염 농도에 따른 Bacillus sp. N2 유래의 LAP 활성을 확인한 결과 고농도의 \( \mathrm{NaCl} \)이 있을 시 활성이 높아지고, 농도에 따른 활성도를 보기위해 서로다른 \( \mathrm{NaCl} \) 농도와 lineweaver-Burk 식을 이용한 결과 농도가 증가함에 따라 활성도 역시 높아짐을 확인했다. Di-, Tripeptide 기질에 따른 활성을 확인한 결과 Leu-Pro을 제외한 C-말단에 위치하는 소수성 아미노산 기질에 대해서는 효소활성을 나타내 산업적으로 Hydrolyzate 같은 쓴맛을 내는 단백질을 제거할 수 있음을 확인했다. 한편 보고된 다른 효소들과 효소활성도를 비교한 결과 본 연구의 LAP가 고농도의 \( \mathrm{NaCl} \)에서 가장 높은 효소활성을 나타내었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>염 농도에 의한 LAP의 활성</h2> <p>여러 염 \( (\mathrm{NaCl}, \mathrm{LiBr}, \mathrm{NaBr}, \mathrm{KBr}, \mathrm{LiCl}, \mathrm{KCl}) \) 들에 의한 LAP의 가수분해 활성을 조사하기 위하여 0,1,2,3,4 M 염의 농도가 포함된 L-Leu-pNA 기질을 사용하여 효소활성을 조사하였다. LAP은 다른 염들과 비교하여 상대적으로 \( \mathrm{NaCl} \) 에서 가장 높은 효소활성을 나타내었다. LAP의 효소활성은 \( \mathrm{NaC1} \) 농도에 비례적으로 증가하였으며, \( 2 \mathrm{M} \mathrm{~NaC1} \) 농도에서 최대활성을 보였다.</p> <p>이전에, 우리는 Bacillus sp. N2 유래의 LAP 정제 및 효소활성에 대해 보고하였다. 본 연구에는 다른 염들에 의한 LAP의 효소활성에 관한 내용을 조사하였다. 특히, LAP는 \( \mathrm{NaC1} \)에 의해서 효소활성이 증가되었다. 또한, 정제된 효소의 온도에 대한 안정성을 조사한 결과, 고농도의 \( \mathrm{NaC1} \) 조건에서 24시간 동안 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)와 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \)에서 효소의 활성이 안정한 것으로 확인되었다(data not shown). 고농도의 \( \mathrm{NaC1} \)이 존재할 경우에 LAP가 높은 효소활성이 보인다는 점과 온도에 대한 효소의 안정성은 산업적인 응용 측면에서 용이할 것으로 판단된다.</p> <h2>\( \mathrm{NaC1} \) 농도에 따른 LAP 활성에 관한 속도론</h2> <p>5 가지의 서로 다른 \( \mathrm{NaCl} \) 농도 (0,1,2,3,4 M) 에서 LAP의 L-Leu-pNA에 대한 반응속도(\(v\))는 lineweaver-Burk ([1/ \( V \) vs \( 1 / \mathrm{S}] \) 식에 의해 그래프화하였다(Fig. 2). Km과 Vmax 값은 lin-ear-squares regression 방법에 의해 계산되었다. \( \mathrm{Km} \) 값은 \( \mathrm{NaC1} \) 의 존재에 의해 영향을 받으며 \( \mathrm{Vmax} \) 값은 \( \mathrm{NaC1} \) 농도가 증가함에 따라 값이 높아진다는 것을 알 수 있었다.</p> <h2>\( \mathrm{Di} \)-와 tripeptide 기질에 대한 LAP의 가수분해활성</h2> <p>12종류의 C-말단 끝부분의 scissile bond에 di-와 tripeptide가 붙은 기질을 이용하여 \( \mathrm{NaC1} \)이 LAP의 활성에 끼치는 영향에 대해 조사하였다. 그 반응은 각 \( \mathrm{Km} \) 값 보다 낮은 기질 농도에서 수행하였다. \( \mathrm{NaC1} \)이 존재할 경우, C-말단 끝부분에 소수성 아미노산을 기질로써 사용하였을 때, LAP은 Leu-Met, Leu-Leu-Leu, Leu-Val, Leu-Leu, Leu-Phe, Leu-Trp 에는 활성이 있었지만, Leu-Pro에는 활성이 없었다. 그리고, 동일한 \( \mathrm{NaC1} \)의 조건에서 친수성 아미노산을 기질로써 사용하였을 때, LAP은 Leu-Tyr와 Leu-Asp에서는 활성이 있었으나, Leu-Arg, Leu-Gly, Leu-Asn에서는 가수분해가 일어나지 않았다. 이와 같은 결과는 Bacillus sp. N2 유래 LAP의 가수분해활성은 C-말단에 위치하는 소수성과 친수성 아미노산과는 아무런 관련이 없다라는 것을 의미한다. 하지만, LAP은 Leu-Pro을 제외한 C-말단에 위치하는 소수성 아미노산 기질에 대해서는 효소활성을 나타내었다라는 점은 주목할 만하다.</p> <p>단백질의 효소 처리공정은 다양한 식품산업 분야에서 많이 이용된다. 이러한 과정 동안 쓴맛을 내는 peptide가 생성되는데, 그 peptide로 인해 쓴맛이 발생된다. 이러한 쓴맛은 pep-tide의 소수성 아미노산과 밀접한 관계가 있다고 알려져 있으며, 소수성 아미노산을 제거함으로써 그 쓴맛을 제거하려는 연구가 진행되고 있다. Izawa 등에 의하면, Aeromanas cav-iae T-64 유래의 AP는 N-말단에 붙어있는 소수성 아미노산 잔기들을 가진 peptide을 가수분해한다는 것을 알았으며, 쓴맛을 내는 소수성 peptide를 포함한 milk casein과 soy protein의 hydrolyzate을 기질로 사용했을 때 쓴맛이 제거된다는 사실을 보고했다.</p> <p>이전에 우리는 정제된 LAP은 mono peptide 잔기 하나가 붙여 있는 합성기질인 L-Leu-pNA에서 가수분해 활성이 가장 높았다는 사실을 밝혔다. 본 연구에서는 정제된 LAP가 고농도의 \( \mathrm{NaC1} \)에서 여러 소수성 아미노산이 붙여 있는 di-와 tripeptide 기질에 대해서 활성화된다는 것을 보여주었다. 이러한 사실은 단백질 hydrolyzate으로부터 쓴맛을 제거하는 것과 반응시간을 줄이는데 중요한 인자가 될 수 있을 것이다.</p> <h2>보고된 AP와 LAP와의 효소활성 비교</h2> <p>\( \mathrm{NaC1} \) 이 효소활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 L-Leu-pNA을 기질로 하여 예전에 보고된 다른 AP들과 정제된 LAP의 효소활성을 비교하였다. 여러 가지 농도의 염(\(1\sim 4.5\mathrm{~M}\mathrm{~NaC1}\))이 존재할 경우, Bacillus sp. N2 유래의 LAP은 매우 안정한 효소활성을 보였지만, Streptomyes griseus 유래의 AP와 Porcine kidney cytosol 유래의 AP에서는 \( \mathrm{NaC1} \)의 농도가 증가함에 따라 효소활성이 감소하였다. Porcine kidney microsome 유래의 AP는 \(0.5\sim 1 \mathrm{~M} \mathrm{~NaC1} \) 농도에서는 효소활성이 증가하였으나, \( 2 \sim 4.5 \mathrm{~M} \)의 농도에서는 활성이 감소하였다. Aeromonas protedytica 유래의 AP 효소활성은 \( \mathrm{NaC1} \)의 농도와는 무관하게 아무런 영향을 받지 않았다.</p> <p>기존의 알려진 AP들과의 비교 실험 결과, Bacillus sp. N2 유래의 LAP가 고농도의 \( \mathrm{NaC1} \)에서 가장 높은 효소활성을 나타내었다는 것은 가장 주목할 만한 점이다. 비록 그 기질이 LAP 활성 조사에서 서로 다르게 사용되었다 할지라도 정제된 LAP은 다른 AP들보다도 1~3배의 높은 활성을 보여주었다.</p> <p>미생물 유래의 AP는 중요한 식품 처리공정에 사용되는 효소이며, 식품의 단백질을 변형하기 위해 사용되고 있다. 염과 관련된 식품산업에서 이러한 효소를 사용하려면 염에 대한 안정성이 아주 중요할 것으로 사료된다. \( \mathrm{NaC1} \)에 내성을 지닌 LAP는 치즈와 멸치 젓갈과 같은 식품 산업 공정에서 단백질 hydrolyzate의 쓴맛을 가진 펩타이드를 제거하는데 용이한 효소로 제공될 수 있을 것이다.</p>