세포는 외부 신호를 세포 내부로 전달하며, 이 과정에서 Akt라는 인산화 신호전달기구는 중요한 역할을 수행한다. Akt는 생존 신호를 제공하고 인슐린과 관련된 대사 과정에 참여하며, 이는 세포의 보호와 생존에 필수적이다. 이 연구에서는 인간의 Akt 키나제를 활성 상태로 유지하면서 대장균에서 대량 발현시키는 실험을 수행하였다. 다양한 조건에서 IPTG 농도를 조절하고 배양온도를 낮추어 Akt 단백질을 솔루블 형태로 대량 발현시켰으나, 인솔루블 형태의 단백질도 상당량 확인되었다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <p>세포는 세포 밖의 신호(signal)를 세포내로 전달해주는 다양한 신호전달기구에 의존하여 생명현상을 유지한다. 그 중 세포내의 작은 2차 신호전달 물질(second-messenger molecules)은 중요한 역할을 하는뎨, 특히 inosites는 kinase와 반응하는 것으로 알려져 있다. Growth-factor regulated</p> <p>serine/threonine kinase인 protein kinase \( \mathrm{B}(\mathrm{Akt} / \mathrm{PKB}) \) 는 phosphoinositide 3-OH kinase( \( \mathrm{PI}-3 \mathrm{~K}) \) product와 결합하여 plasma membrane으로 translocation되며 phosphoinoside-dependent kinase 1(PDK1) 등에 의하여 473 번째 위치의 serine과 308 번째 위치의 threonine이 인산화 됨으로써 활성화(activation)된다[3]. 이렇게 활성화 된 Akt는 다양한 스트레스에 의해서 야기되는 apoptosis로부터 세포를 보호하는 survival signal을 전달해주며 insulin과 관련된 대사과정에 참여하여 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 이와 같은 Akt kinase 활성을 조절 할 수 있는 조절물질은 Akt kinase가 관여하는 다양한 조절 기능으로부터 유추할 때 암, 당뇨, 치매 등을 치료할 수 있는 신약 개발에 많은 기여를 할 수 있을 것으로 판단된다. 따라서 세포내 신호전달 기구 중 Akt등을 포함하는 인산화를 통한 신호전달기구를 분석할 수 있는 assay kit개발을 목적으로 human Akt kinase를 활성이 상실되지 않은 형태로 대장균에서 대량으로 발현시키는 연구를 실시 하였다.</p> <h2>Human \( \mathrm{Akt} / \mathrm{PKB} \) 의 대장균에서의 발현</h2> <p>대장균 발현 vector인 \( \mathrm{pET} 28 \mathrm{a}(+) \) 에 human \( \mathrm{Akt} / \mathrm{PKB} \) 의 cDNA 유전자를 삽입한 pET28-Akt1 재조합 벡터를 제조한 후, 이를 E. coli \( \mathrm{BL} 21 \) 에 형질전환하였다. 형질전환체 접종시 IPTG를 최종농도 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 이 되도록 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 배양한 후 cell lysate를 SDS-PAGE로 확인해 본 결과 \( \mathrm{Akt} / \mathrm{PKB} \) 로 추정되는 단백질이 발현됨을 알 수 있었다(Fig. 1). 예상되는 발현 단백질은 \( 60 \mathrm{kDa} \) 정도이지만 발현된 단백질의 분자량은 이 보다 약간 큰 것으로 분석되었다. 하지만 상기 조건에서 발현된 단백질은 soluble fraction이 아닌ㅜinsoluble fraction으로 발현되어 보다 구체적인 발현 조건 개선이 요구되었다(data not shown).</p> <h2>Akt/PKB 발현조건 최적화</h2> <p>\( \mathrm{Akt} / \mathrm{PKB} \) 를 soluble form으로 대량 발현시키기 위해서 IPTG 농도를 바꾸어주거나 배양온도를 낮추어 주는 등 다양한 조건에서 형질전환 된 E. coli를 배양하는 실험을 실시하였다. 전반적으로는 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3 시간 배양 하였을 때 가용성 발현 단백질 양이 많았다. 따라서 다양한 IPTG 농도 하에서 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3 시간 발현시킨 Akt kinase의 발현 양상을 Fig. 2에 나타냈다. 결과적으로, IPTG가 0.01-0.09 mM까지 Akt 단백질이 soluble form으로 발현되었으나, insoluble form도 상당량 존재하였다. 최종적으로 0.03-0.07 \( \mathrm{mM} \) 의 IPTG 농도에서 soluble form으로의 발현율이 가장 높은 것으로 판단되었으며, 이후의 모든 발현 실험은 \( 0.05 \) \( \mathrm{mM} \) IPTG 농도로 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3 시간 발현을 유도하여 진행하였다.</p>