본 연구는 항산화물질에 반응하는 형질전환마우스 생성을 위한 hPrx 6/Luc 벡터를 제조하였다. 이 벡터는 폐 상피암세포주에서의 반응을 통해 세포 내 Prx6~mRNA의 존재를 효과적으로 확인하며, 이는 SOD 활성과 연관성이 있음을 나타내었다. 이를 바탕으로, 이 벡터를 이용한 형질전환마우스의 개발은 항산화물질의 효능 평가에 대한 보다 정확한 방법을 제공할 수 있을 것이다. 반면, \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)의 적절한 농도는 유전자 발현, 세포 성장 및 분화를 자극하나, 고농도에서는 세포에 손상을 입히는 것으로 확인되었다. 이런 관점에서 본 실험에서 사용된 항산화추출물은 Prx 6의 발현유도에 적합함을 나타냈다. 그러나 ROS를 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)로 변화시키는 SOD와 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 제거하는 Prx 6의 기능적 차이를 설명하기 위해서는 추가적인 연구가 필요하다. 끝으로, 본 연구에서 RLP의 항산화 기능을 규명하였는데, 이는 향후 RLP의 신약 개발 가능성을 제시하였다.
<h1>고 찰</h1> <p>대부분의 포유동물에서 발생하는 호기성대사에서는 산소를 물로 순차적으로 환원하는 과정에서 활성산소(ROS)가 생성되며, 이들은 SOD에 의해 산소에 하나의 전자가 부가됨에 따라 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 가 형성된다. 체내에서 적절한 농도의 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 는 유전자발현과 세포성장 및 분화를 자극하지만, 고농도의 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 는 막지질과 핵산, 단백질에 손상을 초래한다. 과도하게 생성된 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 는 많은 생물체에서 catalase, glutathione peroxidase (GPx) 또는 Prx와 같은 항산화효소에 의해서 제거되므로 산화적 손상이 예방된다. Prx는 이러한 항산화효소 중의 하나로서, 최근에 주목받고 있는 티올-특이적 항산화 단백질로 다양한 과산화물을 환원시키는 항산화효소로 작용한다. 그러나 Prx의 항산화물질 반응 특성을 이용하여 항산화능을 검색하는 시스템에 적용하려는 새로운 시도는 없었다. 따라서 본 연구에서 제시된 결과는 Prx의 새로운 가능성을 제시하는 중요한 의미를 내포하고 있는 것으로 사료된다.</p> <p>항산화추출물질로 사용된 KWG, KRG, LP, RLP는 최근까지도 다양한 만성질환의 치료제로서 뿐만 아니라 면역력 증진제로서 가능성이 연구되고 있다. KWG는 세계적으로 가장 잘 알려진 천연물의약품으로 주요한 작용을 하는 물질은 사포닌 이라고 알려져 있는 ginsenoside이다. 일부 연구에서는 ginsenoside 중에서 가장 중요한 작용을 하는 Rg 1이 폐에 유익한 작용을 하며, 간과 뇌에서 지질의 과산화를 막을 뿐만 아니라, SOD활성을 통해 뉴런의 산화적 스트레 스를 억제한다고 보고되어있다. 또한, KWG를 증숙가공하여 제조한 KRG도 인간의 dermal fibroblast에서 radical scav-enging activity와 SOD activity를 유도하였다. LP는 백합과에 속하는 다년생 상록 초본식물로, 우리나라에서는 남부지역에 널리 자생하고 있는 한국산 LP를 주로 약재로 사용한다. 항암효과, 세포보호 및 기억력 증진효과를 포함하여 LP의 다양한 생리활성이 보고되어 있지만 항산화능에 관한 연구는 미흡한 실정이다. Bae 등은 LP 의 총 항산화능을 ABTS 양이온 소거능으로 측정하였을 때, LP의 항산화능은 무처리군에 비해 열수추출물의 농도와 열처리 가공온도가 증가할수록 항산화활성이 증가한다고 보고하였다. 또한 LP의 total saponin은 Ninety Kunming 마우스에서 SOD activity와 GSH-Px 수준의 증가를 유도하였다. 비록 이전에 보고된 논문과 각 물질을 추출하는 방법에는 차이가 있었지만, 본 실험에서 측정된 SOD activity는 전반적으로 이전의 보고와 매우 유사하였다. 이러한 결과는 본 실험에서 사용된 항산화추출물이 우수한 항산화능을 갖고 있으므로 Prx 6의 발현유도에 적합함을 제시하고 있다.</p> <p>최근까지도 Prx promoter에 대한 연구는 거의 수행되지 않고 있다. 일부 Prx 1 promoter에 대한 연구에 따르면, 이들 promoter는 phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-a-cetate (TPA)에 반응할 수 있는 element를 포함하지만 tran-scription factor Nrf2에 반응할 수 있는 element는 포함하지 못하고 있음을 보여주고 있다. 또한, 여기에는 여러 개의activator protein 1-c (AP-1-C) response element들과 nu-clear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-кB) response element도 포함하고 있다. 하지만 Prx 6 promoter에 대한 연구는 현재까지 수행되지 않고 있으며, 본연구에서 처음으로 그 가능성을 평가하였다. 본 연구의 결과에 따르면, Prx 6 promoter는 항산화물질에 효과적으로 반응하기 때문에 다양한 response element가 존재할 것으로 추정된다. 특히, hPrx 6 promoter에는 AP-1-C, TATA box bind-ing protein (TBP), Nrf2 response element 유사서열이 관찰되었음을 알 수 있었다. 또한 제조된 hPrx 6/Luc 벡터를 이용하여 최종적으로 모델동물을 개발한다면 항산화물질의 검색에 효과적으로 적용이 가능할 것으로 사료된다. 하지만 Prx 6 promoter에서 새로운 response element를 찾는 연구는 추가적으로 수행된다면 형질전환마우스의 항산화물질에 대한 반응성의 구체적인 기전을 규명하는데 중요하게 기여하리라 사료된다.</p> <p>한편, 본 연구에서 항산화물질의 하나로 사용한 LP는 세포에서 항산화관련 인자의 변화에 대해 서로 다른 반응이 관찰되었다. 즉, SOD는 LP처리에 의해 유도되지 않고 오히려 감소하였으나, hPrx 6/Luc 벡터에 의한 luciferase 활성은 크게 증가하였다. 이러한 차이는 ROS를 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 로 변화 시키는 SOD 와 생성된 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 를 제거하는 Prx 6 기능적 차이에서 비롯된 것으로 사료되나 보다 근본적인 원인을 연구하기 위해서는 추가적인 연구가 필요할 것이다.</p> <p>또한 본 연구에서는 항산화 추출물에 의해 유도되는 hPrx 6/Luc의 반응을 알아보기 위해서 hPrx 6/Luc 벡터를 tran-sient transfection한 세포주를 이용하여 luciferase activity를 측정하였다. 본 연구의 궁극적인 목적을 세포주를 이용하여 항산화물질을 검색하는 시스템을 개발하는 것으로 한정한다면, stable transfection을 실시하여 클론을 확보함으로서 지속적으로 효능평가에 사용하는 것이 일정한 결과를 확보하는 우수한 방법일 것이다. 그러나, 본 논문은 최종적인 목적인 형질전환마우스를 개발하기 위한 중간단계로서 hPrx 6/Luc 벡터를 제조하여 제조된 벡터가 세포주 내에서 성공적으로 발현되고 반응하는 지를 평가하는 단계이다. 따라서, hPrx 6/Luc 벡터는 transient transfection을 실시하여 신속히 반응성을 관찰하는 것만으로도 연구목적을 달성하는데 충분한 것으로 사료된다. 또한, 이전의 연구에서도 간단하고 신속하게 유전자의 발현을 확인하기 위한 방법으로 stable transfection보다 transient transfection을 실시하여 확인하는 연구들이 보고되었다. Transient transfection은 비록 세포주 집단 전체의 반응성을 나타내지는 못하지만 유전자의 안정적 발현이나 세포내 반응을 신속하고 간편하게 확인할 수 있는 방법으로 다양한 연구에 널리 적용되고 있다. 따라서, 본 연구에서도 이를 적용하여 신속히 hPrx 6/Luc 벡터의 가능성을 세포주에서 평가하기 위해 transient transfection을 실시하였다.</p> <p>더불어 본 연구에서는 hPrx 6/Luc 벡터의 농도별 반응성을 관찰하기 위하여 RLP를 선별하여 luciferase activity를 측정하였다. 지금까지 KWG와 KRG의 항산화능에 대한 연구는 이전의 연구에서 많이 규명되었지만, RLP의 이러한 기능에 대한 연구는 아직 없다. 따라서 RLP의 항산화에 대한 새로운 기능을 규명한 본 연구는 향후 RLP의 신약으로써 높은 발전기능성을 제시하고 있다.</p> <p>이상의 결과를 종합해보면, 본 연구에서는 형질전환마우스를 생산하기 위해 제작된 hPrx 6/Luc 벡터가 성공적으로 제조되었고, 이는 폐 상피암세포주에서 항산화물질에 반응함을 제시하고 있다. 또한, 이러한 결과는 hPrx 6/Luc 벡터에 의한 반응은 세포 내 Prx6~mRNA를 확인하는 방법보다 효과적이며, SOD 활성과 연관성이 있음을 제시하고 있다. 따라서, 이러한 반응의 결과를 토대로 형질전환마우스를 개발한다면 보다 정확하고 과학적으로 항산화물질의 효능을 평가할 수 있는 방법으로서 발전가능성을 제시하고 있다.</p>