차가버섯은 항종양 활성을 나타내는 다당체를 많이 함유하고 있어 건강식품 및 기능성 식품의 소재로 각광 받고 있으며, 식물 및 버섯유래의 다당 및 세균류의 세포벽 성분 등에서 면역계를 자극하여 숙주의 생물학적 반응 변화를 유도하는 BRM가 발견되고 있으므로, 본 연구는 차가버섯의 균사체 액체배양을 통한 균사체 생장과 세포외 다당체 생산을 위한 배양조건의 최적화를 조사하고 세포내/외 다당체의 항보체 활성과 대식세포 활성을 비교 검토한다. 종균은 차가버섯 균사체를 진탕 배양하여 사용하였으며, 균사체 세포 내/외 다당체는 각 방법으로 처리된 상등액 에탄올을 첨가후 원심분리하는 과정으로 회수하였다.
<h1>서 론</h1> <p>차가버섯(Inonotus obliquus)은 소나무비늘버섯과(Hymenochaetaceae)에 속하는 버섯으로써 주로 약용으로 사용되어 왔으며, 한랭지역의 자작나무 줄기에 기생하는 균핵으로 표면은 검고 내부는 황갈색을 띄고 있고, 주요 자생지역은 시베리아, 캐나다 및 일본 홋카이도 지역으로 알려져 있다. 이 버섯은 다른 약용버섯과 마찬가지로 항종양 활성을 나타내는 다당체를 많이 함유하고 있는 것으로 보고되었을 뿐만 아니라, 항산화, 항당뇨 및 항돌연변이 등의 효과를 가지고 있어 최근에 건강식품 및 기능성 식품의 소재로 각광 받고 있다.</p> <p>면역계 중에서 보체계는 fungi, bacteria, virus 등의 미생물 감염으로부터 숙주를 보호하는 자기 방어(host defense)기능을 가지며 암세포를 사멸시키는 식작용(phagocytosis)을 원활히 돕고 염증(inflammation) 또는 알레르기 반응 등 여러 가지 면역 조절에 중요한 역할을 담당한다고 알려져 있다. 이러한 면역계를 자극하여 숙주의 생물학적 반응의 변화를 유도함으로써 여러 가지 치료효과를 나타내는 물질인 biological response modifier (BRM)는 식물 및 버섯유래의 다당, 세균류의 세포벽 성분 등에서 발견되고 있다. 특히, 버섯류에서 유래된 면역조절물질들은 그 잠재적인 가치에 비하여 밝혀진 바는 아직 일부분에 지나지 않는다. 특히 진균류에 속하는 담자균류에서 분리된 단백다당체 또는 다당체가 생체 면역기능을 증강시키거나 억제된 면역기능을 정상적으로 회복시켜줌 으로써 효과를 발휘한다는 것이 그간의 연구 결과에 의해 밝혀지고 있다.</p> <p>따라서 본 연구는 차가버섯의 균사체 액체배양을 통한 균사체 생장과 세포외 다당체 생산을 위한 배양조건의 최적화를 조사하고 세포내, 외 다당체의 항보체 활성과 대식세포 lysomal enzyme 활성을 비교 검토하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>균주 및 종균</h2> <p>본 실험에 사용된 차가버섯은 한국농업미생물자원센터로부터 분양 받아 사용하였다. 보관용 배지로는 potato dextrose agar (Difico. Co.)를 사용하였고, 종균은 차가버섯 균사체를 potato dextrose broth 배지 \( 100 \mathrm { ml } \)을 포함한 \( 250 \mathrm { ml } \) flask를 진탕배양기(125 \( \mathrm { rpm } \))에서 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 7일간 배양하여 사용하였다. 배양 후 균사체를 포함한 배지 \( 100 \mathrm { ml } \) 을 ice bath에서 3분간 Sorvall omi-mixer를 이용하여 무균적으로 균질화 한 후, 균사체 현탁액을 종균으로 사용하였다.</p> <h2>균사체 및 세포 내 · 외다당체 회수</h2> <p>배양된 차가버섯 균사체 배양액을 \( 10,000 \times g \)에서 20 분간 원심분리하고, 침전된 균사체는 증류수로 3회에 걸쳐 세척하여 냉동건조기에서 중량이 일정하게 될 때까지 냉동건조하여 무게를 측정하였다. 세포외 다당체(extracellular polysaccharide)는 분리된 상등액에 4배의 에탄올을 첨가한 다음 24시간 동안 침전하고, 원심분리 \( (10,000 \times \mathrm { g } / 20 \mathrm { ~min } ) \)한 후 침전물을 동결건조하였으며, 세포내 다당체(intracellular polysaccharide)는 냉동건조된 균사체를 열수추출 후 원심분리 \( (10,000 \times \mathrm { g } / 20 \mathrm { ~min } ) \)하여 상등액에 4배의 에탄올을 첨가하고 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 방치 한 후 다시 원심분리하여 침전물을 동결건조하여 시료로 사용하였다.</p>