본 실험은 5개월된 비글 개 12마리를 대조군과 2,20 및 50\( \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 의 4개 시험군에 체중이 균등히 분포해 시험 물질을 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 설정하고 , 공비 5를 적용하여 10 및 \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 의 중간 및 저용량군을 추가하여서 사망률 및 일반증상, 체중측정, 혈액학적 검사, 혈청생화학적 검사, 부검 결과를 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시혐동물 및 사육환경</h2> <p>5개월령의 비글 개를 Covance Research Product Inc.(Cumberland, VA, USA)로부터 구입하여 2주간 순화◦사육하였다. 순화기간 중 임상증상, 혈액검사, 노검사, 안검사 및 심전도 검사롤 실시하였고, 건강한 수컷 12마리를 선택하여 시험에 공시하였다. 동물실의 사육환경은 온도 \( 23 \pm 3^{\circ} \mathrm{C} \), 상대습도 \( 50 \pm 10 \% \), 환기횟수 \( 13 \sim 18 \) 회/h, 조명시간 12 시간(오전 7시 점등~오후 7시 소등) 및 조도 \( 200 \sim 300 \mathrm{lux} \) 로 설정된 차폐시설에서 수행하였다. 동물은 스테인레스 철망사육상자 \( (700 \mathrm{~W} \times 700 \mathrm{~L} \times 800 \mathrm{H} \mathrm{mm}) \) 에 개체별로 수용하였고, 개용 고형사료(오리엔탈효모사: 日本 東京都 板橋區 小豆泥 3-6-10)는 일일 마리당 \( 300 \mathrm{~g} \) 씩, 그리고 멸균수도수는 일일 마리당 \( 1000 \mathrm{ml} \) 씩으로 제한 급여하였다. 동물의 개체식별은 이개부내측의 tattoo 번호와 사육상자 전면에 개체식별카드를 이용하였다. 본 시험은 국제실험동물관리인중협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)로부터 인증된 사설에서 수행하였으며, 동물은 미국 NRC (National Research Council)의 실헙동물의 관리 및 사용기준에 준하여 유지하였다.</p> <h2>시험물질 및 투여</h2> <p>시험물질은 시판되고 있는 상품(녹삽자수의약품, 용인)을 구입하여, 투여 직전에 각 투여용량에 맞게 증류수로 희석하여 조제하였다. 투여액량은 투여직전에 축정된 채중을 기준으로 \( \mathrm{kg} \) 당 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 의 액량으로 경배부에 1회 피하투여 하였다.</p> <h2>시험군의 구성 및 투여용량의 설정</h2> <p>건강한 수컷동물 12 마리를 선발하여 대조군과 2,20 및 50\( \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 의 4개 시험군에 체중이 균등히 분포하도록 무작위로 3마리씩 분배하였다. 본 시험에 사용된 용랑은 이전 시험들의 연구결과를 참조하여 충분히 독성이 나타날 것으로 예상되는 \( 50 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 을 괴용량으로 설정하였고, 공비 5를 적용하여 10 및 \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 의 중간 및 저용량군을 추가하였다.</p> <h2>사망률 및 일반증상의 관찰</h2> <p>시험물질 투여 후 1시간에서 6시간까지는 매시간 마다, 그리고 투여 다음날부터 14일까지는 매일 1회쌕 일반중상과 사망유무를 관찰 ◦ 기록(Labcat System, Innovative Programming Associates Inc., NJ, USA) 하였다. 사망동물과 빈사동물의 경우, 발견 즉시 부검하여 육안적 부검소견을 관찰하였다.</p> <h2>체중측정</h2> <p>시험에 사용된 모든 동물에 대하여 투여개시전과 투여 후 \( 1,3,7 \) 및 14일에 체중을 측정하였다.</p> <h2>혈액학적 검사</h2> <p>투여 후 14일째에 요측피정맥으로부터 약 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 의 혈액을 EDTA-2K 함유 채혈병(녹십자, 용인)에 채취하였다. 혈구자동계측장치(Coulter Counter T-540, Coulter Counter Elec-tronics, USA)를 이용하여 총백혈구수(white blood cell count, WBC), 적혈구수(red blood cell count, RBC), 혈색소 농도(hemoglobin concentration), 적혈구용적(hematocrit), 평균적혈구용적(mean corpuscular volume, MCV), 평균적혈구혈색소량(mean corpuscular hemoglobin, \( \mathrm{MCH}) \), 평균적혈구혈색소농도(mean corpuscular hemoglobin concentration, \( \mathrm{MCHC} \) ) 및 혈소판수(platelet count)를 측정하였다. 자동분석 후 남은 혈액을 이용하여 백혈구 감별계산을 위한 도말표본을 제작하였다. 자연건조한 도말표본을 Wright 염색법으로 염색하고, 각 표본당 200개의 백혈구를 관찰하여 총백혈구에 대한 백분율로 표기하였다.</p> <h2>혈청생화학적 검사</h2> <p>혈액학적검사와 같은 방법으로 \( 4 \mathrm{ml} \) 의 혈액을 채혈하여 혈청분리관(Iatron Laboratoies Inc., Japan)에 넣고 15 분간 상온에 방치하였다. \( 3,000 \mathrm{rpm} \) 으로 10 분간 원심분리하여 획득한 혈청을 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \) 의 저온 냉동기에 분석할 때까지 보관하였다. 생화학 자동분석장치(Shimadzu-CL-7200, Shimadzu Co., Japan)와 전해질 자동분석장치 \( (644 \mathrm{Na} / \mathrm{K} / \mathrm{Cl} \) Analyzer, Ciba-Corning Co., USA)를 이용하여 AST (aspartate amino-transferase), ALT (alanine aminotransferase), 알카리성 포스 파타아제(alkaline phosphatase), 크레아틴 포스포키나제(creatine phosphokinase), 혈당(glucose), 총단백질(total pro-tein), 알부민(albumin), 알부민/글로부린 비율(albumin/globulin ratio), 혈중요소질소(blood urea nitrogen), 크레아티닌(creatinine), 중성지방(triglyceride), 인지질(phospholipid), 총콜레스테롤(total cholesterol), 총빌리루빈(total bilirubin), 칼슘(calcium), 무기인(inorganic phosphorus), 염소(chloride), 나트륩(sodium) 및 칼륨(potassium)치를 측정하였다.</p> <h2>부검</h2> <p>투여 후 14일째에 모든 생존 동물을 pentobarbital (중외제약, 서울)로 마취 후 액와동맥 절단으로 방혈 - 치사시켜 부검하였다. 모든 생존동물과 도중 사망동물에 대해서 육안적 부검소견을 관찰하였다.</p> <h2>통계학적 분석</h2> <p>시험자료에 대한 통계분석은 SAS program (Statistical Analysis System Institute Inc., Version 6.12, NC, USA)을 이용하여 실시하였다. 시험결과는 가능한 한 평균값과 표준편차로 포기하였다. 반수치사량은 Probit 법을 이용하여 산출하였고, 체중과 혈액학치 및 혈청생화학치에 대해서는 Kruskal-Wallis ANOVA (analysis of variance)로 유의성을 조사한 후 통계학적 차이가 인정된 자료는 Dunnett 다중비교법으로 유의차를 분석하였다. 유의수준은 \( 5 \% \) 및 \( 1 \% \) 에서 검정하였다.</p>