본문에서는 transposon을 이용한 random mutagenesis방법으로 부터 Agarase 결손 돌연변이주를 구축했다. agar를 넣지 않은 M9에서는 균이 생육하지 않았고 agar가 들어있는 배지에서는 균이 생육함을 관찰했다. 이로 인해 CK214 균주는 agar를 탄소원으로 이용하는 균주임을 확인했다. Agar 표면 환경에서 분리한 CK214균주는 집락을 형성하고 주위로 투명환이 만들어졌고 swarming 운동 능력을 보였다.
<h2>Random mutagenesis</h2> <p>Agarase 결손 돌연변이주를 구축하기 위해서 transposon을 이용한 random mutagenesis 방법을 수행하였다. CK214균주와 transposon 유전자(TnphoA)가 클로닝 되어 있는 플라스미드 pRT733을 가지는 Escherichia coli \( \times 7213 / \mathrm { pRT733 } \) 균주를 각각 \( 2 \mathrm { ml } \) 의 LB 액체배지에 배양한 후 원심분리를 이용하여 균체를 분리하였다. 이 균체를 \( 20 \mu 1 \) 의 LB 액체배지에 재현탁 한 후 각 현탁액을 잘 섞어서 diaminopipelic acid (DAP)이 첨가된 LB 평판배지에 떨어뜨린 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양하였다.배양 중 pRT733 플라 \( \mathrm { tm } \) 미드는 CK214 균주 내로 접합을 통해이동하게 된다. pRT733이 들어간 CK214 균주 내에서는 transposon의 염색체 내 삽입이 이루어지며, transposon 삽입이 일어난 균주의 선별은 transposon 유전자 내에 포함된 kanamy-cin 내성 유전자를 이용하였다. DAP이 첨가된 LB 평판배지에서 배양한 균체 1 백금이를 \( 100 \mu 1 \) 의 LB 액체배지에 재현탁한 후 \( 2.0 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) 의 agar가 첨가된 kanamycin \( (50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \)항생제 배지에 도말하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 배양하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Agar 표면에서 agar 분해능을 가지는 swarming 박테리아의 분리</h2> <p>Agar 표면 환경에서 분리한 \( \mathrm { CK } 214 \) 균주는 \( \mathrm { LB } \) agar 평판배지에서 이동 중에 스스로 집락을 형성하며 소용돌이 형태의 특이한 swarming 운동 능력을 보였으며 집락 주위로 움푹한 투명환이 형성되는 것이 관찰되었다(Fig. \( 1 \mathrm { ~A } ) \). 집락 주위의 투명환은 일반적으로 일부 protease를 생산하는 균주가 우유가 첨가된 고체평판배지에서 집락 주위로 투명환을 형성하는 것처럼 여러 가지 분해 효소에 의해 나타난다. LB agar 평 판배지에서 \( \mathrm { CK } 214 \) 집락 주위의 투명환이 움푹 들어간 것은 고형화제로 사용된 agar가 분해되어 생기는 현상이라 추정되었다. CK214 균주는 agar를 분해하여 탄소원으로 이용할 것이라는 가설을 설정하고서 이를 실험적으로 증명하기 위하여 M9 최소배지에 단일 탄소원으로 \( 0.2 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) agar만을 넣고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 시간 동안 진탕 배양한 후 파장 \( 600 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하여 CK214 균주의 성장을 확인하였다. 예측한 바와 같이 \( \mathrm { agar } \) 를 넣지 않은 \( \mathrm { M } 9 \) 최소배지에서는 균이 생육하지 않은 반면에 agar가 들어있는 배지에서는 균이 생육하였음을 관찰하였다(Data not shown). 이를 통해 CK214 균주는 agar를분해하여 탄소원으로 이용하는 균주 중의 하나임을 확인할 수 있었다.</p>