MSAP를 이용한 유전자 동정은 DNA methylation의 과정을 통해 식물의 발달을 조절하고, 유지하는 상보적인 시스템을 갖게 하는데 사용된다. 발현 조절 vector를 이용한 유전자 기능 구명은 Cauliflower Mosaic Virus (CaMV)의 35S promoter를 이용하여 식물에서의 형질전환을 가능하게 하고, 과발현 벡터를 이용하여 목표 유전자의 과발현을 유도하여 내부 대사과정을 조절할 수 있게 한다.
<h2>MSAP를 이용한 유전자 동정</h2><p>식물체의 유전자 발현을 조절하기 위해서는 알맞은 methylation pattern의 유지가 필요하며, 이를 위해 초기에 methylation 되어있지 않은 DNA에 methylation을 일으키는 과정과 함께 고정된 pattern을 유지하는 형태의 상보적인 시스템이 필요하다. 식물에서 DNA methylation은 genome DNA의 CpG 또는 CpNpG 염기의 시토신 (cytosine)에 메틸기 (methyl group)가 결합하는 것으로 이 과정에 의해서 식물의 발달을 조절하고, 전체 게놈의 순수한 유전정보를 유지하는 등의 유전자 조절이 가능하게 된다. Methy-ltransferase 유전자 발현을 억제함으로써 유발될 수 있는 methylation pattern의 변화를 관찰하고 변화에 의해 조절되는 것으로 추정되는 유전자를 동정하기 위해 MSAP (Methylation Sensitive Amplification Polymorphism) 방법이 이용된다. MSAP 기법은 기존 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 방법에 methylation sensitive enzyme을 도입함으로써 목표 식물체의 genomic DNA 상에서 나타나는 methylation pattern를 관찰하고 hypermethylated pa-ttern의 대조군과 비교하여 변화된 band의 염기서열을 분석함으로써 methylation 정도에 따라 변화된 유전자를 찾아 내는 방법이다 .</p><h2>발현 조절 vector를 이용한 유전자 기능 구명</h2><p>유용 유전자의 분리가 가능해 짐으로써 분리된 유전자의 기능을 연구하기 위해 식물형질전환용 발현벡터가 발명되었다. 이 벡터는 유전자를 삽입하여 식물체내에 전달되어 DNA가 mRNA로 발현하게 된다. 강력한 프로모터인 Cauliflower Mosaic Virus (CaMV)의 35S promoter 발견으로 식물에서의 형질전환을 가능하게 하였다. 과발현(over-expression)벡터를 이용한 식물형질 전환은 식물체 내부의 유전자로부터 분리된 유전자를 다시 삽입함으로서 목표 유전자의 과발현을 유도하게 되고, 최종적으로 그 유전자와 관련된 내부의 대사과정을 조절할 수 있게 된다.</p><p>유전자의 발현을 억제하는 방법에는 크게 2종류로 나뉜다. 즉 전사과정에서 DNA가 mRNA로 전사되지 않는 silencing과정을 TGS (Transcriptional Gene Silencing)와 전사 후 mRNA의 번역을 억제하는 PTGS (Post Transcriptional Gene Silencing)로 구분되어진다. 1998년 Caenorhabditis ele-gans 에서 RNA interference 현상이 Andrew Fire와 Craig C. Mello에 의해 처음 발견되어 유전정보의 흐름을 제어하는데 근본적인 메커니즘을 규명했다. RNAi 란 dsRNA가 dicer라는 효소에 의해 siRNA로 분해되면서 RISC (RNA-induced Silencing Complex)라는 단백질 복합체에 결합하게 되고 이 복합체가 상보적인 목적 mRNA에 결합하면mRNA가 분해되어 자극하여 단백질의 발현을 억제하는 PTGS 현상 중 하나이다. RNAi 현상을 이용한 pHANNIBAL과 GATE-WAY 벡터 시스템 이 개발 되어져 유전자의 일부서열을 삽입하여 식물체내에 전달되면 유전자의 mRNA가 분해되어 그 기능을 억제하게 된다.</p>