Polyacrylamide gel 실험은 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 항온기를 사용한 polyacrylamide vertical slab system을 활용하였다. 여기에 Davis 방법에 따라 구성한 acrylamide separation gel과 stacking gel을 사용하였다. 단백질 정량은 Bradford 방법에 의거하여 BSA를 표준단백질로 사용하였고, Oxamate-agarose gel 준비와 affinity chromatography는 O'Carra와 Barry의 방법을 변형하였다. LDH 활성 측정과 단백질 정량을 통해 elution profile을 작성하고, LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소를 함유한 분획은 농축시켜 역학실험과 항원으로 사용하였다.
<h2>단백질 정량</h2> <p>단백질은 Bradford의 방법으로 정량하였다. Coomassie brilliant blue G-250 \( 100 \mathrm { mg } \) 을 \( 85 \% \) \( \mathrm { H } _ { 3 } \mathrm { PO } _ { 4 } 100 \mathrm { ml } \) 에 세게 저어주면서 섞은 후 \( 95 \% \) 에탄올 \( 50 \mathrm { ml } \) 를 첨가한 다음 증류수로 \( 1 \mathrm { L } \)를 만든 후 사용하였다. 표준단백질로 BSA를 사용하여 분광광도계로 \( 595 \mathrm { ~nm } \) 에서 정량하였다.</p> <h2>Native-polyacrylamide gel 전기영동(native-PAGE)</h2> <p>Polyacrylamide gel은 항온기(Rikakikai CA-1100)를 사용하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 유지시킨 polyacrylamide vertical slab system (Hoefer SE250)으로 실시하였다. Davis의 방법에 따라 \( 7.5 \% \mathrm { ~T } , 2.67 \% \mathrm { C } \) acrylamide separation gel과 \( 3 \% \mathrm { T } \), \( 2.67 \% \mathrm { C } \) acrylamide stacking gel이 되도록 slab gel을 만들었다. 시료에는 \( 50 \% \) sucrose, \( 0.05 \% \) bromophenol blue 용액을 1:1(v/v) 로 가한 후 \( 5 \mathrm { mM } \) Tris-glycine buffer ( \( \mathrm { pH } \) 8.3)를 사용하여 \( 100 \mathrm { ~V } \) 에서 20분간 전개시킨 다음 \( 200 \mathrm { ~V } \) 에서 2시간 10분 동안 전기영동 하였다. LDH 효소염색은 Whitt의 방법에 따라 DL-lactic acid, NBT, PMS 및 \( \mathrm { NAD } ^ { + } \)혼합용액에 gel을 넣어 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 염색한 후 \( 15 \% \) 초산용액 내에서 고정시켰다.</p> <h2>LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소의 정제</h2> <p>Oxamate-agarose gel의 준비와 affinity chromatography 는 O'Carra와 Barry의 방법 및 O'Carra 등의 방법을 변형하여 실시하였다. \( \omega \)-Aminohexyl-agarose \( 100 \mathrm { ml } \) 를 Büchner funnel에 넣고 \( 0.5 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } (200 \mathrm { ml } / 4 \mathrm { ml } ) \) 로 씻어준 후 증류수로 씻어서 NaCl을 제거한 다음 Büchner funnel 의 gel을 beaker로 옮긴다. \( 30 \mathrm { ~g } \) 의 potassium oxalate를 증류수 \( 160 \mathrm { ml } \) 에 용해시킨 후 EDC \( 10 \mathrm { ~g } \) 을 증류수 \( 80 \mathrm { ml } \) 에 용해시켜 potassium oxalate 용액에 빠르게 한 방울씩 가해주며 저어주었다. 5분 후, ligand 및 EDC 혼합용액을 gel 현탁액과 섞은 후, \( \mathrm { pH } \) 를 \( 4.5 \sim 6.0 \) 사이로 조절한 다음 \( 8 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 회전식 진탕기에서 45시간 동안 진탕시켰다. Ligand-spacer-agarose 결합이 완료된 후 gel을 Büchner funnel로 옮긴 다음 증류수 \( 5 \mathrm { l } , 1 \mathrm { M } \mathrm { NaCl } \) 을 포함하는 \( 0.05 \mathrm { M } \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } \) 용액 21 및 \( 1 \mathrm { M } \) NaCl을 포함하는 \( 0.05 \mathrm { M } \mathrm { K } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } \) 용액 21 로 충분히 씻어서 잉여 ligand, 요소유도체 및 반응되지 않은 EDC를 제거하였 다. \( 0.5 \mathrm { M } \mathrm { KCl } \) 을 포함하는 \( 0.05 \mathrm { M } \) potassium phosphate buffer (column buffer) \( 2 \mathrm { L } \)로 평형시킨 후 Büchner funnel의 gel을 column에 채우고 다시 column buffer로 평형시킨 다음 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 저장하였다. Oxamate-agarose column은 사용하기 전에 \( 0.20 \mathrm { mM } \) NADH를 함유한 column buffer로 평형시킨 후 \( 0.50 \mathrm { M } \mathrm { KCl } \) 과 \( 0.20 \mathrm { mM } \) NADH를 첨가한 쏘가리 골격근 조직 추출액 \( 5 \mathrm { ml } \) 를 가하였다. Column으로부터 단백질이 용출되지 않을 때까지 \( 0.20 \mathrm { mM } \) NADH를 함유한 column buffer로 씻어 준 후 \( 1.6 \mathrm { mM } \mathrm { NAD } ^ { + } \) 를 함유한 column buffer 와 column buffer를 차례로 유입시키면서 용출액을 \( 3.2 \mathrm { ml } \) 씩 분획하였다. 각 분획에 대하여 LDH 활성 측정 및 단백질 정량을 실시하여 elution profile을 작성하고 LDH \( \mathrm { A } _ { 4 } \) 동위효소를 함유한 분획은 모아서 PM-10 membrane으로 농축시킨 후 역학실험 및 항원으로 사용하였다.</p>