본 연구에서는 분리된 미생물을 TSB 배지에서 24시간 진탕배양한 후 원심분리를 통해 균체를 회수하였다. 회수된 균체의 genomic DNA를 추출 및 분리하여 PCR 주형으로 활용하였으며, 이를 통해 \(16 \mathrm { ~S } \mathrm { rDNA }\)를 증폭시켰다. 증폭된 \(16 \mathrm { ~S } \mathrm { rDNA }\) 단편은 정제 후 DNA analyzer를 이용하여 분석하였다. 분석된 \(16 \mathrm { ~S } \mathrm { rDNA }\) 염기서열은 NCBI의 GeneBank database 정보를 통해 균주 염기서열의 상동성을 확인하였다.
<h2>16S rDNA 염기서열 및 계통 분석</h2> <p>분리 미생물을 TSB 배지에 24 시간 동안 진탕배양 후 \( 15,000 \mathrm { rpm } \) 에서 10 분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체의 genomic DNA를 Wizard genomic DNA purification kit (Promega Co., WI, USA)를 사용하여 추출 및 분리하여 PCR 주형으로 사용하였다. \( 16 \mathrm { ~S } \mathrm { rDNA } \) 는 universal primer인 27F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3') 및 1492R (5'-GGC TAC CTT GTT ACG ACT \( \left . \mathrm { T } -3 ^ {\prime } \right ) \) 을 사용하여 증폭하였다. 증폭된 \( 16 \mathrm { ~S } \mathrm { rDNA } \) 단편은 Wizard SV Gel 및 PCR clean-up system (Promega Co.)을 이용하여 정제한 후, ABI PRISM 377 DNA analyzer (Applied Biosystems, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. \( 16 \mathrm { ~S } \mathrm { rDNA } \) 염기서열 분석은 오차의 가능성을 배제하기 위하여 3 회 반</p> <p>복 실시하였다. 분석된 \( 16 \mathrm { ~S } \mathrm { rDNA } \) 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BlastN program의 GeneBank database의 정보로부터 균주 염기서열의 상동성을 확인하였다. 또한 EzTaxon database (http://www. ezbiocloud.net/)로부터 표준균주의 16S rDNA 염기서열들을 조사하여 계통발생적 연관성을 분석하였다. 수집된 염기 서열들 간의 Multiple alignment는 Clustal X (2.0) software를 사용하였고 BioEdit software (7.0)를 사용하여 편집하였다. Mega (5.03) software를 이용하여 neighbor-joining method, maximum likelihood method, maximum parsimony method에 의해 염기서열간의 유전적 거리와 phylogenetic tree를 얻었다. 신뢰도(bootstrap value)는 1,000 회의 재구성된 자료로부터 새로운 tree를 작성하여 계산하였다.</p> <h2>Protease 생산을 위한 배양방법</h2> <p>전배양 배지로서 TSB를 이용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 200 \mathrm { rpm } \) 에서 15 시간 배양한 후 본배양의 접종균으로 이용하였다. 균주 보관은 전배양 배지에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 200 \mathrm { rpm } \) 으로 15 시간 배양한 후 \( 2 \mathrm { ml } \) micro-cap tube에 glycerol \( 0.7 \mathrm { ml } \) 와 배양액 \( 0.7 \mathrm { ml } \) 를 혼합하여 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 보관하였다.</p>