건선은 \( \mathrm{T} \) 세포 분화와이들이 생산하는 염증성 cytokine과 밀접한 연관이 있으며, 특히 Th17 세포의 분화와 IL-17 및 chemokine ligand 20이 중요한 역할을 한다고 알려져있다. 건선 치료제로 흔히 사용되고 있는 국소 비타민 A 혹은 D 유사체, 국소 스테로이드제, UVB 광선 치료법은 장기간 이용 시 면역 억제의 부작용이 있기 때문에 천연 소재의 건선 치료 소재 발굴이 절실하다. 본 연구에서 사용한 1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-7phenylheptan-3-one (Yakuchinone-A, CAS Number 78954-23-1)는 Ensol Bioscience에서 구매했다. 항염증 효능 평가를 위해 사용된 인간 각질형성세포인 \( \mathrm{HaCaT} \) 세포주는 고려대학교 생명공학원에서 분양 받았다. Yakuchinone- \( \mathrm{A} \)의 무독성 세포 치리 농도 설정을 위해 cell counting kit-8 assay를 시행했다.
<h1>\( \mathrm{TNF}-\alpha \) 자극에 활성화된 HaCaT 세포주에서 Yakuchinone-A에 의한 건선 피부염 개선 효과</h1> <h2>서 론</h2> <p>건선은 만성 염증성 페부질환으로, 발병율 또한 지속적으로 증가하고 있는 추세이다. 최근 연구에서 건선은 \( \mathrm{T} \) 세포의 분화 및 이들이 생산하는 염증성 cytokine과 밀접한 연관이 있으며, 특히 Th17 세포의 분화와 IL-17 및 chemokine (C-C motif) ligand 20 (CCL20)이 중요한 역할을 한다고 보고된다. 혈액 속에 분포하고 있는 면역세포 중 랑게르한스 세포나, 수지상 세포와 같은 antigen-presenting cell (APCs)은 미성숙한 \( \mathrm{CD}^{+} \mathrm{T} \) 세포에 항원(antigen)을 전달하여 성숙한 \( \mathrm{T} \) 세포(Th1, Th2, Th17)로 분화시킨다. Th1 세포는 tumor necrosis factor- alpha \( (\mathrm{TNF}-\alpha) \) 를 생산하며, TNF- \( \alpha \) 는 IL-1 \( \alpha / \beta, \mathrm{IL}-6, \mathrm{IL}-23 \) 등의 cytokine을 분비하여 펴부 keratinocyte의 분화 촉진 및 과각화를 유발할 뿐 아니라 NF-KB 및 STAT3 pathway에 의존적으로 Th17 세포 분화를 유도한다. TNF- \( \alpha \) 는 keratinocyte에서 NF-KB pathway를 통해 CCL20을 분비한다. 피부의 keratinocyte나 fibroblast, 점막 등에서 주로 발현되는 CCL20은 liver and activation-regulated chemokine, macrophage inflammatory protein-\( 3 \alpha \) ), Exodus-1으로불리는 chemokine으로, C-C chemokine receptor type 6와 특이적으로 결합하여 미성숙한 수지상세포, \( \mathrm{T} \) 세포, \( \mathrm{B} \) 세포 등의 변역세포를 염증부위로 유인하는 역할을 한다. Th17 세포는 CCL20을 따라 염증부위로 이동하여 Th17 세포의 특이적 cytokine인 IL-17을 분비하고, IL-17은 다시 CCL20의 분비를 증폭시켜 궁극적으로 CCL20에 의한 면역세포 유도 및 염증반응을 지속시킨다. 따라서 CCL20은 크론병과 궤양성 대장암, 만성 폐쇄성 폐질환 등 다양한 질병에서 과다 발현되는 것으로 보고되며, 특히 만성 염증성 피부질환 중 건선 피부의 환자에게서 동일하게 보고된다. 그러나 최근까지 건선 치료제로 흔히 사용되고 있는 국소 비타민 A 혹은 D 유사체, 국소 스테로이드제, UVB 광선 치료법은 장기간 이용 시 면역 억제의 부작용이 나타나 천연 소재 기반의 새로운 건선 치료 소재 발굴이 중요하다.</p> <h2>재료 및 방법</h2> <h3>실험재료</h3> <p>본 연구에서 사용한 1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-7phenylheptan-3-one (Yakuchinone-A, CAS Number 78954-23-1)는 Ensol Bioscience (Daejeon, Korea)에서 구매하여 사용하였다. TNF- \( \alpha \)은 Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, MO, USA)에서 구매하였으며, IL-17A (recombinant human IL-17A (human cell-expressed) protein, CF summary)؛ 2 R\&D system(Minneapolis, \( \mathrm{MN} \), USA)에서 구매하였다.</p> <h3>세포 배양</h3> <p>본 연구에서 항염증 효능을 평가하기 위해 사용된 인간 각질형성세포인 \( \mathrm{HaCaT} \) 세포주는 고려대학교 생명공학원에서 분양 받아 사용하였다. \( \mathrm{HaCaT} \) 세포는 \( 10 \% \) fetal bovine senum (Welgene, Gyeongxan-si, Korea)과 \( 100 \mathrm{U} / \mathrm{mL} \) penicillin, \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) streptomycin (Gibco, Waltham, MA, USA)이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Welgene)에서 배양하였다. 배양은 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{CO}_{2} 5 \% \) 유지 조건의 동물세포 배양기(Panasonic, Kadoma, Osaka, Japan)에서 이루어졌다.</p> <h3>세포독성 실혐</h3> <p>Yakuchinone- \( \mathrm{A} \) 의 독성이 없는 세포 치리 농노를 설정하기 위해 cell counting kit-8 assay (CCK-8 assay, DoGen bio, Seoul, Korea)를 시행하였다. 세포독성 평가는 Choi 등의 방법에 따라 측정하였다. \( \mathrm{HaCaT} \) 세포주를 24 well-plate에서 약 \( 5.0 \times 10^{4} \mathrm{cell} / \mathrm{well} \) 이 되도록 \( 500 \mu \mathrm{L} \) 씩 분주한 후 24 시간 배양하였다. 이후 기존의 배양액을 제기하고, Serum Free-DMEM에 \( \mathrm{TNF}-\alpha 20 \mathrm{ng} / \mathrm{mL} \) 와 yakuchinone-A를 공동 처리한 배양액으로 교체 후 24 시간 동안 반응시겼다. 배양액은 제기하고 phenol red free-DMEM과 CCK-8reagent (DoGen bio, Seoul, Korea)를 \( 10: 1 \) 비율로 혀석한 훌, 각 well 당 \( 500 \mu \mathrm{L} \) 씩 분주하여 30분간 반응시켰다. 이후 상등액을 96 well-plate에 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 씩 3번 분주하여 \( 450 \mathrm{~nm} \) 파장에서 흡광도를 관찰하였다. 세포 생존율은 아래 수식에 따라 계산하였다.</p> <p>Cell viability \( (\%)=\frac{O D_{\text {sample }}^{\mathrm{a}}-\mathrm{OD}_{\text {blank }}^{\mathrm{b}}}{\mathrm{OD}_{\text {control }}^{\mathrm{c}}-\mathrm{OD}_{\text {blank }}} \times 100 \)</p> <ol type=a start=1><li>Absorbance of the group treated with yakuchinone-A</li> <li>Absorbance of CCK-8 solution</li> <li>Absorbance of the control group</li></ol>