PCR 산물을 Dcode System(Bio-Rad)을 이용하여 DG-DGGE를 수행하였으며, polyacrylamide 농도구배는 8-12%로 urea와 formamide 변성제를 40-70%까지 형성하였고, PCR 증폭산물을 30\(\mu\mathrm{l}\) loading하여 1xTAE buffer (40mM Tris, 20mM acetic acid, 1mM EDTA, pH 8.0)에 100V 전류로 운전하였다.
<h3>DG-DGGE 운전조건</h3> <p>\( \mathrm { PCR } \) 산물은 Dcode \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) System (Bio-Rad)을 이용하여 DG-DGGE를 수행하였다. DG-denaturing gradient gel은 \( 8-12 \% \) polyacrylamide (37.5:1 = acrylamide:bisacrylamide)에 urea와 formamide 변성제를 \( 40-70 \% \)까지 농도구배가 형성되도록 제작하였으며, 제작된 DG-DGGE gel에 PCR 증폭산물을 \( 30 \mu \mathrm { l } \) 씩 loading하여 \( 1 \times \mathrm { TAE } \) buffer ( \( 40 \mathrm { mM } \) Tris, \( 20 \mathrm { mM } \) acetic acid, \( 1 \mathrm { mM } \) EDTA, \( \mathrm { pH } \) 8.0)에서 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 110 \mathrm { ~V } \) 로 21시간 동안 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 DG-DGGE gel은 ethidium bromide \( (1: 10,000) \)에서 염색한 후, \( \mathrm { UV } \)로 확인하였다.</p> <h3>\( 16S \\mathrm { rRNA } \) gene clone library를 통한 미생물 군집분석</h3> <p>\( 16S \\mathrm { rRNA } \) gene clone library 분석을 위한 \( \mathrm { PCR } \)은 \( 27 \mathrm { F } \)(5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 \( 1542 \mathrm { R } \)(5'-AGA AAG GAG GTG ATC CAN CCR CA-3')을 사용하였으며. 각각의 primer를 이용하여 \( 50 \mu \mathrm { l } \)안에 \( 10 \times \mathrm { PCR } \) buffer, \( 20 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } 2,40 \mathrm { mM } \) dNTP mixture, 각 primes \( (1 \mu \mathrm { M } ) \), template \( \mathrm { DNA } \)와 \( 0.5 \mathrm { U } \mathrm { Taq } \) polymerase를 첨가하여 \( \mathrm { PCR } \) 을 수행하였다. 반응조건은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 5 \mathrm { ~min } \)동안 \( \mathrm { DNA } \)를 pre-denaturation시켜, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1 min denaturation \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 1 \mathrm { ~min } \) annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 1 \mathrm { ~min } 30 \mathrm { sec } \) extension 하고 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 5 \mathrm { ~min } \)동안 final extension을 수행하였다. \( 16S \\mathrm { rRNA } \) gene clone library 구축을 위해 \( \mathrm { PCR } \) 증폭산물을 \( 1 \% \) agarose gel에 loading한 후 약 \( 1,500 \mathrm { bp } \) 크기의 band를 잘라, LaboPass Gel Extraction kit(CosmoGen)를 이용하여 정제한 후, All-in-one vector (Biofact)에 ligation하고, 이 plasmid를 E. coli DH5 \( \alpha \) (RBC Korea)에 넣은 후 \( \mathrm { LB } + \) kanamycin \( (50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 배지에서 키워 생성된 군집락들을 \( 16 \mathrm { ~S } \mathrm { rRNA } \) 유전자 분석에 이용하였으며, 모두 241개의 군집락을 분석하였다.</p>