실험에서는 calidolactis ATCC 10149 등은 식품 의약품안전청에서 분양 받았고, Escherichia coli ATCC 11303, Micrococcus luteus ATCC 9341 균주 2종은 한국 미생물 보존센터에서 분양, tetracycline와 oxytetracycline, erythromycin, ampicillin, neomycin, sulfadimethoxine, chloramphenicol, monensin, novobiocin 등의 항생제와 trimethoprim은 Sigma사 제품을 사용, 이외의 시험 용액 및 시약 등도 이들과 동등한 규격품을 사용하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>표준시약</h2> <p>실험에서는 tetracycline와 oxytetracycline, erythromycin, ampicillin, neomycin, sulfadimethoxine, chloramphenicol, monensin, novobiocin 등의 항생제와 trimethoprim(TMP)은 Sigma사(St Louis, MO, USA) 제품을 사용하였으며, 이외의 시험 용액 및 시약 등도 이들과 동등한 규격품을 사용하였다. 실험기구로는 Advantec 사(Toyo Roshi Kaisha, Japan)의 paper disk(직경 \(10\mathrm{mm}\)), BBL사(Claix,France)의 streptomycin sensi-disk(직경 \( 6 \mathrm{~mm}, 10 \mu \mathrm{g}, \mathrm{S} 10 \)), petridish(\( 90 \times 15 \mathrm{~mm}, \mathrm{SPL} \), SPL 10090), caliper(Mitutoyo)을 사용하였다. 배지로는 계대용으로 nutrient agar는 Criterion사 Santa maria, CA, USA), 증균용으로 tryptic soy broth는 (Difco, Detroit, MI, USA), 아포제조용으로 A-K #2 sporulating(BBL) 또는 Nutrient agar(\( \mathrm{MnSO}_{4} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} 0.005 \% \)첨가), 시험용 배지로는 Difco사의 Mueller-Hinton agar(pH \( 7.3 \pm 0.1 \), MH), Antibiotic medium No. 2(pH \( 6.55 \pm 0.05 \), #2), Antibiotic medium No.5(pH \( 7.9 \pm 0.1 \), #5), Antibiotic medium No.8(pH \( 5.85 \pm 0.05 \), #8), Merck사(Darmstadt, Germany)의 Test agar pH 6.0(TA)과 pH 8.0 혹은 증류수 \(1\mathrm{L}\)당 peptone \( 6.9 \mathrm{~g}, \mathrm{NaCl} 5.1 \mathrm{~g}, \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} 1.0 \mathrm{~g} \), Agar \( 13 \mathrm{~g} \)(EEC agar)을 사용하였다.</p> <h2>시험용 균주</h2> <p>실험에 사용될 균주는 총 6가지로 Table 2에 나타내었다. 항생물질 간이검사법에 사용되는 시험용 균주인 Bacillus megaterium ATCC 9885, Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus cereus. var. mycoides ATCC 11778, Bacillus stearothermophilus var. B. calidolactis ATCC 10149 등은 식품 의약품안전청에서 분양 받았고, Escherichia coli ATCC 11303, Micrococcus luteus(Kocuria rhizophila) ATCC 9341 균주 2종은 한국 미생물 보존센터(KCCM)에서 분양받았다.</p> <h2>아포부유액 조제</h2> <p>Nutrient agar에 계대 보관되어 온 B. megaterium ATCC 9885, B. subtilis ATCC 6633, B. cereus. var. mycoides ATCC 11778, B. stearothermophilus var. B. calidolactis ATCC 10149 시험균주들을 멸균생리식염수 \( 5 \mathrm{~mL} \)에 현탁시킨 후 nutrient agar \( 300 \mathrm{~mL} \)를 넣어 굳힌 배양병(Roux bottle)에 접종하여 B. megaterium ATCC 9885, B. subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC 11778은 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), B. stearothermophilus ATCC 10149는 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1일간 배양하였다. 배양 후 멸균생리식염수 2-3 mL에 현탁시킨 후 아포조제용 배지 \( 300 \mathrm{~mL} \)를 넣어 굳힌 배양병(Roux bottle)에 접종하여 B. megaterium ATCC 9885, B. subtilis ATCC \( 6633, B \). cereus ATCC 11778 는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 1일간 배양한 후 실온에서 6일, B. stearothermophilus ATCC 10149 는 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1 주일간 아포를 형성시켰다. 멸균 유리구슬과 멸균증류수 \( 25 \mathrm{~mL} \)를 넣어 집균한 후 B. megaterium ATCC 9885, B. subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC 11778 는 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간, B. stearothermophilus ATCC 10149 는 \( 85^{\circ}\mathrm{C} \) 에서 15분간 가열한 후 B. megaterium ATCC 9885는 분당 \( 15,000 \times \mathrm{g} \)으로 20분간, B. subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC 11778, B. stearothermophilus ATCC 10149는 3,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 상층액을 제거한 다음 다시 멸균증류수에 부유시켜 세척을 3회 이상 반복하고 잔사를 멸균증류수에 부유시켜 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간, \( 85^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 재 가열하였다. 이 농후한 아포부유액들 중에서 B. megaterium은 표준평판희석법으로 균수를 측정한 후 아포농도를 \( 2 \times 10^{6} \mathrm{CFU} / \)\( \mathrm{mL} \)가 되도록 희석하여 사용하였다. B. subtilis와 B. cereus는 MacFaland No.1, B. stearothermophilus 는 MacFaland No.2 정도 되게 희석소분하여 냉장보관하여 사용하였다.</p>