\( \mathrm{DON} \) 을 일반 대조구 세포와 dnPKR 발현 세포주에 처리 시 IL-8 ELISA assay 결과에서 일반 대조구 세포에서는 IL-8의 생산이 DON 처리 했을 때 농도 의존적으로 증가하였지만 dnPKR 세포주에서는 생산이 유의성 있게 감소하였고, \( \mathrm{DON} \) 에 의한 IL-8의 생성이 상피세포에서 초기전사인자의 하나인 EGR-1가 매우 핵심적인 역할을 하는 것으로 나타났고, PKR 신호 전달 체계는 IL-8의 전사 활성뿐 만 아니라 \( I L-8 \) 의 발현에 중요한 EGR-1의 조절에도 기여하고 있다. EGR-1는 상호 협조를 통해 IL-8의 유전자를 조절할 수 있다.
<h3>ELISA</h3> <p>세포 배양액으로부터 IL-8의 농도를 측정하기 위하여 ELISA법을 이용하였다. 24 well plate에 세포를 배양하여 각각의 시료를 처리한 후 배양액을 회수하고 OptEIA 인체 IL-8 ELISA set (BD biosciences)을 이용하여 세포로부터 분비된 IL8을 측정하였다. 완충액으로 항체를 희석하여 96 well plate에 하릇밤 동안 정치시켜 항체를 흡착 시켰다. 이어서 세척용 완충액으로 3회 세척한 후 \( 3 \% \) bovine serum al-bumin (BSA) 용액으로 빈자리를 봉쇄하였다. 여기에 세포 배양액과 항체-효소 접합체를 2 시간 동안 순서대로 가하여 반응 시킨 다음 기질인 TMB와 과산화수소액을 가하여 30 분간 발색시켰다. 이어서 \( 6 \mathrm{~N} \) 염산액으로 반응을 중지시킨 다음 \( 405 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h3>Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)</h3> <p>RNA는 RNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) 통해서 분리하였다. 추출된 RNA \( (100 \mathrm{ng}) \) 을 역전사효소를 이용해서 \( \mathrm{cDNA} \) 로 전환하였다. 유전자 증폭은 HOT START ExTaq DNA Polymerase (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)을 이용하여 Mycycler Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)에서 아래의 조전에서 시행하였다. 즉, 94도에서 2분 및 denaturation (98도, 10초), annealing (59도, 30 초), elongation (72도, 45초)에서 25회를 실시하였다. PCR product는 \( 1.2 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) agarose 젤에서 확인하였다.</p> <h3>통계처리</h3> <p>데이타는 Sigma Stat (Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA)를 이용해서 분석하였다. 두 그룹의 데이터 비교는 Student's \( t \) test를 하였고, multiple groups 비교는 ANOVA를 실시한다.</p> <h2>결과 및 고찰</h2> <h3>\( \mathrm{DON} \) 에 의한 IL8의 생성과 PKR저해의 영향</h3> <p>\( \mathrm{DON} \) 을 일반 대조구 세포와 dominant negative PKR (dnPKR) 발현 세포주에 처리 시 IL-8 ELISA assay 결과에서 일반 대조구 세포에서는 대조구세포주에는 IL-8의 생산이 \( \mathrm{DON} 250 \mathrm{ng} / \mathrm{ml}, 500 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 을 처리 했을 때 농도 의존적으로 증가하는 것을 볼 수 있었고, 반면 dnPKR 세포주에서는 \( \mathrm{IL}-8 \) 의 발현이 DON 처리 했을 때 생산이 유의성 있게 감소 하였다(Fig. 1A). 그리고 IL-8 promoter assay 결과에서는 대조구 세포주 DON \( (0,250 \mathrm{ng} / \mathrm{ml}, 500 \mathrm{ng} / \mathrm{ml}) \) 을 처리했을때 IL-8 프로모터 활성이 증가하는 것을 확인 할 수 있었고 dnPKR cell line에서는 IL8 프로모터 활성이 억제 되었다 (Fig. 1B). 또한 최근의 본 연구실의 연구 결과에서 \( \mathrm{DON} \) 에 의한 IL-8의 생성이 상피세포에서 초기전사인자의 하나인 EGR-1이 매우 핵심적인 역할을 하는 것을 규명하였으며[24], 특히 본 연구에서 PKR에 의해 또한 EGR-1의 생성이 조절되는지를 확인하기 위하여 PKR 저해제(Calbiochem 카탈로그.번호, 527450)를 처리시 \( 500 \mathrm{ng} / \mathrm{nl} \mathrm{DON} \) 에 의한 EGR-1의 전사활성화가 급격하게 억제되었다(Fig. 2). 따라서, PKR 신호 전달 체계는 IL-8의 전사 활성뿐 만 아니라 \( I L-8 \) 의 발현에 중요한 EGR-1의 조절에도 기여하고 있다.</p> <h3>DON에 의한 IL-8 유전자 발현에 있어서의 PKR/EGR-1의 상호작용의 역할</h3> <p>다양한 보고에서 세포 내 스트레스 감지 신호 전달 체계로서 매우 중요한 MAP kinase가 리보솜 독소자극에 의한 사이토카인 생성에서 매우 중요한 역할을 하는 것이 보고 되고 PKR 저해제를 처리한 세포와 처리를 하지 않은 세포 사이의 발현양의 차이를 확연히 보이지만, pSiEGR1 발현 세포주에서는 발현양의 차이가 없음을 확인하였다. 결론적으로 EGR-1은 리보솜 독소에 의한 IL-8유도에서 매우 핵심적인 역할을 하였으며, 또한 IL-8의 유도현상에는 부분적으로 PKR 신호가 관여되며, PKR 에 의해 조절 받는 하부 신호에는 EGR-1이 또한 핵심적인 역할을 한다.</p> <p>본 연구에서 알 수 있듯이 EGR-1이 IL-8의 생성에서 매우 주요한 역할을 하며 또한 점막상피에서 조직 재생 회복에도 핵심적인 역할을 한다[8]. EGR-1의 장관 조직 염증 손상 후 재생에서 면역 염증구를 유도하는 데 주요한 기능을 하며 특히 EGR-1에 의한 사이토 카인 조절 능력이 보고 되며 이를 증명하고 있다[9,10,12,22]. 사실상 리보솜 독성 반응에서의 염증 사이토카인 유도에는 많이 알려진 ERK1/2, JNK과 p38 MAP kinase 신호의 조합이 또한 주요한 역할을 할 것으로 사료 된다[14,16](Fig. 5). 예를 들어 ribotoxin인 UVB light와 palytoxinare은 peptidyl transferase 활성를 저해하고 riboso- mal RNA 에 손상을 가하며 이는 특히 ERK1/2 신호의 변화를 수반하고 Palytoxin은 \( \mathrm{JNK} \) 와 p38 kinase를 활성화 한다 [13]. 최근의 연구에서는 소포체 포함의 독성 반응이 염증성 장질환과의 관련성이 보고되고 있다[4,31]. 또한 EGR-1은 NF-kappaB 발현 등의 염증성 전사인자에도 영향을 미친다 \( [1,20,38] \). NF-kappa B이외에도 IL-8생산에서 주요한 AP-1도 EGR-1에 의해 항진되는 신호이다[17]. 따라서 EGR-1이 염증성 전사인자들과의 상호 협조를 통하여 IL-8의 유전자를 조절할 수 있다. 향후 \( \mathrm{DON} \) 에 의해 항진되는 염증성 사이토카인의 발현에 있어 좀 더 명확한 EGR-1에 의해 조절되는 기전적인 분석연구가 요구 된다.</p> <h2>요 약</h2> <p>점막 상피는 외부 인자를 감지하는 최전선의 인식부위로서 외부스트레스 자극을 하부의 반응 신호로 전달하는 주요 세포이다. 리보솜독성 반응을 유발하는 데옥시니발레놀 \( (\mathrm{DON}) \) 및 그 관련 곰팡이 독소는 푸자륨 곰팡이 오염에 의한 식중독성 소화기 염증성 질환과의 연관성이 알려 져 있다. 본 연구의 목적은 \( \mathrm{DON} \) 이 상피세포 감지 신호 전달 분자로서 PKR과 EGR-1이 관련 되고 이들이 상피세포에서의 염증성 사이토카인 인터루킨 8 의 생성에 관련 된다는 가정 하에서 연구를 수행 하였다. PKR 발현의 세프내 작용 억제는 \( \mathrm{DON} \) 에 의해 유도되는 인터루킨 8의 생성을 감소시켰다. 또한 \( \mathrm{DON} \) 에 의한 \( \mathrm{IL}-8 \) 전사 활성화는 \( \mathrm{PKR} \) 억제에 의하여 장관 상피세포에서 감소하였다. PKR 저해제의 처리는 EGR-1 promoter 활성, mRNA, 단백질 유도 등을 감소를 유발하였으며 MAP kinase \( (\mathrm{ERK} 1 / 2, \mathrm{p} 38, \mathrm{JNK}) \) 는 변화가 적거나 오히려 \( \mathrm{PKR} \) 저해제의 전처리에 의하여 항진 되었다. 결론적으로 \( \mathrm{DON} \) 에 의해 자극된 감지신호인 EGR-1은 자체적으로 또는 PKR 신호를 경유하여 인터루킨8의 생산을 항진하는데 주요한 기능을 하였다. 이를 통하여 향후 리보솜 독성 반응과 관련된 소화기 염증유발의 주요한 기전을 제공하고 있다.</p> <h2>감사의 글</h2> <p>본 논문은 부산대학교 자유 과제 학술연구비(2년)에 의하여 연구되었음.</p>