Heat Shock Protein(HSP)는 생물계에서 단백질 folding, assembly, degradation 등의 기능을 조절하는 molecular chaperone으로 필수적인 단백질 중 하나이다. HSP70/DnaK family는 모든 생물계에 가장 잘 보존되어 있고, 원핵생물은 한 개의 HSP70 유전자를 가지고 있었으나 최근 복수의 HSP70 유전자가 보고되고 있다. 광합성 cyanobacteria는 고등식물과 생리적, 기능적으로 아주 유사한 기구를 가지고 있어 환경 스트레스에 대한 적응기작이 고등식물과 비슷할 것으로 추정되며, 본 실험에서는 A halophytica의 HSP70 homolog인 DnaK의 기능을 밝히기 위해 genomic library로부터 유전자를 cloning하여 그 구조와 다양한 환경 스트레스에 대한 발현양상 및 특성을 조사하였다.
<h1>서 론</h1> <p>생물계에 있어서 heat shock protein (HSP)은 세포 내 단백질들의 folding, assembly, degradation 등에 있어서 이들을 조절하는 molecular chaperone으로서 기능하는 필수적인 단백질 중의 하나이다. 대부분의 HSP 유전자들은 높은 온도 또는 다양한 환경 스트레스에 의해 그 발현이 유도된다. 이러한 HSP들 중에서도 HSP70/DnaK family가 모든 생물계에 가장 잘 보존되어 있는 것 중의 하나로 알려져 있고, 진핵생물의 경우 세포내의 각 소기관에 존재하는 10여 개의 HSP70 family로 구성되어 있으며, 원핵생물의 경우, 한 개의 HSP70 유전자를 가지는 것으로 알려져 있다. 그러나 최근 원핵생물로부터 그 기능과 조절 기구가 서로 다른 복수의 HSP70 유전자가 보고되고 있는데, 이는 원핵생물이 다양한 환경 스트레스에 적응하기 위하여 다양한 molecular chaperone system을 분화시켜왔기 때문으로 추정된다 . 광합성 cyanobacteria는 고등식물의 엽록체와 생리적, 기능적으로 아주 유사한 기구를 가지고 있어서 환경 스트레스에 대한 적응기작이 고등식물과 매우 유사할 것으로 추정된다. 따라서 광합성 cyanobacteria의 HSP70의 기능을 밝히면 고등식물에 있어서 엽록체에 존재하는 HSP70의 기능을 추정할 수 있을 것으로 생각된다.</p> <p>본 실험은 A. halophytica에 있어서 HSP70 homolog인 DnaK의 기능을 밝히고자 genomic library로부터 유전자를 cloning하여 그 구조와 다양한 환경 스트레스에 대한 유전자의 발현양상 및 특성을 조사하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>배양조건 및 스트레스 처리</h2> <p>A. halophytica는 Lee 등의 방법에 따라 \(18~ \mathrm { mM } \)의 \( \mathrm { NaNO } _ { 3 } \)와 Turk Island salt solution이 첨가된 BG11 배지로 \(28 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 광조건하에서 배양하였다. 고온처리를 위하여 생장시킨 cyanobacteria를 각각의 온도로 설정된 waterbath에서 30분간 광조건하에서 처리하였다. 염 스트레스의 처리는 1주일간 \(0.5~ \mathrm { M } \mathrm { NaCl } \) 이 첨가된 배지에서 생장시킨 세포를 원심분리하여 모은 후, 각각의 농도로 \( \mathrm { NaCl } \)이 첨가된 배지에서 3시간 처리하였다.</p> <h2>Genomic DNA library의 구축 및 screening</h2> <p>A. halophytica로부터의 genomic DNA는 Williams의 방법에 따라 분리하였다. 분리한 genomic DNA를 부분 분해한 다음 lambda FIX II vector에 도입하여 gnomic library를 구축하였다. Library screening을 위한 probe는 genomic DNA로부터 dnaK 유전자 단편을 PCR로 증폭하여 사용하였다. PCR 반응을 위한 primer로는 지금까지 보고된 원핵생물 유래의 HSP70 유전자들의 염기서열을 기초로하여 oligonucleotides, hsp5N (5'-GG(G/T)ATCGACCT (C/G)GGTACTACCA-3')과 hsp3C (5'-GC(T/A)GCGGTGGG(C/T)TCGTT(G/A)AT-3') 를 각각 forward 및 reverse primer로 사용하였다. 증폭된 \(0.5 \mathrm { ~kb } \)의 PCR산물의 염기서열을 확인한 후, 이를 \( ^ { 32 } \mathrm { P } \)로 labelling하여 library screening을 위한 probe로 사용하였다.</p> <h2>Subcloning 및 염기서열의 결정 분석</h2> <p>선발된 positive phage clone으로부터 phage DNA를 조제하여 제한효소 지도를 작성한 후, dnaK 유전자를 포함하는 최소 단편을 pBluescript SK-vector에 subcloning 하였다. 염기서열을 결정하기 위하여 분리한 plasmid DNA의 양방향의 염기서열을 dideoxy chain termination 법으로 ALFexpress Auto Cycle Sequencing Kit를 사용하여 AL-Fexpress DNA sequencer (Pharmacia, Uppsala)로 결정하였다. 염기서열 및 아미노산 배열의 분석은 Genetyx soft-ware (SDC Software Development, Tokyo)를 사용하여 분석하였다.</p> <h2>Southern 및 Northern blot 분석</h2> <p>Genomic DNA \(5 \mathrm { ~ \mu g } ) \)를 각각의 제한효소로 절단한 후 \(0.8 \% \) agarose gel로 전기영동한 다음 nylon membrane에 blotting 하였다. Probe DNA는 다른 dnaK와의 homology가 낮은 영역인 C-terminal의 EcoRI 단편(Fig. 1, nucleotide 1213-1975)을 \( ^ { 32 } \mathrm { P } \)로 labelling하여 dnaK-specific probe로 사용하였다. Membrane을 dnaK-specific probe로 hybridization 시킨 후 \(65 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(0.2 \times \mathrm { SSC } \)로 30분간 2회 washing하여 X-ray film에 노출시켰다.</p> <p>Total RNA는 Lee 등의 방법에 따라 분리하였으며, \(10~ \mathrm {\mu g } \)의 RNA를 \(1 \% \) agarose gel로 전기영동하여 nylon membrane에 blotting한 후 dnaK-specific probe와 hybridization 시켰다.</p>