본문에서는 조효소액을 이용하여 온도에 따른 한천분해효소의 활성을 비교하였다. 기질용액을 가열한 후, \( 20-70 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 온도별로 냉각하였고, 효소액을 이용한 agarose의 분해산물은 TLC를 통해 분석하였다.
<h2>반응온도에 따른 한천분해 효소의 활성측정</h2> <p>조효소액을 이용하여 온도에 따른 한천분해효소의 활성을 비교하였다. 표준 기질용액으로는 \( 0.2 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) 의 agarose가 포함된 \( 20 \mathrm { ~mM } \) Tris-HCl \(( \mathrm { pH } ~6.0) \) 완충용액을 이용하였다. 기질용액을 중탕 가열한 후 \( 20-70 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 온도별로 냉각하였다. 기질용액 \( 1.0 \mathrm { ~ml } \)에 조효소액 \( 0.5 \mathrm { ~ml } \)를 첨가하여 각 온도에서 30 분간 반응시킨 후 효소활성을 측정하였다.</p> <h2>한천분해 효소의 열안정성 측정</h2> <p>조효소액을 이용하여 온도에 따른 한천분해효소의 활성을 비교하였다. 표준 기질용액으로는 \( 0.2 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \)의 agarose가 포함된 \( 20 \mathrm { ~mM } \) Tris-HCl \(( \mathrm { pH } ~6.0) \) 완충용액을 이용하였다. 조효소액 \( 0.5 \mathrm { ml } \)를 첨가하여 각 온도별로 30분 열처리한 후, 기질용액 \( 1.0 \mathrm { ml } \)를 첨가하여 30분간 반응시켰다. 측정된 효소활성은 열처리전의 효소활성과 비교하였다.</p> <h2>한천가수분해산물의 thin-layer chromatography (TLC)분석</h2> <p>효소액을 이용한 agarose의 분해산물을 TLC로 분석하였다. 조효소액과 \( 0.2 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) 의 agarose가 포함된 \( 20 \mathrm { ~mM } \) Tris-HCl \(( \mathrm { pH } ~6.0) \) 완충용액을 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 0, 0.25, 0.5, 1.5, 6, 13시간 반응시킨 후, Silica Gel 60 TLC Plate (Merck, Germany)로 분석을 수행하였다. \( n \)-Butanol/acetic acid \( / \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) \( (2 / 1 / 1( \mathrm { v } / \mathrm { v } / \mathrm { v } )) \)를 이용하여 전개시켰고, \( 10 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \)로 가시화시켰다. 표준물질로는 D-galactose (Sigma) 및 neoagarooligosaccharides를 사용하였다. TLC에서 나타난 가수분해산물의 농도를 계산하기 위하여 Image J 1.44(Wayne Rasband, USA)를 이용하여 측정하였다.</p>