본 실험은 AnyGen사에서 98% 이상의 순도로 합성한 합성 펩타이드 CopA3와 invitrogen사에서 구입한 세포배양용 시약을 사용하여 MTT용액과 함께 대조군에 대한 세포생존율을 측정하였다. 1차 항체는 iNOS BD bioscience와 COX-2 cayman을, 2차 항체는 anti-rabbit Ig-G horseradish peroxidase (HRP)-conjugated antibody를 사용하였고, 한국세포주은행에서 분양 받은 Raw 264.7 cell과 DMEN배지를 사용해 배양하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>본 실험에 사용한 합성 펩타이드 CopA3는 자동화 된 sol-id-phase peptide synthesizer (Pioneer Applied Biosystems, Foster, CA)를 이용하여 AnyGen (Kwang-ju, Korea)사에서 \( 98 \% \) 이상의 순도로 합성하였고, \( 0.01 \% \) acetic acid에 녹여 사용하였다.</p> <h2>시약 및 기기</h2> <p>세포 배양액인 dulbeco's modified eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), streptomycin penicillin 등의 세포배양용 시약들은 invitrogen사(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 sodium dodesyl sulfate (SDS), acrylamide, bisacrylamide는 Bio-rad사(Hercules, CA, USA)에서 구입하였고, NP-40, protease inhibitor, RIPA buffer, griess reagent 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 1차 항체에는 iNOS BD bioscience (Sanjose, CA, USA)와 COX-2 cayman (Ann arbor, MI, USA)를 사용하였으며, \( \beta \)-actin과 2차항체인 anti-rabbit Ig-G horseradish peroxidase (HRP)-conjugated antibody는 Santa cruz사(CA, USA)에서 구입하였다. \( \mathrm { PGE } _ { 2 } \) 측정을 위한 ELISA kit는 R&D systems Inc. (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하여 실험에 사용하였다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>마우스의 대식세포주인 Raw 264.7 cell은 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받았으며, 세포배양을 위해 \( 10 \% \) FBS과 \( 1 \% \) penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지를 사용하였다. 세포는 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건에서 배양하였다.</p> <h2>MTT assay에 의한 세포 생존율 측정</h2> <p>애기뿔소똥구리에서 분리된 합성 펩타이드 CopA3에 대한 세포 독성 측정은 MTT 방법으로 분석하였다. Raw 264.7 cell \( 5 \times 10 ^ { 4 } \) cells/ ml를 96 well plate에 분주하고 CopA3를 농도 별 \( (5, 10, 25, 50, 100, 500 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } ) \)로 24시간 동안 처리하였다. Well당 \( 20 \mu 1 \)의 MTT용액을 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator 에서 4시간 동안 반응시킨 후, ELISA reader를 이용하여 540 \( \mathrm { nm } \)에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다.</p>