Viviparous 소식물체의 형성에 관련한 유전자의 분석을 위하여 K. pinnata의 재배 조건은 독립된 화분에 심어 온도 \( 38,400^{\circ} \mathrm{C} \), 습도\( 70 \% \) 이상, 광 조건 16시간, 암 조건 8시간에서 재배하였고, 잎 조직의 채취는 목표한 잎 가장자리를 포함하여 가로세로 \( 2 \mathrm{~mm} \) 정도의 정방형으로 조직을 잘라 곧바로 액체 질소에 얼려, \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 초저온 냉동고에 보관하였다. RNA의 추출과 differential expressed genes의 검출과 Real-time PCR을 통한 선발된 DEG유전자 발현 양 분석을 진행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>Kalanchoe pinnata의 재배 조건</h2> <p>Viviparous 소식물체의 형성에 관련한 유전자의 분석을 위하여 K. pinnata를 독립된 화분에 심어 온도 \( 38,400^{\circ} \mathrm{C} \) 와 습도\( 70 \% \) 이상의 배양 조건에서 공기 순환을 통하여 신선한 공기가 지속적으로 유입 될 수 있도록 한 배양실에서 재배하였다. 광주기는 광 조건 16시간, 암 조건 8시간으로 설정하였으며, 명 배양과 암 배양 간의 온도편차를 최소화하여 재배하였다. 배양실에서 재배한 K. pinnata의 성숙한 잎에서 소식물체의 발생이 이루어지지 않은 잎 가장자리, 발생 초기 단계의 잎 가장자리와 소식물체의 발생이 완료되어 viviparous 소식물체가 탈리 된 후의 잎 가장자리를 채취하였다. 조직의 특이성을 확보하기 위하여 잎 조직의 채취는 목표한 잎 가장자리를 포함하여 최소한의 범위로 가로세로 \( 2 \mathrm{~mm} \) 정도의 정방형으로 조직을 잘라 곧바로 액체 질소에 얼려, 실험에 사용할 때까지 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 초저온 냉동고에 보관하였다.</p> <h2>RNA의 추출과 differential expressed genes의 검출</h2> <p>Differential expressed gene (DEG) 검출 실험을 수행하기 위하여 budding이 되지 않은 K. pinnata와 소식물체가 발생한 K. pinnata에서 총 RNA를 분리하여 실험을 시행하였다. 엽육식물종인 K. pinnata에서 RNA의 순수분리를 위하여 본 실험에서는 guanidinium hydrochloride와 PEG를 이용한 총 RNA 추출 방법을 적용하였다. 발생단계 별로 채취 된 조직에서 분리된 RNA를 사용하여서 발생 단계에 따라 발현 차이를 보이는 유전자를 확인하기 위하여 GeneFishing\( { }^{\mathrm{TM}}\) DEG Premix Kit (Seegene Co., Korea)를 사용하였다. 각 단계에서 추출한 총 RNA \( 3 \mu \mathrm{g} \) 을 사용하여 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 의 반응 최종 반응액에 \( 2 \mathrm{mM} \) dNTPs \( 5 \mu \mathrm{l}, 5 \times \) reaction buffer \( 4 \mu \mathrm{l} \), Moloney murin leukemia virus reverse transcriptase (MMLV-RTase, Takara-bio Inc., Japan) \( 1 \mu \mathrm{l} \) 와 Kit에서 제공되는 dT-ACP (Deoxythymidine-Annealing Control Primer) 1 primer (5'-CTGTGAATGCTGCGACTACGATXXXXX(T)18-3' \( 2 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하여 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 90분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 합성된 first-strand cDNA에 \( 80 \mu \) 의 DEPC 처리된 고순도 증류수를 넣어 5배로 희석하여 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관, 사용하였다. Differentially expressed genes을 검출하기 위하여 GeneFishing\( { }^{\mathrm{Ti}}\) DEG Kit의 ACP-based PCR을 수행하였다. 총 \( 20 \mu 1 \) 의 반응액에 \( 4 \mu 1 \) 의 희석한 first-strand cDNA을 주형으로 하고, \( 1 \mu 1 \) 의 dT-ACP2 (5'-CTGTGAATGCTGCGACTACGATXXXXX(T)15-3')와 \( 2 \mu \)의 arbitrary ACP를 첨가하고 \( 10 \mu 1 \) 의 \( 2 \times \)SeeAmp\( \operatorname{}^{\mathrm{Ms}} \) ACP\(\mathrm{}^{\mathrm{TM}} \) master mix를 첨가하여 PCR 반응을 수행하였다. \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 로 예열된 PCR 기계(PTC-0200, MJ research Co., Germany)에 반응용액을 넣고 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분, \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3분, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분간 반응한 뒤, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 40초, \( 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 40초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 40초 반응을 40회 반복한 후 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 최종 반응시켜 PCR을 종료하였다. 증폭된 PCR 결과물을 \( 2 \% \) agarose gel에 전기 영동하여 각 primer에 따라 band의 상이한 패턴을 확인하였다. DEG PCR 결과물의 전기영동을 통하여 서로 다른 발현 양상이 확인된 band를 HiYield \( { }^{\mathrm{TM}} \) Gel / PCR DNA Extraction Kit (Real Biotech Co., Taiwan)를 이용하여 분리하여 pGEM-T easy Vector (Promega Co., USA)에 클로닝하여 보관하였다. PCR 결과물과 ligation된 pGEM-T easy Vector를 E. Coli DH5 \(\alpha\) 형질 전환하여 형질 전환체를 선발하고 plasmid를 추출하여 염기서열 분석을 의뢰하였다. 분석된 염기서열을 바탕으로 National Center for Biotechnology Information (NCBI, http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 중 nucleotide blast (BlastN)와 blastX program을 이용하여 algorithm analysis를 시행하였다.</p> <h2>Real-time PCR을 통한 선발된 DEG유전자 발현 양 분석</h2> <p>검출된 DEG의 확인을 위하여 분석된 유전자 염기서열을 기준으로 PCR 결과물의 크기가 \( 150 \sim 200 \mathrm{bp} \) 사이가 될 수 있도록 PCR primer를 작성하였다. 반응 혼합물 총 \( 20\mu 1 \)에 \( 10 \mu 1 \) 의 SYBR Premix Ex Taq \( { }^{\text {TM }} \) (Takara-bio Inc., Japan)과 제작한 10 uM Real-time PCR용 primer를 forward와 reverse를 \( 0.4 \mu \mathrm{l} \) 씩 첨가하고 각각 sample의 cDNA를 \( 0.2 \mu \mathrm{g} \) 을 주형으로 하여 Rotor-Gene \( { }^{\mathrm{TM}} \) 3000 real-time PCR 기계(Corbett Life Science Co., Australia)를 사용하여 real-time PCR을 수행하고 결과를 Roter-Gene\( { }^{\mathrm{TM}} \) (v6.034) software를 이용하여 Delta-Delta-CT 방법으로 분석하였다.</p>