다양한 농작물과 발효식품에서 채집된 샘플을 이용해 균주 동정을 수행하는 과정을 서술하고 있다. 콜로니 주위에 투명환을 형성하는 균주를 선정한 후 순수분리하고, 이를 바탕으로 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 통해 균주 동정을 진행한다. 분석된 염기 서열은 Clustal X 프로그램을 사용하여 정렬하고, 이를 통해 균주의 계통분류학적 위치를 확인한다. 마지막으로, NCBI GenBank 데이터베이스를 통해 유사 균주와 비교하게 된다.
<p>다양한 농작물(양파, 오이, 호박, 맥문동 등)과 발효식품(가정에서 제조된 된장, 김치, 채소절임, 동동주 등)을 수집 한 후, 멸균된 생리적 식염수 \( 90 \mathrm{~mL} \) 에 \( 10 \mathrm{~g} \) 을 첨가하였다. Homogenizer를 이용하여 시료를 파쉐 및 계단희석한 후, 희석된 각 시료를 MRS 평판배지 \( \left(0.5 \% \mathrm{CaCO}_{3}\right. \) 함유)에 도말하였다. \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48 시간 동안 배양한 후, 콜로니 주위에 투명환을 생성하는 균주들을 선정하여 순수분리하였다. 실험 균주의 동정은 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하여 수행하였다. 16S rRNA 유전자 중폭에 사용된 primers는 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') primer와 1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACG ACTT-3') primer이었다. 16S rRNA 유전자의 염기서열을 결정한 후, NCBI GenBank의 database를 통하여 유사균주들과 비교하였다. 또한 염기 서열을 Clustal X program을 이용하여 정렬한 후, neighbor-joining method에 의거하여 실험균주의 계통분류학적 위치를 조사하였다.</p> <p>실험균주의 내산성 및 담즙내성은 Kobayashi 등의 방법에 따라 조사하였다. 실험균주는 MRS broth( \( \mathrm{pH} \) 6.8)에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), 24시간 동안 전배양하였다. Pepsin \( 0.3 \% \) 가 첨가된 MRS broth의 \( \mathrm{pH} \) 를 각각 2.5 및 3.0으로 조정한 것과 oxgallo 각각 \( 0.1 \% \), \( 0.3 \% \)및 \( 0.5 \% \) 첨가된 MRS broth에 실험균주를 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하였다. 내산성 실험은 3 시간 동안 배양하여 생균수를, 담즙내성 실험은 12 시간 및 24 시간 동안 배양 후, \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서의 흡광도를 측정하였다. Pepsin 또는 oxgall이 첨가되지 않은 MRS broth( \( \mathrm{pH} \) 6.8)를 대조구로 하여 생균수 또는 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서의 흡광도를 비교한 후, 백분율로 내산성과 담즙내성을 나타내었다.</p> <p>실험균주의 항균능은 agar-well diffusion법을 이용하여 조사하였다. 실험균주를 MRS broth에서 48시간동안 배양한 후, \( 10000 \mathrm{~g} \) 에서 10 분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 상등액의 \( \mathrm{pH} \) 를 조정하지 않은 것과 6.8로 조정한 것을 시료로 사용하였다. 피검균주인 Escherichia coli KCCM 40880, Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Staphyloco-ccus aureus ATCC 6538 및 Listeria monocytogenes KCCM 40307 등을 BHI 평판배지에 도말하고, 직경 \( 0.8 \mathrm{~mm} \) 의 구멍을 뚫은 후, 시료 \( 200 \mu \mathrm{L} \) 를 분주하였다. \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간동안 배양하여 생육 저지대의 직경을 측정하였다.</p>