본 실험에 사용된 식물세포배양액은 Taxus chinensis의 잎으로부터 얻은 세포주(cell line)를 이용하였으며, 수정된 Gamborg's B5 배지에서 \( 24^{\circ} \mathrm{C} \), 암 조건으로 교반 \( (150 \mathrm{~rpm}) \) 하여 배양했다. Paclitaxel 함량 분석을 위해 HPLC system과 Capell Pak \( \mathrm{C}_{18} (250 \times 4.6 \mathrm{~mm} \), Shiseido, Japan) 칼럼을 사용하였다. 식물세포배양액으로부터 회수한 바이오매스와 메탄올의 비율을 \( 1 / 1(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 로 하여 실온에서 4 회 반복 추출한 후 농축 (원액의 \( 30 \% \) )하였다. 기존 문헌에서 원료의약품의 입자크기 감소에 효과적인 세 종류의 고분자물질(HPMC 2910, PVP-K 90, PVA 31,000-50,000)를 각각 농도 \( (0.1,0.2,0.3 \% , \mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 를 달리하여 증류수에 녹인 후 첨가하여 분별침전을 수행했고, 그 동안 paclitaxel 침전물 형태 확인 및 크기 측정을 위하여 전자현미경을 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물재료</h2> <p>본 실험에 사용된 식물세포배양액은 Taxus chinensis의 잎으로부터 얻은 세포주(cell line)를 이용하였으며, 수정된 Gamborg's B5 배지에서 \( 24^{\circ} \mathrm{C} \), 암 조건으로 교반 \( (150 \mathrm{~rpm}) \) 하여 배양하였다. 식물세포배양 후 배양액으로부터 decanter (Westfalia, CA150 Claritying Decanter)와 고속원심분리기 ( \( \alpha \)-Laval, BTPX205GD-35CDEEP)를 이용하여 식물세포와 세포조각(cell debris)을 회수하였다. 회수한 식물 세포와 세포조각을 합하여 바이오매스라 하였다. 본 연구에 사용된 바이오매스는 (주)삼양제넥스로부터 제공받았다.</p> <h2>Paclitaxel 분석</h2> <p>Paclitaxel 함량 분석을 위해 HPLC system(Waters, USA)과 Capell Pak \( \mathrm{C}_{18} (250 \times 4.6 \mathrm{~mm} \), Shiseido, Japan) 칼럼을 사용하였다. 이동상은 아세토니트릴과 증류수 혼합 용액(35/65-65/35, v/v, gradient mode)을 유속 \( 1.0 \mathrm{~ml} / \mathrm{min} \) 으로 흘려주었다. 시료 주입양은 \( 20 \mathrm{~ml} \) 이며 \( 227 \mathrm{~nm} \) 에서 UV 에 의해 검출하였다. HPLC 분석은 표준정량곡선을 이용하였으며 표준시료는 Sigma-Aldrich 제품(순도: \( 95\% \))을 사용하였다.</p> <h2>분별침전(fractional precipitation)을 위한 시료준비</h2> <p>식물세포배양액으로부터 회수한 바이오매스와 메탄올의 비율을 \( 1 / 1(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 로 하여 실온에서 4 회 반복 추출한 후 농축 (원액의 \( 30 \% \) )하였다. 액-액 추출을 위해 농축된 메탄올 용액에 메틸렌 클로라이드를 첨가(메탄올 농축액의 \( 25 \% \))하고, \( 30 \mathrm{~min} \) 동안 교반 후 정체 시켜 상 분리를 유도하였다. 액-액 추출을 수행하여 paclitaxel이 포함된 하층인 메틸렌 클로라이드 층으로 paclitaxel을 회수하여 농축/건조하였다. 건조된 추출물(crude extract)을 메틸렌 클로라이드에 \( 20 \%(\mathrm{v} / \mathrm{w}) \) 비율로 녹이고 흡착제 sylopute(Fuji Silysia Chemical Ltd., Japan)를 건조된 추출물 대비 \( 50 \%(\mathrm{w} / \mathrm{w}) \) 비율로 첨가하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 항온조에서 \( 30 \mathrm{~min} \) 동안 교반 시킨 후 여과하였다. 여과액은 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \), 감압상태에서 건조하고, 건조된 시료를 메틸렌 클로라이드에 녹인 후 헥산에 떨어뜨려 헥산 침전을 수행하였다(메틸렌 클로라이드/헥산 \( =1 / 10, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \). 혝산 침전 후 여과를 통하여 paclitaxel 침전물을 얻고 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 동안 진공 건조하고, 건조된 시료를 메탄올에 용해하고 (순수한 paclitaxel의 함량. \( 0.5 \%, \mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 메탄올이 \( 61.5 \% \) 가 될 때까지 한 방울씩 천천히 증류수를 떨어뜨린 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하여 paclitaxel 침전물을 얻었다. 침전 후 침전물을 여과하고 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 동안 진공 건조하여 ODS \( \mathrm{C}_{18} \) 컬럼 \( (50 \mathrm{~mm} \times 500 \mathrm{~mm} \), Shiseido, Japan)과 Silica 컬럼(50 mm \( \times \) \( 500 \mathrm{~mm} \), Shiseido, Japan)이 장착된 HPLC 공정으로 추가 정제하였다. 최종 정제된 paclitaxel 순도는 \( 98.0 \% \) 이었으며 시료 준비 과정을 Fig. 1에 나타내었다.</p> <h2>표면적이 증가된 분별침전(increased surface area fractional precipitation)</h2> <p>표면적이 증가된 분별침전 공정의 개략도를 Fig. 2 에 나타내었다. 기존 문헌에서 원료의약품의 입자크기 감소에 효과적인 세 종류의 고분자물질(HPMC 2910, PVP-K 90, PVA 31,000-50,000)를 각각 농도 \( (0.1,0.2,0.3 \% , \mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 를 달리하여 증류수에 녹인 후 첨가하여 분별침전을 수행하였다. 시료를 메탄올에 녹이고(순수한 paclitaxel 함량 기준: \( 0.3 \%, \mathrm{w} / \mathrm{v}) \), 메탄올이 \( 61.5 \% \) 가 될 때까지 고분자물질이 포함된 증류수를 교반 \( (\sim 180 \mathrm{~rpm}) \) 하에 한 방울씩 떨어뜨렸다. 분별침 전공정의 반응액 부피당 표면적(S/V) 증가를 위해 이온교환 수지(Amberlite IRA 400 OH) 를 첨가 \( \left(\mathrm{S} / \mathrm{V}=0.428 \mathrm{~mm}^{-1}\right. \) )한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 로 항온항습기(KCL-2000W, EYEIA, Japan)에 보관하여 paclitaxel 침전물을 얻었다. 이온교환수지는 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 하루 동안 건조한 후 실험에 사용하였다. 분별침전 시간 변화에 따른 paclitaxel 침전 양상을 전자현미경을 이용하여 관찰하였다.</p> <h2>침전물 형태 및 크기 확인</h2> <p>분별침전 동안 paclitaxel 침전물 형태 확인 및 크기 측정을 위하여 전자현미경(SV-35 Video Microscope System, Some Tech., Korea)을 사용하였다. 분별침전을 통해 얻은 paclitaxel 침전물을 고배율 \( (\times 100) \) 에서 관찰 하였다. 관찰된 paclitaxel 침전물은 IT-Plus software(Some Tech., Korea) 에서 동화상으로 확인하였으며 이를 통해 paclitaxel 침전물의 형태와 크기를 확인하였다.</p> <h2>제타전위(zeta potential) 측정</h2> <p>표면적이 증가된 분별침전공정에서 고분자물질을 첨가하지 않은 경우와 동일 농도 \( (0.2 \% \mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 로 세 종류의 고분자물질(PVA, HPMC 2910, PVP-K90)을 각각 첨가한 경우 분별 침전(24시간) 용액에서의 제타전위를 측정하였다. ELS-Z (Photal, Japan)를 이용하여 제타전위를 측정하였으며 측정된 제타전위는 ELS-Z software를 사용해 확인하였다.</p>