갑상선세포주 FRTL-5를 \(5\%\) calf serum, \( 1 \mathrm{mM} \) non-essential amino acid, TSH \( (10 \mathrm{mU} / \mathrm{ml}) \), insulin \( (10 \mu \mathrm{g} / \)\( \mathrm{ml}) \), hydrocortisone \( (0.4 \mathrm{ng} / \mathrm{ml}) \), transferrin \( (5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 등의 4가지 호르몬 혼합체를 첨가한 Coon's modified F-12 배양액에 배양하였다. ER stress를 정도를 확인하기 위해 세포에 Sericin을 처리해 배양하였으며 negative control에는 tunicamycin을 처리하였다. 배양한 세포에 RNA isolation reagent를 \( 500 \mu \mathrm{l} \) 넣은 후 2회 원심 분리하여 pellet을 얻고, 얻은 pellet에 \( 500 \mu \mathrm{l} \)의 \( 75 \% \) ethanol을 처리하여 다시 원심 분리함으로써 total RNA를 얻는다. RT-PCR을 통해 cDNA를 합성하고 합성한 cDNA를 PCR을 통해 증폭시킨후, SDS-PAGE에 전기영동, PVDF cell membrane에 transfer, blocking, membrane 세척의 과정으로 Western blotting을 진행하고, 발색반응을 일으키는 West save를 사용하여 X-ray film으로 결과를 분석한다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>갑상선세포의 배양</h2><p>Coon's modified F-12 배양액에 \(5\%\) calf serum, \( 1 \mathrm{mM} \) non-essential amino acid, TSH \( (10 \mathrm{mU} / \mathrm{ml}) \), insulin \( (10 \mu \mathrm{g} / \)\( \mathrm{ml}) \), hydrocortisone \( (0.4 \mathrm{ng} / \mathrm{ml}) \), transferrin \( (5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 등의 4가지 호르몬 혼합체를 첨가하여 만든 배양액(4H 배양액)에 FRTL-5 세포주를 배양하였다. 새로운 배양액을 2-3일마다 교환하였고, 세포를 5~7일마다 계대 배양하였다.</p><h2>Sericin 처리</h2><p>Pure Sericin \( { }^{\mathrm{TM}} \) (Wako, Japan)을 구입하여 PBS (phosphate buffer saline)에 \( 10 \% \) 가 되도록 녹인다. 각각 다른 농도\( (0.5, 1,2.5 \mu \mathrm{g} / \mu \mathrm{l}) \) 를 처리하여 48시간 동안 배양한다. ER stress를 정도를 확인하기 위하여 negative control로 tunicamycin을 처리하였다.</p><h2>RNA 추출 및 RT-PCR</h2><p>FRTL-5 세포주를 \( 100 \mathrm{mm} \) 접시에서 배양한 후 여기에 RNA isolation reagent (TRI-REAGENT)를 \( 500 \mu \mathrm{l} \) 넣고 2-3분 지난 후 scrapper로 긁어 모아 \( 1.5 \mathrm{ml} \) tube에 넣고 \( 100 \mu \mathrm{l} \)의 chloroform을 첨가하여 충분히 섞어준 다음 \( 13,000 \mathrm{rpm}\), \(4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15분 동안 원심 분리하였다. 약 \( 500 \mu \mathrm{l} \) 의 상등액을 취하여 새로운 tube로 옮기고 동량의 isopropanol 넣고 상온에서 10분 정도 처리한 후 \( 13,000 \mathrm{rpm} \) 으로 10분 동안 원심분리하고 tube의 바닥에 얻어진 pellet에 \( 75 \% \) ethanol을 초기 RNA iso-lation reagent 양과 동일한 \( 500 \mu \mathrm{l} \) 넣고 \( 12,000 \mathrm{rpm} \) 으로 5분 동안 원심 분리하여 최종적으로 total RNA를 얻었다. DEPC가 처리된 증류수에 녹여 UV spectrophotometer로 정량하였다. 그 다음으로 수행한 RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)은 RNA \( (3 \mu \mathrm{g}) \) 를 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3분간 가열하여 denaturation시킨 후 바로 ice에 담가둔다. \( 10 \times \) buf-fer \( 3 \mu \mathrm{l} \), dNTP \( 4 \mu \mathrm{l} \)의 oligo-dT (\(300 \mathrm{ng}\)), \(10,000 \mathrm{U}\)의 reverse transcriptase와 RNase inhibitor를 첨가하고 총 \( 30 \mu \mathrm{l} \)가 되게 한 후 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 시간 30분간 반응시켜 cDNA를 합성한다. 반응이 끝난 후 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2분간 반응시켜 reverse tran-scriptase를 inactivation시킨 다음 최종 \( 100 \mu \mathrm{l} \)가 되도록 맞춘다. 그 다음 단계로 cDNA를 증폭하기 위해서 PCR을 수행하였다. PCR 반응액 \( 20 \mu \mathrm{l} \)에 각각의 F & R primer를 넣어서 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 5분, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 30분, \( 57^{\circ} \mathrm{C} \) 40초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 40초로 27회 반복한 후 이를 전기영동으로 확인하였다.</p><p>F (5'-ATCCCAGTGTCTGATGATGCGGAA-3'), and R (5'-CTCTCCTGGACTGGCTGATATC-3') for Tg; F (5'-ACCAC CAGTCCATCGCCATT-3') and R (5'-CCACCCTGGACGGAAGTTTG-3') for IRE1; F (5'-AGTGGTGGCCACTAATGGAG-3') and R (5'-TCTTTTGTCAGG GGTCGTTC-3') for Bip; F (5'-CTAGGCCTGGAGGCCAGGTT-3') and R (5'-ACCCTGGAGTATGCGGGTTT-3') for ATF6; F (5'-GGTCTGGTTCCTTGGTTTCA-3') and R (5'-TTCGCTGGCTGTGTAACTTG-3')for PERK; F (5'-AAACAGAGTAGCAGCTCAGACTGC-3') and R (5'-CTTCTGGGTAGACCTCTGGGAG-3') for XBP1; F (5'-GGACTGGGACGAAGAGATGG-3') and R (5'-CCTCTGCTCCTCATCCTGCT-3') for calreticulin; F (5'-AGCCATG TACGTAGCCATCC-3') and R (5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3') for actin.</p><h2>Western blot 분석</h2><p>Western blotting 은 Protein electrophoresis kit (ATTO Co., Japan)를 사용하여 \( 12 \% \) SDS-PAGE에 준비된 sample을 전기 영동 하였다. 전기영동이 끝난 후 transfer kit (Bio-RAD)를 사용하여 gel의 protein을 PVDF cell membrane (PALL corpo-ration)에 transfer buffer ( \( 20 \mathrm{mM} \) Tris-HCl, \( 150 \mathrm{mM} \) glycine, \( 20 \% \) methanol, \( \mathrm{pH} 8.3 \))를 사용하여 transfer하였다. Transfer 가 끝난 후 membrane을 \( 3.75\% \) skim milk in PBST (PBST, Tween 20, \( 0.05\% \))를 사용하여 상온에서 1시간 동안 blocking 하였다. Blocking이 끝난 후 1차 항체를 반응 시킬 때에는 \( 5 \% \) skim milk in PBST에 1:1,000의 비율로 희석하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2시간 동안 반응시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 후 membrane을 PBST를 10분씩 5회 상온에서 shaker를 사용하여 세척하였다. 세척이 끝난 후 2차 항체를 반응 시킬 때에는 PBST에 1: 2,000의 비율로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응 시켰으며, 반응이 끝난 후 membrane을 PBST를 10분씩 5회 상온에서 shaker를 사용하여 세척하였다. 세척이 끝난 후 West save (Lab Frontier, Korea)을 사용하여 발색반응을 유도한 후 X-ray film에 감광하여 결과를 분석하였다.</p><h2>세포 증식 측정(cell viability assay)</h2><p>갑상선세포 \( 5 \times 10^{5} \) cell \( / \mathrm{ml} \) 을 96 well plate의 각각의 well에 세포배양액 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 을 첨가한 뒤 이산화탄소 배양기에 배양한다. EZ-CyTox kit (Daeil, Korea)를 사용하여 MTT assay하였다. 각 well 에 assay reagent \( 10 \mu \mathrm{l} \) 을 첨가한 후 이산화탄소배양기에 2-4 시간 정도 배양하며 반응시킨다. \( 450 \mathrm{nm} \) 에서 흡광도를 측정한다.</p>