ECHB 분해반응에서 DMSO와 다양한 금속 이온의 효과를 분석한 결과, \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } , \mathrm { Ca } ^ { 2 + } , \mathrm { Cu } ^ { 2 + } \)의 존재는 전환 수율과 e. e. s 값을 감소시켰다. 반면, \( \mathrm { K } ^ { + } \)와 \( \mathrm { Li } ^ { + } \)는 전환 수율과 e. e. s 값을 대조군과 비슷하게 유지하였다. 따라서, 메타게놈에서 발견된 저온성 에스터라제 EM2L8는 다양한 유기용매 환경에서 높은 에스터라제 활성을 보여준다.
<h2>ECHB 분해반응에서의 유기용매 및 금속이온의 영향</h2> <p>에스터라제 EM2L8이 (R,S)-ECHB 기질에 대한 가수분해 활성이 있는 것으로 확인됨에 따라서 유기용매 및 금속이온이 효소반응 속도와 입체선택성에 미치는 영향을 분석하였다. Fig. 2A에 나타난 유기용매의 효소활성에 미치는 영향을 근거로 유기용매의 농도를 10%(v/v)로 정하였다. 유기용매를 첨가하고 앞에서와 동일한 방법으로 6시간 동안 반응을 수행하고 전환수율을 구한 결과, 메탄올, 에탄올, 아세톤의 경우에는 유사한 값을 얻을 수 있었으나, 아세토니트릴의 경우에는 크게 감소하였다(Fig. 5A). 반면에 DMSO를 첨가한 경우에는 4시간 동안 반응을 수행해도 전환수율이 크게 증가하였다. 이것은 DMSO 첨가에 의해서 효소의 가수분해 반응속도가 크게 증가되었음을 보여준다. 효소의 입체 선택성을 보여주는 e.e.s값을 측정한 결과, 아세톤과 아세토니트릴의 경우에는 상대적으로 e.e.s값이 감소하였으나, DMSO의 경우에는 e.e.s값이 증가된 것으로 나타났다.</p> <p>금속이온을 10mM 농도로 첨가하고 동일한 반응을 6시간 동안 수행한 결과, \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } , \mathrm { Ca } ^ { 2 + } , \mathrm { Cu } ^ { 2 + } \) 를 사용한 경우에는 전화수율과 e.e.s값이 대조군에 비해 모두 감소하였으나, \( \mathrm { K } ^ { + } \)와 \( \mathrm { Li } ^ { + } \)을 사용한 경우에는 전환수율과 e.e.s값이 대조군과 유사한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5B).</p> <h2>ECHB 분해반응에서의 DMSO의 영향</h2> <p>각종 유기용매와 금속이온을 첨가한 효소반응에서 얻은 결과로부터 DMSO가 가장 좋은 첨가제인 것으로 밝혀졌다. DMSO를 10% 농도로 첨가하고 동일한 ECHB 분해반응을 수행하였다. DMSO를 첨가하지 않은 반응과 비교할 때, (R,S)-ECHB 기질이 훨씬 빠르게 가수분해됨을 확인할 수 있었으며(Fig. 6A), ECHB의 분해속도는 10.4 μmole/h로 계산되었다. 즉 DMSO 첨가에 의해서 효소반응속도가 1.5배 증가되었음을 알 수 있다. 한편, DMSO 첨가에 의한 입체선택성 변화를 알아보기 위해서 전화수율과 e.e.s 값을 그래프로 구하였다(Fig. 6B). DMSO 의 유무와 상관없이 전환수율에 따른 e.e.s 값은 유사하게 나타났다. 따라서 DMSO는 효소의 입체선택성에는 영향을 미치지 않고 ECHB의 분해속도만을 증가시킨 것임을 알 수 있다.</p> <p>결론적으로 메타게놈에서 발굴한 저온성 에스터라제 EM2L8 효소는 각종 유기용매 하에서도 높은 에스터라제 활성을 지니는 것이 확인되었다. 또한, rac-ECHB 기질을 가수분해 할 수 있으며 DMSO 용매를 첨가하는 경우에 효소의 기질 분해속도가 1.5배 빨라지는 것을 확인하였다. 이 효소는 (S)-ECHB 기질에 대한 입체선택성을 갖고 있지만 그대로 상업적 공정에서 이용하기에는 e.e.s값이 높지 않다. 그러나 분자진화기법을 이용해서 효소의 입체선택성을 증가시킨다면 상업적으로 이용할 수 있을 것으로 보인다. 에스터라제 EM2L8 효소는 저온에서 높은 활성을 보일 뿐만 아니라 각종 유기용매 하에서도 높은 안정성과 활성을 갖고 있기 때문에 이러한 장점을 이용해서 여러 가지 의약품의 유기합성공정에서 효소촉매로 널리 활용될 수 있다고 기대된다.</p>