이 연구에서는 PM2.5 및 후보 물질의 효과를 분석하기 위해 hCEC 세포에서의 ROS 생성 변화를 DCF-DA 염색법을 사용하여 측정하였다. 또한, 미토콘드리아의 활성도를 측정하기 위해 MitoTracker Red 염색법을 사용하였다. 후보 물질이 PM2.5에 의한 DNA 손상에 대한 개선 효과를 확인하기 위해 PM2.5 단독 처리 또는 후보 물질 처리 후 PM2.5를 24시간 동안 배양하였다. DNA 손상 마크인 γ-H2AX와 인플라마솜 형성에 관여하는 ASC와 caspase-1의 발현을 면역 형광 검사법으로 조사하였다.
<h2>ROS 생성의 측정</h2> <p>\( \mathrm { PM } _ { 2.5 } \)및 후보 물질에 의한 hCEC세포에서의 ROS생성 변화를 측정하기 위해 \( 2 ^ {\prime } , 7 \) '-dichlorodihydrofluorescein di-acetate (DCF-DA)염색법을 이용하였다. 이를 위하여 상기와 동일한 조건에서 배양된 세포들을 모아 \( 10 \mu \mathrm { M } \)의 DCF-DA(Invitrogen) 용액을 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \)배양기에서 20분간 반응시킨 후, 형광현미경(EVOS FS Auto, Thermo Fisher Scientific, Bothell, WA, USA)을 이용하여 형광 강도를 관찰하였으며, 핵의 교차 염색을 위해서는 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI, \( 2.5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \); Thermo Fisher Scientific) 용액를 사용하였다.</p> <h2>미토콘드리아 활성 측정</h2> <p>\( \mathrm { PM } _ { 2.5 } \)와 각 후보 물질에 의한 미토콘드리아의 활성을 측정하기 위해 MitoTracker \( { } ^ {\circledR } \)Red 염색법을 적용하였다. 이를 위하여 제조사의 지침에 따라, 다양한 조건에서 배양된 세포를 대상으로 MitoTracker \( { } ^ { 8 } \) Red \( (100 \mathrm { nM } \), Thermo Fisher Scientific)을 처리하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20분 염색하고, phosphate buffer saline (PBS)로 2회 세척한 후 형광현미경하에서 관찰하였다.</p> <h2>DNA 손상 여부 조사</h2> <p>\( \mathrm { PM } _ { 2.5 } \)에 의한 DNA 손상에 대한 후보 물질의 개선 효과를 확인하기 위해 \( \mathrm { PM } _ { 2.5 } \)단독 또는 후보 물질 처리 1 시간 후 \( \mathrm { PM } _ { 2.5 } \) 를 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 처리가 완료된 후, 배양액을 수거하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 잔존해 있는 미세먼지를 제거한 후 8-hy-droxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG) enzyme-linked immuno-specific assay (ELISA) kit (Biovision, K4160-100, Milpitas, CA, USA)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 정량적인 평가를 수행하였다.</p> <h2>면역 형광 검사</h2> <p>DNA 손상 마크인 phosphorylated-H2A histone family member \( \mathrm { X } ( \gamma- \mathrm { H } 2 \mathrm { AX } ) \)및 인플라마솜의 형성에 관여하는 apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain (ASC) 및 caspase-1의 발현을 조사하기 위하여 면역 형광 검사법을 적용하였다. 이를 위하기 동일한 조건에서 배양된 세포를 100 \( \% \) 메탄올로 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분 동안 고정시켰다. PBS로 3번 세척 후, PBS-T \( (0.1 \% \)Triton \( \mathrm { X } \) )에 \( 5 \% \) bovine serum albumin (BSA, Sigma-Aldrich Chemical Co.)이 함유된 blocking buffer에 1시간 상온에 반응시키고 2.5 \( \% \) BSA로 희석한 \( \gamma- \mathrm { H } 2 \mathrm { AX } \), ASC 및 cas-pase-1 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA,USA)를 첨가하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 밤새 반응시킨 다음 PBS-T로 2회 10분간 세척하였다. 이후 1 \( \% \)BSA로 희석한 2차 항체(Alexa Fluor 488-labeled donkey anti-rabbit IgG, Thermo Fisher Scientific)를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, PBS-T로 2회 10분간 세척하였으며,DAPI 용액을 이용하여 핵을 염색하고 형광현미경을 이용 하여 각 항체에 대한 형광 강도를 분석하였다. Image-Pro Plus 6.0이미지 분석 소프트웨어(Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA)를 사용하여 각 이미지의 광학 밀도 를 측정하고 각 이미지의 평균 광학 밀도를 산출하였다.</p>