Kanamycin 농도가 높아질수록 배 유도 발생에 심각한 영향을 주는 것으로 나타났다. Kanamycin 농도 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)에서 배 발생율이 4배 이하로 떨어겼으며 \( 100 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)에서는 Kanamycin 처리하지 않은 실험구 보다 약 10배 이상으로 배발생이 저해되었다. 배양 28일 째의 배 발생에서는 Cefotaxime \( 200 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)에서의 처리가 Cefotaxime \( 0 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)에서의 실험구 보다 약 4배 정도의 감소를 나타냄으로서 Agrobacterium 의 오염을 제거하고자 Cefotaxime을 200 \( \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 이상으로 사용하면 배발생이 감소될 것이라 관측된다. 형질전환체의 selection pressure와 Agrobacterium 의 오염 제거를 위하여 공동으로 Kanamycin과 Cefotaxime을 사용한다면 배발생 유도가 어렵다고 보이므로 GFP reporter gene을 사용하는 것이 좋다고 보인다. 소포자는 배양 12일째 소포자 분열으로 cluster를 형성, 24일째 반복되는 분열을 통하여 큰 mass로 변해있는 배가 관측된다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Kanamycin과 Cefotaxime 농도에 따른 소포자 활력조사</h2> <p>형질전환에 사용한 벡터 pmGFP5-ER에는 선발 마커인 NPTII 유전자를 함유하고 있어서 전처리 과정을 거친 소포자에 Kanamycin 적응력을 시험하고자 0,5,10,20,50,100 \( \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 농도로 처리 하였다. 밀도가 \( 2 \times 10^{5} / \mathrm{mL} \)인 소포자를 90x \( 15 \mathrm{~mm} \) Petri dish에 \( 8 \mathrm{ml} \) 씩 분주한 후 2일간 배양하였을 때 Kanamycin 농도에 상관없이 소포자 활력이 동일하게 나타났다. 배양 6일째는 농도가 Kanamycin \( 20 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 이후서부터 소포자 활력이 2배 이상 감소되었다. 배양 28일 후 최종 배 유도의 수를 조사 한 결과 Kanamycin 농도가 높아질수록 배 유도 발생에 심각한 영향을 주는 것으로 나타났다. Kanamycin 농도 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)에서 배 발생율이 4배 이하로 떨어겼으며 \( 100 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)에서는 Kanamycin 처리하지 않은 실험구 보다 약 10배 이상으로 배발생이 저해되었다. 일반적으로 자엽이나 배축을 이용하여 Kanamycin 처리를 해서 항생제 적응 실험을 한 경우 Kanamycin 농도를 \( 100 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)로 처리하면 \( 0 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)에 비해 신초발생율이 약 \( 90-100 \% \) 정도 감소한다. 그리고 Kanamycin 농도 \( 60-80 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)에서 고정하여 신초발생을 유도하면 신초발생율이 약 \( 20-50 \% \) 정도 유지되면서 형질전환율도 안정된다. 반면에 소포자 배양시 Kanamycin을 이용하여 selection하는 경우, Kanamycin 농도 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 정도에도 약 8배 정도 배발생이 감소됨으로서 selection pressure가 매우 높기 때문에 소포자 배양에 Kanamycin을 이용한 선발은 쉽지 않을 것으로 사려된다.</p> <p>Agrobacterium의 오염 및 성장을 억제시키기 위한 Cefotaxime 은 \( 0,50,100,200 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 농도로 처리하였다. 각각의 처리구에 대하여 배양 2일째와 6일째에 소포자의 할력을 조사하였다. 소포자를 2, 6일 각각 배양하였을 때 소포자 활력의 차이는 거의 없었다. 그러나 배양 28일 째의 배 발생에서는 Cefotaxime \( 200 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)에서의 처리가 Cefotaxime \( 0 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)에서의 실험구 보다 약 4배 정도의 감소를 나타냄으로서 Agrobacterium 의 오염을 제거하고자 Cefotaxime을 200 \( \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 이상으로 사용하면 배발생 유도가 감소할 것으로 사려 된다. 따라서 형질전환체의 selection pressure와 Agrobacterium 의 오염 제거를 위하여 공동으로 Kanamycin과 Cefotaxime을 사용할 경우 배발생 유도가 쉽지 않을 것으로 판단되며 이를 극복하기 위해서 Kanamycin을 이용한 선발 배양 보다는 GFP reporter gene을 사용하여 선발하는 것이 바람직하다.</p> <h2>Agrobacterium을 이용한 소포자 형질전환</h2> <p>목원대 김문자교수 실험실에서 성공적으로 구축한 고추 소포자를 이용한 배발생 시스템을 답습하여 본 실험실에서 소포자 배 발생을 재현하였고 고추 육묘까지 만들었다. 이런 시스템에다 Agrobacterium 공동배양을 적용하여 소포자에 Agrobacterium-mediated genetic transformation이 가능 한지를 조사하기 위하여 소포자 형질전환을 구축하고자 하였다. 형질전환에 사용한 벡터는 GFP 유전자가 함유된 pmGFP5-ER이며 Agrobacterium 과 공동배양 후 배발생 유도 배지에서 치상한 후 소포자가 배로 발생하는 과정을 현미경으로 조사하였다. 소포자는 배양 12일 째서부터 소포자 분열으로 cluster를 형성하였으며 24일째에는 반복되는 분열을 통하여 큰 mass로 변해있는 배로 발달된 모습을 볼 수 있었다.</p> <P>\( 0.5 \times 10^{5} / \mathrm{mL} \) 농도인 소포자를 \( 90 \times 15 \mathrm{~mm} \) petri-disch에 \( 8 \mathrm{~mL} \) 씩 총 40 개 plate를 배양하여 screen 하였다. 소포자로부터 4일, 8일, 24일, 48일째 배발생 과정을 관찰하면서 GFP filter를 이용하여 GFP 발현을 조사하였다. 40개 plate를 조사 한 결과 총 120개의 소포자에서 GFP 발현을 볼 수 있었다. Figure 5에서 보는 것처럼 non-transformed 소포자 (24일째)는 GFP filter에서 GFP 발현이 관찰되지 않았으며 형질전환을 시킨 실험구에서는 4일째서부터 GFP filter를 통하여 GFP 가 관찰되었다. 8일째 cluster에서는 GFP 발현이 뚜렷하게 보이며 24일째 초기 유도배에서는 전 부위가 GFP로 발현되었다.</p> <P>Agrobacterium 공동배양 이후 48일째 된 배 총 18개가 정상적으로 성장을 하지 못하는 미성숙배로 관찰되었다. 이들 중에서 GFP 발현이 계속 유지되는 배는 8개 이었으며 같은 배지에서 나머지 10개의 배는 GFP 발현이 되지 않았다. 따라서 GFP 발현된 미성숙 배는 GFP gene이 삽입된 것이며 GFP 발현이 되지 않은 미성숙배는 유전자 삽입이 되지 않은 것으로 사려 된다.</p> <P>GFP 발현이 미성숙배에서 확실하게 나타남과 동시에 여러 개체가 발견됨으로서 재현성이 있다는 결론이다. 따라서 본 논문은 GFP 유전자가 Agrobacterium 공동배양에 의해서 소포자에 삽입되어 소포자 형질전환이 가능하다는 고무적 인 결과를 보여주고 있다. 그러나 미성숙배는 더 이상 자라지 않고 그 상태에서 성숙이 멈추었기에 그 이후의 정상적인 배 발생 조건이 필요하며 실제로 배를 통한 고추의 재분화를 구축하고 PCR과 Southern 등을 통해서 형질전환체임을 증명해야 할 것이다.</p>