균주를 통해 발현된 endoxylanase의 활성이 S. cerevisiae와 Bacillus subtilis에서 발현된 효소 활성이 낮게 측정되었는데, 그 이유는 효모세포 표면의 \( \alpha \)-agglutinin수가 제한적이기 때문으로 추정된다. 발현된 효소는 기질과 반응할 공간이 충분할 때 기질 친화성이 더 증가하였기 때문에 표면발현 효소활성이 일반적인 episomal 발현에 비해 상대적으로 낮은 것으로 사료된다. xynB 표면발현 효모세포를 생촉매로 사용했을 때 최적의 기질 농도를 결정하기 위해서 여러 농도의 OSX를 반응시켜 반응산물의 농도를 측정하였다. 표층발현 xynB의 경우 6% OSX에서 최적의 반응 산물 생산을 보여주었다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>재조합 plasmid의 구축 및 효모 형질전환제 선별</h2><p>xynB의 자체 분비신호(27개 아미노산으로 구성)를 사용할 경우, S. cerevisiae에서 분비효율이 \( 70 \% \) 이상으로 높게 유지되기 때문에 mating factor \( \alpha\)-1(MF\(\alpha\)1)과 같은 효모 분비신호를 사용하지 않았다. 즉, xynB 자체 분비신호를 포함한 전체 ORF\( (642 \mathrm{bp}) \)를 PCR 증폭하였고, 증폭 후 Nhel와 BamHI로 처리하고 미리 절단된 pCTcon의 AGA 유전자 하류에 연결시켰다. 구축이 확인된 xynB 표면발현계를 pCTXYN \( (6.8 \mathrm{~kb}) \)으로 명명하고 S. cerevisiae EBY100에 형질전환시켜 tryptophan 결핍 최소배지(YNBCAD)에서 형질 전환체를 선별하였다.</p><p>효모 형질전환체 (EBY 100/pCTXYN)를 \( 1 \% \) xylan이 포함된 YPDG 평판배지에서 배양한 후 Congo red 염색한 결과, 모든 형질전환체들의 colony 주위에는 투명환이 생성되었으며, 숙주세포 S. cerevisiae EBY100에서는 투평환이 생성되지 않았다. 이 결과로 xynB는 GAL1 promoter에 의해 효모 형질전환체에서 성공적으로 발현되었음을 확인하였다. 형질전환체들 중 투평환이 가장 큰 2 번 균주를 최종적으로 선별하였다. xynB의 표면발현 확인은 anti-c-myc(1차 항체)와 FITC(2차 항체)로 EBY 100/pCTXYN 균체를 labeling 후 immunofluorescence microscopy로 관찰한 결과, EBY100/ pCTXYN은 형광을 나타내었고, EBY100 (control)은 그렇지 않았다. 이 결과로 EBY100 / pCTXYN 균체에서 xynB는 성공적으로 표면발현됨을 확인하였다(data not shown).</p><h2>Flask 배양에서의 균체증식과 xynB 발현</h2><p>효모 형질전환체 EBY100 / pCTXYN를 YPDG 배지에서 48시간동안 flask 배양하여 균체증식, 탄소원 소모, endoxylanase 활성, plasmid stability 등을 조사하였다. 배양 12시간까지 균체증식은 활발했으며(포도당 소모구 구간), 갈락토스가 소모되는 배양 10시간부터 endoxylanase의 활성이 증가하기 시작하여 배양 48시간째 최대 활성에 도달하였다. 또한 plasmid stability는 배양 말기에 접어들어도 \( 90 \% \) 이상 안정하게 유지되었다. Endoxylanase 최대 활성은 \( 1.9 \mathrm{unit} / \mathrm{mL} \)로 나타났으며, 배양 상등액에서는 활성이 나타나지 않았다. 즉, 발현된 endoxylanase는 대부분 표면발현됨을 알 수 있었다.</p><p>S. cerevisiae에서의 xynB의 발현율 약 \( 8 \sim 10 \mathrm{unit} / \mathrm{mL} \)과 Bacillus subtilis에서의 발현율 \( 857 \mathrm{unit} / \mathrm{mL} \) 보다 효모 표면발현의 활성이 낮은 이유는 효모세포 표면에 발현되는 \( \alpha \)-agglutinin의 수가 약 \( 10^{4} \sim 10^{5} \) 개로 한정되어 있기 때문에 발현시킬 수 있는 효소의 양이 일정하고, 따라서 상대적으로 효소활성이 낮은 것으로 추정된다. Rhizopus orygae lipase를 효모 세포 표면에 발현시킬 때 \( \alpha \)-agglutinin과 lipase 사이의 linker peptides 수가 늘어감에 따라 기질 친화성이 증가하였다. 이를 볼 때 표면 발현된 효소가 기질과 반응하기 위해 필요한 공간 확보가 일반 episomal 발현보다 어려워 기질과의 친화력이 감소하는 것으로 사료된다. 따라서, 일반적인 episomal 발현에 비해 표면발현의 효소활성이 상대적으로 낮은 것으로 사료된다.</p><h2>기질 농도에 따른 XOS 생산</h2><p>xynB 표면발현 호모세포를 생촉매로 사용했을 때 최적의 기질 농도를 결정하기 위해 OSX(\(2 \sim 8 \%) \)과 생촉매 \( 5 \mathrm{unit} \)를 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 반응시켰다. 이 반응 생성물을 TLC로 분석한 결과 OSX를 \(6\%\) 사용하였을 때 가장 많은 XOS가 생성되었고, 기질농도가 늪아지면 가수분해속도가 저하됨에 따라 생성물의 양도 감소하는 것으로 나타났다. 주 반응산물은 xylotriose(X3)였으며 xylobiose (X2), xylotetraose (X4), xylopentaose(X5), xylohexaose(X6) 등도 소량 생성되었다.</p><p>Pichia에서 발현된 Aspergillus niger와 B. licheniformis의 xylanase 경우, \( 1 \% \) birchwood xylan(BWX)과 \( 1 \% \) wheat bran insoluble xylan으로부터 X3가 주로 생성되었다. 곰팡이 Plectosphaerella cucumerina xylanase를 Pichia에서 발현시킨 경우에서도 \( 1 \%\) OSX가 최적 기질과 농도로 보고되었다. B. halodurans endoxylanase를 K. lactis에서 발현한 경우, 중합도가 높은 XOSs(X4, X5 등) 생성이 관찰되기도 하지만 사용한 기질 농도는 \( 2 \% \)였다. xynB를 B. subtilis에서 발현 · 생산한 재조합 endoxylanase 경우 \( 4 \%\) BWX를 사용하였다. 즉, \( 1 \sim 4 \% \) 기질농도가 일반적으로 사용된 것에 비해 표층발현 xynB의 경우 \( 6 \%\) OSX에서 최적 XOSs 생산을 보임으로써 XOSs 수율과 생산성이 크게 개선될 것으로 예상된다.</p>