토마토 내혼계통 'FTX'의 하배축 절편을 이용한 ZmCRT 형질전환을 수행결과 총 20개체의 \( \mathrm{T}_{0} \) 재분화 식물체를 획득하였고 PCR 분석결과 모든 개체에서 ZmCRT 유전자 단편이 증폭되었음을 확인하였다.. ZmCRT 형질전환 고정세대 종자를 파종 후 20일에 TMV-U1과 ToMV 분리주를 각각 접종하고 20일 후 병징을 관찰한 결과 형질전환체와 wild-type 모두에서 육안으로 식별할 수 있는 병징이 관찰되지 않아, 이 상엽을 대상으로 Chl-F quenching 분석을 수행하여 매개변수 NPQ 와 \( \phi{\mathrm{PSII}} \)를 산출한 후 상호 비교하였다. 결론적으로 ZmCRT 과발현은 tobamovirus의 상엽이동을 감속시키고, 따라서 상엽의 바이러스 감염이 지연됨으로 인해 상엽의 광합성 효율 감소가 제어된 것으로 추론할 수 있으며, 이러한 추론으로 병징관찰이 가능한 시점에 도달한 ZmCRT 형질전환체와 wild-type간 생장량 차이의 원인 설명이 가능하다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>ZmCRT형질전환 토마토 획득과 동형접합계통 육성</h2> <p>토마토 내혼계통 'FTX'의 하배축 절편을 이용한 ZmCRT형질전환을 수행하여 총 20 개체의 \( \mathrm{T}_{0} \) 재분화 식물체를 획득하고 PCR 분석을 수행하였는데, 모든 개체에서 ZmCRT 유전자 단편 (910 bp)이 증폭되었다. 이것은 본 연구에서 활용한 토마토 형질전환 체계 (Park et al. 2003, 2005)가 유전자형 'FTX'에도 상당히 효과적이라는 것을 나타낸 결과라고 할 수 있다. T-DNA의 삽입을 재확인하고 copy 수를 결정하기 위하여 1개체 ('FCR18')를 제외한 19 개체를 대상으로 Southern 혼성화 분석을 실시하였는데 단 3 개체 ('FCRT02', 'FCRT06', 'FCRT17')만이 1 copy T-DNA가 삽입되었고 나머지 개체는 2~10 copy의 T-DNA 가 삽입된 것으로 확인되었다. 형질전환 초기 세대에서 T-DNA가 2 copy 이상 존재할 경우 비분리 고정계통 육성 과정에서 집단의 규모를 키워야 하는 단점과 경우에 따라서는 도입 유전자의 발현 자체가 억제될 수도 있다 (Stam et al. 1997). 따라서 다양한 접근방법을 통해 1 copy T-DNA 삽입효율을 높이거나 copy수에 무관하게 도입 유전자의 발현을 유도할 수 있는 방법 (Mlynárová et al. 1995; De Buck et al. 2007)이 토마토 형질 전환에 적용되어야 할 것으로 사료된다. 또한 본 연구에서 활용한 형질전환 체계뿐 아니라 대부분의 토마토 형질전환에서는 배수성 변이체를 포함한 체세포변이체의 고빈도 발생을 야기할 수 있는 캘루스를 경유하여 식물체를 재분화시키고 있다 (Bulk et al. 1990; Fras and Maluszynska 2003). 이는 재분화된 토마토 형질전환체의 경우 최소한 배수성 분석이 필요하다는 것을 의미한다고 할 수 있는데, 실제로 본 연구에서 재분화된 일부 형질전환체도 비정상적 4배성 및 이수성을 나타내는 것으로 분석되었다. 이들 비정상적 배수체는 엽형의 뚜렷한 변화 또는 엽색의 변화를 수반하였다. 배수성 분석 결과를 토대로 1 copy T-DNA가 삽입된 'FCRT06' \( \mathrm{T}_{0} \) 식물체는 4 배체로 판단되어 세대진전에서 제외하고 'FCRT02'와 'FCRT17'을 대상으로 인공 자가수분을 실시하여 \( \mathrm{T}_{1} \) 집단을 각각 육성하였다. 두 집단의 각 식물체에 대한 PCR 분석을 수행한 결과 두 집단 모두 멘델식 분리 (positive:negative=3:1) 를 하였고 (data not shown), ZmCRT 단편의 증폭이 확인된 각 집단의 \( \mathrm{T}_{1} \) 식물체 5 주에 대해 다시 인공 자가수분을 실시하여 총 10개의 \( \mathrm{T}_{2} \) 집단을 육성하였다. 각 \( \mathrm{T}_{2} \) 집단의 개체에 대한 PCR분석을 다시 실시하여 ZmCRT유전자가 모두 탐지되는 4개 집단을 확인 (data not shown)하였으며 그 중 'FCRT02' \( \mathrm{T}_{0} \) 식물체로부터 육성된 계통을 다음 실험의 재료로 사용하였다.</p> <h2>Tobamovirus가 접종된 ZmCRT 형질전환체의 표현형</h2> <p>ZmCRT 형질전환 고정세대 종자를 파종하여 본엽이 2매 완전 전개한 시점 (파종 후 20 일)에 TMV-U1과 ToMV 분리주를 각각 접종한 20 일 후 (파종 후 40일) 병징을 관찰한 결과 형질전환체와 wild-type 모두에서 육안으로 식별할 수 있는 병징이 관찰되지 않았으나 바이러스 접종 40일 후 (파종 후 60일)에는 주로 신엽을 중심으로 토마토 유전자형과 바이러스를 달리한 4조합 모두에서 뚜렷한 모자이크 병징이 관찰되었다. ToMV 접종 식물체에 한한 반정량적 RT-PCR 분석은 모자이크 병징이 접종 후 감염된 바이러스의 상엽으로 이동에 따른 결과임을 확인시켜 주었다. 그러나 형질전환 식물체가 ZmCRT를 전사함에도 불구하고 wild-type과 비교하여 모자이크 병징의 심도에는 차이가 없었다. 이러한 결과는 Chen 등 (2005)이 tobamovirus 접종 후 28일까지 상엽에서 바이러스 CP를 탐지할 수 없다는 보고와 차이를 나타내는 것으로 그 원인이 접종방법의 차이인지 바이러스의 병원성 차이인지 단언하기 어렵다. 전자를 채택한다면 본 연구에서는 잎의 윗면 전체에 바이러스를 접종하였기 때문에 바이러스의 유관속 접근이 용이했던 반면 Chen 등 (2005)은 바이러스를 엽연부에 접종함으로써 바이러스의 유관속 접근이 굉장히 어려웠을 것이라는 추측이 가능하다. 그러나 본 연구에서 TMV-U1과 ToMV를 접종한 ZmCRT 형질전환체에서 나타나는 특징적인 표현형은 ZmCRT 형질전환체의 초장이 바이러스를 접종하지 않은 wild-type와 비교하여 비등한 수준으로 길다는 점이다. 바이러스 접종 시험구에서 wild-type 대비 ZmCRT 형질전환체가 긴 초장을 갖게 된 원인은 과발현된 calreticulin 단백질이 tobamovirus의 상엽 이동을 지연시켰기 때문으로 사료된다.</p> <h2>엽록소형광 (Chl-F) quenching 분석을 통한 바이러스접종 형질전환체의 광합성 효율 검증</h2> <p>바이러스 감염과 광합성 효율과의 관계, 특히 바이러스감염에 따른 Chl-F 변화에 관한 주목할 만한 보고가 있다 (Wolf and Millatiner 2000; Pérez-Bueno et al. 2006; Christov et al. 2007; Pineda et al. 2008). Pineda 등 (2008)은 병원성이 다른 Pepper mild mottle virus (PMMoV) 2개 strain을 N. ben-thamiana에 각각 접종한 4~6일 후에 포화광 pulse를 조사하여 얻어진 Chl-F 매개변수 중 NPQ와 ФPsII 가 무병징 상태인 식물체간 바이러스 감염정도를 판별하는데 효과적이라고 하였다. 언급한 바와 같이 본 연구에서 TMV-U1과 ToMV를 접종한 20 일 후 ZmCRT 형질전환체와 wild-type 및 바이러스 미접종 wild-type 모두는 병징이 관찰되지 않아 상엽을 대상으로 Chl-F quenching 분석을 수행하여 매개변수 NPQ 와 \( \phi_{\mathrm{PSII}} \) 를 산출한 후 상호 비교하였다. 암적응된 시료의 잠재적 quantum yield인 Fv/Fm (Kitajima and Butler, 1975; \( \mathrm{Fv}=\mathrm{Fm}-\mathrm{F}_{0} ; \mathrm{F}_{0} \): dark or initial fluorescence)값은 바이러스 미접종 wild-type \( 0.81 \pm 0.01 \) (mean \( \pm \) S.E.), ToMV 접종 wild-type \( 0.78 \pm 0.01 \) 및 ToMV 접종 ZmCRT 형질전환체 \( 0.80 \pm 0.01 \) 로 측정되어 바이러스 미접종 wild-type이 경시적으로 가장 높았으나 각 처리간 통계적 차이는 인정되지 않았다. 그러나 포화광 pulse가 지속되는 명적응 상태에서 \( \phi_{\mathrm{PsII}} \) 값에 처리간 뚜렷한 차이를 나타내었는데 최종적으로 바이러스 미접종 wild-type이 0.24, ToMV 접종 wild-type이 0.15, 그리고 ToMV 접종 ZmCRT 형질전환체가 0.18로 산출되어 바이러스 감염이 토마토 식물체의 PSII quantum yield에 영향을 미칠 뿐 만 아니라 ZmCRT 발현이 상엽으로의 ToMV 이동 또는 감염을 줄일 수 있는 것으로 판단되었다. 한편, NPQ는 시간이 경과함에 따라 미접종 wild-type, ToMV 접종 ZmCRT 형질전환체, ToMV 접종 wild-type 순으로 높은 경향을 보이기는 하였지만 통계적 차이는 인정되지 않았다. 이러한 결과는 tobamovirus 접종 후 무병징 시기에 바이러스 감염정도를 \( \phi_{\mathrm{PSII}} \) 또는 NPQ가 대별할 수 있다는 보고 (Pérez-Bueno et al. 2006; Pineda et al. 2008)와 일부 일치하는 것이다. 요약하면 ZmCRT 과발현은 tobamovirus의 상엽이동을 감속시키고, 따라서 상엽의 바이러스 감염이 지연됨으로 인해 상엽의 광합성 효율 감소가 제어된 것으로 추론할 수 있다. 즉, 이러한 추론으로 병징관찰이 가능한 시점 (바이러스 접종 40일 후)에 도달한 ZmCRT 형질전환체와 wild-type간 생장량 차이의 원인 설명이 가능하다.</p>