선인장열매 추출을 위해 열매를 으깨고 동결 건조 후 분말을 만들어 냉동 보관하고 이를 최전식 증발기로 추출한다. 세포중식능의 평가를 위해 MTT법을 이용해 약물을 투약하고 반복 시험 후 유의성을 검정한다. 대식세포의 배양을 위해서 THP 세포주는 배양상태에서 사이토카인을 생산하기에 이를 항온기에서 배양한다. 그리고 대식세포에 미치는 영향을 확인하는 것을 목적으로 THP-1 세포주의 사이토카인을 RT-PCR로 확인한 뒤, 자가면역성 질병 모델에 미치는 영향을 보기 위해 자기면역성뇌척수염을 이용하여 동물 실험을 진행한다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>선인장열매 추출</h2> <p>손바닥선인장 열매를 으깬 다음 동결건조 후 분말을 만들어 냉동 보관하였다. 알코올 추출물을 만들기 위해서는 선인장 일매를 \( 70 \% \) 알코을에 2일간 침적하고 상층액을 회수하여 회전식 진공증발기로 추출하였다. 그 후 선인장 추출물의 건조용량을 기준으로 \( 100 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 되게 생리식염수로 회석한 후 원액으로 사용하였다.</p> <h2>T세포 증식능 검사</h2> <p>이용한 세포는 IL-1에만 특이적인 T helper-cell line (D10S)으로 IL-1의 자극이 있을 때 분화 증식하는 톡성을 가지고 있다. 세포중식능의 평가는 Orencole와 Dinarello의 방법에 따라 MTT법을 활용하였으며 Table 2에 나타난 바와 같은 악물의 농도에 따라 투여하고, 3시간 후 중식능을 검사하였고, 이 후 2회 반복(충 3회) 실험 후 유의성을 검정하였다.</p> <h2>대식세포의 배양</h2> <p>THP 세포주는 매양상테에서 다양한 사이토카인을 생산할 수 있는 사람유래 대식 세포이다. THP-1 세포(human monocytic leukemia line, American Type Culture Collection TIB 202)는 \( 10\% \) FCS을 첨가한 RPMII-1640 (Sigma Chemical Co.)을 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \mathrm{~CO}_{2} \) 항온기에서 배양하였다.</p> <h2>자극시험</h2> <p>선인장 추출물이 대식세포에 미치는 영향을 확인하기 위하여 THP-1 세포주에서 사이토카인을 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) 방법으로 관찰하였다. 먼저 경시적인 변화를 확인하기 위하여 추출물을 배양액에 첨가한 후 30분, 1시간, 6시간, 12시간 및 24시간이 경과한 세포를 회수하였다. 그리고 자극물질의 농도에 따른 시이토카인의 변화릍 확인하기 위하여 vehicle 및 다양한 농도 \( (10 \mathrm{ug} / \mathrm{mi}-2000 \mathrm{ug} / \mathrm{ml}) \)를 배양세포에 적용한 후 6시간째 세포를 회수하여 RT-PCR을 실시하였다.</p> <h2>RNA의 분리, cDNA합성 및 PCR</h2> <p>RNA분리를 위하여 total RNA isolaton system (Promega)을 사용하였으며 RNA의 량은 \( 260 \mathrm{~nm} \)의 흡광도를 측정하여 정량 하였다. cDNA 합성은 Advantage RT-for PCR kit (Clontech)을 사용하여 합성하였다. cDNA합성이 끝난 후 GeneAmp PCR System (Perkin-Elmer)을 이옹하여 통상적인 방법에 따라 PCR을 수헹하였으며 반옹산물은 전기영동한 후 UV lamp 하에서 사진 촬영하였고, 그 결과를 densitometer (M GS-700 Imaging Densitometer, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)로 측정하여 Fig. 1에서 사이토카인의 변화를 그래프로 나타내었다. 사용한 사이토카인 primer는 Table 1과 같다.</p> <h2>자기면역성뇌척수염 모델에 선인장 추출물의 투여시험</h2> <p>선인장 추출물이 자기면역성 질병 모델에 미치는 영향을 확인하기 위하여 자기면역성뇌척수염을 이용하였다. 뇌척수염의 유도는 Shin 등의 방법에 따라 뇌조직유제(\(1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) in PBS)를 Macobactertum tuberculosis H37Ra을 \(5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 되게 첨가한 complete Freund's adjuvant와 동량 혼합하여 랫트 뒷발바닥에 \( 100 \mathrm{ul} \) 씩 피하주사하였다. 실험 동물은 면역 후 7일간 매일 선인장 열매 추출물(\(100 \mathrm{mg} / \mathrm{ea} \) )을 경구 투여하고, 먼역 후 21일째 부검하였다. 척수조직 내 염증 반응을 평가하기 위하여 실험군별로 3-5마리의 척수조직 표본을 만든 후 헤마톡실린-에오진 염색을 실시하였으며 염증정도의 평가를 위하여 혈관주위엽증 세포침윤(perivascular cuffing)의 수를 산정한 후 대조군과 비교하였다(Student t-test). 동시에 척수조직에 침윤하는 염증세포와 신경아교세포와의 상관관계를 확인하기 위하여 일부 조직편은 \( 2.5 \% \) glutaraldehyde 고정액 및 \( 2 \% \) osmicacid에 고정한 후 전자현미경 표본을 만들어 투과전자현미경으로 관찰하였다.</p>