재조합 Bacillus subtilis DB(431)/pJHKJ(4)를 이용한 플라스크 배양을 통해 glucose, maltose 및 yeast extract의 최적 농도를 찾아 endoxylanase의 균체 증식과 발현 활성의 최적 조건을 알아보고자 한다. 탄소원의 농도를 \(0.5\sim5\%\)로 했을 때 \(2\%\)의 농도에서 glucose는 가장 높은 활성 \(166\mathrm{unit}/\mathrm { ml } \) 를 보였으며, maltose도 \( 180 \mathrm { unit } / \mathrm { ml } \) 로 나타났다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>재조합 Bacillus의 발효조 회분배양 및 유가배양에서의 균체 증식과 endoxylanase 발현</h2> <p>재조합 균주 B. subtilis DB \(431 \)/pJHKJ \(4 \)를 이용한 플라스크 배양을 통해 탄소원인 glucose, maltose와 질소원인 yeast extract에서의 균체증식과 재조합 endoxylanase의 활성이 높은 최적 조건을 찾아보았다. 탄소원의 농도를 \( 0.5 \sim 5 \% \) 로 했을 때 \( 2 \% \) 의 농도에서 glucose는 가장 높은 활성 \( 166 \mathrm { unit } / \mathrm { ml } \) 를 보였으며, maltose의 경우도 \( 180 \mathrm { unit } / \mathrm { ml } \) 로 나타났다. 질소원인 yeast extract의 경우 농도가 높을수록 균체증식과 활성이 높게 나왔으나, \( 1 \% \) 의 yeast extract를 사용하였을 때 가장 높은 specific activity \( \left (29.8 \mathrm { unit } / \mathrm { ml } / \mathrm { OD } _ { 660 } \right ) \) 를 얻을 수 있었다. 따라서 회분배양시 배지로는 \( 2 \% \) maltose, \( 1 \% \) yeast extract를 사용하기로 했다(data not shown).</p> <p>실제로 Bacillus에 재조합된 endoxylanase를 LBM 배지에서 \(30 \) 시간 회분배양하여 균체증식, 균체내외 endoxylanase 활성, plasmid stability 등을 조사하였다.(Fig. \(1 \)A). \(2 \% \) maltose 함유 배지에서 \(12 \)시간까지 균체증식은 활발했으며, en-doxylanase 발현은 \(3 \)시간째부터 서서히 발현되기 시작하여 배양 말기에 최대 활성 \( 780 \mathrm { unit } / \mathrm { ml } \) 로 나타났다. 세포내 활성은 \( 70 \mathrm { unit } / \mathrm { ml } \) 로 endoxylanase는 대부분 세포밖으로 분비됨을 알 수 있었다. \(8 \) 시간까지의 비증식속도 \( ( \mu) \) 는 약 \( 1.329 \) \( \mathrm { h } ^ { -1 } \) 로 나타났고 배양 \(8 \) 시간 이후의 \(2 \)차 증식기에서는 비증식 속도가 \( 0.08 \mathrm { ~h } ^ { -1 } \) 로 크게 감소하였다. 공급해준 탄소원인 mal-tose의 소모양상은 서서히 소모하기 시작하여 배양말기에는 maltose를 거의 다 소모하였다. B. subtilis DB \(104 \)에 재조합된 endoxylanase가 같은 조건에서 배양 시 탄소원인 maltose를 절반밖에 소모하지 못한 결과에 비추어 볼 때, B. subtilis \( \mathrm { DB431 } \) 예 재조합된 endoxylanase는 소모속도는 느리지만 거의 다 소모하였다. 또한, plasmid stability는 배양 말기에 접어들어도 \( 90 \% \) 이상 안정하게 유지되었다.</p>