시험관에 WF, IF, PF, GF를 처리한 후 배양하였다. iNOS 및 COX-2 발현을 확인하기 위해 24시간, NF- \( \kappa \mathrm{B} \) 및 MAPK 인자의 발현을 확인하기 위해 30분 동안 배양되었다. 그 후 상등액과 Griess 시약을 혼합하여 반응을 측정하였다.
<h2>Nitric oxide 분석</h2> <p>RAW 264.7 세포를 6-well plate를 이용하여 24 시간 동안 인큐베이터에서 배양했다. 배양 후 각 well에 WF, IF, PF, GF를 각 well에 처리한 후, 다시 인큐베이터에서 배양했다. 2 시간 후, 세포를 24시간 동안 LPS \( (1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \) 로 처리하였다. \( 100 \mu \mathrm { L } \) 의 상등액을 96-well plate에 넣고 동일한 부피의 Griess 시약(Sigma-Aldrich)과 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 5 분 동안 반응했다. 흡광도는 microplate reader을 사용하여 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정되었다.</p> <h2>Immunoblotting</h2> <p>RAW 264.7 세포를 6-well plate를 이용해서 24 시간 동안 인큐베이터에서 배양했다. 세포에 WF, IF, PF, GF \( (200 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \) 를 2 시간 동안 처리한 후, LPS \( (1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \) 를 처리했다. iNOS 및 COX-2 발현을 확인하기 위해 24 시간 동안 배양하였으며, NF- \( \kappa \mathrm { KB } \) 및 MAPK 인자의 발현을 확인하기 위해 30 분 동안 배양되었다. 배양 후, 세포를 phosphate-buffered saline (PBS)로 세척하고 protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich)이 포함된 RIPA buffer에서 용해 시킨 뒤, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 15 분간 \( 12,000 \times g \) 에서 원심분리 했다. 시료의 단백질 농도는 Bradford protein assay로 정량 했다. 단백질은 \( 2 \times \) Laemmli buffer와 혼합해서 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분 동안 끓였다. 단백질을 \( 10 \% \) SDS-PAGE에서 분리하고 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane으로 옮겼다. \(1 \% \) Tween 20 을 포함하는 tris-buffered saline (TBS-T)에서 \(5 \% \) BSA 으로 비특이적 결합을 차단한 다음 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 각 target 단백질에 결합하는 항체 및 GAPDH 를 \( 3 \% \) BSA에 희석하여 \( 4 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 밤새 반응 시켰다. TBS-T로 3 회 세척한 후, PVDF membrane을 상온에서 horse radish peroxidase-conjugated immunoglobulin G(IgG)와 함께 반응시켰다. 각 target 단백질은 ECL Western blotting substrate 및 ChemiDoc (Bio-Rad)을 사용하여 시각화 되었다.</p>