국내 토종 참당귀와 세발당귀를 판별할 수 있는 분자 마커를 개발하기 위해 두 종의 염기서열을 비교한 결과 단 두개의 SNP를 확인할 수 있었으며 굳이 ARMS-PCR기술을 사용하지 않아도 일반 PCR을 사용하여 판별이 가능하였다. 또한, 국내 토종인 세발당귀의 ITS 유전자 단편내 확인된 단 2개의 SNP를 다양한 ARMS-PCR 프라이머 조합을 사용한 경우 해외 당귀 계통과도 판별이 가능한 결과를 얻을 수 있었다.
<h2>세발당귀 및 참당귀의 구분을 위한 판별 마커의 제작</h2> <p>국내 토종 당귀인 참당귀와 세발당귀를 각각 판별할 수 있는 분자 마커를 개발하고자 두 종에 대한 염기서열을 비교한 결과 단 두 개의 SNP를 확인할 수 있었다. 이에 근거하여 먼저 세발당귀에만 특이하게 적용되는 정방향 프라이머를 제작하였다(Table 2C, Fig. 3A). 제작된 프라이머는 참당귀를 포함하여 다른 해외 당귀종과 유일하게 차이가 나는 염기서열 T를 3'-말단에 위치하도록 하여 24-me를 제작하였으며, 이영역에 대한 다른 4 종의 염기서열과 비교하면 참당귀와는 1개, 일당귀와는 2개, 중국당귀 및 구당귀와는 7개의 염기가 mismatching 하였다. 역방향 프라이머는 참당귀와 유일하게 차이가 나는 A를 3'-말단에 위치하도록 하여 18-mer를 제작하였다. 이 프라이머의 염기서열을 다른 4종의 당귀와 비교 한 결과 참당귀와 일당귀와는3'-말단에 단 1개, 중국 및 구당귀와는 3'-말단은 차이가 없지만 내부에 C 대신 G가 mismatching 되는 다른 1개의 차이를 보였다. 이렇게 제작된 세발당귀 판별용 특이 프라이머를 사용하여 PCR 증폭 실험을 한 결과, 4종의 당귀 계통에서 밴드를 형성하여 상호 구분이 불가능하였다(Fig. 3B). 따라서 정방향 및 역방향 프라이머의 3'-말단에 인접한 세 번째 염기를 다른 3 종의 염기로 임의로 변경하여 정방향 및 역방향에 각각 동일한 염기가 변경된 4조합(Table 2C)을 사용하여 ARMS-PCR 실험을 수행한 결과 정방향 및 역방향 프라이머의 3'-말단에 인접한 세 번째 염기를 T 또는 G로 변경한 경우에 세발당귀에만 선명하게 밴드가 나타나고 다른 시료에는 모든 밴드가 사라진 것을 확인하였다. 그러나 A 또는 C로 변경한 프라이머 조합에는 ARMS-PCR의 효과가 없는 것으로 조사되었다.</p> <p>참당귀 판별용 프라이머를 제작하기 위하여 정방향 프라이머는 유일하게 일당귀와 차이가 나는 C를 3'-말단에 위치하게 하여 19-mer를 제작하였으며 역방향 프라이머는 세발당귀 판별용 프라이머와 동일한 위치에서 제작하였으나 5'-말단에 T 염기를 하나 더 추가한 19-mer를 제작하였다(Table 2C, Fig. 3A). 정방향 프라이머의 3'-말단은 일당귀와 차이가 나며, 역방향 프라이머의 3'-말단은 세발당귀, 중국당귀 그리고 구당귀와 차이가 나도록 제작하였다. 정방향 프라이머의 전체 염기서열을 상호 비교하여 보면 중국당귀와 구 당귀와 각각 1 개 및 2 개의 mismatching을 보였다. 역방향 프라이머는 세발당귀 판별용 역방향 프라이머와 동일한 것으로 3'-말단은 일당귀와는 동일하나 세발당귀, 중국 및 구당귀와는 차이가 나도록 하였으며, 추가적으로 프라이머의 내부 염기서열에 중국당귀와 구당귀는 각각 2 개의 mismatching을 보였다. 이렇게 제작된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭실험을 수행 한 결과 중국당귀와 구당귀에는 밴드가 나타나지 않았으나, 세발당귀 및 일당귀에도 동일한 위치에서 밴드가 확인되었다. 이러한 결과는 세발당귀의 경우에는 역방향 프라이머 그리고 일당귀와는 정방향 및 역방향 프라이머의 3'-말단에 단 하나의 mismatch만 존재하는 프라이머 조합이기 때문에 대립 유전자(allele)의 구분이 어려울 것이라고 이미 예견되었다. 따라서 3'-말단에 인접한 세 번째 염기를 다른 3종의 염기로 치환하여 만든 3 종류의 프라이머들을 사용하여 세발당귀의 경우와 동일하게 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 동일한 염기로 치환된 조합을 사용하여 ARMS-PCR 분석을 진행하였다(Table 2C). 그 결과 정방향 및 역방향 프라이머의 3'-말단에서 3 번 째 염기를 G로 변경한 프라이머 세트를 이용한 경우에만 참당귀 시료에서 유일하게 특이적인 밴드를 형성하여 역시 ARMS-PCR기술의 효율을 확인할 수 있었다. 그러나 A또는 T로 변경한 프라이머 조합에서는 치환하지 않은 프라이머를 사용하였을 때와 동일하게 세발당귀 및 일당귀에 강한 밴드를 확인하였으며 C로 변경한 프라이머 조합의 경우에는 오히려 모든 시료에서 밴드가 사라지는 것을 확인하여 판별 마커로는 부적절한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3C).</p> <p>이상의 연구결과를 보면, 국내 자생 당귀인 참당귀와 세발당귀는 굳이 ARMS-PCR 기술을 사용하지 않고 관행적인 일반 PCR을 사용하여 확실하게 판별이 가능하였다. 따라서 지금까지의 연구결과를 현장에 실용화하기 위한 방법은 먼저 국내자생용 당귀 판별용 프라이머 조합(Table 2B)을 사용하여 외국종과 분리한 다음 세발당귀 또는 참당귀의 여부는 ARMS-PCR용으로 세발당귀 특이 프라이머 조합(Table 2C)을 사용하면 쉽게 판별이 가능할 것으로 사료된다. 그 이유는 본 연구에서 제작한 참당귀 특이 판별 마커를 이용한 ARMS-PCR 실험결과 단지 3'-말단에 인접한 염기서열 "C"를 “G”로 치환한 경우에만 유일한 밴드를 확인하여 판별이 가능하다고 할 수 있으나 밴드의 강도가 상대적으로 많이 약화된 것이 단점이었기 때문이다.</p> <p>본 연구에 사용된 국내 토종인 세발당귀의 경우 ITS 유전자 단편내 확인된 단 2개의 SNP를 사용하여 다양한 ARMS-PCR용 프라이머 조합을 사용한 경우 참당귀 뿐만 아니라 다른 해외 당귀 계통과도 확실하게 판별이 가능한 우수한 결과를 얻을 수 있었다. 또한 참당귀의 경우에도 일당귀와 염기서열이 아주 유사하였으나 유일하게 일당귀와만 차이가 나는 염기 하나를 3'-말단에 위치하게 하여 정방향 특이 프라이머로 사용하고 역방향 프라이머는 세발당귀에 사용된 프라이머를 그대로 사용하여 ARMS-PCR기술을 적용한 결과 밴드가 약화된 것이 단점이긴 하나 중국당귀와 구당귀는 물론 세발당귀 및 일당귀와도 판별에 대한 가능성은 확인하였다. 이러한 연구결과는 정방향 및 역방향 프라이머의 3'-말단에 인접한 3 번째 염기를 각각 동일한 염기로 변경한 조합만을 조사한 연구결과로, 향후 3'-말단에 인접한 2번째 및 4번째 염기를 변경한 프라이머와 서로 다른 염기로 변경한 조합 등 적어도 50 조합 이상의 다양한 프라이머 조합에 대한 조사를 수행하면 밴드의 강도가 약화되지 않는 보다 개선된 프라이머 조합의 탐색이 가능할 것으로 조사되었다.</p> <p>뿐만 아니라, annealing 온도에 따라 극도로 민감하므로 현장에서 적용이 가능한 실용화를 위하여 온도 변화에 따른 결과의 변동성, 실험하는 실험자에 따른 유사 밴드의 출현을 최소화할 수 있는 조건의 확립 등에 관한 보완 연구 또한 필요하다고 사료된다. 또한, 최근 급속하게 발전하고 있는 NGS기술과 병행하여 보다 다양한 SNP를 보이는 유전자 단편을 확보하여 제 2, 제 3의 분자마커를 사용한 교차 분석시스템을 이용하거나 SNP를 보이는 특정 DNA 단편(약 \( 200 \mathrm{bp} \) )을 대상으로 High resoultion melting 곡선 패턴을 비교하는 기술을 적용하여 상호 비교하는 시스템을 확립하면 현장에서 적용할 수 있는 실용화를 조기에 확립할 수 있을 것으로 사료된다.</p> <p>본 연구에서 확인된 분자표지는 당귀 이외에 국내 및 해외에서 그 기원을 달리하는 다양한 당귀 및 유사 종들의 정확한 기원판별을 위하여 실용화가 가능할 것으로 사료된다. 생육 조건이나, 형태적 변이 등에 따라 크게 영향을 받지 않는 DNA 단편을 이용한 기술로 향후 국내외 유통시장에서 혼용되는 사례들을 적발하기 위한 실용화에 관한 추가 연구의 필요성을 제시하였다. 뿐만 아니라 건재 또는 탕재 등으로 가공된 시료를 대상으로 한 추가 연구도 수행되어야 실용화가 가능할 것이다.</p>