실험재료로써 Catfish의 두 종인 Pangasius polyuranodon 및 Hypostomus ple-costomus는 열대어 도매상에서 구입해서 사용하였다. 조직 추출액을 추출하기 위해 골격근, 심장, 신장, 간, 눈 및 뇌 조직을 제거하고 혈액을 빼낸 후에 시료 조직을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지시킨 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} 6.85)\)를 3배 또는 7배(v/w) 가하여 얼음에 채운 glass homogenizer (Wheaton)로 파쇄하는 과정을 거쳤다. 동위효소 LDH의 활성은 spectrophotometer (Shimadzu UV-160A, Japan)로 \( 25^{\circ} \mathrm{C}\), \(340 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였고 단백질은 Bradford의 방법으로 정량하였다. 전기영동에 사용된 Polyacrylamide gel은 Davis의 방법을 사용하여 만들었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>Catfish 두 종, Pangasius polyuranodon 및 Hypostomus ple-costomus는 열대어 도매상에서 구입하여 사용하였다. Acryl-amide, N, \(\mathrm{N}^{\prime} \)-methyl-bisacrylamide, DL-lactic acid, nitro blue tetrazolium (NBT), methyl thiazolyl blue (MTT), phe-nazine methosulfate (PMS), nicotinamide adenine dinu-cleotide \( \left(\mathrm{NAD}^{+}\right) \), NAD reduced form (NADH), pyruvic acid, bovine serum albumin (BSA), coomassie brilliant blue G-250 및 anti-rabbit IgG (peroxidase conjugate)는 Sigma(USA)사의 제품을 사용하였고, 나머지 시약은 GR (guaranted reagent)급 시약을 사용하였다.</p> <h2>조직추출액의 준비</h2> <p>골격근, 심장, 신장, 간, 눈 및 뇌 조직을 떼어낸 후 증류수로 혈액을 충분히 제거한 다음, 시료 조직에 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지시킨 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} 6.85)\)를 3배 또는 7배(v/w) 가하여 얼음에 채운 glass homogenizer (Wheaton)로 파쇄하였다. 조직파쇄액은 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(20,000 \times \mathrm{g} \) refrigerated cen-trifuge (Hitachi 20 PR-52D, Japan)에서 1시간씩 2회 원심분리 하였으며 상등액을 시료로 사용하였다.</p> <h2>LDH의 활성측정</h2> <p>\( \mathrm{LDH} \) 동위효소의 활성은 \( 1.50 \mathrm{mM} \) 피루브산과 \( 0.14 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{NADH} \)를 포함한 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 6.85)\) \( 3 \mathrm{ml} \)에 시료를 가한 다음 \( \mathrm{NADH} \)로부터 \( \mathrm{NAD}^{+} \)로 전환되는 정도를 spectrophotometer (Shimadzu UV-160A, Japan)로 \( 25^{\circ} \mathrm{C}\), \(340 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 활성의 단위는 1 분 동안 감소되는 흡광도 1.0을 1 unit로 하였다.</p> <h2>단백질 정량</h2> <p>단백질은 Bradford의 방법으로 정량하였다. Coomassie brilliant blue G-250 \( 100 \mathrm{mg} \)을 \( 85 \% \mathrm{~H}_{3} \mathrm{PO}_{4} ~100 \mathrm{ml} \)에 세게 저어주면서 섞은 후 \( 95 \% \)ethanol \( 50 \mathrm{ml} \)를 첨가한 다음 증류수로 \( 1\mathrm{l} \)를 만든 후 사용하였다. BSA \( (\mu \mathrm{g} / \mathrm{\mu l}) \)를 표준 단백질로 사용하여 \( 595 \mathrm{~nm} \)에서 표준정량곡선을 얻었으며 시료의 흡광도를 측정하여 단백질을 정량하였다.</p> <h2>전기영동(native-PAGE) 및 동위효소의 분석</h2> <p>Polyacrylamide gel은 Davis의 방법에 따라 \( 7.5 \% \mathrm{~T} \), \( 2.65 \% \mathrm{C} \) acrylamide separation gel과 \(3\% \mathrm{~T}\), \(2.65 \% \) acrylamide stacking gel이 되도록 만들었다. Polyacrylamide vertical slab system (Hoefer SE250, USA)으로 thermostatic circulator (Rikakikai CA-1100, Japan)를 사용하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지시키면서 전기영동하였다. 시료에 \( 50 \% \) sucrose, \( 0.05 \% \) bromophenol blue 용액을 \( 1: 1(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 가하였고, Tris-glycine buffer \( (\mathrm{pH} 8.3) \)를 사용하여 \( 100 \mathrm{~V} \)에서 20 분간 전개시킨 후 \( 200 \mathrm{~V} \)에서 2 시간 10 분 동안 전기영동 하였다. 전기영동 후 LDH 동위효소는 Whitt의 방법에 의해 \( \mathrm{NAD}^{+}\), DL-lactic acid, PMS, NBT의 혼합물을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 염색하였으며, MTT를 사용하는 경우, \( \mathrm{NAD}^{+} \) 대신에 \( \mathrm{MTT}\)를 사용하여 염색하였다. 염색된 gel은 \( 15 \% \) acetic acid로 고정한 후 동위효소를 확인하였다. LDH 동위효소의 활성 정도는 PAGE gel을 Bio-profile image analysis system (Vilber Lourmat, France)으로 사진을 찍은 후 \( \mathrm{BIO-ID++} \) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 밀도계에 의해 정량한 동위효소들의 밀도 또는 양은 각 동위효소 밴드를 구성하는 모든 점들의 합, \( \mathrm{V}=\sum_{\mathrm{nj}} \mathrm{I}_{\mathrm{i}} \)로 계산되었으며, 각 동위효소의 밀도는 동위효소들을 이룬 모든 점들의 합을 기준으로 하여 상대농도\((\%)\)로 재 측정하였다.</p>