배양 끝난 세포를 3회 PBS로 세척후, 세포질 단백질과 핵 내 단백질 추출은 원심분리하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 BCA protein assay kit를 사용하였고, 단백질 밴드는 Gene tool를 이용하여 가시화 및 정량하였다.
<h2>Western blotting</h2> <p>배양이 끝난 세포를 수집하여 3회 PBS (phosphate buffered saline)로 세척한 후, 세포질 단백질 추출의 경우, lysis buffer \( [50 \mathrm { mM } \) HEPES pH 7.4, \( 150 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } \), \( 5 \mathrm { mM } \) EDTA, 1 \% deoxycholate, \( 5 \mathrm { mM } \) phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), \( 1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) aprotinin, 1 \% Triton X-100, \( 0.1 \% \mathrm { NP } -40] \) 를 첨가하여 30분간 \( 4 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 lysis 시킨 후, 14,240 \( \times g \)에서 20분간 원심분리 하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 핵 내 단백질 추출의 경우, nucleus lysis buffer (10 mM HEPES, \( 100 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } , 1.5 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } 2,0.1 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { EDTA } , 0.1 \mathrm { mM } \) dithiotreitol)를 첨가하여 30분간 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 lysis 시킨 후 \( 15,520 \times g \)에서 20분간 원심분리 하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 BCA protein assay kit (Pierce, USA)를 사용하여 정량하였으며, 30 \( \mu 1 \)의 lysate를 10 \( \% \) SDS-PAGE로 분리하였다. 분리된 단백질은 polyvinylidene difluoride membrane (PVDF, Bio-rad)에 \( 70 \mathrm { ~mA } \) 에서 1시간 30분 동안 전사시킨 후, 5 \( \% \) skim milk가 포함된 TBSS (tris buffered saline; pH 7.5) 용액으로 상온 에서 2 시간 동안 blocking하였다. iNOS, COX-2 및 \( \mathrm { NF } - \kappa \mathrm { B } \) p65의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS, COX-2 및 NF-кB p65 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., USA)를 사용하였으며, MAPKs의 발현량을 알아보기 위해 anti-mouse p-JNK, JNK, p-ERK, ERK, p-p38 및 p38 (Cell Signalling Technology Inc., USA) 항체를 사용하여 1: 500으로 희석해서 사용하였다. 각각 상온에서 2시간 반응 시킨 후 TBSS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 horse radish peroxidase (HRP)가 결합된 anti-mouse IgG 및 anti-rabbit IgG (Santa Cruz Biotechnology, Inc.)를 1:2,000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, TBSS로 3 회 세정하여 ECL (Thermo Scientific, USA) 기질과 1-3분간 반응한 후 각각의 단백질 밴드는 Gene tool (Syngene software, Synoptics Ltd., UK)를 이용하여 가시화 및 정량하였다.</p>