효소반응속도와 입체선택성 변화를 평가하기 위해 유기용매 및 금속이온을 효소 반응액에 첨가하고 반응을 수행하였다. 에스터라제 EM2L8의 합성 기질 pNPB에 대한 분해속도는 15분 동안 다양한 온도에서 측정되었으며, 그 결과 최적 반응온도는 \( 40-45 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 나타났다.
<p>기체크로마토그래피 분석에서는 (R)-ECHB와 (S)- ECHB를 분석할 수 있는 Chirasil-dex 컬럼이 장착된 GC 장치를 사용하였고 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 180 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 분당 \( 5 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 씩 높여준 후 \( 180 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2분간 유지시켰다. 검출기로는 frame ionization detector (FID)를 사용하였다.</p> <p>유기용매와 금속이온을 효소 반응액에 첨가하고 반응을 수행한 후, 효소반응속도와 입체선택성의 변화를 측정하였다. 사용한 유기용매로는 메탄올, 에탄올, DMSO, 아세토니트릴, 아세톤이며 \( 10 \%( \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 농도가 되도록 첨가하여 사용하였다. 금속이온은 \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } , \mathrm { Ca } ^ { 2 + } , \mathrm { K } ^ { + } , \mathrm { Li } ^ { + } , \mathrm { Cu } ^ { 2 + } \) 를 사용하였고 \( 10 \mathrm { mM } \) 농도가 되도록 첨가하여 사용하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>에스터라제 EM2L8의 온도 및 pH 특성</h2> <p>파푸아뉴기니의 심해바닥에서 발굴된 메타게놈 에스터라제 EM2L8 유전자를 E. coli BL21(DE3) 균에서 발현하고 균체를 초음파분쇄법으로 분쇄하여 세포추출액을 제조하였다. 세포추출액의 에스터라제 활성을 pNPB 분석법으로 확인함으로써 에스터라제 효소의 발현을 확인한 후, 이 효소의 최적 반응온도를 측정하였다. 에스터라제 EM2L8의 합성 기질 pNPB에 대한 분해속도를 15분 동안 온도별로 측정한 결과, 최적반응온도는 \( 40-45 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 인 것으로 밝혀젔다(Fig. 1A). 최적반응온도가 이전에 보고된 온도 \( \left (50-55 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \)보다 낮은 이유는 pNPB 분해 과정에서의 반응시간이 15분으로 길어졌기 때문이라고 보인다. 한편, 이 효소는 \( 15 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서도 최적 온도의 \( 45 \% \) 에 해당되는 활성을 보이며 \( 15-45 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 온도범위에서 4.9 kcal/mol의 낮은 활성화에너지를 갖는 것으로 계산 되었다(Fig. 1B). 일반적으로 활성화에너지가 10 kcal/mol 이하인 효소를 저온성 효소 또는 저온 적응효소로 분류한다. 따라서 이 효소는 전형적인 저온 적응효소인 것으로 확인되었다.</p>