Hepa-1c1c7 세포에 재조합 HBV 발현 벡터인 1. 3eq HBV genome 5 \( \mu \mathrm { g } \)과 10 \( \% \)의 HBV 보균자의 혈청을 도입한 후, 이들 및 처리하지 않은 대조군의 RNA를 분리하여 HBV, TNF-a, CYP1A1, b-actin 유전자의 mRNA 발현을 검증하였다. 그 결과 HBV에 의해 TNF-a mRNA의 발현이 유도됨을 확인하였다. 이 과정에서 세포배양액 분석을 위해 Abbott IMx system과 microparticle immunoassay를, 그리고 TNF-a mRNA 발현을 정량적으로 분석하기 위해 competitive/quanti-tative RT-PCR을 사용하였다.
<h2>통계분석</h2> <p>각각의 실험에 있어서 각가의 비표군에 대하여 평균값 \( \pm \) 표준오차(SE)를 계산하였다. 대조군에 대한 유의성은 Dunnett의 two-tailed t-test를 수행하여 평가하였다.</p> <h1>결 과</h1> <p>Hepa-1c1c7 세포는 재조합 HBV 발현 벡터인 1.3eq HBV genome 5 \( \mu \mathrm { g } \)을 세포내 도입시킨 경우와 10 \( \% \)의 HBV 보균자의 혈청으로 감염시킨 경우, 그리고 아무것도 처리하지 않은 경우에 대하여 세포 및 세포배양액을 취하여 분석에 이용하였다. 세포로부터 RNA를 분리하여 HBV, TNF-a, CYP1A1, 그리고 b-actin 유전자에 대해 특이적인 primer들을 사용한 RT-PCR:을 수행하여 가 유전자에 대한 mRNA의 발현 여부를 결정하였으며, 세포배양액은 Abbott IMx system을 이용하여 microparticle immunoassay블 수행하여 HBsAg의 발현 및 분비양상을 측정하였다. 동량의 RNA를 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과 1.3-eq HBV genome이 세포내 도입된 Hepa-1c1c7세포에서 대조군으로 사용되 b-actin mRNA의 발현에는 영향이 없었던 반면, HBV mRNA의 발현이 이루어지고 있음을 알 수 있었다. 또한 HBV 혈청으로 감염시킨 Hepa-1c1c7 세포에서도 미약하나마 HBV mRNA가 존재한다는 사실을 알 수 있었다. 한편, 1.3-eq HBV genome을 세포내 도입시킨 경우와 HBV혈청으로 감염시킨 경우 모두 세포 내에서의 TNF-a mRNA의 발현이 유도되었다. HBV가 처리된 경우, 세포 내부에서의 mRNA 발현과 더불어 HBsAg을 의미 있게 분비하는 결과도 나타났다(S/N ratio \( >2.0) \).</p> <p>HBV에 의한 TNF-a mRNA 발현을 정량적으로 분석하기 위하여 TNF-a PCR의 대상이 되는 부위에서 중간부분이 빠진 DNA internal standard를 이용하여 competitive/quanti-tative RT-PCR을 수행하였다. Fig. 2는 다양한 농도의 internal standard를 이용하여 TNF-a PCR 산물(370-bp)과 internal standard PCR 산물(324-bp)과의 농도비율을 이용한 표준곡선 \( \left (R ^ { 2 } = 0.974 \right ) \)을 보여주며(panel A), 이 표준곡선에 대하여 각 시료에 있어서의 TNF-a와 internal standard의 PCR 산물들의 농도비를 외삽하여 구한 TNF-a mRNA의 양을 보여주고 있다(panel B). 이 결과는 정성적 분석과 마찬가지로 정량적 분석 역시 HBV에 의하여 TNF-a mRNA의 발현이 유도된다는 것을 보여주었다.</p> <p>HBV의 농도에 따른 세포내 도입의 영향을 측정하기 위하여 HBV 발현 벡터인 1.3-eq HBV genome 1 \( \mu \mathrm { g } \)과 10 \( \mu \mathrm { g } \)을 Hepa-1c1c7 세포내로 도입시킨 결과 세포에서는 TNF-a mRNA의 발현이 사용한 HBV DNA의 농도에 비례하여 증가하는 양상을 보였으며, 이 때 HBsAg의 발현 및 분비 역시 농도 의존적으로 증가하는 양상을 보여 주었다. HBV 혈청을 이용한 감염의 경우에도 사용 혈청의 농도와 HBsAg의 분비와의 상관관계를 측정한 결과, HBsAg의 분비는 HBV 혈청 \( 0.1 \% \)에서는 영향이 없었으나, \( 1 \% \)부터 농도에 비례하여 증가하는 경향음 보여추었다. HBV 감염 후 시간에 따른 변화로서, TNF-a mRNA 발현은 감염 후 2일 까지는 발현이 유도되었으며 그 후로는 원상태로 회복되었고, HBsAg 또한 초기에 분비가 이루어진 후 더 이상의 변화는 보이지 않았다.</p>