DPB11은 DNA 복제에 직접 관여하지 않고, DNA 복제와 관련된 효소 등에 결합하여 S기 Check-point에 관여할 수 있다. DPB11은 DPB2와 결합하여 S기 Check-point 기능을 수행할 가능성이 있으며, Two-hybrid 시스템의 결과로 두 단백질 간 상호작용이 시사된다. 이 결과는 양성 반응 가능성과 결합의 저해 가능성을 고려할 수 있으며, DPB11과 DPB2의 결합은 약한 결합을 나타낼 수 있다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>DPB 11의 전사수준은 세포주기를 통해 일정하게 발현된다.</h2> <p>DNA 중합효소를 포함한 S기에 작용하는 많은 유전자들은 세포주기에 따라 그 전사수준의 변동을 나타내며, 대부분 G1/S기 경계에서 그 발현이 최고점에 이르게 된다. DNA 중합효소 Ⅱ(\( \varepsilon \))의 두 번째 subunit인 DPB2 유전자 역시 이러한 전사수준을 나타내며, 변이주인 dpb2-1의 multi-copy suppressor로서 Araki 등에 의해 DPB11 유전자가 보고되었다. 이러한 DPB11 유전자의 세포주기 중 전사수준을 조사하였는데, 먼저 elutriation법에 의하여 동조시킨 출아효모 세포를 사용하여 세포주기의 각 시기 별로 RNA를 추출하여 조사하였다. Northern blot analysis의 대조군으로서 세포주기 중 G1\S기에서 발현이 최고점을 나타내는 POL2와 S기에서 발현이 최대화되는 Histone 2B 그리고 발현량의 변동을 나타내지 않고 전사수준이 일정하게 나타나는 Protein 1을 사용하였다.</p> <p>Fig. 1에서 보여주는 것과 같이 DPB11 유전자의 전사수준은 대조군의 Protein 1과 같이 세포주기를 통해 그 전사수준이 변동하지 않았다. 이러한 결과는 분열효모에서 DNA 염기배열에서 상동성을 지니며 기능상 유사성을 나타내는 Cut5 유전자의 전사수준과 동일하게 나타났다. 따라서, DPB11은 S기의 DNA 복제과정에 직접 관여하지 않고 DNA 복제에 관련된 효소 등에 결합하여 S기 Check-point에 관여할 가능성을 나타내었다. 그러므로 유전적 상호작용이 밝혀진 DPB2와의 단백질간 상호작용을 two hybrid analysis를 통하여 조사하였다.<h2>Dpb2와 Dpb11 단백질 간의 물리적 상호 결합</h2> <p>dpb2-1 변이주에 대한 DPB11 유전자의 multi-copy sup-pression의 결과는 DPB2와 DPB11 두 유전자 사이의 유전학적 상호작용을 시사한다. 또한 DPB11 유전자는 HU(hydroxyurea)와 같은 S기 저해물질에 대해서도 감수성을 나타내었다. 유전자의 발현에 있어서도 DPB2 유전자 산물은 세포주기동안 각 시기에 따른 전사수준의 변동을 보이지만, DPB11 유전자 산물은 Fig. 1에서 보여주는 것과 같이 일정한 발현량을 나타낸다. 이러한 결과를 미루어 DPB 11의 기능은 DNA 복제 메카니즘에 속한 DPB2와 같은 유전자와 직접 결합하여 S기 checkpoint 기능을 수행할 가능성이 시사된다. 이러한 가능성을 조사하기 위해 출아 효모의 two-hybrid system을 이용하여 in vivo 상 두 단백질 사이의 상호결합을 조사하였다. Two-hybrid analysis에 이용된 plasmid는 재료 및 방법에서 전술한 것과 같이 Gal4 의 binding domain(pAS1)과 activation domain(pACT Ⅱ)을 지닌 plasmid 내에 Table 2의 primer를 이용하여 PCR을 수행하여 얻은 각 ORF를 삽입하여 제작하였다. 실험대조군으로서 pAS1과 pACTⅡ plasmid만 들어있는 형 질전환체(Fig. 2-①)와 각 DPB2 와 DPB11의 한 쪽만을 지닌 plasmid가 형질전환된 균주(Fig. 2-② ~⑤), 그리고 두 단백 질 사이의 상호결합이 알려진 양성 대조군으로 SNF1과 SNF4 plasmid(pSE1111과 pSE1112)의 형질전환체(Fig. 2-⑥)을 사용하였다. 또한 Dpb2와 Dpb11의 각 단백질이 상호간 이량체를 형성하는가를 조사하기 위해 pAS1/DPB2 와 pACTП/DPB2가 형질전환된 균주(Fig. 2-⑦)와 pAS1/ DPB11 과 pACT Ⅱ/ DPB11이 형질전환된 균주(Fig. 2-⑩)를 조사하였다. Dpb2와 Dpb11 두 단백질 사이의 상호결합을 조사하기 위해 서로 Gal4 binding domain과 activation damain을 바꾸어 만든 plasmid를 형질전환(Fig. 2-⑧, ⑨)하여 조사하였다.</p> <p>Fig. 2의 결과는 각 형질전환체를 \( 25~ \mathrm{mM} \)의 3-AT를 포함한 SD-His 선택배지에 streaking하여 성장을 조사한 것이다. 그 결과 대조군으로 사용한 ①~⑤의 균주에서는 SD-His\(+ 25~ \mathrm{mM} \) 3-AT 배지에서 낮은 성장률을 나타냈으며, 양성 대조군으로 이용된 SNF1과 SNF4의 결합은 ⑥에서 보이는 것과 같은 좋은 성장을 나타내었다. 단백질간 이량체를 조사한 결과에서 Dpb11 단백질(Fig. 2-⑩) 사이에는 상호 이량체를 형성하지 않는 것으로 나타났으나, Fig. 2-⑦에서 보여주는 것과 같이 Dpb2 단백질은 이량체 형성으로 Dpb2 단백질 사이에는 결합력을 지니는 것으로 나타났다. Dpb2-Dpb11 두 단백질 사이의 상호결합은 비록 Fig. 2-⑨에서는 SD-His \( +25~ \mathrm{mM} \) 3-AT의 선택배지에서 낮은 성장을 나타내었으나 Fig. 2-⑧에서는 양성 대조군과 같은 높은 성장을 나타내므로 두 단벡질 사이의 상호작용을 시사한다.</p> <p>Table 3은 단백질 사이의 상호결합을 \( \beta \)-galactosidase의 활성 측정에 의해 산정한 수치를 unit로 나타내었다. Table 3에 사용된 각 형질전환체는 Fig. 2와 동일한 것으로 ⑧의 pAS1/DPB2-pACTDPPB11의 결합에 의한 활성은 양성대조군 SNF1-SNF4와 유사한 값을 나타내었다. 그러나 융합 단백질을 상호 융합 단백질을 바꾸어 결합시킨 pAS1/DPB11-pACTⅡ/DPB2의 경우에는 활성 값이 낮게 나타나 Fig. 2와 동일한 결과를 나타내었다. 이러한 결과의 차이는 Dpb2 와 Dpb11 단백질이 Gal4의 binding domain 혹은 activation domain과 결합하여 만들어진 융합 단백질이므로 융합 위치에 따라 단벡질간 상호 작용이 저해될 가능성을 시사한다. 또 다른 가능성으로는 각 plasmid 내에 삽입된 유전자에서 만들어지는 단백질의 발현량이 한 쪽으로 편중되는 경우에도 이와 같은 결과가 얻어질 수 있다.</p> <h2>효모세포 내에서의 Gal4-HA-Dpb11 단백질의 발현 조사</h2> <p>Two-hybrid system에 의해 산출된 결과는 비특이적 결합에 의한 양성 반응의 가능성 및 융합 단백질 구조상의 문제 혹은 단백질 발현의 불균형 등으로 나타나는 결합의 저해를 생각할 수 있다. Fig. 2와 Table 3의 결과에서 비특이적 결합의 가능성을 알아보기 위해 Gal-HA와 Gal-HA-Dpb2 혹은 Gal-HA-Dpb11을 조사하여 형질전환을 수행하였으나 비특이적인 높은 결합력은 나타내지 않았다. 따라서 pAS1\DPB2-pACT Ⅱ\DPB11의 구조는 결합하지만 pAS1/ DPB11-pACTⅡ/DPB2의 구조로는 결합 저해가 일어날 가능성과 단백질 발현량의 불균형도 생각되어지므로, 먼저 각 플라스미드를 지닌 형질전환체에서 단백질 발현을 조사하였다. Fig. 3에서 나타내는 것과 같이 pAS1/DPB11(lane 3)를 지닌 균주에서의 Dpb11단백질의 발현은 pACT Ⅱ Dpb11 및 Dpb 2 단백질의 발현량에 비헤 약 10배 이하의 적은 단백질만이 anti-HA monocional antibody에 의해 검출되었다. 결과적으로 pAS1/DPB11에 의한 DPB 11단백질의 pACTⅡ/DPB2에 비해 매우 적은 양으로 발현되어 pAS1/DPB2와 pACTⅡ/DPB11의 결합보다 매우 약한 결합을 나타내었을 가능성을 시사한다.</p>