본 연구에서는 SARS-\(3\)CL protease 유전자를 pMAL vector의 cloning site에 재조합한 pMAL/3CLP plasmid DNA를 이용해 template DNA를 만들었다. 그리고 이를 이용해 정제된 SARS-\(3\)CL protease 유전자를 만들었으며, 이를 발현벡터와 재조합해 pET29a/3CLP 벡터를 만들었다. 이러한 벡터로 생성이 예상되는 SARS-\(3\)CL protease에 대해 단백질 발현은 무세포 단백질 합성 반응법 따라 진행되었으며, 이에 대한 효소활성 측정은 형광 펩타이드 기질을 통해 분석되었다. 마지막으로 SARS-\(3\)CL protease에 대한 Western Blot의 경우 ECL Western detection reagents로 반응시킨 완충액을 LAS-\(3000\) Luminescent Image Analyzer를 이용해 진행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용 균주 및 시약</h2> <p>본 연구에서 사용한 E. coli strain DH5\(\alpha\), BL21 (DE3) 및 plasmid pET29a는 Novagen (Madison, USA)으로 부터 구입하였다. ATP, UTP, GTP, CTP, Creatine phosphate (CP),Creatine kinase (CK), phosphor-enolpyruvate, Escherichia colitotal tRNA mixture, T7 RNA polymerase 및 S30 extract는 Roche Applied science (Indianapolis, USA)에서 구입하였다. Pyruvate kinase, L(-)-5-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid(folinic acid), cAMP, potassium glutamate, polyethyleneglycol (PEG) (average MW 8,000) 및 acetyl coenzyme A는Sigma Aldrich사로부터 구매하여 사용하였다. 각종 아미노산, dithiothreitol (DTT) 및 diethylpyrocarbonate (DTNB)는 Nacalai Tesque (Kyoto, Japan)로부터, Recombinant Pfu DNA polymerase, T4 DNA ligase, alkaline phophatase (CIP) 및 제한효소는 Stratagene (La Jolla, USA)에서 구입하였다. 그 외에 본 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 특급시약을 사용하였다.</p> <h2>발현 벡타의 구축</h2> <p>SARS-3CL protease의 유전자를 pMAL vector (New England BioLabs Inc., USA)의 cloning site에 재조합한 pMAL/3CLP plasmid (N. Yamamoto, Tokyo Medical and Dental University, Japan) DNA를 E. coli DH5\(\alpha\)에서 발현\( \cdot \)정제한 후 template DNA로 사용하였다. SARS-3CL protease 유전자의 증폭은 아래의 primers를 사용하여 polymerase chainreaction (PCR) 법으로 실행하였다. Forward primer (5’-CGTGGATCCCAGACATCAATCACTTCTGCTGTTCTGCAGAGTGGTTTTAGGAAAATGGC-3')에는 BamHI site (밑줄)와 천연 pplab polyprotein의 SARS-3CLP의 N-말단의 상부에 해당하는 10개의 아미노산(QTSITSAVLQ)을 코딩하는 30 nucleotides를 도입하였다. Reverse primer (5'-GGTG CTCGAGAGTGCCCTTAACAATTTTCTTGAACTTACCTT GGAAGGTAACACCAGAGC-3')에는 XhoI site (밑줄)와 연 pp1ab polyprotein의 SARS-3CLP의 C-말단의 하부에 해당하는 10개의 아미노산(GKFKKIVKGT)을 코딩하는 30 nucleotides를 도입한 것을 사용하였다. PCR 조건은 변성 온도 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \), annealing 온도 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \), 합성 온도 \( 68^{\circ} \mathrm{C} \)이었고, 총 25 cycle을 수행하였다. PCR 생성물은 \( 1 \% \) agarose gel 전기영동으로 확인한 후, PCR purification kit (Quagen)로 정제하여 발현계의 구축에 사용하였다. 정제된 SARS-3CL protease 유전자와 발현벡터 pET29a를 제한효소 BanHI과 XhoI로 절단한 다음, 재조합 pET29a/3CLP 벡터를 작성하였다. 그 결과 생성되는 예상 단백질인 SARS-3CL protease의 도식은 Fig.1A에 나타내었다.</p> <h2>무세포 단백질 발현 반응 및 정제</h2> <p>SARS-3CL protease의 단백질 발현은 Kigawa 등의 무세포 단백질 합성 반응법에 따라 실시하였다. 반응액은 다음과 같이 조제하여 사용하였다: \( 55 \mathrm{~mM} \) Hepes-KOH buffer \( (\mathrm{pH} ~7.5\)); \( 1.7 \mathrm{~mM} \) DTT; \( 1.2 \mathrm{~mM} \) ATP \( (\mathrm{pH} ~7.0\)); 각 \( 0.8 \mathrm{~mM} \)의 CTP \( (\mathrm{pH} ~7.0\)), GTP \( (\mathrm{pH} ~7.0\)), 및 UTP \( (\mathrm{pH} ~7.0\)); \( 80 \mathrm{~mM} \) CP; \( 250\ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\) CK; \(4.0 \% \) PEG 8000; \( 0.64 \mathrm{~mM}\) 3' ,5'-cyclic AMP; \( 68\ \mu \mathrm{M} \) folinic acid; \( 175\ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) E. coli total tRNA; \( 210 \mathrm{~mM} \) potassium glutamate; \( 27.5 \mathrm{~mM} \) ammonium acetate; \( 10.7 \mathrm{~mM} \) magnesium acetate; 각 \( 1.0 \mathrm{~mM} \)의 20종 아미노산; \( 2 \sim 32\ \mu \mathrm{g} / \) \( \mathrm{ml} \) 발현벡타(pET29a/3CLP plasmid); \( 93\ \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) T7 RNA polymerase; \( 30 \% \) (v/v) S30 세포 파쇄액; \( 0.05 \% \) sodium azide. 투석액은 반응액에서 CK, E. coli total tRNA, 발현벡터, T7 RNA polymerase, 및 S30세포 파쇄액을 제외하고 조제하여 사용하였다. 반응액을 투석막(Spectra/Por 7 MWCo: 15,000, Spectrum Laboratories, Inc., USA)에 넣고 투석액에 대하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 6시간 투석하여 발현 반응을 실행하였다.</p> <p>단백질 합성반응이 종료한 반응액을 회수하여 완충액 A \(20 \mathrm{~mM}\) Tris-HCl, \( (\mathrm{pH} ~7.6\)), \( 1 \mathrm{~mM} \) EDTA, \( 1 \mathrm{~mM} \) DTT)로 투석하고 원심분리 \((12,000 \times g\), 20 min, \(4^{\circ} \mathrm{C}) \)하였다. 상층액을 완충액 A로 평형화시킨 High Q (\(12.6 \times 40 \mathrm{~mm}\) Bio-Red) 컬럼에 주입하고, 충분한 양의 완충액 A로 세척한 후, 완충액 A의 \(\mathrm{NaCl}\) 농도가 \( 0 \sim 0.2 \mathrm{~M} \)에 이르도록 농도 기울기법으로 분별 용출하였다. 효소 단백질이 함유된 분획을 회수하여 완충액 B (\(25 \mathrm{~mM} \) Imidazole-HCl, \( \mathrm{pH} ~7.6\), \( 1 \mathrm{~mM} \) DTT)로 투석하여, 원심분리 \((12,000 \times g\), 20 min, \(4^{\circ} \mathrm{C}) \)하였다. 동일한 완충액 B로 평형화 시킨 Mono P 컬럼\( (5 \times 200 \mathrm{~mm}\) GE Healthcare)에 위의 상층액을 주입하고, 비흡착 단백질을 완충액 B로 세척한 후, 완충액 C (1/8 Polybuffer74, \( 1 \mathrm{~mM}\) DTT)로 분별 용출시켰다. 효소 단백질이 함유된 Mono P 컬럼 분획을 회수하여 완충액 D (\(20 \mathrm{~mM}\) Tris-HCl, \( \mathrm{pH} ~7.5\), \(1 \mathrm{~mM}\) EDTA, \( 1 \mathrm{~mM} \) DTT, \( 0.1 \mathrm{~M} \) \(\mathrm{NaCl}\)로 투석하였다. 이 단백질용액을 완충액 D로 평형화된 Sephacryl S-300 컬럼(\(26\times600 \mathrm{~mm}\), GE Healthcare)에 주입하여 동일한 용액으로 단백질을 분별 용출시켜 SARS-3CL protease의 효소활성을 나타내는 분획을 회수하였다. 이상의 과정으로 정제한 효소를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하면서 정제 효소의 특성 실험에 사용하였다. 정제 효소의 단백질 정량은 소 혈청 알부민을 표준 단백질로 사용하여 Bicinchoninic acid (BCA)법으로 측정하였다.</p> <h2>효소 활성 측정</h2> <p>SARS-3CL protease의 효소 활성은 형광 펩타이드 기질, Nma-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys(Dnp)-\(\mathrm{N H}_{2} \) (Peptron, Korea)을 사용하여 분석하였다. 효소활성은 \(100 \mathrm{~mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\) \( (\mathrm{pH} ~7.3\)) \(/ 1 \mathrm{~mM} \) DTT 완충액 \( 150\ \mu \mathrm{l}, 1 \mathrm{~mM} \) 기질 용액 \( 20 \mu \mathrm{l} \), 및 효소용액 \( 30 \mu \mathrm{l} \)를 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 효소 반응을 연속적으로 측정하였다. 효소 반응은 기질 첨가로 시작되고, 효소활성은 microplate reader (Tecan Infinite 200 , Austria)를 사용하여 excitation wavelength, \( 320 \mathrm{~nm} \) 및 emission wavelength, \( 420 \mathrm{~nm} \)에서 연속적으로 형광의 세기를 측정하여 분석하였다. 기질의 분해 정도는 Nma/Dnp type fluorescence-quencing 기질에 대한 표준형광물질인 D-A2pr(Nma)-Gly 및 Ala-Phe-Pro-Lys(Dnp)-D-Arg-D-Arg (Peptide, Japan)의 혼합물의 농도로 환산하여 계산하였다. 3CL protease의 효소 활성 \(1 \mathrm{~unit}\)는 \( 1 \mathrm{~min} \) 당 생산된 \( 1 \mathrm{~nmol} \) 기질 분해 펩타이드 농도로 정의하였다.</p> <h2>Western Blot 분석 및 기타</h2> <p>무세포 단백질 합성법으로 발현된 단백질 용액은 \( 15 \% \) SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)로 분리하여, polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Bio-Rad, USA)에 전사하였다. 이 PVDF membrane을 \(5\%\) skim milk로 1시간 동안 blocking 한 후, TBS-T 완충액 (\(20 \mathrm{~mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\), \( \mathrm{pH} ~7.6\), \( 137 \mathrm{~mM}\) \(\mathrm{NaCl}\), \(0.1 \% \) Tween 20)으로 10분간 3회 세척하였으며 적정 희석된 1차 항체, anti-SARS-CoV 3CL protease, mouse mAb (Genesis Biotech Inc., Taiwan)로 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 TBS-T 완충액으로 세척하고 2차 항체, ECL HRP-conjugated anti-mouse antibody (Amersham Biosciences, NJ, USA)로 추가 반응시켰다. 반응 후 TBS-T 완충액으로 다시 10분간 3회 세척하였으며, ECL Western detection reagents (Amersham Biosciences, USA)를 사용하여 반응시키고, LAS-3000 Luminescent Image Analyzer (FUJIFILM, Japan)로 발현 수준을 분석하였다.</p> <p>정제 단백질의 분자량은 MALDI-TOF mass spectrometer (Applied Biosystems Voyager-DE STR mass spectrometer, USA)를 사용하여 측정하였다. N-말단 아미노산 서열 분석은 Porcise\( ^{\circledR} \) cLC System Model 492 cLC (Applied Biosystem, USA)를 사용하여 Edman 분해법으로 분석하였다.</p>