CCD-986sk 세포를 배양한 후 96 well white plate에 \( 2 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well로 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 ROS Glo \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) assay를 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 또한, CCD-986sk 세포를 배양한 후 6 well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well로 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 UVB \( \left (20 \mathrm { ~mJ } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \right ) \)를 조사하고, 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물을 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 또한, 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물이 pro-collagen 및 MMP-1 mRNA의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 CCD-986sk 세포를 6 well plate에 \( 5 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well로 배양하여 24시간 동안 관찰하였다.
<h2>ROS (Reactive Oxygen Species) 생성량 측정</h2> <p>CCD-986sk 세포를 배양한 후 96 well white plate에 \( 2 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well로 접종하고 24시간 배양하였다. 24시간 후 PBS로 교체한 후 UVB \( \left (20 \mathrm { ~mJ } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \right ) \)을 조사 한 뒤, 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물을 \( 5,10,25 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 희석하여 처리한 후 24시간 배양 하였다. 그 후 제조사의 매뉴얼에 따라 ROS Glo \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) assay를 수행하였다.</p> <h2>Pro-collagen 합성 및 MMP-1 발현 측정</h2> <p>CCD-986sk 세포를 배양한 후 6 well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well로 접종하고 24시간 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 PBS \( 1 \mathrm { ~mL } \)을 첨가하여 UVB \( \left (20 \mathrm { ~mJ } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \right ) \)를 조사한 뒤, \( \mathrm { PBS } \)를 제거하고 \( 10 \% \) FBS와 \( 1 \% \) penicillin streptomycin이 들어 있지 않은 DMEM 배지로 교체한 후 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물을 \( 5,10,25 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 희석하여 처리하여 48시간 배양하였다. 상등액을 취하여 pro-collagen과 MMP-1을 각 kit사의 protocol에 따라 실험을 진행한 뒤, microplate reader로 \( 450 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Pro-collagen 및 MMP-1 단백질 발현 측정</h2> <p>CCD-986sk 세포를 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well로 6 well plate에 분주하여 24시간 배양한 후에 UVB \( \left (20 \mathrm { ~mJ } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \right ) \)를 조사한 뒤 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물을 농도별로 처리하여 48시간 배양하였다. 세포를 RIPA buffer (Pierce, Appleton, WI, USA)로 용해하고 원심분리한 후 얻은 상층액을 BCA protein assay (Pierce, Appleton, WI, USA)로 protein을 \( 20 \mu \mathrm { g } \)의 농도로 정량하였다. 준비된 protein sample은 \( 10 \% \) SDS-PAGE를 이용해 전기영동하고 PVDF membrane으로 transfer 시킨 뒤, 5 \% skim milk가 함유된 tris 완충용액으로 1시간 blocking 한 후, pro-collagen, \( \mathrm { MMP } -1, \beta \)-actin 각각의 1차 및 2차 항체와 반응시켰다. 반응 후 Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrate(Millipore, Billerica, MA, USA)를 이용하여 5분간 반응시킨 후 Chemi-Doc을 이용하여 현상하였다.</p> <h2>Pro-collagen 및 MMP-1 mRNA 발현 측정</h2> <p>노랑어리연꽃 추출물 및 분획물의 pro-collagen 및 MMP-1 mRNA 발현에 미치는 영향을 보기 위하여 CCD-986sk 세포를 6 well에 \( 5 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { cells } / \) well에 되도록 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 UVB \( \left (20 \mathrm { ~mJ } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \right ) \)를 조사한 뒤, 시료를 농도별로 처리한 배지로 교환하고 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후 cold PBS로 세척한 뒤, trizol reagent (Biosesang, Seongnam, Korea)을 이용하여 분리하였다. Total RNA \( 1 \mu \mathrm { g } \)과 PCR primer oligonucleotide를 RT-PCR mixer와 혼합하고 RT-PCR을 시행하였다. Pro-collagen (forward, CTCCAACGAGAT CGAGATC and reverse, GTTACAGGAA GCAGACAGG)과 MMP-1 (forward, AAAGGG AATAAGTACTGGGC and reverse, AATTCCAGGAAAG TCATGTG)을 이용하여 RT-PCR을 실시하였으며, 조건은 \( 94 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초(denaturation), \( 50 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5초 (annealing), \( 72 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 90초(extension)의 반응을 30-35회 반복 하는 것을 기본으로 target cDNA 종류에 따라 최적의 조건으로 조절하였다. 증폭된 \( \mathrm { cDNA } \)는 \( 1.25 \% \) agarose gel을 사용한 전기영동으로 분리하고 Gel-doc으로 확인하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>본 실험의 통계처리는 SPSS \( 12.0 \)을 사용하였다. 각 실험군의 결과는 평균치와 표준편차로 나타내었으며, 각 실험군의 간의 결과는 2-표본 \( \mathrm { t } \) 검정을 사용하여 분석하고 유의적인 차이가 있는 항목에 대해서만 검정하였다. 실험군 간의 차이는 \( 95 \% \) 수 준 \( \left ( * p<0.01, { } ^ { * * } p<0.001 \right ) \)에서 유의성 있는 것으로 하였다.</p>