박테리오신 생성 균주의 배양 상등액에 황산암모늄을 첨가하여 염석후 원심분리하여 침전하였다. 농축한 시료를 이온교환크로마토그래피를 통해 항균활성이 있는 분획을 모아 동결건조로 농축하였다. 이 시료를 역상HPLC로 분리하였는데 이때 C18칼럼을 주입하였다. 각 피크별 분획의 박테리오신 활성 여부를 파악하여 활성이 있는 분획을 용매증발 후 인산 완충액에 용해시켰다. Tricine SDS-PAGE 전기영동은 정제된 박테리오신의 분자량과 순도를 알아보기위해 실시하였다.
<h2>황산암모늄 침전법에 의한 시료의 농축</h2> <p>박테리오신 생성 균주의 배양 상등액 \( 480 \mathrm{ml} \) 에 천천히 교반하면서 황산암모늄을 첨가하여 \( 75 \% \) 로 포화시킨 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2~3시간 염석하여 원심분리 \( \left(12,000 \times g, 25 \mathrm{~min}, 4^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 하였다. 침전물만을 회수하여 \( 10 \mathrm{mM} \) sodium phosphate buffer\( (\mathrm{pH} 6.0) \) \( 40 \mathrm{ml} \) 에 녹이고, MWCO가 1000 인 투석막(Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA)을 사용하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 동일한 buffer 21 에서 하룻밤 투석시켜 항균활성을 확인하였다.</p> <h2>이온교환크로마토그래피</h2> <p>황산암모늄 침전법으로 농축한 시료를 \( 50 \mathrm{mM} \) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 6.0) \)로 평형화시킨 SP-Sepharose 칼럼에 주입하고 동일한 완충액으로 세척하였다. \( \mathrm{NaCl} \) 농도구배를 0~1.0 M로 걸어주어 이온교환체에 결합한 단백질을 용출하여 분획을 \( 2.5 \mathrm{ml} \) 씩 받았다. 항균활성이 있는 분획을 합치고 증류수에서 투석을 행하여 \( \mathrm{NaCl} \) 을 제거한 후 동결건조로 농축하였다.</p> <h2>역상 HPLC</h2> <p>동결건조한 시료를 \( 1 \mathrm{ml} \) 의 3차 증류수 (\( 0.1 \% \) TFA)에 녹이고 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) 여과지를 통해 여과한 후 buffer A (\(0.1\%\) TFA in HPLC grade water) 용액으로 평형화시킨 C18칼럼에 주입하여 역상 HPLC로 분리하였다. 시료 주입 후에는 5 분간 \( 100 \% \) buffer A로 세척하였고, 다음 20분간 buffer B (\(80\%\) acetoni-trile/ \(0.1\%\) TFA)를 0~\(100\%\)까지 linear gradient, 그리고 그 다음 5분간은 \( 100 \% \) Buffer B로 용출시켰다. 유속은 \( 2.0 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 로 유지하였고, 각 peak 별로 회수한 분획의 박테리오신 활성을 조사하였고 박테리오신 활성이 있는 분획을 모아서 용매를 증발시킨 후 \( 50 \mathrm{mM} \) 인산 완충액\( (\mathrm{pH} 6.0) \)에 용해시켰다.</p> <h2>Tricine SDS-PAGE 전기영동</h2> <p>정제한 박테리오신의 순도와 분자량을 추정하기 위해 tri-cine SDS-PAGE를 실시하였다. 정제한 시료를 tricine sample buffer와 1:1의 부피 비율로 혼합하여 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3분간 가열하였다. \( 4 \sim 20 \% \) gradient polyacrylamide gel에서 \( 125 \mathrm{~V} \) 로 2시간 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 종료된 후 유리판으로부터 gel을 분리하여 하나는 polypeptide fixative solution (\( 40 \% \) methanol, \( 10 \% \) acetic acid)에 30분간 담군 후에 \( 0.1 \% \) Coomassie brilliant blue R-250 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 2시간 염색한 후 methanol:acetic acid:water (1:1:8, v:v:v) 용액으로 2시간 탈색하였다. 단백질 표준물질로는 Bio-Rad사의 polypeptide SDS-PAGE molecular weight standards mark-er를 사용하였다. 나머지 gel은 증류수를 30분마다 교체하면서 5회 세척하였다. 세척한 gel을 petri dish에 넣고 UV 10분간 조사시킨 후 M. luteus가 접종된 NB soft agar를 중층하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양하여 항균활성을 확인하였다.</p>