Yakuchinone-A에 의한 NF-kB 및 STAT3 pathway의 조절을 확인하기 위해 염증성 cytokine 및 chemokine의 발현 억제 메커니즘을 western blot을 통해 신호전달 기작을 관찰하였다. 관찰 결과, yakuchinone-\( \mathrm{A}^{2} \) T TNF- \( \alpha \) 에 의해 활성화된 keratinocyte에서 \( \mathrm{IKB} \) 과 STAT3 단맥질의 인산화를 억제하여 조절 되는것을 알 수 있었다. 또한 IL-17A 유도된 HaCaT 세포에서 yakuchinone-A에 의한 CCL20 mRNA 발현 조절을 실험을 통해 규명하였다. 실험결과, 각질형성세포가 IL-17A에 의해 활성화되면 CCL20의 발현 또한 yakuchinone-A에 의해 억제됨을 확인하였다.
<h3>Yakuchinone-A에 의한 NF-kB 및 STAT3 pathway의 조절</h3> <p>Yakuchinone-A에 의해 염증성 cytokine 및 chemokine의 발현 억제 메커니즘 규명을 위해 western blot을 통해 NF-\(\mathrm{\kappa}\)B 및 STAT3 신호전달 기작을 관찰하였다. 먼저, I\(\mathrm{\kappa}\)B는 NF-\(\mathrm{\kappa}\)B와 복합체를 이루어 전사조절 인자인 NF-\(\mathrm{\kappa}\)B 기능을 저해하지만, 신호전달에 의해 인산화되면 NF-\(\mathrm{\kappa}\)B와 분리되어 NF-\(\mathrm{\kappa}\)B가 핵 안으로 이동하게 되며, 여러 cytokine 및 chemokine 단백질 발현이 촉진된다. TNF-\(\alpha \)에 의해 활성화된 HaCaT 세포에서 yakuchinone-A에 의한 I\(\mathrm{\kappa}\)B 단백질의 인산화를 관찰한 결과, TNF-\(\alpha \) 처리군에서는 무처리군 대비 인산화된 I\(\mathrm{\kappa}\)B의 발현이 \( 11.7 \pm 1.1 \)배 증가하였고, 이때 yakuchinone-A를 \( 2.5,5,10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도로 동시 처리 시 TNF-\(\alpha \) 처리군 대비 각각 \( 64.4 \pm 1.2,\) \(57.6 \pm 5.1,79.1 \pm 5.0 \% \)로 단백질 발현이 억제되었다(Figs. 3A, B). 또한 IL-6, IL-8, CCL20 발현뿐 아니라 염증반응 촉진과 Th17 분화 등에 밀접하게 연관된 STAT3 단백질의 인산화 조절 변화를 관찰한 결과, TNF-\(\alpha \) 처리군에서 무처리군 대비 인산화된 STAT3의 발현이 약 \( 15.0 \pm 1.5 \)배 증가된 반면, TNF-\(\alpha} \)와 yakuchinone-A를 \( 2.5,5,10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도조건으로 동시 처리한 걸과 TNF-\(\alpha \) 처리군 대비 \( 63.3 \pm 2.1,70.2 \pm 2.8,80.8 \pm 2.3 \% \) 수준만큼 감소하였다(Figs. 3C, D). 따라서 우리는 본 연구를 통해 yakuchinone-A는 TNF-\( \alpha \)에 의해 활성화된 keratinocyte에서 I\(\mathrm{\kappa}\)B뿐만 아니라 STAT3 단백질의 인산화를 유의적으로 억제하는 것을 알 수 있었다.</p><h3>IL-17A 유도된 HaCaT 세포에서 yakuchinone-A에 의한 CCL20 mRNA 발현 조절</h3> <p>건선 피부염 발병과 밀접한 관련이 있는 Th17 세포에서 분비되는 IL-17A는 각질형성세포를 자극하여 CCL20를 분비하는데, 이는 건선 피부염 발병 기작과 연계되어 있다고 알려진다. 따라서 우리는 HaCaT 세포에 IL-17A를 48시간 처리한 후 yakuchinone-A에 의한 CCL20 mRNA 발현을 관찰하였다. 먼저 IL-17A, yakuchinone-A의 세포독성을 확인하기 위해 CCK-8 assay를 수행하였다. HaCaT 세포에 IL-17A\((100 \mathrm{ng} / \mathrm{mL}) \)과 yakuchinone-A를 농도별로 48시간 동시 처리한 결과, 최대 \(6 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도까지 세포독성이 나타나지 않아 이후 실험에 yakuchinone-A의 최대 농도를 \( 6 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)로 설정하여 진행하였다(Fig 4A). 인간 각질형성세포주인 HaCaT 세포에 IL-17A\((100~ \mathrm{ng} / \mathrm{mL} \) )을 처리한 후 yakuchinone-A를 \( 1.5,3,6 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도로 동시 처리한 결과, IL-17A 처리군에서 CCL20의 발현이 무처리군 대비 약 \( 6.2 \pm 0.7 \)배 증가하였으나, yakuchinone-A를 \(3,6 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도로 동시 처리한 결과 \( 25.0 \pm 7.4,55.5 \pm 1.1 \% \) 수준만큼 CCL20 mRNA 발현이 감소되었다(Fig 4B). 따라서 위 결과들을 통해 IL-17A에 의해 활성화된 각질형성세포에서 CCL20의 발현 또한 yakuchinone-A에 의해 억제됨을 알 수 있었다.</p>