임신 3.5일 된 흰쥐의 복강을 열어 자궁과 난관을 떼어내 포배를 채취하였다. 수확한 포배는 줄기세포 배지 방울에 두고, 다시 포배 주위의 방사관 세포를 제거하기 위해 5-6개의 줄기세포 배지 방울을 지나면서 세척하였다. 효소 희석 용액을 이용하여 속 세포 덩이만을 분리하고, 생후 3일 된 흰쥐의 피부를 벗겨 그 아래서 긁어낸 진피조직을 모아서 얻은 섬유모세포 위에 분리된 줄기세포들을 접종한 후 간세포 배지에서 합동 배양한 후 이식에 사용하였으며, 배양액의 제조 방법 등을 설명하였다.
<h1>실험방법</h1> <h2>포배의 채취</h2> <p>포배의 채취는 임신 3.5일된 흰쥐의 복강을 열어서 자궁과 난관에 붙어 있는 조직을 충분히 제거한 후 자궁과 난관을 떼어내었다. 배자줄기세포 배양액내에서 난관을 겸자로 잡고 \( 22 \mathrm{G} \) 주사 바늘로 난관을 뚫어 포배를 난관으로부터 배지내로 빠져나오게 하였다. 각 포배를 매우 조심스럽게 검사하여 수확한 후 포배는 준비해 둔 \( 5 \mu \mathrm{\ell} \) 의 줄기세포 배지방울에 두고, 다시 포배 주위에 붙어 있는 방사관 세포를 제거하기 위하여 5-6개의 줄기세포 배지방울을 지나면서 세척하였다.</p> <h2>배자줄기세포의 분리와 배양액의 제조</h2> <p>포배를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 기반시키면서 \( 1 \% \) dispase 용액 \( 2 \mathrm{~m} \ell \)를 가하여 15분간 처리하여 투명대가 녹는 것을 확인하면서 떨어지도록 하였다. 효소희석용액 \( 2 \mathrm{m \ell} \)를 가하여 원심분리하여 다른 영양막세포들을 제거한 후 속세포덩이만을 분리하였다. 속세포덩이를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 교반시키면서 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{m \ell} \) type \(\mathrm{IV} \) collagenase 용액에 1시간 두었다가 줄기세포 배양액 내에서 하룻밤 두어 배자체를 형성시킨 후 다시 type \(\mathrm{IV} \) collagenase 용액 내에서 1시간 동안 처리하여 각각 세포들 분리하여 배양하였다.</p> <p>줄기세포 배양액은 \( 20 \% \) fetal calf serum(GI \( 16000 \)-\( 036 \)) \( 100 \mathrm{~m} \ell \), glutamine \( (1 \mathrm{mM}), \quad \beta \)-mercaptoethanol \( (0.1 \mathrm{mM} \), Sigma), nonessential amino acid stock \( (0.1 \% \), Gibco), penicillin \( (100 \mathrm{U} / \mathrm{m} \ell) \)-streptomycin \( 100 \)\( \mu \mathrm{g} / \mathrm{m} \ell \), GI \( 15140 \)-\( 122 \)), fungizone \( (1.25 \mu \mathrm{g} / \mathrm{m \ell} \), GI \( 15290 \)-\( 018 \)), gentamycin \( (50 \mathrm{ng} / \mathrm{m \ell} \), GI \( 15710 \)-\( 015 \)), kanamycin \( (100 \mathrm{ng} / \mathrm{m \ell} \), GI \( 15160 \)-\( 054 \))을 혼합한 후 Dulbecco's modified eagle medium(GI \( 11965 \)- \( 092 \))으로 \( 500 \mathrm{m} \)이 되도록 채워서 만들었다.</p> <p>분리된 줄기세포둘은 배양액 속에서 미리 배양 해둔 feeder cell인 섬유모세포 위에 접종한 후 배양하였다. 섬유모세포는 생후 3일된 흰쥐의 피부를 벗겨내어 그 아래에서 긁어낸 진피조직을 모아서 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{m \ell} \) type \( \mathrm{IV} \) collagenase 용액을 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1시간 동안 교반시키고 cell strainer (\( 40 \)\( \mu \mathrm{m} \) nylon, Falcon \( 2340 \), USA)에 여과시켜 얻었다.</p> <p>줄기세포는 6일 동안 배양한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 교반시키면서 \( 0.05 \% \) trypsin- \( 0.53 \mathrm{mM} \) EDTA 용액내로 15분간 처리하여 바닥에 부착한 세포가 배양용기 표면에서 떨어지도록 처리하여 미리 준비된 3일간 배양한 간세포 배지에서 8일 동안 합동배양한 후 이식에 사용하였다.</p> <p>합동배양을 위한 간세포는 관류법에 의하여 얻었으며, 간세포 배양을 위한 배양액은 DMEM \( 444.5 \mathrm{m \ell} \), FCS \( 50 \mathrm{m \ell} \), penicillin-streptomycin 용액 \( 5 \mathrm{m \ell} \), fungizone \( 2.5 \mathrm{m \ell} \), insulin \( 0.2 \mathrm{m \ell} \), dexamethasone \( 0.3 \mathrm{m \ell} \)을 넣어 만들었다. 배양액은 제조 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 저장하고 사용하기 전 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)로 맞추어 사용하였다.</p> <p>멸균된 \( 10 \mathrm{m \ell} \) 피펫으로 간세포가 혼합된 용액을 되도록 천천히 흡입, 배출을 반복하여 고르게 세포가 분산되도록한 다음 cell strainer를 이용하여 여과하였다. Trypan blue를 이용하여 \( 1 \times 10^{5} \) 세포 \( / 0.2 \mathrm{m \ell} \cdot \mathrm{cm}^{2} \)의 밀도가 되도록 \( 60 \mathrm{mm} \) dish 위에 \( 5 \mathrm{m \ell} \)씩 분주하여 배양하였다.</p>