이 연구에서는 t-PA 및 t-PA 파생 단백질을 발현하기 위해 cauliflower mosaic virus (CaMV)35S 프로모터와 알팔파 Rbcsk-1A 프로모터를 사용한 식물 발현 벡터를 사용했다. 동결-해동 방법을 통해 p221a-t-PAER, p221a-t-PAHis, p221a-st-PA, p221a-rbc-t-PA, p221a-rbc-st-PA 벡터를 Agrobacterium EHA105에 도입했다. Rbcsk-1A 프로모터의 염기서열을 확인한 후, p221a 벡터의 Kpn I와 Hind III 부위에 클로닝하여 p221a-st-PA를 생성했다. 또한, Rbcsk-1A 프로모터와 t-PA 및 합성 t-PA 유전자를 이용하여 p221a-rbc-t-PA와 p221a-rbc-st-PA를 생성했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>식물 형질전환용 발현벡터 제조 및 Agrobacterium 형질전환</h2> <p>본 연구에서 t-PA 및 t-PA 파생 단백질들을 발현하기 위해서 사용한 식물 발현 벡터의 프로모터는 cauliflower mosaic virus (CaMV)35S 프로모터와 알팔파 Rbcsk-1A 프로모터 (GenBank accession no.X96847)를 이용하였다. CaMV 35S 프로모터를 이용한 발현벡터는 p221a을 이용하였다 (Hahn et al. 2009). t-PA 유전자 및 t-PA 유전자에 소포체 지연서열 (SEKDEL)이 카르복실 말단에 붙어 있는 t-PAER (1,746 bp) 유전자, histidine이 카르복실 말단에 붙어 있는 t-PAHis \( _{6}(1,749 \mathrm{bp}) \) 유전자 또는 합성 t-PA 유전자 \( (1,728 \mathrm{bp}) \) 를 식물 발현 벡터 p221a에 클로닝하기 위해서 다음과 같이 발현 벡터를 제조하였다. 알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질의 신호서열 및 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 끓는 물에 5분간 가열하고 상온에서 30 분 어닐링 (annealing)하여 이중나선을 형성하도록 하였다. 프라이머 (5'-TCTTACCAAGTGATCTGCAGAG-3')와 프라이머 (5'-CCCAAGCTTTCACGGTCGCATGTTGTCACG-3')를 이용하여 ATCC 회사에서 구입한 pETPFR (코드번호, 40403)를 주형으로 증폭된 t-PA PCR 산물과 상기에서 이중나선을 형성한 신호서열을 혼합 후 T4 DNA ligase (Takara, 일본)를 이용하여 \( 16^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30 분간 배양하여 연결하였다. 그리고 정방향 프라이머 (5'-CGGGGTACCATGAAAATGGAGATGC-ATCAGATC-3')와 역방향 프라이머 (5'-CCCAAGCTTTCACGGTCGCAT-GTTGTCACG-3')를 사용하여 PCR (반응조건 : \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 분, 1 회; \( 94^{\circ} \mathrm{C} 30 \) 초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} 30 \) 초,\( 72^{\circ} \mathrm{C} 2 \) 분, 30 회; \( 72^{\circ} \mathrm{C} 7 \) 분, 1 회)을 실시하여 알팔표 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질의 신호서열과 연결된 t-PA PCR 산물을 얻었다. t-PA PCR 산물을 Kpn I과 Hind III 로 절단하여 얻은 단편(알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질의 신호서열과 연결된 t-PA 유전자)을 p221a 벡터의 Kpn I과 Hind III 부위 사이에 클로닝하여 p221a-t-PA를 제작하였다. 그런 후 t-PA에 소포체 지연 서열 (endoplasmic reticulum retention sequence)인 SEKDEL을 카르복실 부분에 부착하기 위해서 p221a-t-PA를 주형으로 사용하여 정방향 프라이머 (5'-CGGGGTACCAT-GAAAATGGAGATGCATCAGATC-3')과 역방향 프라이머 (5'-CCCAAGC-TTTTAAAGTTCATCCTTTTCAGACGGTCGCATGTTGTCACGAATCC-3')를 사용하였고,6 개의 histidine을 카르복실 부분에 추가하기 위해서 정방향 프라이머 (5'-CGGGGTACCATGAAAATGGAGATGCATCAGATC-3')과 역방향 프라이머 (5'-CCCAAG CTTTTACACATGATGATGATGATGATGCG-GTCGCATGTTGTCACGAATCC-3')를 사용하여 PCR (반응조건 : \( 95^{\circ} \mathrm{C} 5 \) 분, 1 회; \( 94^{\circ} \mathrm{C} 30 \) 초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} 30 \) 초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} 2 \) 분, 30 회; 7\( 2^{\circ} \mathrm{C} 7 \) 분, 1 회)을 하여 알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질의 신호서열과 연결된 t- PAER과 t-PAHis \( { }_{6} \) PCR 산물들을 얻었다.그런 후 t-PAER과 t-PAHis \( { }_{6} \) PCR 산물을 Kpn I과 Hind IIII로 절단하여 얻은 단편을 상기 p221a 벡터의 Kpn I과 Hind III 부위에 클로닝하여 p221a-t-PAER과 p221a-t-PAHis \( { }_{6} \) 를 제작하였다. 또한 알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질의 신호서열을 포함하는 합성 t-PA 유전자는 염기서열 합성회사 (Entelochon, 독일)에 의뢰하여 이중나선의 단편을 제작하였다. 이를 Kpn I과 Hind III 로 절단하여 얻은 단편을 상기 p221a 벡터의 Kpn I과 Hind III 부위 사이에 클로닝하여 p221a-st-PA를 제작하였다. Rbcsk-1A 프로모터는 정방향 프라이머 (5'-GGAATTCAAATAATTAAAAACTACAACAGATGATT-3')과 역방향 프라이머 (5'-CGACGCGTTTTTTTTCTCCCTT ACTTAGTTCAC-3')를 이용하여 Rbcsk-1A 프로모터 \( (1,149 \mathrm{bp}) \) 클로닝 후 염기서열 확인 후 제한효소 Eco RI과 Mlu \( \mathrm{I} \) 로 \( 35 \mathrm{~S} \) 프로모터가 제게된 부위에 Rbcsk-1A 프로모터로 치환하여 p221a-rbc벡터제조 후 t-PA 및 합성 t-PA 유전자를 이용하여 p221a-rbc-t-PA와 p221a-rbc-st-PA를 제조하였다. p221a-t-PAER, p221a-t-PAHis, p221a-st-PA, p221a-rbc-t-PA, p221a-rbc-st-PA 벡터를 동결-해동 (freeze-thaw)방법으로 Agrobacterium EHA105에 도입시켰다.</p>