전기 영동으로 사용되는 한천의 제조법은 여러 단계의 유기 용매 분획을 통하여 한천중의 황산기가 부착된 agaropectin을 제거함으로써 agarose 순도를 높여 의학과 생명공학 분야에 광범위하게 사용되고 있으나 하지만 이러한유기용매를 사용한 agarose의 정제법은 공정비가 과도하게 소요될 뿐만 아니라 고가의 장비와 이에 따른 고도의 기술이 요구되어지기 때문에 고순도 agarose 생산을 위하여 arylsulfatase나 desulfatase 같은 탈황효소를 이용한 agarose 제조방법들이 활발히 연구되고 있다. 본 연구에서는 Aga2 단백질의 C 말단에 P. carageenovora 유래 arylsulfatase를 유전적으로 subcloning하여 효모 S. cerevisiae의 세포표면에 arylsulfatase 효소가 고정부착된 새로운 생체촉매제(biocatalyst)로부터 agarose를 생산함으로서, 유용 산업효소를 표면발현시 단백질의 표면밀도가 agglutinin의 경우 효모세포 1 개당 \( 10^{4}-10^{5} \) 으로써 원핵세포 시스템에 비하여 매우 높다는 장점을 가진 S. cerevisiae 세포표면에 발현하는 표면 발현 시스템을 구축하고자 한다.
<h1>서 론</h1> <p>한천(agar)은 갈조류나 홍조류 등의 해조류에 다량으로 함유되어 있는 점질성의 화합물(다당류)이며, galactose 중합체로 구성된 약 70% 의 agarose와 이들에 황산기가 부착된 상태인 약 30% 의 agaropectin으로 구성되어 있다. 한천에 결합되어 있는 황산기는 실질적으로 음전하를 띠고 있으므로 전기장 하에서 물질의 이동에 영향을 줄 뿐만 아니라 겔 강도를 약화시킨다. 따라서 전기 영동으로 사용되는 한천의 제조법은 여러 단계의 유기 용매 분획을 통하여 한천중의 황산기가 부착된 agaropectin을 제거함으로써 agarose 순도를 높여 의학과 생명공학 분야에 광범위하게 사용되고 있다. 하지만 이러한유기용매를 사용한 agarose의 정제법은 공정비가 과도하게 소요될 뿐만 아니라 고가의 장비와 이에 따른 고도의 기술이 요구되어진다. 따라서 최근에 고순도 agarose 생산을 위하여 arylsulfatase나 desulfatase 같은 탈황효소를 이용한 agarose 제조방법들이 활발히 연구되고 있다.</p> <p>Arylsulfatase는 해조류를 섭취하는 해양 동물 중에서는 소화효소의 일부로써 분포하는 것으로 알려져 있으며, 이 효소는 해조류에 함유되어 있는 다당류의 sulfate ester 결합을 효율적으로 분해하여 해조 다당류의 체내 이용도를 높이고, 특히 해조류에서의 황의 동화와 이화작용에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한 최근 arylsulfatase를 생산하는 해양 미생물 Pseudoalteromonas carrageenovora가 분리 - 동정되어, arylsulfatase 유전자가 cloning 되었다. 따라서 agaropectin에서 sulfate를 제거할 수 있는 arylsulfatase를 대량생산하는 생물학적 생산 공정을 도입-적용하여 한천으로부터 고순도 agarose를 직접 생산할 수 있다면 유기용매와 계면활성제의 사용을 획기적으로 감소시킴으로써 공정비용을 절약할 수 있을 것으로 사료된다.</p> <p>유용단백질의 표면발현 시스템은 자연적으로 미생물의 표면에 존재하는 단백질 유전자에 외래 유전자를 연결하여 발현함으로써 외래단백질을 세포의 표면에 부착시키는 방법이다. 세포 표면은 내부와 외부사이의 상호작용으로 인해 기능을 하게 되는테 어떤 표면 단백질들은 plasma membrane을 지나서 기능을 하며, 또 다른 것들은 공유결합이나 비공유결합에 의한 세포표면 구성요소에 의해 결합한다. 이러한 표면발현기술은 초기에는 미생물의 표면에 다양한 항원성 또는 항체성의 polypeptide를 노출시켜 항원 항체의 스크리닝에 목적을 두고 개발되었으며 각종 peptide 항원 library의 제조, 다양한 생백신(live vaccine)의 제조에 이용되고 있다. 뿐만 아니라 세포표면에 다양한 생리 활성효소나 금속이온 결합단백질의 고정화를 통하여 고부가 가치의 물질생산을 위한 전세포 생물촉매(whole cell biocatalyst)의 개발 등 그 이용성이 매우 다양하다. 최근에는 원핵세포를 이용한 표면발현의 단점을 보완하기 위하여 진핵세포인 효모 S. cerevisiae 를 이용하는 새로운 표면발현 시스템 연구가 활발히 진행되고 있다.</p> <p>진핵세포인 효모 S. cerevisiae는 표면발현시 단백질의 표면밀도가 agglutinin의 경우 효모세포 1 개당 \( 10^{4}-10^{5} \) 으로써 원핵세포 시스템에 비하여 매우 높다는 장점을 가지고 있다. 본 연구에 사용된 단백질은 효모세포벽에 N 말단이 공유결합된 형태로 존재하는 \( \alpha \)-agglutinin을 사용하였다. 이 단백질은 Aga1과 Aga2 의 소단위체로 구성되어 있으며 Aga1 단백질이 \( \beta \)-glucan 결합으로 세포벽에 고정되고 69개의 amino acid로 이루어진 Aga2가 disulfide 결합을 하고 있다. 따라서 본 연구에서는 Aga2 단백질의 C 말단에 P. carageenovora 유래 arylsulfatase를 유전적으로 subcloning하여 효모 S. cerevisiae의 세포표면에 arylsulfatase 효소가 고정부착된 새로운 생체촉매제(biocatalyst)로부터 agarose를 생산함으로서, 유용 산업효소를 S. cerevisiae 세포표면에 발현하는 표면 발현 시스템을 구축하고자 한다. 또한 효모 S .cerevisiae의 세포표면에서 발현된 재조합 arylsulfatase 효소를 이용하여 저렴한 agar로부터 고순도·친환경적인 agarose 생산에 적용하고자 한다.</p>