이 연구에서는 울릉도에서 채취한 말오줌나무 잎과 줄기를 실험에 사용했다. 채취한 시료는 분쇄한 후 시료 중량의 10배 양의 70% 에탄올에 침지시켜 24시간 동안 추출을 반복하여 상등액과 침전물을 분리했다. 추출물은 여과지를 통해 여과한 후 감압 농축하고 동결건조하여 보관했다. 세포 배양 및 독성 측정에는 RAW 264.7 세포주를 사용하였으며, 실험에는 여러 기기 및 시약들을 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시료준비</h2> <p>실험에 사용된 말오줌나무 잎과 줄기는 울릉도에서 채취 하였으며, 채취한 시료는 분쇄한 시료에 시료 중량의 10배 양의 \( 70 \% \) 에탄올을 가하여 실온에서 24시간 침지한 후 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 시료 추출물은 여과지(Whatman No.2)를 이용하여 여과한 후 EYELA evaporator로 감압 농축하여 용매를 제거 후 동결건조하여 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다.</p> <h2>시약 및 기기</h2> <p>세포 배양 및 세포 독성 측정에 사용된 세포주는 대식세포인 RAW 264.7은 한국 세포주 은행(Korea Cell Line Bank)에서 구매하였으며, 세포 독성 측정에 사용된 haemacytometer (Marienfeld, Germany), 3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide (MTT) 는 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구매하여 사용하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Bioshop (Canada)에서 구매하였다. 항염증 측정에 사용된 시약인 lipopolysaccaride (LPS), griess regent 등은 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하였다. 또한 단백질 발현 측정에 사용된 1차 항체인 iNOS, COX-2와 2차 항체인 anti-rabbit IgG-HRP는 Santa Cruz (USA)에서 구입하여 사용하였고, mRNA 발현 측정 실험에 사용된 cDNA polymerase kit, GoScript \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) Reverse Transcription kits는 Promega (USA)에서 구매하였다. 실험에 사용된 기기는 ELISA reader (Tecan, Austria), PCR (C-100, Bio-Rad, USA), image quant LAS 4,000 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden), \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator (Vision scientific, Korea), \( \mathrm { pH } \) meter (Mettler-Toledo AG, Swltzerland), centrifuge (Hanil Science Industrial Co., Korea), autoclave (JS Research Inc., Korea), Davinch-Chemi \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) imager CAS-400SM System (Davinch-K Co., Korea) 등을 사용하였다.</p> <h2>세포 배양</h2> <p>세포 배양은 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS)과 \( 1 \% \) penicillin/streptomycin \( (100 \mathrm { U } / \mathrm { ml } ) \)을 첨가한 Dulbeco's modified eagle's medium (DMEM) 배지를 사용하였으며, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \%~ \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.</p>