30종의 팽이버섯 균주를 한국, 일본 중국, 필리핀 등 여러국가에서 수집하여 실험에 사용하였다. 실험을 위해 팽이 버섯을 정제하였으며, 정제과정은 진탕 배양한 균사체를 분말상태가 되도록 마쇄한 후, Genomic DNA를 분리하였으며, PCR 반응 조건은 적절하게 온도를 설정한 후, extension을 25회 반복하고, 마지막으로 extension시켜 증폭시키는 과정으로 진행하였다. 그리고 팽이버섯의 염기서열을 분석하기 위해 plasmid DNA를 염기서열을 분석하고, rDNA region 염기서열을 확정하였다. 마지막으로 팽이버섯의 계통학적 유연관계 분석은 MegAlign program을 이용하여 rDNA cluster의 염기서열을 정렬하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>팽이버섯 균주</h2> <p>실험에 사용된 20종의 팽이버섯 균주는 그린합명회사에서 보존하고 있는 균주들을 분양 받아 사용하였으며, Table 3에서 나타낸 바와 같이 한국, 일본, 중국, 필리핀 등에서 수집되었다. 수집된 균주 배양을 위하여 PDA (Potato Dextrose Agar; potato peptone \( 4.0 \mathrm{~g} \), glucose \( 20.0 \mathrm{~g} \) and agar powder \( 15.0 \mathrm{~g}\), \(1 \mathrm{~l}\) distilled water, Scharlau Chemie S.A, Spain) 배지에서 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \), 13일간 배양한 균사를 PDB (Potato Dextrose Broth; Potato peptone \( 4.0 \mathrm{~g} \), Glucose \( 20.0 \mathrm{~g} \) were dissolved \(1 \mathrm{~l}\) of distilled water \(\mathrm{pH} ~5.6 \) and sterilized by autoclaving at \( 121^{\circ} \mathrm{C} \) for \( 15 \mathrm{~min} \)) 액체배지에서 15일간 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 80 \mathrm{rpm} \)으로 배양하여 DNA를 추출하고 rDNA-ITS 영역 증폭에 사용하였다.</p> <h2>팽이버섯의 DNA purification</h2> <p>PDB 액체배지에서 진탕 배양한 균사체를 동결 건조하여 막자 사발을 이용하여 분말상태가 되도록 마쇄한 후, Möller 등의 방법에 따라서 Genomic DNA를 분리하였다. PCR로 각 유전자를 증폭하였으며, ITS region을 증폭하기 위하여 White et al에 보고된 대로 \(100 \mathrm{~pmole}\)의 ITS 1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')과 ITS 4 (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3')를 사용하였고, ITS 외 SSU rRNA gene, 5.8S rRNA gene, LSU rRNA gene, IGS 1 region, 5S rRNA gene, IGS 2 region을 증폭하기 위하여 사용한 Primer는 18개로 Table 2에 명시되어있다. PCR 반응을 위하여 전체 \( 50 \mathrm{ul} \)의 부피가 되도록 \( 10 \times \) Ex Taq buffer (\(20 \mathrm{~mM} \) Tris-HCl \(\mathrm{pH} ~8.0\), \( 100 \mathrm{~mM} \) KCl, \(0.1\mathrm{~mM} \) EDTA, \( 1 \mathrm{~mM} \) DTT), \( 2.5 \mathrm{~mM} \) dNTP mixture, \(100 \mathrm{~pmol}\) primer, sterilized distilled water, Ex Taq polymerase (TaKaRa Co.)를 첨가하여 PCR 증폭을 수행하였다. SSU rRNA gene, LSU rRNA gene과 IGS region은 염기서열의 크기가 크기 때문에 다양하게 디자인한 primer를 이용하여 증폭하였다. PCR 반응 조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \), 2분간 pre-denaturation한 후, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에 1분간 denaturation하고, anneal-ing 온도는 9쌍의 primer를 각각의 조건에서 적절하게 온도를 설정한 후, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분 extension을 25회 반복하고, 마지막으로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 extension시켜 증폭하였다.</p> <h2>팽이버섯의 rDNA-ITS 증폭산물의 염기서열 분석</h2> <p>증폭한 PCR 산물의 DNA를 확인하기 위하여 \( 0.5 \times \)TAE에 \( 0.7 \% \) agarose를 첨가하여 만든 겔 상에서 \( \lambda \) DNA-HindⅢ Digest와 함께 전기영동 한 후, EtBr (Ethidium Bromide)로 염색하여 UV light 상에서 DNA band를 확인하였다. 정확하게 증폭된 증폭산물을 agarose gel로부터 회수하여 Gene clon-ing kit (Qiagen Co.)를 이용하여 정제한 뒤 얻은 이들 유전자 단편을 pGEM T-easy vector system (Promega Co.)에 삽입하였다. 삽입된 증폭산물은 DH5a (HIT Competent cell; Donginbiotech Co.)에 형질전환 시킨 뒤 ampicillin을 첨가한 LB 고체배지에 도말 한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에 14~16시간 정도 배양하여 white colony를 선발하였다. 형질전환된 colony를 한 strain당 8개를 무작위적으로 선발하여 \( 3 \mathrm{~ml} \)의 LB (\(1\%\) tryptone, \( 05 \% \) yeast extract, \( 1 \% \mathrm{~NaCl}, \mathrm{pH} ~7.2 \)) 액체배지에 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 16시간 진탕 배양 한 후, plasmid mini-prep kit (Solgent Co.)를 이용하여 재조합 plasmid DNA를 분리 정제하였다. 팽이버섯의 rDNA cluster 증폭산물의 염기서열을 분석하기 위하여 분리한 plasmid DNA를 T7과 SP6 primer를 이용하여 염기서열 분석을 수행하였다. 팽이버섯에서 분리한 plasmid DNA를 T7과 SP6 primer를 이용하여 염기서열을 분석하고 각 시료의 rDNA region 염기서열을 확정하였다.</p> <h2>팽이버섯의 계통학적 유연관계 분석</h2> <p>유연관계 분석은 Jukes와 Cantor의 방법에 준하여, DNAstar software (Lasergene Co.)의 MegAlign program을 이용하여 CLUSTAL X program으로 rDNA cluster의 염기서열을 정렬하였다. 각 시료 rDNA-ITS 염기서열인 ITS 1, 5.8S, ITS 2 영역은 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)에 등록된 염기서열과 비교하여 결정하였으며, CLUSTAL X program 방법을 이용하여 F. velutipes strain들의 결정된 염기서열을 정렬한 후, MEGA 4.1 program의 Neighbor-Joining method를 이용하여 계통수를 작성하였다. 또한, 계통수의 branch에 대한 신뢰도를 얻기 위한 bootstrap (1,000회 반복)은 parsimony analysis에서 나온 결과를 채택하여 phylogenetic tree를 작성하였다</p>