본 실험은 라이코펜이 세포에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험이다. 이를 위해 혈관내피세포를 FBS가 첨가된 기저 배징 배양 되었고, C57BL/6 수컷 쥐가 실험에 사용되었다. 세포의 EPCR 발현측정을 위해 효소 면역 측정법이 사용되었으며 실험군으로 라이코펜을 6기간 처리한 혈관내피세포, 대조군으로 처리하지 않은 세포를 사용하였다. 그리고 세포의 viability를 측정하기 위해 MTT assay를 진행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>수용성 EPCR과 TNF-a는 Abnova (Taiwan)에서 구입하였다. Phorbol-12-myristate 13-acetate (PMA), IL-13와 항생제 (penicillin G, streptomycin)는 Sigma (St.Louis, MO)에서 구입하여 사용하였다. 라이코펜은 이전에 설명한 대로 준비되었다.</p> <h2>세포 배양</h2> <p>혈관내피세포(Primary human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)는 Cambrex Bio Science (Charles City, IA)에서 구입하였고 이전에 설명한 대로 배양하였다. 즉, 세포들은 Fetal Bovine Serum (FBS, Cambrex Bio Science)가 첨가된 EBM-2 기저 배지에 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건을 유지시키면서 배양되었다. Passage Number 3 또는 4 번으로 분주된 HUVECs이 실험에 사용되었다.</p> <h2>동물과 사육</h2> <p>C57BL/6 수컷 쥐(6-7주 된, \( 18-20 \mathrm{~g}) \)는 Orient Bio Co.(Sungnam, KyungKiDo, Republic Korea)에서 구입하였고, 12일 적응시킨 후에 사용하였다. 동물들은 polycarbonate 케이지에서 조건\((20-25^{\circ} \mathrm{C} / \mathrm{RH} 40-45\%)\)을 조절하고 12:12시간 낮/밤 주기로 5마리씩 사육하였고, 일반적인 설치류 먹이와 물을 자유식으로 공급하였다. 모든 동물들은 경북대학교에서 발행한 Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals에 부합되게 처리되었다.</p> <h2>세포의 EPCR 발현측정을 위한 효소면역측정법(Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)</h2> <p>개선된 whole-cell ELISA는 HUVECs에서 EPCR의 발현 정도의 측정을 위해 이전에 설명한대로 수행되었다. 즉, 단층의 HUVEC은 라이코펜을 6시간 동안 처리한 것과 처리하지 않은 군으로 분리하고 PMA, 종양괴사인자(tumor necrosis factor (TNF)-a, TNF-a) 혹은 인터류킨 (interleukin, 1L) - 1\(\beta\)를 1시간 처리하여 실험하였다. 그 후 배지는 제거하고 세포들은 phosphate buffered saline (PBS)에 씻어주고 상온에서 15 동안 \( 50 \mu \mathrm{l} \)의 \( 1 \% \) paraformaldehyde로 고정시킨다. 세포를 씻어 준 후 \( 100 \mu \mathrm{l} \)의 EPCR 항체(Abonova)를 첨가하고 1시간 \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}\right. \),\( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) ) 후에 3번 씻어주고 peroxidase가 결합된 항 토끼 IgG 항체(Sigma, Saint Louis, MO)를 1:2,000으로 \( 100 \mu \mathrm{l} \)처리한다. 1시간 후에 3번에 걸쳐 씻어주고 O-phenylenediamine 기질(Sigma, St.Louis, MO)을 넣고 \( 490 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정한다. 모든 측정은 3개 well에서 수행되었다. EPCR의 변이계수(coefficient of variability, CV); inter-assay는 \( 8-12 \% \) 보다 적었고, intra-assay는 \( 6-8 \% \)보다 적었다.</p> <h2>세포 Viability 측정</h2> <p>라이코펜이 세포에 미치는 viability를 측정하기 위해 MTT를 사용하였다. 혈관내피세포 \( \left(5 \times 10^{3}\right. \)개/well)을 하루 동안 배양한 후, 농도별 라이코펜을 처리하였다. 48시간 후, 세포를 씻은 후, \( 100 \mu \mathrm{l} \)의 MTT\(\ (1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)을 넣어주고 4 시간 배양하였다. \( 100 \% \) DMSO \( 3 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 세포에 흡수된 MTT for-mazan을 녹여내고 96-well 배양접시에 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 분주하여 \(540 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>