또한 리폴딩 기술을 이용하여 inclusion body로 변성된 EM2L8 효소를 native state로 복귀시킬 수 있다는 것도 밝혀졌다. Ecoli에서 발현하는 경우, 수용성단백질과 inclusion body가 동시에 만들어지며, 이 때 만들어진 inclusion body는 쉽게 리폴딩되어 효소활성을 회복할 수 있었다. 또한 계면활성제의 농도에 따른 리폴딩 수율을 측정하여 완전히 변성된 단백질 구조로부터 활성단백질형태(native state)로 쉽게 리폴딩됨을 알 수 있었다. 이러한 특성으로 인해 의약품의 유기합성반응에 효소촉매로 사용될 수 있을 것으로 예상되었다.
<p>이와 같이 이 효소는 저온에서 장기간 보관해도 처음과 동일한 활성을 지니며 유기용매와 금속이온이 고농도로 포함된 용액에서도 높은 활성을 갖는 특성을 보였다. 이러한 특성은 이 효소가 지닌 리폴딩 능력과 관련있는 것으로 보인다. 이 효소를 E. coli에서 발현하는 경우, 수용성단백질과 inclusion body 가 동시에 만들어지며 이 때 만들어진 inclusion body는 쉽게 리폴딩되어 효소활성을 회복하는 것이 이미 보고되었다. 본 연구에서는 이 점을 자세히 조사하기 위해서 계면활성제의 농도에 따른 리폴딩 수율을 측정하였다(Fig. 3A, 3B). 흥미롭게도 Fig. 3B에 나타난 것과 같이 inclusion body 용액(계면활성제 무첨가)에서도 효소활성(42 U/mL)이 측정되었다. 이 용액에 계면활성제를 첨가하여 inclusion body를 완전히 변성시킨 후, 용액을 10배 희석시킴으로써 손쉽게 리폴딩을 수행할 수 있었다. 이 때, 음이온계면활성제의 농도를 증가시킴에 따라서 리폴딩 수율이 증가되었으며 SDS를 1% 농도로 첨가했을 때에 최대 5.5배까지 효소활성이 증가되었다. 즉 이 효소는 완전히 변성된 단백질 구조로부터 활성단백질형태(native state)로 쉽게 리폴딩됨을 알 수 있었다. EM2L8 효소의 이러한 특성이 이 효소가 지닌 저온에서의 장기 안정성 및 유기용매에서의 활성과 밀접한 관련이 있는 것으로 보인다. 향후 효소단백질의 3차구조 연구 및 리폴딩 kinetics 연구가 이런 사실을 명확하게 밝혀줄 것으로 생각된다.</p> <h2>에스터라제 EM2L8에 의한 ECHB 가수분해</h2> <p>에스터라제 EM2L8이 낮은 온도에서도 높은 가수분해 활성을 갖고 있으며 여러 가지 유기용매에 대해 높은 안정성을 갖고 있는 것으로 밝혀짐에 따라서 의약품의 유기합성반응에 효소촉매로 사용될 수 있을 것으로 예상되었다.</p> <p>고지혈증 치료제의 키랄중간체로 사용되는 (S)-ECHB는 입체선택적인 에스터라제를 이용해서 rac-ECHB기질을 가수분해하여 만들 수 있다(Fig. 4A). 본 연구에서는 EM2L8 효소를 이용하여 다음과 같이 (R,S)-ECHB의 가수반응을 수행하였다. Tris-HCl 용액(100 mM, pH 9.0)에 기질(0.5%, 38mM)과 효소(40 U)를 넣고 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 6시간 동안 가수분해 반응을 수행하였다. 키랄컬럼을 장착한 기체크로마토그래피를 이용하여 반응액에 남아 있는 (R)-ECHB와 (S)-ECHB의 양을 정량하였다(Fig. 4B). 에스터라제 EM2L8에 의해서 (R,S)-ECHB 기질이 가수분해됨을 확인할 수 있었으며, 분해속도는 6.8 μmole/h로 계산되었다(Fig. 4C). (R)-ECHB보다 (S)-ECHB 기질을 빠르게 분해하였으며 전환수율이 80%일 때, e.e.s 값이 40%로 측정되었다. 이 효소는 (S)-형태의 기질에 대해 입체선택성을 갖고 있지만 상업적으로 사용하기 위해서는 반응조건을 개선하거나 입체선택성을 향상시키기 위한 효소분자개량연구가 필요하다.</p>