Cannell 등의 방법에 따라 elastase 저해활성과 astringent 활성을 측정하였다. Elastase 저해활성은 \( \mathrm { N } \)-succinyl-(L-Ala) \( { } _ { 3 } \)-p-nitroanilide를 사용하여 445nm 에서 측정하고, astringent 활성은 혜모글로빈을 사용하여 576nm 에서 측정하였다. 또한 B16F10 melanoma cell을 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin (100 U/ml)을 첨가한 DMEM 배지에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.
<h2>Elastase 저해활성 측정</h2> <p>Cannell 등의 방법[15]에 따라 elastase 저해활성 측정을 실시하였다. 기질로서 \( \mathrm { N } \)-succinyl-(L-Ala) \( { } _ { 3 } \)-p-nitroanilide (Sigma, USA)를 사용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 분간 기질로부터 생 성되는 p-nitroanilide의 생성량을 445nm 에서 측정하였다. 시험용액을 일정 농도가 되도록 희석하여 \( 40 \mu \mathrm { l } \) 씩 96-well plate에 취하고, \( \mathrm { mM } \) tris- \( \mathrm { HCl } \) buffer ( \( \mathrm { pH } \) 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase \( (2.5 \mathrm { U } / \mathrm { ml } ) 40 \mu \mathrm { l } \) 을 가하고, 기질 은 \( 50 \mathrm { mM } \) tris- \( \mathrm { HCl } \) buffer ( \( \mathrm { pH } \) 8.6)에 녹인 \( \mathrm { N } \)-succinyl-(LAla \( )_ { 3 } \)-p-nitroanilide \( (0.5 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } ) \) 을 \( 80 \mu \mathrm { l } \) 첨가하여 30분간 반응시킨 후 p-nitroanilide의 생성량을 \( 445 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하 였다. Elastase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구 의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <h2>Astringent 활성 측정</h2> <p>Astringent 활성 측정은 Lee 등의 방법[16]에 따라 측정하 였다. 피부 단백질과 유사한 혈액단백질인 혜모글로빈을 사 용하였으며, 원심분리관 용기에 각각의 시료용액과 혜모글 로빈 용액을 1:1로 넣어 진탕 혼합한 후 1,500rpm 에서 3분간 원심분리 후 576nm 에서 흡광도를 측정하였다. Astringent 활성측정은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p> <h2>세포 배양</h2> <p>본 실험에 이용한 melanoma cell인 B16F10는 ATCC (USA)에서 구입하여 사용하였다. 배양은 10% fetal bovine serum (FBS)와 1% penicillin/streptomycin (100 U/ml)을 첨가한 dulbecco's modified eagle medium (DMEM) 배지 를 사용하였으며, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.</p>