RAW264.7 cell 내에 생성되는 ROS의 측정을 위해 DCFH-DA를 이용했다. 세포에 ATX를 농도별로 처리한 후, LPS를 이용하여 oxidative stress를 유발했다. 이에따른 ATX의 억제효과를 측정한 결과 ATX 처리군은 농도의존적으로 LPS로 유도된 \( \mathrm { NO } \)의 생성을 유의성 있게 억제하는 결과를 보였다.
<h2>ROS 생성측정</h2> <p>RAW264.7 cell 내에 생성되는 산소라디칼 ROS를 측정하기 위하여 \( 2 ^ {\prime } , 7 ^ {\prime } \)-dichloro-dihydrofluorescin diacetate (DCFH-DA)를 이용하였다. 세포에 ATX를 농도별로 1시간 처리한 후, LPS \( (10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \) 를 이용하여 24시간 동안 oxidative stress를 유발시켰다. 원심분리를 이용하여 pellet을 수집한 후, cell ly-sis buffer를 이용하여 시료를 추출해 실험에 이용하였다. 190 \( \mu 1 \) 의 PBS와 \( 50 \mu 1 \) 의 \( 125 \mu \mathrm { M } \) DCFH-DA와 \( 10 \mu 1 \) 의 시료를 96 well plate (black)에 넣고 잘 혼합하여 30분 동안 배양하였으며 그 후, fluorescence spectrophotometer (Tecan, USA)를 이용하여 Ex: \( 485 \mathrm { ~nm } \) 와 Em: \( 530 \mathrm { ~nm } \)에서 측정한 후, ROS 생성수준을 fluorescence/mg protein으로 계산하였다. 시료의 pro-tein 함량은 BCA protein assay를 이용하여 측정하였다.</p> <h2>통계학적 분석</h2> <p>모든 실험결과는 3회 이상 실험을 반복하여 얻은 자료를 이용하여 평균 \( \pm \) 표준편차로 나타내었고 통계학적 분석에는 SPSS version 14.0을 이용하였다. 실험 군 간 비교에는 one-way analysis of variance (ANOVA) 및 independent \( t \)-test를 이용하였고, \( p<0.05 \)를 통계학적으로 유의성이 있는 것 으로 간주하였다.</p> <h1>결 과</h1> <h2>ATX가 LPS로 유도된 \( \mathrm { NO } \) 생성에 미치는 효과 및 세포생존율</h2> <p>RAW264.7 cell을 이용하여 LPS로 유도된 \( \mathrm { NO } \) 생성에 대한 ATX의 억제효과를 측정하였다. 대조군과 비교할 때, LPS군 \( (10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } , 20 \mathrm { hr } ) \)은 약 36배의 \( \mathrm { NO } \) 생성이 증가하였으며, ATX 처리군 \( (25-100 \mu \mathrm { M } ) \)은 농도의존적으로 LPS로 유도된 \( \mathrm { NO } \)의 생성을 유의성 있게 억제하였다[25-100 \( \mu \mathrm { M } (p<0.01) \)]. 또한, ATX의 세포독성효과를 MTT방법을 이용하여 측정한 결과, 세포생존율은 \( 100 \mu \mathrm { M } \)의 농도에 이르기까지 영향을 받지않았다.</p>