대구 간조직 추출액을 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 열처리할 경우, 30분 이후로 LDH 활성이 뚜렷하게 감소하며, 50분 이후에는 약 \( 50.5 \% \)의 활성만을 보였다. 또한, 10분의 열처리 과정을 거치면 단백질의 변성이 진행되어 약 \( 35.3 \% \)의 부분만이 원래 상태를 유지했다. 이러한 관찰을 바탕으로, liver-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 열처리를 통해 정제하였다. 다른 한편으로, 칠성장어의 골격근, 심장, 그리고 간조직은 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서의 60분 열처리 이후에도 \( 80 \% \) 이상의 활성을 유지하였으며, 특히 심장과 간조직은 열에 대한 안정성을 보였다. 이러한 결과는 각 종 조직들이 열에 대해 보이는 반응성과 안정성에 대한 중요한 정보를 제공한다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>LDH 동위효소의 열에 대한 안정성</h2><p>대구 간조직 추출액을 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 분간 열처리하면 LDH 활성이 급격하게 감소하기 시작했고, 50 분간 열처리하면 LDH 활성은 \( 50.5 \% \) 가 남았으며, 단백질은 10 분간 열처리하면 급격히 변성되어 \( 35.3 \% \) 가 남았다. 또한 동위효소가 불활성화되는 정도를 확인하기 위해 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 25 분간 열처리한 후 liver-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 \( 87.3 \% \)의 활성이 남아 \( \mathrm{A}_{4} \) 및 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소보다 열에 안정하였고, \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소는 \( \mathrm{A}_{4} \) 보다 안정하였으므로 \( \mathrm{C}_{4}>\mathrm{B}_{4}>\mathrm{A}_{4} \)의 순서로 나타났다(Fig. 2). 따라서 liver-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소를 열처리하여 정제하였다.</p><p>대구목 Melanogrammus aegefinus의 LDH의 열에 대한 안정성은 간>심장>골격근조직으로 나타났고, 농어목 \( \mathrm{Geo-} \) phagus brasiliensis의 LDH는 눈>심장>골격근조직의 순서로 열에 안정하였다. 따라서 본 실험의 결과인 \( \mathrm{LDH} \mathrm{~C}_{4}>\mathrm{B}_{4}>\)\( \mathrm{A}_{4} \)의 순서와 일치하였다. 칠성장어 골격근, 심장 및 간조직을 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60 분간 열처리한 결과 \( 80 \% \) 이상의 활성이 남아 있었으나 심장과 간조직이 유사하고 열에 대하여 안정하였다. 칠성장어 LDH 동위효소의 열에 대한 안정성은 조직에 존재하는 동위효소의 구성 비율에 따라 약간의 차이가 있는 것으로 보이며 대구 LDH 와 비교하면 하부단위체의 분화정도가 낮은 것으로 생각된다.</p><h2>LDH 동위효소의 정제</h2><h3>열처리 및 affinity chromatography</h3><p>칠성장어 간조직은 affinity chromatography를 실시하여 LDH를 정제하였고, 대구 간조직 추출액는 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15 분간 열처리한 후 단백질은 \( 36 \% \) 남았고 LDH는 \( 90 \% \) 가 남아 있어 affinity chromatography와 DEAE-Sephacel chromatography 과정에 의해 LDH를 정제하였다.</p><p>LDH는 oxamate-linked sepharose gel에서 abortive ternary complex (LDH-NAD \( { }^{+} \)-pyruvate)를 형성하는 결합력이 동위효소에 따라 다르므로 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 함유한 buffer 유입시 \( \mathrm{A}_{4} \) 동위효소가 용출되기 시작하고 평형 buffer 유입시 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위 효소가 용출된다. 그러나 진화상에서 하부단위체 A,B 및 C의 분화 정도에 따라 역학적 특성의 차이가 있어 affinity chromatography 상에서 다양한 양상을 보이므로 elution profile에서 동위효소들 간의 진화적 유연관계를 고찰할 수 있다.</p><p>Oxamate-linked sepharose gel에 칠성장어 간조직 추출액을 가한 후 LDH는 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 함유한 buffer 유입시 용출되지 않고 평형 buffer 유입 후 13 번째 분획에서 용출되었다. 그러나 대구 간조직의 LDH 동위효소는 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 함유한 buffer 유입 후 26 번째 분획부터 용출되기 시작하여 평형 buffer 유입 후 57번째 분획까지 용출되었다. \( \mathrm{C}_{4} \) 동위 효소는 LDH 가 확인된 모든 분획에 존재하였고 \( \mathrm{B}_{4} \) 동위효소는 평형 buffer 유입 후 21 번째 분획에서 용출되었다. \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소가 포함된 분획들을 ultrafiltration에 의해 농축시킨 후 DEAE-Sephacel chromatography의 시료로 사용하였다. 칠성장어 간조직 LDH는 대구 LDH 동위효소보다 약간 늦게 용출되기 시작하지만 동위효소들이 분화가 덜되어 서로 분자구조가 유사해서 함께 용출되었으며 대구 LDH와 유사하였다. 대구의 LDH는 여러 개의 peak로 나타나지만 \( \mathrm{C}_{4} \) 동위 효소가 모든 분획에서 확인되고 다른 동위효소들이 함께 용출되었다. 그러나 고등어 LDH의 하부단위체 \( \mathrm{A}^{2} \)는 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 함유한 buffer 유입시 16 번째 분획에서 하부단위체 B, C 와 완전히 분리되어 나왔으므로 대구 LDH의 하부단위체 A, B, C는 고등어 LDH의 하부단위체들 보다 분화가 덜 된 것으로 볼 수 있다. 또한 Ldh-C 유전자가 간과 눈조직에서 동시에 발현되는 Acaronia nassa LDH 동위효소의 경우 oxamate sepharose affinity column에서 liver-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 하부단위체 A, eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 동위효소는 하부단위체 B와 유사하게 용출되었으므로 liver-specific \( \mathrm{C}_{4} \) 와 eye-specific \( \mathrm{C}_{4} \)의 분자 구조에 차이가 있음이 보고되었다. 모래무지의 \( \mathrm{LDH} \mathrm{~A}_{4}\) 동위효소는 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 함유한 buffer 유입시 용출되지 않고 평형 buffer 유입 후 22번 분획부터 용출되었다. 꺽지의 LDH \( \ \mathrm{A}_{4} \)는 \( \mathrm{NAD}^{+} \)를 함유한 buffer 유입 후 34번 분획부터 용출되기 시작하여 평형 buffer 유입 후 27번 분획까지 용출되었고, 칠성장어 골격근의 LDH 동위효소는 평형 buffer 유입 후 23-28번 분획에서 모두 용출되었다. 따라서 affinity chromatography 상에서 대구 LDH는 꺽지와 비슷한 양상을 나타내고 모래무지와 칠성장어 LDH보다는 진화된 것으로 보인다.</p>