광학현미경 관찰결과, hypoxia chamber에서 배양한 세포의 부착능력과 세포상태가 정상산소상태에 배양한 것 보다 좋음을 확인하였고, hypoxia 상태에서 배양한 세포에서의 SIRT family의 mRNA 발현을 측정한 결과 HUVEC에서 SIRT\(1-5\)가 발현됨을 알 수 있었다. 가장 많이 발현한 SIRT2에 대해 면역조직화학염색법을 이용하여 SIRT2가 세포 내에 발현되는 위치를 분석한 결과 Hypoxia에 의해 세포질에서 핵 내로 이동함을 알 수 있었다. 다음으로 DFO를 이용하여 hypoxia에 의해 HIF-1\( \alpha \)의 mRNA발현이 강하게 증가함을 알 수 있었으며, SIRT2 억제에 의한 HUVEC혈관형성 능력 분석에 대해서는 억제시 HUVEC의 혈관형성 능력이 억제됨을 확인하였다.
<h1>결 과</h1><h2>저산소상태에서의 인간 제대혈 유래의 혈관내피세포 (HUVEC)의 세포형태</h2><p>Hypoxia에 의해 세포의 성장(growth), 부착(attachment), 증식(proliferation) 능력이 증진된다는 보고를 바탕으로, 먼저 HUVEC을 hypoxia 상태에서 배양하였을때, 세포의 형태를 확인하였다. 광학현미경으로 관찰한 결과, 정상산소상태 (normoxia)에서 보다 hypoxia chamber에서 18시간 배양한 세포의 부착능력과 세포상태가 더 양호하였다.</p><h2>저산소상태에서의 HUVEC세포의 SIRT family member의 발현</h2><p>Hypoxia에 의해 인간 제대혈 유래의 혈관내피세포에서의 SIRT family member의 발현을 확인하기 위해서, hypoxia 상태에서 4시간 배양한 세포에서의 SIRT family의 mRNA 발현을 측정한 결과, hypoxia상태의 HUVEC에서 SIRT1-5가 발현되며, SIRT1, 3, 4는 SIRT2, 5에 비해 현저하게 약하게 발현됨을 확인하였다. 그 중 SIRT2의 mRNA 발현이 가장 강한 것을 확인할 수 있었다. 이 사실을 바탕으로 하여, hypoxia와 SIRT2의 연관성을 알아보고자 다음의 실험을 진행하였다.</p><h2>저산소상태에서의 SIRT2의 핵 내 이동현상</h2><p>SIRT2 단백질은 주로 세포질 내에 존재하며, 세포주기에 의존하여 세포분열의 간기(interphase)와 유사분열(mitosis)동안에 핵 내로 이동한다고 보고되었다. 이러한 연구결과들을 바탕으로 hypoxia에 의해 SIRT2 단백질이 세포질에서 핵 내로 이동하는지 확인하기 위하여, \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 를 \( 50 \mu \mathrm{M} \)의 농도로 처리하여 hypoxia와 유사한 상태를 HUVEC에 주어 24시간 배양하였다. 그리고 면역조직화학염색법을 이용하여 SIRT2가 세포 내에 발현되는 위치를 확인한 결과, Normoxia에서는 SIRT2가 세포질에서 발현되었으나, Hypoxia에 의해 세포질에 위치해 있던 SIRT2가 핵 내로 이동된 것을 확인하였다.</p><h2>저산소상태에서의 SIRT2 발현과 혈관신생성장인자의 발현 증가</h2><p>기존의 연구들은 Hypoxia가 HIF-1\( \alpha \)를 안정화시키고, 안정화된 HIF-1\( \alpha \)에 의해 혈관신생성장인자의 발현을 유도하여 혈관신생을 일으킴을 보고하였다. 이러한 결과들을 바탕으로 하여 Hypoxia에 의해 HUVEC에서 SIRT2와 혈관신생성장인자가 유도되는지를 mRNA 발현을 확인하였다. DFO를 \( 100 \mu \mathrm{M} \)의 농도로 처리하여 세포에 hypoxia를 유도하여 24시간 배양한 결과, 기존 연구결과와 마찬가지로 hypoxia에 의해 HIF-1\( \alpha \)의 mRNA발현이 강하게 증가하였다.</p><h2>SIRT2 억제제에 의한 HUVEC의 혈관튜브형성능력 감소</h2><p>Fig. 4에서 Hypoxia에 의해 SIRT2와 VEGF의 발현이 증가한 사실을 바탕으로 하여, SIRT2의 발현에 의해서 혈관신생이 조절되는지 알아보기 위하여, Matrigel assay를 수행하였다. Matrigel에 HUVEC을 심고, SIRT2 억제제인 AK-1을 \( 10 \mu \mathrm{M} \)을 배지에 처리하여 normoxia와 hypoxia chamber를 이용한 hypoxia상태에서 3시간 30분을 배양하였다. 그 결과, normoxia 배양에서 보다 hypoxia배양에 의해 HUVEC의 혈관튜브형성 능력이 현저하게 증가한 것을 관찰하였으며, 산소농도가 다른 두 배양조건에 SIRT2 억제제인 AK-1을 처리하였을 때 모두 HUVEC의 혈관튜브형성능력이 감소됨을 관찰하였다. 이를 통해서 SIRT2의 발현억제를 통해서 HUVEC의 혈관형성 능력이 억제됨을 확인하였다.</p>