본문에서 KK3 균주가 생산하는 항균물질 생산의 최적 배양시간을 알아보고자 했고, 12시간 배양하여 얻은 조항균물질 용액을 첨가한 경우에도 지시균의 생육저해가 발생하여 항균물질의 생산은 KK3 균주의 생장과 동반 하여 생산되는 것으로 나타나며, 24시간 배양하여 얻은 조 항균물질 용액은 12시간 배양하여 얻은 용액 대비 지시균의 생장을 2배 이상 저해하였지만, 36시간 및 48시간 배양하여 얻은 조항균물질 용액의 항균활성은 24시간 배양의 경우와 차이가 없는 것으로 나타나, 24시간 배양이 최적 배양시간임을 확인했다. 이후 항균물질의 특성을 확인하고자 \( \mathrm{pH} \) , 온도에 대한 안정성, 박테리오신 여부 규명 실험을 진행했다.
<h1>항균물질 생산의 최적 배양시간</h1> <p>KK3 균주가 생산하는 항균물질의 특성 규명에 앞서 항균 물질 생산의 최적 배양시간을 검토해 보았다. \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 미호기 조건에서 전배양한 KK3 균주를 \( 100 \mathrm{~mL} \) MRS 배지에 \( 1 \% \) 접종하고, 12, 24, 36, 48시간 배양하여 얻어진 배양액을 원심분리 및 membrane filter(Millipore)로 제균하여 배양상등액을 얻었다. 이렇게 얻어진 배양상등액을 항균물질 생산의 최적 배양시간 결정을 위한 조항균물질 용액으로 사용하였다. 각 시간에 얻어진 조항균물질 용액 \( 5 \mathrm{~mL} \) 을 nutrient broth \( 30 \mathrm{~mL} \) 에 첨가한 후, 지시균 St. aureus 를 \( 1 \% \) 접종하여 지시균의 생육을 흡광도로 측정하였고, 3번 수행한 실험의 평균값을 그래프로 나타내었다(Fig. 1). 12시간 배양하여 얻은 조항균물질 용액을 첨가한 경우에도 지시균의 생육저해가 발생하여 항균물질의 생산은 KK3 균주의 생장과 동반 하여 생산되는 것으로 나타났다. 24시간 배양하여 얻은 조 항균물질 용액은 12시간 배양하여 얻은 용액 대비 지시균의 생장을 2배 이상 저해하였지만, 36시간 및 48시간 배양하여 얻은 조항균물질 용액의 항균활성은 24시간 배양의 경우와 차이가 없는 것으로 나타났다. 따라서 24시간 배양을 항균 물질 생산의 최적 배양시간으로 결정하였다.</p> <h1>항균물질의 특성</h1> <p>미생물이 생산하는 항균물질 중, 박테리오신은 리보솜에서 합성되는 단백질 또는 펩타이드 계통 항균물질로서 특정 생육환경에서 박테리오신 생산균주들이 비슷한 종류의 다른균의 생육을 저해할 목적으로 생산, 분비하는 것으로 알려져 있다. KK3 균주가 생산하는 항균물질의 박테리오신 여부 규명을 위하여 배양상등액에 \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} \) 를 첨가하여 중성으로 조절한 다음, 냉동건조하여 10배 농축하였다. 농축한 배양상등액에 동량의 \( 50 \mathrm{mM} \) 인산완충용액 \( (\mathrm{pH} 7\))에 녹인 \( \alpha \)-amylase(EC 3.2.1.1 type VIII, Sigma, USA), lipase(EC 3.1.1.3 type VII, Sigma), proteinase K(EC 3.4.21.64, Sigma), catalase(EC 1.11.1.6, Sigma) 를 첨가한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 처리한 다음, 지시균 St. aureus의 생육저해를 agar disk diffusion method를 이용하여 확인하였다. 효소 처리하지 않은 대조군 및 \( \alpha \)-amylase, lipase, catalase 처리 시료에서는 지시균 저해환이 관찰되는 반면, proteinase \( \mathrm{K} \) 처리에 의해 서는 저해환이 형성되지 않아, KK3 균주가 생산하는 항균 물질은 단백질 분해효소에 의하여 분해되는 단백질성 혹은 펩타이드성 박테리오신으로 확인되었다.</p> <p>KK3 균주가 생산하는 박테리오신의 활성에 미치는 \( \mathrm{pH} \) 의 영향을 알아보기 위하여 배양상등액의 \( \mathrm{pH} \) 를 \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{~NaOH} \) 또는 \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{~HCl} \) 용액으로 \( \mathrm{pH} 3.5 \sim 8.5 \) 로 조절하여 실온에서 2시간 방치한 후, 냉동건조하여 10 배 농축하였고, agar disk diffusion method를 사용하여 \( \mathrm{pH} \) 에 따른 지시균의 생육저해를 검토하였다. Nisin을 비롯한 유산균이 생산하는 박테리오신은 낮은 \( \mathrm{pH} \) 에서 활성을 보이거나, 국한된 범위의 \( \mathrm{pH} \) 에서 만 안정한 것으로 보고되고 있으나, \( \mathrm{KK} 3 \) 균주가 생산하는 박테리오신은 \( \mathrm{pH} 3.5 8.5\)의 산도에서 비슷한 크기의 지시균 생육저해환을 형성한 것으로 미루어 넓은 \( \mathrm{pH} \) 구간에서 매우 안정함을 알 수 있었다(Fig. 2A). 따라서 KK3 균주가 생산하는 박테리오신은 다양한 \( \mathrm{pH} \) 영역 식품의 보존기간 연장에 적용 가능할 것으로 추정된다.</p> <p>온도에 대한 안정성 또한 agar disk diffusion method를 사용하여 검토하였다. 농축한 KK3 배양상등액의 열처리는 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 및 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 50^{\circ} \mathrm{C}, 70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 수행하였고, \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서는 5분 및 30분 처리하였으며 autoclave를 이용하여 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \) 에서는 15 분간 열처리하였다. KK3 균주가 생산하는 박테리오신에 의한 지시균의 생육저해는 열처리 조건에 따른 차이가 나타다지 않았고, \( 121^{\circ} \mathrm{C} \) 15분의 조건에서도 활성의 감소는 미미하게 나타났다(Fig. 2B). KK3 균주가 생산하는 박테리오신은 살균처리 조건에서도 불활성화 되지 않는 내열성을 가지고 있는 것으로 추정된다.</p> <p>식품에서 분리된 L. plantarum 균주들이 생산하는 박테리오신의 \( \mathrm{pH} \) 안정성과 열안정성을 문헌조사를 통하여 비교해 본 결과, 대체로 높은 열안정성을 가지고 있었으며, 발효소시지에서 분리된 \( \mathrm{lp} 31 \) 균주를 제외하고는 넓은 \( \mathrm{pH} \) 범위에서 항균활성을 나타내었다(Table 2). 특히 김치류에서 분리된 균주들의 경우에는 높은 \( \mathrm{pH} \) 및 열에 대한 안정성을 가지고 있어, 이들 L. plantarum 균주가 생산하는 박테리오신은 열처리를 비롯하여 다양한 가공조건을 가지고 있는 식품에 적용 가능할 것으로 사료된다.</p>