건선 유발에 밀접한 연관이 IL-17A에 의한 브라질린의 억제 효능을 관찰하기 위해, IL-17A 처리 조건에서 브라질린에 의한 케모카인 CXCL8, CCL20의 발현 변화를 확인하였으며 Real time RT-PCR을 통해 CXCL8, CCL20 mRNA 발현을 확인한 결과, IL-17A를 세포에 처리하였을 때 무처리군 대비 CXCL8, CCL20 mRNA 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
<h2>Transepithelial Electrical Resistance (TEER) 측정</h2> <p>Transwell plate (Coming, Lowell, MA, US)에 HaCaT 세포를 \(5.0 \times 10 ^ { 4 } \)cells/well 밀도로 분주한 후 \( (- \))FBS 배양 조건에서 24시간 동안 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 5 \% \mathrm { ~CO } _ { 2 } \) 배양기에서 안정화 시켰다. 브라질린과 TNF- \( \alpha \) /IL-17A /IFN- \( \gamma \)를 세포에 처리하고 Epithelial Voltohmmete (EVOM2, WPI, Sarasota, FL, USA) 장비를 사용하여 시간대별로 TEER 값을 측정하였다. TEER 측정 전극은 사용하기 전 배양 배지에 0이 되도록 맞추고 STX2 전극의 끝이 긴 쪽을 plate well에 넣어 배지에 잠기게 하였다. 전극의 끝이 짧은 쪽은 transwell insert의 배지에 닿을 정도로만 넣어 세포가 손상되지 않도록 하며 TEER 값을 측정하였다.</p> <h2>통계 처리</h2> <p>모든 실험은 3회 측정을 통해 얻은 평균값과 편차로 나타내었으며, Student's t-test를 통해 \( p<0.05 \) 일 경우 실험값에 대한 통계적 유의성 있는 결과로 판단하였다.</p> <h1>결 과</h1> <h2>IL-17A HaCaT 세포에서 브라질린에 의한 케모카인 발현 조절</h2> <p>건선 유발에 밀접한 연관이 IL-17A에 의한 브라질린의 억제 효능을 관찰하기 위해, IL-17A 처리 조건에서 브라질린에 의한 케모카인 CXCL8, CCL20의 발현 변화를 확인하였다. Real time RT-PCR을 통해 CXCL8, CCL20 mRNA 발현을 확인한 결과, IL-17A를 세포에 처리하였을 때 무처리군 대비 CXCL8, CCL20 mRNA 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 반면, 브라질린을 농도별로 처리한 결과 IL-17A 단독 처리군 대비 CXCL8 mRNA 발현량은 \( 5.7 \pm 14.7 \), \(25.8 \pm 3.6 \% \) 만큼 억제되었고, CCL20 발현량 또한 각각 \( 34.9 \pm 1.7 \), \(68.1 \pm 1.0 \% \) 만큼 억제되었다(Fig. 1A, B). 이를 통해 IL-17A 자극에 따른 CXCL8, CCL20의 발현이 브라질린에 의해 농도의존적 방식으로 저해됨을 확인하였다. 또한 IL-17A는 각질형성세포에서 전사인자인 STAT3 단백질의 인산화를 촉진하고 CCL20 발현을 상향 조절한다. 따라서, 케모카인 발현 저해에 대한 작용 기전을 규명하고자 브라질린에 의한 STAT3 인산화 조절 여부를 조사하였다. IL-17A로 HaCaT 세포를 자극하였을 때, 무처리군 대비 STAT3 단백질 인산화는 \( 2.3 \pm 0.2 \)배로 증가였으며, IL-17A와 브라질린 동시 처리 시 인산화된 STAT3 단백질 수준은 3 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 농도 조건에서 \( 17.0 \pm 9.1 \% \) 만큼 하향 조절되었다(Fig.1C,D). 이는 브라질린이 STAT3 인산화 및 CXCL8, CCL20 mRNA 발현을 유의적으로 억제함을 보여준다.</p>