한천분해활성을 가지는 세균의 분리를 위해 Marine agar 배지에 시료액을 도말하고 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였다. genomic DNA를 획득하고 16S rRNA 유전자 단편을 증폭하였으며, BLAST를 사용하여 보고된 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열과 유사도를 검토하였다. \( 4 \mathrm{ml} \)의 Marine broth 2216 배지에 순수분리한 HY-1 균주를 접종하고 \( 27^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm} \)에서 하루 동안 진탕배양한 후 \( 50 \mathrm{ml} \)의 Marine broth 2216 배지에 \( 0.2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) agar를 첨가하여 24시간마다 일부 배양액을 채취하여 시간에 따른 한천분해 균주의 생육과 효소의 활성을 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>한천분해 균주의 분리 및 동정</h2> <p>인천시 영흥도에서 한천분해활성을 가지는 세균의 분리를 위한 시료를 채취하였으며, Marine broth 2216 배지(Difco, USA)에 \( 1.5 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 한천을 첨가한 Marine agar배지에 시료액을 도말한 후 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하면서 한천분해활성으로 Marine agar 배지를 함몰시키는 HY-1 균주를 3차례 이상 순수 분리하여 선별하였다. 순수분리된 균체를 대상으로 Wizard Genomic DNA isolation Kit (Promega, Cat.\#: A1120)를 사용하여 genomic DNA를 획득하고, 16S rRNA 유전자 단편을 증폭하기 위한 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. PCR pri-mer로는 1492R (5'-TAC GGH TAC CTT GTT ACG ACT T-3')와 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')를 사용하였으며, 증폭된 DNA 단편은 PCR/Gel Combo Kit (Nucleo Gen, Siheung, Korea)로 정제하였다. DNA 염기서열 분석은 Cosmogenetech (Seoul, Korea)에서 수행하였다. 분석된 염기 서열은 BLAST를 사용하여 보고된 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열과 유사도를 검토하였으며, ClustalX (ver. 2.1) 프로그램으로 다중염기배열(multiple alignment)을 수행한 후 Neighbor-joining method와 Bootstrap method (n=1,000)로 분석하여 계통분류학적 위치를 파악하였다</p> <h2>배양시간에 따른 한천분해 균주의 생육과 효소활성 측정</h2> <p>초대배양으로 Marine broth 2216 배지 \( 4 \mathrm{ml} \)에 순수분리한 HY-1 균주를 접종한 후 \( 27^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm} \)에서 하루 동안 진탕배양하였다. 이후 Marine broth 2216 배지 \( 50 \mathrm{ml} \) 에 \( 0.2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)의 agar를 첨가한 후 초대배양액을 접종한 후 \( 27^{\circ} \mathrm{C}, 250 \mathrm{rpm} \)에서 진탕배양하면서 24시간마다 일부 배양액을 채취하여 시간에 따른 한천분해 균주의 생육과 효소의 활성을 측정하였다. 균주의 생육은 분광광도계로 \( 600 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였고 효소활성은 조효소액을 제조하고 효소활성을 측정하였다.</p> <h2>조효소액의 제조</h2> <p>배양액을 원심분리하여 \( \left(3,000 \times \mathrm{g}, 4^{\circ} \mathrm{C}, 15 \mathrm{~min}\right) \) 균체를 제거한 후 얻어진 상층액 \( 15 \mathrm{ml} \)를 Snake Skin Dialysis Tubing (Thermo Scientific, USA)에 넣고 \( 1,000 \mathrm{ml} \) 비커에 \( 20 \mathrm{mM} \) Tris-HCl ( \( \mathrm{pH} \) 7.0) 완충용액 \( 900 \mathrm{ml} \) 첨가하고, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)의 냉장실에 2시간 정치하는 것을 2번 반복한 후 세번째에는 12시간 이상 투석을 시행하였다. 투석이 완료된 조효소액은 membrane fil-ter \( \left(0.45 \mu \mathrm{m}\right. \), Milipore, USA)를 통과시킨 후에 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 냉장 보관하였다.</p>