Piceatannol은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)에서 구매되었으며, dimethyl sulfoxide (DMSO)에 \( 10 \mathrm{mM} \)의 stock solution으로 제조되었습니다. 이후 적절한 농도로 배지에 희석하여 처리되었습니다. 이렇게 모인 세포를 2,000rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 세포만을 남겨둔 후, 1ml의 PBS와 동일한 양의 0.5% trypan blue (Gibco BRL)를 첨가하여 2분간 처리하였습니다. 그 후 위상차 현미경을 사용하여 살아있는 세포를 계수하였습니다. 염색이 완료된 후, DAPI 용액으로 충분히 세척하고 마운팅 용액을 처리한 후, 형광 현미경을 사용하여 관찰하였습니다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>세포배양, piceatannol의 처리 및 생존율 측정</h2> <p>본 연구에 사용된 A549 폐암세포(American Type Culture Collection, Rockville, MD)는 \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS)에 \( 1 \% \) 의 penicillin 및 streptomycin이 포함된 \( 90 \% \) 의 DMEM 배 지(Gibco BRL, Grand Island, NY)를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2} \) 조건 하에서 배양하였다. Piceatannol은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)에서 구입하여 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 \( 10 \mathrm{mM} \) 의 stock solution으로 만든 후, 적정 농도로 배지에 희석하여 처리하였다. A549 세포의 증식에 미치는 piceatannol의 영향을 조사하기 위하여 6 well plate에 A549 세포를 \( 1 \times 10^{3} \) 개로 분주하고 24 시간 동안 안정화시킨 후, 적정 농도의 piceatannol을 처리하였다. 48 시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 \( 0.05 \% \) trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 부유시켜서 phosphate-buffered saline (PBS)를 각 well 당 적정량을 첨가하여 세포를 모았다. 이렇 게 모인 세포를 \( 2,000 \mathrm{rpm} \) 으로 5 분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 세포만 남긴 다음 다시 \( 1 \mathrm{ml} \) 의 PBS와 동량의 0.5\% trypan blue (Gibco BRL)를 첨가하여 2 분간 처리한 후 위상차 현미경을 이용하여 살아있는 세포를 계수하였다.</p> <h2>Flow cytometry를 이용한 세포주기 분석</h2> <p>적정농도의 piceatannol이 48 시간 처리된 A549 세포들을 모아 Cycle TEST PLUS (Becton Dickinson, San Jose, CA) solution A 및 B를 상온에서 각각 10 분씩 처리한 후, Cycle TEST PLUS solution \( \mathrm{C} \) 를 처리하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 염색하였다. 그 후 DNA flow cytometer를 사용하여 세포주기의 각각에 해당되는 histogram을 분석하였다.</p> <h2>DAPI staining에 의한 세포핵의 형태 관찰</h2> <p>Apoptosis가 유발되었을 경우 특이적으로 나타나는 핵의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 \(37\%\) formaldehyde 용액과 PBS를 1: 9의 비율로 섞은 fixing solution을 모아진 세포에 첨가하여 충분히 섞은 후, 상온에서 10 분 동안 고정하였다. 고정된 세포를 \( 2,000 \mathrm{rpm} \)으로 5 분간 원심 분리하여 fixing solution을 제거하고 \( 1,000 \mathrm{rpm} \)에서 5 분간 cytospin하여 세포를 slide glass에 부착하였다. 세포가 부착된 slide glass를 PBS로 2~3회 정도 세척하고 PBS가 마르기 전에 \( 0.2 \% \) 의 Triton X-100 (Amresco, Solon, OH, USA)을 첨가하여 상온에서 10 분간 고정한 후 \( 2.5 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 농도의 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma) 용액을 처리하여 상온에서 15 분간 염색하였다. 염색이 끝난 후 DAPI 용액을 충분하게 세척하고 mounting solution을 처리한 후 형광 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 관찰하였다.</p>