사과 왜성대목의 신초잎을 채취 후 완충액을 첨가하고 Sample bag mesh에 마쇄한 후 원심분리한 상층액을 사용하였다. 바이러스 검정은 Standard Double Antibody Sandwich ELISA방법으로 ACLSV등을 이용하였다. CTAB 방법을 변형하여 total RNA를 추출하였으며, 이를 M-MLV reverse transcriptase를 통해 cDNA 합성에 사용하였다.
<h2>바이러스 검정</h2> <h3>ELISA 검정</h3> <p>사과 왜성대목의 신초잎은 \( 0.5 \mathrm { ~g } \) 씩 채취한 후 시료 무게의 10배가 되게 완충액(Extraction buffer \( 5 \mathrm { ml } ) \) 을 첨가하였고, Sample bag mesh에 마쇄한 후 원심분리한 상층액을 사용하였다. 바이러스 검정은 Standard Double Antibody Sandwich ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 방법으로 Agdia (DAS ELISA, USA)로부터 구입한 ACLSV (Apple chlorotic leaf spot virus), ASPV (Apple stem pitting virus), ASGV (Apple stem grooving virus) 항혈청과 Conjugate enzyme은 Alkaline phosphatase를 이용하였다. 바이러스 측정은 ELISA Microplate Reader (VERSAmax, Molecular Devices, USA) 를 사용하였고, 이병주 판정은 건전주의 평균 O.D (optical density)값의 2 배 이상인 개체로 하였다.</p> <h3>RNA 추출 및 RA-PCR 검정</h3> <p>분석에 사용할 식물 시료 \( 50 \mathrm { mg } \) 을 CTAB 방법을 변형하여 total RNA를 추출하였으며, 추출된 RNA는 M-MLV reverse transcriptase (Invitrogen, USA)를 이용하여 cDNA 합성에 사용하였다. cDNA를 주형으로 각 바이러스 특이 primer sets를 PCR 반응에 사용하였다(Table 1). PCR에 사용한 총 \( 20 \mu \mathrm { L } \) 의 반응액은 \( 0.2 \mu \mathrm { M } \) primer \( 1 \mu \mathrm { L } \) , \(2.5 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { dNTPs } 1.6 \mu \mathrm { L } \) , \( 5 \mathrm { U } \) Takara Ex. Taq polymerase (Takara Bio Inc., Japan) \( 0.1 \mu \mathrm { L } , \) \(10 \mathrm { X } \) Taq Buffer \( 2 \mu \mathrm { L } \), cDNA \( 1 \mu \mathrm { L } \), RNAase-free water \( 13.3 \mu \mathrm { L } \) 를 혼합하여 사용하였다.</p> <p>PCR 조건은 초기변성을 위해 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2 분간 반응시킨 뒤, DNA 증폭을 위한 반응 \( \left (95 ^ {\circ } \mathrm { C } \right . \) 에서 40 초간 DNA 변성, \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초간 primer 접합, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초간 DNA 신장)을 35회 반복하였다. 최종 신장을 위해 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분간 반응시킨후 종료하였으며, NADH를 내부 대조구(internal control)로 사용하여 합성된 cDNA가 RT-PCR 반응에 제대로 사용되었는지 확인하였다. 반응이 증폭된 DNA는 \( 2 \% \) agarose gel상에서 \( 100 \mathrm { ~V } \) 로 30 분간 전기영동한 후, Ethidium bromide로 염색하여 UV상에서 관찰하였다.</p>