생명공학연구소에서 분주 받은 A549 인체 폐암세포를 Park 등의 방법을 통해 배양한 후 실험에 사용했고 histogram을 통해 봉독의 처리에 따른 세포주기 분포도 변화를 조사하였다. 마지막으로 전사 및 번역 수준에서 몇 가지 유전자의 발현 변화 관찰하기 위해 RT-PCR 및 Western blot 분석을 실시했다.
<h1>재료 및 방법</h1><p>실험에 사용한 A549 인체 폐암세포는 생명공학연구소 (KRIBB, Teajeon, Korea)에서 분주 받아 사용하였으며, Park 등의 방법에 준하여 배양하였다. 봉독은 Sigma Chemical Co. (St. Luis, MO, USA)에서 구입하였으며, 3차 증류수에 희석하여 사용하였다. 봉독 처리에 따른 A549 세포의 생존율을 조사하기 위하여 세포배양용 6 well plate에 A549 폐암세포를 \( 2 \times 10^{4} \)개/\(\mathrm{ml}\) 정도를 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후, 적정 농도의 봉독을 처리하였다. 48시간 후 배지를 제거하고 trypan blue 염색 후 도립현미경 하에서 살아있는 세포의 수를 측정하였다. Apoptosis 여부의 확인을 위한 핵의 형태적 변화 관찰을 위해 준비된 세포를 모은 다음 formaldehyde 용액으로 고정하고, \( 4^{\prime}, 6 \)-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma) 용액으로 15분 정도 염색시킨 후, 형광 현미경을 이용하여 400배의 배율로 각 농도에 따른 암세포의 핵의 형태 변화를 관찰하였다. 봉독의 처리에 따른 세포주기 분포도 변화를 조사하기 위하여 준비된 세포를 CycleTEST PLUS DNA REAGENT Kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 고정 및 염색을 하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), 암실에서 30분 동안 반응을 시킨 다음 DNA flow cytometry (Becton Dickinson)에 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 분석하였다.</p><p>전사 및 번역 수준에서 몇 가지 유전자의 발현 변화 관찰을 위하여 Woo 등의 방법에 준하여 RT-PCR 및 Western blot 분석을 실시하였다. 즉 준비된 세포에 TRIzol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 처리하여 total RNA를 분리\(\cdot\)정량한 후, 해당 유전자들의 primer와 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 이용하여 PCR을 실시하여 \( 1 \% \) agarose gel로 \( 100 \mathrm{~V} \)에서 전기영동을 하였다. DNA 분리가 끝난 gel을 ethidium bromide (EtBr) 를 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하였다. 이때 house-keeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자를 internal control로 사용하였다. 또한 해당 유전자들의 단백질 수준에서의 발현 차이 분석을 위하여 총 단백질을 분리\(\cdot\)정량한 후, SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하고, 분리된 단백질을 함유한 gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keenc, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 전이시켰다. 준비된 membrane에 해당 단백질의 1차 항체를 적정시간 처리하고 2차 항체를 사용하여 반응시킨 후, enhanced chemiluminoesence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 적용시켰다. 본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 및 Calbiochem (Cambridge, MA, USA)에서 구입하였으며, 2차 항체로 사용된 peroxidase-labeled donkcy anti-rabbit 및 pcroxidase-labclcd sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham에서 구입하였다. 봉독 처리에 의한 caspase-3 및 caspase-9의 정량적 활성 비교를 위해서는 Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-p-nitroaniline (pNA) 및 caspase-9은 Leu-Glu-His-Asp (LEHD)-pNA을 각각의 기질로 사용하여 분석하였다.</p>