ECP를 얻기 위해 건조된 진피 \( 200 \mathrm{~g} \)에 메탄올을 첨가하여 \( 100 \mathrm{rpm}, 35^{\circ} \mathrm{C} \)조건에서 5일 동안 교반하였다. 실험에는 인체 백혈병 세포인 U937 세포를 사용하였으며, 이 세포의 배양을 위해 RPMI-1640 배지와 \(10\%\) 우태아혈청(FBS) 및 \(1\%\) penicillin이 포함된 성장 배지를 사용하였다. 배양은 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \)조건에서 이루어졌다. Apoptosis 유도 시에는 특이적인 핵의 형태 변화를 관찰하기 위해 MECP로 처리된 세포를 수집한 후 원심 분리하여 상층액을 제거하고, fixing solution(\(37\%\) formaldehyde 용액과 PBS의 1:9 비율 혼합물)을 처리된 세포에 첨가하여 고정시켰다. 고정된 세포는 slide glass에 부착된 후 PBS로 여러 번 세척되었고, 마르기 전에 \(0.2\%\) Triton X-100를 처리하여 상온에서 10분간 고정되었다. 이후 \( 2. 5 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 농도의 DAPI 용액으로 염색하여 상온에서 15분간 처리하였다. 염색이 완료된 후 DAPI 용액을 충분히 세척하고, mounting solution을 처리한 후 형광 현미경을 사용하여 각 농도에 따른 암세포의 핵의 형태 변화를 400배 배율로 관찰하고, Axio Vision 프로그램을 사용하여 사진을 촬영하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시료준비</h2> <p>본 연구에 사용된 진피는 대한생약(주(부산, 한국)에서 구입하여 흐르는 물에 수회 세척하고 그늘에서 하루 동안 건조시켜 사용하였다. MECP를 얻기 위하여 건조된 진피 \( 200 \mathrm{~g} \) 에 메탄올을 \( 1.51 \) 첨가하여 \( 100 \mathrm{rpm}, 35^{\circ} \mathrm{C} \) 조건에서 5 일간 교반하였다. 그 후 상층액만 분리하여 건조하고, 분말을 200 \( \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich)에 용해시킨 후 이를 적정 농도로 배지에 희석하여 처리하였다.</p> <h2>세포배양</h2> <p>실험에 사용한 인체 백혈병 세포(U937)는 생명공학연구소 (KRIBB, 대전, 한국)에서 분양 받았으며, 암세포의 배양을 위해 RPMI-1640 배지(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)와 \( 10 \% \) 의 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Gibco BRL) 및 \( 1 \% \) 의 penicillin이 포함된 성장배지를 사용하였으며, \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) 조건 하에서 배양하였다. 세포수의 증식에 따른 과밀도 현상과 적정수의 세포를 유지하기 위하여 성장배지의 교환을 매 24 시간마다 실시하였다.</p> <h2>MTT assay를 이용한 세포 생존율의 측정</h2> <p>세포 배양용 6 well plate에 \( 3 \times 10^{5} \) 개 \( / \mathrm{ml} \) 로 세포를 분주하고 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 \( \mathrm{EMCP} \) 를 각 well 당 적정 농도로 처리하였다. 24 시간 후 배지를 제거하고 tetrazolium bromide salt (MTT, Ameresco, Solon, Ohio, USA)를 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 희석하여 \( 200 \mu 1 \) 씩 분주하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 시간 동안 다시 배양하였다. 배양이 끝난 다음 MTT 시약을 제거하고 DMSO 를 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 각 well에 분주하여 생성된 formazan을 모두 녹인 후 96 well plate에 200 ㅆ1씩 옮겨서 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>DAPI staining에 의한 세포핵의 형태 관찰</h2> <p>Apoptosis가 유발되었을 경우 특이적으로 나타나는 핵의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 EMCP가 처리된 세포를 모은 다음 2,000 rpm으로 5 분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고 \( 37 \% \) formaldehyde 용액과 PBS 를 1:9의 비율로 섞은 fixing solution을 모아진 세포에 \( 500 \mu 1 \) 첨가하여 충분히 섞은 후, 상온에서 10 분 동안 고정하였다. 고정된 세포를 \( 2,000 \mathrm{rpm} \) 으로 5 분간 원심 분리하여 fixing solution을 제거하고 PBS 200 \( \mu 1 \) 에 부유시킨 후 세포가 포함되어 있는 PBS 80 씨를 slide glass 위에 떨어뜨리고 \( 1,000 \mathrm{rpm} \) 에서 5 분간 cytospin하여 세포를 slide glass에 부착하였다. 세포가 부착된 slide glass를 PBS로 2 3 회 정도 세척하고 PBS가 마르기 전에 \( 0.2 \% \) 의 Triton X-100 (Amresco, Solon, OH, USA)를 첨가하여 상온에서 10 분간 고정한 후 \( 2.5 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 농도의 \( 4^{\prime}, 6 \)-dia-midino-2-phenylindole (DAPI, Sigma-Aldrich) 용액을 처리하여 상온에서 15 분간 염색하였다. 염색이 끝난 후 DAPI 용액을 충분하게 세척하고 mounting solution을 처리한 후 형광 현미경을 이용하여 400 배의 배율로 각 농도에 따른 암세포의 핵의 형태 변화를 관찰한 다음 Axio Vision 프로그램을 이용하여 사진 촬영을 하였다.</p>