본 연구는 단백질 분리에 대해 탐구하며, 실제로 분리된 단백질의 분자량이 예상치보다 약간 크지만, Western blot을 이용하여 human Akt/PKB로 확인된다. 분리 조건에서는 insoluble form의 Akt 단백질은 분리되지 않았으나, soluble Akt는 성공적으로 분리되었다. 추가적으로, 대장균에서 발현시킨 \(\mathrm{Akt} / \mathrm{PKB}\) 단백질은 인산화되지 않았으므로 kinase 활성을 보이지 않는다. 이 연구 결과는 대장균에서 발현된 Akt kinase가 nonradioactive kinase assay의 kinase source로 사용될 수 있음을 입증한다.
<h2>발현된 \( \mathrm{Akt} / \mathrm{PKB} \) 의 정제</h2> <p>발현된 Akt kinase는 \( \mathrm{Ni}^{2+} \)-NTA agarose column을 사용하여 정제하였다(Fig. 3). 예상대로 insoluble form의 Akt 단백질은 제시된 컬럼 조작 조건에서 분리되지 않았으나, soluble Akt만이 성공적으로 분리되었다. 분리된 단백질은 예상 하는 분자량 보다 약간 큰 것으로 생각되었지만, anti-Akt antibody를 이용한 Western blot 결과 human Akt/PKB임을 확인할 수 있었다.</p> <h2>Akt/PKB의 in vitro 활성화 및 nonradioactive kinase assay</h2> <p>E. coli에서 발현 되어 정제된 \( \mathrm{Akt} / \mathrm{PKB} \) 는 473 번째 위치의 serine과 308 번째 위치의 threonine이 인산화 되지 않았으며, 따라서 kinase 활성을 나타내지 않는다. 활성형 Akt/ \( \mathrm{PKB} \) 를 얻기 위하여 정제된 \( \mathrm{Akt} / \mathrm{PKB} \) 를 293 cell lysates와 반응시켜 인산화 시킨 후 다시 정제하여 활성형 \( \mathrm{Akt} / \mathrm{PKB} \) 를 얻을 수 있었다. 이렇게 얻어진 활성형 Akt kinase가 이전에 보고된 형광 peptide를 이용한 nonradioactive kinase assay system에 이용될 수 있는 지 확인하였다(Fig. 4). 그 결과, 활성화되지 않은 Akt 단백질에서는 peptide의 인산화가 관찰되지 않았지만, 활성화 된 Akt 단백질에서는 peptide를 인산화 시킬 수 있음이 관찰되었다. 이러한 사실은 대장균에서 발현시켜 얻은 Akt kinase로도 nonradioactive kinase assay의 kinase source로 사용할 수 있음을 명백하게 보여 주었다.</p> <p>일반적으로 kinase의 활성 측정을 위해 단백질 기질이나 펩타이드에 방사성 인산이 전달되는 정도를 측정하거나 인산화 잔기에 특이적인 항체를 이용하지만, 이러한 방법들은 위험성이 높고, 시간이 오래 걸리며, 고가여서 대량 assay에 적용하기는 불가능하다. 그러나, 상기에서 설명한 nonradioactive Akt protein kinase의 활성 측정법은 방사성 동위원소를 사용하지 않고도 감도가 뛰어나고 신속하게 2 시간 이내에 Akt protein kinase의 활성을 측정할 수 있다. Akt protein kinase가 기질로 이용하는 형광 펩타이드를 인산화시키면 펩타이드의 전하가 \( -2 \) 가 만큼 환원되며, 이러한 전하량의 변화에 따라 인산화된 펩타이드와 인산화되지 않은 펩타이드가 중성 \( \mathrm{pH} \) 상태의 agarose gel 전기 이동 양상이 달라지게 된다. 즉, 인산화된 펩타이드는 양극으로 빠른 속도로 이동하지만 인산화되지 않은 펩타이드는 중성을 띄어 이동하지 않거나 천천히 이동하게 된다. 이러한 방법을 이용하여 Akt protein kinase에 특이적인 저해제를 식물로부터 분리하여 구조 및 효능을 보고한 논문이 있으나, 모든 assay에는 반드시 kinase source가 필요하며, 현재 시판되는 Akt kinase를 사용하기에는 너무 고가이다. 본 연구 결과에서 제시하고 있는 것처럼 Akt kinase를 대장균에서 발현시키고 이를 assay에 사용한다면, 학문적으로는 물론 다양한 Akt kinase inhibitor 탐색에 많은 도움이 될 것으로 사료된다.</p>