MCF-7 (인간 유방암) 세포는 한국 세포주은행 (Korean Cell Line Bank, KCLB)으로부터 분양받아 RPMI 1640 배지에 \(10\%\) FBS를 첨가하여 배양하였다. 세포는 \(0.25\%\) trypsin-EDTA 용액으로 처리되어 단일 세포로 분리되고, 48well plate에 배양되었다. CJP와 PTP의 항암 활성을 확인하기 위해 Hoechst 33258로 세포핵을 염색하고 형태 변화를 관찰하였다. 또한, MCF-7 세포를 희석하여 \(50 \mahtrm{mm}\) Dish에 부착시킨 후 CJP와 PTP를 처리하고 반응시킨 후 형광 염색을 실시하여 핵의 형태 변화를 분석하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>과피 추출물의 제조</h2> <p>실험에 사용한 유자는 일반시장에서(남해산) 구입하였으며, 탱자는 경상북도 청도군에서 재배된 것을 구입하였다. 각 열매의 과육과 분리한 과피를 동결건조 하고 파쇄한 후, 각 과피의 건조물 중량에 대해 각 10 배의 \( 80 \% \mathrm{EtOH} \) 을 가하여 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 환류 냉각시키면서 6시간씩 2회 반복 추출하였다. 추출물을 감압 여과(pore size \( 6 \mathrm{~mm} \) )하고 여액을 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 회전식 진공증발 농축기로 완전 건고 시킨 후 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 냉동보관 하면서 실험에 사용하였다.</p> <h2>시약 및 기기</h2> <p>RPMI 1640, FBS (fetal bovine serum), trypsin-EDTA (0.25\% trypsin, hybri-Max, SRB (sulforhodamine B), TCA (trichloro acetic acid,), RNase, marker, agarose gel, PI (phosphatidylinositol) 등은 Sigma (USA)에서 구입하였으며 Tris-HCl buffer는 Aldrich사로부터 구입하였다. Caspase-3/ CPP32 Colorimetric Assay Kit는 BioVision (USA)로부터 구입하였으며. Bisphenol A, RPMI 1640 Medium modified는 Sigma (USA), Sterile fetal bovine serum charcol stripped (cFBS)는 Valley Biomedical Inc. 121 (Germany)에서 구입하였다. \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator는 Vision사의 VS-9108MS를 사용하였으며 microplate reader (Titertek Multiscan Plus, Finland)로, Hoechst 염색에 의한 핵의 관찰은 형광현미경(BH2-BH2-RPL-T3, Olympus optical CO. Ltd. Japan), 세포주기 분석은 flow cytometer (EPICS XL, Backman Couter, USA)를 사용하였다.</p> <h2>세포주 배양</h2> <p>실험에 사용한 MCF-7 (human breast cancer) 세포를 한국 세포주은행 (Korean Cell Line Bank, \(\operatorname{KCLB}^{\circledR}\) )으로부터 분양 받아 \( 10 \% \) FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 계대 배양하여 실험에 사용하였다.</p> <h2>SRB assay에 의한 암세포 성장 억제 효과</h2> <p>Monolayer로 자란 암세포주 MCF-7 세포를 0.25\(\%\) tryp-sin-EDTA용액으로 처리하여 single 세포로 만들어 \( 5 \times 10^{4} \) cell/ml로 조절하여 48well plate에 분주하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{CO}_{2} \) in-cubator에서 24 시간 배양하였다. 배양 후 plate에 세포의 부착을 확인하고 CJP와 PTP를 농도별로 첨가하여 각각 24,48 , 72시간 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 배양액을 제거하고 각 well에 \( 12 \% \) TCA를 \( 100 \mathrm{ml} \) 씩 가해 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 동안 고정시킨 후 증류수로 5회 세척하여 건조하였다. 각 well에 \( 1 \% \) 빙초산에 녹인 \( 0.4 \% \ \) SRB 용액을 \( 50 \mathrm{ml} \) 씩 가하여 실온에서 60 분간 엄색한 후 \( 1 \% \) acetic acid로 \( 4 \sim 5 \) 회 세척하여 건조시키고 \( 10 \mathrm{mM} \) Tris buffer \( 100 \mathrm{ml} \) 로 충분히 용출시킨 뒤 상등액을 96well plate용 microplate reader로 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Hoechest 염색을 통한 핵의 관찰</h2> <p>CJP 와 PTP가 MCF-7 사멸의 항암 활성에 있어서 세포사멸과의 관련여부를 확인하기 위해 bis-benzimide (Hoechst 33258 ) 염색 후 핵의 형태변화를 관찰하였다. MCF-7 세포를 \( 0.25 \% \) trypsin-EDTA용액으로 처리하여 single 세포로 만든 후 최종 세포농도가 \( 5 \times 10^{5} \mathrm{cell} / \mathrm{ml} \) 되도록 희석하여 \( 50 \mathrm{~mm} \) Dish에 분주한 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5.5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 24 시간 배양하였다. 부착된 세포에 CJP와 PTP를 각각 \( 300 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 와 500 \( \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 로 처리하여 48 시간동안 반응시킨 후 PBS로 세척하고 \( 0.25 \% \) trypsin-EDTA 용액 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 과 배지 \( 1 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 세포를 회수하고 형광 염색물질인 hoechst 용액 \( (0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 를 \( 100 \mathrm{ml} \) 첨가하여 30 분간 염색하고 PBS로 2회 세척하여 형광현미경을 이용하여 핵의 형태변화를 정상군과 비교하였다.</p>