아그로박테리움의 과도한 증식을 조절하기 위해 형질전환에 적합한 콩 품종을 선발하여 사용한 결과로 추정된다. 그리고 추가적으로 절편체 수를 증가시켜 형질전환체를 더 많이 얻을 수 있을 것으로 기대된다. 실험 결과에 따르면 재배품종은 매우 낮은 형질전환율을 보여주었으며, 이로 인해 재현성 있는 콩의 형질전환 시스템을 위해 적합한 벡터와 아그로박테리움 종류, 공배양 조건의 설정, 재분화 체계 등이 고려되어야 할 것으로 사료된다.
<h2>식물체 형질전환</h2> <p>형질전환체를 육성하기 위하여 콩의 자엽마디에 pCAMBIA3301로 형질전환한 아그로박테리움 EHA105와 KYRT1을 공배양한 결과 병원성이 강한 KYRT1을 이용하였을 때 콩의 자엽마디에서 보다 많은 GUS spot을 확인하였으며, 따라서 KYRT1이 외래 유전자의 전달효율이 더 높은 것으로 판단되었다. 하지만 공배양 후 아그로박테리움의 제거가 어려워 자엽마디 주위에 아그로박테리움이 계속적으로 증식함에 따라 콩의 자엽마디에서 신초를 형성하지 못하거나, 신초를 형성하더라도 아그로박테리움으로 인하여 곧 고사하고 말았다 (자료 미제시). 이러한 결과는 콩의 형질전환에서 KYRT1과 EHA105균주를 비교 실험한 Meurer 등의 보고와 일치하였으며, EHA105를 이용한 다른 실험의 결과에서도 비슷한 결과를 얻었다. 아그로박테리움의 과도한 증식은 식물체의 생장 및 형질전환체의 선발에 이롭지 못한 결과를 초래한다는 보고를 참조하여 콩의 형질전환에 이용 하기에는 EHA105균주가 적절함을 확인하였다.</p> <p>아그로박테리움과 공배양한 자엽마디를 \( 1 \mathrm{mM} \mathrm{X} \)-gluc용액에 침지하여 유전자의 도입여부와 발현정도를 GUS발색 반응으로 확인하였다. 유전자가 도입되어 발현된 부분은 푸른색의 점 모양을 나타낸 반면 유전자가 도입되지 않은 부분은 변색되지 않음을 확인할 수 있었다. 공배양한 자엽마디를 선발배지에 치상하고 1 주후부터 자엽마디의 부위에서는 작은 돌기들이 형성되면서 새로운 신초를 유기하였다. 이들을 계대배양하면 신초 주변의 세포들이 급속히 분열하면서 여러 개의 신초들을 형성하였으며, 2차 계대배양 후부터는 phosphinothricin에 저항성을 나타내는 신초는 녹색을 유지하며 계속적으로 자라기 시작하였지만 형질전환이 제대로 이루어지지 않아 제초제 저항성을 갖지 못한 절편체는 갈변되기 시작하여 결국에는 고사하였다. 이는 Cho 등이 보고한 것처럼 형질전환이 일어나지 않은 절편체는 배지 내의 phosphinothricin을 흡수하여 암모니아 축적으로 괴사현상을 나타내지만 형질전환된 절편체는 phosphinothricin acetyl transferase를 합성하여 저항성을 갖게 된 현상으로 보이며,</p> <p>이는 T-DNA의 제초제 저항성 유전자가 올바르게 식물체로 전달되어 발현하고 있음을 알 수 있었다. 또한 형질전환체를 선발하기 위해 phosphinothricin의 농도는 기존의 보고를 참조하여 \( 5,8,10 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 로 배지내에 첨가하여 사용해 보았는데, \( 8 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 이상의 농도를 첨가하였을 때에는 콩의 절편체가 모두 갈변하거나 신초가 발달하지 못하는 등 생육이 눈에 띄게 저하되는 피해를 보였으며 반면에 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 이하의 농도에서는 pseudo 식물체의 발생이 많아 적절한 선발을 할 수 없었다. 따라서 'Jack' 품종을 이용한 콩의 형질전환시 효과적인 선발 농도는 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \)로 생각되며 이는 Zhang 등의 결과와 일치하였다. 선발농도와 관련하여 'Williams 82' 품종을 이용한 형질전환시에 phosphinothricin의 농도는 \(6 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 와 \( 8 \mathrm{mg} / \mathrm{L} \) 를 이용하였는데, 이는 이용한 품종 및 실험조건에 의해 다른 결과가 나타날 수 있음을 시사한다. 본 실험결과 콩 형질전환시 재 배품종에 따른 형질전환율에 상당한 차이를 보였다. 비록 형질전환율 \( (0.6 ~ 3.0 \%) \) 은 높지 않았지만 실험에 이용된 콩 품종 모두에서 GUS발색 반응이 나타나는 식물체를 획득할 수 있었다. 이는 형질전환에 적합한 콩 품종을 선발하여 이용한 결과로 생각되어지며 절편체 수를 늘려 형질전환에 이용하면 보다 많은 형질전환체를 확보할 수 있을 것으로 기대된다. GUS 발색 반응을 나타내어 T-DNA의 전달이 식물체로 전달된 것으로 여겨지는 형질전환체에 \( 0.3 \% \) 제초제 (\( \mathrm{Basta}^{(\mathbb{R})} \))를 면봉을 이용하여 잎에 묻혀 제초제 저항성을 확인하고, 후에 식물체 전면에 \( 0.3 \% \) 제초제를 살포한 결과 'Jack' 품종에서만 2개 \( (0.8 \%) \) 의 제초제 저항성 식물체를 확보할 수 있었으며 나머지 모든 개체들은 제초제에 저항성을 나타내지 못하고 대조구와 마찬가지로 고사하였다. 앞선 재분화율 검정에서 보인 높은 재분화율과는 달리 재배품종에 따라 현저하게 낮은 형질전환율을 보이고 있으므로, 향후 재현성 있는 콩의 형질전환 체계를 위해서는 최적의 콩 품종을 선발하는 것 외에도 적절한 벡터 및 아그로박테리움의 종류, 공배양 조건의 확립, 재분화체계 등이 반드시 극복되어야 할 것으로 생각된다.</p>