세포주기의 분포도에 미치는 sulforaphane의 영향을 조사하기 위하여 DNA flow cytometry에 적용한다. 그리고 RT-PCR를 이용하여 mRNA 발현을 분석한다. SDS-gel을 이용한 전기영동, electroblotting에 의해 전이과정,특정 단백질에 대한 항원 항체 반응을 1차2차 실시후,ECL 용액 적용과정을 거쳐 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 양을 분석한다.
<h2>DNA flow cytometry에 의한 세포주기의 분석</h2> <p>세포주기의 분포도에 미치는 sulforaphane의 영향을 조사하기 위하여 Cycle TEST PLUS kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하였으며, 정상 및 sulforaphane이 함유된 배지에서 48 시간 배양된 암세포들을 buffer solution을 이용하여 두세 번 씻어내고, Cycle TEST PLUS solution A 및 B 를 상온에서 각각 10 분씩 처리한 후 Cycle TEST PLUS solution C 를 처리하여 \( 4 \mathrm { C } \) 에서 30 분 동안 염색하였다. 이를 nylon mesh로 세포를 하나씩으로 분리시킨 후 DNA flow cytometry (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 ModiFit LT (Becton Dickinson) 프로그램으로 분석하였다.</p> <h2>RT-PCR에 의한 mRNA 발현의 분석</h2> <p>상기와 동일한 조건으로 준비된 암세포를 대상으로 TRizol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 4'C에서 1시간 동안 처리하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, oligo dT primer와 AMV reverse tran-scriptase (RT)를 이용하여 2ug 의 RNA에서 single stranded cDNA를 합성하였다. 이 CDNA를 template로 사용하여 관찰 대상 유전자(Table 1)를 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 증폭하였다. 이때 housekeeping 유전자인 glycer-aldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 를 internal control로 사용하였다. 각 PCR 산물들을 \(1 \% \) agarose gel을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide (EtBr, Sigma)를 이용하여 염색한 후 ultra violet (UV)하에서 확인하였다.</p> <h2>Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석</h2> <p>정상 및 sulforaphane이 처리된 배지에서 자란 세포들을<p>수집하여 적당량의 lysis buffer를 첨가하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30분간 반응시킨 후, \(14,000 \mathrm { rpm } \) 으로 15 분간 원심분리하여 그 상층액을 취하였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 측정하였으며, 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitro-cellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 전이시킨 후, \(10 \% \) skim milk를 함유한 PBS-T ( \(0.1 \% \) Tween 20 in PBS)에 \( 4 \mathrm { C } \)에서 1시간 이상 배양하면서 비특이적인 단백질들에 대한 blocking 을 실시하였다. 그리고 특정 단백질에 대한 항체를 mem-brane에 적용시켜 항원 항체 반응을 일으킨 후, PBS-T로 씻어내고 특정 항체에 대한 이차 항체 반응을 실시한 후 en-hanced chemiluminoesence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 양을 분석하였다. 본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 및 Calbiochem (Cambridge, MA, USA)에서 구입하였으며, 이차 항체로 사용된 horseradish peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulin 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Corp.에서 구입하였다.</p>