이 연구에서는 비조사군을 대조군으로 두고 황칠나무 잎 추출물이 함유된 배지에 UVB를 조사하여 세포 생존율을 측정하였다. 세포 생존율은 MTT assay로 측정하였으며, Rose bengal 처리 및 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 처리에 대해서도 같은 실험을 반복하였다. 이 결과는 UVB, Rose bengal, \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 처리에 대한 세포 생존율에 황칠나무 잎 추출물의 효과를 분석하는 데에 활용되었다.
<p>아무것도 처리를 하지 않은 비조사군을 대조군으로 하여 \( 100 \% \) 기준으로 잡아 상대적인 세포 생존율을 구하였다.</p> <p>UVB 조사: 96 well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 4 } \) cells/well로 부착시킨 \( \mathrm { HaCaT } \) 세포를 \( 24 \mathrm { ~h } \) 동안 배양하였다. 정상배지 혹은 농도 별 황칠나무 잎 추출물이 함유된 배지에 UVB Crosslinker를 이용하여 UVB \( 800 \mathrm { ~mJ } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \) 를 조사한 후, 적정 시간 동안 배양하였다.</p> <p>\( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 처리: 96 well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 4 } \) cells/well로 부착시킨 \( \mathrm { HaCaT } \) 세포에 정상배지 혹은 농도 별 황칠나무 잎 추출물이 함유된 배지를 넣고 \( 30 \mathrm { ~min } \) 배양 후, \( 10 \mathrm { mM } \mathrm { H } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 를 함유한 배지를 처리하여 \( 30 \mathrm { ~min } \) 동안 배양하였다.</p> <p>Rose bengal 처리: 96 well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 4 } \) cells/well로 부착시킨 \( \mathrm { HaCaT } \) 세포에 정상배지 혹은 농도 별 황칠나무 잎 추출물이 함유된 배지를 넣고 \( 30 \mathrm { ~min } \) 배양 후, \( 4 \mu \mathrm { M } \) rose bengal를 함유한 배지를 처리하여 \( 15 \mathrm { ~min } \) 광조사하였다.</p> <p>세포 생존율 측정: 세포 생존율은 3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-di-phenytetrazolium bromide (MTT, Sigma, USA) assay로 측정하였다. 살아있는 세포의 mitochondria dehydro-genase의 능력을 이용하여 노란색의 수용성 기질인 MTT를 진청색의 비수용성 formazan으로 변환시키는 방법으로 생성된 formazan의 양은 살아있는 세포 수에 비례한다.</p> <p>\( \mathrm { HaCaT } \) 세포를 96 well plate에서 \( 24 \mathrm { ~h } \) 동안 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건으로 항온 배양한 후, 각 농도별로 황칠나무 잎 추출물을 처리한 세포에 \( 800 \mathrm { ~mJ } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \mathrm { UVB } , 10 \mathrm { mM } \mathrm { H } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \), \( 4 \mu \mathrm { M } \) rose bengal을 처리하였다. 시료 처리 후, \( 24 \mathrm { ~h } \) 동안 배양한 세포를 PBS로 세척하고 MTT 용액 \( (2 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 을 첨가하여 \( 3 \mathrm { ~h } \) 동안 반응시킨 후, 생성된 formazan을 DMSO에 녹여 \( 570 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다.</p>