본 실험에서는 NB/2 배지에서 Haematococcus pluvialis CCAP-34/1F 균주를 배양하여 생산한 ATX를 DMSO에 용해하여 사용하였고, 한국세포주은행에서 대식세포주 RAW264.7 cell을 구입하였으며, NGL cell은 주명수 교수로부터 분양 받았고, 시약은 DMEM, FBS, penicillin, streptomycin, Anti-iNOS monoclonal antibody등을 구입하여 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>ATX의 제조</h2> <p>ATX의 생산을 위해 기본적으로 NB/2 배지(효율적인 성장을 위해 다른 질소원을 추가적으로 첨가)에서 Haematococcus pluvialis CCAP-34/1F 균주를 배양하였으며, 다른 배양조건으로는 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(160 \mathrm { rpm } \), \(10 \% \) inoculum, 초기 \( \mathrm { pH } \)는 7.0, 조도는 \(3,000-3,500 \mathrm { lux } \)를 선정하였다. ATX의 생산유도를 위해 vege-tative cell로부터 cyst cell을 만드는 배양조건을 \( 23 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(150 \mathrm { rpm } \), \(14,000 \mathrm { lux } \)로 하여 15일째 붉은 색의 배양액을 확인하였다. 균체를 원심분리하여 균을 모으고 \( 25 \mathrm { ml } \)의 아세톤을 첨가하여 파쇄한 후 냉각추출을 반복하였다. 그 후, 감압농축을 하였고 n-Hexane으로 다시 추출한 후, 물로 3번 세척하였고, sodium sulfate anhydrous를 이용하여 잔류수분을 제거한 후 ATX 추출물을 제조하였다. 본 실험에서는 ATX를 \( 0.01 \% \) di-methyl sulphoxide (DMSO)에 용해하여 사용하였다.</p> <h2>시약</h2> <p>Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)은 Hyclone(Thermo Scientific Inc., Bremen, Germany)에서 구입하였고 fetal bovine serum (FBS)은 Sigma Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)로부터, penicillin 및 streptomycin은 Gibco/BRL (Grand Island, NY)에서 구입하였다. Anti-iNOS monoclonal antibody는 Calbiochem (San Diego, Calif.)에서, Anti- \( \beta \)-actin monoclonal antibody는 Sigma Aldrich Co. 로부터 구입하였 다. Anti-NF- \( \kappa \)B p65 monoclonal antibodies와 perox-idase-conjugated secondary antibody는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였고, interleukin (IL)-6 및 tumour necrosis factor- \( \alpha \) (TNF- \( \alpha \)) ELISA Kits는 Pierce Endogen (Rockford, IL, USA)에서 Promega luciferase assay system은 Promega (Madison, CA,USA)로부터 구입하였고, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-di-phenyl tetrazolium bromide (MTT), sulfanilamide, lip-opolysaccharide (LPS) 및 다른 모든 시약들은 Sigma Aldrich Co.에서 구입하였다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>대식세포주인 RAW264.7 cell은 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 구입하였으며, NF- \( \kappa \)B 전사활성을 측정하기 위하여 NF- \( \kappa \)B reporter construct로 transfection된 RAW264.7 cell (이하 NGL cell)은 주명수 교수로부터 분양 받아 사용하였다. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에 \(10 \% \) fetal bovine serum (FBS), \( 100 \mathrm { U } / \mathrm { ml } \) penicillin 및 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) strep-tomycin을 혼합한 배지를 사용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(5 \% \), \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator 에서 세포를 배양하여 실험에 이용하였다.</p>