멜라닌 생합성 경로에 관여하는 중요한 효소인 tyrosinase 저해 활성을 측정하는 실험을 진행하였다. 피부 주름 생성의 원인으로 작용하는 elastase의 저해 활성을 측정하였다. 섬유성 단백질인 콜라겐을 분해하는 효소인 collagenase 은 피부의 교원섬유로서 이에 대해 저해활성 측정을 하였다.
<h2>Tyrosinase 저해활성 측정</h2> <p>멜라닌(melanin) 생합성 경로에 관여하는 중요한 효소인 tyrosinase 저해 활성을 측정하는 실험은 Yagi 등의 방법에 따라 진행하였다. 농도별 시료용액 \( 40 \mu \mathrm{l} \) 에 \( 67 \mathrm{mM} \) sodium phosphate buffer \( (\mathrm{pH} 6.8)\) \( 80 \mu \mathrm{l}\) 과 \( 10 \mathrm{mM} \) 의 3,4-di-hydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA)를 녹인 \( 40 \mu \mathrm{l} \) 의 기질 액을 첨가한 혼합액에 \( 200 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) tyrosinase from mushroom \( 40 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 조건에서 10 분간 반응시켰다. 그 후 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 \( 492 \mathrm{~nm} \) 의 흡광도에서 측정하였다. Tyrosinase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <p>저해율 \( (\%)=(1- \) 시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도) \( \times 100 \)</p> <h2>Elastase 저해활성 측정</h2> <p>피부 주름 생성의 원인으로 작용하는 elastase의 저해 활성을 Cannell 등의 방법에 따라 측정하였다. 일정 농도가 되도록 각 시험용액을 희석한 후 \( 40 \mu \mathrm{M} \) 씩 96-well plate에 취하고, \( 50 \mathrm{mM} \) 의 tris- \( \mathrm{HCl} \) buffer \( (\mathrm{pH} 8.6)\)에 녹인 \( 2.5 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) elastase from porcine pancreas 용액 \( 40 \mu \mathrm{l} \) 을 가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 분간 반응시켰다. 그 후 \( 50 \mathrm{mM} \) tris- \( \mathrm{HCl} \) buf-fer \((\mathrm{pH} 8.6)\)에 녹인 N-succinyl-L-ala-ala-ala-p-nitroanilide \( (0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 기질 액 \( 80 \mu \mathrm{l} \) 을 첨가하여 동일한 온도에서 30 분간 반응시켜 생성되는 p-nitroanilide의 양을 \( 445 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. Elastase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <p>저해율 \( (\%)=(1- \) 시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도) \( \times 100 \)</p> <h2>Collagenase 저해활성 측정</h2> <p>피부의 교원섬유로 섬유성 단백질인 collagen을 분해하는 효소인 collagenase 저해활성 측정은 Wünsch \( \mathrm{E} \) 와 Hein-drich HG의 방법에 자라 측정하였다. 각 농도별 시험 용액 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 와 \( 0.1 \mathrm{M} \) tris- \( \mathrm{HCl} \) buffer ( \( \mathrm{pH} 7.5)\)에 \( 4 \mathrm{mM} \) calcium chloride \( \left(\mathrm{CaCl}_{2}\right) \) 를 첨가하여 Pz-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-OH trifluoroacetate salt \( (0.3 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 를 녹인 기질 액 \( 125 \mu \mathrm{l} \) 의 혼합액을 반응구로 설정하여 실온에서 20 분간 반응시켰다. 그 후 반응 정지 시약으로 \( 6 \% \) citric acid \( 250 \mu \mathrm{l} \) 를 넣고 \( 1.5 \mathrm{ml} \) 의 ethyl acetate를 첨가하여 UV/VIS spectroscopy를 이용해 \( 320 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. Collagenase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <p>저해율 \( (\%)=(1- \) 시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도) \( \times 100 \)</p>