sulforaphane이 세포 침투력에 미치는 영향을 관찰하기 위해서 invasion assay를 실행하고, Sulforaphane이 LPS에 의해 증가된 MMP-9 활성에 미치는 영향을 조사하였다. Sulforaphane을 세포 배양액 분리를 통하여 gelatin zymography를 하였고, Sulforaphane에 의한 LPS 유도 MMP-9의 활성을 감소의 원인인 MMP-9 단백질 발현의 전사 단계의 조절에 기인되는지를 확인하기 위하여 RT-PCR 방법으로 mRNA 발현 정도를 측정하였다.
<h2>Invasion assay</h2> <p>sulforaphane이 세포 침투력에 미치는 영향을 관찰하기 위해서 membrane filter ( \( 8 \mu \mathrm { M } \) pore-size)가 부착된 12 well boyden chamber를 사용하여 invasion assay를 실행하였다. \( 5 \times 10 ^ { 4 } \)의 Raw 264.7 세포를 아무것도 처리 안한 배지, LPS 단독 또는 LPS와 sulforaphane을 함께 처리한 배지에 각각 현탁하여, transwellof upper chamber에 넣고, 24시간 동안 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다. Filter의 위쪽에 위치한 이동하지 않은 세포를 면봉으로 제거하고, filter 아래쪽으로 이동한 세포는 고정 시킨 후 methanol, acetic acid, 물이 \(45:10:45 \)로 혼합된 \( 0.125 \% \) Comassie Blue로 염색하여 광학 현미경으로 transwell을 통과한 세포의 수를 세었다.</p> <h1>결 과</h1> <h2>Raw 264.7 세포에서 LPS에 의해서 유도된 MMP-9의 활성에 미치는 sulforaphane의 영향</h2> <p>Sulforaphane이 LPS에 의해 증가된 MMP-9 활성에 미치는 영향을 조사하였다. Sulforaphane을 농도별로 30분 전처리 한 후 LPS를 24시간 동안 처리하여 세포 배양액을 분리하여 gelatin zymography를 하였다. MMP-9 활성은 LPS 처리에 의하여 높은 활성을 보였다. LPS에 의해서 유도된 MMP-9 활성이 sulforaphane에 의해서 농도 의존적으로 억제됨을 알 수 있었다. Sulforaphane의 MMP-9 활성 억제 효과를 다양한 염증 매개의 cytokine인 IL-1 \( \beta \)나 TNF- \( \alpha \)를 처리하여 확인 하였다. IL-1 \( \beta \)와 TNF- \( \alpha \)에 의한 MMP-9 활성 증가는 LPS에 비하여 약하지만 gelatin zymopraphy에서 확인할 수 있었다. 또한 sulforaphane은 IL-1 \( \beta \)와 TNF- \( \alpha \)에 의한 MMP-9 활성 증가를 농도 의존적으로 억제함을 확인하였다.</p> <h2>LPS에 의해 유도된 MMP-9의 mRNA 발현과 promoter 활성 증가에 미치는 sulforaphane의 영향</h2> <p>Sulforaphane에 의한 LPS 유도 MMP-9의 활성을 감소의 원인인 MMP-9 단백질 발현의 전사 단계의 조절에 기인되는지를 확인하기 위하여 RT-PCR 방법으로 mRNA 발현 정도를 측정하였다. Sulforaphane을 농도별로 30분 동안 전 처리한 후, \( 50 \mathrm { ng } / \mathrm { ml } \) LPS를 처리하여 MMP-9의 mRNA 발현 변화를 관찰한 결과, LPS에 의해 증가했던 MMP-9의 mRNA 발현이 sulforaphane 농도 의존적으로 현저히 감소되는 것을 알 수 있었다. Sulforaphane에 의한 LPS 유도 MMP-9의 mRNA 발현 감소가 MMP-9 mRNA 안정성 조절에 의하여 야기 되는지를 확인하였다. Raw 264.7 세포를 LPS \( (50 \mathrm { ng } / \mathrm { ml } ) \)가 함유된 배지에 12시간 동안 배양한 후 RNA 합성 억제제인 actinomycin D (Act.D) 단독과 Act.D와 sulforaphane을 처리 하였다. Sulforaphane의 영향에 따른 MMP-9 mRNA 안정성을 시간별로 조사해 본 결과, Act.D 단독과 Act.D와 sulforaphane이 혼합 처리된 시료 사이에 뚜렷한 차이점은 관찰 할 수가 없었다. 이 결과는 sulforaphane의 MMP-9 mRNA 발현 조절에 있어서 mRNA 안정성에는 영향을 미치 지 않음을 의미하는 것이다. Sulforaphane이 LPS로 유도된 MMP-9 발현을 promoter 활성화 저해를 통한 발현조절임을 확인하기 위하여 reporter gene assay를 수행하였다. Raw 264.7 세포에 MMP-9-Luc reporter gene을 transfection 시킨 후 LPS 처리구와 무처리구, LPS + sulforaphane 처리구로 나누어 실험하였다. LPS만 처리한 경우 luciferase 활성이 무처리구와 비교하여 3.2배 정도 증가하였으며, sulforaphane과 함께 처리한 경우에는 LPS 처리구와 비교하여 논도 의존적으로 luciferase 활성이 감소하였다. 이상의 결과로부터 sulforaphane이 LPS 유도에 의한 MMP-9의 mRNA 발현 및 promoter 활성을 억제시킴을 알 수 있으며, MMP-9 promoter 부 위에 sulforaphane에 의해 조절되는 반응 성분(response element)이 존재함을 유추할 수 있다.</p>