국제동물유전학회(ISAG) 권장의 유전자 표준 9종을 포함해 13종의 microsatellite를 이용하여 말의 유전적 다양성 연구에 활용하였다. PCR 후 deionized formamide, loading buffer, 그리고 Genescan 350-TAMRA internal size standard와 혼합한 뒤 ABI PRISM 377 DNA sequencer를 사용하여 실험하였다. 말 혈액에서 DNA 분리와 정제는 Miller 등이 제시한 방법을 따랐다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>공시재료 및 표지유전자</h2> <p>공시재료는 후보 유전자 표지(MS)의 말 품종별 발현 특성의 분석을 위해 제주도 축산진흥원에 본유중인 제주마 41두, 현재 국내 경주마로 사용 중인 품종으로 한국마사회 유전자 검사실로 의뢰된 더러브렛 44두, 더러브렛종과 제주마 교잡종 56두, 몽고수입마 39두, 그리고 쿼터호스종 11두 동 모두 191 두를 대상으로 하였다. 유전자 감정을 위한 좌위는 ISAG(국제동물유전학회)에서 말의 유전적 다양성 연구를 위해 개체 식별 및 친자 감정 등에 활용하도록 권장하는 국 제최소 표준 9종을 포함한 총 13종의 microsatellite를 사용하였다.</p> <h2>Microsatellite 유전자형 분석</h2> <p>말 혈액 시료에서 genomic DNA의 분리와 정제는 Miller 등의 방법을 준용하여 수행하였다. PCR 반응은 형광 염색된 microsatellites의 색상과 대립 유전자의 크기별 분포 등을 고려하여 주로 multiplex PCR을 수행하였고, 일부의 microsatellites는 단일 marker로서 PCR을 수행하였다. GeneAmp 9700 (Applied Biosystems)에서 각 반응액의 총량을 \( 10 \mu \mathrm { l } \) PCR reaction으로 하고 약 \( 50 \mathrm { ng } \) template DNA, \( 20 \mathrm { ng } \) each primer, \( 1.25 \mathrm { mM } \) each of dNTP, \( 0.5 \mathrm { U } \), Taq DNA polymerases (Promega)과 \( 1 \mu \mathrm { l } 10 \mathrm { X } \) PCR buffer \( \mathrm { mM } (100 \mathrm { mM } \) Tris-HCl, \( \mathrm { pH } 8.3 \), \( 500 \mathrm { mM } \mathrm { KCl } , 0.01 \% \) gelatin, \( 0.25 \% \) nonidet \( \mathrm { P } 40 \) and \( 20 \mathrm { mM } \mathrm { ~MgCl_2 } \) ) 을 이용하여 \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 5 분간 첫 반응을 시작하여, \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30초, micro-satellites marker에 따라 \(53 \) ~ \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분간, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1분으로 35회 반복반응을 실시하고 마지막으로 신장 반응은 \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분간 실시하여 종료하였다. PCR 수행 후 중폭산물들을 deionized formamide, loading buffer 및 Genescan 350-TAMRA internal size standard와 잘 흔합하여, \( 5 \% \) pol-yacrylamide genaturing gel 제조한 후 ABI PRISM 377 DNA sequencer (Applied Biosystems)를 사용하였다. Genescan analysis software (version 3.1)을 이용하여 각 PCR 단편들의 크기를 3차원 최소자숭법(Third order least squares method)으로 분석하였고, Genotyper analysis soft-ware(version 2.0)을 이용하여 microsatellites loci별 대립유전자들의 정확한 크기를 결정하였다.</p>