본 실험에서는 찔레나무뿌리의 항산화능을 측정하였다. 측정 시험에 Folin-Ciocalteu phenol reagent 시약을 통해 폴리페놀 함량을, DPPH 용액을 통한 Blois 방법에 따른 전자공여능을, 항산화능을 측정하기 위해서는 Pellegrin이 제안한 ABTS radical cation decolorization 방법과 Marklund 등이 제안한 SOD 유사활성, Fridovich의 NBT 환원방법에 따른 Superoxide anion radical 소거능을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료 및 시료의 추출</h2> <p>본 실험에 사용한 찔레나무뿌리는 대구약령시에서 구입하여 이물질을 제거하고 세척한 후, 음건하여 실험재료로 사용하였다. 시료의 열수추출물의 경우 시료의 10배의 증류수를 첨가하여 \( 85^{\circ} \mathrm{C} \)에 3시간 환류냉각 추출하여 상등액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였으며, 에탄올, 메탄올 및 아세톤 추출물 시료 중량의 10배 양을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회반복 추출 하여 추출물을 여과, 농축 및 동결 건조 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 냉장실에 보관하여 본 실험의 시료로 사용하였다.</p> <h2>실험 시약</h2> <p>항산화능 측정 실험에 사용된 시약인 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), xanthine, xanthine oxidase, pyrogallol, ni-tro blue tetrazolium (NBT), 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothia-zoline-6-sulfonic acid) diammonium salt, potassium persul-fate, hyaluronidase (HAase), hyaluronic acid, p-dimethyla-minobenzaldehyde (DMAB), sodium nitrite 및 griess reagent 등은 Sigma Chemical Co. Ltd. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포 독성 측정에 사용된 세포주는 mouse 대식세포인 Raw 264.7 cell을 Korean Cell Line Bank (KCLB)에서 구입하여 사용하였다. 세포독성 측정시약 3-[4,5-dime-thylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide (MTT)는Sigma Chemical Co.에서 구입하여 사용하였다.</p> <h2>총 폴리페놀 함량 측정</h2> <p>폴리페놀 함량은 Folin과 Denis에 준하여 정량 하였다. 10배 희석한 시료용액 \( 3 \mathrm{ml} \)에 \( 1 \mathrm{~N} \) Folin-Ciocalteu phenol re-agent 시약 \( 1 \mathrm{ml} \)를 가하고, \( 1 \mathrm{~N} \) \( \mathrm{HCl} \) \( 2 \mathrm{ml} \)로 반응정지 후 포화 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 용액 \( 1 \mathrm{ml} \)를 가하여 혼합한 후 1시간 실온에서 방치하고, \( 640 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정한 후, 표준물질인 tannicacid로 미리 작성한 표준곡선의 흡광도 값과 비교하여 폴리페놀 함량을 산출하였다.</p> <h2>전자공여능 측정</h2> <p>EDA (electron donating abilities)은 Blois의 방법을 따라 측정하였다. 각 시료용액 \( 2 \mathrm{ml} \)에 \( 0.2 \mathrm{mM} \) 의 DPPH \( 1 \mathrm{ml} \)을 넣고 교반한 후 30분간 방치한 다음 \( 517 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <p>전자공여능\( (\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\text { 무첨가군의 흡광도 }}\right) \times 100 \)</p> <h2>ABTS radical cation decolorization 측정</h2> <p>ABTS radical을 이용한 항산화력 측정은 Pellegrin등의 방법에 의하여 측정하였다. \( 7 \mathrm{mM} \)의 2,2-azino-bis (3-ethyl-benzthiazoline- 6-sulfonic acid)와 \( 2.4 \mathrm{mM} \)의 potassium per-sulfate를 최종 농도로 혼합하여 실온인 암소에서 24시간 동안방치하여 ABTS+∙을 형성시킨 후 phosphate buffered saline로 희석하여 \( \mathrm{ABTS}^{+} \cdot\) \( 100 \mu 1 \)에 시료 \( 100 \mathrm{\ul} \) 를 가하여 1분 동안 방치한 후 \( 732 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <p>소거능 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\text { 무첨가군의 흡광도 }}\right) \times 100 \)</p> <h2>Superoxide dismutase (SOD) 유사활성 측정</h2> <p>SOD 유사활성은 Marklund 등의 방법에 따라 측정하였다. 각 시료용액 \( 0.2 \mathrm{ml} \)에 Tris \( \mathrm{HCl} \)의 완충용액 (\(50 \mathrm{mM} \) Tris \(+10 \mathrm{mM}\) EDTA, \(\mathrm{pH} 8.5\) \(~2.6 \mathrm{ml} \)와 \( 7.2 \mathrm{mM} \)의 pyrogallol \( 0.2 \mathrm{ml} \)를 가하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시킨 후 \( 1.0 \mathrm{~N}\) \(\mathrm{HCl} ~0.1 \mathrm{ml} \)를 가하여 반응을 정지시키고 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양을 \( 420 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. SOD 유사활성은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <p>\( \mathrm{SOD} \) 유사활성능 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\text { 무첨가군의 흡광도 }}\right) \times 100 \)</p> <h2>Superoxide anion radical 소거능 측정</h2> <p>Superoxide anion radical 소거능은 Fridovich의 방법에 따라 NBT 환원방법으로 측정하였다. 각 시료용액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)와 \( 0.1 \mathrm{M} \) potassium phosphate buffer (\(\mathrm{pH} 7.5\)) \(0.4 \mathrm{ml} \)에 xanthine (\(0.4 \mathrm{mM}\))과 NBT (\(0.24 \mathrm{mM}\))을 녹인 기질액 \( 1 \mathrm{ml} \)을 첨가하고 xanthine oxidase (\(0.2 \mathrm{U} / \mathrm{ml}\)) \(1 \mathrm{ml} \)를 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 반응시킨 후 \( 1 \mathrm{~N}\) \( \mathrm{HCl}\) \(1 \mathrm{ml} \)을 가하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액 중에 생성된 superoxide anion radical의 양을 \( 560 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <p>저해율 \( (\%)=\left(1-\frac{\text { 시료첨가군의 superoxide anion radical 생성량 }}{\text { 무첨가군의 superoxide anion radical 생성량}}\right) \times 100 \)</p>