제한효소, T4 polynucleotide kinase, DNA ligation kit ver. 제한효소, T4 polynucleotide kinase, DNA ligation kit ver. 2, Taq DNA polymerase는 Takara Korea에서 구입하였고, \( 114 \mathrm{bp} \) 길이의 Leucocin A 유전자 클로닝을 위해 Leucocin A 유전자의 상류부위와 하류부위에 해당하는 oligo DNA를 각각 제작하였다. Leucocin A 유전자의 발현 플라스미드 pYD1-LeucoA 및 운반체 PYD1을 Cell-Porator Electrophoration system을 이용하여 각각 효모(EYB100(+Ura))세포에 형질전환(transformation)시켰다. 고초균(Bacillus subtilis)을 LB 배지를 이용하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤 배양하고 사용직전에 이를 100배로 희석하였다. pYD1-LeucoA 형질전환 효모를 SD-Ura-Trp배지 \( 4\mathrm{ml}\)에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하릇밤 동안 배양한 후, 원심분리(1,4000 \( \mathrm{xg} \), 5분)하여 균체를 회수하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약 및 배지</h2> <p>제한효소, T4 polynucleotide kinase, DNA ligation kit ver. 2, Taq DNA polymerase는 Takara Korea (Seoul, Korea)에서 구입하였다.</p> <p>유전자 클로닝을 위한 숙주로는 E. coli DH5a를 사용하였다. 대장균은 LB 배지(\( 1\%\) bacto tryptone, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 0.5 \%\) \( \mathrm{NaCl} \))를 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다. 대장균 형질 전환체의 선별을 위해서는 LB 배지에 ampicillin이 최종농도 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)가 되게 첨가하여 사용하였다. 고체배지는 LB 배지에 한천(agar)을 \( 1.5 \% \)가 되도록 첨가하여 제작하였다.</p> <p>발현에 사용된 효모(EBY100(+Ura), Invitrogen, USA)의 배양에는 SD-Ura 배지(Bio 101, USA)를 사용하였다. 효모의 발현 플라스미드는 GAL1 promoter에 의해 발현이 유도되는 pYD1(Invitrogen, USA)을 사용하였다. 형질전환된 효모의 선별에는 SD-Ura-Trp 배지(Bio 101, USA)를 사용하였고, 유전자의 발현에는 SD-Ura-Trp( \(2 \%\) galactose) 배지(Bio 101, USA)를 사용하였다.</p> <h2>박테리오신 유전자의 클로닝</h2> <p>\( 114 \mathrm{bp} \) 길이의 Leucocin A 유전자의 클로닝을 위해 Leucocin A 유전자의 상류부위와 하류부위에 해당하는 oligo DNA를 각각 제작하였다. Leucocin A 유전자의 용이한 클로닝을 위하여 Leucocin A 유전자의 5' 부위에 해당하는 합성 oligo DNA에는 제한효소 XhoⅠ 부위를, 3' 부위에 해당하는 합성 oligo DNA에는 종지코돈인 TAA와 제한효소 ApaI 부위를 도입하여 제작하였다. 합성된 두 가닥의 oligo DNA들을 서로 annealing하여 이중쇄 DNA를 만들고 이를 인산화시켰다. 각각 절반씩 제작된 Leucocin A를 코드하는 이중쇄 유전자 단편들을 효모발현 벡터인 PYD1의 XhoI 부위와 ApaI 부위에 연결하였다. 이렇게 제작된 재조합 DNA를 대장균(DH5\( \alpha\))에 형질전환시킨 후, 이로부터 플라스미드 DNA를 분리하고 제한효소를 이용하여 재조합 DNA를 확인하였다. 이렇게 제작된 Leucocin A를 발현하는 효모용 플라스미드는 pYD1-LeucoA라고 명명하였다.</p> <h2>Leucocin A 유전자를 도입시킨 효모세포의 제조 및 유전자의 발현</h2> <p>Leucocin A 유전자의 발현 플라스미드 pYD1-LeucoA 및 운반체 PYD1을 Cell-Porator Electrophoration system (Life Technologies, USA)을 이용하여 각각 효모(EYB100(+Ura))세포에 형질전환(transformation)시켰다. 형질전환이 이루어진 효모세포는 SD-Ura-Trp (1 M Sorbitol)배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일간 배양하여 형질전환된 효모의 콜로니를 생성시켰다.<p>Leucocin A 유전자의 발현을 위하여 pYD1-LeucoA가 형질 전환된 효모의 콜로니(colony) 하나를 SD-Ura-Trp배지 \( 10 \mathrm{ml} \)에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 600 \mathrm{nm} \) 에서 OD 2-5가 될 때까지 진탕 배양(250 \( \mathrm{rpm}\))하였다. 이 배양액을 실온에서 5-10분간 원심분리(3000-5000 \( \mathrm{xg}\))하고 SD-Ura-Trp(\( 2 \%\) galactose) 배지 20-40\( \mathrm{ml} \)에 600\( \mathrm{nm} \)에서 OD 0.5-1이 되도록 현탁한 후, \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 48시간 배양하였다. 운반체 PYD1이 형질선환된 효모도 같은 방법으로 발현을 유도하여 negative control로 사용하였다.</p> <h2>Leucocin A를 생산하는 형질전환 효모세포의 항균활성 측정</h2> <p>고초균(Bacillus subtilis)을 LB 배지를 이용하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤 배양하고 사용직전에 이를 100배로 희석하였다. 이 균의 희석액을 YPD 고체(\( 1 \%\) yeast extract, \( 2 \% \) polypeptone, \( 2 \% \) D-glucose, \( 1.5 \% \) agar)배지에 도말하였다. 여기에 paper disc를 놓고 pYD1-LeucoA가 형질전환된 효모의 발현 배양액과 운반체 pYD1이 형질전환된 효모의 발현 배양액 \( 100 \mu \mathrm{l} \)씩을 paper disc에 접종하였다. 이를 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하룻밤 동안 배양한 후 항균작용에 의해 형성된 생육억제환(clear zone)을 비교 • 관찰하였다.</p> <h2>pYD1-LeucoA 형질전환 효모로부터 플라스미드 DNA의 분리 및 Leucocin A 유전자의 확인</h2> <p>pYD1-LeucoA 형질전환 효모를 SD-Ura-Trp배지 4 \( \mathrm{ml}\)에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 하릇밤 동안 배양한 후, 원심분리(1,4000 \( \mathrm{xg} \), 5분)하여 균체를 회수하였다. 여기에 yeast lysis buffer(\( 2 \%\) Triton X-100, \( 1 \%\) SDS, \( 10 \mathrm{mM} \) tris-\( \mathrm{HCl}\) (\( \mathrm{pH}\) 8.0) buffer, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA) 200 \( \mu \mathrm{l}\)을 넣어 균체를 현탁한 후, acid-washed glass beads (425-600 \( \mathrm{m}\), Sigma #G-8772, USA) 0.3 \( \mathrm{g}\)과 phenol/\( \mathrm{CHCl_3} \) 용액 \( 200 \mu \mathrm{l} \)를 넣고 2분간 vortex하였다. 이것을 원심분리(14,000 \( \mathrm{xg}\), 10분)하여 상청액을 새로운 tube에 읆기고, 여기에 glycogen \( 1 \mu \mathrm{l}\), \(5 \mathrm{M}\) \( \mathrm{LiCl} \) 용액 \(20 \mu \mathrm{l} \), 차가운 에탄올 \( 500 \mu \mathrm{l} \)를 넣은 후, 원심분리(1,4000\( \mathrm{xg}\), 10분)하여 플라스미드 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA는 차가운 \( 70 \% \) 에탄올로 세정한 후 건조시키고, 탈이온수(dd\( \mathrm{H_{2}} \mathrm{O}\)) \( 20 \mu \mathrm{l}\)에 녹였다.</p> <p>효모로부터 회수된 플라스미드 DNA의 확인은 Leucocin A에 특이적인 primer를 이용한 PCR (polymerase chain reaction)밥으로 행하였다. 회수된 플라스미드 DNA \( 50 \mathrm{ng} \)과 Leucocin A에 특이적인 primer인 Leuco4-F (\( 23 \mathrm{mer}\), 5'-CTCGAGAAGTATTATGGTAACGG-3')와 Leuco5-R (\( 26 \mathrm{mer}\), 5'-GGGCCCTTACCAGAAACCATTTCCAC-3')을 각각 \( 10 \mathrm{pmol}\) 씩 사용하여 PCR 반응을 행하였다. PCR 반응산물은 \( 2 \% \)의 agarose gel에 전기영동하여 확인하였다.</p>