Klebsiella sp.KCL-1에 pET-Lip을 형질전환하기 위해 electroporation 방법을 사용하였고, kanamycin을 포함한 LB 한천 배지에서 자라는 흰색 콜로니로 선별하였다. Takara 사 plasmid 추출 kit를 사용하여 플라스미드를 확인하고, TB 고체 배지를 사용하여 lipase 활성 유무를 확인하였다. 또한 LB 액체 배지와 C-배지를 사용하여 표면장력과 균의 생육도를 측정하였고, 일반적으로 사용되는 소수성 탄화수소의 oil 성분에 대해 biosurfactant 용액시료의 유화활성 측정온 Cirigliano와 Car-man의 방법을 약간 변형하여 실시하였다.
<h2>형질전환</h2> <p>pET-Lip을 Klebsiella sp. KCL-1에 형질전할 시킬 때 ele-ctroporation 방법을 사용하였다(Bio-Rad Lab.). 형질전환된 균주는 \( 50 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \) 의 kanamycin 을 포함한 LB 한천 배지에서 자라는 흰색 콜로니로 선별하였다. 형질전환된 plasmid DNA는 Takara 사(Takara Korea Biomedical Inc.)의 plasmid 추출 kit를 사용하여 분리하고 제한효소 처리에 의해 얻어진 DNA 단편의 pattern을 통해 플라스미드를 확인하였다. 선별 된 균주의 lipase 활성 유무룰 확인하기 위하여 Huang et. al. 의 방법을 악간 변형하여 TB 고체 배지 \( [ \mathrm { LB } + 1.3 \%( \mathrm { w } / \mathrm { w } ) \) \( \mathrm { agar } + 2 \% \) (v/v) Tributyrin]롤 제조하여 사용하였다. 제조된 TB 고체 배지에 형질전환된 균주와 parental strain인 KCL-1을 접공하고 24 시간 배양하여 투명대 형성을 비교 분석하였다.</p> <h2>표면 장력과 균의 생육도</h2> <p>표면장력과 세포의 성장을 측정하기 위하어 \( \mathrm { LB } \) 액체 배지에 전 배앙한 \( \mathrm { KCL } -1 \) 과 형질전환된 \( \mathrm { KCL } -1 / \mathrm { pET } - \mathrm { Lip } \) 을 탄소원으로 \( 2 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) glucose, \( 4 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) soybean oil, \( 4 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) kerosene 그러고 \( 0.2 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) glucose와 \( 2 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) soybean oil을 각각 점가한 C-배지에 \( 1 \% \) 씩 접총하여 1 일 단위로 4 일간 측정하였다.</p> <p>표면장력의 측정은 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 배양 상등액에 대해 DeNouy Tensiometer (Itoh Seisakusho, Japan)의 ring method 를 이용하여 3회 반복하여 평균값을 표시하였다. 균의 생육도는 배양액올 \( 1 \mathrm { ml } \) 취하여 UV-VIS spectrophotometer (U-1100, Hitachi, Japan)를 사용하여 \(610 \mathrm { nm } \) 에서 흡광도를 측정하였으며 3회 반복 추정한 결과의 평균값을 사용하였다.</p> <h2>유화활성</h2> <p>일반적으로 사용되는 소수성 탄화수소의 oil 성분에 대해 biosurfactant 용액시료의 유화활성 측정온 Cirigliano와 Car- \( \operatorname { man } \) 의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. KCL-1과 \( \mathrm { KCL-1 } / \mathrm { pET } \)-Lip을 \( 4 \% \) soybean oil이 함유된 C-배지에서 96 시간 배양한 배양용액을 \( 0.2 \mu \mathrm { m } \) 여과막(Millipore)을 통과시켜 제균된 배양액을 biosurfactant 용핵으로 하였다. 여과액 \( 2 \mathrm { ml } \) 를 마개가 있는 시험관에 넣고, \( \mathrm { pH } 3.0 \) 의 \( 0.1 \mathrm { M } \) sodium acetate 완충액 \( 2 \mathrm { ml } \) 와 혼합한 용액에 \( 1 \mathrm { ml } \) 의 기질을 넣고 2 분간 최고속도로 vortex mixing 하고, 10 분간 정치한 후 \(540 \mathrm { nm } \) 에서의 현탁도를 측정하여 유화활성으로 나타내었다.</p> <h2>형질전환 균주의 Lipase 발현확인</h2> <p>KCL-1 KCL-1/pET-Lip은 \( 4 \% \) soybean oilo 함유된 C-배지에 \( 48,72,96 \) 시간 배양한 후 세포를 파쇄하여 Barford 방법[3]에 따라 세포 추출물의 단백질총량을 측정하였으며, Laemmli 방법을 이용하여 단백질을 전기영동 하였다. 단백질의 분자량은 표즌 단백질 BSA (66 kDa; albumin, 45 \( \mathrm { kDa } \); ovalbumin, \( 36 \mathrm { kDa } \); glyceraldehyde-3-phosphate dehy-drogenase, \( 29 \mathrm { kDa } \); carbonic anhydrase, \( 24 \mathrm { kDa } \); trypsi-nogen, \( 20 \mathrm { kDa } \); trypsin inkibitor, \( 14 \mathrm { kDa } \); a-lactalbumin, Sigma Co.)를 사용하였다.</p>