분홍색 색소를 생산하는 균주를 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) PPES-II배지에서 배양한후 진공상태로 에탄올을 증발시킨다. DNA 농도를 측정하기 위하여 DNA를 TE buffer에 현탁시키고 \(260\) 및 \(280 \mathrm { nm } \)에서의 흡광도를 측정하였다. PPES-II 배지에서 배양한 K. gwangalliensis 균주로부터 분리한 Chromosomal DNA로부터 생성된 라이브러리는 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \)개의 클론을 포함, \( 1 \mathrm { ml } \) 당 \( 3 \times 10 ^ { 9 } \)클론까지 증폭되었다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 생장 조건</h2> <p>분홍색 색소를 생산하는 해양 세균인 K.gwangalliensis를 부산 광안리 해변에서 분리하였고, 이 균주를 PPES-II(Polypeptone \( 0.2 \mathrm { g } \), Bacto soytone \( 1.0 \mathrm { g } \), Proteose peptone \( 1.0 \mathrm { g } \), Bacto yeast extract \( 1.0 \mathrm { g } , \mathrm { NaCl } ~3 \% \), Ferric citrate \( 0.1 \% \), Distilled Water \( 1 \mathrm { L } \) )배지에 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다. 대장균 XL1-blue [endA1 gyrA96 ( \( \mathrm { nal } ^ {\mathrm { R } } \)) thi-1 recAl relA1 lac glnV44F' [:: Tn10 proAB \( ^ { + } \) lacI \( ^ { q } \) \( \Delta \)(lacZ) M15] hsdR17 \(( \mathrm { r } _ {\mathrm { K } } ^ { - } \) \( \mathrm { m } _ { K } ^ { + } )] \)와 대장균 BL21 (DE3) \([ \mathrm { F } ^ { - } \)ompT gal dcm lon hsdS \(_ { B } ( \mathrm { r } _ {\mathrm { B } } ^ { - } \) \( \mathrm { m } _ {\mathrm { B } } ^ { - } ) \) \( \lambda \)(DE3) [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])]균주는 Luria-Bertani(LB; Tryptone \(1 \% \), yeast extract \( 0.5 \%, \mathrm { NaCl } ~\mathrm { 1 \% ) } \)배지에 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다.</p> <h2>Genomic DNA 라이브러리 구축</h2> <p>Chromosomal DNA는 PPES-II 배지에서 배양한 K.gwangalliensis 균주로부터 분리하였다. 대수증식기 후기의 배양 세균을 실온에서 \( 5,100 \times g \)에서 10분 동안 원심 분리한 후 \( 50 \mathrm { ml } \)의 TE buffer \( [10 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } ( \mathrm { pH } 7.5 ) \) and \( 1 \mathrm { mM } \) ethylenediamine tetraacetic acid]로 세척하였다. 세척한 세포를 실온에서 \( 11,000 \times g \)에서 10분 동안 원심 분리한 후 \( 5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 리소자임과 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) RNase A (Sigma Chemical Company, USA)를 함유하는 TE buffer \( 9 \mathrm { ml } \)에 재현탁한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1시간 동안 반응시켰다. \( 10 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) SDS \( 0.5 \mathrm { ml } \)과 \( 10 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) proteinase K \( 0.1 \mathrm { ml } \)를 첨가한 후 현탁액을 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 수시간 진탕 배양하여 세포를 완전히 용해시켰다. 용해액에 \( 5 \mathrm { M }~ \mathrm { NaCl } ~1.8 \mathrm { ml } \)와 \( 0.7 \mathrm { M }~ \mathrm { NaCl } \)에 용해된 \( 10 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) acetyltrimenthylammonium bromide(CTAB) 용액 \( 1.5 \mathrm { ml } \)를 혼합한 후 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20분 동안 처리하였다. 같은 양의 chloroform/isoamyl alcohol \( (24: 1, \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \)을 첨가하고 실온에서 10분간 부드럽게 혼합하고, 상온에서 20분 동안 \( 11,000 \times g \)에서 원심분리하여 상을 분리시켰다. Chloroform/isoamyl alcohol로 2회 추출한 후 \( 1 \mathrm { M } \) Tris- \( \mathrm { HCl } ( \mathrm { pH } 7.5) \)로 포화된 페놀을 같은 용량으로 한번 더 추출하고, 다시 한번 chloroform/isoamyl alcohol로 추출하였다. 저온의 에탄올 \( \left (-20 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \)을 2배 용량 첨가하고 유리 막대를 사용하여 침전된 DNA 를 모은 다음 \( 70 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \)에탄올로 헹구었다. 진공상태로 에탄올을 증발시킨 후, DNA를 TE buffer에 현탁시키고 \(260\) 및 \(280 \mathrm { nm } \)에서의 흡광도를 측정하여 DNA 농도를 측정하였다. 정제한 K. gwangalliensis의 genomic DNA를 Sau3AI 제한효소를 \( 5 \mathrm { U } / \mathrm { g } \) 농도로 처리하여 DNA를 부분적으로 분해하였다. K. gwangalliensis의 genomic DNA 라이브러리는 ZAP Express \( ^ {\circledR } \) BamHI/Gigapack \( ^ {\circledR } \) III cloning kit (Stratagene, USA)을 이용하여 지침에 따라 제작하였다. 생성된 라이브러리는 약 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \)개의 클론을 포함하고 \( 1 \mathrm { ml } \) 당 \( 3 \times 10 ^ { 9 } \)클론까지 증폭되었다.</p>