RB797 균주로 단백질의 과량 발현, trpA 와 trpB 유전자가 포함한 ptactrpA를 형질전환하여 발현시켰다. 야생형 및 잔기치환 단백질 과량 발현 및 분리는 이미 보고된 방법으로 하고, TEA 완충용액에서 Varian 4E 분광광도계로 30\(\mu\mathrm{m}\) 농도로 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>박테리아 균주 및 플라스미드</h2> <p>대장균 균주 RB797 (F' lacl" proL8/arg Nal Rif recA sup lac proXIII) 는 단백질의 과량발현에 사용하였다. 야생종 또는 돌연변이 trpA 유전자와 정상적인 trpB 유전자가 포함한 플라스미드 ptactrpA를 이 균주에 형질전환하여 발현시켰다.</p> <h2>효소와 시약</h2> <p>모든 시약은 순도가 높은 것(ultra pure)을 Sigma사로부터 구입하여 사용하였다.</p> <h2>단백질의 과량 발현 및 분리방법</h2> <p>야생형 및 잔기치환 단백질들을 과량 발현시키고, 이의 분리는 이미 보고된 방법으로 하였다. 황산암모늄 \( \left ( \left ( \mathrm { NH } _ { 4 } \right )_ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \right ) \) 침전법과 이온크로마토그래피 HPLC를 사용하였다. 정제된 단백질의 순도는 SDS-PAGE을 실시하여 Coomassie Bril-liant Blue R로 염색하여 확인하였다. 순수 정제된 야생형의 \(a \) 소단위체의 농도는 \( \mathrm { E } ^ { 1 \% } { } _ { 278 \mathrm { ~nm } } = 4.4, \beta \) 소단위체의 경우 \( \mathrm { E } ^ { 1 \% } { } _ { 278 \mathrm { ~nm } } \) \( =6.5 \) 를 사용하여 결정하였다. 잔기치환 단백질의 경우에는 야생형을 표준으로 microbiuret 방법을 사용하였다.</p> <h2>분광광도계 측정</h2> <p>\( 50 \mathrm { mM } \mathrm { TEA } \) 완충용액 \( ( \mathrm { pH } 7.8) \) 을 사용하여 \( 200 \sim 820 \mathrm { ~nm } \) 에 서 Varian \( 4 \mathrm { E } \) 분광광도계로 측정하였다. 단백질의 농도는 30 \( \mu \mathrm { M } \) 로 사용하였으며, L-Ser \( 40 \mathrm { mM } , \mathrm { NaCl } 100 \mathrm { mM } , \mathrm { KCl } 100 \) \( \mathrm { mM } , \mathrm { NH } _ { 4 } \mathrm { Cl } 50 \mathrm { mM } \), 그리고 DL-a-glycerol 3-phosphate (GP) \( 100 \mathrm { mM } \) 를 첨가하여 그 영향을 측정하였다. \( 550 \mathrm { ~nm } \) 의 값을 기준으로 보정하였다.</p>