PCR-based differential display법을 사용하여 A. niger에 의해 유도된 누에의 발현 유전자를 GeneFishing DEG kit을 통해 선별하였다. 50ng의 1st strand cDNA, dT-ACP2(10uM), arbitrary ACP(10uM), 2X master mix를 포함한 20ul의 PCR reaction mix가 사용되었다.
<h2>PCR-based differential display</h2> <p>GeneFishing \( ^ {\mathrm { TM } } \) DEG kit (Seegene, Korea)를 사용하여 A. niger 에 의해서 유도되는 누에의 발현 유전자를 ACP기술에 기초로 한 PCR-based differential display법에 의해 선별하였다. 우선 약 \( 50 \mathrm { ng } (3 \sim 5 \mathrm { ul } ) \) 으로 희석된 \( 1 ^ {\text { st } } \) strand cDNA, \( 1 \mathrm { ul } \) 의 dT-ACP2 \( (10 \mathrm { uM } ), 1 \mathrm { ul } \) 의 \( 10 \mathrm { uM } \) arbitrary ACP, \(10 \mathrm { ul } \) 의 2X master mix가 포함된 최종 20 \( \mathrm { ul } \)의 용액을 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분, \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 3분, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분 동안 반응하여 double-strand cDNA를 합성하였다. 다음 단계로 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30초, \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)도에서 1분을 1회로 하여 총 40회 반복한 후, 최종적으로 증폭된 PCR 산물은 ethidium bromide (10 \( \mathrm { ug/ml } \))가 함유된 \( 2 \% \) 의 agarose gel에서 분리, 확인하였다.</p> <h2>Cloning 및 nucleotide sequencing</h2> <p>Agarose gel 전기영동에 의해서 차별적 발현이 확인된 밴드들은 Core-One \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) Gel elution kit (CorebioSystems, Korea)를 사용하여 분리, 추출한 다음, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30초, \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분을 1회로 하여 총 40회 반복하였다. 마지막으로 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5분간 PCR 반응을 1회 더 실시한 후, TOPO TA vector system (Invitrogen, USA)를 사용하여 클로닝하였다. 이후 X-gal/IPTG를 이용하여 재조합된 대장균을 순수 분리하였다. Core-One \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) Miniprep kit (CorebioSystems, Korea)를 사용하 여 분리한 대장균으로부터 plasmid DNA를 추출한 다음, ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) 를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 이후 NCBI의 BLASTX 상동성 검색을 통해서 차별적으로 발현되는 유전자를 동정하였다.</p>