효소 단백질의 N-terminal 아미노산 서열분석은 Edman 방법에 따라 Protein/Peptide sequencer을 따라 분석되었으며, 최적반응 \(\mathrm{pH}\)는 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium acetate buffer와 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer, Tris-HCl buffer ( \( \mathrm{pH} 8.0\sim10.0\))을 통해 분석되었다. \(\mathrm{pH}\) 안정성은 조효소액과 정제한 효소액 각각의 buffer을 첨가하여 fibrin plate에 \(12\)시간 동안 반응시켜 구해졌다. 다음으로 혈전분해 효소의 온도에 대한 영향은 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)부터 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)까지 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) 간격으로 측정되었으며, 정제한 효소의 금속이온에 대한 영향은 금속 이온 첨가에 따른 잔존효소 활성을 통해 분석하였다.
<h2>N-terminal 아미노산 서열분석</h2><p>정제한 효소단백질을 SDS-PAGE 전기영동한 후, transfer buffer [10×transfer buffer (Tris \( 30.3 \mathrm{~g} \), glycine \( 144.2 \mathrm{~g} \); \( 1 \mathrm{~L}, \mathrm{pH} 8.3\)) \( 100 \mathrm{ml} \), methanol \( 200 \mathrm{ml} \), 증류수 \( 700 \mathrm{ml} \) ]에 평형시킨 polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)에 \( 17 \mathrm{~V}\), 40분 동안 transfer 하였다. Transfer한 후, PVDF membrane은 commasie brilliant blue로 염색하고 methanol로 탈색하였다. PVDF membrane을 건조하여 염색한 효소단백질을 확인한 후, Edman 방법에 따라 Protein/Peptide sequencer(Applied Biosystems Inc., CA, USA)를 이용하여 아미노산 서열을 확인하였다.</p><h2>최적반응 \( \mathrm{pH} \) 및 \( \mathrm{pH} \) 안정성</h2><p>혈전분해 효소의 \( \mathrm{pH} \)에 대한 영향을 조사하기 위해 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium acetate buffer \( (\mathrm{pH} 4.0-6.0\)), \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} 6.0-8.0\)), \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris-HCl buffer ( \( \mathrm{pH} 8.0-10.0\))을 사용하였다. 조효소액과 정제한 효소액 각각 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 와 각 \( \mathrm{pH} \) 의 buffer \( (\mathrm{pH} 4.0-10.0) 190 \mu \mathrm{l} \) 씩 혼합한 후, 각 \( \mathrm{pH} \) 의 buffer로 제조한 \( 0.6 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) fibrin plate에 \( 10 \mu \mathrm{l}\)씩 적가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 동안 반응시킨 후, 효소 활성을 최적반응 \( \mathrm{pH} \) 를 조사하였다. \( \mathrm{pH} \) 안정성은 조효소액과 정제한 효소액 각각 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 와 각 \( \mathrm{pH} \) 의 buffer (\( \mathrm{pH} 4.0-10.0 \)) \( 190 \mu \mathrm{l}\)씩 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 시간 동안 반응시킨 후, \( 0.6 \% \) (w/v) fibrin plate에 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 를 적가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12시간 동안 반응시킨 후, 잔존효소 활성을 조사하였다.</p><h2>최적반응 온도 및 온도 안정성</h2><p>혈전분해 효소의 온도에 대한 영향은 20부터 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)까지 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) 간격으로 측정하였다. 최적반응 온도는 각 온도에서 조효소액과 정제한 효소액을 12시간 동안 반응시킨 후, \( 0.6 \% (\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) fibrin plate를 사용하여 효소 활성을 측정하였고, 온도 안정성은 조효소액과 정제한 효소액을 각 온도에서 1시간 동안 반응시킨 후, 잔존효소 활성을 조사하였다.</p><h2>금속이온과 저해제의 영향</h2><p>정제한 효소의 금속이온에 대한 영향을 알아보기 위해 \( 0.1 \mathrm{M} \) Tris-HCl buffer (\(\mathrm{pH} 8.0\))에 \( \mathrm{Ca}^{2+}, \mathrm{Co}^{2+}, \mathrm{Cu}^{2+}, \mathrm{Fe}^{2+} \), \( \mathrm{Mg}^{2+}, \mathrm{Mn}^{2+}, \mathrm{Zn}^{2+} \) 금속이온들을 최종농도가 \( 2 \mathrm{mM} \)과 \( 5 \mathrm{mM} \)이 되도록 첨가한 후, 잔존효소 활성을 조사하였다.</p><p>정제한 효소의 저해제에 대한 영향을 알아보기 위해 일반적인 단백질분해효소 inhibitor로 알려진 ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA), phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), antipain, pepstatin A을 최종농도가 \( 2 \mathrm{mM} \) 과 \( 5 \mathrm{mM} \) 이 되도록 첨가한 후, 잔존효소 활성을 조사하였다.</p>