S. acaule의 계통발생학적 유연 관계는 S. acaule 엽록체 전장 유전체 염기서열와 NCBI에서 얻은 엽록체 코딩 서열을 기반으로 분석했으며, S. acaule 특이적 분자마커 개발을 위해 S. acaule 특이적 InDel 및 SNP를 대상으로을 이용해서 PCR 기반의 S. acaule 특이적 분자마커 개발을 진행했다.
<h2>엽록체 전장유전체의 비교 및 PCR 기반의 분자마커 개발</h2> <p>S. acaule의 계통발생학적 유연 관계는 S. acaule 엽록체 전장 유전체 염기서열과 NCBI(the National Center for Biotechnology Information)로부터 얻은 재배종 감자 S. tuberosum (KM489056 및 NC008096)을 포함하는 가지과 총 12종 S. berthaultii (KY419708), S. demissum (MK036508), S. hougasii (MF471372), S. stoloniferum (MF471373), S. brevicaule(MK036507), S. commersonii (KM489054), S. chacoense (MF471371), S. bulbocastanum (DQ347958), S. lycopersicum (NC007898), S. nigrum (KM489055), Capsicum annuum (JX270811) 엽록체 전장 유전체 염기서열에서 확인된 엽록체 코딩 서열을 기반으로 1,000번의 Bootstrap 옵션을 적용한 MEGA6.0 프로그램으로 분석되었다(Tamura et al. 2013). 여기에는 Kimura 2-parameter 모델을 적용한 Maximum likelihood 방법이 이용되었다.</p> <p>S. acaule 특이적 분자마커 개발을 위해 S. acaule 엽록체 전장 유전체 염기서열은 NCBI로부터 얻은 S. brevicaule (MK036507), S. demissum (MK036508), S. tuberosum (KM489056), S. commersonii (KM489054), S. bulbocastanum (DQ347958), S. chacoense (MF471371), S. stolonioferum (MF471373)의 엽록체 전장 유전체 염기서열과 EMBL(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)의 ClustalW2에 의해 다중 정렬하여 염기서열을 비교 분석하여 S. acaule 특이적 영역대를 구명하였다. S. acaule 를 포함한 총 8종의 엽록체 전장 유전체 염기서열을 대상으로 한 다중 정렬의 결과로 구명된 S. acaule 특이적 InDel 및 SNP를 대상으로 S. acaule 특이성 검증이 수행 되었다. InDel의 경우에는 InDel이 있는 영역에서 primer를 디자인하여 allele 특이적 분자마커를 개발하고자 하였으며, SNP를 대상으로는 우선 dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)을 이용하여 S. acaule 특이적으로 작용하거나 S. acaule를 제외한 다른 Solanum 종들에 특이적으로 작용하는 제한효소를 확인한 후, SNP 영역을 포함하는 primer를 디자인하여, S. acaule와 S. tuberosum 을 포함하여 총 21개의 유전자 계통, S. acaule (SA11 및 SA10), S. tuberosum (감자품종 '서홍(Seohong)', '하령(Haryeong)', 및 감자품종 육성계통 PT56), S. demissum (SD), S. brevicaule (SB2), S. candolleanum (SC4), S. cardiophyllum (SC1), S. commersonii (SC2), S. hjertingii (SH1), S. hougasii (SH2), S. iopetalum (SI), S. kurtzianum (SK), S. jamesii (SJ), S. microdontum (SM2), S. mochiquense (SM1), S. pinnatisectum (SP), S. stoloniferum \( (\mathrm{SS}), S \). vernei \( (\mathrm{SV} 2) \) and S. verrucosum (SV1)을 대상으로 총 \( 25 \mathrm{ul} \) 볼륨(약 \( 20 \mathrm{ng} \) genomic DNA, \( 0.5 \mathrm{mM} \) dNTPs, \( 10 \mathrm{pMol} \) each primer, \( 1 \mathrm{U} \) Taq polymerase (Genetbio, Daejeon, South Korea))으로 Thermocycler (Biometra, Göttingen, Germany)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR의 결과는 핵산 염색용액인 RedSafe (Intron Biotechnology, Seongnam, South Korea) 를 이용하여 \( 1 \% \) agarose gel에서 확인하였으며, PCR 결과물을 대상으로 제한효소를 처리한 후, 동일한 방법으로 agarose gel에서 확인하여 PCR 기반의 S. acaule 특이적 분자마커 개발을 진행하였다.</p>