본 연구는 환돈을 부검하여 채취한 폐, 관절 및 뇌 등의 가검물에서 균을 분리해 실험하였다. 분리한 균 중 S. suis 의심균주의 생화학적 검사는 세균 동정킷트를 통해 진행하였다. 다음으로 균의 동정을 위해 S. suis의 유전자부위 primer을 제작하여 PCR을 진행하였다. 이후 ethidium bromide가 함유된 agar gel을 이용한 전기영동을 실시한 후 자외선 조사를 통해 균의 동정을 진행하였다. 마지막으로 항균제 감수성 시험은 디스크 확산법을 통해 진행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>균의 분리</h2><p>2004년부터 2009년까지 경북지방 소재 양돈장에서 병성감정 의뢰된 환돈을 부검하여 채취한 폐, 관절 및 뇌 등의 가검물을 대상으로 면양혈액 \( 5 \% \)첨가 혈액배지에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), 18시간 배양하였다. 다음 \(\alpha\)-용혈을 일으키는 작은 집락을 분리하여 비동화 말혈청 \(5\%\)을 첨가한 Tryptic soy agar (TSA, Difco, USA)에 계대하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), 18시간 배양한 다음 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 냉동보관하고 생화학적 성상, PCR 및 항균제 감수성시험 등 추가실험을 실시하였다.</p><h2>생화학적 성상검사</h2><p>분리한 S. suis 의심균주에 대하여 상용화 세균 동정킷트(API20-STREP, bioMeriux, France)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 생화학적 성상을 검사하였다.</p><h2>PCR에 의한 균 동정</h2><p>균 동정을 위해 Marois 등의 방법에 따라 S. suis의 특이 유전자부위인 16S-rRNA 부위의 primer (F: 5'-CAG TAT TTA CCG CAT GGT AGT TAT-3', R: 5'-GTA AGA TAC CGT CAA GTG AGA A-3')를 제작하여 PCR을 실시하였다. 분리주의 PCR을 위해 genomic DNA 추출은 18시간 순수분리하여 증균계대한 균주를 백금이로 1획선 채취하여 멸균증류수 \(500 \mu \mathrm{l} \) 첨가한 microtube에 접종하고 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 중탕가열한 다음 \( 12,000 \mathrm{~rpm} \)에서 10분간 원심분리하고 균체성분을 침전시킨 후 상층액 \( 300 \mu \mathrm{l} \)를 새로운 microtube에 옮겨 냉동보관하면서 PCR을 위한 template DNA로 이용하였다. PCR은 Accu-Power\( { }^{\circledR} \) HL PCR premix [\(1\mathrm{U}\) Taq DNA polymerase, \(250\mathrm{uM} \) each dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), \(10\mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\) (\(\mathrm{pH} 9.0\)), \(40\mathrm{mM} \) \( \mathrm{KCI} \), \(1.5\mathrm{mM} \) \( \mathrm{MgCl}_{2} \), stabilizer and tracking dye, Bioneer\( { }^{\circledR} \)]에 template DNA \( 5 \mu \mathrm{l}\) 와 제작한 primer \( 1 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하여 T-gradient thermoblock (Germany, Biometra Co.)내에서 실시하였다. PCR 반응조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C}\), 5분간 pre-denaturation시킨 다음, denaturation \( \left(94^{\circ} \mathrm{C},\right. \) 30초), annealing \( \left(60^{\circ} \mathrm{C}, \right. \) 30초) 및 extension \( \left(72^{\circ} \mathrm{C}\right. \) 60초)의 과정을 30회 반복 수행시키고 최종적으로 DNA extension을 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 실시하였다. PCR이 끝난 후 증폭된 유전자 부위의 확인을 위해 ethidium bromide가 함유된 \( 1.5 \% \) agar gel (Bioneer, Korea)에 각 반응이 끝난 시료를 \( 8 \mu \mathrm{l} \) 씩 취하여 한천 사이에 점적한 후 \( 110 \mathrm{~V}\), 30분간 전기영동을 실시하고 자외선조사 하에서 특정 위치의 DNA band를 확인하고 사진촬영을 실시하였다. Molecular size marker는 \( 1 \mathrm{~kb}\) \(100 \mathrm{bp} \) DNA ladder (Bioneer, Korea)를 사용하였다.</p><h2>항균제 감수성 시험</h2><p>항균제 감수성 시험은 Clinical Laboratory Standards Institute의 기준에 따라 디스크 확산법(disc diffusion method)을 이용하여 다음과 같이 실시하였다. 먼저 분리주를 \( 5 \% \) 면양혈액첨가배지 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), 18시간 동안 배양한 후 멸균면봉으로 집락을 채취하여 \( 5 \mathrm{ml} \) 멸균생리식염수에 균희석농도를 표준탁도(McFarland No. 0.5)로 희석하고 멸균면봉을 사용하여 미리 준비한 \( 5 \% \) 면양혈액첨가배지에 균등하게 획선 도말한 다음 항생제 disc를 배지당 8개를 접종하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), 18시간 배양한 후 disc 주위에 나타난 발육저지대를 caliper를 이용하여 측정하였고, 항생제에 대한 감수성 결과는 disc 제조사에서 제시한 기준에 따랐다. 본 실험에 사용한 항균제는 BBL sensi-disc (BD \( ^{\circledR} \) , USA) 제품인 penicillin \( (10 \mathrm{~U}) \), amoxycillin/Clavulanic acid (\(20/10 \mu \mathrm{g}) \), ampicillin (\(10 \mu \mathrm{g}) \), cephalothin \( (30 \mu \mathrm{g}) \), cefoperazone \( (75 \mu \mathrm{g}) \), cefepime \( (30 \mu \mathrm{g}) \), kanamycin \( (30 \mu \mathrm{g}) \), gentamicin \( (10 \mu \mathrm{g}) \), amikacin \( (30 \mu \mathrm{g}) \), neomycin \( (30 \mu \mathrm{g}) \), streptomycin \( (10 \mu \mathrm{g}) \), norfloxacin \( (10 \mu \mathrm{g}) \), erythromycin (\(15 \mu \mathrm{g}) \) ), clindamycin \( (2 \mu \mathrm{g}) \), ciprofloxacin (\(5 \mu \mathrm{g}) \), chloramphenicol (\(30 \mu \mathrm{g}) \), doxycycline \( (30 \mu \mathrm{g}) \), tetracycline( \(30 \mu \mathrm{g}) \), trimethoprim/sulfamethoxazole (\(1.25/23.75 \mu \mathrm{g}) \)과 Oxoid \( ^{\circledR} \)(UK) 제품인 enrofloxacin \( (5 \mu \mathrm{g}) \), Ceftiofur ( \(30 \mu \mathrm{g}) \), tilmicosin \( (15 \mu \mathrm{g}) \), spectinomycin \( (100 \mu \mathrm{g}) \), florfenicol (\( 30 \mu \mathrm{g}) \) 등 24종을 사용하였다.</p>