고온 전처리를 최적 조건으로 실시한 후 10 N NaOH를이용하여 pH 5.0으로 중화한 뒤 효소 당화를 실시하였더니 최적 조건은 \( 12 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \) 의 Viscozyme \( \mathrm{L} \)일때 이였다. 미역 가수분해 산물과 Clostridium sp.균주 세개를 특정 조건하 8일간 발효 시켰더니 결과는 pH 5.1을 기점으로 pH가 높으면 acid products가 생산되고 pH가 낮으면 solvent products가 생산된다는 보고와 동일했다. 순치 안한 wild type C. acetobutylicum KCTC 1724 의 발효 과정 확인을 위해 , 시간별로 단당과 균체수, pH, solvent products, 그리고 acid products를 알아본 결과, 단당은 glucose가 4일만에 모두 소비되었고 mannitol의 경우에는 거의 소비되지 않았다.< p>mannitol을 전부 사용 못하는 단점을 해결하기 위해 고농도의 mannitol을 첨가한 배지에서 순치한 C. acetobutylicum KCTC 1724 을 이용하여 발효를 진행한 결과,Glucose, mannitol 모두 4일차에 소비되는걸 확인하였다. 요약문 작성 완료하였습니다.
<h2>효소 당화</h2> <p>초고온 전처리를 최적 조건으로 실시한 후 10 N NaOH를이용하여 pH 5.0으로 중화한 뒤 효소 당화를 실시하였다. 효소는 Viscozyme L과 Celluclast 1.5 L, Ultraflo Max를 \( 16 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \) 로 희석해서 사용하였다. Fig. 2A는 단일 효소와 복합 효소를 사용하여 가수 분해를 실시하였으며 \( 500^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 72시간 동안 당화를 진행한 결과, 48시간 이후는 당이 증가하지 않음을 확인하여 48시간의 효소 당화 효과를 나타냈다. 그 결과, Viscozyme L ( \( \beta \)-glucanase, Novozymes)을 단일로 사용했을 때, \( 23.9 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 로 가장 높은 수치를 나타냈다. 이는 다른 두 효소인 Celluclast 1.5 L (endo-glucanase, Novozymes)와 Ultraflo Max (endo-glucanase, Novozymes)의 효과가 Viscozyme L ( \( \beta \)-glucanase, Novozymes)보다 떨어짐을 알 수 있다. 이후, Fig. 2 B와 같이 효소의 유닛을 \( 4, 8, 12, 16 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \) 로 각각 다르게 하여 \( \mathrm{pH} 5.0 \).에서 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 로 48시간동안 효소 당화를 진행한 결과, \( 12 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \) 에서 \( 25.1 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 로 \( 16 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \)보다 더 많은 당을 얻었다. 최종적으로 효소 당화의 최적 조건으로는 \( 12 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \) 의 Viscozyme \( \mathrm{L} \) 을 사용하는 것으로 확립하였다.</p> <h2>Clostridium sp.를 이용한 아세톤, 부탄올, 에탄올 발효</h2> <p>발효는 \( 10 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 미역 가수분해 산물과 wild type의 Clostridium acetobutylicum KCTC 1724과 Clostridium beijerinckii KCTC 1785, Clostridium tyrobutyricum KCTC 5387 균주를 이용하여 working volume \( 70 \mathrm{ml} \) 으로 \( 120 \mathrm{rpm} \), \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 로 8일 동안 수행하였다. 세 균주 모두 \( \mathrm{OD}_{600}=1.0 \) 일 때 건조 균체량은 \( 0.70 \mathrm{~g} \mathrm{dcw} / 1 \) 로 나타났다. Table 1 은 순치 하지 않은 (wild type) 세 균주의 발효를 진행할 때, pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0으로 각각 고정하여 발효하였고, 초기 glucose농도는 \( 17.57 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), mannitol 농도는 \( 6.57 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 이다. 세 균주의 최적 \( \mathrm{pH} \) 에 대한 발효 결과 최적 \( \mathrm{pH} \) 가 세 균 모두 다르게 나타났다(data not shown). C. acetobutylicum KCTC 1724 는 \( \mathrm{pH} \mathrm{5.0} \) 에서 가장 많은 아세톤, 부탄올, 에탄올(ABE) 1724는 pH 5.0에서 가장 많은 아세톤, 부탄올, 에탄올(ABE)이 생성되었고, C. beijerinckii KCTC 1785는 pH 5.5, C.tyrobutyricum KCTC 5387은 pH 6.0으로 나타났다. 균체수도 다르게 나타났는데 단당의 소비에 있어서는 glucose는 모두 소비하지만 mannitol의 경우 C. acetobutylicum KCTC1724은 \( 2.1 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 정도의 소량만 소비하였고 C. beijerinckiiKCTC 1785는 아예 소비하지 못하였다. 그에 비해 C.tyrobutyricum KCTC 5387은 모두 소비하는 것을 알 수 있었다. 단당의 소비에 따라 균체수도 C. tyrobutyricum KCTC5387이 3.42로 가장 많았고 이어 C. acetobutylicum KCTC1724이 2.72, C. beijerinckii KCTC 1785가 1.98로 가장 작았다. 생산된 아세톤, 부탄올, 에탄올(ABE)의 경우 C.tyrobutyricum KCTC 5387가 당을 모두 소비하고 균체수도 가장 많지만 ABE가 \( 1.82 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)로 가장 낮은 값을 나타냈다. 반면 C. acetobutylicum KCTC 1724은 mannitol을 거의 섭취하지 못해 균체수가 상대적으로 작았지만 ABE는 \( 5.72 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)로 가장 높은 값을 나타냈다. 이는 아세톤, 부탄올, 에탄올과 같은 solvent products 와 acetic acid, butyric acid와 같은acid products 의 생산이 pH 5.1을 기점으로 pH가 높으면acid products가 생산되고 pH가 낮으면 solvent products가 생산된다는 보고와 일치되는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 연구에서는 pH 5.0에서 가장 많은 ABE를 생성한 C.acetobutylicum KCTC 1724을 선택하여 ABE 발효를 진행하였다.</p> <p>순치 하지 않은 wild type C. acetobutylicum KCTC 1724 의 발효 과정을 확인하기 위해 시간별로 진행되는 단당 (glucose, mannitol)과 균체수 \( \left(\mathrm{OD}_{600}\right)\), pH, solvent products, 그리고 acid products를 Fig. 3에 나타냈다. Fig. 3A에 나타낸 바와 같이 단당은 glucose가 4일만에 모두 소비되었고 mannitol의 경우에는 거의 소비되지 않음을 확인하였다. 그에 따른 \( \mathrm{OD}_{600} \) 값도 3일차에 2.72로 더 이상 증가하지 않았다. pH는 5.0으로 유지하기 위해 NaOH와 HCl을 사용하였다. 그에 따라 생성된 결과로 Fig. 3B에 나타낸 바와 같이 solvent products는 아세톤이 \( 1.21 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), 부탄올이 \( 3.17 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), 에탄올이 \( 1.34 \mathrm{~g} / \) 였고, acid products의 경우 acetic acid는 \( 0.04 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 로 매우 소량이 생성되었고 butyric acid도 \( 0.32 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \)로 적은 양이 생성되었다. 아세톤, 부탄올, 에탄올의 수율을 계산했을 때, \( \mathrm{Y}_{\mathrm{ABE}} \) 값이 0.24로 나타났다.</p> <p>Fig. 4는 mannitol을 모두 소비하지 못하는 단점을 해결하기 위해 고농도의 mannitol \( 60 \mathrm{~g} / \) 를 첨가한 배지(PMY) 에서 순치를 한 C. acetobutylicum KCTC 1724 을 이용하여 발효를 진행한 결과이다. Glucose, mannitol 모두 4일차에 소비되는 것을 확인하였고 그에 따라 \( \mathrm{OD}_{600} \) 값도 5 일차에 5.12를 나타내며 순치하지 않은 균을 사용했을 때보다 약 1.9배 증가하였다. pH는 5.0으로 유지하여 생성물의 양을 확인하였다. 그 결과, acetic acid는 \( 0.04 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 로 변함이 없었으며, butyric acid는 \( 0.46 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), 아세톤은 \( 0.99 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 로 순치하지 않은 균을 사용했을 때와 크게 다르지 않았다. 하지만 부탄올은 \( 5.62 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \), 에탄올은 \( 2.44 \mathrm{~g} / \mathrm{l} \) 로 순치를 하지 않았을 때보다 각각 \( 2.45 \mathrm{~g} / 1,1.10 \mathrm{~g} / 1 \) 가 증가한 것을 알 수 있었다. 수율을 계 산했을 때, \( \mathrm{Y}_{\mathrm{ABE}} \) 값이 0.37로 0.13만큼 증가하였다.</p>