다양한 식품으로부터 56종의 젖산균을 분리하여 알코올배지에 생육시켜 5종(N3-2-2, S1, SN3, K3, K5)의 젖산균을 대상으로 2차 실험결과 K3 와 S1 균주가 가장 높은 알코올 내성을 가진것으로 나타났다. 이 두 균주는 모두 Pediococcus acidilactici종과 \( 99 \% \) identity를 보였고 다른 3종은 Pediococcus 속 세균과 유사하다고 나타났다. 젖산균주 5종 중 알코올 내성이 가장 높은 두 균주의 16S rRNA 유전자를 PCR로 증폭시켜 분석하면 Pediococcus acidilactici종과 가장 유사하다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>알코올 내성 젖산균주의 스크리닝 및 선별</h2> <p>다양한 종류의 김치, 시판 중인 누룩 4 종과 생막걸리 5 종으로부터 젖산균 선택 배지인 BCP 배지를 이용하여 황색 콜로니를 생성하는 총 56 종의 젖산균을 순수 분리하였다. 순수 분리한 총 56 종의 젖산균을 \( 10 \% \) 와 \( 15 \% \) 알코올이 함유된 MRS 배지에 접종한 후 생육시킨 결과, 대부분의 젖산균은 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도 \( \left(\mathrm{OD}_{600}\right) \) 가 증가하지 않았으나 \( \mathrm{OD}_{600} \)가 가장 많이 증가한 5 종(N3-2-2, S1, SN3, K3, K5)을 1 차 로 선별하였다. 1 차 선별된 5 균주를 \( 10 \% \) 알코올이 함유된 MRS 배지와 일반적 막걸리 제성 전 발효 원주의 최종 알코올 농도인 \( 13 \% \) 알코올이 함유된 MRS 배지에서 48 시간 동안 생육시키면서 생육 정도를 측정한 결과, K3 와 S1 균주가 가장 높은 알코올 내성을 가진 것으로 확인하였다.</p> <h2>선별 균주의 분자생물학 및 생화학적 동정</h2> <p>1 차 선별된 젖산균주 5 종 중 알코올 내성이 가장 뛰어난 두 균주(K3와 \S1)의 16S rRNA 유전자를 PCR로 증폭하여 염기서열을 분석한 결과 모두 Pediococcus acidilactici종과 \( 99 \% \) identity를 나타내었고 다른 3종(N3-2-2, SN3, K3)도 Pediococcus 속 세균과 가장 유사한 것으로 확인되었다. 본 실험에서 1 차 선별된 5 종의 알코올 내성 젖산균주들은 모두 생막걸리와 시판 누룩에서 분리되었는데, 기존에 막걸리로부터 분리된 대부분의 젖산균은 Lactobacillus 속에 속하는 젖산균이었으나 최근 권 등이 DGGE 분석을 통해 보고한 바에 따르면 Pediococcus 속의 젖산균도 누룩과 막걸리에 상당수 함유되어 있는 것으로 알려지기 시작했으며, 최근 누룩과 막걸리에서도 Pediococcus 속 세균들이 보고되고 있으나 알코올 내성에 대한 연구는 전혀 없는 실정이다.</p> <p>\( 13 \% \) 알코올 농도에서 최고의 생육을 보인 두 균주 (K3 와 S1) 와 P. acidilactici DSM 20284 표준 균주를 API 50 CHL Medium kit를 이용하여 생화학적 동정을 수행한 결과 , 세 균주 모두 Pediococcus pentosaceus와 가장 유사한 결과(99\%)를 나타내었다. 일반적으로 균주의 탄소원 이용 가능성을 보는 생화학적 테스트는 정확한 동정에 한계가 있으며 변종의 경우에는 차이를 보일 수 있고 P. pentosaceus 와 P. acidilactici 는 계통적으로 가까운 균이므로 선별한 두 균주(K3와 S1) 의 16S rRNA 유전자 염기서열을 P. acidilactici DSM 20284와 P. pentosaceus DSM 20336 표준균주의 16S rRNA 유전자 염기서열과 비교하였다. 그 결과, 선별한 두 균주의 서열이 모두 P. acidilactici에 더 가까운 것을 확인되었고 선별한 두 균주를 각각 P.acidilactici K3와 P. acidilactici S1으로 명명하였다.</p>