전기충격법을 이용해 R. glutinis EH 유전자가 들어있는 DNA를 로제타유자격세포에 형질전환 시켰다. SDS-PAGE와 immunoblotting 분석을 통해 EH 단백질의 발현정도를 확인해본 결과 R. glutinis EH 는 뉴클레오티드와 아미노산으로 이루어져 있으며 단백질 과발현이 관찰되었다.
<h2>R. glutinis EH 유전자 발현 및 특성 분석</h2> <p>이전 연구에서 제작하여 사용하였던 P. pastoris 용 재조합 R. glutinis \( \mathrm { EH } \) 를 주형으로 하여 \( \mathrm { PCR } \) 을 행한 후 Fig. 1에서와 같이 E. coli 발현 vector인 \( \mathrm { pET } -21 \mathrm { ~b } ( + ) \) vector에 subcloning하였다. R. glutinis \( \mathrm { EH } \) 유전자가 들어있는 pET-21b \( ( + ) / R g \mathrm { EH } \) plasmid DNA를 Rosetta competent cell에 전기충격법을 이용하여 형질전환시켰으며, \( \mathrm { EH } \) 단백질의 발현정도를 확인하기 위하여 SDS-PAGE와 immunoblotting 분석을 수행한 결과는 Fig. 2와 같았다. R. glutinis \( \mathrm { EH } \) 는 1230 개 nucleotide, 409개의 아미노산으로 이루어졌으며 분자량은 \( 46.3 \) \( \mathrm { kDa } \) 크기의 단백질로써 SDS-PAGE 상으로도 \( 46 \mathrm { kDa } \) 정도의 단백질이 과발현된 것을 관찰할 수 있었으며 His-tag antibody를 이용한 immunoblotting을 행한 결과에서도 같은 크기의 단백질을 관찰할 수 있었다.</p> <p>재조합 E. coli가 입체선택적 가수분해 활성이 있는지를 확인하기 위하여 재조합 Rosetta 세포를 생촉매로 사용하여 라세믹 styrene oxide 기질에 대한 입체특이성 가수분해 반응을 실시하였다. 재조합 균체 \( 40 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) (dry cell weight)을 100 \( \mathrm { mM } \) phosphate buffer ( \( \mathrm { pH } \) 8.0)용액에 넣고 \( 20 \mathrm { mM } \) racemic styrene oxide를 주입한 후 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } , 250 \mathrm { rpm } \) 에서 반응을 진행하였으며 반응과정 중 일정량을 샘플링하여 cyclohexane으로 추출하고 chiral GC 분석을 통해 입체특이성 가수분해 반응을 모니터링 하였다. 효소 반응기에서 10 분 및 20 분 반응 후 반응액을 chiral GC로 분석한 결과, 재조합 Rosetta는 styreneoxide에 대하여 입체특이적인 가수분해활성을 보여주었다. (Fig. 3). 본 연구실에서 R. glutinis \( \mathrm { EH } \) gene을 E. coli BL21 (DE3)에 발현시킨 경우 대비 Rosetta에 발현시켰을 경우 약3 배 정도 활성이 높았었던 것도 codon usage와 관련이 있는 것으로 설명될 수 있을 것이다(data not shown).</p>