Klebsiella sp. DA71-1 균주에 ldh 유전자를 도입한 DA71-1/pLYJ는 electroporation 방법을 통해 생성되었고, 이는 chloramphenicol이 첨가된 LB 고체배지에서 선별되었다. 이 균주는 설탕(glucose, sucrose, maltose)을 탄소원으로 사용하였을 때 기존 균주보다 2.6배 이상 높은 인산가용화능을 보였으며, glucose를 첨가했을 때 pH 저하가 가장 컸다. 이 결과는 비교적 저렴한 탄소원을 이용하여 대량 배양을 위한 기초실험으로, Fig. 2에 결과가 표시되었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Idh gene의 cloning</h2> <p>ldh gene의 도입을 위하여 pLYJ는 Klebsiella sp. DA71-1 균주로 electroporation되었으며, 이를 DA71-1/pLYJ이라고 명명하였다. DA71-1/pLYJ를 chloramphenicol \( (25 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 이 첨가된 LB 고체배지에서 선별한 결과 200여 개의 colony가 나타났다. 200여 개의 colony 중에서 20개를 선택하여 plasmid DNA를 분리하여 확인한 결과 모든 colony에서 재조합 plasmid DNA가 확인되었다. 확인된 균주 중에서 임의로 5개의 균주를 선택한 후 제한효소를 처리하여 ldh gene의 삽입 여부를 확인하였다. 난용성 인산염이 \( 0.5 \% \) 첨가된 SM 고체배지에서 ldh gene이 도입된 DA71-1/pLYJ 균주가 야생형 DA71-1에 비해 3일 이후 투명대의 크기가 훨씬 크게 나타나는 것을 확인하였다(자료 미제시). 그중에서도 투명대가 가장 큰 균주를 선택하여 계속적으로 실험을 수행하였다.</p> <h2>탄소원의 종류 및 농도에 따른 난용성 인산염 가용화 특성</h2> <p>비교적 가격이 저렴한 탄소원을 이용하여 경제적인 배양 단가로 대량 배양을 위한 기초실험으로서 탄소원의 종류 (glucose, sucrose, maltose)에 따른 Klebsiella sp. DA71-1 균주와 DA71-1/pLYJ 균주의 인산가용화능의 차이에 대한 분석 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 그 결과, DA71-1/pLYJ 균주 는 탄소원으로 glucose를 배지에 첨가하였을 때 sucrose의 7.6배, maltose의 11.9배 이상의 유리 인산을 방출하였고, Klebsiella sp. DA71-1 균주에 비해서는 2.6배 이상의 유리 인산을 방출하였다. 또한 glucose를 첨가하였을 때 pH 저하의 정도가 가장 컸다.</p> <p>탄소원으로서 가장 뛰어난 특성을 나타낸 glucose의 농도\((1 \%, 3 \%, 5 \%)\)에 따른 Klebsiella sp. DA71-1 균주와 DA71-1/ pLYJ 균주의 인산가용화능의 차이에 대한 분석결과를 Fig. 3에 나타내었다. DA71-1/pLYJ 균주는 glucose 를 \( 1 \%, 3 \% \), 그리고 \(5 \%\) 첨가한 모든 실험에서 Klebsiella sp. DA71-1 균주보다 난용성 인산염 가용화능이 우수하였으며 각각 9.8배, 2.6배, 그리고 4.1배 이상의 유리 인산을 방출하였다. 특히, DA71-1/pLYJ 균주는 배지에 glucose를 \( 3 \% \) 첨가했을 때 가용화능이 가장 뛰어났다. glucose를 \( 1 \%, 3 \%, 5 \% \) 첨가하였을 때 각각 pH 5.11, 4.85, 4.8로 pH가 저하되었다. \( 3 \% \) 첨가하였을 경우 \( 1 \% \) 첨가하였을 때보다 pH 저하의 정도가 컸다. 이러한 결과는 glucose를 \( 1 \% \) 첨가하였을 때에 비해 시간에 따른 고갈 정도가 낮은 것에 기인한 것이며, \(3 \% \)이상 첨가할 때에는 높은 탄소원의 함량 때문에 기질 저하가 있는 듯했다.</p>