PCR를 이용하여 \( \mathrm { Cu } / \mathrm { Zn } \) SOD와 \( \beta \)-actin의 cDNA를 분리해서 TOPO vector에 삽입했다. 그 다음 Ready-To-Go DNA labeling Kit을 사용해서 probe로 제작하여 Cell passage 5, 15, 25, 35에서 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } ~100 ~ \mu \mathrm { M } , 500 ~ \mu \mathrm { M } \), \( 1 \mathrm { ~mM } , 5 \mathrm { ~mM } \) 되도록 처리한 total RNA를 Immobilon-Ny + membrane에 transfer하여 hybridization함으로써 Northern blotting을 수행하였다.
<h2>PCR(Polymerase Chain Reaction)</h2> <p>합성된 \( \mathrm { Cu } / \mathrm { Zn } \) SOD와 \( \beta \)-actin의 cDNA를 이용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction, Perkin Elmer 480, USA)을 수행하였다. 각각을 \( 1.5 \% \)agarose gel상에서 분리한 후, Gel extraction kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 elution하였다. DNA sequence는 Solgent사(Korea)에 의뢰하였으며 분석 결과 동일 서열임을 확인하였다.</p> <h2>\( \mathrm { Cu } / \mathrm { Zn } \) SOD and \( \beta \)-actin의 TA cloning</h2> <p>\( \mathrm { Cu } / \mathrm { Zn } \) SOD and \( \beta \)-actin의 PCR product를 \( 1.5 \% \) agarose 에서 elution하여 실온에서 30 분 반응시켜 TOPO vector (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen)에 삽입하였다.</p> <h2>DNA labeling</h2> <p>PCR product를 Ready-To-Go DNA labeling Kit (dCTP, Pharmacia Biotech, USA)을 사용하여 \( \mathrm { Cu } / \mathrm { Zn } \) SOD과 \( \beta \)-actin의 probe를 제작하였다. 제공한 protocol에 따라 \( 50 \mathrm { ~ng } \)의 DNA를 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30 분 동안 반응시켜 labeling 하였다. Labeling이 끝난 후, 반응액 중에 labeling 되지 않은 DNA를 제거하기 위해 Qiaquick nucleotide removal kit를 이용하였다.</p> <h2>Northern blotting</h2> <p>Cell passage 5, 15, 25, 35에서 각각 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } ~100 ~ \mu \mathrm { M } , 500 ~ \mu \mathrm { M } \), \( 1 \mathrm { ~mM } , 5 \mathrm { ~mM } \) 되도록 처리하여 30 분, 1 시간 동안 incubator에서 배양한 후, 세포에서 total RNA를 분리하고, 전기 영동하여 Immobilon-Ny + membrane (Millipore)에 transfer한 후, \( \mathrm { Cu } / \mathrm { Zn } \) SOD과 \( \beta \)-actin의 probe로 각각 hybridization 하였다.</p> <p>Total RNA를 전기 영동하여 transfer한 membrane을 hybridization buffer \( 30 \mathrm { ~ml } \)을 넣은 bottle에 넣고, \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 2시간 동안 prehybridization을 수행하였다. Labeling한 probe를 첨가하여 18 시간 동안 hybridization을 수행하였다. Hybridization이 끝난 membrane은 \( 68 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 washing buffer Ⅰ \( (2 \times \mathrm { SSC } , 0.1 \% \) \( \mathrm { SDS } ) \)으로 5 분씩 두 번, washing buffer Ⅱ \( (0.1 \times \mathrm { SSC } , 1 \% \) \( \mathrm { SDS } ) \)로 5 분씩 두 번 수행하였고, washing buffer Ⅲ \( (1 \times \mathrm { SSC } ) \)에서 washing할 때는 방사능 측정기(Geiger counnter)로 감지하면서 시간을 적절히 조절하였다. 세척이 끝난 membrane은 \( -75 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 약 일주일 동안 감광시킨 후에 현상하였다.</p>