23개, 11개, 7개, 16개의 BC 생산균이 전통식초, 사과, 감귤 및 포도 시료로부터 분리되었고, \( 0. 02 \mathrm{mM} \mathrm{AgNO}_{3} \)가 함유된 HS 배지에서 BC를 생산하는 G7 균주가 최종 실험균주로 선정되었다. 그리고 \( 0-0. 1 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{AgNO}_{3} \) 범위에서 BC를 생산하였으며, \(0.12\mathrm{mM}\) 이상의 \(\mathrm{AgNO}_{3}\) 농도에서는 BC가 생산되지 않았다. 따라서 G7 균주가 내성 BC 생산균임이 확인되었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>은 내성 BC 생산균주의 분리 및 동정</h2> <p>전통식초, 사과, 감귤 및 포도 시료로부터 각각 23 균주, 11 균주, 7 균주 및 16 균주에 해당하는 BC 생산균을 분리하였다. 그 중 \( 0.02 \mathrm{mM} \mathrm{AgNO}_{3} \) 가 함유된 HS 배지에서 BC를 생산하는 G7 균주를 최종 실험균주로 선정하였다. 이 균주는 부패된 포도껍질에서 분리되었다. 본 균주의 \( \mathrm{AgNO}_{3} \) 농도에 따른 BC 생산 유무를 조사한 결과, \( 0-0.1 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{AgNO}_{3} \) 범위에서 BC 를 생산하였으나 \( \mathrm{AgNO}_{3} \) 농도 증가에 따라 BC 생산량은 감소하였다. \( 0.12 \mathrm{mM} \) 이상의 \( \mathrm{AgNO}_{3} \) 농도에서는 BC 가 생산되지 않았다. 실험균주를 동정하기 위하여 \( 16 \mathrm{~S} \mathrm{rRNA} \) 유전자의 염기서열을 분석한 결과, 본 균주는 Acetobacter intermdius \( { }^{\mathrm{T}} \)와 \( 99 \% \) 의 유전자간 상동성을 보였다. 또한 \( 16 \mathrm{~S} \mathrm{rRNA} \) 유전자의 구조에 근거하여 유사균주들과의 계통학적 관련성을 조사하기 위하여 계통수를 작성한 결과, 실험균주는 Acetobacte intermdius\( { }^{\mathrm{T}} \) 와 동일한 계통학적 그룹에 속함을 알 수 있었다. 따라서 실험균주를 A. intermdius G7로 명명하였다.</p> <h2>BC 생산 조건</h2> <p>탄소원의 종류와 농도가 BC 생산에 미치는 영향을 조사한 결과, glucose를 탄소원으로 사용하였을 때 BC 생산이 가장 우수하였다. Glucose의 농도를 \( 0 \% \) 에서 \( 3 \% \) 까지 각각 달리하여 배양한 결과, \( 2 \% \) 까지 탄소원의 농도 증가에 따라 BC 생산도 증가하였으며, 그 이상의 농도에서는 생산량이 일정하였다. BC를 생산하는 초산균의 특성은 glucose로부터 BC 합성을 위한 전구체를 생성하는 uridine diphosphoglucose pyrophosphorylase 활성이 높다는 것이다. 따라서 glucose는 생육을 위한 에너지 생성에 이용 되지 않고, 주로 BC 생산에 소비될 수 있다. 질소원의 종류와 농도가 BC 생산에 미치는 영향을 조사한 결과, beef extract와 yeast extract를 질소원으로 사용하였을 때 BC 생산이 가장 좋았으며, 질소원의 첨가는 BC 생산에 필수적임을 알 수 있었다. BC 생산에 최적인 beef extract와 yeast extract의 농도를 조사한 결과, 각각 \( 1 \% \) 와 \( 2 \% \) 로 나타났다. 한편, Acetobacter xylinum을 이용한 BC 생산에 있어 다양한 질소원의 영향이 보고되었는데, casein hydrolyzate, peptone, yeast extract가 적합한 질소원임이 밝혀졌다.</p> <p>보조탄소원의 첨가는 대사 구동력(metabolic drivingforce) 측면에서 BC 합성에 상당히 중요한 역할을 수행한다. 따라서 각종 보조탄소원이 BC 생산에 미치는 영향을 조사한 결과, acetic acid, citric acid, lactic acid 및 ethanol을첨가했을 때 우수한 BC 생산을 보여주었으며, 그 중 aceticacid에서 가장 높은 생산량을 나타내었다. Aceticacid, lactic acid 및 ethanol은 초산균의 생육을 촉진하고, 동시에 BC 생산을 증가시킨다고 알려져 있다. 특히,ethanol은 glucose의 세포 내 대사 즉, ATP 합성을 억제함과동시에 glucose가 직접적으로 BC 생산에 이용될 수 있게 하는 것으로 알려져 있다.</p> <h2>BC 의 구조적 특성</h2>실험균주에 의하여 생산된 BC의 화학적 조성을 FT-IRspectrophotometer를 이용하여 조사한 결과는 Fig. 4A에서보는 바와 같다. 생산된 BC는 cellulose I의 \( \mathrm {C-H} \) 결합의 흡수 스펙트럼에 상응하는 \( 2,900 \mathrm{~cm}^{-1} \) 부근의 밴드를 나타내었다. \( 3,400 \mathrm{~cm}^{-1} \) 부근의 밴드는 cellulose의 \( \mathrm{O}-\mathrm{H} \) stretching frequency에 해당하며, \( 1,370 \mathrm{~cm}^{-1} \) 의 밴드는 cellulose의 \( \mathrm{CH} \) stretching vibration에 해당한다. 실험균주에 의하여 생산된 BC 의 \( \mathrm{X} \) 선 회절 패턴은 Fig. 4B 에서 보는 바와 같다. Cellulose I의 (101)면 및 \( (10 \overline{1}) \) 면에 해당하는 \( 2 \theta=14.6^{\circ} \) 및 \( 16.4^{\circ} \) 에서 회절 피크가 중첩되어 나타났으며, (002)면의 회절피크가 \( 2 \theta=22.6 \) 에서 나타났다. 그러나 cellulose II의 회절 peak \( \left(2 \theta=12.1^{\circ}\right. \) 및 \( \left.20.8^{\circ}\right) \) 는 나타나지 않았다. 이것은 실험균주에 의하여 생산된 BC 는 cellulose I이라는 것을 의미한다. 또한, 생산된 BC 의 결정화 지수는 \( 79.4 \% \) 로 나타났다.</p> <h2>실험균주에 의한 은 나노입자 합성</h2> <p>\( 0.1 \mathrm{mM} \mathrm{AgNO} \) 가 함유된 최적 배지에 실험균주를 접종하여 배양하면서 배양시간 경과에 따른 은 나노입자 합성유무를 조사하였다. Fig. 5A에서 보는 바와 같이 배양시간 경과에 따라 반응액의 색깔이 은 나노입자 특유의 적갈색으로 변화됨을 관찰할 수 있었는데, 이러한 변화는 은 나노입자의 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance; SPR) 진동의 들뜸 현상 때문인 것으로 보고되어 있으며, 이것은 은 이온이 은 나노입자로 환원되었다는 것을 의미한다. 실험균주에 의한 은 나노입자 합성은 UV-Vis 스펙트럼 분석을 통하여 재확인하였는데, Fig. 5B에서 보는 바와 같이 \( 425 \mathrm{~nm} \) 에서 은 나노입자의 고유한 흡수파장이 관찰되었다. Mie의 이론에 따르면, 구형 나노입자의 흡수 스펙트럼에서는 한 개의 SPR 밴드가 나타나지만 이방성 입자는 입자의 모양에 따라 둘 이상의 SPR 밴드를 발생시킬 수 있다. 본 연구에서는 반응 혼합물의 SPR 밴드가 한 개 나타났으므로 구형의 은나노 입자가 합성되었음을 알 수 있었다. 또한 본 연구결과는 은 이온의 환원은 A. intermdius G7에 의해 생성된 환원제에 의해 발생했다는 것을 시사한다. \( 0.1 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{AgNO}_{3} \) 가 함유된 HS 배지에서 생성된 BC 막은 표면과 기공에 은 나노입자가 잘 분산되어 형성됐음을 보여주는 반면, \( \mathrm{AgNO}_{3} \) 가 함유되지 않은 배지에서 생성된 순수한 BC 막은 매끄럽고, 깨끗한 표면을 가진 수많은 nanofibrils로 이루어져 있음을 알 수 있었다.</p> <p>현재 실험균주에 의한 은 나노입자 합성기전에 대한 실험을 수행 중에 있으며, 그 결과를 바탕으로 효율적인 상처 치료용 드레싱 개발을 위한 항균능 등 피부관련 생리활성을 확인하고자 한다.</p>