임상평가는 NC/Nga 생쥐의 피부염은 아토피성 피부염에서 일반적으로 사용되는 Dogru M의 방법을 약간 변형하여 사용하였고 BMAC를 바르고 약물 투여 종료 후 15주령에서 육안평가를 실시하였다. NC/Nga 생쥐의 눈에서 8주, 12주, 15주에 각각 capillary 관을 이용하여 약 \( 100 ~ \mathrm{\mu L} \)의 혈액을 채혈한 후 \( 6,500 ~ \mathrm{rpm} \)에서 20분 동안 원심분리한 후 \( 30 ~ \mathrm{\mu L} \)의 혈청을 분리하였고 NC/Nga 생쥐의 혈청내 IgE와 IgG1 농도 측정은 Enzyme-linked immuno-sorbent assay kit(Shibayagi, Japan)로 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>실험에 사용된 동물은 수컷 7주령의 SPF(specific pathogen-free) NC/Nga mouse(\( 15 \)~\( 20 \mathrm{~g}\)) 로 Charles River Japan (Yokohama, Japan)사에서 공급받았다. 각 실험군마다 6마리씩 사용하였다. BMAC는 Dermatophagoides farinae crude extract (mite antigen, lyophilized)를 진드기 항원으로 제조된 것으로 진드기 항원을 \( 0.5 \% \) tween 20이 포함된 ointment base로 제작된 것을 사용하였다(Biostir, Hiroshima, Japan). IgE, IgG1 ELISA kit는 Shibayagi사(Shibukawa, Japan)제품, \( \gamma \)-PGA는 바이웰㈜에서 구입하였으며 평균 분자량은 \( 300 ~ \mathrm{kDa} \)이다. \( \mathrm{CD}4^{+} \) T isolation kit는 MACS(Mill. Biotec, USA)에서, GolgiStop kit는 BD bioscience(CA, USA)에서 각각 구매하였다. 그 외에 사용된 시약은 따로 언급이 없는 한 시판중인 특급시약을 사용하였다.</p> <h2>저분자 \( \gamma \)-PGA의 제조</h2> <p>증류수(distilled water)에 PGA-HM을 \( 10 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)가 되도록 녹여 sonicator(Branson사)에 60분간 high level(\( 40 ~ \mathrm{khz} \))로 sonication하여 분자량 \( 30 ~ \mathrm{kDa} \) 이하 분리 가능한 밀리포어 필터로 여과하여 여과액을 deep freezer에서 \( 24 ~ \mathrm{hr} \) 동안 냉동시킨 후 freeze dryer(Ilshin사)에 넣어 3~4일 동결 건조하고 결정화시켜 사용하였다.</p> <h2>NC/Nga 생쥐에서 피부발진 유발 및 임상평가</h2> <p>7주령의 NC/Nga 생쥐를 1주일 동안 적응시키고 이미 피부염이 발생된 18주령의 NC/Nga 생쥐와 2주 동안 동시 사육하여 항원 감작시킨 후 capillary 관을 이용하여 눈에서 \( 100 ~ \mathrm{\mu L} \)의 혈액을 채혈하였다. 그 후 마취제인 chloral hydrate(\( 10 \% \))로 마취한 후 귀와 등쪽 목 부위를 깨끗하게 제모제로 제모한 후, 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다. BMAC는 주 2회 3주간(10~13주령) 등과 목 부분에 고르게 도포하였고, 도포 2~3시간 전에 \( 4 \% \) SDS를 분무하여 피부층을 파괴하였다. 2주 후(12주령) 등 부위에 피부염이 충분히 유발되면서 긁는 행동이 심화되면 육안 평가를 실시하였다. BMAC 도포 2주 후 동시에 PGA-HM과 PGA-LM(각각 \( 2 ~ \mathrm{mg} / 25 ~ \mathrm{g} / \mathrm{day} \))을 12주부터 15주까지 3주간 오전 11시에 1회 경구 투여하였다. 또한 양성 대조 약물로 FK506 (tacrolimus) \( 0.3 \% \)를 매주 5회 발진된 등 부위에 도포하였다. 임상평가는 NC/Nga 생쥐의 피부염은 아토피성 피부염에서 일반적으로 사용되는 Dogru M의 방법을 약간 변형하여 사용하였다. BMAC를 바르고 약물 투여 종료 후 15주령에서 육안평가를 실시하였다. 육안평가 항목은 소양 행동을 동반한 홍반(erythema/hemorrhage), 인설 및 가피(dryness/scarring), 부종(edema), 표피박탈/미란(excoriation/erosion), 태선화(lichenification) 5가지 항목으로 하고, 육안 평가 결과는 각각 평가한 점수의 총합으로 나타내었다. 각각의 항목은 없음(0), 약함(1), 중증도(2), 심함(3)으로 채점하였으며 최소 0점에서, 최고 15점 사이의 점수를 측정하였다(Fig. 1. 참고).</p> <h2>혈액채혈 및 immunoglobulin 측정</h2> <p>NC/Nga 생쥐의 눈에서 8주, 12주, 15주에 각각 capillary 관을 이용하여 약 \( 100 ~ \mathrm{\mu L} \)의 혈액을 채혈한 후 \( 6,500 ~ \mathrm{rpm} \)에서 20분 동안 원심분리한 후 \( 30 ~ \mathrm{\mu L} \)의 혈청을 분리하였다. 혈청은 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 냉동 보관하였다. NC/Nga 생쥐의 혈청내 IgE와 IgG1 농도 측정은 Enzyme-linked immuno-sorbent assay kit(Shibayagi, Japan)로 측정하였다. 각 well에 NC/Nga 생쥐에서 채혈한 혈청 \( 5 ~ \mathrm{\mu L} \)(\( 1 / 10 \) dilution)와 dilution buffer \( 45 ~ \mathrm{\mu L} \)를 혼합하여 각 well에 분주하고, 2시간 동안 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 실온에서 방치한 후 2회 washing 완충용액으로 세척한 다음 antibody biotin-conjugated를 넣고 2시간 방치하였다. 다시 2회 수세 후 완충용액으로 세척한 다음 antibody Avidin-HRP conjugated \( 100 ~ \mathrm{\mu L} \)를 처리하고 1시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다. TMB 기질을 \( 100 ~ \mathrm{\mu L} \)씩 분주하고 암소에서 30분 방치한 후 \( 100 ~ \mathrm{\mu L} \)의 stop용액을 처리하여 ELISA reader \( 450 ~ \mathrm{nm} \)에서 각각 IgE와 IgG1에 대한 흡광도를 측정하였다.</p>