생후 2일령 Sprague-Dawley rat를 실험에 사용하였다. HEI-OC1를 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) 세포배양기에서 \( 10 \% \) 우태아혈청이 포함된 DMEM으로 배양하였고, 계대배양하여 log phase에 있는 세포를 실험에 사용하였다. 세포를 조건에 맞춰 배양 후 MTT 용액을 배양액 최종부피의 1/10이 되도록 첨가하였다. 세포생존율은 정상대조군과 비교하여 백분율로 표시하였다.
<h2>Sprague-Dawley rat</h2> <p>Sprague-Dawley rat은 다물싸이언스(대전)에서 생 후 2일령을 분양받아 실험에 사용하였다.</p> <h2>시약</h2> <p>우태아혈청과 trypsin은 GIBCO BRL (Grand Island, NY, USA.), 흡광도계 측정용 96 well plate, 배양용기 12 well plate, 24 well plate 그리고 \( 10 \mathrm { ~cm } \) dish는 Falcon사(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA.), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Phalloidin-TRITC, Basal Medium Eagal (BME), dimethyl sulfoxide (DMSO), Cisplatin, 3-[4,5-dime-thylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 및 Collagen (Type I ; from rat tail)은 Sigma사(St. Louis, Missouri, USA.), anti-TNF \( \alpha \), anti-IL-1 \( \beta \), anti-IL-6, 사이토카인(TNF- \( \alpha \), IL-1 \( \beta \), IL-6), RNAlater 및 pro-inflammatory cyto-kine assay kit은 R&D system (Minnepolis, USA.)의 제품을 사용하였다.</p> <h2>세포 배양</h2> <p>HEI-OC1 세포는 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) 세포배양기 \( \left (33 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \right ) \) 에서 항생제 첨가 없이 \( 10 \% \) 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM으로 배양하였으며, 2-3일 간격으로 계대 배양하여 log phase에 있는 세포를 실험에 사용하였다.</p> <h2>세포생존율 측정</h2> <p>세포생존율은 MTT 방법으로 측정하였다. 세포 \((5 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { cells/ml } \))는 세포 배양판 24 well plate에 \( 1 \mathrm { ~ml } \)씩 분주하여 12시간 이상 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) 세포 배양기에서 부착시킨 후, 각각의 조건에 따라 시료를 처리하였다. 조건에 맞취 배양한 후 각각의 well에 MTT 용액 \( (5 \mathrm { ~mg } / \mathrm { ml } \) in PBS)을 배양액 최종부피의 1/10이 되도록 첨가하였다. 반응 4시간 후 상층액을 제거하여 바닥에 부착된 불용성의 보라색 formazan을 완전히 건조 시킨다. \( 500 ~ \mu \mathrm { I } \)의 DMSO로 용해시킨 후에 \( 100 ~ \mu \mathrm { I } \)를 96 well plate에 넣어 분광광도계(ELISA reader, Molecular Devices Co. Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 \( 595 \mathrm { ~nm } \) 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 정상 대조군과 비교하여 백분율 \(( \%) \)로 표시하였다.</p>