PCR 산물을 agarose gel electrophoresis로 분석하여 예상되는 크기의 산물이 생성된 것을 확인한 후 Promega의 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System으로 정제한 DNA를 SmaI로 절단하고, pBluescript SK Ⅱ plasmid과 ligation 반응을 진행한 후 Escherichia coli competent cell (DH5a)에 transformation하여 ampicillin을 함유하는 MacConkey agar plate에 도말하여 흰색 colony들로부터 plasmid DNA를 추출하고, agarose gel electrophoresis를 통해 정제된 plasmid DNA의 크기를 분석하였다. 또한 이중에서 염기서열의 길이가 phylogenetic comparison을 수행하기에 충분한 52종과 본 연구에서 추가로 밝혀진 5종의 식물들의 염기서열을 포함하여 서로간의 상관관계를 ClustalW 1.83을 사용하여 비교해 본 결과 쥐꼬리망초과, 돌담배과, 질경이과, 그리고 열당과에 속하는 식물들 대부분은 같은 속의 식물들끼리 cluster를 형성함으로써 엽록체 DNA에 의한 분류체계와 일치하고 있는 것을 볼 수 있었다.
<h2>Cloning and DNA sequencing</h2> <p>PCR 산물은 agarose gel electrophoresis로 분석하여 예상되는 크기의 산물이 생성된 것을 확인한 후에 Promega의 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System으로 정제하였다.이렇게 정제된 DNA는 SmaI 으로 절단된 pBluescript SK Ⅱ plasmid \( 0.1 \mu l \) 씨과 섞어서 ligation 반응을 진행시킨 후,Escherichia coli competent cell (DH5a)을 transformation 시키는 데에 사용하고, transformed cells는 ampicillin \( (10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \)을 함유하는 MacConkey agar plate에 도말하였다. 흰색의 colony들로부터 plasmid DNA를 추출하고, agarose gel elec trophoresis를 통해서 예상되는 크기의 insert DNA가 포함되어있는 것을 확인한 후, 염기서열 분석을 수행하였다. 염기서 열 분석은 (주)바이오닉스(서울특별시 구로구 구로3동 235번지)에 의뢰하였다.</p> <h2>Phylogenetic analysis of the DNA sequences</h2> <p>얻어진 염기서열은 BLAST program 및 ClustalW 1.83 program을 이용하여 분석하였다[1].<h1>결과 및 고찰</h1> <p>건조된 식물체들의 잎과 줄기로부터 얻어진 genomic DNA를 template로 사용하여 PCR을 수행하고, 그 산물을 agarose gel electrophoresis를 통하여 분석한 결과, 예상한대로 약 2.1- \( \mathrm { kb } \)의 DNA가 관찰되었다(Fig. 1B). 이 DNA들을 pBluescript II SK-plasmid에 cloning하여서 염기서열을 분석하였다.본 연구에서는 종래에는 모두 현삼과로 분류되었으나 현재에는 다른 과로 분류되고 있는 식물들 중에서 18S rRNA 염기서열이 아직까지 알려져 있지 않으며 우리 주위에서 흔하게 발견되는 국내 자생식물 5 종의 18S rRNA 유전자 및 ITS1의 염기서열을 밝혀서 이들 식물들의 분류에 도움이 되는 단서를 발견하고자 하였다. 또한 이렇게 얻어진 결과를 엽록체 DNA의 염기서열에 의한 분류체계와 비교해 보았다. 그러므로 새로운 분류체계에 따라서 현재에는 열당과(Orobanchaceae)에속하는 꽃며느리밥풀(Melampyrum roseum) 및 나도송이풀(Phtheirospermum japonicum), 질경이과(Plantagianaceae)에 속하는 물칭개나물(Pseudolysimachion undulata), 파리풀과(Phrymaceae)에 속하는 주름잎(Mazus pumilus) 그리고 외풀과(Linderniaceae)에 속하는 외풀(Lindernia crustacea)의 18SrRNA 유전자 및 ITS1의 염기서열을 밝혀내어서 GenBank에 등록하였다(accession numbers GU359046, GU359047, GU359048, GU359049, GU359050, respectively).본 연구자가 조사해 본 바로는 꿀풀목 식물들 중에서는 2009년 12월 현재 62종이 GenBank에 등록되어있는 것으로 밝혀졌다. 따라서 본 연구자는 이 62 종의 식물들 모두의 18S rRNA 유전자의 염기서열을 확보하였다. 그러나 일부의 염기 서열은 너무 짧아서 phylogenetic comparison을 수행하기에 부적합하다고 판단이 되었다. 따라서 이중에서 염기서열의 길이가 phylogenetic comparison을 수행하기에 충분한 52종과 본 연구에서 추가로 밝혀진 5종의 식물들의 염기서열을 포함하여 서로간의 상관관계를 ClustalW 1.83을 사용하여 비교해 보았다(Fig. 2). 그 결과, 쥐꼬리망초과(Acanthaceae, Fig. 2, lines 5 to 9 from the top), 돌담배과(Gesneriaceae, Fig. 2, lines 29 to 35 from the top), 질경이과(Plantaginaceae, Fig. 2, lines 36 to 40 from the top), 그리고 열당과(Orobanchaceae, Fig. 2, lines 41 to 56 from the top)에 속하는 식물들 대부분은 같은 속의 식물들끼리 cluster를 형성함으로써 엽록체 DNA에 의한 분류체계와 일치하고 있는 것을 볼 수 있었다. 그러나 돌담배과가 두 그룹(lines 29-31, lines 32-35)으로 나뉘어 있고, 열당과의 경우는 대부분이 한 cluster에 포함이 되어있으나, Harveya speciosa 및 Hyobache atropurpurea (lines 60-61)는 다른 그룹으로 나뉘어 있는 것을 알 수 있다. 또한 질경이과 역시 Antirthinum majus와 Lineria vulgaris는 별도의 분류군을 형성하고 있다. 이러한 점에 대해서는 추가적인 연구가 필요하다<p>고 여겨진다.본 연구에서 분석한 식물들의 경우에는 18S rRNA 염기서열을 GenBank의 BLAST로 search도 해서 ClustalW1.83에 의한 분석과 비교해 보았다. 우선 Fig. 2에 의하면 꽃며느리밥풀과 나도송이풀은 열당과로 분류되는 것이 옳은 것으로 나타나고 있다. 또한 BLAST search 결과, 꽃며느리밥풀과 나도송이풀은 모두 열당과에 속하는 Pedicularis racemosa와 가장 유사한 것으로 나타났다(data not shown). 또한 현재 엽록체 DNA의 염기서열에 의한 분류체계에서도 이 두 식물들은 모두 열당과로 분류되고 있기 때문에 모든 결과가 서로 잘 일치하고 있다고 볼 수 있다. 물칭개나물은 Fig. 2의 결과에 의하면 질경이과로 분류되고, 또한 엽록체 DNA 염기서열에 의한 분류에서도 질경이과로 분류되고 있다. 또한 BLAST search 결과도 질경이과에 속하는 Verinica anagallis-aquatica와 가장 유사한 것으로 나타나기 때문에, 이 결과도 서로 잘 일치하고 있다고 볼 수 있다(data not shown).주름잎의 경우는 Olmstead 등[10]에 의해서 파리풀과로 분류가 되었으나 Oxelman 등[12]에 의해서 나중에 의문이 제기 되었다. Fig. 2의 결과에서는 주름잎은 열당과와 유사한 것으로 나타나고 있으며, BLAST search 결과로는 현삼과에 속하는 Verbascum thapsus와 가장 가까운 것으로 나타나고 있다(data not shown). 따라서 주름잎의 경우에는 본 연구에 서도 결론을 내리기가 어렵게 되었기 때문에 당분간 분류가 모호한 상태로 남아있을 가능성이 높아지게 되었다. 외풀도 Olmstead 등[10]에 의해서 외풀과로 분류가 되었으나 나중에 Oxelman 등[12]에 의해서 의문이 제기 되었다. 외풀의 경우는 Fig. 2에 의하면 열당과에 속하는 Harveva speciosa 및 Hyobache atropurpurea와 가까운 것으로 나타나고 있고, BLAST search 결과에 의하면 참깨과의 참깨(Sesamum indicumb)와 유사한 것으로 나타나고 있다(data not shown). 따라서 외풀도 본 연구에서 결론을 내리기 어렵게 되었다. 따라서 외풀의 분류도 당분간 결론이 나지 않을 가능성이 높다고 본다. Fig. 2에서 분류상으로 문제가 과가 몇 가지 있는데, 그 중의 하나가 꿀풀과(Lamiaceae)와 마편초과(Verbenaceae)이다. 꿀 풀과에 속하는 Lamium amplexicaule와 Pogostemon cablin는 cluster를 형성하고 있으나, Clerodendrum chinense와 Callicarpa dichotoma는 다른 분류군에 흩어져 있고, 마편초과의 Verbena bracteata와 Chionophila jamesii도 분류에 문제가 있는 것으로 나타났다. 이 식물들의 정확한 분류는 엽록체 DNA 염기서열 이든 18S rRNA 염기서열이든 간에 더 많은 자료가 확보되어 좀 더 체계적인 연구가 진행될 때까지 기다려야 할 것으로 생각된다. 또한 그 결과에 따라서 이러한 식물들을 포함하는 분류군에서 또 한 차례의 대규모 지각변동이 일어날 가능성도 배제할 수는 없다. Fig. 2의 식물들 중에서 ITS1의 염기서열이 알려져 있는 식물들의 ITS1의 염기서열을 찾으려 시도하였다. 그 결과, 열당과의 식물들 중에서는 ITS1의 염기서열이 알려져 있는 것들이 본 연구에서 밝혀진 것들을 제외하고는 거의 없었다. 따라서 열당과의 식물들을 제외한 식물들(lines 1 to 40 of Fig. 2)의 ITS1의 염기서열을 비교해 보았다(Fig. 3). 그 결과, 돌담배과(lines 1 to 5), 질경이과(lines 6 to 12), 쥐꼬리망초과(lines 13-15)의 식물들은 서로 cluster를 형성하고 있는 것을 관찰할 수 있었으나, 나머지 식물들은 여전히 뚜렷한 패턴을 보이지 않고 있었다(Fig. 3).</p>