2005년 5월 대전근교 논에서 자생하는 개구리밥 및 좀개구리밥 엽상체를 채집하여 표면 살균하고 무균작업대에서 멸균수로 멸균한 후 엽상체 배양체계 확립 연구에 사용하였다. 배양개시 4주 후 치상된 엽상체로부터 캘러스 형성이 이루어진 엽상체 수를 조사하여 생장조절제가 개구리밥 및 좀개구리밥 캘러스 형성에 미치는 영향을 조사하고 연간 바이오매스 생산량은 1주일 간격으로 수집된 개구리밥 및 좀개구리밥의 총 건중량을 기준으로 단위 수조 면적에 대한 연간 생산량 추정치를 계산하였다. 캘러스는 좀개구리밥 캘러스로부터 현탁배양체계를 확립하기위하여 \(1 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \mathrm{BA} \)가 첨가된 \( 1 / 2 \mathrm{MS} \) 배지에서 유도된 것을 사용한다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물재료</h2> <p>국내에 자생하는 개구리밥 (Spirodela polyrhiza (L.) Schelid.) 및 좀개구리밥 (Lemna paucicostata (L.) Hegelmaier) 엽상체는 2005년 5월 대전근교 논에서 채집하였으며 아주대학교 수생식물종자은행을 통하여 정확한 동정을 수행한 다음 실험에 사용하였다. 식물체의 표면 살균은 증식된 식물체를 흐르는 수돗물에 1일간 세척한 다음 \( 10 \% \) 상업용 락스 용액에 20분간 표면살균을 하였다. 표면 살균된 식물체를 무균작업대에서 멸균수로 3~4회 세척한 다음 멸균된 여과지에서 표면의 수분을 제거하였다. 살균된 식물체를 이용하여 이후 엽상체 배양체계 확립 연구에 사용하였다.</p> <h2>좀개구리밥의 기내 식물체 증식에 미치는 배지내 무기 염류 농도 영향</h2> <p>표면 살균된 좀개구리밥의 식물체를 MS (Murashige and Skoog 1962) 배지의 무기염류 농도를 \( 1 / 2 \), 1, 2, 4배로 조정한 배지 및 증류수에 각각 배양을 하였다. 좀개구리밥의 엽상체는 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 명배양 (약 \( 80 \mathrm{umol} \mathrm{m}^{-2} \mathrm{~s}^{-1} \); 광주기 \( 16 / 8 \) 시간)하면서 개체 증식을 유도하였다. 각 처리구는 좀개구리밥 엽상체를 20 개씩 3 반복으로 배양배지 \( 100 \mathrm{ml} \) 이 첨가된 배양병에서 유지하였다. 약 3주간 배양 후 증식이 이루어진 엽상체의 수를 조사하여 무기염류 농도에 따른 엽상체의 증식 효율을 조사하였다.</p> <h2>엽상체 증식 및 캘러스 형성에 미치는 생장조절제의 영향</h2> <p>개구리밥 및 좀개구리밥 엽상체를 \( \mathrm{MS} \) 배지의 모든 무기염류 농도를 \( 1 / 2 \) 로 낮추고 각각 \( 0.4 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) thiamine \( \cdot \mathrm{HCl}, 100 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) myo-inositol, \( 30 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) sucrose 및 \( 4 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) Gelrite 가 첨가된 배지(\( 1 / 2 \mathrm{MS} \) 배지)에 치상하여 기내 엽상체 배양을 유지하였다. 기내에서 증식중인 엽상체를 이용하여 엽상체 증식에 미치는 생장조절제 영향을 조사하였다. 기내에 유지중인 개구리밥 및 좀개구리밥 엽상체를 \( 1 / 2 \mathrm{MS} \) 배지에 생장조절제로 BA (benzyl aminopurine) 및 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 를 각각 0, 1, 3, 10과 \( 30 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 첨가된 배지에 치상하였다. 각 처리구는 엽상체를 20개씩 3 반복으로 치상한 후 상기의 배양조건에 따라 명배양하였다. 배양개시 4주 후 치상된 엽상체로부터 대량증식이 이루어진 엽상체 수를 조사하여 생장조절제에 따른 엽상체의 증식 효율을 조사하였다.</p> <p>또한 생장조절제가 개구리밥 및 좀개구리밥 엽상체로부터 캘러스 형성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 엽상체 (길이 약 \( 3 \mathrm{~mm} \) ) 및 뿌리 (길이 약 \( 5 \mathrm{~mm} \) ) 를 절단하여 \( \mathrm{BA} \) 와 2,4-D 가 각각 0,0.1, 0.3, 1,3 및 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 첨가된 \( 1 / 2 \mathrm{MS} \) 배지에 배양하였다. 각 처리구는 엽상체 및 부리를 20 개씩 3 반복으로 치상하였으며 상기의 배양조건에 따라 배양하였다. 배양개시 4주 후 치상된 엽상체로부터 캘러스 형성이 이루어진 엽상체 수를 조사하여 생장조절제가 개구리밥 및 좀개구리밥 캘러스 형성에 미치는 영향을 조사하였다.</p> <h2>좀개구리밥 엽상체 유래 캘러스의 현탁배양체계 확립</h2> <p>좀개구리밥 캘러스로부터 현탁배양체계를 확립하기위하여 \(1 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \mathrm{BA} \) 가 첨가된 \( 1 / 2 \mathrm{MS} \) 배지(1/2 MS1BA 배지)에서 유도된 캘러스를 사용하였다. \( 1 / 2 \mathrm{MS} 1 \mathrm{BA} \) 액체배지 \( 20 \mathrm{ml} \) 이 첨가된 Erlenmeyer flask \( (250 \mathrm{ml}) \) 에 증식된 캘러스(약 \( 1 \mathrm{~g}) \) 를 옮겨준 다음 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 100 \) \( \mathrm{rpm} \) 으로 현탁배양을 개시하였다. 약 1 주간 배양한 다음, 동일 조성의 액체배지를 각각 \( 20 \mathrm{ml} \) 첨가하여 1 주간 배양하였다. 이후에는 현탁배양세포 \( 10 \mathrm{ml} \) 를 동일 조성의 액체배지 \( 50 \mathrm{ml} \) 이 첨가된 Erlen-meyer flask로 옮겨 약 2 주 간격으로 계대배양하였다.</p> <p>현탁배양중인 세포주로부터 식물체 재생을 위하여 약 2 주 배양된 세포괴를 생장조절제가 첨가되지 않은 \( 1 / 2 \mathrm{MS} \) 기본배지로 옮겨 각 Petri dish \( (87 \times 15 \mathrm{~mm}) \) 당 세포괴를 10 개씩 치상하였으며 총 3개의 반복구를 준비하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 명배양하였다.</p> <h2>개구리밥 및 좀개구리밥 대량 배양 및 건중량 생산성 조사</h2> <p>개구리밥 및 좀개구리밥의 엽상체로부터 대량증식 체계를 이용하여 자연 상태에서 바이오매스 생산량을 조사하고자 인공 수조에서 대량 배양체계를 확립하였다. 기내에서 재생된 좀개구리밥 및 개구리밥 식물체를 약 \( 0.63 \mathrm{~m}^{2} \) 수조에 옮긴 다음 하이포네스 영양액 \( (0.25 \mathrm{~g} / \mathrm{L}) \) 을 첨가하였다. 이후 자연 상태에서 배양을 개시하였으며 각각의 식물체가 수조 표면을 충분히 덮을 정도로 증식이 이루어진 상태에서 1 주일 간격으로 수조 표면에 떠 있는 식물체의 약 절반을 수거하여 수돗물로 세척한 다음 표면의 수분이 제거되도록 방치한 다음 생중량 약 \( 10 \mathrm{~g} \) 씩 3 개의 반복구를 준비하였다. 건중량은 \( 60{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 건조기에서 24 시간 말린 다음 조사하였다. 연간 바이오매스 생산량은 1 주일간격으로 수집된 개구리밥 및 좀개구리밥의 총 건중량을 기준으로 단위 수조 면적에 대한 연간 생산량 추정치를 계산하였다.</p>