인공적으로 MVM으로 오염된 CHO 세포주에서 MVM을 검출하고, B혈우병 치료제 생산을 위한 Viresolve NFP 바이러스 필터 공정에서 바이러스 제거 효율을 확인하기 위해 확립된 real-time PCR이 사용되었다. 바이러스가 첨가된 factor Ⅸ 용액, 바이러스 필터 여과액, 인산완충용액 여과액의 바이러스 양을 감염 역가시험법 및 real-time PCR로 정량하였고, 이를 바탕으로 바이러스 감소인수를 계산하였다.
<h2>CHO 세포에서 real-time PCR을 이용한 MVM 검출</h2> <p>확립된 real-time PCR을 생물의약품 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 MVM을 오염시킨 CHO 세포주에서 MVM 검출 시험을 실시하였다. CHO DG44 세포를 \( 5 \% \) 우혈청을 첨가한 Iscove's modified Dulbecco's medium(IMDM: Gibco BRL, USA) 배지에 100X Hypoxanthine-Thyminidine suppliment(HT suppli-ment; Gibco BRL, USA) \( 1 \% \)를 첨가하여 배양하였다. T-25 flask에 배양된 CHO DG44에 MVM을 감염시킨 후 4일 동안 배양하였다. 세포 배양액을 제거한 후 세포 배양액에 남아있을 수 있는 MVM을 완벽히 제거하기 위해 phosphate buffered saline(PBS)으로 3번 세척한 다음 CHO DG44를 계대 배양하였다. 4일 동안 배양한 후 다시 계대 배양한 다음 4일 후에 현미경으로 CHO DG44의 모양을 관찰한 후 세포 배양액과 세포를 따로 수거하였다. 확립된 real-time PCR 방법을 이용하여 세포 배양액과 세포에 MVM이 존재하는지 여부를 확인하였다. Real-time PCR 양성 대조군으로는 titer가 \( 6 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { ~TCID } _ { 50 } / \mathrm { mL } \)인 MVM을 사용하였으며, 음성 대조군으로는 CHO 세포주 배양배지를 사용하였다.</p> <h2>Real-time PCR을 이용한 바이러스 제거 검증</h2> <p>확립된 real-time PCR을 생물의약품 분리정제공정에서 바이러스 제거 효율 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 B혈우병 치료제 factor Ⅸ 생산을 위한 Viresolve NFP 바이러스 필터 공정을 모델 시스템으로 선정하였다. MVM stock 용액 \( 3 \mathrm { ~mL } \)을 \( 0.1 ~ \mu \mathrm { m } \) membrane(Millex-VV, Millipore, Cork, Ireland)으로 여과하여 바이러스 aggregate와 세포 debris를 제거한 후 factor Ⅸ 용액( \( 0.8 \mathrm { ~mg } / \mathrm { mL } \)) \( 27 \mathrm { ~mL } \)에 첨가하였다. 바이러스가 첨가된 factor Ⅸ 용액 \( 16 \mathrm { ~mL } \)을 Viresolve NFP \( 47 \mathrm { ~mm } \) 디스크 여과막(Millipore, Jaffrey, USA)에 \( 2 \mathrm { ~bar } \)의 압력으로 여과하였다. 여과가 끝난 후 다시 인산완충용액 \( 16 \mathrm { ~mL } \)을 첨가하여 \( 2 \mathrm { ~bar } \)의 압력으로 여과하였다. 바이러스가 첨가된 factor Ⅸ 용액, 바이러스 필터 여과액, 인산완충용액 여과액에 존재하는 바이러스 양을 감염 역가시험법과 real-time PCR 시험법으로 정량하였다. 감염 역가 시험시 MVM titer를 정확하게 측정하기 위해서 먼저 factor Ⅸ 용액이 MVM의 정량 분석을 위해 사용되는 A9세포에 cytotoxicity(세포독성)를 나타내는지와 MVM 정량 분석에 interference(간섭)를 일으키는지를 조사하고, cytotoxicity와 interference를 나타내지 않는 농도까지 희석하여 감염역가를 측정하였다. 바이러스 정량 분석이 끝난 후 그 결과를 기초로 바이러스 감소인수를 구하였다. 바이러스 감소인수는 바이러스가 spiking된 공정출발물질에 존재하는 바이러스 양의 \( \mathrm { log } \) 값에서 공정진행 후에 존재하는 바이러스 양의 \( \mathrm { log } \) 값을 뺀 \( \mathrm { log } \) 감소인수(reduction factor)로 정의하였다. 바이러스 제거 검증 실험은 독립적으로 세 번 실시하였고, 그 평균값을 구하였다.</p>