STC에 의해 세라마이드가 형성고 이러한 세라마이드가 STC에 의한 세포사멸 도출에 중요함을 확인할 수 있다. 본 연구는 STC와 구조유사체인 STD도 세라마이드를 생산하는지를 면역형광염색법으로 검증하였다. In vivo에서 STD에 의한 항암 효과를 검증하기 위하여 면역 결핍 생쥐에 HL-60 세포를 이종 이식하여 종양 모델을 구성하였다. HL-60 세포를 면역력 결핍 생쥐의 피하에 주사하여 종양을 생성한 후 STC와 STD를 면역결핍 생쥐의 꼬리에 사흘마다 주사하여 종양의 규모를 측정하였다.
<h2>STD의 세라마이드 합성효소의 활성에 의한 세라마이드 생성</h2> <p>이전의 연구 결과 STC에 의해 세라마이드가 형성되었고 이러한 세라마이드가 STC에 의한 세포사멸 유도에 중요하다는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 연구에서는 STC와 구조유사체인 STD도 세라마이드를 생성하는지를 면역형광염색법으로 살펴보았다. Fig. 3A에서 보는 바와 같이 STD에 의해서도 STC에서처럼 세라마이드가 생성됨을 알 수 있었다. 이러한 STD에 의한 세라마이드 생성이 STD에 의한 세포 사멸에 중요한지와 STC에서처럼 산성 SMase의 활성과 중성 SMase의 활성에 의한 것인지를 확인하기 위하여 산성 SMase의 저해제인 desipramine과 중성 SMase의 저해제인 GW4869를 각각 STC와 STD를 처리하기 1시간 전에 첨가하여 배양하였다. STC에 의한 세포 사멸이 desipramine과 GW4869에 의해서 부분적으로 억제되는 것을 관찰하였으나, STD에 의한 세포 사멸은 desipramine과 GW4869에 의해서 억제되지 않음을 알 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 STC와 STD에 의한 세라마이드의 생성이 산성 및 중성 SMase의 활성화에 의한 것인지를 관찰하기 위하여, 세라마이드 항체에는 FITC를 붙이고, 산성과 중성 SMase 항체에는 각각 PE를 붙여 면역형광염색법으로 확인해 보았다. 그 결과, STC에 의한 산성과 중성 SMase의 활성화를 육안으로 관찰할 수 있었고 또한 세라마이드의 생성도 확인할 수 있었다. 반면에 STD에 의해서는 산성과 중성 SMase 활성은 관찰되지 않았으나 STC와 마찬가지로 세라마이드의 생성은 확인할 수 있었다. 이러한 결과로부터 STC에 의한 세라마이드 형성은 산성 및 중성 SMase의 활성에 의해 일어나는 것이고, STD는 그렇지 않다는 것을 알 수 있었다.</p> <p>또한, STD에 의한 세라마이드 형성이 STD에 의한 세포사멸에 중요한지와 세라마이드 합성효소의 활성에 의한 것인지를 관찰하기 위하여 세라마이드 합성효소 저해제인 fumonisin B1 (FB1)을 STC와 STD를 처리하기 1시간 전에 첨가하여 배양하였다. STC에 의한 세포사멸은 FB1에 의해서 저해되지 않았고 STD에 의한 세포사멸은 FB1에 의해서 부분적으로 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. 그리고, STC에 의한 caspase-9, caspase-3와 caspase-8의 활성은 FB1에 의해 억제되지 않았으며, STD에 의한 caspase-9과 caspase-3의 활성은 FB1에 의해 억제되었고, caspase-8의 활성은 부분적으로 억제되었다. 이러한 결과를 바탕으로 STC와 STD에 의한 세라마이드의 생성을 관찰하기 위하여, 세라마이드 항체에는 FITC를 붙이고, 산성과 중성 SMase 항체에는 각각 PE를 붙여 면역형광염색법으로 확인해 보았다. 그 결과, 앞서 확인한 바와 같이 STC에 의한 산성과 중성 SMase의 활성화를 관찰할 수 있었으나 예상한 바와 같이 FB1에 의해서는 이들 활성화에 변함이 없었다. 또한 세라마이드의 생성도 변화가 없었다. 반면에 STD에 의한 산성과 중성 SMase의 활성은 관찰할 수 없었고, FB1에 의한 영향도 없었다. 그리고 세라마이드의 생성은 FB1에 의해 부분적으로 억제됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로부터 STC에 의한 세라마이드의 생성은 산성과 중성 SMase의 활성화에 기인한 것이고 STD에 의한 세라마이드의 생성은 세라마이드 합성 효소의 활성화에 기인한 것임을 확인할 수 있었다. 또한 STC와 STD에 의해 세라마이드가 생성되는 분자적 기전은 다르지만 이들에 의한 세포사멸 유도에는 세라마이드의 생성이 중요하다는 것을 알 수 있었다.</p> <h2>In ViVo에서 STD에 의한 세라마이드 생성과 항암 효과</h2> <p>In vivo에서 STD에 의한 항암 효과를 확인하기 위하여 면역 결핍 생쥐에 HL-60 세포를 이종 이식하여 종양 모델을 만들었다. HL-60 세포를 면역결핍 생쥐의 옆구리 피하에 주사하여 종양을 만든 후 종양이 어느 정도 자랐을 때 STC와 STD를 면역결핍 생쥐의 꼬리에 3일 마다 주사하여 종양의 크기를 관찰하였다. STC 또는 STD를 주사하지 않은 대조군에서는 종양의 크기가 빨리 증가하였으나 STC 또는 STD를 주사한 실험군에서는 종양의 성장이 크게 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. STD의 경우 STC 용량의 3 배를 주입하였을 때 종양의 성장이 현저하게 억제 되었고, STC와 동량의 STD를 주입했을 때는 종양의 성장 억제 효과가 나타나지 않았다(data not shown). 이러한 결과는 정도의 차이는 있지만 in vitro에서의 작용과 유사하였다. 따라서 in vivo에서도 STC의 항암작용이 STD보다 강하다는 것을 알 수 있었다. 또한 종양을 떼어 낸 후 얇게 썰어 조직을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하여 관찰한 결과 종양세포가 있음을 확인할 수 있었으며 STC 또는 STD를 주사한 실험군의 종양인 경우 세포 사멸이 일어난 부분을 관찰하였다. 그리고 이 종양조직에서 면역조직화학염색법을 이용하여 세라마이드를 관찰한 결과 STC 또는 STD를 주사하지 않은 대조군에서는 세라마이드가 약하게 염색된 반면 STC 또는 STD를 주사한 실험군에서는 세라마이드가 증가됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 in vitro에서의 결과와 유사하였으며 STC와 STD에 의한 세라마이드 생성이 세포 사멸과 종양 억제에 있어 중요하다는 것을 알 수 있었다.</p>