disc agar diffusion method로 H. pylari에 대한 callus 추출물의 항균활성을 검색하고자 실험을 설계하였다. 먼저 Callus 추출물을 동결 건조하여 얻은 powder \( 500 \mathrm{mg} \) 을 Sephadex LH-20 column과 MCI-gel CHP 20P column에 의해 분획하고 분리된 용출액을 silical gel plate로 \( \mathrm{CHC}_{3} \) : ethylfomate : ethyl acetic acid : \( \mathrm{MeOH} \) (5:2:5:0.5, \( \mathrm{V} / \mathrm{V} / \mathrm{V} / \mathrm{V}) \) 의 용매를 사용하여 전개한 다음 \( 10 \% \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 를 분무하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 발색시켜 분리정도를 확인하였다. 이후 할로겐화 알칼리 정제법, \( \mathrm{FT} \) 방법 등을 활용해 정제물질을 구조분석하였다.
<h2>Callus 추출물의 H. pylari 항균활성 검색</h2> <p>H. pylari에 대한 callus 추출물의 항균활성 검색은 disc agar diffusion method로 실시하였다. Disc agar diffusion법은 H. pylori 최적배지 plate에 \( H \) pylori균 \( 100 \mu \) 를 분주하여 멸균 유리봉으로 도말한 다음, 멸균된 disc paper ( \( \phi 8 \mathrm{~mm} \) )를 올리고 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) membrane filter로 제균한 각 추출물을 vacuum evaporator로 농축한 후 멸균수로 희석하여 phenolic com-pound의 함량이 \( 50 \sim 200 \mu \mathrm{g} / 100 \mu \mathrm{l} \) 가 되도록 조절한 후 각 추출물 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 를 disc paper에 흡수시키고, 대조구로는 멸균수를 흡수시킨 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 미 호기성 조건에서 48시간 동안 in-cubation한 다음, disc 주위의 clear zone 생성 유무를 확인하였다.</p> <h2>H. pylori 항균활성을 가지는 callus 추출물의 분리 및 정제</h2> <p>Callus 추출물을 동결 건조하여 얻은 powder \( 500 \mathrm{mg} \) 을 Sephadex LH-20 column \( (10 \times 105 \mathrm{~cm}) \) 과 MCI-gel CHP 20P column \( (3 \times 45 \mathrm{~cm}) \) 에 의해 분획하였다. 용출액은 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 과 etha-\( \mathrm{nol} \) 및 methanol을 사용하였으며, 분획물은 TLC상에서 phe-nolic compound의 분리 정도를 확인한 후 농축시켜 disc method로 H. pylori에 대한 항균활성을 실험하였다.</p> <h2>Thin layer chromatography</h2> <p>Column에 의해 분리된 용출액을 silical gel plate \( (5.0 \times 5.0 \) \( \mathrm{cm}) \) 로 \( \mathrm{CHC}_{3} \) : ethylfomate : ethyl acetic acid : \( \mathrm{MeOH} \) (5:2:5:0.5, \( \mathrm{V} / \mathrm{V} / \mathrm{V} / \mathrm{V}) \) 의 용매를 사용하여 전개한 다음 \( 10 \% \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 를 분무하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 발색시켜 분리정도를 확인하였다.</p> <h2>정제물질의 구조분석</h2> <p>정제물질의 구조분석은 melting point 및 \([\alpha]_{\mathrm{D}} \) 를 측정하였고, 할로겐화 알칼리 정제법을 이용한 infrared spectrum을 측정하였으며, \( { }^{1} \mathrm{H} \) 및 \( { }^{13} \mathrm{C}-\mathrm{NMR} \) spectrum은 \( \mathrm{FT} \) 방법(Pulse Fourier Transform method)을 이용하여 측정용매 \(\mathrm{CDCl}_{3}+ \)DMSO-D \( \mathrm{D}_{6}-\mathrm{D}_{2} \mathrm{O} \) 에 \( 5 \sim 20 \% \) (W/V) 비율로 용해시키고 TMS[Tertamethylsilane; \( \left(\mathrm{CH}_{3}\right)_{4} \mathrm{Si} \) ]를 기준 물질로 하여 PMR \( (300 \) \( \mathrm{MHz} \) )로 측정하였다. Mass spectrum은 negative ion FAB-mass spectrum을 이용하여 emitter전류 \( 22 \sim 28 \mathrm{eV} \), 이온원의 가속가압 \( 6 \sim 7 \mathrm{kV} \) 의 조건에서 질량분석을 하였으며, 원소 분석은 자동 원소분석기로 시료에 함유된 \( \mathrm{C} \) 및 \( \mathrm{H} \) 의 양을 분석하였으며, \( \mathrm{O} \) 는 분자량을 기준으로 계산치에 의해 환산하였다.</p>