인체이식용 무세포 진피 제조를 위해 SureDerm \( { }^{\text {TM}} \)의 생산을 위해 미국조직은행연합회 및 미국 FDA가 인증한 조직은행에서 기증된 피부조직을 사용하였으며, 제조공정을 통해 만든 무세포 진피에 무세포 진피에서 진피층 매트릭스의 미세 구조 변화가 있는지와 세포가 제거되었는지의 여부를 확인하기 위해서 조직학적 평가를 실시하였다. 본 연구에서는 바이러스 불활화 실험시 바이러스 역사를 정확하게 측정하기 위해 사용되는 세포에 세포독성을 나타내는지, 바이러스 정량분석에 간섭효과를 일으키는지를 먼저 실험하였고, \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에 세포병변효과 혹은 거대세포를 현미경으로 관찰했다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>인체이식용 무세포 진피 제조 공정</h2><p>미국 FDA 및 미국조직은행연합회에서 승인한 조직은행을 통해 기증된 피부조직을 사용하여 인체이식용 무세포 진피인 SureDerm \( { }^{\text {TM}} \) 을 생산하였다. 인체조직 기증자의 혈액검사 검사를 통해 HBV, HCV, HIV, HTLV와 매독 감염 여부를 확인하고, 세균 검사를 통해 안전성이 확인된 피부를 재료로 사용하였다. 입고된 사체 피부는 원재료 시험 검사를 실시한 후 조직을 보호하는 보호 용액을 세척하고, \( 70 \% \) 에탄올을 20분간 처리하였다. 면역반응의 항원 대상인 표피를 제거하기 위해 표피제거용액으로 24시간 처리하였다. 생리식염수로 5분씩 6회에 걸쳐 세척하여 표피제거용액을 제거하였다. 면역거부반응을 일으키는 진피 내 세포를 제거하기 위해 \( 0.1 \% \)TnBP 와 \( 2 \% \) Deoxycholic acids로 구성된 세포제거용액을 10시간동안 처리하였다. 세포제거가 끝난 후 생리식염수로 세척을 하여 세포제거용액을 제거하였다. 무세포 진피의 보존 및 보관을 용이하게 하기 위해 동결건조를 실시하였다. 동결건조한 무세포 진피를 포장용기에 넣어 포장한 후 산화에틸렌 가스로 멸균하여 최종 제품을 생산하였다. \( 70 \% \) 에탄올 처리, 세포제거용액 처리, 산화에틸렌 가스 멸균에 의한 바이러스 불활화 효과를 검증하기 위해 SureDerm \( { }^{\mathrm{TM}} \) 제조공정에서 각 단계별 조직을 확보하였다.</p><h2>무세포 진피의 조직학적 검사</h2><p>SureDerm \( { }^{\mathrm{TM}} \) 제조공정을 통해 생산된 무세포 진피에서 진피층 매트릭스의 미세 구조 변화가 있는지와 세포가 제거되었는지의 여부를 확인하기 위해서 조직학적 평가를 실시하였다. 정상피부조직과 무세포 진피의 세포 배열과 형태학적 변화를 비교하기 위해 핵과 세포질을 구분해서 볼 수 있는 H&E(hematoxylin and eosin) 염색을 하였다. 조직을 \( 10 \% \) 포르말린에 넣고 고정시킨 다음, 파라핀에 침지시켰다. 침지되어 고정된 조직을 \( 4 \mu \mathrm{m} \) 두께로 절편하여 슬라이드를 제작하였다. Xylene을 이용하여 파라핀을 제거하고 다시 무수알코올로 xylene을 제거하였다. \( 100 \%\), \(95 \%\), \(80 \%\), \(70 \% \) 에탄올에 각각 1분간 처리하고 증류수에 10분간 넣어 수화과정을 마친 뒤 hematoxylin으로 핵을 염색하였다. 다시 흐르는 물에 1분간 슬라이드 뒷면을 대고 세척하였다. \( 70 \% \) 알코올을 처리한 뒤 5분간 흐르는 물에 슬라이드 뒷면을 대고 세척하였다. Eosin 염색을 3분간 하고 10초간 흐르는 물에 세척하였다. \( 70 \% \) 에서 \( 100 \% \) 알코올로 순차적으로 탈수를 하고 canada balsam으로 고정한 후 현미경으로 관찰 및 촬영을 하였다.</p><h2>바이러스 배양 및 정량</h2><p>본 연구를 위해 사용한 바이러스들의 특성은 Table 1과 같다. HIV-1(HBX2 strain), BHV(ATCC VR 188), BVDV(ATCC VR 534), HAV(ATCC VR 1402), PPV(ATCC VR 742)의 배양과 정량을 위해 C8166-45 세포, Minipig Kidney(MPK) 세포(ATCC CCL 166), bovine turbinate(BT) 세포(ATCC CRL 1390), FRhK-4 세포(ATCC CRL 1688), Minipig Kidney(MPK) 세포(ATCC CCL 166)를 각각 사용하였다. HIV-1(HBX2 strain)과 C8166-45 세포는 성균관대학교 배용수 교수에게 분양받아 사용하였다. C8166-45 세포는 \( 10 \% \) fetal bovine serum(FBS: Gibco BRL, Gaithersburg, USA)를 첨가한 RPMI 1640 배지에 배양하였다. 다른 세포들은 \( 10 \%\) FBS를 첨가한 Dulbecco's Minimun Essential Medium(DMEM: Gibco BRL)에 배양하였다. 바이러스 배양을 위해서는 \( 2 \% \) FBS가 첨가된 배지를 사용하였다. T-175 flask에 배양된 단층 세포에 바이러스를 감염시킨 후 주기적으로 HIV의 경우 거대세포(syncitium), 다른 바이러스들의 경우에는 세포병변효과 (cytopatic effect)를 관찰하였다. 거대세포 또는 세포병변효과가 명백하게 관찰될 때 배양액과 세포를 수거한 다음, \( 400 \times \mathrm{g} \)에서 7분간 원심분리하여 상층액은 따로 모으고 침전물은 현탁하였다. 침전물을 동결과 해빙과정을 2회 반복하여 파쇄한 후 \( 400 \times \mathrm{g} \) 에서 7분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 원심 상등액을 혼합한 후 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) 필터로 여과한 다음 소분하여 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다.</p><p>본 연구에서는 감염성 있는 바이러스의 역가를 \( 50 \% \) 조직 배양감염용량[\(50\%\) tissue culture infectious dose(TCID\(_{50}\))]으로 나타내었다. 바이러스 불활화 실험 시 바이러스 역가를 정확하게 측정하기 위해서 먼저 바이러스를 첨가하지 않은 음성대조 실험에서 취한 시료들이 바이러스의 정량 분석을 위해 사용되는 세포에 세포독성을 나타내는지, 바이러스 정량분석에 간섭효과를 일으키는지를 먼저 실험하였다. 바이러스 불활화 실험 중 취한 시료들을 세포독성과 간섭효과를 나타내지 않은 농도로 바이러스 배양 배지를 사용하여 희석하였다. 희석된 시료를 7 배수로 희석하여 HIV-1의 경우 96 well plate에 배양된 세포에 \( 0.1 \mathrm{~mL} \) 씩, BHV, BVDV, HAV, PPV의 경우에는 24 well plate에 배양된 세포에 \( 0.25 \mathrm{~mL} \) 씩 접종하였다. 각 바이러스의 양성 대조구로 역가를 알고 있는 바이러스를 7 배수로 희석하여 각 plate에 배양된 세포에 접종하였다. 음성대조군으로 바이러스가 첨가되지 않은 배양배지를 접종하였다. 그 후 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 로 배양하면서 계속적으로 현미경으로 거대세포 또는 세포병변효과를 관찰하였다. 감염성 바이러스가 검출되지 않을 때, 즉 검출한계 이하로 관찰될 때에는 바이러스의 역가를 \( 95 \% \) 신뢰도를 가지고 이론적 최소 검출량(a theoretical minimal detection level)을 사용하여 계산하였다. 바이러스의 농도가 낮을 경우 시료에 감염성 바이러스가 없을 확률은 \( \mathrm{c}=\ln \mathrm{p}\) / \(-\mathrm{v}\)라는 Poisson 분포를 따르게 되는데, \( \mathrm{c} \) 는 \( \mathrm{mL} \) 당 감염성 바이러스의 농도, \( \mathrm{p} \) 는 시료에 감염성 바이러스가 없을 확률, \( \mathrm{v} \) 는 시료의 부피를 나타낸다. \( 95 \% \) 신뢰도로 이론적 최소 검출량을 계산할 때 \( \mathrm{p} \)는 0.05이다.</p>