식물세포벽은 5탄당의 중합체로 여러 측쇄를 가지고 있는 복잡한 구조를 지닌다. 이중 Xylanase는 여러 생물공학산업에 유용하게 활용될 수 있고 그 가치를 인정 받고 있다. 토양에서의 Bacillus균주의 chromosomal DNA로부터 xylanase 유전자를 cloning한 후,유전자 발현에 관련된 구조를 분석한다. Xylanase 유전자를 cloning할 때, chromosomal DNA를 Pstl으로 부분 절단한 후 다음 E.coli DH5\(\alpha\)에 형질전환시킨다. 분석결과 Xylanase를 coding하고 있는 open reading frame은 많은 아미노산으로 구성되고 하나의 polypeptide에 유전정보를 지니고 있었다.
<p>식물세포벽의 주요 hemicelluose인 xylan은 5탄당인 D-xylose가 \( \beta-1,4 \) 결합을 하는 중합체로서 일반적으로 acetyl기, arabinosyl기, glucuronosyl기 등의 측쇄를 가지고 있는 복잡한 구조를 지니고 있다. Xylan을 가수분해하여 xylose 또는 xylooligosaccharide로 전환시키는 효소인 xylanase는 동식물과 미생물 등 자연계에 널리 분포되어 있으며 exo-(1 \( \rightarrow 3)- \)\( \beta \)-D-xylanase (EC.3.2.1.72), endo-(1 \( \rightarrow 3)-\beta \)-D-xylanase (EC.3.2.1.32)와 \( \beta\)-1,4-xylanase [endo-(1,4)-(3-D-xylanase (EC.3.2.1.8), exo-xylanase (EC.3.2.1.37)]가 있는데, 이들 중에서 \( \beta \)-1,4 xylanase가 xylan 가수분해의 주요 효소로 작용하고 있다. Xylanase는 자연계에 풍부한 목질계 바이오매스로부터 ethanol 등과 같은 바이오에너지의 생산, 목질계로부터 양질의 pulp 생산, 가축의 사료제조, 식품첨가물 등 생물공학산업에 유용하게 사용될 수 있어 그 산업적 중요성이 강조되고 있다.</p><p>Xylanase 유전자는 현재까지 50여종이 cloning되었으며 이 중 30 여종의 xylanase 유전자의 염기배열 순서가 결정되어 xylanase의 발현기작, 분비기작 및 조절기작 등에 관한 기초적인 정보를 제공하고 있다. 최근 유전공학 및 단백질공학등의 기법을 이용하여 xylanase의 구조와 기능과의 관계를 연구함으로써 유전자의 발현, 효소의 가수분해 효율, 기질 특이성, 그리고 효소의 안정성 등을 개선시키는 연구가 진행되고 있으며, DNA shuffling 등의 기법을 이용하여 새로운 활성을 지니는 xylanase를 제조하는 연구도 이루어지고 있다. 특히, 중성에서는 불용성인 xylan이 알칼리에서는 잘 용해되며, pulp 제조공정에서는 강알칼리 조건에서 표백공정이 이루어지기 때문에 호알칼리성 xylanase에 관한 연구의 필요성이 대두되고 있다.</p><p>본 연구에서는 토양으로부터 분리한 알칼리 내성 Bacillus균주의 chromosomal DNA로부터 xylanase 유전자를 cloning하여 그 염기배열순서를 결정한 후 이로부터 전사, 번역 등 유전자 발현에 관련된 구조를 분석하였다.</p><p>본 연구에 사용된 xylanase 유전자의 공여균주로는 \( \mathrm{pH}10\)에서 최적 효소활성을 지니는 호알칼리성 xylanase를 생산하는 Bacillus alcalophilus AX2000을 사용하였다. Xylanase 효소의 활성 측정은 1\(\% \) 의 xylan 용액(oat-spelts xylan in \(10 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{HCl}, \mathrm{pH} 8.0 \))을 기질로 사용하여 Somogyi-Nelson의 환원당 정량법에 의하여 수행하였으며 효소 1\(\mathrm{U} \)는 주어진 조건에서 분당 \( 1\mu \mathrm{mol} \) 의 D-xylose를 생성할 수 있는 효소의 양으로 정하였다.</p><p>Xylanase 유전자를 cloning하기 위하여 Wizard Genomic DNA Purification System (Promega, USA)을 이용하여 B.alcalophilus AX2000으로부터 분리된 chromosomal DNA를 Pstl으로 부분 절단한 후 \( \mathrm{pUC} \)19에 ligation시킨 다음 E. coli DH5\(\alpha\)에 형질전환시켰다. LB/Ap/X-Gal/IPTG 배지에서 형성된 형질전환체 중에서 white colony를 나타내는 약 2,000주의 재조합체를 \( 0.5 \% \)의 oat-spelts xylan이 함유된 LB 한천배지에 배양시킨 결과 colony 주위에 투명환을 생성하는 균주를 얻었다. 이 균주로부터 plasmid DNA를 분리한 후 제한효소 분석을 실시한 결과 \( \mathrm{pUC}\)19의 PstI 부위에 7.0\(\) \( \mathrm{kb} \)의 DNA 단편이 삽입되었음을 확인하였으며 이 재조합 균주의 xylanase 활성을 측정한 결과 \( 0.24\mathrm{U} / \mathrm{ml} \) 로 나타나 vector 내에 xylanase 유전자가 cloning되었음을 확인하였고, 이 재조합 plasmid DNA를 pXTY99로 명명하였다. pXTY99의 제한효소 분석과 효소활성 측정에 의해 xylanase 유전자가 존재하는 것으로 확인된 \(2.27\mathrm{~kb} \)의 Cla I - Pst I DNA 단편의 염기서열결정을 기초과학지원연구소에 의뢰하여 ABI 자동염기분석기로 수행하였다. 그 결과 xylanase 유전자를 함유한 삽입 DNA의 크기는 \( 2.279\mathrm{bp} \)로 확인되었으며 Vector NTI DNA 분석프로그램(InforMax, USA)을 사용하여 그 염기서열을 분석한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 이 DNA 단편에는 ATG 개시코돈으로 시작되는\( 1,020\mathrm{bp} \)의 open reading frame이 한 개가 존재하는 것으로 확인되었고, 이를 xylanase 유전자인 것으로 확인하여 xynT라 명명하였다(GenBank acces-sion number: AY423561). Xylanase를 coding하고 있는 이 open reading frame은 340개의 아미노산으로 구성되어 있으며 추산 분자량이 40\( \mathrm{kDa} \)인 하나의 polypeptide 분자의 유전정보를 지니고 있었다. Bacillus 중에는 pl가 낮으면서 분자량이 높은 종류와 pI가 높으면서 분자량이 낮은 종류가 있는데 본 xylanase의 pI는 5.6으로 계산되어 pI가 낮으면서 분자량이 높은 종류에 속하는 효소로 확인되었다.</p>