다양한 라이브러리 생성 기술이 발전하고 있고 무작위적 변이법과 조합적 기술이 있다. 최근 실험적 라이브러리 조성 기술과 이성적 설계기술을 조합한 방식이 새롭게 나타났다. 라이브러리의 탐색 기술은 고체상의 탐색 방법보다 많은 시간과 비용, 비싼 분석장비가 필요하지만 적은 샘플로 미량의 활성을 민감하게 분석할 수 있는 웰플레이트 방법이 사용된다.
<h3>라이브러리 조성, 관리</h3> <p>분자진화의 방향성은 기질 특이성과 기질에 대한 활성 및 조효소와 결합 능력, 열이나 유기용매에서의 안정성, 광학 이성질체에 대한 선택성 등 여러 가지 방향으로 선택될 수 있다. 라이브러리 생성 기술은 다양하게 발전하고 있으며 변이유발 PCR, 화학적 변이유발, 돌연변이 유발 숙주 세포의 이용 등과 같은 무작위적 변이법과 DNA shuffling[43, 47]과 같은 조합적 기술이 있다[26](Fig. 1). 조합적 라이브러리 제조기술에는 상동성이 높은 유전자의 조합을 유도하는 기술인 DNA shuffling, Rachitt, Rett 등이 있고, 상동성이 낮은 경우에도 도메인 조합을 통한 라이브러리의 제조가 가능한 ITCHY(truncated head-to-tail fusion), SHIPREC(single crossover products), GeneReassembly(high crossover products) 등의 방법도 있다. 무작위 돌연변이 라이브러리의 제조에는 변이유발 PCR 방법으로 돌연변이 라이브러리를 제조하여 간편하게 적용할 수 있는 키트(Stratagene, Genofocus 등)를 이용할 수도 있다. 효과적인 분자진화연구를 수행하기 위한 유전자 변이정도는 탐색가능한 라이브러리의 규모에 따라 달라지지만[3], 스크리닝 규모가 제한적인 \( \left (<10 ^ { 5 } \right ) \) 조건에서는 돌연변이 비율이 \( 1 \mathrm { ~kb } \) 당 1~2개 아미노산 보다 많지 않고, 유전자 변이도 일부 구간에 편향되지 않고 목표하는 유전자부위에 고르게 분포되도록 하는 것이 중요하다. 일반적으로 DNA shuffling에는 50-200 bp 크기의 DNA 단편을 연결하는 과정에서 재조합(recombination)과 돌연변이가 동시에 유발되는 방식이 사용되고 있으나, 대량의 라이브러리를 스크리닝하기 어려운 일반적인 경우에서는, 두 과정을 독립적으로 수행하는 방식이 더 효과적일 수 있다. 즉 변이유발 \( \mathrm { PCR } \) 을 통하여 무작위 돌연변이 라이브러리의 검색을 통해 특성이 개선된 개체를 선별한 후, 변이를 유발하지 않는 StEP shuffling 조건에서 돌연변이체들을 조합하는 방법이 유용하다[47]. 한편 최근 들어서는 구조분석 및 모델링을 바탕으로 가장 적합한 재설계 후보부위(engineering hotspot)를 선정하여, 이성적 설계기술(rational design) 및 실험적 라이브러리 조성 기술을 조합적용하는 방식이 새로운 흐름으로 나타나고 있다 [1,7,41]. 이러한 방식은 대량의 라이브러리 검색에 필요한 노력을 최소화 하면서 목표달성의 확률을 높이는 등 효율적 대안을 제시하는 방법으로 판단된다(Fig. 1).</p> <h3>고속탐색기술</h3> <p>유전자 라이브러리 제조, 회수, 관리과정은 반복된 연구를 기초로 여러 가지 프로토콜이 제시되어 있다. 변이 유발 PCR 라이브러리의 품질평가는 형질전환 미생물을 다양한 배율로 희석하고, 평판 배지에 도말하여 콜로니 수를 측정하는 방법에 의하여 수행 한다[9]. 총 라이브러리의 규모는 방법에 따라 달라지지만, 대개 약 \( 10 ^ { 5 } -10 ^ { 7 } \) 개 수준이며, 콜로니 PCR을 수행하여 insert 유전자를 함유하는 양질의 라이브러리임을 확인한다. 일반적으로 라이브러리의 탐색 기술은 항생제에 대한 저항성, 특정 영양 요구성 균주를 이용한 탐색, 한천 배지상에서 투명환의 생성, 형광물질의 발현, 유색발현에 의한 고체상의 선별, 로봇시스템으로 자동화가 가능하고 소량의 활성차이를 민감하게 인식할 수 있는 웰플레이트(wellplate) 방법이 사용된다(Fig. 2). 대량 미생물의 배양에는 96-웰플레이트 배양장치(바이오니아, 한국)를 이용하며, 효소불활성화를 최소화 하면서 세포용해가 가능한 Cellytic \( \mathrm { B } \) (시그마, 미국)등 시약을 이용하여 조효소액으로 제조할 수 있다. 효소 활성에 의하여 생성된 산물의 분석에는 다양한 발색방법을 적용하는 분석기를 이용할 수 있다[3]. 웰플레이트 발색에 의한 방법은 소량의 샘플로 미량의 활성이라도 민감하게 분석할 수 있다는 장점이 있는 반면, 고체상의 탐색 방법에 비해 많은 시간과 비용을 소모하고, 특히 .고가의 분석장비를 필요로 하는 단점이 있다[39].</p>