Cyclodextrin glucano-transferases는 반응 효율이 낮아 CD의 생산단가를 높이는 원인이 되고 있으며 Saccharomyces cerevisiae에서 내열성이 높고 반응 특이성이 높은 CGTase를 얻으면 생산성과 단가 문제를 해결할 수 있다. 또한 S. cerevisiae는 GRAS 미생물이기 때문에 대량 생산이 가능하고, Bacillus macerans 유래의 발현 ◦ 분비 ◦ 생산된 재조합CGTase 유전자를 발현하는 효모 형질전환주를 배양하여 CGTase를 부분정제하여 생화학적 특성을 조사하고자 한다.
<h1>서 론</h1> <p>Cyclodextrin (CD) 생산에 이용되는 cyclodextrin glucano-transferases (CGTase; EC 2.4.1.19)들은 최적반응온도가 \( { 30 } ^ {\circ } \mathrm { C } \sim 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 범위라서 기질인 전분의 눟도를 고농도로 사용할 수 없어 반응 효율이 낮을 뼌만 아니라, 효소반용 후 반응산물로부터 \( \alpha-, \beta-, \gamma- \) CD를 따로 분리하는 공정이 까다로워 CD의 생산단가를 높이는 원인이 되고 있다. 따라서 내열성이 높으며, \( \alpha-, \beta- \gamma- \) CD 증 특정 CD를 선택적으로 다랑 생산할 수 있는 반응 특이성이 높온 CGTase를 얻을 경우, 생산성가 단가 문제를 회기적으로 해결할 수 있다.</p> <p>Saccharomyces cerevisiae에서 유용 단백질을 발현 ◦ 생산할 경우 그 효모균체 자체가 식용으로 사용될 수 있기 때문에 (GRAS 미생물) 효모에서 생산된 단백질 역시 식품산업에 바로 이용되어도 안정성에 큰 문제를 야기하지 않는다. 또한 고농도 세포배양 기술이 확립되어 있어 재조합 단벽질의 대량생산이 용이하고, 외래 유전자가 발현될 때 번역후 수식과정 (post-translational modification)을 통하여 당쇄부가 동에 의한 효소 구조의 변형에 따른 생화학적 특성이 달라진 새로운 효소 획독이 가능해 질 수 있다. 따라서, 본 연구에서는 Bacillus macerans 유래의 CGTase 유전자를 발현하는 효모 형질전환주(S. cerevisiae \(2805 \mathrm { /pVT } \)-CGTM)를 배양하여 발현 ◦ 분비 ◦ 생산된 재조합 CGTase를 부분정제하고, 생화학적 특성 등을 조사하여 그 결과를 보고하고자 한다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>균체 농도, Plasmid 안정성 및 CGTase 활성 측정</h2> <p>균체 농도, plasmid 안정성 및 CGTase 활성측정은 전보와 같은 방법으로 촉정하였다.</p> <h2>균체 배양 및 조효소액의 제조</h2> <p>Flask 배양은 \( 50 \mathrm { ~mL } \) YPD( \(1 \% \) Yeast extracr, \(2 \% \) Bacto-peptone, \(2 \% \) dextrose) 배지를 함유한 \( 500 \mathrm { ~mL } \) baffled-flask에서 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } , 170 \mathrm { rpm } \) 에서 수행하였으며, 재조합 CGTase의 조효소액율 제조하기 위한 발효조 회분배양은 YPD 배지로 working volume \( 1.0 \mathrm { ~L } \), 배양온도 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( \mathrm { pH } 5.5 \), 교반속도 \(300 \)- \(800 \mathrm { ~rpm } \), 통기속도 \(1 \)- \(2 \mathrm { vvm } \)의 조건하에서 수행하였다. 48시간 배양 후 배양 상등액을 \(70 \% \) 포화 ammonium sul-fate로 침전시킨 뒤 그 상등액을 증류수로 투석하였다. 계속해서 Resouce Q와 Superose \( 12 \mathrm { HR } \) column을 이용한 FPLC로 조효소액을 제조하였으며 최종 조효소액의 활성은 약 \( 0.3 \mathrm { U } / \mathrm { mL } \) 정도였다.</p>