본 연구에서는 TLC 방법을 개선하여 biodiesel 내의 glycerol을 정량하는 방법을 개발하였다. 이 방법은 chemical assay와 enzymatic assay와 비교하여 평가되었으며, TLC 방법은 특별한 분석장치 없이 간편하게 잔류 glycerol을 측정하는 방법으로 관심을 받고 있다.
<h1>서 론</h1> <p>Trigyceride에서 transesterification 반응을 통하여 biodiesel이 만들어질 때, 동시에 부산물로 발생하는 glycerol은 biodiesel 안에 포함될 수 있는 불순물로서 biodiesel의 엔진 연소과정에서 문제를 일으키는 것으로 알려져 있다. 불순물 glycerol은 biodiesel의 품질을 결정하는 중요한 인자이며, 정제과정에서 제거되어야 하는 물질이다. 그래서 ASTM (American Society for Testing and Materials) standard와 European standard에서는 biodiesel 안에 포함된 잔류 free glycerol의 함량을 \( 0.02 ( \%, \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) 이하로 규정하고 있다. 지금까지 glycerol의 양은 chemical assay, enzymatic assay, TLC (Thin-layer chromatography) 방법, 그리고 gas chromatography (GC) 및 high-performance liquid chromatography (HPLC) 방법에 의해서 정량적으로 분석되어져왔다. 이러한 biodiesel에서의 품질검사를 위한 방법들 중에서 TLC 방법은 상대적으로 특별한 분석장치 없이 잔류 glycerol을 측정하는 간편한 방법으로서 관심의 대상이 되어왔다. 본 연구에서는 기존에 알려진 TLC 방법을 이용한 glycerol 정량법의 이동상을 변경하여 개선하고, 이를 실제 biodiesel 안에 들어있는 glycerol 측정에 적용하여 보았다. 이 때 얻어진 glycerol 정량결과를 chemical assay와 enzymatic assay 방법의 결과와 비교하여, TLC 방법을 이용한 free glycerol 정량분석법을 평가하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>시약 및 시료</h2> <p>TLC plate는 \( 20 \times 10 \mathrm { ~cm } \) PartisilⓇ K5F (Whatman, MA, USA)를 사용하였고, enzymatic glycerol assay는 Sigma-Aldrich의 free glycerol assay kit (Product Code F6428)를 사용하였다. 그 외의 언급하지 않은 것은 reagent-grade 시약을 사용하였다. 그리고 정제된 biodiesel 시료는 강원대학교 생물 공학 연구실과 M-energy (Gyeonggi-do, Korea)로부터 공급받았다.</p> <h2>Glycerol 분석을 위한 TLC</h2> <p>시료는 TLC plate의 아래에서 \( 2 \mathrm { ~cm } \) 위에 \( 1 \mathrm { ~cm } \) 간격으로 \( 1.0 \mathrm {\mu l } \) 씩 loading 하였다. 이동상으로는 acetone : butanol : distilled water \( (8:1:1, \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) , butanol : distilled water \( (1:1, \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \), 그리고 acetonitrile : water \( = 85 : 15 ( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 를 사용하였으며, 전개 후 TLC plate에 staining solution ( \( 1.5 \mathrm { ~g } \\mathrm { KMnO } _ { 4 } , 10 \mathrm { ~g } \mathrm { ~K } _ { 2 } \mathrm { CO } _ { 3 } , 1.25 \mathrm { ~ml } \ 10 \% \\mathrm { NaOH } \) in \( 200 \mathrm { ~ml } \) distilled water)이 스며들게 한 뒤 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) oven에서 10분간 incubation시켜서 band를 확인하였다. Glycerol을 정량 분석하기 위하여 TLC plate 상의 band 이미지를 AlphaEase FC software (Alpha Innotech, San Leonardo, CA, USA)를 이용하여 peak로 변환한 후, 그 면적을 계산하였다.</p> <h2>Glycerol 분석을 위한 chemical assay와 enzymatic assay</h2> <p>Glycerol의 chemical assay를 위해서 Bansal et al.의 논문에서 제시한 방법을 사용하였고, enzymatic assay는 Sigma-Aldrich의 free glycerol assay kit 설명서를 참조하여 분석하였다.</p> <h2>Statictical significance</h2> <p>Microsoft Excel을 이용하여 Table 1의 세 가지 분석법에 의한 실험 결과가 서로 같다는 가정 하에 ANOVA test를 \( 95 \% \) 신뢰수준에서 실시하여 상호간의 유의성 검증을 실시하였다. 이때 3회 실시한 실험결과의 평균값에 대하여, 같은 시료와 같은 방법에 대하여 유의성 검증을 실시하였다.</p>