세포주로부터 RNeasy mini-prep kit를 이용해 total RNA를 추출한 후, 이를 membrane microarray 실험과 reverse-transcription-PCR에 사용했다. p53 유전자의 전사조절 유전자만이 집적된 GEarray p53 signaling pathway microarray를 사용하였으며, biotinylated cDNA의 합성은 Ampho-LPR labeling kit을 통해 이루어졌다. X-ray film에 노출된 membrane의 각 spot의 강도는 GAPDH 유전자를 기준으로 비교분석하였다.
<h2>Western blot analysis</h2> <p>수확된 세포는 RIPA 완충액(50 \( \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { Cl } \) [pH 8.0], 150 \( \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } \), 1 \( \% \) NP40, 0.1 \( \% \) SDS, 그리고 0.5 \( \% \) sodium deox-ycholate)을 첨가하여 lysis시켰다. 총 세포 추출물 중 30 \( \mu \mathrm { g } \)의 단백질을 정량하여, 4-12 \( \% \) acrylamide gel (Invtrogen, CA, USA)에서 전기영동 한 후, nitrocellulose membrane(Invtrogen, CA, USA)으로 전기적으로 전달하였다. Transfer를 마친 membrane은 5 \( \% \) skim milk가 함유된 TTBS 용액 (0.1 \( \% \) Tween-20, 100 \( \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { Cl } \) [pH 7.5], 0.9 \( \% \) \( \mathrm { NaCl } \))에서 1시간 이상 blocking 하였다. 1차 항체의 처리는 blocking 용액과 같은 조성에서 12시간 이상 4 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \) cold chamber에서 수행하였고, 2차 항체의 경우 horseradish peroxidase-con-jugated anti-mouse 혹은 anti-rabbit 항체를 1시간 실온에서 처리하였다. 일련의 세척과정을 마친 후, ECL kit (Amersham, England)을 사용하여 발광시켜 X-ray film으로 expose한 후 확인하였다.</p> <h2>Total RNA 추출</h2> <p>수확한 세포주로부터 RNeasy mini-prep kit (Qiagen, USA)을 이용하여 total RNA를 추출하였다. 분리된 total RNA는 정량 후 membrane microarray 실험 혹은 reverse-transcription-PCR에 각각 사용하였다.</p> <h2>Membrane microarray 실험</h2> <p>사용한 membrane은 p53 유전자의 전사조절 유전자만 집적되어 있는 GEarray p53 signaling pathway microarray (Supcrarray Inc. MD, USA)를 구입하여 사용하였다. Biotinylated cDNA의 합성은 Ampho-LPR labeling kit (Superarray Inc, MD, USA)을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 실험과정을 간단히 설명하면 다음과 같다. 총 RNA의 5 \( \mu \mathrm { g } \) 을 사용하여 cDNA 합성의 주형으로 사용하였고, 합성된 cDNA는 PCR 과정동안 biotin-dUTP (Roche, IN, USA)로 labeling 하였다. 제조된 DNA probe는 prehy-bridized GEArray에 첨가하였다. Hybridization은 60 \( ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 12시간 동안 실시하고, 일련의 세척과정을 통해 membrane microarray를 세척하였다. Blocking을 실시한 후, phospha-tase-conjugated streptavidine으로 처리한 후, CDP-Star al-kaline phosphatase chemiluminiscent 기질에 노출하였다. 발광된 membrane을 X-ray film에 노출한 후, 각 spot의 in-ensity를 GAPDH 유전자를 기준으로 육안으로 비교분석 하였다.</p>