포자 생성 조건을 조사하기 위해 B.subtilis BK-17 균주를 LB, NB, spore forming medium, nutrient yeast extract sporulation medium 등의 배지에 이식한 후 70시간 동안 배양하여 포자 생성 능력을 조사했다. 배양 온도의 영향을 검토하기 위해 온도를 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)까지 조절하여 70시간 동안 배양한 후 총균 수와 포자 생성율을 측정했다. 결과적으로 총균 수와 포자 생성율이 모두 최대로 나타나는 온도는 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)임을 확인할 수 있었다. 대두 고체 배양 조건에서는 포자 생성균의 경우 포자 발아 온도가 배양 온도보다 약간 높다는 것이 일반적이다. 그러나 이 실험에서는 발아 온도와 배양 온도 사이에 유의한 차이가 없었다. 대두 발효에서는 단백질의 증가가 유의적으로 나타나고 이는 생산균에 의한 효소 생성량이 증가한 결과로 해석된다. 필수 아미노산의 증가폭이 높아진 결과로써, 이는 해당 식품의 기능성을 향상시키는 요인으로 해석된다.
<h2>결과 및 고찰</h2> <h2>포자생성용 배지</h2> <p>포자의 생성조건을 검토하기 위하여 LB, NB, spore form-ing medium (SFM), nutrient yeast extract sporulation me-dium (NYSM) 등의 배지를 사용하여 B. subtilis BK-17 균주를 이식한 후 70시간 동안 배양하여 포자 생성능을 검토하였다. 그 결과 Fig. 1에서와 같이 4가지 배지 중 SFM과 NYSM에서 높은 Cell growth를 보였고 그 중 SFM가 포자생성에 있어서는 약 10배 이상 높은 것으로 나타났다. 이상의 결과로 포자생성을 위한 배지로는 spore forming medium (SFM)을 사용하기로 하였다.</p> <p>일반적으로 LB나 NB배지에서 약 70시간 이상 배양을 하면 대부분의 포자생성세균의 경우 영양상태나 부산물의 축척 그리고 산소 부족, \( \mathrm{pH} \) 변화 등으로 생육환경이 열악하여 포자를 생성한다. 그러나 본 연구에서는 가능한 많은 포자 생산을 목표로 하기 때문에 가장 효율성 높은 SFM배지의 포자 생성율은 다른 배지에 비해 약 \( 30 \% \)의 생산 증가를 보였으며 이 결과는 Yoshimoto, T의 결과와 비슷하였다.</p> <h2>\( \mathrm{pH} \)와 온도의 영향</h2> <p>상기의 배지를 사용하여 포자생성을 위한 최적배양 \( \mathrm{pH} \)를 검토하였다. 배지를 \( \mathrm{pH} 2 \)에서 \( \mathrm{pH} 12 \)까지 조정하여 동일하게 접종 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 70시간 동안 배양 후 총균수와 포자생성율을 검토한 결과 Fig. 2와 같이 \( \mathrm{pH} 4.0 \) 이하와 \( \mathrm{pH} 9.0 \) 이상에서 생육에 큰 저해를 나타냄을 알 수 있었으나 \( \mathrm{pH} 5.0 \)에서\(7.0 \)의 중성의 \( \mathrm{pH} \) 에서도 총균수와 포자생성에 큰 변화는 없었다. 그 중 총균수는 \( \mathrm{pH~} 7.0\)에서 가장 높았고 포자생성율은 \( \mathrm{pH} 6.0\)에서 가장 높게 나타났다. 따라서 포자생성시 \( \mathrm{pH} \)를 \( 6.0 \)으로 결정하였다. 포자형성에 영향을 미치는 온도의 경우, \( 10^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)까지 배양온도를 조정하여 70시간 동안 배양 후 총균수와 포자생성율을 검토한 결과 총균수와 포자 생성율 모두 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)가 최대임을 알 수 있었다. 포자 생성율 모두 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 가 최적임을 알 수 있었다(data not shown). 이는 일반적인 Bacilius sp. 균포자 생성조건과 크게 차이가 없는 것으로 사료된다.</p> <h2>포자 최대 생산 시기의 결정</h2> <p>B. subtilis BK-17의 배양 시 포자 수를 최대로 생산할 수 있는 배양시간을 조사하기 위하여 120시간까지 12시간별로 총균수와 포자 수를 조사하였다. 그 결과 Fig. 3와 같이 총균수는 24시간부터 48시간 사이가 가장 높게 나타났으며 포자 수는 60시간에서 가장 높게 나타났다. 따라서 B. subtilis BK-17의 포자생성에 필요한 배양을 위해서는 \( \mathrm{pH} 6.0\), \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60시간 등의 배양조건이 요구된다. 이러한 결과는 일반 배지에서 포자생성이 70-72시간에서 최대로 나타나는 것보다 SFM 배지조건하에서 훨씬 포자생성시간이 빠른 시간에 최대 생산에 달하는 것을 알 수 있다.</p> <h2>각종 곡물기질에 대한 고체배양과 혈전용해효소 생산</h2> <p>각각의 기질(전분질 기질은 밀, 쌀, 옥수수, 식물단백질 기질은 강낭콩, 검은콩, 대두, 팥, 녹두)을 사용하여 포자 접종 후 고체배양을 실시 하였다. 배양은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1-3일간 효소활성을 매일 측정하면서 배양한 결과 Fig. 4에서 보이는 바와 같이 대두, 검정콩, 강낭콩, 녹두, 옥수수의 순으로 혈전용해활성이 높게 나왔다. 곡류 중 탄수화물인 옥수수는 녹두와 거의 같은 수준의 혈전용해활성을 보이는 반면 보리, 밀은 낮은 수준이었다. 콩류 중에도 팥은 제일 낮은 효소활성을 보였다. 이 결과는 혈전용해효소 생산 균주를 곡류에 고체배양으로 응용하여 직접 기능성 식품화 할 목적이므로 대두를 이용한 혈행개선용 기능성 식품개발을 가능하게 할 것으로 사료된다. 특히 Sumi등이 보고한 경구투여에 의한 혈행개선물질의 효과를 참조할 때 상기 결과를 이용하여 고체배양에 의한 혈행 개선제 개발이 기대된다</p> <h2>대두고체배양조건</h2> <p>대두 고체배지에 포자를 이식한 후 포자발아를 위하여 \( 41^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15시간 동안 접종한 다음 본 발효의 온도를 각각 \( 28,33,37,41,45^{\circ} \mathrm{C} \)로 조절하여 시간 별로 혈전용해효소의 활성을 점검하였다. 그 결과 Fig. 5에서 보이는 바와 같이 배양 온도는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)와 \( 41^{\circ} \mathrm{C} \)에서 효소활성에 큰 차이를 보이지 않았으며, 발효시간은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 긴 시간을 요구했으나 괄목할 만한 큰 차이를 보이지 않았다. 일반적인 포자 생성균의 경우 포자 발아온도가 배양온도보다 약간 높아 세균의 경우 \( 41^{\circ} \mathrm{C} \)에서 포자 발아가 양호하나 본 실험에서는 발아온도와 배양온도에서 유의적인 차이가 없는 것이 특징이라 할 수 있다.</p> <h2>발효 대두의 식품영양학적 평가</h2> <p>B. subtilis BK-17로서 발효한 대두를 기능성 식품으로 개발 할 수 있는지의 가능성을 타진하기 위하여 식품 및 영양학적 기초조사를 실시하였다. Fig. 6에서와 같이 고체 배양한 대두를 발효하지 않은 대두와 기초성분을 분석 비교한 결과 발효콩의 단백질과 지방에서 약 \( 20 \% \) 정도 성분증가 결과를 보였다. 또한 아미노산 분석 결과를 Fig. 7에서 보면 필수 아미노산이 약 \( 40 \% \) 증가하였고 일반 아미노산도 약 \( 30 \% \)의 증가를 보였다. 특히, 발효대두에서 단백질의 증가가 두드러지게 나타난것은 생산균에 의한 효소 생성량이 증가한 결과로 사료되며, 아미노산 분석결과 필수아미노산의 증가폭이 높은 것은 기능성 식품으로서 가치를 높이는 결과라 사료된다.</p>