실험 사료 제작을 위해 기본 넙치 사료에 대량 배양된 해양 유래 미생물인 Bacillus subtilis MD-02를 농도 별로 사료 \( 100 \mathrm{g} \)에 첨가하여 최종 농도를 \( 1.2 \times 10^{4} \mathrm{CFU/ 100g}\), \( 1.2 \times 10^{6} \mathrm{CFU} / 100 \mathrm{g}\), \(1.2 \times 10^{8} \mathrm{CFU} / 100 \mathrm{g}\) 으로 농도를 맞춰 제작하고,넙치의 미부 정맥에서 \( 1 \mathrm{ml}\) 주사기를 이용하여 채혈 하였으며, 채혈 된 전혈은 hematocrit 분석에 이용하였다. 혈청 대식세포 분석법은 유리관에 혈청 \( 25 \mu \mathrm{l}\)와 \( \mathrm{NBT} \) \( 175 \mu \mathrm{l}\)를 섞어 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 동안 반응시키고, 대조구와 실험구 그룹에 각각의 사료를 4주간 급이 후, S. parauberis를 \( 1.2 \times 10^{6}\mathrm{CFU / ml} \)의 농도로 \( 200 \mu \mathrm{l} \)씩 어체의 복강에 주사하여 누적 폐사율을 조사하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험어 및 실험 사료 제작</h2> <p>제주도 남원읍에 위치한 양식장에서 넙치 \( (212.7 \pm 31.4 \mathrm{~g}) \)를 구입하여 본 연구에 사용하였다. 구입한 넙치는 제주대학교 실험실로 옮겨 2주 동안 기본 사료(Table 1)를 급이 하여 순치시켜 수조 환경에 적응시켰다. \( 500 \mathrm{~mm} \times 160 \mathrm{~mm} \) 의 사육 수조를 사용하였으며, 총 4개의 그룹에 30마리씩 넙치를 수용하여 1일 2회 환수하였다. 사육수조의 조건은 온도 \( 20.0 \pm 0.3^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{pH} 8.32 \pm 0.19 \), 염분 \( 32.77 \pm 0.2 \% \), 용존산소량 \( 7.85 \pm 1.21 \mathrm{mg/l} \) 로 설정하였다. 사료 공급은 하루에 2번 (AM-10:00, PM-06:00) 어체중의 \( 5 \% \) 로 급이 하였으며, 광주기는 형광등을 이용하여 유지하였다. 실험 사육은 총 4주 동안 수행하였으며, 채혈 시 무작위로 넙치를 선별하여 진행하였다.</p> <p>실험 사료 제작을 위해 기본 넙치 사료에 대량 배양된 해양 유래 미생물인 Bacillus subtilis MD-02를 농도 별로 사료 \( 100 \mathrm{~g} \) 에 첨가하여 최종 농도를 \( 1.2 \times 10^{4} \mathrm{CFU} / 100 \mathrm{~g} \), \( 1.2 \times 10^{6} \mathrm{CFU} / 100 \mathrm{~g}, 1.2 \times 10^{8} \mathrm{CFU} / 100 \mathrm{~g} \) 으로 농도를 맞춰 제작하였다. 대조구는 아무것도 첨가 하지 않은 기본 사료를 사용하였다.</p> <h2>혈액학적 분석</h2> <p>1주에 한번씩 채혈을 진행하였으며, 실험 전 24시간은 절식시켜 무작위로 넙치를 선별하였다. 넙치의 미부 정맥에서 \( 1 \mathrm{ml} \) 주사기를 이용하여 채혈 하였으며, 채혈 된 전혈은 hematocrit 분석에 이용하였다. Hematocrit은 모세혈관 채혈튜브(Micro-Hematocrit Capillary Tubes, USA)에 전혈을 채운 뒤, 찰훍판(Cha-seal, KIMBLE, USA)으로 입구를 막은 뒤, 혈액 원심분리기(Micro-hematocrit centrifuge HHC-24, Hanshin-medical, Korea)에서 5분간 원심 분리하여 값을 측정하였다. 또한 전혈을 상온에서 60분간 방치한 후 원심 분리기를 이용하여 \( 12,000 \mathrm{rpm}, 10 \mathrm{~min} \) 에서 혈청을 분리하였으며, \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하여 실험 시 사용하였다. 분리된 혈청을 Comprehensive kit (Calxis, Korea)에 주입하여 VetScan vs2 (Calxis, Korea)를 이용하여 총 12가지의 항목에 대하여 분석을 진행하였다.</p> <h2>비특이적 면역반응 분석</h2> <p>혈청 라이소자임은 동결 건조된 Micrococcus lysodeikticus를 0.05 M sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 6.2) \) 를 이용하여 \( 0.03 \% \) 의 M. lysodeikticus 현탁액을 만들어 96-well plate에 혈청 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 와 현탁액 \( 250 \mu \mathrm{l} \) 를 분주한다. \( 22^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 방치한 후 흡광도 리더기(Biorad, Ramsey, USA)에서 \( 490 \mathrm{~nm} \)로 흡광도를 측정하였다. 라이소자임 활성의 1 unit은 \( 0.001 / \) \( \min \) 의 흡광도 감소를 나타내는 효소의 양으로 정하였다.</p> <p>혈청 대식세포 분석법은 유리관에 혈청 \( 25 \mu \mathrm{l} \) 와 \( \mathrm{NBT} \) (Nitroblue tetrazolium, Sigma-aldrich, USA) \( 175 \mu \mathrm{l} \) 를 섞어 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2시간 동안 반응시킨다. 이후 상층액을 제거하여 \( 100 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 메탄올을 이용하여 5분간 고정시킨 후, \( 70 \% \) \( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 메탄올을 이용하여 2번 수세하여 건조시킨다. 환원된 \( \mathrm{NBT} \) 를 \( 2 \mathrm{~N} \) 수산화칼륨 \( 125 \mu \) l와 DMSO \( 150 \mu \) 를 이용하여 용해시킨 다음 \( 650 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>어류질병세균을 이용한 병 저항성 실험</h2> <p>병 저항성 실험에 사용한 어류질병세균은 Streptococcus parauberis (KCTC 3651) 를 이용하여 \(1.5\%\) Brain Heart Infusion Broth (BHIB, Difco., USA)에서 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 48 \) 시간 전 배양 후 사용하였다. 대조구와 실험구 그룹에 각각의 사료를 4주간 급이 후, S. parauberis를 \( 1.2 \times 10^{6} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 의 농도로 \( 200 \mu \mathrm{l} \) 씩 어체의 복강에 주사하여 누적 폐사율을 조사하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>분석 결과의 통계처리는 SPSS (SPSS Inc., Version 18.0, USA) 프로그램을 이용하여 독립 검정을 실시하여 T-test \( (p<0.05) \) 로 평균간의 유의성을 검정하였다. 통계 분석을 일원 분산 분석(ANOVA)과 Tukey 테스트를 사용하여 평균을 비교함으로써 수행되었다. 결과 값은 평균값 \( \pm \) 표준편차 (mean \( \pm \) S.D)로 나타내었고 백분율 값은 arcsine 변형 값으로 계산하여 통계 분석하였다.</p>