Bacillus sp J105가 미리 전배양된 mannitol 1%, soytone 0.5%, (NH4)2HPO4 0.1%의 배지에 clox-acillin 300mg/ml을 첨가하여 30\(^\circ \mathrm{C}\)에서 24시간 배양하여 \( \beta \)-lactamase를 원심분리하여 추출하였다.
<h2>배양 및 조효소의 조제</h2> <p>\( \beta \)-lactamase 최적 생산 배지[mannitol \(1 \% \\), soytone \( 0.5 \% \), \( \left . \left ( \mathrm { NH } _ { 4 } \right )_ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } \right ) \) \(0.1 \% \\), \( \mathrm { pH~ } 9 \)] \(250 \mathrm { ml } \)를 분주하여 가압 멸균한 후 미리 전배양한 Bacillus sp. J105를 \( 2 \% \)가 되도록 접종하여 본 배양을 행하였다. 그리고 \( \beta \)-lactamase 유도제로서 clox-acillin \( 300 \mathrm { ~mg } / \mathrm { ml } \)를 첨가하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 진탕 배양한 후 원심분리 \( (23,000 \times \mathrm { g } , \text { 20 min } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } ) \)하여 상등액을 세포의 조효소액으로 사용하였다. 이때 전배양은 \( 500 \mathrm { ~ml } \)의 shaking flask에 최적 생산배지를 \( 100 \mathrm { ~ml } \)를 분주하여 멸균한 뒤, 냉장 보관 중이던 균주를 4~5 백금이를 접종하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 15시간 진탕 배양 (180 rpm, 15 hr, \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \))하였다.</p> <h2>효소 활성 측정법</h2> <p>본 연구에서는 penicillins과 cephalosporins의 다양한 기질들을 사용할 수 있는 rapid fixed-time assay의 변형법인 iodometric assay method의 방법을 응용하여 효소 활성을 측정하였다. 효소 정제 단계에서 얻어진 각 효소 분획물 \( 1 \mathrm { ~ml } \)와 \( 0.01 \mathrm { ~M } \) acetic acid buffer ( \( \mathrm { pH~ } 5.0 \)) \( 1 \mathrm { ~ml } \)를 혼합하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 가온하여 효소를 활성화 시켰다. 동일 buffer에 용해한 \( 0.4 \% \)의 ampicillin용액 \( 1 \mathrm { ~ml } \)를 첨가함으로서 반응을 시작하였다. 반응 후 요오드 시약 \( 5 \mathrm { ~ml } \)를 첨가함으로서 반응을 정지시켰다(요오드 시약은 \( 0.16 \mathrm { ~M } \) iodine과 \( 1.2 \mathrm { ~M } \) potassium iodine용액을 혼합하여 stock용액으로 하고 사용 시에는 \( \mathrm { pH~ } 4.0 \)의 acetic acid buffer로 50배 희석하여 사용하였다). 반응이 정지된 반응액은 잘 교반하여 실온에서 10분 간 방치 후 \( 540 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 요오드 시약으로 발색한 후 동량의 효소액을 첨가하여 측정하였다. 측정된 흡광도로 효소활성의 unit ( \( \mathrm { U } \))는 다음과 같이 계산하였다. 한편 \( \beta \)-lactamase 활성의 \( 1 \mathrm { ~unit } \)는 1분동안 \( 1 \mathrm { mmol } \)의 기질을 가수분해하는 효소량으로 정의하였다.</p>