비활성화상태의 표준 TGF- \( \beta 1 \)과 시료의 활성화를 위하여 표준 TGF- \( \beta 1(100 \mathrm { ng } / \mathrm { ml } ) \)은 \( 20 \mu \mathrm { h } \), 배양상층액은 \( 200 \mu t \)씩을 각각 취하여 회석액으로 희석한 다음 \( 1 \mathrm { ~N } \mathrm { HCl } \)을 작용한 후 \( 1 \mathrm { ~N } \mathrm { NaOH } \)로 중화시켰다.
<h3>Standard \( \mathrm { TGF } - \beta \) 1과 시료의 활성화</h3> <p>비활성화상태의 표준 TGF- \( \beta 1 \) 과 시료의 활성화를 위하여 표준 TGF- \( \beta 1(100 \mathrm { ng } / \mathrm { ml } ) \) 은 \( 20 \mu \mathrm { h } \), 배양상층액은 \( 200 \mu t \)씩을 각 각 취하여 회석액으로 희석한 다음 \( 1 \mathrm { ~N } \mathrm { HCl } \) 을 작용한 후 \( 1 \mathrm { ~N } \mathrm { NaOH } \) 로 중화시켰다.</p> <h3>\( \mathrm { TGF } - \beta 1 \) 의 정량분석</h3> <p>미리 TGF- \( \beta 1 \) 에 대한 모노클론항체를 96 wells micro-plate에 \( 100 \mu \) 씩 적하하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 냉장고에서 하루밤 방치시킨 후 세척용 완충액으로 충분히 세척하였다. \( 1 \% \) 소혈청알부민이 포함된 핵 \( 250 \mu \)씩을 각 well에 작용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 2시간 동안 방치하였다. 세처용 완충액으로 5번 세척한 후 활성화된 시료 \( 100 \mu l \)씩을 적하하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1시간 동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 5번 세척한 후 \( \mathrm { HRP } \)-conjugated 항체액 \( 100 \mu \ell \) 씩을 적하하여 다시 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 2시간 동안 방치하였다. 세척용 완충액으로 5번 세척한 후 기질액(tetramethylbenzidine and hydrogen peroxide) \( 100 \mu 1 \)씩을 적하하여 다시 실온에서 10분 동안 방치한 다음 stop액 \( \left (2 \mathrm { ~N } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \right ) 100 \mu 2 \)씩을 가하였다. 흡광도 microplate reader(Model 550 microplate reader, Bio-Rad, Richmond, USA)를 이용하여 \( 450 \mathrm { ~nm } \)에서 측정하였다.</p> <h3>\( \mathrm { NO } \) 의 측정</h3> <p>\( \mathrm { NO } \) 는 공기중에서 수 초 내에 nitrite ion으로 산화되기 때문에 실제로는 nitrite ion의 농도를 측정하였다. Nitrite ion의 측정은 다음과 같이 시행하였다. 수거한 시료 \( 0.1 \mathrm { ml } \)씩을 96 wells microplate(Corning, NY, U.S.A.)로 옮긴 다음 Griess 시약 \( 1 \% \) sulfanilamide (Sigma, St. Louis, USA)</p>