PeFLS와 ROMT-9를 이용하여 naringenin으로부터 isokaempferide를 생합성하고 S-adenosyl methionine (SAM)의 생합성 증가를 시도하여 isokaempferide 생합성 최적화를 실시하였으며 PeFLS의 발현벡터는 이전에 클로닝한 플라스미드를 주형으로 PCR을 통해 제작하였고, ROMT-9의 발현벡터는 pET-21a(+)를 이용하여 제작하였다.PeFLS와 ROMT-9를 담고 있는 단일 콜로니를 LB배지에 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 밤새도록 배양하였으며 배양 12, 24시간 후에 샘플을 회수하고 거기에 동량의 에칠아세테이트를 2번 반복 첨가하여 반응산물을 추출하였다.
<p>본 연구에서 Poplar flavonol synthase (PeFLS)와 Rice O-mthyltransferae-9 (ROMT-9)를 이용하여 naringenin으로부터 isokaempferide를 생합성을 시도하였다. 또한 메칠전이효소의 donor로 사용되는 S-adenosyl methionine (SAM)의 생합성 증가를 시도하였고, isokaempferide생합성 최적화를 실시하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <p>PeFLS의 발현벡터제작은 이전에 클로닝한 플라스미드를 주형으로 이용하였다. PCR은 Taq polymerase를 활성화 시키기 위하여 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 배양한 후 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분, \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분, 총 35회 반복조건하에서 Hotstart Taq polymerase (Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 실시하였다. Forward primer로 AT \( \underline { GAATTC } \)GATGGAGTTTGATAGAGTTCAA (밑줄 EcoR Ⅰ)와 reverse primer로 CAT \( \underline { GCGGCCGC } \)CTACTGGGGGAGACGATTG (밑줄 Not Ⅰ)을 실험에 사용하였다. PCR산물은 아가로스겔상에서 전기영동 한 후 Gel DNA Purification Kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 정제하여 EcoR Ⅰ/NotⅠ 제한효소를 처리한 후 pCDFDuet의 동일한 제한효소자리에 클로닝 하였다. ROMT-9은 이전의 연구에서 구축된 플라스미드를 본 연구에 사용하였다.</p> <p>대장균 BL21 (De3)에서의 MetJ의 결실은 quick and easy conditional knockout kit (Gene Bridges, Heidelberg, Germany)를 사용하였다. MetJ 결실은 FRT-PGK-gb2-neo-FRT DNA를 template로 forward primer로 \( 5 ^ {\prime } \)-CGTAGCGCATCAGGCGATTCCACTCCGCGCCGCTCTTTTTTGCTTTAGTAAATTAACCCTCACTAAAGGGCG- \( 3 ^ {\prime } \)와 reverse primer로 \( 5 ^ {\prime } \)-TTCTTTGCGTATAGATTGAGCAAATCCCAAATAGCCGTTAAAATTATATGTAATACGACTCACTATAGGGCTC- \( 3 ^ {\prime } \)를 사용하였다. 돌연변이체의 확인은 forward primer \( 5 ^ {\prime } \)-GGTCGCAGACAACGTGCTCG- \( 3 ^ {\prime } \)와 reverse primer \( 5 ^ {\prime } \)-ACGCACTGCGATGGTGGCCT- \( 3 ^ {\prime } \)를 가지고 PCR로 확인하였다.</p> <h2>생물전환</h2> <p>PeFLS와 ROMT-9를 담고 있는 단일 콜로니를 ampicillin ( \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \)과 spectinomycin \( (50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \)이 공급된 LB배지에 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 밤새도록 배양하였다. 다음날 아침 동일한 항생제가 첨가된 \( 25 \mathrm { ~mL } \)LB 배지를 담고 있는 \( 250 \mathrm { ~mL } \) 플라스크에 배양액 \( 250 \mu \mathrm { L } \)를 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다. 세포밀도가 OD \( 600 \mathrm { ~nm } \)에서 1.0에 도달하였을 때 IPTG의 최종농도가 \( 1 \mathrm { ~mM } \)이 되게 첨가하고 배양플라스크를 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 이동하여 20시간 동안 재조합단백질을 유도하였다. 배양이 끝난 후 원심분리기를 이용하여 세포를 회수한 후 \( 10 \mathrm { ~mL } \) Andrew's Magic Media (AMM)배지로 2회 세척하고 동일 배지에 세포밀도가 OD \( 600 \mathrm { ~nm } \)에서 3.0이 되게 현탁 하였다. 배양배지에 ITPG \( 1 \mathrm { ~mM } \), ampicillin \( 50 \mu \mathrm { g } \), spectinomycin \( 50 \mu \mathrm { g } \), naringenin \( 300 \mu \mathrm { M } \)의 최종농도가 되게 첨가하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 생물전환을 실시하였다. 배양 12, 24시간 후 \( 500 \mu \mathrm { L } \)의 샘플을 회수하고 거기에 동량의 에칠아세테이트를 첨가하여 2회 반복하여 반응산물을 추출하였다. 반응산물은 진공건조기를 위하여 완전히 건조하여 DMSO \( 80 \mu \mathrm { L } \)에 다시 녹여 HPLC 분석에 이용하였다.</p>