나타마이신은 실온보다는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서, 그리고 배양액 상태가 침전물 상태로 보관하는 것보다 높은 활성을 유지하여 저항안정성을 유지함을 확인할 수 있었다. 나타마이신의 용해도의 우수성보다는 안정적인 추출을 고려하여 \( 50 \% \) acetic acid 보다는 methanol을 선정하였고, 경제적으로 methanol \( 300 \mathrm{ml} \)를 적정양으로 결정하였다. 그리고 나타마이신을 메탄올에 용해되어 있는 시간은 최소로, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)의 낮은 온도 보관하고, \( 1 \mathrm{l} \)의 methanol에 2회에 나누어 첨가, 추출하는 것 이 활성 손실을 줄이기 위해 효율적인 방법이었다. 효율적인 나타마이신의 정제수율 및 순도를 얻기 위해 배양액의 \( \mathrm{pH} \)를 조절하는 Olson 등의 방법 보다는 본 연구를 통해 확립한 탈지면과 Diaion HP-20을 사용한 column chromatography 실시하였다. 그 결과 보다 높은 순도와 정제수율의 나타마이신을 얻고 효율덕으로 대략 정제할 수 있는 방법을 확립하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>나타마이신의 저항안정성</h2><p>배양액의 보존과 정제과정 동안 발생할 수 있는 나타마이신 활성의 변화를 검토하기 위해 배양액과 그 배양액을 원심분리하여 얻은 침전물을 각각 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)와 실온에 보관하여 저장안정성 시험을 하였다. 그 결과 Table 1에서 보는 바와 같이 배양액과 침전물을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하였을 때 나타마이신의 활성이 14일째까지 \( 80 \% \) 이상 유지되었으나, 침전물의 나타마이신 활성은 보관 21일째에 \( 43 \% \)까지 급격히 감소하였다. 반면 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양액 중의 나타마이신 활성은 보관 35일째까지 악 \( 70 \% \)을 유지하였다. 실온에 보관하였을 때의 배양액과 침전물의 나타마이신 활성은 보관 8일째에 각각 \( 60 \% \) 와 \(35\%\) 정도로 급격히 감소하였다. 이리한 결과를 통해 나타마이신은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보다 실온에서 활성이 더 빨리 감소되었으며, 침전물 상태로 보관하는 것보다 배양액 상태로 보관하는 것이 더 높은 활성을 유지함을 알 수 있었다.</p><h2>나타마이신의 추출용매 선택</h2><p>배양액에서 나타마이신을 경제적으로 추출할 수 있는 용매를 선택하기 위해 \( 50 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) acetic acid, methanol, butanol, 증류수, isopropanol, ethanol에 대해 용해도를 측정하였다. 나타마이신에 대한 용해도는 Table 2에서와 같이 \( 50 \% \) acetic acid >methanol >ethanol >\(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) >isopropanol >butanol 순이었다. 다른 용매보다 나타마이신에 대한 용해도가 훨씬 높은 \( 50 \% \) acetic acid와 methanol을 추출용매로 선정하여 추출과정의 효율성을 검토해 보았다. 그 결과 \( 50 \% \) acctic acid는 용해도는 우수하나 methanol 보다 나타마이신에 대한 안정성이 떨어지고 추출과정에서 불순물이 증가하는 등의 문제점이 대두되었다(결과 미제시). 따라서 본 연구에서는 배양액으로부터 나타마이신을 추출하는데 \( 50 \% \) acetic acid에 비교하여 위의 문제점이 훨씬 적은 methanol을 선정하였다.</p><p>배양액 \( 300 \mathrm{ml}(2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)로부터 methanol을 사용하여 나타마이신을 가장 효율적으로 추출할 수 있는 양을 검토하기 위해 methanol을 \( 100 \mathrm{ml} \)에서부터 \( 800 \mathrm{ml} \)까지 \( 100 \mathrm{ml} \)씩 첨가하여 각 단계별로 나타마이신의 함량을 조사하였다. 그 결과 \( 300 \mathrm{ml} \)의 methanol을 사용하여 추출한 경우가 \( 83 \% \)의 나타마이신의 회수율을 보였고, 그 이상의 methanol을 사용할 경우 이와 비슷한 회수율을 나타내거나 오히려 낮은 회수율을 보였다(결과 미제시). 따라서 경제성을 고려하여 나타마이신 \( 600 \mathrm{mg} \)에 대해 methanol \( 300 \mathrm{ml} \)를 추출을 위한 적정 methanol 양으로 결정하였다. Olson 등은 methanol에 용해된 상태로 나타마이신이 존재할 경우 나타마이신과 methanolol methyl ester를 형성함으로서 나타마이신의 함량이 줄어들며 추출액의 \( \mathrm{pH} \)가 낮을수록 온도가 높을수륵 methyl ester 화합물이 증진한다고 보고하고 있다. 그러나 본 연구에서는 배양액상에 존재하는 나타마이신을 methanol로 추출할 때 \( \mathrm{pH} 3.0 \)으로 맞추었는데 이는 \( \mathrm{pH} \)가 3.0일때 나타마이신이 가장 낮은 용해도를 나타내었기 때문이다(결과 미제시). 나타마이신의 모든 추출 및 정제과정에 사용되는 methanol에 대한 나타마이신의 활성 손실을 줄이기 위해서는 나타마이신이 메탄올에 용해되어 있는 시간을 최대한 줄이고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 정도의 낮은 은도에서 보관하는 것이 필요하다. 또한 나타마이신의 추출에 있어서 나타마이신 \( 2 \mathrm{~g} \)이 함유된 침전물에 대해 \(1\mathrm{l}\)의 methanol을 2회에 나누어 첨가, 추출하는 것이 \( 1 \mathrm{l} \)의 methanol을 한번에 첨가하여 추출하는 방법보다 효율적이었다(결과 미제시).</p><h2>효율적인 나타마이신 정제법의 확립</h2><p>약 \( 4.2 \mathrm{~g} \)의 나타마이신이 함유된 배양액 \( 1,800 \mathrm{ml} \)를 원심분리를 통해 침전물을 회수한 후, \(1\mathrm{~l}\)의 methanol을 사용하여 2회(총 \(2\mathrm{~l}\))에 걸쳐 나타마이신을 추출한 후 적절히 농축 하였다. Column chromatography에서 문제가 되는 이물질을 제거하기 위해 탈지면을 사용하여 농축된 시료를 여과한 후 \( 200 \mathrm{~g} \) 을 Diaion HP-20을 사용하여 column chromatography를 실시하였다. Diaion HP-20에 흡착된 나타마이신의 회수는 \(0, 30, 50, 80\% \) 의 methanol을 이용하여 농도 구배법에 의해 용출하였다. 그 결과 Table 3에서 보는 바와 같이 순도가 \(96.6\%\), 정제수율이 \(69\% \)인 약 \( 2.9 \mathrm{~g} \)의 나타마이신을 얻었다. 정제수율 및 순도는 Sigma사의 나타마이신 표준시료를 이용하여 HPLC에 의해 얻어졌다. 본 연구에서 확립되어진 나타마이신의 정제과정은 Fig. 3에서 보여주는 바와 같다.</p><p>Olson 등은 나타마이신 배양액의 \( \mathrm{pH} \)를 조절하여 나타마이신을 정제하는 공정을 개발하고 지적재산권을 확보한 바 있다. 그러나 이 공정을 통해 획득한 나타마이신의 정제수율은 본 연구에서 확립된 방법과 거의 비슷한 수준이었으나 순도가 \(80\%\) 정도에 불과하며 과량의 강산과 강염기를 사용하므로 나타마이신의 대랑정제에 있어서 많은 문제점이 발생할 가능성이 많다. 따라서 본 연구를 통해 확립된 나타마이신의 정제방법은 고순도의 나타마이신을 효율적으로 대량 정제할 수 있는 방법이라고 생각된다.</p>