해당하는 primer를 사용해 reverse transcriptase-PCR방법으로 발현 차이를 보이는 유전자들이 A. niger 감염으로인해 발현되는지를 최종 확인했으며, ACP-based PCR 방법을 활용한 GenFishing \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) DEG 방법으로 A.niger에 의해서 억제되거나 유도되는 10개의 밴드를 확인했다.
<h2>Reverse transcriptase RT-PCR</h2> <p>발현 차이를 보이는 유전자들은 해당하는 primer를 사용하여 reverse transcriptase-PCR(RT-PCR) 방법을 통해서 A. niger 감염에 의해서 유도되어 발현되는지를 최종 확인하였다. \( 1 ^ {\text { st } } \) strand \( c \) DNA를 \( \beta \)-actin 유전자(Forward primer: 5'-TGACGGGGTCACCCACACTGTGC, Reverse primer: 5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGGATGGAGGG)를 이용 하여 표준화시킨 후 주형으로 사용하였다. 약 \( 50 \mathrm { ng } \) 의 희석시킨 \( 1 ^ {\text { st } } \) cDNA, 각 \( 1 \mathrm { ul } (10 \mathrm { uM } ) \) 의 5', 3' primer \( ( \) 각 \( 10 \mathrm { uM } ) \) 그리고 10 \( \mathrm { ul } \)의 2X master mix (Seegene, Korea)가 포함된 20 \( \mathrm { ul } \)의 반응액을 상기에서와 같은 PCR 조건으로 증폭하였다. 증폭된 PCR 반응액은 \( 2 \% \) 의 agarose gel 전기영동법으로 분리, 확인하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <p>ACP-based PCR 방법을 이용한 GenFishing \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) DEG(Differentially Expressed Gene) 방법을 통해서 A. niger에 의 해서 유도되거나 억제되는 10개의 밴드를 확인 할 수 있었다. Agarose gel에서 확인된 9개의 밴드(DEG 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 및 10)는 A. niger의 감염에 의해서 유도 발현되는 유전자이며 DEG 4 는 A. niger의 감염에 의해서 발현이 억제되는 유전자로 확인되었다. 이들 밴드들을 agarose로부터 분리하여 클로닝을 하고 염기서열을 분석한 다음, NCBI의 BLASTX 상동성 검색을 수행한 결과, DEG 1, 2, 3, 4, 8 등 5개의 유전자 정보를 확인하였다. 하지만 DEG 5, 6, 7, 9 와 10은 GenBank 상의 어떠한 유전자들과 유의한 상동성을 보여 주지 않는 현재까지 보고되지 않은 유전자들이었다. BLASTX 상동성 분석으로 A. niger의 감염에 의해서 발현이 증가되는 유전자는 lysozyme (DEG 1), enbocin (DEG 2), lysosomal thiol reductase IP 30 (DEG 3) 및 high basic serine protease (DEG 8) 등이 동정되었고 발현이 감소하는 DEG 4 는 internal transcribed spacer 1 과 유의한 상동성(4e-87)을 보이는 것으로 나타났다.</p>