된장 분말 1g을 취해 증류수 40ml와 혼합해 항온수조에서 4시간 진탕한 후 원심분리로 얻은 상등액을 여과한 여액을 -20\(^\circ \mathrm{C}\)에 보관한 뒤 단백질 가수분해효소 활성 측정, 총폐놀 함량, 항산화 활성 측정에 사용했다. 이후 해당 시료에 산성, 중성, 염기성 조건에서 protease 활성들을 측정하기 위해 실험에 변화를 주었다. Casein을 0.2M Mcilvaine buffer에 2% 되게 녹여 기질로 사용해 원심분리로 얻은 상등액 1ml에 0.5N NaOH 2ml, Folin-Ciocalteu reagent 100\(\mu\mathrm{l}\)을 첨가하고 실온에서 반응시켜 결과를 측정했다.
<h2>된장 추출물 제조</h2> <p>된장 시료 \( 20 \mathrm { ~g } \)을 동결건조한(PVTFD50A, Korea)후 분말화하였다. 된장 분말 \( 1 \mathrm { ~g } \)씩을 취해서 증류수 \( 40 \mathrm { ml } \)과 혼합하여 항온수조 \( \left (37 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \)에서 4시간 진탕 \( (150 \mathrm { rpm } ) \)하였다. 원심분리 \( (4,000 \times g, 15 \mathrm { ~min } ) \)하여 얻은 상등액을 여과(Whatman, No.2, GE Healthcare, UK)하여 얻은 여액을 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에 보관하고 추후 단백질 가수분해효소 활성 측정과 총폐놀 함량, 항산화 활성 측정들에 사용하였다.</p> <h2>단백질 가수분해효소 활성 측정</h2> <p>동결건조한 된장을 추출하여 얻은 시료에 대해 산성, 중성, 염기성 조건에서 protease 활성들을 앞서 보고한 방법을 일부 수정해서 측정하였다. Casein (Sigma-Aldrich,</p> <p>일부 수정해서 측정하였다[5]. Casein (Sigma-Aldrich, USA)을 \(0.2 \mathrm { M } \) Mcilvaine buffer ( \( \mathrm { pH } 3.0 \), \( \mathrm { pH } 6.0 \))와 \(0.2 \mathrm { M } \)boric acid-borate buffer ( \( \mathrm { pH } \) 9.0)에 \( 2 \%( \mathrm { w } / \mathrm { v } ) \)되게 녹여서 각각 acid, neutral, alkaline protease 활성 측정을 위한 기질로 사용하였다. Casein 기질용액 \( 1 \mathrm { ml } \), 효소액 \( 200 \mu \mathrm { l } \), \( \mathrm { CaCl } _ { 2 } (10 \mathrm { mM } ) 20 \mu \mathrm { l } \)를 혼합한 후 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20분 반응시킨 후 \(5 \% \)TCA (trichloroacetic acid, Sigma-Aldrich) 용액을 \( 2 \mathrm { ml } \) 첨가하여 반응을 정지시켰다. 원심분리 \( (4,000 \times \mathrm { g } \), \( 15 \mathrm { ~min } \) )하여 얻은 상등액 \( 1 \mathrm { ml } \)에 \( 0.5 \mathrm { N } \mathrm { ~NaOH } 2 \mathrm { ml } \), Folin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich) \( 100 \mu \mathrm { l } \)를 첨가하고 실온에서 10분 반응시켰다. 분광광도계(UV-1601, Shimadzu, Japan)를 사용하여 \( 660 \mathrm { ~nm } \)에서 반응액의 흡광도를 측정하였고 효소 1 unit는 1 분당 \( 1 \mu \) mole의 tyrosine을 생성하는 효소 양으로 정의하였다.</p>