P6C promoter DNA 단편을 이용하여 PstI과 BamHI 제한효소 자리를 가진 발현벡터 pSJE6c를 구축하였다. 이 발현벡터는 Leuconostoc 속, Lactobacillus 속, 대장균에서 복제가 가능하며 theta type으로 복제되는 plasmid로서 비교적 안정하다. 그리고 \( \alpha \)-galactosidase 유전자(aga)를 PCR로 증폭하여 PSJE6c의 동일 제한효소 자리들에 도입하여 9kb 크기의 pSJE6caga를 얻었다. 형질전환체를 탄소원이 다른 MRS 배지에 접종하여 생육한 결과 cose와 sucrose 배지에서는 빠르게 melibiose, raffinose, fructose 배지에서는완만하게 생육하였고 galactose 배지에서는 잘 생육되지 않았다.
<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>발현벡터의 구축</h2> <p>이미 보고된 P\(6\)C promoter sequence를 바탕으로 상보적인 염기서열로 이루어진 한 쌍의 oligonucleotides(Table \(2\)) 들을 제조하고 이들을 \(94^{\circ} \mathrm{C}\) 에서 annealing을 실시하였다. 그 결과 양 끝에 PstI과 \(B a m\mathrm{HI}\) 제한효소 자리를 지닌 \(54 \mathrm{bp}\) 크기의 P\(6\)C promoter DNA 단편을 얻었다. 이를 유산균용 셔틀벡터인 pSJE의 multiple cloning site중 PstI과 BamHI에 도입하여 유전자 발현에 필요한 promoter를 지닌 발현벡터 \(\mathrm{pSJE6c}\)를 구축하였다(Fig. \(1\)). pSJE\(6\)c에는 선택표지로서 항생제 erythromycin 내성 유전자가 있고, 전체 크기는 \(6.5 \mathrm{~kb}\)이다. pSJE\(6\)c는 Leuconostoc 속, Lactobacillus 속 뿐만 아 니라 대장균에서도 복제가 가능하다. pSJE는 theta type 으로 복제가 되는 plasmid로서 비교적 안정하다. 배지에 항 생제 Em이 없이도 \(13\)일 배양할 경우 여전히 \(3.1 \%\) 해당하는 균주들은 plasmid를 지니고 있어서 상당히 안정하다. 이는 \( \mathrm{RCR} \) (rolling circle replication)방식으로 복제되는 다른 plasmid들과 비교시 매우 안정적이다.</p> <p>이러한 점은 식품용 벡터 개발에 있어서 큰 장점이 될 수있다. 즉 식품용 벡터에는 Erythromycin과 같은 항생제 내성유전자를 사용할 수 없고 따라서 항생제에 의한 재조합균주 선발도 불가능하다. 때문에 본질적으로 보다 안정한 plasmid가 그렇지 못한 종류들보다 유리할 것이기 때문이다.</p> <h2>발현벡터 구축 및 L. brevis \(2.14\)로의 도입</h2> <p>구축된 발현벡터인 pSJE\(6\)c와 원 벡터인 pSJE의 외래유전자 발현 효율 비교를 위하여 두 종류의 외래 유전자를 이들에 각각 도입하였다. 먼저 \( \alpha \)-galactosidase 유전자 \((a g a)\)를 시험하였다. Table \(2\)의 aga 증폭용 primer 한 쌍을 이용하여 PCR로 \( 2.5 \mathrm{~kb} \) 를 증폭하였다. 증폭물의 양 끝은 각각 \( \mathrm{BamHI} \) 과 NotI 제한효소 자리를 가지며 이들 효소로 처리한 후 PSJE6c의 동일 제한효소 자리들에 도입하였다. 그 결과 \(9\) \( \mathrm{kb} \) 크기의 pSJE6caga를 얻었다(Fig. \(1\)-b).</p> <p>\( \beta \)-galactosidase 유전자인 lacZ 역시 Table \(2\)의 lacZ primer를 이용하여 증폭하였다. \(3\mathrm{~kb} \)크기의 증폭물 말단에는 각각 \(Bam\mathrm{HI}\)과 \( N o t \mathrm{I} \) 제한효소 자리가 있다. 제한효소 처리 후 pSJE\(6\)c에 도입하여 \(9.5 \mathrm{~kb} \)크기의 pSJE\(6\)Z를 얻었다 (Fig. \(1\)-c). pSJE\(6\)c에 도입한 유전자들은 고유 promoter가 없지만 비교 목적으로 pSJE에 도입시킨 \( a g a \) 와 \(\operatorname{lacZ}\) 유전자들 은 원래 promoter를 포함시켜서 증폭하였다. 외래 유전자를 포함한 재조합 플라스미드들은 L .brevis \(2.14\) 균주내로 electroporation방법으로 도입시켰다. L. brevis 형질전환 효율은 plasmid DNA \(1 \mu \mathrm{g} \) 당 \(10^{2}\) 형질전환체 정도로 통상 \(10^{6-7}\) 형질전환체인 대장균에 비해 효율은 낮았다.</p> <h2>형질전환체들의 \( \alpha \)-Gal 효소역가</h2> <p>pSJE\(6\)caga나 pSJEaga를 지닌 형질전환체를 탄소원이 다른 MRS 배지에 접종하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양하여 얻은 생육곡선들을 Fig. \(3\)에 나타내었다. Glucose와 sucrose 배지에서는 빠르게 생육하나 melibiose, raffinose, fructose 배지에서는 완만하게 생육하였고 특히 galactose 배지에서는 생육이 원할하지 않았다.</p> <p>이는 \( L \). brevis \( 2.14 \) 의 경우 galactose를 이용 할 수 있는 대사경로 부재로 인한 것이거나, 또는 세포 내로 galactose를 옮겨주는 수송체 부족 또는 이상으로 인한 것이 아닐까 추정된다. \( \alpha \)-Gal 효소역가 측정결과를 보면(Fig. \(4\)), \( \alpha \)-Gal 효소의 기질인 raffinoses와 melibiose에서 생육한 세포 들이 높은 효소 역가를 나타내었고, 다음으로 galactose, fructose, glucose, sucrose 순으로 나타났다. Raffinose에서 \(12\)시간 배양 시 가장 높은 효소역가 \( 58.64 \mathrm{U} / \mathrm{mg} \) protein)를 나타내었고, melibiose는 \(24\)시간 배양 시 높은 효소역가 (43.17 U/mg protein)를 나타내었다. 하지만 배양시간이 길어지면서 효소역가는 점점 줄어들어서 48 시간에는 각각 \( 3.43 \)\( \mathrm{U} / \mathrm{mg} \) protein과 \( 3.66 \mathrm{U} / \mathrm{mg} \) protein을 나타내었다. 나머지 탄소원 별 효소역가를 보면, galactose에서는 \(24\)시간(6.67 U/ \( \mathrm{mg} \) protein), fructose \(24\)시간(3.21 U/mg protein), glucose \(12\)시간 \( (1.37 \mathrm{U} / \mathrm{mg} \) protein \( ) \), 그리고 sucrose는 \(24\)시간(0.38 \( \mathrm{U} / \mathrm{mg} \) protein) 배양시 역가가 가장 높았다. 한편 Fig. \(3\)의 결과를 살펴보았을 때, pSJE\(6\)caga를 지닌 균주는 pSJEaga를 지닌 균주와 비교할 때 효소역가가 \( 1.5 \) 내지 \(2\) 배 정도 더 높 았고 이는 \(6\)가지 탄소원 모두에서 확인할수 있었다. 이 결 과는 \( a g a \) 고유 promoter보다는 P6C promoter가 \( a g a \) 유전 자 발현에 더욱 적합함을 보여주는 결과로서 강력한 promoter를 지닌 발현벡터 구축의 필요성을 확인시켜준다.</p>