식물체내의 외래 gene 도입여부를 확인하기 위해 선발배지에서 재분화된 개체로부터 DNA extraction buffe를 이용하여 genomic DNA를 분리하고, PCR은 premix kit를 사용하였으며 증폭된 PCR 산물은 1%(w/v) agarose 젤에서 전기영동하여 확인하였다. 형질전환 식물체에서 GUS 활성을 분석하기 위하여 his-tochemical staining assay와 fluorometric assay 방법을 이용하였고, 전체 단백질 함량은 Bio-Rad protein assay dye 용액을 이용하여 결정하였다.
<h3>DNA 분리 및 PCR 검정</h3> <p>식물체내의 외래 gene 도입여부를 확인하기 위해 선발배지에서 재분화된 개체로부터 DNA extraction buffer (Weigel and Glazebrook \(2002 \))를 이응하여 genomic DNA를 분리하였고, PCR은 premix kit (Intron Co., Korea)를 사용하였다. PAT 유전자에 대한 PCR primer로서 \(5 \)'-ATGAGCCCAGAACGACGCC- \(3 \)'는 forward strand용, \( 5 \)'-TCACATCTCGGTGACGGGC- \(3 \)'는 reverse strand용으로 준비하여 \(550 \mathrm { bp } \) 크기의 DNA가 증폭되도록 하였다. PCR 반응은 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \(4 \)분간 최초 변성 후에 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(30 \)초, \( 58 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(30 \) 초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(50 \)초로 총 \(30 \)회 반응시키고, 마지막 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(7 \)분 최종 \(1 \)회 연장시키는 조건으로 수행하였다. 이렇게 증폭된 PCR 산물은 \( 1 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) agarose 젤에서 전기영동하여 확인하였다.</p> <h3>B-glucuronidase (GUS) 발현 분석</h3> <p>형질전환 식물체에서 GUS 활성을 분석하기 위하여 his-tochemical staining assay와 fluorometric assay 방법을 이용하였다. 선발된 개체에서 잎, 꽃, 종자를 잘라 GUS staining buffer [50 mM \( \mathrm { NaH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } ( \mathrm { pH } 7.0), 10 \mathrm { mM } \) Na2EDTA, \( 0.5 \\mathrm { mM } \) potassium ferrocyanide, \( 0.5 \\mathrm { mM } \) potassium ferricyanide, \( 0.1 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) Triton \( \mathrm { X } -100 \) and \( 1 \\mathrm { mM } \) \(5 \)-bromo- \(4 \)-chloro- \(3 \)-indolyl-glucuronide (Gold Bio Technology, Inc)]에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 16 \sim 24 \mathrm { ~ } \)시간 동안 반응시켰다. 염색이 끝난 조직은 에탄올을 이용하여 순차적으로 엽록체를 완전히 제거한 다음, 현미경 (DFC 280, LEICA, Germany)으로 관찰하였다. Fluorometric assay 방법은 막자사발을 이용하여 선발된 개체의 잎을 잘게 부순 후, GUS extraction buffer [50 mM \( \mathrm { NaH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } \) (pH 7.0), \( 10 \\mathrm { mM } \\mathrm { Na } a_ { 4 } \)EDTA, 0.1% SDS, 0.1% Triton \( \mathrm { X } -100,10 \\mathrm { mM } \) ß-mercaptoethanol] 를 첨가하여 균질화시키고 원심분리 \( \left (13,000 \\mathrm { rpm } , 10 \right . \)분, \( \left .4 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \)에 의하여 상등액을 모아 분석에 이용하였다. 상등액의 단백질을 \( 10 \\mu \mathrm { g } \) 으로 정량한 후, GUS assay buffer (10 mM 4-methylumbelliferyl-D-glucuronide in extraction buffer)와 GUS extraction buffer를 넣고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 30 \)분 동안 반응시켰으며 이어서 stop buffer \( (0.2 \) \( \mathrm { M } \\mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { CO } _ { 3 } \) )를 첨가하여 반응을 종료시켰다. Fluorescence의 측정을 위하여 FLX800 Fluorescence Microplate Reader (BioTek Instruments Inc., USA)를 사용하였다. 전체 단백질 함량은 Bio-Rad protein assay dye 용액 (BIO-RAD, USA)을 이용하여 결정하였다.</p>