Pancreatic lipase 활성 저해물질을 탐색하기 위해 메탄올에 녹인 시료와 pancreatic lipase 용액을 섞어 투명환의 형성 크기로 pancreatic lipase의 저해활성을 측정하고 pancreatic lipase의 활성 및 저해능은 triolein으로부터 분리되는 oleic acid를 측정하여 살펴보았다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료 및 시약</h2> <p>본 실험에 사용한 생약재료인 백자인은 측백나무의 종자로서 대전의 일산약품 (주)에서 구입하였다. 활성물질의 분리 및 확인에 사용된 silica gel (Kiesegel 60, paticle size : \( 0.04 \) \( 0 \sim 0.063 \mathrm{~nm} \) )은 Merck사 (Darmstadt, Germany), ODS RP-18 (ODS-A, 120A, S-150\( \mu \mathrm{m} \))은 YMC-GEL사 (Tokyo, Japan)로부터 구입하였고, TLC에 이용-된 procoated silica gel plates \( 60 \mathrm{~F}_{254}(0.25 \mathrm{~mm} \) and \( 0.5 \mathrm{~mm} \) in thickness)와 ODS RP-18 F F 2545 (25DC-Platten \( 5 \times 10 \mathrm{~cm} \) ) 는 Merck사 (Darmstadt, Germany)로부터 구입하였다. 각 분리단게에 이용된 유기용매는 덕산약품공업(주)의 고순도 제품을 사용하였고, HPLC 용매는 Burdick \& Jackson (Muskegon, USA) 을 사용하였다. pancreatic lipase assay에 사용한 tributylin은 Fluka (St. Gallen, Switzerland)에 서, pancreatic lipase (Type VI-S, porcine pancreas), gum arabic 은 Sigma (St. Louis, USA) 제품을 사용하였다. 그 외에 사용된 시약은 모두 특급 및 1 급 시약을 사용하였다.</p> <h2>Pancreatic lipase 활성 저해물질의 탐색</h2> <p>\( 10\mathrm{mM} \) \(\mathrm{CaCl}_{2} \), \(200 \mathrm{mM}\) \( \mathrm{NaCl} \) 을 포함한 \( 5 \% \) gum arabic 용액 \( 100 \mathrm{ml} \) 을 제조하여 \( 9 \mathrm{ml} \) 을 취한 후, 여기에 tributylin 1 \( \mathrm{ml} \) 을 섞어 초음파장치 내에서 유화시킨 후, \( 2 \% \) 한천배지에 혼합하여 평판배지를 제조하였다. \( 5 \mathrm{~mm} \) 두께의 한천배지에 지름 \( 6 \mathrm{~mm} \) 의 구멍을 만들고, 메탄올에 녹인 시료와 pancreatic lipase 용액을 섞어 3분간 반응시커 넣은 후 4 시간 후 투명환(clear zone)의 형성 크기를 측정하여 pancreatic lipase에 대한 저해활성을 측정하였다.</p> <h2>Pancreatic lipase 활성 및 저해능 측정</h2> <p>Pancreatic lipase의 활성 및 저해능은 Bitou 등의 방법에 따라 triolein으로부터 분리되는 oleic acid를 측정함으로써 결정하였다. 기질은 \( 0.1 \mathrm{M}\) \( \mathrm{NaCl} \) 이 첨가된 \( 0.1 \mathrm{M} \) N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid (\( \mathrm{pH} \) 7.0) \( 9 \mathrm{ml} \) 에 \( 90 \mu \mathrm{mol} \) triolein, \( 45 \mathrm{mg} \) gum arabic 과 \( 9.45 \) \( \mu \mathrm{mol} \) taurocholic acid을 넣고 초음파로 5분 동안 처리하여 제조하였다. Lipase 활성측정을 위한 반응용액은 효소용액 (pancreatic lipase, \( 1500 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) ) \( 15 \mu \ell \), 식물추출물 \( 5 \mu \ell \), 기질용액 \( 180 \mu \ell \) 을 섞어 최종 반응용액의 부피는 \( 200 \mu \ell \) 되도록 제조한 후, \( \mathrm{pH} \) 7.0, 반응온도 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분 간 반응시켰다. 효소반응 후 생성된 oleic acid의 정량은 Zapf 등의 방법에 따라 결정하였다. 효소반응 후 반응용액 \( 0.2 \mathrm{ml} \) 에 \( 2 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) methanol이 포함된 chloroform/heptane (1: 1) 용액 \( 3 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 10 분 동안 교반한 후, 10 분 동안 원심분리 \( (2,000 \times \mathrm{g}) \)하여 수층을 제거하였다. 여기에 copper 반응액 1 \( \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 다시 10 분 동안 교반한 후, 10 분 동안 원심분리\( (2,000 \times \mathrm{g}) \)하여 추출된 oleic acid와 copper salt가 포함된 유기용매층 \( 1 \mathrm{ml} \) 을 취하여 \( 0.05 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 3-tert-butyl-4-hydroxyanisole이 포함된 \( 0.1 \%(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) bathocuprione 용액 \( 1 \mathrm{ml} \) 을 첨가한 후, \( 480 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 oleic acid를 정량함으로써 효소 활성을 측정하였다.</p>