Nicotiana tabacum cv Samsun을 식물재료로써 MS 배지에 발아시켜 4-6주간 기내 배양한 잎을 엽록체 형질전환 재료로 사용하였다. Laccase 유전자는 느타리버섯 균사체를 RT-PCR을 통해 확보하였으며, \( 0.15 \mathrm { ~M } \mathrm { ~CuSO } 4 \)가 첨가된 배지로 다시 암배양하였더니 laccase 활성이 증가하는 것을 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물재료</h2> <p>연구에 이용된 식물재료는 Nicotiana tabacum cv. Samsun으로 MS (Murashige and Skoog 1962) 배지에서 발아시켜 4-6주간 기내 배양한 직경 \( 2-3 \mathrm { ~cm } \)인 잎을 엽록체 형질전환 재료로 사용하였다.</p> <h2>유전자 cloning과 형질전환 vector의 제작</h2> <p>Laccase 유전자는 한국생명공학연구원 유전자원센터로부터 분양받은 느타리버섯 (Pleurotus ostreatus cv. Florida) 균사체 (KCTC 26133)에서 RT-PCR을 통해 확보하였다. 느타리버섯 균사체를 potato dextrose agar (PDA) 배지에서 \( 26 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 2주간 암 배양 한 후, \( 0.15 \mathrm { ~M } \mathrm { ~CuSO } 4 \)가 첨가된 동일한 배지에서 4-5일 배양하여 total RNA를 추출하였다. PCR primer는 오페론 방식의 발현을 위하여 Met (ATG) codon과 그 앞쪽에 E. coli의 SD (Shine-Dalgarno) sequence (RBS)가 부가된 laccase-SD5' (GAAGGAGATATACCCATGAGCATTGGGCCCCGCGAAACG)와 laccase-3' (TCATGCTTTCAATGGCGCAG) primer를 제작하여 사용하였다. PCR product는 pBluescript KS 벡터의 EcoRV site에 클로닝하였다. pBluescript KS 벡터에 클로닝된 PCR product를 EcoRV 제한효소로 digestion한 후 Xbal으로 digestion하고 blunting 처리를 한 \( \mathrm { CtV } _ { 2 } \) 벡터에 도입하여 엽록체 형질전환 벡터 CTVL을 완성하였다 (Figure 1).</p> <h2>엽록체 형질전환</h2> <p>Particle bombardment를 이용하여 담배 엽록체 형질전환을 수행하였다. 형질전환에 사용 된 particle bombardment는 BiO-Rad사의 PDS- 1000 기종이며, \( 0.6 ~ \mu \mathrm { m } \) gold particle에 형질전환 플라스미드 벡터를 \( \mathrm { CaCl } _ { 2 } \) 와 spermidine을 사용하여 coating한 후, 무균 상태의 chamber에서 vacuum 28 in.Hg, 압력 \( 1,100 \mathrm { ~psi } \), 거리 \( 9 \mathrm { ~cm } \) 의 조건으로RMOP (regeneration media of plant; MS salt (1X), \(30 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) sucrose, \( 6 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \) phytoagar, \( 100 \mathrm { ~mg } / \mathrm { L } \) myo-inositol, \( 1 \mathrm { ~mg } / \mathrm { L } \) thiamine-HC1 \(1 \mathrm { ~mg } / \mathrm { L } \) BAP, \( 0.1 \mathrm { ~mg } / \mathrm { L } \) NAA, \( \mathrm { pH } \) 5.8) 배지 위에 치상된 담배 잎에 bombarding 하였다.</p>