세포배양된 검체를 시료로 반응시킨 후 원심분리를 통해 RNA pellet으로 만들었으며 reverse transcription을 통해 cDNA로 만들었다. 크립토스포리디움 난포낭을 시료로 반응시켜 bead로 만든 후 mRNA를 분리하였다.
<h2>세포배양후 RNA 분리</h2> <p>세포배양 48시간 후 MEM 배지로 3회 세척하고 상층액을 제거하였다. 감염된 세포에 Trizol reagent (Invitrogen)를 각 \( 500 \mu \mathrm { L } \)씩 넣고 세포를 녹여 \( 1.5 \mathrm { ~mL } \)튜브에 옮긴 후 chloro-form \( 100 \mu \mathrm { L } \)를 첨가하여 섞은 다음 실온에 \( 2 \sim 3 \)분 정치하였다. \( 12,000 \mathrm { rpm } \)에서 15분간 원심분리 후 상층액을 새 튜브에 취하고 나머지는 버리고, Isopropyl alcohol \( 200 \mu \mathrm { L } \)를 첨가하여 잘 섞은 다음 \( -20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 하룻밤동안 정치하였다. \( 12,000 \mathrm { rpm } \)에서 10분간 원심분리하여 RNA를 모은 다음 \( 75 \% \) ethanol로 \( 9,000 \mathrm { rpm } \)에서 5분간 원심분리하여 세척한 후, 상층액을 버리고 RNA pellet만 남겨 공기 중에서 말렸다. DEPC-DW를 \( 10 \mu \mathrm { L } \) 넣어 녹인 다음 DNaseI (Ambion) \( 2 \mathrm { U } \)를 넣어 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 15분간 반응시키고 DNaseI activity를 없애기 위해 EDTA를 최종농도가 \( 5 \mathrm { mM } \) 되도록 넣은 후 \( 75 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분간 반응시켰다. 이 중 \( 5 \mu \mathrm { L } \)를 취하여 reverse tran-scription하고 cDNA를 만들었다. 나머지 \( 5 \mu \mathrm { L } \)는 DNA 오염 여부를 확인하기 위해 reverse transcription를 생략하고 바로 PCR하여 확인하였다.</p> <h2>Direct RT-PCR을 위한 Oocyst mRNA 분리</h2> <p>크립토스포리디움 난포낭을 InstaGene (Biorad) \( 50 \mu \mathrm { L } \)에 넣고 \( 42 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30분간 반응시켰다. Lysis-binding buffer (Dynal, Oslo, Norway) \( 100 \mu \mathrm { L } \) 를 더하고 액체질소와 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \)를 1분씩 반복하여 5희 반응시켰다. \( 12,000 \mathrm { rpm } \)에서 3분간 원심 분리 한 다음 상층액을 \( 5 \mu \mathrm { L } \)의 oligodT-bead (Dynal, Oslo, Norway)에 넣고 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30분간 반응시켰다. Magnetic particle concentrator (MPC, Dynal)에 끼워 bead만 분리한 후 상층액을 버렸다. Wash buffer로 세척후 DEPC-DW \( 10 \mu \mathrm { L } \)를 넣고 \( 65 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 2분간 반응시켜 mRNA를 bead로부터 분리하였다. DNaseI을 앞에서 언급한 바와 같이 처리한 다음 reverse transcription하였다.</p>