식물체 선발은 BASTA selection을 통해 진행하였다. 본 실험에서는 전체 size \( 204 \mathrm{bp} \) 의 완전한 BrMT3 유전자가 제대로 클로닝 되었다. 발현벡터를 효모에 형질 전환하는 것은 Lithium acetate (Ito et al.1983) 방법으로 시행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>식물재료 및 형질전환방법</h2><p>RbcS-BrMT3, BrMT3, RbcS-GFP를 Agrobacterium tumefacience GV3101에 electroporation을 통해 형질 전환 시킨 후 이것을 Arabidopsis thaliana (Col-0)에 floral dipping 방법 (Clough and Bent et al., 1998)을 통해 형질전환 하였다. Agrobacterium을 접종한 후 3~4 주 후에 seed pod가 충분히 익으면 한꺼번에 받아서 BASTA selection을 통해 \( \mathrm{T}_{0} \) 식물체를 선발하였다.</p><h2>유전자 분석 및 클로닝</h2><p>배추로부터 분리한 BrMT3의 계통분석을 위하여 BrMT3 cDNA 서열을 기초로 BLAST search 를 통해 애기장대를 포함한 배추과 작물의 MT3 cDNA (BjMT3c; Accession no. AB057415.1, BjMT3b; Accession no. AB057414.1, BjMT3a; Accession no. AB057413.1, AtMT3; Accession no. NM_112401.1)를 찾았고 각각의 cDNA에 따른 아미노산 서열을 기초로 CLUSTAL W를 통해 계통 분석하였다.</p><p>BrMT3를 효모와 식물체에 발현시키기 위해 배추로부터 분리한 BrMT3 cDNA의 Start 코돈과 Stop 코돈을 포함하는 full-length 유전자를 확보하였다. 벡터 클로닝을 위해서 5' 에 BamH I site (밑줄)를 넣은 sense primer BrMT3-F: ggatccATGTCTTCGTGCGGAAA 와 3'에 Xho I과 Xba I (밑줄) 사이에 stop 코돈을 포함하도록 하는 antisense primer BrMT3-R: ctctagaTTActcgagATTGGG 를 각각 제작하였고 이들 primer 를 이용하여 BrMT3을 PCR을 통해 확보하였다. PCR 증폭은 \( \mathrm{Tm} \) 온도 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 26 cycle을 실시하였다. 그 결과 약 \( 200 \mathrm{bp} \) 정도의 PCR product를 얻었고 \( 1.5 \% \) agarose gel에 전기 영동 하여 gel purification kit (General Bio.)를 사용하여 BrMT3 단편들을 분리하였다. 이렇게 분리한 BrMT3를 앞으로의 실험에 이용하였다. 한편, BrMT3의 cloning 에는 T-vector (Yeastern Biotech co, Ltd )를 이용하였고 이 단계에서 유전자 서열을 확인하기 위한 시퀀싱을 수행하였다. 그 결과, 전체 size \( 204 \mathrm{bp} \) 의 완전한 BrMT3 유전자가 제대로 클로닝 되었음을 확인 할 수 있었다.</p><h2>효모 형질 전환 방법</h2><p>pYES2 효모 발현용 벡터에 BamH I 과 Xho I 을 처리해서 자른 후 T-vector로 cloning 한 BrMT3 유전자를 같은 제한효소로 처리한 뒤 ligation 하여 발현 벡터를 완성하였다. 효모에서 납 \( (\mathrm{Pb}) \) 과 카드뮴 \( (\mathrm{Cd}) \) 그리고 비소 \( (\mathrm{As}) \) 같은 중금속의 무독화에 관련된 단백질인 YCF1 유전자가 deletion되어 중금속에 과민감한 돌연변이종 (DTY 167)을 사용하여 Lithium acetate (Ito et al. 1983) 방법으로 발현벡터를 효모에 형질 전환하였다.</p>