실험을 바탕으로 대규모 추출 및 정제 과정을 진행한 결과, 에탄올로 세척한 베타-카로틴 결정은 기능성 화장품에 적합한 순도를 가진다. 식품의약품 안전청의 UV spectrophotometer를 이용한 순도 확인 방법을 사용해 검증하였으며, 이는 재조합 대장균으로부터 고순도 베타-카로틴을 회수할 수 있는 방법을 개발하였음을 시사한다.
<h2>결정화, 결정의 세척, 여과를 통한 고순도 베타-카로틴 결정 회수</h2> <p>상기에서 언급한 체계적인 실험을 바탕으로 큰 규모의 추출 및 정제를 수행하였다. 재조합 대장균의 유가식 배양을 재 수행하여 배양액 \( 1.8 \mathrm{~L} \) 로부터 \( 99 \mathrm{~g} \) 의 wet cell cake을 회수하였고 이롤 증류수로 두 번 세척한 후 \( 85 \% \) 2-프로판올 용액으로 세포를 탈수하였다. 이 과정에서 약 \( 20 \mathrm{~g} \) 의 세포가 소실되어 \( 79 \mathrm{~g} \) 의 wet cell cake을 얻었다. 여기에 \( 1.6 \mathrm{~L} \) 의 IBA를 첨가하여 탈수세포로부터 베타-카로틴을 추출하였다. 추출액을 감압 하에 \( 160 \mathrm{~mL} \) 로 농축한 후 2-프로판올 \( 640 \mathrm{~mL} \)를 첨가하였다. 이를 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12 시간 방치함으로써 \( 428 \mathrm{mg} \)의 베타-카로틴 결정을 얻었다. 이렇게 얻어진 베타-카로틴 결정의 순도는 88.6±1.6(Fig. 6)으로 기능성 화장품의 품질 기준(순도 \( 98 \% \) 이상)을 만족시키지 못하는 수준이다. 이와 같이 낮은 순도는 아마도 유기용매에 잘 용해되는 세포 유래 지질 성분들이 추출과정에서 함께 회수되었기 때문인 것으로 추측된다. 따라서 이와 같은 불순물들을 제기하기 위하여 지질에 대한 용해도는 높은 반면 베타-카로틴 결정을 용해시키기 함든 용매로 결정을 세척함으로써 순도를 향상시키고자 하였다. 에탄올과 아세톤을 검토 대상 용매로 선정하여 이둘의 성능을 비교하였다. 약 \( 278 \mathrm{mg} \) 의 베타-카로틴 결정을 \( 50 \mathrm{~mL} \) 에탄올로 세척하여 약 \( 229 \mathrm{mg} \) 의 베타-카로틴 결정을 회수하였다. 세척된 베타-카로틴의 순도는 \( 98.5 \pm 1.7 \) 로 향상되었다. 한편 \( 148 \mathrm{mg} \) 의 베타-카로틴 결정에 \( 50 \mathrm{~mL} \) 아세톤을 첨가한 후, 세척하여 얻은 베타-카로틴 결정의 순도는 \( 94.4 \pm 3.6 \) 이었다. 본 결과는 베타-카로틴 결정을 에탄올로 세척 시 기능성 화장품에 사용가능한 순도의 베타-카로틴을 얻을 수 있음을 나타낸다.</p> <p>한편 식품의약품 안전청에서 공시한 UV spectrophotometer를 이용한 순도체크방법[11]을 이용하여 에탄올로 세척된 베타-카로틴 결정의 순도를 재확인 하였다. 본 방법은 베타-카로틴 용액의 흡광도를 측정하여 이들의 비 \( \left(\mathrm{A}_{362} / \mathrm{A}_{340}, \mathrm{~A}_{455} /\right. \) \( \mathrm{A}_{340}, \mathrm{~A}_{455} / \mathrm{A}_{434}, \mathrm{~A}_{455} / \mathrm{A}_{483} \) )를 계산한 후, 이들 4 가지 지표 값들이 각각 기준치 내에 포함되면 사용된 베타-카로틴 순도가 \( 98 \% \) 이상임을 보장한다. 표 1 에 나타내었듯이, \( \mathrm{A}_{362} \) \( \mathrm{A}_{340} \) 은 기준치인 1 보다 높은 \( 1.19 \pm 0.00, \mathrm{~A}_{455} / \mathrm{A}_{34 \sigma} \) 은 기준치인 \( 1.45 \) 보다 높은 \( 1.65 \pm 0.02, \mathrm{~A}_{455} / \mathrm{A}_{434} \) 는 기준범위인 1.3-\( 1.6 \) 사이에 존재하는 \( 1.40 \pm 0.01 \) 이고 \( \mathrm{A}_{455} / \mathrm{A}_{483} \) 는 기준범위인 \( 1.05-1.25 \) 사이에 존재하는 \( 1.08 \pm 0.00 \) 이다. 따라서 HPLC 분석 결과와 UV-Visible spectrophotometer를 이용한 분석결과는 본 연구팀에 의해 정제된 재조합 대장균 유래 베타-카로틴 결정의 순도가 \( 98 \% \) 이상임을 나타낸다. Fig. 7은 고순도로 정제된 베타-카로틴의 질량분석 결과를 나타낸다. 질량분석은 분자에서 전자 \( \left(\mathrm{e}^{-}\right) \)를 떼어낸 후 전하를 뗜 분자를 분석하는 방법이다. 베타-카로틴의 분자량이 \( 536.88 \) 이고, 전자를 띠어내도 분자량이 변하지 않으므로 베타-카로틴의 분자량인 536에 해당하는 피크가 베타-카로틴에 해당한다.</p> <p>따라서 이와 같은 결과는 본 연구팀에 의해 개발된 방법으로 재조합 대장균으로부터 고순도의 베타-카로틴을 회수할 수 있음을 시사한다.</p>