Native-PAGE를 사용하여 비변성 조건 \( ( \mathrm { pH } \) 3.4)에서 30분간 방치한 후, \( 2 \mathrm { mM } \mathrm { ABTS } \) 용액과 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 2분간 반응시켜 laccase의 활성을 측정하는 활성 염색법을 사용하였다. \( M \). scorodonius의 균사체에 대한 리그닌 분해능을 확인하기 위하여 리그닌과 guaiacol이 첨가된 agar 배지상에서 균사체를 배양하면서 형성되는 갈색환의 유무를 확인하였을 때, 배양시간이 경과함에 따라 리그닌 분해 활성이 증가하는 것으로 확인되었다.
<h3>활성 염색</h3> <p>배양액 중에 생산된 laccase의 존재유무를 알아보기 위하여 조효소액을 \( 10 \% \) Native-PAGE를 사용하여 비변성 조건에서 전기영동한 후 활성염색법을 수행하였다. 전기영동한겔은 \( 0.5 \mathrm { M } \) citrate buffer \( ( \mathrm { pH } \) 3.4)에서 30분간 방치한 후 새로운 buffer로 교환하는 과정을 3회 반복하였다. 이후에 전기영동 겔은 \( 0.5 \mathrm { M } \) citrate buffer \( ( \mathrm { pH } \) 3.4)에서 조제한 \( 2 \mathrm { mM } \mathrm { ABTS } \) 용액과 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 2분간 반응시켜 생성되는 단백질 band를 확인하였다.</p> <h3>최적 \( \mathrm { pH } \) 와 최적 온도</h3> <p>효소활성에 대한 \( \mathrm { pH } \)의 영향을 조사하기 위해 \( 50 \mathrm { ~m } \) ] potassium chloride-HCl buffer ( \( \mathrm { pH } \) 1.0-2.2), \( 50 \mathrm { mM } \) glycin \( \mathrm { HCl } \) buffer \( ( \mathrm { pH } \) 2.2-3.4), \( 50 \mathrm { mM } \) sodium acetate buffe ( \( \mathrm { pH } \) 3.4-5.5), \( 50 \mathrm { mM } \) sodium phosphate buffer ( \( \mathrm { pH } 5 \). 7.5), \( 50 \mathrm { mM } \) Tris-HCl buffer ( \( \mathrm { pH } \) 7.5-9.0)을 사용하여 \( 75 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 효소활성을 측정하였다. 효소활성에 대한 온도의 영향은 효소액의 반응온도를 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \)까지 \( 5 ^ {\circ } \mathrm { C } \)간으로 변화시키며 \( 50 \mathrm { mM } \) acetate buffer \( ( \mathrm { pH } 3.4) \)에서 활성을 측정하였다.</p> <h2>결과 및 고찰</h2> <h3>리그닌 분해능 확인</h3> <p>본 실험에 사용된 \( M \). scorodonius의 균사체에 대한 리그닌 분해능을 확인하기 위하여 리그닌과 guaiacol이 첨가된 agar 배지상에서 균사체를 배양하면서 형성되는 갈색환의 유무를 확인하였다. 그 결과 배양 시간 8일째에 \( 4 \mathrm { ~cm } , 14 \) 일째에 \( 6 \mathrm { ~cm } \)의 갈색환을 형성하여 \( M \). scorodonius는 리그닌을 분해하는 것으로 나타났고, 배양시간이 경과함에 따라 리그닌 분해 활성이 증가하는 것으로 확인되었다. Marsmix 속 균주 중에서는 \( M \). quercophilus 균주가 laccase를 생산하는 것으로 처음 보고되었고, 그 이후에 리그닌을 분해하는 Marasmius 속 균주는 보고된 것이 없다. 본 연구 결과를 바탕으로 \( M \). scorodonius 는 리그닌을 분해하는 백색부후균인 것으로 처음 판명되었다.</p>