hypoxia/reoxygenation은 일정 농도의 세포를 저산소배양기로 4시간 동안 밀폐하고 16시간동안 재관류하는 과정이다. Gelatin Zymography는 TCA 침전법과 SDS-polyacrylamide gels를 사용하여 24시간 후 MMP-2, -9의 활성을 측정하는 방법이다. 본 논문의 실험에서 tPA에 의해 발생하는 부작용이 MMP의 활성증가에 의한 것인지, 어떻게 조절될 수 있는지 연구하기 위해 임신 17주의 쥐에서 추출한 뇌피질에서 뇌신경혈관계를 구성하는 신경세포를 분리 배양해 MMP 발현량을 조사했다. 그 결과 농도 의존적으로 \((1-5 \mu \mathrm { g } / \mathrm {ml})\) tPA가 유도하는 MMP의 발현량은 증가하였고 처리한 모든 농도에서 세포독성은 관찰되지 않았다.
<h3>Hypoxia/Reoxygenation</h3> <p>저산소상태(hypoxia)는 일정 농도의 세포가 심겨진 96well 또는 6well 배양접시를 \( 90 \% \mathrm { ~N } 2 / 5 \% \\mathrm { CO } 2/5 \% \mathrm { H } 2 \)를 주입한 저산소배양기(hypoxia chamber)로 옮겨 밀폐된 공간에서 4시간 동안 유지하였고 이어 일반적인 \( \mathrm { CO } 2 \) 세포 배양기로 옮겨 16시간동안 재관류 (re- oxygenation) 시켰다.</p> <h3>Gelatin Zymography</h3> <p>처리 24 시간 후 원심분리를 통해 모아진 배지는 TCA 침전법을 이용하여 농축시켜 \( 1 \mathrm { ~mg } / \mathrm { ml } \) gelatin이 포함된 \( 10 \% \) SDS-polyacrylamide gels에 전기영동 하였다. \(2.7 \% \) Triton X-100 용액에서 1시간 반응하고 \( 50 \mathrm { ~mM } \) Tris base, \( 40 \mathrm { ~mM } \) \( \mathrm { HCl } , 200 \mathrm { ~mM } \mathrm { ~NaCl } , 5 \mathrm { ~mM } \mathrm { ~CaCl } _ { 2 } \) and \( 0.2 \% \) Briji 35를 포함한 developing buffer에서 20 시간 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 항온조에서 반응시킨 후 Coomassie blue로 염색하여 MMP 활성도를 비교하였다. 상대적인 MMP 활성도는 NIH image analysis software을 이용하여 정량화하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <p>지난 10여 년 동안 FDA의 승인을 받아 뇌졸중 치료에 사용되는 tPA는 뇌경색부위의 뇌조직을 재관류를 통해 회복시킨다는 점에서 매우 효과적이지만 발병한지 3시간이후 사용을 하게 되면 상해, 부종, 출혈과 같은 부작용이 나타나 위험률이 상당히 높아지게 된다. 이전의 여러 보고들에 의하면 이러한 현상은 뇌신경혈관계(neurovascular unit)에서 tPA가 유도하는 MMP의 불균형 조절(MMP dyregulation)과 관련이 있는 것으로 보여진다. 동물을 이용한 focal cerebral ischemia모델에서 tPA의 주입은 MMP 발현량을 증가시켰고 증가된 MMP의 활성은 basal lamina나 뇌혈관장벽(BBB)의 투과성을 증대시켜 부종이나 혈관벽 파열을 유도하였다. MMP 증가된 활성은 ischemia 동물 모델에서 뿐만 아니라 혈관내피세포를 이용한 저산소유발 모델에서도 확인되었고 cell free system하에서 기질 물질의 하나인 fibronectin을 분절화를 유도하는 것으로 보고되어 있다. 그러나 in vitro sys-tem에서 저산소증이 유발된 상태에서 tPA가 나타내는 효과와 그 조절 기전에 대한 연구는 거의 전무한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 tPA에 의해 유도될 수 있는 부작용이 MMP의 활성증가에 의한 것인지, 어떠한 작용기전을 통해 조절 될 수 있는지를 알아보기 위해 임신 17주된 쥐의 배에서 적출한 뇌피질에서 뇌신경혈관계를 구성하는 신경세포를 분리, 배양하여 tPA에 의한 MMP 발현량을 조사하였다. 그 결과 농도 의존적으로 \( (1-5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) tPA가 유도하는 MMP의 발현량은 증가되는 양상을 보였고(Fig. 1A) 처리한 모든 농도에서 세포독성은 관찰되지 않았다(data not shown). 시간별에 따른 변화양상은 1 시간 이후부터 MMP의 활성을 확인 할 수 있었고 6시간째에 최대의 활성을 보여 24 시간까지 지속되는 양상을 보였다 (Fig. 2A). In vitro system에서 뇌경색의 효율을 그대로 모방할 수 있는 4 시간의 저산소(hypoxia)에 따른 20 시간의 재관류 (reoxygenation) 역시 약 2 배 정도의 MMP의 활성 증가를 보여주었다(Fig. 2A). tPA 이용한 thrombolytic therapy의 경우 뇌경색이 진행되고 있는 환자에 적용되어지므로 임상적인 치료시기와 유사한 조건을 맞추기 위해 4 시간의 저산소 상태 후에 \( 5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) tPA를 처리하여 재관류 시켜주었다. Fig. 2A 에서 보여 지듯이 함께 처치된 경우 단독 처리된 tPA나 저산소상 태(H/R)의 효과에 비해 월등히 증가된 MMP의 활성을 관찰할 수 있었다. 이는 저산소상태로 인해 유도된 활성화된 MMP가 기저막이나 뇌혈관벽을 약하게 만든 상태에서 tPA의 직접적인 처리는 MMP의 활성을 증폭시켜 이들의 손상을 보다 빨리 가속화시키고 뇌신경혈관계를 구성요소들의 항상성 파괴를 야기할 것으로 생각된다. 다음으로 tPA의 MMP 발현조절 기전을 알아보기 위해 3 가지 MAP kinase 경로와의 관련성을 검토하였다. U0126 (ERK inhibitor), SB203580 (p38 kinase inhibitor), SP600125 (JNK inhibitor) 각각을 30분 전 처리한 후 tPA와 저산소가 유도하는 MMP 활성도를 비교 분석한 결과 U0126과 SB203580 처리군에서는 대조군과 유사한 양상을 보인 반면, SP600125를 처리한 실험군에서는 MMP 활성이 현저히 감소된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2B). 이는 JNK 신호전달경로가 발현조절에 중요한 작용을 하고 있음을 보여주는 것이다. 물론 세포의 타입에 따라 다르긴 하지만 뇌신경혈관계 세포들외의 많은 세포들에서 보고된 바에 따르면 MMP의 발현 조절 기전은 주로 MAP kinase 경로에 의존적인 것으로 보인다. THP-1이나 HL-60 같은 monocytic 세포에서는 ERK 경로를 통해 MMP발현이 조절되고 OVCAR-3 세포에서는 JNK 경로가 관여하고 있다. 이는 MMP 발현이 전사조절 수준에서 MMP 의 프로모터 부위에 존재하는 AP-1에 의해 조절되고 그 상위신호경로에서 작용하는 MAP kinase 계열의 신호전달과정이 중요한 역할을 수행하는 것으로 보여진다.</p>