박테리오신의 일종인 Bacillus subtilis의 Subpeptin JM4-A 및 Subpeptin JM4-B를 생산하는 효모의 제작을 위하여 48bp 길이의 개시코돈과 종지코돈을 포함하는 Subpeptin JM4-A 및 Subpeptin JM4-B의 유전자를 합성하여 효모 발현 vector pAUR123에 클로닝하였으며 이렿게 제작한 재조합 DNA로 효모세포를 형질전환시켜 Subpeptin JM4-A와 Subpeptin JM4-B를 생산하는 형질전환 효모세포를 제작하였다. 형질전환 효모는 그람양성 대표세균인 고초균(B. subtilis)과 그람음성 장내세균인 대장균(E. coli)에 대해 항균활성을 나타냈으며 녹농균(P. aeruginosa)에 대해서도 항균활성을 나타냈다. 이 연구로 보존제 대체물질(부패하기 쉬운 식품들의 보존성을 향상) 또는 항생제 대체물질(가축 사료에서 병원균의 생육을 저해)로 사용할 수 있는 박테리오신을 생산 할 수 있는 효모세포 제작을 완료하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Subpeptin JM4-A 및 Subpeptin JM4-B 유전자의 클로닝</h2> <p>Subpeptin JM4-A 및 Subpeptin JM4-B는 B. subtilis가 생산하는 아미노산 12개로 구성된 항균 펩타이드로 Subpeptin JM4-A 및 Subpeptin JM4-B 유전자의 일차구조는 이미 보고되어 있고, 그 길이가 짧아 B. subtilis 균체로부터 유전자를 클로닝하지 않고 화학합성하였다(Fig. 2). 합성된 oligonucleotide들을 annealing하여 얻어진 이중가닥 DNA 단편들을 효모발현 vector pAUR123의 제한효소 XhoI와 XbaI 부위에 삽입하여 효모발현 플라스미드를 구축하였고 이를 각각 pAUR-SubpA와 pAUR-SubpB이라고 명명하였다.</p> <h2>Subpeptin JM4-A 및 Subpeptin JM4-B를 생산하는 형질전환 효모의 제작</h2> <p>효모(S. cerevisiae)에 pAUR-SubpA 및 pAUR-SubpB를 도입하고 aureobacidin A를 포함하는 YPD 배지에서 선별하여 Subpeptin JM4-A 및 Subpeptin JM4-B의 발현 유전자가 도입된 형질전환 효모를 얻을 수 있었다. 형질전환 효모의 효과적인 선별을 위하여 선별 marker로 사용되는 aureobacidin A의 최종농도를 \( 0.1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 에서 \( 0.5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 까지 다양하게 사용하여 형질전환 효모 콜로니의 형성효율을 검토하였다 그 결과, 이 연구에서는 aureobacidin A의 최종농도가 \( 0.2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 에서 가장 효과적으로 형질전환 콜로니를 형성하였다. Aureobacidin A의 최종농도가 너무 낮으면 콜로니 형성은 원활하지만 형질전환되지 않은 야생 효모의 콜로니의 형성빈도가 높아지고, 최종농도가 너무 높으면 콜로니 형성이 되지 않거나 형성에 많은 시간을 요한다는 사실을 확인할 수 있었다.</p> <h2>형질전환 효모의 항균활성 확인</h2> <p>그람양성 대표세균인 고초균(B. subtilis), 그람음성 대표세균인 대장균(E. coli) 및 그람음성 녹농균 ( P. aeruginosa)에 대한 형질전환 효모들의 항균활성을 측정한 결과, pAUR-SubpA 또 는 pAUR-SubpB가 도입된 형질전환 효모의 경우는 그람양성 고초균, 그람음성 대장균 및 녹농균 모두에서 생육을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 효모 발현 vector (pUAR123) 만을 도입한 형질전환 효모의 경우는 이들 세균 모두에서 생육억제를 나타내지 않았다. 이 결과로 이들 세균 모두에 대해 항균활성을 나타내는 형질전환 효모가 성공적으로 제작되었음을 확인할 수 있었다. 문헌에 따르면 Subpeptin JM4-A는 그람양성 세균들에 대해 항균활성을 나타내는 것으로 알려져 있으며, Subpeptin JM4-B는 그람음성 세균들에 대해 항균활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 실제로 그람양성 세균인 B. subtilis에 대해서는 pAUR-SubpA 를 생산하는 형질전환 효모가 pAUR-SubpB 를 생산하는 형질전환 효모보다 더 넓은 생육억제 환을 나타내는 것이 관찰되었다. 또한, 그람음성 세균인 E. coli에 대해서는 pAUR-SubpA를 생산하는 형질전환 효모보다 pAUR-SubpB를 생산하는 형질전환 효모가 약간 더 넓은 생육억제 환을 나타내는 것이 관찰되었다. 한편, 그람음성 세균인 P. aeruginosa 에 대해서는 pAUR-SubpA를 생산하는 형질전환 효모와 pAUR-SubpB를 생산하는 형질전환 효모 모두가 비교적 넓은 생육억제 환을 나타내는 것이 관찰되었다. 이 연구로 제작된 항균활성 효모를 사료 첨가물로 활용하기 위해서는 효모 배양조건에 따른 항균활성의 영향과 다양한 세균들에 대한 항균활성의 확인 등을 통한 생산 최적조건의 검토가 필요할 것으로 생각된다.</p> <p>이 연구의 결과로 부패하기 쉬운 식품의 보존성을 향상시킬 수 있는 보존료 대체물질 흑은 가축 사료에서 병원균의 생육을 저해하기 위한 항생제 대체물질로 사용가능한 박테리오신의 산업적 대량생산에 활용할 수 있는 효모세포들을 제작하였다. 박테리오신은 세포표면의 특정 혹은 비특정 수용체에 부착하여 항균작용을 나타내며 1차 표적인 세포질막의 막투과성을 변화시켜 막수송을 방해하거나 proton motive force에 영향을 미쳐 에너지 생산과 단백질이나 핵산의 합성을 저해하는 것으로 알려져 있다. 재조합 DNA 기술을 이용하여 유용 유전자 산물의 효율적인 생산을 위해서는 대상 유전자 산물인 단백질의 특성에 따라 사용하는 숙주 (host)를 잘 선택해야 한다. 이 연구의 대상인 Subpeptin JM4-A 및 Subpeptin JM4-B는 세균의 생육을 억제하는 항균 활성을 가지는 단백질이기 때문에 대장균과 같은 세균세포를 생산숙주로 이용할 경우 생산이 불가능한 경우가 많다.이 연구에서 사용한 생산숙주인 효모의 경우는 박테리오신에 의해 생육 저해를 받는 원핵생물과는 다른 진핵생물이지만 배양이 용이하며 생육속도가 비교적 빠르기 때문에 특수한 유전자 산물을 생산하는데 자주 사용되는 숙주세포이다.</p> <h1>요 약</h1> <p>박테리오신의 일종인 Bacillus subtilis의 Subpeptin JM4-A 및 Subpeptin JM4-B를 생산하는 효모의 제작을 위하여 48bp 길이의 개시코돈과 종지코돈을 포함하는 Subpeptin JM4-A 및 Subpeptin JM4-B의 유전자를 합성하여 효모 발현 vector pAUR123에 클로닝하였다. 이렿게 제작된 재조합 DNA로 효모세포를 형질전환시켜 Subpeptin JM4-A와 Subpeptin JM4-B를 생산하는 형질전환 효모세포를 제작하였다. 형질전환 효모는 그람양성 대표세균인 고초균(B. subtilis)과 그람음성 장내세균인 대장균(E. coli 에 대해 항균활성을 나타냈다. 또한 농흉이나 중이염의 원인이 되는 녹농균(P. aeruginosa)에 대해서도 항균활성을 나타냈다. 이 연구의 결과로 부패하기 쉬운 식품들의 보존성을 향상시키기 위한 보존제 대체물질 또는 가축 사료에서 병원균의 생육을 저해하기 위한 항생제 대체물질로 사용할 수 있는 박테리오신을 산업적으로 생산할 수 있는 효모세포를 제작하였다.</p>