본 논문에서는 백두구를 분말에 methanol을 가하여 \( 75^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3회 추출해 시료를 만들었고, 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl radical 소거능 분석을 이용해 전자공여능을 측정한 후 항산화제인 ascorbic acid와 비교 분석했다. 백두구의 항비만 활성을 세포 실험계에서 분석하기 전에 시료가 보유한 lipase 효소 활성 저해능을 측정한 결과를 확인했다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>백두구 추출물의 제조</h2> <p>실험에 사용한 백두구는 부산광역시 소재 (주대한생약제품에서 구입하여 사용하였다. 백두구 \( 10 \mathrm{g} \)을 측량하여 분말로 파쇄한 후 시료 부피 5배의 methanol \( (\mathrm{MeOH}) \)을 가하여 \( 75^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3회 반복 추출하였다. 추출한 시료는 여과 후 감압농축기(N-1000S-W, EYELA, Japan)로 농축하고 동결 건조(FDU2100, EYELA, Japan)한 후 중량법으로 각각의 수율을 계산하였다.</p> <h2>DPPH radical 소거 활성 측정을 통한 백두구 추출물의 항산화능 분석</h2> <p>전자공여작용은 인체 내에서 생성되는 free radical의 전자를 공여하여 free radical에 의한 노화와 질병을 억제한다. 따라서 전자공여능은 항산화작용의 지표로서 사용되고 있으며 특히 식물 추출물의 항산화능 측정에 많이 사용되고 있다. 이러한 전자공여능은 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) radical 소거능 분석을 이용하여 측정하였다. DPPH는 비교적 안정한 free radical로써, ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy 방향족 화합물, 방향족 아민류 등에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되는 원리를 이용하여 항산화 활성을 간단히 측정할 수 있는 동시에 식물체의 항산화 활성과도 연관성이 매우 높기 때문에 많이 이용되고 있는 방법이다.</p> <p>백두구 추출물을 농도별(\(12.8-1,600 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)로 \( \mathrm{MeOH} \)에 녹여 준비한 후, 96 well plate에 \( \mathrm{MeOH} \)에 용해된 \( 1.5 \times 10^{-4} \mathrm{M} \) DPPH \(40 \mu \mathrm{l} \)와 각 시료 \( 160 \mu \mathrm{l} \)를 분주한 혼합액을 실온에서 30분간 반응시키고, multi-plate reader (Paradigm, Beckman, CA, USA)를 이용하여 \( 520 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 음성 대조군과 비교하여 처리 농도별 free radical 소거 정도를 백분율로 나타내고, \( 50 \% \) 저해 농도 (Inhibitory Concentration, \( \mathrm{IC}_{50} \))를 계산하였다. 대표적인 항산화제로 DPPH radical 소거 활성 측정 시 양성 대조군으로 주로 사용되는 ascorbic acid를 함께 비교 분석하였으며 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.</p> <h2>백두구 추출물의 pancreatic lipase 효소 활성 저해능 분석</h2> <p>Lipase는 주로 췌장에서 분비되어 TG를 glycerol과 fatty acid로 가수분해하는 효소로서 지방소화효소인 pancreatic lipase의 활성 저해능은 시료가 보유한 항비만 활성을 예측하기에 매우 유용한 시험법이다. 본 연구에서는 백두구의 항비만 활성을 세포 실험계에서 분석하기에 앞서 시료가 보유한 lipase 효소 활성 저해능을 다음과 같이 측정하였다. 먼저 \( 1.5 \mathrm{ml} \) tube에 \( 0.25 \mathrm{M} \) Tris ( \( \mathrm{pH} \) 7.7), \( 250 \mathrm{mM} \mathrm{CaCl}_{2} \), \( 5 \mathrm{mM} \) 4-nitrophenyl dodecanoate (PNPD)로 구성된 효소액과 기질을 넣고 잘 섞어준 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 예열하고, \( 0.25 \mathrm{M} \) Tris \( \left(\mathrm{pH}\right. \) 7.7)에 녹인 lipase와 시료를 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시킨 후 \( 20 \% \) sodium dodecyl sulfate (SDS)를 첨가하여 반응을 종료하였다. 반응액을 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 15,000 \mathrm{rpm} \)에서 20분간 원심분리하여, 분리한 상층액을 96 -well tissue culture plate에 분주하고 multi-plate reader를 이용하여 \( 412 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정한 후, 10분간 반응시킨 시료의 흡광도로부터 0분 반응 시료의 흡광도를 뺀 값을 control 대비 백분율로 나타내었다. 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.</p>