黃芩이 RARa mRNA 발현에 미치는 영향을 ISH 기법으로 조사한 결과, DIV12의 배양세포에 黃芩 \( (20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)을 처리한 후 DIV14에 정상산소 환경에서 RARa mRNA 발현은 핵, 세포체, 가지돌기에 발현되었고, 가지돌기에 분포하는 mRNA granule의 수는 黃芩 \( (20 \mathrm{ug} / \mathrm{ml}) \)을 처리한 시험군에서 상당히 증가하였다.
<h1>결 과</h1> <h2>정상산소환경(normoxia)에서 黄芩이 RARa mRNA 발현에 미치는 영향</h2> <p>黃芩이 apoptosis 억제 단백질인 RARa의 mRNA 발현에 미치는 영향을 ISH 기법으로 조사하였다. RARa 단백질의 아미노산 \(259 \sim 344\)에 해당하는 유전자 절편 \( 413 \mathrm{bp} \) (Fig. 1A)를 PCR 기법으로 증폭한 결과 예상된 크기의 증폭된 DNA를 확인할 수 있었다(Fig. 1, right panel). 이를 transcription vector인 pCRII-TOPO의 HindIII/ApaI site에 cloning하고, DNA sequencing으로 확인하였다(Fig. 1B, left panel). Sense cRNA probe를 만들기 위하여 이 재조합 plasmid를 HindIII로 잘라 선형으로 만들고 T7 RNA polymerase를 이용하여 in vitro transcription하였다(Fig. 1B, right panel, S). 이때 DIG-UTP를 첨가하여 cRNA를 DIG로 표지하였다. Antisense cRNA probe를 만들기 위하여 재조합 plasmid를 ApaI으로 잘라 선형으로 만들고 SP6 RNA polymerase를 이용하여 in vitro transcription 하였다(Fig. 1B, right panel, AS).</p> <p>DIV12의 배양세포에 黃芩 \( (20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 을 처리한 후 DIV14에 정상산소 환경에서 RARa mRNA 발현을 antisense RNA probe를 이용하여 관찰하였다(Fig. 2). RARa mRNA는 핵, 세포체, 가지돌기에 발현되었다(Fig. 2A). 핵에서의 발현 정도를 densitometer로 측정한 결과 부숙을 처리한 배양에서 약간 증가하였으나 통계적 유의성은 없었다(Fig. 2B). 가지돌기에서는 RARa mRNA의 분포가 과립(granule) 형태로 발현되었다. 따라서 가지돌기에 분포하는 mRNA granule의 수를 조사한 결과, 黃芩 \( (20 \mathrm{ug} / \mathrm{ml}) \) 을 처리한 시험군에서 RARa mRNA 과립의 수는 상당히 증가하였다 \( (69.8 \%, \mathrm{p}=0.001 \) )(Fig. 2C).</p> <h2>저산소증(hypoxia)에서 黃芩이 RARa mRNA 발현에 미치는 영향</h2> <p>다음으로 저산소증에서 黃芩이 RARa mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하였다. DIV12의 배양세포에 黃芩(20 \( \mathrm{ug} / \mathrm{ml}) \) 을 처리한 후 DIV14에 저산소증을 유도하고, 다시 정상산소 환경에서 2시간 더 배양한 후 DIG-labeled antisense RARa cRNA를 이용하여 ISH 기법으로 관찰하였다(Fig.3A). mRNA의 표현정도를 densitomter로 측정한 결과 정상산소 환경에서와 마찬가지로 핵에서의 발현 정도는 변화가 없었다(Fig. 3B). 그러나 가지돌기에 형성된 RARa mRNA 과립의 수는 상당히 증가되었다\( (129.8 \%, \mathrm{p}=0.001) \)(Fig. 3C).</p> <h2>정상산소환경(normoxia)에서 黄菍이 RARa 단백질 발현에 미치는 영향</h2> <p>다음으로 단백질 수준에 黃苓이 정상산소 환경에서 apoptosis 억제에 관여하는 효소인 RARa의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. DIV12의 배양세포에 누속 黃芩( (20 \mathrm{ug} / \mathrm{ml}) \) 을 처리한 후 DIV14에 정상산소 환경에서 RARa의 발현을 항체를 이용하여 IC 기법으로 관찰하였다(Fig. 4). 이때 PSD95 단백질에 대한 항체를 이중 염색하여 신경세포를 확인하였다. RARa는 신경세포의 세포체에서 강하게 발현되었다(Fig. \( 4 \mathrm{~A}) \). 발현의 정도를 관찰하고자 RARa 면역염색 이미지를 흑백으로 전환하고 음양을 반전시킨 후(Fig. 4B), 신경세포 세포체의 신호강도(signal intensity)를 측정한 결과 黃苓으로 처리한 배양에서 상당히 증가하였으며(78.8\%, \( \mathrm{p}=0.004 \) ) (Fig. 8C), 가지돌기에서도 이에 상응하는 증가가 있었다.</p> <h2>저산소증(hypoxia)에서 黄菍이 RARa 단백질 발현에 미치는 영향</h2> <p>다음으로 黃芩이 저산소증에서 RARa의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. DIV12의 배양세포에 黃荶 \( (20 \mathrm{ug} / \mathrm{ml}) \) 을 처리한 후 DIV14에 저산소증을 유도하고, 다시 정상산소 환경에서 2시간 더 배양한 후 RARa의 발현을 IC 기법으로 항체를 이용하여 관찰하였다(Fig. 5). RARa는 정상산소 환경에 비하여 저산소증에서 더 강하게 발현되었는데, 황금을 처리한 시험군에서 더욱 더 많이 발현하였다(Fig. 5A). 정상산소 환경에서와 같은 방법으로 신경세포에서의 발현정도를 측정한 결과 黃芩을 처리한 시험군의 세포체에서 유의하게 증가하였으며(23.6\%, \( \mathrm{p}=0.001) \) (Fig 9B, Fig. 9C), 가지돌기에도 이에 상응하는 증가가 있었다.</p>