본 실험의 재료는 발효 및 비발효 차가버섯 추출물을 여과한 후 동결 건조한 뒤 얻은 분말이며, 실험에 사용된 정상세포주 NIH3T3와 종양세포주 5종은 Korea Cell Line Bank에서 분양받아 계대 배양하여 사용했다. 발효 및 비발효 차가버섯 수용성 추출물에 의한 농도 의존적 세포 생육 저해실험을 MTT assay로 분석하였으며, 각 세포의 형태 변화 관찰을 위해 Culture microscope에 200배 배율로 확대 촬영했다. 또한, 차가버섯 추출물에 의한 암세포증식 억제효과가 세포사멸에 의한 것인지 측정하기 위해 각 암세포를 기본 배양액으로 희석하여 \( 1 \times 10^{6} \) cells/dish의 농도로 \( 100 \mathrm{mm} \) dish에 분주 후 DNA fragmentation 정도를 확인하였다.
<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험재료의 조제</h2><p>차가버섯 분말에 Bacillus sp. WRD-2를 대두 배양원으로 전배양 시킨 것을 접종시켜 습도 \( 50 \sim 60 \% \), 온도 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일 발효시킨 후 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)로 건조시켜 미세 분말화 시켰다. 조제된 발효 차가버섯 및 비발효 차가버섯 분말을 \( 5 \mathrm{~g} / 100 \mathrm{ml} \) \( (5 \%\), \(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 농도로 증류수에 용해하여 끊는 물에서 3시간동안 추출하였다. 추출물을 다시 Whatman filter paper (No. 2)로 여과시킨 후 동결 건조시켜 얻은 분말을 시료로 사용하였다. 본 실험에 사용한 러시아산 차가버섯은 (주)홍재그린에서 제공받았다.</p><h2>정상세포 및 종양세포 배양</h2><p>정상세포주 NIH3T3 (mouse normal fibroblast cell), HCT-15 human colon carcinoma (대장암), 인체 위암 세포주 AGS (human gastric carcinoma), 간암 세포주 Hep3B (human hepatocellular carcinoma), 유방암 세포주 MCF-7 (human breast adenocarcinoma), 자궁경부암 세포주 HeLa (human cervical carcinoma)는 Korea Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea)에서 분양 받아 계대 배양하면서 사용하였다. 세포 배양에는 RPMI 1640 (Invitrogen Co., USA)을 사용하였으며, 그 외 PBS (phosphate buffered saline, \( \mathrm{pH}7.2 \) ), trypsin-EDTA (Grand Island Biological Co., USA) 등 을 사용하였다. 종양세포와 대조군으로 사용한 NIH3T3 세포배양은 전보의 방법에 따라 \( 10 \%\) FBS, \(0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) penicillin-G, \( 0.01 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) streptomycine을 함유한 RPMI 1640 복합배지에 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \mathrm{CO}_{2}\), \(95 \% \) 공기의 조건하에서 \( 10 \mathrm{~cm} \) Falcon dish로 실험에 제공될 세포수가 되기까지 약 1주일간 배양하였으며, 이때 배지는 \(2 \sim 3\)일에 한번씩 교환하였다. 실험 개시전 세포를 배양기에 \( 2 \times 10^{5} \) 개씩 접종하여 세포성장이 배양기 표면의 \(80 \sim 90\%\) 정도 되었을 때 trypsin을 사용하여 세포를 dish에서 분리하고 일정량의 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Bio Whittaker Co, USA)으로 세포를 2회 씻어준 다음 희석하여 본 실험에 사용하였다. 차가버섯 조성물의 \( 5 \% \) 추출물을 동결건조 시켜 얻은 분말을 RPMI 1640에 0, 0.5, \(1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도가 되도록 현탁 시킨 후 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) 필터(Millex-HD, Millipore Co.)로 각각 제균시켜 세포배양에 첨가하였다.</p><h2>MTT 분석에 의한 세포 생존율 측정</h2><p>MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazo-lium bromide) (Sigma chemical Co., Louis, Mo., USA)는 살아있는 세포의 미토콘드리아 내막에 존재하는 oxido-reductase의 효소 작용에 의해 환원되어 보라색의 불용성 formazan을 생성하고, 이들 용해액의 발색정도를 흡광도로 측정함으로써 살아있는 세포수를 계측하는데 이용되는 방법이다. 발효 및 비발효 차가버섯 수용성 추출물에 의한 농도 의존적 세포 생육 저해실험을 MTT assay로 분석하였다. 종양세포 및 정상세포를 각각 \( 2 \times 10^{4} \) cells/ \( \mathrm{ml} \) 농도가 되도록 조절한 후 96 well plate에 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 씩 분주하고 이것을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 세포배양기에서 6시간 배양하여 세포를 부착시킨후 추출물 농도를 0, 0.5, 1 \( \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 씩 첨가하였다. 이것을 96시간 동안 배양시킨 후, MTT 용액을 각 well당 \( 10 \mu \mathrm{l} \)씩 넣고 세포배양기에서 4시간 동안 반응시켰다. MTT 용액을 제거한 후, \(0.04 \mathrm{N} \mathrm{HCl}\) 이 함유된 isopropanol을 첨가하여 각 세포를 용해시킨 후, ELISA-reader (Bio-Rad Model 550 Microplate Reader, USA)로 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 각 세포의 시료 무첨가 대조군을 \( 100 \% \)로 하여 상대적인 세포 증식도를 나타내었다.</p><h2>세포 형태 관찰</h2><p>각 세포의 형태 변화의 관찰을 위하여 0, 0.5, 1 \(\mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 첨가하여 96시간 배양한 후 디지털 카메라가 장착된 Culture microscopes (CKX41, Olympus Optical Co., Ltd. Tokyo, Japan)에 200배 배율로 확대하여 촬영하였다.</p><h2>DNA fragmentation 측정</h2><p>차가버섯 추출물에 의한 암세포증식 억제효과가 세포사멸 (apoptosis)에 의한 것인지를 측정하기 위하여 각 암세포를 기본 배양액으로 희석하여 \( 1 \times 10^{6} \) cells/dish의 농도로 \( 100 \mathrm{mm} \) dish에 분주하여 상기와 같은 방법으로 96시간 배양하였다. 배양된 암 세포들을 PBS로 2회 가볍게 헹군 다음 세포를 긁고 원심분리 하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포에 extraction buffer ( \( 50 \mathrm{mM} \) Tris-\(\mathrm{HCl}\), \(\mathrm{pH} 7.5\) \(20 \mathrm{mM} \) EDTA,\( 1 \% \) Nonidet P-40) \( 2 \mathrm{ml} \)를 넣고 저온에서 2시간 동안 추출하였다. 여기에 sodium dodecyl sulfate (SDS) \( 1 \% \) 및 RNase \( (0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)를 첨가하여 잘 혼합한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 교반 하고, proteinase K \(0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)를 첨가하여 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 다시 반응시켰다. DNA는 phenol-chloroform-isoamylalcohol (\(25:24:1\))을 넣고 잘 추출한 후 원심분리로 DNA가 함유된 상층액을 얻어 0.1배의 \( 3 \mathrm{M} \) sodium acetate와 2.5 배의 ethanol을 넣어 DNA pellet을 침전시키고, 다시 \( 70 \% \) ethanol로 헹구어 준 다음 건조시켰다. 건조된 DNA pellet은 Tris-EDTA buffer (\( 20 \mathrm{mM}\) Tris, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA)로 녹인 다음 \( 260 \mathrm{~nm} \) 흡광도에서 정량한 후 \( 20 \mu \mathrm{g}\) DNA를 2% agarose gel에서 전기 영동하고 ethidium bromide로 염색하고 탈색하여 DNA fragmentation 정도를 확인하였다.</p>