본 연구의 투과성 분석 실험은 세 번 이상 수행하였으며, 선별된 peptide의 투과활성을 확인하기 위해서 FITC가 fusion 된 것을 확인하기 위해서 투과된 phage의 수를 측정하여 비교하였으며 In vitro의 각질 투과성 분석 측정하고자 하는 원료의 각질 투과성을 분석하기 하였다.
<h2>선별된 peptide의 투과성 확인</h2> <p>In vitro 각질 투과성 분석 측정하고자 하는 원료의 각질 투과성을 분석하기 위해서 Franz glass cell (Standard 직경 \( 9 \mathrm{~mm} \), Receiver \( 5 \mathrm{ml} \), Permegear)을 이용하였다. Glass cell의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(\( 0.7 \mathrm{~mm} \) 두께, Medikinetics)를 장착하였다. 하단에는 각각 \( 500 \mu \mathrm{l} \)와 \( 5 \mathrm{ml} \)의 TBS (\(50 \mathrm{mM}\) Tris \( \mathrm{pH~} 7.5,150 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{NaCl} \)) 용액에 \( 1 \% \) BSA (Sigma), \(0.01\%\) Tween 20을 녹여서 사용하였다. 먼저 Phage의 경우, 선별된 phage들의 피부 투과성을 확인하기 위해서 투과된 phage의 수를 측정하여 비교하였다. 처리하는 phage의 수를 \( 10^{10} \)개로 일정하게 맞추어서 처리하였다. \( 16 \mathrm{~h} \) 반응 후에 투과하여 Receiver에 있는 Phage의 수를 측정하였다. 이를 위해 ER2738 배양액에 \( 300 \mu \mathrm{l} \)에 Receiver의 TBS \( 20 \mu \mathrm{l} \)에 녹아있는 phage를 처리한 뒤, 이를 TOP agar \( 4 \mathrm{ml} \)에 섞은 후 LB/X-gal/IPTG plate 상단에 처리하고 \( 16 \mathrm{~h} \) 추가 배양한 뒤 blue colony의 수를 counting하였다. 선별된 peptide의 투과활성을 확인하기 위해서 FITC가 fusion 된 peptide를 사용하였다. 비교대상의 peptide를 \( 1 \mu \mathrm{g} \)씩 donor chamber에 처리하고 receiver chamber에 투과된 Peptide의 양을 Victor fluorescence analyzer를 이용하여 FITC의 intensity를 정량하였다.</p> <h2>Penetration imaging</h2> <p>선별된 peptide의 투과활성을 확인하기 위해서 FITC가 fusion 된 peptide를 사용하였다. 비교대상의 peptide를 \( 1 \mu \mathrm{g} \)씩 Porcine skin의 표면에 처리하였다. Skin을 \( 1 \mathrm{~cm} \times 1 \mathrm{~cm} \)크기로 절단하여 사용하였다. 이후 6 well의 바닥에 거즈를 깔고 PBS를 포함하여 습윤한 환경을 유지하였고, Petide가 도포된 Porcine skin을 두고 \( 24 \mathrm{~h} \) incubation 하였다. 이후 면봉으로 표면을 세정하였고, D-square sampling tape으로 각질을 3회 제거하였다. 이후 two-photon confocal microscopic 장비(IVIM technology)를 이용하여 표면에서부터 \( 5 \mu \mathrm{m} \) 간격으로 피부 속까지 FITC를 이미징하였다. 이후 5군데를 랜덤하게 선정하여 FITC의 강도를 수치화 하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>본 연구의 투과성 분석 실험은 세 번 이상 수행하였으며, 이때 결과 값들은 mean\( \pm \)standard deviation (S.D.)으로 나타내었다. 실험군에 따른 데이터 사이의 통계적 유의성 검정은 two-tailed Student's t-test를 통하여 검증하였고, p값이 0.05 이하일 경우 통계학적으로 유의적인 차이가 있는 것으로 판단하였다.</p>