토마토는 미국 Texas A&M 대학교 채소 및 과일 개량 센터에서 육성한 내혼계통 'FTX'을 분양받아 사용했다. pE1775-ZmCRT는 freeze-thaw 방법을 사용하여 A. tumefaciens LBA4404 균주에 도입되었고, 이를 토마토 'FTX'의 하배축 절편을 이용한 형질전환에 사용되었다. ZmCRT 단편의 증폭을 위한 PCR 반응은 forward 및 reverse primer가 각각 최종 농도 200 μM이 되도록 수행되었으며, gDNA는 DNeasy Plant Mini kit을 사용하여 식물체로부터 추출되어 최종 농도 0.8 ng/μL로 각각 PerfectShot Ex Tag Kit에 첨가되어 수행되었다. PCR 분석에서는 ZmCRT 단편이 증폭되었으며, Southern 혼성화 분석 및 T-DNA의 1 copy 삽입 및 배수성 분석을 통해 \(T_0\) 식물체가 확인되었다. 이후 인공 교배를 통해 \(T_1\) 집단을 육성하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>토마토 유전자형과 tobamovirus 분리주</h2> <p>토마토는 미국 Texas A\&M 대학교 Vegetable and Fruit Improvement Center에서 육성한 내혼계통 'FTX'을 분양 받아 사용하였다. 바이러스는 TMV-U1과 ToMV로 감염된 냉동건조물을 국립원예특작과학원으로부터 분양 받아 N. tabacum cv. Turkish Samsun과 cv. Samsun에서 각각 증식한 후 접종원으로 사용하였다.</p> <h2>플라스미드, Agrobacterium 균주 및 ZmCRT 형질전환</h2> <p>옥수수의 calreticulin을 coding하는 염기서열 (ZmCRT : Gen-Bank accession \#AF190454)이 pUC119 (Vieira and Messing 1987: GenBank accession \#U07650)를 backbone으로 하는 pE1775 binary vector (Lee et al. 2007)에 cloning되었는데, 이 vector (pE1775-ZmCRT: supplied by Dr. Sunghun Park at Kansas State Univ.)에서 ZmCRT는 3 개의 octopine synthase transcriptional activating element와 1개의 mannopine synthase 2' activating & promoter element가 연속적으로 연결된 superpromoter에 의해 그 발현이 조절된다. pE1775-ZmCRT를 freeze-thaw method (Holsters et al. 1978)를 통해 A. tumefaciens LBA4404 균주에 도입하였고 이를 토마토 'FTX'의 하배축 절편을 이용한 형질전환 (Park et al. 2003, 2005)에 이용하였다.</p> <h2>식물체의 핵산분석</h2> <p>ZmCRT 단편의 증폭을 위한 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction: PCR)은 forward와 reverse primer (Table 1) 각각이 최종농도 \( 200 \mu \mathrm{M} \) 이 되도록, gDNA는 DNeasy Plant Mini kit (Qiagen GmBH, Hilden German)을 이용하여 유식물체로부터 추출하여 최종농도 \( 0.8 \mathrm{ng} / \mu \mathrm{L} \) 가 되도록 각각 PerfectShot Ex Tag Kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)에 첨가하여 수행하였다. 더불어 삽입 유전자의 재확인과 T-DNA copy수 결정을 위하여 Southern 혼성화 분석을 수행하였는데 식물체 gDNA의 절단은 제한효소 Xba I을 단용, plasmid로부터 probe 제작을 위해서는 제한효소 Xba I과 Sac I을 혼용하였으며 절단된 genomic DNA (gDNA)의 분획, 분획된 gDNA의 membrane 전이 및 probe와의 혼성화 등은 Chung 등 (2010)의 방법을 따랐다.</p> <p>재분화 식물체에서 나타나는 배수성 변이가 표현형 이상뿐 아니라 목표유전자 발현에 기인한 특성의 구별을 모호하게 할 수 있다 (Dan et al. 2003). 실제로 본 연구에서도 일부 유식물체의 엽형이 wild-type과 뚜렷한 차이를 나타내었는데, 이들 배수성 \( \mathrm{T}_{0} \) 변이체를 고정세대 육성용 모본에서 제외시키기 위한 목적으로 DNA 형광탐지를 기반으로 하는 배수성분석기 (PAII: Partec, Münster, Ger-many)를 활용하여 Han 등 (2004)의 방법을 따라 그 분석을 수행하였다.</p> <p>한편, ToMV를 접종한 식물체에서 ZmCRT의 전사와 바이러스 축적 양상을 분석하기 위하여 ToMV-CP 유전자를 대상으로 반정량적 reverse transcriptional polymerase chain reaction (semi-quantitative RT-PCR) 분석을 수행하였다. 바이러스 접종 후 40 일경 어린 상엽으로부터 RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)를 이용하여 총 RNA를 추출한 후 DNA 오염을 제거하기 위하여 DNase I (Invitrogen, Carlsbad, USA)으로 2회 처리하였다. 이어서 분광광도계 (NanoDrop 2000: Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA)로 RNA를 정량한 후 각 시료가 동일 농도가 되도록 희석하였으며 등량의 각 RNA시료를 template로, random hexamer를 primer로 첨가한 Super-Script III First-Strand Synthesis System (Invitrogen)을 이용하여 cDNA를 합성하였고, 합성된 각 cDNA \(2\mu \mathrm{L} \) 와 primer 조합(Table 1)을 첨가하여 PCR을 수행함으로써 ZmCRT, ToMV-CP 및 actin 유전자 (ACT: GenBank accession \#AB199316, BT013707) 단편을 각각 증폭하였다.</p> <h2>형질전환 동형접합세대 육성</h2> <p>PCR 분석에서 ZmCRT 단편이 증폭되고 Southern 혼성화 분석에서 T-DNA의 1 copy 삽입과 배수성분석을 통해 이 배체로 확인된 \( \mathrm{T}_{0} \) 식물체를 대상으로 인공교배를 통해 \( \mathrm{T}_{1} \) 집단을 육성하였다. \( \mathrm{T}_{1} \) 집단의 각 식물체에 대한 PCR 분석을 통해 ZmCRT 단편의 증폭이 확인된 개체는 개체별로 \(\mathrm{T}_{2} \) 집단을 육성한 후 다시 각 집단에 대한 PCR 분석을 수행함으로써 목표유전자가 분리하지 않는 고정집단을 선발하였다.</p> <h2>바이러스 접종</h2> <p>TMV-U1과 ToMV 분리주가 증식된 N. tabacum cv. Turkish Samsun과 cv. Samsun의 잎을 채취하여 막자사발에 넣고 \( 20 \mathrm{mM} \) sodium phosphate/bisphosphate 완충액 \( (\mathrm{pH} \) 7.0)를 첨가한 후 마쇄하여 접종원으로 사용하였다. \(\mathrm{T}_{2} \) 세대 토마토를 파종한 후 20 일경인 본엽 2 매 완전전개 시점에 제 1본엽의 윗면에 carborundum 분말을 도포한 후 바이러스 접종원을 뭍인 면봉으로 윗면 전체를 상처가 나지 않도록 가볍게 문질러주었다.</p> <h2>엽록소형광 quenching 분석</h2> <p>ZmCRT 형질전환체와 wild-type 식물체의 ToMV 접종에 따른 광합성 효율을 비교하기 위하여 ToMV 접종 20 일 후 WinControl software (version2.08; Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany)가 구동하는 pulse amplitude modulation fluorometer (Mini-PAM: Heinz Walz GmbH)를 활용하여 포화광 pulse 하에서 광계II (photosystem II: PSII) 유래 형광 (Chl-F)을 측정하였다. 각 식물체의 상부 바로 아래 완전 전개된 잎에 Dark Leaf Clip (DLC-8: Heinz Walz GmbH) 을 각각 고정하여 30 분 이상 암적응 시킨 후 measuring light intensity 2, actinic light intensity 5 , pulse 간격 40초의 조건으로 quenching 을 수행하고 측정된 형광값에 의존하는 매개변수를 획득한 후 non-photochemical quenching (NPQ; Bilger and Björkman 1990)과 PSII quantum yield (中Psir; Genty et al. 1989)를 산출하였다. NPQ는 (Fm-Fm')/Fm' 식으로, \( \phi_{\mathrm{PsII}} \) 는 (Fm'-Ft)/Fm'식으로 구하였으며 Fm은 암적응된 상태에서의 최대 Chl-F, Fm'은 명적응된 상태에서의 최대 Chl-F, Ft는 명적응된 상태에서의 포화광 pulse 조사 직전 Chl-F 값을 의미한다. ToMV가 접종된 ZmCRT 형질전환 \( \mathrm{T}_{2} \) 세대 식물체, ToMV접종 wild-type 및 바이러스 미접종 wild-type 각 5개체로 부터 얻어진 매개변수 값의 평균을 구하여 처리간 비교하였다.</p>