애기장대는 야생종인 Col-0 ecotype 또는 rps2 유전자만 결함이 된 돌연변이체를 사용하였다. 형질전환용 벡터는 AtERF11의 염기서열을 가진 primer를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 애기장대의 형질전환 방법은 vacuum infiltration 방법을 사용하였다. 그리고 RNA 분리 및 RNA blot 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>식물재료 및 생장 방법</h2><p>본 연구의 병원균 감염실험 또는 형질전환체 제작에 사용한 애기장대 (Arabidopsis thaliana)는 야생종인 Col-0 ecotype 또는 같은 유전적 배경에 rps2 유전자만 결함이 된 돌연변이체를 사용하였다. 무균 배양을 위해서는 애기장대 종자를 \( 0.1 \% \) SDS가 포함된 \( 50 \% \) bleach 용액에 5분간 담가서 1차 포면소독을 하고난 후 멸균수로 5회 반복하여 세척을 하였다. 소독한 종자는 Gamborg's B5 (GIBCO) 배지에 파종하였다. 이틀간 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 춘화처리 후에 형광 빛에서 16시간 암주기, 8시간의 광주기, \( 22^{\circ} \mathrm{C} \)의 조건으로 2주일간 배양을 하여 자란 유식물체를 배양용 포트에 옮겨 심고 같은 조건에서 4주일간 더 배양한 식물체를 사용하였다.</p><h2>형질전환용 vector 제작 및 애기장대의 형질전환</h2><p>식물 형질전환용 vector를 제작하기 위하여 먼저 AtERF11의 coding 영역을 Xbal과 Sall제한효소 작용 염기서열을 가진 primer (For; TTTCTAGAATGGCACCGACAGTTAAA,Rev; AAGTCGACATCAGTTCTCAGGTGGAG)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 증폭된 DNA 단편을 Xbal과 Sall 제한효소로 절단시키고 같은 제한효소로 절단된 pBTEX binary vector에 연결시켰다. 애기장대의 형질전환은 개화하고있는 애기장대의 꽃봉오리 전체를 AtERF11을 대량 발현하도록 제작된 binary vector를 가지고 있는 Agrobacterium tumefaciens (GV3101) 용액에 담그고 진공을 잠시 걸었다가 풀어주는 vacuum infiltration 방법을 사용하였다. \( \mathrm{T}_{0} \) 세대 식물체에서 수확된 모든 씨앗을 hygromycin \( (20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)이 들어있는 Gamborg's B5 배지에서 발아시켜서 형질전환체를 선별하였다.</p><h2>RNA 분리 및 RNA blot 분석</h2><p>RNA를 추출하기 위해서 먼저 배양토에서 3-4주 동안 자란 애기장대 형질전환체 또는 전 처리된 식물체로부터 잎 조직을 채취하고 액체질소로 완전히 얼린 후에 유발로 분쇄 하였다. 전체 RNA를 TRIzol (Invitrogen) 용매를 사용하여 제공하는 방법에 따라서 추출하였다. RNA blot 분석을 위해서 \( 10 \mu \mathrm{g} \)의 RNA를 \( 1.2 \% \) formaldehyde-agarose gel에서 전기영동을 한 후, 모세관법에 의해서 Hybond \( \mathrm{N}+ \) hybridization membrane (Amersham-Pharmacia Biotech, USA)에 RNA를 전이시켰다. UV cross-linkage를 하여서 RNA를 memebrane에 고정 시킨 후, \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간가량 pre-hybridization을 하였다. 다시 새로운 hybridization 용액을 첨가한 후, \( { }^{32} \mathrm{P} \)로 label된 probe와 함께 16-20시간 반응하였다. AtERF11 특이적인 probe는 PCR로 증폭된 DNA 단편을 주형으로 random primer DNA labeling kit (Stratagene)를 사용해 \( a-\left[{ }^{32} \mathrm{P}\right] \mathrm{dATP} \)로 표지하였다. Hybridization 반응 후, membrane은 washing buffer로 15분간 3회 반복해서 씻어주었다. Labeling 된 membrane은 랩에 싸서 필름 카세트에 x-ray 필름과 함께 넣어 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 정도에서 보관한 후에 현상하였다. 유전자의 발현 양상은 사진의 이미지를 사용하여 측정하였다.</p><h2>병원균의 종과 접종</h2><p>Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000는 병원균 분석에 사용되었다. P. stringae pv. tomato DC3000 (vector)는 단지 empty vector인 pVSP61을 가지고 있으며, P. stringae pv: tomato DC3000 (avrRpt2)는 avrRpt2를 발현하는 pV288 vector를 가지고 있다. 모든 P. stringae pv. tomato 병원균은 rifampicin \( (100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)과 kanamycin \( (50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)이 들어있는 King's B agar 배지나 액체 배지를 사용하여 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \)의 조건으로 24-32시간 배양하였다. 다 자란 bacteria cell은 \( 10 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{MgCl}_{2} \)에 현탁하고 3회 반복해서 씻어낸 후, \( \mathrm{OD}_{600 \mathrm{~nm}}=0.1 \)\( \left(5 \times 10^{7} \mathrm{cfu} / \mathrm{ml}\right) \)의 농도로 희석시킨다. 식물체의 잎에서 P. stringae pv. tomato DC3000 증식정도를 정량적으로 조사하기 위해서는 \( ~ 1 \times 10^{5} \mathrm{cfu} / \mathrm{ml} \)의 농도로 더욱 희석시켰다. 3-4주 정도 된 야생종을 대조군으로, AtERF11을 대량 발현하는 형질전환 식물체를 실험 군으로 이용하여 최소한 4개의 개별식물체로부터 4장 정도의 잎의 뒷면에 \( 1 \mathrm{ml} \) 주사를 사용하여 박테리아 용액을 전체 잎의 반만 감염시키고 습도를 유지하였다. 감염 당일과 3일 후에 박테리아 증식 정도를 정량화하기 위해서 균이 감염된 4장의 잎으로부터 \( 1 \mathrm{~cm}^{2} \)의 부위를 발취하고 \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl}_{2} \) 용액에 갈아서 순차적으로 희석을 시킨 후에 rifampicin \( (100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 과 kanamycin \( (50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)이 들어있는 King's B agar 배지에서 배양하였다.</p>