본 연구에서는 한국인에게서 분리한 H. pylori 균주 간의 IL-8 유도능의 차이 정도를 AGS 세포를 이용하여 검토했고, 이런 차이가 PCR-RFLP 방법으로 분류된 CagE유전자간의 다양성과 연관성이 있는가와 TPMs의 분류에 의한 연관성 및 vacA mid-re-gion allelic 변이와 IL-8 유도능 연관성을 검토하고자 했다. 상부 위장관 내시경검사를 받고 위암, 위염, 십이지장궤양으로 확인된 환자의 위 점막에 phenol red 용액을 산포해 H. pylori의 감염을 확인한 뒤 검체를 채취했다. 이렇게 체취한 검체에서 cagA 유전자와 cagE 다형성을 확인했다.
<p>본 연구에서는 한국인에서 분리한 H. pylori 균주 간의 IL-8 유도능의 차이 정도를 AGS 세포를 이용하여 검토하였고, 이러한 차이가 PCR-RFLP 방법으로 분류된 CagE유전자간의 다양성과 연관성이 있는가를 검토하고자 하였다. 또한 Ordenbreit 등에 의한 cagA tyrosine phophorylation motifs (TPMs)의 분류에 의한 연관성 및 vacA mid-region allelic 변이와 IL-8 유도능 연관성을 검토하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>대 상</h2> <p>2003년 4월부터 2004년 1월까지 본 대학 부속 강남성모병원 내시경검사를 반은 환자들 중 H. pylori 감염 양성으로 확인된 위암 23명 \(31.0 \% \), 위염 24명 \(32.6 \% \), 십이지장궤양 27명 \(36.4 \% \) 총 74명을 대상으로 하며, 최근 1개월 내에 항생제 혹은 스테로이드 복용한 환자는 제외하였다. 위암 환자군의 평균 연령은 \(57.05 \pm11.33 \)세, 남자 15명, 여자 8명이었으며, 위염 환자는 \(49.92 \pm6.48 \)세, 남자 10명, 여자 14명 그리고, 십이지장 궤양 환자는 \(50.47\pm11.32 \)세, 남자 15명, 여자 12명으로 위암 환자군의 연령층이 더 높았고, 위염 군에서 여성의 비율이 높았다.</p> <h2>방 법</h2> <h3>H. pylori 검체 채취</h3> <p>상부 위장관 내시경검사를 받고 위암, 위염, 십이지장궤양으로 확인된 환자의 위 점막에 phenol red 용액을 산포하여 H. pylori의 감염을 확인하여 채취하였다. 각 환자의 위점막을 Columbia blood agar base, Tryptic soy agar와 BCS가 첨가된 배지에 긁어서 \(37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 배양기에서 5일간 (\( 10 \% \mathrm { CO } _ { 2 }\), 포화습도) 배양시킨 후, 배양된 colony를 genomic DNA purifi-cation kit (Wizard genomic, promega, USA)를 사용하여 DNA를 추출하여 \(-20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 보관하였다.</p> <h3>중합효소연쇄반응(PCR) 및 PCR-RFLP를 이용한cagE 다형성 확인</h3> <p>cagA 유전자는 Forward 시발체 5'-GAT AAC AGG CAA GCT TTT GAA G-3', Reverse 시발체 5'-CTG CAA AAG ATT GTT TGG CAG A-3'를 사용하여 349-bp로 증폭시켜 확인하였으며, vacA 서브타입 \( \mathrm { m } 1 / \mathrm { m } 2 \) 는 5'-CAA TCT GTC CAA TCA AGC GAG-3', 5'GCG TCA AAA TAA TTC CAA GG-3' 를 이용하여 PCR을 수행한 후 결정하였다. cagA 의 TPMs 결정을 위해 각각의 기존에 보고된 시발체를 제작하여 A type과 C type을 10 pmoles 시발체 각각 \(2 \mu\mathrm{l}\), 10배의 완충액 \(2.5 \mu,10 \mathrm { mM } \) dNTP \(0.5 \mu \mathrm { l } \), Taq DNA 중합효소 (\(5 \mathrm{unit/\mu l}\))  \( 0.2 \mu \mathrm { l } \), DNA주형 \(2 \mu\mathrm{l}\) 그리고, 증류수를 섞어 총 \(25 \mu\mathrm{l} \)의 반응 양이 되도록 하여 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 5분간 DNA를 변성시킨 후 \(95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 30초, \( 53 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 30초, \(722 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 1분으로 총 35주기 시행하였고 마지막 주기에서 \(72 ^ {\circ } \mathrm { C }\) 5분의 조건으로 PCR를 시행하여 획득된 PCR산물은 Ddel 제한효소를 사용하여 \(37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 4시간 반응, Tsp509I (Biolabs Inc, England)를 사용하여 \(65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 4시간에서 각각 반응시켜 절단한 후 \(3 \% \) 한천 젤에서 전기영동 시켜 A 타입 및 C 타입을 결정하였다. B 타입의 결정을 위해서는 Real-time PCR을 이용하였다. cagE 다형성 확인을 위해서 10 pmoles 의 forward primer cagE748-F (5'-ATG CGA GCC TAT AAT GAG AA-3') 과 reverse primer cagE2268-R (5'-CCA TTA GGA TCA TTG TGG TC-3') 각각 \(1\mathrm{\mu l}\)와 10배의 완충액 \(2.5 \mu \mathrm { l } , 10 \mathrm { mM }\) dNTP \(0.5\mathrm{\mu l} \), Taq DNA 중합효소\((5\mathrm{unit/\mu l})\) \( 0.2 \mu \mathrm { l } \), DNA주형 \(2\mathrm{\mu l}\), 증류수를 섞어 총 \( 25 \mu \mathrm { l } \)의 반응 양이 되도록 하여 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 5분간 DNA를 변성시킨 후 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)1분, \( 56 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 1분, \(72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 2분은 1주기로 하여 총 30주기를 시행하였으며, 마지막 주기에서 \(72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 10분으로 반응시켜 증폭하여 PCR 산불은 MboI 및 NlaIII 제한효소로 \(37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 3시간 반응시켜 절단한 후 UV 투조기로 확인 하였다.</p>