clitocybin A의 발효생산을 위해 미생물 배양은 발효기를 이용하고 포도당 농도를 조절하였다. 실험을 위해 균체량을 측정하고 침전물을 이용한 부피차를 구하는 과정을 반복한다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약 및 발효기</h2> <p>본 연구에 사용한 미생물배지 및 시약은 모두 (주)Difco (USA) 제품을 사용하였으나 \( 300 \mathrm{~L} \) 대용량 발효조 배양시 yeast peptone은 (주)Biospringer (USA)의 yeast peptone 0202 를 사용하였다. 발효 중의 기포 발생억제를 위한 소포제는 (주)Sigma (USA)의 antifoam 204를 사용하였다. 발효기는 (주Kobiotech (Korea)의 KFC LA-150 \( 5 \mathrm{~L} \) 발효기 및 \( \mathrm{KFC} 300 \mathrm{LB} 300 \mathrm{~L} \) 발효기를 사용하였으며 포도당 농도는 (주)YSI (Korea) \( 2700 \mathrm{SELECT} \)를 사용하여 조절하였다. 균체량은 packed mycelium volume (PMV, \( \% \))을 측정하였다. 즉 배양액 \( 30 \mathrm{ml} \) 경시적으로 conical tube에 취한 후 15,000 rpm에서 20분간 원심분리한 후 상등액의 부피를 특정하여 침전물의 부피를 구한 후 침전물의 부피를 백분율하여 부피 차를 측정하여 구하였다. 오차를 줄이기 위하여 각각 3반복으로 측정하였다.</p> <h2>미생물 균주 및 배양조건</h2> <p>주름개선 소재인 clitocybin A의 발효생산을 위하여 사용된 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 보관하고 있는 Clitocybe aurantiaca KCTC 11143BP 균주를 사용하였다. 고체배지는 yeast-maltose (YM) 고체배지(yeast extract \( 3 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), malt extract \( 3 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), bacto peptone \( 5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), glucose \( 10 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), agar \( 15 \mathrm{~g} / \) ) 와 potato-dextrose (PD) 고체배지(potato starch \( 4 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), glucose \( 20 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), agar \( 15 \mathrm{~g} / \mathrm{l}) \) 를 사용하였으며 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 7일간 전 배양하여 사용하였다. \( 5 \mathrm{~L} \) 회분식 배양을 위한 전 배양은 \( 100 \mathrm{ml} \)의 YM 액체배지 및 PD 액체배지를 함유한 \( 1 \mathrm{~L} \) Erlenmeyer flasks를 사용하였고 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \), \( 150 \mathrm{rpm} \) 에서 5일간 배양하였으며, \( 300 \mathrm{~L} \) 유가식 배양은 \( \mathrm{YM} \) 액체배지에서 5일동안 전 배양한 배양액 \( 100 \mathrm{~mL} \) 를 \( 1 \mathrm{~L} \)의 YM 액체배지를 함유한 \( 5 \mathrm{~L} \) Erlenmeyer flasks에 옮겨 \( 28^{\circ} \mathrm{C}, 150 \mathrm{rpm} \) 에서 5일 배양 후 본 배양에 사용하였다. 특히 \( 300 \mathrm{~L} \) 유가식 본 배양시의 배지는 \( \mathrm{YM} \) 액체배지를 변형하여(yeast extract \( 30 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), glucose \( 80 \mathrm{~g} / \mathrm{l}, \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} 1.5 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), \( \mathrm{MgSO}_{4} 1 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), antifoam \( 2 \mathrm{ml} / \mathrm{l} \) ) 사용하였다. \( 5 \mathrm{~L} \) 회분식 배양과 \( 300 \mathrm{~L} \) 유가식 배양의 working volume은 각각 \( 3 \mathrm{~L} \)와 \( 120 \mathrm{~L} \) 로 하였고 \( \mathrm{pH} \)는 조절하지 않았다. 교반은 \( 5 \mathrm{~L} \) 회분식 배양은 \( 0.5 \) air volume/liquid volume/minute (vvm), \( 300 \mathrm{~L} \) 유가식 배양은 \( 0.4-0.8 \mathrm{vvm} \)으로 유지하며 배양하였다.</p>