본 연구에서는 Culture plate를 \( \mathrm{CO}_{2} \) Water Jacketed Incubator를 사용하여 \( 2\% \mathrm{O}_{2} / 5\% \mathrm{CO}_{2} \) 환경에서 3시간 처리하여 저산소증을 유도하였다. 이후 CCD 카메라가 장착된 형광현미경으로 영상을 관찰하고, 디지털 영상을 획득하였다. 또한, 배양 10일 후에 약재를 처리하고 3일간 배양한 후에도 저산소증을 유도하였다.
<h3>저산소증 유발</h3> <p>Culture plate를 \( \mathrm{CO}_{2} \) Water Jacketed Incubator (Forma Scientific Inc.)를 이용하여 \( 2 \% \mathrm{O}_{2} / 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 환경에서 3시간 처리하여 저산소증을 유도하였다. 저산소 처리가 끝나면 배양 세포를 정상산소 환경 배양조에 옮기고 계속 배양하였다.</p> <h3>면역세포화학적 염색(immunocytochemistry)</h3> <p>배양용기(24-well plate)를 얼음 위에 올려놓고 배양액을 \( 500 \mu 1 \) 의 D-인산완충용액(D-PBS; \( 0.1 \mathrm{~g} / 1 \mathrm{CaCl}_{2}, 0.2 \mathrm{~g} / 1 \mathrm{KCl} \),\( 0.2 \mathrm{~g} / 1 \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 0.1 \mathrm{~g} / 1 \mathrm{MgCl}_{2}-6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 8.0 \mathrm{~g} / 1 \mathrm{NaCl}, 2.16 \mathrm{~g} / 1 \) \( \left.\mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4}-7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\right) \) 로 교환해 주었다. 5 분 후 D-PBS를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) meth-anol \( (500 \mu \mathrm{l}) \) 로 교환하고 5 분 후 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) methanol \( (500 \mu \mathrm{l}) \) 로 다시 교환한 다음 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보관하였다. 20 분 후 methanol을 D-PBS \( (500 \mu \mathrm{l}) \) 로 교환하고 15 분 후 전차단용액(preblock sol-ution; 0.05\% Triton \( \mathrm{X}-100,5 \% \) 정상염소혈청)을 넣어 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 처리하였다. 1차 항체(anti-PSD95 (postsynaptic density 95) mouse monoclonal, 1:500, Upstate Biotechnology Inc.,Lake Placid, NY; anti-Synaptophysin mouse monoclonal,1:200, Sigma; anti-SynGAPa rabbit polyclonal, 1:500, Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY)를 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 반응시킨 후 실온에서 전차단용액으로 20 분씩 3회 세척하였다. 형광물질이 표지된 2차 항체(anti-mouse \( \mathrm{IgG} \), Alexa 488-labeled, 1:2,000 혹은 anti-rabbit \( \mathrm{IgG} \), Alexa 568-labeled, \( 1: 2000) \) 를 넣고 1 시간 더 반응시킨 후, D-PBS로 15 분씩 3회 세척하였다. CCD 카메라(Photometrics Inc., Germany)가 장착된 형광현미경(Leica Re search Microscope DM IRE,Germany)으로 영상을 관찰하고, QFluoro version V1.0b soft-ware (Leica Microsystems AG, Germany)를 이용하여 디지털 영상을 획득하였다.</p> <h3>LDH assay</h3> <p>배양 10 일(10 day in vitra DIV 10)에 약재를 처리하고 3일간 배양한 후 저산소증을 유도하였다. 저산소증을 유도하기 직전, 즉 정상 산소 환경 및 저산소증 유발 후 \( 1,3,5,7 \) 일에 각각 배양액 \( 20 \mu 1 \) 를 96-well plate에 옮기고 pyruvate sub-strate \( (\mathrm{NADH} 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 를 \( 20 \mu 1 \) 씩 가한 다음, 상온에서 2분간 흔든 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 더 흔들었다. 발색시약(color re-agent, Sigma 505-2)을 \( 20 \mu \) 씩 가하고 상온에서 20 분간 흔든후, \( 0.4 \mathrm{~N} \mathrm{NaOH} \) 를 \( 100 \mu 1 \) 씩 가하고 상온에서 15 분간 더 흔든 다음 ELISA reader로 흡광도 \( \left(\mathrm{ABS}_{450}\right) \) 를 측정하였다.</p>