재조합 MMP-2, MMP-9, TIMP-1과 TIMP-2 immunoassy kits는 Fuji Chemaical Industries에서, 그 외 시약들은 Sigma사에서 구매했다. PPAECs 세포는 돼지 폐동맥에서 collagenase를 이용해 분리하였고, 이 세포가 내피세포에서 유래됐음은 anti-von Willebrand factor 항체를 이용해 확인하였다. 수용성 오디 추출물은 Chen 등의 방법을 변형하여 제조하였다. 또한, 오디 추출물이 배양 세포의 생존에 미치는 영향은 MTT에 대한 formazan의 환원 발색 방법을 사용해 조사하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약</h2> <p>재조합 MMP-2, MMP-9, TIMP-1과 TIMP-2 immunoassy kits는 Fuji Chemaical Industries (Toyama, Japan)에서 구입하였다. Anti-von Willebrand factor 항체는 Abcam Inc.(Cambridge, MA, USA)에서 구입하였고, 배지와 혈청은 Life Technology Inc. (Gaithersburg, MD. USA)에서 구입하였다. Cyanidin-3-glucoside는 Extrasynthese (Lyon, France)에서 구입하였고, 레스베라트롤과 다른 시약(Giemsa 염색 용액, antibiotics, antimycotics, trypsin-EDTA) 그리고 일일이 적시하지 않은 시약들은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.</p> <h2>세포 배양</h2> <p>PPAECs 세포는 Kim 등의 방법에 따라 porcine pulmonary artery를 collagenase로 소화시켜 분리하였으며, 배양된 세포가 내피세포에서 유래됐다는 것은 anti-von Willebrand factor 항체를 이용한 면역형광 염색방법으로 확인하였다. 이렇게 얻어진 혈관내피세포를 \( 20 \% \) FBS \( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 첨가 Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 조건으로 배양하였다. 본 연구에 사용된 primary 세포의 계대 수는 2~6 사이였다.</p> <h2>수용성 오디 추출물 제조</h2> <p>수용성 오디 추출물의 제조는 Chen 등의 추출 방법을 변형하여 추출하였다. 즉, 오디 \( (200 \mathrm{~g}) \)를 \( 400 \mathrm{~ml} \)의 증류수에 침적시킨 다음 2시간 동안 꿇였다. 여기서 얻어진 추출물을 여과 \( (0.45 ~\mu \mathrm{m}) \)시킨 다음 상등액을 냉동 건조시켰으며 최종적으로 \( 3.8 \mathrm{~g} \)의 수용성 오디추출물을 얻어 사용 전까지 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다. 건조한 추출물을 사용 전에 생리식염수 또는 HEPES-Tyrode 완충용액[\( 136 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaCl}, 5 \mathrm{mM} \mathrm{~KCl}, 2 \mathrm{~mM} \) \( \mathrm{~CaCl}_{2}, 11 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaHCO}_{3}, 0.6 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 2.75 \mathrm{~mM} \mathrm{~MgCl}_{2} \), \( 5.4 \mathrm{~mM} \) HEPES, \( 1.0 ~\mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) bovine serum albumin (BSA), \( 1.0 ~\mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) glucose, \( 0.1 ~\mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) heparin]에 용해시켰다.</p> <h2>오디 추출물이 PPAECs 세포의 생존에 미치는 효과</h2> <p>오디 추출물이 배양 세포의 생존에 미치는 효과는 formazan에 대한 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)의 환원 발색 방법을 사용하여 조사하였다. 즉, PPAECs 세포 \( \left(10^{5}\right. \) cells/well)에 오디 추출물을 첨가한 후 24시간 배양한 다음 phosphate-buffered saline으로 2회 세척한 후, MTT \( (100 ~\mu \mathrm{g} / 0.1 \mathrm{ml} \) phosphate-buffered saline)를 세포에 처리하였다. 이후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 동안 배양한 다음 \( 100 ~\mu \)의 dimethyl sulfoxide를 첨가하여 formazan 결정을 용해시킨 후 흡광광도계(Spectra MAX, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 \( 570 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>