멜라노마 세vh 추출물을 이용한 Real-time RT-PCR를 검사를 실시하였다. Tyrosinase 저해활성 측정에서 피부에서 만들어지는 세포 내의 티로시나아제라는 효소의 생합성 과정에서 melanosome 내에 티로신을 산화시켜 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)를 생성하는 tyrosine hy-droxylase로 DOPA를 산화시켜 dopachrome을 만드는 DOPA oxidase로 작용하여 최종적으로 melanin polymer를 합성하게 되므로 이반응을 억제하여 기미, 주근깨, 반점과 같은 과잉색소증 치료에 유용하다는 점을 알수 있었으며 특히 노간주나무추출물이 효과가 높다는 시실이 확인 되었다.
<h2>Real-time RT-PCR</h2><p>멜라노마 세포로부터 추출 되어진 RNA를 \( 260 \mathrm{~nm}, 280 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 정량 하였다. Oligo (\( \mathrm{dT} \)) 15 primer \( (500 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) 1 \mu \mathrm{g} \), 추출한 RNA (2 \( \mu \mathrm{g}) \) 와 nuclease free water로 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 를 맞추고 \( 75^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 반응시킨 후 \( 5 \times \) reaction buffer, MgCl, PCR nucleotide mix, recombinant rnasin ribonuclease inhibitor, reverse transcriptase, nuclease free water을 첨가하여(총 \( 20 ~ \mu \mathrm{l})\) \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 5분, \( 42^{\circ} \mathrm{C} \) 60분, \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 15 분, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 유지로 반응시켜 cDNA를 합성시켰다. 그 후 cDNA 와 \( 2 \times \) SYBR green mix, primer, ROX를 각각 넣어 ABI step one plus (Applied biosystem, USA) 기기를 이용하여 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 10 분, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 3초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 30초, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 15초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 1분, \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 15초(45 cycles)로 실시간 정량 분석을 한 뒤 analysis program을 이용하여 결과를 분석하였다.</p><h1>결과 및 고찰</h1><h2>Tyrosinase 저해활성 측정 결과</h2><p>피부에서는 세포 내의 티로시나아제라는 효소의 생합성 과정에서 만들어지는데 melanosome 내에 티로신을 산화시켜 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)를 만드는 tyrosine hy-droxylase로 DOPA를 산화시켜 dopachrome을 만드는 DOPA oxidase로 작용하여 최종적으로 melanin polymer를 합성하므로, 이 반응을 억제하게 되면 멜라닌 생합성을 억제 할 수 있어, 기미, 주근깨, 반점과 같은 과잉색소증 치료 등 광범위하게 이용 될 수 있다. 그러므로 tyrosinase 저해는 화장품 산업에 있어서 매우 중요한 부분이다.</p><p>본 연구에서 노간주 나무 추출물의 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과는 Fig. 1과 같이 나타내었다. 노간주나무 열수 추출물의 경우 \( 1,000 \mathrm{~\mu g} / \mathrm{ml} \) 에서 \( 49.4 \% \), 노간주나무 에탄올 추출물의 경우 \( 1,000 \mathrm{~\mu g} / \mathrm{ml} \) 에서 \( 80.0 \% \) 로 노간주나무 에탄올 추출물의 저해효과가 더 높다는 것을 확인하였다. 이는 An 등[1]의 진달래꽃 추출물의 \( 1,000 \mathrm{~\mu g} / \mathrm{ml} \) 에서 열수 추출물과 에탄올 추출물이 각각 \( 24 \%, 48 \% \) 의 효과가 나타났으며, Jeon 등[11]의 비자 추출물의 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 \( 1,000 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 농도에서 \( 21.32 \% \) (물 추출물), \( 3.38 \% \) (에탄올 추출물),\( 4.09 \% \) (열수 추출물)의 효과가 나타났으며, Choi 등[5]의 치자,행인, 지실에서 \( 36 \%, 33 \%, 15 \% \) 의 저해효과를 나타낸다는 결과와, 싸리 추출물이 \( 1,000 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 농도에서 \( 6.17 \sim 27.61 \% \) 라는 Lee 등[16]과 당귀, 토사자, 숙지황 등이 \( 40 \% \) 미만의 tyrosinase 저해율을 나타낸다는 결과와 비교하여 노간주나무추출물의 tyrosinase 저해효과가 우수함을 확인할 수 있었다.</p><h2>멜라노마세포(B16F10)의 생존율 확인</h2><p>세포 생존율을 확인하기 위한 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 담황색의 기질로서 생 세포의 미토콘드리아 내의 호흡연쇄 효소에 의해 환원되어 암적색의 formazan을 생성한다. 죽은 세포에서는 반응이 일어나지 않으므로 이 formazan의 생성량을 생 세포 측정에 이용되는 검색법으로 96 well plate를 사용하며, 검사결과를 ELISA reader (multiwell microplate reader)를 이용하여 많은 시료를 간단하게 판독할 수 있어 세포독성 및 세포증식 검색법으로서 널리 사용되고 있는 방법 중의 한 방법이다.</p><p>노간주 나무 에탄올 추출물의 멜라노마 세포의 생존율을 확인한 결과 Fig. 2에서 보는 바와 같이 노간주나무 에탄올 추출물의 경우 \( 10 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 이하에서 \( 90 \% \) 이상의 세포 생존율을 나타내었으므로 본 실험에서 \( 50 \mathrm{~\mu g} / \mathrm{ml} \) 이하의 농도에서 실험을 하였다. Choi 등[6]의 산수유 추출물이 \( 100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 에서 \( 50 \% \)의 저해율이 나타났으며, An 등[2]의 내소황련탕 복합처방의 경우 \( 100 \mathrm{~\mu g} / \mathrm{ml} \) 에서 열수 추출물의 \( 55 \% \), 에탄올 추출물은 \( 38 \% \) 이하의 낮은 증식억제 효과가 나타내었으며, Lee 등[15]이 보고한 국내산 백화사설초 전초와 뿌리의 항암효과에서 \( 0.4 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) 의 농도에서 \( 32.6 \%, 37.0 \% \) 의 암세포 증식억제효과와 비교하여 노간주나무 에탄올 추출물의 melanoma 세포에 대한 세포 독성이 적은 것을 확인할 수 있었다.</p>