미네랄 균형을 맞춘 해양심층수를 4종류로 제조하고, HEK\(293\) 세포는 \(37~{ }^{\circ}\mathrm{C},~5\%~\mathrm{CO}_{ 2}\)의 인큐베이터에서 배양하고, DCF-DA법을 이용하여 ROS를 측정하는데, 배지의 상층액 제거 후 DPBS를 분주한 후 fluorescence spectrophotometer를 이용하여 \( 485 \mathrm { ~nm } \)에서 형광을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>미네랄 균형을 맞춘 해양심층수 제조</h2> <p>동해 \( 510~ \mathrm { m } \) 깊이에서 채취한 해양심층수를 가공한 샘플은 청주에 소재한 샘표 발효 연구 센터에서 제공받았다. 해양심층수의 경우 높은 나트륨 함량을 가지고 있어, 탈염 과정을 가졌고 해양심층수의 특성상 다른 이온보다 높은 마그네슘 함량을 가지고 있었다. 특히, 마그네슘과 칼슘의 함량 비율이 \(1 \): \(3 \)- \(4 \)로 이에 주목하여, 칼슘과 마그네슘 함량은 적지만 비율은 같으면서 아연이나 셀레늄과 같은 미량 미네랄을 가지고 있는 trace mineral (TM), 높은 마그네슘 함량을 가지고 있으나 칼슘의 함량이 현저히 적은 high magnesium (HM), 마그네슘과 칼슘의 비율이 해양심층수와 비슷하면서 다른 샘플보다 음용하기에 적합한 함량을 가진 high magnesium low sodium (HMLS), 칼슘과 마그네슘의 함량이 거의 \( 1 \): \(1 \)인 high magnesium high calcium (HMHC)로 크게 네 가지로 제조되었다.</p> <h2>세포 배양</h2> <p>HEK \(293 \) 세포는 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하였다. HEK \(293 \) 세포는 Ad \(5 \) DNA 단편을 유산된 태아의 신장에서 추출한 세포로 형질 감염시켜 형질 전환된 세포주이다. \( 10 \% \) fetal bovine serum (Biowest, Nuaille, Cholet, France), \( 1 \% \) nonessential amino acid (MEM-NEAA) (Gibco, Rockville, MD, USA)와 \( 100 ~ \mathrm { U } / \) \( \mathrm { mL } \) penicillin- \( 100 ~ \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) streptomycin (Gibco)이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Gibco)배지를 사용하였다. 세포는 \( 37~ { } ^ {\circ } \mathrm { C } , ~5 \%~ \mathrm { CO } _ { 2 } \)의 인큐베이터에서 배양하였다.</p> <h2>Reactive oxygen species 측정</h2> <p>ROS는 DCF-DA법을 이용하여 측정하였다. \(96 \) well plate에 있는 배지를 다 제거해 준 후 DPBS로 세척하였다. 모든 well에 배지를 \( 180~ \mu \mathrm { L } \)씩 분주하고, \( \mathrm { CON } \)군에는 배지를, \( \mathrm { NaCl } \)군에는 \( \mathrm { NaCl } \)이 들어있는 배지를, 샘플군에는 샘플이 들어있는 배지를 \( 20~ \mu \mathrm { L } \)씩 넣은 후 \(2 \)시간 동안 배양하였다. 상층액을 모두 제거하고 빛을 차단한 후 DCF-DA 용액을 넣고 \(1 \)시간 배양한다. 상층액 제거 후 DPBS를 분주한 후 fluorescence spectrophotometer(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 이용하여 \( 485 \mathrm { ~nm } \)에서 형광을 측정하였다.</p>