제주 연안 해수를 해양 미생물 분리용 평판배지 MA (Ma-rine agar, Difco)에서 \( 10^{1} \)에서 \( 10^{4} \)배로 희석한 후 배지에 도말하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일간 배양, 생성된 균주를 tooth pick로 신선한 배지에 옮긴 후 다시 배양, 생성된 colony에 멸균된 filter paper를 colony상에 놓고 한천배지에 있는 colony의 대사산물 및 균체가 여지에 옮겨지도록 한 후 DPPH 에탄올 용액을 균체 및 대사산물이 묻은 filter paper에 분사해 색이 소실되는 균주를 1차적으로 총 10여종을 선별하였다. 세포 지방산 분석을 위해 Marine broth에 \( 25^{\circ} \mathrm{C}\), 24시간 배양한 균체의 지방산을 Microbial Identification System(MIDI ; Microbial ID, Sherlock System)의 지침에 의해 지방산을 추출하여 분석하였다. 흡광도를 측정하여 대조구에 대한 흡광도의 감소 비율로서 전자 공여능을 나타내었다. 대조구는 균주가 접종되지 않은 Marine broth를 사용하였다. 배지조건의 최적화 과정에서 탄소원의 종류에 따른 배양액의 항산화 활성 측정은 DPPH법에 의한 전자공여능으로 측정하였다.
<h1>재료 및 방법</h1> <h2>항산화 활성 물질 생성 균주의 분리 및 선정</h2> <p>제주 연안 해수를 해양 미생물 분리용 평판배지 MA (Ma-rine agar, Difco)에서 \( 10^{1} \)에서 \( 10^{4} \)배로 희석한 후 배지에 도말하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3일간 배양하고, 생성된 균주를 tooth pick로 새로 만든 신선한 배지에 옮긴 후 다시 배양한 다음 생성된 colony에 멸균된 filter paper를 평판배지위의 colony상에 놓고 한천배지에 있는 colony의 대사산물 및 균체가 여지에 옮겨지도록 한 후 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)에탄올 용액을 균체 및 대사산물이 묻은 filter paper에 분사하여 색이 소실되는 균주를 1차적으로 총 10여종을 선별하였다.</p> <p>항산화 활성능 측정을 위한 균주를 배양하기 위해 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \), \( 200 \mathrm{~rpm} \)에서 진탕 배양하였으며, 상기의 방법으로 분리된 각 균주들을 MB (Marine broth, Difco)에 \( 2 \%~(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)씩 첨가하여 24시간 배양한 후, 에탄올에 녹인 \( 3 \times 10^{-4}\)M DPPH \((0.118 \)\( \mathrm{~mg} / \mathrm{ml}) \) 용액 \( 2.9 \mathrm{~ml} \)에 균주 배앙액 \( 100 ~\mu \mathrm{l} \)를 혼합하여 30분간 반응시켰다. 반응물을 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 10,000 \mathrm{~rpm} \)에서 2분간 원심분리한 후, 분비물을 제거하여 \( 525 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 항산화 활성능이 가장 큰 균주를 선정하였다.</p> <h2>16S rDNA 및 지방산 분석에 의한 균주의 동정</h2> <p>분리 균주의 동정을 위하여 16S rDNA 염기서열 분석과 균주의 세포벽 지방산 조성을 분석하였다. 염기서열을 분석하기 위하여 MB에서 24시간 동안 배양된 균주를 사용하여 배양액을 \( 1.5 \mathrm{~ml} \) microcentrifuge tube에 옮겨 \(10,000 \mathrm{~rpm}\)에서 1분간 원심분리하여 상청액을 제거한 후 모아진 bacteria pellet을 수집하였다. Accuprep Genomic DNA Extraction Kit(Bioneer, Korea)를 사용하여 genomic DNA를 분리하고 Bio-neer사에서 제조한 eubacteria의 Universal Primer 27F for-ward primer와 1522R reverse primer를 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 반응 산물은 Accuprep PCR Purification Kit를 이용하여 정제하였으며, 최종적으로 염기서열을 분석하였다. 세포 지방산 분석을 위해 Marine broth에 \( 25^{\circ} \mathrm{C}\), 24시간 배양한 균체의 지방산을 Microbial Identification System(MIDI ; Microbial ID, Sherlock System)의 지침에 의해 지방산을 추출하여 분석하였다.</p> <h2>분리 균주의 항산화 활성 측정</h2> <p>시료에 대한 전자공여능은 DPPH의 환원성을 이용하여 \(525 \mathrm{~nm}\)에서 흡광도로 측정하였다. 즉, 시료용액 \( 1 \mathrm{~ml} \)를 시험관에 넣고 DPPH \( 2 \mathrm{~ml} \) 가하고 10초동안 vortex mixer로 섞은 후, 상온에서 30분간 반응시킨 후, 흡광도를 측정하여 대조구에 대한 흡광도의 감소 비율로서 전자 공여능을 나타내었다. 대조구는 균주가 접종되지 않은 Marine broth를 사용하였다.</p> <p>\( \mathrm{EDA}(\%)=[( \) \(\text{대조구흡광도-시료첨가구흡광도}\) \( ) \)\[\text { / 대조구흡광도] } \times 100\]</p> <h2>균주의 배양조건</h2> <p>이전 연구에서 균주는 해수에서 분리되어 Marine broth에서 가장 높은 생육도를 보였으며, 분리균주의 최적성장에 따른 온도, 염, \(\mathrm{pH}\)에 대한 영향을 조사해 본 결과 최적온도 \( 25^{\circ} \mathrm{C}\), \(\mathrm{NaCl} \) 농도 \( 4.0 \%\), \(\mathrm{pH}\) 범위는 7~8로 나타났으며, 이 조건에 맞게 균주를 배양하였다.</p> <h2>탄소원 종류 및 농도에 따른 배양액의 항산화 활성</h2> <p>배지조건의 최적화 과정에서 탄소원의 종류에 따른 배양액의 항산화 활성 측정은 DPPH법에 의한 전자공여능으로 측정하였다. 균주 배양은 기본배지인 Marine broth를 기본배지로 하여 mannitol, sucrose, lactose, xylose, maltose, fructose, dextrose, glycerin을 각각 \( 1 \%~(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \)로 첨가하여 초기 \(\mathrm{pH}\)를 7.8로 동일하게 조정한 후, 전 배양된 분리균주를 각각 \( 2 \%~(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 접종하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양한 후, \(600 \mathrm{~nm} \) 흡광도로 생육도를 측정하였으며, \(8,000 \mathrm{~rpm}\)에서 3분간 원심분리하여 얻은 상등액을 가지고 항산화 활성을 측정하였으며, 이에 나타난 maltose의 농도별 효과를 검토하기 위하여 Marine broth에 탄소원을 \(0, 0.5, 1, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0 \% \) 각각의 농도별로 첨가하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C}\), 24시간 배양한 상등액을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.</p>