이 연구는 체중 \( 300 \mathrm{~g} \)의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐의 대동맥에서 얻은 혈관평활근세포를 배양하고, RNA sol \( { }^{\mathrm{TM}} \)와 chloroform, isopropanol 그리고 RNA Tack \( { }^{\mathrm{TM}} \) resin을 이용하여 RNA를 추출하였다. 결과는 5군으로 나누어 성적을 정리하였고, 통계처리는 실험을 4-6회 반복하여, 평균치\(\pm\)표준오차로 표시하였으며, Student's t test로 \(P\)값이 0.05 이하일 때 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포배양</h2> <p>체중 \( 300 \mathrm{~g} \) 내외의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐의 대동맥으로 부터 얻은 혈관평활근세포를 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS)을 첨가한 Dulbecco-Eagle 배양액을 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\) \( \mathrm{CO}_{2} \) incubator내에서 배양하였다. 세포가 밀생 상태에 가까워지면 trypsin을 처리하여 계대배양을 시작하였는데, 5-15 계대 배양세포를 본 실험에 이용하였다. 계대 배양세포를 24-well cluster dish에 분주하여 밀생 여부를 확인 한 후, PMA로 전처리하고 HBSS (Hank's balanced saltsolution)로 세척한 후 IL-1 \(\beta \)을 첨가하여 24시간 배양하고, 이 때 생성된 불안정한 \( \mathrm{NO} \)대신 안정된 상태인 \( \mathrm{NO}_{2} \)를 아래 방법에 의하여 측정하였다.</p> <h2>\( \mathrm{NO}_{2} \)량 측정</h2> <p>혈관평활근세포의 계 대배양을 위하여 분주한 세포는 약 7일 후 밀생 상태를 확인할 수 있었고, 분주한 7일 후 \( 1 \% \) BSA가 함유된 DMEM배양액을 다시 교환하고, PDB, PDD 또는 PMA로 전처리한 후 IL-1 \( \beta \)를 첨가하여 24시간 배양한 배양액을 취하였으며, 이 배양액과 Gries 용액을 \(4:1\)의 비율로 흔합하고, Fast 수정방법을 이용하여 생성된 \( \mathrm{NO}_{2} \)량을 측정하였는데, plate reader (Titerteck Multiskan MCC 344 , 독일산)를 사용하여 \( 543 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 \( \mathrm{NO}_{2} \)량을 sodium nitrate 용액을 희석하여 얻은 표준곡선에서 산정하였다.</p> <h2>NOS유전자발현 검사</h2> <p>배양액 중의 힐관 평활근 세포를 RNA sol \( { }^{\mathrm{TM}} \) (Biotex lab Inc, 미국)에 용해하여, 그 용해물에 E-tube에서 chloroform을 처리하고 원심분리 \( (1200 \mathrm{~g}\), 20분) 하여 상층액에 isopropanol과 RNA Tack \( { }^{\mathrm{TM}} \) resin을 첨가하여 생성된 침전물을, \( 75 \% \) 알콜로 세척하여 광전분광광도계 \( (260-280 \mathrm{~nm}) \)를 이용 하여 RNA순도를 확인하였다.</p> <p>RT-PCR은 Stratagene RT-PCR kit를 사용하였으며 그 처리 및 역전사 방법은 김의 실험방법과 동일하였다. Primer는 iNOS와 GAPDH에 대하여 흰쥐 평활근세포내의 iNOS cDNA와 GAPDH cDNA \( (250 \mathrm{bp} \)) 서열에 근거하여 (주)바이오니아 (한국)에서 제작한 것을 사용하였다.</p> <p>실험군: 본 실험은 편의상 다음과 같이 5군으로 나누어 성적을 정리하였다.</p> <p>제 1 군은 PMA 2, 20 또는 \( 200 \mathrm{nM} \)가 존재한 세포배양액에 IL-1\(\beta\) \(100 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \)를 첨가하여 24 시간 배양으로 생성되는 \( \mathrm{NO}_{2} \)량을 측정하였다.</p> <p>제 2 군은 세포배양액에 PMA \( 200 \mathrm{nM} \)를 첨가하여 2, 8, 24시간 경과 한 후 HBSS로 세척하고, 다시 세포배양액으로 기환하여 이 중 IL- 1\( \beta\) \(100 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 24시간 배양으.로 생성되는 \( \mathrm{NO}_{2} \)량을 측정하였다.</p> <p>제 3 군은 세포배양액에 PMA 2, 20 또는 \( 200 \mathrm{nM} \)를 첨가하여 24시간 경과 후 HBSS로 세척하고 세포배양액에 IL-1\(\beta\) \(100 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) 첨가하여 24시간 배양으로 생성되는 \( \mathrm{NO}_{2} \)량을 측정하였다.</p> <p>제 4 군은 PKC활성제인 PMA는 \( 200 \mathrm{nM}\), PDB는 \( 500 \mathrm{nM} \)와 PKC 비활성제인 PDD는 \( 200 \mathrm{nM} \) 존재 하에서 2, 8, 24 시간 경과 후 HBSS로 세척한 후 세포배양액에 IL-1\(\beta\) \(100 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) 첨가하고 24시간 배양하여 생성되는 \( \mathrm{NO}_{2} \)량을 측정 하였다.</p> <p>제 5 군은 IL-1\( \beta \) 존재 하에 배양시간 경과 및 IL-1\( \beta \) 농도에 따른 iNOS 발현과, PMA전처리 24시간 경과 후, IL-1\( \beta \) 존재로서 야기되는 iNOS 발현을 RT-PCR method를 이용하여 측정하였다.</p> <p>통계처리는 실험을 4-6회 반복하여, 평균치\(\pm\)표준오차로 표시하였으며, Student's t test로 \(P\)값이 0.05 이하일 때 유의성이 있는 것으로 판정하였다.</p>