본 실험에 이용된 애플망고의 껍질로부터 열수 추출 및 에탄올 추출을 진행하였고, 이를 이용해서 본 실험의 시료로 이용했다. 이를 이용해서 tyrosinase 저해 활성 실험은 진행했는데, 이는 DOPA chrome의 생성을 확인하기 위해서 진행했다. 또한 MTT assay를 통해서 세포 생존율을 측정했으며, 이는 시료를 첨가하지 않은 무첨가군을 대조군으로 해서 실험군의 흡광도와 비교하여 백분율로 나타내었다. 그리고 마지막으로 멜라닌 합성에 관여하는 것으로 알려진 요소 MITF, tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2를 이용해서 미백 효과를 확인하기 위해서 western blot 실험을 진행해서 단백질의 발현 정도를 확인했다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>재료 및 시료 추출</h2><p>본 실험에 사용된 애플망고의 껍질은 애플망고를 제주도 대동농원에서 구입하여 껍질을 수거 후 사용하였다. 시료는 세척하여 열풍건조한 후 파쇄한 것을 사용하였다. 열수 추출은 시료 \( 100 \mathrm{~g} \)에 10배의 증류수를 첨가하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 환류 냉각 추출해 실온에서 24시간 침지한 후 부직포로 1차 여과하여 상등액과 침전물을 분리하여 위와 같이 3회 반복 추출하였다. 에탄올 추출은 시료 \( 100 \mathrm{~g} \)에 10배의 에탄올을 첨가하여 24시간 동안 교반시켜 준 후 상등액과 침전물을 부직포를 이용하여 분리하고 이와 같은 방법을 3회 반복하였다. 각 추출물의 상등액은 진공펌프와 여과지(Whatman No. 5, No. 4, No. 2)를 이용하여 여과한 후 용매를 제거하기 위해 rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan)로 감압농축 하였다. 농축이 완료된 추출물을 동결건조하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하며 본 실험의 시료로 사용하였으며, 애플망고 껍질의 열수 및 에탄올 추출물은 각각 \( 21.22 \%\), \(21.57 \% \)의 수율을 얻었다.</p><h2>시약 및 기기</h2><p>Tyrosinase 저해 활성 측정 실험에 사용한 Tyrosinase from mushroom, L-3,4-dihydroxy-phenyl-alanine (L-DOPA) 등은 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포 독성 측정을 위해 사용한 3-[4, 5-dimethylthiazol]-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)와 dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Sigma Chemical Co.에서 구입하여 사용하였다. 미백 효과 측정을 위해 사용한 시약인 \( \alpha\)-MSH, Radio-immunoprecipitation assay buffer (RIPA buffer), Protease \(\&\) Phosphatase Single-Use inhibitor Cocktail 100X 및 Bicinchoninic Acid (BCA) kit는 Sigma Chemical Co.에서 구입하여 사용하였다. 단백질 발현 실험에서 사용된 \( \beta \)-actin, MITF, Tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 primary antibody와 anti-mouse, anti-rabbit인 secondary antibody는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (USA)에서 구입하여 사용하였으며, enhanced chemiluminescence (ECL) 용액으로는 Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate을 Merck Millipore (USA)에서 구입하여 사용하였다. mRNA 발현 측정 실험에 사용된 Trizol \( { }^{\circledR} \) reagent 은 Thermo scientific ambion\( { }^{\circledR} \) (Logan, USA)에서 구입하였으며, Go Script \( { }^{\mathrm{TM}} \) Reverse Transcription kits, Accupower\( { }^{\circledR} \) PCR PreMix는 Promega (USA)와 Bioneer (Korea)에서 구입하였으며, GAPDH, MITF, Tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2 는 Bionics (Korea)에서 구입하여 사용하였다.</p><p>실험에 사용된 기기는 rotary vacuum evaporator (EYELA), micro refrigerated centrifuge (Hanil Scientific Inc., Korea), microplate readers (Molecular Devices, China), nano drop (Jcbio, Korea), SimpliAmp \( { }^{\text {TM }} \) Thermal Cycler (Applied Biosystems, USA), ChemiDoc \( { }^{\mathrm{TM}} \) MP Imaging System (Bio-Rad, USA) 등을 사용하였다.</p><h2>Tyrosinase 저해 활성</h2><p>Tyrosinase 저해 활성 측정은 DOPA chrome의 생성되는지 확인하기 위해 Yagi 등의 방법에 따라 실험하였다. \( 67 \mathrm{mM} \) sodium phosphate buffer (\( \mathrm{pH} 6.8\)) \( 80 \mu \mathrm{l}\)에 \( 10 \mathrm{mM}\) L-DOPA를 녹인 기질 액 \( 40 \mu \mathrm{l} \) 및 시료용액 \( 40 \mu \mathrm{l} \)의 혼합액에 \( 200 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) Tyrosinase from mushroom \( 40 \mu \mathrm{l} \)을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 \( 492 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. Tyrosinase 저해 활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p><p>저해율 \( (\%)=(1- \) 시료첨가군 흡광도/무첨가군 흡광도 ) \(\times 100 \)</p><h2>세포 주 및 세포 배양</h2><p>본 실험에 세포배양을 위해 사용된 세포 주는 melanoma cell인 B16-F10을 ATCC (USA)에서 분양 받았으며, 세포 배양을 위해 \( 10 \% \) FBS와 \(1\%\) penicillin/streptomycin (\(100 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) \)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였다. 세포는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 \(80-90\%\) 정도 자란 후 계대 배양하였다.</p><h2>세포 생존율(MTT assay)</h2><p>세포 생존율 측정은 Carmichael의 방법에 따라 측정 하였다. B16-F10 세포를 \( 1 \times 10^{4} \)cells/well을 96 well plate에 분주하고 24시간 배양하였으며, 이후 시료를 농도 별로 (5, 10, 50, 100, 500, 1,000 \(\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 조제하여 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에서 24시간 배양하였다. MTT 용액을 \( 2.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 제조하여 \( 40 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하여 3-4시간 배양한 후 상층액을 제거하고 DMSO \( 100 \mu \mathrm{l}\)를 각 well에 분주하여 실온에서 10분 반응시킨 뒤 ELISA reader를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율 측정은 시료를 첨가하지 않은 무첨가군을 대조군으로 하여 첨가군의 흡광도를 비교하여 백분율(\(\%\))로 표시하였다.</p><h2>Western Blot을 통한 단백질 발현</h2><p>미백 효과를 확인하기 위해 B16-F10 세포를 이용하여 멜라닌 합성에 관여된 인자인 MITF, tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2 을 통해 확인하였다. B16-F10 세포를 \( 1 \times 10^{6} \)cells/well을 seeding한 후 24시간 동안 배양하였다. 세포에 \( \alpha \)-MSH를 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도로 처리하여 2시간 후 농도별로 (10, 50, 100 \(\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ) 추출물을 처리하여 24시간 배양한 후 배지를 제거하여 phosphate buffered saline (PBS)로 2회 세척하였다. 그 후, RIPA buffer \( 10 \mathrm{ml} \)에 Protease \(\&\) Phosphatase Single-Use inhibitor Cocktail 100X \(100 \mu \mathrm{l} \)를 가하여 제조한 lysis buffer로 세포를 용해하고 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C}\), \(13,200 \mathrm{rpm} \)에서 20분간 원심 분리하였다. 원심 분리 후 상등액을 BCA protein assay kit를 이용하여 단백질을 정량 하였으며, \( 20 \mu \mathrm{l}\)의 단백질을 \( 10 \% \) acrylamide gel에서 전기영동을 통해 분리하였다. 전기영동이 끝난 gel을 transfer 기기를 이용하여 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane에 단백질을 옮긴 후 실온에서 1시간 동안 \( 5 \% \) skim milk를 tris-buffered saline \(\&\) tween 20 (TBST)에 녹여 blocking하였다. Primary antibody를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 overnight한 다음 TBST로 10분 3회 세척하였다. 이 후 secondary antibody를 첨가하여 실온에서 2시간 반응시킨 다음 TBST로 10분 3회 세척한 다음 ChemiDocTM MP Imaging System을 통해 밴드를 확인하였다.</p>