감염된 누에 유충을 균질화한 후 변성용액을 첨가하고 얼음에 5분간 방치한 뒤, phenol, chloroform을 넣고 12,000×g로 원심분리하여 RNA 침전물을 얻었다. 이 RNA pellet을 세척하고 건조하여 total RNA를 분리 및 추출하였다. 분리된 total RNA를 역전사 반응을 통해 1st cDNA를 합성하여 −20\(^\circ \mathrm{C}\)에 보관하였다.
<h2>Total RNA 분리 및 추출</h2> <p>Altas \( ^ {\mathrm { TN } } \) total RNA kit (Clontech, USA)을 일부 변형하여 A. niger에 감염된 5령기 누에 유충으로부터 total RNA를 분리하였다. 우선 A. niger로 감염시킨 누에 및 대조군인 비유도 누에 유충을 액체질소로 급속 냉동시켜 유발에 균질화 한 다음, \( 12.5 \mathrm { ml } \) 의 변성용액(4 M guanidine isothiocyanatem \( 5 \mathrm { mM } \) EDTA, \(1 \% \) \( \beta \)-mercaptoethanol, \( 25 \mathrm { mM } \) sodium acetate)을 첨가하였다. 얼음에 5분간 방치하고 여기에 시료 중량과 동량의 phenol과 chloroform을 넣고 12,000× \( g \) 로 원심분리하여 RNA가 포함된 상층액을 새로운 튜브에 옮겼다. 이 과정을 1회 더 반복한 다음 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 isopropanol을 동량의 비율로 넣고 다시 \( 12,000 \mathrm { xg } \) 로 원심분리하여 RNA침전물을 얻었다. 마지막으로 \( 80 \% \) ethanol로 RNA pellet을 2회 세척하고 실온에서 건조하여 total RNA를 분리, 추출하였다.</p> <h2>cDNA 합성</h2> <p>분리된 total RNA를 역전사 반응을 통해서 \( 1 ^ {\mathrm { st } } \) cDNA를 합성하였다. 역전사 반응은 \( 3 \mathrm { ug } \) 의 total RNA, 4 \( \mathrm { ul } \)의 \( 5 \mathrm { x } \) reaction buffer (Promega, USA), 5 \( \mathrm { ul } \)의 dNTPs (각 \( 2 \mathrm { mM } \) ), 2 \( \mathrm { ul } \)의 10 \( \mathrm { uM } \) dT-ACP1 primer (5'-CGTGAATGCTGCGACTACGAT IIIII(T) \( { } _ { 18 } 3 ^ {\prime } \), Seegene, Korea), RNase inhibitor (40 \( \mathrm { U/ul } \), Promega, USA), 1ul의 molony murine leukemia virus reverse transcriptase \( (200 \mathrm { U } / \mathrm { ul } \), Promega, USA)가 함유된 20 \( \mathrm { ul } \) 용액을 \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2시간 동안 반응시켜 \( 1 ^ {\text { st } } \mathrm { cDNA } \) 를 합성하였다. 합성된 cDNA는 \( 100 \mathrm { ul } \) 의 멸균 증류수에 녹여 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 보관하였다.</p>