MVM DNA 정량을 위하여 Real-time PCR 방법의 신뢰성을 검증하였다. real-time PCR cycle 수에 따른 fluorescence값의 증가를 관찰한 결과로 민감도를 확인하였고, 서로 다른 날에 MVM 표준시료에서 추출한 DNA의 real-time PCR을 수행한 결과 MVM log titer와 crossing point 값 간의 회귀성이 매우 높았으며, 다른 parvovirus과 바이러스들과 bovine herpesvirus를 대상으로 특이성을 실험할 결과 MVM의 경우에만 fluorescence값의 증가를 관찰할 수 있었다.
<h2>Real-time PCR의 신뢰성 검증</h2> <p>MVM DNA 정량을 위한 real-time PCR 방법의 신뢰성(reliability)을 보증하기 위해 확립된 실험법의 민감도(sensitivity), 재현성(reproducibility), 특이성(specificity) 등을 검증하였다. 민감도를 측정하기 위해 titer가 \( 6 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { ~TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \)인 MVM을 순차적으로 10배씩 희석한 후 real-time PCR을 수행하였다. 각 시료에 대해 real-time PCR cycle 수에 따른 fluorescence값의 증가를 관찰한 결과 민감도는 \( 6 \times 10 ^ { -2 } \mathrm { ~TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \)임을 확인할 수 있었다(Fig. 3A). Melting curve 분석 결과 MVM DNA에 특이적인 부분과 primer dimer 등 비특이적인 부분으로 나뉘었으며, 완충용액 대조군에서는 MVM DNA에 특이적인 peak를 확인할 수 없었다(Fig. 3B). 증폭된 PCR 산물을 \( 1.5 \% \)(w/v) agarose gel을 사용하여 전기 영동한 결과 각 MVM 양성시료에서 예상 크기의 밴드를 확인할 수 있었지만, 완충용액 대조구에서는 PCR 산물을 확인할 수 없었다(자료 미제시).</p> <p>확립된 MVM DNA 정량법의 재현성 검증을 위해 서로 다른 날에 MVM 표준시료에서 DNA를 추출하고 real-time PCR을 수행한 후 crossing point 값을 비교하였다(Fig. 4). MVM log titer( \( \log _ { 10 } \mathrm { TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } ; \mathrm { x } \))에 대한 crossing point 값( \( \mathrm { y } \)) 간의 표준 회귀식은 첫째 날의 경우 \( \mathrm { y } =-3.077 \mathrm { x } + 28.75 \) (결정계수 \( \mathrm { r } ^ { 2 } =0.984 \)), 둘째 날의 경우 \( \mathrm { y } =-2.927 \mathrm { x } + 28.10 \)( \( r ^ { 2 } =0.976 \)), 셋째 날의 경우 \( \mathrm { y } =-2.974 \mathrm { x } + 28.42 \) ( \(r ^ { 2 } =0.977 \))로 MVM log titer와 crossing point 값 간의 회귀성이 매우 높았다.</p> <p>다른 parvovirus과 바이러스들(human parvovirus B19, bovine parvovirus, porcine parvovirus)과 DNA 바이러스인 bovine herpesvirus를 대상으로 특이성을 실험할 결과 MVM의 경우에만 fluorescence값의 증가를 관찰할 수 있었고, 다른 바이러스에서는 완충용액 음성 대조군과 같이 fluore-scence값의 증가를 관찰할 수 없었다(Fig. 5A). Real-time PCR 산물을 \( 1.5 \% \) agarose gel 상에서 분석한 결과 MVM 양성 대조군에서만 PCR 반응 산물이 생성되었고, 다른 바이러스와 완충용액 음성 대조군에서는 PCR 반응 산물이 생성되지 않았다(Fig. 5B). 이와 같은 결과에서 확립된 real-time PCR 방법은 MVM에 특이적인 실험법임을 확인하였다.</p>