무세포 단백질 합성법으로 \(\mathrm{EH}\)유전자를 발현하고, SDS-PAGE, immunoblotting, NBP assay, chiral \(\mathrm{GC}\)분석 등으로 (R)-styrene oxide에 대한 입체선택성이 있는지 확인하였다. 그 결과 발현된 EH 단백질이 입체선택성을 유지함을 확인하였고, 이 방법이 putative \(\mathrm{EH}\)유전자 탐색 등에 효율적 응용이 가능함을 알 수 있었다.
<h3>무세포 단백질 합성법으로 발현된 \( \mathrm { EH } \) 의 입체선택성 활성 평가</h3> <p>자외선 분광기법으로 분석하는 겅우 발현된 \( \mathrm { EH } \) 단백질이 에폭사이드 기질에 대한 가수분해 활성이 있음을 용이하게 판단할 수는 있으나, 입체선택성 활성 유지에 대한 평가는 불가능하다. \( \mathrm { EH } \) 와 같이 입체선택적 활성이 증요한 효소를 무세포 단백질 합성법으로 발현해도 입체선택성을 유지할 수 있는지를 평가하는 것이 본 연구의 중요․ 목적이므로, 무세포 단백질 합성법을 통해 발현된 \( \mathrm { EH } \) 단백질의 입지선택성을 확인하기 위하여 chiral \( \mathrm { GC } \) 분석을 수행하였다. 발현된 EH 단벡질을 생촉매로 사용하고, \( 2 \mathrm { mM } \) styrene oxide 라세 믹기절에 대한 입체선택적 가수분해 반웅을 실시한 결과, wild type R. glutinis 세포처럼 (R)-styrene oxide에 대한 입 체선택적 가수분해 활성을 보여주어 올바른 형태로 발현되었음을 알 수 있었다. 따라서 입체선택성이 있는 EH 유전자를 간단히 PCR로 증폭하고 무세포 단백질 합성 시스템을 이용하여 손쉅게 발현해도 입체선택적 가수분해 활성을 얻을 수 있었다. 이러한 방법은 bioinformatics 등을 이용한 putative \( \mathrm { EH } \) 유전자 탐색 및 활성 검석, metagenome library 등외 유전자 library로부터 입체선택성이 있는 \( \mathrm { EH } \) 유전자 탐색 등에 효율적으로 응용될 것으로 기대된다.</p> <h2>요 약</h2> <p>Coupled transcription/translation cocktail을 이용하여 \( R \). glutinis \( \mathrm { EH } \) 유진자를 in vitro에서 합성하고 활성을 평가하였다. SDS-PAGE 및 immunoblotting 을 통하여 \( 45 \mathrm { kDa } \) 크기의 EH 단백질이 발현되었음을 확인하였고, NBP assay 및 chiral \( \mathrm { GC } \) 분석을 통해 발현된 단백질이 (R)-styrene oxide에 대한 입체선택성이 있음을 확인하였다. 따라서 무세포 단백질 합성 시스템을 이용하여 입체선택성을 유지시킨 EH 유전자 발현이 가능하며, 이러한 방법은 putative \( \mathrm { EH } \) 유전자 탐색 등에 효율적으로 응용될 것이다.</p>