형질전환체에 포함된 Genomic DNA library를 CI-F, CI-R primer로 약 500bp DNA 단편을 증폭하였으며, DNA sequencing 결과 \( \mathrm{crtI} \) 유전자의 단편임이 확인되었다. 예측된 \( \mathrm{CrtI}_{\mathrm{Kg}} \) 단백질의 2차 구조는 \( 17 \beta \)-sheet, \( 20 \alpha \)-helices 및 random 코일을 가지며, 막결합 구조가 없기에 수용성 형태로 발현될 것이라고 추정되었다. 대장균에서 \( \mathrm{CrtI}_{\mathrm{Kg}} \) 유전자를 발현시키기 위해 \( \mathrm{pColdI} \) vector를 사용하였으며, 대장균 \( \mathrm{BL} 21 \) (DE3)에서 발현된 \( \mathrm{CrtI}_{\mathrm{Kg}} \) 의 활성은 lycopene의 생합성을 통해 확인하였다. 마지막으로 연구진은 K. gwangalliensis로부터 phytoene desaturase를 code하는 \( \mathrm{crtI}\) 유전자를 분리하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>K. gwangalliensis로부터 유래한 phytoene desaturase 유전자 클로닝</h2> <p>K. gwangalliensis 의 Phytoene desaturase \((\mathrm{crtI}\)\) 유전자를 cloning 하기 위해 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA)에 등록된 카로티노이드 생합성 세균의 phytoene desaturase의 염기서열을 이용하여 degenerate primer인 CI-F, CI-R를 제작하였다. Genomic DNA library가 함유된 형질전환체를 주형으로 하여 CI-F, CI-R primer를 이용하여 약 \( 500 \mathrm{bp} \)의 DNA 단편을 증폭하였으며, 이를 DNA sequencing 한 결과 \( \mathrm{crtI} \) 유전자의 단편임을 확인할 수 있었다.</p> <p>\( \mathrm{crtI} \) ORF (open read frame)를 cloning 하기 위해, 밝혀진 \( \mathrm{crtI} \) 유전자 단편 염기서열을 이용하여 target-specific primers 를 제작하였다. Target-specific primers와 genomic DNA library가 함유된 형질전환주를 주형으로 PCR을 수행한 후 TA-cloning 통해 full length의 \( \mathrm{crtI} \) 유전자를 클로닝할 수 있었으며, DNA sequencing 통해 확보된 클론의 염기서열을 분석한 결과, \( 1.6 \mathrm{kb} \)의 K. gwangalliensis 유래 phytoene desaturase \( \mathrm{crtI}_{\mathrm{Kg}} \) 유전자의 전체 염기서열을 확보할 수 있었다. 클로닝된 \( \mathrm{crtI}_{\mathrm{Kg}} \) 의 ORF는 1,581\(\mathrm{bp} \) 이고, 527개의 아미노산을 암호화하고 있으며, 종결 코돈(TGA)은 \( 1,582- 1,584 \mathrm{bp} \) 였다. 또한, \( \mathrm{crtI}_{\mathrm{Kg}} \) 유전자에 의해 코딩된 phytoene desaturase의 분자량은 \( 57.2 \mathrm{kDa} \) 이고, 예상 등전점(pI)은 6.0이었다.</p> <h2>phytoene desaturase \(( \mathrm{crtI}_{\mathrm{Kg}} )\) 의 아미노산 서열 분석</h2> <p>\( \mathrm{CrtI}_{\mathrm{Kg}} \) 유전자에 의해 암호화 된 phytoene desaturase의 아미노산 서열과 관련하여, 단백질의 2차 구조를 예측하기 위해 SABLE website (http://sable.cchmc.org)를 이용하였다. 또한, phytoene desaturase의 세포 내에서 존재하는 형태는 현재까지 밝혀진 바로는 막결합 단백질과 수용성 형태의 단백질의 두 가지 형태로 존재하는 것으로 알려져 있다. 이러한 특징을 파악하기 위해서, transmembrane domains을 예측하기 위한 Transmembrane Regions and Orientation (TMpred) algorithm (http://www.ch.embnet.org)를 이용하였다. \( \mathrm{CrtI}_{\mathrm{Kg}} \) 단백질의 2차 구조는 \( 17 \beta \)-sheet, \( 20 \alpha \)-helices 및 random 코일을 가질 것으로 예측되며, \( \mathrm{CrtI}_{\mathrm{Kg}} \) 단백질은 막결합 구조가 존재하지 않기 때문에 수용성 형태로만 발현된다고 추측된다.</p> <p>염기 서열이 잘 보존된 구역과 계통 발생 관계를 확인하기 위해 GenBank에 등록되어 있는 세균에서 발견된 phytoene desaturase 유전자들의 염기 서열을 이용하여 multiple alignment를 수행하였다. 분석 결과 두 개의 잘 보존된 구역을 확인할 수 있었으며, dinucleotide binding motif (\(\beta \alpha \beta \) fold)는 N 말단 영역에서 관찰되었지만 다른 종에서 발견되는 C말단 영역의 모티프는 발견되지 않았다. 하지만, 같은 Kocuria 속 사이에서 이 구역은 상당히 높은 상동성을 보였다. 또한, \( \mathrm{CrtI}_{\mathrm{Kg}} \) 단백질의 계통 발생 관계를 결정하기 위해 다른 세균들의 phytoene desaturase를 이용하여 multiple alignment을 수행했다. 가장 높은 상동성은 K. rhizophila (\(74\%\), accession No. BAG30430)의 phytoene desaturase에서 나타났으며, Myxococcus xanthus (\(19.7\%\), accession No. ABF90965)에 가장 낮은 상동성이 나타났다.</p> <h2>대장균에서의 phytoene desaturase \( \left(\mathrm{Crtl}_{\mathrm{Kg}}\right) \) 발현 및 확인</h2> <p>대장균에서 \( \mathrm{CrtI}_{\mathrm{Kg}} \) 유전자를 발현시키기 위해 \( \mathrm{pColdI} \) vector를 사용하였다. Table 1에 나타낸, 발현용 primer를 이용하여 재조합 DNA를 제작하였으며, 이를 \( \mathrm{pCcrtI} \)이라 명명하였다. 또한, 대장균에서 lycopene을 합성하기 위해 재료 및 방법에서 설명한 바와 같이 pRSFDuet-1의 MCS1과 MCS2 부위에 P. haeundaensis의 \( \mathrm{crtIE} \) 와 \( \mathrm{crtB} \) 유전자를 클로닝하여, 재조합 DNA \( \mathrm{pRScrtEB} \) 제작하였다.</p> <p>대장균에서 \( \mathrm{CrtI}_{\mathrm{Kg}} \) 유전자를 발현시키기 위해, 대장균 \( \mathrm{BL} 21 \) (DE3)를 \( \mathrm{pCcrtI} \) plasmid로 형질전환 하였다. 형질전환된 대장균을 선별하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 ampicillin을 함유한 LB배지에서 배양하고 \( \left(\mathrm{OD}_{600}=0.5\right)\), IPTG 를 최종 농도가 \( 0.1 \mathrm{mM} \) 이 되도록 첨가한 후, \( 16^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 과발현을 유도하였고, 이를 \( 12 \% \) SDS-PAGE로 확인하였다. 최적 발현 시간은 IPTG 첨가 후 17 시간이었으며, 분자량은 \( 57 \mathrm{kDa} \) 로 예상 중량과 일치하였다. 또한, 대장균에서 발현된 \( \mathrm{CrtI}_{\mathrm{Kg}} \)의 진위 여부는 western blot으로 확인하였다.</p> <h2>동시 발현을 통한 대장균에서 합성된 카로티노이드의 추출 및 분석</h2> <p>대장균 \( \mathrm{BL} 21 \) (DE3)에서 발현된 \( \mathrm{CrtI}_{\mathrm{Kg}} \) 의 활성을 확인하기 위해 대장균에서 lycopene의 생합성을 유도하였다. 일반적으로 대장균은 non-mevalonic acid 경로를 통해 FPP와 IPP를 합성하지만 \( \mathrm{crtE}, \mathrm{crtB}, \mathrm{crtI} \) 유전자를 가지고 있지 않기 때문에 lycopene을 합성할 수 없다. 이 특성을 이용하여, 위에서 기술한 두 개의 재조합 plasmid를 대장균 \(\mathrm{BL}21\) (DE3)에 형질전환 시켰다. 형질전환 된 균주에서 최종 농도가 \( 0.1 \mathrm{mM} \) 이 되도록 IPTG를 처리한 후 \( 16^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5시간 동안 과발현 시켰다. 이 과발현된 균주에서 생산된 lycopene을 HPLC를 이용하여 분석하였다. 표준물질과 형질전환체에서 생산된 카로티노이드의 흡광도는 \( 280 \mathrm{nm} \) 와 \( 470 \mathrm{nm} \) 에서 측정하였다. 이는 형질전환체에서 생산된 두 종류의 카로티노이드(phytoene과 lycopene)의 detection 파장대가 달라 두 번의 분석을 통해 각각의 카로티노이드 생산 유무를 분석하였으며, 이에 대한 결과는 Fig. 7에 나타내었다. Fig. 7A와 Fig. 7C는 phytoene과 lycopene 표준물질의 분석 결과이며, lycopene은 \( 470 \mathrm{nm} \), retention time \( 22 \mathrm{min} \) (peak 2)에서 분리되었고, phytoene은 \( 280 \mathrm{nm} \), retention time \( 27 \mathrm{min} \) (peak 1)에서 분리되었다. Fig. 7B와 Fig. 7D는 \( \mathrm{pCcrtI} \) 및 \(\mathrm{pRScrtEB}\) 재조합 DNA의 동시 발현에 의해 생성된 카로티노이드를 HPLC로 분석한 결과이다. 표준물질의 결과와 비교하여 형질전환체에서 카로티노이드가 생산 됨을 확인 할 수 있었다. \( 280 \mathrm{nm} \) (peak 1, 검출 시간 \( 27 \mathrm{min} \) ) 및 \( 470 \mathrm{nm} \) (peak 2 , 검출 시간 \( 22 \mathrm{min} \) )에서 분리된 물질은 각각 phytoene 및 lycopene에 해당한다.</p> <p>본 연구진은 K. gwangalliensis로부터 phytoene desaturase 를 coding하는 \( \mathrm{crtI}\) 유전자를 분리하였다. \( \mathrm{CrtI} \) 는 카로티노이드 생합성 경로를 조절하는 주요 효소 중 하나이다. 이 효소의 구조적 특성을 확인하기 위해 \( \mathrm{CrtI}_{\mathrm{Kg}} \) 단백질의 아미노산을 분석하였고, 효소 활성을 시험하기 위해 대장균 \(\mathrm{BL}21\) (DE3)에 이 유전자를 형질 전환하여 phytoene과 lycopene을 생성시킨 다음 HPLC를 이용하여 분석하였다. 이러한 결과는 카로티노이드를 생합성하는 새로운 효소를 동정하고, 카로티노이드를 생산하지 않는 숙주에서 다양한 카로티노이드를 생산하기 위한 기초 자료로 활용할 수 있다.</p>