R4 액체배지에서 생산된 actinorhodin의 생산량은 Kieser등의 방법에 의해 측정되었고, S.natalensis로부터 SAM-S를 코드하는 metK 유전자를 클로닝하기 위해 보존성이 높은 2영역을 확인하고 primer를 제작하였으며, PCR을 통해 metK 유전자를 클로닝하였다. 그 결과 \( 1,209 \mathrm { bp } \)의 염기를 가진 orf2는 metK 염기서열로서 GeneBank에 accession number AB524882로 등록되었다.
<h2>Actinorhodin 측정과 metK 염기서열의 GeneBank 등록</h2> <p>\( \mathrm { R } 4 \) 액체배지에서 생산된 actinorhodin의 생산량은 Kieser등의 방법에 의해 측정되었으며 본 논문에 보고된 S. nata-lensis ATCC 27448의 metK 염기서열은 GeneBank에 accessionnumber AB524882로 등록되었다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>S. natalensis로부터 SAM-S를 코드하는 metK 유전자의 클로닝</h2> <p>S. natalensis로부터 SAM-s를 코드하는 metK 유전자를 클로닝하기 위해 지금까지 확인된 방선균 유래 MetK로부터 보존성이 높은 2영역을 확인하였으며 방선균의 codon usage를 고려해 PCR을 위한 primer를 제작하였다. 제작된 primer와 \( S \).natalensis로부터 얻어진 genomic DNA를 주형으로 사용한 \( \mathrm { PCR } \) 에서 \( 854 \mathrm { bp } \) 의 예상된 \( \mathrm { PCR } \) 산물을 획득할 수 있었으며 염기서열분석을 통해 S. Iydicus, S. peuceticus, 그리고 S. spocta-bilis 유래의 MetK들과 아미노산서열에서 \( 90 \% \) 이상의 높은 상동성을 보인다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 \( \mathrm { PCR } \) 을 통해 획득된 산물이 S. natalensis 유레 metK 유전자의 일부분으로 확인됨에 따라 전체 metK 유전자의 \( \mathrm { ORF } \) 를 클로닝하기 위한 Southern blot과 Colony hybridization의 probe로 사용하다. metK 유전자를 클로닝하기 위해 S. natalensis의 genomic DNA를 \( E_ { c o R } \) I과 Pvillo로 처리하고 Southern blot을 실시한 결과 약 \( 4 \mathrm { ~kb } \) 부근에 강한 positive signal을 확인할 수 있었다. 따라서 \( E_ { c } R \mathrm { I } \) 과 Pril으로 처리한 genomic \( \mathrm { DNA } \) 를 전기영동한 후 \( 4 \mathrm { ~kb } \) 부근의 genomic DNA를 겔로부터 회수하고 T4 DNA polymerase의 평활화와 HindIII-Smal adaptor의 연결 후 HindIII로 처리된 \( \mathrm { pUC19 } \) 에 삽입하여 E. coli \( \mathrm { XL } -10 \mathrm { Gold } \) 에 형질전환시켰다. 획득된 형질전환체들은 Colony hybridization을 통해 positive 콜로니를 확인하였으며 ㄱ. 결과 300개의 형질전환체 중 5 개의 콜로니로부터 positive signal을 확인할 수 있었다. 얻어진 5개의 콜로니들은 모두 동잍한 3,950 bp의 \( \mathrm { DNA } \) 단편을 포함하고 있었으며 염기서열분석결과 3 개의 \( \mathrm { ORF } \) 가 존재하고 있다는 것이 확인되었다(Fig. \( 1 \mathrm { ~A } , \mathrm { ~B } \) ). 또한 Fig. \( 1 \mathrm { C } \) 에서 보는 바와 같이 \( \mathrm { NCBI } \) 의 database를 이용한 BLAST 검색을 통해 \( 1,209 \mathrm { bp } \) (402 amino acid, \( 43.5 \mathrm { kDa } \) )의 염기를 가진 orf2는 S. peucetius ATCC 27952와 S. pristinaespir-alis ATCC 25486의 MetK (accession no. CAJ43279.1, ZP_06912940.1)와 96 \%, S. violaceusniger Tu 4113의 MetK (accession no. ZP_07605998.1)와 95 \% 일치하는 매우 높은 상동성을 보였다. 따라서 orf2는 S. natalensis에서 SAM-s를 코드하는 metK 유전자로 확인되었으며 GeneBank에 accession number AB524882로 그 염기서열이 등록되었다. 또 affl과 arB는 각각 S. violaceusniger Tu 4113의 phosphopantothenoylcys-teine decarboxylase (accession no. ZP_07605997.1)와 85 \%, 그리고 primosome assembly protein PriA (accession no.ZP_07605999.1)와 80 \%의 상동성을 보였다.</p>