본 실험은 경북 영천시에서 재배된 감꼭지를 사용하며, 용매 분획물은 감압농축기를 통해 헥산(\(4. 2 \mathrm{~g}\)), 에틸아세테이트(\(10. 7 \mathrm{~g}\)), 부탄올 (\(35. 1 \mathrm{~g} \)), 물 (\( 45. 8 \mathrm{~g} \))을 얻어냈다. 사용된 B16F10 멜라노마 세포는 ATCC에서 분양받아 Michikaw 등의 방법으로 배양하였으며, 세포 생존률은 Carmichael 등의 방법에 의해 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시료 추출</h2> <p>본 실험에 사용한 감꼭지는 경북 영천시에서 재배된 것으로 (주)휴먼허브에서 구입하여 사용하였다. 시료의 추출은 감꼭지 \( 100 \mathrm{~g} \)을 시료 중량의 10배 양에 \( 70 \% \) 에탄올을 가하여 상온에서 24시간씩 3회 추출한 다음 filter paper (Whatman No. 2)로 여과한 뒤 감압농축기(EYELA N-300, Japan)로 농축한 후 동결 건조하여 에탄올 추출물(\( 14.1 \mathrm{~g} \))을 얻었다. 이후 용매추출법을 이용하여 극성도가 낮은 hexane으로 추출한 후, 다시 ethylacetate와 butanol용매로 순차적으로 분획하였다. 각 용매 분획물은 감압농축기를 이용하여 용매를 모두 제거하여 농축한 뒤 동결 건조하여 헥산(\(4.2 \mathrm{~g}\)), 에틸아세테이트(\(10.7 \mathrm{~g}\)), 부탄올 (\(35.1 \mathrm{~g} \)), 물 (\( 45.8 \mathrm{~g} \))을 얻었다.</p> <h2>시약</h2> <p>세포배양을 위한 Dulbeco's modified eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), streptomycin penicillin, trypsin 250은 Gibco BRL Co. (Grand Island, NY, USA)로부터 구입하여 사용하였고, tyrosianse, 3-[4,5-dimethyl-thia-zol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide (MTT), L-3,4-di-hydroxyphenylalanine (L-DOPA), kojic acid는 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 1차 항체 인 티로시나아제, TRP-1, TRP-2와 2차 항체는 Santa Cruz biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 기기는 ELISA reader, 원심분리기, 현미경, \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기, 세포 수 측정기를 사용하였다.</p> <h2>세포 배양</h2> <p>B16F10 멜라노마 세포는 ATCC (American Type Culture Collection)에서 분양받아 사용하였으며, Michikaw 등의 방법에 따라 배양하였다. 세포에 \( 0.25 \% \) trypsin 용액을 희석 처리한 후 세포를 분리한 다음 DMEM배지에 \( 10 \% \) FBS와 \( 1 \% \) penicillin/streptomycin \( (100 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) \)을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기에 적응시켜 사용하였다.</p> <h2>MTT assay에 의한 세포 생존능력 측정</h2> <p>세포 생존률 측정은 Carmichael 등의 방법에 따라 측정하였다. 세포를 96 well plate에 \( 1 \times 10^{4} \) cells/well이 되게 180\( ~\mu \mathrm{l} \)씩 분주하고, 시료를 농도 별로 \( 20 ~\mu \mathrm{l} \) 처리한 48시간 배양하였다. 배양 후 \( 5 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 제조한 MTT 용액 \( 20 ~ \mathrm{\mu l} \)를 첨가하여 3시간 처리 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO \( 200 ~ \mathrm{\mu l}\)를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA reader로 \( 550 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정한 후 (\(1- \text{시료의 흡광도}/\text{대조구의 흡광도}) \times 100 \)에 의하여 생존율을 계산하였다.</p>