계통수를 작성하기 위해 S. acaule과 가지과에 속하는 12종의 다른 엽록체 전장 유전체의 코딩 서열을 비교하였다. InDel 영역을 이용한 다형성을 활용하여 S. acaule에 특이적인 SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) 마커를 개발할 수 있었다. 이를 위해 InDel 영역에서 특이적인 프라이머를 제작하고 PCR을 통해 염기 서열의 차이로 나타나는 다형성을 분석하였다. 이와 함께 핵 내 염색체 DNA를 대상으로 한 분자 마커의 개발과 엽록체의 전장 유전체 염기 서열 분석은 감자 신품종 육성과 유사 종 간의 진화 연구에 기여할 수 있다. 따라서, 본 연구에서 개발된 InDel 기반 SCAR 마커와 SNP 기반 CAPS 마커는 S. acaule을 이용한 감자 신품종 육성에 활용될 수 있으며, S. acaule와 S. tuberosum의 유전자형을 구별하는 데에 도움이 될 것이다.
<h2>엽록체 전장유전체 비교 및 계통수</h2> <p>S. acaule의 엽록체 전장 유전체와 가지과에 속하는 다른 12종의 엽록체 전장 유전체의 코딩 서열을 비교하여 계통수를 작성하였다(Fig. 3).S. acaule 는 계통수에서 재배종 감자인 S. tuberosum 을 포함하는 다수의 가지속에 포함되어 있는 종들과 매우 근접하여 같은 그룹에 위치해 있음을 확인하였으며, 고추(Capsicum annum), 까마중(S. nigrum), 토마토(S. lycopersicum)</p> <p>와는 상대적으로 유연관계가 먼 것을 확인하였다. 또한, S. acaule의 엽록체 전장 유전체 전체 염기서열을 재배종 감자와 6종의 감자 근연야생종의 엽록체 전장 유전체 전체 염기서열을 EMBL의 ClustalW2 (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)를 이용하여 다중 정렬을 수행한 결과 S. acaule 특이적 분자마커 개발이 가능한 다수의 S. acaule 특이적 InDel과 SNP 영역을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 이는 앞서 보고된 것과 같이, 가지속에 속한 다수의 감자 근연야생종들의 엽록체 전장 유전체가 동일한 구조와 크기 및 높은 염기서열의 유사성에도 불구하고, 다양한 유전적 요인에 의한 변이로 특정 근연야생종 특이적인 InDel과 SNP가 존재하는 것으로 확인된 것이다(Cho and Park 2016; Chung et al. 2006; Kim et al. 2018; Kim and Park 2019, 2020a, 2020b; Park 2021b, 2022). 결과적으로, S. acaule를 포함한 총 8 종의 비교를 통해 S. acaule 특이적인 InDel과 SNP 영역은 각각 4와 79개였으며, 앞서 보고된 바와 유사하게 4개의 InDel은 모두 유전자간 영역에 분포하고 있었으며, SNP의 경우 79개 중 49개는 유전자간 영역에 그리고 30개는 유전자 영역에 분포하고 있었다.</p> <h2>S. acaule 특이적 분자마커 개발</h2> <p>S. acaule를 포함하여 감자와 근연야생종 총 8종의 엽록체 전장 유전체 전체 염기서열의 다중 정렬로 확인한 S. acaule 특이적 InDel과 SNP는 S. acaule 특이적인 분자마커 개발을 위해 활용되었다. InDel 영역을 활용하는 경우 InDel 영역에서 특이적인 primer를 제작하여 PCR을 통해 InDel 영역의 염기서열 차이로 나타나는 다형성의 차이로 S. acaule 특이적인 하나의 SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) 마커의 개발이 가능하였다(Cho et al. 2015; Garcia-Lor et al. 2013; Yamaki et al. 2013)(Table 2, Fig. 5A). 나머지 3개의 InDel 영역에서도 PCR 기반의 분자마커의 개발을 시도하였으나, InDel의 크기가 InDel 특이적인 PCR 결과를 얻기에는 다소 작고 InDel 영역과 인근 영역에서의 반복서열의 존재로 인해 SCAR 마커 개발에 어려움이 있었다(Kim and Park 2020b). SNP 영역의 경우에는 총 79개 영역 중 일부를 대상으로 S. acaule 특이적 SNP를 대상으로 적용가능 한 제한효소의 유무를 확인한 후 SNP 영역을 포함하여 PCR 결과를 얻을 수 있도록 primer를 제작하고 PCR의 결과로 얻은 DNA 단편에 제한효소를 처리하여 하나의 S. acaule 특이적인 CAPS (Cleaved Amplified Polymorphism Sequence; Konieczny and Ausubel 1993) 마커를 얻을 수 있었다(Table 2, Fig. 5B). 이러한 CAPS 마커는 같은 종 내에서의 유전자형을 구분하거나 종간 특이적으로 작용하여 선발에 활용되는 등 다양한 작물들을 대상으로 활용되고 있다(Caranta et al. 1999; Konovalov et al. 2005; Lee et al. 2008; Pettenkofer et al. 2020; Smilde et al. 2005; Uncu et al. 2015; van der Voort et al. 1999). 결과적으로 본 연구에서는 최종 InDel 및 \SNP 기반의 S. acaule 특이적인 PCR 기반의 분자마커를 각각 하나씩 개발하였으며, InDel 기반의 분자마커 SA_InDel_3 (Fig. 4, Fig. 5A)은 \( \operatorname{trnG} \) 와 \( r n f M \) 유전자 사이에 존재하는 SCAR 마커로 개발되었으며, SNP 기반의 분자마커 SA_SNP_7 (Fig. 4, Fig. 5B)은 ccsA 유전자 내에 존재하는 SNP가 제한효소 HaeIII에 의해 S. acaule 만은 특이적으로 절단하여 S. acaule 특이적인 CAPS 마커로 개발되었다.</p> <p>핵 내의 염색체 DNA를 대상으로 한 분자마커의 개발뿐만 아니라 엽록체의 전장유전체의 염기서열을 구명하고 엽록체 DNA를 대상으로 유전자형을 구분할 수 있는 종 특이적인 분자마커를 개발하는 것은 감자 신품종 육성에 기여할 수 있으며, 또한 유사 종의 식물들 간에 진화학적 연구에도 기여할 수 있다(Bohs and Olmstead 1997; Hosaka and Sanetomo 2012). 특히, 감자의 경우 신품종 육성에서 다양한 근연야생종의 유용형질을 감자에 도입하고자 하는 노력이 지속적으로 이루어지고 있으나, 배수성과 EBN의 차이로 인한 교배육종이 정상적으로 이루어지지 않는 여건에서 원형질체를 이용한 체세포융합에 의한 체세포잡종을 육성하고 이를 신품종 육성에 활용하고 있어, 이 과정에서 잡종의 유전자형을 확인하는 작업이 반드시 필요하다. 앞서 보고된 연구결과에 의하면, Solanum 속에 포함된 종들을 포함한 다양한 식물종에서 체세포융합과 기 내 식물체 재분화 과정에서 한 쪽의 엽록체 유전체가 무작위로 배분되고 미토콘드리아 유전체의 경우 높은 빈도로 재조합이 발생하는 것으로 알려져 있다(Chen et al. 2013; Cho et al. 2016; Lössl et al. 2000; Mohapatra et al. 1998; Smyda-Dajmund et al. 2016; Xiang et al. 2004). 하지만, 엽록체 유전체의 경우에도 양친의 유전체가 모두 전달되는 경 우도 있는 것으로 알려져 있어 유전자형을 확인하는 과정이 필요하다(Wang et al. 2011). 따라서, 본 연구에서 개발된 InDel 기반의 SCAR 마커 및 SNP 기반의 CAPS 마커는 S. acaule를 이용하여 체세포융합을 통한 체세포잡종을 육성하여 감자의 신품종을 육성 과정에서 S. acaule와 S. tuberosum 유래의 유전자형을 구별하는데 이용되어 S. acaule를 이용한 감자의 신품종 육성에 기여할 것이다.</p>