컬럼 크로마토그래피 용 실리카겔 수지는 키젤60, ODS는 Lichroprep RP- 18을 사용하였고, 박층 크로마토그래피는 키젤겔60F254와 RP- 18F254 s(Merck)를 사용했으며 정제에 사용된 기기는 YMC LC-Forte/R, 핵자기 공명 스펙트럼은 400MHzFT-NMR분광계를 이용, 적외선 스텍트럼은 599B로 측정했다. 건조된 조팝나무 잎 1kg을 수용액에 24시간담사거 실온 추출하였고, 감압농축하여 MeOh 추출물을 얻은 후 다시 H2O로 2회 분배 추출한 후 감압 농축하여 EtOAc와 n-BuOH 및 H2O 분획을 얻게 되었다. 그후 분취액의 유사한 부분은 모으고 농축하여 5개의 분획물을 얻었고, 210나노미터 파장에서 분리하여 총 12 개의 분획물을 얻어 화합물2를 분리하였다.
<h2>시약 및 기기</h2> <p>Column chromatography (c. c.) 용 silica gel \( \left ( \mathrm { SiO } _ { 2 } \right ) \) resin은 Kiesel gel \(60 \) (Merck, Darmstadt, Germany)을 octadecyl \( \mathrm { SiO } _ { 2 } \) (ODS)은 Lichroprep RP- \(18 \) ( \(40-60 \mu \mathrm { M } \), Merck)을 사용하였다. Thin layer chromatography (TLC)는 Kiesel gel \(60 \) F \(254 \)와 RP- \(18 \) F \(254 \)s (Merck)을 사용하였다. 물질 정제에 사용된 기기는 YMC LC-Forte/R (YMC Co., LTD. Kyoto, Japan)를 사용하였다. Nuclear magnetic resonance (NMR) 스펙트럼은 \(400 \mathrm { MHz } \) FT-NMR spectrometer (Varian Inova AS- \(400 \), Palo Alto, CA, USA)를 사용하였고, infrared spectrum은 Perkin model \(599 \)B (Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA)로 측정하였다. 분석을 위한 증류수, 메탄올 및 아세토니트릴은 HPLC급 (Fisher Scientific Korea Ltd., Seoul, Korea)이었으며, 분석 용매에 첨가한 formic acid는 Fluka (Sigma-aldrich Co. St. Louis, MO, USA) 를 사용하였다. 그 외의 시약 및 용매는 모두 일급 이상의 시약을 구입하여 사용하였다. 신경세포 배양을 위해 사용된 Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), fetal bovine serum (FBS)은 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, penicillin-streptomycin, trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid, \(3-(4,5 \)-Dimethylthiazol- \(2 \)-yl)- \(2,5 \)-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), hydrogen peroxide solution \( \left ( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \right ) \) 및 \( \mathrm { N } \)-acetyl-l-cysteine (NAC) 는 Sigma-Aldrich Co.에서 구입하였다.</p> <h2>추출 및 분리</h2> <p>건조된 상태의 조팝나무 잎, \( 1 \mathrm { kg } \) 를 \( 80 \% \mathrm { MeOH } \) 수용액에 \(24 \) 시간 담가서 실온에서 추출하였다. 얻어진 여액을 합쳐 감압농축하여 MeOH 추출물 \( (105 \mathrm { g } ) \) 을 얻었다. 얻어진 MeOH 추출물을 EtOAc \((2 \mathrm { L } ) / \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } (2 \mathrm { L } ) \)로 \(2 \) 회 분배 추출하였고, 다시 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 층을 n-BuOH \((1.8 \mathrm { L } ) \) 로 \(2 \) 회 분배 추출하였다. 각층을 감압 농축하여 EtOAc 분획(SPLE, \( 12 \mathrm { g } ) \) 과 n-BuOH 분획(SPLB, \(28 \mathrm { g } \)) 및 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 분획을 얻었다. 위에서 얻어진 n-BuOH 분획 \( 25 \mathrm { g } \) 을 Diaion HP- \(20 \) c.c. \( \left ( \varphi 10 \times 40 \mathrm { cm } , \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \rightarrow MeOH \right . \) 를 실시하여 각 \( 500 \mathrm { mL } \) 식 분취하였다. 각 분취액을 \( \mathrm { SiO } _ { 2 } \) TLC 로 확인하여 유사한 부분을 함께 모으고, 농축하여 \(5 \) 개의 분획물(SPLB- \(1 \)-SPLB- \(5 \))을 얻었다. SPLB- \(3 \) 분획 \( (3 \mathrm { g } ) \) 에 대하여 \( \mathrm { SiO } _ { 2 } \) c.c. ( \( \Phi 5.0 \times 15.0 \mathrm { cm } , \mathrm { CHCl } _ { 3 } \)-MeOH- \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } = 12: 3: 1 \rightarrow 10: 3: 1 \rightarrow 7: 3: 1 \rightarrow 65: 35: 10 \), 총 \( 5 \mathrm { L } \) 사용)를 실시하여 총 \(10 \) 개의 분획물(SPLB- \(3 \)- \(1 \) SPLB- \(3 \)- \(10 \))을 얻었다. 그중 SPLB- \(3-5 \) 분획 \( (320 \mathrm { mg } ) \) 에 대하여 중압분취 장비(Medium pressure liquid chromatography, YMC LC-Forte/R)를 이용하여 분리를 진행하였다. 이때 사용된 컬럼은 YMC-pack pro C \(18 (20 \mathrm { mm } \times 250 \mathrm { mm } , 10 \mu \mathrm { m } ) \) 를 사용하였으며 이동상의 기울기 조건은 \( \mathrm { A } \left ( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \right ): \mathrm { B } \) (Acetonitrile) \(=90:10 \)의 조건에서 \( \mathrm { A } \left ( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \right ): \mathrm { B } \) (Acetonitrile) \( =10: 90 \) 의 조건으로 \(30 \) 분간 \( 2.5 \mathrm { mL } / \mathrm { min } \) 의 유속으로 \( 210 \mathrm { nm } \) 파장에서 분리를 하였다. 총 \(12 \) 개의 분획물 (SPLB- \(3-5-1 \)-SPLB- \(3-5-12 \))을 얻었으며 화합물 \(1 \) (SPLB- \(3-5-5 \), \( 17.0 \mathrm { mg } ) \) 를 분리하였다. SPLB- \(5 \) 분획( \(1.2 \mathrm { g } ) \)에 대하여 ODS c.c. ( \( \Phi 5.0 \times 10.0 \mathrm { cm } \), MeOH- \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } =1: 2 \), 총 \( 2.8 \mathrm { L } \) 사용)를 실시하여 총 \(8 \) 개의 분획물(SPLB- \(5-1 \sim \) SPLB- \(5-8 \))을 얻었다. SPLB- \(5-1-1 \) 분획 \( (120 \mathrm { mg } ) \) 에 대하여 중압분취장비를 이용하여 분리를 진행하였다. 이때 사용된 컬럼은 Phenomenex Luna C- \(18 \) \( (10 \mathrm { mm } \times 250 \mathrm { mm } , 10 \mu \mathrm { m } ) \) 를 사용하였으며 이동상의 기울기 조건은 A \( \left ( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \right ): \)B (Acetonitrile) \(=87:13 \)의 조건으로 \(30 \) 분간 \( 2.5 \mathrm { mL } / \mathrm { min } \) 의 유속으로 \( 210 \mathrm { nm } \) 파장에서 분리를 하였다. 총 \(12 \) 개의 분획물(SPLB- \(5-1-1-1 \)-SPLB- \(5-1-1-5 \))을 얻었으며 화합물 \(2 \) (SPLB- \(5-1-1-5 \), \( 25 \mathrm { mg } \) )를 분리하였다.</p>