LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소를 다양한 pH를 가진 버퍼에서 반응시켜 상대적 활성을 측정하고, 최적의 pH를 파악했다. 또한, 피루브산 농도를 \( 100 \mu \mathrm { M } \)에서 \( 10 \mathrm { mM } \)까지 증가시키며 효소활성 저해정도를 조사하였다. 정제한 쏘가리 LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소를 PBS에 녹여 다양한 양의 adjuvant를 사용하여 완전히 유화시킨 후, 뉴질랜드 화이트 순종토끼에 7일 간격으로 3회 주사하였다.
<h2>LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소의 최적 \( \mathrm { pH } \)</h2> <p>LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소를 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } 0.1 \mathrm { M } \) sodium acetate buffer ( \( \mathrm { pH } \) 4.0, 4.5, 5.0), \( 0.1 \mathrm { M } \) sodium citrate buffer ( \( \mathrm { pH } 5.5), 0.1 \)M potassium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } \) 6.0, 6.5, 7.0), \( 0.1 \mathrm { M } \) Tris-HCl buffer ( \( \mathrm { pH } \) 7.5, 8.0, 8.5), \( 0.1 \mathrm { M } \) Tris-glycine buffer \( ( \mathrm { pH } \) 9.0) 및 \( 0.1 \mathrm { M } \) sodium carbonate buffer \( ( \mathrm { pH } \) 9.5, 10.0, 10.5)에서 반응시킨 후 LDH 활성을 측정하였고 최대 활성을 기준으로 상대적 활성( \( \% \))을 구하였으며 최적 \( \mathrm { pH } \) 를 확인하였다.</p> <h2>LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소의 기질의존성 측정</h2> <p>LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소의 기질 농도에 의한 효소활성 저해정도를 알아보기 위해 피루브산 농도를 \( 100 \mu \mathrm { M } \) 에서 \( 10 \mathrm { mM } \) 까지 증가시키면서 활성의 변화를 측정하였다. \( K_ {\mathrm { m } } { } ^ {\mathrm { PYR } } \) 값과 \( V_ {\max } \) 값은 피루브산 농도 \( 10 \mu \mathrm { M } \) 에서 \( 80 \mu \mathrm { M } \) 까지 LDH 활성을 측정 한 후 Lineweaver-Burk plot을 이용하여 구하였다.</p> <h2>LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소에 대한 항혈청 조제</h2> <p>정제한 쏘가리 LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소는 \( 0.58 \mathrm { mg } , 0.68 \mathrm { mg } \) 및 \( 0.73 \mathrm { mg } \) 의 순서로 \( 0.01 \mathrm { M } \) phosphate buffered saline \( ( \mathrm { pH } \) 7.4, PBS)에 녹여 1차 면역은 동량의 Freund's complete adjuvant를 사용하고, 2차 면역부터는 동량의 Freund's incomplete adjuvant를 사용하여 완전히 유화시킨 후, 뉴질랜드 화이트 순종토끼에 7일 간격으로 3회 근육에 주사하였다. 최종 면역주사 5일 후 항응고제를 첨가하지 않고 심장천자로 채혈하였고, 혈액은 실온에서 1시간, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 6시간 방치 후 혈병을 제거한 다음 \( 3,000 \mathrm { rpm } \)에서 20분간 원심분리하였으며 상등액을 다시 \( 15,000 \mathrm { rpm } \) 에서 30분간 원심분리하여 항혈청으로 사용하였다. 항혈청은 동량의 PBS를 가한 후 \( \left ( \mathrm { NH } _ { 4 } \right )_ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \) 로 \( 50 \% \) 포화시켜 \( 0 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1시간 동안 방치한 다음 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 20,000 \times g \) 에서 30분간 원심분리하여 침전물을 얻었다. 침전물은 초기 단계의 항혈청과 동량으로 PBS에 녹여 전과 동일한 과정으로 2회 반복하였다. 이 때 침전물은 처음 항혈청 양의 \( 1 / 3 \) 이 되도록 PBS에 녹여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \), PBS내에서 36시간동안 투석한 후 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } , 20,000 \times g \) 에서 30분간 원심분리 하여 상등액을 항체 용액으로 사용하였다.</p>