DNA 5' 끝에 biotin이 부착되어 PCR로 증폭되고, micron-30을 통해 정제된 Psal promoter, 200bp control DNA, Pcmv control promoter을 사용하여 PCR로 증폭하였으며, 페놀과 방향족 화합물을 산화시킬 수 있는 Pseudomonas outida KCTC1452를 한국유전자은행에서 구입하여 이로부터 capR와 Po 유전자를 PCR 방법으로 쿨로닝하였다.
<h3>biotinylated DNA의 PCR증폭</h3> <p>본 연구에서 사용되어진 DNA는 다음과 같이 모두 5'에biotin을 부착하여 PCR로 증폭하였으며, micron-30 (Milli-pore, 미국)을 이용하여 정제하였다. Psal promoter (forward,</p> <p>biotin-5'-GCTGTACTCGTGATGGCTATTGATG-3';reverse, 5'-GGGGCCTCGCTTGGGTTAT TGCTGGTG- 3'),200bp control DNA (forward, biotin-5'-ATGGAACTGCGTGACCTGACCTGGATTT AAC-3'; reverse, 5'-CCTGTAGCGACCTGCGCAGGCCTTTTCA- \( 3 ^ {\prime } \) ), Pcmv control promoter (forward, biotin-5'-GCACCAAAATCAACGGGGACTTTCCAAA-3'; reverse, 5'-GGTGGCGACCGGTAGCGCTAG CGGATC-3'), Po promoter (forward, biotin-5'-GGCCTTGGGCAATTGATCAAATGC-3'; reverse, 5'-TAAC GAGTGGCTGATCGAAAGTCGGTG- \( \left .3 ^ {\prime } \right ) \)</p> <h3>\( \mathrm { pET } 21 \mathrm { a } ( + ) \mathrm { CapR } \) 벡터의 구축</h3> <p>페놀과 방향족 화합물을 산화시킬 수 있는 Pseudomonas outida KCTC1452를 한국유전자은행에서 구입하여 이로부터 capR와 Po 유전자를 PCR 방법으로 쿨로닝하였다 (투고중). ABI PRISM BigDye \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) terminator sequencing system (Applied Biosystems, 미국)과 ABI PRISM 310 sequencer 를 이용하여 염기서열을 밝혔다. 플라스미드는 Qiagen (미군)의 spin column kit을 이용하여 분리하였으며, 발현 벡터인 pET21a ( + ) \( (5,443 \mathrm { bp } ) \) 는 Promega (미국)에서 구입하였다. 각각 양끝에 \( \mathrm { SacI } \) 과 \( \mathrm { Xho } \mathrm { I } \) 을 가진 \( 5 ^ {\prime } \) -CGGGAGCTCATGCCGATCAAGTACAAGCCT-3',5'-CCGCTCGAGCTAGCCTTCGATGCCGATTTT-3' 프라이머를 이용하여 PCR로 \( \operatorname { capR } (1,692 \mathrm { bp } ) \) 을 증폭시켜 \( \mathrm { SacI } \) 과Xho I 으로 자르고, 이것을 \( \mathrm { Sac } \mathrm { I } \) 과 Xho I 으로 자든 \( \mathrm { pET } 21 \mathrm { a } ( + ) \) 에 넣어 약 \( 7.0 \mathrm { ~kb } \) 의 pET21a ( + )-CapR 벡터를 완성시켰다. 이것은 \( \mathrm { CaCl } _ { 2 } \) 방법을 이용하여 대장균 BL21에 형질 전환시켰다.</p> <h3>CapR 단백질의 발현 및 분리방법</h3> <p>\( \mathrm { pET } 21 \mathrm { a } ( + ) \mathrm { CapR } \) 을 가진 대장균 \( 5 \mathrm { ml } \) 울 TYS 배지에서 약 16 시간 배양한 후, 이를 \( 200 \mathrm { ml } \) 의 새로운 배지에 옮겨서 \( \mathrm { OD } \) 가 \( 0.6 \sim 0.8 \) 이 되도록 \( 2 \sim 3 \) 시간 키운 후 \( \mathrm { IPTG } \)(isopropylthio-D-galactoside)의 최종 농도가 \( 0.4 \mathrm { mM } \) 이 되도록 유도하여 2 3 시간을 키웠다. \( 5,000 \mathrm { x } \mathrm { g } \) 에서 5 분간 원심분리하여 세포를 수확한 뒤 \( \mathrm { T7 } \). Tag Bind/Wash 완충용 \( 0.137 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } , 0.1 \% \) Tween-20, \( 0.002 \% \) sodium azide, \( \mathrm { pH } \)7.3) \( 10 \mathrm { ml } \) 에 현탁시켰다. 이것을 초음파 파쇄기로 깬 다음, \( 39,000 \times g \) 에서 20 분 동안 원심 분리하여 침전물을 제거하고 수용성 단백질을 얻었다.</p>