immunohistochemistry와 Northern blot또는 RT-PCR를 통해 mouse, rat, human 뇌에서 단백질의 발현양상이나 parkin mRNA를 비교하는 연구들이 진행되고 있지만, 포유류 세포 내에서 Parkin의 발현과 기능을 분자 수준에서 규명할 수 있는 시스템은 확립되지 않았으며, 이 연구에서는 생화학적 연구에 Parkin을 사용하기 위한 시스템 구축의 한가지로 대장균 안에서 높은 순도로 Parkin을 정제할 수 있는 시스템과 적당한 조건을 확립했다.
<h2>HEK293 세포 내에서 Parkin의 발현양상 분석</h2> <p>정상적인 folding 과정과 posttranslational modification이 특정 단백질의 생리적 기능에 결정적인 역할을 할 경우, 이 특정 단백질을 포유류 세포에서 발현시켜 기능을 분석할 수 있는 시스템 구축이 필요하다. 그러나 현재까지는 Northern blot과 RT-PCR 또는 immunohistochemistry를 통해 mouse, rat, human 뇌에서 parkin mRNA나 단백질의 발현양상을 비교하는 연구들이 진행되고 있을 뿐, 포유류 세포 내에서 Parkin의 발현과 기능을 분자 수준에서 규명할 수 있는 시스템은 거의 확립이 되어있지 않은 실정이다.</p> <p>대장균에서 발현되는 human Parkin은 매우 불안정하여 50 \( \% \) 이상 분해되는 것을 관찰할 수 있는데, 이런 분해현상이 포유류 세포에서도 나타나는 지를 조사하기 위해 HEK293 세포에서 Parkin의 발현양상울 비교분석하였다. 먼저 HEK293 세포에서 발현되는 Parkin을 쉽게 확인하고자 N-말단과 C-말단에 Myc이나 HA를 tagging한 Parkin을 발현할 수 있는 각종 expression plasmid들을 제작하였다. 각 plas-mid를 HEK293 세포에 transfection한 후 HA, Myc, 또는 Parkin antibody로 Parkin의 발현을 확인하였다. HA antibody로 immunoblot을 한 결과 N-말단 또는 C-말단을 HA로 tagging한 Parkin에서 58 \( \mathrm { kDa } \) 크기의 밴드가 주로 확인되었다. 대장균에서처럼 여러 fragment들이 관찰되지는 않았지만, 58 \( \mathrm { kDa } \) 밴드 외에 48 \( \mathrm { kDa } \) 위치에서 또 다른 frag-ment를 확인할 수 있었다. Parkin의 N-말단에 존재하는 Myc tag을 인지하는 Myc antibody로 immunoblot을 한 결과 58 \( \mathrm { kDa } \)의 Parkin 밴드만 나타나고 48 \( \mathrm { kDa } \)의 밴드는 관찰되지 않았다.</p> <h1>고 찰</h1> <p>본 연구에서는 생화학적 연구에 Parkin을 이용하기 위한 시스템 구축의 일환으로 대장균 내에서 높은 순도로 Parkin을 정제할 수 있는 적정 조건과 시스템을 확립하였다. 또한 포유류 세포인 HEK293 세포에서 Parkin의 발현양상을 분석하기 위해 여러 epitope tag을 이용한 vector 시스템을 제작하여 Parkin의 발현 특성을 확인하였다.</p> <p>대장균 내에서 일반적인 조건으로 발현시킨 경우 Parkin 단백질이 분해되어 순도 높은 Parkin 단백질을 얻을 수 없는 문제점이 발생하였다. 이를 해결하기 위해 여러 배양 및 유도 온도와 IPTG 농도에서 Parkin을 발현, 정제한 후 Parkin의 발현 양상을 비교 분석하였다. 그 결과 25 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 배양 및 유도 온도와 0.01 \( \mathrm { mM } \)의 IPTG 조건에서 Parkin의 분해가 가장 적게 일어나고 단백질의 회수율이 0.2 \( \%(1 \mathrm { ml } \) 대장균 배양액 당 \( 50 \mathrm { ~ng } / 25 \mathrm {\mu g } \), 정제된 GST-Parkin/ 전체 세포 추출물) 정도로 대장균 1 리터로부터 순도 90 \( \% \) 이상의 GST-Parkin 단백질을 50 \( \mu \mathrm { g } \) 정도 정제 할 수 있었다. 비록 양은 적지만 순도 높은 Parkin을 정제하는 방법을 확립 하였으므로, 이 방법을 이용하여 생화학적 연구에 적용할 수 있는 Parkin 단백질을 다량 정제할 수 있다.</p>