꽃송이버섯 50g를 분말화하여 2L 물과 함께 121\(^\circ \mathrm{C}\) 10시간 열수 추출한 후 8,000rpm 4\(^\circ \mathrm{C}\) 20분 원심분리하여 상등액을 회수하고 80% 에탄올로 침전시키고 55\(^\circ \mathrm{C}\) 12시간 건조하여 베타-글루칸 추출물을 획득하였다. 또한 Raw 264.7 cell을 37\(^\circ \mathrm{C}\) 5% CO2 조건에서 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin을 포함한 DMEM 배지에서 배양하였다. 꽃송이버섯으로부터 베타-글루칸을 추출하고, 마우스 대식세포 Raw 264.7 cell을 배양하여 베타-글루칸의 정량을 계산하고 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>꽃송이버섯 유래 베타-글루칸의 추출</h2> <p>꽃송이버섯 \( 50 \mathrm { ~g } \)을 갈아 분말화한 후 물 2 \( \mathrm { l } \) 를 첨가하여 \( 121 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10시간 동안 열수 추출을 실시하였다. 그 후 8,000 \( \mathrm { rpm } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20분 동안 원심분리 후 상등액을 회수하고 \( 80 \% \) 에탄올을 첨가하여 다당체를 침전시킨 후 \( 55 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 12시간 동안 건조하여 열수 추출물을 획득하였다. 열수 추출된 베타-글루칸 시료에 \( \alpha \)-amylase, cellulose, protease, amyloglucosidase 등으로 효소분해를 실시하여 베타-글루칸 이외의 알파글루칸과 단백질 등을 분해한 후 에탄올로 침전시켜 효소분해 되지 않은 베타-글루칸을 회수하여 동결 건조하였다. 베타-글 루칸을 정량하기 위해서는 동결 건조한 베타-글루칸을 산 가 수분해하여 유리되는 총 포도당 함량을 계산하였다 .</p> <h2>세포 배양</h2> <p>마우스의 대식세포주인 Raw 264.7 cell은 한국세포주은행 (KCLB)에서 분양 받아 \( 10 \% \)fetal bovine serum (FBS, Gibco, Invitrogen)와 \( 1 \% \)penicillin-streptomycin을 포함하는 Dul-becco's modified Eagle medium (DMEM)배지를 사용하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \)조건에서 배양하였다.</p> <h2>사이토카인 측정</h2> <p>마이크로플레이트(Corning Laboratory Science Co., NY, \( \mathrm { USA } \)의 각 well에 \( 1 \times 10 ^ { 6 } \)의 세포가 들어가도록 분주한 후 꽃송 이버섯에서 추출한 베타-글루칸을 여러 가지 농도로 처리하고 24 시간 후 Bio Plex (Bio rad)를 이용하여 TNF- \( \alpha \)와 IL- \( \beta \)를 측정하였다. 측정 방법을 간략하게 소개하면, \( 1 \% \mathrm { BSA } \)가 함유된 PBS 100 \( \mu \mathrm { l } \)로 각 well을 적신 후, standard, sample, refer-ence와 blank 시약을 각 100 \( \mu \mathrm { l } \)씩 분주한 후 상온에서 30분간 shaking을 하며 배양하였다. \( 1 \% \) BSA와 \( 0.05 \% \) Tween20이 함유된 PBS 150 \( \mu \mathrm { l } \) 로 3 번 세척한 후, 혼합된 Biotinylated Abs를 well당 \( 50 \mu \mathrm { l } \)씩 분주하고, 30분간 shaking을 하며 상온에서 배양하였다. 3번 세척 후 streptavidin-PE를 넣어준 후 10분간배양하고, 3번 세척 후 \( 1 \% \) BSA와 \( 0.05 \% \)Tween 20 이 함유된 PBS120 \( \mu \mathrm { l } \)를 분주한 후 Bio-Plex array reader를 이용하여 측정하였다.</p>