고정된 뇌 조직은 \( 30 \% \) su crose 용액에서 25일 동안 침전시키고, \( 40 \mu \mathrm{m} \) 두께의 연속관상 절편을 제작한다. BrdU 항체는 PBS와 BSA, sodium azide가 포함된 용액에서 희석하고, 24시간 동안 반응시킨다. 반응된 항체와 세포는 광학 현미경을 이용해 관찰하고, BrdU-양성 세포수는 치상회의 립세포층 \( \mathrm{mm}^{2} \)당으로 정량적 분석을 진행한다.
<h2>뇌 적출 및 조직 처리</h2> <p>기억력검사 종료 24시간 후 실험동물들은 Zoletil \( 50^{\circledR}(10 \) \( \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) )을 복강 내 주사를 통하여 마취시킨 후 흉강을 열고 좌심실을 통하여 \( 50 \mathrm{mM} \)인산염 완충식염수(phosphate buffer saline, PBS)를 주입하고, 이 후 \( 100 \mathrm{mM} \)인산 완충액 에 녹인 \( 4 \% \)paraformaldehyde (PFA)고정액을 관류하였다. 관류 고정 후 뇌를 적출한 다음 고정액에 담아서 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 후 고정을 실시하였다. 고정된 뇌 조직은 \( 30 \% \mathrm{su} \) crose 용액에서 25일간 침적시킨 후 Cryostat (American Optica, USA)를 이용하여 \( 40 \mu \mathrm{m} \)두께의 연속관상 절편을 제 작하였다.</p> <h2>신경세포 생성 검사를 위한 BrdU 면역조직화학법</h2> <p>해마의 조직절편을 \( 50 \mathrm{mM} \)PBS로 세척한 후 \( 0.5 \% \) Triton \( \mathrm{X}-100 \)에 반응시켰다. Triton X-100을 세척한 후 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 50 \% \)formamide와 2x SSC 용액에서 2시간 반응시켰다. 반응 완료 후 \( 2 \times 5 \mathrm{SSC} \)로 세척한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 2 \mathrm{NHCl} \)에 반응시켰다. 반응이 끝나면 바로 \( 100 \mathrm{mM} \) sodium borate, \( \mathrm{pH} 8.5 \) 로 세척한 후 \( 50 \mathrm{mM} \)PBS로 다시 세척하였다. 이 과정이 끝난 조직은 자유부유(free-floating)법을 사용하여 면역조직화학 염색을 시행하였다. 항체와 반응하기 전에 \( 50 \mathrm{mM} \)PBS에 \( 10 \% \)horse serum과 \( 1 \% \) Bovine serum albumin (BSA)를 함유한 차단용으로 한 시간 동안 반응시켰다. BrdU항체 (Boehringer Mannheim, Germany)를 \( 50 \mathrm{mM} \) PBS에 \( 0.5\%\) BSA와 \(0.5\%\) sodium azide를 함유한 일차 항체 용액에 1:600의 비율로 희석한 후 24시간 동안 반응시켰다. \( 50 \mathrm{mM} \) PBS로 세척한 후, biotinylated anti-mouse \( \mathrm{IgG} \) 를 \( 50 \mathrm{mM}\) PBS에 \( 0.3 \% \)Triton X-100을 함유한 이차 항체용액에 \( 1: 200 \) 의 비율 로 희석한 후 1 시간 동안 반응시켰다. \( 50 \mathrm{mM} \) PBS로 세척한 후, HRP avidine-biotin complex (Vectastain-EliteTM HRP \( \mathrm{ABC} \) kit, Vector \( { }^{\circledR}, \mathrm{USA} \) )에서 1시간 동안 반응시켰다. \( 50\mathrm{mM} \) PBS로 세척한 후, \( 50 \mathrm{mM} \) Tris 완충액에 과산화수소와 DAB를 함유하는 발색제로 발색반응을 실시한 다음 세척하였다. 각각의 항체들과 면역 반응이 일어난 세포들은 광학현미경을 이용하여 관찰하고 BrdU-양성 세포수를 치상회의 립세포층 \( \mathrm{mm}^{2} \)당으로 정량적 분석을 실시하였다.</p> <h2>자료 처리</h2> <p>본 실험에서 얻은 자료는 SPSS (version 12.0) 통계프로그램을 이용하여 처리하였다. 측정치는 Mean \( \pm\)SEM로 표시하였고 집단 간 차이 검정은 one-way ANOVA를 이용하였다. 유의차가 나타난 항목에 대한 사후검증은 Duncan의 방법을 이용하였다. 통계적 유의수준은 \( \mathrm{p}<0.05 \)로 정하였다.</P>