Qiagen Sensiscript RTkit을 사용하여 다음과 같은 방법으로 reverse transcription을 했다. 10×RT buffer, dNTP mix, sensiscript reverse transcriptase, random hexamer, RNase inhibitor, mRNA를 섞은 후 RNase free water로 전체 반응용액을 \( 20 \mu \mathrm { L } \)로 만들어 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 60분간 정치하였고, 만들어진 RT 생성물로 HSP70 유전자에 대한 증폭반응을 했는데, HSP70의 경우 \( 361 \mathrm { bp } \)의 밴드를 생성하였고 \(\beta\)-Tubulin의 경우는 \( 282 \mathrm { bp } \)의 밴드를 생성하였다.
<h2>RT-PCR 수행</h2> <p>Qiagen Sensiscript RTkit를 사용하여 reverse transcription하였다. 10× RT buffer \( 2 \mu \mathrm { L } \), dNTP mix \( 2 \mu \mathrm { L } \), sensi-script reverse transcriptase \( 1 \mu \mathrm { L } \) 와 random hexamer \( 2 \mu \mathrm { L } \) 및 RNase inhibitor \( 1 \mu \mathrm { L } \) 를 섞고 mRNA \( 5 \mu \mathrm { L } \) 를 섞은 후 RNase free water를 전체 반응용액이 \( 20 \mu \mathrm { L } \) 가 되도록 섞고, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 60 분간 정치하였다. 만들어진 \( \mathrm { RT } \) product를 가지고 HSP70 유전자에 대한 증폭반응을 수행하였다. HSP70의 경우 forward primer cphsp2423F 5'-AAA TGG TGA GCA ATC CTC TG-3'와 reverse primer cphsp2764R 5'-CTT GCT GCT CTT ACC AGT AC-3'를 사용하였고 \( 361 \mathrm { bp } \) 의 밴드를 생성하였다. \( \beta \)-Tubulin의 경우는 1st round \( \mathrm { PCR } \) 시 btub5 5'-GAT TGG TGC TAA ATT CTG GG-3'와 btub2 5'-GTC TGC AAA ATA CGA TCT GG-3', 2nd round PCR 시 btub3 5'-GTC ATT TCT GAT GAG CAC GG-3'와 btub6 \( 5 ^ {\prime } \)-ACA GCA TCT AAG AGT TCA GCT CC-3'를 사용하였다. 이때 \( 282 \mathrm { bp } \) 의 밴드를 생성하였다. 1.5 \% agarose gel에서 ethidium bromide 염색후 생성된 밴드를 확인하였다.</p> <p>PCR 반응조건은 HSP70 의 경우 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 2분, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 30초, \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 45초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 45초의 조건으로 40 cycle 진행한 다음 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } 5 \) 분 동안 extension하였다. Tubulin유전자의 경우는 nested PCR 로 검출하였다. First round RT-PCR로 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 2분, \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 50초, \( 52 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 50초, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } 1 \)분으로 30 cycle 진행한 다음 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } 3 \)분간 extension하였다. Second round RT-PCR에서는 annealing temperature를 \( 57 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 수행하였다.</p>