세포에서 분리한 total RNA를 주형으로하는 형광표지된 cDNA를 얻기 위해 역전사 과정을 진행했다. 이 일련의 합성과정 그리고 정제과정을 통해 만들어진 두 개의 probe를 섞고 microarray에 적용 했다. 그리고 PCR(polymerase chain reaction)을 수행했는데 이 때 만들어진 cDNA를 주형으로 사용해 microarray 실험에서 증가되는 유전자 중 3개를 선별하여 각 유전자 특이적인 primers 를 이용했다. 역전사 반응은 RT-PCR 방법과 같은 방법으로 진행했다. 두 개의 조건에서 cycle 증폭을 시행해 결과를 얻은 후, dissociation curve를 그려 primer dimer가 생성 되었는지 확인 후 분석했다.
<h2>Oligo DNA microarray 실험 및 데이터 분석</h2> <p>Microarray 실험은 GenomicTree, Inc. (Korea)에 위탁하여 수행하였다. DNA microarray는 미국 Microarrays사의 48.5K Human Array-Illumina HEEBO oligo microarray (USA)를 사용하였다. 간단하게 실험 방법을 설명하면, 세포주에서 분리한 total RNA를 주형으로 형광표지된 cDNA를 얻기 위해 역전사 과정을 진행하였다. 역전사 반응 과정 동안 total RNA \( 18 \mathrm { ~ \mu g } \)에 oligo dT primer를 annealing 한 후, 대조군의 total RNA는 Cy3-dUTP를, 실험군의 total RNA는 Cy5-dUTP를 이용하여 각각 labeling 하였다. 일련의 합성과정과 정제과정을 통해 만들어진 두 개의 probe를 섞어서, microarray에 적용 하였다. 16시간 동안 hybridization한 후, 일련의 세척과정을 거친 후 원심분리하여 DNA microarray를 건조하였다. DNA microarray는 Axon 4000B scanner (USA)를 이용하여 scan한 다음, 미국 Agilent 사의 GeneSpringGX 7.3 프로그램을 이용하여 분석하였다. Normalization은 in-tensity dependent (LOWESS) normalization 방법을 사용하였다. 유전자의 filtering은 median의 값이 1,000 이상이 되는 유전자만 선별하였다.</p> <h2>Reverse Transcription-PCR</h2> <p>정제된 total RNA \( 4 \mathrm { ~ \mu g } \)을 주형으로 하여, 역전사 반응을 수행하였다. 만들어진 cDNA를 주형으로 사용하여 microarray 실험에서 증가되는 유전자 중 3개를 선별하여 각 유전자 특이적인 primers 를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였다. GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 대조 유전자로 사용하였다. PCR 조건은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분 후, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1 분, \( 58 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1 분씩 25 cycle을 수행한 후, 마지막으로 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분간 extention 반응을 수행하였다. PCR 산물들은 전기영동 한 후, UV 하에서 관찰하였다.</p> <h2>Quantitative real-time PCR</h2> <p>역전사 반응은 RT-PCR 방법과 동일하게 수행하였다. 유전자 특이적인 primer 농도는 \( 2 \mathrm { ~pmol/ \mu l } \)로 낮추어 real-time PCR을 수행하였다. PCR mixture는 forward primer \( 2 \mathrm { ~ \mu l } \), reverse primer \( 2 \mathrm { ~ \mu l } \), Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA) \( 10 \mathrm { ~ \mu l } \)를 첨가하여 제조한 뒤, 96 well optical reaction plate에 cDNA \( 6 \mathrm { ~ \mu l } \), PCR mixture \( 14 \mathrm { ~ \mu l } \)를 첨가하여 다음의 조건에 따라 수행하였다. 첫 번째 step인 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20분, \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분 후, 두 번째 step인 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초, \( 54 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30 초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 33초씩 40 cycle 증폭을 시행하여 결과를 얻은 후, dissociation curve를 그려 primer dimer가 생성 되었는지 확인한 후 분석하였다. 각 유전자에 대한 발현은 control (GAPDH) 을 지정해 준 후 각각의 유전자에 대한 RQ value (Relative Quantification value)를 계산하여 이를 그래프화 하였다.</p>