clitocybin A 화합물은 oleanolic acid에 비해 매우 안전한 화합물이며, immuno ELISA assay법을 통한 주름개선 효능을 확인하여 안전하면서도 효과가 우수한 항노화 소재임을 확인하였다.
<h2>주름개선 소재 clitocybin A의 추줄정제</h2> <p>C.aurantiaca KCTC \( 11143 \mathrm{BP} \) 균주의 유가식 배양을 통하여 확보한 균사체 추출물 중의 cliticybin A 함유량을 배양일수에 따라 경시적으로 조사한 결과를 Fig. 4에 나타냈다. 즉 배양 시작 후 2일, 4일, 6일, 8일, 10일, 12일 및 14일의 배양 균사체를 채취한 후 먼저 동량의 acetone으로 1차 추출하였다. Acetone 추출물은 다시 동량의 EtOAc로 분획 추출한 후 EtOAc 층을 chloroform : methanol 비율을 50:1에서 1:1로 순차적으로 silica gel column chromatography를 실시하여 분획한 후 fraction 3과 fraction 4를 재차 용매 \( 100 \% \mathrm{MeOH} \)을 이용하여 Sephadex LH- 20 column chromatography를 실시하였다. 최종적으로 HPLC (20\( \% \) \( \mathrm{MeCN}, 210 \mathrm{~nm} \))을 실시하여 배양액 중의 clitocybin A 함유량을 확인하였다. 이때, 순수한 clitocybin A 화합물을 standard로 비교하여 retention time 8.1분대의 피크를 확인함으로 배양액 중의 clitocybin A 함유량을 확인하였다. 그 결과, Fig. 4와 같이 배양 후 2일경에는 피크가 보이지 않다가 배양 후 4일경부터 clitocybin A의 피크가 보이기 시작하여 배양 후 8일, 10일 이후에는 안정적으로 clitocybin A가 생성됨을 확인할 수 있었다.</p> <h2>Clitocybin A의 세포독성</h2> <p>Clitocybin A 화합물의 in vitro 세포독성은 세포의 미토콘드리아 활성에 의존하여 세포의 생존을 결정할 수 있는 WST-1 반응액에 의해 측정되었다. 즉 세포 생존율은 HDF-N 세포를 이용하여 평가하였으며 시료를 제외한 배양 배지만 처리한 값 (control)에 대한 백분율로 나타냈다. 즉 clitocybin A를 최저 농도 \( 0.001 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서 최고 농도 \( 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)까지 각 농도 별로 처리한 후 세포 생존율을 측정함으로서 본 화합물의 세포독성을 조사하였다. 대조 화합물로는 MMP-1 효소 활성 조사 시 일반적으로 사용하는 oleanolic acid를 사용하였다. 그 결과, 대조구인 oleanolic acid 처리구에서, 배양배지만 처리한 구의 세포 생존율을 \( 100 \% \)로 보았을 때, oleanolic acid \( 0.5,1.0,5.0, \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 처리시에는 \( 102.4 \pm 1.4 \), \( 102.9 \pm 4.0,103.7 \pm 5.0 \% \)로 거의 변화가 없다가 \( 10.0,15.0 \), \( 20.0 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 처리시에는 각각 \( 110.1 \pm 1.4,107.8 \pm 10.9 \), \( 125.1 \pm 7.6 \% \)로 미세하나마 세포증식효과를 나타내는 경향이었다. 그러나 \( 25.0 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 처리시에는 \( 37.5 \pm 1.2 \% \)의 세포 생존율을 보이며 급격한 세포독성을 나타냈다.</p> <p>한편, clitocybin A 처리구에서는 배양배지만 처리한 구의 세포 생존율을 \( 100 \% \)로 보았을 때, clitocybin A \( 0.001,0.01 \), \( 0.1,1.0 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 처리시의 생존율은 각각 \( 93.8 \pm 3.0,99.3 \pm \) \( 1.5,95.4 \pm 3.4,100.3 \pm 3.6 \% \)로 별 변화가 없다가 \( 10.0 \), \( 100.0 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 처리시에는 \( 114.7 \pm 5.0,134.6 \pm 10.4 \% \) 로 세포 생존율이 약간 증가하였다. 그러나 \( 200.0 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 처리시에는 \( 73.5 \pm 5.5 \% \)로 세포가 감소하기 시작하는 것으로 나타났다.</p> <p>이상의 결과로부터 clitocybin A 화합물은 대조구로 활용되는 oleanolic acid에 비하여 매우 안전하며 \( 100.0 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 고농도를 처리하여도 오히려 \( 135 \% \) 정도의 세포증식 효과를 나타내는 안전한 화합물임을 확인하였다.</p> <h2>Clitocybin A 화합물의 MMP-1 발현 억제활성</h2> <p>Clitocybin A 화합물의 주름개선 효능을 확인하기 위하여 주름생성에 직접적으로 관여하는 콜라겐 분해효소인 MMP-1의 발현 저해효능을 immuno ELISA assay법을 이용하여 조사하였으며 이때 oleanolic acid를 표준 대조구로 비교 검토하였다. 먼저 대조구인 oleanolic acid 처리구에서, oleanolic acid \( 0.5,1.0,5,0 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 처리시에는 각각 \( 7.5 \), \( 5.3,4.2 \% \)로 미미한 MMP-1 저해활성을 보이거나 혹은 거의 변화가 없었으나 \( 10.0 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 처리시에는 \( 16.7 \% \)의 MMP-1의 저해활성을 나타났다. 한편, clitocybin A 처리구에서는 \( 10.0 \), \( 100.0 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 처리구에서 \( 9.9,33.1 \% \)로 높은 MMP-1 발현 저해활성을 나타냈다. 이상의 결과로부터 대조구인 oleanolic acid는 비교적 낮은 농도인 \( 10.0 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 처리에서 약 \( 16.7 \% \)의 MMP-1 발현 저해활성을 보였으며, clitocybin A는 10 -\( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도 처리시 높은 MMP-1 저해활성을 보여 대조구인 oleanolic acid 보다 우수한 소재임을 확인하였다.</p> <p>인체의 주름생성에는 MMP-1효소가 매우 중요한 인자가 되며 따라서 MMP-1의 발현을 저해하는 화합물은 주름개선 화장품 소재로 효과가 있다는 것은 이미 잘 알려져 있다. 특히 Kim 등은 주름개선 소재로 Sanguisorba officinalis 뿌리 추출물로부터 ziyuglycoside I을 분리한 후 MMP-1 및 type I collagen 합성능을 조사하여 우수한 효과가 있다는 것을 규명하여 화장품 소재로 활용하고 있다. 본 연구결과, 주름개선 소재로 활용되고 있는 대조군인 oleanolic \( \mathrm{acid} \) 는 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 처리까지는 \( 16.6 \% \) 정도의 MMP-1 발현 저해활성을 나타내나 그 이상의 농도를 처리하면 오히려 급격한 역효과를 내고 있지만, clitocybin {A는 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도를 처리하여도 \( 33.1 \% \)의 MMP-1 발현 저해활성을 보여 안전하면서도 주름개선 효과가 우수한 항노화 소재임을 확인하였다. 향후 clitocybin A의 주름개선 효과를 임상학적으로 검증할 예정이다.</p>