대장균 세포 내에서 유전물질인 DNA와 결합하는 DPS 단백질의 생체 내 기능을 규명하고자 하였다.이 단백질을 코딩하는 유전자를 여러 종의 bacteria에서 Clustal W 소프트웨어를 이용하여 조사해 본 결과, Fig. 1과 같이 DPS 단백질들 간에 매우 보존된 아미노산 서열을 가지고 있음으로써 진화적으로 잘 보존되며 유전되고 있음을 알 수 있다. 이 균주를 야생형 대장균의 특성과 비교하고 대장균 내에 존재하는 DPS단백질의 생체내 기능을 규명하는 실험이다. 결과는대장균 세포의 DNA와 결합하여 DPS단백질은 미생물의 생육에 필요한 영양결핍상태에서 유전자보호라는 기능을 통해 영양분 부족 스트레스로부터 대장균을 보호하는 중요한 기능을 수행한다.
<h1>결 과</h1> <h2>DPS 단백질을 코딩하는 dps 유전자 결손 대장균( \( \boldsymbol{\Delta} \)dps E.coli) 균주에서의 dps유전자 knock-out 확인</h2> <p>대장균 세포 내에서 유전물질인 DNA와 결합하는 DPS 단백질의 생체 내 기능을 규명하고자 하였다. 이 단백질을 코딩하는 유전자를 여러 종의 bacteria에서 Clustal W 소프트웨어를 이용하여 조사해 본 결과, Fig. 1과 같이 DPS 단백질들 간에 매우 보존된 아미노산 서열을 가지고 있음으로써 진화적으로 잘 보존되며 유전되고 있음을 알 수 있다. 대장균 세포 내에서 DPS의 기능을 규명하기 위한 실험을 수행하기 위하여 dps knockout 세포인 \( \boldsymbol{\Delta} \)dps E.coli 균주를 분양 받았다. 분양 받은 돌연변이 대장균 세포를 실제로 dps 유전자가 결손 된 대장균 인지의 여부를 확인하기 위하여 세포 내 유전자 증폭(Colony Polymerase chain reaction, PCR) 실험을 수행하였다. 먼저 야생형 대장균과 \( \boldsymbol{\Delta}\)dps Ecodi 균주 세포를 이용하여 재료 및 방법에서 설명한 것과 같이 각각의 대장균 균주 세포를 끓는 물에서 5분간 끓임으로써 세포를 파괴하고 세포내부의 DNA를 용출시키도록 하였다. 그리고 용출된 DNA를 주형 가닥으로 하여 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 dps 유전자를 유전자 증폭 실험 방법으로 증폭시켰으며, 증폭된 유전자를 이용하여 유전자의 크기, 이동속도 등을 \( 0.8 \% \) 아가로스 겔에서 전기영동방법으로 확인하였다. 그 결과, 야생형 대장균에서 용출된DNA를 주형 가닥으로 사용하여 증폭한 유전자에는 504 bp의 dps 유전자가 존재한다는 것을 확인하였다. 하지만 \( \boldsymbol{\Delta} \) dps E.coli 균주로부터 용출된 DNA를 주형 가닥으로 사용하여 증폭한 유전자에서는 dps 유전자에 해당하는 크기의 유전자가 증폭되지 않았다는 사실을 아가로스 전기영동 방법으로 확인하였다(Fig. 2). 결국, \( \boldsymbol{\Delta} \)dps E.coli 균주에는 dps 유전자가 결손 되었다는 사실을 확인할 수 있었고, 이 균주의 특성을 야생형 대장균의 특성과 비교함으로써 대장균 내에 존재하는 DPS 단백질의 생체 내 기능을 규명하는 실험들을 수행하였다.</p> <h2>영양 결핍 상태에서 DPS 단백질이 대장균의 생육에 미치는 영향</h2> <p>대장균 세포 내에서 DNA와 결합하여 DNA-DPS 결합형태를 유지하는 DPS 단백질이 대장균의 생육에 미치는 영향을 관찰하여 보았다. 이 실험을 수행하기 위하여 야생형 대장균과 dps 유전자의 결손이 확인된 \( \boldsymbol{\Delta} \)dps 대장균 균주를 사용하였다. 이들 균주가 대장균이 살아가는 데 요구되는 영양분의 결핍상태에서 DPS 단백질 역할을 규명하기 위하여 최소한의 영양분만을 함유한 M9 최소배지를 사용하여 대장균을 배양하며 성장속도 변화를 관찰하였다. 이와 같은 영양 부족 환경에서는 미생물의 생육활동에 필요한 대사활동 수행을 위한 영양분이 부족하기 때문에 야생형 대장균의 경우에도 정상적인 세포 생장을 하기 힘들다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 영양분이 충분한 정상배지에서의 생육속도(Fig. 3A)보다 영양분 결핍의M9 배지에서는 대장균 성장속도 저하가 관찰되었으며, 특히 dps 유전자 결손 대장균 세포의 생장 곡선은 야생형 대장균의 성장속도보다 뚜렷하게 낮은 성장속도를 보임을 확인할 수 있었다(Fig. 3B). 이러한 결과는 미생물의 생육속도를 비교한 막대그래프(Fig. 3C)에서 보다 분명하게 확인할 수 있었다. 본 실험의 결과, 대장균 세포의 DNA와 결합하여 DPS단백질은 미생물의 생육에 필요한 영양 결핍상태에서 유전자 보호라는 기능을 통하여 영양분 부족에 의한 스트레스로부터 대장균을 보호하는 중요한 기능을 수행함을 알 수 있었다.</p>