불용성 분획에서 aly가 최대로 발현되는 IPTG의 농도를 \( 20 \, \mu \mathrm{M} \)로 하여 계속되는 chaperone과의 공 발현 실험에 사용하였고 본 연구에서 사용한 alginate lyase의 경우, 잘못 접힌 alginate lyase가 GroEL/ES chaperone과 결합하는 것보다, alginate lyase의 소수성 부위와 DnaK/DnaJ/GrpE chaperone과 상호작용을 더 잘함으로써 alginate lyase의 가용성 생산에 더 효과적인 것으로 판단된다.
<h1>결과 및 고찰</h1><h2>E. coli에서 alginate Iyase 발현</h2><p>pALP4로 형질전환된 E. coli 세포는 \( 50 \, \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ampicillin이 포함된 LB agar 고형배지에서 얻었다. aly 발현을 위하여 IPTG를 각각의 농도로 사용하였고, 가용성 분획에서 효소활성이 매우 낮았다. 이것은 E. coli 세포 내에서 높은 aly 발현속도에 따른(세포 내 alginate lyase 단백질의 용해도를 초과함에 따른) 비가용성의 불용성 내포체를 형성하기 때문인 것으로 판단되었다. 이때 불용성 분획에서 aly가 최대로 발현되는 IPTG의 농도를 \( 20 \, \mu \mathrm{M} \)로 정하여 계속되는 chaperone과의 공발현 실험에 사용하였다.</p><h2>Chaperone Teams의 효과</h2><p>가용성 alginate lyase 생산에 미치는 chaperone의 효과를 알아보기 위해 E. coli에 pALP4와 pG-KJE6을 함께 형질전환시켜 L-arabinose 농도를 바꿔가면서 (\(0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5 , 1, 5 \, \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 대수증식기 초기(\( OD_{600}=0.5 \): 배양 2 시간 째)에 첨가하였고, 또한 aly의 발현을 위해 \( 20 \, \mu \mathrm{M} \) IPTG를 대수증식기 중기(\( OD_{600}=0.8 \) 배양 3 시간 째)에 첨가하였다. 이후 5 시간 동안 aly의 발현을 유도하고 세포를 모아 가용성과 불용성 분획으로 나누었다. 이 중 L-arabinose 농도를 0 에서 \( 5\, \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)까지 첨가한 결과, DnaK/DnaJ/GrpE chaperone band는 각각 70, 40, 그리고 \( 26 \, \mathrm{kDa} \) 으로 관찰되었으며, 특히 L-arabinose 농도가 \( 1 \, \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)일 때 가장 많이 가용성 분획에서 발현됨을 확인할 수 있었다. 그러나 가용성 분획에서 더 많은 양의 alginate lyase은 L-arabinose \( 0.05 \, \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)일 때 얻을 수 있었다. L-arabinose 농도가 \( 0.1 \, \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 이상에서는 alginate lyase가 가용성 분획에서 감소하는 반면, DnaK/DnaJ/GrpE chaperones은 가용성 분획에서 과발현되었다. 이러한 결과는 DnaK/DnaJ/GrpE chaperone의 과발현에 따른 대사적 부담과 배지내 영양 성분의 고갈이 원인으로 추정된다.</p><p>또한, GroEL/ES chaperone에 대한 효과를 분석하기 위하여 tetracycline을 \(0, 10, 20, 50, 100 \, \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 농도로 바꿔가면서 대수증식기 초기( \( OD_{600}=0.5 \): 배양 2 시간 째)에 첨가하였으나, alginate lyase를 가용성 분획에서 생산하는 데에는 큰 효과를 볼 수 없었다. 이전 실험에서도 GroEL/ES chaperone 보다 DnaK/DnaJ/GrpE chaperone과의 공발현으로 human granulocyte-colony stimulating factor를 활성형의 가용성으로 생산하는데 효과가 있음을 관찰한 바 있다.</p><p>DnaK/DnaJ/GrpE chaperone은 가용성을 유지하고 단백질 응집을 방지하기 위하여 풀린 polypeptide의 소수성 부위에 결합하는 것으로 알려져 있다. 이와 대조적으로 GroEL/ES chaperone system은 잘못 접힌(misfolded) polypeptide에 결합하여 재접힘을 일으켜 방출시킨다고 알려져 있다. 그러므로 본 연구에서 사용한 alginate lyase의 경우, 잘못 접힌 alginate lyase가 GroEL/ES chaperone과 결합하는 것 보다, alginate lyase의 소수성 부위와 DnaK/DnaJ/GrpE chaperone과 상호작용을 더 잘 함으로써 alginate lyase의 가용성 생산에 더 효과적으로 기여하는 것으로 판단된다.</p>