본 연구에서는 BMDCs를 분리하여 조성, 세포독성을 확인하기 위해 BMDCs같은 경우 C57BL/6 쥐의 골수를 취해 분리후 채취하였다. BMDCs의 조성을 확인하기 위해 FACs를 이용하여 분석하였고, 세포독성을 확인하기 위해 MTT assay 및 Student \(t\)-test를 진행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료</h2> <p>본 실험에 사용된 fetal bovine serum (FBS), RPMI-1640, penicillin-streptomycin 등의 세포 배양용 시약들은 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였으며, 항체인 flu-orescein isothiocyanate (FITC)-conjugated anti-major histo-compatibility complex (MHC) class I 및 II, anti-CD11c-APC, phycoerythrin (PE)-jugated anti-CD80 및 anti-CD86은 PharMingen (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. Lipopolysaccharide (LPS, Escherichia coli 026:B6) 및 complete medium 제조를 위한 시약들은 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다. 사리장은 인산죽염촌(주)에서 제공 받아서 \( 0.4 \mu \mathrm{l}\)의 siringe filter로 여과 멸균하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 보관하며 사용하였다. DC 분리를 위한 C57BL/ 6 mouse 6주령 수컷은 오리엔트 바이오(경기도 성남)에서 구입하여 사용하였다.</p> <h2>BMDCs의 분리 및 배양</h2> <p>BM 세포로부터 DC의 분리는 Inaba et al. 의 방법에 준하여 C57BL/6 mouse의 경골과 대퇴골 부위에서 골수를 채취하고 원심분리 한 후에 상층액을 제거한 다음 \(0.165 \mathrm{M} \mathrm{~NH}_{4} \mathrm{Cl} \) 을 넣고 적혈구를 제거하였다. 다시 원심분리한 후에 상층액을 버리고 complete medium [RPMI 1640 upplemented with \( 10 \% \) heat-inactivated FBS, \( 2 \mathrm{mM} \) L-glutamine, \( 100 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) pen-icillin, \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) streptomycin, \( 5 \times 10^{5} \) M 2-mercaptoethanol, \( 10 \mathrm{mM} \) HEPES (\(\mathrm{pH} 7.4\)), \( 20 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) ecombinant mouse \( (\mathrm{rm}) \) granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and \( 20 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) of \( \mathrm{rm} \) interleukin-4 (IL-4)]을 이용하여 6-well plate \( \left(3 \mathrm{ml}\right. \) /well)에 \( 3 \times 10^{6} \) 개의 세포를 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{~CO}_{2} \) 의 조건에서 배양하였다. 3 시간 후 plate 바닥에 붙어있는 대식세포를 제거하고 상층액을 취하기 위하여 원심분리하였다. 그 후에 상층액을 버리고, complete medium을 이틀 간격으로 교환하면서 6 일 동안 배양하여 immature DC (iDCs) 또는 DC precursor를 준비하여, 적정 농도의 사리장 및 LPS가 함유된 complete medium을 이용하여 배양하였다.</p> <h2>Flow cytometry analysis</h2> <p>BMDC의 분리 및 배양 7일째, 이들 세포를 PBS로 수세 후, FACS washing buffer \(( 2 \%\) FBS and \( 0.1 \% \) sodium azide in PBS)를 넣은 후 스크랩퍼로 긁어서 세포를 모아 normal rat serum, Fc gamma receptor blocker, anti-CD80-PE, an-ti-CD86-PE, anti-CD11c-APC, anti-I-Ab-FITC-MHC class I 및 II로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20 분간 염색하였다. 염색된 세포들의 세포표면 수용체들의 발현 증가 여부는 FACS Calibur flowcytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.</p> <h2>MTT assay 및 통계처리</h2> <p>사리장 및 LPS가 처리된 조건에서 배양된 DC의 세포표면 수용체들의 발현 변화가 사리장 및 LPS에 의한 세포독성과 연관성이 있는지를 확인하기 위하여 동일 조건에서 배양된 DC를 대상으로 MTT assay를 실시하였다. 또한 모든 실험결과는 평균\(\pm\)표준편차로 표시하였고 SigmaPlot을 이용하여 Student \( t \)-test를 이용하여 통계적 유의성을 얻었다.</p>