세포 생존율 측정을 위하여 well plate에 RAW \( 264.7 \) 세포를 분주하고, 농도별로 조제한 시료를 첨가하여 배양하였다. 여기에 MTT 용액을 첨가하여 배양한 뒤 배양액을 제거하고 실온에서 30분간 반응시킨 다음에 흡광도를 측정하였다. 이때 생성된 NO는 세포배양액에 존재하는 \( \mathrm{NO}_{2} \) 형태로 측정하였다. iNOS와 COX-2의 활성을 확인하기 위해 cell line RAW 264.7을 tissue culture dish에 cell seeding 한 다음 배양하였다. 배지 제거 후 세척과 원심분리, 전기영동 과정을 거쳐 분리된 단백질은 1, 2차 항체를 사용하여 배양한 다음 세척하여 밴드 확인 및 정량하였다.
<h2>3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay에 의한 세포 생존율 측정</h2> <p>세포 생존율 측정은 Carmichael의 방법에 따라 측정하였다. RAW \( 264.7 \) 세포를 96 well plate에 \( 5 \times 10^{4} \) cells/ well이 되게 \( 0.18 \mathrm{ml} \) 분주하고, 시료를 농도별로 조제하여 \( 0.02~ \mathrm{ml} \) 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% ~\mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24시간 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 \( 5~ \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 제조한 MTT 용액 \( 0.02~ \mathrm{ml} \) 를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO \( 0.15~ \mathrm{ml} \)를 가하여 실온에서 30분간 반응시킨 뒤 ELISA reader로 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율 측정은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <p>세포생존율 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\text { 무첨가군의 }}\right) \times 100 \)</p> <h2>Nitric oxide (NO) 생성 억제 활성 측정</h2> <p>RAW \( 264.7 \) cell로부터 생성된 NO의 양은 Green 등의 방법에 따라 griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 \( \mathrm{NO}_{2} \)의 형태로 측정하였다. 6 well plate에 RAW 264.7 cello을 \( 1 \times 10^{5} \mathrm{cell} / \mathrm{well} \) 로 분주하였다. \( 37^{\circ} \mathrm{C} \ \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24시간 배양한 이후 \( 1 \times \mathrm{PBS} \)로 2번 세척한다. Lipopolysaccharide (LPS) \( 10 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)을 normal을 제외하고 처리한 후 2시간 이후 농도 별로 조제한 시료용액을 처리하여 24 시간 배양한 후 상등액을 얻은 후, 동량의 griess 시약을 첨가하여 96 well plate에서 10 분 반응시킨 후 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서의 흡광도를 측정하였다. NO 억제 활성 측정은 시료첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <p>NO 억제능 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\text { 무첨가군의 }}\right) \times 100 \)</p> <h2>Western blot을 통한 단백질 발현 측정</h2> <p>iNOS, COX-2의 활성을 확인하기 위하여 cell line RAW 264.7을 \( 100 \mathrm{~mm} \) tissue culture dish에 \( 1 \times 10^{6} \) cells/well로 cell seeding 후 24시간 동안 배양하여 세포룰 안정화시켰다. 배지를 제거하여 LPS를 \( 1~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도로 2시간 처리 해준 후 추출물을 농도별로 처리한 배지로 24-48시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척해주었다. Radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer \( 10 \mathrm{ml} \)에 complete mini 1 tab을 가한 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 로 용해해서 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 16,110 \times g \)에서 20분간 원심분리 하였다. 원심분리하여 얻은 상층액은 BCA protein assay kit를 사용하여 정량하여 \( 20~ \mu \mathrm{l} \)의 단백질을 \(10\% \) SDS-PAGE사에서 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질은 transfer 기기(BIORAD)를 이용하여 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane에 옮긴 다음 실온에서 1시간 blocking buffer (5\% skim milk in TBST)에서 배양시켰다. iNOS, COX-2, \( \beta \)-actin의 1차 항체를 희석하여 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 overnight한 다음, 다시 10분 간격으로 tris-buffered saline and tween 20 (TBST)로 3회 세척하였다. iNOS와 COX-2의 2차 항체는 anti-rabbit, \( \beta \)-actin의 2차 항체는 anti-mouse를 사용하고 1: 1,000으로 희석하여 실온에서 2시간 배양하였다. 3회 세척한 후 LAS 4,000 기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량하였다.</p>