내냉성 오이 계통 ‘NC76’와 냉해 감수성인 ‘GY14' 계통 간 DNA 다형성을 총 995개 SSR 마커를 이용하여 스크리닝하였다. 본 실험에는 \(2\%\)의 agarose gel을 사용한 전기영동을 수행하였는데 이는 PCR 증폭된 DNA 조각의 1 또는 2 염기 크기 차이를 구분하기에는 적당하지 않은 DNA 분리 방법이다. 145개의 다형성 SSR 마커가 'NC76'와 'GY14' 오이 교배 집단 게놈에서 위치적으로 고루 분포하고 있음을 확인할 수 있으므로 이들 마커가 현재 확보된 교배집단의 유전자 지도를 작성하는데 유용하게 사용될 수 있음을 보여준다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>전기영동분석</h2> <p>내냉성 오이 계통 ‘NC76’와 냉해 감수성인 ‘GY14' 계통 간 DNA 다형성을 총 995개 SSR 마커를 이용하여 스크리닝하였다. 본 실험에는 2%의 agarose gel을 사용한 전기영동을 수행하였는데 이는 PCR 증폭된 DNA 조각의 1 또는 2 염기 크기 차이를 구분하기에는 적당하지 않은 DNA 분리 방법이다. 하지만 3염기 크기 차이 구분은 충분히 가능하므로 poly-acrylamid gel에 비해 비교적 이용이 쉅고 가격이 저렴한 agarosel gel분석으로 SSR 마커의 크기 다형성을 구분하였다.</p> <p>Fig. 1은 995개의 SSR 마커 중 12개 SSR 마커의 PCR 증폭 결과를 보여준다. DNA 샘플로서 왼쪽에 'NC76' 그리고 오른쪽에 'GY14' DNA가 위치하며 1 부터 12번 까지는 총 12개 SSR 마커의 PCR 증폭 후 전기영동 결과이다. 마커 1번, 8 ,9, 10, 그리고 11번에서 증폭된 DNA 크기 차이를 관찰할 수 있으므로 이들 마커를 'NC76'와 'GY14' 간 공우성 마커로 사용이 가능함을 알 수 있다. 이와 같은 방법으로 총 145개의 'NC76' 과 'GY14' 간 다형성 SSR 마커를 개발 할 수 있었다. 본 연구에 사용한 995개 SSR 마커들이 C. S. var hardwickii (R.) Alef 계통과 'GY14' 간 다형성 마커들로서 유전자 지도 작성에 사용되었음을 감안할 때, 상대적으로 현저히 낮은 수준의 'NC76'와 'GY14'간 다형성 율이 관찰되었음을 알 수 있다. Ren 등의 연구에서 사용된 C. s. var hardwickii (R.) Alef 계통이 'NC76'에 비해 유전적으로 'GY14'과 매우 차이가 나는 오이 야생종이기 때문으로 판단된다.</p> <p>확인된 다형성 SSR 마커가 추 후 ‘NC76'와 'GY14' 교배 집단에서 유전자 지도 작성용 마커로 사용이 가능한지 알아보기 위하여 각 145개 다형성 마커의 7개 오이 연관 그룹 상에서의 분포를 조사해 보았다. 연관그룹 1번에 15개, 2에 15개, 3번에 27개, 4번에 21개, 5번에 26개, 6번에 27개, 7번에 13개의 SSR 마커가 위치하고 있었고 이는 본 연구에서 개발된 145개의 다형성 SSR 마커가 'NC76'와 'GY14' 오이 교배 집단 게놈에서 위치적으로 고루 분포하고 있음을 확인할 수 있으므로 이들 마커가 현재 확보된 교배집단의 유전자 지도를 작성하는데 유용하게 사용될 수 있음을 보여준다.</p> <h2>고해상도 용해 분석(High resolution melting analysis)</h2> <p>PCR 증폭된 SSR DNA 조각의 크기 차이가 2 염기 이하일 때는 일반적인 2% agarose gel에서 크기 구분이 어렵다. 앞에서 확인된 145개의 다형성 SSR 마커외에 크기 다형성을 보이지만 아가로스 젤에서 나타나지 않는 마커는 polyacrylamid gel에서 크기 차이를 구분할 수 있다. 이러한 크기 차이 외에 증폭된 SSR DNA 조각에는 염기서열의 차이도 존재할 수 있는데 이는 일반적으로 염기서열 분석을 통하여 다형성 마커로 개발될 수 있다. 하지만 최근에 개발된 high resolution melt-ing analysis 기술은 단 한 개의 염기 서열 차이에 의하여 달라지는 melting 온도를 구분해 줌으로써 염기서열 분석 없이 SSR 증폭 DNA 조각의 염기서열 차이를 보여줄 수 있다. 따라서 이번 조사에서 2% agarose gel에서 크기 차이가 보여지지 않는 SSR 마커들을 대상으로 HRM 분석을 수행하였다. Fig. 1의 A에서 보여지는 11번째 SSR 마커 (SSR07747)는'NC76'와 'GY14'의 PCR 증폭산물 크기가 동일하게 보여지고 있으므로 다형성 마커로 사용이 불가능하다. 하지만 이러한 DNA 조각의 HRM 분석 결과는 두 DNA 샘플 간 melting curve에 있어 차이를 보여줌으로써 다형성 마커로 사용될 수 있음을 보여준다. 이와 같은 방법으로 총 30개의 다형성 SSR 마커를 HRM 기술을 이용하여 개발 할 수 있었다. Ren 등이 보고한 유전자 지도상에 이들 마커들의 위치를 파악한 결과, 이들 마커 역시 다양한 연관그룹에 고루 분포함을 확인할 수 있었다.</p> <h2>연관분석</h2> <p>20개의 SSR 마커를 대상으로 92개체로 구성된 \( \mathrm{F}_{2} \) 집단의 분리양상을 조사하여 연관 지도를 작성 하였다. 20개 중 13개의 마커가 연관군을 구성하였으며, 또한 Ren 등의 유전지도에서 동일한 연관군에 속했던 마커들이 본 연관 분석에서도 같은 군에 연관되어 있음을 확인할 수 있었다. 하지만 7개의 마커가 연관그룹에 포함되지 못하여 ungrouped 마커로 표기되었는데 이는 마커 간 유전 거리가 너무 멀어서 충분히 신뢰할 만한 연관성을 보이지 못하였거나 마커 사이를 연결해 줄 수 있는 마커의 부재에 인한 것으로 생각된다. 따라서 차 후 더 많은 다형성 마커들을 본 \( \mathrm{F}_{2} \) mapping 집단에 적용함으로써 통계적으로 신뢰가 가능한 연관성이 이들 마커들 간에 회복 될 수 있을 것으로 판단된다.</p>