내염성이 강하고 식물성장촉진 능력이 있는 근권세균의 분리를 위해 경기도 지역의 사구지역에서 속속이풀, 소리쟁이, 사초, 쑥, 나리류, 별꽃의 근권토양을 식물체와 함께 채취하였다. 식물의 뿌리와 근권토양으로부터 colony library를 구축하였고 선별된 균주의 내염성 평가를 위해 LB broth \(10 \mathrm{mL} \) 에 colony를 접종 한 후, 1일간 전배양하였다. 분리한 colony들을 대상으로 IAA 생산능을 3반복 실험으로 평가하였고 세균의 식물 생장 촉진 능력의 특성을 내염능의 차이에 따라 비교하기 위해 이변량 상관계수 분석을 수행하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시료 채취</h2> <p>내염성이 강하고 식물성장촉진 능력이 있는 근권세균을 분리하기 위해 경기도 화성시의 궁평항의 사구지역에서 서식하고 있는 속속이풀(Rorippa islandica), 소리쟁이(Rumex crispus), 사초(Cyperaceae), 쑥(Artemisia princeps var. orientalis), 나리류(Lilium sp.), 그리고 별꽃(Stellaria media)의 근권토양을 식물체와 함께 채취하여 실험실로 옮겨 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하였다. 본 식물은 아주대학교 최홍근 교수님의 도움으로 동정이 이루어졌다.</p> <h2>식물의 뿌리와 근권토양으로부터 colony library구축</h2> <p>사구토양에서 채취한 식물의 뿌리(rhizoplane, RP)와 근권토양(rhizosphere soil, RS)을 대상으로 각각의 시료에 서식하고 있는 세균의 library를 다음과 같이 준비하였다. 뿌리는 멸균수로 차례로 처리한 다음, 막자 사발을 이용하여 각 식물의 뿌리 \( 1 \mathrm{g} \) 을 분쇄하였다. 여기에 멸균수 \( 9 \mathrm{mL} \) 을 넣고 30분간 \( 250 \mathrm{rpm} \) 으로 교반하고 30분간 정치 한 후, 상등액을 멸균수로 희석 \( \left(10^{0}-10^{6}\right) \) 하였다. 각각의 희석용액을 LB-agar 배지(Difco, USA)에 \( 100 \mu \mathrm{L} \) 씩 접종하여 도말 한 후, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일간 배양하였다. 배양된 colony 중에서 모양 및 색등 형태적 특성에 따라 세균을 선별한 후 새로운 배지에 옮겼다. 속속이풀의 근권에서는 6개, 뿌리에서는 8개, 소리쟁이의 근권에서는 4개, 뿌리에서는 7개, 사초의 근권토양에서는 12개, 뿌리에서는 10개, 쑥의 근권토양에서는 8개, 뿌리에서는 6개, 나리류의 근권토양에서는 8개, 뿌리에서는 13개, 별꽃의 근권토양에서는 5개 그리고 뿌리에서는 8개로 총 95개 colony가 선별 되었다.</p> <h2>내염성 평가</h2> <p>선별된 균주의 염분 내성을 평가하기 위해 LB broth \(10 \mathrm{mL} \) 에 colony를 접종 한 후, 1일간 전배양하였다. \( \mathrm{NaCl} \) 농도가 \( 0.0,4.0 \), 그리고 \( 8.0 \% \) 가 되도록 주입한 LB broth를 제조한 후 \( 10 \mathrm{mL} \) culture tube에 배지 \( 3 \mathrm{mL} \) 씩 분주한 후 전배양액을 \( 5 \% \) 가 되도록 접종하였다. 접종 후, shaking incubator 에서 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 180 \mathrm{rpm} \) 으로 4일간 배양하며, 매일 시료를 채취하여 \( 600 \mathrm{nm} \) 파장의 흡광광도계(HACH, USA)에서 흡광도를 측정하여 colony의 성장 여부를 평가하였다.</p> <h2>PGPAs의 평가</h2> <p>분리한 colony들을 대상으로 식물성 호르몬인 IAA 생산능을 다음과 같은 방법으로 평가하였고, 모든 실험은 3반복 하였다. \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 의 tryptophane을 첨가한 DF 배지 \(5\mathrm{mL} \) 에 균주를 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 180 \mathrm{rpm} \) 으로 5일간 배양하였다. DF 배지의 조성은 다음과 같다: \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4}, 2 \mathrm{g} ; \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 4 \mathrm{g} ; \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} \cdot 12 \mathrm{H}_{2} 0,15 \mathrm{g} ; \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.2 \mathrm{g} ; \mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 1.0 \mathrm{mg} ; \mathrm{B}\) (as \( \mathrm{H}_{3} \mathrm{BO}_{3} ), 10 \mu \mathrm{g} ; \mathrm{Mn}\) (as \( \mathrm{MnSO}_{4} \cdot \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} ), 11 \mu \mathrm{g} ; \mathrm{Zn}\) (as \( \mathrm{ZnSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)), \( 125 \mu \mathrm{g} ; \mathrm{Cu} \) (as \( \mathrm{CuSO}_{4} \cdot 5 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)), \( 78 \mu \mathrm{g} \); Mo (as \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{MoO}_{4} \cdot 2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)), \( 17 \mu \mathrm{g} \); 증류수, \( 1 \mathrm{L} \). 배양이 진행되는 과정에서 채취한 배양액과 Salkowski's reagent (진한 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4}, 150 \mathrm{~mL} \); 증류수, \( 250 \mathrm{mL} ; 0.5 \mathrm{M}~ \mathrm{FeCl}_{3} \) \( \left.\cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 7.5 \mathrm{mL}\right) \) 를 \( 1: 2(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 의 비율로 섞은 후 상온에서 20분간 정치하였다. 분홍색으로 발색되는 정도는 \( 530 \mathrm{nm} \) 의 파장영역에서 흡광광도계(HACH, USA)를 이용하여 측정하였다. 3-Indoleacetic acid \( \left(\mathrm{C}_{8} \mathrm{H}_{6} \mathrm{~N}-\mathrm{CH}_{2} \mathrm{COOH}\right. \), SHOWA chemical Co., Japan)를 이용하여 동일한 방법으로 실험을 수행한 후 검량선을 작성하여 OD값을 IAA농도로 환산하였다.</p> <p>ACC deaminase 활성은 다음과 같은 방법으로 평가하였다(실험에 사용된 배지는 \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 대신 \( 3 \mathrm{mM} \)의 ACC를 넣은 DF medium이다). 분리된 각각의 colony들을 배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 180 \mathrm{rpm} \) 으로 48시간 동안 배양하였다. 배양기간 동안 흡광광도계를 이용하여 4시간마다 \( 600 \mathrm{nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <p>Siderphores 합성능은 chrom azurol S (CAS) blue agar plate assay 방법을 이용하였다. siderphores indicator인 dark-blue dye solution의 제조방법은 다음과 같다: \( 50 \mathrm{mL} \) 증류수에 \( 60.5 \mathrm{mg} \) 의 CAS를 녹인 다음 \( 1 \mathrm{mM} \mathrm{FeCl}{ }_{3} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 과 \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{HCl} \) 이 첨가된 iron (Ⅲ) solution을 \( 10 \mathrm{mL} \) 첨가한다. 이후 \( 40 \mathrm{mL} \) 증류수에 \( 72.9 \mathrm{mg}\) HDTMA 을 녹인 solution을 위의 용액에 첨가하여 멀균한다. medium solution은 \( 750 \mathrm{mL} \) 증류수에 \( 15 \mathrm{g} \) agar, \( 30.24 \mathrm{g} \) PIPES를 넣은 후 \( 10 \times\)MM 9 salts 용액 \( \left(60 \mathrm{g} / \mathrm{L} \mathrm{Na}_{2} \mathrm{HPO}_{4} ; 0.9 \mathrm{g} / \mathrm{L} \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} ; 5 \mathrm{g} / \mathrm{L} \mathrm{NaCl}\right. \); \( \left.10 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \mathrm{NH}_{4} \mathrm{Cl}\right) 100 \mathrm{mL}, 50 \%(\mathrm{w} / \mathrm{w}) \mathrm{NaOH} \) solution \( 6 \mathrm{mL} \)를 넣고 멸균하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 로 식힌다. 이후 각각 멸균하여 준비된 \( 30 \mathrm{mL} \) casamino acids \( (10 \%, \mathrm{w} / \mathrm{v}), 10 \mathrm{mL} \) glucose \( (20 \%, \mathrm{w} / \mathrm{v}) \), \( 1 \mathrm{mL} \) thiamine \( \cdot \mathrm{HCl}(0.2 \%, \mathrm{w} / \mathrm{v}) \), 그리고 \( 3 \mathrm{mL} \) L-tryptophane \( (1 \%, \mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 를 위의 용액에 첨가한다. 위의 방법에 따라 \( 1 \mathrm{L} \) 의 CAS agar가 제조된다.</p> <p>각각의 세균을 CAS blue agar plate에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 동안 배양하였으며, colony 주변에 orange halo가 형성되는 경우를 siderphores 합성 양성으로 평가하였다.</p> <h2>통계 분석</h2> <p>각각의 근권토양과 식물뿌리 조직으로부터 분리한 세균의 식물 생장 촉진 능력(plant growth promoting ability, PGPA)의 특성을 내염능의 차이에 따라 비교하기 위하여 이변량 상관계수(bivariate correlation coefficient) 분석을 수행하였다(SPSS 14.0K).</p>