\( \mathrm{HaCaT} \) 세포에 염증 유도를 위해 \( \mathrm{TNF}-\alpha 20 \mathrm{ng} / \mathrm{mL} \)을 처리하고 yakuchinone-A를 최대 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도까지 함께 반응시켰다. 2시간 후 배양액을 제거하고 TRIzol reagent를 분주하여 세포를 용해시킨 뒤 \( 200 \mu \mathrm{L} \)의 chroloform을 첨가하여 혼합한 후, \( 14000 \mathrm{rpm} \)으로 원심 분리하여 total RNA를 추출하였다. PCR은 real-time PCR 실험 기법을 사용하였으며 각각의 특이 primer를 사용하여 특정 유전자의 mRNA 발현량을 실시간으로 확인하였다. 본 연구의 모든 실험은 3회 이상 반복 수행했으며, 획득한 실험값에 대한 모든 통계치리는 Student's t-test를 이용하여 \( p \) 값이 \( 0.05 \) 미만이면 통계적으로 유의성이 있다고 결정했다.
<h3>RNA extraction and real time RT-PCR</h3> <p>In-vitro 건선 피부염 시험모델은 Choi 등의 방법[26]에 따라 수행하였다. \( \mathrm{HaCaT} \) 세포를 6 well-plate에 각 well 당 \( 4 \times 10^{5} \) \( \mathrm{cell} / \mathrm{well} \) 이 되도록 \( 2 \mathrm{~mL} \) 씩 분주하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{CO}_{2} 5 \% \) 조건에서 24시간 동안 배양하였다. \( \mathrm{HaCaT} \) 세포에 염증을 유도하기 위해 \( \mathrm{TNF}-\alpha 20 \mathrm{ng} / \mathrm{mL} \) 을 처리하고 yakuchinone-A를 최대 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도까지 함께 반응시켰다. 2시간 후 배양액을 제거하고 TRIzol reagent (Invitrogen, Waltham, MA, USA)를 분주하여 세포를 용해시킨 뒤 \( 200 \mu \mathrm{L} \) 의 chroloform을 첨가하여 흔합한 뒤, \( 14000 \mathrm{rpm} \) 으로 원심 분리하여 total RNA를 추출하였다. RNA는 총 \( 1.5 \mu \mathrm{g} \) 을 되도록 정량 한 후 Revertra ACE kit (Toyobo, OSAKA, Japan)를 활용해 cDNA를 합성하였다. PCR은 real-time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 실험 기법을 사용하였으며 각각의 특이 primer를 사용하여 실시간으로 특정 유전자의 mRNA 발현량을 확인하였다. 사용된 Taqman probe는 Table 1에 표기하였다.</p> <h3>Western blotting</h3> <p>\( \mathrm{HaCaT} \) 세포를 6 well-plate 각 well 당 \( 8 \times 10^{5} \mathrm{cell} / \) well로 seeding한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{CO}_{2} 5 \% \) 조건에서 24 시간 배양하였다. 이후 염증을 유도하기 위해 \( \mathrm{TNF}-\alpha 20 \mathrm{ng} / \mathrm{mL} \) 를 처리하였고, 이와 동시에 yakuchinone-A를 \( 2.5,5,10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \) 농도조건으로 각각 \( 2 \mathrm{~mL} \) 씩 분주한 뒤 2시간 동안 반응시켰다. 그 다음 차가운 phosphate buffered saline로 3회 세척한 후, RIPA lysis buffer (25 mM Tris-HCl pH 7.6, \( 150 \mathrm{nM} \mathrm{NaCl}, 1 \% \mathrm{NP}-40,1 \% \) sodium deoxycholate, 0.1\% SDS, phosphatase inhibitor cocktail, \( 50 \mathrm{mM} \mathrm{EDTA} \) 를 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 씩 분주하여 \( 30 \mathrm{rmm} \) 에서 5 분 동안 교반하였다. \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 12000 \mathrm{rpm} \) 에서 15 분간 원심 분리하여 단백질을 추출한 뒤, Bradford (Bio-rad, Hercules, CA, USA) assay 로 정량을 진행하였다. laemmli sample buffer \( (31.5 \mathrm{mM} \) Tris-\( \mathrm{HCl}, \mathrm{pH} 6.8,10 \% \) glycerol, 1\% SDS, \( 0.005 \% \) Bromophenol Blue), \( \beta \)-mercaptoethanol과 단백질 혼합액을 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 조건에서 5 분간 열 츙격을 주었다. 이후 \( 10 \% \) SDS-PAGE gel에 각 sample 과 buffer를 lane에 넣고 Tris/Glycine/SDS running buffer를 사용하여 전기 영동을 하였다. Filter paper에 gel을 부착하여 iBlot dry blotting system (Invitrogen, Calsbad, CA, USA)을 사용하여 PVDF membrane에 transfer 하였다. \( 10 \% \) skin milk 를 제조하여 1시간 동안 blocking 후, primary antibody를 분주 하여 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 \( 1 \mathrm{X} \) TBST (50 mM Tris, \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 0.1 \% \) Tween \( 20, \mathrm{pH} \) 7.4) buffer를 제조하여 5 분씩 6 번, 총 30 분 동안 washing하였다. Secondary antibody 를 1시간 뒤 5 분씩 6 번, 총 30 분 동안 washing하였다. 이후 암실에서 PVDF membrane에 Western ECL substrates (Bio-rad) 을 처리한 후, 30 분 동안 반응시킨 뒤 이미지 치리장치 (Microchemi-DNR, NeveYamin, Israel)로 단백질 발현량을 측정하였다. 단백질 정량 분석은 Image J program (N.I.H, Bethesda, \( \mathrm{MD}, \mathrm{USA}) \) 을 통해 분석하였고, 사용된 Antibody는 Table 2에 표기하였다.</p> <h3>통계처리</h3> <p>본 연구의 모든 실혐은 3회 이상 반복 실험을 수행하였고, 얻어진 실험값에 대한 모든 통계치리는 Student's t-test를 통해 \( p \) 값이 \( 0.05 \) 미만일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판단하였다.</p>