본 논문은 PEDV 스파크 단백질 유전자의 식물발현 벡터를 제작하기 위해 PEDV 스파크 단백질 유전자의 \( 444 \mathrm{bp} \) 염기서열을 PCR로 합성하고 MYC tag 3개를 붙여 pCAMBIA2300 벡터에 CaMV 35S 프로모터 앞뒤에 HindⅢ와 XbaⅠ를 각각 붙이고 삽입하여 스파크 단백질 유전자의 식물발현 벡터를 완성하였다. 형질전환 벡터를 함유한 Agrobacteria 배양액과 계대배양한 담배 배양세포를 \( 10 \mathrm{~mL} \)의 액체배지가 들어 있는 petridish에 넣어 혼합한 후 공동배양하였다. 또한 카나마이신이 들어간 선발배지에서 선발된 캘러스를 대상으로 PCR로 형질이 바뀐 캘러스 라인을 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물발현 벡터 제작</h2> <p>PEDV 스파크 단백질 유전자의 식물발현벡터 제작을 위하여 먼저 CaMV 35S 프로모터 앞뒤에 HindⅢ와 XbaⅠ를 각각 붙여 pCAMBIA2300 벡터의 동일 제한효소 자리에 삽입하였다 \( (35 \mathrm{Sp} / \mathrm{pCAMBIA2300)} \). 약 \( 4.2 \mathrm{~kb} \) PEDV 스파크 단백질 유전자 염기서열로부터 \( 444 \mathrm{bp} \) (SP1, 염기서열 1,487부터1,930까지)를 표1의 SP1 프라이머를 사용하여 PCR로 합성하고, SP1 3'에 MYC tag 3개를 \( (100 \mathrm{bp}) \) 붙였다. 이 카세트를 EcoRV와 SacI으로 절단한 후 \( 35 \mathrm{Sp} / \mathrm{pCAMBIA2300} \)를 SmaⅠ과 SacⅠ으로 절단한 자리에 삽입하여 벡터를 완성하였다 35S::SP1M. 또 다른 PEDV 단편인 SP2 \( (1.7 \mathrm{~kb} \), 염기서열 2,300 부터 3,987까지), SP3 (\(1.4 \mathrm{~kb} \), 염기서열 1,559부터 2,950까지) 밎 SP4 (\(2.6\mathrm{~kb} \), 염기서열 9부터 2,643까지)를 염기서열 앞뒤에 BamHl를 붙인 각각의 프라이머 (Table 1)를 각각 사용하여 PCR로 합성한 후35S::SP1M의 SP1 위치에 각각 삽입하였다. PEDV 각 단편들의 염기서열을 확인한 후 35S::SP2-M, 35S::SP3-M, 및 35S::SP4-M로 각각 명명하였다. 각각의 벡터는 형질전환을 위해 Agrobacterium tumefaciens \( \mathrm{EAH} 105 \)에 도입하였다.</p> <h2>형질전환 및 배양</h2> <p>형질전환 벡터를 함유한 Agrobacteria 배양액 \( 100 \mu \mathrm{L} \)와 계대배양 5-7일째의 담배 배양세포를 \( 10 \mathrm{~mL} \)의 액체배지가 들어 있는 petridish에 각각 넣어 잘 섞은 후 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \), 암조건에서 2일 동안 공동배양하였다. Agrobacteria를 제거하기 위하여 공동배양한 배양세포를 \( 15 \mathrm{~mL} \) 원심분리용 tube에 옮기고 원심분리 \( \left(1,000 \mathrm{rpm}, 5 \mathrm{~min}, 25^{\circ} \mathrm{C}\right) \)하여 상등액을 제거한 후, 새로운 MS배지에 넣고 원심분리 \( \left(1,000 \mathrm{rpm}, 5 \mathrm{~min}, 25^{\circ} \mathrm{C}\right) \)하여 배양세포를 4번 세척하였다. 공동배양하였던 담배 배양세포를 선발배지 (MS 배지,\( \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} 370 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \), 2,4-D \( 0.18 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \), Thiamin \( \cdot \mathrm{HCl} 1 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \), kanamycin \( 100 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \), claforan \( 400 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) )에 치상한 후 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \), 암조건에서 3주 간격으로 3개월 이상 계대배양 하였다.</p> <h2>형질전환 배양세포의 선발</h2> <p>카나마이신이 첨가된 선발배지에서 선발된 캘러스를 대상으로 PCR로 형질전환된 캘러스 라인을 확인하였다. 캘러스로부터 genomic DNA를 추출한 후 PEDV 스파크 단백질 유전자 특이 primer (Table 1)를 이용하여 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분간 DNA를 변형시키고 \( 56-58^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 분간 annealing, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에 서 1-2분 동안 extension 반응을 30회 반복시켜 DNA를 합성한 후 \( 1 \% \) agarose gel에 전기영동하여 합성된 밴드를 확인하였다. Annealing 온도는 SP1, SP3, SP4의 경우 \( 56^{\circ} \mathrm{C} \)이고, \( \mathrm{SP} 2 \)는 \( 58^{\circ} \mathrm{C} \)이었으며 extension은 SP1의 경우 1분이었고 나머지 primer들은 2분 동안 수행되었다.</p>