농산 부산물인 밀기울과 PKM에 함유되어 있는 hemicellulose의 분해를 위해 미생물을 분리하기 위해 농후배양을 실시하였다. LB 평판배지에서 48시간 배양하여 분해환을 조사한 결과 xylan과 LBG의 분해능이 높은 분리균 YB-1107이 선발되었다. 하지만 전분과 단백질분해력은 있지만 tributyrin은 분해하지 못하였다. 세균의 16S rDNA 염기서열을 미국 \( \mathrm { NCBI } \) 의 BLAST 검색방법을 사용하여 비교한 결과, Cellulosimicrobium sp. TUT1222와 동일하였다. 따라서 콜로니의 색깔과 세포형태는 16S rDNA와 YB-1107은 Cellulosimicrobium 속에 속하는 균으로 판단되어진다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>농후배양을 통한 Hemicellulases 생산균의 탐색</h2> <p>농산 부산물인 밀기울에는 xylan, PKM에는 galactomannan과 같은 hemicellulose가 함유되어 있다. Hemicellulose의 분해에 관여하는 xylanase와 mannanase를 생산하는 미생물을 분리하기 위해서 이들을 탄소원으로 첨가한 합성배지 SMM에 작물재배 토양을 첨가하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 진탕 배양하고 일정기간 마다 동일배지에 계대 배양함으로써 hemicellulose의 분해능을 갖는 미생물을 농후배양하였다. 농후배양액을 xylan과 \( \mathrm { LBG } \) 를 유일탄소원으로 첨가한 평판배지에 도말하여 성장한 콜로니를 선발한 후 고분자 물질을 분해할 수 있는지 분석하기 위해 oat spelt xylan(0.5 \%), skim milk(1 \%), potato starch \( (0.2 \%) \), tributyrin(1 \%)과 carboxymethyl cellulose \( ( \mathrm { CMC } ; 0.5 \% \) )를 각각 첨가한 LB 평판배지에서 48 시간 배양하여 분해환을 조사한 결과, xylan과 LBG 의 분해능이 높은 분리균 YB-1107은 전분과 단백질 분해력이 있으며 tributyrin은 분해하지 못하는 것으로 확인되였다.</p> <p>분리균 YB-1107은 콜로니 색이 노랗고 그람양성의 무포자 균이다. 세균의 \( 16 \mathrm { ~S } \) rDNA 유전자의 보존적 지역의 염기서열 5'-TGCCAGCAGCCGCCCTA-3'(E. coli 16S rDNA 유전자 염기서열의 515 531 지역)와 5'-TTGTACACACCGCCCGTC-3'(E. coli 16S rDNA 유전자 염기서열의 1389 1406 지역)을 primers로 사용하여 \( 16 \mathrm { ~S } \mathrm { rDNA } \) 를 PCR로 증폭한 후 1,390 bp 크기의 염기서열을 결정하였다. YB-1107의 \( 16 \mathrm { ~S } \mathrm { rDNA } \) 염기서열을 미국 \( \mathrm { NCBI } \) 의 BLAST 검색방법을 사용하여 기존에 등록된 세균들의 상응하는 염기서열과 비교한 결과, Cellulosimicrobium sp. TUT1222(Genbank accession No. AB188217)와 동일하였으며 C. cellulans 와도 한 개의 염기만이 차이가 있었다. 따라서 콜로니의 색깔과 세포형태 및 16S rDNA 서열로 볼 때 분리균 YB-1107은 Cellulosimicrobium 속에 속하는 균으로 판단되었다.</p> <h2>부가탄소원에 따른 효소 생산</h2> <p>Hemicellulose의 주요성분인 xylan과 galactomannan에 대한 분해능을 조사하기 위해 분리균이 생산하는 xylanase와 mannanase의 활성을 조사하였다. 미생물 유래의 다당류 분해효소는 배양액 중의 탄수화물 성분에 의해 그 생산성이 영향을 받는 경우가 많으며, mannan 다당류나 xylan이 함유된 배지에서는 이들의 분해효소 생산이 증가되는 예가 많다. 따라서 분리균 YB-1107의 hemicellulases 생산성에 탄수화물이 미치는 영향을 조사하기 위해 LB 액체배지를 기본배지로 하여 부가 탄소원을 \( 0.5 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) 가 되도록 각각 첨가하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 시간 배양하여 배양상등액에 존재하는 xylanase 와 mannanase 활성을 각각 조사한 결과, Table 1에 보인 바와 같이 glucose와 xylose를 첨가하였을 때는 배양액 중에 xylanase와 mannanase의 활성이 관찰되지 않았고 다른 단당류나 이당류는 효소 생산성에 큰 영향을 미치지 못하였다. 특히 glucose나 xylose를 첨가한 배지에서는 균의 성장정도가 이를 첨가하지 않은 배지와 유사하거나 낮은 수준이며 또한 24시간 배양 후에도 배양액에 환원당이 다량 존재하고 있어 분리균 YB-1107이 이들 당을 탄소원으로 잘 이용하지 못하는 것으로 판단된다. 한편 \( \mathrm { PKM } \) 또는 \( \mathrm { LBG } \) 를 첨가한 배지에서 mannanase 생산성이 크게 증가되었으며 밀기울 또는 oat spelt xylan을 첨가한 배지에서는 xylanase의 생산성이 크게 증가되었다. LBG를 첨가한 배지에서 mannanase의 생산성이 증가된 경우는 Bacillus 균주 등에서 다수 보고된바 있으며[ PKM에 의한 mannanase 생산성이 증가되는 현상은 Streptomyces galbus에서 보고되었다 또한 xylanase의 생산성이 xylan이나 밀기울에 의해 증가되는 현상도 Bacillus pumilus에서 확인되었으며 C. cellulans는 사탕수수박을 첨가한 배지에서 xylanase의 생산성이 증가된 바 있다.</p> <p>PKM이 LBG 보다 분리균 YB-1107의 mannanase 생산성을 더 높게 증가시키므로 \( \mathrm { PKM } \) 의 첨가량을 달리한 \( \mathrm { LB } \) 배지에서 분리균을 배양한 후 배양상등액에 존재하는 mannanase 의 활성을 조사한 결과 \( 0.7 \% \) 첨가할 때 까지는 효소 생산량이 증가하였으나, \( 1 \% \) 이상을 첨가한 배지에서는 효소 생산성이 감소하였다. Xylanase의 생산성을 가장 많이 증가시킨 밀기울의 첨가량을 달리하여 배양한 후 효소 생산성을 분석한 결과 \( 1 \% \) 첨가할 때까지는 증가하는 현상을 보였으나, \( 1.5 \% \) 를 첨가하였을 때는 급격히 감소하였다(Table 2).</p>