Goldfish와 channel catfish를 제외하고 아미노산 서열은 61.1 92.6\%, 뉴클레오타이드 서열은 \( 63 \sim 92.6 \% \) 의 서열 일치를 보였다.따라서, 다양한 어종 사이의 SL 아미노산과 뉴클레오타이드 상동성은 GH와 PRL이 어종 사이에 약 \( 40 \% \) 의 상동성을 보이는 것과 달리 높은 보존성을 갖고 있음을 알 수 있다.경골어류 GH의 경우, A,B,C와 D domain은 높은 보존성을 보이고 있어 GH의 생물학적 활성에 관여할 것으로 보고 되어 있으며, 돌돔을 포함한 경골어류 SL에 4개의 conserved domain의 존재는 단백질의 3차구조 형성과 생물학적 활성에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.따라서, 동일 부위의 시스테인 잔기를 갖고 있는 돌돔을 포함한 어류의 SL 단백질은 3개의 이황화 결합을 형성하며, 그외의 시스테인 잔기는 이황화 결합에 관여하지 않을 것으로 생각된다.현재까지 다양한 어류 뇌하수체로부터 native SL이 분리되고 있지만, 생화학 과정을 통해 획득되는 양은 매우 적어 다양한 생물학적 실험을 위해서는 많은 양의 시료가 요구될 뿐더러 안정적 재조합 단백질의 생산을 위한 시도가 이루어져야한다.
<h2>돌돔 SL과 경골어류 SL 비교</h2> <p>밝혀진 돌돔 SL 뉴클레오타이드와 아미노산 서열을 현재까지 밝혀진 경골어류 SL의 뉴클레오타이드와 아미노산 서열 상동성을 비교하였다 (Table 1). Goldfish와 channel catfish를 제외하고 아미노산 서열은 61.1 92.6\%, 뉴클레오타이드 서열은 \( 63 \sim 92.6 \% \) 의 서열 일치를 보였다. 특히, 돌돔이 속한 농어목 (Perciformes) 어류인 European sea bass, red drum, rabbitfish와 gilthead sea bream의 SL 아 미노산 서열에는 각각 \( 92.6 \%, 87.8 \%, 85.3 \%, 85.2 \% \) (nt. identity \( 92.6 \%, 87.8 \%, 86.4 \%, 87.4 \% \) ), 가자미목 (Pleuronectiformes) 어류인 Japanese flounder, Atlantic halibut과 sole에는 \( 88.7 \%, 85.5 \%, 83 \% \) (nt. identity \( 87.9 \%, 86.7 \% \),\( 84.6 \%) \) 의 높은 아미노산과 뉴클레오타이드 서열의 일치를 보이지만, goldfish와 channel catfish의 경우 \( 49.3 \% \) (nt.\( 57.7 \%) \) 와 \( 57.8 \% \) (nt. \( 61.6 \%) \) 의 낮은 상동성을 보였다. 또한, SL mature protein 사이의 비교에서도 앞의 결과에 일치하는 서열 상동성을 보였다. 따라서, 다양한 어종 사이의 SL 아미노산과 뉴클레오타이드 상동성은 GH와 PRL이 어종 사이에 약 \( 40 \% \) 의 상동성을 보이는 것과 달리 높은 보존성을 갖고 있음을 알 수 있다.</p> <p>돌돔 SL 아미노산 서열과 현재까지 밝혀진 경골어류 SL의 아미노산 서열을 이용하여 multiple alignmet를 수행하였다 (Fig. 2). 그 결과, 3개의 variable domain에 의하여 나누어지는 4개의 conserved domain이 15-40 aa, 72-105 aa, 119-146 aa와 173-206 aa에서 확인되었으며, 이들 영역을 domain \( \mathrm{A}_{\mathrm{sL}}, \mathrm{B}_{\mathrm{SL}}, \mathrm{C}_{\mathrm{SL}} \) 과 \( \mathrm{D}_{\mathrm{SL}} \) 로 명명하였다. 돌돔 SL과 타어종간 SL conserved domain 사이에서의 아미노산 서열 상 동성은 65.2 100\% \( \left(\mathrm{A}_{\mathrm{sL}}\right), 66.7 \sim 100 \%\left(\mathrm{~B}_{\mathrm{SL}}\right), 48.1 \sim 100 \% \)\( \left(\mathrm{C}_{\mathrm{SL}}\right) \)와 \( 69.7 \sim 97.1 \% \) \( \left(D_{S L}\right) \)를 나타냈다. 특히, 농어목과 가자미목 어류에 높은 서열 일치를 보였으나, eel, goldfish와 channel catfish와는 낮은 서열의 일치를 보여 앞서 설명된 cDNA와 아미노산 서열에서 보여지는 결과와 일치함을 알수 있다. 돌돔 SL에서 나타나는 4개의 domain은 경골어류 GH와 PRL에서 이미 보고 되었다. 경골어류 GH의 경우, A,B,C와 D domain은 높은 보존성을 보이고 있어 GH의 생물학적 활성에 관여할 것으로 보고 되어 있으며, 돌돔을 포함한 경골어류 SL에 4개의 conserved domain의 존재는 단백질의 3차구조 형성과 생물학적 활성에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.</p> <p>아미노산 서열의 alignment에서 6개의 시스테인 잔기 \( \left(\mathrm{Cys}^{5}, \mathrm{Cys}^{15}, \mathrm{Cys}^{65}, \mathrm{Cys}^{181}, \mathrm{Cys}^{198}\right. \) 과 \( \left.\mathrm{Cys}^{206}\right) \) 가 모든 어류 \( \mathrm{SL}\) 아미노산의 동일 아미노산 부위에 위치하고 있음이 확인되었다. 특히, C-말단에 존재하는 4개의 시스테인 잔기 \( \left(\mathrm{Cys}^{65}, \mathrm{Cys}^{181}, \mathrm{Cys}^{198}\right. \) 과 \( \left.\mathrm{Cys}^{206}\right) \) 의 위치는 \( \mathrm{GH} \) 와 PRL에서 관찰되는 결과와 일치하며, goldfish와 channel catfish의 \( \mathrm{N} \)-말단에 1 개의 시스테인 잔기 \( \left(\mathrm{Cys}^{42}\right) \) 가 결손된 경우를 제외하고 이제까지 발혀진 어류의 SL은 7개의 시스테인 잔기를 갖고 있음이 밝혀졌으나, Atlantic cod에서 분리된 SL은 reduction과 \( S \)-carboxymethylation 분석으로 8 의 시스테인 잔기를 갖고 있는 것으로 밝혀졌다. 시스테인 5 와 15,65 와 181,198 과 206 사이에서는 이황화 결합을 형성하지만, 시스테인 42 와 180 사이에서는 free SH group으로 존재하여 이황화 결합을 형성하지 않음을 확인하였다. 따라서, 동일 부위의 시스테인 잔기를 갖고 있는 돌돔을 포함한 어류의 SL 단백질은 3개의 이황화 결합을 형성하며, 그외의 시스테인 잔기는 이황화 결합에 관여하지 않을 것으로 생각된다.</p> <p>N-glycosylation 분석으로 (Asn-X-Ser/Thr) 돌돔 SL은 \( \mathrm{Asn}^{121}\) 과 \( \mathrm{Asn}^{151}\) 에 두 개의 potential N-glycosylation 부위를 갖고 있지만, 타어종과의 alignment에서 chum salrnon, goldfish와 channel catfish를 제외한 어류에서 공통적으로 \( \mathrm{Asn}^{121} \) 의 N-glycosylation site를 갖고 있음을 확인하였다(Fig. 2). 경골어류에서 확인된 glycosylation site는 lump- fish는 3개, Atlantic cod, Atlantic halibut, sole, eel과 rabbitfish는 2개, Japanese flounder, gilthead seabream, lungfish, red drum과 European sea bass는 1개를 갖고 있지만, chum salmon과 rainbow trout은 Asn이 Lys으로 치환되어 있어 goldfish, channel catfish와 같이 \( \mathrm{N} \)-glycosylation site를 갖고 있지 않다. 이처럼 어류에서 glycosylation site는 다양하게 보고되고 있지만, Atlantic cod에서 분리된 SL의 degly-cosylation과 탄수화물 분석으로 \( \mathrm{Asn}^{121} \) 의 glycosylation site가 단백질의 탄수화물 결합에 관여함을 확인하였다. 따라서, 뇌하수체 호르몬의 glycosylation은 호르몬의 분비, 수용체 결합, 신호 전환과 생물학적 잠재성에 중요하므로 특유의 glycosylation 상태는 SL의 생물학적 활성에서 나타나는 생리학적 차이를 예측할 수 있을 것이다.</p> <h1>돌돔 SL의 E.coli 발현</h1> <p>재조합 SL 단백질의 발현 양상을 확인하기 위하여 염기서열이 분석된 돌돔 SL cDNA 서열에 기초하여 제한효소 부위를 갖는 primer를 제작하여 SL coding region을 증폭 하여 pET-11a vector에 삽입하였다. 삽입된 SL cDNA에서 단백질의 발현을 위해 E. coli BL21(DE3)에 형질전환하여 IPTG에 의한 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. IPTG에 의하여 유도된 단백질은 \( 12 \% \) SDS-PAGE 전기영동을 수행하여 발현된 단백질을 확인한 결과, 재조합 SL 단백질은 약 \( 27 \mathrm{kDa}\) 의 monomer 형태로 과발현되었으며, 이는 앞에서 SL cDNA 서열에 기초하여 예측된 단백질의 크기와 유사함을 알 수 있다 (Fig 3).</p> <p>현재까지 다양한 어류 뇌하수체로부터 native SL이 분리되고 있지만, 생화학 과정을 통해 획득되는 양은 매우 적어 다양한 생물학적 실험을 위해서는 많은 양의 시료가 요구된다. 또한, 알칼리추출과 용때의 처리로 분리된 호르몬의 생물학적작용이 번화되기도 한다. 따라서, 이 단백질을 이용한 in vitro와 in vivo상의 생물학적 작용을 평가하기 위해서는 대량의 재조합 SL 단백질의 이용이 필요하며 일부 어종에서 안정적 재조합 단백질의 생산을 위한 시도가 이루어지고 있다.</p> <p>아직까지 SL의 생리학적 기능은 명확하지 않다. 일부 생화학, 생리학과 존직학적 연구를 통해 SL단백질은 뇌하수체의 pars intermedia 세포에서 분비되며, 칼슘 조절, 이온 인산 수송, 산-염기 평형, 배경 적응, 생식과 같은 다양한 범위에 관여한다고 추측되고 있다.</p>