기존의 방법을 개선하기 위해 85: 15 비율의 acetonitrile과 distilled water을 이동상으로 사용해 TLC를 수행했고, 기존의 TLC보다 더 좋은 결과를 얻어 이 이동상 조건으로 glycerol에 대한 표준곡선을 작성했다. \( X \)축은 log scale이고 \( Y \)축은 TLC 이미지에서 얻은 peak 면적이다. 개선된 TLC 방법을 이용해 biodiesel 안의 잔류 glycerol 농도를 유사한 정도로 측정할 수 있었고, 다른 방법들보다 활용 가능성이 높다고 할 수 있다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>TLC의 이동상 조사</h2> <p>TLC 방법을 이용하여 정량적으로 biodiesel 안의 glycerol 양을 분석하기 위하여 기존의 논문에 알려진 방법을 개선하기 위한 연구를 실시하였다. 기존의 방법은 이동상 전개를 위하여 너무 많은 시간이 소요되는 단점이 있었다. 먼저 이미 보고된 Maleszka et al. 과 Bansal et al.의 방법으로 glycerol 용액에 대한 TLC를 수행하여 Fig. 1A와 Fig. 1B와 같은 TLC 결과를 얻었다. 이 때, 이동상으로 Fig. 1A에서는 acetone : butanol : distilled water \( (8: 1: 1, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 를 사용하였고, Fig. 1B는 butanol : distilled water \( (1: 1, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 를 사용하였다. Fig. 1A의 결과를 얻기 위하여서는 한번 전개할 때에 약 12 분 정도의 시간을 소비하면서, 총 2회 전개하여 결과를 얻었으며, Fig. 1 의 결과를 얻기 위하여서는 한번 전개할 때 약 50 분 정도의 시간을 소비하면서, 총 3회 전개하여 결과를 얻었다. 그러나 본 연구에서 개선된 방법으로 사용한 Fig. 1C에서는 acetonitrile : distilled water \( (85: 15, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 을 이동상으로 사용하여 TLC를 수행하였으며, 상대적으로 glycerol이 잘 분리되고, 명확하고 깨끗한 TLC band를 얻을 수 있었다. 이 때, 한번 전개할 때 약 10 분 정도 소요되었으며, Fig. 1C의 결과는 총 3 회 전개한 결과이다. Fig. 1A와 Fig. 1B에서도 전개 횟수를 증감하여 보았으나, TLC plate를 벗어나거나, 아니면 glycerol 이미지가 크게 퍼지는 등, 좋지 못한 결과를 얻었다. 결과적으로 Fig. 1C는 Fig. 1A와 Fig. 1B에 비해 보다 짧은 시간 내에 더 좋은 TLC 결과를 얻을 수 있었으며, 또한, Fig. 1C에서는 보다 낮은 농도의 glycerol에서도 Fig. 1A와 Fig. 1B에 비하여 명확한 glycerol band를 확인할 수 있었다. 그래서 우리는 Fig. 1C의 이동상 조건으로 TLC를 실시하여 biodiesel 안의 잔류 glycerol 농도를 측정하기로 하였다.</p> <h2>Glycerol 표준곡선 작성</h2> <p>Fig. 1C 의 acetonitrile : distilled water \( (85: 15, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 이동상 조건으로 \( 5.0 \text{-} 0.0625 (\%, \mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 glycerol을 가지고 TLC를 수행하여 glycerol 표준곡선을 작성하는 실험을 Fig. 2 와 같이 수행하였다. 그래서 Fig. 2A 와 같은 명확한 TLC 결과를 얻을 수 있었으며, Fig. 2A의 TLC 이미지를 이미지 분석프로그램을 이용하여 peak로 전환 한 후, 그 면적을 glycerol 농도에 대하여 plotting 하였다. 이 때, Fig. 2B와 같은 표준곡선을 얻을 수 있었으며, 특히, \( X \)축의 glycerol 농도를 \( \log \) scale로 전환하여 표준곡선을 plotting 하였을 경우에 \( 3.0 \text{-} 0.0625 (\%, \mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 glycerol 농도에서 직선의 표준곡선 [regression coefficient \( \left(\mathrm{r}^{2}\right)=0.987 \) 이 됨을 알 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 TLC를 이용한 biodiesel 중의 glycerol 농도의 정량에 glycerol 농도를 표현하는 \( X \)축을 log scale로 하고, TLC 이미지에서 얻은 peak 면적을 \( Y \)축으로 하여 그린 표준곡선을 사용하였다.</p> <h2>Biodiesel에 포함된 glycerol 정량</h2> <p>위의 표준곡선 작성실험 결과를 biodiesel 안의 잔류 glycerol의 함량을 측정하는데 사용할 수 있는지에 대하여 실제 조사하여 보기로 하였다. 국내에서 구할 수 있는 두 가지 biodiesel 시료 중에 잔존하는 glycerol 함량을 측정하여 보기로 하였는데, 최종제품 형태로 얻은 biodiesel 안의 glycerol 양은 위에서 확립된 TLC 방법으로는 측정할 수 없을 정도로 매우 작은 양이었다. 그래서 두 biodiesel 시료에 \( 0.2 (\%, \mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 glycerol을 첨가한 인위적인 시료(S#1, S#2)를 제조한 후, TLC로 glycerol 양을 정량하여 보았다. 그 결과 Fig. 3에서와 같이 \( 1.0 \text{-} 0.125 (\%, \mathrm{w} / \mathrm{v}) \) glycerol을 표준시료로 사용하여, \( 0.2 (\%, \mathrm{w} / \mathrm{v}) \) glycerol이 함유된 두 가지 biodiesel 시료(S#1, S#2)를 TLC로 분석 하였을 때, glycerol band가 확인됨을 알 수 있었다. 이 때, glycerol 이미지뿐만 아니라 fatty acid methyl ester와 그 이외의 잔류물질 들도 같이 확인되었다. Fig. 3 에서와 같이 TLC 결과에서 표준곡선을 작성하고, 그 결과에서 얻은 두 glycerol 함유 biodiesel 시료 안의 glycerol 함량을 정량한 결과는 Table 1 과 같았다. 이 때, 이러한 TLC 방법을 통한 biodiesel 안의 glycerol 양 측정결과를 chemical assay와 enzymatic assay 방법의 결과와도 비교하여 보았다. Table 1 에서와 같이 biodiesel 안의 glycerol 농도가 우리가 biodiesel 안에 첨가한 \( 0.2 (\%, \mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 glycerol 농도와 정확히 일치하지는 않았으나, 어느 정도 유사한 값을 보임을 확인할 수 있었다. 그리고 세가지 측정 방법에서 상대적으로 약간의 차이는 있으나, 서로 간에 통계적으로 유의성 있게 같은 glycerol 값을 측정할 수 있음을 검증을 할 수 있었다 \( (p>0.05) \). 한편, 정확히 일치하지 않는 glycerol 측정값은 우리가 사용한 두 가지의 biodiesel 시료와 glycerol의 혼합 시, 서로 층이 분리되어 잘 섞이지 않았기 때문에 초래되는 것으로 생각된다. 즉, \( 0.2 (\%, \mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 glycerol이 포함된 biodiesel에서 시료를 채취 할 때 층분리에 의하여 발생될 수 있는 실험적인 error가 이러한 측정오차를 발생시켰을 것으로 추정된다.</p> <p>그러나 이러한 TLC 방법을 이용한 glycerol 함량의 정량 결과는 biodiesel 안의 잔류 glycerol 농도를 비교적 유사한 값으로 측정 할 수 있음을 보여주는 결과라 할 수 있겠다. 또한 기존의 TLC 방법에 비하여 정확하게 빠른 시간 내에 특별한 분석기기 없이 biodiesel 안의 잔류 glycerol을 측정할 수 있기 때문에 실용적인 방법으로 쓰일 수 있을 것으로 생각되어진다. 이러한 TLC 방법은 chemical assay나 enzymatic assay 방법, 특히 GC나 HPLC와 같은 측정기기를 이용한 방법에 비하여 보다 간편하기 때문에 보다 실용적으로 유용하게 활용될 가능성이 더 크다고 할 수 있다.</p> <p>Bansal et al.은 TLC 방법으로 \( 0.1 (\%, \mathrm{w} / \mathrm{v}) \)까지 glycerol을 검출하였으며, 검출한계를 낮추기 위하여 연구가 필요하다는 점을 언급하였다. 본 연구는 Bansal et al.의 방법을 개선하여 검출한계를 \( 0.0625 (\%, \mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 까지 낮추는 성과를 얻었다. 그러나 본 연구에서 얻어진 TLC 방법으로 아직까지는 biodiesel 안의 잔류 glycerol의 한계치인 \( 0.02 (\%, \mathrm{w} / \mathrm{v}) \)를 검출하기에는 부족하였다. 그렇지만, 본 연구에서 얻어진 TLC 방법을 이용한 잔류 glycerol 측정방법은 GC나 HPLC와 기기를 사용하지 않는 방법이기 때문에 biodiesel 안의 잔류 glycerol 함량의 pre-screening 방법으로 유용하게 쓰일 수 있을 것으로 생각되어진다. 또한 biodiesel 이외의 시료에서 glycerol을 분석하는 방법으로 쓰일 수 있을 것으로 생각되어진다. 앞으로 TLC 방법의 개선을 통하여 고가의 분석기기를 대체 할 수 있는 방법이 개발되어질 수 있을 것으로 생각되어진다.</p>