간의 이물질대사효소 활성, 혈청의 AST와 ALT 활성도, TBA 반응성물질의 함량 측정을 위해 시험물질인 흰점박이꽂무지(Protaetia brevitarsis)는 종령 유충을 채취하고 고형사료(삼양사)를 분말화하여 시험물질의 균질액(Protaetia brevitarsis extract, PBE)을 농도별로 각각 혼합해 고형사료를 만들었고, 대조군은 일반 사료를 사용한다. 간독성 유발을 위해 Sprague-Dawley (SD)계 흰쥐 수컷을 사용해 사염화탄소와 에탄올을 투여하여 간 손상을 유도하였다. 정상군은 시험물질의 균질액을 급여하지 않고 고형사료를 공급하여 사육했으며, 단독 투여군은 표준사료와 사염화탄소를 투여, 균질액(Protaetia brevitarsis extract, PBE) 식이군은 첨사사료와 사염화탄소를 투여, 에탄올 단독 투여군은 표준사료와 에탄올만을 단독 투여하였다. 혈청의 AST와 ALT 활성도는 자동분석기로 측덩하고, TBA반응성 물질은 Suematsu등의 방법으로 흡광도를 측정해 결정했다. 적출한 흰쥐의 간은 잘게 썰고 완충액에 희석하여 균질화 후 원심분리하여 microsome 분획을 얻었고, 표준물질을 사용해 단백질 농도를 측정하였다. 간의 이물질대사효소 Omura와 Sato의 방법, William와 Kamin의 방법, Mihara와 Sato의 방법에 따라 측정하였고, 정상군 및 대조군과 PBE 식이군과의 비교 및 판정은 Student's t-test로 유의성을 감정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험동물의 사육조건</h2> <p>생후 4주 경과한 \(100\sim110 \mathrm{~g}\)의 Sprague-Dawley (SD)계 흰쥐 수컷만을 선별하여 온도 \( 23 \pm 1{ }^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 55 \pm 5 \% \), 배기 10-18회/hr, 형광등 명암 12hr cycle, 조도 \(300-500 \mathrm{~Lux}\)의 사육환경에서 랫드용 폴리카보네이트 사육상자\( (240 \mathrm{~W} \times 400 \mathrm{~L} \times 180 \mathrm{~H} \mathrm{~mm} \) )에 2마리씩 넣어 사육하였다. 사료는 삼양사의 고형사료를 사용하였으며 음수는 멸균된 수도물을 자유롭게 섭취하도록 하였다.</p> <h2>시험물질의 조제 및 식이</h2> <p>시험물질인 흰점박이꽂무지(Protaetia brevitarsis)는 종령 유충을 채취하여 충체를 음건한 후 한방처방시 사용되는 용량을 기준으로 \( 0.04 \%\), \(0.2 \%\), \(1 \% \)에 해당하는 충체를 잘게 절단하여 균질화하였다. 고형사료(삼양사)를 분말화한 후 시험물질의 균질액(Protaetia brevitarsis extract, PBE)을 농도별로 각각 혼합하여 다시 고형사료를 만들고 건조시킨 다음 공급하였다. 대조군은 일반 고형사료를 사용하였다.</p> <h2>간독성 유발</h2> <p>PBE 첨가사료 \( (0.04,0.2,1 \%) \)로 3개월 동안 사육한 흰쥐에 사염화탄소 \( \left(\mathrm{CCl}_{4}\right) \)와 에탄올을 투여하여 간 손상을 유도하였다. 즉 사염화탄소는 corn oil에 1: 1(V/V)의 비율로 혼합하여 체중 \( \mathrm{kg} \) 당 \( 1 \mathrm{~ml} \)의 용량을 복강주사로 투여하였으며, 에탄올은 아치사농도인 체중 \( \mathrm{kg} \)당 \( 5 \mathrm{~g} \)의 용량을 \( 50 \% \) 에탄올로 경구투여하여 간독성을 유발시켰다.</p> <h2>실험군</h2> <p>정상군은 독성물질 투여나 시험물질의 균질액을 급여하지 않고 삼양사의 고형사료를 정상적으로 공급하여 사육하였으며 \( \mathrm{CCl}_{4} \) 단독 투여군 \((\mathrm{CCl}_{4}) \)은 표준사료로 사육하면서 독성물질인 사염화탄소만을 단독 투여하였다. \( 0.04 \%\) (\(\mathrm{CCl}_{4}\)+Low PBE), \(0.2\%\)(\(\mathrm{CCl}_{4}\)+Middle PBE), 그리고 \( 1 \% \)의 PBE 식이군 \( (\mathrm{CCl}_{4}\)+High PBE)은 \( 0.04 \%\), \(0.2 \%\), \(1 \% \)에 해당하는 PBE 첨가사료로 각각 사육한 후 사염화탄소를 투여한 실험군이다. 에탄올 단독 투여군(EtOH)은 표준사료로 사육하면서 독성물질인 에탄올만을 단독 투여한 실험군이며, \( 0.04 \% \)(EtOH+Low PBE), \(0.2\%\)(EtOH+Middle PBE), 그리고 1\(\%\)의 PBE 식이군(EtOH+High PBE)은 \( 0.04 \%\), \(0.2 \%\), \(1 \% \)에 해당하는 PBE 첨가사료로 각각 사육한 후 에탄올을 투여한 실험군이다. 각 실험군의 동물 수는 10마리씩 사용하였다.</p> <h2>체중 및 간 무게 측정</h2> <p>체중은 매일 측정하였으며 시험종료 후 심장천자로 채혈하였다. 채혈 후 해부한 다음, 간을 적출하여 무게를 측정하였으며 적출한 간은 사용할 때까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 냉동보관하였다.</p> <h2>혈청의 AST와 ALT 활성도 측정</h2> <p>채취한 혈액은 실온에서 30분간 방치한 후 \( 3,000 \mathrm{~rpm} \)에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청의 aspartate aminotransferase (AST)와 alanine aminotransferase (ALT)의 활성도는 자동분석기(Hitachi-7150, Hitach Medical Co.)로 측정하였다.</p> <h2>혈청의 TBA 반응성물질의 함량측정</h2> <p>Thiobarbituric산 반응성물질(Thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)의 함량은 Suematsu 등의 방법에 따라 \( 532 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.</p> <h2>간의 microsome 분리</h2> <p>Bansal 등의 방법에 따라 적출한 흰쥐의 간을 잘게 썰고 5배의 \( 150 \mathrm{~mM}\ \mathrm{KCl} \)을 함유한 \( 30 \mathrm{~mM} \) Hepes 완충액\( (\mathrm{pH}\ 7.4) \)으로 희석하여 균질화 한 다음 원심분리하여 microsome 분획을 얻었다.</p> <h2>단백질 정량</h2> <p>Bovine serum albumin (BSA)을 표준물질로 사용하여 Lowry 등의 방법에 따라 단백질 농도를 측정하였다.</p> <h2>간의 이물질대사효소 활성측정</h2> <p>Cytochrome P-450과 cytochrome \( b_{5} \) 함량은 Omura와 Sato의 방법으로 측정하였으며, NADPH cytochrome P-450 reductase의 활성도는 William와 Kamin의 방법에 따라 \( 550 \mathrm{~nm} \)에서 3분간 흡광도 변화를 측정하여 환산하였다. NADH cytochrome \( \mathrm{b}_{5} \) reductase의 활성도는 Mihara와 Sato의 방법에 따라 \( 420 \mathrm{~nm} \) 에서 potassium ferricyanide의 환원속도로 3분간 흡광도의 차이 측정으로 환산하였다.</p> <h2>통계학적 분석</h2> <p>실험결과는 각 군의 평균\( \pm \)표준편차로 표기하였으며, 정상군 및 대조군과 PBE 식이군과의 상호비교는 Student's t-test로 유의성을 검정하여 \( \mathrm{P}<0.05 \) 이하의 경우 유의한 차이가 있다고 판정하였다.</p>