R. toruloides SJ-4 파생의 epoxide hydrolase activity를 사용한 라세믹 phenyl oxirane의 입체선택적 가수분해 반응에 있어 주요 반응 조건인 \(\mathrm{pH}\), 온도와 에폭사이드 기질의 용해도 증가를 위해 첨가되는 DMSO(dimethyl sul-foxide) 등의 cosolvent 등이 입체선택적 가수분해반응에 끼치는 영향을 분석하여 최적 반응조건을 결정하기 위하여 반응표면 분석법(response surface analysis)을 사용하였다. 세 가지 실험 인자를 각각 -2, -1, 0, 1, 2의 5단계의 실험수준으로 나누어 중심합성 계획법에 따라 총 \( 2^{\mathrm{K}}+2 \mathrm{K}+\mathrm{N}_{0} \) (\(\mathrm{K}\): 변수의 개수, \( \mathrm{N}_{0} \) : 중심점의 개수)개의 실험점을 정하였다. Fig. 1에서와 같이 con-tour plot을 통해 최적 \( \mathrm{pH} \)는 7.3, 반응온도는 \( 34.4^{\circ} \mathrm{C} \)로 결정했다. 반응표면 분석으로 얻은 최적 조건에서 R. toruloides SJ-4의 epoxide hydrolase 활성을 써서 \( 100 \mathrm{~mM} \) 라세믹 phenyl oxirane에 대한 입체선택적 가수분해 반응을 수행했다. 이 결과로 기존 조건의 회분식 분할 결과 대비 \( 67 \% \) 정도의 수율 증가를 얻었고 반응시간도 약 \( 50 \% \) 정도 감소했다.
<h1>결과 및 토론</h1> <h2>반응 표면 분석법을 이용한 R. toruloides SJ-4에 의한 chiral phenyl oxirane 회분식 제조조건 최적화</h2> <p>R. toruloides SJ-4 유래의 epoxide hydrolase activity를 이용한 라세믹 phenyl oxirane의 입체선택적 가수분해 반응에 있어서 주요 반응 조건인 \( \mathrm{pH} \), 온도 및 에폭사이드 기질의 용해도 증가를 위해 첨가되는 DMSO(dimethyl sul-foxide) 등의 cosolvent 등이 입체선택적 가수분해반응에 미치는 영향을 분석하고, 최적 반응조건을 결정하기 위하여 반응표면 분석법(response surface analysis)을 사용하였다. 중심합성계획법(central composite design)을 이용하여 실험점들을 결정하였으며, 2차 회귀모형의 계수를 결정하기 위한 회귀 분석은 Statistical Analysis System (SAS)을 사용하여 분석하였다.</p> <h2>Response surface analysis를 이용한 최적 반응조건결정</h2> <p>중요 실험인자인 \( \mathrm{pH} \), 반응온도, cosolvent 등은 복합적인 상호작용이 예상되므로 이러한 실험인자의 변화가 가수분해 속도에 미치는 영향을 반응표면 분석법을 이용하여 통계적으로 분석하여 최적 반응조건을 결정하였다. 세 가지 실험 인자에 대하여 각각 -2, -1, 0, 1, 2의 다섯 단계의 실험수준으로 나누고, 중심합성 계획법에 따라 총 \( 2^{\mathrm{K}}+2 \mathrm{K}+\mathrm{N}_{0} \) (\(\mathrm{K}\): 변수의 개수, \( \mathrm{N}_{0} \) : 중심점의 개수)개의 실험점을 결정하였다. 실험점은 8개의 요인실험점, 6개의 축점, 그리고 1개의 중심점을 포함하여 총 15개로 구성하였다. 각각 2번 반복 실험한 결과를 이용하였으며, 실험조건과 (R)-phenyl oxirane 분해 속도와의 함수관계는 다음과 같은 2차 회귀식을 사용하였다.</p> <p>\( \begin{aligned} \mathrm{y}=& \beta_{0}+\beta_{1} X_{1}+\beta_{2} X_{2}+\beta_{3} X_{3}+\beta_{12} X_{1} X_{2}+\beta_{13} X_{1} X_{3}+\beta \\ & _{23} X_{2} X_{3}+\beta_{11} X_{1}^{2}+\beta_{22} X_{2}^{2}+\beta_{33} X_{3}^{2} \end{aligned} \)</p> <p>여기서 \( \mathrm{y} \)는 분해 속도(\(\%\))이며 \( X_{1}, X_{2}, X_{3} \)는 각각 \( \mathrm{pH} \), 반응온도\( \left({ }^{\circ} \mathrm{C}\right) \), cosolvent 첨가량(\(\%\)(\(\mathrm{v/v}\)))이며 \( \beta_{0} \)는 절편, \( \beta_{\mathrm{n}} \)은 회귀계수이다. 실험 결과 해석은 SAS 프로그램을 사용하였다.</p> <h2>중심합성법에 의한 반응 표면 분석</h2> <p>Table 2에 제시되어 있는 각각의 실험점에서 얻은 실험값을 대상으로 SAS 프로그램을 이용하여 실험결과를 분석하였다. 전체 9개의 total regression 분석에 대한 \( \mathrm{R}^{2} \) 값이 0.987 (\(\mathrm{p}<0.05\)) 정도로 \( 5 \% \) 유의 수준 이내에서 유의성이 인정되었으며, R. toruloides SJ-4의 epoxide hydrolase의 (R)-phenyl oxirane 가수분해 속도는 \( \mathrm{pH} \), 온도 및 cosolvent의 영향을 받음을 알 수 있었다. SAS 분석을 통해 \( \mathrm{pH} \), 온도, cosolvent 첨가량 변화에 따른 (R)-phenyl oxirane의 초기 가수분해 속도 변화를 나타내주는 반응표면에 대한 2차 회귀분석식은 아래와 같이 결정하였다.</p> <p>\( \begin{aligned} \mathrm{y}=& 0.00236-0.00033 X_{1}-0.00045 X_{2}+0.00041 X_{3}+\\ & 0.00049 X_{1} X_{2}+0.00051 X_{1} X_{3}-0.00014 X_{2} X_{3}-0.00117 X_{1}^{2} \\ &-0.00119 X_{2}^{2}-0.00060 X_{3}^{2} \end{aligned} \)</p> <p>실험 parameter들에 대하여 각각 F-ratio 값을 분석한 결과, \( \mathrm{pH} \)의 F-ratio 값이 60 (\(\mathrm{p}<0.05\))으로 가장 높게 나타나 (R)-phenyl oxirane의 초기 가수분해 속도는 \( \mathrm{pH} \)에 의해 가장 크게 영향을 받고 있음을 알 수 있었으며, 나머지 인자인 온도와 cosolvent 첨가량의 변화에 따른 영향은 각각 F-ratio 값이 40 (\(\mathrm{p}<0.05\)), 24 (\(\mathrm{p}<0.05\))로 나타나 유의수준 \( 5 \% \) 이내에서 모두 유의성을 인정받음을 알 수 있었다.</p> <p>반응표면 곡선에 대한 전반적인 모습과 추정된 stationary point 값이 최대치를 주는지를 알아보기 위하여 canonical analysis를 실시한 결과, 2차 곡선에 대한 행렬식의 eigenvalues 값들이 \( \mathrm{pH} \), 반응온도, cosolvent 첨가량에 대해 모두다 음의 값들이 나와 반응표면이 위로 볼록한 곡면 형태임을 알 수 있었고, 따라서 최적조건인 최대점이 존재함을 알 수 있었다.</p> <p>실험 인자중에서 가장 적은 영향을 주는 cosolvent 첨가량을 \( 2.3 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 결정한 후 \( \mathrm{pH} \) 및 반응온도 변화에 따른 가수분해 속도 변화를 분석하였다. Fig. 1에서와 같이 con-tour plot을 통해 최적 \( \mathrm{pH} \)를 7.3, 반응온도를 \( 34.4^{\circ} \mathrm{C} \)로 결정 할 수 있었다. \( \mathrm{pH} \)와 온도 변화에 따른 (R)-phenyl oxirane 가수분해 속도에 대한 3차원 반응표면이 Fig. 2에 나타나있다.</p> <h2>입체선택성 가수분해 반응을 이용한 (S)-phenyl oxirane 생산</h2> <p>반응표면 분석을 통해 얻은 최적 조건에서 R. toruloides SJ-4의 epoxide hydrolase 활성을 이용하여 \( 100 \mathrm{~mM} \) 라세믹 phenyl oxirane에 대한 입체선택적 가수분해 반응을 수행하였다. \( \mathrm{pH} ~7.4\), 온도 \( 34^{\circ} \mathrm{C} \) 및 cosolvent 첨가량 \( 2.3 \%\)(\(\mathrm{v/v}\))의 최적 조건에서 \( 400 \mathrm{~mg} \) (dry cell weight)의 균체를 \( 10 \mathrm{~ml} \) reaction vessel에 넣은 다음 광학분할 실험을 수행하였다. Fig. 3에 나타난 것과 같이 약 3시간 정도의 반응을 통해 \(\mathrm{ee}\) 값이 \( 100 \% \)인 (S)-phenyl oxirane를 \( 24 \% \) 정도(이론 수율 \( =50 \%\)) 의 수율로 얻을 수 있었다. 이 결과로부터 기존 조건에서의 회분식 분할 결과 대비 \( 67 \% \) 정도의 수율 향상을 얻을 수 있었으며, 반응시간도 약 \( 50 \% \) 정도 줄일 수 있었다.</p>