조각자 추출물 GSM과 GSE를 각각 \( 1,5,10,50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도로 백혈구에 처리한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30분간 반응시킨 후 백혈구에 산화적 손상을 주기 위해 \( 200 \mu \mathrm { M } \)의 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)를 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5분간 처리 후 PBS로 세척하였으며 백혈구의 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)에 의한 DNA 손상 및 손상억제 정도는 핵으로부터 이동해서 꼬리 부분으로 떨어져 나간 꼬리 부분 내 DNA % 함량을 측정하여 나타내었다.
<h2>\( \mathrm { DNA } \) 손상 측정(Comet assay)</h2> <p>신선한 전혈 \( 5 \mathrm { ml } \)을 Histopaque 1077를 이용해 백혈구만을 분리해 낸 후 본 실험에 사용하였다. 2종류의 조각자 추출물 GSM과 GSE를 각각 \( 1,5,10,50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 의 농도로 백혈구에 처리한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30분간 반응시킨 후 백혈구에 산화적 손상을 주기 위해 \( 200 \mu \mathrm { M } \) 의 hydrogen peroxide \( \left ( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \right ) \)를 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5분간 처리 후 PBS로 세척하였다. Negative control은 백혈구에 PBS만을 처리하였으며, positive control은 추출물 대신 PBS를 사용하여 반응 시킨 후 \( 200 \mu \mathrm { M } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)를 처리하였다. Comet assay를 위해 반응을 끝낸 백혈구를 \( 75 \mu 1 \)의 \( 0.7 \% \)low melting agarose gel (LMA)과 섞은 후, \( 1.0 \% \)normal melting agarose (NMA)가 미리 코팅된 슬라이드위로 세포현탁액과 LMA의 현탁액이 골고루 분산되게 한 후 커버 글래스로 덮어 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 냉장고에 보관하였다. 젤이 굳으면 커버 글래스를 벗기고 그 위에 다시 \( 0.7 \% \mathrm { LMA } \) 용액 75 씨로 한겹 더 덮었다. 미리 준비해 둔 차가운 alkali lysis buffer (2.5 M \( \mathrm { NaCl } , 100 \mathrm { mM } \mathrm { Na } \mathrm { EDTA } _ { 2 } , 10 \mathrm { mM } \) tris)에 사용 직전에 \( 1 \% \)Triton X-100을 섞은 후 슬라이드를 담가 저온, 암실에서 1시간 동안 침지시켜 DNA의 double strand를 풀어주었다. Lysis가 끝난 후, 슬라이드를 전기영동 수조에 배열하고 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 차가운 전기영동 buffer \( (300 \mathrm { mM } \mathrm { NaOH } , 10 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { EDTA } , \mathrm { pH } >13 \) )를 채워 40분 동안 unwinding 시켜 DNA의 alkali labile sites가 드러나게 한 후 \( 25 \mathrm { ~V } / 300 \pm 3 \mathrm { ~mA } \) 의 전압을 걸어 20분간 전기영동을 실시하였다. 빛에 의해 DNA 가 부가적으로 손상되는 것을 방지하기 위해 위의 과정은 전기영동 수조를 어두운 천으로 덮은 채 실시하였다. 전기영동이 끝난 후 \( 0.4 \mathrm { M } \) Tris buffer ( \( \mathrm { pH } 7.4) \) 에 5분씩 담가 세척하는 과정을 3회 반복하여 슬라이드를 건조시켰다. \( 20 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 농도의 ethidium bromide로 핵을 염색하여 커버글래스로 덮은 뒤 형광현미경 상에서 관찰하였다. CCD camera를 통해 보내진 각각의 세포핵 이미지는 comet image analyzing system이 설치된 컴퓨터상에서 분석하였다. 백혈구의 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \)에 의한 DNA 손상 및 각 시료에 의한 손상억제 정도는 핵으로부터 이동해서 꼬리 부분으로 떨어져 나간 꼬리 부분 내 DNA % 함량(tail intensity)을 측정하여 나타내었다. 각각의 처리군에서 2개의 슬라이드를 만들어 각각 100개 세포의 DNA 손상 정도를 측정하고 각 처리군은 최소 3회 반복 실험하였다.</p>