실리비닌으로 처리된 PC-3 세포는 PBS로 세척하고, 70% 에탄올에 4도에서 12시간 동안 고정시킨 뒤 RNase A로 1시간 처리하였다. 이후, DNA 염색을 위해 PI를 사용하였고, Flow cytometry를 통해 분석하였다. 세포 사멸에 따른 신호 전달 발생 시, 세포막 내부의 인지질 PS가 외부로 노출되며, 이는 Annexin V 단백질로 측정이 가능하다. 세포를 Annexin V apoptosis detection kit를 이용하여 염색한 후, flow cytometry로 측정하였다. 항체는 4도에서 12시간 동안 1차 반응하고, 상온에서 2시간 동안 2차 반응한 후, ECL kit를 사용하여 측정하였다.
<h2>세포주기 분석</h2> <p>PC-3 세포를 세포배양용 6-well plate를 이용하여 \( 5 \times 10 ^ { 4 } \) cells/well로 분주하고 24 시간 동안 안정화시킨 후, 다양한 농도로 24 시간 동안 배양하였다. 그 후, silibinin이 처리된 PC-3 세포를 분리하여 phosphate-buffered saline (PBS)에 세척하여 \( 70 \% \) ethanol로 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 12 시간 고정한 후, RNase \( \mathrm { A } \) 를 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 1 시간 동안 처리하고 DNA staining dye인 PI로 염색 하였다. 염색된 DNA는 flow cytometry (Becton Dickinson Co., Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 분석하였다.</p> <h2>세포사멸 측정</h2> <p>세포에서 세포사멸에 대한 신호전달이 일어나면 세포막 내부에 있는 인지질인 phosphatidylserin (PS)이 세포막 외부로 노출되는데, 이를 Annexin \( \mathrm { V } \) 단백질을 이용하여 측정 할 수 있다. 간락히, \( \mathrm { PC } -3 \) 세포를 6-Well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well로 분주하고 24 시간 동안 안정화시킨 후, silibinin을 다양한 농도로 PC-3 세포에 처리하여 각각 24,48 시간 배양 후, 세포를 모아 PBS로 세척하였다. 그 후, Annexin V apoptosis de-tection kit를 사용하여 세포를 염색하여 flow cytometry로 측정하였다.</p> <h2>Western blot을 이용한 단백질 발현 분석</h2> <p>Silibinin을 처리한 PC-3 세포를 모아 PBS로 세척한 후 lysis buffer [150 mM NaCl, \( 10 \mathrm { mM } \) Tris ( \( \mathrm { pH } \) 7.4), \( 5 \mathrm { mM } \) EDTA (pH 8.0), 1 \% Triton X-100, \( 1 \mathrm { mM } \) PMSF, \( 20 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) aprotinin, \( 50 \mathrm { lg } / \mathrm { ml } \) leupetin, \( 1 \mathrm { mM } \) venzaidine, \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) pepstain]를 첨가하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 30 분간 반응시킨 후, \( 13,000 \mathrm { rpm } \) 으로 30 분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. Bradford 법을 이용하여 단백질을 정량한 뒤, \( 50 \mu \mathrm { g } \) 의 단백질을 sodium dodecyl sul-phate (SDS)-polyacryamide gel을 이용하여 분리하였다. 그 후, poly-vinylidene difluoride membrane에 transfer하여 5 \% skim milk가 함유 된 TBS-T buffer [20 mM Tris (pH 7.4), 150 \( \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } , 0.1 \% \) Tween-20]를 이용하여 실온에서 1 시간 blocking 하였다. 각각의 1 차 항체를 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 12 시간 반응하 였으며, 2차 항체를 상온에서 2 시간 반응하여 enhanced chemilluminescence (ECL) kit (Amersham pharmacia Biotech)를 이용하여 측정하였다.</p>