PCR은 최종 반응 부피를 \( 20 \) \(\mu l \)로 동일 샘플을 3배수로 준비하였다. 단백질 추출을 위해 분화된 세포들을 cell scraper로 수거한 뒤 용해시켰으며 용해된 세포는 원심분리 한 후, 단백질이 포함된 상등액을 얻었다.
<h2>Real-Time polymerase chain reaction (PCR)</h2> <p>\( 1 \mu g \)의 total RNA는 cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA)를 이용하여 역전사 하였다. Real-time PCR은 StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems)장비를 사용하여 진행하였다. PCR은 다음의 조성으로 최종 반응 부피를 \( 20 \mu 1 \)로 동일 샘플을 triplicate로 준비하여 수행 하였다. TaqMan gene ex-pression master mix, \( 250 \mathrm{nM} \)의TaqMan Probe, \( 2 \mu \mathrm{M} \)의 각 primer 그리고 \( 2 \mu \mathrm{l} \)의 cDNA를 적정조성으로 혼합한 반응용액을 효소를 활성화시키기 위해 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시킨 후 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1분의 과정으로 40 싸이클을 진행하였다. Real-Time PCR에 사용된 primer는 Applied Biosystems 사의 assay on demand gene expression 제품을 구매하여 사용하였다. Endogenous control는 18S rRNA를 사용하였다. 각 샘플에 대한 표적유전자의 mRNA수준은 충분히 발현된 18S rRNA에 의해 표준화되었고, 표준화 된 샘플의 값은 전지방세포(preadipocyte) (day0)의 값을 기준으로 comparative Ct method에 의해 비교 되었다.</p> <h2>단백질 추출 및 Western blotting</h2> <p>분화된 세포들을 cell scraper로 수거한 뒤 ice-cold RIPA buf-fer를 사용하여 용해시켰다. 용해된 세포들은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 14,000\( \mathrm{rpm} \) 으로 20분 동안 원심분리 한 후, 단백질이 포함된 상등액을 취하였다. 단백질은 BCA를 이용한 protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA)을 통해 정량 하였다. \( 50 \mu \mathrm{g} \)의 단백질을 \( 10 \% \) SDS-polyacrylamide gel에 전기영동(electrophoresis) 한 후, \( 150 \mathrm{~mA} \) 로 1시간 동안 nitrocellulose membrane에 전기영동 하였다. 이후 membrane을 상온에서 2시간 동안 PBS로 만들어진 \( 5 \% \) skim milk로 blocking하고 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1:1,000으로 희석된 1차 항체를 overnight으로 반응 시켰다. Horseradish peroxidase가 붙어있는 anti-rabbit 2차 항체와 1시간 동안 상 온에서 반응 시킨 후, ECL kit (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 확인하였다. Anti-PPAR\( \gamma \), anti-(\beta \)-Actin, anti-rabbit 2차 항체는 Cell signaling (Beverly, MA, USA), anti-C/EBP\(\alpha \)는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), anti-\( \beta \) catenin은 BD Transduction Laboratories (Lexington, KY, USA)에서 구입하여 사용하였다. Anti-\( \beta \)-Actin 항체는 각 레인에 동일 량의 단백질이 load되었는지 확인하기 위하여 endog-enous control로 사용되었다.</p>