균주를 LB, TSB, NB 배지에 접종 후 ginsenoside \( \mathrm { Rb } _ { 1 } \) 반응 및 \( \beta \)-glucosidase 활성을 측정한 결과, 서로 상이한 결과가 나타났는데 이는 측정 시에 각각 균체 제거 상층액과 균주배양액을 이용하였기 때문이다. NB에서 \( \mathrm { Rb } _ { 1 } \)의 전환은 \( \mathrm { Rd } \)를 거쳐 \( \mathrm { Rg } _ { 3 } \), \( \mathrm { R } _ { f } \) 값 \(0.71\)을 갖는 미지의 ginsenoside로 전환되었고, LB에서의 반응은 \( \mathrm { Rd } ^ { 2 } \)를 거쳐 \( \mathrm { Rg } _ { 3 } \)를 생성하며, TSB에서는 \( \mathrm { Rd } \)만 확인되었고, 이러한 전환 사포닌은 미생물의 \( \beta \)-glucosidase에 의한 전환이라 볼 수 있다.
<h2>Ginsenoside \( \mathrm { R } \mathrm { b } _ { 1 } \) 의 전환 분석</h2> <p>LB에서 현탁 배양한 균주를 LB, TSB, NB 배지에 \( 1 \%( \mathrm { v } / \) \( \mathrm { v } ) \) 씩 접종하고, 일정 시간 배양한 후 ginsenoside \( \mathrm { Rb } _ { 1 } \) 과의 반응 및 \( \beta \)-glucosidase의 활성을 측정하였다. 이때의 \( \mathrm { O.D. } _ { 600 } \) 값은 TSB; \( 1.959 \), LB; \( 1.770 \), NB ; \(1.097 \) 이었으며, \( \beta \)-glucosidase의 활성은 LB와 TSB에서 \( 0.18 \), NB에서 \( 0.15 \) unit 이었다(Data not shown). Fig. 6은 각 배지에서 키운 Gsoil 235 와 ginsenoside \( \mathrm { Rb } _ { 1 } \) 의 시간별 반응을 분석한 TLC로, \( \mathrm { Rb } _ { 1 } \) 의 분해 및 minor ginsenoside의 생성을 통해 ginsenoside 전환 능력을 확인한 결과 NB>LB>TSB순으로 뛰어난 것을 확인하였다. 측정한 \( \beta \)-glucosidase 활성과 다른 결과로 나타났는데 효소의 활성도를 측정 시 균체를 제거한 상층액을 이용하여 측정을 하였으나 ginsenoside \( \mathrm { Rb } _ { 1 } \) 과의 반응 시에는 균체를 포함한 균주배양액을 이용하여 전환능력을 확인하였다. 균체를 제거한 상등액과 액체질소를 이용하여 cell을 파쇄한 후 얻어낸 세포질 성분을 이용하여 \( \beta \)-glucosidase 활성을 측정한 결과 세포질성분에서 \( 0.55 \), 상층액에서 \( 0.34 \)unit으로 확인되었으며 ginsenoside \( \mathrm { Rb } _ { 1 } \) 과의 반응을 확인한 결과, 효소 활성을 측정한 결과와 같았음을 확인하였다(data not shown). 이는 균체 내의 세포질에 존재하는 \( \beta \)-glucosidase가 세포 외로 분비되면서 ginsenoside 전환에 영향을 미치는 것으로 사료된다.</p> <p>균주의 생장이 가장 좋았던 TSB에서의 \( \mathrm { Rb } _ { 1 } \) 전환은 반응 24 시간에서 \( \mathrm { Rd } \) 가 소량 생성되는 것에 비해 NB에서는 8 시간 만에 많은 양의 \( \mathrm { Rd } \) 가 생기며, 24 시간에는 \( \mathrm { Rb } _ { 1 } \) 이 거의 분해되어 다른 배지의 것에 비해 \( \mathrm { Rb } _ { 1 } \) band가 희미해지며, minor saponin인 \( \mathrm { Rg } _ { 3 } \) 와 동일한 \( \mathrm { R } _ { f } \) 값을 갖는 사포닌을 생성하는 것을 쉽게 확인할 수 있었다. \( \mathrm { LB } \) 에서 자란 균주 또한 24 시간에서 \( \mathrm { Rg } _ { 3 } \) 를 생산하지만 NB의 것에 비해 크게 미치지 못하는 것을 알 수 있었다. NB에서 \( \mathrm { Rb } _ { 1 } \) 의 전환은 시간이 경과함에 따라, \( \mathrm { Rd } \) 를 거쳐, \( \mathrm { Rd } \) 와 \( \mathrm { Rg } _ { 3 } \) 의 사이에 있는 미지의 ginsenoside \( \left ( \mathrm { R } _ { f } = 0.36 \right ) \) 와 \( \mathrm { Rg } _ { 3 } \left ( \mathrm { R } _ { f } =0.42 \right ) \) 로, 마지막으로 compound-K보다 조금 더 큰 \( \mathrm { R } _ { f } \) 값 \( (0.71) \) 을 갖는 미지의 ginsenoside로 전환되는 것을 확인할 수 있다. LB에서의 반응은 NB에 비해 느리지만 \( \mathrm { Rd } ^ { 2 } \) 를 거쳐 \( \mathrm { Rg } _ { 3 } \) 를 생성하는 비슷한 경향을 보이며, TSB에서의 반응은 \( \mathrm { Rd } \) 만 확인되어 비교하기 어려운 것으로 보인다. Ginsenoside \( \mathrm { Rd } \) 는 \( \mathrm { C } -20 \) 위치에 2 개, C-3 위치에 1 개의 glucose를 가지고 있으며, ginsenoside Rg3는 C-20 위치에 2개의 glucose를 가지고 있다. 이러한 전환 사포닌은 ginsenoside \( \mathrm { Rb } _ { 1 } \) 에 결합되어 있는 \( \mathrm { C } -3 \) 위치의 \( \beta-1,6 \) 결합과 \( \mathrm { C } -20 \) 위치의 \( \beta-1,2 \) 결합이 끊어지면서 생성되는 ginsenoside로 미생물이 가지고 있는 \( \beta \)-glucosidase 에 의한 전환이라 볼 수 있다.</p>