온도와 습도를 조건별로 제작한 누룩을 강원 A−F로 각각 명명하였으며, 배양 후 서늘한 곳에서 3일 동안 건조한 후 분쇄한 누룩을 펩톤수에 현탁하여 상등액을 적정농도로 희석하여 도말하였다. \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)의 온도에서 3일 동안 배양하여 곰팡이를 분리하였다. 누룩의 누룩의 \( \alpha \)-amylase 효소 활성은 분쇄한 \( 0.03 \mathrm{~g} \)의 누룩을 \( 3 \mathrm{ml} \)의 인산염 완충액 \( (0.05 \mathrm{M}, \mathrm{pH} \) 6.0)에 현탁하고 \( 1 \mathrm{~g} \)의 glass bead (Sigma-Aldrich, USA)를 첨가하여 3분간 교반(Bohemia, USA) 한 후 원심분리(16,100 \( \times g\), 5분)하여 얻은 상등액을 조효소액으로 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>누룩의 수집 및 제작</h2> <p>누룩은 경기도 용인시, 충청남도 예산군, 경상북도 상주시, 광주광역시, 경상남도 진주시, 부산광역시 및 제주시를 포함한 7개 지역에서 수집하거나 배양온도와 습도를 달리하여 직접 제조하였다. 밀(원주농업협동조합, Korea), 물(평창수, Korea) 및 볏짚(Korea)은 구매하여 누룩 제조에 사용하였다. 밀은 수돗물로 3회 세척하고 12시간 동안 건조한 후 분쇄기(Hanil, Korea)를 사용하여 분쇄하였다. 밀 중량의 \( 14 \% \)에 해당하는 물을 첨가하여 반죽한 후 직경 \( 250 \mathrm{~mm} \)의 원형틀을 이용하여 성형하였다. 성형한 누룩은 볏짚 위에 올린 후 온도와 습도 조건을 조절한 항온항습기(BioFree, Korea)에서 15일간 배양하였다. 온도와 습도를 조건별로 제작한 누룩을 강원 \( \mathrm{A}-\mathrm{F} \)로 각각 명명하였으며, 배양 후 서늘한 곳에서 3일 동안 건조한 후 분쇄기로 분쇄하여 미생물 분리와 효소 활성 측정에 사용하였다.</p> <h2>곰팡이 균주 분리 및 동정</h2> <p>분쇄한 누룩을 펩톤수에 현탁한 후 상등액을 적정농도로 희석하여 potato dextrose agar (PDA, BD, USA) 배지에 도말하였다. 도말한 배지는 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일 동안 배양한 후 집락을 형성한 곰팡이를 분리하였다. A. oryzae는 농촌진흥청 농업유전자원센터에서 분양받은 KACC44246 균주를 R. oryzae는 ATCC1026 균주를 대조구 균주로 사용하였다. 효소 활성은 \( 2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 가용성 전분을 함유하고 있는 potato dextrose broth (PDB, BD) 배지에서 24시간 동안 배양한 후 측정하였다.</p> <p>분리한 곰팡이는 PDB 배지에 접종하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일 동안 배양한 후 여과지(Advantec, USA)를 사용하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체는 액체 질소를 이용하여 급속동결 한 후 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germany)를 사용하여 제조사가 제공한 방법으로 genomic DNA를 추출하였다.</p> <p>곰팡이 균주의 동정은 internal transcribed spacer (ITS) 영역을 증폭할 수 있는 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') 및 ITS2 (5'-TCCTCCGCTGATTGATATGC-3') 프라이머를 사용하여 유전자 단편을 증폭한 후 염기서열을 분석하였다. 분석한 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI, USA)의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 사용하여 기존에 보고된 균주와의 상동성을 근거로 동정하였다.</p> <h2>누룩의 전분분해 효소활성 측정</h2> <p>누룩의 \( \alpha \)-amylase 효소 활성. \( \alpha \)-Amylase 효소 활성은 Park 등의 방법을 수정하여 측정하였다. 분쇄한 \( 0.03 \mathrm{~g} \)의 누룩을 \( 3 \mathrm{ml} \)의 인산염 완충액 \( (0.05 \mathrm{M}, \mathrm{pH} \) 6.0)에 현탁하고 \( 1 \mathrm{~g} \)의 glass bead (Sigma-Aldrich, USA)를 첨가하여 3분간 교반(Bohemia, USA) 한 후 원심분리(16,100 \( \times g\), 5분)하여 얻은 상등액을 조효소액으로 사용하였다. 인산염 완충액 \( (0.8 \mathrm{ml}) \)과 \( 0.2 \mathrm{ml} \)의 조효소액을 혼합한 후 \( 1 \mathrm{ml} \)의 가용성 전분 \( (0.5 \%, \mathrm{w} / \mathrm{v}) \)을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응하였다. 효소 반응액 \( (0.1 \mathrm{ml}) \)과 \( 1 \mathrm{ml} \)의 3,5-dinitrosalicylic aicd 용액을 혼합하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 가열한 후 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 1 unit의 \( \alpha \)-amylase 효소 활성은 \( \mathrm{pH} \) \( 6.0,37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분당 \( 1 \mu \mathrm{mole} \)의 환원당을 생산하는 효소의 양으로 정의하였다.</p> <p>누룩의 glucoamylase 효소 활성. Glucoamylase 효소 활성 (SP)은 Choi 등[3]의 방법을 수정하여 사용하였으며, 분쇄한 \( 2.5 \mathrm{~g} \)의 누룩을 \( 50 \mathrm{ml} \)의 증류수에 현탁하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 교반한 후, 여과지(Advantec)로 거른 여과액을 조효소액으로 사용하였다. 가용성 전분 \( (2 \%, \mathrm{w} / \mathrm{v}) 20 \mathrm{ml} \)에 \( 2.5 \mathrm{ml} \) 의 조효소액을 첨가하고 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 반응한 후 \( 2.5 \mathrm{ml} \)의 \( \mathrm{NaOH}(0.5 \mathrm{~N}) \) 용액을 첨가하여 반응을 종결하였다. 누룩의 glucoamylase효소 활성은 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 누룩 \( 1 \mathrm{~g} \)이 가용성 전분 \( 1 \mathrm{~g} \)에 작용하여 생성되는 포도당을 기질에 대하여 백분율로 표시하는 것으로 대한민국 국세청 주류 분석규정의 환원당 분석법을 기준으로 정의하였다.</p> <p>단백질 농도. 조효소액과 동량의 Bradford dye reagent (Bio-Rad, USA)를 혼합하고 실온에서 5분간 반응한 후 \( 595 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 적정농도로 희석한 bovine serum albumin (Bio-Rad)을 사용하여 검량선을 작성하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>모든 측정은 3회 반복 수행하였으며 측정값은 SPSS (v 20.0 SPSS, IBM, USA)를 사용하여 통계처리 하였으며, 유의성 검증은 일원배치 분산 분석법을 이용하였다.</p>