본 실험에서는 수초 근계에서 분리된 균종, Entero-bacter cloaceae K41의 중금속에 대한 생육 저항성을 조사하였다. 이 균주는 구리에 대해 150 ppm, 카드뮴에 대해 50 ppm까지 생육 가능하였으며, 특히 구리에 대해 생육이 3배 높았다. 그러나 카드뮴이나 두 중금속 혼합 용액에서는 생육을 관찰하지 못하였다. 형질전환 균주의 경우, 구리와 카드뮴 노출 시 각각 70 ppm, 60 ppm 농도까지 생육 저지가 일어나지 않았다.
<h1>결 과</h1> <h2>사용균주 선별</h2> <p>본 실험 사용균주는 담수식물인 수초의 근계에서 분리된 균종을 대상으로 자동 동정 시스템 분석기(E-10136, Biolog Microstation, Biolog, USA)를 사용하여 유사값 0.75이상 신뢰도 값의 균을 분리 후 생화학적 과정을 거치고 각종 중금속에 대한 내성을 검토 한 후 표준 균주와 비교한 후 Entero-bacter cloaceae K41로 명명하여 사용하였다.</p> <h2>중금속이 생육에 미치는 영향</h2> <p>최소생육저해 농도별 비교에서는 단일 중금속 노출 시에는 Fig. 1에서 보는 바와 같이 분리 균은 구리는 \( 150 \mathrm{~ppm} \), 카드뮴은 \( 50 \mathrm{~ppm} \) 까지 생육이 가능함을 확인하였다. 두 중금속 혼합 노출 시의 영향은 단일 중금속보다 낮은 생육도를 보였다. 분리균주는 표준균주보다 구리에서는 생육이 3배 정도 높았으나 카드뮴이나 두 중금속 혼합 용액 내에서는 생육을 관찰 할 수 없었다. 이 같은 차이는 미생물이 중금속에 대한 감수성이 다른 때문으로 설명 할 수 있다.</p> <h2>중금속 농도별 생 세포에 대한 영향</h2> <p>분리 균의 단일 중금속 노출 시 생 세포에 대한 영향은 Fig. 2에서 보는바와 같이 구리는 \( 150 \mathrm{~ppm} \)까지 사멸에 영향을 미치지 않다가 그 이상 농도에서 급격히 사멸하는 것을 볼 수 있었다. 카드뮴은 \( 50 \mathrm{~ppm} \), 흔합 중금속 농도별로 생 세포에 대한 영향도 그림에서 보는바와 같이 농도가 높아질수록 5배 이상 사멸하는 것을 볼 수 있었다. 혼합 중금속에서의 미생물 생 세포에 대한 영향은 단일 중금속내에서 보다 더욱 경쟁적으로 생 세포에 영향을 미치는 것으로 보여 졌다.</p> <h2>형질 전환 균주 선별 및 유전자 재조합 기술</h2> <p>대장균 host중 중금속 내성이 낮은 균주인 E. coli DH5a를 선별하였으며 E. cloaceae K41 plasmid 분리는 Sambrook 방법에 의해 실행하여 Fig. 3과 같이 분리하였으며 그 크기는 \( 6.4 \mathrm{~Kb} \) 이었다. 표준균주는 plasmid를 가지지 않는 것으로 나타났으며 중금속은 고체배지에서 중금속 저해를 나타 내지 않아 pUC18을 이용하여 ampicillin으로 형질 전환된 균주를 선별하였다. 유전자 재조합 방법은 E. cloaceae K41의 plasmid (이하pEC)와 pUC18을 single cutting 되는 제한효소 Sal I을 처리하여 cloning한 후 Fig. 4에서 보는바와 같이 E. coli DH5a에 형질 전환된 균주를 선별하여 사용하였다.</p> <h2>중금속이 형질 전환 균주의 생육에 미치는 영향</h2> <p>형질전환균주의 최소생육저해 농도별 비교에서는 Fig. 5에서 보는 바와 같이 구리 노출 시에는 \( 70 \mathrm{~ppm} \) 농도까지 생육이 저지 되지 않았고, 카드뮴 노출 시에는 \( 60 \mathrm{~ppm} \) 농도까지 생육이 저지되지 않았다. 혼합 금속 노출시 생육에 대한 영향은 단일 중금속보다 낮은 생 육도를 보였으며 \( 10 \mathrm{~ppm} \) 까지 생육이 저지되지 않았다.</p> <h2>pEC의 중금속 저항성 확인</h2> <p>E. coli DH5a, E. coli DH5a/pUC18, E. coli DH5a/pUC18/pEC의 생육도 비교는 Fig. 6에서와 같이 구리 \( 70 \mathrm{~ppm} \) 첨가시 E. coli DH5a, E. coli DH5a/pUC18에 비하여 pEC를 가지고 있는 형질전환 균주는 높은 저항성을 나타냈다. 카드뮴 \( 40 \mathrm{~ppm} \) 첨가 시에는 Fig. 7에서 보는바와 같이 E. coli DH5a, E. coli DH5a/pUC18에 비하여 pEC를 가지고 있는 형질전환균주는 높은 저항성을 나타냈다. 구리와 카드뮴 혼합 중금속 \( 10 \mathrm{~ppm} \) 첨가 시에는 Fig. 8에서 보는바와 같이 E. coli DH5a, E. coli DH5a/pUC18에 비하여 pEC를 가지고 있는 형질전환 균주는 시간이 경과할수록 높은 저항성을 나타냈다.</p> <h2>중금속 흡착 실험</h2> <p>E. coli DH5a와 E. coli DH5a/pUC18/pEC의 중금속 흡착률은 건조균체 \( 0.2 \mathrm{~g}, 28^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{pH} ~3\), \(0.1 \mathrm{~M} \mathrm{~NaOH} \) 전처리 시약을 동일하게 사용하여 실험한 결과 Fig. 9에서 보는 바와 같이 형질전환 전의 균주보다 높은 중금속 농도에서 많은 균의 생육이 가능하여 중금속 제거 효율 증가를 볼 수 있었다.</p>