운반체를 사용하여 육성된 벼 형질전환체에 OsZF2 유전자의 도입과 발현을 확인하기 위한 PCR 분석과 Northern 분석을 실시한다. 벼의 microarray 분석과 형태적 관찰을 실시한다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>운반체 제작</h2><p>벼 형질전환체를 육성하기 위해 사용된 운반체인 pCAMBIA13 OOPRON은 pCAMIA1300을 기간으로 하여 CaMV 35 S promoter와 3'-nos 터미네이터 사이에 멀티클로닝 제한효소부위를 삽입하여 클로닝이 용이 하도록 제작되었다. OsZF2 유전자를 클로닝하기 위하여 EST library에서 사용되었던 pBluescript 벡터에 삽입된 LS333 유전자를 BamHI과 KpnI으로 절단한 후 \( 1.2 \mathrm{~kb} \) 크기의 밴드를 분리한 후 pCAMBIA1300PRON 벡터의 BamHI과 KpnI1위치에 삽입하여 pCAM333 이라 명명하였다. 운반체의 선발마커로는 하이그로마이신 항생제 저항성 유전자(hptⅡ)를 사용하였으며 Agrobacterium tumefaciens LBA4404에 형질전환하여 벼 형질전환에 사용하였다.</p><h2>벼 형질전환 및 동형접합 전환체 선발</h2><p>형질전환된 Agrobacterium tumefaciens LBA4404를 YEP \( (50 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \) kanamycin) 액체배지에 접종하여 48시간 진탕 배양하였다. 낙동벼를 이용하여 배상체 캘러스를 유기한 후 Agrobacterium 배양액과 공동 배양하여 감염시킨 다음 hygromycin 선발배지에서 형질전환된 재분화 식물체를 얻기 위하여 3주 마다 계대 배양하였다. 선발된 형질전환체는 hygromycin \( (50 \mathrm{mg} / \mathrm{l}) \) 이 첨가된 MS 배지에 50 립을 치상하여 hygromycin 저항성 개체수를 확인하였다.</p><h2>PCR 분석</h2><p>형질전환된 재분화 식물체에 OsZF2 유전자가 도입되었는지를 확인하기 위하여 PCR 분석을 수행하였다. 형질전환벼의 genomic DNA는 Genomic DNA Prep Kit for Plant (SolGent, Daejeon, Korea)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 추출하였다. PCR 반응조건은 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 예비변성한 다음 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분간 변성, \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분간 풀림, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 분간 신장하는 과정을 35 사이클 반복하고 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 신장 시켰다. PCR 반응에 사용된 forward 프라이머는 OsZF2 유전자 특이 프라이머 (5'-ACT CGCCGC TGT CGC TCT CC-3')를 사용하고 reverse 프라이머는 3'-nos terminator 부위에서 작성하여 (5'-ATTGCCAAATGTTTGAACGA-\( 3^{\prime} \) ) 사용하였다. PCR 산물은 \( 0.9 \% \) agarose gel에서 전기영동 하였으며 EtBr로 염색하여 밴드를 확인하였다.</p><h2>RNA 분리 및 Northern 분석</h2><p>형질전환체에서 OsZF2 유전자 발현을 확인하기 위하여 벼 잎에서 토탈 RNA를 Trizol로 분리하여 Northern 분석을 실시하였다. \( 10 \mu \mathrm{g} \) RNA를 \( 1.1 \% \) formamide/agarose gel에서 전기영동 후 나일론 멤브레인 (Hybond N+, Amersham) 으로 전이 시킨 다음 OsZF2 유전자를 \( { }^{32} \mathrm{P}-\mathrm{dCTP} \) 로 표식 시킨 후 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 16시간 동안 잡종화반응을 시켰다. 멤브레인은 워싱 용액에 세척하고 포스포이미지 강화 스크린에 감광시킨 후 밴드를 확인하였다.</p><h2>내염성 검정 및 형태적 관찰</h2><p>소독한 벼 종자 25립을 MS 배지와 \( 100 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl} \) 이 첨가된 MS 배지에 각각 치상하여 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \), 광 상태에서 1주간 배양한 후 발아된 23 립의 총 중량과 지상부 잎 길이 및 뿌리 길이를 측정하여 평균값과 표준편차를 측정하였다. 포장에서 형태적 발달 상태를 관찰하기 위해 50공 모판에서 재배하여 4주 후 유전자변형식물체 시험포장에 이앙하여 형태적 특성과 출수시기를 확인하였다.</p><h2>Microarray 분석</h2><p>벼 \( 20 \mathrm{~K} \) 올리고 chip (NSF rice oligonucleotide array \( 20 \mathrm{~K} \) )을 사용하여 microarray 분석을 하였다. 고 순도의 RNA를 분리하기 위하여 column을 사용하는 RNeasy isolation Midi kit (QIAGENE, Hilden, Germany)를 사용하여 벼 잎으로부터 RNA를 분리하였다. total RNA는 Bioanalyzer 2100 (Agilent, Palo Alto, USA)를 이용하여 28S rRNA/18S rRNA ratio를 측정하여 RNA QC를 수행한 후 microarray 분석에 사용하였다. Labelling은 Amino Allyl MessageAmp \( { }^{\mathrm{TM}} \) aRNA Kit (Ambion Catalog #1752)을 사용하여 제조사의 방법으로 RNA를 합성한 후 \( 10 \mu \mathrm{m} \) antisense amino allyl RNA (aRNA)를 cye dye coupling에 사용하였다. 대조구는 cy3, 처리구는 cy5 dye를 사용하여 라벨링된 cRNA \( 20 \mu \mathrm{m} \) 을 잡종화 반응에 사용하였다 (Eom et al. 2006). MAUI 잡종화시스템에서 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \), 16 시간 반응 후 Axon4000B 스캐너에서 GenePix Pro v6.0 (Axon Instrument, Union City, USA) 프로그램을 이용하여 cy3, cy5의 강도를 측정하였다. Normalization과 발현분석은 Genespring5.1 프로그램을 사용하여 분석하였다.</p>