이 연구는 Bacillus sp. CP-1의 단백질 분석과 세포외 혈전용해효소 양상을 확인하였다. 단백질 분석을 위해 \( 40 \mathrm{~g} \)의 배양시료에서 단백질을 추출하고, \( 10 \% \)의 TCA를 사용해 침전시킨 후 SDS-PAGE를 통해 분석하였다. 또한, fibrin zymography 방법으로 혈전용해효소 양상을 조사하였으며, gel상의 상단 부분에서 한 가지 효소 활성을 확인하였다. Bacillus sp. CP-1의 배양에는 TSB 배지와 LB배지가 사용되었으나, 효소 생산 관점에서 TSB 배지가 더 효율적임을 확인하였다.
<h2>배지 종류에 따른 Bacillus sp. CP-1 유래 단백질의 분석 및 특성 규명</h2> <p>두 배지에서 배양된 Bacillus sp. CP-1 유래의 단백질 분석을 위하여 배양시료 \( 40 \mathrm{~g} \) 에 함유되어 있는 단백질을 최종 \( 10 \% \) 농도의 TCA를 이용하여 침전시킨 후 SDS-PAGE상에서 분석하였다. 또한, fibrin zymography 방법을 이용하여 Bacillus sp. CP-1 유래의 세포외 혈전용해효소 양상을 알아보았다. Fig. 4에서 보는 바와 같이 Bacillus sp. CP-1는 gel상의 상단 부분에서 하나의 효소 활성을 확인하였다. 이는 이전에 보고된 subtilisin의 binding mode와 일치하는 결과임을 확인하였다. SDS-PAGE 에 의한 분석에 있어서는 특징적으로 두 배지 배양액 모두에서 54 kDa과 28 kDa 부근에 명확한 단백질 밴드가 확인되었다. 따라서, 두 종류의 단백질 단편의 명확한 규명을 위하여 두 단백질에 대한 N-말단 염기서열 분석을 실행하였다. 먼저, 28 kDa 단백질의 N-말단 염기서열 분석을 분석한 결과 처음 8개가 AQSVPYGI (subtilisin CP-1으로 명명)로 분석되었으며 이 배열은 B. subtilis 유래 subtilisin NAT (P35835)와 동일한 배열임을 나타내었다. 반면, 청국장에서 분리한 Bacillus sp. strain CK 11-4 유래의 CK (AQTVPYGI)와 비교했을 때 3 번째 서열에서 차이를 보였다. Subtilisin CP-1의 효소 특이성을 알아 본 결과, \( \mathrm{pH} 9.0 \) 및 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 최적의 효소활성을 나타내었으며(data not shown), chymotrypsin 에 대한 특이적 기질인 Meo-Suc-Arg−Pro−Tyr−pNA (S-2586)에 대하여 가장 높은 기질 특이성을 보여 subtilisin CP-1의 경우 chymotrypsin 유사 알칼리성 혈전용해효소로 분류되었다.</p> <p>그리고, 50 kDa 단백질의 처음 6 개의 N-말단 염기서열 분석의 결과는 MSSNKL로 분석되었으며 이 배열은 B. subtilis 유래 vegetative catalase (CAB04807)와 동일한 배열인 것으로 확인되었다. Catalase는 산화적 스트레스에 의해 유도되어지는 효소로서 B. subtilis에서는 적어도 3 종류의 catalase, catalase 1 (KatA, 55 kDa), catalase 2 (KatE, 80 kDa), 그리고 catalase 3 가 유래한다고 보고되어져 있다. 특히 KatA 는 glucose의 결핍에 의해 합성되어지는 효소로서 이는 LB 배지에 glucose가 함유되어 있지 않은 관계로 LB 배지에서 특히 50 kDa 단백질이 많이 생산되어 있었으며, 50 kDa 단백질에는 catalase 중에서도 KatA가 많이 존재 할 것이라는 것이 추정되어졌다. Subtilisin은 아시아 지역의 발효 식품인 낫토우, 청국장, 된장 그리고 Douchi 등에서 단리된 Bacillus sp. 유래의 주요 혈전용해효소로서 보고되어져 있으며. 본 연구에서는 subtilisin CP-1의 효율적인 생산의 관점에서 Bacillus sp. CP-1의 배양을 위해 TSB 배지 및 LB배지를 이용하여 검토한 결과 효소 생산의 관점에 있어서는 TSB 배지가 더욱 더 효율적임을 확인하였다. 이러한 결과는 본 연구에서 규명한 subtilisin CP-1의 활성 특성과 함께 발효식품유래의 대표적인 혈전용해효소인 subtilisin의 생산 및 적용 연구에 활용 될 수 있을 것으로 기대되어진다.</p>