세포 배양 및 면역 분석을 하기 위해 HEK293 세포에 5% 이산화탄소 상태로 37도씨에서 배양하였다. HA, Myc, polyclonal Parkin 항체와 반응시킨 다음에 두번째 항체인 antigen-antibody 혼합물과 반응시킨 후 ECL로 밴드를 결과로 확인하였다. GST-Parkin을 발현하는 plasmid 제조와 대장균에서의 발현도 살펴보며, pGEX 시스템을 이용하여 37도씨 배양온도에서 IPTG로 단백질의 발현을 유도하면 대장균에서 안정성이 높은 단백질들은 1리터 대장균 배양액 당 10mg 이상의 GST-fusion 단백질로 회수할 수 있다.
<h2>세포 배양 및 immunoblot assay</h2> <p>HEK293 세포는 10 \( \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) fetal bovine serum, 50 \( \mathrm { U } / \mathrm { ml } \) penicillin과 50 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) streptomycin이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle minimum essential medium (DMEM) (Invitrogen)에 5 \( \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) 상태로 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다. 포유류 세포에서 발현되는 plasmid는 LipofectAMINE re-agent (Invitrogen)를 사용하여 HEK293 세포에 transfection 하였다. 세포에 DNA를 transfection하여 24 시간 경과한 후 세포를 harvest하여 배지를 제거하고 RIPA buffer (20 \( \mathrm { mM } \) Tris, \( \mathrm { pH } \) 7.5, 150 \( \mathrm { mM } \) \( \mathrm { NaCl } \), 0.1 \( \% \) SDS, 1 \( \% \) Triton X-100, 1 \( \% \) sodium deoxycholate)로 30 분간 얼음에 놓아서 세포를 용해시킨 후 14,400 \( \times g \)에서 30 분간 원심분리 하여 세포 찌꺼기를 제거하였다. 상층액은 새 튜브에 옮긴 후 Protein assay solution (BioRad)을 이용해서 단백질 농도를 측정하고 15 \( \mu \) \( \mathrm { g } \)의 단백질을 15 \( \% \) SDS-PAGE로 분리한 후 nitrocellulose membrane으로 옮겨 immunoblotting을 실시하였다. HA (Santa Cruz), Myc (Santa Cruz), polyclonal Parkin (Cell Signaling Technology) antibody와 반응시킨 다음 secondary antibody로 antigen-antibody complex와 반응시킨 후 ECL (Amersham Pharmacia Biotech.)로 밴드를 확인하였다.</p> <h1>결 과</h1> <h2>GST-Parkin을 발현하는 plasmid 제조와 대장균에서의 발현</h2> <p>단백질들의 기능을 in vitro에서 생화학적인 방법으로 연구하기 위해서는 특정 단백질을 대장균에서 다량으로 발현, 정제할 수 있는 시스템이 필요하다. 대장균에서 Parkin을 다량으로 발현, 정제하기 위해 human parkin cDNA를 pGEX4T-1 expression vector에 cloning하여 Escherichia coli BL21 strain에서 GST-Parkin fusion 단백질을 발현하였다(Fig. 1). ExPASy (Expert Protein Analysis System, http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html)에서 이론적으로 계산한 Parkin의 분자량은 약 51,651 \( \mathrm { Da } \)이며, glutathione S-transferase (GST)의 분자량은 27,898 \( \mathrm { Da } \)이므로 pGEX-Parkin으로부터 약 79,500 Da 크기의 GST-Parkin 단백질의 발현을 예상할 수 있다. 배양온도 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서0.5 \( \mathrm { mM } \) IPTG (일반적인 배양조건)로 단백질의 발현을 유도한 후, Gultathione Sepharose 4B bead를 이용하여 친수성의 대장균 lysate로부터 GST-Parkin 단백질을 정제하여 발현양상을 비교 분석하였다(Fig. 1). pGEX 시스템을 이용하여 37 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) 배양온도에서 0.5 \( \mathrm { mM } \) IPTG로 단백질의 발현을 유도하면, 대장균에서 안정성어 높은 단백질들은 1 리터 대장균 배양액 당 10 \( \mathrm { mg } \) 이상의 GST-fusion 단백질로 순수하게 회수할 수 있다. 그러나 GST-Parkin의 경우 79 \( \mathrm { kDa } \)외에도 30 \( \mathrm { kDa } \)과 45 \( \mathrm { kDa } \) 사이에서 여러 밴드들이 나타났으며, 79 \( \mathrm { kDa } \)의 GST-Parkin 단백질보다는 38 \( \mathrm { kDa } \) 크기의 단백질 fragment가 더 많은 양 관찰되었다(Fig. 1B, lane 5).</p>