CK214 균주를 고체 배지에서 배양한 후, 소금 용액에 현탁하여 전자 현미경으로 관찰하였다. 또한, PCR 증폭을 통해 16S rRNA를 암호화하는 DNA 절편을 분석하고, BLAST 결과와 함께 CLUSTAL W2 Multiple Sequence Alignment 프로그램을 사용하여 염기서열을 비교하였다.
<h2>투과 전자 현미경(Transmission Electron Microscope,TEM)</h2> <p>CK214 전배양액 \( 10 \mu 1 \) 를 떨어뜨린 후 \( 1.0 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) LB 고체평판배지에서 배양하여 swarming 운동한 CK214 균체를 \( 0.85 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \mathrm { NaCl } \) 용액 \( 1 \mathrm { ml } \) 에 부드럽게 현탁하였다. 균주현탁액을 grid에 부착시키고 \( 1 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \) uranyl acetate로 1 분간 염색한 후 투과 전자 현미경(TEM, H-7600, HITACHI, 부산대학교 공동실험 실습관)을 사용하여 균체를 관찰하였다\( ( \times 10000-25000) \).</p> <h2>\( 16 \mathrm { ~S } \) rDNA 염기서열분석 및 계통발생학적 분석</h2> <p>\( 16 \mathrm { ~S } \) rDNA 염기서열분석을 위해 PCR 증폭기법을 이용하여 \( \mathrm { CK } 214 \) 균주의 \( 16 \mathrm { ~S } \mathrm { rRNA } \) 를 암호화하는 \( \mathrm { DNA } \) 절편을 증폭하였다. Primer는 \( 16 \mathrm { ~S } \) rDNA 염기분석서열을 위한 universal primer인 B27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 U1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')를 이용하였으며, PCR은 다음과 같은 조건으로 수행하였다: \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분간 pre-denaturation 시간을 준 후 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초간 denaturation, \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 초간 primer annealing, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1 분간 polymerization 과정을 25 회 반복하였다. 마지막으로 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 10 분간 마지막 합성 시간을 주었다. 증폭된 \( 16 \mathrm { SDNA } \) 는 Gel and PCR Purification Kit (Solgent)를 사용하여 정제하였으며, 정제된 DNA 단편을 pGEM-T vector (Promega)에 클로닝 하였다. DNA 단편의 염기서열분석은 Solgent 사에 의뢰하였으며, 분석하여 얻은 CK214의 \( 16 \mathrm { ~S } \mathrm { rDNA } \) 염기서열과 상동성을 가지는 다른 박테리아의 염기서열을 찾기 위해 BLAST 분석을 수행하였다. 분석된 BLAST 결과를 토대로 한 \( 16 S \) rDNA 염기서열들을 CLUSTAL W2 Multiple Sequence Alignment 프로그램을 통해 비교하였다(www.ebi.ac.uk). 계통수의 작성은 Tree view (1.6.6) 소프트웨어를 사용하였으며 Bootstrep 신뢰성 분석은 1,000 회 반복 수행되었다. 계통발생학적 분석에 사용된 박테리아는 다음과 같다: Paenibacillus lautus strain OFB-7 (HM439459), P. lautus (AB073188), Paenibacillus sp. 6495m-C2 (AJ509004), Paenibacillus sp. PRE17 (EU880530), Paenibacillus sp. H28-08 (AM162307), P. glucandyticus (AB073189), P. vortex strain V453 (HQ005270), Paenibacillus sp. isolate vortex (AJ131119), Paenibacillus sp. R-30939 (AM910282), P. lactis strain IB-188D (FN429978), P. lactis strain MB 2035 (AY257870), P. lactis strain MB 1871 (AY257868), Bacillus sp. DB104 (HM566817), P. lactis strain ZYb1 (FJ445392), Paenibacillus sp. P30 (AM162319), P. ginsen-gagri Gsoil 3125 (AB245383), Geobacillus sp. Y412MC10 (CP001793), Paenibacillus sp. XP1-2 (GQ981313), Paenibacillus sp. H25-07 (AM162303), Bacterium DE5 (EU520331).</p>