Peniophora sp. JS17의 배양액을 7µm, 0.45µm 직경의 멤브레인 필터를 통해 균사체와 불순물을 제거하였다. Laccase 활성은 50mM의 sodium acetate buffer에서 ABTS를 기질로 사용해 산화물을 생성하고, 그 산화물의 흡광도를 420nm에서 측정하였다. 또한, Lignin peroxidase 활성은 50 mM sodium malonate buffer에 veratryl alcohol, H2O2를 넣고 37°C에서 반응 후, 생성된 veratraldehyde의 흡광도를 310nm에서 측정하였다. 단백질의 정제도는 SDS-PAGE를 통해 확인하고, 전기영동 밴드는 coomassie로 염색하였다.
<h2>효소활성측정</h2> <p>Peniophora sp. JS17 배양액을 membrane filter (pore size, \( 7 \mu \mathrm{m} \) )을 통과시켜 균사체를 제거하고 다시 membrane filter (pore size, \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) )을 통과시켜 불순물을 완전히 제거하였다. 여과한 배양액은 ultrafiltration 장치 (Centricon, MWCO \( 10 \mathrm{kDa} \) )을 사용하여 농축하였고 이 용액을 조효소액으로 사용하였다. Laccase 활성은 \( 50 \mathrm{mM} \) sodium acetate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 4.5)에서 \( 2 \mathrm{mM} \) 2,2'-azino bis(3-ethylbenzthiazoline- 6 -sulfonate) (ABTS)을 기질로 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 조효소와 반응시켰으며, \( \mathrm{ABTS} \)의 산화에 의해 생성된 산화물은 \( 420 \mathrm{~nm}\left(\varepsilon_{\max }=36,000 \mathrm{M}^{-1} \cdot \mathrm{cm}^{-1}\right) \)에서 측정하였다. Manganese peroxidase 활성은 반응액 \( 0.9 \mathrm{ml}(50 \mathrm{mM} \) sodium malonate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 4.5), \( 0.5 \mathrm{mM} \mathrm{MnSO}, 0.1 \mathrm{mM} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) )에 조효소액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시킨 후, 생성된 \( \mathrm{Mn}^{3+} \)-malonate complex를 흡광도 \( 270 \mathrm{~nm}(\varepsilon=11,590 \) \( \mathrm{M}^{-1} \cdot \mathrm{cm}^{-1} \) )에서 측정하였다. Lignin peroxidase 활성은 반응액 \( 0.9 \mathrm{ml} \) (50 mM sodium malonate buffer ( \( \mathrm{pH} 4.5 \) ), ( 2 \mathrm{mM} \) veratryl alcohol, \( 0.1 \mathrm{mM} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) )에 조효소액 \( 0.1 \mathrm{ml} \)을 첨가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시킨 후, 생성된 veratraldehyde를 흡광도 \( 310 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 효소활성의 단위는 분당 \( 1 \mu \mathrm{M} \)의 기질을 산화시키는 효소의 양을 1 unit (U)로 정의하였다.</p> <h2>효소 정제</h2> <p>Laccase 최적 생산 배지 \( (2 \% \) xylose, \( 0.2 \% \) malt extract, \( 0.4 \% \) tryptone, \( \left.0.1 \% \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4}, 0.4 \% \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\right) \)에서 7일간 배양한 배양액을 membrane filter (pore size, \( 7 \mu \mathrm{m} \) )을 통과시켜 균사체를 제거하고 원심분리 \( (10,000 \times g, 10 \mathrm{~min}) \) 한 후 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액은 포화농도 \( 80 \% \)로 ammonium sulfate를 첨가하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 방치한 후 원심분리 \( (10,000 \times g, 20 \mathrm{~min}) \)하였다. 원심분리 한 후 침전물은 \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-HCl buffer \( (\mathrm{pH} \) 8.0)에 녹인 후 같은 buffer로 24시간 투석하였다. 투석된 단백질은 ÄKTAprime (GE Healthcare, USA)을 이용하여 HiTrap Q HP column에 로딩한 후 0-1.0 M의 NaCl로 농도구배를 주어 결합된 단백질을 용출하였다. 용출된 획분은 laccase 활성을 측정하여 활성이 있는 획분을 모아 Amicon filter (Milipore, USA)로 농축한 다음 \( 20 \mathrm{mM} \) sodium acetate (pH 5.0)로 투석하였다. 단백질의 정제도는 SDS-PAGE (10\% acrylamide gel)을 통하여 확인하였고, 전기영동 밴드는 coomassie를 사용하여 염색하였다.</p>