포도당을 이용한 회분배양에서는 8 시간까지, 유가배양에서는 15 시간까지 균체증식이 활발히 일어나다가 그 이후에는 거의 유지됨을 확인할 수 있었다. endoxylanase 농도에 따른 xylooligosaccharide의 조성 변화와 xylan 종류에 따른 B. subtilis endoxylanase의 분해정도도를 조사한 결과 xylooligosaccharide 생산을 위한 최적반응 조건은 10 unit의 endoxylanase를 첨가하여 1시간 반응시켰을 때이고, 기질로는 birch-wood xylan이 적합함을 알 수 있었다.
<p>이상의 플라스크와 발효조 회분배양의 결과로부터, 값싼 기질인 포도당을 이용하여 유가배양을 실시하였다(Fig. \(1 \)B). 초기에는 LB에 배양하다가 균체증식이 활발한 대수증식기 초반부터 \( 20 \% \) glucose와 \( 10 \% \) yeast extract 농축배지 \( 50 \mathrm { ml } \)을 매 \(2 \)시간 간격으로 \(4 \) 번 \( 50 \mathrm { ml } \) 을 대수 중식기 후반까지 \(4 \)회 공급하였다. 포도당 소모 구간에서 균체중식은 활발히 일어나며 LBM배지에서의 회분배양과 비교해 보면 균체증식은 회분배양보다 \(2 \)배 정도 중가합을 알 수 있었다. endox- ylanase 발현은 \(3 \) 시간째부터 서서히 발현되기 시작하여 배양 \(12 \) 시간째 최대 활성 \( 1,000 \mathrm { unit } / \mathrm { ml } \) 로 나타났으며 이때의 단백질량은 \( 846 \mathrm { mg } / 1 \) 로 나타났다. 회분배양에서는 \(8 \) 시간까지 균체증식이 활발히 일어나다가 그 이후에는 거의 유지함을 황인할 수 있었으며, 유가배양에서는 기질공급을 해준 \(15 \) 시간까지 계속 증가하다가 그 후에는 거의 유지됨을 알 수 있었다.</p> <h2>효소농도와 기질에 따른 xylooligosaccharide의 생산</h2> <p>효소농도에 따른 xylooligosaccharide의 조성 변화를 조사하기 위해서 농축된 endoxylanase 조효소액을 \( 2.5,5,10 \) 및 \(25 \) unit로 \( 2 \% \) birchwood xylan, corncob xylan, oat spelts xylan 용액과 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(12 \) 시간까지 반응시켰다. 이 반응액의 생성물을 TLC로 분석한 결과를 Fig. \(2 \)(birchwood xylan의 경우)에 나타내었는데, \(3 \)가지 종류의 xylan기질에서의 \( x y- \) looligosaccharide 생성양상은 비슷함을 알 수 있었다(data not shown). 즉, \( 2.5 \) unit 첨가 시 반응 \(30 \)분 후에 xylotriose 가 생성되었으며 반응 \(2 \)시간 후에는 xylobiose가 생성됨을 확인할 수 있었다. \(10 \) unit 이상의 효소량 첨가 시 반응 \(10 \) 분 째 xylobiose, xylortiose를 관찰할 수 있었으며 반응 \(1 \) 시간째 는 대부분의 반응이 다 이루어졌음을 확인할 수 있었다. \(10 \) unit의 효소를 첨가시켰을 때 가장 많은 xylooligosaccharide을 얻을 수 있었으며 그 이상의 효소량을 첨가시켰을 때에는 분해되는 속도가 빨랐으며 적은 양이지만 xylose도 생성됨을 확인할 수 있었는데 이런 결과는 xylooligosaccharide 생산 시에는 적합하지 않음을 나타낸다. 또한 위의 실헙결과로 부터 B. subtilis endoxylanase의 xylan 종류에 따른 분해정도도 조사할 수 있었는데, endoxylanase 효소액 \(10 \) unit를 기준으로 비교해 보았을 때, \(3 \) 가지 기질 모두에서 xylobiose, xylo-triose가 주 생성물이었으며, 이 중 birchwood xylan에서 가장 많은 xylobiose, xylotriose가 생산됨을 알 수 있었다. 따라서 xylooligosaccharide 생산을 위한 최직 효소농도는 \(10 \) unit이고, 반웅시간은 \(1 \) 시간으로 충분하며 기질로서는 birch-wood xylan이 적합함을 알 수 있었다.</p>