알코올 발효능력이 우수한 Saccharomyces cerevisiae KOY-1과 전분 분해능력이 우수한 Saccharomyces diastaticus KCTC 1804를 분석하였다. 이 중 Saccharomyces cerevisiae KOY-1만 단수체 상태로 유도하였으며, 이 과정에서 총 13개의 colony를 선발하였다. Saccharomyces cerevisiae KOY-1과 비교했을 때, 단수체 KH-12의 DNA 함량이 약 절반인 것으로 나타났다. 이러한 결과로 인해 분리된 단수체 KH-12는 영양요구성 변이주 제조의 마커로 사용되었다.
<p>DNA content \( ( \mathrm { fg } / \mathrm { cell } )= \frac {\mathrm { A } _ { 600 } } {\mathrm { ~S } } \times \mathrm { D } \times \frac { 10 ^ { 9 } } {\text { Cell No. } } \)</p> <p>S: slope of standard curve \[ \] D: dilution rate</p> <h2>융합주의 유전적 안정성</h2> <p>융합주의 유전적 안정성을 조사하기 위해 YPD 액체배지에 접종하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \), shaking incubator에서 \( 150 \mathrm { rpm } \)으로 진탕 배양하였다. 2일동안 배양한 것을 1세대로 하여 이 과정을 10 세대 동안 반복하였다. 10 세대의 배양액을 채취하여 적당한 배율로 희석한 후, YPD 고체배지와 SD 고체배지에 도말한 뒤, 각각의 고체배지에 나타난 colony수의 비율로 융합주의 유전적 안정성을 조사하였다.</p> <p>유전적 안정성 \( ( \%)= \frac {\mathrm { SD } \text { 고체배지에 나타난 colony 수 } } {\mathrm { YPD } \text { 고체배지에 나타난 colony 수 } } \times 100 \)</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>단수체 분리</h2> <p>Sporulation 배지에서 배양한 후 단수체를 유도한 결과, malachite green으로 염색하였을 때, 포자는 대조염색과 비교하여 녹색으로 관찰되었다. 알코올 발효능이 우수한 Saccharomyces cerevisiae KOY-1의 경우, 이배체 상태로 관찰되었고 전분 분해능이 우수한 Saccharomyces diastaticus KCTC 1804의 경우, 단수체 상태인 것으로 관찰되었다. 따라서 효모의 단수체 유도는 Saccharomyces cerevisiae KOY-1에서만 실시하였다. 단수체 유도 후, 총 13개의 colony를 선발하여 효모의 total DNA 함량을 비교한 결과는 Table 1에 나타난 것처럼 모균주인 Saccharomyces cerevisiae KOY-1과 비교하였을 때 KH-12의 DNA 함량이 모균주의 절반 정도임을 확인할 수 있었다. 따라서 marker로 사용하기 위한 영양요구성 변이주 제조에는 분리된 단수체 KH-12를 사용하였다.</p> <h2>Genetic marker의 도입</h2> <p>원형질체 융합에 의해 생성된 융합체의 선별을 위해서는 parental strain에 genetic marker의 도입이 선행되어야 한다. 전분분해능이 우수한 Saccharomyces diastaticus KCTC 1804 균주는 Trp의 영양요구성 marker가 있음을 확인하였고 알코올 발효능이 우수한 Saccharomyces cerevisiae KOY-1 균주에서 단수체로 분리된 KH-12 균주는 영양요구성 marker를 보유하지 않아 KH-12 균주에 ethylemethane sulfonate (EMS)를 사용하여 genetic marker를 보유한 영양요구성 변이주를 제조하였다. EMS 처리는 \( 90 \% \) 이상의 사멸율을 나타내는 구간인 120분간 처리하였다. 그 결과 7주의 영양요구성 변이주를 획득하였고, 이들은 \( \mathrm { Trp } ^ { - } \)와 \( \mathrm { Met } ^ { - } \)로 확인되었 다. Saccharomyces diastaticus KCTC 1804 균주는 \( \operatorname { Trp } \) 영양요구성 marker가 있기 때문에 Saccharomyces cerevisiae KH-12 균주는 Met 영양요구성 marker가 있는 변이주를 사용하였다.</p>