효모를 각각의 다양한 탄소원에 같은 농도로 배양한 후에 각각 나눈 후 또 그 균주가 대수 증식기에 있을 때 그를 subculture하여 UV spectrophotometer OD600nm에서 관찰하고 Bacillus subtilis를 LB배지에 배양시켜 항균 활성을 알아본다. 처음에 배양된 시료는 원심분리를 해서 상층액을 이용하여 총 분비단백질을 측정하고 광학밀도 UV spectrophotometer OD280nm를 측정한다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주, 배양 배지 및 성장곡선</h2> <p>균주는 발현 플라스미드 pAUR Leuco A를 lithium acetate법에 의해 효모 세포(Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763)에 형질 전환 하여 사용 하였다. 효모의 배양을 위한 배지 조건은 \(2\%\) polypeptone, \(1\%\) yeast extract로 고정한 후, 다양한 탄소원(fructose, glycerol, glucose, sucrose)을 \( 2 \% \) 로 사용하여 배양하였다 \( \left(30^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm}\right) \). Leucocin A를 생산하는 형질 전환된 효모는 전 배양을 aureobacidine A (Takara, Japan)의 최종 농도가 최종농도가 \( 0.2 \mu \mathrm{l} / \mathrm{ml} \) 가 되도록 첨가된 \( 5 \mathrm{ml} \) 배지에서 실시하였다. 전배양이 대수 증식기(OD600 7.5에서 8)에 도달했을 때 탄소원이 각각 다른 \( 50 \mathrm{ml} \) 에 본 배양 시켰다. 균주가 대수 증식기에 있을 때 subculture 하였다. 시간에 따른 형질 전환된 효모 균주의 성장 양상을 UV spectrophotometer \( OD600 \mathrm{~nm}) \) 을 이용하여 측정 하였고 Bacillus subtilis (ATCC 6633)을 LB 배지 \( (0.5 \% \) yeast ex-tract, \(1 \% \mathrm{NaCl}\), \(1 \%\) bacto tryptone)에 배양 시켜 \( ( 30^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm} \) ) 항균 활성을 알아보았다.</p> <h2>총 분비 단백질량과 단백질 분해효소 활성 측정</h2> <p>배양 시료률 원심분리 \( (6000 \mathrm{rpm}, 5 \mathrm{~min}) \) 하여 얻은 상층액을 이용하여 총 분비단백질(Bradford assay, Bio-rad, USA) 단백질 분해효소 및 항균활성을 구하였다. Protease 활성 추정을 위해 상층액 \(200 \mu \mathrm{l}\)와 \( 1 \% \) casein \( (0.2 \mathrm{~M} \) Tris-HCl buffer, \( \mathrm{pH} \) 5.8) 용액 \(200 \mu \mathrm{l}\)를 섞은 후 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 시간 반응시켰다. 이후 \( 0.4 \mathrm{M} \) trichloroacetic acid (TCA) \( 600 \mu \mathrm{l} \)을 섞어 5 분간 반응시키고 원심분리 \( (6000 \mathrm{rpm}, 5 \mathrm{~min}) \) 하여 상층액의 광학밀도를 측정하였다 \( (OD280 \mathrm{~nm}) \).</p> <h2>항균활성 측정</h2> <p>배양액 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 원심분리\( \left(4^{\circ} \mathrm{C}, 6000 \mathrm{rpm}, 5 \mathrm{~min}\right) \) 한 후 cell pellet을 제외한 상층액을 이용하여 항균활성을 촉정하였다. 먼저 탄소원을 달리한 시료의 상등액을 이용, 액체 배지에서 항균 활성을 측정 하였다. 상등액 \(250 \mu \mathrm{l}\)와 멸균수 \( 450 \mu \mathrm{l},4 \times \) 배지 \(250 \mu \mathrm{l}\)에 B. subtilis \(50 \mu \mathrm{l}\)를 접종 한 뒤, \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm}\) 에서 접종 직후와 접종 후 12 시간 배양한 뒤 \( OD600 \mathrm{~nm} \) 를 측정하여 배양 전후의 광학밀도 차를 계산하였다.</p>