염소화합물의 분석은 DB-624 capillary column와 Gas Chromatography-flame ionization detector로 분석하였고, 표준물질로는 TCE와 PCE를 사용하였다. 미생물 다양성의 확인은 PCE와 TCE를 첨가하여 혐기 배양한 농화배양액에서 genomic DNA를 추출한 뒤, 1차와 2차 PCR을 통해 얻은 산물로 DGGE를 수행하여 확인하였다. 전기영동 후 gel은 ethidium bromide 염색을 통해 UV로 확인하였으며, 각각의 밴드를 잘라 DNA를 회수하고, 이를 이용하여 PCR 후 정제산물을 이용하여 염기서열을 결정하고 BLAST search로 분석하였다.
<h2>염소화합물 분석</h2><p>염소화합물 분석을 위한 표준물질 TCE와 PCE는 Aldrich에서 구입하였다. 염소 화합물의 농도는 Gas Chromatography-flame ionization detector (Varian 3400CX, CA, USA)로 분석하였으며, DB-624 capillary column \( (30 \mathrm{~m} \times 0.32 \mathrm{~mm} \times 1.8 \mu \mathrm{m}\), J&W, CA, USA)을 이용하여 headspace 부분에 잔존하는 염소 화합물을 분석하였다. TCE와 PCE분석을 위한 오븐 조건은 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 8분간 머문 후 \( 6^{\circ} \mathrm{C} / \)분으로 승온시켜 최종온도 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분간 정지하였다. 이때, 주입기와 검출기의 온도는 각각 \( 225^{\circ} \mathrm{C} \) 와 \( 250^{\circ} \mathrm{C} \)로 설정하였다. 이상의 조건에서 VC, 1,1-DCE, cis-DCE, trans-DCE, TCE, PCE 각각의 체류시간은 각각 \(1.5, 2.21, 4.9, 3.2, 8.4, 14.6\)분 이었다. 그리고, VC, cis-DCE, TCE, PCE의 검출한계는 각각 \( 0.35,0.48,0.056,0.12 \mu \mathrm{mole} / \mathrm{bottle} \)이었다. 염소화합물의 정량은 Sung 등의 방법을 따랐다.</p><h2>DNA 추출 및 PCR 조건</h2><p>4주간 PCE와 TCE를 첨가하여 혐기 배양한 농화배양액에서 \( 3 \mathrm{~mL} \)을 취한 후, FastDNA Spin Kit for Soil (Bio101, CA, USA)을 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 미생물 다양성을 확인하기 위하여 농화배양으로부터 얻은 DNA를 주형으로 16S rRNA gene을 PCR 반응하여 증폭하였다. 1차 PCR은 27f((5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1541r (5'-AAG GAG GTG ATC CAN CCR CA-3')을 이용하여 \( 50 \mu \mathrm{L} \) 안에 \( 1 \times\) PCR buffer, \( 20 \mathrm{mM} ~\mathrm{MgCl}_{2} \), \( 40 \mathrm{mM} \) dNTP mixture, 각 primer \( (1 \mu \mathrm{M}) \), template DNA(\(50\mathrm{ng}\)), \( 0.5 \mathrm{U} \) Taq polymerase를 첨가하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 동안 DNA를 변성시킨 후 \( 94^{\circ} \mathrm{C}\)에서 1분, \( 56^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분, 그리고 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1.5분으로 25 cycle을 수행한 후 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 7분 동안 final extension을 수행하였다. 각각의 PCR 산물들은 ethidium bromide 염색 후 \( 1 \% \) agarose gel에서 확인하였다. 1차 PCR의 증폭산물을 주형으로 2차 PCR을 수행하였으며, 사용된 primer는 40 개의 GC clamp가 붙은 341fGC (5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3')와 786r (5'-CGA CCA GGG TAT CTA ATC-3')을 이용하여, PCR을 실시하였다. 이때 사용된 PCR mixture는 1차 PCR에 사용된 것과 동일하며, 사용된 PCR 반응조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 동안 DNA를 변성시켜, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 45초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 45초, 그리고 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 45초로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 7분 동안 final extension을 수행하였다. Annealing 온도를 초기에는 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 시작해서 1 cycle당 \( 0.5^{\circ} \mathrm{C} \) 감소하게 20 cycle 수행하였고, 그 후 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15 cycle을 수행하여 PCR을 완료하였다. 얻어진 2차 PCR 증폭산물은 ethidium bromide 염색 후 \( 1 \% \) agarose gel에서 확인 후, DCode System (Bio-Rad, Hercules, USA)를 이용하여 DGGE를 수행하였다.</p><h2>DGGE 조건</h2><p>PCR 증폭산물은 Dcode \( { }^{\mathrm{TM}} \) System (Bio-Rad, Hercules, USA)을 이용하여 DGGE를 수행하여 분석하였다. Denaturing gradient gel은 \( 10 \% \) polyacrylamide \( (37.5: 1= \) acrylamide :bisacrylamide)에 urea와 formamide 변성제를 \( 40\sim 70 \% \)까지 농도구배가 연속적으로 형성되도록 첨가하여 gradient gel을 제작하였다. 이와 같이 제작된 gel에 PCR증폭산물을 \( 30 \mu \mathrm{L} \)씩 loading하여 \( 1 \times \)TAE buffer \( (40 \mathrm{mM} \) Tris, \( 20 \mathrm{mM} \) acetic acid, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( \mathrm{pH} 8.0) \)에서 \( 60^{\circ} \mathrm{C}, 75 \mathrm{~V} \) 로 20시간 동안 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 gel은 ethidium bromide에서 염색한 후, UV로 확인하였다.</p><h2>염기서열분석</h2><p>Denaturing gradient gel 상에서 다른 위치에 존재하는 DNA 단편들을 회수하기 위하여 각각의 밴드를 선택한 후, 각각 잘라내어 3차 증류수 \( 50 \mu \mathrm{L} \)를 첨가하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하롯밤 동안 방치한 후 원심분리 (\( 6,300 \times \mathrm{g}\), 5분)하여 상등액을 취하였다. 각 밴드에서 회수한 DNA를 주형으로 341fGC와 786r primer를 이용하여 위와 같은 방법으로 PCR을 수행하였다. PCR 증폭산물은 gel extraction kit (Cosmo, Seoul, Korea)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 automatic DNA sequencer (model 377; Applied Biosystems, Foster, USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였으며, 결정된 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov)의 Genbank database를 이용하여 BLAST search를 통해 분석하였다.</p>