칠면초의 뿌리에서 분리한 내생진균 Czapek's liquid 배지에서 7 일 동안 \( 180 \mathrm{rpm} \) 으로 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)로 배양하였고 배양된 내생진균의 균체 (mycobiont)는 동정을 위하여 3~5일 동안 동결건조했으며, 배양여과액은 내생진균에 의하여 생산된 이차대사산물 분석 시료로 준비하였다. 난장이벼 유묘의 이엽기 엽액부분에 내생진균의 농축배양여과액 처리 하였고 7일간 생장을 확인하여 지상부와 식물체 길이를 확인하였다. 그리고 내생진균의 이차대사산물인 GA를 확인하기 위하여 Lee의 방법에 따라 실험하였다. 진탕 여액을 분획한 후 감압, 농축하였고 질소가스로 건조한 후해 HPLC 분석시료로 사용했다. GA를 분석하기 위해 GA분획을 100% methanol에 용해하였고 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 질소가스 고정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물 균주 및 식물시료</h2> <p>순천만에 자생하는 염생식물인 칠면초로부터 분리된 내시진균류를 분리하여 실험 균주로 이용하였고, 식물생장촉진홀성검정을 위한 식물시료로 난장이벼(Waito-crice)를 사용하였다.</p> <h2>내생진균의 분리 및 배양조건</h2> <p>칠면초의 뿌리 내생진균류의 분리를 위하여 식물뽀리 외부의 토양을 제거하고, 계면활성제인 Tween 80 을 10분간 처리하여 교반한 후에 증류수로 세척하였으며, Perchloric acid \( 1 \% \)를 10분간 교반한 후에 증류수로 세척하였다. 그리고 살균된 칠면초의 뿌리는 수분을 제거한 후에 \( 3 \sim 4 \mathrm{~cm} \) 길이로 절단하여 실험재료로 사용하였다. 내생진균을 분리하기 위하여 전처리 한 칠면초의 뿌리를 스트렙토마이신(streptomycin) \(80 \mathrm{ppm} \) 이 포함된 Hagem minimal 배지에서 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 조건으로 배양하였다. 그리고 배양한 뿌리의 끝단면에서 배양된 내생진균류를 PDA 배지에 계대배양하여 순수 분러하였다. 칠면초의 뿌리에서 순수 분리한 내생진균을 배양하기 위하여 Czapek's liquid 배지에서 7 일 동안 \( 180 \mathrm{rpm} \) 으로 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 조건으로 진탕베양 하였고, 배양된 내생진균의 균체 (mycobiont)는 동정을 위하여 3~5일 동안 동결건조 하였으며, 배양여과액은 내생진균에 의하여 생산된 이차대사산물(Secondary metabolite)을 분석하기 위하여 시료로 준비하였다.</p> <h2>분리균주의 식물생장 촉진활성</h2> <p>식물생장촉진활성 검정을 위하여 난장이벼의 종자에 uni-conazol \( 20 \mathrm{ppm} \) 과 스포탁을 처리하여 24시간 침전하였고, 발아한 종자를 water agar \( (0.6 \% \)) 에 파종하여 실험재료로 준비하였다. 그리고 Czapek's liquid 배지에 진탕배양한 G. fujikaroi와 내생진균은 filter paper (Whatman, USA)를 사용하여 내생진균 배양액을 여과하였고, 배양여과액 \( 30 \mathrm{ml} \) 을 동결건조를 5~7일 수행하였으며, 완전히 동결건조된 배양여과액은 1\( \mathrm{ml} \) 의 멸균중류수를 처리하여 30배 농축액이 되도록 준비하였다. 그리고 Czapek's liquid 배지도 동결건조를 수행 후, 같은 조건으로 사용하였다.</p> <p>난장이벼 유묘의 이엽기 엽액 부분에 내생진균의 농축배양여과액 \( 10 \mu \mathrm{l} \)를 처리하였고, 7일간 유묘의 생장을 확인하여 지상부길이(Shoot length)와 식물체길이(Plant length)를 확인하였다. 그리고 생물학적 통계처리는 실험으로부터 얻은 결과를 SPSS version 19.0을 이용하여 각 실험에 대하여 평균 표준편차로 표시하였으며, \( p<0.05 \) 수준에서 T-test로 비교 분석하였다.</p> <h2>High-performance liquid chromatography (HPLC)를 이용 한 배양액의 분석</h2> <p>본 연구에서 내생진균의 이차대사산물인 GA를 확인하기 하기 위하여 Lee 의 방법에 따라 실험을 수행하였다. 배양여과액을 membrane filter로 여과시킨 후, \( 6 \mathrm{~N} \mathrm{~HCl} \)을 사용하여 \( \mathrm{pH} \) 2.5로 조정 후, 내부표준물질로는 \( 20 \mathrm{ng} \) 의 [17, \( 17-{ }^{2} \mathrm{H}_{2} \)] GAs를 추출하기 전에 배양여액에 첨가하였다. 배양여과액에 \( 1: 1 \) 비율의 ethyl acetate를 첨가하여 분획한 후에 감압.농축하였고, \( 60 \% \) methanol 로 희석한 후에 \( \mathrm{pH} \) 를 \( 8 \pm 0.3 \) 으로 조정하였다. 분석을 위한 시료는 \( C_{18} \) column \(90-130 \mu \mathrm{m} \), \(60 \mathring{A} \) poresize, Altech)과 Celite/ \( \mathrm{SiO}_{2} \) column (용매 formic acid로 포화된 ethyl acetate:hexane=95:5)을 이용하여 용출된 여액을 감압◦농축한 후에 인산완충용액을 이용하여 녹인 다음 ethylacetate를 이용하여 분획하였으며, polyvinylpolypyrrolidone (PVPP)를 첨가하여 진탕하였다. 진탕시킨 여액을 ethyl ace-tate으로 분획한 후에 감압◦농축하였고, 농축한 잔사를 \( 100 \% \) methanol에 용해시켜 HPLC에서 각 지베렐린의 정확한 re-tention time을 결정한 후, 분획하기 위하여 질소가스로 건조 후에 HPLC 분석시료로 사용하였다.</p> <p>내생진균이 생산하는 이차대사산물의 분석을 확인하기 위하여 HPLC column은 \(\mu\) bondapak \( \mathrm{C}_{18} \) column \( (3.9 \times 300 \mathrm{~mm}) \)을 사용하였으며, GAs는 acetic acid \((1\%)\)를 포함한 methanol \( (28 \%) \) 와 methanol \( (100 \%) \) 농도 구배로 분리 하도록 하였고, 유속은 분당 \( 1.5 \mathrm{ml} \) 로 총 48 분획으로 분류했다. 그리고 liquid scintillation spectrometry 를 이용하여 \( { }^{3} \mathrm{H}-\mathrm{GA} \) 를 표준물질로 사용하여 retention time을 확인하였다.</p> <h2>Gas Chromatography/Mass Spectrometer (GC/MS)에 의한 분석</h2> <p>GA를 분석하기 위하여 건조한 각 GA의 분획을 \( 100 \% \) methanol에 용해하였고, 동일한 GA들을 포함한 분획을 추가하였으며, \( 1 \mathrm{ml} \) 의 reaction vial에 각각 분주하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 조건에서 질소가스로 고정화하였다. 그리고 GA분흭 중에서 불순물이 많은 분획은 \( \mathrm{NH}_{2} \) PreSep extraction cartrige를 사용하여 불순물 제거 후에 각각 분주하였다. GA는 2회에 걸쳐 ethereal diazomethane으로 methyl ester로 유도한 후 질소가스로 고정화하였다. GA분획 샘플은 dichloromethane에 용해시켜서 \( 1 \mu \mathrm{l} \) 를 \( 30 \mathrm{~m} \times 0.25 \mathrm{~mm} \) (i.d.), \( 0.25 \mu \mathrm{m} \) film thickness HP-1 capillary column이 설치된 GC/MS에 주입하여 확인하였다.</p>