만성 골수성 백혈병과 관련된 세포주인 K562 세포의 성장에 대한 성병의 영향을 조사하기 위해 배양 중에 성병의 농도와 기간을 다르게 투여했습니다. 이후 annexin V/PI 염색법을 이용하여 세포 사멸 정도를 평가하였다. 또한 세포 사멸에 중요한 caspase를 활성화시키는 주요 경로, 즉 사멸 수용체의 활성화에 의해 유발되는 외인성 경로와 미토콘드리아 손상에 의해 시작되는 내인성 경로를 포함합니다. 이러한 결과를 바탕으로 STC와 STD는 미토콘드리아를 포함하는 내인성 경로와 세포사멸 수용체의 활성화를 포함하는 외인성 경로 모두를 통해 K562 세포에서 세포사멸을 유도하는 것으로 확인되었습니다.
<h1>결 과</h1> <h2>STD에 의한 백혈병 세포주의 세포 사멸 유도</h2> <p>만성 골수성 백혈병 세포주인 K562 세포에 대한 STD의 세포 성장에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 농도별 및 시간별로 STD를 첨가하여 배양시킨 후, annexin V/PI 염색법을 사용하여 세포 사멸 정도를 관찰하였다. STD는 K562 세포의 세포 사멸을 농도 및 시간 의존적으로 유도하였다. 이러한 STD의 세포 사멸 유도 효과가 K562 세포에만 국한되는지를 살펴보기 위하여 다른 백혈병 세포주인 HL-60 세포에 미치는 영향을 관찰한 결과 정도의 차이는 있으나 HL-60 세포에서도 역시 STD에 의한 세포사멸이 관찰되었다. 이러한 STD의 세포사멸 유도 효과를 비교하기 위하여 양성 대조군으로 STC를 사용하였다. Fig. 1B와 1C에서 보는 바와 같이 K562 세포와 HL-60 세포에서 STD의 세포사멸 유도 효과가 STC의 작용보다는 약하게 나타났고 STC와 비슷한 정도의 세포사멸은 약 2-5배 정도 높은 농도에서 관찰되었다(K562 세포인 경우 STC의 \( \mathrm{IC}_{50} \)는 \( 0.5 \mu \mathrm{M} \), STD의 \( \mathrm{IC}_{50} \)는 \( 1 \mu \mathrm{M} \); HL-60 세포인 경우 STC의 \( \mathrm{IC}_{50} \)는 \( 0.3 \mu \mathrm{M}\), STD의 \( \mathrm{IC}_{50} \)는 \( 1.5 \mu \mathrm{M} \)이었다).</p> <h2>STD에 의한 외인성 경로(extrinsic pathway)와 내인성 경로(intrinsic pathway)의 활성화</h2> <p>세포 사멸에 중요한 caspase를 활성화시키는 경로에는 세포 사멸 수용체(death receptor)의 활성화를 통한 외인성 경로와 미토콘드리아 손상을 통한 내인성 경로가 존재한다. STD가 세포사멸을 유도하는 데 어떠한 경로를 경유하는지를 살펴보기 위하여 K562 세포에 \( 0.5 \mu \mathrm{M} \) STC와 \( 1.0 \mu \mathrm{M}\) STD를 각각 2, 4, 6시간 처리하고, Western blot을 이용하여 여러 가지 caspase들의 활성을 관찰하였다. 그 결과 STC와 STD 모두 시간 의존적으로 caspase-8, caspase-9, 및 caspase-3가 활성화되며, caspase-3의 기질인 PARP가 분해됨을 관찰하였다. 또한 caspase의 활성이 STD에 의한 세포 사멸에 중요한 역할을 하는지 확인하기 위하여 pan-caspase 저해제인 Z-VAD-FMK와 caspase-3 저해제인 Z-DEVD-FMK, caspase-8 저해제인 Z-IETD-FMK, 및 caspase-9 저해제인 Z-LEHD-FMK를 각각 50, 50, 25, 및 \( 25 \mu \mathrm{M} \) 농도로 1시간 처리한 후, \( 0.5\mu \mathrm{M}\) STC와 \( 1.0 \mu \mathrm{M} \) STD를 처리하여 6시간 동안 배양하고 세포 사멸 정도를 확인한 결과 Z-VAD-FMK, Z-DEVD-FMK, Z-IETD-FMK 및 Z-LEHD-FMK를 전 처리한 경우 STC와 STD에 의한 세포 사멸이 부분적으로 억제됨을 알 수 있었다. 이러한 결과로부터 STC와 STD에 의한 세포 사멸이 부분적으로는 caspase 의존적으로 일어남을 알 수 있었다. 또한 STC와 STD에 의해 미토콘드리아 경로가 활성화되는지를 확인하기 위하여 MMP \( (\Delta \psi \mathrm{m}) \)를 측정하고 세포질과 미토콘드리아 분획을 분리하여 단백질 발현을 Western blot을 이용하여 확인하였다. 그 결과 STC와 STD에 의해 MMP가 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 더욱이 STC와 비교하여 STD에 의한 MMP의 감소율이 더 높은 것을 관찰할 수 있었다. 또한, MMP의 감소로 인해 미토콘드리아에서 세포질로 cytochrome c와 Smac/DIABLO 및 AIF가 방출됨을 관찰하였다. 이러한 결과로부터 STC와 STD에 의한 K562 세포의 세포 사멸은 미토콘드리아를 경유하는 내인성 경로와 세포 사멸 수용체의 활성화를 통한 외인성 경로를 통하여 일어남을 알 수 있었다.</p>