AY2000균주는 삼각 플라스크에 접종하고, 원심분리 후 침전물을 멸균된 생리식염수로 2회 씻은 후 동결 건조하여 생육량을 측정하고, 상층액은 동결 건조하여 \(-20^{\circ}\mathrm{C}\)에 보관하여 항효모성 물질의 시료로 사용하였다. NCCLS의 기준 방법을 사용하여 항효모 활성을 측정하였다.
<h2>항효모성 물질의 조제</h2> <p>상기의 배지 및 배양방법에서 기술한 바와 같이 미리 하룻밤 동안 전배양한 AY2000균주는 액체배지가 함유된 삼각 flask에 접종하고, 본 배양을 행한 후에 균체를 제거하기 위해 원심분리 ( \(12,000 \mathrm { rpm } , 10 \mathrm { ~min } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \))를 행하였다. 원심분리 후에 형성된 침전물은 멸균된 생리식염수로 2회 씻은 후 동결 건조시켜서 생육된 균체 량을 측정하였다. 또한, 원심 분리 후 상층액은 이전에 기술된 방법과는 달리 곧 바로 동결 건조하여, \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 보관하면서 항효모성 물질(Anti-yeast substance; AYS)의 시료로 사용하였다.</p> <h2>항효모 활성 측정법</h2> <p>항효모 활성측정은 NCCLS(National Committee for Clinical Laboratory Standards)의 가이드라인에 따라서 broth micro-dilution 법으로 S. cerevisiae에 대한 AYS의 최소생육저해농도(Minimal Inhibitory Concentration; MIC)로 나타내었으며, 이를 간단히 기술하면 다음과 같다. 즉, 96-well microplate의 각 well에 멀균된 YM배지 \( (100 \mu \mathrm { L } ) \)를 넣고, 미리 조제된 \( 10 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) AYS ( \(100 \mu \mathrm { L } ) \)을 가하여 단계별로 2배씩 AYS를 희석하였다. 이와 같이 희석된 AYS가 함유된 각 well \( (100 \mu \mathrm { L } ) \)에는 tetracycline \( (5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \)이 함유된 YM배지 \( (100 \mu \mathrm { L } ) \)를 주입하였다. 별도로 미리 하룻밤 동안 배양시킨 S. cerevisiae 배양액 \( \left (2 \times 10 ^ { 6 } -5 \times 10 ^ { 6 } \right . \) cells \( \left ./ \mathrm { mL } \right ) \)은 YM배지가 함유된 각 well에 \( 10 \mu \mathrm { L } \)씩 접종하여 \( 28 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 동안 생육시킨 후 그 생육의 정도는 Microplate Reader로 흡광도 \( (650 \mathrm { ~nm } ) \)를 측정하였다. 이때 항효모 활성은 MIC로 나타내었으며, MIC는 S. cerevisiae가 \( 100 \% \) 생육되지 않은 시료의 최소농도로 결정하였다. 또한 대조군으로 AYS가 전혀 함유되지 않은 그룹과 항효모 작용이 있는 amphotericin B(Sigma Co. A-4888)가 함유된 그룹과 비교하였으며, 모든 항효모 활성측정은 2반복 실험을 행하였다.</p>