본 논문에서는 균 분리, 다른 Vibrio spp.에 대한 저해 능, 생육 저해물질 생산에 영향을 미치는 인자, 생육도 및 생육저해물질 최고생성시간 등에 대한 연구를 진행하였다. 최적조건으로 조절한 기본배지에 여러 가지 금속이온을 \( 0.05 \% \) 농도별로 첨가하여 배양한 결과 \( \mathrm{Mg}^{+2}\), \(\mathrm{Ca}^{+2} \)를 함유하는 배지에서 활성이 나타났다. 그 중에서 \( \mathrm{Mg}^{+2} \)을 함유하는 배지에서 가장 높은 활성을 나타내었다는 결과를 확인할 수 있었다.
<h1>결 과</h1><h2>균 분리</h2><p>해산어의 여러 부위의 장, 피부, 아가미에서 다종의 균을 분리하여 VNSS 액체배지에서 1차로 20여종의 균을 분리한 결과 방어에서 분리된 균이 nutrient 한천 배지 상에서 V. anguilla-rum NCMB1에 대해 투명환이 생성되어 저해능력을 가지고 있다고 판단되어 이를 동정하기 위하여 미생물 자동 동정 분석기로 동정한 결과 \( 95\% \) 이상의 높은 유사값으로 Bacillus amyloli-quefaciens로 확인되어 B. amyloliquefaciens H41으로 명명하고 표준균주인 B. amyloliquefaciens KCTC1724와 특성을 비교한 후 사용하였다.</p><h2>저해물질 생성 확인</h2><p>분리 균주인 B. amyloliquefaciens H41과 표준균주인 B. amyloliquefaciens KCTC1724 균주를 paper-disk 법을 사용하여 투명환의 생성여부로 V. anguillarum 생육 저해능의 유무를 비교한 결과 Fig. 1에서 보는 바와 같이 분리 균주인 B. amyloliquefaciens H41에서 만이 투명환을 나타내어 저해능이 있는 것을 관찰할 수 있었다. 이 과정에서 배양 상등액에서는 투명환이 확인되었으나 파쇄한 균체 액에서는 확인할 수 없어 이후 배양 상등액 만을 사용하였다.</p><h2>다른 Vibrio spp.에 대한 저해 능</h2><p>B. amyloliquefaciens H41의 다른 Vibrio spp.에 대한 저해능 비교에서는 병원균으로 알려진 V. fluvialis, V. parahaemolyticus, V. furnissi, V. mimicus, V. vulnificus 등을 대상으로 저해능을 실험해본 결과 V. anguillarum NCMB1에만 저해 능을 나타내는 것을 관찰할 수 있었다.</p><h2>생육 저해물질 생산에 영향을 미치는 인자</h2><p>균의 증식용으로는 peptone 배지를 기본배지로 하고 저해 물질의 생산에 영향을 미치는 인자로 다음과 같은 조성을 적용하였다.</p><h2>초기 \( \mathrm{pH}\), \(\mathrm{NaCl} \) 농도</h2><p>기본배지에 \( \mathrm{pH} \)를 각각 달리하여 저해 군의 특성을 비교한 결과 Fig. 2에서 나타난 바와 같이 \( \mathrm{pH} 7.5 \)에서 가장 높은 생육을 나타내었으며 생육저해물질의 활성을 측정해 본 결과, \( \mathrm{pH} 7.5 \)에서 가장 활성이 좋은 것으로 나타나 생육저해물질 생산을 위해 이후의 과정에서는 이 범위를 적용하였다.</p><p>B. amyloliquefaciens H41의 생육도 및 생육저해 물질의 생산에 \( \mathrm{NaCl} \)이 영향을 미칠 것으로 판단되어 \( \mathrm{pH} 7.5 \)로 조정한 기본 배지에 \( \mathrm{NaCl} \)의 농도를 각기 달리하여 배양한 후 생육저해 균의 생육도와 생육저해물질 생산 정도를 측정하였다. Fig, 3에서 보는 바와 같이 \( 0.5 \% \mathrm{~NaCl} \) 농도일 때 저해균의 생육이 가장 높았고 \( \mathrm{NaCl} \)의 농도가 \( 1 \% \)일 때 생육저해물질의 활성이 가장 높았다. 초기 \( \mathrm{pH} \) 결과와 마찬가지로 B. amyloli-quefaciens H41 의 생육과 생육저해물질 생산조건도 큰 차이가 나타냄을 보여주었다.</p><h2>탄소원, 질소원</h2><p>기본 배지조성에서 각종 탄소원을 \( 1 \% \)씩 배지에 첨가하여 배양한 결과 Fig. 4에서 보는 것과 같이 균의 증식은 모든 탄소원의 첨가에서 비교적 다른 양상을 나타내었는데 생육과 생육저해물질 생산 모두에서 sucrose가 높은 활성을 나타내어 생육저해물질의 생산을 위한 최적 탄소원은 sucrose로 결정하였다. 따라서 sucrose를 각각의 농도별로 조절하여 배양한 결과 Fig. 5에서 나타난 바와 같이 \( 1 \% \)에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 탄소원인 sucrose를 \( 1 \% \) 포함한 기본배지에 다양한 질소원을 첨가하여 균의 생육도와 생육저해물질의 생산을 비교한 결과 Fig. 6에서 보는 바와 같이 yeast ex-tract의 첨가에서 균의 생육도 및 생육저해물질의 활성이 높게 나타나 기본 배지 외에 \( 1.5 \% \)의 yeast extract를 첨가 사용하였다.</p><h2>배양온도</h2><p>배양온도에 따른 균의 생육도는 \( 28-35^{\circ} \mathrm{C} \)으로 나타났으며 생육저해물질의 생산 온도는 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)임을 Fig. 7에서 알 수 있다. 따라서 이후의 실험과정에서는 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)를 적용하였다.</p><h2>금속이온</h2><p>위에서의 최적조건으로 조절한 기본배지에 여러 가지 금속이온을 \( 0.05 \% \) 농도별로 첨가하여 배양한 결과 Fig. 8에서 나타난 바와 같이 \( \mathrm{Mg}^{+2}\), \(\mathrm{Ca}^{+2} \)를 함유하는 배지에서 활성이 나타났고 그 중에서 \( \mathrm{Mg}^{+2} \)을 함유하는 배지에서 가장 높은 활성을 나타내었다. \( \mathrm{Co}^{+2}\), \(\mathrm{Fe}^{+2}\), \(\mathrm{Hg}^{+2}\), \(\mathrm{Zn}^{+2}\), \(\mathrm{Ag}^{+2} \) 을 함유하는 배지에서는 오히려 활성이 떨어지는 것으로 나타나 이 같은 금속이온은 생육저해물질의 생산을 방해하는 것으로 나타났다. \( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)를 \( 0.05 \% \) 단위로 조절하여 배양한 결과 \( 0.05 \% \)의 농도에서 가장 높은 활성을 얻을 수 있었다.</p><h2>생육도 및 생육저해물질 최고생성시간</h2><p>이상의 조건들을 검토하여 분리 균의 생육도 및 생육저해 물질의 생산을 위한 최적 배양 조건은 생육은 \( 1.0 \% \)의 pep-tone의 기본배지에 \( 0.5 \% \mathrm{~NaCl}\), \(1.0 \% \) sucrose, \( 1.5 \% \) yeast ex-tract, \( 0.05 \% \mathrm{~MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(\mathrm{pH} 7.0-8.0 \), 배양시간은 20시간 대였으며 온도는 \( 28-35^{\circ} \mathrm{C} \)이었음을 알 수 있었으며 생육저해 물질의 생산 최적 조건은 기본배지에 \( 1.0 \% \)의 \( \mathrm{NaCl}\), \(1.0 \% \)의 sucrose, \( 1.5 \% \)의 yeast extract, \( 0.05 \% \)의 \( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)를 첨가하여 초기배양 \( \mathrm{pH} \)를 7.5로 조절하여 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 140 \mathrm{rpm} \)으로 진탕 배양하였을 때 Fig. 9에서 보는 바와 같이 16시간대에서 생육 저해물질의 활성이 가장 높은 것으로 나타났으며 36시간이 넘어가면서 활성이 점차 떨어지는 것을 관찰할 수 있었다.</p>