본 연구에서는 sili-binin을 \( 100-200 \mu \mathrm { M } \) 의 농도로 24시간과 48시간으로 처리한 후, 세포막 외부로 노출되는 PS과 세포막 파괴로 인해 노출되는 핵을 각각 Annexin-V와 PI 염색을 통해 측정하였다. 세포 내에서 세포사멸은 Bcl-2 단백질 패밀리, caspase-3, PARP 등과 관련된 단백질의 조절에 의해 일어날 수 있다.
<p>또한, \( \mathrm { G } _ { 1 } \) 기와 관련한 세포주기에 관여하는 \( \mathrm { cyclin } \) 과 \( \mathrm { CDK } \) 의 발현 양을 western blot을 통해 확인하였다. Cyclin A, D1, E와 \( \mathrm { CDK } 2,4,6 \) 의 발현양은 시간 및 농도 의존적으로 감소함을 알 수 있었다(Fig. 3A). 이와 같은 결과를 통해 cyclin과 CDK의 발현 양의 감소를 통해 세포주기 중 \( G_ { 1 } \) 기가 억제됨을 알 수 있었다.</p> <h2>Silibinin의 세포 사멸 분석</h2> <p>세포사멸을 유도하는 것을 Annexin V-FITC apoptosis de-tection kit를 이용하여 정량화 할 수 있다. 본 연구에서는 sili-binin을 \( 100-200 \mu \mathrm { M } \) 의 농도로 24,48 시간 처리한 뒤, 세포막 외부로 노출되는 phosphatidylserine (PS)과 세포막의 파괴로 인해 노출되는 핵을 각각 Annexin-V와 PI를 염색하여 flow cytometry로 측정하였다. Silibinin 처리시 세포사멸의 양이 농도 및 시간 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 48 시간 처리시, \( 1.11 \% \) 에서 \( 44.19 \% \) 로 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인함으로써 silibinin이 PC-3 세포에서 세포사멸을 유도하는 것을 알 수 있었다(Fig. 4A). Fig. 4B는 세포사멸이 유도된 세포를 백분율로 나타내었다.</p> <h2>Silibinin의 세포사멸 관련 단백질인 Bcl-2 family의 발현과 caspase-3 및 poly(ADP-ribose) polymerase (PARP)의 활성화</h2> <p>세포 내에서 세포사멸의 조절은 관련 단백질의 조절에 의해 일어 날 수 있는데 대표적으로 Bcl-2 family와 caspase-3, PARP 등이 가장 잘 알려져 있다. 그 중 \( \mathrm { Bcl } -2 \) family는 세포내에서 anti-apoptotic protein (Bcl-2, Bcl-xL)와 pro-apoptotic protein (Bax, Bak)의 균형을 이루고 있는데 세포 내 자극이나 스트레스에 의해 균형에 이상이 생기면 세포사멸 기전을 유발하게 된다. 그 후 미토콘드리아 내의 cytochrome \( \mathrm { c } \) 를 방출하게되어 caspase cascade를 활성화하여 세포사멸을 일으키게 된다. 따라서 PC-3 세포에 세포사멸 유도 경로를 확인하기 위해관련 단백질(Bcl-2, Bax, caspase-3, PARP)의 발현양을 확인하였다(Fig. 5). Anti-apoptotic protein 인 Bcl-2의 발현양은 농도,시간 의존적으로 감소하는 것을 확인하였고, 반면에 pro-apoptotic protein인 Bax의 발현양은 증가하는 것을 확인하였다. 또한 pro-caspase- 3 의 발현이 시간, 농도 의존적으로 감소하였고, caspase- 3 의 기질로 알려진 PARP의 분절형태가 증가하는 것을 확인 하였다. 이와 같은 결과를 통해 silibinin이 PC-3 세포에서 Bcl-2 family의 변화를 유도하여 caspase-3 경로를 동해 세포사멸을 유도하는 것을 알 수 있었다.</p> <p>이상의 결과들을 통해 silibinin이 인간 전립선 암세포 PC-3 세포의 중식을 억제하여 세포사멸을 유도하는 것을 알 수 있었다. 특히 flow cytometry analysis와 세포주기 \( \mathrm { G } _ { 1 } \) 기 관련 cy-clin과 cyclin dependent kinase 등의 단백질 발현이 감소하는 것을 확인함으로써 \( \mathrm { G } _ { 1 } \) arrest를 하여 증식을 억제하는 것을 알 수 있었다. 또한 Bcl-2 family, caspase-3, PARP 등의 단백질의 발현을 확인함으로써 세포사멸을 유도하는 것을 확인하였다. 본 연구는 세포주기와 관련하여 silibinin의 전립선 암에 대한 세포사멸기전을 확인하였으나 앞으로의 전립선암에 대한 치료제로서의 사용 가능성을 나타내기 위해서는 이에 대한 더 자세한 항암기전에 관한 연구가 더 진행 되어야 할 것이다.</p>