본 연구에서는 누에 배양세포(Bm5)의 소포체 내에 비정상 구조를 가지는 단백질들이 발생할 때, 정상구조를 가지는 단백질로 재생하는 분자샤페론이나 folding enzyme의 전사를 증가시키는 효모의 Hac1p와 유사한 기능을 하는 전사제어인자를 코딩하는 유전자를 선발하기 위해 N-glycosylation 형성 저해제인 tunicamycin을 처리하여 cDNA 유전자은행을 제작하고 in vivo excision 방법을 이용하여 768 개의 cDNA 클론을 선발하여 40개의 차별화 발현 클론을 선발하였다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>차별화 선별법에 의한 차별화 발현 클론 선발</h2> <p>누에 배양세포(Bm5)의 소포체 내에 비정상 구조를 가지는 단백질들이 발생될 때, 정상구조를 가지는 단백질로 재생하는 분자샤페론이나 folding enzyme의 전사를 증가시키는 효모의 Hac1p와 유사한 기능을 하는 전사제어인자를 코딩하는 유전자를 선발하기 위하여, 누에 배양세포에 N-glycosylation 형성 저해제인 tunicamycin \( (5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m} \ell) \)을 처리 하여 cDNA 유전자은행을 제작하였다. cDNA 유전자 은행으로부터 cDNA 파아지 클론들을 in vivo excision 방법을 이용하여 플라스미드로 전환하여 무작위로 768 개의 cDNA 클론을 선발한 후 hybri-dot manifold system (BRL Co., USA)을 이용하여 2장의 나일론 막에 동일하게 blotting하였다. 이때 사용한 cDNA 탐침은 정상 세포주와 tunicamycin이 처리된 배양세포로부터 각각 분리한 poly(A)+RNA를 이용하여 합성한 1st-strand cDNA를 사용하였다. 그 결과, 정상 세포주에 비해 tunicamycin이 처리된 배양세포주에서 분리한 poly(A)+RNA 를 이용하여 합성한 1st-strand cDNA를 탐침으로한 나일론 막에서 더 강한 반응을 나타내는 40개의 차별화 발현 클론에 대하여 부분 염기서열 분석 데이터베이스 검색을 통하여 발현 유전자 꼬리표(Expressed Sequence Tags; ESTs)를 작성한 후 DDBJ 국제 유전자은행에 등록하였다.</p> <p>본 연구에서는 선발한 40 개의 차별화 발현 클론 중에서 기존에 밝혀진 효모의 전사제어인자 Hac1p (Homology to ATF and CREB)와 1차 아미노산 구조가 유사한 TmInc329 클론을 선발하여 전체 염기서열 분석 및 유전자의 톡성을 분석하였다. 이는 전사제어인자의 경우, 효모에서 연구가 선행된 이후 포유동물 등에서 많은 연구가 보고된 반면에 곤충에서는 전무한 실정이며, 또한 현재 곤충 세포주에서 재조합단백질 발현시 재조합단백질의 고차 구조 형성 및 번역 후 변형과정(post-translational modification)에서의 문제점이 제기됨으로 이를 해결하기 위한 누에 배양세포주로부터 분리한 분자샤페론이나 folding enzyme의 전자를 조절하는 전사제어인자의 연구 가치가 충분하다고 사료되었기 때문이다.</p> <h2>Tmlnc329 클론의 전체 염기서열 결정</h2> <p>TmInc329 클론의 전체 염기서열 분석 결과, \( 822 \mathrm{bp} \) 의 염기로 구성되어 있었으며 이 cDNA로부터 105 개의 아미노산을 연역할 수 있었다. 또한 316 번째 염기 위치에서 번역종결 코돈인 TAA클 확인할 수 있었으며 774번째 염기 위치에서 잠정 전사종결신호인 'AATAAA'를 확인할 수 있었고 795 번째 염기 위치에서 poly (A) tail을 확인할 수 있었다. 그러나 cDNA 클론은 5' 쪽의 번역 개시코돈인 (ATG) 를 포함하고 있지 않아, TmInc329 클론의 전체 염기 서열 결정 및 유전자를 확보하기 위하여 Clontech 사의 Marathon cDNA Amplification Kit를 사용하여 5'-Rapid Amplication of cDNA ends (RACE) PCR을 실시하였다. 그 결과 TmInc329 클론은 \( 1,386 \mathrm{bp} \)의 염기로 구성되어 있었으며 172 번째 염기에서 개시되어 882 번째 염기 위치에서 종결되는 open reading frame (ORF)을 가지고 있었다. 이 cDNA의 ORF로부터 236개의 아미노산을 연역할 수 있었으며, 이 연역 아미노산으로부터 추정되는 단백질의 분자량은 \( 26.1 \mathrm{kDa} \) 이었다. 전체 염기서열이 결정된 TmInc329 클론을 ATFC (Activating Transcription Factor of Chaperone)로 명명하고 국제 유전자은행에 등록하였다 (GenBank acc. No. AF325210).</p>