녹용에서 미토콘드리아 DNA의 D-loop 영역의 PCR은 공개된 염기서열인 AY970666.1 (Cervus elaphus canadensis)과 AF058371.1 (Cervus elaphus sibericus)의 D-loop 염기서열을 alignment를 통해 서열을 설계하고 각각 forward (DL-F)와 reverse primer (DL-R)로 이름 붙여 합성하였다. DL-F1과 DL-R1을 미토콘드리아 D-loop 영역에서 결실 발생 지점 확인을 위한 primer로서 사용하였다. 이를 통해 확보된 PCR 산물은 정제되어진 후 pGEM T vector sys-tem을 이용하여 12시간 동안 liga-tion을 수행하였으며, 이후 선별 집락을 분리, 정제하여 염기서열 해석에 적용 가능한 주형 DNA로 사용하였다.
<h2>미토콘드리아 DNA의 D-loop 영역 PCR</h2> <p>녹용으로부터 미토콘드리아 DNA의 D-loop 영역의 PCR은 NCBI의 GenBank로부터 염기서열이 공개된 AY970666.1 (Cervus elaphus canadensis)과 AF058371.1 (Cervus elaphus sibericus)의 D-loop 염기서열을 alignment를 통해서 5'-TAA TATACTGGTCTTGTAAACC와 5'-GGGTCGGAAGGCTTG GGACCAAACC의 서열을 설계하여 각각 forward (DL-F)와 reverse primer (DL-R) 명명한 후 합성하였다(Bioneer, Korea). PCR을 위한 반응시약의 조성은 다음과 같이 준비하였다. 즉 최종 PCR 반응액을 20\(\mathrm{ul}\)로 기준으로 할 때 PCR 전용 tube에 template DNA를 약 \( 100 \mathrm{ng} \), primer 각 \( 0.5 \mathrm{uM}, {dNTP} \) 각 200uM, 10x PCR buffer 그리고 ampliTaq DNA polymerase (Applied Biosystens, USA) 2 unit를 첨가하였다. Thermal cy-cler Dice (Takara, Japan)를 이용한 PCR 반응 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 최초 변성 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 45초, \( 54^{\circ} \mathrm{C} \)에서 45초 그리고\( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 70초를 1회로 하여 총 35회 반복한 다음 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 last extension을 수행하였다. 또한, 미토콘드리아 D-loop 영역 중에서 결실이 일어나는 부분을 확인하기위한 primer로서 DL-F1 (5'- AACCTTATGCGCTCGTAGTA)과 DL-R1 (5'-AGTGAAAAGTACATGCTTATA)을 설계하여 사용하였다(Bioneer, Korea). 중국산 녹용의 D-loop 영역 안의 결실 부위를 확인하기 위한 PCR 조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 최초 변성 한 다음, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 초, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초 그리고 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초를 1회로 하여 총 35회 반복한 후, 최종적으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 last extension을 수행하였다. 이때 사용한 PCR 반응시약은 Top Taq DNA polymerase premix kit (Bioneer, Korea)를 사용하였다.</p> <h2>D-loop 영역의 클로닝</h2> <p>D-loop 영역의 결실부위를 확인하기 위해서 DL-F1과 DL-R1 primer를 통해서 확보된 PCR 산물은 PCR purificationkit (CoreBio System, Korea)로 정제한 후, pGEM T vector sys-tem (Promega, USA)를 사용하여 \( 16^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 동안 liga-tion을 수행하였다. \( {Hit}^{{TM}}-{DH} 5 {a} \) competent cell (RBC, Taiwan)을 제조사가 권장하는 방법에 따라서 형질전환 한 다음 LBagar (X-gal, \( 40 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \); IPTG, \( 4 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \); ampicillin, \( 100 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) )에 \( 100 \mathrm{ul} \) 도말하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 항온기에서 16시간 동안 배양하여 흰색의 집락을 선별하였다. 이후 이 집락을 LB broth (ampicillin, \( 100 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \) )에 접종시켜 16시간 동안 진탕 배양 한 후 Plasmid DNA miniprep kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 분리, 정제하여 염기서열 해석을 위한 주형 DNA로 사용하였다.</p>