Tod DNA 중합효소는 DNA 신장능력이 Pfu보다 높고, Taq와 비슷함을 보였다. 또한, 2가 양이온 및 KCl 농도 등의 PCR 조건에서 다른 내열성 DNA 중합효소와는 차별화된 생화학적 특성을 보이므로, 일반적인 내열성 DNA 중합효소로 어려운 PCR 샘플 증폭에 활용될 수 있을 것으로 보인다. 이제 이 중합효소를 다양한 PCR 조건 및 샘플에 대한 적용 가능성을 탐색하고 있다. Tod DNA 중합효소를 이용한 PCR 실험길과, 이 중합효소의 DNA 증폭 및 PCR 기술 응용 가능성에 대해 높은 기대를 가지고 있다.
<h2>Tod DNA polymerase의 PCR 적용</h2> <p>Tod polymerase의 DNA 신장 능력을 기존의 시판중인 Taq 및 Pfu polymerase와 함께 비교하기 위하여, \( \lambda \)-phage DNA를 주형으로 하고 각각 20 초, 40 초, 60 초의 다른 신장 조건에서 PCR을 수행하였다. 그 결과 Pfu polymerase는 60초의 신장 시간에서 아주 적은 양의 DNA 단편이 확인되었고, Tod 와 Taq polymerase는 40 초와 60 초의 신장조건에서 비슷한 양으로 증폭된 DNA 단편이 확인되었다(Fig. 4). 따라서 Tod polymerase의 DNA 신장환성은 Pfu 보다는 높고 Taq와는 비슷한 결과를 나타내었다. Tod polymerase를 long \( \mathrm { PCR } \) 에 적용하기 위하여 \( \lambda \)-phage를 주형으로 하고 각각 \(1, 2, 4, 6, 8 \mathrm { ~kb } \) 의 단편을 \( \mathrm { PCR } \) 로 증폭하였다. 그 결과 Tod polymerase는 1, 2, 4, 6 kb의 DNA 단편은 증폭한(Fig. 5) 반면, \( 8 \mathrm { ~kb } \) 의 단편은 증폭하지 않았다(data not shown). 일반적으로 PCR에 널리 사용되는 Pol I family의 Taq poly-merase는 개량된 PCR 조건에서 \( 24 \mathrm { ~kb } \) 까지 DNA 증폭이 가능한 것으로 보고되었고, \( \alpha \)-family의 Pfu polymerasc는 실제로 증폭할 수 있는 길이가 \( 2 \mathrm { ~kb } \) 이하로 알려져 있다.</p> <p>이상의 걸과에서 Tod polymerasc는 기존에 널리 시판중인 Taq polymerasc와 비슷한 신장활성을 나타내었고 \( 6 \mathrm { ~kb } \)의 긴 DNA 단편을 증폭할 수 있기 때문에 분자생물학, DNA 진단, DNA 지문검사 등에서 PCR 반응에 적용 가능 성이 높다고 할 수 있다. 또한 Tod DNA polymerase는 2가 양이온 및 KCl 농도와 같은 PCR 조건에서 다른 내열성 DNA polymerase와는 다른 생화학적 특성을 나타내기 때문에 기존의 내열성 DNA polymerase에 의해 잘 증폭되지 않는 PCR 샘플에 사용 가능할지도 모른다. 현재, 다양한 샘플에 대한 PCR 조건을 검토 중에 있다.</p> <h1>요 약</h1> <p>PCR법을 이용하여 Thermus thermophilus HJ6 유래 DNA polymerase(Tod) 유전자를 클로닝하고 염기서열을 분석한 결 과, ORF는 2,505개의 뉴클레오타이드로 구성되고 834 개의 아미노산을 암호화하였다. 아마노산 서열을 바탕으로 상동성을 분석한 결과, Thermus thermophilus \( \mathrm { HB } 8 \) 유래 DNA polymerase와 98 \%, Thermus aquaticus 유래 DNA poly-merase와 \( 86 \% \) 의 identity를 나타내었다. 이 유전자를 박테리 오파지 \( \lambda \) 유래 온도감수성 프로모터(PR, PL)를 포함하는 pJLA503 벡터를 이용하여 대장균에서 발현하였다. 발현된 효소는 열처리, HiTrap \( ^ {\mathrm { TM } } \) Q column과 HiPrep \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) Sephacryl \( \mathrm { S } -200 \\mathrm { HR } 26 / 60 \) column으로 정제하여 \( 94 \mathrm { kDa } \) 의 단백질을 얻을 수 있었다. 정제된 효소의 DNA 중합 활성에 대한 최적온도는 \( 75 \sim 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 이고 최적 \( \mathrm { pH } \) 가 \( 9.0 \) 이었다. \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \) and \( \mathrm { Mn } ^ { 2 + } \) 에 대한 최적 농도는 각각 \( 2.5 \mathrm { mM } \) 과 \( 1 \mathrm { mM } \) 이었고 효소활성은 2가 양이온의 존재 하에서는 활성화 되지만 1가 양이온에서는 저해되었다. Tod DNA 중합효소를 이용한 PCR 실험길과, Tod DNA 중합효소는 DNA 증폭 및 PCR 관련 기술에 응용 가능할 것으로 생각된다.</p>