본 연구에서는 Sphingomonas sp. strain MJ-3 및 Pseudomonas sp strain KS-408로부터 각각 재조합하여 얻은 AcAlgE 및 polyM-specific 알긴산 분해효소, ATCC에서 구입한 P. aeruginosa ATCC 39324, Sigma에서 구입한 해조류유래 알긴산, Haug 등의 방법에 따라 산 가수분해하여 분리 정제한 polyM block을 사용하였다. 그리고 히드록삼산반응법을 사용하여 정제한 아세틸알긴산의 아세틸기 함량을 분석하였다. 아세틸알긴산 에스테레이스의 활성실험은 알긴산분해효소 coupling assay를 이용했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 시약</h2> <p>본 연구에 사용한 AcAlgE 및 polyM-specific 알긴산 분해효소는 본 연구실에서 Sphingomonas sp. strain MJ-3 및 Pseudomonas sp. strain KS-408로부터 각각 재조합하여 얻은 효소들로 Park 등과 Kam 등의 방법에 따라 재조합단백질을 과발현시킨 다음 효소들을 분리정제하여 사용하였다 아세틸알긴산은 ATCC (American Type Culture Collection)에서 구입한 P. aeruginosa ATCC 39324를 PIA 고체배지(Pseudomonas Isolation Agar F, Difco, USA)에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 배양한 후 May 및 Chakrabarty의 방법에 따라 분리정제하여 사용하였다. 해조류유래 알긴산은 Sigma에서 구입하였으며 polyM block은 Haug 등의 방법에 따라 산 가수분해하여 분리 정제하였다. 탈아세틸 알긴산(De-O-acetylated alginate)은 P. aeruginosa ATCC 39324 로부터 얻은 아세틸알긴산을 \(0.1 \mathrm { N } \) \( \mathrm { NaOH } \)용액에 \( 0.2 \% \) ( \( \mathrm { w } / \mathrm { v } \)) 되도록 녹인 후 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 분간 가열하고 \( 0.1 \mathrm { N } \) \( \mathrm { HCl } \) 용액 동량을 가한 다음 중화하고 투석하여 얻었다.</p> <h2>정제한 아세틸알긴산의 acety|기 함량 분석</h2> <p>P. aeruginosa ATCC 39324가 PIA 고체배지에서 분비한 아세틸알긴산을 분리하고 정제한 후 아세틸알긴산이 함유한 acetyl기의 함량을 hydroxamic acid 반응법을 사용하여 분석하였다. 표준물질 glucose pentaacetate를 이용하여 만들어진 표준곡선으로부터 아세틸기 함량을 분석하였으며 \(520 \mathrm { nm } \)에서 측정하였다..</p> <h2>아세틸알긴산 esterase 효소활성시험법</h2> <p>아세틸알긴산 esterase의 활성실험은 Fig. 1B와 같이 알긴산분해효소 coupling assay 방법을 이용하였다. 해조류 유래 알긴산과는 달리 박테리아 유래 알긴산은 D-mannuronic acid가 \( \beta \)(1-4) 결합을 한 고분자로 mannuronan 형태이며 2번 탄소 및 3번 탄소에 결합된 산소에 \( \mathrm { O } \)-아세틸화 되어있거나 2번과 3번 위치 모두에 아세틸화 되어 있다. Park 등의 방법에 따라 정제한 재조합효소들을 사용하였으며 기질로는 고분자 아세틸알긴산 및 산가수분해하여 얻은 저분자 아세틸알긴산을 사용하였다. 기질에 MJ-3 AcAlgE 및 KS-408 알긴산 분해효소를 각각 가하여 분해산물을 얻거나 또는 먼저 아세틸알긴산 기질에 MJ-3 AcAlgE를 적정한 시간 동안 반응시켜 탈아세틸화한 후 생성된 mannuronan을 polyM-specific 알긴산 분해효소인 KS-408 lyase로 분해하여 생성물을 얻었다. 이때 생성된 분해물은 비환원말단에 이중결합을 가진 dimer, trimer, tetramer 등 oligomannuronate이므로 TBA와 반응시켜 생성된 붉은 색을 얻은 후 \( 548 \mathrm { nm } \)에서 측정하였다.</p>