VBNC 상태의 세포를 포획하기 위해 필터 멤브레인을 사용했다. 세포는 처음에 \(\mathrm{500~\mu M}\)의 구리 농도에 노출되었습니다. 그 후, \(\mathrm{500~\mu M}\) 구리 농도보다 5배 높은 농도의 EDTA로 세포를 처리하여 구리를 제거하였다. 그런 다음 세포를 \(\mathrm{NaCl}\) 용액에 현탁하고 Luria-Bertani 배지에 접종했습니다. 배양물을 \(\mathrm{25^\circ C}\) 및 \(\mathrm{3500~rpm}\)에서 분리시켰다. 이어서, 세포를 \(\mathrm{3500~rpm}\)에서 원심분리하여 수확하고, \(0.9 \%~\mathrm{NaCl}\) 및 \(\mathrm{500~\mu M ~CuSO_4}\)로 3회 세척하였다. LB 배지에 도포된 처리된 샘플 및 미생물 샘플을 포함하여 매일 샘플을 수집하였다. VBNC로 유도된 대장균을 \(37^\circ \mathrm{C}\) 배양기에서 2일간 배양하여 배양성을 확인하고 콜로니 형성인자(CFU)를 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용한 균주 및 VBNC 유도방법</h2> <p>실험에 사용된 균주는 E. coli KCTC 2134(생물자원센터, 한국생명공학연구원)이었다. Luria-Bertani 배지 (\(\mathrm{1 ~L}\)당 \( 10 \mathrm{~g} \) tryptone, \( 5 \mathrm{~g} \) yeast extract, \( 5 \mathrm{~g} \) sodium chloride)에서 E. coli를 접종하여 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서의 흡광도가(UV-1601 Shimadzu, Japan) 0.6 (exponential phase)이 될 때까지 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양한 후 \( 3500 \mathrm{~rpm} \)에서 원심 분리하여 균체를 수확하였다. 분리된 균체를 \( 0.9 \% ~\mathrm{NaCl} \)로 3회 세척하고 각각 \( 20 \mathrm{~mL} \)의 \( 0.9 \%~ \mathrm{NaCl}\left(500 \mu \mathrm{M}\right. \)의 \( \mathrm{CuSO}_{4} \)를 처리한 것과 처리하지 않은 시료를 따로 준비)에 \( 1 \sim 2 \times 10^{8} \mathrm{cells} / \mathrm{mL} \) 되도록 현탁한 후 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 진탕하였다. 정해진 시간 간격으로 시료를 채취하여 배양성 (culturability)과 생육력(viability)을 결정하였다. 실험은 3회 반복하여 평균치를 결과로 사용하였다.</p> <h2>VBNC 확인을 위한 배양성과 생육력 결정</h2> <p>VBNC 유도된 E. coli의 배양성을 확인하기 위하여 집락 형성계수(colony forming unit, CFU)를 결정하였다. \(500 \mu \mathrm{M} \)의 \( \mathrm{CuSO}_{4} \)를 처리한 시료와 대조군으로 \( \mathrm{CuSO}_{4} \)를 처리하지 않은 미생물 시료를 매일 일정량 채취하여 배지 당 100-200 개의 집락이 생성될 수 있도록 적당히 희석하여 LB 배지에 도말하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 이틀간 배양한 후 그 수를 직접 계수하였다.</p> <p>생육력은 LIVE/DEAD BacLight bacterial viability kit (Molecular Probes Inc, Eugene, Oreg.)를 사용하여 결정하였다. \( 1 \mu \mathrm{L} \)의 SYTO9 nucleic acid stain \( (3.34 \mathrm{mM}) \)과 \( 1 \mu \mathrm{L} \)의 Propidium iodide \( (20 \mathrm{mM}) \)를 시료 \( \left(10^{6} \mathrm{cells} / \mathrm{mL}\right) \)에 처리한 후, 실온에서 빛을 차단하고 15분 이상 반응시킨 후 Flow cytometer(CyFlow, Partec, Germany)를 사용하여 계수하였다. Forward scattering과 side scattering을 이용해 대장균만을 선별하고 FL1 (녹색형광)과 FL3 (빨간색형광)을 이용해 각각 염색된 세포를 계수하였다.</p> <h2>DNA, RNA 정제</h2> <p>\( \mathrm{CuSO}_{4} \)를 처리한 E. coli 배양액으로부터 날짜별로 \( 2 \mathrm{~mL} \)의 시료를 채취한 후 \( 3500 \mathrm{rpm} \)에서 균체를 분리하였다. 그 후 DNeasy Tissue-Kit와 RNeasy mini kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 DNA와 RNA를 각각 정제한 후 \( 1 \% \) agarose gel에서 전기영동하여 DNA와 RNA의 상태를 관찰하였다.</p> <h2>투과전자현미경(Transmission Electron Microscope)</h2> <p>\( 500 \mu \mathrm{M} \mathrm{CuSO} \)를 처리하여 VBNC 를 유도한 지 6일과 12일이 지난 시료의 형태를 관찰하기 위해 대장균 시료를 \( 2.5 \% \) glutaraldehyde(\( \mathrm{pH} ~7.3\))을 포함하는 \( 0.1 \mathrm{M} \) phosphate buffer에서 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 동안 고정하였다. 그 후 시료를 \( 1 \% \) osmium tetroxide로 후고정하고 Epon812에 embed한 후, ultramicrotome(Leica ultracut-cut, Germany)과 diamond knife(Diatome, Switzerland)로 얇게 잘라 uranyl acetate로 염색한 후 한국기초과학연구원의 생물전용 투과전자현미경인 Tecnai \( \mathrm{G}^{2} \) SPIRIT TWIN electron microscope(FEI, USA)를 사용하여 \( 120 \mathrm{kV} \) 전압으로 관찰하였다.</p> <h2>세포 소생</h2> <p>여과막(cellulose nitrate, \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) pore size, Whatman, USA)을 사용하여 VBNC 상태의 균체를 모으고 \( 500 \mu \mathrm{M} \) 구리 농도의 5배의 EDTA를 처리하여 구리를 제거한 후 \( 0.9 \%~ \mathrm{NaCl} \) 에 현탁하고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 진탕 배양하였다. 다양한 시간간격으로 시료를 채취하여 LB 고체 배지에 균체를 도말하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 이틀간 배양한 후 세포소생을 관찰하였다.</p>