본 연구에서 사용된 균주 및 균주 배양에 사용된 배양조건 및 시료들을 확인했고, 식물 실험에서 이용된 식물체와 토양 정보를 확인했다. 본 연구에서 이용된 균주는 Bacillus subtilis AH18, Escherichia coli DH5이며, 유전자 cloning 및 sequencing용 vector로 pUC18,19 vector를 이용했다. 배양조건의 경우 Bacillus subtilis AH18 균주에서 nutrient medium을 이용해 배양하며, E.coli 균주는 LB broth에서 배양한다. 마지막으로 본 연구에 이용된 식물은 고추를 이용했고, 생물방제력 확인과 monitoring을 진행했다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용 균주 및 유전자</h2><p>본 연구에 사용된 균주는 정 등에 의해 분리, 선발된 식물성장촉진호르몬인 auxin과 식물병원성진균의 생육을 억제하는 siderophore 그리고 식물병원성 진균의 세포벽을 융 해하는 cellulase를 동시에 생산하는 plant growth promoting rhizobacterium(PGPR)인 Bacillus subtilis AH18을 사용하였다. PCR로 증폭된 유전자의 cloning용 host cello은 Escherichia coli DH5를 사용하였으며, 유전자 cloning 및 DNA sequencing용 vector는 pUC 18,19 vector를 이용하였다. 사용한 균주 및 plasmid는 Table 1과 같다.</p><h2>균주의 배양 및 배지</h2><p>B. subtilis AH18의 배양조건 확인은 nutrient medium (Difco Co. U.S.A.)을 사용하였으며, 액체배양은 전배양액을 \( 0.1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 160 \mathrm{rpm} \)으로 24시간 진탕배양 하였고, 균주 보존용 고체배양은 nutrient agar에 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 항온기에서 24시간 배양하였다. E. coli의 배양은 LB(LuriaBertani) medium(Difco Co. U.S.A.)을 사용하였으며, 형질 전환 시 heat shock 후 유도배양에 사용한 배지는 SOC medium(tryptone \( 2 \mathrm{~g} \), yeast extract \( 0.5 \mathrm{~g}, 1 \mathrm{M} \mathrm{~NaCl} 1 \mathrm{~mL} \), \( 1 \mathrm{~M} \mathrm{~KCl}~0.25 \mathrm{~mL} \), filter-sterilized \( \mathrm{Mg}^{2+} \) stock( \( 1\mathrm{M} \mathrm{~MgCl}_{2} \)\( \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 1 \mathrm{M} \mathrm{~MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) ) \( 1 \mathrm{~mL} \), filter-sterilized \( 2 \mathrm{M} \) glucose \( 1 \mathrm{~mL} \), total \( 1 \mathrm{~L} \) )을 사용하였다. 액체배양은 전배양액을 \( 0.1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 160 \mathrm{rpm} \) 으로 24시간 진탕배양 하였고, 균주 보존용 고체배양은 LB agar에 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 항온기에서 24시간 배양하였다. 형질전환 균주의 배양 및 보관은 LB agar에 ampicillin \( (50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \)이 첨가된 배지를 사용 하였다.</p><h2>식물 및 토양</h2><p>본 연구에 사용한 식물로는 고추(Capsicum annuum L., 부촌-Seminis Korea Co., 오륜-Seoul Seed Co.)을 이용하였으며, 고추 이식용 pot는 흥농 3공 컵 포트 \( (90.0 \times 90.0 \times 70.0 \) \( \mathrm{mm} \))를 사용하였다. 생물방제력 확인을 위한 식물이식용 토양은 TKS2(Floragard, Germany)를 autoclave( \( 121^{\circ} \mathrm{C}, 30\)분) 하여 사용하였으며, monitoring을 위한 식물이식용 토양은 경산지역의 경작지 밭 토양을 그대로 사용하였다.</p>