 또한 Escherichia coli O157(ATCC 700927D), Salmonella paratyphi(ATCC 9150), Listeria monocytogenes (KCTC 3569), Staphylococcus aureus(KCTC 1621)라는 4가지 병원성 미생물을 사용하였다. 실험은 각 성분을 일정 비율로 혼합 배양한 시험관에서 0, 24, 48 및 96시간 동안 배양하여 성장을 관찰하였고, 항균활성 시험은 각 성분의 다양한 농도로 처리된 filter paper를 사용하여 각 균주가 배양된 배지에 처리하고 성장을 관찰하였다. 마지막으로 분산 분석과 Duncan의 다중검정법을 사용하여 통계적으로 유의한 차이를 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>생리활성물질 및 항생제</h2> <p>본 시험에 사용된 생리활성물질은 무기물성과 식물성에서 유래된 5종의 성분과 상업적으로 이용되고 있는 CLA(Materya사: State College, PA, USA)가 비교물질로서 공시 되었다.</p> <p>생강은 국내산을 시중에서 구매하여 잘 씻은 다음, 물기를 말리고 녹즙기로 즙액을 내었다. 식물에게 저온 stress를 부여함으로써 2차 대사성 활성물질 분비를 증가시키기 위하여 즙액을 냉동실 \( \left(-4^{\circ} \mathrm{C}\right) \)에서 3일간 방치시켜, 비중이 큰 물질은 가라앉히고, 맑게 떠오른 상층액을 회수하여 filter paper로 거른 조추출액을 시료로 사용하였다. Stevia는 (주) 태경에서 생리활성물질로서 시판하고 있는 제품(구성성분: 효소처리 stevia \( 80 \% \) + Dextrin 20\%), germanium는 (주)서봉 바이오 베스텍 제품을 사용하였고, charcoal과 scoria는 (주) 한농챠콜과 (주) Soap Plus에서 각각 구입하여 공시재료로 사용하였다. 생리활성물질의 농도 \( (0.001,0.01,0.10,1.00,5.00 \) 및 \( 10.00 \%) \)는 용매로서 사용된 methylene chloride \( \left(\mathrm{CH}_{2} \mathrm{Cl}_{2}\right) \)의 양을 조절하여 맞추었다. 식물성 생리활성 물질들은 methylene chloride에 용해하여 사용하였고 무기물성 생리활성물질들은 methylene chloride에 부유시켜 사용하였다. Positive \( \left(^{+}\right) \)대조구로서 사용된 항생제는 Sigma(Sigma-Aldrich Co, St. Louis, Mo, USA)로부터 streptomycin sulfate(S9137), penicillin G potassium(P7794) 및 chloramphenicol(C1919)를 구입하여, 역가를 고려하여 각각 \( 0.606 \mathrm{~g}\), 0.132 및 \( 0.030 \mathrm{~g} \)을 \( 300 \mathrm{ml} \)의 멸균증류수에 용해하여 사용하였다.</p> <p>Table 1은 공시된 생리활성물질에 대한 정보를 나타내고 있다.</p> <h2>공시 미생물</h2> <p>병원성 미생물은 Escherichia coli O157(ATCC 700927D), Salmonella paratyphi(ATCC 9150), Listeria monocytogenes (KCTC 3569) 및 Staphylococcus aureus(KCTC 1621) 4종을 축산과학원 동물병원에서 분양 받아 사용하였다.</p> <p>반추위 cannula가 장착된 한우로부터 분리된 반추위 혼합 미생물은 Table 2의 Dehority's artificial medium을 사용하여 Hungate의 anaerobic gassing 방법으로 혐기배양하였다.</p> <h2>병원성 미생물에 대한 항균활성</h2> <p>공시한 병원성 미생물 4종이 동일한 량으로 혼합 배양된 시험관에 각각의 생리활성물질이 \( 0.10 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 가 되도록 첨가하여 0, 24, 48 및 96시간 동안 배양한 다음, 배양액을 채취하여 멸균 증류수로 3회 원심 분리시켜 세척한 후, 부유된 상등액을 spectrophotometer(Model EZ 201, Perkin Elmer, USA)를 이용하여 \( 650 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다.</p> <p>항균활성 시험은 paper disc법을 이용하여 각 균주가 배양되어 있는 배지에 멸균증류수를 처리한 대조구(negative control), 시판 항생제를 처리한 항생제 처리구(positive control)와 methylene chloride \( \left(\mathrm{CH}_{2} \mathrm{Cl}_{2}\right) \) 로 희석한 각각의 생리활성물질의 농도별 (0.001, 0.01, 0.10, 1.00, 5.00 및 \( 10.00 \%, \mathrm{v} / \mathrm{v} \) or \( \mathrm{w} / \mathrm{v} \) for biologically active materials prepared for plants or minerals/media)로 지름 \( 5 \mathrm{~mm} \)의 Whatman #1 filter paper에 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 씩을 흡수시켜 용매는 중발시키고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간동안 배양 후, clear zone을 관찰하였다.</p> <h2>반추위 미생물(박테리아, 프로토조아, 곰팡이) 수의 측정</h2> <p>반추위 박테리아는 Dehority's artificial medium에서 혐기 배양시킨 후, roll tube방법으로 측정 하였다. 곰팡이는 Lowe's media에 배양시킨 후, thallus 생성수를 측정하였다. 프로토조아는 살아있는 프로토조아와 죽은 프로토조아를 구분하여 측정하기 위해 TBFS 용액(trypan blue-for-malin-salin; 증류수 \( 900 \mathrm{ml}, 35 \% \) formaldehyde 용액 \( 100 \mathrm{ml} \), trypan blue \( 2 \mathrm{~g}, \mathrm{NaCl}\) \( 8 \mathrm{~g} \); dark blue 용액으로 living cell의 핵을 염색)으로 염색한 후, Abe 등의 방법에 따라 plankton counter glass를 이용하여 현미경으로 측정하였다.</p> <h2>반추미생물의 가스 생성량 및 암모니아 농도</h2> <p>Serum bottle의 Dehority's artificial broth에서 혐기배양 중인 반추위 혼합 미생물에 methylene chloride로 희석한 (0.01, 0.10 및 1.00 \( \%) \) 각각의 생리활성 물질을 첨가한 후, 처리별 3 반복으로 배양시간대에 따라 가스발생량을 측정하였다. 측정 전 후의 온도에 의한 오차를 줄이기 위하여 상온에서 20분간 방치 후, water displacement apparatus를 이용하여 측정하였다.</p> <p>배양액의 암모니아의 농도는 Chaney와 Marbach의 방법에 따라 측정하였다.</p> <h2>반추위 미생물의 carboxymethylcellulase (CMCase) 활성</h2> <p>반추위 혼합 미생물을 배양한 배양액을 \( 10,000 \times \mathrm{g}, 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15분간 원심분리한 후, 상등액을 회수하여 조효소액으로 사용하였다. CMCase 활성은 Miller 등의 따라 \( 0.1 \mathrm{M} \) acetate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 5.0)에 CMC \(1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 용액을 기질용액으로 하여, 위의 조효소액 \( 0.5 \mathrm{ml} \)과 CMC 기질용액 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 을 혼합하여 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간동안 반응시켜 원심분리한 후, 상층액 \( 0.2 \mathrm{ml} \)에 DNS (Dinitrosalicyclic acid) \( 0.6 \mathrm{ml} \)을 추가하고, \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 진탕 반응시킨 다음, 상층액내 환원당 함량을 측정하여 구하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>통계처리는 SAS package program을 이용하여 분산 분석을 하였고, Duncan의 다중검정법으로 평균간의 유의성을 검정하였다.</p>