체중 약 \( 600 \mathrm { ~kg } \)의 흘스타인 착유우 2두로부터 반추위액을 채취하여 in vitro 시험을 진행하였다. 사료와 물, 미네랄 블록은 특정 비율과 일정 시간에 분할하여 급여하였다. 배양액 제조는 Dehority와 Scott의 방법에 따라 이루어졌으며, 부유된 사료입자를 제거한 후의 반추위 혼합 미생물을 사용하였다. 멸균이 완료된 배양관에 미생물을 접종하고, 다양한 시간 동안 shaking incubator에서 배양을 진행하였다.
<h2>공시축 및 사양관리</h2> <p>반추위 누관이 장착된 체중 약 \( 600 \mathrm { ~kg } \)의 흘스타인 착유우 2두로부터 in vitro 시험을 위한 반추위액을 채취하였다. 사료는 농후사료와 조사료(볏짚 + 티모시)의 비율을 풍건기준으로 \( 4:6(2 + 4) \)으로 하여 체중의 \( 3 \% \)양을 1일 2회( \(06:00 \)와 \(16:00 \)) 분할하여 급여하였고, 물과 미네랄 블록은 자유 섭취토록 하였다.</p> <h2>In vitro 배양 및 실험설계</h2> <p>In vitro 배양액은 Dehority artificial medium을 사용하였고 Dehority와 Scott의 방법에 따라 제조하였다. 반추위 혼합 미생물로 사용될 위액은 in vitro 미생물 접종 개시 2시간 전에 반추위 cannula를 통하여 채취하였다. 채취한 위액은 미리 보온되고 oxygen free \(- \mathrm { CO_2 } \) gas가 충전된 용기에 담아 실험실로 운반한 다음 사료 입자에 부착되어 있는 미생물을 분리하기 위하여 homogenizer에 넣고 oxygen free \(- \mathrm { CO_2 } \) gas를 충전하여 강하게 교반한 다음 2겹의 cheese cloth로 여과하여 반추위 미생물을 분리하기 위한 시료로 사용하였다. 여과된 위액은 30분~1시간 정도 정치시켜 사료입자를 부유시킨 다음 진공펌프로 부유된 상층액을 완전히 제거시킨 후, 하층액을 반추위 혼합 미생물로 사용하였다.</p> <p>공시된 기질(볏짚, 알파파 건초, filter paper 그리고 톨페스큐 건초) 약 \( 750 \mathrm { ~mg } \)을 \( 30 \mathrm { ~ml } \)의 배양관 (serum bottle)에 넣고 \( 9 \mathrm { ~ml } \)의 Dehority artificial medium (NIS 처리구는 me-dium 제조시에 NIS가 총 배양액에 \( 0.05 \% \) \( ( \mathrm { v } / \mathrm { v } \))되게 첨가, Control구는 동일양의 증류수로 대체함)을 anaerobic gas-sing system을 이용하여 혐기적으로 분주한 다음 \( 121 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20분간 멸균 시켰다. 멸균이 완료된 배양관에 시험설계에 따라 분리된 반추위 혼합 미생물을 각각 \( 1 \mathrm { ~ml } \)씩 혐기적으로 접종한 다음 2, 4, 8, 12, 18, 24, 36, 48 그리고 72 시간동안 \( 38 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 shaking incubator \( (120 \mathrm { ~rpm } ) \)에서 각 처리구마다 3반복으로 배양하였다. 각 배양 시간이 완료되면 발효시험관을 shaking incubator에서 꺼낸 후, gas 발생량 측정, 미생물 성장량과 효소활력 측정을 위한 sample 채취, 그리고 \( \mathrm { pH } \) 측정 및 in vitro 소화율 측정의 순으로 분석작업을 수행하였다.</p>