Rubisco를 분리하기 위해, 초기 침전물에 dissolving buffer, ATP, MgCl2, MBT 등을 첨가하여 현탁한 후, PEG-10K를 첨가하여 교반한다. 그 후 침전물을 원심분리하여 DBA 용액으로 현탁하고 다시 원심분리하며, 이 과정을 반복한다. 얻어진 상등액을 Q-sepharose column에 loading한 후, BTP 및 NaCl 용액으로 세척하고 용출하여 rubisco activase를 분리한다. 모든 분리과정은 4 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 진행하고, 분리한 rubisco와 rubisco activase 용액은 -80 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 보관한다.
<h2>Rubisco activase의 분리</h2> <p>Rubisco의 분리 방법 중, 35 \( \% \left ( \mathrm { NH } _ { 4 } \right )_ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \) 처리 후 8,000 \( \mathrm { rpm } \) 에서 8 분간 원심분리하여 얻어진 침전물에 dissolving buffer 용액(20 \( \mathrm { mM } \) BTP \( \mathrm { pH } \) 8.0), 0.2 \( \mathrm { mM } \) ATP, 10 \( \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } _ { 2 } \), 2 \( \mathrm { mM } \) MBT) 5 \( \mathrm { ml } \) 로 현탁하고, 최종농도가 18 \( \% \) 가 되게 50 \( \% \) w/v PEG-10K를 가하여 4 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분간 교반하였다. 8,000 \( \mathrm { rpm } \) 에서 8 분간 원심분리하여 얻은 침전물을 2.5 \( \mathrm { ml } \) DBA 용액으로 현탁하고 10,000 \( \mathrm { rpm } \) 에서 10 분간 원심분리하였다. 이 과정을 반복하여 얻어진 상등액을 모아 Q-sepharose column에 loading하여 20 \( \mathrm { mM } \) BTP ( \( \mathrm { pH } \) 7.0) 용액으로 세척한 후, 0-0.5 \( \mathrm { M } \mathrm { NaCl } \) 용액으로 3 \( \mathrm { ml } \) 씩 용출하여 rubisco activase를 분리하였다.</p> <p>모든 분리과정은 4 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 수행하였으며, 분리한 rubisco와 rubisco activase 용액은 -80 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 저장하였다.</p> <h2>Rubisco와 rubisco activase의 함량 측정</h2> <p>Rubisco와 rubisco activase의 함량은 ELISA로 측정하였다. Microplate well에 0.1 \( \mathrm { M } \) sodium carbonate-bicarbonate buffer ( \( \mathrm { pH } \) 9.5) 용액으로 희석된 효소 용액을 넣은 후, 4 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 하루 밤 동안 반응시키고, 0.05 \( \% \) Tween 20이 함유된 0.01 \( \mathrm { M } \) PBS ( \( \mathrm { pH } \) 7.4) 용액으로 세척하였다. 0.01 \( \mathrm { M } \) PBS ( \( \mathrm { pH } \) 7.4)로 만든 0.1 \( \% \) BSA 용액을 사용하여 blocking시킨 후, 1 차 항체로서 토끼 항 rubisco와 항 rubisco activase 항혈청을 각각 가하고, 2차 항체로서는 0.1 \( \% \) BSA가 들어있는 0.01 \( \mathrm { M } \mathrm { PBS } \) ( \( \mathrm { pH } \) 7.4) 로 1:20,000 희석시킨 peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG 용액을 가하였다. Peroxidase의 기질로서 30 \( \% \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 가 함유된 0.05 \( \mathrm { M } \) citrate/0.1 \( \mathrm { M } \) sodium phosphate buffer ( \( \mathrm { pH } \) 5.0)로 만든 OPD tablet 용액을 가하여 암 상태의 실온에서 20 분간 반응시킨 후, 1 \( \mathrm { ~N } HCl 로 반응을 정지시켰다. ELISA microplate reader (Bio-Rad model 3550-UV)를 사용하여 492 \( \mathrm { ~nm } \) 에서 이들의 흡광도를 측정하여 함량을 계산하였다.</p>