약재 추출물을 제조하고 쥐의 대뇌피질신경세포를 배양하였다. 이후 저산소증을 유발하였고 1차 항체와 형광물질이 포함된 2차 항체를 이용하여 Immunocytochemistry를 수행했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>약재</h2> <p>실험에 사용된 黃芩(Scutellaria baicalensis GEORGI, SB)은 대한약전 및 대한약전 외 한약 규격주해에 근거하여 동국대학교 경주한방병원에서 구입하였다.</p> <h2>熿苓 물추출액 제조</h2> <p>黃芩 \( (85.227 \mathrm{mg}) \) 에 \( 12.5 \mathrm{ml} \) 의 증류수를 넣어 균질화하고 상온에서 4 시간, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 18 시간 흔든 후, 이를 \( 15,000 \mathrm{rpm} \)에서 15 분간 원심분리하여 상등액을 얻고 여과멸균 \( (0.45 \) \( \mathrm{um} \) )한 후 소량씩 분주하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다. 건조물의 양은 \( 1 \mathrm{ml} \) 추출액 3 튜브를 동결 건조한 후 평균치를 사용하였다.</p> <h2>신경세포 배양</h2> <p>임신 18일(embryonic day 18 \( \mathrm{E}_{18} \) )의 Sprague-Dawley계 흰 쥐의 대뇌피질신경세포를 Brewer 등의 방법에 따라 배양하였다. 즉, \( \mathrm{E}_{18} \) 의 휜쥐를 dry ice가 들어있는 통속에 3~5분 간 넣어 마취하고, 자궁을 가른 후 흰쥐 태아를 취하고 뇌를 잘라내었다. 대뇌피질 조직을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 \( 0.25 \% \) trypsin으로 처리하고 \( 1 \mathrm{mM} \) sodium pyruvate와 \( 10 \mathrm{mM} \) HEPES ( \( \mathrm{pH} \) 7.4)가 첨가된 HBSS용액(Invitrogen Life Technology) 5\( \mathrm{ml} \) 로 4 5회 세척하여 반응을 중단시켰다. 조직을 \( 1 \mathrm{ml} \)Hank's 용액으로 옮기고 끝을 불에 달구어 구멍을 작게 한 pasteur pipette으로 6 7회 통과시켜 신경세포를 분산시켰다. 이 후 분산된 세포를 모으고 세포수를 측정한 다음 약 1,500cells \( / \mathrm{mm}^{2} \) 되도록 B27을 첨가한 plating eurobasal media (Invitrogen Life Technology) \( (100 \mathrm{ml} \) neurobasal, 2 \( \mathrm{ml} \) B27 supplement, \( 0.25 \mathrm{ml} \) glutamax I, \( 0.1 \mathrm{ml} 25 \mathrm{mM} \) glutamate, \( 0.1 \mathrm{ml} 25 \mathrm{mM} \) 2-mercaptoethanol)에 접종하여 5\% \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양조에서 배양한 다음 2~3일 간격으로 배양액을 feeding neurobasal media \( (100 \mathrm{ml} \) neurobasal, \( 2 \mathrm{ml} \) B27 supplement, \( 0.25 \mathrm{ml} \) glutamax I)로 \( 1 / 3 \) 씩 교환하였다.</p> <h2>저산소증 유발</h2> <p>Culture plate를 \( \mathrm{CO}_{2} \) Water Jacketed Incubator(Forma Scientific Inc.)를 이용하여 \( 2 \% \mathrm{O}_{2} / 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 환경에서 3시간 처리하여 저산소증을 유도하였다. 저산소 처리가 끝나면 배양세포를 정상산소 환경 배양조에 옮기고 계속 배양하였다.</p> <h2>Immunocytochemistry(IC)</h2> <p>1.1. 배양용기(24-well plate)를 얼음 위에 올려놓고 배양액을 \( 500 \mu \) l의 ice-cold D-PBS\( (0.1 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) \( \mathrm{CaCl}_{2}, 0.2 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \mathrm{KCl} \), \( 0.2 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 0.1 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \mathrm{MgCl} 2_{2}-6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 8.0 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \mathrm{NaCl} \), \( 2.16 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \mathrm{NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4}-7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) )로 교환하였다. D-PBS를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) methanol \( (500 \mu \mathrm{ll}) \) 로 교환하고 5분 후 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) methanol \( (500 \mu \mathrm{l}) \) 로 다시 교환한 다음 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20분간 두었다. Methanol을 ice-cold D-PBS(500 씨)로 교환하고 15분 후 preblock sol- ution \( [0.05 \% \) triton, \( 5 \% \) normal goat serum in h-PBS(20 \( \mathrm{mM} \mathrm{NaPO} 4, \mathrm{pH} \) 7.4, \( 450 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl})] \) 을 넣어 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 처리하였다. 1차 항체(anti-RARa rabbit polyclonal, 1:200, Affinity Biotechnology Inc., Golden, CO, USA; anti-PSD95 (postsynaptic density 95) monoclonal, 1:500, Upstate Biote- chnology Inc., Lake Placid, NY)를 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 반응시킨 후 실온에서 preblock solution으로 20분씩 3회 세척하였다. 형광물질이 포지된 2차 항체(anti-mouse IgG, Alexa 488-labeled, 1:2,000 혹은 anti-rabbit IgG, Alexa 568-labeled, \( 1: 2,000 \) )를 넣고 1시간 더 반응시킨 후, D-PBS로 15분씩 3회 세척하였다.</p>