ESBL 생성 Klebsiella pneumoniae 균주를 대상으로 생화학적 시험하고 동정하였다. ESBL 효소를 만들어내는 유전형 분석을 위해서 중합효소 연쇄반응을 확인하였다. 이때 이중디스크 확산법을 사용하였으며, TEM형, SHV형, CTX-M형의 유전자 염기서열을 이용하여 생성물을 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>대상균주</h2><p>부산시내 소재 종합병원 내과에서 미생물검사실로 의뢰된 객담 검체에서 분리된 ESBL 생성 Klebsiella pneumoniae 균주 (Strain No. 60031)를 대상으로 하였다. 균주의 동정은 VITEK (Vitek System, Hazelwood Inc., MO)의 GNI card에 시험균을 접종하여 생화학적 시험을 하고 동정하였다.</p><h2>이중디스크 확산법(Double disk synergy test)</h2><p>McFarland No. 0.5 농도에 맞춘 신선한 균 부유액을 멸균된 면봉으로 적셔 미리 만든 \( 4 \mathrm{~mm} \) 두께의 Mueller-Hinton (MHA) 평판배지에 고르게 도말 하였다. 이 평판배지의 중앙에 ticarcillin/clavulanate (\( 75/10 \mu \mathrm{g} \), Becton Dickinson, USA) 디스크를 얹어 놓고 그 주변 \( 1.5 \mathrm{cm} \) 간격에 cefotaxime \( (30 \mu \mathrm{g}) \), ceftazidime \( (30 \mu \mathrm{g}) \), ceftriaxone \( (30 \mu \mathrm{g}) \) 디스크를 올려놓아 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 18시간 배양한 후에 억제대의 형태를 관찰하여 상승효과 (synergism)를 판정하였다.</p><h2>PCR (polymerase chain reaction)</h2><p>ESBL 효소를 생성하는 유전형의 분석을 위해 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 시험균주를 TS 액체배지(tryptic soy broth)에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 18시간 배양하여 \( 10,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심한 후 침전물을 AccPrep \( { }^{\circledR} \) plasmid extraction kit (BIONEER Co. Ltd. Korea)를 이용하여 plasmid DNA를 추출하여 주형으로 사용하였다. 중합효소 연쇄반응에 의한 ESBL형 감별 시험에 사용한 primer는 Table 1에 나타내었다. TEM형, SHV형, CTX-M형의 \( \beta \)-lactamase 유전자의 염기서열은 GenBank(http://www.nlm.nih.gov)에서 찾아서 oli-gonucleotides를 제작하였다.</p><p>PCR에 사용된 시약은 AccuPower PCR Premix Kit (BIONEER Co. Ltd. Korea)를 사용하였는데, 키트의 시약 조성은 Tris-HCI \(\mathrm{pH} ~ 9.0\) \( 10 \mathrm{mM} \), dNTP \( 250 \mu \mathrm{M} \), Taq DNA polymerase \( 1 \mathrm{U}\), KCl \(40\mathrm{mM}\), \(~ \mathrm{{MgCl}_2} ~ 1.5 \mathrm{mM} \), stabilizer and tracking dye 이었으며, 여기에 primer \( (10 \mathrm{pmol} / \mu \mathrm{l}) \) 를 각각 \( 1 \mu \mathrm{l} \), template DNA \( 8 \mu \mathrm{l}\) 3차 증류수 \( 10 \mu \mathrm{l}\) 를 가하여 총량이 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 되게 맞춘 후 사용하였다. PCR 기기는 \( \mathrm{Mycycler}^{\mathrm{PM}} \) ThermalCycler (Bio-rad. USA)를 사용하였다. TEM type의 PCR 반응 조건은 redenaturation을 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분간 시행 후 denaturation은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, annealing은 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)에서 90초, extension은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 분으로 하여 30 cycle을 실시하였다. Final extension은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분으로 하였다. SHV type의 PCR의 경우 predenaturation을 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 시행 후 de-naturation은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, annealing은 \( 58^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60 초, ex-tension은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 분으로 하여 30 cycle을 실시하였다. Final extension은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3 분으로 하였다. CTX-M type은 predenaturation을 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5 분간 시행 후 denaturation은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, annealing은 \( 58^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60 초, extension은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분으로 하여 30 cycle을 실시하였다. Final extension은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분으로 하였다. 반응이 끝난 PCR 생성물은 \( 1.5 \% \) agarose gel에서 100 volt로 25분간 전기영동한 후 ethidium bromide로 염색하여 UV transilluminator로 생성물을 확인하였다.</p>