이 연구에서 테스트 목적으로 사용된 파일럿 플랜트 실험 장치는 기존의 급속 여과 시스템에 일반적으로 존재하는 사전 염소화 단계를 제외했습니다. 대신 전처리 및 후처리를 위해 오존과 BAC 공정을 통합한 시스템이 구현되었습니다. BAC 프로세스의 작동 조건은 표 1에 자세히 설명되어 있습니다. 본 연구에서는 낙동강 하류에 위치한 마리 취수구의 지표수를 원수로 사용하였다. 응집 공정을 위해 폴리알루미늄 황산염 유기 마그네슘(PSOM)이 응집제로 사용되었습니다. 박테리아 식별은 개별 콜로니의 형태학적 특성을 관찰하여 서로 다른 콜로니를 구별하고 식별하는 것을 포함합니다. 본 연구에서는 대상균을 블로팅 기법을 이용하여 \( \mathrm{R} 2 \mathrm{A} \) 배지에 옮겨 순수한 형태로 분리하였다. 순수 분리된 세균은 API \( 20 \mathrm{NE} \) Kit (bioMerieux, France) 및 동정을 위한 생화학적 실험을 추가로 수행하였다. 박테리아의 분류 및 동정은 Bergey의 매뉴얼에 요약된 분류 체계를 기반으로 수행되었으며, 그 결과 속명 또는 종명이 결정되었습니다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>Pilot-plant 장치</h2> <p>본 연구에 사용된 Pilot-plant 실험장치는 기존 급속 여과 시스템에서 전 염소처리 공정이 생략되었고, 오존의 전 ◦ 후 처리와 BAC 공정을 부가한 시스템으로 실험하였으며, BAC 운영조건은 Table 1과 같다. 원수는 낙동강 하류지점인 매리 취수장의 표층수를 사용하였고, 응집제로는 Polyaluminum Sulfate Organic Magnesium (PSOM)을 사용하였다. 또한 본 실험 장치의 생물활성탄 재질은 야자계, 목탄계, 석탄계이며 여과층의 깊이는 \( 2.5 \mathrm{m} \)이고 이들 입상활성탄의 물성치는 Table 2와 같다.</p> <h2>조사기간 및 DOC 분석</h2> <p>조사기간은 1년(2006. \( 1 \sim \) 2006. 12)으로 하였으며, 조사 주기는 수질인자 항목의 경우 월 1회, 부착세균 분포조사는 월 1회 간격으로 조사하였다. 수질인자 항목으로는 DOC를 측정하였는데 DOC(dissolved organic carbon)는 \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) 멤브레인 필터(Sartorius, Germany)로 여과한 후 그 여액을 TOC analyzer(Sievers 820, Sievers, U.S.A.)로 분석하였다.</p> <h2>세균 생체량 및 종 동정</h2> <p>세균의 생체량(biomass)은 BAC의 습중량 \( 1 \mathrm{g} \)을 건조시킨 후 초음파 처리 (\(3 \mathrm{~min}, 37 \mathrm{kHz}, 190 \mathrm{~W}\))하여 세균을 탈리시킨 다음 R2A agar (Difco) 평판배지에 시료 \( 1 \mathrm{ml} \)를 단계적으로 희석 도말한 후 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 2주간 배양하여 습중량 \(1 \mathrm{g} \)당 colony형성 세균수로 표시하였다. 총 세균수는 nu-cleotide에 삽입되어 결합하는 DAPI (4,6-diamidino-2- phe-nylindole-2HCl, sigma, USA)로 염색하여 직접 계수하는 DAPI법을 이용하여 측정하였다. 세균의 생산력(bacterial pro-duction)은 \( { }^{3} \mathrm{H} \)-thymidine이 DNA에 흡수되는 정도로 구하였다. 먼저 BAC 습중량 \( 1 \mathrm{~g} \)을 초음파 처리하여 세균을 탈리시킨 시료 \( 2 \mathrm{ml} \)에 \( 200 \mathrm{nM} \) [methyl-\( { }^{3} \mathrm{H}\)] thymidine 용액(specificactivity: \( 40 \sim 50 \mathrm{Ci} / \mathrm{mmol}\)) \(1 \mathrm{ml} \)와 \( 200 \mathrm{nM} \) cold thymidine 용액 \( 1 \mathrm{ml} \)를 첨가한 후 교반 배양기에서 in situ 조건으로 4시간 배양하였다. ATP 용액(\( \mathrm{25g} / \ell) 100 \mu \mathrm{l} \) , DNA 용액(\( \mathrm{0.75g} / \ell) 100 \mu \mathrm{l} \) 그리고 \(1 \mathrm{~N}~ \mathrm{NaOH}\) \(2\mathrm{ml} \)를 첨가하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 가열하여 DNA를 추출한 후 잠시 냉각시키고 \(3000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리하였다. 상등액 \( 1 \mathrm{ml} \)에 ice-cold \( 10 \% \) trichloroacetic acid \( 5 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 반응을 종료시키고 15분정도 냉각시킨 후 \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) 멤브레인 필터로 여과하였다. 이 여지를 vial에 넣고 건조시킨 후 ethyl acetate \( 1 \mathrm{ml} \)와 \( 10 \mathrm{ml} \)의 scintillation cocktail(Aquasol-2, Packard Co.)을 주입하여 liq-uid scintillation analyzer (PerkinElmer, Quantulus 1220)로 방사선량을 측정하였다. 얻어진 DPM (disintergrate per mi-nute) 값으로부터 Parsons 등에 의한 식을 이용하여 in-corporation된 thymidine의 양을 계산하였다. 세균의 동정은 형성된 colony의 형태학적 특징을 관찰하여 서로 다른 colony를 \( \mathrm{R} 2 \mathrm{A} \) 배지에 획선 도말하여 순수 분리하였다. 순수 분리된 세균은 API \( 20 \mathrm{NE} \) Kit (bioMerieux, France) 및 생화학적 실험을 실시하고 Bergey's manual의 분류체계에 따라 속 혹은 종명까지 분류 동정하였다.</p> <h2>주사전자현미경(SEM) 관찰</h2> <p>생물활성탄 입자 표면에 부착된 세균들을 관찰하기 위한 주사전자현미경 (scanning electron microscope; SEM) 분석은 건조시킨 BAC 시료에 \( 10 \mathrm{ml} \)의 \(2.5\% \) glutaraldehyde 용액 (in \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium caccodylate buffer; \( \mathrm{pH} \) 6.8)을 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간동안 전 고정한 후 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium caccodylate buffer (\( \mathrm{pH} \)6.8) \( 10 \mathrm{ml} \)로 전 고정과 같은 조건에서 세정하였다. \( 1 \% \) \( \mathrm{OsO}_{4} \) 용액 (in \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium caccodylate buffer; \(\mathrm{pH} \) 6.8) \( 5 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 후 고정시킨 후 다시 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium caccodylate buffer (\( \mathrm{pH}\) 6.8) \( 10 \mathrm{ml} \)로 실온에서 세정하였다. 그리고 각 \( 10\mathrm{ml} \)의 \( 30\), \(50\), \(70\), \(80\), \(90\), \(95\), \(100 \% \) ethanol로 각각의 농도에서 10분간씩 탈수시킨 후, 한국 신발피혁 연구소에 SEM 촬영 을 의뢰하여 BAC 입자에 부착된 세균을 관찰하였다.</p> <h2>세균 군집구조</h2> <h3>시료 전처리</h3> <p>먼저 BAC 습중량 \( 1 \mathrm{~g} \)을 건조시킨 후 초음파 처리하여 세균을 탈리시킨 다음 시료를 \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) polycarbonate 멤브레인 필터(Millipore)로 여과하였다. 여과 후 \( 1 \times \) phosphate bufferd saline(PBS, \( \mathrm{pH} \)7.4)로 세척하였고, 다시 ethyl alcohol을 이용하여 세척하고 공기 중에서 필터를 건조시켰다.</p> <h3>Gene probes</h3> <p>본 연구에 사용된 probe들은 Eubacteria와 결합하는 EUB338, \( \alpha \) group과 결합하는 ALF 1b, \( \beta \) group과 결합하는 BET 42a, \( \gamma \) group과 결합하는 GAM 42a, Cytophaga-Flavobacterium(CF) group과 결합하는 CF 319a, 그리고 Gram (+) High \( \mathrm{G}+\mathrm{C} \) Content와 결합하는 HGC probe이며, 이들 probe의 sequence 및 specificity를 Table 3에 나타내었다.</p> <h3>Fluorescent in situ Hybridization(FISH)</h3> <p>Gelatin coated slide glass에 필터를 올려놓은 후 probe \(1 \mu \mathrm{l} \) (최종농도 \( 5 \mu \mathrm{g} / \mu \mathrm{l} \))와 hybridization buffer (\(0.9\mathrm{mM~} \mathrm{NaCl} \), \( 0.01 \% \) SDS, \( 20~\mathrm{mM} \) Tris/ \( \mathrm{HCl}\), X\( \% \) Formamide) \( 8 \mu \mathrm{l} \)를 첨가 하여 \( 46^{\circ} \mathrm{C} \)에서 90분 정도 반응시킨 후 water bath (SB-9,Eyela, Japan)로 미리 가열시킨 washing buffer로 \( 48^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분 동안 세정하여 공기 중에서 건조시켰다. 형광현미경 (Axioskop 2 plus, Carl Zeiss, Germany)과 scanning con-focal laser microscopy(LSM 510, Carl Zeiss, Germany)를 사용하여 800배 및 400배의 배율에서 field내에 나타난 세균 등을 10번 이상 계수하여 그 평균값을 사용하였다.</p>