CRP 단백질을 이용해 야생형, \(583\mathrm{G}\) 및 \(5128\mathrm{A}\)의 홉광도를 측정했다. 첫 단계에서는 \(400\mathrm{nm} \sim 190\mathrm{nm}\) 범위에서 흡광도가 가장 큰 파장을 선택하고, 이 파장에서 단백질 용액을 프로그램된 온도 조절장치를 이용해 \(0.3 ^{\circ}\mathrm{C}/\mathrm{min}\)씩 승온하며 홉광도를 측정했다. 각 CRP 단백질 \(32\mu\mathrm{g}\)을 사용하고, 반응은 전사 완충액에서 진행되었다. 반응 후에는 \(12.5\%\) SDS-PAGE에서 전기영동을 수행하고 Coomassie blue staining으로 절단된 단백질 조각을 확인했다.
<p>분광광도계를 이용한 측정</p> <p>반융용액은 \( 40 \mathrm { mM } \) Tris-HCl \( ( \mathrm { pH } = 8.0), 100 \mathrm { mM } \mathrm { KCl } \), \( 10 \mathrm { mM } \mathrm { MgCl } , 1 \mathrm { mM } \mathrm { DTT } , 5 \% \) glycerol이 첨가된 전사 완충액(transcription buffer)을 사용하였다. 정제한 각종의 CRP 단백질의 일정량을 사용하여 야생형, \( 583 \mathrm { G } \) 그리고 \( 5128 \mathrm { ~A } \)에 대하여 측정하였다. 우선 \( 400 \mathrm { ~nm } \sim 190 \mathrm { ~nm } \) 범위의 파장에서 spectrum을 측정한 후, 가장 큰 흡광도를 나타내는 파장을 선택하였다. 그리고 선택한 파장에서 단백질 용액에 프로그램된 온도 조절장치를 이용하여 \( 0.3 ^ {\circ } \mathrm { C } / \mathrm { min } \)씩 승온하며 홉광도를 측정하였다. 이때 사용한 파장은 \( 265 \mathrm { ~nm } \sim 280 \mathrm { n } \pi \) 범위였다.</p> <p>Proteolytic digestion</p> <p>반응은 전사 완충액으로 실행하였으며, CRP 단백질은 각각 \( 32 \mu \mathrm { g } \) 을 사용하였다. 야생형, \( 583 \mathrm { G } \) 및 \( 5128 \mathrm { ~A } \) CRP 단백질과 subtilisin (protease)의 무게 비율을 300대 1 로 하였다. cAMP의 농도는 \( 100 \mu \mathrm { M } \) 이며 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } , 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 45 ^ {\circ } \mathrm { C } , 55 \) \( { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 및 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 온도에서 30 분간 incubation 한 후에 sub-tilisin을 가한 후 30 분 동안 추가로 incubation 하였다. 이때에 PMSF(최종농도 \( 5 \mu \mathrm { M } \) )를 부가하여 반응을 종료시킨다. 반응시킨 용액은 \( 12.5 \% \) SDS- PAGE에 전기영동을 실행한 다음 Coomassie blue staining하여 절단된 단백질 조각을 확인한다.</p>