본 연구에서는 LPS에 의해 활성화된 대식세포가 중간엽 줄기세포의 평활근 세포로의 분화를 유도하는 지 확인하는 실험을 진행하였으며, LPS 배양액의 농도가 증가함에 따라 평활근 세포의 대표 지표인자인 \(\alpha\)-SMA의 발현 증가를 통해 LPS 배양액이 중간엽 줄기세포를 평활근 세포로 분화를 촉진시킨다는 것을 알 수 있었다. 한편 LPS 배양액을 처리했을 때 calponin, smoothelin, h-caldesmon, SM-MHC와 같은 평활근 세포에만 특이적으로 나타나는 지표인자가 발현됨을 보았으며, 추가로 실험된 LPA의 \(\alpha\)-SMA의 발현 관여 여부는 실험결과 관여하지 않음을 알 수 있었다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>대식세포(macrophage)에 LPS를 처리하여 얻은 LPS 배양액에 의한 인체 중간엽 줄기세포의 평활근 세포로의 분화유도</h2><p>본 연구에서는 LPS에 의해 활성화된 대식세포가 인체 중간엽 줄기세포의 평활근 세포로의 분화에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다. 이를 위해 대식세포에 LPS를 처리한 후 48시간 동안 배양하여 회수한 LPS 배양액을 중간엽 줄기세포에 처리하였다. LPS 배양액을 96시간 동안 중간엽 줄기세포에 처리한 후 평활근 세포로의 분화여부는 평활근 세포에 특이적인 표지인자의 발현 여부를 western blotting을 통해 확인함으로써 시행하였다. LPS 배양액을 처리한 군에서는 LPS 배양액의 농도가 증가함에 따라 평활근 세포의 대표 지표인자인 \(\alpha\)-SMA의 발현이 증가함을 확인할 수 있었다(Fig. 1A. 그러나, 대식세포에 아무것도 처리하지 않은 후 얻은 대조군 배양액 (control CM)을 중간엽 줄기세포에 처리하였을 때에는 중간엽 줄기세포 내에서 \(\alpha\)-SMA의 발현이 증가되지 않았다. 그리고 LPS 배양액을 중간엽 줄기세포에 시간 별로 처리했을 때에는 처리 후 24시간부터 \(\alpha\)-SMA이 발현하며 96시간까지 발현이 증가하는 것을 확인하였다.</p><p>LPS 배양액에 의해 중간엽 줄기세포가 평활근 세포로의 분화가 촉진되는 것이 LPS에 의해 활성화 된 대식세포를 통하여 일어나는 것인지 또는 LPS가 중간엽 줄기세포에 직접적인 영향을 끼쳐서 일어나는 현상인지를 알아보고자, 중간엽 줄기세포에 LPS를 처리한 후 \(\alpha\)-SMA의 발현을 확인하였다. LPS를 중간엽 줄기세포에 직접 처리했을 때에는 \(\alpha\)-SMA가 발현되지 않았고, 대식세포에 LPS를 처리하여 얻은 LPS 배양액을 처리한 경우에만 중간엽 줄기세포에서 \(\alpha\)-SMA가 발현되는 것을 확인하였다. 이 결과를 통하여 LPS에 의해 활성화된 대식세포의 배양액인 LPS 배양액이 중간엽 줄기세포를 평활근 세포로 분화를 촉진시킨다는 것을 알 수 있었다.</p><h2>LPS 배양액에 의한 다양한 평활근 세포 지표 인자의 발현 확인</h2><p>중간엽 줄기 세포에 LPS 배양액을 처리 했을 때 평활근 세포의 대표적인 지표인자인 \(\alpha\)-SMA 이외에 다른 지표인자들도 발현이 되는지 확인하는 실험을 진행하였다. LPS 배양액을 처리했을 때 \(\alpha\)-SMA에 뿐만 아니라 calponin, smoothelin, h-caldesmon, SM-MHC와 같은 평활근 세포에만 특이적으로 나타나는 지표인자들이 발현되는 것을 확인하였다. 본 연구결과를 통해 LPS 배양액이 중간엽 줄기세포를 평활근 세포로의 분화를 촉진한다는 것을 다시 한번 확인할 수 있었다.</p><h2>LPS 배양액의 분화 유도에 lysophosphatidic Acid(LPA) 관여 여부 확인</h2><p>본 연구실에서는 LPA에 의해 중간엽 줄기세포가 평활근 세포로 분화를 유도한다는 연구 결과를 보고한 바 있다. LPA는 암 조직의 혈관 생성에 관여하고 암 조직의 크기를 증가시키는데 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히, 난소암 환자의 복수에 다량 존재하는 물질로써 염증성 환경에서는 LPA가 고농도로 존재하며, 중간엽 줄기세포는 LPA 농도가 높은 곳으로 이동한다. 이런 보고를 바탕으로 LPS 배양액에 의해서 중간엽 줄기세포가 평활근 세포로 분화 됨에 있어 LPA가 관여하는지 확인하는 실험을 진행하였다. LPA 수용체 억제제인 Ki16425로 LPA 수용체를 억제 시킨 후 LPS 배양액을 처리하여 \(\alpha\)-SMA의 발현여부를 확인하였다. LPA에 의해 증가 되었던 \(\alpha\)-SMA 발현은 Ki16425의 처리시 \(\alpha\)-SMA발현이 완전히 억제되었다. 그러나, LPS 배양액과 SPC에 의해 증가한 \(\alpha\)-SMA발현은 LPA 수용체를 억제하여도 \(\alpha\)-SMA발현에는 전혀 영향이 없는 것을 확인하였다. 따라서 LPS 배양액에 의한 \(\alpha\)-SMA의 발현에는 LPA가 관여하지 않음을 알 수 있었다.</p>