생마늘, 흑마늘 추출물처리에 따른 3T3-L1 지방전구세포 생존율을 측정한 뒤 MTT assay에 의한 3T3-L1 지방전구세포 성장억제 조사를 하였으며, 도립 현미경을 통해 \( 3 T 3-\mathrm{L} 1 \) 지방전구세포의 성장과 형태의 관찰 후 세포 내 droplet 생성을 확인하기 위해 Oil Red O 염색 및 정량하였다.
<h2>Hemocytometer를 이용한 3T3-L1 지방전구세포 생존율의 측정</h2> <p>생마늘 및 흑마늘 추출물처리에 따른 3T3-L1 지방전구세포의 생존율을 측정하기 위하여 세포 배양용 6 well plate에 3T3-L1 지방전구세포를 well 당 \( 2 \mathrm{ml} \)씩 분주하여 confluent 상태까지 배양한 후 마늘 추출물을 적정 농도로 처리하였다. 72시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 \( 0.05 \% \) trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 부유시켜서 phosphate-buffered saline (PBS)를 각 well 당 적정량을 첨가하여 세포를 모았다. 이렇게 모인 세포를 \( 2,000 \mathrm{rpm} \)으로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 세포만 남긴 다음 다시 \( 1 \mathrm{ml} \)의 PBS 와 동량의 \( 0.5 \% \) trypan blue (Gibco BRL)를 첨가하여 2분간 처리한 후 위상차 현미경을 이용하여 살아있는 세포를 계수하였다. 이에 따른 결과를 Microsoft EXCEL program을 사용하여 분석하였다.</p> <h2>MTT assay에 의한 3T3-L1 지방전구세포 성장억제 조사</h2> <p>세포 배양용 6 well plate에 3T3-L1 지방전구세포를 분주하여 confluent 상태까지 배양한 후 마늘 추출물을 배지에 희석하여 각 well 당 적정농도로 처리하였다. 72시간 후 배지를 제거하고 성장배지와 희석된 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도의 tetrazolium bromide salt (MTT, Amresco, Solon, OH, USA \)를 \( 2 \mathrm{ml} \)씩 분주하고 3시간 동안 \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양시킨 다음 MTT 시약을 깨끗하게 제거하고 DMSO를 \( 1 \mathrm{ml} \)씩 분주하여 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 후 96 well plate에 \( 200 \mu \mathrm{l} \) 옮겨서 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 세 번을 하였으며, 그에 대한 평균값과 표준 오차를 Microsoft EXCEL program을 사용하여 분석하였다.</p> <h2>도립 현미경을 이용한 \( 3 T 3-\mathrm{L} 1 \) 지방전구세포의 성장과 형태의 관찰</h2> <p>마늘 추출물 처리에 의한 3T3-L1 지방전구세포의 분화 및 droplet 생성 정도를 확인하기 위하여 세포 배양용 6 well plate에 3T3-L1 지방전구세포를 분주하여 confluent 상태까지 배양한 후 마늘 추출물을 적정농도로 희석 처리하면서 분화를 유도하였다. 분화가 끝난 후 마늘 추출물 처리농도에 따른 분화 및 droplet 생성 정도를 도립 현미경을 이용하여 200 배의 배율로 관찰하였다.</p> <h2>Oil Red O 염색 및 정량</h2> <p>세포 내 droplet 생성을 확인하기 위하여 Oil Red O 염색을 실시하였다. 준비된 3T3-L1 지방전구세포를 PBS로 세척한 후 \( 3.7 \% \) formalin으로 1시간 동안 고정하고 \( 60 \% \) isopropanol 을 이용하여 세척한 다음 Oil Red O solution을 처리하여 실온에서 20 분 간 염색하였다. 염색 후 Oil Red O solution을 제거하고 증류수로 3회 세척한 다음 염색된 세포를 위상차 현미경을 이용하여 관찰하였다. 또한 정량적 분석을 위하여 \( 100 \% \) isopropanol을 이용하여 지방을 추출한 후 96 well plate에 200 씨씩 옮겨서 ELISA reader로 \( 500\mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>