본 연구는 MMP-9의 활성 증가에 sulforaphane이 미치는 영향과 sulforaphane에 의한 MMP-9 활성 억제 효과가 세포 invasion 능력과 어떠한 상관성이 있는지를 분석하였으며, sulforaphane이 MMP-9 활성을 조절하는데 관여하는 기전에 대한 결과를 보고하고자 한다. 대식세포주인 Raw 264.7 세포는 MD에서 구입하여 배양시켰다. LPS 등의 다른 재료들은 Sigma-Aldrich에서 구입하였고, Sulforaphane은 DMSO를 이용하여 \( 20 \mathrm { mM } \)의 stock solution을 만든 다음 적정 농도로 희석하여 사용하였다.
<h1>서 론</h1> <p>암세포의 전이는 세포의 이동, 부착, 침범 등 일련의 복잡한 과정을 통해 이루어진다. 이러한 과정 중, 초기 단계에서 일어나는 필수적인 현상이 바로 collagens, proteoglycans 및 당단백질 등의 구조 단백질로 구성된 세포외기질(Extracelluar matrix, ECM)의 분해이다. Serine 단백질 분해효소, cysteine 단백질 분해효소, matrix metalloproteinases (MMPs) 등이 이에 관련되어 있으며, 특히 matrixins이라고도 불리는 MMPs는 collagen, fibronetic, laminin 등과 같은 ECM의 구성성분을 분해함으로써, 전이 뿐만 아니라 암세포의 성장, 혈관생성에도 중요한 기능을 한다고 알려져 있다. 현재 human MMPs로 20종류가 동정되어 있고, 분해 기질에 따라 네 분류로 나누어져 있다. Collagenases, gelatinases, stromelysins, membrane- associated MMPs. Human MMPs 중, 기저막의 주요 성분인 type IV collagen을 분해하는데 중요한 역할을 하는 효소인 MMP-2와 MMP-9는 여러 종류의 암세포 전이 뿐만아니라 혈관생성에도 관여하고 있음이 밝혀져 있다. 최근 breast, lung, colon, prostate 등의 조직에서 형성되는 종양에서 MMP-9의 과발현이 알려졌고, 이는 전이 또는 종양형성 과정에서 MMP-9가 기능적으로 중요한 역할을 하고 있음을 시사한다. Human 암세포에서 MMP-9 발현 조절 기전은 아직 규명되지 않았지만, MMP-9의 프로모터에는 전사조절인자인 AP-1 (-533 bp, -71 bp), NF-kB (-600 bp), Sp-1 (-588 bp)의 결합 부위가 존재하고, 이러한 전사조절인지들이 MMP-9 발현 조절에 관여한다고 알려져 있다.</p> <p>Sulforaphane [1-isothiocyanato-4-(methylsulfinyl)-butane] 은 십자화과 채소에 존재하는 isothiocyanate family에 속하는 화합물로써, detoxification에 관여하는 phase Ⅱ enzyme을 활성화 시켜 세포내 항산화 능력을 촉진시킨다고 알려져 있다. 뿐만 아니라, sulforaphane은 세포사멸을 증가시키거나, 세포주기 진행의 억제, 항염증 반응 등의 효과가 관찰됨으로써, chemopreventive agent로 각광 받고 있다. 최근 다양한 암 세포주에서 sulforaphane에 의한 암세포주의 invasion, 전이 및 MMPs 활성 억제 효과가 보고되어 지고 있지만, 명확한 기전을 밝혀지지 않고 있다.</p> <p>본 연구에서는 대식세포에 LPS에 의해서 유도되는 MMP-9의 활성증가에 sulforaphane이 미치는 영향에 대해서 조사를 하였다. 아울러 sulforaphane에 의한 MMP-9 활성 억제 효과가 세포 invasion 능력과 어떠한 연관성이 있는지도 연구하였으며, sulforaphane이 MMP-9 활성을 조절하는데 관여하는 기전에 대한 결과를 보고하고자 한다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포 배양 및 재료</h2> <p>대식세포주인 Raw 264.7세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD)에서 구입한 것을 분양 받았으며, 세포 배양을 위해 RPMI 1640에 \( 100 \mathrm { U } / \mathrm { ml } \) penicillin, \( 100 \mu \mathrm { g } \) \( / \mathrm { ml } \) streptomycin, \( 10 \% \) feral bovine serum을 첨가한 배지를 사용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , \) \(5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) 조건 하에서 배양하였다. 일주일에 두 번씩 계대배양을 하였고, 배양 중인 세포를 6-well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 6 } \)의 세포수로 분주하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , \) \(5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) incubator에서 안정화 시킨 후 시료를 처리하였다. LPS를 비롯한 본 실험에서 사용된 재료는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. Sulforaphane 은 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma Chemical Co., St Louis, \( \mathrm { MO } ) \)을 이용하여 \( 20 \mathrm { mM } \)의 stock solution을 만든 다음 적정 농도로 배지에 희석하여 사용하였다.</p>